ＮＯＤ２における変異は、クローン病を有する患者における線維性狭窄疾患に関連する
【課題】ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５遺伝子に連鎖された変異およびクローン病の臨床サブタイプを診断するための遺伝学的方法を提供する。
【解決手段】線維性狭窄疾患により特徴付けられたクローン病の臨床サブタイプを診断するか、またはそれに対する感受性を予測する方法であって、個体における、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５座に連鎖された線維性狭窄素因対立遺伝子の存在または不在を決定する工程によるものであり、ここで、線維性狭窄素因対立遺伝子の存在が、線維性狭窄疾患により特徴付けられたクローン病の臨床サブタイプの診断またはそれに対する感受性の予測となる、方法。当該クローン病の臨床サブタイプは、例えば、小腸罹患とは独立した線維性狭窄疾患である。
【解決手段】線維性狭窄疾患により特徴付けられたクローン病の臨床サブタイプを診断するか、またはそれに対する感受性を予測する方法であって、個体における、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５座に連鎖された線維性狭窄素因対立遺伝子の存在または不在を決定する工程によるものであり、ここで、線維性狭窄素因対立遺伝子の存在が、線維性狭窄疾患により特徴付けられたクローン病の臨床サブタイプの診断またはそれに対する感受性の予測となる、方法。当該クローン病の臨床サブタイプは、例えば、小腸罹患とは独立した線維性狭窄疾患である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（承認）
本研究は、グラントＤＫ４６７６３およびグラントＤＫ５４９６７（ＮＩＤＤＫにより与えられる）によって支持される。米国政府は、本発明に対し特定の権利を有する。
【０００２】
（発明の背景）
（発明の分野）
本発明は、一般に、遺伝学および自己免疫疾患の分野に関し、より具体的には、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５遺伝子に連鎖された変異およびクローン病の臨床サブタイプを診断するための遺伝学的方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
（背景情報）
炎症性腸疾患（ＩＢＤ）は、以下の未知の病因の２つの胃腸障害を記載するために使用される、集合名である：クローン病（ＣＤ）および潰瘍性大腸炎（ＵＣ）。ＩＢＤ（これは、世界中で生じ、そして２００万人もの多くの人々が罹患していると報告されている）の経過および予後は、広範に変動する。ＩＢＤの発症は、主に、青年期にあり、下痢、腹痛および発熱という３つの最も共通の代表的症状を伴う。下痢は、穏やかから重篤までの範囲にわたり得、そして貧血および体重の減少が、ＩＢＤのさらなる共通の徴候である。ＩＢＤを有する全ての患者の１０％〜１５％は、１０年の期間にわたって診療を必要とする。さらに、ＩＢＤを有する患者は、腸の癌の発症の危険性が増加する。心理学的問題（不安および抑うつを含む）の発症の増加の報告は、おそらく、驚くべき症状ではなく、これは、しばしば、最盛期の人々を襲う消耗性の疾患である。
【０００４】
クローン病は、胃腸管を罹患させ、そして類似の症状を生じる多数の異質性の疾患サブタイプを表す分類である。環境的要因および遺伝的要因の両方が、このような疾患サブタイプの病因に寄与しているようである。クローン病を有する患者は、例えば、以前に記載された診断基準に従って、線維性狭窄疾患（ｆｉｂｒｏｓｔｅｎｏｓｉｎｇ ｄｉｓｅａｓｅ）、内部穿孔疾患（ｉｎｔｅｒｎａｌ−ｐｅｒｆｏｒａｔｉｎｇ ｄｉｓｅａｓｅ）、肛門周囲瘻孔形成疾患（ｐｅｒｉａｎａｌ ｆｉｓｔｕｌｉｚｉｎｇ ｄｉｓｅａｓｅ）、または潰瘍性大腸炎様疾患の存在に基づくサブタイプに分類され得る。線維性狭窄疾患サブタイプは、検査による存続腸閉塞または腸閉塞のための腸管切除によって特徴付けられる。クローン病および疾患サブタイプを診断のために、徹底的でかつしばしば長引く臨床検査が必要とされ、このことにより最適な処置が遅れることになることがあり、またこのような検査は、侵襲性の手順（例えば、内視鏡検査）を伴うこととなる。
【０００５】
クローン病の臨床サブタイプと密に関連した遺伝マーカーの同定は、新規な遺伝子検査の基盤を提供し、そして疾患サブタイプを決定するのに代表的に必要とされる検査室評価、放射線医学評価、および内視鏡評価の一群に対する必要性を排除するか、または減少させる。クローン病の臨床サブタイプを診断する方法の利用性は、クローン病の治療管理の助けとなる大きな臨床上の進歩になり、さらに特定の疾患サブタイプに特異的である処置様式の設計のための土台を敷く。このような方法は、非応答性の（ｕｎｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ）疾患サブタイプの処置に関連する費用を減少させ、そして有効でない治療を不必要に受けることの失望を排除する。特に、クローン病の線維性狭窄サブタイプについての信頼性のある遺伝子検査は、この疾患サブタイプの早期診断のための非侵襲的方法として高く評価され、また、無症状個体におけるクローン病の線維性狭窄サブタイプに対する感受性を予測するために有用であり、これにより予防的治療が可能になる。本発明は、この必要性を満たし、また関連した利点を提供する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（発明の要旨）
本発明は、線維性狭窄疾患により特徴付けられたクローン病の臨床サブタイプを診断するか、またはそれに対する感受性を予測する方法であって、当該方法は、個体における、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５座に連鎖された線維性狭窄素因対立遺伝子の存在または不在を決定する工程によるものであり、ここで、線維性狭窄素因対立遺伝子の存在が、線維性狭窄疾患により特徴付けられたクローン病の臨床サブタイプの診断またはそれに対する感受性の予測となる、方法を提供する。本発明の方法において、当該クローン病の臨床サブタイプは、例えば、小腸罹患(ｓｍａｌｌ ｂｏｗｅｌ ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ）とは独立
した線維性狭窄疾患によって特徴付けられ得る。
本発明はまた、個体における治療を最適化する方法であって、当該方法は、当該個体における、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５座に連鎖された線維性狭窄素因対立遺伝子の存在または不在を決定する工程、線維性狭窄素因対立遺伝子が存在する個体を、クローン病の線維性狭窄サブタイプを有するとして診断する工程、およびこの診断に基づいて、クローン病の線維性狭窄サブタイプを有する個体を処置する工程によるものである、方法を提供する。
本発明の好ましい実施形態では、例えば以下の方法などが提供される：
（項目１）
線維性狭窄疾患により特徴付けられたクローン病の臨床サブタイプを診断するか、またはそれに対する感受性を予測する方法であって、該方法は、
個体における、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５座に連鎖された線維性狭窄素因対立遺伝子の存在または不在を決定する工程
を包含し、
ここで、該線維性狭窄素因対立遺伝子の存在が、線維性狭窄疾患により特徴付けられたクローン病の該臨床サブタイプの診断またはそれに対する感受性の予測となる、
方法。
（項目２）
前記クローン病の臨床サブタイプが、小腸罹患とは独立した線維性狭窄疾患によって特徴付けられる、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記線維性狭窄素因対立遺伝子が、前記ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５座内に位置する、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記線維性狭窄素因対立遺伝子によってコードされたＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５ポリペプチドによるＮＦ−κＢ活性化が、野生型ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５ポリペプチドによるＮＦ−κＢ活性化に比較して減少される、項目３に記載の方法。
（項目５）
前記線維性狭窄素因対立遺伝子が、前記ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５座のコード領域中に位置する、項目３に記載の方法。
（項目６）
前記線維性狭窄素因対立遺伝子が、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５の残基７４４〜１０２０をコードする領域中に位置する、項目５に記載の方法。
（項目７）
前記線維性狭窄素因対立遺伝子が、ＳＮＰ８、ＳＮＰ１２、およびＳＮＰ１３から選択されるＳＮＰでの「２」対立遺伝子である、項目５に記載の方法。
（項目８）
前記線維性狭窄素因対立遺伝子が、ＳＮＰ１３での「２」対立遺伝子である、項目７に記載の方法。
（項目９）
前記線維性狭窄素因対立遺伝子が、前記ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５座の非コード領域中に位置する、項目３に記載の方法。
（項目１０）
前記線維性狭窄素因対立遺伝子が、ＪＷ１、ＪＷ１５、およびＪＷ１６改変型対立遺伝子から選択される、項目９に記載の方法。
（項目１１）
前記線維性狭窄素因対立遺伝子が、前記ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５座のプロモーター領域中に位置する、項目９に記載の方法。
（項目１２）
前記線維性狭窄素因対立遺伝子が、ＪＷ１７およびＪＷ１８改変型対立遺伝子から選択される対立遺伝子である、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
項目１に記載の方法であって、該方法が、
前記個体における、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５座に連鎖された少なくとも２つの線維性狭窄素因対立遺伝子の存在または不在を決定する工程
を包含し、
ここで、該線維性狭窄素因対立遺伝子の１つ以上の存在が、線維性狭窄疾患により特徴付けられたクローン病の臨床サブタイプの診断またはこれに対する感受性の予測となる、方法。
（項目１４）
前記少なくとも２つの線維性狭窄素因対立遺伝子が、ＳＮＰ８、ＳＮＰ１２、およびＳＮＰ１３から選択されるＳＮＰでの「２」対立遺伝子である、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
項目１４に記載の方法であって、該方法が、前記個体における
（ｉ）ＳＮＰ８での「２」対立遺伝子、
（ｉｉ）ＳＮＰ１２での「２」対立遺伝子、および
（ｉｉｉ）ＳＮＰ１３での「２」対立遺伝子
の存在または不在を決定する工程
を包含し、
ここで、該ＳＮＰ８、ＳＮＰ１２、およびＳＮＰ１３での「２」対立遺伝子の１つ以上の存在が、線維性狭窄疾患により特徴付けられたクローン病の臨床サブタイプの診断またはこれに対する感受性の予測となる、
方法。
（項目１６）
前記線維性狭窄素因対立遺伝子が、少なくとも２のオッズ比および１より大きな下位９５％信頼限界で、前記線維性狭窄疾患により特徴付けられたクローン病の臨床サブタイプに関連している、項目１に記載の方法。
（項目１７）
項目１に記載の方法であって、前記個体における前記線維性狭窄素因対立遺伝子の存在または不在を示す報告を作成する工程をさらに包含する、方法。
（項目１８）
項目１に記載の方法であって、前記個体における、前記線維性狭窄疾患により特徴付けられたクローン病の臨床サブタイプの存在または不在を示す報告を作成する工程をさらに包含する、方法。
（項目１９）
前記線維性狭窄素因対立遺伝子の存在または不在を決定する工程が、前記個体からの核酸の酵素的増幅を包含する、項目１に記載の方法。
（項目２０）
前記増幅がポリメラーゼ連鎖反応増幅である、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
前記ポリメラーゼ連鎖反応増幅が、１つ以上の蛍光標識プローブを用いて実施される、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
前記ポリメラーゼ連鎖反応増幅が、ＤＮＡ浅溝結合剤を含む１つ以上のプローブを用いて実施される、項目２０に記載の方法。
（項目２３）
個体における治療を最適化する方法であって、該方法が、
（ａ）該個体における、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５座に連鎖された線維性狭窄素因対立遺伝子の存在または不在を決定する工程、
（ｂ）前記線維性狭窄素因対立遺伝子が存在する個体を、クローン病の線維性狭窄サブタイプを有するとして診断する工程、および
（ｃ）該診断に基づいて、クローン病の線維性狭窄サブタイプを有する該個体を処置する工程
を包含する、方法。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】図１は、ＳＮＰ８、ＳＮＰ１２、ＳＮＰ１３、およびＪＷ１ならびに他のマーカーの位置と共に、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５座のイントロンおよびエキソンの構造を示す。
【図２】図２は、コホート１（「ＣＤ１」）、コホート２（「ＣＤ２」）またはコホート１およびコホート２の組み合わせ（「組み合わせＣＤ」）における、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５の３つの稀な改変型対立遺伝子（ＳＮＰ８、ＳＮＰ１２、またはＳＮＰ１３での「２」対立遺伝子）の少なくとも１つを有するＮＯＤ２改変型キャリアの頻度を示す。縞の棒線は、線維性狭窄疾患を有するクローン病患者を示し、塗りつぶしの棒線は、疾患の線維性狭窄サブタイプを有しなかったクローン病患者を示す。
【図３】図３は、ＳＮＰ８、ＳＮＰ１２、またはＳＮＰ１３でのＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５の稀な改変型対立遺伝子の数に対する、患者における線維性狭窄合併症の頻度を示す。ＳＮＰ８、ＳＮＰ１２、およびＳＮＰ１３での遺伝子型判定に基づいて、患者を、０、１つ、または２つの稀な改変型対立遺伝子を有するとして記載した（ｘ軸、変異型ＮＯＤ２対立遺伝子の数）。左のｙ軸は、塗りつぶされた丸として、線維性狭窄合併症の頻度を示す。右のｙ軸は、塗りつぶされた菱形として、オッズ比を示し、括弧内に９５％信頼区間を示した。０の対立遺伝子と比較して、＊は、ｐ値＝０．００８であることを示し、そして＊＊は、ｐ値が０．００４であることを示す。
【図４】図４は、穿孔疾患と比較した、線維性狭窄疾患を有する患者におけるＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５改変型対立遺伝子頻度の比較を示す。患者を、線維性狭窄の形跡のない穿孔合併症を有する患者（「Ｐｅｒｆのみ」）と比較して、穿孔合併症ありで線維性狭窄がある場合（「Ｆｉｂ＋ｐｅｒｆ」）または穿孔合併症なしで線維性狭窄がある場合（「Ｆｉｂのみ」）によって分別した。
【図５】図５は、ＳＮＰ８の周囲のＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５のヌクレオチド配列を示す。上部の鎖を配列番号１と示し、下部の鎖を配列番号２と示す。ＰＣＲ増幅のためのプライマーとして使用され得るヌクレオチド配列が示される。さらに、この図において、囲みおよび小文字によって、対立遺伝子識別アッセイにおけるプローブとして使用され得るヌクレオチド配列の位置が示される。下線を付したヌクレオチドは、多型部位の位置を示す。
【図６】図６は、ＳＮＰ１２の周囲のＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５のヌクレオチド配列を示す。上部の鎖を配列番号３と示し、下部の鎖を配列番号４と示す。ＰＣＲ増幅のためのプライマーとして使用され得るヌクレオチド配列が示される。さらに、この図において、囲みおよび小文字によって、対立遺伝子識別アッセイにおけるプローブとして使用され得るヌクレオチド配列の位置が示される。下線を付したヌクレオチドは、多型部位の位置を示す。
【図７】図７は、ＳＮＰ１３の周囲のＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５のヌクレオチド配列を示す。上部の鎖を配列番号５と示し、下部の鎖を配列番号６と示す。ＰＣＲ増幅のためのプライマーとして使用され得るヌクレオチド配列が示される。さらに、この図において、囲みおよび小文字によって、対立遺伝子識別アッセイにおけるプローブとして使用され得るヌクレオチド配列の位置が示される。下線を付したヌクレオチドは、多型部位の位置を示す。
【図８】図８は、ＳＮＰ５の周囲のＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５のヌクレオチド配列を示す。上部の鎖を配列番号７と示し、下部の鎖を配列番号８と示す。ＰＣＲ増幅のためのプライマーとして使用され得るヌクレオチド配列が示される。さらに、この図において、囲みおよび小文字によって、対立遺伝子識別アッセイにおけるプローブとして使用され得るヌクレオチド配列の位置が示される。下線を付したヌクレオチドは、多型部位の位置を示す。
【図９】図９は、ＪＷ１改変型配列の周囲のＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５のヌクレオチド配列を示す。上部の鎖を配列番号９と示し、下部の鎖を配列番号１０と示す。ＰＣＲ増幅のためのプライマーとして使用され得るヌクレオチド配列が示される。さらに、この図において、囲みおよび小文字によって、対立遺伝子識別アッセイにおけるプローブとして使用され得るヌクレオチド配列の位置が示される。下線を付したヌクレオチドは、多型部位の位置を示す。
【図１０−１】図１０は、野生型ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５配列（配列番号１１）に比較した１２の個体におけるＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５の５’非翻訳領域のヌクレオチド配列（配列番号１２〜２３）を示す。配列が同一である領域には陰を付けている。２つの多型部位であるＪＷ１８およびＪＷ１７の位置が示される。
【図１０−２】図１０は、野生型ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５配列（配列番号１１）に比較した１２の個体におけるＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５の５’非翻訳領域のヌクレオチド配列（配列番号１２〜２３）を示す。配列が同一である領域には陰を付けている。２つの多型部位であるＪＷ１８およびＪＷ１７の位置が示される。
【図１１−１】図１１は、１２の個体におけるＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５の３’非翻訳領域のヌクレオチド配列を示す。配列が同一である領域には陰を付けている。２つの多型部位であるＪＷ１５およびＪＷ１６の位置が示される。図１１Ａは、野生型ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５配列（配列番号２４）に比較した１２の個体におけるＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５の３’非翻訳領域のヌクレオチド配列（配列番号２５〜３６）、およびＪＷ１６の位置を示す。
【図１１−２】図１１は、１２の個体におけるＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５の３’非翻訳領域のヌクレオチド配列を示す。配列が同一である領域には陰を付けている。２つの多型部位であるＪＷ１５およびＪＷ１６の位置が示される。図１１Ａは、野生型ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５配列（配列番号２４）に比較した１２の個体におけるＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５の３’非翻訳領域のヌクレオチド配列（配列番号２５〜３６）、およびＪＷ１６の位置を示す。
【図１１−３】図１１は、１２の個体におけるＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５の３’非翻訳領域のヌクレオチド配列を示す。配列が同一である領域には陰を付けている。２つの多型部位であるＪＷ１５およびＪＷ１６の位置が示される。図１１Ｂは、野生型ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５配列（配列番号５５）に比較した１２の個体におけるＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５の３’非翻訳領域のヌクレオチド配列（配列番号５６〜６７）、およびＪＷ１５の位置を示す。
【図１１−４】図１１は、１２の個体におけるＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５の３’非翻訳領域のヌクレオチド配列を示す。配列が同一である領域には陰を付けている。２つの多型部位であるＪＷ１５およびＪＷ１６の位置が示される。図１１Ｂは、野生型ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５配列（配列番号５５）に比較した１２の個体におけるＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５の３’非翻訳領域のヌクレオチド配列（配列番号５６〜６７）、およびＪＷ１５の位置を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
（発明の詳細な説明）
本発明は、クローン病の線維性狭窄疾患サブタイプと密に関連した疾患素因対立遺伝子の刺激的な発見に関する。これらの線維性狭窄素因対立遺伝子は、以下にさらに記載するようにＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５座に連鎖しており、そしてクローン病の線維性狭窄疾患サブタイプを診断するか、またはそれに対する感受性を予測するために使用され得る。
【０００９】
本明細書中に開示されるように、遺伝子型判定および他の臨床的特徴づけアプローチを、疾患素因対立遺伝子とクローン病の線維性狭窄疾患サブタイプとの間の強い関連を同定するために使用した。特に、クローン病患者の２つのコホートを集め、臨床的に特徴付けた（実施例Ｉおよび表１を参照のこと）。これらの患者をまた、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５遺伝子における３つの一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）であるＳＮＰ８、ＳＮＰ１２、およびＳＮＰ１３（これらは、クローン病と関連した多型マーカーである）について遺伝子型判定した。本明細書中に開示されるように、単変量解析は、コホート１において、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５座のＳＮＰ８、ＳＮＰ１２、またはＳＮＰ１３での「２」対立遺伝子が、線維性狭窄疾患と有意に関連していることを示した（ｐ＝０．０４９、表５を参照のこと）。さらに、このコホートにおいては、小腸罹患および発症時年齢がより若いこととは、より厳密でない有意水準での正の相関がまた見られ、そして潰瘍性大腸炎様疾患とは、負の相関が見られた。血清学的マーカーに関しては、ＳＮＰ１３での「２」対立遺伝子を有する患者の方が、抗Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ抗体（ＡＳＣＡ）を発現する確率が高かった（ｐ＝０．０５３）。
【００１０】
コホート１で見られた結果を、実施例ＩＶにおいて本明細書中で開示されるように、コホート２を用いてさらに検証した。コホート１と同様に、コホート２は、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５座のＳＮＰ８、ＳＮＰ１２、またはＳＮＰ１３での「２」対立遺伝子と線維性狭窄疾患との間の有意な関連を示した（ｐ＝０．００２、表６を参照のこと）。さらに、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５座のＳＮＰ８、ＳＮＰ１２、またはＳＮＰ１３での「２」対立遺伝子と線維性狭窄疾患との間の有意性は、これら２つのコホートが一緒に解析された場合に増大した（ｐ＝０．００１、図２を参照のこと）。
【００１１】
実施例Ｖにおいて本明細書中にさらに開示されるように、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５座のＳＮＰ８、ＳＮＰ１２、またはＳＮＰ１３での「２」対立遺伝子は、ユダヤ人個体および非ユダヤ人個体の両方で線維性狭窄疾患と関連していた。線維性狭窄疾患を有さないクローン病患者では２３％のみ（ユダヤ人個体２１．６％対非ユダヤ人個体２５％）であることと比較して、線維性狭窄疾患を有するクローン病患者ではおよそ４６％（ユダヤ人個体５２％対非ユダヤ人個体４２％）が、これらの稀な改変型対立遺伝子の少なくとも１つを有した（オッズ比、２．８；９５％信頼区間、１．５６−５．１８）。これら３つの稀な改変型対立遺伝子のうち、ＳＮＰ１３での「２」対立遺伝子（これは、「３０２０ｉｎｓＣ」と示されるフレームシフト変異である）が、線維性狭窄疾患と最大の相関を示した（４７％対１７％、ｐ＝０．００６（組み合わせコホートに対して））。これらの結果は、線維性狭窄素因対立遺伝子がＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５座に連鎖され得ることを示す。
【００１２】
実施例ＶＩにおいてさらに開示されるように、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５における２つの線維性狭窄素因対立遺伝子のキャリアである患者の方が、ＳＮＰ８、ＳＮＰ１２、またはＳＮＰ１３でのＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５変異のキャリアでない患者と比較して、線維性狭窄疾患を有する確率が有意に高かった（８５％対４３％；オッズ比７．４；９５％信頼区間１．９−２８．９、ｐ＝０．００４）。図３を参照のこと。また、単一のＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５線維性狭窄素因対立遺伝子のキャリアである患者の方が、アッセイした３つのＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５線維性狭窄素因対立遺伝子のいずれのキャリアでもない患者と比較した場合に、線維性狭窄疾患を有する確率が有意に高かった（６４％対４３％；オッズ比２．３７；９５％信頼区間１．２６−４．４７；ｐ＝０．００８）。これらの結果は、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５座に連鎖された線維性狭窄素因対立遺伝子を有する患者が、クローン病の線維性狭窄サブタイプを有し得ることを確認し、そしてさらに、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５に連鎖された多重線維性狭窄素因対立遺伝子（ホモ接合性変異または複合ヘテロ接合性変異）を有するクローン病患者が、単一の線維性狭窄素因対立遺伝子を有する個体に比較して、線維性狭窄疾患を有する危険度が高いことを示す。
【００１３】
線維性狭窄疾患および穿孔疾患は、同じ患者において共に生じ得る。線維性狭窄疾患を有する患者は、例えば、ｉ）線維性狭窄疾患のみを有する、またはｉｉ）線維性狭窄疾患および穿孔疾患を共に有するとして特徴付けられ得る。実施例ＶＩＩにおいて本明細書中で開示されるように、線維性狭窄疾患のみを有する患者でＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５座のＳＮＰ８、ＳＮＰ１２、またはＳＮＰ１３での「２」対立遺伝子を有する割合は、４８．３％であった。これは、線維性狭窄および穿孔の両合併症を有する患者において見られた割合と同様であった（４６．０％；ｐ＝０．８）。図４において見られるように、線維性狭窄疾患を有する患者を穿孔疾患（肛門周囲または内部）のみを有するとして記載される患者と比較した場合、線維性狭窄疾患を有する患者（穿孔合併症ありまたは穿孔合併症なし）におけるＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５座のＳＮＰ８、ＳＮＰ１２、またはＳＮＰ１３での「２」対立遺伝子の頻度は、穿孔合併症のみを有する患者で見られるよりも有意に大きかった（４６．６％対１８．６％；ｐ＝０．００２）。
【００１４】
実施例ＶＩＩＩにおいて本明細書中でさらに開示されるように、多変量解析を行って、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５座のＳＮＰ８、ＳＮＰ１２、またはＳＮＰ１３での「２」対立遺伝子と臨床表現型との関連を調べた。多変量解析のために、いずれのコホートにおいても、少なくとも境界域の有意性（ｐ＜０．１）を有する全ての変数を、ロジスティック回帰を用いて、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５座のＳＮＰ８、ＳＮＰ１２、またはＳＮＰ１３での「２」対立遺伝子とのそれらの関連について同時に試験した。表７に示されるように、線維性狭窄疾患の臨床表現型は、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５座でのこれらの稀な対立遺伝子と有意に関連していた（ｐ＜０．０５）（オッズ比２．８；９５％信頼区間、１．３−６．０）。これらの結果は、線維性狭窄疾患が、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５座のＳＮＰ８、ＳＮＰ１２、またはＳＮＰ１３での「２」対立遺伝子と独立に関連していることを確認する。
【００１５】
線維性狭窄疾患が小腸罹患を有する患者において生じる確率が高いので、線維性狭窄疾患とＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５改変型対立遺伝子との間の関連が一次相関であるか否かを解析するために、患者を、小腸罹患に基づいて層別化した（実施例ＩＸを参照のこと）。小腸罹患を有する患者の中で、線維性狭窄疾患を有しない患者（ｎ＝５３）では２６．４％が、ＳＮＰ８、ＳＮＰ１２、またはＳＮＰ１３での「２」対立遺伝子を有したのに対し、線維性狭窄疾患を有した患者（ｎ＝１０２）では４６．１％が、ＳＮＰ８、ＳＮＰ１２、またはＳＮＰ１３での「２」対立遺伝子を有した（ｐ＝０．０１７）。同様の傾向が、小腸罹患を有しない患者の間で見られ（ｐ＝０．０５）、そして小腸罹患に関して条件付けする複合解析は、０．００９の有意水準を生じた。線維性狭窄疾患について条件付けした後、小腸罹患は、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５座のＳＮＰ８、ＳＮＰ１２、またはＳＮＰ１３での「２」対立遺伝子と関連していなかった（ｐ＝０．６３）。この結果は、ロジスティック回帰解析からの結果（実施例ＶＩＩＩを参照のこと）と一致し、そして線維性狭窄疾患とＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５座のＳＮＰ８、ＳＮＰ１２、またはＳＮＰ１３での「２」対立遺伝子との間の関連が、小腸罹患とは独立していることを示す。これらの結果はさらに、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５座のＳＮＰ８、ＳＮＰ１２、またはＳＮＰ１３での「２」対立遺伝子とで観察された小腸の相関が、線維性狭窄疾患の存在に対して二次的であることを示す。
【００１６】
これらの発見に基づいて、本発明は、線維性狭窄疾患により特徴付けられたクローン病の臨床サブタイプを診断するか、またはそれに対する感受性を予測する方法であって、当該方法は、個体における、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５座に連鎖された線維性狭窄素因対立遺伝子の存在または不在を決定する工程によるものであり、ここで、線維性狭窄素因対立遺伝子の存在が、線維性狭窄疾患により特徴付けられたクローン病の臨床サブタイプの診断またはそれに対する感受性の予測となる、方法を提供する。本発明の方法は、それらが非侵襲的であり、かつ例えば、個体由来の血液サンプルを用いて、便宜的に実施され得るという点で、有利であり得る。本発明の方法は、以下にさらに記載するように、迅速、簡単、および信頼性をもって、線維性狭窄疾患により特徴付けられたクローン病の臨床サブタイプを診断するか、またはそれに対する感受性を予測するために使用され得る。
【００１７】
１つの実施形態では、本発明の方法は、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５座内に位置する線維性狭窄素因対立遺伝子を用いて実施される。別の実施形態では、線維性狭窄素因対立遺伝子によりコードされたＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５ポリペプチドによるＮＦ−κＢ活性化が、野生型ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５ポリペプチドによるＮＦ−κＢ活性化に比較して減少される。別の実施形態では、本発明の方法は、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５座のコード領域中に、例えば、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５の残基７４４〜１０２０をコードする領域内に、存在する線維性狭窄素因対立遺伝子を用いて実施される。またさらなる実施形態では、本発明の方法は、ＳＮＰ８、ＳＮＰ１２、またはＳＮＰ１３での「２」対立遺伝子である線維性狭窄素因対立遺伝子を用いて実施される。なおさらなる実施形態では、本発明の方法は、ＳＮＰ１３での「２」対立遺伝子である線維性狭窄素因対立遺伝子を用いて実施される。別の実施形態では、本発明の方法は、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５座の非コード領域中に位置する線維性狭窄素因対立遺伝子を用いて実施される。このような対立遺伝子は、限定されることなく、ＪＷ１、ＪＷ１５、またはＪＷ１６改変型対立遺伝子であり得る。別の実施形態では、本発明の方法は、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５座のプロモーター領域中に位置する線維性狭窄素因対立遺伝子を用いて実施される。ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５のプロモーター領域における有用な線維性狭窄素因対立遺伝子は、ＪＷ１７およびＪＷ１８改変型対立遺伝子を包含するが、これらに限定されない。
【００１８】
本発明は、第１６染色体上のＩＢＤ１座に局在する遺伝マーカーに関する。ゲノムワイドスキャン連鎖戦略（ｇｅｎｏｍｅ ｗｉｄｅ ｓｃａｎ ｌｉｎｋａｇｅ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ）を用いて、ＩＢＤ１座は、カフカス人集団における第１６染色体の長腕の近位領域（１６ｑ１２）にマッピングされた（Ｈｕｇｏｔら，Ｎａｔｕｒｅ ３７９：８２１−８２３（１９９６））。この知見は、多くの研究において再現されており、このような研究は、複合疾患について高いマルチポイント連鎖スコア（ｍｕｌｔｉｐｏｉｎｔ ｌｉｎｋａｇｅ ｓｃｏｒｅ）（ＭＬＳ）を報告する国際的な共同研究を含む（ＭＬＳ＝５．７（１６ｑ１２中のマーカーＤ１６Ｓ４１１で））。以下を参照のこと：Ｃｈｏら，Ｉｎｆｌａｍｍ．Ｂｏｗｅｌ Ｄｉｓ．３：１８６−１９０（１９９７），Ａｋｏｌｋａｒら，Ａｍ．Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．９６：１１２７−１１３２（２００１），Ｏｈｍｅｎら，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．５：１６７９−１６８３（１９９６），Ｐａｒｋｅｓら，Ｌａｎｃｅｔ ３４８：１５８８（１９９６），Ｃａｖａｎａｕｇｈら，Ａｎｎ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｔ．（１９９８），Ｂｒａｎｔら，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １１５：１０５６−１０６１（１９９８），Ｃｕｒｒａｎら，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｌｏｌｏｇｙ １１５：１０６６−１０７１（１９９８），Ｈａｍｐｅら，Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．６４：８０８−８１６（１９９９）、およびＡｎｎｅｓｅら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．７：５６７−５７３（１９９９）。ＩＢＤ１座内のＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５が、ポジショナルクローニング戦略（Ｈｕｇｏｔら，Ｎａｔｕｒｅ ４１１：５９９−６０３（２００１））およびポジショナル候補遺伝子戦略（ｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ ｃａｎｄｉｄａｔｅ ｇｅｎｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ）（Ｏｇｕｒａら，Ｎａｔｕｒｅ ４１１：６０３−６０６（２００１），Ｈａｍｐｅら，Ｌａｎｃｅｔ ３５７：１９２５−１９２８（２００１））によって、同時に同定された。コードされたＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５タンパク質は、アミノ末端カスパーゼ補充ドメイン（ｃａｓｐａｓｅ
ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ ｄｏｍａｉｎｓ）（ＣＡＲＤ）（これは、ＮＦ−カッパＢ（ＮＦ−κＢ）を活性化し得る）およびいくつかのカルボキシ末端ロイシンリッチ反復ドメインを含む（Ｏｇｕｒａら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：４８１２−４８１８（２００１））。図１は、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５座の模式図を示す。
【００１９】
ヒトＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５遺伝子の配列は、登録番号ＮＭ＿０２２１６２としてＧｅｎＢａｎｋで見い出され得る（この内容は、本明細書中に参考として援用される）。さらに、ヒト第１６染色体クローンＲＰ１１−３２７Ｆ２２（これは、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５を含む）の完全配列が、登録番号ＡＣ００７７２８としてＧｅｎＢａｎｋで見い出され得る（この内容は、本明細書中に参考として援用される）。さらに、他の種由来のＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５の配列も、ＧｅｎＢａｎｋデータベースにおいて見い出され得る。
【００２０】
ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５のコード領域における３つの一ヌクレオチド多型でのバリエーションが、以前に記載された。これらの３つのＳＮＰ（ＳＮＰ８、ＳＮＰ１２、およびＳＮＰ１３と称される）は、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５遺伝子のカルボキシ末端領域中に位置する（Ｈｕｇｏｔら，前出、２００１）。
【００２１】
本発明は、一部、個体における、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５座に連鎖された線維性狭窄素因対立遺伝子の存在または不在を決定することに依存する。本明細書中で使用される用語「線維性狭窄素因対立遺伝子」は、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５座に連鎖された、かつ伝統的なメンデル遺伝学に従って予期され得るよりも高い頻度で、線維性狭窄疾患により特徴付けられたクローン病の臨床サブタイプと共に遺伝する傾向のある、安定遺伝性分子バリエーションを意味する。本発明において有用な線維性狭窄素因対立遺伝子は、限定されることなく、一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）、マイクロサテライト（ｍｓ）、縦列反復単位数が可変である（ｖａｒｉａｂｌｅ ｎｕｍｂｅｒ ｔａｎｄｅｍ ｒｅｐｅａｔ）（ＶＮＴＲ）多型、または１以上のヌクレオチドの置換、挿入もしくは欠失であり得る。当業者は、線維性狭窄素因対立遺伝子はまた、異常メチル化、または野生型対立遺伝子と比較して線維性狭窄素因対立遺伝子の一次ヌクレオチド配列に差異を生じない他の改変のような分子バリエーションであり得ることも理解する。
【００２２】
線維性狭窄素因対立遺伝子およびＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５座に関して本明細書中で使用される用語「〜に連鎖された」は、線維性狭窄素因対立遺伝子およびＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５座が、伝統的なメンデル遺伝学に従って予期され得るよりも高い頻度で一緒に遺伝することを意味する。対立遺伝子と遺伝子座とは、これら２つの部位の間での組換えが５０％未満である場合に、連鎖されていると理解される。一般には、線維性狭窄素因対立遺伝子は、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５座とは、せいぜい５０センチモルガン（ｃＭ）離れている。非限定的な例として、線維性狭窄素因対立遺伝子は、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５座から５０センチモルガン（ｃＭ）、４０ｃＭ、３０ｃＭ、２０ｃＭ、１０ｃＭ、５ｃＭ、または１ｃＭ以内にあり得る。連鎖された線維性狭窄素因対立遺伝子とＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５座との間の距離は、例えば、５０，０００，０００塩基対（ｂｐ）、４０，０００，０００ｂｐ、３０，０００，０００ｂｐ、２０，０００，０００ｂｐ、１０，０００，０００ｂｐ、５，０００，０００ｂｐ、１，０００，０００ｂｐ、５００，０００ｂｐ、１００，０００ｂｐ、５０，０００ｂｐ、１０，０００ｂｐ、１，０００ｂｐ、または１００ｂｐであり得る。
【００２３】
本発明の方法は、クローン病（限局性腸炎）（これは、胃腸管の任意の部分を罹患させ得る慢性炎症の疾患である）の臨床サブタイプを診断するか、またはそれに対する感受性を予測するために有用である。通例、クローン病においては、小腸の遠位部分（回腸）および盲腸が罹患される。他の場合では、この疾患は、小腸、結腸、または肛門直腸領域に制限される。クローン病は、時折、十二指腸および胃をも罹患させ、また、より稀なことではあるが、食道および口腔をも罹患させる。
【００２４】
クローン病の不定の臨床発現は、一部、この疾患の多様な解剖学的局在の結果である。クローン病の最も頻度の高い症状は、腹痛、下痢、および回帰熱である。クローン病は、腸閉塞またはフィステル（これは、例えば、腸の患部ループ間の異常な通路である）と一般に関連している。クローン病はまた、腸管外合併症（例えば、眼、関節、および皮膚の炎症；肝臓疾患；腎臓結石またはアミロイドーシス）を包含し得、そして腸癌の危険度の増大と関連している。
【００２５】
いくつかの特徴がクローン病の病理に特徴的である。クローン病と関連した炎症は、経壁性炎症（ｔｒａｎｓｍｕｒａｌ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ）として知られるが、これは、腸壁の全ての層を罹患させる。例えば、肥厚および浮腫が、代表的には、腸壁の至るところに見られ、線維症もまた、長期にわたる疾患において存在する。クローン病に特徴的である炎症はまた不連続なものであり、「跳躍病巣」として知られる炎症組織区域は、見かけ上正常な腸によって離されている。さらに、介在組織の線状潰瘍、浮腫、および炎症が、腸粘膜の「丸石（ｃｏｂｂｌｅｓｔｏｎｅ）」の外観に至る。これは、クローン病に特有である。
【００２６】
クローン病の証明は、炎症細胞の離散性の凝集（肉芽腫として知られる）の存在であり、これは、一般に、粘膜下組織で見られる。クローン病症例の約半分は、典型的な離散性の肉芽腫を示すが、他の症例は、広汎性の肉芽腫性反応または非特異的な経壁性炎症を示す。結果として、離散性の肉芽腫の存在がクローン病の指標であるが、肉芽腫が存在しないこともまた、この疾患と矛盾しない。従って、肉芽腫の存在よりもむしろ、経壁性または不連続の炎症が、クローン病の好ましい診断指標である（ＲｕｂｉｎおよびＦａｒｂｅｒ，Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ（第２版）Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ：Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｃｏｍｐａｎｙ（１９９４））。
【００２７】
クローン病は、胃腸管を罹患させ、そして類似の症状を生じ得る多数の異質性の疾患サブタイプを表す分類である。非限定的な例として、クローン病を有する患者は、以前に記載の診断基準に基づいて、線維性狭窄疾患、内部穿孔疾患、肛門周囲瘻孔形成疾患、または潰瘍性大腸炎（ＵＣ）様疾患により特徴付けられたサブタイプを有するとして特徴付けられ得る（Ｇａｓｃｈｅら，Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｂｏｗｅｌ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ６：８−１５（２０００）；Ｖａｓｉｌｉａｕｓｋａｓら，Ｇｕｔ ４７：４８７−４９６（２０００）；Ｖａｓｉｌｉａｕｓｋａｓら，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １１０：１８１０−１８１９（１９９６）；およびＧｒｅｅｎｓｔｅｉｎら，Ｇｕｔ ２９：５８８−５９２（１９８８））。
【００２８】
十分に確立された判断基準に従って、線維性狭窄疾患は、検査による存続腸閉塞または腸閉塞のための腸管切除によって確定される。Ｘ線撮影検査、内視鏡検査、外科的検査、または組織病理学的検査が、クローン病の線維性狭窄サブタイプの診断を確証するために使用され得る。クローン病の線維性狭窄サブタイプには、他の症状（例えば、穿孔、膿瘍、またはフィステル）が伴い得る。さらに、クローン病の線維性狭窄サブタイプは、腸閉塞（ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｂｌｏｃｋａｇｅ）の存続症状（例えば、悪心、嘔吐、腹部拡延、および固形食物の摂食不能）によって特徴付けられ得る。クローン病の線維性狭窄サブタイプを有する患者の腸内Ｘ線は、例えば、閉塞点の前の腸の拡延を示し得る。
【００２９】
クローン病のさらなるサブタイプは、規定の臨床診断基準を用いて同定され得る。例えば、内部穿孔疾患は、腸−腸もしくは腸−膀胱フィステル、腹内膿瘍、または小腸穿孔の現在または以前の形跡として確定され得る。肛門周囲瘻孔形成疾患は、肛門周囲フィステルもしくは膿瘍または直腸膣フィステルのいずれかの現在または以前の形跡によって確定され得る。潰瘍性大腸炎（ＵＣ）様疾患は、以前に記載されたように、左側結腸罹患、出血もしくは尿意促迫の症状、および結腸生検における陰窩膿瘍の現在または以前の形跡によって確定され得る。疾患の位置は、１つ以上の内視鏡研究、Ｘ線研究、または病理研究に基づいて、小腸、結腸、またはその両方として分類され得る。
【００３０】
クローン病の線維性狭窄サブタイプは、小腸罹患を有する疾患を有する患者において生じ得る。本明細書中に開示されるように、線維性狭窄疾患について条件付けした後、小腸罹患は、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５座のＳＮＰ８、ＳＮＰ１２、またはＳＮＰ１３での「２」対立遺伝子とは関連していなかった（ｐ＝０．６３；実施例ＩＸを参照のこと）。この結果は、実施例ＶＩＩＩに開示されたロジスティック回帰解析からの結果と一致し、そして線維性狭窄疾患とＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５座のＳＮＰ８、ＳＮＰ１２、またはＳＮＰ１３での「２」対立遺伝子との間の関連が、小腸罹患とは独立していることを示す。これらの知見に基づいて、本発明は、小腸罹患とは独立した線維性狭窄疾患により特徴付けられたクローン病の臨床サブタイプを診断するか、またはそれに対する感受性を予測する方法であって、当該方法は、個体における、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５座に連鎖された線維性狭窄素因対立遺伝子の存在または不在を決定する工程によるものであり、ここで、線維性狭窄素因対立遺伝子の存在が、小腸罹患とは独立した線維性狭窄疾患により特徴付けられたクローン病の臨床サブタイプの診断またはそれに対する感受性の予測となる、方法を提供する。
【００３１】
本発明の診断方法は、個体において実施される。本明細書中で使用される用語「個体」は、クローン病の線維性狭窄サブタイプを有し得る動物（例えば、ヒトまたは他の哺乳動物）を意味する。個体は、クローン病の１つ以上の症状またはクローン病の線維性狭窄サブタイプを有し得るか、あるいは無症状性であり得る。本発明の方法は、例えば、１つ以上の症状を有する個体におけるクローン病の線維性狭窄サブタイプの診断のために、または無症状性個体（例えば、クローン病の線維性狭窄サブタイプを有する危険度の高い個体）におけるクローン病の線維性狭窄サブタイプに対する感受性を予測するために、有用であり得る。１つの実施形態では、本発明の方法は、クローン病を有することが知られる個体におけるクローン病の線維性狭窄サブタイプの存在または不在を決定するために使用される。
【００３２】
本発明の方法は、例えば、アシュケナジユダヤ人（Ａｓｈｋｅｎａｚｉ Ｊｅｗｉｓｈ）個体において、クローン病の線維性狭窄サブタイプを診断するか、またはそれに対する感受性を予測するために、有用であり得る。クローン病は、非ユダヤ系カフカス人（ｎｏｎ−Ｊｅｗｉｓｈ Ｃａｕｃａｓｉａｎｓ）におけるよりもアシュケナジユダヤ人（Ａｓｈｋｅｎａｚｉ Ｊｅｗｓ）において、有意により一般的である（２〜８倍高い）（Ｂｒａｎｔら，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．１１５：１０５６−１０６１（１９９８））。さらに、ユダヤ人民族系の人の間では、アメリカまたはヨーロッパのアシュケナジユダヤ人が、セファルディ（Ｓｅｐｈａｒｄｉｃ）または東洋のユダヤ人と比較して、この炎症性腸疾患を有する危険度が２〜４倍高い（ＹａｎｇおよびＲｏｔｔｅｒ、ＫｉｒｓｃｈｎｅｒおよびＳｈｏｒｔｅｒ（編），Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｂｏｗｅｌ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ：Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ，ｐ．３０１−３３１（１９９５）；Ｒｏｚｅｎら，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．７６：２５−３０（１９７９））。クローン病を有する発端者の第一度近親者についてのクローン病の経験的危険度（ｅｍｐｉｒｉｃ ｒｉｓｋ）は、ユダヤ人では７．８％であり、これに対し、非ユダヤ人では５．２％である（ｐ＝０．００５；Ｙａｎｇら，Ｇｕｔ ３４：５１７−５２４（１９９３））。従って、ユダヤ人集団および特にアシュケナジユダヤ人集団は、クローン病および関連した病因の自己免疫疾患に対する危険度の高い集団の代表である。
【００３３】
本発明の方法は、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５座に連鎖された線維性狭窄素因対立遺伝子に依存する。ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５は、アポトーシス制御因子Ａｐａｆ−１／ＣＥＤ−４および植物疾患抵抗性遺伝子産物のクラスの両方と構造的相同性を有する（Ｏｇｕｒａら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，２７６：４８１２−４８１８（２００１））。植物疾患抵抗性遺伝子産物と同様に、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５は、アミノ末端エフェクタードメイン、ヌクレオチド結合ドメイン、およびロイシンリッチ反復（ＬＲＲ）を有する。野生型ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５は核性因子ＮＦ−κＢを活性化し、これを細菌リポ多糖（ＬＰＳ）に対して応答性とする（Ｏｇｕｒａら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，２７６：４８１２−４８１８（２００１）；Ｉｎｏｈａｒａら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：２５５１−２５５４（２００１）。ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５は、ＬＰＳに対する細胞間レセプターとして機能し得、そのロイシンリッチ反復は、応答性のために必要とされる。ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５と同様に、細胞質ゾル植物疾患抵抗性ポリペプチドは、カルボキシ末端ロイシンリッチ反復を有し、この反復は、病原体成分の認識および病原体特異的応答の誘導のために重要である（Ｐａｒｎｉｓｋｅら，Ｃｅｌｌ ９１：８２１−８３２（１９９７）；Ｅｌｌｉｓら，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １１：４９５−５０６（１９９９）；Ｄｉｘｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７：８８０７−８８１４（２０００））。
【００３４】
１つの実施形態では、線維性狭窄素因対立遺伝子は、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５座（その模式図を図１に示す）内に位置する。ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５座は、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５遺伝子のコード領域ならびに非コード領域（例えば、イントロン、および５’非翻訳領域および３’非翻訳領域）を含む。当業者は、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５座が、例えば、プロモーター領域（遺伝子の５’側）、エンハンサー領域（遺伝子の５’もしくは３’側、またはイントロン配列中）、およびｍＲＮＡ安定領域（遺伝子の３’側）を含み得ることを理解する。
【００３５】
別の実施形態では、線維性狭窄素因対立遺伝子は、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５座のコード領域中に、例えば、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５の残基７４４〜１０２０をコードする領域内に、位置する。ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５ポリペプチドの残基７４４〜１０２０は、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５ポリペプチドのカルボキシ末端部分中にいくつかのロイシンリッチ反復を含む。ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５の残基７４４〜１０２０をコードする領域中に位置する線維性狭窄素因対立遺伝子は、限定されることなく、ＳＮＰ１２およびＳＮＰ１３を包含する。本発明において有用な線維性狭窄素因対立遺伝子はまた、野生型ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５ポリペプチドによるＮＦ−κＢ活性化に比較してＮＦ−κＢ活性化が減少したＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５ポリペプチドをコードする対立遺伝子であり得る。例として、ＳＮＰ１３での稀な改変型対立遺伝子は短縮型ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５ポリペプチドを生じ、このポリペプチドは、ＬＰＳ刺激に応答してＮＦ−κＢを誘導する能力を低下したものである（Ｏｇｕｒａら，Ｎａｔｕｒｅ ４１１：６０３−６０６（２００１））。
【００３６】
本発明において有用な線維性狭窄素因対立遺伝子は、例えば、ＳＮＰ８、ＳＮＰ１２、またはＳＮＰ１３での「２」対立遺伝子であり得る。ＳＮＰ８、ＳＮＰ１２、およびＳＮＰ１３は、図１に示されるように、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５のコード領域内に位置する。１つの実施形態では、本発明の方法は、ＳＮＰ８「２」対立遺伝子である線維性狭窄素因対立遺伝子を用いて実施される。本明細書中で使用される用語「ＳＮＰ８」は、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５遺伝子におけるエキソン４内の一ヌクレオチド多型を意味し、これは、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５タンパク質のアミノ酸７０２をコードするトリプレット内で生じる。「１」対立遺伝子（シトシン（ｃ）がＡＣ００７７２８配列の１３８，９９１位に存する）は、一般のまたは「野生型」ＳＮＰ８対立遺伝子であり、アミノ酸７０２のアルギニンをコードするトリプレット内で生じる。ＳＮＰ８の「２」対立遺伝子（チミン（ｔ）がＡＣ００７７２８配列の１３８，９９１位に存する）は、稀な改変型であり、これは、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５タンパク質のアミノ酸７０２にアルギニン（Ｒ）からトリプトファン（Ｗ）への置換を生じる。従って、ＳＮＰ８の稀な「２」対立遺伝子は、「Ｒ７０２Ｗ」または「７０２Ｗ」と表示され、また、Ｈｕｇｏｔら，前出、２００１の先の番号付けシステムに基づいて「Ｒ６７５Ｗ」とも表示され得る。ＳＮＰ８のＮＣＢＩ ＳＮＰ ＩＤ番号はｒｓ２０６６８４４であり、これは、本明細書中に参考として援用される。本明細書中に開示され、かつ以下にさらに記載されるように、ＳＮＰ８または以下に記載の別のＳＮＰでの対立遺伝子「１」または「２」の存在は、例えば、対立遺伝子識別アッセイまたは配列分析によって便宜的に検出され得る。
【００３７】
本発明の方法はまた、ＳＮＰ１２「２」対立遺伝子である線維性狭窄素因対立遺伝子を用いて実施され得る。本明細書中で使用される用語「ＳＮＰ１２」は、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５遺伝子におけるエキソン８内の一ヌクレオチド多型を意味し、これは、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５タンパク質のアミノ酸９０８をコードするトリプレット内で生じる。「１」対立遺伝子（グアニン（ｇ）がＡＣ００７７２８配列の１２８，３７７位に存する）は、一般のまたは「野生型」ＳＮＰ１２対立遺伝子であり、アミノ酸９０８のグリシンをコードするトリプレット内で生じる。ＳＮＰ１２の「２」対立遺伝子（シトシン（ｃ）がＡＣ００７７２８配列の１２８，３７７位に存する）は、稀な改変型であり、これは、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５タンパク質のアミノ酸９０８にグリシン（Ｇ）からアルギニン（Ｒ）への置換を生じる。ＳＮＰ１２でのこの稀な「２」対立遺伝子は、「Ｇ９０８Ｒ」または「９０８Ｒ」と表示され、また、Ｈｕｇｏｔら，前出、２００１の先の番号付けシステムに基づいて「Ｇ８８１Ｒ」とも表示され得る。ＳＮＰ１２は、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５遺伝子のロイシンリッチ反復領域内に位置する。ＳＮＰ１２のＮＣＢＩ ＳＮＰ ＩＤ番号はｒｓ２０６６８４５であり、これは、本明細書中に参考として援用される。
【００３８】
本発明の方法はまた、ＳＮＰ１３「２」対立遺伝子である線維性狭窄素因対立遺伝子を用いて実施され得る。この対立遺伝子は、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５タンパク質の１０番目のロイシンリッチ反復においてフレームシフトを生じ、そして後に未熟停止コドンが続く、一ヌクレオチドの挿入である。ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５タンパク質の得られる短縮は、細菌リポ多糖に応答するＮＦ−κＢの活性化を妨害するようである（Ｏｇｕｒａら，前出、２００１）。本明細書中で使用される用語「ＳＮＰ１３」は、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５遺伝子におけるエキソン１１内の一ヌクレオチド多型を意味し、これは、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５タンパク質のアミノ酸１００７をコードするトリプレットで生じる。ＳＮＰ１３の「２」対立遺伝子（シトシンが、ＡＣ００７７２８配列の１２１，１３９位で付加されている）は、アミノ酸１００７にフレームシフト変異を生じる稀な改変型である。従って、ＳＮＰ１３での稀な「２」対立遺伝子は、「１００７ｆｓ」と表示され、また、「３０２０ｉｎｓＣ」またはＨｕｇｏｔら，前出、２００１の先の番号付けシステムに基づいて「９８０ｆｓ」とも表示され得る。ＳＮＰ１３のＮＣＢＩ ＳＮＰ ＩＤ番号はｒｓ２０６６８４７であり、これは、本明細書中に参考として援用される。
【００３９】
当業者は、特定の多型対立遺伝子が、市販の参照ＤＮＡを用いて（例えば、ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）から得られる）、例えば、Ｃｅｎｔｒｅ ｄ’Ｅｔｕｄｅ ｄｕ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｅ Ｈｕｍａｉｎ（ＣＥＰＨ）参照個体（例えば、１３４７−０２と称される個体）（Ｄｉｂら，Ｎａｔｕｒｅ ３８０：１５２−１５４（１９９６））に比較して、便宜的に定義され得ることを認識する。さらに、ＳＮＰに関する詳細な情報は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）のｄｂＳＮＰから得られ得る。
【００４０】
線維性狭窄素因対立遺伝子はまた、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５座の非コード領域中に位置し得る。非コード領域は、例えば、イントロン配列、および５’非翻訳領域および３’非翻訳領域を含む。ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５遺伝子のイントロン配列中の線維性狭窄素因対立遺伝子の例としては、ＪＷ１改変型対立遺伝子（これは以下に記載される）が挙げられるが、これらに限定されない。ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５遺伝子の３’非翻訳領域中に位置する線維性狭窄素因対立遺伝子の例としては、限定されることなく、ＪＷ１５改変型対立遺伝子およびＪＷ１６改変型対立遺伝子（これらは以下に記載される）が挙げられる。ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５遺伝子の５’非翻訳領域中に位置する線維性狭窄素因対立遺伝子の例としては、限定されることなく、ＪＷ１７改変型対立遺伝子およびＪＷ１８改変型対立遺伝子（これらは以下に記載される）が挙げられる。１つの実施形態では、本発明の方法は、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５座の非コード領域中に位置する線維性狭窄素因対立遺伝子を用いて実施され、この対立遺伝子は、ＪＷ１、ＪＷ１５、またはＪＷ１６改変型対立遺伝子である。別の実施形態では、本発明の方法は、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５座のプロモーター領域中に位置する線維性狭窄素因対立遺伝子を用いて実施され、この対立遺伝子は、ＪＷ１７またはＪＷ１８改変型対立遺伝子である。
【００４１】
本明細書中で使用される用語「ＪＷ１改変型対立遺伝子」は、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５遺伝子の介在配列８（イントロン８）のヌクレオチド１５８での遺伝子バリエーションを意味する。ＡＣ００７７２８配列に関して、ＪＷ１改変型は、１２８，１４３位に位置する。イントロン８のヌクレオチド１５８位での遺伝子バリエーションは、一ヌクレオチド置換、多重ヌクレオチド置換、または１つ以上のヌクレオチドの欠失もしくは挿入であり得るが、これらに限定されない。イントロン８の野生型配列は、１５８位にシトシンを有し；非限定的な例として、ＪＷ１改変型対立遺伝子は、イントロン８のヌクレオチド１５８にシトシン（Ｃ）からアデニン（Ａ）、シトシンからグアニン（Ｇ）、またはシトシンからチミン（Ｔ）の置換を有し得る。１つの実施形態では、ＪＷ１改変型対立遺伝子は、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５イントロン８のヌクレオチド１５８でのシトシンからチミンへの変更である。
【００４２】
本明細書中で使用される用語「ＪＷ１５改変型対立遺伝子」は、ＡＣ００７７２８配列のヌクレオチド１１８，７９０位でのＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５の３’非翻訳領域における遺伝子バリエーションを意味する。ヌクレオチド１１８，７９０での遺伝子バリエーションは、一ヌクレオチド置換、多重ヌクレオチド置換、または１つ以上のヌクレオチドの欠失もしくは挿入であり得るが、これらに限定されない。野生型配列は、１１８，７９０位にアデニン（Ａ）を有し；非限定的な例として、ＪＷ１５改変型対立遺伝子は、ヌクレオチド１１８，７９０にアデニン（Ａ）からシトシン（Ｃ）、アデニンからグアニン（Ｇ）、またはアデニンからチミン（Ｔ）の置換を有し得る。１つの実施形態では、ＪＷ１５改変型対立遺伝子は、ヌクレオチド１１８，７９０でのアデニンからシトシンへの変更である。
【００４３】
本明細書中で使用される用語「ＪＷ１６改変型対立遺伝子」は、ＡＣ００７７２８配列のヌクレオチド１１８，０３１位でのＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５の３’非翻訳領域における遺伝子バリエーションを意味する。ヌクレオチド１１８，０３１での遺伝子バリエーションは、一ヌクレオチド置換、多重ヌクレオチド置換、または１つ以上のヌクレオチドの欠失もしくは挿入であり得るが、これらに限定されない。野生型配列は、１１８，０３１位にグアニン（Ｇ）を有し；非限定的な例として、ＪＷ１６改変型対立遺伝子は、ヌクレオチド１１８，０３１にグアニン（Ｇ）からシトシン（Ｃ）、グアニンからアデニン（Ａ）、またはグアニンからチミン（Ｔ）の置換を有し得る。１つの実施形態では、ＪＷ１６改変型対立遺伝子は、ヌクレオチド１１８，０３１でのグアニンからアデニンへの変更である。
【００４４】
本明細書中で使用される用語「ＪＷ１７改変型対立遺伝子」は、ＡＣ００７７２８配列のヌクレオチド１５４，６８８位でのＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５の５’非翻訳領域における遺伝子バリエーションを意味する。ヌクレオチド１５４，６８８での遺伝子バリエーションは、一ヌクレオチド置換、多重ヌクレオチド置換、または１つ以上のヌクレオチドの欠失もしくは挿入であり得るが、これらに限定されない。野生型配列は、１５４，６８８位にシトシン（Ｃ）を有し；非限定的な例として、ＪＷ１７改変型対立遺伝子は、ヌクレオチド１５４，６８８にシトシン（Ｃ）からグアニン（Ｇ）、シトシンからアデニン（Ａ）、またはシトシンからチミン（Ｔ）の置換を有し得る。１つの実施形態では、ＪＷ１７改変型対立遺伝子は、ヌクレオチド１５４，６８８でのシトシンからチミンへの変更である。
【００４５】
本明細書中で使用される用語「ＪＷ１８改変型対立遺伝子」は、ＡＣ００７７２８配列のヌクレオチド１５４，４７１位でのＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５の５’非翻訳領域における遺伝子バリエーションを意味する。ヌクレオチド１５４，４７１での遺伝子バリエーションは、一ヌクレオチド置換、多重ヌクレオチド置換、または１つ以上のヌクレオチドの欠失もしくは挿入であり得るが、これらに限定されない。野生型配列は、１５４，４７１位にシトシン（Ｃ）を有し；非限定的な例として、ＪＷ１８改変型対立遺伝子は、ヌクレオチド１５４，４７１にシトシン（Ｃ）からグアニン（Ｇ）、シトシンからアデニン（Ａ）、またはシトシンからチミン（Ｔ）の置換を有し得る。１つの実施形態では、ＪＷ１８改変型対立遺伝子は、ヌクレオチド１５４，４７１でのシトシンからチミンへの変更である。
【００４６】
本明細書中ではさらに、線維性狭窄疾患により特徴付けられたクローン病の臨床サブタイプを診断するか、またはそれに対する感受性を予測する方法であって、当該方法は、個体における、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５座に連鎖された少なくとも２つの線維性狭窄素因対立遺伝子の存在または不在を決定する工程によるものであり、ここで、線維性狭窄素因対立遺伝子の１つ以上の存在が、線維性狭窄疾患により特徴付けられたクローン病の臨床サブタイプの診断またはそれに対する感受性の予測となる、方法が提供される。本発明の方法では、この少なくとも２つの線維性狭窄素因対立遺伝子は、ＳＮＰ８、ＳＮＰ１２、またはＳＮＰ１３での「２」対立遺伝子である。
【００４７】
本明細書中ではさらに、線維性狭窄疾患により特徴付けられたクローン病の臨床サブタイプを診断するか、またはそれに対する感受性を予測する方法であって、当該方法は、個体における、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５座に連鎖された少なくとも２つの線維性狭窄素因対立遺伝子の存在または不在を決定する工程によるものであり、ここで、線維性狭窄素因対立遺伝子の１つ以上の存在が、線維性狭窄疾患により特徴付けられたクローン病の臨床サブタイプの診断またはそれに対する感受性の予測となる、方法が提供される。１つの実施形態では、この少なくとも２つの線維性狭窄素因対立遺伝子は、ＳＮＰ８、ＳＮＰ１２、またはＳＮＰ１３での「２」対立遺伝子である。別の実施形態では、線維性狭窄疾患により特徴付けられたクローン病の臨床サブタイプを診断するか、またはそれに対する感受性を予測するための本発明の方法は、個体における、（ｉ）ＳＮＰ８での「２」対立遺伝子、（ｉｉ）ＳＮＰ１２での「２」対立遺伝子、および（ｉｉｉ）ＳＮＰ１３での「２」対立遺伝子の存在または不在を決定することにより実施され、ここで、ＳＮＰ８、ＳＮＰ１２、およびＳＮＰ１３での「２」対立遺伝子の１つ以上の存在が、線維性狭窄疾患により特徴付けられたクローン病の臨床サブタイプの診断またはそれに対する感受性の予測となる。
【００４８】
線維性狭窄素因対立遺伝子とクローン病との間の関連の強さは、１より大きな下位９５％信頼区間限界での特定のオッズ比（例えば、少なくとも２のオッズ比）によって、特徴づけられ得る。このようなオッズ比は、例えば、１より大きな下位９５％信頼区間限界で、少なくとも３．０、４．０、５．０、６．０、７．０、または８．０以上であり得、例えば、１．９−２８．９の９５％信頼区間で、少なくとも７．４のオッズ比である（図３を参照のこと）。さらに、オッズ比は、例えば、１．２６−４．４７の下位信頼区間限界で少なくとも２．３７であり得る（図３を参照のこと）。１つの実施形態では、線維性狭窄素因対立遺伝子は、少なくとも２のオッズ比および１より大きな下位９５％信頼限界で、線維性狭窄疾患により特徴付けられたクローン病の臨床サブタイプと関連している。オッズ比を決定するための方法は、当該分野で周知である（例えば、Ｓｃｈｌｅｓｓｅｌｍａｎら，Ｃａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｓｔｕｄｉｅｓ：Ｄｅｓｉｇｎ，Ｃｏｎｄｕｃｔ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８２）を参照のこと）。
【００４９】
１つの実施形態では、線維性狭窄素因対立遺伝子は、０．０５以下のｐ値で、クローン病の線維性狭窄サブタイプと関連している。他の実施形態では、線維性狭窄素因対立遺伝子は、０．１以下のｐ値で、クローン病の線維性狭窄サブタイプと関連している。本明細書中で使用される用語「ｐ値」は、「確率値」と同義である。当該分野で周知であるように、ランダム対立遺伝子と疾患との間の関連についての期待ｐ値は、１．００である。ｐ値が約０．０５未満であることは、対立遺伝子と疾患とが、偶然に一緒に出現するわけではなく、正の因子によって影響を受けていることを示す。一般に、連鎖の有意性についての統計学的閾値は、２０のゲノム走査で一度偽陽性が生じる対立遺伝子共有のレベルで設定されている（ｐ＝０．０５）。特定の実施形態では、線維性狭窄素因対立遺伝子は、０．１、０．０５、０．０４、０．０３、０．０２、０．０１、０．００９、０．００８、０．００７、０．００６、０．００５、０．００４、０．００３、０．００２もしくは０．００１以下のｐ値で、または０．０００９５、０．０００９、０．０００８５、０．０００８もしくは０．０００５未満のｐ値で、線維性狭窄により特徴付けられたクローン病の臨床サブタイプと関連している。いくつかの場合には、ｐ値は、例えば、因子（例えば、サンプルサイズ（家族数）、遺伝的不均一性、臨床的不均一性、または解析アプローチ（パラメーター法または非パラメーター法））を考慮するように補正される必要があり得ることが認識される。
【００５０】
種々の手段が、本発明の方法において、線維性狭窄素因対立遺伝子の存在または不在を決定するために使用され得る。例として、個体由来の核酸の酵素的増幅が、続く分析のための核酸を得るために、便宜的に使用され得る。また、線維性狭窄素因対立遺伝子の存在または不在は、酵素的増幅を行わずに、個体の核酸から直接決定され得る。
【００５１】
個体由来の核酸の分析（増幅されようがされまいが）は、種々の技術のいずれかを用いて実施され得る。有用な技術としては、限定されることなく、ポリメラーゼ連鎖反応ベースの分析、配列分析、および電気泳動分析が挙げられ、これらは、単独または組み合わせで使用され得る。本明細書中で使用される用語「核酸」は、ポリヌクレオチド（例えば、一本鎖または二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡ分子（例えば、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡおよびｍＲＮＡを含む））を意味する。用語核酸は、天然起源および合成起源の両方の核酸分子、ならびにネイティブ核酸分子のセンス鎖もしくはアンチセンス鎖、またはその両方を呈する直鎖状、環状、または分枝状配置の分子を包含する。このような核酸は、合成材料（例えば、ビーズまたはカラムマトリックス）に付着され得ることが理解される。
【００５２】
線維性狭窄素因対立遺伝子の存在または不在は、ポリメラーゼ連鎖反応による個体の核酸の増幅を包含し得る。核酸の増幅のためのポリメラーゼ連鎖反応の使用は、当該分野で周知である（例えば、Ｍｕｌｌｉｓら（編），Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ，Ｂｉｒｋｈａｅｕｓｅｒ，Ｂｏｓｔｏｎ，（１９９４）を参照のこと）。１つの実施形態では、ポリメラーゼ連鎖反応増幅は、１つ以上の蛍光標識プライマーを用いて実施される。別の実施形態では、ポリメラーゼ連鎖反応増幅は、ＤＮＡ浅溝結合剤（ＤＮＡ ｍｉｎｏｒ ｇｒｏｖｅ ｂｉｎｄｅｒ）を含む１つ以上の標識または未標識プライマーを用いて実施される。
【００５３】
いくつかの異なるプライマーが、ポリメラーゼ連鎖反応によって個体の核酸を増幅するために使用され得る。例えば、表２（配列番号３７〜４４）に列挙し、そして図５〜８に示したＰＣＲプライマーが、個体の核酸のＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５座中の特定の領域を増幅するために使用され得る。例えば、ＳＮＰ８周囲の領域は、配列番号３９および４０を用いて増幅され得；ＳＮＰ１２は、配列番号４１および４２を用いて増幅され得；そしてＳＮＰ１３周囲の領域は、配列番号４３および４４を用いて増幅され得る。さらに、例えば、周囲の領域。当業者に理解されるように、ＰＣＲ分析のために、さらなるプライマーが、目的の領域の側面に位置する配列に基づいて設計され得る。非限定的な例として、配列プライマーは、目的の領域の上流または下流の配列の約１５〜３０ヌクレオチドを含み得る。このようなプライマーは、一般に、増幅反応において安定なアニーリング工程を可能にする高い融解温度を達成するのに十分なグアニンおよびシトシン含有量を有するように設計される。いくつかのコンピュータープログラム（例えば、Ｐｒｉｍｅｒ Ｓｅｌｅｃｔ）が、ＰＣＲプライマーの設計の補助のために利用可能である。
【００５４】
Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから入手可能なＴａｑｍａｎ（登録商標）対立遺伝子識別アッセイが、線維性狭窄素因対立遺伝子の存在または不在を決定するために有用であり得る。Ｔａｑｍａｎ（登録商標）対立遺伝子識別アッセイでは、各対立遺伝子について特異的な蛍光色素標識プローブが構築される。このプローブは、各対立遺伝子の増幅を区別するために、異なる蛍光レポーター色素（例えば、ＦＡＭおよびＶＩＣＴＭ）を含む。さらに、各プローブは、一方の端部にクエンチャー色素（これは、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）により蛍光をクエンチする）を有する。ＰＣＲの間、各プローブは、個体由来の核酸中の相補配列に対して特異的にアニーリングする。Ｔａｑポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性は、対立遺伝子にハイブリダイズするプローブのみを切断するために使用される。切断は、クエンチャー色素からレポーター色素を分離し、レポーター色素による蛍光の増大を生じる。従って、ＰＣＲ増幅によって生じた蛍光シグナルは、サンプル中にどの対立遺伝子が存在するかを示す。プローブと対立遺伝子との間のミスマッチは、プローブハイブリダイゼーションおよびＴａｑポリメラーゼによる切断の両方の効率を減少させ、蛍光シグナルをほとんど生じないものとし、また全く生じさせないこともある。対立遺伝子識別アッセイにおける特異性の改善は、例えば、Ｋｕｔｙａｖｉｎら，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２８：６５５−６６１（２０００）に記載のように、ＤＮＡ浅溝結合剤（ＭＧＢ）基をＤＮＡプローブに結合体化させることにより達成され得る。浅溝結合剤としては、ジヒドロシクロピロロインドールトリペプチド（ｄｉｈｙｄｒｏｃｙｃｌｏｐｙｒｒｏｌｏｉｎｄｏｌｅ ｔｒｉｐｅｐｔｉｄｅ）（ＤＰＩ３）のような化合物が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５５】
配列分析もまた、本発明の方法において線維性狭窄素因対立遺伝子の存在または不在を決定するために有用であり得る。線維性狭窄素因対立遺伝子は、例えば、表２（配列番号３７〜４４）に列挙し、そして図５〜８に示したＰＣＲプライマーとして、本明細書中に開示されたプライマーを用いて、配列分析によって検出され得る。当業者に理解されるように、配列分析のために、さらなるプライマーが、目的の領域の側面に位置する配列に基づいて設計され得る。非限定的な例として、配列プライマーは、目的の領域の上流または下流の約４０〜４００塩基対の配列の約１５〜３０ヌクレオチドを含み得る。このようなプライマーは、一般に、配列決定反応において安定なアニーリング工程を可能にする高い融解温度を達成するのに十分なグアニンおよびシトシン含有量を有するように設計される。
【００５６】
１つ以上の核酸に関して本明細書中で使用される用語「配列分析」は、核酸中のヌクレオチドの順序が決定される任意の手動または自動プロセスを意味する。例として、配列分析は、ＤＮＡのサンプルのヌクレオチド配列を決定するために使用され得る。用語配列分析は、限定されることなく、化学的方法および酵素的方法（例えば、ジデオキシ酵素的方法（例えば、マキサム・ギルバート配列決定およびサンガー配列決定ならびにそれらの変法を包含する））を包含する。用語配列分析は、さらに、キャピラリーアレイＤＮＡ配列決定（キャピラリー電気泳動およびレーザー誘導蛍光検出に依存し、ＭｅｇａＢＡＣＥ １０００またはＡＢＩ ３７００のような機器を用いて実施され得る）を包含するが、これらに限定されない。さらなる非限定的な例として、用語配列分析は、熱サイクル配列決定（Ｓｅａｒｓら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １３：６２６−６３３（１９９２））；固相配列決定（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎら，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．３：３９−４２（１９９２）；および質量分光計（例えば、マトリックス補助レーザー脱着／イオン化飛行時間型質量分析装置ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ）を用いた配列決定（Ｆｕら，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１６：３８１−３８４（１９９８））を包含する。用語配列分析はまた、ハイブリダイゼーションによる配列決定（ＳＢＨ）（これは、未知のＤＮＡ中に存在する配列のセグメントを同定するために、全ての可能性のある短オリゴヌクレオチドのアレイに依存する）（Ｃｈｅｅら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４：６１０−６１４（１９９６）；Ｄｒｍａｎａｃら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０：１６４９−１６５２（１９９３）；およびＤｒｍａｎａｃら，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１６：５４−５８（１９９８））を包含するが、なおこれらに限定されない。当業者は、これらのおよびさらなる変法が、本明細書中で規定されるように、用語配列分析によって包含されることを理解する。一般には、Ａｕｓｕｂｅｌら，前出、Ｃｈａｐｔｅｒ ７およびｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ４７を参照のこと。
【００５７】
本発明はまた、線維性狭窄疾患により特徴付けられたクローン病の臨床サブタイプを診断するか、またはそれに対する感受性を予測する方法であって、当該方法は、個体における、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５座に連鎖された線維性狭窄素因対立遺伝子の存在または不在を決定する工程によるものであり、ここで、線維性狭窄素因対立遺伝子の存在が、線維性狭窄疾患により特徴付けられたクローン病の臨床サブタイプの診断またはそれに対する感受性の予測となり、そしてここで当該方法が、個体からＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５座を含む核酸を含有する材料を得る工程を包含する、方法を提供する。本明細書中で使用される用語「材料」は、核酸が調製され得る任意の生物学的物質を意味する。非限定的な例として、用語材料は、全血、血漿、唾液、頬スワブ、または核酸を含有する他の体液または組織を包含する。１つの実施形態では、本発明の方法は、全血を用いて実施される。全血は、非侵襲的手段によって容易に得られ得、そして例えば酵素的増幅または自動配列決定のために、ゲノムＤＮＡを調製するために使用され得る。別の実施形態では、本発明の方法は、個体から得られた組織（例えば、外科手順または生検手順の間に得られた組織）を用いて実施される。
【００５８】
電気泳動分析もまた、本発明の方法において有用であり得る。１つ以上の核酸（例えば、増幅フラグメント）に関して本明細書中で使用される電気泳動分析は、装填された分子が、電場の影響下で固定培地中を移動するプロセスを意味する。電気泳動移動は、主としてそれらの電荷に基づいて核酸を分離し、電荷は、その大きさに比例し、小さな分子であるほど、より迅速に移動する。用語電気泳動分析は、限定されることなく、スラブゲル電気泳動（例えば、アガロースまたはポリアクリルアミドゲル電気泳動）、またはキャピラリー電気泳動を用いる分析を包含する。キャピラリー電気泳動分析は、一般に、高（キロボルトレベル）分離電圧の存在下で、数分の分離時間で、小直径（５０〜１００ ｍ）石英キャピラリー内部で生じる。キャピラリー電気泳動分析を用いて、核酸は、ＵＶ吸収または蛍光標識によって便宜的に検出され、そして数百塩基対までのフラグメントに対して、一塩基分解能が得られ得る。このような電気泳動分析方法およびそれらの変法は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｃｈａｐｔｅｒ ２（Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ４５）Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９９）に記載されるように、当該分野で周知である。
【００５９】
制限フラグメント長多型（ＲＦＬＰ）分析もまた、本発明の方法において線維性狭窄素因対立遺伝子の存在または不在を決定するために有用であり得る（Ｊａｒｃｈｏら、Ｄｒａｃｏｐｏｌｉら，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２．７．１−２．７．５頁，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｉｎｎｉｓら，（編），ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ：Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．（１９９０））。本明細書中で使用される制限フラグメント長多型分析は、制限酵素を用いて遺伝的多型を識別するための任意の方法であり、この制限酵素は、核酸の分解を触媒し、特異的な塩基配列（一般に、パリンドロームまたは逆方向反復）を認識するエンドヌクレアーゼである。当業者は、ＲＦＬＰ分析の使用が、多型部位で２つの対立遺伝子を区別し得る酵素に依存することを理解する。
【００６０】
対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションもまた、線維性狭窄素因対立遺伝子の存在または不在を検出するために使用され得る。対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションは、（例えば、線維性狭窄素因対立遺伝子を包含する配列に対して）完全に相補的な配列を有する標識オリゴヌクレオチドプローブの使用に基づく。適切な条件下で、対立遺伝子特異的プローブは、線維性狭窄素因対立遺伝子を含有する核酸に対してハイブリダイズするが、１つ以上の他の対立遺伝子（これは、プローブと比較して１つ以上のヌクレオチドミスマッチを有する）にはハイブリダイズしない。所望であれば、代替の対立遺伝子にマッチする第二の対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブもまた用いられ得る。同様に、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド増幅の技術が、例えば、線維性狭窄素因対立遺伝子を、線維性狭窄素因対立遺伝子のヌクレオチド配列に対して完全に相補的であるが、他の対立遺伝子に比較して１つ以上のミスマッチを有する対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプライマーを用いることにより選択的に増幅するために、使用され得る（Ｍｕｌｌｉｓら，前出、１９９４）。当業者は、線維性狭窄素因対立遺伝子と１つ以上の他の対立遺伝子との間を識別する１つ以上のヌクレオチドミスマッチが、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションにおいて使用されるべき対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプライマーの中央部に、しばしば位置することを理解する。対して、ＰＣＲ増幅において使用されるべき対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプライマーは、一般に、プライマーの３’末端に、疾患関連対立遺伝子と他の対立遺伝子との間を識別する１つ以上のヌクレオチドミスマッチを含有する。
【００６１】
ヘテロ二重鎖移動度アッセイ（ＨＭＡ）は、本発明の方法において線維性狭窄素因対立遺伝子の存在または不在を検出するために使用され得る別の周知のアッセイである。ＨＭＡは、多型配列の存在を検出するために有用である。なぜならミスマッチを有するＤＮＡ二重鎖は、完全に塩基対合した二重鎖の移動度に比較してポリアクリルアミドゲル中の移動度が低下しているからである（Ｄｅｌｗａｒｔら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６２：１２５７−１２６１（１９９３）；Ｗｈｉｔｅら，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ １２：３０１−３０６（１９９２））。
【００６２】
一本鎖コンフォメーション多型（ｓｉｎｇｌｅ ｓｔｒａｎｄ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）（ＳＳＣＰ）の技術もまた、本発明の方法において線維性狭窄素因対立遺伝子の存在または不在を検出するために使用され得る（Ｈａｙａｓｈｉ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌｉｃ．１：３４−３８（１９９１）を参照のこと）。この技術は、一本鎖ＤＮＡの二次構造における差異に基づいて変異を検出するために使用され、この差異が、非変性ゲル電気泳動の際に変化した電気泳動移動度を生じる。多型フラグメントは、既知の対立遺伝子を含有する対応する標準フラグメントに対して試験フラグメントの電気泳動パターンを比較することにより検出される。
【００６３】
変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）もまた、本発明の方法において線維性狭窄素因対立遺伝子を検出するために使用され得る。ＤＧＧＥでは、二本鎖ＤＮＡが、変性剤の濃度を増大させながら含有するゲル中で電気泳動される；ミスマッチ対立遺伝子で構成される二本鎖フラグメントは、より迅速に融解するセグメントを有し、このため、このようなフラグメントは、完全に相補的な配列に比較して異なる移動を示す（Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄら，「Ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ ｂｙ Ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ Ｇｒａｄｉｅｎｔ Ｇｅｌ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ」、Ｉｎｎｉｓら，前出、１９９０）。
【００６４】
線維性狭窄素因対立遺伝子の存在または不在を決定するために有用な他の分子学的方法は、当該分野で公知であり、そして本発明の方法において有用である。線維性狭窄素因対立遺伝子の存在または不在を決定するための他の周知のアプローチは、限定されることなく、自動配列決定技術およびＲＮＡアーゼミスマッチ技術（Ｗｉｎｔｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８２：７５７５−７５７９（１９８５））を包含する。さらに、当業者は、多重対立遺伝子または線維性狭窄素因ハプロタイプの存在または不在を決定しようとする場合、個々の対立遺伝子が、分子学的方法の任意の組み合わせによって検出され得ることを理解する。一般には、Ｂｉｒｒｅｎら（編）Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｖｏｌｕｍｅ １（Ａｎａｌｙｚｉｎｇ ＤＮＡ）Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９７）を参照のこと。さらに、当業者は、多重対立遺伝子が個々の反応においてまたは単一の反応において検出され得ることを理解する（「マルチプレックス（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ）」アッセイ）。上記を考慮して、当業者は、線維性狭窄疾患により特徴付けられたクローン病の臨床サブタイプを診断するか、またはそれに対する感受性を予測するための本発明の方法が、上記の周知のアッセイまたは当該分野で公知のアッセイのいずれかまたは任意の組み合わせを用いて実施され得ることを認識する。
【００６５】
本発明は、線維性狭窄疾患により特徴付けられたクローン病の臨床サブタイプを診断するか、またはそれに対する感受性を予測するための方法であって、当該方法は、個体における、線維性狭窄素因ハプロタイプの存在または不在を決定する工程によるものであり、ここで、線維性狭窄素因ハプロタイプの存在が、線維性狭窄疾患により特徴付けられたクローン病の臨床サブタイプの診断またはそれに対する感受性の予測となる、方法をさらに提供する。１つの実施形態では、線維性狭窄素因ハプロタイプは、少なくとも２のオッズ比および１より大きな下位９５％信頼限界で、線維性狭窄疾患により特徴付けられたクローン病の臨床サブタイプと関連している。別の実施形態では、線維性狭窄素因ハプロタイプは、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６のオッズ比および１より大きな下位９５％信頼限界で、線維性狭窄疾患により特徴付けられたクローン病の臨床サブタイプと関連している。
【００６６】
本明細書中で使用される用語「線維性狭窄素因ハプロタイプ」は、伝統的なメンデル遺伝学に従って予期されるよりも高い頻度で、線維性狭窄疾患により特徴付けられたクローン病の臨床サブタイプと共に遺伝する傾向のある対立遺伝子の組み合わせを意味する。本発明の方法において、クローン病の臨床サブタイプは、例えば、小腸罹患とは独立して線維性狭窄疾患により特徴づけられ得る。１つの実施形態では、線維性狭窄素因ハプロタイプは、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５座に連鎖された少なくとも１つの対立遺伝子を含む。別の実施形態では、線維性狭窄素因ハプロタイプは、線維性狭窄素因対立遺伝子を含む。さらなる実施形態では、線維性狭窄素因ハプロタイプは、例えば、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５座での改変型対立遺伝子を含む。別の実施形態では、線維性狭窄素因ハプロタイプは、ＳＮＰ８、ＳＮＰ１２、またはＳＮＰ１３での「２」対立遺伝子を含む。さらなる実施形態では、線維性狭窄素因ハプロタイプは、ＳＮＰ１３での「２」対立遺伝子を含む。なおさらなる実施形態では、線維性狭窄素因ハプロタイプは、ＳＮＰ８、ＳＮＰ１２、およびＳＮＰ１３での「２」対立遺伝子を含む。別の実施形態では、線維性狭窄素因ハプロタイプは、ＪＷ１、ＪＷ１５、ＪＷ１６、ＪＷ１７、またはＪＷ１８改変型対立遺伝子を含む。当業者は、線維性狭窄素因ハプロタイプが、以下のような対立遺伝子を含み得ることを理解する。これら対立遺伝子は、個々には、クローン病の線維性狭窄サブタイプと有意に関連していないが、そのハプロタイプを構成する対立遺伝子の組み合わせでは、伝統的なメンデル遺伝学に従って予期されるよりも高い頻度で、線維性狭窄疾患により特徴付けられたクローン病の臨床サブタイプと共に遺伝する傾向がある。
【００６７】
線維性狭窄素因ハプロタイプの存在または不在は、線維性狭窄素因対立遺伝子の存在または不在を決定するために上記で本明細書中に記載された方法のいずれかを用いて成し遂げられ得る。例として、酵素的増幅（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応増幅（例えば、１つ以上の蛍光標識プローブまたはＤＮＡ浅溝結合剤を含む１つ以上のプローブを用いる））は、本発明の方法において線維性狭窄素因ハプロタイプの存在または不在を決定するために有用であり得る。
【００６８】
抗体ベースの方法もまた、本発明の方法において線維性狭窄素因対立遺伝子または線維性狭窄素因ハプロタイプの存在または不在を決定するために有用であり得る。例として、線維性狭窄素因対立遺伝子によりコードされたポリペプチドまたはそれらのフラグメントと特異的に反応性である抗体が、個体においてその対立遺伝子の存在または不在を検出するために使用され得る。このような抗体は、例えば、ＳＮＰ１３での「２」対立遺伝子により生じたＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５の短縮バージョンと特異的に反応し得るが、全長または野生型ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５とは反応性ではない。
【００６９】
本発明の方法において有用な抗体は、限定されることなく、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体、単鎖抗体、キメラ抗体、二官能性抗体または二重特異的抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、および相補性決定領域（ＣＤＲ）グラフト化抗体（ＣＤＲまたは抗原結合配列を含む化合物を含む）を含み、これらは、線維性狭窄素因対立遺伝子によりコードされたポリペプチドまたはフラグメントに識別的に結合するが他の非素因性対立遺伝子によるものには結合しない。抗体フラグメント（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖを含む）もまた、可塑性抗体（ｐｌａｓｔｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）または分子インプリントポリマー（ｍｏｌｅｃｕｌａｒｌｙ ｉｍｐｒｉｎｔｅｄ ｐｏｌｙｍｅｒｓ）（ＭＩＰ；ＨａｕｐｔおよびＭｏｓｂａｕｃｈ，ＴＩＢＴｅｃｈ １６：４６８−４７５（１９９８））と同様に、本発明の方法において有用であり得る。抗体の識別的な結合特異性を決定するためのスクリーニングアッセイは、当該分野において周知である（Ｈａｒｌｏｗら（編），Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８８）を参照のこと）。
【００７０】
本発明の方法において有用な抗体は、線維性狭窄素因対立遺伝子によりコードされたポリペプチドまたはそれらの免疫原性フラグメントを用いる、当該分野で周知の任意の方法を用いて生成され得る。免疫原性ポリペプチドまたはフラグメントは、天然供給源から、組換え宿主細胞から単離され得るか、または化学合成され得る。このようなペプチドを合成するための方法は、例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９−２１５４（１９６３）；Ｋｒｓｔｅｎａｎｓｋｙら，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２１１：１０（１９８７）に記載されるように、当該分野で公知である。
【００７１】
本発明の線維性狭窄素因対立遺伝子によりコードされたポリペプチドに識別的に結合する抗体は、検出部分で標識され得、そしてそのコードされたポリペプチドの存在、不在、または量をインビボ、インビトロ、またはインサイチュで検出するために使用され得る。蛍光分子のような部分は、本発明の方法において使用される抗体に連結され得る。検出部分のような部分は、例えば、カルボジイミド結合体化を用いて、抗体に連結され得る（ＢａｕｍｉｎｇｅｒおよびＷｉｌｃｈｅｋ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．７０：１５１−１５９（１９８０））。
【００７２】
線維性狭窄素因対立遺伝子によりコードされたポリペプチドに識別的に結合する抗体が、免疫アッセイにおいて使用され得る。免疫アッセイは、限定されることなく、放射性免疫アッセイ、酵素結合型免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、および蛍光標識抗体を用いる免疫アッセイ（これらは当該分野で周知である）を含む。抗体はまた、免疫組織化学または他のインサイチュアッセイを用いて、細胞または組織における目的のポリペプチドの存在または不在を検出するために使用され得る。さらに、細胞の表面上または内部のいずれかに目的のポリペプチドを含有する細胞が、アッセイ（例えば、蛍光活性化細胞分析分離装置（ＦＡＣＳ））を用いて、抗体によって検出され得る。当業者は、これらのアッセイおよび他の慣用のアッセイが、本発明の方法に従って、線維性狭窄素因対立遺伝子の遺伝子産物の存在または不在を決定するために有用であり得ることを理解する。
【００７３】
本発明の方法は、必要に応じて、個体における、線維性狭窄素因対立遺伝子または線維性狭窄素因ハプロタイプの存在または不在を示す報告を作成する工程を包含する。本発明の方法はまた、必要に応じて、個体における、線維性狭窄疾患により特徴付けられたクローン病の臨床サブタイプの存在または不在、または個体がクローン病の線維性狭窄サブタイプを有するもしくは発症する危険度を示す報告を作成する工程を包含する。
【００７４】
報告は、種々の様式であり得る。例えば、報告は紙に印刷され得るか、または報告は、印刷されずに電子媒体で伝達され得る電子報告（例えば、電子メールまたはコンピューターディスク）であり得る。報告はまた、個体における、線維性狭窄素因対立遺伝子の、または線維性狭窄疾患により特徴付けられたクローン病の臨床サブタイプの存在または不在を示す口頭での報告であり得る。
【００７５】
本発明はまた、個体における治療を最適化する方法であって、当該方法は、当該個体における、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５座に連鎖された線維性狭窄素因対立遺伝子の存在または不在を決定する工程、線維性狭窄素因対立遺伝子が存在する個体を、クローン病の線維性狭窄サブタイプを有するとして診断する工程、およびこの診断に基づいて、クローン病の線維性狭窄サブタイプを有する個体を処置する工程によるものである、方法を提供する。クローン病の線維性狭窄サブタイプのための処置は、現行では、例えば、腸の罹患狭窄部の外科的除去を含む。１つの実施形態では、線維性狭窄素因対立遺伝子の存在または不在は、クローン病の既知の診断を有する個体において決定される。別の実施形態では、診断は、上記のような報告の様式で記録される。
【実施例】
【００７６】
以下の実施例は、本発明を例示するが限定するものでないことが意図される。
【００７７】
（実施例Ｉ）
（研究被験体の選択および特徴づけ）
本実施例は、クローン病患者の２つのコホートがいかなるものであるかの臨床的特徴づけを記載する。
【００７８】
（Ａ．研究被験体の選択）
クローン病患者の２つのコホートを、炎症性腸疾患紹介センター（Ｃｅｄａｒｓ−Ｓｉｎａｉ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｂｏｗｅｌ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｅｎｔｅｒ）から引き続いて同定した。１４２人の患者の第一のコホート（１９９３年〜１９９６年の間に把握された；「ＣＤ１」と称する）は、Ｖａｓｉｌｉａｕｓｋａｓら，Ｇｕｔ ４７：４８７−４９６（２０００））において以前に記載された。５９人の患者の第二のコホート（コホート２）を、１９９９年〜２００１年の間に集め、そして「ＣＤ２」と称した。１７５人の潰瘍性大腸炎患者のコホートを、炎症性腸疾患コントロール群として使用した。本研究（これは、Ｃｅｄａｒｓ−Ｓｉｎａｉ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒｄにより、ヒト被験体参加について検討され、認可された）は、本研究に同意する患者からの臨床データ、血清学的データおよび遺伝学的データの収集を包含した。
【００７９】
コホート患者におけるクローン病の診断は、以下のカテゴリーの少なくとも２つからの確立した特徴の組み合わせの存在によって確定した：１）臨床検査−穿孔疾患または瘻孔形成疾患、小腸の狭窄（ｓｔｅｎｏｓｉｓ）または狭窄（ｓｔｒｉｃｔｕｒｅ）に続発的な閉塞性の症状；２）内視鏡検査−深い線状または蛇行状の潰瘍形成、正常に見える粘膜における離散性潰瘍、丸石化（ｃｏｂｂｌｅｓｔｏｎｉｎｇ）、または不連続もしくは非対称の炎症；３）Ｘ線検査−分節性疾患（跳躍病変）、小腸または結腸の狭窄（ｓｔｒｉｃｔｕｒｅｓ）、狭窄（ｓｔｅｎｏｓｉｓ）またはフィステル；および４）組織病理検査−粘膜下または経壁性炎症、多発性肉芽腫、生検の期間内または生検間の顕著な巣状の陰窩炎（ｆｏｃａｌ ｃｒｙｐｔｉｔｉｓ）または巣状の慢性炎症浸潤、または跳躍病変（局所治療なしに直腸節約（ｒｅｃｔａｌ ｓｐａｒｉｎｇ）を含む）。
【００８０】
ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５遺伝子の対立遺伝子改変型と関連した臨床的特徴および免疫学的形質を同定するために、本研究を設計して、２つの引き続き把握されたクローン病患者コホートを解析した。第一のコホートを使用して、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５対立遺伝子と臨床的変数および血清学的変数のアレイとの関係を調査し、それにより仮説を立てた。次いで、第二のコホートを使用して、第一のコホートの解析から立てた特定の仮説を確認した。第一種の過誤を最小とし、そして統計的検出力を最大にするために、第一のコホートにおける関連性の有意性を、第二のコホート（ｐ＜０．０５）におけるよりも厳密でなくてもよいものとした（ｐ＜０．１）。第一のコホートにおいて調べた変数の数について高度に厳密な補正を回避することにより、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５対立遺伝子改変型と臨床的変数との間の特定の関連性を同定することがますますできるようになった。
【００８１】
（Ｂ．研究被験体の臨床的特徴づけ）
クローン病患者を、以前に記載された診断基準（Ｇａｓｃｈｅら，Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｂｏｗｅｌ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ６：８−１５（２０００）；Ｖａｓｉｌｉａｕｓｋａｓら，Ｇｕｔ ４７：４８７−４９６（２０００）；Ｖａｓｉｌｉａｕｓｋａｓら，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １１０：１８１０−１８１９（１９９６）；およびＧｒｅｅｎｓｔｅｉｎら，Ｇｕｔ ２９：５８８−５９２（１９８８））に基づいて、線維性狭窄疾患、内部穿孔疾患、肛門周囲瘻孔形成疾患、または潰瘍性大腸炎（ＵＣ）様疾患を有するとして特徴付けた。十分に確立された判断基準に従って、線維性狭窄疾患を、検査による存続腸閉塞または腸閉塞のための腸管切除によって確定した。内部穿孔疾患を、腸−腸もしくは腸−膀胱フィステル、腹内膿瘍、または小腸穿孔の現在または以前の形跡として確定した。肛門周囲瘻孔形成疾患を、肛門周囲フィステルもしくは膿瘍または直腸膣フィステルのいずれかの現在または以前の形跡によって確定した。潰瘍性大腸炎（ＵＣ）様疾患を、以前に記載されたように、左側結腸罹患、出血もしくは尿意促迫の症状、および結腸生検における陰窩膿瘍の現在または以前の形跡によって確定した。疾患の位置を、１つ以上の内視鏡研究、Ｘ線研究、または病理研究に基づいて、小腸、結腸、またはその両方として分類した。血清学的試験および遺伝学的試験の結果を知らない炎症性腸疾患医師団は、臨床データに基づく表現型に対して同意に達した。
【００８２】
血清ＡＮＣＡ発現およびＡＮＣＡサブタイプ特徴づけを、以前に記載されるように（Ｓａｘｏｎら，Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８６：２０２−２１０（１９９０））、固定好中球酵素結合型免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって実施した。簡潔には、メタノールで固定したヒト末梢血好中球を、コントロール血清およびコード化（ｃｏｄｅｄ）した血清と１：１００希釈で反応させた。アルカリホスファターゼに結合体化した抗ヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）（鎖特異的）抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｓ，Ｉｎｃ．；Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）を添加して好中球結合抗体を標識し、そして比色分析反応を実施した。十分に特徴付けられたｐＡＮＣＡ＋ ＵＣ患者から得たプールした血清からなる標準に対して、レベルを決定した。結果は、１ミリリットル当たりＥＬＩＳＡ単位（ＥＵ）として表した。以前に記載されるように（Ｓａｘｏｎら，前出、１９９０）、間接的免疫蛍光染色によってＡＮＣＡ＋血清をさらにサブタイプ分類して、ＡＮＣＡ好中球結合パターンを決定した。特徴的な核周囲のハイライトを示し、かつデオキシリボヌクレアーゼで処理した場合に特徴的な染色パターンを喪失する血清を、ｐＡＮＣＡ＋と称した（Ｖｉｄｒｉｃｈら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：２９３−２９９（１９９５））。本研究の目的のために、患者が、ＥＬＩＳＡによりＡＮＣＡに対して陽性であり、かつデオキシリボヌクレアーゼ処理で核周囲免疫蛍光染色を喪失した場合、その患者をｐＡＮＣＡ＋とみなした。
【００８３】
血清を、固定ＥＬＩＳＡアッセイを用いることにより、盲検様式で、ＡＳＣＡ発現について分析した（Ｖａｓｉｌｉａｕｓｋａｓら，Ｇｕｔ ４７：４８７−４９６（２０００）；およびＶｅｒｍｅｉｒｅら，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １２０：８２７−８３３（２００１））。第二のコホート中２人の患者は、ＡＳＣＡ試験を受けなかった。高結合ポリスチレンマイクロタイタープレートを、酵母Ｓ．ｕｖａｒｕｍ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの亜種）から抽出された精製ホスホペプチドマンナンでコーティングした。コード化した患者血清を希釈し、そしてウェルに添加し、続いて酵素結合型比色反応を行った。呈色は、血清中に存在するＡＳＣＡ抗体の濃度に比例した。標準（これは、この抗原に対する反応性を有することが見い出された、十分に特徴付けられたクローン病を有する患者の血清のプールに由来した）に対して、レベルを決定し、そしてＥＵ／ｍＬとして結果を表した。４０ＥＵ／ｍＬより大きなＡＳＣＡ ＩｇＧ反応性または２０ＥＵ／ｍＬより大きなＩｇＡ反応性を示す血清を、ＡＳＣＡ＋と称した。Ｃｅｄａｒｓ−Ｓｉｎａｉ
Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ａｎｄ Ｐｒｏｍｅｔｈｅｕｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）で、実質的に同一の方法を用いて、血清学的アッセイを実施した。これら２つのクローン病コホートの臨床的特徴を、表１に示す。
【００８４】
【表１】
（実施例ＩＩ）
（クローン病患者はＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５の稀な対立遺伝子改変型を増大した頻度で有する）
本実施例は、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５座内のＳＮＰ８、ＳＮＰ１２、またはＳＮＰ１３での「２」対立遺伝子（ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５の稀な対立遺伝子改変型）と、北米人集団におけるクローン病との関連を記載する。
【００８５】
コホート１および２における北米人クローン病患者集団がＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５の対立遺伝子改変型を発現したかどうかを決定するために、コホート１（仮説決定）およびコホート２（仮説確認）を、ＳＮＰ８（Ｒ６７５Ｗ）、ＳＮＰ１２（Ｇ８８１Ｒ）、およびＳＮＰ１３（３０２０ｉｎｓＣ）の稀な対立遺伝子改変型について遺伝子型判定した。潰瘍性大腸炎のコホートを比較のために使用した。
【００８６】
遺伝子型判定を、５’−エキソヌクレアーゼ技術を用いる遺伝子型判定アッセイであるＴａｑＭａｎ ＭＧＢＴＭアッセイ（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いて実施した。ソフトウェアＰｒｉｍｅｒＥｘｐｒｅｓｓ １．５ＴＭ（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）およびＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５ ＳＮＰ５、８、１２、および１３についてｄｂＳＮＰにおいて見い出される配列情報を用いて、プライマーを設計した。ＭＧＢＴＭ設計は、「浅溝結合剤」をＴａｑＭａｎＴＭプローブの３’末端に付加し、それによりプローブの結合温度を上昇させ、従来のＴａｑＭａｎＴＭアッセイにおけるよりも短いプローブの使用を可能にする（Ｋｕｔｙａｖｉｎら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３７１８−３７２３（１９９７））。これは、アッセイにおける対立遺伝子間の識別を増大させる効果を有する（Ｋｕｔｙａｖｉｎら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８：６５５−６６１（２０００））。ＡＢＩ ７９００機器で製造者の推奨（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ｂｕｌｌｅｔｉｎ ４３１７５９４）に従ってアッセイを実施した。遺伝子型判定を、被験体の臨床状態に対して目隠しにして実施した。この遺伝子型判定アッセイにおいて使用したプライマーおよびプローブを表２および表３に示す。
【００８７】
【表２】
【００８８】
【表３】
表４に示されるように、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５の３つの稀な対立遺伝子改変型の各々（ＳＮＰ８、ＳＮＰ１２、またはＳＮＰ１３での「２」対立遺伝子）は、潰瘍性大腸炎患者と比較してクローン病患者において有意に頻度が高かった。さらに、表４中で見られ得るように、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５の稀な対立遺伝子改変型の各々の頻度は、クローン病患者の各コホートにおいて同様であり、このことは、これら２つのコホートの組み合わせ使用を支持した。ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５のこれら３つのうちいずれかの稀な対立遺伝子改変型の頻度全体では、潰瘍性大腸炎患者が１１％であるのに比較して、クローン病患者は３５％であった（ｐ＝０．００１）。
【００８９】
組み合わせたクローン病コホートの中で、ＳＮＰ１３での「２」対立遺伝子（３０２０ｉｎｓＣ）を有するホモ接合体および複合の稀な対立遺伝子へテロ接合体の頻度はそれぞれ１％と４％であったが、潰瘍性大腸炎患者のいずれもこのような遺伝子型を有しなかった。これらの結果は、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５の稀な対立遺伝子改変型が、多様な地理学的および民族学的に定義された患者集団を越えて、クローン病と関連していることを実証する。
【００９０】
【表４】
（実施例ＩＩＩ）
（ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５座における稀な改変型対立遺伝子はコホート１においてクローン病の線維性狭窄サブタイプと関連している）
本実施例は、コホート１において、ＳＮＰ８、ＳＮＰ１２、またはＳＮＰ１３での「２」対立遺伝子が、線維性狭窄疾患と有意に関連していることを実証する。
【００９１】
クローン病患者は、多様な臨床表現型を発現し、この表現型は、根底の遺伝的要因における差異に起因し得る。ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５座での稀な改変体対立遺伝子が、特定のクローン病関連臨床表現型または疾患関連血清免疫マーカーと関連しているかを決定するために、単変量解析を実施した。単変量解析は、ＳＮＰ８、ＳＮＰ１２、またはＳＮＰ１３でのＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５対立遺伝子改変型と予め規定された臨床的特徴（発症時年齢、疾患位置、および疾患表現型（線維性狭窄疾患、内部穿孔疾患、肛門周囲瘻孔形成疾患、または潰瘍性大腸炎様疾患）を含む）との間の関連を評価した。ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５対立遺伝子改変型と血清免疫マーカーＡＳＣＡおよびｐＡＮＣＡの発現との間の関連もまた検証した。
【００９２】
表５において示されるように、単変量解析は、コホート１において、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５座のＳＮＰ８、ＳＮＰ１２、またはＳＮＰ１３での「２」対立遺伝子が、組み合わせた３つの対立遺伝子改変型について線維性狭窄疾患と有意に関連している（ｐ＝０．０４９）ことを示した。このコホートにおいては、小腸罹患および発症時年齢がより若いこととは、より厳密でない有意水準での正の相関（ｐ＜０．１）がまた見られ、そしてＵＣ様疾患とは、負の相関が見られた。血清学的マーカーに関して、ＳＮＰ１３での「２」対立遺伝子を有する患者の方が、ＡＳＣＡを発現する確率が高かった（ｐ＝０．０５３）。これらの結果は、コホート１において、ＳＮＰ８、ＳＮＰ１２、またはＳＮＰ１３での「２」対立遺伝子が、線維性狭窄疾患と有意に関連していることを実証する。
【００９３】
統計学的解析を、ＳＡＳコンピューターソフトウェア（Ｖｅｒｓｉｏｎ ６．１０；ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｉｎｃ．；Ｃａｒｙ，ＮＣ）を用いて実施した。量的変数を、範囲と共に中央値として記載した。非パラメーター統計学的検定を用いて、２群間の量的変数における差異を検証した。χ二乗検定またはフィッシャーの直接確率（期待数が５未満である場合）を用いて、稀な対立遺伝子のキャリアと非キャリアとの間、または遺伝子型とカテゴリー変数（例えば、ＩＢＤのタイプ、疾患位置、疾患挙動、および抗体陽性）との間の関連を評価した。さらに、全ての遺伝子型および表現型の関連について、Ｍａｎｔｅｌ Ｈａｅｎｓｚｅｌ層化関連検定（Ｍａｎｔｅｌ Ｈａｅｎｓｚｅｌ ｓｔｒａｔｉｆｉｅｄ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｔｅｓｔ）を、民族バリエーションに起因する潜在的な交絡効果について条件付けすることにより実施した。また、この層化関連検定を使用して、小腸罹患と線維性狭窄疾患とがＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５改変型と独立に関連しているか否かも評価した（以下の実施例ＩＸを参照のこと）。
【００９４】
【表５】
（実施例ＩＶ）
（ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５座における稀な改変型対立遺伝子はコホート２においてクローン病の線維性狭窄サブタイプと関連している）
本実施例は、コホート２において、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５座のＳＮＰ８、ＳＮＰ１２、またはＳＮＰ１３での「２」対立遺伝子が、線維性狭窄疾患と有意に関連していることを実証する。
【００９５】
実施例ＩＩＩにおいてコホート１で得られた結果は、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５の稀な改変型対立遺伝子が線維性狭窄クローン病、小腸罹患、ＡＳＣＡ陽性、および発症時年齢がより若いことと正の相関があり、そしてＵＣ様疾患と負の相関があったことを示した（表５を参照のこと）。これらの仮説を、コホート２を用いてさらに検証した。この結果を表６に示す。コホート１と同様に、コホート２は、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５座のＳＮＰ８、ＳＮＰ１２、またはＳＮＰ１３での「２」対立遺伝子と線維性狭窄疾患との間の有意な相関を示した（ｐ＝０．００２、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ補正ではｐ＝０．０１；表６を参照のこと）。これらの結果は、コホート２において、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５座のＳＮＰ８、ＳＮＰ１２、またはＳＮＰ１３での「２」対立遺伝子が、線維性狭窄疾患と有意に関連していることを示す。
【００９６】
【表６】
（実施例Ｖ）
（ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５座における稀な改変型対立遺伝子はコホート１およびコホート２を表す組み合わせコホートにおいてクローン病の線維性狭窄サブタイプと関連している）
本実施例は、コホート１およびコホート２を表す組み合わせコホートにおいて、ＳＮＰ８、ＳＮＰ１２、またはＳＮＰ１３での「２」対立遺伝子が、線維性狭窄疾患と有意に関連していることを実証する。
【００９７】
図２において見られるように、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５座のＳＮＰ８、ＳＮＰ１２、またはＳＮＰ１３での「２」対立遺伝子（ＮＯＤ２改変型キャリア）と線維性狭窄疾患との間の関連は、これらの２つのコホートを個々に解析した場合よりも一緒に解析した場合において、ずっとより有意であった（ｐ＝０．００１）。
【００９８】
ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５座のＳＮＰ８、ＳＮＰ１２、またはＳＮＰ１３での「２」対立遺伝子（ＮＯＤ２改変型キャリア）と線維性狭窄疾患との間の関連は、ユダヤ人個体と非ユダヤ人個体との両方において観察された。線維性狭窄疾患を有しないクローン病患者では２３％（ユダヤ人２１．６％対非ユダヤ人２５％）のみであることと比較して、線維性狭窄疾患を有するクローン病患者ではおよそ４６％（ユダヤ人５２％対非ユダヤ人４２％）が、これらの稀な対立遺伝子の少なくとも１つを有した（オッズ比２．８；９５％信頼区間１．５６−５．１８）。これら３つの稀な改変型対立遺伝子のうち、フレームシフト変異３０２０ｉｎｓＣ（ＳＮＰ１３での「２」対立遺伝子）が、線維性狭窄疾患と最大の関連を示した（４７％対１７％、ｐ＝０．００６（組み合わせコホートに対して））。これらの結果は、コホート１およびコホート２を表す組み合わせコホートにおいて、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５座における稀な改変型対立遺伝子が、クローン病の線維性狭窄サブタイプと関連していることを示す。
【００９９】
（実施例ＶＩ）
（ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５におけるホモ接合性変異または複合ヘテロ接合性変異を有するクローン病患者）
本実施例は、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５座におけるホモ接合性変異または複合ヘテロ接合性変異を有するクローン病患者における線維性狭窄疾患の危険度の増大を記載する。
【０１００】
図３に示されるように、ＳＮＰ８、ＳＮＰ１２、またはＳＮＰ１３でのＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５変異のキャリアではない患者と比較して、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５における２つの変異のキャリアである患者の方が、線維性狭窄疾患を有する確率が有意に高かった（８５％対４３％；オッズ比７．４；９５％信頼区間１．９−２８．９，ｐ＝０．００４）。また、単一のＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５変異のキャリアである患者の方が、これらのＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５変異のキャリアではない患者と比較した場合に、線維性狭窄疾患を有する確率が有意に高かった（６４％対４３％；オッズ比２．３７；９５％信頼区間１．２６−４．４７；ｐ＝０．００８）。これらの結果は、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５におけるホモ接合性変異または複合ヘテロ接合性変異を有するクローン病患者が、線維性狭窄疾患についての危険度が高いことを示す。
【０１０１】
（実施例ＶＩＩ）
（線維性狭窄疾患のみと線維性狭窄疾患および穿孔疾患との比較）
本実施例は、線維性狭窄疾患および穿孔疾患を有する患者と比較した、線維性狭窄疾患を有する患者におけるＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５座のＳＮＰ８、ＳＮＰ１２、またはＳＮＰ１３での「２」対立遺伝子の関連を記載する。
【０１０２】
線維性狭窄疾患および穿孔疾患は、しばしば、同じ患者において生じる。線維性狭窄疾患を有する患者は、ｉ）線維性狭窄疾患のみを有する、またはｉｉ）線維性狭窄疾患および穿孔疾患の両方を有するとして特徴付けられ得る。これらの表現型に個々に取り組むために、これら２つのコホートの各々における患者を、穿孔合併症ありで線維性狭窄がある場合（Ｆｉｂ＋ｐｅｒｆ）または穿孔合併症なしで線維性狭窄がある場合（Ｆｉｂのみ）によって分別し、線維性狭窄の形跡のない穿孔合併症を有する患者（Ｐｅｒｆのみ）と比較した。線維性狭窄疾患のみを有する患者でＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５座のＳＮＰ８、ＳＮＰ１２、またはＳＮＰ１３での「２」対立遺伝子を有する割合は、４８．３％であり、これは、線維性狭窄合併症および穿孔合併症の両方を有する患者において見られる割合と同様であった（４６．０％；ｐ＝０．８）。図３に見られるように、線維性狭窄疾患を有する患者を穿孔疾患（肛門周囲または内部）のみを有するとして記載される患者と比較した場合、線維性狭窄疾患を有する患者（穿孔合併症ありまたは穿孔合併症なし）におけるＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５座のＳＮＰ８、ＳＮＰ１２、またはＳＮＰ１３での「２」対立遺伝子の頻度は、穿孔合併症のみを有する患者で見られるよりも有意に大きかった（４６．６％対１８．６％；ｐ＝０．００２）。
【０１０３】
（実施例ＶＩＩＩ）
（組み合わせ患者コホートにおける多変量解析）
本実施例は、線維性狭窄疾患がＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５座のＳＮＰ８、ＳＮＰ１２、またはＳＮＰ１３での「２」対立遺伝子と独立に関連していることを実証する。
【０１０４】
多変量解析のために、いずれのコホートにおいても、少なくとも境界域の有意性（ｐ＜０．１）を有する全ての変数を、ロジスティック回帰を用いることにより、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５座のＳＮＰ８、ＳＮＰ１２、またはＳＮＰ１３での「２」対立遺伝子とのそれらの関連について同時に試験した。表７に示されるように、線維性狭窄疾患の臨床表現型は、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５座でのこれらの稀な対立遺伝子と有意に関連していた（ｐ＜０．０５）（ＯＲ ２．８；９５％ ＣＩ，１．３−６．０）。これらの結果は、線維性狭窄疾患が、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５座のＳＮＰ８、ＳＮＰ１２、またはＳＮＰ１３での「２」対立遺伝子と独立に関連していることを確認する。
【０１０５】
【表７】
（実施例ＩＸ）
（線維性狭窄疾患および小腸罹患）
本実施例は、線維性狭窄疾患とＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５座のＳＮＰ８、ＳＮＰ１２、またはＳＮＰ１３での「２」対立遺伝子との間の関連が、小腸罹患とは独立していることを実証する。
【０１０６】
線維性狭窄疾患が小腸罹患を有する患者において生じる確率が高いので、線維性狭窄疾患とＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５改変型対立遺伝子との間の関連が一次相関であるか否かを解析するために、患者を、小腸罹患に基づいて層別化した。小腸罹患を有する患者のうち、線維性狭窄疾患を有さない患者（ｎ＝５３）では２６．４％が、ＳＮＰ８、ＳＮＰ１２、またはＳＮＰ１３での「２」対立遺伝子を有したのに対し、線維性狭窄疾患を有した患者（ｎ＝１０２）では４６．１％が、ＳＮＰ８、ＳＮＰ１２、またはＳＮＰ１３での「２」対立遺伝子を有した（ｐ＝０．０１７）。同様の傾向が、小腸罹患を有さない患者の間で見られ（ｐ＝０．０５）、小腸罹患について条件付けする複合解析は、０．００９の有意水準を生じた。
【０１０７】
線維性狭窄疾患について条件付けした後、小腸罹患は、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５座のＳＮＰ８、ＳＮＰ１２、またはＳＮＰ１３での「２」対立遺伝子と関連していなかった（ｐ＝０．６３）。この結果は、ロジスティック回帰解析からの結果（実施例ＶＩＩＩを参照のこと）と一致し、そして線維性狭窄疾患とＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５座のＳＮＰ８、ＳＮＰ１２、またはＳＮＰ１３での「２」対立遺伝子との間の関連が、小腸罹患とは独立していることを示す。これらの結果はさらに、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５座のＳＮＰ８、ＳＮＰ１２、またはＳＮＰ１３での「２」対立遺伝子との観察された小腸の相関が、線維性狭窄疾患の存在に対して二次的であることを示す。
【０１０８】
以前に述べたか否かに関わらず、括弧内またはそれ以外で上に提示した全ての定期刊行物、参考文献、および特許文献は、本明細書中に参考として援用される。
【０１０９】
本発明を上記実施例に関して記載してきたが、種々の改変が本発明の精神から逸脱することなくなされ得ることが理解されるべきである。従って、本発明は、以下の特許請求の範囲によってのみ制限される。
【表８−１】
【表８−２】
【表８−３】
【表８−４】
【表８−５】
【表８−６】
【表８−７】
【表８−８】
【表８−９】
【表８−１０】
【表８−１１】
【表８−１２】
【表８−１３】
【表８−１４】
【表８−１５】
【表８−１６】
【表８−１７】
【表８−１８】
【表８−１９】
【技術分野】
【０００１】
（承認）
本研究は、グラントＤＫ４６７６３およびグラントＤＫ５４９６７（ＮＩＤＤＫにより与えられる）によって支持される。米国政府は、本発明に対し特定の権利を有する。
【０００２】
（発明の背景）
（発明の分野）
本発明は、一般に、遺伝学および自己免疫疾患の分野に関し、より具体的には、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５遺伝子に連鎖された変異およびクローン病の臨床サブタイプを診断するための遺伝学的方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
（背景情報）
炎症性腸疾患（ＩＢＤ）は、以下の未知の病因の２つの胃腸障害を記載するために使用される、集合名である：クローン病（ＣＤ）および潰瘍性大腸炎（ＵＣ）。ＩＢＤ（これは、世界中で生じ、そして２００万人もの多くの人々が罹患していると報告されている）の経過および予後は、広範に変動する。ＩＢＤの発症は、主に、青年期にあり、下痢、腹痛および発熱という３つの最も共通の代表的症状を伴う。下痢は、穏やかから重篤までの範囲にわたり得、そして貧血および体重の減少が、ＩＢＤのさらなる共通の徴候である。ＩＢＤを有する全ての患者の１０％〜１５％は、１０年の期間にわたって診療を必要とする。さらに、ＩＢＤを有する患者は、腸の癌の発症の危険性が増加する。心理学的問題（不安および抑うつを含む）の発症の増加の報告は、おそらく、驚くべき症状ではなく、これは、しばしば、最盛期の人々を襲う消耗性の疾患である。
【０００４】
クローン病は、胃腸管を罹患させ、そして類似の症状を生じる多数の異質性の疾患サブタイプを表す分類である。環境的要因および遺伝的要因の両方が、このような疾患サブタイプの病因に寄与しているようである。クローン病を有する患者は、例えば、以前に記載された診断基準に従って、線維性狭窄疾患（ｆｉｂｒｏｓｔｅｎｏｓｉｎｇ ｄｉｓｅａｓｅ）、内部穿孔疾患（ｉｎｔｅｒｎａｌ−ｐｅｒｆｏｒａｔｉｎｇ ｄｉｓｅａｓｅ）、肛門周囲瘻孔形成疾患（ｐｅｒｉａｎａｌ ｆｉｓｔｕｌｉｚｉｎｇ ｄｉｓｅａｓｅ）、または潰瘍性大腸炎様疾患の存在に基づくサブタイプに分類され得る。線維性狭窄疾患サブタイプは、検査による存続腸閉塞または腸閉塞のための腸管切除によって特徴付けられる。クローン病および疾患サブタイプを診断のために、徹底的でかつしばしば長引く臨床検査が必要とされ、このことにより最適な処置が遅れることになることがあり、またこのような検査は、侵襲性の手順（例えば、内視鏡検査）を伴うこととなる。
【０００５】
クローン病の臨床サブタイプと密に関連した遺伝マーカーの同定は、新規な遺伝子検査の基盤を提供し、そして疾患サブタイプを決定するのに代表的に必要とされる検査室評価、放射線医学評価、および内視鏡評価の一群に対する必要性を排除するか、または減少させる。クローン病の臨床サブタイプを診断する方法の利用性は、クローン病の治療管理の助けとなる大きな臨床上の進歩になり、さらに特定の疾患サブタイプに特異的である処置様式の設計のための土台を敷く。このような方法は、非応答性の（ｕｎｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ）疾患サブタイプの処置に関連する費用を減少させ、そして有効でない治療を不必要に受けることの失望を排除する。特に、クローン病の線維性狭窄サブタイプについての信頼性のある遺伝子検査は、この疾患サブタイプの早期診断のための非侵襲的方法として高く評価され、また、無症状個体におけるクローン病の線維性狭窄サブタイプに対する感受性を予測するために有用であり、これにより予防的治療が可能になる。本発明は、この必要性を満たし、また関連した利点を提供する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（発明の要旨）
本発明は、線維性狭窄疾患により特徴付けられたクローン病の臨床サブタイプを診断するか、またはそれに対する感受性を予測する方法であって、当該方法は、個体における、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５座に連鎖された線維性狭窄素因対立遺伝子の存在または不在を決定する工程によるものであり、ここで、線維性狭窄素因対立遺伝子の存在が、線維性狭窄疾患により特徴付けられたクローン病の臨床サブタイプの診断またはそれに対する感受性の予測となる、方法を提供する。本発明の方法において、当該クローン病の臨床サブタイプは、例えば、小腸罹患(ｓｍａｌｌ ｂｏｗｅｌ ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ）とは独立
した線維性狭窄疾患によって特徴付けられ得る。
本発明はまた、個体における治療を最適化する方法であって、当該方法は、当該個体における、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５座に連鎖された線維性狭窄素因対立遺伝子の存在または不在を決定する工程、線維性狭窄素因対立遺伝子が存在する個体を、クローン病の線維性狭窄サブタイプを有するとして診断する工程、およびこの診断に基づいて、クローン病の線維性狭窄サブタイプを有する個体を処置する工程によるものである、方法を提供する。
本発明の好ましい実施形態では、例えば以下の方法などが提供される：
（項目１）
線維性狭窄疾患により特徴付けられたクローン病の臨床サブタイプを診断するか、またはそれに対する感受性を予測する方法であって、該方法は、
個体における、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５座に連鎖された線維性狭窄素因対立遺伝子の存在または不在を決定する工程
を包含し、
ここで、該線維性狭窄素因対立遺伝子の存在が、線維性狭窄疾患により特徴付けられたクローン病の該臨床サブタイプの診断またはそれに対する感受性の予測となる、
方法。
（項目２）
前記クローン病の臨床サブタイプが、小腸罹患とは独立した線維性狭窄疾患によって特徴付けられる、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記線維性狭窄素因対立遺伝子が、前記ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５座内に位置する、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記線維性狭窄素因対立遺伝子によってコードされたＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５ポリペプチドによるＮＦ−κＢ活性化が、野生型ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５ポリペプチドによるＮＦ−κＢ活性化に比較して減少される、項目３に記載の方法。
（項目５）
前記線維性狭窄素因対立遺伝子が、前記ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５座のコード領域中に位置する、項目３に記載の方法。
（項目６）
前記線維性狭窄素因対立遺伝子が、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５の残基７４４〜１０２０をコードする領域中に位置する、項目５に記載の方法。
（項目７）
前記線維性狭窄素因対立遺伝子が、ＳＮＰ８、ＳＮＰ１２、およびＳＮＰ１３から選択されるＳＮＰでの「２」対立遺伝子である、項目５に記載の方法。
（項目８）
前記線維性狭窄素因対立遺伝子が、ＳＮＰ１３での「２」対立遺伝子である、項目７に記載の方法。
（項目９）
前記線維性狭窄素因対立遺伝子が、前記ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５座の非コード領域中に位置する、項目３に記載の方法。
（項目１０）
前記線維性狭窄素因対立遺伝子が、ＪＷ１、ＪＷ１５、およびＪＷ１６改変型対立遺伝子から選択される、項目９に記載の方法。
（項目１１）
前記線維性狭窄素因対立遺伝子が、前記ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５座のプロモーター領域中に位置する、項目９に記載の方法。
（項目１２）
前記線維性狭窄素因対立遺伝子が、ＪＷ１７およびＪＷ１８改変型対立遺伝子から選択される対立遺伝子である、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
項目１に記載の方法であって、該方法が、
前記個体における、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５座に連鎖された少なくとも２つの線維性狭窄素因対立遺伝子の存在または不在を決定する工程
を包含し、
ここで、該線維性狭窄素因対立遺伝子の１つ以上の存在が、線維性狭窄疾患により特徴付けられたクローン病の臨床サブタイプの診断またはこれに対する感受性の予測となる、方法。
（項目１４）
前記少なくとも２つの線維性狭窄素因対立遺伝子が、ＳＮＰ８、ＳＮＰ１２、およびＳＮＰ１３から選択されるＳＮＰでの「２」対立遺伝子である、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
項目１４に記載の方法であって、該方法が、前記個体における
（ｉ）ＳＮＰ８での「２」対立遺伝子、
（ｉｉ）ＳＮＰ１２での「２」対立遺伝子、および
（ｉｉｉ）ＳＮＰ１３での「２」対立遺伝子
の存在または不在を決定する工程
を包含し、
ここで、該ＳＮＰ８、ＳＮＰ１２、およびＳＮＰ１３での「２」対立遺伝子の１つ以上の存在が、線維性狭窄疾患により特徴付けられたクローン病の臨床サブタイプの診断またはこれに対する感受性の予測となる、
方法。
（項目１６）
前記線維性狭窄素因対立遺伝子が、少なくとも２のオッズ比および１より大きな下位９５％信頼限界で、前記線維性狭窄疾患により特徴付けられたクローン病の臨床サブタイプに関連している、項目１に記載の方法。
（項目１７）
項目１に記載の方法であって、前記個体における前記線維性狭窄素因対立遺伝子の存在または不在を示す報告を作成する工程をさらに包含する、方法。
（項目１８）
項目１に記載の方法であって、前記個体における、前記線維性狭窄疾患により特徴付けられたクローン病の臨床サブタイプの存在または不在を示す報告を作成する工程をさらに包含する、方法。
（項目１９）
前記線維性狭窄素因対立遺伝子の存在または不在を決定する工程が、前記個体からの核酸の酵素的増幅を包含する、項目１に記載の方法。
（項目２０）
前記増幅がポリメラーゼ連鎖反応増幅である、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
前記ポリメラーゼ連鎖反応増幅が、１つ以上の蛍光標識プローブを用いて実施される、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
前記ポリメラーゼ連鎖反応増幅が、ＤＮＡ浅溝結合剤を含む１つ以上のプローブを用いて実施される、項目２０に記載の方法。
（項目２３）
個体における治療を最適化する方法であって、該方法が、
（ａ）該個体における、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５座に連鎖された線維性狭窄素因対立遺伝子の存在または不在を決定する工程、
（ｂ）前記線維性狭窄素因対立遺伝子が存在する個体を、クローン病の線維性狭窄サブタイプを有するとして診断する工程、および
（ｃ）該診断に基づいて、クローン病の線維性狭窄サブタイプを有する該個体を処置する工程
を包含する、方法。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】図１は、ＳＮＰ８、ＳＮＰ１２、ＳＮＰ１３、およびＪＷ１ならびに他のマーカーの位置と共に、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５座のイントロンおよびエキソンの構造を示す。
【図２】図２は、コホート１（「ＣＤ１」）、コホート２（「ＣＤ２」）またはコホート１およびコホート２の組み合わせ（「組み合わせＣＤ」）における、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５の３つの稀な改変型対立遺伝子（ＳＮＰ８、ＳＮＰ１２、またはＳＮＰ１３での「２」対立遺伝子）の少なくとも１つを有するＮＯＤ２改変型キャリアの頻度を示す。縞の棒線は、線維性狭窄疾患を有するクローン病患者を示し、塗りつぶしの棒線は、疾患の線維性狭窄サブタイプを有しなかったクローン病患者を示す。
【図３】図３は、ＳＮＰ８、ＳＮＰ１２、またはＳＮＰ１３でのＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５の稀な改変型対立遺伝子の数に対する、患者における線維性狭窄合併症の頻度を示す。ＳＮＰ８、ＳＮＰ１２、およびＳＮＰ１３での遺伝子型判定に基づいて、患者を、０、１つ、または２つの稀な改変型対立遺伝子を有するとして記載した（ｘ軸、変異型ＮＯＤ２対立遺伝子の数）。左のｙ軸は、塗りつぶされた丸として、線維性狭窄合併症の頻度を示す。右のｙ軸は、塗りつぶされた菱形として、オッズ比を示し、括弧内に９５％信頼区間を示した。０の対立遺伝子と比較して、＊は、ｐ値＝０．００８であることを示し、そして＊＊は、ｐ値が０．００４であることを示す。
【図４】図４は、穿孔疾患と比較した、線維性狭窄疾患を有する患者におけるＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５改変型対立遺伝子頻度の比較を示す。患者を、線維性狭窄の形跡のない穿孔合併症を有する患者（「Ｐｅｒｆのみ」）と比較して、穿孔合併症ありで線維性狭窄がある場合（「Ｆｉｂ＋ｐｅｒｆ」）または穿孔合併症なしで線維性狭窄がある場合（「Ｆｉｂのみ」）によって分別した。
【図５】図５は、ＳＮＰ８の周囲のＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５のヌクレオチド配列を示す。上部の鎖を配列番号１と示し、下部の鎖を配列番号２と示す。ＰＣＲ増幅のためのプライマーとして使用され得るヌクレオチド配列が示される。さらに、この図において、囲みおよび小文字によって、対立遺伝子識別アッセイにおけるプローブとして使用され得るヌクレオチド配列の位置が示される。下線を付したヌクレオチドは、多型部位の位置を示す。
【図６】図６は、ＳＮＰ１２の周囲のＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５のヌクレオチド配列を示す。上部の鎖を配列番号３と示し、下部の鎖を配列番号４と示す。ＰＣＲ増幅のためのプライマーとして使用され得るヌクレオチド配列が示される。さらに、この図において、囲みおよび小文字によって、対立遺伝子識別アッセイにおけるプローブとして使用され得るヌクレオチド配列の位置が示される。下線を付したヌクレオチドは、多型部位の位置を示す。
【図７】図７は、ＳＮＰ１３の周囲のＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５のヌクレオチド配列を示す。上部の鎖を配列番号５と示し、下部の鎖を配列番号６と示す。ＰＣＲ増幅のためのプライマーとして使用され得るヌクレオチド配列が示される。さらに、この図において、囲みおよび小文字によって、対立遺伝子識別アッセイにおけるプローブとして使用され得るヌクレオチド配列の位置が示される。下線を付したヌクレオチドは、多型部位の位置を示す。
【図８】図８は、ＳＮＰ５の周囲のＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５のヌクレオチド配列を示す。上部の鎖を配列番号７と示し、下部の鎖を配列番号８と示す。ＰＣＲ増幅のためのプライマーとして使用され得るヌクレオチド配列が示される。さらに、この図において、囲みおよび小文字によって、対立遺伝子識別アッセイにおけるプローブとして使用され得るヌクレオチド配列の位置が示される。下線を付したヌクレオチドは、多型部位の位置を示す。
【図９】図９は、ＪＷ１改変型配列の周囲のＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５のヌクレオチド配列を示す。上部の鎖を配列番号９と示し、下部の鎖を配列番号１０と示す。ＰＣＲ増幅のためのプライマーとして使用され得るヌクレオチド配列が示される。さらに、この図において、囲みおよび小文字によって、対立遺伝子識別アッセイにおけるプローブとして使用され得るヌクレオチド配列の位置が示される。下線を付したヌクレオチドは、多型部位の位置を示す。
【図１０−１】図１０は、野生型ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５配列（配列番号１１）に比較した１２の個体におけるＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５の５’非翻訳領域のヌクレオチド配列（配列番号１２〜２３）を示す。配列が同一である領域には陰を付けている。２つの多型部位であるＪＷ１８およびＪＷ１７の位置が示される。
【図１０−２】図１０は、野生型ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５配列（配列番号１１）に比較した１２の個体におけるＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５の５’非翻訳領域のヌクレオチド配列（配列番号１２〜２３）を示す。配列が同一である領域には陰を付けている。２つの多型部位であるＪＷ１８およびＪＷ１７の位置が示される。
【図１１−１】図１１は、１２の個体におけるＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５の３’非翻訳領域のヌクレオチド配列を示す。配列が同一である領域には陰を付けている。２つの多型部位であるＪＷ１５およびＪＷ１６の位置が示される。図１１Ａは、野生型ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５配列（配列番号２４）に比較した１２の個体におけるＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５の３’非翻訳領域のヌクレオチド配列（配列番号２５〜３６）、およびＪＷ１６の位置を示す。
【図１１−２】図１１は、１２の個体におけるＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５の３’非翻訳領域のヌクレオチド配列を示す。配列が同一である領域には陰を付けている。２つの多型部位であるＪＷ１５およびＪＷ１６の位置が示される。図１１Ａは、野生型ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５配列（配列番号２４）に比較した１２の個体におけるＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５の３’非翻訳領域のヌクレオチド配列（配列番号２５〜３６）、およびＪＷ１６の位置を示す。
【図１１−３】図１１は、１２の個体におけるＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５の３’非翻訳領域のヌクレオチド配列を示す。配列が同一である領域には陰を付けている。２つの多型部位であるＪＷ１５およびＪＷ１６の位置が示される。図１１Ｂは、野生型ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５配列（配列番号５５）に比較した１２の個体におけるＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５の３’非翻訳領域のヌクレオチド配列（配列番号５６〜６７）、およびＪＷ１５の位置を示す。
【図１１−４】図１１は、１２の個体におけるＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５の３’非翻訳領域のヌクレオチド配列を示す。配列が同一である領域には陰を付けている。２つの多型部位であるＪＷ１５およびＪＷ１６の位置が示される。図１１Ｂは、野生型ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５配列（配列番号５５）に比較した１２の個体におけるＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５の３’非翻訳領域のヌクレオチド配列（配列番号５６〜６７）、およびＪＷ１５の位置を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
（発明の詳細な説明）
本発明は、クローン病の線維性狭窄疾患サブタイプと密に関連した疾患素因対立遺伝子の刺激的な発見に関する。これらの線維性狭窄素因対立遺伝子は、以下にさらに記載するようにＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５座に連鎖しており、そしてクローン病の線維性狭窄疾患サブタイプを診断するか、またはそれに対する感受性を予測するために使用され得る。
【０００９】
本明細書中に開示されるように、遺伝子型判定および他の臨床的特徴づけアプローチを、疾患素因対立遺伝子とクローン病の線維性狭窄疾患サブタイプとの間の強い関連を同定するために使用した。特に、クローン病患者の２つのコホートを集め、臨床的に特徴付けた（実施例Ｉおよび表１を参照のこと）。これらの患者をまた、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５遺伝子における３つの一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）であるＳＮＰ８、ＳＮＰ１２、およびＳＮＰ１３（これらは、クローン病と関連した多型マーカーである）について遺伝子型判定した。本明細書中に開示されるように、単変量解析は、コホート１において、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５座のＳＮＰ８、ＳＮＰ１２、またはＳＮＰ１３での「２」対立遺伝子が、線維性狭窄疾患と有意に関連していることを示した（ｐ＝０．０４９、表５を参照のこと）。さらに、このコホートにおいては、小腸罹患および発症時年齢がより若いこととは、より厳密でない有意水準での正の相関がまた見られ、そして潰瘍性大腸炎様疾患とは、負の相関が見られた。血清学的マーカーに関しては、ＳＮＰ１３での「２」対立遺伝子を有する患者の方が、抗Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ抗体（ＡＳＣＡ）を発現する確率が高かった（ｐ＝０．０５３）。
【００１０】
コホート１で見られた結果を、実施例ＩＶにおいて本明細書中で開示されるように、コホート２を用いてさらに検証した。コホート１と同様に、コホート２は、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５座のＳＮＰ８、ＳＮＰ１２、またはＳＮＰ１３での「２」対立遺伝子と線維性狭窄疾患との間の有意な関連を示した（ｐ＝０．００２、表６を参照のこと）。さらに、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５座のＳＮＰ８、ＳＮＰ１２、またはＳＮＰ１３での「２」対立遺伝子と線維性狭窄疾患との間の有意性は、これら２つのコホートが一緒に解析された場合に増大した（ｐ＝０．００１、図２を参照のこと）。
【００１１】
実施例Ｖにおいて本明細書中にさらに開示されるように、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５座のＳＮＰ８、ＳＮＰ１２、またはＳＮＰ１３での「２」対立遺伝子は、ユダヤ人個体および非ユダヤ人個体の両方で線維性狭窄疾患と関連していた。線維性狭窄疾患を有さないクローン病患者では２３％のみ（ユダヤ人個体２１．６％対非ユダヤ人個体２５％）であることと比較して、線維性狭窄疾患を有するクローン病患者ではおよそ４６％（ユダヤ人個体５２％対非ユダヤ人個体４２％）が、これらの稀な改変型対立遺伝子の少なくとも１つを有した（オッズ比、２．８；９５％信頼区間、１．５６−５．１８）。これら３つの稀な改変型対立遺伝子のうち、ＳＮＰ１３での「２」対立遺伝子（これは、「３０２０ｉｎｓＣ」と示されるフレームシフト変異である）が、線維性狭窄疾患と最大の相関を示した（４７％対１７％、ｐ＝０．００６（組み合わせコホートに対して））。これらの結果は、線維性狭窄素因対立遺伝子がＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５座に連鎖され得ることを示す。
【００１２】
実施例ＶＩにおいてさらに開示されるように、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５における２つの線維性狭窄素因対立遺伝子のキャリアである患者の方が、ＳＮＰ８、ＳＮＰ１２、またはＳＮＰ１３でのＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５変異のキャリアでない患者と比較して、線維性狭窄疾患を有する確率が有意に高かった（８５％対４３％；オッズ比７．４；９５％信頼区間１．９−２８．９、ｐ＝０．００４）。図３を参照のこと。また、単一のＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５線維性狭窄素因対立遺伝子のキャリアである患者の方が、アッセイした３つのＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５線維性狭窄素因対立遺伝子のいずれのキャリアでもない患者と比較した場合に、線維性狭窄疾患を有する確率が有意に高かった（６４％対４３％；オッズ比２．３７；９５％信頼区間１．２６−４．４７；ｐ＝０．００８）。これらの結果は、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５座に連鎖された線維性狭窄素因対立遺伝子を有する患者が、クローン病の線維性狭窄サブタイプを有し得ることを確認し、そしてさらに、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５に連鎖された多重線維性狭窄素因対立遺伝子（ホモ接合性変異または複合ヘテロ接合性変異）を有するクローン病患者が、単一の線維性狭窄素因対立遺伝子を有する個体に比較して、線維性狭窄疾患を有する危険度が高いことを示す。
【００１３】
線維性狭窄疾患および穿孔疾患は、同じ患者において共に生じ得る。線維性狭窄疾患を有する患者は、例えば、ｉ）線維性狭窄疾患のみを有する、またはｉｉ）線維性狭窄疾患および穿孔疾患を共に有するとして特徴付けられ得る。実施例ＶＩＩにおいて本明細書中で開示されるように、線維性狭窄疾患のみを有する患者でＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５座のＳＮＰ８、ＳＮＰ１２、またはＳＮＰ１３での「２」対立遺伝子を有する割合は、４８．３％であった。これは、線維性狭窄および穿孔の両合併症を有する患者において見られた割合と同様であった（４６．０％；ｐ＝０．８）。図４において見られるように、線維性狭窄疾患を有する患者を穿孔疾患（肛門周囲または内部）のみを有するとして記載される患者と比較した場合、線維性狭窄疾患を有する患者（穿孔合併症ありまたは穿孔合併症なし）におけるＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５座のＳＮＰ８、ＳＮＰ１２、またはＳＮＰ１３での「２」対立遺伝子の頻度は、穿孔合併症のみを有する患者で見られるよりも有意に大きかった（４６．６％対１８．６％；ｐ＝０．００２）。
【００１４】
実施例ＶＩＩＩにおいて本明細書中でさらに開示されるように、多変量解析を行って、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５座のＳＮＰ８、ＳＮＰ１２、またはＳＮＰ１３での「２」対立遺伝子と臨床表現型との関連を調べた。多変量解析のために、いずれのコホートにおいても、少なくとも境界域の有意性（ｐ＜０．１）を有する全ての変数を、ロジスティック回帰を用いて、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５座のＳＮＰ８、ＳＮＰ１２、またはＳＮＰ１３での「２」対立遺伝子とのそれらの関連について同時に試験した。表７に示されるように、線維性狭窄疾患の臨床表現型は、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５座でのこれらの稀な対立遺伝子と有意に関連していた（ｐ＜０．０５）（オッズ比２．８；９５％信頼区間、１．３−６．０）。これらの結果は、線維性狭窄疾患が、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５座のＳＮＰ８、ＳＮＰ１２、またはＳＮＰ１３での「２」対立遺伝子と独立に関連していることを確認する。
【００１５】
線維性狭窄疾患が小腸罹患を有する患者において生じる確率が高いので、線維性狭窄疾患とＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５改変型対立遺伝子との間の関連が一次相関であるか否かを解析するために、患者を、小腸罹患に基づいて層別化した（実施例ＩＸを参照のこと）。小腸罹患を有する患者の中で、線維性狭窄疾患を有しない患者（ｎ＝５３）では２６．４％が、ＳＮＰ８、ＳＮＰ１２、またはＳＮＰ１３での「２」対立遺伝子を有したのに対し、線維性狭窄疾患を有した患者（ｎ＝１０２）では４６．１％が、ＳＮＰ８、ＳＮＰ１２、またはＳＮＰ１３での「２」対立遺伝子を有した（ｐ＝０．０１７）。同様の傾向が、小腸罹患を有しない患者の間で見られ（ｐ＝０．０５）、そして小腸罹患に関して条件付けする複合解析は、０．００９の有意水準を生じた。線維性狭窄疾患について条件付けした後、小腸罹患は、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５座のＳＮＰ８、ＳＮＰ１２、またはＳＮＰ１３での「２」対立遺伝子と関連していなかった（ｐ＝０．６３）。この結果は、ロジスティック回帰解析からの結果（実施例ＶＩＩＩを参照のこと）と一致し、そして線維性狭窄疾患とＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５座のＳＮＰ８、ＳＮＰ１２、またはＳＮＰ１３での「２」対立遺伝子との間の関連が、小腸罹患とは独立していることを示す。これらの結果はさらに、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５座のＳＮＰ８、ＳＮＰ１２、またはＳＮＰ１３での「２」対立遺伝子とで観察された小腸の相関が、線維性狭窄疾患の存在に対して二次的であることを示す。
【００１６】
これらの発見に基づいて、本発明は、線維性狭窄疾患により特徴付けられたクローン病の臨床サブタイプを診断するか、またはそれに対する感受性を予測する方法であって、当該方法は、個体における、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５座に連鎖された線維性狭窄素因対立遺伝子の存在または不在を決定する工程によるものであり、ここで、線維性狭窄素因対立遺伝子の存在が、線維性狭窄疾患により特徴付けられたクローン病の臨床サブタイプの診断またはそれに対する感受性の予測となる、方法を提供する。本発明の方法は、それらが非侵襲的であり、かつ例えば、個体由来の血液サンプルを用いて、便宜的に実施され得るという点で、有利であり得る。本発明の方法は、以下にさらに記載するように、迅速、簡単、および信頼性をもって、線維性狭窄疾患により特徴付けられたクローン病の臨床サブタイプを診断するか、またはそれに対する感受性を予測するために使用され得る。
【００１７】
１つの実施形態では、本発明の方法は、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５座内に位置する線維性狭窄素因対立遺伝子を用いて実施される。別の実施形態では、線維性狭窄素因対立遺伝子によりコードされたＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５ポリペプチドによるＮＦ−κＢ活性化が、野生型ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５ポリペプチドによるＮＦ−κＢ活性化に比較して減少される。別の実施形態では、本発明の方法は、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５座のコード領域中に、例えば、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５の残基７４４〜１０２０をコードする領域内に、存在する線維性狭窄素因対立遺伝子を用いて実施される。またさらなる実施形態では、本発明の方法は、ＳＮＰ８、ＳＮＰ１２、またはＳＮＰ１３での「２」対立遺伝子である線維性狭窄素因対立遺伝子を用いて実施される。なおさらなる実施形態では、本発明の方法は、ＳＮＰ１３での「２」対立遺伝子である線維性狭窄素因対立遺伝子を用いて実施される。別の実施形態では、本発明の方法は、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５座の非コード領域中に位置する線維性狭窄素因対立遺伝子を用いて実施される。このような対立遺伝子は、限定されることなく、ＪＷ１、ＪＷ１５、またはＪＷ１６改変型対立遺伝子であり得る。別の実施形態では、本発明の方法は、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５座のプロモーター領域中に位置する線維性狭窄素因対立遺伝子を用いて実施される。ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５のプロモーター領域における有用な線維性狭窄素因対立遺伝子は、ＪＷ１７およびＪＷ１８改変型対立遺伝子を包含するが、これらに限定されない。
【００１８】
本発明は、第１６染色体上のＩＢＤ１座に局在する遺伝マーカーに関する。ゲノムワイドスキャン連鎖戦略（ｇｅｎｏｍｅ ｗｉｄｅ ｓｃａｎ ｌｉｎｋａｇｅ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ）を用いて、ＩＢＤ１座は、カフカス人集団における第１６染色体の長腕の近位領域（１６ｑ１２）にマッピングされた（Ｈｕｇｏｔら，Ｎａｔｕｒｅ ３７９：８２１−８２３（１９９６））。この知見は、多くの研究において再現されており、このような研究は、複合疾患について高いマルチポイント連鎖スコア（ｍｕｌｔｉｐｏｉｎｔ ｌｉｎｋａｇｅ ｓｃｏｒｅ）（ＭＬＳ）を報告する国際的な共同研究を含む（ＭＬＳ＝５．７（１６ｑ１２中のマーカーＤ１６Ｓ４１１で））。以下を参照のこと：Ｃｈｏら，Ｉｎｆｌａｍｍ．Ｂｏｗｅｌ Ｄｉｓ．３：１８６−１９０（１９９７），Ａｋｏｌｋａｒら，Ａｍ．Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．９６：１１２７−１１３２（２００１），Ｏｈｍｅｎら，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．５：１６７９−１６８３（１９９６），Ｐａｒｋｅｓら，Ｌａｎｃｅｔ ３４８：１５８８（１９９６），Ｃａｖａｎａｕｇｈら，Ａｎｎ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｔ．（１９９８），Ｂｒａｎｔら，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １１５：１０５６−１０６１（１９９８），Ｃｕｒｒａｎら，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｌｏｌｏｇｙ １１５：１０６６−１０７１（１９９８），Ｈａｍｐｅら，Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．６４：８０８−８１６（１９９９）、およびＡｎｎｅｓｅら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．７：５６７−５７３（１９９９）。ＩＢＤ１座内のＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５が、ポジショナルクローニング戦略（Ｈｕｇｏｔら，Ｎａｔｕｒｅ ４１１：５９９−６０３（２００１））およびポジショナル候補遺伝子戦略（ｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ ｃａｎｄｉｄａｔｅ ｇｅｎｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ）（Ｏｇｕｒａら，Ｎａｔｕｒｅ ４１１：６０３−６０６（２００１），Ｈａｍｐｅら，Ｌａｎｃｅｔ ３５７：１９２５−１９２８（２００１））によって、同時に同定された。コードされたＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５タンパク質は、アミノ末端カスパーゼ補充ドメイン（ｃａｓｐａｓｅ
ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ ｄｏｍａｉｎｓ）（ＣＡＲＤ）（これは、ＮＦ−カッパＢ（ＮＦ−κＢ）を活性化し得る）およびいくつかのカルボキシ末端ロイシンリッチ反復ドメインを含む（Ｏｇｕｒａら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：４８１２−４８１８（２００１））。図１は、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５座の模式図を示す。
【００１９】
ヒトＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５遺伝子の配列は、登録番号ＮＭ＿０２２１６２としてＧｅｎＢａｎｋで見い出され得る（この内容は、本明細書中に参考として援用される）。さらに、ヒト第１６染色体クローンＲＰ１１−３２７Ｆ２２（これは、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５を含む）の完全配列が、登録番号ＡＣ００７７２８としてＧｅｎＢａｎｋで見い出され得る（この内容は、本明細書中に参考として援用される）。さらに、他の種由来のＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５の配列も、ＧｅｎＢａｎｋデータベースにおいて見い出され得る。
【００２０】
ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５のコード領域における３つの一ヌクレオチド多型でのバリエーションが、以前に記載された。これらの３つのＳＮＰ（ＳＮＰ８、ＳＮＰ１２、およびＳＮＰ１３と称される）は、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５遺伝子のカルボキシ末端領域中に位置する（Ｈｕｇｏｔら，前出、２００１）。
【００２１】
本発明は、一部、個体における、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５座に連鎖された線維性狭窄素因対立遺伝子の存在または不在を決定することに依存する。本明細書中で使用される用語「線維性狭窄素因対立遺伝子」は、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５座に連鎖された、かつ伝統的なメンデル遺伝学に従って予期され得るよりも高い頻度で、線維性狭窄疾患により特徴付けられたクローン病の臨床サブタイプと共に遺伝する傾向のある、安定遺伝性分子バリエーションを意味する。本発明において有用な線維性狭窄素因対立遺伝子は、限定されることなく、一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）、マイクロサテライト（ｍｓ）、縦列反復単位数が可変である（ｖａｒｉａｂｌｅ ｎｕｍｂｅｒ ｔａｎｄｅｍ ｒｅｐｅａｔ）（ＶＮＴＲ）多型、または１以上のヌクレオチドの置換、挿入もしくは欠失であり得る。当業者は、線維性狭窄素因対立遺伝子はまた、異常メチル化、または野生型対立遺伝子と比較して線維性狭窄素因対立遺伝子の一次ヌクレオチド配列に差異を生じない他の改変のような分子バリエーションであり得ることも理解する。
【００２２】
線維性狭窄素因対立遺伝子およびＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５座に関して本明細書中で使用される用語「〜に連鎖された」は、線維性狭窄素因対立遺伝子およびＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５座が、伝統的なメンデル遺伝学に従って予期され得るよりも高い頻度で一緒に遺伝することを意味する。対立遺伝子と遺伝子座とは、これら２つの部位の間での組換えが５０％未満である場合に、連鎖されていると理解される。一般には、線維性狭窄素因対立遺伝子は、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５座とは、せいぜい５０センチモルガン（ｃＭ）離れている。非限定的な例として、線維性狭窄素因対立遺伝子は、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５座から５０センチモルガン（ｃＭ）、４０ｃＭ、３０ｃＭ、２０ｃＭ、１０ｃＭ、５ｃＭ、または１ｃＭ以内にあり得る。連鎖された線維性狭窄素因対立遺伝子とＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５座との間の距離は、例えば、５０，０００，０００塩基対（ｂｐ）、４０，０００，０００ｂｐ、３０，０００，０００ｂｐ、２０，０００，０００ｂｐ、１０，０００，０００ｂｐ、５，０００，０００ｂｐ、１，０００，０００ｂｐ、５００，０００ｂｐ、１００，０００ｂｐ、５０，０００ｂｐ、１０，０００ｂｐ、１，０００ｂｐ、または１００ｂｐであり得る。
【００２３】
本発明の方法は、クローン病（限局性腸炎）（これは、胃腸管の任意の部分を罹患させ得る慢性炎症の疾患である）の臨床サブタイプを診断するか、またはそれに対する感受性を予測するために有用である。通例、クローン病においては、小腸の遠位部分（回腸）および盲腸が罹患される。他の場合では、この疾患は、小腸、結腸、または肛門直腸領域に制限される。クローン病は、時折、十二指腸および胃をも罹患させ、また、より稀なことではあるが、食道および口腔をも罹患させる。
【００２４】
クローン病の不定の臨床発現は、一部、この疾患の多様な解剖学的局在の結果である。クローン病の最も頻度の高い症状は、腹痛、下痢、および回帰熱である。クローン病は、腸閉塞またはフィステル（これは、例えば、腸の患部ループ間の異常な通路である）と一般に関連している。クローン病はまた、腸管外合併症（例えば、眼、関節、および皮膚の炎症；肝臓疾患；腎臓結石またはアミロイドーシス）を包含し得、そして腸癌の危険度の増大と関連している。
【００２５】
いくつかの特徴がクローン病の病理に特徴的である。クローン病と関連した炎症は、経壁性炎症（ｔｒａｎｓｍｕｒａｌ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ）として知られるが、これは、腸壁の全ての層を罹患させる。例えば、肥厚および浮腫が、代表的には、腸壁の至るところに見られ、線維症もまた、長期にわたる疾患において存在する。クローン病に特徴的である炎症はまた不連続なものであり、「跳躍病巣」として知られる炎症組織区域は、見かけ上正常な腸によって離されている。さらに、介在組織の線状潰瘍、浮腫、および炎症が、腸粘膜の「丸石（ｃｏｂｂｌｅｓｔｏｎｅ）」の外観に至る。これは、クローン病に特有である。
【００２６】
クローン病の証明は、炎症細胞の離散性の凝集（肉芽腫として知られる）の存在であり、これは、一般に、粘膜下組織で見られる。クローン病症例の約半分は、典型的な離散性の肉芽腫を示すが、他の症例は、広汎性の肉芽腫性反応または非特異的な経壁性炎症を示す。結果として、離散性の肉芽腫の存在がクローン病の指標であるが、肉芽腫が存在しないこともまた、この疾患と矛盾しない。従って、肉芽腫の存在よりもむしろ、経壁性または不連続の炎症が、クローン病の好ましい診断指標である（ＲｕｂｉｎおよびＦａｒｂｅｒ，Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ（第２版）Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ：Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｃｏｍｐａｎｙ（１９９４））。
【００２７】
クローン病は、胃腸管を罹患させ、そして類似の症状を生じ得る多数の異質性の疾患サブタイプを表す分類である。非限定的な例として、クローン病を有する患者は、以前に記載の診断基準に基づいて、線維性狭窄疾患、内部穿孔疾患、肛門周囲瘻孔形成疾患、または潰瘍性大腸炎（ＵＣ）様疾患により特徴付けられたサブタイプを有するとして特徴付けられ得る（Ｇａｓｃｈｅら，Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｂｏｗｅｌ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ６：８−１５（２０００）；Ｖａｓｉｌｉａｕｓｋａｓら，Ｇｕｔ ４７：４８７−４９６（２０００）；Ｖａｓｉｌｉａｕｓｋａｓら，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １１０：１８１０−１８１９（１９９６）；およびＧｒｅｅｎｓｔｅｉｎら，Ｇｕｔ ２９：５８８−５９２（１９８８））。
【００２８】
十分に確立された判断基準に従って、線維性狭窄疾患は、検査による存続腸閉塞または腸閉塞のための腸管切除によって確定される。Ｘ線撮影検査、内視鏡検査、外科的検査、または組織病理学的検査が、クローン病の線維性狭窄サブタイプの診断を確証するために使用され得る。クローン病の線維性狭窄サブタイプには、他の症状（例えば、穿孔、膿瘍、またはフィステル）が伴い得る。さらに、クローン病の線維性狭窄サブタイプは、腸閉塞（ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｂｌｏｃｋａｇｅ）の存続症状（例えば、悪心、嘔吐、腹部拡延、および固形食物の摂食不能）によって特徴付けられ得る。クローン病の線維性狭窄サブタイプを有する患者の腸内Ｘ線は、例えば、閉塞点の前の腸の拡延を示し得る。
【００２９】
クローン病のさらなるサブタイプは、規定の臨床診断基準を用いて同定され得る。例えば、内部穿孔疾患は、腸−腸もしくは腸−膀胱フィステル、腹内膿瘍、または小腸穿孔の現在または以前の形跡として確定され得る。肛門周囲瘻孔形成疾患は、肛門周囲フィステルもしくは膿瘍または直腸膣フィステルのいずれかの現在または以前の形跡によって確定され得る。潰瘍性大腸炎（ＵＣ）様疾患は、以前に記載されたように、左側結腸罹患、出血もしくは尿意促迫の症状、および結腸生検における陰窩膿瘍の現在または以前の形跡によって確定され得る。疾患の位置は、１つ以上の内視鏡研究、Ｘ線研究、または病理研究に基づいて、小腸、結腸、またはその両方として分類され得る。
【００３０】
クローン病の線維性狭窄サブタイプは、小腸罹患を有する疾患を有する患者において生じ得る。本明細書中に開示されるように、線維性狭窄疾患について条件付けした後、小腸罹患は、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５座のＳＮＰ８、ＳＮＰ１２、またはＳＮＰ１３での「２」対立遺伝子とは関連していなかった（ｐ＝０．６３；実施例ＩＸを参照のこと）。この結果は、実施例ＶＩＩＩに開示されたロジスティック回帰解析からの結果と一致し、そして線維性狭窄疾患とＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５座のＳＮＰ８、ＳＮＰ１２、またはＳＮＰ１３での「２」対立遺伝子との間の関連が、小腸罹患とは独立していることを示す。これらの知見に基づいて、本発明は、小腸罹患とは独立した線維性狭窄疾患により特徴付けられたクローン病の臨床サブタイプを診断するか、またはそれに対する感受性を予測する方法であって、当該方法は、個体における、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５座に連鎖された線維性狭窄素因対立遺伝子の存在または不在を決定する工程によるものであり、ここで、線維性狭窄素因対立遺伝子の存在が、小腸罹患とは独立した線維性狭窄疾患により特徴付けられたクローン病の臨床サブタイプの診断またはそれに対する感受性の予測となる、方法を提供する。
【００３１】
本発明の診断方法は、個体において実施される。本明細書中で使用される用語「個体」は、クローン病の線維性狭窄サブタイプを有し得る動物（例えば、ヒトまたは他の哺乳動物）を意味する。個体は、クローン病の１つ以上の症状またはクローン病の線維性狭窄サブタイプを有し得るか、あるいは無症状性であり得る。本発明の方法は、例えば、１つ以上の症状を有する個体におけるクローン病の線維性狭窄サブタイプの診断のために、または無症状性個体（例えば、クローン病の線維性狭窄サブタイプを有する危険度の高い個体）におけるクローン病の線維性狭窄サブタイプに対する感受性を予測するために、有用であり得る。１つの実施形態では、本発明の方法は、クローン病を有することが知られる個体におけるクローン病の線維性狭窄サブタイプの存在または不在を決定するために使用される。
【００３２】
本発明の方法は、例えば、アシュケナジユダヤ人（Ａｓｈｋｅｎａｚｉ Ｊｅｗｉｓｈ）個体において、クローン病の線維性狭窄サブタイプを診断するか、またはそれに対する感受性を予測するために、有用であり得る。クローン病は、非ユダヤ系カフカス人（ｎｏｎ−Ｊｅｗｉｓｈ Ｃａｕｃａｓｉａｎｓ）におけるよりもアシュケナジユダヤ人（Ａｓｈｋｅｎａｚｉ Ｊｅｗｓ）において、有意により一般的である（２〜８倍高い）（Ｂｒａｎｔら，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．１１５：１０５６−１０６１（１９９８））。さらに、ユダヤ人民族系の人の間では、アメリカまたはヨーロッパのアシュケナジユダヤ人が、セファルディ（Ｓｅｐｈａｒｄｉｃ）または東洋のユダヤ人と比較して、この炎症性腸疾患を有する危険度が２〜４倍高い（ＹａｎｇおよびＲｏｔｔｅｒ、ＫｉｒｓｃｈｎｅｒおよびＳｈｏｒｔｅｒ（編），Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｂｏｗｅｌ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ：Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ，ｐ．３０１−３３１（１９９５）；Ｒｏｚｅｎら，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．７６：２５−３０（１９７９））。クローン病を有する発端者の第一度近親者についてのクローン病の経験的危険度（ｅｍｐｉｒｉｃ ｒｉｓｋ）は、ユダヤ人では７．８％であり、これに対し、非ユダヤ人では５．２％である（ｐ＝０．００５；Ｙａｎｇら，Ｇｕｔ ３４：５１７−５２４（１９９３））。従って、ユダヤ人集団および特にアシュケナジユダヤ人集団は、クローン病および関連した病因の自己免疫疾患に対する危険度の高い集団の代表である。
【００３３】
本発明の方法は、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５座に連鎖された線維性狭窄素因対立遺伝子に依存する。ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５は、アポトーシス制御因子Ａｐａｆ−１／ＣＥＤ−４および植物疾患抵抗性遺伝子産物のクラスの両方と構造的相同性を有する（Ｏｇｕｒａら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，２７６：４８１２−４８１８（２００１））。植物疾患抵抗性遺伝子産物と同様に、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５は、アミノ末端エフェクタードメイン、ヌクレオチド結合ドメイン、およびロイシンリッチ反復（ＬＲＲ）を有する。野生型ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５は核性因子ＮＦ−κＢを活性化し、これを細菌リポ多糖（ＬＰＳ）に対して応答性とする（Ｏｇｕｒａら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，２７６：４８１２−４８１８（２００１）；Ｉｎｏｈａｒａら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：２５５１−２５５４（２００１）。ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５は、ＬＰＳに対する細胞間レセプターとして機能し得、そのロイシンリッチ反復は、応答性のために必要とされる。ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５と同様に、細胞質ゾル植物疾患抵抗性ポリペプチドは、カルボキシ末端ロイシンリッチ反復を有し、この反復は、病原体成分の認識および病原体特異的応答の誘導のために重要である（Ｐａｒｎｉｓｋｅら，Ｃｅｌｌ ９１：８２１−８３２（１９９７）；Ｅｌｌｉｓら，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １１：４９５−５０６（１９９９）；Ｄｉｘｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７：８８０７−８８１４（２０００））。
【００３４】
１つの実施形態では、線維性狭窄素因対立遺伝子は、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５座（その模式図を図１に示す）内に位置する。ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５座は、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５遺伝子のコード領域ならびに非コード領域（例えば、イントロン、および５’非翻訳領域および３’非翻訳領域）を含む。当業者は、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５座が、例えば、プロモーター領域（遺伝子の５’側）、エンハンサー領域（遺伝子の５’もしくは３’側、またはイントロン配列中）、およびｍＲＮＡ安定領域（遺伝子の３’側）を含み得ることを理解する。
【００３５】
別の実施形態では、線維性狭窄素因対立遺伝子は、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５座のコード領域中に、例えば、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５の残基７４４〜１０２０をコードする領域内に、位置する。ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５ポリペプチドの残基７４４〜１０２０は、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５ポリペプチドのカルボキシ末端部分中にいくつかのロイシンリッチ反復を含む。ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５の残基７４４〜１０２０をコードする領域中に位置する線維性狭窄素因対立遺伝子は、限定されることなく、ＳＮＰ１２およびＳＮＰ１３を包含する。本発明において有用な線維性狭窄素因対立遺伝子はまた、野生型ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５ポリペプチドによるＮＦ−κＢ活性化に比較してＮＦ−κＢ活性化が減少したＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５ポリペプチドをコードする対立遺伝子であり得る。例として、ＳＮＰ１３での稀な改変型対立遺伝子は短縮型ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５ポリペプチドを生じ、このポリペプチドは、ＬＰＳ刺激に応答してＮＦ−κＢを誘導する能力を低下したものである（Ｏｇｕｒａら，Ｎａｔｕｒｅ ４１１：６０３−６０６（２００１））。
【００３６】
本発明において有用な線維性狭窄素因対立遺伝子は、例えば、ＳＮＰ８、ＳＮＰ１２、またはＳＮＰ１３での「２」対立遺伝子であり得る。ＳＮＰ８、ＳＮＰ１２、およびＳＮＰ１３は、図１に示されるように、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５のコード領域内に位置する。１つの実施形態では、本発明の方法は、ＳＮＰ８「２」対立遺伝子である線維性狭窄素因対立遺伝子を用いて実施される。本明細書中で使用される用語「ＳＮＰ８」は、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５遺伝子におけるエキソン４内の一ヌクレオチド多型を意味し、これは、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５タンパク質のアミノ酸７０２をコードするトリプレット内で生じる。「１」対立遺伝子（シトシン（ｃ）がＡＣ００７７２８配列の１３８，９９１位に存する）は、一般のまたは「野生型」ＳＮＰ８対立遺伝子であり、アミノ酸７０２のアルギニンをコードするトリプレット内で生じる。ＳＮＰ８の「２」対立遺伝子（チミン（ｔ）がＡＣ００７７２８配列の１３８，９９１位に存する）は、稀な改変型であり、これは、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５タンパク質のアミノ酸７０２にアルギニン（Ｒ）からトリプトファン（Ｗ）への置換を生じる。従って、ＳＮＰ８の稀な「２」対立遺伝子は、「Ｒ７０２Ｗ」または「７０２Ｗ」と表示され、また、Ｈｕｇｏｔら，前出、２００１の先の番号付けシステムに基づいて「Ｒ６７５Ｗ」とも表示され得る。ＳＮＰ８のＮＣＢＩ ＳＮＰ ＩＤ番号はｒｓ２０６６８４４であり、これは、本明細書中に参考として援用される。本明細書中に開示され、かつ以下にさらに記載されるように、ＳＮＰ８または以下に記載の別のＳＮＰでの対立遺伝子「１」または「２」の存在は、例えば、対立遺伝子識別アッセイまたは配列分析によって便宜的に検出され得る。
【００３７】
本発明の方法はまた、ＳＮＰ１２「２」対立遺伝子である線維性狭窄素因対立遺伝子を用いて実施され得る。本明細書中で使用される用語「ＳＮＰ１２」は、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５遺伝子におけるエキソン８内の一ヌクレオチド多型を意味し、これは、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５タンパク質のアミノ酸９０８をコードするトリプレット内で生じる。「１」対立遺伝子（グアニン（ｇ）がＡＣ００７７２８配列の１２８，３７７位に存する）は、一般のまたは「野生型」ＳＮＰ１２対立遺伝子であり、アミノ酸９０８のグリシンをコードするトリプレット内で生じる。ＳＮＰ１２の「２」対立遺伝子（シトシン（ｃ）がＡＣ００７７２８配列の１２８，３７７位に存する）は、稀な改変型であり、これは、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５タンパク質のアミノ酸９０８にグリシン（Ｇ）からアルギニン（Ｒ）への置換を生じる。ＳＮＰ１２でのこの稀な「２」対立遺伝子は、「Ｇ９０８Ｒ」または「９０８Ｒ」と表示され、また、Ｈｕｇｏｔら，前出、２００１の先の番号付けシステムに基づいて「Ｇ８８１Ｒ」とも表示され得る。ＳＮＰ１２は、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５遺伝子のロイシンリッチ反復領域内に位置する。ＳＮＰ１２のＮＣＢＩ ＳＮＰ ＩＤ番号はｒｓ２０６６８４５であり、これは、本明細書中に参考として援用される。
【００３８】
本発明の方法はまた、ＳＮＰ１３「２」対立遺伝子である線維性狭窄素因対立遺伝子を用いて実施され得る。この対立遺伝子は、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５タンパク質の１０番目のロイシンリッチ反復においてフレームシフトを生じ、そして後に未熟停止コドンが続く、一ヌクレオチドの挿入である。ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５タンパク質の得られる短縮は、細菌リポ多糖に応答するＮＦ−κＢの活性化を妨害するようである（Ｏｇｕｒａら，前出、２００１）。本明細書中で使用される用語「ＳＮＰ１３」は、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５遺伝子におけるエキソン１１内の一ヌクレオチド多型を意味し、これは、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５タンパク質のアミノ酸１００７をコードするトリプレットで生じる。ＳＮＰ１３の「２」対立遺伝子（シトシンが、ＡＣ００７７２８配列の１２１，１３９位で付加されている）は、アミノ酸１００７にフレームシフト変異を生じる稀な改変型である。従って、ＳＮＰ１３での稀な「２」対立遺伝子は、「１００７ｆｓ」と表示され、また、「３０２０ｉｎｓＣ」またはＨｕｇｏｔら，前出、２００１の先の番号付けシステムに基づいて「９８０ｆｓ」とも表示され得る。ＳＮＰ１３のＮＣＢＩ ＳＮＰ ＩＤ番号はｒｓ２０６６８４７であり、これは、本明細書中に参考として援用される。
【００３９】
当業者は、特定の多型対立遺伝子が、市販の参照ＤＮＡを用いて（例えば、ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）から得られる）、例えば、Ｃｅｎｔｒｅ ｄ’Ｅｔｕｄｅ ｄｕ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｅ Ｈｕｍａｉｎ（ＣＥＰＨ）参照個体（例えば、１３４７−０２と称される個体）（Ｄｉｂら，Ｎａｔｕｒｅ ３８０：１５２−１５４（１９９６））に比較して、便宜的に定義され得ることを認識する。さらに、ＳＮＰに関する詳細な情報は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）のｄｂＳＮＰから得られ得る。
【００４０】
線維性狭窄素因対立遺伝子はまた、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５座の非コード領域中に位置し得る。非コード領域は、例えば、イントロン配列、および５’非翻訳領域および３’非翻訳領域を含む。ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５遺伝子のイントロン配列中の線維性狭窄素因対立遺伝子の例としては、ＪＷ１改変型対立遺伝子（これは以下に記載される）が挙げられるが、これらに限定されない。ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５遺伝子の３’非翻訳領域中に位置する線維性狭窄素因対立遺伝子の例としては、限定されることなく、ＪＷ１５改変型対立遺伝子およびＪＷ１６改変型対立遺伝子（これらは以下に記載される）が挙げられる。ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５遺伝子の５’非翻訳領域中に位置する線維性狭窄素因対立遺伝子の例としては、限定されることなく、ＪＷ１７改変型対立遺伝子およびＪＷ１８改変型対立遺伝子（これらは以下に記載される）が挙げられる。１つの実施形態では、本発明の方法は、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５座の非コード領域中に位置する線維性狭窄素因対立遺伝子を用いて実施され、この対立遺伝子は、ＪＷ１、ＪＷ１５、またはＪＷ１６改変型対立遺伝子である。別の実施形態では、本発明の方法は、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５座のプロモーター領域中に位置する線維性狭窄素因対立遺伝子を用いて実施され、この対立遺伝子は、ＪＷ１７またはＪＷ１８改変型対立遺伝子である。
【００４１】
本明細書中で使用される用語「ＪＷ１改変型対立遺伝子」は、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５遺伝子の介在配列８（イントロン８）のヌクレオチド１５８での遺伝子バリエーションを意味する。ＡＣ００７７２８配列に関して、ＪＷ１改変型は、１２８，１４３位に位置する。イントロン８のヌクレオチド１５８位での遺伝子バリエーションは、一ヌクレオチド置換、多重ヌクレオチド置換、または１つ以上のヌクレオチドの欠失もしくは挿入であり得るが、これらに限定されない。イントロン８の野生型配列は、１５８位にシトシンを有し；非限定的な例として、ＪＷ１改変型対立遺伝子は、イントロン８のヌクレオチド１５８にシトシン（Ｃ）からアデニン（Ａ）、シトシンからグアニン（Ｇ）、またはシトシンからチミン（Ｔ）の置換を有し得る。１つの実施形態では、ＪＷ１改変型対立遺伝子は、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５イントロン８のヌクレオチド１５８でのシトシンからチミンへの変更である。
【００４２】
本明細書中で使用される用語「ＪＷ１５改変型対立遺伝子」は、ＡＣ００７７２８配列のヌクレオチド１１８，７９０位でのＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５の３’非翻訳領域における遺伝子バリエーションを意味する。ヌクレオチド１１８，７９０での遺伝子バリエーションは、一ヌクレオチド置換、多重ヌクレオチド置換、または１つ以上のヌクレオチドの欠失もしくは挿入であり得るが、これらに限定されない。野生型配列は、１１８，７９０位にアデニン（Ａ）を有し；非限定的な例として、ＪＷ１５改変型対立遺伝子は、ヌクレオチド１１８，７９０にアデニン（Ａ）からシトシン（Ｃ）、アデニンからグアニン（Ｇ）、またはアデニンからチミン（Ｔ）の置換を有し得る。１つの実施形態では、ＪＷ１５改変型対立遺伝子は、ヌクレオチド１１８，７９０でのアデニンからシトシンへの変更である。
【００４３】
本明細書中で使用される用語「ＪＷ１６改変型対立遺伝子」は、ＡＣ００７７２８配列のヌクレオチド１１８，０３１位でのＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５の３’非翻訳領域における遺伝子バリエーションを意味する。ヌクレオチド１１８，０３１での遺伝子バリエーションは、一ヌクレオチド置換、多重ヌクレオチド置換、または１つ以上のヌクレオチドの欠失もしくは挿入であり得るが、これらに限定されない。野生型配列は、１１８，０３１位にグアニン（Ｇ）を有し；非限定的な例として、ＪＷ１６改変型対立遺伝子は、ヌクレオチド１１８，０３１にグアニン（Ｇ）からシトシン（Ｃ）、グアニンからアデニン（Ａ）、またはグアニンからチミン（Ｔ）の置換を有し得る。１つの実施形態では、ＪＷ１６改変型対立遺伝子は、ヌクレオチド１１８，０３１でのグアニンからアデニンへの変更である。
【００４４】
本明細書中で使用される用語「ＪＷ１７改変型対立遺伝子」は、ＡＣ００７７２８配列のヌクレオチド１５４，６８８位でのＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５の５’非翻訳領域における遺伝子バリエーションを意味する。ヌクレオチド１５４，６８８での遺伝子バリエーションは、一ヌクレオチド置換、多重ヌクレオチド置換、または１つ以上のヌクレオチドの欠失もしくは挿入であり得るが、これらに限定されない。野生型配列は、１５４，６８８位にシトシン（Ｃ）を有し；非限定的な例として、ＪＷ１７改変型対立遺伝子は、ヌクレオチド１５４，６８８にシトシン（Ｃ）からグアニン（Ｇ）、シトシンからアデニン（Ａ）、またはシトシンからチミン（Ｔ）の置換を有し得る。１つの実施形態では、ＪＷ１７改変型対立遺伝子は、ヌクレオチド１５４，６８８でのシトシンからチミンへの変更である。
【００４５】
本明細書中で使用される用語「ＪＷ１８改変型対立遺伝子」は、ＡＣ００７７２８配列のヌクレオチド１５４，４７１位でのＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５の５’非翻訳領域における遺伝子バリエーションを意味する。ヌクレオチド１５４，４７１での遺伝子バリエーションは、一ヌクレオチド置換、多重ヌクレオチド置換、または１つ以上のヌクレオチドの欠失もしくは挿入であり得るが、これらに限定されない。野生型配列は、１５４，４７１位にシトシン（Ｃ）を有し；非限定的な例として、ＪＷ１８改変型対立遺伝子は、ヌクレオチド１５４，４７１にシトシン（Ｃ）からグアニン（Ｇ）、シトシンからアデニン（Ａ）、またはシトシンからチミン（Ｔ）の置換を有し得る。１つの実施形態では、ＪＷ１８改変型対立遺伝子は、ヌクレオチド１５４，４７１でのシトシンからチミンへの変更である。
【００４６】
本明細書中ではさらに、線維性狭窄疾患により特徴付けられたクローン病の臨床サブタイプを診断するか、またはそれに対する感受性を予測する方法であって、当該方法は、個体における、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５座に連鎖された少なくとも２つの線維性狭窄素因対立遺伝子の存在または不在を決定する工程によるものであり、ここで、線維性狭窄素因対立遺伝子の１つ以上の存在が、線維性狭窄疾患により特徴付けられたクローン病の臨床サブタイプの診断またはそれに対する感受性の予測となる、方法が提供される。本発明の方法では、この少なくとも２つの線維性狭窄素因対立遺伝子は、ＳＮＰ８、ＳＮＰ１２、またはＳＮＰ１３での「２」対立遺伝子である。
【００４７】
本明細書中ではさらに、線維性狭窄疾患により特徴付けられたクローン病の臨床サブタイプを診断するか、またはそれに対する感受性を予測する方法であって、当該方法は、個体における、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５座に連鎖された少なくとも２つの線維性狭窄素因対立遺伝子の存在または不在を決定する工程によるものであり、ここで、線維性狭窄素因対立遺伝子の１つ以上の存在が、線維性狭窄疾患により特徴付けられたクローン病の臨床サブタイプの診断またはそれに対する感受性の予測となる、方法が提供される。１つの実施形態では、この少なくとも２つの線維性狭窄素因対立遺伝子は、ＳＮＰ８、ＳＮＰ１２、またはＳＮＰ１３での「２」対立遺伝子である。別の実施形態では、線維性狭窄疾患により特徴付けられたクローン病の臨床サブタイプを診断するか、またはそれに対する感受性を予測するための本発明の方法は、個体における、（ｉ）ＳＮＰ８での「２」対立遺伝子、（ｉｉ）ＳＮＰ１２での「２」対立遺伝子、および（ｉｉｉ）ＳＮＰ１３での「２」対立遺伝子の存在または不在を決定することにより実施され、ここで、ＳＮＰ８、ＳＮＰ１２、およびＳＮＰ１３での「２」対立遺伝子の１つ以上の存在が、線維性狭窄疾患により特徴付けられたクローン病の臨床サブタイプの診断またはそれに対する感受性の予測となる。
【００４８】
線維性狭窄素因対立遺伝子とクローン病との間の関連の強さは、１より大きな下位９５％信頼区間限界での特定のオッズ比（例えば、少なくとも２のオッズ比）によって、特徴づけられ得る。このようなオッズ比は、例えば、１より大きな下位９５％信頼区間限界で、少なくとも３．０、４．０、５．０、６．０、７．０、または８．０以上であり得、例えば、１．９−２８．９の９５％信頼区間で、少なくとも７．４のオッズ比である（図３を参照のこと）。さらに、オッズ比は、例えば、１．２６−４．４７の下位信頼区間限界で少なくとも２．３７であり得る（図３を参照のこと）。１つの実施形態では、線維性狭窄素因対立遺伝子は、少なくとも２のオッズ比および１より大きな下位９５％信頼限界で、線維性狭窄疾患により特徴付けられたクローン病の臨床サブタイプと関連している。オッズ比を決定するための方法は、当該分野で周知である（例えば、Ｓｃｈｌｅｓｓｅｌｍａｎら，Ｃａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｓｔｕｄｉｅｓ：Ｄｅｓｉｇｎ，Ｃｏｎｄｕｃｔ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８２）を参照のこと）。
【００４９】
１つの実施形態では、線維性狭窄素因対立遺伝子は、０．０５以下のｐ値で、クローン病の線維性狭窄サブタイプと関連している。他の実施形態では、線維性狭窄素因対立遺伝子は、０．１以下のｐ値で、クローン病の線維性狭窄サブタイプと関連している。本明細書中で使用される用語「ｐ値」は、「確率値」と同義である。当該分野で周知であるように、ランダム対立遺伝子と疾患との間の関連についての期待ｐ値は、１．００である。ｐ値が約０．０５未満であることは、対立遺伝子と疾患とが、偶然に一緒に出現するわけではなく、正の因子によって影響を受けていることを示す。一般に、連鎖の有意性についての統計学的閾値は、２０のゲノム走査で一度偽陽性が生じる対立遺伝子共有のレベルで設定されている（ｐ＝０．０５）。特定の実施形態では、線維性狭窄素因対立遺伝子は、０．１、０．０５、０．０４、０．０３、０．０２、０．０１、０．００９、０．００８、０．００７、０．００６、０．００５、０．００４、０．００３、０．００２もしくは０．００１以下のｐ値で、または０．０００９５、０．０００９、０．０００８５、０．０００８もしくは０．０００５未満のｐ値で、線維性狭窄により特徴付けられたクローン病の臨床サブタイプと関連している。いくつかの場合には、ｐ値は、例えば、因子（例えば、サンプルサイズ（家族数）、遺伝的不均一性、臨床的不均一性、または解析アプローチ（パラメーター法または非パラメーター法））を考慮するように補正される必要があり得ることが認識される。
【００５０】
種々の手段が、本発明の方法において、線維性狭窄素因対立遺伝子の存在または不在を決定するために使用され得る。例として、個体由来の核酸の酵素的増幅が、続く分析のための核酸を得るために、便宜的に使用され得る。また、線維性狭窄素因対立遺伝子の存在または不在は、酵素的増幅を行わずに、個体の核酸から直接決定され得る。
【００５１】
個体由来の核酸の分析（増幅されようがされまいが）は、種々の技術のいずれかを用いて実施され得る。有用な技術としては、限定されることなく、ポリメラーゼ連鎖反応ベースの分析、配列分析、および電気泳動分析が挙げられ、これらは、単独または組み合わせで使用され得る。本明細書中で使用される用語「核酸」は、ポリヌクレオチド（例えば、一本鎖または二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡ分子（例えば、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡおよびｍＲＮＡを含む））を意味する。用語核酸は、天然起源および合成起源の両方の核酸分子、ならびにネイティブ核酸分子のセンス鎖もしくはアンチセンス鎖、またはその両方を呈する直鎖状、環状、または分枝状配置の分子を包含する。このような核酸は、合成材料（例えば、ビーズまたはカラムマトリックス）に付着され得ることが理解される。
【００５２】
線維性狭窄素因対立遺伝子の存在または不在は、ポリメラーゼ連鎖反応による個体の核酸の増幅を包含し得る。核酸の増幅のためのポリメラーゼ連鎖反応の使用は、当該分野で周知である（例えば、Ｍｕｌｌｉｓら（編），Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ，Ｂｉｒｋｈａｅｕｓｅｒ，Ｂｏｓｔｏｎ，（１９９４）を参照のこと）。１つの実施形態では、ポリメラーゼ連鎖反応増幅は、１つ以上の蛍光標識プライマーを用いて実施される。別の実施形態では、ポリメラーゼ連鎖反応増幅は、ＤＮＡ浅溝結合剤（ＤＮＡ ｍｉｎｏｒ ｇｒｏｖｅ ｂｉｎｄｅｒ）を含む１つ以上の標識または未標識プライマーを用いて実施される。
【００５３】
いくつかの異なるプライマーが、ポリメラーゼ連鎖反応によって個体の核酸を増幅するために使用され得る。例えば、表２（配列番号３７〜４４）に列挙し、そして図５〜８に示したＰＣＲプライマーが、個体の核酸のＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５座中の特定の領域を増幅するために使用され得る。例えば、ＳＮＰ８周囲の領域は、配列番号３９および４０を用いて増幅され得；ＳＮＰ１２は、配列番号４１および４２を用いて増幅され得；そしてＳＮＰ１３周囲の領域は、配列番号４３および４４を用いて増幅され得る。さらに、例えば、周囲の領域。当業者に理解されるように、ＰＣＲ分析のために、さらなるプライマーが、目的の領域の側面に位置する配列に基づいて設計され得る。非限定的な例として、配列プライマーは、目的の領域の上流または下流の配列の約１５〜３０ヌクレオチドを含み得る。このようなプライマーは、一般に、増幅反応において安定なアニーリング工程を可能にする高い融解温度を達成するのに十分なグアニンおよびシトシン含有量を有するように設計される。いくつかのコンピュータープログラム（例えば、Ｐｒｉｍｅｒ Ｓｅｌｅｃｔ）が、ＰＣＲプライマーの設計の補助のために利用可能である。
【００５４】
Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから入手可能なＴａｑｍａｎ（登録商標）対立遺伝子識別アッセイが、線維性狭窄素因対立遺伝子の存在または不在を決定するために有用であり得る。Ｔａｑｍａｎ（登録商標）対立遺伝子識別アッセイでは、各対立遺伝子について特異的な蛍光色素標識プローブが構築される。このプローブは、各対立遺伝子の増幅を区別するために、異なる蛍光レポーター色素（例えば、ＦＡＭおよびＶＩＣＴＭ）を含む。さらに、各プローブは、一方の端部にクエンチャー色素（これは、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）により蛍光をクエンチする）を有する。ＰＣＲの間、各プローブは、個体由来の核酸中の相補配列に対して特異的にアニーリングする。Ｔａｑポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性は、対立遺伝子にハイブリダイズするプローブのみを切断するために使用される。切断は、クエンチャー色素からレポーター色素を分離し、レポーター色素による蛍光の増大を生じる。従って、ＰＣＲ増幅によって生じた蛍光シグナルは、サンプル中にどの対立遺伝子が存在するかを示す。プローブと対立遺伝子との間のミスマッチは、プローブハイブリダイゼーションおよびＴａｑポリメラーゼによる切断の両方の効率を減少させ、蛍光シグナルをほとんど生じないものとし、また全く生じさせないこともある。対立遺伝子識別アッセイにおける特異性の改善は、例えば、Ｋｕｔｙａｖｉｎら，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２８：６５５−６６１（２０００）に記載のように、ＤＮＡ浅溝結合剤（ＭＧＢ）基をＤＮＡプローブに結合体化させることにより達成され得る。浅溝結合剤としては、ジヒドロシクロピロロインドールトリペプチド（ｄｉｈｙｄｒｏｃｙｃｌｏｐｙｒｒｏｌｏｉｎｄｏｌｅ ｔｒｉｐｅｐｔｉｄｅ）（ＤＰＩ３）のような化合物が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５５】
配列分析もまた、本発明の方法において線維性狭窄素因対立遺伝子の存在または不在を決定するために有用であり得る。線維性狭窄素因対立遺伝子は、例えば、表２（配列番号３７〜４４）に列挙し、そして図５〜８に示したＰＣＲプライマーとして、本明細書中に開示されたプライマーを用いて、配列分析によって検出され得る。当業者に理解されるように、配列分析のために、さらなるプライマーが、目的の領域の側面に位置する配列に基づいて設計され得る。非限定的な例として、配列プライマーは、目的の領域の上流または下流の約４０〜４００塩基対の配列の約１５〜３０ヌクレオチドを含み得る。このようなプライマーは、一般に、配列決定反応において安定なアニーリング工程を可能にする高い融解温度を達成するのに十分なグアニンおよびシトシン含有量を有するように設計される。
【００５６】
１つ以上の核酸に関して本明細書中で使用される用語「配列分析」は、核酸中のヌクレオチドの順序が決定される任意の手動または自動プロセスを意味する。例として、配列分析は、ＤＮＡのサンプルのヌクレオチド配列を決定するために使用され得る。用語配列分析は、限定されることなく、化学的方法および酵素的方法（例えば、ジデオキシ酵素的方法（例えば、マキサム・ギルバート配列決定およびサンガー配列決定ならびにそれらの変法を包含する））を包含する。用語配列分析は、さらに、キャピラリーアレイＤＮＡ配列決定（キャピラリー電気泳動およびレーザー誘導蛍光検出に依存し、ＭｅｇａＢＡＣＥ １０００またはＡＢＩ ３７００のような機器を用いて実施され得る）を包含するが、これらに限定されない。さらなる非限定的な例として、用語配列分析は、熱サイクル配列決定（Ｓｅａｒｓら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １３：６２６−６３３（１９９２））；固相配列決定（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎら，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．３：３９−４２（１９９２）；および質量分光計（例えば、マトリックス補助レーザー脱着／イオン化飛行時間型質量分析装置ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ）を用いた配列決定（Ｆｕら，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１６：３８１−３８４（１９９８））を包含する。用語配列分析はまた、ハイブリダイゼーションによる配列決定（ＳＢＨ）（これは、未知のＤＮＡ中に存在する配列のセグメントを同定するために、全ての可能性のある短オリゴヌクレオチドのアレイに依存する）（Ｃｈｅｅら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４：６１０−６１４（１９９６）；Ｄｒｍａｎａｃら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０：１６４９−１６５２（１９９３）；およびＤｒｍａｎａｃら，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１６：５４−５８（１９９８））を包含するが、なおこれらに限定されない。当業者は、これらのおよびさらなる変法が、本明細書中で規定されるように、用語配列分析によって包含されることを理解する。一般には、Ａｕｓｕｂｅｌら，前出、Ｃｈａｐｔｅｒ ７およびｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ４７を参照のこと。
【００５７】
本発明はまた、線維性狭窄疾患により特徴付けられたクローン病の臨床サブタイプを診断するか、またはそれに対する感受性を予測する方法であって、当該方法は、個体における、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５座に連鎖された線維性狭窄素因対立遺伝子の存在または不在を決定する工程によるものであり、ここで、線維性狭窄素因対立遺伝子の存在が、線維性狭窄疾患により特徴付けられたクローン病の臨床サブタイプの診断またはそれに対する感受性の予測となり、そしてここで当該方法が、個体からＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５座を含む核酸を含有する材料を得る工程を包含する、方法を提供する。本明細書中で使用される用語「材料」は、核酸が調製され得る任意の生物学的物質を意味する。非限定的な例として、用語材料は、全血、血漿、唾液、頬スワブ、または核酸を含有する他の体液または組織を包含する。１つの実施形態では、本発明の方法は、全血を用いて実施される。全血は、非侵襲的手段によって容易に得られ得、そして例えば酵素的増幅または自動配列決定のために、ゲノムＤＮＡを調製するために使用され得る。別の実施形態では、本発明の方法は、個体から得られた組織（例えば、外科手順または生検手順の間に得られた組織）を用いて実施される。
【００５８】
電気泳動分析もまた、本発明の方法において有用であり得る。１つ以上の核酸（例えば、増幅フラグメント）に関して本明細書中で使用される電気泳動分析は、装填された分子が、電場の影響下で固定培地中を移動するプロセスを意味する。電気泳動移動は、主としてそれらの電荷に基づいて核酸を分離し、電荷は、その大きさに比例し、小さな分子であるほど、より迅速に移動する。用語電気泳動分析は、限定されることなく、スラブゲル電気泳動（例えば、アガロースまたはポリアクリルアミドゲル電気泳動）、またはキャピラリー電気泳動を用いる分析を包含する。キャピラリー電気泳動分析は、一般に、高（キロボルトレベル）分離電圧の存在下で、数分の分離時間で、小直径（５０〜１００ ｍ）石英キャピラリー内部で生じる。キャピラリー電気泳動分析を用いて、核酸は、ＵＶ吸収または蛍光標識によって便宜的に検出され、そして数百塩基対までのフラグメントに対して、一塩基分解能が得られ得る。このような電気泳動分析方法およびそれらの変法は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｃｈａｐｔｅｒ ２（Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ４５）Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９９）に記載されるように、当該分野で周知である。
【００５９】
制限フラグメント長多型（ＲＦＬＰ）分析もまた、本発明の方法において線維性狭窄素因対立遺伝子の存在または不在を決定するために有用であり得る（Ｊａｒｃｈｏら、Ｄｒａｃｏｐｏｌｉら，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２．７．１−２．７．５頁，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｉｎｎｉｓら，（編），ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ：Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．（１９９０））。本明細書中で使用される制限フラグメント長多型分析は、制限酵素を用いて遺伝的多型を識別するための任意の方法であり、この制限酵素は、核酸の分解を触媒し、特異的な塩基配列（一般に、パリンドロームまたは逆方向反復）を認識するエンドヌクレアーゼである。当業者は、ＲＦＬＰ分析の使用が、多型部位で２つの対立遺伝子を区別し得る酵素に依存することを理解する。
【００６０】
対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションもまた、線維性狭窄素因対立遺伝子の存在または不在を検出するために使用され得る。対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションは、（例えば、線維性狭窄素因対立遺伝子を包含する配列に対して）完全に相補的な配列を有する標識オリゴヌクレオチドプローブの使用に基づく。適切な条件下で、対立遺伝子特異的プローブは、線維性狭窄素因対立遺伝子を含有する核酸に対してハイブリダイズするが、１つ以上の他の対立遺伝子（これは、プローブと比較して１つ以上のヌクレオチドミスマッチを有する）にはハイブリダイズしない。所望であれば、代替の対立遺伝子にマッチする第二の対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブもまた用いられ得る。同様に、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド増幅の技術が、例えば、線維性狭窄素因対立遺伝子を、線維性狭窄素因対立遺伝子のヌクレオチド配列に対して完全に相補的であるが、他の対立遺伝子に比較して１つ以上のミスマッチを有する対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプライマーを用いることにより選択的に増幅するために、使用され得る（Ｍｕｌｌｉｓら，前出、１９９４）。当業者は、線維性狭窄素因対立遺伝子と１つ以上の他の対立遺伝子との間を識別する１つ以上のヌクレオチドミスマッチが、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションにおいて使用されるべき対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプライマーの中央部に、しばしば位置することを理解する。対して、ＰＣＲ増幅において使用されるべき対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプライマーは、一般に、プライマーの３’末端に、疾患関連対立遺伝子と他の対立遺伝子との間を識別する１つ以上のヌクレオチドミスマッチを含有する。
【００６１】
ヘテロ二重鎖移動度アッセイ（ＨＭＡ）は、本発明の方法において線維性狭窄素因対立遺伝子の存在または不在を検出するために使用され得る別の周知のアッセイである。ＨＭＡは、多型配列の存在を検出するために有用である。なぜならミスマッチを有するＤＮＡ二重鎖は、完全に塩基対合した二重鎖の移動度に比較してポリアクリルアミドゲル中の移動度が低下しているからである（Ｄｅｌｗａｒｔら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６２：１２５７−１２６１（１９９３）；Ｗｈｉｔｅら，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ １２：３０１−３０６（１９９２））。
【００６２】
一本鎖コンフォメーション多型（ｓｉｎｇｌｅ ｓｔｒａｎｄ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）（ＳＳＣＰ）の技術もまた、本発明の方法において線維性狭窄素因対立遺伝子の存在または不在を検出するために使用され得る（Ｈａｙａｓｈｉ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌｉｃ．１：３４−３８（１９９１）を参照のこと）。この技術は、一本鎖ＤＮＡの二次構造における差異に基づいて変異を検出するために使用され、この差異が、非変性ゲル電気泳動の際に変化した電気泳動移動度を生じる。多型フラグメントは、既知の対立遺伝子を含有する対応する標準フラグメントに対して試験フラグメントの電気泳動パターンを比較することにより検出される。
【００６３】
変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）もまた、本発明の方法において線維性狭窄素因対立遺伝子を検出するために使用され得る。ＤＧＧＥでは、二本鎖ＤＮＡが、変性剤の濃度を増大させながら含有するゲル中で電気泳動される；ミスマッチ対立遺伝子で構成される二本鎖フラグメントは、より迅速に融解するセグメントを有し、このため、このようなフラグメントは、完全に相補的な配列に比較して異なる移動を示す（Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄら，「Ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ ｂｙ Ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ Ｇｒａｄｉｅｎｔ Ｇｅｌ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ」、Ｉｎｎｉｓら，前出、１９９０）。
【００６４】
線維性狭窄素因対立遺伝子の存在または不在を決定するために有用な他の分子学的方法は、当該分野で公知であり、そして本発明の方法において有用である。線維性狭窄素因対立遺伝子の存在または不在を決定するための他の周知のアプローチは、限定されることなく、自動配列決定技術およびＲＮＡアーゼミスマッチ技術（Ｗｉｎｔｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８２：７５７５−７５７９（１９８５））を包含する。さらに、当業者は、多重対立遺伝子または線維性狭窄素因ハプロタイプの存在または不在を決定しようとする場合、個々の対立遺伝子が、分子学的方法の任意の組み合わせによって検出され得ることを理解する。一般には、Ｂｉｒｒｅｎら（編）Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｖｏｌｕｍｅ １（Ａｎａｌｙｚｉｎｇ ＤＮＡ）Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９７）を参照のこと。さらに、当業者は、多重対立遺伝子が個々の反応においてまたは単一の反応において検出され得ることを理解する（「マルチプレックス（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ）」アッセイ）。上記を考慮して、当業者は、線維性狭窄疾患により特徴付けられたクローン病の臨床サブタイプを診断するか、またはそれに対する感受性を予測するための本発明の方法が、上記の周知のアッセイまたは当該分野で公知のアッセイのいずれかまたは任意の組み合わせを用いて実施され得ることを認識する。
【００６５】
本発明は、線維性狭窄疾患により特徴付けられたクローン病の臨床サブタイプを診断するか、またはそれに対する感受性を予測するための方法であって、当該方法は、個体における、線維性狭窄素因ハプロタイプの存在または不在を決定する工程によるものであり、ここで、線維性狭窄素因ハプロタイプの存在が、線維性狭窄疾患により特徴付けられたクローン病の臨床サブタイプの診断またはそれに対する感受性の予測となる、方法をさらに提供する。１つの実施形態では、線維性狭窄素因ハプロタイプは、少なくとも２のオッズ比および１より大きな下位９５％信頼限界で、線維性狭窄疾患により特徴付けられたクローン病の臨床サブタイプと関連している。別の実施形態では、線維性狭窄素因ハプロタイプは、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６のオッズ比および１より大きな下位９５％信頼限界で、線維性狭窄疾患により特徴付けられたクローン病の臨床サブタイプと関連している。
【００６６】
本明細書中で使用される用語「線維性狭窄素因ハプロタイプ」は、伝統的なメンデル遺伝学に従って予期されるよりも高い頻度で、線維性狭窄疾患により特徴付けられたクローン病の臨床サブタイプと共に遺伝する傾向のある対立遺伝子の組み合わせを意味する。本発明の方法において、クローン病の臨床サブタイプは、例えば、小腸罹患とは独立して線維性狭窄疾患により特徴づけられ得る。１つの実施形態では、線維性狭窄素因ハプロタイプは、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５座に連鎖された少なくとも１つの対立遺伝子を含む。別の実施形態では、線維性狭窄素因ハプロタイプは、線維性狭窄素因対立遺伝子を含む。さらなる実施形態では、線維性狭窄素因ハプロタイプは、例えば、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５座での改変型対立遺伝子を含む。別の実施形態では、線維性狭窄素因ハプロタイプは、ＳＮＰ８、ＳＮＰ１２、またはＳＮＰ１３での「２」対立遺伝子を含む。さらなる実施形態では、線維性狭窄素因ハプロタイプは、ＳＮＰ１３での「２」対立遺伝子を含む。なおさらなる実施形態では、線維性狭窄素因ハプロタイプは、ＳＮＰ８、ＳＮＰ１２、およびＳＮＰ１３での「２」対立遺伝子を含む。別の実施形態では、線維性狭窄素因ハプロタイプは、ＪＷ１、ＪＷ１５、ＪＷ１６、ＪＷ１７、またはＪＷ１８改変型対立遺伝子を含む。当業者は、線維性狭窄素因ハプロタイプが、以下のような対立遺伝子を含み得ることを理解する。これら対立遺伝子は、個々には、クローン病の線維性狭窄サブタイプと有意に関連していないが、そのハプロタイプを構成する対立遺伝子の組み合わせでは、伝統的なメンデル遺伝学に従って予期されるよりも高い頻度で、線維性狭窄疾患により特徴付けられたクローン病の臨床サブタイプと共に遺伝する傾向がある。
【００６７】
線維性狭窄素因ハプロタイプの存在または不在は、線維性狭窄素因対立遺伝子の存在または不在を決定するために上記で本明細書中に記載された方法のいずれかを用いて成し遂げられ得る。例として、酵素的増幅（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応増幅（例えば、１つ以上の蛍光標識プローブまたはＤＮＡ浅溝結合剤を含む１つ以上のプローブを用いる））は、本発明の方法において線維性狭窄素因ハプロタイプの存在または不在を決定するために有用であり得る。
【００６８】
抗体ベースの方法もまた、本発明の方法において線維性狭窄素因対立遺伝子または線維性狭窄素因ハプロタイプの存在または不在を決定するために有用であり得る。例として、線維性狭窄素因対立遺伝子によりコードされたポリペプチドまたはそれらのフラグメントと特異的に反応性である抗体が、個体においてその対立遺伝子の存在または不在を検出するために使用され得る。このような抗体は、例えば、ＳＮＰ１３での「２」対立遺伝子により生じたＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５の短縮バージョンと特異的に反応し得るが、全長または野生型ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５とは反応性ではない。
【００６９】
本発明の方法において有用な抗体は、限定されることなく、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体、単鎖抗体、キメラ抗体、二官能性抗体または二重特異的抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、および相補性決定領域（ＣＤＲ）グラフト化抗体（ＣＤＲまたは抗原結合配列を含む化合物を含む）を含み、これらは、線維性狭窄素因対立遺伝子によりコードされたポリペプチドまたはフラグメントに識別的に結合するが他の非素因性対立遺伝子によるものには結合しない。抗体フラグメント（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖを含む）もまた、可塑性抗体（ｐｌａｓｔｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）または分子インプリントポリマー（ｍｏｌｅｃｕｌａｒｌｙ ｉｍｐｒｉｎｔｅｄ ｐｏｌｙｍｅｒｓ）（ＭＩＰ；ＨａｕｐｔおよびＭｏｓｂａｕｃｈ，ＴＩＢＴｅｃｈ １６：４６８−４７５（１９９８））と同様に、本発明の方法において有用であり得る。抗体の識別的な結合特異性を決定するためのスクリーニングアッセイは、当該分野において周知である（Ｈａｒｌｏｗら（編），Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８８）を参照のこと）。
【００７０】
本発明の方法において有用な抗体は、線維性狭窄素因対立遺伝子によりコードされたポリペプチドまたはそれらの免疫原性フラグメントを用いる、当該分野で周知の任意の方法を用いて生成され得る。免疫原性ポリペプチドまたはフラグメントは、天然供給源から、組換え宿主細胞から単離され得るか、または化学合成され得る。このようなペプチドを合成するための方法は、例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９−２１５４（１９６３）；Ｋｒｓｔｅｎａｎｓｋｙら，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２１１：１０（１９８７）に記載されるように、当該分野で公知である。
【００７１】
本発明の線維性狭窄素因対立遺伝子によりコードされたポリペプチドに識別的に結合する抗体は、検出部分で標識され得、そしてそのコードされたポリペプチドの存在、不在、または量をインビボ、インビトロ、またはインサイチュで検出するために使用され得る。蛍光分子のような部分は、本発明の方法において使用される抗体に連結され得る。検出部分のような部分は、例えば、カルボジイミド結合体化を用いて、抗体に連結され得る（ＢａｕｍｉｎｇｅｒおよびＷｉｌｃｈｅｋ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．７０：１５１−１５９（１９８０））。
【００７２】
線維性狭窄素因対立遺伝子によりコードされたポリペプチドに識別的に結合する抗体が、免疫アッセイにおいて使用され得る。免疫アッセイは、限定されることなく、放射性免疫アッセイ、酵素結合型免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、および蛍光標識抗体を用いる免疫アッセイ（これらは当該分野で周知である）を含む。抗体はまた、免疫組織化学または他のインサイチュアッセイを用いて、細胞または組織における目的のポリペプチドの存在または不在を検出するために使用され得る。さらに、細胞の表面上または内部のいずれかに目的のポリペプチドを含有する細胞が、アッセイ（例えば、蛍光活性化細胞分析分離装置（ＦＡＣＳ））を用いて、抗体によって検出され得る。当業者は、これらのアッセイおよび他の慣用のアッセイが、本発明の方法に従って、線維性狭窄素因対立遺伝子の遺伝子産物の存在または不在を決定するために有用であり得ることを理解する。
【００７３】
本発明の方法は、必要に応じて、個体における、線維性狭窄素因対立遺伝子または線維性狭窄素因ハプロタイプの存在または不在を示す報告を作成する工程を包含する。本発明の方法はまた、必要に応じて、個体における、線維性狭窄疾患により特徴付けられたクローン病の臨床サブタイプの存在または不在、または個体がクローン病の線維性狭窄サブタイプを有するもしくは発症する危険度を示す報告を作成する工程を包含する。
【００７４】
報告は、種々の様式であり得る。例えば、報告は紙に印刷され得るか、または報告は、印刷されずに電子媒体で伝達され得る電子報告（例えば、電子メールまたはコンピューターディスク）であり得る。報告はまた、個体における、線維性狭窄素因対立遺伝子の、または線維性狭窄疾患により特徴付けられたクローン病の臨床サブタイプの存在または不在を示す口頭での報告であり得る。
【００７５】
本発明はまた、個体における治療を最適化する方法であって、当該方法は、当該個体における、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５座に連鎖された線維性狭窄素因対立遺伝子の存在または不在を決定する工程、線維性狭窄素因対立遺伝子が存在する個体を、クローン病の線維性狭窄サブタイプを有するとして診断する工程、およびこの診断に基づいて、クローン病の線維性狭窄サブタイプを有する個体を処置する工程によるものである、方法を提供する。クローン病の線維性狭窄サブタイプのための処置は、現行では、例えば、腸の罹患狭窄部の外科的除去を含む。１つの実施形態では、線維性狭窄素因対立遺伝子の存在または不在は、クローン病の既知の診断を有する個体において決定される。別の実施形態では、診断は、上記のような報告の様式で記録される。
【実施例】
【００７６】
以下の実施例は、本発明を例示するが限定するものでないことが意図される。
【００７７】
（実施例Ｉ）
（研究被験体の選択および特徴づけ）
本実施例は、クローン病患者の２つのコホートがいかなるものであるかの臨床的特徴づけを記載する。
【００７８】
（Ａ．研究被験体の選択）
クローン病患者の２つのコホートを、炎症性腸疾患紹介センター（Ｃｅｄａｒｓ−Ｓｉｎａｉ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｂｏｗｅｌ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｅｎｔｅｒ）から引き続いて同定した。１４２人の患者の第一のコホート（１９９３年〜１９９６年の間に把握された；「ＣＤ１」と称する）は、Ｖａｓｉｌｉａｕｓｋａｓら，Ｇｕｔ ４７：４８７−４９６（２０００））において以前に記載された。５９人の患者の第二のコホート（コホート２）を、１９９９年〜２００１年の間に集め、そして「ＣＤ２」と称した。１７５人の潰瘍性大腸炎患者のコホートを、炎症性腸疾患コントロール群として使用した。本研究（これは、Ｃｅｄａｒｓ−Ｓｉｎａｉ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒｄにより、ヒト被験体参加について検討され、認可された）は、本研究に同意する患者からの臨床データ、血清学的データおよび遺伝学的データの収集を包含した。
【００７９】
コホート患者におけるクローン病の診断は、以下のカテゴリーの少なくとも２つからの確立した特徴の組み合わせの存在によって確定した：１）臨床検査−穿孔疾患または瘻孔形成疾患、小腸の狭窄（ｓｔｅｎｏｓｉｓ）または狭窄（ｓｔｒｉｃｔｕｒｅ）に続発的な閉塞性の症状；２）内視鏡検査−深い線状または蛇行状の潰瘍形成、正常に見える粘膜における離散性潰瘍、丸石化（ｃｏｂｂｌｅｓｔｏｎｉｎｇ）、または不連続もしくは非対称の炎症；３）Ｘ線検査−分節性疾患（跳躍病変）、小腸または結腸の狭窄（ｓｔｒｉｃｔｕｒｅｓ）、狭窄（ｓｔｅｎｏｓｉｓ）またはフィステル；および４）組織病理検査−粘膜下または経壁性炎症、多発性肉芽腫、生検の期間内または生検間の顕著な巣状の陰窩炎（ｆｏｃａｌ ｃｒｙｐｔｉｔｉｓ）または巣状の慢性炎症浸潤、または跳躍病変（局所治療なしに直腸節約（ｒｅｃｔａｌ ｓｐａｒｉｎｇ）を含む）。
【００８０】
ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５遺伝子の対立遺伝子改変型と関連した臨床的特徴および免疫学的形質を同定するために、本研究を設計して、２つの引き続き把握されたクローン病患者コホートを解析した。第一のコホートを使用して、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５対立遺伝子と臨床的変数および血清学的変数のアレイとの関係を調査し、それにより仮説を立てた。次いで、第二のコホートを使用して、第一のコホートの解析から立てた特定の仮説を確認した。第一種の過誤を最小とし、そして統計的検出力を最大にするために、第一のコホートにおける関連性の有意性を、第二のコホート（ｐ＜０．０５）におけるよりも厳密でなくてもよいものとした（ｐ＜０．１）。第一のコホートにおいて調べた変数の数について高度に厳密な補正を回避することにより、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５対立遺伝子改変型と臨床的変数との間の特定の関連性を同定することがますますできるようになった。
【００８１】
（Ｂ．研究被験体の臨床的特徴づけ）
クローン病患者を、以前に記載された診断基準（Ｇａｓｃｈｅら，Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｂｏｗｅｌ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ６：８−１５（２０００）；Ｖａｓｉｌｉａｕｓｋａｓら，Ｇｕｔ ４７：４８７−４９６（２０００）；Ｖａｓｉｌｉａｕｓｋａｓら，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １１０：１８１０−１８１９（１９９６）；およびＧｒｅｅｎｓｔｅｉｎら，Ｇｕｔ ２９：５８８−５９２（１９８８））に基づいて、線維性狭窄疾患、内部穿孔疾患、肛門周囲瘻孔形成疾患、または潰瘍性大腸炎（ＵＣ）様疾患を有するとして特徴付けた。十分に確立された判断基準に従って、線維性狭窄疾患を、検査による存続腸閉塞または腸閉塞のための腸管切除によって確定した。内部穿孔疾患を、腸−腸もしくは腸−膀胱フィステル、腹内膿瘍、または小腸穿孔の現在または以前の形跡として確定した。肛門周囲瘻孔形成疾患を、肛門周囲フィステルもしくは膿瘍または直腸膣フィステルのいずれかの現在または以前の形跡によって確定した。潰瘍性大腸炎（ＵＣ）様疾患を、以前に記載されたように、左側結腸罹患、出血もしくは尿意促迫の症状、および結腸生検における陰窩膿瘍の現在または以前の形跡によって確定した。疾患の位置を、１つ以上の内視鏡研究、Ｘ線研究、または病理研究に基づいて、小腸、結腸、またはその両方として分類した。血清学的試験および遺伝学的試験の結果を知らない炎症性腸疾患医師団は、臨床データに基づく表現型に対して同意に達した。
【００８２】
血清ＡＮＣＡ発現およびＡＮＣＡサブタイプ特徴づけを、以前に記載されるように（Ｓａｘｏｎら，Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８６：２０２−２１０（１９９０））、固定好中球酵素結合型免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって実施した。簡潔には、メタノールで固定したヒト末梢血好中球を、コントロール血清およびコード化（ｃｏｄｅｄ）した血清と１：１００希釈で反応させた。アルカリホスファターゼに結合体化した抗ヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）（鎖特異的）抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｓ，Ｉｎｃ．；Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）を添加して好中球結合抗体を標識し、そして比色分析反応を実施した。十分に特徴付けられたｐＡＮＣＡ＋ ＵＣ患者から得たプールした血清からなる標準に対して、レベルを決定した。結果は、１ミリリットル当たりＥＬＩＳＡ単位（ＥＵ）として表した。以前に記載されるように（Ｓａｘｏｎら，前出、１９９０）、間接的免疫蛍光染色によってＡＮＣＡ＋血清をさらにサブタイプ分類して、ＡＮＣＡ好中球結合パターンを決定した。特徴的な核周囲のハイライトを示し、かつデオキシリボヌクレアーゼで処理した場合に特徴的な染色パターンを喪失する血清を、ｐＡＮＣＡ＋と称した（Ｖｉｄｒｉｃｈら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：２９３−２９９（１９９５））。本研究の目的のために、患者が、ＥＬＩＳＡによりＡＮＣＡに対して陽性であり、かつデオキシリボヌクレアーゼ処理で核周囲免疫蛍光染色を喪失した場合、その患者をｐＡＮＣＡ＋とみなした。
【００８３】
血清を、固定ＥＬＩＳＡアッセイを用いることにより、盲検様式で、ＡＳＣＡ発現について分析した（Ｖａｓｉｌｉａｕｓｋａｓら，Ｇｕｔ ４７：４８７−４９６（２０００）；およびＶｅｒｍｅｉｒｅら，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １２０：８２７−８３３（２００１））。第二のコホート中２人の患者は、ＡＳＣＡ試験を受けなかった。高結合ポリスチレンマイクロタイタープレートを、酵母Ｓ．ｕｖａｒｕｍ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの亜種）から抽出された精製ホスホペプチドマンナンでコーティングした。コード化した患者血清を希釈し、そしてウェルに添加し、続いて酵素結合型比色反応を行った。呈色は、血清中に存在するＡＳＣＡ抗体の濃度に比例した。標準（これは、この抗原に対する反応性を有することが見い出された、十分に特徴付けられたクローン病を有する患者の血清のプールに由来した）に対して、レベルを決定し、そしてＥＵ／ｍＬとして結果を表した。４０ＥＵ／ｍＬより大きなＡＳＣＡ ＩｇＧ反応性または２０ＥＵ／ｍＬより大きなＩｇＡ反応性を示す血清を、ＡＳＣＡ＋と称した。Ｃｅｄａｒｓ−Ｓｉｎａｉ
Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ａｎｄ Ｐｒｏｍｅｔｈｅｕｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）で、実質的に同一の方法を用いて、血清学的アッセイを実施した。これら２つのクローン病コホートの臨床的特徴を、表１に示す。
【００８４】
【表１】
（実施例ＩＩ）
（クローン病患者はＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５の稀な対立遺伝子改変型を増大した頻度で有する）
本実施例は、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５座内のＳＮＰ８、ＳＮＰ１２、またはＳＮＰ１３での「２」対立遺伝子（ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５の稀な対立遺伝子改変型）と、北米人集団におけるクローン病との関連を記載する。
【００８５】
コホート１および２における北米人クローン病患者集団がＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５の対立遺伝子改変型を発現したかどうかを決定するために、コホート１（仮説決定）およびコホート２（仮説確認）を、ＳＮＰ８（Ｒ６７５Ｗ）、ＳＮＰ１２（Ｇ８８１Ｒ）、およびＳＮＰ１３（３０２０ｉｎｓＣ）の稀な対立遺伝子改変型について遺伝子型判定した。潰瘍性大腸炎のコホートを比較のために使用した。
【００８６】
遺伝子型判定を、５’−エキソヌクレアーゼ技術を用いる遺伝子型判定アッセイであるＴａｑＭａｎ ＭＧＢＴＭアッセイ（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いて実施した。ソフトウェアＰｒｉｍｅｒＥｘｐｒｅｓｓ １．５ＴＭ（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）およびＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５ ＳＮＰ５、８、１２、および１３についてｄｂＳＮＰにおいて見い出される配列情報を用いて、プライマーを設計した。ＭＧＢＴＭ設計は、「浅溝結合剤」をＴａｑＭａｎＴＭプローブの３’末端に付加し、それによりプローブの結合温度を上昇させ、従来のＴａｑＭａｎＴＭアッセイにおけるよりも短いプローブの使用を可能にする（Ｋｕｔｙａｖｉｎら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３７１８−３７２３（１９９７））。これは、アッセイにおける対立遺伝子間の識別を増大させる効果を有する（Ｋｕｔｙａｖｉｎら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８：６５５−６６１（２０００））。ＡＢＩ ７９００機器で製造者の推奨（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ｂｕｌｌｅｔｉｎ ４３１７５９４）に従ってアッセイを実施した。遺伝子型判定を、被験体の臨床状態に対して目隠しにして実施した。この遺伝子型判定アッセイにおいて使用したプライマーおよびプローブを表２および表３に示す。
【００８７】
【表２】
【００８８】
【表３】
表４に示されるように、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５の３つの稀な対立遺伝子改変型の各々（ＳＮＰ８、ＳＮＰ１２、またはＳＮＰ１３での「２」対立遺伝子）は、潰瘍性大腸炎患者と比較してクローン病患者において有意に頻度が高かった。さらに、表４中で見られ得るように、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５の稀な対立遺伝子改変型の各々の頻度は、クローン病患者の各コホートにおいて同様であり、このことは、これら２つのコホートの組み合わせ使用を支持した。ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５のこれら３つのうちいずれかの稀な対立遺伝子改変型の頻度全体では、潰瘍性大腸炎患者が１１％であるのに比較して、クローン病患者は３５％であった（ｐ＝０．００１）。
【００８９】
組み合わせたクローン病コホートの中で、ＳＮＰ１３での「２」対立遺伝子（３０２０ｉｎｓＣ）を有するホモ接合体および複合の稀な対立遺伝子へテロ接合体の頻度はそれぞれ１％と４％であったが、潰瘍性大腸炎患者のいずれもこのような遺伝子型を有しなかった。これらの結果は、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５の稀な対立遺伝子改変型が、多様な地理学的および民族学的に定義された患者集団を越えて、クローン病と関連していることを実証する。
【００９０】
【表４】
（実施例ＩＩＩ）
（ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５座における稀な改変型対立遺伝子はコホート１においてクローン病の線維性狭窄サブタイプと関連している）
本実施例は、コホート１において、ＳＮＰ８、ＳＮＰ１２、またはＳＮＰ１３での「２」対立遺伝子が、線維性狭窄疾患と有意に関連していることを実証する。
【００９１】
クローン病患者は、多様な臨床表現型を発現し、この表現型は、根底の遺伝的要因における差異に起因し得る。ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５座での稀な改変体対立遺伝子が、特定のクローン病関連臨床表現型または疾患関連血清免疫マーカーと関連しているかを決定するために、単変量解析を実施した。単変量解析は、ＳＮＰ８、ＳＮＰ１２、またはＳＮＰ１３でのＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５対立遺伝子改変型と予め規定された臨床的特徴（発症時年齢、疾患位置、および疾患表現型（線維性狭窄疾患、内部穿孔疾患、肛門周囲瘻孔形成疾患、または潰瘍性大腸炎様疾患）を含む）との間の関連を評価した。ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５対立遺伝子改変型と血清免疫マーカーＡＳＣＡおよびｐＡＮＣＡの発現との間の関連もまた検証した。
【００９２】
表５において示されるように、単変量解析は、コホート１において、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５座のＳＮＰ８、ＳＮＰ１２、またはＳＮＰ１３での「２」対立遺伝子が、組み合わせた３つの対立遺伝子改変型について線維性狭窄疾患と有意に関連している（ｐ＝０．０４９）ことを示した。このコホートにおいては、小腸罹患および発症時年齢がより若いこととは、より厳密でない有意水準での正の相関（ｐ＜０．１）がまた見られ、そしてＵＣ様疾患とは、負の相関が見られた。血清学的マーカーに関して、ＳＮＰ１３での「２」対立遺伝子を有する患者の方が、ＡＳＣＡを発現する確率が高かった（ｐ＝０．０５３）。これらの結果は、コホート１において、ＳＮＰ８、ＳＮＰ１２、またはＳＮＰ１３での「２」対立遺伝子が、線維性狭窄疾患と有意に関連していることを実証する。
【００９３】
統計学的解析を、ＳＡＳコンピューターソフトウェア（Ｖｅｒｓｉｏｎ ６．１０；ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｉｎｃ．；Ｃａｒｙ，ＮＣ）を用いて実施した。量的変数を、範囲と共に中央値として記載した。非パラメーター統計学的検定を用いて、２群間の量的変数における差異を検証した。χ二乗検定またはフィッシャーの直接確率（期待数が５未満である場合）を用いて、稀な対立遺伝子のキャリアと非キャリアとの間、または遺伝子型とカテゴリー変数（例えば、ＩＢＤのタイプ、疾患位置、疾患挙動、および抗体陽性）との間の関連を評価した。さらに、全ての遺伝子型および表現型の関連について、Ｍａｎｔｅｌ Ｈａｅｎｓｚｅｌ層化関連検定（Ｍａｎｔｅｌ Ｈａｅｎｓｚｅｌ ｓｔｒａｔｉｆｉｅｄ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｔｅｓｔ）を、民族バリエーションに起因する潜在的な交絡効果について条件付けすることにより実施した。また、この層化関連検定を使用して、小腸罹患と線維性狭窄疾患とがＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５改変型と独立に関連しているか否かも評価した（以下の実施例ＩＸを参照のこと）。
【００９４】
【表５】
（実施例ＩＶ）
（ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５座における稀な改変型対立遺伝子はコホート２においてクローン病の線維性狭窄サブタイプと関連している）
本実施例は、コホート２において、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５座のＳＮＰ８、ＳＮＰ１２、またはＳＮＰ１３での「２」対立遺伝子が、線維性狭窄疾患と有意に関連していることを実証する。
【００９５】
実施例ＩＩＩにおいてコホート１で得られた結果は、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５の稀な改変型対立遺伝子が線維性狭窄クローン病、小腸罹患、ＡＳＣＡ陽性、および発症時年齢がより若いことと正の相関があり、そしてＵＣ様疾患と負の相関があったことを示した（表５を参照のこと）。これらの仮説を、コホート２を用いてさらに検証した。この結果を表６に示す。コホート１と同様に、コホート２は、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５座のＳＮＰ８、ＳＮＰ１２、またはＳＮＰ１３での「２」対立遺伝子と線維性狭窄疾患との間の有意な相関を示した（ｐ＝０．００２、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ補正ではｐ＝０．０１；表６を参照のこと）。これらの結果は、コホート２において、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５座のＳＮＰ８、ＳＮＰ１２、またはＳＮＰ１３での「２」対立遺伝子が、線維性狭窄疾患と有意に関連していることを示す。
【００９６】
【表６】
（実施例Ｖ）
（ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５座における稀な改変型対立遺伝子はコホート１およびコホート２を表す組み合わせコホートにおいてクローン病の線維性狭窄サブタイプと関連している）
本実施例は、コホート１およびコホート２を表す組み合わせコホートにおいて、ＳＮＰ８、ＳＮＰ１２、またはＳＮＰ１３での「２」対立遺伝子が、線維性狭窄疾患と有意に関連していることを実証する。
【００９７】
図２において見られるように、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５座のＳＮＰ８、ＳＮＰ１２、またはＳＮＰ１３での「２」対立遺伝子（ＮＯＤ２改変型キャリア）と線維性狭窄疾患との間の関連は、これらの２つのコホートを個々に解析した場合よりも一緒に解析した場合において、ずっとより有意であった（ｐ＝０．００１）。
【００９８】
ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５座のＳＮＰ８、ＳＮＰ１２、またはＳＮＰ１３での「２」対立遺伝子（ＮＯＤ２改変型キャリア）と線維性狭窄疾患との間の関連は、ユダヤ人個体と非ユダヤ人個体との両方において観察された。線維性狭窄疾患を有しないクローン病患者では２３％（ユダヤ人２１．６％対非ユダヤ人２５％）のみであることと比較して、線維性狭窄疾患を有するクローン病患者ではおよそ４６％（ユダヤ人５２％対非ユダヤ人４２％）が、これらの稀な対立遺伝子の少なくとも１つを有した（オッズ比２．８；９５％信頼区間１．５６−５．１８）。これら３つの稀な改変型対立遺伝子のうち、フレームシフト変異３０２０ｉｎｓＣ（ＳＮＰ１３での「２」対立遺伝子）が、線維性狭窄疾患と最大の関連を示した（４７％対１７％、ｐ＝０．００６（組み合わせコホートに対して））。これらの結果は、コホート１およびコホート２を表す組み合わせコホートにおいて、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５座における稀な改変型対立遺伝子が、クローン病の線維性狭窄サブタイプと関連していることを示す。
【００９９】
（実施例ＶＩ）
（ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５におけるホモ接合性変異または複合ヘテロ接合性変異を有するクローン病患者）
本実施例は、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５座におけるホモ接合性変異または複合ヘテロ接合性変異を有するクローン病患者における線維性狭窄疾患の危険度の増大を記載する。
【０１００】
図３に示されるように、ＳＮＰ８、ＳＮＰ１２、またはＳＮＰ１３でのＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５変異のキャリアではない患者と比較して、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５における２つの変異のキャリアである患者の方が、線維性狭窄疾患を有する確率が有意に高かった（８５％対４３％；オッズ比７．４；９５％信頼区間１．９−２８．９，ｐ＝０．００４）。また、単一のＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５変異のキャリアである患者の方が、これらのＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５変異のキャリアではない患者と比較した場合に、線維性狭窄疾患を有する確率が有意に高かった（６４％対４３％；オッズ比２．３７；９５％信頼区間１．２６−４．４７；ｐ＝０．００８）。これらの結果は、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５におけるホモ接合性変異または複合ヘテロ接合性変異を有するクローン病患者が、線維性狭窄疾患についての危険度が高いことを示す。
【０１０１】
（実施例ＶＩＩ）
（線維性狭窄疾患のみと線維性狭窄疾患および穿孔疾患との比較）
本実施例は、線維性狭窄疾患および穿孔疾患を有する患者と比較した、線維性狭窄疾患を有する患者におけるＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５座のＳＮＰ８、ＳＮＰ１２、またはＳＮＰ１３での「２」対立遺伝子の関連を記載する。
【０１０２】
線維性狭窄疾患および穿孔疾患は、しばしば、同じ患者において生じる。線維性狭窄疾患を有する患者は、ｉ）線維性狭窄疾患のみを有する、またはｉｉ）線維性狭窄疾患および穿孔疾患の両方を有するとして特徴付けられ得る。これらの表現型に個々に取り組むために、これら２つのコホートの各々における患者を、穿孔合併症ありで線維性狭窄がある場合（Ｆｉｂ＋ｐｅｒｆ）または穿孔合併症なしで線維性狭窄がある場合（Ｆｉｂのみ）によって分別し、線維性狭窄の形跡のない穿孔合併症を有する患者（Ｐｅｒｆのみ）と比較した。線維性狭窄疾患のみを有する患者でＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５座のＳＮＰ８、ＳＮＰ１２、またはＳＮＰ１３での「２」対立遺伝子を有する割合は、４８．３％であり、これは、線維性狭窄合併症および穿孔合併症の両方を有する患者において見られる割合と同様であった（４６．０％；ｐ＝０．８）。図３に見られるように、線維性狭窄疾患を有する患者を穿孔疾患（肛門周囲または内部）のみを有するとして記載される患者と比較した場合、線維性狭窄疾患を有する患者（穿孔合併症ありまたは穿孔合併症なし）におけるＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５座のＳＮＰ８、ＳＮＰ１２、またはＳＮＰ１３での「２」対立遺伝子の頻度は、穿孔合併症のみを有する患者で見られるよりも有意に大きかった（４６．６％対１８．６％；ｐ＝０．００２）。
【０１０３】
（実施例ＶＩＩＩ）
（組み合わせ患者コホートにおける多変量解析）
本実施例は、線維性狭窄疾患がＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５座のＳＮＰ８、ＳＮＰ１２、またはＳＮＰ１３での「２」対立遺伝子と独立に関連していることを実証する。
【０１０４】
多変量解析のために、いずれのコホートにおいても、少なくとも境界域の有意性（ｐ＜０．１）を有する全ての変数を、ロジスティック回帰を用いることにより、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５座のＳＮＰ８、ＳＮＰ１２、またはＳＮＰ１３での「２」対立遺伝子とのそれらの関連について同時に試験した。表７に示されるように、線維性狭窄疾患の臨床表現型は、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５座でのこれらの稀な対立遺伝子と有意に関連していた（ｐ＜０．０５）（ＯＲ ２．８；９５％ ＣＩ，１．３−６．０）。これらの結果は、線維性狭窄疾患が、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５座のＳＮＰ８、ＳＮＰ１２、またはＳＮＰ１３での「２」対立遺伝子と独立に関連していることを確認する。
【０１０５】
【表７】
（実施例ＩＸ）
（線維性狭窄疾患および小腸罹患）
本実施例は、線維性狭窄疾患とＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５座のＳＮＰ８、ＳＮＰ１２、またはＳＮＰ１３での「２」対立遺伝子との間の関連が、小腸罹患とは独立していることを実証する。
【０１０６】
線維性狭窄疾患が小腸罹患を有する患者において生じる確率が高いので、線維性狭窄疾患とＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５改変型対立遺伝子との間の関連が一次相関であるか否かを解析するために、患者を、小腸罹患に基づいて層別化した。小腸罹患を有する患者のうち、線維性狭窄疾患を有さない患者（ｎ＝５３）では２６．４％が、ＳＮＰ８、ＳＮＰ１２、またはＳＮＰ１３での「２」対立遺伝子を有したのに対し、線維性狭窄疾患を有した患者（ｎ＝１０２）では４６．１％が、ＳＮＰ８、ＳＮＰ１２、またはＳＮＰ１３での「２」対立遺伝子を有した（ｐ＝０．０１７）。同様の傾向が、小腸罹患を有さない患者の間で見られ（ｐ＝０．０５）、小腸罹患について条件付けする複合解析は、０．００９の有意水準を生じた。
【０１０７】
線維性狭窄疾患について条件付けした後、小腸罹患は、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５座のＳＮＰ８、ＳＮＰ１２、またはＳＮＰ１３での「２」対立遺伝子と関連していなかった（ｐ＝０．６３）。この結果は、ロジスティック回帰解析からの結果（実施例ＶＩＩＩを参照のこと）と一致し、そして線維性狭窄疾患とＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５座のＳＮＰ８、ＳＮＰ１２、またはＳＮＰ１３での「２」対立遺伝子との間の関連が、小腸罹患とは独立していることを示す。これらの結果はさらに、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５座のＳＮＰ８、ＳＮＰ１２、またはＳＮＰ１３での「２」対立遺伝子との観察された小腸の相関が、線維性狭窄疾患の存在に対して二次的であることを示す。
【０１０８】
以前に述べたか否かに関わらず、括弧内またはそれ以外で上に提示した全ての定期刊行物、参考文献、および特許文献は、本明細書中に参考として援用される。
【０１０９】
本発明を上記実施例に関して記載してきたが、種々の改変が本発明の精神から逸脱することなくなされ得ることが理解されるべきである。従って、本発明は、以下の特許請求の範囲によってのみ制限される。
【表８−１】
【表８−２】
【表８−３】
【表８−４】
【表８−５】
【表８−６】
【表８−７】
【表８−８】
【表８−９】
【表８−１０】
【表８−１１】
【表８−１２】
【表８−１３】
【表８−１４】
【表８−１５】
【表８−１６】
【表８−１７】
【表８−１８】
【表８−１９】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書中に記載の発明。
【請求項１】
本明細書中に記載の発明。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０−１】
【図１０−２】
【図１１−１】
【図１１−２】
【図１１−３】
【図１１−４】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０−１】
【図１０−２】
【図１１−１】
【図１１−２】
【図１１−３】
【図１１−４】
【公開番号】特開２０１１−１５６８６（Ｐ２０１１−１５６８６Ａ）
【公開日】平成２３年１月２７日（２０１１．１．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１７４０２１（Ｐ２０１０−１７４０２１）
【出願日】平成２２年８月２日（２０１０．８．２）
【分割の表示】特願２００４−５３２８３７（Ｐ２００４−５３２８３７）の分割
【原出願日】平成１５年７月３０日（２００３．７．３０）
【出願人】（３９８０６２１４９）セダーズ−シナイ メディカル センター (34)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年１月２７日（２０１１．１．２７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年８月２日（２０１０．８．２）
【分割の表示】特願２００４−５３２８３７（Ｐ２００４−５３２８３７）の分割
【原出願日】平成１５年７月３０日（２００３．７．３０）
【出願人】（３９８０６２１４９）セダーズ−シナイ メディカル センター (34)
【Ｆターム（参考）】
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