Ｇタンパク質共役型受容体に対する結合性評価方法及び評価用組成物、融合タンパク質、並びに、遺伝子
【課題】被検化合物のＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）に対する結合性を簡便かつハイスループットに評価する。
【解決手段】所望のＧＰＣＲのＮ末端側に折り畳み因子が連結され且つＣ末端側にＧタンパク質αサブユニットが連結された融合タンパク質に、被検化合物を接触させ、次いで、前記Ｇタンパク質αサブユニットとＧＴＰ又はＧＴＰアナログとの結合の有無を検出し、該検出結果によって前記被検化合物の前記ＧＰＣＲに対する結合性を評価する。折り畳み因子の作用によりＧＰＣＲが可溶性の状態で解析でき、より簡便かつハイスループットにＧＰＣＲに対する結合性評価を行なうことができる。
【解決手段】所望のＧＰＣＲのＮ末端側に折り畳み因子が連結され且つＣ末端側にＧタンパク質αサブユニットが連結された融合タンパク質に、被検化合物を接触させ、次いで、前記Ｇタンパク質αサブユニットとＧＴＰ又はＧＴＰアナログとの結合の有無を検出し、該検出結果によって前記被検化合物の前記ＧＰＣＲに対する結合性を評価する。折り畳み因子の作用によりＧＰＣＲが可溶性の状態で解析でき、より簡便かつハイスループットにＧＰＣＲに対する結合性評価を行なうことができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｇタンパク質共役型受容体に対する結合性評価方法及び評価用組成物、融合タンパク質、並びに、遺伝子に関し、さらに詳細には、折り畳み因子とＧタンパク質共役型受容体との融合タンパク質を用いる簡便且つハイスループットなＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価方法、該評価方法に用いるための組成物、融合タンパク質、及び融合タンパク質をコードする遺伝子に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞表面上の膜受容体タンパク質は、細胞外の情報を細胞内へ伝達する極めて重要な働きをしている。そのため、膜受容タンパク質に結合する物質はアゴニスト型医薬品やアンタゴニスト型医薬として候補物質となり、受容体タンパク質と被検化合物との結合性を解析することは、医薬品開発において極めて重要である。膜受容体タンパク質の中でも特にＧタンパク質共役型受容体（Ｇ ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ。以下、「ＧＰＣＲ」と略記する。）は、現在市販されている低分子医薬品の約半数がこの受容体を標的としているため、医薬品開発において極めて注目を集めている。また、ＧＰＣＲの約半数が、生体内で機能しているナチュラルリガンドが同定されていないオーファンＧＰＣＲであり、ナチュラルリガンドやその類縁化合物が新規医薬品の候補物質として期待されていることから、オーファンＧＰＣＲに対するリガンドのスクリーニングが熾烈を極めている。
【０００３】
ＧＰＣＲは細胞膜を貫通して存在する受容体の１つであり、細胞膜を７回貫通し、そのＮ末端を細胞外に、Ｃ末端を細胞内に向けて存在している。ＧＰＣＲは細胞外からリガンドの刺激を受け取り、細胞内のＧタンパク質を活性化する機能を有する。Ｇタンパク質は、α、β、γの３種のサブユニットからなる３量体タンパク質であり、ＧＰＣＲからの刺激を受け取ると、αサブユニットに結合していたＧＤＰ（グアノシン５’二リン酸）がＧＴＰ（グアノシン５’三リン酸）に置換され（ＧＤＰ−ＧＴＰ交換反応）、さらにαサブユニットがβ、γサブユニットから遊離する。遊離したＧタンパク質αサブユニット−ＧＴＰ結合体は、セカンドメッセンジャーを制御する細胞内の効果器を活性化すると共に、自分自身のＧＴＰａｓｅ活性によりＧＴＰを加水分解し、αサブユニット−ＧＤＰ結合体となり、再びβγサブユニットと会合し不活性型となる。
【０００４】
Ｇタンパク質αサブユニットは、そのＧタンパク質の標的分子の種類によってＧｓ、Ｇｉ、Ｇｑ、Ｇ１２の４つのファミリーに分類されている。さらに、各ファミリーはメンバーに細分類されている。例えば、Ｇｉファミリーはαi-1〜4、αo-1〜2、αt-1〜2、αgust、αZの各メンバーに、Ｇ１２ファミリーはα12、α13の各メンバーに細分類されている。
【０００５】
ＧＰＣＲをターゲットとするリガンドのスクリーニングは、リガンドの候補となる被検化合物と所望のＧＰＣＲとの結合性を評価し、特異的に結合したものを選抜することにより行なわれる。結合性の評価方法は、大きく分けて、生きた動物細胞を用いる方法と、細胞膜画分を用いるインビトロの方法の２種類がある。動物細胞を用いる方法は、ＣＨＯ細胞やＨＥＫ２９３細胞などの動物細胞に目的とするＧＰＣＲ遺伝子を導入し、膜表面に発現させた細胞を用いてアッセイする方法である。すなわち、ＧＰＣＲにリガンドが結合した際に共役するＧタンパク質のシグナル伝達を介した細胞内カルシウム濃度変化やｃＡＭＰの濃度変化などのシグナル伝達を、蛍光プローブなどで検出する方法である。
【０００６】
細胞膜画分を用いるインビトロの方法は、ＧＰＣＲとリガンドとの結合を検出する手段の違いによって、さらにいくつかに分類される。一つの例は、標識化したリガンド候補物質を用いる方法である。例えば、ＧＰＣＲを膜表面に発現させた昆虫細胞や動物細胞から調製した細胞膜画分を基板上に固定化させ、リガンドの結合を検出する方法が開発されている。具体例としては、アミノプロピルシランコートしたスライドガラス上にＧＰＣＲが発現した膜画分を固定化したＧＰＣＲチップが開発されている（非特許文献１）。これは、放射性標識したリガンド候補物質を用いてＧＰＣＲとリガンドの結合を検出するものである。
【０００７】
リガンド候補物質を標識化しない方法としては、表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ法）を用いてＧＰＣＲとリガンド候補物質との結合を検出する方法もある。
【０００８】
リガンド候補物質を標識化しない他の方法としては、ＧＰＣＲとリガンドとの結合を、Ｇタンパク質への活性化に基づいて検出する方法が提案されている。例えば、ＧＰＣＲのＣ末端にＧタンパク質αサブユニットを連結させた融合タンパク質を、昆虫細胞に発現させ、該昆虫細胞から細胞膜画分を調製する。次に、該細胞膜画分を試料とし、リガンド候補物質と細胞膜画分中のＧＰＣＲとの結合にともなうＧタンパク質αサブユニット上のＧＤＰ−ＧＴＰ交換反応を、放射性標識したＧＴＰを用いることにより検出し、ＧＰＣＲ−Ｇタンパク質αサブユニット−ＧＴＰ連結体の形成を検出する方法が報告されている（非特許文献２）。
【０００９】
細胞膜画分を用いないインビトロの方法も提案されている。例えば、シャペロニンとＧＰＣＲとの融合タンパク質を構築し、該ＧＰＣＲと被検化合物との結合性をＳＰＲ法で評価する方法が提案されている（特許文献１）。
【特許文献１】特開２００４−８５５４２号公報
【非特許文献１】ファング（Ｆａｎｇ）ら，ケムバイオケム（ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ），２００２年，第３巻，ｐ．９８７−
【非特許文献２】武田ら，ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），２００４年，第１３５巻，ｐ．５９７−
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
しかし、生きた動物細胞を用いる方法は、ＧＰＣＲの種類によっては動物細胞内で必要量が発現しないものが少なくなく、また、発現したとしても発現量を安定に制御することが困難という問題がある。また、ＧＰＣＲの種類によっては共役するＧタンパク質の種類が決まっているため、ＧＰＣＲ遺伝子だけでなく、対応するＧタンパク質の遺伝子を細胞内に導入し、細胞内でシグナル伝達系を再構築する必要がある。さらに、これらの細胞を培養し、目的のタンパク質群を発現させるためには、費用、時間などがかさみ、培養途中のコンタミネーションの防止など熟練した操作が要求される。
【００１１】
また、標識化したリガンド候補物質を用いる方法は、あらかじめリガンド候補の全てに対して、蛍光標識等をする必要があり、操作が煩雑である。また、ＧＰＣＲと非特異的に結合しているリガンド候補物質も検出してしまうため、リガンド候補物質に対して常に正しい評価ができるとは限らない。
【００１２】
また、ＳＰＲ法を用いる方法は、リガンド候補物質を標識せずにすむ利点はあるものの、やはり、ＧＰＣＲとリガンド候補物質との結合が特異的なものかどうかを判断することは困難である。これはシャペロニンとＧＰＣＲとの融合タンパク質を用いる方法でも同じである。
【００１３】
また、ＧＰＣＲ−Ｇタンパク質αサブユニット−ＧＴＰの複合体の形成を検出する方法は、放射性物質を使用するので特別な施設が必要であり、簡便でハイスループットな評価方法とは言えない。また、放射性標識の代わりに蛍光標識されたＧＴＰを使用することも考えられるが、感度を上げるためには高価な細胞膜画分を大量に必要とするため、やはりハイスループット性に欠ける。
以上より、より簡便且つハイスループットなＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価方法が求められている。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
上記した課題を解決するための請求項１に記載の発明は、被検化合物のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性を評価する方法であって、所望のＧタンパク質共役型受容体のＮ末端側に折り畳み因子が連結され且つＣ末端側にＧタンパク質αサブユニットが連結された融合タンパク質に被検化合物を接触させたときの、前記Ｇタンパク質αサブユニットとＧＴＰ又はＧＴＰアナログとの結合の有無を検出することにより、前記被検化合物の前記Ｇタンパク質共役型受容体に対する結合性を評価することを特徴とするＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価方法である。
【００１５】
また請求項２に記載の発明は、下記工程（１）〜（４）を包含することを特徴とする請求項１に記載のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価方法である。
（１）前記融合タンパク質とＧＴＰ又はＧＴＰアナログとを含有する反応液を調製する工程、
（２）工程（１）で調製した反応液に被検化合物を添加し、前記融合タンパク質に被検化合物を接触させる工程、
（３）工程（２）に続いて、前記Ｇタンパク質αサブユニットに結合したＧＴＰ又はＧＴＰアナログの量を測定し、前記Ｇタンパク質αサブユニットとＧＴＰ又はＧＴＰアナログとの結合の有無を検出する工程、
（４）工程（３）で前記Ｇタンパク質αサブユニットとＧＴＰ又はＧＴＰアナログとの結合が検出された場合に、前記被検化合物は前記Ｇタンパク質共役型受容体に対する結合性を有すると評価する工程。
【００１６】
また請求項３に記載の発明は、前記工程（１）の反応液は、さらにＧＤＰを含有することを特徴とする請求項２に記載のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価方法である。
【００１７】
本発明のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価方法においては、所望のＧタンパク質共役型受容体のＮ末端側に折り畳み因子が連結され且つＣ末端側にＧタンパク質αサブユニットが連結された融合タンパク質を使用する。そして、被検化合物と融合タンパク質中のＧＰＣＲとの結合性を、Ｇタンパク質αサブユニットとＧＴＰ又はＧＴＰアナログとの結合の有無をもって検出する。折り畳み因子は、他のタンパク質の折り畳み反応（フォールディング）を促進する作用を有するタンパク質の総称であり、この作用により他のタンパク質が正しく折り畳まれた可溶性タンパク質として得られる。したがって、本発明のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価方法においては、融合タンパク質中のＧＰＣＲが可溶性タンパク質として存在することができる。その結果、不溶性の細胞膜画分を使用する従来の方法に比べて操作性がよい。さらに、組換えＤＮＡ技術によって当該融合タンパク質を生産することができるので、ＧＰＣＲを多量に取得することができ、効率的である。なお、本発明における「折り畳み因子」には、マルトース結合タンパク質のように別の主な活性を持ちながらタンパク質を折り畳む作用も有するタンパク質も含むものとする。
【００１８】
請求項４に記載の発明は、前記折り畳み因子は、シャペロニンサブユニット又はシャペロニンサブユニット連結体であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価方法である。
【００１９】
折り畳み因子は、酵素的に働くフォルダーゼと非酵素的に働く分子シャペロンとに分類される。シャペロニンは分子シャペロンの一種であり、分子量約６万のサブユニット（シャペロニンサブユニット）からなる複合タンパク質ある。代表的なシャペロニンは、シャペロニンサブユニット７〜９個からなるリング状構造体が２個重なった、総分子量８０万〜１００万程度のシリンダー状の巨大な複合タンパク質である。そして、シャペロニンはその内部に他のタンパク質を格納し、正しく折り畳むことができる。そして、本発明のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価方法においては、シャペロニンサブユニット又はシャペロニンサブユニット連結体と、ＧＰＣＲと、Ｇタンパク質αサブユニットとの融合タンパク質を用いる。かかる構成により、ＧＰＣＲがシャペロニンの内部に格納されて折り畳まれ、より容易に可溶性の状態で存在することができる。さらに、シャペロニンサブユニットの遺伝子は単離されているものが多いので、組換えＤＮＡ技術によって当該融合タンパク質をより容易に生産することができる。
【００２０】
ここで、「シャペロニンサブユニット」という語は、単独の分子である場合（単独のシャペロニンサブユニット）の他に、融合タンパク質の一部である場合にも用いる。また、「シャペロニンサブユニット連結体」とは、２個以上のシャペロニンサブユニットがタンデムに連結された人工タンパク質をいう。さらに、Ｎ個のシャペロニンサブユニットからなるシャペロニンサブユニット連結体を、「シャペロニンサブユニットＮ回連結体」と呼ぶこととする。
【００２１】
請求項５に記載の発明は、前記シャペロニンサブユニット又はシャペロニンサブユニット連結体は、シングルリングを形成するものであることを特徴とする請求項４に記載のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価方法である。
【００２２】
一般的なシャペロニンは、リング状構造体が２個重なったダブルリング構造を有しているが、リング状構造体１つからなる「シングルリング」のシャペロニンも知られている。そして、本発明のタンパク質共役型受容体に対する結合性評価方法においては、シングルリングを形成するシャペロニンサブユニット又はシャペロニンサブユニット連結体を用いる。かかる構成により、被検化合物がＧＰＣＲに結合する際の立体的な障害が少ない。
【００２３】
請求項６に記載の発明は、前記シャペロニンサブユニット連結体は、該シャペロニンサブユニットの由来によって決定される最適数のシャペロニンサブユニットが連結されたものであることを特徴とする請求項４又は５に記載のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価方法である。
【００２４】
天然において、シャペロニンを形成しているシャペロニンサブユニットの合計数は、シャペロニンの由来によって概ね決まっている。例えば、細菌由来の場合は７個、古細菌由来の場合は８又は９個、真核生物由来の場合は８個（ミトコンドリア由来の場合は７個）である。すなわち、これらの数が各由来のシャペロニンにおける最適数である。そして、本発明のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価方法においては、融合タンパク質中のシャペロニンサブユニット連結体が、該最適数のシャペロニンサブユニットからなる。かかる構成により、融合タンパク質がより安定なリング構造体を形成することができる。
【００２５】
請求項７に記載の発明は、前記シャペロニンサブユニット又はシャペロニンサブユニット連結体は、大腸菌由来のシャペロニンサブユニットからなることを特徴とする請求項４〜６のいずれかに記載のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価方法である。
【００２６】
大腸菌由来のシャペロニンはＧｒｏＥＬと呼ばれ、その生化学的・物理化学的性質がよく研究されている。また、そのサブユニットの遺伝子も単離されている。したがって、本発明のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価方法においては、融合タンパク質をコードする融合遺伝子を容易に構築することができ、融合タンパク質の調製が容易である。
【００２７】
請求項８に記載の発明は、前記ＧＴＰアナログは、ＧＴＰ−γＳ又はＧＴＰ−ＰＮＰであることを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価方法である。
【００２８】
Ｇタンパク質αサブユニットはＧＴＰａｓｅ活性を有し、自身に結合したＧＴＰを加水分解してＧＤＰとして解離する作用を有する。本発明のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価方法においては、加水分解が制限されたＧＴＰアナログであるＧＴＰ−γＳ又はＧＴＰ−ＰＮＰを使用する。かかる構成により、より安定なＧタンパク質αサブユニットとＧＴＰアナログとの結合体を形成することができる。
【００２９】
請求項９に記載の発明は、前記ＧＴＰ又はＧＴＰアナログは、放射性標識されたものであることを特徴とする請求項１〜８のいずれかに記載のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価方法である。
【００３０】
ＧＰＣＲにリガンドが結合すると、Ｇタンパク質のαサブユニットに結合していたＧＤＰがＧＴＰと置換する（ＧＤＰ−ＧＴＰ交換反応）。この反応は、放射性標識されたＧＴＰ又はＧＴＰアナログでも起こる。本発明のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価方法においては、放射性標識されたＧＴＰ又はＧＴＰアナログがＧタンパク質αサブユニットに結合することを検出するので、感度が高い。
【００３１】
請求項１０に記載の発明は、前記ＧＴＰ又はＧＴＰアナログは、蛍光標識されたものであることを特徴とする請求項１〜８のいずれかに記載のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価方法である。
【００３２】
本発明のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価方法においては、蛍光標識されたＧＴＰ又はＧＴＰアナログを用いる。蛍光標識されたＧＴＰ又はＧＴＰアナログは、Ｇタンパク質αサブユニットに結合すると強い蛍光を発し、遊離の状態ではクエンチングが起こり蛍光が弱まる。かかる構成により、Ｇタンパク質αサブユニットに結合した蛍光標識ＧＴＰ又はＧＴＰアナログが発する蛍光を正確に検出することができる。
【００３３】
請求項１１に記載の発明は、Ｇタンパク質αサブユニットに結合したＧＴＰ又はＧＴＰアナログと、結合しなかった遊離のＧＴＰ又はＧＴＰアナログとを分離することなく、Ｇタンパク質αサブユニットに結合したＧＴＰ又はＧＴＰアナログが発する蛍光を特異的に検出し、前記Ｇタンパク質αサブユニットとＧＴＰ又はＧＴＰアナログとの結合の有無を検出することを特徴とする請求項１０に記載のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価方法である。
【００３４】
本発明のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価方法においては、Ｇタンパク質αサブユニットに結合したＧＴＰ又はＧＴＰアナログと、結合しなかった遊離のＧＴＰ又はＧＴＰアナログとの分離、すなわちＢ／Ｆ分離を行なうことなくＧタンパク質αサブユニットに結合したＧＴＰ又はＧＴＰアナログが発する蛍光を特異的に検出する。かかる構成により、より簡便な操作でＧタンパク質共役型受容体に対する結合性の評価を行なうことができる。
【００３５】
請求項１２に記載の発明は、蛍光相関分光法又は蛍光偏光測定法によって、Ｇタンパク質αサブユニットに結合したＧＴＰ又はＧＴＰアナログが発する蛍光を特異的に検出することを特徴とする請求項１１に記載のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価方法である。
【００３６】
かかる構成により、より高感度でＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価を行なうことができる。
【００３７】
請求項１３に記載の発明は、前記融合タンパク質に代わって、Ｇタンパク質共役型受容体のＮ末端側に折り畳み因子が連結された融合タンパク質と、遊離のＧタンパク質αサブユニットとを使用することを特徴とする請求項１〜１２のいずれかに記載のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価方法である。
【００３８】
本発明のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価方法では、Ｇタンパク質共役型受容体のＮ末端側に折り畳み因子が連結された融合タンパク質と、遊離のＧタンパク質αサブユニットとを使用する。かかる構成により、融合タンパク質の分子量が小さくなり、融合タンパク質の調製が容易である。
【００３９】
請求項１４に記載の発明は、請求項１〜１２のいずれかに記載のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価方法に用いるための組成物であって、所望のＧタンパク質共役型受容体のＮ末端側に折り畳み因子が連結され且つＣ末端側にＧタンパク質αサブユニットが連結された融合タンパク質を含有することを特徴とするＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価用組成物である。
【００４０】
本発明はＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価用組成物にかかり、所望のＧタンパク質共役型受容体のＮ末端側に折り畳み因子が連結され且つＣ末端側にＧタンパク質αサブユニットが連結された融合タンパク質を含有する。本発明のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価用組成物によれば、融合タンパク質中のＧＰＣＲが可溶性タンパク質として存在することができる。その結果、従来用いられていた不溶性の細胞膜画分（懸濁液）に比べて、容易かつ正確にＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価を行なうことができる。
【００４１】
請求項１５に記載の発明は、請求項１３に記載のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価方法に用いるための組成物であって、Ｇタンパク質共役型受容体のＮ末端側に折り畳み因子が連結された融合タンパク質と、遊離のＧタンパク質αサブユニットとを含有することを特徴とするＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価用組成物である。
【００４２】
本発明もＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価用組成物にかかり、Ｇタンパク質共役型受容体のＮ末端側に折り畳み因子が連結された融合タンパク質と、遊離のＧタンパク質αサブユニットとを含有する。本発明のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価用組成物においては、含有される融合タンパク質の分子量が小さいので、融合タンパク質の調製が容易である。
【００４３】
請求項１６に記載の発明は、さらにＧＤＰを含有することを特徴とする請求項１４又は１５に記載のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価用組成物である。
【００４４】
また請求項１７に記載の発明は、さらにＧＴＰ又はＧＴＰアナログを含有することを特徴とする請求項１４〜１６のいずれかに記載のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価用組成物である。
【００４５】
かかる構成により、被検化合物を用意するだけでＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価を行なうことができる。
【００４６】
請求項１８に記載の発明は、前記ＧＴＰ又はＧＴＰアナログは、蛍光標識されたものであることを特徴とする請求項１７に記載のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価用組成物である。
【００４７】
かかる構成により、Ｂ／Ｆ分離を行なうことなくＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価を行なうことができる。
【００４８】
請求項１９に記載の発明は、前記折り畳み因子は、シャペロニンサブユニット又はシャペロニンサブユニット連結体であることを特徴とする請求項１４〜１８のいずれかに記載のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価用組成物である。
【００４９】
また請求項２０に記載の発明は、前記シャペロニンサブユニット又はシャペロニンサブユニット連結体は、シングルリングを形成するものであることを特徴とする請求項１９に記載のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価用組成物である。
【００５０】
また請求項２１に記載の発明は、前記シャペロニンサブユニット連結体は、該シャペロニンサブユニットの由来によって決定される最適数のシャペロニンサブユニットが連結されたものであることを特徴とする請求項１９又は２０に記載のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価用組成物である。
【００５１】
また請求項２２に記載の発明は、前記シャペロニンサブユニット又はシャペロニンサブユニット連結体は、大腸菌由来のシャペロニンサブユニットからなることを特徴とする請求項１９〜２１のいずれかに記載のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価用組成物である。
【００５２】
かかる構成により、融合タンパク質中のＧＰＣＲがシャペロニンリング内に格納され、より容易に可溶性タンパク質として存在することができる。
【００５３】
請求項２３に記載の発明は、Ｇタンパク質共役型受容体タンパク質のＮ末端側に折り畳み因子が結合され且つＣ末端側にＧタンパク質αサブユニットが連結されていることを特徴とする融合タンパク質である。
【００５４】
本発明は融合タンパク質にかかり、Ｇタンパク質共役型受容体タンパク質のＮ末端側に折り畳み因子が結合され且つＣ末端側にＧタンパク質αサブユニットが連結されていることを特徴とする。本発明の融合タンパク質によれば、融合タンパク質中のＧＰＣＲが折り畳まれ、可溶性の状態で存在することができるので、より簡便かつ正確に該ＧＰＣＲに対する結合性評価を行なうことができる。
【００５５】
請求項２４に記載の発明は、前記折り畳み因子は、シャペロニンサブユニット又はシャペロニンサブユニット連結体であることを特徴とする請求項２３に記載の融合タンパク質である。
【００５６】
また請求項２５に記載の発明は、前記シャペロニンサブユニット又はシャペロニンサブユニット連結体は、シングルリングを形成するものであることを特徴とする請求項２４に記載の融合タンパク質である。
【００５７】
また請求項２６に記載の発明は、前記シャペロニンサブユニット連結体は、該シャペロニンサブユニットの由来によって決定される最適数のシャペロニンサブユニットが連結されたものであることを特徴とする請求項２４又は２５に記載の融合タンパク質である。
【００５８】
また請求項２７に記載の発明は、前記シャペロニンサブユニット又はシャペロニンサブユニット連結体は、大腸菌由来のシャペロニンサブユニットからなることを特徴とする請求項２４〜２６のいずれかに記載の融合タンパク質である。
【００５９】
かかる構成により、ＧＰＣＲがシャペロニンリングの内部に格納され、より容易にＧＰＣＲが可溶性タンパク質として存在することができる。
【００６０】
請求項２８に記載の発明は、請求項２３〜２７のいずれかに記載の融合タンパク質をコードする遺伝子である。
【００６１】
本発明の遺伝子は、Ｇタンパク質共役型受容体タンパク質のＮ末端側に折り畳み因子が結合され且つＣ末端側にＧタンパク質αサブユニットが連結されている融合タンパク質をコードする。本発明の遺伝子を転写・翻訳することにより、ＧＰＣＲに対する結合性評価に有用な該融合タンパク質を生産することができる。
【発明の効果】
【００６２】
本発明のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価方法によれば、ＧＰＣＲが可溶性の状態で解析するので、より簡便且つハイスループットにＧＰＣＲに対する結合性評価を行なうことができる。
【００６３】
本発明のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価用組成物によれば、ＧＰＣＲが可溶性の状態で存在するので、より簡便且つハイスループットにＧＰＣＲに対する結合性評価を行なうことができる。
【００６４】
本発明の融合タンパク質によれば、ＧＰＣＲが可溶性の状態で存在することができるので、より簡便且つハイスループットにＧＰＣＲに対する結合性評価を行なうことができる。
【００６５】
本発明の遺伝子によれば、折り畳み因子とＧＰＣＲとＧタンパク質αサブユニットとの融合タンパク質をより簡便に生産することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６６】
以下、本発明を実施するための最良の形態について、詳しく説明する。
【００６７】
本発明のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価方法においては、所望のＧタンパク質共役型受容体のＮ末端側に折り畳み因子が連結され且つＣ末端側にＧタンパク質αサブユニットが連結された融合タンパク質を用いる。そして、該融合タンパク質に被検化合物を接触させ、そのときの前記Ｇタンパク質αサブユニットとＧＴＰ又はＧＴＰアナログとの結合の有無を検出する。そして、その検出結果により、前記被検化合物の前記Ｇタンパク質共役型受容体に対する結合性を評価する。
【００６８】
本発明のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価方法で用いる融合タンパク質は、所望のＧタンパク質共役型受容体のＮ末端側に折り畳み因子が連結され且つＣ末端側にＧタンパク質αサブユニットが連結されたものである。これは、換言すれば、「折り畳み因子−所望のＧＰＣＲ−Ｇタンパク質αサブユニット」の順で連結された融合タンパク質で、折り畳み因子側がＮ末端、Ｇタンパク質αサブユニット側がＣ末端となるものである。ＧＰＣＲは疎水性が高いので単独では不溶性となるが、この融合タンパク質中のＧＰＣＲは、隣接する折り畳み因子の作用によって可溶性となる。その結果、従来のように不溶性の細胞膜画分を使用することなく、ＧＰＣＲに対する結合性評価を行なうことができる。
【００６９】
本発明のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価方法の好ましい実施形態は、４つの工程を包含する。第１の工程では、融合タンパク質とＧＴＰ又はＧＴＰアナログとを含有する反応液を調製する。このとき、該反応液はさらにＧＤＰを含有していることが好ましい。このとき、反応液中では、融合タンパク質中のＧタンパク質αサブユニットとＧＴＰ又はＧＴＰアナログとは結合せず、ＧＴＰ又はＧＴＰアナログが遊離状態で存在する。ＧＤＰが存在すると、ＧＤＰは融合タンパク質中のＧタンパク質αサブユニットに結合している。
【００７０】
第２の工程では、第１の工程で調製した反応液に被検化合物を添加し、上記融合タンパク質に被検物質を接触させる。このとき、被検化合物が目的のリガンドであれば、該被検化合物が融合タンパク質中のＧＰＣＲに結合し、該ＧＰＣＲに構造変化が起こる。その結果、融合タンパク質中のＧタンパク質αサブユニットに、ＧＴＰ又はＧＴＰアナログが結合する。ＧＤＰが存在すると、融合タンパク質中のＧタンパク質αサブユニットに結合していたＧＤＰが、ＧＴＰ又はＧＴＰアナログと置き換わる（ＧＤＰ−ＧＴＰ交換反応）。一方、被検化合物が目的のリガンドでない場合はＧＰＣＲに結合しないので、ＧＴＰ又はＧＴＰアナログはＧＰＣＲに結合しない。
【００７１】
第３の工程では、第２の工程に続いて、Ｇタンパク質αサブユニットに結合したＧＴＰ又はＧＴＰアナログの量を測定し、Ｇタンパク質αサブユニットとＧＴＰ又はＧＴＰアナログとの結合の有無を検出する。換言すれば、Ｇタンパク質αサブユニットに結合したＧＴＰ又はＧＴＰアナログと、遊離状態のＧＴＰ又はＧＴＰアナログとを区別し、Ｇタンパク質αサブユニットに結合したＧＴＰ又はＧＴＰアナログのみを選択的に測定する。そして、この測定結果をもってＧタンパク質αサブユニットとＧＴＰ又はＧＴＰアナログとの結合の有無を検出する。この際、Ｇタンパク質αサブユニットに結合したＧＴＰ又はＧＴＰアナログのみを選択的に測定する方法として、後述する様々の実施形態が可能である。
【００７２】
第４の工程では、第３の工程で前記Ｇタンパク質αサブユニットとＧＴＰ又はＧＴＰアナログとの結合が検出された場合に、上記被検化合物は上記Ｇタンパク質共役型受容体に対する結合性を有すると評価する。このようにしてＧタンパク質共役型受容体に結合すると評価された被検化合物は、特定のＧＰＣＲに対するリガンドである可能性が高く、医薬品開発等に有用と考えられる。
【００７３】
好ましい実施形態では、ＧＴＰ又はＧＴＰアナログとして加水分解が制限されたＧＴＰアナログを用いる。すなわち、そのようなＧＴＰアナログは、Ｇタンパク質αサブユニットが有するＧＴＰａｓｅ活性により加水分解されにくい。該ＧＴＰアナログの例としては、ＧＴＰγＳとＧＭＰ−ＰＮＰ（ＧｐｐＮＨｐ）が挙げられる。ＧＴＰγＳは、ＧＴＰのγ位のＰがＳに置換されたＧＴＰアナログである。またＧＭＰ−ＰＮＰは、ＧＴＰのγ位のリン酸結合に２級アミンが導入されたＧＴＰアナログである。その他、ＧＴＰアナログとしては、トリニトロ基を有するＧＴＰアナログなども用いることができる。
【００７４】
また、好ましい実施形態では、蛍光標識されたＧＴＰ又はＧＴＰアナログを用いる。標識に用いる蛍光物質の例としては、フルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体などが挙げられる。特に、Ｇタンパク質αサブユニットに結合したときに、その蛍光強度が増強されるものが好ましい。例えば、モレキュラープローブ社から市販されているBODIPYR FL、BODIPY R6G、BODIPY TR、N-methylanthraniloyl(MANT) fluorophoreなどの蛍光プローブをＧＴＰ又はＧＴＰアナログに結合させた蛍光標識体の場合、遊離状態ではＧＴＰのもつクエンチング効果により蛍光が消光するが、Ｇタンパク質αサブユニットに結合した状態ではクエンチング効果が抑制され、本来持つ蛍光を発することが知られている。したがって、このような蛍光標識ＧＴＰ又はＧＴＰアナログを用いれば、遊離の蛍光標識ＧＴＰ又はＧＴＰアナログと、Ｇタンパク質αサブユニットに結合した蛍光標識ＧＴＰ又はＧＴＰアナログとを分離（Ｂ／Ｆ分離）することなく、一液系でＧタンパク質αサブユニットに結合した蛍光標識ＧＴＰ又はＧＴＰアナログが発する蛍光を特異的に測定することができる。その結果、ハイスループット性の高いホモジニアスなアッセイを行うことが可能となる。
【００７５】
また、遊離状態ではクエンチングが起こる蛍光標識ＧＴＰ又はＧＴＰアナログを用いる場合は、蛍光相関分光法又は蛍光偏光法を用いることで、さらに高感度なアッセイが可能となる。例えば、蛍光相関分光法は、蛍光物質１分子レベルでそのブラウン運動を検出することができる測定方法であり、低分子化合物と高分子化合物のブラウン運動の違いを高感度に検出することができる。したがって、遊離の蛍光標識ＧＴＰ又はＧＴＰアナログ（低分子化合物）とＧ−タンパク質αサブユニットを介して融合タンパク質に結合した蛍光標識ＧＴＰ又はＧＴＰアナログ（高分子化合物）の違いを検出でき、Ｂ／Ｆ分離を行なうことなくさらに高感度な検出が可能である。一方、蛍光偏光法は、蛍光相関分光法や通常の蛍光分光法に比べて感度は劣るものの、やはり高分子化合物と低分子化合物の濃度変化を検出することができるため、Ｂ／Ｆ分離を行うことなく、ホモジニアスなアッセイが可能となる。なお、蛍光相関分光法や蛍光偏光法を適用するためには、ＧＰＣＲやＧタンパク質αサブユニットがコロイド状に分散するか可溶性の状態であることが必要であり、従来の不溶性の細胞膜画分を用いる方法では適用できない。
【００７６】
他方、ＧＴＰ又はＧＴＰアナログを放射性標識して用いることもできる。この場合は、Ｂ／Ｆ分離を行ない、Ｇタンパク質αサブユニットに結合した放射性標識ＧＴＰ又はＧＴＰアナログから発せられる放射線を検出する。
【００７７】
融合タンパク質に用いられる折り畳み因子は、分子シャペロンとフォルダーゼのいずれも使用可能である。分子シャペロンの例としては、シャペロニン、Ｈｓｐ７０等が挙げられ、フォルダーゼの例としては、ペプチジルプロリルシストランスイソメラーゼやプロテインジスルフィドイソメラーゼが挙げられるが、シャペロニンが特に好ましい。
【００７８】
シャペロニンは、グループ１型とグループ２型とに大別される。バクテリアや真核生物のオルガネラに存在するシャペロニンはグループ１型に分類され、いずれも分子量６０ｋＤａからなるシャペロニンサブユニット７つが環状に連なるリング構造を形成し、さらに２つのリングが２層構造を形成する、１４量体のホモオリゴマーを形成する。これらはコシャペロニンと称される分子量約１０ｋＤａのタンパク質の環状７量体を補因子とする。一方、グループ２型シャペロニンは、真核生物の細胞質や古細菌にみられ、通常８〜９個のシャペロニンサブユニットからなるリングが２層に連なった１６〜１８量体のホモ、またはヘテロオリゴマーを形成している。本発明のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価方法においては、融合タンパク質に含まれるシャペロニンとしてグループ１型及びグループ２型のいずれのシャペロニンも使用可能である。ここで、１型シャペロニンの例として、大腸菌由来のシャペロニンであるＧｒｏＥＬのサブユニット（ＧｒｏＥＬサブユニット）の遺伝子の塩基配列と対応するアミノ酸配列を配列番号１に、対応するアミノ酸配列のみを配列番号２に示す。
【００７９】
バクテリア、古細菌由来のシャペロニンは、組換えＤＮＡ技術により、大腸菌の細胞質可溶性画分に大量生産させることがすでに可能である。さらに、そのようにして発現させた様々のシャペロニンサブユニットであっても、自己集合し、１４〜１８量体からなる２層リング構造のシャペロニン複合体を形成できることが、電子顕微鏡による観察でわかっている。
【００８０】
好ましい実施形態では、シャペロニンサブユニット連結体を使用する。すなわち、シャペロニンサブユニット連結体においても、単独のシャペロニンサブユニットを補充しながら、天然型シャペロニンと同様にリング構造を構成することがわかっている。そして、シャペロニンサブユニット連結体のＣ末端側に目的タンパク質を連結させた融合タンパク質において、その目的タンパク質がシャペロニンのキャビティー内に格納された状態で発現できることがわかっている（古谷ら，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００５，１４，３４１）。本発明のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価方法で用いる融合タンパク質においても、このようなシャペロニンサブユニット連結体のＣ末端側に所望のＧＰＣＲを連結させ、さらに該ＧＰＣＲのＣ末端側にＧタンパク質αサブユニットを連結させることにより、該ＧＰＣＲがシャペロニンのキャビティー内部に格納され、Ｇタンパク質αサブユニットがＧＰＣＲと連結した状態でシャペロニンキャビティー外部に提示させることが可能となる。また、シャペロニンサブユニットＮ回連結体の連結数（Ｎ）は、そのシャペロニンサブユニットの由来によって決定される最適数であることが特に好ましく、グループ１型シャペロニンのサブユニットを用いる場合には７個、グループ２型シャペロニンのサブユニットを用いる場合には８又は９個が好ましい。これらの最適数であれば、シャペロニンサブユニット連結体のみでシャペロニンリングを形成することができ、単独のシャペロニンサブユニットを補充する必要がない。
【００８１】
好ましい実施形態では、シングルリングを形成するシャペロニンを用いる。すなわち、近年、遺伝子工学的にアミノ酸変異を導入することにより、上述のような２層のリング構造を形成せず、シングルリングを形成するようなシャペロニンも得られるようになってきた。これらのシングルリングを形成するシャペロニンも、大腸菌の可溶性画分に大量発現することができ、ゲル濾過や電子顕微鏡及び画像解析等によって発現産物の大部分がシングルリングを構成していることが確認されている。そして、かかるシングルリングのシャペロニンでも他のタンパク質を収容できるキャビティーが充分に形成されることが確認されており、他のタンパク質の折り畳みを行うことができる（特開２００４−４３４４７号公報）。なお、真核生物のミトコンドリア由来のシャペロニン６０は、通常、シングルリングとして精製されるため、特別の遺伝子操作なしで得ることができる（Ｖｉｉｔａｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７，６９５−６９８）。
【００８２】
また、人為的にシングルリングを形成させる手段としては様々な方法があり、いずれの手段を用いてもかまわない。最も一般的に用いられている方法は、リング間の疎水的相互作用や塩橋に寄与するアミノ酸に変異を導入することによって、リング間相互作用を抑制する方法である。例えば、大腸菌由来のシャペロニンＧｒｏＥＬ（配列番号２）の場合、結晶構造解析より赤道ドメインの４つの荷電アミノ酸（Ｒ４５２、Ｅ４６１、Ｓ４６３、Ｖ４６４）がリング間の結合に強く寄与していていることが分かっている。そこで、４５２番目のアミノ酸残基（アルギニン）をグルタミン酸に、４６１（グルタミン酸）、４６３（セリン）、４６４番目（バリン）のアミノ酸残基をアラニンに置換することにより、リング間相互作用が軽減し、シングルリングを構成することが分かっている（Ｗｅｉｓｓｍａｎｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｃｅｌｌ，８３，５７７−５８７）。
【００８３】
さらに、様々な組み合わせのキメラシャペロニンを作製することによって、シャペロニンとしての機能を保持した状態のシングルリングシャペロニンを得ることもできる。例えば、大腸菌由来のシャペロニンＧｒｏＥＬと根粒菌由来のシャペロニンとを用いてキメラシャペロニンを作製することによって、シングルリングシャペロニンを作製することができる（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．，２８２，７８９−８００）。
【００８４】
また、本発明のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価方法で用いる融合タンパク質において、シャペロニン等の折り畳み因子と所望のＧＰＣＲとが、リンカーとなるオリゴペプチドを介して連結されていてもよい。該オリゴペプチドの長さは２〜５０アミノ酸程度が好ましい。同様に、所望のＧＰＣＲとＧタンパク質αサブユニットとがリンカーとなるオリゴペプチドを介して連結されていてもよい。該オリゴペプチドの長さは１〜２５アミノ酸程度が好ましい。
【００８５】
なお、本発明のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価方法の他の様相として、融合タンパク質からＧタンパク質αサブユニットが遊離されていてもよい。すなわち、所望のＧＰＣＲとＧタンパク質αサブユニットとが連結されていない構成も可能である。
【００８６】
本発明のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価方法は、全てのＧＰＣＲに適用可能である。例えば、クラスＡに分類されるロドプシン型のＧＰＣＲ、クラスＢに分類されるセクレチンレセプター型のＧＰＣＲ、クラスＣに分類される代謝共役型ＧＰＣＲまたはホルモンレセプター型ＧＰＣＲ、クラスＤの真菌ホルモンレセプター型ＧＰＣＲ、クラスＥのｃＡＭＰレセプター型ＧＰＣＲなどに適用できる。また、本発明のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価方法は、リガンドや、分類が未同定のオーファンレセプターにも適用できる。
【００８７】
本発明のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価方法で用いる融合タンパク質に含まれるＧタンパク質αサブユニットとしては、Ｇｓファミリー、Ｇｉファミリー、Ｇｑファミリー、及び、Ｇ１２ファミリーに属する全てのαサブユニットが適用可能である。すなわち、Ｇｓファミリーに属するαs-1〜4、αolf；Ｇｉファミリーに属するαi-1〜4、αo-1〜2、αt-1〜2、αgust、αZ；Ｇｑファミリーに属するαq、α11、α14、α15、α16；Ｇ１２ファミリーに属するα12、α13のいずれもが、本発明のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価方法に適用可能である。ただし、ＧＰＣＲとＧタンパク質αサブユニットとの組み合わせは、リガンドの結合によるＧＰＣＲの構造変化に伴い、活性化することのできる（ＧＤＰ及びＧＴＰの親和性が変化するなど）Ｇタンパク質αサブユニットとの組み合わせであることが好ましい。その点において、Ｇｑファミリーに属するα15及びα16は幅広く様々なＧＰＣＲと共役するためより好ましい。
【００８８】
本発明のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価方法は、種々の用途に使用することができる。一つの用途は、オーファンＧＰＣＲに対するリガンドのスクリーニングである。例えば、アゴニスト型リガンドをスクリーニングする場合は、被検化合物とＧＰＣＲとの結合の有無を検出し、結合した候補化合物を所望のリガンドと判定することができる。具体的には、被検化合物が所望のアゴニスト型リガンドであれば、ＧＰＣＲとの結合し、その結果、ＧＴＰ又はＧＴＰアナログがＧタンパク質αサブユニットに結合するので、その結合性を蛍光強度等の増加をもって判定すればよい。一方、アンタゴニスト型リガンドをスクリーニングする場合は、既知のアゴニスト型リガンドと被検化合物とを反応系に共存させて競合的に結合させ、被検化合物とＧＰＣＲとの結合の有無を検出し、結合した候補化合物を所望のリガンドと判定することができる。具体的には、被検化合物が所望のアンタゴニスト型リガンドであれば、競合的結合により既知のリガンドの結合量が減少し、その結果、Ｇタンパク質αサブユニットに結合するＧＴＰ又はＧＴＰアナログが減少するので、その結合性を蛍光強度等の減少をもって判定すればよい。本方法を用いたリガンドのスクリーニングによれば、より効率的に薬物候補となるリガンドをスクリーニングすることができる。
【００８９】
本発明のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価方法の他の用途としては、ターゲットバリデーションが挙げられる。これは、既知又は未知の複数のＧＰＣＲに対して、ある目的のリガンドを用いて本方法を適用し、リガンドが結合したＧＰＣＲを選抜するものである。本方法を用いたターゲットバリデーションによれば、リガンドの作用機序の解明を効率的に行なうことができる。
【００９０】
本発明のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価方法を具体的に行なう手順の例を、図１（ａ）〜（ｃ）の模式図を参照しながら説明する。この例では、折り畳み因子として、シングルリングを形成するＧｒｏＥＬサブユニット７回連結体を用いる。また、ＧＴＰアナログとして、蛍光標識したＧＴＰγＳを用いる。なお、図１（ａ）〜（ｃ）において、ＧｒｏＥＬサブユニット７回連結体は「ＧｒｏＥＬ」と、所望のＧＰＣＲは「ＧＰＣＲ」と、Ｇタンパク質αサブユニットは「α」と、ＧＴＰγＳは「ＧＴＰ」と、ＧＤＰは「ＧＤＰ」と、被検化合物は「Ｌ」と表示されている。
【００９１】
まず最初に、ＧｒｏＥＬサブユニット７回連結体と所望のＧＰＣＲとＧタンパク質αサブユニットとの融合タンパク質を準備する。該融合タンパク質においては、シャペロニンサブユニットによるシングルリング構造体の内部にＧＰＣＲが格納され、Ｇタンパク質αサブユニットが外部に露出している（図１（ａ））。次に、試験管内で、該融合タンパク質とＧＤＰと蛍光標識したＧＴＰγＳとを、適宜の緩衝液中で共存させる（図１（ｂ））。このとき、該融合タンパク質中のＧタンパク質αサブユニットにＧＤＰが結合し、蛍光標識ＧＴＰγＳは遊離している。また、クエンチングにより遊離の蛍光標識ＧＴＰγＳから発せられる蛍光の強度は小さい。
【００９２】
次に、試験管内に被検化合物を添加する。このとき、被検化合物がＧＰＣＲに対する結合性を有するものであれば、ＧＤＰ−ＧＴＰ交換反応が起こり、蛍光標識ＧＴＰγＳがＧタンパク質αサブユニットに結合する。さらに、クエンチングが解消されて、結合した蛍光標識ＧＴＰγＳから強い蛍光が発せられる（図１（ｃ））。一方、蛍光標識ＧＴＰγＳがＧタンパク質αサブユニットに結合しない場合は、ＧＤＰ−ＧＴＰ交換反応は起こらないのでクエンチング状態のままである。
【００９３】
次に、Ｂ／Ｆ分離を行なわずに反応液の蛍光強度を測定する。すなわち、クエンチングが解消されて、蛍光標識ＧＴＰγＳから強い蛍光が発せられる場合は、反応液全体の蛍光強度が増大する。一方、クエンチング状態の場合は、反応液全体の蛍光強度に変化は起こらない。よって、反応液全体の蛍光強度が増大したときに、被検化合物がＧＰＣＲに対する結合性を有すると評価することができる。この例では、反応液の蛍光強度を直接測定したが、この反応液を蛍光相関分光法又は蛍光偏光測定法に供してもよい。
【００９４】
なお、ＧＰＣＲのＮ末端側にシャペロニンサブユニット７回連結体が連結された融合タンパク質と、遊離のＧタンパク質αサブユニットとを用いても、図１（ａ）〜（ｃ）と同様の手順でＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価を行なうことができる。
【００９５】
本発明のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性の解析用組成物は、所望のＧタンパク質共役型受容体のＮ末端側に折り畳み因子が連結され且つＣ末端側にＧタンパク質αサブユニットが連結された融合タンパク質を含有するものである。さらに、本発明のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性の解析用組成物は、さらに、ＧＤＰ、ＧＴＰ又はＧＴＰアナログを含んでいてもよい。また、折り畳み因子がシャペロニン又はシャペロニンサブユニット連結体で、シャペロニンサブユニットの合計数が最適数未満の場合は、単独のシャペロニンサブユニットを加えてもよい。これにより、融合タンパク質が補充された単独のシャペロニンサブユニットを伴ってリング構造体を形成することが可能となる。さらに、本発明のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性の解析用組成物の形状は、適宜の緩衝液等に溶解させた溶液でもよく、凍結乾燥物でもよい。
【００９６】
また、本発明のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性の解析用組成物の他の様相として、融合タンパク質からＧタンパク質αサブユニットが遊離されていてもよい。すなわち、ＧＰＣＲとＧタンパク質αサブユニットとが連結されていない構成も可能である。
【００９７】
本発明の融合タンパク質は、Ｇタンパク質共役型受容体タンパク質のＮ末端側に折り畳み因子が結合され且つＣ末端側にＧタンパク質αサブユニットが連結されているものである。本発明の融合タンパク質は、上記したＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価方法及び評価用組成物の主要な構成をなす。
【００９８】
本発明の融合タンパク質を製造する方法としては、シャペロニンサブユニット又はシャペロニンサブユニット連結体の遺伝子と、ＧＰＣＲ遺伝子と、Ｇタンパク質αサブユニット遺伝子を連結した融合遺伝子を作成し、該融合遺伝子を転写・翻訳させる方法が代表的である。好ましくは、該融合遺伝子を発現ベクターに組み込み、該組換えベクターを適宜の宿主に導入して形質転換体を作製し、該形質転換体内で発現させる。このときに用いる宿主としては特に限定はなく、例えば、バクテリア、酵母、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞等の細胞の他、動物個体、植物個体又は昆虫個体等も用いることができる。この中でも、培養コストが安価であり、培養日数が短く、培養操作が簡便な点から、バクテリア又は酵母が好ましく、特に、大腸菌が取り扱いの容易さの面でより好ましい。
【００９９】
ただし、一般的に、大腸菌では１０ｋｂ以上の発現ベクター（プラスミド）を保有すると、プラスミドのコピー数が減少し、結果的に組換えタンパク質の生産量が低下することがある。折り畳み因子としてシャペロニンサブユニット又はシャペロニンサブユニット連結体を用いる場合を例に挙げると、シャペロニンサブユニットが８個連結したシャペロニンサブユニット８回連結体の場合、その遺伝子をプラスミドに組み込むと、プラスミドのサイズは１５ｋｂｐ以上になる。しかし、このサイズのプラスミドは、大腸菌内で安定に保持されない可能性がある。したがって、大腸菌を宿主として用いる場合は、プラスミドに導入する融合遺伝子の大きさ、すなわち、シャペロニンサブユニット又はシャペロニンサブユニット連結体をコードする遺伝子の大きさ（連結数）、ＧＰＣＲ遺伝子の大きさ、及びＧタンパク質αサブユニット遺伝子の大きさを考慮し、大腸菌内で安定に保持されるようサイズを選択すべきである。
【０１００】
また、大腸菌などの宿主で発現される融合タンパク質が巨大な場合は、転写されたｍＲＮＡの特定のリボヌクレアーゼによる分解、翻訳された融合タンパク質のプロテアーゼによる分解と、２段階の切断を受ける可能性がある。かかる場合には、例えば、ｍＲＮＡの分解に関与するリボヌクレアーゼをコードするＲＮａｓｅＥ遺伝子を欠損させた宿主を用いることでｍＲＮＡの分解を抑制することが可能である。また、翻訳後のプロテーゼによる分解を抑制するために、宿主細胞を１５〜２５℃の低温で培養したり、ｌｏｎ、ｏｍｐＴ等のプロテアーゼの構造遺伝子を欠損させた大腸菌を宿主として用いることができる。
【０１０１】
また、シャペロニンサブユニット連結体の遺伝子には、シャペロニンサブユニット遺伝子が繰り返し含まれるため、それを含むプラスミドが不安定となり、特に宿主とシャペロニンの由来生物が同じであるときには、プラスミドＤＮＡとゲノムＤＮＡの相同組換えが起こる可能性がある。宿主として大腸菌を用いる場合は、遺伝子の相同組換えに関する遺伝子であるｒｅｃＡを欠損させた宿主を用いることで、プラスミドの安定性を向上させ、相同組換えを抑制することができる。
【０１０２】
形質転換体内で融合タンパク質を発現させる方法としては特に限定されず、公知の方法を用いることができる。例えば、薬剤耐性遺伝子を有する発現ベクターを用いる場合は、対応の薬剤を含有する培地を用いて、形質転換体を培養することができる。このようにして、形質転換体内で融合タンパク質を発現させた後、該形質転換体を回収する。さらに回収した形質転換体を破砕して体抽出液を調製し、該菌体抽出液から融合タンパク質を精製する。
【０１０３】
精製の手順としては、例えば、硫安塩析によって菌体抽出液中の融合タンパク質を沈殿させ、沈殿を回収した後、適当な緩衝液に溶解し、疎水クロマトグラフィーやイオン交換クロマトグラフィーによって融合タンパク質の存在するフラクションを回収する。これらを限外ろ過によって濃縮した後、濃縮液を５〜５０ｍＭ程度の塩化マグネシウム及び５０〜３００ｍＭ程度の塩化ナトリウム又は塩化カリウムが含有された緩衝液を展開液としてゲルろ過を行い、排除限界直後のピークを回収することによって融合タンパク質を精製することができる。
【０１０４】
さらに高度な精製が必要な場合は、融合タンパク質のＮ末端及びＣ末端にそれぞれ異なる２種類のタグをペプチド結合を介して付加しておくことが好ましい。例えば、融合タンパク質のＮ末端に６〜１０個のヒスチジンが並んだヒスチジンタグを連結し、さらに、Ｃ末端に配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるＦＬＡＧタグを連結する。この場合、精製のファーストステップとしてニッケル等の金属キレートカラムを用いれば、Ｎ末端にヒスチジンタグの付加されていないタンパク質は除去され、さらにセカンドステップとして抗ＦＬＡＧ抗体を用いたアフィニティクロマトグラフィーによってＣ末端側にＦＬＡＧタッグの付加タンパク質は除去される。したがって、Ｎ末端及びＣ末端にそれぞれヒスチジンタグ及びＦＬＡＧタグが付加された融合タンパク質のみが精製されることになる。Ｎ末端及びＣ末端に付加されるタグとしてはヒスチジンタグ、ＦＬＡＧタグ以外でもよく、他のタグとしては、例えば、Ｓｔｒｅｐタグ、Ｓタグ等が挙げられる。
【０１０５】
また、宿主を用いない方法として、バクテリア、真核生物抽出液等を用いた無細胞翻訳系（例えば、Ｓｐｉｒｉｎ， Ａ．Ｓ．， １９９１， Ｓｃｉｅｎｃｅ １１， ２６５６−２６６４： Ｆａｌｃｏｎｅ， Ｄ． ｅｔ ａｌ．， １９９１， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １１， ２６５６−２６６４）でも、融合タンパク質を可溶性タンパク質として発現させることが可能である。
【０１０６】
本発明の遺伝子は、本発明の融合タンパク質、すなわち、Ｇタンパク質共役型受容体のＮ末端側に折り畳み因子が連結され且つＣ末端側にＧタンパク質αサブユニットが連結された融合タンパク質をコードするものである。本発明の遺伝子は、折り畳み因子の遺伝子と、ＧＰＣＲの遺伝子と、Ｇタンパク質αサブユニットの遺伝子とを連結することにより、製造することができる。例えば、折り畳み因子の遺伝子として、各由来のシャペロニンの遺伝子がすでに単離されている。また、各ＧＰＣＲの遺伝子は米国Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｇｅｎｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＭＧＣ）などの遺伝資源保存機関で入手可能である。さらに、Ｇタンパク質αサブユニットの遺伝子も同様にＭＧＣで入手可能である。
【０１０７】
以下に実施例を掲げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例のみに限定されるものではない。
【実施例１】
【０１０８】
１．シングルリングＧｒｏＥＬ７回連結融合タンパク質の発現系構築
大腸菌Ｋ１２株ゲノムを鋳型とし、配列番号４に示されるプライマーＧｒｏ−Ｆ１と配列番号５に示されるプライマーＧｒｏ−Ｒ１をプライマー対としてＰＣＲを行い、大腸菌シャペロニンＧｒｏＥＬサブユニット遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅した。さらに、該増幅ＤＮＡ断片をｐＴ７ｂｌｕｅＴベクター（ノバジェン社）に導入した。次に、ＧｒｏＥＬ遺伝子中のＤｒａＩＩＩ−ＢａｍＨＩ部分（１３２８〜１４８７番）を同制限酵素で切り出した後、配列番号６で表される塩基配列からなる２本鎖ＤＮＡを代わりに組み込み、ＧｒｏＥＬの４５２番目のアルギニン（Ｒ）をグルタミン酸（Ｅ）に、４６１番目のグルタミン酸（Ｅ）をアラニン（Ａ）に、４６３番目のセリン（Ｓ）をアラニン（Ａ）に、及び４６４番目のバリン（Ｖ）をアラニン（Ａ）に置換する変異を導入した。これにより、シングルリングを形成する変異型ＧｒｏＥＬのサブユニットをコードする遺伝子ＳＲＩＩをｐＴ７ｂｌｕｅＴベクター中にクローニングできた。
【０１０９】
ｐＴｒｃ９９Ａ発現ベクター（アマシャムファルマシア社）のＮｃｏＩ／ＨｉｎｄＩＩＩサイトに配列番号７で表される塩基配列からなる２本鎖ＤＮＡを挿入し、ｐＴｒｃ９９ＡＬＴＣＦベクターを構築した。これにより、ＮｃｏＩ、ＸｂａＩ、ペプチドリンカーサイト（トロンビン翻訳サイト）、ＢｇｌＩＩサイト、スペーサー配列、ＸｈｏＩサイト、ペプチドリンカーサイト（エンテロキナーゼ（Ｅｋ）翻訳サイト）、その下流に、転写翻訳されてＦＬＡＧタグとなる塩基配列（ＦＬＡＧサイト）及び終始コドン、さらにその下流にＨｉｎｄＩＩＩサイトが導入された。すなわち、ｐＴｒｃ９９ＡＬＴＣＦベクターによれば、ＮｃｏＩサイトのＡＴＧが開始コドンとなった場合、各制限酵素サイトにＯＲＦを導入したときに、正しい読み枠となる。
【０１１０】
上記で得られたＳＲＩＩ遺伝子をＳｐｅＩ／ＸｂａＩで処理し、あらかじめＸｂａＩ処理しておいたｐＴｒｃ９９ＡＬＴＣＦベクターに、ＳＲＩＩ遺伝子が正しい方向に翻訳されるように導入した。さらに、得られたベクターをＸｂａＩ処理し、同様にＳｐｅＩ／ＸｂａＩ処理して得られたＳＲＩＩ遺伝子を正しく翻訳されるように導入することにより、変異型ＧｒｏＥＬサブユニット遺伝子が２回連結された発現ベクターｐＴｒｃ（ＳＲＩＩ）2ＴＣＦを構築した。同様の手順を繰り返し、ＳＲＩＩ遺伝子が一方向に７回連結した遺伝子断片が挿入された発現ベクターｐＴｒｃ（ＳＲＩＩ）7ＴＣＦを構築した。発現ベクターｐＴｒｃ（ＳＲＩＩ）7ＴＣＦの構成を図２に示す。図中、「ｇｒｏＥＬ」はＳＲＩＩ遺伝子、「ＰＳ」はペプチドリンカーサイト、「ＣＳ」はクローニングサイト、「ＦＬＡＧ」はＦＬＡＧペプチドサイトを表す。すなわち、発現ベクターｐＴｒｃ（ＳＲＩＩ）7ＴＣＦはｔｒｃプロモーターの下流に、順に、７個のＳＲＩＩ遺伝子（（ＳＲＩＩ）7）、ペプチドリンカーサイト（トロンビン翻訳サイト）、ＢｇｌＩＩサイト、スペーサー配列、ＸｈｏＩサイト、ペプチドリンカーサイト（Ｅｋ翻訳サイト）、ＦＬＡＧペプチドサイト、終始コドン、及びターミネーターを有する。そして、ＢｇｌＩＩ−ＸｈｏＩサイトに目的タンパク質の遺伝子を挿入することにより、変異型ＧｒｏＥＬサブユニット７回連結体と目的タンパク質との融合タンパク質を発現することができる。なお、２つのペプチドリンカーサイトはいずれもプロテアーゼ（トロンビンとエンテロキナーゼ）の認識アミノ酸配列をコードするものであるが、本実施例では単なるペプチドリンカーをコードする塩基配列として機能する。
【０１１１】
発現ベクターｐＴｒｃ（ＳＲＩＩ）7ＴＣＦを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株に導入し、形質転換体を得た。この形質転換体を、カルベニシリン（１００μｇ／ｍＬ）を含む２×Ｙ．Ｔ．培地（１６ｇ／Ｌ バクトトリプトン、１０ｇ／Ｌ 酵母エキス、５ｇ／Ｌ ＮａＣｌ）で２３℃、１１０ｒｐｍで２４時間回転培養した。培養後、菌体を回収し、超音波処理により菌体を破砕した。菌体破砕液を遠心分離して上清を回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、クマシーブリリアントブルーにてゲルを染色した。その結果、ＳＲＩＩの７回連結体（ＳＲＩＩ）7が可溶性画分に大量に発現していることが確認できた。また、得られた（ＳＲＩＩ）7の上清をＮａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥで分析した結果、シングルリングとして存在していることが確認できた。
【０１１２】
２．融合タンパク質の発現
ヒトエンドセリンＡ受容体（ヒトＥＴＡＲ）をモデルＧＰＣＲとし、ヒトＥＴＡＲのＮ末端側に変異型ＧｒｏＥＬサブユニット７回連結体（折り畳み因子）が連結され且つＣ末端側にＧタンパク質α１５サブユニット（Ｇタンパク質αサブユニット）が連結された融合タンパク質を、以下の手順で調製した。
【０１１３】
ヒトＥＴＡＲ遺伝子のｃＤＮＡクローンを、ＯｒｉＧｅｎｅ社より入手した（アクセッションナンバー NM_001957、配列番号８）。このｃＤＮＡクローンを鋳型とし、配列番号９で表されるプライマーと配列番号１０で表されるプライマーをプライマー対としてＰＣＲを行い、ヒトＥＴＡＲ遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅した。この増幅ＤＮＡ断片の両端にはプライマーに由来するＢｇｌＩＩサイト（５’末端）とＸｈｏＩサイト（３’末端）が導入された。この増幅ＤＮＡ断片を、あらかじめＢｇｌＩＩ及びＸｈｏＩで消化したｐＴｒｃ（ＳＲＩＩ）7ベクターに導入し、ｐＴｒｃ（ＳＲＩＩ）7ＥＴＡＲＦベクターを作製した。
【０１１４】
ヒトＧタンパク質α１５サブユニット（以下、単に「ヒトＧタンパク質α１５」、「α１５」等と略記する。）のｃＤＮＡクローンを、ＯｒｉＧｅｎｅ社より入手した(アクセッションナンバー NM_002068、配列番号１１)。このｃＤＮＡクローンを鋳型とし、配列番号１２で表されるプライマーと配列番号１３で表されるプライマーをプライマー対としてＰＣＲを行い、ヒトＧタンパク質α１５遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅した。この増幅ＤＮＡ断片の両端にはプライマーに由来するＸｈｏＩサイトが導入された。この増幅ＤＮＡ断片を、あらかじめＸｈｏＩで消化したｐＴｒｃ（ＳＲＩＩ）7ＥＴＡＲＦベクターに導入し、ｐＴｒｃ（ＳＲＩＩ）7ＥＴＡＲＧ１５Ｆベクターを作製した。本ベクターに含まれる融合遺伝子の構成の概略を図３に、対応する融合タンパク質の構成の概略を図４に示す。図３で、「ｇｒｏＥＬ」は変異型ＧｒｏＥＬサブユニット遺伝子、「ｅｔａｒ」はヒトＥＴＡＲ遺伝子、「ｇ１５」はヒトＧタンパク質α１５遺伝子を表す。また、図４で、「ＧｒｏＥＬ」は変異型ＧｒｏＥＬサブユニット、「ＥＴＡＲ」はヒトＥＴＡＲ，「Ｇ１５」はヒトＧタンパク質α１５を表す。すなわち、ｐＴｒｃ（ＳＲＩＩ）7ＥＴＡＲＧ１５Ｆベクターは、変異型ＧｒｏＥＬサブユニット７回連結体遺伝子（ＳＲＩＩ）7の下流に、ヒトＥＴＡＲ遺伝子、さらに下流にヒトＧタンパク質α１５遺伝子が連結された融合遺伝子を有する。そして、該融合遺伝子が発現することにより、「ヒトＥＴＡＲのＮ末端側に変異型ＧｒｏＥＬサブユニット７回連結体が連結され且つＣ末端側にヒトＧタンパク質α１５が連結された融合タンパク質」（以下、「ＳＲ−ＥＴＡＲ−Ｇ１５」と略記することがある。）が生産される。なお、該融合遺伝子においては、（ＳＲＩＩ）7とヒトＥＴＡＲ遺伝子との間にペプチドリンカーサイト（トロンビン翻訳サイト）があり、さらに、ヒトＧタンパク質α１５遺伝子の下流にペプチドリンカーサイト（エンテロキナーゼ翻訳サイト）及びＦＬＡＧペプチドサイトが連結されている。
【０１１５】
ｐＴｒｃ（ＳＲＩＩ）7ＥＴＡＲＧ１５Ｆベクターを大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）株に導入し、形質転換体を得た。この形質転換体を上記１と同様にして培養し、菌体破砕後、上清を回収した。この上清に対して、抗ＦＬＡＧ抗体固定化ビーズ（シグマ社製）を用いて免疫沈降反応を行った。その結果、「変異型ＧｒｏＥＬサブユニット７回連結体−ヒトＥＴＡＲ−ヒトＧタンパク質α１５」の融合タンパク質（ＳＲ−ＥＴＡＲ−Ｇ１５）の分子量に相当する５１０ｋＤａ付近の位置にバンドが検出された。これにより、目的の融合タンパク質（ＳＲ−ＥＴＡＲ−Ｇ１５）が大腸菌可溶性画分に発現されることが確認された。
【０１１６】
３．融合タンパク質の精製
１０％ 硫酸アンモニウム／１０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液で平衡化したＨｉＴｒａｐ Ｂｕｔｙｌ ＦＦカラム ５ｍＬ（アマシャムファルマシア社）に、上記２で調製した菌体破砕液の上清を供した。次に、１０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液で溶出し、融合タンパク質を含む画分を回収した。この画分を、１０ｍＭ ＣａＣｌ2及び１００ｍＭ ＮａＣｌを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）緩衝液に対して透析を行った。次に、透析内液を同じ緩衝液で平衡化した抗ＦＬＡＧ抗体カラム（シグマ社製）に供し、アフィニティクロマトグラフィーを行った。カラムを同緩衝液で洗浄後、１ｍＭ ＥＤＴＡを含む溶液で融合タンパク質を溶出した。さらに、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ-Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）緩衝液であらかじめ平衡化したＴＳＫｇｅｌ Ｇ４０００ＳＷＸＬを用いたゲル濾過に供し、目的の融合タンパク質を精製した。
【実施例２】
【０１１７】
融合タンパク質を用いたリガンドの結合性評価とスクリーニング
【０１１８】
１ｍＭ ＥＧＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ2、０．０２μＬ ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ ＧＴＰγＳ（モレキュラープローブ社）、及び３μＭ ＧＤＰを含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）緩衝液２００μＬに、実施例１で精製した変異型ＧｒｏＥＬサブユニット７回連結体−ヒトＥＴＡＲ−ヒトＧタンパク質α１５融合タンパク質を２００ｎＭとなるように添加し、ヒトＥＴＡＲに対する結合性評価用組成物を調製した。この組成物に、エンドセリンＡ（被検化合物）を終濃度１ｎＭとなるように添加し、２０℃でインキュベートした。反応液中の蛍光強度（励起波長４８５ｎｍ／蛍光波長５３０ｎｍ）を測定したところ、エンドセリンＡ添加前と比較して蛍光強度が約３倍上昇していた。これは、ＧＤＰに代わってＢＯＤＩＰＹ ＦＬ ＧＴＰγＳがヒトＧタンパク質α１５に結合したことを示し、エンドセリンＡがヒトＥＴＡＲに結合したことを示していた。一方、１ｎＭ エンドセリンＡを添加しなかったコントロール実験区では、蛍光強度の上昇は見られなかった。これにより、エンドセリンＡがヒトＥＴＡＲに対する結合性を有すると評価した。
以上より、実施例１の融合タンパク質を用いて、ヒトＥＴＡＲに対するリガンドがスクリーニングできることが示された。
【実施例３】
【０１１９】
１．融合タンパク質の発現系構築
ヒトＥＴＡＲをモデルＧＰＣＲとし、ヒトＥＴＡＲのＮ末端側に変異型ＧｒｏＥＬサブユニット７回連結体（折り畳み因子）が連結され且つＣ末端側にＧタンパク質αo-1サブユニット（Ｇタンパク質αサブユニット）が連結された融合タンパク質を、以下の手順で調製した。
【０１２０】
ヒトＧタンパク質αo−１サブユニット（以下、単に「ヒトＧタンパク質αo」、「αo」等と略記する。）のｃＤＮＡクローンをＡＴＣＣより入手した（ＡＴＣＣナンバー 7496723、配列番号１４）。このｃＤＮＡクローンを鋳型とし、配列番号１５で表されるプライマーと配列番号１６で表されるプライマーをプライマー対としてＰＣＲを行い、ヒトＧタンパク質αo遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅した。この増幅ＤＮＡ断片の両端にはプライマーに由来するＸｈｏＩサイトが導入された。この増幅ＤＮＡ断片を、あらかじめＸｈｏＩで消化した実施例１のｐＴｒｃ（ＳＲＩＩ）7ＥＴＡＲＦベクターに導入し、ｐＴｒｃ（ＳＲＩＩ）7ＥＴＡＲＧoＦベクターを作製した。本ベクターに含まれる融合遺伝子の構成は、図３に示される融合遺伝子においてヒトＧタンパク質α１５遺伝子（ｇ１５）に代わってヒトＧタンパク質αo遺伝子が融合されたものである。そして、該融合遺伝子が発現することにより、「ヒトＥＴＡＲのＮ末端側に変異型ＧｒｏＥＬサブユニット７回連結体が連結され且つＣ末端側にヒトＧタンパク質αoが連結された融合タンパク質」（以下、「ＳＲ−ＥＴＡＲ−Ｇｏ」と略記することがある。）が生産される。
【０１２１】
２．融合タンパク質の発現
ｐＴｒｃ（ＳＲＩＩ）7ＥＴＡＲＧoＦベクターを、実施例１と同様の方法で大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）株に導入し、形質転換体を得た。この形質転換体を実施例１と同様の培地にて２５℃で約４０時間培養し、菌体の懸濁液を得た。この菌懸濁液を、Ｂｕｇｂｕｓｔｅｒ（ノバジェン社）とリゾチームとの混液を用いた界面活性剤法に供し、菌破砕液を回収した。この上清に対して、抗ＦＬＡＧ抗体固定化ビーズ（シグマ社製）を用いて免疫沈降反応を行った。菌体破砕液上清についてＳＤＳ−ＰＡＧＥにより発現を評価した。結果を図５（ａ）に示す。図５（ａ）はＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を表す写真である。すなわち、「ヒトＥＴＡＲのＮ末端側に変異型ＧｒｏＥＬサブユニット７回連結体が連結され且つＣ末端側にヒトＧタンパク質αoが連結された融合タンパク質」（ＳＲ−ＥＴＡＲ−Ｇｏ）の分子量に相当する５１０ｋＤａ付近の位置にバンドが検出された（矢印参照）。これにより、目的の融合タンパク質（ＳＲ−ＥＴＡＲ−Ｇｏ）が大腸菌可溶性画分に発現されることが確認された。
【０１２２】
３．融合タンパク質の精製
上記２の菌体破砕液上清を、実施例1と同様のＨｉＴｒａｐ Ｂｕｔｙｌ ＦＦカラムによる疎水性クロマトグラフィー、及び、ＴＳＫｇｅｌ Ｇ４０００ＳＷＸＬによるゲル濾過に供し、ＳＲ−ＥＴＡＲ−Ｇｏを精製した。
【０１２３】
４．融合タンパク質とナチュラルリガンドとの結合性
精製したＳＲ−ＥＴＡＲ−Ｇｏを、０．０１％ トリトン３０５を含むＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５；１５０ｍＭ ＮａＣｌ，１０ｍＭ ＭｇＣｌ2，１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＧＤＰを含む）に終濃度４４μｇ／ｍＬとなるように溶解した。この溶液に125Ｉで放射性標識したエンドセリン−１（以下、「ＲＩエンドセリン−１」と略記する。）（終濃度：０．０１〜０．７ｎＭ）を添加し、３７℃で１８時間インキュベートした。ＳＲ−ＥＴＡＲ−Ｇｏに結合しなかった遊離のＲＩ標識エンドセリン−１を遠心ゲル濾過カラムにより除去した後、ＳＲ−ＥＴＡＲ−Ｇｏに結合したＲＩエンドセリン−１の濃度（Ｂ）をγカウンターにより定量した。遊離の（未結合の）ＲＩエンドセリン−１の濃度（Ｆ）については、結合したＲＩエンドセリン−１の濃度（Ｂ）の値を用いて算出した。なお、ＳＲ−ＥＴＡＲ−Ｇｏと非特異的に結合したＲＩエンドセリン−１の濃度について、未標識の１００μＭ エンドセリン−１存在下で同様の操作により測定し、バックグラウンド値とした。縦軸をＢ／Ｆ、横軸をＢ（ｐＭ）としてスキャッチャードプロットを作成した（図６）。このスキャッチャードプロットからＳＲ−ＥＴＡＲ−Ｇｏに特異的に結合するＲＩエンドセリン−１の結合定数を算出したところ、２７５ｐＭであった。この値は、動物細胞等で発現させたヒトＥＴＡＲとエンドセリン−１の結合定数とほぼ同等であった。
以上より、ＳＲ−ＥＴＡＲ−Ｇｏ中のヒトＥＴＡＲがエンドセリン−１との結合性を保持していることが確認された。
【０１２４】
５．融合タンパク質中Ｇタンパク質の活性評価
１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、１ｍＭ ＥＤＴＡ、及び０．０２μＬ ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ ＧＴＰγＳを含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）緩衝液２００μＬに、精製したＳＲ−ＥＴＡＲ−Ｇｏを終濃度７５μｇ／ｍＬとなるように添加した。３７℃でインキュベートした後、反応液中の蛍光強度（励起波長４８５ｎｍ／蛍光波長５３０ｎｍ）を経時的に測定した。コントロールとして、ＳＲ−ＥＴＡＲ−Ｇｏの代わりに「変異型ＧｒｏＥＬサブユニット７回連結体−ヒトＥＴＡＲ」融合タンパク質を用いたもの（コントロール１）、及び、ＳＲ−ＥＴＡＲ−Ｇｏを含む反応液に１ｍＭ ＧＤＰをさらに添加したもの（コントロール２）についても併せて評価した。測定結果を図７に示す。図７は、蛍光強度と経過時間との関係を表すグラフである。すなわち、コントロール１の場合には蛍光強度の上昇は見られなかったが、ＳＲ−ＥＴＡＲ−Ｇｏを含む組成物を用いた実験区（図７では「実施例」と表示）では蛍光強度の上昇が見られた。これは、ＳＲ−ＥＴＡＲ−Ｇｏ中のＧタンパク質αoに蛍光標識ＧＴＰγＳ（ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ ＧＴＰγＳ）が結合することにより、蛍光強度が上昇したことを示していた。一方、コントロール２の場合には蛍光強度の上昇は見られなかった。これは、１ｍＭ ＧＤＰの添加によりＳＲ−ＥＴＡＲ−Ｇｏ中のＧタンパク質αoへの蛍光標識ＧＴＰγＳの結合が阻害されたことを示していた。
以上より、ＳＲ−ＥＴＡＲ−Ｇｏ中のＧタンパク質αoがＧＤＰ及びＧＴＰγＳとの結合性を保持していることが確認された。
【実施例４】
【０１２５】
融合タンパク質を用いたリガンドの結合性評価とスクリーニング
【０１２６】
１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０２μＬ ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ ＧＴＰγＳ、及び１００μＭ ＧＤＰを含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）緩衝液２００μＬに、実施例３で精製したＳＲ−ＥＴＡＲ−Ｇｏを終濃度７５μｇ／ｍＬとなるように添加し、ヒトＥＴＡＲに対する結合性評価用組成物を調製した。この組成物に、エンドセリン−１（被検化合物）を終濃度１μＭとなるように添加し、２５℃で３時間インキュベートした。インキュベート後、反応液中の蛍光強度（励起波長４８５ｎｍ／蛍光波長５３０ｎｍ）を測定した。コントロールとして、上記の結合性評価用組成物からエンドセリン−１を抜いた組成物を用いたものについても同様に測定した。測定結果を図８に示す。図８は各実験区における蛍光強度を表すグラフである。すなわち、上記の結合性評価用組成物を用いた実験区（図８では「実施例」と表示）ではコントロールと比較して高い蛍光強度を示した。これは、ＧＤＰに代わってＢＯＤＩＰＹ ＦＬ ＧＴＰγＳがヒトＧタンパク質αoに結合したことを示し、エンドセリン−１がヒトＥＴＡＲに結合したことを示していた。
以上より、実施例３の融合タンパク質を用いて、ヒトＥＴＡＲに対するリガンドがスクリーニングできることが示された。
【実施例５】
【０１２７】
１．融合タンパク質の発現系構築
ヒトエンドセリンＢ受容体（ヒトＥＴＢＲ）をモデルＧＰＣＲとし、ヒトＥＴＢＲのＮ末端側に変異型ＧｒｏＥＬサブユニット７回連結体（折り畳み因子）が連結され且つＣ末端側にＧタンパク質αoサブユニット（Ｇタンパク質αサブユニット）が連結された融合タンパク質を、以下の手順で調製した。
【０１２８】
ヒトＥＴＢＲのｃＤＮＡクローンを、Mammalian Gene Collectionより入手した(アクセッションナンバー BC014472、配列番号１７)。このｃＤＮＡクローンを鋳型とし、配列番号１８で表されるプライマーと配列番号１９で表されるプライマーをプライマー対としてＰＣＲを行い、ヒトＥＴＢＲ遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅した。この増幅ＤＮＡ断片のＮ末端にはプライマーに由来するＦｂａＩサイトが、Ｃ末端にはＸｈｏＩサイトがそれぞれ導入された。この増幅ＤＮＡ断片を、あらかじめＢｇｌＩＩ／ＸｈｏＩで消化した実施例３のｐＴｒｃ（ＳＲＩＩ）7ＥＴＡＲＧoＦベクターに導入した。これにより、ｐＴｒｃ（ＳＲＩＩ）7ＥＴＡＲＧoＦベクター中のヒトＥＴＡＲ遺伝子がヒトＥＴＢＲ遺伝子に入れ替わり、ｐＴｒｃ（ＳＲＩＩ）7ＥＴＢＲＧoＦベクターが作製された。本ベクターに含まれる融合遺伝子の構成は、図３に示される融合遺伝子において、ヒトＥＴＡＲ遺伝子（ｅｔａｒ）に代わってヒトＥＴＢＲ遺伝子、ヒトＧタンパク質α１５遺伝子（ｇ１５）に代わってヒトＧタンパク質αo遺伝子が融合されたものである。そして、該融合遺伝子が発現することにより、「ヒトＥＴＢＲのＮ末端側に変異型ＧｒｏＥＬサブユニット７回連結体が連結され且つＣ末端側にヒトＧタンパク質αoが連結された融合タンパク質」（以下、「ＳＲ−ＥＴＢＲ−Ｇｏ」と略記することがある。）が生産される。
【０１２９】
２．融合タンパク質の発現
実施例３と同様にしてｐＴｒｃ（ＳＲＩＩ）7ＥＴＢＲＧoＦベクターを大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）株に導入し、形質転換体を得た。実施例３と同様にしてこの形質転換体を培養し、菌体破砕液上清を調製・回収した。菌体破砕液上清についてＳＤＳ−ＰＡＧＥにより発現を評価した。結果を図５（ｂ）に示す。図５（ｂ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を表す写真である。すなわち、「ヒトＥＴＢＲのＮ末端側に変異型ＧｒｏＥＬサブユニット７回連結体が連結され且つＣ末端側にヒトＧタンパク質αoが連結された融合タンパク質」（ＳＲ−ＥＴＢＲ−Ｇｏ）の分子量に相当する５１０ｋＤａ付近の位置にバンドが検出された（矢印参照）。これにより、目的の融合タンパク質（ＳＲ−ＥＴＢＲ−Ｇｏ）が大腸菌可溶性画分に発現されることが確認された。
【０１３０】
３．融合タンパク質の精製
実施例３と同様にして、上記２の菌体破砕液上清からＳＲ−ＥＴＢＲ−Ｇｏを精製した。
【実施例６】
【０１３１】
１．融合タンパク質の発現系構築
ヒト由来Vasoactive Intestinal Polypeptide受容体（ヒトＶＩＰ１Ｒ）をモデルＧＰＣＲとし、ヒトＶＩＰ１ＲのＮ末端側に変異型ＧｒｏＥＬサブユニット７回連結体（折り畳み因子）が連結され且つＣ末端側にＧタンパク質αi-1サブユニット（Ｇタンパク質αサブユニット）が連結された融合タンパク質を、以下の手順で調製した。
【０１３２】
ヒトＶＩＰ１ＲのｃＤＮＡクローンを、Mammalian Gene Collectionより入手した(アクセッションナンバー BC064424、配列番号２０)。このｃＤＮＡクローンを鋳型とし、配列番号２１で表されるプライマーと配列番号２２で表されるプライマーをプライマー対としてＰＣＲを行い、ヒトＶＩＰ１Ｒ遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅した。この増幅ＤＮＡ断片のＮ端にはプライマーに由来するＢｇｌＩＩサイトが、Ｃ末端にはＸｈｏＩサイトがそれぞれ導入された。この増幅ＤＮＡ断片を、あらかじめＢｇｌＩＩ／ＸｈｏＩで消化した実施例１のｐＴｒｃ（ＳＲＩＩ）7ＴＣＦベクターに導入し、ｐＴｒｃ（ＳＲＩＩ）7ＶＩＰ１ＲＦベクターを作製した。
【０１３３】
さらに、ｐＴｒｃ（ＳＲＩＩ）7ＶＩＰ１ＲＦベクターのＶＩＰ１Ｒ遺伝子の下流にＧタンパク質αi-1サブユニット遺伝子を導入するために、ヒトＧタンパク質αi-1サブユニット（以下、単に「ヒトＧタンパク質αi」、「αi」等と略記する。）のｃＤＮＡクローンを、ＡＴＣＣより入手した（アクセッションナンバー BC026326、配列番号２３)。このｃＤＮＡクローンを鋳型とし、配列番号２４で表されるプライマーと配列番号２５で表されるプライマーをプライマー対としてＰＣＲを行い、ヒトＧタンパク質αi遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅した。この増幅ＤＮＡ断片の両端にはプライマーに由来するＸｈｏＩサイトが導入された。この増幅ＤＮＡ断片を、あらかじめＸｈｏＩで消化した上記ｐＴｒｃ（ＳＲＩＩ）7ＶＩＰ１ＲＦベクターに導入し、ｐＴｒｃ（ＳＲＩＩ）7ＶＩＰ１ＲＧiＦベクターを作製した。本ベクターに含まれる融合遺伝子の構成は、図３に示される融合遺伝子において、ヒトＥＴＡＲ遺伝子（ｅｔａｒ）に代わってヒトＶＩＰ１Ｒ遺伝子、ヒトＧタンパク質α１５遺伝子（ｇ１５）に代わってヒトＧタンパク質αi遺伝子が融合されたものである。そして、該融合遺伝子が発現することにより、「ヒトＶＩＰ１ＲのＮ末端側に変異型ＧｒｏＥＬサブユニット７回連結体が連結され且つＣ末端側にヒトＧタンパク質αiが連結された融合タンパク質」（以下、「ＳＲ−ＶＩＰ１Ｒ−Ｇｉ」と略記することがある。）が生産される。
【０１３４】
２．融合タンパク質の発現
実施例３と同様にしてｐＴｒｃ（ＳＲＩＩ）7ＶＩＰ１ＲＧiＦベクターを大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）株に導入し、形質転換体を得た。実施例３と同様にしてこの形質転換体を培養し、菌体破砕液上清を調製・回収した。菌体破砕液上清についてＳＤＳ−ＰＡＧＥにより発現を評価した。結果を図５（ｃ）に示す。図５（ｃ）はＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を表す写真である。すなわち、「ヒトＶＩＰ１ＲのＮ末端側に変異型ＧｒｏＥＬサブユニット７回連結体が連結され且つＣ末端側にヒトＧタンパク質αiが連結された融合タンパク質」（ＳＲ−ＶＩＰ１Ｒ−Ｇｉ）の分子量に相当する５１０ｋＤａ付近の位置にバンドが検出された（矢印参照）。これにより、目的の融合タンパク質（ＳＲ−ＶＩＰ１Ｒ−Ｇｉ）が大腸菌可溶性画分に発現されることが確認された。
【０１３５】
３．融合タンパク質の精製
実施例３と同様にして、上記２の菌体破砕液上清からＳＲ−ＶＩＰ１Ｒ−Ｇｉを精製した。
【図面の簡単な説明】
【０１３６】
【図１】本発明のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価方法を具体的に行なう手順を表す模式図であり、（ａ）は、ＧｒｏＥＬサブユニット７回連結体と所望のＧＰＣＲとＧタンパク質αサブユニットとの融合タンパク質の構造を表す模式図であり、（ｂ）は、融合タンパク質とＧＤＰと蛍光標識したＧＴＰγＳとを、適宜の緩衝液中で共存させた状態を表す模式図であり、（ｃ）は、添加した被検化合物がＧＰＣＲに結合し、ＧＤＰ−ＧＴＰ交換反応が起こり、結合した蛍光標識ＧＴＰγＳから強い蛍光が発せられる状態を表す模式図である。
【図２】発現ベクターｐＴｒｃ（ＳＲＩＩ）7ＴＣＦの主要部の構成を表す模式図である。
【図３】実施例１で構築したｐＴｒｃ（ＳＲＩＩ）7ＥＴＡＲＧ１５Ｆべクターに含まれる融合遺伝子の構造の概略を表す模式図である。
【図４】図３の融合遺伝子に対応する融合タンパク質の構造の概略を表す模式図である。
【図５】（ａ）は実施例３におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を表す写真、（ｂ）は実施例５におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を表す写真、（ｃ）は実施例６におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を表す写真である。
【図６】実施例３で作成したスキャッチャードプロットを表すグラフである。
【図７】実施例３で作成した蛍光強度と経過時間との関係を表すグラフである。
【図８】実施例４で作成した各実験区における蛍光強度を表すグラフである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｇタンパク質共役型受容体に対する結合性評価方法及び評価用組成物、融合タンパク質、並びに、遺伝子に関し、さらに詳細には、折り畳み因子とＧタンパク質共役型受容体との融合タンパク質を用いる簡便且つハイスループットなＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価方法、該評価方法に用いるための組成物、融合タンパク質、及び融合タンパク質をコードする遺伝子に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞表面上の膜受容体タンパク質は、細胞外の情報を細胞内へ伝達する極めて重要な働きをしている。そのため、膜受容タンパク質に結合する物質はアゴニスト型医薬品やアンタゴニスト型医薬として候補物質となり、受容体タンパク質と被検化合物との結合性を解析することは、医薬品開発において極めて重要である。膜受容体タンパク質の中でも特にＧタンパク質共役型受容体（Ｇ ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ。以下、「ＧＰＣＲ」と略記する。）は、現在市販されている低分子医薬品の約半数がこの受容体を標的としているため、医薬品開発において極めて注目を集めている。また、ＧＰＣＲの約半数が、生体内で機能しているナチュラルリガンドが同定されていないオーファンＧＰＣＲであり、ナチュラルリガンドやその類縁化合物が新規医薬品の候補物質として期待されていることから、オーファンＧＰＣＲに対するリガンドのスクリーニングが熾烈を極めている。
【０００３】
ＧＰＣＲは細胞膜を貫通して存在する受容体の１つであり、細胞膜を７回貫通し、そのＮ末端を細胞外に、Ｃ末端を細胞内に向けて存在している。ＧＰＣＲは細胞外からリガンドの刺激を受け取り、細胞内のＧタンパク質を活性化する機能を有する。Ｇタンパク質は、α、β、γの３種のサブユニットからなる３量体タンパク質であり、ＧＰＣＲからの刺激を受け取ると、αサブユニットに結合していたＧＤＰ（グアノシン５’二リン酸）がＧＴＰ（グアノシン５’三リン酸）に置換され（ＧＤＰ−ＧＴＰ交換反応）、さらにαサブユニットがβ、γサブユニットから遊離する。遊離したＧタンパク質αサブユニット−ＧＴＰ結合体は、セカンドメッセンジャーを制御する細胞内の効果器を活性化すると共に、自分自身のＧＴＰａｓｅ活性によりＧＴＰを加水分解し、αサブユニット−ＧＤＰ結合体となり、再びβγサブユニットと会合し不活性型となる。
【０００４】
Ｇタンパク質αサブユニットは、そのＧタンパク質の標的分子の種類によってＧｓ、Ｇｉ、Ｇｑ、Ｇ１２の４つのファミリーに分類されている。さらに、各ファミリーはメンバーに細分類されている。例えば、Ｇｉファミリーはαi-1〜4、αo-1〜2、αt-1〜2、αgust、αZの各メンバーに、Ｇ１２ファミリーはα12、α13の各メンバーに細分類されている。
【０００５】
ＧＰＣＲをターゲットとするリガンドのスクリーニングは、リガンドの候補となる被検化合物と所望のＧＰＣＲとの結合性を評価し、特異的に結合したものを選抜することにより行なわれる。結合性の評価方法は、大きく分けて、生きた動物細胞を用いる方法と、細胞膜画分を用いるインビトロの方法の２種類がある。動物細胞を用いる方法は、ＣＨＯ細胞やＨＥＫ２９３細胞などの動物細胞に目的とするＧＰＣＲ遺伝子を導入し、膜表面に発現させた細胞を用いてアッセイする方法である。すなわち、ＧＰＣＲにリガンドが結合した際に共役するＧタンパク質のシグナル伝達を介した細胞内カルシウム濃度変化やｃＡＭＰの濃度変化などのシグナル伝達を、蛍光プローブなどで検出する方法である。
【０００６】
細胞膜画分を用いるインビトロの方法は、ＧＰＣＲとリガンドとの結合を検出する手段の違いによって、さらにいくつかに分類される。一つの例は、標識化したリガンド候補物質を用いる方法である。例えば、ＧＰＣＲを膜表面に発現させた昆虫細胞や動物細胞から調製した細胞膜画分を基板上に固定化させ、リガンドの結合を検出する方法が開発されている。具体例としては、アミノプロピルシランコートしたスライドガラス上にＧＰＣＲが発現した膜画分を固定化したＧＰＣＲチップが開発されている（非特許文献１）。これは、放射性標識したリガンド候補物質を用いてＧＰＣＲとリガンドの結合を検出するものである。
【０００７】
リガンド候補物質を標識化しない方法としては、表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ法）を用いてＧＰＣＲとリガンド候補物質との結合を検出する方法もある。
【０００８】
リガンド候補物質を標識化しない他の方法としては、ＧＰＣＲとリガンドとの結合を、Ｇタンパク質への活性化に基づいて検出する方法が提案されている。例えば、ＧＰＣＲのＣ末端にＧタンパク質αサブユニットを連結させた融合タンパク質を、昆虫細胞に発現させ、該昆虫細胞から細胞膜画分を調製する。次に、該細胞膜画分を試料とし、リガンド候補物質と細胞膜画分中のＧＰＣＲとの結合にともなうＧタンパク質αサブユニット上のＧＤＰ−ＧＴＰ交換反応を、放射性標識したＧＴＰを用いることにより検出し、ＧＰＣＲ−Ｇタンパク質αサブユニット−ＧＴＰ連結体の形成を検出する方法が報告されている（非特許文献２）。
【０００９】
細胞膜画分を用いないインビトロの方法も提案されている。例えば、シャペロニンとＧＰＣＲとの融合タンパク質を構築し、該ＧＰＣＲと被検化合物との結合性をＳＰＲ法で評価する方法が提案されている（特許文献１）。
【特許文献１】特開２００４−８５５４２号公報
【非特許文献１】ファング（Ｆａｎｇ）ら，ケムバイオケム（ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ），２００２年，第３巻，ｐ．９８７−
【非特許文献２】武田ら，ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），２００４年，第１３５巻，ｐ．５９７−
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
しかし、生きた動物細胞を用いる方法は、ＧＰＣＲの種類によっては動物細胞内で必要量が発現しないものが少なくなく、また、発現したとしても発現量を安定に制御することが困難という問題がある。また、ＧＰＣＲの種類によっては共役するＧタンパク質の種類が決まっているため、ＧＰＣＲ遺伝子だけでなく、対応するＧタンパク質の遺伝子を細胞内に導入し、細胞内でシグナル伝達系を再構築する必要がある。さらに、これらの細胞を培養し、目的のタンパク質群を発現させるためには、費用、時間などがかさみ、培養途中のコンタミネーションの防止など熟練した操作が要求される。
【００１１】
また、標識化したリガンド候補物質を用いる方法は、あらかじめリガンド候補の全てに対して、蛍光標識等をする必要があり、操作が煩雑である。また、ＧＰＣＲと非特異的に結合しているリガンド候補物質も検出してしまうため、リガンド候補物質に対して常に正しい評価ができるとは限らない。
【００１２】
また、ＳＰＲ法を用いる方法は、リガンド候補物質を標識せずにすむ利点はあるものの、やはり、ＧＰＣＲとリガンド候補物質との結合が特異的なものかどうかを判断することは困難である。これはシャペロニンとＧＰＣＲとの融合タンパク質を用いる方法でも同じである。
【００１３】
また、ＧＰＣＲ−Ｇタンパク質αサブユニット−ＧＴＰの複合体の形成を検出する方法は、放射性物質を使用するので特別な施設が必要であり、簡便でハイスループットな評価方法とは言えない。また、放射性標識の代わりに蛍光標識されたＧＴＰを使用することも考えられるが、感度を上げるためには高価な細胞膜画分を大量に必要とするため、やはりハイスループット性に欠ける。
以上より、より簡便且つハイスループットなＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価方法が求められている。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
上記した課題を解決するための請求項１に記載の発明は、被検化合物のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性を評価する方法であって、所望のＧタンパク質共役型受容体のＮ末端側に折り畳み因子が連結され且つＣ末端側にＧタンパク質αサブユニットが連結された融合タンパク質に被検化合物を接触させたときの、前記Ｇタンパク質αサブユニットとＧＴＰ又はＧＴＰアナログとの結合の有無を検出することにより、前記被検化合物の前記Ｇタンパク質共役型受容体に対する結合性を評価することを特徴とするＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価方法である。
【００１５】
また請求項２に記載の発明は、下記工程（１）〜（４）を包含することを特徴とする請求項１に記載のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価方法である。
（１）前記融合タンパク質とＧＴＰ又はＧＴＰアナログとを含有する反応液を調製する工程、
（２）工程（１）で調製した反応液に被検化合物を添加し、前記融合タンパク質に被検化合物を接触させる工程、
（３）工程（２）に続いて、前記Ｇタンパク質αサブユニットに結合したＧＴＰ又はＧＴＰアナログの量を測定し、前記Ｇタンパク質αサブユニットとＧＴＰ又はＧＴＰアナログとの結合の有無を検出する工程、
（４）工程（３）で前記Ｇタンパク質αサブユニットとＧＴＰ又はＧＴＰアナログとの結合が検出された場合に、前記被検化合物は前記Ｇタンパク質共役型受容体に対する結合性を有すると評価する工程。
【００１６】
また請求項３に記載の発明は、前記工程（１）の反応液は、さらにＧＤＰを含有することを特徴とする請求項２に記載のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価方法である。
【００１７】
本発明のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価方法においては、所望のＧタンパク質共役型受容体のＮ末端側に折り畳み因子が連結され且つＣ末端側にＧタンパク質αサブユニットが連結された融合タンパク質を使用する。そして、被検化合物と融合タンパク質中のＧＰＣＲとの結合性を、Ｇタンパク質αサブユニットとＧＴＰ又はＧＴＰアナログとの結合の有無をもって検出する。折り畳み因子は、他のタンパク質の折り畳み反応（フォールディング）を促進する作用を有するタンパク質の総称であり、この作用により他のタンパク質が正しく折り畳まれた可溶性タンパク質として得られる。したがって、本発明のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価方法においては、融合タンパク質中のＧＰＣＲが可溶性タンパク質として存在することができる。その結果、不溶性の細胞膜画分を使用する従来の方法に比べて操作性がよい。さらに、組換えＤＮＡ技術によって当該融合タンパク質を生産することができるので、ＧＰＣＲを多量に取得することができ、効率的である。なお、本発明における「折り畳み因子」には、マルトース結合タンパク質のように別の主な活性を持ちながらタンパク質を折り畳む作用も有するタンパク質も含むものとする。
【００１８】
請求項４に記載の発明は、前記折り畳み因子は、シャペロニンサブユニット又はシャペロニンサブユニット連結体であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価方法である。
【００１９】
折り畳み因子は、酵素的に働くフォルダーゼと非酵素的に働く分子シャペロンとに分類される。シャペロニンは分子シャペロンの一種であり、分子量約６万のサブユニット（シャペロニンサブユニット）からなる複合タンパク質ある。代表的なシャペロニンは、シャペロニンサブユニット７〜９個からなるリング状構造体が２個重なった、総分子量８０万〜１００万程度のシリンダー状の巨大な複合タンパク質である。そして、シャペロニンはその内部に他のタンパク質を格納し、正しく折り畳むことができる。そして、本発明のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価方法においては、シャペロニンサブユニット又はシャペロニンサブユニット連結体と、ＧＰＣＲと、Ｇタンパク質αサブユニットとの融合タンパク質を用いる。かかる構成により、ＧＰＣＲがシャペロニンの内部に格納されて折り畳まれ、より容易に可溶性の状態で存在することができる。さらに、シャペロニンサブユニットの遺伝子は単離されているものが多いので、組換えＤＮＡ技術によって当該融合タンパク質をより容易に生産することができる。
【００２０】
ここで、「シャペロニンサブユニット」という語は、単独の分子である場合（単独のシャペロニンサブユニット）の他に、融合タンパク質の一部である場合にも用いる。また、「シャペロニンサブユニット連結体」とは、２個以上のシャペロニンサブユニットがタンデムに連結された人工タンパク質をいう。さらに、Ｎ個のシャペロニンサブユニットからなるシャペロニンサブユニット連結体を、「シャペロニンサブユニットＮ回連結体」と呼ぶこととする。
【００２１】
請求項５に記載の発明は、前記シャペロニンサブユニット又はシャペロニンサブユニット連結体は、シングルリングを形成するものであることを特徴とする請求項４に記載のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価方法である。
【００２２】
一般的なシャペロニンは、リング状構造体が２個重なったダブルリング構造を有しているが、リング状構造体１つからなる「シングルリング」のシャペロニンも知られている。そして、本発明のタンパク質共役型受容体に対する結合性評価方法においては、シングルリングを形成するシャペロニンサブユニット又はシャペロニンサブユニット連結体を用いる。かかる構成により、被検化合物がＧＰＣＲに結合する際の立体的な障害が少ない。
【００２３】
請求項６に記載の発明は、前記シャペロニンサブユニット連結体は、該シャペロニンサブユニットの由来によって決定される最適数のシャペロニンサブユニットが連結されたものであることを特徴とする請求項４又は５に記載のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価方法である。
【００２４】
天然において、シャペロニンを形成しているシャペロニンサブユニットの合計数は、シャペロニンの由来によって概ね決まっている。例えば、細菌由来の場合は７個、古細菌由来の場合は８又は９個、真核生物由来の場合は８個（ミトコンドリア由来の場合は７個）である。すなわち、これらの数が各由来のシャペロニンにおける最適数である。そして、本発明のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価方法においては、融合タンパク質中のシャペロニンサブユニット連結体が、該最適数のシャペロニンサブユニットからなる。かかる構成により、融合タンパク質がより安定なリング構造体を形成することができる。
【００２５】
請求項７に記載の発明は、前記シャペロニンサブユニット又はシャペロニンサブユニット連結体は、大腸菌由来のシャペロニンサブユニットからなることを特徴とする請求項４〜６のいずれかに記載のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価方法である。
【００２６】
大腸菌由来のシャペロニンはＧｒｏＥＬと呼ばれ、その生化学的・物理化学的性質がよく研究されている。また、そのサブユニットの遺伝子も単離されている。したがって、本発明のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価方法においては、融合タンパク質をコードする融合遺伝子を容易に構築することができ、融合タンパク質の調製が容易である。
【００２７】
請求項８に記載の発明は、前記ＧＴＰアナログは、ＧＴＰ−γＳ又はＧＴＰ−ＰＮＰであることを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価方法である。
【００２８】
Ｇタンパク質αサブユニットはＧＴＰａｓｅ活性を有し、自身に結合したＧＴＰを加水分解してＧＤＰとして解離する作用を有する。本発明のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価方法においては、加水分解が制限されたＧＴＰアナログであるＧＴＰ−γＳ又はＧＴＰ−ＰＮＰを使用する。かかる構成により、より安定なＧタンパク質αサブユニットとＧＴＰアナログとの結合体を形成することができる。
【００２９】
請求項９に記載の発明は、前記ＧＴＰ又はＧＴＰアナログは、放射性標識されたものであることを特徴とする請求項１〜８のいずれかに記載のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価方法である。
【００３０】
ＧＰＣＲにリガンドが結合すると、Ｇタンパク質のαサブユニットに結合していたＧＤＰがＧＴＰと置換する（ＧＤＰ−ＧＴＰ交換反応）。この反応は、放射性標識されたＧＴＰ又はＧＴＰアナログでも起こる。本発明のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価方法においては、放射性標識されたＧＴＰ又はＧＴＰアナログがＧタンパク質αサブユニットに結合することを検出するので、感度が高い。
【００３１】
請求項１０に記載の発明は、前記ＧＴＰ又はＧＴＰアナログは、蛍光標識されたものであることを特徴とする請求項１〜８のいずれかに記載のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価方法である。
【００３２】
本発明のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価方法においては、蛍光標識されたＧＴＰ又はＧＴＰアナログを用いる。蛍光標識されたＧＴＰ又はＧＴＰアナログは、Ｇタンパク質αサブユニットに結合すると強い蛍光を発し、遊離の状態ではクエンチングが起こり蛍光が弱まる。かかる構成により、Ｇタンパク質αサブユニットに結合した蛍光標識ＧＴＰ又はＧＴＰアナログが発する蛍光を正確に検出することができる。
【００３３】
請求項１１に記載の発明は、Ｇタンパク質αサブユニットに結合したＧＴＰ又はＧＴＰアナログと、結合しなかった遊離のＧＴＰ又はＧＴＰアナログとを分離することなく、Ｇタンパク質αサブユニットに結合したＧＴＰ又はＧＴＰアナログが発する蛍光を特異的に検出し、前記Ｇタンパク質αサブユニットとＧＴＰ又はＧＴＰアナログとの結合の有無を検出することを特徴とする請求項１０に記載のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価方法である。
【００３４】
本発明のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価方法においては、Ｇタンパク質αサブユニットに結合したＧＴＰ又はＧＴＰアナログと、結合しなかった遊離のＧＴＰ又はＧＴＰアナログとの分離、すなわちＢ／Ｆ分離を行なうことなくＧタンパク質αサブユニットに結合したＧＴＰ又はＧＴＰアナログが発する蛍光を特異的に検出する。かかる構成により、より簡便な操作でＧタンパク質共役型受容体に対する結合性の評価を行なうことができる。
【００３５】
請求項１２に記載の発明は、蛍光相関分光法又は蛍光偏光測定法によって、Ｇタンパク質αサブユニットに結合したＧＴＰ又はＧＴＰアナログが発する蛍光を特異的に検出することを特徴とする請求項１１に記載のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価方法である。
【００３６】
かかる構成により、より高感度でＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価を行なうことができる。
【００３７】
請求項１３に記載の発明は、前記融合タンパク質に代わって、Ｇタンパク質共役型受容体のＮ末端側に折り畳み因子が連結された融合タンパク質と、遊離のＧタンパク質αサブユニットとを使用することを特徴とする請求項１〜１２のいずれかに記載のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価方法である。
【００３８】
本発明のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価方法では、Ｇタンパク質共役型受容体のＮ末端側に折り畳み因子が連結された融合タンパク質と、遊離のＧタンパク質αサブユニットとを使用する。かかる構成により、融合タンパク質の分子量が小さくなり、融合タンパク質の調製が容易である。
【００３９】
請求項１４に記載の発明は、請求項１〜１２のいずれかに記載のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価方法に用いるための組成物であって、所望のＧタンパク質共役型受容体のＮ末端側に折り畳み因子が連結され且つＣ末端側にＧタンパク質αサブユニットが連結された融合タンパク質を含有することを特徴とするＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価用組成物である。
【００４０】
本発明はＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価用組成物にかかり、所望のＧタンパク質共役型受容体のＮ末端側に折り畳み因子が連結され且つＣ末端側にＧタンパク質αサブユニットが連結された融合タンパク質を含有する。本発明のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価用組成物によれば、融合タンパク質中のＧＰＣＲが可溶性タンパク質として存在することができる。その結果、従来用いられていた不溶性の細胞膜画分（懸濁液）に比べて、容易かつ正確にＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価を行なうことができる。
【００４１】
請求項１５に記載の発明は、請求項１３に記載のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価方法に用いるための組成物であって、Ｇタンパク質共役型受容体のＮ末端側に折り畳み因子が連結された融合タンパク質と、遊離のＧタンパク質αサブユニットとを含有することを特徴とするＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価用組成物である。
【００４２】
本発明もＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価用組成物にかかり、Ｇタンパク質共役型受容体のＮ末端側に折り畳み因子が連結された融合タンパク質と、遊離のＧタンパク質αサブユニットとを含有する。本発明のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価用組成物においては、含有される融合タンパク質の分子量が小さいので、融合タンパク質の調製が容易である。
【００４３】
請求項１６に記載の発明は、さらにＧＤＰを含有することを特徴とする請求項１４又は１５に記載のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価用組成物である。
【００４４】
また請求項１７に記載の発明は、さらにＧＴＰ又はＧＴＰアナログを含有することを特徴とする請求項１４〜１６のいずれかに記載のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価用組成物である。
【００４５】
かかる構成により、被検化合物を用意するだけでＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価を行なうことができる。
【００４６】
請求項１８に記載の発明は、前記ＧＴＰ又はＧＴＰアナログは、蛍光標識されたものであることを特徴とする請求項１７に記載のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価用組成物である。
【００４７】
かかる構成により、Ｂ／Ｆ分離を行なうことなくＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価を行なうことができる。
【００４８】
請求項１９に記載の発明は、前記折り畳み因子は、シャペロニンサブユニット又はシャペロニンサブユニット連結体であることを特徴とする請求項１４〜１８のいずれかに記載のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価用組成物である。
【００４９】
また請求項２０に記載の発明は、前記シャペロニンサブユニット又はシャペロニンサブユニット連結体は、シングルリングを形成するものであることを特徴とする請求項１９に記載のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価用組成物である。
【００５０】
また請求項２１に記載の発明は、前記シャペロニンサブユニット連結体は、該シャペロニンサブユニットの由来によって決定される最適数のシャペロニンサブユニットが連結されたものであることを特徴とする請求項１９又は２０に記載のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価用組成物である。
【００５１】
また請求項２２に記載の発明は、前記シャペロニンサブユニット又はシャペロニンサブユニット連結体は、大腸菌由来のシャペロニンサブユニットからなることを特徴とする請求項１９〜２１のいずれかに記載のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価用組成物である。
【００５２】
かかる構成により、融合タンパク質中のＧＰＣＲがシャペロニンリング内に格納され、より容易に可溶性タンパク質として存在することができる。
【００５３】
請求項２３に記載の発明は、Ｇタンパク質共役型受容体タンパク質のＮ末端側に折り畳み因子が結合され且つＣ末端側にＧタンパク質αサブユニットが連結されていることを特徴とする融合タンパク質である。
【００５４】
本発明は融合タンパク質にかかり、Ｇタンパク質共役型受容体タンパク質のＮ末端側に折り畳み因子が結合され且つＣ末端側にＧタンパク質αサブユニットが連結されていることを特徴とする。本発明の融合タンパク質によれば、融合タンパク質中のＧＰＣＲが折り畳まれ、可溶性の状態で存在することができるので、より簡便かつ正確に該ＧＰＣＲに対する結合性評価を行なうことができる。
【００５５】
請求項２４に記載の発明は、前記折り畳み因子は、シャペロニンサブユニット又はシャペロニンサブユニット連結体であることを特徴とする請求項２３に記載の融合タンパク質である。
【００５６】
また請求項２５に記載の発明は、前記シャペロニンサブユニット又はシャペロニンサブユニット連結体は、シングルリングを形成するものであることを特徴とする請求項２４に記載の融合タンパク質である。
【００５７】
また請求項２６に記載の発明は、前記シャペロニンサブユニット連結体は、該シャペロニンサブユニットの由来によって決定される最適数のシャペロニンサブユニットが連結されたものであることを特徴とする請求項２４又は２５に記載の融合タンパク質である。
【００５８】
また請求項２７に記載の発明は、前記シャペロニンサブユニット又はシャペロニンサブユニット連結体は、大腸菌由来のシャペロニンサブユニットからなることを特徴とする請求項２４〜２６のいずれかに記載の融合タンパク質である。
【００５９】
かかる構成により、ＧＰＣＲがシャペロニンリングの内部に格納され、より容易にＧＰＣＲが可溶性タンパク質として存在することができる。
【００６０】
請求項２８に記載の発明は、請求項２３〜２７のいずれかに記載の融合タンパク質をコードする遺伝子である。
【００６１】
本発明の遺伝子は、Ｇタンパク質共役型受容体タンパク質のＮ末端側に折り畳み因子が結合され且つＣ末端側にＧタンパク質αサブユニットが連結されている融合タンパク質をコードする。本発明の遺伝子を転写・翻訳することにより、ＧＰＣＲに対する結合性評価に有用な該融合タンパク質を生産することができる。
【発明の効果】
【００６２】
本発明のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価方法によれば、ＧＰＣＲが可溶性の状態で解析するので、より簡便且つハイスループットにＧＰＣＲに対する結合性評価を行なうことができる。
【００６３】
本発明のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価用組成物によれば、ＧＰＣＲが可溶性の状態で存在するので、より簡便且つハイスループットにＧＰＣＲに対する結合性評価を行なうことができる。
【００６４】
本発明の融合タンパク質によれば、ＧＰＣＲが可溶性の状態で存在することができるので、より簡便且つハイスループットにＧＰＣＲに対する結合性評価を行なうことができる。
【００６５】
本発明の遺伝子によれば、折り畳み因子とＧＰＣＲとＧタンパク質αサブユニットとの融合タンパク質をより簡便に生産することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６６】
以下、本発明を実施するための最良の形態について、詳しく説明する。
【００６７】
本発明のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価方法においては、所望のＧタンパク質共役型受容体のＮ末端側に折り畳み因子が連結され且つＣ末端側にＧタンパク質αサブユニットが連結された融合タンパク質を用いる。そして、該融合タンパク質に被検化合物を接触させ、そのときの前記Ｇタンパク質αサブユニットとＧＴＰ又はＧＴＰアナログとの結合の有無を検出する。そして、その検出結果により、前記被検化合物の前記Ｇタンパク質共役型受容体に対する結合性を評価する。
【００６８】
本発明のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価方法で用いる融合タンパク質は、所望のＧタンパク質共役型受容体のＮ末端側に折り畳み因子が連結され且つＣ末端側にＧタンパク質αサブユニットが連結されたものである。これは、換言すれば、「折り畳み因子−所望のＧＰＣＲ−Ｇタンパク質αサブユニット」の順で連結された融合タンパク質で、折り畳み因子側がＮ末端、Ｇタンパク質αサブユニット側がＣ末端となるものである。ＧＰＣＲは疎水性が高いので単独では不溶性となるが、この融合タンパク質中のＧＰＣＲは、隣接する折り畳み因子の作用によって可溶性となる。その結果、従来のように不溶性の細胞膜画分を使用することなく、ＧＰＣＲに対する結合性評価を行なうことができる。
【００６９】
本発明のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価方法の好ましい実施形態は、４つの工程を包含する。第１の工程では、融合タンパク質とＧＴＰ又はＧＴＰアナログとを含有する反応液を調製する。このとき、該反応液はさらにＧＤＰを含有していることが好ましい。このとき、反応液中では、融合タンパク質中のＧタンパク質αサブユニットとＧＴＰ又はＧＴＰアナログとは結合せず、ＧＴＰ又はＧＴＰアナログが遊離状態で存在する。ＧＤＰが存在すると、ＧＤＰは融合タンパク質中のＧタンパク質αサブユニットに結合している。
【００７０】
第２の工程では、第１の工程で調製した反応液に被検化合物を添加し、上記融合タンパク質に被検物質を接触させる。このとき、被検化合物が目的のリガンドであれば、該被検化合物が融合タンパク質中のＧＰＣＲに結合し、該ＧＰＣＲに構造変化が起こる。その結果、融合タンパク質中のＧタンパク質αサブユニットに、ＧＴＰ又はＧＴＰアナログが結合する。ＧＤＰが存在すると、融合タンパク質中のＧタンパク質αサブユニットに結合していたＧＤＰが、ＧＴＰ又はＧＴＰアナログと置き換わる（ＧＤＰ−ＧＴＰ交換反応）。一方、被検化合物が目的のリガンドでない場合はＧＰＣＲに結合しないので、ＧＴＰ又はＧＴＰアナログはＧＰＣＲに結合しない。
【００７１】
第３の工程では、第２の工程に続いて、Ｇタンパク質αサブユニットに結合したＧＴＰ又はＧＴＰアナログの量を測定し、Ｇタンパク質αサブユニットとＧＴＰ又はＧＴＰアナログとの結合の有無を検出する。換言すれば、Ｇタンパク質αサブユニットに結合したＧＴＰ又はＧＴＰアナログと、遊離状態のＧＴＰ又はＧＴＰアナログとを区別し、Ｇタンパク質αサブユニットに結合したＧＴＰ又はＧＴＰアナログのみを選択的に測定する。そして、この測定結果をもってＧタンパク質αサブユニットとＧＴＰ又はＧＴＰアナログとの結合の有無を検出する。この際、Ｇタンパク質αサブユニットに結合したＧＴＰ又はＧＴＰアナログのみを選択的に測定する方法として、後述する様々の実施形態が可能である。
【００７２】
第４の工程では、第３の工程で前記Ｇタンパク質αサブユニットとＧＴＰ又はＧＴＰアナログとの結合が検出された場合に、上記被検化合物は上記Ｇタンパク質共役型受容体に対する結合性を有すると評価する。このようにしてＧタンパク質共役型受容体に結合すると評価された被検化合物は、特定のＧＰＣＲに対するリガンドである可能性が高く、医薬品開発等に有用と考えられる。
【００７３】
好ましい実施形態では、ＧＴＰ又はＧＴＰアナログとして加水分解が制限されたＧＴＰアナログを用いる。すなわち、そのようなＧＴＰアナログは、Ｇタンパク質αサブユニットが有するＧＴＰａｓｅ活性により加水分解されにくい。該ＧＴＰアナログの例としては、ＧＴＰγＳとＧＭＰ−ＰＮＰ（ＧｐｐＮＨｐ）が挙げられる。ＧＴＰγＳは、ＧＴＰのγ位のＰがＳに置換されたＧＴＰアナログである。またＧＭＰ−ＰＮＰは、ＧＴＰのγ位のリン酸結合に２級アミンが導入されたＧＴＰアナログである。その他、ＧＴＰアナログとしては、トリニトロ基を有するＧＴＰアナログなども用いることができる。
【００７４】
また、好ましい実施形態では、蛍光標識されたＧＴＰ又はＧＴＰアナログを用いる。標識に用いる蛍光物質の例としては、フルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体などが挙げられる。特に、Ｇタンパク質αサブユニットに結合したときに、その蛍光強度が増強されるものが好ましい。例えば、モレキュラープローブ社から市販されているBODIPYR FL、BODIPY R6G、BODIPY TR、N-methylanthraniloyl(MANT) fluorophoreなどの蛍光プローブをＧＴＰ又はＧＴＰアナログに結合させた蛍光標識体の場合、遊離状態ではＧＴＰのもつクエンチング効果により蛍光が消光するが、Ｇタンパク質αサブユニットに結合した状態ではクエンチング効果が抑制され、本来持つ蛍光を発することが知られている。したがって、このような蛍光標識ＧＴＰ又はＧＴＰアナログを用いれば、遊離の蛍光標識ＧＴＰ又はＧＴＰアナログと、Ｇタンパク質αサブユニットに結合した蛍光標識ＧＴＰ又はＧＴＰアナログとを分離（Ｂ／Ｆ分離）することなく、一液系でＧタンパク質αサブユニットに結合した蛍光標識ＧＴＰ又はＧＴＰアナログが発する蛍光を特異的に測定することができる。その結果、ハイスループット性の高いホモジニアスなアッセイを行うことが可能となる。
【００７５】
また、遊離状態ではクエンチングが起こる蛍光標識ＧＴＰ又はＧＴＰアナログを用いる場合は、蛍光相関分光法又は蛍光偏光法を用いることで、さらに高感度なアッセイが可能となる。例えば、蛍光相関分光法は、蛍光物質１分子レベルでそのブラウン運動を検出することができる測定方法であり、低分子化合物と高分子化合物のブラウン運動の違いを高感度に検出することができる。したがって、遊離の蛍光標識ＧＴＰ又はＧＴＰアナログ（低分子化合物）とＧ−タンパク質αサブユニットを介して融合タンパク質に結合した蛍光標識ＧＴＰ又はＧＴＰアナログ（高分子化合物）の違いを検出でき、Ｂ／Ｆ分離を行なうことなくさらに高感度な検出が可能である。一方、蛍光偏光法は、蛍光相関分光法や通常の蛍光分光法に比べて感度は劣るものの、やはり高分子化合物と低分子化合物の濃度変化を検出することができるため、Ｂ／Ｆ分離を行うことなく、ホモジニアスなアッセイが可能となる。なお、蛍光相関分光法や蛍光偏光法を適用するためには、ＧＰＣＲやＧタンパク質αサブユニットがコロイド状に分散するか可溶性の状態であることが必要であり、従来の不溶性の細胞膜画分を用いる方法では適用できない。
【００７６】
他方、ＧＴＰ又はＧＴＰアナログを放射性標識して用いることもできる。この場合は、Ｂ／Ｆ分離を行ない、Ｇタンパク質αサブユニットに結合した放射性標識ＧＴＰ又はＧＴＰアナログから発せられる放射線を検出する。
【００７７】
融合タンパク質に用いられる折り畳み因子は、分子シャペロンとフォルダーゼのいずれも使用可能である。分子シャペロンの例としては、シャペロニン、Ｈｓｐ７０等が挙げられ、フォルダーゼの例としては、ペプチジルプロリルシストランスイソメラーゼやプロテインジスルフィドイソメラーゼが挙げられるが、シャペロニンが特に好ましい。
【００７８】
シャペロニンは、グループ１型とグループ２型とに大別される。バクテリアや真核生物のオルガネラに存在するシャペロニンはグループ１型に分類され、いずれも分子量６０ｋＤａからなるシャペロニンサブユニット７つが環状に連なるリング構造を形成し、さらに２つのリングが２層構造を形成する、１４量体のホモオリゴマーを形成する。これらはコシャペロニンと称される分子量約１０ｋＤａのタンパク質の環状７量体を補因子とする。一方、グループ２型シャペロニンは、真核生物の細胞質や古細菌にみられ、通常８〜９個のシャペロニンサブユニットからなるリングが２層に連なった１６〜１８量体のホモ、またはヘテロオリゴマーを形成している。本発明のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価方法においては、融合タンパク質に含まれるシャペロニンとしてグループ１型及びグループ２型のいずれのシャペロニンも使用可能である。ここで、１型シャペロニンの例として、大腸菌由来のシャペロニンであるＧｒｏＥＬのサブユニット（ＧｒｏＥＬサブユニット）の遺伝子の塩基配列と対応するアミノ酸配列を配列番号１に、対応するアミノ酸配列のみを配列番号２に示す。
【００７９】
バクテリア、古細菌由来のシャペロニンは、組換えＤＮＡ技術により、大腸菌の細胞質可溶性画分に大量生産させることがすでに可能である。さらに、そのようにして発現させた様々のシャペロニンサブユニットであっても、自己集合し、１４〜１８量体からなる２層リング構造のシャペロニン複合体を形成できることが、電子顕微鏡による観察でわかっている。
【００８０】
好ましい実施形態では、シャペロニンサブユニット連結体を使用する。すなわち、シャペロニンサブユニット連結体においても、単独のシャペロニンサブユニットを補充しながら、天然型シャペロニンと同様にリング構造を構成することがわかっている。そして、シャペロニンサブユニット連結体のＣ末端側に目的タンパク質を連結させた融合タンパク質において、その目的タンパク質がシャペロニンのキャビティー内に格納された状態で発現できることがわかっている（古谷ら，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００５，１４，３４１）。本発明のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価方法で用いる融合タンパク質においても、このようなシャペロニンサブユニット連結体のＣ末端側に所望のＧＰＣＲを連結させ、さらに該ＧＰＣＲのＣ末端側にＧタンパク質αサブユニットを連結させることにより、該ＧＰＣＲがシャペロニンのキャビティー内部に格納され、Ｇタンパク質αサブユニットがＧＰＣＲと連結した状態でシャペロニンキャビティー外部に提示させることが可能となる。また、シャペロニンサブユニットＮ回連結体の連結数（Ｎ）は、そのシャペロニンサブユニットの由来によって決定される最適数であることが特に好ましく、グループ１型シャペロニンのサブユニットを用いる場合には７個、グループ２型シャペロニンのサブユニットを用いる場合には８又は９個が好ましい。これらの最適数であれば、シャペロニンサブユニット連結体のみでシャペロニンリングを形成することができ、単独のシャペロニンサブユニットを補充する必要がない。
【００８１】
好ましい実施形態では、シングルリングを形成するシャペロニンを用いる。すなわち、近年、遺伝子工学的にアミノ酸変異を導入することにより、上述のような２層のリング構造を形成せず、シングルリングを形成するようなシャペロニンも得られるようになってきた。これらのシングルリングを形成するシャペロニンも、大腸菌の可溶性画分に大量発現することができ、ゲル濾過や電子顕微鏡及び画像解析等によって発現産物の大部分がシングルリングを構成していることが確認されている。そして、かかるシングルリングのシャペロニンでも他のタンパク質を収容できるキャビティーが充分に形成されることが確認されており、他のタンパク質の折り畳みを行うことができる（特開２００４−４３４４７号公報）。なお、真核生物のミトコンドリア由来のシャペロニン６０は、通常、シングルリングとして精製されるため、特別の遺伝子操作なしで得ることができる（Ｖｉｉｔａｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７，６９５−６９８）。
【００８２】
また、人為的にシングルリングを形成させる手段としては様々な方法があり、いずれの手段を用いてもかまわない。最も一般的に用いられている方法は、リング間の疎水的相互作用や塩橋に寄与するアミノ酸に変異を導入することによって、リング間相互作用を抑制する方法である。例えば、大腸菌由来のシャペロニンＧｒｏＥＬ（配列番号２）の場合、結晶構造解析より赤道ドメインの４つの荷電アミノ酸（Ｒ４５２、Ｅ４６１、Ｓ４６３、Ｖ４６４）がリング間の結合に強く寄与していていることが分かっている。そこで、４５２番目のアミノ酸残基（アルギニン）をグルタミン酸に、４６１（グルタミン酸）、４６３（セリン）、４６４番目（バリン）のアミノ酸残基をアラニンに置換することにより、リング間相互作用が軽減し、シングルリングを構成することが分かっている（Ｗｅｉｓｓｍａｎｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｃｅｌｌ，８３，５７７−５８７）。
【００８３】
さらに、様々な組み合わせのキメラシャペロニンを作製することによって、シャペロニンとしての機能を保持した状態のシングルリングシャペロニンを得ることもできる。例えば、大腸菌由来のシャペロニンＧｒｏＥＬと根粒菌由来のシャペロニンとを用いてキメラシャペロニンを作製することによって、シングルリングシャペロニンを作製することができる（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．，２８２，７８９−８００）。
【００８４】
また、本発明のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価方法で用いる融合タンパク質において、シャペロニン等の折り畳み因子と所望のＧＰＣＲとが、リンカーとなるオリゴペプチドを介して連結されていてもよい。該オリゴペプチドの長さは２〜５０アミノ酸程度が好ましい。同様に、所望のＧＰＣＲとＧタンパク質αサブユニットとがリンカーとなるオリゴペプチドを介して連結されていてもよい。該オリゴペプチドの長さは１〜２５アミノ酸程度が好ましい。
【００８５】
なお、本発明のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価方法の他の様相として、融合タンパク質からＧタンパク質αサブユニットが遊離されていてもよい。すなわち、所望のＧＰＣＲとＧタンパク質αサブユニットとが連結されていない構成も可能である。
【００８６】
本発明のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価方法は、全てのＧＰＣＲに適用可能である。例えば、クラスＡに分類されるロドプシン型のＧＰＣＲ、クラスＢに分類されるセクレチンレセプター型のＧＰＣＲ、クラスＣに分類される代謝共役型ＧＰＣＲまたはホルモンレセプター型ＧＰＣＲ、クラスＤの真菌ホルモンレセプター型ＧＰＣＲ、クラスＥのｃＡＭＰレセプター型ＧＰＣＲなどに適用できる。また、本発明のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価方法は、リガンドや、分類が未同定のオーファンレセプターにも適用できる。
【００８７】
本発明のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価方法で用いる融合タンパク質に含まれるＧタンパク質αサブユニットとしては、Ｇｓファミリー、Ｇｉファミリー、Ｇｑファミリー、及び、Ｇ１２ファミリーに属する全てのαサブユニットが適用可能である。すなわち、Ｇｓファミリーに属するαs-1〜4、αolf；Ｇｉファミリーに属するαi-1〜4、αo-1〜2、αt-1〜2、αgust、αZ；Ｇｑファミリーに属するαq、α11、α14、α15、α16；Ｇ１２ファミリーに属するα12、α13のいずれもが、本発明のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価方法に適用可能である。ただし、ＧＰＣＲとＧタンパク質αサブユニットとの組み合わせは、リガンドの結合によるＧＰＣＲの構造変化に伴い、活性化することのできる（ＧＤＰ及びＧＴＰの親和性が変化するなど）Ｇタンパク質αサブユニットとの組み合わせであることが好ましい。その点において、Ｇｑファミリーに属するα15及びα16は幅広く様々なＧＰＣＲと共役するためより好ましい。
【００８８】
本発明のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価方法は、種々の用途に使用することができる。一つの用途は、オーファンＧＰＣＲに対するリガンドのスクリーニングである。例えば、アゴニスト型リガンドをスクリーニングする場合は、被検化合物とＧＰＣＲとの結合の有無を検出し、結合した候補化合物を所望のリガンドと判定することができる。具体的には、被検化合物が所望のアゴニスト型リガンドであれば、ＧＰＣＲとの結合し、その結果、ＧＴＰ又はＧＴＰアナログがＧタンパク質αサブユニットに結合するので、その結合性を蛍光強度等の増加をもって判定すればよい。一方、アンタゴニスト型リガンドをスクリーニングする場合は、既知のアゴニスト型リガンドと被検化合物とを反応系に共存させて競合的に結合させ、被検化合物とＧＰＣＲとの結合の有無を検出し、結合した候補化合物を所望のリガンドと判定することができる。具体的には、被検化合物が所望のアンタゴニスト型リガンドであれば、競合的結合により既知のリガンドの結合量が減少し、その結果、Ｇタンパク質αサブユニットに結合するＧＴＰ又はＧＴＰアナログが減少するので、その結合性を蛍光強度等の減少をもって判定すればよい。本方法を用いたリガンドのスクリーニングによれば、より効率的に薬物候補となるリガンドをスクリーニングすることができる。
【００８９】
本発明のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価方法の他の用途としては、ターゲットバリデーションが挙げられる。これは、既知又は未知の複数のＧＰＣＲに対して、ある目的のリガンドを用いて本方法を適用し、リガンドが結合したＧＰＣＲを選抜するものである。本方法を用いたターゲットバリデーションによれば、リガンドの作用機序の解明を効率的に行なうことができる。
【００９０】
本発明のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価方法を具体的に行なう手順の例を、図１（ａ）〜（ｃ）の模式図を参照しながら説明する。この例では、折り畳み因子として、シングルリングを形成するＧｒｏＥＬサブユニット７回連結体を用いる。また、ＧＴＰアナログとして、蛍光標識したＧＴＰγＳを用いる。なお、図１（ａ）〜（ｃ）において、ＧｒｏＥＬサブユニット７回連結体は「ＧｒｏＥＬ」と、所望のＧＰＣＲは「ＧＰＣＲ」と、Ｇタンパク質αサブユニットは「α」と、ＧＴＰγＳは「ＧＴＰ」と、ＧＤＰは「ＧＤＰ」と、被検化合物は「Ｌ」と表示されている。
【００９１】
まず最初に、ＧｒｏＥＬサブユニット７回連結体と所望のＧＰＣＲとＧタンパク質αサブユニットとの融合タンパク質を準備する。該融合タンパク質においては、シャペロニンサブユニットによるシングルリング構造体の内部にＧＰＣＲが格納され、Ｇタンパク質αサブユニットが外部に露出している（図１（ａ））。次に、試験管内で、該融合タンパク質とＧＤＰと蛍光標識したＧＴＰγＳとを、適宜の緩衝液中で共存させる（図１（ｂ））。このとき、該融合タンパク質中のＧタンパク質αサブユニットにＧＤＰが結合し、蛍光標識ＧＴＰγＳは遊離している。また、クエンチングにより遊離の蛍光標識ＧＴＰγＳから発せられる蛍光の強度は小さい。
【００９２】
次に、試験管内に被検化合物を添加する。このとき、被検化合物がＧＰＣＲに対する結合性を有するものであれば、ＧＤＰ−ＧＴＰ交換反応が起こり、蛍光標識ＧＴＰγＳがＧタンパク質αサブユニットに結合する。さらに、クエンチングが解消されて、結合した蛍光標識ＧＴＰγＳから強い蛍光が発せられる（図１（ｃ））。一方、蛍光標識ＧＴＰγＳがＧタンパク質αサブユニットに結合しない場合は、ＧＤＰ−ＧＴＰ交換反応は起こらないのでクエンチング状態のままである。
【００９３】
次に、Ｂ／Ｆ分離を行なわずに反応液の蛍光強度を測定する。すなわち、クエンチングが解消されて、蛍光標識ＧＴＰγＳから強い蛍光が発せられる場合は、反応液全体の蛍光強度が増大する。一方、クエンチング状態の場合は、反応液全体の蛍光強度に変化は起こらない。よって、反応液全体の蛍光強度が増大したときに、被検化合物がＧＰＣＲに対する結合性を有すると評価することができる。この例では、反応液の蛍光強度を直接測定したが、この反応液を蛍光相関分光法又は蛍光偏光測定法に供してもよい。
【００９４】
なお、ＧＰＣＲのＮ末端側にシャペロニンサブユニット７回連結体が連結された融合タンパク質と、遊離のＧタンパク質αサブユニットとを用いても、図１（ａ）〜（ｃ）と同様の手順でＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価を行なうことができる。
【００９５】
本発明のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性の解析用組成物は、所望のＧタンパク質共役型受容体のＮ末端側に折り畳み因子が連結され且つＣ末端側にＧタンパク質αサブユニットが連結された融合タンパク質を含有するものである。さらに、本発明のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性の解析用組成物は、さらに、ＧＤＰ、ＧＴＰ又はＧＴＰアナログを含んでいてもよい。また、折り畳み因子がシャペロニン又はシャペロニンサブユニット連結体で、シャペロニンサブユニットの合計数が最適数未満の場合は、単独のシャペロニンサブユニットを加えてもよい。これにより、融合タンパク質が補充された単独のシャペロニンサブユニットを伴ってリング構造体を形成することが可能となる。さらに、本発明のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性の解析用組成物の形状は、適宜の緩衝液等に溶解させた溶液でもよく、凍結乾燥物でもよい。
【００９６】
また、本発明のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性の解析用組成物の他の様相として、融合タンパク質からＧタンパク質αサブユニットが遊離されていてもよい。すなわち、ＧＰＣＲとＧタンパク質αサブユニットとが連結されていない構成も可能である。
【００９７】
本発明の融合タンパク質は、Ｇタンパク質共役型受容体タンパク質のＮ末端側に折り畳み因子が結合され且つＣ末端側にＧタンパク質αサブユニットが連結されているものである。本発明の融合タンパク質は、上記したＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価方法及び評価用組成物の主要な構成をなす。
【００９８】
本発明の融合タンパク質を製造する方法としては、シャペロニンサブユニット又はシャペロニンサブユニット連結体の遺伝子と、ＧＰＣＲ遺伝子と、Ｇタンパク質αサブユニット遺伝子を連結した融合遺伝子を作成し、該融合遺伝子を転写・翻訳させる方法が代表的である。好ましくは、該融合遺伝子を発現ベクターに組み込み、該組換えベクターを適宜の宿主に導入して形質転換体を作製し、該形質転換体内で発現させる。このときに用いる宿主としては特に限定はなく、例えば、バクテリア、酵母、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞等の細胞の他、動物個体、植物個体又は昆虫個体等も用いることができる。この中でも、培養コストが安価であり、培養日数が短く、培養操作が簡便な点から、バクテリア又は酵母が好ましく、特に、大腸菌が取り扱いの容易さの面でより好ましい。
【００９９】
ただし、一般的に、大腸菌では１０ｋｂ以上の発現ベクター（プラスミド）を保有すると、プラスミドのコピー数が減少し、結果的に組換えタンパク質の生産量が低下することがある。折り畳み因子としてシャペロニンサブユニット又はシャペロニンサブユニット連結体を用いる場合を例に挙げると、シャペロニンサブユニットが８個連結したシャペロニンサブユニット８回連結体の場合、その遺伝子をプラスミドに組み込むと、プラスミドのサイズは１５ｋｂｐ以上になる。しかし、このサイズのプラスミドは、大腸菌内で安定に保持されない可能性がある。したがって、大腸菌を宿主として用いる場合は、プラスミドに導入する融合遺伝子の大きさ、すなわち、シャペロニンサブユニット又はシャペロニンサブユニット連結体をコードする遺伝子の大きさ（連結数）、ＧＰＣＲ遺伝子の大きさ、及びＧタンパク質αサブユニット遺伝子の大きさを考慮し、大腸菌内で安定に保持されるようサイズを選択すべきである。
【０１００】
また、大腸菌などの宿主で発現される融合タンパク質が巨大な場合は、転写されたｍＲＮＡの特定のリボヌクレアーゼによる分解、翻訳された融合タンパク質のプロテアーゼによる分解と、２段階の切断を受ける可能性がある。かかる場合には、例えば、ｍＲＮＡの分解に関与するリボヌクレアーゼをコードするＲＮａｓｅＥ遺伝子を欠損させた宿主を用いることでｍＲＮＡの分解を抑制することが可能である。また、翻訳後のプロテーゼによる分解を抑制するために、宿主細胞を１５〜２５℃の低温で培養したり、ｌｏｎ、ｏｍｐＴ等のプロテアーゼの構造遺伝子を欠損させた大腸菌を宿主として用いることができる。
【０１０１】
また、シャペロニンサブユニット連結体の遺伝子には、シャペロニンサブユニット遺伝子が繰り返し含まれるため、それを含むプラスミドが不安定となり、特に宿主とシャペロニンの由来生物が同じであるときには、プラスミドＤＮＡとゲノムＤＮＡの相同組換えが起こる可能性がある。宿主として大腸菌を用いる場合は、遺伝子の相同組換えに関する遺伝子であるｒｅｃＡを欠損させた宿主を用いることで、プラスミドの安定性を向上させ、相同組換えを抑制することができる。
【０１０２】
形質転換体内で融合タンパク質を発現させる方法としては特に限定されず、公知の方法を用いることができる。例えば、薬剤耐性遺伝子を有する発現ベクターを用いる場合は、対応の薬剤を含有する培地を用いて、形質転換体を培養することができる。このようにして、形質転換体内で融合タンパク質を発現させた後、該形質転換体を回収する。さらに回収した形質転換体を破砕して体抽出液を調製し、該菌体抽出液から融合タンパク質を精製する。
【０１０３】
精製の手順としては、例えば、硫安塩析によって菌体抽出液中の融合タンパク質を沈殿させ、沈殿を回収した後、適当な緩衝液に溶解し、疎水クロマトグラフィーやイオン交換クロマトグラフィーによって融合タンパク質の存在するフラクションを回収する。これらを限外ろ過によって濃縮した後、濃縮液を５〜５０ｍＭ程度の塩化マグネシウム及び５０〜３００ｍＭ程度の塩化ナトリウム又は塩化カリウムが含有された緩衝液を展開液としてゲルろ過を行い、排除限界直後のピークを回収することによって融合タンパク質を精製することができる。
【０１０４】
さらに高度な精製が必要な場合は、融合タンパク質のＮ末端及びＣ末端にそれぞれ異なる２種類のタグをペプチド結合を介して付加しておくことが好ましい。例えば、融合タンパク質のＮ末端に６〜１０個のヒスチジンが並んだヒスチジンタグを連結し、さらに、Ｃ末端に配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるＦＬＡＧタグを連結する。この場合、精製のファーストステップとしてニッケル等の金属キレートカラムを用いれば、Ｎ末端にヒスチジンタグの付加されていないタンパク質は除去され、さらにセカンドステップとして抗ＦＬＡＧ抗体を用いたアフィニティクロマトグラフィーによってＣ末端側にＦＬＡＧタッグの付加タンパク質は除去される。したがって、Ｎ末端及びＣ末端にそれぞれヒスチジンタグ及びＦＬＡＧタグが付加された融合タンパク質のみが精製されることになる。Ｎ末端及びＣ末端に付加されるタグとしてはヒスチジンタグ、ＦＬＡＧタグ以外でもよく、他のタグとしては、例えば、Ｓｔｒｅｐタグ、Ｓタグ等が挙げられる。
【０１０５】
また、宿主を用いない方法として、バクテリア、真核生物抽出液等を用いた無細胞翻訳系（例えば、Ｓｐｉｒｉｎ， Ａ．Ｓ．， １９９１， Ｓｃｉｅｎｃｅ １１， ２６５６−２６６４： Ｆａｌｃｏｎｅ， Ｄ． ｅｔ ａｌ．， １９９１， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １１， ２６５６−２６６４）でも、融合タンパク質を可溶性タンパク質として発現させることが可能である。
【０１０６】
本発明の遺伝子は、本発明の融合タンパク質、すなわち、Ｇタンパク質共役型受容体のＮ末端側に折り畳み因子が連結され且つＣ末端側にＧタンパク質αサブユニットが連結された融合タンパク質をコードするものである。本発明の遺伝子は、折り畳み因子の遺伝子と、ＧＰＣＲの遺伝子と、Ｇタンパク質αサブユニットの遺伝子とを連結することにより、製造することができる。例えば、折り畳み因子の遺伝子として、各由来のシャペロニンの遺伝子がすでに単離されている。また、各ＧＰＣＲの遺伝子は米国Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｇｅｎｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＭＧＣ）などの遺伝資源保存機関で入手可能である。さらに、Ｇタンパク質αサブユニットの遺伝子も同様にＭＧＣで入手可能である。
【０１０７】
以下に実施例を掲げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例のみに限定されるものではない。
【実施例１】
【０１０８】
１．シングルリングＧｒｏＥＬ７回連結融合タンパク質の発現系構築
大腸菌Ｋ１２株ゲノムを鋳型とし、配列番号４に示されるプライマーＧｒｏ−Ｆ１と配列番号５に示されるプライマーＧｒｏ−Ｒ１をプライマー対としてＰＣＲを行い、大腸菌シャペロニンＧｒｏＥＬサブユニット遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅した。さらに、該増幅ＤＮＡ断片をｐＴ７ｂｌｕｅＴベクター（ノバジェン社）に導入した。次に、ＧｒｏＥＬ遺伝子中のＤｒａＩＩＩ−ＢａｍＨＩ部分（１３２８〜１４８７番）を同制限酵素で切り出した後、配列番号６で表される塩基配列からなる２本鎖ＤＮＡを代わりに組み込み、ＧｒｏＥＬの４５２番目のアルギニン（Ｒ）をグルタミン酸（Ｅ）に、４６１番目のグルタミン酸（Ｅ）をアラニン（Ａ）に、４６３番目のセリン（Ｓ）をアラニン（Ａ）に、及び４６４番目のバリン（Ｖ）をアラニン（Ａ）に置換する変異を導入した。これにより、シングルリングを形成する変異型ＧｒｏＥＬのサブユニットをコードする遺伝子ＳＲＩＩをｐＴ７ｂｌｕｅＴベクター中にクローニングできた。
【０１０９】
ｐＴｒｃ９９Ａ発現ベクター（アマシャムファルマシア社）のＮｃｏＩ／ＨｉｎｄＩＩＩサイトに配列番号７で表される塩基配列からなる２本鎖ＤＮＡを挿入し、ｐＴｒｃ９９ＡＬＴＣＦベクターを構築した。これにより、ＮｃｏＩ、ＸｂａＩ、ペプチドリンカーサイト（トロンビン翻訳サイト）、ＢｇｌＩＩサイト、スペーサー配列、ＸｈｏＩサイト、ペプチドリンカーサイト（エンテロキナーゼ（Ｅｋ）翻訳サイト）、その下流に、転写翻訳されてＦＬＡＧタグとなる塩基配列（ＦＬＡＧサイト）及び終始コドン、さらにその下流にＨｉｎｄＩＩＩサイトが導入された。すなわち、ｐＴｒｃ９９ＡＬＴＣＦベクターによれば、ＮｃｏＩサイトのＡＴＧが開始コドンとなった場合、各制限酵素サイトにＯＲＦを導入したときに、正しい読み枠となる。
【０１１０】
上記で得られたＳＲＩＩ遺伝子をＳｐｅＩ／ＸｂａＩで処理し、あらかじめＸｂａＩ処理しておいたｐＴｒｃ９９ＡＬＴＣＦベクターに、ＳＲＩＩ遺伝子が正しい方向に翻訳されるように導入した。さらに、得られたベクターをＸｂａＩ処理し、同様にＳｐｅＩ／ＸｂａＩ処理して得られたＳＲＩＩ遺伝子を正しく翻訳されるように導入することにより、変異型ＧｒｏＥＬサブユニット遺伝子が２回連結された発現ベクターｐＴｒｃ（ＳＲＩＩ）2ＴＣＦを構築した。同様の手順を繰り返し、ＳＲＩＩ遺伝子が一方向に７回連結した遺伝子断片が挿入された発現ベクターｐＴｒｃ（ＳＲＩＩ）7ＴＣＦを構築した。発現ベクターｐＴｒｃ（ＳＲＩＩ）7ＴＣＦの構成を図２に示す。図中、「ｇｒｏＥＬ」はＳＲＩＩ遺伝子、「ＰＳ」はペプチドリンカーサイト、「ＣＳ」はクローニングサイト、「ＦＬＡＧ」はＦＬＡＧペプチドサイトを表す。すなわち、発現ベクターｐＴｒｃ（ＳＲＩＩ）7ＴＣＦはｔｒｃプロモーターの下流に、順に、７個のＳＲＩＩ遺伝子（（ＳＲＩＩ）7）、ペプチドリンカーサイト（トロンビン翻訳サイト）、ＢｇｌＩＩサイト、スペーサー配列、ＸｈｏＩサイト、ペプチドリンカーサイト（Ｅｋ翻訳サイト）、ＦＬＡＧペプチドサイト、終始コドン、及びターミネーターを有する。そして、ＢｇｌＩＩ−ＸｈｏＩサイトに目的タンパク質の遺伝子を挿入することにより、変異型ＧｒｏＥＬサブユニット７回連結体と目的タンパク質との融合タンパク質を発現することができる。なお、２つのペプチドリンカーサイトはいずれもプロテアーゼ（トロンビンとエンテロキナーゼ）の認識アミノ酸配列をコードするものであるが、本実施例では単なるペプチドリンカーをコードする塩基配列として機能する。
【０１１１】
発現ベクターｐＴｒｃ（ＳＲＩＩ）7ＴＣＦを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株に導入し、形質転換体を得た。この形質転換体を、カルベニシリン（１００μｇ／ｍＬ）を含む２×Ｙ．Ｔ．培地（１６ｇ／Ｌ バクトトリプトン、１０ｇ／Ｌ 酵母エキス、５ｇ／Ｌ ＮａＣｌ）で２３℃、１１０ｒｐｍで２４時間回転培養した。培養後、菌体を回収し、超音波処理により菌体を破砕した。菌体破砕液を遠心分離して上清を回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、クマシーブリリアントブルーにてゲルを染色した。その結果、ＳＲＩＩの７回連結体（ＳＲＩＩ）7が可溶性画分に大量に発現していることが確認できた。また、得られた（ＳＲＩＩ）7の上清をＮａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥで分析した結果、シングルリングとして存在していることが確認できた。
【０１１２】
２．融合タンパク質の発現
ヒトエンドセリンＡ受容体（ヒトＥＴＡＲ）をモデルＧＰＣＲとし、ヒトＥＴＡＲのＮ末端側に変異型ＧｒｏＥＬサブユニット７回連結体（折り畳み因子）が連結され且つＣ末端側にＧタンパク質α１５サブユニット（Ｇタンパク質αサブユニット）が連結された融合タンパク質を、以下の手順で調製した。
【０１１３】
ヒトＥＴＡＲ遺伝子のｃＤＮＡクローンを、ＯｒｉＧｅｎｅ社より入手した（アクセッションナンバー NM_001957、配列番号８）。このｃＤＮＡクローンを鋳型とし、配列番号９で表されるプライマーと配列番号１０で表されるプライマーをプライマー対としてＰＣＲを行い、ヒトＥＴＡＲ遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅した。この増幅ＤＮＡ断片の両端にはプライマーに由来するＢｇｌＩＩサイト（５’末端）とＸｈｏＩサイト（３’末端）が導入された。この増幅ＤＮＡ断片を、あらかじめＢｇｌＩＩ及びＸｈｏＩで消化したｐＴｒｃ（ＳＲＩＩ）7ベクターに導入し、ｐＴｒｃ（ＳＲＩＩ）7ＥＴＡＲＦベクターを作製した。
【０１１４】
ヒトＧタンパク質α１５サブユニット（以下、単に「ヒトＧタンパク質α１５」、「α１５」等と略記する。）のｃＤＮＡクローンを、ＯｒｉＧｅｎｅ社より入手した(アクセッションナンバー NM_002068、配列番号１１)。このｃＤＮＡクローンを鋳型とし、配列番号１２で表されるプライマーと配列番号１３で表されるプライマーをプライマー対としてＰＣＲを行い、ヒトＧタンパク質α１５遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅した。この増幅ＤＮＡ断片の両端にはプライマーに由来するＸｈｏＩサイトが導入された。この増幅ＤＮＡ断片を、あらかじめＸｈｏＩで消化したｐＴｒｃ（ＳＲＩＩ）7ＥＴＡＲＦベクターに導入し、ｐＴｒｃ（ＳＲＩＩ）7ＥＴＡＲＧ１５Ｆベクターを作製した。本ベクターに含まれる融合遺伝子の構成の概略を図３に、対応する融合タンパク質の構成の概略を図４に示す。図３で、「ｇｒｏＥＬ」は変異型ＧｒｏＥＬサブユニット遺伝子、「ｅｔａｒ」はヒトＥＴＡＲ遺伝子、「ｇ１５」はヒトＧタンパク質α１５遺伝子を表す。また、図４で、「ＧｒｏＥＬ」は変異型ＧｒｏＥＬサブユニット、「ＥＴＡＲ」はヒトＥＴＡＲ，「Ｇ１５」はヒトＧタンパク質α１５を表す。すなわち、ｐＴｒｃ（ＳＲＩＩ）7ＥＴＡＲＧ１５Ｆベクターは、変異型ＧｒｏＥＬサブユニット７回連結体遺伝子（ＳＲＩＩ）7の下流に、ヒトＥＴＡＲ遺伝子、さらに下流にヒトＧタンパク質α１５遺伝子が連結された融合遺伝子を有する。そして、該融合遺伝子が発現することにより、「ヒトＥＴＡＲのＮ末端側に変異型ＧｒｏＥＬサブユニット７回連結体が連結され且つＣ末端側にヒトＧタンパク質α１５が連結された融合タンパク質」（以下、「ＳＲ−ＥＴＡＲ−Ｇ１５」と略記することがある。）が生産される。なお、該融合遺伝子においては、（ＳＲＩＩ）7とヒトＥＴＡＲ遺伝子との間にペプチドリンカーサイト（トロンビン翻訳サイト）があり、さらに、ヒトＧタンパク質α１５遺伝子の下流にペプチドリンカーサイト（エンテロキナーゼ翻訳サイト）及びＦＬＡＧペプチドサイトが連結されている。
【０１１５】
ｐＴｒｃ（ＳＲＩＩ）7ＥＴＡＲＧ１５Ｆベクターを大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）株に導入し、形質転換体を得た。この形質転換体を上記１と同様にして培養し、菌体破砕後、上清を回収した。この上清に対して、抗ＦＬＡＧ抗体固定化ビーズ（シグマ社製）を用いて免疫沈降反応を行った。その結果、「変異型ＧｒｏＥＬサブユニット７回連結体−ヒトＥＴＡＲ−ヒトＧタンパク質α１５」の融合タンパク質（ＳＲ−ＥＴＡＲ−Ｇ１５）の分子量に相当する５１０ｋＤａ付近の位置にバンドが検出された。これにより、目的の融合タンパク質（ＳＲ−ＥＴＡＲ−Ｇ１５）が大腸菌可溶性画分に発現されることが確認された。
【０１１６】
３．融合タンパク質の精製
１０％ 硫酸アンモニウム／１０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液で平衡化したＨｉＴｒａｐ Ｂｕｔｙｌ ＦＦカラム ５ｍＬ（アマシャムファルマシア社）に、上記２で調製した菌体破砕液の上清を供した。次に、１０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液で溶出し、融合タンパク質を含む画分を回収した。この画分を、１０ｍＭ ＣａＣｌ2及び１００ｍＭ ＮａＣｌを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）緩衝液に対して透析を行った。次に、透析内液を同じ緩衝液で平衡化した抗ＦＬＡＧ抗体カラム（シグマ社製）に供し、アフィニティクロマトグラフィーを行った。カラムを同緩衝液で洗浄後、１ｍＭ ＥＤＴＡを含む溶液で融合タンパク質を溶出した。さらに、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ-Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）緩衝液であらかじめ平衡化したＴＳＫｇｅｌ Ｇ４０００ＳＷＸＬを用いたゲル濾過に供し、目的の融合タンパク質を精製した。
【実施例２】
【０１１７】
融合タンパク質を用いたリガンドの結合性評価とスクリーニング
【０１１８】
１ｍＭ ＥＧＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ2、０．０２μＬ ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ ＧＴＰγＳ（モレキュラープローブ社）、及び３μＭ ＧＤＰを含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）緩衝液２００μＬに、実施例１で精製した変異型ＧｒｏＥＬサブユニット７回連結体−ヒトＥＴＡＲ−ヒトＧタンパク質α１５融合タンパク質を２００ｎＭとなるように添加し、ヒトＥＴＡＲに対する結合性評価用組成物を調製した。この組成物に、エンドセリンＡ（被検化合物）を終濃度１ｎＭとなるように添加し、２０℃でインキュベートした。反応液中の蛍光強度（励起波長４８５ｎｍ／蛍光波長５３０ｎｍ）を測定したところ、エンドセリンＡ添加前と比較して蛍光強度が約３倍上昇していた。これは、ＧＤＰに代わってＢＯＤＩＰＹ ＦＬ ＧＴＰγＳがヒトＧタンパク質α１５に結合したことを示し、エンドセリンＡがヒトＥＴＡＲに結合したことを示していた。一方、１ｎＭ エンドセリンＡを添加しなかったコントロール実験区では、蛍光強度の上昇は見られなかった。これにより、エンドセリンＡがヒトＥＴＡＲに対する結合性を有すると評価した。
以上より、実施例１の融合タンパク質を用いて、ヒトＥＴＡＲに対するリガンドがスクリーニングできることが示された。
【実施例３】
【０１１９】
１．融合タンパク質の発現系構築
ヒトＥＴＡＲをモデルＧＰＣＲとし、ヒトＥＴＡＲのＮ末端側に変異型ＧｒｏＥＬサブユニット７回連結体（折り畳み因子）が連結され且つＣ末端側にＧタンパク質αo-1サブユニット（Ｇタンパク質αサブユニット）が連結された融合タンパク質を、以下の手順で調製した。
【０１２０】
ヒトＧタンパク質αo−１サブユニット（以下、単に「ヒトＧタンパク質αo」、「αo」等と略記する。）のｃＤＮＡクローンをＡＴＣＣより入手した（ＡＴＣＣナンバー 7496723、配列番号１４）。このｃＤＮＡクローンを鋳型とし、配列番号１５で表されるプライマーと配列番号１６で表されるプライマーをプライマー対としてＰＣＲを行い、ヒトＧタンパク質αo遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅した。この増幅ＤＮＡ断片の両端にはプライマーに由来するＸｈｏＩサイトが導入された。この増幅ＤＮＡ断片を、あらかじめＸｈｏＩで消化した実施例１のｐＴｒｃ（ＳＲＩＩ）7ＥＴＡＲＦベクターに導入し、ｐＴｒｃ（ＳＲＩＩ）7ＥＴＡＲＧoＦベクターを作製した。本ベクターに含まれる融合遺伝子の構成は、図３に示される融合遺伝子においてヒトＧタンパク質α１５遺伝子（ｇ１５）に代わってヒトＧタンパク質αo遺伝子が融合されたものである。そして、該融合遺伝子が発現することにより、「ヒトＥＴＡＲのＮ末端側に変異型ＧｒｏＥＬサブユニット７回連結体が連結され且つＣ末端側にヒトＧタンパク質αoが連結された融合タンパク質」（以下、「ＳＲ−ＥＴＡＲ−Ｇｏ」と略記することがある。）が生産される。
【０１２１】
２．融合タンパク質の発現
ｐＴｒｃ（ＳＲＩＩ）7ＥＴＡＲＧoＦベクターを、実施例１と同様の方法で大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）株に導入し、形質転換体を得た。この形質転換体を実施例１と同様の培地にて２５℃で約４０時間培養し、菌体の懸濁液を得た。この菌懸濁液を、Ｂｕｇｂｕｓｔｅｒ（ノバジェン社）とリゾチームとの混液を用いた界面活性剤法に供し、菌破砕液を回収した。この上清に対して、抗ＦＬＡＧ抗体固定化ビーズ（シグマ社製）を用いて免疫沈降反応を行った。菌体破砕液上清についてＳＤＳ−ＰＡＧＥにより発現を評価した。結果を図５（ａ）に示す。図５（ａ）はＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を表す写真である。すなわち、「ヒトＥＴＡＲのＮ末端側に変異型ＧｒｏＥＬサブユニット７回連結体が連結され且つＣ末端側にヒトＧタンパク質αoが連結された融合タンパク質」（ＳＲ−ＥＴＡＲ−Ｇｏ）の分子量に相当する５１０ｋＤａ付近の位置にバンドが検出された（矢印参照）。これにより、目的の融合タンパク質（ＳＲ−ＥＴＡＲ−Ｇｏ）が大腸菌可溶性画分に発現されることが確認された。
【０１２２】
３．融合タンパク質の精製
上記２の菌体破砕液上清を、実施例1と同様のＨｉＴｒａｐ Ｂｕｔｙｌ ＦＦカラムによる疎水性クロマトグラフィー、及び、ＴＳＫｇｅｌ Ｇ４０００ＳＷＸＬによるゲル濾過に供し、ＳＲ−ＥＴＡＲ−Ｇｏを精製した。
【０１２３】
４．融合タンパク質とナチュラルリガンドとの結合性
精製したＳＲ−ＥＴＡＲ−Ｇｏを、０．０１％ トリトン３０５を含むＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５；１５０ｍＭ ＮａＣｌ，１０ｍＭ ＭｇＣｌ2，１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＧＤＰを含む）に終濃度４４μｇ／ｍＬとなるように溶解した。この溶液に125Ｉで放射性標識したエンドセリン−１（以下、「ＲＩエンドセリン−１」と略記する。）（終濃度：０．０１〜０．７ｎＭ）を添加し、３７℃で１８時間インキュベートした。ＳＲ−ＥＴＡＲ−Ｇｏに結合しなかった遊離のＲＩ標識エンドセリン−１を遠心ゲル濾過カラムにより除去した後、ＳＲ−ＥＴＡＲ−Ｇｏに結合したＲＩエンドセリン−１の濃度（Ｂ）をγカウンターにより定量した。遊離の（未結合の）ＲＩエンドセリン−１の濃度（Ｆ）については、結合したＲＩエンドセリン−１の濃度（Ｂ）の値を用いて算出した。なお、ＳＲ−ＥＴＡＲ−Ｇｏと非特異的に結合したＲＩエンドセリン−１の濃度について、未標識の１００μＭ エンドセリン−１存在下で同様の操作により測定し、バックグラウンド値とした。縦軸をＢ／Ｆ、横軸をＢ（ｐＭ）としてスキャッチャードプロットを作成した（図６）。このスキャッチャードプロットからＳＲ−ＥＴＡＲ−Ｇｏに特異的に結合するＲＩエンドセリン−１の結合定数を算出したところ、２７５ｐＭであった。この値は、動物細胞等で発現させたヒトＥＴＡＲとエンドセリン−１の結合定数とほぼ同等であった。
以上より、ＳＲ−ＥＴＡＲ−Ｇｏ中のヒトＥＴＡＲがエンドセリン−１との結合性を保持していることが確認された。
【０１２４】
５．融合タンパク質中Ｇタンパク質の活性評価
１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、１ｍＭ ＥＤＴＡ、及び０．０２μＬ ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ ＧＴＰγＳを含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）緩衝液２００μＬに、精製したＳＲ−ＥＴＡＲ−Ｇｏを終濃度７５μｇ／ｍＬとなるように添加した。３７℃でインキュベートした後、反応液中の蛍光強度（励起波長４８５ｎｍ／蛍光波長５３０ｎｍ）を経時的に測定した。コントロールとして、ＳＲ−ＥＴＡＲ−Ｇｏの代わりに「変異型ＧｒｏＥＬサブユニット７回連結体−ヒトＥＴＡＲ」融合タンパク質を用いたもの（コントロール１）、及び、ＳＲ−ＥＴＡＲ−Ｇｏを含む反応液に１ｍＭ ＧＤＰをさらに添加したもの（コントロール２）についても併せて評価した。測定結果を図７に示す。図７は、蛍光強度と経過時間との関係を表すグラフである。すなわち、コントロール１の場合には蛍光強度の上昇は見られなかったが、ＳＲ−ＥＴＡＲ−Ｇｏを含む組成物を用いた実験区（図７では「実施例」と表示）では蛍光強度の上昇が見られた。これは、ＳＲ−ＥＴＡＲ−Ｇｏ中のＧタンパク質αoに蛍光標識ＧＴＰγＳ（ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ ＧＴＰγＳ）が結合することにより、蛍光強度が上昇したことを示していた。一方、コントロール２の場合には蛍光強度の上昇は見られなかった。これは、１ｍＭ ＧＤＰの添加によりＳＲ−ＥＴＡＲ−Ｇｏ中のＧタンパク質αoへの蛍光標識ＧＴＰγＳの結合が阻害されたことを示していた。
以上より、ＳＲ−ＥＴＡＲ−Ｇｏ中のＧタンパク質αoがＧＤＰ及びＧＴＰγＳとの結合性を保持していることが確認された。
【実施例４】
【０１２５】
融合タンパク質を用いたリガンドの結合性評価とスクリーニング
【０１２６】
１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０２μＬ ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ ＧＴＰγＳ、及び１００μＭ ＧＤＰを含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）緩衝液２００μＬに、実施例３で精製したＳＲ−ＥＴＡＲ−Ｇｏを終濃度７５μｇ／ｍＬとなるように添加し、ヒトＥＴＡＲに対する結合性評価用組成物を調製した。この組成物に、エンドセリン−１（被検化合物）を終濃度１μＭとなるように添加し、２５℃で３時間インキュベートした。インキュベート後、反応液中の蛍光強度（励起波長４８５ｎｍ／蛍光波長５３０ｎｍ）を測定した。コントロールとして、上記の結合性評価用組成物からエンドセリン−１を抜いた組成物を用いたものについても同様に測定した。測定結果を図８に示す。図８は各実験区における蛍光強度を表すグラフである。すなわち、上記の結合性評価用組成物を用いた実験区（図８では「実施例」と表示）ではコントロールと比較して高い蛍光強度を示した。これは、ＧＤＰに代わってＢＯＤＩＰＹ ＦＬ ＧＴＰγＳがヒトＧタンパク質αoに結合したことを示し、エンドセリン−１がヒトＥＴＡＲに結合したことを示していた。
以上より、実施例３の融合タンパク質を用いて、ヒトＥＴＡＲに対するリガンドがスクリーニングできることが示された。
【実施例５】
【０１２７】
１．融合タンパク質の発現系構築
ヒトエンドセリンＢ受容体（ヒトＥＴＢＲ）をモデルＧＰＣＲとし、ヒトＥＴＢＲのＮ末端側に変異型ＧｒｏＥＬサブユニット７回連結体（折り畳み因子）が連結され且つＣ末端側にＧタンパク質αoサブユニット（Ｇタンパク質αサブユニット）が連結された融合タンパク質を、以下の手順で調製した。
【０１２８】
ヒトＥＴＢＲのｃＤＮＡクローンを、Mammalian Gene Collectionより入手した(アクセッションナンバー BC014472、配列番号１７)。このｃＤＮＡクローンを鋳型とし、配列番号１８で表されるプライマーと配列番号１９で表されるプライマーをプライマー対としてＰＣＲを行い、ヒトＥＴＢＲ遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅した。この増幅ＤＮＡ断片のＮ末端にはプライマーに由来するＦｂａＩサイトが、Ｃ末端にはＸｈｏＩサイトがそれぞれ導入された。この増幅ＤＮＡ断片を、あらかじめＢｇｌＩＩ／ＸｈｏＩで消化した実施例３のｐＴｒｃ（ＳＲＩＩ）7ＥＴＡＲＧoＦベクターに導入した。これにより、ｐＴｒｃ（ＳＲＩＩ）7ＥＴＡＲＧoＦベクター中のヒトＥＴＡＲ遺伝子がヒトＥＴＢＲ遺伝子に入れ替わり、ｐＴｒｃ（ＳＲＩＩ）7ＥＴＢＲＧoＦベクターが作製された。本ベクターに含まれる融合遺伝子の構成は、図３に示される融合遺伝子において、ヒトＥＴＡＲ遺伝子（ｅｔａｒ）に代わってヒトＥＴＢＲ遺伝子、ヒトＧタンパク質α１５遺伝子（ｇ１５）に代わってヒトＧタンパク質αo遺伝子が融合されたものである。そして、該融合遺伝子が発現することにより、「ヒトＥＴＢＲのＮ末端側に変異型ＧｒｏＥＬサブユニット７回連結体が連結され且つＣ末端側にヒトＧタンパク質αoが連結された融合タンパク質」（以下、「ＳＲ−ＥＴＢＲ−Ｇｏ」と略記することがある。）が生産される。
【０１２９】
２．融合タンパク質の発現
実施例３と同様にしてｐＴｒｃ（ＳＲＩＩ）7ＥＴＢＲＧoＦベクターを大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）株に導入し、形質転換体を得た。実施例３と同様にしてこの形質転換体を培養し、菌体破砕液上清を調製・回収した。菌体破砕液上清についてＳＤＳ−ＰＡＧＥにより発現を評価した。結果を図５（ｂ）に示す。図５（ｂ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を表す写真である。すなわち、「ヒトＥＴＢＲのＮ末端側に変異型ＧｒｏＥＬサブユニット７回連結体が連結され且つＣ末端側にヒトＧタンパク質αoが連結された融合タンパク質」（ＳＲ−ＥＴＢＲ−Ｇｏ）の分子量に相当する５１０ｋＤａ付近の位置にバンドが検出された（矢印参照）。これにより、目的の融合タンパク質（ＳＲ−ＥＴＢＲ−Ｇｏ）が大腸菌可溶性画分に発現されることが確認された。
【０１３０】
３．融合タンパク質の精製
実施例３と同様にして、上記２の菌体破砕液上清からＳＲ−ＥＴＢＲ−Ｇｏを精製した。
【実施例６】
【０１３１】
１．融合タンパク質の発現系構築
ヒト由来Vasoactive Intestinal Polypeptide受容体（ヒトＶＩＰ１Ｒ）をモデルＧＰＣＲとし、ヒトＶＩＰ１ＲのＮ末端側に変異型ＧｒｏＥＬサブユニット７回連結体（折り畳み因子）が連結され且つＣ末端側にＧタンパク質αi-1サブユニット（Ｇタンパク質αサブユニット）が連結された融合タンパク質を、以下の手順で調製した。
【０１３２】
ヒトＶＩＰ１ＲのｃＤＮＡクローンを、Mammalian Gene Collectionより入手した(アクセッションナンバー BC064424、配列番号２０)。このｃＤＮＡクローンを鋳型とし、配列番号２１で表されるプライマーと配列番号２２で表されるプライマーをプライマー対としてＰＣＲを行い、ヒトＶＩＰ１Ｒ遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅した。この増幅ＤＮＡ断片のＮ端にはプライマーに由来するＢｇｌＩＩサイトが、Ｃ末端にはＸｈｏＩサイトがそれぞれ導入された。この増幅ＤＮＡ断片を、あらかじめＢｇｌＩＩ／ＸｈｏＩで消化した実施例１のｐＴｒｃ（ＳＲＩＩ）7ＴＣＦベクターに導入し、ｐＴｒｃ（ＳＲＩＩ）7ＶＩＰ１ＲＦベクターを作製した。
【０１３３】
さらに、ｐＴｒｃ（ＳＲＩＩ）7ＶＩＰ１ＲＦベクターのＶＩＰ１Ｒ遺伝子の下流にＧタンパク質αi-1サブユニット遺伝子を導入するために、ヒトＧタンパク質αi-1サブユニット（以下、単に「ヒトＧタンパク質αi」、「αi」等と略記する。）のｃＤＮＡクローンを、ＡＴＣＣより入手した（アクセッションナンバー BC026326、配列番号２３)。このｃＤＮＡクローンを鋳型とし、配列番号２４で表されるプライマーと配列番号２５で表されるプライマーをプライマー対としてＰＣＲを行い、ヒトＧタンパク質αi遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅した。この増幅ＤＮＡ断片の両端にはプライマーに由来するＸｈｏＩサイトが導入された。この増幅ＤＮＡ断片を、あらかじめＸｈｏＩで消化した上記ｐＴｒｃ（ＳＲＩＩ）7ＶＩＰ１ＲＦベクターに導入し、ｐＴｒｃ（ＳＲＩＩ）7ＶＩＰ１ＲＧiＦベクターを作製した。本ベクターに含まれる融合遺伝子の構成は、図３に示される融合遺伝子において、ヒトＥＴＡＲ遺伝子（ｅｔａｒ）に代わってヒトＶＩＰ１Ｒ遺伝子、ヒトＧタンパク質α１５遺伝子（ｇ１５）に代わってヒトＧタンパク質αi遺伝子が融合されたものである。そして、該融合遺伝子が発現することにより、「ヒトＶＩＰ１ＲのＮ末端側に変異型ＧｒｏＥＬサブユニット７回連結体が連結され且つＣ末端側にヒトＧタンパク質αiが連結された融合タンパク質」（以下、「ＳＲ−ＶＩＰ１Ｒ−Ｇｉ」と略記することがある。）が生産される。
【０１３４】
２．融合タンパク質の発現
実施例３と同様にしてｐＴｒｃ（ＳＲＩＩ）7ＶＩＰ１ＲＧiＦベクターを大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）株に導入し、形質転換体を得た。実施例３と同様にしてこの形質転換体を培養し、菌体破砕液上清を調製・回収した。菌体破砕液上清についてＳＤＳ−ＰＡＧＥにより発現を評価した。結果を図５（ｃ）に示す。図５（ｃ）はＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を表す写真である。すなわち、「ヒトＶＩＰ１ＲのＮ末端側に変異型ＧｒｏＥＬサブユニット７回連結体が連結され且つＣ末端側にヒトＧタンパク質αiが連結された融合タンパク質」（ＳＲ−ＶＩＰ１Ｒ−Ｇｉ）の分子量に相当する５１０ｋＤａ付近の位置にバンドが検出された（矢印参照）。これにより、目的の融合タンパク質（ＳＲ−ＶＩＰ１Ｒ−Ｇｉ）が大腸菌可溶性画分に発現されることが確認された。
【０１３５】
３．融合タンパク質の精製
実施例３と同様にして、上記２の菌体破砕液上清からＳＲ−ＶＩＰ１Ｒ−Ｇｉを精製した。
【図面の簡単な説明】
【０１３６】
【図１】本発明のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価方法を具体的に行なう手順を表す模式図であり、（ａ）は、ＧｒｏＥＬサブユニット７回連結体と所望のＧＰＣＲとＧタンパク質αサブユニットとの融合タンパク質の構造を表す模式図であり、（ｂ）は、融合タンパク質とＧＤＰと蛍光標識したＧＴＰγＳとを、適宜の緩衝液中で共存させた状態を表す模式図であり、（ｃ）は、添加した被検化合物がＧＰＣＲに結合し、ＧＤＰ−ＧＴＰ交換反応が起こり、結合した蛍光標識ＧＴＰγＳから強い蛍光が発せられる状態を表す模式図である。
【図２】発現ベクターｐＴｒｃ（ＳＲＩＩ）7ＴＣＦの主要部の構成を表す模式図である。
【図３】実施例１で構築したｐＴｒｃ（ＳＲＩＩ）7ＥＴＡＲＧ１５Ｆべクターに含まれる融合遺伝子の構造の概略を表す模式図である。
【図４】図３の融合遺伝子に対応する融合タンパク質の構造の概略を表す模式図である。
【図５】（ａ）は実施例３におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を表す写真、（ｂ）は実施例５におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を表す写真、（ｃ）は実施例６におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を表す写真である。
【図６】実施例３で作成したスキャッチャードプロットを表すグラフである。
【図７】実施例３で作成した蛍光強度と経過時間との関係を表すグラフである。
【図８】実施例４で作成した各実験区における蛍光強度を表すグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検化合物のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性を評価する方法であって、所望のＧタンパク質共役型受容体のＮ末端側に折り畳み因子が連結され且つＣ末端側にＧタンパク質αサブユニットが連結された融合タンパク質に被検化合物を接触させたときの、前記Ｇタンパク質αサブユニットとＧＴＰ又はＧＴＰアナログとの結合の有無を検出することにより、前記被検化合物の前記Ｇタンパク質共役型受容体に対する結合性を評価することを特徴とするＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価方法。
【請求項２】
下記工程（１）〜（４）を包含することを特徴とする請求項１に記載のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価方法。
（１）前記融合タンパク質とＧＴＰ又はＧＴＰアナログとを含有する反応液を調製する工程、
（２）工程（１）で調製した反応液に被検化合物を添加し、前記融合タンパク質に被検化合物を接触させる工程、
（３）工程（２）に続いて、前記Ｇタンパク質αサブユニットに結合したＧＴＰ又はＧＴＰアナログの量を測定し、前記Ｇタンパク質αサブユニットとＧＴＰ又はＧＴＰアナログとの結合の有無を検出する工程、
（４）工程（３）で前記Ｇタンパク質αサブユニットとＧＴＰ又はＧＴＰアナログとの結合が検出された場合に、前記被検化合物は前記Ｇタンパク質共役型受容体に対する結合性を有すると評価する工程。
【請求項３】
前記工程（１）の反応液は、さらにＧＤＰを含有することを特徴とする請求項２に記載のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価方法。
【請求項４】
前記折り畳み因子は、シャペロニンサブユニット又はシャペロニンサブユニット連結体であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価方法。
【請求項５】
前記シャペロニンサブユニット又はシャペロニンサブユニット連結体は、シングルリングを形成するものであることを特徴とする請求項４に記載のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価方法。
【請求項６】
前記シャペロニンサブユニット連結体は、該シャペロニンサブユニットの由来によって決定される最適数のシャペロニンサブユニットが連結されたものであることを特徴とする請求項４又は５に記載のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価方法。
【請求項７】
前記シャペロニンサブユニット又はシャペロニンサブユニット連結体は、大腸菌由来のシャペロニンサブユニットからなることを特徴とする請求項４〜６のいずれかに記載のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価方法。
【請求項８】
前記ＧＴＰアナログは、ＧＴＰ−γＳ又はＧＴＰ−ＰＮＰであることを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価方法。
【請求項９】
前記ＧＴＰ又はＧＴＰアナログは、放射性標識されたものであることを特徴とする請求項１〜８のいずれかに記載のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価方法。
【請求項１０】
前記ＧＴＰ又はＧＴＰアナログは、蛍光標識されたものであることを特徴とする請求項１〜８のいずれかに記載のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価方法。
【請求項１１】
Ｇタンパク質αサブユニットに結合したＧＴＰ又はＧＴＰアナログと、結合しなかった遊離のＧＴＰ又はＧＴＰアナログとを分離することなく、Ｇタンパク質αサブユニットに結合したＧＴＰ又はＧＴＰアナログが発する蛍光を特異的に検出し、前記Ｇタンパク質αサブユニットとＧＴＰ又はＧＴＰアナログとの結合の有無を検出することを特徴とする請求項１０に記載のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価方法。
【請求項１２】
蛍光相関分光法又は蛍光偏光測定法によって、Ｇタンパク質αサブユニットに結合したＧＴＰ又はＧＴＰアナログが発する蛍光を特異的に検出することを特徴とする請求項１１に記載のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価方法。
【請求項１３】
前記融合タンパク質に代わって、Ｇタンパク質共役型受容体のＮ末端側に折り畳み因子が連結された融合タンパク質と、遊離のＧタンパク質αサブユニットとを使用することを特徴とする請求項１〜１２のいずれかに記載のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価方法。
【請求項１４】
請求項１〜１２のいずれかに記載のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価方法に用いるための組成物であって、所望のＧタンパク質共役型受容体のＮ末端側に折り畳み因子が連結され且つＣ末端側にＧタンパク質αサブユニットが連結された融合タンパク質を含有することを特徴とするＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価用組成物。
【請求項１５】
請求項１３に記載のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価方法に用いるための組成物であって、Ｇタンパク質共役型受容体のＮ末端側に折り畳み因子が連結された融合タンパク質と、遊離のＧタンパク質αサブユニットとを含有することを特徴とするＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価用組成物。
【請求項１６】
さらにＧＤＰを含有することを特徴とする請求項１４又は１５に記載のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価用組成物。
【請求項１７】
さらにＧＴＰ又はＧＴＰアナログを含有することを特徴とする請求項１４〜１６のいずれかに記載のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価用組成物。
【請求項１８】
前記ＧＴＰ又はＧＴＰアナログは、蛍光標識されたものであることを特徴とする請求項１７に記載のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価用組成物。
【請求項１９】
前記折り畳み因子は、シャペロニンサブユニット又はシャペロニンサブユニット連結体であることを特徴とする請求項１４〜１８のいずれかに記載のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価用組成物。
【請求項２０】
前記シャペロニンサブユニット又はシャペロニンサブユニット連結体は、シングルリングを形成するものであることを特徴とする請求項１９に記載のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価用組成物。
【請求項２１】
前記シャペロニンサブユニット連結体は、該シャペロニンサブユニットの由来によって決定される最適数のシャペロニンサブユニットが連結されたものであることを特徴とする請求項１９又は２０に記載のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価用組成物。
【請求項２２】
前記シャペロニンサブユニット又はシャペロニンサブユニット連結体は、大腸菌由来のシャペロニンサブユニットからなることを特徴とする請求項１９〜２１のいずれかに記載のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価用組成物。
【請求項２３】
Ｇタンパク質共役型受容体タンパク質のＮ末端側に折り畳み因子が結合され且つＣ末端側にＧタンパク質αサブユニットが連結されていることを特徴とする融合タンパク質。
【請求項２４】
前記折り畳み因子は、シャペロニンサブユニット又はシャペロニンサブユニット連結体であることを特徴とする請求項２３に記載の融合タンパク質。
【請求項２５】
前記シャペロニンサブユニット又はシャペロニンサブユニット連結体は、シングルリングを形成するものであることを特徴とする請求項２４に記載の融合タンパク質。
【請求項２６】
前記シャペロニンサブユニット連結体は、該シャペロニンサブユニットの由来によって決定される最適数のシャペロニンサブユニットが連結されたものであることを特徴とする請求項２４又は２５に記載の融合タンパク質。
【請求項２７】
前記シャペロニンサブユニット又はシャペロニンサブユニット連結体は、大腸菌由来のシャペロニンサブユニットからなることを特徴とする請求項２４〜２６のいずれかに記載の融合タンパク質。
【請求項２８】
請求項２３〜２７のいずれかに記載の融合タンパク質をコードする遺伝子。
【請求項１】
被検化合物のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性を評価する方法であって、所望のＧタンパク質共役型受容体のＮ末端側に折り畳み因子が連結され且つＣ末端側にＧタンパク質αサブユニットが連結された融合タンパク質に被検化合物を接触させたときの、前記Ｇタンパク質αサブユニットとＧＴＰ又はＧＴＰアナログとの結合の有無を検出することにより、前記被検化合物の前記Ｇタンパク質共役型受容体に対する結合性を評価することを特徴とするＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価方法。
【請求項２】
下記工程（１）〜（４）を包含することを特徴とする請求項１に記載のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価方法。
（１）前記融合タンパク質とＧＴＰ又はＧＴＰアナログとを含有する反応液を調製する工程、
（２）工程（１）で調製した反応液に被検化合物を添加し、前記融合タンパク質に被検化合物を接触させる工程、
（３）工程（２）に続いて、前記Ｇタンパク質αサブユニットに結合したＧＴＰ又はＧＴＰアナログの量を測定し、前記Ｇタンパク質αサブユニットとＧＴＰ又はＧＴＰアナログとの結合の有無を検出する工程、
（４）工程（３）で前記Ｇタンパク質αサブユニットとＧＴＰ又はＧＴＰアナログとの結合が検出された場合に、前記被検化合物は前記Ｇタンパク質共役型受容体に対する結合性を有すると評価する工程。
【請求項３】
前記工程（１）の反応液は、さらにＧＤＰを含有することを特徴とする請求項２に記載のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価方法。
【請求項４】
前記折り畳み因子は、シャペロニンサブユニット又はシャペロニンサブユニット連結体であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価方法。
【請求項５】
前記シャペロニンサブユニット又はシャペロニンサブユニット連結体は、シングルリングを形成するものであることを特徴とする請求項４に記載のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価方法。
【請求項６】
前記シャペロニンサブユニット連結体は、該シャペロニンサブユニットの由来によって決定される最適数のシャペロニンサブユニットが連結されたものであることを特徴とする請求項４又は５に記載のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価方法。
【請求項７】
前記シャペロニンサブユニット又はシャペロニンサブユニット連結体は、大腸菌由来のシャペロニンサブユニットからなることを特徴とする請求項４〜６のいずれかに記載のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価方法。
【請求項８】
前記ＧＴＰアナログは、ＧＴＰ−γＳ又はＧＴＰ−ＰＮＰであることを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価方法。
【請求項９】
前記ＧＴＰ又はＧＴＰアナログは、放射性標識されたものであることを特徴とする請求項１〜８のいずれかに記載のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価方法。
【請求項１０】
前記ＧＴＰ又はＧＴＰアナログは、蛍光標識されたものであることを特徴とする請求項１〜８のいずれかに記載のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価方法。
【請求項１１】
Ｇタンパク質αサブユニットに結合したＧＴＰ又はＧＴＰアナログと、結合しなかった遊離のＧＴＰ又はＧＴＰアナログとを分離することなく、Ｇタンパク質αサブユニットに結合したＧＴＰ又はＧＴＰアナログが発する蛍光を特異的に検出し、前記Ｇタンパク質αサブユニットとＧＴＰ又はＧＴＰアナログとの結合の有無を検出することを特徴とする請求項１０に記載のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価方法。
【請求項１２】
蛍光相関分光法又は蛍光偏光測定法によって、Ｇタンパク質αサブユニットに結合したＧＴＰ又はＧＴＰアナログが発する蛍光を特異的に検出することを特徴とする請求項１１に記載のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価方法。
【請求項１３】
前記融合タンパク質に代わって、Ｇタンパク質共役型受容体のＮ末端側に折り畳み因子が連結された融合タンパク質と、遊離のＧタンパク質αサブユニットとを使用することを特徴とする請求項１〜１２のいずれかに記載のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価方法。
【請求項１４】
請求項１〜１２のいずれかに記載のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価方法に用いるための組成物であって、所望のＧタンパク質共役型受容体のＮ末端側に折り畳み因子が連結され且つＣ末端側にＧタンパク質αサブユニットが連結された融合タンパク質を含有することを特徴とするＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価用組成物。
【請求項１５】
請求項１３に記載のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価方法に用いるための組成物であって、Ｇタンパク質共役型受容体のＮ末端側に折り畳み因子が連結された融合タンパク質と、遊離のＧタンパク質αサブユニットとを含有することを特徴とするＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価用組成物。
【請求項１６】
さらにＧＤＰを含有することを特徴とする請求項１４又は１５に記載のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価用組成物。
【請求項１７】
さらにＧＴＰ又はＧＴＰアナログを含有することを特徴とする請求項１４〜１６のいずれかに記載のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価用組成物。
【請求項１８】
前記ＧＴＰ又はＧＴＰアナログは、蛍光標識されたものであることを特徴とする請求項１７に記載のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価用組成物。
【請求項１９】
前記折り畳み因子は、シャペロニンサブユニット又はシャペロニンサブユニット連結体であることを特徴とする請求項１４〜１８のいずれかに記載のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価用組成物。
【請求項２０】
前記シャペロニンサブユニット又はシャペロニンサブユニット連結体は、シングルリングを形成するものであることを特徴とする請求項１９に記載のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価用組成物。
【請求項２１】
前記シャペロニンサブユニット連結体は、該シャペロニンサブユニットの由来によって決定される最適数のシャペロニンサブユニットが連結されたものであることを特徴とする請求項１９又は２０に記載のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価用組成物。
【請求項２２】
前記シャペロニンサブユニット又はシャペロニンサブユニット連結体は、大腸菌由来のシャペロニンサブユニットからなることを特徴とする請求項１９〜２１のいずれかに記載のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価用組成物。
【請求項２３】
Ｇタンパク質共役型受容体タンパク質のＮ末端側に折り畳み因子が結合され且つＣ末端側にＧタンパク質αサブユニットが連結されていることを特徴とする融合タンパク質。
【請求項２４】
前記折り畳み因子は、シャペロニンサブユニット又はシャペロニンサブユニット連結体であることを特徴とする請求項２３に記載の融合タンパク質。
【請求項２５】
前記シャペロニンサブユニット又はシャペロニンサブユニット連結体は、シングルリングを形成するものであることを特徴とする請求項２４に記載の融合タンパク質。
【請求項２６】
前記シャペロニンサブユニット連結体は、該シャペロニンサブユニットの由来によって決定される最適数のシャペロニンサブユニットが連結されたものであることを特徴とする請求項２４又は２５に記載の融合タンパク質。
【請求項２７】
前記シャペロニンサブユニット又はシャペロニンサブユニット連結体は、大腸菌由来のシャペロニンサブユニットからなることを特徴とする請求項２４〜２６のいずれかに記載の融合タンパク質。
【請求項２８】
請求項２３〜２７のいずれかに記載の融合タンパク質をコードする遺伝子。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図６】
【図７】
【図８】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図６】
【図７】
【図８】
【図５】
【公開番号】特開２００６−３４０７１７（Ｐ２００６−３４０７１７Ａ）
【公開日】平成１８年１２月２１日（２００６．１２．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−１３１８８２（Ｐ２００６−１３１８８２）
【出願日】平成１８年５月１０日（２００６．５．１０）
【出願人】（０００００２１７４）積水化学工業株式会社 (5,781)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年１２月２１日（２００６．１２．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年５月１０日（２００６．５．１０）
【出願人】（０００００２１７４）積水化学工業株式会社 (5,781)
【Ｆターム（参考）】
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