ＮＭＤＡ受容体阻害剤
【課題】日常的な摂取に際しても安全性が高いＮＭＤＡ受容体阻害剤を提供する。また、これを含有する、脳疾患もしくは神経疾患の治療もしくは予防等のための製剤または健康機能性食品を提供する。
【解決手段】木クレオソートの主要成分であり、長年使用されたクレオソート製剤に含まれる、２−メトキシフェノール、２−メトキシ−４−メチルフェノール、及び２−メトキシ−４−エチルフェノールのいずれか、またはこれらの組み合わせを用いる。
【解決手段】木クレオソートの主要成分であり、長年使用されたクレオソート製剤に含まれる、２−メトキシフェノール、２−メトキシ−４−メチルフェノール、及び２−メトキシ−４−エチルフェノールのいずれか、またはこれらの組み合わせを用いる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＮＭＤＡ（N-methy1-D-aspartate）受容体（ＮメチルＤアスパラギン酸レセプター）阻害剤に関する。また、脳疾患もしくは神経疾患の治療もしくは予防、または、脳機能もしくはその他の神経機能の改善のための製剤、または健康機能性食品（保健機能食品）に関する。ここで、健康機能性食品（保健機能食品）は、健康維持や健康増進の機能を有する飲食物であり、栄養改善法による特定保健用食品、及び、財団法人 日本健康・栄養食品協会の認定による健康補助食品を含む。
【背景技術】
【０００２】
興奮性神経伝達物質であるグルタミン酸に対応するグルタミン酸受容体には、イオンチャネル内蔵型と代謝調節型がある。一般的に、イオンチャネル内蔵型受容体には、ニコチン性アセチルコリン受容体、ＧＡＢＡ（γ−aminobutyric acid）Ａ受容体、グリシン受容体、ＮＭＤＡ受容体などがある。
グルタミン酸は哺乳類脳内での最も重要な興奮性神経伝達物質である。一方、特殊な環境下ではグルタミン酸には神経細胞死を誘発する毒性があって、種々の神経変性疾患の病因物質として深く関与していると考えられている。グルタミン酸作動性神経は脳全体に分布しており、脳の機能に幅広く関わっていると推察されているが、特に記憶の形成に重要な海馬における働きが明らかにされている。
ＮＭＤＡ受容体阻害剤ないし拮抗剤が有用である疾病としては、脳虚血、アルツハイマー病などの慢性神経変性疾患、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ハンチントン病、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）関連神経損傷、外傷性脳または脊髄損傷、疼痛（例えば、外傷後または術後）、および慢性的疼痛症状、例えば神経因性疼痛または癌関連疼痛などが挙げられている（特許文献１）。また、学習・記憶や動機づけなどの知能の向上、恐怖などに対する不安の解消、蓄尿機能や排出機能などの排尿機能改善、てんかん、精神分裂病やそううつ病などの気分障害、脳血管障害などの治療および症状改善が挙げられる他、海藻などに含まれるカイニン酸、ムラサキ貝に含まれるドモイック酸、イタチササゲに含まれるβ−Ｎ−オキシルアミノ−Ｌ−アラニンやシカスアーシナリスＬに含まれるβ−Ｎ−メチルアミノ−Ｌ−アラニンなどのグルタミン酸受容体に作用する神経毒などの解毒作用もあると考えられている（特許文献２）。
そのため、ＮＭＤＡ受容体阻害剤ないし拮抗剤として、各種アミン化合物など、種々の物質が検討されている（特許文献１〜４）。
【０００３】
【特許文献１】国際公開ＷＯ ２０００／００００１９７
【特許文献２】特開２００４−１８９６２６
【特許文献３】特表２００４−５１２３２４
【特許文献４】特表２００３−５０５５１２
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ＮＭＤＡ受容体阻害剤として上記特許文献１〜２に記載されたものは、ＮＭＤＡ受容体阻害作用が不充分であるか、または、日常的に服用するための安全性が充分に確かめられていない等のいずれかの問題があった。
本発明は、上記に鑑みなされたものであり、充分なＮＭＤＡ受容体阻害作用が得られるとともに、日常的な摂取に際しても安全性の危惧のないものを提供しようとする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明のＮＭＤＡ受容体阻害剤は、下記の一般式（Ｉ−１〜Ｉ−４）で示される化合物あるいはその塩を含有してなることを特徴とする。
【化１】
但し、上記一般式（Ｉ−１〜Ｉ−４）におけるＲ1はメチル基またはエチル基、Ｒ2は水素原子または炭素数１〜５の直鎖または側鎖のアルキル基であって、Ｒ1とＲ2は同一であっても異なっていてもよい。
【発明の効果】
【０００６】
充分なＮＭＤＡ受容体阻害作用が得られるとともに、日常的な摂取に際しても安全性の危惧がほとんどない。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
上記一般式（Ｉ(Ｉ−１〜Ｉ−４)）の化合物について、以下に具体例を挙げるが、この例示でいう「ブチル」は、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓ−ブチル、ｔ−ブチルを総称したものであり、また「プロピル」は、ｎ−プロピル、イソプロピルを総称したものである。すなわち、２−メトキシフェノール（グアヤコール）、２−メトキシ−３−メチルフェノール、２−メトキシ−３−エチルフェノール、２−メトキシ−３−プロピルフェノール、２−メトキシ−３−ブチルフェノール、２−メトキシ−４−メチルフェノール、２−メトキシ−４−エチルフェノール、２−メトキシ−４−プロピルフェノール、２−メトキシ−４−ブチルフェノール、２−メトキシ−５−メチルフェノール、２−メトキシ−５−エチルフェノール、２−メトキシ−５−プロピルフェノール、２−メトキシ−５−ブチルフェノール、２−エトキシフェノール、２−エトキシ−３−メチルフェノール、２−エトキシ−３−エチルフェノール、２−エトキシ−３−プロピルフェノール、２−エトキシ−３−ブチルフェノール、２−エトキシ−４−メチルフェノール、２−エトキシ−４−エチルフェノール、２−エトキシ−４−プロピルフェノール、２−エトキシ−４−ブチルフェノール、２−エトキシ−５−メチルフェノール、２−エトキシ−５−エチルフェノール、２−エトキシ−５−プロピルフェノール、２−エトキシ−５−ブチルフェノールなどが挙げられる。
【０００８】
上記一般式（Ｉ）の化合物の中でも、Ｒ2が炭素数１〜３であることが、ＮＭＤＡ受容体阻害作用に優れているという点で好ましく、メチル基あるいはエチル基であることがさらに好ましい。
また、Ｒ2は３または４の位置に結合していることが、ＮＭＤＡ受容体阻害作用に優れているという点で好ましく、４の位置に結合していることがさらに好ましく、中でも、神経細胞の死滅を防ぐ能力に優れているという点で、２−メトキシフェノール（グアヤコール）、２−メトキシ−４−メチルフェノール（以下、単に「２Ｍ４ＭＰ」ともいう）、２−メトキシ−４−エチルフェノール（以下、単に「２Ｍ４ＥＰ」ともいう）、２−エトキシ−４−メチルフェノール（以下、単に「２Ｅ４ＭＰ」ともいう）、２−エトキシ−４−エチルフェノール（以下、単に「２Ｅ４ＥＰ」ともいう）が好ましく、その中でもグアヤコール、２Ｍ４ＭＰ、及び２Ｍ４ＥＰが最も好ましい。なお、上記一般式（Ｉ）で示される化合物は１種類を単独で使用しても良いし、２種以上を併用することもできる。
これらグアヤコール、２Ｍ４ＭＰ、２Ｍ４ＥＰはいずれも、木クレオソートの構成成分である（Ogata N．，Baba T．Analysis of beechwood creosote by gas chromatography-mass spectrometry and high-performance liquid chromatography．Res Commun Chem Pathol Pharmacol 66,411-423(1989)，ブナ木クレオソートのガスクロマトグラフィー・質量分析法および高速液体クロマトグラフィー法による分析）。緒方規男（N. Ogata）他著ファーマコロジー（Pharmacology）、４６巻、（１９９３）、第１７３頁には、クレオソートが腸管運動抑制に基づく止瀉作用を有する旨記載されている。また、医薬品製造指針（日本公定書協会編）１９８８年版第２４０頁の胃腸薬製造承認基準において、Ｖ欄の止瀉薬の区分中１項の殺菌剤として収載されている。また、伊藤宏著「薬理学」（（株）蛍光堂、１９８３年１月５日改訂第６版発行）第４１６頁にも、木クレオソートは腸内防腐に用いるほか、吸入適応により去痰作用を示す旨記載され、日本薬局方でも、去痰、腸内異常醗酵、食中毒などに用いる旨記載されている。ザ・ユナイテッド・ステーツ・ディスペンサトリー（The United States Dispensatory）、２７ｔｈ ｅｄ．（１９７３）、第３５５頁にも、木クレオソートは、外用として殺菌剤、内用として去痰剤として使用される旨記載されている。
【０００９】
＜塩の形態＞
また、本発明のＮＭＤＡ受容体阻害剤は、塩基を用いた塩の形態とすることも可能である。用いる塩としては、薬学的に（薬剤学的に）許容し得る塩であれば特に限定するものではなく、例えば、ナトリウム、カルシウム、カリウム、マグネシウム、リチウムなどの金属塩、アミン類（モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン）との塩あるいはアンモニウム塩などが挙げられる。
【００１０】
＜使用量＞
本発明のＮＭＤＡ受容体阻害剤の投与量（使用量）については、対象となる動物の種類あるいは性別、年齢、症状の程度によって変わるので一概にはいえないが、ヒトにおける経口投与あるいは直腸内投与（坐剤）の場合は、およそのところ１日当たり成人体重１ｋｇに対して０．１〜１０ｍｇであり、０．５〜５ｍｇであることが好ましく、また注射剤としての投与の場合には、１日当たり成人体重１ｋｇに対して０．０５〜５ｍｇであり、０．２５〜２．５ｍｇであることが好ましい。これらの１日量を１回でまたは分２〜分４、あるいはそれ以上の回数に分けて投与することができる。
【００１１】
＜剤型・摂取形態＞
本発明のＮＭＤＡ受容体阻害剤は、医療用薬剤における一般的な形態で以て使用される。一般的な形態としては、例えば、錠剤、丸剤、散剤、カプセル剤（軟カプセル剤、硬カプセル剤）、顆粒剤、トローチ剤、チュアブル剤、内服液剤や、注射剤（血管内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与など）、あるいは坐剤などが挙げられる。錠剤、顆粒剤、散剤の形態に調製する際には、従来公知の担体を広く使用でき、例えば、乳糖、白糖、ブドウ糖、澱粉、結晶セルロース等の賦形剤、例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、ゼラチン、トラガント、アラビアゴム、アルギン酸ナトリウム等の結合剤、例えば、澱粉、カルボキシメチルセルロース、炭酸カルシウム等の崩壊剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ステアリン酸などの滑沢剤が使用できる。錠剤には、必要に応じて、通常の剤皮を施すこともでき、例えば、糖衣錠、フィルムコーティング錠等とすることができ、さらに二層錠、多層錠としてもよい。また、顆粒剤や散剤も通常の剤皮を施すことができる。
このような医薬品としての剤型のみならず、本発明のＮＭＤＡ受容体阻害剤は一般の飲食物として摂取することもできる。すなわち、菓子類（クッキー、ビスケット、ケーキ、饅頭、スナック菓子、ガム、キャンデーなど）や飲料水（栄養ドリンク、炭酸飲料水、乳酸飲料水、清涼飲料水など）、インスタント食品（即席麺、即席カレーやシチューなど）、練り食品（ハム、ソーセージ、かまぼこなど）、油脂加工品（バター、マーガリン、マヨネーズ、ドレッシングなど）、調味料（ソース、しょう油、塩、コショウなど）、乳製品（ヨーグルト、加工乳など）に含ませて本発明のＮＭＤＡ受容体阻害作用の摂取を図ることもできる。
【実施例】
【００１２】
＜培養ディッシュの準備＞
(1) 培養ディッシュ（ＮＵＮＣ社製マルチディッシュ６ｗｅｌｌ、Φ３５ｍｍ）の各穴（ｗｅｌｌ）に７５μｇ／ｍＬ ポリリジン（Poly-L-lysine）水溶液（各ｗｅｌｌ ２ｍＬずつ、以下同様）を加え、インキュべーター（ＳＡＮＹＯ社，ＭＣＯ−１７ＡＩＣ型：３７℃、５％ ＣＯ2／９５％ ａｉｒ）内で少なくとも２時間静置した。
(2) ポリリジンコーティング後、液を取り除き、洗浄液として特定のダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline without Ｃａ2+・Ｍｇ2+；３３ｍＭ glucose，１００Ｕ／ｍＬ ペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬ ストレプトマイシンを含む（ＰＢＳ ｓｐｅｃｉａｌ））を用いて、１回洗浄した。
(3) 洗浄液をよく取り除き、培養メディウムとして33mM グルコース（glucose）、2mM グルタミン（glutamine）、100U/mL ペニシリン（penicillin）、100μｇ/mL ストレプトマイシン（streptomycin）、5mM HEPES （2-[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl] ethane sulfonic acid）、0.11% 重炭酸ナトリウム（sodium bicarbonate）、および、10％のウシ胎児血清（FBS）を添加したＤＭＥＭ／Ｆ−１２等量混合液（Dulbecco's Modified Eagle Medium：Nutrient Mixture Ｆ−１２（１：１））を加え、細胞の培養に備えた。
【００１３】
＜神経細胞の採取から播種まで（図１）＞
（１）妊娠１８日目のWistar系雌性ラット（三協ラボ）から子宮を全摘出し、クリーンべンチ内に移動した。子宮から胎児を取り出し（平均１２匹／雌親ラット）、胎児の頭部を背側から頚部で切断し、全脳を摘出した。摘出した全脳から、実体顕微鏡下（対物×１０倍）海馬を切り出した。胎児から切り取った各組織はあらかじめ培養メディウムで満たしたペトリ皿に回収し、細胞分散までインキュべーター内に静置した。
（２） 取り出した海馬を、フタ付き遠心管中のベルセン（Versene）液に１２分間、室温にて浸漬した。このようにして、細胞間の結合をゆるめた。なお、ベルセン液は、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）中にエチレンジアミン４酢酸（ＥＤＴＡ）を０．２重量％含むものであり、細胞間の接着に必要なカルシウムをキレートすることで、細胞を分散しやすくする。
（３）先端を加熱して細くしたパスツールピペットを用いて、ベルセン液を除去し、上記の培養メディウムに置き換え、また、当該培養メディウム中に海馬細胞を分散した。
（４）分散した細胞液中に、分散不可能な小片が見えないかどうか目視で確かめたのち、フタをしてから、１，０００×ｇ（重力加速度の１，０００倍の遠心力）にて４分間遠心分離操作を行った。
（５）上澄みを捨て、遠心管の底に得られた沈査を、適量の上記培養メディウムで再懸濁した。
（６）Typan blue 染色によって生細胞の割合を計算し、上記のように準備した培養ディッシュに、３．１３×１０5cells／ｃｍ2の細胞密度になるように細胞を播いた。
【００１４】
＜神経細胞の培養（図２）＞
(1) 上記の培養ディッシュをよく攪拌した後、インキュべーター内に静置し、５％炭酸ガス含有条件下、３７℃に保った。
（２）細胞を播いた時点を０日（DIV; day in vitro）とし、培養２〜３日（播種時から４８〜７２ｈｒの期間）には、培養液に１０μＭとなるようにシトシンアラビノシド（Ara-C；cytosine arabinoside）を添加し、この条件で２４時間処置した。このシトシンアラビノシドによる処理により、グリア細胞の増殖を抑制する。
(３）３日経過以降は、上記培養メディウムからウシ胎児血清（ＦＢＳ）を省き、ホルモンミックスを添加した培養液にて培養を行った。ホルモンミックス：０．５μｇ／ｍｌインスリン、５０μｇ／ｍｌトランスフェリン、２０μｇ／ｍｌプロゲステロン、１ｐＭ β−エストラジオール、３μＭトリヨードチロニン、１００μＭプトレッシン、８ｎｇ／ｍｌセレン２ナトリウム。
すなわち、Dulbecco's Modified Eagle Medium（DMEM）に以下のものを添加した液を用いた。33mM glucose、100U/mL penicillin、100μｇ/mL streptomycin、2mM glutamine、1.125mg/mL sodium bicarbonate、5mM HEPESおよびHormone mix (5μｇ/mL insulin、0.5mg/mL apo-transferrin、0.2μＭ progesterone、0.01nM β-estradiol、0.03mM 3,3',5-triiodo-L-thyronine、1mM putrescineおよび0.08mg/mL sodium selenite．なお、培養６日経過後に、培養液を、同一組成の新しいものに置き換えた。
(3) 培養９日目を経過した上記の細胞培地でもって、ＮＭＤＡによる細胞死とその抑制の評価、及び、ＮＭＤＡによるカルシウムイオン流入の抑制の評価に用いた。
【００１５】
＜ＮＭＤＡによる神経細胞死とその抑制についての評価＞
上記のように９日間培養した海馬由来神経細胞の培地をレコーディングメディウム（−Ｍｇ2+）に置き換え、ＮＭＤＡを１００μＭとなるように各ウェルに添加した。また、同時に、各ウェルに、２−メトキシフェノール（グアヤコール）、２−メトキシ−４−メチルフェノール（２Ｍ４ＭＰ）、及び２−メトキシ−４−エチルフェノール（２Ｍ４ＥＰ）のいずれかを、１００μＭ、及び１ｍＭ（１０００μＭ）のいずれかの濃度となるように添加した。ここで、各フェノール化合物には、東京化成工業（株）の一級試薬を用いた。そして、添加後６時間の経過後に、下記のＭＴＴアッセイにより細胞生存率を評価した（図３〜４）。なお、各条件でのｎ数（同一条件のウェルの数）は４〜６とした。
一方、比較のため、木クレオソート系のフェノール化合物、及びＮＭＤＡのいずれも添加しなかったものを１００％とする細胞生存率を求めておいた（図３〜４左端）。
【００１６】
＜細胞生存率の評価（ＭＴＴアッセイ）＞
上記のようにして神経細胞死を誘起させた後、培養液を、０．５ｍｇ／ｍｌの3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromaide（ＭＴＴ）を含むリン酸緩衝液（ＰＢＳ）に置換し、３７℃の上記炭酸ガスインキュベーターにて１時間、呈色反応を行わせた。続いて、０．０４Ｎ ＨＣｌを含むイソプロパノール(isopropanol)を加えて、細胞を溶解させた。この後、マイクロプレートリーダーを用いて５５０〜５７０ｎｍの吸光度を測定することにより、ＭＴＴの還元反応の活性を求めた。
【００１７】
＜ＮＭＤＡによるカルシウムイオン流入の抑制の評価＞
上記のような培養９日目を経過した細胞培地を、下記のような、細胞中のカルシウムイオン濃度測定用媒体に置き換えて、５分後に、上記３種のフェノール化合物（グアヤコール、２Ｍ４ＭＰおよび２Ｍ４ＥＰ）をそれぞれ１０００μＭの濃度で添加した。次いでこの５分後に１００μＭとなるようにＮＭＤＡを添加した。そして、下記のような方法で、細胞中へのカルシウムイオン流入の程度を調べた。方法の詳細は下記のとおりである。
【００１８】
＜力ルシウムイメージング＞
（１）レコーディングメディウム（＋Ｍｇ2+）（１２９ｍＭ ＮａＣｌ、４ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ2、２ｍＭ ＣａＣｌ2、４．２ｍＭ glucose、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４）で１回洗浄後、細胞膜透過性蛍光Ｃａ2+指示薬であるfluo−３ＡＭ （３μＭ）および３０ｎＭ Pluronic Ｆ−１２７を含むレコーディングメディウム（＋Ｍｇ2+）１ｍｌ／ｗｅｌｌで３７℃、５０分間インキュべートした。細胞をレコーディングメディウム（＋Ｍｇ2+）で２回洗浄したのち、レコーディングメディウム（＋Ｍｇ2+）２ｍｌ／ｗｅｌｌ中で、少なくとも１時間測定場所で静置して、Ｃａ２＋測定実験に備えた。
（２）刺激５分前に、上記レコーディングメディウム（＋Ｍｇ2+）を、Ｍｇ2+を添加していないレコーディングメディウム（−Ｍｇ2+）に置き換えた。蛍光色素を負荷した細胞を、アルゴンレーザーを用いて４８８ｎｍの光で励起させた。共焦点レーザー顕微鏡による観察は、細胞の染色終了後、１−５時間以内に行った。
（３）レコーディングメディウム（−Ｍｇ2+）中に置き換えられた神経細胞をただちに顕微鏡下へと移し、メディウム交換１分後および５分後の蛍光画像を取得した後、各フェノール系化合物を最終濃度１０００μＭとなるように添加した。さらに５分の後、ＮＭＤＡを最終濃度１００μＭとなるように添加した。続いて、最終濃度１０μＭとなるように力ルシウムイオノフォアであるＡ２３１８７を添加し、その５分後、蛍光画像を得た。試薬を添加した後の蛍光画像は１分おきに取得した。また、本実験で用いた各試薬は、使用する直前にレコーディングメディウム（−Ｍｇ2+）を用いて調製した。
（４）得られた各蛍光画像はScion Image 4.03を用いて数値化した。値は、メディウム交換後５分目の値をバックグラウンドとみなし０とし、Ａ２３１８７を添加した後５分後の蛍光強度を１００としてグラフ化した。
【００１９】
＜ＮＭＤＡによる細胞死に対するフェノール系化合物の抑制効果＞
図３〜４の棒グラフに、各フェノール系化合物による細胞死抑制効果について示す。図３から知られるように、用いた３種のフェノール系化合物のいずれによっても、１ｍＭ（１０００μＭ）の濃度条件にて、ＮＭＤＡによる細胞死に対する顕著な抑制効果が見られた。図３中に示すように、９９％以上の確率で有意な効果が得られた。また、細胞死抑制効果は、２−メトキシフェノール（グアヤコール）、２−メトキシ−４−メチルフェノール（２Ｍ４ＭＰ）、及び、２−メトキシ−４−エチルフェノール（２Ｍ４ＥＰ）の間で、有意な差は見られなかった。
図４の棒グラフには、図３中に示した結果とともに、各条件ごとに採用したコントロールとして、３種のフェノール系化合物単独の効果についても示している。
【００２０】
＜力ルシウム流入に対するフェノール系化合物の抑制効果＞
図５は、上記の力ルシウムイメージングにより得られたグラフである。図５から知られるように、用いた３種のフェノール系化合物のいずれによっても、１ｍＭ（１０００μＭ）の濃度条件にて、ＮＭＤＡによるカルシウムイオン流入に対し、抑制効果が見られた。特には、２−メトキシ−４−エチルフェノール（２Ｍ４ＥＰ）を用いた場合に顕著な効果が見られた。２−メトキシ−４−エチルフェノールを用いた場合、ＮＭＤＡを添加する以前の段階で、カルシウムイオン流入量に与える影響も最も小さかった。
図６は、図５の１５分後の状態に対応する蛍光画像である。白黒の状態で示すため、カルシウム濃度の大きいところが白く見えており、カルシウムイオン流入に対する抑制効果が、２−メトキシフェノール（グアヤコール）、２−メトキシ−４−メチルフェノール（２Ｍ４ＭＰ）、及び、２−メトキシ−４−エチルフェノール（２Ｍ４ＥＰ）の順で、大きくなっていることが、図６の蛍光画像からも知ることができる。
【００２１】
＜in vivo における脳梗塞巣抑制効果試験＞
６週齢のWistar系雄性ラット(体重１５０−２００ｇ、三協ラボサービス)に、１日１回carboxymethyl cellulose（ＣＭＣ）およびＣＭＣに懸濁したフェノール系化合物（２Ｍ４ＭＰ，２Ｍ４ＥＰ）を170mg/kgの用量で経口投与した。７日目の投与後に、中大脳動脈結紮術（ＭＣＡＯ）を行ってから、２時間経過後に血流を再開通した（図７）。血流変動はレーザードップラー血流計を用いて測定した。これらフェノール系化合物の経口投与は、いずれの場合でも動物の体重には著明な変動を与えないことが確認された（図８）。血流再開通２４時間経過後に動物から全脳を摘出して、phosphate buffered saline （ＰＢＳ）で洗浄後、ブレインスライサーを用いてブレグマを中心として２ｍｍごとに新鮮脳冠状切片を作成した。この新鮮脳冠状切片を0.8% 2,3,5-triphenyl-tetrazolium chloride（ＴＴＣ）により染色したのち、切片を実体顕微鏡で検鏡し、デジタルカメラを用いて写真撮影を行ってから梗塞巣の面積を算出した。その結果、ＣＭＣを連続投与した対照群動物の脳では、６０％程度の梗塞巣が観察されたが、２Ｍ４ＭＰを１日１回投与した動物群では梗塞巣が２０％以下にまで有意に回復することが判明した（図９）。
次いで、神経細胞のマーカータンパク質であるmicrotubule-associated protein-2（ＭＡＰ２）と、アストログリア細胞のマーカータンパク質であるglial fibrillary acidic protein（ＧＦＡＰ）の発現をウエスタンブロッティング法により検討したところ、ＭＣＡＯ負荷に伴い神経細胞マーカーのＭＡＰ２発現量は反対側の約２０％にまで低下したのに対して、２Ｍ４ＭＰを一週間連続投与した動物では、反対側の８０％程度にまでＭＡＰ２発現量が回復し、２Ｍ４ＥＰでは４０％程度まで回復した（図１０）。アストログリアマーカーのＧＦＡＰ発現量は脳梗塞負荷に伴う有意な変化を示さないだけでなく、２Ｍ４ＭＰ、および２Ｍ４ＥＰのいずれの投与でも有意な影響を受けなかった。以上の結果から、止瀉薬成分である２Ｍ４ＭＰなどのフェノール系化合物を事前に経口投与すると、その後の中大脳動脈結紮による脳梗塞巣の出現が、著明に軽減されることが明らかとなった。この軽減作用は、マーカータンパク質の発現変化から推察して、アストログリア細胞よりはむしろ神経細胞に選択的に出現するものと思われる。
したがって、２Ｍ４ＭＰなどのフェノール系化合物を含む食品や医薬品等は、各種虚血性脳疾患に伴う神経細胞変性の予防薬あるいは治療薬として有効であると考えられる。
【００２２】
＜剤型の例＞
下記に、各剤型による製剤例を示す。
・製剤例１（丸剤）
（処方１）
グアヤコール、２Ｍ４ＭＰまたは２Ｍ４ＥＰ ５ｍｇ
カンゾウ ２５ｍｇ
グリセリン １０ｍｇ
常水 ５０ｍｇ
上記処方の各成分を練合し、その丸剤塊を切丸機で分割し、製丸機で成丸し、１丸中に本発明の神経細胞の細胞死抑制剤５ｍｇを含有する丸剤を調製した。
・製剤例２（硬カプセル剤）
（処方２）
グアヤコール、２Ｍ４ＭＰまたは２Ｍ４ＥＰ １０ｍｇ
デンプン ２５０ｍｇ
グアヤコール、２Ｍ４ＭＰまたは２Ｍ４ＥＰとデンプンを混合して混合末とし、硬カプセルに充填して１カプセル中に本発明の神経細胞の細胞死抑制剤１０ｍｇを含有する硬カプセル剤を調製した。
・製剤例３（軟カプセル剤）
（処方３）
グアヤコール、２Ｍ４ＭＰまたは２Ｍ４ＥＰ １０ｍｇ
オリーブ油 ２００ｍｇ
グアヤコール、２Ｍ４ＭＰまたは２Ｍ４ＥＰとオリーブ油に溶解して溶液を得、ソフトカプセルに充填して、１カプセル中に本発明の神経細胞の細胞死抑制剤１０ｍｇを含有する軟カプセル剤を調製した。
・製剤例４（錠剤）
（処方４）
グアヤコール、２Ｍ４ＭＰまたは２Ｍ４ＥＰ ２０ｍｇ
乳糖 ２５０ｍｇ
メチルセルロース ３ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム ２ｍｇ
カルボキシメチルセルロース １０ｍｇ
上記処方のステアリン酸マグネシウム以外の各成分を混合し、これを水と混練して顆粒とし、この顆粒を乾燥後、ステアリン酸マグネシウムと混合して圧縮成型するか、あるいは上記処方の各成分を混合して直接圧縮成型し、１錠２８５ｍｇの錠剤を調製した。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】神経細胞の採取から播種までの手順を示した略示説明図である。
【図２】神経細胞を培養し、細胞死を誘起する手順を示した略示説明図である。
【図３】ＮＭＤＡにより誘起される細胞死に対する各フェノール系化合物の抑制効果を示す棒グラフ図である。
【図４】ＮＭＤＡにより誘起される細胞死に対する各フェノール系化合物の抑制効果を示す棒グラフ図である。
【図５】ＮＭＤＡにより誘起されるカルシウムイオン流入に対する各フェノール系化合物の抑制効果について、経時的なイオン濃度変化により示すグラフ図である。
【図６】図５の結果に対応する一連の蛍光画像の写真である。
【図７】in vivo における脳梗塞巣抑制効果試験の手順を示した略示説明図である。
【図８】フェノール系化合物の経口投与が動物の体重に変動を与えないことを示したグラフ図である。
【図９】ａは梗塞巣の面積を算出すべく、デジタルカメラを用いた図面代用写真であり、ｂはフェノール系化合物を経口投与することによる梗塞巣の回復度を示したグラフ図である。
【図１０】ウエスタンブロッティング法により判断したＭＡＰ２とＧＦＡＰの発現量を示したグラフ図である（尚、図中の縦軸の値（％）は、未処理の梗塞巣体積（ｃｏｎｔｒａｌａｔｅｒａｌ）に対する処理を施した梗塞巣体積（ｉｐｓｉｌａｔｅｒａｌ）の割合を示す）。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＮＭＤＡ（N-methy1-D-aspartate）受容体（ＮメチルＤアスパラギン酸レセプター）阻害剤に関する。また、脳疾患もしくは神経疾患の治療もしくは予防、または、脳機能もしくはその他の神経機能の改善のための製剤、または健康機能性食品（保健機能食品）に関する。ここで、健康機能性食品（保健機能食品）は、健康維持や健康増進の機能を有する飲食物であり、栄養改善法による特定保健用食品、及び、財団法人 日本健康・栄養食品協会の認定による健康補助食品を含む。
【背景技術】
【０００２】
興奮性神経伝達物質であるグルタミン酸に対応するグルタミン酸受容体には、イオンチャネル内蔵型と代謝調節型がある。一般的に、イオンチャネル内蔵型受容体には、ニコチン性アセチルコリン受容体、ＧＡＢＡ（γ−aminobutyric acid）Ａ受容体、グリシン受容体、ＮＭＤＡ受容体などがある。
グルタミン酸は哺乳類脳内での最も重要な興奮性神経伝達物質である。一方、特殊な環境下ではグルタミン酸には神経細胞死を誘発する毒性があって、種々の神経変性疾患の病因物質として深く関与していると考えられている。グルタミン酸作動性神経は脳全体に分布しており、脳の機能に幅広く関わっていると推察されているが、特に記憶の形成に重要な海馬における働きが明らかにされている。
ＮＭＤＡ受容体阻害剤ないし拮抗剤が有用である疾病としては、脳虚血、アルツハイマー病などの慢性神経変性疾患、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ハンチントン病、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）関連神経損傷、外傷性脳または脊髄損傷、疼痛（例えば、外傷後または術後）、および慢性的疼痛症状、例えば神経因性疼痛または癌関連疼痛などが挙げられている（特許文献１）。また、学習・記憶や動機づけなどの知能の向上、恐怖などに対する不安の解消、蓄尿機能や排出機能などの排尿機能改善、てんかん、精神分裂病やそううつ病などの気分障害、脳血管障害などの治療および症状改善が挙げられる他、海藻などに含まれるカイニン酸、ムラサキ貝に含まれるドモイック酸、イタチササゲに含まれるβ−Ｎ−オキシルアミノ−Ｌ−アラニンやシカスアーシナリスＬに含まれるβ−Ｎ−メチルアミノ−Ｌ−アラニンなどのグルタミン酸受容体に作用する神経毒などの解毒作用もあると考えられている（特許文献２）。
そのため、ＮＭＤＡ受容体阻害剤ないし拮抗剤として、各種アミン化合物など、種々の物質が検討されている（特許文献１〜４）。
【０００３】
【特許文献１】国際公開ＷＯ ２０００／００００１９７
【特許文献２】特開２００４−１８９６２６
【特許文献３】特表２００４−５１２３２４
【特許文献４】特表２００３−５０５５１２
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ＮＭＤＡ受容体阻害剤として上記特許文献１〜２に記載されたものは、ＮＭＤＡ受容体阻害作用が不充分であるか、または、日常的に服用するための安全性が充分に確かめられていない等のいずれかの問題があった。
本発明は、上記に鑑みなされたものであり、充分なＮＭＤＡ受容体阻害作用が得られるとともに、日常的な摂取に際しても安全性の危惧のないものを提供しようとする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明のＮＭＤＡ受容体阻害剤は、下記の一般式（Ｉ−１〜Ｉ−４）で示される化合物あるいはその塩を含有してなることを特徴とする。
【化１】
但し、上記一般式（Ｉ−１〜Ｉ−４）におけるＲ1はメチル基またはエチル基、Ｒ2は水素原子または炭素数１〜５の直鎖または側鎖のアルキル基であって、Ｒ1とＲ2は同一であっても異なっていてもよい。
【発明の効果】
【０００６】
充分なＮＭＤＡ受容体阻害作用が得られるとともに、日常的な摂取に際しても安全性の危惧がほとんどない。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
上記一般式（Ｉ(Ｉ−１〜Ｉ−４)）の化合物について、以下に具体例を挙げるが、この例示でいう「ブチル」は、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓ−ブチル、ｔ−ブチルを総称したものであり、また「プロピル」は、ｎ−プロピル、イソプロピルを総称したものである。すなわち、２−メトキシフェノール（グアヤコール）、２−メトキシ−３−メチルフェノール、２−メトキシ−３−エチルフェノール、２−メトキシ−３−プロピルフェノール、２−メトキシ−３−ブチルフェノール、２−メトキシ−４−メチルフェノール、２−メトキシ−４−エチルフェノール、２−メトキシ−４−プロピルフェノール、２−メトキシ−４−ブチルフェノール、２−メトキシ−５−メチルフェノール、２−メトキシ−５−エチルフェノール、２−メトキシ−５−プロピルフェノール、２−メトキシ−５−ブチルフェノール、２−エトキシフェノール、２−エトキシ−３−メチルフェノール、２−エトキシ−３−エチルフェノール、２−エトキシ−３−プロピルフェノール、２−エトキシ−３−ブチルフェノール、２−エトキシ−４−メチルフェノール、２−エトキシ−４−エチルフェノール、２−エトキシ−４−プロピルフェノール、２−エトキシ−４−ブチルフェノール、２−エトキシ−５−メチルフェノール、２−エトキシ−５−エチルフェノール、２−エトキシ−５−プロピルフェノール、２−エトキシ−５−ブチルフェノールなどが挙げられる。
【０００８】
上記一般式（Ｉ）の化合物の中でも、Ｒ2が炭素数１〜３であることが、ＮＭＤＡ受容体阻害作用に優れているという点で好ましく、メチル基あるいはエチル基であることがさらに好ましい。
また、Ｒ2は３または４の位置に結合していることが、ＮＭＤＡ受容体阻害作用に優れているという点で好ましく、４の位置に結合していることがさらに好ましく、中でも、神経細胞の死滅を防ぐ能力に優れているという点で、２−メトキシフェノール（グアヤコール）、２−メトキシ−４−メチルフェノール（以下、単に「２Ｍ４ＭＰ」ともいう）、２−メトキシ−４−エチルフェノール（以下、単に「２Ｍ４ＥＰ」ともいう）、２−エトキシ−４−メチルフェノール（以下、単に「２Ｅ４ＭＰ」ともいう）、２−エトキシ−４−エチルフェノール（以下、単に「２Ｅ４ＥＰ」ともいう）が好ましく、その中でもグアヤコール、２Ｍ４ＭＰ、及び２Ｍ４ＥＰが最も好ましい。なお、上記一般式（Ｉ）で示される化合物は１種類を単独で使用しても良いし、２種以上を併用することもできる。
これらグアヤコール、２Ｍ４ＭＰ、２Ｍ４ＥＰはいずれも、木クレオソートの構成成分である（Ogata N．，Baba T．Analysis of beechwood creosote by gas chromatography-mass spectrometry and high-performance liquid chromatography．Res Commun Chem Pathol Pharmacol 66,411-423(1989)，ブナ木クレオソートのガスクロマトグラフィー・質量分析法および高速液体クロマトグラフィー法による分析）。緒方規男（N. Ogata）他著ファーマコロジー（Pharmacology）、４６巻、（１９９３）、第１７３頁には、クレオソートが腸管運動抑制に基づく止瀉作用を有する旨記載されている。また、医薬品製造指針（日本公定書協会編）１９８８年版第２４０頁の胃腸薬製造承認基準において、Ｖ欄の止瀉薬の区分中１項の殺菌剤として収載されている。また、伊藤宏著「薬理学」（（株）蛍光堂、１９８３年１月５日改訂第６版発行）第４１６頁にも、木クレオソートは腸内防腐に用いるほか、吸入適応により去痰作用を示す旨記載され、日本薬局方でも、去痰、腸内異常醗酵、食中毒などに用いる旨記載されている。ザ・ユナイテッド・ステーツ・ディスペンサトリー（The United States Dispensatory）、２７ｔｈ ｅｄ．（１９７３）、第３５５頁にも、木クレオソートは、外用として殺菌剤、内用として去痰剤として使用される旨記載されている。
【０００９】
＜塩の形態＞
また、本発明のＮＭＤＡ受容体阻害剤は、塩基を用いた塩の形態とすることも可能である。用いる塩としては、薬学的に（薬剤学的に）許容し得る塩であれば特に限定するものではなく、例えば、ナトリウム、カルシウム、カリウム、マグネシウム、リチウムなどの金属塩、アミン類（モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン）との塩あるいはアンモニウム塩などが挙げられる。
【００１０】
＜使用量＞
本発明のＮＭＤＡ受容体阻害剤の投与量（使用量）については、対象となる動物の種類あるいは性別、年齢、症状の程度によって変わるので一概にはいえないが、ヒトにおける経口投与あるいは直腸内投与（坐剤）の場合は、およそのところ１日当たり成人体重１ｋｇに対して０．１〜１０ｍｇであり、０．５〜５ｍｇであることが好ましく、また注射剤としての投与の場合には、１日当たり成人体重１ｋｇに対して０．０５〜５ｍｇであり、０．２５〜２．５ｍｇであることが好ましい。これらの１日量を１回でまたは分２〜分４、あるいはそれ以上の回数に分けて投与することができる。
【００１１】
＜剤型・摂取形態＞
本発明のＮＭＤＡ受容体阻害剤は、医療用薬剤における一般的な形態で以て使用される。一般的な形態としては、例えば、錠剤、丸剤、散剤、カプセル剤（軟カプセル剤、硬カプセル剤）、顆粒剤、トローチ剤、チュアブル剤、内服液剤や、注射剤（血管内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与など）、あるいは坐剤などが挙げられる。錠剤、顆粒剤、散剤の形態に調製する際には、従来公知の担体を広く使用でき、例えば、乳糖、白糖、ブドウ糖、澱粉、結晶セルロース等の賦形剤、例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、ゼラチン、トラガント、アラビアゴム、アルギン酸ナトリウム等の結合剤、例えば、澱粉、カルボキシメチルセルロース、炭酸カルシウム等の崩壊剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ステアリン酸などの滑沢剤が使用できる。錠剤には、必要に応じて、通常の剤皮を施すこともでき、例えば、糖衣錠、フィルムコーティング錠等とすることができ、さらに二層錠、多層錠としてもよい。また、顆粒剤や散剤も通常の剤皮を施すことができる。
このような医薬品としての剤型のみならず、本発明のＮＭＤＡ受容体阻害剤は一般の飲食物として摂取することもできる。すなわち、菓子類（クッキー、ビスケット、ケーキ、饅頭、スナック菓子、ガム、キャンデーなど）や飲料水（栄養ドリンク、炭酸飲料水、乳酸飲料水、清涼飲料水など）、インスタント食品（即席麺、即席カレーやシチューなど）、練り食品（ハム、ソーセージ、かまぼこなど）、油脂加工品（バター、マーガリン、マヨネーズ、ドレッシングなど）、調味料（ソース、しょう油、塩、コショウなど）、乳製品（ヨーグルト、加工乳など）に含ませて本発明のＮＭＤＡ受容体阻害作用の摂取を図ることもできる。
【実施例】
【００１２】
＜培養ディッシュの準備＞
(1) 培養ディッシュ（ＮＵＮＣ社製マルチディッシュ６ｗｅｌｌ、Φ３５ｍｍ）の各穴（ｗｅｌｌ）に７５μｇ／ｍＬ ポリリジン（Poly-L-lysine）水溶液（各ｗｅｌｌ ２ｍＬずつ、以下同様）を加え、インキュべーター（ＳＡＮＹＯ社，ＭＣＯ−１７ＡＩＣ型：３７℃、５％ ＣＯ2／９５％ ａｉｒ）内で少なくとも２時間静置した。
(2) ポリリジンコーティング後、液を取り除き、洗浄液として特定のダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline without Ｃａ2+・Ｍｇ2+；３３ｍＭ glucose，１００Ｕ／ｍＬ ペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬ ストレプトマイシンを含む（ＰＢＳ ｓｐｅｃｉａｌ））を用いて、１回洗浄した。
(3) 洗浄液をよく取り除き、培養メディウムとして33mM グルコース（glucose）、2mM グルタミン（glutamine）、100U/mL ペニシリン（penicillin）、100μｇ/mL ストレプトマイシン（streptomycin）、5mM HEPES （2-[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl] ethane sulfonic acid）、0.11% 重炭酸ナトリウム（sodium bicarbonate）、および、10％のウシ胎児血清（FBS）を添加したＤＭＥＭ／Ｆ−１２等量混合液（Dulbecco's Modified Eagle Medium：Nutrient Mixture Ｆ−１２（１：１））を加え、細胞の培養に備えた。
【００１３】
＜神経細胞の採取から播種まで（図１）＞
（１）妊娠１８日目のWistar系雌性ラット（三協ラボ）から子宮を全摘出し、クリーンべンチ内に移動した。子宮から胎児を取り出し（平均１２匹／雌親ラット）、胎児の頭部を背側から頚部で切断し、全脳を摘出した。摘出した全脳から、実体顕微鏡下（対物×１０倍）海馬を切り出した。胎児から切り取った各組織はあらかじめ培養メディウムで満たしたペトリ皿に回収し、細胞分散までインキュべーター内に静置した。
（２） 取り出した海馬を、フタ付き遠心管中のベルセン（Versene）液に１２分間、室温にて浸漬した。このようにして、細胞間の結合をゆるめた。なお、ベルセン液は、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）中にエチレンジアミン４酢酸（ＥＤＴＡ）を０．２重量％含むものであり、細胞間の接着に必要なカルシウムをキレートすることで、細胞を分散しやすくする。
（３）先端を加熱して細くしたパスツールピペットを用いて、ベルセン液を除去し、上記の培養メディウムに置き換え、また、当該培養メディウム中に海馬細胞を分散した。
（４）分散した細胞液中に、分散不可能な小片が見えないかどうか目視で確かめたのち、フタをしてから、１，０００×ｇ（重力加速度の１，０００倍の遠心力）にて４分間遠心分離操作を行った。
（５）上澄みを捨て、遠心管の底に得られた沈査を、適量の上記培養メディウムで再懸濁した。
（６）Typan blue 染色によって生細胞の割合を計算し、上記のように準備した培養ディッシュに、３．１３×１０5cells／ｃｍ2の細胞密度になるように細胞を播いた。
【００１４】
＜神経細胞の培養（図２）＞
(1) 上記の培養ディッシュをよく攪拌した後、インキュべーター内に静置し、５％炭酸ガス含有条件下、３７℃に保った。
（２）細胞を播いた時点を０日（DIV; day in vitro）とし、培養２〜３日（播種時から４８〜７２ｈｒの期間）には、培養液に１０μＭとなるようにシトシンアラビノシド（Ara-C；cytosine arabinoside）を添加し、この条件で２４時間処置した。このシトシンアラビノシドによる処理により、グリア細胞の増殖を抑制する。
(３）３日経過以降は、上記培養メディウムからウシ胎児血清（ＦＢＳ）を省き、ホルモンミックスを添加した培養液にて培養を行った。ホルモンミックス：０．５μｇ／ｍｌインスリン、５０μｇ／ｍｌトランスフェリン、２０μｇ／ｍｌプロゲステロン、１ｐＭ β−エストラジオール、３μＭトリヨードチロニン、１００μＭプトレッシン、８ｎｇ／ｍｌセレン２ナトリウム。
すなわち、Dulbecco's Modified Eagle Medium（DMEM）に以下のものを添加した液を用いた。33mM glucose、100U/mL penicillin、100μｇ/mL streptomycin、2mM glutamine、1.125mg/mL sodium bicarbonate、5mM HEPESおよびHormone mix (5μｇ/mL insulin、0.5mg/mL apo-transferrin、0.2μＭ progesterone、0.01nM β-estradiol、0.03mM 3,3',5-triiodo-L-thyronine、1mM putrescineおよび0.08mg/mL sodium selenite．なお、培養６日経過後に、培養液を、同一組成の新しいものに置き換えた。
(3) 培養９日目を経過した上記の細胞培地でもって、ＮＭＤＡによる細胞死とその抑制の評価、及び、ＮＭＤＡによるカルシウムイオン流入の抑制の評価に用いた。
【００１５】
＜ＮＭＤＡによる神経細胞死とその抑制についての評価＞
上記のように９日間培養した海馬由来神経細胞の培地をレコーディングメディウム（−Ｍｇ2+）に置き換え、ＮＭＤＡを１００μＭとなるように各ウェルに添加した。また、同時に、各ウェルに、２−メトキシフェノール（グアヤコール）、２−メトキシ−４−メチルフェノール（２Ｍ４ＭＰ）、及び２−メトキシ−４−エチルフェノール（２Ｍ４ＥＰ）のいずれかを、１００μＭ、及び１ｍＭ（１０００μＭ）のいずれかの濃度となるように添加した。ここで、各フェノール化合物には、東京化成工業（株）の一級試薬を用いた。そして、添加後６時間の経過後に、下記のＭＴＴアッセイにより細胞生存率を評価した（図３〜４）。なお、各条件でのｎ数（同一条件のウェルの数）は４〜６とした。
一方、比較のため、木クレオソート系のフェノール化合物、及びＮＭＤＡのいずれも添加しなかったものを１００％とする細胞生存率を求めておいた（図３〜４左端）。
【００１６】
＜細胞生存率の評価（ＭＴＴアッセイ）＞
上記のようにして神経細胞死を誘起させた後、培養液を、０．５ｍｇ／ｍｌの3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromaide（ＭＴＴ）を含むリン酸緩衝液（ＰＢＳ）に置換し、３７℃の上記炭酸ガスインキュベーターにて１時間、呈色反応を行わせた。続いて、０．０４Ｎ ＨＣｌを含むイソプロパノール(isopropanol)を加えて、細胞を溶解させた。この後、マイクロプレートリーダーを用いて５５０〜５７０ｎｍの吸光度を測定することにより、ＭＴＴの還元反応の活性を求めた。
【００１７】
＜ＮＭＤＡによるカルシウムイオン流入の抑制の評価＞
上記のような培養９日目を経過した細胞培地を、下記のような、細胞中のカルシウムイオン濃度測定用媒体に置き換えて、５分後に、上記３種のフェノール化合物（グアヤコール、２Ｍ４ＭＰおよび２Ｍ４ＥＰ）をそれぞれ１０００μＭの濃度で添加した。次いでこの５分後に１００μＭとなるようにＮＭＤＡを添加した。そして、下記のような方法で、細胞中へのカルシウムイオン流入の程度を調べた。方法の詳細は下記のとおりである。
【００１８】
＜力ルシウムイメージング＞
（１）レコーディングメディウム（＋Ｍｇ2+）（１２９ｍＭ ＮａＣｌ、４ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ2、２ｍＭ ＣａＣｌ2、４．２ｍＭ glucose、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４）で１回洗浄後、細胞膜透過性蛍光Ｃａ2+指示薬であるfluo−３ＡＭ （３μＭ）および３０ｎＭ Pluronic Ｆ−１２７を含むレコーディングメディウム（＋Ｍｇ2+）１ｍｌ／ｗｅｌｌで３７℃、５０分間インキュべートした。細胞をレコーディングメディウム（＋Ｍｇ2+）で２回洗浄したのち、レコーディングメディウム（＋Ｍｇ2+）２ｍｌ／ｗｅｌｌ中で、少なくとも１時間測定場所で静置して、Ｃａ２＋測定実験に備えた。
（２）刺激５分前に、上記レコーディングメディウム（＋Ｍｇ2+）を、Ｍｇ2+を添加していないレコーディングメディウム（−Ｍｇ2+）に置き換えた。蛍光色素を負荷した細胞を、アルゴンレーザーを用いて４８８ｎｍの光で励起させた。共焦点レーザー顕微鏡による観察は、細胞の染色終了後、１−５時間以内に行った。
（３）レコーディングメディウム（−Ｍｇ2+）中に置き換えられた神経細胞をただちに顕微鏡下へと移し、メディウム交換１分後および５分後の蛍光画像を取得した後、各フェノール系化合物を最終濃度１０００μＭとなるように添加した。さらに５分の後、ＮＭＤＡを最終濃度１００μＭとなるように添加した。続いて、最終濃度１０μＭとなるように力ルシウムイオノフォアであるＡ２３１８７を添加し、その５分後、蛍光画像を得た。試薬を添加した後の蛍光画像は１分おきに取得した。また、本実験で用いた各試薬は、使用する直前にレコーディングメディウム（−Ｍｇ2+）を用いて調製した。
（４）得られた各蛍光画像はScion Image 4.03を用いて数値化した。値は、メディウム交換後５分目の値をバックグラウンドとみなし０とし、Ａ２３１８７を添加した後５分後の蛍光強度を１００としてグラフ化した。
【００１９】
＜ＮＭＤＡによる細胞死に対するフェノール系化合物の抑制効果＞
図３〜４の棒グラフに、各フェノール系化合物による細胞死抑制効果について示す。図３から知られるように、用いた３種のフェノール系化合物のいずれによっても、１ｍＭ（１０００μＭ）の濃度条件にて、ＮＭＤＡによる細胞死に対する顕著な抑制効果が見られた。図３中に示すように、９９％以上の確率で有意な効果が得られた。また、細胞死抑制効果は、２−メトキシフェノール（グアヤコール）、２−メトキシ−４−メチルフェノール（２Ｍ４ＭＰ）、及び、２−メトキシ−４−エチルフェノール（２Ｍ４ＥＰ）の間で、有意な差は見られなかった。
図４の棒グラフには、図３中に示した結果とともに、各条件ごとに採用したコントロールとして、３種のフェノール系化合物単独の効果についても示している。
【００２０】
＜力ルシウム流入に対するフェノール系化合物の抑制効果＞
図５は、上記の力ルシウムイメージングにより得られたグラフである。図５から知られるように、用いた３種のフェノール系化合物のいずれによっても、１ｍＭ（１０００μＭ）の濃度条件にて、ＮＭＤＡによるカルシウムイオン流入に対し、抑制効果が見られた。特には、２−メトキシ−４−エチルフェノール（２Ｍ４ＥＰ）を用いた場合に顕著な効果が見られた。２−メトキシ−４−エチルフェノールを用いた場合、ＮＭＤＡを添加する以前の段階で、カルシウムイオン流入量に与える影響も最も小さかった。
図６は、図５の１５分後の状態に対応する蛍光画像である。白黒の状態で示すため、カルシウム濃度の大きいところが白く見えており、カルシウムイオン流入に対する抑制効果が、２−メトキシフェノール（グアヤコール）、２−メトキシ−４−メチルフェノール（２Ｍ４ＭＰ）、及び、２−メトキシ−４−エチルフェノール（２Ｍ４ＥＰ）の順で、大きくなっていることが、図６の蛍光画像からも知ることができる。
【００２１】
＜in vivo における脳梗塞巣抑制効果試験＞
６週齢のWistar系雄性ラット(体重１５０−２００ｇ、三協ラボサービス)に、１日１回carboxymethyl cellulose（ＣＭＣ）およびＣＭＣに懸濁したフェノール系化合物（２Ｍ４ＭＰ，２Ｍ４ＥＰ）を170mg/kgの用量で経口投与した。７日目の投与後に、中大脳動脈結紮術（ＭＣＡＯ）を行ってから、２時間経過後に血流を再開通した（図７）。血流変動はレーザードップラー血流計を用いて測定した。これらフェノール系化合物の経口投与は、いずれの場合でも動物の体重には著明な変動を与えないことが確認された（図８）。血流再開通２４時間経過後に動物から全脳を摘出して、phosphate buffered saline （ＰＢＳ）で洗浄後、ブレインスライサーを用いてブレグマを中心として２ｍｍごとに新鮮脳冠状切片を作成した。この新鮮脳冠状切片を0.8% 2,3,5-triphenyl-tetrazolium chloride（ＴＴＣ）により染色したのち、切片を実体顕微鏡で検鏡し、デジタルカメラを用いて写真撮影を行ってから梗塞巣の面積を算出した。その結果、ＣＭＣを連続投与した対照群動物の脳では、６０％程度の梗塞巣が観察されたが、２Ｍ４ＭＰを１日１回投与した動物群では梗塞巣が２０％以下にまで有意に回復することが判明した（図９）。
次いで、神経細胞のマーカータンパク質であるmicrotubule-associated protein-2（ＭＡＰ２）と、アストログリア細胞のマーカータンパク質であるglial fibrillary acidic protein（ＧＦＡＰ）の発現をウエスタンブロッティング法により検討したところ、ＭＣＡＯ負荷に伴い神経細胞マーカーのＭＡＰ２発現量は反対側の約２０％にまで低下したのに対して、２Ｍ４ＭＰを一週間連続投与した動物では、反対側の８０％程度にまでＭＡＰ２発現量が回復し、２Ｍ４ＥＰでは４０％程度まで回復した（図１０）。アストログリアマーカーのＧＦＡＰ発現量は脳梗塞負荷に伴う有意な変化を示さないだけでなく、２Ｍ４ＭＰ、および２Ｍ４ＥＰのいずれの投与でも有意な影響を受けなかった。以上の結果から、止瀉薬成分である２Ｍ４ＭＰなどのフェノール系化合物を事前に経口投与すると、その後の中大脳動脈結紮による脳梗塞巣の出現が、著明に軽減されることが明らかとなった。この軽減作用は、マーカータンパク質の発現変化から推察して、アストログリア細胞よりはむしろ神経細胞に選択的に出現するものと思われる。
したがって、２Ｍ４ＭＰなどのフェノール系化合物を含む食品や医薬品等は、各種虚血性脳疾患に伴う神経細胞変性の予防薬あるいは治療薬として有効であると考えられる。
【００２２】
＜剤型の例＞
下記に、各剤型による製剤例を示す。
・製剤例１（丸剤）
（処方１）
グアヤコール、２Ｍ４ＭＰまたは２Ｍ４ＥＰ ５ｍｇ
カンゾウ ２５ｍｇ
グリセリン １０ｍｇ
常水 ５０ｍｇ
上記処方の各成分を練合し、その丸剤塊を切丸機で分割し、製丸機で成丸し、１丸中に本発明の神経細胞の細胞死抑制剤５ｍｇを含有する丸剤を調製した。
・製剤例２（硬カプセル剤）
（処方２）
グアヤコール、２Ｍ４ＭＰまたは２Ｍ４ＥＰ １０ｍｇ
デンプン ２５０ｍｇ
グアヤコール、２Ｍ４ＭＰまたは２Ｍ４ＥＰとデンプンを混合して混合末とし、硬カプセルに充填して１カプセル中に本発明の神経細胞の細胞死抑制剤１０ｍｇを含有する硬カプセル剤を調製した。
・製剤例３（軟カプセル剤）
（処方３）
グアヤコール、２Ｍ４ＭＰまたは２Ｍ４ＥＰ １０ｍｇ
オリーブ油 ２００ｍｇ
グアヤコール、２Ｍ４ＭＰまたは２Ｍ４ＥＰとオリーブ油に溶解して溶液を得、ソフトカプセルに充填して、１カプセル中に本発明の神経細胞の細胞死抑制剤１０ｍｇを含有する軟カプセル剤を調製した。
・製剤例４（錠剤）
（処方４）
グアヤコール、２Ｍ４ＭＰまたは２Ｍ４ＥＰ ２０ｍｇ
乳糖 ２５０ｍｇ
メチルセルロース ３ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム ２ｍｇ
カルボキシメチルセルロース １０ｍｇ
上記処方のステアリン酸マグネシウム以外の各成分を混合し、これを水と混練して顆粒とし、この顆粒を乾燥後、ステアリン酸マグネシウムと混合して圧縮成型するか、あるいは上記処方の各成分を混合して直接圧縮成型し、１錠２８５ｍｇの錠剤を調製した。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】神経細胞の採取から播種までの手順を示した略示説明図である。
【図２】神経細胞を培養し、細胞死を誘起する手順を示した略示説明図である。
【図３】ＮＭＤＡにより誘起される細胞死に対する各フェノール系化合物の抑制効果を示す棒グラフ図である。
【図４】ＮＭＤＡにより誘起される細胞死に対する各フェノール系化合物の抑制効果を示す棒グラフ図である。
【図５】ＮＭＤＡにより誘起されるカルシウムイオン流入に対する各フェノール系化合物の抑制効果について、経時的なイオン濃度変化により示すグラフ図である。
【図６】図５の結果に対応する一連の蛍光画像の写真である。
【図７】in vivo における脳梗塞巣抑制効果試験の手順を示した略示説明図である。
【図８】フェノール系化合物の経口投与が動物の体重に変動を与えないことを示したグラフ図である。
【図９】ａは梗塞巣の面積を算出すべく、デジタルカメラを用いた図面代用写真であり、ｂはフェノール系化合物を経口投与することによる梗塞巣の回復度を示したグラフ図である。
【図１０】ウエスタンブロッティング法により判断したＭＡＰ２とＧＦＡＰの発現量を示したグラフ図である（尚、図中の縦軸の値（％）は、未処理の梗塞巣体積（ｃｏｎｔｒａｌａｔｅｒａｌ）に対する処理を施した梗塞巣体積（ｉｐｓｉｌａｔｅｒａｌ）の割合を示す）。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の一般式（Ｉ）で示される化合物あるいはその塩を含有してなることを特徴とするＮＭＤＡ受容体阻害剤。
【化１】
但し、上記一般式（Ｉ）におけるＲ1はメチル基またはエチル基、Ｒ2は水素原子または炭素数１〜５の直鎖または側鎖のアルキル基であって、Ｒ1とＲ2は同一であっても異なっていてもよい。
【請求項２】
前記化合物が、２−メトキシフェノール、２−メトキシ−４−メチルフェノール、及び２−メトキシ−４−エチルフェノールからなる群より選ばれた少なくとも１種であることを特徴とする請求項１に記載のＮＭＤＡ受容体阻害剤。
【請求項３】
脳疾患もしくは神経疾患の治療もしくは予防または疼痛の緩和ための製剤であることを特徴とする請求項１または２に記載のＮＭＤＡ受容体阻害剤。
【請求項４】
請求項１または２に記載のＮＭＤＡ受容体阻害剤を含有することを特徴とする健康機能性食品。
【請求項１】
下記の一般式（Ｉ）で示される化合物あるいはその塩を含有してなることを特徴とするＮＭＤＡ受容体阻害剤。
【化１】
但し、上記一般式（Ｉ）におけるＲ1はメチル基またはエチル基、Ｒ2は水素原子または炭素数１〜５の直鎖または側鎖のアルキル基であって、Ｒ1とＲ2は同一であっても異なっていてもよい。
【請求項２】
前記化合物が、２−メトキシフェノール、２−メトキシ−４−メチルフェノール、及び２−メトキシ−４−エチルフェノールからなる群より選ばれた少なくとも１種であることを特徴とする請求項１に記載のＮＭＤＡ受容体阻害剤。
【請求項３】
脳疾患もしくは神経疾患の治療もしくは予防または疼痛の緩和ための製剤であることを特徴とする請求項１または２に記載のＮＭＤＡ受容体阻害剤。
【請求項４】
請求項１または２に記載のＮＭＤＡ受容体阻害剤を含有することを特徴とする健康機能性食品。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【公開番号】特開２００８−１４３８８４（Ｐ２００８−１４３８８４Ａ）
【公開日】平成２０年６月２６日（２００８．６．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−１３８４５３（Ｐ２００７−１３８４５３）
【出願日】平成１９年５月２４日（２００７．５．２４）
【出願人】（５０４１６０７８１）国立大学法人金沢大学 (282)
【出願人】（３９１００３３９２）大幸薬品株式会社 (20)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年６月２６日（２００８．６．２６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年５月２４日（２００７．５．２４）
【出願人】（５０４１６０７８１）国立大学法人金沢大学 (282)
【出願人】（３９１００３３９２）大幸薬品株式会社 (20)
【Ｆターム（参考）】
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