Ｎ−スクシンイミジルＮ−ビオチニル−６−アミノカプロエートの調製方法
本発明は、Ｎ−スクシンイミジルＮ−ビオチニル−６−アミノカプロエートの調製方法であって、Ｎ−ビオチニル−６−カプロン酸を混合無水物の形態で活性化した後、該混合無水物をＮ−ヒドロキシスクシンイミドとカップリングさせる工程を含むことを特徴とする方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はビオチニル化試薬Ｎ−スクシンイミジルＮ−ビオチニル−６−アミノカプロエートを調製するための新規方法、および、このような試薬を用いるビオチニル化多糖を調製するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｎ−スクシンイミジルＮ−ビオチニル−６−アミノカプロエートは、特に、ＤＮＡ分子または糖タンパク質へのビオチン基のグラフト化に用いられる、商業的に入手可能なビオチニル化試薬である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
労力および原料経費を考慮し、およびＮ−スクシンイミジルＮ−ビオチニル−６−アミノカプロエートを産業規模で得るため、所望の化合物を大量に製造するのに適し、後者を十分に純粋な形態で、即ち、望ましくない副生物の形成なしに得ることを可能にする強固な合成を想定することが必要である。本発明者らは、今や、上述の要求を満たす、ビオチンから出発する２つの主な段階で、Ｎ−スクシンイミジルＮ−ビオチニル−６−アミノカプロエートを入手する経路を見出している。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明による方法は、以下にスキーム１において表される段階を含み、式中、Ｒはアルキルまたはアリール基を表し、並びに、互いに同一であっても異なっていてもよいＸおよびＸ’はハロゲン原子を表す。
【０００５】
スキーム１において、出発、中間および最終化合物は以下のものである：
化合物（Ｉ）：Ｎ−スクシンイミジルＮ−ビオチニル−６−アミノカプロエート、
化合物（ＩＩ）：Ｎ−ビオチニル−６−アミノカプロン酸、
化合物（ＩＩ’）：Ｎ−ビオチニル−６−アミノカプロエートカルボキシレート、
化合物（ＩＩＩ）：ビオチン、
化合物（ＩＩＩ’）：シアノメチルビオチネート。
【０００６】
【化１】
【発明を実施するための形態】
【０００７】
本発明によると、本文中で他に言及されない限り：
「アルキル」という用語は：例えば１から６個の炭素原子、有利には１から４個の炭素原子を含む、直鎖または分岐鎖、飽和または不飽和の炭化水素系脂肪族基を意味するものであり、
「アリール」という用語は：環状芳香族基、例えば、フェニル基を意味するものであり、および
「ハロゲン」という用語は：フッ素、塩素、臭素またはヨウ素原子を意味するものである。
【０００８】
従って、本発明の主題は、化合物（Ｉ）の調製方法であって、化合物（ＩＩ’）をＮ−ヒドロキシスクシンイミドとカップリングさせる段階を含むことを特徴とする方法である。このカップリングは、有利には、０℃未満の温度、例えば、約−５℃で行う。
【０００９】
本発明によると、化合物（ＩＩ’）は、三級アミン型の弱塩基の存在下、極性および非プロトン性溶媒、例えば、ＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）またはＮＭＰ（Ｎ−メチルピロリドン）中で、化合物（ＩＩ）をアルキルまたはアリールハロホルメート（Ｘ’ＣＯＯＲ、式中、Ｒはアルキルまたはアリール基を表し、Ｘ’はハロゲン原子を表す。）で処理することによって得られる。この反応は、混合無水物の形態で、化合物（ＩＩ）の酸官能基を活性化することを可能にする。これは０℃未満の温度、例えば、約−５℃で有利に行われる。
【００１０】
化合物（ＩＩ’）を得るのにエチルクロロホルメート（ＣｌＣＯＯＥｔ）が有利に用いられる。この反応は、三級アミン型の弱塩基としてのトリエチルアミン（ＮＥｔ３）の存在下、ＤＭＦのような溶媒中で有利に行われる。
【００１１】
本発明によると、化合物（ＩＩ）は化合物（ＩＩＩ’）とアミノカプロン酸（Ｈ２Ｎ−（ＣＨ２）５−ＣＯＯＨ）とのカップリングの段階によって得られる。この段階の間、極性溶媒、例えば、ＤＭＦ、ＤＭＳＯまたはＮＭＰが有利に用いられる。この反応は約１００℃の熱条件下で有利に行われる。
【００１２】
化合物（ＩＩＩ’）に関しては、三級アミン型の弱塩基の存在下、極性および非プロトン性溶媒、例えば、ＤＭＦ、ＤＭＳＯまたはＮＭＰ中で、化合物（ＩＩＩ）をハロアセトニトリル（Ｘ−ＣＨ２ＣＮ、式中、Ｘはハロゲン原子を表す。）で処理することによって得られる。この反応は化合物（ＩＩＩ）の酸官能基を、エステルの形態で、活性化することを可能にする。この反応は約６０℃の熱条件下で有利に行われる。
【００１３】
化合物（ＩＩＩ’）を得るのにクロロアセトニトリル（ＣｌＣＨ２ＣＮ）が好ましく用いられる。この反応は、三級アミン型の弱塩基としてのトリエチルアミンの存在下、ＮＭＰのような溶媒中で有利に行われる。
【００１４】
本発明の方法によると、合成中間体（ＩＩ’）および（ＩＩＩ’）は単離しない；従って、スキーム１によって提示される化合物（Ｉ）を調製するための反応はビオチンから出発する２段階反応からなる。
【００１５】
特に有利には、本発明による方法は、ビオチンおよびアミノカプロン酸から出発し、（８０％を上回る）高収率で、優れた純度の生成物を生じる、１段階での化合物（ＩＩ）を容易に得ることを可能とする。
【００１６】
驚くべきことに、ペプチド合成から生じるカップリング技術により想定できる化合物（ＩＩ）を得る他の経路は、工業生産には非効率であるか、または不適切であることが立証されている。
【００１７】
特に、本発明者らは、ビオチン（ＩＩＩ）を酸塩化物に変換し（例えば、Ｄ．Ｅ．Ｗｏｌｆ ｅｔ ａｌ．，ｉｎ Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，ｙｅａｒ １９５１，７３，ｐ．４１４２−４１４４ ａｎｄ ｙｅａｒ １９５２，７４，ｐ．２００２−２００３）、次いでこれを塩基性媒体中でアミノカプロン酸と反応させることからなる酸塩化物経路が、ビオチンの不溶性のため、満足のいく収率を得ることを可能にすることがないことを示している。さらに、この経路は非常に過剰な塩化チオニルの使用を含む：この溶媒の毒性は産業衛生上の問題を生じる。
【００１８】
その場（ｉｎ ｓｉｔｕ）でビオチンを活性化した後に、これをアミノカプロン酸とカップリングさせる（例えば、Ｃ．Ｓｏｍｌａｉ ｅｔ ａｌ．，ｉｎ Ｚｅｉｔ．Ｎａｔｕｒｆｏｒｓｃｈ．，１９９３，４８，ｐ．５１１−５１６を参照のこと。）ことからなるジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）経路に関しては、活性化ビオチンおよびアミノカプロン酸の間の不十分な反応性のため、非効率的であることが立証されている。加えて、ＤＣＣをアミノカプロン酸と共に用いることで、反応の最後で除去することが非常に困難な副生物であるＤＣＵ（ジシクロヘキシル尿素）が生じる（ＤＣＵは化合物（ＩＩ’）から分離不能である。）。
【００１９】
最後に、混合無水物経路（次にアミノカプロン酸と反応する、非常に反応性の無水物の形成によるビオチンの酸官能基の活性化）は所望の化合物（ＩＩ）を得ることを可能にするが、これを産業規模には不適切とする幾つかの欠点を有する：実際、用いられる条件とは無関係に、反応の最後に残留する幾らかのビオチンが常に存在する（少なくとも２％）；ビオチンへの２アミノカプロン酸の添加に対応して副生物が形成され、媒体が極度に濃厚なゲルに急速に変換される。
【００２０】
従って、本発明による活性化エステル経路は、化合物（ＩＩ）を得るための他の上記経路の欠点を克服する。
【００２１】
特に有利には、本発明による方法は、混合無水物合成経路により、式（ＩＩ）の中間体およびＮ−ヒドロキシスクシンイミドから出発する１段階で化合物（Ｉ）を得ることを可能にする。この合成経路は、化合物（Ｉ）を高純度および高収率で得ることを可能にする。
【００２２】
本発明の主題は、ビオチニル化多糖、例えば、イドラバイオタパリヌクスの調製方法であって、以下の段階：
上で定義される方法により化合物（Ｉ）を調製し、次いで
化合物（Ｉ）を、化合物（Ｉ）の活性化エステル官能基に対して反応性である官能基を有する多糖とカップリングさせる
ことを含むことを特徴とする方法でもある。
【００２３】
多糖の該反応性官能基は、例えば、アミン官能基であり、この場合、活性化エステル官能基を含む化合物（Ｉ）とのカップリングは通常のアミノ／酸カップリング反応によって行われる。
【００２４】
化合物（Ｉ）と多糖とのカップリング反応は、炭酸水素ナトリウムの水溶液中で有利に行われる。
【００２５】
ビオチニル化多糖（この調製は上に記載される。）は、例えば、特許出願ＷＯ０２／２４７５４およびＷＯ２００６／０３０１０４に記載されるものである。これらは、特に、国際一般名「イドラバイオタパリヌクス」で公知であり、特許出願ＷＯ０２／２４７５４に記載されるビオチニル化五糖、または特許出願ＷＯ２００６／０３０１０４の実施例１および２に記載されるビオチニル化六糖であり得る。
【００２６】
これらのビオチニル化多糖を調製するため、化合物（Ｉ）を、それぞれ、特許出願ＷＯ０２／２４７５４に記載される五糖４４または特許出願ＷＯ２００６／０３０１０４に記載される十六糖（ｈｅｘａｄｅｃａｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ）４２および４３とカップリングさせる：
五糖４４：メチル（２−アミノ−２−デオキシ−３，４−ジ−Ｏ−メチル−６−Ｏ−スルホナト−α−Ｄ−グルコピラノシル）−（１→４）−（２，３−ジ−Ｏ−メチル−β−Ｄ−グルコピラノシルウロン酸）−（１→４）−（２，３，６−トリ−Ｏ−スルホナト−α−Ｄ−グルコピラノシル）−（１→４）−（２，３−ジ−Ｏ−メチル−α−Ｌ−イドピラノシルウロン酸）−（１→４）−２，３，６−トリ−Ｏ−スルホナト−α−Ｄ−グルコピラノシド；
十六糖４２：メチル（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−スルホナト−α−Ｄ−グルコピラノシル）−（１→４）−（２，３，６−トリ−Ｏ−スルホナト−α−Ｄ−グルコピラノシル）−（１→４）−（２，３，６−トリ−Ｏ−スルホナト−β−Ｄ−グルコピラノシル）−（１→４）−（２，３−ジ−Ｏ−メチル−６−Ｏ−スルホナト−α−Ｄ−グルコピラノシル）−（１→４）−（２，３，６−トリ−Ｏ−メチル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−（１→４）−［（２，３，６−トリ−Ｏ−メチル−α−Ｄ−グルコピラノシル）−（１→４）−Ｏ−（２，３，６−トリ−Ｏ−メチル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−（１→４）］３−（２−アミノ−２−デオキシ−３−Ｏ−メチル−６−Ｏ−スルホナト−α−Ｄ−グルコピラノシル）−（１→４）−（２，３−ジ−Ｏ−メチル−β−Ｄ−グルコピラノシルウロン酸）−（１→４）−（２，３，６−トリ−Ｏ−スルホナト−α−Ｄ−グルコピラノシル）−（１→４）−（２，３−ジ−Ｏ−メチル−α−Ｌ−イドピラノシルウロン酸）−（１→４）−３−Ｏ−メチル−２，６−ジ−Ｏ−スルホナト−α−Ｄ−グルコピラノシド；
十六糖４３：メチル（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−スルホナト−α−Ｄ−グルコピラノシル）−（１→４）−（２，３，６−トリ−Ｏ−スルホナト−α−Ｄ−グルコピラノシル）−（１→４）−（２，３，６−トリ−Ｏ−スルホナト−β−Ｄ−グルコピラノシル）−（１→４）−（２，３−ジ−Ｏ−メチル−６−Ｏ−スルホナト−α−Ｄ−グルコピラノシル）−（１→４）−（２，３，６−トリ−Ｏ−メチル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−（１→４）−［（２，３，６−トリ−Ｏ−メチル−α−Ｄ−グルコピラノシル）−（１→４）−Ｏ−（２，３，６−トリ−Ｏ−メチル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−（１→４）］３−（２−アミノ−２−デオキシ−３−Ｏ−メチル−６−Ｏ−スルホナト−α−Ｄ−グルコピラノシル）−（１→４）−（２，３−ジ−Ｏ−メチル−β−Ｄ−グルコピラノシルウロン酸）−（１→４）−（２，３，６−トリ−Ｏ−スルホナト−α−Ｄ−グルコピラノシル）−（１→４）−（２，３−ジ−Ｏ−メチル−α−Ｌ−イドピラノシルウロン酸）−（１→４）−２，３，６−トリ−Ｏ−スルホナト−α−Ｄ−グルコピラノシド。
【００２７】
本発明を、本発明による化合物（Ｉ）の調製方法を詳述する以下の例によって説明する。これらの例において、以下の略語を用いる：Ａｃ：アセチル；ＬＣ：液体クロマトグラフィー；ＤＭＦ：ジメチルホルムアミド；ｍｉｎ：分；ＭＴＢＥ：メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル；ＮＭＰ：Ｎ−メチルピロリドン；ｅｑ：モル当量；Ｅｔ：エチル；Ｔ：温度；ＴＨＦ：テトラヒドロフラン；ｔＲ：保持時間；ＯＵ：操作単位；Ｖ：体積。
【実施例】
【００２８】
［実施例１］
化合物（Ｉ）の調製
反応は、ＬＣにより以下の条件でモニターする：Ｓｙｍｍｅｔｒｙ Ｃ１８ １５０×４．６ｍｍ ５μカラム（Ｗａｔｅｒｓ）；溶離液Ａ：ｐＨ＝３に調整した０．０１Ｍ ＫＨ２ＰＯ４バッファ；溶離液Ｂ：アセトニトリル；流速１ｍｌ／分；勾配：ｔ＝０分 Ａ／Ｂ ８５／１５、ｔ＝９分 Ａ／Ｂ ６５／３５、ｔ＝１０分 Ａ／Ｂ ８５／１５、ｔ＝１５分 Ａ／Ｂ ８５／１５。この方法はビオチン（化合物（ＩＩＩ）、ｔＲ＝４．５分）、中間活性化エスエル（ＩＩＩ’）（ｔＲ＝８．４分）、Ｎ−ビオチニル−６−アミノカプロン酸（化合物（ＩＩ）、ｔＲ＝５．５から５．６分）、中間混合無水物（ＩＩ’）（ｔＲ＝１１．２分）およびＮ−スクシンイミジルＮ−ビオチニル−６−アミノカプロエート（化合物（Ｉ）、ｔＲ＝７．９から８．２分）を可視化することを可能にする。
【００２９】
１．１：化合物（ＩＩ）の調製
７．５ｋｇのビオチン（ＩＩＩ）、トリエチルアミン（１５ｌ、２Ｖ、３．５ｅｑ）、ＮＭＰ（１５ｌ、２Ｖ）および、最後に、クロロアセトニトリル（３．５ｋｇ、０．４７ＯＵ、１．５ｅｑ）を反応器に投入する。この媒体を６０℃に加熱する。この温度を２時間維持した後、ＬＣ分析はすべてのビオチンが化合物（ＩＩＩ’）に変換されている（＜２％）ことを示す。媒体を５０℃に冷却した後、アミノカプロン酸（９．０５ｋｇ、１．２０６ＯＵ、２．２ｅｑ）を収容する他の反応器に移す。ＮＭＰ（０．１Ｖ）ですすぎを行う。媒体を１００℃に加熱し、この温度で２時間維持する。ＬＣ分析は残留する活性化ビオチン（ＩＩＩ’）が２％未満であることを示す。媒体を６０℃に冷却する。５５℃に予備加熱したアセトニトリル（６０ｌ、８Ｖ）を注ぎ入れる。この混合物を６０℃で３０分間撹拌した後、２０℃に冷却する。撹拌を１時間行う。この懸濁液を濾過した後、すすぎをアセトニトリル（５Ｖ）で３回、次いでＴＨＦ（５Ｖ）で行う。真空下、最大６０℃で、重量の変化がなくなるまで乾燥を行う。このようにして、１０９％の収率および、ＬＣによる測定で、９８．６％の有機物純度で、１２．０ｋｇの化合物（ＩＩ）が得られる。
【００３０】
１０．０ｋｇの化合物（ＩＩ）を反応器に再投入する。次に塩酸（９０ｌ、９Ｖの水＋１０ｌ、１Ｖの３６％ ＨＣｌ）を添加する。この懸濁液を２０℃で３０分間撹拌する。懸濁液を濾過し、すすぎを水で３回（４Ｖ、４０ｌ）、次いでＴＨＦで２回（３．５Ｖ）行う。真空下、最大４５℃で、重量の変化がなくなるまで乾燥を行う。このようにして、６６％の収率で、６．１ｋｇの化合物（ＩＩ）が得られる。
【００３１】
１．２：化合物（Ｉ）の調製
反応器内で、３ｋｇの化合物（ＩＩ）をＤＭＦ（２５ｌ、８．３Ｖ）に懸濁させ、温度を−５℃にする。次にトリエチルアミン（１．０２ｋｇ、０．３４ＯＵ、１．２ｅｑ）を添加する。１５分間撹拌した後、エチルクロロホルメート（１．１ｋｇ、０．３６５ＯＵ、１．２ｅｑ）を（少なくとも１時間にわたって）徐々に添加する。ＤＭＦ（０．９ｌ、０．３Ｖ）ですすぎを行う。この媒体を−５℃で少なくとも２時間撹拌する。懸濁液はより細かく、黄色になる。ＬＣ分析はすべての化合物（ＩＩ）（＜３％）が反応していることを示す。
【００３２】
次に、ＤＭＦ（３ｌ、１Ｖ）の溶液中のＮ−ヒドロキシスクシンイミド（１．０４ｋｇ、０．３８６ＯＵ、１．２ｅｑ）を（少なくとも２０分にわたって）１工程で導入する。ＤＭＦ（１．５ｌ、０．５Ｖ）ですすぎを行う。この媒体を−５℃で１時間３０分間撹拌する。ＬＣ分析は残留化合物（ＩＩ）の存在が３％未満であることを示す。温度を２２℃にし、懸濁液をＤＣＭ（１２Ｖ、３６ｌ）に取って生じる有機相を水（１５ｌ、５Ｖ）で洗浄する。有機相を抜き出し、水相をＤＣＭ（３０ｌ、３Ｖ）で２回抽出する。有機相を混合し、水（１．５ｌ、０．５Ｖ）で洗浄する。有機相を６Ｖ、即ち、１８ｌに濃縮する。４０℃で加熱を行い、ＭＴＢＥ（６．２５Ｖ、１９ｌ）を最低１時間にわたって添加する。この混合物を４０℃で１時間維持した後、ＭＴＢＥ（８．７５Ｖ、２６ｌ）を最低２時間にわたって添加する。この混合物を４０℃で少なくとも３０分間維持した後、最低２時間にわたって２０℃に冷却し、この温度で３０分間維持する。この懸濁液を吸引によって濾過し、ケークをアセトン（５Ｖ、１５ｌ）で洗浄した後、アセトン（２Ｖ、６ｌ）でさらに２回洗浄する。生じる生成物を吸引によって濾過し、オーブン内、真空下、最大４０℃で、重量の変化がなくなるまで乾燥させる。
【００３３】
このようにして、８０％の収率および、ＬＣによる測定で、９６．０％の有機物純度で、３ｋｇの化合物（Ｉ）がクリーム色の粉末の形態で得られる。次の多糖とのカップリング反応にとって、このカップリングの間不活性であるためその存在が問題にならない化合物（ＩＩ）を除いて、化合物（Ｉ）の純度は９８％である。
【００３４】
［実施例２］
ビオチニル化多糖、イドラバイオタパリヌクスの調製
【００３５】
【化２】
８．５ｌの水（７Ｖ）中に、特許出願ＷＯ０２／２４７５４に記載される、粗製五糖４４（塩を含む。）１．２２ｋｇの溶液を調製する。０．５ｋｇ（１．６ｅｑ）の化合物（Ｉ）、０．１２ｋｇ（２．０ｅｑ）のＮａＨＣＯ３および０．３７ｋｇのＮａＣｌをこの溶液に添加する。この溶液は、白色懸濁液の形態にある。３．７ｌのアセトンをこの溶液に添加し、この反応媒体を約２５℃で少なくとも２２時間撹拌する。次に、この懸濁液を、ビオチニル化五糖を沈殿させることを可能にする、予め約４℃に冷却されているエタノール（１２０ｌ）およびＭＴＢＥ（６０ｌ）の混合液中に徐々に流し込む。次いで、生じる懸濁液を濾過し、無水エタノールおよびアセトンで連続的に洗浄する。沈殿を、重量の変化がなくなるまで、真空下でオーブン乾燥させる。このようにして、９９％の有機物純度、多糖４４に対して１０９％の収率、および最後の３段階にわたって７０％の化学収率で、１．６０ｋｇの粗製イドラバイオタパリヌクス（塩を含む。）がクリーム色の粉末の形態で得られる。
【技術分野】
【０００１】
本発明はビオチニル化試薬Ｎ−スクシンイミジルＮ−ビオチニル−６−アミノカプロエートを調製するための新規方法、および、このような試薬を用いるビオチニル化多糖を調製するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｎ−スクシンイミジルＮ−ビオチニル−６−アミノカプロエートは、特に、ＤＮＡ分子または糖タンパク質へのビオチン基のグラフト化に用いられる、商業的に入手可能なビオチニル化試薬である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
労力および原料経費を考慮し、およびＮ−スクシンイミジルＮ−ビオチニル−６−アミノカプロエートを産業規模で得るため、所望の化合物を大量に製造するのに適し、後者を十分に純粋な形態で、即ち、望ましくない副生物の形成なしに得ることを可能にする強固な合成を想定することが必要である。本発明者らは、今や、上述の要求を満たす、ビオチンから出発する２つの主な段階で、Ｎ−スクシンイミジルＮ−ビオチニル−６−アミノカプロエートを入手する経路を見出している。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明による方法は、以下にスキーム１において表される段階を含み、式中、Ｒはアルキルまたはアリール基を表し、並びに、互いに同一であっても異なっていてもよいＸおよびＸ’はハロゲン原子を表す。
【０００５】
スキーム１において、出発、中間および最終化合物は以下のものである：
化合物（Ｉ）：Ｎ−スクシンイミジルＮ−ビオチニル−６−アミノカプロエート、
化合物（ＩＩ）：Ｎ−ビオチニル−６−アミノカプロン酸、
化合物（ＩＩ’）：Ｎ−ビオチニル−６−アミノカプロエートカルボキシレート、
化合物（ＩＩＩ）：ビオチン、
化合物（ＩＩＩ’）：シアノメチルビオチネート。
【０００６】
【化１】
【発明を実施するための形態】
【０００７】
本発明によると、本文中で他に言及されない限り：
「アルキル」という用語は：例えば１から６個の炭素原子、有利には１から４個の炭素原子を含む、直鎖または分岐鎖、飽和または不飽和の炭化水素系脂肪族基を意味するものであり、
「アリール」という用語は：環状芳香族基、例えば、フェニル基を意味するものであり、および
「ハロゲン」という用語は：フッ素、塩素、臭素またはヨウ素原子を意味するものである。
【０００８】
従って、本発明の主題は、化合物（Ｉ）の調製方法であって、化合物（ＩＩ’）をＮ−ヒドロキシスクシンイミドとカップリングさせる段階を含むことを特徴とする方法である。このカップリングは、有利には、０℃未満の温度、例えば、約−５℃で行う。
【０００９】
本発明によると、化合物（ＩＩ’）は、三級アミン型の弱塩基の存在下、極性および非プロトン性溶媒、例えば、ＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）またはＮＭＰ（Ｎ−メチルピロリドン）中で、化合物（ＩＩ）をアルキルまたはアリールハロホルメート（Ｘ’ＣＯＯＲ、式中、Ｒはアルキルまたはアリール基を表し、Ｘ’はハロゲン原子を表す。）で処理することによって得られる。この反応は、混合無水物の形態で、化合物（ＩＩ）の酸官能基を活性化することを可能にする。これは０℃未満の温度、例えば、約−５℃で有利に行われる。
【００１０】
化合物（ＩＩ’）を得るのにエチルクロロホルメート（ＣｌＣＯＯＥｔ）が有利に用いられる。この反応は、三級アミン型の弱塩基としてのトリエチルアミン（ＮＥｔ３）の存在下、ＤＭＦのような溶媒中で有利に行われる。
【００１１】
本発明によると、化合物（ＩＩ）は化合物（ＩＩＩ’）とアミノカプロン酸（Ｈ２Ｎ−（ＣＨ２）５−ＣＯＯＨ）とのカップリングの段階によって得られる。この段階の間、極性溶媒、例えば、ＤＭＦ、ＤＭＳＯまたはＮＭＰが有利に用いられる。この反応は約１００℃の熱条件下で有利に行われる。
【００１２】
化合物（ＩＩＩ’）に関しては、三級アミン型の弱塩基の存在下、極性および非プロトン性溶媒、例えば、ＤＭＦ、ＤＭＳＯまたはＮＭＰ中で、化合物（ＩＩＩ）をハロアセトニトリル（Ｘ−ＣＨ２ＣＮ、式中、Ｘはハロゲン原子を表す。）で処理することによって得られる。この反応は化合物（ＩＩＩ）の酸官能基を、エステルの形態で、活性化することを可能にする。この反応は約６０℃の熱条件下で有利に行われる。
【００１３】
化合物（ＩＩＩ’）を得るのにクロロアセトニトリル（ＣｌＣＨ２ＣＮ）が好ましく用いられる。この反応は、三級アミン型の弱塩基としてのトリエチルアミンの存在下、ＮＭＰのような溶媒中で有利に行われる。
【００１４】
本発明の方法によると、合成中間体（ＩＩ’）および（ＩＩＩ’）は単離しない；従って、スキーム１によって提示される化合物（Ｉ）を調製するための反応はビオチンから出発する２段階反応からなる。
【００１５】
特に有利には、本発明による方法は、ビオチンおよびアミノカプロン酸から出発し、（８０％を上回る）高収率で、優れた純度の生成物を生じる、１段階での化合物（ＩＩ）を容易に得ることを可能とする。
【００１６】
驚くべきことに、ペプチド合成から生じるカップリング技術により想定できる化合物（ＩＩ）を得る他の経路は、工業生産には非効率であるか、または不適切であることが立証されている。
【００１７】
特に、本発明者らは、ビオチン（ＩＩＩ）を酸塩化物に変換し（例えば、Ｄ．Ｅ．Ｗｏｌｆ ｅｔ ａｌ．，ｉｎ Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，ｙｅａｒ １９５１，７３，ｐ．４１４２−４１４４ ａｎｄ ｙｅａｒ １９５２，７４，ｐ．２００２−２００３）、次いでこれを塩基性媒体中でアミノカプロン酸と反応させることからなる酸塩化物経路が、ビオチンの不溶性のため、満足のいく収率を得ることを可能にすることがないことを示している。さらに、この経路は非常に過剰な塩化チオニルの使用を含む：この溶媒の毒性は産業衛生上の問題を生じる。
【００１８】
その場（ｉｎ ｓｉｔｕ）でビオチンを活性化した後に、これをアミノカプロン酸とカップリングさせる（例えば、Ｃ．Ｓｏｍｌａｉ ｅｔ ａｌ．，ｉｎ Ｚｅｉｔ．Ｎａｔｕｒｆｏｒｓｃｈ．，１９９３，４８，ｐ．５１１−５１６を参照のこと。）ことからなるジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）経路に関しては、活性化ビオチンおよびアミノカプロン酸の間の不十分な反応性のため、非効率的であることが立証されている。加えて、ＤＣＣをアミノカプロン酸と共に用いることで、反応の最後で除去することが非常に困難な副生物であるＤＣＵ（ジシクロヘキシル尿素）が生じる（ＤＣＵは化合物（ＩＩ’）から分離不能である。）。
【００１９】
最後に、混合無水物経路（次にアミノカプロン酸と反応する、非常に反応性の無水物の形成によるビオチンの酸官能基の活性化）は所望の化合物（ＩＩ）を得ることを可能にするが、これを産業規模には不適切とする幾つかの欠点を有する：実際、用いられる条件とは無関係に、反応の最後に残留する幾らかのビオチンが常に存在する（少なくとも２％）；ビオチンへの２アミノカプロン酸の添加に対応して副生物が形成され、媒体が極度に濃厚なゲルに急速に変換される。
【００２０】
従って、本発明による活性化エステル経路は、化合物（ＩＩ）を得るための他の上記経路の欠点を克服する。
【００２１】
特に有利には、本発明による方法は、混合無水物合成経路により、式（ＩＩ）の中間体およびＮ−ヒドロキシスクシンイミドから出発する１段階で化合物（Ｉ）を得ることを可能にする。この合成経路は、化合物（Ｉ）を高純度および高収率で得ることを可能にする。
【００２２】
本発明の主題は、ビオチニル化多糖、例えば、イドラバイオタパリヌクスの調製方法であって、以下の段階：
上で定義される方法により化合物（Ｉ）を調製し、次いで
化合物（Ｉ）を、化合物（Ｉ）の活性化エステル官能基に対して反応性である官能基を有する多糖とカップリングさせる
ことを含むことを特徴とする方法でもある。
【００２３】
多糖の該反応性官能基は、例えば、アミン官能基であり、この場合、活性化エステル官能基を含む化合物（Ｉ）とのカップリングは通常のアミノ／酸カップリング反応によって行われる。
【００２４】
化合物（Ｉ）と多糖とのカップリング反応は、炭酸水素ナトリウムの水溶液中で有利に行われる。
【００２５】
ビオチニル化多糖（この調製は上に記載される。）は、例えば、特許出願ＷＯ０２／２４７５４およびＷＯ２００６／０３０１０４に記載されるものである。これらは、特に、国際一般名「イドラバイオタパリヌクス」で公知であり、特許出願ＷＯ０２／２４７５４に記載されるビオチニル化五糖、または特許出願ＷＯ２００６／０３０１０４の実施例１および２に記載されるビオチニル化六糖であり得る。
【００２６】
これらのビオチニル化多糖を調製するため、化合物（Ｉ）を、それぞれ、特許出願ＷＯ０２／２４７５４に記載される五糖４４または特許出願ＷＯ２００６／０３０１０４に記載される十六糖（ｈｅｘａｄｅｃａｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ）４２および４３とカップリングさせる：
五糖４４：メチル（２−アミノ−２−デオキシ−３，４−ジ−Ｏ−メチル−６−Ｏ−スルホナト−α−Ｄ−グルコピラノシル）−（１→４）−（２，３−ジ−Ｏ−メチル−β−Ｄ−グルコピラノシルウロン酸）−（１→４）−（２，３，６−トリ−Ｏ−スルホナト−α−Ｄ−グルコピラノシル）−（１→４）−（２，３−ジ−Ｏ−メチル−α−Ｌ−イドピラノシルウロン酸）−（１→４）−２，３，６−トリ−Ｏ−スルホナト−α−Ｄ−グルコピラノシド；
十六糖４２：メチル（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−スルホナト−α−Ｄ−グルコピラノシル）−（１→４）−（２，３，６−トリ−Ｏ−スルホナト−α−Ｄ−グルコピラノシル）−（１→４）−（２，３，６−トリ−Ｏ−スルホナト−β−Ｄ−グルコピラノシル）−（１→４）−（２，３−ジ−Ｏ−メチル−６−Ｏ−スルホナト−α−Ｄ−グルコピラノシル）−（１→４）−（２，３，６−トリ−Ｏ−メチル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−（１→４）−［（２，３，６−トリ−Ｏ−メチル−α−Ｄ−グルコピラノシル）−（１→４）−Ｏ−（２，３，６−トリ−Ｏ−メチル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−（１→４）］３−（２−アミノ−２−デオキシ−３−Ｏ−メチル−６−Ｏ−スルホナト−α−Ｄ−グルコピラノシル）−（１→４）−（２，３−ジ−Ｏ−メチル−β−Ｄ−グルコピラノシルウロン酸）−（１→４）−（２，３，６−トリ−Ｏ−スルホナト−α−Ｄ−グルコピラノシル）−（１→４）−（２，３−ジ−Ｏ−メチル−α−Ｌ−イドピラノシルウロン酸）−（１→４）−３−Ｏ−メチル−２，６−ジ−Ｏ−スルホナト−α−Ｄ−グルコピラノシド；
十六糖４３：メチル（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−スルホナト−α−Ｄ−グルコピラノシル）−（１→４）−（２，３，６−トリ−Ｏ−スルホナト−α−Ｄ−グルコピラノシル）−（１→４）−（２，３，６−トリ−Ｏ−スルホナト−β−Ｄ−グルコピラノシル）−（１→４）−（２，３−ジ−Ｏ−メチル−６−Ｏ−スルホナト−α−Ｄ−グルコピラノシル）−（１→４）−（２，３，６−トリ−Ｏ−メチル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−（１→４）−［（２，３，６−トリ−Ｏ−メチル−α−Ｄ−グルコピラノシル）−（１→４）−Ｏ−（２，３，６−トリ−Ｏ−メチル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−（１→４）］３−（２−アミノ−２−デオキシ−３−Ｏ−メチル−６−Ｏ−スルホナト−α−Ｄ−グルコピラノシル）−（１→４）−（２，３−ジ−Ｏ−メチル−β−Ｄ−グルコピラノシルウロン酸）−（１→４）−（２，３，６−トリ−Ｏ−スルホナト−α−Ｄ−グルコピラノシル）−（１→４）−（２，３−ジ−Ｏ−メチル−α−Ｌ−イドピラノシルウロン酸）−（１→４）−２，３，６−トリ−Ｏ−スルホナト−α−Ｄ−グルコピラノシド。
【００２７】
本発明を、本発明による化合物（Ｉ）の調製方法を詳述する以下の例によって説明する。これらの例において、以下の略語を用いる：Ａｃ：アセチル；ＬＣ：液体クロマトグラフィー；ＤＭＦ：ジメチルホルムアミド；ｍｉｎ：分；ＭＴＢＥ：メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル；ＮＭＰ：Ｎ−メチルピロリドン；ｅｑ：モル当量；Ｅｔ：エチル；Ｔ：温度；ＴＨＦ：テトラヒドロフラン；ｔＲ：保持時間；ＯＵ：操作単位；Ｖ：体積。
【実施例】
【００２８】
［実施例１］
化合物（Ｉ）の調製
反応は、ＬＣにより以下の条件でモニターする：Ｓｙｍｍｅｔｒｙ Ｃ１８ １５０×４．６ｍｍ ５μカラム（Ｗａｔｅｒｓ）；溶離液Ａ：ｐＨ＝３に調整した０．０１Ｍ ＫＨ２ＰＯ４バッファ；溶離液Ｂ：アセトニトリル；流速１ｍｌ／分；勾配：ｔ＝０分 Ａ／Ｂ ８５／１５、ｔ＝９分 Ａ／Ｂ ６５／３５、ｔ＝１０分 Ａ／Ｂ ８５／１５、ｔ＝１５分 Ａ／Ｂ ８５／１５。この方法はビオチン（化合物（ＩＩＩ）、ｔＲ＝４．５分）、中間活性化エスエル（ＩＩＩ’）（ｔＲ＝８．４分）、Ｎ−ビオチニル−６−アミノカプロン酸（化合物（ＩＩ）、ｔＲ＝５．５から５．６分）、中間混合無水物（ＩＩ’）（ｔＲ＝１１．２分）およびＮ−スクシンイミジルＮ−ビオチニル−６−アミノカプロエート（化合物（Ｉ）、ｔＲ＝７．９から８．２分）を可視化することを可能にする。
【００２９】
１．１：化合物（ＩＩ）の調製
７．５ｋｇのビオチン（ＩＩＩ）、トリエチルアミン（１５ｌ、２Ｖ、３．５ｅｑ）、ＮＭＰ（１５ｌ、２Ｖ）および、最後に、クロロアセトニトリル（３．５ｋｇ、０．４７ＯＵ、１．５ｅｑ）を反応器に投入する。この媒体を６０℃に加熱する。この温度を２時間維持した後、ＬＣ分析はすべてのビオチンが化合物（ＩＩＩ’）に変換されている（＜２％）ことを示す。媒体を５０℃に冷却した後、アミノカプロン酸（９．０５ｋｇ、１．２０６ＯＵ、２．２ｅｑ）を収容する他の反応器に移す。ＮＭＰ（０．１Ｖ）ですすぎを行う。媒体を１００℃に加熱し、この温度で２時間維持する。ＬＣ分析は残留する活性化ビオチン（ＩＩＩ’）が２％未満であることを示す。媒体を６０℃に冷却する。５５℃に予備加熱したアセトニトリル（６０ｌ、８Ｖ）を注ぎ入れる。この混合物を６０℃で３０分間撹拌した後、２０℃に冷却する。撹拌を１時間行う。この懸濁液を濾過した後、すすぎをアセトニトリル（５Ｖ）で３回、次いでＴＨＦ（５Ｖ）で行う。真空下、最大６０℃で、重量の変化がなくなるまで乾燥を行う。このようにして、１０９％の収率および、ＬＣによる測定で、９８．６％の有機物純度で、１２．０ｋｇの化合物（ＩＩ）が得られる。
【００３０】
１０．０ｋｇの化合物（ＩＩ）を反応器に再投入する。次に塩酸（９０ｌ、９Ｖの水＋１０ｌ、１Ｖの３６％ ＨＣｌ）を添加する。この懸濁液を２０℃で３０分間撹拌する。懸濁液を濾過し、すすぎを水で３回（４Ｖ、４０ｌ）、次いでＴＨＦで２回（３．５Ｖ）行う。真空下、最大４５℃で、重量の変化がなくなるまで乾燥を行う。このようにして、６６％の収率で、６．１ｋｇの化合物（ＩＩ）が得られる。
【００３１】
１．２：化合物（Ｉ）の調製
反応器内で、３ｋｇの化合物（ＩＩ）をＤＭＦ（２５ｌ、８．３Ｖ）に懸濁させ、温度を−５℃にする。次にトリエチルアミン（１．０２ｋｇ、０．３４ＯＵ、１．２ｅｑ）を添加する。１５分間撹拌した後、エチルクロロホルメート（１．１ｋｇ、０．３６５ＯＵ、１．２ｅｑ）を（少なくとも１時間にわたって）徐々に添加する。ＤＭＦ（０．９ｌ、０．３Ｖ）ですすぎを行う。この媒体を−５℃で少なくとも２時間撹拌する。懸濁液はより細かく、黄色になる。ＬＣ分析はすべての化合物（ＩＩ）（＜３％）が反応していることを示す。
【００３２】
次に、ＤＭＦ（３ｌ、１Ｖ）の溶液中のＮ−ヒドロキシスクシンイミド（１．０４ｋｇ、０．３８６ＯＵ、１．２ｅｑ）を（少なくとも２０分にわたって）１工程で導入する。ＤＭＦ（１．５ｌ、０．５Ｖ）ですすぎを行う。この媒体を−５℃で１時間３０分間撹拌する。ＬＣ分析は残留化合物（ＩＩ）の存在が３％未満であることを示す。温度を２２℃にし、懸濁液をＤＣＭ（１２Ｖ、３６ｌ）に取って生じる有機相を水（１５ｌ、５Ｖ）で洗浄する。有機相を抜き出し、水相をＤＣＭ（３０ｌ、３Ｖ）で２回抽出する。有機相を混合し、水（１．５ｌ、０．５Ｖ）で洗浄する。有機相を６Ｖ、即ち、１８ｌに濃縮する。４０℃で加熱を行い、ＭＴＢＥ（６．２５Ｖ、１９ｌ）を最低１時間にわたって添加する。この混合物を４０℃で１時間維持した後、ＭＴＢＥ（８．７５Ｖ、２６ｌ）を最低２時間にわたって添加する。この混合物を４０℃で少なくとも３０分間維持した後、最低２時間にわたって２０℃に冷却し、この温度で３０分間維持する。この懸濁液を吸引によって濾過し、ケークをアセトン（５Ｖ、１５ｌ）で洗浄した後、アセトン（２Ｖ、６ｌ）でさらに２回洗浄する。生じる生成物を吸引によって濾過し、オーブン内、真空下、最大４０℃で、重量の変化がなくなるまで乾燥させる。
【００３３】
このようにして、８０％の収率および、ＬＣによる測定で、９６．０％の有機物純度で、３ｋｇの化合物（Ｉ）がクリーム色の粉末の形態で得られる。次の多糖とのカップリング反応にとって、このカップリングの間不活性であるためその存在が問題にならない化合物（ＩＩ）を除いて、化合物（Ｉ）の純度は９８％である。
【００３４】
［実施例２］
ビオチニル化多糖、イドラバイオタパリヌクスの調製
【００３５】
【化２】
８．５ｌの水（７Ｖ）中に、特許出願ＷＯ０２／２４７５４に記載される、粗製五糖４４（塩を含む。）１．２２ｋｇの溶液を調製する。０．５ｋｇ（１．６ｅｑ）の化合物（Ｉ）、０．１２ｋｇ（２．０ｅｑ）のＮａＨＣＯ３および０．３７ｋｇのＮａＣｌをこの溶液に添加する。この溶液は、白色懸濁液の形態にある。３．７ｌのアセトンをこの溶液に添加し、この反応媒体を約２５℃で少なくとも２２時間撹拌する。次に、この懸濁液を、ビオチニル化五糖を沈殿させることを可能にする、予め約４℃に冷却されているエタノール（１２０ｌ）およびＭＴＢＥ（６０ｌ）の混合液中に徐々に流し込む。次いで、生じる懸濁液を濾過し、無水エタノールおよびアセトンで連続的に洗浄する。沈殿を、重量の変化がなくなるまで、真空下でオーブン乾燥させる。このようにして、９９％の有機物純度、多糖４４に対して１０９％の収率、および最後の３段階にわたって７０％の化学収率で、１．６０ｋｇの粗製イドラバイオタパリヌクス（塩を含む。）がクリーム色の粉末の形態で得られる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）に相当し、および活性化エステル官能基を含む、Ｎ−スクシンイミジルＮ−ビオチニル−６−アミノカプロエートの調製方法であって：
【化１】
化合物（ＩＩ）：
【化２】
の酸官能基を、Ｒがアルキルまたはアリール基を表す化合物（ＩＩ’）：
【化３】
が得られるように混合無水物の形態で活性化する段階と、これに続く化合物（ＩＩ’）のＮ−ヒドロキシスクシンイミドとのカップリングを含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
化合物（ＩＩ）の酸官能基の活性化を、三級アミン型の弱塩基の存在下、極性および非プロトン性溶媒中で該化合物を式Ｘ’ＣＯＯＲ（式中、Ｒはアルキルまたはアリール基を表し、およびＸ’はハロゲン原子を表す。）のアルキルまたはアリールハロホルメートで処理することによって行うことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記式Ｘ’ＣＯＯＲのハロホルメートが、エチルクロロホルメートであることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記三級アミン型の弱塩基が、トリエチルアミンであることを特徴とする、請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
前記極性および非プロトン性溶媒が、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシドまたはＮ−メチルピロリドンから選択されることを特徴とする、請求項２から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
化合物（ＩＩ）の酸官能基を活性化する段階を０℃未満の温度で行うことを特徴とする、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
化合物（ＩＩＩ）：
【化４】
の酸官能基を、化合物（ＩＩＩ’）：
【化５】
が得られるように、エステルの形態で活性化する工程と、これに続く化合物（ＩＩＩ’）とアミノカプロン酸とのカップリングによって化合物（ＩＩ）を得ることを特徴とする、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
化合物（ＩＩＩ）の酸官能基の活性化を、ハロアセトニトリルを用いて、三級アミン型の弱塩基の存在下、極性および非プロトン性溶媒中で行うことを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ハロアセトニトリルが、クロロアセトニトリルであることを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記三級アミン型の弱塩基が、トリエチルアミンであることを特徴とする、請求項８または請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記極性および非プロトン性溶媒が、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシドまたはＮ−メチルピロリドンから選択されることを特徴とする、請求項８から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
化合物（ＩＩＩ）の酸官能基を活性化するための反応を、約６０℃で行うことを特徴とする、請求項７から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
化合物（ＩＩＩ’）とアミノカプロン酸とのカップリング反応を、約１００℃で行うことを特徴とする、請求項７から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
ビオチニル化多糖の調製方法であって、以下の段階を含むことを特徴とする方法：
請求項１から１３のいずれか一項において定義される方法により化合物（Ｉ）を調製し、次いで
化合物（Ｉ）を、化合物（Ｉ）の活性化エステル官能基に対して反応性である官能基を有する多糖とカップリングさせる。
【請求項１５】
前記多糖の反応性官能基が、アミン官能基であることを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１４または請求項１５に記載の方法であって、該方法がイドラバイオタパリヌクスの調製からなり、および以下の段階を含むことを特徴とする、方法：
請求項１から１３のいずれか一項において定義される方法により化合物（Ｉ）を調製し、次いで
化合物（Ｉ）を、五糖メチル（２−アミノ−２−デオキシ−３，４−ジ−Ｏ−メチル−６−Ｏ−スルホナト−α−Ｄ−グルコピラノシル）−（１→４）−（２，３−ジ−Ｏ−メチル−β−Ｄ−グルコピラノシルウロン酸）−（１→４）−（２，３，６−トリ−Ｏ−スルホナト−α−Ｄ−グルコピラノシル）−（１→４）−（２，３−ジ−Ｏ−メチル−α−Ｌ−イドピラノシルウロン酸）−（１→４）−２，３，６−トリ−Ｏ−スルホナト−α−Ｄ−グルコピラノシドのナトリウム塩とカップリングさせる。
【請求項１】
式（Ｉ）に相当し、および活性化エステル官能基を含む、Ｎ−スクシンイミジルＮ−ビオチニル−６−アミノカプロエートの調製方法であって：
【化１】
化合物（ＩＩ）：
【化２】
の酸官能基を、Ｒがアルキルまたはアリール基を表す化合物（ＩＩ’）：
【化３】
が得られるように混合無水物の形態で活性化する段階と、これに続く化合物（ＩＩ’）のＮ−ヒドロキシスクシンイミドとのカップリングを含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
化合物（ＩＩ）の酸官能基の活性化を、三級アミン型の弱塩基の存在下、極性および非プロトン性溶媒中で該化合物を式Ｘ’ＣＯＯＲ（式中、Ｒはアルキルまたはアリール基を表し、およびＸ’はハロゲン原子を表す。）のアルキルまたはアリールハロホルメートで処理することによって行うことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記式Ｘ’ＣＯＯＲのハロホルメートが、エチルクロロホルメートであることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記三級アミン型の弱塩基が、トリエチルアミンであることを特徴とする、請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
前記極性および非プロトン性溶媒が、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシドまたはＮ−メチルピロリドンから選択されることを特徴とする、請求項２から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
化合物（ＩＩ）の酸官能基を活性化する段階を０℃未満の温度で行うことを特徴とする、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
化合物（ＩＩＩ）：
【化４】
の酸官能基を、化合物（ＩＩＩ’）：
【化５】
が得られるように、エステルの形態で活性化する工程と、これに続く化合物（ＩＩＩ’）とアミノカプロン酸とのカップリングによって化合物（ＩＩ）を得ることを特徴とする、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
化合物（ＩＩＩ）の酸官能基の活性化を、ハロアセトニトリルを用いて、三級アミン型の弱塩基の存在下、極性および非プロトン性溶媒中で行うことを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ハロアセトニトリルが、クロロアセトニトリルであることを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記三級アミン型の弱塩基が、トリエチルアミンであることを特徴とする、請求項８または請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記極性および非プロトン性溶媒が、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシドまたはＮ−メチルピロリドンから選択されることを特徴とする、請求項８から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
化合物（ＩＩＩ）の酸官能基を活性化するための反応を、約６０℃で行うことを特徴とする、請求項７から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
化合物（ＩＩＩ’）とアミノカプロン酸とのカップリング反応を、約１００℃で行うことを特徴とする、請求項７から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
ビオチニル化多糖の調製方法であって、以下の段階を含むことを特徴とする方法：
請求項１から１３のいずれか一項において定義される方法により化合物（Ｉ）を調製し、次いで
化合物（Ｉ）を、化合物（Ｉ）の活性化エステル官能基に対して反応性である官能基を有する多糖とカップリングさせる。
【請求項１５】
前記多糖の反応性官能基が、アミン官能基であることを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１４または請求項１５に記載の方法であって、該方法がイドラバイオタパリヌクスの調製からなり、および以下の段階を含むことを特徴とする、方法：
請求項１から１３のいずれか一項において定義される方法により化合物（Ｉ）を調製し、次いで
化合物（Ｉ）を、五糖メチル（２−アミノ−２−デオキシ−３，４−ジ−Ｏ−メチル−６−Ｏ−スルホナト−α−Ｄ−グルコピラノシル）−（１→４）−（２，３−ジ−Ｏ−メチル−β−Ｄ−グルコピラノシルウロン酸）−（１→４）−（２，３，６−トリ−Ｏ−スルホナト−α−Ｄ−グルコピラノシル）−（１→４）−（２，３−ジ−Ｏ−メチル−α−Ｌ−イドピラノシルウロン酸）−（１→４）−２，３，６−トリ−Ｏ−スルホナト−α−Ｄ−グルコピラノシドのナトリウム塩とカップリングさせる。
【公表番号】特表２０１３−５１１４９９（Ｐ２０１３−５１１４９９Ａ）
【公表日】平成２５年４月４日（２０１３．４．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５３９３８８（Ｐ２０１２−５３９３８８）
【出願日】平成２２年１１月１９日（２０１０．１１．１９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＲ２０１０／０５２４５２
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０６１４４９
【国際公開日】平成２３年５月２６日（２０１１．５．２６）
【出願人】（５０４４５６７９８）サノフイ (433)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年４月４日（２０１３．４．４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１１月１９日（２０１０．１１．１９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＲ２０１０／０５２４５２
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０６１４４９
【国際公開日】平成２３年５月２６日（２０１１．５．２６）
【出願人】（５０４４５６７９８）サノフイ (433)
【Ｆターム（参考）】
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