ＨＩＦ−１αＣ−末端ペプチドとＣＢＰまたはｐ３００蛋白質間の結合を定量分析する方法、及び前記方法を利用した抑制剤のスクリーニング方法
【課題】本発明は、蛍光物質で標識されたＨＩＦ−１αＣ−末端ペプチドとＣＢＰまたはｐ３００蛋白質間の結合を定量分析する方法、及び前記方法を利用したＨＩＦ−１α−ｐ３００またはＨＩＦ−１α−ＣＢＰ蛋白質複合体の形成を阻害する抑制剤のスクリーニング方法を提供する。
【解決手段】本発明の蛍光偏光測定方法は、ＨＩＦ−１α−ＣＢＰまたはＨＩＦ−１α−ｐ３００の反応を体系的に評価し、ｐ３００蛋白質の補充時、ＨＩＦ−１αＣ−末端トランス活性ドメインペプチドの蛋白質合成後の変形（水酸化、Ｓ−ニトロソ化、及びリン酸化）の作用を調査するのに有用である。
【解決手段】本発明の蛍光偏光測定方法は、ＨＩＦ−１α−ＣＢＰまたはＨＩＦ−１α−ｐ３００の反応を体系的に評価し、ｐ３００蛋白質の補充時、ＨＩＦ−１αＣ−末端トランス活性ドメインペプチドの蛋白質合成後の変形（水酸化、Ｓ−ニトロソ化、及びリン酸化）の作用を調査するのに有用である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペプチドの結合、より詳しくは、蛍光物質で標識されたＨＩＦ−１αＣ−末端ペプチドとＣＢＰまたはｐ３００蛋白質間の結合を定量分析する方法、及び前記方法、つまり、蛍光偏光に基づいた結合分析法を利用したＨＩＦ−１αペプチドとＣＢＰまたはｐ３００蛋白質間の結合を阻害する抑制剤のスクリーニング方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
動物細胞が酸素数値の変化を感知及び反応する能力を持つことは生存に必須であり、このような能力は、血管形成、心筋虚血、脳虚血、肺性高血圧、及び多様な種類の癌のような人間の病気だけでなく、発生及び生理的過程において大変重要な役割を果たす。低酸素症は、マスター転写因子、つまり、低酸素誘導因子−１（ＨＩＦ−１）と関連している。
【０００３】
低酸素誘導因子−１（ＨＩＦ−１）は、αとβサブユニットで構成されており、この時、前記βサブユニットは常に安定して発現するが、ＨＩＦ−１α（αサブユニット）は、低酸素状態では安定化しており、正常酸素状態では、プロテアソームによって退化する。低酸素状態で安定化されたＨＩＦ−１αは、核内にあるＣＢＰ（cAMP-response element-binding protein）またはｐ３００蛋白質と結合して複合体を形成した後、標的遺伝子のプロモーターに存在する低酸素応答因子（hypoxia-response element, ＨＲＥ）と結合して、標的遺伝子の転写を活性化させる（Lando, D.ら、Genes. Dev., 16: 1466-14, 2002）。
【０００４】
このようなＣＢＰ及びｐ３００転写補助蛋白質は多様な信号伝達経路の終結点で作用して、細胞の成長、分化、及び恒常性維持に関連する特定の遺伝子の発現を調節するので、ＨＩＦ−１αとＣＢＰまたはｐ３００蛋白質間の結合を調節することは、冠不全、脳虚血、及び血管不全（vascular insufficiency）のような虚血性疾患を治療、および血管形成抑制を通じた癌治療研究に有用である。
【０００５】
ＣＢＰまたはｐ３００蛋白質は、亜鉛イオン（Ｚｎ２＋）結合因子を含むシステイン−/ヒスチジン−リッチ１（cystein-/histidine-rich 1, ＣＨ１）ドメインを有しており、この時、前記ＣＨ１ドメインは、ＨＩＦ−１αのＣ−末端トランス活性ドメイン（C-terminal transactivation domain, Ｃ−ＴＡＤ）と結合する（Kung, A.L.ら、Nature Medicine, 6: 1335-1340, 2000）。また、ＮＭＲ研究を通じて、ｐ３００蛋白質の３３１−４１８番目のアミノ酸部位とＨＩＦ−１αの７９２−８２４番目のアミノ酸ペプチドの複合体構造、及びＣＢＰ蛋白質の３４５−４３９番目のアミノ酸部位とＨＩＦ−１αの７７６−８２６番目のアミノ酸ペプチドの複合体構造が明らかになった（Dames, S.A.ら、PNAS, 99: 5271-5276, 2002）。このような複合体構造によれば、ＣＨ１は、ＨＩＦ−１αのＣ−末端ドメインの折り畳み構造のための骨格として作用するので、多様な疎水性及び極性相互作用によって安定化される。また、本発明では分析に要する資料が少量でよく、ペプチドを数ｍＭの高濃度で使用するＮＭＲ分析とは違って、μＭ単位の低濃度でも充分に結合可能なＨＩＦ−１αのアミノ酸部位を使用する結合分析法を開発した。
【０００６】
ＨＩＦ−１依存性標的遺伝子の発現は、２種類の互いに異なる酸素依存性メカニズム、つまり、プロリン水酸化反応とアスパラギン水酸化反応により調節される。ＨＩＦ−１αに、特異なプロリル水酸化酵素によるＨＩＦ−１αの酸素依存性ドメイン（oxygen-dependent domain, ＯＤＤ）にあるプロリン残基の水酸化反応はＨＩＦ−１αの分解を誘導する反面、アスパラギンの水酸化反応は、ＨＩＦ−１αのＣ−末端トランス活性ドメイン（Ｃ−ＴＡＤ）とＣＢＰまたはｐ３００蛋白質間の結合を不活性化させ、ＨＩＦ−１依存性標的遺伝子の発現を減少させる。
【０００７】
初期に、ＨＩＦ−１を阻害する因子として知られたＨＩＦ−１阻害因子（factor-inhibiting HIF-1, ＦＩＨ−１）蛋白質（Mahon, P.C.ら、Genes Dev., 15: 2675-2686, 2001）は、その後、ＨＩＦ−１αの調節に関与する酸素センサの特徴を有していることが明らかになった（Lando, D.ら、Genes Dev., 16: 1466-14, 2002）。つまり、ＨＩＦ−１阻害因子（ＦＩＨ−１）は、２−オキソグルタル酸及び鉄分依存性ジオキシゲナーゼ蛋白質（Safran, M.ら、J. Clin. Invest., 111: 779-783, 2003）であって、正常酸素状態では、ＨＩＦ−１αのＣ−末端トランス活性ドメインにあるアスパラギン（Ａｓｎ）−８０３を水酸化させ、ＨＩＦ−１αとＣＢＰまたはｐ３００蛋白質間の結合及びＨＩＦに関するトランス活性を阻害するものと知られている（Lando, D.ら、Science, 295: 858-861, 2002）。
【０００８】
標的遺伝子に対するＨＩＦ−１αの転写的活性のために、アスパラギンの水酸化反応と共に、Ｃ−末端トランス活性ドメインにある他の残基の翻訳後修飾が、ＨＩＦ−１αのこのような機能を微細に調節することに影響を与えると提示されている（Brahimi-Horn.ら、Cell, Signal., 17: 1-9, 2005）。ＨＩＦ−１αの転写的活性調節のための代表的なメカニズムのうちの一つは、転写因子のリン酸化（Holmberg, C. I.ら、Trends Biochem. Sci., 27: 619-627, 2002）、つまり、正常酸素状態及び低酸素状態でのＨＩＦ−１αの直接的なリン酸化が報告されている（Brahimi-Horn, C.ら、Cellular Signalling, 17: 1-9, 2005）。
【０００９】
また、ＨＩＦ−１αのリン酸化は、それ自体の転写的活性を調節することが可能である。低酸素状態で誘導されたＭＡＰＫ（mitogen-activated protein kinase）の活性はＨＩＦ−１αをリン酸化させることと提示されており、リン酸化されたＨＩＦ−１αはｐ３００蛋白質との結合を増加させるが、それ自体の転写的活性との関連性はないと報告されている（Sang, N.ら、J. Biol. Chem., 278: 14013-14019, 2003）。しかし、ＨＩＦ−１αを核内に蓄積するように誘導するリン酸化部位が、Ｃ−末端トランス活性ドメインから遠く離れた部位に存在することが明らかになった（Mylonis, I.ら、J. Biol. Chem., 281: 33095-33106, 2006）。これとは異なり、Ｃ−末端トランス活性ドメインにあるスレオニン（Ｔｈｒ）−７９６は、カゼインキナーゼ２（ＣＫ２）によってリン酸化される候補物質として報告されている（Mottet, D.ら、Int. J. Cancer, 117: 764-774, 2005）。ＨＩＦ−１αのＣ−末端トランス活性ドメインの蛋白質合成後変形による転写的活性を示す資料が充分であるにもかかわらず、ＨＩＦ−１αのＣ−末端トランス活性ドメインとｐ３００またはＣＢＰ蛋白質間の結合において、このような変形の直接的な影響を示す明白な資料は有用であり得る。
【００１０】
さらに、一酸化窒素（ＮＯ）は、細胞の種類及びＮＯ濃度に依存的なＨＩＦ−１αの安定性を増加させたりあるいは減少させるものと知られており（Bilton, R. L.ら、Eur. J. Biochem., 270: 791-798, 2003）、ＨＩＦ−１αのシステイン（Ｃｙｓ）−８００残基のＳ−ニトロソ化は、ＨＩＦ−１αとｐ３００蛋白質間の結合を強化させてＨＩＦ−１αの転写的活性を増加させるという報告もあるが（Yasinska, I.M.ら、FEBS Lett., 549: 105-109, 2003）、いくつかの反対の結果も報告されている（Brahimi-Horn, C.ら、Cell, Signal., 17: 1-9, 2005）。
【００１１】
他の方法としては、ＨＩＦ−１αとＣＢＰまたはｐ３００蛋白質のうちの一つの蛋白質は簡単に検出可能な物質で標識し、他の一つの蛋白質は固体担体に固定させて、二つの蛋白質の結合を測定する方法がある。
【００１２】
また他の方法としては、ＣＢＰまたはｐ３００蛋白質とＨＩＦ−１αの結合を確認するために、ＨＩＦ−１αの特定の部位を認識する抗体を利用した免疫共沈降に基づいた測定法がある。しかし、このような方法は大量の試料を要求し、その過程が複雑であり、実験所要時間も長いだけでなく、放射性同位元素を使用しなければならないなどの多くの短所を有している。
【００１３】
これと共に、蛋白質間の直接的な結合を分析する代わり、間接的な方法、つまり、ＨＩＦ−１αがＣＢＰまたはｐ３００蛋白質と結合した後、標的遺伝子の低酸素−反応因子（ＨＲＥ）に結合して転写的活性を現わすということに着眼したリポーター分析法もある。一例として、Ｅｐｏ−ルシフェラーゼ（Epo-luciferase）を利用した測定方法がある（Kung, A. L.ら、Nature Medicine, 6: 1335-1340, 2000）。
【００１４】
このような生化学的または免疫学的方法がや放射能を表示する方法は大量の試料が要求され、過程が複雑であり、実験時間が長く、放射線同位元素を使用しなければならないなどの多くの短所を有しているので、ＨＩＦ−１αとＣＢＰまたはｐ３００蛋白質との結合を定量分析するより簡単な測定方法が要求されている。
【００１５】
このような研究の一環として、放射線同位元素を使わずに短時間にＨＩＦ−１αとＣＢＰまたはｐ３００蛋白質間の結合を観察することができる９６穴プレートを利用した分析法が開発された（Kung, A. L., et al, Cancer Cell, 6: 33-43, 2004）。このような分析法は、ＨＩＦ−１αとＣＢＰまたはｐ３００蛋白質間の結合を阻害する化合物をスクリーニングすることに利用可能であるが、高価なアビジンがコーティングされたプレート、ユウロピウムが融合された抗−ＧＳＴ抗体、及び時間分解蛍光分光計を使用しなければならないという短所を有している。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明者らは、蛍光物質で標識されたＨＩＦ−１αＣ−末端ペプチドとＣＢＰまたはｐ３００蛋白質間の蛋白質複合体が形成されたか否かを、蛍光偏光値の変化を測定して定量分析する方法を開発した。
【００１７】
また、本発明者らは、ＨＩＦ−１αＣ−末端トランス活性ドメイン（Ｃ−ＴＡＤ）の蛋白質合成後変形（水酸化反応、Ｓ−ニトロソ化反応、及びリン酸化反応）の直接的な影響の調査や、またはＨＩＦ−１α−ＣＢＰまたはＨＩＦ−１α−ｐ３００蛋白質複合体の形成を阻害する抑制剤をスクリーニングに有用な方法を開発した。
【００１８】
したがって、本発明の目的は、ＨＩＦ−１αＣ−末端ペプチドとＣＢＰまたはｐ３００蛋白質間の結合を定量分析する簡単な方法を提供することにある。
【００１９】
本発明の他の目的は、前記方法を利用して、ＨＩＦ−１αＣ−末端ペプチドとＣＢＰまたはｐ３００蛋白質間の結合を阻害する抑制剤のスクリーニング方法を提供することにある。
【００２０】
また、本発明の他の目的は、ＨＩＦ−１αＣ−末端部位にあるアミノ酸配列中、ＣＢＰまたはｐ３００蛋白質との結合に必要な少なくとも４１−５１個のアミノ酸を含む変形された蛍光物質で標識されたＨＩＦ−１αＣ−末端ペプチドを提供することにある。
【００２１】
このような目的を達成するために、本発明は、ＨＩＦ−１αＣ−末端ペプチドとＣＢＰまたはｐ３００蛋白質間の結合を定量分析する方法を提供する。
【００２２】
また他の側面より、本発明は、前記方法、つまり、蛍光偏光に基づいた結合分析法を利用したＨＩＦ−１αＣ−末端ペプチドとＣＢＰまたはｐ３００蛋白質間の結合を阻害する抑制剤のスクリーニング方法を提供する。
【００２３】
また他の側面より、本発明は、ＨＩＦ−１αＣ−末端アミノ酸配列中、ＣＢＰまたはｐ３００蛋白質との反応に必要な少なくとも４１−５１個のアミノ酸を含む合成されたＨＩＦ−１αＣ−末端ペプチド、より望ましくは、各々、Ｆ−ＨＩＦ−１α−（７７６−８２６、配列番号３）及びＦ−ＨＩＦ−１α−（７８６−８２６、配列番号４）に表記されたＨＩＦ−１αペプチドの７７６−８２６番目の残基及び７８６−８２６番目の残基を含むＨＩＦ−１αＣ−末端ペプチドを提供する。
【課題を解決するための手段】
【００２４】
本発明は、
１）ＨＩＦ−１α蛋白質のＣ−末端トランス活性ドメインから由来したペプチドに蛍光物質を結合させて、蛍光プローブを製造する段階；
２）前記蛍光プローブをＣＢＰまたはｐ３００蛋白質と反応させる段階；及び
３）前記２）段階で得られた反応物の蛍光偏光値を測定し、測定された蛍光偏光値の変化を分析するために、蛍光プローブ自体の蛍光偏光値と前記測定された蛍光偏光値とを比較する段階；
を含んで、ＨＩＦ−１αとＣＢＰまたはｐ３００蛋白質間の結合を定量分析する方法を提供する。
【００２５】
この定量分析方法において、前記１）段階の蛍光プローブは、ＨＩＦ−１α（ＮＣＢＩ受入番号ＡＡＡ５０１５２）の全長アミノ酸配列内に連続的に存在する少なくとも４１個のアミノ酸を有するペプチドを含み、この時、前記ペプチドは、配列番号４であるＨＩＦ−１α内に存在する７８６番目のアミノ酸乃至８２６番目のアミノ酸配列を必ず含み、前記ペプチドのＮ−末端にはアミノカプロン酸リンカーが連結されており、前記アミノカプロン酸リンカーの端部には蛍光物質が連結されたものであってもよい。
【００２６】
これは、前記蛍光プローブ内にある前記ペプチドが４１個のアミノ酸より短い場合、ＣＢＰまたはｐ３００蛋白質に対する前記ペプチドの結合活性が完全に抑制され得るため、前記ペプチドは、４１個またはＨＩＦ−１αの全長アミノ酸配列内に連続的に存在する４１個以上のアミノ酸を有するものであることができる。さらに、前記ペプチドは、５５個のアミノ酸より道場合、前記ペプチドのより大きい蛍光偏光値により、ＣＢＰまたはｐ３００蛋白質に対する前記ペプチドの結合活性を蛍光偏光変化で測定できないので、望ましくは、前記ペプチドは、ＨＩＦ−１αの全長アミノ酸配列内に連続的に存在する４１乃至５５個のアミノ酸を有するものであることができ、より望ましくは、配列番号３であるアミノ酸配列を有する５１個のアミノ酸であることができ、最も望ましくは、配列番号４であるアミノ酸配列を有する４１個のアミノ酸であることができる。
【００２７】
また、前記プローブは、ＨＩＦ−１αのアミノ酸配列上にある配列番号３であるアミノ酸配列を含むことができ、この時、前記ペプチドのＮ−末端にはアミノカプロン酸リンカーが連結されており、及び前記アミノカプロン酸リンカーの端部には蛍光物質が連結されてもよい。
【００２８】
また、前記１）段階の蛍光プローブは、特に制限されているわけではないが、追加的に前記プローブは、前記ペプチドのＮ−末端にはアミノカプロン酸リンカー、及び蛍光物質、望ましくはＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）で標識された蛍光物質が連結されており、前記リンカーの端には、配列番号３または配列番号４であるペプチドが連結されていることが好ましい（表１）。
【００２９】
前記定量分析方法において、前記リンカーが特に制限されているのではなく、できるだけリンカーの種類に関係なしでまたはリンカーなしで前記ペプチドに連結されることができ、これは蛍光物質で標識されたＨＩＦ−１αＣ−末端ペプチド、つまり、蛍光プローブと対象蛋白質間の結合によって誘導された蛍光強さの不要な変化を最少化することによって、蛍光偏光測定に用いてもよい。
【００３０】
また、前記蛍光物質はフルオレセイン及びその類似体を含むことができるが、これに制限する必要はない。例えば、前記蛍光物質は、望ましくはフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フィコエリトリン（ＰＥ）、テキサスレッド（ＴＲ）、及びテトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、フルオレセインカルボン酸（ＦＣＡ）、フルオレセインチオウレア（ＦＴＨ）、７−アセトキシクマリン−３−１、フルオレセイン−５−１、フルオレセイン−６−１、２’，７’−ジクロロフルオレセイン−５−１、ジヒドロテトラメチルローダミン−４−１、テトラメチルローダミン−５−１、及びテトラメチルローダミン−６−１からなる群より選択されたものであることができ、より望ましくは、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）であることができる。
【００３１】
前記定量分析方法において、前記ＣＢＰまたはｐ３００蛋白質は、特に制限されているのではなく、この時、前記ＣＢＰ蛋白質は、望ましくは配列番号１である１−４５０番目のアミノ酸配列を含むことができ、及び前記ｐ３００蛋白質は、望ましくは配列番号２である１−２２１番目のアミノ酸配列を含むことができる。さらに、前記ＣＢＰまたはｐ３００蛋白質は、各々、GenBank受入番号Ｕ８５９６２（ＣＢＰコーディング配列）及びＵ０１８７７（ｐ３００コーディング配列）である遺伝子上に存在するＨＩＦ−１αの結合部位を含む一部または全長アミノ酸配列を含みうる。
【００３２】
本発明の好ましい具体例では、合成されたＣＢＰまたはｐ３００蛋白質を提供することができ、この時、前記蛋白質は、培養した細胞または培養培地から分離及び精製されたものであることができる。前記蛋白質の分離及び精製方法は特に制限されているのではなく、望ましくは、前記方法は透析、限外濾過、ゲル濾過、及びＳＤＳ−ＰＡＧＥのような分子量の差に基づいた蛋白質分離方法、イオン−交換クロマトグラフィーのような電荷の差に基づいた蛋白質分離方法、及び逆相高性能液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）のような親水性の差に基づいた蛋白質分離方法からなる群より選択しうる。
【００３３】
また、前記２）段階の反応は、望ましくは蛍光プローブをＣＢＰまたはｐ３００蛋白質と１：１（１００ｎＭ：１００ｎＭ）乃至１：３０（１００ｎＭ：３０００ｎＭ）の範囲内で、より望ましくは、１：２（１００ｎＭ：２００ｎＭ）乃至１：１０（１００ｎＭ：１０００ｎＭ）の範囲内で混合して、誘導することができる。
【００３４】
前記定量分析方法において、前記３）段階の蛍光偏光測定は特に制限されているのではなく、望ましくは、蛍光偏光測定のための蛍光分光器またはウェルプレート基盤の蛍光検出器（Victor plate reader等）を利用することができ、この時、前記蛍光偏光値の変化は、２）段階で測定された反応物の蛍光偏光値から、蛍光プローブ自体の蛍光偏光値を差し引いて示すことができる。ここで、前記蛍光プローブはそれ自体の分子量が非常に小さいため、相対的に小さい蛍光偏光値を有する。しかし、前記蛍光ＨＩＦ−１αペプチドプローブがより大きい分子量を有するＣＢＰまたはｐ３００蛋白質と結合する場合、ＨＩＦ−１α−ＣＢＰまたはＨＩＦ−１α−ｐ３００複合体の蛍光偏光値は著しく増加する。
【００３５】
結果として、ＨＩＦ−１αとＣＢＰまたはｐ３００蛋白質間の結合の要否は、前記蛍光プローブをＣＢＰまたはｐ３００蛋白質と混合する前と混合した後に測定された蛍光偏光値の変化を通じて分析することができる。より詳しくは、前記蛍光偏光値の変化から、前記蛍光偏光値の差が陽性（＋）である時に複合体が形成されることを判断することができる。
【００３６】
同時に、本発明は、
１）ＨＩＦ−１α蛋白質のＣ−末端トランス活性ドメインから由来したペプチドに蛍光物質を結合させて製造した蛍光プローブと、ＣＢＰまたはｐ３００蛋白質を含む反応液に阻害剤候補物質を添加し、
２）前記反応液に阻害剤候補物質を添加する前と添加した後の蛍光偏光値の変化を測定し；及び
３）前記阻害剤候補物質の添加後に測定された前記反応液の蛍光偏光値が減少すれば、前記候補物質を抑制剤として決定する段階；を含む、ＨＩＦ−１αとＣＢＰまたはｐ３００蛋白質間の結合を阻害する抑制剤のスクリーニング方法を提供する。
【００３７】
前記スクリーニング方法において、前記１）段階の蛍光プローブは、ＨＩＦ−１α（ＮＣＢＩ受入番号ＡＡＡ５０１５２）の全長アミノ酸配列内に連続的に存在する少なくとも４１個のアミノ酸を有するペプチドを含み、この時、前記ペプチドは、配列番号４であるＨＩＦ−１α内に存在する７８６番目のアミノ酸乃至８２６番目のアミノ酸配列を必ず含み、前記ペプチドのＮ−末端にはアミノカプロン酸リンカーが連結されており、前記アミノカプロン酸リンカーの端部には蛍光物質を連結しうる。
【００３８】
これは、前記蛍光プローブ内にあるペプチドが４１個のアミノ酸より短い場合、ＣＢＰまたはｐ３００蛋白質に対する前記ペプチドの結合活性が完全に抑制され得るため、前記ペプチドは、４１個またはＨＩＦ−１αの全長アミノ酸配列内に連続的に存在する４１個以上のアミノ酸を有することができる。さらに、前記ペプチドは、５５個のアミノ酸より長い場合、前記ペプチドのより大きい蛍光偏光値により、ＣＢＰまたはｐ３００蛋白質に対する前記ペプチドの結合活性を蛍光偏光変化で測定できないため、望ましくは、前記ペプチドは、ＨＩＦ−１αの全長アミノ酸配列内に連続的に存在する４１乃至５５個のアミノ酸を有することができ、より望ましくは、配列番号３であるアミノ酸配列を有する５１個のアミノ酸であることができ、最も望ましくは、配列番号４であるアミノ酸配列を有する４１個のアミノ酸であることができる。
【００３９】
また、前記プローブは、ＨＩＦ−１αのアミノ酸配列上にある配列番号３であるアミノ酸配列を含むことができ、この時、前記ペプチドのＮ−末端にはアミノカプロン酸リンカーが連結されており、及び前記アミノカプロン酸リンカーの端部には蛍光物質を連結しうる。
【００４０】
また、前記１）段階の蛍光プローブは特に制限されているのではないが、追加として前記プローブは、前記ペプチドのＮ−末端にはアミノカプロン酸リンカー及び蛍光物質、望ましくはＦＩＴＣで標識された蛍光物質が連結されており、前記リンカーの端には、配列番号３または配列番号４であるペプチドが連結されているのが好ましい（表１）。
【００４１】
このようなスクリーニング方法において、前記リンカーは特に制限されているのではなく、できるだけリンカーの種類に関係なしでまたはリンカーなしで前記ペプチドに連結することができ、これは蛍光物質で標識されたＨＩＦ−１αＣ−末端ペプチド、つまり、蛍光プローブと対象蛋白質間の結合によって誘導された蛍光強さの不要な変化を最少化することによって、蛍光偏光測定に用いられうる。
【００４２】
また、前記蛍光物質は、フルオレセイン及びその類似体を含むこともできるが、これに制限されるわけではない。例えば、前記蛍光物質は、望ましくはフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フィコエリトリン（ＰＥ）、テキサスレッド（ＴＲ）及びテトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、フルオレセインカルボン酸（ＦＣＡ）、フルオレセインチオウレア（ＦＴＨ）、７−アセトキシクマリン−３−１、フルオレセイン−５−１、フルオレセイン−６−１、２’，７’−ジクロロフルオレセイン−５−１、ジヒドロテトラメチルローダミン−４−１、テトラメチルローダミン−５−１、及びテトラメチルローダミン−６−１からなる群より選択されることができ、より望ましくは、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）でありうる。
【００４３】
前記スクリーニング方法において、前記ＣＢＰまたはｐ３００蛋白質は特に制限されているのではなく、この時、前記ＣＢＰ蛋白質は、望ましくは配列番号１である１−４５０番目のアミノ酸配列を含むことができ、及び前記ｐ３００蛋白質は、望ましくは配列番号２である１−２２１番目のアミノ酸配列を含みうる。さらに、前記ＣＢＰまたはｐ３００蛋白質は、各々、GenBank 受入番号Ｕ８５９６２（ＣＢＰコーディング配列）及びＵ０１８７７（ｐ３００コーディング配列）である遺伝子上に存在するＨＩＦ−１αの結合部位を含む一部または全長アミノ酸配列を含みうる。
【００４４】
また、前記２）段階の阻害剤候補物質は特に制限されているのではなく、望ましくは、前記候補物質は、前記蛍光プローブとＣＢＰまたはｐ３００蛋白質間の結合を競合阻害する抗体、ペプチド、オリゴヌクレオチド、及び天然及び合成化合物からなる群より選択されうる。
【００４５】
これに、本発明は、
ａ）蛍光物質をＨＩＦ−１α蛋白質のＣ−末端トランス活性ドメイン（Ｃ−ＴＡＤ）から由来したペプチドに結合させて、蛍光プローブを製造し、前記蛍光プローブをＣＢＰまたはｐ３００蛋白質と反応させて、これらの蛍光偏光値を測定する段階；
ｂ）前記蛍光プローブに、ＨＩＦ−１阻害因子（ＦＩＨ−１）、Ｓ−ニトロソ−Ｎ−アセチルペニシラミン（ＳＮＡＰ）、及びカゼインキナーゼ２（ＣＫ２）からなる群より選択されたいずれか一つの酵素を処理し、前記酵素処理されたプローブをＣＢＰまたはｐ３００蛋白質と反応させて、これらの蛍光偏光値を測定する段階；及び
ｃ）ＣＢＰまたはｐ３００蛋白質との結合相で、ＨＩＦ−１αＣ−末端トランス活性ドメインの蛋白質合成後の変形の影響を分析するために、前記ａ）及びｂ）段階で測定された蛍光偏光値を比較する段階；
を含む、定量分析する方法を提供する。
【発明の効果】
【００４６】
結果として、本発明による作用が、たとえｐ３００蛋白質との結合活性において、蛋白質合成後の変形の影響がＨＩＦ−１α−ｐ３００蛋白質結合の直接的な調節よりも、いくつかの他のメカニズムを通じてＨＩＦ−１αに関する転写活性に影響を与えるものだとしても、このような効果において相反する問題の解決を援助することができる。
【実施例】
【００４７】
以下、本発明をより詳しく説明する。
【００４８】
本発明の実用的であり好ましい実施例は、本発明に関する当業者が本発明を実施できるように、より明確にするためのものであり、これは本発明の精神及び範囲内で変形及び向上させうる。
【００４９】
（実施例１）
ＣＢＰ及びｐ３００蛋白質の分離及び発現
本発明の実施例によるＣＢＰ及びｐ３００蛋白質の発現のために、配列番号１であるアミノ酸配列を含む切片化された人間ＣＢＰ（１−４５０番目のアミノ酸）及び配列番号２であるアミノ酸配列を含む切片化されたｐ３００（１−２２１番目のアミノ酸）を、各々、ｐＧＥＸ−ＫＧ（GE Healthcare Life Sciences, 米国）及びｐＧＥＸ−４Ｔ−１（Amersham Biosciences, 米国）ベクターにクローニングした後、大腸菌ＢＬ２１（Novagen）に形質転換させた。
【００５０】
前記形質転換された細胞を、５０μｇ/ｍｌのアンピシリンが添加されたLuria-Bertani（ＬＢ）液体培地に接種して、吸光度（Ｏ.Ｄ）が０.６程度になるまで３７℃で培養した後、蛋白質の発現を誘導するために、０.５ｍＭのＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド）を添加して、１８℃で１５時間培養した。遠心分離した後、前記細胞にＰＭＳＦ（フッ化フェニルメチルスルホニル）及びリゾチームを、最終濃度が各々０．２ｍＭ及び１ｍｇ/ｍｌになるように添加した１０ｍＭのリン酸塩緩衝溶液（ＰＢＳ、ｐＨ７.４；１１０ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴ）に懸濁させ、４℃で粉砕した。細胞抽出物に２％のトリトンＸ−１００を添加してよく混合した後、１０分間氷に入れた後、１３，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。分離された上清に１ｍＭのＤＴＴを添加して、グルタチオン−セファロース（Amersham Biosciences, 米国）と混合した後、４℃で２時間攪拌し、前記反応混合物に１０倍体積のリン酸塩緩衝溶液を添加して５分間遠心分離した後、上清を除去した。このような過程を３回連続で繰り返し、遠心分離して上清を除去した後、前記処理されたセファロースビードをBio-Spin（登録商標）の使い捨てクロマトグラフィーカラム（Bio-Rad）に添加した。前記ビードに非特異的に結合された不要な物質を除去するために、５ｍｌのリン酸塩緩衝溶液で濾過させ、２ｍｌの１ＭＮａＣｌ溶液で濾過させた。
【００５１】
最後に、１０ｍＭのグルタチオン−セファロースを利用して、前記ビードからＧＳＴ−ＣＢＰ及びＧＳＴ−ｐ３００蛋白質を収得した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを利用してその純度を確認し、ブラッドフォード分析法（Bio-Red）を利用して、定量化した。
【００５２】
（実施例２）
蛍光物質で標識されたＨＩＦ−１αペプチドとＣＢＰまたはｐ３００蛋白質間の結合分析
２−１．蛍光物質で標識されたＨＩＦ−１αペプチド
人間ＨＩＦ−１αのＣ−末端トランス活性ドメイン（Ｃ−ＴＡＤ）を含む蛍光物質で標識された４個のＨＩＦ−１αペプチドは、Ｎ−末端にアミノカプロン酸リンカー（Anygen、Kwangju、韓国）と共にフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）を連結して合成し、この時７７６−８２６、７８６−８２６、７７６−８１４、及び７８８−８２２番目のアミノ酸残基を含む前記合成された４個のペプチドは、各々、Ｆ−ＨＩＦ−１α（７７６−８２６、配列番号３）、Ｆ−ＨＩＦ−１α（７８６−８２６、配列番号４）、Ｆ−ＨＩＦ−１α（７７６−８１４、配列番号５）、及びＦ−ＨＩＦ−１α（７８８−８２２、配列番号６）に記載した（表１）。
【表１】
【００５３】
変異ペプチドを製造するために、ＰＣＲ反応により調製したＨＩＦ−１α（７８６−８２６、配列番号４）の単一変異生成物をｐＧＥＸ−２Ｔ−１（Amersham Biosciences,米国）ベクターにクローニングした後、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）で過発現させた。過発現されたＧＳＴ融合蛋白質をグルタチオ−セファロース（Amersham Biosciences,米国）を利用して精製した後、トロンビンを処理してＧＳＴを除去し、得られたペプチドを逆相ＨＰＬＣを利用して精製し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法でその質量を確認した。
【００５４】
前記ＨＩＦ−１αペプチドとＣＢＰまたはｐ３００蛋白質間の結合親和力及びその特徴は、前記実施例１の方法によって製造された合成ペプチドとＣＢＰまたはｐ３００蛋白質間の結合による蛋白質−リガンド複合体の形成によって変化された蛍光偏光値を測定することによって分析される。前記蛍光偏光値は、蛍光分光器（Perkin-Elmer）で測定し、この時、スリット幅は５ｎｍ、総測定時間（integration time）は５秒に設定した。前記結合反応において、ＥＢＣ溶液（５０ｍＭのＴｒｉｓ；１２０ｍＭのＮａＣｌ；ｐＨ８.０、０.２５％NonidetP（ＮＰ）−４０）が使用された。
【００５５】
２−２．蛍光物質で標識されたＨＩＦ−１αペプチドとＺｎ２＋処理または未処理されたＣＢＰまたはｐ３００蛋白質間の結合分析
ＣＢＰまたはｐ３００蛋白質のシステイン−/ヒスチジン−リーチ１（ＣＨ１）ドメインは、Ｚｎ２＋結合センターを含んでいるＨＩＦ−１αのＣ−末端トランス活性ドメイン（Ｃ−ＴＡＤ）と結合するので、本発明の実施例では、ＣＢＰまたはｐ３００蛋白質とＨＩＦ−１αから由来したペプチドとの結合において、前記ＣＢＰまたはｐ３００蛋白質調製過程、つまり、細胞粉砕及び蛋白質溶出時に添加されたＺｎ２＋の重要性を最初に調査し、この時、前記ＣＨ１ドメインを含むＧＳＴ−ＣＢＰまたはＧＳＴ−ｐ３００蛋白質は、蛋白質調製過程時細胞粉砕または蛋白質溶出過程で、硫酸亜鉛（ＺｎＳＯ４）を添加または添加せずに調製した。前記実施例１で調製したＥＢＣ溶液に８００ｎＭのＣＢＰまたはｐ３００蛋白質を添加した後、ＣＢＰ添加溶液には１００ｎＭのＦ−ＨＩＦ−１α（７７６−８２６、配列番号３）ペプチドを、及びｐ３００添加溶液には１００ｎＭのＦ−ＨＩＦ−１α（７８６−８２６、配列番号４）ペプチドを、各々２５℃で混合し、その後蛍光偏光値を測定した。
【００５６】
その結果、前記ＧＳＴ−ＣＢＰ及びＧＳＴ−ｐ３００を前記ペプチドと混合した場合には、蛍光偏光値が著しく増加し、この時、ＣＢＰ−Ｆ−ＨＩＦ−１α（７７６−８２６、配列番号３）及びｐ３００−ＨＩＦ−１α（７８６−８２６、配列番号４）複合体形成によって測定された蛍光偏光値は、各々、ＨＩＦ−１α（７７６−８２６、配列番号３）及びＨＩＦ−１α（７８６−８２６、配列番号４）ペプチド自体の蛍光偏光値に比べて増加した（図１Ａ及び１Ｂ）。しかし、ＣＢＰまたはｐ３００蛋白質調製過程時の硫酸亜鉛（ＺｎＳＯ４）の添加有無に応じた蛍光偏光値の変化は殆どなく、これは、前記ＨＩＦ−１αペプチドとＧＳＴ−ＣＢＰまたはＧＳＴ−ｐ３００蛋白質のＣＨ１ドメインとの複合体を形成するにおいて、前記大腸菌培養額内に充分な量のＺｎ２＋が存在していることを意味する。
【００５７】
２−３．蛍光物質で標識されたＨＩＦ−１αと多様な濃度のＣＢＰまたはｐ３００蛋白質間の結合分析
ＨＩＦ−１αＣ−末端トランス活性ドメイン内にある互いに異なる部位から由来した４個のペプチドと、ＣＢＰまたはｐ３００蛋白質間の結合を比較するために、蛍光物質で標識されたＨＩＦ−１αペプチドと０−３０００ｎＭの多様な濃度を有するＣＢＰ蛋白質を、前記実施例２−２と同一な条件で反応させて、蛍光偏光値を測定した（図２Ａ）。このようなペプチドはその大きさにより固有の蛍光偏光値を有しているので、前記蛋白質複合体の蛍光偏光値から前記ペプチド自体の蛍光偏光値を差し引いて、その変化を測定した。
【００５８】
ＣＢＰの場合、ＣＢＰと混合されたＨＩＦ−１α（７７６−８２６、配列番号３）、及びＨＩＦ−１α（７８６−８２６、配列番号４）の蛍光偏光値は、ＧＳＴ−ＣＢＰの濃度が増加することに伴って各々増加し、場合によっては一定の安定値に到達した（図２Ａ）。また、このような二つのペプチドの解離定数は、各々ＨＩＦ−１α（７７６−８２６、配列番号３）に対しては１９５.７ｎＭであり、ＨＩＦ−１α（７８６−８２６、配列番号４）に対しては１７４.９ｎＭであった。これとは異なり、ＨＩＦ−１α（７８８−８２２、配列番号６）の蛍光偏光値は、前記二つのペプチドの蛍光偏光値に比べて遥かに増加せず、ＨＩＦ−１α（７７６−８１４、配列番号５）の蛍光偏光値は３０００ｎＭ以上のＧＳＴ−ＣＢＰ蛋白質濃度でも増加しなかった（図２Ａ）。
【００５９】
ｐ３００の場合、ｐ３００と混合されたＨＩＦ−１α（７７６−８２６、配列番号３）及びＨＩＦ−１α（７８６−８２６、配列番号４）の蛍光偏光値は、図２Ａに示したものに類似しているように、ＧＳＴ−ｐ３００の濃度増加に伴って増加した（図２Ｂ）。このような二つのペプチドの解離定数は、各々、ＨＩＦ−１α（７７６−８２６、配列番号３）に対しては１５７.３ｎＭであり、ＨＩＦ−１α（７８６−８２６、配列番号４）に対しては１８０.１ｎＭであった。これとは異なり、ＨＩＦ−１α（７８８−８２２、配列番号６）の蛍光偏光値は、前記二つのペプチドの蛍光偏光値に比べて遥かに増加せず、ＨＩＦ−１α（７７６−８１４、配列番号５）の蛍光偏光値はＧＳＴ−ｐ３００と共に培養する場合、いかなる増加もなかったが、これはｐ３００との結合において、ＨＩＦ−１αＣ−末端トランス活性ドメインのＣ−末端螺旋形が重要な役割を果たしていることを意味する。
【００６０】
このような結果は、蛍光物質で標識されたＨＩＦ−１αペプチドを利用した簡単な蛍光偏光に基づいた測定法が、ＨＩＦ−１αＣ−末端トランス活性ドメインから由来したペプチド断片とＣＢＰまたはｐ３００蛋白質間の結合活性を定量分析する可能性があることを意味する。
【００６１】
（実施例３）蛍光偏光に基づいた分析法を利用したＨＩＦ−１αとｐ３００蛋白質間の結合におけるＨＩＦ−１αの蛋白質合成後の変形（水酸化、ニトロソ化、及び水酸化）の影響
３−１．ＦＩＨ−１による水酸化作用
ＨＩＦ−１αのアスパラギン（Ａｓｎ）−８０３相での水酸化反応は、ＨＩＦ−１αによるＣＢＰまたはｐ３００蛋白質の補充を阻害させてＨＩＦ−１の転写的活性を抑制するため、本発明の実施例では、前記蛍光偏光に基づいた分析法を利用して、ｐ３００蛋白質との結合におけるＨＩＦ−１αペプチドの直接的な水酸化作用を調査した。まず、蛍光物質で標識されたＨＩＦ−１αペプチドを、ＨＩＦ−１αの特定アスパラギン残基を水酸化させる酵素として知られたＨＩＦ−１阻害因子（ＨＩＦ−１）で処理した後、前記ＨＩＦ−１αペプチドとｐ３００蛋白質間の結合を、蛍光偏光に基づいた分析法で測定した。前記ＦＩＨ−１酵素は下記のような方法で分離及び精製した。
【００６２】
つまり、全長人間ＦＩＨ−１（１−３４９番目のアミノ酸；GenBank I.D.：ＡＦ３９５８３０）をｐＥＴ２８ａ（＋）（Novagen）ベクターにクローニングし、大腸菌ＢＬ２１（Novagen）に形質転換した。前記形質転換された菌株から過発現されたＦＩＨ−１蛋白質を、前記ＣＢＰまたはｐ３００蛋白質の分離方法と同一に粉砕、懸濁、及び分離した。前記細胞抽出物を２％のトリトンＸ−１００と混合して氷で１０分間の反応させ、１３,０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。これから得られた上清を、ニッケル−親和性アガローズ（Qiagen、米国）相で４℃、１時間攪拌し、リン酸塩緩衝溶液で２回洗浄した後、前記反応混合物を、Bio-Spin（登録商標）の使い捨てクロマトグラフィーカラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）積載した。最後に、３００ｍＭのイミダゾール溶液でヒスチジン−ＦＩＨ−１を溶出し、前記精製された蛋白質はＳＤＳ−ＰＡＧＥを利用してその純度を確認し、ブラッドフォード分析法（Bio-Red）で定量化した。
【００６３】
前記アスパラギン残基の水酸化反応のために、４００ｍＭのアスコルブサン及び１００μＭのアルファ−ケトグルタレートを含む水酸化反応溶液（２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＬ、５ｍＭＫＣｌ、１.５ｍＭのＭｇＣｌ２；ｐＨ７.５）に０.７μｇ/μＬの再組み合わせＨｉｓ−ＦＩＨ−１を混合して、反応させた。室温で２時間反応させた後、前記反応混合物をＺｉｐＴｉｐＣ１８（Millipore、米国）に通過させて塩を除去し、アセトニトリル/水に０.１％ＴＦＡ（１：１ｖｏｌ/ｖｏｌ）を含んでいるアルファ−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸を添加して、溶出した。前記溶出したペプチド溶液をＭＡＬＤＩサンプルプレートに移した後、ボイジャー（Voyager）分析器を利用してＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ測定を行った。結合分析のために、前記水酸化されたペプチドを逆相ＨＰＬＣに精製した。
【００６４】
水酸化反応の要否を調査するために、まず、ＨＩＦ−１α（７８６−８２６、配列番号４）ペプチドに再組み合わせＨｉｓ−ＦＩＨ−１蛋白質を処理した後、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析を行い、この時、前記ペプチドは、ＦＩＨ−１の完全な活性（図２Ｂ）だけでなく、ｐ３００結合活性のための残基を含んでいる。ＦＩＨ−１によるＦ−ＨＩＦ−１α（７８６−８２６、配列番号４）の水酸化反応結果を図３Ａに示した。
【００６５】
図３Ａに示したように、Ｈｉｓ−ＦＩＨ−１を処理したペプチドは、対照群（Ｈｉｓ−ＦＩＨ−１を処理していないペプチド）に比べて〜１６ダルトン程度その分子量が増加したが（図３Ａ）、これは前記アスパラギンが再組み合わせＨｉｓ−ＦＩＨ−１によって水酸化されたことを意味する。前記水酸化されたＦ−ＨＩＦ−１α（７８６−８２６、配列番号４）ペプチドを逆相ＨＰＬＣに精製し、ＧＳＴ−ｐ３００との結合における蛍光偏光変化をモニタリングすることに利用したが、これは前記反応混合物に含まれているアスコルブサン及びアルファ−ケトグルタレートがＨＩＦ−１α−ｐ３００結合及び蛍光偏光測定を妨害し得るためである。前記水酸化されたペプチドの蛍光偏光変化を図３Ｂに示した。
【００６６】
図３Ｂに示したように、水酸化されたペプチドによる蛍光偏光変化数値は、単にｐ３００蛋白質濃度が増加することに伴って弱いながらも増加したが、これは変形していないペプチドに比べて遥かに増加していない（図３Ｂ）。したがって、このような結果は、ＦＩＨ−１によるＨＩＦ−１αのアスパラギン水酸化がたとえ完全ではなくても、ｐ３００との結合活性を抑制する可能性があることを意味する。
【００６７】
３−２．ＳＮＡＰによるＳ−ニトロソ化作用
ＨＩＦ−１αのシステイン（Ｃｙｓ）−８００相でのＳ−ニトロソ化反応は、ｐ３００蛋白質の補充及びＨＩＦ−１α自体の転写的活性を増加させるものと報告された反面、一酸化窒素（ＮＯ）はＨＩＦ−１αの安定性を増加または減少させるものと報告された（Ema, M.ら、EMBO J., 18: 1905-1914, 1999；Yasinska, I.M.とSumbayev, V.V.、FEBS Lett., 549: 105-109, 2003；Hagen, T.ら、Science, 302: 1975-1978, 2003）。本発明の実施例によれば、ＨＩＦ−１αとｐ３００蛋白質との結合相で、ＨＩＦ−１α内にあるＣｙｓ−８００のＳ−ニトロソ化作用が確認された。また、ニトロソチオール結合は、レーザー照射下で、それ自体の光誘導分解のため、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析で検出できなかった。したがって、前記ニトロソチオール結合の形成は、Ｓ−ニトロソ−Ｎ−アセチルペニシラミン（ＳＮＡＰ）処理されたＦ−ＨＩＦ−１α（７８６−８２６、配列番号４）の存在下ではは〜３２０ｎｍの吸光度で検出されたが、ＳＮＡＰが処理されていないペプチドでは検出されず（図４Ａ）、この時、前記ペプチドの含有量は前記蛍光吸光度のピークに標準化させた。
【００６８】
同時に、本発明では、Ｓ−ニトロソ化されたペプチドを検出及び精製するために、既に公知された方法を若干変形させたビオチン化法を利用した（Jaffery, S.R.ら、Na. Cell Biol., 3: 193-197, 2001）。つまり、スルフヒドリル基をビオチン化するために、Ｓ−ニトロソ−Ｎ−アセチルペニシラミン（ＳＮＡＰ）を処理または処理していないＦ−ＨＩＦ−１α（７８６−８２６、配列番号４）と、合成ビオチン化試料を反応させた。Ｆ−ＨＩＦ−１α（７８６−８２６、配列番号４）は単に一つのシステイン（Ｃｙｓ）−８００を有しているため、Ｓ−ニトロソ化によって変形された前記ペプチドはビオチン化されることができず、反面、ＳＡＮＰを処理していないペプチド内で遊離されたシステインはビオチン化される。このようなビオチン化方法は、ストレプトアビジン添加時に蛍光偏光の変化を測定することができ、また、逆相ＨＰＬＣを利用して測定時、Ｓ−ニトロ消化されて変形していないペプチドはよく分離しないが、Ｓ−ニトロ消化されてビオチン化されたペプチドは簡単に分離するので、Ｓ−ニトロソ化されたペプチドを分離することに容易である。
【００６９】
より具体的には、システイン（Ｃｙｓ）の代わりに、アラニン（Ａｌａ）を含んでいる３０μＭのＦ−ＨＩＦ−１α−（７８６−８２６、配列番号４）及びＦ−ＨＩＦ−１α（７８６−８２６）［Ｃ８００Ａ］を、各々、２ｍＭのＳＮＡＰを含む３０℃の５０ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ８.０）溶液で３０分間反応させた。反応していないＳＮＡＰを、セファデックスＧ−１５レジンを利用して除去した後、前記ペプチドのＳ−ニトロソ化反応を、前記ニトロソチオール一部の吸光度を測定することによって分光学的に分析した（Jaffery, S.R.ら、Nat. Cell Biol., 3: 193-197, 2001）。Ｓ−ニトロソ化の要否を確認するために、前記で調製した３００μＭのビオチン化試料をＳＮＡＰ処理した後、変形していないシステインを標識する際利用した。室温で２時間反応させた後、ビオチン化を、スクレプタビジン添加による蛍光偏光変化に測定した。また、結合分析のために、逆相ＨＰＬＣ上に存在するビオチン化デンペプチドから、前記Ｓ−ニトロソ化されたペプチドを分離して、収得した。
【００７０】
Ｓ−ニトロソ化の定量分析のためのビオチン化試料を調製するために、まず、ビオチン−システイン−アミノ基（ＮＨ２）を、固形状ペプチド合成プロトコルに従って、２５μｍｏｌのＦｍｏｃ−システインを利用して Rink Amide（登録商標）レジン（NovaBiochem）相で合成した。１２ｍｇの１,１１−ビス−マレイミドトリエチレングリコール（Pierce）を１.５ｍｌのビオチン−システイン−アミノ基（４ｍｇ）溶液を含むＰＢＳ/ＤＭＳＯ（１：２ｖ／ｖ）に添加した。前記混合物を室温で夜通しで混合した後、前記ビオチン化試料を逆相ＨＰＬＣを利用して精製し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析器でその質量を測定した。前記ビオチン化試料を処理したペプチドの蛍光偏光値を図４Ｂに示した。
【００７１】
図４Ｂに示したように、ストレプトアビジンを添加した場合には、前記ビオチン化デンペプチドの蛍光偏光値は増加したが、前記Ｓ−ニトロソ化されたペプチドの蛍光偏光値は変わらなかったが、これは、前記Ｓ−ニトロソ化されたペプチドは、ビオチン化試料を処理した時にはビオチン化できないからである。さらに、システイン（Ｃｙｓ）−８００がアラニン（Ａｌａ）で置換された変異Ｆ−ＨＩＦ−１α（７８６−８２６）［Ｃ８００Ａ］ペプチドは、ＳＮＡＰを処理し、ビオチン化を行った場合にも蛍光偏光値が変わらなかった（図４Ｂ）。
【００７２】
Ｆ−ＨＩＦ−１α（７８６−８２６、配列番号４）内にあるシステイン（Ｃｙｓ）−８００のＳ−ニトロソ化反応を確認した後、このような反応がｐ３００蛋白質との結合にいかなる影響を示すかを分析した。Ｓ−ニトロソ化された場合、ＧＳＴ−ｐ３００蛋白質が未処理されたＦ−ＨＩＦ−１α（７８６−８２６、配列番号４）、及びＧＳＴ−ｐ３００と混合されたＦ−ＨＩＦ−１α（７８６−８２６）［Ｃ８００Ａ］の蛍光偏光を測定した時、Ｆ−ＨＩＦ−１α（７８６−８２６）［Ｃ８００Ａ］及び未処理されたＦ−ＨＩＦ−１α（７８６−８２６、配列番号４）が全て類似に濃度−依存的な結合様相を示したが、Ｓ−ニトロソ化されたＦ−ＨＩＦ−１α（７８６−８２６、配列番号４）は、ｐ３００蛋白質の濃度増加に伴って多少増加した（図４Ｃ）。
【００７３】
このような結果は、たとえ一酸化窒素（ＮＯ）がプロリルヒドロキシラーゼに依存してＨＩＦ−１αの分解を誘導すると提案されているが（Hagen, T.ら、Science, 302: 1975-1978, 2003）、ＨＩＦ−１αのＳ−ニトロソ化反応それ自体は、ｐ３００蛋白質との結合を著しく阻害し、減少したＨＩＦ−１αの安定性に直接的なメカニズムで作用する可能性があることを意味する。
【００７４】
３−３．キナーゼによるリン酸化作用
ＨＩＦ−１α内にあるスレオニン（Ｔｈｒ）−７９６のリン酸化反応はＨＩＦ−１α−ＣＢＰ結合を増加させることと報告されたが（Gradin, K.ら、J. Biol. Chem., 277: 23508-23514, 2002）、ＨＩＦ−１αのリン酸化部位はＣ−末端トランス活性ドメイン（Ｃ−ＴＡＤ）から遠く離れている（Mylonis, I.ら、J. Biol. Chem., 281: 33095-33106, 2006）。したがって、本発明の実施例では、直接的な結合分析法を利用して、ｐ３００蛋白質との結合におけるＦ−ＨＩＦ−１α（７８６−８２６、配列番号４）ペプチドのリン酸化作用を調査した。まだ、ＨＩＦ−１αのスレオニン（Ｔｈｒ）−７９６をリン酸化させるプロテインキナーゼは確認されていないため、低酸素状態（Ｈ）及び正常酸素状態（Ｎ）下で培養したＨｅＬａ細胞から得られたキナーゼ分画物を、ｐ３００蛋白質に結合するＦ−ＨＩＦ−１α（７８６−８２６、配列番号４）のリン酸化反応を分析する際に利用した。
【００７５】
より具体的には、低酸素状態（Ｈ）または正常酸素状態（Ｎ）下で培養した人間ＨｅＬａ細胞を受取し、均質化溶液（５０ｍＭＰＩＰＥＳ、２ｍＭ ＤＴＴ、プロテアーゼ阻害剤カクテル、ｐＨ７．０）で懸濁させ、超音波で前記細胞を粉砕した。前記細胞粉砕物からキナーゼ分画物を収得するために、まず、０.５Ｍ ＮａＯＨで膨らむようにしたセルロースリン酸塩（Whatman）を焼結ガラスフィルターを有する開口カラムに入れて、ｐＨが３になるまで０.５ＭのＨＣｌを添加し、４℃、０.５Ｍ ＨＥＰＥＳ溶液で洗浄した。同時に、前記細胞粉砕物を洗浄溶液（０.５Ｍ ＨＥＰＥＳ、０.１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７.５）で予め−水平化させたカラムに積載した。結合していない物質を前記洗浄溶液で洗浄して除去した後、結合された蛋白質を溶出溶液（０.５Ｍ ＨＥＰＥＳ、０.４５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７.５）で溶出し、ブラッドフォード法を利用して、定量化した。
【００７６】
リン酸化反応のために、基質としては、３μＭのＦ−ＨＩＦ１α−（７８６−８２６、配列番号４）を利用し、１００μＭの［γ−３２Ｐ］ＡＴＰまたは同位元素で標識されないＡＴＰを含む５０μＬのキナーゼ反応溶液（２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、２０ｍＭのＭｇＣｌ２、２ｍＭのＤＴＴ、０．１ｍＭのＮａ３ＶＯ４、ｐＨ７.５）内に正常酸素状態または低酸素状態のキナーゼ（４０μｇ）、またはＣＫ２（５００ユニット；New England Biolabs, Beverly、米国）を混合して、反応させた。結合分析のために、［γ−３２Ｐ］ＡＴＰを含んでいない前記リン酸化された生成物を室温で夜通しで反応させた後、逆相ＨＰＬＣで精製した。正常酸素状態（Ｎ）または低酸素状態（Ｈ）のキナーゼ分画物による前記Ｆ−ＨＩＦ−１α（７８６−８２６、配列番号４）ペプチドのリン酸化反応結果を図５Ａに示した。
【００７７】
図５Ａに示したように、正常酸素状態（Ｎ）または低酸素状態（Ｈ）のキナーゼ分画物で処理した前記ペプチドの放射能は、対照群（キナーゼ処理していないペプチド）に比べて著しく増加した（図５Ａ）。
【００７８】
また、正常酸素状態（Ｎ）または低酸素状態（Ｈ）のキナーゼ分画物で処理及び逆相ＨＰＬＣに精製された前記ペプチドは、前記酵素で処理していないペプチドに類似に、ＧＳＴ−ｐ３００蛋白質と反応時、蛍光偏光が増加した（図５Ｂ）。同時に、前記ペプチド内に存在するスレオニン（Ｔｈｒ）−７９６は固有なＣＫ２リン酸化部位を有しているので（Mottet, D.ら、Int. J. Cancer, 117: 764-774, 2005）、前記Ｆ−ＨＩＦ−１α−（７８６−８２６、配列番号４）ペプチドは、ＣＫ２によってリン酸化される（図５Ｃ）。前記精製されたＣＫ２によってリン酸化されたペプチドの蛍光偏光は、前記酵素で処理されていないがペプチドの蛍光偏光と比較すると、類似なｐ３００蛋白質結合様相を示した（図５Ｄ）。
【００７９】
したがって、このような結果は、ＨＩＦ−１α内にあるＣ−末端トランス活性ドメイン（Ｃ−ＴＡＤ）のリン酸化反応はＨＩＦ−１α−ｐ３００結合にいかなる影響度与えず、リン酸化反応による前記増加された転写的活性は、他のメカニズムが関連していることを意味する（Brahimi-Horn, C.ら、Cell. Signal., 17: 1-9, 2005）。
【００８０】
３−４．競合的結合分析
ｐ３００蛋白質との結合における、ＨＩＦ−１αペプチドのスレオニン（Ｔｈｒ）−７９６、システイン（Ｃｙｓ）−８００、及びアスパラギン（Ａｓｎ）−８０３残基の重要度を比較するために、本発明の実施例では、簡単な変異ペプチドを利用して分析する蛍光偏光に基づいた競合的抑制分析法を行った。前記変異ペプチドは下記のような方法で調製した。
【００８１】
つまり、人間ＨＩＦ−１α−（７８６−８２６、配列番号４）ペプチド及びＰＣＲによって調製したその単一変異生成物をｐＧＥＸ−２Ｔ−１（Amersham Biosciences）ベクターにクローニングした後、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）で過発現させた。過発現されたＧＳＴ融合蛋白質をグルタチオ−セファロース（Amersham Biosciences）を利用して精製した後、トロンビンを処理してＧＳＴを除去し、得られたペプチドを逆相ＨＰＬＣを利用して精製し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法でその質量を確認した。ＨＩＦ−１α−ｐ３００蛋白質結合相で点突然変異を有するＨＩＦ−１α−（７８６−８２６、配列番号４）ペプチドによる競合的抑制結果を図６に示した。
【００８２】
図６に示したように、多様な濃度の自然型ペプチド及び単一変異ペプチドを含んでいるＧＳＴ−ｐ３００とＦ−ＨＩＦ−１α−（７８６−８２６、配列番号４）の混合物の蛍光偏光において、ＨＩＦ−１αの７８６−８２６番目の残基を有する前記自然型ペプチドは、ｐ３００蛋白質との結合でＦ−ＨＩＦ−１α−（７８６−８２６、配列番号４）ペプチドと効果的に競合したが（３１８.６ｎＭのＫｉ）、前記Ｃ８００Ｓ辺がペプチドは抑制剤として作用しなかった（３５９２.３ｎＭのＫｉ）（図６）。このような結果は、ＨＩＦ−１α内にあるシステイン（Ｃｙｓ）−８００を、親水性を帯びたセリン（Ｓｅｒ）またはアスパルト酸（Ａｓｐ）で置換する場合はｐ３００蛋白質との結合を妨害するが、疎水性を帯びたアラニン（Ａｌａ）またはバリン（Ｖａｌ）で置換すると、ｐ３００蛋白質との結合を妨害しないという以前の研究報告と一脈相通ずることであって、これはまた、Ｆ−ＨＩＦ−１α（７８６−８２６）［Ｃ８００Ａ］とｐ３００蛋白質間の結合でも観察された（図４Ｃ）。
【００８３】
これとは異なり、Ｔ７９６Ｄ及びＮ８０３Ａ変異ペプチドは、ｐ３００蛋白質との結合において、前記自然型ペプチドに比べてはその抑制の程度はそれほどでないが、Ｆ−ＨＩＦ−１α−（７８６−８２６、配列番号４）を競合的に抑制した（図６）。このような結果は、アスパラギン（Ａｓｎ）−８０３をアラニン（Ａｌａ）で置換した変異ペプチドは、ｐ３００蛋白質との結合においてその効果が殆どないが、ＦＩＨ−１による水酸化反応は抑制しており、また、スレオニン（Ｔｈｒ）−７９６のリン酸化反応は少なくともｐ３００蛋白質結合で重要な役割を果たしていないことを意味する。
【００８４】
前記で説明された実施例は、単に本発明の原理を適用した例に過ぎない。多くの変形と選択的な実施例は本発明の精神及び範囲を越えない限り自由に変形されることができ、添付の特許請求の範囲はこのような変形及び整列と一致する。したがって、本発明が図面から見られるように、特により実用的であり好ましい実施例として見なされる場合、これと関連してより詳しく説明する際、請求の範囲で説明する本発明の原理及び概念を越えずに、当業系の普通の熟練者によって多様な変形が行われることは自明である。
【図面の簡単な説明】
【００８５】
【図１Ａ】蛍光物質で標識されたＨＩＦ−１αペプチドとＣＢＰ蛋白質間の結合における、ＣＢＰ蛋白質の調製時に添加されたＺｎ２＋の作用を示すグラフであって、この時使用されたペプチドはＦ−ＨＩＦ−１α（７７６−８２６、配列番号３）であり、測定された値は、３回を独立に繰り返して得られた蛍光偏光値を平均±標準偏差に示したものである。
【図１Ｂ】蛍光物質で標識されたＨＩＦ−１αペプチドとｐ３００蛋白質間の結合における、ｐ３００蛋白質の調製時に添加されたＺｎ２＋の作用を示すグラフであって、この時使用されたペプチドはＦ−ＨＩＦ−１α（７８６−８２６、配列番号４）であり、測定された値は、３回を独立に繰り返して得られた蛍光偏光値を平均±標準偏差に示したものである。
【図２】図２は、蛍光物質で標識された長さの多様な４個のＨＩＦ−１αペプチドとＣＢＰ（図２Ａ）またはｐ３００（図２Ｂ）蛋白質間の結合による蛍光偏光値の変化を示すグラフであって、この時、（■）、（□）、（●）、及び（○）は、各々、Ｆ−ＨＩＦ−１α（７７６−８２６、配列番号３）、Ｆ−ＨＩＦ−１α（７８６−８２６、配列番号４）、Ｆ−ＨＩＦ−１α（７８８−８２２、配列番号６）、及びＦ−ＨＩＦ−１α（７７６−８１４、配列番号５）ペプチドを示したものである。また、蛍光偏光値の変化（△ＦＰ）は、ＣＢＰまたはｐ３００蛋白質の不在下で測定された前記蛍光物質で標識されたペプチドの蛍光偏光値を差し引いて示したものである。
【図３Ａ】図３は、ＨＩＦ−１αペプチドとｐ３００蛋白質間の結合における、ＨＩＦ−１αペプチドのアスパラギンの水酸化作用を示したものであって、図３Ａは、ＨＩＦ−１阻害因子（ＦＩＨ−１）酵素を処理または処理していないＦ−ＨＩＦ−１α（７８６−８２６、配列番号４）ペプチドのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析結果を示したものである。
【図３Ｂ】図３は、ＨＩＦ−１αペプチドとｐ３００蛋白質間の結合における、ＨＩＦ−１αペプチドのアスパラギンの水酸化作用を示したものであって、図３Ｂは、前記反応後、逆相ＨＰＬＣによって精製された、水酸化されたペプチド（●）及び酵素処理していない対照群ペプチド（○）を示したものである。
【図４Ａ】図４は、ＨＩＦ−１αペプチドとｐ３００蛋白質間の結合における、ＨＩＦ−１αペプチドのシステイン（Ｃｙｓ）−８００のＳ−ニトロソ化の作用を示したものであって、図４Ａは、ＳＮＡＰを処理したペプチド（実線）または処理していないペプチド（点線）の吸光度を示したものである。
【図４Ｂ】図４は、ＨＩＦ−１αペプチドとｐ３００蛋白質間の結合における、ＨＩＦ−１αペプチドのシステイン（Ｃｙｓ）−８００のＳ−ニトロソ化の作用を示したものであって、図４Ｂは、ＳＮＡＰで処理または処理していない自然型ペプチド（ＷＴ）及びシステイン（Ｃｙｓ）がアラニン（Ａｌａ）で置換されたＦ−ＨＩＦ−１α（７８６−８２６）［Ｃ８００Ａ］ペプチドの蛍光偏光値の変化を示したものである。
【図４Ｃ】図４は、ＨＩＦ−１αペプチドとｐ３００蛋白質間の結合における、ＨＩＦ−１αペプチドのシステイン（Ｃｙｓ）−８００のＳ−ニトロソ化の作用を示したものであって、図４Ｃは、（●）、Ｆ−ＨＩＦ−１α−（７８６−８２６、配列番号４）ペプチド；（■）、Ｓ−ニトロソ化されたＦ−ＨＩＦ−１α（７８６−８２６、配列番号４）ペプチド；及び（▲）、Ｆ−ＨＩＦ−１α（７８６−８２６）［Ｃ８００Ａ］ペプチドとｐ３００蛋白質間の結合による蛍光偏光値の変化を各々示したものである。
【図５Ａ】図５は、ＨＩＦ−１αペプチドとｐ３００蛋白質間の結合における、ＨＩＦ−１αペプチドのリン酸化作用を示したものであって、図５Ａは、正常酸素状態（Ｎ）で分離したキナーゼ分画物または低酸素状態（Ｈ）で分離したキナーゼ分画物と反応させたＦ−ＨＩＦ−１α（７８６−８２６、配列番号４）ペプチドのリン酸化数値を示したものであり、放射線分析法で測定したものである。
【図５Ｂ】図５は、ＨＩＦ−１αペプチドとｐ３００蛋白質間の結合における、ＨＩＦ−１αペプチドのリン酸化作用を示したものであって、図５Ｂは、ｐ３００蛋白質を処理または処理していない前記ペプチドの結合活性を示したものであり、ここで結合活性は、蛍光偏光分析で測定したものである。
【図５Ｃ】図５は、ＨＩＦ−１αペプチドとｐ３００蛋白質間の結合における、ＨＩＦ−１αペプチドのリン酸化作用を示したものであって、図５Ｃは、ＣＫ２処理によるＨＩＦ−１αペプチドのリン酸化数値を示したものであり、放射線分析法で測定したものである。
【図５Ｄ】図５は、ＨＩＦ−１αペプチドとｐ３００蛋白質間の結合における、ＨＩＦ−１αペプチドのリン酸化作用を示したものであって、図５Ｄは、ＣＫ２がまだ処理されていないＨＩＦ−１αペプチド（●）またはリン酸化されたＨＩＦ−１αペプチド（○）の結合活性を示したものであり、ここで結合活性は、蛍光偏光分析で測定したものである。
【図６】図６は、Ｆ−ＨＩＦ−１α−ｐ３００反応における、Ｆ−ＨＩＦ−１αペプチドの点突然変異による競合的抑制活性を示したものであって、この時（●）、（■）、（○）、及び（□）は、各々、野生型、Ｔ７９Ｄ、Ｎ８０３Ａ、及びＣ８００ＳＨＩＦ−１α（７８６−８２６）ペプチドを示したものである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペプチドの結合、より詳しくは、蛍光物質で標識されたＨＩＦ−１αＣ−末端ペプチドとＣＢＰまたはｐ３００蛋白質間の結合を定量分析する方法、及び前記方法、つまり、蛍光偏光に基づいた結合分析法を利用したＨＩＦ−１αペプチドとＣＢＰまたはｐ３００蛋白質間の結合を阻害する抑制剤のスクリーニング方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
動物細胞が酸素数値の変化を感知及び反応する能力を持つことは生存に必須であり、このような能力は、血管形成、心筋虚血、脳虚血、肺性高血圧、及び多様な種類の癌のような人間の病気だけでなく、発生及び生理的過程において大変重要な役割を果たす。低酸素症は、マスター転写因子、つまり、低酸素誘導因子−１（ＨＩＦ−１）と関連している。
【０００３】
低酸素誘導因子−１（ＨＩＦ−１）は、αとβサブユニットで構成されており、この時、前記βサブユニットは常に安定して発現するが、ＨＩＦ−１α（αサブユニット）は、低酸素状態では安定化しており、正常酸素状態では、プロテアソームによって退化する。低酸素状態で安定化されたＨＩＦ−１αは、核内にあるＣＢＰ（cAMP-response element-binding protein）またはｐ３００蛋白質と結合して複合体を形成した後、標的遺伝子のプロモーターに存在する低酸素応答因子（hypoxia-response element, ＨＲＥ）と結合して、標的遺伝子の転写を活性化させる（Lando, D.ら、Genes. Dev., 16: 1466-14, 2002）。
【０００４】
このようなＣＢＰ及びｐ３００転写補助蛋白質は多様な信号伝達経路の終結点で作用して、細胞の成長、分化、及び恒常性維持に関連する特定の遺伝子の発現を調節するので、ＨＩＦ−１αとＣＢＰまたはｐ３００蛋白質間の結合を調節することは、冠不全、脳虚血、及び血管不全（vascular insufficiency）のような虚血性疾患を治療、および血管形成抑制を通じた癌治療研究に有用である。
【０００５】
ＣＢＰまたはｐ３００蛋白質は、亜鉛イオン（Ｚｎ２＋）結合因子を含むシステイン−/ヒスチジン−リッチ１（cystein-/histidine-rich 1, ＣＨ１）ドメインを有しており、この時、前記ＣＨ１ドメインは、ＨＩＦ−１αのＣ−末端トランス活性ドメイン（C-terminal transactivation domain, Ｃ−ＴＡＤ）と結合する（Kung, A.L.ら、Nature Medicine, 6: 1335-1340, 2000）。また、ＮＭＲ研究を通じて、ｐ３００蛋白質の３３１−４１８番目のアミノ酸部位とＨＩＦ−１αの７９２−８２４番目のアミノ酸ペプチドの複合体構造、及びＣＢＰ蛋白質の３４５−４３９番目のアミノ酸部位とＨＩＦ−１αの７７６−８２６番目のアミノ酸ペプチドの複合体構造が明らかになった（Dames, S.A.ら、PNAS, 99: 5271-5276, 2002）。このような複合体構造によれば、ＣＨ１は、ＨＩＦ−１αのＣ−末端ドメインの折り畳み構造のための骨格として作用するので、多様な疎水性及び極性相互作用によって安定化される。また、本発明では分析に要する資料が少量でよく、ペプチドを数ｍＭの高濃度で使用するＮＭＲ分析とは違って、μＭ単位の低濃度でも充分に結合可能なＨＩＦ−１αのアミノ酸部位を使用する結合分析法を開発した。
【０００６】
ＨＩＦ−１依存性標的遺伝子の発現は、２種類の互いに異なる酸素依存性メカニズム、つまり、プロリン水酸化反応とアスパラギン水酸化反応により調節される。ＨＩＦ−１αに、特異なプロリル水酸化酵素によるＨＩＦ−１αの酸素依存性ドメイン（oxygen-dependent domain, ＯＤＤ）にあるプロリン残基の水酸化反応はＨＩＦ−１αの分解を誘導する反面、アスパラギンの水酸化反応は、ＨＩＦ−１αのＣ−末端トランス活性ドメイン（Ｃ−ＴＡＤ）とＣＢＰまたはｐ３００蛋白質間の結合を不活性化させ、ＨＩＦ−１依存性標的遺伝子の発現を減少させる。
【０００７】
初期に、ＨＩＦ−１を阻害する因子として知られたＨＩＦ−１阻害因子（factor-inhibiting HIF-1, ＦＩＨ−１）蛋白質（Mahon, P.C.ら、Genes Dev., 15: 2675-2686, 2001）は、その後、ＨＩＦ−１αの調節に関与する酸素センサの特徴を有していることが明らかになった（Lando, D.ら、Genes Dev., 16: 1466-14, 2002）。つまり、ＨＩＦ−１阻害因子（ＦＩＨ−１）は、２−オキソグルタル酸及び鉄分依存性ジオキシゲナーゼ蛋白質（Safran, M.ら、J. Clin. Invest., 111: 779-783, 2003）であって、正常酸素状態では、ＨＩＦ−１αのＣ−末端トランス活性ドメインにあるアスパラギン（Ａｓｎ）−８０３を水酸化させ、ＨＩＦ−１αとＣＢＰまたはｐ３００蛋白質間の結合及びＨＩＦに関するトランス活性を阻害するものと知られている（Lando, D.ら、Science, 295: 858-861, 2002）。
【０００８】
標的遺伝子に対するＨＩＦ−１αの転写的活性のために、アスパラギンの水酸化反応と共に、Ｃ−末端トランス活性ドメインにある他の残基の翻訳後修飾が、ＨＩＦ−１αのこのような機能を微細に調節することに影響を与えると提示されている（Brahimi-Horn.ら、Cell, Signal., 17: 1-9, 2005）。ＨＩＦ−１αの転写的活性調節のための代表的なメカニズムのうちの一つは、転写因子のリン酸化（Holmberg, C. I.ら、Trends Biochem. Sci., 27: 619-627, 2002）、つまり、正常酸素状態及び低酸素状態でのＨＩＦ−１αの直接的なリン酸化が報告されている（Brahimi-Horn, C.ら、Cellular Signalling, 17: 1-9, 2005）。
【０００９】
また、ＨＩＦ−１αのリン酸化は、それ自体の転写的活性を調節することが可能である。低酸素状態で誘導されたＭＡＰＫ（mitogen-activated protein kinase）の活性はＨＩＦ−１αをリン酸化させることと提示されており、リン酸化されたＨＩＦ−１αはｐ３００蛋白質との結合を増加させるが、それ自体の転写的活性との関連性はないと報告されている（Sang, N.ら、J. Biol. Chem., 278: 14013-14019, 2003）。しかし、ＨＩＦ−１αを核内に蓄積するように誘導するリン酸化部位が、Ｃ−末端トランス活性ドメインから遠く離れた部位に存在することが明らかになった（Mylonis, I.ら、J. Biol. Chem., 281: 33095-33106, 2006）。これとは異なり、Ｃ−末端トランス活性ドメインにあるスレオニン（Ｔｈｒ）−７９６は、カゼインキナーゼ２（ＣＫ２）によってリン酸化される候補物質として報告されている（Mottet, D.ら、Int. J. Cancer, 117: 764-774, 2005）。ＨＩＦ−１αのＣ−末端トランス活性ドメインの蛋白質合成後変形による転写的活性を示す資料が充分であるにもかかわらず、ＨＩＦ−１αのＣ−末端トランス活性ドメインとｐ３００またはＣＢＰ蛋白質間の結合において、このような変形の直接的な影響を示す明白な資料は有用であり得る。
【００１０】
さらに、一酸化窒素（ＮＯ）は、細胞の種類及びＮＯ濃度に依存的なＨＩＦ−１αの安定性を増加させたりあるいは減少させるものと知られており（Bilton, R. L.ら、Eur. J. Biochem., 270: 791-798, 2003）、ＨＩＦ−１αのシステイン（Ｃｙｓ）−８００残基のＳ−ニトロソ化は、ＨＩＦ−１αとｐ３００蛋白質間の結合を強化させてＨＩＦ−１αの転写的活性を増加させるという報告もあるが（Yasinska, I.M.ら、FEBS Lett., 549: 105-109, 2003）、いくつかの反対の結果も報告されている（Brahimi-Horn, C.ら、Cell, Signal., 17: 1-9, 2005）。
【００１１】
他の方法としては、ＨＩＦ−１αとＣＢＰまたはｐ３００蛋白質のうちの一つの蛋白質は簡単に検出可能な物質で標識し、他の一つの蛋白質は固体担体に固定させて、二つの蛋白質の結合を測定する方法がある。
【００１２】
また他の方法としては、ＣＢＰまたはｐ３００蛋白質とＨＩＦ−１αの結合を確認するために、ＨＩＦ−１αの特定の部位を認識する抗体を利用した免疫共沈降に基づいた測定法がある。しかし、このような方法は大量の試料を要求し、その過程が複雑であり、実験所要時間も長いだけでなく、放射性同位元素を使用しなければならないなどの多くの短所を有している。
【００１３】
これと共に、蛋白質間の直接的な結合を分析する代わり、間接的な方法、つまり、ＨＩＦ−１αがＣＢＰまたはｐ３００蛋白質と結合した後、標的遺伝子の低酸素−反応因子（ＨＲＥ）に結合して転写的活性を現わすということに着眼したリポーター分析法もある。一例として、Ｅｐｏ−ルシフェラーゼ（Epo-luciferase）を利用した測定方法がある（Kung, A. L.ら、Nature Medicine, 6: 1335-1340, 2000）。
【００１４】
このような生化学的または免疫学的方法がや放射能を表示する方法は大量の試料が要求され、過程が複雑であり、実験時間が長く、放射線同位元素を使用しなければならないなどの多くの短所を有しているので、ＨＩＦ−１αとＣＢＰまたはｐ３００蛋白質との結合を定量分析するより簡単な測定方法が要求されている。
【００１５】
このような研究の一環として、放射線同位元素を使わずに短時間にＨＩＦ−１αとＣＢＰまたはｐ３００蛋白質間の結合を観察することができる９６穴プレートを利用した分析法が開発された（Kung, A. L., et al, Cancer Cell, 6: 33-43, 2004）。このような分析法は、ＨＩＦ−１αとＣＢＰまたはｐ３００蛋白質間の結合を阻害する化合物をスクリーニングすることに利用可能であるが、高価なアビジンがコーティングされたプレート、ユウロピウムが融合された抗−ＧＳＴ抗体、及び時間分解蛍光分光計を使用しなければならないという短所を有している。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明者らは、蛍光物質で標識されたＨＩＦ−１αＣ−末端ペプチドとＣＢＰまたはｐ３００蛋白質間の蛋白質複合体が形成されたか否かを、蛍光偏光値の変化を測定して定量分析する方法を開発した。
【００１７】
また、本発明者らは、ＨＩＦ−１αＣ−末端トランス活性ドメイン（Ｃ−ＴＡＤ）の蛋白質合成後変形（水酸化反応、Ｓ−ニトロソ化反応、及びリン酸化反応）の直接的な影響の調査や、またはＨＩＦ−１α−ＣＢＰまたはＨＩＦ−１α−ｐ３００蛋白質複合体の形成を阻害する抑制剤をスクリーニングに有用な方法を開発した。
【００１８】
したがって、本発明の目的は、ＨＩＦ−１αＣ−末端ペプチドとＣＢＰまたはｐ３００蛋白質間の結合を定量分析する簡単な方法を提供することにある。
【００１９】
本発明の他の目的は、前記方法を利用して、ＨＩＦ−１αＣ−末端ペプチドとＣＢＰまたはｐ３００蛋白質間の結合を阻害する抑制剤のスクリーニング方法を提供することにある。
【００２０】
また、本発明の他の目的は、ＨＩＦ−１αＣ−末端部位にあるアミノ酸配列中、ＣＢＰまたはｐ３００蛋白質との結合に必要な少なくとも４１−５１個のアミノ酸を含む変形された蛍光物質で標識されたＨＩＦ−１αＣ−末端ペプチドを提供することにある。
【００２１】
このような目的を達成するために、本発明は、ＨＩＦ−１αＣ−末端ペプチドとＣＢＰまたはｐ３００蛋白質間の結合を定量分析する方法を提供する。
【００２２】
また他の側面より、本発明は、前記方法、つまり、蛍光偏光に基づいた結合分析法を利用したＨＩＦ−１αＣ−末端ペプチドとＣＢＰまたはｐ３００蛋白質間の結合を阻害する抑制剤のスクリーニング方法を提供する。
【００２３】
また他の側面より、本発明は、ＨＩＦ−１αＣ−末端アミノ酸配列中、ＣＢＰまたはｐ３００蛋白質との反応に必要な少なくとも４１−５１個のアミノ酸を含む合成されたＨＩＦ−１αＣ−末端ペプチド、より望ましくは、各々、Ｆ−ＨＩＦ−１α−（７７６−８２６、配列番号３）及びＦ−ＨＩＦ−１α−（７８６−８２６、配列番号４）に表記されたＨＩＦ−１αペプチドの７７６−８２６番目の残基及び７８６−８２６番目の残基を含むＨＩＦ−１αＣ−末端ペプチドを提供する。
【課題を解決するための手段】
【００２４】
本発明は、
１）ＨＩＦ−１α蛋白質のＣ−末端トランス活性ドメインから由来したペプチドに蛍光物質を結合させて、蛍光プローブを製造する段階；
２）前記蛍光プローブをＣＢＰまたはｐ３００蛋白質と反応させる段階；及び
３）前記２）段階で得られた反応物の蛍光偏光値を測定し、測定された蛍光偏光値の変化を分析するために、蛍光プローブ自体の蛍光偏光値と前記測定された蛍光偏光値とを比較する段階；
を含んで、ＨＩＦ−１αとＣＢＰまたはｐ３００蛋白質間の結合を定量分析する方法を提供する。
【００２５】
この定量分析方法において、前記１）段階の蛍光プローブは、ＨＩＦ−１α（ＮＣＢＩ受入番号ＡＡＡ５０１５２）の全長アミノ酸配列内に連続的に存在する少なくとも４１個のアミノ酸を有するペプチドを含み、この時、前記ペプチドは、配列番号４であるＨＩＦ−１α内に存在する７８６番目のアミノ酸乃至８２６番目のアミノ酸配列を必ず含み、前記ペプチドのＮ−末端にはアミノカプロン酸リンカーが連結されており、前記アミノカプロン酸リンカーの端部には蛍光物質が連結されたものであってもよい。
【００２６】
これは、前記蛍光プローブ内にある前記ペプチドが４１個のアミノ酸より短い場合、ＣＢＰまたはｐ３００蛋白質に対する前記ペプチドの結合活性が完全に抑制され得るため、前記ペプチドは、４１個またはＨＩＦ−１αの全長アミノ酸配列内に連続的に存在する４１個以上のアミノ酸を有するものであることができる。さらに、前記ペプチドは、５５個のアミノ酸より道場合、前記ペプチドのより大きい蛍光偏光値により、ＣＢＰまたはｐ３００蛋白質に対する前記ペプチドの結合活性を蛍光偏光変化で測定できないので、望ましくは、前記ペプチドは、ＨＩＦ−１αの全長アミノ酸配列内に連続的に存在する４１乃至５５個のアミノ酸を有するものであることができ、より望ましくは、配列番号３であるアミノ酸配列を有する５１個のアミノ酸であることができ、最も望ましくは、配列番号４であるアミノ酸配列を有する４１個のアミノ酸であることができる。
【００２７】
また、前記プローブは、ＨＩＦ−１αのアミノ酸配列上にある配列番号３であるアミノ酸配列を含むことができ、この時、前記ペプチドのＮ−末端にはアミノカプロン酸リンカーが連結されており、及び前記アミノカプロン酸リンカーの端部には蛍光物質が連結されてもよい。
【００２８】
また、前記１）段階の蛍光プローブは、特に制限されているわけではないが、追加的に前記プローブは、前記ペプチドのＮ−末端にはアミノカプロン酸リンカー、及び蛍光物質、望ましくはＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）で標識された蛍光物質が連結されており、前記リンカーの端には、配列番号３または配列番号４であるペプチドが連結されていることが好ましい（表１）。
【００２９】
前記定量分析方法において、前記リンカーが特に制限されているのではなく、できるだけリンカーの種類に関係なしでまたはリンカーなしで前記ペプチドに連結されることができ、これは蛍光物質で標識されたＨＩＦ−１αＣ−末端ペプチド、つまり、蛍光プローブと対象蛋白質間の結合によって誘導された蛍光強さの不要な変化を最少化することによって、蛍光偏光測定に用いてもよい。
【００３０】
また、前記蛍光物質はフルオレセイン及びその類似体を含むことができるが、これに制限する必要はない。例えば、前記蛍光物質は、望ましくはフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フィコエリトリン（ＰＥ）、テキサスレッド（ＴＲ）、及びテトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、フルオレセインカルボン酸（ＦＣＡ）、フルオレセインチオウレア（ＦＴＨ）、７−アセトキシクマリン−３−１、フルオレセイン−５−１、フルオレセイン−６−１、２’，７’−ジクロロフルオレセイン−５−１、ジヒドロテトラメチルローダミン−４−１、テトラメチルローダミン−５−１、及びテトラメチルローダミン−６−１からなる群より選択されたものであることができ、より望ましくは、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）であることができる。
【００３１】
前記定量分析方法において、前記ＣＢＰまたはｐ３００蛋白質は、特に制限されているのではなく、この時、前記ＣＢＰ蛋白質は、望ましくは配列番号１である１−４５０番目のアミノ酸配列を含むことができ、及び前記ｐ３００蛋白質は、望ましくは配列番号２である１−２２１番目のアミノ酸配列を含むことができる。さらに、前記ＣＢＰまたはｐ３００蛋白質は、各々、GenBank受入番号Ｕ８５９６２（ＣＢＰコーディング配列）及びＵ０１８７７（ｐ３００コーディング配列）である遺伝子上に存在するＨＩＦ−１αの結合部位を含む一部または全長アミノ酸配列を含みうる。
【００３２】
本発明の好ましい具体例では、合成されたＣＢＰまたはｐ３００蛋白質を提供することができ、この時、前記蛋白質は、培養した細胞または培養培地から分離及び精製されたものであることができる。前記蛋白質の分離及び精製方法は特に制限されているのではなく、望ましくは、前記方法は透析、限外濾過、ゲル濾過、及びＳＤＳ−ＰＡＧＥのような分子量の差に基づいた蛋白質分離方法、イオン−交換クロマトグラフィーのような電荷の差に基づいた蛋白質分離方法、及び逆相高性能液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）のような親水性の差に基づいた蛋白質分離方法からなる群より選択しうる。
【００３３】
また、前記２）段階の反応は、望ましくは蛍光プローブをＣＢＰまたはｐ３００蛋白質と１：１（１００ｎＭ：１００ｎＭ）乃至１：３０（１００ｎＭ：３０００ｎＭ）の範囲内で、より望ましくは、１：２（１００ｎＭ：２００ｎＭ）乃至１：１０（１００ｎＭ：１０００ｎＭ）の範囲内で混合して、誘導することができる。
【００３４】
前記定量分析方法において、前記３）段階の蛍光偏光測定は特に制限されているのではなく、望ましくは、蛍光偏光測定のための蛍光分光器またはウェルプレート基盤の蛍光検出器（Victor plate reader等）を利用することができ、この時、前記蛍光偏光値の変化は、２）段階で測定された反応物の蛍光偏光値から、蛍光プローブ自体の蛍光偏光値を差し引いて示すことができる。ここで、前記蛍光プローブはそれ自体の分子量が非常に小さいため、相対的に小さい蛍光偏光値を有する。しかし、前記蛍光ＨＩＦ−１αペプチドプローブがより大きい分子量を有するＣＢＰまたはｐ３００蛋白質と結合する場合、ＨＩＦ−１α−ＣＢＰまたはＨＩＦ−１α−ｐ３００複合体の蛍光偏光値は著しく増加する。
【００３５】
結果として、ＨＩＦ−１αとＣＢＰまたはｐ３００蛋白質間の結合の要否は、前記蛍光プローブをＣＢＰまたはｐ３００蛋白質と混合する前と混合した後に測定された蛍光偏光値の変化を通じて分析することができる。より詳しくは、前記蛍光偏光値の変化から、前記蛍光偏光値の差が陽性（＋）である時に複合体が形成されることを判断することができる。
【００３６】
同時に、本発明は、
１）ＨＩＦ−１α蛋白質のＣ−末端トランス活性ドメインから由来したペプチドに蛍光物質を結合させて製造した蛍光プローブと、ＣＢＰまたはｐ３００蛋白質を含む反応液に阻害剤候補物質を添加し、
２）前記反応液に阻害剤候補物質を添加する前と添加した後の蛍光偏光値の変化を測定し；及び
３）前記阻害剤候補物質の添加後に測定された前記反応液の蛍光偏光値が減少すれば、前記候補物質を抑制剤として決定する段階；を含む、ＨＩＦ−１αとＣＢＰまたはｐ３００蛋白質間の結合を阻害する抑制剤のスクリーニング方法を提供する。
【００３７】
前記スクリーニング方法において、前記１）段階の蛍光プローブは、ＨＩＦ−１α（ＮＣＢＩ受入番号ＡＡＡ５０１５２）の全長アミノ酸配列内に連続的に存在する少なくとも４１個のアミノ酸を有するペプチドを含み、この時、前記ペプチドは、配列番号４であるＨＩＦ−１α内に存在する７８６番目のアミノ酸乃至８２６番目のアミノ酸配列を必ず含み、前記ペプチドのＮ−末端にはアミノカプロン酸リンカーが連結されており、前記アミノカプロン酸リンカーの端部には蛍光物質を連結しうる。
【００３８】
これは、前記蛍光プローブ内にあるペプチドが４１個のアミノ酸より短い場合、ＣＢＰまたはｐ３００蛋白質に対する前記ペプチドの結合活性が完全に抑制され得るため、前記ペプチドは、４１個またはＨＩＦ−１αの全長アミノ酸配列内に連続的に存在する４１個以上のアミノ酸を有することができる。さらに、前記ペプチドは、５５個のアミノ酸より長い場合、前記ペプチドのより大きい蛍光偏光値により、ＣＢＰまたはｐ３００蛋白質に対する前記ペプチドの結合活性を蛍光偏光変化で測定できないため、望ましくは、前記ペプチドは、ＨＩＦ−１αの全長アミノ酸配列内に連続的に存在する４１乃至５５個のアミノ酸を有することができ、より望ましくは、配列番号３であるアミノ酸配列を有する５１個のアミノ酸であることができ、最も望ましくは、配列番号４であるアミノ酸配列を有する４１個のアミノ酸であることができる。
【００３９】
また、前記プローブは、ＨＩＦ−１αのアミノ酸配列上にある配列番号３であるアミノ酸配列を含むことができ、この時、前記ペプチドのＮ−末端にはアミノカプロン酸リンカーが連結されており、及び前記アミノカプロン酸リンカーの端部には蛍光物質を連結しうる。
【００４０】
また、前記１）段階の蛍光プローブは特に制限されているのではないが、追加として前記プローブは、前記ペプチドのＮ−末端にはアミノカプロン酸リンカー及び蛍光物質、望ましくはＦＩＴＣで標識された蛍光物質が連結されており、前記リンカーの端には、配列番号３または配列番号４であるペプチドが連結されているのが好ましい（表１）。
【００４１】
このようなスクリーニング方法において、前記リンカーは特に制限されているのではなく、できるだけリンカーの種類に関係なしでまたはリンカーなしで前記ペプチドに連結することができ、これは蛍光物質で標識されたＨＩＦ−１αＣ−末端ペプチド、つまり、蛍光プローブと対象蛋白質間の結合によって誘導された蛍光強さの不要な変化を最少化することによって、蛍光偏光測定に用いられうる。
【００４２】
また、前記蛍光物質は、フルオレセイン及びその類似体を含むこともできるが、これに制限されるわけではない。例えば、前記蛍光物質は、望ましくはフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フィコエリトリン（ＰＥ）、テキサスレッド（ＴＲ）及びテトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、フルオレセインカルボン酸（ＦＣＡ）、フルオレセインチオウレア（ＦＴＨ）、７−アセトキシクマリン−３−１、フルオレセイン−５−１、フルオレセイン−６−１、２’，７’−ジクロロフルオレセイン−５−１、ジヒドロテトラメチルローダミン−４−１、テトラメチルローダミン−５−１、及びテトラメチルローダミン−６−１からなる群より選択されることができ、より望ましくは、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）でありうる。
【００４３】
前記スクリーニング方法において、前記ＣＢＰまたはｐ３００蛋白質は特に制限されているのではなく、この時、前記ＣＢＰ蛋白質は、望ましくは配列番号１である１−４５０番目のアミノ酸配列を含むことができ、及び前記ｐ３００蛋白質は、望ましくは配列番号２である１−２２１番目のアミノ酸配列を含みうる。さらに、前記ＣＢＰまたはｐ３００蛋白質は、各々、GenBank 受入番号Ｕ８５９６２（ＣＢＰコーディング配列）及びＵ０１８７７（ｐ３００コーディング配列）である遺伝子上に存在するＨＩＦ−１αの結合部位を含む一部または全長アミノ酸配列を含みうる。
【００４４】
また、前記２）段階の阻害剤候補物質は特に制限されているのではなく、望ましくは、前記候補物質は、前記蛍光プローブとＣＢＰまたはｐ３００蛋白質間の結合を競合阻害する抗体、ペプチド、オリゴヌクレオチド、及び天然及び合成化合物からなる群より選択されうる。
【００４５】
これに、本発明は、
ａ）蛍光物質をＨＩＦ−１α蛋白質のＣ−末端トランス活性ドメイン（Ｃ−ＴＡＤ）から由来したペプチドに結合させて、蛍光プローブを製造し、前記蛍光プローブをＣＢＰまたはｐ３００蛋白質と反応させて、これらの蛍光偏光値を測定する段階；
ｂ）前記蛍光プローブに、ＨＩＦ−１阻害因子（ＦＩＨ−１）、Ｓ−ニトロソ−Ｎ−アセチルペニシラミン（ＳＮＡＰ）、及びカゼインキナーゼ２（ＣＫ２）からなる群より選択されたいずれか一つの酵素を処理し、前記酵素処理されたプローブをＣＢＰまたはｐ３００蛋白質と反応させて、これらの蛍光偏光値を測定する段階；及び
ｃ）ＣＢＰまたはｐ３００蛋白質との結合相で、ＨＩＦ−１αＣ−末端トランス活性ドメインの蛋白質合成後の変形の影響を分析するために、前記ａ）及びｂ）段階で測定された蛍光偏光値を比較する段階；
を含む、定量分析する方法を提供する。
【発明の効果】
【００４６】
結果として、本発明による作用が、たとえｐ３００蛋白質との結合活性において、蛋白質合成後の変形の影響がＨＩＦ−１α−ｐ３００蛋白質結合の直接的な調節よりも、いくつかの他のメカニズムを通じてＨＩＦ−１αに関する転写活性に影響を与えるものだとしても、このような効果において相反する問題の解決を援助することができる。
【実施例】
【００４７】
以下、本発明をより詳しく説明する。
【００４８】
本発明の実用的であり好ましい実施例は、本発明に関する当業者が本発明を実施できるように、より明確にするためのものであり、これは本発明の精神及び範囲内で変形及び向上させうる。
【００４９】
（実施例１）
ＣＢＰ及びｐ３００蛋白質の分離及び発現
本発明の実施例によるＣＢＰ及びｐ３００蛋白質の発現のために、配列番号１であるアミノ酸配列を含む切片化された人間ＣＢＰ（１−４５０番目のアミノ酸）及び配列番号２であるアミノ酸配列を含む切片化されたｐ３００（１−２２１番目のアミノ酸）を、各々、ｐＧＥＸ−ＫＧ（GE Healthcare Life Sciences, 米国）及びｐＧＥＸ−４Ｔ−１（Amersham Biosciences, 米国）ベクターにクローニングした後、大腸菌ＢＬ２１（Novagen）に形質転換させた。
【００５０】
前記形質転換された細胞を、５０μｇ/ｍｌのアンピシリンが添加されたLuria-Bertani（ＬＢ）液体培地に接種して、吸光度（Ｏ.Ｄ）が０.６程度になるまで３７℃で培養した後、蛋白質の発現を誘導するために、０.５ｍＭのＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド）を添加して、１８℃で１５時間培養した。遠心分離した後、前記細胞にＰＭＳＦ（フッ化フェニルメチルスルホニル）及びリゾチームを、最終濃度が各々０．２ｍＭ及び１ｍｇ/ｍｌになるように添加した１０ｍＭのリン酸塩緩衝溶液（ＰＢＳ、ｐＨ７.４；１１０ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴ）に懸濁させ、４℃で粉砕した。細胞抽出物に２％のトリトンＸ−１００を添加してよく混合した後、１０分間氷に入れた後、１３，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。分離された上清に１ｍＭのＤＴＴを添加して、グルタチオン−セファロース（Amersham Biosciences, 米国）と混合した後、４℃で２時間攪拌し、前記反応混合物に１０倍体積のリン酸塩緩衝溶液を添加して５分間遠心分離した後、上清を除去した。このような過程を３回連続で繰り返し、遠心分離して上清を除去した後、前記処理されたセファロースビードをBio-Spin（登録商標）の使い捨てクロマトグラフィーカラム（Bio-Rad）に添加した。前記ビードに非特異的に結合された不要な物質を除去するために、５ｍｌのリン酸塩緩衝溶液で濾過させ、２ｍｌの１ＭＮａＣｌ溶液で濾過させた。
【００５１】
最後に、１０ｍＭのグルタチオン−セファロースを利用して、前記ビードからＧＳＴ−ＣＢＰ及びＧＳＴ−ｐ３００蛋白質を収得した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを利用してその純度を確認し、ブラッドフォード分析法（Bio-Red）を利用して、定量化した。
【００５２】
（実施例２）
蛍光物質で標識されたＨＩＦ−１αペプチドとＣＢＰまたはｐ３００蛋白質間の結合分析
２−１．蛍光物質で標識されたＨＩＦ−１αペプチド
人間ＨＩＦ−１αのＣ−末端トランス活性ドメイン（Ｃ−ＴＡＤ）を含む蛍光物質で標識された４個のＨＩＦ−１αペプチドは、Ｎ−末端にアミノカプロン酸リンカー（Anygen、Kwangju、韓国）と共にフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）を連結して合成し、この時７７６−８２６、７８６−８２６、７７６−８１４、及び７８８−８２２番目のアミノ酸残基を含む前記合成された４個のペプチドは、各々、Ｆ−ＨＩＦ−１α（７７６−８２６、配列番号３）、Ｆ−ＨＩＦ−１α（７８６−８２６、配列番号４）、Ｆ−ＨＩＦ−１α（７７６−８１４、配列番号５）、及びＦ−ＨＩＦ−１α（７８８−８２２、配列番号６）に記載した（表１）。
【表１】
【００５３】
変異ペプチドを製造するために、ＰＣＲ反応により調製したＨＩＦ−１α（７８６−８２６、配列番号４）の単一変異生成物をｐＧＥＸ−２Ｔ−１（Amersham Biosciences,米国）ベクターにクローニングした後、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）で過発現させた。過発現されたＧＳＴ融合蛋白質をグルタチオ−セファロース（Amersham Biosciences,米国）を利用して精製した後、トロンビンを処理してＧＳＴを除去し、得られたペプチドを逆相ＨＰＬＣを利用して精製し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法でその質量を確認した。
【００５４】
前記ＨＩＦ−１αペプチドとＣＢＰまたはｐ３００蛋白質間の結合親和力及びその特徴は、前記実施例１の方法によって製造された合成ペプチドとＣＢＰまたはｐ３００蛋白質間の結合による蛋白質−リガンド複合体の形成によって変化された蛍光偏光値を測定することによって分析される。前記蛍光偏光値は、蛍光分光器（Perkin-Elmer）で測定し、この時、スリット幅は５ｎｍ、総測定時間（integration time）は５秒に設定した。前記結合反応において、ＥＢＣ溶液（５０ｍＭのＴｒｉｓ；１２０ｍＭのＮａＣｌ；ｐＨ８.０、０.２５％NonidetP（ＮＰ）−４０）が使用された。
【００５５】
２−２．蛍光物質で標識されたＨＩＦ−１αペプチドとＺｎ２＋処理または未処理されたＣＢＰまたはｐ３００蛋白質間の結合分析
ＣＢＰまたはｐ３００蛋白質のシステイン−/ヒスチジン−リーチ１（ＣＨ１）ドメインは、Ｚｎ２＋結合センターを含んでいるＨＩＦ−１αのＣ−末端トランス活性ドメイン（Ｃ−ＴＡＤ）と結合するので、本発明の実施例では、ＣＢＰまたはｐ３００蛋白質とＨＩＦ−１αから由来したペプチドとの結合において、前記ＣＢＰまたはｐ３００蛋白質調製過程、つまり、細胞粉砕及び蛋白質溶出時に添加されたＺｎ２＋の重要性を最初に調査し、この時、前記ＣＨ１ドメインを含むＧＳＴ−ＣＢＰまたはＧＳＴ−ｐ３００蛋白質は、蛋白質調製過程時細胞粉砕または蛋白質溶出過程で、硫酸亜鉛（ＺｎＳＯ４）を添加または添加せずに調製した。前記実施例１で調製したＥＢＣ溶液に８００ｎＭのＣＢＰまたはｐ３００蛋白質を添加した後、ＣＢＰ添加溶液には１００ｎＭのＦ−ＨＩＦ−１α（７７６−８２６、配列番号３）ペプチドを、及びｐ３００添加溶液には１００ｎＭのＦ−ＨＩＦ−１α（７８６−８２６、配列番号４）ペプチドを、各々２５℃で混合し、その後蛍光偏光値を測定した。
【００５６】
その結果、前記ＧＳＴ−ＣＢＰ及びＧＳＴ−ｐ３００を前記ペプチドと混合した場合には、蛍光偏光値が著しく増加し、この時、ＣＢＰ−Ｆ−ＨＩＦ−１α（７７６−８２６、配列番号３）及びｐ３００−ＨＩＦ−１α（７８６−８２６、配列番号４）複合体形成によって測定された蛍光偏光値は、各々、ＨＩＦ−１α（７７６−８２６、配列番号３）及びＨＩＦ−１α（７８６−８２６、配列番号４）ペプチド自体の蛍光偏光値に比べて増加した（図１Ａ及び１Ｂ）。しかし、ＣＢＰまたはｐ３００蛋白質調製過程時の硫酸亜鉛（ＺｎＳＯ４）の添加有無に応じた蛍光偏光値の変化は殆どなく、これは、前記ＨＩＦ−１αペプチドとＧＳＴ−ＣＢＰまたはＧＳＴ−ｐ３００蛋白質のＣＨ１ドメインとの複合体を形成するにおいて、前記大腸菌培養額内に充分な量のＺｎ２＋が存在していることを意味する。
【００５７】
２−３．蛍光物質で標識されたＨＩＦ−１αと多様な濃度のＣＢＰまたはｐ３００蛋白質間の結合分析
ＨＩＦ−１αＣ−末端トランス活性ドメイン内にある互いに異なる部位から由来した４個のペプチドと、ＣＢＰまたはｐ３００蛋白質間の結合を比較するために、蛍光物質で標識されたＨＩＦ−１αペプチドと０−３０００ｎＭの多様な濃度を有するＣＢＰ蛋白質を、前記実施例２−２と同一な条件で反応させて、蛍光偏光値を測定した（図２Ａ）。このようなペプチドはその大きさにより固有の蛍光偏光値を有しているので、前記蛋白質複合体の蛍光偏光値から前記ペプチド自体の蛍光偏光値を差し引いて、その変化を測定した。
【００５８】
ＣＢＰの場合、ＣＢＰと混合されたＨＩＦ−１α（７７６−８２６、配列番号３）、及びＨＩＦ−１α（７８６−８２６、配列番号４）の蛍光偏光値は、ＧＳＴ−ＣＢＰの濃度が増加することに伴って各々増加し、場合によっては一定の安定値に到達した（図２Ａ）。また、このような二つのペプチドの解離定数は、各々ＨＩＦ−１α（７７６−８２６、配列番号３）に対しては１９５.７ｎＭであり、ＨＩＦ−１α（７８６−８２６、配列番号４）に対しては１７４.９ｎＭであった。これとは異なり、ＨＩＦ−１α（７８８−８２２、配列番号６）の蛍光偏光値は、前記二つのペプチドの蛍光偏光値に比べて遥かに増加せず、ＨＩＦ−１α（７７６−８１４、配列番号５）の蛍光偏光値は３０００ｎＭ以上のＧＳＴ−ＣＢＰ蛋白質濃度でも増加しなかった（図２Ａ）。
【００５９】
ｐ３００の場合、ｐ３００と混合されたＨＩＦ−１α（７７６−８２６、配列番号３）及びＨＩＦ−１α（７８６−８２６、配列番号４）の蛍光偏光値は、図２Ａに示したものに類似しているように、ＧＳＴ−ｐ３００の濃度増加に伴って増加した（図２Ｂ）。このような二つのペプチドの解離定数は、各々、ＨＩＦ−１α（７７６−８２６、配列番号３）に対しては１５７.３ｎＭであり、ＨＩＦ−１α（７８６−８２６、配列番号４）に対しては１８０.１ｎＭであった。これとは異なり、ＨＩＦ−１α（７８８−８２２、配列番号６）の蛍光偏光値は、前記二つのペプチドの蛍光偏光値に比べて遥かに増加せず、ＨＩＦ−１α（７７６−８１４、配列番号５）の蛍光偏光値はＧＳＴ−ｐ３００と共に培養する場合、いかなる増加もなかったが、これはｐ３００との結合において、ＨＩＦ−１αＣ−末端トランス活性ドメインのＣ−末端螺旋形が重要な役割を果たしていることを意味する。
【００６０】
このような結果は、蛍光物質で標識されたＨＩＦ−１αペプチドを利用した簡単な蛍光偏光に基づいた測定法が、ＨＩＦ−１αＣ−末端トランス活性ドメインから由来したペプチド断片とＣＢＰまたはｐ３００蛋白質間の結合活性を定量分析する可能性があることを意味する。
【００６１】
（実施例３）蛍光偏光に基づいた分析法を利用したＨＩＦ−１αとｐ３００蛋白質間の結合におけるＨＩＦ−１αの蛋白質合成後の変形（水酸化、ニトロソ化、及び水酸化）の影響
３−１．ＦＩＨ−１による水酸化作用
ＨＩＦ−１αのアスパラギン（Ａｓｎ）−８０３相での水酸化反応は、ＨＩＦ−１αによるＣＢＰまたはｐ３００蛋白質の補充を阻害させてＨＩＦ−１の転写的活性を抑制するため、本発明の実施例では、前記蛍光偏光に基づいた分析法を利用して、ｐ３００蛋白質との結合におけるＨＩＦ−１αペプチドの直接的な水酸化作用を調査した。まず、蛍光物質で標識されたＨＩＦ−１αペプチドを、ＨＩＦ−１αの特定アスパラギン残基を水酸化させる酵素として知られたＨＩＦ−１阻害因子（ＨＩＦ−１）で処理した後、前記ＨＩＦ−１αペプチドとｐ３００蛋白質間の結合を、蛍光偏光に基づいた分析法で測定した。前記ＦＩＨ−１酵素は下記のような方法で分離及び精製した。
【００６２】
つまり、全長人間ＦＩＨ−１（１−３４９番目のアミノ酸；GenBank I.D.：ＡＦ３９５８３０）をｐＥＴ２８ａ（＋）（Novagen）ベクターにクローニングし、大腸菌ＢＬ２１（Novagen）に形質転換した。前記形質転換された菌株から過発現されたＦＩＨ−１蛋白質を、前記ＣＢＰまたはｐ３００蛋白質の分離方法と同一に粉砕、懸濁、及び分離した。前記細胞抽出物を２％のトリトンＸ−１００と混合して氷で１０分間の反応させ、１３,０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。これから得られた上清を、ニッケル−親和性アガローズ（Qiagen、米国）相で４℃、１時間攪拌し、リン酸塩緩衝溶液で２回洗浄した後、前記反応混合物を、Bio-Spin（登録商標）の使い捨てクロマトグラフィーカラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）積載した。最後に、３００ｍＭのイミダゾール溶液でヒスチジン−ＦＩＨ−１を溶出し、前記精製された蛋白質はＳＤＳ−ＰＡＧＥを利用してその純度を確認し、ブラッドフォード分析法（Bio-Red）で定量化した。
【００６３】
前記アスパラギン残基の水酸化反応のために、４００ｍＭのアスコルブサン及び１００μＭのアルファ−ケトグルタレートを含む水酸化反応溶液（２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＬ、５ｍＭＫＣｌ、１.５ｍＭのＭｇＣｌ２；ｐＨ７.５）に０.７μｇ/μＬの再組み合わせＨｉｓ−ＦＩＨ−１を混合して、反応させた。室温で２時間反応させた後、前記反応混合物をＺｉｐＴｉｐＣ１８（Millipore、米国）に通過させて塩を除去し、アセトニトリル/水に０.１％ＴＦＡ（１：１ｖｏｌ/ｖｏｌ）を含んでいるアルファ−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸を添加して、溶出した。前記溶出したペプチド溶液をＭＡＬＤＩサンプルプレートに移した後、ボイジャー（Voyager）分析器を利用してＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ測定を行った。結合分析のために、前記水酸化されたペプチドを逆相ＨＰＬＣに精製した。
【００６４】
水酸化反応の要否を調査するために、まず、ＨＩＦ−１α（７８６−８２６、配列番号４）ペプチドに再組み合わせＨｉｓ−ＦＩＨ−１蛋白質を処理した後、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析を行い、この時、前記ペプチドは、ＦＩＨ−１の完全な活性（図２Ｂ）だけでなく、ｐ３００結合活性のための残基を含んでいる。ＦＩＨ−１によるＦ−ＨＩＦ−１α（７８６−８２６、配列番号４）の水酸化反応結果を図３Ａに示した。
【００６５】
図３Ａに示したように、Ｈｉｓ−ＦＩＨ−１を処理したペプチドは、対照群（Ｈｉｓ−ＦＩＨ−１を処理していないペプチド）に比べて〜１６ダルトン程度その分子量が増加したが（図３Ａ）、これは前記アスパラギンが再組み合わせＨｉｓ−ＦＩＨ−１によって水酸化されたことを意味する。前記水酸化されたＦ−ＨＩＦ−１α（７８６−８２６、配列番号４）ペプチドを逆相ＨＰＬＣに精製し、ＧＳＴ−ｐ３００との結合における蛍光偏光変化をモニタリングすることに利用したが、これは前記反応混合物に含まれているアスコルブサン及びアルファ−ケトグルタレートがＨＩＦ−１α−ｐ３００結合及び蛍光偏光測定を妨害し得るためである。前記水酸化されたペプチドの蛍光偏光変化を図３Ｂに示した。
【００６６】
図３Ｂに示したように、水酸化されたペプチドによる蛍光偏光変化数値は、単にｐ３００蛋白質濃度が増加することに伴って弱いながらも増加したが、これは変形していないペプチドに比べて遥かに増加していない（図３Ｂ）。したがって、このような結果は、ＦＩＨ−１によるＨＩＦ−１αのアスパラギン水酸化がたとえ完全ではなくても、ｐ３００との結合活性を抑制する可能性があることを意味する。
【００６７】
３−２．ＳＮＡＰによるＳ−ニトロソ化作用
ＨＩＦ−１αのシステイン（Ｃｙｓ）−８００相でのＳ−ニトロソ化反応は、ｐ３００蛋白質の補充及びＨＩＦ−１α自体の転写的活性を増加させるものと報告された反面、一酸化窒素（ＮＯ）はＨＩＦ−１αの安定性を増加または減少させるものと報告された（Ema, M.ら、EMBO J., 18: 1905-1914, 1999；Yasinska, I.M.とSumbayev, V.V.、FEBS Lett., 549: 105-109, 2003；Hagen, T.ら、Science, 302: 1975-1978, 2003）。本発明の実施例によれば、ＨＩＦ−１αとｐ３００蛋白質との結合相で、ＨＩＦ−１α内にあるＣｙｓ−８００のＳ−ニトロソ化作用が確認された。また、ニトロソチオール結合は、レーザー照射下で、それ自体の光誘導分解のため、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析で検出できなかった。したがって、前記ニトロソチオール結合の形成は、Ｓ−ニトロソ−Ｎ−アセチルペニシラミン（ＳＮＡＰ）処理されたＦ−ＨＩＦ−１α（７８６−８２６、配列番号４）の存在下ではは〜３２０ｎｍの吸光度で検出されたが、ＳＮＡＰが処理されていないペプチドでは検出されず（図４Ａ）、この時、前記ペプチドの含有量は前記蛍光吸光度のピークに標準化させた。
【００６８】
同時に、本発明では、Ｓ−ニトロソ化されたペプチドを検出及び精製するために、既に公知された方法を若干変形させたビオチン化法を利用した（Jaffery, S.R.ら、Na. Cell Biol., 3: 193-197, 2001）。つまり、スルフヒドリル基をビオチン化するために、Ｓ−ニトロソ−Ｎ−アセチルペニシラミン（ＳＮＡＰ）を処理または処理していないＦ−ＨＩＦ−１α（７８６−８２６、配列番号４）と、合成ビオチン化試料を反応させた。Ｆ−ＨＩＦ−１α（７８６−８２６、配列番号４）は単に一つのシステイン（Ｃｙｓ）−８００を有しているため、Ｓ−ニトロソ化によって変形された前記ペプチドはビオチン化されることができず、反面、ＳＡＮＰを処理していないペプチド内で遊離されたシステインはビオチン化される。このようなビオチン化方法は、ストレプトアビジン添加時に蛍光偏光の変化を測定することができ、また、逆相ＨＰＬＣを利用して測定時、Ｓ−ニトロ消化されて変形していないペプチドはよく分離しないが、Ｓ−ニトロ消化されてビオチン化されたペプチドは簡単に分離するので、Ｓ−ニトロソ化されたペプチドを分離することに容易である。
【００６９】
より具体的には、システイン（Ｃｙｓ）の代わりに、アラニン（Ａｌａ）を含んでいる３０μＭのＦ−ＨＩＦ−１α−（７８６−８２６、配列番号４）及びＦ−ＨＩＦ−１α（７８６−８２６）［Ｃ８００Ａ］を、各々、２ｍＭのＳＮＡＰを含む３０℃の５０ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ８.０）溶液で３０分間反応させた。反応していないＳＮＡＰを、セファデックスＧ−１５レジンを利用して除去した後、前記ペプチドのＳ−ニトロソ化反応を、前記ニトロソチオール一部の吸光度を測定することによって分光学的に分析した（Jaffery, S.R.ら、Nat. Cell Biol., 3: 193-197, 2001）。Ｓ−ニトロソ化の要否を確認するために、前記で調製した３００μＭのビオチン化試料をＳＮＡＰ処理した後、変形していないシステインを標識する際利用した。室温で２時間反応させた後、ビオチン化を、スクレプタビジン添加による蛍光偏光変化に測定した。また、結合分析のために、逆相ＨＰＬＣ上に存在するビオチン化デンペプチドから、前記Ｓ−ニトロソ化されたペプチドを分離して、収得した。
【００７０】
Ｓ−ニトロソ化の定量分析のためのビオチン化試料を調製するために、まず、ビオチン−システイン−アミノ基（ＮＨ２）を、固形状ペプチド合成プロトコルに従って、２５μｍｏｌのＦｍｏｃ−システインを利用して Rink Amide（登録商標）レジン（NovaBiochem）相で合成した。１２ｍｇの１,１１−ビス−マレイミドトリエチレングリコール（Pierce）を１.５ｍｌのビオチン−システイン−アミノ基（４ｍｇ）溶液を含むＰＢＳ/ＤＭＳＯ（１：２ｖ／ｖ）に添加した。前記混合物を室温で夜通しで混合した後、前記ビオチン化試料を逆相ＨＰＬＣを利用して精製し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析器でその質量を測定した。前記ビオチン化試料を処理したペプチドの蛍光偏光値を図４Ｂに示した。
【００７１】
図４Ｂに示したように、ストレプトアビジンを添加した場合には、前記ビオチン化デンペプチドの蛍光偏光値は増加したが、前記Ｓ−ニトロソ化されたペプチドの蛍光偏光値は変わらなかったが、これは、前記Ｓ−ニトロソ化されたペプチドは、ビオチン化試料を処理した時にはビオチン化できないからである。さらに、システイン（Ｃｙｓ）−８００がアラニン（Ａｌａ）で置換された変異Ｆ−ＨＩＦ−１α（７８６−８２６）［Ｃ８００Ａ］ペプチドは、ＳＮＡＰを処理し、ビオチン化を行った場合にも蛍光偏光値が変わらなかった（図４Ｂ）。
【００７２】
Ｆ−ＨＩＦ−１α（７８６−８２６、配列番号４）内にあるシステイン（Ｃｙｓ）−８００のＳ−ニトロソ化反応を確認した後、このような反応がｐ３００蛋白質との結合にいかなる影響を示すかを分析した。Ｓ−ニトロソ化された場合、ＧＳＴ−ｐ３００蛋白質が未処理されたＦ−ＨＩＦ−１α（７８６−８２６、配列番号４）、及びＧＳＴ−ｐ３００と混合されたＦ−ＨＩＦ−１α（７８６−８２６）［Ｃ８００Ａ］の蛍光偏光を測定した時、Ｆ−ＨＩＦ−１α（７８６−８２６）［Ｃ８００Ａ］及び未処理されたＦ−ＨＩＦ−１α（７８６−８２６、配列番号４）が全て類似に濃度−依存的な結合様相を示したが、Ｓ−ニトロソ化されたＦ−ＨＩＦ−１α（７８６−８２６、配列番号４）は、ｐ３００蛋白質の濃度増加に伴って多少増加した（図４Ｃ）。
【００７３】
このような結果は、たとえ一酸化窒素（ＮＯ）がプロリルヒドロキシラーゼに依存してＨＩＦ−１αの分解を誘導すると提案されているが（Hagen, T.ら、Science, 302: 1975-1978, 2003）、ＨＩＦ−１αのＳ−ニトロソ化反応それ自体は、ｐ３００蛋白質との結合を著しく阻害し、減少したＨＩＦ−１αの安定性に直接的なメカニズムで作用する可能性があることを意味する。
【００７４】
３−３．キナーゼによるリン酸化作用
ＨＩＦ−１α内にあるスレオニン（Ｔｈｒ）−７９６のリン酸化反応はＨＩＦ−１α−ＣＢＰ結合を増加させることと報告されたが（Gradin, K.ら、J. Biol. Chem., 277: 23508-23514, 2002）、ＨＩＦ−１αのリン酸化部位はＣ−末端トランス活性ドメイン（Ｃ−ＴＡＤ）から遠く離れている（Mylonis, I.ら、J. Biol. Chem., 281: 33095-33106, 2006）。したがって、本発明の実施例では、直接的な結合分析法を利用して、ｐ３００蛋白質との結合におけるＦ−ＨＩＦ−１α（７８６−８２６、配列番号４）ペプチドのリン酸化作用を調査した。まだ、ＨＩＦ−１αのスレオニン（Ｔｈｒ）−７９６をリン酸化させるプロテインキナーゼは確認されていないため、低酸素状態（Ｈ）及び正常酸素状態（Ｎ）下で培養したＨｅＬａ細胞から得られたキナーゼ分画物を、ｐ３００蛋白質に結合するＦ−ＨＩＦ−１α（７８６−８２６、配列番号４）のリン酸化反応を分析する際に利用した。
【００７５】
より具体的には、低酸素状態（Ｈ）または正常酸素状態（Ｎ）下で培養した人間ＨｅＬａ細胞を受取し、均質化溶液（５０ｍＭＰＩＰＥＳ、２ｍＭ ＤＴＴ、プロテアーゼ阻害剤カクテル、ｐＨ７．０）で懸濁させ、超音波で前記細胞を粉砕した。前記細胞粉砕物からキナーゼ分画物を収得するために、まず、０.５Ｍ ＮａＯＨで膨らむようにしたセルロースリン酸塩（Whatman）を焼結ガラスフィルターを有する開口カラムに入れて、ｐＨが３になるまで０.５ＭのＨＣｌを添加し、４℃、０.５Ｍ ＨＥＰＥＳ溶液で洗浄した。同時に、前記細胞粉砕物を洗浄溶液（０.５Ｍ ＨＥＰＥＳ、０.１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７.５）で予め−水平化させたカラムに積載した。結合していない物質を前記洗浄溶液で洗浄して除去した後、結合された蛋白質を溶出溶液（０.５Ｍ ＨＥＰＥＳ、０.４５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７.５）で溶出し、ブラッドフォード法を利用して、定量化した。
【００７６】
リン酸化反応のために、基質としては、３μＭのＦ−ＨＩＦ１α−（７８６−８２６、配列番号４）を利用し、１００μＭの［γ−３２Ｐ］ＡＴＰまたは同位元素で標識されないＡＴＰを含む５０μＬのキナーゼ反応溶液（２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、２０ｍＭのＭｇＣｌ２、２ｍＭのＤＴＴ、０．１ｍＭのＮａ３ＶＯ４、ｐＨ７.５）内に正常酸素状態または低酸素状態のキナーゼ（４０μｇ）、またはＣＫ２（５００ユニット；New England Biolabs, Beverly、米国）を混合して、反応させた。結合分析のために、［γ−３２Ｐ］ＡＴＰを含んでいない前記リン酸化された生成物を室温で夜通しで反応させた後、逆相ＨＰＬＣで精製した。正常酸素状態（Ｎ）または低酸素状態（Ｈ）のキナーゼ分画物による前記Ｆ−ＨＩＦ−１α（７８６−８２６、配列番号４）ペプチドのリン酸化反応結果を図５Ａに示した。
【００７７】
図５Ａに示したように、正常酸素状態（Ｎ）または低酸素状態（Ｈ）のキナーゼ分画物で処理した前記ペプチドの放射能は、対照群（キナーゼ処理していないペプチド）に比べて著しく増加した（図５Ａ）。
【００７８】
また、正常酸素状態（Ｎ）または低酸素状態（Ｈ）のキナーゼ分画物で処理及び逆相ＨＰＬＣに精製された前記ペプチドは、前記酵素で処理していないペプチドに類似に、ＧＳＴ−ｐ３００蛋白質と反応時、蛍光偏光が増加した（図５Ｂ）。同時に、前記ペプチド内に存在するスレオニン（Ｔｈｒ）−７９６は固有なＣＫ２リン酸化部位を有しているので（Mottet, D.ら、Int. J. Cancer, 117: 764-774, 2005）、前記Ｆ−ＨＩＦ−１α−（７８６−８２６、配列番号４）ペプチドは、ＣＫ２によってリン酸化される（図５Ｃ）。前記精製されたＣＫ２によってリン酸化されたペプチドの蛍光偏光は、前記酵素で処理されていないがペプチドの蛍光偏光と比較すると、類似なｐ３００蛋白質結合様相を示した（図５Ｄ）。
【００７９】
したがって、このような結果は、ＨＩＦ−１α内にあるＣ−末端トランス活性ドメイン（Ｃ−ＴＡＤ）のリン酸化反応はＨＩＦ−１α−ｐ３００結合にいかなる影響度与えず、リン酸化反応による前記増加された転写的活性は、他のメカニズムが関連していることを意味する（Brahimi-Horn, C.ら、Cell. Signal., 17: 1-9, 2005）。
【００８０】
３−４．競合的結合分析
ｐ３００蛋白質との結合における、ＨＩＦ−１αペプチドのスレオニン（Ｔｈｒ）−７９６、システイン（Ｃｙｓ）−８００、及びアスパラギン（Ａｓｎ）−８０３残基の重要度を比較するために、本発明の実施例では、簡単な変異ペプチドを利用して分析する蛍光偏光に基づいた競合的抑制分析法を行った。前記変異ペプチドは下記のような方法で調製した。
【００８１】
つまり、人間ＨＩＦ−１α−（７８６−８２６、配列番号４）ペプチド及びＰＣＲによって調製したその単一変異生成物をｐＧＥＸ−２Ｔ−１（Amersham Biosciences）ベクターにクローニングした後、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）で過発現させた。過発現されたＧＳＴ融合蛋白質をグルタチオ−セファロース（Amersham Biosciences）を利用して精製した後、トロンビンを処理してＧＳＴを除去し、得られたペプチドを逆相ＨＰＬＣを利用して精製し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法でその質量を確認した。ＨＩＦ−１α−ｐ３００蛋白質結合相で点突然変異を有するＨＩＦ−１α−（７８６−８２６、配列番号４）ペプチドによる競合的抑制結果を図６に示した。
【００８２】
図６に示したように、多様な濃度の自然型ペプチド及び単一変異ペプチドを含んでいるＧＳＴ−ｐ３００とＦ−ＨＩＦ−１α−（７８６−８２６、配列番号４）の混合物の蛍光偏光において、ＨＩＦ−１αの７８６−８２６番目の残基を有する前記自然型ペプチドは、ｐ３００蛋白質との結合でＦ−ＨＩＦ−１α−（７８６−８２６、配列番号４）ペプチドと効果的に競合したが（３１８.６ｎＭのＫｉ）、前記Ｃ８００Ｓ辺がペプチドは抑制剤として作用しなかった（３５９２.３ｎＭのＫｉ）（図６）。このような結果は、ＨＩＦ−１α内にあるシステイン（Ｃｙｓ）−８００を、親水性を帯びたセリン（Ｓｅｒ）またはアスパルト酸（Ａｓｐ）で置換する場合はｐ３００蛋白質との結合を妨害するが、疎水性を帯びたアラニン（Ａｌａ）またはバリン（Ｖａｌ）で置換すると、ｐ３００蛋白質との結合を妨害しないという以前の研究報告と一脈相通ずることであって、これはまた、Ｆ−ＨＩＦ−１α（７８６−８２６）［Ｃ８００Ａ］とｐ３００蛋白質間の結合でも観察された（図４Ｃ）。
【００８３】
これとは異なり、Ｔ７９６Ｄ及びＮ８０３Ａ変異ペプチドは、ｐ３００蛋白質との結合において、前記自然型ペプチドに比べてはその抑制の程度はそれほどでないが、Ｆ−ＨＩＦ−１α−（７８６−８２６、配列番号４）を競合的に抑制した（図６）。このような結果は、アスパラギン（Ａｓｎ）−８０３をアラニン（Ａｌａ）で置換した変異ペプチドは、ｐ３００蛋白質との結合においてその効果が殆どないが、ＦＩＨ−１による水酸化反応は抑制しており、また、スレオニン（Ｔｈｒ）−７９６のリン酸化反応は少なくともｐ３００蛋白質結合で重要な役割を果たしていないことを意味する。
【００８４】
前記で説明された実施例は、単に本発明の原理を適用した例に過ぎない。多くの変形と選択的な実施例は本発明の精神及び範囲を越えない限り自由に変形されることができ、添付の特許請求の範囲はこのような変形及び整列と一致する。したがって、本発明が図面から見られるように、特により実用的であり好ましい実施例として見なされる場合、これと関連してより詳しく説明する際、請求の範囲で説明する本発明の原理及び概念を越えずに、当業系の普通の熟練者によって多様な変形が行われることは自明である。
【図面の簡単な説明】
【００８５】
【図１Ａ】蛍光物質で標識されたＨＩＦ−１αペプチドとＣＢＰ蛋白質間の結合における、ＣＢＰ蛋白質の調製時に添加されたＺｎ２＋の作用を示すグラフであって、この時使用されたペプチドはＦ−ＨＩＦ−１α（７７６−８２６、配列番号３）であり、測定された値は、３回を独立に繰り返して得られた蛍光偏光値を平均±標準偏差に示したものである。
【図１Ｂ】蛍光物質で標識されたＨＩＦ−１αペプチドとｐ３００蛋白質間の結合における、ｐ３００蛋白質の調製時に添加されたＺｎ２＋の作用を示すグラフであって、この時使用されたペプチドはＦ−ＨＩＦ−１α（７８６−８２６、配列番号４）であり、測定された値は、３回を独立に繰り返して得られた蛍光偏光値を平均±標準偏差に示したものである。
【図２】図２は、蛍光物質で標識された長さの多様な４個のＨＩＦ−１αペプチドとＣＢＰ（図２Ａ）またはｐ３００（図２Ｂ）蛋白質間の結合による蛍光偏光値の変化を示すグラフであって、この時、（■）、（□）、（●）、及び（○）は、各々、Ｆ−ＨＩＦ−１α（７７６−８２６、配列番号３）、Ｆ−ＨＩＦ−１α（７８６−８２６、配列番号４）、Ｆ−ＨＩＦ−１α（７８８−８２２、配列番号６）、及びＦ−ＨＩＦ−１α（７７６−８１４、配列番号５）ペプチドを示したものである。また、蛍光偏光値の変化（△ＦＰ）は、ＣＢＰまたはｐ３００蛋白質の不在下で測定された前記蛍光物質で標識されたペプチドの蛍光偏光値を差し引いて示したものである。
【図３Ａ】図３は、ＨＩＦ−１αペプチドとｐ３００蛋白質間の結合における、ＨＩＦ−１αペプチドのアスパラギンの水酸化作用を示したものであって、図３Ａは、ＨＩＦ−１阻害因子（ＦＩＨ−１）酵素を処理または処理していないＦ−ＨＩＦ−１α（７８６−８２６、配列番号４）ペプチドのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析結果を示したものである。
【図３Ｂ】図３は、ＨＩＦ−１αペプチドとｐ３００蛋白質間の結合における、ＨＩＦ−１αペプチドのアスパラギンの水酸化作用を示したものであって、図３Ｂは、前記反応後、逆相ＨＰＬＣによって精製された、水酸化されたペプチド（●）及び酵素処理していない対照群ペプチド（○）を示したものである。
【図４Ａ】図４は、ＨＩＦ−１αペプチドとｐ３００蛋白質間の結合における、ＨＩＦ−１αペプチドのシステイン（Ｃｙｓ）−８００のＳ−ニトロソ化の作用を示したものであって、図４Ａは、ＳＮＡＰを処理したペプチド（実線）または処理していないペプチド（点線）の吸光度を示したものである。
【図４Ｂ】図４は、ＨＩＦ−１αペプチドとｐ３００蛋白質間の結合における、ＨＩＦ−１αペプチドのシステイン（Ｃｙｓ）−８００のＳ−ニトロソ化の作用を示したものであって、図４Ｂは、ＳＮＡＰで処理または処理していない自然型ペプチド（ＷＴ）及びシステイン（Ｃｙｓ）がアラニン（Ａｌａ）で置換されたＦ−ＨＩＦ−１α（７８６−８２６）［Ｃ８００Ａ］ペプチドの蛍光偏光値の変化を示したものである。
【図４Ｃ】図４は、ＨＩＦ−１αペプチドとｐ３００蛋白質間の結合における、ＨＩＦ−１αペプチドのシステイン（Ｃｙｓ）−８００のＳ−ニトロソ化の作用を示したものであって、図４Ｃは、（●）、Ｆ−ＨＩＦ−１α−（７８６−８２６、配列番号４）ペプチド；（■）、Ｓ−ニトロソ化されたＦ−ＨＩＦ−１α（７８６−８２６、配列番号４）ペプチド；及び（▲）、Ｆ−ＨＩＦ−１α（７８６−８２６）［Ｃ８００Ａ］ペプチドとｐ３００蛋白質間の結合による蛍光偏光値の変化を各々示したものである。
【図５Ａ】図５は、ＨＩＦ−１αペプチドとｐ３００蛋白質間の結合における、ＨＩＦ−１αペプチドのリン酸化作用を示したものであって、図５Ａは、正常酸素状態（Ｎ）で分離したキナーゼ分画物または低酸素状態（Ｈ）で分離したキナーゼ分画物と反応させたＦ−ＨＩＦ−１α（７８６−８２６、配列番号４）ペプチドのリン酸化数値を示したものであり、放射線分析法で測定したものである。
【図５Ｂ】図５は、ＨＩＦ−１αペプチドとｐ３００蛋白質間の結合における、ＨＩＦ−１αペプチドのリン酸化作用を示したものであって、図５Ｂは、ｐ３００蛋白質を処理または処理していない前記ペプチドの結合活性を示したものであり、ここで結合活性は、蛍光偏光分析で測定したものである。
【図５Ｃ】図５は、ＨＩＦ−１αペプチドとｐ３００蛋白質間の結合における、ＨＩＦ−１αペプチドのリン酸化作用を示したものであって、図５Ｃは、ＣＫ２処理によるＨＩＦ−１αペプチドのリン酸化数値を示したものであり、放射線分析法で測定したものである。
【図５Ｄ】図５は、ＨＩＦ−１αペプチドとｐ３００蛋白質間の結合における、ＨＩＦ−１αペプチドのリン酸化作用を示したものであって、図５Ｄは、ＣＫ２がまだ処理されていないＨＩＦ−１αペプチド（●）またはリン酸化されたＨＩＦ−１αペプチド（○）の結合活性を示したものであり、ここで結合活性は、蛍光偏光分析で測定したものである。
【図６】図６は、Ｆ−ＨＩＦ−１α−ｐ３００反応における、Ｆ−ＨＩＦ−１αペプチドの点突然変異による競合的抑制活性を示したものであって、この時（●）、（■）、（○）、及び（□）は、各々、野生型、Ｔ７９Ｄ、Ｎ８０３Ａ、及びＣ８００ＳＨＩＦ−１α（７８６−８２６）ペプチドを示したものである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１）ＨＩＦ−１α蛋白質のＣ−末端トランス活性ドメインから由来したペプチドに蛍光物質を結合させて蛍光プローブを製造する段階；
２）前記蛍光プローブをＣＢＰまたはｐ３００蛋白質と反応させる段階；及び
３）前記２）段階で得られた反応物の蛍光偏光値を測定し、測定された蛍光偏光値の変化を分析するために、蛍光プローブ自体の蛍光偏光値と前記測定された蛍光偏光値とを比較する段階；
を含む、ＨＩＦ−１αとＣＢＰまたはｐ３００蛋白質間結合の定量分析方法。
【請求項２】
前記蛍光プローブは、ＨＩＦ−１α（ＮＣＢＩ受入番号ＡＡＡ５０１５２）の全長アミノ酸配列内に連続的に存在する少なくとも４１個のアミノ酸を有するペプチドを含み、この時、前記ペプチドは、配列番号４であるＨＩＦ−１α内に存在する７８６番目のアミノ酸乃至８２６番目のアミノ酸配列を必ず含み、前記ペプチドのＮ−末端にはアミノカプロン酸リンカーが連結されており、前記アミノカプロン酸リンカーの端部には蛍光物質が連結されている、請求項１に記載の定量分析方法。
【請求項３】
前記蛍光プローブは、配列番号３であるアミノ酸配列を有するペプチドを含むものである、請求項２に記載の定量分析方法。
【請求項４】
前記ＣＢＰは、配列番号１であるアミノ酸配列を含むものである、請求項１に記載の定量分析方法。
【請求項５】
前記ｐ３００蛋白質は、配列番号２であるアミノ酸配列を含むものである、請求項１に記載の定量分析方法。
【請求項６】
前記蛍光物質は、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フィコエリトリン（ＰＥ）、テキサスレッド（ＴＲ）及びテトラ−メチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、フルオレセインカルボン酸（ＦＣＡ）、フルオレセインチオウレア（ＦＴＨ）、７−アセトキシクマリン−３−１、フルオレセイン−５−１、フルオレセイン−６−１、２’，７’−ジクロロフルオレセイン−５−１、ジヒドロテトラメチルローダミン−４−１、テトラメチルローダミン−５−１、及びテトラメチルローダミン−６−１からなる群より選択された蛍光物質を含むものである、請求項１に記載の定量分析方法。
【請求項７】
前記反応は、蛍光プローブをＣＢＰまたはｐ３００蛋白質と１：２（１００ｎＭ：２００ｎＭ）乃至１：１０（１００ｎＭ：１０００ｎＭ）の範囲内で混合して、誘導する、請求項１に記載の定量分析方法。
【請求項８】
１）ＨＩＦ−１α蛋白質のＣ−末端トランス活性ドメインから由来したペプチドに蛍光物質を結合させて製造した蛍光プローブと、ＣＢＰまたはｐ３００蛋白質を含む反応液に阻害剤候補物質を添加する段階；
２）前記反応液に阻害剤候補物質を添加する前と添加した後の蛍光偏光値の変化を測定する段階；及び
３）前記阻害剤候補物質の添加後に測定された前記反応液の蛍光偏光値が減少すれば、前記候補物質を抑制剤として決定する段階；
を含む、ＨＩＦ−１αとＣＢＰまたはｐ３００蛋白質間の結合を阻害する抑制剤のスクリーニング方法。
【請求項９】
前記蛍光プローブは、ＨＩＦ−１α（ＮＣＢＩ受入番号ＡＡＡ５０１５２）の全長アミノ酸配列内に連続的に存在する少なくとも４１個のアミノ酸を有するペプチドを含み、この時、前記ペプチドは、配列番号４であるＨＩＦ−１α内に存在する７８６番目のアミノ酸乃至８２６番目のアミノ酸配列を必ず含み、前記ペプチドのＮ−末端にはアミノカプロン酸リンカーが連結されており、前記アミノカプロン酸リンカーの端部には蛍光物質が連結されている、請求項８に記載の抑制剤のスクリーニング方法。
【請求項１０】
前記蛍光プローブは、配列番号３であるアミノ酸配列を有するペプチドを含むものである、請求項９に記載の抑制剤のスクリーニング方法。
【請求項１１】
前記ＣＢＰは、配列番号１であるアミノ酸配列を含むものである、請求項８に記載の抑制剤のスクリーニング方法。
【請求項１２】
前記ｐ３００蛋白質は、配列番号２であるアミノ酸配列を含むものである、請求項８に記載の抑制剤のスクリーニング方法。
【請求項１３】
前記方法は、
ａ）ＨＩＦ−１α蛋白質のＣ−末端トランス活性ドメインに蛍光物質を結合させて蛍光プローブを製造し、前記蛍光プローブをＣＢＰまたはｐ３００蛋白質と反応させて、これらの蛍光偏光値を測定する段階；
ｂ）前記蛍光プローブに、ＨＩＦ−１阻害因子（ＦＩＨ−１）、Ｓ−ニトロソ−Ｎ−アセチルペニシラミン（ＳＮＡＰ）、及びカゼインキナーゼ２（ＣＫ２）からなる群より選択されたいずれか一つの酵素を処理し、前記酵素処理されたプローブをＣＢＰまたはｐ３００蛋白質と反応させて、これらの蛍光偏光値を測定する段階；及び
ｃ）ＣＢＰまたはｐ３００蛋白質との結合相で、ＨＩＦ−１αＣ−末端トランス活性ドメインの蛋白質合成後の変形の影響を分析するために、前記ａ）及びｂ）段階で測定された蛍光偏光値を比較する段階；
を含む、請求項１に記載の定量分析方法。
【請求項１】
１）ＨＩＦ−１α蛋白質のＣ−末端トランス活性ドメインから由来したペプチドに蛍光物質を結合させて蛍光プローブを製造する段階；
２）前記蛍光プローブをＣＢＰまたはｐ３００蛋白質と反応させる段階；及び
３）前記２）段階で得られた反応物の蛍光偏光値を測定し、測定された蛍光偏光値の変化を分析するために、蛍光プローブ自体の蛍光偏光値と前記測定された蛍光偏光値とを比較する段階；
を含む、ＨＩＦ−１αとＣＢＰまたはｐ３００蛋白質間結合の定量分析方法。
【請求項２】
前記蛍光プローブは、ＨＩＦ−１α（ＮＣＢＩ受入番号ＡＡＡ５０１５２）の全長アミノ酸配列内に連続的に存在する少なくとも４１個のアミノ酸を有するペプチドを含み、この時、前記ペプチドは、配列番号４であるＨＩＦ−１α内に存在する７８６番目のアミノ酸乃至８２６番目のアミノ酸配列を必ず含み、前記ペプチドのＮ−末端にはアミノカプロン酸リンカーが連結されており、前記アミノカプロン酸リンカーの端部には蛍光物質が連結されている、請求項１に記載の定量分析方法。
【請求項３】
前記蛍光プローブは、配列番号３であるアミノ酸配列を有するペプチドを含むものである、請求項２に記載の定量分析方法。
【請求項４】
前記ＣＢＰは、配列番号１であるアミノ酸配列を含むものである、請求項１に記載の定量分析方法。
【請求項５】
前記ｐ３００蛋白質は、配列番号２であるアミノ酸配列を含むものである、請求項１に記載の定量分析方法。
【請求項６】
前記蛍光物質は、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フィコエリトリン（ＰＥ）、テキサスレッド（ＴＲ）及びテトラ−メチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、フルオレセインカルボン酸（ＦＣＡ）、フルオレセインチオウレア（ＦＴＨ）、７−アセトキシクマリン−３−１、フルオレセイン−５−１、フルオレセイン−６−１、２’，７’−ジクロロフルオレセイン−５−１、ジヒドロテトラメチルローダミン−４−１、テトラメチルローダミン−５−１、及びテトラメチルローダミン−６−１からなる群より選択された蛍光物質を含むものである、請求項１に記載の定量分析方法。
【請求項７】
前記反応は、蛍光プローブをＣＢＰまたはｐ３００蛋白質と１：２（１００ｎＭ：２００ｎＭ）乃至１：１０（１００ｎＭ：１０００ｎＭ）の範囲内で混合して、誘導する、請求項１に記載の定量分析方法。
【請求項８】
１）ＨＩＦ−１α蛋白質のＣ−末端トランス活性ドメインから由来したペプチドに蛍光物質を結合させて製造した蛍光プローブと、ＣＢＰまたはｐ３００蛋白質を含む反応液に阻害剤候補物質を添加する段階；
２）前記反応液に阻害剤候補物質を添加する前と添加した後の蛍光偏光値の変化を測定する段階；及び
３）前記阻害剤候補物質の添加後に測定された前記反応液の蛍光偏光値が減少すれば、前記候補物質を抑制剤として決定する段階；
を含む、ＨＩＦ−１αとＣＢＰまたはｐ３００蛋白質間の結合を阻害する抑制剤のスクリーニング方法。
【請求項９】
前記蛍光プローブは、ＨＩＦ−１α（ＮＣＢＩ受入番号ＡＡＡ５０１５２）の全長アミノ酸配列内に連続的に存在する少なくとも４１個のアミノ酸を有するペプチドを含み、この時、前記ペプチドは、配列番号４であるＨＩＦ−１α内に存在する７８６番目のアミノ酸乃至８２６番目のアミノ酸配列を必ず含み、前記ペプチドのＮ−末端にはアミノカプロン酸リンカーが連結されており、前記アミノカプロン酸リンカーの端部には蛍光物質が連結されている、請求項８に記載の抑制剤のスクリーニング方法。
【請求項１０】
前記蛍光プローブは、配列番号３であるアミノ酸配列を有するペプチドを含むものである、請求項９に記載の抑制剤のスクリーニング方法。
【請求項１１】
前記ＣＢＰは、配列番号１であるアミノ酸配列を含むものである、請求項８に記載の抑制剤のスクリーニング方法。
【請求項１２】
前記ｐ３００蛋白質は、配列番号２であるアミノ酸配列を含むものである、請求項８に記載の抑制剤のスクリーニング方法。
【請求項１３】
前記方法は、
ａ）ＨＩＦ−１α蛋白質のＣ−末端トランス活性ドメインに蛍光物質を結合させて蛍光プローブを製造し、前記蛍光プローブをＣＢＰまたはｐ３００蛋白質と反応させて、これらの蛍光偏光値を測定する段階；
ｂ）前記蛍光プローブに、ＨＩＦ−１阻害因子（ＦＩＨ−１）、Ｓ−ニトロソ−Ｎ−アセチルペニシラミン（ＳＮＡＰ）、及びカゼインキナーゼ２（ＣＫ２）からなる群より選択されたいずれか一つの酵素を処理し、前記酵素処理されたプローブをＣＢＰまたはｐ３００蛋白質と反応させて、これらの蛍光偏光値を測定する段階；及び
ｃ）ＣＢＰまたはｐ３００蛋白質との結合相で、ＨＩＦ−１αＣ−末端トランス活性ドメインの蛋白質合成後の変形の影響を分析するために、前記ａ）及びｂ）段階で測定された蛍光偏光値を比較する段階；
を含む、請求項１に記載の定量分析方法。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図５Ｄ】
【図６】
【図１Ｂ】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図５Ｄ】
【図６】
【公開番号】特開２００８−９６４２３（Ｐ２００８−９６４２３Ａ）
【公開日】平成２０年４月２４日（２００８．４．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−２１０１０３（Ｐ２００７−２１０１０３）
【出願日】平成１９年８月１０日（２００７．８．１０）
【出願人】（５９１０７４１１６）韓国科学技術研究院 (17)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年４月２４日（２００８．４．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年８月１０日（２００７．８．１０）
【出願人】（５９１０７４１１６）韓国科学技術研究院 (17)
【Ｆターム（参考）】
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