ＭＲＥＪタイプｘｉ〜ｘｘのメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）を検出および同定するための配列
【課題】メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）を検出または認識する方法及び組成物ならびにそのキッドを提供する。
【解決手段】メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）を検出するためまたは認識するための新規ＳＣＣｍｅｃ右端接合部（ＭＲＥＪ）配列を示す。診断目的および／または疫学的目的への、ＭＲＥＪ配列タイプｘｉ、ｘｉｉ、ｘｉｉｉ、ｘｉｖ、ｘｖ、ｘｖｉ、ｘｖｉｉ、ｘｖｉｉｉ、ｘｉｘ、およびｘｘ特異検出用ＤＮＡ配列に基づく手段および組成物を調製する。さらに、その使用について開示する。
【解決手段】メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）を検出するためまたは認識するための新規ＳＣＣｍｅｃ右端接合部（ＭＲＥＪ）配列を示す。診断目的および／または疫学的目的への、ＭＲＥＪ配列タイプｘｉ、ｘｉｉ、ｘｉｉｉ、ｘｉｖ、ｘｖ、ｘｖｉ、ｘｖｉｉ、ｘｖｉｉｉ、ｘｉｘ、およびｘｘ特異検出用ＤＮＡ配列に基づく手段および組成物を調製する。さらに、その使用について開示する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌を検出するための新規ＳＣＣｍｅｃ右端接合部配列、ならびに診断的目的および／または疫学的目的へのその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
（関連技術の説明）
コアグラーゼ陽性種黄色ブドウ球菌はヒト日和見病原体として詳細に記録されている（非特許文献１：Ｍｕｒｒａｙら編，１９９９，Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，第７版，ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ，ワシントン）。黄色ブドウ球菌が引き起こす院内感染は、罹病および死亡の主な原因である。黄色ブドウ球菌が引き起こす最も一般的な感染の一部には皮膚が関わり、これにはさまざまな部位におけるフルンケルまたはセツ、蜂窩織炎、膿痂疹、および術後創感染が含まれる。黄色ブドウ球菌が引き起こすさらに重篤な感染の一部は、菌血症、肺炎、骨髄炎、急性心内膜炎、心筋炎、心膜炎、脳炎、髄膜炎、熱傷様皮膚症候群、および種々の膿瘍である。ブドウ球菌エンテロトキシンが媒介する食中毒は、黄色ブドウ球菌に関連するもう一つの重要な症候群である。市中疾患である毒素性ショック症候群は、毒素産生黄色ブドウ球菌による感染または定着に原因があるとされている。
【０００３】
メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）は、１９８０年代に、病院における臨床上および疫学上の大問題になった（非特許文献２：Ｏｌｉｖｅｉｒａら，２００２，Ｌａｎｃｅｔ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ．２：１８０−９）。ＭＲＳＡは、黄色ブドウ球菌感染症の治療に最もよく使用される抗生物質であるペニシリン類、セファロスポリン類、カルバペネム類、およびモノバクタム類を含む、全てのβ−ラクタムに対して耐性である。ＭＲＳＡ感染症は、通常であれば最後の防御策として使用される、より毒性が高く、より高価な抗生物質でしか、処置することができない。ＭＲＳＡは職員を介して患者から患者へと容易に拡散しうるので、世界中の病院が、ＭＲＳＡ管理上の問題に直面している。したがって、ＭＲＳＡの伝播を減らし感染患者の診断および処置を改良するために、ＭＲＳＡを検出および／または同定するための迅速かつ簡便なスクリーニング検査または診断検査が必要とされている。
【０００４】
黄色ブドウ球菌におけるメチシリン耐性は、それが、β−ラクタム系抗生物質に細胞が曝された時に正常なβ−ラクタム耐性ペニシリン結合タンパク質（ＰＢＰ）の生合成機能を引き継ぐ過剰なＰＢＰをコードするＤＮＡを、他のコアグラーゼ陰性ブドウ球菌（ＣＮＳ）から獲得したことによるという点でユニークである。黄色ブドウ球菌は通常、四つのＰＢＰを含有し、そのうち、ＰＢＰ１、２および３は必須である。ＰＢＰ２ａ（またはＰＢＰ２’）と呼ばれるＭＲＳＡ中の低親和性ＰＢＰは染色体ｍｅｃＡ遺伝子によってコードされ、β−ラクタム耐性トランスペプチダーゼとして機能する。ｍｅｃＡ遺伝子はメチシリン感受性黄色ブドウ球菌には存在しないが、ブドウ球菌の他の種には広く分布し、高度に保存されている（非特許文献３：Ｕｂｕｋａｔａら，１９９０，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．３４：１７０−１７２）。
【０００５】
黄色ブドウ球菌Ｎ３１５株（１９８２年に日本で分離されたもの）に由来するｍｅｃＡ遺伝子周辺のＤＮＡ領域のヌクレオチド配列決定は、染色体に挿入されるブドウ球菌カセット染色体ｍｅｃ（ＳＣＣｍｅｃ）と呼ばれる新規遺伝要素によってｍｅｃＡ遺伝子が運ばれるという発見をもたらした。ＳＣＣｍｅｃは、末端逆方向および直列反復配列、一組の部位特異的リコンビナーゼ遺伝子（ｃｃｒＡおよびｃｃｒＢ）、ならびにｍｅｃＡ遺伝子複合体の存在を特徴とする可動遺伝要素である（非特許文献４：Ｉｔｏら，１９９９，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４３：１４４９−１４５８；非特許文献５：Ｋａｔａｙａｍａら，２０００，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４４：１５４９−１５５５）。ＳＣＣｍｅｃは、ｃｃｒＡおよびｃｃｒＢを含むユニークな一組のリコンビナーゼ遺伝子の機能により、黄色ブドウ球菌Ｎ３１５株の染色体から正確に切り出され、特異的黄色ブドウ球菌染色体部位に、同じ向きに組み込まれる。ＭＲＳＡ ＮＣＴＣ１０４４２株（１９６１年に英国で分離された最初のＭＲＳＡ株）および８５／２０８２株（１９８５年に分離されたニュージーランドからの株）に由来するｍｅｃＡ遺伝子周辺のＤＮＡのクローニングおよび配列解析は、類似するＳＣＣｍｅｃの構造的特徴を共有する二つの新規遺伝要素の発見をもたらした。これら三つのＳＣＣｍｅｃは、その株が分離された年に基づいて、タイプＩ（ＮＣＴＣ１０４４２）、タイプＩＩ（Ｎ３１５）およびタイプＩＩＩ（８５／２０８２）と命名された（非特許文献６：Ｉｔｏら，２００１，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４５：１３２３−１３３６）。Ｈｉｒａｍａｔｓｕらは、ＳＣＣｍｅｃ ＤＮＡがメチシリン感受性黄色ブドウ球菌（ＭＳＳＡ）の染色体中の特異的部位に組み込まれることを発見した。ＳＣＣｍｅｃ ＤＮＡの左境界および右境界周辺の領域（すなわちそれぞれａｔｔＬおよびａｔｔＲ）のヌクレオチド配列、ならびにＳＣＣｍｅｃ ＤＮＡ組み込み部位付近の領域（すなわちＳＣＣｍｅｃ ＤＮＡの細菌染色体付着部位であるａｔｔＢｓｃｃ）のヌクレオチド配列を解析した。ａｔｔＬ、ａｔｔＲ ａｔｔＢｓｃｃ部位の配列解析により、ａｔｔＢｓｃｃは新規オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）ｏｒｆＸの３’末端に位置することが明らかになった。ｏｒｆＸは、以前に同定された機能未知のポリペプチドのいくつかと配列ホモロジーを示す推定１５９アミノ酸ポリペプチドをコードする（非特許文献７：Ｉｔｏら，１９９９，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４３：１４４９−１４５８）。最近になって、タイプＩＶおよびタイプＶと呼ばれる新しいタイプのＳＣＣｍｅｃが記載された（非特許文献８：Ｍａら，２００２，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４６：１１４７−１１５２、非特許文献９：Ｉｔｏら，２００４，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４８：２６３７−２６５１、非特許文献１０：Ｏｌｉｖｅｉｒａら，２００１，Ｍｉｃｒｏｂ．Ｄｒｕｇ Ｒｅｓｉｓｔ．７：３４９−３６０）。黄色ブドウ球菌ＣＡ０５株および８／６−３Ｐ株に由来する新しいＳＣＣｍｅｃタイプＩＶの右端の配列解析により、それらの配列は、黄色ブドウ球菌Ｎ３１５株のタイプＩＩ ＳＣＣｍｅｃのものと２０００ヌクレオチドにわたってほぼ同一であることが明らかになった（非特許文献８および６：Ｍａら，２００２，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４６：１１４７−１１５２；Ｉｔｏら，２００１，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４５：１３２３−１３３６）。今のところ、黄色ブドウ球菌ＨＤＥ２８８株およびＰＬ７２株に由来するＳＣＣｍｅｃタイプＩＶの右端に関する配列データは公表されていない（非特許文献１０：Ｏｌｉｖｅｉｒａら，２００１，Ｍｉｃｒｏｂ．Ｄｒｕｇ Ｒｅｓｉｓｔ．７：３４９−３６０）。
【０００６】
ｍｅｃＡ遺伝子および黄色ブドウ球菌特異的染色体配列の検出に基づいてＭＲＳＡを検出し同定するための方法は、既に記載されている（非特許文献１１：Ｓａｉｔｏら，１９９５，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３３：２４９８−２５００；非特許文献１２：Ｕｂｕｋａｔａら，１９９２，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３０：１７２８−１７３３；非特許文献１３：Ｍｕｒａｋａｍｉら，１９９１，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２９：２２４０−２２４４；非特許文献１４：Ｈｉｒａｍａｔｓｕら，１９９２，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３６：４４５−４５３）。しかし、ｍｅｃＡ遺伝子は、黄色ブドウ球菌とコアグラーゼ陰性ブドウ球菌の両方に広く分布するので、これらの方法でＭＲＳＡをメチシリン耐性ＣＮＳと区別することは必ずしも可能とは限らない（非特許文献１５：Ｓｕｚｕｋｉら，１９９２，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ．Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．３６：４２９−４３４）。この問題に対処するために、Ｈｉｒａｍａｔｓｕらは、ＭＲＳＡに特異的なＰＣＲに基づくアッセイを開発した。このアッセイでは、３タイプのＳＣＣｍｅｃ ＤＮＡの右端にハイブリダイズするプライマーを、ＳＣＣｍｅｃ組み込み部位の右側にあるヌクレオチド配列に対応する黄色ブドウ球菌染色体に特異的なプライマーと組み合わせて利用する（特許文献１：米国特許第６，１５６，５０７号、以下「５０７号特許」という）。他のブドウ球菌種（例えばスタフィロコッカス・エピデルミディス（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）およびスタフィロコッカス・ヘモリティカス（Ｓ．ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ））におけるＳＣＣｍｅｃ組み込み部位周辺のヌクレオチド配列は、黄色ブドウ球菌に見出されるものとは異なっている。したがってこのＰＣＲアッセイはＭＲＳＡの検出に関して特異的である。
【０００７】
「５０７号特許」に記載のＰＣＲアッセイは、ＳＣＣｍｅｃ ＤＮＡの「ＭＲＥＰタイピング」（ｍｅｃ ｒｉｇｈｔ ｅｘｔｒｅｍｉｔｙ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ（ｍｅｃ右端多型））の開発にもつながった（非特許文献６：Ｉｔｏら，２００１，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４５：１３２３−１３３６；非特許文献１６：Ｈｉｒａｍａｔｓｕら，１９９６，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．２：１１７−１２９）。ＭＲＥＰタイピング法では、３タイプのＳＣＣｍｅｃ間で、三つのＭＲＥＪタイプのヌクレオチド配列が、組み込み部位に隣接するＳＣＣｍｅｃ ＤＮＡの右端で異なっているという事実を利用する。タイプＩと比較すると、タイプＩＩＩはユニークなヌクレオチド配列を持ち、タイプＩＩはＳＣＣｍｅｃの右末端に１０２ヌクレオチドの挿入を持つ。Ｈｉｒａｍａｔｓｕらが記述したＭＲＥＰタイピング法では以下の命名が用いられる：ＳＣＣｍｅｃタイプＩはＭＲＥＰタイプｉであり、ＳＣＣｍｅｃタイプＩＩはＭＲＥＰタイプｉｉであり、ＳＣＣｍｅｃタイプＩＩＩはＭＲＥＰタイプｉｉｉである。
【０００８】
ＳＣＣｍｅｃタイプＩＩおよびＩＶは右端まで同じヌクレオチド配列を持つので、上記のＭＲＥＰタイピング法では、Ｈｉｒａｍａｔｓｕらが記載した新しいＳＣＣｍｅｃタイプＩＶ（非特許文献８：Ｍａら，２００２，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４６：１１４７−１１５２）をＳＣＣｍｅｃタイプＩＩと区別することができない。
【０００９】
ＭＲＥＪという表現は、ｍｅｃ右端接合部≪ｍｅｃ ｒｉｇｈｔ ｅｘｔｒｅｍｉｔｙ ｊｕｎｃｔｉｏｎ≫を指す。ＭＲＥＪは、長さが約１キロ塩基（ｋｂ）で、ＳＣＣｍｅｃ右端に由来する配列と、ＳＣＣｍｅｃ組み込み部位の右側にある細菌染色体ＤＮＡに由来する配列とを含んでいる。ＭＲＥＰタイプｉ〜ｉｉｉと分類された株は、ＭＲＥＪタイプｉ〜ｉｉｉに対応する。ＭＲＥＪタイプｉｖ、ｖ、ｖｉ、ｖｉｉ、ｖｉｉｉ、ｉｘ、およびｘは、以前に特徴づけられている（非特許文献１７：Ｈｕｌｅｔｓｋｙら，２００４，Ｊ Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４２：１８７５−１８８４；特許文献２：国際特許出願ＰＣＴ／ＣＡ０２／００８２４）。
【００１０】
本明細書に記載する実施形態は、ＭＲＳＡ検出用のＮＡＴアッセイを改良するために、より多くのＭＲＳＡ株の検出を可能にする、ＳＣＣｍｅｃ右端接合部配列データの作成に関する。世界中のＭＲＳＡ株のほとんどを検出するために、より偏在的なプライマーおよびプローブを開発する必要がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】米国特許第６，１５６，５０７号
【特許文献２】国際特許出願ＰＣＴ／ＣＡ０２／００８２４
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｍｕｒｒａｙら編，１９９９，Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，第７版，ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ，ワシントン
【非特許文献２】Ｏｌｉｖｅｉｒａら，２００２，Ｌａｎｃｅｔ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ．２：１８０−９
【非特許文献３】Ｕｂｕｋａｔａら，１９９０，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．３４：１７０−１７２）
【非特許文献４】Ｉｔｏら，１９９９，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４３：１４４９−１４５８
【非特許文献５】Ｋａｔａｙａｍａら，２０００，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４４：１５４９−１５５５）
【非特許文献６】Ｉｔｏら，２００１，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４５：１３２３−１３３６
【非特許文献７】Ｉｔｏら，１９９９，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４３：１４４９−１４５８
【非特許文献８】Ｍａら，２００２，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４６：１１４７−１１５２
【非特許文献９】Ｉｔｏら，２００４，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４８：２６３７−２６５１
【非特許文献１０】Ｏｌｉｖｅｉｒａら，２００１，Ｍｉｃｒｏｂ．Ｄｒｕｇ Ｒｅｓｉｓｔ．７：３４９−３６０
【非特許文献１１】Ｓａｉｔｏら，１９９５，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３３：２４９８−２５００
【非特許文献１２】Ｕｂｕｋａｔａら，１９９２，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３０：１７２８−１７３３
【非特許文献１３】Ｍｕｒａｋａｍｉら，１９９１，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２９：２２４０−２２４４
【非特許文献１４】Ｈｉｒａｍａｔｓｕら，１９９２，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３６：４４５−４５３
【非特許文献１５】Ｓｕｚｕｋｉら，１９９２，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ．Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．３６：４２９−４３４
【非特許文献１６】Ｈｉｒａｍａｔｓｕら，１９９６，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．２：１１７−１２９
【非特許文献１７】Ｈｕｌｅｔｓｋｙら，２００４，Ｊ Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４２：１８７５−１８８４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
あらゆるメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）株の存在および／またはそれに由来する核酸の量を決定するための特異的、偏在的かつ高感度な方法および組成物を、ここに提供する。新規ＭＲＥＪタイプｘｉ〜ｘｘの検出および定量を可能にする方法、組成物およびキットを開示する。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
いくつかの態様は、細菌核酸を含む試料中のＭＲＳＡ細菌の存在を検出するための方法に関する。ＭＲＳＡ株は、ｍｅｃＡ遺伝子を含むＳＣＣｍｅｃ核酸インサートを持っている。ＳＣＣｍｅｃインサートはＭＲＳＡ細菌をメチシリン耐性にする。ＳＣＣｍｅｃは、オープンリーディングフレームｏｒｆＸの３’末端で細菌ＤＮＡ中に挿入されて、多型右端接合部（ＭＲＥＪ）を生成する。ＭＲＥＪタイプｘｉ〜ｘｘの多型ＭＲＥＪ核酸にハイブリダイズする、ＭＲＳＡ株に特異的な少なくとも一つのプライマーおよび／またはプローブを用意する。プライマーおよび／またはプローブを試料の核酸とアニールさせる。アニールしたプライマーおよび／またはプローブは、ＭＲＥＪの存在を示す。
【００１５】
好ましい実施形態では、二つ以上のプライマーおよび／またはプローブを用意する。プライマーおよび／またはプローブは、実質的に同じアニーリング条件下で、ＭＲＥＪ核酸にアニールすることができる。プライマーおよび／またはプローブは、少なくとも１０ヌクレチド長、１２ヌクレオチド長、１４ヌクレオチド長、１６ヌクレオチド長、１８ヌクレオチド長、２０ヌクレオチド長、２５ヌクレオチド長、または３０ヌクレオチド長であることができる。プローブおよびプライマーは、同じ物理的容器内で一緒に使用するか、異なる物理的容器内で使用することができる。
【００１６】
いくつかの実施形態では、プライマーおよび／またはプローブが、配列番号１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２５、２６、３９、４０、４１、４２、５５、および５６の核酸のいずれか一つとアニールする。例えばいくつかの実施形態では、表４に列挙するプライマーおよび／またはプローブが、以下のＭＲＥＪ核酸を含むＭＲＳＡ細菌を検出するために使用される。
【表１】
【００１７】
いくつかの実施形態では、ストリンジェントな条件下で二つ以上のＭＲＥＪタイプ株にアニールするプライマーおよび／またはプローブが用意される。例えば、好ましい実施形態では、配列番号３１、３２、３３が、ＭＲＥＪタイプｘｉ〜ｘｖおよびｘｖｉｉ〜ｘｘの検出用に用意される。
【００１８】
さらなる実施形態では、タイプｘｉ〜ｘｘのＭＲＥＪを持つ少なくとも一つのＭＲＳＡを検出するために、プライマーおよび／またはプローブが、二つ一組にして用意される。したがっていくつかの実施形態では、配列番号３４／４５、３４／３０、３４／７６、および３４／４４からなる群より選択される少なくとも一対のオリゴヌクレオチドが、ＭＲＥＪタイプｘｉの検出用に用意される。別の実施形態では、配列番号３５／４５、３５／３０、３５／６２、および３５／４４からなる群より選択される少なくとも一対のオリゴヌクレオチドが、ＭＲＥＪタイプｘｉｉの検出用に用意される。さらに別の実施形態では、配列番号２９／４５、２９／３０、２９／７６、および２９／４４からなる群より選択される少なくとも一対のオリゴヌクレオチドが、ＭＲＥＪタイプｘｉｉｉの検出用に用意される。さらに別の実施形態では、配列番号２９／４５、２９／３０、２９／５９、および２９／４４からなる群より選択される少なくとも一対のオリゴヌクレオチドが、ＭＲＥＪタイプｘｉｖの検出用に用意される。別の実施形態では、配列番号２４／４５、２４／３０、２４／６２、および２４／４４からなる群より選択される少なくとも一対のオリゴヌクレオチドが、ＭＲＥＪタイプｘｖの検出用に用意される。さらに別の実施形態では、配列番号３６および４４のオリゴヌクレオチドが、ＭＲＥＪタイプｘｖｉの検出用に用意される。さらに別の実施形態では、配列番号４／４５、４／３０、４／６２、および４／４４からなる群より選択される少なくとも一対のオリゴヌクレオチドが、ＭＲＥＪタイプｘｖｉｉの検出用に用意される。さらに別の実施形態では、７／４５、７／３０、７／５９および７／４４からなる群より選択される少なくとも一対のオリゴヌクレオチドが、ＭＲＥＪタイプｘｖｉｉｉの検出用に用意される。別の実施形態では、９／４５、９／３０、９／５９および９／４４からなる群より選択される少なくとも一対のオリゴヌクレオチドが、ＭＲＥＪタイプｘｉｘの検出用に用意される。さらに別の実施形態では、配列番号８／４５、８／３０、８／５９、および８／４４からなる群より選択される少なくとも一対のオリゴヌクレオチドが、ＭＲＥＪタイプｘｘの検出用に用意される。
【００１９】
いくつかの実施形態では、少なくとも二対のプライマーが、二つ以上のＭＲＥＪタイプを検出するために用意される。
【００２０】
別の好ましい実施形態では、表５に列挙するプライマーおよび／またはプローブが、以下のＭＲＥＪ核酸を含むＭＲＳＡ細菌を検出するために、一緒に用意される。
【表２】
【００２１】
さらなる実施形態では、上記の方法が、所定のＭＲＥＪタイプに特異的なプライマーおよび／またはプローブを用意すること、ならびにアニールしたプローブまたはプライマーを、所定のＭＲＥＪタイプの存在の指標として検出することを、さらに含む。
【００２２】
さらに別の実施形態では、表６に列挙する配列番号に特異的なプライマーおよび／またはプローブが、以下のＭＲＥＪ核酸を含むＭＲＳＡ細菌を検出するために用意される。
【表３】
【００２３】
いくつかの実施形態では、プライマーが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）ならびにその変形、例えばネステッドＰＣＲおよびマルチプレックスＰＣＲ、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、核酸配列に基づく増幅法（ＮＡＳＢＡ）、自己持続配列複製法（３ＳＲ）、鎖置換増幅法（ＳＤＡ）、分枝ＤＮＡシグナル増幅法（ｂＤＮＡ）、転写仲介増幅法（ＴＭＡ）、サイクリングプローブ技術（ＣＰＴ）、固相増幅法（ＳＰＡ）、ヌクレアーゼ依存的シグナル増幅法（ＮＤＳＡ）、ローリングサークル増幅法、固定鎖置換増幅法、固相（固定化）ローリングサークル増幅法、Ｑβレプリカーゼ増幅法および他のＲＮＡポリメラーゼによる技法などといった増幅反応に用いられる。
【００２４】
好ましい実施形態では、ＰＣＲが、試料中の核酸を増幅するために用いられる。
【００２５】
別の実施形態では、ストリンジェントな条件下で配列番号１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２５、２６、３９、４０、４１、４２、５５、および５６の核酸のいずれかとハイブリダイズし、ｘｉ〜ｘｘから選択されるタイプの一つ以上のＭＲＥＪとハイブリダイズする、少なくとも１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、または３０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドが用意される。
【００２６】
別の実施形態では、プライマーおよび／またはプローブ対が、タイプｘｉ〜ｘｘの全てのＭＲＳＡを検出するために用意される。例えば、一定の実施形態では、表７に列挙するプライマー対（またはプローブ）が用意される。
【表４】
【００２７】
上述した方法のさらなる実施形態では、配列番号３１、３２、および３３のいずれか一つに定義されるヌクレオチド配列を持つ内部プローブが用意される。
【００２８】
さらに別の実施形態では、ＭＲＥＪタイプｘｉ〜ｘｘの検出に使用されるプライマーおよび／またはプローブが、ＭＲＥＪタイプｉ〜ｘのＭＲＳＡを検出する能力を持つプライマーおよび／またはプローブ（例えば同時係属中の国際特許出願ＰＣＴ／ＣＡ０２／００８２４に開示されているプライマーまたはプローブなど）と組み合わせて使用される。
【００２９】
本発明の別の態様は、配列番号１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２５、２６、３９、４０、４１、４２、５５、および５６の核酸の少なくとも一つを含むヌクレオチド配列またはその相補体に関する。さらなる実施形態は、配列番号１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２５、２６、３９、４０、４１、４２、５５、および５６の核酸の少なくとも３０、５０、１００、１５０、２００、３００、または５００連続ヌクレオチドを含む、配列番号１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２５、２６、３９、４０、４１、４２、５５、および５６の核酸のフラグメント、またはその相補体に関する。さらなる態様は、配列番号１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２５、２６、３９、４０、４１、４２、５５、および５６の核酸配列を含むベクター、ならびに配列番号１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２５、２６、３９、４０、４１、４２、５５、および５６の核酸配列を含むベクターを含む宿主細胞（例えば大腸菌宿主細胞）に関する。
【００３０】
さらに別の態様は、配列番号１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２５、２６、３９、４０、４１、４２、５５、および５６のいずれか一つにアニールする、少なくとも１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５または３０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドに関する。例えば、いくつかの実施形態は、配列番号３１、３２、または３３のいずれか一つの配列を含むオリゴヌクレオチドである。さらに別の実施形態は、配列番号１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２５、２６、３９、４０、４１、４２、５５、および５６の一つだけにアニールする、少なくとも１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５または３０ヌクレオチド長であるオリゴヌクレオチドに関する。
【００３１】
さらに別の態様は、プライマーおよび／またはプローブを含むキットに関する。プライマーおよび／またはプローブは、少なくとも１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、または３０ヌクレオチド長であり、ＭＲＥＪタイプｘｉ〜ｘｘの核酸のいずれか一つとハイブリダイズすることができる。さらなる実施形態は、少なくとも１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、または３０ヌクレオチド長であって配列番号１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２５、２６、３９、４０、４１、４２、５５、および５６の核酸のいずれか一つとハイブリダイズするプライマーおよび／またはプローブを含むキットに関する。いくつかの実施形態は、プライマー対を含むキットに関する。例えば、いくつかの実施形態では、キットが以下のプライマー対を含む。
【表５】
【発明の効果】
【００３２】
本発明により、今までに利用可能であった方法では検出することができなかったＭＲＳＡの検出を可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】ＳＣＣｍｅｃ右端接合部を表す。新規ＭＲＥＪタイプｘｉ〜ｘｘを配列決定するために使用するプライマーの位置および向きが示されている。ＭＲＥＪタイプｘｉ、ｘｉｉ、ｘｉｉｉ、ｘｉｖ、ｘｖ、ｘｖｉ、ｘｖｉｉ、ｘｖｉｉｉ、ｘｉｘ、およびｘｘを配列決定するために、配列番号４、２４、２７−３０、３６、４３−４５、５０−５７、７８−８６を使用した。矢印とその下の数字は、プライマーの位置とそれぞれの配列番号を示す。「ｗａｌｋ」は、ＳＣＣｍｅｃ配列上で、ＤＮＡ Ｗａｌｋｉｎｇ ＳｐｅｅｄＵｐ Ｋｉｔ（Ｓｅｅｇｅｎｅ、カリフォルニア州デルマー）のＤＮＡ Ｗａｌｋｉｎｇ ＡＣＰ（ＤＷ−ＡＰＣ）プライマーがアニールしていた位置を示す。
【図２】ＳＣＣｍｅｃ右端接合部と、新規ＭＲＥＪタイプｘｉ、ｘｉｉ、ｘｉｉｉ、ｘｉｖ、ｘｖ、ｘｖｉ、ｘｖｉｉ、ｘｖｉｉｉ、ｘｉｘ、およびｘｘの検出および同定用に本発明で開発されたプライマー（配列番号４、７−９、２４、２９−３６、４４、４５、５９、６２、７３）の位置を表す。アンプリコンのサイズを表１１に列挙する。ＭＲＥＪタイプの下にある括弧内の数字は、ＭＲＥＪ配列番号を示す。矢印はプライマーの位置を示し、その下の数字はそれぞれの配列番号を示す。黒いバーとその下の数字はプローブの位置とそれぞれの配列番号を示す。ＭＲＥＪタイプｘｖｉ中の「ｄｅｌｅｔｉｏｎ」は、ｏｒｆＸ中の２６９ｂｐ欠失の位置を示す。
【図３Ａ】ｏｒｆＸ、組み込み部位、ＳＳＣｍｅｃ右端の最初の５３５ヌクレオチドを含む１９の代表的ＭＲＥＪタイプｉ〜ｉｘおよびｘｉ〜ｘｘの多重配列アラインメントを示す。ＭＲＥＪタイプｉ〜ｉｘ配列は、それぞれ、同時係属中の国際特許出願ＰＣＴ／ＣＡ０２／００８２４配列番号１、２、２３２、４６、５０、１７１、１６６、１６７および１６８から採った。配列番号１８はＭＲＥＪタイプｘｉに対応し、配列番号２０はＭＲＥＪタイプｘｉｉに対応し、配列番号１５はＭＲＥＪタイプｘｉｉｉに対応し、配列番号１６はＭＲＥＪタイプｘｉｖに対応し、配列番号５６はＭＲＥＪタイプｘｖに対応し、配列番号２１はＭＲＥＪタイプｘｖｉに対応し、配列番号５５はＭＲＥＪタイプｘｖｉｉに対応し、配列番号３９はＭＲＥＪタイプｘｖｉｉｉに対応し、配列番号４１はＭＲＥＪタイプに対応し、そして配列番号４２はＭＲＥＪタイプｘｘに対応する。
【図３Ｂ】ｏｒｆＸ、組み込み部位、ＳＳＣｍｅｃ右端の最初の５３５ヌクレオチドを含む１９の代表的ＭＲＥＪタイプｉ〜ｉｘおよびｘｉ〜ｘｘの多重配列アラインメントを示す。ＭＲＥＪタイプｉ〜ｉｘ配列は、それぞれ、同時係属中の国際特許出願ＰＣＴ／ＣＡ０２／００８２４配列番号１、２、２３２、４６、５０、１７１、１６６、１６７および１６８から採った。配列番号１８はＭＲＥＪタイプｘｉに対応し、配列番号２０はＭＲＥＪタイプｘｉｉに対応し、配列番号１５はＭＲＥＪタイプｘｉｉｉに対応し、配列番号１６はＭＲＥＪタイプｘｉｖに対応し、配列番号５６はＭＲＥＪタイプｘｖに対応し、配列番号２１はＭＲＥＪタイプｘｖｉに対応し、配列番号５５はＭＲＥＪタイプｘｖｉｉに対応し、配列番号３９はＭＲＥＪタイプｘｖｉｉｉに対応し、配列番号４１はＭＲＥＪタイプに対応し、そして配列番号４２はＭＲＥＪタイプｘｘに対応する。
【図３Ｃ】ｏｒｆＸ、組み込み部位、ＳＳＣｍｅｃ右端の最初の５３５ヌクレオチドを含む１９の代表的ＭＲＥＪタイプｉ〜ｉｘおよびｘｉ〜ｘｘの多重配列アラインメントを示す。ＭＲＥＪタイプｉ〜ｉｘ配列は、それぞれ、同時係属中の国際特許出願ＰＣＴ／ＣＡ０２／００８２４配列番号１、２、２３２、４６、５０、１７１、１６６、１６７および１６８から採った。配列番号１８はＭＲＥＪタイプｘｉに対応し、配列番号２０はＭＲＥＪタイプｘｉｉに対応し、配列番号１５はＭＲＥＪタイプｘｉｉｉに対応し、配列番号１６はＭＲＥＪタイプｘｉｖに対応し、配列番号５６はＭＲＥＪタイプｘｖに対応し、配列番号２１はＭＲＥＪタイプｘｖｉに対応し、配列番号５５はＭＲＥＪタイプｘｖｉｉに対応し、配列番号３９はＭＲＥＪタイプｘｖｉｉｉに対応し、配列番号４１はＭＲＥＪタイプに対応し、そして配列番号４２はＭＲＥＪタイプｘｘに対応する。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）は、個体にとって深刻な健康への脅威となり、ＭＲＳＡを検出、同定、および定量するための迅速かつ簡便な方法の必要性は明白である。
【００３５】
今までに利用可能であった方法では検出することができなかったＭＲＳＡの検出を可能にするＭＲＳＡ株中に存在する新規ＤＮＡ配列およびＤＮＡ編成を、ここに開示する。この新規ＤＮＡ配列およびＤＮＡ編成は、ＭＲＳＡ ＤＮＡのＳＣＣｍｅｃ領域に存在する。ＭＲＳＡ株は、ｍｅｃＡ遺伝子を含むＳＣＣｍｅｃインサートを含んでいる。ＳＣＣｍｅｃは、ｏｒｆＸオープンリーディングフレームの３’末端で細菌ＤＮＡに挿入される。細菌ＤＮＡへのＳＣＣｍｅｃの挿入は多型右端接合部を生成する。以下、これをＭＲＥＪ（≪ｍｅｃ ｒｉｇｈｔ ｅｘｔｒｅｍｉｔｙ ｊｕｎｃｔｉｏｎ＝ｍｅｃ右端接合部≫を意味する）という。ＭＲＥＪ領域には、ＳＣＣｍｅｃ右端由来の配列と、右ＳＣＣｍｅｃ組み込み部位に隣接する染色体ＤＮＡ由来の配列とが含まれる。本発明の実施形態は、後述するＭＲＳＡの検出および同定に役立つプライマーおよび／またはプローブを導き出す親配列として使用することができる本明細書に開示する新規ＭＲＥＪの配列および編成に関する。本発明の別の態様は、新規ＭＲＥＪ配列から導き出される新規プライマーおよび／またはプローブ、ならびにＭＲＥＪタイプｘｉ〜ｘｘにハイブリダイズするＭＲＳＡ検出用のプライマーおよび／またはプローブを含むキットに関する。
【００３６】
本明細書には、核酸を含む試料中のＭＲＳＡ株の存在または非存在の検出に備えた方法も開示する。ＭＲＳＡ株に特異的であって、本明細書に開示するタイプｘｉ〜ｘｘのＭＲＥＪ核酸にアニールする、少なくとも一つのプライマーおよび／またはプローブを用意する。そのプライマーおよび／またはプローブを試料の核酸にアニールさせることができる。アニールしたプライマーおよび／またはプローブの検出は、そのプライマーおよび／またはプローブにハイブリダイズするＭＲＥＪタイプのＭＲＳＡが存在することを示す。
【００３７】
プライマーおよびプローブ
本明細書で使用する用語「プライマー」および「プローブ」は、オリゴヌクレオチドまたは核酸に限定されるわけではなく、ヌクレオチドの他に、ヌクレオチドの類似体である分子も包含する。本明細書で使用したヌクレオチドおよびポリヌクレオチドは、ポリデオキシリボヌクレオチド（２−デオキシ−Ｄ−リボースを含有）、ポリリボヌクレオチド（Ｄ−リボースを含有）、プリン塩基またはピリミジン塩基のＮ−またはＣ−グリコシドである他のあらゆるタイプのポリヌクレオチド、ならびに非ヌクレオチド主鎖を含有する他のポリマー、例えばポリアミド（例えばペプチド核酸（ＰＮＡ）およびポリモルホリノ（Ａｎｔｉ−Ｖｉｒａｌｓ，Ｉｎｃ．（オレゴン州コーバリス）からＮｅｕｇｅｎｅ（商標）ポリマーとして市販されている）、および他の合成配列特異的核酸ポリマー（ただし、これらのポリマーは、ＤＮＡおよびＲＮＡに見出されるような塩基対形成および塩基スタッキングが可能な配置で核酸塩基を含有するものとする）を総称するものとする。
【００３８】
ヌクレオチドおよびポリヌクレオチドという用語は、例えば３’−デオキシ−２’，５’−ＤＮＡ、オリゴデオキシリボヌクレオチドＮ３’→Ｐ５’ホスホロアミデート、２’−Ｏ−アルキル−置換ＲＮＡ、二本鎖および一本鎖ＤＮＡ、ならびに二本鎖および一本鎖ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッド、およびＰＮＡとＤＮＡまたはＲＮＡとのハイブリッドを包含する。この用語は、無修飾型のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドだけでなく、既知タイプの修飾、例えば当技術分野で知られるラベル、メチル化、「キャップ」、類似体による一つ以上の天然ヌクレオチドの置換、ヌクレオチド間修飾、例えば非荷電結合を持つもの（例えばメチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホロアミデート、カルバメートなど）、負荷電結合を持つもの（例えばホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）、および正荷電結合を持つもの（例えばアミノアルキルホスホロアミデート、アミノアルキルホスホトリエステル）、例えばタンパク質（ヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リジンなどを含む）などのペンダント部分を含有するもの、インターカレーター（例えばアクリジン、ソラレンなど）を持つもの、キレーター（例えば金属、放射性金属、ホウ素、酸化金属など）を含有するもの、アルキル化剤を含有するもの、修飾結合を持つもの（例えばアルファアノマー核酸など）も包含する。
【００３９】
本明細書で使用する用語「ヌクレオシド」および「ヌクレオチド」が、既知のプリン塩基およびピリミジン塩基を含有する部分だけでなく、修飾された他の複素環塩基を含有する部分も包含することは、理解されるだろう。そのような修飾として、メチル化されたプリン類もしくはピリミジン類、アシル化されたプリン類もしくはピリミジン類、または他の複素環が挙げられる。修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドは、糖部分上の修飾（例えば一つ以上のヒドロキシル基がハロゲン、脂肪族基で置き換えられるか、またはエーテル、アミンなどとして官能化される修飾）も包含するだろう。ヌクレオチドまたはポリヌクレオチドへの他の修飾は、各相補的ピリミジンまたはプリンに対して水素結合を形成するプリン塩基またはピリミジン塩基上の官能基の、転位、付加、置換、または他の形での改変を伴う。その結果得られる修飾ヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、他のそのような修飾ヌクレオチド単位と塩基対を形成しうるが、Ａ、Ｔ、Ｃ、ＧまたはＵとは塩基対を形成することができない。例えば、グアノシン（２−アミノ−６−オキシ−９−β−Ｄ−リボフラノシル−プリン）を修飾してイソグアノシン（２−オキシ−６−アミノ−９−β−Ｄ−リボフラノシル−プリン）を形成させることができる。そのような修飾は、もやはシトシンとは標準塩基対を効果的に形成しないであろうヌクレオシド塩基をもたらす。しかし、シトシン（１−β−Ｄ−リボフラノシル−２−オキシ−４−アミノ−ピリミジン）の修飾によるイソシトシン（１−β−Ｄ−リボフラノシル−２−アミノ−４−オキシ−ピリミジン）の形成は、グアノシンとは効果的に塩基対を形成しないが、イソグアノシンとは塩基対を形成するでだろう修飾ヌクレオチドをもたらす。イソシトシンはＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（ミズーリ州セントルイス）から入手することができ；イソシチジンはＳｗｉｔｚｅｒら（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３２：１０４８９−１０４９６およびその引用文献に記載の方法によって製造することができ；２’−デオキシ−５−メチル−イソシチジンは、Ｔｏｒら（１９９３）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１５：４４６１−４４６７およびその引用文献の方法によって製造することができ；イソグアニンヌクレオチドは、Ｍａｎｔｓｃｈら（１９７５）Ｂｉｏｃｈｅｍ．１４：５５９３−５６０１に記載の方法、またはＣｏｌｌｉｎｓらの米国特許第５，７８０，６１０号に記載の方法を使って製造することができる。κおよびπと呼ばれる非天然型塩基対は、２，６−ジアミノピリミジンおよびその相補体（１−メチルピラゾロ［４，３］−ピリミジン−５，７−（４Ｈ，６Ｈ）−ジオンの合成に関するＰｉｃｃｉｒｉｌｌｉら（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ ３４３：３３−３７に記載の方法によって、合成することができる。ユニークな塩基対を形成する他のそのような修飾ヌクレオチド単位は、Ｌｅａｃｈら（１９９２）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：３６７５−３６８３に記載されており、すなわち当業者には明白であるだろう。
【００４０】
プライマーおよび／またはプローブは、例えば固形支持体に結合された状態、液状、および凍結乾燥状態など、任意の適切な形態で用意することができる。
【００４１】
核酸配列へのプライマーおよび／またはプローブの特異的結合またはアニーリングは、特異的ハイブリダイゼーションによって達成される。特異的ハイブリダイゼーションが、ターゲットまたは基準核酸配列に少なくとも実質的に相補的である配列を選択することによって達成されることは、当業者には理解されるだろう。これには、オリゴヌクレオチド配列の全長にわたるオリゴヌクレオチドターゲット核酸配列の塩基対形成が含まれる。そのような配列は互いに「完全に相補的」であるということができる。あるオリゴヌクレオチドが本明細書に記載の核酸配列に対して「実質的に相補的」であるという場合、それら二つの配列は完全に相補的であってもよいし、あるいはハイブリダイゼーション時にミスマッチを形成するが、ＭＲＳＡ核酸の存在を検出するために使用される条件下でハイブリダイズする能力は保っている状態であってもよい。
【００４２】
プローブ長とプローブがターゲット配列にアニールする効率および正確さの両方との間には、正の相関関係が存在する。特に、長い配列ほど短い配列よりも融解温度（Ｔｍ）が高く、所与のターゲット配列内で繰り返される可能性が低く、その結果、非特異的なハイブリダイゼーションが最小限に抑えられる。
【００４３】
本明細書で使用する場合、「Ｔｍ」と「融解温度」は互いに交換可能な用語であり、ある二本鎖ポリヌクレオチド分子集団の５０％が一本鎖に解離した状態になる時の温度を指す。ポリヌクレオチドのＴｍを計算するための式は、当技術分野ではよく知られている。例えばＴｍは、以下の等式によって計算することができる：Ｔｍ＝６９．３＋０．４１×（Ｇ＋Ｃ）％−６−５０／Ｌ（式中、Ｌはヌクレオチド数で表したプローブの長さである）。ハイブリッドポリヌクレオチドのＴｍも、１Ｍ塩でのハイブリダイゼーションアッセイから採用された式を使って見積ることができ、ＰＣＲプライマーのＴｍを計算するためによく用いられる：［（Ａ＋Ｔの数）×２℃＋（Ｇ＋Ｃの数）×４℃］。例えばＣ．Ｒ．Ｎｅｗｔｏｎら，ＰＣＲ，第２版，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ（ニューヨーク：１９９７）の２４頁を参照されたい。構造および配列特徴を考慮してＴｍを計算するさらに洗練された他の計算方法も、当技術分野には存在する。計算されたＴｍは推定値に過ぎず、至適温度は普通、実験的に決定される。
【００４４】
高いＧ＋Ｃ含量を持つまたはパリンドローム配列を含むプライマーもしくはプローブ配列は、その意図するターゲット部位と同様に、自己ハイブリダイズする傾向がある。なぜなら、溶解状態では一般に、二分子ハイブリダイゼーションキネティクスよりも単分子ハイブリダイゼーションキネティクスの方が有利だからである。しかし、十分な数のＧ：Ｃヌクレオチド塩基対を含有するプローブを設計することも重要である。なぜなら、各Ｇ：Ｃ対は、ＡおよびＴ（またはＡおよびＵ）塩基が対を形成してターゲット配列を結合する際に見られる二つの水素結合ではなく、三つの水素結合によって結合され、それゆえに、より密着した強い結合を形成するからである。好ましいＧ＋Ｃ含量は約５０％である。
【００４５】
ハイブリダイゼーション温度は、プローブアニーリング効率とは逆に変化し、ハイブリダイゼーション混合物に含まれているかもしれない有機溶媒（例えばホルムアミド）の濃度も同様であるが、塩濃度の増加は結合を促進する。ストリンジェントなアニーリング条件下では、長いハイブリダイゼーションプローブまたは合成プライマーほど、短いものよりも効率よくハイブリダイズし、より許容的な条件下で十分である。好ましくは、ストリンジェントなハイブリダイゼーションを、基準またはターゲット核酸配列がプローブにハイブリダイズすることを許す条件下に、適切なバッファー中で行う。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、例えば約１Ｍ未満、より一般的には約５００ｍＭ未満、好ましくは約２００ｍＭ未満）の塩濃度から変動することができ、ハイブリダイゼーション温度は、（例えば、プローブの長さおよび／または核酸組成に依存して、下は０℃から２２℃を超える温度、約３０℃を超える温度、そして（ほとんどの場合）約３７℃を超える温度にまでわたりうる。長いフラグメントほど、特異的結合には高いハイブリダイゼーション温度を必要としうる。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーにはいくつかの因子が影響を及ぼすので、単一の因子の絶対尺度よりも、パラメータの組み合わせの方が大切である。「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、以下のどちらか一方または両方を指す：ａ）６×ＳＳＣ、約４５℃の後、０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃中で１回以上の洗浄、およびｂ）４００ｍＭ ＮａＣｌ、４０ｍＭ ＰＩＰＥＳ ｐＨ６．４、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５０℃または７０℃で１２〜１６時間の後、洗浄。
【００４６】
本明細書に記載する方法において、アニールしたプライマーおよび／またはプローブの検出は、直接的または間接的であることができる。例えば、プローブを被検試料にアニールさせて、それを直接検出することができる。一方、プライマーを被検試料にアニールさせた後、増幅ステップを行うこともできる。増幅産物は直接検出するか、増幅産物にアニールするプローブの検出を介して検出することができる。
【００４７】
いくつかの実施形態では、二つ以上のプライマーおよび／またはプローブを用意する。例えば、いくつかの実施形態は、ＭＲＥＪタイプｘｉ〜ｘｘを含む複数のＭＲＳＡ株を検出するための方法に関する。複数のプライマーおよび／またはプローブは、別個の物理的容器または同じ物理的容器中で行われる反応に使用することができる。さまざまなＭＲＳＡタイプについて調べる反応を、一つずつまたは同時に行うことができる。複数のプライマーを同じ物理的容器に用意する実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドを使って、最も好ましくは全てが共通の条件下でターゲット領域とアニールする能力を持つ複数のオリゴヌクレオチドを使って、マルチプレックスＰＣＲ反応を行うことができる。
【００４８】
いくつかの実施形態では、異なるＭＲＥＪタイプに特異的な複数のプライマーおよび／またはプローブを、ＭＲＥＪのタイプを決定することができるように、マルチプレックスＰＣＲ反応に用意する。検出に使用するプライマーおよび／またはプローブは、あるＭＲＥＪタイプをもう一つのＭＲＥＪタイプと区別することができるように、異なるラベルを持つことができる。本明細書で使用する用語「ラベル」は、検出可能シグナルを直接または間接的に与える能力を持つ物体を指す。典型的なラベルには、放射性同位体、蛍光分子、ビオチンなどがある。
【００４９】
ｏｒｆＸ遺伝子およびいくつかのＳＣＣｍｅｃ ＤＮＡフラグメント由来の配列は公的データベースから入手することができ、それを使って、ＭＲＳＡを検出するためのＤＮＡに基づく検査が開発されているが、本明細書に開示する新規配列データは、当技術分野で知られるアッセイを使って検出されることが今までなかったＭＲＥＪタイプｘｉ〜ｘｘのＭＲＳＡの検出を可能にする。表８に列挙するこれらの新規配列は、ＭＲＳＡの既知ＭＲＥＪ配列に基づいて開発されたＰＣＲアッセイでは予測することも検出することもできなかったであろう（米国特許第６，１５６，５０７号；国際特許出願ＰＣＴ／ＣＡ０２／００８２４；Ｉｔｏら，２００１，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４５：１３２３−１３３６；Ｈｕｌｅｔｓｋｙら，２００４，Ｊ Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４２：１８７５−１８８４；Ｍａら，２００２，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４６：１１４７−１１５２；Ｉｔｏら，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．２００４．４８：２６３７−２６５１；Ｏｌｉｖｅｉｒａら，２００１，Ｍｉｃｒｏｂ．Ｄｒｕｇ Ｒｅｓｉｓｔ．７：３４９−３６０）。したがって、これらの新規ＭＲＥＪ配列は、ＭＲＥＪタイプｘｉ〜ｘｘを持つＭＲＳＡ株を検出および／または同定するためのプライマーおよびプローブを当業者が設計することを可能にするので、ＭＲＳＡ診断用の現在のＮＡＴアッセイを改良するものである。
【００５０】
オリゴヌクレオチドプライマーおよび／またはプローブの設計および合成
ハイブリダイゼーション用のプローブおよびＤＮＡ増幅用のプライマーを含めて、全てのオリゴヌクレオチドを、ハイブリダイゼーションまたはＰＣＲ増幅に関するその適合性について、公的または商業的に入手することができるコンピュータソフトウェア、例えばＧｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎパッケージプログラム、ならびにＯｌｉｇｏ（商標）６およびＭＦＯＬＤ３．０プライマー解析ソフトウェアなどを用いるコンピュータ解析によって評価した。ＰＣＲプライマー対の潜在的適合性も、その合成に先だって、１ヌクレオチドの長いストレッチや３’末端の高いＧまたはＣ残基比率などといった望ましくない特徴が存在しないことを確認することによって評価した（Ｐｅｒｓｉｎｇら，１９９３，Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，ワシントン）。オリゴヌクレオチド増幅プライマーは、自動ＤＮＡ合成装置（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使って合成した。
【００５１】
プライマーまたはプローブのオリゴヌクレオチド配列は、二重鎖ＤＮＡのどちらの鎖に由来してもよい。プライマーまたはプローブは、塩基Ａ、Ｇ、Ｃ、もしくはＴまたは類似体からなることができ、四つの天然ヌクレオチドのいずれとも対を形成するヌクレオチド類似体を使って、一つ以上の選択したヌクレオチド位置で縮重させてもよい（Ｎｉｃｈｏｌｓら，１９９４，Ｎａｔｕｒｅ ３６９：４９２−４９３）。プライマーおよびプローブは、ロックト核酸（ＬＮＡ）（Ｋｏｓｋｉｎら，１９９８，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ５４：３６０７−３６３０）や、ペプチド核酸（ＰＮＡ）（Ｅｇｈｏｌｍら，１９９３，Ｎａｔｕｒｅ ３６５：５６６−５６８）などのヌクレオチド類似体も含有しうる。プライマーまたはプローブは任意の適切な長さを持つことができ、ＭＲＥＪタイプｘｉ〜ｘｘを持つＭＲＳＡの検出に適した専有フラグメント由来のまたは選択したデータベース配列由来のＤＮＡ配列内で、どこでも選択することができる。好ましい実施形態では、プライマーおよび／またはプローブが、少なくとも１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、または３０ヌクレオチド長である。
【００５２】
所与のターゲット微生物遺伝子には変異体が自然界に存在し、それは進化中にその遺伝子内で起こった配列変異に起因すると考えられる（Ｗａｔｓｏｎら，１９８７，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｅ，第４版，Ｔｈｅ Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、カリフォルニア州メンローパーク；Ｌｅｗｉｎ，１９８９，Ｇｅｎｅｓ ＩＶ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ニューヨーク州ニューヨーク）。例えば、同じ微生物種の異なる株は、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション部位に一つ以上のヌクレオチド変異を持ちうる。ある特定遺伝子に変異核酸および／または配列が存在すること、および配列変異の頻度は所与の遺伝子産物に対する進化中の選択圧に依存することは、当業者には容易に理解される。二つのＰＣＲプライマー間の領域に関する変異配列の検出は、増幅産物を配列決定することによって達成しうる。一方、プライマーハイブリダイゼーション部位とオーバーラップする配列変異を検出するには、そのハイブリダイゼーション部位の外側にあるＰＣＲプライマーを使った、より大きなＤＮＡターゲットの増幅と、それに続く配列決定とが必要になる。同じような戦略を使って、プローブのハイブリダイゼーション部位における変異を検出することができる。変異ＭＲＥＪへのハイブリダイゼーションまたは増幅に役立つ変異プライマーおよび／またはプローブ配列が考えられるのと同様に、ターゲット核酸および／もしくは配列またはその一部の分岐が増幅プライマーまたはプローブの感度および／または特異性および／または偏在性に著しい影響を及ぼさない限りにおいて、変異ＭＲＥＪ配列も考えられる。
【００５３】
本明細書に明示的に記載するオリゴヌクレオチド配列以外のオリゴヌクレオチド配列であって、ＭＲＳＡの検出および／または同定に適しているオリゴヌクレオチド配列も、本明細書に開示する新規ＭＲＥＪ配列または選択した公的データベース配列から導き出すことができる。例えば、オリゴヌクレオチドプライマーまたはプローブは、選ばれたものより短くても（ただし少なくとも１０ヌクレオチド長）、長くてもよく；本明細書に開示するＭＲＥＪ配列中または公的データベースから選択した配列中の、他のどこを選択してもよい。さらに、本明細書に開示するオリゴヌクレオチドの変異体を設計することもできる。ターゲットＤＮＡもしくはその変異体が所与のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズするか、またはターゲットＤＮＡもしくはその変異体を所与のオリゴヌクレオチドＰＣＲプライマー対によって増幅することができるならば、逆もまた真であり、所与のターゲットＤＮＡは変異オリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズするか、変異オリゴヌクレオチドＰＣＲプライマーによって増幅されうる。あるいは、ＰＣＲ以外の増幅方法に使用するためのオリゴヌクレオチドをＭＲＥＪ配列から設計してもよい。本明細書に開示するプライマーおよび／またはプローブは、ＭＲＥＪタイプｘｉ〜ｘｘの特異的かつ偏在的なオリゴヌクレオチドプローブおよび／または増幅プライマーの由来源として使用されるゲノムＤＮＡ配列をターゲットとすることによって設計された。専有フラグメントまたは公的データベース配列をその特異性および偏在性ゆえに選択すれば、そのサブセットも特異的かつ偏在的になる可能性が増加する。したがって、診断的目的に適したオリゴヌクレオチドの選択および評価は多くの努力を必要とするが、診断的目的に適した表９、１０および１１に列挙するもの以外のオリゴヌクレオチドを、選択したＤＮＡフラグメントから導き出すことは、当業者にとって十分に可能である。
【００５４】
本明細書に開示する診断キット、プライマーおよびプローブは、インビトロおよび／またはインサイチューでの応用例の両方で、ＭＲＥＪタイプｘｉ〜ｘｘのＭＲＳＡを検出および／または同定するために使用することができる。例えばキットは、今までに記載されたＭＲＥＪタイプｉ〜ｘのＭＲＳＡを検出するプライマー／プローブと組み合わせて使用することができると考えられる。また、本明細書に開示する診断キット、プライマーおよびプローブは単独で使用することも、微生物の検出および／または同定に適した他の任意のアッセイ、例えば、限定するわけではないが、核酸検出に基づく任意のアッセイ、任意のイムノアッセイ、任意の酵素アッセイ、任意の生化学アッセイ、任意の溶菌型アッセイ、任意の血清学的アッセイ、任意の分別培養培地、任意の濃縮培養培地、任意の選択培養培地、任意の特異的アッセイ培地、任意の同定培養培地、任意の計数培養培地、任意の細胞染色、特定細胞株での任意の培養、および動物での任意の感染性アッセイなどと組み合わせて使用することもできると考えられる。
【００５５】
試料には、任意の臨床試料、任意の環境試料、任意の微生物培養物、任意の微生物コロニー、任意の組織、および任意の細胞株が含まれうるが、これらに限るわけではない。
【００５６】
ＤＮＡ増幅
いくつかの実施形態では、アニーリングステップの後に、増幅および／または検出ステップが続く。本明細書に記載する方法では、あらゆるタイプの核酸増幅技術を使用することができる。本明細書に記載する方法で使用することができる増幅反応の限定でない例には、以下に挙げるものがあるが、これらに限るわけではない：ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（Ｉｎｎｉｓ編「ＰＣＲ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ，Ａ ＧＵＩＤＥ ＴＯ ＭＥＴＨＯＤＳ ＡＮＤ ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ」Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ニューヨーク（１９９０）およびＩｎｎｉｓ編「ＰＣＲ ＳＴＲＡＴＥＧＩＥＳ」（１９９５）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，ニューヨーク（Ｉｎｎｉｓ）参照）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（Ｗｕ（１９８９）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ４：５６０；Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：１０７７；Ｂａｒｒｉｎｇｅｒ（１９９０）Ｇｅｎｅ ８９：１１７参照）、核酸配列に基づく増幅法（ＮＡＳＢＡ）、自己持続配列複製法（３ＳＲ）（Ｇｕａｔｅｌｌｉ（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：１８７４参照）、鎖置換増幅法（ＳＤＡ）、分枝ＤＮＡシグナル増幅法 ｂＤＮＡ、転写仲介増幅法（ＴＭＡ）（Ｋｗｏｈ（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：１１７３参照）、サイクリングプローブ技術（ＣＰＴ）、ネステッドＰＣＲ、マルチプレックスＰＣＲ、固相増幅法（ＳＰＡ）、ヌクレアーゼ依存的シグナル増幅法（ＮＤＳＡ）、ローリングサークル増幅技術（ＲＣＡ）、固定鎖置換増幅法、固相（固定化）ローリングサークル増幅、Ｑβレプリカーゼ増幅法および他のＲＮＡポリメラーゼによる技法（例えばＮＡＳＢＡ、Ｃａｎｇｅｎｅ、オンタリオ州ミシソーガ）。これらの技法および他の技法は、Ｂｅｒｇｅｒ（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５２：３０７−３１６；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｍｕｌｌｉｓ（１９８７）米国特許第４，６８３，１９５号および同第４，６８３，２０２号；Ａｍｈｅｉｍ（１９９０）Ｃ＆ＥＮ ３６−４７；Ｌｏｍｅｌｌ Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，３５：１８２６（１９８９）；Ｖａｎ Ｂｒｕｎｔ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，８：２９１−２９４（１９９０）；Ｗｕ（１９８９）Ｇｅｎｅ ４：５６０；Ｓｏｏｋｎａｎａｎ（１９９５）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １３：５６３−５６４にも記述されている。
【００５７】
好ましい実施形態では、ＰＣＲを使って試料中の核酸を増幅する。ＰＣＲによるＤＮＡ増幅中は、微生物ゲノム由来の熱変性ターゲットＤＮＡの各鎖にそれぞれ結合する二つのオリゴヌクレオチドプライマーを使って、各サイクルでのＤＮＡの変性、プライマーのアニーリングおよび新しいターゲットの合成を許す連続的熱サイクルにより、ターゲットＤＮＡをインビトロで指数的に増幅させる（Ｐｅｒｓｉｎｇら，１９９３，Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，ワシントン）。
【００５８】
核酸増幅効率を改善するために、標準的増幅プロトコールには、反応混合物への変更を含めて、変更を加えることができる（ＣｈａｋｒａｂａｒｔｉおよびＳｃｈｕｔｔ，２００２，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，３２：８６６−８７４；Ａｌ−ＳｏｕｄおよびＲａｄｓｔｒｏｍ，２００２，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３８：４４６３−４４７０；Ａｌ−ＳｏｕｄおよびＲａｄｓｔｒｏｍ，１９９８，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６４：３７４８−３７５３；Ｗｉｌｓｏｎ，１９９７，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６３：３７４１−３７５１）。増幅反応混合物のそのような変更としては、さまざまなポリメラーゼの使用、または核酸増幅促進剤、例えばベタイン、ＢＳＡ、スルホキシド類、タンパク質ｇｐ３２、界面活性剤、陽イオン、およびテトラメチルアンモニウムクロリドなどの添加が挙げられるが、これらに限るわけではない。
【００５９】
核酸の検出
増幅された核酸の検出には、当業者に知られる任意のリアルタイム技術または増幅後技術が含まれうる。古典的には、ＰＣＲ増幅産物の検出は、標準的な臭化エチジウム染色アガロースゲル電気泳動によって行われるが、より迅速であり、ルーチン診断にとってより実用的でありうる他の特異的増幅産物検出方法、例えば同時係属中の特許出願ＷＯ０１／２３６０４Ａ２に記載されている方法を使用しうることは、当業者には容易に理解されるだろう。アンプリコン検出は、増幅産物にハイブリダイズする種特異的内部ＤＮＡプローブを使った固形支持体または液相ハイブリダイゼーションによって行うこともできる。そのようなプローブは、本明細書に開示するＭＲＥＪ核酸のレパートリーに由来する任意の配列から作成し、ＤＮＡ増幅物に特異的にハイブリダイズするように設計することができる。あるいは、アンプリコンを配列決定によって特徴づけることもできる。検出および配列決定方法の例については同時係属中の特許出願ＷＯ０１／２３６０４Ａ２を参照されたい。
【００６０】
本明細書に開示する実施形態で使用することができる核酸検出技術の限定でない他の例には、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）に基づく方法、例えばプローブの隣接ハイブリダイゼーション（プローブ−プローブ法およびプローブ−プライマー法を含む）（Ｊ．Ｒ．Ｌａｋｏｗｉｃｚ「Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ」Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ／Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，ニューヨーク，１９９９参照）、ＴａｑＭａｎプローブ技術（欧州特許ＥＰ０５４３９４２参照）、分子ビーコンプローブ技術（Ｔｙａｇｉら（１９９６）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１４：３０３−３０８参照）、Ｓｃｏｒｐｉｏｎプローブ技術（Ｔｈｅｗｅｌｌ（２０００）Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８：３７５２参照）、ナノ粒子プローブ技術（Ｅｌｇｈａｎｉａｎら（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７７：１０７８−１０８１参照）、およびＡｍｐｌｉｆｌｕｏｒプローブ技術（米国特許第５，８６６，３６６号；同第６，０９０，５９２号；同第６，１１７，６３５号；および同第６，１１７，９８６号参照）があるが、これらに限るわけではない。
【００６１】
好ましい実施形態では、ターゲット核酸の増幅後検出に、分子ビーコンを使用する。分子ビーコンは、ターゲットに結合しない限りヘアピンコンフォメーションで存在する一本鎖オリゴヌクレオチドである。このオリゴヌクレオチドの５’末端は蛍光色素を含有する。消光色素はオリゴヌクレオチドの３’末端に取付けられる。ビーコンがターゲットに結合していない場合は、ヘアピン構造が蛍光体と消光体とを近接させるので、蛍光を観測することはできない。しかし、ビーコンがターゲットとハイブリダイズすると、ヘアピン構造が破壊されることにより、蛍光体と消光体とが分離され、蛍光の検出が可能になる（Ｋｒａｍｅｒ ＦＲ．，１９９６，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３：３０３−８参照）。他の検出方法として、免疫学的方法によるターゲット遺伝子核酸検出、フィルター、チップまたは他の任意の固形支持体上での固相ハイブリダイゼーション法が挙げられる。これらの系では、蛍光、化学発光、ポテンシオメトリー、質量分析、プラズモン共鳴、偏光測定、比色法、フローサイトメトリーまたはスキャン分析など、当業者に知られる任意の適切な方法によって、ハイブリダイゼーションを監視することができる。ジデオキシターミネーション法による配列決定またはハイブリダイゼーションによる配列決定（例えばＤＮＡチップを使った配列決定）などのヌクレオチド配列決定は、ターゲット遺伝子の核酸を検出し特徴づけるためのもう一つの方法である。
【００６２】
ＭＲＥＪ核酸
本明細書の開示するＭＲＥＪフラグメントは、新規プライマーを使ってＭＲＳＡを増幅することによって生成される配列のレパートリーとして得られた。表８〜１１に開示する増幅およびシークエンスプライマー、ＭＲＥＪ配列のレパートリー、ならびにそこから導き出される診断的目的用のオリゴヌクレオチド配列は、本発明のさらなる目的である。
【００６３】
本発明の諸態様は、核酸、特に、ＳＣＣｍｅｃの右端とＭＲＳＡタイプｘｉ〜ｘｘ中のＳＣＣｍｅｃ組み込み部位の右側にある染色体ＤＮＡとに由来する配列を含む、ＳＣＣｍｅｃ右端接合部（ＭＲＥＪ）のＤＮＡフラグメントに由来する核酸配列に関する。いくつかの実施形態は、ＭＲＥＪタイプｘｉ〜ｘｘ株に特異的プライマーおよび／またはプローブを導き出す元となるＭＲＥＪタイプｘｉ〜ｘｘの親配列に関する。したがって、いくつかの実施形態は、配列番号１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２５、２６、３９、４０、４１、４２、５５、もしくは５６のヌクレオチド配列、またはその相補体に関する。別の実施形態は、ＤＮＡフラグメントおよびオリゴヌクレオチド、例えばプライマーおよびプローブに関する。例えばいくつかの実施形態は、配列番号１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２５、２６、３９、４０、４１、４２、５５、または５６の核酸の少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、または８００連続ヌクレオチドを含む核酸に関する。
【００６４】
本発明の範囲は、ＰＣＲによる増幅の使用に限定されず、任意の核酸増幅法または核酸に基づく診断検査の感度および／もしくは迅速性を増加させるために使用することができる他の任意の手法の使用を包含する。本発明の範囲は、リアルタイム検出技術および増幅後検出技術を含む任意の核酸増幅および検出技術、検出と組み合わされた任意の増幅技術、任意のハイブリダイゼーション核酸チップまたはアレイ技術、任意の増幅チップまたは増幅およびハイブリダイゼーションチップ技術の組み合わせの使用も包含する。任意のヌクレオチド配列決定法による検出および同定も、本発明の範囲に包含される。
【実施例】
【００６５】
（実施例１）
以前に記載されたＭＲＳＡ診断増幅アッセイの評価
当初、文献は、ＤＮＡ配列ホモロジーに基づいて、ＭＲＳＡ株には５タイプのＳＣＣｍｅｃ右端配列（ＳＣＣｍｅｃタイプＩ〜Ｖ）が見出されると、教示していた（Ｉｔｏら，１９９９，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４３：１４４９−１４５８；Ｋａｔａｙａｍａら，２０００，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４４：１５４９−１５５５；Ｉｔｏら，２００１，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４５：１３２３−１３３６；Ｍａら，２００２，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４６：１１４７−１１５２；Ｉｔｏら，２００４，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４８：２６３７−２６５１参照）。ＳＣＣｍｅｃ ＤＮＡは、メチシリン感受性黄色ブドウ球菌（ＭＳＳＡ）の染色体のｏｒｆＸと呼ばれる特異的部位に組み込まれる。一般に、各ＳＣＣｍｅｃタイプは、ＳＣＣｍｅｃカセットの右端にユニークなヌクレオチド配列を持つ。この規則の例外はＳＣＣｍｅｃタイプＩＩおよびＩＶに見られ、これらは２０００ヌクレオチドにわたってほぼ同一な配列を示す。しかし、ＳＣＣｍｅｃタイプＩＩは、ＳＣＣｍｅｃタイプＩの右末端に１０２ヌクレオチドの挿入を持つ。ＳＣＣｍｅｃタイプＩ〜ＩＩＩと分類される株はＭＲＥＪタイプｉ〜ｉｉｉのカテゴリーに入る。
【００６６】
最近、本発明者らは数株のＭＲＳＡのＭＲＥＪ領域を解析した。本発明者らは、ＭＲＳＡ由来のＳＣＣｍｅｃの右端接合部にある７個の新しい配列を記載し、それらをＭＲＥＪタイプイｉｖ、ｖ、ｖｉ、ｖｉｉ、ｖｉｉｉ、ｉｘ、およびｘと名付けた（Ｈｕｌｅｔｓｋｙら，２００４，Ｊ Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４２：１８７５−１８８４；国際特許出願ＰＣＴ／ＣＡ０２／００８２４）。
【００６７】
本発明者らは、ＭＲＥＪタイプｉ、ｉｉ、ｉｉｉ、ｉｖ、ｖ、およびｖｉｉのＳＣＣｍｅｃ部分をターゲットとするプライマーと、黄色ブドウ球菌ｏｒｆＸをターゲットとするプライマーとを持つ、リアルタイムＭＲＳＡ特異的マルチプレックスＰＣＲアッセイを設計した。ｏｒｆＸ配列のこの領域中に同定された全ての配列多型を検出するために、ｏｒｆＸ配列に特異的な三つの分子ビーコンプローブ（ＭＢＰ）を使用した（Ｈｕｌｅｔｓｋｙら，２００４，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４２：１８７５−１８８４）。黄色ブドウ球菌ｏｒｆＸにハイブリダイズする配列番号３０のオリゴヌクレオチドと、ＭＲＥＪタイプｉ、ｉｉ、ｉｉｉ、ｉｖ、ｖ、およびｖｉｉのＳＣＣｍｅｃ部分にハイブリダイズする配列番号３６、７０、７１、７２、および７４のオリゴヌクレオチドとを、ＰＣＲ反応に使用した。黄色ブドウ球菌ｏｒｆＸにハイブリダイズする配列番号３１、３２、および３３のオリゴヌクレオチドをプローブとして使用した。メチシリン感受性黄色ブドウ球菌（ＭＳＳＡ）の基準株および臨床株５６９株ならびに３２カ国から得られた異なるＭＲＳＡ株（周知の流行クローンを含む）１６５７株のパネルを使って、ＰＣＲアッセイの特異性および偏在性（すなわち全てまたは大半のＭＲＳＡ株を検出する能力）を確認した。
【００６８】
本明細書に開示するＭＲＥＪ核酸のレパートリーおよびそこに由来するオリゴヌクレオチドを構築するために使用した被検株のリストを表１に示す。本発明で使用した黄色ブドウ球菌臨床株は、ＳＥＮＴＲＹプログラム収集物およびいくつかの供給者の収集物の一部である。これらの黄色ブドウ球菌基準株または臨床分離株は３２カ国に起源を持つ：アフリカ諸国（ｎ＝１５）、アルバニア（ｎ＝２）、アルゼンチン（ｎ＝５０）、オーストラリア（ｎ＝７１）、オーストリア（ｎ＝２）、ベルギー（ｎ＝１０）、ブラジル（ｎ＝７８）、カナダ（ｎ＝６０７）、チリ（ｎ＝４２）、中国（ｎ＝７０）、デンマーク（ｎ＝３３）、エジプト（ｎ＝１）、フィンランド（ｎ＝１２）、フランス（ｎ＝５０）、ドイツ（ｎ＝４７）、ギリシャ（ｎ＝７）、アイルランド（ｎ＝５）、イスラエル（ｎ＝１９）、イタリア（ｎ＝６１）、日本（ｎ＝６２）、メキシコ（ｎ＝１）、オランダ（ｎ＝１７９）、ポーランド（ｎ＝３３）、ポルトガル（ｎ＝２４）、シンガポール（ｎ＝２０）、スロベニア（ｎ＝１２）、スペイン（ｎ＝３１）、スウェーデン（ｎ＝１０）、スイス（ｎ＝１３）、トルコ（ｎ＝２８）、英国（ｎ＝２２）、および米国（ｎ＝５２８）。ブドウ球菌株の同定の確認は、必要な場合に、ＭｉｃｒｏＳｃａｎ ＷａｌｋＡｗａｙ Ｐａｎｅｌ ｔｙｐｅ Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｂｒｅａｋｐｏｉｎｔ Ｃｏｍｂｏ １３を使って行った（Ｄａｄｅ Ｂｅｈｒｉｎｇ Ｃａｎａｄａ Ｉｎｃ．、カナダ・オンタリオ州ミシソーガ）。必要な場合は、黄色ブドウ球菌特異的プライマーおよびｍｅｃＡ特異的プライマー（配列番号５０、６０、６１、６３）を用いるＰＣＲ解析によって、同定を再確認した（Ｍａｒｔｉｎｅａｕら，２０００，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４４：２３１−２３８）。アッセイで得たデータを表２に示す。
【００６９】
試験した５６９株のＭＳＳＡのうち、２６株はＰＣＲアッセイに基づいてＭＲＳＡと誤認された。試験した１６５７株のＭＲＳＡのうち、１６４０株はＰＣＲアッセイで特異的に検出されたが、広範囲にわたるさまざまな起源を代表する、これらＭＲＳＡ株のうちの２３株は、このアッセイでは検出されなかった。そこで、このＰＣＲアッセイの特異性および偏在性（すなわち全てまたは大半のＭＲＳＡ株を検出する能力）を確認した。上記のアッセイで検出されなかったこれらの２３株のＭＲＳＡのうちの４株、ＣＣＲＩ−９２０８、ＣＣＲＩ−９７７０、ＣＣＲＩ−９６８１、およびＣＣＲＩ−９８６０は、それぞれＭＲＥＪタイプｖｉ、ｖｉｉｉ、ｉｘ、およびｘを保有することが、以前に示されている（国際特許出願ＰＣＴ／ＣＡ０２／００８２４）。
【００７０】
アッセイで検出されなかった残り１９株のＭＲＳＡをさらに解析した。各株から得たゲノムＤＮＡに対して、ＭＲＥＪタイプｖｉ、ｖｉｉｉ、またはｉｘのＳＣＣｍｅｃ右端にある配列をターゲットとするプライマーを、黄色ブドウ球菌ｏｒｆＸをターゲットとするプライマーと組み合わせて使用することにより、ＰＣＲを行った。具体的には、各ＰＣＲ反応は、ＭＲＥＪタイプｖｉにアニールする配列番号６５のオリゴヌクレオチド、ＭＲＥＪタイプｖｉｉｉにアニールする配列番号７５のオリゴヌクレオチド、またはＭＲＥＪタイプｉｘにアニールする配列番号２９のオリゴヌクレオチドと、黄色ブドウ球菌特異的プライマーである配列番号３０のオリゴヌクレオチドとの組み合わせを含有した。ＭＲＥＪタイプｘは、全ｏｒｆＸおよびＳＣＣｍｅｃタイプＩＩの右端の一部の欠失を持つことが、以前に示されている（国際特許出願ＰＣＴ／ＣＡ０２／００８２４）。そこで、ＭＲＥＪタイプｘを検出するためのＰＣＲ反応では、黄色ブドウ球菌染色体中のｏｒｆ２２にアニールする配列番号７７のオリゴヌクレオチドと、ＳＣＣｍｅｃタイプＩＩ内に位置するｏｒｆ２７にアニールする配列番号７３のオリゴヌクレオチドとを使用した。１９株のうち２株、ＣＣＲＩ−１１８７９およびＣＣＲＩ−１２０３６は、これらのＰＣＲプライマーにより、ＭＲＥＪタイプｉｘを保有することが示された。しかし、１７株のＭＲＳＡは、ＭＲＥＪタイプｖｉ、ｖｉｉｉ、ｉｘ、およびｘをターゲットとするプライマーでは検出されず、これらの株は新しいＭＲＥＪタイプを保有することが示唆された（表２および表３）。
【００７１】
（実施例２）
ＭＲＳＡ由来の新規ＭＲＥＪタイプの配列決定
ＭＲＥＪタイプｉ〜ｘの検出を可能にするプライマーでＤＮＡが増幅されなかった１７株のＭＲＳＡのＭＲＥＪ領域をさらに特徴づけるために、これらの１７株のＭＲＳＡのうち１５株について、ＭＲＥＪのヌクレオチド配列を決定した。まず最初に、ｍｅｃＡにアニールするプライマー（配列番号５０）とｏｒｆＸの５’末端にアニールするプライマー（配列番号４４）とを、ＰＣＲ反応で一緒に使用して、ＭＲＳＡのＭＲＥＪフラグメントを増幅した。これらのプライマーを選択するために使用した戦略を図１に図解する。それぞれ１００ｎｇの精製ゲノムＤＮＡを含有する四つの同一ＰＣＲ反応を行った。各ＰＣＲ反応は、１×ＨＥＲＣＵＬＡＳＥ（商標）ＤＮＡポリメラーゼバッファー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カリフォルニア州ラホーヤ）、各０．８μＭの配列番号４４および５０のオリゴ、各０．５６ｍＭの四つのｄＮＴＰ、および５単位のＨＥＲＣＵＬＡＳＥ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カリフォルニア州ラホーヤ）を、最終体積５０μｌ中に１ｍＭ ＭｇＣｌ２と共に含有した。標準的サーマルサイクラー（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｃ．のＰＴＣ−２００）を使って、ＰＣＲ反応を、以下のとおり、サイクリングに付した：９２℃で２分の後、変性ステップとして９２℃で１０秒、アニーリングステップとして５５℃で３０秒、および伸長ステップとして６８℃で１５分を３５または４０サイクル。
【００７２】
四つのＰＣＲ反応をプールした。ＰＣＲ反応のうち１０μＬを、０．２５μｇ／ｍＬの臭化エチジウムを含有する０．７％アガロースゲルでの電気泳動によって分離した。次にアンプリコンをＡｌｐｈａ−Ｉｍａｇｅｒ（Ａｌｐｈａ Ｉｎｎｏｔｅｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カリフォルニア州サンリアンドロ）で、２５４ｎｍのＵＶ光に曝露することにより、可視化した。残りのＰＣＲ増幅混合物（合計１５０〜２００μｌ）も、０．７％アガロースゲルでの電気泳動によって分離し、メチレンブルーを使った染色によって可視化した（Ｆｌｏｒｅｓら，１９９２，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１３：２０３−２０５）。
【００７３】
試験した１５株のうち、以下の８株は、配列番号４４および５０をプライマーとして、長さが１２〜２０ｋｂの範囲の増幅産物を与えた：ＣＣＲＩ−１１９７６、ＣＣＲＩ−１１９９９、ＣＣＲＩ−１２１５７、ＣＣＲＩ−１２１９８、ＣＣＲＩ−１２１９９、ＣＣＲＩ−１２７１９、ＣＣＲＩ−９８８７、ＣＣＲＩ−９７７２。増幅産物をアガロースゲルから切り出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ（商標）ゲル抽出キット（ＱＩＡＧＥＮ Ｉｎｃ．、カリフォルニア州バレンシア）を使って精製した。ゲル精製したＤＮＡフラグメントを、そのままシークエンス反応に使用した。ＭＲＥＪ増幅産物の両鎖を、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｔｅｍｓ自動ＤＮＡシーケンサー（モデル３７７または３７３０ｘｌ）を、同社のＢｉｇ Ｄｙｅ（商標）Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州フォスターシティ）と共に使って、ジデオキシヌクレオチド連鎖停止配列決定法により、配列決定した。シークエンス反応には、４２５〜４９５ｎｇのゲル精製アンプリコンを、増幅反応に使用した配列番号４４と共に使用した。配列番号４４を使った反応から作成した配列情報に基づいて、内部シークエンスプライマーを設計し、各アンプリコン調製物のより大きい部分について両鎖から配列データを得るために使用した。具体的には、配列番号４３および４５のオリゴヌクレオチドを使って、ＭＲＳＡ ＣＣＲＩ−１１９７６株およびＣＣＲＩ−１１９９９株を配列決定し；配列番号４３、４５、および５１を使って、ＭＲＳＡ ＣＣＲＩ−１２１５７株、ＣＣＲＩ−１２１９８株、およびＣＣＲＩ−１２１９９株を配列決定し；配列番号４３、４５、および５２を使って、ＭＲＳＡ ＣＣＲＩ−１２７１９株を配列決定し；配列番号２４を使って、ＭＲＳＡ ＣＣＲＩ−９８８７株を配列決定し、配列番号４、４５、および５７を使って、ＭＲＳＡ ＣＣＲＩ−９７７２株を配列決定した（図１、表９および表１１）。表３に記載する８株の配列を、配列番号１５、１６、１７、１８、１９、２０、５５、および５６として示す（表８）。
【００７４】
決定された配列がＰＣＲアーチファクトの配列決定に起因すると考えられるエラーを含まないことを保証するために、２回の独立したＰＣＲ増幅に由来する二つの独立したゲル精製ＭＲＥＪ増幅産物の調製物を、上述のように配列決定した。大半のターゲットフラグメントに関して、両アンプリコン調製物について決定された配列は同一だった。さらにまた、両鎖の配列は１００％相補的であったことから、決定された配列の高い正確さが確認された。上記の戦略を使って決定されたＭＲＥＪ配列を、配列表および表８に記載する。
【００７５】
異なるオリゴヌクレオチドプライマーセット（Ｏｌｉｖｉｅｒａらに記載）を使って、ＭＲＥＪタイプｉ〜ｖｉｉを検出するためのプライマーでは増幅産物を与えなかった１７株のＭＲＳＡを、さらに解析した（Ｏｌｉｖｅｉｒａおよびｄｅ Ｌｅｎｃａｓｔｒｅ．２００２，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４６：２１５５−２１６１）。二つの株（ＣＣＲＩ−１２３８２およびＣＣＲＩ−１２３８３）が、ＳＣＣｍｅｃタイプＩＩＩを保有し、Ψｃｃｒ複合体に特異的な配列を含有していた。もう一つの株（ＣＣＲＩ−１２８４５）はＳＣＣｍｅｃタイプＩＩを保有していた。
【００７６】
ＣＣＲＩ−１２３８２株およびＣＣＲＩ−１２３８３株のＭＲＥＪ配列を決定するために、ＳＣＣｍｅｃタイプＩＩＩ内に位置するΨｃｃｒ複合体配列をターゲットとするプライマー（配列番号２７）を、ｏｒｆＸの５’末端をターゲットとするプライマー（配列番号４４）と組み合わせて使用することにより、これら二つのＭＲＳＡ株のＭＲＥＪフラグメントを増幅した（表１０および図１）。それぞれ１００ｎｇの精製ゲノムＤＮＡ分子を含有する四つの同一ＰＣＲ反応を行った。各ＰＣＲ反応は、１×ＨＥＲＣＵＬＡＳＥ（商標）ＤＮＡポリメラーゼバッファー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カリフォルニア州ラホーヤ）、各０．８μＭの上記二つのプライマー（配列番号２７および４４）、各０．５６ｍＭの四つのｄＮＴＰおよび５単位のＨＥＲＣＵＬＡＳＥ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カリフォルニア州ラホーヤ）を、最終体積５０μｌ中に１ｍＭ ＭｇＣｌ２と共に含有した。標準的サーマルサイクラー（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｃ．（マサチューセッツ州ウォータータウン）のＰＴＣ−２００）を使って、ＰＣＲ反応を、以下のとおり、サイクルさせた：９２℃で２分の後、変性ステップとして９２℃で１０秒、アニーリングステップとして５５℃で３０秒、および伸長ステップとして６８℃で１５分を３５サイクル。
【００７７】
ＰＣＲ反応をプールし、ＰＣＲ増幅混合物のうち１０μｌを、０．２５μｇ／ｍｌの臭化エチジウムを含有する０．７％アガロースゲルでの電気泳動によって分離した。次にアンプリコンをＡｌｐｈａ−Ｉｍａｇｅｒ（Ａｌｐｈａ Ｉｎｎｏｔｅｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カリフォルニア州サンリアンドロ）で、２５４ｎｍのＵＶ光に曝露することにより、可視化した。残りのＰＣＲ増幅混合物（合計１５０〜２００μｌ）も、０．７％アガロースゲルでの電気泳動によって分離し、上述のようにメチレンブルーを使った染色によって可視化した。これらの二つのＭＲＳＡ株の場合、約８ｋｂの増幅産物が得られた。そのＰＣＲ増幅産物をアガロースゲルから切り出し、上述のように精製した。次に、ゲル精製したＤＮＡフラグメントを、上述のようにそのままシークエンス反応に使用した。シークエンス反応は、配列番号４４（増幅反応にも使用したもの）と各反応につき４２５〜４９５ｎｇのゲル精製アンプリコンとを使って行った。次に、異なる内部シークエンスプライマーセットを使って、そのアンプリコンの、より大きい部分について、両鎖からの配列データを得た（配列番号２８、３０、および４３）（図１、表９および表１１）。この戦略を使って配列決定された表３に記載のＭＲＳＡ ＣＣＲＩ−１２３８２およびＣＣＲＩ−１２３８３の配列を、それぞれ配列番号２５および２６と名付ける（表８）。
【００７８】
ＣＣＲＩ−１２８４５株（ＳＣＣｍｅｃタイプＩＩ）のＭＲＥＪフラグメントを配列決定するために、ｏｒｆＸの５’末端にアニールする配列番号４４のオリゴヌクレオチドを、ＭＲＥＪタイプｉｉのＳＣＣｍｅｃ右端にアニールする配列番号５３のオリゴヌクレオチドと組み合わせて使用することにより、ＰＣＲ増幅を行った。１μＬの精製ゲノムＤＮＡ調製物を、３９μＬのＰＣＲ反応混合物が入っている４本のチューブに直接移した。各ＰＣＲ反応は、５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、各０，４μＭの配列番号４４および５３のオリゴヌクレオチド、各２００μＭの四つのｄＮＴＰ、３．３μｇ／μｌのＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃａｎａｄａ Ｌｔｄ）、およびＴａｑＳｔａｒｔ（商標）抗体（ＢＤ Ｂｉｓｏｃｉｅｎｃｅｓ、カリフォルニア州サンホゼ）と結合させた０．５単位のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ、ウィスコンシン州マディソン）を含有した。ＰＣＲ反応は、標準的サーマルサイクラー（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｃ．（マサチューセッツ州ウォータータウン）のＰＴＣ−２００）を使って、以下のように行った：９４℃で３分の後、変性ステップとして９５℃で５秒、アニーリングステップとして５８℃で１分、および伸長ステップとして７２℃で１分を４０サイクル。このプライマーセットで４．５ｋｂの増幅産物が得られた。
【００７９】
増幅産物をプールし、その混合物のうち１０μｌを、０．２５μｇ／ｍｌの臭化エチジウムを含有する１．２％アガロースゲルでの電気泳動によって分離した。次に、Ａｌｐｈａ−Ｉｍａｇｅｒでアンプリコンを可視化した。アンプリコンサイズは、１ｋｂ分子量ラダー（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、メリーランド州ベセスダ）との比較によって見積った。残りのＰＣＲ増幅混合物（合計１５０μｌ）も１．２％アガロースゲルでの電気泳動によって分離し、上述のようにメチレンブルーを使った染色によって可視化した。ＰＣＲ反応は１．２ｋｂの増幅産物を与えた。この特異的増幅産物に対応するバンドをアガロースゲルから切り出し、上述のように精製した。次に、ゲル精製したＤＮＡフラグメントを、上述のように、そのままシークエンス反応に使用した。シークエンス反応は、配列番号４４および５３のオリゴヌクレオチドならび一つの内部プライマー（配列番号５４）および１反応あたり１０ｎｇ／１００ｂｐのゲル精製アンプリコンを使って行った（図１、表１０）。ＣＣＲＩ−１２８４５株のＭＲＥＪ配列を配列番号２１と名付ける（表８）。
【００８０】
残り四つのＭＲＳＡ株（ＣＣＲＩ−１２５２４、ＣＣＲＩ−１２５３５、ＣＣＲＩ−１２８１０、およびＣＣＲＩ−１２９０５）のＭＲＥＪ配列を決定するために、配列番号４４のオリゴヌクレオチドを、ＤＮＡ ＷＡＬＫＩＮＧ ＳＰＥＥＤ ＵＰ（商標）Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｓｅｅｇｅｎｅ、カリフォルニア州デルマー）の四つのＤＮＡ Ｗａｌｋｉｎｇ ＡＣＰ（ＤＷ−ＡＣＰ）プライマーのそれぞれと組み合わせて、製造者の説明に従い、ＰＴＣ−２００サーマルサイクラーで使用した。ＤＷ−ＡＣＰプライマーシステム（ＤＷ ＡＣＰ−ＰＣＲ（商標）技術）を使うと、２ｋｂまでの本物の未知ターゲット増幅産物を得ることが可能になる。ＤＷ−ＡＣＰプライマーの一つを使って得られる最初の増幅産物を、ＱＩＡＱＵＩＫ（商標）ＰＣＲ精製キット（ＱＩＡＧＥＮ Ｉｎｃ．、カリフォルニア州バレンシア）を使って精製した。ＤＷ−ＡＣＰ−ＮプライマーをｏｒｆＸにアニールする配列番号３０のオリゴヌクレオチドと組み合わせて使用することにより、製造者が推奨するＰＣＲ条件下で、精製ＰＣＲ産物を再増幅した。四つの異なる５０μＬ ＰＣＲ反応のＰＣＲ増幅混合物をプールし、１．２％アガロースゲルでの電気泳動によって分離した。次にアンプリコンを、上述のように、メチレンブルーを使った染色によって可視化した。１ｋｂ分子量ラダーとの比較によって、アンプリコンサイズをもう一度見積った。１．５〜３ｋｂの増幅産物が得られた。増幅産物をアガロースゲルから切り出し、上述のように精製した後、ＤＮＡを、そのまま上述のようにシークエンスプロトコールに使用した。アンプリコン１００ｂｐごとに１０ｎｇの精製ＤＮＡを、配列番号３０のオリゴヌクレオチドおよびＤＷ−ＡＣＰ−Ｎを用いるシークエンス反応に使用した。ＭＲＳＡ株ＣＣＲＩ−１２５２４、ＣＣＲＩ−１２５３５、ＣＣＲＩ−１２８１０、およびＣＣＲＩ−１２９０５株（表３に記載）由来のＭＲＥＪ配列を、配列番号３９、４０、４１、および４２と名付ける（表８）。
【００８１】
表３に記載するＣＣＲＩ−１２３７６およびＣＣＲＩ−１２５９３を、配列決定するのではなくＰＣＲプライマーを使って特徴づけたところ、特異的増幅プライマーの使用により、ＭＲＥＪタイプｘｉｉｉを含有することが示された。
【００８２】
（実施例３）
新規ＭＲＥＪタイプｘｉ〜ｘｘの配列解析
以前に記載されたＭＲＥＪタイプｉ〜ｘを検出するＭＲＳＡ特異的プライマーによって増幅されえない１７株のうち１５株について取得した配列を、公的データベースから入手できる配列と比較した。ＭＲＳＡ ＣＣＲＩ−１２８４５株を除く全ての例で、ＭＲＥＪ配列のｏｒｆＸ部分は、ｏｒｆＸの公的に入手できる配列と１００％近くの一致度を持っていた。ＣＲＲＩ−１２８４５はｏｒｆＸに欠失を持っていた（配列番号２１）（後述）。ＣＣＲＩ−１２８４５株を除けば、大半のＭＲＥＪフラグメント（配列番号１５〜２０、２５〜２６、３９〜４２、５５〜５６）のｏｒｆＸ部分は、公的に入手できる黄色ブドウ球菌ｏｒｆＸ配列とほぼ１００％の一致度を持つが、ＳＣＣｍｅｃ自体の右端内のＤＮＡ配列は、ＭＲＥＪタイプｉ、ｉｉ、ｉｉｉ、ｉｖ、ｖ、ｖｉ、ｖｉｉ、ｖｉｉｉ、ｉｘ、およびｘのものとは異なることが示された（国際特許出願ＰＣＴ／ＣＡ０２／００８２４；米国特許第６，１５６，５０７号）。ＣＣＲＩ−１２８４５のＳＣＣｍｅｃの右端内のＤＮＡ配列はＭＲＥＪタイプｉｉの配列に似ていた（下記参照）。したがって、１０個の異なる新規ＭＲＥＪ配列タイプ、すなわちＭＲＥＪタイプｘｉ〜ｘｘを、ここに報告する。
【００８３】
ＣＣＲＩ−１２１５７、ＣＣＲＩ−１２１９８、およびＣＣＲＩ−１２１９９株から得られるＳＣＣｍｅｃの右端内の配列（配列番号１７、１８、および１９）は互いにほぼ同一であり、ＭＲＥＪタイプｉ、ｉｉ、ｉｉｉ、ｉｖ、ｖ、ｖｉ、ｖｉｉ、ｖｉｉｉ、ｉｘ、およびｘの配列とは異なっていた（Ｉｔｏら，２００１，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４５：１３２３−１３３６；Ｍａら，２００２，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４６：１１４７−１１５２、Ｈｕｌｅｔｓｋｙら，２００４，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４２：１８７５−１８８４、国際特許出願ＰＣＴ／ＣＡ０２／００８２４、米国特許第６，１５６，５０７号）。これらの新しい配列をＭＲＥＪタイプｘｉ（配列番号１７〜１９）と名付けた。ＢＬＡＳＴ（商標）検索により、ＭＲＥＪタイプｘｉのＳＣＣｍｅｃ部分の最初の８６ｂｐは、スタフィロコッカス・エピデルミディスＳＲ１株の未知配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ２７００４６）と８７％の一致度を示すことがわかった。ＭＲＥＪ配列の残りの部分はユニークであり、公表されたどの配列とも有意なホモロジーを示さないことがわかった。
【００８４】
ＣＣＲＩ−１２７１９株由来のＳＣＣｍｅｃの右端に得られた配列（配列番号２０）は、ＭＲＥＪタイプｉ〜ｘともＭＲＥＪタイプｘｉとも異なっていた。この新しいＭＲＥＪタイプをＭＲＥＪタイプｘｉｉと名付けた。ＢＬＡＳＴ（商標）を使ってＧｅｎＢａｎｋ配列と比較したところ、ＭＲＥＪタイプｘｉｉのＳＣＣｍｅｃの右端にある配列は、最近記載されたＳＣＣｍｅｃタイプＶの右端に見出される配列と１００％の一致度を示した（Ｉｔｏら，２００４，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ．Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４８：２６３７−２６５１；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢ１２１２１９）。この配列は、スタフィロコッカス・エピデルミディスＲＰ６２ａ推定ＧＴＰ結合タンパク質配列の２１２ヌクレオチド領域と、８５％の一致度を示した。
【００８５】
ＣＣＲＩ−１１９７６株、ＣＣＲＩ−１２３８２株、およびＣＣＲＩ−１２３８３株から得たＳＣＣｍｅｃの右端内の配列（配列番号１５、２５、および２６）は、互いに１００％同一であり、ＭＲＥＪタイプｉ〜ｘならびにＭＲＥＪタイプｘｉおよびｘｉｉとは異なっていた。この新しいＭＲＥＪ配列をＭＲＥＪタイプｘｉｉｉと名付けた（配列番号１５、２５、および２６）。
【００８６】
ＣＣＲＩ−１１９９９株から得たＳＣＣｍｅｃの右端内の配列（配列番号１６）も、ＭＲＥＪタイプｉ〜ｘならびにＭＲＥＪタイプｘｉ、ｘｉｉ、およびｘｉｉｉとは異なっていたので、これをＭＲＥＪタイプｘｉｖと名付けた。ＭＲＥＪタイプｘｉｉｉ配列およびｘｉｖ配列のＢＬＡＳＴ（商標）検索は、これら二つのＭＲＥＪタイプのＳＣＣｍｅｃの一部が、ＭＲＥＪタイプｉｘの配列と同一であることを示した。実際、ＭＲＥＪタイプｘｉｉｉと比較すると、ＭＲＥＪタイプｉｘおよびｘｉｖのＳＣＣｍｅｃ部分の前には、連続する１０２ｂｐ挿入がそれぞれ１個および２個存在している。ＭＲＥＪタイプｉｘ、ｘｉｉｉ、およびｘｉｖ配列の残りの部分は、互いに９９．９％同一だった。これらの配列は、メチシリン感受性株スタフィロコッカス・エピデルミディスＡＴＣＣ１２２２８の染色体リコンビナーゼ遺伝子を保有するｍｅｃＡを持たないＳＣＣカセットの非連続領域（サイズは１５３５〜１８８０ヌクレオチドとさまざま）（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＢＫ００１５３９）と、（最も高いＢＬＡＳＴスコアに関して）９７〜１００％の範囲の一致度を示した。１０２ｂｐ挿入の配列は、ＭＲＥＪタイプｉｉに見出されるものと９９〜１００％同一だった。
【００８７】
ＣＣＲＩ−９８８７株由来のＳＣＣｍｅｃの右端内に得られた配列は、ＭＲＥＪタイプｉ〜ｘとも、ＭＲＥＪタイプｘｉ〜ｘｉｖとも異なっており、それゆえにこれを、ＭＲＥＪタイプｘｖと名付けた（配列番号５６）。ＭＲＥＪタイプｘｖのＳＣＣｍｅｃ部分内に得られた配列のＢＬＡＳＴ検索は、このＤＮＡフラグメントが、メチシリン感受性黄色ブドウ球菌Ｍ株のＳＣＣカセット（これはｍｅｃＡを含有しない）の非連続配列（サイズは３４２〜６１８ヌクレオチドとさまざま）（ＧｅｎＢｎａｋアクセッション番号Ｕ１０９２７）と、（最も高いＢＬＡＳＴスコアに関して）９２％〜９６％の範囲の一致度を示すことを明らかにした。ＭＲＥＪタイプｘｖの配列は記載されていたが、ＭＲＳＡ株のｏｒｆＸの下流にあるこの配列の局在は、これまで記載がなかった。ＣＣＲＩ−９８８７ ＭＲＥＪ配列は、ｏｒｆＸ配列の近くに位置するスタフィロコッカス・ヘモリティカスＪＣＳＣ１４３５株の３０６ヌクレオチド領域とも、９４％の一致度を示した。
【００８８】
ＣＣＲＩ−１２８４５株由来のＭＲＥＪについて得られた配列（配列番号２１）は、この株のＭＲＥＪフラグメントがｏｒｆＸのヌクレオチド１６５〜４３４（２６９ｂｐフラグメント）の欠失を持つ一方、ＳＣＣｍｅｃの右端にある配列（３２８ヌクレオチド）は、公的データベースに登録されているＭＲＥＪタイプｉｉの配列と９９．８〜１００％の範囲の一致度を持つことを明らかにした。この株から得たＭＲＥＪ配列は、既知のＭＲＥＪ配列と高レベルな一致を示したが、ｏｒｆＸ内の２６９ｂｐ欠失の存在がこれまでに記載されたことは一度もなかった。上述の初期ＰＣＲ増幅アッセイで使用したオリゴヌクレオチドの一つはこの２６９ｂｐ欠失部に含まれるので、ｏｒｆＸ中の欠失は、このＭＲＳＡ株が、これまでに記載されたＭＲＳＡ検出用のプライマーおよびプローブでは検出されなかった、または検出することができなかった理由の説明になる（米国特許第６，１５６，５０７号および国際特許出願ＰＣＴ／ＣＡ０２／００８２４）。この株の新規ＭＲＥＪ配列をＭＲＥＪタイプｘｖｉと名付けた。
【００８９】
ＣＣＲＩ−９７７２株由来のＳＣＣｍｅｃの右端に得られた配列は、ＭＲＥＪタイプｉ〜ｘとも、ＭＲＥＪタイプｘｉ〜ｘｖｉとも異なっていた。この新しいＭＲＥＪタイプをＭＲＥＪタイプｘｖｉｉと名付けた（配列番号５５）。ＧｅｎＢａｎｋデータベースに対するＢＬＡＳＴ（商標）検索により、ＭＲＥＪタイプｘｖｉｉのＳＣＣｍｅｃ部分は、ＳＣＣｍｅｃタイプＩＶを保有する黄色ブドウ球菌ＣＡ０５株（ＪＣＳＣ１９６８）のＳＣＣｍｅｃ接合部の左にある配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢ０６３１７２）（Ｍａら，２００２．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４６：１１４７−１１５２）と、１００％の一致を示すことが明らかになった。ＭＲＥＪタイプｘｖｉｉの遺伝子構成は、ＭＳＳＡ中のｏｒｆｘの下流にある領域と類似している。配列そのものは以前に記載されていたが、ＭＲＳＡ株中のｏｒｆＸの下流にあるこの配列の局在は、これまで一度も記載されたことがなかった。
【００９０】
ＣＣＲＩ−１２５２４およびＣＣＲＩ−１２５３５株由来のＳＣＣｍｅｃの右端から得られた配列は、互いにほぼ同一だったが、ＭＲＥＪタイプｉ〜ｘともＭＲＥＪタイプｘｉ〜ｘｖｉｉとも異なっていたので、これをＭＲＥＪタイプｘｖｉｉｉと名付けた（配列番号３９および４０）。ＧｅｎＢａｎｋ配列に対するＢＬＡＳＴ検索により、スタフィロコッカス・ヘモリティカスＪＣＳＣ１４３５のＳＣＣｍｅｃカセットの４８７ヌクレオチド領域と１００％一致することが明らかになった。この配列の残りの部分は、ユニークであり、公表されたどの配列とも有意なホモロジーを示さないことがわかった。
【００９１】
ＣＣＲＩ−１２８１０株から得た配列は、ＭＲＥＪタイプｉ〜ｘともＭＲＥＪタイプｘｉ〜ｘｖｉｉｉとも異なっており、これをＭＲＥＪタイプｘｉｘと名付けた（配列番号４１）。ＢＬＡＳＴを使ってＧｅｎＢａｎｋ配列と比較したところ、ＭＲＥＪタイプｘｉｘ配列のＳＣＣｍｅｃ部分は、ＡＴＣＣ２５９２３株の機能未知の５９７ヌクレオチド領域（これはＳＣＣｍｅｃの左に位置する）（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢ０４７２３９）と、１００％の一致を示した。この結果は、ＳＣＣｍｅｃ配列が公表されている他の四つのＭＲＳＡ株、ＭＲＳＡ２５２、８５／３９０７、８５／２０８２、およびＭＲ１０８（それぞれＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＢＸ５７１８５６、ＡＢ０４７０８８、ＡＢ０３７６７１およびＡＢ０９６２１７）でも観察された。ＭＲＥＪタイプｘｉｘの遺伝子構成は、ＭＳＳＡ中でｏｒｆｘの下流にある領域と類似している。この配列そのものは既に記載されていたが、ｏｒｆＸの下流にあるこのＤＮＡフラグメントの存在は一度も記載されていなかった。
【００９２】
ＣＣＲＩ−１２９０５株由来のＳＣＣｍｅｃの右端に得られた配列は、ＭＲＥＪタイプｉ〜ｘともＭＲＥＪタイプｘｉ〜ｘｉｘとも異なっており、これをＭＲＥＪタイプｘｘと名付けた（配列番頭４２）。ＢＬＡＳＴを使ってＧｅｎｂａｎｋ配列と比較したところ、ＭＲＥＪタイプｘｘ配列のＳＣＣｍｅｃは、メチシリン感受性黄色ブドウ球菌ＮＣＴＣ８３２５株のｏｒｆＸの下流にある二つの非連続配列（それぞれ７２７および３０７ヌクレオチド長）（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢ０１４４４０）と、１００％および９９％の一致を示した。ＭＲＥＪタイプｘｘの遺伝子構成は、ＭＳＳＡ中のｏｒｆｘの下流にある領域と類似している。ＭＲＳＡ株中のｏｒｆＸの下流にあるこの配列の局在は、今まで一度も記載されたことがなかった。非連続フラグメント（サイズは９１〜７２７ヌクレオチドとさまざま）との９８％〜１００％の範囲の一致レベルが、ＳＣＣｍｅｃ配列が公表されている１１株のＭＲＳＡ、すなわちＮ３１５、ＮＣＴＣ１０４４２、ＣＯＬ、ＵＳＡ３００、Ｍｕ５０、２３１４、８５／４２３１、８５／２２３５、ＪＣＳＣ１９７８、ＰＬ７２、ＨＤＥ２８８（それぞれＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＢＡ００００１８、ＡＢ０３３７６３、ＣＰ００００４６、ＣＰ０００２５５、ＢＡ００００１７、ＡＹ２７１７１７、ＡＢ０１４４２８、ＡＢ０１４４２７、ＡＢ０６３１７３、ＡＦ４１１９３６、ＡＦ４１１９３５）で見出された。これらの同一フラグメントは、ｍｅｃＡ遺伝子の下流、ＳＣＣｍｅｃの左挿入点近く（またはさらに下流）に位置する。
【００９３】
（実施例４）
新しいＭＲＥＪタイプｘｉ〜ｘｘの配列比較
ＧＣＧソフトウェアプログラムＰｉｌｅｕｐおよびＧａｐ（ＧＣＧ、ウィスコンシン州）を使って、全ての新しいＭＲＥＪタイプ（ｘｉ〜ｘｘ）について、ＳＣＣｍｅｃ右端の最初の５００ヌクレオチド部分の配列を互いに比較し、以前記載されたＭＲＥＪタイプｉ〜ｉｘの配列とも比較した。表１２に、１０タイプの新規ＭＲＥＪタイプ（ｘｉ〜ｘｘ）のＳＣＣｍｅｃ右端と、以前記載されたＭＲＥＪタイプ（ｉ〜ｉｘ）のものとの間のヌクレオチドレベルでの一致度を、ＧＣＧプログラムＧａｐを使って示す。ＭＲＥＪタイプｘは、この比較から除外した。なぜなら、このＭＲＥＪ配列は、ＳＣＣｍｅｃタイプＩＩの右端と比較して、全ｏｒｆＸおよびＳＣＣｍｅｃ組み込み部位、ならびにＳＣＣｍｅｃの右端にある約４ｋｂを欠いているからである。ＭＲＥＪタイプｉｘ、ｘｉｉｉ、およびｘｉｖのＳＣＣｍｅｃ右端は、ＭＲＥＪタイプｉｘおよびｘｉｖ中に存在するそれぞれ１個よび２個の１０２ｂｐ挿入だけが相違点だった。しかし、これら三つの配列の残りの部分はほぼ１００％の一致度を示した（図３）。ＭＲＥＪタイプｘｖｉのＳＣＣｍｅｃ部分はＭＲＥＪタイプｉｉのそれとほぼ１００％同一であるが、ＭＲＥＪタイプｘｖｉにおけるｏｒｆＸのヌクレオチド１６５〜４３４の欠失は、今まで一度も記載されていない。他の全ての新しいＭＲＥＪタイプのＳＣＣｍｅｃ右端は、互いに、またはＭＲＥＪタイプｉ〜ｉｘと、３８．２〜５９．５％の範囲の一致度を示した。新規ＭＲＥＪ配列と、先行技術の検出アッセイの基礎となった以前記載された配列との間の実質的な変異は、本発明で開示する新規ＭＲＥＪタイプｘｉ〜ｘｘの右端が、以前記載されたＭＲＥＪプライマーでは予測することも検出することもできなかった理由の説明になる（米国特許第６，１５６，５０７号；国際特許出願ＰＣＴ／ＣＡ０２／００８２４；Ｉｔｏら，２００１，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４５：１３２３−１３３６；Ｈｕｌｅｔｓｋｙら，２００４，Ｊ Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４２：１８７５−１８８４；Ｍａら，２００２，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４６：１１４７−１１５２；Ｉｔｏら，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．２００４．４８：２６３７−２６５１；Ｏｌｉｖｅｉｒａら，２００１，Ｍｉｃｒｏｂ．Ｄｒｕｇ Ｒｅｓｉｓｔ．７：３４９−３６０）。
【００９４】
（実施例５）
ＭＲＥＪタイプｘｉ〜ｘｘを持つＭＲＳＡのＳＣＣｍｅｃ／ｏｒｆＸ配列からの増幅プライマーの選択
上述した１０タイプの新ＭＲＥＪタイプｘｉ〜ｘｘの配列データを解析して、各新ＭＲＥＪタイプ配列に特異的なプライマーを設計した（図２、表９および１１）。ＭＲＥＪタイプｘｉ（配列番号３４）、ＭＲＥＪタイプｘｉｉ（配列番号３５）、ＭＲＥＪタイプｘｉｉｉおよびｘｉｖ（配列番号２９）（ＭＲＥＪタイプｉｘも検出するがＭＲＥＪタイプｉｘ、ｘｉｉｉ、およびｘｉｖのそれぞれは異なるアンプリコン長を持つ）、ＭＲＥＪタイプｘｖ（配列番号２４）、ＭＲＥＪタイプｘｖｉｉ（配列番号４）、ＭＲＥＪタイプｘｖｉｉｉ（配列番号７）、ＭＲＥＪタイプｘｉｘ（配列番号９）、ＭＲＥＪタイプｘｘ（配列番号８）に特異的なプライマーを、それぞれ、黄色ブドウ球菌ｏｒｆＸに特異的なプライマー（配列番号３０）と組み合わせて使用し、それらの特異的ＭＲＥＪターゲットに対して試験した。ＭＲＥＪタイプｘｖｉの検出には、ＭＲＥＪタイプｉ、ｉｉ、およびｘｖｉをターゲットとするプライマー（表１０）を、黄色ブドウ球菌ｏｒｆＸをターゲットとするプライマー（配列番号４４）と組み合わせて使用した。ＭＲＥＪタイプｉ、ｉｉ、およびｘｖｉは、そのアンプリコンの長さが異なるので、互いに区別することができる。
【００９５】
次に、ターゲットＭＲＳＡ ＭＲＥＪタイプのＤＮＡを特異的に増幅することがわかったオリゴヌクレオチドプライマーを、ＰＣＲ増幅によって、その偏在性について試験した（すなわち、偏在的なプライマーは、ターゲットＭＲＥＪタイプのＭＲＳＡの大半のまたは全ての分離株を効率より増幅した）。ＰＣＲアッセイの特異性および偏在性は、細菌培養物を使って直接試験するか、精製細菌ゲノムＤＮＡを使って試験した。ＭＲＥＪタイプｘｉ〜ｘｘをターゲットとするプライマーの特異性も、他の全てのＭＲＥＪタイプを保有するＭＲＳＡ株からのＤＮＡを試験することによって確認した。
【００９６】
処理した規格化細菌懸濁液または細菌から精製したゲノムＤＮＡ調製物１μｌを２０μｌＰＣＲ反応混合物で増幅した。各ＰＣＲ反応は５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、各０．４μＭのＭＲＥＪタイプｘｉプライマー（配列番号３４）、ＭＲＥＪタイプｘｉｉプライマー（配列番号３５）、ＭＲＥＪタイプｘｉｉｉおよびｘｉｖプライマー（配列番号２９）、ＭＲＥＪタイプｘｖプライマー（配列番号２４）、ＭＲＥＪタイプｘｖｉ（配列番号３６）、ＭＲＥＪタイプｘｖｉｉプライマー（配列番号４）、ＭＲＥＪタイプｘｖｉｉｉプライマー（配列番号７）、ＭＲＥＪタイプｘｉｘプライマー（配列番号９）、またはＭＲＥＪタイプｘｘプライマー（配列番号８）（これらを、それぞれ０．４μＭの黄色ブドウ球菌特異的プライマー（配列番号３０またはＭＲＥＪタイプｘｖｉについては配列番号４４）と組み合わせて使用）、各２００μＭの四つのｄＮＴＰ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、ニュージャージー州ピスカタウェイ）、３．３μｇ／μｌのＢＳＡ（ＳＩＧＭＡ、ミズーリ州セントルイス）、およびＴａｑＳｔａｒｔ（商標）抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カリフォルニア州サンホゼ）と結合させた０．５Ｕ Ｔａｑポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ、ウィスコンシン州マディソン）を含有した。
【００９７】
次に、標準的なサーマルサイクラー（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｃ．（マサチューセッツ州ウォータータウン）のＰＴＣ−２００）を使って、ＰＣＲ反応を熱サイクリングに付した：９４℃で３分の後、変性ステップとして９５℃で６０秒、アニーリングステップとして５５℃で６０秒、および伸長ステップとして７２℃で６０秒を４０サイクル、次に７２℃で７分の最終的伸長。ＰＣＲ産物の検出は、０．２５μｇ／ｍｌの臭化エチジウムを含有するアガロースゲル（１．２％）における電気泳動によって行った。
【００９８】
特異的ＭＲＥＪターゲットを保有する各ＭＲＳＡ株は、それぞれの特異的ＭＲＥＪプライマーで特異的に検出され、非ターゲットＭＲＥＪタイプとの交差検出はなかった。
【００９９】
本発明を上に説明したが、本発明の要旨から逸脱することなくこれに変更を加えうることは、明白だろう。これらの変更は本願請求項に定義する本発明の範囲に包含される。
【表６】
【表７】
【表８】
【表９】
【表１０】
【表１１】
【表１２】
【表１３】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌を検出するための新規ＳＣＣｍｅｃ右端接合部配列、ならびに診断的目的および／または疫学的目的へのその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
（関連技術の説明）
コアグラーゼ陽性種黄色ブドウ球菌はヒト日和見病原体として詳細に記録されている（非特許文献１：Ｍｕｒｒａｙら編，１９９９，Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，第７版，ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ，ワシントン）。黄色ブドウ球菌が引き起こす院内感染は、罹病および死亡の主な原因である。黄色ブドウ球菌が引き起こす最も一般的な感染の一部には皮膚が関わり、これにはさまざまな部位におけるフルンケルまたはセツ、蜂窩織炎、膿痂疹、および術後創感染が含まれる。黄色ブドウ球菌が引き起こすさらに重篤な感染の一部は、菌血症、肺炎、骨髄炎、急性心内膜炎、心筋炎、心膜炎、脳炎、髄膜炎、熱傷様皮膚症候群、および種々の膿瘍である。ブドウ球菌エンテロトキシンが媒介する食中毒は、黄色ブドウ球菌に関連するもう一つの重要な症候群である。市中疾患である毒素性ショック症候群は、毒素産生黄色ブドウ球菌による感染または定着に原因があるとされている。
【０００３】
メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）は、１９８０年代に、病院における臨床上および疫学上の大問題になった（非特許文献２：Ｏｌｉｖｅｉｒａら，２００２，Ｌａｎｃｅｔ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ．２：１８０−９）。ＭＲＳＡは、黄色ブドウ球菌感染症の治療に最もよく使用される抗生物質であるペニシリン類、セファロスポリン類、カルバペネム類、およびモノバクタム類を含む、全てのβ−ラクタムに対して耐性である。ＭＲＳＡ感染症は、通常であれば最後の防御策として使用される、より毒性が高く、より高価な抗生物質でしか、処置することができない。ＭＲＳＡは職員を介して患者から患者へと容易に拡散しうるので、世界中の病院が、ＭＲＳＡ管理上の問題に直面している。したがって、ＭＲＳＡの伝播を減らし感染患者の診断および処置を改良するために、ＭＲＳＡを検出および／または同定するための迅速かつ簡便なスクリーニング検査または診断検査が必要とされている。
【０００４】
黄色ブドウ球菌におけるメチシリン耐性は、それが、β−ラクタム系抗生物質に細胞が曝された時に正常なβ−ラクタム耐性ペニシリン結合タンパク質（ＰＢＰ）の生合成機能を引き継ぐ過剰なＰＢＰをコードするＤＮＡを、他のコアグラーゼ陰性ブドウ球菌（ＣＮＳ）から獲得したことによるという点でユニークである。黄色ブドウ球菌は通常、四つのＰＢＰを含有し、そのうち、ＰＢＰ１、２および３は必須である。ＰＢＰ２ａ（またはＰＢＰ２’）と呼ばれるＭＲＳＡ中の低親和性ＰＢＰは染色体ｍｅｃＡ遺伝子によってコードされ、β−ラクタム耐性トランスペプチダーゼとして機能する。ｍｅｃＡ遺伝子はメチシリン感受性黄色ブドウ球菌には存在しないが、ブドウ球菌の他の種には広く分布し、高度に保存されている（非特許文献３：Ｕｂｕｋａｔａら，１９９０，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．３４：１７０−１７２）。
【０００５】
黄色ブドウ球菌Ｎ３１５株（１９８２年に日本で分離されたもの）に由来するｍｅｃＡ遺伝子周辺のＤＮＡ領域のヌクレオチド配列決定は、染色体に挿入されるブドウ球菌カセット染色体ｍｅｃ（ＳＣＣｍｅｃ）と呼ばれる新規遺伝要素によってｍｅｃＡ遺伝子が運ばれるという発見をもたらした。ＳＣＣｍｅｃは、末端逆方向および直列反復配列、一組の部位特異的リコンビナーゼ遺伝子（ｃｃｒＡおよびｃｃｒＢ）、ならびにｍｅｃＡ遺伝子複合体の存在を特徴とする可動遺伝要素である（非特許文献４：Ｉｔｏら，１９９９，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４３：１４４９−１４５８；非特許文献５：Ｋａｔａｙａｍａら，２０００，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４４：１５４９−１５５５）。ＳＣＣｍｅｃは、ｃｃｒＡおよびｃｃｒＢを含むユニークな一組のリコンビナーゼ遺伝子の機能により、黄色ブドウ球菌Ｎ３１５株の染色体から正確に切り出され、特異的黄色ブドウ球菌染色体部位に、同じ向きに組み込まれる。ＭＲＳＡ ＮＣＴＣ１０４４２株（１９６１年に英国で分離された最初のＭＲＳＡ株）および８５／２０８２株（１９８５年に分離されたニュージーランドからの株）に由来するｍｅｃＡ遺伝子周辺のＤＮＡのクローニングおよび配列解析は、類似するＳＣＣｍｅｃの構造的特徴を共有する二つの新規遺伝要素の発見をもたらした。これら三つのＳＣＣｍｅｃは、その株が分離された年に基づいて、タイプＩ（ＮＣＴＣ１０４４２）、タイプＩＩ（Ｎ３１５）およびタイプＩＩＩ（８５／２０８２）と命名された（非特許文献６：Ｉｔｏら，２００１，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４５：１３２３−１３３６）。Ｈｉｒａｍａｔｓｕらは、ＳＣＣｍｅｃ ＤＮＡがメチシリン感受性黄色ブドウ球菌（ＭＳＳＡ）の染色体中の特異的部位に組み込まれることを発見した。ＳＣＣｍｅｃ ＤＮＡの左境界および右境界周辺の領域（すなわちそれぞれａｔｔＬおよびａｔｔＲ）のヌクレオチド配列、ならびにＳＣＣｍｅｃ ＤＮＡ組み込み部位付近の領域（すなわちＳＣＣｍｅｃ ＤＮＡの細菌染色体付着部位であるａｔｔＢｓｃｃ）のヌクレオチド配列を解析した。ａｔｔＬ、ａｔｔＲ ａｔｔＢｓｃｃ部位の配列解析により、ａｔｔＢｓｃｃは新規オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）ｏｒｆＸの３’末端に位置することが明らかになった。ｏｒｆＸは、以前に同定された機能未知のポリペプチドのいくつかと配列ホモロジーを示す推定１５９アミノ酸ポリペプチドをコードする（非特許文献７：Ｉｔｏら，１９９９，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４３：１４４９−１４５８）。最近になって、タイプＩＶおよびタイプＶと呼ばれる新しいタイプのＳＣＣｍｅｃが記載された（非特許文献８：Ｍａら，２００２，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４６：１１４７−１１５２、非特許文献９：Ｉｔｏら，２００４，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４８：２６３７−２６５１、非特許文献１０：Ｏｌｉｖｅｉｒａら，２００１，Ｍｉｃｒｏｂ．Ｄｒｕｇ Ｒｅｓｉｓｔ．７：３４９−３６０）。黄色ブドウ球菌ＣＡ０５株および８／６−３Ｐ株に由来する新しいＳＣＣｍｅｃタイプＩＶの右端の配列解析により、それらの配列は、黄色ブドウ球菌Ｎ３１５株のタイプＩＩ ＳＣＣｍｅｃのものと２０００ヌクレオチドにわたってほぼ同一であることが明らかになった（非特許文献８および６：Ｍａら，２００２，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４６：１１４７−１１５２；Ｉｔｏら，２００１，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４５：１３２３−１３３６）。今のところ、黄色ブドウ球菌ＨＤＥ２８８株およびＰＬ７２株に由来するＳＣＣｍｅｃタイプＩＶの右端に関する配列データは公表されていない（非特許文献１０：Ｏｌｉｖｅｉｒａら，２００１，Ｍｉｃｒｏｂ．Ｄｒｕｇ Ｒｅｓｉｓｔ．７：３４９−３６０）。
【０００６】
ｍｅｃＡ遺伝子および黄色ブドウ球菌特異的染色体配列の検出に基づいてＭＲＳＡを検出し同定するための方法は、既に記載されている（非特許文献１１：Ｓａｉｔｏら，１９９５，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３３：２４９８−２５００；非特許文献１２：Ｕｂｕｋａｔａら，１９９２，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３０：１７２８−１７３３；非特許文献１３：Ｍｕｒａｋａｍｉら，１９９１，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２９：２２４０−２２４４；非特許文献１４：Ｈｉｒａｍａｔｓｕら，１９９２，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３６：４４５−４５３）。しかし、ｍｅｃＡ遺伝子は、黄色ブドウ球菌とコアグラーゼ陰性ブドウ球菌の両方に広く分布するので、これらの方法でＭＲＳＡをメチシリン耐性ＣＮＳと区別することは必ずしも可能とは限らない（非特許文献１５：Ｓｕｚｕｋｉら，１９９２，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ．Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．３６：４２９−４３４）。この問題に対処するために、Ｈｉｒａｍａｔｓｕらは、ＭＲＳＡに特異的なＰＣＲに基づくアッセイを開発した。このアッセイでは、３タイプのＳＣＣｍｅｃ ＤＮＡの右端にハイブリダイズするプライマーを、ＳＣＣｍｅｃ組み込み部位の右側にあるヌクレオチド配列に対応する黄色ブドウ球菌染色体に特異的なプライマーと組み合わせて利用する（特許文献１：米国特許第６，１５６，５０７号、以下「５０７号特許」という）。他のブドウ球菌種（例えばスタフィロコッカス・エピデルミディス（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）およびスタフィロコッカス・ヘモリティカス（Ｓ．ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ））におけるＳＣＣｍｅｃ組み込み部位周辺のヌクレオチド配列は、黄色ブドウ球菌に見出されるものとは異なっている。したがってこのＰＣＲアッセイはＭＲＳＡの検出に関して特異的である。
【０００７】
「５０７号特許」に記載のＰＣＲアッセイは、ＳＣＣｍｅｃ ＤＮＡの「ＭＲＥＰタイピング」（ｍｅｃ ｒｉｇｈｔ ｅｘｔｒｅｍｉｔｙ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ（ｍｅｃ右端多型））の開発にもつながった（非特許文献６：Ｉｔｏら，２００１，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４５：１３２３−１３３６；非特許文献１６：Ｈｉｒａｍａｔｓｕら，１９９６，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．２：１１７−１２９）。ＭＲＥＰタイピング法では、３タイプのＳＣＣｍｅｃ間で、三つのＭＲＥＪタイプのヌクレオチド配列が、組み込み部位に隣接するＳＣＣｍｅｃ ＤＮＡの右端で異なっているという事実を利用する。タイプＩと比較すると、タイプＩＩＩはユニークなヌクレオチド配列を持ち、タイプＩＩはＳＣＣｍｅｃの右末端に１０２ヌクレオチドの挿入を持つ。Ｈｉｒａｍａｔｓｕらが記述したＭＲＥＰタイピング法では以下の命名が用いられる：ＳＣＣｍｅｃタイプＩはＭＲＥＰタイプｉであり、ＳＣＣｍｅｃタイプＩＩはＭＲＥＰタイプｉｉであり、ＳＣＣｍｅｃタイプＩＩＩはＭＲＥＰタイプｉｉｉである。
【０００８】
ＳＣＣｍｅｃタイプＩＩおよびＩＶは右端まで同じヌクレオチド配列を持つので、上記のＭＲＥＰタイピング法では、Ｈｉｒａｍａｔｓｕらが記載した新しいＳＣＣｍｅｃタイプＩＶ（非特許文献８：Ｍａら，２００２，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４６：１１４７−１１５２）をＳＣＣｍｅｃタイプＩＩと区別することができない。
【０００９】
ＭＲＥＪという表現は、ｍｅｃ右端接合部≪ｍｅｃ ｒｉｇｈｔ ｅｘｔｒｅｍｉｔｙ ｊｕｎｃｔｉｏｎ≫を指す。ＭＲＥＪは、長さが約１キロ塩基（ｋｂ）で、ＳＣＣｍｅｃ右端に由来する配列と、ＳＣＣｍｅｃ組み込み部位の右側にある細菌染色体ＤＮＡに由来する配列とを含んでいる。ＭＲＥＰタイプｉ〜ｉｉｉと分類された株は、ＭＲＥＪタイプｉ〜ｉｉｉに対応する。ＭＲＥＪタイプｉｖ、ｖ、ｖｉ、ｖｉｉ、ｖｉｉｉ、ｉｘ、およびｘは、以前に特徴づけられている（非特許文献１７：Ｈｕｌｅｔｓｋｙら，２００４，Ｊ Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４２：１８７５−１８８４；特許文献２：国際特許出願ＰＣＴ／ＣＡ０２／００８２４）。
【００１０】
本明細書に記載する実施形態は、ＭＲＳＡ検出用のＮＡＴアッセイを改良するために、より多くのＭＲＳＡ株の検出を可能にする、ＳＣＣｍｅｃ右端接合部配列データの作成に関する。世界中のＭＲＳＡ株のほとんどを検出するために、より偏在的なプライマーおよびプローブを開発する必要がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】米国特許第６，１５６，５０７号
【特許文献２】国際特許出願ＰＣＴ／ＣＡ０２／００８２４
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｍｕｒｒａｙら編，１９９９，Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，第７版，ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ，ワシントン
【非特許文献２】Ｏｌｉｖｅｉｒａら，２００２，Ｌａｎｃｅｔ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ．２：１８０−９
【非特許文献３】Ｕｂｕｋａｔａら，１９９０，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．３４：１７０−１７２）
【非特許文献４】Ｉｔｏら，１９９９，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４３：１４４９−１４５８
【非特許文献５】Ｋａｔａｙａｍａら，２０００，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４４：１５４９−１５５５）
【非特許文献６】Ｉｔｏら，２００１，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４５：１３２３−１３３６
【非特許文献７】Ｉｔｏら，１９９９，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４３：１４４９−１４５８
【非特許文献８】Ｍａら，２００２，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４６：１１４７−１１５２
【非特許文献９】Ｉｔｏら，２００４，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４８：２６３７−２６５１
【非特許文献１０】Ｏｌｉｖｅｉｒａら，２００１，Ｍｉｃｒｏｂ．Ｄｒｕｇ Ｒｅｓｉｓｔ．７：３４９−３６０
【非特許文献１１】Ｓａｉｔｏら，１９９５，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３３：２４９８−２５００
【非特許文献１２】Ｕｂｕｋａｔａら，１９９２，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３０：１７２８−１７３３
【非特許文献１３】Ｍｕｒａｋａｍｉら，１９９１，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２９：２２４０−２２４４
【非特許文献１４】Ｈｉｒａｍａｔｓｕら，１９９２，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３６：４４５−４５３
【非特許文献１５】Ｓｕｚｕｋｉら，１９９２，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ．Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．３６：４２９−４３４
【非特許文献１６】Ｈｉｒａｍａｔｓｕら，１９９６，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．２：１１７−１２９
【非特許文献１７】Ｈｕｌｅｔｓｋｙら，２００４，Ｊ Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４２：１８７５−１８８４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
あらゆるメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）株の存在および／またはそれに由来する核酸の量を決定するための特異的、偏在的かつ高感度な方法および組成物を、ここに提供する。新規ＭＲＥＪタイプｘｉ〜ｘｘの検出および定量を可能にする方法、組成物およびキットを開示する。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
いくつかの態様は、細菌核酸を含む試料中のＭＲＳＡ細菌の存在を検出するための方法に関する。ＭＲＳＡ株は、ｍｅｃＡ遺伝子を含むＳＣＣｍｅｃ核酸インサートを持っている。ＳＣＣｍｅｃインサートはＭＲＳＡ細菌をメチシリン耐性にする。ＳＣＣｍｅｃは、オープンリーディングフレームｏｒｆＸの３’末端で細菌ＤＮＡ中に挿入されて、多型右端接合部（ＭＲＥＪ）を生成する。ＭＲＥＪタイプｘｉ〜ｘｘの多型ＭＲＥＪ核酸にハイブリダイズする、ＭＲＳＡ株に特異的な少なくとも一つのプライマーおよび／またはプローブを用意する。プライマーおよび／またはプローブを試料の核酸とアニールさせる。アニールしたプライマーおよび／またはプローブは、ＭＲＥＪの存在を示す。
【００１５】
好ましい実施形態では、二つ以上のプライマーおよび／またはプローブを用意する。プライマーおよび／またはプローブは、実質的に同じアニーリング条件下で、ＭＲＥＪ核酸にアニールすることができる。プライマーおよび／またはプローブは、少なくとも１０ヌクレチド長、１２ヌクレオチド長、１４ヌクレオチド長、１６ヌクレオチド長、１８ヌクレオチド長、２０ヌクレオチド長、２５ヌクレオチド長、または３０ヌクレオチド長であることができる。プローブおよびプライマーは、同じ物理的容器内で一緒に使用するか、異なる物理的容器内で使用することができる。
【００１６】
いくつかの実施形態では、プライマーおよび／またはプローブが、配列番号１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２５、２６、３９、４０、４１、４２、５５、および５６の核酸のいずれか一つとアニールする。例えばいくつかの実施形態では、表４に列挙するプライマーおよび／またはプローブが、以下のＭＲＥＪ核酸を含むＭＲＳＡ細菌を検出するために使用される。
【表１】
【００１７】
いくつかの実施形態では、ストリンジェントな条件下で二つ以上のＭＲＥＪタイプ株にアニールするプライマーおよび／またはプローブが用意される。例えば、好ましい実施形態では、配列番号３１、３２、３３が、ＭＲＥＪタイプｘｉ〜ｘｖおよびｘｖｉｉ〜ｘｘの検出用に用意される。
【００１８】
さらなる実施形態では、タイプｘｉ〜ｘｘのＭＲＥＪを持つ少なくとも一つのＭＲＳＡを検出するために、プライマーおよび／またはプローブが、二つ一組にして用意される。したがっていくつかの実施形態では、配列番号３４／４５、３４／３０、３４／７６、および３４／４４からなる群より選択される少なくとも一対のオリゴヌクレオチドが、ＭＲＥＪタイプｘｉの検出用に用意される。別の実施形態では、配列番号３５／４５、３５／３０、３５／６２、および３５／４４からなる群より選択される少なくとも一対のオリゴヌクレオチドが、ＭＲＥＪタイプｘｉｉの検出用に用意される。さらに別の実施形態では、配列番号２９／４５、２９／３０、２９／７６、および２９／４４からなる群より選択される少なくとも一対のオリゴヌクレオチドが、ＭＲＥＪタイプｘｉｉｉの検出用に用意される。さらに別の実施形態では、配列番号２９／４５、２９／３０、２９／５９、および２９／４４からなる群より選択される少なくとも一対のオリゴヌクレオチドが、ＭＲＥＪタイプｘｉｖの検出用に用意される。別の実施形態では、配列番号２４／４５、２４／３０、２４／６２、および２４／４４からなる群より選択される少なくとも一対のオリゴヌクレオチドが、ＭＲＥＪタイプｘｖの検出用に用意される。さらに別の実施形態では、配列番号３６および４４のオリゴヌクレオチドが、ＭＲＥＪタイプｘｖｉの検出用に用意される。さらに別の実施形態では、配列番号４／４５、４／３０、４／６２、および４／４４からなる群より選択される少なくとも一対のオリゴヌクレオチドが、ＭＲＥＪタイプｘｖｉｉの検出用に用意される。さらに別の実施形態では、７／４５、７／３０、７／５９および７／４４からなる群より選択される少なくとも一対のオリゴヌクレオチドが、ＭＲＥＪタイプｘｖｉｉｉの検出用に用意される。別の実施形態では、９／４５、９／３０、９／５９および９／４４からなる群より選択される少なくとも一対のオリゴヌクレオチドが、ＭＲＥＪタイプｘｉｘの検出用に用意される。さらに別の実施形態では、配列番号８／４５、８／３０、８／５９、および８／４４からなる群より選択される少なくとも一対のオリゴヌクレオチドが、ＭＲＥＪタイプｘｘの検出用に用意される。
【００１９】
いくつかの実施形態では、少なくとも二対のプライマーが、二つ以上のＭＲＥＪタイプを検出するために用意される。
【００２０】
別の好ましい実施形態では、表５に列挙するプライマーおよび／またはプローブが、以下のＭＲＥＪ核酸を含むＭＲＳＡ細菌を検出するために、一緒に用意される。
【表２】
【００２１】
さらなる実施形態では、上記の方法が、所定のＭＲＥＪタイプに特異的なプライマーおよび／またはプローブを用意すること、ならびにアニールしたプローブまたはプライマーを、所定のＭＲＥＪタイプの存在の指標として検出することを、さらに含む。
【００２２】
さらに別の実施形態では、表６に列挙する配列番号に特異的なプライマーおよび／またはプローブが、以下のＭＲＥＪ核酸を含むＭＲＳＡ細菌を検出するために用意される。
【表３】
【００２３】
いくつかの実施形態では、プライマーが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）ならびにその変形、例えばネステッドＰＣＲおよびマルチプレックスＰＣＲ、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、核酸配列に基づく増幅法（ＮＡＳＢＡ）、自己持続配列複製法（３ＳＲ）、鎖置換増幅法（ＳＤＡ）、分枝ＤＮＡシグナル増幅法（ｂＤＮＡ）、転写仲介増幅法（ＴＭＡ）、サイクリングプローブ技術（ＣＰＴ）、固相増幅法（ＳＰＡ）、ヌクレアーゼ依存的シグナル増幅法（ＮＤＳＡ）、ローリングサークル増幅法、固定鎖置換増幅法、固相（固定化）ローリングサークル増幅法、Ｑβレプリカーゼ増幅法および他のＲＮＡポリメラーゼによる技法などといった増幅反応に用いられる。
【００２４】
好ましい実施形態では、ＰＣＲが、試料中の核酸を増幅するために用いられる。
【００２５】
別の実施形態では、ストリンジェントな条件下で配列番号１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２５、２６、３９、４０、４１、４２、５５、および５６の核酸のいずれかとハイブリダイズし、ｘｉ〜ｘｘから選択されるタイプの一つ以上のＭＲＥＪとハイブリダイズする、少なくとも１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、または３０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドが用意される。
【００２６】
別の実施形態では、プライマーおよび／またはプローブ対が、タイプｘｉ〜ｘｘの全てのＭＲＳＡを検出するために用意される。例えば、一定の実施形態では、表７に列挙するプライマー対（またはプローブ）が用意される。
【表４】
【００２７】
上述した方法のさらなる実施形態では、配列番号３１、３２、および３３のいずれか一つに定義されるヌクレオチド配列を持つ内部プローブが用意される。
【００２８】
さらに別の実施形態では、ＭＲＥＪタイプｘｉ〜ｘｘの検出に使用されるプライマーおよび／またはプローブが、ＭＲＥＪタイプｉ〜ｘのＭＲＳＡを検出する能力を持つプライマーおよび／またはプローブ（例えば同時係属中の国際特許出願ＰＣＴ／ＣＡ０２／００８２４に開示されているプライマーまたはプローブなど）と組み合わせて使用される。
【００２９】
本発明の別の態様は、配列番号１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２５、２６、３９、４０、４１、４２、５５、および５６の核酸の少なくとも一つを含むヌクレオチド配列またはその相補体に関する。さらなる実施形態は、配列番号１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２５、２６、３９、４０、４１、４２、５５、および５６の核酸の少なくとも３０、５０、１００、１５０、２００、３００、または５００連続ヌクレオチドを含む、配列番号１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２５、２６、３９、４０、４１、４２、５５、および５６の核酸のフラグメント、またはその相補体に関する。さらなる態様は、配列番号１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２５、２６、３９、４０、４１、４２、５５、および５６の核酸配列を含むベクター、ならびに配列番号１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２５、２６、３９、４０、４１、４２、５５、および５６の核酸配列を含むベクターを含む宿主細胞（例えば大腸菌宿主細胞）に関する。
【００３０】
さらに別の態様は、配列番号１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２５、２６、３９、４０、４１、４２、５５、および５６のいずれか一つにアニールする、少なくとも１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５または３０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドに関する。例えば、いくつかの実施形態は、配列番号３１、３２、または３３のいずれか一つの配列を含むオリゴヌクレオチドである。さらに別の実施形態は、配列番号１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２５、２６、３９、４０、４１、４２、５５、および５６の一つだけにアニールする、少なくとも１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５または３０ヌクレオチド長であるオリゴヌクレオチドに関する。
【００３１】
さらに別の態様は、プライマーおよび／またはプローブを含むキットに関する。プライマーおよび／またはプローブは、少なくとも１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、または３０ヌクレオチド長であり、ＭＲＥＪタイプｘｉ〜ｘｘの核酸のいずれか一つとハイブリダイズすることができる。さらなる実施形態は、少なくとも１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、または３０ヌクレオチド長であって配列番号１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２５、２６、３９、４０、４１、４２、５５、および５６の核酸のいずれか一つとハイブリダイズするプライマーおよび／またはプローブを含むキットに関する。いくつかの実施形態は、プライマー対を含むキットに関する。例えば、いくつかの実施形態では、キットが以下のプライマー対を含む。
【表５】
【発明の効果】
【００３２】
本発明により、今までに利用可能であった方法では検出することができなかったＭＲＳＡの検出を可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】ＳＣＣｍｅｃ右端接合部を表す。新規ＭＲＥＪタイプｘｉ〜ｘｘを配列決定するために使用するプライマーの位置および向きが示されている。ＭＲＥＪタイプｘｉ、ｘｉｉ、ｘｉｉｉ、ｘｉｖ、ｘｖ、ｘｖｉ、ｘｖｉｉ、ｘｖｉｉｉ、ｘｉｘ、およびｘｘを配列決定するために、配列番号４、２４、２７−３０、３６、４３−４５、５０−５７、７８−８６を使用した。矢印とその下の数字は、プライマーの位置とそれぞれの配列番号を示す。「ｗａｌｋ」は、ＳＣＣｍｅｃ配列上で、ＤＮＡ Ｗａｌｋｉｎｇ ＳｐｅｅｄＵｐ Ｋｉｔ（Ｓｅｅｇｅｎｅ、カリフォルニア州デルマー）のＤＮＡ Ｗａｌｋｉｎｇ ＡＣＰ（ＤＷ−ＡＰＣ）プライマーがアニールしていた位置を示す。
【図２】ＳＣＣｍｅｃ右端接合部と、新規ＭＲＥＪタイプｘｉ、ｘｉｉ、ｘｉｉｉ、ｘｉｖ、ｘｖ、ｘｖｉ、ｘｖｉｉ、ｘｖｉｉｉ、ｘｉｘ、およびｘｘの検出および同定用に本発明で開発されたプライマー（配列番号４、７−９、２４、２９−３６、４４、４５、５９、６２、７３）の位置を表す。アンプリコンのサイズを表１１に列挙する。ＭＲＥＪタイプの下にある括弧内の数字は、ＭＲＥＪ配列番号を示す。矢印はプライマーの位置を示し、その下の数字はそれぞれの配列番号を示す。黒いバーとその下の数字はプローブの位置とそれぞれの配列番号を示す。ＭＲＥＪタイプｘｖｉ中の「ｄｅｌｅｔｉｏｎ」は、ｏｒｆＸ中の２６９ｂｐ欠失の位置を示す。
【図３Ａ】ｏｒｆＸ、組み込み部位、ＳＳＣｍｅｃ右端の最初の５３５ヌクレオチドを含む１９の代表的ＭＲＥＪタイプｉ〜ｉｘおよびｘｉ〜ｘｘの多重配列アラインメントを示す。ＭＲＥＪタイプｉ〜ｉｘ配列は、それぞれ、同時係属中の国際特許出願ＰＣＴ／ＣＡ０２／００８２４配列番号１、２、２３２、４６、５０、１７１、１６６、１６７および１６８から採った。配列番号１８はＭＲＥＪタイプｘｉに対応し、配列番号２０はＭＲＥＪタイプｘｉｉに対応し、配列番号１５はＭＲＥＪタイプｘｉｉｉに対応し、配列番号１６はＭＲＥＪタイプｘｉｖに対応し、配列番号５６はＭＲＥＪタイプｘｖに対応し、配列番号２１はＭＲＥＪタイプｘｖｉに対応し、配列番号５５はＭＲＥＪタイプｘｖｉｉに対応し、配列番号３９はＭＲＥＪタイプｘｖｉｉｉに対応し、配列番号４１はＭＲＥＪタイプに対応し、そして配列番号４２はＭＲＥＪタイプｘｘに対応する。
【図３Ｂ】ｏｒｆＸ、組み込み部位、ＳＳＣｍｅｃ右端の最初の５３５ヌクレオチドを含む１９の代表的ＭＲＥＪタイプｉ〜ｉｘおよびｘｉ〜ｘｘの多重配列アラインメントを示す。ＭＲＥＪタイプｉ〜ｉｘ配列は、それぞれ、同時係属中の国際特許出願ＰＣＴ／ＣＡ０２／００８２４配列番号１、２、２３２、４６、５０、１７１、１６６、１６７および１６８から採った。配列番号１８はＭＲＥＪタイプｘｉに対応し、配列番号２０はＭＲＥＪタイプｘｉｉに対応し、配列番号１５はＭＲＥＪタイプｘｉｉｉに対応し、配列番号１６はＭＲＥＪタイプｘｉｖに対応し、配列番号５６はＭＲＥＪタイプｘｖに対応し、配列番号２１はＭＲＥＪタイプｘｖｉに対応し、配列番号５５はＭＲＥＪタイプｘｖｉｉに対応し、配列番号３９はＭＲＥＪタイプｘｖｉｉｉに対応し、配列番号４１はＭＲＥＪタイプに対応し、そして配列番号４２はＭＲＥＪタイプｘｘに対応する。
【図３Ｃ】ｏｒｆＸ、組み込み部位、ＳＳＣｍｅｃ右端の最初の５３５ヌクレオチドを含む１９の代表的ＭＲＥＪタイプｉ〜ｉｘおよびｘｉ〜ｘｘの多重配列アラインメントを示す。ＭＲＥＪタイプｉ〜ｉｘ配列は、それぞれ、同時係属中の国際特許出願ＰＣＴ／ＣＡ０２／００８２４配列番号１、２、２３２、４６、５０、１７１、１６６、１６７および１６８から採った。配列番号１８はＭＲＥＪタイプｘｉに対応し、配列番号２０はＭＲＥＪタイプｘｉｉに対応し、配列番号１５はＭＲＥＪタイプｘｉｉｉに対応し、配列番号１６はＭＲＥＪタイプｘｉｖに対応し、配列番号５６はＭＲＥＪタイプｘｖに対応し、配列番号２１はＭＲＥＪタイプｘｖｉに対応し、配列番号５５はＭＲＥＪタイプｘｖｉｉに対応し、配列番号３９はＭＲＥＪタイプｘｖｉｉｉに対応し、配列番号４１はＭＲＥＪタイプに対応し、そして配列番号４２はＭＲＥＪタイプｘｘに対応する。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）は、個体にとって深刻な健康への脅威となり、ＭＲＳＡを検出、同定、および定量するための迅速かつ簡便な方法の必要性は明白である。
【００３５】
今までに利用可能であった方法では検出することができなかったＭＲＳＡの検出を可能にするＭＲＳＡ株中に存在する新規ＤＮＡ配列およびＤＮＡ編成を、ここに開示する。この新規ＤＮＡ配列およびＤＮＡ編成は、ＭＲＳＡ ＤＮＡのＳＣＣｍｅｃ領域に存在する。ＭＲＳＡ株は、ｍｅｃＡ遺伝子を含むＳＣＣｍｅｃインサートを含んでいる。ＳＣＣｍｅｃは、ｏｒｆＸオープンリーディングフレームの３’末端で細菌ＤＮＡに挿入される。細菌ＤＮＡへのＳＣＣｍｅｃの挿入は多型右端接合部を生成する。以下、これをＭＲＥＪ（≪ｍｅｃ ｒｉｇｈｔ ｅｘｔｒｅｍｉｔｙ ｊｕｎｃｔｉｏｎ＝ｍｅｃ右端接合部≫を意味する）という。ＭＲＥＪ領域には、ＳＣＣｍｅｃ右端由来の配列と、右ＳＣＣｍｅｃ組み込み部位に隣接する染色体ＤＮＡ由来の配列とが含まれる。本発明の実施形態は、後述するＭＲＳＡの検出および同定に役立つプライマーおよび／またはプローブを導き出す親配列として使用することができる本明細書に開示する新規ＭＲＥＪの配列および編成に関する。本発明の別の態様は、新規ＭＲＥＪ配列から導き出される新規プライマーおよび／またはプローブ、ならびにＭＲＥＪタイプｘｉ〜ｘｘにハイブリダイズするＭＲＳＡ検出用のプライマーおよび／またはプローブを含むキットに関する。
【００３６】
本明細書には、核酸を含む試料中のＭＲＳＡ株の存在または非存在の検出に備えた方法も開示する。ＭＲＳＡ株に特異的であって、本明細書に開示するタイプｘｉ〜ｘｘのＭＲＥＪ核酸にアニールする、少なくとも一つのプライマーおよび／またはプローブを用意する。そのプライマーおよび／またはプローブを試料の核酸にアニールさせることができる。アニールしたプライマーおよび／またはプローブの検出は、そのプライマーおよび／またはプローブにハイブリダイズするＭＲＥＪタイプのＭＲＳＡが存在することを示す。
【００３７】
プライマーおよびプローブ
本明細書で使用する用語「プライマー」および「プローブ」は、オリゴヌクレオチドまたは核酸に限定されるわけではなく、ヌクレオチドの他に、ヌクレオチドの類似体である分子も包含する。本明細書で使用したヌクレオチドおよびポリヌクレオチドは、ポリデオキシリボヌクレオチド（２−デオキシ−Ｄ−リボースを含有）、ポリリボヌクレオチド（Ｄ−リボースを含有）、プリン塩基またはピリミジン塩基のＮ−またはＣ−グリコシドである他のあらゆるタイプのポリヌクレオチド、ならびに非ヌクレオチド主鎖を含有する他のポリマー、例えばポリアミド（例えばペプチド核酸（ＰＮＡ）およびポリモルホリノ（Ａｎｔｉ−Ｖｉｒａｌｓ，Ｉｎｃ．（オレゴン州コーバリス）からＮｅｕｇｅｎｅ（商標）ポリマーとして市販されている）、および他の合成配列特異的核酸ポリマー（ただし、これらのポリマーは、ＤＮＡおよびＲＮＡに見出されるような塩基対形成および塩基スタッキングが可能な配置で核酸塩基を含有するものとする）を総称するものとする。
【００３８】
ヌクレオチドおよびポリヌクレオチドという用語は、例えば３’−デオキシ−２’，５’−ＤＮＡ、オリゴデオキシリボヌクレオチドＮ３’→Ｐ５’ホスホロアミデート、２’−Ｏ−アルキル−置換ＲＮＡ、二本鎖および一本鎖ＤＮＡ、ならびに二本鎖および一本鎖ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッド、およびＰＮＡとＤＮＡまたはＲＮＡとのハイブリッドを包含する。この用語は、無修飾型のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドだけでなく、既知タイプの修飾、例えば当技術分野で知られるラベル、メチル化、「キャップ」、類似体による一つ以上の天然ヌクレオチドの置換、ヌクレオチド間修飾、例えば非荷電結合を持つもの（例えばメチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホロアミデート、カルバメートなど）、負荷電結合を持つもの（例えばホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）、および正荷電結合を持つもの（例えばアミノアルキルホスホロアミデート、アミノアルキルホスホトリエステル）、例えばタンパク質（ヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リジンなどを含む）などのペンダント部分を含有するもの、インターカレーター（例えばアクリジン、ソラレンなど）を持つもの、キレーター（例えば金属、放射性金属、ホウ素、酸化金属など）を含有するもの、アルキル化剤を含有するもの、修飾結合を持つもの（例えばアルファアノマー核酸など）も包含する。
【００３９】
本明細書で使用する用語「ヌクレオシド」および「ヌクレオチド」が、既知のプリン塩基およびピリミジン塩基を含有する部分だけでなく、修飾された他の複素環塩基を含有する部分も包含することは、理解されるだろう。そのような修飾として、メチル化されたプリン類もしくはピリミジン類、アシル化されたプリン類もしくはピリミジン類、または他の複素環が挙げられる。修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドは、糖部分上の修飾（例えば一つ以上のヒドロキシル基がハロゲン、脂肪族基で置き換えられるか、またはエーテル、アミンなどとして官能化される修飾）も包含するだろう。ヌクレオチドまたはポリヌクレオチドへの他の修飾は、各相補的ピリミジンまたはプリンに対して水素結合を形成するプリン塩基またはピリミジン塩基上の官能基の、転位、付加、置換、または他の形での改変を伴う。その結果得られる修飾ヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、他のそのような修飾ヌクレオチド単位と塩基対を形成しうるが、Ａ、Ｔ、Ｃ、ＧまたはＵとは塩基対を形成することができない。例えば、グアノシン（２−アミノ−６−オキシ−９−β−Ｄ−リボフラノシル−プリン）を修飾してイソグアノシン（２−オキシ−６−アミノ−９−β−Ｄ−リボフラノシル−プリン）を形成させることができる。そのような修飾は、もやはシトシンとは標準塩基対を効果的に形成しないであろうヌクレオシド塩基をもたらす。しかし、シトシン（１−β−Ｄ−リボフラノシル−２−オキシ−４−アミノ−ピリミジン）の修飾によるイソシトシン（１−β−Ｄ−リボフラノシル−２−アミノ−４−オキシ−ピリミジン）の形成は、グアノシンとは効果的に塩基対を形成しないが、イソグアノシンとは塩基対を形成するでだろう修飾ヌクレオチドをもたらす。イソシトシンはＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（ミズーリ州セントルイス）から入手することができ；イソシチジンはＳｗｉｔｚｅｒら（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３２：１０４８９−１０４９６およびその引用文献に記載の方法によって製造することができ；２’−デオキシ−５−メチル−イソシチジンは、Ｔｏｒら（１９９３）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１５：４４６１−４４６７およびその引用文献の方法によって製造することができ；イソグアニンヌクレオチドは、Ｍａｎｔｓｃｈら（１９７５）Ｂｉｏｃｈｅｍ．１４：５５９３−５６０１に記載の方法、またはＣｏｌｌｉｎｓらの米国特許第５，７８０，６１０号に記載の方法を使って製造することができる。κおよびπと呼ばれる非天然型塩基対は、２，６−ジアミノピリミジンおよびその相補体（１−メチルピラゾロ［４，３］−ピリミジン−５，７−（４Ｈ，６Ｈ）−ジオンの合成に関するＰｉｃｃｉｒｉｌｌｉら（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ ３４３：３３−３７に記載の方法によって、合成することができる。ユニークな塩基対を形成する他のそのような修飾ヌクレオチド単位は、Ｌｅａｃｈら（１９９２）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：３６７５−３６８３に記載されており、すなわち当業者には明白であるだろう。
【００４０】
プライマーおよび／またはプローブは、例えば固形支持体に結合された状態、液状、および凍結乾燥状態など、任意の適切な形態で用意することができる。
【００４１】
核酸配列へのプライマーおよび／またはプローブの特異的結合またはアニーリングは、特異的ハイブリダイゼーションによって達成される。特異的ハイブリダイゼーションが、ターゲットまたは基準核酸配列に少なくとも実質的に相補的である配列を選択することによって達成されることは、当業者には理解されるだろう。これには、オリゴヌクレオチド配列の全長にわたるオリゴヌクレオチドターゲット核酸配列の塩基対形成が含まれる。そのような配列は互いに「完全に相補的」であるということができる。あるオリゴヌクレオチドが本明細書に記載の核酸配列に対して「実質的に相補的」であるという場合、それら二つの配列は完全に相補的であってもよいし、あるいはハイブリダイゼーション時にミスマッチを形成するが、ＭＲＳＡ核酸の存在を検出するために使用される条件下でハイブリダイズする能力は保っている状態であってもよい。
【００４２】
プローブ長とプローブがターゲット配列にアニールする効率および正確さの両方との間には、正の相関関係が存在する。特に、長い配列ほど短い配列よりも融解温度（Ｔｍ）が高く、所与のターゲット配列内で繰り返される可能性が低く、その結果、非特異的なハイブリダイゼーションが最小限に抑えられる。
【００４３】
本明細書で使用する場合、「Ｔｍ」と「融解温度」は互いに交換可能な用語であり、ある二本鎖ポリヌクレオチド分子集団の５０％が一本鎖に解離した状態になる時の温度を指す。ポリヌクレオチドのＴｍを計算するための式は、当技術分野ではよく知られている。例えばＴｍは、以下の等式によって計算することができる：Ｔｍ＝６９．３＋０．４１×（Ｇ＋Ｃ）％−６−５０／Ｌ（式中、Ｌはヌクレオチド数で表したプローブの長さである）。ハイブリッドポリヌクレオチドのＴｍも、１Ｍ塩でのハイブリダイゼーションアッセイから採用された式を使って見積ることができ、ＰＣＲプライマーのＴｍを計算するためによく用いられる：［（Ａ＋Ｔの数）×２℃＋（Ｇ＋Ｃの数）×４℃］。例えばＣ．Ｒ．Ｎｅｗｔｏｎら，ＰＣＲ，第２版，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ（ニューヨーク：１９９７）の２４頁を参照されたい。構造および配列特徴を考慮してＴｍを計算するさらに洗練された他の計算方法も、当技術分野には存在する。計算されたＴｍは推定値に過ぎず、至適温度は普通、実験的に決定される。
【００４４】
高いＧ＋Ｃ含量を持つまたはパリンドローム配列を含むプライマーもしくはプローブ配列は、その意図するターゲット部位と同様に、自己ハイブリダイズする傾向がある。なぜなら、溶解状態では一般に、二分子ハイブリダイゼーションキネティクスよりも単分子ハイブリダイゼーションキネティクスの方が有利だからである。しかし、十分な数のＧ：Ｃヌクレオチド塩基対を含有するプローブを設計することも重要である。なぜなら、各Ｇ：Ｃ対は、ＡおよびＴ（またはＡおよびＵ）塩基が対を形成してターゲット配列を結合する際に見られる二つの水素結合ではなく、三つの水素結合によって結合され、それゆえに、より密着した強い結合を形成するからである。好ましいＧ＋Ｃ含量は約５０％である。
【００４５】
ハイブリダイゼーション温度は、プローブアニーリング効率とは逆に変化し、ハイブリダイゼーション混合物に含まれているかもしれない有機溶媒（例えばホルムアミド）の濃度も同様であるが、塩濃度の増加は結合を促進する。ストリンジェントなアニーリング条件下では、長いハイブリダイゼーションプローブまたは合成プライマーほど、短いものよりも効率よくハイブリダイズし、より許容的な条件下で十分である。好ましくは、ストリンジェントなハイブリダイゼーションを、基準またはターゲット核酸配列がプローブにハイブリダイズすることを許す条件下に、適切なバッファー中で行う。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、例えば約１Ｍ未満、より一般的には約５００ｍＭ未満、好ましくは約２００ｍＭ未満）の塩濃度から変動することができ、ハイブリダイゼーション温度は、（例えば、プローブの長さおよび／または核酸組成に依存して、下は０℃から２２℃を超える温度、約３０℃を超える温度、そして（ほとんどの場合）約３７℃を超える温度にまでわたりうる。長いフラグメントほど、特異的結合には高いハイブリダイゼーション温度を必要としうる。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーにはいくつかの因子が影響を及ぼすので、単一の因子の絶対尺度よりも、パラメータの組み合わせの方が大切である。「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、以下のどちらか一方または両方を指す：ａ）６×ＳＳＣ、約４５℃の後、０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃中で１回以上の洗浄、およびｂ）４００ｍＭ ＮａＣｌ、４０ｍＭ ＰＩＰＥＳ ｐＨ６．４、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５０℃または７０℃で１２〜１６時間の後、洗浄。
【００４６】
本明細書に記載する方法において、アニールしたプライマーおよび／またはプローブの検出は、直接的または間接的であることができる。例えば、プローブを被検試料にアニールさせて、それを直接検出することができる。一方、プライマーを被検試料にアニールさせた後、増幅ステップを行うこともできる。増幅産物は直接検出するか、増幅産物にアニールするプローブの検出を介して検出することができる。
【００４７】
いくつかの実施形態では、二つ以上のプライマーおよび／またはプローブを用意する。例えば、いくつかの実施形態は、ＭＲＥＪタイプｘｉ〜ｘｘを含む複数のＭＲＳＡ株を検出するための方法に関する。複数のプライマーおよび／またはプローブは、別個の物理的容器または同じ物理的容器中で行われる反応に使用することができる。さまざまなＭＲＳＡタイプについて調べる反応を、一つずつまたは同時に行うことができる。複数のプライマーを同じ物理的容器に用意する実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドを使って、最も好ましくは全てが共通の条件下でターゲット領域とアニールする能力を持つ複数のオリゴヌクレオチドを使って、マルチプレックスＰＣＲ反応を行うことができる。
【００４８】
いくつかの実施形態では、異なるＭＲＥＪタイプに特異的な複数のプライマーおよび／またはプローブを、ＭＲＥＪのタイプを決定することができるように、マルチプレックスＰＣＲ反応に用意する。検出に使用するプライマーおよび／またはプローブは、あるＭＲＥＪタイプをもう一つのＭＲＥＪタイプと区別することができるように、異なるラベルを持つことができる。本明細書で使用する用語「ラベル」は、検出可能シグナルを直接または間接的に与える能力を持つ物体を指す。典型的なラベルには、放射性同位体、蛍光分子、ビオチンなどがある。
【００４９】
ｏｒｆＸ遺伝子およびいくつかのＳＣＣｍｅｃ ＤＮＡフラグメント由来の配列は公的データベースから入手することができ、それを使って、ＭＲＳＡを検出するためのＤＮＡに基づく検査が開発されているが、本明細書に開示する新規配列データは、当技術分野で知られるアッセイを使って検出されることが今までなかったＭＲＥＪタイプｘｉ〜ｘｘのＭＲＳＡの検出を可能にする。表８に列挙するこれらの新規配列は、ＭＲＳＡの既知ＭＲＥＪ配列に基づいて開発されたＰＣＲアッセイでは予測することも検出することもできなかったであろう（米国特許第６，１５６，５０７号；国際特許出願ＰＣＴ／ＣＡ０２／００８２４；Ｉｔｏら，２００１，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４５：１３２３−１３３６；Ｈｕｌｅｔｓｋｙら，２００４，Ｊ Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４２：１８７５−１８８４；Ｍａら，２００２，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４６：１１４７−１１５２；Ｉｔｏら，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．２００４．４８：２６３７−２６５１；Ｏｌｉｖｅｉｒａら，２００１，Ｍｉｃｒｏｂ．Ｄｒｕｇ Ｒｅｓｉｓｔ．７：３４９−３６０）。したがって、これらの新規ＭＲＥＪ配列は、ＭＲＥＪタイプｘｉ〜ｘｘを持つＭＲＳＡ株を検出および／または同定するためのプライマーおよびプローブを当業者が設計することを可能にするので、ＭＲＳＡ診断用の現在のＮＡＴアッセイを改良するものである。
【００５０】
オリゴヌクレオチドプライマーおよび／またはプローブの設計および合成
ハイブリダイゼーション用のプローブおよびＤＮＡ増幅用のプライマーを含めて、全てのオリゴヌクレオチドを、ハイブリダイゼーションまたはＰＣＲ増幅に関するその適合性について、公的または商業的に入手することができるコンピュータソフトウェア、例えばＧｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎパッケージプログラム、ならびにＯｌｉｇｏ（商標）６およびＭＦＯＬＤ３．０プライマー解析ソフトウェアなどを用いるコンピュータ解析によって評価した。ＰＣＲプライマー対の潜在的適合性も、その合成に先だって、１ヌクレオチドの長いストレッチや３’末端の高いＧまたはＣ残基比率などといった望ましくない特徴が存在しないことを確認することによって評価した（Ｐｅｒｓｉｎｇら，１９９３，Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，ワシントン）。オリゴヌクレオチド増幅プライマーは、自動ＤＮＡ合成装置（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使って合成した。
【００５１】
プライマーまたはプローブのオリゴヌクレオチド配列は、二重鎖ＤＮＡのどちらの鎖に由来してもよい。プライマーまたはプローブは、塩基Ａ、Ｇ、Ｃ、もしくはＴまたは類似体からなることができ、四つの天然ヌクレオチドのいずれとも対を形成するヌクレオチド類似体を使って、一つ以上の選択したヌクレオチド位置で縮重させてもよい（Ｎｉｃｈｏｌｓら，１９９４，Ｎａｔｕｒｅ ３６９：４９２−４９３）。プライマーおよびプローブは、ロックト核酸（ＬＮＡ）（Ｋｏｓｋｉｎら，１９９８，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ５４：３６０７−３６３０）や、ペプチド核酸（ＰＮＡ）（Ｅｇｈｏｌｍら，１９９３，Ｎａｔｕｒｅ ３６５：５６６−５６８）などのヌクレオチド類似体も含有しうる。プライマーまたはプローブは任意の適切な長さを持つことができ、ＭＲＥＪタイプｘｉ〜ｘｘを持つＭＲＳＡの検出に適した専有フラグメント由来のまたは選択したデータベース配列由来のＤＮＡ配列内で、どこでも選択することができる。好ましい実施形態では、プライマーおよび／またはプローブが、少なくとも１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、または３０ヌクレオチド長である。
【００５２】
所与のターゲット微生物遺伝子には変異体が自然界に存在し、それは進化中にその遺伝子内で起こった配列変異に起因すると考えられる（Ｗａｔｓｏｎら，１９８７，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｅ，第４版，Ｔｈｅ Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、カリフォルニア州メンローパーク；Ｌｅｗｉｎ，１９８９，Ｇｅｎｅｓ ＩＶ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ニューヨーク州ニューヨーク）。例えば、同じ微生物種の異なる株は、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション部位に一つ以上のヌクレオチド変異を持ちうる。ある特定遺伝子に変異核酸および／または配列が存在すること、および配列変異の頻度は所与の遺伝子産物に対する進化中の選択圧に依存することは、当業者には容易に理解される。二つのＰＣＲプライマー間の領域に関する変異配列の検出は、増幅産物を配列決定することによって達成しうる。一方、プライマーハイブリダイゼーション部位とオーバーラップする配列変異を検出するには、そのハイブリダイゼーション部位の外側にあるＰＣＲプライマーを使った、より大きなＤＮＡターゲットの増幅と、それに続く配列決定とが必要になる。同じような戦略を使って、プローブのハイブリダイゼーション部位における変異を検出することができる。変異ＭＲＥＪへのハイブリダイゼーションまたは増幅に役立つ変異プライマーおよび／またはプローブ配列が考えられるのと同様に、ターゲット核酸および／もしくは配列またはその一部の分岐が増幅プライマーまたはプローブの感度および／または特異性および／または偏在性に著しい影響を及ぼさない限りにおいて、変異ＭＲＥＪ配列も考えられる。
【００５３】
本明細書に明示的に記載するオリゴヌクレオチド配列以外のオリゴヌクレオチド配列であって、ＭＲＳＡの検出および／または同定に適しているオリゴヌクレオチド配列も、本明細書に開示する新規ＭＲＥＪ配列または選択した公的データベース配列から導き出すことができる。例えば、オリゴヌクレオチドプライマーまたはプローブは、選ばれたものより短くても（ただし少なくとも１０ヌクレオチド長）、長くてもよく；本明細書に開示するＭＲＥＪ配列中または公的データベースから選択した配列中の、他のどこを選択してもよい。さらに、本明細書に開示するオリゴヌクレオチドの変異体を設計することもできる。ターゲットＤＮＡもしくはその変異体が所与のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズするか、またはターゲットＤＮＡもしくはその変異体を所与のオリゴヌクレオチドＰＣＲプライマー対によって増幅することができるならば、逆もまた真であり、所与のターゲットＤＮＡは変異オリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズするか、変異オリゴヌクレオチドＰＣＲプライマーによって増幅されうる。あるいは、ＰＣＲ以外の増幅方法に使用するためのオリゴヌクレオチドをＭＲＥＪ配列から設計してもよい。本明細書に開示するプライマーおよび／またはプローブは、ＭＲＥＪタイプｘｉ〜ｘｘの特異的かつ偏在的なオリゴヌクレオチドプローブおよび／または増幅プライマーの由来源として使用されるゲノムＤＮＡ配列をターゲットとすることによって設計された。専有フラグメントまたは公的データベース配列をその特異性および偏在性ゆえに選択すれば、そのサブセットも特異的かつ偏在的になる可能性が増加する。したがって、診断的目的に適したオリゴヌクレオチドの選択および評価は多くの努力を必要とするが、診断的目的に適した表９、１０および１１に列挙するもの以外のオリゴヌクレオチドを、選択したＤＮＡフラグメントから導き出すことは、当業者にとって十分に可能である。
【００５４】
本明細書に開示する診断キット、プライマーおよびプローブは、インビトロおよび／またはインサイチューでの応用例の両方で、ＭＲＥＪタイプｘｉ〜ｘｘのＭＲＳＡを検出および／または同定するために使用することができる。例えばキットは、今までに記載されたＭＲＥＪタイプｉ〜ｘのＭＲＳＡを検出するプライマー／プローブと組み合わせて使用することができると考えられる。また、本明細書に開示する診断キット、プライマーおよびプローブは単独で使用することも、微生物の検出および／または同定に適した他の任意のアッセイ、例えば、限定するわけではないが、核酸検出に基づく任意のアッセイ、任意のイムノアッセイ、任意の酵素アッセイ、任意の生化学アッセイ、任意の溶菌型アッセイ、任意の血清学的アッセイ、任意の分別培養培地、任意の濃縮培養培地、任意の選択培養培地、任意の特異的アッセイ培地、任意の同定培養培地、任意の計数培養培地、任意の細胞染色、特定細胞株での任意の培養、および動物での任意の感染性アッセイなどと組み合わせて使用することもできると考えられる。
【００５５】
試料には、任意の臨床試料、任意の環境試料、任意の微生物培養物、任意の微生物コロニー、任意の組織、および任意の細胞株が含まれうるが、これらに限るわけではない。
【００５６】
ＤＮＡ増幅
いくつかの実施形態では、アニーリングステップの後に、増幅および／または検出ステップが続く。本明細書に記載する方法では、あらゆるタイプの核酸増幅技術を使用することができる。本明細書に記載する方法で使用することができる増幅反応の限定でない例には、以下に挙げるものがあるが、これらに限るわけではない：ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（Ｉｎｎｉｓ編「ＰＣＲ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ，Ａ ＧＵＩＤＥ ＴＯ ＭＥＴＨＯＤＳ ＡＮＤ ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ」Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ニューヨーク（１９９０）およびＩｎｎｉｓ編「ＰＣＲ ＳＴＲＡＴＥＧＩＥＳ」（１９９５）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，ニューヨーク（Ｉｎｎｉｓ）参照）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（Ｗｕ（１９８９）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ４：５６０；Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：１０７７；Ｂａｒｒｉｎｇｅｒ（１９９０）Ｇｅｎｅ ８９：１１７参照）、核酸配列に基づく増幅法（ＮＡＳＢＡ）、自己持続配列複製法（３ＳＲ）（Ｇｕａｔｅｌｌｉ（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：１８７４参照）、鎖置換増幅法（ＳＤＡ）、分枝ＤＮＡシグナル増幅法 ｂＤＮＡ、転写仲介増幅法（ＴＭＡ）（Ｋｗｏｈ（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：１１７３参照）、サイクリングプローブ技術（ＣＰＴ）、ネステッドＰＣＲ、マルチプレックスＰＣＲ、固相増幅法（ＳＰＡ）、ヌクレアーゼ依存的シグナル増幅法（ＮＤＳＡ）、ローリングサークル増幅技術（ＲＣＡ）、固定鎖置換増幅法、固相（固定化）ローリングサークル増幅、Ｑβレプリカーゼ増幅法および他のＲＮＡポリメラーゼによる技法（例えばＮＡＳＢＡ、Ｃａｎｇｅｎｅ、オンタリオ州ミシソーガ）。これらの技法および他の技法は、Ｂｅｒｇｅｒ（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５２：３０７−３１６；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｍｕｌｌｉｓ（１９８７）米国特許第４，６８３，１９５号および同第４，６８３，２０２号；Ａｍｈｅｉｍ（１９９０）Ｃ＆ＥＮ ３６−４７；Ｌｏｍｅｌｌ Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，３５：１８２６（１９８９）；Ｖａｎ Ｂｒｕｎｔ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，８：２９１−２９４（１９９０）；Ｗｕ（１９８９）Ｇｅｎｅ ４：５６０；Ｓｏｏｋｎａｎａｎ（１９９５）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １３：５６３−５６４にも記述されている。
【００５７】
好ましい実施形態では、ＰＣＲを使って試料中の核酸を増幅する。ＰＣＲによるＤＮＡ増幅中は、微生物ゲノム由来の熱変性ターゲットＤＮＡの各鎖にそれぞれ結合する二つのオリゴヌクレオチドプライマーを使って、各サイクルでのＤＮＡの変性、プライマーのアニーリングおよび新しいターゲットの合成を許す連続的熱サイクルにより、ターゲットＤＮＡをインビトロで指数的に増幅させる（Ｐｅｒｓｉｎｇら，１９９３，Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，ワシントン）。
【００５８】
核酸増幅効率を改善するために、標準的増幅プロトコールには、反応混合物への変更を含めて、変更を加えることができる（ＣｈａｋｒａｂａｒｔｉおよびＳｃｈｕｔｔ，２００２，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，３２：８６６−８７４；Ａｌ−ＳｏｕｄおよびＲａｄｓｔｒｏｍ，２００２，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３８：４４６３−４４７０；Ａｌ−ＳｏｕｄおよびＲａｄｓｔｒｏｍ，１９９８，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６４：３７４８−３７５３；Ｗｉｌｓｏｎ，１９９７，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６３：３７４１−３７５１）。増幅反応混合物のそのような変更としては、さまざまなポリメラーゼの使用、または核酸増幅促進剤、例えばベタイン、ＢＳＡ、スルホキシド類、タンパク質ｇｐ３２、界面活性剤、陽イオン、およびテトラメチルアンモニウムクロリドなどの添加が挙げられるが、これらに限るわけではない。
【００５９】
核酸の検出
増幅された核酸の検出には、当業者に知られる任意のリアルタイム技術または増幅後技術が含まれうる。古典的には、ＰＣＲ増幅産物の検出は、標準的な臭化エチジウム染色アガロースゲル電気泳動によって行われるが、より迅速であり、ルーチン診断にとってより実用的でありうる他の特異的増幅産物検出方法、例えば同時係属中の特許出願ＷＯ０１／２３６０４Ａ２に記載されている方法を使用しうることは、当業者には容易に理解されるだろう。アンプリコン検出は、増幅産物にハイブリダイズする種特異的内部ＤＮＡプローブを使った固形支持体または液相ハイブリダイゼーションによって行うこともできる。そのようなプローブは、本明細書に開示するＭＲＥＪ核酸のレパートリーに由来する任意の配列から作成し、ＤＮＡ増幅物に特異的にハイブリダイズするように設計することができる。あるいは、アンプリコンを配列決定によって特徴づけることもできる。検出および配列決定方法の例については同時係属中の特許出願ＷＯ０１／２３６０４Ａ２を参照されたい。
【００６０】
本明細書に開示する実施形態で使用することができる核酸検出技術の限定でない他の例には、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）に基づく方法、例えばプローブの隣接ハイブリダイゼーション（プローブ−プローブ法およびプローブ−プライマー法を含む）（Ｊ．Ｒ．Ｌａｋｏｗｉｃｚ「Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ」Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ／Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，ニューヨーク，１９９９参照）、ＴａｑＭａｎプローブ技術（欧州特許ＥＰ０５４３９４２参照）、分子ビーコンプローブ技術（Ｔｙａｇｉら（１９９６）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１４：３０３−３０８参照）、Ｓｃｏｒｐｉｏｎプローブ技術（Ｔｈｅｗｅｌｌ（２０００）Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８：３７５２参照）、ナノ粒子プローブ技術（Ｅｌｇｈａｎｉａｎら（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７７：１０７８−１０８１参照）、およびＡｍｐｌｉｆｌｕｏｒプローブ技術（米国特許第５，８６６，３６６号；同第６，０９０，５９２号；同第６，１１７，６３５号；および同第６，１１７，９８６号参照）があるが、これらに限るわけではない。
【００６１】
好ましい実施形態では、ターゲット核酸の増幅後検出に、分子ビーコンを使用する。分子ビーコンは、ターゲットに結合しない限りヘアピンコンフォメーションで存在する一本鎖オリゴヌクレオチドである。このオリゴヌクレオチドの５’末端は蛍光色素を含有する。消光色素はオリゴヌクレオチドの３’末端に取付けられる。ビーコンがターゲットに結合していない場合は、ヘアピン構造が蛍光体と消光体とを近接させるので、蛍光を観測することはできない。しかし、ビーコンがターゲットとハイブリダイズすると、ヘアピン構造が破壊されることにより、蛍光体と消光体とが分離され、蛍光の検出が可能になる（Ｋｒａｍｅｒ ＦＲ．，１９９６，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３：３０３−８参照）。他の検出方法として、免疫学的方法によるターゲット遺伝子核酸検出、フィルター、チップまたは他の任意の固形支持体上での固相ハイブリダイゼーション法が挙げられる。これらの系では、蛍光、化学発光、ポテンシオメトリー、質量分析、プラズモン共鳴、偏光測定、比色法、フローサイトメトリーまたはスキャン分析など、当業者に知られる任意の適切な方法によって、ハイブリダイゼーションを監視することができる。ジデオキシターミネーション法による配列決定またはハイブリダイゼーションによる配列決定（例えばＤＮＡチップを使った配列決定）などのヌクレオチド配列決定は、ターゲット遺伝子の核酸を検出し特徴づけるためのもう一つの方法である。
【００６２】
ＭＲＥＪ核酸
本明細書の開示するＭＲＥＪフラグメントは、新規プライマーを使ってＭＲＳＡを増幅することによって生成される配列のレパートリーとして得られた。表８〜１１に開示する増幅およびシークエンスプライマー、ＭＲＥＪ配列のレパートリー、ならびにそこから導き出される診断的目的用のオリゴヌクレオチド配列は、本発明のさらなる目的である。
【００６３】
本発明の諸態様は、核酸、特に、ＳＣＣｍｅｃの右端とＭＲＳＡタイプｘｉ〜ｘｘ中のＳＣＣｍｅｃ組み込み部位の右側にある染色体ＤＮＡとに由来する配列を含む、ＳＣＣｍｅｃ右端接合部（ＭＲＥＪ）のＤＮＡフラグメントに由来する核酸配列に関する。いくつかの実施形態は、ＭＲＥＪタイプｘｉ〜ｘｘ株に特異的プライマーおよび／またはプローブを導き出す元となるＭＲＥＪタイプｘｉ〜ｘｘの親配列に関する。したがって、いくつかの実施形態は、配列番号１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２５、２６、３９、４０、４１、４２、５５、もしくは５６のヌクレオチド配列、またはその相補体に関する。別の実施形態は、ＤＮＡフラグメントおよびオリゴヌクレオチド、例えばプライマーおよびプローブに関する。例えばいくつかの実施形態は、配列番号１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２５、２６、３９、４０、４１、４２、５５、または５６の核酸の少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、または８００連続ヌクレオチドを含む核酸に関する。
【００６４】
本発明の範囲は、ＰＣＲによる増幅の使用に限定されず、任意の核酸増幅法または核酸に基づく診断検査の感度および／もしくは迅速性を増加させるために使用することができる他の任意の手法の使用を包含する。本発明の範囲は、リアルタイム検出技術および増幅後検出技術を含む任意の核酸増幅および検出技術、検出と組み合わされた任意の増幅技術、任意のハイブリダイゼーション核酸チップまたはアレイ技術、任意の増幅チップまたは増幅およびハイブリダイゼーションチップ技術の組み合わせの使用も包含する。任意のヌクレオチド配列決定法による検出および同定も、本発明の範囲に包含される。
【実施例】
【００６５】
（実施例１）
以前に記載されたＭＲＳＡ診断増幅アッセイの評価
当初、文献は、ＤＮＡ配列ホモロジーに基づいて、ＭＲＳＡ株には５タイプのＳＣＣｍｅｃ右端配列（ＳＣＣｍｅｃタイプＩ〜Ｖ）が見出されると、教示していた（Ｉｔｏら，１９９９，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４３：１４４９−１４５８；Ｋａｔａｙａｍａら，２０００，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４４：１５４９−１５５５；Ｉｔｏら，２００１，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４５：１３２３−１３３６；Ｍａら，２００２，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４６：１１４７−１１５２；Ｉｔｏら，２００４，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４８：２６３７−２６５１参照）。ＳＣＣｍｅｃ ＤＮＡは、メチシリン感受性黄色ブドウ球菌（ＭＳＳＡ）の染色体のｏｒｆＸと呼ばれる特異的部位に組み込まれる。一般に、各ＳＣＣｍｅｃタイプは、ＳＣＣｍｅｃカセットの右端にユニークなヌクレオチド配列を持つ。この規則の例外はＳＣＣｍｅｃタイプＩＩおよびＩＶに見られ、これらは２０００ヌクレオチドにわたってほぼ同一な配列を示す。しかし、ＳＣＣｍｅｃタイプＩＩは、ＳＣＣｍｅｃタイプＩの右末端に１０２ヌクレオチドの挿入を持つ。ＳＣＣｍｅｃタイプＩ〜ＩＩＩと分類される株はＭＲＥＪタイプｉ〜ｉｉｉのカテゴリーに入る。
【００６６】
最近、本発明者らは数株のＭＲＳＡのＭＲＥＪ領域を解析した。本発明者らは、ＭＲＳＡ由来のＳＣＣｍｅｃの右端接合部にある７個の新しい配列を記載し、それらをＭＲＥＪタイプイｉｖ、ｖ、ｖｉ、ｖｉｉ、ｖｉｉｉ、ｉｘ、およびｘと名付けた（Ｈｕｌｅｔｓｋｙら，２００４，Ｊ Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４２：１８７５−１８８４；国際特許出願ＰＣＴ／ＣＡ０２／００８２４）。
【００６７】
本発明者らは、ＭＲＥＪタイプｉ、ｉｉ、ｉｉｉ、ｉｖ、ｖ、およびｖｉｉのＳＣＣｍｅｃ部分をターゲットとするプライマーと、黄色ブドウ球菌ｏｒｆＸをターゲットとするプライマーとを持つ、リアルタイムＭＲＳＡ特異的マルチプレックスＰＣＲアッセイを設計した。ｏｒｆＸ配列のこの領域中に同定された全ての配列多型を検出するために、ｏｒｆＸ配列に特異的な三つの分子ビーコンプローブ（ＭＢＰ）を使用した（Ｈｕｌｅｔｓｋｙら，２００４，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４２：１８７５−１８８４）。黄色ブドウ球菌ｏｒｆＸにハイブリダイズする配列番号３０のオリゴヌクレオチドと、ＭＲＥＪタイプｉ、ｉｉ、ｉｉｉ、ｉｖ、ｖ、およびｖｉｉのＳＣＣｍｅｃ部分にハイブリダイズする配列番号３６、７０、７１、７２、および７４のオリゴヌクレオチドとを、ＰＣＲ反応に使用した。黄色ブドウ球菌ｏｒｆＸにハイブリダイズする配列番号３１、３２、および３３のオリゴヌクレオチドをプローブとして使用した。メチシリン感受性黄色ブドウ球菌（ＭＳＳＡ）の基準株および臨床株５６９株ならびに３２カ国から得られた異なるＭＲＳＡ株（周知の流行クローンを含む）１６５７株のパネルを使って、ＰＣＲアッセイの特異性および偏在性（すなわち全てまたは大半のＭＲＳＡ株を検出する能力）を確認した。
【００６８】
本明細書に開示するＭＲＥＪ核酸のレパートリーおよびそこに由来するオリゴヌクレオチドを構築するために使用した被検株のリストを表１に示す。本発明で使用した黄色ブドウ球菌臨床株は、ＳＥＮＴＲＹプログラム収集物およびいくつかの供給者の収集物の一部である。これらの黄色ブドウ球菌基準株または臨床分離株は３２カ国に起源を持つ：アフリカ諸国（ｎ＝１５）、アルバニア（ｎ＝２）、アルゼンチン（ｎ＝５０）、オーストラリア（ｎ＝７１）、オーストリア（ｎ＝２）、ベルギー（ｎ＝１０）、ブラジル（ｎ＝７８）、カナダ（ｎ＝６０７）、チリ（ｎ＝４２）、中国（ｎ＝７０）、デンマーク（ｎ＝３３）、エジプト（ｎ＝１）、フィンランド（ｎ＝１２）、フランス（ｎ＝５０）、ドイツ（ｎ＝４７）、ギリシャ（ｎ＝７）、アイルランド（ｎ＝５）、イスラエル（ｎ＝１９）、イタリア（ｎ＝６１）、日本（ｎ＝６２）、メキシコ（ｎ＝１）、オランダ（ｎ＝１７９）、ポーランド（ｎ＝３３）、ポルトガル（ｎ＝２４）、シンガポール（ｎ＝２０）、スロベニア（ｎ＝１２）、スペイン（ｎ＝３１）、スウェーデン（ｎ＝１０）、スイス（ｎ＝１３）、トルコ（ｎ＝２８）、英国（ｎ＝２２）、および米国（ｎ＝５２８）。ブドウ球菌株の同定の確認は、必要な場合に、ＭｉｃｒｏＳｃａｎ ＷａｌｋＡｗａｙ Ｐａｎｅｌ ｔｙｐｅ Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｂｒｅａｋｐｏｉｎｔ Ｃｏｍｂｏ １３を使って行った（Ｄａｄｅ Ｂｅｈｒｉｎｇ Ｃａｎａｄａ Ｉｎｃ．、カナダ・オンタリオ州ミシソーガ）。必要な場合は、黄色ブドウ球菌特異的プライマーおよびｍｅｃＡ特異的プライマー（配列番号５０、６０、６１、６３）を用いるＰＣＲ解析によって、同定を再確認した（Ｍａｒｔｉｎｅａｕら，２０００，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４４：２３１−２３８）。アッセイで得たデータを表２に示す。
【００６９】
試験した５６９株のＭＳＳＡのうち、２６株はＰＣＲアッセイに基づいてＭＲＳＡと誤認された。試験した１６５７株のＭＲＳＡのうち、１６４０株はＰＣＲアッセイで特異的に検出されたが、広範囲にわたるさまざまな起源を代表する、これらＭＲＳＡ株のうちの２３株は、このアッセイでは検出されなかった。そこで、このＰＣＲアッセイの特異性および偏在性（すなわち全てまたは大半のＭＲＳＡ株を検出する能力）を確認した。上記のアッセイで検出されなかったこれらの２３株のＭＲＳＡのうちの４株、ＣＣＲＩ−９２０８、ＣＣＲＩ−９７７０、ＣＣＲＩ−９６８１、およびＣＣＲＩ−９８６０は、それぞれＭＲＥＪタイプｖｉ、ｖｉｉｉ、ｉｘ、およびｘを保有することが、以前に示されている（国際特許出願ＰＣＴ／ＣＡ０２／００８２４）。
【００７０】
アッセイで検出されなかった残り１９株のＭＲＳＡをさらに解析した。各株から得たゲノムＤＮＡに対して、ＭＲＥＪタイプｖｉ、ｖｉｉｉ、またはｉｘのＳＣＣｍｅｃ右端にある配列をターゲットとするプライマーを、黄色ブドウ球菌ｏｒｆＸをターゲットとするプライマーと組み合わせて使用することにより、ＰＣＲを行った。具体的には、各ＰＣＲ反応は、ＭＲＥＪタイプｖｉにアニールする配列番号６５のオリゴヌクレオチド、ＭＲＥＪタイプｖｉｉｉにアニールする配列番号７５のオリゴヌクレオチド、またはＭＲＥＪタイプｉｘにアニールする配列番号２９のオリゴヌクレオチドと、黄色ブドウ球菌特異的プライマーである配列番号３０のオリゴヌクレオチドとの組み合わせを含有した。ＭＲＥＪタイプｘは、全ｏｒｆＸおよびＳＣＣｍｅｃタイプＩＩの右端の一部の欠失を持つことが、以前に示されている（国際特許出願ＰＣＴ／ＣＡ０２／００８２４）。そこで、ＭＲＥＪタイプｘを検出するためのＰＣＲ反応では、黄色ブドウ球菌染色体中のｏｒｆ２２にアニールする配列番号７７のオリゴヌクレオチドと、ＳＣＣｍｅｃタイプＩＩ内に位置するｏｒｆ２７にアニールする配列番号７３のオリゴヌクレオチドとを使用した。１９株のうち２株、ＣＣＲＩ−１１８７９およびＣＣＲＩ−１２０３６は、これらのＰＣＲプライマーにより、ＭＲＥＪタイプｉｘを保有することが示された。しかし、１７株のＭＲＳＡは、ＭＲＥＪタイプｖｉ、ｖｉｉｉ、ｉｘ、およびｘをターゲットとするプライマーでは検出されず、これらの株は新しいＭＲＥＪタイプを保有することが示唆された（表２および表３）。
【００７１】
（実施例２）
ＭＲＳＡ由来の新規ＭＲＥＪタイプの配列決定
ＭＲＥＪタイプｉ〜ｘの検出を可能にするプライマーでＤＮＡが増幅されなかった１７株のＭＲＳＡのＭＲＥＪ領域をさらに特徴づけるために、これらの１７株のＭＲＳＡのうち１５株について、ＭＲＥＪのヌクレオチド配列を決定した。まず最初に、ｍｅｃＡにアニールするプライマー（配列番号５０）とｏｒｆＸの５’末端にアニールするプライマー（配列番号４４）とを、ＰＣＲ反応で一緒に使用して、ＭＲＳＡのＭＲＥＪフラグメントを増幅した。これらのプライマーを選択するために使用した戦略を図１に図解する。それぞれ１００ｎｇの精製ゲノムＤＮＡを含有する四つの同一ＰＣＲ反応を行った。各ＰＣＲ反応は、１×ＨＥＲＣＵＬＡＳＥ（商標）ＤＮＡポリメラーゼバッファー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カリフォルニア州ラホーヤ）、各０．８μＭの配列番号４４および５０のオリゴ、各０．５６ｍＭの四つのｄＮＴＰ、および５単位のＨＥＲＣＵＬＡＳＥ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カリフォルニア州ラホーヤ）を、最終体積５０μｌ中に１ｍＭ ＭｇＣｌ２と共に含有した。標準的サーマルサイクラー（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｃ．のＰＴＣ−２００）を使って、ＰＣＲ反応を、以下のとおり、サイクリングに付した：９２℃で２分の後、変性ステップとして９２℃で１０秒、アニーリングステップとして５５℃で３０秒、および伸長ステップとして６８℃で１５分を３５または４０サイクル。
【００７２】
四つのＰＣＲ反応をプールした。ＰＣＲ反応のうち１０μＬを、０．２５μｇ／ｍＬの臭化エチジウムを含有する０．７％アガロースゲルでの電気泳動によって分離した。次にアンプリコンをＡｌｐｈａ−Ｉｍａｇｅｒ（Ａｌｐｈａ Ｉｎｎｏｔｅｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カリフォルニア州サンリアンドロ）で、２５４ｎｍのＵＶ光に曝露することにより、可視化した。残りのＰＣＲ増幅混合物（合計１５０〜２００μｌ）も、０．７％アガロースゲルでの電気泳動によって分離し、メチレンブルーを使った染色によって可視化した（Ｆｌｏｒｅｓら，１９９２，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１３：２０３−２０５）。
【００７３】
試験した１５株のうち、以下の８株は、配列番号４４および５０をプライマーとして、長さが１２〜２０ｋｂの範囲の増幅産物を与えた：ＣＣＲＩ−１１９７６、ＣＣＲＩ−１１９９９、ＣＣＲＩ−１２１５７、ＣＣＲＩ−１２１９８、ＣＣＲＩ−１２１９９、ＣＣＲＩ−１２７１９、ＣＣＲＩ−９８８７、ＣＣＲＩ−９７７２。増幅産物をアガロースゲルから切り出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ（商標）ゲル抽出キット（ＱＩＡＧＥＮ Ｉｎｃ．、カリフォルニア州バレンシア）を使って精製した。ゲル精製したＤＮＡフラグメントを、そのままシークエンス反応に使用した。ＭＲＥＪ増幅産物の両鎖を、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｔｅｍｓ自動ＤＮＡシーケンサー（モデル３７７または３７３０ｘｌ）を、同社のＢｉｇ Ｄｙｅ（商標）Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州フォスターシティ）と共に使って、ジデオキシヌクレオチド連鎖停止配列決定法により、配列決定した。シークエンス反応には、４２５〜４９５ｎｇのゲル精製アンプリコンを、増幅反応に使用した配列番号４４と共に使用した。配列番号４４を使った反応から作成した配列情報に基づいて、内部シークエンスプライマーを設計し、各アンプリコン調製物のより大きい部分について両鎖から配列データを得るために使用した。具体的には、配列番号４３および４５のオリゴヌクレオチドを使って、ＭＲＳＡ ＣＣＲＩ−１１９７６株およびＣＣＲＩ−１１９９９株を配列決定し；配列番号４３、４５、および５１を使って、ＭＲＳＡ ＣＣＲＩ−１２１５７株、ＣＣＲＩ−１２１９８株、およびＣＣＲＩ−１２１９９株を配列決定し；配列番号４３、４５、および５２を使って、ＭＲＳＡ ＣＣＲＩ−１２７１９株を配列決定し；配列番号２４を使って、ＭＲＳＡ ＣＣＲＩ−９８８７株を配列決定し、配列番号４、４５、および５７を使って、ＭＲＳＡ ＣＣＲＩ−９７７２株を配列決定した（図１、表９および表１１）。表３に記載する８株の配列を、配列番号１５、１６、１７、１８、１９、２０、５５、および５６として示す（表８）。
【００７４】
決定された配列がＰＣＲアーチファクトの配列決定に起因すると考えられるエラーを含まないことを保証するために、２回の独立したＰＣＲ増幅に由来する二つの独立したゲル精製ＭＲＥＪ増幅産物の調製物を、上述のように配列決定した。大半のターゲットフラグメントに関して、両アンプリコン調製物について決定された配列は同一だった。さらにまた、両鎖の配列は１００％相補的であったことから、決定された配列の高い正確さが確認された。上記の戦略を使って決定されたＭＲＥＪ配列を、配列表および表８に記載する。
【００７５】
異なるオリゴヌクレオチドプライマーセット（Ｏｌｉｖｉｅｒａらに記載）を使って、ＭＲＥＪタイプｉ〜ｖｉｉを検出するためのプライマーでは増幅産物を与えなかった１７株のＭＲＳＡを、さらに解析した（Ｏｌｉｖｅｉｒａおよびｄｅ Ｌｅｎｃａｓｔｒｅ．２００２，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４６：２１５５−２１６１）。二つの株（ＣＣＲＩ−１２３８２およびＣＣＲＩ−１２３８３）が、ＳＣＣｍｅｃタイプＩＩＩを保有し、Ψｃｃｒ複合体に特異的な配列を含有していた。もう一つの株（ＣＣＲＩ−１２８４５）はＳＣＣｍｅｃタイプＩＩを保有していた。
【００７６】
ＣＣＲＩ−１２３８２株およびＣＣＲＩ−１２３８３株のＭＲＥＪ配列を決定するために、ＳＣＣｍｅｃタイプＩＩＩ内に位置するΨｃｃｒ複合体配列をターゲットとするプライマー（配列番号２７）を、ｏｒｆＸの５’末端をターゲットとするプライマー（配列番号４４）と組み合わせて使用することにより、これら二つのＭＲＳＡ株のＭＲＥＪフラグメントを増幅した（表１０および図１）。それぞれ１００ｎｇの精製ゲノムＤＮＡ分子を含有する四つの同一ＰＣＲ反応を行った。各ＰＣＲ反応は、１×ＨＥＲＣＵＬＡＳＥ（商標）ＤＮＡポリメラーゼバッファー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カリフォルニア州ラホーヤ）、各０．８μＭの上記二つのプライマー（配列番号２７および４４）、各０．５６ｍＭの四つのｄＮＴＰおよび５単位のＨＥＲＣＵＬＡＳＥ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カリフォルニア州ラホーヤ）を、最終体積５０μｌ中に１ｍＭ ＭｇＣｌ２と共に含有した。標準的サーマルサイクラー（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｃ．（マサチューセッツ州ウォータータウン）のＰＴＣ−２００）を使って、ＰＣＲ反応を、以下のとおり、サイクルさせた：９２℃で２分の後、変性ステップとして９２℃で１０秒、アニーリングステップとして５５℃で３０秒、および伸長ステップとして６８℃で１５分を３５サイクル。
【００７７】
ＰＣＲ反応をプールし、ＰＣＲ増幅混合物のうち１０μｌを、０．２５μｇ／ｍｌの臭化エチジウムを含有する０．７％アガロースゲルでの電気泳動によって分離した。次にアンプリコンをＡｌｐｈａ−Ｉｍａｇｅｒ（Ａｌｐｈａ Ｉｎｎｏｔｅｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カリフォルニア州サンリアンドロ）で、２５４ｎｍのＵＶ光に曝露することにより、可視化した。残りのＰＣＲ増幅混合物（合計１５０〜２００μｌ）も、０．７％アガロースゲルでの電気泳動によって分離し、上述のようにメチレンブルーを使った染色によって可視化した。これらの二つのＭＲＳＡ株の場合、約８ｋｂの増幅産物が得られた。そのＰＣＲ増幅産物をアガロースゲルから切り出し、上述のように精製した。次に、ゲル精製したＤＮＡフラグメントを、上述のようにそのままシークエンス反応に使用した。シークエンス反応は、配列番号４４（増幅反応にも使用したもの）と各反応につき４２５〜４９５ｎｇのゲル精製アンプリコンとを使って行った。次に、異なる内部シークエンスプライマーセットを使って、そのアンプリコンの、より大きい部分について、両鎖からの配列データを得た（配列番号２８、３０、および４３）（図１、表９および表１１）。この戦略を使って配列決定された表３に記載のＭＲＳＡ ＣＣＲＩ−１２３８２およびＣＣＲＩ−１２３８３の配列を、それぞれ配列番号２５および２６と名付ける（表８）。
【００７８】
ＣＣＲＩ−１２８４５株（ＳＣＣｍｅｃタイプＩＩ）のＭＲＥＪフラグメントを配列決定するために、ｏｒｆＸの５’末端にアニールする配列番号４４のオリゴヌクレオチドを、ＭＲＥＪタイプｉｉのＳＣＣｍｅｃ右端にアニールする配列番号５３のオリゴヌクレオチドと組み合わせて使用することにより、ＰＣＲ増幅を行った。１μＬの精製ゲノムＤＮＡ調製物を、３９μＬのＰＣＲ反応混合物が入っている４本のチューブに直接移した。各ＰＣＲ反応は、５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、各０，４μＭの配列番号４４および５３のオリゴヌクレオチド、各２００μＭの四つのｄＮＴＰ、３．３μｇ／μｌのＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃａｎａｄａ Ｌｔｄ）、およびＴａｑＳｔａｒｔ（商標）抗体（ＢＤ Ｂｉｓｏｃｉｅｎｃｅｓ、カリフォルニア州サンホゼ）と結合させた０．５単位のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ、ウィスコンシン州マディソン）を含有した。ＰＣＲ反応は、標準的サーマルサイクラー（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｃ．（マサチューセッツ州ウォータータウン）のＰＴＣ−２００）を使って、以下のように行った：９４℃で３分の後、変性ステップとして９５℃で５秒、アニーリングステップとして５８℃で１分、および伸長ステップとして７２℃で１分を４０サイクル。このプライマーセットで４．５ｋｂの増幅産物が得られた。
【００７９】
増幅産物をプールし、その混合物のうち１０μｌを、０．２５μｇ／ｍｌの臭化エチジウムを含有する１．２％アガロースゲルでの電気泳動によって分離した。次に、Ａｌｐｈａ−Ｉｍａｇｅｒでアンプリコンを可視化した。アンプリコンサイズは、１ｋｂ分子量ラダー（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、メリーランド州ベセスダ）との比較によって見積った。残りのＰＣＲ増幅混合物（合計１５０μｌ）も１．２％アガロースゲルでの電気泳動によって分離し、上述のようにメチレンブルーを使った染色によって可視化した。ＰＣＲ反応は１．２ｋｂの増幅産物を与えた。この特異的増幅産物に対応するバンドをアガロースゲルから切り出し、上述のように精製した。次に、ゲル精製したＤＮＡフラグメントを、上述のように、そのままシークエンス反応に使用した。シークエンス反応は、配列番号４４および５３のオリゴヌクレオチドならび一つの内部プライマー（配列番号５４）および１反応あたり１０ｎｇ／１００ｂｐのゲル精製アンプリコンを使って行った（図１、表１０）。ＣＣＲＩ−１２８４５株のＭＲＥＪ配列を配列番号２１と名付ける（表８）。
【００８０】
残り四つのＭＲＳＡ株（ＣＣＲＩ−１２５２４、ＣＣＲＩ−１２５３５、ＣＣＲＩ−１２８１０、およびＣＣＲＩ−１２９０５）のＭＲＥＪ配列を決定するために、配列番号４４のオリゴヌクレオチドを、ＤＮＡ ＷＡＬＫＩＮＧ ＳＰＥＥＤ ＵＰ（商標）Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｓｅｅｇｅｎｅ、カリフォルニア州デルマー）の四つのＤＮＡ Ｗａｌｋｉｎｇ ＡＣＰ（ＤＷ−ＡＣＰ）プライマーのそれぞれと組み合わせて、製造者の説明に従い、ＰＴＣ−２００サーマルサイクラーで使用した。ＤＷ−ＡＣＰプライマーシステム（ＤＷ ＡＣＰ−ＰＣＲ（商標）技術）を使うと、２ｋｂまでの本物の未知ターゲット増幅産物を得ることが可能になる。ＤＷ−ＡＣＰプライマーの一つを使って得られる最初の増幅産物を、ＱＩＡＱＵＩＫ（商標）ＰＣＲ精製キット（ＱＩＡＧＥＮ Ｉｎｃ．、カリフォルニア州バレンシア）を使って精製した。ＤＷ−ＡＣＰ−ＮプライマーをｏｒｆＸにアニールする配列番号３０のオリゴヌクレオチドと組み合わせて使用することにより、製造者が推奨するＰＣＲ条件下で、精製ＰＣＲ産物を再増幅した。四つの異なる５０μＬ ＰＣＲ反応のＰＣＲ増幅混合物をプールし、１．２％アガロースゲルでの電気泳動によって分離した。次にアンプリコンを、上述のように、メチレンブルーを使った染色によって可視化した。１ｋｂ分子量ラダーとの比較によって、アンプリコンサイズをもう一度見積った。１．５〜３ｋｂの増幅産物が得られた。増幅産物をアガロースゲルから切り出し、上述のように精製した後、ＤＮＡを、そのまま上述のようにシークエンスプロトコールに使用した。アンプリコン１００ｂｐごとに１０ｎｇの精製ＤＮＡを、配列番号３０のオリゴヌクレオチドおよびＤＷ−ＡＣＰ−Ｎを用いるシークエンス反応に使用した。ＭＲＳＡ株ＣＣＲＩ−１２５２４、ＣＣＲＩ−１２５３５、ＣＣＲＩ−１２８１０、およびＣＣＲＩ−１２９０５株（表３に記載）由来のＭＲＥＪ配列を、配列番号３９、４０、４１、および４２と名付ける（表８）。
【００８１】
表３に記載するＣＣＲＩ−１２３７６およびＣＣＲＩ−１２５９３を、配列決定するのではなくＰＣＲプライマーを使って特徴づけたところ、特異的増幅プライマーの使用により、ＭＲＥＪタイプｘｉｉｉを含有することが示された。
【００８２】
（実施例３）
新規ＭＲＥＪタイプｘｉ〜ｘｘの配列解析
以前に記載されたＭＲＥＪタイプｉ〜ｘを検出するＭＲＳＡ特異的プライマーによって増幅されえない１７株のうち１５株について取得した配列を、公的データベースから入手できる配列と比較した。ＭＲＳＡ ＣＣＲＩ−１２８４５株を除く全ての例で、ＭＲＥＪ配列のｏｒｆＸ部分は、ｏｒｆＸの公的に入手できる配列と１００％近くの一致度を持っていた。ＣＲＲＩ−１２８４５はｏｒｆＸに欠失を持っていた（配列番号２１）（後述）。ＣＣＲＩ−１２８４５株を除けば、大半のＭＲＥＪフラグメント（配列番号１５〜２０、２５〜２６、３９〜４２、５５〜５６）のｏｒｆＸ部分は、公的に入手できる黄色ブドウ球菌ｏｒｆＸ配列とほぼ１００％の一致度を持つが、ＳＣＣｍｅｃ自体の右端内のＤＮＡ配列は、ＭＲＥＪタイプｉ、ｉｉ、ｉｉｉ、ｉｖ、ｖ、ｖｉ、ｖｉｉ、ｖｉｉｉ、ｉｘ、およびｘのものとは異なることが示された（国際特許出願ＰＣＴ／ＣＡ０２／００８２４；米国特許第６，１５６，５０７号）。ＣＣＲＩ−１２８４５のＳＣＣｍｅｃの右端内のＤＮＡ配列はＭＲＥＪタイプｉｉの配列に似ていた（下記参照）。したがって、１０個の異なる新規ＭＲＥＪ配列タイプ、すなわちＭＲＥＪタイプｘｉ〜ｘｘを、ここに報告する。
【００８３】
ＣＣＲＩ−１２１５７、ＣＣＲＩ−１２１９８、およびＣＣＲＩ−１２１９９株から得られるＳＣＣｍｅｃの右端内の配列（配列番号１７、１８、および１９）は互いにほぼ同一であり、ＭＲＥＪタイプｉ、ｉｉ、ｉｉｉ、ｉｖ、ｖ、ｖｉ、ｖｉｉ、ｖｉｉｉ、ｉｘ、およびｘの配列とは異なっていた（Ｉｔｏら，２００１，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４５：１３２３−１３３６；Ｍａら，２００２，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４６：１１４７−１１５２、Ｈｕｌｅｔｓｋｙら，２００４，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４２：１８７５−１８８４、国際特許出願ＰＣＴ／ＣＡ０２／００８２４、米国特許第６，１５６，５０７号）。これらの新しい配列をＭＲＥＪタイプｘｉ（配列番号１７〜１９）と名付けた。ＢＬＡＳＴ（商標）検索により、ＭＲＥＪタイプｘｉのＳＣＣｍｅｃ部分の最初の８６ｂｐは、スタフィロコッカス・エピデルミディスＳＲ１株の未知配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ２７００４６）と８７％の一致度を示すことがわかった。ＭＲＥＪ配列の残りの部分はユニークであり、公表されたどの配列とも有意なホモロジーを示さないことがわかった。
【００８４】
ＣＣＲＩ−１２７１９株由来のＳＣＣｍｅｃの右端に得られた配列（配列番号２０）は、ＭＲＥＪタイプｉ〜ｘともＭＲＥＪタイプｘｉとも異なっていた。この新しいＭＲＥＪタイプをＭＲＥＪタイプｘｉｉと名付けた。ＢＬＡＳＴ（商標）を使ってＧｅｎＢａｎｋ配列と比較したところ、ＭＲＥＪタイプｘｉｉのＳＣＣｍｅｃの右端にある配列は、最近記載されたＳＣＣｍｅｃタイプＶの右端に見出される配列と１００％の一致度を示した（Ｉｔｏら，２００４，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ．Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４８：２６３７−２６５１；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢ１２１２１９）。この配列は、スタフィロコッカス・エピデルミディスＲＰ６２ａ推定ＧＴＰ結合タンパク質配列の２１２ヌクレオチド領域と、８５％の一致度を示した。
【００８５】
ＣＣＲＩ−１１９７６株、ＣＣＲＩ−１２３８２株、およびＣＣＲＩ−１２３８３株から得たＳＣＣｍｅｃの右端内の配列（配列番号１５、２５、および２６）は、互いに１００％同一であり、ＭＲＥＪタイプｉ〜ｘならびにＭＲＥＪタイプｘｉおよびｘｉｉとは異なっていた。この新しいＭＲＥＪ配列をＭＲＥＪタイプｘｉｉｉと名付けた（配列番号１５、２５、および２６）。
【００８６】
ＣＣＲＩ−１１９９９株から得たＳＣＣｍｅｃの右端内の配列（配列番号１６）も、ＭＲＥＪタイプｉ〜ｘならびにＭＲＥＪタイプｘｉ、ｘｉｉ、およびｘｉｉｉとは異なっていたので、これをＭＲＥＪタイプｘｉｖと名付けた。ＭＲＥＪタイプｘｉｉｉ配列およびｘｉｖ配列のＢＬＡＳＴ（商標）検索は、これら二つのＭＲＥＪタイプのＳＣＣｍｅｃの一部が、ＭＲＥＪタイプｉｘの配列と同一であることを示した。実際、ＭＲＥＪタイプｘｉｉｉと比較すると、ＭＲＥＪタイプｉｘおよびｘｉｖのＳＣＣｍｅｃ部分の前には、連続する１０２ｂｐ挿入がそれぞれ１個および２個存在している。ＭＲＥＪタイプｉｘ、ｘｉｉｉ、およびｘｉｖ配列の残りの部分は、互いに９９．９％同一だった。これらの配列は、メチシリン感受性株スタフィロコッカス・エピデルミディスＡＴＣＣ１２２２８の染色体リコンビナーゼ遺伝子を保有するｍｅｃＡを持たないＳＣＣカセットの非連続領域（サイズは１５３５〜１８８０ヌクレオチドとさまざま）（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＢＫ００１５３９）と、（最も高いＢＬＡＳＴスコアに関して）９７〜１００％の範囲の一致度を示した。１０２ｂｐ挿入の配列は、ＭＲＥＪタイプｉｉに見出されるものと９９〜１００％同一だった。
【００８７】
ＣＣＲＩ−９８８７株由来のＳＣＣｍｅｃの右端内に得られた配列は、ＭＲＥＪタイプｉ〜ｘとも、ＭＲＥＪタイプｘｉ〜ｘｉｖとも異なっており、それゆえにこれを、ＭＲＥＪタイプｘｖと名付けた（配列番号５６）。ＭＲＥＪタイプｘｖのＳＣＣｍｅｃ部分内に得られた配列のＢＬＡＳＴ検索は、このＤＮＡフラグメントが、メチシリン感受性黄色ブドウ球菌Ｍ株のＳＣＣカセット（これはｍｅｃＡを含有しない）の非連続配列（サイズは３４２〜６１８ヌクレオチドとさまざま）（ＧｅｎＢｎａｋアクセッション番号Ｕ１０９２７）と、（最も高いＢＬＡＳＴスコアに関して）９２％〜９６％の範囲の一致度を示すことを明らかにした。ＭＲＥＪタイプｘｖの配列は記載されていたが、ＭＲＳＡ株のｏｒｆＸの下流にあるこの配列の局在は、これまで記載がなかった。ＣＣＲＩ−９８８７ ＭＲＥＪ配列は、ｏｒｆＸ配列の近くに位置するスタフィロコッカス・ヘモリティカスＪＣＳＣ１４３５株の３０６ヌクレオチド領域とも、９４％の一致度を示した。
【００８８】
ＣＣＲＩ−１２８４５株由来のＭＲＥＪについて得られた配列（配列番号２１）は、この株のＭＲＥＪフラグメントがｏｒｆＸのヌクレオチド１６５〜４３４（２６９ｂｐフラグメント）の欠失を持つ一方、ＳＣＣｍｅｃの右端にある配列（３２８ヌクレオチド）は、公的データベースに登録されているＭＲＥＪタイプｉｉの配列と９９．８〜１００％の範囲の一致度を持つことを明らかにした。この株から得たＭＲＥＪ配列は、既知のＭＲＥＪ配列と高レベルな一致を示したが、ｏｒｆＸ内の２６９ｂｐ欠失の存在がこれまでに記載されたことは一度もなかった。上述の初期ＰＣＲ増幅アッセイで使用したオリゴヌクレオチドの一つはこの２６９ｂｐ欠失部に含まれるので、ｏｒｆＸ中の欠失は、このＭＲＳＡ株が、これまでに記載されたＭＲＳＡ検出用のプライマーおよびプローブでは検出されなかった、または検出することができなかった理由の説明になる（米国特許第６，１５６，５０７号および国際特許出願ＰＣＴ／ＣＡ０２／００８２４）。この株の新規ＭＲＥＪ配列をＭＲＥＪタイプｘｖｉと名付けた。
【００８９】
ＣＣＲＩ−９７７２株由来のＳＣＣｍｅｃの右端に得られた配列は、ＭＲＥＪタイプｉ〜ｘとも、ＭＲＥＪタイプｘｉ〜ｘｖｉとも異なっていた。この新しいＭＲＥＪタイプをＭＲＥＪタイプｘｖｉｉと名付けた（配列番号５５）。ＧｅｎＢａｎｋデータベースに対するＢＬＡＳＴ（商標）検索により、ＭＲＥＪタイプｘｖｉｉのＳＣＣｍｅｃ部分は、ＳＣＣｍｅｃタイプＩＶを保有する黄色ブドウ球菌ＣＡ０５株（ＪＣＳＣ１９６８）のＳＣＣｍｅｃ接合部の左にある配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢ０６３１７２）（Ｍａら，２００２．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４６：１１４７−１１５２）と、１００％の一致を示すことが明らかになった。ＭＲＥＪタイプｘｖｉｉの遺伝子構成は、ＭＳＳＡ中のｏｒｆｘの下流にある領域と類似している。配列そのものは以前に記載されていたが、ＭＲＳＡ株中のｏｒｆＸの下流にあるこの配列の局在は、これまで一度も記載されたことがなかった。
【００９０】
ＣＣＲＩ−１２５２４およびＣＣＲＩ−１２５３５株由来のＳＣＣｍｅｃの右端から得られた配列は、互いにほぼ同一だったが、ＭＲＥＪタイプｉ〜ｘともＭＲＥＪタイプｘｉ〜ｘｖｉｉとも異なっていたので、これをＭＲＥＪタイプｘｖｉｉｉと名付けた（配列番号３９および４０）。ＧｅｎＢａｎｋ配列に対するＢＬＡＳＴ検索により、スタフィロコッカス・ヘモリティカスＪＣＳＣ１４３５のＳＣＣｍｅｃカセットの４８７ヌクレオチド領域と１００％一致することが明らかになった。この配列の残りの部分は、ユニークであり、公表されたどの配列とも有意なホモロジーを示さないことがわかった。
【００９１】
ＣＣＲＩ−１２８１０株から得た配列は、ＭＲＥＪタイプｉ〜ｘともＭＲＥＪタイプｘｉ〜ｘｖｉｉｉとも異なっており、これをＭＲＥＪタイプｘｉｘと名付けた（配列番号４１）。ＢＬＡＳＴを使ってＧｅｎＢａｎｋ配列と比較したところ、ＭＲＥＪタイプｘｉｘ配列のＳＣＣｍｅｃ部分は、ＡＴＣＣ２５９２３株の機能未知の５９７ヌクレオチド領域（これはＳＣＣｍｅｃの左に位置する）（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢ０４７２３９）と、１００％の一致を示した。この結果は、ＳＣＣｍｅｃ配列が公表されている他の四つのＭＲＳＡ株、ＭＲＳＡ２５２、８５／３９０７、８５／２０８２、およびＭＲ１０８（それぞれＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＢＸ５７１８５６、ＡＢ０４７０８８、ＡＢ０３７６７１およびＡＢ０９６２１７）でも観察された。ＭＲＥＪタイプｘｉｘの遺伝子構成は、ＭＳＳＡ中でｏｒｆｘの下流にある領域と類似している。この配列そのものは既に記載されていたが、ｏｒｆＸの下流にあるこのＤＮＡフラグメントの存在は一度も記載されていなかった。
【００９２】
ＣＣＲＩ−１２９０５株由来のＳＣＣｍｅｃの右端に得られた配列は、ＭＲＥＪタイプｉ〜ｘともＭＲＥＪタイプｘｉ〜ｘｉｘとも異なっており、これをＭＲＥＪタイプｘｘと名付けた（配列番頭４２）。ＢＬＡＳＴを使ってＧｅｎｂａｎｋ配列と比較したところ、ＭＲＥＪタイプｘｘ配列のＳＣＣｍｅｃは、メチシリン感受性黄色ブドウ球菌ＮＣＴＣ８３２５株のｏｒｆＸの下流にある二つの非連続配列（それぞれ７２７および３０７ヌクレオチド長）（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢ０１４４４０）と、１００％および９９％の一致を示した。ＭＲＥＪタイプｘｘの遺伝子構成は、ＭＳＳＡ中のｏｒｆｘの下流にある領域と類似している。ＭＲＳＡ株中のｏｒｆＸの下流にあるこの配列の局在は、今まで一度も記載されたことがなかった。非連続フラグメント（サイズは９１〜７２７ヌクレオチドとさまざま）との９８％〜１００％の範囲の一致レベルが、ＳＣＣｍｅｃ配列が公表されている１１株のＭＲＳＡ、すなわちＮ３１５、ＮＣＴＣ１０４４２、ＣＯＬ、ＵＳＡ３００、Ｍｕ５０、２３１４、８５／４２３１、８５／２２３５、ＪＣＳＣ１９７８、ＰＬ７２、ＨＤＥ２８８（それぞれＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＢＡ００００１８、ＡＢ０３３７６３、ＣＰ００００４６、ＣＰ０００２５５、ＢＡ００００１７、ＡＹ２７１７１７、ＡＢ０１４４２８、ＡＢ０１４４２７、ＡＢ０６３１７３、ＡＦ４１１９３６、ＡＦ４１１９３５）で見出された。これらの同一フラグメントは、ｍｅｃＡ遺伝子の下流、ＳＣＣｍｅｃの左挿入点近く（またはさらに下流）に位置する。
【００９３】
（実施例４）
新しいＭＲＥＪタイプｘｉ〜ｘｘの配列比較
ＧＣＧソフトウェアプログラムＰｉｌｅｕｐおよびＧａｐ（ＧＣＧ、ウィスコンシン州）を使って、全ての新しいＭＲＥＪタイプ（ｘｉ〜ｘｘ）について、ＳＣＣｍｅｃ右端の最初の５００ヌクレオチド部分の配列を互いに比較し、以前記載されたＭＲＥＪタイプｉ〜ｉｘの配列とも比較した。表１２に、１０タイプの新規ＭＲＥＪタイプ（ｘｉ〜ｘｘ）のＳＣＣｍｅｃ右端と、以前記載されたＭＲＥＪタイプ（ｉ〜ｉｘ）のものとの間のヌクレオチドレベルでの一致度を、ＧＣＧプログラムＧａｐを使って示す。ＭＲＥＪタイプｘは、この比較から除外した。なぜなら、このＭＲＥＪ配列は、ＳＣＣｍｅｃタイプＩＩの右端と比較して、全ｏｒｆＸおよびＳＣＣｍｅｃ組み込み部位、ならびにＳＣＣｍｅｃの右端にある約４ｋｂを欠いているからである。ＭＲＥＪタイプｉｘ、ｘｉｉｉ、およびｘｉｖのＳＣＣｍｅｃ右端は、ＭＲＥＪタイプｉｘおよびｘｉｖ中に存在するそれぞれ１個よび２個の１０２ｂｐ挿入だけが相違点だった。しかし、これら三つの配列の残りの部分はほぼ１００％の一致度を示した（図３）。ＭＲＥＪタイプｘｖｉのＳＣＣｍｅｃ部分はＭＲＥＪタイプｉｉのそれとほぼ１００％同一であるが、ＭＲＥＪタイプｘｖｉにおけるｏｒｆＸのヌクレオチド１６５〜４３４の欠失は、今まで一度も記載されていない。他の全ての新しいＭＲＥＪタイプのＳＣＣｍｅｃ右端は、互いに、またはＭＲＥＪタイプｉ〜ｉｘと、３８．２〜５９．５％の範囲の一致度を示した。新規ＭＲＥＪ配列と、先行技術の検出アッセイの基礎となった以前記載された配列との間の実質的な変異は、本発明で開示する新規ＭＲＥＪタイプｘｉ〜ｘｘの右端が、以前記載されたＭＲＥＪプライマーでは予測することも検出することもできなかった理由の説明になる（米国特許第６，１５６，５０７号；国際特許出願ＰＣＴ／ＣＡ０２／００８２４；Ｉｔｏら，２００１，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４５：１３２３−１３３６；Ｈｕｌｅｔｓｋｙら，２００４，Ｊ Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４２：１８７５−１８８４；Ｍａら，２００２，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４６：１１４７−１１５２；Ｉｔｏら，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．２００４．４８：２６３７−２６５１；Ｏｌｉｖｅｉｒａら，２００１，Ｍｉｃｒｏｂ．Ｄｒｕｇ Ｒｅｓｉｓｔ．７：３４９−３６０）。
【００９４】
（実施例５）
ＭＲＥＪタイプｘｉ〜ｘｘを持つＭＲＳＡのＳＣＣｍｅｃ／ｏｒｆＸ配列からの増幅プライマーの選択
上述した１０タイプの新ＭＲＥＪタイプｘｉ〜ｘｘの配列データを解析して、各新ＭＲＥＪタイプ配列に特異的なプライマーを設計した（図２、表９および１１）。ＭＲＥＪタイプｘｉ（配列番号３４）、ＭＲＥＪタイプｘｉｉ（配列番号３５）、ＭＲＥＪタイプｘｉｉｉおよびｘｉｖ（配列番号２９）（ＭＲＥＪタイプｉｘも検出するがＭＲＥＪタイプｉｘ、ｘｉｉｉ、およびｘｉｖのそれぞれは異なるアンプリコン長を持つ）、ＭＲＥＪタイプｘｖ（配列番号２４）、ＭＲＥＪタイプｘｖｉｉ（配列番号４）、ＭＲＥＪタイプｘｖｉｉｉ（配列番号７）、ＭＲＥＪタイプｘｉｘ（配列番号９）、ＭＲＥＪタイプｘｘ（配列番号８）に特異的なプライマーを、それぞれ、黄色ブドウ球菌ｏｒｆＸに特異的なプライマー（配列番号３０）と組み合わせて使用し、それらの特異的ＭＲＥＪターゲットに対して試験した。ＭＲＥＪタイプｘｖｉの検出には、ＭＲＥＪタイプｉ、ｉｉ、およびｘｖｉをターゲットとするプライマー（表１０）を、黄色ブドウ球菌ｏｒｆＸをターゲットとするプライマー（配列番号４４）と組み合わせて使用した。ＭＲＥＪタイプｉ、ｉｉ、およびｘｖｉは、そのアンプリコンの長さが異なるので、互いに区別することができる。
【００９５】
次に、ターゲットＭＲＳＡ ＭＲＥＪタイプのＤＮＡを特異的に増幅することがわかったオリゴヌクレオチドプライマーを、ＰＣＲ増幅によって、その偏在性について試験した（すなわち、偏在的なプライマーは、ターゲットＭＲＥＪタイプのＭＲＳＡの大半のまたは全ての分離株を効率より増幅した）。ＰＣＲアッセイの特異性および偏在性は、細菌培養物を使って直接試験するか、精製細菌ゲノムＤＮＡを使って試験した。ＭＲＥＪタイプｘｉ〜ｘｘをターゲットとするプライマーの特異性も、他の全てのＭＲＥＪタイプを保有するＭＲＳＡ株からのＤＮＡを試験することによって確認した。
【００９６】
処理した規格化細菌懸濁液または細菌から精製したゲノムＤＮＡ調製物１μｌを２０μｌＰＣＲ反応混合物で増幅した。各ＰＣＲ反応は５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、各０．４μＭのＭＲＥＪタイプｘｉプライマー（配列番号３４）、ＭＲＥＪタイプｘｉｉプライマー（配列番号３５）、ＭＲＥＪタイプｘｉｉｉおよびｘｉｖプライマー（配列番号２９）、ＭＲＥＪタイプｘｖプライマー（配列番号２４）、ＭＲＥＪタイプｘｖｉ（配列番号３６）、ＭＲＥＪタイプｘｖｉｉプライマー（配列番号４）、ＭＲＥＪタイプｘｖｉｉｉプライマー（配列番号７）、ＭＲＥＪタイプｘｉｘプライマー（配列番号９）、またはＭＲＥＪタイプｘｘプライマー（配列番号８）（これらを、それぞれ０．４μＭの黄色ブドウ球菌特異的プライマー（配列番号３０またはＭＲＥＪタイプｘｖｉについては配列番号４４）と組み合わせて使用）、各２００μＭの四つのｄＮＴＰ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、ニュージャージー州ピスカタウェイ）、３．３μｇ／μｌのＢＳＡ（ＳＩＧＭＡ、ミズーリ州セントルイス）、およびＴａｑＳｔａｒｔ（商標）抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カリフォルニア州サンホゼ）と結合させた０．５Ｕ Ｔａｑポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ、ウィスコンシン州マディソン）を含有した。
【００９７】
次に、標準的なサーマルサイクラー（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｃ．（マサチューセッツ州ウォータータウン）のＰＴＣ−２００）を使って、ＰＣＲ反応を熱サイクリングに付した：９４℃で３分の後、変性ステップとして９５℃で６０秒、アニーリングステップとして５５℃で６０秒、および伸長ステップとして７２℃で６０秒を４０サイクル、次に７２℃で７分の最終的伸長。ＰＣＲ産物の検出は、０．２５μｇ／ｍｌの臭化エチジウムを含有するアガロースゲル（１．２％）における電気泳動によって行った。
【００９８】
特異的ＭＲＥＪターゲットを保有する各ＭＲＳＡ株は、それぞれの特異的ＭＲＥＪプライマーで特異的に検出され、非ターゲットＭＲＥＪタイプとの交差検出はなかった。
【００９９】
本発明を上に説明したが、本発明の要旨から逸脱することなくこれに変更を加えうることは、明白だろう。これらの変更は本願請求項に定義する本発明の範囲に包含される。
【表６】
【表７】
【表８】
【表９】
【表１０】
【表１１】
【表１２】
【表１３】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸を含む試料中のメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）株の存在を検出する方法（ＭＲＳＡ株は、細菌核酸に挿入されたｍｅｃＡ遺伝子を含むＳＣＣｍｅｃインサートを含み、細菌核酸における前記ＳＳＣｍｅｃインサートの挿入は、多型右端接合部（ＭＲＥＪ）を生成する）であって、
ＭＲＳＡ株に特異的な少なくとも一つのプライマーおよび／またはプローブ（このプライマーおよび／またはプローブは少なくとも一つのタイプｘｉ〜ｘｘの多型ＭＲＥＪ核酸にアニールする）を準備すること；
試料の核酸をプライマーおよび／またはプローブとアニールさせること（この場合、アニールしたプライマーおよび／またはプローブは、試料中にＭＲＳＡ株が存在することを示す）；および
ＭＲＳＡの存在および／または量の指標として、アニールしたプローブの存在および／または量を検出するか、核酸へのプライマーのアニーリングによって生成する増幅産物の量を検出すること、
を含む方法。
【請求項２】
用意ステップが、ＭＲＥＪタイプｘｉ、ｘｉｉ、ｘｉｉｉ、ｘｉｖ、ｘｖ、ｘｖｉ、ｘｖｉｉ、ｘｖｉｉｉ、ｘｉｘ、およびｘｘから選択される少なくとも一つのＭＲＥＪタイプとアニールすることができる複数のプライマーおよび／またはプローブを用意することをさらに含む、請求項１の方法。
【請求項３】
さらにＤＮＡ増幅ステップを含み、そのＤＮＡ増幅がＰＣＲ、ＬＣＲ、ＮＡＢＳＡ、３ＳＲ、ＳＤＡ、ｂＤＮＡ、ＴＭＡ、ＣＰＴ、ＳＰＡ、ＮＤＳＡ、ローリングサークル増幅、固定鎖置換増幅、固相（固定化）ローリングサークル増幅、またはＱβレプリカーゼ増幅である、請求項２の方法。
【請求項４】
複数のプライマーおよび／またはプローブがＭＲＥＪタイプｘｉ、ｘｉｉ、ｘｉｉｉ、ｘｉｖ、ｘｖ、ｘｖｉ、ｘｖｉｉ、ｘｖｉｉｉ、ｘｉｘ、およびｘｘから選択される少なくとも四つのＭＲＥＪタイプとアニールすることができる、請求項２の方法。
【請求項５】
プライマーおよび／またはプローブが共通のアニーリング条件下でアニールする、請求項２の方法。
【請求項６】
プライマーおよび／またはプローブが同じ物理的容器内に用意される、請求項５の方法。
【請求項７】
プライマーおよび／またはプローブが少なくとも１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、または３０ヌクレオチド長である、請求項１の方法。
【請求項８】
プライマーおよび／またはプローブが、配列番号１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２５、２６、３９、４０、４１、４２、５５、および５６の少なくとも一つにアニールする能力を持つ、請求項１の方法。
【請求項９】
複数のプライマーおよび／またはプローブのうち、少なくとも一つのプライマーおよび／またはプローブが、配列番号１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２５、２６、３９、４０、４１、４２、５５、および５６のそれぞれにアニールする能力を持つ、請求項２の方法。
【請求項１０】
複数のプライマーおよび／またはプローブがＭＲＥＪタイプｘｉ検出用の配列番号５１、３０、３１、３２、および３３を含む、請求項２の方法。
【請求項１１】
複数のプライマーおよび／またはプローブがＭＲＥＪタイプｘｉｉ検出用の配列番号５２、３０、３１、３２、および３３を含む、請求項２の方法。
【請求項１２】
複数のプライマーおよび／またはプローブがＭＲＥＪタイプｘｉｉｉ検出用の配列番号２９、３０、３１、３２、および３３を含む、請求項２の方法。
【請求項１３】
複数のプライマーおよび／またはプローブがＭＲＥＪタイプｘｉｖ検出用の配列番号２９、３０、３１、３２、および３３を含む、請求項２の方法。
【請求項１４】
複数のプライマーおよび／またはプローブがＭＲＥＪタイプｘｖ検出用の配列番号２４、３０、３１、３２、および３３を含む、請求項２の方法。
【請求項１５】
複数のプライマーおよび／またはプローブがＭＲＥＪタイプｘｖｉ検出用の配列番号３６および４４を含む、請求項２の方法。
【請求項１６】
複数のプライマーおよび／またはプローブがＭＲＥＪタイプｘｖｉｉ検出用の配列番号４、３０、３１、３２、および３３を含む、請求項２の方法。
【請求項１７】
複数のプライマーおよび／またはプローブがＭＲＥＪタイプｘｖｉｉｉ検出用の配列番号７、３０、３１、３２、および３３を含む、請求項２の方法。
【請求項１８】
複数のプライマーおよび／またはプローブがＭＲＥＪタイプｘｉｘ検出用の配列番号９、３０、３１、３２、および３３を含む、請求項２の方法。
【請求項１９】
複数のプライマーおよび／またはプローブがＭＲＥＪタイプｘｘ検出用の配列番号８、３０、３１、３２、および３３を含む、請求項２の方法。
【請求項２０】
複数のプライマーおよび／またはプローブが、
ＭＲＥＪタイプｘｉ検出用の配列番号５１、３０、３１、３２、および３３、
ＭＲＥＪタイプｘｉｉ検出用の配列番号５２、３０、３１、３２、および３３、
ＭＲＥＪタイプｘｉｉｉ検出用の配列番号２９、３０、３１、３２、および３３、
ＭＲＥＪタイプｘｉｖ検出用の配列番号２９、３０、３１、３２、および３３、
ＭＲＥＪタイプｘｖ検出用の配列番号２４、３０、３１、３２、および３３、
ＭＲＥＪタイプｘｖｉ検出用の配列番号３６および４４、
ＭＲＥＪタイプｘｖｉｉ検出用の配列番号４、３０、３１、３２、および３３、
ＭＲＥＪタイプｘｖｉｉｉ検出用の配列番号７、３０、３１、３２、および３３、
ＭＲＥＪタイプｘｉｘ検出用の配列番号９、３０、３１、３２、および３３、ならびに
ＭＲＥＪタイプｘｘ検出用の配列番号８、３０、３１、３２、および３３
を含む、請求項２の方法。
【請求項２１】
複数のプライマーおよび／またはプローブが、ＭＲＥＪタイプｘｉ検出用の配列番号３４、４４、４５、および７６のプライマーおよび／またはプローブをさらに含む、請求項１０の方法。
【請求項２２】
複数のプライマーおよび／またはプローブが、ＭＲＥＪタイプｘｉｉ検出用の配列番号３４、４４、４５、５２、および６２のプライマーおよび／またはプローブをさらに含む、請求項１１の方法。
【請求項２３】
複数のプライマーおよび／またはプローブが、ＭＲＥＪタイプｘｉｉｉ検出用の配列番号３３、４４、４５、および７６のプライマーおよび／またはプローブをさらに含む、請求項１２の方法。
【請求項２４】
複数のプライマーおよび／またはプローブが、ＭＲＥＪタイプｘｉｖ検出用の配列番号４４、４５、および５９のプライマーおよび／またはプローブをさらに含む、請求項１３の方法。
【請求項２５】
複数のプライマーおよび／またはプローブが、ＭＲＥＪタイプｘｖ検出用の配列番号４、４５、および６２のプライマーおよび／またはプローブをさらに含む、請求項１４の方法。
【請求項２６】
複数のプライマーおよび／またはプローブが、ＭＲＥＪタイプｘｖｉｉ検出用の配列番号４４、４５、および６２のプライマーおよび／またはプローブをさらに含む、請求項１６の方法。
【請求項２７】
複数のプライマーおよび／またはプローブが、ＭＲＥＪタイプｘｖｉｉｉ検出用の配列番号４４、４５、および５９のプライマーおよび／またはプローブをさらに含む、請求項１７の方法。
【請求項２８】
複数のプライマーおよび／またはプローブが、ＭＲＥＪタイプｘｉｘ検出用の配列番号４４、４５、および５９のプライマーおよび／またはプローブをさらに含む、請求項１８の方法。
【請求項２９】
複数のプライマーおよび／またはプローブが、ＭＲＥＪタイプｘｘ検出用の配列番号４４、４５、および５９のプライマーおよび／またはプローブをさらに含む、請求項１９の方法。
【請求項３０】
配列番号３４、３５、４４、４５、５２、５９、６２、７６のプライマーおよび／またはプローブをさらに含む、請求項２０の方法。
【請求項３１】
プライマーが二つ一組にして用意され、そのプライマー対が、ＭＲＥＪタイプｘｉ検出用の配列番号３４／４５、３４／３０、３４／７６、および３４／４４からなる群より選択される、請求項２１の方法。
【請求項３２】
プライマーが二つ一組にして用意され、そのプライマー対が、ＭＲＥＪタイプｘｉｉ検出用の配列番号３５／４５、３５／３０、３５／６２、および３５／４４からなる群より選択される、請求項２２の方法。
【請求項３３】
プライマーが二つ一組にして用意され、そのプライマー対が、ＭＲＥＪタイプｘｉｉｉ検出用の配列番号２９／４５、２９／３０、２９／７６、および２９／４４からなる群より選択される、請求項２３の方法。
【請求項３４】
プライマーが二つ一組にして用意され、そのプライマー対が、ＭＲＥＪタイプｘｉｖ検出用の配列番号２９／４５、２９／３０、２９／５９、および２９／４４からなる群より選択される、請求項２４の方法。
【請求項３５】
プライマーが二つ一組にして用意され、そのプライマー対が、ＭＲＥＪタイプｘｖ検出用の配列番号２４／４５、２４／３０、２４／６２、および２４／４４からなる群より選択される、請求項２５の方法。
【請求項３６】
プライマーが二つ一組にして用意され、そのプライマー対が、ＭＲＥＪタイプｘｖｉｉ検出用の配列番号４／４５、４／３０、４／６２、および４／４４からなる群より選択される、請求項２６の方法。
【請求項３７】
プライマーが二つ一組にして用意され、そのプライマー対が、ＭＲＥＪタイプｘｖｉｉｉ検出用の配列番号７／４５、７／３０、７／５９、および７／４４からなる群より選択される、請求項２７の方法。
【請求項３８】
プライマーが二つ一組にして用意され、そのプライマー対が、ＭＲＥＪタイプｘｉｘ検出用の配列番号９／４５、９／３０、９／５９、および９／４４からなる群より選択される、請求項２８の方法。
【請求項３９】
プライマーが二つ一組にして用意され、そのプライマー対が、ＭＲＥＪタイプｘｘ検出用の配列番号８／４５、８／３０、８／５９、および８／４４からなる群より選択される、請求項２９の方法。
【請求項４０】
プライマーが二つ一組にして用意され、そのプライマー対が、
ＭＲＥＪタイプｘｉ検出用の配列番号３４／４５、３４／３０、３４／７６、および３４／４４；
ＭＲＥＪタイプｘｉｉ検出用の配列番号３５／４５、３５／３０、３５／６２、および３５／４４；
ＭＲＥＪタイプｘｉｉｉ検出用の配列番号２９／４５、２９／３０、２９／７６、および２９／４４；
ＭＲＥＪタイプｘｉｖ検出用の配列番号２９／４５、２９／３０、２９／５９、および２９／４４；
ＭＲＥＪタイプｘｖ’検出用の配列番号２４／４５、２４／３０、２４／６２、および２４／４４
ＭＲＥＪタイプｘｖｉ検出用の配列番号３６／４４；
ＭＲＥＪタイプｘｖｉｉ検出用の配列番号４／４５、４／３０、４／６２、および４／４４；
ＭＲＥＪタイプｘｖｉｉｉ検出用の配列番号７／４５、７／３０、７／５９、および７／４４；
ＭＲＥＪタイプｘｉｘ検出用の配列番号９／４５、９／３０、９／５９、および９／４４；ならびに
ＭＲＥＪタイプｘｘ検出用の配列番号８／４５、８／３０、８／５９、および８／４４
からなる群より選択される、請求項３０の方法。
【請求項４１】
以下の配列を持つプローブをさらに含む、請求項４０の方法：
ＭＲＥＪタイプｘｉ〜ｘｘを検出するための配列番号３０、３１、および３２。
【請求項４２】
前記プローブおよびプライマーが一緒に使用される、請求項４０の方法。
【請求項４３】
前記プローブおよび／またはプライマーが同じ物理的容器内で一緒に使用される、請求項４２の方法。
【請求項４４】
タイプｘｉ〜ｘｘから選ばれる所定のＭＲＥＪタイプの存在の指標として、アニールしたプローブおよび／またはプライマーを検出することをさらに含む、請求項１の方法。
【請求項４５】
検出方法がアガロースゲル電気泳動、蛍光共鳴エネルギー移動、ＴａｑＭａｎプローブ、分子ビーコンプローブ、スコーピオンプローブ、ナノ粒子プローブ、Ａｍｐｌｉｆｌｏｕｒプローブ、化学発光、ポテンシオメトリー、質量分析、プラズモン共鳴、偏光測定、比色法、フローサイトメトリー、スキャン分析、およびＤＮＡ配列決定からなる群より選択される、請求項４４の方法。
【請求項４６】
配列番号１７、１８、１９（ＭＲＥＪタイプｘｉ）；
配列番号２０（ＭＲＥＪタイプｘｉｉ）；
配列番号１５、２５、２６（ＭＲＥＪタイプｘｉｉｉ）；
配列番号１６（ＭＲＥＪタイプｘｉｖ）；
配列番号５６（ＭＲＥＪタイプｘｖ）；
配列番号２１（ＭＲＥＪタイプｘｖｉ）；
配列番号５５（ＭＲＥＪタイプｘｖｉｉ）；
配列番号３９、４０（ＭＲＥＪタイプｘｖｉｉｉ）；
配列番号４１（ＭＲＥＪタイプｘｉｘ）；および
配列番号４２（ＭＲＥＪタイプｘｘ）
からなる群より選択される核酸、またはその相補体。
【請求項４７】
請求項４６の核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする少なくとも１０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチド。
【請求項４８】
ＭＲＥＪタイプｘｉ検出用の配列番号３４／４５、３４／３０、３４／７６、および３４／４４の配列を含むオリゴヌクレオチド、
ＭＲＥＪタイプｘｉｉ検出用の配列番号３５／４５、３５／３０、３５／６２、および３５／４４の配列を含むオリゴヌクレオチド、
ＭＲＥＪタイプｘｉｉｉ検出用の配列番号２９／４５、２９／３０、２９／７６、および２９／４４の配列を含むオリゴヌクレオチド、
ＭＲＥＪタイプｘｉｖ検出用の配列番号２９／４５、２９／３０、２９／５９、および２９／４４の配列を含むオリゴヌクレオチド、
ＭＲＥＪタイプｘｖ検出用の配列番号２４／４５、２４／３０、２４／６２、および２４／４４の配列を含むオリゴヌクレオチド、
ＭＲＥＪタイプｘｖｉ検出用の配列番号３６／４４の配列を含むオリゴヌクレオチド、
ＭＲＥＪタイプｘｖｉｉ検出用の配列番号４／４５、４／３０、４／６２、および４／４４の配列を含むオリゴヌクレオチド、
ＭＲＥＪタイプｘｖｉｉｉ検出用の配列番号７／４５、７／３０、７／５９、および７／４４の配列を含むオリゴヌクレオチド、
ＭＲＥＪタイプｘｉｘ検出用の配列番号９／４５、９／３０、９／５９、および９／４４の配列を含むオリゴヌクレオチド、ならびに
ＭＲＥＪタイプｘｘ検出用の配列番号８／４５、８／３０、８／５９、および８／４４の配列を含むオリゴヌクレオチド
からなる群より選択されるオリゴヌクレオチド対。
【請求項４９】
配列番号３１、３２、または３３の配列を含むオリゴヌクレオチド。
【請求項５０】
複数のプライマーおよび／またはプローブを含むキットであって、プライマーおよび／またはプローブが少なくとも１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、または３０ヌクレオチド長であり、プライマーおよび／またはプローブがストリンジェントな条件下で請求項４６の核酸の少なくとも一つにハイブリダイズし、複数のプライマーおよび／またはプローブがｘｉ〜ｘｘから選択されるタイプの少なくとも一つのＭＲＥＪとハイブリダイズするキット。
【請求項５１】
ｉ〜ｘから選択されるタイプの一つ以上のＭＲＥＪとハイブリダイズするプライマーおよび／またはプローブをさらに含む、請求項５０のキット。
【請求項５２】
プライマー対をさらに含み、そのプライマー対が、
ＭＲＥＪタイプｉ検出用の配列番号３０／３６；
ＭＲＥＪタイプｉｉ検出用の配列番号３０／３６；
ＭＲＥＪタイプｉｉｉ検出用の配列番号３０／７０；
ＭＲＥＪタイプｉｖ検出用の配列番号３０／７１；
ＭＲＥＪタイプｖ検出用の配列番号３０／７２；
ＭＲＥＪタイプｖｉ検出用の配列番号３０／６５；
ＭＲＥＪタイプｖｉｉ検出用の配列番号３０／７４；
ＭＲＥＪタイプｖｉｉｉ検出用の配列番号３０／７５；
ＭＲＥＪタイプｉｘ検出用の配列番号３０／２９；
ＭＲＥＪタイプｘ検出用の配列番号７３／７７；
ＭＲＥＪタイプｘｉ検出用の配列番号３４／４５、３４／３０、３４／７６、３４／４４；
ＭＲＥＪタイプｘｉｉ検出用の配列番号３５／４５、３５／３０、３５／６２、３５／４４；
ＭＲＥＪタイプｘｉｉｉ検出用の配列番号２９／４５、２９／３０、２９／７６、２９／４４；
ＭＲＥＪタイプｘｉｖ検出用の配列番号２９／４５、２９／３０、２９／５９、２９／４４；
ＭＲＥＪタイプｘｖ検出用の配列番号２４／４５、２４／３０、２４／６２、２４／４４；
ＭＲＥＪタイプｘｖｉ検出用の配列番号３６／４４；
ＭＲＥＪタイプｘｖｉｉ検出用の配列番号４／４５、４／３０、４／６２、４／４４；
ＭＲＥＪタイプｘｖｉｉｉ検出用の配列番号７／４５、７／３０、７／５９、７／４４；
ＭＲＥＪタイプｘｉｘ検出用の配列番号９／４５、９／３０、９／５９、９／４４；および
ＭＲＥＪタイプｘｘ検出用の配列番号８／４５、８／３０、８／５９、８／４４
のヌクレオチド配列を含む、請求項５１のキット。
【請求項５３】
さらにプローブを含み、そのプローブが配列番号３１、３２、３３の核酸配列を含む、請求項５１のキット。
【請求項１】
核酸を含む試料中のメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）株の存在を検出する方法（ＭＲＳＡ株は、細菌核酸に挿入されたｍｅｃＡ遺伝子を含むＳＣＣｍｅｃインサートを含み、細菌核酸における前記ＳＳＣｍｅｃインサートの挿入は、多型右端接合部（ＭＲＥＪ）を生成する）であって、
ＭＲＳＡ株に特異的な少なくとも一つのプライマーおよび／またはプローブ（このプライマーおよび／またはプローブは少なくとも一つのタイプｘｉ〜ｘｘの多型ＭＲＥＪ核酸にアニールする）を準備すること；
試料の核酸をプライマーおよび／またはプローブとアニールさせること（この場合、アニールしたプライマーおよび／またはプローブは、試料中にＭＲＳＡ株が存在することを示す）；および
ＭＲＳＡの存在および／または量の指標として、アニールしたプローブの存在および／または量を検出するか、核酸へのプライマーのアニーリングによって生成する増幅産物の量を検出すること、
を含む方法。
【請求項２】
用意ステップが、ＭＲＥＪタイプｘｉ、ｘｉｉ、ｘｉｉｉ、ｘｉｖ、ｘｖ、ｘｖｉ、ｘｖｉｉ、ｘｖｉｉｉ、ｘｉｘ、およびｘｘから選択される少なくとも一つのＭＲＥＪタイプとアニールすることができる複数のプライマーおよび／またはプローブを用意することをさらに含む、請求項１の方法。
【請求項３】
さらにＤＮＡ増幅ステップを含み、そのＤＮＡ増幅がＰＣＲ、ＬＣＲ、ＮＡＢＳＡ、３ＳＲ、ＳＤＡ、ｂＤＮＡ、ＴＭＡ、ＣＰＴ、ＳＰＡ、ＮＤＳＡ、ローリングサークル増幅、固定鎖置換増幅、固相（固定化）ローリングサークル増幅、またはＱβレプリカーゼ増幅である、請求項２の方法。
【請求項４】
複数のプライマーおよび／またはプローブがＭＲＥＪタイプｘｉ、ｘｉｉ、ｘｉｉｉ、ｘｉｖ、ｘｖ、ｘｖｉ、ｘｖｉｉ、ｘｖｉｉｉ、ｘｉｘ、およびｘｘから選択される少なくとも四つのＭＲＥＪタイプとアニールすることができる、請求項２の方法。
【請求項５】
プライマーおよび／またはプローブが共通のアニーリング条件下でアニールする、請求項２の方法。
【請求項６】
プライマーおよび／またはプローブが同じ物理的容器内に用意される、請求項５の方法。
【請求項７】
プライマーおよび／またはプローブが少なくとも１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、または３０ヌクレオチド長である、請求項１の方法。
【請求項８】
プライマーおよび／またはプローブが、配列番号１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２５、２６、３９、４０、４１、４２、５５、および５６の少なくとも一つにアニールする能力を持つ、請求項１の方法。
【請求項９】
複数のプライマーおよび／またはプローブのうち、少なくとも一つのプライマーおよび／またはプローブが、配列番号１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２５、２６、３９、４０、４１、４２、５５、および５６のそれぞれにアニールする能力を持つ、請求項２の方法。
【請求項１０】
複数のプライマーおよび／またはプローブがＭＲＥＪタイプｘｉ検出用の配列番号５１、３０、３１、３２、および３３を含む、請求項２の方法。
【請求項１１】
複数のプライマーおよび／またはプローブがＭＲＥＪタイプｘｉｉ検出用の配列番号５２、３０、３１、３２、および３３を含む、請求項２の方法。
【請求項１２】
複数のプライマーおよび／またはプローブがＭＲＥＪタイプｘｉｉｉ検出用の配列番号２９、３０、３１、３２、および３３を含む、請求項２の方法。
【請求項１３】
複数のプライマーおよび／またはプローブがＭＲＥＪタイプｘｉｖ検出用の配列番号２９、３０、３１、３２、および３３を含む、請求項２の方法。
【請求項１４】
複数のプライマーおよび／またはプローブがＭＲＥＪタイプｘｖ検出用の配列番号２４、３０、３１、３２、および３３を含む、請求項２の方法。
【請求項１５】
複数のプライマーおよび／またはプローブがＭＲＥＪタイプｘｖｉ検出用の配列番号３６および４４を含む、請求項２の方法。
【請求項１６】
複数のプライマーおよび／またはプローブがＭＲＥＪタイプｘｖｉｉ検出用の配列番号４、３０、３１、３２、および３３を含む、請求項２の方法。
【請求項１７】
複数のプライマーおよび／またはプローブがＭＲＥＪタイプｘｖｉｉｉ検出用の配列番号７、３０、３１、３２、および３３を含む、請求項２の方法。
【請求項１８】
複数のプライマーおよび／またはプローブがＭＲＥＪタイプｘｉｘ検出用の配列番号９、３０、３１、３２、および３３を含む、請求項２の方法。
【請求項１９】
複数のプライマーおよび／またはプローブがＭＲＥＪタイプｘｘ検出用の配列番号８、３０、３１、３２、および３３を含む、請求項２の方法。
【請求項２０】
複数のプライマーおよび／またはプローブが、
ＭＲＥＪタイプｘｉ検出用の配列番号５１、３０、３１、３２、および３３、
ＭＲＥＪタイプｘｉｉ検出用の配列番号５２、３０、３１、３２、および３３、
ＭＲＥＪタイプｘｉｉｉ検出用の配列番号２９、３０、３１、３２、および３３、
ＭＲＥＪタイプｘｉｖ検出用の配列番号２９、３０、３１、３２、および３３、
ＭＲＥＪタイプｘｖ検出用の配列番号２４、３０、３１、３２、および３３、
ＭＲＥＪタイプｘｖｉ検出用の配列番号３６および４４、
ＭＲＥＪタイプｘｖｉｉ検出用の配列番号４、３０、３１、３２、および３３、
ＭＲＥＪタイプｘｖｉｉｉ検出用の配列番号７、３０、３１、３２、および３３、
ＭＲＥＪタイプｘｉｘ検出用の配列番号９、３０、３１、３２、および３３、ならびに
ＭＲＥＪタイプｘｘ検出用の配列番号８、３０、３１、３２、および３３
を含む、請求項２の方法。
【請求項２１】
複数のプライマーおよび／またはプローブが、ＭＲＥＪタイプｘｉ検出用の配列番号３４、４４、４５、および７６のプライマーおよび／またはプローブをさらに含む、請求項１０の方法。
【請求項２２】
複数のプライマーおよび／またはプローブが、ＭＲＥＪタイプｘｉｉ検出用の配列番号３４、４４、４５、５２、および６２のプライマーおよび／またはプローブをさらに含む、請求項１１の方法。
【請求項２３】
複数のプライマーおよび／またはプローブが、ＭＲＥＪタイプｘｉｉｉ検出用の配列番号３３、４４、４５、および７６のプライマーおよび／またはプローブをさらに含む、請求項１２の方法。
【請求項２４】
複数のプライマーおよび／またはプローブが、ＭＲＥＪタイプｘｉｖ検出用の配列番号４４、４５、および５９のプライマーおよび／またはプローブをさらに含む、請求項１３の方法。
【請求項２５】
複数のプライマーおよび／またはプローブが、ＭＲＥＪタイプｘｖ検出用の配列番号４、４５、および６２のプライマーおよび／またはプローブをさらに含む、請求項１４の方法。
【請求項２６】
複数のプライマーおよび／またはプローブが、ＭＲＥＪタイプｘｖｉｉ検出用の配列番号４４、４５、および６２のプライマーおよび／またはプローブをさらに含む、請求項１６の方法。
【請求項２７】
複数のプライマーおよび／またはプローブが、ＭＲＥＪタイプｘｖｉｉｉ検出用の配列番号４４、４５、および５９のプライマーおよび／またはプローブをさらに含む、請求項１７の方法。
【請求項２８】
複数のプライマーおよび／またはプローブが、ＭＲＥＪタイプｘｉｘ検出用の配列番号４４、４５、および５９のプライマーおよび／またはプローブをさらに含む、請求項１８の方法。
【請求項２９】
複数のプライマーおよび／またはプローブが、ＭＲＥＪタイプｘｘ検出用の配列番号４４、４５、および５９のプライマーおよび／またはプローブをさらに含む、請求項１９の方法。
【請求項３０】
配列番号３４、３５、４４、４５、５２、５９、６２、７６のプライマーおよび／またはプローブをさらに含む、請求項２０の方法。
【請求項３１】
プライマーが二つ一組にして用意され、そのプライマー対が、ＭＲＥＪタイプｘｉ検出用の配列番号３４／４５、３４／３０、３４／７６、および３４／４４からなる群より選択される、請求項２１の方法。
【請求項３２】
プライマーが二つ一組にして用意され、そのプライマー対が、ＭＲＥＪタイプｘｉｉ検出用の配列番号３５／４５、３５／３０、３５／６２、および３５／４４からなる群より選択される、請求項２２の方法。
【請求項３３】
プライマーが二つ一組にして用意され、そのプライマー対が、ＭＲＥＪタイプｘｉｉｉ検出用の配列番号２９／４５、２９／３０、２９／７６、および２９／４４からなる群より選択される、請求項２３の方法。
【請求項３４】
プライマーが二つ一組にして用意され、そのプライマー対が、ＭＲＥＪタイプｘｉｖ検出用の配列番号２９／４５、２９／３０、２９／５９、および２９／４４からなる群より選択される、請求項２４の方法。
【請求項３５】
プライマーが二つ一組にして用意され、そのプライマー対が、ＭＲＥＪタイプｘｖ検出用の配列番号２４／４５、２４／３０、２４／６２、および２４／４４からなる群より選択される、請求項２５の方法。
【請求項３６】
プライマーが二つ一組にして用意され、そのプライマー対が、ＭＲＥＪタイプｘｖｉｉ検出用の配列番号４／４５、４／３０、４／６２、および４／４４からなる群より選択される、請求項２６の方法。
【請求項３７】
プライマーが二つ一組にして用意され、そのプライマー対が、ＭＲＥＪタイプｘｖｉｉｉ検出用の配列番号７／４５、７／３０、７／５９、および７／４４からなる群より選択される、請求項２７の方法。
【請求項３８】
プライマーが二つ一組にして用意され、そのプライマー対が、ＭＲＥＪタイプｘｉｘ検出用の配列番号９／４５、９／３０、９／５９、および９／４４からなる群より選択される、請求項２８の方法。
【請求項３９】
プライマーが二つ一組にして用意され、そのプライマー対が、ＭＲＥＪタイプｘｘ検出用の配列番号８／４５、８／３０、８／５９、および８／４４からなる群より選択される、請求項２９の方法。
【請求項４０】
プライマーが二つ一組にして用意され、そのプライマー対が、
ＭＲＥＪタイプｘｉ検出用の配列番号３４／４５、３４／３０、３４／７６、および３４／４４；
ＭＲＥＪタイプｘｉｉ検出用の配列番号３５／４５、３５／３０、３５／６２、および３５／４４；
ＭＲＥＪタイプｘｉｉｉ検出用の配列番号２９／４５、２９／３０、２９／７６、および２９／４４；
ＭＲＥＪタイプｘｉｖ検出用の配列番号２９／４５、２９／３０、２９／５９、および２９／４４；
ＭＲＥＪタイプｘｖ’検出用の配列番号２４／４５、２４／３０、２４／６２、および２４／４４
ＭＲＥＪタイプｘｖｉ検出用の配列番号３６／４４；
ＭＲＥＪタイプｘｖｉｉ検出用の配列番号４／４５、４／３０、４／６２、および４／４４；
ＭＲＥＪタイプｘｖｉｉｉ検出用の配列番号７／４５、７／３０、７／５９、および７／４４；
ＭＲＥＪタイプｘｉｘ検出用の配列番号９／４５、９／３０、９／５９、および９／４４；ならびに
ＭＲＥＪタイプｘｘ検出用の配列番号８／４５、８／３０、８／５９、および８／４４
からなる群より選択される、請求項３０の方法。
【請求項４１】
以下の配列を持つプローブをさらに含む、請求項４０の方法：
ＭＲＥＪタイプｘｉ〜ｘｘを検出するための配列番号３０、３１、および３２。
【請求項４２】
前記プローブおよびプライマーが一緒に使用される、請求項４０の方法。
【請求項４３】
前記プローブおよび／またはプライマーが同じ物理的容器内で一緒に使用される、請求項４２の方法。
【請求項４４】
タイプｘｉ〜ｘｘから選ばれる所定のＭＲＥＪタイプの存在の指標として、アニールしたプローブおよび／またはプライマーを検出することをさらに含む、請求項１の方法。
【請求項４５】
検出方法がアガロースゲル電気泳動、蛍光共鳴エネルギー移動、ＴａｑＭａｎプローブ、分子ビーコンプローブ、スコーピオンプローブ、ナノ粒子プローブ、Ａｍｐｌｉｆｌｏｕｒプローブ、化学発光、ポテンシオメトリー、質量分析、プラズモン共鳴、偏光測定、比色法、フローサイトメトリー、スキャン分析、およびＤＮＡ配列決定からなる群より選択される、請求項４４の方法。
【請求項４６】
配列番号１７、１８、１９（ＭＲＥＪタイプｘｉ）；
配列番号２０（ＭＲＥＪタイプｘｉｉ）；
配列番号１５、２５、２６（ＭＲＥＪタイプｘｉｉｉ）；
配列番号１６（ＭＲＥＪタイプｘｉｖ）；
配列番号５６（ＭＲＥＪタイプｘｖ）；
配列番号２１（ＭＲＥＪタイプｘｖｉ）；
配列番号５５（ＭＲＥＪタイプｘｖｉｉ）；
配列番号３９、４０（ＭＲＥＪタイプｘｖｉｉｉ）；
配列番号４１（ＭＲＥＪタイプｘｉｘ）；および
配列番号４２（ＭＲＥＪタイプｘｘ）
からなる群より選択される核酸、またはその相補体。
【請求項４７】
請求項４６の核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする少なくとも１０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチド。
【請求項４８】
ＭＲＥＪタイプｘｉ検出用の配列番号３４／４５、３４／３０、３４／７６、および３４／４４の配列を含むオリゴヌクレオチド、
ＭＲＥＪタイプｘｉｉ検出用の配列番号３５／４５、３５／３０、３５／６２、および３５／４４の配列を含むオリゴヌクレオチド、
ＭＲＥＪタイプｘｉｉｉ検出用の配列番号２９／４５、２９／３０、２９／７６、および２９／４４の配列を含むオリゴヌクレオチド、
ＭＲＥＪタイプｘｉｖ検出用の配列番号２９／４５、２９／３０、２９／５９、および２９／４４の配列を含むオリゴヌクレオチド、
ＭＲＥＪタイプｘｖ検出用の配列番号２４／４５、２４／３０、２４／６２、および２４／４４の配列を含むオリゴヌクレオチド、
ＭＲＥＪタイプｘｖｉ検出用の配列番号３６／４４の配列を含むオリゴヌクレオチド、
ＭＲＥＪタイプｘｖｉｉ検出用の配列番号４／４５、４／３０、４／６２、および４／４４の配列を含むオリゴヌクレオチド、
ＭＲＥＪタイプｘｖｉｉｉ検出用の配列番号７／４５、７／３０、７／５９、および７／４４の配列を含むオリゴヌクレオチド、
ＭＲＥＪタイプｘｉｘ検出用の配列番号９／４５、９／３０、９／５９、および９／４４の配列を含むオリゴヌクレオチド、ならびに
ＭＲＥＪタイプｘｘ検出用の配列番号８／４５、８／３０、８／５９、および８／４４の配列を含むオリゴヌクレオチド
からなる群より選択されるオリゴヌクレオチド対。
【請求項４９】
配列番号３１、３２、または３３の配列を含むオリゴヌクレオチド。
【請求項５０】
複数のプライマーおよび／またはプローブを含むキットであって、プライマーおよび／またはプローブが少なくとも１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、または３０ヌクレオチド長であり、プライマーおよび／またはプローブがストリンジェントな条件下で請求項４６の核酸の少なくとも一つにハイブリダイズし、複数のプライマーおよび／またはプローブがｘｉ〜ｘｘから選択されるタイプの少なくとも一つのＭＲＥＪとハイブリダイズするキット。
【請求項５１】
ｉ〜ｘから選択されるタイプの一つ以上のＭＲＥＪとハイブリダイズするプライマーおよび／またはプローブをさらに含む、請求項５０のキット。
【請求項５２】
プライマー対をさらに含み、そのプライマー対が、
ＭＲＥＪタイプｉ検出用の配列番号３０／３６；
ＭＲＥＪタイプｉｉ検出用の配列番号３０／３６；
ＭＲＥＪタイプｉｉｉ検出用の配列番号３０／７０；
ＭＲＥＪタイプｉｖ検出用の配列番号３０／７１；
ＭＲＥＪタイプｖ検出用の配列番号３０／７２；
ＭＲＥＪタイプｖｉ検出用の配列番号３０／６５；
ＭＲＥＪタイプｖｉｉ検出用の配列番号３０／７４；
ＭＲＥＪタイプｖｉｉｉ検出用の配列番号３０／７５；
ＭＲＥＪタイプｉｘ検出用の配列番号３０／２９；
ＭＲＥＪタイプｘ検出用の配列番号７３／７７；
ＭＲＥＪタイプｘｉ検出用の配列番号３４／４５、３４／３０、３４／７６、３４／４４；
ＭＲＥＪタイプｘｉｉ検出用の配列番号３５／４５、３５／３０、３５／６２、３５／４４；
ＭＲＥＪタイプｘｉｉｉ検出用の配列番号２９／４５、２９／３０、２９／７６、２９／４４；
ＭＲＥＪタイプｘｉｖ検出用の配列番号２９／４５、２９／３０、２９／５９、２９／４４；
ＭＲＥＪタイプｘｖ検出用の配列番号２４／４５、２４／３０、２４／６２、２４／４４；
ＭＲＥＪタイプｘｖｉ検出用の配列番号３６／４４；
ＭＲＥＪタイプｘｖｉｉ検出用の配列番号４／４５、４／３０、４／６２、４／４４；
ＭＲＥＪタイプｘｖｉｉｉ検出用の配列番号７／４５、７／３０、７／５９、７／４４；
ＭＲＥＪタイプｘｉｘ検出用の配列番号９／４５、９／３０、９／５９、９／４４；および
ＭＲＥＪタイプｘｘ検出用の配列番号８／４５、８／３０、８／５９、８／４４
のヌクレオチド配列を含む、請求項５１のキット。
【請求項５３】
さらにプローブを含み、そのプローブが配列番号３１、３２、３３の核酸配列を含む、請求項５１のキット。
【図１】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【公開番号】特開２０１２−２２８２６２（Ｐ２０１２−２２８２６２Ａ）
【公開日】平成２４年１１月２２日（２０１２．１１．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−１５７７７１（Ｐ２０１２−１５７７７１）
【出願日】平成２４年７月１３日（２０１２．７．１３）
【分割の表示】特願２００８−５３５６９２（Ｐ２００８−５３５６９２）の分割
【原出願日】平成１８年１０月１０日（２００６．１０．１０）
【出願人】（５０４３７７８５１）ジーンオーム サイエンシーズ、インク． (9)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１１月２２日（２０１２．１１．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２４年７月１３日（２０１２．７．１３）
【分割の表示】特願２００８−５３５６９２（Ｐ２００８−５３５６９２）の分割
【原出願日】平成１８年１０月１０日（２００６．１０．１０）
【出願人】（５０４３７７８５１）ジーンオーム サイエンシーズ、インク． (9)
【Ｆターム（参考）】
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