Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ２遺伝子の一塩基多型を検出するためのプライマーセット
【課題】ＮＡＴ２遺伝子の９種類の一塩基多型を簡便・且つ効率的に検出する方法を提供する。
【解決手段】特定の１０塩基以上連続した塩基配列を有するプライマーの組合わせを含む、８種類のプライマーセットを用いることによって、ＮＡＴ２遺伝子の９種類の多型塩基のうち、特定の位置の塩基を含む複数のフラグメントを同時に増幅し、該フラグメントを用いて各多型を同時に検出する。
【解決手段】特定の１０塩基以上連続した塩基配列を有するプライマーの組合わせを含む、８種類のプライマーセットを用いることによって、ＮＡＴ２遺伝子の９種類の多型塩基のうち、特定の位置の塩基を含む複数のフラグメントを同時に増幅し、該フラグメントを用いて各多型を同時に検出する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はＮ−アセチルトランスフェラーゼ２遺伝子の一塩基多型を検出するためのプライマーセットに関する。
【背景技術】
【０００２】
N-アセチルトランスフェラーゼ2(NAT2)遺伝子は結核治療薬であるイソニアジドの早い代謝及び遅い代謝に関与することが知られている。イソニアジドをリファンピシンと共に患者に投与した際、代謝が遅い患者では悪心・嘔吐、発熱、発疹、末梢神経障害が観察されることがあるが、これらの症状は、NAT2遺伝子上に存在する9箇所の一塩基多型の種類によって差異があることが知られていた。このことからNAT2遺伝子の一塩基多型を検出し、結核患者へのイソニアジドの投与量を調節することが重要であるといわれてきた（非特許文献１）。
【０００３】
NAT2遺伝子の一塩基多型を検出する方法としては、以下のような方法が知られている。（１）ゲノムDNAをpolymerase chain reaction(PCR)で増幅し、それを制限酵素で消化出来るか否かにより一塩基多型を検出する方法(PCR-RFLP法：非特許文献１)。
（２）塩基配列決定法によって検出する方法（非特許文献２）。
（３）TaqManプローブを用いて検出する方法（特許文献１）。
【０００４】
（１）の方法で検出しようとした場合、制限酵素での消化が不十分である場合などに消化されたPCR産物と未消化のPCR産物が混在することになり、誤判定の可能性がある。また、制限酵素の認識配列を持たない塩基番号341の多型を検出する場合、変異を導入したプライマーを用いて再度PCR反応を行う必要があり、操作が煩雑なうえ、時間もかかる。
（2）の方法で検出しようとした場合、1対のプライマーで９箇所の一塩基多型箇所すべてを含むフラグメントを増幅し塩基配列決定法に供することが出来るが、ゲノムから増幅したPCR産物の塩基配列をじかに決定しようとした場合、波形の重なり具合から野生型ホモまたは変異型ホモなのか野生型と変異型のヘテロなのかを判定することが非常に困難なことがある。この点を解消する為にゲノムから増幅したPCR産物をクローニングする方法が考えられるが、一種類のゲノム由来のクローンを複数塩基配列決定法に供する必要があり、非常な手間と時間を要する。
（3）の方法では、それぞれの変異に対応するTaqManプローブを作製し、それぞれのプローブに対して別々に反応を行わなければならないため、多型箇所を複数同時に検出することが出来ない。
【０００５】
一方、マイクロアレイを用いて多型を同時に検出することもできるが、そのためには検出対象となる配列を増幅する必要がある。増幅には1対のみのプライマーを用いることが考えられるが、1対のプライマーセットで増幅された単一フラグメントでは9箇所の多型を同時に検出することが困難であった。また、複数対のプライマーを用いることも考えられるが、その場合、各多型を含むフラグメントを同時に増幅することは困難であり、増幅に手間がかかるという問題があった。
【特許文献１】特開2001-17185号公報
【非特許文献１】INT J TUBERC LUNG DIS (2000), vol. 4(3):p256-261
【非特許文献２】J Hum Genet(2001), vol. 46(6):p314-9
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、NAT2遺伝子の第191、282、341、434、481、590、803、845、及び857番目の塩基における９種類の一塩基多型を同時に増幅する為のプライマーセット及び、その検出方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意検討した。その結果、特定の組合わせのプライマーセットを用いることにより、NAT2遺伝子の9種類の一塩基多型部位を含む複数のフラグメントを同時に増幅でき、さらに、該増幅産物を用いてハイブリダイゼーション反応を行うことにより9種類の一塩基多型を同時に検出できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は以下のプライマーセットを提供する。
下記（a）〜（f）のプライマーのうち、
（I）（a）、（b）及び（f）
（II）（a）、（c）及び（f）
（III）（a）、（b）、（c）及び（f）
（IV）（a）、（c）、（e）及び（f）
（V）（a）、（b）、（c）、（d）及び（f）
（VI）（a）、（c）、（d）、（e）及び（f）、又は
（VII）（a）、（b）、（c）、（e）及び（f）、
(VIII) (a)、(b)、(d)、(e)及び(f)のいずれかの組合わせのプライマーを含む、N-アセチルトランスフェラーゼ2遺伝子を増幅するためのプライマーセット；
（a）配列番号１に示される塩基配列のうちの10塩基以上連続した塩基配列を有するプライマー
（b）配列番号２に示される塩基配列のうちの10塩基以上連続した塩基配列を有するプライマー
（c）配列番号３に示される塩基配列のうちの10塩基以上連続した塩基配列を有するプライマー
（d）配列番号４に示される塩基配列のうちの10塩基以上連続した塩基配列を有するプライマー
（e）配列番号５に示される塩基配列のうちの10塩基以上連続した塩基配列を有するプライマー
（f）配列番号６に示される塩基配列のうちの10塩基以上連続した塩基配列を有するプライマー
【０００９】
本発明はまた、上記プライマーセットを用いてNAT2遺伝子を増幅する方法を提供する。
本発明はさらに、NAT2遺伝子の９種類の塩基多型のうち、（x）191、282及び341番目の塩基、（y）434、481及び590番目の塩基、（z）803、845及び857番目の塩基の1群以上をそれぞれ含む複数のフラグメントを、全体で前記９種類の多型を網羅するように、上記プライマーセットを用いて同時に増幅し、増幅されたフラグメントを用いたハイブリダイゼーション反応、好ましくはマイクロアレイを用いたハイブリダイゼーション反応によって、前記９種類の塩基における多型を同時に検出する方法を提供する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明のプライマーセットを用いることにより、NAT2遺伝子の9種類の一塩基多型を簡便・且つ効率的に検出できる。検出された多型は薬剤に対する副作用の予測などに有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明のプライマーセットは、下記（a）〜（f）のプライマーのうち、
（I）（a）、（b）及び（f）
（II）（a）、（c）及び（f）
（III）（a）、（b）、（c）及び（f）
（IV）（a）、（c）、（e）及び（f）
（V）（a）、（b）、（c）、（d）及び（f）
（VI）（a）、（c）、（d）、（e）及び（f）、又は
（VII）（a）、（b）、（c）、（e）及び（f）、
(VIII) (a)、(b)、(d)、(e)及び(f)のいずれかの組合わせのプライマーを含む、N-アセチルトランスフェラーゼ2遺伝子を増幅するためのプライマーセットである。
（a）配列番号１に示される塩基配列のうちの10塩基以上連続した塩基配列を有するプライマー
（b）配列番号２に示される塩基配列のうちの10塩基以上連続した塩基配列を有するプライマー
（c）配列番号３に示される塩基配列のうちの10塩基以上連続した塩基配列を有するプライマー
（d）配列番号４に示される塩基配列のうちの10塩基以上連続した塩基配列を有するプライマー
（e）配列番号５に示される塩基配列のうちの10塩基以上連続した塩基配列を有するプライマー
（f）配列番号６に示される塩基配列のうちの10塩基以上連続した塩基配列を有するプライマー
【００１２】
配列番号１〜６の配列はヒトNAT2遺伝子の塩基配列（例えば、配列番号７；GenBank Accession No.AF320309）の部分配列またはその相補配列である。配列番号１はNAT2遺伝子の149〜179番目の塩基配列、配列番号２はNAT2遺伝子の392〜422番目の塩基配列、配列番号３はNAT2遺伝子の740〜770番目の塩基配列、配列番号４はNAT2遺伝子の358〜388番目の塩基配列の相補配列、配列番号５はNAT2遺伝子の606〜636番目の塩基配列の相補配列、配列番号６はNAT2遺伝子の900〜929番目の塩基配列の相補配列である。
なお、ヒトNAT2遺伝子の配列は人種の違いなどにより変化することがあるため、NAT2遺伝子は配列番号７の塩基配列において1又は数個の塩基が置換・欠失もしくは付加された配列を有する遺伝子であってもよい。ここで数個とは、例えば、2〜50個、好ましくは２〜20個、より好ましくは2〜10個、特に好ましくは2〜5個である。
上記6種類の配列に基いて設計されるプライマーを上記特定の組合わせで含むプライマーセットを用いることにより、NAT2遺伝子の191、282、341、434、481、590、803、845、及び857番目の塩基における一塩基多型を検出することができる。なお、多型の塩基番号はNAT2遺伝子の開始コドンATGのAから数えた番号で示しているが、これらの番号はNAT2遺伝子における塩基の付加や欠失によって変動することがあり、その場合、配列番号７の191、282、341、434、481、590、803、845、及び857番目の塩基に相当する塩基の番号となる。
上記の塩基には191G/A, 282C/T, 341T/C, 434A/C, 481C/T, 590G/A, 803A/G, 845A/C, 857G/Aの一塩基多型が存在する。なお、多型箇所の表記法は（塩基番号 野生型／変異型）のように示した。例えば、191G/Aとは、191番目の塩基に多型があり、Gが野生型NAT2遺伝子における塩基、Aが変異型NAT2遺伝子における塩基であることを意味している。
NAT2遺伝子上における配列番号１〜６の配列と一塩基多型箇所9箇所(191G/A, 282C/T, 341T/C, 434A/C, 481C/T, 590G/A, 803A/G, 845A/C, 857G/A) との位置関係は図１に示される。
【００１３】
プライマーの長さは10塩基以上であれば特に制限されないが、30塩基を越えると特異性が下がり、非特異的増幅が起こることがあるため、10〜30塩基が好ましく、15〜25塩基がより好ましい。
【００１４】
プライマーはフラグメントの増幅が出来る限り特に制限されず、DNA、RNA、その他の核酸のいずれでも良い。またプライマーは標識されたものであってもよい。プライマーを標識する物質は、通常のハイブリダイゼーション法に用いられる標識物質を使用することができる。このような標識物質として蛍光物質やハプテンなどが挙げられる。具体的にはフルオレセイン、ローダミン、フィコエリスリン、テキサスレッド、シアニン系蛍光色素が、ハプテンとしてはビオチン、ジゴキシゲニン、ジニトロフェニルなどが挙げられる。
【００１５】
本発明においては、上記のプライマーセットを用いることにより、NAT2遺伝子の多型のうち、（x）191、282及び341番目の塩基、（y）434、481及び590番目の塩基、（z）803、845及び857番目の塩基の1群以上をそれぞれ含む複数のフラグメントを全体で前記９種類の多型を網羅するように、同時に増幅する。ここで、同時とは、単一の反応系において、単一の増幅反応（増幅サイクル）で反応を行うことを意味する。
例えば、上記（I）のプライマーセットを用いる場合は、（a）及び（f）のプライマーによって９種類全ての多型部位の塩基を含むフラグメント、（b）及び（f）のプライマーによって434、481、590、803、845、及び857番目の６種類の多型部位の塩基を含むフラグメントの２つのフラグメントが同時に増幅される。
【００１６】
増幅方法は上記のプライマーを用いることができる方法であれば特に制限されないが、PCR（RT-PCR法を含む）、LAMP法（特許第3313358号明細書）、NASBA法(Nucleic Acid Sequence-Based Amplification；特許２８４３５８６号明細書)、ICAN法（特開2002-233379号公報）などが挙げられる。この中ではPCR法が特に好ましい。反応条件は通常の条件を採用することができ、試料中の標的核酸の濃度などに応じて適宜変更することができる。
【００１７】
増幅に用いる鋳型は人由来のゲノム、プラスミド、RNAなど特に制限されない。核酸の調製は、通常核酸の調製に用いられている方法を採用することができる。例えばＡｎｉｍ．Ｓｃｉ．Ｊ．７１（８）：２２２−２３４，２０００で紹介されている方法が挙げられる。
【００１８】
本発明においてはさらに、上記のようにして増幅されたフラグメントを用いてNAT２遺伝子の一塩基多型を検出することができる。検出方法は特に制限されず、TaqManプローブを用いた方法であってもよいが、同時に検出できる方法、例えば、DNAマイクロアレイを用いた方法のようなハイブリダイゼーション法を用いた検出法が好ましい。ここで、同時とは、単一の反応系において、単一の検出反応（ハイブリダイゼーション反応）で反応を行うことを意味する。
DNAマイクロアレイを用いる方法では、例えば、1枚の基板上に固定化された各多型に対応するプローブDNA(ここではキャプチャーオリゴDNAと呼称する)を用いることによって、各多型を同時に検出することができる。
【００１９】
キャプチャーオリゴヌクレオチドは、多型部位を含む領域の塩基配列に相補的又は相同な塩基配列を有するものを用いる。キャプチャーオリゴヌクレオチドの設計は、それぞれの遺伝子に存在する各々の多型部位を含むように行う。また、１つのキャプチャーオリゴヌクレオチドのなかに２塩基以上のタイプ固有の塩基配列が存在していてもかまわない。
【００２０】
キャプチャーオリゴヌクレオチドの塩基の長さは、１０〜４０塩基が好ましい。これより短いとハイブリダイゼーションの検出が困難になり、長いとタイプ固有の配列によるハイブリダイゼーションの差が少なくなり、タイプの判定が難しくなることがある。ただし
、このキャプチャーオリゴヌクレオチドの長さは、主として各塩基の含有率や同一塩基の繰り返しなどの配列の特性に依存する。また、ハイブリダイゼーションを妨げる要因である２次構造的障害がある場合は、遺伝子の多型性に関係しない任意の塩基をスペーサー化合物で置換することによりハイブリダイゼーションにおける結合親和性を緩和したオリゴヌクレオチドを用いることにより、前記障害を回避することもできる。このようなスペーサー化合物としては、いずれの種類の塩基との相補結合性を有しない核酸骨格等が挙げられる。
【００２１】
キャプチャーオリゴヌクレオチドの塩基配列の例を、配列番号８〜２５に示す。なお、配列番号８，９が191番目の塩基の多型を検出するためのものであり、配列番号１０，１１が282番目の塩基の多型を検出するためのものであり、配列番号１２，１３が341番目の塩基の多型を検出するためのものであり、配列番号１４，１５が434番目の塩基の多型を検出するためのものであり、配列番号１６，１７が481番目の塩基の多型を検出するためのものであり、配列番号１８，１９が590番目の塩基の多型を検出するためのものであり、配列番号２０，２１が803番目の塩基の多型を検出するためのものであり、配列番号２２，２３が845番目の塩基の多型を検出するためのものであり、配列番号２４，２５が857番目の塩基の多型を検出するためのものである。
尚、配列番号８〜２５に示した番号のほか、各塩基配列の５'側もしくは３'側またはその両方において、各々の塩基配列を、NAT２遺伝子の塩基配列に対応して伸長、または短縮させてもよいが、いずれの場合もキャプチャーオリゴヌクレオチドは１０〜４０塩基の範囲とすることが好ましい。
【００２２】
キャプチャーオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド核酸、またはロックド核酸のいずれであってもよい。また、標識されたものであってもよい。キャプチャーオリゴヌクレオチドの合成方法は、通常のオリゴヌクレオチドと同様にして、例えば市販のＤＮＡ合成機を用いる方法等によって、行うことができる。
【００２３】
ハイブリダイゼーションは、通常の核酸のハイブリダイゼーションと同様にして行うことができる。以下に具体的な方法を例示する。
ＳＳＣ（Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｓａｌｉｎｅ Ｃｉｔｒａｔｅ）などの塩溶液、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ウシ血清アルブミンなどのブロッキング溶液、および反応促進のための添加剤からなる混合液に増幅フラグメントを加える。増幅フラグメントが２本鎖の場合は熱などによる変性を行う。支持体上に増幅フラグメント溶液を数μＬ滴下した後、数時間加熱操作（通常３０℃〜８０℃）を行い、支持体上に固定化されているキャプチャーオリゴヌクレオチドと増幅フラグメントでハイブリッドを形成させる。
【００２４】
適当な濃度のＳＳＣ溶液またはテトラメチルアンモニウムクロリド溶液中に支持体を沈め、加熱（通常３７℃〜７０℃）し、特異的なハイブリッドのみを選択的に支持体上に残す。このとき、ＳＤＳなどを加えても良い。
【００２５】
ハイブリッドの検出には増幅フラグメントに標識されている蛍光物質またはハプテン等を使用することが好ましい。蛍光物質を使用する場合は、専用の蛍光スキャナーを用いて検出することができる。
【００２６】
ハプテンを使用する場合は、ハプテンを認識するタンパクまたはそれに結合するタンパクと、アルカリフォスファターゼまたはホースラディッシュ・パーオキシダーゼなどの結合体（酵素コンジュゲート）を含む溶液を支持体上に加え、室温で数１０分間反応させる。なお、このハプテンと酵素コンジュゲートの結合反応を行う前に、キャプチャーオリゴヌクレオチドを固定した領域以外の支持体の領域をカゼインやウシ血清アルブミンなどのタンパクを用いて被覆することによって酵素コンジュゲートと支持体の非特異的吸着を阻
止することができる。この処置は、オリゴヌクレオチドを固定した後、支持体上にカゼインなどのタンパクの溶液を加え、室温で数１０分間放置することによって行うことができる。
【００２７】
酵素コンジュゲートと核酸プローブのハプテンとの結合反応後、ハプテンと結合しなかった酵素コンジュゲートを、界面活性剤を含む適当な緩衝液で洗浄することによって、支持体上には増幅フラグメントのハプテンと結合した酵素コンジュゲートのみが残ることになる。
【００２８】
この後酵素コンジュゲートに結合されたアルカリフォスファターゼまたはホースラディッシュ・パーオキシダーゼなどの酵素によって発色し、沈着するような化合物を添加することでハイブリッドを形成している部分だけが可視化される。
【００２９】
ここで用いられる化合物としては、ニトロブルーテトラゾリウムクロライド、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸−ｐ−トルイジン塩）、３，３'，５，５'−テトラメチルベンチジンなどが用いられる。
【００３０】
多型の検出は、得られたハイブリダイゼーションの結果をもとに、キャプチャーオリゴヌクレオチド毎に沈着した色素または蛍光を検出することで行う。具体的には、キャプチャーオリゴヌクレオチド毎の発色量および蛍光強度を、対応するキャプチャーオリゴヌクレオチドと比較し、その量の大きい方をハイブリダイゼーション陽性と判定する。量が同じときは共に陽性と判定する。また、その基準は特に制限されないが、用いる標識物質等によって異なるため、検出系毎に基準を決めることが望ましい。
【実施例】
【００３１】
プライマーはどのように組み合わせれば9箇所の多型を一度に検出できるかを調べた。
＜1＞オリゴヌクレオチドの合成
定法に従い、オリゴヌクレオチド合成機（Perkin-Elmer Applied biosystems）を用いて、オリゴヌクレオチドを合成し、脱保護を施した後、乾燥させた。このオリゴヌクレオチド乾燥体を、10mM Tris-HCl(ｐH7.5)、1mM EDTA緩衝液を用いて溶解し、100pmol/μLのオリゴヌクレオチド溶液を調製した。この合成法は、キャプチャーオリゴヌクレオチド又はプライマーとして使用するいずれのオリゴヌクレオチドに対しても同様である。キャプチャーオリゴヌクレオチド（配列番号８−２５）については上記合成機を用いて5'末端にアミノ基を結合させ、プライマーには5´末端にビオチンを結合させた。
【００３２】
＜2＞基板へのキャプチャーオリゴヌクレオチドのスポッティング
5'末端にアミノ基を有するオリゴヌクレオチド溶液10μLに対してマイクロスポッティング溶液（TeleChem International Inc.）を10μL混合し、マイクロタイタープレート（Greiner Laboratory Inc.）上に分注した。スポッティングマシンの所定の位置にカルボジイミド樹脂処理スライドグラスOligoArray（日清紡績株式会社）を配置し、スポッティングマシンを作動させた。スポッティング終了後、スライドグラスに熱水からの蒸気を数秒間あて、その後紫外線を600mJ照射した。再度蒸気に数秒間曝露した後、ホットプレート上にスライドグラスを置いて水分を除去した。スライドグラスを3% BSA（ウシ血清アルブミン）を含む100mM Tris-HCl(pH7.5), 100mM NaCl，0.1% Triton X-100に室温で30分間浸し、ブロッキングした。その後、10mM Tris-HCl(pH7.5), 1mM EDTA緩衝液で洗浄した。スライドグラスを室温で乾燥させ、使用まで乾燥状態で冷暗所にて保存した。
【００３３】
＜3＞プローブ核酸（増幅フラグメント）の調製
ヒトのゲノムDNAを鋳型として、それぞれPCRによりプローブ核酸を調製した。
核酸はHuman Genomic DNA(Roche社製)を使用した。このゲノムDNAの塩基配列をシークエンス法にて調べたところ、NAT2遺伝子の多型部位191はG、282はCとTのヘテロ、341はTとCのヘテロ、434はA、481はCとTのヘテロ、590はGとAのヘテロ、803はAとGのヘテロ、845はA、857はGであることが分かった。
PCRに用いたプライマーは、GGGCTTAGAGGCTATTTTTGATC（配列番号1の１〜２３番目：プライマー１）、GTGGCAGCCTCTAGAATTAATTTC（配列番号２の１〜２４番目：プライマー２）、AGACAATACAGATCTGGTCGAG（配列番号３の１〜２２番目：プライマー３）、GGGAGGAGCTTCCAGACCCAG（配列番号４の１〜２１番目：プライマー４）、AGACGTCTGCAGGTATGTATTC（配列番号５の１〜２２番目：プライマー５）GTTGATAATTAGTGAGTTGGGTG（配列番号６の１〜２３番目：プライマー６）を使用し、表１に示すプライマーの組合せでＰＣＲ反応を行った。
PCR反応液の組成は、Taq DNAポリメラーゼを1Unit、プライマーを各10pmol、反応用緩衝液5μl、dNTPを各10nmol、テンプレートDNAを100ng、および滅菌水を加えて総量50μlとした。チューブに入れた溶液をサーマルサイクラーにセットして、95℃で3分間加熱した後、95℃：1分間、59℃：30秒間、72℃：30分間の反応を40サイクル行い、その後72℃：3分間反応させた。
【００３４】
＜4＞ハイブリダイゼーション
＜3＞で作製したプローブ核酸（増幅フラグメント）溶液を6μlエッペンチューブに取り、95℃で1分間加熱処理を行った後、氷中に5分間浸した。これを室温に戻し、ArrayIt Unihyb Hybridization Solution（TeleChem International Inc.）6μlを加えて混合し、プローブ核酸溶液とした。プローブ核酸溶液を全量とり、＜2＞で作製したキャプチャーオリゴヌクレオチドを固定化した基板にのせ、その上にカバーグラスをのせた。これを保湿箱に入れ、さらに37℃に設定した恒温器に入れて120分間静置した。基板を取り出し、すばやく室温下で2×SSC溶液（2×SSC：0.033M NaCl, 0.033Mクエン酸ナトリウム）に浸してカバーグラスを除去し、基板を37℃で2×SSCに5分間浸した。
【００３５】
＜5＞ハイブリダイゼーションシグナルの検出
ハイブリダイゼーションを終えた基板を2×SSCから取り出し、遠心機（Beckman社製）にセットし、2000rpmで１分間遠心した。次にVECTASTAIN Elite ABC kit(VECTOR社)を用いてアビジン−ビオチン化ペルオキシダーゼ複合体を作製し基板上に1.4ml滴下し、室温下で30分間静置した。その後、PBS溶液（10ｍMリン酸ナトリウム，pH7.5、0.9％塩化ナトリウム）中で洗浄した。TMB substrate kit for peroxidase (VECTOR社)を用いて発色溶液を作製し基板上に1.4ml滴下し、室温下で30分間静置した。基盤を蒸留水で洗浄して発色反応を停止した。
【００３６】
＜6＞判定
それぞれのプライマーの組合せによるＰＣＲ反応で得られたプローブ核酸をアレイで検出した結果と、ゲノムDNAをシークエンスすることで得られたＮＡＴ２遺伝子の多型とを比較し、両者が合致したものは○、合致しなかったものについては×で記した(表１)。ここで合致しなかったものには、ハイブリダイゼーションの結果、発色シグナルが現れなかったものを含む。
例えば２つのプライマー１と６の組合せを用いた場合（実験番号１）は、多型のうち341はTとC、434はA、481はCとT、590はGとA、803はAとG、845はAとC、857はGとAと判定され、845と857がシークエンス法により得られたNAT2遺伝子の多型と一致しなかった。また、191と282はシグナルが検出出来なかったことから、ＮＡＴ２遺伝子の全ての多型を一度に正確に検出することは出来なかった。
また６つのプライマー全てを用いた場合（実験番号１６）は、多型のうち191がG、282がCとT、341がTとC、434がA、481がCとT、590がGとAと判定されたが、803、845、857のハイブリダイゼーションシグナルは検出出来なかった。従ってＮＡＴ２遺伝子の全ての多型
を一度に正確に検出することは出来なかった。
一方で、３つのプライマーの組合せのうち実験番号３と５、４つのプライマーの組合せのうち実験番号１０と１１、５つのプライマーの組合せの全て（実験番号１２、１３、１４、１５）のプライマーを用いた場合には、９つの多型がそれぞれ191はG、282はCとT、341はTとC、434はA、481はCとT、590はGとA、803はAとG、845はA、857はGと判定され、シークエンス法により得られたＮＡＴ２遺伝子の多型と一致した。従ってＮＡＴ２遺伝子の全ての多型を一度に正確に検出することが出来た。
【００３７】
【表１】
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】NAT2遺伝子における各プライマーと各多型の位置を示す図。
【技術分野】
【０００１】
本発明はＮ−アセチルトランスフェラーゼ２遺伝子の一塩基多型を検出するためのプライマーセットに関する。
【背景技術】
【０００２】
N-アセチルトランスフェラーゼ2(NAT2)遺伝子は結核治療薬であるイソニアジドの早い代謝及び遅い代謝に関与することが知られている。イソニアジドをリファンピシンと共に患者に投与した際、代謝が遅い患者では悪心・嘔吐、発熱、発疹、末梢神経障害が観察されることがあるが、これらの症状は、NAT2遺伝子上に存在する9箇所の一塩基多型の種類によって差異があることが知られていた。このことからNAT2遺伝子の一塩基多型を検出し、結核患者へのイソニアジドの投与量を調節することが重要であるといわれてきた（非特許文献１）。
【０００３】
NAT2遺伝子の一塩基多型を検出する方法としては、以下のような方法が知られている。（１）ゲノムDNAをpolymerase chain reaction(PCR)で増幅し、それを制限酵素で消化出来るか否かにより一塩基多型を検出する方法(PCR-RFLP法：非特許文献１)。
（２）塩基配列決定法によって検出する方法（非特許文献２）。
（３）TaqManプローブを用いて検出する方法（特許文献１）。
【０００４】
（１）の方法で検出しようとした場合、制限酵素での消化が不十分である場合などに消化されたPCR産物と未消化のPCR産物が混在することになり、誤判定の可能性がある。また、制限酵素の認識配列を持たない塩基番号341の多型を検出する場合、変異を導入したプライマーを用いて再度PCR反応を行う必要があり、操作が煩雑なうえ、時間もかかる。
（2）の方法で検出しようとした場合、1対のプライマーで９箇所の一塩基多型箇所すべてを含むフラグメントを増幅し塩基配列決定法に供することが出来るが、ゲノムから増幅したPCR産物の塩基配列をじかに決定しようとした場合、波形の重なり具合から野生型ホモまたは変異型ホモなのか野生型と変異型のヘテロなのかを判定することが非常に困難なことがある。この点を解消する為にゲノムから増幅したPCR産物をクローニングする方法が考えられるが、一種類のゲノム由来のクローンを複数塩基配列決定法に供する必要があり、非常な手間と時間を要する。
（3）の方法では、それぞれの変異に対応するTaqManプローブを作製し、それぞれのプローブに対して別々に反応を行わなければならないため、多型箇所を複数同時に検出することが出来ない。
【０００５】
一方、マイクロアレイを用いて多型を同時に検出することもできるが、そのためには検出対象となる配列を増幅する必要がある。増幅には1対のみのプライマーを用いることが考えられるが、1対のプライマーセットで増幅された単一フラグメントでは9箇所の多型を同時に検出することが困難であった。また、複数対のプライマーを用いることも考えられるが、その場合、各多型を含むフラグメントを同時に増幅することは困難であり、増幅に手間がかかるという問題があった。
【特許文献１】特開2001-17185号公報
【非特許文献１】INT J TUBERC LUNG DIS (2000), vol. 4(3):p256-261
【非特許文献２】J Hum Genet(2001), vol. 46(6):p314-9
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、NAT2遺伝子の第191、282、341、434、481、590、803、845、及び857番目の塩基における９種類の一塩基多型を同時に増幅する為のプライマーセット及び、その検出方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意検討した。その結果、特定の組合わせのプライマーセットを用いることにより、NAT2遺伝子の9種類の一塩基多型部位を含む複数のフラグメントを同時に増幅でき、さらに、該増幅産物を用いてハイブリダイゼーション反応を行うことにより9種類の一塩基多型を同時に検出できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は以下のプライマーセットを提供する。
下記（a）〜（f）のプライマーのうち、
（I）（a）、（b）及び（f）
（II）（a）、（c）及び（f）
（III）（a）、（b）、（c）及び（f）
（IV）（a）、（c）、（e）及び（f）
（V）（a）、（b）、（c）、（d）及び（f）
（VI）（a）、（c）、（d）、（e）及び（f）、又は
（VII）（a）、（b）、（c）、（e）及び（f）、
(VIII) (a)、(b)、(d)、(e)及び(f)のいずれかの組合わせのプライマーを含む、N-アセチルトランスフェラーゼ2遺伝子を増幅するためのプライマーセット；
（a）配列番号１に示される塩基配列のうちの10塩基以上連続した塩基配列を有するプライマー
（b）配列番号２に示される塩基配列のうちの10塩基以上連続した塩基配列を有するプライマー
（c）配列番号３に示される塩基配列のうちの10塩基以上連続した塩基配列を有するプライマー
（d）配列番号４に示される塩基配列のうちの10塩基以上連続した塩基配列を有するプライマー
（e）配列番号５に示される塩基配列のうちの10塩基以上連続した塩基配列を有するプライマー
（f）配列番号６に示される塩基配列のうちの10塩基以上連続した塩基配列を有するプライマー
【０００９】
本発明はまた、上記プライマーセットを用いてNAT2遺伝子を増幅する方法を提供する。
本発明はさらに、NAT2遺伝子の９種類の塩基多型のうち、（x）191、282及び341番目の塩基、（y）434、481及び590番目の塩基、（z）803、845及び857番目の塩基の1群以上をそれぞれ含む複数のフラグメントを、全体で前記９種類の多型を網羅するように、上記プライマーセットを用いて同時に増幅し、増幅されたフラグメントを用いたハイブリダイゼーション反応、好ましくはマイクロアレイを用いたハイブリダイゼーション反応によって、前記９種類の塩基における多型を同時に検出する方法を提供する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明のプライマーセットを用いることにより、NAT2遺伝子の9種類の一塩基多型を簡便・且つ効率的に検出できる。検出された多型は薬剤に対する副作用の予測などに有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明のプライマーセットは、下記（a）〜（f）のプライマーのうち、
（I）（a）、（b）及び（f）
（II）（a）、（c）及び（f）
（III）（a）、（b）、（c）及び（f）
（IV）（a）、（c）、（e）及び（f）
（V）（a）、（b）、（c）、（d）及び（f）
（VI）（a）、（c）、（d）、（e）及び（f）、又は
（VII）（a）、（b）、（c）、（e）及び（f）、
(VIII) (a)、(b)、(d)、(e)及び(f)のいずれかの組合わせのプライマーを含む、N-アセチルトランスフェラーゼ2遺伝子を増幅するためのプライマーセットである。
（a）配列番号１に示される塩基配列のうちの10塩基以上連続した塩基配列を有するプライマー
（b）配列番号２に示される塩基配列のうちの10塩基以上連続した塩基配列を有するプライマー
（c）配列番号３に示される塩基配列のうちの10塩基以上連続した塩基配列を有するプライマー
（d）配列番号４に示される塩基配列のうちの10塩基以上連続した塩基配列を有するプライマー
（e）配列番号５に示される塩基配列のうちの10塩基以上連続した塩基配列を有するプライマー
（f）配列番号６に示される塩基配列のうちの10塩基以上連続した塩基配列を有するプライマー
【００１２】
配列番号１〜６の配列はヒトNAT2遺伝子の塩基配列（例えば、配列番号７；GenBank Accession No.AF320309）の部分配列またはその相補配列である。配列番号１はNAT2遺伝子の149〜179番目の塩基配列、配列番号２はNAT2遺伝子の392〜422番目の塩基配列、配列番号３はNAT2遺伝子の740〜770番目の塩基配列、配列番号４はNAT2遺伝子の358〜388番目の塩基配列の相補配列、配列番号５はNAT2遺伝子の606〜636番目の塩基配列の相補配列、配列番号６はNAT2遺伝子の900〜929番目の塩基配列の相補配列である。
なお、ヒトNAT2遺伝子の配列は人種の違いなどにより変化することがあるため、NAT2遺伝子は配列番号７の塩基配列において1又は数個の塩基が置換・欠失もしくは付加された配列を有する遺伝子であってもよい。ここで数個とは、例えば、2〜50個、好ましくは２〜20個、より好ましくは2〜10個、特に好ましくは2〜5個である。
上記6種類の配列に基いて設計されるプライマーを上記特定の組合わせで含むプライマーセットを用いることにより、NAT2遺伝子の191、282、341、434、481、590、803、845、及び857番目の塩基における一塩基多型を検出することができる。なお、多型の塩基番号はNAT2遺伝子の開始コドンATGのAから数えた番号で示しているが、これらの番号はNAT2遺伝子における塩基の付加や欠失によって変動することがあり、その場合、配列番号７の191、282、341、434、481、590、803、845、及び857番目の塩基に相当する塩基の番号となる。
上記の塩基には191G/A, 282C/T, 341T/C, 434A/C, 481C/T, 590G/A, 803A/G, 845A/C, 857G/Aの一塩基多型が存在する。なお、多型箇所の表記法は（塩基番号 野生型／変異型）のように示した。例えば、191G/Aとは、191番目の塩基に多型があり、Gが野生型NAT2遺伝子における塩基、Aが変異型NAT2遺伝子における塩基であることを意味している。
NAT2遺伝子上における配列番号１〜６の配列と一塩基多型箇所9箇所(191G/A, 282C/T, 341T/C, 434A/C, 481C/T, 590G/A, 803A/G, 845A/C, 857G/A) との位置関係は図１に示される。
【００１３】
プライマーの長さは10塩基以上であれば特に制限されないが、30塩基を越えると特異性が下がり、非特異的増幅が起こることがあるため、10〜30塩基が好ましく、15〜25塩基がより好ましい。
【００１４】
プライマーはフラグメントの増幅が出来る限り特に制限されず、DNA、RNA、その他の核酸のいずれでも良い。またプライマーは標識されたものであってもよい。プライマーを標識する物質は、通常のハイブリダイゼーション法に用いられる標識物質を使用することができる。このような標識物質として蛍光物質やハプテンなどが挙げられる。具体的にはフルオレセイン、ローダミン、フィコエリスリン、テキサスレッド、シアニン系蛍光色素が、ハプテンとしてはビオチン、ジゴキシゲニン、ジニトロフェニルなどが挙げられる。
【００１５】
本発明においては、上記のプライマーセットを用いることにより、NAT2遺伝子の多型のうち、（x）191、282及び341番目の塩基、（y）434、481及び590番目の塩基、（z）803、845及び857番目の塩基の1群以上をそれぞれ含む複数のフラグメントを全体で前記９種類の多型を網羅するように、同時に増幅する。ここで、同時とは、単一の反応系において、単一の増幅反応（増幅サイクル）で反応を行うことを意味する。
例えば、上記（I）のプライマーセットを用いる場合は、（a）及び（f）のプライマーによって９種類全ての多型部位の塩基を含むフラグメント、（b）及び（f）のプライマーによって434、481、590、803、845、及び857番目の６種類の多型部位の塩基を含むフラグメントの２つのフラグメントが同時に増幅される。
【００１６】
増幅方法は上記のプライマーを用いることができる方法であれば特に制限されないが、PCR（RT-PCR法を含む）、LAMP法（特許第3313358号明細書）、NASBA法(Nucleic Acid Sequence-Based Amplification；特許２８４３５８６号明細書)、ICAN法（特開2002-233379号公報）などが挙げられる。この中ではPCR法が特に好ましい。反応条件は通常の条件を採用することができ、試料中の標的核酸の濃度などに応じて適宜変更することができる。
【００１７】
増幅に用いる鋳型は人由来のゲノム、プラスミド、RNAなど特に制限されない。核酸の調製は、通常核酸の調製に用いられている方法を採用することができる。例えばＡｎｉｍ．Ｓｃｉ．Ｊ．７１（８）：２２２−２３４，２０００で紹介されている方法が挙げられる。
【００１８】
本発明においてはさらに、上記のようにして増幅されたフラグメントを用いてNAT２遺伝子の一塩基多型を検出することができる。検出方法は特に制限されず、TaqManプローブを用いた方法であってもよいが、同時に検出できる方法、例えば、DNAマイクロアレイを用いた方法のようなハイブリダイゼーション法を用いた検出法が好ましい。ここで、同時とは、単一の反応系において、単一の検出反応（ハイブリダイゼーション反応）で反応を行うことを意味する。
DNAマイクロアレイを用いる方法では、例えば、1枚の基板上に固定化された各多型に対応するプローブDNA(ここではキャプチャーオリゴDNAと呼称する)を用いることによって、各多型を同時に検出することができる。
【００１９】
キャプチャーオリゴヌクレオチドは、多型部位を含む領域の塩基配列に相補的又は相同な塩基配列を有するものを用いる。キャプチャーオリゴヌクレオチドの設計は、それぞれの遺伝子に存在する各々の多型部位を含むように行う。また、１つのキャプチャーオリゴヌクレオチドのなかに２塩基以上のタイプ固有の塩基配列が存在していてもかまわない。
【００２０】
キャプチャーオリゴヌクレオチドの塩基の長さは、１０〜４０塩基が好ましい。これより短いとハイブリダイゼーションの検出が困難になり、長いとタイプ固有の配列によるハイブリダイゼーションの差が少なくなり、タイプの判定が難しくなることがある。ただし
、このキャプチャーオリゴヌクレオチドの長さは、主として各塩基の含有率や同一塩基の繰り返しなどの配列の特性に依存する。また、ハイブリダイゼーションを妨げる要因である２次構造的障害がある場合は、遺伝子の多型性に関係しない任意の塩基をスペーサー化合物で置換することによりハイブリダイゼーションにおける結合親和性を緩和したオリゴヌクレオチドを用いることにより、前記障害を回避することもできる。このようなスペーサー化合物としては、いずれの種類の塩基との相補結合性を有しない核酸骨格等が挙げられる。
【００２１】
キャプチャーオリゴヌクレオチドの塩基配列の例を、配列番号８〜２５に示す。なお、配列番号８，９が191番目の塩基の多型を検出するためのものであり、配列番号１０，１１が282番目の塩基の多型を検出するためのものであり、配列番号１２，１３が341番目の塩基の多型を検出するためのものであり、配列番号１４，１５が434番目の塩基の多型を検出するためのものであり、配列番号１６，１７が481番目の塩基の多型を検出するためのものであり、配列番号１８，１９が590番目の塩基の多型を検出するためのものであり、配列番号２０，２１が803番目の塩基の多型を検出するためのものであり、配列番号２２，２３が845番目の塩基の多型を検出するためのものであり、配列番号２４，２５が857番目の塩基の多型を検出するためのものである。
尚、配列番号８〜２５に示した番号のほか、各塩基配列の５'側もしくは３'側またはその両方において、各々の塩基配列を、NAT２遺伝子の塩基配列に対応して伸長、または短縮させてもよいが、いずれの場合もキャプチャーオリゴヌクレオチドは１０〜４０塩基の範囲とすることが好ましい。
【００２２】
キャプチャーオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド核酸、またはロックド核酸のいずれであってもよい。また、標識されたものであってもよい。キャプチャーオリゴヌクレオチドの合成方法は、通常のオリゴヌクレオチドと同様にして、例えば市販のＤＮＡ合成機を用いる方法等によって、行うことができる。
【００２３】
ハイブリダイゼーションは、通常の核酸のハイブリダイゼーションと同様にして行うことができる。以下に具体的な方法を例示する。
ＳＳＣ（Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｓａｌｉｎｅ Ｃｉｔｒａｔｅ）などの塩溶液、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ウシ血清アルブミンなどのブロッキング溶液、および反応促進のための添加剤からなる混合液に増幅フラグメントを加える。増幅フラグメントが２本鎖の場合は熱などによる変性を行う。支持体上に増幅フラグメント溶液を数μＬ滴下した後、数時間加熱操作（通常３０℃〜８０℃）を行い、支持体上に固定化されているキャプチャーオリゴヌクレオチドと増幅フラグメントでハイブリッドを形成させる。
【００２４】
適当な濃度のＳＳＣ溶液またはテトラメチルアンモニウムクロリド溶液中に支持体を沈め、加熱（通常３７℃〜７０℃）し、特異的なハイブリッドのみを選択的に支持体上に残す。このとき、ＳＤＳなどを加えても良い。
【００２５】
ハイブリッドの検出には増幅フラグメントに標識されている蛍光物質またはハプテン等を使用することが好ましい。蛍光物質を使用する場合は、専用の蛍光スキャナーを用いて検出することができる。
【００２６】
ハプテンを使用する場合は、ハプテンを認識するタンパクまたはそれに結合するタンパクと、アルカリフォスファターゼまたはホースラディッシュ・パーオキシダーゼなどの結合体（酵素コンジュゲート）を含む溶液を支持体上に加え、室温で数１０分間反応させる。なお、このハプテンと酵素コンジュゲートの結合反応を行う前に、キャプチャーオリゴヌクレオチドを固定した領域以外の支持体の領域をカゼインやウシ血清アルブミンなどのタンパクを用いて被覆することによって酵素コンジュゲートと支持体の非特異的吸着を阻
止することができる。この処置は、オリゴヌクレオチドを固定した後、支持体上にカゼインなどのタンパクの溶液を加え、室温で数１０分間放置することによって行うことができる。
【００２７】
酵素コンジュゲートと核酸プローブのハプテンとの結合反応後、ハプテンと結合しなかった酵素コンジュゲートを、界面活性剤を含む適当な緩衝液で洗浄することによって、支持体上には増幅フラグメントのハプテンと結合した酵素コンジュゲートのみが残ることになる。
【００２８】
この後酵素コンジュゲートに結合されたアルカリフォスファターゼまたはホースラディッシュ・パーオキシダーゼなどの酵素によって発色し、沈着するような化合物を添加することでハイブリッドを形成している部分だけが可視化される。
【００２９】
ここで用いられる化合物としては、ニトロブルーテトラゾリウムクロライド、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸−ｐ−トルイジン塩）、３，３'，５，５'−テトラメチルベンチジンなどが用いられる。
【００３０】
多型の検出は、得られたハイブリダイゼーションの結果をもとに、キャプチャーオリゴヌクレオチド毎に沈着した色素または蛍光を検出することで行う。具体的には、キャプチャーオリゴヌクレオチド毎の発色量および蛍光強度を、対応するキャプチャーオリゴヌクレオチドと比較し、その量の大きい方をハイブリダイゼーション陽性と判定する。量が同じときは共に陽性と判定する。また、その基準は特に制限されないが、用いる標識物質等によって異なるため、検出系毎に基準を決めることが望ましい。
【実施例】
【００３１】
プライマーはどのように組み合わせれば9箇所の多型を一度に検出できるかを調べた。
＜1＞オリゴヌクレオチドの合成
定法に従い、オリゴヌクレオチド合成機（Perkin-Elmer Applied biosystems）を用いて、オリゴヌクレオチドを合成し、脱保護を施した後、乾燥させた。このオリゴヌクレオチド乾燥体を、10mM Tris-HCl(ｐH7.5)、1mM EDTA緩衝液を用いて溶解し、100pmol/μLのオリゴヌクレオチド溶液を調製した。この合成法は、キャプチャーオリゴヌクレオチド又はプライマーとして使用するいずれのオリゴヌクレオチドに対しても同様である。キャプチャーオリゴヌクレオチド（配列番号８−２５）については上記合成機を用いて5'末端にアミノ基を結合させ、プライマーには5´末端にビオチンを結合させた。
【００３２】
＜2＞基板へのキャプチャーオリゴヌクレオチドのスポッティング
5'末端にアミノ基を有するオリゴヌクレオチド溶液10μLに対してマイクロスポッティング溶液（TeleChem International Inc.）を10μL混合し、マイクロタイタープレート（Greiner Laboratory Inc.）上に分注した。スポッティングマシンの所定の位置にカルボジイミド樹脂処理スライドグラスOligoArray（日清紡績株式会社）を配置し、スポッティングマシンを作動させた。スポッティング終了後、スライドグラスに熱水からの蒸気を数秒間あて、その後紫外線を600mJ照射した。再度蒸気に数秒間曝露した後、ホットプレート上にスライドグラスを置いて水分を除去した。スライドグラスを3% BSA（ウシ血清アルブミン）を含む100mM Tris-HCl(pH7.5), 100mM NaCl，0.1% Triton X-100に室温で30分間浸し、ブロッキングした。その後、10mM Tris-HCl(pH7.5), 1mM EDTA緩衝液で洗浄した。スライドグラスを室温で乾燥させ、使用まで乾燥状態で冷暗所にて保存した。
【００３３】
＜3＞プローブ核酸（増幅フラグメント）の調製
ヒトのゲノムDNAを鋳型として、それぞれPCRによりプローブ核酸を調製した。
核酸はHuman Genomic DNA(Roche社製)を使用した。このゲノムDNAの塩基配列をシークエンス法にて調べたところ、NAT2遺伝子の多型部位191はG、282はCとTのヘテロ、341はTとCのヘテロ、434はA、481はCとTのヘテロ、590はGとAのヘテロ、803はAとGのヘテロ、845はA、857はGであることが分かった。
PCRに用いたプライマーは、GGGCTTAGAGGCTATTTTTGATC（配列番号1の１〜２３番目：プライマー１）、GTGGCAGCCTCTAGAATTAATTTC（配列番号２の１〜２４番目：プライマー２）、AGACAATACAGATCTGGTCGAG（配列番号３の１〜２２番目：プライマー３）、GGGAGGAGCTTCCAGACCCAG（配列番号４の１〜２１番目：プライマー４）、AGACGTCTGCAGGTATGTATTC（配列番号５の１〜２２番目：プライマー５）GTTGATAATTAGTGAGTTGGGTG（配列番号６の１〜２３番目：プライマー６）を使用し、表１に示すプライマーの組合せでＰＣＲ反応を行った。
PCR反応液の組成は、Taq DNAポリメラーゼを1Unit、プライマーを各10pmol、反応用緩衝液5μl、dNTPを各10nmol、テンプレートDNAを100ng、および滅菌水を加えて総量50μlとした。チューブに入れた溶液をサーマルサイクラーにセットして、95℃で3分間加熱した後、95℃：1分間、59℃：30秒間、72℃：30分間の反応を40サイクル行い、その後72℃：3分間反応させた。
【００３４】
＜4＞ハイブリダイゼーション
＜3＞で作製したプローブ核酸（増幅フラグメント）溶液を6μlエッペンチューブに取り、95℃で1分間加熱処理を行った後、氷中に5分間浸した。これを室温に戻し、ArrayIt Unihyb Hybridization Solution（TeleChem International Inc.）6μlを加えて混合し、プローブ核酸溶液とした。プローブ核酸溶液を全量とり、＜2＞で作製したキャプチャーオリゴヌクレオチドを固定化した基板にのせ、その上にカバーグラスをのせた。これを保湿箱に入れ、さらに37℃に設定した恒温器に入れて120分間静置した。基板を取り出し、すばやく室温下で2×SSC溶液（2×SSC：0.033M NaCl, 0.033Mクエン酸ナトリウム）に浸してカバーグラスを除去し、基板を37℃で2×SSCに5分間浸した。
【００３５】
＜5＞ハイブリダイゼーションシグナルの検出
ハイブリダイゼーションを終えた基板を2×SSCから取り出し、遠心機（Beckman社製）にセットし、2000rpmで１分間遠心した。次にVECTASTAIN Elite ABC kit(VECTOR社)を用いてアビジン−ビオチン化ペルオキシダーゼ複合体を作製し基板上に1.4ml滴下し、室温下で30分間静置した。その後、PBS溶液（10ｍMリン酸ナトリウム，pH7.5、0.9％塩化ナトリウム）中で洗浄した。TMB substrate kit for peroxidase (VECTOR社)を用いて発色溶液を作製し基板上に1.4ml滴下し、室温下で30分間静置した。基盤を蒸留水で洗浄して発色反応を停止した。
【００３６】
＜6＞判定
それぞれのプライマーの組合せによるＰＣＲ反応で得られたプローブ核酸をアレイで検出した結果と、ゲノムDNAをシークエンスすることで得られたＮＡＴ２遺伝子の多型とを比較し、両者が合致したものは○、合致しなかったものについては×で記した(表１)。ここで合致しなかったものには、ハイブリダイゼーションの結果、発色シグナルが現れなかったものを含む。
例えば２つのプライマー１と６の組合せを用いた場合（実験番号１）は、多型のうち341はTとC、434はA、481はCとT、590はGとA、803はAとG、845はAとC、857はGとAと判定され、845と857がシークエンス法により得られたNAT2遺伝子の多型と一致しなかった。また、191と282はシグナルが検出出来なかったことから、ＮＡＴ２遺伝子の全ての多型を一度に正確に検出することは出来なかった。
また６つのプライマー全てを用いた場合（実験番号１６）は、多型のうち191がG、282がCとT、341がTとC、434がA、481がCとT、590がGとAと判定されたが、803、845、857のハイブリダイゼーションシグナルは検出出来なかった。従ってＮＡＴ２遺伝子の全ての多型
を一度に正確に検出することは出来なかった。
一方で、３つのプライマーの組合せのうち実験番号３と５、４つのプライマーの組合せのうち実験番号１０と１１、５つのプライマーの組合せの全て（実験番号１２、１３、１４、１５）のプライマーを用いた場合には、９つの多型がそれぞれ191はG、282はCとT、341はTとC、434はA、481はCとT、590はGとA、803はAとG、845はA、857はGと判定され、シークエンス法により得られたＮＡＴ２遺伝子の多型と一致した。従ってＮＡＴ２遺伝子の全ての多型を一度に正確に検出することが出来た。
【００３７】
【表１】
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】NAT2遺伝子における各プライマーと各多型の位置を示す図。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（a）〜（f）のプライマーのうち、
（I）（a）、（b）及び（f）
（II）（a）、（c）及び（f）
（III）（a）、（b）、（c）及び（f）
（IV）（a）、（c）、（e）及び（f）
（V）（a）、（b）、（c）、（d）及び（f）
（VI）（a）、（c）、（d）、（e）及び（f）、又は
（VII）（a）、（b）、（c）、（e）及び（f）、
(VIII) (a)、(b)、(d)、(e)及び(f)、
のいずれかの組合わせのプライマーを含む、Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ２遺伝子を増幅するためのプライマーセット；
（a）配列番号１に示される塩基配列のうちの10塩基以上連続した塩基配列を有するプライマー
（b）配列番号２に示される塩基配列のうちの10塩基以上連続した塩基配列を有するプライマー
（c）配列番号３に示される塩基配列のうちの10塩基以上連続した塩基配列を有するプライマー
（d）配列番号４に示される塩基配列のうちの10塩基以上連続した塩基配列を有するプライマー
（e）配列番号５に示される塩基配列のうちの10塩基以上連続した塩基配列を有するプライマー
（f）配列番号６に示される塩基配列のうちの10塩基以上連続した塩基配列を有するプライマー。
【請求項２】
Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ２遺伝子を増幅する方法であって、請求項１に記載のプライマーセットを用いて増幅することを特徴とする方法。
【請求項３】
Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ２遺伝子の191、282、341、434、481、590、803、845及び857番目の塩基における一塩基多型９箇所を同時に検出する方法であって、（x）191、282及び341番目の塩基、（y）434、481及び590番目の塩基、（z）803、845及び857番目の塩基から選ばれる１群以上をそれぞれ含む複数のフラグメントを、全体で前記９種類の多型を網羅するように、請求項１に記載のプライマーセットを用いて同時に増幅し、増幅された産物を用いたハイブリダイゼーション法によって前記多型を検出することを特徴とする方法。
【請求項４】
ハイブリダイゼーション反応がマイクロアレイを用いたハイブリダイゼーション反応である請求項３に記載の方法。
【請求項１】
下記（a）〜（f）のプライマーのうち、
（I）（a）、（b）及び（f）
（II）（a）、（c）及び（f）
（III）（a）、（b）、（c）及び（f）
（IV）（a）、（c）、（e）及び（f）
（V）（a）、（b）、（c）、（d）及び（f）
（VI）（a）、（c）、（d）、（e）及び（f）、又は
（VII）（a）、（b）、（c）、（e）及び（f）、
(VIII) (a)、(b)、(d)、(e)及び(f)、
のいずれかの組合わせのプライマーを含む、Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ２遺伝子を増幅するためのプライマーセット；
（a）配列番号１に示される塩基配列のうちの10塩基以上連続した塩基配列を有するプライマー
（b）配列番号２に示される塩基配列のうちの10塩基以上連続した塩基配列を有するプライマー
（c）配列番号３に示される塩基配列のうちの10塩基以上連続した塩基配列を有するプライマー
（d）配列番号４に示される塩基配列のうちの10塩基以上連続した塩基配列を有するプライマー
（e）配列番号５に示される塩基配列のうちの10塩基以上連続した塩基配列を有するプライマー
（f）配列番号６に示される塩基配列のうちの10塩基以上連続した塩基配列を有するプライマー。
【請求項２】
Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ２遺伝子を増幅する方法であって、請求項１に記載のプライマーセットを用いて増幅することを特徴とする方法。
【請求項３】
Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ２遺伝子の191、282、341、434、481、590、803、845及び857番目の塩基における一塩基多型９箇所を同時に検出する方法であって、（x）191、282及び341番目の塩基、（y）434、481及び590番目の塩基、（z）803、845及び857番目の塩基から選ばれる１群以上をそれぞれ含む複数のフラグメントを、全体で前記９種類の多型を網羅するように、請求項１に記載のプライマーセットを用いて同時に増幅し、増幅された産物を用いたハイブリダイゼーション法によって前記多型を検出することを特徴とする方法。
【請求項４】
ハイブリダイゼーション反応がマイクロアレイを用いたハイブリダイゼーション反応である請求項３に記載の方法。
【図１】
【公開番号】特開２００６−３１４２０５（Ｐ２００６−３１４２０５Ａ）
【公開日】平成１８年１１月２４日（２００６．１１．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−１３７２０２（Ｐ２００５−１３７２０２）
【出願日】平成１７年５月１０日（２００５．５．１０）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 第４５回日本呼吸器学会学術講演会 社団法人日本呼吸器学会 平成１７年４月１０日
【出願人】（５０４１４５３６４）国立大学法人群馬大学 (352)
【出願人】（０００００４３７４）日清紡績株式会社 (370)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年１１月２４日（２００６．１１．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年５月１０日（２００５．５．１０）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 第４５回日本呼吸器学会学術講演会 社団法人日本呼吸器学会 平成１７年４月１０日
【出願人】（５０４１４５３６４）国立大学法人群馬大学 (352)
【出願人】（０００００４３７４）日清紡績株式会社 (370)
【Ｆターム（参考）】
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