ＨＥＲ２に対する結合親和性を有するポリペプチド
ＨＥＲ２に対する結合親和性を有し、ブドウ球菌プロテインＡ（ＳＰＡ）のドメインに関連するポリペプチドであって、該ポリペプチドの配列は１〜約２０の置換変異を有するＳＰＡドメインの配列に相当する、ポリペプチドが提供される。ポリペプチドをコードする核酸、ならびに発現ベクターおよび核酸を発現するための宿主細胞も提供される。そのようなポリペプチドの薬剤としての使用、及びＨＥＲ２を過剰発現する細胞へ該ポリペプチドに結合させた物質を誘導するためのターゲッティング剤としての使用が提供される。該ポリペプチドとＨＥＲ２との結合を利用する方法および当該方法を実施するためのキットも提供される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト上皮細胞成長因子受容体２（以後、ＨＥＲ２と呼ぶ）と結合する新規のポリペプチドに関する。該ポリペプチドは、ブドウ球菌のプロテインＡ（ＳＰＡ）のドメインに関連するものであって、該ポリペプチドの配列は少なくとも１つの置換変異を有するＳＰＡドメインの配列に相当する。本発明は、このようなＨＥＲ２結合ポリペプチドの薬剤としての使用に関し、より具体的には、ＨＥＲ２の過剰発現により特徴付けられる種類の癌の治療用薬剤を調製するための該ポリペプチドの使用にも関する。
【背景技術】
【０００２】
Ａｆｆｉｂｏｄｙ（登録商標）分子
ブドウ球菌のプロテインＡ（ＳＰＡ）のドメインＢに由来するプロテインＺに関連した分子（Nilsson B et al (1987) Protein Engineering 1, 107-133）が、このような分子の無作為化されたライブラリーから、種々の相互作用標的を用いて選択されている（例えばＷＯ９５／１９３７４；ＷＯ００／６３２４３；Nord K et al (1995) Prot Eng 8: 601-608; Nord K et al (1997) Nature Biotechnology 15, 772-777参照）。種々の標的分子を用いて、例えばNord K et al (1997、上述)に記載されているようなプロテインＺ誘導体を選択する。この参考文献に記載された実験は、特定の治療またはバイオテクノロジーへの応用に用いるための十分に高い親和性を有する分子を得るという明確な目的をもった研究というよりはむしろ、所定の標的に対するプロテインＺ誘導体を選択するという一般的な技法の原理の概要を記したものである。
【０００３】
ＨＥＲ２および癌疾患におけるその役割
ＨＥＲ２癌原遺伝子は、ＨＥＲ２タンパク質または受容体として既知である１８５ｋＤ細胞表面受容体タンパク質の産生をコードする（Hynes NE et al (1994) Biochim Biophys Acta 1198: 165-184）。この遺伝子は、時として、ｎｅｕ、ＨＥＲ２／ｎｅｕまたはｃ−ｅｒｂＢ−２とも呼ばれる．ｎｅｕは、エチルニトロソ尿素で処理され、この遺伝子の突然変異を示すラットで最初に発見されたものである（Shih C et al (1981) Nature 290: 261-264）。突然変異型のｎｅｕは、構成的な活性型受容体の産生を引き起こし、低コピー数で細胞を形質転換し得る強力な癌遺伝子を構成する（Hynes NE et al、上記を参照）。
【０００４】
正常細胞は、組織特異的パターンで、その形質膜上に少量のＨＥＲ２タンパク質を発現する。ＨＥＲ２に対する既知のリガンドは明らかにされていない。しかしながら、ＨＥＲ２は、ＨＥＲ１（上皮細胞成長因子受容体（ＥＧＦＲ））、ＨＥＲ３およびＨＥＲ４とともに、これらの受容体に対するリガンドと複合してヘテロ二量体を形成することが示されている。このようなヘテロ二量体の形成は、細胞の外側から核に成長シグナルを伝達し、それにより正常細胞の成長および分裂の局面を制御する活性化ＨＥＲ２受容体をもたらす（Sundaresan S et al (1999) Curr Oncol Rep 1: 16-22）。
【０００５】
腫瘍細胞では、ＤＮＡ複製システムの誤りが単一染色体上の遺伝子の多重コピーの存在を生じ得るが、これは遺伝子増幅として既知の現象である。ＨＥＲ２遺伝子の増幅は、この遺伝子の転写増大をもたらす。これはＨＥＲ２のｍＲＮＡレベルを上昇させ、同時にＨＥＲ２タンパク質の合成を増大させ、これらの腫瘍細胞の表面におけるＨＥＲ２タンパク質の過剰発現を引き起こす。この過剰発現は、隣接の正常細胞中に見出されるものと比べて１０〜１００倍高いＨＥＲ２タンパク質レベルを生じ得る。これは次に、細胞分裂増大及びそれに付随した高速度の細胞成長を生じる。ＨＥＲ２遺伝子の増幅は、正常細胞の癌表現型への形質転換に関連づけられる（Hynes NE et al、上記を参照； Sundaresan S et
al、上記を参照）。
【０００６】
ＨＥＲ２タンパク質の過剰発現はＨＥＲ２のホモ二量体の形成を引き起こし、次いでこれは構成的に活性な受容体を生じると考えられている（Sliwkowski MX et al (1999) Semin Oncol 26 (4 Suppl 12): 60-70）。これらの条件下で、成長促進シグナルは、リガンドの存在なしに、細胞中に継続的に伝達され得る。その結果として、多数の細胞内シグナル伝達経路が活性化されるようになり、無秩序な細胞成長を生じ、そして場合によっては、発癌性の形質転換を生じる（Hynes NE et al、上記を参照）。したがって成長因子受容体により媒介されるシグナル伝達メカニズムは、細胞複製および腫瘍増殖を抑制するための重要な標的である。
【０００７】
乳癌は、米国における女性の間で最も一般的な悪性疾患であり、１９２，２００例の新規の症例が２００１年に生じたと見積もられている（Greenlee R et al (2001) CA Cancer J Clin 51: 15-36）。全乳癌患者の約２５％において、ＨＥＲ２遺伝子の、増幅に起因する過剰発現が認められる（Slamon DJ et al (1989) Science 244: 707-712）。このＨＥＲ２タンパク質の過剰発現は、いくつかの否定的な予後変数、例えばエストロゲン受容体の陰性状態、高いＳ相画分、陽性の結節状態、変異型ｐ５３および核異型度と相関する（Sjogren S et al (1998) J Clin Oncol 16(2): 462-469）。Slamon等（上記参照）によれば、ＨＥＲ２遺伝子の増幅は、無病生存率の短縮、及び結節が陽性の患者の全生存率（overall survival）の短縮と強く相関することが見出された。
【０００８】
これらの理由により、乳癌の病因および治療におけるＨＥＲ２の役割をさらに研究することがこれまでの重要な目標であったし、依然としてそうである。ＨＥＲ２と相互作用する分子の同定は、この努力の一部を形成する。
【０００９】
前臨床ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験によって、ＨＥＲ２活性の抑制が腫瘍細胞の増殖に影響を及ぼし得るか否かを検査した。ＨＥＲ２タンパク質を過剰発現するＳＫ−ＢＲ−３乳癌細胞を、いくつかあるネズミ抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体のうちの１つである４Ｄ５を用で処理すると、対照のモノクローナル抗体での処理と比較して、腫瘍細胞の増殖が実際に抑制された。ＨＥＲ２を過剰発現するヒト乳癌および卵巣癌を保有する（異種移植片）マウスへの４Ｄ５の投与は、それらマウスの無腫瘍生存時間を延長した。同様の試験により、マウスにおけるヒト胃癌異種移植片の抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体による増殖抑制が実証された（Pietras RJ et al (1994) Oncogene 9: 1829-1838）。
【００１０】
抗体を用いて腫瘍細胞の表面上に豊富に存在するＨＥＲ２タンパク質を抑制するためのアプローチの中で、一療法が近年市販されるようになってきた。したがってモノクローナル抗体４Ｄ５すなわちトラスツズマブが、ハーセプチン（Herceptin）（登録商標）の商品名でF Hoffman-La Roche および Genentechによりこの目的のために市場に出されている。
【００１１】
ＨＥＲ２タンパク質の過剰発現により特徴付けられる癌に対する抗体療法により示される明らかな利点にもかかわらず、種々の因子が抗体効力を低減する潜在力を有するという事実が依然として存在する（例えばReilly RM et al (1995) Clin Pharmacokinet 28: 126-142参照）。これらの例としては以下のものが挙げられる。（１）大型の固形腫瘍中への又は脳のような生命維持領域中への抗体の浸透制限（２）血管透過性の低下による、標的部位への抗体の血管外浸出の減少（３）ターゲッティング作用を低下させる、抗体の正常組織との交差反応性および非特異的結合（４）腫瘍による不均一な取込みによる、処理されない帯域の発生（５）治療効果を低下させる注入された抗体の代謝の増大、ならびに（６）治療用抗体を不活性化する、ＨＡＭＡおよびヒト抗ヒト抗体の急速な生成である。
【００１２】
さらに、毒性作用が、癌に関する治療用抗体の開発における大きな障害であった（Carter P (2001)Nat Rev Cancer 1: 118-129; Goldenberg DM (2002) J Nucl Med 43: 693-713; Reichert JM (2002) Curr Opin Mol Ther 4: 110-118）。健常組織との交差反応性は、非結合（裸の）抗体に対する実質的な副作用を引き起こし得るが、この副作用は該抗体が毒素または放射性同位体と結合した際に増強されることがある。免疫介在性の合併症としては、肺への毒性作用による呼吸困難、偶発的な中枢および末梢神経系合併症、ならびに肝機能および腎機能の低下が挙げられる。時には、予期せぬ中毒性合併症、例えばＨＥＲ−２ターゲッティング抗体トラスツズマブ（ハーセプチン（登録商標））に関連した心毒性作用が観察され得る（Schneider JW et al (2002) Semin Oncol 29(3 suppl 11): 22-28）。放射性同位体を結合した抗体を用いた放射免疫療法も骨髄抑制を引き起こし得る。
【００１３】
したがって、一般的に用いられる抗癌抗体の、近年の臨床的および商業的成功にもかかわらず、この治療戦略の将来に関する相当数の重大な疑問が依然として存在する。その結果、ＨＥＲ２に対して同程度の親和性を有する薬剤を継続して提供することは、疾患の治療においてこのような分子の利用法を提供することと同様に、依然として当該技術分野内での多大な関心事である。
【発明の開示】
【００１４】
ＨＥＲ２との特異的な結合を特徴とするポリペプチドの提供によってこの関心を満足させることが、本発明の一目的である。
【００１５】
本発明に関連する目的物は、非特異的結合をほとんどまたは全く示さないＨＥＲ２結合ポリペプチドである。
【００１６】
本発明の別の目的は、融合ポリペプチド中の一部として容易に用いられ得るＨＥＲ２結合ポリペプチドを提供することである。
【００１７】
別の目的は、既存の抗体試薬に関連して経験される既知の問題のうちの１または複数を解決する、ＨＥＲ２結合ポリペプチドの提供である。
【００１８】
本発明のさらなる目的は、治療的用途に用い易いＨＥＲ２結合ポリペプチドを提供することである。
【００１９】
関連する目的は、ＨＥＲ２タンパク質の過剰発現により特徴付けられる癌疾患の臨床設定における、治療、抑制および／またはターゲッティングのための新規の方法を見出すことである。
【００２０】
低濃度でＨＥＲ２の検出用試薬として用いることができる分子を提供することも一目的である。
【００２１】
これらのおよびその他の目的は、添付の特許請求の範囲で主張されているような本発明の様々な態様により達成される。したがって第一の態様において、本発明は、ＨＥＲ２に対する結合親和性を有し、かつブドウ球菌のプロテインＡ（ＳＰＡ）のドメインに関連したポリペプチドであって、該ポリペプチドの配列は１〜約２０の置換変異を有するＳＰＡドメインの配列に相当する、ポリペプチドを提供する。
【００２２】
本発明のこの態様によるポリペプチドの実施の一形態では、ＨＥＲ２に対するその親和性は、相互作用のＫD値が最大でも１×１０-6Ｍであるようなものである。別の実施形態では、ＨＥＲ２に対するポリペプチドの親和性は、相互作用のＫD値が最大でも１×１０-
7Ｍであるようなものである。
【００２３】
別の実施の形態では、本発明のポリペプチドは、ＨＥＲ２タンパク質の細胞外ドメインであるＥＣＤと特異的に結合する。
【００２４】
本明細書に記すように、本発明者らは、ＳＰＡからのドメインの置換変異によって高親和性ＨＥＲ２結合ポリペプチドが得られるということ、そしてそのようなポリペプチドがＨＥＲ２と相互作用し得るということを見出した。本発明のポリペプチドは、多様な用途においてＨＥＲ２に対する抗体の代替物として利用できる。限定的でない例として、該ポリペプチドは、ＨＥＲ２の過剰発現により特徴付けられる癌の治療に、細胞表面上のＨＥＲ２との結合による細胞シグナル伝達の抑制に、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏの両方における癌の診断に、ＨＥＲ２を過剰発現する細胞に対する薬剤のターゲッティングに、ＨＥＲ２を検出するための組織化学的方法に、分離の方法およびその他の用途に有用である。本発明のポリペプチドは、ＨＥＲ２に対する試薬の親和性を利用するあらゆる方法に有用であることが判明するかもしれない。したがって該ポリペプチドは、そのような方法における検出試薬、捕捉試薬または分離試薬としてだけではなく、それ自体で治療薬として、またはＨＥＲ２タンパク質に対して他の治療薬をターゲッティングするための一手段として用いられ得る。ｉｎ ｖｉｔｒｏで本発明のポリペプチドを用いる方法は、種々の形式で、例えば微量滴定プレート中で、タンパク質アレイで、バイオセンサー表面上で、組織切片上等において実施され得る。本発明のポリペプチドの種々の修飾および／または該ポリペプチドへの付加は、本発明の範囲を逸脱しない限り、特定の所望の用途に該ポリペプチドを適合させるために実施してもよい。そのような修飾および付加は以下でさらに詳細に記載され、そして同一ポリペプチド鎖中に含まれる付加的アミノ酸、あるいは標識および／または化学的にあるいは別の方法により本発明のポリペプチドに結合される治療薬を包含し得る。さらに本発明は、ＨＥＲ２に結合する能力を有するポリペプチドの断片も包含する。
【００２５】
「ＨＥＲ２に対する結合親和性」とは、例えば表面プラズモン共鳴技法の使用により、例えばビアコア（登録商標）機器で試験され得るポリペプチドの特性を指す。ＨＥＲ２結合親和性は、ＨＥＲ２を計器のセンサーチップ上に固定し、試験されるポリペプチドを含有する試料を該チップ上に流す実験によって試験することができる。あるいは、試験されるポリペプチドは計器のセンサーチップ上に固定され、ＨＥＲ２を含有する試料は該チップ上を通過させられる。次いで、当業者であれば、得られたセンサグラムを読み取って、ＨＥＲ２に対するポリペプチドの結合親和性の少なくとも定性的な測定を確立することができる。例えば相互作用に関する信頼できるＫD値を確証するための目的で、定量的測定が求められる場合、表面プラズモン共鳴法もまた用いることができる。結合値は、例えばビアコア（登録商標）２０００機器（Biacore AB）によって決定できる。ＨＥＲ２は計器のセンサーチップ上に固定され、そして親和性が決定されるポリペプチドの試料が連続希釈により調製され、順不同で注入される。次に、その結果から、ＫD値が、例えば計器メーカーにより提供されるBIAevaluation３．２ソフトウエアの１：１ラングミュア結合モデルを用いて算定され得る。
【００２６】
上記のように、本発明のポリペプチドの配列は、上記ＳＰＡドメインの１〜約２０のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基で置換されたＳＰＡドメイン配列に関連する。しかしながら、導入される置換変異は、ポリペプチドの基本構造に影響を及ぼすべきではない。即ち、本発明のポリペプチドのＣα主鎖の全体的な折り畳みは、関連するＳＰＡドメインのものと本質的に同一であり、例えば、二次構造の同一要素を同一順序で有するなどである。したがって、ポリペプチドは、基本的な構造特性、例えば類似のＣＤスペクトルを生じる特性が共有される場合、ＳＰＡと同一の折り畳みを有するという定義に分類されることになる。関係のある他のパラメーターを、当業者は承知している。ＳＰＡドメインの基本構
造を本質的に保存するというこの要件により、その突然変異時に置換を受け得るドメインの位置は制限される。例えばＺタンパク質の既知の構造から出発する場合、Ｚタンパク質の表面上に位置するアミノ酸残基が置換される一方、Ｚタンパク質のコア内に埋め込まれたアミノ酸残基「３ヘリックス束」は分子の構造特性を保存するために不変のまま維持されるべきである、というのが好ましい。同一の推論が、他のＳＰＡドメインおよびその断片に当てはまる。
【００２７】
本発明は、上記のＨＥＲ２結合ポリペプチドが、いずれかの末端に付加的なアミノ酸残基が付加されたＨＥＲ２結合ドメインとして存在するポリペプチドも包含する。これらの付加的なアミノ酸残基は、該ポリペプチドによるＨＥＲ２の結合に一役を演じ得るが、しかし、例えばポリペプチドの生産、精製、安定化、カップリングまたは検出のうちの１又は複数に関連したその他の目的にも同様に十分に役立ち得る。このような付加的なアミノ酸残基は、化学的カップリングの目的のために付加された１又は複数のアミノ酸残基を含んでも良い。この一例は、ポリペプチド鎖中の一番初めのまたは後ろの位置での、即ちＮまたはＣ末端でのシステイン残基の付加である。このような付加的なアミノ酸残基は、ポリペプチドの精製または検出のための「タグ」、例えばヘキサヒスチジル（Ｈｉｓ6）タグ、あるいはタグに特異的な抗体との相互作用のための「ｍｙｃ」タグまたは「Ｆｌａｇ」タグも含み得る。その他の選択肢についても、当業者は承知している。
【００２８】
上述の「付加的なアミノ酸残基」は、任意の所望の機能、例えば最初のＨＥＲ２結合ドメインと同一の結合機能、または別の結合機能、あるいは酵素的機能、または蛍光的機能、あるいはそれらを複合した機能、を有する１又は複数のポリペプチドドメイン（単数または複数）を構成してもよい。
【００２９】
したがって本発明は、ＨＥＲ２に対する親和性を有するポリペプチドの多量体を包含する。例えば癌の治療のために又はＨＥＲ２の精製方法において本発明のポリペプチドを用いる場合には、本発明のポリペプチドを１つ用いて可能であるよりもさらに強力なＨＥＲ２の結合を獲得することは興味深い。この場合、ポリペプチドの多量体、例えば二量体、三量体または四量体の提供は、必要とする親和性作用を提供し得る。多量体は、適切な数の本発明のポリペプチドで構成できる。これらの本発明のポリペプチドドメインは、単量体によりそのような多量体が形成されており、それらの全てが同一のアミノ酸配列を有していてもよいが、しかし、それらが異なるアミノ酸配列を有することも同様に可能である。本発明の多量体中の連結されたポリペプチド「単位」は、既知の有機化学的方法を用いて共有結合により結合され得るし、あるいはポリペプチドの組換え発現のための系において１又は複数の融合ポリペプチドとして発現され、あるいは任意のその他の方式で、直接的に又はリンカー（例えばアミノ酸リンカー）を介して、連結され得る。
【００３０】
さらに、ＨＥＲ２結合ポリペプチドが第一のドメインまたは第一の部分、ならびにＨＥＲ２を結合する以外の他の機能を有する第二のおよびさらなる部分を構成する「異質性の（heterogenic）」融合ポリペプチドも意図され、それは本発明の範囲内である。融合ポリペプチドの第二のおよびさらなる部分（単数または複数）は、ＨＥＲ２以外の別の標的分子に対する親和性を有する結合ドメインを含んでも良い。そのような結合ドメインも、ＳＰＡドメインの１〜約２０個の位置における置換変異を通じてＳＰＡドメインに良好に関連し得る。結果的には、少なくとも１つのＨＥＲ２結合ドメイン、及び上記のその他の標的分子に対する親和性を有する少なくとも１つのドメインを有する融合ポリペプチドであって、両ドメインがＳＰＡドメインに関連する、融合ポリペプチドが得られる。これは、治療薬として、あるいは捕捉、検出または分離試薬として用いられるようないくつかのバイオテクノロジー用途に用いられ得る多特異的な試薬の作製を可能にする。少なくとも１つのポリペプチドドメインがＨＥＲ２に対する親和性を有する、このようなＳＰＡドメイン関連ポリペプチドの多特異的多量体の調製は、複数のＨＥＲ２結合「単位（unit）」
からなる多量体に対しても、上述のように適用し得る。その他の選択肢では、第二の又はさらなる部分（単数または複数）は、ある標的に対する結合親和性を有する、関連性のない天然または組換えタンパク質（あるいは天然または組換えタンパク質の結合能力を維持するその断片）を含み得る。ヒト血清アルブミンに対する親和性を有し、かつ本発明のＨＥＲ２結合ＳＰＡドメイン誘導体の融合相手として用いられ得るこのような結合タンパク質の一例は、連鎖球菌のプロテインＧ（ＳＰＧ）のアルブミン結合ドメインである（Nygren P-A et al (1988) Mol Recogn 1: 69-74）。ＨＥＲ２結合ＳＰＡドメイン関連ポリペプチドとＳＰＧのアルブミン結合ドメインとの融合ポリペプチドは、したがって、本発明の範囲内に入る。本発明のポリペプチドを、治療薬として、またはターゲッティング剤としてヒト被験体に投与する場合に、該ペプチドを、血清アルブミンを結合する部分と融合させることが有益かもしれないが、それは、このような融合タンパク質のｉｎ ｖｉｖｏでの半減期が、単離型のＳＰＡドメイン関連ＨＥＲ２結合部分の半減期と比較した場合、おそらく延長されるだろうと考えられるためである（この原理は、例えばＷＯ９１／０１７４３に記載されている）。
【００３１】
融合ポリペプチドの作製のためのその他の可能性も意図される。したがって本発明の第一の態様によるＨＥＲ２結合ＳＰＡドメイン関連ポリペプチドは、目的物との結合に加えて、あるいはその代わりに、他の機能を示す第二の又はさらなる単数または複数の部分と共有結合され得る。一例は、１又は複数のＨＥＲ２結合ポリペプチドと、レポーターまたはエフェクター部分として働く酵素活性を有するポリペプチドとの間の融合である。ＨＥＲ２結合ポリペプチドと結合して融合タンパク質を生成し得るレポーター酵素の例は当業者に既知であり、例としては、β−ガラクトシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、カルボキシペプチダーゼのような酵素が挙げられる。本発明の融合ポリペプチドの第二の及びさらなる単数または複数の部分に関するその他の選択肢としては、蛍光ポリペプチド、例えば緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼおよびそれらの変異体が挙げられる。
【００３２】
本発明の融合ポリペプチドの第二の及びさらなる単数または複数の部分に関するその他の選択肢としては、治療的用途のための単数または複数の部分が挙げられる。治療的用途では、その他の分子もまた、その他の手段により、本発明のポリペプチドと共有的にまたは非共有的に結合され得る。非限定的な例としては、エフェクター酵素（例えばカルボキシペプチダーゼ）を送達するために本願のポリペプチドを利用する、「ＡＤＥＰＴ」（抗体酵素プロドラッグ療法（antibody-directed enzyme prodrug therapy））用途のための酵素、エフェクター細胞および免疫系のその他の構成成分を動員するためのタンパク質、サイトカイン（例えばＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＴＮＦα、ＩＰ−１０）、凝血原因子（例えば組織因子、フォン・ウィルブラント因子）、毒素（例えばリシンＡ、シュードモナス外毒素、カルケアマイシン（calcheamicin）、マイタンシノイド（maytansinoid））、有毒な小分子（例えばアウリスタチン（auristatin）類似体、ドキソルビシン）が挙げられる。さらに、診断用（例えば68Ｇａ、76Ｂｒ、111Ｉｎ、99Ｔｃ、124Ｉ、125Ｉ）または治療用（例えば90Ｙ、131Ｉ、211Ａｔ）の放射性核種を容易に組入れるために、放射性同位体のためのキレート剤をポリペプチド配列にカップリングすることを目的として、上記で言及した付加的アミノ酸（特にヘキサヒスチジンタグ、システイン）が意図される。
【００３３】
本発明は、ポリペプチドであって、該ポリペプチド中で上記のＨＥＲ２結合ポリペプチドが、例えば該ポリペプチドの検出を目的として標識基（例えば少なくとも１つの蛍光体、ビオチンまたは放射性同位体）を備えていることを特徴とするポリペプチドを包含する。
【００３４】
本発明のＨＥＲ２結合ポリペプチドを組入れた融合タンパク質についての上記の説明に関しては、第一、第二及びさらなる部分の呼称は、一方のＨＥＲ２結合部分（単数または
複数）と、他方の他の機能を示す部分とを明白に区別する目的でなされる、ということに留意すべきである。これらの呼称は、融合タンパク質のポリペプチド鎖中における異なるドメインの実際の順序を指すものではない。したがって例えば上記の第一の部分は、制限なしに、融合タンパク質のＮ末端、中間、またはＣ末端に出現し得る。
【００３５】
本発明のポリペプチドを作製する出発点として用いるためのＳＰＡドメインの一例は、ブドウ球菌のプロテインＡのドメインＢに由来するプロテインＺである。「背景技術」の節で指摘したように、このタンパク質は、従来、種々の標的と結合し得るＡｆｆｉｂｏｄｙ（登録商標）分子と命名された分子の作製のための足場構造として用いられてきた。非修飾プロテインＺ（Ｚwtと示す）の５８のアミノ酸配列は配列番号１で示され、図１に例示されている。
【００３６】
本発明のポリペプチドの一実施形態では、ポリペプチドはＳＰＡの一ドメインに関連するものであって、該ポリペプチドの配列は４〜約２０の置換変異を有するＳＰＡドメインの配列に相当する。その他の実施形態は、１〜約１３の置換変異、あるいは４〜約１３の置換変異を有し得る。
【００３７】
本発明のポリペプチドのさらに具体的な実施形態では、ポリペプチドの配列は、配列番号１に示される配列において１〜約２０の置換変異、例えば４〜約２０、１〜約１３または４〜約１３の置換変異を有する配列に相当する。
【００３８】
いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチドは、その配列が、配列番号１に示される配列において、第１３位、第１４位、第２８位、第３２位および第３５位のうちの単数または複数の位置における置換変異を含む配列に相当し得る。さらに本発明のポリペプチドの配列は、第９位、第１０位、第１１位、第１７位、第１８位、第２４位、第２５位および第２７位のうちの単数または複数の位置における置換変異を含み得る。
【００３９】
本発明の別の実施形態のポリペプチドの配列は、配列番号１の配列において、第１３位でのフェニルアラニンからチロシンへの置換変異を少なくとも含む配列に相当する。
【００４０】
本発明の別の実施形態のポリペプチドの配列は、配列番号１の配列において、第１４位でのチロシンからトリプトファンへの置換変異を少なくとも含む配列に相当する。
【００４１】
本発明の別の実施形態のポリペプチドの配列は、配列番号１の配列において、第２８位での、アスパラギンから、アルギニン及びヒスチジンから選択されるアミノ酸残基への、より好ましくはアルギニンへの置換変異を少なくとも含む配列に相当する。
【００４２】
本発明の別の実施形態のポリペプチドの配列は、配列番号１の配列において、第３２位でのグルタミンからアルギニンへの置換変異を少なくとも含む配列に相当する。
【００４３】
本発明の別の実施形態のポリペプチドの配列は、配列番号１の配列において、第３５位でのリジンからチロシンへの置換変異を少なくとも含む配列に相当する。
【００４４】
本発明の別の実施形態のポリペプチドの配列は、配列番号１の配列において、第１０位でのグルタミンからアルギニンへの置換変異を少なくとも含む配列に相当する。
【００４５】
本発明の別の実施形態のポリペプチドの配列は、配列番号１の配列において、第１１位でのアスパラギンからスレオニンへの置換変異を少なくとも含む配列に相当する。
【００４６】
本発明の別の実施形態のポリペプチドの配列は、配列番号１の配列において、第１７位
でのロイシンからバリンへの置換変異を少なくとも含む配列に相当する。
【００４７】
本発明の別の実施形態のポリペプチドの配列は、配列番号１の配列において、第２７位での、アルギニンから、リジンおよびセリンから選択されるアミノ酸残基への置換変異を少なくとも含む配列に相当する。
【００４８】
本発明の好ましいポリペプチドは、そのアミノ酸配列が、配列番号１の配列において少なくとも以下の突然変異、Ｆ１３Ｙ、Ｙ１４Ｗ、Ｎ２８Ｒ、Ｑ３２ＲおよびＫ３５Ｙ、を含む配列に相当する。
【００４９】
本発明のポリペプチドの種々の実施形態の具体的な配列の例（各々が上記の１又は複数の特定の突然変異を含む）は配列番号２〜７９に記載され、かつ図１に例示されている。これらのポリペプチドのＨＥＲ２結合特性は、ここでの全般的な本発明の説明の後の実施例に開示される。
【００５０】
非修飾ＳＰＡドメインの使用に代わるものとして、ＳＰＡドメインは、アルカリ性条件下での安定性を増大させるために、突然変異誘発も施され得る。このような安定化は、非修飾配列中に出現する任意のアスパラギン残基を、アルカリ条件に対してより感受性の低いアミノ酸残基に置換する、部位特異的置換を包含する。アフィニティークロマトグラフィーにおけるアフィニティーリガンドとして本発明のポリペプチドを用いる場合、このアルカリに対する低感受性という特性は、以下の利点をもたらす。アフィニティークロマトグラフィーカラムは分離操作の合間に定置洗浄（ＣＩＰ）を目的とした厳しいアルカリ処理をしばしば施されるが、このような処理に耐える能力がアフィニティークロマトグラフィーマトリックスの耐用寿命を延長する。一例として、出発点としてプロテインＺを使用する場合、本発明のポリペプチドは、ＨＥＲ２結合を付与する置換変異の他に、Ｎ３、Ｎ６、Ｎ１１、Ｎ２１、Ｎ２３、Ｎ２８、Ｎ４３およびＮ５２から選択される少なくとも１つのアスパラギン残基が、アルカリ処理に対して低感受性であるアミノ酸残基で置換されているという修飾を有し得る。このようなポリペプチドの非限定的な例は、以下の組の突然変異（Ｚwtの配列に関して）を有するものである。Ｎ３Ａ。Ｎ６Ｄ。Ｎ３Ａ、Ｎ６ＤおよびＮ２３Ｔ。Ｎ３Ａ、Ｎ６Ｄ、Ｎ２３ＴかつＮ２８Ａ。Ｎ２３Ｔ。Ｎ２３ＴかつＮ４３Ｅ。Ｎ２８Ａ。Ｎ６Ａ。Ｎ１１Ｓ。Ｎ１１ＳかつＮ２３Ｔ。Ｎ６ＡかつＮ２３Ｔ。したがってこれらのＳＰＡドメイン、ならびに安定性の理由のためにアスパラギン突然変異を施されたその他のＳＰＡドメインは全て、本発明のＨＥＲ２結合ポリペプチドを得るために、アミノ酸残基のさらなる置換変異に付すことができる。あるいは、アスパラギン残基を含む本発明のＨＥＲ２結合ポリペプチドは、アスパラギン残基を置き換えるためにさらなる突然変異に付してもよい。この後者の選択肢は、そのような分子のＨＥＲ２結合能力が維持される程度においてのみ可能であることは明らかである。
【００５１】
本発明は、上記ポリペプチドの断片の生成を通じて任意の上記ポリペプチドから得られたポリペプチドも包含するが、ここで該ポリペプチド断片はＨＥＲ２親和性を維持している。該ポリペプチド断片は、その安定性が維持され、かつＨＥＲ２を結合する特異性を保持するものである。免疫グロブリンＧに対する結合特異性を維持した野生型ＳＰＡドメインの断片を作製する可能性は、Braisted AC and Wells JA et al in Proc Natl Acad Sci
USA 93: 5688-5692 (1996)により示されている。構造ベースの設計およびファージディスプレイ法を用いることにより、５９残基からなる３ヘリックス束の結合ドメインは、結果的に３３残基からなる２ヘリックス誘導体へと縮小された。これは、異なる領域からの無作為な突然変異の段階的な選択により達成され、それによって、安定性および結合親和性が繰り返し改善された。本発明の第一の態様によるポリペプチドに対すると同一の推論により、当業者は、「親」ＨＥＲ２ポリペプチドと同一の結合特性を有する「最小化」ＨＥＲ２結合ポリペプチドを得ることができよう。それゆえ、本発明の上記の態様によるポ
リペプチドの断片を構成するポリペプチドであって、該断片がＨＥＲ２に対する結合親和性を保有するポリペプチドは、本発明のさらなる態様である。
【００５２】
本発明の別の態様は、本発明のポリペプチドをコードする配列を含む核酸分子に関する。
【００５３】
本発明のさらなる態様は、前の態様の核酸分子、ならびに核酸分子の発現により本発明のポリペプチドの産生を可能にするその他の核酸要素を含む発現ベクターに関する。
【００５４】
本発明のさらに別の態様は、前の態様の発現ベクターを含む宿主細胞に関する。
【００５５】
後半３つの本発明の態様は、本発明のポリペプチドの産生のための手段であり、発現されるべきポリペプチドに関する本明細書中の情報が与えられれば、そしてタンパク質の組換え発現についての当業者の一般的レベルを考えれば、過度の負担をかけることなく、当業者はそれらを生成し得るし、それらを実際に使用し得る。一例として、非修飾プロテインＺの発現のためのプラスミド（例えばNilsson B et al (1987)、上記参照）が、出発物質として用いられ得る。所望の置換変異は、既知の技法を用いてこのプラスミド中に導入されて、本発明にのっとった発現ベクターを生成し得る。
【００５６】
しかしながら、本発明のポリペプチドは、その他の既知の手段、例えば化学合成、あるいは種々の原核生物または真核生物宿主、例えば植物およびトランスジェニック動物中での発現によっても生成され得る。化学的なポリペプチドの合成を利用する場合、上記のようなポリペプチド中の天然アミノ酸残基のいずれかを、ポリペプチドのＨＥＲ２結合能力が実質的に弱められることがない限り、任意の対応する非天然アミノ酸残基またはその誘導体によって置換しても良い。少なくとも結合能力は保持されるべきであるが、しかしながら、対応する非天然アミノ酸残基またはその誘導体による置換も、実際には、ポリペプチドのＨＥＲ２結合能力を改善するのに役立つ可能性がある。さらに、非天然アミノ酸の組入れは、分子（例えば標識、エフェクター、キレート剤等）の、ＨＥＲ２結合ポリペプチドへの、既存のものに代わる結合部位を提供するために実施され得る。非古典的なアミノ酸または合成アミノ酸類似体としては、普通のアミノ酸のＤ−異性体、α−アミノイソ酪酸、４−アミノ酪酸、２−アミノ酪酸、６−アミノヘキサン酸、２−アミノイソ酪酸、３−アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、システイン酸、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、β−アラニン、フルオロアミノ酸、デザイナーアミノ酸（designer amino acids）（例えばβ−メチルアミノ酸、Ｃα−メチルアミノ酸、Ｎα−メチルアミノ酸）、ならびにアミノ酸類似体全般が挙げられるが、これらに限定されない。さらにアミノ酸残基は、ＤまたはＬ形態で存在し得る。
【００５７】
本発明は、上記のＨＥＲ２結合ポリペプチドの使用態様、ならびに該ポリペプチドがその結合特性によって有用なものになっている、治療、診断および検出のための種々の方法にも関する。これらの使用および方法に関する以下の説明において「ＨＥＲ２結合ポリペプチド」に言及する場合、この用語はＨＥＲ２結合ポリペプチドのみを包含することを意図するものではなく、例えばその断片を構成し、および／または融合タンパク質中の一部分としてＨＥＲ２結合ポリペプチドを組入れるか、および／または標識または治療薬に結合されるか、および／またはタグとしてまたはその他の目的のために付加的アミノ酸残基を備える、このポリペプチドを基礎にした上述の分子もまた全て包含される。上記で説明したように、このような融合タンパク質、誘導体、断片等は、本発明の一部を形成する。
【００５８】
したがってこのような一態様では、本発明は、本明細書中に記載されたような薬剤としてのＨＥＲ２結合ポリペプチドの使用を提供する。
【００５９】
さらなる態様において、本発明は、ＨＥＲ２の過剰発現により特徴付けられる癌の少なくとも一形態の治療を目的とした薬剤の調製における、本明細書中に記載されたようなＨＥＲ２結合ポリペプチドの用途を提供する。ＨＥＲ２の過剰発現により特徴付けられる癌の特定の一形態は、乳癌である。「背景技術」の節に記載されたように、全ての乳癌患者の約２５％が、ＨＥＲ２の過剰発現を示す（Slamon DJ et al、上記を参照）。
【００６０】
この説に縛られることは望まないが、本明細書中に記載されたポリペプチドは、以下のメカニズムのうちの少なくとも１つを基礎にした治療薬として有用であると考えられる。（ｉ）化学療法（細胞傷害性）の増強作用。ここで、ポリペプチドの投与は、現存の及び将来的な化学療法およびホルモン療法と相乗的に機能する。細胞表面のＨＥＲ２タンパク質の遮断は、ＤＮＡ傷害薬が作用した後のＤＮＡ修復を阻止することが示されている（Pietras RJ et al (1994) Oncogene 9: 1829-1838）。（ｉｉ）腫瘍細胞の増殖の抑制（細胞分裂抑制）。この論証は、分子（抗体）が細胞表面上のＨＥＲ２タンパク質に結合するといくつかの受容体の細胞内取り込みが生じ、細胞がさらに増殖するためのシグナルを制限する、という観察に基づいている（Baselga J et al (1998) Cancer Res 58: 2825-2831; Sliwkowski MX et al、上記を参照）。
【００６１】
本発明の関連態様は、ＨＥＲ２の過剰発現により特徴付けられる癌のうちの少なくとも１つの形態を治療するための方法であって、活性物質として本明細書中に上述されたようなＨＥＲ２結合ポリペプチドを含む治療的に有効な量の組成物を、このような治療を必要とする被験体に投与することを包含する方法の提供である。
【００６２】
本発明のポリペプチドのＨＥＲ２結合特性は、融合タンパク質および／または標識結合分子の作製に対する該ポリペプチドの適性に加えて、ＨＥＲ２を過剰発現する細胞を含む腫瘍の部位に対して他の活性物質を標的化するためにも該ポリペプチドが有用であり得る、ということを意味する。したがって本発明の別の態様は、抗癌活性を有する物質と結合された本明細書中に記載されるＨＥＲ２結合ポリペプチドの用途であって、ＨＥＲ２を過剰発現する細胞への上記物質の送達を目的とした用途を提供することである。結合される物質は、被験体の内因性免疫系の応答を引き出すよう機能するものであっても良い。ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞または免疫系のその他のエフェクターは、そのようなエフェクターを動員する機能を担う融合部分の提示を通じて、細胞表面上のＨＥＲ２とＨＥＲ２結合ポリペプチドとの複合体に引き付けられ得る。細胞が異常であることを検出したＮＫ細胞またはその他のエフェクターは、ＨＥＲ２結合融合タンパク質に結合する。その結果、癌細胞は、ＮＫ細胞により食べ尽くされる（Sliwkowski MX et al、上記を参照；Pegram MD et al (1997) Proc Am Assoc Cancer Res 38: 602, Abstract 4044）。
【００６３】
このような活性物質は、融合により、または化学的連結により、ＨＥＲ２結合ポリペプチドに結合されるタンパク質、例えば「ＡＤＥＰＴ」（抗体酵素プロドラッグ療法）用途のためにエフェクター酵素の中から選択されるタンパク質；免疫系のエフェクター細胞およびその他の構成成分の動員のためのタンパク質；サイトカイン、例えばＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＴＮＦα、ＩＰ−１０；凝血原因子（procoagulant factors）、例えば組織因子、フォン・ウィルブラント因子；毒素、例えばリシンＡ、シュードモナス内毒素、カルケアマイシン、マイタンシノイドであり得る。あるいは、該活性物質は、細胞傷害剤、例えばアウリスタチン類似体またはドキソルビシン、あるいは放射性同位体（例えば90Ｙ、131Ｉ、211Ａｔ）であり、この同位体は、ＨＥＲ２結合ポリペプチドと直接結合してもよく、あるいはキレート剤、例えば周知のキレート剤であるＤＯＴＡまたはＤＴＰＡを介して結合しても良い。
【００６４】
関連する態様において、本発明は、抗癌活性を有する物質をｉｎ ｖｉｖｏでＨＥＲ２
を過剰発現する細胞に対して送達する方法であって、上記活性物質と本明細書中に記載されるＨＥＲ２結合ポリペプチドとの結合体を患者に投与することを包含する方法も提供する。該結合体は、上記段落に記載されたように適切に調製される。
【００６５】
本発明の別の態様は、試料中のＨＥＲ２の検出を目的とした、本明細書中に記載されているようなＨＥＲ２結合ポリペプチドの使用である。例えばこのような検出は、ＨＥＲ２の過剰発現により特徴付けられる疾患状態を診断するという目的で実施され得る。試料中のＨＥＲ２の存在の検出は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで実施され得る。ｉｎ ｖｉｖｏ診断のための好ましい選択肢は、陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）の使用である。当該試料は、例えば生体液試料または組織試料であり得る。本発明のＨＥＲ２結合ポリペプチドに対して用いるに適した、ＨＥＲ２に対して作られた抗体に対して今日用いられている一般的な方法は、新鮮な、凍結された、またはホルマリン固定、パラフィン包埋された組織試料中のＨＥＲ２タンパク質の過剰発現を検証するために用いられる、ＨＥＲ２の存在の組織化学的検出である。ＨＥＲ２検出のために、本発明のポリペプチドは融合タンパク質の一部としても用いられ得るが、ここで、他のドメインはレポーター酵素または蛍光酵素である。あるいは、ポリペプチドは、状況によってはキレート剤を介して、１又は複数の蛍光剤（単数または複数）および／または放射性同位体（単数または複数）で標識され得る。適切な放射性同位体としては、68Ｇａ、76Ｂｒ、111Ｉｎ、99Ｔｃ、124Ｉおよび125Ｉが挙げられる。
【００６６】
本発明のさらに別の態様は、生体液試料中のＨＥＲ２の検出方法における、本明細書中に記載されたようなＨＥＲ２結合ポリペプチドの使用により構成される。この方法は、（ｉ）試験されるべき患者からの生体液試料を準備する工程、（ｉｉ）本明細書中に記載されるようなＨＥＲ２結合ポリペプチドを、該試料中に存在する任意のＨＥＲ２と該ポリペプチドとの結合が可能になるような条件下で、該試料に添加する工程、（ｉｉｉ）結合していないポリペプチドを除去する工程、および（ｉｖ）結合したポリペプチドを検出する工程、を包含する。検出される結合したポリペプチドの量は、試料中に存在するＨＥＲ２の量と相関する。工程（ｉｉ）において、試料へのＨＥＲ２結合ポリペプチドの添加は、任意の適切な形式で実施され、例えば試料が接触する固体支持体上にＨＥＲ２結合ポリペプチドが固定される状況、ならびにＨＥＲ２結合ポリペプチドが溶液中に存在する設定を包含する。
【００６７】
本発明の別の関連する態様は、試料中のＨＥＲ２の検出方法であって、（ｉ）ＨＥＲ２を含有する疑いのある組織試料、例えば組織のクリオスタット切片またはパラフィン包埋切片を準備する工程、（ｉｉ）試料中に存在する任意のＨＥＲ２とのポリペプチドの結合を実行し得る条件下で、上記試料に本発明のＨＥＲ２結合ポリペプチドを添加する工程、（ｉｉｉ）結合していないポリペプチドを除去する工程、および（ｉｖ）結合したポリペプチドを検出する工程、を包含する方法である。検出される結合したポリペプチドの量は、試料中に存在するＨＥＲ２の量と相関する。
【００６８】
組織試料におけるＨＥＲ２の過剰発現を診断するためのキットであって、レポーター酵素（例えばアルカリ性ホスファターゼまたはホースラディッシュペルオキシダーゼ）と融合した本発明のＨＥＲ２結合ポリペプチド、酵素活性の検出のための試薬、ならびに陽性および陰性対照組織スライドを包含するキットも、本発明により提供される。
【００６９】
組織試料におけるＨＥＲ２過剰発現の診断のためのキットであって、抗体による検出のためのタグ（例えばＦｌａｇタグまたはｍｙｃタグ）と融合した本発明のＨＥＲ２結合ポリペプチド、タグに特異的な一次抗体、一次抗体に特異的で、かつレポーター酵素を結合した二次抗体、酵素活性の検出のための試薬、ならびに陽性および陰性対照組織スライドを包含するキットも、本発明により提供される。
【００７０】
診断用途における一領域は、癌細胞またはその集合体のｉｎ ｖｉｖｏでの検出である。本発明は、このような診断を実施するためのキットであって、キレート剤で標識された本発明のＨＥＲ２結合ポリペプチド、診断用放射性同位体（非限定的な例は、68Ｇａ、76Ｂｒ、111Ｉｎ、99Ｔｃ、124Ｉおよび125Ｉである）、ならびに取り込み効率の分析のための試薬を包含するキットを提供する。
【００７１】
上記のように、本発明は、ＨＥＲ２を過剰発現する細胞、例えばある種の癌細胞に活性物質をターゲッティングすることを目的とした、本発明のＨＥＲ２結合ポリペプチドの使用を包含する。本発明は、この目的のためのキットであって、キレート剤で標識された本発明のＨＥＲ２結合ポリペプチド、治療用放射性同位体（非限定的な例は90Ｙ、131Ｉ、211Ａｔである）、および取り込み効率の分析のための試薬を包含するキットも提供する。
【００７２】
本発明に従って実行される実験についての非限定的な詳述により、ここで本発明をさらに例示する。
【実施例１】
【００７３】
ＨＥＲ２結合ポリペプチドの選択および試験
これらの実験では、多数の異なるＳＰＡドメイン関連ポリペプチドのライブラリーから本発明のいくつかのＨＥＲ２結合ポリペプチドを選択し、その後、特性を明らかにした。
【００７４】
ライブラリーのパニング及びクローンの選択
Nord K et al (1995、上記参照)に記載されたのと本質的に同様に、コンビナトリアル・ファージディスプレイライブラリーを調製した。本試験に用いたこのライブラリーのプールは、第９位、１０位、１１位、１３位、１４位、１７位、１８位、２４位、２５位、２７位、２８位、３２位および３５位に無作為なアミノ酸残基を有するプロテインＺ（Ａｆｆｉｂｏｄｙ（登録商標）分子）の８．７×１０8の変異体を含む。標的としてビオチニル化ヒトＨＥＲ２細胞外ドメイン（ＨＥＲ２−ＥＣＤ）を用いて、４回のパニングで、抗原結合Ａｆｆｉｂｏｄｙ（登録商標）分子を選択した（組換えヒト細胞外ドメイン、アミノ酸２３８〜２１０９、Fox Chase Cancer Center, Philadelphia, USAにより提供）。４回の選択サイクルの結果、９１個のクローンをファージＥＬＩＳＡ用に選択し、それらのＨＥＲ２結合活性の分析を実施した。
【００７５】
ＨＥＲ２結合の分析用のファージＥＬＩＳＡ
４回の選択後に得られたクローンからのファージを９６ウエルプレート中で生成させ、ＨＥＲ２結合Ａｆｆｉｂｏｄｙ（登録商標）分子を発現するファージをスクリーニングするために、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）を用いた。シングルコロニーを、深穴９６ウエルプレート中で２％グルコースおよび１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを補充した２５０μｌのＴＳＢ培地（３０．０ｇのトリプシンダイズブロス（Merck）、水で最終容積を１ｌとする。オートクレーブ処理）に接種し、３７℃で一晩、振盪器上で増殖させた。５μｌの一晩培養物を、新プレート中で、０．１％グルコースおよび１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを補充した５００μｌのＴＳＢ＋ＹＥ培地（３０．０ｇのトリプシンダイズブロス（Merck）、５．０ｇの酵母抽出物、水で最終容積を１ｌとする。オートクレーブ処理）に添加した。３７℃で３時間増殖後、０．５μｌの５×１０12ｐｆｕ／ｍｌ（２．５×１０9ｐｆｕ）のヘルパーファージＭ１３Ｋ０７（New England Biolabs, #NO315S）および１００μｌのＴＳＢ＋ＹＥ培地を各ウエルに添加し、３７℃で３０分間、振盪せずにプレートをインキュベートした。ＩＰＴＧ、カナマイシンおよびアンピシリンを補充した３００μｌのＴＳＢ＋ＹＥを各ウエルに添加して、最終濃度を１ｍＭのＩＰＴＧ、２５μｇ／ｍｌのカナマイシンおよび１００μｇ／ｍｌのアンピシリンとして、プレートを３０℃で一晩、振盪器上でインキュベートした。２，５００ｇで１５分間の遠心分離に
より細胞をペレット化し、Ａｆｆｉｂｏｄｙ（登録商標）分子を発現するファージを含有する上清をＥＬＩＳＡに用いた。ＰＢＳ（２．６８ｍＭのＫＣｌ、１３７ｍＭのＮａＣｌ、１．４７ｍＭのＫＨ2ＰＯ4、８．１ｍＭのＮａ2ＨＰＯ4、ｐＨ７．４）中の４μｇ／ｍｌのＨＥＲ２の１００μｌを、微量滴定プレート（Nunc #446612）に添加し、４℃で１ヶ月間インキュベートした。ＰＢＳ中の２％粉末スキムミルク（ブロッキング緩衝液）で、室温で１時間、ウエルをブロッキング処理し、２００μｌのファージ含有上清および５０μｌの１０％ブロッキング緩衝液を添加した。プレートを、室温で２時間インキュベートした。ポリクローナル抗体（ウサギ抗Ｍ１３、Abcam #ab6188）を２％ブロッキング緩衝液中で１：１，０００に希釈し、１５０μｌを各ウエルに添加した。プレートを、室温で１時間インキュベートした。アルカリ性ホスファターゼと結合したヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体（Sigma #A-3687）を２％ブロッキング緩衝液中で１：１０，０００に希釈し、その後１５０μｌを各ウエルに添加し、室温で１時間インキュベートした。１Ｍのジエタノールアミン、５ｍＭのＭｇＣｌ2（ｐＨ９．８）と水の１：１混合物中にＳｉｇｍａ−１０４基質（Sigma #104-105）を溶解することにより（１錠／５ｍｌの１：１混合物）、展開溶液を調製した。その後、１８０μｌの展開溶液を各ウエルに添加した。ウエルをＰＢＳ−Ｔ（ＰＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０）で２回、ＰＢＳで１回洗浄した後、各々の新試薬を添加した。基質を添加してから２５分後、ＥＬＩＳＡ分光光度計（Basic Sunrise, Tecan）を用い、Ａ405で、プレートを読取った。
【００７６】
ＥＬＩＳＡ値の閾値判定基準（Ａ405が０．５より高い）を用いて、ＨＥＲ２結合物質をコードするファージを同定した。４８のクローンがこの値より高いＥＬＩＳＡシグナルを生じ、無作為で選択された、ＥＬＩＳＡ結果が利用可能でない５クローンとともに、ＤＮＡ配列分析用に選択された。
【００７７】
ＤＮＡ配列分析
上記の手法に従って単離されたクローンからのＤＮＡのシーケンシングを、メーカーの推奨によりＡＢＩプリズム（登録商標）、ビッグダイ（商標）ターミネーターｖ２．０レディリアクションサイクルシーケンシングキット（Applied Biosystems）を用いて実施した。プラスミドを調製し、オリゴヌクレオチドＲＩＴ−２７（５’−ＧＣＴＴＣＣＧＧＣＴＣＧＴＡＴＧＴＴＧＴＧＴＧ−３’）およびビオチン化ＮＯＫＡ−２（５’−ビオチン−ＣＧＧＡＡＣＣＡＧＡＧＣＣＡＣＣＡＣＣＧＧ−３’）を用いて、Ａｆｆｉｂｏｄｙ（登録商標）分子をコードするＤＮＡをシーケンシングした。ＡＢＩプリズム（登録商標）３７００遺伝子分析装置（Applied Biosystems）で、配列を分析した。予め選択された５３のクローンから、いくつかのクローンが同一アミノ酸配列をコードすることが判明した。これらの縮重を考慮に入れて、ＥＬＩＳＡ結合検定で選択されたクローンにより発現されるＡｆｆｉｂｏｄｙ（登録商標）分子の４つの配列を図１に示し（ＺHER2 A-D）、かつ配列番号２〜５として配列表中で同定した。
【００７８】
クローニングおよびタンパク質産生
図２で概略的に示されている構築物をコードする発現ベクターを用いて、大腸菌細胞中でＺHER2ポリペプチドを発現させた。これにより、該ポリペプチドは、Ｎ末端ヘキサヒスチジルタグとの融合体として産生された。融合ポリペプチドＨｉｓ6−ＺHER2 AおよびＨｉｓ6−ＺHER2 Bを固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）カラムで精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ実験の結果を、図３に示す。
【００７９】
融合ポリペプチドのバイオセンサー分析
前節により産生されたＨｉｓタグ化ＺHER2変異体とＨＥＲ２との間の相互作用を、ビアコア（登録商標）２０００システム（Biacore AB, Uppsala, Sweden）により表面プラズモン共鳴を利用して分析した。ヒトＨＥＲ２、ＨＩＶ−１ｇｐ１２０（Protein Sciences
Corporation、#2003-MN）およびＢＢ（連鎖球菌プロテインＧ由来のアルブミン結合タンパク質）（後者２つは対照として用いる）を、メーカーの推奨に従って、ＣＭ−５チップの表面のカルボキシル化デキストラン層上へのアミンカップリングにより、異なるフローセル中に固定した。ヒトＨＥＲ２、ＨＩＶ−１ｇｐ１２０およびＢＢの固定化は、それぞれ１９００、６２９０および１０００共鳴単位（ＲＵ）を生じた。第四フローセル表面を活性化し、注入を行う間のブランクとして用いるために非活性化した。Ｈｉｓ6−ＺHER2 AおよびＨｉｓ6−ＺHER2 Bタンパク質をＨＢＳ（５ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３．４ｍＭのＥＤＴＡ、０．００５％界面活性剤Ｐ−２０（ｐＨ７．４））で希釈して最終濃度を１０μＭとし、３０μｌ／分の一定流量で、二つ組として、順不同に注入した。精製タンパク質Ｈｉｓ6−ＺHER2 A及びＨｉｓ6−ＺHER2 BのＨＥＲ２と相互作用する能力を、それぞれ図４および５のセンサグラム（sensorgram）に例示したように確認した。
【００８０】
さらにＨｉｓ6−ＺHER2 AおよびＨｉｓ6−ＺHER2 Bに関して、動態試験を実施した。チップに固定された１９００ＲＵのヒトＨＥＲ２を有するＣＭ−５チップを用いた。Ｈｉｓ6−ＺHER2 AおよびＨｉｓ6−ＺHER2 Bの各々に関して、一連の６つの異なる濃度（１μＭ〜４０μＭ）のＨＥＲ２結合ポリペプチドをＨＢＳ中に調製し、３０μｌ／分の流量で、二つ組として、順不同に注入した。総注入時間は５０秒（会合）で、その後、６分間洗浄した（解離）。表面を、２０ｍＭのＨＣｌで１０秒間再生した。参照細胞中で測定された応答（活性化／非活性化表面）を、固定化ＨＥＲ２を有する細胞中で測定された応答から差し引いた。BIAevaluation３．０．２ソフトウエア（Biacore AB）の１：１ラングミュア結合モデルを用いて、結合曲線（センサグラム）を分析した。図６（Ｈｉｓ6−ＺHER2 A）および７（Ｈｉｓ6−ＺHER2 B）に示された結合曲線から明らかなように、Ｈｉｓ6−ＺHER2 Aに関しては１０〜１００ｎＭの、Ｈｉｓ6−ＺHER2 Bに関しては２００〜４００ｎＭの表示されたＫDを有する会合及び解離曲線により立証されるように、Ｈｉｓ6−ＺHER2 AおよびＨｉｓ6−ＺHER2 Bはともに、ＨＥＲ２と明瞭に結合する。さらに、試験したＨＥＲ２結合ポリペプチドのいずれもＢＢ対照抗原およびｇｐ１２０対照抗原とは結合しないことから（図４および図５）、該結合は選択的である。
【００８１】
第二の動態実験では、Ｈｉｓ6−ＺHER2 AおよびＨｉｓ6−ＺHER2 B変異体を再び、３０μｌ／分の流量で、異なる濃度（０〜５μＭ、最小濃度：Ｈｉｓ6−ＺHER2 Aに関しては０．００９８μＭ、Ｈｉｓ6−ＺHER2 Bに関しては０．０１９６μＭ；ＨＢＳで希釈）でＨＥＲ２表面上に注入した。動態分析前に、アミノ酸分析によりタンパク質濃度を確定した。BIAevaluation３．２ソフトウエア（Biacore）を用いて、解離平衡定数（ＫD）、会合速度定数（ｋa）および解離速度定数（ｋd）を算定し、１対１結合であると推定した。最初の２つのビアコア（登録商標）分析に関しては、試料は、２５℃で、順不同に２度流し、各回の注入の後には、１０ｍＭのＨＣｌの注入によりフローセルを再生した。結合曲線（図８Ａ〜８Ｂ）の評価時に、解離平衡定数（ＫD）を、Ｈｉｓ6−ＺHER2 Aに関しては約５０ｎＭ、Ｈｉｓ6−ＺHER2 Bに関しては約１４０ｎＭであると確定した。ＫDの違いの理由は、おそらく、図４のグラフＡを図５のグラフＡと比較することにより分かるように、解離速度の顕著な差のためである。Ｈｉｓ6−ＺHER2 Aに関しては、会合速度定数（ｋa）は、約１．８×１０5 Ｍ-1ｓ-1および解離速度定数（ｋd）は約９．９×１０-3 ｓ-1であると算定され、一方、Ｈｉｓ6−ＺHER2 Bに関しては、高速な会合および解離動態のため、ｋaおよびｋdは見積もるのが難しかった。したがって、その標的とのより強力な結合を示すＨｉｓ6−ＺHER2 AＡｆｆｉｂｏｄｙ変異体を、さらなる特徴付けのために選択した。
【実施例２】
【００８２】
ＨＥＲ２を発現する細胞とのＺHER2 Aの結合
細胞培養
約２×１０6ＨＥＲ２分子／細胞を発現することが知られているヒト乳癌細胞株ＳＫＢＲ−３を、ＡＴＣＣから購入した（ＡＴＣＣ＃ＨＴＢ−３０）。１０％ウシ胎仔血清、２ｍＭのＬ−グルタミンおよびＰＥＳＴ（１００ ＩＵ／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン）（すべてBiochrom KG, Berlin, Germanyから）を補充したＲＰＭＩ １６４０培地中で細胞を培養した。細胞を、３７℃で、５％ＣＯ2を含有する湿潤空気中で培養し、実験の３日前に３ｃｍペトリ皿中に植え付けた。
【００８３】
放射性標識
Orlova et al in Nucl Med Biol 27: 827-835 (2000)に従って、標識前駆体Ｎ−スクシンイミジルｐ−（トリメチル−スタンニル）ベンゾエート（ＳＰＭＢ）を調製し、５μｇのＳＰＭＢを５％酢酸溶液中の５ＭＢｑの125Ｉに添加した。反応を開始するために、水溶液中の４０μｇのクロラミン−Ｔ（Sigma, St. Louis, MO）を添加した。反応混合物を５分間撹拌し、水溶液中の８０μｇのナトリウム−メタ−ビスルフェート（Aldrich, Steinheim, Germany）を添加して、反応を停止した。０．０７Ｍのホウ酸緩衝液（ｐＨ９．２）中の４０μｇのＨｉｓ6−ＺHER2 AまたはＨｉｓ6−ＺHER2 Bに、該放射性標識前駆体を添加した。連続的に撹拌しながら、室温で４５分間、カップリング反応を実施した。ＰＢＳで平衡化したＮＡＰ（商標）−５サイズ排除カラム（Amersham Biosciences）を用いて、標識ＺHER2変異体を低分子量生成物から分離した。次に放射性標識ＺHER2変異体をビアコア（登録商標）技法を用いて分析して、標識処理がＨＥＲ２−ＥＣＤに対する結合親和性に影響を及ぼさなかったことを確認した。両ＺHER2変異体は親和性保持を示した（データは示されていない）。
【００８４】
細胞試験
約１００，０００個のＳＫＢＲ−３細胞を有する各培養皿に、１４ｎｇの標識Ｈｉｓ6−ＺHER2 AまたはＨｉｓ6−ＺHER2 Bを含む１ｍｌの培地を添加した。この量は、理論的なリガンド：受容体比である５：１に相当する。細胞に由来しない非特異的結合を測定するために、細胞を含有しない３つの培養皿を同一方法で処理した。この値を、全ての他の値から差し引いた。細胞結合の特異性を分析するために、３つの培養皿を、標識されたＺHER2変異体だけでなく、５００倍過剰量の標識されていないＺHER2変異体でも処理した。３７℃で３時間のインキュベーション後、放射性培地を除去し、培養皿を氷冷無血清培地で３回、迅速に洗浄した。０．５ｍｌのトリプシン／ＥＤＴＡ溶液（ＰＢＳ中０．２５％／０．０２％；Biochrom KG, Berlin, Germany）を用いて、３７℃で１５分間、細胞をトリプシン処理した。次に細胞を１ｍｌの培地中に再懸濁し、０．５ｍｌの細胞懸濁液を細胞計数のために用い、残り１ｍｌを自動ガンマーカウンターでの放射能測定のために用いた。
【００８５】
図９に示したように、Ｈｉｓ6−ＺHER2 Aは、２×１０6のＨＥＲ２受容体／細胞を発現することが知られているＳＫＢＲ−３細胞との特異的な結合を示した（「遮断なし」バー）。放射性標識Ｈｉｓ6−ＺHER2 Aの結合は、過剰量の非標識Ｈｉｓ6−ＺHER2 Aの添加により完全に遮断することができた（「遮断あり」バー）。しかしながら、ＳＫＢＲ−３細胞とのＨｉｓ6−ＺHER2 Bの結合は、おそらくはこのＺHER2変異体に関するより迅速な解離速度の結果（上記参照）として、検出限界より低かった（データは示されていない）。
【実施例３】
【００８６】
ＨＥＲ２結合ポリペプチド二量体の発現および特徴付け
ＤＮＡ構築およびタンパク質産生
ＨＥＲ２受容体に対する親和性を有する新規のＡｆｆｉｂｏｄｙリガンド（Ｈｉｓ6−ＺHER2 Aと名づけられている）の選抜を、上に記した。ＺHER2 Aポリペプチドをコードする遺伝子断片をＨｉｓ6−ＺHER2 Aのための発現ベクター中にサブクローニングすることにより、二量体ＺHER2変異体を構築した。ＤＮＡシーケンサーＡＢＩプリズム（登録商標
）３７００アナライザー（Applied Biosystems, Foster City, CA）によるＤＮＡシーケンシングにより、ＺHER2 A断片の導入を確認した。大腸菌ＲＲＩΔＭ１５菌株（Ruther, Nucleic Acids Res 10: 5765-5772 (1982)）を、クローニングを行う間、細菌宿主として用いた。その結果得られたベクターは、Ｔ７プロモーターの制御下で（Studier et al, Methods Enzymol 185: 60-89 (1990)）、Ｎ末端ヘキサヒスチジン（Ｈｉｓ6）タグと融合した二量体ＺHER2変異体（ＺHER2 A）2をコードし、これにより固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）による精製が可能になる。
【００８７】
二量体ＺHER2変異体を、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）菌株中でＨｉｓ6−タグ化融合タンパク質として発現させて、実施例１において単量体ポリペプチドに関して記載されたように、変性条件下で、タロン（Talon）金属アフィニティー樹脂（８９０１−２、BD Biosciences, CA）カラムによるＩＭＡＣ精製により回収した。メーカーのプロトコル（Amersham Biosciences）に従って、ＰＢＳ（１０ｍＭのリン酸塩、１５４ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．１））で平衡化したＰＤ−１０カラムを用い、ゲル濾過により、精製Ｈｉｓ6−（ＺHER2 A）2融合タンパク質の再生を実施した。適切な吸光係数（30440Ｍ-1ｃｍ-1）を用いて、２８０ｎｍでの吸光度測定値からタンパク質濃度を算定し、アミノ酸分析（Aminosyraanalyscentralen, Uppsala, Sweden）によっても確認した。Ｎｏｖｅｘシステム（Novex, CA, USA）を用いて、トリス−グリシン１６％均質ゲル上でのＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、精製タンパク質をさらに分析した。クマシーブリリアントブルー染色により、タンパク質帯域を可視化した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により、該タンパク質は、予測分子量（１５．６ｋＤ）の明確な帯域として観察された（図１０、挿入図のレーン２）。２８０ｎｍでの吸光度測定値からの概算により、培養細胞ｌリットルあたり約２００ｍｇの発現レベルが実証された。
【００８８】
バイオセンサー分析
リアルタイム生体特異的相互作用分析（ＢＩＡ）のために、ビアコア（登録商標）２０００機器（Biacore AB）を用いた。１０ｍＭのＮａＡｃ（ｐＨ４．５）で希釈したＨＥＲ２の組換え細胞外ドメイン（ＨＥＲ２−ＥＣＤ）を、メーカーの使用説明書に従って、アミンカップリングによりＣＭ５センサーチップ（研究等級）（ＢＲ−１０００−１４、Biacore AB）の一方のフローセル表面のカルボキシル化デキストラン層上に固定した（約２２００ＲＵ）。他方のフローセル表面を活性化及び非活性化して、参照用の表面として供した。ＺHER2試料に関しては、メーカーのプロトコル（Amersham Biosciences）に従って、ＮＡＰ（商標）−１０カラムを用いて、ゲル濾過により、緩衝液をＨＢＳ（５ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３．４ｍＭのＥＤＴＡ、０．００５％界面活性剤Ｐ２０（ｐＨ７．４））へと変更し、その後試料を濾過した（０．４５μｍ；Millipore, Billerica, MA）。結合分析を２５℃で実施し、ＨＢＳをランニングバッファーとして用いた。全てのビアコア（登録商標）分析に関して；試料は順不同に２度繰り返して流し、各回の注入の後に、１０ｍＭのＨＣｌの注入により、フローセルを復元させた。
【００８９】
第一の実験では、ＨＥＲ２−ＥＣＤとの結合における、単量体と二量体ＺHER2タンパク質（実施例１のＨｉｓ6−ＺHER2 A及びＨｉｓ6−（ＺHER2 A）2）との差を、５μｌ／分の流量でのＨＥＲ２−ＥＣＤ表面上への５μＭの各タンパク質の注入により検定した。図１０から分かるように、Ｈｉｓ6−（ＺHER2 A）2に関してより遅い解離速度（off-rate）が観察されたが、これは、ＨＥＲ−ＥＣＤとＨｉｓ6−（ＺHER2 A）2との結合が、Ｈｉｓ6−ＺHER2 Aと比較してより強力であることを示す。
【００９０】
第二の実験では、Ｈｉｓ6−（ＺHER2 A）2を動態分析に付したが、ここでは、３０μｌ／分の流量で、異なる濃度（０〜５μＭ、最小濃度として０．００４９μＭ；ＨＢＳ中に希釈）でＨＥＲ２−ＥＣＤ表面上にタンパク質を注入した。動態分析前に、アミノ酸分析によりタンパク質濃度を確定した。BIAevaluation３．２ソフトウエア（Biacore AB）を
用いて、解離平衡定数（ＫD）、会合速度定数（ｋa）および解離速度定数（ｋd）を算定し、１対１結合であると推定した。結合曲線の評価時に、解離平衡定数（ＫD）を、約３ｎＭであると確定し、会合速度定数（ｋa）を、約２．５×１０5 Ｍ-1ｓ-1及び解離速度定数（ｋd）を約７．６×１０-4 ｓ-1であると算定した。これらの値を、実施例１の単量体Ｈｉｓ6−ＺHER2 Aに関して得られた動態定数と比較して、二量体Ｈｉｓ6−（ＺHER2
A）2のより強力な結合を確認することができる。二量体構築物に関する親和性作用による、このような向上した明白な高親和性は、他のＡｆｆｉｂｏｄｙ（登録商標）分子に関してはより早期に既に実証されている（Gunneriusson E et al, Protein Eng 12: 873-878 (1999)）。
【実施例４】
【００９１】
ＳＫＯＶ−３異種移植片を有するヌードマウスにおける、（ＺHER2 A）2の生体内分布および腫瘍へのターゲッティング
本実施例を構成する実験では、実施例３のＨｉｓ6タグ化二量体（ＺHER2 A）2ポリペプチドを125Ｉで放射性標識し、ＨＥＲ２の過剰発現により特徴付けられる移植された腫瘍を保有するマウスに注入した。標識されたポリペプチドの局在化を調べるため、ペプチドを注入されたマウスの画像処理と同様に、該ポリペプチドの生体内分布の検査も実施した。Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼに対する結合親和性を有する標識されたＺドメイン誘導体を、ＨＥＲ２に対する特異性を有さない対照として用いた（ＺTaq；Gunneriusson E et al（上記参照）に記載され、その中ではＺTaq S1-1として言及されている）。
【００９２】
材料および方法
（ＺHER2 A）2の間接的放射性ヨウ素標識
２．３μｌの容量の125Ｉ（１０ＭＢｑに相当する）（Ｎａ［125Ｉ］、Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden）を、シリコン処理した微量遠心分離管に加えた。１０μｌの酢酸（水に０．１％）、５μｌのＮ−スクシンイミジルｐ−トリメチル−スタンニル−ベンゾエート（の５％酢酸メタノール中で１ｍｇ／ｍｌ）（Koziorowski J et al, Appl Radiat Isot 49: 955-959 (1998)に従って調製）、ならびに１０μｌのクロラミン−Ｔ（４ｍｇ／ｍｌ水溶液）（ＣＨ3Ｃ6Ｈ4ＳＯ2Ｎ（Ｃｌ）Ｎａ・Ｈ2Ｏ、Sigma, St Louis, MO, USA）を添加した。多少混合しながら、５分間反応させた。次に、１０μｌのメタ亜硫酸水素ナトリウム（８ｍｇ／ｍｌ水溶液）（Ｎａ2Ｓ2Ｏ5、Sigma, St Louis, MO, USA）で、反応を終わらせた。４０μｌの容量の（ＺHER2 A）2二量体（０．０７Ｍのホウ酸緩衝液（ｐＨ９．２）（ホウ酸ナトリウム（Ｎａ2Ｂ4Ｈ7・１０Ｈ2Ｏ）Sigma, St Louis, MO,
USAおよび塩酸（ＨＣｌ）Merck, Darmstadt, Germany）中、０．２５ｍｇ／ｍｌ）を、反応試験管に添加した。別の４０μｌのホウ酸緩衝液を、ｐＨを約９に上げるために、各試験管に添加した。連続振盪しながら４５分間反応させた後、メーカーのプロトコルに従って、ＰＢＳで平衡化したＮＡＰ−５サイズ排除カラム（Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden）上で、反応成分を分離した。反応試験管、素通り画分、高ＭＷ画分、低ＭＷ画分およびカラムを、標識収率を算定するために、小型γ検出器（Mini-instruments Ltd, Essex, UK）を用いて６０ｃｍ（125Ｉ）で測定した。後日使用するまで、２０℃で、シリコン処理微量遠心分離管中に高分子量画分を貯蔵した。得られた収率は、２５〜３０％であった。
【００９３】
ＺTaqの間接的放射性ヨウ素標識
［125Ｉ］−ＮａＩのストック溶液を、０．１％酢酸水溶液１０μｌ、５μｌのＮ−スクシンイミジルｐ−トリメチル−スタンニル−ベンゾエート溶液（５％酢酸メタノール中で１ｍｇ／ｍｌ）、および１０μｌのクロラミン−Ｔの水溶液（４ｍｇ／ｍｌ）と混合した。反応混合物を激しく撹拌し、振盪しながら室温で５分間、インキュベートした。１０μｌのメタ亜硫酸水素ナトリウムの水溶液（８ｍｇ／ｍｌ）で、反応を終了させた。ＰＢＳ中のＺTaq（２．４ｍｇ／ｍｌ）の溶液２１μｌを粗反応混合物に添加した。ホウ酸緩
衝液（０．１Ｍ、ｐＨ９．１５）の添加により、反応混合物のｐＨを約９に調整した。振盪しながら３０分間、室温で反応混合物をインキュベートし、溶離液としてＰＢＳを用いて、ＰＢＳ中の５％アルブミン（ウシ、分画Ｖ、Sigma, St Louis, MO, USA）で予備平衡化したＮＡＰ−５カラムを用い、高分子量画分（標識ＺTaq）および低分子量画分に分離した。得られた放射性物質の収率は、７５％〜８０％であった。具体的な放射能は、１００ｋＢｑ／μｇであった。
【００９４】
動物の準備
M & Bからの雌非近交系ｎｕ／ｎｕ ｂａｌｂマウス（到着時に１０〜１２週齢）を、Ｃ１８１／１承認下で用いた。異種移植片を該マウスに移植する前の１週間、ルドベック研究所（Uppsala, Sweden）の動物施設で、標準的な食餌、寝床および環境を用い、マウスを順応させた。マウスは食餌および飲料水を自由に摂取した。
【００９５】
第一の実験の２ヶ月前に、５×１０6個のＳＫＯＶ−３ヒト卵巣癌細胞（ＡＴＣＣ＃ＨＴＢ−７７）を３３匹のマウスの右後足に皮下注射した。このグループを「Ａ組」と名づけた。
【００９６】
第二の実験の３週間前に、１０7個のＳＫＯＶ−３細胞を３２匹のマウスの両後足に皮下注射した。このグループを「Ｂ組」と名づけた。
【００９７】
画像処理試験のために、大型の腫瘍を有する２匹のマウス（下記参照）をＡ組から取り出し、そして他の全てをＢ組から取り出した。
【００９８】
実験時までに、腫瘍は全マウスにおいて定着していたが、サイズおよび状態はかなり小さく且つ異なった（被包性および侵潤、血管新生の段階）。使用時に、全マウスの体重は２２〜２７ｇであった。
【００９９】
生体内分布実験Ｉ
Ａ組からのマウス２０匹を、各グループ４匹で５つのグループ（Ｉ〜Ｖ）に無作為に分けた。大型腫瘍を有するＡ組からの２匹は、画像処理試験に用いるために除外した。グループ、注射および屠殺の時間は、スキーム１に従った。
【０１００】
ＰＢＳ５０μｌ中の125Ｉ（１００ｋＢｑ／マウス）で間接標識した（ＺHER2 A）2 ０．５μｇをマウスの尾部に静脈注射した。ＩＩグループ（「遮断グループ」）のマウスに対しては、ＰＢＳ２００μｌ中の０．０５ｍｇの非標識（ＺHER2 A）2を皮下に予備注射した４５分後に、標識（ＺHER2 A）2を注射した。いかなる視覚的問題もないことから、全注射が良好に耐容されたと判断した。
【０１０１】
【表１】
【０１０２】
屠殺の５分前に、致死用量のケタラール／ロンプン溶液（２０μｌ／体重１ｇ、ケタラ
ール１０ｍｇ／ｍｌ（Pfizer, New York, USA）、ロンプン１ｍｇ／ｍｌ（Bayer, Leverkusen, Germany））をマウスに腹腔内注射した。希釈ヘパリン（５０００ ＩＥ／ｍｌ、Leo Pharma, Copenhagen, Denmark）で洗浄した１ｍｌ注射器を用いて、心臓穿刺により、屠殺時に血液を採取した。血液と、尿、筋肉、骨、大腸、小腸、心臓、膀胱、肺、肝臓、脾臓、膵臓、腎臓、胃、唾液腺および甲状腺、脳、腫瘍および尾の試料を解剖し、重さを測った２０ｍｌプラスチックボトル中に回収した。Ｂ組からの数匹のマウスにおける複数の腫瘍の場合、全ての腫瘍を別個のボトル中に回収した。器官および組織の試料を計量し、それらの放射能をγ計数器（３インチＮａＩ（Ｔ１）検出器を伴う自動γ計数器である１４８０ ＷａｌｌａｃＷＩＺＡＲＤ(Wallac OY, Turku, Finland)）で測定した。
【０１０３】
生体内分布実験ＩＩ
Ｂ組からのマウス２４匹を、各グループ４匹で６つのグループに無作為に分けた。大型腫瘍を有するＢ組からの８匹は、画像処理試験に用いるために選択した。グループ、注射および屠殺の時間は、スキーム２に従った。
【０１０４】
ＰＢＳ５０μｌ中の125Ｉ（１００ｋＢｑ／マウス）で間接標識した（ＺHER2 A）2 ０．５μｇを、ＩおよびグループＩＶ〜ＶＩのマウスの尾部に静脈注射した。グループIIのマウスを、同量の放射性ヨウ素標識（ＺHER2 A）2を用いて、今回は尾の皮下に注射した。グループＩＩＩのマウスの尾に、ＰＢＳ５０μｌ中の125Ｉ（１００ｋＢｑ／マウス）で間接標識したＺTaq１．０７μｇを静脈注射した。いかなる視覚的問題もないことから、全注射が良好に耐容されたと判断した。
【０１０５】
【表２】
【０１０６】
生体内分布実験Ｉに関して上記したのと同様に、屠殺および試料の採取を実施した。この第二の実験では、胴体（carcass）も回収し、その放射能含量を測定した。器官および組織の試料を計量し、それらの放射能をγ計数器で測定した。
【０１０７】
放射能の測定
125Ｉの測定に関する標準プロトコルを用いた。バックグラウンドレベルを用いて補正した計数／分を、評価のために用いた。％ＩＤ／ｇ（組織１ｇあたりの、注射された線量に対する百分率）として表される組織取込み値を、以下のように算出した。
％ＩＤ／ｇ＝［（組織の放射能／注射された放射能）／組織重量］×１００
ここで、静脈注射に関しては、
注射された放射能＝対照の注射器の平均放射能−使用した注射器の放射能−尾の放射能であり、皮下注射に関しては：
注射された放射能＝対照の注射器の平均放射能−使用した注射器の放射能
である。
【０１０８】
画像処理試験
画像処理のために、全てのグループがＡ組からの大型腫瘍を有する１匹のマウスを含むということを考慮に入れつつ、各グループ５匹で２つのグループにマウスを分けた。Ｂ組からのマウスを無作為に抽出した。２グループのマウスに、ＰＢＳ９０μｌ中の125Ｉ（２．９ＭＢｑ／マウス）で間接標識した（ＺHER2 A）2 ２．３μｇを、それぞれ画像処理の６時間または８時間前に注射した。いかなる視覚的問題もないことから、全ての注射が良好に耐容されたと判断した。
【０１０９】
放射性複合体(radioconjugate)の注射後（ｐｉ）６時間および８時間目に、マウスの全身画像処理を実施した。マウスを強制排尿させて、致死量のケタラール／ロンプンの腹腔内注射により麻酔して、頚椎脱臼により殺害した。マウス（各グループ５匹）をｅ．ＣＡＭγカメラ（Siemens, Germany）中に置いて、各時点において１０分間の画像を得た。大型腫瘍を有する２匹のマウス（各グループから１匹）を、露出時間を２０分とした、同一カメラでの特別な画像を撮るために選択した。９９％ウインドウサイズ、３５ｋｅＶエネルギーウインドウで、低エネルギー、高分解能絞りを用いて、２５６×２５６ビットマトリックスで画像を得た。Nuclear Diagnostics（Kent, UK）からのＨｅｒｍｅｓソフトウエアを用いて、画像を評価した。
【０１１０】
結果
遮断実験
腫瘍中への（ＺHER2 A）2の取込みが特異的で且つ受容体調節性であるか否かをはっきりさせるために、生体内分布実験Ｉにおける遮断実験を実施した。放射性ヨウ素標識二量体の主要静脈注射の前に、スキーム１のグループＩＩのマウスに、０．０５ｍｇの非標識（ＺHER2 A）2を皮下注射した。グループＩおよびグループＩＩにおける注射後１時間での放射能の取込みを比較した。マウスの２つのグループに関する腫瘍対血液比は、０．７２（グループＩ平均）および０．２５（グループＩＩ平均）であった（図１１）。しかしながら、取込みの差は有意でなかった（ｐ＝０．１６）。腫瘍を除く全ての器官において、放射能取込みは遮断ありおよび遮断なし、の動物の両方に関して同一であった。
【０１１１】
遮断なしマウスの場合における比較的低い腫瘍対血液比は、この実験では早い時点（注射後１時間）が選択されたことにより説明できる。
【０１１２】
取込みの特異性
生体内分布実験ＩＩにおいて、グループＩＩＩのマウスに、他のグループのマウスに注射した（ＺHER2 A）2の量に相当する量のＺTaqを注射した。（ＺHER2 A）2に関すると同一の間接的な方法を用いて、放射性ヨウ素でＺTaqを標識しておいた。ＺTaqは、ＨＥＲ２受容体に対して非特異的である。グループＩおよびグループＩＩＩにおける注射後４時間での放射能の取込みを比較した。この実験の結果（図１２）は、非特異的ＺTaq分子が特異的（ＺHER2 A）2分子より低い腫瘍取り込みを有する、ということを示した。この実験における腫瘍対血液比は、１．４３（グループＩ、特異的（ＺHER2 A）2）および０．１５（グループＩＩＩ、非特異的ＺTaq）であった。統計学的分析により、差が有意である（ｐ＝０．００９）ことが示された。他の器官すべてにおいて、放射能取込みは、両Ｚ分子に関して同一レベルであった。
【０１１３】
遮断実験と比較した場合、（ＺHER2 A）2に対する高い腫瘍対血液比が、この実験で観察された。これは、実験の時点がより遅い（注射後４時間）ためであると考えられた。
【０１１４】
生体内分布
標識された（ＺHER2 A）2を静脈注射しておいた生体内分布実験ＩおよびＩＩにおけるマウスのグループからの結果を、腫瘍を保持するマウスの器官および組織中の放射性ヨウ素の生体内分布の分析と併せた。結果を図１３〜図１６に示す。
【０１１５】
図１３および図１４を参照すると、腫瘍中の125Ｉの濃度はほとんどの正常器官中の濃度より高く、このことは、（ＺHER2 A）2ポリペプチドがＨＥＲ２を保有する腫瘍細胞を標的とすることができることを示す。正常器官および組織中の放射能濃度は、腎臓（全時点）、甲状腺（全時点）および肝臓（早期時点）を除いて、腫瘍中よりも低いことが判明した。実験は、血液および正常器官からの放射性ヨウ素の迅速なクリアランスを示した。正常器官からのクリアランスは、放射性ヨウ素の蓄積が見出された甲状腺を除いて、主に血中クリアランスに次ぐものであった。遊離ヨウ素の甲状腺取込み増大は、間接的標識法に関してさえ既知であり、ある程度まで、「非アイソトープ」すなわち非放射性ヨウ素で防止され得る（Larsen RH et al, Nucl Med Biol 25: 351-357 (1998)）。高濃度の放射性ヨウ素はマウスの腎臓においても見出されたが、これも腎臓がこのような小タンパク質および異化代謝産物のための主要排泄経路であるためと予測された。
【０１１６】
図１５Ａおよび図１５Ｂは、血中および腫瘍中の放射性ヨウ素濃度の長時間にわたる経過を示す。注射後４時間から始めると、腫瘍放射能は、血液放射能より高かった。図１５Ａに示したような実験データを用いて、血液および腫瘍中の放射性ヨウ素の半減期を、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍcｖ３．０（GraphPad Software (San Diego, USA)社製）を用いて算定した。２相の指数関数的な崩壊に関する非線形回帰をモデルとして用い、得られたグラフを図１５Ｂに示す。腫瘍に対するＴ1/2α（０．３６時間）は、血液に対するもの（０．７６時間）より短かったが、Ｔ1/2βは長かった（腫瘍では８７．５時間に対し、血液では４．３時間）が、これは得られた結果と良好に一致する。比較のために、腫瘍を保有しない正常なマウスからの生体内分布データを用いて同一モデルで算定された標識二量体に対する血液中のＴ1/2αは、０．３時間であった（データは示されていない）。
【０１１７】
放射能濃度の腫瘍対血液比（図１６）は、注射後少なくとも１２時間の間、時間に伴って増大した。この比は、放射能画像処理における主バックグラウンドが血液中の放射能からのものであるため、画像のコントラストを見積もるのに好都合な因子である。腫瘍対血液比および腫瘍の放射能濃度を考慮に入れると、注射後６時間及び８時間が画像化のための最適時点であり得る、と結論づけられた。良好なコントラストを有する画像に対しては、腫瘍対非腫瘍の放射能濃度比は、２未満であるべきである。
【０１１８】
ガンマ画像
画像処理のために選択された各々５匹から成る２グループの各々から、ガンマ画像を撮影した（それぞれ注射後６時間および８時間）。両時点での全てのマウスにおいて、鮮明な構造を有する腎臓を同定することができた。いくつかのさらなる構造（おそらくは肝臓）が、注射後６時間のマウスの画像に、腎臓に重なって、全身血液プールからのバックグラウンド増大に加えて、認められる。いくつかの動物はそれらの膀胱中に多少の尿を有したが、これも直接観察される。注射後８時間のマウスに関する画像では、頚部領域のさらなる構造が同定され得るが、これはおそらく甲状腺である。
【０１１９】
各画像セッションにおける５匹の動物から、１つの大型侵潤腫瘍（ＳＫＯＶ−３注射の第一バッチから）が視覚化された。他の腫瘍の局在化は明白ではなかった。２匹の当該動物を付加的な画像処理セッションのために選択した。結果を図１７に示す。
【０１２０】
要約
ＳＫＯＶ−３（卵巣癌細胞株）腫瘍を保有するマウスにおける、ベンゾエート基を介して放射性ヨウ素（125Ｉ）で間接的に標識された二量体ポリペプチド（ＺHER2 A）2の生体内分布は、正常マウスにおける該二量体ポリペプチドの正常な生体内分布と良好な一致を示した。125Ｉ−ベンゾエート−（ＺHER2 A）2として注射される放射性ヨウ素の腫瘍への取込みが達成された。腫瘍への取込みは、高濃度の非標識（ＺHER2 A）2分子の予備注射
を用いた遮断実験により、且つ非特異的な、標識されたＺ変異体ＺTaqの注射により示されるように、受容体介在性かつ特異的であった。得られたデータの分析により、腫瘍中の放射能濃度が注射後４時間の血中の放射能濃度より高く、且つ腎臓および甲状腺を除いて、注射後６時間における大多数の正常器官および組織中より高い、ということが示された。ＳＫＯＶ−３異種移植腫瘍を保有するマウスのガンマ画像を、注射後６および８時間で得た。良好な分解能が達成された。両時点で、大きい侵潤腫瘍を明瞭に同定できた。
【実施例５】
【０１２１】
ＳＫＯＶ−３異種移植片を保有するヌードマウスにおけるＨｉｓ6−ＺHER2 A単量体の生体内分布および腫瘍へのターゲッティング
本実施例を構成する実験では、実施例１および２の単量体ＺHER2 Aポリペプチドを125Ｉで放射性標識し、ＨＥＲ２の過剰発現により特徴付けられる移植された腫瘍を保有するマウスに注入した。該ポリペプチドの生体内分布の検査を、その局在化を調べるために実施した。
【０１２２】
材料および方法
ＺHER2 Aの間接的放射性ヨウ素標識
125Ｉで標識するために、４０μｌの単量体Ｈｉｓ6−ＺHER2 Aを、実施例４における二量体ポリペプチド構築物と同様の処理に付した。
【０１２３】
動物の準備
M & Bからの雌の非近交系ｎｕ／ｎｕ ｂａｌｂマウス（到着時、１０〜１２週齢）を、Ｃ６６／４承認下で用いた。異種移植片をマウス中に移植する前の１週間、ルドベック研究所（Uppsala, Sweden）の動物施設で、標準的な食餌、寝床および環境を用い、マウスを順応させた。マウスは食餌および飲料水を自由に摂取した。実験の３週間前に、５×１０7個のＳＫＯＶ−３ヒト卵巣癌細胞（ＡＴＣＣ＃ＨＴＢ−７７）を１６匹のマウスの右後足に皮下注射した。実験時までに、腫瘍は全てのマウスにおいて定着しており、全てのマウスの体重は２２〜２７ｇであった。
【０１２４】
放射能の測定
実施例４に記載されたように125Ｉ測定を実施し、％ＩＤ／ｇを算出した。
【０１２５】
生体内分布実験
マウス１６匹を、各グループ４匹で４つのグループ（Ｉ〜ＩＶ）に無作為に分けた。グループ、注射および屠殺の時間は、スキーム３に従った。ＰＢＳ５０μｌ中の125Ｉ（１００ｋＢｑ／マウス）で間接標識したＺHER2 A０．５μｇをマウスの尾部に静脈注射した。いかなる視覚的問題もないことから、全注射が良好に耐容されたと判断した。
【０１２６】
【表３】
【０１２７】
実施例４の第一の生体内分布試験に記載したように、マウスを屠殺し、試料を採取した。器官および組織の試料を計量し、それらの放射能をγ計数器（３インチＮａＩ（Ｔ１）検出器を伴う自動γ計数器である１４８０ＷａｌｌａｃＷＩＺＡＲＤ(Wallac OY, Turku,
Finland)）で測定した。
【０１２８】
結果
標識されたＺHER2 Aを皮下注射しておいたマウスのグループからの結果を、マウスの器官および組織中の放射性ヨウ素の分布を確証するために分析した。結果を図１８〜図２０に示す。図１８および図１９を参照すると、腫瘍中の125Ｉの濃度は、４時間および２４時間で大多数の正常器官中での濃度より高く、このことはＺHER2 AポリペプチドがＨＥＲ２を保有する腫瘍細胞を標的にすることができる、ということを示す。正常な器官および組織中の放射能濃度は、腎臓（全時点）および甲状腺（全時点）を除いて、腫瘍中よりも低いことが判明した。実験は、血液および正常器官からの放射性ヨウ素の迅速なクリアランスを示した。正常器官からのクリアランスは、放射性ヨウ素の蓄積が見出された甲状腺を除いて、大抵の場合は血中クリアランスに次ぐものであった。高濃度の放射性ヨウ素はマウスの腎臓においても見出された。図２０は、血中および腫瘍中の放射性ヨウ素濃度の長時間にわたる経過を示す。注射後４時間から始めると、腫瘍の放射能は、血液の放射能より６倍高かった。放射能濃度の腫瘍対血液比（図２１）は、注射後少なくとも８時間の間（この時点での該比の値は１０対１であった）、時間に伴って増大した。
【０１２９】
要約
ＳＫＯＶ−３（卵巣癌細胞株）腫瘍を保有するマウスにおける、ベンゾエート基を介して放射性ヨウ素（125Ｉ）で間接的に標識された単量体ポリペプチドＺHER2 Aの生体内分布は、正常マウスにおける該ポリペプチドの正常な生体内分布と良好な一致を示した。125Ｉ−ベンゾエート−ＺHER2 Aとして注射される放射性ヨウ素の腫瘍取込みが達成された。得られたデータの分析により、腫瘍中の放射能濃度が注射後４時間の血中の放射能濃度より高く、二量体の形態（ＺHER2 A）2と比較した場合、腎臓および甲状腺を除いて、注射後４時間においてすでに大多数の正常器官および組織中より高い、ということが示された。
【実施例６】
【０１３０】
ＳＫＯＶ−３異種移植片を保有するヌードマウスにおけるＡＢＤ（ＺHER2 A）2の生体内分布および腫瘍へのターゲッティング
本実施例を構成する実験では、ＡＢＤ（ＺHER2 A）2と名づけられたポリペプチドを生成するために、実施例３の二量体（ＺHER2 A）2ポリペプチドを、そのＮ末端で、連鎖球菌プロテインＧ由来の「アルブミン結合ドメイン」（ＡＢＤ）と遺伝子操作によって融合した（図２２）。ＡＢＤは、ヒトおよびマウス血清アルブミンに高い親和性で結合する（M Johansson et al, J Biol Chem 277: 8114-8120 (2002)）。アルブミンは、緩徐な血漿クリアランスを有する血中に豊富なタンパク質である。アルブミンとの高親和性の結合は、アルブミンタンパク質それ自体と同様に、該結合剤に緩徐な動態を付与する。動物における腫瘍ターゲッティングリガンドの循環時間が延長されると、理論上、腫瘍に送達される用量は増加する。これを試験するために、ＡＢＤ（ＺHER2 A）2ポリペプチドを125Ｉで放射性標識し、ＨＥＲ２過剰発現により特徴付けられる移植された腫瘍を保有するマウスに注入した。ポリペプチドの生体内分布の検査を、その局在化を調べるために実行した。
【０１３１】
材料および方法
ＤＮＡ構築およびタンパク質産生
Ｈｉｓ6−ＺHER2 Aと名づけた、ＨＥＲ２受容体に対する親和性を有する新規のＡｆｆｉｂｏｄｙリガンドの選択は、実施例１および２に記されている。ＺHER2 Aポリペプチドをコードする遺伝子断片をＨｉｓ6−ＺHER2 A用の発現ベクター中にサブクローニングすることにより構築される二量体ＺHER2変異体は、実施例３に記載された。ＡＢＤポリペプチドをコードする遺伝子断片をＨｉｓ6−ＺHER2 A用の発現ベクター中にサブクローニングし、ヘキサヒスチジンタグをＡＢＤポリペプチドで置換することにより、この二量体Ｚ
HER2 A変異体のＡＢＤ融合タンパク質を構築した。さらに、エクステンションＰＣＲを利用して、Ｃ末端システイン残基を融合タンパク質に付加した。ＤＮＡシーケンサーＡＢＩプリズム（登録商標）３７００アナライザー（Applied Biosystems, Foster City, CA）でのＤＮＡシーケンシングにより、導入されたＡＢＤ断片を確認した。大腸菌ＲＲＩΔＭ１５菌株（Ruther, Nucleic Acids Res 10: 5765-5772 (1982)）を、クローニングの間、細菌宿主として用いた。得られたベクターは、Ｔ７プロモーターの制御下で（Studier et
al, Meth Enzymol 185: 60-89 (1990)）、ＡＢＤと融合した二量体ＺHER2変異体（ＡＢＤ（ＺHER2 A）2）をコードしており、これはＣ末端がシステイン残基と融合されていることにより部位特異的な化学的修飾が可能である（図２２）。二量体ＺHER2変異体を、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）菌株中でＡＢＤとの融合体として発現させて、メーカーのプロトコル（Amersham Biosciences）に従って調製されたアルブミンセファロースアフィニティーカラム上でのアフィニティークロマトグラフィー精製により、回収した。適切な吸光係数を用いて、２８０ｎｍでの吸光度測定値からタンパク質濃度を算定した。Ｎｏｖｅｘシステム（Novex, CA, USA）を用いて、トリス−グリシン１６％均質ゲル上でのＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、精製タンパク質をさらに分析した。クマシーブリリアントブルー染色により、タンパク質帯域を可視化した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により、該タンパク質は、予測された分子量の明確な帯域として観察された。
【０１３２】
ＡＢＤ（ＺHER2 A）2の間接的放射性ヨウ素標識
125Ｉで標識するために、４０μｌのＡＢＤ（ＺHER2 A）2を、実施例４における二量体ポリペプチド構築物と同一の処理に付した。
【０１３３】
動物の準備
M & Bからの雌非近交系ｎｕ／ｎｕ ｂａｌｂマウス（到着時、１０〜１２週齢）を、Ｃ６６／４承認下で用いた。異種移植片を該マウスに移植する前の１週間、ルドベック研究所（Uppsala, Sweden）の動物施設で、標準的な食餌、寝床および環境を用い、マウスを順応させた。マウスは食餌および飲料水を自由に摂取した。実験の３週間前に、５×１０7個のＳＫＯＶ−３ヒト卵巣癌細胞（ＡＴＣＣ＃ＨＴＢ−７７）を１６匹のマウスの右後足に皮下注射した。実験時までに、腫瘍は全マウスにおいて定着しており、全マウスの体重は２２〜２７ｇであった。
【０１３４】
放射能の測定
実施例４に記載されたように、125Ｉ測定を実施し、％ＩＤ／ｇを算定した。
【０１３５】
生体分布実験
マウス１６匹を、各グループ４匹の４つのグループ（Ｉ〜ＩＶ）に無作為に分けた。グループ、注射および屠殺の時間は、スキーム４に従った。５０μｌのＰＢＳ中の125Ｉ（１００ｋＢｑ／マウス）で間接標識した０．５μｇのＡＢＤ（ＺHER2 A）2をマウスの尾部に静脈注射した。いかなる視覚的問題もないことから、全注射が良好に耐容されたと判断した。
【０１３６】
【表４】
【０１３７】
実施例４の第一の生体内分布試験に記載したように、マウスを屠殺し、試料を採取した。器官および組織の試料を計量し、それらの放射能をγ計数器（３インチＮａＩ（Ｔ１）検出器を伴う自動γ計数器である１４８０ＷａｌｌａｃＷＩＺＡＲＤ(Wallac OY, Turku,
Finland)）で測定した。
【０１３８】
結果
結果を図２３〜図２４に示す。図２３を参照すると、腫瘍中の125Ｉの濃度は、１２時間（腫瘍 ２．４％ＩＤ／ｇ）および２４時間（腫瘍 ２．２％ＩＤ／ｇ）では、ほとんどの正常器官中の濃度より高く、このことは、ＡＢＤ（ＺHER2 A）2ポリペプチドがＨＥＲ２を保有する腫瘍細胞を標的にし得る、ということを示す。正常な器官および組織中の放射能濃度は、腎臓（全時点、２４時間で３．５％ＩＤ／ｇ）、甲状腺（全時点、２４時間で５．２％ＩＤ／ｇ）および血液（全時点、２４時間で３．９％ＩＤ／ｇ）を除いて、腫瘍中よりも低いことが判明した。肺での値は、腫瘍での値とほとんど等価であるが、これは、肺中の血液含量が高いためかもしれない。実験は、血液からの放射性ヨウ素の非常に遅いクリアランスを示した。これは、ＡＢＤ（ＺHER2 A）2のＡＢＤ部分が、緩徐な動態を有する血中に豊富なタンパク質である血清アルブミンと高親和性で結合するため、予測できることである。正常器官からのクリアランスは、放射性ヨウ素の蓄積が見出された甲状腺を除いて、血中クリアランスより迅速であった。高濃度の放射性ヨウ素はマウスの腎臓においても見出された。図２４は、実施例４および５におけるＺHER2 Aの単量体および二量体構築物に関して作成された結果と比較した場合の、腫瘍中のＡＢＤ（ＺHER2 A）2に関連した放射性ヨウ素濃度の長時間にわたる経過を示す。注射後２４時間で、ＡＢＤ（ＺHER2 A）2を用いた際の腫瘍の放射活性は、単量体または二量体の場合より１３倍高かったが、これは、標的部分の体内での残留時間の延長が実際に腫瘍上での線量を増大するために利用され得る、ということを示す。このデータにより（ＺHER2 A）2部分をアルブミン結合ドメインに機能的に結合できる、ということも裏付けられる。
【０１３９】
要約
ＳＫＯＶ−３（卵巣癌細胞株）腫瘍を保有するマウスにおける、ベンゾエート基を介して放射性ヨウ素（125Ｉ）で間接的に標識された融合ポリペプチドＡＢＤ（ＺHER2 A）2の生体内分布は、予測されたアルブミン結合ポリペプチドの特性と良好な一致を示した。125Ｉ−ＡＢＤ（ＺHER2 A）2として注射された放射性ヨウ素の腫瘍への取込みが達成され、腫瘍での線量はＺHER2 Aポリペプチドの二量体または単量体バージョンでのものより高かった。得られたデータの分析により、肺、腎臓、甲状腺および血液中の放射能は依然として高かったものの、腫瘍中の放射能濃度は注射後１２時間でのほとんどの他の器官中の放射能濃度よりは高いことが示された。
【実施例７】
【０１４０】
テクネチウム標識二量体99mＴｃ−（ＺHER2 A）2の生体内分布
本実施例を構成する実験では、実施例３による二量体Ｈｉｓ6−（ＺHER2 A）2ポリペプチドを、診断用画像処理核種９９ｍ−テクネチウムで標識し、正常マウス及びＨＥＲ２過剰発現により特徴付けられる移植された腫瘍を保有するマウス中に注射した。99mテクネチウム（99mＴｃ）は、ｉｎ ｖｉｖｏ診断のための理想に近い特性を有する放射性核種である。さらにこれは安価で且つ容易に入手可能であり、このことが99mテクネチウムを、病院における医学的画像処理のための望ましい候補にしている。該ポリペプチドの生体内分布の試験を実行して、その局在化を調べた。
【０１４１】
材料および方法
Ｈｉｓ6−（ＺHER2 A）2のテクネチウム標識
Ｈｉｓ6−（ＺHER2 A）2タンパク質上のヘキサヒスチジンタグへ99mＴｃ核種を送達する市販のIsoLink（商標）キット（Mallinckrodt, Netherlands）を用いて、メーカーの使
用説明書に従って、Ｈｉｓ6−（ＺHER2 A）2ポリペプチドを標識した。IsoLink（商標）キット試薬はテクネチウム陽イオン［99mＴｃ（ＣＯ）3（Ｈ2Ｏ）3］+を生じ、これは次に、ヘキサヒスチジンタグにより安定的に配位結合されて、Ｈｉｓ6−（ＺHER2 A）2ポリペプチドのＨｉｓ6タグを特異的に標識するための手段を提供する。
【０１４２】
簡単に述べると、ウプサラ大学病院で発生器から溶離された99mＴｃストック溶液０．５〜０．６ｍｌを、水浴中で、１００℃で２０分間、IsoLink（商標）カルボニル標識剤（ＤＲＮ４３３５、Mallinckrodt）の内容物とともにインキュベートした。このようにして得られたテクネチウム陽イオン［99mＴｃ（ＣＯ）3（Ｈ2Ｏ）3］+４０μｌを、ＰＢＳ中のＨｉｓ6−（ＺHER2 A）2（１．２ｍｇ／ｍｌ）４０μｌと混合し、５０℃で１時間インキュベートした。５ｋＤの排除分子量を有するＮＡＰ−５サイズ排除カラム（Pharmacia, Uppsala）上での分離により、生成物を精製した。生成物の純度は、薄層クロマトグラフィーをすぐに行って確認したところ、９７％であった。
【０１４３】
動物の準備
M & Bからの雌非近交系ｎｕ／ｎｕ ｂａｌｂマウス（到着時、１０〜１２週齢）を、Ｃ６６／４承認下で用いた。異種移植片をマウス中に移植する前の１週間、標準的な食餌、寝床および環境を用い、ルドベック研究所（Uppsala, Sweden）の動物施設でマウスを順応させた。マウスは食餌および飲料水を自由に摂取した。実験の３週間前に、５×１０7個のＳＫＯＶ−３ヒト卵巣癌細胞（ＡＴＣＣ＃ＨＴＢ−７７）を４匹のマウスの右後足に皮下注射した。実験時までに、腫瘍は全マウスにおいて定着しており、全マウスの体重は２２〜２７ｇであった。
【０１４４】
放射能の測定
実施例４において125Ｉに関して記載したと同様に、99mＴｃの測定を実施し、％ＩＤ／ｇを算出した。
【０１４５】
生体内分布実験
４匹のマウスを有する１つのグループを実験に用いた。注射および屠殺の時間は、スキーム５に従った。５０μｌのＰＢＳ中の99mＴｃ（１００ｋＢｑ／マウス）で標識した０．５μｇのＨｉｓ6−（ＺHER2 A）2をマウスの尾部に静脈注射した。いかなる視覚的問題もないことから、全注射が良好に耐容されたと判断した。
【０１４６】
【表５】
【０１４７】
実施例４の第一の生体内分布試験に記載したように、マウスを屠殺し、試料を採取した。器官および組織の試料を計量し、それらの放射能をγ計数器（３インチＮａＩ（Ｔ１）検出器を有する自動γ計数器。１４８０ＷａｌｌａｃＷＩＺＡＲＤ、Wallac OY(Turku, Finland)で測定した。
【０１４８】
結果
結合体99mＴｃ−Ｈｉｓ6−（ＺHER2 A）2は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで高い安定性を有した（ＰＢＳ、血漿、システインおよび過剰量の遊離ヒスチジンで攻撃）。99mＴｃ−Ｈｉｓ6−（ＺHER2 A）2のｉｎ ｖｉｖｏでの生体内分布実験からの結果を、図２５〜図２７に示す。図２５を参照すると、総腫瘍線量は、125Ｉ標識された単量体構築物である125Ｉ−
ベンゾエート−ＺHER2 A（注射後８時間で１．１％ＩＤ／ｇ）または二量体構築物である125Ｉ−ベンゾエート−（ＺHER2 A）2（注射後８時間で１．０６％ＩＤ／ｇ）と比較した場合、99mＴｃ−Ｈｉｓ6−（ＺHER2 A）2（注射後８時間で、３．３％ＩＤ／ｇ）を用いた場合は３倍高かった。99mＴｃは、125Ｉより良好な残留性物質であるということが既知であり、これは、99mＴｃでは送達された用量が残存する一方、ヨウ素では用量は代謝され、腫瘍細胞から放出されることを意味する。図２６を参照すると、腫瘍中の99mＴｃの濃度は、注射後８時間においてはほとんどの正常器官より高かった（腫瘍 ３．３％ＩＤ／ｇ）が、これは、99mＴｃ−Ｈｉｓ6−（ＺHER2 A）2ポリペプチドがＨＥＲ２を保有する腫瘍細胞を標的にし得る、ということを示す。正常器官および組織中の放射能濃度は、腎臓（８時間で２７％ＩＤ／ｇ、腫瘍線量の３６倍）および肝臓（８時間で１１．４％ＩＤ／ｇ、腫瘍線量の３倍）を除いて、腫瘍中よりも低いことが判明した（図２７）。99mＴｃ−Ｈｉｓ6−（ＺHER2 A）2は腎臓を介して除去されるため、腎臓での高い値が予測された。腎臓中の高レベルのトレーサーは毒性の問題を示さないが、これは、注射された総線量は診断目的であって非常に低いからである。甲状腺中の放射能の量は、予測どおり、125Ｉを用いた場合（実施例４）ほど高いことは全くなかった（８時間で１％ＩＤ／ｇ）。正常器官からのクリアランスは、１時間をピークとする99mテクネチウムの蓄積が観察された腎臓を除き、主として血中クリアランスに次ぐものであった。レベルはその後低下し、１時間の間（注射後２時間まで）に急速排除期、その後、緩徐排除期が続き、２４時間後においても腎臓中には依然としてかなりの線量（７０％ＩＤ／ｇ）が認められた。
【０１４９】
注射後８時間での該テクネチウム結合体に関する腫瘍対血液比は４であり、総腫瘍線量は３．３％ＩＤ／ｇであった。これは、99mテクネチウムがｉｎ ｖｉｖｏ診断用途に用いられ得る、ということを示した。比較としては、同じ時点で、125Ｉ−ベンゾエート−（ＺHER2 A）2および125Ｉ−ベンゾエート−ＺHER2 Aの腫瘍線量は約１％であったが、腫瘍対血液比は約１１であった。
【０１５０】
要約
ＳＫＯＶ−３（卵巣癌細胞株）腫瘍を保有するマウスにおける、99mＴｃ標識ポリペプチド99mＴｃ−Ｈｉｓ6−（ＺHER2 A）2の生体内分布は、医療用画像処理目的にとって相対的に良好な分布特性を示した。99mＴｃ−Ｈｉｓ6−（ＺHER2 A）2として注射されたテクネチウムの腫瘍への取込みが達成され、腫瘍での線量は、ＺHER2 Aポリペプチドの125Ｉ標識二量体または単量体バージョンに対するものより高かった。得られたデータの分析により、腫瘍中の放射能濃度は、実質的に腫瘍より高い取込みが肝臓および腎臓で認められるものの、注射後８時間ではほとんどの他の器官および血液中の放射能濃度よりは高いことが示された。
【実施例８】
【０１５１】
211Ａｔを用いたｉｎ ｖｉｔｒｏ標識および特徴付け
本実施例を構成する実験においては、実施例３による二量体Ｈｉｓ6−（ＺHER2 A）2ポリペプチドを、125Ｉを用いた標識に関して上記したと同様の化学的手法を用いて、治療用放射性核種である211アスタチン（211Ａｔ）で標識した。放射性核種の腫瘍へのターゲッティングの一目的は、放射線療法である。これは、標的細胞を根絶することができる高エネルギー粒子、例えばα粒子および高エネルギーβ粒子を放射する核種を要する。α放出放射性ハロゲン211Ａｔ（Ｔ1/2＝７．２時間）は、ごく少数の細胞の直径程度の飛程（range）を有しており、これは、細胞の根絶が高精度で起こり得ることを意味する。211Ａｔ標識ポリペプチドのｉｎ ｖｉｔｒｏでの殺細胞能力の試験を実行した。
【０１５２】
材料および方法
２日前に、ＨＥＲ２過剰発現により特徴付けられる１００，０００個のＳＫＢＲ−３細胞を、３ｃｍ培養皿に植え付けた。６０μｇのＨｉｓ6−（ＺHER2 A）2ポリペプチドを、
コペンハーゲン大学病院のＳｃａｎｄｉｔｒｏｎｉｘＭＣ３２サイクロトロン中で生成した211Ａｔで標識して、Jorgen Carlsson（ウプサラ大学(Uppsala, Sweden)）の研究室で精製した。約１：１および５：１モル比の211Ａｔ−（ＺHER2 A）2分子／細胞受容体を、３つの培養皿の各々に添加した。さらに３つの別の培養皿には、５：１濃度の211Ａｔ−（ＺHER2 A）2に加えて、結合部位を遮断することにより非特異的な放射の影響を概算することを目的として、５００倍過剰量の非標識Ｈｉｓ6−（ＺHER2 A）2を供給した。細胞を、３７℃で２４時間、211Ａｔ−（ＺHER2 A）2とともにインキュベートした。２４時間のインキュベーション後、全細胞を洗浄し、新しい新鮮な培地を補給した。次に、約２ヶ月間、週に１回、それらの増殖をモニタリングした。
【０１５３】
並行して、上記の細胞殺滅検定に用いたのと同一方法で調製した一組の培養皿に、同じ211Ａｔ−（ＺHER2 A）2溶液を供給した。培養皿中の全グループに関する取込み曲線を確立するために、これらの細胞を異なる時点で採取し、細胞数を計数し、放射能含量を測定した。これらの曲線を用いて、細胞殺滅実験で用いた２４時間に亘る、細胞当たりの崩壊量を算出した。
【０１５４】
結果
ＨＥＲ−２を過剰発現するヒト乳癌細胞株ＳＫＢＲ−３からの細胞を、２つの異なる用量の211Ａｔ−（ＺHER2 A）2に２４時間曝露した。第一の用量では、添加した211Ａｔ−（ＺHER2 A）2分子は、細胞上のＨＥＲ２標的受容体の数と等しかった。第二の用量では、211Ａｔ−標識分子を５倍過剰量で添加した。２４時間のインキュベーション後、週に1回、２ヶ月にわたって細胞をモニタリング、計数し、生存画分を確定した。図２８で観察されるように、応答は、投与された用量に関連した。等モル量の211Ａｔ−（ＺHER2 A）2を投与された細胞は、放射能がターゲッティング剤を伴わずに添加される対照と比較して、いかなる特異的な増殖の遅延も示さなかった。非特異的な放射線傷害により短期間の増殖遅延が認められたが、しかし細胞は増殖を停止しなかった。これに対比して、211Ａｔ−（ＺHER2 A）2を５倍過剰量で添加した場合、細胞増殖の抑制は目覚ましいものであった。実験終了時、高用量投与グループは未だ正常な状態に回復していなかったが、一方、低用量および対照グループは１０6倍に増殖していた。生存細胞が実験前とほぼ同一の増殖率を照射後にも維持していると考えると、５：１グループ中の全細胞が根絶されたことになる。取込み曲線は、遮断処理された５：１グループも、おそらくは遮断が不十分であったために、細胞に対してかなりの量の照射を受けていた、ということを明示した。細胞あたりの崩壊数（ＤＰＣ）を、統合した取込み曲線から概算した。増殖曲線から、指数増殖曲線の勾配として倍加時間を算出し、かつ、遅延した増殖の曝露時間への外挿により、生存画分を算定した。第1表に結果を示す。
【０１５５】
【表６】
【０１５６】
要約
211Ａｔ−（ＺHER2 A）2は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＨＥＲ２過剰発現ＳＫＢＲ−３細胞との特異的な結合を示した。誘導された細胞死は、蓄積された線量と良好に相関した。１００未満の崩壊数／細胞は、単一の細胞を殺傷して完全に細胞を根絶するのに十分であることを示した。
【実施例９】
【０１５７】
付加的なＨＥＲ２結合ポリペプチドの同定および特徴付け
実施例１に記載した選択から得られるＨＥＲ２結合Ｚ変異体の親和性を増大させるために、第二のライブラリーの構築（Gunneriusson et al, Protein Eng 12: 873-878 (1999); Nord et al, Eur J Biochem 268: 4269-77 (2001)）と、その後のＨＥＲ２に対する再選択とを包含する親和性の成熟戦略を適用した。第一世代のポリペプチド変異体ＺHER2 A、B、CおよびDのアラインメントは、第１３位、１４位、２８位、３２位および３５位での同一性とは別に、ＺHER2 AおよびＺHER2 B間に、第１０位におけるＲおよびＫへの、そして第１１位におけるＱおよびＴへの集中（convergence）が認められる、ということを示した。したがって第二世代のライブラリーは、５つの固定された位置、すなわち第１３位、１４位、２８位、３２位および３５位、ならびに２つの部分的に固定された位置、すなわち第１０位（縮重コドンとしてｃｇｃ／ａａａ）および第１１位（縮重コドンとしてｃａａ／ａｃｃ）を含有する一方、残りの第９位、１７位、１８位、２４位、２５位および２７位は、ＮＮＧ／Ｔ縮重コドンを用いて再び無作為化された。形質転換後、３×１０8クローンのライブラリーを得た。標的としてヒトＨＥＲ２（ＨＥＲ２−ＥＣＤ）のビオチニル化細胞外ドメイン（組換えヒトＨＥＲ２細胞外ドメイン、アミノ酸２３８〜２１０９、Fox Chase Cancer Center, Philadelphia, USAによる提供）を用い、その濃度を低下させながら、抗原結合分子に対して５回の選択を施した。
【０１５８】
それぞれ４回および５回目に得られた８０および２６０コロニーのクローンを、それらのＨＥＲ２結合活性の分析を実施するために選別した。
【０１５９】
ＨＥＲ２結合の分析のためのＡＢＡＳ ＥＬＩＳＡ
４回および５回の選択から無作為に選択されるクローンを、９６ウエルプレート（Nunc）中で生成させた。ＡＢＡＳ ＥＬＩＳＡと呼ばれるＥＬＩＳＡスクリーニング手法を用いて、高親和性ＨＥＲ２結合Ｚ変異体を同定した。単一コロニーを、深穴９６ウエルプレート中で１ｍＭのＩＰＴＧおよび１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを補充した１ｍｌのＴＳＢ−ＹＥ培地（３０．０ｇのトリプシンダイズブロス（Merck）および５．０ｇの酵母抽出物（Merck）、水で最終容積を１ｌとする）に接種し、３７℃で一晩、振盪器上で増殖させた。３，０００ｇで１０分間の遠心分離により細胞をペレット化した。ペレットを３００μｌのＰＢＳ−Ｔ中に再懸濁し、−８０℃で少なくとも３０分間凍結させた。プレートをぬるま湯中で解凍し、３，５００ｇで２０分間遠心分離した。１００μｌの上清を微量滴定ウエル（＃９０１８ Ｃｏｓｔａｒ（登録商標））に入れて、これを４℃で一晩、１５ｍＭのＮａ2ＣＯ3および３５ｍＭのＮａＨＣＯ3（ｐＨ９．６）中の６μｇ／ｍｌのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）と共にインキュベートし、室温で１時間、ＰＢＳ−Ｔ中の２％粉末スキムミルクでブロッキングしておいた。プレートを４回洗浄した後、１μｇ／ｍｌのビオチニル化ＨＥＲ２／ウエル１００μｌを添加し、１．５時間インキュベートした。ウエルを４回洗浄した後、ストレプトアビジン−ＨＲＰ（１：５，０００）（＃Ｐ０３９７ Ｄａｋｏ）を添加し、１時間インキュベートした。ウエルを４回洗浄し、最終洗浄後、１００μｌの展開溶液（ＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ）ＴＭＢ（＃３４０２１ Ｐｉｅｒｃｅ）を各ウエルに添加した。２０〜３０分後、１００μｌの停止溶液（２ＭのＨ2ＳＯ4）を、各ウエルに添加した。４５０ｎｍでの吸光度をＥＬＩＳＡ読取器（Tecan）で測定した。ＡＢＡＳ ＥＬＩＳＡからの結果を図２９に示す。図２９Ａおよび図２９ＢのグラフのＸ軸は、該９６ウエルプレートのウエルの番号に対応する。したがって図２９Ａは第一の９６ウエルプレートに関するＥＬＩＳＡ結果を示し、一方、図２９Ｂは第二のプレートに関する結果を示す。
【０１６０】
ＤＮＡ配列分析
ＡＢＡＳ−ＥＬＩＳＡで分析したＺHER2変異体をコードするＤＮＡのシーケンシングを
、ビオチニル化オリゴヌクレオチドＡＦＦＩ−７２（５’−ビオチン−ＣＧＧＡＡＣＣＡＧＡＧＣＣＡＣＣＡＣＣＧＧ）を用いて、製造者の推奨に従って、ＡＢＩプリズム（登録商標）、ｄＧＴＰ、ビッグダイ（商標）ターミネーターｖ３．０レディリアクションサイクルシーケンシングキット（Applied Biosystems）を用いて実施した。ＡＢＩプリズム（登録商標）３１００遺伝子分析器（Applied Biosystems）で、配列を分析した。配列分析は、１３０の独特の配列を生じた。ネガティブ対照の値より少なくとも２倍高い吸光度値により立証されるような、ＡＢＡＳ ＥＬＩＳＡ実験で結合を示したＺHER2変異体かに由来する配列は図１に示されており、配列番号６〜７６として配列表で同定される。これらのＨＥＲ２結合Ｚ変異体の命名法は、以下の通りである。ＥＬＩＳＡ実験の第一のプレートから単離された変異体（図２９Ａ）は、ＺHER2:1NNと呼ばれ、この場合、ＮＮはその特定のポリペプチド変異体が分析された第一のプレート中のウエルの番号に対応する。ＥＬＩＳＡ実験の第二のプレートから単離された変異体（図２９Ｂ）は、ＺHER2:2NNと呼ばれ、この場合、ＮＮはその特定のポリペプチド変異体が分析された第二のプレート中のウエルの番号に対応する。
【０１６１】
クローニングおよびタンパク質産生
図３０で模式的に示されている構築物をコードする発現ベクターを用いて、大腸菌細胞中で、選定したＨＥＲ２結合ポリペプチドを発現させた。Ｎ末端ヘキサヒスチジルタグとの融合体として、該ポリペプチドを生成させた。Ｈｉｓ6−タグ化ポリペプチドＺHER2:101、ＺHER2:107、ＺHER2:149、ＺHER2:202、ＺHER2:205、ＺHER2:207、ＺHER2:209、ＺHER2:222、ＺHER2:225およびＺHER2:229、ならびにＺHER2 Aを、変性条件下で、ＢｉｏＲｏｂｏｔ３０００（Qiagen）およびＮＩ−ＮＴＡ Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ９６ＢｉｏＲｏｂｏｔ手法を用いて精製した。精製されたＨｉｓ6−タグ化タンパク質を、ＰＢＳ（２．６８ｍＭのＫＣｌ、１３７ｍＭのＮａＣｌ、１．４７ｍＭのＫＨ2ＰＯ4、８．１ｍＭのＮａ2ＨＰＯ4、ｐＨ７．４）中で透析した。試料のタンパク質濃度を、２８０ｎｍでの測定吸光度値およびそれぞれのタンパク質の理論的吸光係数から算出した。
【０１６２】
Ｈｉｓ6−タグ化ＺHER2変異体のバイオセンサー分析
前節により産生されたＨｉｓタグ化ＺHER2変異体とＨＥＲ２との間の相互作用を、ビアコア（登録商標）２０００システム（Biacore AB, Uppsala, Sweden）での表面プラズモン共鳴を用いて分析した。ヒトＨＥＲ２およびＩｇＧ（免疫グロブリンＧ）を、製造者の推奨に従って、ＣＭ−５チップの表面のカルボキシル化デキストラン層上へのアミンカップリングにより、別個のフローセル中に固定した。ヒトＨＥＲ２およびＩｇＧの固定化は、それぞれ４，６００および５，１００共鳴単位（ＲＵ）を生じた。第三のフローセル表面を活性化し、及び注入の間のブランクとして用いるために不活性化した。融合ポリペプチドＺHER2:101、ＺHER2:107、ＺHER2:149、ＺHER2:202、ＺHER2:205、ＺHER2:207、ＺHER2:209、ＺHER2:222、ＺHER2:225およびＺHER2:229を、１×ＨＢＳ−ＥＰ（５ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３．４ｍＭのＥＤＴＡ、０．００５％界面活性剤Ｐ−２０、ｐＨ７．４）により希釈して、最終濃度を５０ｎＭとし、１０μｌ／分の一定流量で注入した。総注入時間は２分（会合）で、その後３分間洗浄した（解離）。表面を、２５ｍＭのＨＣｌの２回の注入により再生した（３０秒／注入）。参照細胞中で測定された応答（活性化／不活性化表面）を、固定化されたＨＥＲ２を有する細胞中で測定された応答から差し引いた。ＨＥＲ２と相互作用する精製タンパク質の能力を、図３１のセンサグラムにより例示されるように、確認した。
【実施例１０】
【０１６３】
付加的なＨＥＲ２結合ポリペプチドの同定および特徴付け
実施例１に記載した選択の３回目および４回目に得られるクローンの包括的な配列分析を実施した。製造者の推奨に従って、ＡＢＩプリズム（登録商標）、ｄＧＴＰ、ビッグダイ（商標）ターミネーターｖ３．０レディリアクションサイクルシーケンシングキット（
Applied Biosystems）を、そしてＡＢＩプリズム（登録商標）３１００遺伝子分析器（Applied Biosystems）を用いて、ＤＮＡをシーケンシングした。ビオチニル化オリゴヌクレオチドＡＦＦＩ−７２（５’−ビオチン−ＣＧＧＡＡＣＣＡＧＡＧＣＣＡＣＣＡＣＣＧＧ）を、プライマーとして用いた。配列分析は、１１の新規のポリペプチド配列、即ち実施例１に記載した試験において見出されなかったクローンを明示した。
【０１６４】
図３０に模式的に例示される構築物をコードする発現ベクターを用いて、大腸菌細胞中でこれらのＺ変異体を発現させることを決定した。その結果、Ｎ末端ヘキサヒスチジルタグとの融合体として、ポリペプチドが生成された。変性条件下で、ＢｉｏＲｏｂｏｔ ３０００（Qiagen）およびＮＩ−ＮＴＡ Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ９６ＢｉｏＲｏｂｏｔ手法を用いて、固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）により、該ポリペプチドを精製した。溶離したタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分析した。精製Ｈｉｓ6−タグ化タンパク質の緩衝液を、製造者の推奨に従って、ＰＤ−１０カラム（Amersham Biosciences）を用いて、５ｍＭのＮＨ4Ａｃに交換した。その後、タンパク質を凍結乾燥し、ＨＢＳ−ＥＰ（５ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３．４ｍＭのＥＤＴＡ、０．００５％界面活性剤Ｐ−２０、ｐＨ７．４）中に溶解した。試料のタンパク質濃度を、２８０ｎｍでの測定吸光度値、ならびにそれぞれのタンパク質の理論的吸光係数から算定した。
【０１６５】
Ｈｉｓ6−タグ化ＺHER2変異体のバイオセンサー分析
Ｈｉｓ6タグ化ＺHER2変異体とＨＥＲ２との間の結合活性を、ビアコア（登録商標）２０００（Biacore AB, Uppsala, Sweden）を用いて分析した。ヒトＨＥＲ２およびＨＩＶ−１ｇｐ１２０（Protein Sciences Corporation、＃２００３−ＭＮ）を、製造者の推奨に従って、ＣＭ−５チップの表面のカルボキシル化デキストラン層上へのアミンカップリングにより、別個のフローセル中に固定した。ヒトＨＥＲ２およびＨＩＶ−１ｇｐ１２０の固定化は、それぞれ２６３１および３１３８共鳴単位（ＲＵ）を生じた。第三のフローセル表面を活性化し、及び注入を行う間のブランクとして用いるために不活性化した。ＺHER2変異体を、１×ＨＢＳ−ＥＰ（５ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３．４ｍＭのＥＤＴＡ、０．００５％界面活性剤Ｐ−２０、ｐＨ７．４）中に希釈して、最終濃度を１μＭとし、１０μｌ／分の一定流量で注入した。総注入時間は１分（会合）で、その後３分間洗浄した（解離）。表面を、１０ｍＭのＨＣｌの３０秒間の注入により再生した。参照細胞中で測定された応答（活性化／不活性化表面）を、固定化ＨＥＲ２を有する細胞中で測定された応答から差し引いた。３つの精製タンパク質ＺHER2:3035、ＺHER2:0434およびＺHER2:0024*は、図３２のセンサグラムにより例示されるように、ＨＥＲ２と特異的に結合した。これらのＺHER2変異体の配列は図１に示されており、配列番号７７〜７９として配列表で同定される。
【図面の簡単な説明】
【０１６６】
【図１−１】配列表に示された配列のアラインメントを示す。本発明のポリペプチドＺHER2（配列番号２〜７９で表す）中の修飾を施されたアミノ酸の位置は、太字で示される。
【図１−２】配列表に示された配列のアラインメントを示す。本発明のポリペプチドＺHER2（配列番号２〜７９で表す）中の修飾を施されたアミノ酸の位置は、太字で示される。
【図１−３】配列表に示された配列のアラインメントを示す。本発明のポリペプチドＺHER2（配列番号２〜７９で表す）中の修飾を施されたアミノ酸の位置は、太字で示される。
【図２】実施例１で産生される融合ポリペプチドのアミノ酸配列の模式図である。ＺHER2は、配列番号２〜３から選択される配列を有するＨＥＲ２結合ドメインを表し、Ｈｉｓ6はヘキサヒスチジルタグを表す。
【図３】精製された融合タンパク質のゲル電気泳動の結果を示す。レーン１：Ｈｉｓ6−ＺHER2 A（８．７ｋＤａ）；レーン２：Ｈｉｓ6−ＺHER2 B（８．７ｋＤａ）；Ｍ：分子量マーカー（ＬＭＷ−ＳＤＳマーカーキット、Amersham Biosciences ＃１７−０４４６−０１）。
【図４】Ｈｉｓ6−ＺHER2 A融合タンパク質１０μＭを、Ａ：ＨＥＲ２、Ｂ：ＨＩＶ−１ｇｐ１２０、およびＣ：ＢＢ、が固定されたセンサーチップ表面に対して注入した後に得られた、ビアコア（登録商標）センサグラムを示す。
【図５】Ｈｉｓ6−ＺHER2 B融合タンパク質１０μＭを、Ａ：ＨＥＲ２、Ｂ：ＨＩＶ−１ｇｐ１２０、およびＣ：ＢＢ、が固定されたセンサーチップ表面に対して注入した後に得られた、ビアコア（登録商標）センサグラムを示す。
【図６】ＨＥＲ２が固定されたセンサーチップ表面に対し、Ｈｉｓ6−ＺHER2 A融合タンパク質を、Ａ：１μＭ；Ｂ：２μＭ；Ｃ：５μＭ；Ｄ：１０μＭ；Ｅ：２０μＭ；Ｆ：４０μＭ、注入した後に得られたビアコア（登録商標）センサグラムを示す。
【図７】ＨＥＲ２が固定されたセンサーチップ表面に対し、Ｈｉｓ6−ＺHER2 B融合タンパク質を、Ａ：１μＭ；Ｂ：２μＭ；Ｃ：５μＭ；Ｄ：１０μＭ；Ｅ：２０μＭ；Ｆ：４０μＭ、注入した後に得られたビアコア（登録商標）センサグラムを示す。
【図８Ａ】Ｈｉｓ6−ＺHER2 Aを、以下の選定した濃度：３１２．５ｎＭ（黒菱形）、１５６．３ｎＭ（黒丸）、７８．２ｎＭ（黒三角）、３９．１ｎＭ（白四角）、１９．６ｎＭ（白菱形）および９．８ｎＭ（白丸）で、ＨＥＲ２−ＥＣＤフローセル表面に対して注入した後に得られたビアコア（登録商標）センサグラムを示す。
【図８Ｂ】Ｈｉｓ6−ＺHER2 Bを、以下の選定した濃度：６２５ｎＭ（黒四角）、３１２．５ｎＭ（黒菱形）、１５６．３ｎＭ（黒丸）、７８．２ｎＭ（黒三角）、３９．１ｎＭ（白四角）および１９．６ｎＭ（白菱形）で、ＨＥＲ２−ＥＣＤフローセル表面に対して注入した後に得られたビアコア（登録商標）センサグラムを示す。
【図９】Ｈｉｓ6−ＺHER2 Aの、ＳＫＢＲ−３細胞への結合特異性を示す。125Ｉ標識Ｈｉｓ6−ＺHER2 AはＳＫＢＲ−３細胞と、理論的には５：１のリガンド：ＨＥＲ２受容体比で結合できると見積もられた。値は３つの測定値の平均である。誤差バーは標準偏差を表す。
【図１０】アミン結合ＨＥＲ２−ＥＣＤを含有するセンサーチップフローセル表面に対し、精製Ｈｉｓ6−ＺHER2 A（中白四角）およびＨｉｓ6−（ＺHER2 A）2（中黒四角）を注入した後に得られたビアコア（登録商標）センサグラムを示す。曲線のｙ値を、０〜１００の共鳴単位間に標準化した。挿入されているＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（トリス−グリシン１６％均質ゲル、還元条件）像は、発現させてＩＭＡＣで精製したＨｉｓ6−ＺHER2 A（レーン１）およびＨｉｓ6−（ＺHER2 A）2（レーン２）を示す。レーンＭ：分子量（キロダルトン）を有するマーカータンパク質。
【図１１】125Ｉ−ベンゾエート−（ＺHER2 A）2注射１時間後の腫瘍保有ヌードマウスにおける放射能の生体内分布の比較を示す。遮断あり：非標識（ＺHER2 A）2を予備注射されたマウスに関するデータ。遮断なし：予備注射なしのマウスに関するデータ。
【図１２】125Ｉ−ベンゾエート−（ＺHER2 A）2（Ｚ４二量体）または125Ｉ−ベンゾエート−ＺTaq（Ｚ Ｔａｑ４：５）注射４時間後の腫瘍保有ヌードマウスにおける放射能の生体内分布の比較を示す。
【図１３】125Ｉ−ベンゾエート−（ＺHER2 A）2注射後の種々の時間での腫瘍保有ヌードマウスにおける放射能の生体内分布を示す。２つの生体内分布実験からのデータを組合せて示す。注射後４時間に関するデータは、両実験からの平均である。
【図１４】125Ｉ−ベンゾエート−（ＺHER2 A）2注射８時間後の腫瘍保有ヌードマウスにおける放射能の生体内分布を示す。
【図１５】血液および腫瘍中の放射能濃度の比較を示す。２つの生体内分布実験からのデータを組合せて示す。Ａ：実験データ。Ｂ：２相指数関数的崩壊モデルによる非線形回帰を用いてフィッティングした曲線。
【図１６】放射能濃度の腫瘍対血液比を示す。２つの生体内分布実験からのデータを組合せて示す。
【図１７】125Ｉ−ベンゾエート−（ＺHER2 A）2結合体の尾部静脈注射後６時間（左マウス）および８時間（右マウス）における、腫瘍保有マウス（ＳＫＯＶ−３）の全身γカメラ画像である。
【図１８】125Ｉ−ベンゾエート−ＺHER2 A注射４時間後の腫瘍保有ヌードマウスにおける放射能の生体内分布を示す。
【図１９】125Ｉ−ベンゾエート−ＺHER2 A注射２４時間後の腫瘍保有ヌードマウスにおける放射能の生体内分布を示す。
【図２０】125Ｉ−ベンゾエート−ＺHER2 A注射後の種々の時間における腫瘍保有ヌードマウスの腫瘍および血液中の放射性ヨウ素の動態を示す。
【図２１】125Ｉ−ベンゾエート−ＺHER2 A注射後の放射能の腫瘍対血液比を示す。
【図２２】実施例６で産生される融合ポリペプチドのアミノ酸配列の模式図である。ＺHER2 Aは、配列番号２で示される配列を有するＨＥＲ２結合ドメインを表し、ＡＢＤは連鎖球菌プロテインＧに由来するアルブミン結合ドメインを表す。
【図２３】125Ｉ−ベンゾエート−ＡＢＤ（ＺHER2 A）2の注射後１２時間（灰色）および２４時間（白色）の腫瘍保有ヌードマウスにおける放射能の生体内分布を示す。
【図２４】（Ａ）：125Ｉ−ＡＢＤ（ＺHER2 A）2、（Ｂ）：125Ｉ−（ＺHER2 A）2、および（Ｃ）：125Ｉ−ＺHER2 A、注射後の種々の時点での腫瘍保有ヌードマウスの腫瘍中の放射性ヨウ素の動態を示す。
【図２５】125Ｉ−ベンゾエート−ＺHER2 A、125Ｉ−ベンゾエート−（ＺHER2 A）2、および99mＴｃ−（ＺHER2 A）2の送達された用量の比較を示す。
【図２６】99mＴｃ−（ＺHER2 A）2注射８時間後の腫瘍保有ヌードマウスにおける放射能の生体内分布を示す。
【図２７】99mＴｃ−（ＺHER2 A）2注射８時間後の腫瘍保有ヌードマウスにおける選択した器官中の放射能の比較を示す。
【図２８】211Ａｔ−（ＺHER2 A）2に２４時間曝露した後のＳＫＢＲ−３細胞の増殖を示すグラフである。曲線Ａの黒丸は、曝露なしの細胞を示し、曲線Ｂの白四角は、中程度に曝露された細胞を示し、曲線Ｄの灰色四角は、高レベルの211Ａｔ−（ＺHER2 A）2に曝露された細胞を示す。曲線Ｃの灰色三角は、５００倍過剰量の非標識Ｈｉｓ6−（ＺHER2 A）2と組合せて高レベルの211Ａｔ−（ＺHER2 A）2に曝露された細胞を示す。値は３つの実験の平均であり、誤差バーは標準偏差を表す。
【図２９】Ａ及びＢは、４回目および５回目の親和性の成熟の選択から採取したクローンの結合活性を確定するための、ＡＢＡＳ ＥＬＩＳＡからの結果を示す。
【図３０】実施例９および１０で産生される融合ポリペプチドのアミノ酸配列の模式図である。ＺHER2は、本発明の第一の態様のＨＥＲ２結合ポリペプチドを表し、Ｈｉｓ6はヘキサヒスチジルタグを表す。
【図３１】概算で５０ｎＭの濃度でＨＥＲ２被覆表面に注入した場合の、本発明の１０の親和性の成熟したＨＥＲ２結合ポリペプチドから得られたセンサグラムのオーバーレイしたプロットである。Ａ：ＺHER2:205；Ｂ：ＺHER2:149；Ｃ：ＺHER2:202；Ｄ：ＺHER2 A；Ｅ：ＺHER2:222；Ｆ：ＺHER2:225；Ｇ：ＺHER2:209；Ｈ：ＺHER2:229；Ｉ：ＺHER2:207；Ｊ：ＺHER2:107；Ｋ：ＺHER2:101。ここで留意すべきは、第一世代ライブラリーを用いた選択から単離されたＺHER2 Aを試験に付加した、ということである。
【図３２】特異的なＨＥＲ２結合活性を有するＺHER2変異体の結合分析結果を示す。図中に示されているＨＥＲ２またはＨＩＶ−１ｇｐ１２０を含有するセンサーチップ表面に対し、（Ａ）ＺHER2:3053（Ｂ）ＺHER2:0434（Ｃ）ＺHER2:0024*を注入することにより得られたオーバーレイ・センサグラムである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト上皮細胞成長因子受容体２（以後、ＨＥＲ２と呼ぶ）と結合する新規のポリペプチドに関する。該ポリペプチドは、ブドウ球菌のプロテインＡ（ＳＰＡ）のドメインに関連するものであって、該ポリペプチドの配列は少なくとも１つの置換変異を有するＳＰＡドメインの配列に相当する。本発明は、このようなＨＥＲ２結合ポリペプチドの薬剤としての使用に関し、より具体的には、ＨＥＲ２の過剰発現により特徴付けられる種類の癌の治療用薬剤を調製するための該ポリペプチドの使用にも関する。
【背景技術】
【０００２】
Ａｆｆｉｂｏｄｙ（登録商標）分子
ブドウ球菌のプロテインＡ（ＳＰＡ）のドメインＢに由来するプロテインＺに関連した分子（Nilsson B et al (1987) Protein Engineering 1, 107-133）が、このような分子の無作為化されたライブラリーから、種々の相互作用標的を用いて選択されている（例えばＷＯ９５／１９３７４；ＷＯ００／６３２４３；Nord K et al (1995) Prot Eng 8: 601-608; Nord K et al (1997) Nature Biotechnology 15, 772-777参照）。種々の標的分子を用いて、例えばNord K et al (1997、上述)に記載されているようなプロテインＺ誘導体を選択する。この参考文献に記載された実験は、特定の治療またはバイオテクノロジーへの応用に用いるための十分に高い親和性を有する分子を得るという明確な目的をもった研究というよりはむしろ、所定の標的に対するプロテインＺ誘導体を選択するという一般的な技法の原理の概要を記したものである。
【０００３】
ＨＥＲ２および癌疾患におけるその役割
ＨＥＲ２癌原遺伝子は、ＨＥＲ２タンパク質または受容体として既知である１８５ｋＤ細胞表面受容体タンパク質の産生をコードする（Hynes NE et al (1994) Biochim Biophys Acta 1198: 165-184）。この遺伝子は、時として、ｎｅｕ、ＨＥＲ２／ｎｅｕまたはｃ−ｅｒｂＢ−２とも呼ばれる．ｎｅｕは、エチルニトロソ尿素で処理され、この遺伝子の突然変異を示すラットで最初に発見されたものである（Shih C et al (1981) Nature 290: 261-264）。突然変異型のｎｅｕは、構成的な活性型受容体の産生を引き起こし、低コピー数で細胞を形質転換し得る強力な癌遺伝子を構成する（Hynes NE et al、上記を参照）。
【０００４】
正常細胞は、組織特異的パターンで、その形質膜上に少量のＨＥＲ２タンパク質を発現する。ＨＥＲ２に対する既知のリガンドは明らかにされていない。しかしながら、ＨＥＲ２は、ＨＥＲ１（上皮細胞成長因子受容体（ＥＧＦＲ））、ＨＥＲ３およびＨＥＲ４とともに、これらの受容体に対するリガンドと複合してヘテロ二量体を形成することが示されている。このようなヘテロ二量体の形成は、細胞の外側から核に成長シグナルを伝達し、それにより正常細胞の成長および分裂の局面を制御する活性化ＨＥＲ２受容体をもたらす（Sundaresan S et al (1999) Curr Oncol Rep 1: 16-22）。
【０００５】
腫瘍細胞では、ＤＮＡ複製システムの誤りが単一染色体上の遺伝子の多重コピーの存在を生じ得るが、これは遺伝子増幅として既知の現象である。ＨＥＲ２遺伝子の増幅は、この遺伝子の転写増大をもたらす。これはＨＥＲ２のｍＲＮＡレベルを上昇させ、同時にＨＥＲ２タンパク質の合成を増大させ、これらの腫瘍細胞の表面におけるＨＥＲ２タンパク質の過剰発現を引き起こす。この過剰発現は、隣接の正常細胞中に見出されるものと比べて１０〜１００倍高いＨＥＲ２タンパク質レベルを生じ得る。これは次に、細胞分裂増大及びそれに付随した高速度の細胞成長を生じる。ＨＥＲ２遺伝子の増幅は、正常細胞の癌表現型への形質転換に関連づけられる（Hynes NE et al、上記を参照； Sundaresan S et
al、上記を参照）。
【０００６】
ＨＥＲ２タンパク質の過剰発現はＨＥＲ２のホモ二量体の形成を引き起こし、次いでこれは構成的に活性な受容体を生じると考えられている（Sliwkowski MX et al (1999) Semin Oncol 26 (4 Suppl 12): 60-70）。これらの条件下で、成長促進シグナルは、リガンドの存在なしに、細胞中に継続的に伝達され得る。その結果として、多数の細胞内シグナル伝達経路が活性化されるようになり、無秩序な細胞成長を生じ、そして場合によっては、発癌性の形質転換を生じる（Hynes NE et al、上記を参照）。したがって成長因子受容体により媒介されるシグナル伝達メカニズムは、細胞複製および腫瘍増殖を抑制するための重要な標的である。
【０００７】
乳癌は、米国における女性の間で最も一般的な悪性疾患であり、１９２，２００例の新規の症例が２００１年に生じたと見積もられている（Greenlee R et al (2001) CA Cancer J Clin 51: 15-36）。全乳癌患者の約２５％において、ＨＥＲ２遺伝子の、増幅に起因する過剰発現が認められる（Slamon DJ et al (1989) Science 244: 707-712）。このＨＥＲ２タンパク質の過剰発現は、いくつかの否定的な予後変数、例えばエストロゲン受容体の陰性状態、高いＳ相画分、陽性の結節状態、変異型ｐ５３および核異型度と相関する（Sjogren S et al (1998) J Clin Oncol 16(2): 462-469）。Slamon等（上記参照）によれば、ＨＥＲ２遺伝子の増幅は、無病生存率の短縮、及び結節が陽性の患者の全生存率（overall survival）の短縮と強く相関することが見出された。
【０００８】
これらの理由により、乳癌の病因および治療におけるＨＥＲ２の役割をさらに研究することがこれまでの重要な目標であったし、依然としてそうである。ＨＥＲ２と相互作用する分子の同定は、この努力の一部を形成する。
【０００９】
前臨床ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験によって、ＨＥＲ２活性の抑制が腫瘍細胞の増殖に影響を及ぼし得るか否かを検査した。ＨＥＲ２タンパク質を過剰発現するＳＫ−ＢＲ−３乳癌細胞を、いくつかあるネズミ抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体のうちの１つである４Ｄ５を用で処理すると、対照のモノクローナル抗体での処理と比較して、腫瘍細胞の増殖が実際に抑制された。ＨＥＲ２を過剰発現するヒト乳癌および卵巣癌を保有する（異種移植片）マウスへの４Ｄ５の投与は、それらマウスの無腫瘍生存時間を延長した。同様の試験により、マウスにおけるヒト胃癌異種移植片の抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体による増殖抑制が実証された（Pietras RJ et al (1994) Oncogene 9: 1829-1838）。
【００１０】
抗体を用いて腫瘍細胞の表面上に豊富に存在するＨＥＲ２タンパク質を抑制するためのアプローチの中で、一療法が近年市販されるようになってきた。したがってモノクローナル抗体４Ｄ５すなわちトラスツズマブが、ハーセプチン（Herceptin）（登録商標）の商品名でF Hoffman-La Roche および Genentechによりこの目的のために市場に出されている。
【００１１】
ＨＥＲ２タンパク質の過剰発現により特徴付けられる癌に対する抗体療法により示される明らかな利点にもかかわらず、種々の因子が抗体効力を低減する潜在力を有するという事実が依然として存在する（例えばReilly RM et al (1995) Clin Pharmacokinet 28: 126-142参照）。これらの例としては以下のものが挙げられる。（１）大型の固形腫瘍中への又は脳のような生命維持領域中への抗体の浸透制限（２）血管透過性の低下による、標的部位への抗体の血管外浸出の減少（３）ターゲッティング作用を低下させる、抗体の正常組織との交差反応性および非特異的結合（４）腫瘍による不均一な取込みによる、処理されない帯域の発生（５）治療効果を低下させる注入された抗体の代謝の増大、ならびに（６）治療用抗体を不活性化する、ＨＡＭＡおよびヒト抗ヒト抗体の急速な生成である。
【００１２】
さらに、毒性作用が、癌に関する治療用抗体の開発における大きな障害であった（Carter P (2001)Nat Rev Cancer 1: 118-129; Goldenberg DM (2002) J Nucl Med 43: 693-713; Reichert JM (2002) Curr Opin Mol Ther 4: 110-118）。健常組織との交差反応性は、非結合（裸の）抗体に対する実質的な副作用を引き起こし得るが、この副作用は該抗体が毒素または放射性同位体と結合した際に増強されることがある。免疫介在性の合併症としては、肺への毒性作用による呼吸困難、偶発的な中枢および末梢神経系合併症、ならびに肝機能および腎機能の低下が挙げられる。時には、予期せぬ中毒性合併症、例えばＨＥＲ−２ターゲッティング抗体トラスツズマブ（ハーセプチン（登録商標））に関連した心毒性作用が観察され得る（Schneider JW et al (2002) Semin Oncol 29(3 suppl 11): 22-28）。放射性同位体を結合した抗体を用いた放射免疫療法も骨髄抑制を引き起こし得る。
【００１３】
したがって、一般的に用いられる抗癌抗体の、近年の臨床的および商業的成功にもかかわらず、この治療戦略の将来に関する相当数の重大な疑問が依然として存在する。その結果、ＨＥＲ２に対して同程度の親和性を有する薬剤を継続して提供することは、疾患の治療においてこのような分子の利用法を提供することと同様に、依然として当該技術分野内での多大な関心事である。
【発明の開示】
【００１４】
ＨＥＲ２との特異的な結合を特徴とするポリペプチドの提供によってこの関心を満足させることが、本発明の一目的である。
【００１５】
本発明に関連する目的物は、非特異的結合をほとんどまたは全く示さないＨＥＲ２結合ポリペプチドである。
【００１６】
本発明の別の目的は、融合ポリペプチド中の一部として容易に用いられ得るＨＥＲ２結合ポリペプチドを提供することである。
【００１７】
別の目的は、既存の抗体試薬に関連して経験される既知の問題のうちの１または複数を解決する、ＨＥＲ２結合ポリペプチドの提供である。
【００１８】
本発明のさらなる目的は、治療的用途に用い易いＨＥＲ２結合ポリペプチドを提供することである。
【００１９】
関連する目的は、ＨＥＲ２タンパク質の過剰発現により特徴付けられる癌疾患の臨床設定における、治療、抑制および／またはターゲッティングのための新規の方法を見出すことである。
【００２０】
低濃度でＨＥＲ２の検出用試薬として用いることができる分子を提供することも一目的である。
【００２１】
これらのおよびその他の目的は、添付の特許請求の範囲で主張されているような本発明の様々な態様により達成される。したがって第一の態様において、本発明は、ＨＥＲ２に対する結合親和性を有し、かつブドウ球菌のプロテインＡ（ＳＰＡ）のドメインに関連したポリペプチドであって、該ポリペプチドの配列は１〜約２０の置換変異を有するＳＰＡドメインの配列に相当する、ポリペプチドを提供する。
【００２２】
本発明のこの態様によるポリペプチドの実施の一形態では、ＨＥＲ２に対するその親和性は、相互作用のＫD値が最大でも１×１０-6Ｍであるようなものである。別の実施形態では、ＨＥＲ２に対するポリペプチドの親和性は、相互作用のＫD値が最大でも１×１０-
7Ｍであるようなものである。
【００２３】
別の実施の形態では、本発明のポリペプチドは、ＨＥＲ２タンパク質の細胞外ドメインであるＥＣＤと特異的に結合する。
【００２４】
本明細書に記すように、本発明者らは、ＳＰＡからのドメインの置換変異によって高親和性ＨＥＲ２結合ポリペプチドが得られるということ、そしてそのようなポリペプチドがＨＥＲ２と相互作用し得るということを見出した。本発明のポリペプチドは、多様な用途においてＨＥＲ２に対する抗体の代替物として利用できる。限定的でない例として、該ポリペプチドは、ＨＥＲ２の過剰発現により特徴付けられる癌の治療に、細胞表面上のＨＥＲ２との結合による細胞シグナル伝達の抑制に、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏの両方における癌の診断に、ＨＥＲ２を過剰発現する細胞に対する薬剤のターゲッティングに、ＨＥＲ２を検出するための組織化学的方法に、分離の方法およびその他の用途に有用である。本発明のポリペプチドは、ＨＥＲ２に対する試薬の親和性を利用するあらゆる方法に有用であることが判明するかもしれない。したがって該ポリペプチドは、そのような方法における検出試薬、捕捉試薬または分離試薬としてだけではなく、それ自体で治療薬として、またはＨＥＲ２タンパク質に対して他の治療薬をターゲッティングするための一手段として用いられ得る。ｉｎ ｖｉｔｒｏで本発明のポリペプチドを用いる方法は、種々の形式で、例えば微量滴定プレート中で、タンパク質アレイで、バイオセンサー表面上で、組織切片上等において実施され得る。本発明のポリペプチドの種々の修飾および／または該ポリペプチドへの付加は、本発明の範囲を逸脱しない限り、特定の所望の用途に該ポリペプチドを適合させるために実施してもよい。そのような修飾および付加は以下でさらに詳細に記載され、そして同一ポリペプチド鎖中に含まれる付加的アミノ酸、あるいは標識および／または化学的にあるいは別の方法により本発明のポリペプチドに結合される治療薬を包含し得る。さらに本発明は、ＨＥＲ２に結合する能力を有するポリペプチドの断片も包含する。
【００２５】
「ＨＥＲ２に対する結合親和性」とは、例えば表面プラズモン共鳴技法の使用により、例えばビアコア（登録商標）機器で試験され得るポリペプチドの特性を指す。ＨＥＲ２結合親和性は、ＨＥＲ２を計器のセンサーチップ上に固定し、試験されるポリペプチドを含有する試料を該チップ上に流す実験によって試験することができる。あるいは、試験されるポリペプチドは計器のセンサーチップ上に固定され、ＨＥＲ２を含有する試料は該チップ上を通過させられる。次いで、当業者であれば、得られたセンサグラムを読み取って、ＨＥＲ２に対するポリペプチドの結合親和性の少なくとも定性的な測定を確立することができる。例えば相互作用に関する信頼できるＫD値を確証するための目的で、定量的測定が求められる場合、表面プラズモン共鳴法もまた用いることができる。結合値は、例えばビアコア（登録商標）２０００機器（Biacore AB）によって決定できる。ＨＥＲ２は計器のセンサーチップ上に固定され、そして親和性が決定されるポリペプチドの試料が連続希釈により調製され、順不同で注入される。次に、その結果から、ＫD値が、例えば計器メーカーにより提供されるBIAevaluation３．２ソフトウエアの１：１ラングミュア結合モデルを用いて算定され得る。
【００２６】
上記のように、本発明のポリペプチドの配列は、上記ＳＰＡドメインの１〜約２０のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基で置換されたＳＰＡドメイン配列に関連する。しかしながら、導入される置換変異は、ポリペプチドの基本構造に影響を及ぼすべきではない。即ち、本発明のポリペプチドのＣα主鎖の全体的な折り畳みは、関連するＳＰＡドメインのものと本質的に同一であり、例えば、二次構造の同一要素を同一順序で有するなどである。したがって、ポリペプチドは、基本的な構造特性、例えば類似のＣＤスペクトルを生じる特性が共有される場合、ＳＰＡと同一の折り畳みを有するという定義に分類されることになる。関係のある他のパラメーターを、当業者は承知している。ＳＰＡドメインの基本構
造を本質的に保存するというこの要件により、その突然変異時に置換を受け得るドメインの位置は制限される。例えばＺタンパク質の既知の構造から出発する場合、Ｚタンパク質の表面上に位置するアミノ酸残基が置換される一方、Ｚタンパク質のコア内に埋め込まれたアミノ酸残基「３ヘリックス束」は分子の構造特性を保存するために不変のまま維持されるべきである、というのが好ましい。同一の推論が、他のＳＰＡドメインおよびその断片に当てはまる。
【００２７】
本発明は、上記のＨＥＲ２結合ポリペプチドが、いずれかの末端に付加的なアミノ酸残基が付加されたＨＥＲ２結合ドメインとして存在するポリペプチドも包含する。これらの付加的なアミノ酸残基は、該ポリペプチドによるＨＥＲ２の結合に一役を演じ得るが、しかし、例えばポリペプチドの生産、精製、安定化、カップリングまたは検出のうちの１又は複数に関連したその他の目的にも同様に十分に役立ち得る。このような付加的なアミノ酸残基は、化学的カップリングの目的のために付加された１又は複数のアミノ酸残基を含んでも良い。この一例は、ポリペプチド鎖中の一番初めのまたは後ろの位置での、即ちＮまたはＣ末端でのシステイン残基の付加である。このような付加的なアミノ酸残基は、ポリペプチドの精製または検出のための「タグ」、例えばヘキサヒスチジル（Ｈｉｓ6）タグ、あるいはタグに特異的な抗体との相互作用のための「ｍｙｃ」タグまたは「Ｆｌａｇ」タグも含み得る。その他の選択肢についても、当業者は承知している。
【００２８】
上述の「付加的なアミノ酸残基」は、任意の所望の機能、例えば最初のＨＥＲ２結合ドメインと同一の結合機能、または別の結合機能、あるいは酵素的機能、または蛍光的機能、あるいはそれらを複合した機能、を有する１又は複数のポリペプチドドメイン（単数または複数）を構成してもよい。
【００２９】
したがって本発明は、ＨＥＲ２に対する親和性を有するポリペプチドの多量体を包含する。例えば癌の治療のために又はＨＥＲ２の精製方法において本発明のポリペプチドを用いる場合には、本発明のポリペプチドを１つ用いて可能であるよりもさらに強力なＨＥＲ２の結合を獲得することは興味深い。この場合、ポリペプチドの多量体、例えば二量体、三量体または四量体の提供は、必要とする親和性作用を提供し得る。多量体は、適切な数の本発明のポリペプチドで構成できる。これらの本発明のポリペプチドドメインは、単量体によりそのような多量体が形成されており、それらの全てが同一のアミノ酸配列を有していてもよいが、しかし、それらが異なるアミノ酸配列を有することも同様に可能である。本発明の多量体中の連結されたポリペプチド「単位」は、既知の有機化学的方法を用いて共有結合により結合され得るし、あるいはポリペプチドの組換え発現のための系において１又は複数の融合ポリペプチドとして発現され、あるいは任意のその他の方式で、直接的に又はリンカー（例えばアミノ酸リンカー）を介して、連結され得る。
【００３０】
さらに、ＨＥＲ２結合ポリペプチドが第一のドメインまたは第一の部分、ならびにＨＥＲ２を結合する以外の他の機能を有する第二のおよびさらなる部分を構成する「異質性の（heterogenic）」融合ポリペプチドも意図され、それは本発明の範囲内である。融合ポリペプチドの第二のおよびさらなる部分（単数または複数）は、ＨＥＲ２以外の別の標的分子に対する親和性を有する結合ドメインを含んでも良い。そのような結合ドメインも、ＳＰＡドメインの１〜約２０個の位置における置換変異を通じてＳＰＡドメインに良好に関連し得る。結果的には、少なくとも１つのＨＥＲ２結合ドメイン、及び上記のその他の標的分子に対する親和性を有する少なくとも１つのドメインを有する融合ポリペプチドであって、両ドメインがＳＰＡドメインに関連する、融合ポリペプチドが得られる。これは、治療薬として、あるいは捕捉、検出または分離試薬として用いられるようないくつかのバイオテクノロジー用途に用いられ得る多特異的な試薬の作製を可能にする。少なくとも１つのポリペプチドドメインがＨＥＲ２に対する親和性を有する、このようなＳＰＡドメイン関連ポリペプチドの多特異的多量体の調製は、複数のＨＥＲ２結合「単位（unit）」
からなる多量体に対しても、上述のように適用し得る。その他の選択肢では、第二の又はさらなる部分（単数または複数）は、ある標的に対する結合親和性を有する、関連性のない天然または組換えタンパク質（あるいは天然または組換えタンパク質の結合能力を維持するその断片）を含み得る。ヒト血清アルブミンに対する親和性を有し、かつ本発明のＨＥＲ２結合ＳＰＡドメイン誘導体の融合相手として用いられ得るこのような結合タンパク質の一例は、連鎖球菌のプロテインＧ（ＳＰＧ）のアルブミン結合ドメインである（Nygren P-A et al (1988) Mol Recogn 1: 69-74）。ＨＥＲ２結合ＳＰＡドメイン関連ポリペプチドとＳＰＧのアルブミン結合ドメインとの融合ポリペプチドは、したがって、本発明の範囲内に入る。本発明のポリペプチドを、治療薬として、またはターゲッティング剤としてヒト被験体に投与する場合に、該ペプチドを、血清アルブミンを結合する部分と融合させることが有益かもしれないが、それは、このような融合タンパク質のｉｎ ｖｉｖｏでの半減期が、単離型のＳＰＡドメイン関連ＨＥＲ２結合部分の半減期と比較した場合、おそらく延長されるだろうと考えられるためである（この原理は、例えばＷＯ９１／０１７４３に記載されている）。
【００３１】
融合ポリペプチドの作製のためのその他の可能性も意図される。したがって本発明の第一の態様によるＨＥＲ２結合ＳＰＡドメイン関連ポリペプチドは、目的物との結合に加えて、あるいはその代わりに、他の機能を示す第二の又はさらなる単数または複数の部分と共有結合され得る。一例は、１又は複数のＨＥＲ２結合ポリペプチドと、レポーターまたはエフェクター部分として働く酵素活性を有するポリペプチドとの間の融合である。ＨＥＲ２結合ポリペプチドと結合して融合タンパク質を生成し得るレポーター酵素の例は当業者に既知であり、例としては、β−ガラクトシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、カルボキシペプチダーゼのような酵素が挙げられる。本発明の融合ポリペプチドの第二の及びさらなる単数または複数の部分に関するその他の選択肢としては、蛍光ポリペプチド、例えば緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼおよびそれらの変異体が挙げられる。
【００３２】
本発明の融合ポリペプチドの第二の及びさらなる単数または複数の部分に関するその他の選択肢としては、治療的用途のための単数または複数の部分が挙げられる。治療的用途では、その他の分子もまた、その他の手段により、本発明のポリペプチドと共有的にまたは非共有的に結合され得る。非限定的な例としては、エフェクター酵素（例えばカルボキシペプチダーゼ）を送達するために本願のポリペプチドを利用する、「ＡＤＥＰＴ」（抗体酵素プロドラッグ療法（antibody-directed enzyme prodrug therapy））用途のための酵素、エフェクター細胞および免疫系のその他の構成成分を動員するためのタンパク質、サイトカイン（例えばＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＴＮＦα、ＩＰ−１０）、凝血原因子（例えば組織因子、フォン・ウィルブラント因子）、毒素（例えばリシンＡ、シュードモナス外毒素、カルケアマイシン（calcheamicin）、マイタンシノイド（maytansinoid））、有毒な小分子（例えばアウリスタチン（auristatin）類似体、ドキソルビシン）が挙げられる。さらに、診断用（例えば68Ｇａ、76Ｂｒ、111Ｉｎ、99Ｔｃ、124Ｉ、125Ｉ）または治療用（例えば90Ｙ、131Ｉ、211Ａｔ）の放射性核種を容易に組入れるために、放射性同位体のためのキレート剤をポリペプチド配列にカップリングすることを目的として、上記で言及した付加的アミノ酸（特にヘキサヒスチジンタグ、システイン）が意図される。
【００３３】
本発明は、ポリペプチドであって、該ポリペプチド中で上記のＨＥＲ２結合ポリペプチドが、例えば該ポリペプチドの検出を目的として標識基（例えば少なくとも１つの蛍光体、ビオチンまたは放射性同位体）を備えていることを特徴とするポリペプチドを包含する。
【００３４】
本発明のＨＥＲ２結合ポリペプチドを組入れた融合タンパク質についての上記の説明に関しては、第一、第二及びさらなる部分の呼称は、一方のＨＥＲ２結合部分（単数または
複数）と、他方の他の機能を示す部分とを明白に区別する目的でなされる、ということに留意すべきである。これらの呼称は、融合タンパク質のポリペプチド鎖中における異なるドメインの実際の順序を指すものではない。したがって例えば上記の第一の部分は、制限なしに、融合タンパク質のＮ末端、中間、またはＣ末端に出現し得る。
【００３５】
本発明のポリペプチドを作製する出発点として用いるためのＳＰＡドメインの一例は、ブドウ球菌のプロテインＡのドメインＢに由来するプロテインＺである。「背景技術」の節で指摘したように、このタンパク質は、従来、種々の標的と結合し得るＡｆｆｉｂｏｄｙ（登録商標）分子と命名された分子の作製のための足場構造として用いられてきた。非修飾プロテインＺ（Ｚwtと示す）の５８のアミノ酸配列は配列番号１で示され、図１に例示されている。
【００３６】
本発明のポリペプチドの一実施形態では、ポリペプチドはＳＰＡの一ドメインに関連するものであって、該ポリペプチドの配列は４〜約２０の置換変異を有するＳＰＡドメインの配列に相当する。その他の実施形態は、１〜約１３の置換変異、あるいは４〜約１３の置換変異を有し得る。
【００３７】
本発明のポリペプチドのさらに具体的な実施形態では、ポリペプチドの配列は、配列番号１に示される配列において１〜約２０の置換変異、例えば４〜約２０、１〜約１３または４〜約１３の置換変異を有する配列に相当する。
【００３８】
いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチドは、その配列が、配列番号１に示される配列において、第１３位、第１４位、第２８位、第３２位および第３５位のうちの単数または複数の位置における置換変異を含む配列に相当し得る。さらに本発明のポリペプチドの配列は、第９位、第１０位、第１１位、第１７位、第１８位、第２４位、第２５位および第２７位のうちの単数または複数の位置における置換変異を含み得る。
【００３９】
本発明の別の実施形態のポリペプチドの配列は、配列番号１の配列において、第１３位でのフェニルアラニンからチロシンへの置換変異を少なくとも含む配列に相当する。
【００４０】
本発明の別の実施形態のポリペプチドの配列は、配列番号１の配列において、第１４位でのチロシンからトリプトファンへの置換変異を少なくとも含む配列に相当する。
【００４１】
本発明の別の実施形態のポリペプチドの配列は、配列番号１の配列において、第２８位での、アスパラギンから、アルギニン及びヒスチジンから選択されるアミノ酸残基への、より好ましくはアルギニンへの置換変異を少なくとも含む配列に相当する。
【００４２】
本発明の別の実施形態のポリペプチドの配列は、配列番号１の配列において、第３２位でのグルタミンからアルギニンへの置換変異を少なくとも含む配列に相当する。
【００４３】
本発明の別の実施形態のポリペプチドの配列は、配列番号１の配列において、第３５位でのリジンからチロシンへの置換変異を少なくとも含む配列に相当する。
【００４４】
本発明の別の実施形態のポリペプチドの配列は、配列番号１の配列において、第１０位でのグルタミンからアルギニンへの置換変異を少なくとも含む配列に相当する。
【００４５】
本発明の別の実施形態のポリペプチドの配列は、配列番号１の配列において、第１１位でのアスパラギンからスレオニンへの置換変異を少なくとも含む配列に相当する。
【００４６】
本発明の別の実施形態のポリペプチドの配列は、配列番号１の配列において、第１７位
でのロイシンからバリンへの置換変異を少なくとも含む配列に相当する。
【００４７】
本発明の別の実施形態のポリペプチドの配列は、配列番号１の配列において、第２７位での、アルギニンから、リジンおよびセリンから選択されるアミノ酸残基への置換変異を少なくとも含む配列に相当する。
【００４８】
本発明の好ましいポリペプチドは、そのアミノ酸配列が、配列番号１の配列において少なくとも以下の突然変異、Ｆ１３Ｙ、Ｙ１４Ｗ、Ｎ２８Ｒ、Ｑ３２ＲおよびＫ３５Ｙ、を含む配列に相当する。
【００４９】
本発明のポリペプチドの種々の実施形態の具体的な配列の例（各々が上記の１又は複数の特定の突然変異を含む）は配列番号２〜７９に記載され、かつ図１に例示されている。これらのポリペプチドのＨＥＲ２結合特性は、ここでの全般的な本発明の説明の後の実施例に開示される。
【００５０】
非修飾ＳＰＡドメインの使用に代わるものとして、ＳＰＡドメインは、アルカリ性条件下での安定性を増大させるために、突然変異誘発も施され得る。このような安定化は、非修飾配列中に出現する任意のアスパラギン残基を、アルカリ条件に対してより感受性の低いアミノ酸残基に置換する、部位特異的置換を包含する。アフィニティークロマトグラフィーにおけるアフィニティーリガンドとして本発明のポリペプチドを用いる場合、このアルカリに対する低感受性という特性は、以下の利点をもたらす。アフィニティークロマトグラフィーカラムは分離操作の合間に定置洗浄（ＣＩＰ）を目的とした厳しいアルカリ処理をしばしば施されるが、このような処理に耐える能力がアフィニティークロマトグラフィーマトリックスの耐用寿命を延長する。一例として、出発点としてプロテインＺを使用する場合、本発明のポリペプチドは、ＨＥＲ２結合を付与する置換変異の他に、Ｎ３、Ｎ６、Ｎ１１、Ｎ２１、Ｎ２３、Ｎ２８、Ｎ４３およびＮ５２から選択される少なくとも１つのアスパラギン残基が、アルカリ処理に対して低感受性であるアミノ酸残基で置換されているという修飾を有し得る。このようなポリペプチドの非限定的な例は、以下の組の突然変異（Ｚwtの配列に関して）を有するものである。Ｎ３Ａ。Ｎ６Ｄ。Ｎ３Ａ、Ｎ６ＤおよびＮ２３Ｔ。Ｎ３Ａ、Ｎ６Ｄ、Ｎ２３ＴかつＮ２８Ａ。Ｎ２３Ｔ。Ｎ２３ＴかつＮ４３Ｅ。Ｎ２８Ａ。Ｎ６Ａ。Ｎ１１Ｓ。Ｎ１１ＳかつＮ２３Ｔ。Ｎ６ＡかつＮ２３Ｔ。したがってこれらのＳＰＡドメイン、ならびに安定性の理由のためにアスパラギン突然変異を施されたその他のＳＰＡドメインは全て、本発明のＨＥＲ２結合ポリペプチドを得るために、アミノ酸残基のさらなる置換変異に付すことができる。あるいは、アスパラギン残基を含む本発明のＨＥＲ２結合ポリペプチドは、アスパラギン残基を置き換えるためにさらなる突然変異に付してもよい。この後者の選択肢は、そのような分子のＨＥＲ２結合能力が維持される程度においてのみ可能であることは明らかである。
【００５１】
本発明は、上記ポリペプチドの断片の生成を通じて任意の上記ポリペプチドから得られたポリペプチドも包含するが、ここで該ポリペプチド断片はＨＥＲ２親和性を維持している。該ポリペプチド断片は、その安定性が維持され、かつＨＥＲ２を結合する特異性を保持するものである。免疫グロブリンＧに対する結合特異性を維持した野生型ＳＰＡドメインの断片を作製する可能性は、Braisted AC and Wells JA et al in Proc Natl Acad Sci
USA 93: 5688-5692 (1996)により示されている。構造ベースの設計およびファージディスプレイ法を用いることにより、５９残基からなる３ヘリックス束の結合ドメインは、結果的に３３残基からなる２ヘリックス誘導体へと縮小された。これは、異なる領域からの無作為な突然変異の段階的な選択により達成され、それによって、安定性および結合親和性が繰り返し改善された。本発明の第一の態様によるポリペプチドに対すると同一の推論により、当業者は、「親」ＨＥＲ２ポリペプチドと同一の結合特性を有する「最小化」ＨＥＲ２結合ポリペプチドを得ることができよう。それゆえ、本発明の上記の態様によるポ
リペプチドの断片を構成するポリペプチドであって、該断片がＨＥＲ２に対する結合親和性を保有するポリペプチドは、本発明のさらなる態様である。
【００５２】
本発明の別の態様は、本発明のポリペプチドをコードする配列を含む核酸分子に関する。
【００５３】
本発明のさらなる態様は、前の態様の核酸分子、ならびに核酸分子の発現により本発明のポリペプチドの産生を可能にするその他の核酸要素を含む発現ベクターに関する。
【００５４】
本発明のさらに別の態様は、前の態様の発現ベクターを含む宿主細胞に関する。
【００５５】
後半３つの本発明の態様は、本発明のポリペプチドの産生のための手段であり、発現されるべきポリペプチドに関する本明細書中の情報が与えられれば、そしてタンパク質の組換え発現についての当業者の一般的レベルを考えれば、過度の負担をかけることなく、当業者はそれらを生成し得るし、それらを実際に使用し得る。一例として、非修飾プロテインＺの発現のためのプラスミド（例えばNilsson B et al (1987)、上記参照）が、出発物質として用いられ得る。所望の置換変異は、既知の技法を用いてこのプラスミド中に導入されて、本発明にのっとった発現ベクターを生成し得る。
【００５６】
しかしながら、本発明のポリペプチドは、その他の既知の手段、例えば化学合成、あるいは種々の原核生物または真核生物宿主、例えば植物およびトランスジェニック動物中での発現によっても生成され得る。化学的なポリペプチドの合成を利用する場合、上記のようなポリペプチド中の天然アミノ酸残基のいずれかを、ポリペプチドのＨＥＲ２結合能力が実質的に弱められることがない限り、任意の対応する非天然アミノ酸残基またはその誘導体によって置換しても良い。少なくとも結合能力は保持されるべきであるが、しかしながら、対応する非天然アミノ酸残基またはその誘導体による置換も、実際には、ポリペプチドのＨＥＲ２結合能力を改善するのに役立つ可能性がある。さらに、非天然アミノ酸の組入れは、分子（例えば標識、エフェクター、キレート剤等）の、ＨＥＲ２結合ポリペプチドへの、既存のものに代わる結合部位を提供するために実施され得る。非古典的なアミノ酸または合成アミノ酸類似体としては、普通のアミノ酸のＤ−異性体、α−アミノイソ酪酸、４−アミノ酪酸、２−アミノ酪酸、６−アミノヘキサン酸、２−アミノイソ酪酸、３−アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、システイン酸、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、β−アラニン、フルオロアミノ酸、デザイナーアミノ酸（designer amino acids）（例えばβ−メチルアミノ酸、Ｃα−メチルアミノ酸、Ｎα−メチルアミノ酸）、ならびにアミノ酸類似体全般が挙げられるが、これらに限定されない。さらにアミノ酸残基は、ＤまたはＬ形態で存在し得る。
【００５７】
本発明は、上記のＨＥＲ２結合ポリペプチドの使用態様、ならびに該ポリペプチドがその結合特性によって有用なものになっている、治療、診断および検出のための種々の方法にも関する。これらの使用および方法に関する以下の説明において「ＨＥＲ２結合ポリペプチド」に言及する場合、この用語はＨＥＲ２結合ポリペプチドのみを包含することを意図するものではなく、例えばその断片を構成し、および／または融合タンパク質中の一部分としてＨＥＲ２結合ポリペプチドを組入れるか、および／または標識または治療薬に結合されるか、および／またはタグとしてまたはその他の目的のために付加的アミノ酸残基を備える、このポリペプチドを基礎にした上述の分子もまた全て包含される。上記で説明したように、このような融合タンパク質、誘導体、断片等は、本発明の一部を形成する。
【００５８】
したがってこのような一態様では、本発明は、本明細書中に記載されたような薬剤としてのＨＥＲ２結合ポリペプチドの使用を提供する。
【００５９】
さらなる態様において、本発明は、ＨＥＲ２の過剰発現により特徴付けられる癌の少なくとも一形態の治療を目的とした薬剤の調製における、本明細書中に記載されたようなＨＥＲ２結合ポリペプチドの用途を提供する。ＨＥＲ２の過剰発現により特徴付けられる癌の特定の一形態は、乳癌である。「背景技術」の節に記載されたように、全ての乳癌患者の約２５％が、ＨＥＲ２の過剰発現を示す（Slamon DJ et al、上記を参照）。
【００６０】
この説に縛られることは望まないが、本明細書中に記載されたポリペプチドは、以下のメカニズムのうちの少なくとも１つを基礎にした治療薬として有用であると考えられる。（ｉ）化学療法（細胞傷害性）の増強作用。ここで、ポリペプチドの投与は、現存の及び将来的な化学療法およびホルモン療法と相乗的に機能する。細胞表面のＨＥＲ２タンパク質の遮断は、ＤＮＡ傷害薬が作用した後のＤＮＡ修復を阻止することが示されている（Pietras RJ et al (1994) Oncogene 9: 1829-1838）。（ｉｉ）腫瘍細胞の増殖の抑制（細胞分裂抑制）。この論証は、分子（抗体）が細胞表面上のＨＥＲ２タンパク質に結合するといくつかの受容体の細胞内取り込みが生じ、細胞がさらに増殖するためのシグナルを制限する、という観察に基づいている（Baselga J et al (1998) Cancer Res 58: 2825-2831; Sliwkowski MX et al、上記を参照）。
【００６１】
本発明の関連態様は、ＨＥＲ２の過剰発現により特徴付けられる癌のうちの少なくとも１つの形態を治療するための方法であって、活性物質として本明細書中に上述されたようなＨＥＲ２結合ポリペプチドを含む治療的に有効な量の組成物を、このような治療を必要とする被験体に投与することを包含する方法の提供である。
【００６２】
本発明のポリペプチドのＨＥＲ２結合特性は、融合タンパク質および／または標識結合分子の作製に対する該ポリペプチドの適性に加えて、ＨＥＲ２を過剰発現する細胞を含む腫瘍の部位に対して他の活性物質を標的化するためにも該ポリペプチドが有用であり得る、ということを意味する。したがって本発明の別の態様は、抗癌活性を有する物質と結合された本明細書中に記載されるＨＥＲ２結合ポリペプチドの用途であって、ＨＥＲ２を過剰発現する細胞への上記物質の送達を目的とした用途を提供することである。結合される物質は、被験体の内因性免疫系の応答を引き出すよう機能するものであっても良い。ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞または免疫系のその他のエフェクターは、そのようなエフェクターを動員する機能を担う融合部分の提示を通じて、細胞表面上のＨＥＲ２とＨＥＲ２結合ポリペプチドとの複合体に引き付けられ得る。細胞が異常であることを検出したＮＫ細胞またはその他のエフェクターは、ＨＥＲ２結合融合タンパク質に結合する。その結果、癌細胞は、ＮＫ細胞により食べ尽くされる（Sliwkowski MX et al、上記を参照；Pegram MD et al (1997) Proc Am Assoc Cancer Res 38: 602, Abstract 4044）。
【００６３】
このような活性物質は、融合により、または化学的連結により、ＨＥＲ２結合ポリペプチドに結合されるタンパク質、例えば「ＡＤＥＰＴ」（抗体酵素プロドラッグ療法）用途のためにエフェクター酵素の中から選択されるタンパク質；免疫系のエフェクター細胞およびその他の構成成分の動員のためのタンパク質；サイトカイン、例えばＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＴＮＦα、ＩＰ−１０；凝血原因子（procoagulant factors）、例えば組織因子、フォン・ウィルブラント因子；毒素、例えばリシンＡ、シュードモナス内毒素、カルケアマイシン、マイタンシノイドであり得る。あるいは、該活性物質は、細胞傷害剤、例えばアウリスタチン類似体またはドキソルビシン、あるいは放射性同位体（例えば90Ｙ、131Ｉ、211Ａｔ）であり、この同位体は、ＨＥＲ２結合ポリペプチドと直接結合してもよく、あるいはキレート剤、例えば周知のキレート剤であるＤＯＴＡまたはＤＴＰＡを介して結合しても良い。
【００６４】
関連する態様において、本発明は、抗癌活性を有する物質をｉｎ ｖｉｖｏでＨＥＲ２
を過剰発現する細胞に対して送達する方法であって、上記活性物質と本明細書中に記載されるＨＥＲ２結合ポリペプチドとの結合体を患者に投与することを包含する方法も提供する。該結合体は、上記段落に記載されたように適切に調製される。
【００６５】
本発明の別の態様は、試料中のＨＥＲ２の検出を目的とした、本明細書中に記載されているようなＨＥＲ２結合ポリペプチドの使用である。例えばこのような検出は、ＨＥＲ２の過剰発現により特徴付けられる疾患状態を診断するという目的で実施され得る。試料中のＨＥＲ２の存在の検出は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで実施され得る。ｉｎ ｖｉｖｏ診断のための好ましい選択肢は、陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）の使用である。当該試料は、例えば生体液試料または組織試料であり得る。本発明のＨＥＲ２結合ポリペプチドに対して用いるに適した、ＨＥＲ２に対して作られた抗体に対して今日用いられている一般的な方法は、新鮮な、凍結された、またはホルマリン固定、パラフィン包埋された組織試料中のＨＥＲ２タンパク質の過剰発現を検証するために用いられる、ＨＥＲ２の存在の組織化学的検出である。ＨＥＲ２検出のために、本発明のポリペプチドは融合タンパク質の一部としても用いられ得るが、ここで、他のドメインはレポーター酵素または蛍光酵素である。あるいは、ポリペプチドは、状況によってはキレート剤を介して、１又は複数の蛍光剤（単数または複数）および／または放射性同位体（単数または複数）で標識され得る。適切な放射性同位体としては、68Ｇａ、76Ｂｒ、111Ｉｎ、99Ｔｃ、124Ｉおよび125Ｉが挙げられる。
【００６６】
本発明のさらに別の態様は、生体液試料中のＨＥＲ２の検出方法における、本明細書中に記載されたようなＨＥＲ２結合ポリペプチドの使用により構成される。この方法は、（ｉ）試験されるべき患者からの生体液試料を準備する工程、（ｉｉ）本明細書中に記載されるようなＨＥＲ２結合ポリペプチドを、該試料中に存在する任意のＨＥＲ２と該ポリペプチドとの結合が可能になるような条件下で、該試料に添加する工程、（ｉｉｉ）結合していないポリペプチドを除去する工程、および（ｉｖ）結合したポリペプチドを検出する工程、を包含する。検出される結合したポリペプチドの量は、試料中に存在するＨＥＲ２の量と相関する。工程（ｉｉ）において、試料へのＨＥＲ２結合ポリペプチドの添加は、任意の適切な形式で実施され、例えば試料が接触する固体支持体上にＨＥＲ２結合ポリペプチドが固定される状況、ならびにＨＥＲ２結合ポリペプチドが溶液中に存在する設定を包含する。
【００６７】
本発明の別の関連する態様は、試料中のＨＥＲ２の検出方法であって、（ｉ）ＨＥＲ２を含有する疑いのある組織試料、例えば組織のクリオスタット切片またはパラフィン包埋切片を準備する工程、（ｉｉ）試料中に存在する任意のＨＥＲ２とのポリペプチドの結合を実行し得る条件下で、上記試料に本発明のＨＥＲ２結合ポリペプチドを添加する工程、（ｉｉｉ）結合していないポリペプチドを除去する工程、および（ｉｖ）結合したポリペプチドを検出する工程、を包含する方法である。検出される結合したポリペプチドの量は、試料中に存在するＨＥＲ２の量と相関する。
【００６８】
組織試料におけるＨＥＲ２の過剰発現を診断するためのキットであって、レポーター酵素（例えばアルカリ性ホスファターゼまたはホースラディッシュペルオキシダーゼ）と融合した本発明のＨＥＲ２結合ポリペプチド、酵素活性の検出のための試薬、ならびに陽性および陰性対照組織スライドを包含するキットも、本発明により提供される。
【００６９】
組織試料におけるＨＥＲ２過剰発現の診断のためのキットであって、抗体による検出のためのタグ（例えばＦｌａｇタグまたはｍｙｃタグ）と融合した本発明のＨＥＲ２結合ポリペプチド、タグに特異的な一次抗体、一次抗体に特異的で、かつレポーター酵素を結合した二次抗体、酵素活性の検出のための試薬、ならびに陽性および陰性対照組織スライドを包含するキットも、本発明により提供される。
【００７０】
診断用途における一領域は、癌細胞またはその集合体のｉｎ ｖｉｖｏでの検出である。本発明は、このような診断を実施するためのキットであって、キレート剤で標識された本発明のＨＥＲ２結合ポリペプチド、診断用放射性同位体（非限定的な例は、68Ｇａ、76Ｂｒ、111Ｉｎ、99Ｔｃ、124Ｉおよび125Ｉである）、ならびに取り込み効率の分析のための試薬を包含するキットを提供する。
【００７１】
上記のように、本発明は、ＨＥＲ２を過剰発現する細胞、例えばある種の癌細胞に活性物質をターゲッティングすることを目的とした、本発明のＨＥＲ２結合ポリペプチドの使用を包含する。本発明は、この目的のためのキットであって、キレート剤で標識された本発明のＨＥＲ２結合ポリペプチド、治療用放射性同位体（非限定的な例は90Ｙ、131Ｉ、211Ａｔである）、および取り込み効率の分析のための試薬を包含するキットも提供する。
【００７２】
本発明に従って実行される実験についての非限定的な詳述により、ここで本発明をさらに例示する。
【実施例１】
【００７３】
ＨＥＲ２結合ポリペプチドの選択および試験
これらの実験では、多数の異なるＳＰＡドメイン関連ポリペプチドのライブラリーから本発明のいくつかのＨＥＲ２結合ポリペプチドを選択し、その後、特性を明らかにした。
【００７４】
ライブラリーのパニング及びクローンの選択
Nord K et al (1995、上記参照)に記載されたのと本質的に同様に、コンビナトリアル・ファージディスプレイライブラリーを調製した。本試験に用いたこのライブラリーのプールは、第９位、１０位、１１位、１３位、１４位、１７位、１８位、２４位、２５位、２７位、２８位、３２位および３５位に無作為なアミノ酸残基を有するプロテインＺ（Ａｆｆｉｂｏｄｙ（登録商標）分子）の８．７×１０8の変異体を含む。標的としてビオチニル化ヒトＨＥＲ２細胞外ドメイン（ＨＥＲ２−ＥＣＤ）を用いて、４回のパニングで、抗原結合Ａｆｆｉｂｏｄｙ（登録商標）分子を選択した（組換えヒト細胞外ドメイン、アミノ酸２３８〜２１０９、Fox Chase Cancer Center, Philadelphia, USAにより提供）。４回の選択サイクルの結果、９１個のクローンをファージＥＬＩＳＡ用に選択し、それらのＨＥＲ２結合活性の分析を実施した。
【００７５】
ＨＥＲ２結合の分析用のファージＥＬＩＳＡ
４回の選択後に得られたクローンからのファージを９６ウエルプレート中で生成させ、ＨＥＲ２結合Ａｆｆｉｂｏｄｙ（登録商標）分子を発現するファージをスクリーニングするために、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）を用いた。シングルコロニーを、深穴９６ウエルプレート中で２％グルコースおよび１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを補充した２５０μｌのＴＳＢ培地（３０．０ｇのトリプシンダイズブロス（Merck）、水で最終容積を１ｌとする。オートクレーブ処理）に接種し、３７℃で一晩、振盪器上で増殖させた。５μｌの一晩培養物を、新プレート中で、０．１％グルコースおよび１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを補充した５００μｌのＴＳＢ＋ＹＥ培地（３０．０ｇのトリプシンダイズブロス（Merck）、５．０ｇの酵母抽出物、水で最終容積を１ｌとする。オートクレーブ処理）に添加した。３７℃で３時間増殖後、０．５μｌの５×１０12ｐｆｕ／ｍｌ（２．５×１０9ｐｆｕ）のヘルパーファージＭ１３Ｋ０７（New England Biolabs, #NO315S）および１００μｌのＴＳＢ＋ＹＥ培地を各ウエルに添加し、３７℃で３０分間、振盪せずにプレートをインキュベートした。ＩＰＴＧ、カナマイシンおよびアンピシリンを補充した３００μｌのＴＳＢ＋ＹＥを各ウエルに添加して、最終濃度を１ｍＭのＩＰＴＧ、２５μｇ／ｍｌのカナマイシンおよび１００μｇ／ｍｌのアンピシリンとして、プレートを３０℃で一晩、振盪器上でインキュベートした。２，５００ｇで１５分間の遠心分離に
より細胞をペレット化し、Ａｆｆｉｂｏｄｙ（登録商標）分子を発現するファージを含有する上清をＥＬＩＳＡに用いた。ＰＢＳ（２．６８ｍＭのＫＣｌ、１３７ｍＭのＮａＣｌ、１．４７ｍＭのＫＨ2ＰＯ4、８．１ｍＭのＮａ2ＨＰＯ4、ｐＨ７．４）中の４μｇ／ｍｌのＨＥＲ２の１００μｌを、微量滴定プレート（Nunc #446612）に添加し、４℃で１ヶ月間インキュベートした。ＰＢＳ中の２％粉末スキムミルク（ブロッキング緩衝液）で、室温で１時間、ウエルをブロッキング処理し、２００μｌのファージ含有上清および５０μｌの１０％ブロッキング緩衝液を添加した。プレートを、室温で２時間インキュベートした。ポリクローナル抗体（ウサギ抗Ｍ１３、Abcam #ab6188）を２％ブロッキング緩衝液中で１：１，０００に希釈し、１５０μｌを各ウエルに添加した。プレートを、室温で１時間インキュベートした。アルカリ性ホスファターゼと結合したヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体（Sigma #A-3687）を２％ブロッキング緩衝液中で１：１０，０００に希釈し、その後１５０μｌを各ウエルに添加し、室温で１時間インキュベートした。１Ｍのジエタノールアミン、５ｍＭのＭｇＣｌ2（ｐＨ９．８）と水の１：１混合物中にＳｉｇｍａ−１０４基質（Sigma #104-105）を溶解することにより（１錠／５ｍｌの１：１混合物）、展開溶液を調製した。その後、１８０μｌの展開溶液を各ウエルに添加した。ウエルをＰＢＳ−Ｔ（ＰＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０）で２回、ＰＢＳで１回洗浄した後、各々の新試薬を添加した。基質を添加してから２５分後、ＥＬＩＳＡ分光光度計（Basic Sunrise, Tecan）を用い、Ａ405で、プレートを読取った。
【００７６】
ＥＬＩＳＡ値の閾値判定基準（Ａ405が０．５より高い）を用いて、ＨＥＲ２結合物質をコードするファージを同定した。４８のクローンがこの値より高いＥＬＩＳＡシグナルを生じ、無作為で選択された、ＥＬＩＳＡ結果が利用可能でない５クローンとともに、ＤＮＡ配列分析用に選択された。
【００７７】
ＤＮＡ配列分析
上記の手法に従って単離されたクローンからのＤＮＡのシーケンシングを、メーカーの推奨によりＡＢＩプリズム（登録商標）、ビッグダイ（商標）ターミネーターｖ２．０レディリアクションサイクルシーケンシングキット（Applied Biosystems）を用いて実施した。プラスミドを調製し、オリゴヌクレオチドＲＩＴ−２７（５’−ＧＣＴＴＣＣＧＧＣＴＣＧＴＡＴＧＴＴＧＴＧＴＧ−３’）およびビオチン化ＮＯＫＡ−２（５’−ビオチン−ＣＧＧＡＡＣＣＡＧＡＧＣＣＡＣＣＡＣＣＧＧ−３’）を用いて、Ａｆｆｉｂｏｄｙ（登録商標）分子をコードするＤＮＡをシーケンシングした。ＡＢＩプリズム（登録商標）３７００遺伝子分析装置（Applied Biosystems）で、配列を分析した。予め選択された５３のクローンから、いくつかのクローンが同一アミノ酸配列をコードすることが判明した。これらの縮重を考慮に入れて、ＥＬＩＳＡ結合検定で選択されたクローンにより発現されるＡｆｆｉｂｏｄｙ（登録商標）分子の４つの配列を図１に示し（ＺHER2 A-D）、かつ配列番号２〜５として配列表中で同定した。
【００７８】
クローニングおよびタンパク質産生
図２で概略的に示されている構築物をコードする発現ベクターを用いて、大腸菌細胞中でＺHER2ポリペプチドを発現させた。これにより、該ポリペプチドは、Ｎ末端ヘキサヒスチジルタグとの融合体として産生された。融合ポリペプチドＨｉｓ6−ＺHER2 AおよびＨｉｓ6−ＺHER2 Bを固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）カラムで精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ実験の結果を、図３に示す。
【００７９】
融合ポリペプチドのバイオセンサー分析
前節により産生されたＨｉｓタグ化ＺHER2変異体とＨＥＲ２との間の相互作用を、ビアコア（登録商標）２０００システム（Biacore AB, Uppsala, Sweden）により表面プラズモン共鳴を利用して分析した。ヒトＨＥＲ２、ＨＩＶ−１ｇｐ１２０（Protein Sciences
Corporation、#2003-MN）およびＢＢ（連鎖球菌プロテインＧ由来のアルブミン結合タンパク質）（後者２つは対照として用いる）を、メーカーの推奨に従って、ＣＭ−５チップの表面のカルボキシル化デキストラン層上へのアミンカップリングにより、異なるフローセル中に固定した。ヒトＨＥＲ２、ＨＩＶ−１ｇｐ１２０およびＢＢの固定化は、それぞれ１９００、６２９０および１０００共鳴単位（ＲＵ）を生じた。第四フローセル表面を活性化し、注入を行う間のブランクとして用いるために非活性化した。Ｈｉｓ6−ＺHER2 AおよびＨｉｓ6−ＺHER2 Bタンパク質をＨＢＳ（５ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３．４ｍＭのＥＤＴＡ、０．００５％界面活性剤Ｐ−２０（ｐＨ７．４））で希釈して最終濃度を１０μＭとし、３０μｌ／分の一定流量で、二つ組として、順不同に注入した。精製タンパク質Ｈｉｓ6−ＺHER2 A及びＨｉｓ6−ＺHER2 BのＨＥＲ２と相互作用する能力を、それぞれ図４および５のセンサグラム（sensorgram）に例示したように確認した。
【００８０】
さらにＨｉｓ6−ＺHER2 AおよびＨｉｓ6−ＺHER2 Bに関して、動態試験を実施した。チップに固定された１９００ＲＵのヒトＨＥＲ２を有するＣＭ−５チップを用いた。Ｈｉｓ6−ＺHER2 AおよびＨｉｓ6−ＺHER2 Bの各々に関して、一連の６つの異なる濃度（１μＭ〜４０μＭ）のＨＥＲ２結合ポリペプチドをＨＢＳ中に調製し、３０μｌ／分の流量で、二つ組として、順不同に注入した。総注入時間は５０秒（会合）で、その後、６分間洗浄した（解離）。表面を、２０ｍＭのＨＣｌで１０秒間再生した。参照細胞中で測定された応答（活性化／非活性化表面）を、固定化ＨＥＲ２を有する細胞中で測定された応答から差し引いた。BIAevaluation３．０．２ソフトウエア（Biacore AB）の１：１ラングミュア結合モデルを用いて、結合曲線（センサグラム）を分析した。図６（Ｈｉｓ6−ＺHER2 A）および７（Ｈｉｓ6−ＺHER2 B）に示された結合曲線から明らかなように、Ｈｉｓ6−ＺHER2 Aに関しては１０〜１００ｎＭの、Ｈｉｓ6−ＺHER2 Bに関しては２００〜４００ｎＭの表示されたＫDを有する会合及び解離曲線により立証されるように、Ｈｉｓ6−ＺHER2 AおよびＨｉｓ6−ＺHER2 Bはともに、ＨＥＲ２と明瞭に結合する。さらに、試験したＨＥＲ２結合ポリペプチドのいずれもＢＢ対照抗原およびｇｐ１２０対照抗原とは結合しないことから（図４および図５）、該結合は選択的である。
【００８１】
第二の動態実験では、Ｈｉｓ6−ＺHER2 AおよびＨｉｓ6−ＺHER2 B変異体を再び、３０μｌ／分の流量で、異なる濃度（０〜５μＭ、最小濃度：Ｈｉｓ6−ＺHER2 Aに関しては０．００９８μＭ、Ｈｉｓ6−ＺHER2 Bに関しては０．０１９６μＭ；ＨＢＳで希釈）でＨＥＲ２表面上に注入した。動態分析前に、アミノ酸分析によりタンパク質濃度を確定した。BIAevaluation３．２ソフトウエア（Biacore）を用いて、解離平衡定数（ＫD）、会合速度定数（ｋa）および解離速度定数（ｋd）を算定し、１対１結合であると推定した。最初の２つのビアコア（登録商標）分析に関しては、試料は、２５℃で、順不同に２度流し、各回の注入の後には、１０ｍＭのＨＣｌの注入によりフローセルを再生した。結合曲線（図８Ａ〜８Ｂ）の評価時に、解離平衡定数（ＫD）を、Ｈｉｓ6−ＺHER2 Aに関しては約５０ｎＭ、Ｈｉｓ6−ＺHER2 Bに関しては約１４０ｎＭであると確定した。ＫDの違いの理由は、おそらく、図４のグラフＡを図５のグラフＡと比較することにより分かるように、解離速度の顕著な差のためである。Ｈｉｓ6−ＺHER2 Aに関しては、会合速度定数（ｋa）は、約１．８×１０5 Ｍ-1ｓ-1および解離速度定数（ｋd）は約９．９×１０-3 ｓ-1であると算定され、一方、Ｈｉｓ6−ＺHER2 Bに関しては、高速な会合および解離動態のため、ｋaおよびｋdは見積もるのが難しかった。したがって、その標的とのより強力な結合を示すＨｉｓ6−ＺHER2 AＡｆｆｉｂｏｄｙ変異体を、さらなる特徴付けのために選択した。
【実施例２】
【００８２】
ＨＥＲ２を発現する細胞とのＺHER2 Aの結合
細胞培養
約２×１０6ＨＥＲ２分子／細胞を発現することが知られているヒト乳癌細胞株ＳＫＢＲ−３を、ＡＴＣＣから購入した（ＡＴＣＣ＃ＨＴＢ−３０）。１０％ウシ胎仔血清、２ｍＭのＬ−グルタミンおよびＰＥＳＴ（１００ ＩＵ／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン）（すべてBiochrom KG, Berlin, Germanyから）を補充したＲＰＭＩ １６４０培地中で細胞を培養した。細胞を、３７℃で、５％ＣＯ2を含有する湿潤空気中で培養し、実験の３日前に３ｃｍペトリ皿中に植え付けた。
【００８３】
放射性標識
Orlova et al in Nucl Med Biol 27: 827-835 (2000)に従って、標識前駆体Ｎ−スクシンイミジルｐ−（トリメチル−スタンニル）ベンゾエート（ＳＰＭＢ）を調製し、５μｇのＳＰＭＢを５％酢酸溶液中の５ＭＢｑの125Ｉに添加した。反応を開始するために、水溶液中の４０μｇのクロラミン−Ｔ（Sigma, St. Louis, MO）を添加した。反応混合物を５分間撹拌し、水溶液中の８０μｇのナトリウム−メタ−ビスルフェート（Aldrich, Steinheim, Germany）を添加して、反応を停止した。０．０７Ｍのホウ酸緩衝液（ｐＨ９．２）中の４０μｇのＨｉｓ6−ＺHER2 AまたはＨｉｓ6−ＺHER2 Bに、該放射性標識前駆体を添加した。連続的に撹拌しながら、室温で４５分間、カップリング反応を実施した。ＰＢＳで平衡化したＮＡＰ（商標）−５サイズ排除カラム（Amersham Biosciences）を用いて、標識ＺHER2変異体を低分子量生成物から分離した。次に放射性標識ＺHER2変異体をビアコア（登録商標）技法を用いて分析して、標識処理がＨＥＲ２−ＥＣＤに対する結合親和性に影響を及ぼさなかったことを確認した。両ＺHER2変異体は親和性保持を示した（データは示されていない）。
【００８４】
細胞試験
約１００，０００個のＳＫＢＲ−３細胞を有する各培養皿に、１４ｎｇの標識Ｈｉｓ6−ＺHER2 AまたはＨｉｓ6−ＺHER2 Bを含む１ｍｌの培地を添加した。この量は、理論的なリガンド：受容体比である５：１に相当する。細胞に由来しない非特異的結合を測定するために、細胞を含有しない３つの培養皿を同一方法で処理した。この値を、全ての他の値から差し引いた。細胞結合の特異性を分析するために、３つの培養皿を、標識されたＺHER2変異体だけでなく、５００倍過剰量の標識されていないＺHER2変異体でも処理した。３７℃で３時間のインキュベーション後、放射性培地を除去し、培養皿を氷冷無血清培地で３回、迅速に洗浄した。０．５ｍｌのトリプシン／ＥＤＴＡ溶液（ＰＢＳ中０．２５％／０．０２％；Biochrom KG, Berlin, Germany）を用いて、３７℃で１５分間、細胞をトリプシン処理した。次に細胞を１ｍｌの培地中に再懸濁し、０．５ｍｌの細胞懸濁液を細胞計数のために用い、残り１ｍｌを自動ガンマーカウンターでの放射能測定のために用いた。
【００８５】
図９に示したように、Ｈｉｓ6−ＺHER2 Aは、２×１０6のＨＥＲ２受容体／細胞を発現することが知られているＳＫＢＲ−３細胞との特異的な結合を示した（「遮断なし」バー）。放射性標識Ｈｉｓ6−ＺHER2 Aの結合は、過剰量の非標識Ｈｉｓ6−ＺHER2 Aの添加により完全に遮断することができた（「遮断あり」バー）。しかしながら、ＳＫＢＲ−３細胞とのＨｉｓ6−ＺHER2 Bの結合は、おそらくはこのＺHER2変異体に関するより迅速な解離速度の結果（上記参照）として、検出限界より低かった（データは示されていない）。
【実施例３】
【００８６】
ＨＥＲ２結合ポリペプチド二量体の発現および特徴付け
ＤＮＡ構築およびタンパク質産生
ＨＥＲ２受容体に対する親和性を有する新規のＡｆｆｉｂｏｄｙリガンド（Ｈｉｓ6−ＺHER2 Aと名づけられている）の選抜を、上に記した。ＺHER2 Aポリペプチドをコードする遺伝子断片をＨｉｓ6−ＺHER2 Aのための発現ベクター中にサブクローニングすることにより、二量体ＺHER2変異体を構築した。ＤＮＡシーケンサーＡＢＩプリズム（登録商標
）３７００アナライザー（Applied Biosystems, Foster City, CA）によるＤＮＡシーケンシングにより、ＺHER2 A断片の導入を確認した。大腸菌ＲＲＩΔＭ１５菌株（Ruther, Nucleic Acids Res 10: 5765-5772 (1982)）を、クローニングを行う間、細菌宿主として用いた。その結果得られたベクターは、Ｔ７プロモーターの制御下で（Studier et al, Methods Enzymol 185: 60-89 (1990)）、Ｎ末端ヘキサヒスチジン（Ｈｉｓ6）タグと融合した二量体ＺHER2変異体（ＺHER2 A）2をコードし、これにより固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）による精製が可能になる。
【００８７】
二量体ＺHER2変異体を、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）菌株中でＨｉｓ6−タグ化融合タンパク質として発現させて、実施例１において単量体ポリペプチドに関して記載されたように、変性条件下で、タロン（Talon）金属アフィニティー樹脂（８９０１−２、BD Biosciences, CA）カラムによるＩＭＡＣ精製により回収した。メーカーのプロトコル（Amersham Biosciences）に従って、ＰＢＳ（１０ｍＭのリン酸塩、１５４ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．１））で平衡化したＰＤ−１０カラムを用い、ゲル濾過により、精製Ｈｉｓ6−（ＺHER2 A）2融合タンパク質の再生を実施した。適切な吸光係数（30440Ｍ-1ｃｍ-1）を用いて、２８０ｎｍでの吸光度測定値からタンパク質濃度を算定し、アミノ酸分析（Aminosyraanalyscentralen, Uppsala, Sweden）によっても確認した。Ｎｏｖｅｘシステム（Novex, CA, USA）を用いて、トリス−グリシン１６％均質ゲル上でのＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、精製タンパク質をさらに分析した。クマシーブリリアントブルー染色により、タンパク質帯域を可視化した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により、該タンパク質は、予測分子量（１５．６ｋＤ）の明確な帯域として観察された（図１０、挿入図のレーン２）。２８０ｎｍでの吸光度測定値からの概算により、培養細胞ｌリットルあたり約２００ｍｇの発現レベルが実証された。
【００８８】
バイオセンサー分析
リアルタイム生体特異的相互作用分析（ＢＩＡ）のために、ビアコア（登録商標）２０００機器（Biacore AB）を用いた。１０ｍＭのＮａＡｃ（ｐＨ４．５）で希釈したＨＥＲ２の組換え細胞外ドメイン（ＨＥＲ２−ＥＣＤ）を、メーカーの使用説明書に従って、アミンカップリングによりＣＭ５センサーチップ（研究等級）（ＢＲ−１０００−１４、Biacore AB）の一方のフローセル表面のカルボキシル化デキストラン層上に固定した（約２２００ＲＵ）。他方のフローセル表面を活性化及び非活性化して、参照用の表面として供した。ＺHER2試料に関しては、メーカーのプロトコル（Amersham Biosciences）に従って、ＮＡＰ（商標）−１０カラムを用いて、ゲル濾過により、緩衝液をＨＢＳ（５ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３．４ｍＭのＥＤＴＡ、０．００５％界面活性剤Ｐ２０（ｐＨ７．４））へと変更し、その後試料を濾過した（０．４５μｍ；Millipore, Billerica, MA）。結合分析を２５℃で実施し、ＨＢＳをランニングバッファーとして用いた。全てのビアコア（登録商標）分析に関して；試料は順不同に２度繰り返して流し、各回の注入の後に、１０ｍＭのＨＣｌの注入により、フローセルを復元させた。
【００８９】
第一の実験では、ＨＥＲ２−ＥＣＤとの結合における、単量体と二量体ＺHER2タンパク質（実施例１のＨｉｓ6−ＺHER2 A及びＨｉｓ6−（ＺHER2 A）2）との差を、５μｌ／分の流量でのＨＥＲ２−ＥＣＤ表面上への５μＭの各タンパク質の注入により検定した。図１０から分かるように、Ｈｉｓ6−（ＺHER2 A）2に関してより遅い解離速度（off-rate）が観察されたが、これは、ＨＥＲ−ＥＣＤとＨｉｓ6−（ＺHER2 A）2との結合が、Ｈｉｓ6−ＺHER2 Aと比較してより強力であることを示す。
【００９０】
第二の実験では、Ｈｉｓ6−（ＺHER2 A）2を動態分析に付したが、ここでは、３０μｌ／分の流量で、異なる濃度（０〜５μＭ、最小濃度として０．００４９μＭ；ＨＢＳ中に希釈）でＨＥＲ２−ＥＣＤ表面上にタンパク質を注入した。動態分析前に、アミノ酸分析によりタンパク質濃度を確定した。BIAevaluation３．２ソフトウエア（Biacore AB）を
用いて、解離平衡定数（ＫD）、会合速度定数（ｋa）および解離速度定数（ｋd）を算定し、１対１結合であると推定した。結合曲線の評価時に、解離平衡定数（ＫD）を、約３ｎＭであると確定し、会合速度定数（ｋa）を、約２．５×１０5 Ｍ-1ｓ-1及び解離速度定数（ｋd）を約７．６×１０-4 ｓ-1であると算定した。これらの値を、実施例１の単量体Ｈｉｓ6−ＺHER2 Aに関して得られた動態定数と比較して、二量体Ｈｉｓ6−（ＺHER2
A）2のより強力な結合を確認することができる。二量体構築物に関する親和性作用による、このような向上した明白な高親和性は、他のＡｆｆｉｂｏｄｙ（登録商標）分子に関してはより早期に既に実証されている（Gunneriusson E et al, Protein Eng 12: 873-878 (1999)）。
【実施例４】
【００９１】
ＳＫＯＶ−３異種移植片を有するヌードマウスにおける、（ＺHER2 A）2の生体内分布および腫瘍へのターゲッティング
本実施例を構成する実験では、実施例３のＨｉｓ6タグ化二量体（ＺHER2 A）2ポリペプチドを125Ｉで放射性標識し、ＨＥＲ２の過剰発現により特徴付けられる移植された腫瘍を保有するマウスに注入した。標識されたポリペプチドの局在化を調べるため、ペプチドを注入されたマウスの画像処理と同様に、該ポリペプチドの生体内分布の検査も実施した。Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼに対する結合親和性を有する標識されたＺドメイン誘導体を、ＨＥＲ２に対する特異性を有さない対照として用いた（ＺTaq；Gunneriusson E et al（上記参照）に記載され、その中ではＺTaq S1-1として言及されている）。
【００９２】
材料および方法
（ＺHER2 A）2の間接的放射性ヨウ素標識
２．３μｌの容量の125Ｉ（１０ＭＢｑに相当する）（Ｎａ［125Ｉ］、Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden）を、シリコン処理した微量遠心分離管に加えた。１０μｌの酢酸（水に０．１％）、５μｌのＮ−スクシンイミジルｐ−トリメチル−スタンニル−ベンゾエート（の５％酢酸メタノール中で１ｍｇ／ｍｌ）（Koziorowski J et al, Appl Radiat Isot 49: 955-959 (1998)に従って調製）、ならびに１０μｌのクロラミン−Ｔ（４ｍｇ／ｍｌ水溶液）（ＣＨ3Ｃ6Ｈ4ＳＯ2Ｎ（Ｃｌ）Ｎａ・Ｈ2Ｏ、Sigma, St Louis, MO, USA）を添加した。多少混合しながら、５分間反応させた。次に、１０μｌのメタ亜硫酸水素ナトリウム（８ｍｇ／ｍｌ水溶液）（Ｎａ2Ｓ2Ｏ5、Sigma, St Louis, MO, USA）で、反応を終わらせた。４０μｌの容量の（ＺHER2 A）2二量体（０．０７Ｍのホウ酸緩衝液（ｐＨ９．２）（ホウ酸ナトリウム（Ｎａ2Ｂ4Ｈ7・１０Ｈ2Ｏ）Sigma, St Louis, MO,
USAおよび塩酸（ＨＣｌ）Merck, Darmstadt, Germany）中、０．２５ｍｇ／ｍｌ）を、反応試験管に添加した。別の４０μｌのホウ酸緩衝液を、ｐＨを約９に上げるために、各試験管に添加した。連続振盪しながら４５分間反応させた後、メーカーのプロトコルに従って、ＰＢＳで平衡化したＮＡＰ−５サイズ排除カラム（Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden）上で、反応成分を分離した。反応試験管、素通り画分、高ＭＷ画分、低ＭＷ画分およびカラムを、標識収率を算定するために、小型γ検出器（Mini-instruments Ltd, Essex, UK）を用いて６０ｃｍ（125Ｉ）で測定した。後日使用するまで、２０℃で、シリコン処理微量遠心分離管中に高分子量画分を貯蔵した。得られた収率は、２５〜３０％であった。
【００９３】
ＺTaqの間接的放射性ヨウ素標識
［125Ｉ］−ＮａＩのストック溶液を、０．１％酢酸水溶液１０μｌ、５μｌのＮ−スクシンイミジルｐ−トリメチル−スタンニル−ベンゾエート溶液（５％酢酸メタノール中で１ｍｇ／ｍｌ）、および１０μｌのクロラミン−Ｔの水溶液（４ｍｇ／ｍｌ）と混合した。反応混合物を激しく撹拌し、振盪しながら室温で５分間、インキュベートした。１０μｌのメタ亜硫酸水素ナトリウムの水溶液（８ｍｇ／ｍｌ）で、反応を終了させた。ＰＢＳ中のＺTaq（２．４ｍｇ／ｍｌ）の溶液２１μｌを粗反応混合物に添加した。ホウ酸緩
衝液（０．１Ｍ、ｐＨ９．１５）の添加により、反応混合物のｐＨを約９に調整した。振盪しながら３０分間、室温で反応混合物をインキュベートし、溶離液としてＰＢＳを用いて、ＰＢＳ中の５％アルブミン（ウシ、分画Ｖ、Sigma, St Louis, MO, USA）で予備平衡化したＮＡＰ−５カラムを用い、高分子量画分（標識ＺTaq）および低分子量画分に分離した。得られた放射性物質の収率は、７５％〜８０％であった。具体的な放射能は、１００ｋＢｑ／μｇであった。
【００９４】
動物の準備
M & Bからの雌非近交系ｎｕ／ｎｕ ｂａｌｂマウス（到着時に１０〜１２週齢）を、Ｃ１８１／１承認下で用いた。異種移植片を該マウスに移植する前の１週間、ルドベック研究所（Uppsala, Sweden）の動物施設で、標準的な食餌、寝床および環境を用い、マウスを順応させた。マウスは食餌および飲料水を自由に摂取した。
【００９５】
第一の実験の２ヶ月前に、５×１０6個のＳＫＯＶ−３ヒト卵巣癌細胞（ＡＴＣＣ＃ＨＴＢ−７７）を３３匹のマウスの右後足に皮下注射した。このグループを「Ａ組」と名づけた。
【００９６】
第二の実験の３週間前に、１０7個のＳＫＯＶ−３細胞を３２匹のマウスの両後足に皮下注射した。このグループを「Ｂ組」と名づけた。
【００９７】
画像処理試験のために、大型の腫瘍を有する２匹のマウス（下記参照）をＡ組から取り出し、そして他の全てをＢ組から取り出した。
【００９８】
実験時までに、腫瘍は全マウスにおいて定着していたが、サイズおよび状態はかなり小さく且つ異なった（被包性および侵潤、血管新生の段階）。使用時に、全マウスの体重は２２〜２７ｇであった。
【００９９】
生体内分布実験Ｉ
Ａ組からのマウス２０匹を、各グループ４匹で５つのグループ（Ｉ〜Ｖ）に無作為に分けた。大型腫瘍を有するＡ組からの２匹は、画像処理試験に用いるために除外した。グループ、注射および屠殺の時間は、スキーム１に従った。
【０１００】
ＰＢＳ５０μｌ中の125Ｉ（１００ｋＢｑ／マウス）で間接標識した（ＺHER2 A）2 ０．５μｇをマウスの尾部に静脈注射した。ＩＩグループ（「遮断グループ」）のマウスに対しては、ＰＢＳ２００μｌ中の０．０５ｍｇの非標識（ＺHER2 A）2を皮下に予備注射した４５分後に、標識（ＺHER2 A）2を注射した。いかなる視覚的問題もないことから、全注射が良好に耐容されたと判断した。
【０１０１】
【表１】
【０１０２】
屠殺の５分前に、致死用量のケタラール／ロンプン溶液（２０μｌ／体重１ｇ、ケタラ
ール１０ｍｇ／ｍｌ（Pfizer, New York, USA）、ロンプン１ｍｇ／ｍｌ（Bayer, Leverkusen, Germany））をマウスに腹腔内注射した。希釈ヘパリン（５０００ ＩＥ／ｍｌ、Leo Pharma, Copenhagen, Denmark）で洗浄した１ｍｌ注射器を用いて、心臓穿刺により、屠殺時に血液を採取した。血液と、尿、筋肉、骨、大腸、小腸、心臓、膀胱、肺、肝臓、脾臓、膵臓、腎臓、胃、唾液腺および甲状腺、脳、腫瘍および尾の試料を解剖し、重さを測った２０ｍｌプラスチックボトル中に回収した。Ｂ組からの数匹のマウスにおける複数の腫瘍の場合、全ての腫瘍を別個のボトル中に回収した。器官および組織の試料を計量し、それらの放射能をγ計数器（３インチＮａＩ（Ｔ１）検出器を伴う自動γ計数器である１４８０ ＷａｌｌａｃＷＩＺＡＲＤ(Wallac OY, Turku, Finland)）で測定した。
【０１０３】
生体内分布実験ＩＩ
Ｂ組からのマウス２４匹を、各グループ４匹で６つのグループに無作為に分けた。大型腫瘍を有するＢ組からの８匹は、画像処理試験に用いるために選択した。グループ、注射および屠殺の時間は、スキーム２に従った。
【０１０４】
ＰＢＳ５０μｌ中の125Ｉ（１００ｋＢｑ／マウス）で間接標識した（ＺHER2 A）2 ０．５μｇを、ＩおよびグループＩＶ〜ＶＩのマウスの尾部に静脈注射した。グループIIのマウスを、同量の放射性ヨウ素標識（ＺHER2 A）2を用いて、今回は尾の皮下に注射した。グループＩＩＩのマウスの尾に、ＰＢＳ５０μｌ中の125Ｉ（１００ｋＢｑ／マウス）で間接標識したＺTaq１．０７μｇを静脈注射した。いかなる視覚的問題もないことから、全注射が良好に耐容されたと判断した。
【０１０５】
【表２】
【０１０６】
生体内分布実験Ｉに関して上記したのと同様に、屠殺および試料の採取を実施した。この第二の実験では、胴体（carcass）も回収し、その放射能含量を測定した。器官および組織の試料を計量し、それらの放射能をγ計数器で測定した。
【０１０７】
放射能の測定
125Ｉの測定に関する標準プロトコルを用いた。バックグラウンドレベルを用いて補正した計数／分を、評価のために用いた。％ＩＤ／ｇ（組織１ｇあたりの、注射された線量に対する百分率）として表される組織取込み値を、以下のように算出した。
％ＩＤ／ｇ＝［（組織の放射能／注射された放射能）／組織重量］×１００
ここで、静脈注射に関しては、
注射された放射能＝対照の注射器の平均放射能−使用した注射器の放射能−尾の放射能であり、皮下注射に関しては：
注射された放射能＝対照の注射器の平均放射能−使用した注射器の放射能
である。
【０１０８】
画像処理試験
画像処理のために、全てのグループがＡ組からの大型腫瘍を有する１匹のマウスを含むということを考慮に入れつつ、各グループ５匹で２つのグループにマウスを分けた。Ｂ組からのマウスを無作為に抽出した。２グループのマウスに、ＰＢＳ９０μｌ中の125Ｉ（２．９ＭＢｑ／マウス）で間接標識した（ＺHER2 A）2 ２．３μｇを、それぞれ画像処理の６時間または８時間前に注射した。いかなる視覚的問題もないことから、全ての注射が良好に耐容されたと判断した。
【０１０９】
放射性複合体(radioconjugate)の注射後（ｐｉ）６時間および８時間目に、マウスの全身画像処理を実施した。マウスを強制排尿させて、致死量のケタラール／ロンプンの腹腔内注射により麻酔して、頚椎脱臼により殺害した。マウス（各グループ５匹）をｅ．ＣＡＭγカメラ（Siemens, Germany）中に置いて、各時点において１０分間の画像を得た。大型腫瘍を有する２匹のマウス（各グループから１匹）を、露出時間を２０分とした、同一カメラでの特別な画像を撮るために選択した。９９％ウインドウサイズ、３５ｋｅＶエネルギーウインドウで、低エネルギー、高分解能絞りを用いて、２５６×２５６ビットマトリックスで画像を得た。Nuclear Diagnostics（Kent, UK）からのＨｅｒｍｅｓソフトウエアを用いて、画像を評価した。
【０１１０】
結果
遮断実験
腫瘍中への（ＺHER2 A）2の取込みが特異的で且つ受容体調節性であるか否かをはっきりさせるために、生体内分布実験Ｉにおける遮断実験を実施した。放射性ヨウ素標識二量体の主要静脈注射の前に、スキーム１のグループＩＩのマウスに、０．０５ｍｇの非標識（ＺHER2 A）2を皮下注射した。グループＩおよびグループＩＩにおける注射後１時間での放射能の取込みを比較した。マウスの２つのグループに関する腫瘍対血液比は、０．７２（グループＩ平均）および０．２５（グループＩＩ平均）であった（図１１）。しかしながら、取込みの差は有意でなかった（ｐ＝０．１６）。腫瘍を除く全ての器官において、放射能取込みは遮断ありおよび遮断なし、の動物の両方に関して同一であった。
【０１１１】
遮断なしマウスの場合における比較的低い腫瘍対血液比は、この実験では早い時点（注射後１時間）が選択されたことにより説明できる。
【０１１２】
取込みの特異性
生体内分布実験ＩＩにおいて、グループＩＩＩのマウスに、他のグループのマウスに注射した（ＺHER2 A）2の量に相当する量のＺTaqを注射した。（ＺHER2 A）2に関すると同一の間接的な方法を用いて、放射性ヨウ素でＺTaqを標識しておいた。ＺTaqは、ＨＥＲ２受容体に対して非特異的である。グループＩおよびグループＩＩＩにおける注射後４時間での放射能の取込みを比較した。この実験の結果（図１２）は、非特異的ＺTaq分子が特異的（ＺHER2 A）2分子より低い腫瘍取り込みを有する、ということを示した。この実験における腫瘍対血液比は、１．４３（グループＩ、特異的（ＺHER2 A）2）および０．１５（グループＩＩＩ、非特異的ＺTaq）であった。統計学的分析により、差が有意である（ｐ＝０．００９）ことが示された。他の器官すべてにおいて、放射能取込みは、両Ｚ分子に関して同一レベルであった。
【０１１３】
遮断実験と比較した場合、（ＺHER2 A）2に対する高い腫瘍対血液比が、この実験で観察された。これは、実験の時点がより遅い（注射後４時間）ためであると考えられた。
【０１１４】
生体内分布
標識された（ＺHER2 A）2を静脈注射しておいた生体内分布実験ＩおよびＩＩにおけるマウスのグループからの結果を、腫瘍を保持するマウスの器官および組織中の放射性ヨウ素の生体内分布の分析と併せた。結果を図１３〜図１６に示す。
【０１１５】
図１３および図１４を参照すると、腫瘍中の125Ｉの濃度はほとんどの正常器官中の濃度より高く、このことは、（ＺHER2 A）2ポリペプチドがＨＥＲ２を保有する腫瘍細胞を標的とすることができることを示す。正常器官および組織中の放射能濃度は、腎臓（全時点）、甲状腺（全時点）および肝臓（早期時点）を除いて、腫瘍中よりも低いことが判明した。実験は、血液および正常器官からの放射性ヨウ素の迅速なクリアランスを示した。正常器官からのクリアランスは、放射性ヨウ素の蓄積が見出された甲状腺を除いて、主に血中クリアランスに次ぐものであった。遊離ヨウ素の甲状腺取込み増大は、間接的標識法に関してさえ既知であり、ある程度まで、「非アイソトープ」すなわち非放射性ヨウ素で防止され得る（Larsen RH et al, Nucl Med Biol 25: 351-357 (1998)）。高濃度の放射性ヨウ素はマウスの腎臓においても見出されたが、これも腎臓がこのような小タンパク質および異化代謝産物のための主要排泄経路であるためと予測された。
【０１１６】
図１５Ａおよび図１５Ｂは、血中および腫瘍中の放射性ヨウ素濃度の長時間にわたる経過を示す。注射後４時間から始めると、腫瘍放射能は、血液放射能より高かった。図１５Ａに示したような実験データを用いて、血液および腫瘍中の放射性ヨウ素の半減期を、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍcｖ３．０（GraphPad Software (San Diego, USA)社製）を用いて算定した。２相の指数関数的な崩壊に関する非線形回帰をモデルとして用い、得られたグラフを図１５Ｂに示す。腫瘍に対するＴ1/2α（０．３６時間）は、血液に対するもの（０．７６時間）より短かったが、Ｔ1/2βは長かった（腫瘍では８７．５時間に対し、血液では４．３時間）が、これは得られた結果と良好に一致する。比較のために、腫瘍を保有しない正常なマウスからの生体内分布データを用いて同一モデルで算定された標識二量体に対する血液中のＴ1/2αは、０．３時間であった（データは示されていない）。
【０１１７】
放射能濃度の腫瘍対血液比（図１６）は、注射後少なくとも１２時間の間、時間に伴って増大した。この比は、放射能画像処理における主バックグラウンドが血液中の放射能からのものであるため、画像のコントラストを見積もるのに好都合な因子である。腫瘍対血液比および腫瘍の放射能濃度を考慮に入れると、注射後６時間及び８時間が画像化のための最適時点であり得る、と結論づけられた。良好なコントラストを有する画像に対しては、腫瘍対非腫瘍の放射能濃度比は、２未満であるべきである。
【０１１８】
ガンマ画像
画像処理のために選択された各々５匹から成る２グループの各々から、ガンマ画像を撮影した（それぞれ注射後６時間および８時間）。両時点での全てのマウスにおいて、鮮明な構造を有する腎臓を同定することができた。いくつかのさらなる構造（おそらくは肝臓）が、注射後６時間のマウスの画像に、腎臓に重なって、全身血液プールからのバックグラウンド増大に加えて、認められる。いくつかの動物はそれらの膀胱中に多少の尿を有したが、これも直接観察される。注射後８時間のマウスに関する画像では、頚部領域のさらなる構造が同定され得るが、これはおそらく甲状腺である。
【０１１９】
各画像セッションにおける５匹の動物から、１つの大型侵潤腫瘍（ＳＫＯＶ−３注射の第一バッチから）が視覚化された。他の腫瘍の局在化は明白ではなかった。２匹の当該動物を付加的な画像処理セッションのために選択した。結果を図１７に示す。
【０１２０】
要約
ＳＫＯＶ−３（卵巣癌細胞株）腫瘍を保有するマウスにおける、ベンゾエート基を介して放射性ヨウ素（125Ｉ）で間接的に標識された二量体ポリペプチド（ＺHER2 A）2の生体内分布は、正常マウスにおける該二量体ポリペプチドの正常な生体内分布と良好な一致を示した。125Ｉ−ベンゾエート−（ＺHER2 A）2として注射される放射性ヨウ素の腫瘍への取込みが達成された。腫瘍への取込みは、高濃度の非標識（ＺHER2 A）2分子の予備注射
を用いた遮断実験により、且つ非特異的な、標識されたＺ変異体ＺTaqの注射により示されるように、受容体介在性かつ特異的であった。得られたデータの分析により、腫瘍中の放射能濃度が注射後４時間の血中の放射能濃度より高く、且つ腎臓および甲状腺を除いて、注射後６時間における大多数の正常器官および組織中より高い、ということが示された。ＳＫＯＶ−３異種移植腫瘍を保有するマウスのガンマ画像を、注射後６および８時間で得た。良好な分解能が達成された。両時点で、大きい侵潤腫瘍を明瞭に同定できた。
【実施例５】
【０１２１】
ＳＫＯＶ−３異種移植片を保有するヌードマウスにおけるＨｉｓ6−ＺHER2 A単量体の生体内分布および腫瘍へのターゲッティング
本実施例を構成する実験では、実施例１および２の単量体ＺHER2 Aポリペプチドを125Ｉで放射性標識し、ＨＥＲ２の過剰発現により特徴付けられる移植された腫瘍を保有するマウスに注入した。該ポリペプチドの生体内分布の検査を、その局在化を調べるために実施した。
【０１２２】
材料および方法
ＺHER2 Aの間接的放射性ヨウ素標識
125Ｉで標識するために、４０μｌの単量体Ｈｉｓ6−ＺHER2 Aを、実施例４における二量体ポリペプチド構築物と同様の処理に付した。
【０１２３】
動物の準備
M & Bからの雌の非近交系ｎｕ／ｎｕ ｂａｌｂマウス（到着時、１０〜１２週齢）を、Ｃ６６／４承認下で用いた。異種移植片をマウス中に移植する前の１週間、ルドベック研究所（Uppsala, Sweden）の動物施設で、標準的な食餌、寝床および環境を用い、マウスを順応させた。マウスは食餌および飲料水を自由に摂取した。実験の３週間前に、５×１０7個のＳＫＯＶ−３ヒト卵巣癌細胞（ＡＴＣＣ＃ＨＴＢ−７７）を１６匹のマウスの右後足に皮下注射した。実験時までに、腫瘍は全てのマウスにおいて定着しており、全てのマウスの体重は２２〜２７ｇであった。
【０１２４】
放射能の測定
実施例４に記載されたように125Ｉ測定を実施し、％ＩＤ／ｇを算出した。
【０１２５】
生体内分布実験
マウス１６匹を、各グループ４匹で４つのグループ（Ｉ〜ＩＶ）に無作為に分けた。グループ、注射および屠殺の時間は、スキーム３に従った。ＰＢＳ５０μｌ中の125Ｉ（１００ｋＢｑ／マウス）で間接標識したＺHER2 A０．５μｇをマウスの尾部に静脈注射した。いかなる視覚的問題もないことから、全注射が良好に耐容されたと判断した。
【０１２６】
【表３】
【０１２７】
実施例４の第一の生体内分布試験に記載したように、マウスを屠殺し、試料を採取した。器官および組織の試料を計量し、それらの放射能をγ計数器（３インチＮａＩ（Ｔ１）検出器を伴う自動γ計数器である１４８０ＷａｌｌａｃＷＩＺＡＲＤ(Wallac OY, Turku,
Finland)）で測定した。
【０１２８】
結果
標識されたＺHER2 Aを皮下注射しておいたマウスのグループからの結果を、マウスの器官および組織中の放射性ヨウ素の分布を確証するために分析した。結果を図１８〜図２０に示す。図１８および図１９を参照すると、腫瘍中の125Ｉの濃度は、４時間および２４時間で大多数の正常器官中での濃度より高く、このことはＺHER2 AポリペプチドがＨＥＲ２を保有する腫瘍細胞を標的にすることができる、ということを示す。正常な器官および組織中の放射能濃度は、腎臓（全時点）および甲状腺（全時点）を除いて、腫瘍中よりも低いことが判明した。実験は、血液および正常器官からの放射性ヨウ素の迅速なクリアランスを示した。正常器官からのクリアランスは、放射性ヨウ素の蓄積が見出された甲状腺を除いて、大抵の場合は血中クリアランスに次ぐものであった。高濃度の放射性ヨウ素はマウスの腎臓においても見出された。図２０は、血中および腫瘍中の放射性ヨウ素濃度の長時間にわたる経過を示す。注射後４時間から始めると、腫瘍の放射能は、血液の放射能より６倍高かった。放射能濃度の腫瘍対血液比（図２１）は、注射後少なくとも８時間の間（この時点での該比の値は１０対１であった）、時間に伴って増大した。
【０１２９】
要約
ＳＫＯＶ−３（卵巣癌細胞株）腫瘍を保有するマウスにおける、ベンゾエート基を介して放射性ヨウ素（125Ｉ）で間接的に標識された単量体ポリペプチドＺHER2 Aの生体内分布は、正常マウスにおける該ポリペプチドの正常な生体内分布と良好な一致を示した。125Ｉ−ベンゾエート−ＺHER2 Aとして注射される放射性ヨウ素の腫瘍取込みが達成された。得られたデータの分析により、腫瘍中の放射能濃度が注射後４時間の血中の放射能濃度より高く、二量体の形態（ＺHER2 A）2と比較した場合、腎臓および甲状腺を除いて、注射後４時間においてすでに大多数の正常器官および組織中より高い、ということが示された。
【実施例６】
【０１３０】
ＳＫＯＶ−３異種移植片を保有するヌードマウスにおけるＡＢＤ（ＺHER2 A）2の生体内分布および腫瘍へのターゲッティング
本実施例を構成する実験では、ＡＢＤ（ＺHER2 A）2と名づけられたポリペプチドを生成するために、実施例３の二量体（ＺHER2 A）2ポリペプチドを、そのＮ末端で、連鎖球菌プロテインＧ由来の「アルブミン結合ドメイン」（ＡＢＤ）と遺伝子操作によって融合した（図２２）。ＡＢＤは、ヒトおよびマウス血清アルブミンに高い親和性で結合する（M Johansson et al, J Biol Chem 277: 8114-8120 (2002)）。アルブミンは、緩徐な血漿クリアランスを有する血中に豊富なタンパク質である。アルブミンとの高親和性の結合は、アルブミンタンパク質それ自体と同様に、該結合剤に緩徐な動態を付与する。動物における腫瘍ターゲッティングリガンドの循環時間が延長されると、理論上、腫瘍に送達される用量は増加する。これを試験するために、ＡＢＤ（ＺHER2 A）2ポリペプチドを125Ｉで放射性標識し、ＨＥＲ２過剰発現により特徴付けられる移植された腫瘍を保有するマウスに注入した。ポリペプチドの生体内分布の検査を、その局在化を調べるために実行した。
【０１３１】
材料および方法
ＤＮＡ構築およびタンパク質産生
Ｈｉｓ6−ＺHER2 Aと名づけた、ＨＥＲ２受容体に対する親和性を有する新規のＡｆｆｉｂｏｄｙリガンドの選択は、実施例１および２に記されている。ＺHER2 Aポリペプチドをコードする遺伝子断片をＨｉｓ6−ＺHER2 A用の発現ベクター中にサブクローニングすることにより構築される二量体ＺHER2変異体は、実施例３に記載された。ＡＢＤポリペプチドをコードする遺伝子断片をＨｉｓ6−ＺHER2 A用の発現ベクター中にサブクローニングし、ヘキサヒスチジンタグをＡＢＤポリペプチドで置換することにより、この二量体Ｚ
HER2 A変異体のＡＢＤ融合タンパク質を構築した。さらに、エクステンションＰＣＲを利用して、Ｃ末端システイン残基を融合タンパク質に付加した。ＤＮＡシーケンサーＡＢＩプリズム（登録商標）３７００アナライザー（Applied Biosystems, Foster City, CA）でのＤＮＡシーケンシングにより、導入されたＡＢＤ断片を確認した。大腸菌ＲＲＩΔＭ１５菌株（Ruther, Nucleic Acids Res 10: 5765-5772 (1982)）を、クローニングの間、細菌宿主として用いた。得られたベクターは、Ｔ７プロモーターの制御下で（Studier et
al, Meth Enzymol 185: 60-89 (1990)）、ＡＢＤと融合した二量体ＺHER2変異体（ＡＢＤ（ＺHER2 A）2）をコードしており、これはＣ末端がシステイン残基と融合されていることにより部位特異的な化学的修飾が可能である（図２２）。二量体ＺHER2変異体を、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）菌株中でＡＢＤとの融合体として発現させて、メーカーのプロトコル（Amersham Biosciences）に従って調製されたアルブミンセファロースアフィニティーカラム上でのアフィニティークロマトグラフィー精製により、回収した。適切な吸光係数を用いて、２８０ｎｍでの吸光度測定値からタンパク質濃度を算定した。Ｎｏｖｅｘシステム（Novex, CA, USA）を用いて、トリス−グリシン１６％均質ゲル上でのＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、精製タンパク質をさらに分析した。クマシーブリリアントブルー染色により、タンパク質帯域を可視化した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により、該タンパク質は、予測された分子量の明確な帯域として観察された。
【０１３２】
ＡＢＤ（ＺHER2 A）2の間接的放射性ヨウ素標識
125Ｉで標識するために、４０μｌのＡＢＤ（ＺHER2 A）2を、実施例４における二量体ポリペプチド構築物と同一の処理に付した。
【０１３３】
動物の準備
M & Bからの雌非近交系ｎｕ／ｎｕ ｂａｌｂマウス（到着時、１０〜１２週齢）を、Ｃ６６／４承認下で用いた。異種移植片を該マウスに移植する前の１週間、ルドベック研究所（Uppsala, Sweden）の動物施設で、標準的な食餌、寝床および環境を用い、マウスを順応させた。マウスは食餌および飲料水を自由に摂取した。実験の３週間前に、５×１０7個のＳＫＯＶ−３ヒト卵巣癌細胞（ＡＴＣＣ＃ＨＴＢ−７７）を１６匹のマウスの右後足に皮下注射した。実験時までに、腫瘍は全マウスにおいて定着しており、全マウスの体重は２２〜２７ｇであった。
【０１３４】
放射能の測定
実施例４に記載されたように、125Ｉ測定を実施し、％ＩＤ／ｇを算定した。
【０１３５】
生体分布実験
マウス１６匹を、各グループ４匹の４つのグループ（Ｉ〜ＩＶ）に無作為に分けた。グループ、注射および屠殺の時間は、スキーム４に従った。５０μｌのＰＢＳ中の125Ｉ（１００ｋＢｑ／マウス）で間接標識した０．５μｇのＡＢＤ（ＺHER2 A）2をマウスの尾部に静脈注射した。いかなる視覚的問題もないことから、全注射が良好に耐容されたと判断した。
【０１３６】
【表４】
【０１３７】
実施例４の第一の生体内分布試験に記載したように、マウスを屠殺し、試料を採取した。器官および組織の試料を計量し、それらの放射能をγ計数器（３インチＮａＩ（Ｔ１）検出器を伴う自動γ計数器である１４８０ＷａｌｌａｃＷＩＺＡＲＤ(Wallac OY, Turku,
Finland)）で測定した。
【０１３８】
結果
結果を図２３〜図２４に示す。図２３を参照すると、腫瘍中の125Ｉの濃度は、１２時間（腫瘍 ２．４％ＩＤ／ｇ）および２４時間（腫瘍 ２．２％ＩＤ／ｇ）では、ほとんどの正常器官中の濃度より高く、このことは、ＡＢＤ（ＺHER2 A）2ポリペプチドがＨＥＲ２を保有する腫瘍細胞を標的にし得る、ということを示す。正常な器官および組織中の放射能濃度は、腎臓（全時点、２４時間で３．５％ＩＤ／ｇ）、甲状腺（全時点、２４時間で５．２％ＩＤ／ｇ）および血液（全時点、２４時間で３．９％ＩＤ／ｇ）を除いて、腫瘍中よりも低いことが判明した。肺での値は、腫瘍での値とほとんど等価であるが、これは、肺中の血液含量が高いためかもしれない。実験は、血液からの放射性ヨウ素の非常に遅いクリアランスを示した。これは、ＡＢＤ（ＺHER2 A）2のＡＢＤ部分が、緩徐な動態を有する血中に豊富なタンパク質である血清アルブミンと高親和性で結合するため、予測できることである。正常器官からのクリアランスは、放射性ヨウ素の蓄積が見出された甲状腺を除いて、血中クリアランスより迅速であった。高濃度の放射性ヨウ素はマウスの腎臓においても見出された。図２４は、実施例４および５におけるＺHER2 Aの単量体および二量体構築物に関して作成された結果と比較した場合の、腫瘍中のＡＢＤ（ＺHER2 A）2に関連した放射性ヨウ素濃度の長時間にわたる経過を示す。注射後２４時間で、ＡＢＤ（ＺHER2 A）2を用いた際の腫瘍の放射活性は、単量体または二量体の場合より１３倍高かったが、これは、標的部分の体内での残留時間の延長が実際に腫瘍上での線量を増大するために利用され得る、ということを示す。このデータにより（ＺHER2 A）2部分をアルブミン結合ドメインに機能的に結合できる、ということも裏付けられる。
【０１３９】
要約
ＳＫＯＶ−３（卵巣癌細胞株）腫瘍を保有するマウスにおける、ベンゾエート基を介して放射性ヨウ素（125Ｉ）で間接的に標識された融合ポリペプチドＡＢＤ（ＺHER2 A）2の生体内分布は、予測されたアルブミン結合ポリペプチドの特性と良好な一致を示した。125Ｉ−ＡＢＤ（ＺHER2 A）2として注射された放射性ヨウ素の腫瘍への取込みが達成され、腫瘍での線量はＺHER2 Aポリペプチドの二量体または単量体バージョンでのものより高かった。得られたデータの分析により、肺、腎臓、甲状腺および血液中の放射能は依然として高かったものの、腫瘍中の放射能濃度は注射後１２時間でのほとんどの他の器官中の放射能濃度よりは高いことが示された。
【実施例７】
【０１４０】
テクネチウム標識二量体99mＴｃ−（ＺHER2 A）2の生体内分布
本実施例を構成する実験では、実施例３による二量体Ｈｉｓ6−（ＺHER2 A）2ポリペプチドを、診断用画像処理核種９９ｍ−テクネチウムで標識し、正常マウス及びＨＥＲ２過剰発現により特徴付けられる移植された腫瘍を保有するマウス中に注射した。99mテクネチウム（99mＴｃ）は、ｉｎ ｖｉｖｏ診断のための理想に近い特性を有する放射性核種である。さらにこれは安価で且つ容易に入手可能であり、このことが99mテクネチウムを、病院における医学的画像処理のための望ましい候補にしている。該ポリペプチドの生体内分布の試験を実行して、その局在化を調べた。
【０１４１】
材料および方法
Ｈｉｓ6−（ＺHER2 A）2のテクネチウム標識
Ｈｉｓ6−（ＺHER2 A）2タンパク質上のヘキサヒスチジンタグへ99mＴｃ核種を送達する市販のIsoLink（商標）キット（Mallinckrodt, Netherlands）を用いて、メーカーの使
用説明書に従って、Ｈｉｓ6−（ＺHER2 A）2ポリペプチドを標識した。IsoLink（商標）キット試薬はテクネチウム陽イオン［99mＴｃ（ＣＯ）3（Ｈ2Ｏ）3］+を生じ、これは次に、ヘキサヒスチジンタグにより安定的に配位結合されて、Ｈｉｓ6−（ＺHER2 A）2ポリペプチドのＨｉｓ6タグを特異的に標識するための手段を提供する。
【０１４２】
簡単に述べると、ウプサラ大学病院で発生器から溶離された99mＴｃストック溶液０．５〜０．６ｍｌを、水浴中で、１００℃で２０分間、IsoLink（商標）カルボニル標識剤（ＤＲＮ４３３５、Mallinckrodt）の内容物とともにインキュベートした。このようにして得られたテクネチウム陽イオン［99mＴｃ（ＣＯ）3（Ｈ2Ｏ）3］+４０μｌを、ＰＢＳ中のＨｉｓ6−（ＺHER2 A）2（１．２ｍｇ／ｍｌ）４０μｌと混合し、５０℃で１時間インキュベートした。５ｋＤの排除分子量を有するＮＡＰ−５サイズ排除カラム（Pharmacia, Uppsala）上での分離により、生成物を精製した。生成物の純度は、薄層クロマトグラフィーをすぐに行って確認したところ、９７％であった。
【０１４３】
動物の準備
M & Bからの雌非近交系ｎｕ／ｎｕ ｂａｌｂマウス（到着時、１０〜１２週齢）を、Ｃ６６／４承認下で用いた。異種移植片をマウス中に移植する前の１週間、標準的な食餌、寝床および環境を用い、ルドベック研究所（Uppsala, Sweden）の動物施設でマウスを順応させた。マウスは食餌および飲料水を自由に摂取した。実験の３週間前に、５×１０7個のＳＫＯＶ−３ヒト卵巣癌細胞（ＡＴＣＣ＃ＨＴＢ−７７）を４匹のマウスの右後足に皮下注射した。実験時までに、腫瘍は全マウスにおいて定着しており、全マウスの体重は２２〜２７ｇであった。
【０１４４】
放射能の測定
実施例４において125Ｉに関して記載したと同様に、99mＴｃの測定を実施し、％ＩＤ／ｇを算出した。
【０１４５】
生体内分布実験
４匹のマウスを有する１つのグループを実験に用いた。注射および屠殺の時間は、スキーム５に従った。５０μｌのＰＢＳ中の99mＴｃ（１００ｋＢｑ／マウス）で標識した０．５μｇのＨｉｓ6−（ＺHER2 A）2をマウスの尾部に静脈注射した。いかなる視覚的問題もないことから、全注射が良好に耐容されたと判断した。
【０１４６】
【表５】
【０１４７】
実施例４の第一の生体内分布試験に記載したように、マウスを屠殺し、試料を採取した。器官および組織の試料を計量し、それらの放射能をγ計数器（３インチＮａＩ（Ｔ１）検出器を有する自動γ計数器。１４８０ＷａｌｌａｃＷＩＺＡＲＤ、Wallac OY(Turku, Finland)で測定した。
【０１４８】
結果
結合体99mＴｃ−Ｈｉｓ6−（ＺHER2 A）2は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで高い安定性を有した（ＰＢＳ、血漿、システインおよび過剰量の遊離ヒスチジンで攻撃）。99mＴｃ−Ｈｉｓ6−（ＺHER2 A）2のｉｎ ｖｉｖｏでの生体内分布実験からの結果を、図２５〜図２７に示す。図２５を参照すると、総腫瘍線量は、125Ｉ標識された単量体構築物である125Ｉ−
ベンゾエート−ＺHER2 A（注射後８時間で１．１％ＩＤ／ｇ）または二量体構築物である125Ｉ−ベンゾエート−（ＺHER2 A）2（注射後８時間で１．０６％ＩＤ／ｇ）と比較した場合、99mＴｃ−Ｈｉｓ6−（ＺHER2 A）2（注射後８時間で、３．３％ＩＤ／ｇ）を用いた場合は３倍高かった。99mＴｃは、125Ｉより良好な残留性物質であるということが既知であり、これは、99mＴｃでは送達された用量が残存する一方、ヨウ素では用量は代謝され、腫瘍細胞から放出されることを意味する。図２６を参照すると、腫瘍中の99mＴｃの濃度は、注射後８時間においてはほとんどの正常器官より高かった（腫瘍 ３．３％ＩＤ／ｇ）が、これは、99mＴｃ−Ｈｉｓ6−（ＺHER2 A）2ポリペプチドがＨＥＲ２を保有する腫瘍細胞を標的にし得る、ということを示す。正常器官および組織中の放射能濃度は、腎臓（８時間で２７％ＩＤ／ｇ、腫瘍線量の３６倍）および肝臓（８時間で１１．４％ＩＤ／ｇ、腫瘍線量の３倍）を除いて、腫瘍中よりも低いことが判明した（図２７）。99mＴｃ−Ｈｉｓ6−（ＺHER2 A）2は腎臓を介して除去されるため、腎臓での高い値が予測された。腎臓中の高レベルのトレーサーは毒性の問題を示さないが、これは、注射された総線量は診断目的であって非常に低いからである。甲状腺中の放射能の量は、予測どおり、125Ｉを用いた場合（実施例４）ほど高いことは全くなかった（８時間で１％ＩＤ／ｇ）。正常器官からのクリアランスは、１時間をピークとする99mテクネチウムの蓄積が観察された腎臓を除き、主として血中クリアランスに次ぐものであった。レベルはその後低下し、１時間の間（注射後２時間まで）に急速排除期、その後、緩徐排除期が続き、２４時間後においても腎臓中には依然としてかなりの線量（７０％ＩＤ／ｇ）が認められた。
【０１４９】
注射後８時間での該テクネチウム結合体に関する腫瘍対血液比は４であり、総腫瘍線量は３．３％ＩＤ／ｇであった。これは、99mテクネチウムがｉｎ ｖｉｖｏ診断用途に用いられ得る、ということを示した。比較としては、同じ時点で、125Ｉ−ベンゾエート−（ＺHER2 A）2および125Ｉ−ベンゾエート−ＺHER2 Aの腫瘍線量は約１％であったが、腫瘍対血液比は約１１であった。
【０１５０】
要約
ＳＫＯＶ−３（卵巣癌細胞株）腫瘍を保有するマウスにおける、99mＴｃ標識ポリペプチド99mＴｃ−Ｈｉｓ6−（ＺHER2 A）2の生体内分布は、医療用画像処理目的にとって相対的に良好な分布特性を示した。99mＴｃ−Ｈｉｓ6−（ＺHER2 A）2として注射されたテクネチウムの腫瘍への取込みが達成され、腫瘍での線量は、ＺHER2 Aポリペプチドの125Ｉ標識二量体または単量体バージョンに対するものより高かった。得られたデータの分析により、腫瘍中の放射能濃度は、実質的に腫瘍より高い取込みが肝臓および腎臓で認められるものの、注射後８時間ではほとんどの他の器官および血液中の放射能濃度よりは高いことが示された。
【実施例８】
【０１５１】
211Ａｔを用いたｉｎ ｖｉｔｒｏ標識および特徴付け
本実施例を構成する実験においては、実施例３による二量体Ｈｉｓ6−（ＺHER2 A）2ポリペプチドを、125Ｉを用いた標識に関して上記したと同様の化学的手法を用いて、治療用放射性核種である211アスタチン（211Ａｔ）で標識した。放射性核種の腫瘍へのターゲッティングの一目的は、放射線療法である。これは、標的細胞を根絶することができる高エネルギー粒子、例えばα粒子および高エネルギーβ粒子を放射する核種を要する。α放出放射性ハロゲン211Ａｔ（Ｔ1/2＝７．２時間）は、ごく少数の細胞の直径程度の飛程（range）を有しており、これは、細胞の根絶が高精度で起こり得ることを意味する。211Ａｔ標識ポリペプチドのｉｎ ｖｉｔｒｏでの殺細胞能力の試験を実行した。
【０１５２】
材料および方法
２日前に、ＨＥＲ２過剰発現により特徴付けられる１００，０００個のＳＫＢＲ−３細胞を、３ｃｍ培養皿に植え付けた。６０μｇのＨｉｓ6−（ＺHER2 A）2ポリペプチドを、
コペンハーゲン大学病院のＳｃａｎｄｉｔｒｏｎｉｘＭＣ３２サイクロトロン中で生成した211Ａｔで標識して、Jorgen Carlsson（ウプサラ大学(Uppsala, Sweden)）の研究室で精製した。約１：１および５：１モル比の211Ａｔ−（ＺHER2 A）2分子／細胞受容体を、３つの培養皿の各々に添加した。さらに３つの別の培養皿には、５：１濃度の211Ａｔ−（ＺHER2 A）2に加えて、結合部位を遮断することにより非特異的な放射の影響を概算することを目的として、５００倍過剰量の非標識Ｈｉｓ6−（ＺHER2 A）2を供給した。細胞を、３７℃で２４時間、211Ａｔ−（ＺHER2 A）2とともにインキュベートした。２４時間のインキュベーション後、全細胞を洗浄し、新しい新鮮な培地を補給した。次に、約２ヶ月間、週に１回、それらの増殖をモニタリングした。
【０１５３】
並行して、上記の細胞殺滅検定に用いたのと同一方法で調製した一組の培養皿に、同じ211Ａｔ−（ＺHER2 A）2溶液を供給した。培養皿中の全グループに関する取込み曲線を確立するために、これらの細胞を異なる時点で採取し、細胞数を計数し、放射能含量を測定した。これらの曲線を用いて、細胞殺滅実験で用いた２４時間に亘る、細胞当たりの崩壊量を算出した。
【０１５４】
結果
ＨＥＲ−２を過剰発現するヒト乳癌細胞株ＳＫＢＲ−３からの細胞を、２つの異なる用量の211Ａｔ−（ＺHER2 A）2に２４時間曝露した。第一の用量では、添加した211Ａｔ−（ＺHER2 A）2分子は、細胞上のＨＥＲ２標的受容体の数と等しかった。第二の用量では、211Ａｔ−標識分子を５倍過剰量で添加した。２４時間のインキュベーション後、週に1回、２ヶ月にわたって細胞をモニタリング、計数し、生存画分を確定した。図２８で観察されるように、応答は、投与された用量に関連した。等モル量の211Ａｔ−（ＺHER2 A）2を投与された細胞は、放射能がターゲッティング剤を伴わずに添加される対照と比較して、いかなる特異的な増殖の遅延も示さなかった。非特異的な放射線傷害により短期間の増殖遅延が認められたが、しかし細胞は増殖を停止しなかった。これに対比して、211Ａｔ−（ＺHER2 A）2を５倍過剰量で添加した場合、細胞増殖の抑制は目覚ましいものであった。実験終了時、高用量投与グループは未だ正常な状態に回復していなかったが、一方、低用量および対照グループは１０6倍に増殖していた。生存細胞が実験前とほぼ同一の増殖率を照射後にも維持していると考えると、５：１グループ中の全細胞が根絶されたことになる。取込み曲線は、遮断処理された５：１グループも、おそらくは遮断が不十分であったために、細胞に対してかなりの量の照射を受けていた、ということを明示した。細胞あたりの崩壊数（ＤＰＣ）を、統合した取込み曲線から概算した。増殖曲線から、指数増殖曲線の勾配として倍加時間を算出し、かつ、遅延した増殖の曝露時間への外挿により、生存画分を算定した。第1表に結果を示す。
【０１５５】
【表６】
【０１５６】
要約
211Ａｔ−（ＺHER2 A）2は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＨＥＲ２過剰発現ＳＫＢＲ−３細胞との特異的な結合を示した。誘導された細胞死は、蓄積された線量と良好に相関した。１００未満の崩壊数／細胞は、単一の細胞を殺傷して完全に細胞を根絶するのに十分であることを示した。
【実施例９】
【０１５７】
付加的なＨＥＲ２結合ポリペプチドの同定および特徴付け
実施例１に記載した選択から得られるＨＥＲ２結合Ｚ変異体の親和性を増大させるために、第二のライブラリーの構築（Gunneriusson et al, Protein Eng 12: 873-878 (1999); Nord et al, Eur J Biochem 268: 4269-77 (2001)）と、その後のＨＥＲ２に対する再選択とを包含する親和性の成熟戦略を適用した。第一世代のポリペプチド変異体ＺHER2 A、B、CおよびDのアラインメントは、第１３位、１４位、２８位、３２位および３５位での同一性とは別に、ＺHER2 AおよびＺHER2 B間に、第１０位におけるＲおよびＫへの、そして第１１位におけるＱおよびＴへの集中（convergence）が認められる、ということを示した。したがって第二世代のライブラリーは、５つの固定された位置、すなわち第１３位、１４位、２８位、３２位および３５位、ならびに２つの部分的に固定された位置、すなわち第１０位（縮重コドンとしてｃｇｃ／ａａａ）および第１１位（縮重コドンとしてｃａａ／ａｃｃ）を含有する一方、残りの第９位、１７位、１８位、２４位、２５位および２７位は、ＮＮＧ／Ｔ縮重コドンを用いて再び無作為化された。形質転換後、３×１０8クローンのライブラリーを得た。標的としてヒトＨＥＲ２（ＨＥＲ２−ＥＣＤ）のビオチニル化細胞外ドメイン（組換えヒトＨＥＲ２細胞外ドメイン、アミノ酸２３８〜２１０９、Fox Chase Cancer Center, Philadelphia, USAによる提供）を用い、その濃度を低下させながら、抗原結合分子に対して５回の選択を施した。
【０１５８】
それぞれ４回および５回目に得られた８０および２６０コロニーのクローンを、それらのＨＥＲ２結合活性の分析を実施するために選別した。
【０１５９】
ＨＥＲ２結合の分析のためのＡＢＡＳ ＥＬＩＳＡ
４回および５回の選択から無作為に選択されるクローンを、９６ウエルプレート（Nunc）中で生成させた。ＡＢＡＳ ＥＬＩＳＡと呼ばれるＥＬＩＳＡスクリーニング手法を用いて、高親和性ＨＥＲ２結合Ｚ変異体を同定した。単一コロニーを、深穴９６ウエルプレート中で１ｍＭのＩＰＴＧおよび１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを補充した１ｍｌのＴＳＢ−ＹＥ培地（３０．０ｇのトリプシンダイズブロス（Merck）および５．０ｇの酵母抽出物（Merck）、水で最終容積を１ｌとする）に接種し、３７℃で一晩、振盪器上で増殖させた。３，０００ｇで１０分間の遠心分離により細胞をペレット化した。ペレットを３００μｌのＰＢＳ−Ｔ中に再懸濁し、−８０℃で少なくとも３０分間凍結させた。プレートをぬるま湯中で解凍し、３，５００ｇで２０分間遠心分離した。１００μｌの上清を微量滴定ウエル（＃９０１８ Ｃｏｓｔａｒ（登録商標））に入れて、これを４℃で一晩、１５ｍＭのＮａ2ＣＯ3および３５ｍＭのＮａＨＣＯ3（ｐＨ９．６）中の６μｇ／ｍｌのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）と共にインキュベートし、室温で１時間、ＰＢＳ−Ｔ中の２％粉末スキムミルクでブロッキングしておいた。プレートを４回洗浄した後、１μｇ／ｍｌのビオチニル化ＨＥＲ２／ウエル１００μｌを添加し、１．５時間インキュベートした。ウエルを４回洗浄した後、ストレプトアビジン−ＨＲＰ（１：５，０００）（＃Ｐ０３９７ Ｄａｋｏ）を添加し、１時間インキュベートした。ウエルを４回洗浄し、最終洗浄後、１００μｌの展開溶液（ＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ）ＴＭＢ（＃３４０２１ Ｐｉｅｒｃｅ）を各ウエルに添加した。２０〜３０分後、１００μｌの停止溶液（２ＭのＨ2ＳＯ4）を、各ウエルに添加した。４５０ｎｍでの吸光度をＥＬＩＳＡ読取器（Tecan）で測定した。ＡＢＡＳ ＥＬＩＳＡからの結果を図２９に示す。図２９Ａおよび図２９ＢのグラフのＸ軸は、該９６ウエルプレートのウエルの番号に対応する。したがって図２９Ａは第一の９６ウエルプレートに関するＥＬＩＳＡ結果を示し、一方、図２９Ｂは第二のプレートに関する結果を示す。
【０１６０】
ＤＮＡ配列分析
ＡＢＡＳ−ＥＬＩＳＡで分析したＺHER2変異体をコードするＤＮＡのシーケンシングを
、ビオチニル化オリゴヌクレオチドＡＦＦＩ−７２（５’−ビオチン−ＣＧＧＡＡＣＣＡＧＡＧＣＣＡＣＣＡＣＣＧＧ）を用いて、製造者の推奨に従って、ＡＢＩプリズム（登録商標）、ｄＧＴＰ、ビッグダイ（商標）ターミネーターｖ３．０レディリアクションサイクルシーケンシングキット（Applied Biosystems）を用いて実施した。ＡＢＩプリズム（登録商標）３１００遺伝子分析器（Applied Biosystems）で、配列を分析した。配列分析は、１３０の独特の配列を生じた。ネガティブ対照の値より少なくとも２倍高い吸光度値により立証されるような、ＡＢＡＳ ＥＬＩＳＡ実験で結合を示したＺHER2変異体かに由来する配列は図１に示されており、配列番号６〜７６として配列表で同定される。これらのＨＥＲ２結合Ｚ変異体の命名法は、以下の通りである。ＥＬＩＳＡ実験の第一のプレートから単離された変異体（図２９Ａ）は、ＺHER2:1NNと呼ばれ、この場合、ＮＮはその特定のポリペプチド変異体が分析された第一のプレート中のウエルの番号に対応する。ＥＬＩＳＡ実験の第二のプレートから単離された変異体（図２９Ｂ）は、ＺHER2:2NNと呼ばれ、この場合、ＮＮはその特定のポリペプチド変異体が分析された第二のプレート中のウエルの番号に対応する。
【０１６１】
クローニングおよびタンパク質産生
図３０で模式的に示されている構築物をコードする発現ベクターを用いて、大腸菌細胞中で、選定したＨＥＲ２結合ポリペプチドを発現させた。Ｎ末端ヘキサヒスチジルタグとの融合体として、該ポリペプチドを生成させた。Ｈｉｓ6−タグ化ポリペプチドＺHER2:101、ＺHER2:107、ＺHER2:149、ＺHER2:202、ＺHER2:205、ＺHER2:207、ＺHER2:209、ＺHER2:222、ＺHER2:225およびＺHER2:229、ならびにＺHER2 Aを、変性条件下で、ＢｉｏＲｏｂｏｔ３０００（Qiagen）およびＮＩ−ＮＴＡ Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ９６ＢｉｏＲｏｂｏｔ手法を用いて精製した。精製されたＨｉｓ6−タグ化タンパク質を、ＰＢＳ（２．６８ｍＭのＫＣｌ、１３７ｍＭのＮａＣｌ、１．４７ｍＭのＫＨ2ＰＯ4、８．１ｍＭのＮａ2ＨＰＯ4、ｐＨ７．４）中で透析した。試料のタンパク質濃度を、２８０ｎｍでの測定吸光度値およびそれぞれのタンパク質の理論的吸光係数から算出した。
【０１６２】
Ｈｉｓ6−タグ化ＺHER2変異体のバイオセンサー分析
前節により産生されたＨｉｓタグ化ＺHER2変異体とＨＥＲ２との間の相互作用を、ビアコア（登録商標）２０００システム（Biacore AB, Uppsala, Sweden）での表面プラズモン共鳴を用いて分析した。ヒトＨＥＲ２およびＩｇＧ（免疫グロブリンＧ）を、製造者の推奨に従って、ＣＭ−５チップの表面のカルボキシル化デキストラン層上へのアミンカップリングにより、別個のフローセル中に固定した。ヒトＨＥＲ２およびＩｇＧの固定化は、それぞれ４，６００および５，１００共鳴単位（ＲＵ）を生じた。第三のフローセル表面を活性化し、及び注入の間のブランクとして用いるために不活性化した。融合ポリペプチドＺHER2:101、ＺHER2:107、ＺHER2:149、ＺHER2:202、ＺHER2:205、ＺHER2:207、ＺHER2:209、ＺHER2:222、ＺHER2:225およびＺHER2:229を、１×ＨＢＳ−ＥＰ（５ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３．４ｍＭのＥＤＴＡ、０．００５％界面活性剤Ｐ−２０、ｐＨ７．４）により希釈して、最終濃度を５０ｎＭとし、１０μｌ／分の一定流量で注入した。総注入時間は２分（会合）で、その後３分間洗浄した（解離）。表面を、２５ｍＭのＨＣｌの２回の注入により再生した（３０秒／注入）。参照細胞中で測定された応答（活性化／不活性化表面）を、固定化されたＨＥＲ２を有する細胞中で測定された応答から差し引いた。ＨＥＲ２と相互作用する精製タンパク質の能力を、図３１のセンサグラムにより例示されるように、確認した。
【実施例１０】
【０１６３】
付加的なＨＥＲ２結合ポリペプチドの同定および特徴付け
実施例１に記載した選択の３回目および４回目に得られるクローンの包括的な配列分析を実施した。製造者の推奨に従って、ＡＢＩプリズム（登録商標）、ｄＧＴＰ、ビッグダイ（商標）ターミネーターｖ３．０レディリアクションサイクルシーケンシングキット（
Applied Biosystems）を、そしてＡＢＩプリズム（登録商標）３１００遺伝子分析器（Applied Biosystems）を用いて、ＤＮＡをシーケンシングした。ビオチニル化オリゴヌクレオチドＡＦＦＩ−７２（５’−ビオチン−ＣＧＧＡＡＣＣＡＧＡＧＣＣＡＣＣＡＣＣＧＧ）を、プライマーとして用いた。配列分析は、１１の新規のポリペプチド配列、即ち実施例１に記載した試験において見出されなかったクローンを明示した。
【０１６４】
図３０に模式的に例示される構築物をコードする発現ベクターを用いて、大腸菌細胞中でこれらのＺ変異体を発現させることを決定した。その結果、Ｎ末端ヘキサヒスチジルタグとの融合体として、ポリペプチドが生成された。変性条件下で、ＢｉｏＲｏｂｏｔ ３０００（Qiagen）およびＮＩ−ＮＴＡ Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ９６ＢｉｏＲｏｂｏｔ手法を用いて、固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）により、該ポリペプチドを精製した。溶離したタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分析した。精製Ｈｉｓ6−タグ化タンパク質の緩衝液を、製造者の推奨に従って、ＰＤ−１０カラム（Amersham Biosciences）を用いて、５ｍＭのＮＨ4Ａｃに交換した。その後、タンパク質を凍結乾燥し、ＨＢＳ−ＥＰ（５ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３．４ｍＭのＥＤＴＡ、０．００５％界面活性剤Ｐ−２０、ｐＨ７．４）中に溶解した。試料のタンパク質濃度を、２８０ｎｍでの測定吸光度値、ならびにそれぞれのタンパク質の理論的吸光係数から算定した。
【０１６５】
Ｈｉｓ6−タグ化ＺHER2変異体のバイオセンサー分析
Ｈｉｓ6タグ化ＺHER2変異体とＨＥＲ２との間の結合活性を、ビアコア（登録商標）２０００（Biacore AB, Uppsala, Sweden）を用いて分析した。ヒトＨＥＲ２およびＨＩＶ−１ｇｐ１２０（Protein Sciences Corporation、＃２００３−ＭＮ）を、製造者の推奨に従って、ＣＭ−５チップの表面のカルボキシル化デキストラン層上へのアミンカップリングにより、別個のフローセル中に固定した。ヒトＨＥＲ２およびＨＩＶ−１ｇｐ１２０の固定化は、それぞれ２６３１および３１３８共鳴単位（ＲＵ）を生じた。第三のフローセル表面を活性化し、及び注入を行う間のブランクとして用いるために不活性化した。ＺHER2変異体を、１×ＨＢＳ−ＥＰ（５ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３．４ｍＭのＥＤＴＡ、０．００５％界面活性剤Ｐ−２０、ｐＨ７．４）中に希釈して、最終濃度を１μＭとし、１０μｌ／分の一定流量で注入した。総注入時間は１分（会合）で、その後３分間洗浄した（解離）。表面を、１０ｍＭのＨＣｌの３０秒間の注入により再生した。参照細胞中で測定された応答（活性化／不活性化表面）を、固定化ＨＥＲ２を有する細胞中で測定された応答から差し引いた。３つの精製タンパク質ＺHER2:3035、ＺHER2:0434およびＺHER2:0024*は、図３２のセンサグラムにより例示されるように、ＨＥＲ２と特異的に結合した。これらのＺHER2変異体の配列は図１に示されており、配列番号７７〜７９として配列表で同定される。
【図面の簡単な説明】
【０１６６】
【図１−１】配列表に示された配列のアラインメントを示す。本発明のポリペプチドＺHER2（配列番号２〜７９で表す）中の修飾を施されたアミノ酸の位置は、太字で示される。
【図１−２】配列表に示された配列のアラインメントを示す。本発明のポリペプチドＺHER2（配列番号２〜７９で表す）中の修飾を施されたアミノ酸の位置は、太字で示される。
【図１−３】配列表に示された配列のアラインメントを示す。本発明のポリペプチドＺHER2（配列番号２〜７９で表す）中の修飾を施されたアミノ酸の位置は、太字で示される。
【図２】実施例１で産生される融合ポリペプチドのアミノ酸配列の模式図である。ＺHER2は、配列番号２〜３から選択される配列を有するＨＥＲ２結合ドメインを表し、Ｈｉｓ6はヘキサヒスチジルタグを表す。
【図３】精製された融合タンパク質のゲル電気泳動の結果を示す。レーン１：Ｈｉｓ6−ＺHER2 A（８．７ｋＤａ）；レーン２：Ｈｉｓ6−ＺHER2 B（８．７ｋＤａ）；Ｍ：分子量マーカー（ＬＭＷ−ＳＤＳマーカーキット、Amersham Biosciences ＃１７−０４４６−０１）。
【図４】Ｈｉｓ6−ＺHER2 A融合タンパク質１０μＭを、Ａ：ＨＥＲ２、Ｂ：ＨＩＶ−１ｇｐ１２０、およびＣ：ＢＢ、が固定されたセンサーチップ表面に対して注入した後に得られた、ビアコア（登録商標）センサグラムを示す。
【図５】Ｈｉｓ6−ＺHER2 B融合タンパク質１０μＭを、Ａ：ＨＥＲ２、Ｂ：ＨＩＶ−１ｇｐ１２０、およびＣ：ＢＢ、が固定されたセンサーチップ表面に対して注入した後に得られた、ビアコア（登録商標）センサグラムを示す。
【図６】ＨＥＲ２が固定されたセンサーチップ表面に対し、Ｈｉｓ6−ＺHER2 A融合タンパク質を、Ａ：１μＭ；Ｂ：２μＭ；Ｃ：５μＭ；Ｄ：１０μＭ；Ｅ：２０μＭ；Ｆ：４０μＭ、注入した後に得られたビアコア（登録商標）センサグラムを示す。
【図７】ＨＥＲ２が固定されたセンサーチップ表面に対し、Ｈｉｓ6−ＺHER2 B融合タンパク質を、Ａ：１μＭ；Ｂ：２μＭ；Ｃ：５μＭ；Ｄ：１０μＭ；Ｅ：２０μＭ；Ｆ：４０μＭ、注入した後に得られたビアコア（登録商標）センサグラムを示す。
【図８Ａ】Ｈｉｓ6−ＺHER2 Aを、以下の選定した濃度：３１２．５ｎＭ（黒菱形）、１５６．３ｎＭ（黒丸）、７８．２ｎＭ（黒三角）、３９．１ｎＭ（白四角）、１９．６ｎＭ（白菱形）および９．８ｎＭ（白丸）で、ＨＥＲ２−ＥＣＤフローセル表面に対して注入した後に得られたビアコア（登録商標）センサグラムを示す。
【図８Ｂ】Ｈｉｓ6−ＺHER2 Bを、以下の選定した濃度：６２５ｎＭ（黒四角）、３１２．５ｎＭ（黒菱形）、１５６．３ｎＭ（黒丸）、７８．２ｎＭ（黒三角）、３９．１ｎＭ（白四角）および１９．６ｎＭ（白菱形）で、ＨＥＲ２−ＥＣＤフローセル表面に対して注入した後に得られたビアコア（登録商標）センサグラムを示す。
【図９】Ｈｉｓ6−ＺHER2 Aの、ＳＫＢＲ−３細胞への結合特異性を示す。125Ｉ標識Ｈｉｓ6−ＺHER2 AはＳＫＢＲ−３細胞と、理論的には５：１のリガンド：ＨＥＲ２受容体比で結合できると見積もられた。値は３つの測定値の平均である。誤差バーは標準偏差を表す。
【図１０】アミン結合ＨＥＲ２−ＥＣＤを含有するセンサーチップフローセル表面に対し、精製Ｈｉｓ6−ＺHER2 A（中白四角）およびＨｉｓ6−（ＺHER2 A）2（中黒四角）を注入した後に得られたビアコア（登録商標）センサグラムを示す。曲線のｙ値を、０〜１００の共鳴単位間に標準化した。挿入されているＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（トリス−グリシン１６％均質ゲル、還元条件）像は、発現させてＩＭＡＣで精製したＨｉｓ6−ＺHER2 A（レーン１）およびＨｉｓ6−（ＺHER2 A）2（レーン２）を示す。レーンＭ：分子量（キロダルトン）を有するマーカータンパク質。
【図１１】125Ｉ−ベンゾエート−（ＺHER2 A）2注射１時間後の腫瘍保有ヌードマウスにおける放射能の生体内分布の比較を示す。遮断あり：非標識（ＺHER2 A）2を予備注射されたマウスに関するデータ。遮断なし：予備注射なしのマウスに関するデータ。
【図１２】125Ｉ−ベンゾエート−（ＺHER2 A）2（Ｚ４二量体）または125Ｉ−ベンゾエート−ＺTaq（Ｚ Ｔａｑ４：５）注射４時間後の腫瘍保有ヌードマウスにおける放射能の生体内分布の比較を示す。
【図１３】125Ｉ−ベンゾエート−（ＺHER2 A）2注射後の種々の時間での腫瘍保有ヌードマウスにおける放射能の生体内分布を示す。２つの生体内分布実験からのデータを組合せて示す。注射後４時間に関するデータは、両実験からの平均である。
【図１４】125Ｉ−ベンゾエート−（ＺHER2 A）2注射８時間後の腫瘍保有ヌードマウスにおける放射能の生体内分布を示す。
【図１５】血液および腫瘍中の放射能濃度の比較を示す。２つの生体内分布実験からのデータを組合せて示す。Ａ：実験データ。Ｂ：２相指数関数的崩壊モデルによる非線形回帰を用いてフィッティングした曲線。
【図１６】放射能濃度の腫瘍対血液比を示す。２つの生体内分布実験からのデータを組合せて示す。
【図１７】125Ｉ−ベンゾエート−（ＺHER2 A）2結合体の尾部静脈注射後６時間（左マウス）および８時間（右マウス）における、腫瘍保有マウス（ＳＫＯＶ−３）の全身γカメラ画像である。
【図１８】125Ｉ−ベンゾエート−ＺHER2 A注射４時間後の腫瘍保有ヌードマウスにおける放射能の生体内分布を示す。
【図１９】125Ｉ−ベンゾエート−ＺHER2 A注射２４時間後の腫瘍保有ヌードマウスにおける放射能の生体内分布を示す。
【図２０】125Ｉ−ベンゾエート−ＺHER2 A注射後の種々の時間における腫瘍保有ヌードマウスの腫瘍および血液中の放射性ヨウ素の動態を示す。
【図２１】125Ｉ−ベンゾエート−ＺHER2 A注射後の放射能の腫瘍対血液比を示す。
【図２２】実施例６で産生される融合ポリペプチドのアミノ酸配列の模式図である。ＺHER2 Aは、配列番号２で示される配列を有するＨＥＲ２結合ドメインを表し、ＡＢＤは連鎖球菌プロテインＧに由来するアルブミン結合ドメインを表す。
【図２３】125Ｉ−ベンゾエート−ＡＢＤ（ＺHER2 A）2の注射後１２時間（灰色）および２４時間（白色）の腫瘍保有ヌードマウスにおける放射能の生体内分布を示す。
【図２４】（Ａ）：125Ｉ−ＡＢＤ（ＺHER2 A）2、（Ｂ）：125Ｉ−（ＺHER2 A）2、および（Ｃ）：125Ｉ−ＺHER2 A、注射後の種々の時点での腫瘍保有ヌードマウスの腫瘍中の放射性ヨウ素の動態を示す。
【図２５】125Ｉ−ベンゾエート−ＺHER2 A、125Ｉ−ベンゾエート−（ＺHER2 A）2、および99mＴｃ−（ＺHER2 A）2の送達された用量の比較を示す。
【図２６】99mＴｃ−（ＺHER2 A）2注射８時間後の腫瘍保有ヌードマウスにおける放射能の生体内分布を示す。
【図２７】99mＴｃ−（ＺHER2 A）2注射８時間後の腫瘍保有ヌードマウスにおける選択した器官中の放射能の比較を示す。
【図２８】211Ａｔ−（ＺHER2 A）2に２４時間曝露した後のＳＫＢＲ−３細胞の増殖を示すグラフである。曲線Ａの黒丸は、曝露なしの細胞を示し、曲線Ｂの白四角は、中程度に曝露された細胞を示し、曲線Ｄの灰色四角は、高レベルの211Ａｔ−（ＺHER2 A）2に曝露された細胞を示す。曲線Ｃの灰色三角は、５００倍過剰量の非標識Ｈｉｓ6−（ＺHER2 A）2と組合せて高レベルの211Ａｔ−（ＺHER2 A）2に曝露された細胞を示す。値は３つの実験の平均であり、誤差バーは標準偏差を表す。
【図２９】Ａ及びＢは、４回目および５回目の親和性の成熟の選択から採取したクローンの結合活性を確定するための、ＡＢＡＳ ＥＬＩＳＡからの結果を示す。
【図３０】実施例９および１０で産生される融合ポリペプチドのアミノ酸配列の模式図である。ＺHER2は、本発明の第一の態様のＨＥＲ２結合ポリペプチドを表し、Ｈｉｓ6はヘキサヒスチジルタグを表す。
【図３１】概算で５０ｎＭの濃度でＨＥＲ２被覆表面に注入した場合の、本発明の１０の親和性の成熟したＨＥＲ２結合ポリペプチドから得られたセンサグラムのオーバーレイしたプロットである。Ａ：ＺHER2:205；Ｂ：ＺHER2:149；Ｃ：ＺHER2:202；Ｄ：ＺHER2 A；Ｅ：ＺHER2:222；Ｆ：ＺHER2:225；Ｇ：ＺHER2:209；Ｈ：ＺHER2:229；Ｉ：ＺHER2:207；Ｊ：ＺHER2:107；Ｋ：ＺHER2:101。ここで留意すべきは、第一世代ライブラリーを用いた選択から単離されたＺHER2 Aを試験に付加した、ということである。
【図３２】特異的なＨＥＲ２結合活性を有するＺHER2変異体の結合分析結果を示す。図中に示されているＨＥＲ２またはＨＩＶ−１ｇｐ１２０を含有するセンサーチップ表面に対し、（Ａ）ＺHER2:3053（Ｂ）ＺHER2:0434（Ｃ）ＺHER2:0024*を注入することにより得られたオーバーレイ・センサグラムである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＥＲ２に対する結合親和性を有し、かつブドウ球菌のプロテインＡ（ＳＰＡ）のドメインに関連するポリペプチドであって、該ポリペプチドの配列は１〜約２０の置換変異を有する前記ＳＰＡドメインの配列に相当する、ポリペプチド。
【請求項２】
ＨＥＲ２に対する結合親和性を有し、相互作用のＫD値が最大で１×１０-6Ｍであることを特徴とする、請求項１記載のポリペプチド。
【請求項３】
ＨＥＲ２に対する結合親和性を有し、相互作用のＫD値が最大で１×１０-7Ｍであることを特徴とする、請求項２記載のポリペプチド。
【請求項４】
配列番号１に示されるＳＰＡプロテインＺの配列において１〜約２０の置換変異を含む配列に相当する配列であることを特徴とする、請求項１〜３いずれか一項記載のポリペプチド。
【請求項５】
４〜約２０の置換変異を含む、請求項４記載のポリペプチド。
【請求項６】
第１３位、第１４位、第２８位、第３２位および第３５位のうちの１以上の位置における置換変異を含む、請求項４又は５記載のポリペプチド。
【請求項７】
第９位、第１０位、第１１位、第１７位、第１８位、第２４位、第２５位および第２７位のうちの１以上の位置における置換変異をさらに含む、請求項６記載のポリペプチド。
【請求項８】
第１３位におけるフェニルアラニンからチロシンへの置換変異を含む、請求項４〜７いずれか一項記載のポリペプチド。
【請求項９】
第１４位におけるチロシンからトリプトファンへの置換変異を含む、請求項４〜８いずれか一項記載のポリペプチド。
【請求項１０】
第２８位における、アスパラギンから、アルギニンおよびヒスチジンから選択されるアミノ酸残基への置換変異を含む、請求項４〜９いずれか一項記載のポリペプチド。
【請求項１１】
第２８位におけるアスパラギンからアルギニンへの置換変異を含む、請求項４〜１０いずれか一項記載のポリペプチド。
【請求項１２】
第３２位におけるグルタミンからアルギニンへの置換変異を含む、請求項４〜１１いずれか一項記載のポリペプチド。
【請求項１３】
第３５位におけるリジンからチロシンへの置換変異を含む、請求項４〜１２いずれか一項記載のポリペプチド。
【請求項１４】
第１０位におけるグルタミンからアルギニンへの置換変異を含む、請求項４〜１３いずれか一項記載のポリペプチド。
【請求項１５】
第１１位におけるアスパラギンからスレオニンへの置換変異を含む、請求項４〜１４いずれか一項記載のポリペプチド。
【請求項１６】
第１７位におけるロイシンからバリンへの置換変異を含む、請求項４〜１５いずれか一項記載のポリペプチド。
【請求項１７】
第２７位における、アルギニンから、リジンおよびセリンから選択されるアミノ酸残基への置換変異を含む、請求項４〜１２いずれか一項記載のポリペプチド。
【請求項１８】
配列番号１の配列において突然変異Ｆ１３Ｙ、Ｙ１４Ｗ、Ｎ２８Ｒ、Ｑ３２ＲおよびＫ３５Ｙを少なくとも含む配列に相当するアミノ酸配列であることを特徴とする、請求項４〜１７いずれか一項記載のポリペプチド。
【請求項１９】
アミノ酸配列が、配列番号２〜７９のいずれか１つに示される、請求項４〜１８いずれか一項記載のポリペプチド。
【請求項２０】
アミノ酸配列が、配列番号２又は３に示される、請求項１９記載のポリペプチド。
【請求項２１】
関連するブドウ球菌プロテインＡ（ＳＰＡ）のドメイン中に存在するアスパラギン残基のうちの少なくとも１つが、別のアミノ酸残基に置換されていることを特徴とする、前記請求項のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項２２】
前記ブドウ球菌プロテインＡ（ＳＰＡ）のドメインの配列が配列番号１に示されるＳＰＡプロテインＺの配列に相当し、かつ該ポリペプチドはＮ３、Ｎ６、Ｎ１１、Ｎ２１、Ｎ２３、Ｎ２８、Ｎ４３およびＮ５２から選択される少なくとも１つの位置での置換変異を含む、請求項２１記載のポリペプチド。
【請求項２３】
Ｎ３Ａ、Ｎ６Ａ、Ｎ６Ｄ、Ｎ１１Ｓ、Ｎ２３Ｔ、Ｎ２８ＡおよびＮ４３Ｅ、の突然変異のうち少なくとも１つを含む、請求項２２記載のポリペプチド。
【請求項２４】
前記請求項のいずれかに記載のポリペプチドの断片を構成し、該断片はＨＥＲ２に対する結合親和性を保持していることを特徴とする、ポリペプチド。
【請求項２５】
いずれかの末端に付加的なアミノ酸残基を含む、前記請求項のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項２６】
前記付加的なアミノ酸残基は、Ｎ−またはＣ末端におけるシステイン残基を含む、請求項２５記載のポリペプチド。
【請求項２７】
前記付加的なアミノ酸残基は、好ましくはヘキサヒスチジニルタグ、ｍｙｃタグおよびＦｌａｇタグから選択される、タグを含む、請求項２５又は２６記載のポリペプチド。
【請求項２８】
前記付加的なアミノ酸残基が少なくとも１つの機能的なポリペプチドドメインを含み、請求項１〜２４のいずれか一項記載のポリペプチドから成る第一の部分と、少なくとも１つの第二の部分及び任意のさらなる単一又は複数の部分との融合ポリペプチドである、請求項２５又は２６記載のポリペプチド。
【請求項２９】
前記第二の部分が請求項１〜２４いずれか一項記載の１又は複数のポリペプチドから構成され、請求項１〜２４いずれか一項記載の配列が同一でも異なっていてもよい、ＨＥＲ２結合ポリペプチドの多量体である、請求項２８記載のポリペプチド。
【請求項３０】
前記第二の部分はＨＥＲ２以外の標的分子と結合し得る少なくとも１つのポリペプチドドメインを含む、請求項２８記載のポリペプチド。
【請求項３１】
前記第二の部分はヒト血清アルブミンと結合し得る少なくとも１つのポリペプチドドメ
インを含む、請求項３０記載のポリペプチド。
【請求項３２】
前記ヒト血清アルブミンと結合し得る少なくとも１つのポリペプチドドメインは連鎖球菌のプロテインＧのアルブミン結合ドメインである、請求項３１記載のポリペプチド。
【請求項３３】
前記第二の部分がブドウ球菌のプロテインＡ（ＳＰＡ）のドメインに関連するポリペプチドを含み、該ポリペプチドの配列は１〜約２０の置換変異を有する前記ＳＰＡドメインの配列に相当する、請求項３０記載のポリペプチド。
【請求項３４】
前記第二の部分のポリペプチドの配列が、配列番号１に示されるＳＰＡプロテインＺの配列において１〜約２０の置換変異を有する配列に相当する、請求項３３記載のポリペプチド。
【請求項３５】
前記第二の部分が酵素作用を有する、請求項２８記載のポリペプチド。
【請求項３６】
前記第二の部分が蛍光作用を有する、請求項２８記載のポリペプチド。
【請求項３７】
前記第二の部分が、ファージのコートタンパク質またはその断片である、請求項２８記載のポリペプチド。
【請求項３８】
標識基を含む、前記請求項のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項３９】
前記標識基が蛍光標識、ビオチンおよび放射性標識から選択される、請求項３８記載のポリペプチド。
【請求項４０】
ＨＥＲ２を過剰発現する細胞に対して活性を有する物質と結合された、前記請求項のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項４１】
ＨＥＲ２を過剰発現する細胞に対する活性を有する前記物質が、細胞傷害性物質、放射性物質、ＡＤＥＰＴ法に使用される酵素、サイトカインおよび凝血原因子から選択される、請求項４０記載のポリペプチド。
【請求項４２】
請求項１〜３７いずれか一項記載のポリペプチドをコードする配列を含む核酸分子。
【請求項４３】
請求項４２記載の核酸分子を含む発現ベクター。
【請求項４４】
請求項４３記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項４５】
請求項１〜４１いずれか一項記載のポリペプチドの薬剤としての使用。
【請求項４６】
ＨＥＲ２の過剰発現を特徴とする少なくとも一形態の癌の治療のための薬剤の調製における、請求項１〜４１のいずれか一項に記載のポリペプチドの使用。
【請求項４７】
ＨＥＲ２の過剰発現を特徴とする少なくとも一形態の癌の治療方法であって、請求項１〜４１いずれか一項記載のポリペプチドを活性物質として含む治療的有効量の組成物を、そのような治療を必要とする患者に投与することを包含する方法。
【請求項４８】
抗癌活性を有する物質と結合された請求項１〜４１いずれか一項記載のポリペプチドの、ＨＥＲ２を過剰発現する細胞に前記物質を送達するための使用。
【請求項４９】
ｉｎ ｖｉｖｏで、ＨＥＲ２を過剰発現する細胞へ抗癌活性を有する物質を送達する方法であって、前記物質と請求項１〜４１いずれか一項記載のポリペプチドとの複合体を患者に投与することを包含する方法。
【請求項５０】
試料中のＨＥＲ２の検出のための請求項１〜４１いずれか一項記載のポリペプチドの使用。
【請求項５１】
請求項１〜４１いずれか一項記載のポリペプチドを用いることを特徴とする、試料中のＨＥＲ２の検出方法。
【請求項５２】
（ｉ）試験される試料を準備する工程、（ｉｉ）前記試料に対して請求項１〜４１いずれか一項記載のポリペプチドを、該試料中に存在する任意のＨＥＲ２との結合が可能な条件下で添加する工程、（ｉｉｉ）結合していないポリペプチドを除去する工程、および（ｉｖ）結合したポリペプチドを検出する工程を包含する、請求項５１記載の方法。
【請求項５３】
前記試料は生体液試料、好ましくはヒト血漿試料である、請求項５２記載の方法。
【請求項５４】
前記試料は組織試料、好ましくはヒト組織試料、さらに好ましくは癌に罹患しているヒトからの生検試料である、請求項５２記載の方法。
【請求項５５】
レポーター酵素を融合した請求項１〜４１いずれか一項記載のポリペプチド、前記レポーター酵素の活性の検出のための試薬、ならびに陽性および陰性対照組織スライドを包含する、組織試料におけるＨＥＲ２過剰発現の診断のためのキット。
【請求項５６】
キレート剤で標識された請求項１〜４１いずれか一項記載のポリペプチド、診断用放射性同位体、ならびに取り込み効率の分析のための試薬を包含する、ＨＥＲ２過剰発現をｉｎ ｖｉｖｏで診断するためのキット。
【請求項５７】
キレート剤で標識された請求項１〜４１いずれか一項記載のポリペプチド、治療用放射性同位体、ならびに取り込み効率の分析のための試薬を包含する、請求項４９記載の方法を実施するためのキット。
【請求項１】
ＨＥＲ２に対する結合親和性を有し、かつブドウ球菌のプロテインＡ（ＳＰＡ）のドメインに関連するポリペプチドであって、該ポリペプチドの配列は１〜約２０の置換変異を有する前記ＳＰＡドメインの配列に相当する、ポリペプチド。
【請求項２】
ＨＥＲ２に対する結合親和性を有し、相互作用のＫD値が最大で１×１０-6Ｍであることを特徴とする、請求項１記載のポリペプチド。
【請求項３】
ＨＥＲ２に対する結合親和性を有し、相互作用のＫD値が最大で１×１０-7Ｍであることを特徴とする、請求項２記載のポリペプチド。
【請求項４】
配列番号１に示されるＳＰＡプロテインＺの配列において１〜約２０の置換変異を含む配列に相当する配列であることを特徴とする、請求項１〜３いずれか一項記載のポリペプチド。
【請求項５】
４〜約２０の置換変異を含む、請求項４記載のポリペプチド。
【請求項６】
第１３位、第１４位、第２８位、第３２位および第３５位のうちの１以上の位置における置換変異を含む、請求項４又は５記載のポリペプチド。
【請求項７】
第９位、第１０位、第１１位、第１７位、第１８位、第２４位、第２５位および第２７位のうちの１以上の位置における置換変異をさらに含む、請求項６記載のポリペプチド。
【請求項８】
第１３位におけるフェニルアラニンからチロシンへの置換変異を含む、請求項４〜７いずれか一項記載のポリペプチド。
【請求項９】
第１４位におけるチロシンからトリプトファンへの置換変異を含む、請求項４〜８いずれか一項記載のポリペプチド。
【請求項１０】
第２８位における、アスパラギンから、アルギニンおよびヒスチジンから選択されるアミノ酸残基への置換変異を含む、請求項４〜９いずれか一項記載のポリペプチド。
【請求項１１】
第２８位におけるアスパラギンからアルギニンへの置換変異を含む、請求項４〜１０いずれか一項記載のポリペプチド。
【請求項１２】
第３２位におけるグルタミンからアルギニンへの置換変異を含む、請求項４〜１１いずれか一項記載のポリペプチド。
【請求項１３】
第３５位におけるリジンからチロシンへの置換変異を含む、請求項４〜１２いずれか一項記載のポリペプチド。
【請求項１４】
第１０位におけるグルタミンからアルギニンへの置換変異を含む、請求項４〜１３いずれか一項記載のポリペプチド。
【請求項１５】
第１１位におけるアスパラギンからスレオニンへの置換変異を含む、請求項４〜１４いずれか一項記載のポリペプチド。
【請求項１６】
第１７位におけるロイシンからバリンへの置換変異を含む、請求項４〜１５いずれか一項記載のポリペプチド。
【請求項１７】
第２７位における、アルギニンから、リジンおよびセリンから選択されるアミノ酸残基への置換変異を含む、請求項４〜１２いずれか一項記載のポリペプチド。
【請求項１８】
配列番号１の配列において突然変異Ｆ１３Ｙ、Ｙ１４Ｗ、Ｎ２８Ｒ、Ｑ３２ＲおよびＫ３５Ｙを少なくとも含む配列に相当するアミノ酸配列であることを特徴とする、請求項４〜１７いずれか一項記載のポリペプチド。
【請求項１９】
アミノ酸配列が、配列番号２〜７９のいずれか１つに示される、請求項４〜１８いずれか一項記載のポリペプチド。
【請求項２０】
アミノ酸配列が、配列番号２又は３に示される、請求項１９記載のポリペプチド。
【請求項２１】
関連するブドウ球菌プロテインＡ（ＳＰＡ）のドメイン中に存在するアスパラギン残基のうちの少なくとも１つが、別のアミノ酸残基に置換されていることを特徴とする、前記請求項のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項２２】
前記ブドウ球菌プロテインＡ（ＳＰＡ）のドメインの配列が配列番号１に示されるＳＰＡプロテインＺの配列に相当し、かつ該ポリペプチドはＮ３、Ｎ６、Ｎ１１、Ｎ２１、Ｎ２３、Ｎ２８、Ｎ４３およびＮ５２から選択される少なくとも１つの位置での置換変異を含む、請求項２１記載のポリペプチド。
【請求項２３】
Ｎ３Ａ、Ｎ６Ａ、Ｎ６Ｄ、Ｎ１１Ｓ、Ｎ２３Ｔ、Ｎ２８ＡおよびＮ４３Ｅ、の突然変異のうち少なくとも１つを含む、請求項２２記載のポリペプチド。
【請求項２４】
前記請求項のいずれかに記載のポリペプチドの断片を構成し、該断片はＨＥＲ２に対する結合親和性を保持していることを特徴とする、ポリペプチド。
【請求項２５】
いずれかの末端に付加的なアミノ酸残基を含む、前記請求項のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項２６】
前記付加的なアミノ酸残基は、Ｎ−またはＣ末端におけるシステイン残基を含む、請求項２５記載のポリペプチド。
【請求項２７】
前記付加的なアミノ酸残基は、好ましくはヘキサヒスチジニルタグ、ｍｙｃタグおよびＦｌａｇタグから選択される、タグを含む、請求項２５又は２６記載のポリペプチド。
【請求項２８】
前記付加的なアミノ酸残基が少なくとも１つの機能的なポリペプチドドメインを含み、請求項１〜２４のいずれか一項記載のポリペプチドから成る第一の部分と、少なくとも１つの第二の部分及び任意のさらなる単一又は複数の部分との融合ポリペプチドである、請求項２５又は２６記載のポリペプチド。
【請求項２９】
前記第二の部分が請求項１〜２４いずれか一項記載の１又は複数のポリペプチドから構成され、請求項１〜２４いずれか一項記載の配列が同一でも異なっていてもよい、ＨＥＲ２結合ポリペプチドの多量体である、請求項２８記載のポリペプチド。
【請求項３０】
前記第二の部分はＨＥＲ２以外の標的分子と結合し得る少なくとも１つのポリペプチドドメインを含む、請求項２８記載のポリペプチド。
【請求項３１】
前記第二の部分はヒト血清アルブミンと結合し得る少なくとも１つのポリペプチドドメ
インを含む、請求項３０記載のポリペプチド。
【請求項３２】
前記ヒト血清アルブミンと結合し得る少なくとも１つのポリペプチドドメインは連鎖球菌のプロテインＧのアルブミン結合ドメインである、請求項３１記載のポリペプチド。
【請求項３３】
前記第二の部分がブドウ球菌のプロテインＡ（ＳＰＡ）のドメインに関連するポリペプチドを含み、該ポリペプチドの配列は１〜約２０の置換変異を有する前記ＳＰＡドメインの配列に相当する、請求項３０記載のポリペプチド。
【請求項３４】
前記第二の部分のポリペプチドの配列が、配列番号１に示されるＳＰＡプロテインＺの配列において１〜約２０の置換変異を有する配列に相当する、請求項３３記載のポリペプチド。
【請求項３５】
前記第二の部分が酵素作用を有する、請求項２８記載のポリペプチド。
【請求項３６】
前記第二の部分が蛍光作用を有する、請求項２８記載のポリペプチド。
【請求項３７】
前記第二の部分が、ファージのコートタンパク質またはその断片である、請求項２８記載のポリペプチド。
【請求項３８】
標識基を含む、前記請求項のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項３９】
前記標識基が蛍光標識、ビオチンおよび放射性標識から選択される、請求項３８記載のポリペプチド。
【請求項４０】
ＨＥＲ２を過剰発現する細胞に対して活性を有する物質と結合された、前記請求項のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項４１】
ＨＥＲ２を過剰発現する細胞に対する活性を有する前記物質が、細胞傷害性物質、放射性物質、ＡＤＥＰＴ法に使用される酵素、サイトカインおよび凝血原因子から選択される、請求項４０記載のポリペプチド。
【請求項４２】
請求項１〜３７いずれか一項記載のポリペプチドをコードする配列を含む核酸分子。
【請求項４３】
請求項４２記載の核酸分子を含む発現ベクター。
【請求項４４】
請求項４３記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項４５】
請求項１〜４１いずれか一項記載のポリペプチドの薬剤としての使用。
【請求項４６】
ＨＥＲ２の過剰発現を特徴とする少なくとも一形態の癌の治療のための薬剤の調製における、請求項１〜４１のいずれか一項に記載のポリペプチドの使用。
【請求項４７】
ＨＥＲ２の過剰発現を特徴とする少なくとも一形態の癌の治療方法であって、請求項１〜４１いずれか一項記載のポリペプチドを活性物質として含む治療的有効量の組成物を、そのような治療を必要とする患者に投与することを包含する方法。
【請求項４８】
抗癌活性を有する物質と結合された請求項１〜４１いずれか一項記載のポリペプチドの、ＨＥＲ２を過剰発現する細胞に前記物質を送達するための使用。
【請求項４９】
ｉｎ ｖｉｖｏで、ＨＥＲ２を過剰発現する細胞へ抗癌活性を有する物質を送達する方法であって、前記物質と請求項１〜４１いずれか一項記載のポリペプチドとの複合体を患者に投与することを包含する方法。
【請求項５０】
試料中のＨＥＲ２の検出のための請求項１〜４１いずれか一項記載のポリペプチドの使用。
【請求項５１】
請求項１〜４１いずれか一項記載のポリペプチドを用いることを特徴とする、試料中のＨＥＲ２の検出方法。
【請求項５２】
（ｉ）試験される試料を準備する工程、（ｉｉ）前記試料に対して請求項１〜４１いずれか一項記載のポリペプチドを、該試料中に存在する任意のＨＥＲ２との結合が可能な条件下で添加する工程、（ｉｉｉ）結合していないポリペプチドを除去する工程、および（ｉｖ）結合したポリペプチドを検出する工程を包含する、請求項５１記載の方法。
【請求項５３】
前記試料は生体液試料、好ましくはヒト血漿試料である、請求項５２記載の方法。
【請求項５４】
前記試料は組織試料、好ましくはヒト組織試料、さらに好ましくは癌に罹患しているヒトからの生検試料である、請求項５２記載の方法。
【請求項５５】
レポーター酵素を融合した請求項１〜４１いずれか一項記載のポリペプチド、前記レポーター酵素の活性の検出のための試薬、ならびに陽性および陰性対照組織スライドを包含する、組織試料におけるＨＥＲ２過剰発現の診断のためのキット。
【請求項５６】
キレート剤で標識された請求項１〜４１いずれか一項記載のポリペプチド、診断用放射性同位体、ならびに取り込み効率の分析のための試薬を包含する、ＨＥＲ２過剰発現をｉｎ ｖｉｖｏで診断するためのキット。
【請求項５７】
キレート剤で標識された請求項１〜４１いずれか一項記載のポリペプチド、治療用放射性同位体、ならびに取り込み効率の分析のための試薬を包含する、請求項４９記載の方法を実施するためのキット。
【図１−１】
【図１−２】
【図１−３】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図１−２】
【図１−３】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【公表番号】特表２００７−５３７７００（Ｐ２００７−５３７７００Ａ）
【公表日】平成１９年１２月２７日（２００７．１２．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５１８５８６（Ｐ２００６−５１８５８６）
【出願日】平成１６年６月３０日（２００４．６．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＳＥ２００４／００１０４９
【国際公開番号】ＷＯ２００５／００３１５６
【国際公開日】平成１７年１月１３日（２００５．１．１３）
【出願人】（３０７０１５２８６）アフィボディ・アーベー (9)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年１２月２７日（２００７．１２．２７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年６月３０日（２００４．６．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＳＥ２００４／００１０４９
【国際公開番号】ＷＯ２００５／００３１５６
【国際公開日】平成１７年１月１３日（２００５．１．１３）
【出願人】（３０７０１５２８６）アフィボディ・アーベー (9)
【Ｆターム（参考）】
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