ＤＮＡチップに基づく遺伝子型決定
本発明は、一般的に、核酸分析の分野に関する。詳細には、本発明は、特に核酸ハイブリダイゼーションにおける使用に適切な支持体を備えるチップを用いて、標的遺伝子を型決定する方法を提供する。この支持体上には、上記標的のヌクレオチド配列と相補的なオリゴヌクレオチドプローブ、および以下のオリゴヌクレオチドコントロールプローブ：ポジティブコントロールプローブ、ネガジティブコントロールプローブ、ハイブリダイゼーションコントロールプローブ、および固定コントロールプローブ、の少なくとも１つが固定されている。ＨＬＡ標的遺伝子を型決定するためのオリゴヌクレオチドプローブアレイもまた提供される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に核酸分析の分野に関連する。特に本発明は、とりわけ、核酸ハイブリダイゼーションにおける使用に適した支持体を含むチップを用いる標的遺伝子の型決定方法を提供する。ここで、この支持体は、上記標的ヌクレオチド配列に対して相補的なオリゴヌクレオチドプローブを有し、そして、少なくとも以下のオリゴヌクレオチドコントロールプローブ（ポジティブコントロールプローブ、ネガティブコントロールプローブ、ハイブリダイゼーションコントロールプローブ、および固定コントロールプローブ）のうち１つを有する。ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）標的遺伝子の型決定のためのオリゴヌクレオチドプローブまたはプローブアレイもまた、提供される。
【背景技術】
【０００２】
ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）は、ヒトの第６染色体の短鎖上に位置するＨＬＡ遺伝子複合体によりコードされる。上記ヒトＨＬＡ遺伝子は、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）（組織抗原および免疫応答に関連する遺伝子クラスター）の一部である。個体間の臓器移植の成功は、容認度（すなわち、ドナーとレシピエントとの組み合わせの間の組織適合性）に依存する。移植した臓器に対する拒絶を生じる抗原は、移植抗原または組織適合性抗原である。人体における拒絶反応と関連する２０以上の抗原系がある。それらの中の強くかつ急性拒絶反応を生じ得る抗原は、主要組織適合性抗原と称される。その遺伝子は、堅く結合した遺伝子クラスターであり、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）と称される。免疫応答および機能調節をコントロールする免疫応答遺伝子（ＩＲ遺伝子）がＭＨＣ中に位置することが、現在証明されている。従って、ＭＨＣは、移植拒絶に関連するだけでなく、免疫応答および免疫調節の誘導および調節においても広く関係する。ＨＬＡ遺伝子は、ヒトの第６染色体上に位置する約４０００ｋｂの領域（全ヒトゲノムの約３，０００分の１に生じる領域）内に位置する。同定されたＨＬＡ座が２２４個ある。ＨＬＡタンパク質は、それらの構造、発現パターン、組織分布、および機能に基づき、３つのクラス（ＨＬＡ−Ｉ，ＨＬＡ−ＩＩおよびＨＬＡ−ＩＩＩ）に分類される。各遺伝子座内に、対立遺伝子が数百ある。
【０００３】
ＨＬＡ遺伝子によりコードされるタンパク質は、組織移植の間の移植片拒絶における重要な役割を担う。成功した組織移植は、ドナーとレシピエントとの間で、ある一定のＨＬＡマッチングの程度が得られるかに依存する。従って、ＨＬＡ型決定は、最適にマッチしたドナーを選択するために必要である。現在のところ、ＨＬＡ型決定は、多数の医学的処置（例えば、臓器移植、特に、骨髄移植）と組み合わせて慣用的に行われている。ヒト集団のＨＬＡ遺伝子における広範囲にわたる多型、免疫応答の調節におけるＨＬＡ遺伝子によりコードされるタンパク質の役割、ならびに、父性遺伝子および母性遺伝子両方による相互優性発現に基づき、ＨＬＡ型決定はまた、疾患に対する感受性予測、法医学的同定、父性決定、および遺伝子研究において、用いられる。従って、正確なＨＬＡ型決定方法が必要とされている。
【０００４】
ＨＬＡ型決定のための異なる方法が用いられている。現在のところ、ＨＬＡ遺伝子は、血清学的方法、混合リンパ球型培養（ＭＬＣ）、およびＤＮＡ配列に基づく型決定方法を用いて、型決定される。
【０００５】
血清学的方法は、白血球の表面上のＨＬＡタンパク質を有する血清の反応に基づいている。血清学的型決定の原理に基づいた方法（例えば、ＩＤ−ＩＥＦおよびモノクローナル抗体型決定法）は、特異性を高めるため、そして検査時間を短縮するために開発された。血清学的ＨＬＡ型決定の主な欠点は、血清の複雑性、検査を行うのに必要な標準血清の広範囲にわたる利用性の欠如、および、すでに知られたＨＬＡ型のみが検出され、新しい多型は検出されないことである。
【０００６】
混合リンパ球培養試験においては、１個体に由来するリンパ球「レスポンダー（ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ）」を、別の個体に由来する「刺激性」リンパ球とともに培養する。刺激性細胞が無関係な人物または家族（この家族のＭＨＣは、レスポンダーのＭＨＣとは異なる）に由来する細胞である場合、未処理のリンパ球が増殖する。この増殖は、個体からの適合しない抗原のインジケーターである。ＭＬＣ方法は、細胞の型決定の利用性の欠如、および検査手順の複雑性のために広くは用いられない。
【０００７】
ＤＮＡ配列に基づくＨＬＡ型決定方法は、血清学的方法または混合リンパ球培養方法の欠点を克服するために開発された。このような方法の１つは、ＨＬＡ型決定の基礎であるＤＮＡ制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）の使用を含む。米国特許第４，５８２，７８８号を参照のこと。ヒト集団のＨＬＡ遺伝子における多型により生じた制限エンドヌクレアーゼ消化物の長さの多型は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術と組み合わせて、ＨＬＡ型決定のために用いられる。しかしながら、ＲＦＬＰ法は、集団中に存在することが知られた特定のアレイ（例えば、ＨＬＡ−ＤＲ４のサブタイプ）との間で区別することができず、そして従って、対立遺伝子特定の組合せを区別するために用いることができない。
【０００８】
さらに最近では、研究者は、ＨＬＡ−ＩＩ型決定を行うための配列特異的オリゴヌクオチド（ＳＳＯ）プローブハイブリダイゼーション法を確立した。この方法は、ＨＬＡ座の多型領域をＰＣＲを用いて増幅する工程、増幅したＤＮＡと配列特異的オリゴヌクレオチドプローブとをハイブリダイズする工程、および、増幅したＤＮＡと配列特異的オリゴヌクレオチドプローブとの間で形成したハイブリッドを検出する工程を包含する。この方法は、ＨＬＡ対立遺伝子の間で１つまたは２つのヌクレオチドの相違を同定し得る。この方法の欠点は、調査において、ハイブリダイゼーションのための複数の等価な膜を形成する複雑性および困難性、または、多数の対立遺伝子が原因で現在自動化されてない、ハイブリダイゼーション後の同じ膜の再使用の複雑性および困難性である。逆線ストリップ型決定法（ｒｅｖｅｒｓｅ ｌｉｎｅ ｓｔｒｉｐ ｔｙｐｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ）は、検出するシグナルを発生するために酵素法を用いてＳＳＯ法を改善するために開発されたが、この方法の操作は、所望の結果を得るためには複雑かつ困難である。
【０００９】
ＨＬＡ型決定のための配列特異的プライマー増幅（ＰＣＲ−ＳＳＰ）法は、ＨＬＡ型のＰＣＲ増幅のためにＰＣＲプライマーの配列特異的部位を利用し、そして、電気泳動によって増幅産物を分析する。この方法を用いる検査に必要な時間は、２〜３時間のみである（Ｍｙｔｉｌｉｎｅｏｓら、Ｈｕｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，５９：５１２−７（１９９８））。しかしながら、未知のサンプルについては、この方法は、特定のプライマーの各々を検査するために多くの研究を必要とする。加えて、ＨＬＡサブタイプの高い識別能での型決定を達成することは困難である。
【００１０】
他のＤＮＡ配列に基づくＨＬＡ型決定法としては、ＰＣＲ１本鎖コンフォメーション多型（ＰＣＲ−ＳＳＣＰ）およびＰＣＲフィンガープリントが挙げられる。ＤＮＡ配列に基づくＨＬＡ型決定法は、ＨＬＡ型決定をより正確にし、そしてまた、より多くのＨＬＡ対立遺伝子を同定するのを補助する。
【００１１】
ＤＮＡチップ技術は、多数の異なるＤＮＡ配列またはＤＮＡ断片を同時に１つのＤＮＡチップ上で分析するために広く用いられた。この技術は、ＤＮＡ断片のハイスループットで同時に迅速な分析を実現させる。この技術は、非常に少ない量の標的ＤＮＡ断片しか必要としない。ＨＬＡ遺伝子の複雑性のため、ＤＮＡチップは、ＨＬＡ型決定の用途のための理想のツールであり得る。いくつかのキットおよび方法が、記載されている。Ｋａｈｉｗａｓｅ，Ｒｉｎｓｈｏ Ｂｙｏｒｉ Ｓｕｐｐｌ．１１０：９９−１０６（１９９９）；Ｃａｏら、Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔ，１：１７７−２０８（１９９９）；および、Ｇｕｏら、Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔ．１：２２０−３０（１９９９）を参照のこと。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
１つの局面において、本発明は、標的遺伝子の型決定方法に関する。上記方法は、以下：
ａ）適切なサンプルから標的遺伝子を含む標的細胞を単離し、そして上記単離された標的細胞由来の上記標的遺伝子の少なくとも一部である標的ヌクレオチド配列と、必要に応じて上記標的遺伝子に無関係の別のヌクレオチド配列とを含む調製物を得る工程；
ｂ）核酸ハイブリダイゼーションにおいて使用するために適切な支持体を含むチップを提供する工程であって、上記支持体上には、上記標的ヌクレオチド配列に対して相補的なオリゴヌクレオチドプローブと、以下のオリゴヌクレオチドコントロールプローブ：ポジティブコントロールプローブ、ネガティブコントロールプローブ、ハイブリダイゼーションコントロールプローブ、および固定コントロールプローブのうちの少なくとも１つとが固定されている、工程；ならびに、
ｃ）工程ａ）において得られた上記調製物を工程ｂ）において提供された上記チップに対してハイブリダイズさせ、上記標的ヌクレオチド配列および／または上記別のヌクレオチド配列と、上記チップ上に含まれる上記コントロールプローブとの間のハイブリダイゼーションを評価して、上記標的遺伝子の型を決定する工程、
を包含する。
【００１３】
別の局面において、本発明はＨＬＡ標的遺伝子の型決定のためのオリゴヌクレオチドプローブに関する。上記オリゴヌクレオチドプローブが、以下のヌクレオチド配列：
ａ）高ストリンジェンシーの条件下で、表１に示される標的ＨＬＡヌクレオチド配列もしくはその相補鎖とハイブリダイズする、ヌクレオチド配列；または、
ｂ）表１に示されるヌクレオチド配列もしくはその相補鎖を含む標的ＨＬＡヌクレオチド配列に対して、少なくとも９０％の同一性を有する、ヌクレオチド配列、
を包含する。
【００１４】
さらなる別の局面において、本発明は、ＨＬＡ標的遺伝子を型決定するために支持体上に固定されたオリゴヌクレオチドプローブのアレイに関する。上記アレイは、核酸ハイブリダイゼーションにおいて使用するために適切な支持体を含み、上記支持体上には、複数のオリゴヌクレオチドプローブが固定されており、上記プローブの少なくとも１つは、以下のヌクレオチド配列：
ａ）高ストリンジェンシー条件下で、表１に示される標的ＨＬＡヌクレオチド配列もしくはその相補鎖とハイブリダイズする、ヌクレオチド配列；または、
ｂ）表１に示されるヌクレオチド配列もしくはその相補鎖を含む標的ＨＬＡヌクレオチド配列に対して、少なくとも９０％の同一性を有する、ヌクレオチド配列、
を包含する。
【００１５】
（発明を実施する形態）
開示を明確にするため、そして限定しない目的で、本発明の詳細な説明を以下の小節に分ける。
【００１６】
（Ａ．定義）
定義されていなければ、本明細書中において用いられるすべての技術用語および科学用語は、本発明の属する当該分野における当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書中で引用されたすべての特許、特許出願、公開された特許出願、および他の出版物は、本明細書中にそれらの全体が参考として援用される。本節に記載された定義が、本明細書中で引用された特許、特許出願、公開された特許出願、および他の出版物に記載された定義と逆である場合、またはそうでなければ一致しない場合、本節に記載された定義を、参考として本明細書中において援用される定義よりも優先する。
【００１７】
本明細書中において用いられる場合、「ａ」または「ａｎ」は、「少なくとも１つ」または「１つ以上」を意味する。
【００１８】
本明細書中において用いられる場合、「プライマー」は、標的配列にハイブリダイズする（一般的には、増幅工程において核酸にプライミングする）オリゴヌクレオチドをいう。
【００１９】
本明細書中において用いられる場合、「プローブ」は、標的配列にハイブリダイズする（一般的には、その検出を促進する）オリゴヌクレオチドをいう。用語「標的配列」は、プローブが特異的に結合する核酸配列をいう。増幅工程において上記標的核酸をプライミングするのに用いられるプライマーとは違って、プローブは、ポリメラーゼ酵素を用いて標的配列を増幅するために伸長する必要がない。しかしながら、多くの場合においてプローブおよびプライマーが構造的に類似しているかまたは同一であることは当業者にとって明らかである。
【００２０】
本明細書中において用いられる場合、「ポジティブコントロールプローブ」は、標的配列群（もしくはファミリー）の保存された配列またはコンセンサス配列とハイブリダイズするプローブをいう。本明細書中において用いられる場合「ネガティブコントロールプローブ」が、上記ポジティブコントロールプローブと比較した場合、単一または複数の塩基対の変化を含むプローブをいう。好ましくは、ネガティブコントロールプローブは、ポジティブコントロールプローブと比較した場合、単一の塩基対の変化を含む。別の例示的なネガティブコントロールプローブは、標的配列が由来する起点とは異なる起点からの相同配列である。１つの特定の例において、２つのポジティブコントロールプローブ（すなわち、強いプローブおよび弱いプローブ、ならびに一緒に用いられ得る単一のネガティブコントロール）である。上記強いポジティブコントロールプローブおよびネガティブコントロールは、全ハイブリダイゼーション効率を評価されるのに用いられる。上記弱いポジティブコントロールプローブは、検査用プローブ（すなわち、ハイブリダイゼーションが評価される非コントロールプローブ）のハイブリダイゼーションシグナルを評価するのに用いられる。例えば、上記検査用プローブのハイブリダイゼーションシグナルと上記弱いポジティブコントロールプローブのハイブリダイゼーションシグナルとの間の比は、検査用プローブのハイブリダイゼーション強度を評価する範囲を得るために用いられ得る。
【００２１】
本明細書中に用いられる場合、「ハイブリダイゼーションコントロールプローブ」とは、検査用プローブと標的配列との間のハイブリダイゼーションに依存しない全ハイブリダイゼーション効率を評価するのに用いられるプローブをいう。例えば、標的配列がＨＬＡ配列である場合、ハイブリダイゼーションコントロールプローブは、どのＨＬＡ配列に対しても無関係である配列であり得、好ましくは、標的ＨＬＡ標的配列が由来する起源とは異なる起源に由来する。ハイブリダイゼーションコントロールプローブは、ＮＨ２基で修飾され得、そして、検査用プローブを含む他のプローブが適用されるのと同じかもしくは類似する濃度および／または手順でチップ表面に適用（または固定）され得る。ハイブリダイゼーションコントロールプローブに相補的な、別の標識プローブ（例えば、ヘキサクロロフルオロセイン（ＨＥＸ））は、他のプローブの濃度または比に匹敵する濃度または比で、全ハイブリダイゼーション溶液中に添加され得る。他のフルオロセインもまた、本明細書中で用いられ得る。このように、全ハイブリダイゼーション工程がモニタリングされ得る。ハイブリダイゼーションコントロールプローブはまた、チップ表面上のプローブの位置を導く工程または決定する工程において用いられ得る。
【００２２】
本明細書中で使用される場合、「固定コントロールプローブ」とは、固定プロセスを評価するために使用されるプローブをいう。固定コントロールプローブは、いずれのハイブリダイゼーション反応にも関与しない。一例では、この固定コントロールプローブの一端は（例えば、チップ表面への固定を促進するため、ＮＨ２基によって）改変され、そしてこの固定コントロールプローブ他の端は、検出可能な標識（例えば、ＨＥＸ）によって標識される。
【００２３】
本明細書中に用いられる場合「ＨＥＸ」は、フルオロセインの１つであるヘキサクロロフルオロセインを意味する。
【００２４】
本明細書中に用いられる場合、「相補的」とは、２つの核酸配列が少なくとも５０％の配列同一性を有することを意味する。好ましくは、この２つの核酸配列は、少なくとも６０％の配列同一性、７０％の配列同一性、８０％の配列同一性、９０％の配列同一性、９５％の配列同一性、９６％の配列同一性、９７％の配列同一性、９８％の配列同一性、９９％の配列同一性、または１００％の配列同一性を有する。「相補的」はまた、上記２つの核酸配列が、低ストレンジェンシー条件下、中ストレンジェンシー条件下、および／または、高ストレンジェンシー条件下でハイブリダイズし得ることを意味する。
【００２５】
本明細書中に用いられる場合、「実質的に相補的」とは、２つの核酸配列が、少なくとも９０％の配列同一性を有することを意味する。好ましくは、この２つの核酸配列は、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９６％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、少なくとも９９％の配列同一性、または１００％の配列同一性を有する。あるいは、「実質的に相補的」とは、２つの核酸配列が高ストレンジェンシー条件下でハイブリダイズし得ることを意味する。
【００２６】
本明細書中に用いられる場合、「完全にマッチする２つのヌクレオチド配列」は、核酸二重鎖をいい、ここで上記２つのヌクレオチド鎖は、ワトソン−クリック塩基対形成原理（すなわち、ＤＮＡ：ＤＮＡ二重鎖においてはＡ−Ｔ対およびＣ−Ｇ対、ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖またはＲＮＡ：ＲＮＡ二重鎖においてはＡ−Ｕ対およびＣ−Ｇ対）に従ってマッチし、そして、二重鎖中の配列の何れにも欠損または付加がない。
【００２７】
本明細書中において用いられる場合、ミスマッチ率決定における「ハイブリダイゼーションのストレンジェンシー」とは、以下である：
１）高ストレンジェンシー：０．１×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ、６５℃；
２）中ストレンジェンシー：０．２×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ、５０℃（中程度なストレンジェンシーとしても称される）；および
３）低ストレンジェンシー：１．０×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ、５０℃。
【００２８】
同等のストレンジェンシーを代替的な緩衝液、塩、および温度を用いて達成され得ることが理解されている（一般的には、Ａｕｓｕｂｅｌ（編）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２．９Ａ．Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ，２．９Ｂ．Ｄｏｔ ａｎｄ Ｓｌｏｔ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ ｏｆ ＤＮＡ、および２．１０．Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＤＮＡ Ｂｌｏｔｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（２０００）を参照のこと）。
【００２９】
本明細書中において用いられる場合、「融解温度」（「Ｔｍ」）とは、核酸二重鎖（すなわち、ＤＮＡ：ＤＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡ、ＲＮＡ：ＲＮＡ）が変性する温度範囲の中間点をいう。プローブのＴｍ値は、ハイブリダイズしたプローブのＴｍ値を意味する。
【００３０】
本明細書中において用いられる場合、「評価する」は、プローブと標的ヌクレオチド配列との間で形成したハイブリッドの量的決定および／または質的決定をいう（例えば、ハイブリッドの量または濃度についての絶対値、そしてまた、係数、比、百分率、視覚、またはハイブリダイゼーションレベルの指標となる他の値を得ることである。評価は、直接的または間接的あり得、そして、実際に検出された化学種は、ハイブリッドそのものである必要はなく、例えば、その誘導体、プローブおよび／もしくは標的ヌクレオチド配列、またはいくつかのさらなる物質の減少または消失であり得る。
【００３１】
本明細書中において用いられる場合、「磁性物質」は、磁石の特性（磁気によって生成する、生じるまたは作用する、磁石または磁気に関連する特性）を有する任意の物質をいう。
【００３２】
本明細書中において用いられる場合、「磁化可能な物質」は、磁場と相互作用する特性、およびそれゆえに、磁場内で懸架されるかまたは自由に配置される場合に、磁気を誘導し磁気モーメントを生成する特性を有する任意の物質をいう。磁化可能な物質の例としては、限定はされないが、常磁性物質、強磁性物質、およびフェリ磁性物質が挙げられる。
【００３３】
本明細書中において用いられる場合、「常磁性物質」は、個々の原子、イオン、または分子が、永久磁気双極子モーメントを有する物質を称する。外部磁場が存在しない場合、原子双極子点は、無作為な方向へ向けられ、そして全体としてどの方向にも物質は磁化しない。この無作為な方向付けは、物質内の熱運動の結果である。外部磁場が適用された場合、原子双極子は、それ自身をその磁場と平行になるように向ける傾向がある。なぜなら、これは、逆平行な位置よりも低いエネルギー状態であるからである。これは、上記磁場と平行する正味磁性を与え、そして、磁化率にプラスに貢献する。「常磁性物質」または「常磁性」についてのさらなる詳細は、種々の文献において見出され得る（例えば、Ｂ．Ｉ ＢｌｅａｎｅｙおよびＢ．Ｂｌｅａｎｅｙ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９７５「Ｅｌｅｃｔｒｉｃｉｔｙ ａｎｄ Ｍａｇｎｅｔｉｓｍ」中の第６章、１６９頁〜１７１頁）。
【００３４】
本明細書中において用いられる場合、「強磁性物質」は、磁化率の非常に大きな（正の）値により区別される物質を称し、そしてこれは、適用された磁場の強さに依存する。加えて、強磁性物質は、適用された磁場が存在しなくとも磁気モーメントを有し得、そして、ゼロ磁場における磁性の保持は、「残留磁気」として公知である。「強磁性物質」または「強磁性化」についてのさらなる詳細は、種々の文献において見出され得る（例えば、Ｂ．Ｉ ＢｌｅａｎｅｙおよびＢ．Ｂｌｅａｎｅｙ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９７５「Ｅｌｅｃｔｒｉｃｉｔｙ ａｎｄ Ｍａｇｎｅｔｉｓｍ」中の第６章、１７１頁〜１７４頁）。
【００３５】
本明細書中に用いられる場合、「フェリ磁性物質」は、自発磁化、残留磁気、および通常のフェリ磁性材料と類似する他の特性を示す物質を称する。しかし、この自発モーメントは、物質中の（磁気）双極子の全平行整列に対する期待値とは一致しない。「フェリ磁性物質」または「フェリ磁性化」についてのさらなる詳細は、種々の文献において見出され得る（例えば、Ｂ．Ｉ ＢｌｅａｎｅｙおよびＢ．Ｂｌｅａｎｅｙ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９７５「Ｅｌｅｃｔｒｉｃｉｔｙ ａｎｄ Ｍａｇｎｅｔｉｓｍ」中の第１６章、５１９頁〜５２４頁）。
【００３６】
本明細書中において用いられる場合、「金属酸化物粒子」は、粒子形態における金属の任意の酸化物を称する。特定の金属酸化物粒子は、常磁性特性または超常時性特性を有する。「常磁性粒子」は、外部磁場の適用に感受性であるが、しかし、永久磁区を維持し得ない粒子として定義される。言い換えると、「常磁性粒子」はまた、「常磁性物質」から作製されるか、または「常磁性物質」からなる粒子として定義される。常磁性粒子の非限定的な例としては、特定の金属酸化物粒子、例えば、Ｆｅ３Ｏ４粒子、金属合金粒子（例えば、ＣｏＴａＺｒ粒子）が挙げられる。
【００３７】
本明細書中において用いられる場合、「サンプル（例えば、全血）は新鮮である」とは、約１２時間以内にサンプルの供給源から得られたかまたは単離されたサンプルを意味する。好ましくは、上記サンプルは、約１０時間以内、５時間以内、４時間以内、３時間以内、２時間以内、１時間以内、３０分以内、２０分以内、１０分以内、５分以内、２分以内、または１分以内にサンプルの供給源から得られたかまたは単離されている。
【００３８】
本明細書中において用いられる場合、「サンプル（例えば、全血）は、低温保存される」は、約０℃かまたはそれ以下の温度で保存されているサンプルを意味する。
【００３９】
（Ｂ．標的遺伝子の型決定方法）
１つの局面において、本発明は標的遺伝子の型決定方法を対象とする。上記方法は、以下：
ａ）適切なサンプルから標的遺伝子を含む標的細胞を単離し、そして上記単離された標的細胞由来の上記標的遺伝子の少なくとも一部である標的ヌクレオチド配列と、必要に応じて上記標的遺伝子に無関係の別のヌクレオチド配列とを含む調製物を得る工程；
ｂ）核酸ハイブリダイゼーションにおいて使用するために適切な支持体を含むチップを提供する工程であって、上記支持体上には、上記標的ヌクレオチド配列に対して相補的なオリゴヌクレオチドプローブと、以下のオリゴヌクレオチドコントロールプローブ：ポジティブコントロールプローブ、ネガティブコントロールプローブ、ハイブリダイゼーションコントロールプローブ、および固定コントロールプローブのうちの少なくとも１つとが固定されている、工程；ならびに、
ｃ）工程ａ）において得られた上記調製物を工程ｂ）において提供された上記チップに対してハイブリダイズさせ、上記標的ヌクレオチド配列および／または上記別のヌクレオチド配列と、上記チップ上に含まれる上記コントロールプローブとの間のハイブリダイゼーションを評価して、上記標的遺伝子の型を決定する工程、
を包含する。
【００４０】
本方法は、任意の標的細胞（例えば、白血球）由来の標的遺伝子の型決定に用いられ得る。他の例示的な標的細胞としては、動物細胞、植物細胞、真菌細胞、細菌細胞、組換え細胞、および培養細胞が挙げられる。
【００４１】
本方法は、任意の標的遺伝子（例えば、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ））の型決定に用いられ得る。
【００４２】
任意の適切なサンプル（例えば、血液、唾液、毛髪、ヒト核酸を含むヒト組織）は、本方法において用いられ得る。１つの例として、上記血液サンプルは、血清、血漿、または全血である。別の例として、上記血液サンプルは、新鮮全血または低温保存全血である。
【００４３】
標的細胞は、任意の適切な方法を用いて適切なサンプルから単離され得る。例えば、この標的細胞は、磁性マイクロビーズを用いて適切なサンプルから単離され得る。好ましくは、この磁性マイクロビーズは、約５μｍから約２００μｍの範囲に及ぶ直径を有する。
【００４４】
上記磁性マイクロビーズは、任意の適切な方法によって調製され得る。例えば、ＣＮ ０１／１０９８７０．８またはＷＯ０２／０７５３０９において開示された方法が用いられ得る。任意の磁化可能な物質は、本発明において有用な磁性マイクロビーズを調製するために用いられ得る。磁化可能な物質の非限定的な例としては、フェリ磁性物質、強磁性物質、常磁性物質、または、超常磁性物質が挙げられる。特定の実施形態において、磁性マイクロビーズは、常磁性物質（例えば、常磁性金属酸化物組成物）を含む。好ましくは、上記常磁性金属酸化物組成物は、遷移金属酸化物またはそれらの合金である。任意の適切な遷移金属（例えば、鉄、ニッケル、銅、コバルト、マンガン、タンタル（Ｔａ）、亜鉛、およびジルコニウム（Ｚｒ））が用いられ得る。好ましい実施形態において、上記金属酸化物組成物は、Ｆｅ３Ｏ４またはＦｅ２Ｏ３である。別の例として、磁性マイクロビーズに用いられる磁化可能な物質は、金属組成物を含む。好ましくは、上記金属組成物は、遷移金属組成物またはそれらの合金である（例えば、鉄、ニッケル、銅、コバルト、マンガン、タンタル、ジルコニウム、およびコバルト−タンタル−ジルコニウム（ＣｏＴａＺｒ）合金）。
【００４５】
磁性マイクロビーズは、利用可能な一次ビーズから調製され得るか、原材料から、または単量体（これは、米国特許第５，８３４，１２１号において開示されるように、架橋する場合、硬いポリマーコーティングを形成する）によってカプセル化された金属酸化物から調製され得る。本明細書中において用いられる場合、「硬い」は、コーティング中の金属酸化物粒子を安定させる程度に架橋され（すなわち、このコーティングは基本的に膨張または分解しない）、それによってこの粒子が中に包まれた状態にある、重合体コーティングを称する。本明細書中において用いられる場合、「微小孔」は、極性有機溶媒中で、膨張または拡張する樹脂重合体マトリックスを称する。本明細書中において用いられる場合、「負荷」は、機能化または誘導体化に有用な連結部位に関するビーズの受容能を意味するために用いられる。
【００４６】
磁化可能材料として組込まれ得る適切な支持体としては、例えば、マグネタイトのような鉄酸化物、マンガン、コバルトおよびニッケルのフェライト、ヘマタイト、ならびに種々の合金が挙げられる。マグネタイトが最も好ましい鉄酸化物である。しばしば、金属塩は、金属酸化物に変化し、次いで、重合体でコーティングされるか、または、還元基をその上に有する熱可塑性重合体樹脂を含むビーズに吸着されるかのいずれかであることが教示される。疎水性一次ビーズを得るために金属酸化物粒子を用いて開始する場合、ビニル単量体由来の熱可塑性重合体（好ましくは、微小孔性マトリクスに結合し得るかまたは微小孔性マトリクスによって結合され得る架橋ポリスチレン）の硬いコーティングを提供することが必要である。磁性粒子は、当該分野において公知の方法（例えば、Ｖａｎｄｅｎｂｅｒｇｅら、Ｊ．ｏｆ Ｍａｇｎｅｔｉｓｍ ａｎｄ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ，１５〜１８：１１１７〜１８（１９８０）；Ｍａｔｉｊｅｖｉｃ，Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．，１４：２２〜２９（１９８１）；ならびに米国特許第５，０９１，２０６号、同第４，７７４，２６５号、同第４，５５４，０８８号および同第４，４２１，６６０号において示される手順）によって形成され得る。本発明において用いられ得る一次ビーズの例は、米国特許第５，３９５，６８８号、同第５，３１８，７９７号、同第５，２８３，０７９号、同第５，２３２，７８９２号、同第５，０９１，２０６号、同第４，９６５，００７号、同第４，７７４，２６５号、同第４，６５４，２６７号、同第４，４９０，４３６号、同第４，３３６，１７３号および同第４，４２１，６６０号において示される。あるいは、一次ビーズは、市販の疎水性ビーズまたは親水性ビーズから得られ得る。これらのビーズは、サイズ、常磁性粒子を保持する溶媒中で膨張するための重合体コーティングの十分な安定性、および、メッシュ化したマトリックス網を形成するために使用されるビニル単量体を吸収するという、開始時の要求を満たす。好ましくは、一次ビーズは、疎水性ビーズ、ポリスチレンでカプセル化されたビーズ、常磁性ビーズである。このようなポリスチレン常磁性ビーズは、Ｄｙｎａｌ，Ｉｎｃ（Ｌａｋｅ Ｓｕｃｃｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．）、Ｒｈｏｎｅ Ｐｏｕｌｏｎｃ（Ｆｒａｎｃｅ）、およびＳＩＮＴＥＦ（Ｔｒｏｎｄｈｅｉｍ，Ｎｏｒｗａｙ）より利用可能である。トナー粒子の使用、または、外部の硬い重合体コーティングを生成するためにさらにカプセル化された不安定な重合体の第一コーティングを有する磁性粒子の使用もまた、考慮される。
【００４７】
標的ヌクレオチド配列の調製は、核酸増幅工程を包含し得る。標的ヌクレオチド配列は、単離された標的細胞からの直接的核酸増幅を経て得られ得る。あるいは、標的ヌクレオチド配列は、単離された標的細胞から単離された核酸テンプレートを用いた核酸増幅を経て得られ得る。任意の適切な核酸増幅工程は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）および転写媒介性増幅（ＴＭＡ）で用いられ得る。好ましくは、ＴＭＡは、Ｔ７プロモーターによって進められる。
【００４８】
また好ましくは、ＰＣＲは、非対称ＰＣＲである。非対称ＰＣＲに使用される２つのプライマーは、任意の適切な比（例えば、約１：５〜約１：２００の範囲に及ぶ比）を有し得る。非対称ＰＣＲに使用される２つのプライマーは、同じＴｍ値または異なるＴｍ値を有し得る。例えば、非対称ＰＣＲに使用される２つのプライマーのＴｍ値の間の差は、約１℃〜約２０℃の範囲に及ぶ。別の例として、非対称ＰＣＲに３つのプライマーが使用され、このプライマーのうちの２つは、同じかもしくは類似のＴｍ値を有し、そしてこの２つのプライマーのＴｍ値と第３のプライマーのＴｍ値との間の差は、約１℃〜約２０℃の範囲に及ぶ。上記プライマーは、直鎖プライマーであるか、またはヘアピン構造を含み得る。単一または複数のアニーリング温度が、ＰＣＲおいて使用される。例えば、アニーリング温度の間の差は、約１℃〜約２０℃の範囲に及ぶ。
【００４９】
本方法の工程ａ）において得られた標的ヌクレオチド配列は、１本鎖、２本鎖、または３本鎖であり得る。好ましくは、工程ａ）において得られた標的ヌクレオチド配列は、１本鎖ＤＮＡまたは１本鎖ＲＮＡである。本方法の工程ａ）において得られた標的ヌクレオチド配列は、プラス鎖またはマイナス鎖であり得る。好ましくは、上記１本鎖ＤＮＡまたは１本鎖ＲＮＡは、プラス鎖またはマイナス鎖である。標識された標的ヌクレオチド配列は、工程ａ）において得られ得る。好ましくは、この標識された標的ヌクレオチド配列は、蛍光標識を含むか、またはビオチン標識を含む。また好ましくは、別のヌクレオチド配列が、チップ上に含まれるポジティブコントロールプローブ、ネガティブコントロールプローブまたはハイブリダイゼーションコントロールプローブに相補的であり得る。
【００５０】
チップ上に含まれるプローブは、プラス鎖プローブであるかまたはマイナス鎖プローブであり得る。チップ上に含まれるプローブは、修飾され得る。例示的なプローブ修飾としては、５’−ＮＨ２修飾、５’−ＳＨ修飾、５’−ポリＴ（またはＡ、ＣもしくはＧ）修飾、５’−ビオチン修飾、３’−ＮＨ２修飾、３’−ＳＨ修飾、３’−ポリＴ（またはＡ、ＣもしくはＧ）修飾、および３’−ビオチン修飾が挙げられる。
【００５１】
本方法において用いられるチップは、任意の適切な型のプローブまたは多数のプローブを含み得る。例えば、チップは、１〜５００種の異なる型のプローブを含み得る。別の例として、チップは、プローブの複数のアレイを含み得、そして、各アレイは、１〜４００種の異なる型のプローブを含み得る。
【００５２】
プローブは、任意の適切な温度（例えば、約４０℃〜約１００℃の範囲に及ぶ温度）でチップ上に固定され得る。上記チップは、修飾され得る。例示的なチップ修飾としては、ＣＨＯ修飾、ＮＨ２修飾、ポリリジン修飾、ＳＨ修飾、ＢＳＡ修飾、ストレプトアビジン修飾、アガロースゲル修飾およびポリアクリルアミドゲル修飾が挙げられる。
【００５３】
プローブの配列、純度または末端修飾は、評価され得る。好ましくは、プローブの配列、純度または末端修飾は、ＤＨＰＬＣによって評価される。
【００５４】
任意の適切なコピーのプローブまたは多数のプローブは、チップ上に固定され得る。例えば、プローブの複数のコピー（例えば、プローブの１〜１０個のコピー）は、チップ上に固定され得る。
【００５５】
複数のコピーのプローブまたは多数のプローブは、任意の適切なパターンに従ってチップ上に固定され得る。例えば、複数のコピーのプローブまたは多数のプローブは、チップ上に隣接して固定され得るか、または離れて固定され得る。好ましくは、ポジティブコントロールプローブの複数のコピーがチップ上に固定されており、そしてこの固定されたポジティブコントロールプローブの長さおよび配列の変化により、工程ａ）において提供された調製物中の標的ヌクレオチド配列もしくは別のヌクレオチド配列とハイブリダイズする場合、強−弱もしくは弱−強の順序でそろえられた大きさを有するハイブリダイゼーションシグナルの群が作製される。
【００５６】
任意の適切なポジティブコントロールプローブは、本方法において用いられ得る。好ましくは、このポジティブコントロールプローブは、以下：標的ヌクレオチド配列、標的ヌクレオチド配列と同時に増幅されるヌクレオチド配列または合成ヌクレオチド配列、の一部と相補的である。
【００５７】
任意の適切なネガティブコントロールプローブは、本方法において用いられ得る。好ましくは、このネガティブコントロールプローブは、上記ポジティブコントロールプローブと比較した場合、約１〜３塩基対ミスマッチを有する。
【００５８】
任意の適切なハイブリダイゼーションコントロールプローブは、本方法において用いられ得る。好ましくは、このハイブリダイゼーションコントロールプローブは、上記標的遺伝子と無関係な合成ヌクレオチド配列と相補的である。より好ましくは、上記ハイブリダイゼーションコントロールプローブは、合成標識ヌクレオチド配列と相補的であるか、または合成標識ヌクレオチド配列と比較した場合、約１〜２塩基対ミスマッチを有する。
【００５９】
任意の適切な固定コントロールプローブは、本方法において用いられ得る。好ましくは、この固定コントロールプローブは、あらゆるハイブリダイゼーションシグナルを発生しない。一般的には、上記固定コントロールプローブは、化学修飾スライド、スポット工程、固定手順などの品質管理のための内部コントロールプローブである。この内部コントロールプローブは、標的核酸とはハイブリダイズしない。１つの特定の実施形態において、固定コントロールプローブの一方の末端は、化学的に修飾されており、この固定コントロールプローブの他方の末端は、検出可能な標識を有する。
【００６０】
本方法において使用されるチップは、ポジティブコントロールプローブ、ネガティブコントロールプローブ、ハイブリダイゼーションコントロールプローブ、および固定コントロールプローブのうちのいずれか、いくつかまたは全てを含み得る。１つの特定の実施形態において、このチップは、ポジティブコントロールプローブ、ネガティブコントロールプローブ、ハイブリダイゼーションコントロールプローブ、および固定コントロールプローブを含む。ポジティブコントロールプローブ、ネガティブコントロールプローブ、ハイブリダイゼーションコントロールプローブおよび／または固定コントロールプローブは、任意の適切なパターンで、このチップ上に固定され得る。例えば、ポジティブコントロールプローブ、ネガティブコントロールプローブ、ハイブリダイゼーションコントロールプローブおよび固定コントロールプローブは、このチップの四隅に固定され得るか、このチップの中央部に固定され得るか、または任意の適切な規則的もしくは無作為な固定パターンを有し得る。
【００６１】
工程ｃ）におけるハイブリダイゼーション反応は、任意の適切なハイブリダイゼーション溶液（例えば、塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）および界面活性剤を含有するハイブリダイゼーション溶液）において、実施され得る。このハイブリダイゼーション溶液は、任意の適切な濃度（例えば、約３倍〜約１０倍のＳＳＣ）のＳＳＣを含有し得る。任意の適切な界面活性剤（例えば、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００およびラウリル硫酸ナトリウム（ＳＬＳ））が、使用され得る。このハイブリダイゼーション溶液は、任意の適切な濃度（例えば、約０．０５％（ｗ／ｗ）〜約５％）ｗ／ｗ）の範囲の濃度）の界面活性剤を含有し得る。
【００６２】
工程ｃ）におけるハイブリダイゼーション反応は、任意の適切な温度（例えば、約４２℃〜約７０℃の範囲の温度）で実施され得る。
【００６３】
本方法は、ハイブリダイゼーション反応の後に、洗浄工程をさらに包含し得る。任意の適切な洗浄溶液が、使用され得る。例えば、この洗浄工程は、約０％（ｗ／ｗ）〜約２％（ｗ／ｗ）の範囲の濃度を有する界面活性剤を含有する洗浄溶液中で、実施され得る。この洗浄工程は、任意の適切な時間（例えば、約５分間〜約３０分間の範囲の時間）にわたって、実施され得る。
【００６４】
種々のプローブの固定効率は、任意の有用な（ｕｓｉｔａｂｌｅ）方法によって、評価され得る。例えば、固定効率は、固定コントロールプローブからのシグナルを分析することによって、評価され得る。この固定コントロールプローブは、検出可能な標識（例えば、蛍光性分子）を保有し得る。
【００６５】
全体的な固定効率（標的ヌクレオチド配列に相補的なオリゴヌクレオチドプローブおよび種々のコントロールプローブを含むハイブリダイゼーションを含む）は、任意の適切な方法によって、評価され得る。例えば、全体的なハイブリダイゼーション効率は、ハイブリダイゼーションコントロールプローブと、標的遺伝子に関連しない標識された合成ヌクレオチド配列との間のハイブリダイゼーションを分析することによって、評価され得る。
【００６６】
全体的なハイブリダイゼーション効率（標的ヌクレオチド配列に相補的なオリゴヌクレオチドプローブおよび種々のコントロールプローブを含むハイブリダイゼーションを含む）は、任意の適切な方法によって評価され得る。例えば、ハイブリダイゼーション効率は、ポジティブコントロールプローブを含むハイブリダイゼーションシグナルと、ネガティブコントロールプローブを含むハイブリダイゼーションシグナルとの間の比、およびポジティブハイブリダイゼーションコントロールプローブを含むハイブリダイゼーションシグナルと、ネガティブハイブリダイゼーションコントロールプローブを含むハイブリダイゼーションシグナルとの間の比を分析することによって、評価され得、そして増加した比は、ハイブリダイゼーション効率が増加したことを示す。
【００６７】
ポジティブシグナルは、任意の適切な基準に基づいて、決定され得る。例えば、密接に関連するプローブの群を含むハイブリダイゼーションにおいて、ポジティブシグナルは、以下の基準に基づいて、決定され得る：ａ）バックグラウンドノイズに対するハイブリダイゼーションシグナルの比が、３より大きい；ｂ）関連するポジティブコントロールプローブハイブリダイゼーションシグナルに対するハイブリダイゼーションシグナルの比が、所定の範囲内にある；ｃ）工程ａ）およびｂ）に基づくポジティブシグナルを与える全てのプローブのハイブリダイゼーションシグナル、または１つのみのプローブが工程ａ）およびｂ）に基づくポジティブシグナルを与える場合には、２つの最も強いハイブリダイゼーションシグナルを与える２つのプローブのハイブリダイゼーションシグナルを比較して、そのシグナルが正であるか負であるかを決定すること；ならびにｄ）密接に関連するプローブの群を含む２つ以下のポジティブシグナルが存在する。
【００６８】
密接に関連するプローブの群は、任意の適切な基準に基づき得る。例えば、特定の遺伝子座において改変を評価するために設計されたプローブの群が、密接に関連したプローブの郡として使用され得る。評価されるべき改変は、単一かまたは複数の塩基対変化であり得る。通常、塩基対の変化は、プローブの長さの内部（たとえば、２０ｂｐ以下）に位置する。
【００６９】
上記ｂ）に記載されるような所定の範囲は、異なるプローブについて、異なり得る。この範囲は、実験的研究を介して得られ得る。例えば、この範囲は、複数（例えば、数百）のハイブリダイゼーション実験を、既知の標準的な標的および／またはプローブを使用して実施することによって、得られ得る。
【００７０】
本方法は、任意の標的遺伝子の型を決定するために使用され得る。例えば、本方法は、ＨＬＡ遺伝子に相補的なオリゴヌクレオチドプローブを使用して、ＨＬＡ遺伝子の方を決定するために使用され得る。好ましくは、このオリゴヌクレオチドプローブは、ａ）高いストリンジェンシーの下で、標的ＬＨＡ分子配列またはその相補鎖（これは、表１に記載される）にハイブリダイズするヌクレオチド配列；あるいはｂ）ヌクレオチド配列を含む標的ＨＬＡヌクレオチド配列またはその相補鎖（これは、表１に記載される）に対して少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。また好ましくは、このオリゴヌクレオチドプローブは、表１に記載されるヌクレオチド配列、またはその相補鎖を含む。このチップは、表１に記載されるヌクレオチド配列のいくつかまたは全て、あるいはその相補鎖を含み得る。
【００７１】
（Ｃ．ＨＬＡ標的遺伝子の型を決定するための、オリゴヌクレオチドプローブおよびプローブアレイ）
別の局面において、本発明は、ＨＬＡ標的遺伝子の型を決定するためのオリゴヌクレオチドプローブに関し、このＨＬＡ標的遺伝子は、ａ）高ストリンジェンシー下で、標的ＬＨＡ分子配列またはその相補鎖（これは、表１に記載される）にハイブリダイズするヌクレオチド配列；あるいはｂ）ヌクレオチド配列を含む標的ＨＬＡヌクレオチド配列またはその相補鎖（これは、表１に記載される）に対して少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。このオリゴヌクレオチドプローブは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、またはその誘導体を含み得る。好ましくは、このプローブは、表１に記載されるヌクレオチド配列、またはその相補鎖を含む。このプローブは、標識され得る。例示的な標識としては、化学標識、酵素標識、免疫原性標識、放射能標識、蛍光標識、発光標識、およびＦＲＥＴ標識が挙げられる。
【００７２】
オリゴヌクレオチドプローブは、任意の適切な方法によって、産生され得る。例えば、これらのプローブは、化学的に合成され得るか（一般的に、Ａｕｓｕｂｅｌ（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２．１１．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｐｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（２０００）を参照のこと）、天然の供給源から単離され得るか、組換え方法によって産生され得るか、またはこれらの組み合わせであり得る。合成オリゴヌクレオチドはまた、Ｍａｔｔｅｕｃｃｉら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，３：３１８５−３１９１（１９８１）のトリエステル法を使用することによって、調製され得る。あるいは、例えば、シアノエチルホスホロアミダイト化学を使用する、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ＤＮＡ合成機での自動合成が好ましくあり得る。好ましくは、これらのプローブは、化学的に合成される。
【００７３】
本発明のオリゴヌクレオチドプローブを調製するために適切な塩基は、天然に存在するヌクレオチド塩基（例えば、アデニン、シトシン、グアニン、ウラシル、およびチミン）から選択され得る。この塩基はまた、天然には存在しないヌクレオチド塩基、すなわち「合成」ヌクレオチド塩基（例えば、８−オキソ−グアニン、６−メルカプトグアニン、４−アセチルシチジン、５−（カルボキシヒドロキシエチル）ウリジン、２’−Ｏ−メチルシチジン、５−カルボキシメチルアミノ−メチル−２−チオリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウリジン、ジヒドロウリジン、２’−Ｏ−メチルプソイドウリジン、β−Ｄ−ガラクトシルキューオシン、２’−Ｏメチルグアノシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデノシン、１−メチルアデノシン、１−メチルプソイドウリジン、１−メチルグアノシン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアノシン、２−メチルアデノシン、７−メチルグアノシン、５−メチルアミノメチルウリジン、５−メトキシアミノメチル−２−チオウリジン、β−Ｄ−マンノシルキューオシン、５−メトキシカルボニルメチルウリジン、５−メトキシウリジン、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデノシン、Ｎ−（（９−β−Ｄ−リボフラノシル−２−メチルチオプリン−６−イル）カルバモイル）スレオニン、Ｎ−（（９−β−Ｄ−リボフラノシルプリン−６−イル）Ｎ−メチルカルボニル）スレオニン、ウリジン−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウリジン−５−オキシ酢酸、ワイブトキソシン、プソイドウリジン、キューオシン、２−チオシチジン、５−メチル−２−チオウリジン、２−チオウリジン、２−チオウリジン、５−メチルウリジン、Ｎ−（（９−β−Ｄ−リボフラノシルプリン−６−イル）カルバモイル）スレオニン、２’−Ｏ−メチル−５−メチルウリジン、２’−Ｏ−メチルウリジン、ワイブトシン、および３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）ウリジン）から選択され得る。
【００７４】
同様に、オリゴヌクレオチドの化学的アナログ（例えば、ホスホジエステル結合が、例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、またはホスホロアミデートに修飾されたオリゴヌクレオチド）もまた、使用され得る。分解からの保護は、「３’末端」ストラテジーの使用によって、達成され得る。このストラテジーによって、ヌクレアーゼ耐性結合が、オリゴヌクレオチドの３’末端におけるホスホジエステル結合の代わりに置き換えられる（Ｓｈａｗら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９：７４７（１９９１））。ホスホロアミデート結合、ホスホロチオエート結合、およびメチルホスホネート結合は、全て、この様式で十分に機能する。ホスホジエステル骨格のより広範な修飾は、安定性を付与し、そしてオリゴヌクレオチドの増強した親和性および増加した細胞浸透性を可能にし得ることが示された（Ｍｉｌｌｉｇａｎら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３６：１９２３（１９９３））。多くの異なる化学的ストラテジーが、ホスホジエステル骨格全体を新規結合で置き換えるために、使用されている。骨格のアナログとしては、ホスホロチオエート結合、ホスホロジチオエート結合、メチルホスホネート結合、ホスホロアミデート結合、ボラノホスフェート結合、ホスホトリエステル結合、ホルムアセタール結合、３’−チオホルムアセタール結合、５’−チオホルムアセタール結合、５’−チオエーテル結合、カーボネート結合、５’−Ｎ−カルバメート結合、スルフェート結合、スルホネート結合、スルファメート結合、スルホンアミド結合、スルホン結合、スルファイト結合、スルホキシド結合、スルフィド結合、ヒドロキシルアミン結合、メチレン（メチルイミノ）（ＭＭＩ）結合またはメチレンオキシ（メチルイミノ）（ＭＯＭＩ）結合が挙げられる。ホスホロチオエートで修飾されたオリゴヌクレオチドおよびメチルホスホネートで修飾されたオリゴヌクレオチドは、それらが自動オリゴヌクレオチド合成によって入手可能であることに起因して、特に好ましい。オリゴヌクレオチドは、（Ｍｉｌｌｉｇａｎら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３６：１９２３（１９９３））によって記載されるような、「ペプチド核酸」であり得る。唯一の要件は、このオリゴヌクレオチドプローブが、少なくとも一部分が標的ＤＮＡ分子の配列の一部分に結合し得る配列を保有することである。
【００７５】
ハイブリダイゼーションプローブは、任意の適切な長さのものであり得る。このプローブの長さに対しては、このプローブがＨＬＡ標的核酸にハイブリダイズし、そしてプローブとして効果的に機能する（例えば、検出を容易にする）限り、上限も下限もない。本発明のプローブは、５０ヌクレオチド、４０ヌクレオチド、３０ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、１５ヌクレオチド、または１０ヌクレオチド、またはより短くあり得る。同様に、このプローブは、２０ヌクレオチド、４０ヌクレオチド、５０ヌクレオチド、６０ヌクレオチド、７５ヌクレオチド、１００ヌクレオチド、または２００ヌクレオチド程度の長さであり得るか、またはそれより長くあり得る（例えば、ＨＬＡ標的配列の全長まで）。一般に、これらのプローブは、相補的な標的核酸鎖のイオずれかの、少なくとも１４個のヌクレオチド、好ましくは、少なくとも１８個のヌクレオチド、そしてより好ましくは、少なくとも２０〜３０個のヌクレオチドを有し、そしていかなるヘアピン型二次構造も含まない。特定の実施形態において、このプローブは、少なくとも３０ヌクレオチド、または少なくとも５０ヌクレオチドの長さを有し得る。完全に相補的であるべきである場合、すなわち、その鎖が、プローブの配列と同一の配列を含む場合、その二重鎖は、かなりストリンジェントな条件下で、比較的安定であり、そしてこれらのプローブは、短くあり得る（すなわち、約１０〜３０塩基対の範囲）。ある程度のミスマッチが、プローブにおいて予測される場合、すなわち、そのプローブが、改変領域または特定の属における全ての種のような配列の群にハイブリダイズすることが疑われる場合、そのプローブは、そのミスマッチの影響と釣り合いをとるために、より長いものであり得る（すなわち、１５〜４０塩基）。
【００７６】
プローブは、ＨＬＡ標的遺伝子全体に及ぶ必要はない。ＨＬＡ標的または対立遺伝子を特異的に識別する可能性を有する標的領域の任意のサブセットが、使用され得る。その結果として、核酸プローブは、標的領域のわずか８ヌクレオチドにハイブリダイズし得る。さらに、プローブのフラグメントは、それらがタイピングされるべきＨＬＡ標的遺伝子の特性を十分に示す限り、使用され得る。
【００７７】
プローブは、長さが少なくとも８ヌクレオチドであるＨＬＡ標的ヌクレオチド配列と、低ストリンジェンシー下でハイブリダイズし得るべきである。好ましくは、プローブは、ＨＬＡ標的ヌクレオチド配列と、中程度または高いストリンジェンシー下でハイブリダイズする。
【００７８】
さらに別の局面において、本発明は、ＨＬＡ標的遺伝子をタイピングするために支持体に固定化されたオリゴヌクレオチドプローブのアレイに関し、このアレイは、核酸ハイブリダイゼーションにおける使用に適切な支持体を含み、この支持体は、それに固定化された複数のオリゴヌクレオチドプローブを有し、上記プローブの少なくとも１つは以下のヌクレオチド配列を含む：ａ）高ストリンジェンシー下で、表１に示される標的ＨＬＡヌクレオチド配列、またはその相補鎖とハイブリダイズするヌクレオチド配列；あるいはｂ）表１に示されるヌクレオチド配列、またはその相補鎖を含む標的ＨＬＡヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列。
【００７９】
複数のプローブは、ＤＮＡ，ＲＮＡ，ＰＮＡまたはそれらの誘導体を含み得る。プローブのうちの少なくとも１つまたはいくつかは、表１に示されるヌクレオチド配列、またはその相補鎖を含み得る。好ましくは、プローブアレイは、表１に示されるヌクレオチド配列のすべて、またはその相補鎖を含む。プローブのうちの少なくとも１つ、いくつか、またはすべてが、標識され得る。例示的な標識としては、化学標識、酵素標識、免疫原標識、放射活性標識、蛍光標識、発光標識およびＦＲＥＴ標識が挙げられる。任意の適切な支持体（例えば、シリコン、プラスチック、ガラス、セラミック、ゴム、およびポリマー表面）が、使用され得る。
【００８０】
（Ｄ．アッセイ形式）
（プローブの固定化）
本発明の方法、プローブおよびプローブアレイが溶液中で使用され得る。好ましくは、チップ形式（例えば、固体支持体に固定化されたプローブを使用することによって）で行われる。
【００８１】
プローブは、任意の適切な表面（好ましくは、シリコン、プラスチック、ガラス、セラミック、ゴム、またはポリマー表面のような固体支持体）に固定化され得る。プローブはまた、３次元の多孔性ゲル基質（例えば、Ｐａｃｋａｒｄ ＨｙｄｒｏＧｅｌチップ（Ｂｒｏｕｄｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２９（１９）：Ｅ９２（２００１）））に固定化され得る。
【００８２】
アレイベースのアッセイのために、プローブは、好ましくは、「バイオチップ」のような固体支持体に固定化される。固体支持体は、粒子、鎖、沈殿物、ゲル、シート、管、球体、容器、キャピラリー、パッド、薄片、フィルム、プレート、スライドなどとして存在する、生物学的支持体、非生物学的支持体、有機的支持体、無機的支持体、またはこれらのいずれかの組み合わせであり得る。
【００８３】
プローブのライブラリーを含むマイクロアレイバイオチップは、多数の周知のアプローチによって調製され得、このアプローチとしては、例えば、光依存法（ｌｉｇｈｔ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｅｔｈｏｄ）（例えば、米国特許第５，１４３，８５４号、同第５，３８４，２６１号または同第５，５６１，０７１号に記載されるＶＬＳＩＰＳＴＭ）；米国特許第５，５４１，０６１号に記載されるようなビーズベースの方法；および米国特許第５，２８８，５１４号に詳述されるようなピンベースの方法が挙げられる。ＶＬＳＩＰＳＴＭを使用してマイクロアレイとしての様々な二重鎖プローブライブラリーの調製を詳述する米国特許第５，５５６，７５２号もまた、マイクロアレイにおけるヘアピンプローブライブラリーの調製に適切である。
【００８４】
米国特許第５，６７７，１９５号および同第５，３８４，２６１号に記載されるようなフローチャネル法が、多種多様なプローブを有するマイクロアレイバイオチップを調製するために使用され得る。この事例では、プローブがフローチャネルから支持体に送達されるときに、基質の特定の活性化領域が他の領域から機械的に分離される。フローチャネル法の詳細な記載は、米国特許第５，５５６，７５２号（指定された流路を通る液体の有向チャネリングを高めるための、保護塗装した湿式ファシリテータ（ｗｅｔｔｉｎｇ ｆａｃｉｌｉｔａｔｏｒ）の使用を含む）に見出され得る。
【００８５】
スポット法もまた、多様なプローブが固定化されたマイクロアレイバイオチップを調製するために使用され得る。この事例では、反応物質は、支持体の選択された領域に比較的少量を直接蒸着させることによって送達される。いくつかの工程では、当然のことながら、全支持体表面が、特定の溶液でスプレーされるか、他の場合にはコーティングされる。特定の形式において、ディスペンサは、領域から領域まで、それぞれの停止において必要なだけのプローブまたは他の試薬を蒸着して移動する。代表的なディスペンサは、溶液または他の流体を含むプローブを支持体に送達するためのマイクロピペット、ナノピペット、インクジェト型カートリッジおよびピン、ならびに必要に応じて、支持体に関してこれらの送達デバイスの位置を制御するためのロボットシステムを含む。他の形式では、ディスペンサは、一連のチューブまたは複数のウェルトレイ、マニホールド、および送達デバイスのアレイを含み、その結果、種々の試薬が同時に反応領域に送達され得る。スポット法は、当該分野で周知であり、例えば、米国特許第５，２８８，５１４号、同第５，３１２，２３３号および同第６，０２４，１３８号に記載されるスポット法が挙げられる。いくつかの事例では、支持体の好ましい領域において、フローチャネルと「スポット」との組み合わせもまた、固体化プローブを有するマイクロアレイバイオチップを調製するために使用され得る。
【００８６】
プローブを固定化するための固体支持体は、好ましくは平坦であるが、代替的な表面形状を呈し得る。例えば、固体支持体は、盛り上がった領域または落ち込んだ領域を含み得、そこでプローブ合成が行われるかまたはプローブが結合される。いくつかの実施形態において、固体支持体は、適切な光吸収特性を提供するように選択され得る。例えば、支持体は、重合したＬａｎｇｍｕｉｒ Ｂｌｏｄｇｅｔｔフィルム、ガラスまたは機能化ガラス、Ｓｉ、Ｇｅ、ＧａＡｓ、ＧａＰ、ＳｉＯ２、ＳｉＮ４、改変したシリコン、あるいは種々のゲルまたはポリマー（例えば、（ポリ）テトラフルオロエチレン、（ポリ）ビニリデン二フッ化物、ポリスチレン、ポリカーボネート、またはそれらの組み合わせ）のうちのいずれか１つであり得る。他の適切な固体支持体材料は、当業者に容易に明らかである。
【００８７】
固体支持体の表面は、オリゴヌクレオチドまたは核酸に関連する反応基と結合するのに適切な反応基（カルボキシル、アミノ、ヒドロキシル、チオールなどが挙げられる）を含み得る。好ましくは、その表面は、光学的に透明であり、シリカ表面で見出されるような表面Ｓｉ−−ＯＨ官能性を有する。
【００８８】
プローブは、化学的手段または物理的手段（例えば、イオン力、共有力または当該分野で周知の他の力）によって支持体に結合され得る。核酸およびオリゴヌクレオチドの固定化は、当該分野で周知の任意の手段によって達成され得る（例えば、Ｄａｔｔａｇｕｐｔａら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１７７：８５−８９（１９８９）；Ｓａｉｋｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８６：６２３０−６２３４（１９８９）；およびＧｒａｖｉｔｔら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏ．，３６：３０２０−３０２７（１９９８）を参照のこと）。
【００８９】
プローブは、ハイブリダイゼーションアッセイに役立ち得るようにプローブの二重鎖部分の間に空間を提供するために、（例えば、Ｌｏｃｋｈａｒｔらに対する米国特許第５，５５６，７５２号に記載されるように）スペーサー分子を用いて支持体に結合され得る。スペーサー分子は、代表的には、長さが６〜５０の原子を含み、そして支持体に結合する表面結合部分を含む。支持体への結合は、例えば、（ポリ）トリフルオロクロロエチレン表面を有する支持体を使用する炭素−炭素結合、またはシロキサン結合（例えば、固体支持体としてガラスまたは酸化シリコンを使用する）によって達成され得る。シリコン結合は、支持体をスペーサーのトリクロロシリル基またはトリアルコキシシリル基と反応させることによって形成され得る。アミノアルキルシランおよびヒドロキシアルキルシラン、ビス（２−ヒドロキシエチル）−アミノプロピルトリエトキシシラン、２−ヒドロキシエチルアミノプロピルトリエトキシシラン、アミノプロピルトリエトキシシランまたはヒドロキシプロピルトリエトキシシランが、表面結合基として有用である。
【００９０】
スペーサーはまた、プローブの表面結合部分に結合される延長部分またはより長い鎖部分を含み得る。例えば、アミン基、ヒドロキシル基、チオール基、およびカルボキシル基が、そのスペーサーの延長部分を表面結合部分に結合するのに適切である。スペーサーの延長部分は、ポリマー合成のためのその後の任意の条件に対して不活性である種々の分子のうちのいずれかであり得る。これらのより長い鎖部分は、代表的には、アリールアセチレン、２〜１４のモノマー単位を含むエチレングリコールオリゴマー、ジアミン、二価酸、アミノ酸、ペプチド、またはそれらの混合物である。
【００９１】
いくつかの実施形態において、スペーサーの延長部分がポリヌクレオチドであるか、またはスペーサー全体がポリヌクレオチドであり得る。スペーサーの延長部分はまた、ポリエチレングリコール、ポリヌクレオチド、アルキレン、ポリアルコール、ポリエステル、ポリアミン、ポリホスホジエステルおよびそれらの組み合わせで構成され得る。さらに、プローブの合成での使用のために、スペーサーは、そのスペーサーの遠位端または終端（固体支持体の反対側）の官能基（例えば、ヒドロキシル基、アミノ基またはカルボン酸）に結合される保護基を有し得る。脱保護およびカップリングの後、その遠位端はオリゴマーまたはプローブに共有結合され得る。
【００９２】
本発明の方法は、一度に単一のプローブを含む単一のサンプルを分析するために使用され得る。好ましくは、その方法は、ハイスループット形式で行われる。例えば、複数のサンプルが、単一のプローブを用いて同時に分析され得るか、または単一のサンプルが、複数のプローブを使用して同時に分析され得る。より好ましくは、複数のサンプルが、複数のプローブを使用して同時に分析され得る。
【００９３】
（ハイブリダイゼーション条件）
ハイブリダイゼーションは、当該分野で公知の任意の適切な技術のもとで行われ得る。ハイブリダイゼーション条件が、ハイブリダイゼーションの程度、および非特異的な結合のバックグラウンドレベルを増加または減少させるために変更され得る（すなわち、洗浄する塩濃度または温度でハイブリダイゼーションを変更することによって）ことが、当業者に明らかである。プローブと標的ヌクレオチド配列との間のハイブリダイゼーションは、任意の適切なストリンジェンシー（高ストリンジェンシー、中程度のストリンジェンシーまたは低ストリンジェンシーを含む）のもとで行われ得る。代表的には、ハイブリダイゼーションは、高ストリンジェンシーの条件下で行われる。
【００９４】
プローブと標的核酸との間のハイブリダイゼーションは、均質（例えば、分子ビーコン（Ｔｙａｇｉ Ｓ．ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１４：３０３−３０８（１９９６）；および米国特許第６，１５０，０９７号）および保護アッセイ（Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ，Ｉｎｃ）（米国特許第６，００４，７４５号）で使用される代表的な条件）であり得るか、または異質（種々の型のニトロセルロースベースのハイブリダイゼーションで使用される代表的な条件、および磁性ビーズベースのハイブリダイゼーションで使用される代表的な条件）であり得る。
【００９５】
標的ポリヌクレオチド配列は、高ストリンジェンシーから低いストリンジェンシーなハイブリダイゼーション条件および洗浄条件下で標的配列と安定なハイブリッドを形成するオリゴヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼーションによって検出され得る。ハイブリダイゼーションによる検出の利点は、使用されるプローブに依存して、さらなる特異性が見込めることである。プローブが標的配列に対して完全に相補的（すなわち、約９９％またはそれ以上）であることが予期される場合、高ストリンジェンシー条件が使用される。いくらかのミスマッチが予期される場合、例えば、プローブが完全に相補的でない結果として改変体株が予期される場合、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、低くされ得る。しかし、条件は、非特異的なハイブリダイゼーションを最小限にするかまたは排除するように選択される。
【００９６】
ハイブリダイゼーションに影響を及ぼし、非特異的ハイブリダイゼーションを選択する条件は、当該分野で公知である（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第二版、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ．Ｅ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９）。一般的に、より低い塩濃度およびより高い温度は、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを高める。例えば、概して、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、約０．１×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ含む溶液中で、約６５℃のインキュベーション／洗浄温度でのインキュベーションを含む。中程度のストリンジェント条件は、約１〜２×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳを含む溶液中で、約５０℃〜６５℃のインキュベーション／洗浄温度でのインキュベーションである。低ストリンジェンシー条件は、２×ＳＳＣで約３０℃〜５０℃の温度である。
【００９７】
ハイブリダイゼーションおよび洗浄の代替的な方法は、最初に低ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション（５×ＳＳＰＥ、０．５％ ＳＤＳ）を行い、その後、３Ｍの塩化テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＣ）の存在下で高ストリンジェンシーの洗浄を行なう。ＴＭＡＣの効果は、Ａ−Ｔ塩基対およびＧ−Ｃ塩基対の相対的な結合を等しくし、所定の温度でのハイブリダイゼーションの効率を、ポリヌクレオチドの長さに近接して対応させることである。ＴＭＡＣを用いて、所望のストリンジェンシーのレベルを達成するために洗浄の温度を変動させることが可能である（Ｗｏｏｄら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８２：１５８５〜１５８８（１９８５））。
【００９８】
ハイブリダイゼーション溶液は、２５％のホルムアミド、５×ＳＳＣ、５×デンハート溶液、１００μｇ／ｍｌの単鎖ＤＮＡ、５％の硫酸デキストラン、またはプローブハイブリダイゼーションに有用であることが公知の他の試薬を含有し得る。
【００９９】
（ハイブリッドの検出）
プローブと標的ＨＬＡ核酸との間のハイブリダイゼーションの検出は、当該分野で公知の任意の方法（例えば、プローブの標識化、二次プローブ、標的核酸またはそれらのいくつかの組合せ）により実施され得、本発明の目的に適している。あるいは、ハイブリッドは、検出可能な標識の非存在下で質量分析により検出され得る（例えば、米国特許第６，３００，０７６号）。
【０１００】
検出可能な標識は、ハイブリダイゼーションの後に、直接的に、または間接的に検出され得る部分である。言い換えれば、検出可能な標識は、測定可能な物理学的な特性（例えば、蛍光または吸光度）を有するか、または酵素反応に関与する。直接的な標識を使用して、標的ヌクレオチド配列またはプローブは、標識され、そしてハイブリッドの形成は、ハイブリッドにおける標識の検出によって評価される。間接的な標識を使用して、二次プローブが標識され、ハイブリッドの形成が、二次プローブと元のハイブリッドとの間に形成された二次ハイブリッドの検出によって評価される。
【０１０１】
プローブまたは核酸を標識する方法は、当該分野で周知である。適切な標識としては、フルオロフォア、発色団、発光団、放射性同位体、電子密度試薬、ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）、特定の結合相手を有する酵素およびリガンドが挙げられる。特に有用な標識は、酵素的に活性な群（例えば、酵素（Ｗｉｓｄｏｍ，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，２２：１２４３（１９７６））；酵素基質（英国特許第１，５４８，７４１号）；補酵素（米国特許第４，２３０，７９７号および同第４，２３８，５６５号）および酵素インヒビター（米国特許第４，１３４，７９２号））；蛍光剤（ＳｏｉｎｉおよびＨｅｍｍｉｌａ、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，２５：３５３（１９７９））；フィコビリンタンパク質を含む発色団、発光剤（例えば、化学発光剤および生物発光剤（ＧｏｒｕｓおよびＳｃｈｒａｍ、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，２５：５１２（１９７９）および同書、１５３１））；特に結合可能なリガンド（すなわち、タンパク質結合リガンド）；抗原；ならびに放射性同位体（例えば、３Ｈ、３５Ｓ、３２Ｐ、１２５Ｉおよび１４Ｃ）を含む残基である。このような標識は、それら自体の物理的な特性（例えば、蛍光剤、発色団、および放射性同位体）またはそれらの反応性の特性もしくは結合特性（例えば、抗体、酵素、基質、補酵素、およびインヒビター）に基づいて検出される。リガンド標識はまた、オリゴヌクレオチドプローブの固相捕捉（すなわち、捕捉プローブ）に有用である。例示的な標識としては、ビオチン（標識されたアビジンまたはストレプトアビジンに対する結合により検出可能である）および酵素（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ）（着色した反応産物を生成するための酵素基質の添加により検出可能である）が挙げられる。
【０１０２】
例えば、放射性同位体標識したプローブまたは標的核酸は、オートラジオグラフィーにより検出され得る。あるいは、蛍光部分で標識されたプローブまたは標的核酸は、当該分野で公知の蛍光定量法により検出され得る。ハプテンまたはリガンド（例えば、ビオチン）標識された核酸は、抗体または抗体色素を、ハプテンまたは標識したリガンド（例えば、アビジン）に結合するタンパク質に添加することにより検出され得る。
【０１０３】
さらなる代替として、プローブまたは核酸は、ハイブリダイゼーションを検出するためのさらなる試薬を必要とする部分で標識され得る。この標識が酵素である場合、その標識された核酸（例えば、ＤＮＡ）は、最終的に、触媒作用の程度を決定するために、適切な培地に配置される。例えば、補助因子標識した核酸は、その標識が補助因子であって、その酵素に対する基質である酵素を添加することにより検出され得る。従って、酵素がホスファターゼである場合、培地は、リン酸ニトロフェニルを含有し得、色を観察することにより、生成されたニトロフェノールの量をモニタリングし得る。酵素がβガラクトシダーゼである場合、培地は、ｏ−ニトロ−フェニル−Ｄ−ガラクト−ピラノシドを含有し得、これはまた、ニトロフェノールを遊離する。後者の例示的な例としては、β−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ、パパインおよびペルオキシダーゼが挙げられるが、これらに限定されない。インサイチュハイブリダイゼーション研究については、基質の最終生成物は、水溶性であることが好ましい。他の標識（例えば、色素）は、当業者に明らかである。
【０１０４】
標識（例えば、アクリジン色素、フェナントリジン、フェナジン、フロクマリン、フェノチアジンおよびキノリン）は、直接的化学結合（例えば、共有結合が挙げられる）により、または間接結合（例えば、標識のミクロカプセルまたはリポソームへの組込み、これは、次に結合リガンドに結合される）によりＤＮＡ結合リガンドに直接連結され得る。標識がＤＮＡ結合リガンド（例えば、インターカレート化合物）に結合される方法は、当該分野で周知であって、任意の従来の方法が使用され得る。代表的なインターカレート剤としては、モノ−またはビス−アジドアミノアルキルメチジウムまたはエチジウム化合物、エチジウムモノアジド、エチジウムジアジド、エチジウム二量体アジド（Ｍｉｔｃｈｅｌｌら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１０４：４２６５（１９８２））、４−アジド−７−クロロキノリン、２−アジドフルオレン、４’−アミノメチル−４，５’−ジメチルアンジェリシン、４’−アミノメチル−トリオキサレン（４’アミノメチル−４，５’，８−トリメチル−ソラレン）、３−カルボキシ−５−ソラレン、−８−アミノ−ソラレン、または−ヒドロキシ−ソラレン（３−ｃａｒｂｏｘｙ−５− ｏｒ−８−ａｍｉｎｏ− ｏｒ −ｈｙｄｒｏｘｙ−ｐｓｏｒａｌｅｎ）が挙げられる。特定の核酸が結合したアジド化合物が、Ｆｏｒｓｔｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，１３：７４５（１９８５）により記載されている。他の有用な光反応性インターカレート剤は、ピリミジン残基と（２＋２）環付加物を形成するフロクマリンである。アルキル化剤はまた、ＤＮＡ結合リガンド（例えば、ビス−クロロエチルアミンおよびエポキシドまたはアジリジン（例えば、アフラトキシン、多環式炭化水素エポキシド、ミトマイシンおよびノルフィリンが挙げられる）が挙げられる）として使用され得る。インターカレート剤の特に有用な光反応性形態は、アジドインターカレート剤である。これらの反応性のニトレンは、長波長の紫外線または可視光で容易に生成され、アリールアジドのニトレンは、それらの再構成産物に対する挿入反応が好ましい（Ｗｈｉｔｅら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，４６：６４４（１９７７））。
【０１０５】
上記プローブはまた、特定の形態（例えば、逆ドットブロットのための１０〜１００のＴ残基の添加、またはウシ血清アルブミンへの結合または磁気ビーズ上への固定化）での使用のために改変され得る。
【０１０６】
間接的な検出方法によりハイブリダイゼーションを検出する場合、検出可能に標識された二次プローブは、プローブと標的との間の最初のハイブリダイゼーションの後、またはプローブと標的とのハイブリダイゼーションの間に添加され得る。必要に応じて、ハイブリダイゼーション条件は、二次プローブの添加の後に、改変され得る。ハイブリダイゼーション後、ハイブリダイズしなかった二次プローブは、例えば、一次プローブが、固体支持体上に固定化されている場合、洗浄により一次プローブから分離され得る。固体支持体の場合、支持体上の位置に結合した標識の検出は、サンプル中の標的核酸配列のプローブへのハイブリダイゼーションを示す。
【０１０７】
検出可能に標識された二次プローブは、特異的プローブであり得る。あるいは、検出可能に標識されたプローブは、縮重プローブ（例えば、本質的に米国特許第５，３４８，８５５号に記載される全ゲノムＤＮＡなどの配列の混合物）であり得る。後者の場合、標識は、二次プローブが二本鎖ＤＮＡを含む場合、インターカレート色素を用いて達成され得る。好ましいＤＮＡ結合リガンドは、例えば、上記のインターカレート化合物である。
【０１０８】
二次プローブはまたランダムヌクレオチドプローブ配列のライブラリーであり得る。二次プローブの長さは、二次プローブにより検出されるべき、固体支持体上の一次プローブまたは標的核酸配列の長さおよび成分の観点から決定されるべきである。このようなプローブライブラリーは、好ましくは、光活性化試薬で標識された３’または５’末端および検出試薬（例えば、フルオロフォア、酵素、色素、発光団または他の公知の検出可能部分）で負荷された他の末端で提供される。
【０１０９】
標識された核酸に印をつけるのに使用される特定の配列は、変更され得る。従って例えば、アミノ置換されたソラレンは、最初に核酸、それが標識に結合され得るペンダントアミノ基を有する生成物と光化学的に結合され得る（すなわち、標識化は、ＤＮＡ結合リガンドを試験サンプル中で核酸と光化学的に反応させることにより実施される）。あるいは、ソラレンは、最初に標識（例えば、酵素）に結合され、次いで、核酸に結合され得る。
【０１１０】
有利には、ＤＮＡ結合リガンドは、最初に化学的に標識と結合され、その後核酸プローブと結合される。例えば、ビオチンは、カルボキシル基を保有するので、フロクマリンの光化学反応性またはビオチンの生物学的活性を妨害することなく、アミド形成またはエステル形成によってフロクマリンと結合され得る。アミノメチルアンジェリシン、ソラレンおよびフェナントリジウム誘導体は、フェナントリジウムハロゲン化物およびその誘導体（例えば、アミノプロピルメチジウムクロライド）と同様に標識に結合され得る（Ｈｅｒｔｚｂｅｒｇら、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１０４：３１３（１９８２））。あるいは、ＤＮＡ結合リガンドを標識に結合させるために、二官能性試薬（例えば、ジチオビススクシンイミジルプロピオネートまたは１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル）が直接的に使用され得、ここで、その反応剤は、アルキルアミノ基を有し、溶媒、割合および反応条件に関しては、公知の様式である。特定の二官能性試薬、おそらくグルタルアルデヒドは、適していない。なぜならそれらは結合している間、核酸を改変し得、従ってアッセイを干渉し得るからである。このような問題を防止するために、従来の予防策がとられ得る。
【０１１１】
また有利には、ＤＮＡ結合リガンドは、スペーサーによって標識に結合され得、このスペーサーは、約４０原子まで、好ましくは約２〜２０原子の鎖を含み、その原子としては、炭素、酸素、窒素および硫黄が挙げられるが、これらに限定されない。このようなスペーサーは、メンバーの多官能性ラジカルであり得、ペプチド、炭化水素、多価アルコール、ポリエーテル、ポリアミン、ポリイミンおよび炭水化物（例えば、−グリシル−グリシル−グリシル−または他のオリゴペプチド、カルボニルジペプチドおよびω−アミノ−アルカン−カルボニルラジカルなど）が挙げられるが、これらに限定されない。糖、酸化ポリエチレンラジカル、グリセリル、ペンタエリスリトールなどのラジカルもまた、スペーサーとして作用し得る。スペーサーは、核酸結合リガンドおよび／または標識に直接的に結合され得るか、または結合は、結合剤（例えば、ジチオビススクシンイミジルプロピオネート、１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル、ジイソシアネート、カルボジイミド、グリオキサール、グルタルアルデヒドなど）の二価ラジカルを含み得る。
【０１１２】
ハイブリダイゼーションの間接的な検出のための二次プローブはまた、例えば、ＴｙａｇｉおよびＫｒａｍｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ、１４：３０３〜３０９（１９９６）またはＬｉｚａｒｄｉらの米国特許第５，１１９，８０１号および同第５，３１２，７２８号に記載される「ビーコンプローブ」法におけるエネルギー移動により検出され得る。当該分野で公知の任意のＦＲＥＴ検出系が、本発明の方法に使用され得る。例えば、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎＴＭ系が使用され得る。ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ技術は、「増幅された発光近接性均質アッセイ（Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ Ａｓｓａｙ）」法である。６８０ｎｍでのレーザー光での照射の際に、供与体ビーズの感光剤が、周囲の酸素を一重項状態の酸素に変換する。励起した一重項状態の酸素分子は、急激に崩壊する前に約２５０ｎｍ（１つのビーズの直径）を拡散する。受容体ビーズが、供与体ビーズに近接して存在する場合、生物学的相互作用によって、一重項状態の酸素分子は、受容体ビーズの化学発光基と反応し、ただちに、エネルギーを同じビーズの蛍光受容体に移動する。蛍光受容体は、放射波長を５２０〜６２０ｎｍにシフトする。この全反応は、０．３秒間の崩壊の半減期を有するので、測定は、時間分解様式で開始し得る。他の例示的なＦＲＥＴ供与体／受容体対としては、５５Åの有効距離を有するフルオレセイン（供与体）およびテトラメチルローダミン（受容体）；４６Åの有効距離を有するＩＡＥＤＡＮＳ（供与体）およびフルオレセイン（受容体）；ならびに６１Åの有効距離を有するフルオレセイン（供与体）およびＱＳＹ−７色素（受容体）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）が挙げられる。
【０１１３】
核酸検出のための定量アッセイもまた、本発明に従って実施され得る。マイクロアレイスポットに結合した二次プローブの量が、測定され得る。その量は、上記サンプル中にある核酸標的の量に関連し得る。そのサンプルの希釈物が、既知量の上記標的核酸を含むコントロールとともに使用され得る。これらの工程を実施するための正確な条件は、当業者にとって明らかである。マイクロアレイ分析において、検出可能なレベルが、可視化され得るか、またはそのプローブアレイをＸ線フィルムまたはホスホイメージャーに近接して配置してそのプローブが結合した部位を同定することによって評価され得る。蛍光が、電荷結合素子（ＣＣＤ）またはレーザー走査によって検出され得る。
【０１１４】
（試験サンプル）
任意の適切なサンプル（ヒト起源サンプル、動物起源サンプル、または環境（土壌もしくは水）起源サンプルが挙げられる）が、本方法を使用して分析され得る。試験サンプルとしては、体液（例えば、尿、血液、精液、脳脊髄液、膿、羊水、涙液）、または半固体分泌物もしくは固体分泌物（例えば、痰、唾液、肺吸引物、膣分泌物もしくは尿道分泌物）、糞便または固体組織サンプル（例えば、生検もしくは絨毛膜絨毛標本）が、挙げられる。試験サンプルとしてはまた、皮膚からの塗抹標本、生殖器からの塗抹標本、または咽喉からの塗抹標本も、挙げられる。
【０１１５】
試験サンプルは、当該分野で周知の種々の手段によって、核酸を単離するために処理され得る（一般的には、Ａｕｓｕｂｅｌ編、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２．Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＤＮＡ ａｎｄ ４．Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＲＮＡ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（２０００）を参照のこと）。標的核酸は、ＲＮＡまたはＤＮＡであり得、これは、直接サンプルの形態であっても、または精製核酸もしくはアンプリコンの形態であってもよいことが、当業者にとって明らかである。
【０１１６】
精製核酸は、上記サンプルから抽出され得、そして純度について分光光度的にかまたは他の器具によって測定され得る。核酸増幅の当業者にとって、アンプリコンは、種々の増幅方法によって最終産物として得られ、その方法は、例えば、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応、米国特許第４，６８３，１９５号、同第４，６８３，２０２号、同第４，８００，１５９号、および同第４，９６５，１８８号）、ＮＡＳＢＡ（核酸配列ベースの増幅、米国特許第５，１３０，２３８号）、ＴＭＡ（転写媒介性増幅）（Ｋｗｏｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：１１７３〜１１７７（１９８９））、ＳＤＡ（鎖置換増幅、Ｗａｌｋｅｒら、米国特許第５，２７０，１８４号に記載される）、ｔＳＤＡ（高温鎖置換増幅（ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃ Ｓｔｒａｎｄ Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（米国特許第５，６４８，２１１号および欧州特許番号ＥＰ ０ ６８４３１５）、ＳＳＳＲ（３ＳＲ（Ｓｅｌｆ−Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ））（米国特許第６，１５６，５０８号）である。
【０１１７】
具体的な実施形態において、ヒト起源のサンプルが、アッセイされる。なお別の具体的な実施形態において、痰サンプル、尿サンプル、血液サンプル、組織切片サンプル、食物サンプル、土壌サンプルまたは水サンプルが、アッセイされる。
【０１１８】
（キット）
本プローブは、キット形式にて、好ましくは、標的遺伝子を検出するためにそのプローブを使用する指示書とともに、包装され得る。そのキットの構成要素は、一般的容器中に一緒に包装され、代表的には、本明細書中に開示される方法の選択された具体的実施形態を実施するための指示書を含む。本明細書中に記載される検出方法のための構成成分が、必要に応じて上記キット中に含まれ得、それは、例えば、二次プローブおよび／または試薬、ならびに標識検出を実施するための手段（例えば、放射性標識、酵素基質、抗体など）である。
【０１１９】
（Ｅ．例示的実施形態）
本明細書中に記載される例示的実施形態は、標的遺伝子を型決定するための（例えば、ＤＮＡチップを使用してＨＬＡ型決定するための）方法を提供する。そのような型決定は、ヒト骨髄幹細胞ドナーライブラリーおよびヒト臍帯血幹細胞ライブラリーの構築、器官移植試験、骨髄移植試験、自己免疫疾患研究、ウイルス感染研究、および癌研究、疾患に対する感受性を予測する研究、法医学的同定、父系決定、ならびにヒト遺伝研究などにおいて、使用され得る。
【０１２０】
一局面において、上記の例示的実施形態は、標的遺伝子を型決定するための方法を提供する。この方法は、ａ）適切なサンプルから標的遺伝子を含む標的細胞を単離し、そしてその単離された標的細胞由来の標的遺伝子の少なくとも一部である標的ヌクレオチド配列と、必要に応じてその標的遺伝子に無関係の別のヌクレオチド配列とを含む調製物を得る工程；ｂ）核酸ハイブリダイゼーションにおいて使用するために適切な支持体を含むチップを提供する工程であって、その支持体上には、上記標的ヌクレオチド配列に対して相補的なオリゴヌクレオチドプローブと、ポジティブコントロールプローブ、ネガティブコントロールプローブ、ハイブリダイゼーションコントロールプローブ、および固定コントロールプローブというオリゴヌクレオチドコントロールプローブのうちの少なくとも１つとが固定されている、工程；ならびにｃ）工程ａ）において得られた調製物を工程ｂ）において提供されたチップに対してハイブリダイズさせ、上記標的ヌクレオチド配列および／または上記別のヌクレオチド配列と、上記チップ上に含まれるコントロールプローブとの間のハイブリダイゼーションを評価して、その標的遺伝子の型を決定する工程、を包含する。いくつかの実施形態において、上記標的遺伝子は、ＨＬＡ遺伝子（例えば、ＨＬＡクラスＩ遺伝子またはＨＬＡクラスＩＩ遺伝子）である。
【０１２１】
一実施形態において、上記標的ヌクレオチド配列の調製物は、磁性ビーズを使用して全血から白血球を単離する工程；その白血球から核酸を単離するかまたはその白血球を直接標的遺伝子増幅のために使用して、その標的ヌクレオチド配列の調製物を得る工程によって得られる。上記標的ヌクレオチド配列は、蛍光標識もしくはビオチン標識を含む、１本鎖ＤＮＡまたは１本鎖ＲＮＡである。
【０１２２】
本実施形態は、上記標的ヌクレオチド配列の調製のための改良方法を提供する。上記標的ヌクレオチド配列の調製のための先行技術の方法は、ＰＣＲによる上記標的ヌクレオチド配列の増幅の前に全血からＤＮＡを精製する工程、および後のハイブリダイゼーションのためにそのＰＣＲ産物を精製および変性する工程を必要とする。米国特許第５，７０２，８８５号を参照のこと。上記標的ヌクレオチド配列の調製のための本方法は、全血から単離した白血球をＰＣＲテンプレートとして直接磁性ビーズととともに使用すること、またはその白血球から単離した核酸を核酸増幅のために使用して、蛍光標識もしくはビオチン標識を含む１本鎖ＤＮＡもしくは１本鎖ＲＮＡを得ることを、可能にする。上記標識ＤＮＡまたは標識ＲＮＡは、さらに精製することなくハイブリダイゼーションのために使用され得る。
【０１２３】
この実施形態において、上記１本鎖ＤＮＡまたは１本鎖ＲＮＡは、非対称ＰＣＲを使用して取得され得る。上記ＰＣＲ増幅プロセスは、不均等量のプライマーを使用する従来の非対称ＰＣＲであり得る。上記プライマーは、直鎖プライマーであり得るか、またはヘアピン構造を有し得る。上記非対称ＰＣＲにおいて使用されるプライマーは、同じＴｍ値を有しても、異なるＴｍ値を有してもよい。上記非対称ＰＣＲにおいて使用される２つ以上のプライマーのＴｍ値間の差異は、約１℃〜約２０℃の範囲であり得る。上記プライマーのうちの一方は、２本鎖産物の増幅を可能にするために、より低いＴｍ値を有し得る。もう一方のプライマーは、特定量の２本鎖ＤＮＡを取得した後に１本鎖ＤＮＡの増幅を可能にするために、より高いＴｍ値を有し得る。このＰＣＲ増幅プロセスによって生成される１本鎖標的ヌクレオチド配列は、さらに精製することなくハイブリダイゼーションのために直接使用され得る。実施例１は、この方法により得られる１本鎖ＨＬＡ標的ヌクレオチド配列が、さらに精製することなくＤＮＡチップハイブリダイゼーションのために使用され得たことを実証した。
【０１２４】
あるいは、１本鎖ＲＮＡが、転写媒介性増幅（ＴＭＡ）法によって取得され得る。Ｔ７プロモーターを含むプライマーが、増幅のために含められ得る。１本鎖ＲＮＡが、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼによって合成され得る。ハイブリダイゼーションのために１本鎖ＤＮＡまたは１本鎖ＲＮＡを使用すると、上記ＰＣＲ増幅産物を精製および変性する工程と、ハイブリダイゼーションのために２本鎖ＤＮＡを使用する間の弱いシグナルまたはシグナル喪失という問題とが、回避される。
【０１２５】
この実施形態において、上記磁性マイクロビーズは、中国特許第０１１３４８６１．５号において開示される方法によって調製される。
【０１２６】
標的ヌクレオチド配列の調製のための本明細書中に開示される方法は、迅速な核酸サンプル調製のため、および微小全分析系（またはラボオンチップ（ｌａｂ−ｏｎ−ａ−ｃｈｉｐ））を構築するためのバイオチップ操作を達成するために、使用され得る。
【０１２７】
上記ＰＣＲ系およびＰＣＲプロセスは、実施例１にさらに詳述される。そのＰＣＲ増幅産物は、図１および図２において示される。
【０１２８】
別の実施形態において、本発明のチップは、公開されたＨＬＡ対立遺伝子配列に従ってオリゴヌクレオチドプローブを設計し、そしてそのチップの化学修飾した表面上に上記チップを固定することによって、構築される。
【０１２９】
この実施形態において、上記プローブは、中レベル分解能のＨＬＡ型決定のために公開されたＨＬＡ対立遺伝子配列に従って設計され、そして上記チップの化学修飾支持体上に固定される。上記プローブは、プラス鎖プローブであっても、マイナス鎖プローブであってもよい。上記プローブは、約１０ヌクレオチド〜約３０ヌクレオチドを有し得る。上記ＨＬＡ対立遺伝子配列は、まず、一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）部位を同定するための配列分析ソフトウェアによって分析され得、そのＳＮＰ部位を変換するプローブ配列が、必要なＴｍ値に基づいて設計される。本発明のために使用されるプローブの例が、表１において示される。
【０１３０】
この実施形態において、上記プローブは、固定効率を増加するために室温よりも高い温度にて、上記チップの支持体上に固定され得る。より高い固定効率によって、使用されるべきプローブの量が節約され、そしてチップ構築費用が低減される。プローブを固定するための先行技術の方法は、室温または室温付近の温度を使用する。本実施形態は、その一端にＮＨ２改変を有するプローブを固定するために、より高温を使用する。なぜなら、−ＮＨ−ＣＯ−結合を形成するＮＨ２基とＣＨＯ基との間の反応は、より高温で効率が良いからである。
【０１３１】
別の実施形態において、上記プローブの品質（例えば、純度および末端改変）を、ＤＨＰＬＣを介して評価するための方法が、提供される。末端改変効率は、上記プローブの品質にとって重要な指標である。ＤＨＰＬＣは、末端改変プローブと非改変プローブとを分離し得、従って、上記プローブの品質制御のために使用され得る。プローブの末端ＮＨ２改変を評価するためにＤＨＰＬＣを使用する例が、表２において示される。ＤＨＰＬＣはまた、上記プローブにおけるヌクレオチドの変異または欠失を評価するために使用され得る。
【０１３２】
別の実施形態において、方法は、上記標的ヌクレオチド配列を含む調製物を、上記チップに対してハイブリダイズする工程；そのチップを溶液で洗浄する工程；そのチップをハイブリダイゼーション後にシグナルについて走査する工程；および上記標的ヌクレオチド配列と上記チップ上に固定されたプローブとの間のハイブリダイゼーションを評価して上記標的遺伝子の型を決定する工程；を包含する。
【０１３３】
この実施形態において、強いシグナルを与え、偽ポジティブシグナルの可能性を最小にするハイブリダイゼーション条件および洗浄条件が選択される。本発明に使用されるプローブは、Ｔｗｅｌｆｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｆ Ｈｉｓｔｏｃａｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ（ｆｔｐ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ）から提供されるヒトＨＬＡ対立遺伝子配列およびクローン化標準ＨＬＡ対立遺伝子から選択される。クローン化標準ＨＬＡ対立遺伝子は、配列決定され、多くの配列が、Ｔｗｅｌｆｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｆ Ｈｉｓｔｏｃａｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙによって提供される配列と一致しなかった。ＨＬＡ対立遺伝子ライブラリーは、本発明のプローブを設計するために構築された。
【０１３４】
別の実施形態において、表３に示される一連のコントロールプローブおよびプローブ配列のパターンは、チップの品質およびハイブリダイゼーションプロセスからの結果の信頼性を評価するために提供される。表３に示されるプローブの配列は、標的遺伝子のタイピング（ＨＬＡタイピングが挙げられるがこれらに限定されない）のために使用され得る。プローブの複数のコピー（例えば、１〜１０コピー）が、チップ上に固定され得る。プローブの複数のコピーは、チップ上に隣接してまたは別々に固定され得る。ポジティブコントロールプローブの１〜１０個のコピーを、チップ上に固定し得、そして固定されたポジティブコントロールプローブの長さおよび配列のバリエーションは、標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズした場合、強〜弱または弱〜強の順序正しい大きさを有する一群のハイブリダイゼーションシグナルを作り出す。ネガティブコントロールプローブは、ポジティブコントロールプローブと比較した場合、約１〜３塩基対のミスマッチを有する。ポジティブコントロールプローブまたはネガティブコントロールプローブは、標的ヌクレオチド配列の一部、標的ヌクレオチド配列と同時に増幅されるヌクレオチド配列、または合成ヌクレオチド配列に対して相補的であり得る。ハイブリダイゼーションコントロールプローブは、標的遺伝子に関連しない合成ヌクレオチド配列に対して相補的であり得る。ハイブリダイゼーションコントロールプローブは、合成標識ヌクレオチド配列に対して相補的であり得るか、または、合成標識ヌクレオチド配列と比較した場合、約１〜２個の塩基対ミスマッチを有する。固定コントロールプローブは、一端において化学的に改変されており（例えば、ＮＨ２改変されている）、そして他端に検出可能標識（例えば、蛍光標識）を有するプローブである。固定コントロールプローブは、標的遺伝子に関連しない合成ヌクレオチド配列に対して相補的である。ポジティブコントロールプローブ、ネガティブコントロールプローブ、ハイブリダイゼーションコントロールプローブ、および固定コントロールプローブは、チップの４つの角、またはチップの中心に固定され得るか、あるいは任意の適切な順序またはランダムな固定パターンを有し得る。コントロールプローブについてのこのパターンの配列が、ＨＬＡタイピングのために使用され得るが、これらに限定されない。
【０１３５】
別の実施形態において、任意の標的遺伝子をタイピングするため（ＨＬＡ遺伝子をタイピングするためを含むがこれらに限定されない）に使用され得るハイブリダイゼーションシグナルを評価するためのデータ分析のための方法が提供される。この方法は、固定効率、全体的なハイブリダイゼーション効率、ハイブリダイゼーション特異性、ならびにポジティブシグナルおよびネガティブシグナルの評価を含む。全体的なハイブリダイゼーション効率は、固定コントロールプローブからのシグナルの分析、ハイブリダイゼーションコントロールプローブと標的遺伝子に関連しない標識合成ヌクレオチド配列との間のハイブリダイゼーションの分析、ならびにポジティブコントロールプローブおよびネガティブコントロールプローブに関係するハイブリダイゼーションシグナルの分析によって評価され得る。ハイブリダイゼーション特異性は、ポジティブコントロールプローブに関係するハイブリダイゼーションシグナルとネガティブコントロールプローブに関係するハイブリダイゼーションシグナルとの間の比、ならびにポジティブハイブリダイゼーションコントロールプローブに関係するハイブリダイゼーションシグナルとネガティブハイブリダイゼーションコントロールプローブに関係するハイブリダイゼーションシグナルとに間の比を分析することによって評価され得、そして増加したハイブリダイゼーション特異性を示す比を増加し得る。一群の密接に関連するプローブに関係するハイブリダイゼーションにおいて、ポジティブシグナルは、以下の基準に基づいて決定され得る：ａ）バックグラウンドノイズに対するハイブリダイゼーションシグナルの比は、３より大きい；ｂ）関連ポジティブコントロールプローブハイブリダイゼーションシグナルに対するハイブリダイゼーションシグナルの比は、所定の範囲内である；ｃ）ａ）およびｂ）の工程に基づいてポジティブシグナルを与える全てのプローブのハイブリダイゼーションシグナル、または１つのプローブのみがａ）およびｂ）の工程に基づいてポジティブシグナルを与える場合、２つの最も強いハイブリダイゼーションシグナルを与える２つのプローブのハイブリダイゼーションシグナルを比較して、このシグナルがポジティブであるかまたはネガティブであるかを決定する；ならびにｄ）その群の密接に関連するプローブに関係する２つまたは２つ未満のポジティブシグナルが存在する。
【０１３６】
ハイブリダイゼーションの後に、チップが走査され得、そしてデータが分析され得る。標的遺伝子型（例えば、ＨＬＡ遺伝子）が、データ分析ソフトウェアを使用して決定され得る。
【実施例】
【０１３７】
（Ｆ．実施例）
（実施例１）
標的ＨＬＡ遺伝子をタイピングするための標的細胞を単離するために、ＡＣＤ（２３ｍＭクエン酸、８０ｍＭグルコース、および４５ｍＭクエン酸ナトリウム）中の抗凝集剤を含む５μｌの全血を、回転シェーカー上の１．５ｍｌ Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管中の２０μｌ磁性ビーズ（１５ｍｇ／ｍｌのＴＥ緩衝液（ｐＨ６．０）中にある）とともに１０秒間穏やかに混合し、３分間静置させた。次いで、磁性ビーズを磁気スタンドによって固定し、上清を廃棄した。磁性ビーズをＰＢＳで２回洗浄した。洗浄後、磁性ビーズを１００μｌ ＴＥ緩衝液中に再懸濁させ、５μｌの再懸濁磁性ビーズを、ＰＣＴ増幅のためにテンプレートとして使用した。ＰＣＲを２５μｌのＰＣＴ反応溶液中で行った。この反応溶液を、２．５μｌの１０×緩衝液、０．５μｌの１０ｍＭ ｄＮＴＰ、０．５μｌの１ｍＭ Ｃｙ５標識ｄＣＴＰ、０．５μｌの１００ｎｇ／μｌテンプレートＤＮＡ、０．５μｌの１μＭ上流プライマー、２．５μｌの１０μＭ下流プライマー、０．５μｌの５Ｕ／μｌ Ｔａｑポリメラーゼ、および最終反応容量を２５μｌにするための滅菌再蒸留水を混合させることによって作製した。ＰＣＴ増幅プロセスは、以下を含んだ：９６℃で３分；９６で２５秒、７１℃で４５秒、および７２℃で３０秒の２６サイクル；９６℃で２５秒、６８℃で６０秒、および７２℃で１２０秒の９サイクル；続いて、７２℃で８分。
【０１３８】
ＰＣＴ増幅の後に、反応産物を、１．２％アガロースゲル電気泳動によって分析し得る。反応産物を、分析することなく、以下のハイブリダイゼーション反応に直接使用し得る。
【０１３９】
ハイブリダイゼーションを行うために、３μｌのハイブリダイゼーション溶液と混合した後に、５μｌのＰＣＴ反応産物を、９８℃で５分間インキュベートした。次いで、ハイブリダイゼーション反応を、６５℃で１時間行い、ＰＣＴ反応産物とＤＮＡチップ上に固定されたプローブとのハイブリダイゼーションを行わせた。ハイブリダイゼーション後、チップ上の未反応ＰＣＴ反応産物を、脱イオン水を使用して洗浄した。チップをさらに１０分間、４５℃で洗浄緩衝液において洗浄し、そして脱イオン水でリンスした。次いで、チップを乾燥させた。
【０１４０】
ハイブリダイゼーションチップを特別なスキャナーで走査し、そしてハイブリダイゼーションパターンを得た（図３）。ハイブリダイゼーションパターンを、特別なソフトウェアを使用して分析し、データベースを作製した。データベースを分析し、標的遺伝子の遺伝子タイピングを得た。
【０１４１】
（実施例２）
プローブの品質を決定するために、Ｈ２Ｏ中１０μＭの、一端にＮＨ２改変を有する２つのオリゴヌクレオチドプローブ（ＰＢＨ＿０３０３０１９およびＰＢＨ＿０３０１１１９）を、ＷＡＶＥ（登録商標）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃ，ＵＳＡ）に適用した。カラム温度を８０℃に設定し、プローブを勾配アセトニトリル緩衝液中で洗浄した。溶出液を紫外光検出器を使用して２６０ｎＭで検出した。時間にわたって溶出されたピークの数および形状は、プローブの品質を示した。図５に示されるように、５Ａおよび５Ｂの有用な内容は、それぞれ、９３．３５％および６４．８％である。
【０１４２】
（実施例３）
表１のプローブを、ＨＬＡ＿Ａ、ＨＬＡ＿Ｂ、ＨＬＡ＿ＤＲＢ１遺伝子型決定プローブとして使用した。ＰＢＨ＿０３０１ｘｘｘは、ＨＬＡ−Ａプローブを表し、ＰＢＨ＿０２０２ｘｘｘは、ＨＬＡ−Ｂプローブを表し、そしてＰＢＨ＿０３０３ｘｘｘは、ＨＬＡ−ＤＲＢ１プローブを表す。
【０１４３】
（実施例４）
ＨＬＡ標準対立遺伝子のクローニング。その手順は、以下の通りである：
【０１４４】
【化１】
ＨＬＡ標準遺伝子バンクを、ＨＬＡ＿Ａ、ＨＬＡ＿Ｂ、ＨＬＡ＿ＤＲＢ１遺伝子型決定プローブの検出およびＨＬＡチップのＱＣのために構築した。４３のＨＬＡ−Ａ対立遺伝子が存在し、これは、１９の対立遺伝子群に分布し、メジウムタイプの９５．０％をカバーしてクローニングされている；ＨＬＡ＿Ｂについて、４７の対立遺伝子が、クローニングされ、これは、２９の対立遺伝子群に分布し、メジウムタイプの８０％をカバーする；ＨＬＡ＿ＤＲについて、２２の対立遺伝子がクローニングされ、これは、１４の対立遺伝子群に分布し、メジウムタイプの８７．５％をカバーする。１２ｔｈ ＩＨＷＧ（ｗｗｗ．ｉｈｗｇ．ｏｒｇ）の対立遺伝子配列に基づく表１のプローブが設計された。次いで、プローブを化学改変側鎖上に固定してＨＬＡチップを作製した。
【０１４５】
ハイブリダイゼーション条件および洗浄条件は、強力なポジティブシグナルおよび比較的弱い偽ポジティブシグナルを維持するべきである。ハイブリダイゼーションの温度および洗浄の温度は、それぞれ、６５℃および４５℃であり、イオン強度は、０．２％ＳＤＳ、０．１×ＳＳＣであった。
【０１４６】
標的遺伝子を含むサンプルを、ＨＬＡチップとハイブリダイズし、次いで、洗浄および走査によって、データを得、遺伝子型を検出した。例えば、５μｌ ＰＣＲ産物および５μｌハイブリダイゼーション緩衝液を混合し、次いで、１時間、６５℃でハイブリダイズし、次いで、０．２％ＳＤＳおよび０．１×ＳＳＣを含む溶液を使用して、１０分間、４５℃でチップを洗浄し、５分間再び、１×ＳＳＣを使用して洗浄し、１分間水でリンスした。次いで、チップを遠心分離して乾燥し、スキャナーで走査した。写真をとり、データをＨＬＡ特異的ソフトウェアを使用して分析し、遺伝子型の結果を作製した。
【０１４７】
ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子型決定のためのプローブを表１に示した。
【０１４８】
【表１−１】
【０１４９】
【表１−２】
【０１５０】
【表１−３】
【０１５１】
【表１−４】
【０１５２】
【表１−５】
【０１５３】
【表１−６】
【０１５４】
【表１−７】
【０１５５】
【表１−８】
（実施例５）
ＨＬＡタイピングのアレイでは、６４個の検出プローブ、２個のポジティブプローブ、１個のネガティブプローブ、１個のハイブリダイゼーションコントロールネガティブプローブ、１個のハイブリダイゼーションコントロールポジティブプローブが存在する。表２に示されるように、イタリック文字は、コントロールプローブを表し、他の文字は、検出プローブである。表３は、ＨＬＡチップのプローブの配置の一例を示している。
【０１５６】
【表２−１】
【０１５７】
【表２−２】
【０１５８】
【表３】
上記実施例は、例示の目的のみで含まれ、本発明の範囲を制限することを意図しない。上記に対する多くのバリエーションが可能である。上記の実施例に対する改変およびバリエーションが当業者に明らかであるので、本発明が添付の特許請求の範囲によってのみ制限されることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【０１５９】
【図１】図１は、磁性マイクロビーズによって白血球が捕獲された結果を例証する。
【図２】図２は、異なる３つのタイプの磁性マイクロビーズを用いて単離した白血球からのＰＣＲ結果を例証する。
【図３】図３は、同じ磁性マイクロビーズを用いて単離した白血球からのＰＣＲ結果を例証する。
【図４】図４は、１４４個のプローブを含むチップ上のハイブリダイゼーションシグナルを例証する。
【図５】図５は、２つのプローブ（ＰＢＨ＿０３０３０１９およびＰＢＨ＿０３０１１１９）のＤＨＰＬＣ分析を例証する。
【図６−１】図６は、４つのタイプのプローブ（６ａ．非常に純度が高いプローブ；６ｂ．少量の不純物を含むプローブ；６ｃ．高い不純率のプローブ；６ｄ．非常に高い不純率の非常に純度が低いプローブ）のＤＨＰＬＣ分析を例証する。
【図６−２】図６は、４つのタイプのプローブ（６ａ．非常に純度が高いプローブ；６ｂ．少量の不純物を含むプローブ；６ｃ．高い不純率のプローブ；６ｄ．非常に高い不純率の非常に純度が低いプローブ）のＤＨＰＬＣ分析を例証する
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に核酸分析の分野に関連する。特に本発明は、とりわけ、核酸ハイブリダイゼーションにおける使用に適した支持体を含むチップを用いる標的遺伝子の型決定方法を提供する。ここで、この支持体は、上記標的ヌクレオチド配列に対して相補的なオリゴヌクレオチドプローブを有し、そして、少なくとも以下のオリゴヌクレオチドコントロールプローブ（ポジティブコントロールプローブ、ネガティブコントロールプローブ、ハイブリダイゼーションコントロールプローブ、および固定コントロールプローブ）のうち１つを有する。ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）標的遺伝子の型決定のためのオリゴヌクレオチドプローブまたはプローブアレイもまた、提供される。
【背景技術】
【０００２】
ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）は、ヒトの第６染色体の短鎖上に位置するＨＬＡ遺伝子複合体によりコードされる。上記ヒトＨＬＡ遺伝子は、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）（組織抗原および免疫応答に関連する遺伝子クラスター）の一部である。個体間の臓器移植の成功は、容認度（すなわち、ドナーとレシピエントとの組み合わせの間の組織適合性）に依存する。移植した臓器に対する拒絶を生じる抗原は、移植抗原または組織適合性抗原である。人体における拒絶反応と関連する２０以上の抗原系がある。それらの中の強くかつ急性拒絶反応を生じ得る抗原は、主要組織適合性抗原と称される。その遺伝子は、堅く結合した遺伝子クラスターであり、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）と称される。免疫応答および機能調節をコントロールする免疫応答遺伝子（ＩＲ遺伝子）がＭＨＣ中に位置することが、現在証明されている。従って、ＭＨＣは、移植拒絶に関連するだけでなく、免疫応答および免疫調節の誘導および調節においても広く関係する。ＨＬＡ遺伝子は、ヒトの第６染色体上に位置する約４０００ｋｂの領域（全ヒトゲノムの約３，０００分の１に生じる領域）内に位置する。同定されたＨＬＡ座が２２４個ある。ＨＬＡタンパク質は、それらの構造、発現パターン、組織分布、および機能に基づき、３つのクラス（ＨＬＡ−Ｉ，ＨＬＡ−ＩＩおよびＨＬＡ−ＩＩＩ）に分類される。各遺伝子座内に、対立遺伝子が数百ある。
【０００３】
ＨＬＡ遺伝子によりコードされるタンパク質は、組織移植の間の移植片拒絶における重要な役割を担う。成功した組織移植は、ドナーとレシピエントとの間で、ある一定のＨＬＡマッチングの程度が得られるかに依存する。従って、ＨＬＡ型決定は、最適にマッチしたドナーを選択するために必要である。現在のところ、ＨＬＡ型決定は、多数の医学的処置（例えば、臓器移植、特に、骨髄移植）と組み合わせて慣用的に行われている。ヒト集団のＨＬＡ遺伝子における広範囲にわたる多型、免疫応答の調節におけるＨＬＡ遺伝子によりコードされるタンパク質の役割、ならびに、父性遺伝子および母性遺伝子両方による相互優性発現に基づき、ＨＬＡ型決定はまた、疾患に対する感受性予測、法医学的同定、父性決定、および遺伝子研究において、用いられる。従って、正確なＨＬＡ型決定方法が必要とされている。
【０００４】
ＨＬＡ型決定のための異なる方法が用いられている。現在のところ、ＨＬＡ遺伝子は、血清学的方法、混合リンパ球型培養（ＭＬＣ）、およびＤＮＡ配列に基づく型決定方法を用いて、型決定される。
【０００５】
血清学的方法は、白血球の表面上のＨＬＡタンパク質を有する血清の反応に基づいている。血清学的型決定の原理に基づいた方法（例えば、ＩＤ−ＩＥＦおよびモノクローナル抗体型決定法）は、特異性を高めるため、そして検査時間を短縮するために開発された。血清学的ＨＬＡ型決定の主な欠点は、血清の複雑性、検査を行うのに必要な標準血清の広範囲にわたる利用性の欠如、および、すでに知られたＨＬＡ型のみが検出され、新しい多型は検出されないことである。
【０００６】
混合リンパ球培養試験においては、１個体に由来するリンパ球「レスポンダー（ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ）」を、別の個体に由来する「刺激性」リンパ球とともに培養する。刺激性細胞が無関係な人物または家族（この家族のＭＨＣは、レスポンダーのＭＨＣとは異なる）に由来する細胞である場合、未処理のリンパ球が増殖する。この増殖は、個体からの適合しない抗原のインジケーターである。ＭＬＣ方法は、細胞の型決定の利用性の欠如、および検査手順の複雑性のために広くは用いられない。
【０００７】
ＤＮＡ配列に基づくＨＬＡ型決定方法は、血清学的方法または混合リンパ球培養方法の欠点を克服するために開発された。このような方法の１つは、ＨＬＡ型決定の基礎であるＤＮＡ制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）の使用を含む。米国特許第４，５８２，７８８号を参照のこと。ヒト集団のＨＬＡ遺伝子における多型により生じた制限エンドヌクレアーゼ消化物の長さの多型は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術と組み合わせて、ＨＬＡ型決定のために用いられる。しかしながら、ＲＦＬＰ法は、集団中に存在することが知られた特定のアレイ（例えば、ＨＬＡ−ＤＲ４のサブタイプ）との間で区別することができず、そして従って、対立遺伝子特定の組合せを区別するために用いることができない。
【０００８】
さらに最近では、研究者は、ＨＬＡ−ＩＩ型決定を行うための配列特異的オリゴヌクオチド（ＳＳＯ）プローブハイブリダイゼーション法を確立した。この方法は、ＨＬＡ座の多型領域をＰＣＲを用いて増幅する工程、増幅したＤＮＡと配列特異的オリゴヌクレオチドプローブとをハイブリダイズする工程、および、増幅したＤＮＡと配列特異的オリゴヌクレオチドプローブとの間で形成したハイブリッドを検出する工程を包含する。この方法は、ＨＬＡ対立遺伝子の間で１つまたは２つのヌクレオチドの相違を同定し得る。この方法の欠点は、調査において、ハイブリダイゼーションのための複数の等価な膜を形成する複雑性および困難性、または、多数の対立遺伝子が原因で現在自動化されてない、ハイブリダイゼーション後の同じ膜の再使用の複雑性および困難性である。逆線ストリップ型決定法（ｒｅｖｅｒｓｅ ｌｉｎｅ ｓｔｒｉｐ ｔｙｐｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ）は、検出するシグナルを発生するために酵素法を用いてＳＳＯ法を改善するために開発されたが、この方法の操作は、所望の結果を得るためには複雑かつ困難である。
【０００９】
ＨＬＡ型決定のための配列特異的プライマー増幅（ＰＣＲ−ＳＳＰ）法は、ＨＬＡ型のＰＣＲ増幅のためにＰＣＲプライマーの配列特異的部位を利用し、そして、電気泳動によって増幅産物を分析する。この方法を用いる検査に必要な時間は、２〜３時間のみである（Ｍｙｔｉｌｉｎｅｏｓら、Ｈｕｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，５９：５１２−７（１９９８））。しかしながら、未知のサンプルについては、この方法は、特定のプライマーの各々を検査するために多くの研究を必要とする。加えて、ＨＬＡサブタイプの高い識別能での型決定を達成することは困難である。
【００１０】
他のＤＮＡ配列に基づくＨＬＡ型決定法としては、ＰＣＲ１本鎖コンフォメーション多型（ＰＣＲ−ＳＳＣＰ）およびＰＣＲフィンガープリントが挙げられる。ＤＮＡ配列に基づくＨＬＡ型決定法は、ＨＬＡ型決定をより正確にし、そしてまた、より多くのＨＬＡ対立遺伝子を同定するのを補助する。
【００１１】
ＤＮＡチップ技術は、多数の異なるＤＮＡ配列またはＤＮＡ断片を同時に１つのＤＮＡチップ上で分析するために広く用いられた。この技術は、ＤＮＡ断片のハイスループットで同時に迅速な分析を実現させる。この技術は、非常に少ない量の標的ＤＮＡ断片しか必要としない。ＨＬＡ遺伝子の複雑性のため、ＤＮＡチップは、ＨＬＡ型決定の用途のための理想のツールであり得る。いくつかのキットおよび方法が、記載されている。Ｋａｈｉｗａｓｅ，Ｒｉｎｓｈｏ Ｂｙｏｒｉ Ｓｕｐｐｌ．１１０：９９−１０６（１９９９）；Ｃａｏら、Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔ，１：１７７−２０８（１９９９）；および、Ｇｕｏら、Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔ．１：２２０−３０（１９９９）を参照のこと。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
１つの局面において、本発明は、標的遺伝子の型決定方法に関する。上記方法は、以下：
ａ）適切なサンプルから標的遺伝子を含む標的細胞を単離し、そして上記単離された標的細胞由来の上記標的遺伝子の少なくとも一部である標的ヌクレオチド配列と、必要に応じて上記標的遺伝子に無関係の別のヌクレオチド配列とを含む調製物を得る工程；
ｂ）核酸ハイブリダイゼーションにおいて使用するために適切な支持体を含むチップを提供する工程であって、上記支持体上には、上記標的ヌクレオチド配列に対して相補的なオリゴヌクレオチドプローブと、以下のオリゴヌクレオチドコントロールプローブ：ポジティブコントロールプローブ、ネガティブコントロールプローブ、ハイブリダイゼーションコントロールプローブ、および固定コントロールプローブのうちの少なくとも１つとが固定されている、工程；ならびに、
ｃ）工程ａ）において得られた上記調製物を工程ｂ）において提供された上記チップに対してハイブリダイズさせ、上記標的ヌクレオチド配列および／または上記別のヌクレオチド配列と、上記チップ上に含まれる上記コントロールプローブとの間のハイブリダイゼーションを評価して、上記標的遺伝子の型を決定する工程、
を包含する。
【００１３】
別の局面において、本発明はＨＬＡ標的遺伝子の型決定のためのオリゴヌクレオチドプローブに関する。上記オリゴヌクレオチドプローブが、以下のヌクレオチド配列：
ａ）高ストリンジェンシーの条件下で、表１に示される標的ＨＬＡヌクレオチド配列もしくはその相補鎖とハイブリダイズする、ヌクレオチド配列；または、
ｂ）表１に示されるヌクレオチド配列もしくはその相補鎖を含む標的ＨＬＡヌクレオチド配列に対して、少なくとも９０％の同一性を有する、ヌクレオチド配列、
を包含する。
【００１４】
さらなる別の局面において、本発明は、ＨＬＡ標的遺伝子を型決定するために支持体上に固定されたオリゴヌクレオチドプローブのアレイに関する。上記アレイは、核酸ハイブリダイゼーションにおいて使用するために適切な支持体を含み、上記支持体上には、複数のオリゴヌクレオチドプローブが固定されており、上記プローブの少なくとも１つは、以下のヌクレオチド配列：
ａ）高ストリンジェンシー条件下で、表１に示される標的ＨＬＡヌクレオチド配列もしくはその相補鎖とハイブリダイズする、ヌクレオチド配列；または、
ｂ）表１に示されるヌクレオチド配列もしくはその相補鎖を含む標的ＨＬＡヌクレオチド配列に対して、少なくとも９０％の同一性を有する、ヌクレオチド配列、
を包含する。
【００１５】
（発明を実施する形態）
開示を明確にするため、そして限定しない目的で、本発明の詳細な説明を以下の小節に分ける。
【００１６】
（Ａ．定義）
定義されていなければ、本明細書中において用いられるすべての技術用語および科学用語は、本発明の属する当該分野における当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書中で引用されたすべての特許、特許出願、公開された特許出願、および他の出版物は、本明細書中にそれらの全体が参考として援用される。本節に記載された定義が、本明細書中で引用された特許、特許出願、公開された特許出願、および他の出版物に記載された定義と逆である場合、またはそうでなければ一致しない場合、本節に記載された定義を、参考として本明細書中において援用される定義よりも優先する。
【００１７】
本明細書中において用いられる場合、「ａ」または「ａｎ」は、「少なくとも１つ」または「１つ以上」を意味する。
【００１８】
本明細書中において用いられる場合、「プライマー」は、標的配列にハイブリダイズする（一般的には、増幅工程において核酸にプライミングする）オリゴヌクレオチドをいう。
【００１９】
本明細書中において用いられる場合、「プローブ」は、標的配列にハイブリダイズする（一般的には、その検出を促進する）オリゴヌクレオチドをいう。用語「標的配列」は、プローブが特異的に結合する核酸配列をいう。増幅工程において上記標的核酸をプライミングするのに用いられるプライマーとは違って、プローブは、ポリメラーゼ酵素を用いて標的配列を増幅するために伸長する必要がない。しかしながら、多くの場合においてプローブおよびプライマーが構造的に類似しているかまたは同一であることは当業者にとって明らかである。
【００２０】
本明細書中において用いられる場合、「ポジティブコントロールプローブ」は、標的配列群（もしくはファミリー）の保存された配列またはコンセンサス配列とハイブリダイズするプローブをいう。本明細書中において用いられる場合「ネガティブコントロールプローブ」が、上記ポジティブコントロールプローブと比較した場合、単一または複数の塩基対の変化を含むプローブをいう。好ましくは、ネガティブコントロールプローブは、ポジティブコントロールプローブと比較した場合、単一の塩基対の変化を含む。別の例示的なネガティブコントロールプローブは、標的配列が由来する起点とは異なる起点からの相同配列である。１つの特定の例において、２つのポジティブコントロールプローブ（すなわち、強いプローブおよび弱いプローブ、ならびに一緒に用いられ得る単一のネガティブコントロール）である。上記強いポジティブコントロールプローブおよびネガティブコントロールは、全ハイブリダイゼーション効率を評価されるのに用いられる。上記弱いポジティブコントロールプローブは、検査用プローブ（すなわち、ハイブリダイゼーションが評価される非コントロールプローブ）のハイブリダイゼーションシグナルを評価するのに用いられる。例えば、上記検査用プローブのハイブリダイゼーションシグナルと上記弱いポジティブコントロールプローブのハイブリダイゼーションシグナルとの間の比は、検査用プローブのハイブリダイゼーション強度を評価する範囲を得るために用いられ得る。
【００２１】
本明細書中に用いられる場合、「ハイブリダイゼーションコントロールプローブ」とは、検査用プローブと標的配列との間のハイブリダイゼーションに依存しない全ハイブリダイゼーション効率を評価するのに用いられるプローブをいう。例えば、標的配列がＨＬＡ配列である場合、ハイブリダイゼーションコントロールプローブは、どのＨＬＡ配列に対しても無関係である配列であり得、好ましくは、標的ＨＬＡ標的配列が由来する起源とは異なる起源に由来する。ハイブリダイゼーションコントロールプローブは、ＮＨ２基で修飾され得、そして、検査用プローブを含む他のプローブが適用されるのと同じかもしくは類似する濃度および／または手順でチップ表面に適用（または固定）され得る。ハイブリダイゼーションコントロールプローブに相補的な、別の標識プローブ（例えば、ヘキサクロロフルオロセイン（ＨＥＸ））は、他のプローブの濃度または比に匹敵する濃度または比で、全ハイブリダイゼーション溶液中に添加され得る。他のフルオロセインもまた、本明細書中で用いられ得る。このように、全ハイブリダイゼーション工程がモニタリングされ得る。ハイブリダイゼーションコントロールプローブはまた、チップ表面上のプローブの位置を導く工程または決定する工程において用いられ得る。
【００２２】
本明細書中で使用される場合、「固定コントロールプローブ」とは、固定プロセスを評価するために使用されるプローブをいう。固定コントロールプローブは、いずれのハイブリダイゼーション反応にも関与しない。一例では、この固定コントロールプローブの一端は（例えば、チップ表面への固定を促進するため、ＮＨ２基によって）改変され、そしてこの固定コントロールプローブ他の端は、検出可能な標識（例えば、ＨＥＸ）によって標識される。
【００２３】
本明細書中に用いられる場合「ＨＥＸ」は、フルオロセインの１つであるヘキサクロロフルオロセインを意味する。
【００２４】
本明細書中に用いられる場合、「相補的」とは、２つの核酸配列が少なくとも５０％の配列同一性を有することを意味する。好ましくは、この２つの核酸配列は、少なくとも６０％の配列同一性、７０％の配列同一性、８０％の配列同一性、９０％の配列同一性、９５％の配列同一性、９６％の配列同一性、９７％の配列同一性、９８％の配列同一性、９９％の配列同一性、または１００％の配列同一性を有する。「相補的」はまた、上記２つの核酸配列が、低ストレンジェンシー条件下、中ストレンジェンシー条件下、および／または、高ストレンジェンシー条件下でハイブリダイズし得ることを意味する。
【００２５】
本明細書中に用いられる場合、「実質的に相補的」とは、２つの核酸配列が、少なくとも９０％の配列同一性を有することを意味する。好ましくは、この２つの核酸配列は、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９６％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、少なくとも９９％の配列同一性、または１００％の配列同一性を有する。あるいは、「実質的に相補的」とは、２つの核酸配列が高ストレンジェンシー条件下でハイブリダイズし得ることを意味する。
【００２６】
本明細書中に用いられる場合、「完全にマッチする２つのヌクレオチド配列」は、核酸二重鎖をいい、ここで上記２つのヌクレオチド鎖は、ワトソン−クリック塩基対形成原理（すなわち、ＤＮＡ：ＤＮＡ二重鎖においてはＡ−Ｔ対およびＣ−Ｇ対、ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖またはＲＮＡ：ＲＮＡ二重鎖においてはＡ−Ｕ対およびＣ−Ｇ対）に従ってマッチし、そして、二重鎖中の配列の何れにも欠損または付加がない。
【００２７】
本明細書中において用いられる場合、ミスマッチ率決定における「ハイブリダイゼーションのストレンジェンシー」とは、以下である：
１）高ストレンジェンシー：０．１×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ、６５℃；
２）中ストレンジェンシー：０．２×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ、５０℃（中程度なストレンジェンシーとしても称される）；および
３）低ストレンジェンシー：１．０×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ、５０℃。
【００２８】
同等のストレンジェンシーを代替的な緩衝液、塩、および温度を用いて達成され得ることが理解されている（一般的には、Ａｕｓｕｂｅｌ（編）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２．９Ａ．Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ，２．９Ｂ．Ｄｏｔ ａｎｄ Ｓｌｏｔ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ ｏｆ ＤＮＡ、および２．１０．Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＤＮＡ Ｂｌｏｔｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（２０００）を参照のこと）。
【００２９】
本明細書中において用いられる場合、「融解温度」（「Ｔｍ」）とは、核酸二重鎖（すなわち、ＤＮＡ：ＤＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡ、ＲＮＡ：ＲＮＡ）が変性する温度範囲の中間点をいう。プローブのＴｍ値は、ハイブリダイズしたプローブのＴｍ値を意味する。
【００３０】
本明細書中において用いられる場合、「評価する」は、プローブと標的ヌクレオチド配列との間で形成したハイブリッドの量的決定および／または質的決定をいう（例えば、ハイブリッドの量または濃度についての絶対値、そしてまた、係数、比、百分率、視覚、またはハイブリダイゼーションレベルの指標となる他の値を得ることである。評価は、直接的または間接的あり得、そして、実際に検出された化学種は、ハイブリッドそのものである必要はなく、例えば、その誘導体、プローブおよび／もしくは標的ヌクレオチド配列、またはいくつかのさらなる物質の減少または消失であり得る。
【００３１】
本明細書中において用いられる場合、「磁性物質」は、磁石の特性（磁気によって生成する、生じるまたは作用する、磁石または磁気に関連する特性）を有する任意の物質をいう。
【００３２】
本明細書中において用いられる場合、「磁化可能な物質」は、磁場と相互作用する特性、およびそれゆえに、磁場内で懸架されるかまたは自由に配置される場合に、磁気を誘導し磁気モーメントを生成する特性を有する任意の物質をいう。磁化可能な物質の例としては、限定はされないが、常磁性物質、強磁性物質、およびフェリ磁性物質が挙げられる。
【００３３】
本明細書中において用いられる場合、「常磁性物質」は、個々の原子、イオン、または分子が、永久磁気双極子モーメントを有する物質を称する。外部磁場が存在しない場合、原子双極子点は、無作為な方向へ向けられ、そして全体としてどの方向にも物質は磁化しない。この無作為な方向付けは、物質内の熱運動の結果である。外部磁場が適用された場合、原子双極子は、それ自身をその磁場と平行になるように向ける傾向がある。なぜなら、これは、逆平行な位置よりも低いエネルギー状態であるからである。これは、上記磁場と平行する正味磁性を与え、そして、磁化率にプラスに貢献する。「常磁性物質」または「常磁性」についてのさらなる詳細は、種々の文献において見出され得る（例えば、Ｂ．Ｉ ＢｌｅａｎｅｙおよびＢ．Ｂｌｅａｎｅｙ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９７５「Ｅｌｅｃｔｒｉｃｉｔｙ ａｎｄ Ｍａｇｎｅｔｉｓｍ」中の第６章、１６９頁〜１７１頁）。
【００３４】
本明細書中において用いられる場合、「強磁性物質」は、磁化率の非常に大きな（正の）値により区別される物質を称し、そしてこれは、適用された磁場の強さに依存する。加えて、強磁性物質は、適用された磁場が存在しなくとも磁気モーメントを有し得、そして、ゼロ磁場における磁性の保持は、「残留磁気」として公知である。「強磁性物質」または「強磁性化」についてのさらなる詳細は、種々の文献において見出され得る（例えば、Ｂ．Ｉ ＢｌｅａｎｅｙおよびＢ．Ｂｌｅａｎｅｙ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９７５「Ｅｌｅｃｔｒｉｃｉｔｙ ａｎｄ Ｍａｇｎｅｔｉｓｍ」中の第６章、１７１頁〜１７４頁）。
【００３５】
本明細書中に用いられる場合、「フェリ磁性物質」は、自発磁化、残留磁気、および通常のフェリ磁性材料と類似する他の特性を示す物質を称する。しかし、この自発モーメントは、物質中の（磁気）双極子の全平行整列に対する期待値とは一致しない。「フェリ磁性物質」または「フェリ磁性化」についてのさらなる詳細は、種々の文献において見出され得る（例えば、Ｂ．Ｉ ＢｌｅａｎｅｙおよびＢ．Ｂｌｅａｎｅｙ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９７５「Ｅｌｅｃｔｒｉｃｉｔｙ ａｎｄ Ｍａｇｎｅｔｉｓｍ」中の第１６章、５１９頁〜５２４頁）。
【００３６】
本明細書中において用いられる場合、「金属酸化物粒子」は、粒子形態における金属の任意の酸化物を称する。特定の金属酸化物粒子は、常磁性特性または超常時性特性を有する。「常磁性粒子」は、外部磁場の適用に感受性であるが、しかし、永久磁区を維持し得ない粒子として定義される。言い換えると、「常磁性粒子」はまた、「常磁性物質」から作製されるか、または「常磁性物質」からなる粒子として定義される。常磁性粒子の非限定的な例としては、特定の金属酸化物粒子、例えば、Ｆｅ３Ｏ４粒子、金属合金粒子（例えば、ＣｏＴａＺｒ粒子）が挙げられる。
【００３７】
本明細書中において用いられる場合、「サンプル（例えば、全血）は新鮮である」とは、約１２時間以内にサンプルの供給源から得られたかまたは単離されたサンプルを意味する。好ましくは、上記サンプルは、約１０時間以内、５時間以内、４時間以内、３時間以内、２時間以内、１時間以内、３０分以内、２０分以内、１０分以内、５分以内、２分以内、または１分以内にサンプルの供給源から得られたかまたは単離されている。
【００３８】
本明細書中において用いられる場合、「サンプル（例えば、全血）は、低温保存される」は、約０℃かまたはそれ以下の温度で保存されているサンプルを意味する。
【００３９】
（Ｂ．標的遺伝子の型決定方法）
１つの局面において、本発明は標的遺伝子の型決定方法を対象とする。上記方法は、以下：
ａ）適切なサンプルから標的遺伝子を含む標的細胞を単離し、そして上記単離された標的細胞由来の上記標的遺伝子の少なくとも一部である標的ヌクレオチド配列と、必要に応じて上記標的遺伝子に無関係の別のヌクレオチド配列とを含む調製物を得る工程；
ｂ）核酸ハイブリダイゼーションにおいて使用するために適切な支持体を含むチップを提供する工程であって、上記支持体上には、上記標的ヌクレオチド配列に対して相補的なオリゴヌクレオチドプローブと、以下のオリゴヌクレオチドコントロールプローブ：ポジティブコントロールプローブ、ネガティブコントロールプローブ、ハイブリダイゼーションコントロールプローブ、および固定コントロールプローブのうちの少なくとも１つとが固定されている、工程；ならびに、
ｃ）工程ａ）において得られた上記調製物を工程ｂ）において提供された上記チップに対してハイブリダイズさせ、上記標的ヌクレオチド配列および／または上記別のヌクレオチド配列と、上記チップ上に含まれる上記コントロールプローブとの間のハイブリダイゼーションを評価して、上記標的遺伝子の型を決定する工程、
を包含する。
【００４０】
本方法は、任意の標的細胞（例えば、白血球）由来の標的遺伝子の型決定に用いられ得る。他の例示的な標的細胞としては、動物細胞、植物細胞、真菌細胞、細菌細胞、組換え細胞、および培養細胞が挙げられる。
【００４１】
本方法は、任意の標的遺伝子（例えば、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ））の型決定に用いられ得る。
【００４２】
任意の適切なサンプル（例えば、血液、唾液、毛髪、ヒト核酸を含むヒト組織）は、本方法において用いられ得る。１つの例として、上記血液サンプルは、血清、血漿、または全血である。別の例として、上記血液サンプルは、新鮮全血または低温保存全血である。
【００４３】
標的細胞は、任意の適切な方法を用いて適切なサンプルから単離され得る。例えば、この標的細胞は、磁性マイクロビーズを用いて適切なサンプルから単離され得る。好ましくは、この磁性マイクロビーズは、約５μｍから約２００μｍの範囲に及ぶ直径を有する。
【００４４】
上記磁性マイクロビーズは、任意の適切な方法によって調製され得る。例えば、ＣＮ ０１／１０９８７０．８またはＷＯ０２／０７５３０９において開示された方法が用いられ得る。任意の磁化可能な物質は、本発明において有用な磁性マイクロビーズを調製するために用いられ得る。磁化可能な物質の非限定的な例としては、フェリ磁性物質、強磁性物質、常磁性物質、または、超常磁性物質が挙げられる。特定の実施形態において、磁性マイクロビーズは、常磁性物質（例えば、常磁性金属酸化物組成物）を含む。好ましくは、上記常磁性金属酸化物組成物は、遷移金属酸化物またはそれらの合金である。任意の適切な遷移金属（例えば、鉄、ニッケル、銅、コバルト、マンガン、タンタル（Ｔａ）、亜鉛、およびジルコニウム（Ｚｒ））が用いられ得る。好ましい実施形態において、上記金属酸化物組成物は、Ｆｅ３Ｏ４またはＦｅ２Ｏ３である。別の例として、磁性マイクロビーズに用いられる磁化可能な物質は、金属組成物を含む。好ましくは、上記金属組成物は、遷移金属組成物またはそれらの合金である（例えば、鉄、ニッケル、銅、コバルト、マンガン、タンタル、ジルコニウム、およびコバルト−タンタル−ジルコニウム（ＣｏＴａＺｒ）合金）。
【００４５】
磁性マイクロビーズは、利用可能な一次ビーズから調製され得るか、原材料から、または単量体（これは、米国特許第５，８３４，１２１号において開示されるように、架橋する場合、硬いポリマーコーティングを形成する）によってカプセル化された金属酸化物から調製され得る。本明細書中において用いられる場合、「硬い」は、コーティング中の金属酸化物粒子を安定させる程度に架橋され（すなわち、このコーティングは基本的に膨張または分解しない）、それによってこの粒子が中に包まれた状態にある、重合体コーティングを称する。本明細書中において用いられる場合、「微小孔」は、極性有機溶媒中で、膨張または拡張する樹脂重合体マトリックスを称する。本明細書中において用いられる場合、「負荷」は、機能化または誘導体化に有用な連結部位に関するビーズの受容能を意味するために用いられる。
【００４６】
磁化可能材料として組込まれ得る適切な支持体としては、例えば、マグネタイトのような鉄酸化物、マンガン、コバルトおよびニッケルのフェライト、ヘマタイト、ならびに種々の合金が挙げられる。マグネタイトが最も好ましい鉄酸化物である。しばしば、金属塩は、金属酸化物に変化し、次いで、重合体でコーティングされるか、または、還元基をその上に有する熱可塑性重合体樹脂を含むビーズに吸着されるかのいずれかであることが教示される。疎水性一次ビーズを得るために金属酸化物粒子を用いて開始する場合、ビニル単量体由来の熱可塑性重合体（好ましくは、微小孔性マトリクスに結合し得るかまたは微小孔性マトリクスによって結合され得る架橋ポリスチレン）の硬いコーティングを提供することが必要である。磁性粒子は、当該分野において公知の方法（例えば、Ｖａｎｄｅｎｂｅｒｇｅら、Ｊ．ｏｆ Ｍａｇｎｅｔｉｓｍ ａｎｄ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ，１５〜１８：１１１７〜１８（１９８０）；Ｍａｔｉｊｅｖｉｃ，Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．，１４：２２〜２９（１９８１）；ならびに米国特許第５，０９１，２０６号、同第４，７７４，２６５号、同第４，５５４，０８８号および同第４，４２１，６６０号において示される手順）によって形成され得る。本発明において用いられ得る一次ビーズの例は、米国特許第５，３９５，６８８号、同第５，３１８，７９７号、同第５，２８３，０７９号、同第５，２３２，７８９２号、同第５，０９１，２０６号、同第４，９６５，００７号、同第４，７７４，２６５号、同第４，６５４，２６７号、同第４，４９０，４３６号、同第４，３３６，１７３号および同第４，４２１，６６０号において示される。あるいは、一次ビーズは、市販の疎水性ビーズまたは親水性ビーズから得られ得る。これらのビーズは、サイズ、常磁性粒子を保持する溶媒中で膨張するための重合体コーティングの十分な安定性、および、メッシュ化したマトリックス網を形成するために使用されるビニル単量体を吸収するという、開始時の要求を満たす。好ましくは、一次ビーズは、疎水性ビーズ、ポリスチレンでカプセル化されたビーズ、常磁性ビーズである。このようなポリスチレン常磁性ビーズは、Ｄｙｎａｌ，Ｉｎｃ（Ｌａｋｅ Ｓｕｃｃｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．）、Ｒｈｏｎｅ Ｐｏｕｌｏｎｃ（Ｆｒａｎｃｅ）、およびＳＩＮＴＥＦ（Ｔｒｏｎｄｈｅｉｍ，Ｎｏｒｗａｙ）より利用可能である。トナー粒子の使用、または、外部の硬い重合体コーティングを生成するためにさらにカプセル化された不安定な重合体の第一コーティングを有する磁性粒子の使用もまた、考慮される。
【００４７】
標的ヌクレオチド配列の調製は、核酸増幅工程を包含し得る。標的ヌクレオチド配列は、単離された標的細胞からの直接的核酸増幅を経て得られ得る。あるいは、標的ヌクレオチド配列は、単離された標的細胞から単離された核酸テンプレートを用いた核酸増幅を経て得られ得る。任意の適切な核酸増幅工程は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）および転写媒介性増幅（ＴＭＡ）で用いられ得る。好ましくは、ＴＭＡは、Ｔ７プロモーターによって進められる。
【００４８】
また好ましくは、ＰＣＲは、非対称ＰＣＲである。非対称ＰＣＲに使用される２つのプライマーは、任意の適切な比（例えば、約１：５〜約１：２００の範囲に及ぶ比）を有し得る。非対称ＰＣＲに使用される２つのプライマーは、同じＴｍ値または異なるＴｍ値を有し得る。例えば、非対称ＰＣＲに使用される２つのプライマーのＴｍ値の間の差は、約１℃〜約２０℃の範囲に及ぶ。別の例として、非対称ＰＣＲに３つのプライマーが使用され、このプライマーのうちの２つは、同じかもしくは類似のＴｍ値を有し、そしてこの２つのプライマーのＴｍ値と第３のプライマーのＴｍ値との間の差は、約１℃〜約２０℃の範囲に及ぶ。上記プライマーは、直鎖プライマーであるか、またはヘアピン構造を含み得る。単一または複数のアニーリング温度が、ＰＣＲおいて使用される。例えば、アニーリング温度の間の差は、約１℃〜約２０℃の範囲に及ぶ。
【００４９】
本方法の工程ａ）において得られた標的ヌクレオチド配列は、１本鎖、２本鎖、または３本鎖であり得る。好ましくは、工程ａ）において得られた標的ヌクレオチド配列は、１本鎖ＤＮＡまたは１本鎖ＲＮＡである。本方法の工程ａ）において得られた標的ヌクレオチド配列は、プラス鎖またはマイナス鎖であり得る。好ましくは、上記１本鎖ＤＮＡまたは１本鎖ＲＮＡは、プラス鎖またはマイナス鎖である。標識された標的ヌクレオチド配列は、工程ａ）において得られ得る。好ましくは、この標識された標的ヌクレオチド配列は、蛍光標識を含むか、またはビオチン標識を含む。また好ましくは、別のヌクレオチド配列が、チップ上に含まれるポジティブコントロールプローブ、ネガティブコントロールプローブまたはハイブリダイゼーションコントロールプローブに相補的であり得る。
【００５０】
チップ上に含まれるプローブは、プラス鎖プローブであるかまたはマイナス鎖プローブであり得る。チップ上に含まれるプローブは、修飾され得る。例示的なプローブ修飾としては、５’−ＮＨ２修飾、５’−ＳＨ修飾、５’−ポリＴ（またはＡ、ＣもしくはＧ）修飾、５’−ビオチン修飾、３’−ＮＨ２修飾、３’−ＳＨ修飾、３’−ポリＴ（またはＡ、ＣもしくはＧ）修飾、および３’−ビオチン修飾が挙げられる。
【００５１】
本方法において用いられるチップは、任意の適切な型のプローブまたは多数のプローブを含み得る。例えば、チップは、１〜５００種の異なる型のプローブを含み得る。別の例として、チップは、プローブの複数のアレイを含み得、そして、各アレイは、１〜４００種の異なる型のプローブを含み得る。
【００５２】
プローブは、任意の適切な温度（例えば、約４０℃〜約１００℃の範囲に及ぶ温度）でチップ上に固定され得る。上記チップは、修飾され得る。例示的なチップ修飾としては、ＣＨＯ修飾、ＮＨ２修飾、ポリリジン修飾、ＳＨ修飾、ＢＳＡ修飾、ストレプトアビジン修飾、アガロースゲル修飾およびポリアクリルアミドゲル修飾が挙げられる。
【００５３】
プローブの配列、純度または末端修飾は、評価され得る。好ましくは、プローブの配列、純度または末端修飾は、ＤＨＰＬＣによって評価される。
【００５４】
任意の適切なコピーのプローブまたは多数のプローブは、チップ上に固定され得る。例えば、プローブの複数のコピー（例えば、プローブの１〜１０個のコピー）は、チップ上に固定され得る。
【００５５】
複数のコピーのプローブまたは多数のプローブは、任意の適切なパターンに従ってチップ上に固定され得る。例えば、複数のコピーのプローブまたは多数のプローブは、チップ上に隣接して固定され得るか、または離れて固定され得る。好ましくは、ポジティブコントロールプローブの複数のコピーがチップ上に固定されており、そしてこの固定されたポジティブコントロールプローブの長さおよび配列の変化により、工程ａ）において提供された調製物中の標的ヌクレオチド配列もしくは別のヌクレオチド配列とハイブリダイズする場合、強−弱もしくは弱−強の順序でそろえられた大きさを有するハイブリダイゼーションシグナルの群が作製される。
【００５６】
任意の適切なポジティブコントロールプローブは、本方法において用いられ得る。好ましくは、このポジティブコントロールプローブは、以下：標的ヌクレオチド配列、標的ヌクレオチド配列と同時に増幅されるヌクレオチド配列または合成ヌクレオチド配列、の一部と相補的である。
【００５７】
任意の適切なネガティブコントロールプローブは、本方法において用いられ得る。好ましくは、このネガティブコントロールプローブは、上記ポジティブコントロールプローブと比較した場合、約１〜３塩基対ミスマッチを有する。
【００５８】
任意の適切なハイブリダイゼーションコントロールプローブは、本方法において用いられ得る。好ましくは、このハイブリダイゼーションコントロールプローブは、上記標的遺伝子と無関係な合成ヌクレオチド配列と相補的である。より好ましくは、上記ハイブリダイゼーションコントロールプローブは、合成標識ヌクレオチド配列と相補的であるか、または合成標識ヌクレオチド配列と比較した場合、約１〜２塩基対ミスマッチを有する。
【００５９】
任意の適切な固定コントロールプローブは、本方法において用いられ得る。好ましくは、この固定コントロールプローブは、あらゆるハイブリダイゼーションシグナルを発生しない。一般的には、上記固定コントロールプローブは、化学修飾スライド、スポット工程、固定手順などの品質管理のための内部コントロールプローブである。この内部コントロールプローブは、標的核酸とはハイブリダイズしない。１つの特定の実施形態において、固定コントロールプローブの一方の末端は、化学的に修飾されており、この固定コントロールプローブの他方の末端は、検出可能な標識を有する。
【００６０】
本方法において使用されるチップは、ポジティブコントロールプローブ、ネガティブコントロールプローブ、ハイブリダイゼーションコントロールプローブ、および固定コントロールプローブのうちのいずれか、いくつかまたは全てを含み得る。１つの特定の実施形態において、このチップは、ポジティブコントロールプローブ、ネガティブコントロールプローブ、ハイブリダイゼーションコントロールプローブ、および固定コントロールプローブを含む。ポジティブコントロールプローブ、ネガティブコントロールプローブ、ハイブリダイゼーションコントロールプローブおよび／または固定コントロールプローブは、任意の適切なパターンで、このチップ上に固定され得る。例えば、ポジティブコントロールプローブ、ネガティブコントロールプローブ、ハイブリダイゼーションコントロールプローブおよび固定コントロールプローブは、このチップの四隅に固定され得るか、このチップの中央部に固定され得るか、または任意の適切な規則的もしくは無作為な固定パターンを有し得る。
【００６１】
工程ｃ）におけるハイブリダイゼーション反応は、任意の適切なハイブリダイゼーション溶液（例えば、塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）および界面活性剤を含有するハイブリダイゼーション溶液）において、実施され得る。このハイブリダイゼーション溶液は、任意の適切な濃度（例えば、約３倍〜約１０倍のＳＳＣ）のＳＳＣを含有し得る。任意の適切な界面活性剤（例えば、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００およびラウリル硫酸ナトリウム（ＳＬＳ））が、使用され得る。このハイブリダイゼーション溶液は、任意の適切な濃度（例えば、約０．０５％（ｗ／ｗ）〜約５％）ｗ／ｗ）の範囲の濃度）の界面活性剤を含有し得る。
【００６２】
工程ｃ）におけるハイブリダイゼーション反応は、任意の適切な温度（例えば、約４２℃〜約７０℃の範囲の温度）で実施され得る。
【００６３】
本方法は、ハイブリダイゼーション反応の後に、洗浄工程をさらに包含し得る。任意の適切な洗浄溶液が、使用され得る。例えば、この洗浄工程は、約０％（ｗ／ｗ）〜約２％（ｗ／ｗ）の範囲の濃度を有する界面活性剤を含有する洗浄溶液中で、実施され得る。この洗浄工程は、任意の適切な時間（例えば、約５分間〜約３０分間の範囲の時間）にわたって、実施され得る。
【００６４】
種々のプローブの固定効率は、任意の有用な（ｕｓｉｔａｂｌｅ）方法によって、評価され得る。例えば、固定効率は、固定コントロールプローブからのシグナルを分析することによって、評価され得る。この固定コントロールプローブは、検出可能な標識（例えば、蛍光性分子）を保有し得る。
【００６５】
全体的な固定効率（標的ヌクレオチド配列に相補的なオリゴヌクレオチドプローブおよび種々のコントロールプローブを含むハイブリダイゼーションを含む）は、任意の適切な方法によって、評価され得る。例えば、全体的なハイブリダイゼーション効率は、ハイブリダイゼーションコントロールプローブと、標的遺伝子に関連しない標識された合成ヌクレオチド配列との間のハイブリダイゼーションを分析することによって、評価され得る。
【００６６】
全体的なハイブリダイゼーション効率（標的ヌクレオチド配列に相補的なオリゴヌクレオチドプローブおよび種々のコントロールプローブを含むハイブリダイゼーションを含む）は、任意の適切な方法によって評価され得る。例えば、ハイブリダイゼーション効率は、ポジティブコントロールプローブを含むハイブリダイゼーションシグナルと、ネガティブコントロールプローブを含むハイブリダイゼーションシグナルとの間の比、およびポジティブハイブリダイゼーションコントロールプローブを含むハイブリダイゼーションシグナルと、ネガティブハイブリダイゼーションコントロールプローブを含むハイブリダイゼーションシグナルとの間の比を分析することによって、評価され得、そして増加した比は、ハイブリダイゼーション効率が増加したことを示す。
【００６７】
ポジティブシグナルは、任意の適切な基準に基づいて、決定され得る。例えば、密接に関連するプローブの群を含むハイブリダイゼーションにおいて、ポジティブシグナルは、以下の基準に基づいて、決定され得る：ａ）バックグラウンドノイズに対するハイブリダイゼーションシグナルの比が、３より大きい；ｂ）関連するポジティブコントロールプローブハイブリダイゼーションシグナルに対するハイブリダイゼーションシグナルの比が、所定の範囲内にある；ｃ）工程ａ）およびｂ）に基づくポジティブシグナルを与える全てのプローブのハイブリダイゼーションシグナル、または１つのみのプローブが工程ａ）およびｂ）に基づくポジティブシグナルを与える場合には、２つの最も強いハイブリダイゼーションシグナルを与える２つのプローブのハイブリダイゼーションシグナルを比較して、そのシグナルが正であるか負であるかを決定すること；ならびにｄ）密接に関連するプローブの群を含む２つ以下のポジティブシグナルが存在する。
【００６８】
密接に関連するプローブの群は、任意の適切な基準に基づき得る。例えば、特定の遺伝子座において改変を評価するために設計されたプローブの群が、密接に関連したプローブの郡として使用され得る。評価されるべき改変は、単一かまたは複数の塩基対変化であり得る。通常、塩基対の変化は、プローブの長さの内部（たとえば、２０ｂｐ以下）に位置する。
【００６９】
上記ｂ）に記載されるような所定の範囲は、異なるプローブについて、異なり得る。この範囲は、実験的研究を介して得られ得る。例えば、この範囲は、複数（例えば、数百）のハイブリダイゼーション実験を、既知の標準的な標的および／またはプローブを使用して実施することによって、得られ得る。
【００７０】
本方法は、任意の標的遺伝子の型を決定するために使用され得る。例えば、本方法は、ＨＬＡ遺伝子に相補的なオリゴヌクレオチドプローブを使用して、ＨＬＡ遺伝子の方を決定するために使用され得る。好ましくは、このオリゴヌクレオチドプローブは、ａ）高いストリンジェンシーの下で、標的ＬＨＡ分子配列またはその相補鎖（これは、表１に記載される）にハイブリダイズするヌクレオチド配列；あるいはｂ）ヌクレオチド配列を含む標的ＨＬＡヌクレオチド配列またはその相補鎖（これは、表１に記載される）に対して少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。また好ましくは、このオリゴヌクレオチドプローブは、表１に記載されるヌクレオチド配列、またはその相補鎖を含む。このチップは、表１に記載されるヌクレオチド配列のいくつかまたは全て、あるいはその相補鎖を含み得る。
【００７１】
（Ｃ．ＨＬＡ標的遺伝子の型を決定するための、オリゴヌクレオチドプローブおよびプローブアレイ）
別の局面において、本発明は、ＨＬＡ標的遺伝子の型を決定するためのオリゴヌクレオチドプローブに関し、このＨＬＡ標的遺伝子は、ａ）高ストリンジェンシー下で、標的ＬＨＡ分子配列またはその相補鎖（これは、表１に記載される）にハイブリダイズするヌクレオチド配列；あるいはｂ）ヌクレオチド配列を含む標的ＨＬＡヌクレオチド配列またはその相補鎖（これは、表１に記載される）に対して少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。このオリゴヌクレオチドプローブは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、またはその誘導体を含み得る。好ましくは、このプローブは、表１に記載されるヌクレオチド配列、またはその相補鎖を含む。このプローブは、標識され得る。例示的な標識としては、化学標識、酵素標識、免疫原性標識、放射能標識、蛍光標識、発光標識、およびＦＲＥＴ標識が挙げられる。
【００７２】
オリゴヌクレオチドプローブは、任意の適切な方法によって、産生され得る。例えば、これらのプローブは、化学的に合成され得るか（一般的に、Ａｕｓｕｂｅｌ（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２．１１．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｐｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（２０００）を参照のこと）、天然の供給源から単離され得るか、組換え方法によって産生され得るか、またはこれらの組み合わせであり得る。合成オリゴヌクレオチドはまた、Ｍａｔｔｅｕｃｃｉら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，３：３１８５−３１９１（１９８１）のトリエステル法を使用することによって、調製され得る。あるいは、例えば、シアノエチルホスホロアミダイト化学を使用する、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ＤＮＡ合成機での自動合成が好ましくあり得る。好ましくは、これらのプローブは、化学的に合成される。
【００７３】
本発明のオリゴヌクレオチドプローブを調製するために適切な塩基は、天然に存在するヌクレオチド塩基（例えば、アデニン、シトシン、グアニン、ウラシル、およびチミン）から選択され得る。この塩基はまた、天然には存在しないヌクレオチド塩基、すなわち「合成」ヌクレオチド塩基（例えば、８−オキソ−グアニン、６−メルカプトグアニン、４−アセチルシチジン、５−（カルボキシヒドロキシエチル）ウリジン、２’−Ｏ−メチルシチジン、５−カルボキシメチルアミノ−メチル−２−チオリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウリジン、ジヒドロウリジン、２’−Ｏ−メチルプソイドウリジン、β−Ｄ−ガラクトシルキューオシン、２’−Ｏメチルグアノシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデノシン、１−メチルアデノシン、１−メチルプソイドウリジン、１−メチルグアノシン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアノシン、２−メチルアデノシン、７−メチルグアノシン、５−メチルアミノメチルウリジン、５−メトキシアミノメチル−２−チオウリジン、β−Ｄ−マンノシルキューオシン、５−メトキシカルボニルメチルウリジン、５−メトキシウリジン、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデノシン、Ｎ−（（９−β−Ｄ−リボフラノシル−２−メチルチオプリン−６−イル）カルバモイル）スレオニン、Ｎ−（（９−β−Ｄ−リボフラノシルプリン−６−イル）Ｎ−メチルカルボニル）スレオニン、ウリジン−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウリジン−５−オキシ酢酸、ワイブトキソシン、プソイドウリジン、キューオシン、２−チオシチジン、５−メチル−２−チオウリジン、２−チオウリジン、２−チオウリジン、５−メチルウリジン、Ｎ−（（９−β−Ｄ−リボフラノシルプリン−６−イル）カルバモイル）スレオニン、２’−Ｏ−メチル−５−メチルウリジン、２’−Ｏ−メチルウリジン、ワイブトシン、および３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）ウリジン）から選択され得る。
【００７４】
同様に、オリゴヌクレオチドの化学的アナログ（例えば、ホスホジエステル結合が、例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、またはホスホロアミデートに修飾されたオリゴヌクレオチド）もまた、使用され得る。分解からの保護は、「３’末端」ストラテジーの使用によって、達成され得る。このストラテジーによって、ヌクレアーゼ耐性結合が、オリゴヌクレオチドの３’末端におけるホスホジエステル結合の代わりに置き換えられる（Ｓｈａｗら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９：７４７（１９９１））。ホスホロアミデート結合、ホスホロチオエート結合、およびメチルホスホネート結合は、全て、この様式で十分に機能する。ホスホジエステル骨格のより広範な修飾は、安定性を付与し、そしてオリゴヌクレオチドの増強した親和性および増加した細胞浸透性を可能にし得ることが示された（Ｍｉｌｌｉｇａｎら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３６：１９２３（１９９３））。多くの異なる化学的ストラテジーが、ホスホジエステル骨格全体を新規結合で置き換えるために、使用されている。骨格のアナログとしては、ホスホロチオエート結合、ホスホロジチオエート結合、メチルホスホネート結合、ホスホロアミデート結合、ボラノホスフェート結合、ホスホトリエステル結合、ホルムアセタール結合、３’−チオホルムアセタール結合、５’−チオホルムアセタール結合、５’−チオエーテル結合、カーボネート結合、５’−Ｎ−カルバメート結合、スルフェート結合、スルホネート結合、スルファメート結合、スルホンアミド結合、スルホン結合、スルファイト結合、スルホキシド結合、スルフィド結合、ヒドロキシルアミン結合、メチレン（メチルイミノ）（ＭＭＩ）結合またはメチレンオキシ（メチルイミノ）（ＭＯＭＩ）結合が挙げられる。ホスホロチオエートで修飾されたオリゴヌクレオチドおよびメチルホスホネートで修飾されたオリゴヌクレオチドは、それらが自動オリゴヌクレオチド合成によって入手可能であることに起因して、特に好ましい。オリゴヌクレオチドは、（Ｍｉｌｌｉｇａｎら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３６：１９２３（１９９３））によって記載されるような、「ペプチド核酸」であり得る。唯一の要件は、このオリゴヌクレオチドプローブが、少なくとも一部分が標的ＤＮＡ分子の配列の一部分に結合し得る配列を保有することである。
【００７５】
ハイブリダイゼーションプローブは、任意の適切な長さのものであり得る。このプローブの長さに対しては、このプローブがＨＬＡ標的核酸にハイブリダイズし、そしてプローブとして効果的に機能する（例えば、検出を容易にする）限り、上限も下限もない。本発明のプローブは、５０ヌクレオチド、４０ヌクレオチド、３０ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、１５ヌクレオチド、または１０ヌクレオチド、またはより短くあり得る。同様に、このプローブは、２０ヌクレオチド、４０ヌクレオチド、５０ヌクレオチド、６０ヌクレオチド、７５ヌクレオチド、１００ヌクレオチド、または２００ヌクレオチド程度の長さであり得るか、またはそれより長くあり得る（例えば、ＨＬＡ標的配列の全長まで）。一般に、これらのプローブは、相補的な標的核酸鎖のイオずれかの、少なくとも１４個のヌクレオチド、好ましくは、少なくとも１８個のヌクレオチド、そしてより好ましくは、少なくとも２０〜３０個のヌクレオチドを有し、そしていかなるヘアピン型二次構造も含まない。特定の実施形態において、このプローブは、少なくとも３０ヌクレオチド、または少なくとも５０ヌクレオチドの長さを有し得る。完全に相補的であるべきである場合、すなわち、その鎖が、プローブの配列と同一の配列を含む場合、その二重鎖は、かなりストリンジェントな条件下で、比較的安定であり、そしてこれらのプローブは、短くあり得る（すなわち、約１０〜３０塩基対の範囲）。ある程度のミスマッチが、プローブにおいて予測される場合、すなわち、そのプローブが、改変領域または特定の属における全ての種のような配列の群にハイブリダイズすることが疑われる場合、そのプローブは、そのミスマッチの影響と釣り合いをとるために、より長いものであり得る（すなわち、１５〜４０塩基）。
【００７６】
プローブは、ＨＬＡ標的遺伝子全体に及ぶ必要はない。ＨＬＡ標的または対立遺伝子を特異的に識別する可能性を有する標的領域の任意のサブセットが、使用され得る。その結果として、核酸プローブは、標的領域のわずか８ヌクレオチドにハイブリダイズし得る。さらに、プローブのフラグメントは、それらがタイピングされるべきＨＬＡ標的遺伝子の特性を十分に示す限り、使用され得る。
【００７７】
プローブは、長さが少なくとも８ヌクレオチドであるＨＬＡ標的ヌクレオチド配列と、低ストリンジェンシー下でハイブリダイズし得るべきである。好ましくは、プローブは、ＨＬＡ標的ヌクレオチド配列と、中程度または高いストリンジェンシー下でハイブリダイズする。
【００７８】
さらに別の局面において、本発明は、ＨＬＡ標的遺伝子をタイピングするために支持体に固定化されたオリゴヌクレオチドプローブのアレイに関し、このアレイは、核酸ハイブリダイゼーションにおける使用に適切な支持体を含み、この支持体は、それに固定化された複数のオリゴヌクレオチドプローブを有し、上記プローブの少なくとも１つは以下のヌクレオチド配列を含む：ａ）高ストリンジェンシー下で、表１に示される標的ＨＬＡヌクレオチド配列、またはその相補鎖とハイブリダイズするヌクレオチド配列；あるいはｂ）表１に示されるヌクレオチド配列、またはその相補鎖を含む標的ＨＬＡヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列。
【００７９】
複数のプローブは、ＤＮＡ，ＲＮＡ，ＰＮＡまたはそれらの誘導体を含み得る。プローブのうちの少なくとも１つまたはいくつかは、表１に示されるヌクレオチド配列、またはその相補鎖を含み得る。好ましくは、プローブアレイは、表１に示されるヌクレオチド配列のすべて、またはその相補鎖を含む。プローブのうちの少なくとも１つ、いくつか、またはすべてが、標識され得る。例示的な標識としては、化学標識、酵素標識、免疫原標識、放射活性標識、蛍光標識、発光標識およびＦＲＥＴ標識が挙げられる。任意の適切な支持体（例えば、シリコン、プラスチック、ガラス、セラミック、ゴム、およびポリマー表面）が、使用され得る。
【００８０】
（Ｄ．アッセイ形式）
（プローブの固定化）
本発明の方法、プローブおよびプローブアレイが溶液中で使用され得る。好ましくは、チップ形式（例えば、固体支持体に固定化されたプローブを使用することによって）で行われる。
【００８１】
プローブは、任意の適切な表面（好ましくは、シリコン、プラスチック、ガラス、セラミック、ゴム、またはポリマー表面のような固体支持体）に固定化され得る。プローブはまた、３次元の多孔性ゲル基質（例えば、Ｐａｃｋａｒｄ ＨｙｄｒｏＧｅｌチップ（Ｂｒｏｕｄｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２９（１９）：Ｅ９２（２００１）））に固定化され得る。
【００８２】
アレイベースのアッセイのために、プローブは、好ましくは、「バイオチップ」のような固体支持体に固定化される。固体支持体は、粒子、鎖、沈殿物、ゲル、シート、管、球体、容器、キャピラリー、パッド、薄片、フィルム、プレート、スライドなどとして存在する、生物学的支持体、非生物学的支持体、有機的支持体、無機的支持体、またはこれらのいずれかの組み合わせであり得る。
【００８３】
プローブのライブラリーを含むマイクロアレイバイオチップは、多数の周知のアプローチによって調製され得、このアプローチとしては、例えば、光依存法（ｌｉｇｈｔ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｅｔｈｏｄ）（例えば、米国特許第５，１４３，８５４号、同第５，３８４，２６１号または同第５，５６１，０７１号に記載されるＶＬＳＩＰＳＴＭ）；米国特許第５，５４１，０６１号に記載されるようなビーズベースの方法；および米国特許第５，２８８，５１４号に詳述されるようなピンベースの方法が挙げられる。ＶＬＳＩＰＳＴＭを使用してマイクロアレイとしての様々な二重鎖プローブライブラリーの調製を詳述する米国特許第５，５５６，７５２号もまた、マイクロアレイにおけるヘアピンプローブライブラリーの調製に適切である。
【００８４】
米国特許第５，６７７，１９５号および同第５，３８４，２６１号に記載されるようなフローチャネル法が、多種多様なプローブを有するマイクロアレイバイオチップを調製するために使用され得る。この事例では、プローブがフローチャネルから支持体に送達されるときに、基質の特定の活性化領域が他の領域から機械的に分離される。フローチャネル法の詳細な記載は、米国特許第５，５５６，７５２号（指定された流路を通る液体の有向チャネリングを高めるための、保護塗装した湿式ファシリテータ（ｗｅｔｔｉｎｇ ｆａｃｉｌｉｔａｔｏｒ）の使用を含む）に見出され得る。
【００８５】
スポット法もまた、多様なプローブが固定化されたマイクロアレイバイオチップを調製するために使用され得る。この事例では、反応物質は、支持体の選択された領域に比較的少量を直接蒸着させることによって送達される。いくつかの工程では、当然のことながら、全支持体表面が、特定の溶液でスプレーされるか、他の場合にはコーティングされる。特定の形式において、ディスペンサは、領域から領域まで、それぞれの停止において必要なだけのプローブまたは他の試薬を蒸着して移動する。代表的なディスペンサは、溶液または他の流体を含むプローブを支持体に送達するためのマイクロピペット、ナノピペット、インクジェト型カートリッジおよびピン、ならびに必要に応じて、支持体に関してこれらの送達デバイスの位置を制御するためのロボットシステムを含む。他の形式では、ディスペンサは、一連のチューブまたは複数のウェルトレイ、マニホールド、および送達デバイスのアレイを含み、その結果、種々の試薬が同時に反応領域に送達され得る。スポット法は、当該分野で周知であり、例えば、米国特許第５，２８８，５１４号、同第５，３１２，２３３号および同第６，０２４，１３８号に記載されるスポット法が挙げられる。いくつかの事例では、支持体の好ましい領域において、フローチャネルと「スポット」との組み合わせもまた、固体化プローブを有するマイクロアレイバイオチップを調製するために使用され得る。
【００８６】
プローブを固定化するための固体支持体は、好ましくは平坦であるが、代替的な表面形状を呈し得る。例えば、固体支持体は、盛り上がった領域または落ち込んだ領域を含み得、そこでプローブ合成が行われるかまたはプローブが結合される。いくつかの実施形態において、固体支持体は、適切な光吸収特性を提供するように選択され得る。例えば、支持体は、重合したＬａｎｇｍｕｉｒ Ｂｌｏｄｇｅｔｔフィルム、ガラスまたは機能化ガラス、Ｓｉ、Ｇｅ、ＧａＡｓ、ＧａＰ、ＳｉＯ２、ＳｉＮ４、改変したシリコン、あるいは種々のゲルまたはポリマー（例えば、（ポリ）テトラフルオロエチレン、（ポリ）ビニリデン二フッ化物、ポリスチレン、ポリカーボネート、またはそれらの組み合わせ）のうちのいずれか１つであり得る。他の適切な固体支持体材料は、当業者に容易に明らかである。
【００８７】
固体支持体の表面は、オリゴヌクレオチドまたは核酸に関連する反応基と結合するのに適切な反応基（カルボキシル、アミノ、ヒドロキシル、チオールなどが挙げられる）を含み得る。好ましくは、その表面は、光学的に透明であり、シリカ表面で見出されるような表面Ｓｉ−−ＯＨ官能性を有する。
【００８８】
プローブは、化学的手段または物理的手段（例えば、イオン力、共有力または当該分野で周知の他の力）によって支持体に結合され得る。核酸およびオリゴヌクレオチドの固定化は、当該分野で周知の任意の手段によって達成され得る（例えば、Ｄａｔｔａｇｕｐｔａら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１７７：８５−８９（１９８９）；Ｓａｉｋｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８６：６２３０−６２３４（１９８９）；およびＧｒａｖｉｔｔら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏ．，３６：３０２０−３０２７（１９９８）を参照のこと）。
【００８９】
プローブは、ハイブリダイゼーションアッセイに役立ち得るようにプローブの二重鎖部分の間に空間を提供するために、（例えば、Ｌｏｃｋｈａｒｔらに対する米国特許第５，５５６，７５２号に記載されるように）スペーサー分子を用いて支持体に結合され得る。スペーサー分子は、代表的には、長さが６〜５０の原子を含み、そして支持体に結合する表面結合部分を含む。支持体への結合は、例えば、（ポリ）トリフルオロクロロエチレン表面を有する支持体を使用する炭素−炭素結合、またはシロキサン結合（例えば、固体支持体としてガラスまたは酸化シリコンを使用する）によって達成され得る。シリコン結合は、支持体をスペーサーのトリクロロシリル基またはトリアルコキシシリル基と反応させることによって形成され得る。アミノアルキルシランおよびヒドロキシアルキルシラン、ビス（２−ヒドロキシエチル）−アミノプロピルトリエトキシシラン、２−ヒドロキシエチルアミノプロピルトリエトキシシラン、アミノプロピルトリエトキシシランまたはヒドロキシプロピルトリエトキシシランが、表面結合基として有用である。
【００９０】
スペーサーはまた、プローブの表面結合部分に結合される延長部分またはより長い鎖部分を含み得る。例えば、アミン基、ヒドロキシル基、チオール基、およびカルボキシル基が、そのスペーサーの延長部分を表面結合部分に結合するのに適切である。スペーサーの延長部分は、ポリマー合成のためのその後の任意の条件に対して不活性である種々の分子のうちのいずれかであり得る。これらのより長い鎖部分は、代表的には、アリールアセチレン、２〜１４のモノマー単位を含むエチレングリコールオリゴマー、ジアミン、二価酸、アミノ酸、ペプチド、またはそれらの混合物である。
【００９１】
いくつかの実施形態において、スペーサーの延長部分がポリヌクレオチドであるか、またはスペーサー全体がポリヌクレオチドであり得る。スペーサーの延長部分はまた、ポリエチレングリコール、ポリヌクレオチド、アルキレン、ポリアルコール、ポリエステル、ポリアミン、ポリホスホジエステルおよびそれらの組み合わせで構成され得る。さらに、プローブの合成での使用のために、スペーサーは、そのスペーサーの遠位端または終端（固体支持体の反対側）の官能基（例えば、ヒドロキシル基、アミノ基またはカルボン酸）に結合される保護基を有し得る。脱保護およびカップリングの後、その遠位端はオリゴマーまたはプローブに共有結合され得る。
【００９２】
本発明の方法は、一度に単一のプローブを含む単一のサンプルを分析するために使用され得る。好ましくは、その方法は、ハイスループット形式で行われる。例えば、複数のサンプルが、単一のプローブを用いて同時に分析され得るか、または単一のサンプルが、複数のプローブを使用して同時に分析され得る。より好ましくは、複数のサンプルが、複数のプローブを使用して同時に分析され得る。
【００９３】
（ハイブリダイゼーション条件）
ハイブリダイゼーションは、当該分野で公知の任意の適切な技術のもとで行われ得る。ハイブリダイゼーション条件が、ハイブリダイゼーションの程度、および非特異的な結合のバックグラウンドレベルを増加または減少させるために変更され得る（すなわち、洗浄する塩濃度または温度でハイブリダイゼーションを変更することによって）ことが、当業者に明らかである。プローブと標的ヌクレオチド配列との間のハイブリダイゼーションは、任意の適切なストリンジェンシー（高ストリンジェンシー、中程度のストリンジェンシーまたは低ストリンジェンシーを含む）のもとで行われ得る。代表的には、ハイブリダイゼーションは、高ストリンジェンシーの条件下で行われる。
【００９４】
プローブと標的核酸との間のハイブリダイゼーションは、均質（例えば、分子ビーコン（Ｔｙａｇｉ Ｓ．ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１４：３０３−３０８（１９９６）；および米国特許第６，１５０，０９７号）および保護アッセイ（Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ，Ｉｎｃ）（米国特許第６，００４，７４５号）で使用される代表的な条件）であり得るか、または異質（種々の型のニトロセルロースベースのハイブリダイゼーションで使用される代表的な条件、および磁性ビーズベースのハイブリダイゼーションで使用される代表的な条件）であり得る。
【００９５】
標的ポリヌクレオチド配列は、高ストリンジェンシーから低いストリンジェンシーなハイブリダイゼーション条件および洗浄条件下で標的配列と安定なハイブリッドを形成するオリゴヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼーションによって検出され得る。ハイブリダイゼーションによる検出の利点は、使用されるプローブに依存して、さらなる特異性が見込めることである。プローブが標的配列に対して完全に相補的（すなわち、約９９％またはそれ以上）であることが予期される場合、高ストリンジェンシー条件が使用される。いくらかのミスマッチが予期される場合、例えば、プローブが完全に相補的でない結果として改変体株が予期される場合、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、低くされ得る。しかし、条件は、非特異的なハイブリダイゼーションを最小限にするかまたは排除するように選択される。
【００９６】
ハイブリダイゼーションに影響を及ぼし、非特異的ハイブリダイゼーションを選択する条件は、当該分野で公知である（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第二版、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ．Ｅ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９）。一般的に、より低い塩濃度およびより高い温度は、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを高める。例えば、概して、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、約０．１×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ含む溶液中で、約６５℃のインキュベーション／洗浄温度でのインキュベーションを含む。中程度のストリンジェント条件は、約１〜２×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳを含む溶液中で、約５０℃〜６５℃のインキュベーション／洗浄温度でのインキュベーションである。低ストリンジェンシー条件は、２×ＳＳＣで約３０℃〜５０℃の温度である。
【００９７】
ハイブリダイゼーションおよび洗浄の代替的な方法は、最初に低ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション（５×ＳＳＰＥ、０．５％ ＳＤＳ）を行い、その後、３Ｍの塩化テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＣ）の存在下で高ストリンジェンシーの洗浄を行なう。ＴＭＡＣの効果は、Ａ−Ｔ塩基対およびＧ−Ｃ塩基対の相対的な結合を等しくし、所定の温度でのハイブリダイゼーションの効率を、ポリヌクレオチドの長さに近接して対応させることである。ＴＭＡＣを用いて、所望のストリンジェンシーのレベルを達成するために洗浄の温度を変動させることが可能である（Ｗｏｏｄら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８２：１５８５〜１５８８（１９８５））。
【００９８】
ハイブリダイゼーション溶液は、２５％のホルムアミド、５×ＳＳＣ、５×デンハート溶液、１００μｇ／ｍｌの単鎖ＤＮＡ、５％の硫酸デキストラン、またはプローブハイブリダイゼーションに有用であることが公知の他の試薬を含有し得る。
【００９９】
（ハイブリッドの検出）
プローブと標的ＨＬＡ核酸との間のハイブリダイゼーションの検出は、当該分野で公知の任意の方法（例えば、プローブの標識化、二次プローブ、標的核酸またはそれらのいくつかの組合せ）により実施され得、本発明の目的に適している。あるいは、ハイブリッドは、検出可能な標識の非存在下で質量分析により検出され得る（例えば、米国特許第６，３００，０７６号）。
【０１００】
検出可能な標識は、ハイブリダイゼーションの後に、直接的に、または間接的に検出され得る部分である。言い換えれば、検出可能な標識は、測定可能な物理学的な特性（例えば、蛍光または吸光度）を有するか、または酵素反応に関与する。直接的な標識を使用して、標的ヌクレオチド配列またはプローブは、標識され、そしてハイブリッドの形成は、ハイブリッドにおける標識の検出によって評価される。間接的な標識を使用して、二次プローブが標識され、ハイブリッドの形成が、二次プローブと元のハイブリッドとの間に形成された二次ハイブリッドの検出によって評価される。
【０１０１】
プローブまたは核酸を標識する方法は、当該分野で周知である。適切な標識としては、フルオロフォア、発色団、発光団、放射性同位体、電子密度試薬、ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）、特定の結合相手を有する酵素およびリガンドが挙げられる。特に有用な標識は、酵素的に活性な群（例えば、酵素（Ｗｉｓｄｏｍ，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，２２：１２４３（１９７６））；酵素基質（英国特許第１，５４８，７４１号）；補酵素（米国特許第４，２３０，７９７号および同第４，２３８，５６５号）および酵素インヒビター（米国特許第４，１３４，７９２号））；蛍光剤（ＳｏｉｎｉおよびＨｅｍｍｉｌａ、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，２５：３５３（１９７９））；フィコビリンタンパク質を含む発色団、発光剤（例えば、化学発光剤および生物発光剤（ＧｏｒｕｓおよびＳｃｈｒａｍ、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，２５：５１２（１９７９）および同書、１５３１））；特に結合可能なリガンド（すなわち、タンパク質結合リガンド）；抗原；ならびに放射性同位体（例えば、３Ｈ、３５Ｓ、３２Ｐ、１２５Ｉおよび１４Ｃ）を含む残基である。このような標識は、それら自体の物理的な特性（例えば、蛍光剤、発色団、および放射性同位体）またはそれらの反応性の特性もしくは結合特性（例えば、抗体、酵素、基質、補酵素、およびインヒビター）に基づいて検出される。リガンド標識はまた、オリゴヌクレオチドプローブの固相捕捉（すなわち、捕捉プローブ）に有用である。例示的な標識としては、ビオチン（標識されたアビジンまたはストレプトアビジンに対する結合により検出可能である）および酵素（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ）（着色した反応産物を生成するための酵素基質の添加により検出可能である）が挙げられる。
【０１０２】
例えば、放射性同位体標識したプローブまたは標的核酸は、オートラジオグラフィーにより検出され得る。あるいは、蛍光部分で標識されたプローブまたは標的核酸は、当該分野で公知の蛍光定量法により検出され得る。ハプテンまたはリガンド（例えば、ビオチン）標識された核酸は、抗体または抗体色素を、ハプテンまたは標識したリガンド（例えば、アビジン）に結合するタンパク質に添加することにより検出され得る。
【０１０３】
さらなる代替として、プローブまたは核酸は、ハイブリダイゼーションを検出するためのさらなる試薬を必要とする部分で標識され得る。この標識が酵素である場合、その標識された核酸（例えば、ＤＮＡ）は、最終的に、触媒作用の程度を決定するために、適切な培地に配置される。例えば、補助因子標識した核酸は、その標識が補助因子であって、その酵素に対する基質である酵素を添加することにより検出され得る。従って、酵素がホスファターゼである場合、培地は、リン酸ニトロフェニルを含有し得、色を観察することにより、生成されたニトロフェノールの量をモニタリングし得る。酵素がβガラクトシダーゼである場合、培地は、ｏ−ニトロ−フェニル−Ｄ−ガラクト−ピラノシドを含有し得、これはまた、ニトロフェノールを遊離する。後者の例示的な例としては、β−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ、パパインおよびペルオキシダーゼが挙げられるが、これらに限定されない。インサイチュハイブリダイゼーション研究については、基質の最終生成物は、水溶性であることが好ましい。他の標識（例えば、色素）は、当業者に明らかである。
【０１０４】
標識（例えば、アクリジン色素、フェナントリジン、フェナジン、フロクマリン、フェノチアジンおよびキノリン）は、直接的化学結合（例えば、共有結合が挙げられる）により、または間接結合（例えば、標識のミクロカプセルまたはリポソームへの組込み、これは、次に結合リガンドに結合される）によりＤＮＡ結合リガンドに直接連結され得る。標識がＤＮＡ結合リガンド（例えば、インターカレート化合物）に結合される方法は、当該分野で周知であって、任意の従来の方法が使用され得る。代表的なインターカレート剤としては、モノ−またはビス−アジドアミノアルキルメチジウムまたはエチジウム化合物、エチジウムモノアジド、エチジウムジアジド、エチジウム二量体アジド（Ｍｉｔｃｈｅｌｌら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１０４：４２６５（１９８２））、４−アジド−７−クロロキノリン、２−アジドフルオレン、４’−アミノメチル−４，５’−ジメチルアンジェリシン、４’−アミノメチル−トリオキサレン（４’アミノメチル−４，５’，８−トリメチル−ソラレン）、３−カルボキシ−５−ソラレン、−８−アミノ−ソラレン、または−ヒドロキシ−ソラレン（３−ｃａｒｂｏｘｙ−５− ｏｒ−８−ａｍｉｎｏ− ｏｒ −ｈｙｄｒｏｘｙ−ｐｓｏｒａｌｅｎ）が挙げられる。特定の核酸が結合したアジド化合物が、Ｆｏｒｓｔｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，１３：７４５（１９８５）により記載されている。他の有用な光反応性インターカレート剤は、ピリミジン残基と（２＋２）環付加物を形成するフロクマリンである。アルキル化剤はまた、ＤＮＡ結合リガンド（例えば、ビス−クロロエチルアミンおよびエポキシドまたはアジリジン（例えば、アフラトキシン、多環式炭化水素エポキシド、ミトマイシンおよびノルフィリンが挙げられる）が挙げられる）として使用され得る。インターカレート剤の特に有用な光反応性形態は、アジドインターカレート剤である。これらの反応性のニトレンは、長波長の紫外線または可視光で容易に生成され、アリールアジドのニトレンは、それらの再構成産物に対する挿入反応が好ましい（Ｗｈｉｔｅら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，４６：６４４（１９７７））。
【０１０５】
上記プローブはまた、特定の形態（例えば、逆ドットブロットのための１０〜１００のＴ残基の添加、またはウシ血清アルブミンへの結合または磁気ビーズ上への固定化）での使用のために改変され得る。
【０１０６】
間接的な検出方法によりハイブリダイゼーションを検出する場合、検出可能に標識された二次プローブは、プローブと標的との間の最初のハイブリダイゼーションの後、またはプローブと標的とのハイブリダイゼーションの間に添加され得る。必要に応じて、ハイブリダイゼーション条件は、二次プローブの添加の後に、改変され得る。ハイブリダイゼーション後、ハイブリダイズしなかった二次プローブは、例えば、一次プローブが、固体支持体上に固定化されている場合、洗浄により一次プローブから分離され得る。固体支持体の場合、支持体上の位置に結合した標識の検出は、サンプル中の標的核酸配列のプローブへのハイブリダイゼーションを示す。
【０１０７】
検出可能に標識された二次プローブは、特異的プローブであり得る。あるいは、検出可能に標識されたプローブは、縮重プローブ（例えば、本質的に米国特許第５，３４８，８５５号に記載される全ゲノムＤＮＡなどの配列の混合物）であり得る。後者の場合、標識は、二次プローブが二本鎖ＤＮＡを含む場合、インターカレート色素を用いて達成され得る。好ましいＤＮＡ結合リガンドは、例えば、上記のインターカレート化合物である。
【０１０８】
二次プローブはまたランダムヌクレオチドプローブ配列のライブラリーであり得る。二次プローブの長さは、二次プローブにより検出されるべき、固体支持体上の一次プローブまたは標的核酸配列の長さおよび成分の観点から決定されるべきである。このようなプローブライブラリーは、好ましくは、光活性化試薬で標識された３’または５’末端および検出試薬（例えば、フルオロフォア、酵素、色素、発光団または他の公知の検出可能部分）で負荷された他の末端で提供される。
【０１０９】
標識された核酸に印をつけるのに使用される特定の配列は、変更され得る。従って例えば、アミノ置換されたソラレンは、最初に核酸、それが標識に結合され得るペンダントアミノ基を有する生成物と光化学的に結合され得る（すなわち、標識化は、ＤＮＡ結合リガンドを試験サンプル中で核酸と光化学的に反応させることにより実施される）。あるいは、ソラレンは、最初に標識（例えば、酵素）に結合され、次いで、核酸に結合され得る。
【０１１０】
有利には、ＤＮＡ結合リガンドは、最初に化学的に標識と結合され、その後核酸プローブと結合される。例えば、ビオチンは、カルボキシル基を保有するので、フロクマリンの光化学反応性またはビオチンの生物学的活性を妨害することなく、アミド形成またはエステル形成によってフロクマリンと結合され得る。アミノメチルアンジェリシン、ソラレンおよびフェナントリジウム誘導体は、フェナントリジウムハロゲン化物およびその誘導体（例えば、アミノプロピルメチジウムクロライド）と同様に標識に結合され得る（Ｈｅｒｔｚｂｅｒｇら、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１０４：３１３（１９８２））。あるいは、ＤＮＡ結合リガンドを標識に結合させるために、二官能性試薬（例えば、ジチオビススクシンイミジルプロピオネートまたは１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル）が直接的に使用され得、ここで、その反応剤は、アルキルアミノ基を有し、溶媒、割合および反応条件に関しては、公知の様式である。特定の二官能性試薬、おそらくグルタルアルデヒドは、適していない。なぜならそれらは結合している間、核酸を改変し得、従ってアッセイを干渉し得るからである。このような問題を防止するために、従来の予防策がとられ得る。
【０１１１】
また有利には、ＤＮＡ結合リガンドは、スペーサーによって標識に結合され得、このスペーサーは、約４０原子まで、好ましくは約２〜２０原子の鎖を含み、その原子としては、炭素、酸素、窒素および硫黄が挙げられるが、これらに限定されない。このようなスペーサーは、メンバーの多官能性ラジカルであり得、ペプチド、炭化水素、多価アルコール、ポリエーテル、ポリアミン、ポリイミンおよび炭水化物（例えば、−グリシル−グリシル−グリシル−または他のオリゴペプチド、カルボニルジペプチドおよびω−アミノ−アルカン−カルボニルラジカルなど）が挙げられるが、これらに限定されない。糖、酸化ポリエチレンラジカル、グリセリル、ペンタエリスリトールなどのラジカルもまた、スペーサーとして作用し得る。スペーサーは、核酸結合リガンドおよび／または標識に直接的に結合され得るか、または結合は、結合剤（例えば、ジチオビススクシンイミジルプロピオネート、１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル、ジイソシアネート、カルボジイミド、グリオキサール、グルタルアルデヒドなど）の二価ラジカルを含み得る。
【０１１２】
ハイブリダイゼーションの間接的な検出のための二次プローブはまた、例えば、ＴｙａｇｉおよびＫｒａｍｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ、１４：３０３〜３０９（１９９６）またはＬｉｚａｒｄｉらの米国特許第５，１１９，８０１号および同第５，３１２，７２８号に記載される「ビーコンプローブ」法におけるエネルギー移動により検出され得る。当該分野で公知の任意のＦＲＥＴ検出系が、本発明の方法に使用され得る。例えば、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎＴＭ系が使用され得る。ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ技術は、「増幅された発光近接性均質アッセイ（Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ Ａｓｓａｙ）」法である。６８０ｎｍでのレーザー光での照射の際に、供与体ビーズの感光剤が、周囲の酸素を一重項状態の酸素に変換する。励起した一重項状態の酸素分子は、急激に崩壊する前に約２５０ｎｍ（１つのビーズの直径）を拡散する。受容体ビーズが、供与体ビーズに近接して存在する場合、生物学的相互作用によって、一重項状態の酸素分子は、受容体ビーズの化学発光基と反応し、ただちに、エネルギーを同じビーズの蛍光受容体に移動する。蛍光受容体は、放射波長を５２０〜６２０ｎｍにシフトする。この全反応は、０．３秒間の崩壊の半減期を有するので、測定は、時間分解様式で開始し得る。他の例示的なＦＲＥＴ供与体／受容体対としては、５５Åの有効距離を有するフルオレセイン（供与体）およびテトラメチルローダミン（受容体）；４６Åの有効距離を有するＩＡＥＤＡＮＳ（供与体）およびフルオレセイン（受容体）；ならびに６１Åの有効距離を有するフルオレセイン（供与体）およびＱＳＹ−７色素（受容体）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）が挙げられる。
【０１１３】
核酸検出のための定量アッセイもまた、本発明に従って実施され得る。マイクロアレイスポットに結合した二次プローブの量が、測定され得る。その量は、上記サンプル中にある核酸標的の量に関連し得る。そのサンプルの希釈物が、既知量の上記標的核酸を含むコントロールとともに使用され得る。これらの工程を実施するための正確な条件は、当業者にとって明らかである。マイクロアレイ分析において、検出可能なレベルが、可視化され得るか、またはそのプローブアレイをＸ線フィルムまたはホスホイメージャーに近接して配置してそのプローブが結合した部位を同定することによって評価され得る。蛍光が、電荷結合素子（ＣＣＤ）またはレーザー走査によって検出され得る。
【０１１４】
（試験サンプル）
任意の適切なサンプル（ヒト起源サンプル、動物起源サンプル、または環境（土壌もしくは水）起源サンプルが挙げられる）が、本方法を使用して分析され得る。試験サンプルとしては、体液（例えば、尿、血液、精液、脳脊髄液、膿、羊水、涙液）、または半固体分泌物もしくは固体分泌物（例えば、痰、唾液、肺吸引物、膣分泌物もしくは尿道分泌物）、糞便または固体組織サンプル（例えば、生検もしくは絨毛膜絨毛標本）が、挙げられる。試験サンプルとしてはまた、皮膚からの塗抹標本、生殖器からの塗抹標本、または咽喉からの塗抹標本も、挙げられる。
【０１１５】
試験サンプルは、当該分野で周知の種々の手段によって、核酸を単離するために処理され得る（一般的には、Ａｕｓｕｂｅｌ編、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２．Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＤＮＡ ａｎｄ ４．Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＲＮＡ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（２０００）を参照のこと）。標的核酸は、ＲＮＡまたはＤＮＡであり得、これは、直接サンプルの形態であっても、または精製核酸もしくはアンプリコンの形態であってもよいことが、当業者にとって明らかである。
【０１１６】
精製核酸は、上記サンプルから抽出され得、そして純度について分光光度的にかまたは他の器具によって測定され得る。核酸増幅の当業者にとって、アンプリコンは、種々の増幅方法によって最終産物として得られ、その方法は、例えば、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応、米国特許第４，６８３，１９５号、同第４，６８３，２０２号、同第４，８００，１５９号、および同第４，９６５，１８８号）、ＮＡＳＢＡ（核酸配列ベースの増幅、米国特許第５，１３０，２３８号）、ＴＭＡ（転写媒介性増幅）（Ｋｗｏｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：１１７３〜１１７７（１９８９））、ＳＤＡ（鎖置換増幅、Ｗａｌｋｅｒら、米国特許第５，２７０，１８４号に記載される）、ｔＳＤＡ（高温鎖置換増幅（ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃ Ｓｔｒａｎｄ Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（米国特許第５，６４８，２１１号および欧州特許番号ＥＰ ０ ６８４３１５）、ＳＳＳＲ（３ＳＲ（Ｓｅｌｆ−Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ））（米国特許第６，１５６，５０８号）である。
【０１１７】
具体的な実施形態において、ヒト起源のサンプルが、アッセイされる。なお別の具体的な実施形態において、痰サンプル、尿サンプル、血液サンプル、組織切片サンプル、食物サンプル、土壌サンプルまたは水サンプルが、アッセイされる。
【０１１８】
（キット）
本プローブは、キット形式にて、好ましくは、標的遺伝子を検出するためにそのプローブを使用する指示書とともに、包装され得る。そのキットの構成要素は、一般的容器中に一緒に包装され、代表的には、本明細書中に開示される方法の選択された具体的実施形態を実施するための指示書を含む。本明細書中に記載される検出方法のための構成成分が、必要に応じて上記キット中に含まれ得、それは、例えば、二次プローブおよび／または試薬、ならびに標識検出を実施するための手段（例えば、放射性標識、酵素基質、抗体など）である。
【０１１９】
（Ｅ．例示的実施形態）
本明細書中に記載される例示的実施形態は、標的遺伝子を型決定するための（例えば、ＤＮＡチップを使用してＨＬＡ型決定するための）方法を提供する。そのような型決定は、ヒト骨髄幹細胞ドナーライブラリーおよびヒト臍帯血幹細胞ライブラリーの構築、器官移植試験、骨髄移植試験、自己免疫疾患研究、ウイルス感染研究、および癌研究、疾患に対する感受性を予測する研究、法医学的同定、父系決定、ならびにヒト遺伝研究などにおいて、使用され得る。
【０１２０】
一局面において、上記の例示的実施形態は、標的遺伝子を型決定するための方法を提供する。この方法は、ａ）適切なサンプルから標的遺伝子を含む標的細胞を単離し、そしてその単離された標的細胞由来の標的遺伝子の少なくとも一部である標的ヌクレオチド配列と、必要に応じてその標的遺伝子に無関係の別のヌクレオチド配列とを含む調製物を得る工程；ｂ）核酸ハイブリダイゼーションにおいて使用するために適切な支持体を含むチップを提供する工程であって、その支持体上には、上記標的ヌクレオチド配列に対して相補的なオリゴヌクレオチドプローブと、ポジティブコントロールプローブ、ネガティブコントロールプローブ、ハイブリダイゼーションコントロールプローブ、および固定コントロールプローブというオリゴヌクレオチドコントロールプローブのうちの少なくとも１つとが固定されている、工程；ならびにｃ）工程ａ）において得られた調製物を工程ｂ）において提供されたチップに対してハイブリダイズさせ、上記標的ヌクレオチド配列および／または上記別のヌクレオチド配列と、上記チップ上に含まれるコントロールプローブとの間のハイブリダイゼーションを評価して、その標的遺伝子の型を決定する工程、を包含する。いくつかの実施形態において、上記標的遺伝子は、ＨＬＡ遺伝子（例えば、ＨＬＡクラスＩ遺伝子またはＨＬＡクラスＩＩ遺伝子）である。
【０１２１】
一実施形態において、上記標的ヌクレオチド配列の調製物は、磁性ビーズを使用して全血から白血球を単離する工程；その白血球から核酸を単離するかまたはその白血球を直接標的遺伝子増幅のために使用して、その標的ヌクレオチド配列の調製物を得る工程によって得られる。上記標的ヌクレオチド配列は、蛍光標識もしくはビオチン標識を含む、１本鎖ＤＮＡまたは１本鎖ＲＮＡである。
【０１２２】
本実施形態は、上記標的ヌクレオチド配列の調製のための改良方法を提供する。上記標的ヌクレオチド配列の調製のための先行技術の方法は、ＰＣＲによる上記標的ヌクレオチド配列の増幅の前に全血からＤＮＡを精製する工程、および後のハイブリダイゼーションのためにそのＰＣＲ産物を精製および変性する工程を必要とする。米国特許第５，７０２，８８５号を参照のこと。上記標的ヌクレオチド配列の調製のための本方法は、全血から単離した白血球をＰＣＲテンプレートとして直接磁性ビーズととともに使用すること、またはその白血球から単離した核酸を核酸増幅のために使用して、蛍光標識もしくはビオチン標識を含む１本鎖ＤＮＡもしくは１本鎖ＲＮＡを得ることを、可能にする。上記標識ＤＮＡまたは標識ＲＮＡは、さらに精製することなくハイブリダイゼーションのために使用され得る。
【０１２３】
この実施形態において、上記１本鎖ＤＮＡまたは１本鎖ＲＮＡは、非対称ＰＣＲを使用して取得され得る。上記ＰＣＲ増幅プロセスは、不均等量のプライマーを使用する従来の非対称ＰＣＲであり得る。上記プライマーは、直鎖プライマーであり得るか、またはヘアピン構造を有し得る。上記非対称ＰＣＲにおいて使用されるプライマーは、同じＴｍ値を有しても、異なるＴｍ値を有してもよい。上記非対称ＰＣＲにおいて使用される２つ以上のプライマーのＴｍ値間の差異は、約１℃〜約２０℃の範囲であり得る。上記プライマーのうちの一方は、２本鎖産物の増幅を可能にするために、より低いＴｍ値を有し得る。もう一方のプライマーは、特定量の２本鎖ＤＮＡを取得した後に１本鎖ＤＮＡの増幅を可能にするために、より高いＴｍ値を有し得る。このＰＣＲ増幅プロセスによって生成される１本鎖標的ヌクレオチド配列は、さらに精製することなくハイブリダイゼーションのために直接使用され得る。実施例１は、この方法により得られる１本鎖ＨＬＡ標的ヌクレオチド配列が、さらに精製することなくＤＮＡチップハイブリダイゼーションのために使用され得たことを実証した。
【０１２４】
あるいは、１本鎖ＲＮＡが、転写媒介性増幅（ＴＭＡ）法によって取得され得る。Ｔ７プロモーターを含むプライマーが、増幅のために含められ得る。１本鎖ＲＮＡが、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼによって合成され得る。ハイブリダイゼーションのために１本鎖ＤＮＡまたは１本鎖ＲＮＡを使用すると、上記ＰＣＲ増幅産物を精製および変性する工程と、ハイブリダイゼーションのために２本鎖ＤＮＡを使用する間の弱いシグナルまたはシグナル喪失という問題とが、回避される。
【０１２５】
この実施形態において、上記磁性マイクロビーズは、中国特許第０１１３４８６１．５号において開示される方法によって調製される。
【０１２６】
標的ヌクレオチド配列の調製のための本明細書中に開示される方法は、迅速な核酸サンプル調製のため、および微小全分析系（またはラボオンチップ（ｌａｂ−ｏｎ−ａ−ｃｈｉｐ））を構築するためのバイオチップ操作を達成するために、使用され得る。
【０１２７】
上記ＰＣＲ系およびＰＣＲプロセスは、実施例１にさらに詳述される。そのＰＣＲ増幅産物は、図１および図２において示される。
【０１２８】
別の実施形態において、本発明のチップは、公開されたＨＬＡ対立遺伝子配列に従ってオリゴヌクレオチドプローブを設計し、そしてそのチップの化学修飾した表面上に上記チップを固定することによって、構築される。
【０１２９】
この実施形態において、上記プローブは、中レベル分解能のＨＬＡ型決定のために公開されたＨＬＡ対立遺伝子配列に従って設計され、そして上記チップの化学修飾支持体上に固定される。上記プローブは、プラス鎖プローブであっても、マイナス鎖プローブであってもよい。上記プローブは、約１０ヌクレオチド〜約３０ヌクレオチドを有し得る。上記ＨＬＡ対立遺伝子配列は、まず、一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）部位を同定するための配列分析ソフトウェアによって分析され得、そのＳＮＰ部位を変換するプローブ配列が、必要なＴｍ値に基づいて設計される。本発明のために使用されるプローブの例が、表１において示される。
【０１３０】
この実施形態において、上記プローブは、固定効率を増加するために室温よりも高い温度にて、上記チップの支持体上に固定され得る。より高い固定効率によって、使用されるべきプローブの量が節約され、そしてチップ構築費用が低減される。プローブを固定するための先行技術の方法は、室温または室温付近の温度を使用する。本実施形態は、その一端にＮＨ２改変を有するプローブを固定するために、より高温を使用する。なぜなら、−ＮＨ−ＣＯ−結合を形成するＮＨ２基とＣＨＯ基との間の反応は、より高温で効率が良いからである。
【０１３１】
別の実施形態において、上記プローブの品質（例えば、純度および末端改変）を、ＤＨＰＬＣを介して評価するための方法が、提供される。末端改変効率は、上記プローブの品質にとって重要な指標である。ＤＨＰＬＣは、末端改変プローブと非改変プローブとを分離し得、従って、上記プローブの品質制御のために使用され得る。プローブの末端ＮＨ２改変を評価するためにＤＨＰＬＣを使用する例が、表２において示される。ＤＨＰＬＣはまた、上記プローブにおけるヌクレオチドの変異または欠失を評価するために使用され得る。
【０１３２】
別の実施形態において、方法は、上記標的ヌクレオチド配列を含む調製物を、上記チップに対してハイブリダイズする工程；そのチップを溶液で洗浄する工程；そのチップをハイブリダイゼーション後にシグナルについて走査する工程；および上記標的ヌクレオチド配列と上記チップ上に固定されたプローブとの間のハイブリダイゼーションを評価して上記標的遺伝子の型を決定する工程；を包含する。
【０１３３】
この実施形態において、強いシグナルを与え、偽ポジティブシグナルの可能性を最小にするハイブリダイゼーション条件および洗浄条件が選択される。本発明に使用されるプローブは、Ｔｗｅｌｆｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｆ Ｈｉｓｔｏｃａｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ（ｆｔｐ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ）から提供されるヒトＨＬＡ対立遺伝子配列およびクローン化標準ＨＬＡ対立遺伝子から選択される。クローン化標準ＨＬＡ対立遺伝子は、配列決定され、多くの配列が、Ｔｗｅｌｆｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｆ Ｈｉｓｔｏｃａｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙによって提供される配列と一致しなかった。ＨＬＡ対立遺伝子ライブラリーは、本発明のプローブを設計するために構築された。
【０１３４】
別の実施形態において、表３に示される一連のコントロールプローブおよびプローブ配列のパターンは、チップの品質およびハイブリダイゼーションプロセスからの結果の信頼性を評価するために提供される。表３に示されるプローブの配列は、標的遺伝子のタイピング（ＨＬＡタイピングが挙げられるがこれらに限定されない）のために使用され得る。プローブの複数のコピー（例えば、１〜１０コピー）が、チップ上に固定され得る。プローブの複数のコピーは、チップ上に隣接してまたは別々に固定され得る。ポジティブコントロールプローブの１〜１０個のコピーを、チップ上に固定し得、そして固定されたポジティブコントロールプローブの長さおよび配列のバリエーションは、標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズした場合、強〜弱または弱〜強の順序正しい大きさを有する一群のハイブリダイゼーションシグナルを作り出す。ネガティブコントロールプローブは、ポジティブコントロールプローブと比較した場合、約１〜３塩基対のミスマッチを有する。ポジティブコントロールプローブまたはネガティブコントロールプローブは、標的ヌクレオチド配列の一部、標的ヌクレオチド配列と同時に増幅されるヌクレオチド配列、または合成ヌクレオチド配列に対して相補的であり得る。ハイブリダイゼーションコントロールプローブは、標的遺伝子に関連しない合成ヌクレオチド配列に対して相補的であり得る。ハイブリダイゼーションコントロールプローブは、合成標識ヌクレオチド配列に対して相補的であり得るか、または、合成標識ヌクレオチド配列と比較した場合、約１〜２個の塩基対ミスマッチを有する。固定コントロールプローブは、一端において化学的に改変されており（例えば、ＮＨ２改変されている）、そして他端に検出可能標識（例えば、蛍光標識）を有するプローブである。固定コントロールプローブは、標的遺伝子に関連しない合成ヌクレオチド配列に対して相補的である。ポジティブコントロールプローブ、ネガティブコントロールプローブ、ハイブリダイゼーションコントロールプローブ、および固定コントロールプローブは、チップの４つの角、またはチップの中心に固定され得るか、あるいは任意の適切な順序またはランダムな固定パターンを有し得る。コントロールプローブについてのこのパターンの配列が、ＨＬＡタイピングのために使用され得るが、これらに限定されない。
【０１３５】
別の実施形態において、任意の標的遺伝子をタイピングするため（ＨＬＡ遺伝子をタイピングするためを含むがこれらに限定されない）に使用され得るハイブリダイゼーションシグナルを評価するためのデータ分析のための方法が提供される。この方法は、固定効率、全体的なハイブリダイゼーション効率、ハイブリダイゼーション特異性、ならびにポジティブシグナルおよびネガティブシグナルの評価を含む。全体的なハイブリダイゼーション効率は、固定コントロールプローブからのシグナルの分析、ハイブリダイゼーションコントロールプローブと標的遺伝子に関連しない標識合成ヌクレオチド配列との間のハイブリダイゼーションの分析、ならびにポジティブコントロールプローブおよびネガティブコントロールプローブに関係するハイブリダイゼーションシグナルの分析によって評価され得る。ハイブリダイゼーション特異性は、ポジティブコントロールプローブに関係するハイブリダイゼーションシグナルとネガティブコントロールプローブに関係するハイブリダイゼーションシグナルとの間の比、ならびにポジティブハイブリダイゼーションコントロールプローブに関係するハイブリダイゼーションシグナルとネガティブハイブリダイゼーションコントロールプローブに関係するハイブリダイゼーションシグナルとに間の比を分析することによって評価され得、そして増加したハイブリダイゼーション特異性を示す比を増加し得る。一群の密接に関連するプローブに関係するハイブリダイゼーションにおいて、ポジティブシグナルは、以下の基準に基づいて決定され得る：ａ）バックグラウンドノイズに対するハイブリダイゼーションシグナルの比は、３より大きい；ｂ）関連ポジティブコントロールプローブハイブリダイゼーションシグナルに対するハイブリダイゼーションシグナルの比は、所定の範囲内である；ｃ）ａ）およびｂ）の工程に基づいてポジティブシグナルを与える全てのプローブのハイブリダイゼーションシグナル、または１つのプローブのみがａ）およびｂ）の工程に基づいてポジティブシグナルを与える場合、２つの最も強いハイブリダイゼーションシグナルを与える２つのプローブのハイブリダイゼーションシグナルを比較して、このシグナルがポジティブであるかまたはネガティブであるかを決定する；ならびにｄ）その群の密接に関連するプローブに関係する２つまたは２つ未満のポジティブシグナルが存在する。
【０１３６】
ハイブリダイゼーションの後に、チップが走査され得、そしてデータが分析され得る。標的遺伝子型（例えば、ＨＬＡ遺伝子）が、データ分析ソフトウェアを使用して決定され得る。
【実施例】
【０１３７】
（Ｆ．実施例）
（実施例１）
標的ＨＬＡ遺伝子をタイピングするための標的細胞を単離するために、ＡＣＤ（２３ｍＭクエン酸、８０ｍＭグルコース、および４５ｍＭクエン酸ナトリウム）中の抗凝集剤を含む５μｌの全血を、回転シェーカー上の１．５ｍｌ Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管中の２０μｌ磁性ビーズ（１５ｍｇ／ｍｌのＴＥ緩衝液（ｐＨ６．０）中にある）とともに１０秒間穏やかに混合し、３分間静置させた。次いで、磁性ビーズを磁気スタンドによって固定し、上清を廃棄した。磁性ビーズをＰＢＳで２回洗浄した。洗浄後、磁性ビーズを１００μｌ ＴＥ緩衝液中に再懸濁させ、５μｌの再懸濁磁性ビーズを、ＰＣＴ増幅のためにテンプレートとして使用した。ＰＣＲを２５μｌのＰＣＴ反応溶液中で行った。この反応溶液を、２．５μｌの１０×緩衝液、０．５μｌの１０ｍＭ ｄＮＴＰ、０．５μｌの１ｍＭ Ｃｙ５標識ｄＣＴＰ、０．５μｌの１００ｎｇ／μｌテンプレートＤＮＡ、０．５μｌの１μＭ上流プライマー、２．５μｌの１０μＭ下流プライマー、０．５μｌの５Ｕ／μｌ Ｔａｑポリメラーゼ、および最終反応容量を２５μｌにするための滅菌再蒸留水を混合させることによって作製した。ＰＣＴ増幅プロセスは、以下を含んだ：９６℃で３分；９６で２５秒、７１℃で４５秒、および７２℃で３０秒の２６サイクル；９６℃で２５秒、６８℃で６０秒、および７２℃で１２０秒の９サイクル；続いて、７２℃で８分。
【０１３８】
ＰＣＴ増幅の後に、反応産物を、１．２％アガロースゲル電気泳動によって分析し得る。反応産物を、分析することなく、以下のハイブリダイゼーション反応に直接使用し得る。
【０１３９】
ハイブリダイゼーションを行うために、３μｌのハイブリダイゼーション溶液と混合した後に、５μｌのＰＣＴ反応産物を、９８℃で５分間インキュベートした。次いで、ハイブリダイゼーション反応を、６５℃で１時間行い、ＰＣＴ反応産物とＤＮＡチップ上に固定されたプローブとのハイブリダイゼーションを行わせた。ハイブリダイゼーション後、チップ上の未反応ＰＣＴ反応産物を、脱イオン水を使用して洗浄した。チップをさらに１０分間、４５℃で洗浄緩衝液において洗浄し、そして脱イオン水でリンスした。次いで、チップを乾燥させた。
【０１４０】
ハイブリダイゼーションチップを特別なスキャナーで走査し、そしてハイブリダイゼーションパターンを得た（図３）。ハイブリダイゼーションパターンを、特別なソフトウェアを使用して分析し、データベースを作製した。データベースを分析し、標的遺伝子の遺伝子タイピングを得た。
【０１４１】
（実施例２）
プローブの品質を決定するために、Ｈ２Ｏ中１０μＭの、一端にＮＨ２改変を有する２つのオリゴヌクレオチドプローブ（ＰＢＨ＿０３０３０１９およびＰＢＨ＿０３０１１１９）を、ＷＡＶＥ（登録商標）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃ，ＵＳＡ）に適用した。カラム温度を８０℃に設定し、プローブを勾配アセトニトリル緩衝液中で洗浄した。溶出液を紫外光検出器を使用して２６０ｎＭで検出した。時間にわたって溶出されたピークの数および形状は、プローブの品質を示した。図５に示されるように、５Ａおよび５Ｂの有用な内容は、それぞれ、９３．３５％および６４．８％である。
【０１４２】
（実施例３）
表１のプローブを、ＨＬＡ＿Ａ、ＨＬＡ＿Ｂ、ＨＬＡ＿ＤＲＢ１遺伝子型決定プローブとして使用した。ＰＢＨ＿０３０１ｘｘｘは、ＨＬＡ−Ａプローブを表し、ＰＢＨ＿０２０２ｘｘｘは、ＨＬＡ−Ｂプローブを表し、そしてＰＢＨ＿０３０３ｘｘｘは、ＨＬＡ−ＤＲＢ１プローブを表す。
【０１４３】
（実施例４）
ＨＬＡ標準対立遺伝子のクローニング。その手順は、以下の通りである：
【０１４４】
【化１】
ＨＬＡ標準遺伝子バンクを、ＨＬＡ＿Ａ、ＨＬＡ＿Ｂ、ＨＬＡ＿ＤＲＢ１遺伝子型決定プローブの検出およびＨＬＡチップのＱＣのために構築した。４３のＨＬＡ−Ａ対立遺伝子が存在し、これは、１９の対立遺伝子群に分布し、メジウムタイプの９５．０％をカバーしてクローニングされている；ＨＬＡ＿Ｂについて、４７の対立遺伝子が、クローニングされ、これは、２９の対立遺伝子群に分布し、メジウムタイプの８０％をカバーする；ＨＬＡ＿ＤＲについて、２２の対立遺伝子がクローニングされ、これは、１４の対立遺伝子群に分布し、メジウムタイプの８７．５％をカバーする。１２ｔｈ ＩＨＷＧ（ｗｗｗ．ｉｈｗｇ．ｏｒｇ）の対立遺伝子配列に基づく表１のプローブが設計された。次いで、プローブを化学改変側鎖上に固定してＨＬＡチップを作製した。
【０１４５】
ハイブリダイゼーション条件および洗浄条件は、強力なポジティブシグナルおよび比較的弱い偽ポジティブシグナルを維持するべきである。ハイブリダイゼーションの温度および洗浄の温度は、それぞれ、６５℃および４５℃であり、イオン強度は、０．２％ＳＤＳ、０．１×ＳＳＣであった。
【０１４６】
標的遺伝子を含むサンプルを、ＨＬＡチップとハイブリダイズし、次いで、洗浄および走査によって、データを得、遺伝子型を検出した。例えば、５μｌ ＰＣＲ産物および５μｌハイブリダイゼーション緩衝液を混合し、次いで、１時間、６５℃でハイブリダイズし、次いで、０．２％ＳＤＳおよび０．１×ＳＳＣを含む溶液を使用して、１０分間、４５℃でチップを洗浄し、５分間再び、１×ＳＳＣを使用して洗浄し、１分間水でリンスした。次いで、チップを遠心分離して乾燥し、スキャナーで走査した。写真をとり、データをＨＬＡ特異的ソフトウェアを使用して分析し、遺伝子型の結果を作製した。
【０１４７】
ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子型決定のためのプローブを表１に示した。
【０１４８】
【表１−１】
【０１４９】
【表１−２】
【０１５０】
【表１−３】
【０１５１】
【表１−４】
【０１５２】
【表１−５】
【０１５３】
【表１−６】
【０１５４】
【表１−７】
【０１５５】
【表１−８】
（実施例５）
ＨＬＡタイピングのアレイでは、６４個の検出プローブ、２個のポジティブプローブ、１個のネガティブプローブ、１個のハイブリダイゼーションコントロールネガティブプローブ、１個のハイブリダイゼーションコントロールポジティブプローブが存在する。表２に示されるように、イタリック文字は、コントロールプローブを表し、他の文字は、検出プローブである。表３は、ＨＬＡチップのプローブの配置の一例を示している。
【０１５６】
【表２−１】
【０１５７】
【表２−２】
【０１５８】
【表３】
上記実施例は、例示の目的のみで含まれ、本発明の範囲を制限することを意図しない。上記に対する多くのバリエーションが可能である。上記の実施例に対する改変およびバリエーションが当業者に明らかであるので、本発明が添付の特許請求の範囲によってのみ制限されることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【０１５９】
【図１】図１は、磁性マイクロビーズによって白血球が捕獲された結果を例証する。
【図２】図２は、異なる３つのタイプの磁性マイクロビーズを用いて単離した白血球からのＰＣＲ結果を例証する。
【図３】図３は、同じ磁性マイクロビーズを用いて単離した白血球からのＰＣＲ結果を例証する。
【図４】図４は、１４４個のプローブを含むチップ上のハイブリダイゼーションシグナルを例証する。
【図５】図５は、２つのプローブ（ＰＢＨ＿０３０３０１９およびＰＢＨ＿０３０１１１９）のＤＨＰＬＣ分析を例証する。
【図６−１】図６は、４つのタイプのプローブ（６ａ．非常に純度が高いプローブ；６ｂ．少量の不純物を含むプローブ；６ｃ．高い不純率のプローブ；６ｄ．非常に高い不純率の非常に純度が低いプローブ）のＤＨＰＬＣ分析を例証する。
【図６−２】図６は、４つのタイプのプローブ（６ａ．非常に純度が高いプローブ；６ｂ．少量の不純物を含むプローブ；６ｃ．高い不純率のプローブ；６ｄ．非常に高い不純率の非常に純度が低いプローブ）のＤＨＰＬＣ分析を例証する
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的遺伝子の型を決定するための方法であって、該方法は、以下：
ａ）適切なサンプルから標的遺伝子を含む標的細胞を単離し、そして該単離された標的細胞由来の該標的遺伝子の少なくとも一部である標的ヌクレオチド配列と、必要に応じて該標的遺伝子に無関係の別のヌクレオチド配列とを含む調製物を得る工程；
ｂ）核酸ハイブリダイゼーションにおいて使用するために適切な支持体を含むチップを提供する工程であって、該支持体上には、該標的ヌクレオチド配列に対して相補的なオリゴヌクレオチドプローブと、以下のオリゴヌクレオチドコントロールプローブ：ポジティブコントロールプローブ、ネガティブコントロールプローブ、ハイブリダイゼーションコントロールプローブ、および固定コントロールプローブのうちの少なくとも１つとが固定されている、工程；ならびに、
ｃ）工程ａ）において得られた該調製物を工程ｂ）において提供された該チップに対してハイブリダイズさせ、該標的ヌクレオチド配列および／または該別のヌクレオチド配列と、該チップ上に含まれる該コントロールプローブとの間のハイブリダイゼーションを評価して、該標的遺伝子の型を決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、前記標的細胞が、白血球であり、しかし白血球に限定されない、方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法であって、前記標的遺伝子が、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）であって、本方法がまた、他の遺伝子の遺伝型決定のために使用され得る、方法。
【請求項４】
請求項１に記載の方法であって、前記適切なサンプルが、血液、唾液、毛髪、ヒト核酸を含むヒト組織、および有核細胞を含有する任意の他のヒト組織からなる群より選択される、方法。
【請求項５】
請求項４に記載の方法であって、前記血液サンプルが、血清、血漿、および全血からなる群より選択される、方法。
【請求項６】
請求項５に記載の方法であって、前記血液サンプルが、新鮮全血または低温保存全血である、方法。
【請求項７】
請求項１に記載の方法であって、前記標的細胞が、磁性マイクロビーズを用いて適切なサンプルから単離される、方法。
【請求項８】
請求項７に記載の方法であって、前記磁性マイクロビーズが、約５μｍから約２００μｍの範囲に及ぶ直径を有する、方法。
【請求項９】
請求項１に記載の方法であって、前記標的ヌクレオチド配列の調製が、核酸増幅工程を包含する、方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の方法であって、前記標的ヌクレオチド配列が、前記単離された標的細胞からの直接的核酸増幅を経て得られる、方法。
【請求項１１】
請求項９に記載の方法であって、前記標的ヌクレオチド配列が、前記単離された標的細胞から単離された核酸テンプレートを用いた核酸増幅を経て得られる、方法。
【請求項１２】
請求項９に記載の方法であって、前記核酸増幅工程が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）および転写媒介性増幅（ＴＭＡ）からなる群より選択される、方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の方法であって、前記ＴＭＡが、Ｔ７プロモーターによって進められる、方法。
【請求項１４】
請求項１２に記載の方法であって、前記ＰＣＲが、非対称ＰＣＲである、方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の方法であって、前記非対称ＰＣＲに使用される２つのプライマーが、約１：５〜約１：２００の範囲に及ぶ比を有する、方法。
【請求項１６】
請求項１４に記載の方法であって、前記非対称ＰＣＲに使用される２つのプライマーが、同じＴｍ値または異なるＴｍ値を有する、方法。
【請求項１７】
請求項１４に記載の方法であって、前記非対称ＰＣＲに使用される２つのプライマーの前記Ｔｍ値の間の差が、約１℃〜約２０℃の範囲に及ぶ、方法。
【請求項１８】
請求項１４に記載の方法であって、前記非対称ＰＣＲに３つのプライマーが使用され、該プライマーのうちの２つは、同じかもしくは類似のＴｍ値を有し、そして該２つのプライマーのＴｍ値と該第３のプライマーのＴｍ値との間の差が、約１℃〜約２０℃の範囲に及ぶ、方法。
【請求項１９】
請求項１４に記載の方法であって、前記プライマーが、直鎖プライマーであるか、またはヘアピン構造を含む、方法。
【請求項２０】
請求項１２に記載の方法であって、前記単一または複数のアニーリング温度が、前記ＰＣＲに使用される、方法。
【請求項２１】
請求項２０に記載の方法であって、前記アニーリング温度の間の差が、約１℃〜約２０℃の範囲に及ぶ、方法。
【請求項２２】
請求項１に記載の方法であって、前記工程ａ）において得られた標的ヌクレオチド配列が、１本鎖ＤＮＡまたは１本鎖ＲＮＡである、方法。
【請求項２３】
請求項２２に記載の方法であって、前記１本鎖ＤＮＡまたは１本鎖ＲＮＡが、プラス鎖プローブであるかまたはマイナス鎖プローブである、方法。
【請求項２４】
請求項１に記載の方法であって、工程ａ）において標識された標的ヌクレオチド配列が得られる、方法。
【請求項２５】
請求項２４に記載の方法であって、前記標識された標的ヌクレオチド配列が、蛍光標識を含むか、またはビオチン標識を含む、方法。
【請求項２６】
請求項１に記載の方法であって、前記別のヌクレオチド配列が、前記チップ上に含まれる前記ポジティブコントロールプローブ、前記ネガティブコントロールプローブまたは前記ハイブリダイゼーションコントロールプローブに相補的である、方法。
【請求項２７】
請求項１に記載の方法であって、前記チップ上に含まれる前記プローブが、プラス鎖プローブであるかまたはマイナス鎖プローブである、方法。
【請求項２８】
請求項１に記載の方法であって、前記チップ上に含まれる前記プローブが修飾されている、方法。
【請求項２９】
請求項２８に記載の方法であって、前記プローブ修飾が、５’−ＮＨ２修飾、５’−ＳＨ修飾、５’−ポリＴ（またはＡ、ＣもしくはＧ）修飾、５’−ビオチン修飾、３’−ＮＨ２修飾、３’−ＳＨ修飾、３’−ポリＴ（またはＡ、ＣもしくはＧ）修飾、および３’−ビオチン修飾からなる群より選択される、方法。
【請求項３０】
請求項１に記載の方法であって、前記チップが１〜４００種の異なる型のプローブを含む、方法。
【請求項３１】
請求項１に記載の方法であって、前記チップがプローブのアレイを含み、各アレイが１〜４００種の異なる型のプローブを含む、方法。
【請求項３２】
請求項１に記載の方法であって、前記プローブが、約３７℃〜約１００℃の範囲に及ぶ温度で前記チップ上に固定される、方法。
【請求項３３】
請求項１に記載の方法であって、前記チップが修飾されている、方法。
【請求項３４】
請求項３３に記載の方法であって、前記チップ修飾が、ＣＨＯ修飾、ＮＨ２修飾、ポリリジン修飾、ＳＨ修飾、ＢＳＡ修飾、ストレプトアビジン修飾、アガロースゲル修飾およびポリアクリルアミドゲル修飾からなる群より選択される、方法。
【請求項３５】
請求項１に記載の方法であって、前記プローブの配列、純度、もしくは末端修飾が評価される、方法。
【請求項３６】
請求項３５に記載の方法であって、前記プローブの配列、純度、もしくは末端修飾が、ＤＨＰＬＣによって評価される、方法。
【請求項３７】
請求項１に記載の方法であって、前記チップ上に、１プローブの複数のコピーが固定されている、方法。
【請求項３８】
請求項１に記載の方法であって、１プローブの１〜１０個のコピーが固定されている、方法。
【請求項３９】
請求項１に記載の方法であって、前記チップ上に、前記１プローブの複数のコピーが隣接して固定されているか、または離れて固定されている、方法。
【請求項４０】
請求項３９に記載の方法であって、ポジティブコントロールプローブの前記複数のコピーが前記チップ上に固定されており、そして該固定されたポジティブコントロールプローブの長さおよび配列の変化により、工程ａ）において提供された前記調製物中の前記標的ヌクレオチド配列もしくは前記別のヌクレオチド配列とハイブリダイズする場合、強−弱もしくは弱−強の順序でそろえられた大きさを有するハイブリダイゼーションシグナルの群が作製される、方法。
【請求項４１】
請求項１に記載の方法であって、前記ポジティブコントロールプローブが、前記標的ヌクレオチド配列、該標的ヌクレオチド配列と同時に増幅されるヌクレオチド配列、または合成ヌクレオチド配列の一部と相補的である、方法。
【請求項４２】
請求項４１に記載の方法であって、前記ネガティブコントロールプローブが、前記ポジティブコントロールプローブと比較した場合、約１〜３塩基対ミスマッチを有する、方法。
【請求項４３】
請求項１に記載の方法であって、前記ハイブリダイゼーションコントロールプローブが、前記標的遺伝子と無関係な合成ヌクレオチド配列と相補的である、方法。
【請求項４４】
請求項４３に記載の方法であって、前記ハイブリダイゼーションコントロールプローブが、合成標識ヌクレオチド配列と相補的であるか、または該合成標識ヌクレオチド配列と比較した場合、約１〜２塩基対ミスマッチを有する、方法。
【請求項４５】
請求項１に記載の方法であって、前記固定コントロールプローブが、あらゆるハイブリダイゼーションシグナルを発生しない、方法。
【請求項４６】
請求項１に記載の方法であって、前記固定コントロールプローブの一方の末端が、化学的に修飾されており、該固定コントロールプローブの他方の末端が、検出可能な標識を有する、方法。
【請求項４７】
請求項１に記載の方法であって、前記チップが、ポジティブコントロールプローブ、ネガティブコントロールプローブ、ハイブリダイゼーションコントロールプローブ、および固定コントロールプローブを含む、方法。
【請求項４８】
請求項１に記載の方法であって、前記ポジティブコントロールプローブ、前記ネガティブコントロールプローブ、前記ハイブリダイゼーションコントロールプローブおよび前記固定コントロールプローブが、前記チップの四隅に固定されているか、前記チップの中央に固定されているか、または任意の適切な秩序ある固定パターンもしくはランダムな固定パターンを有する、方法。
【請求項４９】
請求項１に記載の方法であって、前記工程ｃ）におけるハイブリダイゼーション反応が、塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）および界面活性剤を含有するハイブリダイゼーション溶液中で行われる、方法。
【請求項５０】
請求項４９に記載の方法であって、前記ハイブリダイゼーション溶液が、約３×ＳＳＣ〜約１０×ＳＳＣを含有する、方法。
【請求項５１】
請求項４９に記載の方法であって、前記界面活性剤が、約０．０５％（ｗ／ｗ）〜約５％（ｗ／ｗ）の範囲に及ぶ濃度を有する、方法。
【請求項５２】
請求項４９に記載の方法であって、前記界面活性剤が、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、Ｔｒｉｔｏｎ １００およびラウリル硫酸ナトリウム（ＳＬＳ）からなる群より選択される、方法。
【請求項５３】
請求項１に記載の方法であって、前記工程ｃ）におけるハイブリダイゼーション反応が、約４２℃〜約７０℃の範囲に及ぶ温度で行われる、方法。
【請求項５４】
請求項１に記載の方法であって、ハイブリダイゼーション反応後に洗浄工程をさらに包含する、方法。
【請求項５５】
請求項５４に記載の方法であって、前記洗浄工程が、約０．％（ｗ／ｗ）〜約２％（ｗ／ｗ）の範囲に及ぶ濃度を有する界面活性剤を含有する洗浄溶液中で行われる、方法。
【請求項５６】
請求項５４に記載の方法であって、前記洗浄工程が、約５分〜約３０分の範囲に及ぶ時間の間行われる、方法。
【請求項５７】
請求項１に記載の方法であって、前記固定の効率が、前記固定コントロールプローブからのシグナルを分析することによって評価される、方法。
【請求項５８】
請求項１に記載の方法であって、前記全ハイブリダイゼーション効率が、前記ハイブリダイゼーションコントロールプローブと、前記標的遺伝子と無関係な標識された合成ヌクレオチド配列との間のハイブリダイゼーションを分析することによって評価される、方法。
【請求項５９】
請求項１に記載の方法であって、前記ハイブリダイゼーション特異性が、前記ポジティブコントロールプローブに関する前記ハイブリダイゼーションシグナルと前記ネガティブコントロールプローブに関する前記ハイブリダイゼーションシグナルとの間の比、および前記ポジティブハイブリダイゼーションコントロールプローブに関する前記ハイブリダイゼーショシグナルと前記ネガティブハイブリダイゼーションコントロールプローブに関する前記ハイブリダイゼーションシグナルとの間の比、およびハイブリダイゼーション特異性の増加を示す比の増加を分析することによって評価される、方法。
【請求項６０】
請求項１に記載の方法であって、密接な関係があるプローブの群に関するハイブリダイゼーションにおいて、ポジティブシグナルが、以下の基準：
ａ）バックグラウンドノイズに対する前記ハイブリダイゼーションシグナルの比が、３より大きい；
ｂ）関連するポジティブコントロールプローブハイブリダイゼーションシグナルに対する前記ハイブリダイゼーションシグナルの比が、所定の範囲内である；
ｃ）該工程ａ）およびｂ）に基づいてポジティブシグナルを与える、全プローブのハイブリダイゼーションシグナルを比較するか、または、該工程ａ）およびｂ）に基づいてただ１つのプローブがポジティブシグナルを与える場合、２つの最大のハイブリダイゼーションシグナルを与える２つのプローブのハイブリダイゼーションシグナルを比較して、該シグナルがポジティブであるかまたはネガティブであるかを決定する工程；そして、
ｄ）該密接な関係があるプローブの群に関して２つ以下のポジティブシグナルが存在する、
に基づいて決定される、方法。
【請求項６１】
請求項１に記載の方法であって、前記オリゴヌクレオチドプローブが、標的ＨＬＡ遺伝子と相補的である、方法。
【請求項６２】
請求項６１に記載の方法であって、前記オリゴヌクレオチドプローブが、以下のヌクレオチド配列：
ａ）高ストリンジェント条件下で、表１に示される標的ＨＬＡヌクレオチド配列もしくはその相補鎖とハイブリダイズする、ヌクレオチド配列；または、
ｂ）表１に示されるヌクレオチド配列もしくはその相補鎖を含む標的ＨＬＡヌクレオチド配列に対して、少なくとも９０％の同一性を有する、ヌクレオチド配列、
を包含する、方法。
【請求項６３】
請求項６１に記載の方法であって、前記オリゴヌクレオチドプローブが、表１に示されるヌクレオチド配列もしくはその相補鎖を包含する、方法。
【請求項６４】
請求項６１に記載の方法であって、前記チップが、表１に示されるヌクレオチド配列の全てもしくはその相補鎖の全てを含む、方法。
【請求項６５】
ＨＬＡ標的遺伝子を型決定するためのオリゴヌクレオチドプローブであって、以下のヌクレオチド配列：
ａ）高ストリンジェント条件下で、表１に示される標的ＨＬＡヌクレオチド配列もしくはその相補鎖とハイブリダイズする、ヌクレオチド配列；または、
ｂ）表１に示されるヌクレオチド配列もしくはその相補鎖を含む標的ＨＬＡヌクレオチド配列に対して、少なくとも９０％の同一性を有する、ヌクレオチド配列、
を包含する、方法。
【請求項６６】
請求項６５に記載のプローブであって、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡまたはそれらの誘導体を包含する、プローブ。
【請求項６７】
請求項６５に記載のプローブであって、表１に示されるヌクレオチド配列もしくはその相補鎖を包含する、プローブ。
【請求項６８】
請求項６５に記載のプローブであって、標識されている、プローブ。
【請求項６９】
請求項６８に記載のプローブであって、前記標識が、化学標識、酵素標識、免疫原性標識、放射性標識、蛍光標識、発光標識およびＦＲＥＴ標識からなる群より選択される、プローブ。
【請求項７０】
ＨＬＡ標的遺伝子を型決定するための支持体上に固定されたオリゴヌクレオチドプローブのアレイであって、該アレイは、核酸ハイブリダイゼーションにおいて使用するために適切な支持体を含み、該支持体上には、複数のオリゴヌクレオチドプローブが固定されており、該プローブの少なくとも１つは、以下のヌクレオチド配列：
ａ）高ストリンジェント条件下で、表１に示される標的ＨＬＡヌクレオチド配列もしくはその相補鎖とハイブリダイズする、ヌクレオチド配列；または、
ｂ）表１に示されるヌクレオチド配列もしくはその相補鎖を含む標的ＨＬＡヌクレオチド配列に対して、少なくとも９０％の同一性を有する、ヌクレオチド配列、
を包含する、アレイ。
【請求項７１】
請求項７０に記載のアレイであって、前記複数のプローブが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡまたはそれらの誘導体を含む、アレイ。
【請求項７２】
請求項７０に記載のアレイであって、前記プローブの少なくとも１つが、表１に示されるヌクレオチド配列もしくはその相補鎖を包含する、アレイ。
【請求項７３】
請求項７０に記載のアレイであって、表１に示されるヌクレオチド配列もしくはその相補鎖を包含する前記プローブの全てを含む、アレイ。
【請求項７４】
請求項７３に記載のアレイであって、前記プローブの少なくとも１つが、標識されている、アレイ。
【請求項７５】
請求項７４に記載のアレイであって、前記標識が、化学標識、酵素標識、免疫原性標識、放射性標識、蛍光標識、発光標識およびＦＲＥＴ標識からなる群より選択される、アレイ。
【請求項７６】
請求項７０に記載のアレイであって、前記支持体が、シリコン表面、プラスチック表面、ガラス表面、セラミック表面、ゴム表面、およびポリマー表面からなる群より選択される表面を含む、アレイ。
【請求項１】
標的遺伝子の型を決定するための方法であって、該方法は、以下：
ａ）適切なサンプルから標的遺伝子を含む標的細胞を単離し、そして該単離された標的細胞由来の該標的遺伝子の少なくとも一部である標的ヌクレオチド配列と、必要に応じて該標的遺伝子に無関係の別のヌクレオチド配列とを含む調製物を得る工程；
ｂ）核酸ハイブリダイゼーションにおいて使用するために適切な支持体を含むチップを提供する工程であって、該支持体上には、該標的ヌクレオチド配列に対して相補的なオリゴヌクレオチドプローブと、以下のオリゴヌクレオチドコントロールプローブ：ポジティブコントロールプローブ、ネガティブコントロールプローブ、ハイブリダイゼーションコントロールプローブ、および固定コントロールプローブのうちの少なくとも１つとが固定されている、工程；ならびに、
ｃ）工程ａ）において得られた該調製物を工程ｂ）において提供された該チップに対してハイブリダイズさせ、該標的ヌクレオチド配列および／または該別のヌクレオチド配列と、該チップ上に含まれる該コントロールプローブとの間のハイブリダイゼーションを評価して、該標的遺伝子の型を決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、前記標的細胞が、白血球であり、しかし白血球に限定されない、方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法であって、前記標的遺伝子が、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）であって、本方法がまた、他の遺伝子の遺伝型決定のために使用され得る、方法。
【請求項４】
請求項１に記載の方法であって、前記適切なサンプルが、血液、唾液、毛髪、ヒト核酸を含むヒト組織、および有核細胞を含有する任意の他のヒト組織からなる群より選択される、方法。
【請求項５】
請求項４に記載の方法であって、前記血液サンプルが、血清、血漿、および全血からなる群より選択される、方法。
【請求項６】
請求項５に記載の方法であって、前記血液サンプルが、新鮮全血または低温保存全血である、方法。
【請求項７】
請求項１に記載の方法であって、前記標的細胞が、磁性マイクロビーズを用いて適切なサンプルから単離される、方法。
【請求項８】
請求項７に記載の方法であって、前記磁性マイクロビーズが、約５μｍから約２００μｍの範囲に及ぶ直径を有する、方法。
【請求項９】
請求項１に記載の方法であって、前記標的ヌクレオチド配列の調製が、核酸増幅工程を包含する、方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の方法であって、前記標的ヌクレオチド配列が、前記単離された標的細胞からの直接的核酸増幅を経て得られる、方法。
【請求項１１】
請求項９に記載の方法であって、前記標的ヌクレオチド配列が、前記単離された標的細胞から単離された核酸テンプレートを用いた核酸増幅を経て得られる、方法。
【請求項１２】
請求項９に記載の方法であって、前記核酸増幅工程が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）および転写媒介性増幅（ＴＭＡ）からなる群より選択される、方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の方法であって、前記ＴＭＡが、Ｔ７プロモーターによって進められる、方法。
【請求項１４】
請求項１２に記載の方法であって、前記ＰＣＲが、非対称ＰＣＲである、方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の方法であって、前記非対称ＰＣＲに使用される２つのプライマーが、約１：５〜約１：２００の範囲に及ぶ比を有する、方法。
【請求項１６】
請求項１４に記載の方法であって、前記非対称ＰＣＲに使用される２つのプライマーが、同じＴｍ値または異なるＴｍ値を有する、方法。
【請求項１７】
請求項１４に記載の方法であって、前記非対称ＰＣＲに使用される２つのプライマーの前記Ｔｍ値の間の差が、約１℃〜約２０℃の範囲に及ぶ、方法。
【請求項１８】
請求項１４に記載の方法であって、前記非対称ＰＣＲに３つのプライマーが使用され、該プライマーのうちの２つは、同じかもしくは類似のＴｍ値を有し、そして該２つのプライマーのＴｍ値と該第３のプライマーのＴｍ値との間の差が、約１℃〜約２０℃の範囲に及ぶ、方法。
【請求項１９】
請求項１４に記載の方法であって、前記プライマーが、直鎖プライマーであるか、またはヘアピン構造を含む、方法。
【請求項２０】
請求項１２に記載の方法であって、前記単一または複数のアニーリング温度が、前記ＰＣＲに使用される、方法。
【請求項２１】
請求項２０に記載の方法であって、前記アニーリング温度の間の差が、約１℃〜約２０℃の範囲に及ぶ、方法。
【請求項２２】
請求項１に記載の方法であって、前記工程ａ）において得られた標的ヌクレオチド配列が、１本鎖ＤＮＡまたは１本鎖ＲＮＡである、方法。
【請求項２３】
請求項２２に記載の方法であって、前記１本鎖ＤＮＡまたは１本鎖ＲＮＡが、プラス鎖プローブであるかまたはマイナス鎖プローブである、方法。
【請求項２４】
請求項１に記載の方法であって、工程ａ）において標識された標的ヌクレオチド配列が得られる、方法。
【請求項２５】
請求項２４に記載の方法であって、前記標識された標的ヌクレオチド配列が、蛍光標識を含むか、またはビオチン標識を含む、方法。
【請求項２６】
請求項１に記載の方法であって、前記別のヌクレオチド配列が、前記チップ上に含まれる前記ポジティブコントロールプローブ、前記ネガティブコントロールプローブまたは前記ハイブリダイゼーションコントロールプローブに相補的である、方法。
【請求項２７】
請求項１に記載の方法であって、前記チップ上に含まれる前記プローブが、プラス鎖プローブであるかまたはマイナス鎖プローブである、方法。
【請求項２８】
請求項１に記載の方法であって、前記チップ上に含まれる前記プローブが修飾されている、方法。
【請求項２９】
請求項２８に記載の方法であって、前記プローブ修飾が、５’−ＮＨ２修飾、５’−ＳＨ修飾、５’−ポリＴ（またはＡ、ＣもしくはＧ）修飾、５’−ビオチン修飾、３’−ＮＨ２修飾、３’−ＳＨ修飾、３’−ポリＴ（またはＡ、ＣもしくはＧ）修飾、および３’−ビオチン修飾からなる群より選択される、方法。
【請求項３０】
請求項１に記載の方法であって、前記チップが１〜４００種の異なる型のプローブを含む、方法。
【請求項３１】
請求項１に記載の方法であって、前記チップがプローブのアレイを含み、各アレイが１〜４００種の異なる型のプローブを含む、方法。
【請求項３２】
請求項１に記載の方法であって、前記プローブが、約３７℃〜約１００℃の範囲に及ぶ温度で前記チップ上に固定される、方法。
【請求項３３】
請求項１に記載の方法であって、前記チップが修飾されている、方法。
【請求項３４】
請求項３３に記載の方法であって、前記チップ修飾が、ＣＨＯ修飾、ＮＨ２修飾、ポリリジン修飾、ＳＨ修飾、ＢＳＡ修飾、ストレプトアビジン修飾、アガロースゲル修飾およびポリアクリルアミドゲル修飾からなる群より選択される、方法。
【請求項３５】
請求項１に記載の方法であって、前記プローブの配列、純度、もしくは末端修飾が評価される、方法。
【請求項３６】
請求項３５に記載の方法であって、前記プローブの配列、純度、もしくは末端修飾が、ＤＨＰＬＣによって評価される、方法。
【請求項３７】
請求項１に記載の方法であって、前記チップ上に、１プローブの複数のコピーが固定されている、方法。
【請求項３８】
請求項１に記載の方法であって、１プローブの１〜１０個のコピーが固定されている、方法。
【請求項３９】
請求項１に記載の方法であって、前記チップ上に、前記１プローブの複数のコピーが隣接して固定されているか、または離れて固定されている、方法。
【請求項４０】
請求項３９に記載の方法であって、ポジティブコントロールプローブの前記複数のコピーが前記チップ上に固定されており、そして該固定されたポジティブコントロールプローブの長さおよび配列の変化により、工程ａ）において提供された前記調製物中の前記標的ヌクレオチド配列もしくは前記別のヌクレオチド配列とハイブリダイズする場合、強−弱もしくは弱−強の順序でそろえられた大きさを有するハイブリダイゼーションシグナルの群が作製される、方法。
【請求項４１】
請求項１に記載の方法であって、前記ポジティブコントロールプローブが、前記標的ヌクレオチド配列、該標的ヌクレオチド配列と同時に増幅されるヌクレオチド配列、または合成ヌクレオチド配列の一部と相補的である、方法。
【請求項４２】
請求項４１に記載の方法であって、前記ネガティブコントロールプローブが、前記ポジティブコントロールプローブと比較した場合、約１〜３塩基対ミスマッチを有する、方法。
【請求項４３】
請求項１に記載の方法であって、前記ハイブリダイゼーションコントロールプローブが、前記標的遺伝子と無関係な合成ヌクレオチド配列と相補的である、方法。
【請求項４４】
請求項４３に記載の方法であって、前記ハイブリダイゼーションコントロールプローブが、合成標識ヌクレオチド配列と相補的であるか、または該合成標識ヌクレオチド配列と比較した場合、約１〜２塩基対ミスマッチを有する、方法。
【請求項４５】
請求項１に記載の方法であって、前記固定コントロールプローブが、あらゆるハイブリダイゼーションシグナルを発生しない、方法。
【請求項４６】
請求項１に記載の方法であって、前記固定コントロールプローブの一方の末端が、化学的に修飾されており、該固定コントロールプローブの他方の末端が、検出可能な標識を有する、方法。
【請求項４７】
請求項１に記載の方法であって、前記チップが、ポジティブコントロールプローブ、ネガティブコントロールプローブ、ハイブリダイゼーションコントロールプローブ、および固定コントロールプローブを含む、方法。
【請求項４８】
請求項１に記載の方法であって、前記ポジティブコントロールプローブ、前記ネガティブコントロールプローブ、前記ハイブリダイゼーションコントロールプローブおよび前記固定コントロールプローブが、前記チップの四隅に固定されているか、前記チップの中央に固定されているか、または任意の適切な秩序ある固定パターンもしくはランダムな固定パターンを有する、方法。
【請求項４９】
請求項１に記載の方法であって、前記工程ｃ）におけるハイブリダイゼーション反応が、塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）および界面活性剤を含有するハイブリダイゼーション溶液中で行われる、方法。
【請求項５０】
請求項４９に記載の方法であって、前記ハイブリダイゼーション溶液が、約３×ＳＳＣ〜約１０×ＳＳＣを含有する、方法。
【請求項５１】
請求項４９に記載の方法であって、前記界面活性剤が、約０．０５％（ｗ／ｗ）〜約５％（ｗ／ｗ）の範囲に及ぶ濃度を有する、方法。
【請求項５２】
請求項４９に記載の方法であって、前記界面活性剤が、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、Ｔｒｉｔｏｎ １００およびラウリル硫酸ナトリウム（ＳＬＳ）からなる群より選択される、方法。
【請求項５３】
請求項１に記載の方法であって、前記工程ｃ）におけるハイブリダイゼーション反応が、約４２℃〜約７０℃の範囲に及ぶ温度で行われる、方法。
【請求項５４】
請求項１に記載の方法であって、ハイブリダイゼーション反応後に洗浄工程をさらに包含する、方法。
【請求項５５】
請求項５４に記載の方法であって、前記洗浄工程が、約０．％（ｗ／ｗ）〜約２％（ｗ／ｗ）の範囲に及ぶ濃度を有する界面活性剤を含有する洗浄溶液中で行われる、方法。
【請求項５６】
請求項５４に記載の方法であって、前記洗浄工程が、約５分〜約３０分の範囲に及ぶ時間の間行われる、方法。
【請求項５７】
請求項１に記載の方法であって、前記固定の効率が、前記固定コントロールプローブからのシグナルを分析することによって評価される、方法。
【請求項５８】
請求項１に記載の方法であって、前記全ハイブリダイゼーション効率が、前記ハイブリダイゼーションコントロールプローブと、前記標的遺伝子と無関係な標識された合成ヌクレオチド配列との間のハイブリダイゼーションを分析することによって評価される、方法。
【請求項５９】
請求項１に記載の方法であって、前記ハイブリダイゼーション特異性が、前記ポジティブコントロールプローブに関する前記ハイブリダイゼーションシグナルと前記ネガティブコントロールプローブに関する前記ハイブリダイゼーションシグナルとの間の比、および前記ポジティブハイブリダイゼーションコントロールプローブに関する前記ハイブリダイゼーショシグナルと前記ネガティブハイブリダイゼーションコントロールプローブに関する前記ハイブリダイゼーションシグナルとの間の比、およびハイブリダイゼーション特異性の増加を示す比の増加を分析することによって評価される、方法。
【請求項６０】
請求項１に記載の方法であって、密接な関係があるプローブの群に関するハイブリダイゼーションにおいて、ポジティブシグナルが、以下の基準：
ａ）バックグラウンドノイズに対する前記ハイブリダイゼーションシグナルの比が、３より大きい；
ｂ）関連するポジティブコントロールプローブハイブリダイゼーションシグナルに対する前記ハイブリダイゼーションシグナルの比が、所定の範囲内である；
ｃ）該工程ａ）およびｂ）に基づいてポジティブシグナルを与える、全プローブのハイブリダイゼーションシグナルを比較するか、または、該工程ａ）およびｂ）に基づいてただ１つのプローブがポジティブシグナルを与える場合、２つの最大のハイブリダイゼーションシグナルを与える２つのプローブのハイブリダイゼーションシグナルを比較して、該シグナルがポジティブであるかまたはネガティブであるかを決定する工程；そして、
ｄ）該密接な関係があるプローブの群に関して２つ以下のポジティブシグナルが存在する、
に基づいて決定される、方法。
【請求項６１】
請求項１に記載の方法であって、前記オリゴヌクレオチドプローブが、標的ＨＬＡ遺伝子と相補的である、方法。
【請求項６２】
請求項６１に記載の方法であって、前記オリゴヌクレオチドプローブが、以下のヌクレオチド配列：
ａ）高ストリンジェント条件下で、表１に示される標的ＨＬＡヌクレオチド配列もしくはその相補鎖とハイブリダイズする、ヌクレオチド配列；または、
ｂ）表１に示されるヌクレオチド配列もしくはその相補鎖を含む標的ＨＬＡヌクレオチド配列に対して、少なくとも９０％の同一性を有する、ヌクレオチド配列、
を包含する、方法。
【請求項６３】
請求項６１に記載の方法であって、前記オリゴヌクレオチドプローブが、表１に示されるヌクレオチド配列もしくはその相補鎖を包含する、方法。
【請求項６４】
請求項６１に記載の方法であって、前記チップが、表１に示されるヌクレオチド配列の全てもしくはその相補鎖の全てを含む、方法。
【請求項６５】
ＨＬＡ標的遺伝子を型決定するためのオリゴヌクレオチドプローブであって、以下のヌクレオチド配列：
ａ）高ストリンジェント条件下で、表１に示される標的ＨＬＡヌクレオチド配列もしくはその相補鎖とハイブリダイズする、ヌクレオチド配列；または、
ｂ）表１に示されるヌクレオチド配列もしくはその相補鎖を含む標的ＨＬＡヌクレオチド配列に対して、少なくとも９０％の同一性を有する、ヌクレオチド配列、
を包含する、方法。
【請求項６６】
請求項６５に記載のプローブであって、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡまたはそれらの誘導体を包含する、プローブ。
【請求項６７】
請求項６５に記載のプローブであって、表１に示されるヌクレオチド配列もしくはその相補鎖を包含する、プローブ。
【請求項６８】
請求項６５に記載のプローブであって、標識されている、プローブ。
【請求項６９】
請求項６８に記載のプローブであって、前記標識が、化学標識、酵素標識、免疫原性標識、放射性標識、蛍光標識、発光標識およびＦＲＥＴ標識からなる群より選択される、プローブ。
【請求項７０】
ＨＬＡ標的遺伝子を型決定するための支持体上に固定されたオリゴヌクレオチドプローブのアレイであって、該アレイは、核酸ハイブリダイゼーションにおいて使用するために適切な支持体を含み、該支持体上には、複数のオリゴヌクレオチドプローブが固定されており、該プローブの少なくとも１つは、以下のヌクレオチド配列：
ａ）高ストリンジェント条件下で、表１に示される標的ＨＬＡヌクレオチド配列もしくはその相補鎖とハイブリダイズする、ヌクレオチド配列；または、
ｂ）表１に示されるヌクレオチド配列もしくはその相補鎖を含む標的ＨＬＡヌクレオチド配列に対して、少なくとも９０％の同一性を有する、ヌクレオチド配列、
を包含する、アレイ。
【請求項７１】
請求項７０に記載のアレイであって、前記複数のプローブが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡまたはそれらの誘導体を含む、アレイ。
【請求項７２】
請求項７０に記載のアレイであって、前記プローブの少なくとも１つが、表１に示されるヌクレオチド配列もしくはその相補鎖を包含する、アレイ。
【請求項７３】
請求項７０に記載のアレイであって、表１に示されるヌクレオチド配列もしくはその相補鎖を包含する前記プローブの全てを含む、アレイ。
【請求項７４】
請求項７３に記載のアレイであって、前記プローブの少なくとも１つが、標識されている、アレイ。
【請求項７５】
請求項７４に記載のアレイであって、前記標識が、化学標識、酵素標識、免疫原性標識、放射性標識、蛍光標識、発光標識およびＦＲＥＴ標識からなる群より選択される、アレイ。
【請求項７６】
請求項７０に記載のアレイであって、前記支持体が、シリコン表面、プラスチック表面、ガラス表面、セラミック表面、ゴム表面、およびポリマー表面からなる群より選択される表面を含む、アレイ。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公表番号】特表２００７−５０６４０２（Ｐ２００７−５０６４０２Ａ）
【公表日】平成１９年３月２２日（２００７．３．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５０３１７６（Ｐ２００５−５０３１７６）
【出願日】平成１５年７月１８日（２００３．７．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＮ２００３／０００５８０
【国際公開番号】ＷＯ２００５／００１１２３
【国際公開日】平成１７年１月６日（２００５．１．６）
【出願人】（５０３０１２２０３）ツィンフア ユニバーシティ (10)
【出願人】（５０４２７８２６０）キャピタルバイオ コーポレーション (10)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年３月２２日（２００７．３．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１５年７月１８日（２００３．７．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＮ２００３／０００５８０
【国際公開番号】ＷＯ２００５／００１１２３
【国際公開日】平成１７年１月６日（２００５．１．６）
【出願人】（５０３０１２２０３）ツィンフア ユニバーシティ (10)
【出願人】（５０４２７８２６０）キャピタルバイオ コーポレーション (10)
【Ｆターム（参考）】
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