ＨＩＦ−１α活性剤
本発明は、クリオキノール（Ｃｌｉｏｑｕｉｎｏｌ）及びその誘導体を有効成分として含むＨＩＦ−１α活性剤に関するもので、より詳細には、クリオキノール及びその誘導体は正常酸素状態（ｎｏｒｍｏｘｉａ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）の細胞でＨＩＦ−１α（Ｈｙｐｏｘｉａ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｆａｃｔｏｒ−１α）のユビキチン化を阻害してＨＩＦ−１αを蓄積させる一方、ＦＩＨ−１の活性を阻害して蓄積されたＨＩＦ−１αが転写活性を有するようにすることで、ＨＩＦ−１α標的遺伝子であるＶＥＧＦ（ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）及びＥＰＯ（ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ）の発現を誘導するので、虚血性疾患治療剤として有用に使用することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、クリオキノール（ｃｌｉｏｑｕｉｎｏｌ）及びその誘導体を有効成分として含むＨＩＦ−１α活性剤に関するもので、より詳細には、クリオキノール及びその誘導体を正常酸素状態でＨＩＦ−１αのユビキチン化を阻害してＨＩＦ−１αを蓄積させる一方、ＦＩＨ−１の活性を阻害して蓄積されたＨＩＦ−１αが転写活性を有するようにすることで、ＨＩＦ−１αの標的遺伝子であるＶＥＧＦ及びＥＰＯの発現を誘導することにより、虚血性疾患治療に使用することができる。
【背景技術】
【０００２】
虚血は、身体に部分的に生じる貧血状態で、血管が詰まったり減ったりすることによって生じる現象をいう。身体の各部分が機能を正常に遂行しようとすれば、血管を通じて適切な酸素と栄養が供給されなければならない。心臓も冠状動脈という血管を通じて必要な酸素と栄養の供給を受けている。しかし、必要量の血流量供給を受けることができなければ、心臓筋肉に代謝産物が積もって低酸素症に陥るようになって機能に障害が生じる。このような場合を心筋虚血であるという。そして、心筋虚血によって起きた心臓機能の障害を虚血性心臓疾患という。心臓疾患は、大きく分けて狭心症と心筋梗塞症に分けられる。一般的に男性が女性に比較して発生頻度が高くて年齢が高いほど、危険要素が揃った人であればあるほど、発生頻度が高い。虚血が発生する場合、血管が詰まって前記の疾病が発生し得、脳の血管が詰まって虚血性脳疾患が発病する。虚血によって血液循環が円滑ではない場合、身体末端でも問題になり得、この場合、末端組職の壊死が起きて虚血性末端疾患が発病し得る。このように虚血は、多くの疾患に発展し得るため、これに対する治療剤の開発が至急な実情である。
【０００３】
ＨＩＦ−１（Ｈｙｐｏｘｉａ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｆａｃｔｏｒ−１）は、酸素恒常性の主要調節子として、血管新生、赤血球形成、糖分解に係わる様々な遺伝子の発現を開始する転写誘導因子である（Ｍａｓｓｏｎ ａｎｄ Ｒａｔｃｌｉｆｆｅ，Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ，２００３年，第１１６巻，３０４１−３０４９頁；Ｓｅａｇｒｏｖｅｓ等，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，２００１年，第２１巻，３４３６−３４４４頁）。ＨＩＦ−１は、ＨＩＦ−１αとＨＩＦ−１βとで構成されている。ＨＩＦ−１αは、正常酸素状態でユビキチン−プロテアソームシステム（ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ ｓｙｓｔｅｍ）によって迅速に減少してＨＩＦ−１βのレベルは、一定に維持される（Ｈｕａｎｇ等，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，１９９８年，第９５巻，７９７８−７９９２頁；Ｋａｌｌｉｏ等，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，１９９９年，第２７４巻，６５１９−６５２５頁）。正常に酸素が供給されている状態でＨＩＦ−１αの５６４番及び／または４０２番プロリンは、ＰＨＤｓ（ＨＩＦ−１α−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｏｌｙ−４ ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅｓ）によって水酸化されて活性が抑制される。この過程で、酸素（Ｏ２）、２−オキソグルタル酸、ビタミンＣ、Ｆｅ２＋を必要とする（Ｂｒｕｉｋｃ ａｎｄ ＭｃＫｎｉｇｈｔ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００１年，第２９４巻，１３３７−１３４０頁；Ｅｐｓｔｅｉｎ等，Ｃｅｌｌ，２００１年，第１０７巻，４３−５４頁；Ｉｖａｎ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００１年，第２９２巻，４６４−４６８頁；Ｊａａｋｋｏｌａ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００１年，第２９２巻，４６８−４７２頁；Ｍａｓｓｏｎ等，ＥＭＢＯ Ｊ，２００１年，第２０巻，５１９７−５２０６頁）。哺乳動物細胞でＰＨＤｓのファミリーは、ＰＨＤ１（ＨＰＨ３，ＥＧＬＮ２）、ＰＨＤ２（ＨＰＨ２，ＥＧＬＮ１）、ＰＨＤ３（ＨＰＨ１，ＥＧＬＮ３）と明らかにされた（Ｈｕａｎｇ等，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２００２年，第２７７巻，３９７９２−３９８００頁；Ｔａｌｙｅｒ，Ｇｅｎｅ，２００１年，第２７５巻，１２５−１３２頁）。水酸化されたプロリン残基は、Ｅ３ユビキチン・リガーゼ構成成分であるＶＨＬ（ｖｏｎ Ｈｉｐｐｅｌ−Ｌｉｎｄａｕ）タンパク質と結合し、ＨＩＦ−１αは ＶＣＢ Ｅ３ユビキチン・リガーゼ複合体（ＶＨＬタンパク質，Ｅｌｏｎｇｉｎ Ｂ，Ｅｌｏｎｇｉｎ Ｃ，Ｃｕｌ２，Ｒｂｘ１）と結合しながらユビキチン化される（Ｉｗａｉ等，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，１９９９年，第９６巻，１２４３６−１２４４１頁；Ｋａｍｕｒａ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９９年，第２８４巻，６５７−６６１頁）。低酸素状態では、プロリン水酸化が減少しながらＨＩＦ−１αタンパク質が蓄積される。蓄積されたＨＩＦ−１αが、転写因子で活性化されるには、核に移動してＨＩＦ−１βと結合する。ＨＩＦ−１α／β異形複合体は、ターゲット遺伝子のプローモーターに位置する低酸素反応構成要素、ＨＲＥ（Ｈｙｐｏｘｉａ ｒｅｓｐｏｓｉｖｅ ｅｌｅｍｅｎｔ）というＤＮＡ配列に結合して、転写活性に必要な転写補助因子であるｐ３００／ＣＢＰなどのタンパク質に結合することで、血管生成及び細胞内エネルギー供給に必須なタンパク質の発現を増加させる（Ｎａｔｈａｌｉ等，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，２００４年，第６８巻，９７１−９８０頁）。
【０００４】
一方、酸素分子は、ＨＩＦ−１αの安定化を阻害するのみならず、ＨＩＦ−１αの転写活性を阻害する。ＦＩＨ−１（ｆａｃｔｏｒ ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ ＨＩＦ−１α）は、ＨＩＦ−１αの８０３番目アスパラギン残基を水酸化させる。ＨＩＦ−１αの転写活性ドメインのアスパラギン残基の水酸化は、ＨＩＦ−１αとＣＢＰとの結合を妨害して転写活性がないＨＩＦ−１αの蓄積を誘導する。ＦＩＨ−１は、最近発見されて、その活性が知られた酵素であり、その３次構造が明かされた（Ｌｅｅ等，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２００３年，第２７８巻，７５５８−７５６３頁；Ｅｌｋｉｎｓ等，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２００３年，第２７８巻，１８０２−１８０６頁）。ＦＩＨ−１もＰＨＤと同じくＦｅ２＋を補助因子に使用して、２−オキソグルタル酸、酸素（Ｏ２）を基質に使用してＨＩＦ−１αの８０３番目アスパラギン残基を水和させることが明らかにされた（Ｌａｎｄｏ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００２年，第２９５巻，８５８−８６５頁）。前記酵素は、ＰＨＤより２−オキソグルタル酸及び酸素に対するＫｍ値が２倍以上低く、ＰＨＤが作用することができない酸素分圧でも一部機能できることが明らかにされた（Ｋｏｉｖｕｎｅｎ等，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２００４年，第２７９巻，９８９９−９９０４頁）。
【０００５】
ＨＩＦ−１αの活性化によって発現が誘導される標的遺伝子は、ＥＰＯ（ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ）とＶＥＧＦ（ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）であり、前記遺伝子は、低酸素状態で保護機序の主要媒介子として作用する（Ｇｒｉｍｍ等，Ｎａｔ Ｍｅｄ，２００２年，第８巻，１７８−７２４頁：Ｃａｌｖｉｌｌｏ等，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，２００３年，第１００巻，４８０２−４８０６頁：Ｆｅｒｒｉｅｒｏ Ｄ．Ｍ．，Ｅｐｉｌｅｐｓｉａ．，２００５年，第４６巻，４５−５１頁；Ｓｉｍｏｎｓ，Ａ．，Ｗａｒｅ，Ｊ．Ａ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．，２００３年，第２巻，８６３−８７１頁）。ＥＰＯとその受容体は脳で発現されて、脳梗塞による損傷時の神経保護と連関していて（Ｄｉｇｉｃａｙｏｌｉｏｇｌｕ，Ｍ．等，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，１９９５年，第９２巻，３７１７−３７２０頁；Ｅｈｒｅｎｒｅｉｃｈ，Ｈ．等，Ｍｅｔａｂ Ｂｒａｉｎ Ｄｉｓ．，２００４年，第１９巻，１９５−２０６頁）、生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）で脳梗塞発生時にニューロンを保護することが報告された（Ｓａｓａｋｉ等，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，１９９８年，第９５巻，４６３５−４６４０頁）。ＶＥＧＦは、心筋梗塞研究において臨床１期及び２期実験で安定性と治療剤としての安定性が報告された（Ｙｏｏｎ，Ｙ．Ｓ．等，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２００４年，第２６４巻，１４９４−１５０４頁；Ｓｈａｈ，Ｐ．Ｂ．ａｎｄ Ｌｏｓｏｒｄｏ，Ｄ．Ｗ．，Ａｄｖ Ｇｅｎｅｔ，２００５年，第５４巻，３３９−３６１頁；Ｓｉｍｏｎｓ，Ｍ．ａｎｄ Ｗａｒｅ Ｊ．Ａ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．，２００３年，第２巻，８６３−８７１頁；Ｈｅｎｒｙ，Ｔ．Ｄ．等，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，２００３年，第１０７巻，１３５９−１３６５頁 ）。ＶＥＧＦの血管形成活性によって損傷受けたニューロンと神経グリア（ｎｅｕｒｏｎｇｌｉａ）で新しい保護活性を有する（Ｒｏｓｅｎｓｔｅｉｎ，Ｊ．Ｍ．ａｎｄ Ｋｒｕｍ，Ｋ，Ｅｘｐ Ｎｅｕｒｏｌ，２００４年，第１８７巻，２４６−２５３頁）。ＶＥＧＦのレベルが阻害されると、筋萎縮性側索硬化症が発生して、還流と神経保護機能が低下する（Ｓｔｏｒｋｅｂａｕｍ，Ｅ．．Ｌａｍｂｒｅｃｈｔｓ，Ｄ．，Ｃａｒｍｅｌｉｅｔ，Ｐ．，Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ，２０４年，第２６巻，９４３−９５４頁）。
【０００６】
クリオキノール（Ｃｌｉｏｑｕｉｎｏｌ：以下「ＣＱ」と略称する）は、Ｚｎ２＋、Ｃｕ２＋及びＣａ２＋のような重金属イオンを選択的にキレート化させて、酵素活性及びタンパク質形成において重金属イオンの効果を調節するのに使用される。ＣＱのｐＫａ値は、Ｃｕ２＋，１５．８；Ｚｎ２＋，１２．５；Ｃａ２＋，８．１；Ｍｇ２＋，８．６である（Ａｇｒａｗａｌ，Ｙ．Ｋ．等，Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ．，１９８６年，第７５巻，１９０−１９２頁）。ＣＱは疎水性であり、血管脳関門を通過する。ＣＱは最近アルツハイマー疾患、パーキンソン疾患、ホンチントン疾患でメタロタンパク質の沈殿とそれによる酸化ストレスを減少させるプロトタイプメタルタンパク質希少コンパウンド（ｐｒｏｔｏｔｙｐｅ ｍｅｔａｌ−ｐｒｏｔｅｉｎ ａｔｔｅｎｕａｔｉｎｇ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）として再評価されている。ＣＱは、１９００年代中盤に抗生剤として脚光を浴びたが、日本で骨髓・視覚神経病症の原因として明かされ回収された（Ｃｈｅｒｎｙ，Ｒ．Ａ．，Ｎｅｕｒｏｎ，２００１年，第３０巻，６６５−６７６頁；Ｋａｕｒ，Ｄ．等，Ｎｅｕｒｏｎ，２００３年，第３７巻，８９９−９０９頁；Ｎｇｕｙｅｎ Ｔ．等，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，２００５年，第１０２巻，１１８４０−１１８４５頁）。最近、アルツハイマー疾患動物モデルであるＡＰＰ２５７６形質転換マウス研究でＣＱは、アミロイドベータプラグとアミロイドセラム数値を副作用なしに減少させると報告された（Ｄｏｒａｉｓｗａｍｙ，Ｐ．Ｍ．等，Ｌａｎｃｅｔ Ｎｅｏｒｕｌ，２００４年，第３巻，４３１−４３４頁）。最近、２工程臨床の調査でアルツハイマー患者３６人を対象にした実験で、ＣＱは認知減退を遅延させ、有意性をもってアミロイドベータ濃度を減少させた（Ｒｉｔｃｈｉｅ Ｃ．Ｗ．等，Ａｒｃｈ Ｎｅｕｒｏｌ，２００３年，第６０巻，１６８５−１６９１頁）。
【０００７】
ＣＱはまた、多くのヒト癌細胞株で細胞死の原因になる。これは、細胞死滅過程を通じて起きる。ＣＱを処理した癌細胞株に銅またはジンク（ｚｉｎｃ）を添加しても、ＣＱによる細胞死は防ぐことができず、むしろさらに細胞死を増加させた。ＣＱ処理細胞に蛍光標識でジンク数値が増加することが観察されたが、これを通じてＣＱがイオン透過担体（ｚｉｎｃ ｉｏｎｏｐｈｏｒｅ）の活性化によって細胞死を起こすことが分かる（Ｄｉｎｇ，Ｗ．Ｏ．，等，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，２００５年，第６５巻，３３８９−３３９５頁）。
【０００８】
ＣＱのような金属キレートであるＴＰＥＮ（テトラキス−（２−ピリジルメチル）エチレンジアミン：Ｃ２６Ｈ２８Ｎ６）は、Ｚｎ２＋、Ｃｕ２＋及びＦｅ２＋のような重金属イオンを選択的にキレート化させて、酵素活性及びタンパク質形成において重金属イオンの効果を調節するのに使用される。ＴＰＥＮのｐＫａ値は、Ｃｕ２＋，２０．２；Ｚｎ２＋，１５．４；Ｆｅ３＋，１４．４；Ｃａ２＋，３である（Ｃｈｅｒｎｙ Ｒ．Ａ．等，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．，１９９９年，第２７４巻，２３２２３−２３２２８頁）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の主な目的は、虚血性疾患治療剤としてクリオキノールまたはその誘導体の新しい用途を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
前記目的を達成するために、本発明はクリオキノールまたはその誘導体を有効成分として含むＨＩＦ−１α活性剤を提供する。
【００１１】
また、本発明は、クリオキノールまたはその誘導体を有効成分として含むＦＩＨ−１阻害剤を提供する。
【００１２】
また、本発明は、クリオキノールまたはその誘導体を有効成分として含むＶＥＧＦ発現誘導剤を提供する。
【００１３】
また、本発明は、クリオキノールまたはその誘導体を有効成分として含むＥＰＯ発現誘導剤を提供する。
【００１４】
また、本発明は、クリオキノールまたはその誘導体を有効成分として含む虚血性疾患治療剤を提供する。
【００１５】
また、本発明は、クリオキノールまたはその誘導体を有効成分として含む血管生成誘導剤を提供する。
【００１６】
また、本発明は、治療的有効量のクリオキノールまたはその誘導体を虚血性疾患にかかった患者に投与する工程を含む虚血の治療方法を提供する。
【００１７】
同時に、本発明は、虚血性疾患治療剤の製造において、クリオキノールまたはその誘導体の用途を提供する。
【００１８】
以下、本発明を詳しく説明する。
【００１９】
本発明は、クリオキノールまたはその誘導体を有効成分として含むＨＩＦ−１α活性剤を提供する。
【００２０】
また、本発明は、クリオキノールまたはその誘導体を有効成分として含むＦＩＨ−１阻害剤を提供する。
【００２１】
また、本発明は、クリオキノールまたはその誘導体を有効成分として含むＶＥＧＦ発現誘導剤を提供する。
【００２２】
また、本発明は、クリオキノールまたはその誘導体を有効成分として含むＥＰＯ発現誘導剤を提供する。
【００２３】
クリオキノール（以下「ＣＱ」と略称する：化学式２）は、重金属キレーターとして、Ｚｎ２＋、Ｃｕ２＋及びＣａ２＋のような重金属イオンを選択的にキレート化させて、酵素活性及びタンパク質形成において重金属イオンの効果を調節するのに使用される。ＣＱのｐＫａ値は、Ｃｕ２＋、１５．８；Ｚｎ２＋、１２．５；Ｃａ２＋、８．１；Ｍｇ２＋、８．６である。
【００２４】
ＣＱまたはその誘導体は、下記の化学式１のような構造を有する。
【００２５】
【化１】
【００２６】
Ｒは、Ｈまたはアセチル基、Ｘ１及びＸ２は独立して、Ｈまたはハロゲン族。
【００２７】
前記ハロゲン族は、Ｆ、Ｂｒ、ＣｌまたはＩであることが好ましい。
【００２８】
ＣＱ（化学式２）の誘導体では、５−クロロキノリン−８−イル アセテート（５−ｃｈｌｏｒｏｑｕｉｎｏｌｉｎ−８−ｙｌ ａｃｅｔａｔｅ：化学式３）、５，７−ジイオド−８−ヒドロキシキノリン（５，７−ｄｉｉｏｄｏ−８−ｈｙｄｒｏｘｙｑｕｉｎｏｌｉｎｅ：化学式４）、５，７−ジブロモ−８−ヒドロキシキノリン（５，７−ｄｉｂｒｏｍｏ−８−ｈｙｄｒｏｘｙｑｕｉｎｏｌｉｎｅ：化学式５）、及び８−ヒドロキシキノリン（８−ｈｙｄｒｏｘｙｑｕｉｎｏｌｉｎｅ：化学式６）などがあり、その化学式を下記に示す。
【００２９】
【化２】
【００３０】
【化３】
【００３１】
【化４】
【００３２】
【化５】
【００３３】
【化６】
【００３４】
ＴＰＥＮ（テトラキス−（２−ピリジルメチル）エチレンジアミン：Ｃ２６Ｈ２８Ｎ６）は、Ｚｎ２＋、Ｃｕ２＋及びＦｅ２＋のような重金属イオンを選択的にキレート化させて、酵素活性及びタンパク質形成において重金属イオンの効果を調節するのに使用される。ＴＰＥＮのｐＫａ値は、Ｃｕ２＋、２０．２；Ｚｎ２＋、１５．４；Ｆｅ３＋、１４．４；Ｃａ２＋、３である（Ｃｈｅｒｎｙ Ｒ．Ａ．等，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．，１９９９年，第２７４巻，２３２２３−２３２２８頁）。
【００３５】
本発明の発明者等は、低酸素状態でＨＩＦ−１αメカニズムに関与するＰＨＤ２のようなＨＩＦ−１α調節子、ユビキチン化構成酵素、ＣＢＰタンパク質がジンクフィンガー（ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ）モチーブを有するので、重金属キレートであるＣＱがＨＩＦ−１αメカニズムに及ぼす影響を調査し、重金属キレートであるＴＰＥＮを使用してその効果を比較した。
【００３６】
本発明の発明者等は、ヒトＨｅｐＧ２肝細胞とＳＨ−ＳＹ５Ｙ脳細胞にＣＱとＴＰＥＮを処理して、ＨＩＦ−１αの活性化を調査した。その結果、正常酸素状態でＣＱとＴＰＥＮはすべてＨＩＦ−１αタンパク質を安定化させてその量を増加させた（図１参照）。また、正常酸素状態のＳＨ−ＳＹ５Ｙ脳細胞株にＣＱ及び陽イオン（Ｚｕ２＋、Ｃｕ２＋、Ｆｅ２＋）を処理した結果、Ｚｕ２＋及びＣｕ２＋をＣＱと処理した時、ＣＱのＨＩＦ−１α蓄積効果が減少したが、Ｆｅ２＋をＣＱと処理した時は、ＣＱのＨＩＦ−１α蓄積効果に影響を及ぼし得ないことを確認した（図２参照）。本発明者等は、ＣＱ誘導体（５−クロロキノリン−８−イル アセテート、５，７−ジイオド−８−ヒドロキシキノリン、５，７−ジブロモ−８−ヒドロキシキノリン及び８−ヒドロキシキノリン）をＨｅｐＧ２及びＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞株に処理した時、ＨＩＦ−１αの安定化を増加させることを確認した（図３参照）。以後、ＣＱとＴＰＥＮがＨＩＦ−１αの標的遺伝子であるＶＥＧＦの活性に及ぼす影響を、ＲＴ−ＰＣＲで調査した。その結果、正常酸素状態でＣＱがＴＰＥＮより非常に多くＶＥＧＦの発現を誘導することが確認された（図４参照）。また、ＣＱ誘導体（５−クロロキノリン−８−イル アセテート、５，７−ジイオド−８−ヒドロキシキノリン、５，７−ジブロモ−８−ヒドロキシキノリン及び８−ヒドロキシキノリン）が、ＨｅｐＧ２及びＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞株上でＶＥＧＦの発現を増加させた（図５参照）。それで、本発明者等は、低酸素状態で反応する低酸素反応構成要素（ｈｙｐｏｘｉａ−ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｅｌｅｍｅｎｔ：以下「ＨＲＥ」と略称する）で、ＣＱ及びＴＰＥＮの影響を調査した。その結果、ＣＱによって低酸素状態で反応するＨＲＥ−依存遺伝子が、正常酸素状態でも強く発現誘導されることが分かった（図６参照）。これを通じて、ＣＱとＴＰＥＮはＨＩＦ−１αを安定化させるが、標的遺伝子発現誘導のためのＨＩＦ−１αの転移活性においては差を示すので、ＣＱは ＴＰＥＮと異なりＨＩＦ−１α標的遺伝子であるＶＥＧＦの発現を誘導することが分かる。
【００３７】
本発明者等は、ＣＱがＰＨＤ２の変化に影響を与えるかどうか調査したが、ＶＨＬ（ｖｏｎ Ｈｉｐｐｅｌ−Ｌｉｎｄａｕ）とＨＩＦ−１αの結合が４０２／５６４番目プロリンの水酸化に依存するので、ヒトＨＩＦ−１αタンパク質のＯＤＤドメイン（４０１−６０３アミノ酸）による［３５Ｓ］−標識ＶＨＬ捕捉を測定して調査した。その結果、ＴＰＥＮはＣＱと異なりＰＨＤ２の活性を増加させた（図７参照）。これを通じて、亜鉛キレートであるＴＰＥＮとＣＱがＰＨＤ２の活性にお互いに異なって作用することが分かった。
【００３８】
正常酸素状態でＨＩＦ−１αは、ユビキチン化によって分解される。それで本発明者等は、ＣＱとＴＰＥＮがＨＩＦ−１αのユビキチン化に及ぼす影響を調査した。その結果、ＣＱとＴＰＥＮは、正常酸素状態でＨＩＦ−１αのユビキチン化を阻害した（図８及び図９参照）。ＨＩＦ−１αのユビキチン化は、ｐＶＨＬ、エロンジン（ｅｌｏｎｇｉｎ）Ｂ、エロンジンＣ、Ｃｕｌ２、ＲｂｘからなるＶＣＢ Ｅ３リガーゼ複合体によって成り立つ（Ｉｗａｉ等，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，１９９９年，第９６巻，１２４３６−１２４４１頁；Ｋａｍｕｒａ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ, １９９９年,第２８４巻,６５７−６６１頁）。Ｒｂｘ１は、ユビキチンリガーゼ活性度に重要な役割をするＲＩＮＧ−Ｈ２−タイプジンクフィンガードメインを有していて（Ｋａｍｕｒａ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９９年、第２８４巻,６５７−６６１頁）、ＣＱがこのような活性を阻害するものと考えられる（Ｗｅｂｓｔｅｒ等，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２００３年，第２７８巻，３８２３８−３８２４６頁）。これを通じて、ＣＱとＴＰＥＮがＨＩＦ−１αのユビキチン化阻害を通じて、正常酸素状態でＨＩＦ−１αタンパク質の量を増加させることが分かる。
【００３９】
ＨＩＦ−１α転写活性は、８０３番アスパラギン残基の水酸化によって阻害され、これはＦＩＨ−１によって成り立つ（Ｄａｎｎ等，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，２００２年，第９９巻，１５３５１−１５３５６頁；Ｌａｎｄｏ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００２年，第２９５巻，８５８−８６１頁）。ＨＩＦ−１αの８０３番アスパラギン残基の水酸化は、ＨＩＦ−１αと活性化補助因子であるＣＢＰとの結合を阻害して、転写活性がない（ｎｏｎ−ｆｕｎｃｔｉｏｎ）ＨＩＦ−１αの蓄積を誘導するので、ＨＩＦ−１αはＦＩＨ−１の活性度が減少する時、転写活性が増加するようになる（Ｆｒｅｅｍａｎ等，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，２００２年，第９９巻，５３６７−５３７２頁）。このような事実を基に本発明者等は、ＦＩＨ−１の活性度に及ぼすＣＱとＴＰＥＮの影響を調査した。放射線が標識されたＨＩＦ−１αを単独でレジンにローディングした場合、レジン中に充填されたＣＢＰと結合した（図１０Ａのレーン１及び図１０Ｂのレーン１参照）。放射線標識されたＨＩＦ−１αとＦＩＨ−１を反応させた時には、ＦＩＨ−１によってＨＩＦ−１αの８０３番アスパラギン残基が水酸化されて、ＨＩＦ−１αとＣＢＰとの結合を妨害した（図１０Ａのレーン４参照）。放射線標識されたＨＩＦ−１α、ＦＩＨ−１、ＴＰＥＮを一緒に反応させた時 、ＦＩＨ−１によって水和されたＨＩＦ−１αは、ＣＢＰと結合することができなかったが、それを通じてＴＰＥＮがＨＩＦ−１αに及ぼすＦＩＨ−１の活性に影響を及ぼすことができないことが分かる（図１０Ｂのレーン６参照）。放射線標識されたＨＩＦ−１αとＣＱを反応させた時、ＨＩＦ−１αはＣＢＰと結合して（図１０Ａのレーン２、３及び図１０Ｂのレーン２参照）、放射線標識されたＨＩＦ−１αとＦＩＨ、ＣＱを一緒に反応させた時、ＣＱの濃度が高くなれば、ＨＩＦ−１αに対するＦＩＨ−１の活性を減少させることが分かる（図１０Ａのレーン５、６及び図１０Ｂのレーン５参照）。
【００４０】
また、Ｚｎ（II）またはＣｕ（II）が、ＣＱのＦＩＨ−１活性阻害に及ぼす影響を調査した。その結果、Ｚｎ（II）またはＣｕ（II）は、ＣＱがＦＩＨ−１の活性を阻害させるのに影響を及ぼすことができないことを確認した（図１１のレーン４、５、６参照）。これを通じて、ＣＱはＺｎ（II）またはＣｕ（II）の有無とは無関係に、ＦＩＨ−１の活性を阻害することを確認した。以後、ＨＩＦ−１αの８０３番目アスパラギン残基をアラニンに入れ替えたＨＩＦ−１α−Ｃ（Ｎ８０３Ａ）突然変異体を製作して実験した。その結果、ＦＩＨ−１とＨＩＦ−１α−Ｃ（Ｎ８０３Ａ）を一緒に反応させた後、ＣＢＰとの結合を調査した。ＣＱの有無やＦＩＨ−１の有無は、ＣＢＰとＨＩＦ−１α−Ｃ（Ｎ８０３Ａ）との結合を変化させなかった。すなわち、ＣＱの効果は、ＦＩＨ−１がＨＩＦ−１αの８０３番目アスパラギン残基を水酸化する過程を抑制するからであることを間接的に提示している（図１２参照）。
【００４１】
本発明者等は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析方法を使用して、ＣＱ処理時のＦＩＨ−１の活性を調査した。その結果、ＣＱがＨＩＦ−１αの８０３番目アスパラギン残基の水酸化を阻害させることを確認した（図１３参照）
前記結果から分かるようにＣＱは、直接的にＨＩＦ−１αに対するＦＩＨ−１活性を減少させることが分かる。ＦＩＨ−１は、ＨＩＦ−１αの８０３番目アスパラギン残基を水酸化してＣＢＰとＨＩＦ−１αの転写活性ドメインとの結合を妨害する。ゆえに、ＣＱは ＦＩＨ−１によるＨＩＦ−１αの８０３番アスパラギン残基の水酸化を妨害して、それを通じて転写機能を完全に有する（ｆｕｎｃｔｉｏｎ）ＨＩＦ−１αを蓄積させる。ＴＰＥＮは、 ＦＩＨ−１の活性化を阻害することができないので、転写機能がない（ｎｏｎ−ｆｕｎｃｔｉｏｎ）ＨＩＦ−１αを増加させる。これを通じてＣＱは、ＰＨＤ２の活性は阻害しないで、ユビキチンによるタンパク質分解は抑制するので、プロリン残基が水酸化されたＨＩＦ−１αの蓄積を招来し、またＦＩＨ−１の活性を抑制することで蓄積されたＨＩＦ−１αの８０３番のアスパラギン残基は、水酸化されなくなる。
【００４２】
本発明者等は、ＨＩＦ−１αによる低酸素誘導転写活性（ｈｙｐｏｘｉａ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）に対する、ＣＱとＴＰＥＮの影響を調査した。これを調査するために共−免疫沈降法、リポーター遺伝子分析システム、ジンク存在下のＨＩＦ−１αとＣＢＰとの結合を調査した。共―免疫沈降法を使用した調査で、８０３番のアスパラギンが水酸化されないＨＩＦ−１αは、活性化補助因子であるＣＢＰと結合することが可能になる（図１４Ａレーン２参照）。一方、タンパク質分解抑制剤であるＭＧ１３２ あるいはＴＰＥＮの処理は、ＨＩＦ−１αタンパク質の蓄積を引き起こすが、ＦＩＨ−１の活性を抑制することができないので、蓄積されたＨＩＦ−１αは活性化補助因子であるＣＢＰとの結合をすることができない（図１４Ａレーン１、図１４Ｂレーン１、３参照）。イーストタンパク質であるＧＡＬ４のＤＮＡ結合部位とＨＩＦ−１αを融合したタンパク質（ＧＡＬ４−ＨＩＦ−１α）をＧＡＬ４結合部位を有するリポーターと一緒にトランスフェクションした後、ＧＡＬ４−ＨＩＦ−１αによるリポーター遺伝子の発現を調査することで、ＨＩＦ−１αの転写活性のみを調査した。ＣＱは、正常酸素状態にもかかわらずＨＩＦ−１αの転写活性を増加させた。それとは対照的に、ＴＰＥＮは正常酸素状態でＨＩＦ−１αの転移活性を増加させなかった（図１５参照）。ＣＢＰ自体がジンクフィンガードメインＣＨ１を有していて、このＣＨ１ドメインがＨＩＦ−１αと結合する部分であるので、ジンクキレーターであるＣＱとＴＰＥＮがＣＨ１ ドメイン構造を変化させることで、ＣＢＰとＨＩＦ−１αの結合を阻害する可能性を調査した。ジンク存在下のＨＩＦ−１αとＣＢＰとの結合の調査結果、ＣＱとＴＰＥＮがＨＩＦ−１αとＣＢＰとの結合に何らの影響を与えないことが分かった（図１６参照）。このような結果を通じて、ＣＱはＦＩＨ−１を抑制することでＨＩＦ−１αの転写活性を増大させて、正常酸素状態でＨＩＦ−１αとＣＢＰの結合を増加させる。
【００４３】
本発明の発明者等は、ノーザンブロット方法を通じてＣＱによるＨＩＦ−１α標的遺伝子ＶＥＧＦ及びＥＰＯの発現を調査した。その結果、ＣＱは正常酸素状態でＶＥＧＦ及びＥＰＯの発現を誘導した（図１７参照）。
【００４４】
本発明者等は、ＣＱ及びその誘導体が血管生成に及ぼす影響を調査した結果、ＶＥＧＦと同様に効果的な血管形成能力を有することを確認した（図１８参照）。
【００４５】
本発明は、ＣＱ及びその誘導体を有効成分として含む虚血性疾患治療剤を提供する。前記虚血性疾患治療剤は、虚血性心臓疾患、虚血性脳疾患、虚血性末端疾患を対象にする。
【００４６】
本発明の発明者等は、ＣＱがＶＥＧＦ及びＥＰＯの発現を誘導して、ＣＱ誘導体がＶＥＧＦの発現を誘導することを確認した。最近研究では、組換えＶＥＧＦタンパク質を使用して虚血性疾患及び心血管疾患を有した患者に適用したし（Ｙｏｏｎ Ｙ．Ｓ．等，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ，２００４年，第２６４巻，６３−７４頁；Ｈｅｎｒｙ Ｔ．Ｄ．等，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，２００３年，第１０７巻，１３５９−１３６５頁 ）、ＶＥＧＦ発現ベクターを虚血性心臓疾患患者に適用して安全性を確認した（Ｈｅｄｍａｎ Ｍ．等，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，２００３年，第１０７巻，２６７７−２６８３頁）。また、ＶＥＧＦの発現調節を通じて虚血性脳疾患で神経細胞保護効果が現われることが報告された（Ｓｔｏｒｋｅｂａｕｍ Ｅ．，Ｌａｍｂｒｅｃｈｔｓ Ｄ．，Ｃａｒｍｅｌｉｅｔ Ｐ．，Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ，２００４年，第２６巻，９４３−９５４頁；Ｊｉｎ Ｋ．Ｌ．，Ｍａｏ Ｘ．Ｏ．，Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ Ｄ．Ａ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，２０００年，第９７巻，１０２４２−１０２４７頁；Ｓｕｎ Ｙ．等，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ，２００３年，第１１１巻，１８４３−１８５１頁；Ｚｈｕ Ｗ．等，Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ，２００５年，第５７巻，３２５−３３３頁）。ＥＰＯの場合、組換えＥＰＯタンパク質は、心筋梗塞及び脳梗塞疾患で細胞保護効果を示すことが多数の論文で報告された（Ｃａｉ Ｚ．等，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，２００３年，第１０８巻，７９−８５頁；Ｅｈｒｅｎｒｅｉｃｈ Ｈ．等，Ｍｅｔａｂ Ｂｒａｉｎ Ｄｉｓ，２００４年，第１９巻，１９５−２０６頁；Ｓａｋａｎａｋａ Ｍ．等，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，１９９８年，第９５巻，４６３５−４６４０頁；Ｅｈｒｅｎｒｅｉｃｈ Ｈ．等，Ｍｏｌ Ｍｅｄ，２０００年，第８巻，４９５−５０５頁）。したがって、ＣＱ及びその誘導体は、ＶＥＧＦ及びＥＰＯ発現増加を通じて虚血性疾患の治療に使用することができる。
【００４７】
本発明のＣＱ及びその誘導体はそのまま、または薬学的に許容可能な塩の形態で使用することができる。本発明で使用可能な塩では、薬剤学的に許容可能な無毒性塩なら特別に限定されない。例えば、塩酸、硫酸、硝酸、リン酸、フッ化水素酸、ブロム化水素酸、ギ酸、酢酸、酒石酸、乳酸、クエン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、メタルスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、トルエンスルホ酸、ナフタリンスルホン酸などの塩形態で使用することができる。
【００４８】
本発明の虚血性疾患治療剤は、虚血性疾患の予防及び治療のために単独で、または手術、ホルモン治療、化学治療及び生物学的反応調節剤を使用する方法と併用して使用することができる。
【００４９】
本発明の虚血性疾患治療剤は、前記ＣＱ及びその誘導体に追加で同一または類似の機能を示す有効成分を１種以上含むことができる。薬剤学的に許容可能な担体は、食塩水、滅菌水、リンゲル液、緩衝食塩水、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液，グリセロール、エチルアルコール及びこれら成分の中で１成分以上を混合して使用することができ、必要によって抗酸化剤、緩衝液、静菌剤など他の通常の添加剤を添加することができる。本発明の組成物は、実際臨床投与時に経口及び非経口のさまざまな剤形で投与され得る。製剤化する場合には、普通使用する充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩解剤、界面活性剤などの希釈剤または賦形剤を使用して調剤される。さらに、当分野の適正な方法で、またはＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ（最近版）、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ ＰＡに開示されている方法を使用して、各疾患によってまたは成分によって好ましく製剤化することができる。
【００５０】
本発明の組成物は、目的とする方法によって経口投与したり非経口投与（例えば、静脈内、皮下、腹腔内または局所に適用）でき、投与量は患者の体重、年齢、性別、健康状態、食餌、投与時間、投与方法、排泄率及び疾患の重症度などによってその範囲が多様である。 投薬単位は、例えば個別投薬量の１、２、３または４倍で、または１／２、１／３または１／４倍を含むことができる。個別投薬量は、好ましくは有効薬物が１回に投与される量を含み、これは通常１日投与量の全部、１／２、１／３または１／４倍に当たる。
【００５１】
有効用量は、０．５〜６ｍｇ／ｋｇで、好ましくは３ｍｇ／ｋｇであり、一日に１〜３回投与することができる。用量は必ずこれに限定されるものではなく、患者の状態及び疾患の発病程度によって変わり得る。
【００５２】
本発明は、ＣＱ及びその誘導体を有効成分として含む血管新生誘導剤を提供する。
【００５３】
ＣＱ及びその誘導体は、ＶＥＧＦと同様に効果的に血管生成能力を有することで（図１８参照）、血管生成誘導剤として有用に使用することができる。
【００５４】
本発明は、治療的有効量のＣＱを虚血性疾患にかかった患者に投与する工程を含む虚血性疾患の治療方法を提供する。
【００５５】
前記虚血性疾患では、虚血性心臓疾患、虚血性脳疾患、虚血性末端疾患が含まれる。ＣＱは、好ましくは経口または注射液（静脈内または皮下）で投与され、対象に投与される正確な量は、担当医療者の責任下にある。しかし、ここに使用される治療的有効量は、対象の年及び性別、治療が行われる正確な疾病、及び疾病の重症度を含んだ多数の因子に影響を受ける。また、投与経路は、患者の状態及びその重症度によって変化することができる。
【００５６】
本発明は、虚血性疾患治療剤の製造において、ＣＱ及びその誘導体の用途を提供する。
【００５７】
本発明者等は、ＣＱ及びその誘導体がＨＩＦ−１αの転写活性を有するようにして、ＨＩＦ−１α標的遺伝子であるＶＥＧＦ及びＥＰＯの発現を誘導することを証明することにより、虚血性疾患治療剤の製造に使用され得るＣＱ及びその誘導体の新しい用途を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５８】
以下、本発明を実施例によって詳しく説明する。
【００５９】
但し、下記実施例は本発明を例示するだけであって、本発明の内容が下記実施例に限定されるものではない。
実施例１：ＨＩＦ−１α安定化に対するクリオキノール、その誘導体とＴＰＥＮの影響調査
実施例１−１：ＨｅｐＧ２細胞でＨＩＦ−１α安定化に対するＣＱとＴＰＥＮの影響調査
ヒトＨｅｐＧ２肝細胞（ｈｅｐａｔｏｍａ ｃｅｌｌ：ＡＴＣＣ ＨＢ−８０６５）を正常酸素状態と低酸素状態で培養した。ＨｅｐＧ２細胞は、非必須アミノ酸が含まれているＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，米国）に１０％ＦＢＳ（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ：Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ，米国）が入っている培地で培養した。細胞を低酸素状態で培養するために嫌気性培養器（ａｎａｅｒｏｂｉｃ ｉｎｃｕｂａｔｏｒ：Ｍｏｄｅｌ １０２９，Ｆｏｒｍａ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ．Ｉｎｃ）で５％ＣＯ２、１０％Ｈ２、８５％Ｎ２で３７℃で培養した。薬物と低酸素を一緒に処理した場合、薬物は１時間前に処理して、追加で低酸素処理をして、ＲＮＡ分離をする時は低酸素状態で１６時間培養した。タンパク質分離のためには、６時間低酸素状態で培養した。前記培養した正常酸素状態ヒトＨｅｐＧ２肝細胞には、ＣＱ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，米国）（１０，１００，５００μＭ）とＴＰＥＮ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，米国）（５μＭ）を、低酸素状態のヒトＨｅｐＧ２肝細胞には、ＣＱ（１０，１００μＭ）とＴＰＥＮ（５μＭ）を６時間処理した。その後、ウエスタンブロット方法でＨＩＦ−１αの発現を調査した。それぞれの群から取った試料を８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに電気泳動を遂行してニトロセルロース膜（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，米国）に移動させた。以後、１次抗体で抗−ヒトＨＩＦ−１α抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，米国）（１：８００に希釈）を使用し、２次抗体ではマウス−Ｉｇ複合ホースラディシュペルオキシダーゼ（ｍｏｕｓｅ Ｉｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）（１：３，０００に希釈）を使用した。対照群のために抗β―チュブリン（ｔｕｂｕｌｉｎ）抗体（ＢＤ，Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，米国）を使用した。
【００６０】
本実験の結果、ヒト肝細胞で正常酸素状態の時、ＴＰＥＮはＨＩＦ−１αタンパク質の量を増加させ、ＣＱもＨＩＦ−１αを大きく増加させた。低酸素状態では、対照群と比較した時、ＴＰＥＮ及びＣＱの両方でＨＩＦ−１αの蓄積が起きた（図１Ａ）。
実施例１−２：ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞でＨＩＦ−１α安定化に対するＣＱとＴＰＥＮの影響の調査
ヒトＳＨ−ＳＹ５Ｙ脳細胞（ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ ｃｅｌｌ：ＡＴＣＣ ＣＲＬ−２２６６）を正常酸素状態と低酸素状態で培養した。ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞は、非必須アミノ酸が含まれているＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，米国）に１０％ＦＢＳ（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ：Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ，米国）が入っている培地で培養した。細胞を低酸素状態で培養するために嫌気性培養器（ａｎａｅｒｏｂｉｃ ｉｎｃｕｂａｔｏｒ：Ｍｏｄｅｌ １０２９，Ｆｏｒｍａ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ．Ｉｎｃ）で５％ ＣＯ２、１０％Ｈ２、８５％Ｎ２で３７℃で培養した。薬物と低酸素を一緒に処理した場合、薬物は１時間前に処理して、追加で低酸素処理をし、ＲＮＡ分離をする時は低酸素状態で１６時間培養した。タンパク質分離のためには、６時間低酸素状態で培養した。前記培養した正常酸素状態のヒトＳＨ−ＳＹ５Ｙ脳細胞には、ＴＰＥＮ（５μＭ）とＣＱ（１０，１００μＭ）を、低酸素状態のヒトＳＨ−ＳＹ５Ｙ脳細胞には、ＣＱ（１００μＭ）を６時間処理した。その後、ウエスタンブロット方法でＨＩＦ−１αの発現を調査した。それぞれの群から取った試料を８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに電気泳動を遂行してニトロセルロース膜（Ｓｉｇｍａ，米国）に移動させた。以後、１次抗体で抗−ヒトＨＩＦ−１α抗体（ＢＤ，Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，米国）（１：８００に希釈）を使用し，２次抗体ではマウス−Ｉｇ複合ホースラディシュペルオキシダーゼ（ｍｏｕｓｅ Ｉｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）（１：３，０００に希釈）を使用した。対照群のために抗β―チュブリン抗体（ＢＤ，Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，米国）を使用した。
【００６１】
本実験の結果、ヒト神経細胞でＴＰＥＮは、ＨＩＦ−１αタンパク質量を増加させ、ＣＱもＨＩＦ−１αを多く蓄積させた。低酸素状態では対照群、ＴＰＥＮ、及びＣＱすべてでＨＩＦ−１αタンパク質量の蓄積が起きた（図１Ｂ）。
実施例１−３：ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞でのＨＩＦ−１α安定化に対するＣＱと陽イオンの影響の調査
ヒトＳＨ−ＳＹ５Ｙ脳細胞株を実施例１−２と同様に正常酸素状態と低酸素状態で培養した。ヒトＳＨ−ＳＹ５Ｙ脳細胞株を正常酸素状態で培養した後、ＣＱ（５０μＭ）を処理し、それぞれＺｎ２＋（１０μＭ）、Ｃｕ２＋（１０μＭ）及びＦｅ２＋（１０μＭ）を一緒に処理した後、１６時間培養した。以後、実施例１−２と同じ方法でウエスタンブロットを遂行してＨＩＦ−１αの発現を調査した。
【００６２】
実験結果、Ｚｎ（II）とＣｕ（II）添加時に、ＣＱの効果が減少した（図２Ａ）。これを通じてＨＩＦ−１αは、Ｚｎ（II）及びＣｕ（II）の枯渇によって安定化することが分かった。Ｆｅ（II）の添加の場合、ＣＱ効果を減少させることができないので（図２Ｂ）、Ｆｅ（II）はＣＱによるＨＩＦ−１αの安定化と関連しないことが分かった。
実施例１−４：ＨｅｐＧ２及びＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞でＨＩＦ−１α安定化に対するＣＱ誘導体の影響の調査
本発明者等は、ＣＱ誘導体（５−クロロキノリン−８−イル アセテート、５，７−ジイオド−８−ヒドロキシキノリン、５，７−ジブロモ−８−ヒドロキシキノリン、８−ヒドロキシキノリン）がＨｅｐＧ２及びＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞上でＨＩＦ−１αの安定化に及ぼす影響を調査し、実施例１−１及び実施例１−２と同一な方法で調査した。具体的に、ＨｅｐＧ２及びＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を実施例１−１及び１−２の方法で細胞株を培養し、ＣＱ及びＣＱ誘導体を５、１０、５０及び１００μＭの濃度で処理した。その後、実施例１−１及び実施例１−２と同じ方法でウエスタンブロットを遂行した。対照群のために抗Ｈｓｐ７０抗体（Ｓｔｒｅｓｓｇｅｎ，カナダ）を使用した。
【００６３】
その結果、ＣＱ誘導体（５−クロロキノリン−８−イル アセテート、５，７−ジイオド−８−ヒドロキシキノリン、５，７−ジブロモ−８−ヒドロキシキノリン、８−ヒドロキシキノリン）は、ＣＱと同じくＨＩＦ−１αを安定化させることを確認した（図３）。
実施例１−５：ＨＩＦ−１α標的遺伝子ＶＥＧＦ発現に対するＣＱとＴＰＥＮの影響の調査
ヒトＳＨ−ＳＹ５Ｙ脳細胞株とヒトＨｅｐＧ２肝細胞株を実施例１−１及び１−２と同様に正常酸素状態と低酸素状態で培養した。ヒトＳＨ−ＳＹ５Ｙ脳細胞とヒトＨｅｐＧ２ 肝細胞を正常酸素状態で培養した後、ＴＰＥＮ（５μＭ）、ＣＱ（１０，１００μＭ）を処理し、低酸素状態で培養した細胞株にはＴＰＥＮ（５μＭ）、ＣＱ（１００μＭ）を１６時間処理した。以後、全体ＲＮＡは、ＲＮａｓｅスピンカラム（Ｑｉａｇｅｎ，米国）を使用して分離した。分離したＲＮＡの中で１μｌを使用してＡＭＶ逆転写酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ，米国）とランダムヘキサマー（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ，米国）でｃＤＮＡを合成した。合成されたｃＤＮＡを鋳型にして配列番号１で記載されるＶＥＧＦ正方向プライマー（５’−ｃｃａｔｇａａｃｔｔｔｃｔｇｃｔｇｔｃｔｔ−３’）と配列番号２で記載されるＶＥＧＦ逆方向プライマー（５’−ａｔｃｇｃａｔｃａｇｇｇｇｃａｃａｃａｇ−３’）を使用してＲＴ−ＰＣＲを遂行した。ＲＴ−ＰＣＲ条件は、下記のとおりである。９５℃で５分間初期変性過程を経た後、９５℃で４５秒間変性反応、５６℃で４５秒間プライマー結合反応、７２℃で６０秒間長さ延長反応を遂行し、前記過程を３０回繰り返した。対照群に配列番号３で記載される１８Ｓ正方向プライマー（５’−ａｃｃｇｃａｇｃｔａｇｇａａｔａａｔｇｇａａｔａ−３’）と配列番号４で記載される１８Ｓ逆方向プライマー（５’−ｃｔｔｔｃｇｃｔｃｔｇｇｔｃｃｇｔｃｔｔ−３’）を使用してＰＣＲを遂行した。ＲＴ−ＰＣＲ条件は下記のとおりである。９５℃で５分間初期変性過程を経た後、９５℃で４５秒間変性反応、５６℃で４５秒間プライマー結合反応、７２℃で６０秒間長さ延長反応を遂行し、前記過程を３０回繰り返した。
【００６４】
本実験の結果、ヒトＳＨ−ＳＹ５Ｙ脳細胞株の場合、正常酸素状態でＣＱがＴＰＥＮとは異なってＶＥＧＦの発現を増加させることを確認した。低酸素状態の場合、ＣＱがＶＥＧＦの発現を増加させ、ＴＰＥＮの場合多少減少させた。ヒトＨｅｐＧ２肝細胞株の場合も、ＣＱがＴＰＥＮとは異なってＶＥＧＦの発現を増加させ、低酸素状態では対照群、ＴＰＥＮ、ＣＱを処理するにおいて、ＶＥＧＦの発現に変化がなかった（図４）。
実施例１−６：ＨＩＦ−１α標的遺伝子ＶＥＧＦ発現に対するＣＱ誘導体の影響の調査
ヒトＨｅｐＧ２細胞及びＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞株を実施例１−１及び１−２と同じ条件で培養した。以後、細胞にＣＱ及びＣＱ誘導体（５−クロロキノリン−８−イル アセテート、５，７−ジイオド−８−ヒドロキシキノリン、５，７−ジブロモ−８−ヒドロキシキノリン、及び８−ヒドロキシキノリン）を５、１０、５０及び１００μＭで処理して実施例１−５と同じ方法でＲＴ−ＰＣＲを遂行した。
【００６５】
その結果、ＨｅｐＧ２細胞株でＣＱ誘導体は、低酸素状態とＣＱを処理した時、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞株でよりＶＥＧＦの発現を増加させることができなかった。ＣＱ誘導体である５−クロロキノリン−８−イル アセテート（５０μＭ）、５，７−ジイオド−８−ヒドロキシキノリン（２５μＭ）及び８−ヒドロキシキノリン（５０μＭ）の場合、ＣＱが増加させたＶＥＧＦ発現増加量の４０〜５０％を増加させ、５，７−ジブロモ−８−ヒドロキシキノリン（５０μＭ）は、ＣＱが増加させたＶＥＧＦ発現増加量の６０〜７０％を増加させた（図５）。
実施例１−７：ＨｅｐＧ２肝細胞で低酸素反応構成要素（ＨＲＥ：ｈｙｐｏｘｉａ−ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｅｌｅｍｅｎｔ）−依存遺伝子発現に対するＣＱとＴＰＥＮの影響の調査
ヒトＨｅｐＧ２肝細胞を５×１０４個になるように培養した後、１００ｎｇのＨＲＥ−レポータープラスミド、ｐ（ＨＲＥ）４−ｌｕｃとβ−ガラクトシダーゼがクローニングされたｐＣＨＯ１１０を形質転換させた。形質転換したヒトＨｅｐＧ２肝細胞を正常酸素状態と低酸素状態でそれぞれ培養した後、それぞれＴＰＥＮ（５，１０μＭ）、ＣＱ（１０，５０μＭ）を１６時間それぞれ処理し、形質転換して４８時間以後、ルシフェラーゼ分析をレポーター遺伝子分析システム（Ｐｒｏｍｅｇａ，米国）を使用して測定し、β−ガラクトシダーゼの活性度の値を使用してサンプルごとに差がでるトランスフェクション効率を補正した。
【００６６】
本実験の結果、ＣＱはＴＰＥＮとは異なり、ＨＩＦ−１αの低酸素反応構成要素の活性を誘導することを確認した（図６）。
実施例２：ＰＨＤ２活性化に対するＣＱとＴＰＥＮの影響の調査
本発明者等は、ＰＨＤ２活性変化に及ぼすＣＱの影響を調査した。ヒトＰＨＤ−２遺伝子（ＡＪ３１０５４３）は、ｐＥＴ２１ｂ Ｈｉｓ２（＋）ベクターにクローニングし、ヒスチジンがタグされた融合タンパク質で大腸菌で過発現させて、Ｎｉ−吸着クロマトグラフィー方法で精製した（Ｃｈｏｉ，Ｋ．Ｏ．等，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．,２００５年,第６８巻，１８０３−１８０９頁）。これを使用して、Ｈａａｋｋｏｌａなどの方法で試験管内（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）ＶＨＬプルダウン分析（ｐｕｌｌ ｄｏｗｎ ａｓｓａｙ）を遂行した（Ｈａａｋｋｏｌａ，Ｐ．等，Ｓｃｉｅｎｃｅ,２００１年,第２９２巻，４６８−４７２頁）。詳しくは、［３５Ｓ］−メチオニン−標識ＶＨＬタンパク質（［３５Ｓ］−ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ−ｌａｂｅｌｅｄ ＶＨＬ ｐｒｏｔｅｉｎ）を製造社の方法にしたがってｐｃＤＮＡ３．１／ｍｙｃ−ｈｙｇｒｏ−ＶＨＬプラスミド（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｃａｔ＃ Ｌ１１７０，米国）を使用して試験管内転写及び翻訳によって合成した。ＧＳＴ−ＯＤＤ（ヒトＨＩＦ−１α４０１−６０３アミノ酸）は、大腸菌で発現させてグルタチオンユニフローレジン（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ−ｕｎｉｆｌｏｗ ｒｅｓｉｎ）を使用して製造社の方法（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｃａｔ＃ ８９１２−１，米国）にしたがって精製した。レジンに結合したＧＳＴ−ＯＤＤ（２００μｇタンパク質／約８０μｌレジン体積）は、１．５〜３μｇＰＨＤ２が含まれた２００μｌ ＮＥＴＮバッファー［２００ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）,１００ｍＭ ＮａＣｌ，１ｍＭ ＥＤＴＡ，０．５％Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０，１ｍＭ ＰＭＳＦ］に、２ｍＭアスコルビン酸、１００μＭ ＦｅＣｌ２，５ｍＭ α−ケトグルタレート（ｋｅｔｏｇｌｕｔａｒａｔｅ）が存在する状態で、３０℃条件で９０分間撹拌して反応させた。反応混合物を５００×ｇで２分間遠心分離し、１０倍体積のＮＥＴＮバッファーで３回洗浄した。レジンに結合されたＯＤＤは、１０μＭ［３５Ｓ］−標識ＶＨＬが含まれた５０μｌ ＥＢＣバッファー［１２０ｍＭ ＮａＣｌ，５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．５％（ｖ／ｖ）Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０］と混合した。４℃で２時間撹拌した後、レジンを１ｍｌ ＮＥＴＮバッファーで３回洗浄し、タンパク質は３Ｘ ＳＤＳサンプルバッファーで溶出後、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離して放射線撮影方法で検出した。それぞれの試料量は、クマシー染色法でＧＳＴ−ＯＤＤを染色してモニターした。
【００６７】
その結果、ＴＰＥＮはＣＱと異なり、ＰＨＤ２の活性を増加させた（図７）。
実施例３：ＨＩＦ−１αユビキチン化に対するＣＱとＴＰＥＮの影響の調査
実施例３−１：試験管内（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）ユビキチン化調査
ＨｅＬａ細胞は、ＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，米国）に１０％ＦＢＳ（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ：Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ，米国）が入っている培地で培養した。１００ｍＭ培養プレートに８０％程度育った時、ＨｅＬａ細胞を冷却した保存抽出バッファー（ｈｙｐｏｔｏｎｉｃ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ：２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．５），５ｍＭ ＫＣｌ，１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２，１ｍＭ ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ，２μｇ／ｍｌ ａｐｒｏｔｉｎｉｎ，２μｇ／ｍｌ ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ，０．２ｍＭ ＰＭＳＦ）で２回洗浄した。バッファー除去した後、細胞を細胞破砕機（Ｄｏｕｎｃｅ ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ）を使用して破砕して１０，０００×ｇで１０分間４℃で遠心分離を遂行して細胞残物と核酸を除去した。上澄み液（Ｓ−１０分画）は、−７０℃に保存した。ユビキチン化の調査は、３０℃で２７０分間遂行し、２μｌ［３５Ｓ］−ラベルヒトＨＩＦ−１α−プログラム網状赤血球、２７μｌ Ｓ−１０抽出物、４μｌ １０×ＡＴＰ−再生システム（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ ７．５）、１０ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍＭマグネシウムアセテート、３００ｍＭクレアチンホスファート、０．５μｇ／ｍｌクレアチンホスホキナーゼ）、５ｍｇ／ｍｌユビキチン（Ｓｉｇｍａ，米国）の４μｌ、１５０μＭユビキチンアルデヒド（Ｓｉｇｍａ，米国）０．８３μｌを含んで最終体積４０μｌになるようにして遂行した。ＣＱを処理した試料は、ＣＱ１００μＭを含んで遂行した。ＳＤＳ試料バッファーを添加し、反応生産物は６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに電気泳動した後、放射線写真撮影（ａｕｔｏｒａｄｉｏｇｒａｐｈｙ）で分析した（Ｃｏｃｋｍａｎ等，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２０００年，第２７５巻，２５７３３−２５７４１頁）。
【００６８】
本実験の結果、ＣＱはＨＩＦ−１αのユビキチン化を抑制することを確認した（図８）。
実施例３−２：生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）ユビキチン化調査
ヒトＨｅｐＧ２肝細胞株にＴＰＥＮ（５μＭ）、ＣＱ（１００μＭ）、ＭＧ１３２（５μＭ）を処理して、６時間正常酸素状態で培養した。その後、ウエスタンブロット方法でＨＩＦ−１αのユビキチン化を調査した。ウエスタンブロット方法は、実施例１−２と同じ方法で遂行した。
【００６９】
ＭＧ１３２は、特異的に２６Ｓプロテアソーム（ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ）を特異的に阻害して、正常酸素状態でもユビキチン接合ＨＩＦ−１αの分解を阻害する。本実験結果、ＣＱはＨＩＦ−１αのユビキチン化を妨害して正常酸素状態でＨＩＦ−１αを蓄積させて、これは実施例３−１の試験管内ユビキチン化の調査と同一な結果を得ることができた（図８）。
実施例４：ＦＩＨ−１に対するＣＱとＴＰＥＮの影響の調査
ＨＩＦ−１αによる転写活性は、８０３番アスパラギン残基の水酸化によって阻害され、これはＦＩＨ−１によってなされる（Ｄａｎｎ等，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，２００２年，第９９巻，１５３５１−１５３５６，頁；Ｌａｎｄｏ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００２年，第２９５巻，８５８−８６１頁）。ＨＩＦ−１αの８０３番アスパラギン残基の水酸化は、ＨＩＦ−１αと活性化補助因子であるＣＢＰとの結合を阻害するので、ＨＩＦ−１αはＦＩＨ−１の活性度が減少する時、活性が増加するので（Ｆｒｅｅｍａｎ等，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，２００２年，第９９巻，５３６７−５３７２頁）、ＣＱとＴＰＥＮがＦＩＨ−１の活性度に及ぼす影響を調査した。また、ＣＱとＺｎ（II）またはＣｕ（II）を実施例１−３と同じに処理してＦＩＨ−１の活性度に及ぼす影響を調査した。
実施例４−１：試験管内ＦＩＨ−１活性化の調査
ヒトＦＩＨ−１遺伝子（ＡＦ３９５８３０）は、ｐＥＴ２８ａベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ，米国）にクローニングし、ＦＩＨ−１をヒスチジン標識融合タンパク質でＥ．ｃｏｌｉで大量発現して、ニッケル−親和クロマトグラフィー（Ｎｉ−ａｆｆｉｎｉｔｙ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）で精製した。融合タンパク質は、ゲルろ過クロマトグラフィー（ｇｅｌ−ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：Ｈｉ−Ｌｏａｄ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００）で精製し、限外ろ過（ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）で濃縮した（Ｃｈｏｉ等，Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，２００５年，第６８巻，１８０３−１８０９頁）。
【００７０】
２０μｌ［３５Ｓ］−ラベルヒトＨＩＦ−１αタンパク質を精製したＦＩＨ−１タンパク質とともに反応バッファー（２００μｌ；２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．５），５ｍＭ ＫＣｌ，１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２，１ｍＭ ＤＴＴ，２ｍＭアスコルビン酸，２ｍＭ α−ケトグルタレート，２５０μＭ ＦｅＳＯ４）で１時間３０℃で反応するようにした。固定されたＧＳＴ−ＣＢＰ Ｎ−ドメイン（アミノ酸１−４５０）（Ｋａｍｅｉ等，Ｃｅｌｌ，１９９６年，第８５巻，４０３−４１４頁）１μｇを混合物それぞれに５００μｌ結合バッファー（２００ｍＭ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ（ｐＨ ８．０），１５０ｍＭ ＮａＣｌ，２０μＭ ＺｎＣｌ２，０．５ｍＭ ＤＴＴ）とともに混合して、４℃で１時間放置した。グルタチオン−ユニフローレジン（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ−ｕｎｉｆｌｏｗ ｒｅｓｉｎ）に結合したタンパク質を１ｍｌの０．１％Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０が含まれた結合バッファーで４回洗浄し、ＳＤＳ試料バッファーで加熱して溶出させてＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した（Ｄａｎｎ等，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，２００２年，第９９巻，１５３５１−１５３５６）。また、本発明者等は、ＨＩＦ−１αの８０３番残基アスパラギンをアラニンに入れ替えて、ＨＩＦ−１α突然変異体［ＨＩＦ−１α−Ｃ（Ｎ８０３Ａ）］を製作して、前記と同じ方法で実験してＦＩＨ−１の活性に及ぼす影響を調査した。
【００７１】
放射線標識されたＨＩＦ−１αを精製した組換えＦＩＨ−１と反応させ、ＣＱまたはＴＰＥＮ有無条件で遂行した。ＦＩＨ−１は、ＨＩＦ−１αの８０３番アスパラギン残基を水酸化させてＨＩＦ−１αの転写活性ドメインに結合するＣＢＰとの結合を阻害させるだろう（Ｍａｈｏｎ，Ｐ．Ｃ．等，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．，２００１年，第１５巻，２６７５−２６８６頁；Ｄａｎｎｍ Ｃ．Ｅ．Ｒ．等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ，２００２年，第９９巻，１５３５１−１５３５６頁；Ｌａｎｄｏ，Ｄ．，等，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００２年，第２９５巻，８５８−８６１頁；Ｆｒｅｅｄｍａｎ，Ｓ．Ｊ．等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃｉＵＳＡ，２００２年，第９９巻，５３６７−５３７２頁）。
【００７２】
実験の結果、放射性標識されたＨＩＦ−１αは、ビーズに結合したＧＳＲ−ＣＢＰタンパク質と結合して、ＦＩＨ−１単独処理時、ＨＩＦ−１αとＣＢＰとの結合が顕著に減少した（図１０Ａレーン１、４及び図１０Ｂレーン１、４）。ＦＩＨ−１は、ＨＩＦ−１αの８０３番目アスパラギンを水酸化させることで、ＨＩＦ−１αの転写活性ドメインとＣＢＰとの結合を減少させることにより、ＦＩＨ−１活性はＨＩＦ−１αとＣＢＰとの結合を減少させた。本発明者等は、ＦＩＨ−１活性に及ぼすＣＱの効果を確認した。ＣＱ（１０μＭ及び５０μＭ）存在時、ＦＩＨ−１の活性が減少することによりＨＩＦ−１αとＣＢＰとの結合が増加した（図１０Ａレーン５、６、図１０Ｂのライン５、図１１Ａレーン４及び図１１Ｂレーン４）。しかし、ＴＰＥＮの場合、ＦＩＨ−１活性を減少させることができなかった（図１０Ｂのライン３、６）。
【００７３】
Ｚｎ（II）またはＣｕ（II）が、ＣＱのＦＩＨ−１活性阻害に及ぼす影響を調査した。その結果、Ｃｕ（II）及びＺｎ（II）は、ＣＱのＦＩＨ−１活性阻害効果に影響を及ぼさなかった（図１１）。
【００７４】
本発明者等は、ＨＩＦ−１αの８０３番目アスパラギンをアラニンに入れ替えたＨＩＦ−１α−Ｃ（Ｎ８０３Ａ）突然変異体を製作して実験した。ＦＩＨ−１とＨＩＦ−１α−Ｃ（Ｎ８０３Ａ）を一緒に反応させた後、ＣＢＰとの結合を調査した。その結果、ＣＱの有無やＦＩＨ−１の有無は、ＣＢＰとＨＩＦ−１α−Ｃ（Ｎ８０３Ａ）との結合を変化させなかった。すなわち、ＣＱの効果は、ＦＩＨ−１がＨＩＦ−１αの８０３アスパラギン残基を水酸化する過程を抑制するからであることを間接的に提示している（図１２）。
実施例４−２：ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦを使用したＦＩＨ−１活性に対するＣＱ影響の調査
本発明者等は、ＦＩＨ−１の活性化をＦ−ＨＩＦ−１αペプチドのアスパラギン水酸化有無測定を通じて評価した。ペプチドの水酸化は、質量分析（Ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｙ）方法で測定した。
【００７５】
詳しくは、Ｎ末端にフルオレセイン（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）とａｃａ（アミノカプロン酸）リンカー（ＡｎｙＧｅｎ，ＫｗａｎｇＪｕ，韓国）を含んだＦ−ＨＩＦ−１α（７８８−８２２アミノ酸：ＦＩＴＣ−ａｃａ−ＤＥＳＧＬＰＱＬＴＳＹＤＣＥＶＮＡＰＩＱＧＳＲＮＬＬＱＧＥＥＬＬＲＡＬ）を、ＦＩＨ−１タンパク質との反応に使用した。前記Ｆ−ＨＩＦ−１αペプチドを、２．８μｇ組換えＦＩＨ−１が含まれた反応溶液［２０ｍＭ Ｔｒｉｓバッファー（ｐＨ７．５），５ｍＭ ＫＣｌ，１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１００μＭ α−ケトグルタル酸及び４００μＭアスコルビン酸：最終体積５０μｌ］に最終濃度が４μＭになるように添加した。その後、室温で２時間撹拌しながら反応させて、ＺｉｐＴｉｐＣ１８（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，米国）を使用して塩を除去した。前記Ｆ−ＨＩＦ−１αペプチドは、０．１％ＴＦＡ（ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）を含むアセトニトリル／蒸留水（５０：５０ｖ／ｖ）溶液にａ−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（ａ−ｃｙａｎｏ−４−ｈｙｄｒｏｘｙｃｉｎｎａｍｉｃ ａｃｉｄ）を添加してｔｉｐで溶出した。以後、０．１％ＴＦＡを含む蒸留水で洗浄した。溶出されたペプチド溶液をＭＡＬＤＩ試料プレートに移して、Ｖｏｙａｇｅｒアナライザー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，米国）を使用してＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ測定を遂行した。
【００７６】
その結果、ＦＩＨ−１処理時のペプチドの分子量が１６増加したＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ピークが観察された（図１３Ａ及び１３Ｂ）。これを通じて組換えＦＩＨ−１がＨＩＦ−１αの８０３番目アスパラギンを水酸化させることが分かった。これとは対照的に、ＣＱとＦＩＨ−１を一緒に処理した場合、分子量の変化を観察することができなかった（図１３Ｃ及び１３Ｄ）。これを通じて、ＣＱがＦＩＨ−１のアスパラギンを水酸化させる活性を阻害することが分かった。
実施例５：ＨＩＦ−１αによる低酸素誘導転写活性（ｈｙｐｏｘｉａ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）に対するＣＱとＴＰＥＮの影響の調査
実施例５−１：共−免疫沈降法（ｃｏ−ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）を使用したＣＱとＴＰＥＮの影響の調査
ヒトＨｅｐＧ２肝細胞は、１００ｍｍプレートに８０％になるように培養して、正常条件でＭＧ１３２（５μＭ）を６時間処理して、正常酸素状態でＣＱ１００μＭを処理した。全体細胞抽出物は、Ｊａａｋｋｏｌａなどの方法で準備した（Ｊａａｋｋｏｌａ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００１年，第２９２巻，４６８−４７２頁）。免疫沈殿のために全体細胞溶解質（ｌｙｓａｔｅ）試料２００μｇを抗マウスＩｇＧ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，米国）１μｇ、０．５％ＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ不活性プロテインＡ／Ｇゲル（Ｐｉｅｒｃｅ，米国）１０μｌと４℃で３０分間反応させた。プロテインＡ／Ｇゲルを除去した後、澄んだ反応液を抗−ＣＢＰ抗体（抗−ＣＢＰ抗体：Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，米国）１μｇと混合した。０．５％ＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ不活性プロテインＡ／Ｇゲル１５μｌを添加した後、混合物を４℃で１６時間以上放置した。免疫沈殿物を沈殿させて、ＰＢＳで４回洗浄した後、ＳＤＳ試料バッファーで反応を中断させた。試料は、５分間加熱して、８％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで電気泳動した後、セミドライ転写（Ｔｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ ＳＤ，Ｂｉｏ−Ｒｅｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，米国）を使用してニトロセルロース膜に移動させた。共−免疫沈降タンパク質を抗体−ヒトＨＩＦ−１α抗体（ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎＨＩＦ−１αａｎｔｉｂｏｄｙ）（ＢＤ，Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，米国）及び／または抗−ＣＢＰ抗体で反応させて、増進された化学発光（ｈａｎｃｅｄ ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）によって、抗−マウスまたは抗−ウサギＩｇ結合ホースラディシュペルオキシダーゼ（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ：ＨＲＰ）を２次抗体に使用して製作者の指示にしたがって（Ａｍｅｒｓｈａｍ，米国）視覚化させた。
【００７７】
本実験の結果、ＣＱを処理した細胞と低酸素状態の細胞でＨＩＦ−１αはＣＢＰと結合したが、ＭＧ１３２を処理した細胞ではＨＩＦ−１αがＣＢＰと結合しなかった（図１４Ａ）。ＭＧ１３２は、２６Ｓプロテアソームを特異的に阻害して、正常酸素状態でもユビキチン接合ＨＩＦ−１αの分解を阻害する。ＭＧ１３２処理細胞では、ＦＩＨ−１がＨＩＦ−１αの８０３番アスパラギン残基の水酸化が起きるのでＣＢＰと結合しない。ＴＰＥＮの場合、ＨＩＦ−１αとＣＢＰと結合しない（図１４）。
実施例５−２：レポーター遺伝子分析システムを使用したＣＱとＴＰＥＮの影響の調査
ヒトＨｅｐＧ２肝細胞５×１０４個になるように培養した後、１００ｎｇのＧａｌ４−作動レポータープラスミド（Ｇａｌ４結合サイト（ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ）とホタルルシフェラーゼ遺伝子（ｆｉｒｅｆｌｙ ｌｅｕｃｉｆｅｒａｓｅ ｇｅｎｅ）融合）とｐＧａｌ４／ＨＩＦ−１αプラスミド（酵母Ｇａｌ４タンパク質（１−１４７アミノ酸）のＤＮＡ結合ドメインと融合したＨＩＦ−１αを発現するプラスミド）を形質転換させた。形質転換されたヒトＨｅｐＧ２肝細胞を正常酸素状態と低酸素状態でそれぞれ培養した後、正常酸素状態にＣＱ（１０，５０μＭ）を１６時間処理し、形質転換して４８時間以後、ルシフェラーゼ分析をレポーター遺伝子分析システム（Ｐｒｏｍｅｇａ，米国）を使用して測定し、β−ガラクトシダーゼの活性度で値を平均化した。ＴＰＥＮの場合、ヒトＨｅｐＧ２肝細胞を正常酸素状態と低酸素状態で培養した後、それぞれＴＰＥＮ（５μＭ）を１６時間処理した。
【００７８】
Ｇａｌ４融合タンパク質は、Ｇａｌ４結合サイトに結合することができるので、リポーター遺伝子はＨＩＦ−１αが転写活性度を示す時のみ転写することができる。本実験結果、ＣＱは正常酸素状態でＨＩＦ−１αの転移活性度を増加させる。それとは対照的に、ＴＰＥＮの場合、低酸素状態ではＨＩＦ−１αの活性を増加させるが、正常酸素状態ではＨＩＦ−１αの活性を増加させることができない（図１５）。
実施例５−３：試験管内（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）ＨＩＦ−１αとＣＢＰの結合に対するＣＱとＴＰＥＮの影響の調査
２０μｌ［３５Ｓ］−ラベルヒトＨＩＦ−１αタンパク質と固定されたＧＳＴ−ＣＢＰ Ｎ−ドメイン（アミノ酸１−４５０）（Ｋａｗｅｉ等，Ｃｅｌｌ，１９９６年，第８５巻，４０３−４１３頁）を、ＺｎＣｌ２のない状態またはＺｎＣｌ２ ２０μＭで一緒に反応バッファー（２００μｌ；２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．５），５ｍＭ ＫＣｌ，１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２，１ｍＭ ＤＴＴ）で１時間、４℃で反応するようにした。グルタチオン−ユニフローレジン（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ−ｕｎｉｆｌｏｗ ｒｅｓｉｎ）に結合したタンパク質を１ｍｌの０．１％Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０が含まれた結合バッファーで４回洗浄し、ＳＤＳ試料バッファーで加熱して溶出させてＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した（Ｄａｎｎ等，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，２００２年，第９９巻，１５３５１−１５３５６頁）。
【００７９】
本実験の結果、ＣＢＰがＨＩＦ−１αと結合するためにジンクフィンガードメイン（ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ ｄｏｍａｉｎ）ＣＨ１を有しているにもかかわらず、ＺｎＣｌ２ 存在してＣＱとＴＰＥＮ処理時、ＨＩＦ−１αとＣＢＰとの結合には何らの影響を与えない（図１６）。
実施例６：ＨＩＦ−１α標的遺伝子ＶＥＧＦ及びＥＰＯの発現に対するＣＱに対する影響の調査
ヒトＨｅｐＧ２肝細胞及びＳＨ−ＳＹ５Ｙ脳細胞をＣＱ（１０，５０μＭ）を処理した後、正常酸素状態と低酸素状態で１６時間培養した。以後、全体ＲＮＡは、ＲＮａｓｅスピンカラム（Ｑｉａｇｅｎ，米国）を使用して分離した。ＶＥＧＦの発現は、ノーザンブロット方法を使用して調査した。ノーザンブロットハイブリダイゼーションは、３２Ｐ−ラベルされたＶＥＧＦ ｃＤＮＡプローブ及び３２Ｐ−ラベルされたＥＰＯ ｃＤＮＡプローブで遂行した。ノーザンブロット方法は、当業者に知られた公知の方法を使用した（Ｓａｍｂｒｏｏｋ等，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ，１９８９年）。
【００８０】
本実験の結果、ＣＱは正常酸素状態でＶＥＧＦ及びＥＰＯの発現を増加させる（図１７）。
実施例７：血管生成でのＣＱ及びＣＱ誘導体の影響の調査
本発明者等は、血管ＣＱ及びＣＱ誘導体が血管生成に及ぼす影響を調査するために、ＣＡＭ（ｃｈｏｒｉａｌｌａｎｔｏｉｃ ｍｅｍｂｒａｎｅ）分析を遂行した（Ｃｈｏ，Ｈ．等，Ｏｎｃｏｌ Ｒｅｐ．，２００４年，第１１（１）巻，１９１−１９５頁）。具体的に本発明者等は、受精したたまごを３７゜Ｃ及び５５％湿潤条件の湿潤培養器に保管した。１０日後に、たまごアルブミン２ｍｌを皮下注射器を使用して除去して、ＣＡＭ及び卵黄嚢が卵殻膜から分離するようにした。１０．５日に卵殻（１ｃｍ２）を除去した。血管形成能を調査するために、ＶＥＧＦ（１０ｎｇ）、ＣＱ（１０，５０μＭ溶液１０μｌ：３０．６ｎｇ，１５２．８ｎｇ）、５，７−ジイオド−８−ヒドロキシキノリン（１０，５０μＭ溶液１０ｕｌ：３９．７ｎｇ，１９８．５ｎｇ）、及び５，７−ジブロモ−８−ヒドロキシキノリン（１０，５０μＭ溶液１０ｕｌ：３０．３ｎｇ，１５１．５ｎｇ）が含まれた滅菌循環フィルターペーパー（０．５ｃｍ，ｄｉａｍｅｔｅｒ，Ｗｈａｔｍａｎｎ，ＵＫ）を室温で乾燥し、Ｙ型血管分岐点上のＣＡＭ（ｃｈｏｒｉａｌｌａｎｔｏｉｃ ｍｅｍｂｒａｎｅ）に適用した。３日以後に、１０％脂肪油剤１〜２ｍｌを繊毛尿膜に注入して顕微鏡で観察した。
【００８１】
その結果、ＣＱとその誘導体（５，７−ジイオド−８−ヒドロキシキノリン及び５，７−ジブロモ−８−ヒドロキシキノリン）が、血管生成を促進することを確認した（表１及び図１８）。
【００８２】
【表１】
【産業上の利用可能性】
【００８３】
前記で詳しくみたように、本発明のクリオキノール及びその誘導体は、正常酸素状態の細胞でＨＩＦ−１α（Ｈｙｐｏｘｉａ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｆａｃｔｏｒ−１α）のユビキチン化を阻害してＨＩＦ−１αを蓄積させる一方、ＦＩＨ−１の活性化を阻害してＨＩＦ−１αの転写活性を増加させて、ＨＩＦ−１α標的遺伝子であるＶＥＧＦ（ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）及びＥＰＯ（ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ）の発現を誘導するので、虚血性疾患治療剤として有用に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００８４】
【図１】クリオキノールとＴＰＥＮによるＨＩＦ−１αの発現をウエスタンブロット方法で調査した結果を示した図である。
【００８５】
Ｎ：正常酸素状態（ｎｏｒｍｏｘｉａ）
Ｈ：低酸素状態（ｈｙｐｏｘｉａ）
【図２】ＣＱ及び陽イオンによるＨＩＦ−１αの発現をウエスタンブロット方法で調査した結果を示した図である。
【００８６】
Ｎ：正常酸素状態
Ｈ：低酸素状態
【図３】ＣＱ及びＣＱ誘導体によるＨＩＦ−１αの発現をウエスタンブロット方法で調査した結果を示した図である。
【００８７】
Ｎ：正常酸素状態
Ｈ：低酸素状態
Ａ：５−クロロキノリン−８−イル アセテート
Ｂ：５，７−ジイオド−８−ヒドロキシキノリン
Ｃ：５，７−ジブロモ−８−ヒドロキシキノリン
Ｄ：８−ヒドロキシキノリン
【図４】ＣＱとＴＰＥＮによるＶＥＧＦの発現をＲＴ−ＰＣＲ方法で調査した結果を示した図である。
【００８８】
Ｎ：正常酸素状態
Ｈ：低酸素状態．
【図５】ＣＱ及びＣＱ誘導体によるＶＥＧＦ発現をＲＴ−ＰＣＲ方法で調査した結果を示した図である。
【００８９】
Ｎ：正常酸素状態
Ｈ：低酸素状態
Ａ：５−クロロキノリン−８−イル アセテート
Ｂ：５，７−ジイオド−８−ヒドロキシキノリン
Ｃ：５，７−ジブロモ−８−ヒドロキシキノリン
Ｄ：８−ヒドロキシキノリン
【図６】ＣＱとＴＰＥＮによるＨＲＥ依存遺伝子発現をレポーター遺伝子システム方法で調査した結果を示した図である。
【図７】ＰＨＤ２活性化に対するＣＱ及びＴＰＥＮの影響を調査した図である。
【図８】ＣＱによる試験管内（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）ＨＩＦ−１αユビキチン化の調査結果を示した図である。
【図９】ＣＱとＴＰＥＮによる生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）ＨＩＦ−１αユビキチン化の調査結果を示した図である。
【図１０】ＣＱとＴＰＥＮによるＦＩＨ−１活性変化を調査した図である。
【図１１】ＣＱと陽イオンによるＦＩＨ−１活性変化を調査した図である。
【図１２】ＨＩＦ−１α突然変異体を使用したＣＱによるＦＩＨ−１活性変化を調査した図である。
【図１３】ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ方法で分析したＣＱによるＦＩＨ−１活性変化を調査した図である。
【図１４】ＣＱによるＨＩＦ−１αとＣＢＰの結合増加を共―免疫沈降法を使用した調査（ｉｎ ｖｉｖｏ）結果を示した図である。
【図１５】ＣＱとＴＰＥＮによるＨＩＦ−１αによる低酸素誘導転移活性をレポーター遺伝子システム方法で調査した結果を示した図である。
【図１６】ＣＱとＴＰＥＮによる試験管内（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）ＨＩＦ−１αとＣＢＰとの結合に及ぼす影響の調査結果を示した面である。
【図１７】ＣＱとＴＰＥＮによるＶＥＧＦ及びＥＰＯ発現の調査結果を示した面である。
【図１８】ＣＱ及びＣＱ誘導体の血管生成能力を測定した写真である。
【配列表フリーテキスト】
【００９０】
配列番号１は、ＶＥＧＦ正方向プライマーである。
【００９１】
配列番号２は、ＶＥＧＦ逆方向プライマーである。
【００９２】
配列番号３は、１８ｓ正方向プライマーである。
【００９３】
配列番号４は、１８ｓ逆方向プライマーである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、クリオキノール（ｃｌｉｏｑｕｉｎｏｌ）及びその誘導体を有効成分として含むＨＩＦ−１α活性剤に関するもので、より詳細には、クリオキノール及びその誘導体を正常酸素状態でＨＩＦ−１αのユビキチン化を阻害してＨＩＦ−１αを蓄積させる一方、ＦＩＨ−１の活性を阻害して蓄積されたＨＩＦ−１αが転写活性を有するようにすることで、ＨＩＦ−１αの標的遺伝子であるＶＥＧＦ及びＥＰＯの発現を誘導することにより、虚血性疾患治療に使用することができる。
【背景技術】
【０００２】
虚血は、身体に部分的に生じる貧血状態で、血管が詰まったり減ったりすることによって生じる現象をいう。身体の各部分が機能を正常に遂行しようとすれば、血管を通じて適切な酸素と栄養が供給されなければならない。心臓も冠状動脈という血管を通じて必要な酸素と栄養の供給を受けている。しかし、必要量の血流量供給を受けることができなければ、心臓筋肉に代謝産物が積もって低酸素症に陥るようになって機能に障害が生じる。このような場合を心筋虚血であるという。そして、心筋虚血によって起きた心臓機能の障害を虚血性心臓疾患という。心臓疾患は、大きく分けて狭心症と心筋梗塞症に分けられる。一般的に男性が女性に比較して発生頻度が高くて年齢が高いほど、危険要素が揃った人であればあるほど、発生頻度が高い。虚血が発生する場合、血管が詰まって前記の疾病が発生し得、脳の血管が詰まって虚血性脳疾患が発病する。虚血によって血液循環が円滑ではない場合、身体末端でも問題になり得、この場合、末端組職の壊死が起きて虚血性末端疾患が発病し得る。このように虚血は、多くの疾患に発展し得るため、これに対する治療剤の開発が至急な実情である。
【０００３】
ＨＩＦ−１（Ｈｙｐｏｘｉａ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｆａｃｔｏｒ−１）は、酸素恒常性の主要調節子として、血管新生、赤血球形成、糖分解に係わる様々な遺伝子の発現を開始する転写誘導因子である（Ｍａｓｓｏｎ ａｎｄ Ｒａｔｃｌｉｆｆｅ，Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ，２００３年，第１１６巻，３０４１−３０４９頁；Ｓｅａｇｒｏｖｅｓ等，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，２００１年，第２１巻，３４３６−３４４４頁）。ＨＩＦ−１は、ＨＩＦ−１αとＨＩＦ−１βとで構成されている。ＨＩＦ−１αは、正常酸素状態でユビキチン−プロテアソームシステム（ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ ｓｙｓｔｅｍ）によって迅速に減少してＨＩＦ−１βのレベルは、一定に維持される（Ｈｕａｎｇ等，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，１９９８年，第９５巻，７９７８−７９９２頁；Ｋａｌｌｉｏ等，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，１９９９年，第２７４巻，６５１９−６５２５頁）。正常に酸素が供給されている状態でＨＩＦ−１αの５６４番及び／または４０２番プロリンは、ＰＨＤｓ（ＨＩＦ−１α−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｏｌｙ−４ ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅｓ）によって水酸化されて活性が抑制される。この過程で、酸素（Ｏ２）、２−オキソグルタル酸、ビタミンＣ、Ｆｅ２＋を必要とする（Ｂｒｕｉｋｃ ａｎｄ ＭｃＫｎｉｇｈｔ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００１年，第２９４巻，１３３７−１３４０頁；Ｅｐｓｔｅｉｎ等，Ｃｅｌｌ，２００１年，第１０７巻，４３−５４頁；Ｉｖａｎ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００１年，第２９２巻，４６４−４６８頁；Ｊａａｋｋｏｌａ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００１年，第２９２巻，４６８−４７２頁；Ｍａｓｓｏｎ等，ＥＭＢＯ Ｊ，２００１年，第２０巻，５１９７−５２０６頁）。哺乳動物細胞でＰＨＤｓのファミリーは、ＰＨＤ１（ＨＰＨ３，ＥＧＬＮ２）、ＰＨＤ２（ＨＰＨ２，ＥＧＬＮ１）、ＰＨＤ３（ＨＰＨ１，ＥＧＬＮ３）と明らかにされた（Ｈｕａｎｇ等，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２００２年，第２７７巻，３９７９２−３９８００頁；Ｔａｌｙｅｒ，Ｇｅｎｅ，２００１年，第２７５巻，１２５−１３２頁）。水酸化されたプロリン残基は、Ｅ３ユビキチン・リガーゼ構成成分であるＶＨＬ（ｖｏｎ Ｈｉｐｐｅｌ−Ｌｉｎｄａｕ）タンパク質と結合し、ＨＩＦ−１αは ＶＣＢ Ｅ３ユビキチン・リガーゼ複合体（ＶＨＬタンパク質，Ｅｌｏｎｇｉｎ Ｂ，Ｅｌｏｎｇｉｎ Ｃ，Ｃｕｌ２，Ｒｂｘ１）と結合しながらユビキチン化される（Ｉｗａｉ等，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，１９９９年，第９６巻，１２４３６−１２４４１頁；Ｋａｍｕｒａ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９９年，第２８４巻，６５７−６６１頁）。低酸素状態では、プロリン水酸化が減少しながらＨＩＦ−１αタンパク質が蓄積される。蓄積されたＨＩＦ−１αが、転写因子で活性化されるには、核に移動してＨＩＦ−１βと結合する。ＨＩＦ−１α／β異形複合体は、ターゲット遺伝子のプローモーターに位置する低酸素反応構成要素、ＨＲＥ（Ｈｙｐｏｘｉａ ｒｅｓｐｏｓｉｖｅ ｅｌｅｍｅｎｔ）というＤＮＡ配列に結合して、転写活性に必要な転写補助因子であるｐ３００／ＣＢＰなどのタンパク質に結合することで、血管生成及び細胞内エネルギー供給に必須なタンパク質の発現を増加させる（Ｎａｔｈａｌｉ等，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，２００４年，第６８巻，９７１−９８０頁）。
【０００４】
一方、酸素分子は、ＨＩＦ−１αの安定化を阻害するのみならず、ＨＩＦ−１αの転写活性を阻害する。ＦＩＨ−１（ｆａｃｔｏｒ ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ ＨＩＦ−１α）は、ＨＩＦ−１αの８０３番目アスパラギン残基を水酸化させる。ＨＩＦ−１αの転写活性ドメインのアスパラギン残基の水酸化は、ＨＩＦ−１αとＣＢＰとの結合を妨害して転写活性がないＨＩＦ−１αの蓄積を誘導する。ＦＩＨ−１は、最近発見されて、その活性が知られた酵素であり、その３次構造が明かされた（Ｌｅｅ等，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２００３年，第２７８巻，７５５８−７５６３頁；Ｅｌｋｉｎｓ等，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２００３年，第２７８巻，１８０２−１８０６頁）。ＦＩＨ−１もＰＨＤと同じくＦｅ２＋を補助因子に使用して、２−オキソグルタル酸、酸素（Ｏ２）を基質に使用してＨＩＦ−１αの８０３番目アスパラギン残基を水和させることが明らかにされた（Ｌａｎｄｏ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００２年，第２９５巻，８５８−８６５頁）。前記酵素は、ＰＨＤより２−オキソグルタル酸及び酸素に対するＫｍ値が２倍以上低く、ＰＨＤが作用することができない酸素分圧でも一部機能できることが明らかにされた（Ｋｏｉｖｕｎｅｎ等，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２００４年，第２７９巻，９８９９−９９０４頁）。
【０００５】
ＨＩＦ−１αの活性化によって発現が誘導される標的遺伝子は、ＥＰＯ（ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ）とＶＥＧＦ（ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）であり、前記遺伝子は、低酸素状態で保護機序の主要媒介子として作用する（Ｇｒｉｍｍ等，Ｎａｔ Ｍｅｄ，２００２年，第８巻，１７８−７２４頁：Ｃａｌｖｉｌｌｏ等，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，２００３年，第１００巻，４８０２−４８０６頁：Ｆｅｒｒｉｅｒｏ Ｄ．Ｍ．，Ｅｐｉｌｅｐｓｉａ．，２００５年，第４６巻，４５−５１頁；Ｓｉｍｏｎｓ，Ａ．，Ｗａｒｅ，Ｊ．Ａ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．，２００３年，第２巻，８６３−８７１頁）。ＥＰＯとその受容体は脳で発現されて、脳梗塞による損傷時の神経保護と連関していて（Ｄｉｇｉｃａｙｏｌｉｏｇｌｕ，Ｍ．等，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，１９９５年，第９２巻，３７１７−３７２０頁；Ｅｈｒｅｎｒｅｉｃｈ，Ｈ．等，Ｍｅｔａｂ Ｂｒａｉｎ Ｄｉｓ．，２００４年，第１９巻，１９５−２０６頁）、生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）で脳梗塞発生時にニューロンを保護することが報告された（Ｓａｓａｋｉ等，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，１９９８年，第９５巻，４６３５−４６４０頁）。ＶＥＧＦは、心筋梗塞研究において臨床１期及び２期実験で安定性と治療剤としての安定性が報告された（Ｙｏｏｎ，Ｙ．Ｓ．等，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２００４年，第２６４巻，１４９４−１５０４頁；Ｓｈａｈ，Ｐ．Ｂ．ａｎｄ Ｌｏｓｏｒｄｏ，Ｄ．Ｗ．，Ａｄｖ Ｇｅｎｅｔ，２００５年，第５４巻，３３９−３６１頁；Ｓｉｍｏｎｓ，Ｍ．ａｎｄ Ｗａｒｅ Ｊ．Ａ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．，２００３年，第２巻，８６３−８７１頁；Ｈｅｎｒｙ，Ｔ．Ｄ．等，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，２００３年，第１０７巻，１３５９−１３６５頁 ）。ＶＥＧＦの血管形成活性によって損傷受けたニューロンと神経グリア（ｎｅｕｒｏｎｇｌｉａ）で新しい保護活性を有する（Ｒｏｓｅｎｓｔｅｉｎ，Ｊ．Ｍ．ａｎｄ Ｋｒｕｍ，Ｋ，Ｅｘｐ Ｎｅｕｒｏｌ，２００４年，第１８７巻，２４６−２５３頁）。ＶＥＧＦのレベルが阻害されると、筋萎縮性側索硬化症が発生して、還流と神経保護機能が低下する（Ｓｔｏｒｋｅｂａｕｍ，Ｅ．．Ｌａｍｂｒｅｃｈｔｓ，Ｄ．，Ｃａｒｍｅｌｉｅｔ，Ｐ．，Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ，２０４年，第２６巻，９４３−９５４頁）。
【０００６】
クリオキノール（Ｃｌｉｏｑｕｉｎｏｌ：以下「ＣＱ」と略称する）は、Ｚｎ２＋、Ｃｕ２＋及びＣａ２＋のような重金属イオンを選択的にキレート化させて、酵素活性及びタンパク質形成において重金属イオンの効果を調節するのに使用される。ＣＱのｐＫａ値は、Ｃｕ２＋，１５．８；Ｚｎ２＋，１２．５；Ｃａ２＋，８．１；Ｍｇ２＋，８．６である（Ａｇｒａｗａｌ，Ｙ．Ｋ．等，Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ．，１９８６年，第７５巻，１９０−１９２頁）。ＣＱは疎水性であり、血管脳関門を通過する。ＣＱは最近アルツハイマー疾患、パーキンソン疾患、ホンチントン疾患でメタロタンパク質の沈殿とそれによる酸化ストレスを減少させるプロトタイプメタルタンパク質希少コンパウンド（ｐｒｏｔｏｔｙｐｅ ｍｅｔａｌ−ｐｒｏｔｅｉｎ ａｔｔｅｎｕａｔｉｎｇ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）として再評価されている。ＣＱは、１９００年代中盤に抗生剤として脚光を浴びたが、日本で骨髓・視覚神経病症の原因として明かされ回収された（Ｃｈｅｒｎｙ，Ｒ．Ａ．，Ｎｅｕｒｏｎ，２００１年，第３０巻，６６５−６７６頁；Ｋａｕｒ，Ｄ．等，Ｎｅｕｒｏｎ，２００３年，第３７巻，８９９−９０９頁；Ｎｇｕｙｅｎ Ｔ．等，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，２００５年，第１０２巻，１１８４０−１１８４５頁）。最近、アルツハイマー疾患動物モデルであるＡＰＰ２５７６形質転換マウス研究でＣＱは、アミロイドベータプラグとアミロイドセラム数値を副作用なしに減少させると報告された（Ｄｏｒａｉｓｗａｍｙ，Ｐ．Ｍ．等，Ｌａｎｃｅｔ Ｎｅｏｒｕｌ，２００４年，第３巻，４３１−４３４頁）。最近、２工程臨床の調査でアルツハイマー患者３６人を対象にした実験で、ＣＱは認知減退を遅延させ、有意性をもってアミロイドベータ濃度を減少させた（Ｒｉｔｃｈｉｅ Ｃ．Ｗ．等，Ａｒｃｈ Ｎｅｕｒｏｌ，２００３年，第６０巻，１６８５−１６９１頁）。
【０００７】
ＣＱはまた、多くのヒト癌細胞株で細胞死の原因になる。これは、細胞死滅過程を通じて起きる。ＣＱを処理した癌細胞株に銅またはジンク（ｚｉｎｃ）を添加しても、ＣＱによる細胞死は防ぐことができず、むしろさらに細胞死を増加させた。ＣＱ処理細胞に蛍光標識でジンク数値が増加することが観察されたが、これを通じてＣＱがイオン透過担体（ｚｉｎｃ ｉｏｎｏｐｈｏｒｅ）の活性化によって細胞死を起こすことが分かる（Ｄｉｎｇ，Ｗ．Ｏ．，等，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，２００５年，第６５巻，３３８９−３３９５頁）。
【０００８】
ＣＱのような金属キレートであるＴＰＥＮ（テトラキス−（２−ピリジルメチル）エチレンジアミン：Ｃ２６Ｈ２８Ｎ６）は、Ｚｎ２＋、Ｃｕ２＋及びＦｅ２＋のような重金属イオンを選択的にキレート化させて、酵素活性及びタンパク質形成において重金属イオンの効果を調節するのに使用される。ＴＰＥＮのｐＫａ値は、Ｃｕ２＋，２０．２；Ｚｎ２＋，１５．４；Ｆｅ３＋，１４．４；Ｃａ２＋，３である（Ｃｈｅｒｎｙ Ｒ．Ａ．等，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．，１９９９年，第２７４巻，２３２２３−２３２２８頁）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の主な目的は、虚血性疾患治療剤としてクリオキノールまたはその誘導体の新しい用途を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
前記目的を達成するために、本発明はクリオキノールまたはその誘導体を有効成分として含むＨＩＦ−１α活性剤を提供する。
【００１１】
また、本発明は、クリオキノールまたはその誘導体を有効成分として含むＦＩＨ−１阻害剤を提供する。
【００１２】
また、本発明は、クリオキノールまたはその誘導体を有効成分として含むＶＥＧＦ発現誘導剤を提供する。
【００１３】
また、本発明は、クリオキノールまたはその誘導体を有効成分として含むＥＰＯ発現誘導剤を提供する。
【００１４】
また、本発明は、クリオキノールまたはその誘導体を有効成分として含む虚血性疾患治療剤を提供する。
【００１５】
また、本発明は、クリオキノールまたはその誘導体を有効成分として含む血管生成誘導剤を提供する。
【００１６】
また、本発明は、治療的有効量のクリオキノールまたはその誘導体を虚血性疾患にかかった患者に投与する工程を含む虚血の治療方法を提供する。
【００１７】
同時に、本発明は、虚血性疾患治療剤の製造において、クリオキノールまたはその誘導体の用途を提供する。
【００１８】
以下、本発明を詳しく説明する。
【００１９】
本発明は、クリオキノールまたはその誘導体を有効成分として含むＨＩＦ−１α活性剤を提供する。
【００２０】
また、本発明は、クリオキノールまたはその誘導体を有効成分として含むＦＩＨ−１阻害剤を提供する。
【００２１】
また、本発明は、クリオキノールまたはその誘導体を有効成分として含むＶＥＧＦ発現誘導剤を提供する。
【００２２】
また、本発明は、クリオキノールまたはその誘導体を有効成分として含むＥＰＯ発現誘導剤を提供する。
【００２３】
クリオキノール（以下「ＣＱ」と略称する：化学式２）は、重金属キレーターとして、Ｚｎ２＋、Ｃｕ２＋及びＣａ２＋のような重金属イオンを選択的にキレート化させて、酵素活性及びタンパク質形成において重金属イオンの効果を調節するのに使用される。ＣＱのｐＫａ値は、Ｃｕ２＋、１５．８；Ｚｎ２＋、１２．５；Ｃａ２＋、８．１；Ｍｇ２＋、８．６である。
【００２４】
ＣＱまたはその誘導体は、下記の化学式１のような構造を有する。
【００２５】
【化１】
【００２６】
Ｒは、Ｈまたはアセチル基、Ｘ１及びＸ２は独立して、Ｈまたはハロゲン族。
【００２７】
前記ハロゲン族は、Ｆ、Ｂｒ、ＣｌまたはＩであることが好ましい。
【００２８】
ＣＱ（化学式２）の誘導体では、５−クロロキノリン−８−イル アセテート（５−ｃｈｌｏｒｏｑｕｉｎｏｌｉｎ−８−ｙｌ ａｃｅｔａｔｅ：化学式３）、５，７−ジイオド−８−ヒドロキシキノリン（５，７−ｄｉｉｏｄｏ−８−ｈｙｄｒｏｘｙｑｕｉｎｏｌｉｎｅ：化学式４）、５，７−ジブロモ−８−ヒドロキシキノリン（５，７−ｄｉｂｒｏｍｏ−８−ｈｙｄｒｏｘｙｑｕｉｎｏｌｉｎｅ：化学式５）、及び８−ヒドロキシキノリン（８−ｈｙｄｒｏｘｙｑｕｉｎｏｌｉｎｅ：化学式６）などがあり、その化学式を下記に示す。
【００２９】
【化２】
【００３０】
【化３】
【００３１】
【化４】
【００３２】
【化５】
【００３３】
【化６】
【００３４】
ＴＰＥＮ（テトラキス−（２−ピリジルメチル）エチレンジアミン：Ｃ２６Ｈ２８Ｎ６）は、Ｚｎ２＋、Ｃｕ２＋及びＦｅ２＋のような重金属イオンを選択的にキレート化させて、酵素活性及びタンパク質形成において重金属イオンの効果を調節するのに使用される。ＴＰＥＮのｐＫａ値は、Ｃｕ２＋、２０．２；Ｚｎ２＋、１５．４；Ｆｅ３＋、１４．４；Ｃａ２＋、３である（Ｃｈｅｒｎｙ Ｒ．Ａ．等，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．，１９９９年，第２７４巻，２３２２３−２３２２８頁）。
【００３５】
本発明の発明者等は、低酸素状態でＨＩＦ−１αメカニズムに関与するＰＨＤ２のようなＨＩＦ−１α調節子、ユビキチン化構成酵素、ＣＢＰタンパク質がジンクフィンガー（ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ）モチーブを有するので、重金属キレートであるＣＱがＨＩＦ−１αメカニズムに及ぼす影響を調査し、重金属キレートであるＴＰＥＮを使用してその効果を比較した。
【００３６】
本発明の発明者等は、ヒトＨｅｐＧ２肝細胞とＳＨ−ＳＹ５Ｙ脳細胞にＣＱとＴＰＥＮを処理して、ＨＩＦ−１αの活性化を調査した。その結果、正常酸素状態でＣＱとＴＰＥＮはすべてＨＩＦ−１αタンパク質を安定化させてその量を増加させた（図１参照）。また、正常酸素状態のＳＨ−ＳＹ５Ｙ脳細胞株にＣＱ及び陽イオン（Ｚｕ２＋、Ｃｕ２＋、Ｆｅ２＋）を処理した結果、Ｚｕ２＋及びＣｕ２＋をＣＱと処理した時、ＣＱのＨＩＦ−１α蓄積効果が減少したが、Ｆｅ２＋をＣＱと処理した時は、ＣＱのＨＩＦ−１α蓄積効果に影響を及ぼし得ないことを確認した（図２参照）。本発明者等は、ＣＱ誘導体（５−クロロキノリン−８−イル アセテート、５，７−ジイオド−８−ヒドロキシキノリン、５，７−ジブロモ−８−ヒドロキシキノリン及び８−ヒドロキシキノリン）をＨｅｐＧ２及びＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞株に処理した時、ＨＩＦ−１αの安定化を増加させることを確認した（図３参照）。以後、ＣＱとＴＰＥＮがＨＩＦ−１αの標的遺伝子であるＶＥＧＦの活性に及ぼす影響を、ＲＴ−ＰＣＲで調査した。その結果、正常酸素状態でＣＱがＴＰＥＮより非常に多くＶＥＧＦの発現を誘導することが確認された（図４参照）。また、ＣＱ誘導体（５−クロロキノリン−８−イル アセテート、５，７−ジイオド−８−ヒドロキシキノリン、５，７−ジブロモ−８−ヒドロキシキノリン及び８−ヒドロキシキノリン）が、ＨｅｐＧ２及びＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞株上でＶＥＧＦの発現を増加させた（図５参照）。それで、本発明者等は、低酸素状態で反応する低酸素反応構成要素（ｈｙｐｏｘｉａ−ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｅｌｅｍｅｎｔ：以下「ＨＲＥ」と略称する）で、ＣＱ及びＴＰＥＮの影響を調査した。その結果、ＣＱによって低酸素状態で反応するＨＲＥ−依存遺伝子が、正常酸素状態でも強く発現誘導されることが分かった（図６参照）。これを通じて、ＣＱとＴＰＥＮはＨＩＦ−１αを安定化させるが、標的遺伝子発現誘導のためのＨＩＦ−１αの転移活性においては差を示すので、ＣＱは ＴＰＥＮと異なりＨＩＦ−１α標的遺伝子であるＶＥＧＦの発現を誘導することが分かる。
【００３７】
本発明者等は、ＣＱがＰＨＤ２の変化に影響を与えるかどうか調査したが、ＶＨＬ（ｖｏｎ Ｈｉｐｐｅｌ−Ｌｉｎｄａｕ）とＨＩＦ−１αの結合が４０２／５６４番目プロリンの水酸化に依存するので、ヒトＨＩＦ−１αタンパク質のＯＤＤドメイン（４０１−６０３アミノ酸）による［３５Ｓ］−標識ＶＨＬ捕捉を測定して調査した。その結果、ＴＰＥＮはＣＱと異なりＰＨＤ２の活性を増加させた（図７参照）。これを通じて、亜鉛キレートであるＴＰＥＮとＣＱがＰＨＤ２の活性にお互いに異なって作用することが分かった。
【００３８】
正常酸素状態でＨＩＦ−１αは、ユビキチン化によって分解される。それで本発明者等は、ＣＱとＴＰＥＮがＨＩＦ−１αのユビキチン化に及ぼす影響を調査した。その結果、ＣＱとＴＰＥＮは、正常酸素状態でＨＩＦ−１αのユビキチン化を阻害した（図８及び図９参照）。ＨＩＦ−１αのユビキチン化は、ｐＶＨＬ、エロンジン（ｅｌｏｎｇｉｎ）Ｂ、エロンジンＣ、Ｃｕｌ２、ＲｂｘからなるＶＣＢ Ｅ３リガーゼ複合体によって成り立つ（Ｉｗａｉ等，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，１９９９年，第９６巻，１２４３６−１２４４１頁；Ｋａｍｕｒａ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ, １９９９年,第２８４巻,６５７−６６１頁）。Ｒｂｘ１は、ユビキチンリガーゼ活性度に重要な役割をするＲＩＮＧ−Ｈ２−タイプジンクフィンガードメインを有していて（Ｋａｍｕｒａ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９９年、第２８４巻,６５７−６６１頁）、ＣＱがこのような活性を阻害するものと考えられる（Ｗｅｂｓｔｅｒ等，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２００３年，第２７８巻，３８２３８−３８２４６頁）。これを通じて、ＣＱとＴＰＥＮがＨＩＦ−１αのユビキチン化阻害を通じて、正常酸素状態でＨＩＦ−１αタンパク質の量を増加させることが分かる。
【００３９】
ＨＩＦ−１α転写活性は、８０３番アスパラギン残基の水酸化によって阻害され、これはＦＩＨ−１によって成り立つ（Ｄａｎｎ等，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，２００２年，第９９巻，１５３５１−１５３５６頁；Ｌａｎｄｏ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００２年，第２９５巻，８５８−８６１頁）。ＨＩＦ−１αの８０３番アスパラギン残基の水酸化は、ＨＩＦ−１αと活性化補助因子であるＣＢＰとの結合を阻害して、転写活性がない（ｎｏｎ−ｆｕｎｃｔｉｏｎ）ＨＩＦ−１αの蓄積を誘導するので、ＨＩＦ−１αはＦＩＨ−１の活性度が減少する時、転写活性が増加するようになる（Ｆｒｅｅｍａｎ等，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，２００２年，第９９巻，５３６７−５３７２頁）。このような事実を基に本発明者等は、ＦＩＨ−１の活性度に及ぼすＣＱとＴＰＥＮの影響を調査した。放射線が標識されたＨＩＦ−１αを単独でレジンにローディングした場合、レジン中に充填されたＣＢＰと結合した（図１０Ａのレーン１及び図１０Ｂのレーン１参照）。放射線標識されたＨＩＦ−１αとＦＩＨ−１を反応させた時には、ＦＩＨ−１によってＨＩＦ−１αの８０３番アスパラギン残基が水酸化されて、ＨＩＦ−１αとＣＢＰとの結合を妨害した（図１０Ａのレーン４参照）。放射線標識されたＨＩＦ−１α、ＦＩＨ−１、ＴＰＥＮを一緒に反応させた時 、ＦＩＨ−１によって水和されたＨＩＦ−１αは、ＣＢＰと結合することができなかったが、それを通じてＴＰＥＮがＨＩＦ−１αに及ぼすＦＩＨ−１の活性に影響を及ぼすことができないことが分かる（図１０Ｂのレーン６参照）。放射線標識されたＨＩＦ−１αとＣＱを反応させた時、ＨＩＦ−１αはＣＢＰと結合して（図１０Ａのレーン２、３及び図１０Ｂのレーン２参照）、放射線標識されたＨＩＦ−１αとＦＩＨ、ＣＱを一緒に反応させた時、ＣＱの濃度が高くなれば、ＨＩＦ−１αに対するＦＩＨ−１の活性を減少させることが分かる（図１０Ａのレーン５、６及び図１０Ｂのレーン５参照）。
【００４０】
また、Ｚｎ（II）またはＣｕ（II）が、ＣＱのＦＩＨ−１活性阻害に及ぼす影響を調査した。その結果、Ｚｎ（II）またはＣｕ（II）は、ＣＱがＦＩＨ−１の活性を阻害させるのに影響を及ぼすことができないことを確認した（図１１のレーン４、５、６参照）。これを通じて、ＣＱはＺｎ（II）またはＣｕ（II）の有無とは無関係に、ＦＩＨ−１の活性を阻害することを確認した。以後、ＨＩＦ−１αの８０３番目アスパラギン残基をアラニンに入れ替えたＨＩＦ−１α−Ｃ（Ｎ８０３Ａ）突然変異体を製作して実験した。その結果、ＦＩＨ−１とＨＩＦ−１α−Ｃ（Ｎ８０３Ａ）を一緒に反応させた後、ＣＢＰとの結合を調査した。ＣＱの有無やＦＩＨ−１の有無は、ＣＢＰとＨＩＦ−１α−Ｃ（Ｎ８０３Ａ）との結合を変化させなかった。すなわち、ＣＱの効果は、ＦＩＨ−１がＨＩＦ−１αの８０３番目アスパラギン残基を水酸化する過程を抑制するからであることを間接的に提示している（図１２参照）。
【００４１】
本発明者等は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析方法を使用して、ＣＱ処理時のＦＩＨ−１の活性を調査した。その結果、ＣＱがＨＩＦ−１αの８０３番目アスパラギン残基の水酸化を阻害させることを確認した（図１３参照）
前記結果から分かるようにＣＱは、直接的にＨＩＦ−１αに対するＦＩＨ−１活性を減少させることが分かる。ＦＩＨ−１は、ＨＩＦ−１αの８０３番目アスパラギン残基を水酸化してＣＢＰとＨＩＦ−１αの転写活性ドメインとの結合を妨害する。ゆえに、ＣＱは ＦＩＨ−１によるＨＩＦ−１αの８０３番アスパラギン残基の水酸化を妨害して、それを通じて転写機能を完全に有する（ｆｕｎｃｔｉｏｎ）ＨＩＦ−１αを蓄積させる。ＴＰＥＮは、 ＦＩＨ−１の活性化を阻害することができないので、転写機能がない（ｎｏｎ−ｆｕｎｃｔｉｏｎ）ＨＩＦ−１αを増加させる。これを通じてＣＱは、ＰＨＤ２の活性は阻害しないで、ユビキチンによるタンパク質分解は抑制するので、プロリン残基が水酸化されたＨＩＦ−１αの蓄積を招来し、またＦＩＨ−１の活性を抑制することで蓄積されたＨＩＦ−１αの８０３番のアスパラギン残基は、水酸化されなくなる。
【００４２】
本発明者等は、ＨＩＦ−１αによる低酸素誘導転写活性（ｈｙｐｏｘｉａ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）に対する、ＣＱとＴＰＥＮの影響を調査した。これを調査するために共−免疫沈降法、リポーター遺伝子分析システム、ジンク存在下のＨＩＦ−１αとＣＢＰとの結合を調査した。共―免疫沈降法を使用した調査で、８０３番のアスパラギンが水酸化されないＨＩＦ−１αは、活性化補助因子であるＣＢＰと結合することが可能になる（図１４Ａレーン２参照）。一方、タンパク質分解抑制剤であるＭＧ１３２ あるいはＴＰＥＮの処理は、ＨＩＦ−１αタンパク質の蓄積を引き起こすが、ＦＩＨ−１の活性を抑制することができないので、蓄積されたＨＩＦ−１αは活性化補助因子であるＣＢＰとの結合をすることができない（図１４Ａレーン１、図１４Ｂレーン１、３参照）。イーストタンパク質であるＧＡＬ４のＤＮＡ結合部位とＨＩＦ−１αを融合したタンパク質（ＧＡＬ４−ＨＩＦ−１α）をＧＡＬ４結合部位を有するリポーターと一緒にトランスフェクションした後、ＧＡＬ４−ＨＩＦ−１αによるリポーター遺伝子の発現を調査することで、ＨＩＦ−１αの転写活性のみを調査した。ＣＱは、正常酸素状態にもかかわらずＨＩＦ−１αの転写活性を増加させた。それとは対照的に、ＴＰＥＮは正常酸素状態でＨＩＦ−１αの転移活性を増加させなかった（図１５参照）。ＣＢＰ自体がジンクフィンガードメインＣＨ１を有していて、このＣＨ１ドメインがＨＩＦ−１αと結合する部分であるので、ジンクキレーターであるＣＱとＴＰＥＮがＣＨ１ ドメイン構造を変化させることで、ＣＢＰとＨＩＦ−１αの結合を阻害する可能性を調査した。ジンク存在下のＨＩＦ−１αとＣＢＰとの結合の調査結果、ＣＱとＴＰＥＮがＨＩＦ−１αとＣＢＰとの結合に何らの影響を与えないことが分かった（図１６参照）。このような結果を通じて、ＣＱはＦＩＨ−１を抑制することでＨＩＦ−１αの転写活性を増大させて、正常酸素状態でＨＩＦ−１αとＣＢＰの結合を増加させる。
【００４３】
本発明の発明者等は、ノーザンブロット方法を通じてＣＱによるＨＩＦ−１α標的遺伝子ＶＥＧＦ及びＥＰＯの発現を調査した。その結果、ＣＱは正常酸素状態でＶＥＧＦ及びＥＰＯの発現を誘導した（図１７参照）。
【００４４】
本発明者等は、ＣＱ及びその誘導体が血管生成に及ぼす影響を調査した結果、ＶＥＧＦと同様に効果的な血管形成能力を有することを確認した（図１８参照）。
【００４５】
本発明は、ＣＱ及びその誘導体を有効成分として含む虚血性疾患治療剤を提供する。前記虚血性疾患治療剤は、虚血性心臓疾患、虚血性脳疾患、虚血性末端疾患を対象にする。
【００４６】
本発明の発明者等は、ＣＱがＶＥＧＦ及びＥＰＯの発現を誘導して、ＣＱ誘導体がＶＥＧＦの発現を誘導することを確認した。最近研究では、組換えＶＥＧＦタンパク質を使用して虚血性疾患及び心血管疾患を有した患者に適用したし（Ｙｏｏｎ Ｙ．Ｓ．等，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ，２００４年，第２６４巻，６３−７４頁；Ｈｅｎｒｙ Ｔ．Ｄ．等，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，２００３年，第１０７巻，１３５９−１３６５頁 ）、ＶＥＧＦ発現ベクターを虚血性心臓疾患患者に適用して安全性を確認した（Ｈｅｄｍａｎ Ｍ．等，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，２００３年，第１０７巻，２６７７−２６８３頁）。また、ＶＥＧＦの発現調節を通じて虚血性脳疾患で神経細胞保護効果が現われることが報告された（Ｓｔｏｒｋｅｂａｕｍ Ｅ．，Ｌａｍｂｒｅｃｈｔｓ Ｄ．，Ｃａｒｍｅｌｉｅｔ Ｐ．，Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ，２００４年，第２６巻，９４３−９５４頁；Ｊｉｎ Ｋ．Ｌ．，Ｍａｏ Ｘ．Ｏ．，Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ Ｄ．Ａ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，２０００年，第９７巻，１０２４２−１０２４７頁；Ｓｕｎ Ｙ．等，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ，２００３年，第１１１巻，１８４３−１８５１頁；Ｚｈｕ Ｗ．等，Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ，２００５年，第５７巻，３２５−３３３頁）。ＥＰＯの場合、組換えＥＰＯタンパク質は、心筋梗塞及び脳梗塞疾患で細胞保護効果を示すことが多数の論文で報告された（Ｃａｉ Ｚ．等，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，２００３年，第１０８巻，７９−８５頁；Ｅｈｒｅｎｒｅｉｃｈ Ｈ．等，Ｍｅｔａｂ Ｂｒａｉｎ Ｄｉｓ，２００４年，第１９巻，１９５−２０６頁；Ｓａｋａｎａｋａ Ｍ．等，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，１９９８年，第９５巻，４６３５−４６４０頁；Ｅｈｒｅｎｒｅｉｃｈ Ｈ．等，Ｍｏｌ Ｍｅｄ，２０００年，第８巻，４９５−５０５頁）。したがって、ＣＱ及びその誘導体は、ＶＥＧＦ及びＥＰＯ発現増加を通じて虚血性疾患の治療に使用することができる。
【００４７】
本発明のＣＱ及びその誘導体はそのまま、または薬学的に許容可能な塩の形態で使用することができる。本発明で使用可能な塩では、薬剤学的に許容可能な無毒性塩なら特別に限定されない。例えば、塩酸、硫酸、硝酸、リン酸、フッ化水素酸、ブロム化水素酸、ギ酸、酢酸、酒石酸、乳酸、クエン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、メタルスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、トルエンスルホ酸、ナフタリンスルホン酸などの塩形態で使用することができる。
【００４８】
本発明の虚血性疾患治療剤は、虚血性疾患の予防及び治療のために単独で、または手術、ホルモン治療、化学治療及び生物学的反応調節剤を使用する方法と併用して使用することができる。
【００４９】
本発明の虚血性疾患治療剤は、前記ＣＱ及びその誘導体に追加で同一または類似の機能を示す有効成分を１種以上含むことができる。薬剤学的に許容可能な担体は、食塩水、滅菌水、リンゲル液、緩衝食塩水、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液，グリセロール、エチルアルコール及びこれら成分の中で１成分以上を混合して使用することができ、必要によって抗酸化剤、緩衝液、静菌剤など他の通常の添加剤を添加することができる。本発明の組成物は、実際臨床投与時に経口及び非経口のさまざまな剤形で投与され得る。製剤化する場合には、普通使用する充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩解剤、界面活性剤などの希釈剤または賦形剤を使用して調剤される。さらに、当分野の適正な方法で、またはＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ（最近版）、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ ＰＡに開示されている方法を使用して、各疾患によってまたは成分によって好ましく製剤化することができる。
【００５０】
本発明の組成物は、目的とする方法によって経口投与したり非経口投与（例えば、静脈内、皮下、腹腔内または局所に適用）でき、投与量は患者の体重、年齢、性別、健康状態、食餌、投与時間、投与方法、排泄率及び疾患の重症度などによってその範囲が多様である。 投薬単位は、例えば個別投薬量の１、２、３または４倍で、または１／２、１／３または１／４倍を含むことができる。個別投薬量は、好ましくは有効薬物が１回に投与される量を含み、これは通常１日投与量の全部、１／２、１／３または１／４倍に当たる。
【００５１】
有効用量は、０．５〜６ｍｇ／ｋｇで、好ましくは３ｍｇ／ｋｇであり、一日に１〜３回投与することができる。用量は必ずこれに限定されるものではなく、患者の状態及び疾患の発病程度によって変わり得る。
【００５２】
本発明は、ＣＱ及びその誘導体を有効成分として含む血管新生誘導剤を提供する。
【００５３】
ＣＱ及びその誘導体は、ＶＥＧＦと同様に効果的に血管生成能力を有することで（図１８参照）、血管生成誘導剤として有用に使用することができる。
【００５４】
本発明は、治療的有効量のＣＱを虚血性疾患にかかった患者に投与する工程を含む虚血性疾患の治療方法を提供する。
【００５５】
前記虚血性疾患では、虚血性心臓疾患、虚血性脳疾患、虚血性末端疾患が含まれる。ＣＱは、好ましくは経口または注射液（静脈内または皮下）で投与され、対象に投与される正確な量は、担当医療者の責任下にある。しかし、ここに使用される治療的有効量は、対象の年及び性別、治療が行われる正確な疾病、及び疾病の重症度を含んだ多数の因子に影響を受ける。また、投与経路は、患者の状態及びその重症度によって変化することができる。
【００５６】
本発明は、虚血性疾患治療剤の製造において、ＣＱ及びその誘導体の用途を提供する。
【００５７】
本発明者等は、ＣＱ及びその誘導体がＨＩＦ−１αの転写活性を有するようにして、ＨＩＦ−１α標的遺伝子であるＶＥＧＦ及びＥＰＯの発現を誘導することを証明することにより、虚血性疾患治療剤の製造に使用され得るＣＱ及びその誘導体の新しい用途を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５８】
以下、本発明を実施例によって詳しく説明する。
【００５９】
但し、下記実施例は本発明を例示するだけであって、本発明の内容が下記実施例に限定されるものではない。
実施例１：ＨＩＦ−１α安定化に対するクリオキノール、その誘導体とＴＰＥＮの影響調査
実施例１−１：ＨｅｐＧ２細胞でＨＩＦ−１α安定化に対するＣＱとＴＰＥＮの影響調査
ヒトＨｅｐＧ２肝細胞（ｈｅｐａｔｏｍａ ｃｅｌｌ：ＡＴＣＣ ＨＢ−８０６５）を正常酸素状態と低酸素状態で培養した。ＨｅｐＧ２細胞は、非必須アミノ酸が含まれているＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，米国）に１０％ＦＢＳ（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ：Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ，米国）が入っている培地で培養した。細胞を低酸素状態で培養するために嫌気性培養器（ａｎａｅｒｏｂｉｃ ｉｎｃｕｂａｔｏｒ：Ｍｏｄｅｌ １０２９，Ｆｏｒｍａ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ．Ｉｎｃ）で５％ＣＯ２、１０％Ｈ２、８５％Ｎ２で３７℃で培養した。薬物と低酸素を一緒に処理した場合、薬物は１時間前に処理して、追加で低酸素処理をして、ＲＮＡ分離をする時は低酸素状態で１６時間培養した。タンパク質分離のためには、６時間低酸素状態で培養した。前記培養した正常酸素状態ヒトＨｅｐＧ２肝細胞には、ＣＱ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，米国）（１０，１００，５００μＭ）とＴＰＥＮ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，米国）（５μＭ）を、低酸素状態のヒトＨｅｐＧ２肝細胞には、ＣＱ（１０，１００μＭ）とＴＰＥＮ（５μＭ）を６時間処理した。その後、ウエスタンブロット方法でＨＩＦ−１αの発現を調査した。それぞれの群から取った試料を８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに電気泳動を遂行してニトロセルロース膜（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，米国）に移動させた。以後、１次抗体で抗−ヒトＨＩＦ−１α抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，米国）（１：８００に希釈）を使用し、２次抗体ではマウス−Ｉｇ複合ホースラディシュペルオキシダーゼ（ｍｏｕｓｅ Ｉｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）（１：３，０００に希釈）を使用した。対照群のために抗β―チュブリン（ｔｕｂｕｌｉｎ）抗体（ＢＤ，Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，米国）を使用した。
【００６０】
本実験の結果、ヒト肝細胞で正常酸素状態の時、ＴＰＥＮはＨＩＦ−１αタンパク質の量を増加させ、ＣＱもＨＩＦ−１αを大きく増加させた。低酸素状態では、対照群と比較した時、ＴＰＥＮ及びＣＱの両方でＨＩＦ−１αの蓄積が起きた（図１Ａ）。
実施例１−２：ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞でＨＩＦ−１α安定化に対するＣＱとＴＰＥＮの影響の調査
ヒトＳＨ−ＳＹ５Ｙ脳細胞（ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ ｃｅｌｌ：ＡＴＣＣ ＣＲＬ−２２６６）を正常酸素状態と低酸素状態で培養した。ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞は、非必須アミノ酸が含まれているＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，米国）に１０％ＦＢＳ（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ：Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ，米国）が入っている培地で培養した。細胞を低酸素状態で培養するために嫌気性培養器（ａｎａｅｒｏｂｉｃ ｉｎｃｕｂａｔｏｒ：Ｍｏｄｅｌ １０２９，Ｆｏｒｍａ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ．Ｉｎｃ）で５％ ＣＯ２、１０％Ｈ２、８５％Ｎ２で３７℃で培養した。薬物と低酸素を一緒に処理した場合、薬物は１時間前に処理して、追加で低酸素処理をし、ＲＮＡ分離をする時は低酸素状態で１６時間培養した。タンパク質分離のためには、６時間低酸素状態で培養した。前記培養した正常酸素状態のヒトＳＨ−ＳＹ５Ｙ脳細胞には、ＴＰＥＮ（５μＭ）とＣＱ（１０，１００μＭ）を、低酸素状態のヒトＳＨ−ＳＹ５Ｙ脳細胞には、ＣＱ（１００μＭ）を６時間処理した。その後、ウエスタンブロット方法でＨＩＦ−１αの発現を調査した。それぞれの群から取った試料を８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに電気泳動を遂行してニトロセルロース膜（Ｓｉｇｍａ，米国）に移動させた。以後、１次抗体で抗−ヒトＨＩＦ−１α抗体（ＢＤ，Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，米国）（１：８００に希釈）を使用し，２次抗体ではマウス−Ｉｇ複合ホースラディシュペルオキシダーゼ（ｍｏｕｓｅ Ｉｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）（１：３，０００に希釈）を使用した。対照群のために抗β―チュブリン抗体（ＢＤ，Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，米国）を使用した。
【００６１】
本実験の結果、ヒト神経細胞でＴＰＥＮは、ＨＩＦ−１αタンパク質量を増加させ、ＣＱもＨＩＦ−１αを多く蓄積させた。低酸素状態では対照群、ＴＰＥＮ、及びＣＱすべてでＨＩＦ−１αタンパク質量の蓄積が起きた（図１Ｂ）。
実施例１−３：ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞でのＨＩＦ−１α安定化に対するＣＱと陽イオンの影響の調査
ヒトＳＨ−ＳＹ５Ｙ脳細胞株を実施例１−２と同様に正常酸素状態と低酸素状態で培養した。ヒトＳＨ−ＳＹ５Ｙ脳細胞株を正常酸素状態で培養した後、ＣＱ（５０μＭ）を処理し、それぞれＺｎ２＋（１０μＭ）、Ｃｕ２＋（１０μＭ）及びＦｅ２＋（１０μＭ）を一緒に処理した後、１６時間培養した。以後、実施例１−２と同じ方法でウエスタンブロットを遂行してＨＩＦ−１αの発現を調査した。
【００６２】
実験結果、Ｚｎ（II）とＣｕ（II）添加時に、ＣＱの効果が減少した（図２Ａ）。これを通じてＨＩＦ−１αは、Ｚｎ（II）及びＣｕ（II）の枯渇によって安定化することが分かった。Ｆｅ（II）の添加の場合、ＣＱ効果を減少させることができないので（図２Ｂ）、Ｆｅ（II）はＣＱによるＨＩＦ−１αの安定化と関連しないことが分かった。
実施例１−４：ＨｅｐＧ２及びＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞でＨＩＦ−１α安定化に対するＣＱ誘導体の影響の調査
本発明者等は、ＣＱ誘導体（５−クロロキノリン−８−イル アセテート、５，７−ジイオド−８−ヒドロキシキノリン、５，７−ジブロモ−８−ヒドロキシキノリン、８−ヒドロキシキノリン）がＨｅｐＧ２及びＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞上でＨＩＦ−１αの安定化に及ぼす影響を調査し、実施例１−１及び実施例１−２と同一な方法で調査した。具体的に、ＨｅｐＧ２及びＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を実施例１−１及び１−２の方法で細胞株を培養し、ＣＱ及びＣＱ誘導体を５、１０、５０及び１００μＭの濃度で処理した。その後、実施例１−１及び実施例１−２と同じ方法でウエスタンブロットを遂行した。対照群のために抗Ｈｓｐ７０抗体（Ｓｔｒｅｓｓｇｅｎ，カナダ）を使用した。
【００６３】
その結果、ＣＱ誘導体（５−クロロキノリン−８−イル アセテート、５，７−ジイオド−８−ヒドロキシキノリン、５，７−ジブロモ−８−ヒドロキシキノリン、８−ヒドロキシキノリン）は、ＣＱと同じくＨＩＦ−１αを安定化させることを確認した（図３）。
実施例１−５：ＨＩＦ−１α標的遺伝子ＶＥＧＦ発現に対するＣＱとＴＰＥＮの影響の調査
ヒトＳＨ−ＳＹ５Ｙ脳細胞株とヒトＨｅｐＧ２肝細胞株を実施例１−１及び１−２と同様に正常酸素状態と低酸素状態で培養した。ヒトＳＨ−ＳＹ５Ｙ脳細胞とヒトＨｅｐＧ２ 肝細胞を正常酸素状態で培養した後、ＴＰＥＮ（５μＭ）、ＣＱ（１０，１００μＭ）を処理し、低酸素状態で培養した細胞株にはＴＰＥＮ（５μＭ）、ＣＱ（１００μＭ）を１６時間処理した。以後、全体ＲＮＡは、ＲＮａｓｅスピンカラム（Ｑｉａｇｅｎ，米国）を使用して分離した。分離したＲＮＡの中で１μｌを使用してＡＭＶ逆転写酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ，米国）とランダムヘキサマー（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ，米国）でｃＤＮＡを合成した。合成されたｃＤＮＡを鋳型にして配列番号１で記載されるＶＥＧＦ正方向プライマー（５’−ｃｃａｔｇａａｃｔｔｔｃｔｇｃｔｇｔｃｔｔ−３’）と配列番号２で記載されるＶＥＧＦ逆方向プライマー（５’−ａｔｃｇｃａｔｃａｇｇｇｇｃａｃａｃａｇ−３’）を使用してＲＴ−ＰＣＲを遂行した。ＲＴ−ＰＣＲ条件は、下記のとおりである。９５℃で５分間初期変性過程を経た後、９５℃で４５秒間変性反応、５６℃で４５秒間プライマー結合反応、７２℃で６０秒間長さ延長反応を遂行し、前記過程を３０回繰り返した。対照群に配列番号３で記載される１８Ｓ正方向プライマー（５’−ａｃｃｇｃａｇｃｔａｇｇａａｔａａｔｇｇａａｔａ−３’）と配列番号４で記載される１８Ｓ逆方向プライマー（５’−ｃｔｔｔｃｇｃｔｃｔｇｇｔｃｃｇｔｃｔｔ−３’）を使用してＰＣＲを遂行した。ＲＴ−ＰＣＲ条件は下記のとおりである。９５℃で５分間初期変性過程を経た後、９５℃で４５秒間変性反応、５６℃で４５秒間プライマー結合反応、７２℃で６０秒間長さ延長反応を遂行し、前記過程を３０回繰り返した。
【００６４】
本実験の結果、ヒトＳＨ−ＳＹ５Ｙ脳細胞株の場合、正常酸素状態でＣＱがＴＰＥＮとは異なってＶＥＧＦの発現を増加させることを確認した。低酸素状態の場合、ＣＱがＶＥＧＦの発現を増加させ、ＴＰＥＮの場合多少減少させた。ヒトＨｅｐＧ２肝細胞株の場合も、ＣＱがＴＰＥＮとは異なってＶＥＧＦの発現を増加させ、低酸素状態では対照群、ＴＰＥＮ、ＣＱを処理するにおいて、ＶＥＧＦの発現に変化がなかった（図４）。
実施例１−６：ＨＩＦ−１α標的遺伝子ＶＥＧＦ発現に対するＣＱ誘導体の影響の調査
ヒトＨｅｐＧ２細胞及びＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞株を実施例１−１及び１−２と同じ条件で培養した。以後、細胞にＣＱ及びＣＱ誘導体（５−クロロキノリン−８−イル アセテート、５，７−ジイオド−８−ヒドロキシキノリン、５，７−ジブロモ−８−ヒドロキシキノリン、及び８−ヒドロキシキノリン）を５、１０、５０及び１００μＭで処理して実施例１−５と同じ方法でＲＴ−ＰＣＲを遂行した。
【００６５】
その結果、ＨｅｐＧ２細胞株でＣＱ誘導体は、低酸素状態とＣＱを処理した時、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞株でよりＶＥＧＦの発現を増加させることができなかった。ＣＱ誘導体である５−クロロキノリン−８−イル アセテート（５０μＭ）、５，７−ジイオド−８−ヒドロキシキノリン（２５μＭ）及び８−ヒドロキシキノリン（５０μＭ）の場合、ＣＱが増加させたＶＥＧＦ発現増加量の４０〜５０％を増加させ、５，７−ジブロモ−８−ヒドロキシキノリン（５０μＭ）は、ＣＱが増加させたＶＥＧＦ発現増加量の６０〜７０％を増加させた（図５）。
実施例１−７：ＨｅｐＧ２肝細胞で低酸素反応構成要素（ＨＲＥ：ｈｙｐｏｘｉａ−ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｅｌｅｍｅｎｔ）−依存遺伝子発現に対するＣＱとＴＰＥＮの影響の調査
ヒトＨｅｐＧ２肝細胞を５×１０４個になるように培養した後、１００ｎｇのＨＲＥ−レポータープラスミド、ｐ（ＨＲＥ）４−ｌｕｃとβ−ガラクトシダーゼがクローニングされたｐＣＨＯ１１０を形質転換させた。形質転換したヒトＨｅｐＧ２肝細胞を正常酸素状態と低酸素状態でそれぞれ培養した後、それぞれＴＰＥＮ（５，１０μＭ）、ＣＱ（１０，５０μＭ）を１６時間それぞれ処理し、形質転換して４８時間以後、ルシフェラーゼ分析をレポーター遺伝子分析システム（Ｐｒｏｍｅｇａ，米国）を使用して測定し、β−ガラクトシダーゼの活性度の値を使用してサンプルごとに差がでるトランスフェクション効率を補正した。
【００６６】
本実験の結果、ＣＱはＴＰＥＮとは異なり、ＨＩＦ−１αの低酸素反応構成要素の活性を誘導することを確認した（図６）。
実施例２：ＰＨＤ２活性化に対するＣＱとＴＰＥＮの影響の調査
本発明者等は、ＰＨＤ２活性変化に及ぼすＣＱの影響を調査した。ヒトＰＨＤ−２遺伝子（ＡＪ３１０５４３）は、ｐＥＴ２１ｂ Ｈｉｓ２（＋）ベクターにクローニングし、ヒスチジンがタグされた融合タンパク質で大腸菌で過発現させて、Ｎｉ−吸着クロマトグラフィー方法で精製した（Ｃｈｏｉ，Ｋ．Ｏ．等，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．,２００５年,第６８巻，１８０３−１８０９頁）。これを使用して、Ｈａａｋｋｏｌａなどの方法で試験管内（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）ＶＨＬプルダウン分析（ｐｕｌｌ ｄｏｗｎ ａｓｓａｙ）を遂行した（Ｈａａｋｋｏｌａ，Ｐ．等，Ｓｃｉｅｎｃｅ,２００１年,第２９２巻，４６８−４７２頁）。詳しくは、［３５Ｓ］−メチオニン−標識ＶＨＬタンパク質（［３５Ｓ］−ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ−ｌａｂｅｌｅｄ ＶＨＬ ｐｒｏｔｅｉｎ）を製造社の方法にしたがってｐｃＤＮＡ３．１／ｍｙｃ−ｈｙｇｒｏ−ＶＨＬプラスミド（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｃａｔ＃ Ｌ１１７０，米国）を使用して試験管内転写及び翻訳によって合成した。ＧＳＴ−ＯＤＤ（ヒトＨＩＦ−１α４０１−６０３アミノ酸）は、大腸菌で発現させてグルタチオンユニフローレジン（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ−ｕｎｉｆｌｏｗ ｒｅｓｉｎ）を使用して製造社の方法（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｃａｔ＃ ８９１２−１，米国）にしたがって精製した。レジンに結合したＧＳＴ−ＯＤＤ（２００μｇタンパク質／約８０μｌレジン体積）は、１．５〜３μｇＰＨＤ２が含まれた２００μｌ ＮＥＴＮバッファー［２００ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）,１００ｍＭ ＮａＣｌ，１ｍＭ ＥＤＴＡ，０．５％Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０，１ｍＭ ＰＭＳＦ］に、２ｍＭアスコルビン酸、１００μＭ ＦｅＣｌ２，５ｍＭ α−ケトグルタレート（ｋｅｔｏｇｌｕｔａｒａｔｅ）が存在する状態で、３０℃条件で９０分間撹拌して反応させた。反応混合物を５００×ｇで２分間遠心分離し、１０倍体積のＮＥＴＮバッファーで３回洗浄した。レジンに結合されたＯＤＤは、１０μＭ［３５Ｓ］−標識ＶＨＬが含まれた５０μｌ ＥＢＣバッファー［１２０ｍＭ ＮａＣｌ，５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．５％（ｖ／ｖ）Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０］と混合した。４℃で２時間撹拌した後、レジンを１ｍｌ ＮＥＴＮバッファーで３回洗浄し、タンパク質は３Ｘ ＳＤＳサンプルバッファーで溶出後、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離して放射線撮影方法で検出した。それぞれの試料量は、クマシー染色法でＧＳＴ−ＯＤＤを染色してモニターした。
【００６７】
その結果、ＴＰＥＮはＣＱと異なり、ＰＨＤ２の活性を増加させた（図７）。
実施例３：ＨＩＦ−１αユビキチン化に対するＣＱとＴＰＥＮの影響の調査
実施例３−１：試験管内（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）ユビキチン化調査
ＨｅＬａ細胞は、ＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，米国）に１０％ＦＢＳ（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ：Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ，米国）が入っている培地で培養した。１００ｍＭ培養プレートに８０％程度育った時、ＨｅＬａ細胞を冷却した保存抽出バッファー（ｈｙｐｏｔｏｎｉｃ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ：２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．５），５ｍＭ ＫＣｌ，１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２，１ｍＭ ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ，２μｇ／ｍｌ ａｐｒｏｔｉｎｉｎ，２μｇ／ｍｌ ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ，０．２ｍＭ ＰＭＳＦ）で２回洗浄した。バッファー除去した後、細胞を細胞破砕機（Ｄｏｕｎｃｅ ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ）を使用して破砕して１０，０００×ｇで１０分間４℃で遠心分離を遂行して細胞残物と核酸を除去した。上澄み液（Ｓ−１０分画）は、−７０℃に保存した。ユビキチン化の調査は、３０℃で２７０分間遂行し、２μｌ［３５Ｓ］−ラベルヒトＨＩＦ−１α−プログラム網状赤血球、２７μｌ Ｓ−１０抽出物、４μｌ １０×ＡＴＰ−再生システム（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ ７．５）、１０ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍＭマグネシウムアセテート、３００ｍＭクレアチンホスファート、０．５μｇ／ｍｌクレアチンホスホキナーゼ）、５ｍｇ／ｍｌユビキチン（Ｓｉｇｍａ，米国）の４μｌ、１５０μＭユビキチンアルデヒド（Ｓｉｇｍａ，米国）０．８３μｌを含んで最終体積４０μｌになるようにして遂行した。ＣＱを処理した試料は、ＣＱ１００μＭを含んで遂行した。ＳＤＳ試料バッファーを添加し、反応生産物は６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに電気泳動した後、放射線写真撮影（ａｕｔｏｒａｄｉｏｇｒａｐｈｙ）で分析した（Ｃｏｃｋｍａｎ等，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２０００年，第２７５巻，２５７３３−２５７４１頁）。
【００６８】
本実験の結果、ＣＱはＨＩＦ−１αのユビキチン化を抑制することを確認した（図８）。
実施例３−２：生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）ユビキチン化調査
ヒトＨｅｐＧ２肝細胞株にＴＰＥＮ（５μＭ）、ＣＱ（１００μＭ）、ＭＧ１３２（５μＭ）を処理して、６時間正常酸素状態で培養した。その後、ウエスタンブロット方法でＨＩＦ−１αのユビキチン化を調査した。ウエスタンブロット方法は、実施例１−２と同じ方法で遂行した。
【００６９】
ＭＧ１３２は、特異的に２６Ｓプロテアソーム（ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ）を特異的に阻害して、正常酸素状態でもユビキチン接合ＨＩＦ−１αの分解を阻害する。本実験結果、ＣＱはＨＩＦ−１αのユビキチン化を妨害して正常酸素状態でＨＩＦ−１αを蓄積させて、これは実施例３−１の試験管内ユビキチン化の調査と同一な結果を得ることができた（図８）。
実施例４：ＦＩＨ−１に対するＣＱとＴＰＥＮの影響の調査
ＨＩＦ−１αによる転写活性は、８０３番アスパラギン残基の水酸化によって阻害され、これはＦＩＨ−１によってなされる（Ｄａｎｎ等，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，２００２年，第９９巻，１５３５１−１５３５６，頁；Ｌａｎｄｏ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００２年，第２９５巻，８５８−８６１頁）。ＨＩＦ−１αの８０３番アスパラギン残基の水酸化は、ＨＩＦ−１αと活性化補助因子であるＣＢＰとの結合を阻害するので、ＨＩＦ−１αはＦＩＨ−１の活性度が減少する時、活性が増加するので（Ｆｒｅｅｍａｎ等，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，２００２年，第９９巻，５３６７−５３７２頁）、ＣＱとＴＰＥＮがＦＩＨ−１の活性度に及ぼす影響を調査した。また、ＣＱとＺｎ（II）またはＣｕ（II）を実施例１−３と同じに処理してＦＩＨ−１の活性度に及ぼす影響を調査した。
実施例４−１：試験管内ＦＩＨ−１活性化の調査
ヒトＦＩＨ−１遺伝子（ＡＦ３９５８３０）は、ｐＥＴ２８ａベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ，米国）にクローニングし、ＦＩＨ−１をヒスチジン標識融合タンパク質でＥ．ｃｏｌｉで大量発現して、ニッケル−親和クロマトグラフィー（Ｎｉ−ａｆｆｉｎｉｔｙ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）で精製した。融合タンパク質は、ゲルろ過クロマトグラフィー（ｇｅｌ−ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：Ｈｉ−Ｌｏａｄ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００）で精製し、限外ろ過（ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）で濃縮した（Ｃｈｏｉ等，Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，２００５年，第６８巻，１８０３−１８０９頁）。
【００７０】
２０μｌ［３５Ｓ］−ラベルヒトＨＩＦ−１αタンパク質を精製したＦＩＨ−１タンパク質とともに反応バッファー（２００μｌ；２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．５），５ｍＭ ＫＣｌ，１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２，１ｍＭ ＤＴＴ，２ｍＭアスコルビン酸，２ｍＭ α−ケトグルタレート，２５０μＭ ＦｅＳＯ４）で１時間３０℃で反応するようにした。固定されたＧＳＴ−ＣＢＰ Ｎ−ドメイン（アミノ酸１−４５０）（Ｋａｍｅｉ等，Ｃｅｌｌ，１９９６年，第８５巻，４０３−４１４頁）１μｇを混合物それぞれに５００μｌ結合バッファー（２００ｍＭ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ（ｐＨ ８．０），１５０ｍＭ ＮａＣｌ，２０μＭ ＺｎＣｌ２，０．５ｍＭ ＤＴＴ）とともに混合して、４℃で１時間放置した。グルタチオン−ユニフローレジン（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ−ｕｎｉｆｌｏｗ ｒｅｓｉｎ）に結合したタンパク質を１ｍｌの０．１％Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０が含まれた結合バッファーで４回洗浄し、ＳＤＳ試料バッファーで加熱して溶出させてＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した（Ｄａｎｎ等，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，２００２年，第９９巻，１５３５１−１５３５６）。また、本発明者等は、ＨＩＦ−１αの８０３番残基アスパラギンをアラニンに入れ替えて、ＨＩＦ−１α突然変異体［ＨＩＦ−１α−Ｃ（Ｎ８０３Ａ）］を製作して、前記と同じ方法で実験してＦＩＨ−１の活性に及ぼす影響を調査した。
【００７１】
放射線標識されたＨＩＦ−１αを精製した組換えＦＩＨ−１と反応させ、ＣＱまたはＴＰＥＮ有無条件で遂行した。ＦＩＨ−１は、ＨＩＦ−１αの８０３番アスパラギン残基を水酸化させてＨＩＦ−１αの転写活性ドメインに結合するＣＢＰとの結合を阻害させるだろう（Ｍａｈｏｎ，Ｐ．Ｃ．等，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．，２００１年，第１５巻，２６７５−２６８６頁；Ｄａｎｎｍ Ｃ．Ｅ．Ｒ．等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ，２００２年，第９９巻，１５３５１−１５３５６頁；Ｌａｎｄｏ，Ｄ．，等，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００２年，第２９５巻，８５８−８６１頁；Ｆｒｅｅｄｍａｎ，Ｓ．Ｊ．等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃｉＵＳＡ，２００２年，第９９巻，５３６７−５３７２頁）。
【００７２】
実験の結果、放射性標識されたＨＩＦ−１αは、ビーズに結合したＧＳＲ−ＣＢＰタンパク質と結合して、ＦＩＨ−１単独処理時、ＨＩＦ−１αとＣＢＰとの結合が顕著に減少した（図１０Ａレーン１、４及び図１０Ｂレーン１、４）。ＦＩＨ−１は、ＨＩＦ−１αの８０３番目アスパラギンを水酸化させることで、ＨＩＦ−１αの転写活性ドメインとＣＢＰとの結合を減少させることにより、ＦＩＨ−１活性はＨＩＦ−１αとＣＢＰとの結合を減少させた。本発明者等は、ＦＩＨ−１活性に及ぼすＣＱの効果を確認した。ＣＱ（１０μＭ及び５０μＭ）存在時、ＦＩＨ−１の活性が減少することによりＨＩＦ−１αとＣＢＰとの結合が増加した（図１０Ａレーン５、６、図１０Ｂのライン５、図１１Ａレーン４及び図１１Ｂレーン４）。しかし、ＴＰＥＮの場合、ＦＩＨ−１活性を減少させることができなかった（図１０Ｂのライン３、６）。
【００７３】
Ｚｎ（II）またはＣｕ（II）が、ＣＱのＦＩＨ−１活性阻害に及ぼす影響を調査した。その結果、Ｃｕ（II）及びＺｎ（II）は、ＣＱのＦＩＨ−１活性阻害効果に影響を及ぼさなかった（図１１）。
【００７４】
本発明者等は、ＨＩＦ−１αの８０３番目アスパラギンをアラニンに入れ替えたＨＩＦ−１α−Ｃ（Ｎ８０３Ａ）突然変異体を製作して実験した。ＦＩＨ−１とＨＩＦ−１α−Ｃ（Ｎ８０３Ａ）を一緒に反応させた後、ＣＢＰとの結合を調査した。その結果、ＣＱの有無やＦＩＨ−１の有無は、ＣＢＰとＨＩＦ−１α−Ｃ（Ｎ８０３Ａ）との結合を変化させなかった。すなわち、ＣＱの効果は、ＦＩＨ−１がＨＩＦ−１αの８０３アスパラギン残基を水酸化する過程を抑制するからであることを間接的に提示している（図１２）。
実施例４−２：ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦを使用したＦＩＨ−１活性に対するＣＱ影響の調査
本発明者等は、ＦＩＨ−１の活性化をＦ−ＨＩＦ−１αペプチドのアスパラギン水酸化有無測定を通じて評価した。ペプチドの水酸化は、質量分析（Ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｙ）方法で測定した。
【００７５】
詳しくは、Ｎ末端にフルオレセイン（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）とａｃａ（アミノカプロン酸）リンカー（ＡｎｙＧｅｎ，ＫｗａｎｇＪｕ，韓国）を含んだＦ−ＨＩＦ−１α（７８８−８２２アミノ酸：ＦＩＴＣ−ａｃａ−ＤＥＳＧＬＰＱＬＴＳＹＤＣＥＶＮＡＰＩＱＧＳＲＮＬＬＱＧＥＥＬＬＲＡＬ）を、ＦＩＨ−１タンパク質との反応に使用した。前記Ｆ−ＨＩＦ−１αペプチドを、２．８μｇ組換えＦＩＨ−１が含まれた反応溶液［２０ｍＭ Ｔｒｉｓバッファー（ｐＨ７．５），５ｍＭ ＫＣｌ，１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１００μＭ α−ケトグルタル酸及び４００μＭアスコルビン酸：最終体積５０μｌ］に最終濃度が４μＭになるように添加した。その後、室温で２時間撹拌しながら反応させて、ＺｉｐＴｉｐＣ１８（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，米国）を使用して塩を除去した。前記Ｆ−ＨＩＦ−１αペプチドは、０．１％ＴＦＡ（ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）を含むアセトニトリル／蒸留水（５０：５０ｖ／ｖ）溶液にａ−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（ａ−ｃｙａｎｏ−４−ｈｙｄｒｏｘｙｃｉｎｎａｍｉｃ ａｃｉｄ）を添加してｔｉｐで溶出した。以後、０．１％ＴＦＡを含む蒸留水で洗浄した。溶出されたペプチド溶液をＭＡＬＤＩ試料プレートに移して、Ｖｏｙａｇｅｒアナライザー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，米国）を使用してＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ測定を遂行した。
【００７６】
その結果、ＦＩＨ−１処理時のペプチドの分子量が１６増加したＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ピークが観察された（図１３Ａ及び１３Ｂ）。これを通じて組換えＦＩＨ−１がＨＩＦ−１αの８０３番目アスパラギンを水酸化させることが分かった。これとは対照的に、ＣＱとＦＩＨ−１を一緒に処理した場合、分子量の変化を観察することができなかった（図１３Ｃ及び１３Ｄ）。これを通じて、ＣＱがＦＩＨ−１のアスパラギンを水酸化させる活性を阻害することが分かった。
実施例５：ＨＩＦ−１αによる低酸素誘導転写活性（ｈｙｐｏｘｉａ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）に対するＣＱとＴＰＥＮの影響の調査
実施例５−１：共−免疫沈降法（ｃｏ−ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）を使用したＣＱとＴＰＥＮの影響の調査
ヒトＨｅｐＧ２肝細胞は、１００ｍｍプレートに８０％になるように培養して、正常条件でＭＧ１３２（５μＭ）を６時間処理して、正常酸素状態でＣＱ１００μＭを処理した。全体細胞抽出物は、Ｊａａｋｋｏｌａなどの方法で準備した（Ｊａａｋｋｏｌａ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００１年，第２９２巻，４６８−４７２頁）。免疫沈殿のために全体細胞溶解質（ｌｙｓａｔｅ）試料２００μｇを抗マウスＩｇＧ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，米国）１μｇ、０．５％ＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ不活性プロテインＡ／Ｇゲル（Ｐｉｅｒｃｅ，米国）１０μｌと４℃で３０分間反応させた。プロテインＡ／Ｇゲルを除去した後、澄んだ反応液を抗−ＣＢＰ抗体（抗−ＣＢＰ抗体：Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，米国）１μｇと混合した。０．５％ＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ不活性プロテインＡ／Ｇゲル１５μｌを添加した後、混合物を４℃で１６時間以上放置した。免疫沈殿物を沈殿させて、ＰＢＳで４回洗浄した後、ＳＤＳ試料バッファーで反応を中断させた。試料は、５分間加熱して、８％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで電気泳動した後、セミドライ転写（Ｔｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ ＳＤ，Ｂｉｏ−Ｒｅｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，米国）を使用してニトロセルロース膜に移動させた。共−免疫沈降タンパク質を抗体−ヒトＨＩＦ−１α抗体（ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎＨＩＦ−１αａｎｔｉｂｏｄｙ）（ＢＤ，Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，米国）及び／または抗−ＣＢＰ抗体で反応させて、増進された化学発光（ｈａｎｃｅｄ ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）によって、抗−マウスまたは抗−ウサギＩｇ結合ホースラディシュペルオキシダーゼ（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ：ＨＲＰ）を２次抗体に使用して製作者の指示にしたがって（Ａｍｅｒｓｈａｍ，米国）視覚化させた。
【００７７】
本実験の結果、ＣＱを処理した細胞と低酸素状態の細胞でＨＩＦ−１αはＣＢＰと結合したが、ＭＧ１３２を処理した細胞ではＨＩＦ−１αがＣＢＰと結合しなかった（図１４Ａ）。ＭＧ１３２は、２６Ｓプロテアソームを特異的に阻害して、正常酸素状態でもユビキチン接合ＨＩＦ−１αの分解を阻害する。ＭＧ１３２処理細胞では、ＦＩＨ−１がＨＩＦ−１αの８０３番アスパラギン残基の水酸化が起きるのでＣＢＰと結合しない。ＴＰＥＮの場合、ＨＩＦ−１αとＣＢＰと結合しない（図１４）。
実施例５−２：レポーター遺伝子分析システムを使用したＣＱとＴＰＥＮの影響の調査
ヒトＨｅｐＧ２肝細胞５×１０４個になるように培養した後、１００ｎｇのＧａｌ４−作動レポータープラスミド（Ｇａｌ４結合サイト（ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ）とホタルルシフェラーゼ遺伝子（ｆｉｒｅｆｌｙ ｌｅｕｃｉｆｅｒａｓｅ ｇｅｎｅ）融合）とｐＧａｌ４／ＨＩＦ−１αプラスミド（酵母Ｇａｌ４タンパク質（１−１４７アミノ酸）のＤＮＡ結合ドメインと融合したＨＩＦ−１αを発現するプラスミド）を形質転換させた。形質転換されたヒトＨｅｐＧ２肝細胞を正常酸素状態と低酸素状態でそれぞれ培養した後、正常酸素状態にＣＱ（１０，５０μＭ）を１６時間処理し、形質転換して４８時間以後、ルシフェラーゼ分析をレポーター遺伝子分析システム（Ｐｒｏｍｅｇａ，米国）を使用して測定し、β−ガラクトシダーゼの活性度で値を平均化した。ＴＰＥＮの場合、ヒトＨｅｐＧ２肝細胞を正常酸素状態と低酸素状態で培養した後、それぞれＴＰＥＮ（５μＭ）を１６時間処理した。
【００７８】
Ｇａｌ４融合タンパク質は、Ｇａｌ４結合サイトに結合することができるので、リポーター遺伝子はＨＩＦ−１αが転写活性度を示す時のみ転写することができる。本実験結果、ＣＱは正常酸素状態でＨＩＦ−１αの転移活性度を増加させる。それとは対照的に、ＴＰＥＮの場合、低酸素状態ではＨＩＦ−１αの活性を増加させるが、正常酸素状態ではＨＩＦ−１αの活性を増加させることができない（図１５）。
実施例５−３：試験管内（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）ＨＩＦ−１αとＣＢＰの結合に対するＣＱとＴＰＥＮの影響の調査
２０μｌ［３５Ｓ］−ラベルヒトＨＩＦ−１αタンパク質と固定されたＧＳＴ−ＣＢＰ Ｎ−ドメイン（アミノ酸１−４５０）（Ｋａｗｅｉ等，Ｃｅｌｌ，１９９６年，第８５巻，４０３−４１３頁）を、ＺｎＣｌ２のない状態またはＺｎＣｌ２ ２０μＭで一緒に反応バッファー（２００μｌ；２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．５），５ｍＭ ＫＣｌ，１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２，１ｍＭ ＤＴＴ）で１時間、４℃で反応するようにした。グルタチオン−ユニフローレジン（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ−ｕｎｉｆｌｏｗ ｒｅｓｉｎ）に結合したタンパク質を１ｍｌの０．１％Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０が含まれた結合バッファーで４回洗浄し、ＳＤＳ試料バッファーで加熱して溶出させてＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した（Ｄａｎｎ等，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，２００２年，第９９巻，１５３５１−１５３５６頁）。
【００７９】
本実験の結果、ＣＢＰがＨＩＦ−１αと結合するためにジンクフィンガードメイン（ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ ｄｏｍａｉｎ）ＣＨ１を有しているにもかかわらず、ＺｎＣｌ２ 存在してＣＱとＴＰＥＮ処理時、ＨＩＦ−１αとＣＢＰとの結合には何らの影響を与えない（図１６）。
実施例６：ＨＩＦ−１α標的遺伝子ＶＥＧＦ及びＥＰＯの発現に対するＣＱに対する影響の調査
ヒトＨｅｐＧ２肝細胞及びＳＨ−ＳＹ５Ｙ脳細胞をＣＱ（１０，５０μＭ）を処理した後、正常酸素状態と低酸素状態で１６時間培養した。以後、全体ＲＮＡは、ＲＮａｓｅスピンカラム（Ｑｉａｇｅｎ，米国）を使用して分離した。ＶＥＧＦの発現は、ノーザンブロット方法を使用して調査した。ノーザンブロットハイブリダイゼーションは、３２Ｐ−ラベルされたＶＥＧＦ ｃＤＮＡプローブ及び３２Ｐ−ラベルされたＥＰＯ ｃＤＮＡプローブで遂行した。ノーザンブロット方法は、当業者に知られた公知の方法を使用した（Ｓａｍｂｒｏｏｋ等，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ，１９８９年）。
【００８０】
本実験の結果、ＣＱは正常酸素状態でＶＥＧＦ及びＥＰＯの発現を増加させる（図１７）。
実施例７：血管生成でのＣＱ及びＣＱ誘導体の影響の調査
本発明者等は、血管ＣＱ及びＣＱ誘導体が血管生成に及ぼす影響を調査するために、ＣＡＭ（ｃｈｏｒｉａｌｌａｎｔｏｉｃ ｍｅｍｂｒａｎｅ）分析を遂行した（Ｃｈｏ，Ｈ．等，Ｏｎｃｏｌ Ｒｅｐ．，２００４年，第１１（１）巻，１９１−１９５頁）。具体的に本発明者等は、受精したたまごを３７゜Ｃ及び５５％湿潤条件の湿潤培養器に保管した。１０日後に、たまごアルブミン２ｍｌを皮下注射器を使用して除去して、ＣＡＭ及び卵黄嚢が卵殻膜から分離するようにした。１０．５日に卵殻（１ｃｍ２）を除去した。血管形成能を調査するために、ＶＥＧＦ（１０ｎｇ）、ＣＱ（１０，５０μＭ溶液１０μｌ：３０．６ｎｇ，１５２．８ｎｇ）、５，７−ジイオド−８−ヒドロキシキノリン（１０，５０μＭ溶液１０ｕｌ：３９．７ｎｇ，１９８．５ｎｇ）、及び５，７−ジブロモ−８−ヒドロキシキノリン（１０，５０μＭ溶液１０ｕｌ：３０．３ｎｇ，１５１．５ｎｇ）が含まれた滅菌循環フィルターペーパー（０．５ｃｍ，ｄｉａｍｅｔｅｒ，Ｗｈａｔｍａｎｎ，ＵＫ）を室温で乾燥し、Ｙ型血管分岐点上のＣＡＭ（ｃｈｏｒｉａｌｌａｎｔｏｉｃ ｍｅｍｂｒａｎｅ）に適用した。３日以後に、１０％脂肪油剤１〜２ｍｌを繊毛尿膜に注入して顕微鏡で観察した。
【００８１】
その結果、ＣＱとその誘導体（５，７−ジイオド−８−ヒドロキシキノリン及び５，７−ジブロモ−８−ヒドロキシキノリン）が、血管生成を促進することを確認した（表１及び図１８）。
【００８２】
【表１】
【産業上の利用可能性】
【００８３】
前記で詳しくみたように、本発明のクリオキノール及びその誘導体は、正常酸素状態の細胞でＨＩＦ−１α（Ｈｙｐｏｘｉａ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｆａｃｔｏｒ−１α）のユビキチン化を阻害してＨＩＦ−１αを蓄積させる一方、ＦＩＨ−１の活性化を阻害してＨＩＦ−１αの転写活性を増加させて、ＨＩＦ−１α標的遺伝子であるＶＥＧＦ（ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）及びＥＰＯ（ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ）の発現を誘導するので、虚血性疾患治療剤として有用に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００８４】
【図１】クリオキノールとＴＰＥＮによるＨＩＦ−１αの発現をウエスタンブロット方法で調査した結果を示した図である。
【００８５】
Ｎ：正常酸素状態（ｎｏｒｍｏｘｉａ）
Ｈ：低酸素状態（ｈｙｐｏｘｉａ）
【図２】ＣＱ及び陽イオンによるＨＩＦ−１αの発現をウエスタンブロット方法で調査した結果を示した図である。
【００８６】
Ｎ：正常酸素状態
Ｈ：低酸素状態
【図３】ＣＱ及びＣＱ誘導体によるＨＩＦ−１αの発現をウエスタンブロット方法で調査した結果を示した図である。
【００８７】
Ｎ：正常酸素状態
Ｈ：低酸素状態
Ａ：５−クロロキノリン−８−イル アセテート
Ｂ：５，７−ジイオド−８−ヒドロキシキノリン
Ｃ：５，７−ジブロモ−８−ヒドロキシキノリン
Ｄ：８−ヒドロキシキノリン
【図４】ＣＱとＴＰＥＮによるＶＥＧＦの発現をＲＴ−ＰＣＲ方法で調査した結果を示した図である。
【００８８】
Ｎ：正常酸素状態
Ｈ：低酸素状態．
【図５】ＣＱ及びＣＱ誘導体によるＶＥＧＦ発現をＲＴ−ＰＣＲ方法で調査した結果を示した図である。
【００８９】
Ｎ：正常酸素状態
Ｈ：低酸素状態
Ａ：５−クロロキノリン−８−イル アセテート
Ｂ：５，７−ジイオド−８−ヒドロキシキノリン
Ｃ：５，７−ジブロモ−８−ヒドロキシキノリン
Ｄ：８−ヒドロキシキノリン
【図６】ＣＱとＴＰＥＮによるＨＲＥ依存遺伝子発現をレポーター遺伝子システム方法で調査した結果を示した図である。
【図７】ＰＨＤ２活性化に対するＣＱ及びＴＰＥＮの影響を調査した図である。
【図８】ＣＱによる試験管内（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）ＨＩＦ−１αユビキチン化の調査結果を示した図である。
【図９】ＣＱとＴＰＥＮによる生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）ＨＩＦ−１αユビキチン化の調査結果を示した図である。
【図１０】ＣＱとＴＰＥＮによるＦＩＨ−１活性変化を調査した図である。
【図１１】ＣＱと陽イオンによるＦＩＨ−１活性変化を調査した図である。
【図１２】ＨＩＦ−１α突然変異体を使用したＣＱによるＦＩＨ−１活性変化を調査した図である。
【図１３】ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ方法で分析したＣＱによるＦＩＨ−１活性変化を調査した図である。
【図１４】ＣＱによるＨＩＦ−１αとＣＢＰの結合増加を共―免疫沈降法を使用した調査（ｉｎ ｖｉｖｏ）結果を示した図である。
【図１５】ＣＱとＴＰＥＮによるＨＩＦ−１αによる低酸素誘導転移活性をレポーター遺伝子システム方法で調査した結果を示した図である。
【図１６】ＣＱとＴＰＥＮによる試験管内（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）ＨＩＦ−１αとＣＢＰとの結合に及ぼす影響の調査結果を示した面である。
【図１７】ＣＱとＴＰＥＮによるＶＥＧＦ及びＥＰＯ発現の調査結果を示した面である。
【図１８】ＣＱ及びＣＱ誘導体の血管生成能力を測定した写真である。
【配列表フリーテキスト】
【００９０】
配列番号１は、ＶＥＧＦ正方向プライマーである。
【００９１】
配列番号２は、ＶＥＧＦ逆方向プライマーである。
【００９２】
配列番号３は、１８ｓ正方向プライマーである。
【００９３】
配列番号４は、１８ｓ逆方向プライマーである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
クリオキノール（ｃｌｉｏｑｕｉｎｏｌ）またはその誘導体を有効成分として含む、ＨＩＦ（ｈｙｐｏｘｉａ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｆａｃｔｏｒ）−１α活性剤。
【請求項２】
クリオキノールまたはその誘導体が、下記の化学式の構造を有することを特徴とする、請求項１に記載のＨＩＦ−１α活性剤：
【化１】
式中、ＲはＨまたはアセチル基、Ｘ１またはＸ２は独立して、Ｈまたはハロゲン族。
【請求項３】
前記ハロゲン族が、Ｆ、Ｂｒ、ＣｌまたはＩであることを特徴とする、請求項２に記載のＨＩＦ−１α活性剤。
【請求項４】
クリオキノールの誘導体が、５−クロロキノリン−８−イル アセテート、５，７−ジイオド−８−ヒドロキシキノリン、５，７−ジブロモ−８−ヒドロキシキノリンまたは８−ヒドロキシキノリンであることを特徴とする、請求項１に記載のＨＩＦ−１α活性剤。
【請求項５】
クリオキノールまたはその誘導体が、ＨＩＦ−１αのユビキチン化を抑制したりＨＩＦ−１α転写活性を増大させたりすることを特徴とする、請求項１に記載のＨＩＦ−１α活性剤。
【請求項６】
クリオキノールまたはその誘導体を有効成分として含む、ＦＩＨ−１（ｆａｃｔｏｒ ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ ｈｙｐｏｘｉａ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｆａｃｔｏｒ−１α）活性阻害剤。
【請求項７】
クリオキノールまたはその誘導体が、下記の化学式の構造を有することを特徴とする、請求項６に記載のＦＩＨ−１活性阻害剤：
【化２】
式中、ＲはＨまたはアセチル基、 Ｘ１またはＸ２は独立して、Ｈまたはハロゲン族。
【請求項８】
前記ハロゲン族が、Ｆ、Ｂｒ、ＣｌまたはＩであることを特徴とする、請求項７に記載のＦＩＨ−１活性阻害剤。
【請求項９】
クリオキノールの誘導体が、５−クロロキノリン−８−イル アセテート、５，７−ジイオド−８−ヒドロキシキノリン、５，７−ジブロモ−８−ヒドロキシキノリンまたは８−ヒドロキシキノリンであることを特徴とする、請求項６に記載のＦＩＨ−１活性阻害剤。
【請求項１０】
クリオキノールまたはその誘導体を有効成分として含む、ＶＥＧＦ（ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）発現誘導剤。
【請求項１１】
クリオキノールまたはその誘導体が、下記の化学式の構造を有することを特徴とする、請求項１０に記載のＶＥＧＦ発現誘導剤：
【化３】
式中、ＲはＨまたはアセチル基、Ｘ１またはＸ２は独立して、Ｈまたはハロゲン族。
【請求項１２】
前記ハロゲン族が、Ｆ、Ｂｒ、ＣｌまたはＩであることを特徴とする、請求項１１に記載のＶＥＧＦ発現誘導剤。
【請求項１３】
クリオキノールの誘導体が、５−クロロキノリン−８−イル アセテート、５，７−ジイオド−８−ヒドロキシキノリン、５，７−ジブロモ−８−ヒドロキシキノリンまたは８−ヒドロキシキノリンであることを特徴とする、請求項１０に記載のＶＥＧＦ発現誘導剤。
【請求項１４】
クリオキノールまたはその誘導体を有効成分として含む、ＥＰＯ（ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ）発現誘導剤。
【請求項１５】
クリオキノールまたはその誘導体が、下記の化学式の構造を有することを特徴とする、請求項１４に記載のＥＰＯ発現誘導剤：
【化４】
式中、ＲはＨまたはアセチル基、Ｘ１またはＸ２は独立して、Ｈまたはハロゲン族
【請求項１６】
前記ハロゲン族が、Ｆ、Ｂｒ、ＣｌまたはＩであることを特徴とする、請求項１５に記載のＥＰＯ発現誘導剤。
【請求項１７】
クリオキノールの誘導体が、５−クロロキノリン−８−イル アセテート、５，７−ジイオド−８−ヒドロキシキノリン、５，７−ジブロモ−８−ヒドロキシキノリンまたは８−ヒドロキシキノリンであることを特徴とする、請求項１４に記載のＥＰＯ発現誘導剤。
【請求項１８】
クリオキノールまたはその誘導体を有効成分として含む、虚血性疾患治療剤。
【請求項１９】
クリオキノールまたはその誘導体が、下記の化学式の構造を有することを特徴とする、請求項１８に記載の虚血性疾患治療剤：
【化５】
式中、ＲはＨまたはアセチル基、Ｘ１またはＸ２は独立して、Ｈまたはハロゲン族。
【請求項２０】
前記ハロゲン族が、Ｆ、Ｂｒ、ＣｌまたはＩであることを特徴とする、請求項１９に記載の虚血性疾患治療剤。
【請求項２１】
クリオキノールの誘導体が、５−クロロキノリン−８−イル アセテート、５，７−ジイオド−８−ヒドロキシキノリン、５，７−ジブロモ−８−ヒドロキシキノリンまたは８−ヒドロキシキノリンであるのを特徴とする、請求項１８に記載の虚血性疾患治療剤。
【請求項２２】
虚血性疾患が、虚血性心臓疾患、虚血性脳疾患、虚血性末端疾患であることを特徴とする、請求項１８に記載の虚血性疾患治療剤。
【請求項２３】
クリオキノールまたはその誘導体を有効成分として含む、血管生成誘導剤。
【請求項２４】
クリオキノールまたはその誘導体が、下記の化学式の構造を有することを特徴とする、請求項２３に記載の血管生成誘導剤：
【化６】
式中、ＲはＨまたはアセチル基、Ｘ１またはＸ２は独立して、Ｈまたはハロゲン族
【請求項２５】
前記ハロゲン族が、Ｆ、Ｂｒ、ＣｌまたはＩであることを特徴とする、請求項２４に記載の血管生成誘導剤。
【請求項２６】
クリオキノールの誘導体が、５−クロロキノリン−８−イル アセテート、５，７−ジイオド−８−ヒドロキシキノリン、５，７−ジブロモ−８−ヒドロキシキノリンまたは８−ヒドロキシキノリンであることを特徴とする、請求項２３に記載の血管生成誘導剤。
【請求項２７】
治療的有効量のクリオキノールまたはその誘導体を、虚血性疾患にかかった患者に投与する工程を含む虚血性疾患の治療方法。
【請求項２８】
クリオキノールまたはその誘導体が、下記の化学式の構造を有することを特徴とする、請求項２７に記載の虚血性疾患の治療方法：
【化７】
式中、ＲはＨまたはアセチル基、Ｘ１またはＸ２は独立して、Ｈまたはハロゲン族
【請求項２９】
前記ハロゲン族が、Ｆ、Ｂｒ、ＣｌまたはＩであることを特徴とする、請求項２８に記載の虚血性疾患の治療方法。
【請求項３０】
クリオキノールの誘導体が、５−クロロキノリン−８−イル アセテート、５，７−ジイオド−８−ヒドロキシキノリン、５，７−ジブロモ−８−ヒドロキシキノリンまたは８−ヒドロキシキノリンであることを特徴とする、請求項２７に記載の虚血性疾患の治療方法。
【請求項３１】
虚血性疾患治療剤の製造において、クリオキノールまたはその誘導体の用途。
【請求項１】
クリオキノール（ｃｌｉｏｑｕｉｎｏｌ）またはその誘導体を有効成分として含む、ＨＩＦ（ｈｙｐｏｘｉａ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｆａｃｔｏｒ）−１α活性剤。
【請求項２】
クリオキノールまたはその誘導体が、下記の化学式の構造を有することを特徴とする、請求項１に記載のＨＩＦ−１α活性剤：
【化１】
式中、ＲはＨまたはアセチル基、Ｘ１またはＸ２は独立して、Ｈまたはハロゲン族。
【請求項３】
前記ハロゲン族が、Ｆ、Ｂｒ、ＣｌまたはＩであることを特徴とする、請求項２に記載のＨＩＦ−１α活性剤。
【請求項４】
クリオキノールの誘導体が、５−クロロキノリン−８−イル アセテート、５，７−ジイオド−８−ヒドロキシキノリン、５，７−ジブロモ−８−ヒドロキシキノリンまたは８−ヒドロキシキノリンであることを特徴とする、請求項１に記載のＨＩＦ−１α活性剤。
【請求項５】
クリオキノールまたはその誘導体が、ＨＩＦ−１αのユビキチン化を抑制したりＨＩＦ−１α転写活性を増大させたりすることを特徴とする、請求項１に記載のＨＩＦ−１α活性剤。
【請求項６】
クリオキノールまたはその誘導体を有効成分として含む、ＦＩＨ−１（ｆａｃｔｏｒ ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ ｈｙｐｏｘｉａ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｆａｃｔｏｒ−１α）活性阻害剤。
【請求項７】
クリオキノールまたはその誘導体が、下記の化学式の構造を有することを特徴とする、請求項６に記載のＦＩＨ−１活性阻害剤：
【化２】
式中、ＲはＨまたはアセチル基、 Ｘ１またはＸ２は独立して、Ｈまたはハロゲン族。
【請求項８】
前記ハロゲン族が、Ｆ、Ｂｒ、ＣｌまたはＩであることを特徴とする、請求項７に記載のＦＩＨ−１活性阻害剤。
【請求項９】
クリオキノールの誘導体が、５−クロロキノリン−８−イル アセテート、５，７−ジイオド−８−ヒドロキシキノリン、５，７−ジブロモ−８−ヒドロキシキノリンまたは８−ヒドロキシキノリンであることを特徴とする、請求項６に記載のＦＩＨ−１活性阻害剤。
【請求項１０】
クリオキノールまたはその誘導体を有効成分として含む、ＶＥＧＦ（ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）発現誘導剤。
【請求項１１】
クリオキノールまたはその誘導体が、下記の化学式の構造を有することを特徴とする、請求項１０に記載のＶＥＧＦ発現誘導剤：
【化３】
式中、ＲはＨまたはアセチル基、Ｘ１またはＸ２は独立して、Ｈまたはハロゲン族。
【請求項１２】
前記ハロゲン族が、Ｆ、Ｂｒ、ＣｌまたはＩであることを特徴とする、請求項１１に記載のＶＥＧＦ発現誘導剤。
【請求項１３】
クリオキノールの誘導体が、５−クロロキノリン−８−イル アセテート、５，７−ジイオド−８−ヒドロキシキノリン、５，７−ジブロモ−８−ヒドロキシキノリンまたは８−ヒドロキシキノリンであることを特徴とする、請求項１０に記載のＶＥＧＦ発現誘導剤。
【請求項１４】
クリオキノールまたはその誘導体を有効成分として含む、ＥＰＯ（ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ）発現誘導剤。
【請求項１５】
クリオキノールまたはその誘導体が、下記の化学式の構造を有することを特徴とする、請求項１４に記載のＥＰＯ発現誘導剤：
【化４】
式中、ＲはＨまたはアセチル基、Ｘ１またはＸ２は独立して、Ｈまたはハロゲン族
【請求項１６】
前記ハロゲン族が、Ｆ、Ｂｒ、ＣｌまたはＩであることを特徴とする、請求項１５に記載のＥＰＯ発現誘導剤。
【請求項１７】
クリオキノールの誘導体が、５−クロロキノリン−８−イル アセテート、５，７−ジイオド−８−ヒドロキシキノリン、５，７−ジブロモ−８−ヒドロキシキノリンまたは８−ヒドロキシキノリンであることを特徴とする、請求項１４に記載のＥＰＯ発現誘導剤。
【請求項１８】
クリオキノールまたはその誘導体を有効成分として含む、虚血性疾患治療剤。
【請求項１９】
クリオキノールまたはその誘導体が、下記の化学式の構造を有することを特徴とする、請求項１８に記載の虚血性疾患治療剤：
【化５】
式中、ＲはＨまたはアセチル基、Ｘ１またはＸ２は独立して、Ｈまたはハロゲン族。
【請求項２０】
前記ハロゲン族が、Ｆ、Ｂｒ、ＣｌまたはＩであることを特徴とする、請求項１９に記載の虚血性疾患治療剤。
【請求項２１】
クリオキノールの誘導体が、５−クロロキノリン−８−イル アセテート、５，７−ジイオド−８−ヒドロキシキノリン、５，７−ジブロモ−８−ヒドロキシキノリンまたは８−ヒドロキシキノリンであるのを特徴とする、請求項１８に記載の虚血性疾患治療剤。
【請求項２２】
虚血性疾患が、虚血性心臓疾患、虚血性脳疾患、虚血性末端疾患であることを特徴とする、請求項１８に記載の虚血性疾患治療剤。
【請求項２３】
クリオキノールまたはその誘導体を有効成分として含む、血管生成誘導剤。
【請求項２４】
クリオキノールまたはその誘導体が、下記の化学式の構造を有することを特徴とする、請求項２３に記載の血管生成誘導剤：
【化６】
式中、ＲはＨまたはアセチル基、Ｘ１またはＸ２は独立して、Ｈまたはハロゲン族
【請求項２５】
前記ハロゲン族が、Ｆ、Ｂｒ、ＣｌまたはＩであることを特徴とする、請求項２４に記載の血管生成誘導剤。
【請求項２６】
クリオキノールの誘導体が、５−クロロキノリン−８−イル アセテート、５，７−ジイオド−８−ヒドロキシキノリン、５，７−ジブロモ−８−ヒドロキシキノリンまたは８−ヒドロキシキノリンであることを特徴とする、請求項２３に記載の血管生成誘導剤。
【請求項２７】
治療的有効量のクリオキノールまたはその誘導体を、虚血性疾患にかかった患者に投与する工程を含む虚血性疾患の治療方法。
【請求項２８】
クリオキノールまたはその誘導体が、下記の化学式の構造を有することを特徴とする、請求項２７に記載の虚血性疾患の治療方法：
【化７】
式中、ＲはＨまたはアセチル基、Ｘ１またはＸ２は独立して、Ｈまたはハロゲン族
【請求項２９】
前記ハロゲン族が、Ｆ、Ｂｒ、ＣｌまたはＩであることを特徴とする、請求項２８に記載の虚血性疾患の治療方法。
【請求項３０】
クリオキノールの誘導体が、５−クロロキノリン−８−イル アセテート、５，７−ジイオド−８−ヒドロキシキノリン、５，７−ジブロモ−８−ヒドロキシキノリンまたは８−ヒドロキシキノリンであることを特徴とする、請求項２７に記載の虚血性疾患の治療方法。
【請求項３１】
虚血性疾患治療剤の製造において、クリオキノールまたはその誘導体の用途。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【公表番号】特表２００９−５２２３５３（Ｐ２００９−５２２３５３Ａ）
【公表日】平成２１年６月１１日（２００９．６．１１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５４９４３１（Ｐ２００８−５４９４３１）
【出願日】平成１９年１月１５日（２００７．１．１５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００７／０００２４２
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０８６６６３
【国際公開日】平成１９年８月２日（２００７．８．２）
【出願人】（５０８２０６３２４）ユニバーシティ オブ ソウル ファンデーション オブ インダストリアル アンド アカデミック コーポレーション (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年６月１１日（２００９．６．１１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１月１５日（２００７．１．１５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００７／０００２４２
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０８６６６３
【国際公開日】平成１９年８月２日（２００７．８．２）
【出願人】（５０８２０６３２４）ユニバーシティ オブ ソウル ファンデーション オブ インダストリアル アンド アカデミック コーポレーション (1)
【Ｆターム（参考）】
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