Ｌ−アミノ酸生産菌及びＬ−アミノ酸の製造法
【課題】Ｌ−リジンなどのＬ−アミノ酸を効率よく生産することのできる腸内細菌科に属する微生物を提供すること、及び該微生物を用いてＬ−アミノ酸を効率よく生産する方法を提供する。
【解決手段】Ｌ−アミノ酸生産能を有し、かつ、ｙｄｃＵ、ｙｆｅＫ、ｓｍｐＡ、ｈｔｒＧ、ａｄｉＣ、ｈｔｒＡ、ｙｄｈＫ、ｂａｃＡ、ｙａｉＷ、及びｙｉｄＱから選択される１又はそれ以上の遺伝子の発現が弱まるように改変された腸内細菌科に属する細菌を培地で培養して、Ｌ−アミノ酸を該培地中に蓄積させ、該培地よりＬ−アミノ酸を採取することにより、Ｌ−アミノ酸を製造する。
【解決手段】Ｌ−アミノ酸生産能を有し、かつ、ｙｄｃＵ、ｙｆｅＫ、ｓｍｐＡ、ｈｔｒＧ、ａｄｉＣ、ｈｔｒＡ、ｙｄｈＫ、ｂａｃＡ、ｙａｉＷ、及びｙｉｄＱから選択される１又はそれ以上の遺伝子の発現が弱まるように改変された腸内細菌科に属する細菌を培地で培養して、Ｌ−アミノ酸を該培地中に蓄積させ、該培地よりＬ−アミノ酸を採取することにより、Ｌ−アミノ酸を製造する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物を用いたＬ−アミノ酸の製造法、特にＬ−リジン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン等のＬ−アミノ酸の製造法に関する。Ｌ−グルタミン酸は調味料として、Ｌ−リジン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファンは、動物飼料用の添加物、健康食品の成分、または、アミノ酸輸液等として、産業上有用なＬ−アミノ酸である。
【背景技術】
【０００２】
Ｌ−アミノ酸は、種々の微生物を用いた発酵法により工業生産されている。例えば、Ｌ−グルタミン酸は、主としてブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、ミクロバクテリウム属に属するいわゆるコリネ型細菌のＬ−グルタミン酸生産菌またはそれらの変異株を用いた発酵法により製造されている（例えば、非特許文献１参照）。その他の微生物を用いた発酵法によるＬ−グルタミン酸の製造法としては、バチルス属、ストレプトミセス属、ペニシリウム属等の微生物（例えば、特許文献１参照）、シュードモナス属、アースロバクター属、セラチア属、キャンディダ属等の微生物（例えば、特許文献２参照）、バチルス属、シュードモナス属、セラチア属、アエロバクター・アエロゲネス（現エンテロバクター・アエロゲネス）等の微生物（例えば、特許文献３参照）、エシェリヒア・コリの変異株（例えば、特許文献１参照）等を用いる方法が知られている。また、クレブシエラ属、エルビニア属又はパントエア属、エンテロバクター属に属する微生物を用いたＬ−グルタミン酸の製造法も開示されている（例えば、特許文献２〜４参照）。
【０００３】
上記のような微生物を用いた発酵法によってＬ−アミノ酸等の目的物質を製造するには、野生型微生物（野生株）を用いる方法、野生株から誘導された栄養要求株を用いる方法、野生株から種々の薬剤耐性変異株として誘導された代謝調節変異株を用いる方法、栄養要求株と代謝調節変異株の両方の性質を持った株を用いる方法等がある。
【０００４】
さらに、近年は、目的物質の発酵生産に、組換えＤＮＡ技術を用いることが行われている。例えば、Ｌ−アミノ酸生合成系酵素をコードする遺伝子の発現を増強すること（特許文献５、特許文献６）、又はＬ−アミノ酸生合成系への炭素源の流入を増強すること（特許文献７）によって、微生物のＬ−アミノ酸生産性を向上させることが行われている。
【０００５】
ydcU遺伝子は、同遺伝子がコードするアミノ酸配列との相同性から、ABCトランスポーターのコンポーネント（非特許文献２）、あるいは、スペルミジン／プトレシントランスポーターのサブユニット（非特許文献３）をコードすると推測されているが、実験的な証明はなされていない。また、ydcU遺伝子とＬ−アミノ酸の生産との関係についての報告はない。
ｓｍｐＡ遺伝子は、small membrane protein Aをコードしていると推定されている（非特許文献４）。ｈｔｒＧ遺伝子は、signal transduction proterin(SH3)をコードしていると推定されている。ａｄｉＣ遺伝子は、arginine:agmatine antiporteをコードしていると推定されている（非特許文献５。ｈｔｒＡ遺伝子は、膜結合型セリンエンドプロテアーゼ（プロテアーゼDo）serine endoprotease (protease Do)をコードしていると推定されている（非特許文献６）。ｙｄｈＫ遺伝子は、conserved inner membrane proteinをコードしていると推定されている。ｂａｃＡ遺伝子は、ウンデカプレニル−ジホスファターゼをコードしていると推定されている（非特許文献７）。ｙａｉＷ遺伝子は、predicted DNA-binding transcriptional regulator（推定上のＤＮＡ結合型転写レギュレータ）をコードしていると推定されている（非特許文献８）。ｙｉｄＱ遺伝子は、conserved outer membrane proteinをコードしていると推定されている。しかし、これらの遺伝子とＬ−
アミノ酸の生産との関係についての報告はない。
【特許文献１】特開平５−２４４９７０号公報
【特許文献２】米国特許第３，５６３，８５７号明細書
【特許文献３】特公昭３２−９３９３号公報
【特許文献４】特開２０００−１８９１７５号公報
【特許文献５】米国特許第５，１６８，０５６号明細書
【特許文献６】米国特許第５，７７６，７３６号明細書
【特許文献７】米国特許第５，９０６，９２５号明細書
【非特許文献１】明石邦彦ら著 アミノ酸発酵、学会出版センター、１９５〜２１５頁、
【非特許文献２】Saurin, W. et al., J. Mol. Evol., 48(1);22-41 (1999)
【非特許文献３】Riley, M. et al., Nucleic Acids Res., 34: 1-9 (2006)
【非特許文献４】Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 2007 Apr 10;104(15):6400-5. Epub 2007 Apr 2.
【非特許文献５】J. Bacteriol., 2003 Nov;185(22):6556-61.）
【非特許文献６】Arch. Biochem. Biophys., 2007 Aug 1;464(1):80-9.
【非特許文献７】Microbiology. 2007 Aug;153(Pt 8):2518-29.
【非特許文献８】FEMS Microbiol Lett., 2003 Aug 8;225(1):1-7.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、Ｌ−アミノ酸を効率よく生産することのできる腸内細菌科に属する微生物を提供すること、及び該微生物を用いてＬ−アミノ酸を効率よく生産する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、ydcU、yfeK、smpA、htrG、adiC、htrA、ydhK、bacA、yaiW、又はyidQ遺伝子の発現が弱まるように改変された腸内細菌科に属する細菌が、Ｌ−アミノ酸を効率よく製造できることを見いだし、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）Ｌ−アミノ酸生産能を有し、かつ、ｙｄｃＵ、ｙｆｅＫ、ｓｍｐＡ、ｈｔｒＧ、ａｄｉＣ、ｈｔｒＡ、ｙｄｈＫ、ｂａｃＡ、ｙａｉＷ、及びｙｉｄＱから選択される１又はそれ以上の遺伝子の発現が弱まるように改変された腸内細菌科に属する細菌。
（２）ｙｄｃＵ、ｙｆｅＫ、ｓｍｐＡ、ｈｔｒＧ、ａｄｉＣ、ｈｔｒＡ、ｙｄｈＫ、ｂａｃＡ、ｙａｉＷ、又はｙｉｄＱの不活化により、各々の遺伝子の発現が弱められた、前記細菌。
（３）前記遺伝子が、ｙｄｃＵ、ｙｆｅＫ、又はｓｍｐＡである、前記細菌。
（４）ｙｄｃＵ遺伝子が、配列番号２のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ又はそのバリアントである、前記細菌。
（５）ｙｆｅＫ遺伝子が、配列番号４のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ又はそのバリアントである、前記細菌。
（６）ｓｍｐＡ遺伝子が、配列番号６のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ又はそのバリアントである、前記細菌。
（７）ｈｔｒＧ遺伝子が、配列番号８のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ又はそのバリアントである、前記細菌。
（８）ａｄｉＣ遺伝子が、配列番号１０のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ又はそのバリアントである、前記細菌。
（９）ｈｔｒＡ遺伝子が、配列番号１２のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ又はそのバリアントである、前記細菌。
（１０）ｙｄｈＫ遺伝子が、配列番号１４のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ又はそのバリアントである、前記細菌。
（１１）ｂａｃＡ遺伝子が、配列番号１６のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ又はそのバリアントである、前記細菌。
（１２）ｙａｉＷ遺伝子が、配列番号１８のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ又はそのバリアントである、前記細菌。
（１３）ｙｉｄＱ遺伝子が、配列番号２０のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ又はそのバリアントである、前記細菌。
（１４）前記Ｌ−アミノ酸がＬ−リジン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−スレオニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−トリプトファン、及びＬ−システインからなる群から選択される一種または二種以上のＬ−アミノ酸である前記細菌。
（１５）前記Ｌ−アミノ酸がＬ−リジンであり、リジンデカルボキシラーゼの活性が弱化されている、前記細菌。
（１６）前記腸内細菌科に属する微生物が、エシェリヒア属細菌、エンテロバクター属細菌またはパントエア属細菌である前記細菌。
（１７）前記細菌を培地で培養して、Ｌ−アミノ酸を該培地中に蓄積させ、該培地よりＬ−アミノ酸を採取する、Ｌ−アミノ酸の製造法。
（１８）前記Ｌ−アミノ酸がＬ−グルタミン酸、Ｌ−リジン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−トリプトファン、及びＬ−システインから選択される一種または二種以上のＬ−アミノ酸である、前記方法。
（１９）前記Ｌ−アミノ酸がＬ−リジンである、前記方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の微生物を用いることにより、効率よく、Ｌ−リジン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−スレオニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−トリプトファン、又はＬ−システイン、Ｌ−グルタミン酸等のＬ−アミノ酸を発酵生産することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下、本発明を詳細に説明する。
＜１＞本発明の微生物
本発明の細菌は、Ｌ−アミノ酸生産能を有し、かつ、ydcU、yfeK、smpA、htrG、adiC、htrA、ydhK、bacA、yaiW、及びyidQから選択される１又はそれ以上の遺伝子の発現が弱まるように改変された腸内細菌科に属する細菌である。ここで、Ｌ−アミノ酸生産能とは、本発明の細菌を培地中で培養したときに、培地中または菌体内にＬ−アミノ酸を生成し、培地中または菌体から回収できる程度に蓄積する能力をいう。なお、本発明の細菌は複数のＬ−アミノ酸の生産能を有するものであってもよい。Ｌ−アミノ酸の生産能を有する細菌としては、本来的にＬ−アミノ酸の生産能を有するものであってもよいが、下記のような細菌を、変異法や組換えDNA技術を利用して、Ｌ−アミノ酸の生産能を有するように改変したものであってもよい。
【００１１】
本発明に用いる微生物としては、エシェリヒア（Escherichia）属、エンテロバクター（Enterobacter）属、パントエア（Pantoea）属、クレブシエラ（Klebsiella）属、セラチア（Serratia）属、エルビニア（Erwinia）属、サルモネラ（Salmonella）属、モルガネラ（Morganella）属などのγ−プロテオバクテリアに属する腸内細菌や、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、ミクロバクテリウム属に属するいわゆるコリネ型細菌、アリサイクロバチルス（Alicyclobacillus）属、バチルス（Bacillus）属、サッカロマイセス（Saccharomyces）属等に属する微生物が挙げられる。γ−プロテオバクテリアは
、NCBI（National Center for Biotechnology Information）タキソノミーデータベースhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?mode=Undef&id=1236&lvl=3&p=mapview&p=has_linkout&p=blast_url&p=genome_blast&lin=f&keep=1&srchmode=1&unlock）に開示されている分類により微生物に属するものが利用出来る。
【００１２】
エシェリヒア属細菌としては、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）等が挙げられる。エシェリヒア・コリを遺伝子工学的手法を用いて育種する場合には、エシェリヒア・コリK-12株及びその誘導体であるエシェリヒア・コリ MG1655株（ATCC 47076）、及びW3110株（ATCC 27325）を用いることができる。エシェリヒア・コリK-12株は、1922年にスタンフォード大学で分離されたものであり、λファージの溶原菌であるとともに、F因子を持ち、接合等遺伝的組み換え体の作成が可能である汎用性の高い菌株である。またエシェリヒア・コリK-12株のゲノム配列は既に決定されており、遺伝子情報も自由に利用出来る。エシェリヒア・コリK-12株や、誘導株を入手するには、例えばアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ATCC）より分譲を受けることができる（住所ATCC, Address: P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, United States of America）。
【００１３】
特に、パントエア属細菌、エルビニア属細菌、エンテロバクター属細菌は、γ−プロテオバクテリアに分類される細菌であり、分類学的に非常に近縁である（J. Gen. Appl. Microbiol. 1997, 43: 355-361; Int. J. Syst. Bacteriol. 1997, 47: 1061-1067）。近年、DNA-DNAハイブリダイゼーション実験等により、エンテロバクター属に属する細菌には、パントエア・アグロメランス（Pantoea agglomerans）又はパントエア・ディスパーサ(Pantoea dispersa)等に再分類されているものがある(Int. J. Syst. Bacteriol. 1989, 39: 337-345）。また、エルビニア属に属する細菌にはパントエア・アナナス（Pantoea ananas）、パントエア・スチューアルティに再分類されているものがある（Int. J. Syst. Bacteriol. 1993, 43: 162-173 参照）。
【００１４】
エンテロバクター属細菌としては、エンテロバクター・アグロメランス（Enterobacter
agglomerans）、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）等が挙げられる。具体的には、欧州特許出願公開952221号明細書に例示された菌株を使用することが出来る。エンテロバクター属の代表的な株として、エンテロバクター・アグロメランスATCC12287株が挙げられる。
【００１５】
パントエア属細菌の代表的な菌株として、パントエア・アナナティス、パントエア・スチューアルティ（Pantoea stewartii）パントエア・アグロメランス、パントエア・シトレア（Pantoea citrea）が挙げられる。具体的には、下記の菌株が挙げられる。
パントエア・アナナティスAJ13355株（FERM BP-6614）(欧州特許出願公開0952221号明細書)
パントエア・アナナティスAJ13356株（FERM BP-6615）(欧州特許出願公開0952221号明細書)
【００１６】
尚、これらの菌株は、欧州特許出願公開0952221号明細書にはエンテロバクター・アグロメランスとして記載されているが、現在では、上記のとおり、16S rRNAの塩基配列解析などにより、パントエア・アナナティスに再分類されている。
【００１７】
エルビニア属細菌としては、エルビニア・アミロボーラ、エルビニア・カロトボーラが挙げられ、クレブシエラ属細菌としては、クレブシエラ・プランティコーラが挙げられる。具体的には、下記の菌株が挙げられる。
エルビニア・アミロボーラ ATCC15580株
エルビニア・カロトボーラ ATCC15713株
クレブシエラ・プランティコーラAJ13399株（FERM BP-6600）(欧州特許出願公開955368
号明細書)
クレブシエラ・プランティコーラAJ13410株（FERM BP-6617）(欧州特許出願公開955368号明細書)
【００１８】
本発明において、Ｌ−アミノ酸生産能を有する細菌とは、培地に培養したときに、培地中又は菌体内に、細菌の野生株又は親株よりも多量のＬ−アミノ酸、例えば、好ましくは0.5 g/L以上、より好ましくは1.0g/L以上のＬ−アミノ酸を蓄積する細菌を意味する。細菌の野生株としては例えばエシェリヒア・コリK-12のようなエシェリヒア・コリが挙げられる。
【００１９】
Ｌ−アミノ酸の種類は特に制限されないが、Ｌ−リジン、Ｌ−オルニチン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−シトルリンのような塩基性アミノ酸、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−グリシンのような脂肪族アミノ酸、Ｌ−スレオニン、Ｌ−セリンのようなヒドロキシモノアミノカルボン酸であるアミノ酸、Ｌ−プロリンのような環式アミノ酸、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−トリプトファンのような芳香族アミノ酸、Ｌ−システイン、Ｌ−シスチン、Ｌ−メチオニンのような含硫アミノ酸、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アスパラギン等のような酸性アミノ酸が挙げられ、特にＬ−リジン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファンが好ましく、Ｌ−リジンが最もが好ましい。本発明の細菌は２種類以上のアミノ酸の生産能を有するものであってもよい。
【００２０】
以下、前記のような細菌にＬ−アミノ酸生産能を付与する方法、又は前記のような細菌のＬ−アミノ酸生産能を増強する方法について述べる。
Ｌ−アミノ酸生産能を付与するには、栄養要求性変異株、Ｌ−アミノ酸のアナログ耐性株又は代謝制御変異株の取得や、Ｌ−アミノ酸の生合成系酵素の発現が増強された組換え株の創製等、従来、コリネ型細菌又はエシェリヒア属細菌等のアミノ酸生産菌の育種に採用されてきた方法を適用することができる（アミノ酸発酵、（株）学会出版センター、1986年５月30日初版発行、第７７〜１００頁参照）。ここで、Ｌ−アミノ酸生産菌の育種において、付与される栄養要求性、アナログ耐性、代謝制御変異等の性質は、単独でもよく、２種又は３種以上であってもよい。また、発現が増強されるＬ−アミノ酸生合成系酵素も、単独であっても、２種又は３種以上であってもよい。さらに、栄養要求性、アナログ耐性、代謝制御変異等の性質の付与と、生合成系酵素の増強が組み合わされてもよい。
【００２１】
Ｌ−アミノ酸生産能を有する栄養要求性変異株、アナログ耐性株、又は代謝制御変異株を取得するには、親株又は野生株を通常の変異処理、すなわちＸ線や紫外線の照射、またはＮ−メチル−Ｎ'−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン等の変異剤処理などによって処理し、得られた変異株の中から、栄養要求性、アナログ耐性、又は代謝制御変異を示し、かつＬ−アミノ酸生産能を有するものを選択することによって得ることができる。
【００２２】
また、Ｌ−アミノ酸生産能の付与又は増強は、遺伝子組換えによって、酵素活性を増強することによっても行うことが出来る。酵素活性の増強は、例えば、Ｌ−アミノ酸の生合成に関与する酵素をコードする遺伝子の発現が増強するように細菌を改変する方法を挙げることができる。遺伝子の発現を増強するための方法としては、遺伝子を含むＤＮＡ断片を、適当なプラスミド、例えば微生物内でプラスミドの複製増殖機能を司る遺伝子を少なくとも含むプラスミドベクターに導入した増幅プラスミドを導入すること、または、これらの遺伝子を染色体上で接合、転移等により多コピー化すること、またこれらの遺伝子のプロモーター領域に変異を導入することにより達成することもできる（国際公開パンフレットWO95/34672号参照）。
【００２３】
上記増幅プラスミドまたは染色体上に目的遺伝子を導入する場合、これらの遺伝子を発
現させるためのプロモーターはコリネ型細菌において機能するものであればいかなるプロモーターであっても良く、用いる遺伝子自身のプロモーターであってもよいし、改変したものでもよい。コリネ型細菌で強力に機能するプロモーターを適宜選択することや、プロモーターの−35、−10領域をコンセンサス配列に近づけることによっても遺伝子の発現量の調節が可能である。以上のような、酵素遺伝子の発現を増強する方法は、WO00/18935号パンフレット、欧州特許出願公開1010755号明細書等に記載されている。
【００２４】
以下、細菌にＬ−アミノ酸生産能を付与する方法、及びＬ−アミノ酸生産能が付与された細菌について例示する。
【００２５】
Ｌ−スレオニン生産菌
Ｌ−スレオニン生産能を有する微生物として好ましいものは、Ｌ−スレオニン生合成系酵素の１種又は２種以上の活性が増強された細菌が挙げられる。Ｌ−スレオニン生合成系酵素としては、アスパルトキナーゼIII（lysC）、アスパルテートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（asd）、thrオペロンにコードされるアスパルトキナーゼI（thrA）、ホモセリンキナーゼ（thrB）、スレオニンシンターゼ（thrC）、アスパルテートアミノトランスフェラーゼ（アスパルテートトランスアミナーゼ）(aspC)が挙げられる。カッコ内は、その遺伝子の略記号である（以下の記載においても同様）。これらの酵素の中では、アスパルテートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、アスパルトキナーゼI、ホモセリンキナーゼ、アスパルテートアミノトランスフェラーゼ、及びスレオニンシンターゼが特に好ましい。Ｌ−スレオニン生合成系遺伝子は、スレオニン分解が抑制されたエシェリヒア属細菌に導入してもよい。スレオニン分解が抑制されたエシェリヒア属細菌としては、例えば、スレオニンデヒドロゲナーゼ活性が欠損したTDH6株（特開2001−346578号）等が挙げられる。
【００２６】
Ｌ−スレオニン生合成系酵素は、最終産物のＬ−スレオニンによって酵素活性が抑制される。従って、Ｌ−スレオニン生産菌を構築するためには、Ｌ−スレオニンによるフィードバック阻害を受けないようにＬ−スレオニン生合成系遺伝子を改変することが望ましい。また、上記thrA、thrB、thrC遺伝子は、スレオニンオペロンを構成しているが、スレオニンオペロンは、アテニュエーター構造を形成しており、スレオニンオペロンの発現は、培養液中のイソロイシン、スレオニンに阻害を受け、アテニュエーションにより発現が抑制される。この改変は、アテニュエーション領域のリーダー配列あるいは、アテニュエーターを除去することにより達成出来る。（Lynn, S. P., Burton, W. S., Donohue, T. J., Gould, R. M., Gumport, R. I., and Gardner, J. F. J. Mol. Biol. 194:59-69 (1987); 国際公開第02/26993号パンフレット; 国際公開第2005/049808号パンフレット参照）
【００２７】
スレオニンオペロンの上流には、固有のプロモーターが存在するが、非天然のプロモーターに置換してもよいし（WO98/04715号パンフレット参照）、スレオニン生合成関与遺伝子の発現がラムダファ−ジのリプレッサーおよびプロモーターにより支配されるようなスレオニンオペロンを構築してもよい。（欧州特許第0593792号明細書参照）また、Ｌ−スレオニンによるフィードバック阻害を受けないように細菌を改変するために、α-amino-β-hydroxyvaleric acid （AHV）に耐性な菌株を選抜することも可能である。
【００２８】
このようにＬ−スレオニンによるフィ−ドバック阻害を受けないように改変されたスレオニンオペロンは、宿主内でコピー数が上昇しているか、あるいは強力なプロモーターに連結し、発現量が向上していることが好ましい。コピー数の上昇は、プラスミドによる増幅の他、トランスポゾン、Mu−ファ−ジ等でゲノム上にスレオニンオペロンを転移させることによっても達成出来る。
【００２９】
Ｌ−スレオニン生合成系酵素以外にも、解糖系、TCA回路、呼吸鎖に関する遺伝子や遺
伝子の発現を制御する遺伝子、糖の取り込み遺伝子を強化することも好適である。これらのＬ−スレオニン生産に効果がある遺伝子としては、トランスヒドロナーゼ（pntAB）遺伝子（欧州特許733712号明細書）、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子（pepC）(国際公開95/06114号パンフレット)、ホスホエノールピルビン酸シンターゼ遺伝子（pps）(欧州特許877090号明細書)、コリネ型細菌あるいはバチルス属細菌のピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子（国際公開99/18228号パンフレット、欧州出願公開1092776号明細書）が挙げられる。
【００３０】
また、Ｌ−スレオニンに耐性を付与する遺伝子、Ｌ−ホモセリンに耐性を付与する遺伝子の発現を強化することや、宿主にＬ−スレオニン耐性、Ｌ−ホモセリン耐性を付与することも好適である。耐性を付与する遺伝子としては、rhtA遺伝子(Res. Microbiol. 154:123−135 (2003))、rhtB遺伝子（欧州特許出願公開第0994190号明細書）、rhtC遺伝子（欧州特許出願公開第1013765号明細書）、yfiK、yeaS遺伝子（欧州特許出願公開第1016710号明細書）が挙げられる。また宿主にＬ−スレオニン耐性を付与する方法は、欧州特許出願公開第0994190号明細書や、国際公開第90/04636号パンフレット記載の方法を参照出来る。
【００３１】
Ｌ−スレオニン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、E. coli TDH-6/pVIC40 (VKPM B-3996) (米国特許第5,175,107号、米国特許第5,705,371号)、E. coli 472T23/pYN7 (ATCC 98081) (米国特許第5,631,157号)、E. coli NRRL-21593 (米国特許第5,939,307号)、E. coli FERM BP-3756 (米国特許第5,474,918号)、E. coli FERM BP-3519及びFERM BP-3520 (米国特許第5,376,538号)、E. coli MG442 (Gusyatiner et al., Genetika (in Russian), 14, 947-956 (1978))、E. coli VL643及びVL2055 (EP 1149911 A)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３２】
TDH-6株はthrC遺伝子を欠損し、スクロース資化性であり、また、そのilvA遺伝子がリーキー(leaky)変異を有する。この株はまた、rhtA遺伝子に、高濃度のスレオニンまたはホモセリンに対する耐性を付与する変異を有する。B-3996株は、RSF1010由来ベクターに、変異thrA遺伝子を含むthrA*BCオペロンを挿入したプラスミドpVIC40を保持する。この変異thrA遺伝子は、スレオニンによるフィードバック阻害が実質的に解除されたアスパルトキナーゼホモセリンデヒドロゲナーゼＩをコードする。B-3996株は、1987年11月19日、オールユニオン・サイエンティフィック・センター・オブ・アンチビオティクス(Nagatinskaya Street 3-A, 117105 Moscow, Russia)に、受託番号RIA 1867で寄託されている。この株は、また、1987年4月7日、ルシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオルガニズムズ(VKPM) (1 Dorozhny proezd., 1 Moscow 117545, Russia) に、受託番号B-3996で寄託されている。
【００３３】
E. coli VKPM B-5318 (EP 0593792B)も、Ｌ−スレオニン生産菌又はそれを誘導するための親株として使用できる。B-5318株は、イソロイシン非要求性であり、プラスミドpVIC40中のスレオニンオペロンの制御領域が、温度感受性ラムダファージC1リプレッサー及びPRプロモーターにより置換されている。VKPM B-5318は、1990年5月3日、ルシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオルガニズムズ(VKPM) (1 Dorozhny proezd., 1 Moscow 117545, Russia)に、受託番号VKPM B-5318で国際寄託されている。
【００３４】
Escherichia coliのアスパルトキナーゼホモセリンデヒドロゲナーゼＩをコードするthrA遺伝子は明らかにされている(ヌクレオチド番号337〜2799, GenBank accession NC_000913.2, gi: 49175990)。thrA遺伝子は、E. coli K-12の染色体において、thrL遺伝子とthrB遺伝子との間に位置する。Escherichia coliのホモセリンキナーゼをコードするthrB遺伝子は明らかにされている(ヌクレオチド番号2801〜3733, GenBank accession NC_000913
.2, gi: 49175990)。thrB遺伝子は、E. coli K-12の染色体において、thrA遺伝子とthrC遺伝子との間に位置する。Escherichia coliのスレオニンシンターゼをコードするthrC遺伝子は明らかにされている(ヌクレオチド番号3734〜5020, GenBank accession NC_000913.2, gi: 49175990)。thrC遺伝子は、E. coli K-12の染色体において、thrB遺伝子とyaaXオープンリーディングフレームとの間に位置する。これら三つの遺伝子は、全て、単一のスレオニンオペロンとして機能する。スレオニンオペロンの発現を増大させるには、転写に影響するアテニュエーター領域を、好ましくは、オペロンから除去する(WO2005/049808, WO2003/097839)。
【００３５】
スレオニンによるフィードバック阻害に耐性のアスパルトキナーゼホモセリンデヒドロゲナーゼＩをコードする変異thrA遺伝子、ならびに、thrB遺伝子及びthrC遺伝子は、スレオニン生産株E. coli VKPM B-3996に存在する周知のプラスミドpVIC40から一つのオペロンとして取得できる。プラスミドpVIC40の詳細は、米国特許第5,705,371号に記載されている。
【００３６】
rhtA遺伝子は、グルタミン輸送系の要素をコードするglnHPQ オペロンに近いE. coli染色体の18分に存在する。rhtA遺伝子は、ORF1 (ybiF遺伝子, ヌクレオチド番号764〜1651,
GenBank accession number AAA218541, gi:440181)と同一であり、pexB遺伝子とompX遺伝子との間に位置する。ORF1によりコードされるタンパク質を発現するユニットは、rhtA遺伝子と呼ばれている(rht: ホモセリン及びスレオニンに耐性)。また、rhtA23変異が、ATG開始コドンに対して-1位のG→A置換であることが判明している(ABSTRACTS of the 17th
International Congress of Biochemistry and Molecular Biology in conjugation with Annual Meeting of the American Society for Biochemistry and Molecular Biology,
San Francisco, California August 24-29, 1997, abstract No. 457, EP 1013765 A)。
【００３７】
E. coliのasd遺伝子は既に明らかにされており(ヌクレオチド番号3572511〜3571408, GenBank accession NC_000913.1, gi:16131307)、その遺伝子の塩基配列に基づいて作製されたプライマーを用いるPCRにより得ることができる(White, T.J. et al., Trends Genet., 5, 185 (1989)参照)。他の微生物のasd遺伝子も同様に得ることができる。
【００３８】
また、E. coliのaspC遺伝子も既に明らかにされており(ヌクレオチド番号983742〜984932, GenBank accession NC_000913.1, gi:16128895)、PCRにより得ることができる。他の微生物のaspC遺伝子も同様に得ることができる。
【００３９】
Ｌ−リジン生産菌
エシェリヒア属に属するＬ−リジン生産菌の例としては、Ｌ−リジンアナログに耐性を有する変異株が挙げられる。Ｌ−リジンアナログはエシェリヒア属に属する細菌の生育を阻害するが、この阻害は、Ｌ−リジンが培地に共存するときには完全にまたは部分的に解除される。Ｌ−リジンアナログの例としては、オキサリジン、リジンヒドロキサメート、Ｓ−（２−アミノエチル）−Ｌ−システイン(AEC)、γ−メチルリジン、α−クロロカプロラクタムなどが挙げられるが、これらに限定されない。これらのリジンアナログに対して耐性を有する変異株は、エシェリヒア属に属する細菌を通常の人工変異処理に付すことによって得ることができる。Ｌ−リジンの生産に有用な細菌株の具体例としては、Escherichia coli AJ11442 (FERM BP-1543, NRRL B-12185; 米国特許第4,346,170号参照)及びEscherichia coli VL611が挙げられる。これらの微生物では、アスパルトキナーゼのＬ−リジンによるフィードバック阻害が解除されている。
【００４０】
WC196株は、Escherichia coliのＬ−リジン生産菌として使用できる。この菌株は、Escherichia coli K-12に由来するW3110株にAEC耐性を付与することにより育種された。同株は、Escherichia coli AJ13069と命名され、1994年12月6日、工業技術院生命工学工業技
術研究所（現 独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター、〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に受託番号FERM P-14690として寄託され、1995年9月29日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-5252が付与されている(米国特許第5,827,698号)。
【００４１】
Ｌ−リジン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、Ｌ−リジン生合成系酵素の１種又は２種以上の活性が増強されている株も挙げられる。かかる酵素の例としては、ジヒドロジピコリン酸シンターゼ(dapA)、アスパルトキナーゼ(lysC)、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ(dapB)、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ(lysA)、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ(ddh) (米国特許第6,040,160号)、フォスフォエノールピルビン酸カルボキシラーゼ(ppc)、アスパルテートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子、ジアミノピメリン酸エピメラーゼ(dapF)、テトラヒドロジピコリン酸スクシニラーゼ(dapD)、スクシニルジアミノピメリン酸デアシラーゼ(dapE)及びアスパルターゼ(aspA) (EP 1253195 A)が挙げられるが、これらに限定されない。これらの酵素の中では、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ、フォスフォエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、アスパルテートアミノトランスフェラーゼ、ジアミノピメリン酸エピメラーゼ、アスパルテートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、テトラヒドロジピコリン酸スクシニラーゼ、及び、スクシニルジアミノピメリン酸デアシラーゼが特に好ましい。また、親株は、エネルギー効率に関与する遺伝子(cyo) (EP 1170376 A)、ニコチンアミドヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼをコードする遺伝子(pntAB) (米国特許第5,830,716号)、ybjE遺伝子(WO2005/073390)、または、これらの組み合わせの発現レベルが増大していてもよい。
【００４２】
Ｌ−リジン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、Ｌ−リジンの生合成経路から分岐してＬ−リジン以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素の活性が低下または欠損している株も挙げられる。Ｌ−リジンの生合成経路から分岐してＬ−リジン以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素の例としては、ホモセリンデヒドロゲナーゼ、リジンデカルボキシラーゼ(米国特許第5,827,698号)、及び、リンゴ酸酵素(WO2005/010175)が挙げられる。
【００４３】
好ましいＬ−リジン生産菌として、エシェリヒア・コリWC196ΔcadAΔldc/pCABD2が挙げられる（WO2006/078039）。この菌株は、リジンデカルボキシラーゼをコードするcadA及びldcC遺伝子が破壊されたWC196株に、米国特許第6040160に記載されたプラスミドpCABD2が導入することにより得られた株である。WC196ΔcadAΔldc自体も、好ましいＬ−リジン生産菌である。pCABD2は、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害が解除された変異を有するエシェリヒア・コリ由来のジヒドロジピコリン酸合成酵素（DDPS）をコードする変異型dapA遺伝子と、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害が解除された変異を有するエシェリヒア・コリ由来のアスパルトキナーゼIIIをコードする変異型lysC遺伝子と、エシェリヒア・コリ由来のジヒドロジピコリン酸レダクターゼをコードするdapB遺伝子と、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム由来ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼをコードするddh遺伝子を含んでいる。このプラスミドを持つエシェリヒア・コリW3110(tyrA)/pCABD2は、AJ12604と命名され、1991年1月28日に独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（住所 〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）にFERM P-11975の受託番号で寄託され、1991年9月26日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管されて、FERM BP-3579の受託番号で寄託されている。
【００４４】
Ｌ−システイン生産菌
Ｌ−システイン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、フィードバック阻害耐性のセリンアセチルトランスフェラーゼをコードする異なるcysEアレルで形質転換されたE. coli JM15(米国特許第6,218,168号、ロシア特許出願第2003121601号)、細胞に毒
性の物質を排出するのに適したタンパク質をコードする過剰発現遺伝子を有するE. coli W3110 (米国特許第5,972,663号)、システインデスルフォヒドラーゼ活性が低下したE. coli株 (JP11155571A2)、cysB遺伝子によりコードされる正のシステインレギュロンの転写制御因子の活性が上昇したE. coli W3110 (WO0127307A1)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４５】
Ｌ−ロイシン生産菌
Ｌ−ロイシン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、ロイシン耐性のE. coil株 (例えば、57株 (VKPM B-7386, 米国特許第6,124,121号))またはβ−２−チエニルアラニン、３−ヒドロキシロイシン、４−アザロイシン、5,5,5-トリフルオロロイシンなどのロイシンアナログ耐性のE.coli株(特公昭62-34397号及び特開平8-70879号)、WO96/06926に記載された遺伝子工学的方法で得られたE. coli株、E. coli H-9068 (特開平8-70879号)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４６】
本発明に用いる細菌は、Ｌ−ロイシン生合成に関与する遺伝子の１種以上の発現が増大されることにより改良されていてもよい。このような遺伝子の例としては、好ましくはＬ−ロイシンによるフィードバック阻害が解除されたイソプロピルマレートシンターゼをコードする変異leuA遺伝子(米国特許第6,403,342号)に代表される、leuABCDオペロンの遺伝子が挙げられる。さらに、本発明に用いる細菌は、細菌の細胞からＬ−アミノ酸を排出するタンパク質をコードする遺伝子の１種以上の発現が増大されることにより改良されていてもよい。このような遺伝子の例としては、b2682遺伝子及びb2683遺伝子(ygaZH遺伝子) (EP 1239041 A2)が挙げられる。
【００４７】
Ｌ−ヒスチジン生産菌
Ｌ−ヒスチジン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、E. coli 24株 (VKPM B-5945, RU2003677)、E. coli 80株 (VKPM B-7270, RU2119536)、E. coli NRRL B-12116 - B12121 (米国特許第4,388,405号)、E. coli H-9342 (FERM BP-6675)及びH-9343 (FERM BP-6676) (米国特許第6,344,347号)、E. coli H-9341 (FERM BP-6674) (EP1085087)、E. coli AI80/pFM201 (米国特許第6,258,554号)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４８】
Ｌ−ヒスチジン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、Ｌ−ヒスチジン生合成系酵素をコードする遺伝子の１種以上の発現が増大した株も挙げられる。かかる遺伝子の例としては、ATPフォスフォリボシルトランスフェラーゼ遺伝子(hisG)、フォスフォリボシルAMPサイクロヒドロラーゼ遺伝子(hisI)、フォスフォリボシル-ATPピロフォスフォヒドロラーゼ遺伝子(hisI)、フォスフォリボシルフォルミミノ-5-アミノイミダゾールカルボキサミドリボタイドイソメラーゼ遺伝子(hisA)、アミドトランスフェラーゼ遺伝子(hisH)、ヒスチジノールフォスフェイトアミノトランスフェラーゼ遺伝子(hisC)、ヒスチジノールフォスファターゼ遺伝子(hisB)、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ遺伝子(hisD)などが挙げられる。
【００４９】
hisG及びhisBHAFIにコードされるＬ−ヒスチジン生合成系酵素はＬ−ヒスチジンにより阻害されることが知られており、従って、Ｌ−ヒスチジン生産能は、ATPフォスフォリボシルトランスフェラーゼ遺伝子(hisG)にフィードバック阻害への耐性を付与する変異を導入することにより効率的に増大させることができる(ロシア特許第2003677号及び第2119536号)。
【００５０】
Ｌ−ヒスチジン生産能を有する株の具体例としては、Ｌ−ヒスチジン生合成系酵素をコードするDNAを保持するベクターを導入したE. coli FERM-P 5038及び5048 (特開昭56-005099号)、アミノ酸輸送の遺伝子を導入したE.coli株(EP1016710A)、スルファグアニジン、
DL-1,2,4-トリアゾール-3-アラニン及びストレプトマイシンに対する耐性を付与したE. coli 80株(VKPM B-7270, ロシア特許第2119536号)などが挙げられる。
【００５１】
Ｌ−グルタミン酸生産菌
Ｌ−グルタミン酸生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、E. coli VL334thrC+ (EP 1172433)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。E. coli VL334 (VKPM B-1641)は、thrC遺伝子及びilvA遺伝子に変異を有するＬ−イソロイシン及びＬ−スレオニン要求性株である(米国特許第4,278,765号)。thrC遺伝子の野生型アレルは、野生型E. coli K12株 (VKPM B-7)の細胞で増殖したバクテリオファージP1を用いる一般的形質導入法により導入された。この結果、Ｌ−イソロイシン要求性のＬ−グルタミン酸生産菌VL334thrC+ (VKPM B-8961) が得られた。
【００５２】
Ｌ−グルタミン酸生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、Ｌ−グルタミン酸生合成系酵素１種又は２種以上の活性が増強された株が挙げられるが、これらに限定されない。かかる遺伝子の例としては、グルタメートデヒドロゲナーゼ（gdhA）、グルタミンシンテターゼ(glnA)、グルタメートシンテターゼ(gltAB)、イソシトレートデヒドロゲナーゼ(icdA)、アコニテートヒドラターゼ(acnA, acnB)、クエン酸シンターゼ(gltA)、メチルクエン酸シンターゼ（prpC）、フォスフォエノールピルベートカルボシラーゼ(ppc)、ピルベートデヒドロゲナーゼ(aceEF, lpdA)、ピルベートキナーゼ(pykA, pykF)、フォスフォエノールピルベートシンターゼ(ppsA)、エノラーゼ(eno)、フォスフォグリセロムターゼ(pgmA, pgmI)、フォスフォグリセレートキナーゼ(pgk)、グリセルアルデヒド-3-フォスフェートデヒドロゲナーゼ(gapA)、トリオースフォスフェートイソメラーゼ(tpiA)、フルクトースビスフォスフェートアルドラーゼ(fbp)、フォスフォフルクトキナーゼ（pfkA, pfkB）、グルコースフォスフェートイソメラーゼ(pgi)などが挙げられる。これらの酵素の中では、グルタメートデヒドロゲナーゼ、クエン酸シンターゼ、フォスフォエノールピルベートカルボキシラーゼ、及びメチルクエン酸シンターゼが好ましい。
【００５３】
シトレートシンテターゼ遺伝子、フォスフォエノールピルベートカルボキシラーゼ遺伝子、及び／またはグルタメートデヒドロゲナーゼ遺伝子の発現が増大するように改変された株の例としては、EP1078989A、EP955368A及びEP952221Aに開示されたものが挙げられる。
【００５４】
Ｌ−グルタミン酸生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、Ｌ−グルタミン酸の生合成経路から分岐してＬ−グルタミン酸以外の化合物の合成を触媒する酵素の活性が低下または欠損している株も挙げられる。このような酵素の例としては、イソシトレートリアーゼ(aceA)、α-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ(sucA)、フォスフォトランスアセチラーゼ(pta)、アセテートキナーゼ(ack)、アセトヒドロキシ酸シンターゼ(ilvG)、アセトラクテートシンターゼ(ilvI)、フォルメートアセチルトランスフェラーゼ(pfl)、ラクテートデヒドロゲナーゼ(ldh)、グルタメートデカルボキシラーゼ(gadAB)などが挙げられる。α-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ活性が欠損した、または、α-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ活性が低下したエシェリヒア属に属する細菌、及び、それらの取得方法は米国特許第5,378,616 号及び第5,573,945号に記載されている。
【００５５】
具体例としては下記のものが挙げられる。
E. coli W3110sucA::Kmr
E. coli AJ12624 (FERM BP-3853)
E. coli AJ12628 (FERM BP-3854)
E. coli AJ12949 (FERM BP-4881)
【００５６】
E. coli W3110sucA::Kmr は、E. coli W3110のα-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ
遺伝子（以下、「sucA遺伝子」ともいう）を破壊することにより得られた株である。この株は、α-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼを完全に欠損している。
【００５７】
Ｌ−グルタミン酸生産菌の他の例としては、エシェリヒア属に属し、アスパラギン酸代謝拮抗物質に耐性を有するものが挙げられる。これらの株は、α-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼを欠損していてもよく、例えば、E. coli AJ13199 (FERM BP-5807) (米国特許第5.908,768号)、さらにＬ−グルタミン酸分解能が低下したFFRM P-12379(米国特許第5,393,671号); AJ13138 (FERM BP-5565) (米国特許第6,110,714号)などが挙げられる。
【００５８】
パントアエ・アナナティスのＬ−グルタミン酸生産菌の例としては、パントエア・アナナティスAJ13355株が挙げられる。同株は、静岡県磐田市の土壌から、低pHでＬ−グルタミン酸及び炭素源を含む培地で増殖できる株として分離された株である。パントエア・アナナティスAJ13355は、1998年2月19日に、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（住所 〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に、受託番号FERM P-16644として寄託され、1999年1月11日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-6614が付与されている。尚、同株は、分離された当時はエンテロバクター・アグロメランス（Enterobacter agglomerans）と同定され、エンテロバクター・アグロメランスAJ13355として寄託されたが、近年16S rRNAの塩基配列解析などにより、パントエア・アナナティス（Pantoea ananatis）に再分類されている。
【００５９】
また、パントアエ・アナナティスのＬ−グルタミン酸生産菌として、α-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ（αKGDH）活性が欠損した、または、αKGDH活性が低下したパントエア属に属する細菌が挙げられる。このような株としては、AJ13355株のαKGDH-E1サブユニット遺伝子（sucA）を欠損させたAJ13356(米国特許第6,331,419号)、及びAJ13355株から粘液質低生産変異株として選択されたSC17株由来のsucA遺伝子欠損株であるSC17sucA(米国特許第6,596,517号)がある。AJ13356は、1998年2月19日、工業技術院生命工学工業技術研究所（現 独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター、〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に受託番号FERM P-16645として寄託され、1999年1月11日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-6616が付与されている。AJ13355及びAJ13356は、上記寄託機関にEnterobacter agglomeransとして寄託されているが、本明細書では、Pantoea ananatisとして記載する。また、SC17sucA株は、ブライベートナンバーAJ417株が付与され、2004年2月26日に産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号FERM BP-08646として寄託されている。
【００６０】
さらに、パントアエ・アナナティスのＬ−グルタミン酸生産菌として、SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB株、AJ13601株、NP106株、及びNA1株が挙げられる。SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB株は、SC17sucA株に、エシェリヒア・コリ由来のクエン酸シンターゼ遺伝子（gltA）、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子（ppsA）、およびグルタメートデヒドロゲナーゼ遺伝子（gdhA）を含むプラスミドRSFCPG、並びに、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム由来のクエン酸シンターゼ遺伝子（gltA）を含むプラスミドpSTVCBを導入して得た株である。AJ13601株は、このSC17sucA/RSFCPG+pSTVCB株から低pH下で高濃度のＬ−グルタミン酸に耐性を示す株として選択された株である。また、NP106株は、AJ13601株からプラスミドRSFCPG+pSTVCBを脱落させた株である。AJ13601株は、1999年8月18日に、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に受託番号FERM P-17516として寄託され、2000年7月6日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-7207が付与されている。
【００６１】
Ｌ−フェニルアラニン生産菌
Ｌ−フェニルアラニン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、コリスミ酸
ムターゼ−プレフェン酸デヒドロゲナーゼ及びチロシンリプレッサーを欠損したE.coli AJ12739 (tyrA::Tn10, tyrR) (VKPM B-8197)(WO03/044191)、フィードバック阻害が解除されたコリスミ酸ムターゼ−プレフェン酸デヒドラターゼをコードする変異型pheA34遺伝子を保持するE.coli HW1089 (ATCC 55371) (米国特許第 5,354,672号)、E.coli MWEC101-b (KR8903681)、E.coli NRRL B-12141, NRRL B-12145, NRRL B-12146及びNRRL B-12147 (米国特許第4,407,952号)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。また、親株として、フィードバック阻害が解除されたコリスミ酸ムターゼ−プレフェン酸デヒドラターゼをコードする遺伝子を保持するE. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHAB] (FERM BP-3566)、E. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHAD] (FERM BP-12659)、E. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHATerm] (FERM BP-12662)及びAJ 12604と命名されたE. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pBR-aroG4, pACMAB] (FERM BP-3579)も使用できる(EP 488424 B1)。さらに、yedA遺伝子またはyddG遺伝子にコードされるタンパク質の活性が増大したエシェリヒア属に属するＬ−フェニルアラニン生産菌も使用できる(米国特許出願公開2003/0148473 A1及び2003/0157667 A1、WO03/044192)。
【００６２】
Ｌ−トリプトファン生産菌
Ｌ−トリプトファン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、変異trpS遺伝子によりコードされるトリプトファニル-tRNAシンテターゼが欠損したE. coli JP4735/pMU3028 (DSM10122)及びJP6015/pMU91 (DSM10123) (米国特許第5,756,345号)、セリンによるフィードバック阻害を受けないフォスフォグリセレートデヒドロゲナーゼをコードするserAアレル及びトリプトファンによるフィードバック阻害を受けないアントラニレートシンターゼをコードするtrpEアレルを有するE. coli SV164 (pGH5) (米国特許第6,180,373号)、トリプトファナーゼが欠損したE. coli AGX17 (pGX44) (NRRL B-12263)及びAGX6(pGX50)aroP (NRRL B-12264) (米国特許第4,371,614号)、フォスフォエノールピルビン酸生産能が増大したE. coli AGX17/pGX50,pACKG4-pps (WO9708333, 米国特許第6,319,696号)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。yedA遺伝子またはyddG遺伝子にコードされるタンパク質の活性が増大したエシェリヒア属に属するＬ−トリプトファン生産菌も使用できる(米国特許出願公開2003/0148473 A1及び2003/0157667
A1)。
【００６３】
Ｌ−トリプトファン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、アントラニレートシンターゼ(trpE)、フォスフォグリセレートデヒドロゲナーゼ(serA)、３−デオキシ−Ｄ−アラビノヘプツロン酸−７−リン酸シンターゼ(aroG)、３−デヒドロキネートシンターゼ(aroB)、シキミ酸デヒドロゲナーゼ(aroE)、シキミ酸キナーゼ(aroL)、５−エノール酸ピルビルシキミ酸３−リン酸シンターゼ(aroA)、コリスミ酸シンターゼ(aroC)、プレフェン酸デヒドラターゼ、コリスミ酸ムターゼ及び、トリプトファンシンターゼ(trpAB)から選ばれる１種又は２種以上の酵素の活性が増強された株も挙げられる。プレフェン酸デヒドラターゼ及びコリスミ酸ムターゼは、２機能酵素（CM-PD）としてpheA遺伝子によってコードされている。これらの酵素の中では、フォスフォグリセレートデヒドロゲナーゼ、３−デオキシ−Ｄ−アラビノヘプツロン酸−７−リン酸シンターゼ、３−デヒドロキネートシンターゼ、シキミ酸デヒドラターゼ、シキミ酸キナーゼ、５−エノール酸ピルビルシキミ酸３−リン酸シンターゼ、コリスミ酸シンターゼ、プレフェン酸デヒドラターゼ、コリスミン酸ムターゼ−プレフェン酸デヒドロゲナーゼが特に好ましい。アントラニレートシンターゼ及びフォスフォグリセレートデヒドロゲナーゼは共にＬ−トリプトファン及びＬ−セリンによるフィードバック阻害を受けるので、フィードバック阻害を解除する変異をこれらの酵素に導入してもよい。このような変異を有する株の具体例としては、脱感作型アントラニレートシンターゼを保持するE. coli SV164、及び、フィードバック阻害が解除されたフォスフォグリセレートデヒドロゲナーゼをコードする変異serA遺伝子を含むプラスミドpGH5 (WO 94/08031)をE. coli SV164に導入することにより得られた形質転換株が挙げられる。
【００６４】
Ｌ−トリプトファン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、阻害解除型アントラニレートシンターゼをコードする遺伝子を含むトリプトファンオペロンが導入された株(特開昭57-71397号, 特開昭62-244382号, 米国特許第4,371,614号)も挙げられる。さらに、トリプトファンオペロン(trpBA)中のトリプトファンシンターゼをコードする遺伝子の発現を増大させることによりＬ−トリプトファン生産能を付与してもよい。トリプトファンシンターゼは、それぞれtrpA及びtrpB遺伝子によりコードされるα及びβサブユニットからなる。さらに、イソシトレートリアーゼ-マレートシンターゼオペロンの発現を増大させることによりＬ−トリプトファン生産能を改良してもよい(WO2005/103275)。
【００６５】
Ｌ−プロリン生産菌
Ｌ−プロリン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、ilvA遺伝子が欠損し、Ｌ−プロリンを生産できるE. coli 702ilvA (VKPM B-8012) (EP 1172433)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６６】
本発明に用いる細菌は、Ｌ−プロリン生合成に関与する遺伝子の一種以上の発現を増大することにより改良してもよい。Ｌ−プロリン生産菌に好ましい遺伝子の例としては、Ｌ−プロリンによるフィードバック阻害が解除されたグルタメートキナーゼをコードするproB遺伝子(ドイツ特許第3127361号)が挙げられる。さらに、本発明に用いる細菌は、細菌の細胞からＬ−アミノ酸を排出するタンパク質をコードする遺伝子の一種以上の発現が増大することにより改良してもよい。このような遺伝子としては、b2682 遺伝子及びb2683遺伝子(ygaZH遺伝子) (EP1239041 A2)が挙げられる。
【００６７】
Ｌ−プロリン生産能を有するエシェリヒア属に属する細菌の例としては、NRRL B-12403及びNRRL B-12404 (英国特許第2075056号)、VKPM B-8012 (ロシア特許出願2000124295)、ドイツ特許第3127361号に記載のプラスミド変異体、Bloom F.R. et al (The 15th Miami winter symposium, 1983, p.34)に記載のプラスミド変異体などのE. coli 株が挙げられる。
【００６８】
Ｌ−アルギニン生産菌
Ｌ−アルギニン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、E. coli 237株 (VKPM B-7925) (米国特許出願公開2002/058315 A1)、及び、変異N-アセチルグルタメートシンターゼを保持するその誘導株(ロシア特許出願第2001112869号)、E. coli 382株 (VKPM B-7926) (EP1170358A1)、N-アセチルグルタメートシンテターゼをコードするargA遺伝子が導入されたアルギニン生産株(EP1170361A1)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６９】
Ｌ−アルギニン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、Ｌ−アルギニン生合成系酵素をコードする遺伝子の１種以上の発現が増大した株も挙げられる。かかる遺伝子の例としては、N-アセチルグルタミルフォスフェートレダクターゼ遺伝子(argC)、オルニチンアセチルトランスフェラーゼ遺伝子(argJ)、N-アセチルグルタメートキナーゼ遺伝子(argB)、アセチルオルニチントランスアミナーゼ遺伝子(argD)、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ遺伝子(argF)、アルギノコハク酸シンテターゼ遺伝子(argG)、アルギノコハク酸リアーゼ遺伝子(argH)、カルバモイルフォスフェートシンテターゼ遺伝子(carAB)が挙げられる。
【００７０】
Ｌ−バリン生産菌
Ｌ−バリン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、ilvGMEDAオペロンを過剰発現するように改変された株(米国特許第5,998,178号)が挙げられるが、これらに限定されない。アテニュエーションに必要なilvGMEDAオペロンの領域を除去し、生産されるＬ
−バリンによりオペロンの発現が減衰しないようにすることが好ましい。さらに、オペロンのilvA遺伝子が破壊され、スレオニンデアミナーゼ活性が減少することが好ましい。
【００７１】
Ｌ−バリン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、アミノアシルt-RNAシンテターゼの変異を有する変異株(米国特許第5,658,766号)も挙げられる。例えば、イソロイシンtRNAシンテターゼをコードするileS 遺伝子に変異を有するE. coli VL1970が使用できる。E. coli VL1970は、1988年6月24日、ルシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオルガニズムズ(VKPM) (1 Dorozhny proezd., 1 Moscow 117545, Russia)に、受託番号VKPM B-4411で寄託されている。
【００７２】
さらに、生育にリポ酸を要求する、及び／または、H+-ATPaseを欠失している変異株(WO96/06926)を親株として用いることができる。
【００７３】
Ｌ−イソロイシン生産菌
Ｌ−イソロイシン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、６−ジメチルアミノプリンに耐性を有する変異株(特開平5-304969号)、チアイソロイシン、イソロイシンヒドロキサメートなどのイソロイシンアナログに耐性を有する変異株、さらにDL-エチオニン及び／またはアルギニンヒドロキサメートに耐性を有する変異株(特開平5-130882号).が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、スレオニンデアミナーゼ、アセトヒドロキシ酸シンターゼなどのＬ−イソロイシン生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子で形質転換された組換え株もまた親株として使用できる(特開平2-458号, FR 0356739, 及び米国特許第5,998,178号)。
【００７４】
本発明の細菌は、上記のようなＬ−アミノ酸生産能を有し、かつ、ydcU、yfeK、smpA、htrG、adiC、htrA、ydhK、bacA、yaiW、及びyidQから選択される１又はそれ以上の遺伝子の発現が弱まるように改変されたものである。
【００７５】
本発明の細菌は、Ｌ−アミノ酸生産能を有する腸内細菌科に属する細菌を、遺伝子組換えによりydcU、yfeK、smpA、htrG、adiC、htrA、ydhK、bacA、yaiW、又はyidQ遺伝子の発現が弱まるように改変することにより得ることができる。なお、本発明の腸内細菌科に属する細菌の育種において、Ｌ−アミノ酸生産能の付与と上記各遺伝子の発現を弱める改変は、どちらを先に行ってもよい。
【００７６】
「ydcU、yfeK、smpA、htrG、adiC、htrA、ydhK、bacA、yaiW、又はyidQから選ばれる１又はそれ以上の遺伝子の発現が弱まるように改変された」とは、非改変株、例えば親株又は野生株に比べてydcU、yfeK、smpA、htrG、adiC、htrA、ydhK、bacA、yaiW、又はyidQの各遺伝子産物であるYdcU、YfeK、SmpA、HtrG、AdiC、HtrA、YdhK、BacA、YaiW、又はYidQの各タンパク質が正常に機能しないように改変したことを意味する。例えば、遺伝子組換えによりydcU遺伝子を改変することにより、親株、あるいは野生株に対して細胞あたりのYdcUタンパク質の分子の数が減少した場合、又はYdcUタンパク質分子が全く生成されなくなった場合、あるいはYdcUタンパク質の分子当たりの活性が低下又は喪失した場合等が含まれる。YdcUタンパク質分子の数は、ydcU遺伝子の転写量、又はydcU mRNAの翻訳量を低下させることにより減少させることができる。ydcU遺伝子以外の他の遺伝子についても同様である。比較対象となる野生株としては、エシェリヒア・コリK12株、パントエア・アナナティスAJ13355株、クレブシエラ・プランティコーラAJ13399株等が挙げられる。
【００７７】
また、ydcU、yfeK、smpA、htrG、adiC、htrA、ydhK、bacA、yaiW、又はyidQ遺伝子（以下、「標的遺伝子」ともいう）の不活化とは、改変された各々の遺伝子がコードする各々のタンパク質が完全に機能を失うことを意味する。
【００７８】
各標的遺伝子の改変は、具体的には、染色体上の各標的遺伝子コード領域の一部又は全部を欠損させたり、プロモーターやシャインダルガルノ（SD）配列等の発現調節配列を改変したりすることなどによって達成される。また、発現調節配列以外の非翻訳領域の改変によっても、遺伝子の発現量を低下させることができる。さらには、染色体上の標的遺伝子の前後の配列を含めて、標的遺伝子全体を欠失させてもよい。また、遺伝子組換えにより、染色体上の標的遺伝子のコード領域にアミノ酸置換（ミスセンス変異）を導入すること、また終始コドンを導入すること（ナンセンス変異）、あるいは一〜二塩基付加・欠失するフレームシフト変異を導入することによっても達成出来る（Journal of Biological Chemistry 272:8611-8617（1997） Proceedings of the National Academy of Sciences,USA 95 5511-5515(1998), Journal of Biological Chemistry 266, 20833-20839(1991)）。
【００７９】
各遺伝子の改変は、遺伝子組換えにより行われることが好ましい。遺伝子組換えによる方法として具体的には、相同組換えを利用して、染色体上の標的遺伝子の発現調節配列、例えばプロモーター領域、又はコード領域、もしくは非コード領域の一部又は全部を欠損させること、又はこれらの領域に他の配列を挿入することが挙げられる。
【００８０】
発現調節配列の改変は、好ましくは１塩基以上、より好ましくは２塩基以上、特に好ましくは３塩基以上である。また、コード領域を欠失させる場合は、各遺伝子が産生するタンパク質の機能が低下又は欠失するのであれば、欠失させる領域は、Ｎ末端領域、内部領域、Ｃ末端領域のいずれの領域であってもよく、コード領域全体であってよい。通常、欠失させる領域は長い方が確実に標的遺伝子を不活化することができる。また、欠失させる領域の上流と下流のリーディングフレームは一致しないことが好ましい。
【００８１】
コード領域に他の配列を挿入する場合も、挿入する位置は標的遺伝子のいずれに領域であってもよいが、挿入する配列は長い方が、確実に標的遺伝子を不活化することができる。挿入部位の前後の配列は、リーディングフレームが一致しないことが好ましい。他の配列としては、標的遺伝子がコードするタンパク質の機能を低下又は欠損させるものであれば特に制限されないが、例えば、抗生物質耐性遺伝子やＬ−グルタミン酸生産に有用な遺伝子を搭載したトランスポゾン等が挙げられる。
【００８２】
染色体上の標的遺伝子を上記のように改変するには、例えば、標的遺伝子の部分配列を欠失し、正常に機能するタンパク質を産生しないように改変した欠失型遺伝子を作製し、該遺伝子を含むＤＮＡで細菌を形質転換して、欠失型遺伝子と染色体上の標的遺伝子とで相同組換えを起こさせることにより、染色体上の標的遺伝子を欠失型遺伝子に置換することによって達成できる。欠失型標的遺伝子によってコードされるタンパク質は、生成したとしても、野生型タンパク質とは異なる立体構造を有し、機能が低下又は消失する。このような相同組換えを利用した遺伝子置換による遺伝子破壊は既に確立しており、「Redドリブンインテグレーション(Red-driven integration)」と呼ばれる方法（Datsenko, K. A, and Wanner, B. L. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 97:6640-6645 (2000)）、又は、Redドリブンインテグレーション法とλファージ由来の切り出しシステム（Cho, E. H., Gumport, R. I., Gardner, J. F. J. Bacteriol. 184: 5200-5203 (2002)）とを組合わせた方法（WO2005/010175号参照）等の直鎖状ＤＮＡを用いる方法や、温度感受性複製起点を含むプラスミド、接合伝達可能なプラスミドを用いる方法、宿主内で複製起点を持たないスイサイドベクターを利用する方法などがある（米国特許第6303383号明細書、または特開平05-007491号公報）。
【００８３】
標的遺伝子の転写量が低下したことの確認は、標的遺伝子から転写されるmRNAの量を野生株、あるいは非改変株と比較することによって行うことが出来る。mRNAの量を評価する方法としては、ノーザンハイブリダイゼーション、RT−PCR等が挙げられる（Molecular c
loning（Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor (USA), 2001））。転写量の低下は、野生株あるいは非改変株と比較して低下していれば、いずれでもよいが、例えば野生株、非改変株と比べて少なくとも75%以下、50％以下、25％以下、又は10％以下に低下していることが望ましく、全く発現していないことが特に好ましい。
【００８４】
標的遺伝子がコードするタンパク質の量が低下したことの確認は、同タンパク質に結合する抗体を用いてウェスタンブロットによって行うことが出来る（Molecular cloning（Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor (USA), 2001））。タンパク質量の低下は、野生株あるいは非改変株と比較して、低下していればいずれでもよいが、例えば野生株、非改変株と比べて、野生株あるいは非改変株と比べて少なくとも75%以下、50％以下、25％以下、又は10％以下以下に減少していることが望ましく、全くタンパク質を産生していない（完全に活性が消失している）ことが特に好ましい。
【００８５】
ydcU遺伝子がコードするタンパク質（YdcUタンパク質）は、ABCトランスポーターのコンポーネント、あるいは、スペルミジン／プトレシントランスポーターのサブユニットであると推測されている。「YdcUタンパク質の機能」とは、このような推定上のトランスポーターの一要素としての機能をいう。SmpAはsmall membrane protein A、HtrGはsignal transduction proterin(SH3)、AdiCはarginine:agmatine antiporter、HtrAは膜結合型セリンエンドプロテアーゼ（プロテアーゼDo）、YdhKはconserved inner membrane protein、BacAはウンデカプレニル−ジホスファターゼ、YaiWはpredicted DNA-binding transcriptional regulator（推定上のＤＮＡ結合型転写レギュレータ）、及びYidQ遺伝子はconserved outer membrane proteinであると推定されており、各々のタンパク質の機能とは、このような推定上の機能をいう。
【００８６】
各遺伝子がコードするタンパク質が正常に機能しないと、同タンパク質が正常に機能する菌株、例えば野生株において発現する遺伝子の発現が低下又は消失することが予想される。細胞内の各タンパク質の機能の低下の確認は、前述したような、各遺伝子から転写されるmRNAのサザンブロッティング等による検出、又は遺伝子産物のウェスタンブロンティング等による検出により行うことができる。
【００８７】
ここで、腸内細菌科のYdcUタンパク質としては、エシェリヒア・コリのydcU遺伝子（配列番号１）がコードするタンパク質（配列番号２）が挙げられる。YdcUタンパク質は、ABCトランスポーターのコンポーネント、あるいは、スペルミジン／プトレシントランスポーターのサブユニットをコードすると推測されている。
YfeKタンパク質としては、エシェリヒア・コリのyfeK遺伝子（GenBank Annotation NP_416914.1 GI:16130345、配列番号３）がコードするタンパク質（配列番号４）が挙げられる。
SmpAタンパク質としては、エシェリヒア・コリのsmpA遺伝子（GenBank NP_417107.2 GI:90111468、配列番号５）がコードするタンパク質（配列番号６）が挙げられる。SmpAタンパク質は、small membrane protein Aであると推定されている。
HtrGタンパク質としては、エシェリヒア・コリのhtrG遺伝子（GenBank Annotation NP_417527.1 GI:16130951、配列番号７）がコードするタンパク質（配列番号８）が挙げられる。HtrGは、膜結合型セリンエンドプロテアーゼ（プロテアーゼDo）であると推定されている。
AdiCタンパク質としては、エシェリヒア・コリのadiC遺伝子（yjdE、yjdD、yjdD12とも呼ばれる。GenBank Annotation NP_418539.1 GI:16131941、配列番号９）がコードするタンパク質（配列番号１０）が挙げられる。AdiCタンパク質は、arginine:agmatine antiporter、HtrAは膜結合型セリンエンドプロテアーゼ（プロテアーゼDo）であると推定されている。
HtrAタンパク質としては、エシェリヒア・コリのhtrA遺伝子（degPとも呼ばれる。Genb
ank annotation NP_414703.1 GI:16128154、配列番号１１）がコードするタンパク質（配列番号１２）が挙げられる。HtrAタンパク質は、膜結合型セリンエンドプロテアーゼ（プロテアーゼDo）serine endoprotease (protease Do)であると推定されている。
YdhKタンパク質としては、エシェリヒア・コリのydhK遺伝子（GenBank NP_416162.1 GI:16129603、配列番号１３）がコードするタンパク質（配列番号１４）が挙げられる。YdhKタンパク質は、conserved inner membrane proteinであると推定されている。
BacAタンパク質としては、エシェリヒア・コリのbacA遺伝子（GenBank NP_417529.1 GI:16130953、配列番号１５）がコードするタンパク質（配列番号１６）が挙げられる。BacAタンパク質は、ウンデカプレニル−ジホスファターゼであると推定されている。
YaiWタンパク質としては、エシェリヒア・コリのyaiW遺伝子（GenBank NP_414912.1 GI:16128363、配列番号１７）がコードするタンパク質（配列番号１８２）が挙げられる。YaiWタンパク質は、predicted DNA-binding transcriptional regulator（推定上のＤＮＡ結合型転写レギュレータ）であると推定されている。
YidQタンパク質としては、エシェリヒア・コリのyidQ遺伝子（GenBank NC_000913.2 (3865751..3866083)、配列番号１９）がコードするタンパク質（配列番号２０）が挙げられる。YidQタンパク質は、conserved outer membrane proteinであると推定されている。
また、腸内細菌科の属する種又は菌株によって、各タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列に差異が存在することがあるため、各遺伝子は配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、又は１９の塩基配列を有する遺伝子のバリアントであってもよい。各々の遺伝子のバリアントは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、又は１９の塩基配列を参考にして、BLAST等によって検索出来る（http://blast.genome.jp/）。また、各々の遺伝子のバリアントは、各々の遺伝子ホモログ、例えば腸内細菌科の染色体を鋳型にして、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、又は１９の塩基配列に基づいて作成され得るプライマーを用いてPCRで増幅可能な遺伝子を含む。
【００８８】
YdcU、SmpA、HtrG、AdiC、HtrA、YdhK、BacA、YaiW、又はYidQタンパク質としては、各々配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、又は２０のアミノ酸配列を有するものが挙げられるが、細菌の種や菌株によって使用コドンが異なり、各々の遺伝子の塩基配列に差異が存在することがあるため、コードされるタンパク質の機能が変わらない限り、これらのアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列をコードしている場合がある。ここで、数個とは、例えば、１〜２０個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個を意味する。上記の１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加は、各々のタンパク質産生が正常に行われる保存的変異である。保存的変異とは、置換部位が芳香族アミノ酸である場合には、Phe、Trp、Tyr間で、置換部位が疎水性アミノ酸である場合には、Leu、Ile、Val間で、極性アミノ酸である場合には、Gln、Asn間で、塩基性アミノ酸である場合には、Lys、Arg、His間で、酸性アミノ酸である場合には、Asp、Glu間で、ヒドロキシル基を持つアミノ酸である場合には、Ser、Thr間でお互いに置換する変異である。保存的変異の代表的なものは、保存的置換であり、保存的置換とみなされる置換としては、AlaからSer又はThrへの置換、ArgからGln、His又はLysへの置換、AsnからGlu、Gln、Lys、His又はAspへの置換、AspからAsn、Glu又はGlnへの置換、CysからSer又はAlaへの置換、GlnからAsn、Glu、Lys、His、Asp又はArgへの置換、GluからAsn、Gln、Lys又はAspへの置換、GlyからProへの置換、HisからAsn、Lys、Gln、Arg又はTyrへの置換、IleからLeu、Met、Val又はPheへの置換、LeuからIle、Met、Val又はPheへの置換、LysからAsn、Glu、Gln、His又はArgへの置換、MetからIle、Leu、Val又はPheへの置換、PheからTrp、Tyr、Met、Ile又はLeuへの置換、SerからThr又はAlaへの置換、ThrからSer又はAlaへの置換、TrpからPhe又はTyrへの置換、TyrからHis、Phe又はTrpへの置換、及び、ValからMet、Ile又はLeuへの置換が挙げられる。
【００８９】
ydcU、yfeK、smpA、htrG、adiC、htrA、ydhK、bacA、yaiW、及びyidQ遺伝子のバリアン
トは、各々配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、及び１９の塩基配列を有する遺伝子だけでなく、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、又は１９からなる塩基配列に相補的な塩基配列、またはその一部からなるプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであってもよい。「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。一例を示せば、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、特に好ましくは９９％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、好ましくは、６０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、さらに好ましくは、６８℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度、温度で、１回、より好ましくは２〜３回洗浄する条件が挙げられる。プローブの長さは、ハイブリダイゼーションの条件により適宜選択されるが、通常には、100bp〜1Kbpである。
【００９０】
プローブは、各々の遺伝子の一部の配列を有するものであってもよい。そのようなプローブは、当業者によく知られた方法により、各遺伝子の塩基配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとし、各遺伝子を含むDNA断片を鋳型とするPCR反応により作製することができる。なお、プローブに300bp程度の長さのDNA断片を用いる場合には、上記の条件でハイブリダイズさせた後の洗いの条件としては、50℃、2×SSC, 0.1%SDSで1回または２〜３回洗浄する条件が挙げられる。
【００９１】
尚、上記バリアント及びホモログに関する記述は、細菌へのＬ−アミノ酸生産能の付与に用いられる遺伝子についても同様に適用される。
【００９２】
＜２＞本発明のＬ−アミノ酸の製造法
本発明の微生物を培地で培養して、Ｌ−アミノ酸を該培地中に生成蓄積させ、該培地からＬ−アミノ酸を採取することにより、Ｌ−アミノ酸を製造することができる。
【００９３】
培養に用いる培地は、炭素源、窒素源、無機塩類、その他必要に応じてアミノ酸、ビタミン等の有機微量栄養素を含有する通常の培地を用いることができる。合成培地または天然培地のいずれも使用可能である。培地に使用される炭素源および窒素源は培養する菌株が利用可能であるものならばいずれの種類を用いてもよい。
【００９４】
炭素源としては、グルコース、グリセロール、フラクトース、スクロース、マルトース、マンノース、ガラクトース、澱粉加水分解物、糖蜜等の糖類が使用でき、その他、酢酸、クエン酸等の有機酸、エタノール等のアルコール類も単独あるいは他の炭素源と併用して用いることができる。窒素源としては、アンモニア、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、酢酸アンモニウム等のアンモニウム塩または硝酸塩等が使用することができる。有機微量栄養素としては、アミノ酸、ビタミン、脂肪酸、核酸、更にこれらのものを含有するペプトン、カザミノ酸、酵母エキス、大豆たん白分解物等が使用でき、生育にアミノ酸などを要求する栄養要求性変異株を使用する場合には要求される栄養素を補添することが好ましい。
【００９５】
特にＬ−グルタミン酸が析出するような条件に調整された液体培地を用いる場合、培地中にパントテン酸を添加すると、より効率よく晶析できる（WO2004/111258号パンフレット）。無機塩類としてはりん酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、鉄塩、マンガン塩等が使用できる。
【００９６】
培養は、好ましくは、発酵温度２０〜４５℃、ｐＨを３〜９に制御し、通気培養を行う
。培養中にｐＨが下がる場合には、例えば、炭酸カルシウムを加えるか、アンモニアガス等のアルカリで中和する。このような条件下で、好ましくは１０時間〜１２０時間程度培養することにより、培養液中に目的アミノ酸が蓄積される。
また、Ｌ−グルタミン酸が析出するような条件に調整された液体培地を用いて、培地中にＬ−グルタミン酸を析出させながら培養を行うことも出来る。Ｌ−グルタミン酸が析出する条件としては、例えば、ｐＨ５．０〜４．０、好ましくはｐＨ４．５〜４．０、さらに好ましくはｐＨ４．３〜４．０、特に好ましくはｐＨ４．０を挙げることができる。
【００９７】
また、Ｌ−グルタミン酸を培地中に析出させる場合には、予めＬ−グルタミン酸、Ｌ−リジンの結晶を種晶として添加しておくとより効率よく晶析できる（欧州特許1233069号、欧州特許出願公開1624069号）。
【００９８】
培養終了後の培養液からＬ−アミノ酸を採取する方法は、公知の回収方法に従って行えばよい。例えば、培養液から菌体を除去した後に濃縮晶析する方法あるいはイオン交換クロマトグラフィー等によって採取される。Ｌ−グルタミン酸が析出するような条件下で培養した場合、培養液中に析出したＬ−グルタミン酸は、遠心分離又は濾過等により採取することができる。この場合、培地中に溶解しているＬ−グルタミン酸を晶析した後に、併せて単離してもよい。
【００９９】
なお、塩基性アミノ酸を製造する際には、培養中のｐＨが６．５〜９．０、培養終了時の培地のｐＨが７．２〜９．０となるように制御し、発酵中の発酵槽内圧力が正となるように制御するか、又は、炭酸ガスもしくは炭酸ガスを含む混合ガスを培地に供給して、培地中の重炭酸イオン及び／または炭酸イオンが少なくとも２ｇ／Ｌ以上存在する培養期があるようにし、前記重炭酸イオン及び／または炭酸イオンを塩基性アミノ酸を主とするカチオンのカウンタイオンとする方法で発酵し、目的の塩基性アミノ酸を回収する方法で製造を行ってもよい（特開2002-065287号参照、米国特許出願公開第2002025564号）。
【実施例】
【０１００】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
【０１０１】
〔実施例１〕Ｌ−リジン生産菌の構築及び標的遺伝子の破壊
Ｌ−リジン生産菌として、国際公開第2006/078039号パンフレット記載のエシェリヒア・コリWC196ΔcadAΔldcを使用した。この菌株は、エシェリヒア・コリWC196のリジンデカルボキシラーゼ遺伝子cadA及びldcを、Red-driven integration法（Datsenko, K. A, and Wanner, B. L. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 97:6640-6645 (2000)）とλファージ由来の切り出しシステムにより、破壊した株である。
【０１０２】
上記WC196ΔcadAΔldcC 株からの標的遺伝子の欠失は、以下のようにして行うことができる。目的の遺伝子がKmr遺伝子に置換されたKOコレクション株（Baba, T. et al., (2006) Mol. Syst. Biol., 2, 2006 0008）をドナーとし、WC196ΔcadAΔldcCをレシピエントとしてP1トランスダクションを行い、WC196ΔcadAΔldcCから目的遺伝子がKmr遺伝子に置換された株を得る。次に、これらの株にFLPリコンビナーゼ遺伝子を搭載したプラスミドpCP20を導入し、Red-driven integrationによってKmr遺伝子を除去することにより、WC196ΔcadAΔldcC から目的遺伝子が欠失した株を得ることができる。
KOコレクション株は、エシェリヒア・コリBW25113[rrnB3 ΔlacZ4787 hsdR514 Δ(araBAD)567 Δ(rhaBAD)568 rph-1]株の種々の遺伝子がKmr遺伝子で置換された株のコレクションであり、ナショナルバイオリソースプロジェクト（nbrp@chanko.lab.nig.ac.jp）から入手することができる。
【０１０３】
〔実施例２〕WC196ΔcadAΔldcC 株のydcU、yfeK、及びsmpA遺伝子の破壊
KOコレクション株、BW25113 ydcU::Kmrをドナーとし、WC196ΔcadAΔldcCをレシピエントとしてP1トランスダクションを行い、WC196ΔcadAΔldcC ydcU::Kmrを得た。次に、この株にFLPリコンビナーゼ遺伝子を搭載したプラスミドpCP20を導入し、Red-driven integration法でKmr遺伝子を除去し、WC196ΔcadAΔldcCΔydcUを得た。
BW25113 yfeK::Kmr株、又はBW25113 smpA::Kmr株を用いて、上記と同様にしてyfeKo 又はsmpA遺伝子が破壊された株WC196ΔcadAΔldcCΔyfeK、及びWC196ΔcadAΔldcCΔsmpAを得た。
【０１０４】
〔実施例３〕ydcU遺伝子破壊株によるＬ−リジン生産
実施例２で得られたWC196ΔcadAΔldcCΔydcU、及びコントロールとしてWC196ΔcadAΔldcCを、それぞれＬプレートに塗布し、37℃にて24時間培養した。プレートのおよそ1/8量の菌体を、発酵培地20 mLを入れた500mL坂口フラスコに接種し、往復振とう培養装置で37℃において、グルコースを全量消費するまで約50時間培養した。培養後、培地中に蓄積したＬ−リジンの量をバイオテックアナライザーAS210（サクラ精機）を用いて測定した。独立に取得した３クローンについて、Ｌ−リジン収率（グルコースに対する収率）の平均値±SDを算出し、表１に示した。
【０１０５】
〔Ｌプレート組成〕
バクト・トリプトン（Difco社製） 10g/L
イーストエキストラクト（Difco社製） 5g/L
NaCl 5g/L
寒天 15g/L
【０１０６】
〔発酵培地組成〕
グルコース 60g/L
(NH4)2SO4 30g/L
KH2PO4 1.0g/L
MgSO4・7H20 1.0g/L
FeSO4・7H20 0.01g/L
MnSO4・4H20 0.01g/L
イーストエキストラクト（Difco社製）2.0g/L
炭酸カルシウム 30g/L
水酸化カリウムでpH7.0に調整し、115℃で10分オートクレーブした。但しグルコース及びMgSO4・7H2Oは別々に殺菌した。
【０１０７】
【表１】
【０１０８】
表１に示されるとおり、ydcU遺伝子が破壊された菌株は、親株に比べてＬ−リジン収率が向上している。
【０１０９】
〔実施例４〕yfeK遺伝子破壊株によるＬ−リジン生産
実施例２で得られたWC196ΔcadAΔldcCΔyfeK、及びコントロールとしてWC196ΔcadAΔldcCを、実施例３と同様に培養して、培地中に蓄積したＬ−リジンの量を測定した。独立に取得した３クローンについて、Ｌ−リジン収率（グルコースに対する収率）の平均値±SDを算出し、表２に示した。
【０１１０】
【表２】
【０１１１】
表２に示されるとおり、yfeK遺伝子が破壊された菌株は、親株に比べてＬ−リジン収率が向上している。
【０１１２】
〔実施例５〕smpA遺伝子破壊株によるＬ−リジン生産
実施例２で得られたWC196ΔcadAΔldcCΔsmpA、及びコントロールとしてWC196ΔcadAΔldcCを、実施例３と同様に培養して、培地中に蓄積したＬ−リジンの量を測定した。独立に取得した４クローンについて、Ｌ−リジン収率（グルコースに対する収率）の平均値±SDを算出し、表３に示した。
【０１１３】
【表３】
【０１１４】
表３に示されるとおり、smpA遺伝子が破壊された菌株は、親株に比べてＬ−リジン収率が向上している。
【０１１５】
〔配列表の説明〕
配列番号１：ydcU遺伝子の塩基配列
配列番号２：YdcUタンパク質のアミノ酸配列
配列番号３：yfeK遺伝子の塩基配列
配列番号４：YfeKタンパク質のアミノ酸配列
配列番号５：smpA遺伝子の塩基配列
配列番号６：SmpAタンパク質のアミノ酸配列
配列番号７：htrG遺伝子の塩基配列
配列番号８：HtrGタンパク質のアミノ酸配列
配列番号９：adiC遺伝子の塩基配列
配列番号10：AdiCタンパク質のアミノ酸配列
配列番号11：htrA遺伝子の塩基配列
配列番号12：HtrAタンパク質のアミノ酸配列
配列番号13：ydhK遺伝子の塩基配列
配列番号14：YdhKタンパク質のアミノ酸配列
配列番号15：bacA遺伝子の塩基配列
配列番号16：BacAタンパク質のアミノ酸配列
配列番号17：yaiW遺伝子の塩基配列
配列番号18：YaiWタンパク質のアミノ酸配列
配列番号19：yidQ遺伝子の塩基配列
配列番号20：YidQタンパク質のアミノ酸配列
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物を用いたＬ−アミノ酸の製造法、特にＬ−リジン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン等のＬ−アミノ酸の製造法に関する。Ｌ−グルタミン酸は調味料として、Ｌ−リジン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファンは、動物飼料用の添加物、健康食品の成分、または、アミノ酸輸液等として、産業上有用なＬ−アミノ酸である。
【背景技術】
【０００２】
Ｌ−アミノ酸は、種々の微生物を用いた発酵法により工業生産されている。例えば、Ｌ−グルタミン酸は、主としてブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、ミクロバクテリウム属に属するいわゆるコリネ型細菌のＬ−グルタミン酸生産菌またはそれらの変異株を用いた発酵法により製造されている（例えば、非特許文献１参照）。その他の微生物を用いた発酵法によるＬ−グルタミン酸の製造法としては、バチルス属、ストレプトミセス属、ペニシリウム属等の微生物（例えば、特許文献１参照）、シュードモナス属、アースロバクター属、セラチア属、キャンディダ属等の微生物（例えば、特許文献２参照）、バチルス属、シュードモナス属、セラチア属、アエロバクター・アエロゲネス（現エンテロバクター・アエロゲネス）等の微生物（例えば、特許文献３参照）、エシェリヒア・コリの変異株（例えば、特許文献１参照）等を用いる方法が知られている。また、クレブシエラ属、エルビニア属又はパントエア属、エンテロバクター属に属する微生物を用いたＬ−グルタミン酸の製造法も開示されている（例えば、特許文献２〜４参照）。
【０００３】
上記のような微生物を用いた発酵法によってＬ−アミノ酸等の目的物質を製造するには、野生型微生物（野生株）を用いる方法、野生株から誘導された栄養要求株を用いる方法、野生株から種々の薬剤耐性変異株として誘導された代謝調節変異株を用いる方法、栄養要求株と代謝調節変異株の両方の性質を持った株を用いる方法等がある。
【０００４】
さらに、近年は、目的物質の発酵生産に、組換えＤＮＡ技術を用いることが行われている。例えば、Ｌ−アミノ酸生合成系酵素をコードする遺伝子の発現を増強すること（特許文献５、特許文献６）、又はＬ−アミノ酸生合成系への炭素源の流入を増強すること（特許文献７）によって、微生物のＬ−アミノ酸生産性を向上させることが行われている。
【０００５】
ydcU遺伝子は、同遺伝子がコードするアミノ酸配列との相同性から、ABCトランスポーターのコンポーネント（非特許文献２）、あるいは、スペルミジン／プトレシントランスポーターのサブユニット（非特許文献３）をコードすると推測されているが、実験的な証明はなされていない。また、ydcU遺伝子とＬ−アミノ酸の生産との関係についての報告はない。
ｓｍｐＡ遺伝子は、small membrane protein Aをコードしていると推定されている（非特許文献４）。ｈｔｒＧ遺伝子は、signal transduction proterin(SH3)をコードしていると推定されている。ａｄｉＣ遺伝子は、arginine:agmatine antiporteをコードしていると推定されている（非特許文献５。ｈｔｒＡ遺伝子は、膜結合型セリンエンドプロテアーゼ（プロテアーゼDo）serine endoprotease (protease Do)をコードしていると推定されている（非特許文献６）。ｙｄｈＫ遺伝子は、conserved inner membrane proteinをコードしていると推定されている。ｂａｃＡ遺伝子は、ウンデカプレニル−ジホスファターゼをコードしていると推定されている（非特許文献７）。ｙａｉＷ遺伝子は、predicted DNA-binding transcriptional regulator（推定上のＤＮＡ結合型転写レギュレータ）をコードしていると推定されている（非特許文献８）。ｙｉｄＱ遺伝子は、conserved outer membrane proteinをコードしていると推定されている。しかし、これらの遺伝子とＬ−
アミノ酸の生産との関係についての報告はない。
【特許文献１】特開平５−２４４９７０号公報
【特許文献２】米国特許第３，５６３，８５７号明細書
【特許文献３】特公昭３２−９３９３号公報
【特許文献４】特開２０００−１８９１７５号公報
【特許文献５】米国特許第５，１６８，０５６号明細書
【特許文献６】米国特許第５，７７６，７３６号明細書
【特許文献７】米国特許第５，９０６，９２５号明細書
【非特許文献１】明石邦彦ら著 アミノ酸発酵、学会出版センター、１９５〜２１５頁、
【非特許文献２】Saurin, W. et al., J. Mol. Evol., 48(1);22-41 (1999)
【非特許文献３】Riley, M. et al., Nucleic Acids Res., 34: 1-9 (2006)
【非特許文献４】Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 2007 Apr 10;104(15):6400-5. Epub 2007 Apr 2.
【非特許文献５】J. Bacteriol., 2003 Nov;185(22):6556-61.）
【非特許文献６】Arch. Biochem. Biophys., 2007 Aug 1;464(1):80-9.
【非特許文献７】Microbiology. 2007 Aug;153(Pt 8):2518-29.
【非特許文献８】FEMS Microbiol Lett., 2003 Aug 8;225(1):1-7.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、Ｌ−アミノ酸を効率よく生産することのできる腸内細菌科に属する微生物を提供すること、及び該微生物を用いてＬ−アミノ酸を効率よく生産する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、ydcU、yfeK、smpA、htrG、adiC、htrA、ydhK、bacA、yaiW、又はyidQ遺伝子の発現が弱まるように改変された腸内細菌科に属する細菌が、Ｌ−アミノ酸を効率よく製造できることを見いだし、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）Ｌ−アミノ酸生産能を有し、かつ、ｙｄｃＵ、ｙｆｅＫ、ｓｍｐＡ、ｈｔｒＧ、ａｄｉＣ、ｈｔｒＡ、ｙｄｈＫ、ｂａｃＡ、ｙａｉＷ、及びｙｉｄＱから選択される１又はそれ以上の遺伝子の発現が弱まるように改変された腸内細菌科に属する細菌。
（２）ｙｄｃＵ、ｙｆｅＫ、ｓｍｐＡ、ｈｔｒＧ、ａｄｉＣ、ｈｔｒＡ、ｙｄｈＫ、ｂａｃＡ、ｙａｉＷ、又はｙｉｄＱの不活化により、各々の遺伝子の発現が弱められた、前記細菌。
（３）前記遺伝子が、ｙｄｃＵ、ｙｆｅＫ、又はｓｍｐＡである、前記細菌。
（４）ｙｄｃＵ遺伝子が、配列番号２のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ又はそのバリアントである、前記細菌。
（５）ｙｆｅＫ遺伝子が、配列番号４のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ又はそのバリアントである、前記細菌。
（６）ｓｍｐＡ遺伝子が、配列番号６のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ又はそのバリアントである、前記細菌。
（７）ｈｔｒＧ遺伝子が、配列番号８のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ又はそのバリアントである、前記細菌。
（８）ａｄｉＣ遺伝子が、配列番号１０のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ又はそのバリアントである、前記細菌。
（９）ｈｔｒＡ遺伝子が、配列番号１２のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ又はそのバリアントである、前記細菌。
（１０）ｙｄｈＫ遺伝子が、配列番号１４のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ又はそのバリアントである、前記細菌。
（１１）ｂａｃＡ遺伝子が、配列番号１６のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ又はそのバリアントである、前記細菌。
（１２）ｙａｉＷ遺伝子が、配列番号１８のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ又はそのバリアントである、前記細菌。
（１３）ｙｉｄＱ遺伝子が、配列番号２０のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ又はそのバリアントである、前記細菌。
（１４）前記Ｌ−アミノ酸がＬ−リジン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−スレオニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−トリプトファン、及びＬ−システインからなる群から選択される一種または二種以上のＬ−アミノ酸である前記細菌。
（１５）前記Ｌ−アミノ酸がＬ−リジンであり、リジンデカルボキシラーゼの活性が弱化されている、前記細菌。
（１６）前記腸内細菌科に属する微生物が、エシェリヒア属細菌、エンテロバクター属細菌またはパントエア属細菌である前記細菌。
（１７）前記細菌を培地で培養して、Ｌ−アミノ酸を該培地中に蓄積させ、該培地よりＬ−アミノ酸を採取する、Ｌ−アミノ酸の製造法。
（１８）前記Ｌ−アミノ酸がＬ−グルタミン酸、Ｌ−リジン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−トリプトファン、及びＬ−システインから選択される一種または二種以上のＬ−アミノ酸である、前記方法。
（１９）前記Ｌ−アミノ酸がＬ−リジンである、前記方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の微生物を用いることにより、効率よく、Ｌ−リジン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−スレオニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−トリプトファン、又はＬ−システイン、Ｌ−グルタミン酸等のＬ−アミノ酸を発酵生産することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下、本発明を詳細に説明する。
＜１＞本発明の微生物
本発明の細菌は、Ｌ−アミノ酸生産能を有し、かつ、ydcU、yfeK、smpA、htrG、adiC、htrA、ydhK、bacA、yaiW、及びyidQから選択される１又はそれ以上の遺伝子の発現が弱まるように改変された腸内細菌科に属する細菌である。ここで、Ｌ−アミノ酸生産能とは、本発明の細菌を培地中で培養したときに、培地中または菌体内にＬ−アミノ酸を生成し、培地中または菌体から回収できる程度に蓄積する能力をいう。なお、本発明の細菌は複数のＬ−アミノ酸の生産能を有するものであってもよい。Ｌ−アミノ酸の生産能を有する細菌としては、本来的にＬ−アミノ酸の生産能を有するものであってもよいが、下記のような細菌を、変異法や組換えDNA技術を利用して、Ｌ−アミノ酸の生産能を有するように改変したものであってもよい。
【００１１】
本発明に用いる微生物としては、エシェリヒア（Escherichia）属、エンテロバクター（Enterobacter）属、パントエア（Pantoea）属、クレブシエラ（Klebsiella）属、セラチア（Serratia）属、エルビニア（Erwinia）属、サルモネラ（Salmonella）属、モルガネラ（Morganella）属などのγ−プロテオバクテリアに属する腸内細菌や、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、ミクロバクテリウム属に属するいわゆるコリネ型細菌、アリサイクロバチルス（Alicyclobacillus）属、バチルス（Bacillus）属、サッカロマイセス（Saccharomyces）属等に属する微生物が挙げられる。γ−プロテオバクテリアは
、NCBI（National Center for Biotechnology Information）タキソノミーデータベースhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?mode=Undef&id=1236&lvl=3&p=mapview&p=has_linkout&p=blast_url&p=genome_blast&lin=f&keep=1&srchmode=1&unlock）に開示されている分類により微生物に属するものが利用出来る。
【００１２】
エシェリヒア属細菌としては、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）等が挙げられる。エシェリヒア・コリを遺伝子工学的手法を用いて育種する場合には、エシェリヒア・コリK-12株及びその誘導体であるエシェリヒア・コリ MG1655株（ATCC 47076）、及びW3110株（ATCC 27325）を用いることができる。エシェリヒア・コリK-12株は、1922年にスタンフォード大学で分離されたものであり、λファージの溶原菌であるとともに、F因子を持ち、接合等遺伝的組み換え体の作成が可能である汎用性の高い菌株である。またエシェリヒア・コリK-12株のゲノム配列は既に決定されており、遺伝子情報も自由に利用出来る。エシェリヒア・コリK-12株や、誘導株を入手するには、例えばアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ATCC）より分譲を受けることができる（住所ATCC, Address: P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, United States of America）。
【００１３】
特に、パントエア属細菌、エルビニア属細菌、エンテロバクター属細菌は、γ−プロテオバクテリアに分類される細菌であり、分類学的に非常に近縁である（J. Gen. Appl. Microbiol. 1997, 43: 355-361; Int. J. Syst. Bacteriol. 1997, 47: 1061-1067）。近年、DNA-DNAハイブリダイゼーション実験等により、エンテロバクター属に属する細菌には、パントエア・アグロメランス（Pantoea agglomerans）又はパントエア・ディスパーサ(Pantoea dispersa)等に再分類されているものがある(Int. J. Syst. Bacteriol. 1989, 39: 337-345）。また、エルビニア属に属する細菌にはパントエア・アナナス（Pantoea ananas）、パントエア・スチューアルティに再分類されているものがある（Int. J. Syst. Bacteriol. 1993, 43: 162-173 参照）。
【００１４】
エンテロバクター属細菌としては、エンテロバクター・アグロメランス（Enterobacter
agglomerans）、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）等が挙げられる。具体的には、欧州特許出願公開952221号明細書に例示された菌株を使用することが出来る。エンテロバクター属の代表的な株として、エンテロバクター・アグロメランスATCC12287株が挙げられる。
【００１５】
パントエア属細菌の代表的な菌株として、パントエア・アナナティス、パントエア・スチューアルティ（Pantoea stewartii）パントエア・アグロメランス、パントエア・シトレア（Pantoea citrea）が挙げられる。具体的には、下記の菌株が挙げられる。
パントエア・アナナティスAJ13355株（FERM BP-6614）(欧州特許出願公開0952221号明細書)
パントエア・アナナティスAJ13356株（FERM BP-6615）(欧州特許出願公開0952221号明細書)
【００１６】
尚、これらの菌株は、欧州特許出願公開0952221号明細書にはエンテロバクター・アグロメランスとして記載されているが、現在では、上記のとおり、16S rRNAの塩基配列解析などにより、パントエア・アナナティスに再分類されている。
【００１７】
エルビニア属細菌としては、エルビニア・アミロボーラ、エルビニア・カロトボーラが挙げられ、クレブシエラ属細菌としては、クレブシエラ・プランティコーラが挙げられる。具体的には、下記の菌株が挙げられる。
エルビニア・アミロボーラ ATCC15580株
エルビニア・カロトボーラ ATCC15713株
クレブシエラ・プランティコーラAJ13399株（FERM BP-6600）(欧州特許出願公開955368
号明細書)
クレブシエラ・プランティコーラAJ13410株（FERM BP-6617）(欧州特許出願公開955368号明細書)
【００１８】
本発明において、Ｌ−アミノ酸生産能を有する細菌とは、培地に培養したときに、培地中又は菌体内に、細菌の野生株又は親株よりも多量のＬ−アミノ酸、例えば、好ましくは0.5 g/L以上、より好ましくは1.0g/L以上のＬ−アミノ酸を蓄積する細菌を意味する。細菌の野生株としては例えばエシェリヒア・コリK-12のようなエシェリヒア・コリが挙げられる。
【００１９】
Ｌ−アミノ酸の種類は特に制限されないが、Ｌ−リジン、Ｌ−オルニチン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−シトルリンのような塩基性アミノ酸、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−グリシンのような脂肪族アミノ酸、Ｌ−スレオニン、Ｌ−セリンのようなヒドロキシモノアミノカルボン酸であるアミノ酸、Ｌ−プロリンのような環式アミノ酸、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−トリプトファンのような芳香族アミノ酸、Ｌ−システイン、Ｌ−シスチン、Ｌ−メチオニンのような含硫アミノ酸、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アスパラギン等のような酸性アミノ酸が挙げられ、特にＬ−リジン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファンが好ましく、Ｌ−リジンが最もが好ましい。本発明の細菌は２種類以上のアミノ酸の生産能を有するものであってもよい。
【００２０】
以下、前記のような細菌にＬ−アミノ酸生産能を付与する方法、又は前記のような細菌のＬ−アミノ酸生産能を増強する方法について述べる。
Ｌ−アミノ酸生産能を付与するには、栄養要求性変異株、Ｌ−アミノ酸のアナログ耐性株又は代謝制御変異株の取得や、Ｌ−アミノ酸の生合成系酵素の発現が増強された組換え株の創製等、従来、コリネ型細菌又はエシェリヒア属細菌等のアミノ酸生産菌の育種に採用されてきた方法を適用することができる（アミノ酸発酵、（株）学会出版センター、1986年５月30日初版発行、第７７〜１００頁参照）。ここで、Ｌ−アミノ酸生産菌の育種において、付与される栄養要求性、アナログ耐性、代謝制御変異等の性質は、単独でもよく、２種又は３種以上であってもよい。また、発現が増強されるＬ−アミノ酸生合成系酵素も、単独であっても、２種又は３種以上であってもよい。さらに、栄養要求性、アナログ耐性、代謝制御変異等の性質の付与と、生合成系酵素の増強が組み合わされてもよい。
【００２１】
Ｌ−アミノ酸生産能を有する栄養要求性変異株、アナログ耐性株、又は代謝制御変異株を取得するには、親株又は野生株を通常の変異処理、すなわちＸ線や紫外線の照射、またはＮ−メチル−Ｎ'−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン等の変異剤処理などによって処理し、得られた変異株の中から、栄養要求性、アナログ耐性、又は代謝制御変異を示し、かつＬ−アミノ酸生産能を有するものを選択することによって得ることができる。
【００２２】
また、Ｌ−アミノ酸生産能の付与又は増強は、遺伝子組換えによって、酵素活性を増強することによっても行うことが出来る。酵素活性の増強は、例えば、Ｌ−アミノ酸の生合成に関与する酵素をコードする遺伝子の発現が増強するように細菌を改変する方法を挙げることができる。遺伝子の発現を増強するための方法としては、遺伝子を含むＤＮＡ断片を、適当なプラスミド、例えば微生物内でプラスミドの複製増殖機能を司る遺伝子を少なくとも含むプラスミドベクターに導入した増幅プラスミドを導入すること、または、これらの遺伝子を染色体上で接合、転移等により多コピー化すること、またこれらの遺伝子のプロモーター領域に変異を導入することにより達成することもできる（国際公開パンフレットWO95/34672号参照）。
【００２３】
上記増幅プラスミドまたは染色体上に目的遺伝子を導入する場合、これらの遺伝子を発
現させるためのプロモーターはコリネ型細菌において機能するものであればいかなるプロモーターであっても良く、用いる遺伝子自身のプロモーターであってもよいし、改変したものでもよい。コリネ型細菌で強力に機能するプロモーターを適宜選択することや、プロモーターの−35、−10領域をコンセンサス配列に近づけることによっても遺伝子の発現量の調節が可能である。以上のような、酵素遺伝子の発現を増強する方法は、WO00/18935号パンフレット、欧州特許出願公開1010755号明細書等に記載されている。
【００２４】
以下、細菌にＬ−アミノ酸生産能を付与する方法、及びＬ−アミノ酸生産能が付与された細菌について例示する。
【００２５】
Ｌ−スレオニン生産菌
Ｌ−スレオニン生産能を有する微生物として好ましいものは、Ｌ−スレオニン生合成系酵素の１種又は２種以上の活性が増強された細菌が挙げられる。Ｌ−スレオニン生合成系酵素としては、アスパルトキナーゼIII（lysC）、アスパルテートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（asd）、thrオペロンにコードされるアスパルトキナーゼI（thrA）、ホモセリンキナーゼ（thrB）、スレオニンシンターゼ（thrC）、アスパルテートアミノトランスフェラーゼ（アスパルテートトランスアミナーゼ）(aspC)が挙げられる。カッコ内は、その遺伝子の略記号である（以下の記載においても同様）。これらの酵素の中では、アスパルテートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、アスパルトキナーゼI、ホモセリンキナーゼ、アスパルテートアミノトランスフェラーゼ、及びスレオニンシンターゼが特に好ましい。Ｌ−スレオニン生合成系遺伝子は、スレオニン分解が抑制されたエシェリヒア属細菌に導入してもよい。スレオニン分解が抑制されたエシェリヒア属細菌としては、例えば、スレオニンデヒドロゲナーゼ活性が欠損したTDH6株（特開2001−346578号）等が挙げられる。
【００２６】
Ｌ−スレオニン生合成系酵素は、最終産物のＬ−スレオニンによって酵素活性が抑制される。従って、Ｌ−スレオニン生産菌を構築するためには、Ｌ−スレオニンによるフィードバック阻害を受けないようにＬ−スレオニン生合成系遺伝子を改変することが望ましい。また、上記thrA、thrB、thrC遺伝子は、スレオニンオペロンを構成しているが、スレオニンオペロンは、アテニュエーター構造を形成しており、スレオニンオペロンの発現は、培養液中のイソロイシン、スレオニンに阻害を受け、アテニュエーションにより発現が抑制される。この改変は、アテニュエーション領域のリーダー配列あるいは、アテニュエーターを除去することにより達成出来る。（Lynn, S. P., Burton, W. S., Donohue, T. J., Gould, R. M., Gumport, R. I., and Gardner, J. F. J. Mol. Biol. 194:59-69 (1987); 国際公開第02/26993号パンフレット; 国際公開第2005/049808号パンフレット参照）
【００２７】
スレオニンオペロンの上流には、固有のプロモーターが存在するが、非天然のプロモーターに置換してもよいし（WO98/04715号パンフレット参照）、スレオニン生合成関与遺伝子の発現がラムダファ−ジのリプレッサーおよびプロモーターにより支配されるようなスレオニンオペロンを構築してもよい。（欧州特許第0593792号明細書参照）また、Ｌ−スレオニンによるフィードバック阻害を受けないように細菌を改変するために、α-amino-β-hydroxyvaleric acid （AHV）に耐性な菌株を選抜することも可能である。
【００２８】
このようにＬ−スレオニンによるフィ−ドバック阻害を受けないように改変されたスレオニンオペロンは、宿主内でコピー数が上昇しているか、あるいは強力なプロモーターに連結し、発現量が向上していることが好ましい。コピー数の上昇は、プラスミドによる増幅の他、トランスポゾン、Mu−ファ−ジ等でゲノム上にスレオニンオペロンを転移させることによっても達成出来る。
【００２９】
Ｌ−スレオニン生合成系酵素以外にも、解糖系、TCA回路、呼吸鎖に関する遺伝子や遺
伝子の発現を制御する遺伝子、糖の取り込み遺伝子を強化することも好適である。これらのＬ−スレオニン生産に効果がある遺伝子としては、トランスヒドロナーゼ（pntAB）遺伝子（欧州特許733712号明細書）、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子（pepC）(国際公開95/06114号パンフレット)、ホスホエノールピルビン酸シンターゼ遺伝子（pps）(欧州特許877090号明細書)、コリネ型細菌あるいはバチルス属細菌のピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子（国際公開99/18228号パンフレット、欧州出願公開1092776号明細書）が挙げられる。
【００３０】
また、Ｌ−スレオニンに耐性を付与する遺伝子、Ｌ−ホモセリンに耐性を付与する遺伝子の発現を強化することや、宿主にＬ−スレオニン耐性、Ｌ−ホモセリン耐性を付与することも好適である。耐性を付与する遺伝子としては、rhtA遺伝子(Res. Microbiol. 154:123−135 (2003))、rhtB遺伝子（欧州特許出願公開第0994190号明細書）、rhtC遺伝子（欧州特許出願公開第1013765号明細書）、yfiK、yeaS遺伝子（欧州特許出願公開第1016710号明細書）が挙げられる。また宿主にＬ−スレオニン耐性を付与する方法は、欧州特許出願公開第0994190号明細書や、国際公開第90/04636号パンフレット記載の方法を参照出来る。
【００３１】
Ｌ−スレオニン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、E. coli TDH-6/pVIC40 (VKPM B-3996) (米国特許第5,175,107号、米国特許第5,705,371号)、E. coli 472T23/pYN7 (ATCC 98081) (米国特許第5,631,157号)、E. coli NRRL-21593 (米国特許第5,939,307号)、E. coli FERM BP-3756 (米国特許第5,474,918号)、E. coli FERM BP-3519及びFERM BP-3520 (米国特許第5,376,538号)、E. coli MG442 (Gusyatiner et al., Genetika (in Russian), 14, 947-956 (1978))、E. coli VL643及びVL2055 (EP 1149911 A)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３２】
TDH-6株はthrC遺伝子を欠損し、スクロース資化性であり、また、そのilvA遺伝子がリーキー(leaky)変異を有する。この株はまた、rhtA遺伝子に、高濃度のスレオニンまたはホモセリンに対する耐性を付与する変異を有する。B-3996株は、RSF1010由来ベクターに、変異thrA遺伝子を含むthrA*BCオペロンを挿入したプラスミドpVIC40を保持する。この変異thrA遺伝子は、スレオニンによるフィードバック阻害が実質的に解除されたアスパルトキナーゼホモセリンデヒドロゲナーゼＩをコードする。B-3996株は、1987年11月19日、オールユニオン・サイエンティフィック・センター・オブ・アンチビオティクス(Nagatinskaya Street 3-A, 117105 Moscow, Russia)に、受託番号RIA 1867で寄託されている。この株は、また、1987年4月7日、ルシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオルガニズムズ(VKPM) (1 Dorozhny proezd., 1 Moscow 117545, Russia) に、受託番号B-3996で寄託されている。
【００３３】
E. coli VKPM B-5318 (EP 0593792B)も、Ｌ−スレオニン生産菌又はそれを誘導するための親株として使用できる。B-5318株は、イソロイシン非要求性であり、プラスミドpVIC40中のスレオニンオペロンの制御領域が、温度感受性ラムダファージC1リプレッサー及びPRプロモーターにより置換されている。VKPM B-5318は、1990年5月3日、ルシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオルガニズムズ(VKPM) (1 Dorozhny proezd., 1 Moscow 117545, Russia)に、受託番号VKPM B-5318で国際寄託されている。
【００３４】
Escherichia coliのアスパルトキナーゼホモセリンデヒドロゲナーゼＩをコードするthrA遺伝子は明らかにされている(ヌクレオチド番号337〜2799, GenBank accession NC_000913.2, gi: 49175990)。thrA遺伝子は、E. coli K-12の染色体において、thrL遺伝子とthrB遺伝子との間に位置する。Escherichia coliのホモセリンキナーゼをコードするthrB遺伝子は明らかにされている(ヌクレオチド番号2801〜3733, GenBank accession NC_000913
.2, gi: 49175990)。thrB遺伝子は、E. coli K-12の染色体において、thrA遺伝子とthrC遺伝子との間に位置する。Escherichia coliのスレオニンシンターゼをコードするthrC遺伝子は明らかにされている(ヌクレオチド番号3734〜5020, GenBank accession NC_000913.2, gi: 49175990)。thrC遺伝子は、E. coli K-12の染色体において、thrB遺伝子とyaaXオープンリーディングフレームとの間に位置する。これら三つの遺伝子は、全て、単一のスレオニンオペロンとして機能する。スレオニンオペロンの発現を増大させるには、転写に影響するアテニュエーター領域を、好ましくは、オペロンから除去する(WO2005/049808, WO2003/097839)。
【００３５】
スレオニンによるフィードバック阻害に耐性のアスパルトキナーゼホモセリンデヒドロゲナーゼＩをコードする変異thrA遺伝子、ならびに、thrB遺伝子及びthrC遺伝子は、スレオニン生産株E. coli VKPM B-3996に存在する周知のプラスミドpVIC40から一つのオペロンとして取得できる。プラスミドpVIC40の詳細は、米国特許第5,705,371号に記載されている。
【００３６】
rhtA遺伝子は、グルタミン輸送系の要素をコードするglnHPQ オペロンに近いE. coli染色体の18分に存在する。rhtA遺伝子は、ORF1 (ybiF遺伝子, ヌクレオチド番号764〜1651,
GenBank accession number AAA218541, gi:440181)と同一であり、pexB遺伝子とompX遺伝子との間に位置する。ORF1によりコードされるタンパク質を発現するユニットは、rhtA遺伝子と呼ばれている(rht: ホモセリン及びスレオニンに耐性)。また、rhtA23変異が、ATG開始コドンに対して-1位のG→A置換であることが判明している(ABSTRACTS of the 17th
International Congress of Biochemistry and Molecular Biology in conjugation with Annual Meeting of the American Society for Biochemistry and Molecular Biology,
San Francisco, California August 24-29, 1997, abstract No. 457, EP 1013765 A)。
【００３７】
E. coliのasd遺伝子は既に明らかにされており(ヌクレオチド番号3572511〜3571408, GenBank accession NC_000913.1, gi:16131307)、その遺伝子の塩基配列に基づいて作製されたプライマーを用いるPCRにより得ることができる(White, T.J. et al., Trends Genet., 5, 185 (1989)参照)。他の微生物のasd遺伝子も同様に得ることができる。
【００３８】
また、E. coliのaspC遺伝子も既に明らかにされており(ヌクレオチド番号983742〜984932, GenBank accession NC_000913.1, gi:16128895)、PCRにより得ることができる。他の微生物のaspC遺伝子も同様に得ることができる。
【００３９】
Ｌ−リジン生産菌
エシェリヒア属に属するＬ−リジン生産菌の例としては、Ｌ−リジンアナログに耐性を有する変異株が挙げられる。Ｌ−リジンアナログはエシェリヒア属に属する細菌の生育を阻害するが、この阻害は、Ｌ−リジンが培地に共存するときには完全にまたは部分的に解除される。Ｌ−リジンアナログの例としては、オキサリジン、リジンヒドロキサメート、Ｓ−（２−アミノエチル）−Ｌ−システイン(AEC)、γ−メチルリジン、α−クロロカプロラクタムなどが挙げられるが、これらに限定されない。これらのリジンアナログに対して耐性を有する変異株は、エシェリヒア属に属する細菌を通常の人工変異処理に付すことによって得ることができる。Ｌ−リジンの生産に有用な細菌株の具体例としては、Escherichia coli AJ11442 (FERM BP-1543, NRRL B-12185; 米国特許第4,346,170号参照)及びEscherichia coli VL611が挙げられる。これらの微生物では、アスパルトキナーゼのＬ−リジンによるフィードバック阻害が解除されている。
【００４０】
WC196株は、Escherichia coliのＬ−リジン生産菌として使用できる。この菌株は、Escherichia coli K-12に由来するW3110株にAEC耐性を付与することにより育種された。同株は、Escherichia coli AJ13069と命名され、1994年12月6日、工業技術院生命工学工業技
術研究所（現 独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター、〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に受託番号FERM P-14690として寄託され、1995年9月29日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-5252が付与されている(米国特許第5,827,698号)。
【００４１】
Ｌ−リジン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、Ｌ−リジン生合成系酵素の１種又は２種以上の活性が増強されている株も挙げられる。かかる酵素の例としては、ジヒドロジピコリン酸シンターゼ(dapA)、アスパルトキナーゼ(lysC)、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ(dapB)、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ(lysA)、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ(ddh) (米国特許第6,040,160号)、フォスフォエノールピルビン酸カルボキシラーゼ(ppc)、アスパルテートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子、ジアミノピメリン酸エピメラーゼ(dapF)、テトラヒドロジピコリン酸スクシニラーゼ(dapD)、スクシニルジアミノピメリン酸デアシラーゼ(dapE)及びアスパルターゼ(aspA) (EP 1253195 A)が挙げられるが、これらに限定されない。これらの酵素の中では、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ、フォスフォエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、アスパルテートアミノトランスフェラーゼ、ジアミノピメリン酸エピメラーゼ、アスパルテートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、テトラヒドロジピコリン酸スクシニラーゼ、及び、スクシニルジアミノピメリン酸デアシラーゼが特に好ましい。また、親株は、エネルギー効率に関与する遺伝子(cyo) (EP 1170376 A)、ニコチンアミドヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼをコードする遺伝子(pntAB) (米国特許第5,830,716号)、ybjE遺伝子(WO2005/073390)、または、これらの組み合わせの発現レベルが増大していてもよい。
【００４２】
Ｌ−リジン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、Ｌ−リジンの生合成経路から分岐してＬ−リジン以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素の活性が低下または欠損している株も挙げられる。Ｌ−リジンの生合成経路から分岐してＬ−リジン以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素の例としては、ホモセリンデヒドロゲナーゼ、リジンデカルボキシラーゼ(米国特許第5,827,698号)、及び、リンゴ酸酵素(WO2005/010175)が挙げられる。
【００４３】
好ましいＬ−リジン生産菌として、エシェリヒア・コリWC196ΔcadAΔldc/pCABD2が挙げられる（WO2006/078039）。この菌株は、リジンデカルボキシラーゼをコードするcadA及びldcC遺伝子が破壊されたWC196株に、米国特許第6040160に記載されたプラスミドpCABD2が導入することにより得られた株である。WC196ΔcadAΔldc自体も、好ましいＬ−リジン生産菌である。pCABD2は、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害が解除された変異を有するエシェリヒア・コリ由来のジヒドロジピコリン酸合成酵素（DDPS）をコードする変異型dapA遺伝子と、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害が解除された変異を有するエシェリヒア・コリ由来のアスパルトキナーゼIIIをコードする変異型lysC遺伝子と、エシェリヒア・コリ由来のジヒドロジピコリン酸レダクターゼをコードするdapB遺伝子と、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム由来ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼをコードするddh遺伝子を含んでいる。このプラスミドを持つエシェリヒア・コリW3110(tyrA)/pCABD2は、AJ12604と命名され、1991年1月28日に独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（住所 〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）にFERM P-11975の受託番号で寄託され、1991年9月26日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管されて、FERM BP-3579の受託番号で寄託されている。
【００４４】
Ｌ−システイン生産菌
Ｌ−システイン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、フィードバック阻害耐性のセリンアセチルトランスフェラーゼをコードする異なるcysEアレルで形質転換されたE. coli JM15(米国特許第6,218,168号、ロシア特許出願第2003121601号)、細胞に毒
性の物質を排出するのに適したタンパク質をコードする過剰発現遺伝子を有するE. coli W3110 (米国特許第5,972,663号)、システインデスルフォヒドラーゼ活性が低下したE. coli株 (JP11155571A2)、cysB遺伝子によりコードされる正のシステインレギュロンの転写制御因子の活性が上昇したE. coli W3110 (WO0127307A1)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４５】
Ｌ−ロイシン生産菌
Ｌ−ロイシン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、ロイシン耐性のE. coil株 (例えば、57株 (VKPM B-7386, 米国特許第6,124,121号))またはβ−２−チエニルアラニン、３−ヒドロキシロイシン、４−アザロイシン、5,5,5-トリフルオロロイシンなどのロイシンアナログ耐性のE.coli株(特公昭62-34397号及び特開平8-70879号)、WO96/06926に記載された遺伝子工学的方法で得られたE. coli株、E. coli H-9068 (特開平8-70879号)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４６】
本発明に用いる細菌は、Ｌ−ロイシン生合成に関与する遺伝子の１種以上の発現が増大されることにより改良されていてもよい。このような遺伝子の例としては、好ましくはＬ−ロイシンによるフィードバック阻害が解除されたイソプロピルマレートシンターゼをコードする変異leuA遺伝子(米国特許第6,403,342号)に代表される、leuABCDオペロンの遺伝子が挙げられる。さらに、本発明に用いる細菌は、細菌の細胞からＬ−アミノ酸を排出するタンパク質をコードする遺伝子の１種以上の発現が増大されることにより改良されていてもよい。このような遺伝子の例としては、b2682遺伝子及びb2683遺伝子(ygaZH遺伝子) (EP 1239041 A2)が挙げられる。
【００４７】
Ｌ−ヒスチジン生産菌
Ｌ−ヒスチジン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、E. coli 24株 (VKPM B-5945, RU2003677)、E. coli 80株 (VKPM B-7270, RU2119536)、E. coli NRRL B-12116 - B12121 (米国特許第4,388,405号)、E. coli H-9342 (FERM BP-6675)及びH-9343 (FERM BP-6676) (米国特許第6,344,347号)、E. coli H-9341 (FERM BP-6674) (EP1085087)、E. coli AI80/pFM201 (米国特許第6,258,554号)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４８】
Ｌ−ヒスチジン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、Ｌ−ヒスチジン生合成系酵素をコードする遺伝子の１種以上の発現が増大した株も挙げられる。かかる遺伝子の例としては、ATPフォスフォリボシルトランスフェラーゼ遺伝子(hisG)、フォスフォリボシルAMPサイクロヒドロラーゼ遺伝子(hisI)、フォスフォリボシル-ATPピロフォスフォヒドロラーゼ遺伝子(hisI)、フォスフォリボシルフォルミミノ-5-アミノイミダゾールカルボキサミドリボタイドイソメラーゼ遺伝子(hisA)、アミドトランスフェラーゼ遺伝子(hisH)、ヒスチジノールフォスフェイトアミノトランスフェラーゼ遺伝子(hisC)、ヒスチジノールフォスファターゼ遺伝子(hisB)、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ遺伝子(hisD)などが挙げられる。
【００４９】
hisG及びhisBHAFIにコードされるＬ−ヒスチジン生合成系酵素はＬ−ヒスチジンにより阻害されることが知られており、従って、Ｌ−ヒスチジン生産能は、ATPフォスフォリボシルトランスフェラーゼ遺伝子(hisG)にフィードバック阻害への耐性を付与する変異を導入することにより効率的に増大させることができる(ロシア特許第2003677号及び第2119536号)。
【００５０】
Ｌ−ヒスチジン生産能を有する株の具体例としては、Ｌ−ヒスチジン生合成系酵素をコードするDNAを保持するベクターを導入したE. coli FERM-P 5038及び5048 (特開昭56-005099号)、アミノ酸輸送の遺伝子を導入したE.coli株(EP1016710A)、スルファグアニジン、
DL-1,2,4-トリアゾール-3-アラニン及びストレプトマイシンに対する耐性を付与したE. coli 80株(VKPM B-7270, ロシア特許第2119536号)などが挙げられる。
【００５１】
Ｌ−グルタミン酸生産菌
Ｌ−グルタミン酸生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、E. coli VL334thrC+ (EP 1172433)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。E. coli VL334 (VKPM B-1641)は、thrC遺伝子及びilvA遺伝子に変異を有するＬ−イソロイシン及びＬ−スレオニン要求性株である(米国特許第4,278,765号)。thrC遺伝子の野生型アレルは、野生型E. coli K12株 (VKPM B-7)の細胞で増殖したバクテリオファージP1を用いる一般的形質導入法により導入された。この結果、Ｌ−イソロイシン要求性のＬ−グルタミン酸生産菌VL334thrC+ (VKPM B-8961) が得られた。
【００５２】
Ｌ−グルタミン酸生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、Ｌ−グルタミン酸生合成系酵素１種又は２種以上の活性が増強された株が挙げられるが、これらに限定されない。かかる遺伝子の例としては、グルタメートデヒドロゲナーゼ（gdhA）、グルタミンシンテターゼ(glnA)、グルタメートシンテターゼ(gltAB)、イソシトレートデヒドロゲナーゼ(icdA)、アコニテートヒドラターゼ(acnA, acnB)、クエン酸シンターゼ(gltA)、メチルクエン酸シンターゼ（prpC）、フォスフォエノールピルベートカルボシラーゼ(ppc)、ピルベートデヒドロゲナーゼ(aceEF, lpdA)、ピルベートキナーゼ(pykA, pykF)、フォスフォエノールピルベートシンターゼ(ppsA)、エノラーゼ(eno)、フォスフォグリセロムターゼ(pgmA, pgmI)、フォスフォグリセレートキナーゼ(pgk)、グリセルアルデヒド-3-フォスフェートデヒドロゲナーゼ(gapA)、トリオースフォスフェートイソメラーゼ(tpiA)、フルクトースビスフォスフェートアルドラーゼ(fbp)、フォスフォフルクトキナーゼ（pfkA, pfkB）、グルコースフォスフェートイソメラーゼ(pgi)などが挙げられる。これらの酵素の中では、グルタメートデヒドロゲナーゼ、クエン酸シンターゼ、フォスフォエノールピルベートカルボキシラーゼ、及びメチルクエン酸シンターゼが好ましい。
【００５３】
シトレートシンテターゼ遺伝子、フォスフォエノールピルベートカルボキシラーゼ遺伝子、及び／またはグルタメートデヒドロゲナーゼ遺伝子の発現が増大するように改変された株の例としては、EP1078989A、EP955368A及びEP952221Aに開示されたものが挙げられる。
【００５４】
Ｌ−グルタミン酸生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、Ｌ−グルタミン酸の生合成経路から分岐してＬ−グルタミン酸以外の化合物の合成を触媒する酵素の活性が低下または欠損している株も挙げられる。このような酵素の例としては、イソシトレートリアーゼ(aceA)、α-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ(sucA)、フォスフォトランスアセチラーゼ(pta)、アセテートキナーゼ(ack)、アセトヒドロキシ酸シンターゼ(ilvG)、アセトラクテートシンターゼ(ilvI)、フォルメートアセチルトランスフェラーゼ(pfl)、ラクテートデヒドロゲナーゼ(ldh)、グルタメートデカルボキシラーゼ(gadAB)などが挙げられる。α-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ活性が欠損した、または、α-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ活性が低下したエシェリヒア属に属する細菌、及び、それらの取得方法は米国特許第5,378,616 号及び第5,573,945号に記載されている。
【００５５】
具体例としては下記のものが挙げられる。
E. coli W3110sucA::Kmr
E. coli AJ12624 (FERM BP-3853)
E. coli AJ12628 (FERM BP-3854)
E. coli AJ12949 (FERM BP-4881)
【００５６】
E. coli W3110sucA::Kmr は、E. coli W3110のα-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ
遺伝子（以下、「sucA遺伝子」ともいう）を破壊することにより得られた株である。この株は、α-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼを完全に欠損している。
【００５７】
Ｌ−グルタミン酸生産菌の他の例としては、エシェリヒア属に属し、アスパラギン酸代謝拮抗物質に耐性を有するものが挙げられる。これらの株は、α-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼを欠損していてもよく、例えば、E. coli AJ13199 (FERM BP-5807) (米国特許第5.908,768号)、さらにＬ−グルタミン酸分解能が低下したFFRM P-12379(米国特許第5,393,671号); AJ13138 (FERM BP-5565) (米国特許第6,110,714号)などが挙げられる。
【００５８】
パントアエ・アナナティスのＬ−グルタミン酸生産菌の例としては、パントエア・アナナティスAJ13355株が挙げられる。同株は、静岡県磐田市の土壌から、低pHでＬ−グルタミン酸及び炭素源を含む培地で増殖できる株として分離された株である。パントエア・アナナティスAJ13355は、1998年2月19日に、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（住所 〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に、受託番号FERM P-16644として寄託され、1999年1月11日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-6614が付与されている。尚、同株は、分離された当時はエンテロバクター・アグロメランス（Enterobacter agglomerans）と同定され、エンテロバクター・アグロメランスAJ13355として寄託されたが、近年16S rRNAの塩基配列解析などにより、パントエア・アナナティス（Pantoea ananatis）に再分類されている。
【００５９】
また、パントアエ・アナナティスのＬ−グルタミン酸生産菌として、α-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ（αKGDH）活性が欠損した、または、αKGDH活性が低下したパントエア属に属する細菌が挙げられる。このような株としては、AJ13355株のαKGDH-E1サブユニット遺伝子（sucA）を欠損させたAJ13356(米国特許第6,331,419号)、及びAJ13355株から粘液質低生産変異株として選択されたSC17株由来のsucA遺伝子欠損株であるSC17sucA(米国特許第6,596,517号)がある。AJ13356は、1998年2月19日、工業技術院生命工学工業技術研究所（現 独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター、〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に受託番号FERM P-16645として寄託され、1999年1月11日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-6616が付与されている。AJ13355及びAJ13356は、上記寄託機関にEnterobacter agglomeransとして寄託されているが、本明細書では、Pantoea ananatisとして記載する。また、SC17sucA株は、ブライベートナンバーAJ417株が付与され、2004年2月26日に産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号FERM BP-08646として寄託されている。
【００６０】
さらに、パントアエ・アナナティスのＬ−グルタミン酸生産菌として、SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB株、AJ13601株、NP106株、及びNA1株が挙げられる。SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB株は、SC17sucA株に、エシェリヒア・コリ由来のクエン酸シンターゼ遺伝子（gltA）、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子（ppsA）、およびグルタメートデヒドロゲナーゼ遺伝子（gdhA）を含むプラスミドRSFCPG、並びに、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム由来のクエン酸シンターゼ遺伝子（gltA）を含むプラスミドpSTVCBを導入して得た株である。AJ13601株は、このSC17sucA/RSFCPG+pSTVCB株から低pH下で高濃度のＬ−グルタミン酸に耐性を示す株として選択された株である。また、NP106株は、AJ13601株からプラスミドRSFCPG+pSTVCBを脱落させた株である。AJ13601株は、1999年8月18日に、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に受託番号FERM P-17516として寄託され、2000年7月6日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-7207が付与されている。
【００６１】
Ｌ−フェニルアラニン生産菌
Ｌ−フェニルアラニン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、コリスミ酸
ムターゼ−プレフェン酸デヒドロゲナーゼ及びチロシンリプレッサーを欠損したE.coli AJ12739 (tyrA::Tn10, tyrR) (VKPM B-8197)(WO03/044191)、フィードバック阻害が解除されたコリスミ酸ムターゼ−プレフェン酸デヒドラターゼをコードする変異型pheA34遺伝子を保持するE.coli HW1089 (ATCC 55371) (米国特許第 5,354,672号)、E.coli MWEC101-b (KR8903681)、E.coli NRRL B-12141, NRRL B-12145, NRRL B-12146及びNRRL B-12147 (米国特許第4,407,952号)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。また、親株として、フィードバック阻害が解除されたコリスミ酸ムターゼ−プレフェン酸デヒドラターゼをコードする遺伝子を保持するE. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHAB] (FERM BP-3566)、E. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHAD] (FERM BP-12659)、E. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHATerm] (FERM BP-12662)及びAJ 12604と命名されたE. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pBR-aroG4, pACMAB] (FERM BP-3579)も使用できる(EP 488424 B1)。さらに、yedA遺伝子またはyddG遺伝子にコードされるタンパク質の活性が増大したエシェリヒア属に属するＬ−フェニルアラニン生産菌も使用できる(米国特許出願公開2003/0148473 A1及び2003/0157667 A1、WO03/044192)。
【００６２】
Ｌ−トリプトファン生産菌
Ｌ−トリプトファン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、変異trpS遺伝子によりコードされるトリプトファニル-tRNAシンテターゼが欠損したE. coli JP4735/pMU3028 (DSM10122)及びJP6015/pMU91 (DSM10123) (米国特許第5,756,345号)、セリンによるフィードバック阻害を受けないフォスフォグリセレートデヒドロゲナーゼをコードするserAアレル及びトリプトファンによるフィードバック阻害を受けないアントラニレートシンターゼをコードするtrpEアレルを有するE. coli SV164 (pGH5) (米国特許第6,180,373号)、トリプトファナーゼが欠損したE. coli AGX17 (pGX44) (NRRL B-12263)及びAGX6(pGX50)aroP (NRRL B-12264) (米国特許第4,371,614号)、フォスフォエノールピルビン酸生産能が増大したE. coli AGX17/pGX50,pACKG4-pps (WO9708333, 米国特許第6,319,696号)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。yedA遺伝子またはyddG遺伝子にコードされるタンパク質の活性が増大したエシェリヒア属に属するＬ−トリプトファン生産菌も使用できる(米国特許出願公開2003/0148473 A1及び2003/0157667
A1)。
【００６３】
Ｌ−トリプトファン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、アントラニレートシンターゼ(trpE)、フォスフォグリセレートデヒドロゲナーゼ(serA)、３−デオキシ−Ｄ−アラビノヘプツロン酸−７−リン酸シンターゼ(aroG)、３−デヒドロキネートシンターゼ(aroB)、シキミ酸デヒドロゲナーゼ(aroE)、シキミ酸キナーゼ(aroL)、５−エノール酸ピルビルシキミ酸３−リン酸シンターゼ(aroA)、コリスミ酸シンターゼ(aroC)、プレフェン酸デヒドラターゼ、コリスミ酸ムターゼ及び、トリプトファンシンターゼ(trpAB)から選ばれる１種又は２種以上の酵素の活性が増強された株も挙げられる。プレフェン酸デヒドラターゼ及びコリスミ酸ムターゼは、２機能酵素（CM-PD）としてpheA遺伝子によってコードされている。これらの酵素の中では、フォスフォグリセレートデヒドロゲナーゼ、３−デオキシ−Ｄ−アラビノヘプツロン酸−７−リン酸シンターゼ、３−デヒドロキネートシンターゼ、シキミ酸デヒドラターゼ、シキミ酸キナーゼ、５−エノール酸ピルビルシキミ酸３−リン酸シンターゼ、コリスミ酸シンターゼ、プレフェン酸デヒドラターゼ、コリスミン酸ムターゼ−プレフェン酸デヒドロゲナーゼが特に好ましい。アントラニレートシンターゼ及びフォスフォグリセレートデヒドロゲナーゼは共にＬ−トリプトファン及びＬ−セリンによるフィードバック阻害を受けるので、フィードバック阻害を解除する変異をこれらの酵素に導入してもよい。このような変異を有する株の具体例としては、脱感作型アントラニレートシンターゼを保持するE. coli SV164、及び、フィードバック阻害が解除されたフォスフォグリセレートデヒドロゲナーゼをコードする変異serA遺伝子を含むプラスミドpGH5 (WO 94/08031)をE. coli SV164に導入することにより得られた形質転換株が挙げられる。
【００６４】
Ｌ−トリプトファン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、阻害解除型アントラニレートシンターゼをコードする遺伝子を含むトリプトファンオペロンが導入された株(特開昭57-71397号, 特開昭62-244382号, 米国特許第4,371,614号)も挙げられる。さらに、トリプトファンオペロン(trpBA)中のトリプトファンシンターゼをコードする遺伝子の発現を増大させることによりＬ−トリプトファン生産能を付与してもよい。トリプトファンシンターゼは、それぞれtrpA及びtrpB遺伝子によりコードされるα及びβサブユニットからなる。さらに、イソシトレートリアーゼ-マレートシンターゼオペロンの発現を増大させることによりＬ−トリプトファン生産能を改良してもよい(WO2005/103275)。
【００６５】
Ｌ−プロリン生産菌
Ｌ−プロリン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、ilvA遺伝子が欠損し、Ｌ−プロリンを生産できるE. coli 702ilvA (VKPM B-8012) (EP 1172433)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６６】
本発明に用いる細菌は、Ｌ−プロリン生合成に関与する遺伝子の一種以上の発現を増大することにより改良してもよい。Ｌ−プロリン生産菌に好ましい遺伝子の例としては、Ｌ−プロリンによるフィードバック阻害が解除されたグルタメートキナーゼをコードするproB遺伝子(ドイツ特許第3127361号)が挙げられる。さらに、本発明に用いる細菌は、細菌の細胞からＬ−アミノ酸を排出するタンパク質をコードする遺伝子の一種以上の発現が増大することにより改良してもよい。このような遺伝子としては、b2682 遺伝子及びb2683遺伝子(ygaZH遺伝子) (EP1239041 A2)が挙げられる。
【００６７】
Ｌ−プロリン生産能を有するエシェリヒア属に属する細菌の例としては、NRRL B-12403及びNRRL B-12404 (英国特許第2075056号)、VKPM B-8012 (ロシア特許出願2000124295)、ドイツ特許第3127361号に記載のプラスミド変異体、Bloom F.R. et al (The 15th Miami winter symposium, 1983, p.34)に記載のプラスミド変異体などのE. coli 株が挙げられる。
【００６８】
Ｌ−アルギニン生産菌
Ｌ−アルギニン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、E. coli 237株 (VKPM B-7925) (米国特許出願公開2002/058315 A1)、及び、変異N-アセチルグルタメートシンターゼを保持するその誘導株(ロシア特許出願第2001112869号)、E. coli 382株 (VKPM B-7926) (EP1170358A1)、N-アセチルグルタメートシンテターゼをコードするargA遺伝子が導入されたアルギニン生産株(EP1170361A1)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６９】
Ｌ−アルギニン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、Ｌ−アルギニン生合成系酵素をコードする遺伝子の１種以上の発現が増大した株も挙げられる。かかる遺伝子の例としては、N-アセチルグルタミルフォスフェートレダクターゼ遺伝子(argC)、オルニチンアセチルトランスフェラーゼ遺伝子(argJ)、N-アセチルグルタメートキナーゼ遺伝子(argB)、アセチルオルニチントランスアミナーゼ遺伝子(argD)、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ遺伝子(argF)、アルギノコハク酸シンテターゼ遺伝子(argG)、アルギノコハク酸リアーゼ遺伝子(argH)、カルバモイルフォスフェートシンテターゼ遺伝子(carAB)が挙げられる。
【００７０】
Ｌ−バリン生産菌
Ｌ−バリン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、ilvGMEDAオペロンを過剰発現するように改変された株(米国特許第5,998,178号)が挙げられるが、これらに限定されない。アテニュエーションに必要なilvGMEDAオペロンの領域を除去し、生産されるＬ
−バリンによりオペロンの発現が減衰しないようにすることが好ましい。さらに、オペロンのilvA遺伝子が破壊され、スレオニンデアミナーゼ活性が減少することが好ましい。
【００７１】
Ｌ−バリン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、アミノアシルt-RNAシンテターゼの変異を有する変異株(米国特許第5,658,766号)も挙げられる。例えば、イソロイシンtRNAシンテターゼをコードするileS 遺伝子に変異を有するE. coli VL1970が使用できる。E. coli VL1970は、1988年6月24日、ルシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオルガニズムズ(VKPM) (1 Dorozhny proezd., 1 Moscow 117545, Russia)に、受託番号VKPM B-4411で寄託されている。
【００７２】
さらに、生育にリポ酸を要求する、及び／または、H+-ATPaseを欠失している変異株(WO96/06926)を親株として用いることができる。
【００７３】
Ｌ−イソロイシン生産菌
Ｌ−イソロイシン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、６−ジメチルアミノプリンに耐性を有する変異株(特開平5-304969号)、チアイソロイシン、イソロイシンヒドロキサメートなどのイソロイシンアナログに耐性を有する変異株、さらにDL-エチオニン及び／またはアルギニンヒドロキサメートに耐性を有する変異株(特開平5-130882号).が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、スレオニンデアミナーゼ、アセトヒドロキシ酸シンターゼなどのＬ−イソロイシン生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子で形質転換された組換え株もまた親株として使用できる(特開平2-458号, FR 0356739, 及び米国特許第5,998,178号)。
【００７４】
本発明の細菌は、上記のようなＬ−アミノ酸生産能を有し、かつ、ydcU、yfeK、smpA、htrG、adiC、htrA、ydhK、bacA、yaiW、及びyidQから選択される１又はそれ以上の遺伝子の発現が弱まるように改変されたものである。
【００７５】
本発明の細菌は、Ｌ−アミノ酸生産能を有する腸内細菌科に属する細菌を、遺伝子組換えによりydcU、yfeK、smpA、htrG、adiC、htrA、ydhK、bacA、yaiW、又はyidQ遺伝子の発現が弱まるように改変することにより得ることができる。なお、本発明の腸内細菌科に属する細菌の育種において、Ｌ−アミノ酸生産能の付与と上記各遺伝子の発現を弱める改変は、どちらを先に行ってもよい。
【００７６】
「ydcU、yfeK、smpA、htrG、adiC、htrA、ydhK、bacA、yaiW、又はyidQから選ばれる１又はそれ以上の遺伝子の発現が弱まるように改変された」とは、非改変株、例えば親株又は野生株に比べてydcU、yfeK、smpA、htrG、adiC、htrA、ydhK、bacA、yaiW、又はyidQの各遺伝子産物であるYdcU、YfeK、SmpA、HtrG、AdiC、HtrA、YdhK、BacA、YaiW、又はYidQの各タンパク質が正常に機能しないように改変したことを意味する。例えば、遺伝子組換えによりydcU遺伝子を改変することにより、親株、あるいは野生株に対して細胞あたりのYdcUタンパク質の分子の数が減少した場合、又はYdcUタンパク質分子が全く生成されなくなった場合、あるいはYdcUタンパク質の分子当たりの活性が低下又は喪失した場合等が含まれる。YdcUタンパク質分子の数は、ydcU遺伝子の転写量、又はydcU mRNAの翻訳量を低下させることにより減少させることができる。ydcU遺伝子以外の他の遺伝子についても同様である。比較対象となる野生株としては、エシェリヒア・コリK12株、パントエア・アナナティスAJ13355株、クレブシエラ・プランティコーラAJ13399株等が挙げられる。
【００７７】
また、ydcU、yfeK、smpA、htrG、adiC、htrA、ydhK、bacA、yaiW、又はyidQ遺伝子（以下、「標的遺伝子」ともいう）の不活化とは、改変された各々の遺伝子がコードする各々のタンパク質が完全に機能を失うことを意味する。
【００７８】
各標的遺伝子の改変は、具体的には、染色体上の各標的遺伝子コード領域の一部又は全部を欠損させたり、プロモーターやシャインダルガルノ（SD）配列等の発現調節配列を改変したりすることなどによって達成される。また、発現調節配列以外の非翻訳領域の改変によっても、遺伝子の発現量を低下させることができる。さらには、染色体上の標的遺伝子の前後の配列を含めて、標的遺伝子全体を欠失させてもよい。また、遺伝子組換えにより、染色体上の標的遺伝子のコード領域にアミノ酸置換（ミスセンス変異）を導入すること、また終始コドンを導入すること（ナンセンス変異）、あるいは一〜二塩基付加・欠失するフレームシフト変異を導入することによっても達成出来る（Journal of Biological Chemistry 272:8611-8617（1997） Proceedings of the National Academy of Sciences,USA 95 5511-5515(1998), Journal of Biological Chemistry 266, 20833-20839(1991)）。
【００７９】
各遺伝子の改変は、遺伝子組換えにより行われることが好ましい。遺伝子組換えによる方法として具体的には、相同組換えを利用して、染色体上の標的遺伝子の発現調節配列、例えばプロモーター領域、又はコード領域、もしくは非コード領域の一部又は全部を欠損させること、又はこれらの領域に他の配列を挿入することが挙げられる。
【００８０】
発現調節配列の改変は、好ましくは１塩基以上、より好ましくは２塩基以上、特に好ましくは３塩基以上である。また、コード領域を欠失させる場合は、各遺伝子が産生するタンパク質の機能が低下又は欠失するのであれば、欠失させる領域は、Ｎ末端領域、内部領域、Ｃ末端領域のいずれの領域であってもよく、コード領域全体であってよい。通常、欠失させる領域は長い方が確実に標的遺伝子を不活化することができる。また、欠失させる領域の上流と下流のリーディングフレームは一致しないことが好ましい。
【００８１】
コード領域に他の配列を挿入する場合も、挿入する位置は標的遺伝子のいずれに領域であってもよいが、挿入する配列は長い方が、確実に標的遺伝子を不活化することができる。挿入部位の前後の配列は、リーディングフレームが一致しないことが好ましい。他の配列としては、標的遺伝子がコードするタンパク質の機能を低下又は欠損させるものであれば特に制限されないが、例えば、抗生物質耐性遺伝子やＬ−グルタミン酸生産に有用な遺伝子を搭載したトランスポゾン等が挙げられる。
【００８２】
染色体上の標的遺伝子を上記のように改変するには、例えば、標的遺伝子の部分配列を欠失し、正常に機能するタンパク質を産生しないように改変した欠失型遺伝子を作製し、該遺伝子を含むＤＮＡで細菌を形質転換して、欠失型遺伝子と染色体上の標的遺伝子とで相同組換えを起こさせることにより、染色体上の標的遺伝子を欠失型遺伝子に置換することによって達成できる。欠失型標的遺伝子によってコードされるタンパク質は、生成したとしても、野生型タンパク質とは異なる立体構造を有し、機能が低下又は消失する。このような相同組換えを利用した遺伝子置換による遺伝子破壊は既に確立しており、「Redドリブンインテグレーション(Red-driven integration)」と呼ばれる方法（Datsenko, K. A, and Wanner, B. L. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 97:6640-6645 (2000)）、又は、Redドリブンインテグレーション法とλファージ由来の切り出しシステム（Cho, E. H., Gumport, R. I., Gardner, J. F. J. Bacteriol. 184: 5200-5203 (2002)）とを組合わせた方法（WO2005/010175号参照）等の直鎖状ＤＮＡを用いる方法や、温度感受性複製起点を含むプラスミド、接合伝達可能なプラスミドを用いる方法、宿主内で複製起点を持たないスイサイドベクターを利用する方法などがある（米国特許第6303383号明細書、または特開平05-007491号公報）。
【００８３】
標的遺伝子の転写量が低下したことの確認は、標的遺伝子から転写されるmRNAの量を野生株、あるいは非改変株と比較することによって行うことが出来る。mRNAの量を評価する方法としては、ノーザンハイブリダイゼーション、RT−PCR等が挙げられる（Molecular c
loning（Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor (USA), 2001））。転写量の低下は、野生株あるいは非改変株と比較して低下していれば、いずれでもよいが、例えば野生株、非改変株と比べて少なくとも75%以下、50％以下、25％以下、又は10％以下に低下していることが望ましく、全く発現していないことが特に好ましい。
【００８４】
標的遺伝子がコードするタンパク質の量が低下したことの確認は、同タンパク質に結合する抗体を用いてウェスタンブロットによって行うことが出来る（Molecular cloning（Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor (USA), 2001））。タンパク質量の低下は、野生株あるいは非改変株と比較して、低下していればいずれでもよいが、例えば野生株、非改変株と比べて、野生株あるいは非改変株と比べて少なくとも75%以下、50％以下、25％以下、又は10％以下以下に減少していることが望ましく、全くタンパク質を産生していない（完全に活性が消失している）ことが特に好ましい。
【００８５】
ydcU遺伝子がコードするタンパク質（YdcUタンパク質）は、ABCトランスポーターのコンポーネント、あるいは、スペルミジン／プトレシントランスポーターのサブユニットであると推測されている。「YdcUタンパク質の機能」とは、このような推定上のトランスポーターの一要素としての機能をいう。SmpAはsmall membrane protein A、HtrGはsignal transduction proterin(SH3)、AdiCはarginine:agmatine antiporter、HtrAは膜結合型セリンエンドプロテアーゼ（プロテアーゼDo）、YdhKはconserved inner membrane protein、BacAはウンデカプレニル−ジホスファターゼ、YaiWはpredicted DNA-binding transcriptional regulator（推定上のＤＮＡ結合型転写レギュレータ）、及びYidQ遺伝子はconserved outer membrane proteinであると推定されており、各々のタンパク質の機能とは、このような推定上の機能をいう。
【００８６】
各遺伝子がコードするタンパク質が正常に機能しないと、同タンパク質が正常に機能する菌株、例えば野生株において発現する遺伝子の発現が低下又は消失することが予想される。細胞内の各タンパク質の機能の低下の確認は、前述したような、各遺伝子から転写されるmRNAのサザンブロッティング等による検出、又は遺伝子産物のウェスタンブロンティング等による検出により行うことができる。
【００８７】
ここで、腸内細菌科のYdcUタンパク質としては、エシェリヒア・コリのydcU遺伝子（配列番号１）がコードするタンパク質（配列番号２）が挙げられる。YdcUタンパク質は、ABCトランスポーターのコンポーネント、あるいは、スペルミジン／プトレシントランスポーターのサブユニットをコードすると推測されている。
YfeKタンパク質としては、エシェリヒア・コリのyfeK遺伝子（GenBank Annotation NP_416914.1 GI:16130345、配列番号３）がコードするタンパク質（配列番号４）が挙げられる。
SmpAタンパク質としては、エシェリヒア・コリのsmpA遺伝子（GenBank NP_417107.2 GI:90111468、配列番号５）がコードするタンパク質（配列番号６）が挙げられる。SmpAタンパク質は、small membrane protein Aであると推定されている。
HtrGタンパク質としては、エシェリヒア・コリのhtrG遺伝子（GenBank Annotation NP_417527.1 GI:16130951、配列番号７）がコードするタンパク質（配列番号８）が挙げられる。HtrGは、膜結合型セリンエンドプロテアーゼ（プロテアーゼDo）であると推定されている。
AdiCタンパク質としては、エシェリヒア・コリのadiC遺伝子（yjdE、yjdD、yjdD12とも呼ばれる。GenBank Annotation NP_418539.1 GI:16131941、配列番号９）がコードするタンパク質（配列番号１０）が挙げられる。AdiCタンパク質は、arginine:agmatine antiporter、HtrAは膜結合型セリンエンドプロテアーゼ（プロテアーゼDo）であると推定されている。
HtrAタンパク質としては、エシェリヒア・コリのhtrA遺伝子（degPとも呼ばれる。Genb
ank annotation NP_414703.1 GI:16128154、配列番号１１）がコードするタンパク質（配列番号１２）が挙げられる。HtrAタンパク質は、膜結合型セリンエンドプロテアーゼ（プロテアーゼDo）serine endoprotease (protease Do)であると推定されている。
YdhKタンパク質としては、エシェリヒア・コリのydhK遺伝子（GenBank NP_416162.1 GI:16129603、配列番号１３）がコードするタンパク質（配列番号１４）が挙げられる。YdhKタンパク質は、conserved inner membrane proteinであると推定されている。
BacAタンパク質としては、エシェリヒア・コリのbacA遺伝子（GenBank NP_417529.1 GI:16130953、配列番号１５）がコードするタンパク質（配列番号１６）が挙げられる。BacAタンパク質は、ウンデカプレニル−ジホスファターゼであると推定されている。
YaiWタンパク質としては、エシェリヒア・コリのyaiW遺伝子（GenBank NP_414912.1 GI:16128363、配列番号１７）がコードするタンパク質（配列番号１８２）が挙げられる。YaiWタンパク質は、predicted DNA-binding transcriptional regulator（推定上のＤＮＡ結合型転写レギュレータ）であると推定されている。
YidQタンパク質としては、エシェリヒア・コリのyidQ遺伝子（GenBank NC_000913.2 (3865751..3866083)、配列番号１９）がコードするタンパク質（配列番号２０）が挙げられる。YidQタンパク質は、conserved outer membrane proteinであると推定されている。
また、腸内細菌科の属する種又は菌株によって、各タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列に差異が存在することがあるため、各遺伝子は配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、又は１９の塩基配列を有する遺伝子のバリアントであってもよい。各々の遺伝子のバリアントは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、又は１９の塩基配列を参考にして、BLAST等によって検索出来る（http://blast.genome.jp/）。また、各々の遺伝子のバリアントは、各々の遺伝子ホモログ、例えば腸内細菌科の染色体を鋳型にして、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、又は１９の塩基配列に基づいて作成され得るプライマーを用いてPCRで増幅可能な遺伝子を含む。
【００８８】
YdcU、SmpA、HtrG、AdiC、HtrA、YdhK、BacA、YaiW、又はYidQタンパク質としては、各々配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、又は２０のアミノ酸配列を有するものが挙げられるが、細菌の種や菌株によって使用コドンが異なり、各々の遺伝子の塩基配列に差異が存在することがあるため、コードされるタンパク質の機能が変わらない限り、これらのアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列をコードしている場合がある。ここで、数個とは、例えば、１〜２０個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個を意味する。上記の１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加は、各々のタンパク質産生が正常に行われる保存的変異である。保存的変異とは、置換部位が芳香族アミノ酸である場合には、Phe、Trp、Tyr間で、置換部位が疎水性アミノ酸である場合には、Leu、Ile、Val間で、極性アミノ酸である場合には、Gln、Asn間で、塩基性アミノ酸である場合には、Lys、Arg、His間で、酸性アミノ酸である場合には、Asp、Glu間で、ヒドロキシル基を持つアミノ酸である場合には、Ser、Thr間でお互いに置換する変異である。保存的変異の代表的なものは、保存的置換であり、保存的置換とみなされる置換としては、AlaからSer又はThrへの置換、ArgからGln、His又はLysへの置換、AsnからGlu、Gln、Lys、His又はAspへの置換、AspからAsn、Glu又はGlnへの置換、CysからSer又はAlaへの置換、GlnからAsn、Glu、Lys、His、Asp又はArgへの置換、GluからAsn、Gln、Lys又はAspへの置換、GlyからProへの置換、HisからAsn、Lys、Gln、Arg又はTyrへの置換、IleからLeu、Met、Val又はPheへの置換、LeuからIle、Met、Val又はPheへの置換、LysからAsn、Glu、Gln、His又はArgへの置換、MetからIle、Leu、Val又はPheへの置換、PheからTrp、Tyr、Met、Ile又はLeuへの置換、SerからThr又はAlaへの置換、ThrからSer又はAlaへの置換、TrpからPhe又はTyrへの置換、TyrからHis、Phe又はTrpへの置換、及び、ValからMet、Ile又はLeuへの置換が挙げられる。
【００８９】
ydcU、yfeK、smpA、htrG、adiC、htrA、ydhK、bacA、yaiW、及びyidQ遺伝子のバリアン
トは、各々配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、及び１９の塩基配列を有する遺伝子だけでなく、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、又は１９からなる塩基配列に相補的な塩基配列、またはその一部からなるプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであってもよい。「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。一例を示せば、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、特に好ましくは９９％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、好ましくは、６０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、さらに好ましくは、６８℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度、温度で、１回、より好ましくは２〜３回洗浄する条件が挙げられる。プローブの長さは、ハイブリダイゼーションの条件により適宜選択されるが、通常には、100bp〜1Kbpである。
【００９０】
プローブは、各々の遺伝子の一部の配列を有するものであってもよい。そのようなプローブは、当業者によく知られた方法により、各遺伝子の塩基配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとし、各遺伝子を含むDNA断片を鋳型とするPCR反応により作製することができる。なお、プローブに300bp程度の長さのDNA断片を用いる場合には、上記の条件でハイブリダイズさせた後の洗いの条件としては、50℃、2×SSC, 0.1%SDSで1回または２〜３回洗浄する条件が挙げられる。
【００９１】
尚、上記バリアント及びホモログに関する記述は、細菌へのＬ−アミノ酸生産能の付与に用いられる遺伝子についても同様に適用される。
【００９２】
＜２＞本発明のＬ−アミノ酸の製造法
本発明の微生物を培地で培養して、Ｌ−アミノ酸を該培地中に生成蓄積させ、該培地からＬ−アミノ酸を採取することにより、Ｌ−アミノ酸を製造することができる。
【００９３】
培養に用いる培地は、炭素源、窒素源、無機塩類、その他必要に応じてアミノ酸、ビタミン等の有機微量栄養素を含有する通常の培地を用いることができる。合成培地または天然培地のいずれも使用可能である。培地に使用される炭素源および窒素源は培養する菌株が利用可能であるものならばいずれの種類を用いてもよい。
【００９４】
炭素源としては、グルコース、グリセロール、フラクトース、スクロース、マルトース、マンノース、ガラクトース、澱粉加水分解物、糖蜜等の糖類が使用でき、その他、酢酸、クエン酸等の有機酸、エタノール等のアルコール類も単独あるいは他の炭素源と併用して用いることができる。窒素源としては、アンモニア、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、酢酸アンモニウム等のアンモニウム塩または硝酸塩等が使用することができる。有機微量栄養素としては、アミノ酸、ビタミン、脂肪酸、核酸、更にこれらのものを含有するペプトン、カザミノ酸、酵母エキス、大豆たん白分解物等が使用でき、生育にアミノ酸などを要求する栄養要求性変異株を使用する場合には要求される栄養素を補添することが好ましい。
【００９５】
特にＬ−グルタミン酸が析出するような条件に調整された液体培地を用いる場合、培地中にパントテン酸を添加すると、より効率よく晶析できる（WO2004/111258号パンフレット）。無機塩類としてはりん酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、鉄塩、マンガン塩等が使用できる。
【００９６】
培養は、好ましくは、発酵温度２０〜４５℃、ｐＨを３〜９に制御し、通気培養を行う
。培養中にｐＨが下がる場合には、例えば、炭酸カルシウムを加えるか、アンモニアガス等のアルカリで中和する。このような条件下で、好ましくは１０時間〜１２０時間程度培養することにより、培養液中に目的アミノ酸が蓄積される。
また、Ｌ−グルタミン酸が析出するような条件に調整された液体培地を用いて、培地中にＬ−グルタミン酸を析出させながら培養を行うことも出来る。Ｌ−グルタミン酸が析出する条件としては、例えば、ｐＨ５．０〜４．０、好ましくはｐＨ４．５〜４．０、さらに好ましくはｐＨ４．３〜４．０、特に好ましくはｐＨ４．０を挙げることができる。
【００９７】
また、Ｌ−グルタミン酸を培地中に析出させる場合には、予めＬ−グルタミン酸、Ｌ−リジンの結晶を種晶として添加しておくとより効率よく晶析できる（欧州特許1233069号、欧州特許出願公開1624069号）。
【００９８】
培養終了後の培養液からＬ−アミノ酸を採取する方法は、公知の回収方法に従って行えばよい。例えば、培養液から菌体を除去した後に濃縮晶析する方法あるいはイオン交換クロマトグラフィー等によって採取される。Ｌ−グルタミン酸が析出するような条件下で培養した場合、培養液中に析出したＬ−グルタミン酸は、遠心分離又は濾過等により採取することができる。この場合、培地中に溶解しているＬ−グルタミン酸を晶析した後に、併せて単離してもよい。
【００９９】
なお、塩基性アミノ酸を製造する際には、培養中のｐＨが６．５〜９．０、培養終了時の培地のｐＨが７．２〜９．０となるように制御し、発酵中の発酵槽内圧力が正となるように制御するか、又は、炭酸ガスもしくは炭酸ガスを含む混合ガスを培地に供給して、培地中の重炭酸イオン及び／または炭酸イオンが少なくとも２ｇ／Ｌ以上存在する培養期があるようにし、前記重炭酸イオン及び／または炭酸イオンを塩基性アミノ酸を主とするカチオンのカウンタイオンとする方法で発酵し、目的の塩基性アミノ酸を回収する方法で製造を行ってもよい（特開2002-065287号参照、米国特許出願公開第2002025564号）。
【実施例】
【０１００】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
【０１０１】
〔実施例１〕Ｌ−リジン生産菌の構築及び標的遺伝子の破壊
Ｌ−リジン生産菌として、国際公開第2006/078039号パンフレット記載のエシェリヒア・コリWC196ΔcadAΔldcを使用した。この菌株は、エシェリヒア・コリWC196のリジンデカルボキシラーゼ遺伝子cadA及びldcを、Red-driven integration法（Datsenko, K. A, and Wanner, B. L. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 97:6640-6645 (2000)）とλファージ由来の切り出しシステムにより、破壊した株である。
【０１０２】
上記WC196ΔcadAΔldcC 株からの標的遺伝子の欠失は、以下のようにして行うことができる。目的の遺伝子がKmr遺伝子に置換されたKOコレクション株（Baba, T. et al., (2006) Mol. Syst. Biol., 2, 2006 0008）をドナーとし、WC196ΔcadAΔldcCをレシピエントとしてP1トランスダクションを行い、WC196ΔcadAΔldcCから目的遺伝子がKmr遺伝子に置換された株を得る。次に、これらの株にFLPリコンビナーゼ遺伝子を搭載したプラスミドpCP20を導入し、Red-driven integrationによってKmr遺伝子を除去することにより、WC196ΔcadAΔldcC から目的遺伝子が欠失した株を得ることができる。
KOコレクション株は、エシェリヒア・コリBW25113[rrnB3 ΔlacZ4787 hsdR514 Δ(araBAD)567 Δ(rhaBAD)568 rph-1]株の種々の遺伝子がKmr遺伝子で置換された株のコレクションであり、ナショナルバイオリソースプロジェクト（nbrp@chanko.lab.nig.ac.jp）から入手することができる。
【０１０３】
〔実施例２〕WC196ΔcadAΔldcC 株のydcU、yfeK、及びsmpA遺伝子の破壊
KOコレクション株、BW25113 ydcU::Kmrをドナーとし、WC196ΔcadAΔldcCをレシピエントとしてP1トランスダクションを行い、WC196ΔcadAΔldcC ydcU::Kmrを得た。次に、この株にFLPリコンビナーゼ遺伝子を搭載したプラスミドpCP20を導入し、Red-driven integration法でKmr遺伝子を除去し、WC196ΔcadAΔldcCΔydcUを得た。
BW25113 yfeK::Kmr株、又はBW25113 smpA::Kmr株を用いて、上記と同様にしてyfeKo 又はsmpA遺伝子が破壊された株WC196ΔcadAΔldcCΔyfeK、及びWC196ΔcadAΔldcCΔsmpAを得た。
【０１０４】
〔実施例３〕ydcU遺伝子破壊株によるＬ−リジン生産
実施例２で得られたWC196ΔcadAΔldcCΔydcU、及びコントロールとしてWC196ΔcadAΔldcCを、それぞれＬプレートに塗布し、37℃にて24時間培養した。プレートのおよそ1/8量の菌体を、発酵培地20 mLを入れた500mL坂口フラスコに接種し、往復振とう培養装置で37℃において、グルコースを全量消費するまで約50時間培養した。培養後、培地中に蓄積したＬ−リジンの量をバイオテックアナライザーAS210（サクラ精機）を用いて測定した。独立に取得した３クローンについて、Ｌ−リジン収率（グルコースに対する収率）の平均値±SDを算出し、表１に示した。
【０１０５】
〔Ｌプレート組成〕
バクト・トリプトン（Difco社製） 10g/L
イーストエキストラクト（Difco社製） 5g/L
NaCl 5g/L
寒天 15g/L
【０１０６】
〔発酵培地組成〕
グルコース 60g/L
(NH4)2SO4 30g/L
KH2PO4 1.0g/L
MgSO4・7H20 1.0g/L
FeSO4・7H20 0.01g/L
MnSO4・4H20 0.01g/L
イーストエキストラクト（Difco社製）2.0g/L
炭酸カルシウム 30g/L
水酸化カリウムでpH7.0に調整し、115℃で10分オートクレーブした。但しグルコース及びMgSO4・7H2Oは別々に殺菌した。
【０１０７】
【表１】
【０１０８】
表１に示されるとおり、ydcU遺伝子が破壊された菌株は、親株に比べてＬ−リジン収率が向上している。
【０１０９】
〔実施例４〕yfeK遺伝子破壊株によるＬ−リジン生産
実施例２で得られたWC196ΔcadAΔldcCΔyfeK、及びコントロールとしてWC196ΔcadAΔldcCを、実施例３と同様に培養して、培地中に蓄積したＬ−リジンの量を測定した。独立に取得した３クローンについて、Ｌ−リジン収率（グルコースに対する収率）の平均値±SDを算出し、表２に示した。
【０１１０】
【表２】
【０１１１】
表２に示されるとおり、yfeK遺伝子が破壊された菌株は、親株に比べてＬ−リジン収率が向上している。
【０１１２】
〔実施例５〕smpA遺伝子破壊株によるＬ−リジン生産
実施例２で得られたWC196ΔcadAΔldcCΔsmpA、及びコントロールとしてWC196ΔcadAΔldcCを、実施例３と同様に培養して、培地中に蓄積したＬ−リジンの量を測定した。独立に取得した４クローンについて、Ｌ−リジン収率（グルコースに対する収率）の平均値±SDを算出し、表３に示した。
【０１１３】
【表３】
【０１１４】
表３に示されるとおり、smpA遺伝子が破壊された菌株は、親株に比べてＬ−リジン収率が向上している。
【０１１５】
〔配列表の説明〕
配列番号１：ydcU遺伝子の塩基配列
配列番号２：YdcUタンパク質のアミノ酸配列
配列番号３：yfeK遺伝子の塩基配列
配列番号４：YfeKタンパク質のアミノ酸配列
配列番号５：smpA遺伝子の塩基配列
配列番号６：SmpAタンパク質のアミノ酸配列
配列番号７：htrG遺伝子の塩基配列
配列番号８：HtrGタンパク質のアミノ酸配列
配列番号９：adiC遺伝子の塩基配列
配列番号10：AdiCタンパク質のアミノ酸配列
配列番号11：htrA遺伝子の塩基配列
配列番号12：HtrAタンパク質のアミノ酸配列
配列番号13：ydhK遺伝子の塩基配列
配列番号14：YdhKタンパク質のアミノ酸配列
配列番号15：bacA遺伝子の塩基配列
配列番号16：BacAタンパク質のアミノ酸配列
配列番号17：yaiW遺伝子の塩基配列
配列番号18：YaiWタンパク質のアミノ酸配列
配列番号19：yidQ遺伝子の塩基配列
配列番号20：YidQタンパク質のアミノ酸配列
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｌ−アミノ酸生産能を有し、かつ、ｙｄｃＵ、ｙｆｅＫ、ｓｍｐＡ、ｈｔｒＧ、ａｄｉＣ、ｈｔｒＡ、ｙｄｈＫ、ｂａｃＡ、ｙａｉＷ、及びｙｉｄＱから選択される１又はそれ以上の遺伝子の発現が弱まるように改変された腸内細菌科に属する細菌。
【請求項２】
ｙｄｃＵ、ｙｆｅＫ、ｓｍｐＡ、ｈｔｒＧ、ａｄｉＣ、ｈｔｒＡ、ｙｄｈＫ、ｂａｃＡ、ｙａｉＷ、又はｙｉｄＱの不活化により、各々の遺伝子の発現が弱められた、請求項１に記載の細菌。
【請求項３】
前記遺伝子が、ｙｄｃＵ、ｙｆｅＫ、又はｓｍｐＡである、請求項１又は２に記載の細菌。
【請求項４】
ｙｄｃＵ遺伝子が、配列番号２のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ又はそのバリアントである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の細菌。
【請求項５】
ｙｆｅＫ遺伝子が、配列番号４のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ又はそのバリアントである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の細菌。
【請求項６】
ｓｍｐＡ遺伝子が、配列番号６のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ又はそのバリアントである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の細菌。
【請求項７】
ｈｔｒＧ遺伝子が、配列番号８のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ又はそのバリアントである、請求項１又は２に記載の細菌。
【請求項８】
ａｄｉＣ遺伝子が、配列番号１０のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ又はそのバリアントである、請求項１又は２に記載の細菌。
【請求項９】
ｈｔｒＡ遺伝子が、配列番号１２のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ又はそのバリアントである、請求項１又は２に記載の細菌。
【請求項１０】
ｙｄｈＫ遺伝子が、配列番号１４のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ又はそのバリアントである、請求項１又は２に記載の細菌。
【請求項１１】
ｂａｃＡ遺伝子が、配列番号１６のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ又はそのバリアントである、請求項１又は２に記載の細菌。
【請求項１２】
ｙａｉＷ遺伝子が、配列番号１８のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ又はそのバリアントである、請求項１又は２に記載の細菌。
【請求項１３】
ｙｉｄＱ遺伝子が、配列番号２０のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ又はそのバリアントである、請求項１又は２に記載の細菌。
【請求項１４】
前記Ｌ−アミノ酸がＬ−リジン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−スレオニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−トリプトファン、及びＬ−システインからなる群から選択される一種または二種以上のＬ−アミノ酸である請求項１〜１３のいずれか一項に記載の細菌。
【請求項１５】
前記Ｌ−アミノ酸がＬ−リジンであり、リジンデカルボキシラーゼの活性が弱化されている、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の細菌。
【請求項１６】
前記腸内細菌科に属する微生物が、エシェリヒア属細菌、エンテロバクター属細菌またはパントエア属細菌である請求項１〜１５のいずれか一項に記載の細菌。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれか一項に記載の細菌を培地で培養して、Ｌ−アミノ酸を該培地中に蓄積させ、該培地よりＬ−アミノ酸を採取する、Ｌ−アミノ酸の製造法。
【請求項１８】
前記Ｌ−アミノ酸がＬ−グルタミン酸、Ｌ−リジン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−トリプトファン、及びＬ−システインから選択される一種または二種以上のＬ−アミノ酸である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記Ｌ−アミノ酸がＬ−リジンである、請求項１８に記載の方法。
【請求項１】
Ｌ−アミノ酸生産能を有し、かつ、ｙｄｃＵ、ｙｆｅＫ、ｓｍｐＡ、ｈｔｒＧ、ａｄｉＣ、ｈｔｒＡ、ｙｄｈＫ、ｂａｃＡ、ｙａｉＷ、及びｙｉｄＱから選択される１又はそれ以上の遺伝子の発現が弱まるように改変された腸内細菌科に属する細菌。
【請求項２】
ｙｄｃＵ、ｙｆｅＫ、ｓｍｐＡ、ｈｔｒＧ、ａｄｉＣ、ｈｔｒＡ、ｙｄｈＫ、ｂａｃＡ、ｙａｉＷ、又はｙｉｄＱの不活化により、各々の遺伝子の発現が弱められた、請求項１に記載の細菌。
【請求項３】
前記遺伝子が、ｙｄｃＵ、ｙｆｅＫ、又はｓｍｐＡである、請求項１又は２に記載の細菌。
【請求項４】
ｙｄｃＵ遺伝子が、配列番号２のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ又はそのバリアントである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の細菌。
【請求項５】
ｙｆｅＫ遺伝子が、配列番号４のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ又はそのバリアントである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の細菌。
【請求項６】
ｓｍｐＡ遺伝子が、配列番号６のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ又はそのバリアントである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の細菌。
【請求項７】
ｈｔｒＧ遺伝子が、配列番号８のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ又はそのバリアントである、請求項１又は２に記載の細菌。
【請求項８】
ａｄｉＣ遺伝子が、配列番号１０のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ又はそのバリアントである、請求項１又は２に記載の細菌。
【請求項９】
ｈｔｒＡ遺伝子が、配列番号１２のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ又はそのバリアントである、請求項１又は２に記載の細菌。
【請求項１０】
ｙｄｈＫ遺伝子が、配列番号１４のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ又はそのバリアントである、請求項１又は２に記載の細菌。
【請求項１１】
ｂａｃＡ遺伝子が、配列番号１６のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ又はそのバリアントである、請求項１又は２に記載の細菌。
【請求項１２】
ｙａｉＷ遺伝子が、配列番号１８のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ又はそのバリアントである、請求項１又は２に記載の細菌。
【請求項１３】
ｙｉｄＱ遺伝子が、配列番号２０のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ又はそのバリアントである、請求項１又は２に記載の細菌。
【請求項１４】
前記Ｌ−アミノ酸がＬ−リジン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−スレオニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−トリプトファン、及びＬ−システインからなる群から選択される一種または二種以上のＬ−アミノ酸である請求項１〜１３のいずれか一項に記載の細菌。
【請求項１５】
前記Ｌ−アミノ酸がＬ−リジンであり、リジンデカルボキシラーゼの活性が弱化されている、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の細菌。
【請求項１６】
前記腸内細菌科に属する微生物が、エシェリヒア属細菌、エンテロバクター属細菌またはパントエア属細菌である請求項１〜１５のいずれか一項に記載の細菌。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれか一項に記載の細菌を培地で培養して、Ｌ−アミノ酸を該培地中に蓄積させ、該培地よりＬ−アミノ酸を採取する、Ｌ−アミノ酸の製造法。
【請求項１８】
前記Ｌ−アミノ酸がＬ−グルタミン酸、Ｌ−リジン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−トリプトファン、及びＬ−システインから選択される一種または二種以上のＬ−アミノ酸である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記Ｌ−アミノ酸がＬ−リジンである、請求項１８に記載の方法。
【公開番号】特開２０１０−２６３７８９（Ｐ２０１０−２６３７８９Ａ）
【公開日】平成２２年１１月２５日（２０１０．１１．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−２２８７２８（Ｐ２００７−２２８７２８）
【出願日】平成１９年９月４日（２００７．９．４）
【出願人】（０００００００６６）味の素株式会社 (887)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年１１月２５日（２０１０．１１．２５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年９月４日（２００７．９．４）
【出願人】（０００００００６６）味の素株式会社 (887)
【Ｆターム（参考）】
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