ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを支配的に含む免疫グロブリン
本発明は、特定エフェクター機能を与える、免疫グロブリン糖タンパク質の支配的グリコフォーム構造を有する免疫グロブリン糖タンパク質組成物に関する。加えて、本発明は、特定の富化Ｎ−グリカン構造を有する抗体を含み、前記Ｎ−グリカン構造がＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2である医薬組成物に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本出願は、２００４年７月２１日出願の米国特許仮出願第６０／５８９，９８８号及び２００４年７月２１日出願の米国特許仮出願第６０／５８９，９８１号の優先権を主張するものであり、及び２０００年６月２８日出願の米国特許仮出願第６０／２１４，３５８号、２０００年６月３０日出願の米国特許仮出願第６０／２１５，６３８号及び２００１年３月３０日出願の米国特許仮出願第６０／２７９，９９７号の優先権を主張する、２００１年６月２７日出願の米国特許出願第０９／８９２，５９１号の一部継続出願である、２００３年２月２０日出願の米国特許出願第１０／３７１，８７７号の一部継続出願である。上記で引用する特許出願の各々は、その全体が参照してここに組み込まれる。
【０００２】
本発明は、特異的Ｎ結合グリコシル化パターンを有する糖タンパク質を生産するための組成物及び方法に関する。特に、本発明は、特異的Ｎ−グリカン構造を有する複数のＮ−グリカンを含む免疫グロブリン糖タンパク質の組成物に関し、より特定すると、複数のＮ−グリカン内に、特定エフェクター機能を調節する、例えば促進する、免疫グロブリン上の１又はそれ以上の支配的グリコフォーム構造が存在する免疫グロブリン糖タンパク質を含む組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
糖タンパク質は、触媒作用、シグナル伝達、細胞間連絡、及び分子認識と会合を含む、ヒト及び他の哺乳動物における多くの重要な機能を媒介する。糖タンパク質は真核生物における非サイトゾルタンパク質の大部分を構成する(Lis and Sharon, 1993, Eur. J. Biochem. 218:1-27)。多くの糖タンパク質が治療目的に利用されており、この２０年間、天然に生じる糖タンパク質の組換え型がバイオテクノロジー産業の主要部分となってきた。治療薬として使用される組換えグリコシル化タンパク質の例は、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、治療用モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）、インターフェロン−β（ＩＦＮ−β）、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、及びヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＨ）(Cumming et al., 1991, Glycobiology 1:115-130)を含む。潜在的予防薬及び治療薬として生産された組換えタンパク質が臨床段階に近づいているので、組換え生産された糖タンパク質のグリコシル化パターンの変動性は近年科学界で注目の対象となっている。
【０００４】
抗体又は免疫グロブリン（Ｉｇ）は、体液性免疫応答において中心的役割を果たす糖タンパク質である。抗体は、体液と細胞の防御機構の間の連結をもたらすアダプター分子とみなし得る。抗体による抗原特異的認識は、多数のエフェクター機構を活性化し得る免疫複合体の形成をもたらし、複合体の除去と破壊を生じさせる。免疫グロブリンの一般的クラスの中で、５つのクラスの抗体−ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＥ−が生化学的並びに機能的に区別でき、可変領域に限定されるより微妙な差異が抗原結合の特異性の原因となる。これら５つのクラスのＩｇの中で、ラムダ（λ）及びカッパ（κ）と称される２種類だけの軽鎖が存在する。λ鎖又はκ鎖を有する抗体の間で機能的な相違は認められず、２種類の軽鎖の比は種によって異なる。５つの重鎖クラス又はアイソタイプが存在し、これらは抗体分子の機能的活性を決定する。免疫グロブリンの５つの機能的クラスは：免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）、免疫グロブリンＤ（ＩｇＤ）、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）、免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）及び免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）である。各々のアイソタイプは免疫応答において特定の機能を有し、それらの独特の機能的性質は、軽鎖と結合していない、重鎖のカルボキシ末端部分によって付与される。ＩｇＧは血漿中で最も豊富な免疫グロブリンアイソタイプである（例えばImmunobiology, Janeway et al, 6th Edition, 2004, Garland Publishing, New York参照）。
【０００５】
免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子は、定常及び可変領域を有するＦａｂ（抗原結合フラグメント）ドメイン及びＦｃ（結晶化フラグメント）ドメインを含む。各々の重鎖のＣＨ２ドメインは、Ｎ−グリカンをＩｇ分子に連結するアスパラギン残基、通常は残基Ａｓｎ−２９７にＮ結合グリコシル化のための単一部位を含む(Kabat et al., Sequences of proteins of immunological interest, Fifth Ed., U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91- 3242)。
【０００６】
Ｎ結合オリゴ糖の構造及び機能的態様の分析は、３つの主たる理由から生物学的関心の対象である：（１）ＣＨ２ドメインのグリコシル化は進化を通じて保存されており、前記オリゴ糖の重要な役割を示唆する；（２）免疫グロブリン分子はオリゴ糖の異質性の分析のためのモデル系として役立つ(Rademacher and Dwek, 1984; Rademacher et al., 1982)；及び（３）抗体は、２個のオリゴ糖単位を互いに直接接触させて位置づける２本の重鎖の二量体会合を含むので、免疫グロブリン分子は特異的タンパク質−炭水化物及び炭水化物−炭水化物相互作用の両方を含む。
【０００７】
Ｉｇの異なるグリコシル化パターンは異なる生物学的性質に結びつくことが示された (Jefferis and Lund, 1997, Antibody Eng. Chem. Immunol., 65: 111-128; Wright and Morrison, 1997, Trends Biotechnol, 15: 26-32)。しかし、ほんのわずかな特定グリコフォームだけが所望の生物学的機能を付与することが知られている。例えばＮ結合グリカンの低いフコシル化を有する免疫グロブリン組成物は、ヒトＦｃγＲＩＩＩへの高い結合を有し、それ故高い抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を有することが報告されている (Shields et al, 2002, J. Biol Chem, 277: 26733-26740; Shinkawa et al, 2003, J. Biol. Chem. 278: 3466-3473)。また、ＣＨＯ細胞中で作られるフコシル化Ｇ２（Ｇａｌ2ＧｌｃＮＡｃ2Ｍａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2）ＩｇＧの組成物は、報告によれば、異種抗体の組成物よりも大きな度合で補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）活性を上昇させる（Ｒａｊｕ、２００４年、米国特許出願第２００４／０１３６９８６号)。また、腫瘍に対する最適抗体は、Ｆｃ受容体（ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩＩ）に選択的に結合して活性化し、阻害性ＦｃγＲＩＩｂ受容体に最小限に結合するものであることが示唆されてきた(Clynes et al, 2000, Nature, 6:443-446)。それ故、Ｉｇ糖タンパク質の特定グリコフォームを富化する能力は極めて望ましい。
【０００８】
一般に、糖タンパク質のグリコシル化構造（オリゴ糖）は、発現宿主及び培養条件に依存して変化する。非ヒト宿主細胞において生産される治療タンパク質は、ヒトにおいて免疫原性応答を惹起し得る非ヒトグリコシル化、例えば酵母における高マンノシル化(Ballou, 1990, Methods Enzymol. 185:440-470)；植物におけるα（１，３）−フコース及びβ（１，２）−キシロース(Cabanes-Macheteau et al., 1999, Glycobiology, 9: 365-372)；チャイニーズハムスター卵巣細胞におけるＮ−グリコリルノイラミン酸(Noguchi et al., 1995. J. Biochem. 117: 5-62)及びマウスにおけるＧａｌα−１，３Ｇａｌグリコシル化 (Borrebaeck et al, 1993,Immun. Today, 14: 477-479)を含む可能性が高い。さらに、ガラクトシル化は細胞培養条件によって異なることがあり、一部の免疫グロブリン組成物を、それらの特定ガラクトースパターンに依存して免疫原性にし得る(Patel et al, 1992. Biochem J. 285: 839-845)。非ヒト哺乳動物細胞によって生産される糖タンパク質のオリゴ糖構造は、ヒト糖タンパク質のものとより密接に関連する傾向がある。それ故、大部分の市販の免疫グロブリンは哺乳動物細胞において生産される。しかし、哺乳動物細胞は、タンパク質生産のための宿主細胞としていくつかの重大な難点を有する。コストがかかることに加えて、哺乳動物細胞においてタンパク質を発現するための工程は、グリコフォームの不均一な個体群を生産し、容積力価が低く、継続的なウイルスの封じ込めと安定な細胞系を生成するための多大の時間の両方を必要とする。
【０００９】
種々のグリコフォームが、薬物動態、薬力学、受容体相互作用及び組織特異的ターゲティングを含む、治療薬の性質に深く影響し得ることは了解されている(Graddis et al., 2002, Curr Pharm Biotechnol. 3: 285-297)。特に、抗体に関して、オリゴ糖構造は、プロテアーゼ耐性に関する性質、ＦｃＲｎ受容体によって媒介される抗体の血清半減期、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を誘導する、補体複合体Ｃ１への結合、及び抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）経路、食作用及び抗体フィードバックを調節する役割を担うＦｃγＲ受容体への結合に影響を及ぼし得る(Nose and Wigzell, 1983; Leatherbarrow and Dwek, 1983; Leatherbarrow et al.,1985; Walker et al., 1989; Carter et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Set USA, 89: 4285-4289)。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
異なるグリコフォームは異なる生物学的性質に結びつくので、１又はそれ以上の特定グリコフォームを富化する能力は、特定グリコフォームと特定生物学的機能の間の関係を明らかにするために使用できる。所望生物学的機能を特定グリコフォームパターンに結びつけた後、好都合なグリコフォーム構造を富化した糖タンパク質組成物を生産することができる。それ故、特定グリコフォームが富化された糖タンパク質組成物を生産できることは極めて望ましい。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、複数の免疫グロブリンを含む組成物であって、各々の免疫グロブリンがそれに結合した少なくとも１つのＮ−グリカンを含み、それによって組成物が、支配的Ｎ−グリカンが本質的にＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2から成る複数のＮ−グリカンを含む、前記組成物を提供する。好ましい実施形態では、前記複数のＮ−グリカンの５０モルパーセント以上が本質的にＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2から成る。より好ましくは、前記複数のＮ−グリカンの７５モルパーセント以上が本質的にＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2から成る。最も好ましくは、前記複数のＮ−グリカンの９０パーセント以上が本質的にＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2から成る。他の好ましい実施形態では、前記ＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2 Ｎ−グリカン構造は、前記複数のＮ−グリカンのその次に最も支配的なＮ−グリカン構造よりも多い約５モルパーセントから約５０モルパーセント多いレベルで存在する。
【００１２】
本発明はまた、免疫グロブリンの特定グリコフォーム（例えばＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2）を富化することによってＦｃγＲＩＩＩａ及びＦｃγＲＩＩＩｂ受容体への結合を上昇させ、ＦｃγＲＩＩｂ受容体への結合を低下させるための方法を提供する。好ましい実施形態は、複数の免疫グロブリンを含む組成物を生産するための方法であって、各々の免疫グロブリンがそれに結合した少なくとも１つのＮ−グリカンを含み、組成物が、支配的Ｎ−グリカンが本質的にＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2から成る複数のＮ−グリカンを含み、前記免疫グロブリン又はそのフラグメントを発現するように工作又は選択された宿主細胞を培養する工程を含む、前記方法を提供する。もう１つの好ましい実施形態は、複数の免疫グロブリンを含む組成物を生産するための方法であって、各々の免疫グロブリンがそれに結合した少なくとも１つのＮ−グリカンを含み、組成物が、支配的Ｎ−グリカンが本質的にＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2から成る複数のＮ−グリカンを含み、前記免疫グロブリン又はそのフラグメントを発現するように工作又は選択された下等真核宿主細胞を培養する工程を含む、前記方法を提供する。本発明の他の実施形態では、宿主細胞は免疫グロブリン又はそのフラグメントをコードする外来性遺伝子を含み、前記宿主細胞は、前記免疫グロブリン又はそのフラグメントを発現するように工作又は選択されており、それによって複数の免疫グロブリンを含む組成物を生産し、各々の免疫グロブリンはそれに結合した少なくとも１つのＮ−グリカンを含み、組成物は、支配的Ｎ−グリカンが本質的にＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2から成る複数のＮ−グリカンを含む。本発明のさらなる他の実施形態では、下等真核宿主細胞は、免疫グロブリン又はそのフラグメントをコードする外来性遺伝子を含み、前記宿主細胞は、前記免疫グロブリン又はそのフラグメントを発現するように工作又は選択されており、それによって複数の免疫グロブリンを含む組成物を生産し、各々の免疫グロブリンはそれに結合した少なくとも１つのＮ−グリカンを含み、組成物は、支配的Ｎ−グリカンが本質的にＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2から成る複数のＮ−グリカンを含む。
【００１３】
本発明の好ましい実施形態では、複数の免疫グロブリンを含む組成物であって、各々の免疫グロブリンがそれに結合した少なくとも１つのＮ−グリカンを含み、それによって組成物が、支配的Ｎ−グリカンが本質的にＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2から成る複数のＮ−グリカンを含み、前記免疫グロブリンがＦｃγＲＩＩｂ受容体に対して低い結合親和性を示す、前記組成物。本発明の他の好ましい実施形態では、複数の免疫グロブリンを含む組成物であって、各々の免疫グロブリンがそれに結合した少なくとも１つのＮ−グリカンを含み、それによって組成物が、支配的Ｎ−グリカンが本質的にＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2から成る複数のＮ−グリカンを含み、前記免疫グロブリンがＦｃγＲＩＩＩａ及びＦｃγＲＩＩＩｂ受容体に対して高い結合親和性を示す、前記組成物。本発明のさらにもう１つの好ましい実施形態では、複数の免疫グロブリンを含む組成物であって、各々の免疫グロブリンがそれに結合した少なくとも１つのＮ−グリカンを含み、それによって組成物が、支配的Ｎ−グリカンが本質的にＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2から成る複数のＮ−グリカンを含み、前記免疫グロブリンが高い抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を示す、前記組成物。
【００１４】
１つの実施形態では、本発明の組成物は、本質的にフコースを含まない免疫グロブリンを含む。もう１つの実施形態では、本発明の組成物は、フコースを欠く免疫グロブリンを含む。本発明の組成物はまた、医薬組成物と製薬上許容される担体を含む。本発明の組成物はまた、精製され、診断キットに組み込まれた免疫グロブリンの医薬組成物を含む。
【００１５】
従って、本発明は、あらかじめ定められたグリコシル化構造を有する糖タンパク質、特に、本質的にＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2から成るＮ−グリカンを有する免疫グロブリン又は抗体分子の組成物の生産のための材料及び方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本文中で異なる定義が為されない限り、本発明に関して使用する学術的及び技術的用語及び語句は、当業者によって一般的に理解されている意味を有するものとする。さらに、文脈から異なる要求がない限り、単数用語は複数用語を包含し、複数用語は単数用語を包含する。一般に、ここで述べる生化学、酵素学、分子及び細胞生物学、微生物学、遺伝学、及びタンパク質及び核酸化学及びハイブリダイゼーションに関して使用する命名法及び手法は、当技術分野において周知であり、一般的に使用されるものである。本発明のための方法及び手法は、異なる指示がない限り、一般に、当技術分野において周知の従来の方法に従って、及び本明細書を通じて引用し、論じる種々の一般的な及びより特定の参考文献において述べられているように実施される。例えばSambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989); Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992, and Supplements to 2002); Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1990); Taylor and Drickamer, Introduction to Glycobiology, Oxford Univ. Press (2003); Worthington Enzyme Manual, Worthington Biochemical Corp., Freehold, NJ; Handbook of Biochemistry: Section A Protems, Vol I, CRC Press (1976); Handbook of Biochemistry: Section A Proteins, Vol II, CRC Press (1976); Essentials of Glycobiology, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1999); Immunobiology, Janeway et al, 6th Edition, 2004, Garland Publishing, New York参照。
【００１７】
ここで言及する全ての刊行物、特許及び他の参考文献は、それらの全体が参照してここに組み込まれる。
【００１８】
以下の用語は、異なる指示がない限り、以下の意味を有すると理解される：
【００１９】
ここで使用する、「Ｎ−グリカン」、「グリカン」及び「グリコフォーム」という用語は、交換可能に使用され、Ｎ結合オリゴ糖、例えばタンパク質中のアスパラギン残基のアミド窒素に連結されたＮ−アセチルグルコサミン残基によって結合されている又は結合されていたものを指す。糖タンパク質上に認められる主要な糖は、グルコース、ガラクトース、マンノース、フコース、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）及びシアル酸（例えばＮ−アセチル−ノイラミン酸（ＮＡＮＡ））である。糖群のプロセシングはＥＲの管腔内で共翻訳的に起こり、Ｎ結合糖タンパク質についてはゴルジ装置で継続される。
【００２０】
Ｎ−グリカンは、Ｍａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2（「Ｍａｎ」はマンノースを指し、「Ｇｌｃ」はグルコースを指し、「ＮＡｃ」はＮ−アセチルを指し、ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミンを指す）の共通五糖コアを有する。Ｎ−グリカンは、「トリマンノースコア」、「五糖コア」又は「少マンノースコア」とも称されるＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2（「Ｍａｎ3」）コア構造に付加された末梢糖（peripheral sugars）（例えばＧｌｃＮＡｃ、ガラクトース、フコース及びシアル酸）を含む分枝（アンテナ）の数に関して異なる。Ｎ−グリカンはそれらの分枝成分に従って分類される（例えば高マンノース型、複合型又は混成型）。「高マンノース」型Ｎ−グリカンは、５又はそれ以上のマンノース残基を有する。「複合」型Ｎ−グリカンは、典型的には「トリマンノース」コアの１，３マンノース腕に結合した少なくとも１個のＧｌｃＮＡｃ及び１，６マンノース腕に結合した少なくとも１個のＧｌｃＮＡｃを有する。複合型Ｎ−グリカンはまた、場合によりシアル酸又は誘導体（例えば「ＮＡＮＡ」又は「ＮｅｕＡｃ」、「Ｎｅｕ」はノイラミン酸を指し、「Ａｃ」はアセチルを指す）で修飾されたガラクトース（「Ｇａｌ」）又はＮ−アセチルガラクトサミン（「ＧａｌＮＡｃ」）残基を有し得る。複合型Ｎ−グリカンはまた、「２分岐（バイセクティング）」ＧｌｃＮＡｃ及びコアフコース（「Ｆｕｃ」）を含む鎖内置換を有し得る。複合型Ｎ−グリカンはまた、しばしば「多分枝グリカン」と称される、「トリマンノースコア」上に多数の分枝を有し得る。「混成型」Ｎ−グリカンは、トリマンノースコアの１，３−マンノース腕の末端に少なくとも１個のＧｌｃＮＡｃ及びトリマンノースコアの１，６マンノース腕上にゼロ又はそれ以上のマンノースを有する。様々なＮ−グリカンは「グリコフォーム」とも称される。
【００２１】
ここで使用する略語は当技術分野で一般的に使用されるものであり、例えば上記の糖の略語参照。他の一般的な略語は、全てペプチドＮ−グルコシダーゼＦ（ＥＣ３．２．２．１８）を指す「ＰＮＧアーゼ」又は「グリカナーゼ」又は「グルコシダーゼ」を含む。
【００２２】
「単離された」又は「実質的に純粋な」核酸又はポリヌクレオチド（例えばＲＮＡ、ＤＮＡ又は混合ポリマー）は、その天然宿主細胞内の天然ポリヌクレオチドに天然に付随する他の細胞成分、例えばそれが天然に結合しているリボソーム、ポリメラーゼ及びゲノム配列から実質的に分離されているものである。この用語は、（１）その天然に生じる環境から取り出された、（２）「単離ポリヌクレオチド」が本来その中に存在するポリヌクレオチドの全部又は一部と結合していない、（３）天然では結合していないポリヌクレオチドに作動可能に連結されている、又は（４）天然では生じない、核酸又はポリヌクレオチドを包含する。「単離された」又は「実質的に純粋な」という用語はまた、組換え又はクローン化ＤＮＡ単離物、化学合成ポリヌクレオチド類似体、又は異種系によって生物学的に合成されるポリヌクレオチド類似体に関しても使用できる。
【００２３】
しかし、「単離された」は、必ずしも、そのように表わされる核酸又はポリヌクレオチドがそれ自体その天然環境から物理的に取り出されていることを必要としない。例えば生物のゲノム内の内在性核酸配列は、この内在性核酸配列の発現が変化するように、異種配列が内在性核酸配列に隣接して位置する場合、ここでは「単離された」とみなす。これに関して、異種配列は、その異種配列自体が内在性であるか（同じ宿主細胞又はその子孫を起源とする）又は外来性であるか（異なる宿主細胞又はその子孫を起源とする）否かに関わらず、天然ではその内在性核酸配列に隣接していない配列である。例として、宿主細胞のゲノム内の遺伝子の天然プロモーターに関して、この遺伝子が変化した発現パターンを有するように、プロモーター配列を置換することができる（例えば相同的組換えによって）。この遺伝子は、天然でそれに隣接する配列の少なくとも一部から分離されているので、今や「単離された」ことになる。
【００２４】
核酸配列はまた、ゲノム内の対応する核酸に天然では生じない修飾を含む場合、「単離された」とみなされる。例えば内在性コード配列は、人為的に、例えばヒトの介入処置によって、導入された挿入、欠失又は点突然変異を含む場合、「単離された」とみなされる。「単離された核酸配列」はまた、異なる部位で宿主細胞染色体に組み込まれた核酸及びエピソームとして存在する核酸構築物を含む。さらに、「単離された核酸配列」は、他の細胞物質を実質的に含まない、又は組換え手法によって生産されるときは培地を実質的に含まない、又は化学合成されるときは化学的前駆物質又は他の化学物質を実質的に含まないものであり得る。
【００２５】
ここで使用する、基準核酸配列の「縮重変異体」という語句は、標準遺伝暗号に従って、基準核酸配列から翻訳されるものと同一のアミノ酸配列を提供するように翻訳され得る核酸配列を包含する。「縮重オリゴヌクレオチド」又は「縮重プライマー」という用語は、配列においては必ずしも同一でないが、１又はそれ以上の特定セグメント内で互いに相同である、標的核酸配列とハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドを表わすために使用される。
【００２６】
核酸配列に関して「配列同一性パーセント」又は「同一」という用語は、一致が最大になるように整列したとき同じである２個の配列内の残基を指す。配列同一性比較の長さは、少なくとも約９ヌクレオチド、通常は少なくとも約２０ヌクレオチド、より通常は少なくとも約２４ヌクレオチド、典型的には少なくとも約２８ヌクレオチド、より典型的には少なくとも約３２ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約３６又はそれ以上のヌクレオチドの範囲にわたり得る。ヌクレオチド配列同一性を測定するために使用できる、当技術分野で公知の多くの異なるアルゴリズムが存在する。例えばポリヌクレオチド配列は、ウィスコンシンパッケージバージョン１０．０、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ），Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎのプログラムである、ＦＡＳＴＡ、Ｇａｐ又はＢｅｓｔｆｉｔを用いて比較することができる。ＦＡＳＴＡは、問い合わせ配列と検索配列の間の最良重複の領域のアラインメントと配列同一性パーセントを提供する。Pearson, Methods Enzymol. 183:63-98 (1990)（その全体が参照してここに組み込まれる）。例えば核酸配列間の配列同一性パーセントは、そのデフォルトパラメータ（ワードサイズ６及びスコアリングマトリックスのためのＮＯＰＡＭ係数）と共にＦＡＳＴＡを使用して、又は参照してここに組み込まれる、ＧＣＧバージョン６．１において提供されるようなそのデフォルトパラメータでＧａｐを使用して決定することができる。あるいは、コンピュータプログラム、ＢＬＡＳＴ (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990); Gish and States, Nature Genet. 3:266-272 (1993); Madden et al., Meth. Enzymol. 266: 131-141 (1996); Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (1997); Zhang and Madden, Genome Res. 7:649-656 (1997))、特にｂｌａｓｔｐ又はｔｂｌａｓｔｎ (Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (1997)) を使用して配列を比較することができる。
【００２７】
核酸又はそのフラグメントに言及するとき、「実質的相同性」又は「実質的類似性」という用語は、もう１つ別の核酸（又はその相補鎖）と適切なヌクレオチド挿入又は欠失で最適整列したとき、上述したような配列同一性の周知のアルゴリズム、例えばＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ又はＧａｐによって測定される、ヌクレオチド塩基の少なくとも約５０％、より好ましくは６０％、通常は少なくとも約７０％、より通常は少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくはヌクレオチド塩基の少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％のヌクレオチド配列同一性が存在することを指示する。
【００２８】
あるいは、核酸又はそのフラグメントが、ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下でもう１つ別の核酸、もう１つ別の核酸の鎖又はその相補鎖にハイブリダイズするとき、実質的相同性又は類似性が存在する。核酸ハイブリダイゼーション実験に関して「ストリンジェントハイブリダイゼーション条件」及び「ストリンジェント洗浄条件」は、多くの異なる物理的パラメータに依存する。核酸ハイブリダイゼーションは、当業者には容易に認識されるように、塩濃度、温度、溶媒、ハイブリダイズする種の塩基組成、相補領域の長さ、及びハイブリダイズする核酸の間のヌクレオチド塩基ミスマッチの数などの条件によって影響される。当業者は、特定ストリンジェンシーのハイブリダイゼーションを達成するためにこれらのパラメータをどのように変化させるかを熟知する。
【００２９】
一般に、「ストリンジェントハイブリダイゼーション」は、特定の組み合わせの条件下で特定ＤＮＡハイブリッドについての融解温度（Ｔm）より約２５℃低い温度で実施される。「ストリンジェント洗浄」は、特定の組み合わせの条件下で特定ＤＮＡハイブリッドについてのＴmより約５℃低い温度で実施される。Ｔmは、標的配列の５０％が完全にマッチするプローブにハイブリダイズする温度である。参照してここに組み込まれる、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989), page 9.51参照。ここでの目的のために、「ストリンジェント条件」は、液相ハイブリダイゼーション、例えば６Ｘ ＳＳＣ（２０Ｘ ＳＳＣは３．０Ｍ ＮａＣｌ及び０．３Ｍクエン酸ナトリウムを含む）、１％ＳＤＳ中６５℃で８−１２時間の水溶液ハイブリダイゼーション（すなわちホルムアミドを含まない）、続いて０．２Ｘ ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中６５℃で２０分間ずつ２回の洗浄、について定義される。６５℃でのハイブリダイゼーションが、ハイブリダイズする配列の長さ及び同一性パーセントを含む多くの因子に依存して異なる速度で起こることは当業者に認識される。
【００３０】
核酸配列に適用するとき「突然変異した」という用語は、基準核酸配列と比較して核酸配列内のヌクレオチドが挿入、欠失又は変化し得ることを意味する。単一変化を１つの遺伝子座で作製し得るか（点突然変異）又は多数のヌクレオチドを単一遺伝子座で挿入、欠失又は変更し得る。加えて、１又はそれ以上の変化を核酸配列内のいかなる数の遺伝子座においても作製し得る。核酸配列は、突然変異誘発手法、例えば「エラープローンＰＣＲ」（高い割合の点突然変異がＰＣＲ産物の長さ全体にわたって得られるように、ＤＮＡポリメラーゼの複製信頼度が低い条件下でＰＣＲを実施するための方法；例えばLeung et al., Technique, 1:11-15 (1989) and Caldwell and Joyce, PCR Methods Applic. 2:28-33 (1992)参照；及び「オリゴヌクレオチド指定突然変異誘発」（何らかのクローン化された対象ＤＮＡセグメントにおける部位特異的突然変異の生成を可能にする方法；例えばReidhaar-Olson and Sauer, Science 241 :53-57 (1988)参照）を含むが、これらに限定されない、当技術分野で公知の何らかの方法によって突然変異させ得る。
【００３１】
ここで使用する「ベクター」という用語は、それが連結されているもう１つ別の核酸を輸送することができる核酸分子を指すことが意図されている。１つの種類のベクターは、その中に付加的なＤＮＡセグメントを連結し得る環状二本鎖ＤＮＡループを指す、「プラスミド」である。他のベクターは、コスミド、細菌人工染色体（ＢＡＣ）及び酵母人工染色体（ＹＡＣ）を含む。もう１つの種類のベクターは、付加的なＤＮＡセグメントをウイルスゲノム内に連結し得る、ウイルスベクターである（以下でより詳細に論じる）。ある種のベクターは、それらが導入された宿主細胞において自律複製することができる（例えば宿主細胞において機能する複製起点を有するベクター）。他のベクターは、宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノムに組み込まれることができ、それによって宿主ゲノムと共に複製される。さらに、ある種の好ましいベクターは、それらが作動可能に連結されている遺伝子の発現を指令することができる。そのようなベクターをここでは「組換え発現ベクター」（又は単に「発現ベクター」）と称する。
【００３２】
ここで使用する、「対象配列」又は「対象遺伝子」という用語は、宿主細胞において通常は生産されない、典型的にはタンパク質をコードする、核酸配列を指す。ここで開示する方法は、１又はそれ以上の対象配列又は対象遺伝子を宿主細胞ゲノムに安定に組み込むことを可能にする。対象配列の非限定的な例は、酵素活性を有する１又はそれ以上のポリペプチド、例えば宿主におけるＮ−グリカン合成に影響を及ぼす酵素、例えばマンノシルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン輸送体、ガラクトシルトランスフェラーゼ、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルガラクトシルトランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼ及びフコシルトランスフェラーゼをコードする配列を含む。
【００３３】
「マーカー配列」又は「マーカー遺伝子」という用語は、宿主細胞内の配列の存在又は不在についての陽性又は陰性選択を可能にする活性を発現することができる核酸配列を指す。例えばピキア・パストリス(P. pastoris)ＵＲＡ５遺伝子は、この遺伝子を含む細胞がウラシルの不在下で増殖する能力によってその存在を選択することができるので、マーカー遺伝子である。その存在はまた、この遺伝子を含む細胞が５−ＦＯＡの存在下で増殖することができないことによって選択できる。マーカー配列又は遺伝子は、必ずしも陽性と陰性の両方の選択可能性を示す必要はない。Ｐ．パストリスからのマーカー配列又は遺伝子の非限定的な例は、ＡＤＥ１、ＡＲＧ４、ＨＩＳ４及びＵＲＡ３を含む。抗生物質耐性マーカー遺伝子に関しては、カナマイシン、ネオマイシン、ゲネチシン（又はＧ４１８）、パロモマイシン及びハイグロマイシン耐性遺伝子が、これらの抗生物質の存在下での増殖を可能にするために一般的に使用される。
【００３４】
「作動可能に連結された」発現制御配列は、発現制御配列が対象遺伝子を制御するために対象遺伝子に隣接する結合、並びにイントランスで又は離れて対象遺伝子を制御するように働く発現制御配列を指す。
【００３５】
ここで使用する「発現制御配列」という用語は、それらが作動可能に連結されているコード配列の発現に影響を及ぼすために必要なポリヌクレオチド配列を指す。発現制御配列は、核酸配列の転写、転写後事象及び翻訳を制御する配列である。発現制御配列は、適切な転写開始、終結、プロモーター及びエンハンサー配列；効率的なＲＮＡプロセシングシグナル、例えばスプライシング及びポリアデニル化シグナル；細胞質ｍＲＮＡを安定化する配列；翻訳効率を高める配列（例えばリボソーム結合部位）；タンパク質の安定性を高める配列；及び所望するときは、タンパク質分泌を上昇させる配列を含む。そのような制御配列の性質は宿主生物に依存して異なる：原核生物では、そのような制御配列は一般に、プロモーター、リボソーム結合部位及び転写終結配列を含む。「制御配列」という用語は、最小限で、その存在が発現のために必須である全ての成分を含むことが意図されており、その存在が好都合である付加的な成分、例えばリーダー配列及び融合パートナー配列も含み得る。
【００３６】
ここで使用する、「組換え宿主細胞」（「発現宿主細胞」、「発現宿主系」、「発現系」又は単に「宿主細胞」）という用語は、組換えベクターが導入された細胞を指すことが意図されている。そのような用語は、特定被験細胞だけでなく、そのような細胞の子孫も表わすことが意図されていることは了解されるべきである。突然変異又は環境影響のために連続する世代の中である種の修飾が起こり得るので、そのような子孫は、実際には、親細胞と同じでないことがあり得るが、やはりここで使用する「宿主細胞」の用語の範囲内に包含される。組換え宿主細胞は、単離細胞又は培養中で増殖する細胞系統であり得るか、又は生体組織又は生物内に存する細胞であり得る。
【００３７】
「真核」という用語は、有核細胞又は生物を指し、昆虫細胞、植物細胞、哺乳動物細胞、動物細胞及び下等真核細胞を含む。
【００３８】
「下等真核細胞」という用語は、酵母、真菌、襟鞭毛虫、微胞子虫、アルベオラータ（例えば渦鞭毛虫）、ストラメノパイル（例えば褐藻類、原生動物）、紅藻植物（例えば紅藻類）、植物（例えば緑藻類、植物細胞、苔）及び他の原生生物を含む。酵母及び真菌は、ピキア属（Pichia sp.）、例えばピキア・パストリス（Pichia pastoris）、ピキア・フィンランディカ（Pichia finlandica）、ピキア・トレハロフィラ（Pichia trehalophila）、ピキア・コクラメー（Pichia koclamae）、ピキア・メンブラネファシエンス（Pichia membranaefaciens）、ピキア・ミヌータ(Pichia minuta)（メタノール資化性酵母（オガテー・ミヌータ）（Ogataea minuta）、ピキア・リンデネリ（Pichia lindneri））、ピキア・オパンティエー（Pichia opuntiae）、ピキア・サーモトレランス（Pichia thermotolerans）、ピキア・サリクタリア（Pichia salictaria）、ピキア・グエルカム（Pichia guercuum）、ピキア・ピジュペリ（Pichia pijperi）、ピキア・スチプチス(Pichia stiptis)及びピキア・メタノリカ(Pichia methanolica)；サッカロミセス属（Saccharomyces sp）、例えばサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)；ハンセヌラ・ポリモーファ（Hansenula polymorpha）、クルイヴェロミセス属（Kluyveromyces sp）、例えばクルイヴェロミセス・ラクチス(Kluyveromyces lactis)；カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、アスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulans）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、アスペルギルス・オリゼー（Aspergillus oryzae）、トリコデルマ・レエセイ（Trichoderma reesei）、クリソスポリウム・ルクノヴェンス（Chrysosporium lucknowense）、フザリウム属（Fusarium sp）、例えばフザリウム・グラミネウム（Fusarium gramineum）、フザリウム・ヴェネナタム(Fusarium venenatum)；フィスコミトレラ・パテンス(Physcomitrella patens)及びアカパンカビ（ニューロスポラ・クラッサ(Neurospora crassa)）を含むが、これらに限定されない。
【００３９】
ここで使用する「ペプチド」という用語は、短いポリペプチド、例えば典型的には約５０アミノ酸長未満、より典型的には約３０アミノ酸長未満であるものを指す。ここで使用するこの用語は、構造、及びそれ故生物学的機能を模倣する類似体及びミメティックを包含する。
【００４０】
「ポリペプチド」という用語は、天然に生じるタンパク質と非天然に生じるタンパク質の両方、及びそれらのフラグメント、突然変異体、誘導体及び類似体を包含する。ポリペプチドは単量体又は多量体であり得る。さらに、ポリペプチドは、各々が１又はそれ以上の別個の活性を有する多くの異なるドメインを含み得る。
【００４１】
「単離タンパク質」又は「単離ポリペプチド」という用語は、その起源又は誘導のソースによって（１）天然の状態でそれに付随する天然結合成分と結合していない、（２）天然では認められない純度で存在する、純度は他の細胞物質の存在に関して判定され得る（例えば同じ種からの他のタンパク質を含まない）、（３）異なる種からの細胞によって発現される、又は（４）天然では生じない（例えば天然に認められるポリペプチドのフラグメントである、又は天然では認められないアミノ酸類似体又は誘導体あるいは標準ペプチド結合以外の結合を含む）、タンパク質又はポリペプチドである。それ故、化学合成される又はそれが天然に由来する細胞とは異なる細胞系で合成されるポリペプチドは、その天然結合成分から「単離」されている。ポリペプチド又はタンパク質はまた、当技術分野で周知のタンパク質精製手法を用いて、単離によって天然結合成分を実質的に含まないようにし得る。そのように定義される「単離」は、そのように表わされるタンパク質、ポリペプチド、ペプチド又はオリゴペプチドがその天然環境から物理的に取り出されていることを必ずしも必要としない。
【００４２】
ここで使用する「ポリペプチドフラグメント」という用語は、完全長ポリペプチドと比較して欠失、例えばアミノ末端及び／又はカルボキシ末端欠失を有するポリペプチドを指す。好ましい実施形態では、ポリペプチドフラグメントは、フラグメントのアミノ酸配列が天然に生じる配列内の対応する位置と同一である隣接配列である。フラグメントは、典型的には少なくとも５、６、７、８、９又は１０アミノ酸長、好ましくは少なくとも１２、１４、１６又は１８アミノ酸長、より好ましくは少なくとも２０アミノ酸長、より好ましくは少なくとも２５、３０、３５、４０又は４５アミノ酸長、さらに一層好ましくは少なくとも５０又は６０アミノ酸長、さらに一層好ましくは少なくとも７０アミノ酸長である。
【００４３】
「修飾誘導体」は、一次構造配列において実質的に相同であるが、例えばインビボ又はインビトロでの化学及び生化学的修飾を含む又は天然ポリペプチドでは認められないアミノ酸が組み込まれているポリペプチド又はそのフラグメントを指す。そのような修飾は、当業者には容易に認識されるように、例えばアセチル化、カルボキシル化、リン酸化、グリコシル化、ユビキチン化、例えば放射性核種による、標識、及び様々な酵素修飾を含む。ポリペプチドを修飾するための様々な方法及びそのような目的のために有用な様々な置換基又は標識は当技術分野において周知であり、放射性同位体、例えば125Ｉ、32Ｐ、35Ｓ及び3Ｈ、標識抗リガンド（例えば抗体）に結合するリガンド、発蛍光団、化学発光物質、酵素、及び標識リガンドのための特異的結合対成員として使用できる抗リガンドを含む。標識の選択は、求められる感受性、プライマーとの複合の容易さ、安定性必要条件、及び使用可能な機器に依存する。ポリペプチドを標識するための方法は当技術分野において周知である。例えばAusubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992, and Supplements to 2002)（参照してここに組み込まれる）参照。
【００４４】
「融合タンパク質」という用語は、異種アミノ酸配列に結合したポリペプチド又はフラグメントを含むポリペプチドを指す。融合タンパク質は、２又はそれ以上の異なるタンパク質からの２又はそれ以上の所望機能エレメントを含むように構築することができるので、有用である。融合タンパク質は、対象ポリペプチドからの少なくとも１０隣接アミノ酸、より好ましくは少なくとも２０又は３０アミノ酸、さらに一層好ましくは少なくとも４０、５０又は６０アミノ酸、さらにより好ましくは少なくとも７５、１００又は１２５アミノ酸を含む。本発明のタンパク質の全体を含む融合物は特に有用である。本発明の融合タンパク質内に含まれる異種ポリペプチドは、少なくとも６アミノ酸長、しばしば少なくとも８アミノ酸長、有用には少なくとも１５、２０及び２５アミノ酸長である。より大きなポリペプチド、例えば免疫グロブリンＦｃフラグメント又は免疫グロブリンＦａｂフラグメント、さらにはタンパク質全体、例えばグリーン蛍光タンパク質（「ＧＦＰ」）発色団含有タンパク質又は特に有用な完全長免疫グロブリンを含む融合物。融合タンパク質は、異なるタンパク質又はペプチドをコードする核酸配列と共にポリペプチド又はそのフラグメントをインフレームでコードする核酸配列を構築し、次にこの融合タンパク質を発現することによって組換え生産することができる。あるいは、融合タンパク質は、ポリペプチド又はそのフラグメントをもう１つ別のタンパク質に架橋することによって化学的に生産することができる。
【００４５】
ここで使用する、「抗体」、「免疫グロブリン」、「Ｉｇ」及び「Ｉｇ分子」という用語は交換可能に用いられる。各々の抗体分子は、その特異性抗原に結合することを可能にする独自の構造を有するが、全ての抗体／免疫グロブリンはここで述べるような同じ全体的構造を有する。基本的抗体構造単位は、サブユニットの四量体を含むことが知られている。各々の四量体は２つの同一のポリペプチド鎖の対を有し、各々の対は１本の「軽」鎖（約２５ｋＤａ）と１本の「重」鎖（約５０−７０ｋＤａ）を有する。各々の鎖のアミノ末端部分は、主として抗原認識の役割を担う約１００−１１０又はそれ以上のアミノ酸の可変領域を含む。各々の鎖のカルボキシ末端部分は、主としてエフェクター機能の役割を担う定常領域を規定する。軽鎖はκ又はλと分類される。重鎖は、γ、μ、α、δ又はεと分類され、それぞれ抗体のアイソタイプをＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥと規定する。軽鎖と重鎖は可変領域と定常領域に細分される（一般に、Fundamental Immunology (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N. Y., 1989), Ch. 7（全ての目的のためにその全体が参照してここに組み込まれる）参照）。各々の軽／重鎖対の可変領域は抗体結合部位を形成する。それ故、無傷抗体は２つの結合部位を有する。二元機能性又は二重特異性抗体（bifunctional or bispecific antibodies）を除き、２つの結合部位は同じである。鎖は全て、相補性決定領域又はＣＤＲとも呼ばれる、３つの超可変領域によって接合される比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）の同じ一般構造を示す。各々の対の２本の鎖からのＣＤＲはフレームワーク領域によって並列され、特定エピトープへの結合を可能にする。前記用語は、天然に生じる形態、並びにフラグメント及び誘導体を含む。Ｉｇのクラス、すなわちＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ及びＩｇＤは前記用語の範囲内に含まれる。ＩｇＧのサブタイプ、すなわちＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４も用語の範囲内に含まれる。この用語は最も広い意味で使用され、単一モノクローナル抗体（アゴニスト及びアンタゴニスト抗体を含む）並びに多数のエピトープ又は抗原に結合する抗体組成物を含む。前記用語は特に、モノクローナル抗体（完全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、及びＣH２ドメインのＮ結合グリコシル化部位を含む重鎖免疫グロブリン定常領域のＣH２ドメインの少なくとも一部を含むか又は含むように修飾される限り、抗体フラグメント、又はその変異体をカバーする。Ｆｃ領域を含む分子、例えばイムノアドヘシン（米国特許出願第２００４／０１３６９８６号）、Ｆｃ融合物及び抗体様分子は前記用語に包含される。あるいは、これらの用語は、少なくともＮ結合グリコシル化部位を含む、少なくともＦａｂ領域の抗体フラグメントを表わし得る。
【００４６】
「Ｆｃ」フラグメントという用語は、ＣH２及びＣH３ドメインを含む抗体の「結晶化フラグメント」Ｃ末端領域を指す（図１）。「Ｆａｂ」フラグメントという用語は、ＶＨ、ＣＨ１、ＶＬ及びＣＬドメインを含む抗体の「抗原結合フラグメント」領域を指す（図１）。
【００４７】
ここで使用する「モノクローナル抗体」（ｍＡｂ）という用語は、実質的に均一な抗体の個体群から得られる抗体、すなわち個体群を構成する個々の抗体は、少量存在し得る、天然に生じる可能性のある突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は、高度特異性であり、単一抗原部位を標的とする。さらに、典型的には種々の決定基（エピトープ）を標的とする種々の抗体を含む従来の（ポリクローナル）抗体製剤と異なり、各々のｍＡｂは抗原上の単一決定基を標的する。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体は、他の免疫グロブリンによって汚染されない、ハイブリドーマ培養によって合成できるという点で好都合である。「モノクローナル」という用語は、抗体の実質的に均一な個体群から得られるという抗体の性質を指示し、何らかの特定方法による抗体の生産を必要とすると解釈されるべきではない。例えば本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、Kohler et al., (1975) Nature, 256:495によって最初に記述されたハイブリドーマ法によって作製し得るか、又は組換えＤＮＡ法（例えばＣａｂｉｌｌｙらへの米国特許第４，８１６，５６７号参照）によって作製し得る。
【００４８】
モノクローナル抗体は、ここでは、起源の種又は免疫グロブリンクラス又はサブクラス指定に関わりなく、抗体の可変（超可変を含む）ドメインを定常ドメインで（例えば「ヒト化」抗体）、又は軽鎖を重鎖で、又はある種からの鎖をもう１つ別の種からの鎖で、又は融合物を異種タンパク質で、スプライシングすることによって生産されるハイブリッド及び組換え抗体を含む（例えばＣａｂｉｌｌｙらへの米国特許第４，８１６，５６７号； Mage and Lamoyi, in Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 79-97 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)参照）。モノクローナル抗体は、ここでは特に、重鎖及び／又は軽鎖の一部が、最初の種に由来する又は特定抗体クラス又はサブクラスに属する抗体内の対応配列と同一又は相同であり、鎖の残りの部分が、異なる種に由来する又は異なる抗体クラス又はサブクラスに属する抗体内の対応配列と同一又は相同である、「キメラ」抗体（免疫グロブリン）、並びにそれらが少なくとも１つのＣH２を含むか又は含むように修飾される限り、そのような抗体のフラグメントを含む。非ヒト（例えばマウス）抗体の「ヒト化」形態は、ヒト免疫グロブリンに由来する配列を含む特異的キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖又はそのフラグメント（例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、又は抗体の他の抗原結合サブ配列）である。抗体のＦｖフラグメントは、全体分子の結合特性及び特異性を保持する抗体の最小単位である。Ｆｖフラグメントは、抗体重鎖及び軽鎖の可変ドメインの非共有結合ヘテロ二量体である。Ｆ（ａｂ’）2フラグメントは、ジスルフィド架橋によって結合されたＦａｂフラグメントの両方の腕を含むフラグメントである。
【００４９】
最も一般的な形態のヒト化抗体は、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）からの残基が、所望特異性、親和性及び能力を有する非ヒト種（ドナー抗体）、例えばマウス、ラット又はウサギのＣＤＲからの残基によって置換されているヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。一部の場合は、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基が対応する非ヒト残基によって置換される。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体又は導入されるＣＤＲ又はフレームワーク配列のいずれにおいても認められない残基を含み得る。これらの修飾は、抗体性能をさらに洗練し、最大化するために行われる。一般に、ヒト化抗体は、ＣＤＲ領域の全部又は実質的に全部が非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、及びＣＤＲ領域の全部又は実質的に全部がヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである、少なくとも１、典型的には２個の可変ドメインの実質的に全部を含む。ヒト化抗体はまた、最適には、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的にはヒト免疫グロブリンのものの少なくとも一部を含む。さらなる詳細については、Jones et al., 1986, Nature 321:522-524; Reichmann et al., 1988, Nature 332:323-327, and Presta, 1992, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596参照。
【００５０】
抗体又は免疫グロブリンの用語の範囲内の「フラグメント」は、フラグメントが依然として標的分子に特異結合することができる限り、様々なプロテアーゼでの消化によって生産されるもの、化学的切断及び／又は化学的解離によって生産されるもの、及び組換え生産されるものを含む。そのようなフラグメントには、Ｆｃ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ’）2、及び一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメントがある。
【００５１】
本発明の抗体の対象標的は、増殖因子受容体（例えばＦＧＦＲ、ＰＤＧＦＲ、ＥＧＦＲ、ＮＧＦＲ及びＶＥＧＦ）及びそれらのリガンドを含む。他の標的はＧタンパク質受容体であり、サブスタンスＫ受容体、アンギオテンシン受容体、α及びβアドレナリン受容体、セロトニン受容体及びＰＡＦ受容体を含む。例えばGilman, Ann. Rev.Biochem. 56:625-649 (1987)参照。他の標的は、イオンチャネル（例えばカルシウム、ナトリウム、カリウムチャネル）、ムスカリン受容体、アセチルコリン受容体、ＧＡＢＡ受容体、グルタミン酸受容体及びドーパミン受容体を含む（Ｈａｒｐｏｌｄ、米国特許第５，４０１，６２９号及び米国特許第５，４３６，１２８号参照）。他の標的は、接着タンパク質、例えばインテグリン、セレクチン及び免疫グロブリンスーパーファミリー成員である（Springer, Nature 346:425-433 (1990). Osborn, Cell 62:3 (1990); Hynes, Cell 69:11 (1992)参照）。他の標的は、サイトカイン、例えばインターロイキンＩＬ−１からＩＬ−１３、腫瘍壊死因子α及びβ、インターフェロンα、β及びγ、腫瘍増殖因子β（ＴＧＦ−β）、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）及び顆粒球単球コロニー刺激因子（ＧＭＣＳＦ）である。Human Cytokines: Handbook for Basic & Clinical Research (Aggrawal et al. eds., Blackwell Scientific, Boston, MA 1991)参照。他の標的は、ホルモン、酵素、及び細胞内及び細胞間メッセンジャー、例えばアデニルシクラーゼ、グアニルシクラーゼ及びホスホリパーゼＣである。他の対象標的は、白血球抗原、例えばＣＤ２０及びＣＤ３３である。薬剤も対象標的であり得る。標的分子は、ヒト、哺乳動物又は細菌性であり得る。他の標的は、抗原、例えばウイルス及び細菌の両方の、微生物病原体からのタンパク質、糖タンパク質及び炭水化物、及び腫瘍である。さらなる他の標的は、米国特許第４，３６６，２４１号に述べられている。
【００５２】
ここで論じる免疫Ｆｃ受容体は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩＩＩｂ及びＦｃＲｎ（新生児受容体）を含み得る。ＦｃγＲＩという用語は、異なる規定がない限りいかなるＦｃγＲＩサブタイプも表わし得る。ＦｃγＲＩＩという用語は、異なる規定がない限りいかなるＦｃγＲＩＩ受容体も表わし得る。ＦｃγＲＩＩＩという用語は、異なる規定がない限りあらゆるＦｃγＲＩＩＩサブタイプを指す。
【００５３】
「誘導体」はその用語の範囲内に、種間キメラ及びヒト化抗体；抗体融合物；ヘテロマー抗体複合体及び抗体融合物、例えば二重特異性抗体（ダイアボディ）（bispecific antibodies）、一本鎖二重特異性抗体及び細胞内発現抗体（イントラボディ）を含む、配列が修飾されているが、依然として標的分子に特異結合することができる抗体（又はそのフラグメント）を含む（例えばIntracellular Antibodies: Research and Disease Applications, (Marasco, ed., Springer-Verlag New York, Inc., 1998)参照）。
【００５４】
「非ペプチド類似体」という用語は、基準ポリペプチドのものに類似した性質を有する化合物を指す。非ペプチド化合物はまた、「ペプチドミメティック」（peptide mimetic、peptidomimetic）と称されることもある。例えば参照してここに組み込まれる、Jones, Amino Acid and Peptide Synthesis, Oxford University Press (1992); Jung, Combinatorial Peptide and Nonpeptide Libraries: A Handbook, John Wiley (1997); Bodanszky et al., Peptide Chemistry-A Practical Textbook, Springer Verlag (1993); Synthetic Peptides: A Users Guide, (Grant, ed., W. H. Freeman and Co., 1992); Evans et al., J. Med. Chem. 30:1229 (1987); Fauchere, J. Adv. Drug Res. 15:29 (1986); Veber and Freidinger, Trends Neurosci, 8:392-396 (1985)；及び上記の各々で引用される参考文献参照。そのような化合物はしばしばコンピュータ分子モデリングを用いて開発される。本発明の有用なペプチドに構造的に類似するペプチドミメティックは、等しい作用を生じさせるために使用でき、それ故本発明の一部と考えられる。
【００５５】
アミノ酸置換は、（１）タンパク質分解に対する感受性を低下させる、（２）酸化に対する感受性を低下させる、（３）タンパク質複合体を形成するための結合親和性を変化させる、（４）結合親和性又は酵素活性を変化させる、及び（５）そのような類似体の他の物理化学的又は機能的性質を付与する又は修飾する、アミノ酸置換を含み得る。
【００５６】
ここで使用する、２０個の従来のアミノ酸及びそれらの略記は従来の使用法に従う。参照してここに組み込まれる、Immunology - A Synthesis (Golub and Gren eds., Sinauer Associates, Sunderland, Mass., 2nd ed. 1991)参照。２０個の従来のアミノ酸の立体異性体（例えばＤ−アミノ酸）、非天然アミノ酸、例えばα−アミノ酸、α−二置換アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸、及び他の非慣例的アミノ酸も、本発明のポリペプチドのための適切な成分であり得る。非慣例的アミノ酸の例は、４−ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタメート、ε−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルリシン、ε−Ｎ−アセチルリシン、Ｏ−ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリシン、Ｎ−メチルアルギニン、及び他の類似アミノ酸及びイミノ酸（例えば４−ヒドロキシプロリン）を含む。ここで使用するポリペプチド表記では、標準使用法及び慣例に従って、左側末端はアミノ末端に対応し、右側末端はカルボキシ末端に対応する。
【００５７】
タンパク質は、そのタンパク質をコードする核酸配列が第二のタンパク質をコードする核酸配列と類似の配列を有する場合、第二タンパク質に「相同性」を有する又は「相同」である。あるいは、２個のタンパク質が「類似」アミノ酸配列を有する場合、タンパク質は第二タンパク質に相同性を有する。（それ故、「相同タンパク質」という用語は、２個のタンパク質が類似アミノ酸配列を有することを意味すると定義される。）好ましい実施形態では、相同タンパク質は、野生型タンパク質に少なくとも６５％の配列相同性を示すものであり、少なくとも７０％の配列相同性がより好ましい。野生型タンパク質に少なくとも７５％、８０％、８５％又は９０％の配列相同性を示す相同タンパク質がさらに一層好ましい。さらなるより好ましい実施形態では、相同タンパク質は少なくとも９５％、９８％、９９％又は９９．９％の配列同一性を示す。ここで使用する、アミノ酸配列の２つの領域の間の相同性（特に予測上の構造類似性に関して）は、機能における類似性を意味すると解釈される。
【００５８】
タンパク質又はペプチドに関して「相同な」を使用するときは、同一でない残基位置がしばしば保存的アミノ酸置換によって異なると認識される。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、類似の化学的性質（例えば電荷又は疎水性）を備えた側鎖（Ｒ基）を有するもう１つ別のアミノ酸残基によって置換されているものである。一般に、保存的アミノ酸置換はタンパク質の機能特性を実質的に変化させない。２又はそれ以上のアミノ酸配列が保存的置換によって互いに異なる場合、配列同一性パーセント又は相同性の程度は、置換の保存的性質を補正するように上方調整し得る。この調整を行うための手段は当業者に周知である。例えばPearson, 1994, Methods Mol. Biol. 24:307-31 and 25:365-89参照（参照してここに組み込まれる）。
【００５９】
以下の６つの群は各々、互いに保存的置換であるアミノ酸を含む：１）セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、及び６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）。
【００６０】
配列同一性パーセントとも称される、ポリペプチドについての配列相同性は、典型的には配列解析ソフトウエアを用いて測定される。例えばｔｈｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｅｎｔｅｒ，９１０ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ａｖｅｎｕｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ ５３７０５の配列解析ソフトウエアパッケージ参照。タンパク質解析ソフトウエアは、様々な置換、欠失、及び保存的アミノ酸置換を含む他の修飾に割り当てられた相同性の測定を用いて類似配列を対合させる。例えばＧＣＧは、密接に関連するポリペプチド、例えば生物の異なる種からの相同ポリペプチドの間、又は野生型タンパク質とそのムテインとの間の配列相同性又は配列同一性を決定するためのデフォルトパラメータと共に使用できるプログラム、例えば「Ｇａｐ」及び「Ｂｅｓｔｆｉｔ」を含む。例えばＧＣＧバージョン６．１参照。
【００６１】
特定ポリペプチド配列を、種々の生物からの数多くの配列を含むデータベースと比較するときの好ましいアルゴリズムは、コンピュータプログラムＢＬＡＳＴ(Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990); Gish and States, Nature Genet. 3:266-272 (1993); Madden et al., Meth. Enzymol. 266: 131-141 (1996); Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (1997); Zhang and Madden, Genome Res. 7:649-656 (1997))、特にｂｌａｓｔｐ又はｔｂｌａｓｔｎ(Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (1997))である。
【００６２】
ＢＬＡＳＴｐのための好ましいパラメータは、期待値：１０（デフォルト）；フィルター：ｓｅｇ（デフォルト）；ギャップを開くためのコスト：１１（デフォルト）；ギャップを伸長するためのコスト：１（デフォルト）；最大整列：１００（デフォルト）；ワードサイズ：１１（デフォルト）；記述数：１００（デフォルト）；ペナルティーマトリックス：ＢＬＯＷＳＵＭ６２である。
【００６３】
相同性に関して比較するポリペプチド配列の長さは、一般に少なくとも約１６アミノ酸残基、通常は少なくとも約２０残基、より通常は少なくとも約２４残基、典型的には少なくとも約２８残基、好ましくは約３５残基以上である。数多くの異なる生物からの配列を含むデータベースを検索するときは、アミノ酸配列を比較することが好ましい。アミノ酸配列を用いるデータベース検索は、当技術分野で公知のｂｌａｓｔｐ以外のアルゴリズムによって測定できる。例えばポリペプチド配列は、ＧＣＧバージョン６．１の中のプログラム、ＦＡＳＴＡを用いて比較することができる。ＦＡＳＴＡは、問い合わせ配列と検索配列の間の最良重複の領域のアラインメントと配列同一性パーセントを提供する。Pearson, Methods Enzymol. 183:63-98 (1990)（参照してここに組み込まれる）。例えばアミノ酸配列間の配列同一性パーセントは、参照してここに組み込まれるＧＣＧバージョン６．１において提供されるように、ＦＡＳＴＡをそのデフォルトパラメータ（ワードサイズ２及びＰＡＭ２５０スコアリングマトリックス）と共に使用して決定できる。
【００６４】
「特異的結合」は、２個の分子が環境において他の分子への結合よりも選択的に互いに結合する能力を指す。典型的には、「特異的結合」は、反応における偶発的結合と少なくとも２倍、より典型的には少なくとも１０倍、しばしば少なくとも１００倍の差がある。典型的には、特異的結合反応の親和性又はアビディティーは、解離定数によって数量化したとき、約１０-7Ｍ又はそれ以上強力（例えば約１０-8Ｍ、１０-9Ｍ又はさらに強力）である。
【００６５】
ここで使用する「領域」という用語は、生体分子の一次構造の物理的に隣接する部分を指す。タンパク質の場合、領域は、そのタンパク質のアミノ酸配列の隣接部分によって規定される。
【００６６】
ここで使用する「ドメイン」という用語は、生体分子の公知の又は考えられる機能に寄与する生体分子の構造を指す。ドメインはその領域又は部分と同一の広がりを有し得る；ドメインはまた、生体分子の別個の非隣接領域を含み得る。
【００６７】
ここで使用する、「分子」という用語は、低分子、ペプチド、タンパク質、糖タンパク質、糖、ヌクレオチド、核酸、脂質等を含むが、これらに限定されない、いかなる化合物も意味し、そのような化合物は天然又は合成であり得る。
【００６８】
ここで使用する、「含む（comprise）」という用語又はその三人称単数形（comprises）又は「含むこと（comprising）」のような変形は、言明される整数又は整数の群の包含を意味するが、他の何らかの整数又は整数の群の排除を意味しないことが了解される。
【００６９】
ここで使用する、「本質的に〜から成る」という用語は、言明される整数又は整数の群の包含を意味し、言明される整数に実質的に影響を及ぼす又は変化させる修飾又は他の整数を排除することが了解される。Ｎ−グリカンの種に関して、「本質的に言明されるＮ−グリカンから成る」という用語は、Ｎ−グリカンが糖タンパク質のアスパラギン残基に直接結合しているＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）でフコシル化されているか否かに関わりなくＮ−グリカンを含むことが了解される。
【００７０】
ここで使用する、「支配的に」という用語又は「支配的な」又は「支配的である」のような変形は、糖タンパク質をＰＮＧアーゼで処理し、放出されたグリカンを質量分析、例えばＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳによって分析した後、総Ｎ−グリカンの最高モルパーセント（％）を有するグリカン種を意味することが了解される。言い換えると、「支配的に」という語句は、個別実体、例えば特定グリコフォームが、他のいかなる個別実体よりも高いモルパーセントで存在すると定義される。例えば組成物が４０モルパーセントのＡ種、３５モルパーセントのＢ種及び２５モルパーセントのＣ種から成る場合、組成物はＡ種を支配的に含み、Ｂ種はその次に最も支配的な種である。
【００７１】
ここで使用するとき、特定糖残基、例えばフコース又はガラクトース等を「本質的に含まない」という用語は、糖タンパク質組成物が、そのような残基を含むＮ−グリカンを実質的に欠くことを指示するために使用される。純度に関して表わされる、実質的に含まないということは、そのような糖残基を含むＮ−グリカン構造の量が１０％を超えない、好ましくは５％未満、より好ましくは１％未満、最も好ましくは０．５％未満であることを意味し、前記パーセンテージは重量又はモルパーセントである。それ故、本発明に従った糖タンパク質組成物中の実質的に全てのＮ−グリカン構造は、フコース又はガラクトース又はその両方を含まない。
【００７２】
ここで使用するとき、糖タンパク質組成物は、特定糖残基、例えばフコース又はガラクトースの検出可能な量がいかなる時点でもＮ−グリカン構造上に存在しないとき、そのような糖残基を「欠く」又は「欠如している」。例えば本発明の好ましい実施形態では、糖タンパク質組成物は、酵母［例えばピキア属(Pichia sp.)；サッカロミセス属(Saccharomyces sp)；クルイヴェロミセス属(Kluyveromyces sp.)；アスペルギルス属(Aspergillus sp.)］を含む、上記で定義したような下等真核生物によって生産され、これらの生物の細胞はフコシル化Ｎ−グリカン構造を生成するために必要な酵素を持たないので、「フコースを欠く」。それ故、「本質的にフコースを含まない」という用語は、「フコースを欠く」という用語を包含する。しかし、組成物がかつてフコシル化Ｎ−グリカン構造を含んだ場合又は上述したように限られているが検出可能な量のフコシル化Ｎ−グリカン構造を含む場合でも、組成物は「本質的にフコースを含まない」と考えられる。
【００７３】
ここで使用する、「高い結合活性」という語句は、受容体又はさもなければ指示される分子とＩｇＧ分子の結合の上昇を表わす「高い結合親和性」と交換可能に使用される。
【００７４】
ここで使用する、「低い結合活性」という語句は、受容体又はさもなければ指示される分子とＩｇＧ分子の結合の低下を表わす「低い結合親和性」と交換可能に使用される。
【００７５】
ここで使用する、「食作用」という語句は、免疫複合体の清掃であると定義される。食作用は、マクロファージ及び好中球を含むがこれらに限定されない、免疫細胞の免疫学的作用である。
【００７６】
抗体及び抗体−抗原複合体と免疫系の細胞の相互作用及び様々な応答、例えば抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、免疫複合体の清掃（食作用）、Ｂ細胞による抗体産生及びＩｇＧ血清半減期は、それぞれ以下において定義される：Daeron et al, 1997, Annu. Rev. Immunol. 15: 203-234; Ward and Ghetie, 1995, Therapeutic Immunol. 2:77-94; Cox and Greenberg, 2001, Semin. Immunol. 13: 339-345; Heyman, 2003, Immunol. Lett. 88:157-161; and Ravetch, 1997, Curr. Opin. Immunol. 9: 121-125。
【００７７】
異なる定義がない限り、ここで使用する全ての技術的及び学術的用語は、本発明が関係する技術分野の当業者によって一般的に理解されているのと同じ意味を有する。例示的な方法及び材料を以下で述べるが、ここで述べるものと類似又は等価の方法及び材料も本発明の実施において使用することができ、当業者には明白である。ここで言及する全ての刊行物及び他の参考文献は、それらの全体が参照してここに組み込まれる。係争の場合は、定義を含む本明細書に準拠する。材料、方法及び実施例は単なる例示であり、限定を意図しない。
【００７８】
組換えＩｇ−ＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2分子
本発明は、支配的なＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2 Ｎ結合グリコフォームを有するグリコシル化Ｉｇの個体群を含む組成物を提供する。本発明はまた、抗体エフェクター機能、例えば受容体結合を媒介する支配的なＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2 Ｎ結合グリコフォームを有するＩｇ及びＩｇ組成物を提供する。好ましくは、本発明のＩｇとＦｃγＲＩＩＩ受容体の間の相互作用は、直接結合活性の上昇を提供する。及び、好ましくは、本発明のＩｇとＦｃγＲＩＩｂ受容体の間の相互作用は、直接結合活性の低下（又は欠如）を提供する。もう１つの実施形態では、本発明のＩｇ又はＩｇ組成物は、１つのグリコフォーム構造の富化／支配性によって与えられる高い結合活性を示す。本発明の顕著な特徴は、抗体エフェクター機能、例えばＡＤＣＣ活性の上昇又はＢ細胞による抗体産生の上昇を媒介する、支配的な特定グリコフォームを有するＩｇ及びＩｇ組成物を提供することである。もう１つの実施形態では、本発明のＩｇ又はＩｇ組成物は、１つのグリコフォームの富化／支配性によって与えられる高いＡＤＣＣ活性又はＢ細胞による抗体産生を示す。さらに、支配的グリコフォームを有するＩｇ組成物を生産することの１つの利点は、望ましくないグリコフォームを有するＩｇの産生及び／又は望ましくない作用を誘導し得る及び／又はより有効なＩｇグリコフォームの濃度を希釈し得るＩｇの不均一混合物の産生を回避することであることは、当業者には容易に明らかである。それ故、支配的にＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2グリコフォームを有するＩｇを含む医薬組成物は、ＦｃγＲＩＩｂへの結合低下及びＦｃγＲＩＩＩａ及びＦｃγＲＩＩＩｂへの結合上昇を含むがこれらに限定されない、有益な特徴を有し、それ故おそらくより低用量で有効であると考えられ、従ってより高い効果／効力を有し得る。
【００７９】
１つの実施形態では、本発明のＩｇ分子は、Ｉｇ分子における抗体エフェクター機能を媒介するＦｃ領域上の重鎖のＣH２ドメインのＡｓｎ−２９７に少なくとも１つのＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2グリカン構造を含む。好ましくは、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2グリカン構造は、二量体化Ｉｇ内の各々のＣＨ２ドメインの各々のＡｓｎ−２９７上に存在する（図１）。もう１つの実施形態では、本発明は、Ａｓｎ−２９７において本質的にＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2グリカン構造から成るＮ−グリカンで支配的にグリコシル化されているＩｇを含む組成物を提供する（図１）。あるいは、Ｉｇ分子上に認められる１又はそれ以上の炭水化物部分が欠失されて及び／又は分子に付加されて、それによってＩｇ上のグリコシル化部位の数が追加又は欠失されていてもよい。さらに、Ｉｇ分子のＣH２領域内のＮ結合グリコシル化部位の位置は、分子内の様々な位置にアスパラギン（Ａｓｎ）又はＮ−グリコシル化部位を導入することによって変化し得る。Ａｓｎ−２９７は、典型的にはマウス及びヒトＩｇＧ分子において認められるＮ−グリコシル化部位であるが（Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 1991)、この部位は想定し得る唯一の部位ではなく、またこの部位は必ずしも機能のために維持される必要はない。突然変異誘発のための公知の方法を用いて、当業者は、Ａｓｎ−２９７のＮ−グリコシル化部位が欠失されるように本発明のＩｇをコードするＤＮＡ分子を変化させることができ、さらに１又はそれ以上のＮ−グリコシル化部位をＩｇ分子内の他の位置に創造するようにＤＮＡ分子を変化させることができる。Ｎ−グリコシル化部位は、Ｉｇ分子のＣH２領域内に創造されることが好ましい。しかし、ＩｇのＦａｂ領域のグリコシル化が血清抗体の３０％で記述されており−一般にＡｓｎ−７５で認められる(Rademacher et al., 1986, Biochem. Soc. Symp., 51: 131-148)。Ｉｇ分子のＦａｂ領域におけるグリコシル化は、Ｆｃ領域内のＮ−グリコシル化と組み合わせ得るか又は単独の追加部位である。
【００８０】
１つの実施形態では、本発明は、支配的なＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2 Ｎ−グリカン構造を有する組換えＩｇ組成物を提供し、前記ＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2グリカン構造は、組換えＩｇ組成物のその次に支配的なグリカン構造よりも少なくとも約５モルパーセント多いレベルで存在する。好ましい実施形態では、本発明は、支配的なＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2グリカン構造を有する組換えＩｇ組成物を提供し、前記ＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2グリカン構造は、組換えＩｇ組成物のその次に支配的なグリカン構造よりも少なくとも約１０モルパーセントから約２５モルパーセント多いレベルで存在する。より好ましい実施形態では、本発明は、支配的なＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2グリカン構造を有する組換えＩｇ組成物を提供し、前記ＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2グリカン構造は、組換えＩｇ組成物のその次に支配的なグリカン構造よりも少なくとも約２５モルパーセントから約５０モルパーセント多いレベルで存在する。好ましい実施形態では、本発明は、支配的なＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2グリカン構造を有する組換えＩｇ組成物を提供し、前記ＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2グリカン構造は、組換えＩｇ組成物のその次に支配的なグリカン構造よりも約５０モルパーセント以上多いレベルで存在する。もう１つの好ましい実施形態では、本発明は、支配的なＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2グリカン構造を有する組換えＩｇ組成物を提供し、前記ＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2グリカン構造は、組換えＩｇ組成物のその次に支配的なグリカン構造よりも約７５モルパーセント以上多いレベルで存在する。さらにもう１つの実施形態では、本発明は、支配的なＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2グリカン構造を有する組換えＩｇ組成物を提供し、前記ＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2グリカン構造は、組換えＩｇ組成物のその次に支配的なグリカン構造よりも約９０モルパーセント以上多いレベルで存在する。支配的なＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2 Ｎ−グリカン（５５．８％）を有するＪＣ−ＩｇＧのＮ−グリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析を図４Ａに示す。支配的なＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2（６０％）を有するＤＸ−ＩｇＧのＮ−グリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析を図４Ｂに示す。
【００８１】
ＦｃγＲＩＩＩ受容体へのＩｇ−ＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2の高い結合
ＦｃγＲＩＩＩａ及びＦｃγＲＩＩＩｂへのＩｇ結合のエフェクター機能、例えばＡＤＣＣの活性化は、Ｉｇ分子のＦｃ領域によって媒介される。種々の機能がこの領域内の種々のドメインによって媒介される。従って本発明は、Ｉｇ分子上のＦｃ領域が、エフェクター機能を実施することができる支配的ＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2 Ｎ−グリカンを有するＩｇ分子及び組成物を提供する。１つの実施形態では、支配的ＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2 Ｎ−グリカンを有するＦｃ領域は、ＦｃγＲＩＩＩａ（図６）及びＦｃγＲＩＩＩｂ（図５）受容体への結合上昇を与える。もう１つの実施形態では、Ｆｃは支配的ＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2 Ｎ−グリカンを有する。Ｆｃ領域を含む分子、例えばイムノアドヘシン(Chamow and Ashkenazi, 1996, Trends Biotechnol. 14: 52-60; Ashkenazi and Chamow, 1997, Curr . Opin. Immunol. 9: 195-200)、Ｆｃ融合物及び抗体様分子も本発明に包含されることは、当業者には容易に明らかである。
【００８２】
Ｆｃ受容体へのＩｇ分子の結合活性（親和性）はアッセイによって測定し得る。ＩｇＧに関するＦｃγＲＩＩＩ結合アッセイの一例を実施例６で述べる。当業者は、このアッセイが、何らかの免疫グロブリン分子についてのアッセイと組み合わせた使用のために容易に適合させ得ることを認識する。
【００８３】
支配的ＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2 Ｎ−グリカンを有するＪＣ−ＩｇＧ（本発明に従って作製されるＩｇ）は、図５Ａに示すようにリツキシマブ（登録商標）と比較して１０倍高いＦｃγＲＩＩＩｂへの結合活性を有し、図６に示すように１０倍以上高いＦｃγＲＩＩＩａへの結合活性を有する。支配的ＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2 Ｎ−グリカンを有するＤＸ−ＩｇＧ（本発明に従って作製されるもう１つのＩｇ）も、図５Ｂに示すようにリツキシマブ（登録商標）と比較して約１００倍高いＦｃγＲＩＩＩｂへの結合活性を有する。
【００８４】
最も興味深いことに、ＦｃγＲＩＩＩａ遺伝子の二型性は２つのアロタイプ：ＦｃγＲＩＩＩａ−１５８Ｖ及びＦｃγＲＩＩＩａ−１５８Ｆを生じる(Dall'Ozzo et al., 2004, Cancer Res. 64: 4664-4669)。ＦｃγＲＩＩＩａ−１５８Ｖについてホモ接合の遺伝子型は、リツキシマブ（登録商標）へのより高い臨床応答に結びつく(Cartron et al., 2002, Blood, 99: 754-758)。しかし、個体群の大部分は１個のＦｃγＲＩＩＩａ−１５８Ｆ対立遺伝子を担持しており、個体群の大部分にとってＦｃγＲＩＩＩａ結合を通したＡＤＣＣの誘導のためにリツキシマブ（登録商標）をあまり有効ではないものにする。しかし、フコシルトランスフェラーゼ活性を欠く宿主細胞においてリツキシマブ（登録商標）様の抗ＣＤ２０抗体が発現されるとき、この抗体は、ＦｃγＲＩＩＩａ−１５８Ｆ及びＦｃγＲＩＩＩａ−１５８Ｖの両方を通してＡＤＣＣを増強するために等しく有効である(Niwa et al., 2004, Clin. Cane Res. 10: 6248-6255)。本発明のある好ましい実施形態の抗体は、Ｎ−グリカンにフコースを付加しない宿主細胞（例えばフコースを欠く酵母宿主、Ｐ．パストリス；実施例１及び２参照）において発現される。それ故、フコースを欠き、ＦｃγＲＩＩＩａ−１５８Ｆへの高い結合を有する本発明の抗体は、リツキシマブ（登録商標）に対して低い臨床応答を示す多くの患者を治療するために特に有用であり得ると考えられる。
【００８５】
ＦｃγＲＩＩｂ受容体へのＩｇ−ＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2の低い結合
ＦｃγＲＩＩｂへのＩｇ結合のエフェクター機能、例えばＢ細胞による抗体産生の上昇及びＡＤＣＣ活性の上昇は、Ｉｇ分子のＦｃ領域によって媒介される。種々の機能がこの領域内の種々のドメインによって媒介される。従って本発明は、Ｉｇ分子上のＦｃ領域が、エフェクター機能を実施することができる支配的ＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2 Ｎ−グリカンを有するＩｇ分子及び組成物を提供する。１つの実施形態では、支配的ＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2 Ｎ−グリカンを有するＦｃ領域は、ＦｃγＲＩＩｂ受容体への結合低下を与える。Ｆｃ領域を含む分子、例えばイムノアドヘシン(Chamow and Ashkenazi, 1996, Trends Biotechnol. 14: 52-60; Ashkenazi and Chamow, 1997, Curr . Opin. Immunol. 9: 195-200)、Ｆｃ融合物及び抗体様分子も本発明に包含されることは、当業者には容易に明らかである。
【００８６】
Ｆｃ受容体へのＩｇ分子の結合活性（親和性）はアッセイによって測定し得る。ＩｇＧ１に関するＦｃγＲＩＩｂ結合アッセイの一例を実施例６において開示する。当業者は、この開示するアッセイが、何らかの免疫グロブリン分子に関する使用のために容易に適合させ得ることを認識する。
【００８７】
支配的ＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2 Ｎ−グリカンを有するＪＣ−ＩｇＧ（本発明のＩｇ）は、図７Ａに示すようにリツキシマブ（登録商標）と比較して約８倍低いＦｃγＲＩＩｂへの結合活性を有する。支配的ＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2 Ｎ−グリカンを有するＤＸ−ＩｇＧ（本発明のもう１つのＩｇ）は、図７Ｂに示すようにリツキシマブ（登録商標）と比較して約２から５倍低いＦｃγＲＩＩｂへの結合活性を有する。
【００８８】
高い抗体依存性細胞傷害
さらにもう１つの実施形態では、支配的Ｎ−グリカンとしてＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2を有するＩｇ分子又は組成物のＦｃγＲＩＩＩａ又はＦｃγＲＩＩＩｂ結合の上昇は、ＦｃγＲＩＩＩを介したＡＤＣＣの上昇を与え得る。ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）受容体がＡＤＣＣ活性についての責任を担うことは広く確立されている(Daeron et al., 1997, Annu. Rev. Immunol. 15: 203-234)。もう１つの実施形態では、支配的Ｎ−グリカンとしてＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2を有するＩｇ分子又は組成物のＦｃγＲＩＩｂ結合の低下はＡＤＣＣの上昇を与える(Clynes et al., 2000, supra)。もう１つの実施形態では、本発明のＩｇ分子又は組成物は、支配的ＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2グリカンの存在によって与えられる高いＡＤＣＣ活性を示す。
【００８９】
Ｂ細胞減少を測定するインビトロアッセイ及び蛍光放出ＡＤＣＣアッセイの一例を実施例７において開示する。当業者は、これらの開示するアッセイが、何らかのＩｇ分子に関するアッセイと組み合わせた使用のために容易に適合させ得ることを認識する。さらに、動物モデルにおけるインビボＡＤＣＣアッセイは、Borchmann et al., 2003, Blood, 102: 3737-3742, Niwa et al., 2004, Cancer Research, 64: 2127-2133及び実施例７からの特定ＩｇＧのために適合させることができる。
【００９０】
Ｂ細胞による抗体産生上昇
調節ＦｃγＲ経路を通しての腫瘍に対する抗体の関与が示された(Clynes et al., 2000, Nature, 6: 443-446)。特に、ＦｃγＲＩＩｂは、免疫受容体のチロシンベースの活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含む受容体、例えばＢ細胞受容体（ＢＣＲ）、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＩ及びＦｃεＲＩと共架橋するとき、ＩＴＡＭを介したシグナルを阻害することが知られている(Vivier and Daeron, 1997, Immunol. Today, 18: 286-291)。例えばＦｃｇＲＩＩ特異的抗体の付加はＦｃｇＲＩＩＢへのＦｃ結合をブロックし、Ｂ細胞増殖の上昇を生じさせる (Wagle et al., 1999, J of Immunol. 162: 2732-2740)。従って１つの実施形態では、本発明のＩｇ分子は、Ｂ細胞の活性化を生じさせ、次には形質細胞による抗体産生を触媒する、ＦｃγＲＩＩｂ受容体結合の低下を媒介することができる(Parker, D.C. 1993, Annu. Rev. Immunol. 11 : 331-360)。ＩｇＧ１に関するＢ細胞による抗体産生を測定するアッセイの一例を実施例６で述べる。当業者は、このアッセイが、何らかの免疫グロブリン分子に関するアッセイと組み合わせた使用のために容易に適合させ得ることを認識する。
【００９１】
他の免疫学的活性
好中球上のエフェクター細胞分子の変化した表面発現は、細菌感染に対する感受性を高めることが示されている(Ohsaka et al., 1997, Br. J. Haematol. 98: 108-113)。さらに、ＦｃγＲＩＩＩａエフェクター細胞受容体へのＩｇＧ結合が腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）の発現を調節することも明らかにされた (Blom et al., 2004, Arthritis Rheum., 48: 1002-1014)。さらに、ＦｃγＲ誘導のＴＮＦ−αは、ＩｇＧ被覆赤血球に結合してそれを貪食する好中球の能力も上昇させる(Capsoni et al, 1991, J. Clin. Lab Immunol. 34: 115-124)。それ故、ＦｃγＲＩＩＩへの結合上昇を示す本発明のＩｇ分子及び組成物は、ＴＮＦ−αの発現上昇を与え得ると考えられる。
【００９２】
ＦｃγＲＩＩＩ受容体活性の上昇は、リソソームβ−グルクロニダーゼ並びに他のリソソーム酵素の分泌を上昇させることが示された(Kavai et al., 1982, Adv. Exp Med. Biol. 141: 575-582; Ward and Ghetie, 1995, Therapeutic Immunol, 2: 77-94)。さらに、リガンドによる免疫受容体の結合後の重要な工程は、それらのインターナリゼーションとリソソームへの送達である(Bonnerot et al., 1998, EMBO J, 17: 4906-4916)。それ故、ＦｃγＲＩＩＩａ及びＦｃγＲＩＩＩｂへの結合上昇を示す本発明のＩｇ分子及び組成物は、リソソーム酵素の分泌上昇を与え得ると考えられる。
【００９３】
もっぱら好中球上に存在するＦｃγＲＩＩＩｂは、免疫複合体の構築において支配的役割を果たし、その凝集は、食作用、脱顆粒、及びオプソニン化病原体の破壊を導く呼吸バーストを活性化する。好中球の活性化は、その２つの細胞外ドメインに対応する受容体のタンパク質分解切断可溶性形態の分泌を導く。可溶性ＦｃγＲＩＩＩｂは、ＦｃγＲ依存性エフェクター機能の競合的阻害によって及び補体受容体ＣＲ３への結合を通して調節機能を及ぼし、炎症メディエイタの産生を導く(Sautes-Fridman et al., 2003, ASHI Quarterly, 148-151)。
【００９４】
本発明は、それ故、本質的にＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2から成るＮ−グリカンを含む免疫グロブリン分子を提供し、及び、免疫グロブリン及びそれに結合した複数のＮ−グリカンを含み、前記複数のＮ−グリカン中の支配的Ｎ−グリカンが本質的にＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2から成る組成物を提供する。いずれの実施形態においても、免疫グロブリン上の前記ＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2 Ｎ−グリカンの支配性が、好ましくは、ここで示すようにＦｃγＲＩＩＩａ及びＦｃγＲＩＩＩｂへの結合上昇とＦｃγＲＩＩｂへの結合低下に加えて所望の治療エフェクター活性を付与する。
【００９５】
免疫グロブリンサブクラス
ＩｇＧサブクラスはＦｃ受容体に対して異なる結合親和性を有することが示されている(Huizinga et al., 1989, J. of Immunol, 142: 2359-2364)。ＩｇＧサブクラスの各々は、本発明の種々の態様において特定の利点を提供し得る。それ故１つの態様では、本発明は、ＩｇＧ１分子に結合した支配的Ｎ−グリカンとしてＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2を含むＩｇＧ１組成物を提供する。もう１つの態様では、本発明は、ＩｇＧ２分子に結合した支配的Ｎ−グリカンとしてＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2を含むＩｇＧ２組成物を包含する。さらにもう１つの態様では、本発明は、ＩｇＧ３分子に結合した支配的Ｎ−グリカンとしてＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2を含むＩｇＧ３組成物を包含する。もう１つの態様では、本発明は、ＩｇＧ４分子に結合した支配的Ｎ−グリカンとしてＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2を含むＩｇＧ４組成物を包含する。
【００９６】
あるいは、本発明は、免疫グロブリンの５つの主要クラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ及びＩｇＧの全てに適用することができる。本発明の好ましい免疫グロブリンはヒトＩｇＧであり、好ましくはサブタイプＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４の１つからである。より好ましくは、本発明の免疫グロブリンはＩｇＧ１分子である。
【００９７】
抗体エフェクター機能と活性を媒介する組換え免疫グロブリン（Ｉｇ）分子の生産
１つの態様では、本発明は、ＣH２ドメインのＡｓｎ−２９７に、本質的にＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2グリカン構造から成るＮ−グリカンを有する、抗体エフェクター機能と活性を媒介する組換えＩｇ分子、及び同様に、免疫グロブリンに結合した支配的Ｎ−グリカンがＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2である免疫グロブリン組成物を生産するための方法を提供する。１つの実施形態では、Ｉｇの重鎖及び軽鎖は重複オリゴヌクレオチドを用いて合成され、宿主細胞における発現のために発現ベクターに別々にクローニングされる（実施例１）。好ましい実施形態では、組換えＩｇ重鎖及び軽鎖は、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2の付加を支配的に触媒する宿主菌株において発現される。１つの実施形態では、このグリコフォーム構造は、より詳細には、Ｉｇ上のＦｃ領域のアミノ酸Ａｓｎ−２９７の窒素とＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2グリカン上のＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミンのヒドロキシル基の間の結合を形成する［（ＧｌｃＮＡｃβ１，２−Ｍａｎα１，３）（Ｍａｎα１，３ Ｍａｎα１，６ Ｍａｎα１，６）Ｍａｎβ１，４−ＧｌｃＮＡｃβ１，４−ＧｌｃＮＡｃ］と表わされる。さらにもう１つの実施形態では、この支配的グリカンは、Ｉｇ分子内の異なる部位（Ａｓｎ−２９７以外）で、又はＦａｂ領域内のＮ−グリコシル化部位と組み合わせて、アスパラギンに付加され得る。
【００９８】
下等真核生物における、支配的にＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2を有するＩｇの生産
本発明の１つの態様は、支配的にＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2グリコフォームを有する免疫グロブリン又は抗体分子を生産するために使用し得る、前記グリコフォームを天然に低い収率で生産する哺乳動物細胞において発現される糖タンパク質の組成物に比べて有利な、組換え下等真核宿主細胞を提供する。
【００９９】
糖タンパク質の組成物が、容易に再現可能なあらかじめ定められたグリコシル化パターンで提供されることは、本発明のもう１つの利点である。そのような組成物の性質を評価し、所望特性のために最適化して、一方有害作用は最小限に抑え得るか又は完全に回避し得る。
【０１００】
本発明はまた、本質的にＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2から成るＮ−グリカンを含むＩｇ分子及び支配的にＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2グリカン構造を有するＩｇ組成物の生産のための１又はそれ以上の核酸を発現するように工作又は選択された組換え宿主細胞を生産するための方法を提供する。本発明のある好ましい実施形態では、組換え宿主細胞、好ましくは組換え下等真核宿主細胞が、支配的にＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2グリカンを有する前記Ｉｇ分子及び組成物を生産するために使用される。
【０１０１】
他の好ましい実施形態では、本発明は、組換え宿主細胞から又は本発明の方法によって入手し得る糖タンパク質を含む。
【０１０２】
本発明の宿主細胞は、所望Ｉｇ領域をコードするベクターで、及びここで述べるグリコシル化関連酵素の１又はそれ以上をコードするベクターで形質転換し、その後支配的なＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2 Ｎ−グリカンを有する組換えＩｇ分子又は組成物の発現に関して選択し得る。本発明の組換え宿主細胞は、支配的にＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2 Ｎ−グリカン構造を有するＩｇ組成物を生産するように工作又は選択された、真核又は原核宿主細胞、例えば動物、植物、昆虫、細菌細胞等であり得る。
【０１０３】
好ましくは、本発明の組換え宿主細胞は、当技術分野において記述されているように遺伝子操作された下等真核宿主細胞である（国際公開公報第ＷＯ０２／００８７９号、国際公開公報第ＷＯ０３／０５６９１４号、国際公開公報第ＷＯ０４／０７４４９８号、国際公開公報第ＷＯ０４／０７４４９９号、Choi et al., 2003, PNAS, 100: 5022-5027; Hamilton et al., 2003, Nature, 301: 1244-1246 and Bobrowicz et al., 2004, Glycobiology, 14: 757-766)。特に、国際公開公報第ＷＯ０２／００８７９号は、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2 Ｎ−グリカンを有する糖タンパク質を開示し、国際公開公報第ＷＯ０４／０７４４９９号は、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2 Ｎ−グリカンを支配的に有する糖タンパク質（及び免疫グロブリンの特定開示）を開示する。
【０１０４】
１つの実施形態では、ＩｇＧ１をコードするベクター、例えばＪＣ−ＩｇＧ１を含むＡＯＸ１／ｐＰＩＣＺＡベクター（実施例１）を酵母Ｐ．パストリスＹＡＳ３８５−１菌株に導入する。このＹＡＳ３８５−１菌株は、Ｋ３レポータータンパク質を除去したＹＳＨ４４菌株に類似し(Hamilton et al., 2003, Science, 301: 1244-1246)、記述されているように（米国特許出願第１１／０２０８０８号）ＰＮＯ１及びＭＮＮ４ｂ遺伝子が破壊されており、並びに記述されているように（米国特許出願第１１／１０８０８８号)β−１，４ガラクトシルトランスフェラーゼＩ遺伝子が導入されている。Δｐｎｏ１ Δｍｎｎ４ｂの二重破壊はマンノシルリン酸化の排除を生じさせる。ＵＲＡ５遺伝子によって隣接されるＹＳＨ４４に関して記述されているように(Hamilton et al., 2003)導入されたマンノシダーゼＩＩ遺伝子は、菌株を５−フルオロオロト酸（５−ＦＯＡ）上で増殖させることによって除去された(Guthrie and Fink, 1991, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Vol. 169, Academic Press, San Diego)。マンノシダーゼＩＩ遺伝子の除去は、α−１，６マンノース腕及びα−１，３マンノース上のβ−１，２ＧｌｃＮＡｃに結合した末端α−１，３及びα−１，６マンノース、及びβ−１，２ＧｌｃＮＡｃに結合した末端β−１，４ガラクトースを有する、ペンタ−マンノースコア構造を維持する。次に、ＡＭＲ２遺伝子座にＵＲＡ３遺伝子を挿入したＵＲＡ３ノックアウトプラスミドを用いてＡＭＲ２遺伝子を破壊し(Guthrie and Fink, 1991, supra)、それによってβ−マンノシル化を排除した（米国特許出願第１１／１１８００８号）。このＹＡＳ３８５−１菌株は、ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2及びＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2の両方を支配的に有する糖タンパク質を発現し、それ故ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2とＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2を支配的に有するＪＣ−ＩｇＧを生じさせる。ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2とＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2を支配的に有するこのＪＣ−ＩｇＧのβ−ガラクトシダーゼによる処理は（実施例３）、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2 Ｎ−グリカンを支配的に有するＪＣ−ＩｇＧを生じさせる（実施例４Ａ）。
【０１０５】
もう１つの実施形態では、ＤＸ−ＩｇＧを含むＡＯＸ１／ｐＰＩＣＺＡ内にＩｇＧ１をコードするベクター（実施例１）を、同じく酵母Ｐ．パストリスＹＡ３８５−１菌株（前出）に導入し、精製して、その後β−ガラクトシダーゼで処理し（実施例３）、支配的にＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2 Ｎ−グリカンを有するＤＸ−ＩｇＧを生じさせる（図４Ｂ）。
【０１０６】
あるいは、本発明の抗体は、当技術分野で公知のいくつかの方法を用いて発現することができる（Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 79-97 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)）。
【０１０７】
グリコシルトランスフェラーゼの発現及び下等真核生物への安定な遺伝子組込み
選択マーカー、例えばＵＲＡ３、ＵＲＡ５、ＨＩＳ４、ＳＵＣ２、Ｇ４１８、ＢＬＡ又はＳＨ ＢＬＡを用いて下等真核宿主菌株（例えばＰ．パストリス）に異種遺伝子を導入し、異種遺伝子の組込みを確認するための方法が記述されている。そのような方法は、発現系が下等真核細胞において生産されるとき、本発明のＩｇを生産するように適合させ得る。加えて、望ましくないマンノシルトランスフェラーゼ活性を排除するためにＵＲＡ３マーカーの反復使用を可能にする方法が記述されている。Alani et al., 1987, Genetics, 116: 541-545及び米国特許第６，０５１，４１９号は、Ｐ．パストリスにおいてＵＲＡ３遺伝子を破壊することに基づく選択系を述べている。好ましくは、ウラシルに対する栄養要求性及び５−フルオロオロト酸（５ＦＯＡ）に対する耐性に基づき、陽性及び陰性選択の両方を可能にする、ＰｐＵＲＡ３−又はＰｐＵＲＡ５−ブラスター（blaster）カセットが、ＵＲＡ３、ＵＲＡ５又はウラシル生合成経路内の何らかの遺伝子を破壊するために使用される(Boeke, et al., 1984, Mol. Gen. Genet, 197: 345-346)。当業者は、それ故、そのような系が選択及び対抗選択によって多数の異種遺伝子の挿入を可能にすることを認識する。
【０１０８】
さらなる酵素修飾
さらなる酵素欠失は、ヒトにおいて免疫作用の異常を与え得るマンノシルリン酸化又はβ−マンノシル化を含まないＩｇを単離するために有益又は必要であり得る。上述したように、米国特許出願第１１／０２０８０８号はマンノシルリン酸化の排除のための方法を開示し、米国特許出願第１１／１１８００８号はβ−マンノシル化の排除のための方法を開示する。
【０１０９】
他のタンパク質発現系における、支配的にＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2グリカン構造を有するＩｇの生産
異種タンパク質発現のために、支配的グリカン構造を有するＩｇを発現するように工作する必要がある又は工作する必要がないと考えられる発現宿主系（生物）が選択されることは当業者に了解される。ここで提供する実施例は、Ａｓｎ−２９７又はもう１つ別のＮ−グリコシル化部位又はその両方で特定グリカンを有するＩｇの発現を実施するための１つの方法の例である。当業者は、本発明のこれらの詳細及び実施例をいかなるタンパク質発現宿主系（生物）にも容易に適合させることができる。
【０１１０】
動物、植物、昆虫、細菌細胞等を含む他のタンパク質発現宿主系は、本発明に従ったＩｇ分子及び組成物を生産するために使用し得る。そのようなタンパク質発現宿主系は、支配的グリコフォームを発現するように工作又は選択し得るか、あるいは支配的グリカン構造を有する糖タンパク質を天然で生産し得る。支配的グリコフォームを有する糖タンパク質を生産する、工作されたタンパク質発現宿主系の例は、遺伝子ノックアウト／突然変異(Shields et al., 2002, JBC, 277: 26733-26740)；遺伝子操作(Umana et al., 1999, Nature Biotech., 17: 176-180)又は両方の組合せを含む。あるいは、ある種の細胞−例えばニワトリ、ヒト及びウシ−は、支配的グリコフォームを天然に発現する(Raju et al., 2000, Glycobiology, 10: 477-486)。それ故、本発明に従った１つの特定グリカン構造を支配的に有するＩｇ糖タンパク質又は組成物の発現は、当業者により、多くの発現宿主系の少なくとも１つを選択することによって達成され得る。糖タンパク質の生産のために当技術分野において見出されるさらなる発現宿主系は、ＣＨＯ細胞：Ｒａｊｕ国際公開公報第ＷＯ９９２２７６４Ａ１号及びＰｒｅｓｔａ国際公開公報第ＷＯ０３／０３５８３５Ａ１号；ハイブリドーマ細胞：Trebak et al., 1999, J. Immunol. Methods, 230: 59-70；昆虫細胞：Hsu et al., 1997, JBC, 272:9062-970、及び植物細胞：Gerngross et al., 国際公開公報第ＷＯ０４／０７４４９９Ａ２号を含む。
【０１１１】
ＩｇＧの精製
抗体の精製及び単離のための方法は公知であり、当技術分野において開示されている。例えばKohler & Milstein, (1975) Nature 256:495; Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp.51- 63, Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-104 (Academic Press, 1986); and Jakobovits et al.(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2551-255 and Jakobovits et al., (1993) Nature 362:255-258参照。さらなる実施形態では、抗体又は抗体フラグメントを、適切な抗体又は抗体フラグメントを選択するための対象抗原を使用して、McCafferty et al. (1990) Nature, 348:552-554 (1990)に述べられている手法を用いて作製される抗体ファージライブラリーから単離することができる。
【０１１２】
本発明の方法に従って生産される組換えＩｇ分子は、実施例３で概説する方法に従って精製することができる。図２は、ＹＡＳ３８５−１から精製したＪＣ−ＩｇＧのＳＤＳ−ＰＡＧＥクマシー染色ゲルを示す。図３は、ＹＡＳ３８５−１から精製したＤＸ−ＩｇＧのＳＤＳ−ＰＡＧＥクマシー染色ゲルを示す。もう１つの実施形態では、精製Ｉｇ抗体は、支配的Ｎ−グリカンとしてＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2を有する。何らかのＩｇ分子に関するグリカンの分析及び分布は、ＨＰＬＣ、ＮＭＲ、ＬＣＭＳ及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳを含むがこれらに限定されない、当業者に公知のいくつかの質量分析法によって測定することができる。好ましい実施形態では、グリカンの分布は、実施例５において開示するようなＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ分析によって測定される。図４Ａは、ＹＡＳ３８５−１から精製し、β−ガラクトシダーゼで処理したＪＣ−ＩｇＧのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルを示す（実施例３）。このＭＡＬＤＩ−ＴＯＦは、総Ｎ−グリカンの約５５．８モル％がＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2であることを示す。図４Ｂは、ＹＡＳ３８５−１から精製し、β−ガラクトシダーゼで処理したＤＸ−ＩｇＧのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルを示す。このＭＡＬＤＩ−ＴＯＦは、総Ｎ−グリカンの約６０モル％がＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2であることを示す。
【０１１３】
医薬組成物
本発明の抗体は、活性治療物質としての抗体及び様々な他の製薬上許容される成分を含有する医薬組成物の組み込むことができる。Remington's Pharmaceutical Science (15th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, 1980)参照。好ましい形態は、意図する投与様式及び治療適用に依存する。組成物はまた、所望する製剤に依存して、動物又はヒトへの投与のための医薬組成物を製剤するために一般的に使用される賦形剤と定義される、製薬上許容される非毒性担体又は希釈剤を含み得る。希釈剤は、配合剤の生物活性に影響を及ぼさないように選択される。そのような希釈剤の例は、蒸留水、生理的リン酸緩衝食塩水、リンガー液、デキストロース溶液及びハンクス液である。加えて、医薬組成物又は製剤はまた、他の担体、アジュバント、又は非毒性、非治療性、非免疫原性安定剤等も含み得る。
【０１１４】
非経口投与用の医薬組成物は、無菌で、実質的に等張であり、発熱物質不含であって、ＦＤＡ又は同様の機関のＧＭＰに従って製造される。抗体は、滅菌液、例えば水、油、食塩水、グリセロール又はエタノールであり得る、製薬上許容される担体と共に生理的に許容される希釈剤中の物質の溶液又は懸濁液の注射用製剤として投与することができる。加えて、補助剤、例えば湿潤剤又は乳化剤、界面活性剤、ｐＨ緩衝物質等が組成物中に存在し得る。医薬組成物の他の成分は、石油、動物、植物又は合成起源の成分、例えば落花生油、ダイズ油及び鉱物油である。一般に、グリコール、例えばプロピレングリコール又はポリエチレングリコールは、特に注射用溶液のために、好ましい液体担体である。抗体は、有効成分の持続放出を可能にするように製剤できるデポー注射剤又は移植製剤の形態で投与され得る。典型的には、組成物は、液体溶液又は懸濁液のいずれかの、注射剤として製造され、注射の前に液体媒質中に溶解又は懸濁するのに適した固体形態も製造され得る。製剤はまた、上述したように、アジュバント作用を増強するためにリポソーム又は微粒子、例えばポリアクチド、ポリグリコリド、又はコポリマーに乳化又は封入することができる（Langer, Science 249, 1527 (1990) and Hanes, Advanced Drug Delivery Reviews 28, 97-119 (1997)参照）。
【０１１５】
診断製品
本発明の抗体はまた、様々な診断キット及び他の診断製品、例えばアレイに組み込むことができる。抗体はしばしば固相、例えばマイクロタイタープレートのウエルにあらかじめ結合して提供される。キットはまた、しばしば、抗体結合を検出するための試薬及びキットの使用のための指示を与えるラベルを含む。免疫測定法又はサンドイッチアッセイは診断キットのための好ましい形式である（米国特許第４，３７６，１１０号、同第４，４８６，５３０号、同第５，９１４，２４１号及び同第５，９６５，３７５号参照）。抗体アレイは、例えば米国特許第５，９２２，６１５号、同第５，４５８，８５２号、同第６，０１９，９４４号及び同第６，１４３，５７６号に述べられている。
【０１１６】
治療適用
本発明は、糖タンパク質の特定グリコフォームを支配的に含む糖タンパク質組成物を提供する。ヒトを含む哺乳動物に投与したとき、新規糖タンパク質組成物を含む医薬組成物が、好ましい実施形態では、類似一次構造を有する他の糖タンパク質組成物に比べて卓越したインビボ特性を好都合に示すことが本発明の特徴である。それ故、本発明の新規組成物は、現在糖タンパク質薬剤が使用されているいかなる場所でも使用でき、改善された特性並びに生産ロット間で及び生産ロット全体を通して高い均一性を好都合に提供し得る。本発明の製剤は、特定薬物又は薬剤及びその標的領域に依存して、溶液、単位投与形態、例えば経口投与用の錠剤及びカプセル、並びに懸濁液、軟膏等に組み込むことができる。
【０１１７】
特定態様では、本発明は、糖タンパク質が免疫グロブリン分子を含み、組成物が糖タンパク質物質の特定グリコフォームを支配的に含む、糖タンパク質医薬製剤、薬物又は薬剤のための新規組成物を提供する。本発明の特定態様によれば、ここで述べるＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2グリカン構造のＮ結合オリゴ糖を支配的に有する免疫グロブリン糖タンパク質を含む組成物が提供される。好ましい態様では、糖タンパク質は抗体であり、特にモノクローナル抗体であり得る。本発明はさらに、本発明の組成物を生産するための方法及びツールを提供する。
【０１１８】
本発明はさらに、本発明のグリコフォーム製剤を含む医薬組成物を包含する。前記組成物は、好ましくは無菌である。組成物が水溶液である場合、好ましくは、糖タンパク質は可溶性である。組成物が凍結乾燥粉末である場合、好ましくは、粉末は適切な溶媒中に再溶解することができる。
【０１１９】
他の態様では、本発明は、その必要のある哺乳動物に本発明の医薬組成物の治療有効用量を投与することを含む、疾患状態の治療のための方法を含む。疾患又は障害を治療するために使用できる製品又はキットの中でグリコフォーム製剤を提供することが本発明のさらなる目的である。
【０１２０】
ＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2 Ｎ−グリカンを支配的に有する本発明のＩｇ分子は、適応症、例えば癌、炎症性疾患、感染、免疫疾患、特発性血小板減少性紫斑病、関節炎、全身性エリテマトーデス及び自己免疫性溶血性貧血を含む自己免疫疾患のための、多くの治療適用を有する。
【０１２１】
以下は、Ｉｇ糖タンパク質組成物の生産に関する本発明の組成物及び方法を説明する実施例である。これらの実施例は限定と解釈されるべきではない−実施例は説明のためにのみ含まれるものである。当業者は、最適化を含む、本開示の数多くの修正及び拡大が可能であることを認識する。そのような修正及び拡大は本発明の一部とみなされる。
【実施例１】
【０１２２】
Ｐ．パストリスにおける発現のためのＤＸ−ＩｇＧ１のクローニング
ＤＸ−ＩｇＧ１（抗ＣＤ２０ ＩｇＧ１）の軽（Ｌ）鎖及び重（Ｈ）鎖は、マウス可変領域とヒト定常領域から成る。軽鎖を配列番号１として、及び重鎖を配列番号２として開示する。重鎖及び軽鎖配列は、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）より購入した重複オリゴヌクレオチドを用いて合成した。軽鎖可変領域については、１５個の重複オリゴヌクレオチド（配列番号５−１９）を購入し、５’ ＭｌｙＩ部位を有する軽鎖可変領域フラグメントを作製するためにＰＣＲ反応においてＥｘｔａｑ（Ｔａｋａｄａ）を用いてアニーリングした。次にこの軽鎖可変フラグメントを、５’ＭｌｙＩプライマーＣＤ２０Ｌ／ｕｐ（配列番号２０）、３’可変／５’定常プライマーＬｆｕｓｉｏｎＲＴＶＡＡＰＳ／ｕｐ（配列番号２１）、３’定常領域プライマーＬｆｕｓｉｏｎＲＴＶＡＡＰＳ／ｌｐ（配列番号２２）及び３’ＣＤ２０Ｌ／ｌｐ（配列番号２３）を用いたオーバーラップＰＣＲによって軽鎖定常領域（配列番号３）（Ｇｅｎｅ Ａｒｔ，Ｔｏｒｏｎｔｏ，Ｃａｎａｄａ）と連結した。最終的なＭｌｙＩ−軽鎖フラグメント（５’ＡＧ塩基対を含んだ）をｐＣＲ２．１トポベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に挿入してｐＤＸ３４３を生成した。重鎖については、マウス重鎖可変領域に対応する１７個の重複オリゴヌクレオチド（配列番号２４−４０）をＩＤＴより購入し、Ｅｘｔａｑを用いてアニーリングした。次にこの重鎖可変フラグメントを、５’ＭｌｙＩプライマーＣＤ２０Ｈ／ｕｐ（配列番号４１）、５’可変／定常プライマーＨｃｈａｉｎＡＳＴＫＧＰＳ／ｕｐ（配列番号４２）、３’可変／定常領域プライマーＨｃｈａｉｎＡＳＴＫＧＰＳ／ｌｐ（配列番号４３）及び３’定常領域プライマーＨＦｃｋｐｎ１／ｌｐ（配列番号４４）を用いたオーバーラップＰＣＲによって重鎖定常領域（配列番号４）（Ｇｅｎｅ Ａｒｔ）と連結した。最終的なＭｌｙＩ−重鎖フラグメント（５’ＡＧ塩基対を含んだ）をｐＣＲ２．１トポベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に挿入してｐＤＸ３６０を生成した。完全長軽鎖及び完全長重鎖をそれぞれのトポベクターからＭｌｙ１及びＮｏｔ１フラグメントとして単離した。次にこれらの軽鎖及び重鎖フラグメントを、４個の重複オリゴヌクレオチド−Ｐ．ＢｉＰｓｓ／ＵＰ１−ＥｃｏＲＩ、Ｐ．ＢｉＰｓｓ／ＬＰ１、Ｐ．ＢｉＰｓｓ／ＵＰ２及びＰ．ＢｉＰ／ＬＰ２（それぞれ配列番号４６−４９）を用いてＫａｒ２（Ｂｉｐ）シグナル配列（配列番号４５）に連結し、その後ｐＰＩＣＺＡのＥｃｏＲＩ−Ｎｏｔ１部位に連結して、Ｋａｒ２−軽鎖を担持するｐＤＸ３４４とＫａｒ２−重鎖を担持するｐＤＸ４６８を生成した。ｐＤＸ３４４からのＢｇｌＩＩ−ＢａｍＨＩフラグメントを、次に、染色体組込みのためにＡＯＸ２プロモーター遺伝子を含むｐＢＫ８５にサブクローニングして、ｐＤＸ４５８を生成した。次に、重鎖を担持するｐＤＸ４６８からのＢｇｌＩＩ−ＢａｍＨＩフラグメントをｐＤＸ４５８にサブクローニングして、ＡＯＸ１プロモーター下にＣＤ２０の重鎖と軽鎖の両方を含むｐＤＸ４７８を生成した。次にこのプラスミドをＳｐｅＩで線状化した後、ＡＯＸ２遺伝子座への組込みのために形質転換し、ゼオシン耐性を用いて形質転換体を選択した（実施例２参照）。
【０１２３】
Ｐ．パストリスにおける発現のためのＪＣ−ＩｇＧのクローニング
ＪＣ−ＩｇＧ１の軽（Ｌ）鎖及び重（Ｈ）鎖は、マウス可変領域とヒト定常領域から成る。マウス可変軽鎖を配列番号５０（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＦ０１３５７６）として、及びマウス可変重鎖を配列番号５１（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＦ０１３５７７）として開示する。重鎖及び軽鎖配列は、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）より購入した重複オリゴヌクレオチドを用いて合成した。軽鎖については、１２個の重複オリゴヌクレオチド（配列番号５２−６３）を購入し、５’ ＥｃｏＲＩ部位及び３’Ｋｐｎ１部位を有する６６０塩基対の軽鎖を生成するためにＰＣＲ反応においてＥｘｔａｑ（Ｔａｋａｄａ）を用いてアニーリングした。次にこの軽鎖を、ＥｃｏＲＩ−Ｋｐｎ１フラグメントとしてｐＰＩＣＺａベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にサブクローニングした。重鎖については、Ｆａｂフラグメントに対応する１２個の重複オリゴヌクレオチド（配列番号６４−７５）を購入し、６６０塩基対のＦａｂフラグメントを生成するためにＥｘｔａｑを用いてアニーリングした。Ｆｃフラグメントは、１２個の重複オリゴヌクレオチド（配列番号７６−８７）を用いて、同様のオーバーラップＰＣＲ反応でそれらをアニーリングして合成した。次に重鎖のＦａｂとＦｃフラグメントの両方を、重鎖Ｆａｂフラグメントの５’末端に対応する５’ＥｃｏＲＩプライマー（配列番号６４）及びＦｃフラグメントの３’末端に対応する３’Ｋｐｎ１プライマー（配列番号８８）を使用して、ｐＦＵ Ｔｕｒｂｏポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いてアニーリングし、１，３３０塩基対の重鎖を生成した。プライマー内にコードされる５’ＥｃｏＲＩ及び３’Ｋｐｎ１部位を用いて、重鎖をｐＰＩＣＺａベクターにクローニングした。組込み遺伝子座として機能するＡＯＸ２プロモーター配列を最終的なｐＰＩＣＺａベクターにサブクローニングした。次に、ＡＯＸ１プロモーターを含むＢｇｌＩＩ−ＢｓｔＢ１フラグメント、及びヒト肝ｃＤＮＡライブラリー（配列番号８９）からのＨＳＡ配列、トロンビン部位（配列番号９０）及びＪＣ軽鎖を含むＢｓｔＢ１−ＢａｍＨＩフラグメントの両方を、このＡＯＸ２／ｐＰＩＣＺａベクターのＢａｍＨＩ部位にサブクローニングした。次にＡＯＸ１プロモーターを含むもう１つ別のＢｌｇＩＩ−ＢｓｔＢＩフラグメント、及びＨＳＡ配列、トロンビン部位及びＪＣ重鎖を含むＢｓｔＩＢ１−ＢａｍＨＩフラグメントをこの同じｐＰＩＣＺａベクターのＢａｍＨＩ部位にサブクローニングした。この最終的なベクターは、ＡＯＸ２組込み遺伝子座、ＨＳＡ標識ＪＣ軽鎖及びＨＳＡ標識ＪＣ重鎖を含み、ｐＪＣ１４０を生成した。この発現カセットをＰ．パストリス菌株のＡＯＸ２遺伝子座に組み込み、形質転換体をゼオシン耐性に関して選択した（実施例２参照）。
【０１２４】
リツキシマブ（登録商標）／リツキサン（登録商標）は、Ｂｉｏｇｅｎ−ＩＤＥＣ／Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡより購入した抗ＣＤ２０マウス／ヒトキメラＩｇＧｌである。
【０１２５】
ＰＣＲ増幅。エッペンドルフマスターサイクラーを全てのＰＣＲ反応のために使用した。ＰＣＲ反応は、鋳型ＤＮＡ、１２５μＭ ｄＮＴＰ、各々０．２μＭの正及び逆プライマー、Ｅｘ Ｔａｑポリメラーゼ緩衝液（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ Ｉｎｃ．）及びＥｘ Ｔａｑポリメラーゼ、又はｐＦＵ Ｔｕｒｂｏポリメラーゼ緩衝液（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）及びｐＦＵ Ｔｕｒｂｏポリメラーゼを含んだ。ＤＮＡフラグメントを、９７℃、１５秒間、５５℃、１５秒間及び７２℃、９０秒間の３０サイクル及び９７℃、２分間の初期変性工程と７２℃、７分間の最終伸長工程によって増幅した。
【０１２６】
ＰＣＲ試料をアガロースゲル電気泳動によって分離し、ＤＮＡバンドを抽出して、Ｑｉａｇｅｎからのゲル抽出キットを用いて精製した。全てのＤＮＡ精製物は、脱イオン水中で溶出した最終ＰＣＲ（３つのフラグメント全部の重複）を除き、１０ｍＭ トリス、ｐＨ８．０中で溶出した。
【実施例２】
【０１２７】
Ｐ．パストリスＹＡＳ３８５−１菌株へのＩｇＧベクターの形質転換。ベクターＤＮＡを、酢酸ナトリウムを０．３Ｍの最終濃度まで添加することによって作製する。次に１００％氷冷エタノールを７０％の最終濃度までＤＮＡ試料に添加する。ＤＮＡを遠心分離（１２０００ｇ×１０分間）によってペレット化し、７０％氷冷エタノールで２回洗浄する。ＤＮＡを乾燥し、１０ｍＭ トリス、ｐＨ８．０ ５０μｌに再懸濁する。形質転換するＹＡＳ３８５−１酵母培養（Choi et al., 2003; Hamilton et al., 2003）は、より少量の培養をＢＭＧＹ培地（緩衝最小グリセロール：１００ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ６．０；１．３４％酵母窒素ベース；４×１０-5％ビオチン；１％グリセロール）中で〜２−６のＯ．Ｄ．に増殖させることによって調製する。次に酵母細胞を、１Ｍソルビトール中で３回洗い、１Ｍ ソルビトール〜１−２ｍｌに再懸濁することによってエレクトロコンピテントにする。ＤＮＡ（１−２μｇ）をコンピテント酵母１００μｌと混合し、氷上で１０分間インキュベートする。次に、以下のパラメータ：１．５ｋＶ、１２９Ω及び２５μＦ、を用いてＢＴＸ Ｅｌｅｃｔｒｏｃｅｌｌ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｏｒ ６００で酵母細胞を電気穿孔する。ＹＰＤＳ（１％酵母抽出物、２％ペプトン、２％デキストロース、１Ｍ ソルビトール）１ｍｌを電気穿孔細胞に添加した。その後、ゼオシンを含む選択寒天平板に形質転換酵母をプレートした。
【０１２８】
Ｐ．パストリスにおけるＩｇＧｌのための培養条件。ｐＤＸ４７８又はｐＪＣ１４０で形質転換したＹＡＳ３８５−１の単一コロニーを、５０ｍｌファルコン遠心チューブ中のＢＭＧＹ培地（１％酵母抽出物、２％ペプトン、１００ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）、１．３４％酵母窒素ベース、４×１０-5％ビオチン及び１％グリセロールから成る）１０ｍｌに接種した。培養を、２４℃／１７０−１９０ｒｐｍで振とうしながら４８時間、培養が飽和するまでインキュベートした。次にＢＭＧＹ１００ｍｌを５００ｍｌバッフル付きフラスコに加えた。その後種培養を、ＢＭＧＹ培地１００ｍｌを含むバッフル付きフラスコに移した。この培養を、２４℃／１７０−１９０ｒｐｍで振とうしながら２４時間インキュベートした。フラスコの内容物を２つの５０ｍｌファルコン遠心チューブ中に傾瀉し、３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。細胞ペレットを、グリセロールを含まないＢＭＧＹ２０ｍｌで１回洗い、続いてＢＭＭＹ（１％グリセロールの代わりに１％ＭｅＯＨを含むＢＭＧＹ）２０ｍｌで静かに再懸濁した。懸濁細胞を２５０ｍｌバッフル付きフラスコに移した。培養を、２４℃／１７０−１９０ｒｐｍで振とうしながら２４時間インキュベートした。次にフラスコの内容物を２つの５０ｍｌファルコン遠心チューブ中に傾瀉し、３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。タンパク質単離の前におおよその抗体力価を測定するために培養上清をＥＬＩＳＡによって分析した（実施例３参照）。
培養上清中の抗体の定量を固相酵素免疫検定法（ＥＬＩＳＡ）によって実施した：高結合マイクロタイタープレート（Ｃｏｓｔａｒ）を、ＰＢＳ、ｐＨ７．４ １０ｍｌ中のヤギ抗ヒトＦａｂ（Ｂｉｏｃａｒｔａ，Ｉｎｃ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）２４μｇで被覆し、４℃で一晩インキュベートした。緩衝液を除去し、ブロッキング緩衝液（ＰＢＳ中３％ＢＳＡ）を添加して、その後室温で１時間インキュベートした。ブロッキング緩衝液を除去し、プレートをＰＢＳで３回洗った。最後の洗浄後、漸増容量の抗体培養上清（０．４、０．８、１．５、３．２、６．２５、１２．５、２５及び５０μｌ）を添加し、室温で１時間インキュベートした。次にプレートをＰＢＳ＋０．０５％トゥイーン２０で洗った。最後の洗浄後、抗ヒトＦｃ−ＨＲＰを１：２０００ＰＢＳ溶液中に添加し、その後室温で１時間インキュベートした。次にプレートをＰＢＳ＋トゥイーン２０で４回洗った。ＴＭＢ基質キットを製造者の指示に従って使用して（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）プレートを分析した。
【実施例３】
【０１２９】
ＩｇＧｌの精製
ＳｔｒｅａｍｌｉｎｅプロテインＡカラムを使用して培養上清からモノクローナル抗体を捕獲した。抗体をトリス−グリシンｐＨ３．５中で溶出し、１Ｍ トリスｐＨ８．０を用いて中和した。疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を用いてさらなる精製を実施した。ＨＩＣカラムの詳細な型は抗体に依存する。ＪＣ−ＩｇＧ及びＤＸ−ＩｇＧに関して、フェニルセファロースカラム（オクチルセファロースも使用できる）を２０ｍＭ トリス（７．０）、１Ｍ（ＮＨ4）2ＳＯ4緩衝液と共に使用して、１Ｍ−０Ｍ（ＮＨ4）2ＳＯ4の線形勾配緩衝液で溶出した。フェニルセファロースカラムからの抗体分画をプールし、陽イオン交換（ＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）カラムを通しての最終精製のために５０ｍＭ ＮａＯＡｃ／トリスｐＨ５．２緩衝液に交換した。５０ｍＭ トリス、１Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ７．０）を用いた線形勾配で抗体を溶出した。
【０１３０】
β−ガラクトシダーゼによるＩｇ−ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2の処理
精製ＩｇＧ（ＪＣ−ＩｇＧ又はＤＸ−ＩｇＧ）５ｍｇを５０ｍＭ ＮＨ4Ａｃ ｐＨ５．０に緩衝液交換した。シリコーン処理チューブにおいて、β−１，４ガラクトシダーゼ０．０３Ｕ（ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を、５０ｍＭ ＮＨ4Ａｃ ｐＨ５．０中の精製ＩｇＧに添加し、３７℃で１６−２４時間インキュベートした。この試料を蒸発乾固させ、水に再懸濁して、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによって分析した。次に、上述したようなフェニルセファロース精製を用いてβ−１，４ガラクトシダーゼから抗体を精製した。
【実施例４】
【０１３１】
精製Ｉｇの検出
精製ＪＣ−ＩｇＧ又はＤＸ−ＩｇＧを適切な容量の試料負荷緩衝液と混合し、プレキャストゲルを製造者の指示に従って使用して（ＮｕＰＡＧＥビス−トリス電気泳動システム；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．）ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に供した。ゲルタンパク質をクマシーブリリアントブルー染料（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）で染色した。図２及び３参照。
【０１３２】
抗体濃度
タンパク質クロマトグラフィー分画の濃度を、アルブミンを標準品として用いる（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）ブラッドーフォードアッセイ(Bradford, M. 1976, Anal. Biochem. (1976) 72, 248-254)によって測定した。
【実施例５】
【０１３３】
ＩｇＧｌ炭水化物分析
マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ）。アスパラギン結合オリゴ糖のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析：Ｎ結合グリカンを、Papac et al., Glycobiology 8, 445-454 (1998)の修正手順を用いてＪＣ−ＩｇＧ及びＤＸ−ＩｇＧから放出した。抗体の試料を還元し、カルボキシメチル化して、膜をブロックし、ウエルを水で３回洗った。Ｎ−グリカナーゼ（ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）１ｍＵを含む１０ｍＭ ＮＨ4ＨＣＯ3（ｐＨ８．３）３０μｌを加えてＩｇＧタンパク質を脱グリコシル化した。３７℃で１６時間後、グリカンを含む溶液を遠心分離によって除去し、蒸発乾固させた。各々のウエルからの乾燥グリカンを水１５μｌに溶解し、０．５μｌをステンレス鋼試料プレート上にスポットして、Ｓ−ＤＨＢマトリックス（１：１の水／アセトニトリル／０．１％トリフルオロ酢酸中の９ｍｇ／ｍｌジヒドロキシ安息香酸／１ｍｇ／ｍｌ ５−メトキシ−サリチル酸）０．５μｌと混合し、放置乾燥させた。４−ｎｓパルス時間でのパルス窒素レーザー（３３７ｎｍ）の照射によってイオンを生成した。装置は、１２５−ｎｓ遅延及び２０ｋＶの加速電圧で、遅延引き出しモードで操作した。グリッド電圧は９３．００％、ガイドワイヤ電圧は０．１％、内圧は＜５×１０-7トール（１トール＝１３３Ｐａ）、及び低質量ゲートは８７５Ｄａであった。合計１００−２００レーザーパルスからスペクトルを作成し、５００ＭＨｚデジタイザで獲得した。（Ｍａｎ）5（ＧｌｃＮＡｃ）2オリゴ糖を外部分子量標準として使用した。全てのスペクトルを陽イオンモードの装置で作成した。
【実施例６】
【０１３４】
抗原結合ＥＬＩＳＡアッセイ
高結合マイクロタイタープレート（Ｃｏｓｔａｒ）を、ＰＢＳ、ｐＨ７．４中の抗原１０μｇで被覆し、４℃で一晩インキュベートした。緩衝液を除去し、ブロッキング緩衝液（ＰＢＳ中３％ＢＳＡ）を添加して、その後室温で１時間インキュベートした。ブロッキング緩衝液を除去し、プレートをＰＢＳで３回洗った。最後の洗浄後、０．２ｎｇ−１００ｎｇの漸増量の精製抗体を添加し、室温で１時間インキュベートした。次にプレートをＰＢＳ＋０．０５％トゥイーン２０で洗った。最後の洗浄後、抗ヒトＦｃ−ＨＲＰを１：２０００ＰＢＳ溶液に添加し、その後室温で１時間インキュベートした。次にプレートをＰＢＳ＋トゥイーン２０で４回洗った。ＴＭＢ基質キットを製造者の指示に従って使用して（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）プレートを分析した。
【０１３５】
Ｆｃ受容体結合アッセイ
ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａ及びＦｃγＲＩＩＩｂについてのＦｃ受容体結合アッセイを、先に記述されているプロトコールに従って実施した(Shields et al., 2001, J.Biol.Chem, 276: 6591-6604)。ＦｃγＲＩＩＩ結合については：ＰＢＳ、ｐＨ７．４中１μｇ／ｍｌのＦｃγＲＩＩＩｂ（図５）及びＦｃγＲＩＩｂ（図７）融合タンパク質又は０．８μｇ／ｍｌのＦｃγＲＩＩＩａ−ＬＦ（図６）融合タンパク質を４℃で４８時間、ＥＬＩＳＡプレート（Ｎａｌｇｅ−Ｎｕｎｃ，Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ，ＩＬ）に被覆した。プレートを２５℃で１時間、ＰＢＳ中３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）でブロックした。ＪＣ−ＩｇＧ又はＤＸ−ＩｇＧ二量複合体を、２：１モル量のＪＣ−ＩｇＧ又はＤＸ−ＩｇＧとＨＲＰ複合Ｆ（Ａｂ’）2抗Ｆ（Ａｂ’）2を２５℃で１時間混合することにより、ＰＢＳ中１％ＢＳＡにおいて作製した。次に二量複合体を１％ＢＳＡ／ＰＢＳ中１：２で連続希釈し、２５℃で１時間プレートに被覆した。使用した基質は３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）である。４５０ｎｍでの吸光度を製造者の指示に従って（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）読み取った。
【０１３６】
Ｂ細胞における抗体フィードバックについてのＥＬＩＳＰＯＴアッセイ
このアッセイは、Westman, et al., 1997, Scand. J. Immunol. 46: 10-15に述べられているように実施する。ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を最初にＩｇＧ抗体に複合し、ＢＳＡ−ＩｇＧ複合体を生成する。ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを用いてＢＳＡ特異的ＩｇＧを分泌するＢ細胞の数を測定する。注入マウスから脾臓を切除し、０．５％正常マウス血清を含むＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）中で細胞懸濁液を調製する。細胞懸濁液１００μｌをＢＳＡ被覆マイクロタイタープレートに適用し（上記ＥＬＩＳＡプロトコール参照）、３７℃、５％ＣＯ2で３．５時間インキュベートする。プレートを洗い、ＰＢＳ−トゥイーン中１／１００希釈のアルカリホスファターゼ複合ヒツジ抗マウスＩｇＧ５０μｌと共に約４℃でインキュベートする。５ブロモ−４−クロロ−３−インドイルホスフェート（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）５０μｌ中、室温で１時間スポットを展開し、立体顕微鏡下で計数する。
【実施例７】
【０１３７】
ＡＤＣＣについては、Vugmeyster and Howell, 2004, Int. Immunopharm. 4: 1117-1124に述べられているように血液マトリックス試験（例えばＢ細胞除去）を用いて検定する。血漿及び赤血球（ＲＢＣ）を除去した全血を、染色緩衝液（１％ＢＳＡ及び０．１％アジ化ナトリウムを含むハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ））に再溶解して、染色緩衝液中の白血球懸濁液を調製する。次に全血試料を１０００ｇで５分間遠心し、上清（血漿）を廃棄して、ペレットを塩化アンモニウム溶解（ＡＣＬ）試薬で処理し、洗浄して、等容量の染色緩衝液に再懸濁する。Ｂ細胞除去アッセイについては：抗体の１００μｇ／ｍｌ溶液又は染色緩衝液１０μｌをＳＢマトリックス９０μｌに添加し、３７℃で１時間インキュベートする。試料を直ちに抗ＣＤ１９−ＦＩＴＣ及び抗ＣＤ４５−ＰＥによって２５℃で３０分間染色する。次に試料を１％ホルムアルデヒド中に固定し、３回測定する。フローサイトメトリーによってＢ細胞除去の定量を得る。Ｂ細胞除去のフローサイトメトリー分析：自動ＦＡＣＳローダー及びＣｅｌｌ Ｑｕｅｓｔソフトウエアを備えるＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を、全ての試料の獲得と分析のために使用する。サイトメータのＱＣと設定は、装置の機能性と検出器の線形性を確認するためにＣａｌｉＢｒｉｔｅビーズ及びＳｐｈｅｒｏ Ｔｅｃｈレインボービーズ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を検定することを含む。装置の設定を確認するために各々のアッセイに関してアイソタイプと補正対照を検定する。総リンパ球のＢ細胞パーセントを以下のゲーティング戦略によって得る。リンパ球個体群を前方散乱／側方散乱散布図上に示して領域１（Ｒ１）を定義する。Ｒ１における事象を用いて、ＣＤ１９及びＣＤ４５マーカーに関して蛍光強度ドットプロットを示す。蛍光標識したアイソタイプ対照を使用して、ＣＤ１９及びＣＤ４５陽性度に関するそれぞれのカットオフ点を決定する。ＣｅｌｌＱｕｅｓｔを用いて、ＣＤ１９陽性、ＣＤ４５陽性表現型を有するＲ１領域内の細胞の分画としてＢ％を決定する。各々の処置群について３つの試料を検定する。Ｂ細胞除去パーセントを、式平均［１００＊（１−対照抗体で処理したＢ％／平均［ＳＢで処理したＢ％］）を用いて算定する。蛍光染料放出ＡＤＣＣアッセイ：ＰＢＭＣ単離：健常個人又は供血者（１０−２０からの末梢静脈血をヘパリン加真空採血管（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｒｕｔｈｅｒｆｏｒｄ，ＮＪ，ＵＳＡ）に収集する。２匹のマウスに移植するのに血液約５ｍｌが必要である。ＯｐｔｉＰｒｅｐを製造者の指示に従って使用して、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を遠心分離によって分離する。ＰＢＭＣを、２０％ウシ胎仔血清を添加した、ＲＰＭＩ １６４０、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１００ＩＵ／ｍｌ ペニシリン、１００ｇ／ｍｌ ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）から成る完全培地（ＣＭ）で１回洗浄し、その後１×１０6／ｍｌ ＣＭの濃度で再懸濁して、単球除去のために２５０ｍｌ培養フラスコ（Ｆａｌｃｏｎ，ＮＪ，ＵＳＡ）に移す。３７℃、５％ＣＯ2で１時間のインキュベーション後、非接着細胞を回収し、培地で１回洗って、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を２．５×１０7／ｍｌ ＣＭの濃度に調整する。蛍光染料放出ＡＤＣＣ。ＡＤＣＣアッセイの前提は、ＣＤ２０又はＣＤ４０抗原を提示する標的細胞（それぞれＲａｊｉ細胞系又はＢＣＬ１−３Ｂ３細胞）への抗体結合がエフェクター細胞上のＦｃγ受容体への標的細胞結合を刺激することである。これは、次に、ＣＤ２０又はＣＤ４０抗原を提示する標的細胞の溶解を促進し、定量することができる内部蛍光染料を放出する。標的細胞の51Ｃｒ標識の代わりにアラマーブルー蛍光を使用する。ＣＤ２０提示Ｒａｊｉ細胞懸濁液（１×１０4細胞）５０μｌを、９６穴組織培養プレートにおいて５０μｌ量の抗ＤＸ−ＩｇＧ又は抗ＪＣ−ＩｇＧ ｍＡｂ（様々な濃度）及び上述したように単離した５０μｌ量のＰＢＭＣエフェクター細胞と混合し（エフェクター対標的細胞の比は１００：１、５０：１、２５：１及び１２．５：１であり得る）、Ｒａｊｉ又はＢＣＬ１−３Ｂ３細胞の溶解を促進するために３７℃、５％ＣＯ2で４時間インキュベートする。アラマーブルー５０μｌを添加し、染料の取り込みとその蛍光状態への代謝を可能にするためにさらに５時間インキュベーションを継続する。プレートを振とう機上で室温に冷却し、５３０ｎｍの励起と５９０ｎｍの放出で蛍光光度計において蛍光を読み取る。相対蛍光単位（ＲＦＵ）をｍＡｂ濃度に対してプロットし、対照抗体、例えばリツキシマブ（登録商標）を用いて標準曲線から試料濃度を算定する。重症複合型免疫欠損（ＳＣＩＤ）マウスを用いたインビボＡＤＣＣ(Niwa et al., 2004, Cancer Research, 64: 2127-2133)。インビボＡＤＣＣ活性は、ヘテロ接合（ＦｃγＲＩＩＩａ−ＬＦ／ＦｃγＲＩＩＩａ−ＬＶ）及びホモ接合（ＦｃγＲＩＩＩａ−ＬＶ／ＦｃγＲＩＩＩａ−ＬＶ及びＦｃγＲＩＩＩａ−ＬＦ／ＦｃγＲＩＩＩａ−ＬＦ）遺伝子型を含む健常ドナーからのヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を移植したマウスモデルを用いて検定することができる。このモデル系を使用して、支配的Ｎ−グリカンを有するＩｇを、リツキシマブ（登録商標）又は他の何らかの対照抗体と比較してＡＤＣＣ活性の増強に関して検定する。このインビボＡＤＣＣアッセイについての詳細で十分なプロトコールは、Niwa et al., 2004, supraに認められる。
（配列の簡単な説明）
配列番号１は、ＤＸ−ＩｇＧ１軽鎖のマウス可変及びヒト定常領域のヌクレオチド配列をコードする。
配列番号２は、ＤＸ−ＩｇＧ１重鎖のマウス可変及びヒト定常領域のヌクレオチド配列をコードする。
配列番号３は、ＩｇＧ１軽鎖のヒト定常領域のヌクレオチド配列をコードする。
配列番号４は、ＩｇＧ１重鎖のヒト定常領域のヌクレオチド配列をコードする。
配列番号５から１９は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によってＤＸ−ＩｇＧ１のマウス軽鎖可変領域を合成するために使用される１５個の重複オリゴヌクレオチドをコードする。
配列番号２０から２３は、ＤＸ−ＩｇＧ１マウス軽鎖可変領域をヒト軽鎖定常領域に連結するために使用される４個のオリゴヌクレオチドプライマーをコードする。
配列番号２４から４０は、ＰＣＲによってＤＸ−ＩｇＧ１のマウス重鎖可変領域を合成するために使用される１７個の重複オリゴヌクレオチドをコードする。
配列番号４１から４４は、ＤＸ−ＩｇＧ１マウス重鎖可変領域をヒト重鎖定常領域に連結するために使用される４個のオリゴヌクレオチドプライマーをコードする。
配列番号４５は、Ｎ末端ＥｃｏＲＩ部位と共にＫａｒ２（Ｂｉｐ）シグナル配列をコードするヌクレオチド配列をコードする。
配列番号４６から４９は、Ｋａｒ２シグナル配列をＤＸ−ＩｇＧ１の軽鎖及び重鎖に連結するために使用される４個のオリゴヌクレオチドプライマーをコードする。
配列番号５０は、ＪＣ−ＩｇＧ１軽鎖のマウスＩｇＧ１可変領域に対応するヌクレオチド配列をコードする（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＦ０１３５７６）。
配列番号５１は、ＪＣ−ＩｇＧ１重鎖のマウスＩｇＧ１可変領域に対応するヌクレオチド配列をコードする（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＦ０１３５７７）。
配列番号５２から６３は、ＪＣ−ＩｇＧ１のマウス軽鎖可変領域をＰＣＲ合成するために使用される１２個の重複オリゴヌクレオチド配列をコードする。
配列番号６４から７５は、ＪＣ−ＩｇＧ１のマウス重鎖ＦａｂフラグメントをＰＣＲ合成するために使用される１２個の重複オリゴヌクレオチドをコードする。
配列番号７６から８７は、ＪＣ−ＩｇＧ１のマウス重鎖ＦｃフラグメントをＰＣＲによって合成するために使用される１２個の重複オリゴヌクレオチドをコードする。
配列番号８８は、Ｆｃフラグメントの３’末端に対応する３’Ｋｐｎ１プライマーをコードする。
配列番号８９は、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）についてのヌクレオチド配列をコードする。
配列番号９０は、本発明において使用するトロンビン切断のためのヌクレオチド配列をコードする。
【図面の簡単な説明】
【０１３８】
【図１】ＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2グリカン構造を有するＩｇＧの図式的表示。
【図２】プロテインＡカラム（レーン１）及びフェニルセファロースカラム（レーン２）での、ＹＡＳ３８５−１において発現され（実施例２で述べるように）、培地から精製された（実施例３で述べるように）ＪＣ−ＩｇＧのクマシーブルー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル。（２．５μｇタンパク質／レーン）。
【図３】プロテインＡカラム（レーン１）及びフェニルセファロースカラム（レーン２）での、ＹＡＳ３８５−１において発現され（実施例２で述べるように）、培地から精製された（実施例３で述べるように）ＤＸ−ＩｇＧのクマシーブルー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル。（２．５μｇタンパク質／レーン）。
【図４】図４Ａは、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2 Ｎ−グリカンを支配的に示す、β−ガラクトシダーゼで処理した、ＹＡＳ３８５−１で発現されるＪＣ−ＩｇＧのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトル。図４Ｂは、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2 Ｎ−グリカンを支配的に示す、β−ガラクトシダーゼで処理した、ＹＡＳ３８５−１で発現されるＤＸ−ＩｇＧのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトル。
【図５】図５Ａは、ＪＣ−ＩｇＧ及びリツキシマブ（登録商標）に関するＦｃγＲＩＩＩｂのＥＬＩＳＡ結合アッセイ。図５Ｂは、ＤＸ−ＩｇＧ及びリツキシマブ（登録商標）に関するＦｃγＲＩＩＩｂのＥＬＩＳＡ結合アッセイ。（ＧＭ５＝ＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2 Ｎ−グリカン）。
【図６】ＪＣ−ＩｇＧ及びリツキシマブ（登録商標）に関するＦｃγＲＩＩＩａ−１５８ＦのＥＬＩＳＡ結合アッセイ。（ＧＭ５＝ＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2 Ｎ−グリカン）。
【図７】図７Ａは、ＪＣ−ＩｇＧ及びリツキシマブ（登録商標）に関するＦｃγＲＩＩｂのＥＬＩＳＡ結合アッセイ。図７Ｂは、ＤＸ−ＩｇＧ及びリツキシマブ（登録商標）に関するＦｃγＲＩＩｂのＥＬＩＳＡ結合アッセイ。（ＧＭ５＝ＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2 Ｎ−グリカン）。
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本出願は、２００４年７月２１日出願の米国特許仮出願第６０／５８９，９８８号及び２００４年７月２１日出願の米国特許仮出願第６０／５８９，９８１号の優先権を主張するものであり、及び２０００年６月２８日出願の米国特許仮出願第６０／２１４，３５８号、２０００年６月３０日出願の米国特許仮出願第６０／２１５，６３８号及び２００１年３月３０日出願の米国特許仮出願第６０／２７９，９９７号の優先権を主張する、２００１年６月２７日出願の米国特許出願第０９／８９２，５９１号の一部継続出願である、２００３年２月２０日出願の米国特許出願第１０／３７１，８７７号の一部継続出願である。上記で引用する特許出願の各々は、その全体が参照してここに組み込まれる。
【０００２】
本発明は、特異的Ｎ結合グリコシル化パターンを有する糖タンパク質を生産するための組成物及び方法に関する。特に、本発明は、特異的Ｎ−グリカン構造を有する複数のＮ−グリカンを含む免疫グロブリン糖タンパク質の組成物に関し、より特定すると、複数のＮ−グリカン内に、特定エフェクター機能を調節する、例えば促進する、免疫グロブリン上の１又はそれ以上の支配的グリコフォーム構造が存在する免疫グロブリン糖タンパク質を含む組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
糖タンパク質は、触媒作用、シグナル伝達、細胞間連絡、及び分子認識と会合を含む、ヒト及び他の哺乳動物における多くの重要な機能を媒介する。糖タンパク質は真核生物における非サイトゾルタンパク質の大部分を構成する(Lis and Sharon, 1993, Eur. J. Biochem. 218:1-27)。多くの糖タンパク質が治療目的に利用されており、この２０年間、天然に生じる糖タンパク質の組換え型がバイオテクノロジー産業の主要部分となってきた。治療薬として使用される組換えグリコシル化タンパク質の例は、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、治療用モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）、インターフェロン−β（ＩＦＮ−β）、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、及びヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＨ）(Cumming et al., 1991, Glycobiology 1:115-130)を含む。潜在的予防薬及び治療薬として生産された組換えタンパク質が臨床段階に近づいているので、組換え生産された糖タンパク質のグリコシル化パターンの変動性は近年科学界で注目の対象となっている。
【０００４】
抗体又は免疫グロブリン（Ｉｇ）は、体液性免疫応答において中心的役割を果たす糖タンパク質である。抗体は、体液と細胞の防御機構の間の連結をもたらすアダプター分子とみなし得る。抗体による抗原特異的認識は、多数のエフェクター機構を活性化し得る免疫複合体の形成をもたらし、複合体の除去と破壊を生じさせる。免疫グロブリンの一般的クラスの中で、５つのクラスの抗体−ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＥ−が生化学的並びに機能的に区別でき、可変領域に限定されるより微妙な差異が抗原結合の特異性の原因となる。これら５つのクラスのＩｇの中で、ラムダ（λ）及びカッパ（κ）と称される２種類だけの軽鎖が存在する。λ鎖又はκ鎖を有する抗体の間で機能的な相違は認められず、２種類の軽鎖の比は種によって異なる。５つの重鎖クラス又はアイソタイプが存在し、これらは抗体分子の機能的活性を決定する。免疫グロブリンの５つの機能的クラスは：免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）、免疫グロブリンＤ（ＩｇＤ）、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）、免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）及び免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）である。各々のアイソタイプは免疫応答において特定の機能を有し、それらの独特の機能的性質は、軽鎖と結合していない、重鎖のカルボキシ末端部分によって付与される。ＩｇＧは血漿中で最も豊富な免疫グロブリンアイソタイプである（例えばImmunobiology, Janeway et al, 6th Edition, 2004, Garland Publishing, New York参照）。
【０００５】
免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子は、定常及び可変領域を有するＦａｂ（抗原結合フラグメント）ドメイン及びＦｃ（結晶化フラグメント）ドメインを含む。各々の重鎖のＣＨ２ドメインは、Ｎ−グリカンをＩｇ分子に連結するアスパラギン残基、通常は残基Ａｓｎ−２９７にＮ結合グリコシル化のための単一部位を含む(Kabat et al., Sequences of proteins of immunological interest, Fifth Ed., U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91- 3242)。
【０００６】
Ｎ結合オリゴ糖の構造及び機能的態様の分析は、３つの主たる理由から生物学的関心の対象である：（１）ＣＨ２ドメインのグリコシル化は進化を通じて保存されており、前記オリゴ糖の重要な役割を示唆する；（２）免疫グロブリン分子はオリゴ糖の異質性の分析のためのモデル系として役立つ(Rademacher and Dwek, 1984; Rademacher et al., 1982)；及び（３）抗体は、２個のオリゴ糖単位を互いに直接接触させて位置づける２本の重鎖の二量体会合を含むので、免疫グロブリン分子は特異的タンパク質−炭水化物及び炭水化物−炭水化物相互作用の両方を含む。
【０００７】
Ｉｇの異なるグリコシル化パターンは異なる生物学的性質に結びつくことが示された (Jefferis and Lund, 1997, Antibody Eng. Chem. Immunol., 65: 111-128; Wright and Morrison, 1997, Trends Biotechnol, 15: 26-32)。しかし、ほんのわずかな特定グリコフォームだけが所望の生物学的機能を付与することが知られている。例えばＮ結合グリカンの低いフコシル化を有する免疫グロブリン組成物は、ヒトＦｃγＲＩＩＩへの高い結合を有し、それ故高い抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を有することが報告されている (Shields et al, 2002, J. Biol Chem, 277: 26733-26740; Shinkawa et al, 2003, J. Biol. Chem. 278: 3466-3473)。また、ＣＨＯ細胞中で作られるフコシル化Ｇ２（Ｇａｌ2ＧｌｃＮＡｃ2Ｍａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2）ＩｇＧの組成物は、報告によれば、異種抗体の組成物よりも大きな度合で補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）活性を上昇させる（Ｒａｊｕ、２００４年、米国特許出願第２００４／０１３６９８６号)。また、腫瘍に対する最適抗体は、Ｆｃ受容体（ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩＩ）に選択的に結合して活性化し、阻害性ＦｃγＲＩＩｂ受容体に最小限に結合するものであることが示唆されてきた(Clynes et al, 2000, Nature, 6:443-446)。それ故、Ｉｇ糖タンパク質の特定グリコフォームを富化する能力は極めて望ましい。
【０００８】
一般に、糖タンパク質のグリコシル化構造（オリゴ糖）は、発現宿主及び培養条件に依存して変化する。非ヒト宿主細胞において生産される治療タンパク質は、ヒトにおいて免疫原性応答を惹起し得る非ヒトグリコシル化、例えば酵母における高マンノシル化(Ballou, 1990, Methods Enzymol. 185:440-470)；植物におけるα（１，３）−フコース及びβ（１，２）−キシロース(Cabanes-Macheteau et al., 1999, Glycobiology, 9: 365-372)；チャイニーズハムスター卵巣細胞におけるＮ−グリコリルノイラミン酸(Noguchi et al., 1995. J. Biochem. 117: 5-62)及びマウスにおけるＧａｌα−１，３Ｇａｌグリコシル化 (Borrebaeck et al, 1993,Immun. Today, 14: 477-479)を含む可能性が高い。さらに、ガラクトシル化は細胞培養条件によって異なることがあり、一部の免疫グロブリン組成物を、それらの特定ガラクトースパターンに依存して免疫原性にし得る(Patel et al, 1992. Biochem J. 285: 839-845)。非ヒト哺乳動物細胞によって生産される糖タンパク質のオリゴ糖構造は、ヒト糖タンパク質のものとより密接に関連する傾向がある。それ故、大部分の市販の免疫グロブリンは哺乳動物細胞において生産される。しかし、哺乳動物細胞は、タンパク質生産のための宿主細胞としていくつかの重大な難点を有する。コストがかかることに加えて、哺乳動物細胞においてタンパク質を発現するための工程は、グリコフォームの不均一な個体群を生産し、容積力価が低く、継続的なウイルスの封じ込めと安定な細胞系を生成するための多大の時間の両方を必要とする。
【０００９】
種々のグリコフォームが、薬物動態、薬力学、受容体相互作用及び組織特異的ターゲティングを含む、治療薬の性質に深く影響し得ることは了解されている(Graddis et al., 2002, Curr Pharm Biotechnol. 3: 285-297)。特に、抗体に関して、オリゴ糖構造は、プロテアーゼ耐性に関する性質、ＦｃＲｎ受容体によって媒介される抗体の血清半減期、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を誘導する、補体複合体Ｃ１への結合、及び抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）経路、食作用及び抗体フィードバックを調節する役割を担うＦｃγＲ受容体への結合に影響を及ぼし得る(Nose and Wigzell, 1983; Leatherbarrow and Dwek, 1983; Leatherbarrow et al.,1985; Walker et al., 1989; Carter et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Set USA, 89: 4285-4289)。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
異なるグリコフォームは異なる生物学的性質に結びつくので、１又はそれ以上の特定グリコフォームを富化する能力は、特定グリコフォームと特定生物学的機能の間の関係を明らかにするために使用できる。所望生物学的機能を特定グリコフォームパターンに結びつけた後、好都合なグリコフォーム構造を富化した糖タンパク質組成物を生産することができる。それ故、特定グリコフォームが富化された糖タンパク質組成物を生産できることは極めて望ましい。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、複数の免疫グロブリンを含む組成物であって、各々の免疫グロブリンがそれに結合した少なくとも１つのＮ−グリカンを含み、それによって組成物が、支配的Ｎ−グリカンが本質的にＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2から成る複数のＮ−グリカンを含む、前記組成物を提供する。好ましい実施形態では、前記複数のＮ−グリカンの５０モルパーセント以上が本質的にＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2から成る。より好ましくは、前記複数のＮ−グリカンの７５モルパーセント以上が本質的にＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2から成る。最も好ましくは、前記複数のＮ−グリカンの９０パーセント以上が本質的にＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2から成る。他の好ましい実施形態では、前記ＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2 Ｎ−グリカン構造は、前記複数のＮ−グリカンのその次に最も支配的なＮ−グリカン構造よりも多い約５モルパーセントから約５０モルパーセント多いレベルで存在する。
【００１２】
本発明はまた、免疫グロブリンの特定グリコフォーム（例えばＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2）を富化することによってＦｃγＲＩＩＩａ及びＦｃγＲＩＩＩｂ受容体への結合を上昇させ、ＦｃγＲＩＩｂ受容体への結合を低下させるための方法を提供する。好ましい実施形態は、複数の免疫グロブリンを含む組成物を生産するための方法であって、各々の免疫グロブリンがそれに結合した少なくとも１つのＮ−グリカンを含み、組成物が、支配的Ｎ−グリカンが本質的にＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2から成る複数のＮ−グリカンを含み、前記免疫グロブリン又はそのフラグメントを発現するように工作又は選択された宿主細胞を培養する工程を含む、前記方法を提供する。もう１つの好ましい実施形態は、複数の免疫グロブリンを含む組成物を生産するための方法であって、各々の免疫グロブリンがそれに結合した少なくとも１つのＮ−グリカンを含み、組成物が、支配的Ｎ−グリカンが本質的にＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2から成る複数のＮ−グリカンを含み、前記免疫グロブリン又はそのフラグメントを発現するように工作又は選択された下等真核宿主細胞を培養する工程を含む、前記方法を提供する。本発明の他の実施形態では、宿主細胞は免疫グロブリン又はそのフラグメントをコードする外来性遺伝子を含み、前記宿主細胞は、前記免疫グロブリン又はそのフラグメントを発現するように工作又は選択されており、それによって複数の免疫グロブリンを含む組成物を生産し、各々の免疫グロブリンはそれに結合した少なくとも１つのＮ−グリカンを含み、組成物は、支配的Ｎ−グリカンが本質的にＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2から成る複数のＮ−グリカンを含む。本発明のさらなる他の実施形態では、下等真核宿主細胞は、免疫グロブリン又はそのフラグメントをコードする外来性遺伝子を含み、前記宿主細胞は、前記免疫グロブリン又はそのフラグメントを発現するように工作又は選択されており、それによって複数の免疫グロブリンを含む組成物を生産し、各々の免疫グロブリンはそれに結合した少なくとも１つのＮ−グリカンを含み、組成物は、支配的Ｎ−グリカンが本質的にＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2から成る複数のＮ−グリカンを含む。
【００１３】
本発明の好ましい実施形態では、複数の免疫グロブリンを含む組成物であって、各々の免疫グロブリンがそれに結合した少なくとも１つのＮ−グリカンを含み、それによって組成物が、支配的Ｎ−グリカンが本質的にＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2から成る複数のＮ−グリカンを含み、前記免疫グロブリンがＦｃγＲＩＩｂ受容体に対して低い結合親和性を示す、前記組成物。本発明の他の好ましい実施形態では、複数の免疫グロブリンを含む組成物であって、各々の免疫グロブリンがそれに結合した少なくとも１つのＮ−グリカンを含み、それによって組成物が、支配的Ｎ−グリカンが本質的にＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2から成る複数のＮ−グリカンを含み、前記免疫グロブリンがＦｃγＲＩＩＩａ及びＦｃγＲＩＩＩｂ受容体に対して高い結合親和性を示す、前記組成物。本発明のさらにもう１つの好ましい実施形態では、複数の免疫グロブリンを含む組成物であって、各々の免疫グロブリンがそれに結合した少なくとも１つのＮ−グリカンを含み、それによって組成物が、支配的Ｎ−グリカンが本質的にＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2から成る複数のＮ−グリカンを含み、前記免疫グロブリンが高い抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を示す、前記組成物。
【００１４】
１つの実施形態では、本発明の組成物は、本質的にフコースを含まない免疫グロブリンを含む。もう１つの実施形態では、本発明の組成物は、フコースを欠く免疫グロブリンを含む。本発明の組成物はまた、医薬組成物と製薬上許容される担体を含む。本発明の組成物はまた、精製され、診断キットに組み込まれた免疫グロブリンの医薬組成物を含む。
【００１５】
従って、本発明は、あらかじめ定められたグリコシル化構造を有する糖タンパク質、特に、本質的にＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2から成るＮ−グリカンを有する免疫グロブリン又は抗体分子の組成物の生産のための材料及び方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本文中で異なる定義が為されない限り、本発明に関して使用する学術的及び技術的用語及び語句は、当業者によって一般的に理解されている意味を有するものとする。さらに、文脈から異なる要求がない限り、単数用語は複数用語を包含し、複数用語は単数用語を包含する。一般に、ここで述べる生化学、酵素学、分子及び細胞生物学、微生物学、遺伝学、及びタンパク質及び核酸化学及びハイブリダイゼーションに関して使用する命名法及び手法は、当技術分野において周知であり、一般的に使用されるものである。本発明のための方法及び手法は、異なる指示がない限り、一般に、当技術分野において周知の従来の方法に従って、及び本明細書を通じて引用し、論じる種々の一般的な及びより特定の参考文献において述べられているように実施される。例えばSambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989); Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992, and Supplements to 2002); Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1990); Taylor and Drickamer, Introduction to Glycobiology, Oxford Univ. Press (2003); Worthington Enzyme Manual, Worthington Biochemical Corp., Freehold, NJ; Handbook of Biochemistry: Section A Protems, Vol I, CRC Press (1976); Handbook of Biochemistry: Section A Proteins, Vol II, CRC Press (1976); Essentials of Glycobiology, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1999); Immunobiology, Janeway et al, 6th Edition, 2004, Garland Publishing, New York参照。
【００１７】
ここで言及する全ての刊行物、特許及び他の参考文献は、それらの全体が参照してここに組み込まれる。
【００１８】
以下の用語は、異なる指示がない限り、以下の意味を有すると理解される：
【００１９】
ここで使用する、「Ｎ−グリカン」、「グリカン」及び「グリコフォーム」という用語は、交換可能に使用され、Ｎ結合オリゴ糖、例えばタンパク質中のアスパラギン残基のアミド窒素に連結されたＮ−アセチルグルコサミン残基によって結合されている又は結合されていたものを指す。糖タンパク質上に認められる主要な糖は、グルコース、ガラクトース、マンノース、フコース、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）及びシアル酸（例えばＮ−アセチル−ノイラミン酸（ＮＡＮＡ））である。糖群のプロセシングはＥＲの管腔内で共翻訳的に起こり、Ｎ結合糖タンパク質についてはゴルジ装置で継続される。
【００２０】
Ｎ−グリカンは、Ｍａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2（「Ｍａｎ」はマンノースを指し、「Ｇｌｃ」はグルコースを指し、「ＮＡｃ」はＮ−アセチルを指し、ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミンを指す）の共通五糖コアを有する。Ｎ−グリカンは、「トリマンノースコア」、「五糖コア」又は「少マンノースコア」とも称されるＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2（「Ｍａｎ3」）コア構造に付加された末梢糖（peripheral sugars）（例えばＧｌｃＮＡｃ、ガラクトース、フコース及びシアル酸）を含む分枝（アンテナ）の数に関して異なる。Ｎ−グリカンはそれらの分枝成分に従って分類される（例えば高マンノース型、複合型又は混成型）。「高マンノース」型Ｎ−グリカンは、５又はそれ以上のマンノース残基を有する。「複合」型Ｎ−グリカンは、典型的には「トリマンノース」コアの１，３マンノース腕に結合した少なくとも１個のＧｌｃＮＡｃ及び１，６マンノース腕に結合した少なくとも１個のＧｌｃＮＡｃを有する。複合型Ｎ−グリカンはまた、場合によりシアル酸又は誘導体（例えば「ＮＡＮＡ」又は「ＮｅｕＡｃ」、「Ｎｅｕ」はノイラミン酸を指し、「Ａｃ」はアセチルを指す）で修飾されたガラクトース（「Ｇａｌ」）又はＮ−アセチルガラクトサミン（「ＧａｌＮＡｃ」）残基を有し得る。複合型Ｎ−グリカンはまた、「２分岐（バイセクティング）」ＧｌｃＮＡｃ及びコアフコース（「Ｆｕｃ」）を含む鎖内置換を有し得る。複合型Ｎ−グリカンはまた、しばしば「多分枝グリカン」と称される、「トリマンノースコア」上に多数の分枝を有し得る。「混成型」Ｎ−グリカンは、トリマンノースコアの１，３−マンノース腕の末端に少なくとも１個のＧｌｃＮＡｃ及びトリマンノースコアの１，６マンノース腕上にゼロ又はそれ以上のマンノースを有する。様々なＮ−グリカンは「グリコフォーム」とも称される。
【００２１】
ここで使用する略語は当技術分野で一般的に使用されるものであり、例えば上記の糖の略語参照。他の一般的な略語は、全てペプチドＮ−グルコシダーゼＦ（ＥＣ３．２．２．１８）を指す「ＰＮＧアーゼ」又は「グリカナーゼ」又は「グルコシダーゼ」を含む。
【００２２】
「単離された」又は「実質的に純粋な」核酸又はポリヌクレオチド（例えばＲＮＡ、ＤＮＡ又は混合ポリマー）は、その天然宿主細胞内の天然ポリヌクレオチドに天然に付随する他の細胞成分、例えばそれが天然に結合しているリボソーム、ポリメラーゼ及びゲノム配列から実質的に分離されているものである。この用語は、（１）その天然に生じる環境から取り出された、（２）「単離ポリヌクレオチド」が本来その中に存在するポリヌクレオチドの全部又は一部と結合していない、（３）天然では結合していないポリヌクレオチドに作動可能に連結されている、又は（４）天然では生じない、核酸又はポリヌクレオチドを包含する。「単離された」又は「実質的に純粋な」という用語はまた、組換え又はクローン化ＤＮＡ単離物、化学合成ポリヌクレオチド類似体、又は異種系によって生物学的に合成されるポリヌクレオチド類似体に関しても使用できる。
【００２３】
しかし、「単離された」は、必ずしも、そのように表わされる核酸又はポリヌクレオチドがそれ自体その天然環境から物理的に取り出されていることを必要としない。例えば生物のゲノム内の内在性核酸配列は、この内在性核酸配列の発現が変化するように、異種配列が内在性核酸配列に隣接して位置する場合、ここでは「単離された」とみなす。これに関して、異種配列は、その異種配列自体が内在性であるか（同じ宿主細胞又はその子孫を起源とする）又は外来性であるか（異なる宿主細胞又はその子孫を起源とする）否かに関わらず、天然ではその内在性核酸配列に隣接していない配列である。例として、宿主細胞のゲノム内の遺伝子の天然プロモーターに関して、この遺伝子が変化した発現パターンを有するように、プロモーター配列を置換することができる（例えば相同的組換えによって）。この遺伝子は、天然でそれに隣接する配列の少なくとも一部から分離されているので、今や「単離された」ことになる。
【００２４】
核酸配列はまた、ゲノム内の対応する核酸に天然では生じない修飾を含む場合、「単離された」とみなされる。例えば内在性コード配列は、人為的に、例えばヒトの介入処置によって、導入された挿入、欠失又は点突然変異を含む場合、「単離された」とみなされる。「単離された核酸配列」はまた、異なる部位で宿主細胞染色体に組み込まれた核酸及びエピソームとして存在する核酸構築物を含む。さらに、「単離された核酸配列」は、他の細胞物質を実質的に含まない、又は組換え手法によって生産されるときは培地を実質的に含まない、又は化学合成されるときは化学的前駆物質又は他の化学物質を実質的に含まないものであり得る。
【００２５】
ここで使用する、基準核酸配列の「縮重変異体」という語句は、標準遺伝暗号に従って、基準核酸配列から翻訳されるものと同一のアミノ酸配列を提供するように翻訳され得る核酸配列を包含する。「縮重オリゴヌクレオチド」又は「縮重プライマー」という用語は、配列においては必ずしも同一でないが、１又はそれ以上の特定セグメント内で互いに相同である、標的核酸配列とハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドを表わすために使用される。
【００２６】
核酸配列に関して「配列同一性パーセント」又は「同一」という用語は、一致が最大になるように整列したとき同じである２個の配列内の残基を指す。配列同一性比較の長さは、少なくとも約９ヌクレオチド、通常は少なくとも約２０ヌクレオチド、より通常は少なくとも約２４ヌクレオチド、典型的には少なくとも約２８ヌクレオチド、より典型的には少なくとも約３２ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約３６又はそれ以上のヌクレオチドの範囲にわたり得る。ヌクレオチド配列同一性を測定するために使用できる、当技術分野で公知の多くの異なるアルゴリズムが存在する。例えばポリヌクレオチド配列は、ウィスコンシンパッケージバージョン１０．０、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ），Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎのプログラムである、ＦＡＳＴＡ、Ｇａｐ又はＢｅｓｔｆｉｔを用いて比較することができる。ＦＡＳＴＡは、問い合わせ配列と検索配列の間の最良重複の領域のアラインメントと配列同一性パーセントを提供する。Pearson, Methods Enzymol. 183:63-98 (1990)（その全体が参照してここに組み込まれる）。例えば核酸配列間の配列同一性パーセントは、そのデフォルトパラメータ（ワードサイズ６及びスコアリングマトリックスのためのＮＯＰＡＭ係数）と共にＦＡＳＴＡを使用して、又は参照してここに組み込まれる、ＧＣＧバージョン６．１において提供されるようなそのデフォルトパラメータでＧａｐを使用して決定することができる。あるいは、コンピュータプログラム、ＢＬＡＳＴ (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990); Gish and States, Nature Genet. 3:266-272 (1993); Madden et al., Meth. Enzymol. 266: 131-141 (1996); Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (1997); Zhang and Madden, Genome Res. 7:649-656 (1997))、特にｂｌａｓｔｐ又はｔｂｌａｓｔｎ (Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (1997)) を使用して配列を比較することができる。
【００２７】
核酸又はそのフラグメントに言及するとき、「実質的相同性」又は「実質的類似性」という用語は、もう１つ別の核酸（又はその相補鎖）と適切なヌクレオチド挿入又は欠失で最適整列したとき、上述したような配列同一性の周知のアルゴリズム、例えばＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ又はＧａｐによって測定される、ヌクレオチド塩基の少なくとも約５０％、より好ましくは６０％、通常は少なくとも約７０％、より通常は少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくはヌクレオチド塩基の少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％のヌクレオチド配列同一性が存在することを指示する。
【００２８】
あるいは、核酸又はそのフラグメントが、ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下でもう１つ別の核酸、もう１つ別の核酸の鎖又はその相補鎖にハイブリダイズするとき、実質的相同性又は類似性が存在する。核酸ハイブリダイゼーション実験に関して「ストリンジェントハイブリダイゼーション条件」及び「ストリンジェント洗浄条件」は、多くの異なる物理的パラメータに依存する。核酸ハイブリダイゼーションは、当業者には容易に認識されるように、塩濃度、温度、溶媒、ハイブリダイズする種の塩基組成、相補領域の長さ、及びハイブリダイズする核酸の間のヌクレオチド塩基ミスマッチの数などの条件によって影響される。当業者は、特定ストリンジェンシーのハイブリダイゼーションを達成するためにこれらのパラメータをどのように変化させるかを熟知する。
【００２９】
一般に、「ストリンジェントハイブリダイゼーション」は、特定の組み合わせの条件下で特定ＤＮＡハイブリッドについての融解温度（Ｔm）より約２５℃低い温度で実施される。「ストリンジェント洗浄」は、特定の組み合わせの条件下で特定ＤＮＡハイブリッドについてのＴmより約５℃低い温度で実施される。Ｔmは、標的配列の５０％が完全にマッチするプローブにハイブリダイズする温度である。参照してここに組み込まれる、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989), page 9.51参照。ここでの目的のために、「ストリンジェント条件」は、液相ハイブリダイゼーション、例えば６Ｘ ＳＳＣ（２０Ｘ ＳＳＣは３．０Ｍ ＮａＣｌ及び０．３Ｍクエン酸ナトリウムを含む）、１％ＳＤＳ中６５℃で８−１２時間の水溶液ハイブリダイゼーション（すなわちホルムアミドを含まない）、続いて０．２Ｘ ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中６５℃で２０分間ずつ２回の洗浄、について定義される。６５℃でのハイブリダイゼーションが、ハイブリダイズする配列の長さ及び同一性パーセントを含む多くの因子に依存して異なる速度で起こることは当業者に認識される。
【００３０】
核酸配列に適用するとき「突然変異した」という用語は、基準核酸配列と比較して核酸配列内のヌクレオチドが挿入、欠失又は変化し得ることを意味する。単一変化を１つの遺伝子座で作製し得るか（点突然変異）又は多数のヌクレオチドを単一遺伝子座で挿入、欠失又は変更し得る。加えて、１又はそれ以上の変化を核酸配列内のいかなる数の遺伝子座においても作製し得る。核酸配列は、突然変異誘発手法、例えば「エラープローンＰＣＲ」（高い割合の点突然変異がＰＣＲ産物の長さ全体にわたって得られるように、ＤＮＡポリメラーゼの複製信頼度が低い条件下でＰＣＲを実施するための方法；例えばLeung et al., Technique, 1:11-15 (1989) and Caldwell and Joyce, PCR Methods Applic. 2:28-33 (1992)参照；及び「オリゴヌクレオチド指定突然変異誘発」（何らかのクローン化された対象ＤＮＡセグメントにおける部位特異的突然変異の生成を可能にする方法；例えばReidhaar-Olson and Sauer, Science 241 :53-57 (1988)参照）を含むが、これらに限定されない、当技術分野で公知の何らかの方法によって突然変異させ得る。
【００３１】
ここで使用する「ベクター」という用語は、それが連結されているもう１つ別の核酸を輸送することができる核酸分子を指すことが意図されている。１つの種類のベクターは、その中に付加的なＤＮＡセグメントを連結し得る環状二本鎖ＤＮＡループを指す、「プラスミド」である。他のベクターは、コスミド、細菌人工染色体（ＢＡＣ）及び酵母人工染色体（ＹＡＣ）を含む。もう１つの種類のベクターは、付加的なＤＮＡセグメントをウイルスゲノム内に連結し得る、ウイルスベクターである（以下でより詳細に論じる）。ある種のベクターは、それらが導入された宿主細胞において自律複製することができる（例えば宿主細胞において機能する複製起点を有するベクター）。他のベクターは、宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノムに組み込まれることができ、それによって宿主ゲノムと共に複製される。さらに、ある種の好ましいベクターは、それらが作動可能に連結されている遺伝子の発現を指令することができる。そのようなベクターをここでは「組換え発現ベクター」（又は単に「発現ベクター」）と称する。
【００３２】
ここで使用する、「対象配列」又は「対象遺伝子」という用語は、宿主細胞において通常は生産されない、典型的にはタンパク質をコードする、核酸配列を指す。ここで開示する方法は、１又はそれ以上の対象配列又は対象遺伝子を宿主細胞ゲノムに安定に組み込むことを可能にする。対象配列の非限定的な例は、酵素活性を有する１又はそれ以上のポリペプチド、例えば宿主におけるＮ−グリカン合成に影響を及ぼす酵素、例えばマンノシルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン輸送体、ガラクトシルトランスフェラーゼ、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルガラクトシルトランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼ及びフコシルトランスフェラーゼをコードする配列を含む。
【００３３】
「マーカー配列」又は「マーカー遺伝子」という用語は、宿主細胞内の配列の存在又は不在についての陽性又は陰性選択を可能にする活性を発現することができる核酸配列を指す。例えばピキア・パストリス(P. pastoris)ＵＲＡ５遺伝子は、この遺伝子を含む細胞がウラシルの不在下で増殖する能力によってその存在を選択することができるので、マーカー遺伝子である。その存在はまた、この遺伝子を含む細胞が５−ＦＯＡの存在下で増殖することができないことによって選択できる。マーカー配列又は遺伝子は、必ずしも陽性と陰性の両方の選択可能性を示す必要はない。Ｐ．パストリスからのマーカー配列又は遺伝子の非限定的な例は、ＡＤＥ１、ＡＲＧ４、ＨＩＳ４及びＵＲＡ３を含む。抗生物質耐性マーカー遺伝子に関しては、カナマイシン、ネオマイシン、ゲネチシン（又はＧ４１８）、パロモマイシン及びハイグロマイシン耐性遺伝子が、これらの抗生物質の存在下での増殖を可能にするために一般的に使用される。
【００３４】
「作動可能に連結された」発現制御配列は、発現制御配列が対象遺伝子を制御するために対象遺伝子に隣接する結合、並びにイントランスで又は離れて対象遺伝子を制御するように働く発現制御配列を指す。
【００３５】
ここで使用する「発現制御配列」という用語は、それらが作動可能に連結されているコード配列の発現に影響を及ぼすために必要なポリヌクレオチド配列を指す。発現制御配列は、核酸配列の転写、転写後事象及び翻訳を制御する配列である。発現制御配列は、適切な転写開始、終結、プロモーター及びエンハンサー配列；効率的なＲＮＡプロセシングシグナル、例えばスプライシング及びポリアデニル化シグナル；細胞質ｍＲＮＡを安定化する配列；翻訳効率を高める配列（例えばリボソーム結合部位）；タンパク質の安定性を高める配列；及び所望するときは、タンパク質分泌を上昇させる配列を含む。そのような制御配列の性質は宿主生物に依存して異なる：原核生物では、そのような制御配列は一般に、プロモーター、リボソーム結合部位及び転写終結配列を含む。「制御配列」という用語は、最小限で、その存在が発現のために必須である全ての成分を含むことが意図されており、その存在が好都合である付加的な成分、例えばリーダー配列及び融合パートナー配列も含み得る。
【００３６】
ここで使用する、「組換え宿主細胞」（「発現宿主細胞」、「発現宿主系」、「発現系」又は単に「宿主細胞」）という用語は、組換えベクターが導入された細胞を指すことが意図されている。そのような用語は、特定被験細胞だけでなく、そのような細胞の子孫も表わすことが意図されていることは了解されるべきである。突然変異又は環境影響のために連続する世代の中である種の修飾が起こり得るので、そのような子孫は、実際には、親細胞と同じでないことがあり得るが、やはりここで使用する「宿主細胞」の用語の範囲内に包含される。組換え宿主細胞は、単離細胞又は培養中で増殖する細胞系統であり得るか、又は生体組織又は生物内に存する細胞であり得る。
【００３７】
「真核」という用語は、有核細胞又は生物を指し、昆虫細胞、植物細胞、哺乳動物細胞、動物細胞及び下等真核細胞を含む。
【００３８】
「下等真核細胞」という用語は、酵母、真菌、襟鞭毛虫、微胞子虫、アルベオラータ（例えば渦鞭毛虫）、ストラメノパイル（例えば褐藻類、原生動物）、紅藻植物（例えば紅藻類）、植物（例えば緑藻類、植物細胞、苔）及び他の原生生物を含む。酵母及び真菌は、ピキア属（Pichia sp.）、例えばピキア・パストリス（Pichia pastoris）、ピキア・フィンランディカ（Pichia finlandica）、ピキア・トレハロフィラ（Pichia trehalophila）、ピキア・コクラメー（Pichia koclamae）、ピキア・メンブラネファシエンス（Pichia membranaefaciens）、ピキア・ミヌータ(Pichia minuta)（メタノール資化性酵母（オガテー・ミヌータ）（Ogataea minuta）、ピキア・リンデネリ（Pichia lindneri））、ピキア・オパンティエー（Pichia opuntiae）、ピキア・サーモトレランス（Pichia thermotolerans）、ピキア・サリクタリア（Pichia salictaria）、ピキア・グエルカム（Pichia guercuum）、ピキア・ピジュペリ（Pichia pijperi）、ピキア・スチプチス(Pichia stiptis)及びピキア・メタノリカ(Pichia methanolica)；サッカロミセス属（Saccharomyces sp）、例えばサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)；ハンセヌラ・ポリモーファ（Hansenula polymorpha）、クルイヴェロミセス属（Kluyveromyces sp）、例えばクルイヴェロミセス・ラクチス(Kluyveromyces lactis)；カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、アスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulans）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、アスペルギルス・オリゼー（Aspergillus oryzae）、トリコデルマ・レエセイ（Trichoderma reesei）、クリソスポリウム・ルクノヴェンス（Chrysosporium lucknowense）、フザリウム属（Fusarium sp）、例えばフザリウム・グラミネウム（Fusarium gramineum）、フザリウム・ヴェネナタム(Fusarium venenatum)；フィスコミトレラ・パテンス(Physcomitrella patens)及びアカパンカビ（ニューロスポラ・クラッサ(Neurospora crassa)）を含むが、これらに限定されない。
【００３９】
ここで使用する「ペプチド」という用語は、短いポリペプチド、例えば典型的には約５０アミノ酸長未満、より典型的には約３０アミノ酸長未満であるものを指す。ここで使用するこの用語は、構造、及びそれ故生物学的機能を模倣する類似体及びミメティックを包含する。
【００４０】
「ポリペプチド」という用語は、天然に生じるタンパク質と非天然に生じるタンパク質の両方、及びそれらのフラグメント、突然変異体、誘導体及び類似体を包含する。ポリペプチドは単量体又は多量体であり得る。さらに、ポリペプチドは、各々が１又はそれ以上の別個の活性を有する多くの異なるドメインを含み得る。
【００４１】
「単離タンパク質」又は「単離ポリペプチド」という用語は、その起源又は誘導のソースによって（１）天然の状態でそれに付随する天然結合成分と結合していない、（２）天然では認められない純度で存在する、純度は他の細胞物質の存在に関して判定され得る（例えば同じ種からの他のタンパク質を含まない）、（３）異なる種からの細胞によって発現される、又は（４）天然では生じない（例えば天然に認められるポリペプチドのフラグメントである、又は天然では認められないアミノ酸類似体又は誘導体あるいは標準ペプチド結合以外の結合を含む）、タンパク質又はポリペプチドである。それ故、化学合成される又はそれが天然に由来する細胞とは異なる細胞系で合成されるポリペプチドは、その天然結合成分から「単離」されている。ポリペプチド又はタンパク質はまた、当技術分野で周知のタンパク質精製手法を用いて、単離によって天然結合成分を実質的に含まないようにし得る。そのように定義される「単離」は、そのように表わされるタンパク質、ポリペプチド、ペプチド又はオリゴペプチドがその天然環境から物理的に取り出されていることを必ずしも必要としない。
【００４２】
ここで使用する「ポリペプチドフラグメント」という用語は、完全長ポリペプチドと比較して欠失、例えばアミノ末端及び／又はカルボキシ末端欠失を有するポリペプチドを指す。好ましい実施形態では、ポリペプチドフラグメントは、フラグメントのアミノ酸配列が天然に生じる配列内の対応する位置と同一である隣接配列である。フラグメントは、典型的には少なくとも５、６、７、８、９又は１０アミノ酸長、好ましくは少なくとも１２、１４、１６又は１８アミノ酸長、より好ましくは少なくとも２０アミノ酸長、より好ましくは少なくとも２５、３０、３５、４０又は４５アミノ酸長、さらに一層好ましくは少なくとも５０又は６０アミノ酸長、さらに一層好ましくは少なくとも７０アミノ酸長である。
【００４３】
「修飾誘導体」は、一次構造配列において実質的に相同であるが、例えばインビボ又はインビトロでの化学及び生化学的修飾を含む又は天然ポリペプチドでは認められないアミノ酸が組み込まれているポリペプチド又はそのフラグメントを指す。そのような修飾は、当業者には容易に認識されるように、例えばアセチル化、カルボキシル化、リン酸化、グリコシル化、ユビキチン化、例えば放射性核種による、標識、及び様々な酵素修飾を含む。ポリペプチドを修飾するための様々な方法及びそのような目的のために有用な様々な置換基又は標識は当技術分野において周知であり、放射性同位体、例えば125Ｉ、32Ｐ、35Ｓ及び3Ｈ、標識抗リガンド（例えば抗体）に結合するリガンド、発蛍光団、化学発光物質、酵素、及び標識リガンドのための特異的結合対成員として使用できる抗リガンドを含む。標識の選択は、求められる感受性、プライマーとの複合の容易さ、安定性必要条件、及び使用可能な機器に依存する。ポリペプチドを標識するための方法は当技術分野において周知である。例えばAusubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992, and Supplements to 2002)（参照してここに組み込まれる）参照。
【００４４】
「融合タンパク質」という用語は、異種アミノ酸配列に結合したポリペプチド又はフラグメントを含むポリペプチドを指す。融合タンパク質は、２又はそれ以上の異なるタンパク質からの２又はそれ以上の所望機能エレメントを含むように構築することができるので、有用である。融合タンパク質は、対象ポリペプチドからの少なくとも１０隣接アミノ酸、より好ましくは少なくとも２０又は３０アミノ酸、さらに一層好ましくは少なくとも４０、５０又は６０アミノ酸、さらにより好ましくは少なくとも７５、１００又は１２５アミノ酸を含む。本発明のタンパク質の全体を含む融合物は特に有用である。本発明の融合タンパク質内に含まれる異種ポリペプチドは、少なくとも６アミノ酸長、しばしば少なくとも８アミノ酸長、有用には少なくとも１５、２０及び２５アミノ酸長である。より大きなポリペプチド、例えば免疫グロブリンＦｃフラグメント又は免疫グロブリンＦａｂフラグメント、さらにはタンパク質全体、例えばグリーン蛍光タンパク質（「ＧＦＰ」）発色団含有タンパク質又は特に有用な完全長免疫グロブリンを含む融合物。融合タンパク質は、異なるタンパク質又はペプチドをコードする核酸配列と共にポリペプチド又はそのフラグメントをインフレームでコードする核酸配列を構築し、次にこの融合タンパク質を発現することによって組換え生産することができる。あるいは、融合タンパク質は、ポリペプチド又はそのフラグメントをもう１つ別のタンパク質に架橋することによって化学的に生産することができる。
【００４５】
ここで使用する、「抗体」、「免疫グロブリン」、「Ｉｇ」及び「Ｉｇ分子」という用語は交換可能に用いられる。各々の抗体分子は、その特異性抗原に結合することを可能にする独自の構造を有するが、全ての抗体／免疫グロブリンはここで述べるような同じ全体的構造を有する。基本的抗体構造単位は、サブユニットの四量体を含むことが知られている。各々の四量体は２つの同一のポリペプチド鎖の対を有し、各々の対は１本の「軽」鎖（約２５ｋＤａ）と１本の「重」鎖（約５０−７０ｋＤａ）を有する。各々の鎖のアミノ末端部分は、主として抗原認識の役割を担う約１００−１１０又はそれ以上のアミノ酸の可変領域を含む。各々の鎖のカルボキシ末端部分は、主としてエフェクター機能の役割を担う定常領域を規定する。軽鎖はκ又はλと分類される。重鎖は、γ、μ、α、δ又はεと分類され、それぞれ抗体のアイソタイプをＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥと規定する。軽鎖と重鎖は可変領域と定常領域に細分される（一般に、Fundamental Immunology (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N. Y., 1989), Ch. 7（全ての目的のためにその全体が参照してここに組み込まれる）参照）。各々の軽／重鎖対の可変領域は抗体結合部位を形成する。それ故、無傷抗体は２つの結合部位を有する。二元機能性又は二重特異性抗体（bifunctional or bispecific antibodies）を除き、２つの結合部位は同じである。鎖は全て、相補性決定領域又はＣＤＲとも呼ばれる、３つの超可変領域によって接合される比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）の同じ一般構造を示す。各々の対の２本の鎖からのＣＤＲはフレームワーク領域によって並列され、特定エピトープへの結合を可能にする。前記用語は、天然に生じる形態、並びにフラグメント及び誘導体を含む。Ｉｇのクラス、すなわちＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ及びＩｇＤは前記用語の範囲内に含まれる。ＩｇＧのサブタイプ、すなわちＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４も用語の範囲内に含まれる。この用語は最も広い意味で使用され、単一モノクローナル抗体（アゴニスト及びアンタゴニスト抗体を含む）並びに多数のエピトープ又は抗原に結合する抗体組成物を含む。前記用語は特に、モノクローナル抗体（完全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、及びＣH２ドメインのＮ結合グリコシル化部位を含む重鎖免疫グロブリン定常領域のＣH２ドメインの少なくとも一部を含むか又は含むように修飾される限り、抗体フラグメント、又はその変異体をカバーする。Ｆｃ領域を含む分子、例えばイムノアドヘシン（米国特許出願第２００４／０１３６９８６号）、Ｆｃ融合物及び抗体様分子は前記用語に包含される。あるいは、これらの用語は、少なくともＮ結合グリコシル化部位を含む、少なくともＦａｂ領域の抗体フラグメントを表わし得る。
【００４６】
「Ｆｃ」フラグメントという用語は、ＣH２及びＣH３ドメインを含む抗体の「結晶化フラグメント」Ｃ末端領域を指す（図１）。「Ｆａｂ」フラグメントという用語は、ＶＨ、ＣＨ１、ＶＬ及びＣＬドメインを含む抗体の「抗原結合フラグメント」領域を指す（図１）。
【００４７】
ここで使用する「モノクローナル抗体」（ｍＡｂ）という用語は、実質的に均一な抗体の個体群から得られる抗体、すなわち個体群を構成する個々の抗体は、少量存在し得る、天然に生じる可能性のある突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は、高度特異性であり、単一抗原部位を標的とする。さらに、典型的には種々の決定基（エピトープ）を標的とする種々の抗体を含む従来の（ポリクローナル）抗体製剤と異なり、各々のｍＡｂは抗原上の単一決定基を標的する。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体は、他の免疫グロブリンによって汚染されない、ハイブリドーマ培養によって合成できるという点で好都合である。「モノクローナル」という用語は、抗体の実質的に均一な個体群から得られるという抗体の性質を指示し、何らかの特定方法による抗体の生産を必要とすると解釈されるべきではない。例えば本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、Kohler et al., (1975) Nature, 256:495によって最初に記述されたハイブリドーマ法によって作製し得るか、又は組換えＤＮＡ法（例えばＣａｂｉｌｌｙらへの米国特許第４，８１６，５６７号参照）によって作製し得る。
【００４８】
モノクローナル抗体は、ここでは、起源の種又は免疫グロブリンクラス又はサブクラス指定に関わりなく、抗体の可変（超可変を含む）ドメインを定常ドメインで（例えば「ヒト化」抗体）、又は軽鎖を重鎖で、又はある種からの鎖をもう１つ別の種からの鎖で、又は融合物を異種タンパク質で、スプライシングすることによって生産されるハイブリッド及び組換え抗体を含む（例えばＣａｂｉｌｌｙらへの米国特許第４，８１６，５６７号； Mage and Lamoyi, in Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 79-97 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)参照）。モノクローナル抗体は、ここでは特に、重鎖及び／又は軽鎖の一部が、最初の種に由来する又は特定抗体クラス又はサブクラスに属する抗体内の対応配列と同一又は相同であり、鎖の残りの部分が、異なる種に由来する又は異なる抗体クラス又はサブクラスに属する抗体内の対応配列と同一又は相同である、「キメラ」抗体（免疫グロブリン）、並びにそれらが少なくとも１つのＣH２を含むか又は含むように修飾される限り、そのような抗体のフラグメントを含む。非ヒト（例えばマウス）抗体の「ヒト化」形態は、ヒト免疫グロブリンに由来する配列を含む特異的キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖又はそのフラグメント（例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、又は抗体の他の抗原結合サブ配列）である。抗体のＦｖフラグメントは、全体分子の結合特性及び特異性を保持する抗体の最小単位である。Ｆｖフラグメントは、抗体重鎖及び軽鎖の可変ドメインの非共有結合ヘテロ二量体である。Ｆ（ａｂ’）2フラグメントは、ジスルフィド架橋によって結合されたＦａｂフラグメントの両方の腕を含むフラグメントである。
【００４９】
最も一般的な形態のヒト化抗体は、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）からの残基が、所望特異性、親和性及び能力を有する非ヒト種（ドナー抗体）、例えばマウス、ラット又はウサギのＣＤＲからの残基によって置換されているヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。一部の場合は、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基が対応する非ヒト残基によって置換される。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体又は導入されるＣＤＲ又はフレームワーク配列のいずれにおいても認められない残基を含み得る。これらの修飾は、抗体性能をさらに洗練し、最大化するために行われる。一般に、ヒト化抗体は、ＣＤＲ領域の全部又は実質的に全部が非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、及びＣＤＲ領域の全部又は実質的に全部がヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである、少なくとも１、典型的には２個の可変ドメインの実質的に全部を含む。ヒト化抗体はまた、最適には、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的にはヒト免疫グロブリンのものの少なくとも一部を含む。さらなる詳細については、Jones et al., 1986, Nature 321:522-524; Reichmann et al., 1988, Nature 332:323-327, and Presta, 1992, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596参照。
【００５０】
抗体又は免疫グロブリンの用語の範囲内の「フラグメント」は、フラグメントが依然として標的分子に特異結合することができる限り、様々なプロテアーゼでの消化によって生産されるもの、化学的切断及び／又は化学的解離によって生産されるもの、及び組換え生産されるものを含む。そのようなフラグメントには、Ｆｃ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ’）2、及び一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメントがある。
【００５１】
本発明の抗体の対象標的は、増殖因子受容体（例えばＦＧＦＲ、ＰＤＧＦＲ、ＥＧＦＲ、ＮＧＦＲ及びＶＥＧＦ）及びそれらのリガンドを含む。他の標的はＧタンパク質受容体であり、サブスタンスＫ受容体、アンギオテンシン受容体、α及びβアドレナリン受容体、セロトニン受容体及びＰＡＦ受容体を含む。例えばGilman, Ann. Rev.Biochem. 56:625-649 (1987)参照。他の標的は、イオンチャネル（例えばカルシウム、ナトリウム、カリウムチャネル）、ムスカリン受容体、アセチルコリン受容体、ＧＡＢＡ受容体、グルタミン酸受容体及びドーパミン受容体を含む（Ｈａｒｐｏｌｄ、米国特許第５，４０１，６２９号及び米国特許第５，４３６，１２８号参照）。他の標的は、接着タンパク質、例えばインテグリン、セレクチン及び免疫グロブリンスーパーファミリー成員である（Springer, Nature 346:425-433 (1990). Osborn, Cell 62:3 (1990); Hynes, Cell 69:11 (1992)参照）。他の標的は、サイトカイン、例えばインターロイキンＩＬ−１からＩＬ−１３、腫瘍壊死因子α及びβ、インターフェロンα、β及びγ、腫瘍増殖因子β（ＴＧＦ−β）、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）及び顆粒球単球コロニー刺激因子（ＧＭＣＳＦ）である。Human Cytokines: Handbook for Basic & Clinical Research (Aggrawal et al. eds., Blackwell Scientific, Boston, MA 1991)参照。他の標的は、ホルモン、酵素、及び細胞内及び細胞間メッセンジャー、例えばアデニルシクラーゼ、グアニルシクラーゼ及びホスホリパーゼＣである。他の対象標的は、白血球抗原、例えばＣＤ２０及びＣＤ３３である。薬剤も対象標的であり得る。標的分子は、ヒト、哺乳動物又は細菌性であり得る。他の標的は、抗原、例えばウイルス及び細菌の両方の、微生物病原体からのタンパク質、糖タンパク質及び炭水化物、及び腫瘍である。さらなる他の標的は、米国特許第４，３６６，２４１号に述べられている。
【００５２】
ここで論じる免疫Ｆｃ受容体は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩＩＩｂ及びＦｃＲｎ（新生児受容体）を含み得る。ＦｃγＲＩという用語は、異なる規定がない限りいかなるＦｃγＲＩサブタイプも表わし得る。ＦｃγＲＩＩという用語は、異なる規定がない限りいかなるＦｃγＲＩＩ受容体も表わし得る。ＦｃγＲＩＩＩという用語は、異なる規定がない限りあらゆるＦｃγＲＩＩＩサブタイプを指す。
【００５３】
「誘導体」はその用語の範囲内に、種間キメラ及びヒト化抗体；抗体融合物；ヘテロマー抗体複合体及び抗体融合物、例えば二重特異性抗体（ダイアボディ）（bispecific antibodies）、一本鎖二重特異性抗体及び細胞内発現抗体（イントラボディ）を含む、配列が修飾されているが、依然として標的分子に特異結合することができる抗体（又はそのフラグメント）を含む（例えばIntracellular Antibodies: Research and Disease Applications, (Marasco, ed., Springer-Verlag New York, Inc., 1998)参照）。
【００５４】
「非ペプチド類似体」という用語は、基準ポリペプチドのものに類似した性質を有する化合物を指す。非ペプチド化合物はまた、「ペプチドミメティック」（peptide mimetic、peptidomimetic）と称されることもある。例えば参照してここに組み込まれる、Jones, Amino Acid and Peptide Synthesis, Oxford University Press (1992); Jung, Combinatorial Peptide and Nonpeptide Libraries: A Handbook, John Wiley (1997); Bodanszky et al., Peptide Chemistry-A Practical Textbook, Springer Verlag (1993); Synthetic Peptides: A Users Guide, (Grant, ed., W. H. Freeman and Co., 1992); Evans et al., J. Med. Chem. 30:1229 (1987); Fauchere, J. Adv. Drug Res. 15:29 (1986); Veber and Freidinger, Trends Neurosci, 8:392-396 (1985)；及び上記の各々で引用される参考文献参照。そのような化合物はしばしばコンピュータ分子モデリングを用いて開発される。本発明の有用なペプチドに構造的に類似するペプチドミメティックは、等しい作用を生じさせるために使用でき、それ故本発明の一部と考えられる。
【００５５】
アミノ酸置換は、（１）タンパク質分解に対する感受性を低下させる、（２）酸化に対する感受性を低下させる、（３）タンパク質複合体を形成するための結合親和性を変化させる、（４）結合親和性又は酵素活性を変化させる、及び（５）そのような類似体の他の物理化学的又は機能的性質を付与する又は修飾する、アミノ酸置換を含み得る。
【００５６】
ここで使用する、２０個の従来のアミノ酸及びそれらの略記は従来の使用法に従う。参照してここに組み込まれる、Immunology - A Synthesis (Golub and Gren eds., Sinauer Associates, Sunderland, Mass., 2nd ed. 1991)参照。２０個の従来のアミノ酸の立体異性体（例えばＤ−アミノ酸）、非天然アミノ酸、例えばα−アミノ酸、α−二置換アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸、及び他の非慣例的アミノ酸も、本発明のポリペプチドのための適切な成分であり得る。非慣例的アミノ酸の例は、４−ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタメート、ε−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルリシン、ε−Ｎ−アセチルリシン、Ｏ−ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリシン、Ｎ−メチルアルギニン、及び他の類似アミノ酸及びイミノ酸（例えば４−ヒドロキシプロリン）を含む。ここで使用するポリペプチド表記では、標準使用法及び慣例に従って、左側末端はアミノ末端に対応し、右側末端はカルボキシ末端に対応する。
【００５７】
タンパク質は、そのタンパク質をコードする核酸配列が第二のタンパク質をコードする核酸配列と類似の配列を有する場合、第二タンパク質に「相同性」を有する又は「相同」である。あるいは、２個のタンパク質が「類似」アミノ酸配列を有する場合、タンパク質は第二タンパク質に相同性を有する。（それ故、「相同タンパク質」という用語は、２個のタンパク質が類似アミノ酸配列を有することを意味すると定義される。）好ましい実施形態では、相同タンパク質は、野生型タンパク質に少なくとも６５％の配列相同性を示すものであり、少なくとも７０％の配列相同性がより好ましい。野生型タンパク質に少なくとも７５％、８０％、８５％又は９０％の配列相同性を示す相同タンパク質がさらに一層好ましい。さらなるより好ましい実施形態では、相同タンパク質は少なくとも９５％、９８％、９９％又は９９．９％の配列同一性を示す。ここで使用する、アミノ酸配列の２つの領域の間の相同性（特に予測上の構造類似性に関して）は、機能における類似性を意味すると解釈される。
【００５８】
タンパク質又はペプチドに関して「相同な」を使用するときは、同一でない残基位置がしばしば保存的アミノ酸置換によって異なると認識される。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、類似の化学的性質（例えば電荷又は疎水性）を備えた側鎖（Ｒ基）を有するもう１つ別のアミノ酸残基によって置換されているものである。一般に、保存的アミノ酸置換はタンパク質の機能特性を実質的に変化させない。２又はそれ以上のアミノ酸配列が保存的置換によって互いに異なる場合、配列同一性パーセント又は相同性の程度は、置換の保存的性質を補正するように上方調整し得る。この調整を行うための手段は当業者に周知である。例えばPearson, 1994, Methods Mol. Biol. 24:307-31 and 25:365-89参照（参照してここに組み込まれる）。
【００５９】
以下の６つの群は各々、互いに保存的置換であるアミノ酸を含む：１）セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、及び６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）。
【００６０】
配列同一性パーセントとも称される、ポリペプチドについての配列相同性は、典型的には配列解析ソフトウエアを用いて測定される。例えばｔｈｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｅｎｔｅｒ，９１０ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ａｖｅｎｕｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ ５３７０５の配列解析ソフトウエアパッケージ参照。タンパク質解析ソフトウエアは、様々な置換、欠失、及び保存的アミノ酸置換を含む他の修飾に割り当てられた相同性の測定を用いて類似配列を対合させる。例えばＧＣＧは、密接に関連するポリペプチド、例えば生物の異なる種からの相同ポリペプチドの間、又は野生型タンパク質とそのムテインとの間の配列相同性又は配列同一性を決定するためのデフォルトパラメータと共に使用できるプログラム、例えば「Ｇａｐ」及び「Ｂｅｓｔｆｉｔ」を含む。例えばＧＣＧバージョン６．１参照。
【００６１】
特定ポリペプチド配列を、種々の生物からの数多くの配列を含むデータベースと比較するときの好ましいアルゴリズムは、コンピュータプログラムＢＬＡＳＴ(Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990); Gish and States, Nature Genet. 3:266-272 (1993); Madden et al., Meth. Enzymol. 266: 131-141 (1996); Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (1997); Zhang and Madden, Genome Res. 7:649-656 (1997))、特にｂｌａｓｔｐ又はｔｂｌａｓｔｎ(Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (1997))である。
【００６２】
ＢＬＡＳＴｐのための好ましいパラメータは、期待値：１０（デフォルト）；フィルター：ｓｅｇ（デフォルト）；ギャップを開くためのコスト：１１（デフォルト）；ギャップを伸長するためのコスト：１（デフォルト）；最大整列：１００（デフォルト）；ワードサイズ：１１（デフォルト）；記述数：１００（デフォルト）；ペナルティーマトリックス：ＢＬＯＷＳＵＭ６２である。
【００６３】
相同性に関して比較するポリペプチド配列の長さは、一般に少なくとも約１６アミノ酸残基、通常は少なくとも約２０残基、より通常は少なくとも約２４残基、典型的には少なくとも約２８残基、好ましくは約３５残基以上である。数多くの異なる生物からの配列を含むデータベースを検索するときは、アミノ酸配列を比較することが好ましい。アミノ酸配列を用いるデータベース検索は、当技術分野で公知のｂｌａｓｔｐ以外のアルゴリズムによって測定できる。例えばポリペプチド配列は、ＧＣＧバージョン６．１の中のプログラム、ＦＡＳＴＡを用いて比較することができる。ＦＡＳＴＡは、問い合わせ配列と検索配列の間の最良重複の領域のアラインメントと配列同一性パーセントを提供する。Pearson, Methods Enzymol. 183:63-98 (1990)（参照してここに組み込まれる）。例えばアミノ酸配列間の配列同一性パーセントは、参照してここに組み込まれるＧＣＧバージョン６．１において提供されるように、ＦＡＳＴＡをそのデフォルトパラメータ（ワードサイズ２及びＰＡＭ２５０スコアリングマトリックス）と共に使用して決定できる。
【００６４】
「特異的結合」は、２個の分子が環境において他の分子への結合よりも選択的に互いに結合する能力を指す。典型的には、「特異的結合」は、反応における偶発的結合と少なくとも２倍、より典型的には少なくとも１０倍、しばしば少なくとも１００倍の差がある。典型的には、特異的結合反応の親和性又はアビディティーは、解離定数によって数量化したとき、約１０-7Ｍ又はそれ以上強力（例えば約１０-8Ｍ、１０-9Ｍ又はさらに強力）である。
【００６５】
ここで使用する「領域」という用語は、生体分子の一次構造の物理的に隣接する部分を指す。タンパク質の場合、領域は、そのタンパク質のアミノ酸配列の隣接部分によって規定される。
【００６６】
ここで使用する「ドメイン」という用語は、生体分子の公知の又は考えられる機能に寄与する生体分子の構造を指す。ドメインはその領域又は部分と同一の広がりを有し得る；ドメインはまた、生体分子の別個の非隣接領域を含み得る。
【００６７】
ここで使用する、「分子」という用語は、低分子、ペプチド、タンパク質、糖タンパク質、糖、ヌクレオチド、核酸、脂質等を含むが、これらに限定されない、いかなる化合物も意味し、そのような化合物は天然又は合成であり得る。
【００６８】
ここで使用する、「含む（comprise）」という用語又はその三人称単数形（comprises）又は「含むこと（comprising）」のような変形は、言明される整数又は整数の群の包含を意味するが、他の何らかの整数又は整数の群の排除を意味しないことが了解される。
【００６９】
ここで使用する、「本質的に〜から成る」という用語は、言明される整数又は整数の群の包含を意味し、言明される整数に実質的に影響を及ぼす又は変化させる修飾又は他の整数を排除することが了解される。Ｎ−グリカンの種に関して、「本質的に言明されるＮ−グリカンから成る」という用語は、Ｎ−グリカンが糖タンパク質のアスパラギン残基に直接結合しているＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）でフコシル化されているか否かに関わりなくＮ−グリカンを含むことが了解される。
【００７０】
ここで使用する、「支配的に」という用語又は「支配的な」又は「支配的である」のような変形は、糖タンパク質をＰＮＧアーゼで処理し、放出されたグリカンを質量分析、例えばＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳによって分析した後、総Ｎ−グリカンの最高モルパーセント（％）を有するグリカン種を意味することが了解される。言い換えると、「支配的に」という語句は、個別実体、例えば特定グリコフォームが、他のいかなる個別実体よりも高いモルパーセントで存在すると定義される。例えば組成物が４０モルパーセントのＡ種、３５モルパーセントのＢ種及び２５モルパーセントのＣ種から成る場合、組成物はＡ種を支配的に含み、Ｂ種はその次に最も支配的な種である。
【００７１】
ここで使用するとき、特定糖残基、例えばフコース又はガラクトース等を「本質的に含まない」という用語は、糖タンパク質組成物が、そのような残基を含むＮ−グリカンを実質的に欠くことを指示するために使用される。純度に関して表わされる、実質的に含まないということは、そのような糖残基を含むＮ−グリカン構造の量が１０％を超えない、好ましくは５％未満、より好ましくは１％未満、最も好ましくは０．５％未満であることを意味し、前記パーセンテージは重量又はモルパーセントである。それ故、本発明に従った糖タンパク質組成物中の実質的に全てのＮ−グリカン構造は、フコース又はガラクトース又はその両方を含まない。
【００７２】
ここで使用するとき、糖タンパク質組成物は、特定糖残基、例えばフコース又はガラクトースの検出可能な量がいかなる時点でもＮ−グリカン構造上に存在しないとき、そのような糖残基を「欠く」又は「欠如している」。例えば本発明の好ましい実施形態では、糖タンパク質組成物は、酵母［例えばピキア属(Pichia sp.)；サッカロミセス属(Saccharomyces sp)；クルイヴェロミセス属(Kluyveromyces sp.)；アスペルギルス属(Aspergillus sp.)］を含む、上記で定義したような下等真核生物によって生産され、これらの生物の細胞はフコシル化Ｎ−グリカン構造を生成するために必要な酵素を持たないので、「フコースを欠く」。それ故、「本質的にフコースを含まない」という用語は、「フコースを欠く」という用語を包含する。しかし、組成物がかつてフコシル化Ｎ−グリカン構造を含んだ場合又は上述したように限られているが検出可能な量のフコシル化Ｎ−グリカン構造を含む場合でも、組成物は「本質的にフコースを含まない」と考えられる。
【００７３】
ここで使用する、「高い結合活性」という語句は、受容体又はさもなければ指示される分子とＩｇＧ分子の結合の上昇を表わす「高い結合親和性」と交換可能に使用される。
【００７４】
ここで使用する、「低い結合活性」という語句は、受容体又はさもなければ指示される分子とＩｇＧ分子の結合の低下を表わす「低い結合親和性」と交換可能に使用される。
【００７５】
ここで使用する、「食作用」という語句は、免疫複合体の清掃であると定義される。食作用は、マクロファージ及び好中球を含むがこれらに限定されない、免疫細胞の免疫学的作用である。
【００７６】
抗体及び抗体−抗原複合体と免疫系の細胞の相互作用及び様々な応答、例えば抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、免疫複合体の清掃（食作用）、Ｂ細胞による抗体産生及びＩｇＧ血清半減期は、それぞれ以下において定義される：Daeron et al, 1997, Annu. Rev. Immunol. 15: 203-234; Ward and Ghetie, 1995, Therapeutic Immunol. 2:77-94; Cox and Greenberg, 2001, Semin. Immunol. 13: 339-345; Heyman, 2003, Immunol. Lett. 88:157-161; and Ravetch, 1997, Curr. Opin. Immunol. 9: 121-125。
【００７７】
異なる定義がない限り、ここで使用する全ての技術的及び学術的用語は、本発明が関係する技術分野の当業者によって一般的に理解されているのと同じ意味を有する。例示的な方法及び材料を以下で述べるが、ここで述べるものと類似又は等価の方法及び材料も本発明の実施において使用することができ、当業者には明白である。ここで言及する全ての刊行物及び他の参考文献は、それらの全体が参照してここに組み込まれる。係争の場合は、定義を含む本明細書に準拠する。材料、方法及び実施例は単なる例示であり、限定を意図しない。
【００７８】
組換えＩｇ−ＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2分子
本発明は、支配的なＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2 Ｎ結合グリコフォームを有するグリコシル化Ｉｇの個体群を含む組成物を提供する。本発明はまた、抗体エフェクター機能、例えば受容体結合を媒介する支配的なＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2 Ｎ結合グリコフォームを有するＩｇ及びＩｇ組成物を提供する。好ましくは、本発明のＩｇとＦｃγＲＩＩＩ受容体の間の相互作用は、直接結合活性の上昇を提供する。及び、好ましくは、本発明のＩｇとＦｃγＲＩＩｂ受容体の間の相互作用は、直接結合活性の低下（又は欠如）を提供する。もう１つの実施形態では、本発明のＩｇ又はＩｇ組成物は、１つのグリコフォーム構造の富化／支配性によって与えられる高い結合活性を示す。本発明の顕著な特徴は、抗体エフェクター機能、例えばＡＤＣＣ活性の上昇又はＢ細胞による抗体産生の上昇を媒介する、支配的な特定グリコフォームを有するＩｇ及びＩｇ組成物を提供することである。もう１つの実施形態では、本発明のＩｇ又はＩｇ組成物は、１つのグリコフォームの富化／支配性によって与えられる高いＡＤＣＣ活性又はＢ細胞による抗体産生を示す。さらに、支配的グリコフォームを有するＩｇ組成物を生産することの１つの利点は、望ましくないグリコフォームを有するＩｇの産生及び／又は望ましくない作用を誘導し得る及び／又はより有効なＩｇグリコフォームの濃度を希釈し得るＩｇの不均一混合物の産生を回避することであることは、当業者には容易に明らかである。それ故、支配的にＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2グリコフォームを有するＩｇを含む医薬組成物は、ＦｃγＲＩＩｂへの結合低下及びＦｃγＲＩＩＩａ及びＦｃγＲＩＩＩｂへの結合上昇を含むがこれらに限定されない、有益な特徴を有し、それ故おそらくより低用量で有効であると考えられ、従ってより高い効果／効力を有し得る。
【００７９】
１つの実施形態では、本発明のＩｇ分子は、Ｉｇ分子における抗体エフェクター機能を媒介するＦｃ領域上の重鎖のＣH２ドメインのＡｓｎ−２９７に少なくとも１つのＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2グリカン構造を含む。好ましくは、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2グリカン構造は、二量体化Ｉｇ内の各々のＣＨ２ドメインの各々のＡｓｎ−２９７上に存在する（図１）。もう１つの実施形態では、本発明は、Ａｓｎ−２９７において本質的にＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2グリカン構造から成るＮ−グリカンで支配的にグリコシル化されているＩｇを含む組成物を提供する（図１）。あるいは、Ｉｇ分子上に認められる１又はそれ以上の炭水化物部分が欠失されて及び／又は分子に付加されて、それによってＩｇ上のグリコシル化部位の数が追加又は欠失されていてもよい。さらに、Ｉｇ分子のＣH２領域内のＮ結合グリコシル化部位の位置は、分子内の様々な位置にアスパラギン（Ａｓｎ）又はＮ−グリコシル化部位を導入することによって変化し得る。Ａｓｎ−２９７は、典型的にはマウス及びヒトＩｇＧ分子において認められるＮ−グリコシル化部位であるが（Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 1991)、この部位は想定し得る唯一の部位ではなく、またこの部位は必ずしも機能のために維持される必要はない。突然変異誘発のための公知の方法を用いて、当業者は、Ａｓｎ−２９７のＮ−グリコシル化部位が欠失されるように本発明のＩｇをコードするＤＮＡ分子を変化させることができ、さらに１又はそれ以上のＮ−グリコシル化部位をＩｇ分子内の他の位置に創造するようにＤＮＡ分子を変化させることができる。Ｎ−グリコシル化部位は、Ｉｇ分子のＣH２領域内に創造されることが好ましい。しかし、ＩｇのＦａｂ領域のグリコシル化が血清抗体の３０％で記述されており−一般にＡｓｎ−７５で認められる(Rademacher et al., 1986, Biochem. Soc. Symp., 51: 131-148)。Ｉｇ分子のＦａｂ領域におけるグリコシル化は、Ｆｃ領域内のＮ−グリコシル化と組み合わせ得るか又は単独の追加部位である。
【００８０】
１つの実施形態では、本発明は、支配的なＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2 Ｎ−グリカン構造を有する組換えＩｇ組成物を提供し、前記ＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2グリカン構造は、組換えＩｇ組成物のその次に支配的なグリカン構造よりも少なくとも約５モルパーセント多いレベルで存在する。好ましい実施形態では、本発明は、支配的なＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2グリカン構造を有する組換えＩｇ組成物を提供し、前記ＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2グリカン構造は、組換えＩｇ組成物のその次に支配的なグリカン構造よりも少なくとも約１０モルパーセントから約２５モルパーセント多いレベルで存在する。より好ましい実施形態では、本発明は、支配的なＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2グリカン構造を有する組換えＩｇ組成物を提供し、前記ＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2グリカン構造は、組換えＩｇ組成物のその次に支配的なグリカン構造よりも少なくとも約２５モルパーセントから約５０モルパーセント多いレベルで存在する。好ましい実施形態では、本発明は、支配的なＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2グリカン構造を有する組換えＩｇ組成物を提供し、前記ＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2グリカン構造は、組換えＩｇ組成物のその次に支配的なグリカン構造よりも約５０モルパーセント以上多いレベルで存在する。もう１つの好ましい実施形態では、本発明は、支配的なＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2グリカン構造を有する組換えＩｇ組成物を提供し、前記ＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2グリカン構造は、組換えＩｇ組成物のその次に支配的なグリカン構造よりも約７５モルパーセント以上多いレベルで存在する。さらにもう１つの実施形態では、本発明は、支配的なＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2グリカン構造を有する組換えＩｇ組成物を提供し、前記ＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2グリカン構造は、組換えＩｇ組成物のその次に支配的なグリカン構造よりも約９０モルパーセント以上多いレベルで存在する。支配的なＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2 Ｎ−グリカン（５５．８％）を有するＪＣ−ＩｇＧのＮ−グリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析を図４Ａに示す。支配的なＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2（６０％）を有するＤＸ−ＩｇＧのＮ−グリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析を図４Ｂに示す。
【００８１】
ＦｃγＲＩＩＩ受容体へのＩｇ−ＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2の高い結合
ＦｃγＲＩＩＩａ及びＦｃγＲＩＩＩｂへのＩｇ結合のエフェクター機能、例えばＡＤＣＣの活性化は、Ｉｇ分子のＦｃ領域によって媒介される。種々の機能がこの領域内の種々のドメインによって媒介される。従って本発明は、Ｉｇ分子上のＦｃ領域が、エフェクター機能を実施することができる支配的ＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2 Ｎ−グリカンを有するＩｇ分子及び組成物を提供する。１つの実施形態では、支配的ＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2 Ｎ−グリカンを有するＦｃ領域は、ＦｃγＲＩＩＩａ（図６）及びＦｃγＲＩＩＩｂ（図５）受容体への結合上昇を与える。もう１つの実施形態では、Ｆｃは支配的ＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2 Ｎ−グリカンを有する。Ｆｃ領域を含む分子、例えばイムノアドヘシン(Chamow and Ashkenazi, 1996, Trends Biotechnol. 14: 52-60; Ashkenazi and Chamow, 1997, Curr . Opin. Immunol. 9: 195-200)、Ｆｃ融合物及び抗体様分子も本発明に包含されることは、当業者には容易に明らかである。
【００８２】
Ｆｃ受容体へのＩｇ分子の結合活性（親和性）はアッセイによって測定し得る。ＩｇＧに関するＦｃγＲＩＩＩ結合アッセイの一例を実施例６で述べる。当業者は、このアッセイが、何らかの免疫グロブリン分子についてのアッセイと組み合わせた使用のために容易に適合させ得ることを認識する。
【００８３】
支配的ＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2 Ｎ−グリカンを有するＪＣ−ＩｇＧ（本発明に従って作製されるＩｇ）は、図５Ａに示すようにリツキシマブ（登録商標）と比較して１０倍高いＦｃγＲＩＩＩｂへの結合活性を有し、図６に示すように１０倍以上高いＦｃγＲＩＩＩａへの結合活性を有する。支配的ＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2 Ｎ−グリカンを有するＤＸ−ＩｇＧ（本発明に従って作製されるもう１つのＩｇ）も、図５Ｂに示すようにリツキシマブ（登録商標）と比較して約１００倍高いＦｃγＲＩＩＩｂへの結合活性を有する。
【００８４】
最も興味深いことに、ＦｃγＲＩＩＩａ遺伝子の二型性は２つのアロタイプ：ＦｃγＲＩＩＩａ−１５８Ｖ及びＦｃγＲＩＩＩａ−１５８Ｆを生じる(Dall'Ozzo et al., 2004, Cancer Res. 64: 4664-4669)。ＦｃγＲＩＩＩａ−１５８Ｖについてホモ接合の遺伝子型は、リツキシマブ（登録商標）へのより高い臨床応答に結びつく(Cartron et al., 2002, Blood, 99: 754-758)。しかし、個体群の大部分は１個のＦｃγＲＩＩＩａ−１５８Ｆ対立遺伝子を担持しており、個体群の大部分にとってＦｃγＲＩＩＩａ結合を通したＡＤＣＣの誘導のためにリツキシマブ（登録商標）をあまり有効ではないものにする。しかし、フコシルトランスフェラーゼ活性を欠く宿主細胞においてリツキシマブ（登録商標）様の抗ＣＤ２０抗体が発現されるとき、この抗体は、ＦｃγＲＩＩＩａ−１５８Ｆ及びＦｃγＲＩＩＩａ−１５８Ｖの両方を通してＡＤＣＣを増強するために等しく有効である(Niwa et al., 2004, Clin. Cane Res. 10: 6248-6255)。本発明のある好ましい実施形態の抗体は、Ｎ−グリカンにフコースを付加しない宿主細胞（例えばフコースを欠く酵母宿主、Ｐ．パストリス；実施例１及び２参照）において発現される。それ故、フコースを欠き、ＦｃγＲＩＩＩａ−１５８Ｆへの高い結合を有する本発明の抗体は、リツキシマブ（登録商標）に対して低い臨床応答を示す多くの患者を治療するために特に有用であり得ると考えられる。
【００８５】
ＦｃγＲＩＩｂ受容体へのＩｇ−ＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2の低い結合
ＦｃγＲＩＩｂへのＩｇ結合のエフェクター機能、例えばＢ細胞による抗体産生の上昇及びＡＤＣＣ活性の上昇は、Ｉｇ分子のＦｃ領域によって媒介される。種々の機能がこの領域内の種々のドメインによって媒介される。従って本発明は、Ｉｇ分子上のＦｃ領域が、エフェクター機能を実施することができる支配的ＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2 Ｎ−グリカンを有するＩｇ分子及び組成物を提供する。１つの実施形態では、支配的ＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2 Ｎ−グリカンを有するＦｃ領域は、ＦｃγＲＩＩｂ受容体への結合低下を与える。Ｆｃ領域を含む分子、例えばイムノアドヘシン(Chamow and Ashkenazi, 1996, Trends Biotechnol. 14: 52-60; Ashkenazi and Chamow, 1997, Curr . Opin. Immunol. 9: 195-200)、Ｆｃ融合物及び抗体様分子も本発明に包含されることは、当業者には容易に明らかである。
【００８６】
Ｆｃ受容体へのＩｇ分子の結合活性（親和性）はアッセイによって測定し得る。ＩｇＧ１に関するＦｃγＲＩＩｂ結合アッセイの一例を実施例６において開示する。当業者は、この開示するアッセイが、何らかの免疫グロブリン分子に関する使用のために容易に適合させ得ることを認識する。
【００８７】
支配的ＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2 Ｎ−グリカンを有するＪＣ−ＩｇＧ（本発明のＩｇ）は、図７Ａに示すようにリツキシマブ（登録商標）と比較して約８倍低いＦｃγＲＩＩｂへの結合活性を有する。支配的ＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2 Ｎ−グリカンを有するＤＸ−ＩｇＧ（本発明のもう１つのＩｇ）は、図７Ｂに示すようにリツキシマブ（登録商標）と比較して約２から５倍低いＦｃγＲＩＩｂへの結合活性を有する。
【００８８】
高い抗体依存性細胞傷害
さらにもう１つの実施形態では、支配的Ｎ−グリカンとしてＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2を有するＩｇ分子又は組成物のＦｃγＲＩＩＩａ又はＦｃγＲＩＩＩｂ結合の上昇は、ＦｃγＲＩＩＩを介したＡＤＣＣの上昇を与え得る。ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）受容体がＡＤＣＣ活性についての責任を担うことは広く確立されている(Daeron et al., 1997, Annu. Rev. Immunol. 15: 203-234)。もう１つの実施形態では、支配的Ｎ−グリカンとしてＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2を有するＩｇ分子又は組成物のＦｃγＲＩＩｂ結合の低下はＡＤＣＣの上昇を与える(Clynes et al., 2000, supra)。もう１つの実施形態では、本発明のＩｇ分子又は組成物は、支配的ＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2グリカンの存在によって与えられる高いＡＤＣＣ活性を示す。
【００８９】
Ｂ細胞減少を測定するインビトロアッセイ及び蛍光放出ＡＤＣＣアッセイの一例を実施例７において開示する。当業者は、これらの開示するアッセイが、何らかのＩｇ分子に関するアッセイと組み合わせた使用のために容易に適合させ得ることを認識する。さらに、動物モデルにおけるインビボＡＤＣＣアッセイは、Borchmann et al., 2003, Blood, 102: 3737-3742, Niwa et al., 2004, Cancer Research, 64: 2127-2133及び実施例７からの特定ＩｇＧのために適合させることができる。
【００９０】
Ｂ細胞による抗体産生上昇
調節ＦｃγＲ経路を通しての腫瘍に対する抗体の関与が示された(Clynes et al., 2000, Nature, 6: 443-446)。特に、ＦｃγＲＩＩｂは、免疫受容体のチロシンベースの活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含む受容体、例えばＢ細胞受容体（ＢＣＲ）、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＩ及びＦｃεＲＩと共架橋するとき、ＩＴＡＭを介したシグナルを阻害することが知られている(Vivier and Daeron, 1997, Immunol. Today, 18: 286-291)。例えばＦｃｇＲＩＩ特異的抗体の付加はＦｃｇＲＩＩＢへのＦｃ結合をブロックし、Ｂ細胞増殖の上昇を生じさせる (Wagle et al., 1999, J of Immunol. 162: 2732-2740)。従って１つの実施形態では、本発明のＩｇ分子は、Ｂ細胞の活性化を生じさせ、次には形質細胞による抗体産生を触媒する、ＦｃγＲＩＩｂ受容体結合の低下を媒介することができる(Parker, D.C. 1993, Annu. Rev. Immunol. 11 : 331-360)。ＩｇＧ１に関するＢ細胞による抗体産生を測定するアッセイの一例を実施例６で述べる。当業者は、このアッセイが、何らかの免疫グロブリン分子に関するアッセイと組み合わせた使用のために容易に適合させ得ることを認識する。
【００９１】
他の免疫学的活性
好中球上のエフェクター細胞分子の変化した表面発現は、細菌感染に対する感受性を高めることが示されている(Ohsaka et al., 1997, Br. J. Haematol. 98: 108-113)。さらに、ＦｃγＲＩＩＩａエフェクター細胞受容体へのＩｇＧ結合が腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）の発現を調節することも明らかにされた (Blom et al., 2004, Arthritis Rheum., 48: 1002-1014)。さらに、ＦｃγＲ誘導のＴＮＦ−αは、ＩｇＧ被覆赤血球に結合してそれを貪食する好中球の能力も上昇させる(Capsoni et al, 1991, J. Clin. Lab Immunol. 34: 115-124)。それ故、ＦｃγＲＩＩＩへの結合上昇を示す本発明のＩｇ分子及び組成物は、ＴＮＦ−αの発現上昇を与え得ると考えられる。
【００９２】
ＦｃγＲＩＩＩ受容体活性の上昇は、リソソームβ−グルクロニダーゼ並びに他のリソソーム酵素の分泌を上昇させることが示された(Kavai et al., 1982, Adv. Exp Med. Biol. 141: 575-582; Ward and Ghetie, 1995, Therapeutic Immunol, 2: 77-94)。さらに、リガンドによる免疫受容体の結合後の重要な工程は、それらのインターナリゼーションとリソソームへの送達である(Bonnerot et al., 1998, EMBO J, 17: 4906-4916)。それ故、ＦｃγＲＩＩＩａ及びＦｃγＲＩＩＩｂへの結合上昇を示す本発明のＩｇ分子及び組成物は、リソソーム酵素の分泌上昇を与え得ると考えられる。
【００９３】
もっぱら好中球上に存在するＦｃγＲＩＩＩｂは、免疫複合体の構築において支配的役割を果たし、その凝集は、食作用、脱顆粒、及びオプソニン化病原体の破壊を導く呼吸バーストを活性化する。好中球の活性化は、その２つの細胞外ドメインに対応する受容体のタンパク質分解切断可溶性形態の分泌を導く。可溶性ＦｃγＲＩＩＩｂは、ＦｃγＲ依存性エフェクター機能の競合的阻害によって及び補体受容体ＣＲ３への結合を通して調節機能を及ぼし、炎症メディエイタの産生を導く(Sautes-Fridman et al., 2003, ASHI Quarterly, 148-151)。
【００９４】
本発明は、それ故、本質的にＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2から成るＮ−グリカンを含む免疫グロブリン分子を提供し、及び、免疫グロブリン及びそれに結合した複数のＮ−グリカンを含み、前記複数のＮ−グリカン中の支配的Ｎ−グリカンが本質的にＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2から成る組成物を提供する。いずれの実施形態においても、免疫グロブリン上の前記ＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2 Ｎ−グリカンの支配性が、好ましくは、ここで示すようにＦｃγＲＩＩＩａ及びＦｃγＲＩＩＩｂへの結合上昇とＦｃγＲＩＩｂへの結合低下に加えて所望の治療エフェクター活性を付与する。
【００９５】
免疫グロブリンサブクラス
ＩｇＧサブクラスはＦｃ受容体に対して異なる結合親和性を有することが示されている(Huizinga et al., 1989, J. of Immunol, 142: 2359-2364)。ＩｇＧサブクラスの各々は、本発明の種々の態様において特定の利点を提供し得る。それ故１つの態様では、本発明は、ＩｇＧ１分子に結合した支配的Ｎ−グリカンとしてＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2を含むＩｇＧ１組成物を提供する。もう１つの態様では、本発明は、ＩｇＧ２分子に結合した支配的Ｎ−グリカンとしてＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2を含むＩｇＧ２組成物を包含する。さらにもう１つの態様では、本発明は、ＩｇＧ３分子に結合した支配的Ｎ−グリカンとしてＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2を含むＩｇＧ３組成物を包含する。もう１つの態様では、本発明は、ＩｇＧ４分子に結合した支配的Ｎ−グリカンとしてＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2を含むＩｇＧ４組成物を包含する。
【００９６】
あるいは、本発明は、免疫グロブリンの５つの主要クラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ及びＩｇＧの全てに適用することができる。本発明の好ましい免疫グロブリンはヒトＩｇＧであり、好ましくはサブタイプＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４の１つからである。より好ましくは、本発明の免疫グロブリンはＩｇＧ１分子である。
【００９７】
抗体エフェクター機能と活性を媒介する組換え免疫グロブリン（Ｉｇ）分子の生産
１つの態様では、本発明は、ＣH２ドメインのＡｓｎ−２９７に、本質的にＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2グリカン構造から成るＮ−グリカンを有する、抗体エフェクター機能と活性を媒介する組換えＩｇ分子、及び同様に、免疫グロブリンに結合した支配的Ｎ−グリカンがＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2である免疫グロブリン組成物を生産するための方法を提供する。１つの実施形態では、Ｉｇの重鎖及び軽鎖は重複オリゴヌクレオチドを用いて合成され、宿主細胞における発現のために発現ベクターに別々にクローニングされる（実施例１）。好ましい実施形態では、組換えＩｇ重鎖及び軽鎖は、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2の付加を支配的に触媒する宿主菌株において発現される。１つの実施形態では、このグリコフォーム構造は、より詳細には、Ｉｇ上のＦｃ領域のアミノ酸Ａｓｎ−２９７の窒素とＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2グリカン上のＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミンのヒドロキシル基の間の結合を形成する［（ＧｌｃＮＡｃβ１，２−Ｍａｎα１，３）（Ｍａｎα１，３ Ｍａｎα１，６ Ｍａｎα１，６）Ｍａｎβ１，４−ＧｌｃＮＡｃβ１，４−ＧｌｃＮＡｃ］と表わされる。さらにもう１つの実施形態では、この支配的グリカンは、Ｉｇ分子内の異なる部位（Ａｓｎ−２９７以外）で、又はＦａｂ領域内のＮ−グリコシル化部位と組み合わせて、アスパラギンに付加され得る。
【００９８】
下等真核生物における、支配的にＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2を有するＩｇの生産
本発明の１つの態様は、支配的にＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2グリコフォームを有する免疫グロブリン又は抗体分子を生産するために使用し得る、前記グリコフォームを天然に低い収率で生産する哺乳動物細胞において発現される糖タンパク質の組成物に比べて有利な、組換え下等真核宿主細胞を提供する。
【００９９】
糖タンパク質の組成物が、容易に再現可能なあらかじめ定められたグリコシル化パターンで提供されることは、本発明のもう１つの利点である。そのような組成物の性質を評価し、所望特性のために最適化して、一方有害作用は最小限に抑え得るか又は完全に回避し得る。
【０１００】
本発明はまた、本質的にＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2から成るＮ−グリカンを含むＩｇ分子及び支配的にＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2グリカン構造を有するＩｇ組成物の生産のための１又はそれ以上の核酸を発現するように工作又は選択された組換え宿主細胞を生産するための方法を提供する。本発明のある好ましい実施形態では、組換え宿主細胞、好ましくは組換え下等真核宿主細胞が、支配的にＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2グリカンを有する前記Ｉｇ分子及び組成物を生産するために使用される。
【０１０１】
他の好ましい実施形態では、本発明は、組換え宿主細胞から又は本発明の方法によって入手し得る糖タンパク質を含む。
【０１０２】
本発明の宿主細胞は、所望Ｉｇ領域をコードするベクターで、及びここで述べるグリコシル化関連酵素の１又はそれ以上をコードするベクターで形質転換し、その後支配的なＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2 Ｎ−グリカンを有する組換えＩｇ分子又は組成物の発現に関して選択し得る。本発明の組換え宿主細胞は、支配的にＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2 Ｎ−グリカン構造を有するＩｇ組成物を生産するように工作又は選択された、真核又は原核宿主細胞、例えば動物、植物、昆虫、細菌細胞等であり得る。
【０１０３】
好ましくは、本発明の組換え宿主細胞は、当技術分野において記述されているように遺伝子操作された下等真核宿主細胞である（国際公開公報第ＷＯ０２／００８７９号、国際公開公報第ＷＯ０３／０５６９１４号、国際公開公報第ＷＯ０４／０７４４９８号、国際公開公報第ＷＯ０４／０７４４９９号、Choi et al., 2003, PNAS, 100: 5022-5027; Hamilton et al., 2003, Nature, 301: 1244-1246 and Bobrowicz et al., 2004, Glycobiology, 14: 757-766)。特に、国際公開公報第ＷＯ０２／００８７９号は、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2 Ｎ−グリカンを有する糖タンパク質を開示し、国際公開公報第ＷＯ０４／０７４４９９号は、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2 Ｎ−グリカンを支配的に有する糖タンパク質（及び免疫グロブリンの特定開示）を開示する。
【０１０４】
１つの実施形態では、ＩｇＧ１をコードするベクター、例えばＪＣ−ＩｇＧ１を含むＡＯＸ１／ｐＰＩＣＺＡベクター（実施例１）を酵母Ｐ．パストリスＹＡＳ３８５−１菌株に導入する。このＹＡＳ３８５−１菌株は、Ｋ３レポータータンパク質を除去したＹＳＨ４４菌株に類似し(Hamilton et al., 2003, Science, 301: 1244-1246)、記述されているように（米国特許出願第１１／０２０８０８号）ＰＮＯ１及びＭＮＮ４ｂ遺伝子が破壊されており、並びに記述されているように（米国特許出願第１１／１０８０８８号)β−１，４ガラクトシルトランスフェラーゼＩ遺伝子が導入されている。Δｐｎｏ１ Δｍｎｎ４ｂの二重破壊はマンノシルリン酸化の排除を生じさせる。ＵＲＡ５遺伝子によって隣接されるＹＳＨ４４に関して記述されているように(Hamilton et al., 2003)導入されたマンノシダーゼＩＩ遺伝子は、菌株を５−フルオロオロト酸（５−ＦＯＡ）上で増殖させることによって除去された(Guthrie and Fink, 1991, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Vol. 169, Academic Press, San Diego)。マンノシダーゼＩＩ遺伝子の除去は、α−１，６マンノース腕及びα−１，３マンノース上のβ−１，２ＧｌｃＮＡｃに結合した末端α−１，３及びα−１，６マンノース、及びβ−１，２ＧｌｃＮＡｃに結合した末端β−１，４ガラクトースを有する、ペンタ−マンノースコア構造を維持する。次に、ＡＭＲ２遺伝子座にＵＲＡ３遺伝子を挿入したＵＲＡ３ノックアウトプラスミドを用いてＡＭＲ２遺伝子を破壊し(Guthrie and Fink, 1991, supra)、それによってβ−マンノシル化を排除した（米国特許出願第１１／１１８００８号）。このＹＡＳ３８５−１菌株は、ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2及びＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2の両方を支配的に有する糖タンパク質を発現し、それ故ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2とＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2を支配的に有するＪＣ−ＩｇＧを生じさせる。ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2とＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2を支配的に有するこのＪＣ−ＩｇＧのβ−ガラクトシダーゼによる処理は（実施例３）、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2 Ｎ−グリカンを支配的に有するＪＣ−ＩｇＧを生じさせる（実施例４Ａ）。
【０１０５】
もう１つの実施形態では、ＤＸ−ＩｇＧを含むＡＯＸ１／ｐＰＩＣＺＡ内にＩｇＧ１をコードするベクター（実施例１）を、同じく酵母Ｐ．パストリスＹＡ３８５−１菌株（前出）に導入し、精製して、その後β−ガラクトシダーゼで処理し（実施例３）、支配的にＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2 Ｎ−グリカンを有するＤＸ−ＩｇＧを生じさせる（図４Ｂ）。
【０１０６】
あるいは、本発明の抗体は、当技術分野で公知のいくつかの方法を用いて発現することができる（Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 79-97 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)）。
【０１０７】
グリコシルトランスフェラーゼの発現及び下等真核生物への安定な遺伝子組込み
選択マーカー、例えばＵＲＡ３、ＵＲＡ５、ＨＩＳ４、ＳＵＣ２、Ｇ４１８、ＢＬＡ又はＳＨ ＢＬＡを用いて下等真核宿主菌株（例えばＰ．パストリス）に異種遺伝子を導入し、異種遺伝子の組込みを確認するための方法が記述されている。そのような方法は、発現系が下等真核細胞において生産されるとき、本発明のＩｇを生産するように適合させ得る。加えて、望ましくないマンノシルトランスフェラーゼ活性を排除するためにＵＲＡ３マーカーの反復使用を可能にする方法が記述されている。Alani et al., 1987, Genetics, 116: 541-545及び米国特許第６，０５１，４１９号は、Ｐ．パストリスにおいてＵＲＡ３遺伝子を破壊することに基づく選択系を述べている。好ましくは、ウラシルに対する栄養要求性及び５−フルオロオロト酸（５ＦＯＡ）に対する耐性に基づき、陽性及び陰性選択の両方を可能にする、ＰｐＵＲＡ３−又はＰｐＵＲＡ５−ブラスター（blaster）カセットが、ＵＲＡ３、ＵＲＡ５又はウラシル生合成経路内の何らかの遺伝子を破壊するために使用される(Boeke, et al., 1984, Mol. Gen. Genet, 197: 345-346)。当業者は、それ故、そのような系が選択及び対抗選択によって多数の異種遺伝子の挿入を可能にすることを認識する。
【０１０８】
さらなる酵素修飾
さらなる酵素欠失は、ヒトにおいて免疫作用の異常を与え得るマンノシルリン酸化又はβ−マンノシル化を含まないＩｇを単離するために有益又は必要であり得る。上述したように、米国特許出願第１１／０２０８０８号はマンノシルリン酸化の排除のための方法を開示し、米国特許出願第１１／１１８００８号はβ−マンノシル化の排除のための方法を開示する。
【０１０９】
他のタンパク質発現系における、支配的にＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2グリカン構造を有するＩｇの生産
異種タンパク質発現のために、支配的グリカン構造を有するＩｇを発現するように工作する必要がある又は工作する必要がないと考えられる発現宿主系（生物）が選択されることは当業者に了解される。ここで提供する実施例は、Ａｓｎ−２９７又はもう１つ別のＮ−グリコシル化部位又はその両方で特定グリカンを有するＩｇの発現を実施するための１つの方法の例である。当業者は、本発明のこれらの詳細及び実施例をいかなるタンパク質発現宿主系（生物）にも容易に適合させることができる。
【０１１０】
動物、植物、昆虫、細菌細胞等を含む他のタンパク質発現宿主系は、本発明に従ったＩｇ分子及び組成物を生産するために使用し得る。そのようなタンパク質発現宿主系は、支配的グリコフォームを発現するように工作又は選択し得るか、あるいは支配的グリカン構造を有する糖タンパク質を天然で生産し得る。支配的グリコフォームを有する糖タンパク質を生産する、工作されたタンパク質発現宿主系の例は、遺伝子ノックアウト／突然変異(Shields et al., 2002, JBC, 277: 26733-26740)；遺伝子操作(Umana et al., 1999, Nature Biotech., 17: 176-180)又は両方の組合せを含む。あるいは、ある種の細胞−例えばニワトリ、ヒト及びウシ−は、支配的グリコフォームを天然に発現する(Raju et al., 2000, Glycobiology, 10: 477-486)。それ故、本発明に従った１つの特定グリカン構造を支配的に有するＩｇ糖タンパク質又は組成物の発現は、当業者により、多くの発現宿主系の少なくとも１つを選択することによって達成され得る。糖タンパク質の生産のために当技術分野において見出されるさらなる発現宿主系は、ＣＨＯ細胞：Ｒａｊｕ国際公開公報第ＷＯ９９２２７６４Ａ１号及びＰｒｅｓｔａ国際公開公報第ＷＯ０３／０３５８３５Ａ１号；ハイブリドーマ細胞：Trebak et al., 1999, J. Immunol. Methods, 230: 59-70；昆虫細胞：Hsu et al., 1997, JBC, 272:9062-970、及び植物細胞：Gerngross et al., 国際公開公報第ＷＯ０４／０７４４９９Ａ２号を含む。
【０１１１】
ＩｇＧの精製
抗体の精製及び単離のための方法は公知であり、当技術分野において開示されている。例えばKohler & Milstein, (1975) Nature 256:495; Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp.51- 63, Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-104 (Academic Press, 1986); and Jakobovits et al.(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2551-255 and Jakobovits et al., (1993) Nature 362:255-258参照。さらなる実施形態では、抗体又は抗体フラグメントを、適切な抗体又は抗体フラグメントを選択するための対象抗原を使用して、McCafferty et al. (1990) Nature, 348:552-554 (1990)に述べられている手法を用いて作製される抗体ファージライブラリーから単離することができる。
【０１１２】
本発明の方法に従って生産される組換えＩｇ分子は、実施例３で概説する方法に従って精製することができる。図２は、ＹＡＳ３８５−１から精製したＪＣ−ＩｇＧのＳＤＳ−ＰＡＧＥクマシー染色ゲルを示す。図３は、ＹＡＳ３８５−１から精製したＤＸ−ＩｇＧのＳＤＳ−ＰＡＧＥクマシー染色ゲルを示す。もう１つの実施形態では、精製Ｉｇ抗体は、支配的Ｎ−グリカンとしてＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2を有する。何らかのＩｇ分子に関するグリカンの分析及び分布は、ＨＰＬＣ、ＮＭＲ、ＬＣＭＳ及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳを含むがこれらに限定されない、当業者に公知のいくつかの質量分析法によって測定することができる。好ましい実施形態では、グリカンの分布は、実施例５において開示するようなＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ分析によって測定される。図４Ａは、ＹＡＳ３８５−１から精製し、β−ガラクトシダーゼで処理したＪＣ−ＩｇＧのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルを示す（実施例３）。このＭＡＬＤＩ−ＴＯＦは、総Ｎ−グリカンの約５５．８モル％がＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2であることを示す。図４Ｂは、ＹＡＳ３８５−１から精製し、β−ガラクトシダーゼで処理したＤＸ−ＩｇＧのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルを示す。このＭＡＬＤＩ−ＴＯＦは、総Ｎ−グリカンの約６０モル％がＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2であることを示す。
【０１１３】
医薬組成物
本発明の抗体は、活性治療物質としての抗体及び様々な他の製薬上許容される成分を含有する医薬組成物の組み込むことができる。Remington's Pharmaceutical Science (15th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, 1980)参照。好ましい形態は、意図する投与様式及び治療適用に依存する。組成物はまた、所望する製剤に依存して、動物又はヒトへの投与のための医薬組成物を製剤するために一般的に使用される賦形剤と定義される、製薬上許容される非毒性担体又は希釈剤を含み得る。希釈剤は、配合剤の生物活性に影響を及ぼさないように選択される。そのような希釈剤の例は、蒸留水、生理的リン酸緩衝食塩水、リンガー液、デキストロース溶液及びハンクス液である。加えて、医薬組成物又は製剤はまた、他の担体、アジュバント、又は非毒性、非治療性、非免疫原性安定剤等も含み得る。
【０１１４】
非経口投与用の医薬組成物は、無菌で、実質的に等張であり、発熱物質不含であって、ＦＤＡ又は同様の機関のＧＭＰに従って製造される。抗体は、滅菌液、例えば水、油、食塩水、グリセロール又はエタノールであり得る、製薬上許容される担体と共に生理的に許容される希釈剤中の物質の溶液又は懸濁液の注射用製剤として投与することができる。加えて、補助剤、例えば湿潤剤又は乳化剤、界面活性剤、ｐＨ緩衝物質等が組成物中に存在し得る。医薬組成物の他の成分は、石油、動物、植物又は合成起源の成分、例えば落花生油、ダイズ油及び鉱物油である。一般に、グリコール、例えばプロピレングリコール又はポリエチレングリコールは、特に注射用溶液のために、好ましい液体担体である。抗体は、有効成分の持続放出を可能にするように製剤できるデポー注射剤又は移植製剤の形態で投与され得る。典型的には、組成物は、液体溶液又は懸濁液のいずれかの、注射剤として製造され、注射の前に液体媒質中に溶解又は懸濁するのに適した固体形態も製造され得る。製剤はまた、上述したように、アジュバント作用を増強するためにリポソーム又は微粒子、例えばポリアクチド、ポリグリコリド、又はコポリマーに乳化又は封入することができる（Langer, Science 249, 1527 (1990) and Hanes, Advanced Drug Delivery Reviews 28, 97-119 (1997)参照）。
【０１１５】
診断製品
本発明の抗体はまた、様々な診断キット及び他の診断製品、例えばアレイに組み込むことができる。抗体はしばしば固相、例えばマイクロタイタープレートのウエルにあらかじめ結合して提供される。キットはまた、しばしば、抗体結合を検出するための試薬及びキットの使用のための指示を与えるラベルを含む。免疫測定法又はサンドイッチアッセイは診断キットのための好ましい形式である（米国特許第４，３７６，１１０号、同第４，４８６，５３０号、同第５，９１４，２４１号及び同第５，９６５，３７５号参照）。抗体アレイは、例えば米国特許第５，９２２，６１５号、同第５，４５８，８５２号、同第６，０１９，９４４号及び同第６，１４３，５７６号に述べられている。
【０１１６】
治療適用
本発明は、糖タンパク質の特定グリコフォームを支配的に含む糖タンパク質組成物を提供する。ヒトを含む哺乳動物に投与したとき、新規糖タンパク質組成物を含む医薬組成物が、好ましい実施形態では、類似一次構造を有する他の糖タンパク質組成物に比べて卓越したインビボ特性を好都合に示すことが本発明の特徴である。それ故、本発明の新規組成物は、現在糖タンパク質薬剤が使用されているいかなる場所でも使用でき、改善された特性並びに生産ロット間で及び生産ロット全体を通して高い均一性を好都合に提供し得る。本発明の製剤は、特定薬物又は薬剤及びその標的領域に依存して、溶液、単位投与形態、例えば経口投与用の錠剤及びカプセル、並びに懸濁液、軟膏等に組み込むことができる。
【０１１７】
特定態様では、本発明は、糖タンパク質が免疫グロブリン分子を含み、組成物が糖タンパク質物質の特定グリコフォームを支配的に含む、糖タンパク質医薬製剤、薬物又は薬剤のための新規組成物を提供する。本発明の特定態様によれば、ここで述べるＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2グリカン構造のＮ結合オリゴ糖を支配的に有する免疫グロブリン糖タンパク質を含む組成物が提供される。好ましい態様では、糖タンパク質は抗体であり、特にモノクローナル抗体であり得る。本発明はさらに、本発明の組成物を生産するための方法及びツールを提供する。
【０１１８】
本発明はさらに、本発明のグリコフォーム製剤を含む医薬組成物を包含する。前記組成物は、好ましくは無菌である。組成物が水溶液である場合、好ましくは、糖タンパク質は可溶性である。組成物が凍結乾燥粉末である場合、好ましくは、粉末は適切な溶媒中に再溶解することができる。
【０１１９】
他の態様では、本発明は、その必要のある哺乳動物に本発明の医薬組成物の治療有効用量を投与することを含む、疾患状態の治療のための方法を含む。疾患又は障害を治療するために使用できる製品又はキットの中でグリコフォーム製剤を提供することが本発明のさらなる目的である。
【０１２０】
ＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2 Ｎ−グリカンを支配的に有する本発明のＩｇ分子は、適応症、例えば癌、炎症性疾患、感染、免疫疾患、特発性血小板減少性紫斑病、関節炎、全身性エリテマトーデス及び自己免疫性溶血性貧血を含む自己免疫疾患のための、多くの治療適用を有する。
【０１２１】
以下は、Ｉｇ糖タンパク質組成物の生産に関する本発明の組成物及び方法を説明する実施例である。これらの実施例は限定と解釈されるべきではない−実施例は説明のためにのみ含まれるものである。当業者は、最適化を含む、本開示の数多くの修正及び拡大が可能であることを認識する。そのような修正及び拡大は本発明の一部とみなされる。
【実施例１】
【０１２２】
Ｐ．パストリスにおける発現のためのＤＸ−ＩｇＧ１のクローニング
ＤＸ−ＩｇＧ１（抗ＣＤ２０ ＩｇＧ１）の軽（Ｌ）鎖及び重（Ｈ）鎖は、マウス可変領域とヒト定常領域から成る。軽鎖を配列番号１として、及び重鎖を配列番号２として開示する。重鎖及び軽鎖配列は、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）より購入した重複オリゴヌクレオチドを用いて合成した。軽鎖可変領域については、１５個の重複オリゴヌクレオチド（配列番号５−１９）を購入し、５’ ＭｌｙＩ部位を有する軽鎖可変領域フラグメントを作製するためにＰＣＲ反応においてＥｘｔａｑ（Ｔａｋａｄａ）を用いてアニーリングした。次にこの軽鎖可変フラグメントを、５’ＭｌｙＩプライマーＣＤ２０Ｌ／ｕｐ（配列番号２０）、３’可変／５’定常プライマーＬｆｕｓｉｏｎＲＴＶＡＡＰＳ／ｕｐ（配列番号２１）、３’定常領域プライマーＬｆｕｓｉｏｎＲＴＶＡＡＰＳ／ｌｐ（配列番号２２）及び３’ＣＤ２０Ｌ／ｌｐ（配列番号２３）を用いたオーバーラップＰＣＲによって軽鎖定常領域（配列番号３）（Ｇｅｎｅ Ａｒｔ，Ｔｏｒｏｎｔｏ，Ｃａｎａｄａ）と連結した。最終的なＭｌｙＩ−軽鎖フラグメント（５’ＡＧ塩基対を含んだ）をｐＣＲ２．１トポベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に挿入してｐＤＸ３４３を生成した。重鎖については、マウス重鎖可変領域に対応する１７個の重複オリゴヌクレオチド（配列番号２４−４０）をＩＤＴより購入し、Ｅｘｔａｑを用いてアニーリングした。次にこの重鎖可変フラグメントを、５’ＭｌｙＩプライマーＣＤ２０Ｈ／ｕｐ（配列番号４１）、５’可変／定常プライマーＨｃｈａｉｎＡＳＴＫＧＰＳ／ｕｐ（配列番号４２）、３’可変／定常領域プライマーＨｃｈａｉｎＡＳＴＫＧＰＳ／ｌｐ（配列番号４３）及び３’定常領域プライマーＨＦｃｋｐｎ１／ｌｐ（配列番号４４）を用いたオーバーラップＰＣＲによって重鎖定常領域（配列番号４）（Ｇｅｎｅ Ａｒｔ）と連結した。最終的なＭｌｙＩ−重鎖フラグメント（５’ＡＧ塩基対を含んだ）をｐＣＲ２．１トポベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に挿入してｐＤＸ３６０を生成した。完全長軽鎖及び完全長重鎖をそれぞれのトポベクターからＭｌｙ１及びＮｏｔ１フラグメントとして単離した。次にこれらの軽鎖及び重鎖フラグメントを、４個の重複オリゴヌクレオチド−Ｐ．ＢｉＰｓｓ／ＵＰ１−ＥｃｏＲＩ、Ｐ．ＢｉＰｓｓ／ＬＰ１、Ｐ．ＢｉＰｓｓ／ＵＰ２及びＰ．ＢｉＰ／ＬＰ２（それぞれ配列番号４６−４９）を用いてＫａｒ２（Ｂｉｐ）シグナル配列（配列番号４５）に連結し、その後ｐＰＩＣＺＡのＥｃｏＲＩ−Ｎｏｔ１部位に連結して、Ｋａｒ２−軽鎖を担持するｐＤＸ３４４とＫａｒ２−重鎖を担持するｐＤＸ４６８を生成した。ｐＤＸ３４４からのＢｇｌＩＩ−ＢａｍＨＩフラグメントを、次に、染色体組込みのためにＡＯＸ２プロモーター遺伝子を含むｐＢＫ８５にサブクローニングして、ｐＤＸ４５８を生成した。次に、重鎖を担持するｐＤＸ４６８からのＢｇｌＩＩ−ＢａｍＨＩフラグメントをｐＤＸ４５８にサブクローニングして、ＡＯＸ１プロモーター下にＣＤ２０の重鎖と軽鎖の両方を含むｐＤＸ４７８を生成した。次にこのプラスミドをＳｐｅＩで線状化した後、ＡＯＸ２遺伝子座への組込みのために形質転換し、ゼオシン耐性を用いて形質転換体を選択した（実施例２参照）。
【０１２３】
Ｐ．パストリスにおける発現のためのＪＣ−ＩｇＧのクローニング
ＪＣ−ＩｇＧ１の軽（Ｌ）鎖及び重（Ｈ）鎖は、マウス可変領域とヒト定常領域から成る。マウス可変軽鎖を配列番号５０（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＦ０１３５７６）として、及びマウス可変重鎖を配列番号５１（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＦ０１３５７７）として開示する。重鎖及び軽鎖配列は、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）より購入した重複オリゴヌクレオチドを用いて合成した。軽鎖については、１２個の重複オリゴヌクレオチド（配列番号５２−６３）を購入し、５’ ＥｃｏＲＩ部位及び３’Ｋｐｎ１部位を有する６６０塩基対の軽鎖を生成するためにＰＣＲ反応においてＥｘｔａｑ（Ｔａｋａｄａ）を用いてアニーリングした。次にこの軽鎖を、ＥｃｏＲＩ−Ｋｐｎ１フラグメントとしてｐＰＩＣＺａベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にサブクローニングした。重鎖については、Ｆａｂフラグメントに対応する１２個の重複オリゴヌクレオチド（配列番号６４−７５）を購入し、６６０塩基対のＦａｂフラグメントを生成するためにＥｘｔａｑを用いてアニーリングした。Ｆｃフラグメントは、１２個の重複オリゴヌクレオチド（配列番号７６−８７）を用いて、同様のオーバーラップＰＣＲ反応でそれらをアニーリングして合成した。次に重鎖のＦａｂとＦｃフラグメントの両方を、重鎖Ｆａｂフラグメントの５’末端に対応する５’ＥｃｏＲＩプライマー（配列番号６４）及びＦｃフラグメントの３’末端に対応する３’Ｋｐｎ１プライマー（配列番号８８）を使用して、ｐＦＵ Ｔｕｒｂｏポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いてアニーリングし、１，３３０塩基対の重鎖を生成した。プライマー内にコードされる５’ＥｃｏＲＩ及び３’Ｋｐｎ１部位を用いて、重鎖をｐＰＩＣＺａベクターにクローニングした。組込み遺伝子座として機能するＡＯＸ２プロモーター配列を最終的なｐＰＩＣＺａベクターにサブクローニングした。次に、ＡＯＸ１プロモーターを含むＢｇｌＩＩ−ＢｓｔＢ１フラグメント、及びヒト肝ｃＤＮＡライブラリー（配列番号８９）からのＨＳＡ配列、トロンビン部位（配列番号９０）及びＪＣ軽鎖を含むＢｓｔＢ１−ＢａｍＨＩフラグメントの両方を、このＡＯＸ２／ｐＰＩＣＺａベクターのＢａｍＨＩ部位にサブクローニングした。次にＡＯＸ１プロモーターを含むもう１つ別のＢｌｇＩＩ−ＢｓｔＢＩフラグメント、及びＨＳＡ配列、トロンビン部位及びＪＣ重鎖を含むＢｓｔＩＢ１−ＢａｍＨＩフラグメントをこの同じｐＰＩＣＺａベクターのＢａｍＨＩ部位にサブクローニングした。この最終的なベクターは、ＡＯＸ２組込み遺伝子座、ＨＳＡ標識ＪＣ軽鎖及びＨＳＡ標識ＪＣ重鎖を含み、ｐＪＣ１４０を生成した。この発現カセットをＰ．パストリス菌株のＡＯＸ２遺伝子座に組み込み、形質転換体をゼオシン耐性に関して選択した（実施例２参照）。
【０１２４】
リツキシマブ（登録商標）／リツキサン（登録商標）は、Ｂｉｏｇｅｎ−ＩＤＥＣ／Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡより購入した抗ＣＤ２０マウス／ヒトキメラＩｇＧｌである。
【０１２５】
ＰＣＲ増幅。エッペンドルフマスターサイクラーを全てのＰＣＲ反応のために使用した。ＰＣＲ反応は、鋳型ＤＮＡ、１２５μＭ ｄＮＴＰ、各々０．２μＭの正及び逆プライマー、Ｅｘ Ｔａｑポリメラーゼ緩衝液（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ Ｉｎｃ．）及びＥｘ Ｔａｑポリメラーゼ、又はｐＦＵ Ｔｕｒｂｏポリメラーゼ緩衝液（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）及びｐＦＵ Ｔｕｒｂｏポリメラーゼを含んだ。ＤＮＡフラグメントを、９７℃、１５秒間、５５℃、１５秒間及び７２℃、９０秒間の３０サイクル及び９７℃、２分間の初期変性工程と７２℃、７分間の最終伸長工程によって増幅した。
【０１２６】
ＰＣＲ試料をアガロースゲル電気泳動によって分離し、ＤＮＡバンドを抽出して、Ｑｉａｇｅｎからのゲル抽出キットを用いて精製した。全てのＤＮＡ精製物は、脱イオン水中で溶出した最終ＰＣＲ（３つのフラグメント全部の重複）を除き、１０ｍＭ トリス、ｐＨ８．０中で溶出した。
【実施例２】
【０１２７】
Ｐ．パストリスＹＡＳ３８５−１菌株へのＩｇＧベクターの形質転換。ベクターＤＮＡを、酢酸ナトリウムを０．３Ｍの最終濃度まで添加することによって作製する。次に１００％氷冷エタノールを７０％の最終濃度までＤＮＡ試料に添加する。ＤＮＡを遠心分離（１２０００ｇ×１０分間）によってペレット化し、７０％氷冷エタノールで２回洗浄する。ＤＮＡを乾燥し、１０ｍＭ トリス、ｐＨ８．０ ５０μｌに再懸濁する。形質転換するＹＡＳ３８５−１酵母培養（Choi et al., 2003; Hamilton et al., 2003）は、より少量の培養をＢＭＧＹ培地（緩衝最小グリセロール：１００ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ６．０；１．３４％酵母窒素ベース；４×１０-5％ビオチン；１％グリセロール）中で〜２−６のＯ．Ｄ．に増殖させることによって調製する。次に酵母細胞を、１Ｍソルビトール中で３回洗い、１Ｍ ソルビトール〜１−２ｍｌに再懸濁することによってエレクトロコンピテントにする。ＤＮＡ（１−２μｇ）をコンピテント酵母１００μｌと混合し、氷上で１０分間インキュベートする。次に、以下のパラメータ：１．５ｋＶ、１２９Ω及び２５μＦ、を用いてＢＴＸ Ｅｌｅｃｔｒｏｃｅｌｌ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｏｒ ６００で酵母細胞を電気穿孔する。ＹＰＤＳ（１％酵母抽出物、２％ペプトン、２％デキストロース、１Ｍ ソルビトール）１ｍｌを電気穿孔細胞に添加した。その後、ゼオシンを含む選択寒天平板に形質転換酵母をプレートした。
【０１２８】
Ｐ．パストリスにおけるＩｇＧｌのための培養条件。ｐＤＸ４７８又はｐＪＣ１４０で形質転換したＹＡＳ３８５−１の単一コロニーを、５０ｍｌファルコン遠心チューブ中のＢＭＧＹ培地（１％酵母抽出物、２％ペプトン、１００ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）、１．３４％酵母窒素ベース、４×１０-5％ビオチン及び１％グリセロールから成る）１０ｍｌに接種した。培養を、２４℃／１７０−１９０ｒｐｍで振とうしながら４８時間、培養が飽和するまでインキュベートした。次にＢＭＧＹ１００ｍｌを５００ｍｌバッフル付きフラスコに加えた。その後種培養を、ＢＭＧＹ培地１００ｍｌを含むバッフル付きフラスコに移した。この培養を、２４℃／１７０−１９０ｒｐｍで振とうしながら２４時間インキュベートした。フラスコの内容物を２つの５０ｍｌファルコン遠心チューブ中に傾瀉し、３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。細胞ペレットを、グリセロールを含まないＢＭＧＹ２０ｍｌで１回洗い、続いてＢＭＭＹ（１％グリセロールの代わりに１％ＭｅＯＨを含むＢＭＧＹ）２０ｍｌで静かに再懸濁した。懸濁細胞を２５０ｍｌバッフル付きフラスコに移した。培養を、２４℃／１７０−１９０ｒｐｍで振とうしながら２４時間インキュベートした。次にフラスコの内容物を２つの５０ｍｌファルコン遠心チューブ中に傾瀉し、３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。タンパク質単離の前におおよその抗体力価を測定するために培養上清をＥＬＩＳＡによって分析した（実施例３参照）。
培養上清中の抗体の定量を固相酵素免疫検定法（ＥＬＩＳＡ）によって実施した：高結合マイクロタイタープレート（Ｃｏｓｔａｒ）を、ＰＢＳ、ｐＨ７．４ １０ｍｌ中のヤギ抗ヒトＦａｂ（Ｂｉｏｃａｒｔａ，Ｉｎｃ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）２４μｇで被覆し、４℃で一晩インキュベートした。緩衝液を除去し、ブロッキング緩衝液（ＰＢＳ中３％ＢＳＡ）を添加して、その後室温で１時間インキュベートした。ブロッキング緩衝液を除去し、プレートをＰＢＳで３回洗った。最後の洗浄後、漸増容量の抗体培養上清（０．４、０．８、１．５、３．２、６．２５、１２．５、２５及び５０μｌ）を添加し、室温で１時間インキュベートした。次にプレートをＰＢＳ＋０．０５％トゥイーン２０で洗った。最後の洗浄後、抗ヒトＦｃ−ＨＲＰを１：２０００ＰＢＳ溶液中に添加し、その後室温で１時間インキュベートした。次にプレートをＰＢＳ＋トゥイーン２０で４回洗った。ＴＭＢ基質キットを製造者の指示に従って使用して（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）プレートを分析した。
【実施例３】
【０１２９】
ＩｇＧｌの精製
ＳｔｒｅａｍｌｉｎｅプロテインＡカラムを使用して培養上清からモノクローナル抗体を捕獲した。抗体をトリス−グリシンｐＨ３．５中で溶出し、１Ｍ トリスｐＨ８．０を用いて中和した。疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を用いてさらなる精製を実施した。ＨＩＣカラムの詳細な型は抗体に依存する。ＪＣ−ＩｇＧ及びＤＸ−ＩｇＧに関して、フェニルセファロースカラム（オクチルセファロースも使用できる）を２０ｍＭ トリス（７．０）、１Ｍ（ＮＨ4）2ＳＯ4緩衝液と共に使用して、１Ｍ−０Ｍ（ＮＨ4）2ＳＯ4の線形勾配緩衝液で溶出した。フェニルセファロースカラムからの抗体分画をプールし、陽イオン交換（ＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）カラムを通しての最終精製のために５０ｍＭ ＮａＯＡｃ／トリスｐＨ５．２緩衝液に交換した。５０ｍＭ トリス、１Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ７．０）を用いた線形勾配で抗体を溶出した。
【０１３０】
β−ガラクトシダーゼによるＩｇ−ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2の処理
精製ＩｇＧ（ＪＣ−ＩｇＧ又はＤＸ−ＩｇＧ）５ｍｇを５０ｍＭ ＮＨ4Ａｃ ｐＨ５．０に緩衝液交換した。シリコーン処理チューブにおいて、β−１，４ガラクトシダーゼ０．０３Ｕ（ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を、５０ｍＭ ＮＨ4Ａｃ ｐＨ５．０中の精製ＩｇＧに添加し、３７℃で１６−２４時間インキュベートした。この試料を蒸発乾固させ、水に再懸濁して、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによって分析した。次に、上述したようなフェニルセファロース精製を用いてβ−１，４ガラクトシダーゼから抗体を精製した。
【実施例４】
【０１３１】
精製Ｉｇの検出
精製ＪＣ−ＩｇＧ又はＤＸ−ＩｇＧを適切な容量の試料負荷緩衝液と混合し、プレキャストゲルを製造者の指示に従って使用して（ＮｕＰＡＧＥビス−トリス電気泳動システム；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．）ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に供した。ゲルタンパク質をクマシーブリリアントブルー染料（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）で染色した。図２及び３参照。
【０１３２】
抗体濃度
タンパク質クロマトグラフィー分画の濃度を、アルブミンを標準品として用いる（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）ブラッドーフォードアッセイ(Bradford, M. 1976, Anal. Biochem. (1976) 72, 248-254)によって測定した。
【実施例５】
【０１３３】
ＩｇＧｌ炭水化物分析
マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ）。アスパラギン結合オリゴ糖のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析：Ｎ結合グリカンを、Papac et al., Glycobiology 8, 445-454 (1998)の修正手順を用いてＪＣ−ＩｇＧ及びＤＸ−ＩｇＧから放出した。抗体の試料を還元し、カルボキシメチル化して、膜をブロックし、ウエルを水で３回洗った。Ｎ−グリカナーゼ（ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）１ｍＵを含む１０ｍＭ ＮＨ4ＨＣＯ3（ｐＨ８．３）３０μｌを加えてＩｇＧタンパク質を脱グリコシル化した。３７℃で１６時間後、グリカンを含む溶液を遠心分離によって除去し、蒸発乾固させた。各々のウエルからの乾燥グリカンを水１５μｌに溶解し、０．５μｌをステンレス鋼試料プレート上にスポットして、Ｓ−ＤＨＢマトリックス（１：１の水／アセトニトリル／０．１％トリフルオロ酢酸中の９ｍｇ／ｍｌジヒドロキシ安息香酸／１ｍｇ／ｍｌ ５−メトキシ−サリチル酸）０．５μｌと混合し、放置乾燥させた。４−ｎｓパルス時間でのパルス窒素レーザー（３３７ｎｍ）の照射によってイオンを生成した。装置は、１２５−ｎｓ遅延及び２０ｋＶの加速電圧で、遅延引き出しモードで操作した。グリッド電圧は９３．００％、ガイドワイヤ電圧は０．１％、内圧は＜５×１０-7トール（１トール＝１３３Ｐａ）、及び低質量ゲートは８７５Ｄａであった。合計１００−２００レーザーパルスからスペクトルを作成し、５００ＭＨｚデジタイザで獲得した。（Ｍａｎ）5（ＧｌｃＮＡｃ）2オリゴ糖を外部分子量標準として使用した。全てのスペクトルを陽イオンモードの装置で作成した。
【実施例６】
【０１３４】
抗原結合ＥＬＩＳＡアッセイ
高結合マイクロタイタープレート（Ｃｏｓｔａｒ）を、ＰＢＳ、ｐＨ７．４中の抗原１０μｇで被覆し、４℃で一晩インキュベートした。緩衝液を除去し、ブロッキング緩衝液（ＰＢＳ中３％ＢＳＡ）を添加して、その後室温で１時間インキュベートした。ブロッキング緩衝液を除去し、プレートをＰＢＳで３回洗った。最後の洗浄後、０．２ｎｇ−１００ｎｇの漸増量の精製抗体を添加し、室温で１時間インキュベートした。次にプレートをＰＢＳ＋０．０５％トゥイーン２０で洗った。最後の洗浄後、抗ヒトＦｃ−ＨＲＰを１：２０００ＰＢＳ溶液に添加し、その後室温で１時間インキュベートした。次にプレートをＰＢＳ＋トゥイーン２０で４回洗った。ＴＭＢ基質キットを製造者の指示に従って使用して（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）プレートを分析した。
【０１３５】
Ｆｃ受容体結合アッセイ
ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａ及びＦｃγＲＩＩＩｂについてのＦｃ受容体結合アッセイを、先に記述されているプロトコールに従って実施した(Shields et al., 2001, J.Biol.Chem, 276: 6591-6604)。ＦｃγＲＩＩＩ結合については：ＰＢＳ、ｐＨ７．４中１μｇ／ｍｌのＦｃγＲＩＩＩｂ（図５）及びＦｃγＲＩＩｂ（図７）融合タンパク質又は０．８μｇ／ｍｌのＦｃγＲＩＩＩａ−ＬＦ（図６）融合タンパク質を４℃で４８時間、ＥＬＩＳＡプレート（Ｎａｌｇｅ−Ｎｕｎｃ，Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ，ＩＬ）に被覆した。プレートを２５℃で１時間、ＰＢＳ中３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）でブロックした。ＪＣ−ＩｇＧ又はＤＸ−ＩｇＧ二量複合体を、２：１モル量のＪＣ−ＩｇＧ又はＤＸ−ＩｇＧとＨＲＰ複合Ｆ（Ａｂ’）2抗Ｆ（Ａｂ’）2を２５℃で１時間混合することにより、ＰＢＳ中１％ＢＳＡにおいて作製した。次に二量複合体を１％ＢＳＡ／ＰＢＳ中１：２で連続希釈し、２５℃で１時間プレートに被覆した。使用した基質は３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）である。４５０ｎｍでの吸光度を製造者の指示に従って（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）読み取った。
【０１３６】
Ｂ細胞における抗体フィードバックについてのＥＬＩＳＰＯＴアッセイ
このアッセイは、Westman, et al., 1997, Scand. J. Immunol. 46: 10-15に述べられているように実施する。ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を最初にＩｇＧ抗体に複合し、ＢＳＡ−ＩｇＧ複合体を生成する。ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを用いてＢＳＡ特異的ＩｇＧを分泌するＢ細胞の数を測定する。注入マウスから脾臓を切除し、０．５％正常マウス血清を含むＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）中で細胞懸濁液を調製する。細胞懸濁液１００μｌをＢＳＡ被覆マイクロタイタープレートに適用し（上記ＥＬＩＳＡプロトコール参照）、３７℃、５％ＣＯ2で３．５時間インキュベートする。プレートを洗い、ＰＢＳ−トゥイーン中１／１００希釈のアルカリホスファターゼ複合ヒツジ抗マウスＩｇＧ５０μｌと共に約４℃でインキュベートする。５ブロモ−４−クロロ−３−インドイルホスフェート（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）５０μｌ中、室温で１時間スポットを展開し、立体顕微鏡下で計数する。
【実施例７】
【０１３７】
ＡＤＣＣについては、Vugmeyster and Howell, 2004, Int. Immunopharm. 4: 1117-1124に述べられているように血液マトリックス試験（例えばＢ細胞除去）を用いて検定する。血漿及び赤血球（ＲＢＣ）を除去した全血を、染色緩衝液（１％ＢＳＡ及び０．１％アジ化ナトリウムを含むハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ））に再溶解して、染色緩衝液中の白血球懸濁液を調製する。次に全血試料を１０００ｇで５分間遠心し、上清（血漿）を廃棄して、ペレットを塩化アンモニウム溶解（ＡＣＬ）試薬で処理し、洗浄して、等容量の染色緩衝液に再懸濁する。Ｂ細胞除去アッセイについては：抗体の１００μｇ／ｍｌ溶液又は染色緩衝液１０μｌをＳＢマトリックス９０μｌに添加し、３７℃で１時間インキュベートする。試料を直ちに抗ＣＤ１９−ＦＩＴＣ及び抗ＣＤ４５−ＰＥによって２５℃で３０分間染色する。次に試料を１％ホルムアルデヒド中に固定し、３回測定する。フローサイトメトリーによってＢ細胞除去の定量を得る。Ｂ細胞除去のフローサイトメトリー分析：自動ＦＡＣＳローダー及びＣｅｌｌ Ｑｕｅｓｔソフトウエアを備えるＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を、全ての試料の獲得と分析のために使用する。サイトメータのＱＣと設定は、装置の機能性と検出器の線形性を確認するためにＣａｌｉＢｒｉｔｅビーズ及びＳｐｈｅｒｏ Ｔｅｃｈレインボービーズ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を検定することを含む。装置の設定を確認するために各々のアッセイに関してアイソタイプと補正対照を検定する。総リンパ球のＢ細胞パーセントを以下のゲーティング戦略によって得る。リンパ球個体群を前方散乱／側方散乱散布図上に示して領域１（Ｒ１）を定義する。Ｒ１における事象を用いて、ＣＤ１９及びＣＤ４５マーカーに関して蛍光強度ドットプロットを示す。蛍光標識したアイソタイプ対照を使用して、ＣＤ１９及びＣＤ４５陽性度に関するそれぞれのカットオフ点を決定する。ＣｅｌｌＱｕｅｓｔを用いて、ＣＤ１９陽性、ＣＤ４５陽性表現型を有するＲ１領域内の細胞の分画としてＢ％を決定する。各々の処置群について３つの試料を検定する。Ｂ細胞除去パーセントを、式平均［１００＊（１−対照抗体で処理したＢ％／平均［ＳＢで処理したＢ％］）を用いて算定する。蛍光染料放出ＡＤＣＣアッセイ：ＰＢＭＣ単離：健常個人又は供血者（１０−２０からの末梢静脈血をヘパリン加真空採血管（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｒｕｔｈｅｒｆｏｒｄ，ＮＪ，ＵＳＡ）に収集する。２匹のマウスに移植するのに血液約５ｍｌが必要である。ＯｐｔｉＰｒｅｐを製造者の指示に従って使用して、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を遠心分離によって分離する。ＰＢＭＣを、２０％ウシ胎仔血清を添加した、ＲＰＭＩ １６４０、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１００ＩＵ／ｍｌ ペニシリン、１００ｇ／ｍｌ ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）から成る完全培地（ＣＭ）で１回洗浄し、その後１×１０6／ｍｌ ＣＭの濃度で再懸濁して、単球除去のために２５０ｍｌ培養フラスコ（Ｆａｌｃｏｎ，ＮＪ，ＵＳＡ）に移す。３７℃、５％ＣＯ2で１時間のインキュベーション後、非接着細胞を回収し、培地で１回洗って、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を２．５×１０7／ｍｌ ＣＭの濃度に調整する。蛍光染料放出ＡＤＣＣ。ＡＤＣＣアッセイの前提は、ＣＤ２０又はＣＤ４０抗原を提示する標的細胞（それぞれＲａｊｉ細胞系又はＢＣＬ１−３Ｂ３細胞）への抗体結合がエフェクター細胞上のＦｃγ受容体への標的細胞結合を刺激することである。これは、次に、ＣＤ２０又はＣＤ４０抗原を提示する標的細胞の溶解を促進し、定量することができる内部蛍光染料を放出する。標的細胞の51Ｃｒ標識の代わりにアラマーブルー蛍光を使用する。ＣＤ２０提示Ｒａｊｉ細胞懸濁液（１×１０4細胞）５０μｌを、９６穴組織培養プレートにおいて５０μｌ量の抗ＤＸ−ＩｇＧ又は抗ＪＣ−ＩｇＧ ｍＡｂ（様々な濃度）及び上述したように単離した５０μｌ量のＰＢＭＣエフェクター細胞と混合し（エフェクター対標的細胞の比は１００：１、５０：１、２５：１及び１２．５：１であり得る）、Ｒａｊｉ又はＢＣＬ１−３Ｂ３細胞の溶解を促進するために３７℃、５％ＣＯ2で４時間インキュベートする。アラマーブルー５０μｌを添加し、染料の取り込みとその蛍光状態への代謝を可能にするためにさらに５時間インキュベーションを継続する。プレートを振とう機上で室温に冷却し、５３０ｎｍの励起と５９０ｎｍの放出で蛍光光度計において蛍光を読み取る。相対蛍光単位（ＲＦＵ）をｍＡｂ濃度に対してプロットし、対照抗体、例えばリツキシマブ（登録商標）を用いて標準曲線から試料濃度を算定する。重症複合型免疫欠損（ＳＣＩＤ）マウスを用いたインビボＡＤＣＣ(Niwa et al., 2004, Cancer Research, 64: 2127-2133)。インビボＡＤＣＣ活性は、ヘテロ接合（ＦｃγＲＩＩＩａ−ＬＦ／ＦｃγＲＩＩＩａ−ＬＶ）及びホモ接合（ＦｃγＲＩＩＩａ−ＬＶ／ＦｃγＲＩＩＩａ−ＬＶ及びＦｃγＲＩＩＩａ−ＬＦ／ＦｃγＲＩＩＩａ−ＬＦ）遺伝子型を含む健常ドナーからのヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を移植したマウスモデルを用いて検定することができる。このモデル系を使用して、支配的Ｎ−グリカンを有するＩｇを、リツキシマブ（登録商標）又は他の何らかの対照抗体と比較してＡＤＣＣ活性の増強に関して検定する。このインビボＡＤＣＣアッセイについての詳細で十分なプロトコールは、Niwa et al., 2004, supraに認められる。
（配列の簡単な説明）
配列番号１は、ＤＸ−ＩｇＧ１軽鎖のマウス可変及びヒト定常領域のヌクレオチド配列をコードする。
配列番号２は、ＤＸ−ＩｇＧ１重鎖のマウス可変及びヒト定常領域のヌクレオチド配列をコードする。
配列番号３は、ＩｇＧ１軽鎖のヒト定常領域のヌクレオチド配列をコードする。
配列番号４は、ＩｇＧ１重鎖のヒト定常領域のヌクレオチド配列をコードする。
配列番号５から１９は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によってＤＸ−ＩｇＧ１のマウス軽鎖可変領域を合成するために使用される１５個の重複オリゴヌクレオチドをコードする。
配列番号２０から２３は、ＤＸ−ＩｇＧ１マウス軽鎖可変領域をヒト軽鎖定常領域に連結するために使用される４個のオリゴヌクレオチドプライマーをコードする。
配列番号２４から４０は、ＰＣＲによってＤＸ−ＩｇＧ１のマウス重鎖可変領域を合成するために使用される１７個の重複オリゴヌクレオチドをコードする。
配列番号４１から４４は、ＤＸ−ＩｇＧ１マウス重鎖可変領域をヒト重鎖定常領域に連結するために使用される４個のオリゴヌクレオチドプライマーをコードする。
配列番号４５は、Ｎ末端ＥｃｏＲＩ部位と共にＫａｒ２（Ｂｉｐ）シグナル配列をコードするヌクレオチド配列をコードする。
配列番号４６から４９は、Ｋａｒ２シグナル配列をＤＸ−ＩｇＧ１の軽鎖及び重鎖に連結するために使用される４個のオリゴヌクレオチドプライマーをコードする。
配列番号５０は、ＪＣ−ＩｇＧ１軽鎖のマウスＩｇＧ１可変領域に対応するヌクレオチド配列をコードする（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＦ０１３５７６）。
配列番号５１は、ＪＣ−ＩｇＧ１重鎖のマウスＩｇＧ１可変領域に対応するヌクレオチド配列をコードする（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＦ０１３５７７）。
配列番号５２から６３は、ＪＣ−ＩｇＧ１のマウス軽鎖可変領域をＰＣＲ合成するために使用される１２個の重複オリゴヌクレオチド配列をコードする。
配列番号６４から７５は、ＪＣ−ＩｇＧ１のマウス重鎖ＦａｂフラグメントをＰＣＲ合成するために使用される１２個の重複オリゴヌクレオチドをコードする。
配列番号７６から８７は、ＪＣ−ＩｇＧ１のマウス重鎖ＦｃフラグメントをＰＣＲによって合成するために使用される１２個の重複オリゴヌクレオチドをコードする。
配列番号８８は、Ｆｃフラグメントの３’末端に対応する３’Ｋｐｎ１プライマーをコードする。
配列番号８９は、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）についてのヌクレオチド配列をコードする。
配列番号９０は、本発明において使用するトロンビン切断のためのヌクレオチド配列をコードする。
【図面の簡単な説明】
【０１３８】
【図１】ＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2グリカン構造を有するＩｇＧの図式的表示。
【図２】プロテインＡカラム（レーン１）及びフェニルセファロースカラム（レーン２）での、ＹＡＳ３８５−１において発現され（実施例２で述べるように）、培地から精製された（実施例３で述べるように）ＪＣ−ＩｇＧのクマシーブルー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル。（２．５μｇタンパク質／レーン）。
【図３】プロテインＡカラム（レーン１）及びフェニルセファロースカラム（レーン２）での、ＹＡＳ３８５−１において発現され（実施例２で述べるように）、培地から精製された（実施例３で述べるように）ＤＸ−ＩｇＧのクマシーブルー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル。（２．５μｇタンパク質／レーン）。
【図４】図４Ａは、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2 Ｎ−グリカンを支配的に示す、β−ガラクトシダーゼで処理した、ＹＡＳ３８５−１で発現されるＪＣ−ＩｇＧのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトル。図４Ｂは、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2 Ｎ−グリカンを支配的に示す、β−ガラクトシダーゼで処理した、ＹＡＳ３８５−１で発現されるＤＸ−ＩｇＧのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトル。
【図５】図５Ａは、ＪＣ−ＩｇＧ及びリツキシマブ（登録商標）に関するＦｃγＲＩＩＩｂのＥＬＩＳＡ結合アッセイ。図５Ｂは、ＤＸ−ＩｇＧ及びリツキシマブ（登録商標）に関するＦｃγＲＩＩＩｂのＥＬＩＳＡ結合アッセイ。（ＧＭ５＝ＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2 Ｎ−グリカン）。
【図６】ＪＣ−ＩｇＧ及びリツキシマブ（登録商標）に関するＦｃγＲＩＩＩａ−１５８ＦのＥＬＩＳＡ結合アッセイ。（ＧＭ５＝ＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2 Ｎ−グリカン）。
【図７】図７Ａは、ＪＣ−ＩｇＧ及びリツキシマブ（登録商標）に関するＦｃγＲＩＩｂのＥＬＩＳＡ結合アッセイ。図７Ｂは、ＤＸ−ＩｇＧ及びリツキシマブ（登録商標）に関するＦｃγＲＩＩｂのＥＬＩＳＡ結合アッセイ。（ＧＭ５＝ＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2 Ｎ−グリカン）。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の免疫グロブリンを含む組成物であって、各々の免疫グロブリンがそれに結合した少なくとも１つのＮ−グリカンを含み、それによって組成物が、支配的Ｎ−グリカンが本質的にＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2から成る複数のＮ−グリカンを含む、前記組成物。
【請求項２】
前記複数のＮ−グリカンの５０モルパーセント以上が本質的にＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2から成る、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記複数のＮ−グリカンの７５モルパーセント以上が本質的にＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2から成る、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記複数のＮ−グリカンの９０モルパーセント以上が本質的にＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2から成る、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記ＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2 Ｎ−グリカンが、前記複数のＮ−グリカンのその次に最も支配的なＮ−グリカン構造よりも約５モルパーセントから約５０モルパーセント多いレベルで存在する、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記免疫グロブリンがＦｃγＲＩＩｂ受容体に対して低い結合親和性を示す、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記免疫グロブリンがＦｃγＲＩＩＩ受容体に対して高い結合親和性を示す、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記ＦｃγＲＩＩＩ受容体がＦｃγＲＩＩＩａ受容体である、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記ＦｃγＲＩＩＩ受容体がＦｃγＲＩＩＩｂ受容体である、請求項７に記載の組成物。
【請求項１０】
前記免疫グロブリンが高い抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を示す、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
前記免疫グロブリンが本質的にフコースを含まない、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
前記免疫グロブリンがフコースを欠く、請求項１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記免疫グロブリンが、増殖因子、ＦＧＦＲ、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦ、白血球抗原、ＣＤ２０、ＣＤ３３、サイトカイン、ＴＮＦ−α及びＴＮＦ−βから成る群より選択される抗原に結合する、請求項１に記載の組成物。
【請求項１４】
前記免疫グロブリンが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４領域から成る群より選択されるＦｃ領域を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１５】
請求項１から１４のいずれかに記載の組成物及び製薬上許容される担体を含有する医薬組成物。
【請求項１６】
前記免疫グロブリンが本質的にフコースを含まない、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
前記免疫グロブリンがフコースを欠く、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
前記免疫グロブリンが、増殖因子、ＦＧＦＲ、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦ、白血球抗原、ＣＤ２０、ＣＤ３３、サイトカイン、ＴＮＦ−α及びＴＮＦ−βから成る群より選択される抗原に結合する抗体を含む、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
前記免疫グロブリンが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４領域から成る群より選択されるＦｃ領域を含む、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
請求項１に記載の組成物を含むキット。
【請求項２１】
免疫グロブリン又はそのフラグメントをコードする外来性遺伝子を含む真核宿主細胞であって、前記真核宿主細胞が前記免疫グロブリン又はそのフラグメントを発現するように工作又は選択されており、それによって複数の免疫グロブリンを含む組成物を生産し、各々の免疫グロブリンがそれに結合した少なくとも１つのＮ−グリカンを含み、それによって組成物が、支配的Ｎ−グリカンが本質的にＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2から成る複数のＮ−グリカンを含む、前記真核宿主細胞。
【請求項２２】
宿主細胞が下等真核宿主細胞である、請求項２１に記載の宿主細胞。
【請求項２３】
複数の免疫グロブリンを含む組成物を真核生物宿主において生産するための方法であって、各々の免疫グロブリンがそれに結合した少なくとも１つのＮ−グリカンを含み、それによって組成物が、支配的Ｎ−グリカンが本質的にＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2から成る複数のＮ−グリカンを含む、前記方法。
【請求項２４】
宿主細胞が下等真核宿主細胞である、請求項２３に記載の方法。
【請求項１】
複数の免疫グロブリンを含む組成物であって、各々の免疫グロブリンがそれに結合した少なくとも１つのＮ−グリカンを含み、それによって組成物が、支配的Ｎ−グリカンが本質的にＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2から成る複数のＮ−グリカンを含む、前記組成物。
【請求項２】
前記複数のＮ−グリカンの５０モルパーセント以上が本質的にＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2から成る、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記複数のＮ−グリカンの７５モルパーセント以上が本質的にＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2から成る、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記複数のＮ−グリカンの９０モルパーセント以上が本質的にＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2から成る、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記ＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2 Ｎ−グリカンが、前記複数のＮ−グリカンのその次に最も支配的なＮ−グリカン構造よりも約５モルパーセントから約５０モルパーセント多いレベルで存在する、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記免疫グロブリンがＦｃγＲＩＩｂ受容体に対して低い結合親和性を示す、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記免疫グロブリンがＦｃγＲＩＩＩ受容体に対して高い結合親和性を示す、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記ＦｃγＲＩＩＩ受容体がＦｃγＲＩＩＩａ受容体である、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記ＦｃγＲＩＩＩ受容体がＦｃγＲＩＩＩｂ受容体である、請求項７に記載の組成物。
【請求項１０】
前記免疫グロブリンが高い抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を示す、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
前記免疫グロブリンが本質的にフコースを含まない、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
前記免疫グロブリンがフコースを欠く、請求項１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記免疫グロブリンが、増殖因子、ＦＧＦＲ、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦ、白血球抗原、ＣＤ２０、ＣＤ３３、サイトカイン、ＴＮＦ−α及びＴＮＦ−βから成る群より選択される抗原に結合する、請求項１に記載の組成物。
【請求項１４】
前記免疫グロブリンが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４領域から成る群より選択されるＦｃ領域を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１５】
請求項１から１４のいずれかに記載の組成物及び製薬上許容される担体を含有する医薬組成物。
【請求項１６】
前記免疫グロブリンが本質的にフコースを含まない、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
前記免疫グロブリンがフコースを欠く、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
前記免疫グロブリンが、増殖因子、ＦＧＦＲ、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦ、白血球抗原、ＣＤ２０、ＣＤ３３、サイトカイン、ＴＮＦ−α及びＴＮＦ−βから成る群より選択される抗原に結合する抗体を含む、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
前記免疫グロブリンが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４領域から成る群より選択されるＦｃ領域を含む、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
請求項１に記載の組成物を含むキット。
【請求項２１】
免疫グロブリン又はそのフラグメントをコードする外来性遺伝子を含む真核宿主細胞であって、前記真核宿主細胞が前記免疫グロブリン又はそのフラグメントを発現するように工作又は選択されており、それによって複数の免疫グロブリンを含む組成物を生産し、各々の免疫グロブリンがそれに結合した少なくとも１つのＮ−グリカンを含み、それによって組成物が、支配的Ｎ−グリカンが本質的にＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2から成る複数のＮ−グリカンを含む、前記真核宿主細胞。
【請求項２２】
宿主細胞が下等真核宿主細胞である、請求項２１に記載の宿主細胞。
【請求項２３】
複数の免疫グロブリンを含む組成物を真核生物宿主において生産するための方法であって、各々の免疫グロブリンがそれに結合した少なくとも１つのＮ−グリカンを含み、それによって組成物が、支配的Ｎ−グリカンが本質的にＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2から成る複数のＮ−グリカンを含む、前記方法。
【請求項２４】
宿主細胞が下等真核宿主細胞である、請求項２３に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公表番号】特表２００８−５１２３５５（Ｐ２００８−５１２３５５Ａ）
【公表日】平成２０年４月２４日（２００８．４．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５２２６９５（Ｐ２００７−５２２６９５）
【出願日】平成１７年７月１９日（２００５．７．１９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０２５７３０
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０１４７２５
【国際公開日】平成１８年２月９日（２００６．２．９）
【出願人】（５０３００７２８７）グライコフィ， インコーポレイテッド (37)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年４月２４日（２００８．４．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年７月１９日（２００５．７．１９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０２５７３０
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０１４７２５
【国際公開日】平成１８年２月９日（２００６．２．９）
【出願人】（５０３００７２８７）グライコフィ， インコーポレイテッド (37)
【Ｆターム（参考）】
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