Ｎｏｔｃｈシグナル伝達を高感度で検出するレポーターコンストラクト
【課題】検出感度が高く、正確なスクリーニングが可能なスクリーニング系を提供すること、および内因性のＮｏｔｃｈシグナル伝達系を測定し得るスクリーニング系を提供すること。
【解決手段】少なくとも３つのＲＢＰ−Ｊκ結合配列を含む核酸分子であって、該ＲＢＰ−Ｊκ結合配列が、ＴＧＧＧＡＡである、核酸分子。Ｎｏｔｃｈシグナル伝達系を調節する物質のスクリーニング方法であって、該方法は、（ａ）該核酸分子を含み、プロモーター配列と作動可能に連結されたレポータータンパク質コード配列をさらに含み、かつ内因性のＮｏｔｃｈタンパク質または構成的に活性なＮｏｔｃｈタンパク質を発現する細胞と、候補物質とを接触させる工程；および（ｂ）該細胞中での該レポータータンパク質の発現量を測定する工程を包含する、方法。
【解決手段】少なくとも３つのＲＢＰ−Ｊκ結合配列を含む核酸分子であって、該ＲＢＰ−Ｊκ結合配列が、ＴＧＧＧＡＡである、核酸分子。Ｎｏｔｃｈシグナル伝達系を調節する物質のスクリーニング方法であって、該方法は、（ａ）該核酸分子を含み、プロモーター配列と作動可能に連結されたレポータータンパク質コード配列をさらに含み、かつ内因性のＮｏｔｃｈタンパク質または構成的に活性なＮｏｔｃｈタンパク質を発現する細胞と、候補物質とを接触させる工程；および（ｂ）該細胞中での該レポータータンパク質の発現量を測定する工程を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、少なくとも３つのＲＢＰ−Ｊκ結合配列を含む核酸分子およびその利用に関する。本発明は特に、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達系を調節する物質のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達系は、発生および分化、さらには癌化および神経変性に関連する、多細胞生物にとって極めて重要な情報伝達系のひとつである。Ｎｏｔｃｈシグナル伝達系の模式図を図１に示す。Ｎｏｔｃｈシグナル伝達系の一翼を担うＮｏｔｃｈタンパク質は、細胞膜を貫通するレセプターである。Ｎｏｔｃｈタンパク質は、Ｎｏｔｃｈタンパク質に対するリガンドであるデルタタンパク質、リガンド結合性の制御因子等により活性化され、ＡＤＡＭ、ＴＡＣＥなどによって細胞外ドメインが切断され（Ｓ２切断）、次に膜貫通ドメインのＣ末端側において、γ−セクレターゼ（γ−ｓｅｃｒｅｔａｓｅ）によりプロセッシングを受けて（Ｓ３切断）、細胞内ドメイン（ＮＩＣＤ）が遊離し、核内に移行すると考えられている（図１）。そして、核内に移行した細胞内ドメインが標的遺伝子の転写活性化に寄与することにより、細胞外から細胞核へのシグナル伝達が行われるものと考えられている。Ｎｏｔｃｈシグナルの異常活性化は癌化へと繋がる一方で、阻害は細胞の発生および分化に影響を与える。このように、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達系は、シグナル異常活性化による癌化（例えば、急性白血病）、アルツハイマー病治療を目的とした薬物（例えば、γ−セクレターゼ阻害薬）のシグナル阻害による副作用の懸念などに関連すると考えられている。
【０００３】
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達系は、様々な点から重要である。特に、疾患との関連から重要である。第一に、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達系が異常活性化されると、急性白血病などの癌化が生じる。例えば、Ｔ細胞性急性リンパ芽球性白血病（Ｔ−ＡＬＬ）患者の５０％超には、ＮＯＴＣＨ１の異所性活性化がみられる（非特許文献１、図２）。他の癌についてもシグナル異常活性化と関連があることから、Ｎｏｔｃｈシグナルと癌とは密接な関係性があるといえる。
【０００４】
第二に、アルツハイマー病治療を目的とした薬物による副作用の懸念をぬぐうという観点で重要である。現在、アルツハイマー病治療薬として、Ａβ４２の産生抑制を目的とした阻害薬が開発されている。Ａβ４２は、病態進行に密接に関連すると考えられているペプチドである。Ａβ４２はＡβ４０とともに、膜貫通タンパク質であるアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）からβセクレターゼによって切断され、そして膜貫通領域でγ−セクレターゼにより切断され産生される。そのため治療薬として開発されつつあるものは、主にβ，γ−セクレターゼ阻害薬あるいはＡβ４２産生抑制薬となっている。しかし、この戦略には大きな問題点が内在している。γ−セクレターゼは、細胞の分化に必須のＮｏｔｃｈも切断する。γ−セクレターゼ阻害薬によるＮｏｔｃｈシグナル伝達の阻害の模式図を図３に示す。γ−セクレターゼを阻害すると、Ｎｏｔｃｈの切断も阻害される。そのため、γ−セクレターゼ阻害薬には副作用の懸念があることが容易に考えられる。この懸念は、実際に、成熟マウスにγ−セクレターゼ阻害薬を投与するとリンパ球の分化が阻害されることからも裏付けられている（非特許文献２）。また、Ａβ４２産生抑制薬に関しても、間接的にＮｏｔｃｈシグナル伝達を阻害することが懸念される。したがって、現在、これらの問題を克服したγ−セクレターゼ阻害薬あるいはＡβ４２産生阻害薬の開発の戦略として、Ａβ産生の抑制効果は維持したままＮｏｔｃｈシグナル伝達系を抑制しない薬剤が期待されている。
【０００５】
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達系の活性化を検知するために、いくつかの実験が行われている。例えば、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達系が活性化すると、最終的に、核内でＨｅｓ−１遺伝子の活性化が起きるため、Ｎｏｔｃｈシグナルの活性化の指標としてＨＥＳ−１プロモーター（ＲＢＰ−Ｊκ結合配列をもつ）の活性化を利用し、Ｎｏｔｃｈシグナルの活性化に従ってＨＥＳ−１プロモーターの制御下でルシフェラーゼを発現させることでＮｏｔｃｈシグナル伝達系の活性化が検知可能である（図４および非特許文献３）。
【０００６】
このように、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達を測定するためには、２つのＲＢＰ−Ｊκ結合配列を上流に持ったルシフェラーゼレポーターが使用されてきた。しかし、それらの感度は悪く、培養細胞を用いても例えば内因性のＮｏｔｃｈによるシグナル伝達は測定できなかった。
【０００７】
例えば、特許文献１は、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達系が活性化された細胞を検知するＮｏｔｃｈシグナル伝達系活性化検知方法を記載する。この文献の方法は、野生型Ｈｅｓ−１遺伝子プロモーター配列および変異Ｈｅｓ−１遺伝子プロモーター配列を利用する。野生型Ｈｅｓ−１遺伝子プロモーター配列は２つのＲＢＰ−Ｊκ結合配列を含む。しかし、特許文献１に記載された方法を用いても、検出感度が低く、バックグラウンドが大きいために正確なスクリーニングは困難であり、そのため、ハイスループットスクリーニングに利用することができなかった。また、特許文献１に記載の方法では、検出感度を上げるためにＮｏｔｃｈシグナル伝達系を構成的に活性化する必要があり、そのため、内因性のＮｏｔｃｈシグナル伝達系を測定することはできなかった。
【０００８】
非特許文献４は、ＲＢＰ−Ｊκに関連する転写因子であるＲＢＰ−Ｌを記載する。この文献では、ＲＢＰ−Ｌが転写に対して及ぼす影響を調べるためにレポータープラスミドｐＧａ９８１−６を使用している。このプラスミドはエプスタインバーウイルスのＴＰ１プロモーター由来の１２コピーのＲＢＰ−Ｊ／−Ｌ結合部位を含む。しかし、このプラスミドの検出感度は低く、バックグラウンドが大きく、ばらつきが大きいために正確なスクリーニングは困難であり、そのため、ハイスループットスクリーニングに利用することができなかった。また、この方法では検出感度を上げるためにＮｏｔｃｈシグナル伝達系を構成的に活性化する必要があり、そのため、内因性のＮｏｔｃｈシグナル伝達系を測定することはできなかった。
【０００９】
このように、検出感度が高く、正確なスクリーニングが可能なスクリーニング系を提供することが望まれていた。内因性のＮｏｔｃｈシグナル伝達系を測定し得るスクリーニング系を提供することもまた望まれていた。
【特許文献１】特開２００６−１０９７１７号公報
【非特許文献１】Ｗｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，”Ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｏｆ ＮＯＴＣＨ１ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｔ Ｃｅｌｌ Ａｃｕｔｅ Ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ Ｌｅｕｋｅｍｉａ”，Ｖｏｌ．３０６，２００４，２６９−２７１
【非特許文献２】Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２７９，Ｉｓｓｕｅ １３，１２８７６−１２８８２，Ｍａｒｃｈ ２６，２００４
【非特許文献３】Ｓｏｐｈｉｅ Ｊａｒｒｉａｕｌｔ ｅｔ ａｌ．，"Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ ｏｆ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｎｏｔｃｈ”，Ｎａｔｕｒｅ ３７７，１９９５，３５５−８
【非特許文献４】Ｍｉｎｏｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，”ＲＢＰ−Ｌ， ａ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ ＲＢＰ−Ｊｋ”， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｍａｙ １９９７， ｐ．２６７９−２６８７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、上記問題点の解決を意図するものであり、検出感度が高く、正確なスクリーニングが可能なスクリーニング系を提供すること、および内因性のＮｏｔｃｈシグナル伝達系を測定し得るスクリーニング系を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、少なくとも３つのＲＢＰ−Ｊκ結合配列を用いることにより、検出感度、Ｚ’ ｆａｃｔｏｒおよびＳ／Ｎ比の顕著な改善が得られることを見出し、これに基づいて本発明を完成させた。
【００１２】
本発明者らは特に、既存のコンストラクトに大幅な改変を加えることにより、検出感度を数百倍、Ｓ／Ｎ比を数十倍改善させることができた。このため、培養細胞の内因性のＮｏｔｃｈシグナル伝達を測定できるレベルの高感度を持つコンストラクトを得ることができた。
【００１３】
従来、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達を測定するためには、ＲＢＰ−Ｊκ結合配列を上流に持ったルシフェラーゼレポーターが使用されてきた。今回本発明者らは、既存のコンストラクトの「２つのＲＢＰ−Ｊκ結合配列を含む部分の配列の変異を訂正しかつその配列を２〜４つタンデムにつなげてルシフェラーゼレポーターの上流に配置した」コンストラクトを作成した。さらにその新規ＲＢＰ−Ｊκ結合配列部分を発現効率の高いルシフェラーゼレポータープラスミドに挿入した。そしてその性質について検討したところ感度が数百倍、Ｓ／Ｎ比を数十倍改善していた。さらに、このコンストラクトを用いることにより、０．５０以上のＺ’ ｆａｃｔｏｒが得られることがわかった。
【００１４】
本発明によれば、既存のＨＥＳ−１プロモーターに大幅な改変を加えることによって従来と比べ高感度にＮｏｔｃｈシグナル伝達系を検知することが可能となった。例えば、２つのＲＢＰ−Ｊκ結合配列を含む部分の配列を２〜４つタンデムにつなげてルシフェラーゼレポーターの上流に配置したコンストラクトを作成した。その結果、結合配列の増加とともにルシフェラーゼ活性の増加が認められた。
【００１５】
さらにその新規ＲＢＰ−Ｊκ結合配列部分を発現効率の高く又ＰＥＳＴ配列を持つルシフェラーゼレポータープラスミドに挿入した。そしてその性質について検討したところ感度が数百倍、Ｓ／Ｎ比を数十倍改善していた。また、このコンストラクトを用いることによっても、０．５０以上のＺ’ ｆａｃｔｏｒが得られることがわかった。
【００１６】
上記目的を達成するために、本発明は、例えば、以下の手段を提供する：
（項目１）
少なくとも３つのＲＢＰ−Ｊκ結合配列を含む核酸分子であって、該ＲＢＰ−Ｊκ結合配列が、ＴＧＧＧＡＡである、核酸分子。
【００１７】
（項目２）
前記少なくとも３つのＲＢＰ−Ｊκ結合配列のそれぞれが、５塩基〜４０塩基の塩基配列によりタンデムに連結されている、項目１に記載の核酸分子。
【００１８】
（項目３）
配列番号１の配列を少なくとも２つ含む、項目１または２に記載の核酸分子。
【００１９】
（項目４）
配列番号２の配列を少なくとも２つ含む、項目１〜３のいずれか１項に記載の核酸分子。
【００２０】
（項目５）
配列番号３の配列を含む、項目１〜４のいずれか１項に記載の核酸分子。
【００２１】
（項目６）
配列番号４の配列を含む、項目１〜５のいずれか１項に記載の核酸分子。
【００２２】
（項目７）
配列番号５の配列を含む、項目１〜６のいずれか１項に記載の核酸分子。
【００２３】
（項目８）
配列番号６の配列を含む、項目１〜７のいずれか１項に記載の核酸分子。
【００２４】
（項目９）
前記少なくとも３つのＲＢＰ−Ｊκ結合配列と作動可能に連結されたプロモーター配列をさらに含む、項目１〜８のいずれか１項に記載の核酸分子。
【００２５】
（項目１０）
前記プロモーター配列と作動可能に連結されたレポータータンパク質コード配列をさらに含む、項目９に記載の核酸分子。
【００２６】
（項目１１）
前記レポータータンパク質コード配列が、発光タンパク質または蛍光タンパク質をコードする、項目１０に記載の核酸分子。
【００２７】
（項目１２）
前記レポータータンパク質コード配列の下流にＰＥＳＴ配列コード配列が連結されている、項目１０または１１に記載の核酸分子。
【００２８】
（項目１３）
直鎖状分子またはプラスミドである、項目１〜１２のいずれか１項に記載の核酸分子。
【００２９】
（項目１４）
（ａ）プロモーター配列と作動可能に連結された構成的に活性なＮｏｔｃｈタンパク質をコードする配列を含む核酸分子とともに細胞内に導入して発現させた場合の前記レポータータンパク質の発現量と、（ｂ）該Ｎｏｔｃｈタンパク質コード配列を含まない核酸分子とともに細胞内に導入して発現させた場合の該レポータータンパク質の発現量とを比較したときの、Ｚ’ ｆａｃｔｏｒ値が０．５以上である、項目１０〜１２のいずれか１項に記載の核酸分子。
【００３０】
（項目１５）
項目１〜１４のいずれか１項に記載の核酸分子を含む、細胞。
【００３１】
（項目１６）
前記核酸分子が、前記プロモーター配列と作動可能に連結されたレポータータンパク質コード配列をさらに含む、項目１５に記載の細胞。
【００３２】
（項目１７）
内因性のＮｏｔｃｈタンパク質または構成的に活性なＮｏｔｃｈタンパク質を発現する、項目１６に記載の細胞。
【００３３】
（項目１８）
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達系を調節する物質のスクリーニング方法であって、該方法は、
（ａ）項目１７に記載の細胞と候補物質とを接触させる工程；および
（ｂ）該細胞中での該レポータータンパク質の発現量を測定する工程
を包含する、方法。
【００３４】
（項目１９）
γ−セクレターゼ阻害薬候補物質から、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達系を抑制しないγ−セクレターゼ阻害薬を選択するためのスクリーニング方法であって、該方法は、
（ａ）項目１７に記載の細胞と該候補物質とを接触させる工程；および
（ｂ）該細胞中での該レポータータンパク質の発現量を測定する工程
を包含する、方法。
【００３５】
（項目２０）
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達系を調節する物質のスクリーニング方法であって、該方法は、
（ａ）項目１７に記載の細胞中での前記レポータータンパク質の発現量を測定する工程；
（ｂ）該細胞と候補物質とを接触させる工程；
（ｃ）該細胞中での該レポータータンパク質の発現量を測定する工程；および
（ｄ）工程（ｃ）での該レポータータンパク質の発現量が工程（ａ）での該レポータータンパク質の発現量よりも増加したかまたは減少した場合、該候補物質をＮｏｔｃｈシグナル伝達系を調節する物質として選択する工程
を包含する、方法。
【００３６】
（項目２１）
工程（ｃ）での該レポータータンパク質の発現量が工程（ａ）での該レポータータンパク質の発現量よりも増加し、前記候補物質をＮｏｔｃｈシグナル伝達系の活性化剤として選択する、項目２０に記載の方法。
【００３７】
（項目２２）
工程（ｃ）での該レポータータンパク質の発現量が工程（ａ）での該レポータータンパク質の発現量よりも減少し、前記候補物質をＮｏｔｃｈシグナル伝達系の抑制剤として選択する、項目２０に記載の方法。
【００３８】
（項目２３）
γ−セクレターゼ阻害薬候補物質から、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達系を抑制しないγ−セクレターゼ阻害薬を選択するためのスクリーニング方法であって、該方法は、
（ａ）項目１７に記載の細胞中での前記レポータータンパク質の発現量を測定する工程；
（ｂ）該細胞と候補物質とを接触させる工程；
（ｃ）該細胞中での該レポータータンパク質の発現量を測定する工程；および
（ｄ）工程（ｃ）での該レポータータンパク質の発現量が工程（ａ）での該レポータータンパク質の発現量と実質的に同じである場合、該候補物質をＮｏｔｃｈシグナル伝達系を抑制しないγ−セクレターゼ阻害薬として選択する工程
を包含する、方法。
【００３９】
（項目２４）
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達系を調節する物質のスクリーニング方法において使用するためのキットであって、
項目１７に記載の細胞；および
前記レポータータンパク質の発現量を測定するための試薬
を備える、キット。
【００４０】
（項目２５）
γ−セクレターゼ阻害薬候補物質から、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達系を抑制しないγ−セクレターゼ阻害薬を選択するためのスクリーニング方法において使用するためのキットであって、
項目１７に記載の細胞；および
前記レポータータンパク質の発現量を測定するための試薬
を備える、キット。
【００４１】
（項目２６）
内因性のＮｏｔｃｈシグナルの調節を測定するための組成物であって、該組成物は、少なくとも３つのＲＢＰ−Ｊκ結合配列を含む核酸分子を含み、該ＲＢＰ−Ｊκ結合配列が、ＴＧＧＧＡＡである、組成物。
【００４２】
（項目２７）
前記少なくとも３つのＲＢＰ−Ｊκ結合配列のそれぞれが、５塩基〜４０塩基の塩基配列によりタンデムに連結されている、項目２６に記載の組成物。
【００４３】
（項目２８）
前記核酸分子が、配列番号１の配列を少なくとも２つ含む、項目２６または２７に記載の組成物。
【００４４】
（項目２９）
前記核酸分子が、配列番号２の配列を少なくとも２つ含む、項目２６〜２８のいずれか１項に記載の組成物。
【００４５】
（項目３０）
前記核酸分子が、配列番号３の配列を含む、項目２６〜２９のいずれか１項に記載の組成物。
【００４６】
（項目３１）
前記核酸分子が、配列番号４の配列を含む、項目２６〜３０のいずれか１項に記載の組成物。
【００４７】
（項目３２）
前記核酸分子が、配列番号５の配列を含む、項目２６〜３１のいずれか１項に記載の組成物。
【００４８】
（項目３３）
前記核酸分子が、配列番号６の配列を含む、項目２６〜３２のいずれか１項に記載の組成物。
【００４９】
（項目３４）
前記核酸分子が、前記少なくとも３つのＲＢＰ−Ｊκ結合配列と作動可能に連結されたプロモーター配列をさらに含む、項目２６〜３３のいずれか１項に記載の組成物。
【００５０】
（項目３５）
前記核酸分子が、前記プロモーター配列と作動可能に連結されたレポーター遺伝子配列をさらに含む、項目３４に記載の組成物。
【００５１】
（項目３６）
前記レポータータンパク質コード配列が、発光タンパク質または蛍光タンパク質をコードする、項目３５に記載の組成物。
【００５２】
（項目３７）
前記レポータータンパク質コード配列の下流にＰＥＳＴ配列コード配列が連結されている、項目３５または３６に記載の組成物。
【００５３】
（項目３８）
前記核酸分子が、直鎖状分子またはプラスミドである、項目２６〜３７のいずれか１項に記載の組成物。
【００５４】
（項目３９）
（ａ）前記核酸分子を、プロモーター配列と作動可能に連結された構成的に活性なＮｏｔｃｈタンパク質をコードする配列を含む核酸分子とともに細胞内に導入して発現させた場合の前記レポータータンパク質の発現量と、（ｂ）該核酸分子を、該Ｎｏｔｃｈタンパク質コード配列を含まない核酸分子とともに細胞内に導入して発現させた場合の該レポータータンパク質の発現量とを比較したときの、Ｚ’ ｆａｃｔｏｒ値が０．５以上である、項目３５〜３７のいずれか１項に記載の組成物。
【００５５】
（項目４０）
Ａβ４２の産生を抑制するアルツハイマー病治療薬候補物質から、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達系を抑制しないアルツハイマー病治療薬を選択するためのスクリーニング方法であって、該方法は、
（ａ）項目１７に記載の細胞と該候補物質とを接触させる工程；および
（ｂ）該細胞中での該レポータータンパク質の発現量を測定する工程
を包含する、方法。
【発明の効果】
【００５６】
高感度にＮｏｔｃｈシグナル伝達を測定できるレポーターコンストラクトは業界で待望されていたものであり、今までその感度の低さのために多くの現象を可視化することができなかったがその点で大きな改善が認められると考えられる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５７】
以下、本発明を詳細に説明する。本明細書の全体にわたり、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。
【００５８】
（１．少なくとも３つのＲＢＰ−Ｊκ結合配列を含む核酸分子）
本発明の核酸分子は、少なくとも３つのＲＢＰ−Ｊκ結合配列を含む。本明細書中では、用語「ＲＢＰ−Ｊκ結合配列」とは、配列ＴＧＧＧＡＡをいう。本発明の核酸分子は、少なくとも３つのＲＢＰ−Ｊκ結合配列を含むことにより、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達系のシグナルの検出が従来よりも優れた感度で行われ得る。本発明の核酸分子に含まれるＲＢＰ−Ｊκ結合配列の数は、少なくとも３個であれば任意の数であり得る。本発明の核酸分子は、例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、またはそれより多くのＲＢＰ−Ｊκ結合配列を含み得る。本発明の核酸分子に含まれるＲＢＰ−Ｊκ結合配列の数に特に上限はない。例えば、本発明の核酸分子に含まれるＲＢＰ−Ｊκ結合配列の数は、１００個以下、９０個以下、８０個以下、７０個以下、６０個以下、５０個以下、４０個以下、３０個以下、２０個以下、１５個以下、１０個以下などであり得る。特定の実施形態では、本発明の核酸分子に含まれるＲＢＰ−Ｊκ結合配列の数は、偶数個であることが好ましい。
【００５９】
本発明の核酸分子において、ＲＢＰ−Ｊκ結合配列のそれぞれは、核酸分子中に広くちらばって存在することも可能であるが、好ましくは比較的狭い範囲においてタンデムに連結されている。ＲＢＰ−Ｊκ結合配列間にはある程度の長さの配列が挿入されていることが好ましい。ＲＢＰ−Ｊκ結合配列間の配列は任意の配列であり得る。ＲＢＰ−Ｊκ結合配列間の配列の長さは当業者によって任意に決定され得る。ＲＢＰ−Ｊκ結合配列間の配列の長さは好ましくは５塩基以上であり、より好ましくは６塩基以上であり、さらに好ましくは７塩基以上であり、最も好ましくは８塩基以上である。ＲＢＰ−Ｊκ結合配列間の配列の長さは好ましくは４０塩基以下であり、より好ましくは３５塩基以下であり、さらに好ましくは３０塩基以下であり、特に好ましくは２５塩基以下であり、最も好ましくは２０塩基以下である。好ましい実施形態では、少なくとも３つのＲＢＰ−Ｊκ結合配列のそれぞれが、５塩基〜４０塩基の塩基配列によりタンデムに連結されている。
【００６０】
本発明の核酸分子は、好ましくは、配列番号１の配列を少なくとも２つ含む。ここで、配列番号１の配列は、ＴＧＧＧＡＡＸｎＴＧＧＧＡＡであり、ここで、ＸはＡ、Ｔ、ＧまたはＣを表し、ｎは５〜４０を表す。配列番号１の配列は、ＲＢＰ−Ｊκ結合配列を２つ含む。ｎは好ましくは６以上の整数であり、さらに好ましくは７以上の整数であり、最も好ましくは８以上の整数である。ｎは好ましくは４０塩基以下の整数であり、より好ましくは３５以下の整数であり、さらに好ましくは３０以下の整数であり、特に好ましくは２５以下の整数であり、最も好ましくは２０以下の整数である。配列番号１の配列を１単位として含むことにより、奇数個のＲＢＰ−Ｊκ結合配列を含む場合よりもさらに優れた結果が得られる。
【００６１】
本発明の核酸分子は、好ましくは、配列番号２の配列を少なくとも２つ含む。配列番号２の配列は、天然のＨｅｓ−１プロモーターに含まれる配列であり、２つのＲＢＰ−Ｊκ結合配列を含む。
【００６２】
本発明の核酸分子は、好ましくは、配列番号３の配列を含む。配列番号３の配列は、配列番号２の配列を２つタンデムに連結した配列である。
【００６３】
本発明の核酸分子は、好ましくは、配列番号４の配列を含む。配列番号４の配列は、配列番号２の配列を３つタンデムに連結した配列である。
【００６４】
本発明の核酸分子は、好ましくは、配列番号５の配列を含む。配列番号５の配列は、配列番号２の配列を４つタンデムに連結した配列である。
【００６５】
本明細書においては配列番号２の配列を２〜４個タンデムに連結した配列を例示として記載したが、もちろん、連結する数に制限はない。例えば、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、４０、５０個などの任意の数で連結することができる。
【００６６】
配列番号３〜５は、同じ配列をタンデムに連結した配列の例であり、このような配列を用いることが本発明では好ましい。しかし、ＲＢＰ−Ｊκ結合配列の間の配列は必ずしも同じである必要はなく、それぞれ異なり得る。
【００６７】
本発明の核酸分子は、好ましくは、配列番号６の配列を含む。配列番号６の配列は、天然のＴＰ−１プロモーターに含まれる、２つのＲＢＰ−Ｊκ結合配列を含む配列を１２個タンデムに連結した配列である。本明細書においては、天然のＴＰ−１プロモーターに含まれる、２つのＲＢＰ−Ｊκ結合配列を含む配列を１２個タンデムに連結した配列を例示として用いたが、もちろん、連結する数に制限はない。例えば、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、４０、５０個などの任意の数で連結することができる。
【００６８】
これらの天然のプロモーターから得られた塩基配列は例示であり、これらの配列とはわずかに異なる配列を有する改変体（いわゆる、対立遺伝子改変体）が天然に存在し得ることは公知である。本発明においては、ＲＢＰ−Ｊκ配列を含みかつこれらの配列と同等以上の効果が得られる限り、これらの例示した配列以外にも、天然に存在する改変体も本発明の核酸分子に用い得る。
【００６９】
天然のＲＢＰ−Ｊκ配列およびその周辺の配列を含む核酸分子は、既知のＲＢＰ−Ｊκ配列およびその周辺の配列を参考にしてプライマーを設計し、目的の天然配列を得ようとするゲノムライブラリーを鋳型としてＰＣＲを行うことによって得ることができる。あるいは、既知の配列情報をもとに、ゲノムライブラリー作製をへることなく、化学合成により直接、天然のＲＢＰ−Ｊκ配列およびその周辺の配列を含む核酸分子を作製することも可能である。
【００７０】
本発明の核酸分子はまた、ＲＢＰ−Ｊκ配列を含みかつこれらの配列と同等以上の効果が得られる限り、ＲＢＰ−Ｊκ配列の周辺の天然配列に対して何らかの改変（例えば、１または数個の改変）が加えられた配列を含んでもよい。このような改変は、少なくとも１個のヌクレオチドの欠失、トランジションおよびトランスバージョンを含む置換、または挿入からなる群より選択され得る。この変化は対照塩基配列の５’末端もしくは３’末端の位置で生じてもよく、またはこれら末端以外のどの位置で生じてもよい。塩基の変化は、１塩基ずつ点在していてもよく、数塩基連続していてもよい。改変は、当該分野で周知の方法を用いて、例えば、部位特異的変異誘発法、変異原を用いた変異誘発法（対象遺伝子を亜硝酸塩などの変異剤で処理すること、紫外線処理を行うこと）、エラープローンＰＣＲを行うことなどによって行われ得る。目的の変異を得やすい点から、部位特異的変異誘発を用いることが好ましい。部位特異的変異誘発を用いれば、目的とする部位で目的とする改変を導入することができるからである。あるいは、目的とする配列をもつ核酸分子を直接合成してもよい。そのような化学合成の方法は、当該分野において周知である。
【００７１】
本発明の核酸分子は、直鎖状分子であっても環状分子であってもよい。本明細書において、用語「核酸分子」はまた、核酸、オリゴヌクレオチド、およびポリヌクレオチドと互換可能に使用される。核酸分子の例としては、フラグメント、コンストラクト、カセット、プラスミド、ベクター、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡなどが挙げられる。本明細書では、核酸および核酸分子は、その核酸および核酸分子がタンパク質をコードするときなどは、用語「遺伝子」の概念に含まれる。ある遺伝子配列をコードする核酸分子はまた、「スプライス変異体」および「スプライス改変体」を包含する。スプライス変異体とスプライス改変体とは同義である。同様に、核酸によりコードされる特定のタンパク質は、その核酸のスプライス改変体によりコードされる任意のタンパク質を包含する。その名が示唆するように「スプライス変異体」は、遺伝子のオルタナティブスプライシングの産物である。転写後、最初の核酸転写物は、異なる（別の）核酸スプライス産物が異なるポリペプチドをコードするようにスプライスされる場合がある。スプライス変異体の産生機構は変化するが、エキソンのオルタナティブスプライシングを含む。読み過し転写により同じ核酸に由来する別のポリペプチドもまた、この定義に包含される。スプライシング反応の任意の産物（組換え形態のスプライス産物を含む）がこの定義に含まれる。
【００７２】
本発明の核酸分子は、単離された核酸分子であることが好ましい。本明細書中では「単離された」核酸分子とは、その核酸分子が、天然に存在する生物体の細胞内の他の生物学的因子（例えば、核酸分子以外の因子および目的とする核酸分子以外の核酸分子）から実質的に分離または精製されたものをいう。「単離された」核酸分子には、標準的な精製方法によって精製された核酸分子が含まれる。したがって、単離された核酸分子は、化学的に合成した核酸分子を包含する。また、標準的な精製方法によって精製した後に、他の物質と混合した核酸分子および緩衝液中に溶解した核酸分子なども、本明細書でいう単離された核酸分子に該当する。
【００７３】
本明細書において「精製された」核酸分子とは、その核酸分子に天然に随伴する因子の少なくとも一部が除去されたものをいう。したがって、通常、精製された核酸分子におけるその核酸分子の純度は、その核酸分子が通常存在する状態よりも高い（すなわち濃縮されている）。
【００７４】
他にそうではないと示されなければ、特定の核酸配列はまた、明示的に示された配列と同様に、その保存的に改変された改変体（例えば、縮重コドン置換体）および相補配列を包含することが意図される。具体的には、縮重コドン置換体は、１もしくは数個、またはより多数の選択された（または、すべての）コドンの３番目の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を作成することにより達成され得る（Ｂａｔｚｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１９：５０８１（１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５−２６０８（１９８５）；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ ８：９１−９８（１９９４））。
【００７５】
本明細書において、ポリペプチド配列または塩基配列の「置換、欠失または付加」とは、もとのポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対して、それぞれアミノ酸もしくはその代替物、またはヌクレオチドもしくはその代替物が、置き換わること、取り除かれることまたは付け加わることをいう。このような置換、欠失または付加の技術は、当該分野において周知であり、そのような技術の例としては、部位特異的変異誘発技術などが挙げられる。置換、欠失または付加は、１つ以上であれば任意の数でよく、そのような数は、その置換、欠失または付加を有する改変体において目的とする機能（例えば、ＲＢＰ−Ｊκ結合活性、プロモーター活性、レポータータンパク質配列の場合、所望のレポータータンパク質活性など）が保持される限り、多くすることができる。例えば、そのような数は、１または数個であり得、そして好ましくは、全体の長さの２０％以内、１０％以内、または１００個以下、５０個以下、２５個以下などであり得る。本発明で用いられるプロモーター配列は、プロモーター活性を保持する限り、任意の長さであり得る。このような配列は、例えば、もとのプロモーター配列の塩基配列を５’側または３’側から少しずつ欠失させ、プロモーター活性を保持しているかを確認することにより、容易に決定され得る。このようなプロモーター配列を短縮させる方法は、当業者に周知であり、容易に実施され得る。
【００７６】
本明細書において、「改変体」とは、もとのポリペプチドまたはポリヌクレオチドなどの物質に対して、一部が変更されているものをいう。そのような改変体としては、置換改変体、付加改変体、欠失改変体、短縮（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）改変体、対立遺伝子変異体、グリコシル化改変体、脂質化改変体、複合分子による改変体などが挙げられる。好ましくは、改変体は、改変のもととなる物質（例えば、酵素）の特性（例えば、生物学的特性）を少なくとも１つ、より好ましくは複数保持している。などが挙げられる。対立遺伝子（ａｌｌｅｌｅ）とは、同一遺伝子座に属し、互いに区別される遺伝的改変体のことをいう。従って、「対立遺伝子変異体」とは、ある遺伝子に対して、対立遺伝子の関係にある改変体をいう。そのような対立遺伝子変異体は、通常その対応する対立遺伝子と同一または非常に類似性の高い配列を有し、通常はほぼ同一の生物学的活性を有するが、まれに異なる生物学的活性を有することもある。「種相同体またはホモログ（ｈｏｍｏｌｏｇ）」とは、ある種の中で、ある遺伝子とアミノ酸レベルまたはヌクレオチドレベルで、相同性（好ましくは、６０％以上の相同性、より好ましくは、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上の相同性）を有するものをいう。そのような種相同体を取得する方法は、当該分野で周知である。「オルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）」とは、オルソロガス遺伝子（ｏｒｔｈｏｌｏｇｏｕｓ ｇｅｎｅ）ともいい、二つの遺伝子がある共通祖先からの種分化に由来する遺伝子をいう。例えば、多重遺伝子構造をもつヘモグロビン遺伝子ファミリーを例にとると、ヒトおよびマウスのαヘモグロビン遺伝子はオルソログであるが、ヒトのαヘモグロビン遺伝子およびβヘモグロビン遺伝子はパラログ（遺伝子重複で生じた遺伝子）である。また、システインプロテアーゼインヒビターである、ヒトのシスタチンＡと、イネのオリザシスタチンとを比較すると、標的となるプロテアーゼとの相互作用に重要と考えられる３箇所の短いアミノ酸モチーフが保存されているだけで、他の部分のアミノ酸の共通性は非常に低い。しかし、両者はともにシスタチン遺伝子スーパーファミリーに属し、共通祖先遺伝子を持つとされていることから、単に全体的なアミノ酸の相同性に限らず、局所的に高い相同性を持つアミノ酸配列が共通して存在する場合も、オルソログたり得る。このように、オルソログは、通常別の種においてもとの種と同様の機能を果たしていることがあり得ることから、上記に列挙した、天然のＲＢＰ−Ｊκ結合配列を含む周辺配列（配列番号２および６）のオルソログもまた、本発明において有用であり得る。
【００７７】
本発明の核酸分子は、直鎖状分子またはプラスミドであることが好ましい。本明細書において用語「プラスミド」とは、染色体に組み込まれず、染色体と異なる機構で複製および維持される環状核酸分子をいう。本発明の核酸分子は、ベクターであってもよい。
【００７８】
本明細書において核酸分子について言及する場合、用語「ベクター」とは、目的の塩基配列を目的の細胞へと移入させることができる核酸分子をいう。そのようなベクターとしては、目的の細胞において自律複製が可能であるか、または目的の細胞の染色体中への組込みが可能で、かつ改変された塩基配列の転写に適した位置にプロモーターを含有しているものが例示される。
【００７９】
全長ヌクレオチドから一部のヌクレオチドが欠失したヌクレオチドおよび全長ポリペプチドから一部のアミノ酸が欠失したポリペプチドは、フラグメントとも呼ばれる。本明細書において、「フラグメント」とは、全長のポリペプチドまたはポリヌクレオチド（長さがｎ）に対して、１〜ｎ−１までの配列長さを有するポリペプチドまたはポリヌクレオチドをいう。フラグメントの長さは、その目的に応じて、適宜変更することができ、例えば、その長さの下限としては、ポリペプチドの場合、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０およびそれ以上のアミノ酸が挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。また、ポリヌクレオチドの場合、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００およびそれ以上のヌクレオチドが挙げられ、ここに具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。
【００８０】
本明細書において用語「発現ベクター」とは、目的のタンパク質コード配列を目的の細胞中で発現し得るベクターをいう。発現ベクターは、目的のタンパク質コード配列に加えて、その発現を調節するプロモーターのような種々の調節エレメント、および必要に応じて、目的の細胞中での複製および組換え体の選択に必要な因子（例えば、複製起点（ｏｒｉ）、および薬剤耐性遺伝子のような選択マーカー）を含む。発現ベクター中では、目的のタンパク質コード配列は、転写および翻訳されるように作動可能に連結されている。調節エレメントとしては、プロモーター、ターミネーターおよびエンハンサーが挙げられる。また、発現されたタンパク質を細胞外へ分泌させることが意図される場合は、分泌シグナルペプチドをコードする塩基配列が、目的のタンパク質コード配列の上流に正しいリーディングフレームで結合される。特定の生物（例えば、細菌）に導入するために使用される発現ベクターのタイプ、その発現ベクター中で使用される調節エレメントおよび他の因子の種類が、目的の細胞に応じて変わり得ることは、当業者に周知の事項である。
【００８１】
本明細書においてベクターの例としては、スクリーニングに用いる細胞において複製可能なベクター、および遺伝子実験に用いられる一般的な細菌（代表的なものとして大腸菌Ｋ１２株由来の大腸菌株）で複製可能かつ単離精製可能なベクターが挙げられる。これは、目的の生物細胞（例えば、動物細胞）に導入する目的の核酸分子を構築するために必要である。具体的には、例えば、ｐＧＥＭ−Ｔ Ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）、ｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）、ｐＧＬ４．１８（ｌｕｃ２Ｐ／Ｎｅｏ）ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社）、ｐＧＬ４．２１（ｌｕｃ２Ｐ／Ｐｕｒｏ）ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社）、ｐＧＢＴ９（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、大腸菌のｐＢＲ３２２プラスミド、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔといった市販の構築プラスミドがある。エレクトロポレーション法、ポリエチレングリコール法、パーティクルガン法といった方法により直接的に遺伝子断片を細胞に導入して形質転換する場合には、このような市販されている一般的なプラスミドを用いて、導入する遺伝子の構築を行えばよい。
【００８２】
発現ベクターは、発現カセットの中に、選択マーカーを含み得る。「発現カセット」とは、ある発現すべき塩基配列（例えば、構造遺伝子）と、その発現を調節するプロモーター配列、ｍＲＮＡ転写を終結させるターミネーター配列および必要に応じて他の種々の調節エレメントとを、目的の細胞中でその発現すべき塩基配列が作動し得る状態で連結してある、人工構築遺伝子の１単位を示す。発現カセットの代表例としては、目的の細胞のうちの形質転換された細胞のみを選択するための選択マーカー（例えば、ネオマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子など）の発現カセット、および宿主細胞内に発現させたい有用タンパク質コード配列の発現カセットが挙げられる。準備するべき発現カセットの種類、構造および数については、生物、宿主細胞および目的に応じて使い分けられるべきであり、その組み合わせは当業者には周知である。
【００８３】
「発現ベクター」は、上記の「発現カセット」を１つ以上含み得る「ベクター」としても定義され得る。目的の細胞に導入をすべき発現カセットごとに別々のベクター上に配置してもよいし、１つのベクター上に全ての発現カセットを連結してもよい。例えば、本発明において、選択マーカーがさらに用いられる場合、少なくとも３つのＲＢＰ−Ｊκ配列、プロモーター配列およびそのプロモーター配列に作動可能に連結されたレポータータンパク質コード配列を含む発現カセットと、選択マーカーを含む発現カセットとは、同じ発現ベクター上に存在しても別の発現ベクター上に存在してもよい。同じ発現ベクター上に存在することが好ましい。より好ましくは、少なくとも３つのＲＢＰ−Ｊκ配列、プロモーター配列およびそのプロモーター配列に作動可能に連結されたレポータータンパク質コード配列を含む発現カセットと、選択マーカーを含む発現カセットとは、同じ発現カセット中に含まれる。
【００８４】
本発明の核酸分子は、少なくとも３つのＲＢＰ−Ｊκ結合配列と作動可能に連結されたプロモーター配列をさらに含み得る。
【００８５】
本明細書において使用される用語「プロモーター」とは、遺伝子の転写の開始部位を決定し、また転写頻度を直接的に調節する、核酸分子上の領域をいい、ＲＮＡポリメラーゼが結合して転写を始める塩基配列である。プロモーター領域は、通常、推定タンパク質コード領域の第１エキソンの上流約２ｋｂｐ以内の領域であることが多いので、ＤＮＡ解析用ソフトウエアを用いてゲノム塩基配列中のタンパク質コード領域を予測すれば、プロモーター領域を推定することはできる。推定プロモーター領域は、構造遺伝子ごとに変動するが、通常構造遺伝子の上流にあるが、これらに限定されず、構造遺伝子の下流にもあり得る。好ましくは、推定プロモーター領域は、第一エキソン翻訳開始点から上流約２ｋｂｐ以内に存在する。
【００８６】
本明細書において使用される用語「プロモーター配列」とは、プロモーター活性を有する配列を意味する。プロモーター活性とは、ＤＮＡからＲＮＡを転写させる活性をいう。したがって、「プロモーター配列」とは、その下流（３’側）にＤＮＡを連結して細胞に導入した場合にそのＤＮＡに対応するＲＮＡを合成できる配列をいう。
【００８７】
本発明で用いられるプロモーター配列の長さは、通常約１０ヌクレオチド以上であるが、好ましくは約２０ヌクレオチド以上であり、より好ましくは約３０ヌクレオチド以上であり、さらに好ましくは約４０ヌクレオチド以上であり、特に好ましくは約５０ヌクレオチド以上である。プロモーター配列の長さはまた、約６０ヌクレオチド以上、約７０ヌクレオチド以上、約８０ヌクレオチド以上、約９０ヌクレオチド以上、約１００ヌクレオチド以上、約１５０ヌクレオチド以上、約２００ヌクレオチド以上、または約３００ヌクレオチド以上などの長さであり得る。プロモーター配列の長さに上限はなく、例えば、約５００ヌクレオチド以下、約４００ヌクレオチド以下、約３００ヌクレオチド以下、約２００ヌクレオチド以下、約１５０ヌクレオチド以下、約１００ヌクレオチド以下、約９０ヌクレオチド以下、約８０ヌクレオチド以下、約７０ヌクレオチド以下、約６０ヌクレオチド以下、約５０ヌクレオチド以下などであり得る。
【００８８】
本発明で用いられるプロモーター配列は、従来のプロモーター配列（例えば、ミニマムプロモーター）で有り得る。プロモーター配列は、構成的プロモーター配列であってもよく、組織特異的プロモーター配列であってもよく、時期特異的プロモーター配列であってもよい。プロモーター配列は、本発明の核酸分子の使用目的に応じて適切に選択され得る。本発明で用いられるプロモーターの好ましい例としては、Ｈｅｓ−１プロモーター、ウサギβ−グロビン最少プロモーターが挙げられる。
【００８９】
本明細書において、あるプロモーターの発現が「構成的」であるとは、そのプロモーターと作動可能に連結されたコード配列の発現が、生物のすべての組織において、その生物の生長の幼若期または成熟期のいずれにあってもほぼ一定の量で発現される性質をいう。具体的には、そのコード配列の発現を分析したとき、例えば、任意の時点で（例えば、２点以上）の同一または対応する部位のいずれにおいても発現がみられるとき、本発明の定義上、発現が構成的であるという。構成的プロモーターは、通常の生育環境にある生物の恒常性維持に役割を果たしていると考えられる。
【００９０】
本明細書において、プロモーターの発現が「組織特異的」であるとは、そのプロモーターと作動可能に連結されたコード配列の発現が、生物の特定の組織においてのみ見られる性質をいう。具体的には、そのコード配列の発現を分析したとき、例えば、Ｔ細胞では発現が見られるが他の細胞では発現が見られないならば、Ｔ細胞特異的に発現されているといえる。
【００９１】
本明細書において、プロモーターの発現が「時期特異的」であるとは、そのプロモーターと作動可能に連結されたコード配列の発現が、発生の特定の時期においてのみ見られる性質をいう。具体的には、そのコード配列の発現を分析したとき、例えば、細胞分裂中には発現が確認されるが他の時期には発現が見られないならば、細胞分裂特異的に発現されているといえる。
【００９２】
本明細書において使用される「ターミネーター」は、タンパク質コード領域の下流に位置し、塩基配列がｍＲＮＡに転写される際の転写の終結、ポリＡ配列の付加に関与する配列である。ターミネーターは、ｍＲＮＡの安定性に関与して遺伝子の発現量に影響を及ぼすことが知られている。ターミネーターは、任意の生物由来のターミネーターであり得るが、好ましくは、選択マーカーが導入されるべき生物由来のターミネーターである。本発明では、目的の生物においてターミネーターの活性を示すものであれば、どのような塩基配列でも使用することができる。
【００９３】
本明細書において使用される「エンハンサー」は、目的のタンパク質の発現効率を高めるために用いられ得る。そのようなエンハンサーは当該分野において周知である。エンハンサーは複数個用いられ得るが、１個用いられてもよいし、用いなくともよい。エンハンサーは、任意の生物由来のエンハンサーであり得るが、好ましくは、選択マーカーが導入されるべき生物由来のエンハンサーである。本発明では、目的の生物においてエンハンサーの活性を示すものであれば、どのような塩基配列でも使用することができる。
【００９４】
本明細書中では、「イントロン」とは、任意の２つのエキソンの間に存在する塩基配列であって、ＲＮＡに転写されるが、成熟後のＲＮＡには見られない塩基配列をいう。イントロンは、存在することによって、ポリペプチドの発現量を増大させる作用を有する場合がある。イントロンは、任意の生物由来のイントロンであり得るが、好ましくは、選択マーカーが導入されるべき生物由来のイントロンである。本発明では、目的の生物においてイントロンの活性を示すものであれば、どのような塩基配列でも使用することができる。
【００９５】
本明細書中では、「エキソン」とは、ＲＮＡに転写され、かつポリペプチドへと翻訳される塩基配列をいう。
【００９６】
本明細書において使用される「作動可能に連結された（る）」とは、所望の塩基配列が、発現（すなわち、作動）をもたらす転写翻訳調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサーなど）または翻訳調節配列（例えば、イントロン、スプライスドナー、スプライスアクセプターなど）の制御下に配置されることをいう。プロモーターが遺伝子に作動可能に連結されるためには、通常、その遺伝子のすぐ上流にプロモーターが配置されるが、必ずしも隣接して配置される必要はない。
【００９７】
少なくとも３つのＲＢＰ-Ｊκ配列とプロモーター配列とを作動可能に連結するため、またはプロモーター配列とレポータータンパク質コード配列とを作動可能に連結するために、これらのいずれかの核酸配列を加工すべき場合がある。例えば、プロモーターとレポータータンパク質コード配列との間が長すぎて転写効率の低下が予想される場合、またはリボゾーム結合部位と翻訳開始コドンとの間隔が適切でない場合などである。加工の手段としては、制限酵素による消化、Ｂａｌ３１、ＥｘｏＩＩＩなどのエキソヌクレアーゼによる消化、あるいはＭ１３などの一本鎖ＤＮＡまたはＰＣＲを使用した部位特異的変異誘発の導入が挙げられる。
【００９８】
本発明の核酸分子は、プロモーター配列と作動可能に連結されたレポータータンパク質コード配列をさらに含み得る。「レポータータンパク質」とは、その発現を確認することが容易であるタンパク質をいう。レポータータンパク質は、そのレポータータンパク質を発現する細胞に対して悪影響を及ぼさないことが好ましい。レポータータンパク質は、細胞を破壊せずに発現を確認できることが好ましい。レポータータンパク質コード配列は、一般に、プロモーター活性を確認したいプロモーターの下流に連結される。種々のレポータータンパク質が当該分野で公知であり、当業者は目的にあった適切なレポータータンパク質を容易に選択し得る。レポータータンパク質の例としては、発光タンパク質（すなわち、ルシフェラーゼ）、蛍光タンパク質、β−グルクロニダーゼ、レポータータンパク質コード配列は、発光タンパク質または蛍光タンパク質をコードすることが好ましい。レポータータンパク質は、天然のものであってもよく、天然のものが改変されることにより得られたものであってもよい。天然のレポータータンパク質の性質が改良された種々のレポータータンパク質が公知である。
【００９９】
本明細書において使用される用語「タンパク質」、「ポリペプチド」および「ペプチド」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマーをいう。このポリマーは、直鎖であっても分岐していてもよく、環状であってもよい。
【０１００】
レポータータンパク質は、レポーターとしての機能を発揮し得るのであれば、任意の長さのアミノ酸ポリマーであり得る。例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０残基長などの短いポリマーであってもよい。
【０１０１】
一般に、特定のタンパク質のアミノ酸配列のうちのあるアミノ酸は、そのタンパク質が有する生物学的活性の明らかな低下または消失なしに、他のアミノ酸に置換され得る。あるタンパク質の生物学的活性を規定するのは、タンパク質の相互作用能力および性質である。従って、特定のアミノ酸の置換がそのタンパク質のアミノ酸配列において、またはそのタンパク質をコードする塩基配列のレベルにおいて行われ得、置換後もなお、もとの性質を維持するタンパク質が生じ得る。従って、生物学的活性の明らかな損失なしに、種々の改変が、本明細書において開示されたタンパク質またはこのタンパク質をコードする塩基配列を有するヌクレオチドにおいて行われ得る。
【０１０２】
本明細書において「生物学的活性」とは、ある因子（例えば、タンパク質または核酸分子）が、生体内において有し得る活性のことをいい、種々の機能を発揮する活性が包含される。例えば、ある因子が酵素である場合、その生物学的活性は、その酵素活性を包含する。別の例では、ある因子がリガンドである場合、そのリガンドが対応するレセプターへの結合を包含する。例えば、ある因子がアンチセンス分子である場合、その生物学的活性は、対象となる核酸分子への結合、それによる発現抑制などを包含する。そのような生物学的活性は、当該分野において周知の技術によって測定することができる。ある因子がプロモーターである場合、その生物学的活性は、標的となる遺伝子の転写がそのプロモーターに特異的な刺激によって変動（好ましくは上昇）することを確認することができる。そのような確認は、当該分野において周知の分子生物学的手法を用いて行うことができる。
【０１０３】
本明細書中では一般に、レポータータンパク質に対して、アミノ酸の置換、付加、欠失または修飾を行うことができる。
【０１０４】
アミノ酸の置換とは、１つのアミノ酸を別の１つのアミノ酸に置き換えることをいう。得られるレポータータンパク質が、天然のレポータータンパク質の活性と実質的に同等以上のレポータータンパク質活性を有する限り、アミノ酸の置換は、任意の箇所で任意の個数行われ得る。例えば、置換は、好ましくは１〜３０個行われ得、より好ましくは１〜２０個行われ得、さらに好ましくは１〜１０個行われ得、特に好ましくは１〜５個行われ得、最も好ましくは１〜３個行われ得る。アミノ酸の置換は、１残基ずつ点在していてもよく、２残基以上連続していてもよい。特に、置換がＮ末端またはＣ末端で行われる場合、他の箇所に比較して活性への影響が少ないので、他の箇所への置換より多くのアミノ酸残基を置換してもよい。
【０１０５】
アミノ酸の付加とは、もとのアミノ酸配列中のどこかの位置に、１つ以上、例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個のアミノ酸を挿入することをいう。１〜３０個、より好ましくは１〜２０個、さらに好ましくは１〜１０個、特に好ましくは１〜５個、最も好ましくは１〜３個のアミノ酸を挿入することをいう。アミノ酸の付加もまた、１残基ずつ点在していてもよく、２残基以上連続していてもよい。アミノ酸の付加はまた、特に、Ｎ末端またはＣ末端で行われる場合、他の箇所に比較して活性への影響が少ないので、他の箇所への付加より多くのアミノ酸残基を付加してもよい。例えば１〜１００個、より好ましくは１〜５０個、さらにより好ましくは１〜３０個、特に好ましくは５〜３０個、最も好ましくは５〜１０個のアミノ酸残基を付加してもよい。
【０１０６】
アミノ酸の欠失とは、もとのアミノ酸配列から１つ以上、例えば、１〜３０個、より好ましくは１〜１０個、特に好ましくは１〜５個、最も好ましくは１〜３個のアミノ酸を除去することをいう。アミノ酸の欠失もまた、１残基ずつ点在していてもよく、２残基以上連続していてもよい。特に、欠失がＮ末端またはＣ末端で行われる場合、他の箇所に比較して活性への影響が少ないので、他の箇所への欠失より多くのアミノ酸残基を欠失してもよい。
【０１０７】
アミノ酸修飾の例としては、アミド化、カルボキシル化、硫酸化、ハロゲン化、アルキル化、グリコシル化、リン酸化、水酸化、アシル化（例えば、アセチル化）などが挙げられるが、これらに限定されない。置換または付加されるアミノ酸は、通常、天然のアミノ酸である。
【０１０８】
用語「天然のアミノ酸」とは、天然のアミノ酸のＬ−異性体を意味する。天然のアミノ酸は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、メチオニン、トレオニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、システイン、プロリン、ヒスチジン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、γ−カルボキシグルタミン酸、アルギニン、オルニチン、およびリジンである。特に示されない限り、本明細書でいう全てのアミノ酸はＬ体である。
【０１０９】
このような発現されるレポータータンパク質は、天然のレポータータンパク質のアミノ酸配列に対して、好ましくは約４０％、より好ましくは約４５％、より好ましくは約５０％、より好ましくは約５５％、より好ましくは約６０％、より好ましくは約６５％、より好ましくは約７０％、より好ましくは約７５％、より好ましくは約８０％、より好ましくは約８５％、より好ましくは約９０％、より好ましくは約９５％、そして最も好ましくは約９９％の同一性を有する。
【０１１０】
上記のような改変を設計する際に、アミノ酸の疎水性指数が考慮され得る。タンパク質における相互作用的な生物学的機能を与える際の疎水性アミノ酸指数の重要性は、一般に当該分野で認められている（Ｋｙｔｅ．ＪおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｒ．Ｆ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７（１）：１０５−１３２，１９８２）。アミノ酸の疎水的性質は、生成したタンパク質の二次構造に寄与し、次いでそのタンパク質と他の分子（例えば、酵素、基質、レセプター、ＤＮＡ、抗体、抗原など）との相互作用を規定する。各アミノ酸は、それらの疎水性および電荷の性質に基づく疎水性指数を割り当てられる。それらは：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；スレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５））である。
【０１１１】
あるアミノ酸を、同様の疎水性指数を有する他のアミノ酸により置換して、そして依然として実質的に同様の生物学的機能を有するタンパク質（例えば、酵素活性において実質的に等価なタンパク質）を生じさせ得ることは、当該分野で周知である。このようなアミノ酸置換において、疎水性指数が±２以内であることが好ましく、±１以内であることがより好ましく、および±０．５以内であることがさらにより好ましい。疎水性に基づくこのようなアミノ酸の置換は効率的であることが当該分野において理解される。米国特許第４，５５４，１０１号に記載されるように、以下の親水性指数がアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；スレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；およびトリプトファン（−３．４）。アミノ酸が同様の親水性指数を有しかつ依然として生物学的等価体を与え得る別のものに置換され得ることが理解される。このようなアミノ酸置換において、親水性指数が±２以内であることが好ましく、±１以内であることがより好ましく、および±０．５以内であることがさらにより好ましい。
【０１１２】
本発明において、「保存的置換」とは、アミノ酸置換において、元のアミノ酸と置換されるアミノ酸との親水性指数または／および疎水性指数が上記のように類似している置換をいう。保存的置換の例は、当業者に周知であり、例えば、次の各グループ内での置換が挙げられるがこれらに限定されない：アルギニンおよびリジン；グルタミン酸およびアスパラギン酸；セリンおよびスレオニン；グルタミンおよびアスパラギン；ならびにバリン、ロイシン、およびイソロイシン。
【０１１３】
アミノ酸は、その一般に公知の３文字記号か、またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎにより推奨される１文字記号のいずれかにより、本明細書中で言及され得る。ヌクレオチドも同様に、一般に受け入れられた１文字コードにより言及され得る。
【０１１４】
本発明の核酸分子においては、レポータータンパク質コード配列の下流にＰＥＳＴ配列コード配列が連結されていることが好ましい。本明細書において用語「ＰＥＳＴ配列」とは、プロリン−グルタミン酸−セリン−トレオニンに富むアミノ酸配列をいう。ＰＥＳＴ配列は、配列自体およびその長さに特異性はない。ＰＥＳＴ配列は、その配列が融合されたタンパク質の細胞内での半減期を短縮させる機能を有する。ＰＥＳＴ配列をレポータータンパク質と融合させると、レポータータンパク質の細胞内での過度の蓄積を防ぐことができ、その結果、レポータータンパク質のリアルタイムの測定を行うことができる。
【０１１５】
ＰＥＳＴ配列コード配列の下流またはＰＥＳＴ配列コード配列を含まない場合にはレポータータンパク質コード配列の下流に、選択マーカーの配列がさらに連結され得る。本明細書において用語「選択マーカーの配列」とは、選択遺伝子と同義であり、その選択マーカーがコードする産物の発現によって、選択マーカーが存在する細胞と存在しない細胞とを識別することができる、ヌクレオチドをいう。
【０１１６】
本明細書において遺伝子、ポリヌクレオチド、タンパク質などの「発現」とは、その遺伝子などがインビトロまたはインビボで一定の作用を受けて、別の形態になることをいう。好ましくは、遺伝子、タンパク質をコードする配列などが、転写および翻訳されて、タンパク質の形態になることをいうが、転写されてｍＲＮＡが作製されることもまた発現の一形態であり得る。より好ましくは、そのようなタンパク質の形態は、翻訳後プロセシングを受けたものであり得る。
【０１１７】
従って、本明細書において遺伝子、ポリヌクレオチド、ポリペプチドなどの「発現」の「減少」とは、本発明の因子を作用させたときに、作用させないときよりも、発現の量が有意に減少することをいう。好ましくは、発現の減少は、ポリペプチドの発現量の減少を含む。本明細書において遺伝子、ポリヌクレオチド、タンパク質などの「発現」の「増加」とは、本発明の因子を作用させたときに、作用させないときよりも、発現の量が有意に増加することをいう。好ましくは、発現の増加は、タンパク質の発現量の増加を含む。
【０１１８】
（２．Ｎｏｔｃｈシグナル伝達系の検出をさらに容易にするための配列）
本発明においては、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達系の検出をさらに容易にするための配列をさらに用いてもよい。この配列は、例えば、構成的に活性なＮｏｔｃｈタンパク質をコードする配列であり得る。「構成的に活性なＮｏｔｃｈタンパク質」とは、活性化を受けなくとも常に活性であって、下流にシグナルを伝えるＮｏｔｃｈタンパク質をいう。Ｎｏｔｃｈタンパク質は通常、デルタタンパク質の存在下で活性型になるが、構成的に活性なＮｏｔｃｈタンパク質は、デルタタンパク質が存在する必要がない。構成的に活性なＮｏｔｃｈタンパク質は、活性型Ｎｏｔｃｈ、活性型Ｎｏｔｃｈタンパク質、恒常的に活性なＮｏｔｃｈなどともいわれる。
【０１１９】
構成的に活性なＮｏｔｃｈタンパク質の例としては、ＣＣ＞ＳＳ、細胞外ドメイン欠損ＮＯＴＣＨ、Ｆ−ＮＥＸＴ、ＮｏｔｃｈΔＥ、Ｔ−ＡＬＬ変異含有Ｎｏｔｃｈなどが挙げられるがこれらに限定されない。ＣＣ＞ＳＳは、ＬＮＲｍＮｏｔｃｈ１のヘテロダイマー形成部分である１６７５位のシステインをセリンに、１６８２位のシステインをセリンに置換したもの（すなわち、Ｃ１６７５Ｓ，Ｃ１６８２Ｓにしたもの）である。ＣＣ＞ＳＳは、Ｍｕｍｍ ＪＳ，Ｓｃｈｒｏｅｔｅｒ ＥＨ，Ｓａｘｅｎａ ＭＴ，Ｇｒｉｅｓｅｍｅｒ Ａ，Ｔｉａｎ Ｘ，Ｐａｎ ＤＪ，Ｒａｙ ＷＪ，Ｋｏｐａｎ Ｒ．，”Ａ ｌｉｇａｎｄ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｌｅａｖａｇｅ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｇａｍｍａ−ｓｅｃｒｅｔａｓｅ−ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｏｔｃｈ１．”Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ．２０００ Ｆｅｂ；５（２）：１９７−２０６およびＫｏｐａｎ Ｒ，Ｓｃｈｒｏｅｔｅｒ ＥＨ，Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ Ｈ，Ｎｙｅ ＪＳ．，”Ｓｉｇｎａｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｍＮｏｔｃｈ：ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ ｏｆ ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ａｎｄ ｉｔｓ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｂｙ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｏｍａｉｎ．”Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．１９９６ Ｆｅｂ ２０；９３（４）：１６８３−８に記載される。細胞外ドメイン欠損ＮＯＴＣＨは、Ｎｏｔｃｈの細胞外ドメイン部分を欠損したものであり、ΔＮＳ１ともいう。細胞外ドメイン欠損ＮＯＴＣＨの核酸配列を配列番号７に示し、そのアミノ酸配列を配列番号８および図５に示す。細胞外ドメイン欠損ＮＯＴＣＨは、シグナルシークエンス＋Ｓ１＋Ｓ２＋Ｓ３＋Ｓ４サイトをもつ。Ｆ−ＮＥＸＴはＯｋｏｃｈｉ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｅｓｅｎｉｌｉｎｓ ｍｅｄｉａｔｅ ａ ｄｕａｌ ｉｎｔｒａｍｅｍｂｒａｎｏｕｓ ｇａｍｍａ−ｓｅｃｒｅｔａｓｅ ｃｌｅａｖａｇｅ ｏｆ Ｎｏｔｃｈ−１． ＥＭＢＯ Ｊ． ２００２ Ｏｃｔ １５；２１（２０）：５４０８−１６．に記載される。ＮｏｔｃｈΔＥはＫｏｐａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｓｉｇｎａｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｍＮｏｔｃｈ： ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ ｏｆ ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ａｎｄ ｉｔｓ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｂｙ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｏｍａｉｎ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ． １９９６ Ｆｅｂ ２０；９３（４）：１６８３−８．に記載される。Ｔ−ＡＬＬ変異含有ＮｏｔｃｈはＷｅｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｏｆ ＮＯＴＣＨ１ ｉｎ ｈｕｍａｎ Ｔ ｃｅｌｌ ａｃｕｔｅ ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ． Ｓｃｉｅｎｃｅ． ２００４ Ｏｃｔ ８；３０６（５６９４）：２６９−７１．に記載される。
【０１２０】
構成的に活性なＮｏｔｃｈタンパク質をコードする配列は、プロモーター配列と作動可能に連結されることが好ましい。プロモーター配列については上記に説明したのと同様である。構成的に活性なＮｏｔｃｈタンパク質をコードする配列に連結されるプロモーター配列は、少なくとも３つのＲＢＰ−Ｊκ結合配列に連結されるプロモーター配列と同じ配列を有してもよく、異なる配列を有してもよく、同じ配列であっても異なる配列であってもよい。。
【０１２１】
構成的に活性なＮｏｔｃｈタンパク質をコードする配列には、必要に応じて、ターミネーター、エンハンサーなどの他の発現調節エレメントが連結され得る。
【０１２２】
構成的に活性なＮｏｔｃｈタンパク質をコードする配列を含む核酸分子は、少なくとも３つのＲＢＰ−Ｊκ結合配列を含む核酸分子と別の分子であってもよく、同じ分子であってもよい。別の分子であることが好ましい。
【０１２３】
本発明の核酸分子は、好ましくは、プロモーター配列と作動可能に連結された構成的に活性なＮｏｔｃｈタンパク質をコードする配列を含む核酸分子とともに細胞内に導入して発現させた場合の前記レポータータンパク質の発現量と、該Ｎｏｔｃｈタンパク質コード配列を含まない核酸分子とともに細胞内に導入して発現させた場合の該レポータータンパク質の発現量とを比較したときの、Ｚ’ ｆａｃｔｏｒ値が０．５以上である。
【０１２４】
Ｚ’ｆａｃｔｏｒ値は、アッセイ精度に関する指標である。Ｚ’ｆａｃｔｏｒ値については、Ｊｉ−Ｈｕ Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｃｒｅｅｎ．５，６７−７３，１９９９に詳細に説明されている。Ｚ’ｆａｃｔｏｒ値（Ｚ’）は、以下の式に従って求められる。
【０１２５】
【数１】
Ｚ’ｆａｃｔｏｒ値の計算式およびその概念図を図６（ａ）に示す。Ｚ’ｆａｃｔｏｒ値を説明するために模式的なデータの例を、図６（ｂ）および図６（ｃ）に示す。図６（ｂ）は、Ｓ／Ｂ＝１０でかつＺ’＝０．４の場合のデータ例であり、図６（ｃ）は、Ｓ／Ｂ＝２でかつＺ’＝０．８の場合のデータ例である。それぞれ、縦軸はカウント数を示し、横軸はサンプル番号を示す。図６（ｂ）および図６（ｃ）からわかるように、Ｓ／Ｂが比較的大きくてもＺ’が小さいとデータはばらつき、Ｓ／Ｂが比較的小さくてもＺ’が大きければデータのばらつきは小さい。Ｚ’ｆａｃｔｏｒ値は好ましくは０．５０以上であり、より好ましくは０．５５以上であり、さらに好ましくは０．６０以上であり、特に好ましくは０．６５以上であり、ことさら好ましくは０．７０以上であり、さらになお好ましくは０．８以上である。Ｚ’ｆａｃｔｏｒ値の上限は１である。Ｚ’ｆａｃｔｏｒ値が高いほどアッセイ精度が高い。ハイスループットスクリーニングを行うためには、Ｚ’ｆａｃｔｏｒ値が０．５０以上であることが好ましい。
【０１２６】
（３．本発明の核酸分子を含む細胞）
本発明の細胞は、本発明の核酸分子を含む。本発明の細胞は、好ましくは、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達が容易に活性化される細胞を含む。本発明の細胞は、任意の生物の細胞であり得る。本発明の細胞は、好ましくは動物細胞であり、より好ましくは哺乳動物細胞であり、さらに好ましくは霊長類の細胞であり、最も好ましくはヒト細胞である。本発明の細胞は好ましくは単離された細胞である。本発明の細胞として用いるのに好ましい細胞の例としては、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＨＯ細胞などが挙げられる。ＨＥＫ２９３細胞は、ヒト胎児腎細胞をアデノウィルスのＥ１遺伝子により形質転換することにより樹立された細胞株である。あるいは、細胞は、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達系についての調査が望ましい細胞であり得る。例えば、患者由来の細胞であり得る。本発明の細胞は、これまでに樹立された細胞株から作製されてもよく、あるいは患者、被験者などから採取された細胞から作製されてもよい。
【０１２７】
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達系を調節する物質のスクリーニングにおいて本発明の細胞を用いることが意図される場合、この細胞において、少なくとも３つのＲＢＰ−Ｊκ配列を含む核酸分子は、プロモーター配列と作動可能に連結されたレポータータンパク質コード配列をさらに含むことが好ましい。このような場合、本発明の細胞は、内因性のＮｏｔｃｈタンパク質を発現する細胞であってもよく、または構成的に活性なＮｏｔｃｈタンパク質を発現する細胞であってもよい。特定の実施形態では、内因性のＮｏｔｃｈタンパク質を発現する細胞であることが好ましい。内因性のＮｏｔｃｈタンパク質を発現する細胞であれば、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達系の調節活性をさらにより正確に調べることができる。別の実施形態では、構成的に活性なＮｏｔｃｈタンパク質を発現する細胞であることが好ましい。構成的に活性なＮｏｔｃｈタンパク質を発現する細胞であれば、レポータータンパク質の発現量が非常に多くなるという利点を有する。
【０１２８】
本発明の細胞は、本発明の核酸分子を目的の細胞に導入することによって得られ得る。
【０１２９】
本発明の核酸分子を導入する細胞（宿主ともいう）の例としては、原核生物および真核生物が挙げられる。核酸分子を導入する細胞は、内因性のＮｏｔｃｈタンパク質を発現するか否か、レポータータンパク質の発現の容易さ、培養の容易さ、増殖の速さ、安全性などの種々の条件を考慮して容易に選択され得る。
【０１３０】
本発明の方法において、本発明の核酸分子を細胞に導入する技術は、当該分野で公知の任意の技術であり得る。また、個々の細胞に対してではなく、組織、器官に対して導入してもよい。このような技術の例としては、例えば、形質転換、形質導入、トランスフェクションなどが挙げられる。例えば、リポフェクトアミンを用いるリポフェクションによって行われてもよい。核酸分子の生物細胞への導入は、一過的（トランジェント）であっても恒常的であってもよい。一過性または恒常性の遺伝子導入の技術はそれぞれ当該分野において周知である。本発明において用いられる細胞を分化させる技術もまた当該分野において周知である。そのような核酸分子の導入技術は、当該分野において周知であり、かつ、慣用されるものであり、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ Ｆ．Ａ．ら編（１９８８）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊら（１９８７）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載される。
【０１３１】
「形質転換体」とは、形質転換によって作製された細胞などの生物体の全部または一部をいう。形質転換体は、その対象に依存して、形質転換細胞、形質転換組織、形質転換宿主などともいわれ、本明細書においてそれらの形態をすべて包含するが、特定の文脈において特定の形態を指し得る。
【０１３２】
本発明の細胞において、本発明の核酸分子（すなわち、少なくとも３つのＲＢＰ−Ｊκ結合配列を含む核酸分子）は、細胞の染色体に導入されていても、導入されていなくてもよい。
【０１３３】
形質転換処理をする際には、必要により、選択マーカーの配列が使用される。選択マーカーとその選択マーカーに適切な選択因子（例えば、抗生物質、色素など）とを組合せて用いることにより、形質転換処理が施された細胞の中から、本発明の核酸分子が導入された細胞をより効率よく選択することができる。しかし、この工程は、本発明において必ずしも必須というわけではない。このような選択方法は、導入された核酸分子が有する選択マーカーの特性によって変動し、例えば、抗生物質（例えば、ネオマイシン（Ｎｅｏｍｙｃｉｎ）、ピューロマイシン（Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ）など）に対する耐性遺伝子が選択マーカーとして導入された場合は、その特定の抗生物質を用いて目的の細胞を選択することができる。あるいは、選択マーカーとして標識遺伝子（例えば、グリーン蛍光遺伝子など）を用いれば、そのような標識を目安に目的の細胞を選択することができる。ただし、少なくとも３つのＲＢＰ−Ｊκ結合配列に連結するレポータータンパク質と選択マーカーとは異なるものであることが好ましい。あるいは、外来遺伝子そのものが表現型に識別可能な差異を生じさせる場合は、そのような差異を目安に遺伝子導入細胞を選択してもよい。そのような識別可能な差異としては、例えば、色素の発現の有無などがあるがそれに限定されない。
【０１３４】
本発明の細胞は、組織を形成していない、単なる細胞として用いられてもよく、あるいは、組織、器官および生物体へと分化したものであってもよい。
【０１３５】
本明細書において、生物の「組織」とは、細胞の集団であって、その集団において一定の同様の作用を有するものをいう。従って、組織は、器官の一部であり得る。器官内では、同じ働きを有する細胞を有することが多いが、微妙に異なる働きを有するものが混在することもあることから、本明細書において組織は、一定の特性を共有する限り、種々の細胞を混在して有していてもよい。通常「組織」は、同じ起源を有するが、異なる起源を持つ細胞集団であっても、同一の機能および／または形態を有するのであれば、組織と呼ばれ得る。通常、組織は、器官の一部を構成する。
【０１３６】
本明細書において、「器官」とは、１つ独立した形態をもち、１種以上の組織が組み合わさって特定の機能を営む構造体を形成したものをいう。本発明が対象とする器官はどのような器官でもよく、また本発明が対象とする組織または細胞は、生物のどの器官に由来するものでもよい。一般に多細胞生物（例えば、動物）では器官は特定の空間的配置をもついくつかの組織からなり、組織は多数の細胞からなる。本発明の器官は、当該分野で周知の形質転換方法に従って作出された細胞を用いて、当該分野で公知の方法に従って組織分化させ、そして器官を形成させることによって入手され得る。
【０１３７】
本明細書において「生物体」とは、当該分野における最も広義に用いられ、生命現象を営むものをいい、代表的には、細胞構造、増殖（自己再生産）、成長、調節性、物質代謝、修復能力など種々の特性を有し、通常、核酸のつかさどる遺伝と、タンパク質のつかさどる代謝の関与する増殖を基本的な属性として有する。生物には、原核生物、真核生物（植物、動物など）などが包含される。好ましくは、本発明では、生物は、動物であり得る。本発明の生物体は、当該分野で周知の形質転換方法に従って作出された細胞を用いて、当該分野で公知の方法に従って再分化させることによって入手され得る。あるいは、本発明の生物体は、当該分野で周知の形質転換方法に従って作出された細胞を再分化させ、形質転換個体を得て、その個体を交配することによって得た子孫から得られる生物体であり得る。
【０１３８】
（４．Ｎｏｔｃｈシグナル伝達系を調節する物質のスクリーニング方法）
本発明によれば、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達系を調節する物質のスクリーニング方法が提供される。この方法は、（ａ）本発明の細胞と候補物質とを接触させる工程；および（ｂ）この細胞中での該レポータータンパク質の発現量を測定する工程を包含する。
【０１３９】
このスクリーニング方法において、候補物質は任意の物質であり得る。候補物質は例えば、化学的に合成された化合物であってもよく、天然から抽出された物質であってもよく、天然から抽出された物質を修飾することにより得られる物質であってもよい。候補物質は、種々の化合物ライブラリーであってもよい。
【０１４０】
候補物質は直接細胞に添加されてもよいが、利便性の面から、候補物質は例えば、溶液中に溶解され、この溶液を細胞に添加することによって、本発明の細胞と接触し得る。
【０１４１】
スクリーニングは、任意のフォーマットで行われ得る。例えば、９６ウェルプレートのような多穴プレートの各ウェルに細胞を入れ、この細胞に、候補物質を含む溶液を添加することによって、本発明の細胞と候補物質とを接触させ得る。次いで、これらの各ウェル中でのレポータータンパク質の発現量が測定され得る。本発明のスクリーニングはインビトロまたはインビボのいずれで行ってもよいが、好ましくはインビトロで行われる。
【０１４２】
より好ましい実施形態では、本発明の、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達系を調節する物質のスクリーニング方法は、（ａ’）本発明の細胞中での前記レポータータンパク質の発現量を測定する工程；（ｂ’）該細胞と候補物質とを接触させる工程；（ｃ’）該細胞中での該レポータータンパク質の発現量を測定する工程；および（ｄ’）工程（ｃ’）での該レポータータンパク質の発現量が工程（ａ’）での該レポータータンパク質の発現量よりも増加したかまたは減少した場合、該候補物質をＮｏｔｃｈシグナル伝達系を調節する物質として選択する工程を包含する。
【０１４３】
工程（ａ’）で発現量を測定する代わりに、細胞と、候補物質を含まないコントロール溶液とを接触させた場合のレポータータンパク質の発現量を測定してもよい。この場合の本発明のスクリーニング方法は、（ａ”）候補物質の存在下での本発明の細胞中でのレポータータンパク質の発現量を測定する工程；（ｂ”）候補物質の非存在下での本発明の細胞中でのレポータータンパク質の発現量を測定する工程；および（ｃ”）工程（ａ”）での発現量と工程（ｂ”）での発現量とを比較する工程を包含する。
【０１４４】
このようにして、候補物質の存在下と非存在下とでレポータータンパク質の発現量が変化（すなわち、増加または減少）した場合、その候補物質は、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達系を調節する物質である。
【０１４５】
本発明のスクリーニング方法を用いて、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達系を調節する物質を選択するだけでなく、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達系に実質的に影響を与えない物質を選択することもできる。本明細書において「Ｎｏｔｃｈシグナル伝達系に実質的に影響を与えない物質」とは、その物質の存在下と非存在下とでのレポータータンパク質の発現量が実質的に同じである物質をいう。「発現量が実質的に同じである」とは、その物質の非存在下での発現量を１００％としたときの１０μＭのその物質の存在下での発現量が、８０％より高く１２０％以下であることをいう。
【０１４６】
レポータータンパク質が発光タンパク質である場合、その発現量は、特定の波長の光を測定することにより測定され得る。特定の発光タンパク質についての特徴的な波長は当業者に公知であり、その測定方法もまた当業者に公知である。
【０１４７】
レポータータンパク質が蛍光タンパク質である場合、その発現量は、適切な波長の光を細胞に当てて蛍光タンパク質を励起し、特定の波長の発光を測定することにより測定され得る。特定の蛍光タンパク質についての特徴的な波長は当業者に公知であり、その測定方法もまた当業者に公知である。
【０１４８】
レポータータンパク質が他の特性を有するタンパク質である場合もそのレポータータンパク質についての発現量の測定法は当業者に公知であり、適切に選択され得る。
【０１４９】
特に好ましい実施形態では、本発明の方法において工程（ｃ’）での該レポータータンパク質の発現量が工程（ａ’）での該レポータータンパク質の発現量よりも増加した場合、あるいは、工程（ａ”）での該レポータータンパク質の発現量が工程（ｂ”）での該レポータータンパク質の発現量よりも増加した場合、この候補物質をＮｏｔｃｈシグナル伝達系の活性化剤として選択する。好ましくは、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達系の活性化剤は、その物質の非存在下での発現量を１００％としたときの１０μＭのその物質の存在下での発現量が、１２０％以上である物質であり、より好ましくは約１５０％以上である物質であり、さらに好ましくは約２００％以上である物質であり、特に好ましくは約３００％以上である物質である。Ｎｏｔｃｈシグナル伝達系の活性化剤は例えば、その物質の非存在下での発現量を１００％としたときの１０μＭのその物質の存在下での発現量が、約５００％以下である物質であり、より好ましくは約４００％以下である物質であり、さらに好ましくは約３００％以下である物質であり、特に好ましくは約２００％以下である物質である。Ｎｏｔｃｈシグナル伝達系の活性化剤は、例えば、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達が抑制された状態を改善するための薬剤として有用である。
【０１５０】
特に好ましい実施形態では、本発明の方法において工程（ｃ’）での該レポータータンパク質の発現量が工程（ａ’）での該レポータータンパク質の発現量よりも減少した場合、あるいは、工程（ａ”）での該レポータータンパク質の発現量が工程（ｂ”）での該レポータータンパク質の発現量よりも減少した場合、この候補物質をＮｏｔｃｈシグナル伝達系の抑制剤として選択する。好ましくは、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達系の抑制剤は、その物質の非存在下での発現量を１００％としたときの１０μＭのその物質の存在下での発現量が、８０％以下である物質であり、より好ましくは約７０％以下である物質であり、さらに好ましくは約６０％以下である物質であり、特に好ましくは約５０％以下である物質である。Ｎｏｔｃｈシグナル伝達系の抑制剤は例えば、その物質の非存在下での発現量を１００％としたときの１０μＭのその物質の存在下での発現量が、約１０％以上である物質であり、より好ましくは約２０％以上である物質であり、さらに好ましくは約３０％以上である物質であり、特に好ましくは約４０％以上である物質である。Ｎｏｔｃｈシグナル伝達系の抑制剤は、例えば、癌などのＮｏｔｃｈシグナル伝達が異常に活性化された状態を改善するための薬剤（すなわち、例えば、抗癌剤）として有用である。
【０１５１】
（５．γ−セクレターゼ阻害薬候補物質から、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達系を抑制しないγ−セクレターゼ阻害薬を選択するためのスクリーニング方法）
本発明によれば、γ−セクレターゼ阻害薬候補物質から、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達系を抑制しないγ−セクレターゼ阻害薬を選択するためのスクリーニング方法が提供される。
【０１５２】
γ−セクレターゼ阻害薬候補物質から、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達系を抑制しないγ−セクレターゼ阻害薬を選択するためのスクリーニング方法は、（ａ）本発明の細胞と該候補物質とを接触させる工程；および（ｂ）該細胞中での該レポータータンパク質の発現量を測定する工程を包含する。
【０１５３】
このスクリーニング方法において、γ−セクレターゼ阻害薬候補物質は任意の物質であり得る。γ−セクレターゼ阻害薬候補物質は例えば、化学的に合成された化合物であってもよく、天然から抽出された物質であってもよく、天然から抽出された物質を修飾することにより得られる物質であってもよい。候補物質は、種々の化合物ライブラリーであってもよい。
【０１５４】
γ−セクレターゼ阻害薬候補物質は直接細胞に添加されてもよいが、利便性の面から、γ−セクレターゼ阻害薬候補物質は例えば、溶液中に溶解され、この溶液を細胞に添加することによって、本発明の細胞と接触し得る。
【０１５５】
スクリーニングは、任意のフォーマットで行われ得る。例えば、９６ウェルプレートのような多穴プレートの各ウェルに細胞を入れ、この細胞に、γ−セクレターゼ阻害薬候補物質を含む溶液を添加することによって、本発明の細胞とγ−セクレターゼ阻害薬候補物質とを接触させ得る。次いで、これらの各ウェル中でのレポータータンパク質の発現量が測定され得る。本発明のスクリーニングはインビトロまたはインビボのいずれで行ってもよいが、好ましくはインビトロで行われる。
【０１５６】
より好ましい実施形態では、本発明の、γ−セクレターゼ阻害薬候補物質から、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達系を抑制しないγ−セクレターゼ阻害薬を選択するためのスクリーニング方法は、（ａ’）本発明の細胞中での前記レポータータンパク質の発現量を測定する工程；（ｂ’）該細胞と候補物質とを接触させる工程；（ｃ’）該細胞中での該レポータータンパク質の発現量を測定する工程；および（ｄ’）工程（ｃ’）での該レポータータンパク質の発現量が工程（ａ’）での該レポータータンパク質の発現量と実質的に同じである場合、該候補物質をＮｏｔｃｈシグナル伝達系を抑制しないγ−セクレターゼ阻害薬として選択する工程を包含する。
【０１５７】
工程（ａ’）で発現量を測定する代わりに、細胞と、γ−セクレターゼ阻害薬候補物質を含まないコントロール溶液とを接触させた場合のレポータータンパク質の発現量を測定してもよい。この場合の本発明のスクリーニング方法は、（ａ”）候補物質の存在下での本発明の細胞中でのレポータータンパク質の発現量を測定する工程；（ｂ”）候補物質の非存在下での本発明の細胞中でのレポータータンパク質の発現量を測定する工程；および（ｃ”）工程（ａ”）での発現量と工程（ｂ”）での発現量とを比較する工程を包含する。
【０１５８】
このようにして、γ−セクレターゼ阻害薬候補物質の存在下と非存在下とでレポータータンパク質の発現量が減少した場合、その候補物質は、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達系を抑制する物質であり、レポータータンパク質の発現量が変化しないかまたは増加した場合、その候補物質は、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達系を抑制しない物質である。
【０１５９】
好ましくは、γ−セクレターゼ阻害薬は、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達系を実質的に抑制しない物質である。「Ｎｏｔｃｈシグナル伝達系を実質的に抑制しない物質」とは、その物質の存在下でのレポータータンパク質の発現量が、その物質の非存在下でのレポータータンパク質の発現量と実質的に同じであるかまたは多い物質をいう。さらに好ましくは、γ−セクレターゼ阻害薬は、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達系に実質的に影響を与えない物質である。好ましくは、γ−セクレターゼ阻害薬は、この物質の非存在下での発現量を１００％としたときのこの物質の存在下での発現量が、８０％〜約１２０％である物質であり、より好ましくは約９０％〜約１１０％である物質である。
【０１６０】
本発明のスクリーニング方法を用いることにより、アルツハイマー病治療薬候補であるγ−セクレターゼ阻害薬の副作用の検討を行うことができる。本発明のスクリーニング方法によれば、このような検討を、特に、ハイスループットスクリーニング（ｈｉｇｈ ｔｈｒｏｕｇｈ−ｐｕｔ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）によって行うことができるという顕著な効果を有する。
【０１６１】
本発明のスクリーニング方法を用いることにより、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達阻害型抗がん剤の主作用の検討を行うことができる。本発明のスクローニング方法によれば、このような検討を、特に、ハイスループットスクリーニングによって行うことができるという顕著な効果を有する。
【０１６２】
（６．Ａβ４２の産生を抑制するアルツハイマー病治療薬候補物質から、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達系を抑制しないアルツハイマー病治療薬を選択するためのスクリーニング方法）
本発明によれば、Ａβ４２の産生を抑制するアルツハイマー病治療薬候補物質から、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達系を抑制しないアルツハイマー病治療薬を選択するためのスクリーニング方法が提供される。
【０１６３】
Ａβ４２の産生を抑制するアルツハイマー病治療薬候補物質から、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達系を抑制しないアルツハイマー病治療薬を選択するためのスクリーニング方法は、（ａ）本発明の細胞と該候補物質とを接触させる工程；および（ｂ）該細胞中での該レポータータンパク質の発現量を測定する工程を包含する。
【０１６４】
このスクリーニング方法において、Ａβ４２の産生を抑制するアルツハイマー病治療薬候補物質は、Ａβ４２の産生を抑制する任意の物質であり得る。Ａβ４２の産生を抑制するアルツハイマー病治療薬候補物質は例えば、化学的に合成された化合物であってもよく、天然から抽出された物質であってもよく、天然から抽出された物質を修飾することにより得られる物質であってもよい。候補物質は、種々の化合物ライブラリーであってもよい。
【０１６５】
Ａβ４２の産生を抑制するアルツハイマー病治療薬候補物質は直接細胞に添加されてもよいが、利便性の面から、Ａβ４２の産生を抑制するアルツハイマー病治療薬候補物質は例えば、溶液中に溶解され、この溶液を細胞に添加することによって、本発明の細胞と接触し得る。
【０１６６】
スクリーニングは、任意のフォーマットで行われ得る。例えば、９６ウェルプレートのような多穴プレートの各ウェルに細胞を入れ、この細胞に、Ａβ４２の産生を抑制するアルツハイマー病治療薬候補物質を含む溶液を添加することによって、本発明の細胞とＡβ４２の産生を抑制するアルツハイマー病治療薬候補物質とを接触させ得る。次いで、これらの各ウェル中でのレポータータンパク質の発現量が測定され得る。本発明のスクリーニングはインビトロまたはインビボのいずれで行ってもよいが、好ましくはインビトロで行われる。
【０１６７】
より好ましい実施形態では、本発明の、Ａβ４２の産生を抑制するアルツハイマー病治療薬候補物質から、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達系を抑制しないアルツハイマー病治療薬を選択するためのスクリーニング方法は、（ａ’）本発明の細胞中での前記レポータータンパク質の発現量を測定する工程；（ｂ’）該細胞と候補物質とを接触させる工程；（ｃ’）該細胞中での該レポータータンパク質の発現量を測定する工程；および（ｄ’）工程（ｃ’）での該レポータータンパク質の発現量が工程（ａ’）での該レポータータンパク質の発現量と実質的に同じである場合、該候補物質をＮｏｔｃｈシグナル伝達系を抑制しないＡβ４２産生阻害薬として選択する工程を包含する。
【０１６８】
工程（ａ’）で発現量を測定する代わりに、細胞と、Ａβ４２の産生を抑制するアルツハイマー病治療薬候補物質を含まないコントロール溶液とを接触させた場合のレポータータンパク質の発現量を測定してもよい。この場合の本発明のスクリーニング方法は、（ａ”）候補物質の存在下での本発明の細胞中でのレポータータンパク質の発現量を測定する工程；（ｂ”）候補物質の非存在下での本発明の細胞中でのレポータータンパク質の発現量を測定する工程；および（ｃ”）工程（ａ”）での発現量と工程（ｂ”）での発現量とを比較する工程を包含する。
【０１６９】
このようにして、Ａβ４２の産生を抑制するアルツハイマー病治療薬候補物質の存在下と非存在下とでレポータータンパク質の発現量が減少した場合、その候補物質は、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達系を抑制する物質であり、レポータータンパク質の発現量が変化しないかまたは増加した場合、その候補物質は、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達系を抑制しない物質である。
【０１７０】
好ましくは、この候補物質は、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達系を実質的に抑制しない物質である。「Ｎｏｔｃｈシグナル伝達系を実質的に抑制しない物質」とは、その物質の存在下でのレポータータンパク質の発現量が、その物質の非存在下でのレポータータンパク質の発現量と実質的に同じであるかまたは多い物質をいう。さらに好ましくは、アルツハイマー病治療薬は、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達系に実質的に影響を与えない物質である。好ましくは、アルツハイマー病治療薬は、この物質の非存在下での発現量を１００％としたときのこの物質の存在下での発現量が、約８０％〜約１２０％である物質であり、より好ましくは約９０％〜約１１０％である物質である。
【０１７１】
本発明のスクリーニング方法を用いることにより、アルツハイマー病治療薬候補であるＡβ４２産生抑制薬の副作用の検討を行うことができる。本発明のスクリーニング方法によれば、このような検討を、特に、ハイスループットスクリーニング（ｈｉｇｈ ｔｈｒｏｕｇｈ−ｐｕｔ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）によって行うことができるという顕著な効果を有する。本発明のスクリーニング方法を用いることにより、Ａβ４２の産生を抑制しながらも、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達に実質的に影響を与えないアルツハイマー病治療薬を得ることができる。
【０１７２】
本発明のスクリーニング方法を用いることにより、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達阻害型抗がん剤の主作用の検討を行うことができる。本発明のスクローニング方法によれば、このような検討を、特に、ハイスループットスクリーニングによって行うことができるという顕著な効果を有する。
【０１７３】
（７．キット）
本発明によれば、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達系を調節する物質のスクリーニング方法において使用するためのキットが提供される。このキットは、本発明の細胞およびレポータータンパク質の発現量を測定するための試薬を備える。
【０１７４】
本発明によれば、γ−セクレターゼ阻害薬候補物質あるいはＡβ４２産生抑制薬候補物質から、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達系を抑制しないγ−セクレターゼ阻害薬あるいはＡβ４２産生抑制薬を選択するためのスクリーニング方法において使用するためのキットもまた提供される。このキットは、本発明の細胞；レポータータンパク質の発現量を測定するための試薬を備える。このキットはまた、使用説明書、ポジティブコントロール（例えば、ＤＡＰＴ、Ｌ−６８５４５８）、ネガティブコントロール（例えば、スリンダクスルフィド、インドメタシン、イブプロフェン，Ｒ−フルビプロフェン）などを備え得る。
【０１７５】
ＤＡＰＴは、Ｎ−［Ｎ−（３，５−ジフルオロフェナセチル−Ｌ−アラニル）］−Ｓ−フェニルグリシン ｔ−ブチルエステル（Ｎ−［Ｎ−（３，５−Ｄｉｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎａｃｅｔｙｌ−Ｌ−ａｌａｎｙｌ）］−Ｓ−ｐｈｅｎｙｌｇｌｙｃｉｎｅ ｔ−Ｂｕｔｙｌ Ｅｓｔｅｒ）であり、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達系も阻害するγ−セクレターゼ阻害剤として公知である（Ｄｏｖｅｙ ｅｔ ａｌ． （２００１） Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｇａｍｍａ−ｓｅｃｒｅｔａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｒｅｄｕｃｅ ｂｅｔａ−ａｍｙｌｏｉｄ ｐｅｐｔｉｄｅ ｌｅｖｅｌｓ ｉｎ ｂｒａｉｎ． Ｊ． Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ． ７６， １７３-１８１．）。
【０１７６】
Ｌ−６８５４５８は、｛１Ｓ−Ｂｅｎｚｙｌ−４Ｒ−［１−（１Ｓ−ｃａｒｂａｍｏｙｌ−２−ｐｈｅｎｙｌｅｔｈｙｌｃａｒｂａｍｏｙｌ）−１Ｓ−３−ｍｅｔｈｙｌｂｕｔｙｌｃａｒｂａｍｏｙｌ］−２Ｒ−ｈｙｄｒｏｘｙ−５−ｐｈｅｎｙｌｐｅｎｔｙｌ｝ｃａｒｂａｍｉｃ ａｃｉｄ ｔｅｒｔ−ｂｕｔｙｌ ｅｓｔｅｒであり、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達系も阻害するγ−セクレターゼ阻害剤として公知である（Ｓｈｅａｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｌ−６８５，４５８， ａｎ ａｓｐａｒｔｙｌ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ ｓｔａｔｅ ｍｉｍｉｃ， ｉｓ ａ ｐｏｔｅｎｔ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ａｍｙｌｏｉｄ ｂｅｔａ−ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｇａｍｍａ−ｓｅｃｒｅｔａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ． ２０００ Ａｕｇ １；３９（３０）：８６９８−７０４．)。
【０１７７】
スリンダクスルフィドは、（Ｚ）−５−フルオロ−２−メチル−１−［ｐ−（メチルチオ）ベンジリデン］インデン−３−酢酸（（Ｚ）−５−Ｆｌｕｏｒｏ−２−ｍｅｔｈｙｌ−１−［ｐ−（ｍｅｔｈｙｌｔｈｉｏ）ｂｅｎｚｙｌｉｄｅｎｅ］ｉｎｄｅｎｅ−３−ａｃｅｔｉｃ Ａｃｉｄ）であり、Ａβ４２産生抑制活性があるが、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達系に何の影響も与えないことが公知である(Ｗｅｇｇｅｎ Ｓ ｅｔ ａｌ．， Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｔｈａｔ ｎｏｎｓｔｅｒｏｉｄａｌ ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｄｒｕｇｓ ｄｅｃｒｅａｓｅ ａｍｙｌｏｉｄ ｂｅｔａ ４２ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ ｄｉｒｅｃｔ ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｇａｍｍａ−ｓｅｃｒｅｔａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． ２００３ Ａｕｇ ２２，２７８（３４）：３１８３１−７；Ｗｅｇｇｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ａｂｅｔａ４２−ｌｏｗｅｒｉｎｇ ｎｏｎｓｔｅｒｏｉｄａｌ ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｄｒｕｇｓ ｐｒｅｓｅｒｖｅ ｉｎｔｒａｍｅｍｂｒａｎｅ ｃｌｅａｖａｇｅ ｏｆ ｔｈｅ ａｍｙｌｏｉｄ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ （ＡＰＰ） ａｎｄ ＥｒｂＢ−４ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｎｄ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ ＡＰＰ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｏｍａｉｎ． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． ２００３ Ａｕｇ １５，２７８（３３）：３０７４８−５４；Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．， Ｓｕｌｉｎｄａｃ ｓｕｌｆｉｄｅ ｉｓ ａ ｎｏｎｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ｇａｍｍａ−ｓｅｃｒｅｔａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｔｈａｔ ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｒｅｄｕｃｅｓ Ａｂｅｔａ ４２ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． ２００３ Ｍａｙ １６，２７８（２０）：１８６６４−７０；Ｗｅｇｇｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ａ ｓｕｂｓｅｔ ｏｆ ＮＳＡＩＤｓ ｌｏｗｅｒ ａｍｙｌｏｉｄｏｇｅｎｉｃ Ａｂｅｔａ４２ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ ｏｆ ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ． Ｎａｔｕｒｅ． ２００１ Ｎｏｖ ８，４１４（６８６０）：２１２−６）。
【０１７８】
（８．組成物）
本発明の組成物は、内因性のＮｏｔｃｈシグナルの調節を測定するための組成物である。本発明の組成物は、少なくとも３つのＲＢＰ−Ｊκ結合配列を含む核酸分子を含み、該ＲＢＰ−Ｊκ結合配列が、ＴＧＧＧＡＡである。
【０１７９】
本発明の組成物に含まれる核酸分子については、上記（１．少なくとも３つのＲＢＰ−Ｊκ結合配列を含む核酸分子）の項目に記載したとおりである。
【０１８０】
本発明の組成物は、液体であっても固体であってもよい。
【実施例】
【０１８１】
（実施例１．各種プラスミドの作製）
（実施例１−１：Ｈｅｓ１−ｌｕｃ ｘ２、Ｈｅｓ１−ｌｕｃ ｘ３、およびＨｅｓ１−ｌｕｃ ｘ４の作製）
Ｈｅｓ１ｐ−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ（Ｊａｒｒｉａｕｌｔ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ３７７，３５５−３５８，１９９５）にＱｕｉｋｃｈａｎｇｅ ＩＩ ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）およびプライマー１：ＣＧＴＧＴＣＴＣＴＴＣＣＴＣＣＣＧＣＴＡＧＣＴＧＡＡＡＧＴＴＡＣＴＧ（配列番号９）；プライマー２：ＣＡＧＴＡＡＣＴＴＴＣＡＧＣＴＡＧＣＧＧＧＡＧＧＡＡＧＡＧＡＣＡＣＧ（配列番号１０）を用いて９５℃ ３０秒、５５℃ １分、６８℃ ６分を１６回繰り返す条件でＰＣＲを行うことにより、ＮｈｅＩ 制限酵素部位を導入し、Ｈｅｓ１−ｌｕｃ−ＮｈｅＩを作製した。このプラスミドのＲＢＰ−Ｊκ結合部位を下記のプライマーを用い、９４℃ ３０秒、６０℃ ３０秒、７２℃ ３０秒を２０回繰り返すの条件でＰＣＲで増幅した：
プライマー３：ＣＧＣＴＡＧＣＴＧＡＡＡＧＴＴＡＣＴＧＧＴＧＧ（配列番号１１）；および
プライマー４：ＧＴＣＴＡＧＡＧＧＣＴＣＧＴＧＴＧＡＡＡＣＴＴＣＣ（配列番号１２）。増幅した断片をｐＧＥＭ−Ｔ Ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）に挿入して連結してプラスミドを得た。このプラスミドを制限酵素ＮｈｅＩおよびＸｂａＩで処理することにより、ＲＢＰ−Ｊκ配列を２つ含むＮｈｅＩ−ＸｂａＩ断片を作製した。この作成した断片を、Ｈｅｓ１−ｌｕｃ−ＮｈｅＩのＮｈｅＩ部位にそれぞれ１〜３個挿入することにより、Ｈｅｓ１−ｌｕｃ ｘ２、Ｈｅｓ１−ｌｕｃ ｘ３、およびＨｅｓ１−ｌｕｃ ｘ４（Ｈｅｓ−Ｙとも記載する）を作製した。これらのプラスミドの構造の模式図を図７ａおよび図１３（ａ）に示す。Ｈｅｓ１−ｌｕｃ ｘ４（Ｈｅｓ−Ｙ）のＮｈｅＩ部位の２６塩基上流の部位からＨｉｎｄＩＩＩ部位までの配列を図１３（ｂ）に示す。Ｈｅｓ１−ｌｕｃ ｘ２は、４つのＲＢＰ−Ｊκ結合配列を含む。Ｈｅｓ１−ｌｕｃ ｘ３は、６つのＲＢＰ−Ｊκ結合配列を含む。Ｈｅｓ１−ｌｕｃ ｘ４は、８つのＲＢＰ−Ｊκ結合配列を含む。
【０１８２】
（実施例１−２：Ｈｅｓ−ＹＰ ＮｅｏおよびＨｅｓ−ＹＰ Ｐｕｒｏの作製）
Ｈｅｓ−ＹをＮｈｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで処理することにより、８つのＲＢＰ−Ｊκ配列を含むＮｈｅＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を得た。このＮｈｅＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片をｐＧＬ４．１８（ｌｕｃ２Ｐ／Ｎｅｏ）ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社）およびｐＧＬ４．２１（ｌｕｃ２Ｐ／Ｐｕｒｏ）ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社）にそれぞれ導入することにより、Ｈｅｓ−ＹＰ ＮｅｏおよびＨｅｓ−ＹＰ Ｐｕｒｏを作製した。これらのプラスミドの構造の模式図を図８ａに示す。ｐＧＬ４．１８およびｐＧＬ４．２１にはもともとルシフェラーゼコード配列の下流にＰＥＳＴ配列が含まれているため、得られたＨｅｓ−ＹＰ ＮｅｏおよびＨｅｓ−ＹＰ Ｐｕｒｏにも、ＰＥＳＴ配列コード配列が含まれている。
【０１８３】
（実施例１−３：ＴＰ−Ｙの作製）
ｐＧＡ９８１−６（Ｍｉｎｏｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１７（５），２６７９−８７，１９９７）のＲＢＰ−Ｊκ結合部位を下記のプライマーを用い、９４℃ ３０秒、６０℃ ３０秒、７２℃ １分を２０回繰り返す条件を用いてＰＣＲで増幅した：
プライマー５：ＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＴＣＴＡＧ（配列番号１３）および
プライマー６：ＡＧＡＴＣＴＣＣＡＡＧＡＴＧＣＡＴＡＣＡＧＴＧＧＡＴＣ（配列番号１４）。
【０１８４】
増幅した断片をｐＧＥＭ−Ｔ Ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）に挿入し、制限酵素ＢａｍＨＩ−ＢｇｌＩＩで処理することにより作成した断片を、ｐＧＡ９８１−６のＢａｍＨＩ部位に挿入し、ＴＰ−Ｙを作製した。ＴＰ−Ｙは、２４個のＲＢＰ−Ｊκ配列を含む。ＴＰ−Ｙの構造の模式図を図７ａに示す。ＴＰ−Ｙの２４個のＲＢＰ−Ｊκ配列を含む領域とｐＵＣ１８ベクター、ウサギβ−グロビン最小プロモーターおよびルシフェラーゼ遺伝子との連結部の配列を図９に示す。
【０１８５】
（実施例２．Ｎｏｔｃｈシグナル伝達系活性化に対する各プロモーターの反応）
培養細胞におけるトランジェント・アッセイを用い、Ｈｅｓ１−ｌｕｃ ｘ２、Ｈｅｓ１−ｌｕｃ ｘ３、Ｈｅｓ−ＹおよびＴＰ−ＹのＮｏｔｃｈシグナル伝達系活性化に対する反応を調べた。比較のために、プラスミドＨｅｓ１−ｌｕｃおよびｐＧＡ９８１−６を用いた。
【０１８６】
１０％ＦＣＳ（ウシ胎仔血清）を含有するＤＭＥＭ（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８，３９６（１９５９））を用い、５％ＣＯ２、３７℃の条件下でＨｅＬａ細胞を培養した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ社）を用い、添付のプロトコールに従って、レポーターとしてＨｅｓ１−ｌｕｃ、Ｈｅｓ１−ｌｕｃ ｘ２、Ｈｅｓ１−ｌｕｃ ｘ３、Ｈｅｓ−Ｙ、ｐＧＡ９８１−６またはＴＰ−Ｙと、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達系を活性化するための活性型ＮｏｔｃｈコンストラクトであるＣＣ＞ＳＳ（Ｍｕｍｍ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ ５，１９７−２０６，２０００）と内部コントロールレポーターとしてウミシイタケルシフェラーゼを発現するベクターであるｐＲＬ−Ｔｋベクターを導入した。この工程を、本明細書中ではリポフェクション（ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎ）という。
【０１８７】
ネガティブコントロールとして、ＣＣ＞ＳＳを導入せず、ｐｃＤＮＡ３．１ Ｈｙｇｒｏ（＋）ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を導入する実験も行った。
【０１８８】
リポフェクションを行ってから２４時間後、それぞれの細胞を溶解し、Ｄｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いて、蛍光強度を測った。結果を図７（ｂ）に示す。この図においては、Ｈｅｓ１−ｌｕｃをＣＣ＞ＳＳとともに共発現したときの蛍光活性（図中ではＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ活性と示す）を１として他のコンストラクトを用いたときの蛍光活性の相対値を示した。
【０１８９】
この結果、ＲＢＰ−Ｊκ結合配列の増加とともにルシフェラーゼ活性の増加が認められた。しかも、原理はわからないが、ＲＢＰ−Ｊκ結合配列を複数連結することにより、ネガティブコントロールを用いた場合の蛍光強度（すなわち、バックグラウンド）が顕著に低下した。これは驚くべき結果であった。これらの各コンストラクトを用いたときのＳ／Ｎ比は、Ｈｅｓ１−ｌｕｃの場合が１．５４であるのに対して、Ｈｅｓ１−ｌｕｃ ｘ２の場合に８．６７、Ｈｅｓ１−ｌｕｃ ｘ３の場合に１３．９０、Ｈｅｓ−Ｙの場合に１８．６４であった。また、ｐＧＡ９８１−６の場合が５．９８であるのに対して、ＴＰ−Ｙのい場合が２７．１２であった。Ｓ／Ｎ比は、ＣＣ＞ＳＳプラスミドと共発現した場合の蛍光強度をｐｃＤＮＡ３．１ Ｈｙｇｒｏ（＋）ベクターと共発現下場合の蛍光強度で除算することにより得られる。このように、ＲＢＰ−Ｊκ結合配列を複数連結することにより、ＳＮ比が飛躍的に向上した。
【０１９０】
（実施例３．Ｎｏｔｃｈシグナル伝達系活性化に対する各プロモーターの反応）
培養細胞におけるトランジェント・アッセイを用い、Ｈｅｓ１−ｌｕｃ、Ｈｅｓ−Ｙ、Ｈｅｓ−ＹＰ ＮｅｏおよびＨｅｓ−ＹＰ ＰｕｒｏのＮｏｔｃｈシグナル伝達系活性化に対する反応を調べた。
【０１９１】
１０％ＦＣＳを含有するＤＭＥＭを用い、５％ＣＯ２、３７℃の条件下でＨｅＬａ細胞を培養した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ社）を用い、添付のプロトコールに従って、レポーターとしてＨｅｓ１−ｌｕｃ、Ｈｅｓ−Ｙ、Ｈｅｓ−ＹＰ ＮｅｏまたはＨｅｓ−ＹＰ Ｐｕｒｏと、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達系を活性化するための活性型ＮｏｔｃｈコンストラクトのＣＣ＞ＳＳ（Ｍｕｍｍ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ ５，１９７−２０６，２０００）と内部コントロールレポーターとしてウミシイタケルシフェラーゼを発現するベクターであるｐＧＬ４．７４［ｈＲｌｕｃ／ＴＫ］ベクターをを導入した。
【０１９２】
ネガティブコントロールとして、ＣＣ＞ＳＳを導入せず、ｐｃＤＮＡ３．１ Ｈｙｇｒｏ（＋）ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を導入する実験も行った。
【０１９３】
リポフェクションを行ってから２４時間後、それぞれの細胞を溶解し、Ｄｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いて、蛍光強度を測った。結果を図８（ｂ）に示す。図８（ｂ）は、これらのＮｏｔｃｈレポーターアッセイ用コンストラクトと、活性型Ｎｏｔｃｈとを共発現した時のルシフェラーゼ活性を示すグラフである。図８（ｃ）は、これらのＮｏｔｃｈレポーターアッセイ用コンストラクトと、活性型Ｎｏｔｃｈとを共発現した時のルシフェラーゼ活性を、活性型Ｎｏｔｃｈを用いた場合のそれぞれの活性を１として示すグラフである。
【０１９４】
Ｈｅｓ１−ｌｕｃを用いた場合と比較して、Ｈｅｓ−Ｙ、Ｈｅｓ−ＹＰ ＮｅｏまたはＨｅｓ−ＹＰ Ｐｕｒｏを用いた場合は、蛍光強度（図８（ｂ）中ではＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ活性と記載する）が著しく改善し、特に、Ｈｅｓ−ＹＰ ＮｅｏまたはＨｅｓ−ＹＰ Ｐｕｒｏを用いた場合の蛍光強度は非常に高かった。このことから、ｐＧＬ２ベクターからｐＧＬ４ベクターに入れ替えることによって蛍光強度の顕著な増強が得られることがわかった。
【０１９５】
しかも、原理はわからないが、図８（ｃ）からわかるように、Ｈｅｓ−Ｙ、Ｈｅｓ−ＹＰ ＮｅｏまたはＨｅｓ−ＹＰ Ｐｕｒｏを用いた場合には、ネガティブコントロールを用いた場合の蛍光強度（すなわち、バックグラウンド）が顕著に低下した。これは驚くべき結果であった。このように、ＲＢＰ−Ｊκ結合配列を複数連結し、ＰＥＳＴ配列をもつルシフェラーゼレポータープラスミドに挿入した結果、感度が著しく上昇した。
【０１９６】
（実施例４．内因性Ｎｏｔｃｈシグナル伝達の阻害の測定）
培養細胞におけるトランジェント・アッセイを用い、Ｈｅｓ−ＹおよびＨｅｓ−ＹＰ Ｎｅｏが内因性のＮｏｔｃｈシグナル伝達の阻害を測定できるかどうか調べた。
【０１９７】
１０％ＦＣＳを含有するＤＭＥＭを用い、５％ＣＯ２、３７℃の条件下でＨｅＬａ細胞を培養した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ社）を用い、添付のプロトコールに従って、レポーターとしてＨｅｓ−ＹまたはＨｅｓ−ＹＰ Ｎｅｏと、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達系を活性化するための活性型ＮｏｔｃｈコンストラクトのＣＣ＞ＳＳ（Ｍｕｍｍ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ ５，１９７−２０６，２０００）とを導入した。
【０１９８】
ネガティブコントロールとして、ＣＣ＞ＳＳを導入せず、ｐｃＤＮＡ３．１ Ｈｙｇｒｏ（＋）ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を導入する実験も行った。
【０１９９】
リポフェクションを行ってから２４時間後、γ−セクレターゼ阻害剤であるＤＡＰＴを１０μＭ含むＤＭＥＭ培地を２５０μｌ添加し、３７℃にてインキュベートしながら０時間から２４時間後の蛍光強度を測定して、ＤＡＰＴのＮｏｔｃｈシグナル伝達系への影響を調べた。これらの実験を９６ウェルプレートを用いて行った。Ｈｅｓ−ＹおよびＨｅｓ−ＹＰ ｎｅｏを用いた場合の結果を図１０に示す。
【０２００】
この結果、活性型Ｎｏｔｃｈ１を共発現させた場合も共発現させなかった場合も、添加後の蛍光強度（図中ではＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ活性と示す）の低下が見られた。このことは、ＤＡＰＴによってＮｏｔｃｈシグナルの伝達が阻害されたことを示す。従って、活性型Ｎｏｔｃｈ１を共発現させなくても、ＤＡＰＴによる内因性のＮｏｔｃｈシグナルの阻害を測定できることがわかった。また、Ｈｅｓ−ＹおよびＨｅｓ−ＹＰ Ｎｅｏのいずれを用いた場合も、内因性のＮｏｔｃｈシグナルの阻害を測定できることがわかった。それゆえ、これらのプラスミドを用いれば、内因性のＮｏｔｃｈシグナル伝達系に影響を与える物質をスクリーニングすることができる。
【０２０１】
（実施例５．薬剤によるＨＥＫ２９３細胞の内因性Ｎｏｔｃｈシグナルの影響）
培養細胞におけるトランジェント・アッセイを用い、Ｈｅｓ−ＹＰ ｎｅｏを用いて、薬剤による内因性のＮｏｔｃｈシグナル伝達系への影響を調べた。
【０２０２】
１０％ＦＣＳを含有するＤＭＥＭを用い、５％ＣＯ２、３７℃の条件下でＨＥＫ２９３細胞を培養した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ社）を用い、添付のプロトコールに従って、レポーターとしてＨｅｓ−ＹＰ ｎｅｏを導入した。
【０２０３】
リポフェクションを行ってから２４時間後、Ａβ４２の産生もＮｏｔｃｈシグナル伝達系も抑制するγ−セクレターゼ阻害薬であるＤＡＰＴ（０．００１μＭ、０．００３μＭ，０．０１μＭ、０．０３μＭ、 ０．１ μＭ、０．３μＭ、１μＭ、３μＭまたは１０μＭ）またはＬ−６８５４５８（０．００３μＭ，０．０１μＭ、０．０３μＭ、 ０．１ μＭ、０．３μＭ、１μＭ、３μＭ、１０μＭ、または３０μＭ）、あるいはＡβ４２の産生を抑制するがＮｏｔｃｈシグナル伝達系を抑制しないγ−セクレターゼ阻害薬であるスリンダクスルフィド（Ｓｕｌｉｎｄａｃ ｓｕｌｆｉｄｅ）（０．８０μＭ、１．５７μＭ、３．１３μＭ、６．２５μＭ、１２．５μＭ、２５μＭ、５０μＭまたは１００μＭ）を各種濃度で添加して３７℃にて２４時間インキュベートした。
【０２０４】
添加から２４時間後の蛍光強度を測定して、各種薬剤のＮｏｔｃｈシグナル伝達系への影響を調べた。また、コントロールとして、各種薬剤を添加せず、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）を添加した場合の蛍光強度も測定した。ＤＡＰＴを１０μＭ添加した場合およびコントロールの結果を図１１（ａ）に示す。図１１（ａ）からわかるように、活性型Ｎｏｔｃｈを共発現させなくても蛍光強度の測定ができ、しかも、γ−セクレターゼ阻害薬による蛍光強度の減少を測定できる。このように、この系を用いれば、各種薬物が内因性のＮｏｔｃｈシグナルに対して与える影響を確認することができる。
【０２０５】
Ｈｅｓ−ＹＰ ｎｅｏコンストラクトを用い、各薬剤を添加した場合のルシフェラーゼ活性の蛍光強度を、図１１（ｂ）に示す。図１１（ｂ）においては、コントロールの蛍光強度を１００％としたときの相対強度を示す。この結果、γ−セクレターゼ阻害薬（ＤＡＰＴまたはＬ−６８５４５８）の添加により、内因性のＮｏｔｃｈシグナルが阻害され、阻害薬でなく修飾薬（スリンダクスルフィド）を用いた場合には内因性のＮｏｔｃｈシグナルは影響を受けないことが確認された。このことから、本発明により、各種薬物が内因性のＮｏｔｃｈシグナルに対して与える影響を正しく確認することができる。従って、本発明の方法を、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達系に影響を与えない物質のスクリーニングに用いることができること、特に、Ａβ４２産生を阻害するがＮｏｔｃｈシグナル伝達系に影響を与えない物質のスクリーニングに用いることができることがわかった。既存技術ではＮｏｔｃｈコンストラクトを人工的に共発現させて初めてシグナルの検知が可能であった。しかし本発明によればＮｏｔｃｈコンストラクトを発現させることなく内因性シグナルの検知が可能となった。また上記のように、本発明によれば、薬剤による内因性シグナルへの影響も検知することが可能である。
【０２０６】
（実施例６：各プロモーターでのＮｏｔｃｈシグナルアッセイ系パラメーターの挙動）
培養細胞におけるトランジェント・アッセイを用い、Ｈｅｓ１−ｌｕｃ ｘ２、Ｈｅｓ１−ｌｕｃ ｘ３、Ｈｅｓ−ＹおよびＨｅｓ−ＹＰ ＮｅｏのＮｏｔｃｈシグナルアッセイ系パラメーターであるＳ／ＢおよびＺ’ ｆａｃｔｏｒ（Ｊｉ−Ｈｕ Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｃｒｅｅｎ．５，６７−７３，１９９９）について調べた。比較のために、プラスミドＨｓｅ１−ｌｕｃを用いた。
【０２０７】
１０％ＦＣＳを含有するＤＭＥＭを用い、５％ＣＯ２、３７℃の条件下でＨｅＬａ細胞を培養した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ社）を用い、添付のプロトコールに従って、レポーターとしてＨｅｓ１−ｌｕｃ、Ｈｅｓ１−ｌｕｃ ｘ２、Ｈｅｓ１−ｌｕｃ ｘ３、Ｈｅｓ−ＹまたはＨｅｓ−ＹＰ Ｎｅｏと、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達系を活性化するための活性型ＮｏｔｃｈコンストラクトのＣＣ＞ＳＳ（Ｍｕｍｍ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ ５，１９７−２０６，２０００）とを導入した。
【０２０８】
リポフェクションを行ってから２４時間後、、ＤＡＰＴ濃度１０μＭのＤＭＥＭ培養液（ＤＭＳＯ濃度０．１％）および無添加のＤＭＥＭ培養液（ＤＭＳＯ濃度０．１％）を３７℃にて２４時間インキュベートした後、細胞を溶解し、Ｄｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いて、蛍光強度を測った。シグナルとしてＤＭＳＯのみ添加したもの、またバックグラウンドとしてＮｏｔｃｈシグナル伝達系を阻害するのに十分量のＤＡＰＴ（１０μＭ）を添加したものの蛍光強度を測った。本系においては９６ウェルプレートを用いた。得られた結果を図１２（ａ）〜図１２（ｅ）に示す。Ｈｅｓ−１コンストラクトを用い、ＤＡＰＴを１０μＭ添加した場合およびコントロールの結果を図１２（ａ）に示す。Ｈｅｓ−ＹＰ ｎｅｏコンストラクトを用い、ＤＡＰＴを１０μＭ添加した場合およびコントロールの結果を図１２（ｂ）に示す。Ｈｅｓ１−ｌｕｃｘ２コンストラクトを用い、ＤＡＰＴを１０μＭ添加した場合およびコントロールの結果を図１２（ｃ）に示す。Ｈｅｓ−１−ｌｕｃｘ３コンストラクトを用い、ＤＡＰＴを１０μＭ添加した場合およびコントロールの結果を図１２（ｄ）に示す。Ｈｅｓ−Ｙコンストラクトを用い、ＤＡＰＴを１０μＭ添加した場合およびコントロールの結果を図１２（ｅ）に示す。
【０２０９】
この結果、ＲＢＰ−Ｊκ結合配列の数が増加するにつれ、Ｓ／ＢおよびＺ’ ｆａｃｔｏｒも増加した。またＲＢＰ−Ｊ結合配列の数が増加するにつれ、Ｚ’ ｆａｃｔｏｒが理想値である１に近づいた。ＲＢＰ−Ｊκ結合配列の増加とともにルシフェラーゼ活性の増加が認められる。複数連結することにより、予想以上にバックグラウンドが下がりＺ’ｆａｃｔｏｒが飛躍的に向上した。既存技術では十分なＳ／Ｂ比および少ないばらつきが確保できず、Ｚ’ ｆａｃｔｏｒが０．５には程遠く、そのため、ＨＴＳ（ｈｉｇｈ ｔｈｒｏｕｇｈ−ｐｕｔ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ；ハイスループットスクリーニング）を行うことができなかった。しかし本発明によって十分なＳ／Ｂ比および少ないばらつきが確保でき、Ｚ’ ｆａｃｔｏｒが０．５以上になったことにより、ＨＴＳへの使用が可能である。これに伴い、本発明を薬剤がＮｏｔｃｈシグナルに及ぼす影響を正確に検討することができる。また、本発明では、ＨＴＳを構築する際にミニチュア化した場合においても、より精度の高いアッセイ系を構築することが可能である。
【０２１０】
また、Ｈｅｓ−ＹＰ ｎｅｏコンストラクトでの形質転換細胞については、各種薬剤の濃度の影響についても試験した。リポフェクションを行ってから２４時間後、γ−セクレターゼ阻害剤であるＤＡＰＴ（０．００１μＭ、０．００３μＭ，０．０１μＭ、０．０３μＭ、 ０．１ μＭ、０．３μＭ、１μＭ、３μＭまたは１０μＭ）またはＬ−６８５４５８（０．００３μＭ，０．０１μＭ、０．０３μＭ、０．１μＭ、０．３μＭ、１μＭ、３μＭ、１０μＭ、または３０μＭ）、あるいはγ−セクレターゼ修飾薬であるスリンダクスルフィド（Ｓｕｌｉｎｄａｃ ｓｕｌｆｉｄｅ）（０．８０μＭ、１．５７μＭ、３．１３μＭ、６．２５μＭ、１２．５μＭ、２５μＭ、５０μＭまたは１００μＭ）を各種濃度で添加し、添加から２４時間後の蛍光強度を測定して、各種薬剤のＮｏｔｃｈシグナル伝達系への影響を調べた。また、コントロールとして、各種薬剤を添加しない場合の蛍光強度も測定した。Ｈｅｓ−ＹＰ ｎｅｏコンストラクトを用い、各薬剤を添加した場合の結果を図１２（ｆ）に示す。図１２（ｆ）においては、コントロールの蛍光強度を１００％としたときの相対強度を示す。
【０２１１】
この結果、本発明のコンストラクトを用いることにより、γ−セクレターゼ阻害剤の添加により、内因性のＮｏｔｃｈシグナルが阻害され、阻害剤でない薬剤を用いた場合には内因性のＮｏｔｃｈシグナルは影響を受けないことが確認された。本発明のコンストラクトを用いれば、高感度に高い精度でＮｏｔｃｈシグナル伝達系に対する物質の影響を確認することができる。
【０２１２】
（実施例７：Ｎｏｔｃｈシグナル伝達系に実質的に影響を与えない物質のスクリーニング）
培養細胞におけるトランジェント・アッセイを用い、Ｈｅｓ−ＹＰ ｎｅｏまたはＨｅｓ−ＹＰ ｐｕｒｏを用いて、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達系に実質的に影響を与えない物質をスクリーニングする。
【０２１３】
１０％ＦＣＳを含有するＤＭＥＭを用い、５％ＣＯ２、３７℃の条件下でＨｅＬａ細胞を培養する。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ社）を用い、添付のプロトコールに従って、レポーターとしてＨｅｓ−ＹＰ ｎｅｏまたはＨｅｓ−ＹＰ ｐｕｒｏと、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達系を活性化するために、活性型ＮｏｔｃｈコンストラクトのＣＣ＞ＳＳ（Ｍｕｍｍ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ ５，１９７−２０６，２０００）とを導入する。
【０２１４】
リポフェクションを行ってから２４時間後、候補物質またはγ−セクレターゼ阻害剤であるＤＡＰＴ（コントロール）を含むＤＭＳＯ溶液を添加するか、あるいはＤＭＳＯを添加する。添加の２４時間後に細胞を溶解し、Ｄｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いて、蛍光強度を測定して、ＤＡＰＴのＮｏｔｃｈシグナル伝達系への影響を調べる。Ｈｅｓ−ＹＰ ｎｅｏまたはＨｅｓ−ＹＰ ｐｕｒｏとＣＣ＞ＳＳとを共発現する細胞に水を添加した場合の蛍光強度を１００％として、Ｈｅｓ−ＹＰ ｎｅｏまたはＨｅｓ−ＹＰ ｐｕｒｏとＣＣ＞ＳＳとを共発現する細胞に候補物質を添加した場合の蛍光強度が９０〜１１０％となる候補物質を選択する。このようにして、蛍光強度が実質的に変化しない候補物質が選択される。
【０２１５】
（実施例８：Ａβ４２産生を抑制するγ−セクレターゼ阻害薬候補物質から、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達系を抑制しないγ−セクレターゼ阻害薬を選択するためのスクリーニング）
培養細胞におけるトランジェント・アッセイを用い、Ｈｅｓ−ＹＰ ｎｅｏまたはＨｅｓ−ＹＰ ｐｕｒｏを用いて、γ−セクレターゼ阻害薬候補物質から、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達系を抑制しないγ−セクレターゼ阻害薬をスクリーニングする。
【０２１６】
１０％ＦＣＳを含有するＤＭＥＭを用い、５％ＣＯ２、３７℃の条件下でＨｅＬａ細胞を培養する。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ社）を用い、添付のプロトコールに従って、レポーターとしてＨｅｓ−ＹＰ ｎｅｏまたはＨｅｓ−ＹＰ ｐｕｒｏと、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達系を活性化するために、活性型ＮｏｔｃｈコンストラクトのＣＣ＞ＳＳ（Ｍｕｍｍ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ ５，１９７−２０６，２０００）とを導入する。
【０２１７】
リポフェクションを行ってから２４時間後、γ−セクレターゼ阻害薬候補物質またはγ−セクレターゼ阻害薬であるＤＡＰＴ（コントロール）を含むＤＭＳＯ溶液を添加するか、あるいはＤＭＳＯを添加する。２４時間後に細胞を溶解し、Ｄｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いて、蛍光強度を測定して、ＤＡＰＴのＮｏｔｃｈシグナル伝達系への影響を調べる。候補物質としてγ−セクレターゼ阻害薬候補物質を使用する。これらの候補物質は基質ＡＰＰ（アミロイド前駆体タンパク質）を安定発現させたＨＥＫ細胞においてＡβ４２の産生を抑制する化合物群である。
【０２１８】
Ｈｅｓ−ＹＰ ｎｅｏまたはＨｅｓ−ＹＰ ｐｕｒｏとＣＣ＞ＳＳとを共発現する細胞にＤＭＳＯを添加した場合の蛍光強度を１００％として、Ｈｅｓ−ＹＰ ｎｅｏまたはＨｅｓ−ＹＰ ｐｕｒｏとＣＣ＞ＳＳとを共発現する細胞に候補物質を添加した場合の蛍光強度が９０〜１１０％となる候補物質を選択する。このようにして、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達系を抑制しない候補物質が選択される。
【０２１９】
このようにして、Ａβ４２産生を抑制するγ−セクレターゼ阻害薬候補物質から、Ａβ４２産生を抑制し、かつＮｏｔｃｈシグナル伝達系を抑制しないγ−セクレターゼ阻害薬が選択される。
【０２２０】
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、この実施形態に限定して解釈されるべきものではない。本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。当業者は、本発明の具体的な好ましい実施形態の記載から、本発明の記載および技術常識に基づいて等価な範囲を実施することができることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。
【産業上の利用可能性】
【０２２１】
本発明の核酸分子およびスクリーニング方法は、種々の用途に応用できる。例えば、アルツハイマー病治療薬候補であるγ−セクレターゼ阻害修飾薬の副作用の検討（例えば、ハイスループットスクリーニング時）、およびＮｏｔｃｈシグナル伝達阻害型抗がん剤の主作用の検討（ハイスループットスクリーニング時）に利用できる。
【図面の簡単な説明】
【０２２２】
【図１】図１は、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達系の模式図を示す。
【図２】図２は、ヒトＮＯＴＣＨ１の模式図を示す。
【図３】図３は、γ−セクレターゼ阻害薬によるＮｏｔｃｈシグナル伝達の阻害の模式図を示す。
【図４】図４は、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達系の活性化を検知するための既存の技術の模式図を示す。
【図５】図５は、ΔＳＮ１のアミノ酸配列におけるシグナル配列、Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４サイトの位置を示す図である。
【図６】図６（ａ）は、Ｚ’ｆａｃｔｏｒの計算式およびその概念図を示す。図６（ｂ）は、Ｓ／Ｂ＝１０でかつＺ’＝０．４の場合のデータ例を示す。図６（ｃ）は、Ｓ／Ｂ＝２でかつＺ’＝０．８の場合のデータ例を示す。
【図７】図７（ａ）は、今回作製したＮｏｔｃｈレポーターアッセイ用のコンストラクトおよび従来公知のコンストラクトの模式図である。図７（ｂ）は、これらのＮｏｔｃｈレポーターアッセイ用コンストラクトと、活性型ＮｏｔｃｈまたはネガティブコントロールであるｐｃＤＮＡ３．１ Ｈｙｇｒｏ（＋）ベクターとを共発現した時のルシフェラーゼ活性を示すグラフである。
【図８】図８（ａ）は、Ｈｅｓ−ＹおよびＨｅｓ−ＹにさらにＰＥＳＴ配列を導入したＮｏｔｃｈレポーターアッセイ用のコンストラクトの模式図である。図８（ｂ）は、これらのＮｏｔｃｈレポーターアッセイ用コンストラクトと、活性型Ｎｏｔｃｈとを共発現した時のルシフェラーゼ活性を示すグラフである。図８（ｃ）は、これらのＮｏｔｃｈレポーターアッセイ用コンストラクトと、活性型Ｎｏｔｃｈとを共発現した時のルシフェラーゼ活性を、活性型Ｎｏｔｃｈを用いた場合のそれぞれの活性を１として示すグラフである。図８（ｂ）および図８（ｃ）において、ＣＣ＞ＳＳは、活性型Ｎｏｔｃｈを示す。ｐｃＤＮＡは、コントロールである空のプラスミドを示す。
【図９】図９は、ＴＰ−Ｙの２４個のＲＢＰ−Ｊκ配列を含む領域とｐＵＣ１８ベクター、ウサギβ−グロビン最小プロモーターおよびルシフェラーゼ遺伝子との連結部の配列を示す。
【図１０】図１０は、本発明のＮｏｔｃｈレポーターアッセイ用コンストラクトを、活性型Ｎｏｔｃｈとともに共発現させた場合またはコントロールのｐｃＤＮＡとともに共発現させた場合のルシフェラーゼ活性を添加から０〜２４時間にわたって示すグラフである。Ｈｅｓ−ＹとｐｃＤＮＡとを共発現させ、ＤＡＰＴを添加時のルシフェラーゼ活性を１として示すグラフである。
【図１１】図１１（ａ）は、コントロール（ｃｏｎｔｒｏｌ）またはＤＡＰＴ １０μＭでのルシフェラーゼ活性を示す棒グラフである。図１１（ｂ）は、薬剤によるＨＥＫ２９３細胞の内因性Ｎｏｔｃｈシグナルの影響を示すグラフである。
【図１２】図１２（ａ）は、Ｈｅｓ−１コンストラクトを、ＤＡＰＴを添加したかまたは添加しなかった（ＤＭＳＯのみ）場合のルシフェラーゼ活性を示す棒グラフである。このときのＳ／Ｂ比は１．３９であり、Ｚ’ｆａｃｔｏｒは０．３３である。図１２（ｂ）は、Ｈｅｓ−ＹＰ ｎｅｏコンストラクトを、ＤＡＰＴを添加したかまたは添加しなかった（ＤＭＳＯのみ）場合のルシフェラーゼ活性を示す棒グラフである。このときのＳ／Ｂ比は９．９８であり、Ｚ’ｆａｃｔｏｒは０．７２である。図１２（ｃ）は、Ｈｅｓ−Ｙコンストラクトを、ＤＡＰＴを添加したかまたは添加しなかった（ＤＭＳＯのみ）場合のルシフェラーゼ活性を示す棒グラフである。このときのＳ／Ｂ比は８．４６であり、Ｚ’ｆａｃｔｏｒは０．６０である。図１２（ｄ）は、Ｈｅｓ１−ｌｕｃｘ２コンストラクトを、ＤＡＰＴを添加したかまたは添加しなかった（ＤＭＳＯのみ）場合のルシフェラーゼ活性を示す棒グラフである。このときのＳ／Ｂ比は３．７１であり、Ｚ’ｆａｃｔｏｒは０．５０である。図１２（ｅ）は、Ｈｅｓ１−ｌｕｃｘ３コンストラクトを、ＤＡＰＴを添加したかまたは添加しなかった（ＤＭＳＯのみ）場合のルシフェラーゼ活性を示す棒グラフである。このときのＳ／Ｂ比は７．２２であり、Ｚ’ｆａｃｔｏｒは０．５４である。図１２（ｆ）は、各薬剤（ＤＡＰＴ、Ｌ−６８５４５８またはスリンダクスルフィド）による活性型Ｎｏｔｃｈを共発現したときのＮｏｔｃｈシグナルの阻害曲線を示すグラフである。
【図１３】図１３（ａ）は、Ｈｅｓ−Ｙ、Ｈｅｓ−ＹＰ ＮｅｏおよびＨｅｓ−ＹＰ Ｐｕｒｏのコンストラクトの模式図を示す。図１３（ｂ）は、Ｈｅｓ−ＹＰ，Ｈｅｓ−ＹＰ ＮｅｏおよびＨｅｓ−ＹＰ Ｐｕｒｏにおいて用いた、８個のＲＢＰ−Ｊκ配列を含む領域とベクターおよびプロモーターとの連結部の配列を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、少なくとも３つのＲＢＰ−Ｊκ結合配列を含む核酸分子およびその利用に関する。本発明は特に、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達系を調節する物質のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達系は、発生および分化、さらには癌化および神経変性に関連する、多細胞生物にとって極めて重要な情報伝達系のひとつである。Ｎｏｔｃｈシグナル伝達系の模式図を図１に示す。Ｎｏｔｃｈシグナル伝達系の一翼を担うＮｏｔｃｈタンパク質は、細胞膜を貫通するレセプターである。Ｎｏｔｃｈタンパク質は、Ｎｏｔｃｈタンパク質に対するリガンドであるデルタタンパク質、リガンド結合性の制御因子等により活性化され、ＡＤＡＭ、ＴＡＣＥなどによって細胞外ドメインが切断され（Ｓ２切断）、次に膜貫通ドメインのＣ末端側において、γ−セクレターゼ（γ−ｓｅｃｒｅｔａｓｅ）によりプロセッシングを受けて（Ｓ３切断）、細胞内ドメイン（ＮＩＣＤ）が遊離し、核内に移行すると考えられている（図１）。そして、核内に移行した細胞内ドメインが標的遺伝子の転写活性化に寄与することにより、細胞外から細胞核へのシグナル伝達が行われるものと考えられている。Ｎｏｔｃｈシグナルの異常活性化は癌化へと繋がる一方で、阻害は細胞の発生および分化に影響を与える。このように、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達系は、シグナル異常活性化による癌化（例えば、急性白血病）、アルツハイマー病治療を目的とした薬物（例えば、γ−セクレターゼ阻害薬）のシグナル阻害による副作用の懸念などに関連すると考えられている。
【０００３】
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達系は、様々な点から重要である。特に、疾患との関連から重要である。第一に、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達系が異常活性化されると、急性白血病などの癌化が生じる。例えば、Ｔ細胞性急性リンパ芽球性白血病（Ｔ−ＡＬＬ）患者の５０％超には、ＮＯＴＣＨ１の異所性活性化がみられる（非特許文献１、図２）。他の癌についてもシグナル異常活性化と関連があることから、Ｎｏｔｃｈシグナルと癌とは密接な関係性があるといえる。
【０００４】
第二に、アルツハイマー病治療を目的とした薬物による副作用の懸念をぬぐうという観点で重要である。現在、アルツハイマー病治療薬として、Ａβ４２の産生抑制を目的とした阻害薬が開発されている。Ａβ４２は、病態進行に密接に関連すると考えられているペプチドである。Ａβ４２はＡβ４０とともに、膜貫通タンパク質であるアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）からβセクレターゼによって切断され、そして膜貫通領域でγ−セクレターゼにより切断され産生される。そのため治療薬として開発されつつあるものは、主にβ，γ−セクレターゼ阻害薬あるいはＡβ４２産生抑制薬となっている。しかし、この戦略には大きな問題点が内在している。γ−セクレターゼは、細胞の分化に必須のＮｏｔｃｈも切断する。γ−セクレターゼ阻害薬によるＮｏｔｃｈシグナル伝達の阻害の模式図を図３に示す。γ−セクレターゼを阻害すると、Ｎｏｔｃｈの切断も阻害される。そのため、γ−セクレターゼ阻害薬には副作用の懸念があることが容易に考えられる。この懸念は、実際に、成熟マウスにγ−セクレターゼ阻害薬を投与するとリンパ球の分化が阻害されることからも裏付けられている（非特許文献２）。また、Ａβ４２産生抑制薬に関しても、間接的にＮｏｔｃｈシグナル伝達を阻害することが懸念される。したがって、現在、これらの問題を克服したγ−セクレターゼ阻害薬あるいはＡβ４２産生阻害薬の開発の戦略として、Ａβ産生の抑制効果は維持したままＮｏｔｃｈシグナル伝達系を抑制しない薬剤が期待されている。
【０００５】
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達系の活性化を検知するために、いくつかの実験が行われている。例えば、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達系が活性化すると、最終的に、核内でＨｅｓ−１遺伝子の活性化が起きるため、Ｎｏｔｃｈシグナルの活性化の指標としてＨＥＳ−１プロモーター（ＲＢＰ−Ｊκ結合配列をもつ）の活性化を利用し、Ｎｏｔｃｈシグナルの活性化に従ってＨＥＳ−１プロモーターの制御下でルシフェラーゼを発現させることでＮｏｔｃｈシグナル伝達系の活性化が検知可能である（図４および非特許文献３）。
【０００６】
このように、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達を測定するためには、２つのＲＢＰ−Ｊκ結合配列を上流に持ったルシフェラーゼレポーターが使用されてきた。しかし、それらの感度は悪く、培養細胞を用いても例えば内因性のＮｏｔｃｈによるシグナル伝達は測定できなかった。
【０００７】
例えば、特許文献１は、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達系が活性化された細胞を検知するＮｏｔｃｈシグナル伝達系活性化検知方法を記載する。この文献の方法は、野生型Ｈｅｓ−１遺伝子プロモーター配列および変異Ｈｅｓ−１遺伝子プロモーター配列を利用する。野生型Ｈｅｓ−１遺伝子プロモーター配列は２つのＲＢＰ−Ｊκ結合配列を含む。しかし、特許文献１に記載された方法を用いても、検出感度が低く、バックグラウンドが大きいために正確なスクリーニングは困難であり、そのため、ハイスループットスクリーニングに利用することができなかった。また、特許文献１に記載の方法では、検出感度を上げるためにＮｏｔｃｈシグナル伝達系を構成的に活性化する必要があり、そのため、内因性のＮｏｔｃｈシグナル伝達系を測定することはできなかった。
【０００８】
非特許文献４は、ＲＢＰ−Ｊκに関連する転写因子であるＲＢＰ−Ｌを記載する。この文献では、ＲＢＰ−Ｌが転写に対して及ぼす影響を調べるためにレポータープラスミドｐＧａ９８１−６を使用している。このプラスミドはエプスタインバーウイルスのＴＰ１プロモーター由来の１２コピーのＲＢＰ−Ｊ／−Ｌ結合部位を含む。しかし、このプラスミドの検出感度は低く、バックグラウンドが大きく、ばらつきが大きいために正確なスクリーニングは困難であり、そのため、ハイスループットスクリーニングに利用することができなかった。また、この方法では検出感度を上げるためにＮｏｔｃｈシグナル伝達系を構成的に活性化する必要があり、そのため、内因性のＮｏｔｃｈシグナル伝達系を測定することはできなかった。
【０００９】
このように、検出感度が高く、正確なスクリーニングが可能なスクリーニング系を提供することが望まれていた。内因性のＮｏｔｃｈシグナル伝達系を測定し得るスクリーニング系を提供することもまた望まれていた。
【特許文献１】特開２００６−１０９７１７号公報
【非特許文献１】Ｗｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，”Ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｏｆ ＮＯＴＣＨ１ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｔ Ｃｅｌｌ Ａｃｕｔｅ Ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ Ｌｅｕｋｅｍｉａ”，Ｖｏｌ．３０６，２００４，２６９−２７１
【非特許文献２】Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２７９，Ｉｓｓｕｅ １３，１２８７６−１２８８２，Ｍａｒｃｈ ２６，２００４
【非特許文献３】Ｓｏｐｈｉｅ Ｊａｒｒｉａｕｌｔ ｅｔ ａｌ．，"Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ ｏｆ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｎｏｔｃｈ”，Ｎａｔｕｒｅ ３７７，１９９５，３５５−８
【非特許文献４】Ｍｉｎｏｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，”ＲＢＰ−Ｌ， ａ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ ＲＢＰ−Ｊｋ”， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｍａｙ １９９７， ｐ．２６７９−２６８７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、上記問題点の解決を意図するものであり、検出感度が高く、正確なスクリーニングが可能なスクリーニング系を提供すること、および内因性のＮｏｔｃｈシグナル伝達系を測定し得るスクリーニング系を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、少なくとも３つのＲＢＰ−Ｊκ結合配列を用いることにより、検出感度、Ｚ’ ｆａｃｔｏｒおよびＳ／Ｎ比の顕著な改善が得られることを見出し、これに基づいて本発明を完成させた。
【００１２】
本発明者らは特に、既存のコンストラクトに大幅な改変を加えることにより、検出感度を数百倍、Ｓ／Ｎ比を数十倍改善させることができた。このため、培養細胞の内因性のＮｏｔｃｈシグナル伝達を測定できるレベルの高感度を持つコンストラクトを得ることができた。
【００１３】
従来、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達を測定するためには、ＲＢＰ−Ｊκ結合配列を上流に持ったルシフェラーゼレポーターが使用されてきた。今回本発明者らは、既存のコンストラクトの「２つのＲＢＰ−Ｊκ結合配列を含む部分の配列の変異を訂正しかつその配列を２〜４つタンデムにつなげてルシフェラーゼレポーターの上流に配置した」コンストラクトを作成した。さらにその新規ＲＢＰ−Ｊκ結合配列部分を発現効率の高いルシフェラーゼレポータープラスミドに挿入した。そしてその性質について検討したところ感度が数百倍、Ｓ／Ｎ比を数十倍改善していた。さらに、このコンストラクトを用いることにより、０．５０以上のＺ’ ｆａｃｔｏｒが得られることがわかった。
【００１４】
本発明によれば、既存のＨＥＳ−１プロモーターに大幅な改変を加えることによって従来と比べ高感度にＮｏｔｃｈシグナル伝達系を検知することが可能となった。例えば、２つのＲＢＰ−Ｊκ結合配列を含む部分の配列を２〜４つタンデムにつなげてルシフェラーゼレポーターの上流に配置したコンストラクトを作成した。その結果、結合配列の増加とともにルシフェラーゼ活性の増加が認められた。
【００１５】
さらにその新規ＲＢＰ−Ｊκ結合配列部分を発現効率の高く又ＰＥＳＴ配列を持つルシフェラーゼレポータープラスミドに挿入した。そしてその性質について検討したところ感度が数百倍、Ｓ／Ｎ比を数十倍改善していた。また、このコンストラクトを用いることによっても、０．５０以上のＺ’ ｆａｃｔｏｒが得られることがわかった。
【００１６】
上記目的を達成するために、本発明は、例えば、以下の手段を提供する：
（項目１）
少なくとも３つのＲＢＰ−Ｊκ結合配列を含む核酸分子であって、該ＲＢＰ−Ｊκ結合配列が、ＴＧＧＧＡＡである、核酸分子。
【００１７】
（項目２）
前記少なくとも３つのＲＢＰ−Ｊκ結合配列のそれぞれが、５塩基〜４０塩基の塩基配列によりタンデムに連結されている、項目１に記載の核酸分子。
【００１８】
（項目３）
配列番号１の配列を少なくとも２つ含む、項目１または２に記載の核酸分子。
【００１９】
（項目４）
配列番号２の配列を少なくとも２つ含む、項目１〜３のいずれか１項に記載の核酸分子。
【００２０】
（項目５）
配列番号３の配列を含む、項目１〜４のいずれか１項に記載の核酸分子。
【００２１】
（項目６）
配列番号４の配列を含む、項目１〜５のいずれか１項に記載の核酸分子。
【００２２】
（項目７）
配列番号５の配列を含む、項目１〜６のいずれか１項に記載の核酸分子。
【００２３】
（項目８）
配列番号６の配列を含む、項目１〜７のいずれか１項に記載の核酸分子。
【００２４】
（項目９）
前記少なくとも３つのＲＢＰ−Ｊκ結合配列と作動可能に連結されたプロモーター配列をさらに含む、項目１〜８のいずれか１項に記載の核酸分子。
【００２５】
（項目１０）
前記プロモーター配列と作動可能に連結されたレポータータンパク質コード配列をさらに含む、項目９に記載の核酸分子。
【００２６】
（項目１１）
前記レポータータンパク質コード配列が、発光タンパク質または蛍光タンパク質をコードする、項目１０に記載の核酸分子。
【００２７】
（項目１２）
前記レポータータンパク質コード配列の下流にＰＥＳＴ配列コード配列が連結されている、項目１０または１１に記載の核酸分子。
【００２８】
（項目１３）
直鎖状分子またはプラスミドである、項目１〜１２のいずれか１項に記載の核酸分子。
【００２９】
（項目１４）
（ａ）プロモーター配列と作動可能に連結された構成的に活性なＮｏｔｃｈタンパク質をコードする配列を含む核酸分子とともに細胞内に導入して発現させた場合の前記レポータータンパク質の発現量と、（ｂ）該Ｎｏｔｃｈタンパク質コード配列を含まない核酸分子とともに細胞内に導入して発現させた場合の該レポータータンパク質の発現量とを比較したときの、Ｚ’ ｆａｃｔｏｒ値が０．５以上である、項目１０〜１２のいずれか１項に記載の核酸分子。
【００３０】
（項目１５）
項目１〜１４のいずれか１項に記載の核酸分子を含む、細胞。
【００３１】
（項目１６）
前記核酸分子が、前記プロモーター配列と作動可能に連結されたレポータータンパク質コード配列をさらに含む、項目１５に記載の細胞。
【００３２】
（項目１７）
内因性のＮｏｔｃｈタンパク質または構成的に活性なＮｏｔｃｈタンパク質を発現する、項目１６に記載の細胞。
【００３３】
（項目１８）
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達系を調節する物質のスクリーニング方法であって、該方法は、
（ａ）項目１７に記載の細胞と候補物質とを接触させる工程；および
（ｂ）該細胞中での該レポータータンパク質の発現量を測定する工程
を包含する、方法。
【００３４】
（項目１９）
γ−セクレターゼ阻害薬候補物質から、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達系を抑制しないγ−セクレターゼ阻害薬を選択するためのスクリーニング方法であって、該方法は、
（ａ）項目１７に記載の細胞と該候補物質とを接触させる工程；および
（ｂ）該細胞中での該レポータータンパク質の発現量を測定する工程
を包含する、方法。
【００３５】
（項目２０）
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達系を調節する物質のスクリーニング方法であって、該方法は、
（ａ）項目１７に記載の細胞中での前記レポータータンパク質の発現量を測定する工程；
（ｂ）該細胞と候補物質とを接触させる工程；
（ｃ）該細胞中での該レポータータンパク質の発現量を測定する工程；および
（ｄ）工程（ｃ）での該レポータータンパク質の発現量が工程（ａ）での該レポータータンパク質の発現量よりも増加したかまたは減少した場合、該候補物質をＮｏｔｃｈシグナル伝達系を調節する物質として選択する工程
を包含する、方法。
【００３６】
（項目２１）
工程（ｃ）での該レポータータンパク質の発現量が工程（ａ）での該レポータータンパク質の発現量よりも増加し、前記候補物質をＮｏｔｃｈシグナル伝達系の活性化剤として選択する、項目２０に記載の方法。
【００３７】
（項目２２）
工程（ｃ）での該レポータータンパク質の発現量が工程（ａ）での該レポータータンパク質の発現量よりも減少し、前記候補物質をＮｏｔｃｈシグナル伝達系の抑制剤として選択する、項目２０に記載の方法。
【００３８】
（項目２３）
γ−セクレターゼ阻害薬候補物質から、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達系を抑制しないγ−セクレターゼ阻害薬を選択するためのスクリーニング方法であって、該方法は、
（ａ）項目１７に記載の細胞中での前記レポータータンパク質の発現量を測定する工程；
（ｂ）該細胞と候補物質とを接触させる工程；
（ｃ）該細胞中での該レポータータンパク質の発現量を測定する工程；および
（ｄ）工程（ｃ）での該レポータータンパク質の発現量が工程（ａ）での該レポータータンパク質の発現量と実質的に同じである場合、該候補物質をＮｏｔｃｈシグナル伝達系を抑制しないγ−セクレターゼ阻害薬として選択する工程
を包含する、方法。
【００３９】
（項目２４）
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達系を調節する物質のスクリーニング方法において使用するためのキットであって、
項目１７に記載の細胞；および
前記レポータータンパク質の発現量を測定するための試薬
を備える、キット。
【００４０】
（項目２５）
γ−セクレターゼ阻害薬候補物質から、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達系を抑制しないγ−セクレターゼ阻害薬を選択するためのスクリーニング方法において使用するためのキットであって、
項目１７に記載の細胞；および
前記レポータータンパク質の発現量を測定するための試薬
を備える、キット。
【００４１】
（項目２６）
内因性のＮｏｔｃｈシグナルの調節を測定するための組成物であって、該組成物は、少なくとも３つのＲＢＰ−Ｊκ結合配列を含む核酸分子を含み、該ＲＢＰ−Ｊκ結合配列が、ＴＧＧＧＡＡである、組成物。
【００４２】
（項目２７）
前記少なくとも３つのＲＢＰ−Ｊκ結合配列のそれぞれが、５塩基〜４０塩基の塩基配列によりタンデムに連結されている、項目２６に記載の組成物。
【００４３】
（項目２８）
前記核酸分子が、配列番号１の配列を少なくとも２つ含む、項目２６または２７に記載の組成物。
【００４４】
（項目２９）
前記核酸分子が、配列番号２の配列を少なくとも２つ含む、項目２６〜２８のいずれか１項に記載の組成物。
【００４５】
（項目３０）
前記核酸分子が、配列番号３の配列を含む、項目２６〜２９のいずれか１項に記載の組成物。
【００４６】
（項目３１）
前記核酸分子が、配列番号４の配列を含む、項目２６〜３０のいずれか１項に記載の組成物。
【００４７】
（項目３２）
前記核酸分子が、配列番号５の配列を含む、項目２６〜３１のいずれか１項に記載の組成物。
【００４８】
（項目３３）
前記核酸分子が、配列番号６の配列を含む、項目２６〜３２のいずれか１項に記載の組成物。
【００４９】
（項目３４）
前記核酸分子が、前記少なくとも３つのＲＢＰ−Ｊκ結合配列と作動可能に連結されたプロモーター配列をさらに含む、項目２６〜３３のいずれか１項に記載の組成物。
【００５０】
（項目３５）
前記核酸分子が、前記プロモーター配列と作動可能に連結されたレポーター遺伝子配列をさらに含む、項目３４に記載の組成物。
【００５１】
（項目３６）
前記レポータータンパク質コード配列が、発光タンパク質または蛍光タンパク質をコードする、項目３５に記載の組成物。
【００５２】
（項目３７）
前記レポータータンパク質コード配列の下流にＰＥＳＴ配列コード配列が連結されている、項目３５または３６に記載の組成物。
【００５３】
（項目３８）
前記核酸分子が、直鎖状分子またはプラスミドである、項目２６〜３７のいずれか１項に記載の組成物。
【００５４】
（項目３９）
（ａ）前記核酸分子を、プロモーター配列と作動可能に連結された構成的に活性なＮｏｔｃｈタンパク質をコードする配列を含む核酸分子とともに細胞内に導入して発現させた場合の前記レポータータンパク質の発現量と、（ｂ）該核酸分子を、該Ｎｏｔｃｈタンパク質コード配列を含まない核酸分子とともに細胞内に導入して発現させた場合の該レポータータンパク質の発現量とを比較したときの、Ｚ’ ｆａｃｔｏｒ値が０．５以上である、項目３５〜３７のいずれか１項に記載の組成物。
【００５５】
（項目４０）
Ａβ４２の産生を抑制するアルツハイマー病治療薬候補物質から、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達系を抑制しないアルツハイマー病治療薬を選択するためのスクリーニング方法であって、該方法は、
（ａ）項目１７に記載の細胞と該候補物質とを接触させる工程；および
（ｂ）該細胞中での該レポータータンパク質の発現量を測定する工程
を包含する、方法。
【発明の効果】
【００５６】
高感度にＮｏｔｃｈシグナル伝達を測定できるレポーターコンストラクトは業界で待望されていたものであり、今までその感度の低さのために多くの現象を可視化することができなかったがその点で大きな改善が認められると考えられる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５７】
以下、本発明を詳細に説明する。本明細書の全体にわたり、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。
【００５８】
（１．少なくとも３つのＲＢＰ−Ｊκ結合配列を含む核酸分子）
本発明の核酸分子は、少なくとも３つのＲＢＰ−Ｊκ結合配列を含む。本明細書中では、用語「ＲＢＰ−Ｊκ結合配列」とは、配列ＴＧＧＧＡＡをいう。本発明の核酸分子は、少なくとも３つのＲＢＰ−Ｊκ結合配列を含むことにより、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達系のシグナルの検出が従来よりも優れた感度で行われ得る。本発明の核酸分子に含まれるＲＢＰ−Ｊκ結合配列の数は、少なくとも３個であれば任意の数であり得る。本発明の核酸分子は、例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、またはそれより多くのＲＢＰ−Ｊκ結合配列を含み得る。本発明の核酸分子に含まれるＲＢＰ−Ｊκ結合配列の数に特に上限はない。例えば、本発明の核酸分子に含まれるＲＢＰ−Ｊκ結合配列の数は、１００個以下、９０個以下、８０個以下、７０個以下、６０個以下、５０個以下、４０個以下、３０個以下、２０個以下、１５個以下、１０個以下などであり得る。特定の実施形態では、本発明の核酸分子に含まれるＲＢＰ−Ｊκ結合配列の数は、偶数個であることが好ましい。
【００５９】
本発明の核酸分子において、ＲＢＰ−Ｊκ結合配列のそれぞれは、核酸分子中に広くちらばって存在することも可能であるが、好ましくは比較的狭い範囲においてタンデムに連結されている。ＲＢＰ−Ｊκ結合配列間にはある程度の長さの配列が挿入されていることが好ましい。ＲＢＰ−Ｊκ結合配列間の配列は任意の配列であり得る。ＲＢＰ−Ｊκ結合配列間の配列の長さは当業者によって任意に決定され得る。ＲＢＰ−Ｊκ結合配列間の配列の長さは好ましくは５塩基以上であり、より好ましくは６塩基以上であり、さらに好ましくは７塩基以上であり、最も好ましくは８塩基以上である。ＲＢＰ−Ｊκ結合配列間の配列の長さは好ましくは４０塩基以下であり、より好ましくは３５塩基以下であり、さらに好ましくは３０塩基以下であり、特に好ましくは２５塩基以下であり、最も好ましくは２０塩基以下である。好ましい実施形態では、少なくとも３つのＲＢＰ−Ｊκ結合配列のそれぞれが、５塩基〜４０塩基の塩基配列によりタンデムに連結されている。
【００６０】
本発明の核酸分子は、好ましくは、配列番号１の配列を少なくとも２つ含む。ここで、配列番号１の配列は、ＴＧＧＧＡＡＸｎＴＧＧＧＡＡであり、ここで、ＸはＡ、Ｔ、ＧまたはＣを表し、ｎは５〜４０を表す。配列番号１の配列は、ＲＢＰ−Ｊκ結合配列を２つ含む。ｎは好ましくは６以上の整数であり、さらに好ましくは７以上の整数であり、最も好ましくは８以上の整数である。ｎは好ましくは４０塩基以下の整数であり、より好ましくは３５以下の整数であり、さらに好ましくは３０以下の整数であり、特に好ましくは２５以下の整数であり、最も好ましくは２０以下の整数である。配列番号１の配列を１単位として含むことにより、奇数個のＲＢＰ−Ｊκ結合配列を含む場合よりもさらに優れた結果が得られる。
【００６１】
本発明の核酸分子は、好ましくは、配列番号２の配列を少なくとも２つ含む。配列番号２の配列は、天然のＨｅｓ−１プロモーターに含まれる配列であり、２つのＲＢＰ−Ｊκ結合配列を含む。
【００６２】
本発明の核酸分子は、好ましくは、配列番号３の配列を含む。配列番号３の配列は、配列番号２の配列を２つタンデムに連結した配列である。
【００６３】
本発明の核酸分子は、好ましくは、配列番号４の配列を含む。配列番号４の配列は、配列番号２の配列を３つタンデムに連結した配列である。
【００６４】
本発明の核酸分子は、好ましくは、配列番号５の配列を含む。配列番号５の配列は、配列番号２の配列を４つタンデムに連結した配列である。
【００６５】
本明細書においては配列番号２の配列を２〜４個タンデムに連結した配列を例示として記載したが、もちろん、連結する数に制限はない。例えば、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、４０、５０個などの任意の数で連結することができる。
【００６６】
配列番号３〜５は、同じ配列をタンデムに連結した配列の例であり、このような配列を用いることが本発明では好ましい。しかし、ＲＢＰ−Ｊκ結合配列の間の配列は必ずしも同じである必要はなく、それぞれ異なり得る。
【００６７】
本発明の核酸分子は、好ましくは、配列番号６の配列を含む。配列番号６の配列は、天然のＴＰ−１プロモーターに含まれる、２つのＲＢＰ−Ｊκ結合配列を含む配列を１２個タンデムに連結した配列である。本明細書においては、天然のＴＰ−１プロモーターに含まれる、２つのＲＢＰ−Ｊκ結合配列を含む配列を１２個タンデムに連結した配列を例示として用いたが、もちろん、連結する数に制限はない。例えば、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、４０、５０個などの任意の数で連結することができる。
【００６８】
これらの天然のプロモーターから得られた塩基配列は例示であり、これらの配列とはわずかに異なる配列を有する改変体（いわゆる、対立遺伝子改変体）が天然に存在し得ることは公知である。本発明においては、ＲＢＰ−Ｊκ配列を含みかつこれらの配列と同等以上の効果が得られる限り、これらの例示した配列以外にも、天然に存在する改変体も本発明の核酸分子に用い得る。
【００６９】
天然のＲＢＰ−Ｊκ配列およびその周辺の配列を含む核酸分子は、既知のＲＢＰ−Ｊκ配列およびその周辺の配列を参考にしてプライマーを設計し、目的の天然配列を得ようとするゲノムライブラリーを鋳型としてＰＣＲを行うことによって得ることができる。あるいは、既知の配列情報をもとに、ゲノムライブラリー作製をへることなく、化学合成により直接、天然のＲＢＰ−Ｊκ配列およびその周辺の配列を含む核酸分子を作製することも可能である。
【００７０】
本発明の核酸分子はまた、ＲＢＰ−Ｊκ配列を含みかつこれらの配列と同等以上の効果が得られる限り、ＲＢＰ−Ｊκ配列の周辺の天然配列に対して何らかの改変（例えば、１または数個の改変）が加えられた配列を含んでもよい。このような改変は、少なくとも１個のヌクレオチドの欠失、トランジションおよびトランスバージョンを含む置換、または挿入からなる群より選択され得る。この変化は対照塩基配列の５’末端もしくは３’末端の位置で生じてもよく、またはこれら末端以外のどの位置で生じてもよい。塩基の変化は、１塩基ずつ点在していてもよく、数塩基連続していてもよい。改変は、当該分野で周知の方法を用いて、例えば、部位特異的変異誘発法、変異原を用いた変異誘発法（対象遺伝子を亜硝酸塩などの変異剤で処理すること、紫外線処理を行うこと）、エラープローンＰＣＲを行うことなどによって行われ得る。目的の変異を得やすい点から、部位特異的変異誘発を用いることが好ましい。部位特異的変異誘発を用いれば、目的とする部位で目的とする改変を導入することができるからである。あるいは、目的とする配列をもつ核酸分子を直接合成してもよい。そのような化学合成の方法は、当該分野において周知である。
【００７１】
本発明の核酸分子は、直鎖状分子であっても環状分子であってもよい。本明細書において、用語「核酸分子」はまた、核酸、オリゴヌクレオチド、およびポリヌクレオチドと互換可能に使用される。核酸分子の例としては、フラグメント、コンストラクト、カセット、プラスミド、ベクター、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡなどが挙げられる。本明細書では、核酸および核酸分子は、その核酸および核酸分子がタンパク質をコードするときなどは、用語「遺伝子」の概念に含まれる。ある遺伝子配列をコードする核酸分子はまた、「スプライス変異体」および「スプライス改変体」を包含する。スプライス変異体とスプライス改変体とは同義である。同様に、核酸によりコードされる特定のタンパク質は、その核酸のスプライス改変体によりコードされる任意のタンパク質を包含する。その名が示唆するように「スプライス変異体」は、遺伝子のオルタナティブスプライシングの産物である。転写後、最初の核酸転写物は、異なる（別の）核酸スプライス産物が異なるポリペプチドをコードするようにスプライスされる場合がある。スプライス変異体の産生機構は変化するが、エキソンのオルタナティブスプライシングを含む。読み過し転写により同じ核酸に由来する別のポリペプチドもまた、この定義に包含される。スプライシング反応の任意の産物（組換え形態のスプライス産物を含む）がこの定義に含まれる。
【００７２】
本発明の核酸分子は、単離された核酸分子であることが好ましい。本明細書中では「単離された」核酸分子とは、その核酸分子が、天然に存在する生物体の細胞内の他の生物学的因子（例えば、核酸分子以外の因子および目的とする核酸分子以外の核酸分子）から実質的に分離または精製されたものをいう。「単離された」核酸分子には、標準的な精製方法によって精製された核酸分子が含まれる。したがって、単離された核酸分子は、化学的に合成した核酸分子を包含する。また、標準的な精製方法によって精製した後に、他の物質と混合した核酸分子および緩衝液中に溶解した核酸分子なども、本明細書でいう単離された核酸分子に該当する。
【００７３】
本明細書において「精製された」核酸分子とは、その核酸分子に天然に随伴する因子の少なくとも一部が除去されたものをいう。したがって、通常、精製された核酸分子におけるその核酸分子の純度は、その核酸分子が通常存在する状態よりも高い（すなわち濃縮されている）。
【００７４】
他にそうではないと示されなければ、特定の核酸配列はまた、明示的に示された配列と同様に、その保存的に改変された改変体（例えば、縮重コドン置換体）および相補配列を包含することが意図される。具体的には、縮重コドン置換体は、１もしくは数個、またはより多数の選択された（または、すべての）コドンの３番目の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を作成することにより達成され得る（Ｂａｔｚｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１９：５０８１（１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５−２６０８（１９８５）；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ ８：９１−９８（１９９４））。
【００７５】
本明細書において、ポリペプチド配列または塩基配列の「置換、欠失または付加」とは、もとのポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対して、それぞれアミノ酸もしくはその代替物、またはヌクレオチドもしくはその代替物が、置き換わること、取り除かれることまたは付け加わることをいう。このような置換、欠失または付加の技術は、当該分野において周知であり、そのような技術の例としては、部位特異的変異誘発技術などが挙げられる。置換、欠失または付加は、１つ以上であれば任意の数でよく、そのような数は、その置換、欠失または付加を有する改変体において目的とする機能（例えば、ＲＢＰ−Ｊκ結合活性、プロモーター活性、レポータータンパク質配列の場合、所望のレポータータンパク質活性など）が保持される限り、多くすることができる。例えば、そのような数は、１または数個であり得、そして好ましくは、全体の長さの２０％以内、１０％以内、または１００個以下、５０個以下、２５個以下などであり得る。本発明で用いられるプロモーター配列は、プロモーター活性を保持する限り、任意の長さであり得る。このような配列は、例えば、もとのプロモーター配列の塩基配列を５’側または３’側から少しずつ欠失させ、プロモーター活性を保持しているかを確認することにより、容易に決定され得る。このようなプロモーター配列を短縮させる方法は、当業者に周知であり、容易に実施され得る。
【００７６】
本明細書において、「改変体」とは、もとのポリペプチドまたはポリヌクレオチドなどの物質に対して、一部が変更されているものをいう。そのような改変体としては、置換改変体、付加改変体、欠失改変体、短縮（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）改変体、対立遺伝子変異体、グリコシル化改変体、脂質化改変体、複合分子による改変体などが挙げられる。好ましくは、改変体は、改変のもととなる物質（例えば、酵素）の特性（例えば、生物学的特性）を少なくとも１つ、より好ましくは複数保持している。などが挙げられる。対立遺伝子（ａｌｌｅｌｅ）とは、同一遺伝子座に属し、互いに区別される遺伝的改変体のことをいう。従って、「対立遺伝子変異体」とは、ある遺伝子に対して、対立遺伝子の関係にある改変体をいう。そのような対立遺伝子変異体は、通常その対応する対立遺伝子と同一または非常に類似性の高い配列を有し、通常はほぼ同一の生物学的活性を有するが、まれに異なる生物学的活性を有することもある。「種相同体またはホモログ（ｈｏｍｏｌｏｇ）」とは、ある種の中で、ある遺伝子とアミノ酸レベルまたはヌクレオチドレベルで、相同性（好ましくは、６０％以上の相同性、より好ましくは、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上の相同性）を有するものをいう。そのような種相同体を取得する方法は、当該分野で周知である。「オルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）」とは、オルソロガス遺伝子（ｏｒｔｈｏｌｏｇｏｕｓ ｇｅｎｅ）ともいい、二つの遺伝子がある共通祖先からの種分化に由来する遺伝子をいう。例えば、多重遺伝子構造をもつヘモグロビン遺伝子ファミリーを例にとると、ヒトおよびマウスのαヘモグロビン遺伝子はオルソログであるが、ヒトのαヘモグロビン遺伝子およびβヘモグロビン遺伝子はパラログ（遺伝子重複で生じた遺伝子）である。また、システインプロテアーゼインヒビターである、ヒトのシスタチンＡと、イネのオリザシスタチンとを比較すると、標的となるプロテアーゼとの相互作用に重要と考えられる３箇所の短いアミノ酸モチーフが保存されているだけで、他の部分のアミノ酸の共通性は非常に低い。しかし、両者はともにシスタチン遺伝子スーパーファミリーに属し、共通祖先遺伝子を持つとされていることから、単に全体的なアミノ酸の相同性に限らず、局所的に高い相同性を持つアミノ酸配列が共通して存在する場合も、オルソログたり得る。このように、オルソログは、通常別の種においてもとの種と同様の機能を果たしていることがあり得ることから、上記に列挙した、天然のＲＢＰ−Ｊκ結合配列を含む周辺配列（配列番号２および６）のオルソログもまた、本発明において有用であり得る。
【００７７】
本発明の核酸分子は、直鎖状分子またはプラスミドであることが好ましい。本明細書において用語「プラスミド」とは、染色体に組み込まれず、染色体と異なる機構で複製および維持される環状核酸分子をいう。本発明の核酸分子は、ベクターであってもよい。
【００７８】
本明細書において核酸分子について言及する場合、用語「ベクター」とは、目的の塩基配列を目的の細胞へと移入させることができる核酸分子をいう。そのようなベクターとしては、目的の細胞において自律複製が可能であるか、または目的の細胞の染色体中への組込みが可能で、かつ改変された塩基配列の転写に適した位置にプロモーターを含有しているものが例示される。
【００７９】
全長ヌクレオチドから一部のヌクレオチドが欠失したヌクレオチドおよび全長ポリペプチドから一部のアミノ酸が欠失したポリペプチドは、フラグメントとも呼ばれる。本明細書において、「フラグメント」とは、全長のポリペプチドまたはポリヌクレオチド（長さがｎ）に対して、１〜ｎ−１までの配列長さを有するポリペプチドまたはポリヌクレオチドをいう。フラグメントの長さは、その目的に応じて、適宜変更することができ、例えば、その長さの下限としては、ポリペプチドの場合、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０およびそれ以上のアミノ酸が挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。また、ポリヌクレオチドの場合、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００およびそれ以上のヌクレオチドが挙げられ、ここに具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。
【００８０】
本明細書において用語「発現ベクター」とは、目的のタンパク質コード配列を目的の細胞中で発現し得るベクターをいう。発現ベクターは、目的のタンパク質コード配列に加えて、その発現を調節するプロモーターのような種々の調節エレメント、および必要に応じて、目的の細胞中での複製および組換え体の選択に必要な因子（例えば、複製起点（ｏｒｉ）、および薬剤耐性遺伝子のような選択マーカー）を含む。発現ベクター中では、目的のタンパク質コード配列は、転写および翻訳されるように作動可能に連結されている。調節エレメントとしては、プロモーター、ターミネーターおよびエンハンサーが挙げられる。また、発現されたタンパク質を細胞外へ分泌させることが意図される場合は、分泌シグナルペプチドをコードする塩基配列が、目的のタンパク質コード配列の上流に正しいリーディングフレームで結合される。特定の生物（例えば、細菌）に導入するために使用される発現ベクターのタイプ、その発現ベクター中で使用される調節エレメントおよび他の因子の種類が、目的の細胞に応じて変わり得ることは、当業者に周知の事項である。
【００８１】
本明細書においてベクターの例としては、スクリーニングに用いる細胞において複製可能なベクター、および遺伝子実験に用いられる一般的な細菌（代表的なものとして大腸菌Ｋ１２株由来の大腸菌株）で複製可能かつ単離精製可能なベクターが挙げられる。これは、目的の生物細胞（例えば、動物細胞）に導入する目的の核酸分子を構築するために必要である。具体的には、例えば、ｐＧＥＭ−Ｔ Ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）、ｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）、ｐＧＬ４．１８（ｌｕｃ２Ｐ／Ｎｅｏ）ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社）、ｐＧＬ４．２１（ｌｕｃ２Ｐ／Ｐｕｒｏ）ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社）、ｐＧＢＴ９（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、大腸菌のｐＢＲ３２２プラスミド、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔといった市販の構築プラスミドがある。エレクトロポレーション法、ポリエチレングリコール法、パーティクルガン法といった方法により直接的に遺伝子断片を細胞に導入して形質転換する場合には、このような市販されている一般的なプラスミドを用いて、導入する遺伝子の構築を行えばよい。
【００８２】
発現ベクターは、発現カセットの中に、選択マーカーを含み得る。「発現カセット」とは、ある発現すべき塩基配列（例えば、構造遺伝子）と、その発現を調節するプロモーター配列、ｍＲＮＡ転写を終結させるターミネーター配列および必要に応じて他の種々の調節エレメントとを、目的の細胞中でその発現すべき塩基配列が作動し得る状態で連結してある、人工構築遺伝子の１単位を示す。発現カセットの代表例としては、目的の細胞のうちの形質転換された細胞のみを選択するための選択マーカー（例えば、ネオマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子など）の発現カセット、および宿主細胞内に発現させたい有用タンパク質コード配列の発現カセットが挙げられる。準備するべき発現カセットの種類、構造および数については、生物、宿主細胞および目的に応じて使い分けられるべきであり、その組み合わせは当業者には周知である。
【００８３】
「発現ベクター」は、上記の「発現カセット」を１つ以上含み得る「ベクター」としても定義され得る。目的の細胞に導入をすべき発現カセットごとに別々のベクター上に配置してもよいし、１つのベクター上に全ての発現カセットを連結してもよい。例えば、本発明において、選択マーカーがさらに用いられる場合、少なくとも３つのＲＢＰ−Ｊκ配列、プロモーター配列およびそのプロモーター配列に作動可能に連結されたレポータータンパク質コード配列を含む発現カセットと、選択マーカーを含む発現カセットとは、同じ発現ベクター上に存在しても別の発現ベクター上に存在してもよい。同じ発現ベクター上に存在することが好ましい。より好ましくは、少なくとも３つのＲＢＰ−Ｊκ配列、プロモーター配列およびそのプロモーター配列に作動可能に連結されたレポータータンパク質コード配列を含む発現カセットと、選択マーカーを含む発現カセットとは、同じ発現カセット中に含まれる。
【００８４】
本発明の核酸分子は、少なくとも３つのＲＢＰ−Ｊκ結合配列と作動可能に連結されたプロモーター配列をさらに含み得る。
【００８５】
本明細書において使用される用語「プロモーター」とは、遺伝子の転写の開始部位を決定し、また転写頻度を直接的に調節する、核酸分子上の領域をいい、ＲＮＡポリメラーゼが結合して転写を始める塩基配列である。プロモーター領域は、通常、推定タンパク質コード領域の第１エキソンの上流約２ｋｂｐ以内の領域であることが多いので、ＤＮＡ解析用ソフトウエアを用いてゲノム塩基配列中のタンパク質コード領域を予測すれば、プロモーター領域を推定することはできる。推定プロモーター領域は、構造遺伝子ごとに変動するが、通常構造遺伝子の上流にあるが、これらに限定されず、構造遺伝子の下流にもあり得る。好ましくは、推定プロモーター領域は、第一エキソン翻訳開始点から上流約２ｋｂｐ以内に存在する。
【００８６】
本明細書において使用される用語「プロモーター配列」とは、プロモーター活性を有する配列を意味する。プロモーター活性とは、ＤＮＡからＲＮＡを転写させる活性をいう。したがって、「プロモーター配列」とは、その下流（３’側）にＤＮＡを連結して細胞に導入した場合にそのＤＮＡに対応するＲＮＡを合成できる配列をいう。
【００８７】
本発明で用いられるプロモーター配列の長さは、通常約１０ヌクレオチド以上であるが、好ましくは約２０ヌクレオチド以上であり、より好ましくは約３０ヌクレオチド以上であり、さらに好ましくは約４０ヌクレオチド以上であり、特に好ましくは約５０ヌクレオチド以上である。プロモーター配列の長さはまた、約６０ヌクレオチド以上、約７０ヌクレオチド以上、約８０ヌクレオチド以上、約９０ヌクレオチド以上、約１００ヌクレオチド以上、約１５０ヌクレオチド以上、約２００ヌクレオチド以上、または約３００ヌクレオチド以上などの長さであり得る。プロモーター配列の長さに上限はなく、例えば、約５００ヌクレオチド以下、約４００ヌクレオチド以下、約３００ヌクレオチド以下、約２００ヌクレオチド以下、約１５０ヌクレオチド以下、約１００ヌクレオチド以下、約９０ヌクレオチド以下、約８０ヌクレオチド以下、約７０ヌクレオチド以下、約６０ヌクレオチド以下、約５０ヌクレオチド以下などであり得る。
【００８８】
本発明で用いられるプロモーター配列は、従来のプロモーター配列（例えば、ミニマムプロモーター）で有り得る。プロモーター配列は、構成的プロモーター配列であってもよく、組織特異的プロモーター配列であってもよく、時期特異的プロモーター配列であってもよい。プロモーター配列は、本発明の核酸分子の使用目的に応じて適切に選択され得る。本発明で用いられるプロモーターの好ましい例としては、Ｈｅｓ−１プロモーター、ウサギβ−グロビン最少プロモーターが挙げられる。
【００８９】
本明細書において、あるプロモーターの発現が「構成的」であるとは、そのプロモーターと作動可能に連結されたコード配列の発現が、生物のすべての組織において、その生物の生長の幼若期または成熟期のいずれにあってもほぼ一定の量で発現される性質をいう。具体的には、そのコード配列の発現を分析したとき、例えば、任意の時点で（例えば、２点以上）の同一または対応する部位のいずれにおいても発現がみられるとき、本発明の定義上、発現が構成的であるという。構成的プロモーターは、通常の生育環境にある生物の恒常性維持に役割を果たしていると考えられる。
【００９０】
本明細書において、プロモーターの発現が「組織特異的」であるとは、そのプロモーターと作動可能に連結されたコード配列の発現が、生物の特定の組織においてのみ見られる性質をいう。具体的には、そのコード配列の発現を分析したとき、例えば、Ｔ細胞では発現が見られるが他の細胞では発現が見られないならば、Ｔ細胞特異的に発現されているといえる。
【００９１】
本明細書において、プロモーターの発現が「時期特異的」であるとは、そのプロモーターと作動可能に連結されたコード配列の発現が、発生の特定の時期においてのみ見られる性質をいう。具体的には、そのコード配列の発現を分析したとき、例えば、細胞分裂中には発現が確認されるが他の時期には発現が見られないならば、細胞分裂特異的に発現されているといえる。
【００９２】
本明細書において使用される「ターミネーター」は、タンパク質コード領域の下流に位置し、塩基配列がｍＲＮＡに転写される際の転写の終結、ポリＡ配列の付加に関与する配列である。ターミネーターは、ｍＲＮＡの安定性に関与して遺伝子の発現量に影響を及ぼすことが知られている。ターミネーターは、任意の生物由来のターミネーターであり得るが、好ましくは、選択マーカーが導入されるべき生物由来のターミネーターである。本発明では、目的の生物においてターミネーターの活性を示すものであれば、どのような塩基配列でも使用することができる。
【００９３】
本明細書において使用される「エンハンサー」は、目的のタンパク質の発現効率を高めるために用いられ得る。そのようなエンハンサーは当該分野において周知である。エンハンサーは複数個用いられ得るが、１個用いられてもよいし、用いなくともよい。エンハンサーは、任意の生物由来のエンハンサーであり得るが、好ましくは、選択マーカーが導入されるべき生物由来のエンハンサーである。本発明では、目的の生物においてエンハンサーの活性を示すものであれば、どのような塩基配列でも使用することができる。
【００９４】
本明細書中では、「イントロン」とは、任意の２つのエキソンの間に存在する塩基配列であって、ＲＮＡに転写されるが、成熟後のＲＮＡには見られない塩基配列をいう。イントロンは、存在することによって、ポリペプチドの発現量を増大させる作用を有する場合がある。イントロンは、任意の生物由来のイントロンであり得るが、好ましくは、選択マーカーが導入されるべき生物由来のイントロンである。本発明では、目的の生物においてイントロンの活性を示すものであれば、どのような塩基配列でも使用することができる。
【００９５】
本明細書中では、「エキソン」とは、ＲＮＡに転写され、かつポリペプチドへと翻訳される塩基配列をいう。
【００９６】
本明細書において使用される「作動可能に連結された（る）」とは、所望の塩基配列が、発現（すなわち、作動）をもたらす転写翻訳調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサーなど）または翻訳調節配列（例えば、イントロン、スプライスドナー、スプライスアクセプターなど）の制御下に配置されることをいう。プロモーターが遺伝子に作動可能に連結されるためには、通常、その遺伝子のすぐ上流にプロモーターが配置されるが、必ずしも隣接して配置される必要はない。
【００９７】
少なくとも３つのＲＢＰ-Ｊκ配列とプロモーター配列とを作動可能に連結するため、またはプロモーター配列とレポータータンパク質コード配列とを作動可能に連結するために、これらのいずれかの核酸配列を加工すべき場合がある。例えば、プロモーターとレポータータンパク質コード配列との間が長すぎて転写効率の低下が予想される場合、またはリボゾーム結合部位と翻訳開始コドンとの間隔が適切でない場合などである。加工の手段としては、制限酵素による消化、Ｂａｌ３１、ＥｘｏＩＩＩなどのエキソヌクレアーゼによる消化、あるいはＭ１３などの一本鎖ＤＮＡまたはＰＣＲを使用した部位特異的変異誘発の導入が挙げられる。
【００９８】
本発明の核酸分子は、プロモーター配列と作動可能に連結されたレポータータンパク質コード配列をさらに含み得る。「レポータータンパク質」とは、その発現を確認することが容易であるタンパク質をいう。レポータータンパク質は、そのレポータータンパク質を発現する細胞に対して悪影響を及ぼさないことが好ましい。レポータータンパク質は、細胞を破壊せずに発現を確認できることが好ましい。レポータータンパク質コード配列は、一般に、プロモーター活性を確認したいプロモーターの下流に連結される。種々のレポータータンパク質が当該分野で公知であり、当業者は目的にあった適切なレポータータンパク質を容易に選択し得る。レポータータンパク質の例としては、発光タンパク質（すなわち、ルシフェラーゼ）、蛍光タンパク質、β−グルクロニダーゼ、レポータータンパク質コード配列は、発光タンパク質または蛍光タンパク質をコードすることが好ましい。レポータータンパク質は、天然のものであってもよく、天然のものが改変されることにより得られたものであってもよい。天然のレポータータンパク質の性質が改良された種々のレポータータンパク質が公知である。
【００９９】
本明細書において使用される用語「タンパク質」、「ポリペプチド」および「ペプチド」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマーをいう。このポリマーは、直鎖であっても分岐していてもよく、環状であってもよい。
【０１００】
レポータータンパク質は、レポーターとしての機能を発揮し得るのであれば、任意の長さのアミノ酸ポリマーであり得る。例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０残基長などの短いポリマーであってもよい。
【０１０１】
一般に、特定のタンパク質のアミノ酸配列のうちのあるアミノ酸は、そのタンパク質が有する生物学的活性の明らかな低下または消失なしに、他のアミノ酸に置換され得る。あるタンパク質の生物学的活性を規定するのは、タンパク質の相互作用能力および性質である。従って、特定のアミノ酸の置換がそのタンパク質のアミノ酸配列において、またはそのタンパク質をコードする塩基配列のレベルにおいて行われ得、置換後もなお、もとの性質を維持するタンパク質が生じ得る。従って、生物学的活性の明らかな損失なしに、種々の改変が、本明細書において開示されたタンパク質またはこのタンパク質をコードする塩基配列を有するヌクレオチドにおいて行われ得る。
【０１０２】
本明細書において「生物学的活性」とは、ある因子（例えば、タンパク質または核酸分子）が、生体内において有し得る活性のことをいい、種々の機能を発揮する活性が包含される。例えば、ある因子が酵素である場合、その生物学的活性は、その酵素活性を包含する。別の例では、ある因子がリガンドである場合、そのリガンドが対応するレセプターへの結合を包含する。例えば、ある因子がアンチセンス分子である場合、その生物学的活性は、対象となる核酸分子への結合、それによる発現抑制などを包含する。そのような生物学的活性は、当該分野において周知の技術によって測定することができる。ある因子がプロモーターである場合、その生物学的活性は、標的となる遺伝子の転写がそのプロモーターに特異的な刺激によって変動（好ましくは上昇）することを確認することができる。そのような確認は、当該分野において周知の分子生物学的手法を用いて行うことができる。
【０１０３】
本明細書中では一般に、レポータータンパク質に対して、アミノ酸の置換、付加、欠失または修飾を行うことができる。
【０１０４】
アミノ酸の置換とは、１つのアミノ酸を別の１つのアミノ酸に置き換えることをいう。得られるレポータータンパク質が、天然のレポータータンパク質の活性と実質的に同等以上のレポータータンパク質活性を有する限り、アミノ酸の置換は、任意の箇所で任意の個数行われ得る。例えば、置換は、好ましくは１〜３０個行われ得、より好ましくは１〜２０個行われ得、さらに好ましくは１〜１０個行われ得、特に好ましくは１〜５個行われ得、最も好ましくは１〜３個行われ得る。アミノ酸の置換は、１残基ずつ点在していてもよく、２残基以上連続していてもよい。特に、置換がＮ末端またはＣ末端で行われる場合、他の箇所に比較して活性への影響が少ないので、他の箇所への置換より多くのアミノ酸残基を置換してもよい。
【０１０５】
アミノ酸の付加とは、もとのアミノ酸配列中のどこかの位置に、１つ以上、例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個のアミノ酸を挿入することをいう。１〜３０個、より好ましくは１〜２０個、さらに好ましくは１〜１０個、特に好ましくは１〜５個、最も好ましくは１〜３個のアミノ酸を挿入することをいう。アミノ酸の付加もまた、１残基ずつ点在していてもよく、２残基以上連続していてもよい。アミノ酸の付加はまた、特に、Ｎ末端またはＣ末端で行われる場合、他の箇所に比較して活性への影響が少ないので、他の箇所への付加より多くのアミノ酸残基を付加してもよい。例えば１〜１００個、より好ましくは１〜５０個、さらにより好ましくは１〜３０個、特に好ましくは５〜３０個、最も好ましくは５〜１０個のアミノ酸残基を付加してもよい。
【０１０６】
アミノ酸の欠失とは、もとのアミノ酸配列から１つ以上、例えば、１〜３０個、より好ましくは１〜１０個、特に好ましくは１〜５個、最も好ましくは１〜３個のアミノ酸を除去することをいう。アミノ酸の欠失もまた、１残基ずつ点在していてもよく、２残基以上連続していてもよい。特に、欠失がＮ末端またはＣ末端で行われる場合、他の箇所に比較して活性への影響が少ないので、他の箇所への欠失より多くのアミノ酸残基を欠失してもよい。
【０１０７】
アミノ酸修飾の例としては、アミド化、カルボキシル化、硫酸化、ハロゲン化、アルキル化、グリコシル化、リン酸化、水酸化、アシル化（例えば、アセチル化）などが挙げられるが、これらに限定されない。置換または付加されるアミノ酸は、通常、天然のアミノ酸である。
【０１０８】
用語「天然のアミノ酸」とは、天然のアミノ酸のＬ−異性体を意味する。天然のアミノ酸は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、メチオニン、トレオニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、システイン、プロリン、ヒスチジン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、γ−カルボキシグルタミン酸、アルギニン、オルニチン、およびリジンである。特に示されない限り、本明細書でいう全てのアミノ酸はＬ体である。
【０１０９】
このような発現されるレポータータンパク質は、天然のレポータータンパク質のアミノ酸配列に対して、好ましくは約４０％、より好ましくは約４５％、より好ましくは約５０％、より好ましくは約５５％、より好ましくは約６０％、より好ましくは約６５％、より好ましくは約７０％、より好ましくは約７５％、より好ましくは約８０％、より好ましくは約８５％、より好ましくは約９０％、より好ましくは約９５％、そして最も好ましくは約９９％の同一性を有する。
【０１１０】
上記のような改変を設計する際に、アミノ酸の疎水性指数が考慮され得る。タンパク質における相互作用的な生物学的機能を与える際の疎水性アミノ酸指数の重要性は、一般に当該分野で認められている（Ｋｙｔｅ．ＪおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｒ．Ｆ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７（１）：１０５−１３２，１９８２）。アミノ酸の疎水的性質は、生成したタンパク質の二次構造に寄与し、次いでそのタンパク質と他の分子（例えば、酵素、基質、レセプター、ＤＮＡ、抗体、抗原など）との相互作用を規定する。各アミノ酸は、それらの疎水性および電荷の性質に基づく疎水性指数を割り当てられる。それらは：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；スレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５））である。
【０１１１】
あるアミノ酸を、同様の疎水性指数を有する他のアミノ酸により置換して、そして依然として実質的に同様の生物学的機能を有するタンパク質（例えば、酵素活性において実質的に等価なタンパク質）を生じさせ得ることは、当該分野で周知である。このようなアミノ酸置換において、疎水性指数が±２以内であることが好ましく、±１以内であることがより好ましく、および±０．５以内であることがさらにより好ましい。疎水性に基づくこのようなアミノ酸の置換は効率的であることが当該分野において理解される。米国特許第４，５５４，１０１号に記載されるように、以下の親水性指数がアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；スレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；およびトリプトファン（−３．４）。アミノ酸が同様の親水性指数を有しかつ依然として生物学的等価体を与え得る別のものに置換され得ることが理解される。このようなアミノ酸置換において、親水性指数が±２以内であることが好ましく、±１以内であることがより好ましく、および±０．５以内であることがさらにより好ましい。
【０１１２】
本発明において、「保存的置換」とは、アミノ酸置換において、元のアミノ酸と置換されるアミノ酸との親水性指数または／および疎水性指数が上記のように類似している置換をいう。保存的置換の例は、当業者に周知であり、例えば、次の各グループ内での置換が挙げられるがこれらに限定されない：アルギニンおよびリジン；グルタミン酸およびアスパラギン酸；セリンおよびスレオニン；グルタミンおよびアスパラギン；ならびにバリン、ロイシン、およびイソロイシン。
【０１１３】
アミノ酸は、その一般に公知の３文字記号か、またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎにより推奨される１文字記号のいずれかにより、本明細書中で言及され得る。ヌクレオチドも同様に、一般に受け入れられた１文字コードにより言及され得る。
【０１１４】
本発明の核酸分子においては、レポータータンパク質コード配列の下流にＰＥＳＴ配列コード配列が連結されていることが好ましい。本明細書において用語「ＰＥＳＴ配列」とは、プロリン−グルタミン酸−セリン−トレオニンに富むアミノ酸配列をいう。ＰＥＳＴ配列は、配列自体およびその長さに特異性はない。ＰＥＳＴ配列は、その配列が融合されたタンパク質の細胞内での半減期を短縮させる機能を有する。ＰＥＳＴ配列をレポータータンパク質と融合させると、レポータータンパク質の細胞内での過度の蓄積を防ぐことができ、その結果、レポータータンパク質のリアルタイムの測定を行うことができる。
【０１１５】
ＰＥＳＴ配列コード配列の下流またはＰＥＳＴ配列コード配列を含まない場合にはレポータータンパク質コード配列の下流に、選択マーカーの配列がさらに連結され得る。本明細書において用語「選択マーカーの配列」とは、選択遺伝子と同義であり、その選択マーカーがコードする産物の発現によって、選択マーカーが存在する細胞と存在しない細胞とを識別することができる、ヌクレオチドをいう。
【０１１６】
本明細書において遺伝子、ポリヌクレオチド、タンパク質などの「発現」とは、その遺伝子などがインビトロまたはインビボで一定の作用を受けて、別の形態になることをいう。好ましくは、遺伝子、タンパク質をコードする配列などが、転写および翻訳されて、タンパク質の形態になることをいうが、転写されてｍＲＮＡが作製されることもまた発現の一形態であり得る。より好ましくは、そのようなタンパク質の形態は、翻訳後プロセシングを受けたものであり得る。
【０１１７】
従って、本明細書において遺伝子、ポリヌクレオチド、ポリペプチドなどの「発現」の「減少」とは、本発明の因子を作用させたときに、作用させないときよりも、発現の量が有意に減少することをいう。好ましくは、発現の減少は、ポリペプチドの発現量の減少を含む。本明細書において遺伝子、ポリヌクレオチド、タンパク質などの「発現」の「増加」とは、本発明の因子を作用させたときに、作用させないときよりも、発現の量が有意に増加することをいう。好ましくは、発現の増加は、タンパク質の発現量の増加を含む。
【０１１８】
（２．Ｎｏｔｃｈシグナル伝達系の検出をさらに容易にするための配列）
本発明においては、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達系の検出をさらに容易にするための配列をさらに用いてもよい。この配列は、例えば、構成的に活性なＮｏｔｃｈタンパク質をコードする配列であり得る。「構成的に活性なＮｏｔｃｈタンパク質」とは、活性化を受けなくとも常に活性であって、下流にシグナルを伝えるＮｏｔｃｈタンパク質をいう。Ｎｏｔｃｈタンパク質は通常、デルタタンパク質の存在下で活性型になるが、構成的に活性なＮｏｔｃｈタンパク質は、デルタタンパク質が存在する必要がない。構成的に活性なＮｏｔｃｈタンパク質は、活性型Ｎｏｔｃｈ、活性型Ｎｏｔｃｈタンパク質、恒常的に活性なＮｏｔｃｈなどともいわれる。
【０１１９】
構成的に活性なＮｏｔｃｈタンパク質の例としては、ＣＣ＞ＳＳ、細胞外ドメイン欠損ＮＯＴＣＨ、Ｆ−ＮＥＸＴ、ＮｏｔｃｈΔＥ、Ｔ−ＡＬＬ変異含有Ｎｏｔｃｈなどが挙げられるがこれらに限定されない。ＣＣ＞ＳＳは、ＬＮＲｍＮｏｔｃｈ１のヘテロダイマー形成部分である１６７５位のシステインをセリンに、１６８２位のシステインをセリンに置換したもの（すなわち、Ｃ１６７５Ｓ，Ｃ１６８２Ｓにしたもの）である。ＣＣ＞ＳＳは、Ｍｕｍｍ ＪＳ，Ｓｃｈｒｏｅｔｅｒ ＥＨ，Ｓａｘｅｎａ ＭＴ，Ｇｒｉｅｓｅｍｅｒ Ａ，Ｔｉａｎ Ｘ，Ｐａｎ ＤＪ，Ｒａｙ ＷＪ，Ｋｏｐａｎ Ｒ．，”Ａ ｌｉｇａｎｄ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｌｅａｖａｇｅ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｇａｍｍａ−ｓｅｃｒｅｔａｓｅ−ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｏｔｃｈ１．”Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ．２０００ Ｆｅｂ；５（２）：１９７−２０６およびＫｏｐａｎ Ｒ，Ｓｃｈｒｏｅｔｅｒ ＥＨ，Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ Ｈ，Ｎｙｅ ＪＳ．，”Ｓｉｇｎａｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｍＮｏｔｃｈ：ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ ｏｆ ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ａｎｄ ｉｔｓ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｂｙ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｏｍａｉｎ．”Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．１９９６ Ｆｅｂ ２０；９３（４）：１６８３−８に記載される。細胞外ドメイン欠損ＮＯＴＣＨは、Ｎｏｔｃｈの細胞外ドメイン部分を欠損したものであり、ΔＮＳ１ともいう。細胞外ドメイン欠損ＮＯＴＣＨの核酸配列を配列番号７に示し、そのアミノ酸配列を配列番号８および図５に示す。細胞外ドメイン欠損ＮＯＴＣＨは、シグナルシークエンス＋Ｓ１＋Ｓ２＋Ｓ３＋Ｓ４サイトをもつ。Ｆ−ＮＥＸＴはＯｋｏｃｈｉ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｅｓｅｎｉｌｉｎｓ ｍｅｄｉａｔｅ ａ ｄｕａｌ ｉｎｔｒａｍｅｍｂｒａｎｏｕｓ ｇａｍｍａ−ｓｅｃｒｅｔａｓｅ ｃｌｅａｖａｇｅ ｏｆ Ｎｏｔｃｈ−１． ＥＭＢＯ Ｊ． ２００２ Ｏｃｔ １５；２１（２０）：５４０８−１６．に記載される。ＮｏｔｃｈΔＥはＫｏｐａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｓｉｇｎａｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｍＮｏｔｃｈ： ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ ｏｆ ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ａｎｄ ｉｔｓ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｂｙ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｏｍａｉｎ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ． １９９６ Ｆｅｂ ２０；９３（４）：１６８３−８．に記載される。Ｔ−ＡＬＬ変異含有ＮｏｔｃｈはＷｅｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｏｆ ＮＯＴＣＨ１ ｉｎ ｈｕｍａｎ Ｔ ｃｅｌｌ ａｃｕｔｅ ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ． Ｓｃｉｅｎｃｅ． ２００４ Ｏｃｔ ８；３０６（５６９４）：２６９−７１．に記載される。
【０１２０】
構成的に活性なＮｏｔｃｈタンパク質をコードする配列は、プロモーター配列と作動可能に連結されることが好ましい。プロモーター配列については上記に説明したのと同様である。構成的に活性なＮｏｔｃｈタンパク質をコードする配列に連結されるプロモーター配列は、少なくとも３つのＲＢＰ−Ｊκ結合配列に連結されるプロモーター配列と同じ配列を有してもよく、異なる配列を有してもよく、同じ配列であっても異なる配列であってもよい。。
【０１２１】
構成的に活性なＮｏｔｃｈタンパク質をコードする配列には、必要に応じて、ターミネーター、エンハンサーなどの他の発現調節エレメントが連結され得る。
【０１２２】
構成的に活性なＮｏｔｃｈタンパク質をコードする配列を含む核酸分子は、少なくとも３つのＲＢＰ−Ｊκ結合配列を含む核酸分子と別の分子であってもよく、同じ分子であってもよい。別の分子であることが好ましい。
【０１２３】
本発明の核酸分子は、好ましくは、プロモーター配列と作動可能に連結された構成的に活性なＮｏｔｃｈタンパク質をコードする配列を含む核酸分子とともに細胞内に導入して発現させた場合の前記レポータータンパク質の発現量と、該Ｎｏｔｃｈタンパク質コード配列を含まない核酸分子とともに細胞内に導入して発現させた場合の該レポータータンパク質の発現量とを比較したときの、Ｚ’ ｆａｃｔｏｒ値が０．５以上である。
【０１２４】
Ｚ’ｆａｃｔｏｒ値は、アッセイ精度に関する指標である。Ｚ’ｆａｃｔｏｒ値については、Ｊｉ−Ｈｕ Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｃｒｅｅｎ．５，６７−７３，１９９９に詳細に説明されている。Ｚ’ｆａｃｔｏｒ値（Ｚ’）は、以下の式に従って求められる。
【０１２５】
【数１】
Ｚ’ｆａｃｔｏｒ値の計算式およびその概念図を図６（ａ）に示す。Ｚ’ｆａｃｔｏｒ値を説明するために模式的なデータの例を、図６（ｂ）および図６（ｃ）に示す。図６（ｂ）は、Ｓ／Ｂ＝１０でかつＺ’＝０．４の場合のデータ例であり、図６（ｃ）は、Ｓ／Ｂ＝２でかつＺ’＝０．８の場合のデータ例である。それぞれ、縦軸はカウント数を示し、横軸はサンプル番号を示す。図６（ｂ）および図６（ｃ）からわかるように、Ｓ／Ｂが比較的大きくてもＺ’が小さいとデータはばらつき、Ｓ／Ｂが比較的小さくてもＺ’が大きければデータのばらつきは小さい。Ｚ’ｆａｃｔｏｒ値は好ましくは０．５０以上であり、より好ましくは０．５５以上であり、さらに好ましくは０．６０以上であり、特に好ましくは０．６５以上であり、ことさら好ましくは０．７０以上であり、さらになお好ましくは０．８以上である。Ｚ’ｆａｃｔｏｒ値の上限は１である。Ｚ’ｆａｃｔｏｒ値が高いほどアッセイ精度が高い。ハイスループットスクリーニングを行うためには、Ｚ’ｆａｃｔｏｒ値が０．５０以上であることが好ましい。
【０１２６】
（３．本発明の核酸分子を含む細胞）
本発明の細胞は、本発明の核酸分子を含む。本発明の細胞は、好ましくは、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達が容易に活性化される細胞を含む。本発明の細胞は、任意の生物の細胞であり得る。本発明の細胞は、好ましくは動物細胞であり、より好ましくは哺乳動物細胞であり、さらに好ましくは霊長類の細胞であり、最も好ましくはヒト細胞である。本発明の細胞は好ましくは単離された細胞である。本発明の細胞として用いるのに好ましい細胞の例としては、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＨＯ細胞などが挙げられる。ＨＥＫ２９３細胞は、ヒト胎児腎細胞をアデノウィルスのＥ１遺伝子により形質転換することにより樹立された細胞株である。あるいは、細胞は、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達系についての調査が望ましい細胞であり得る。例えば、患者由来の細胞であり得る。本発明の細胞は、これまでに樹立された細胞株から作製されてもよく、あるいは患者、被験者などから採取された細胞から作製されてもよい。
【０１２７】
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達系を調節する物質のスクリーニングにおいて本発明の細胞を用いることが意図される場合、この細胞において、少なくとも３つのＲＢＰ−Ｊκ配列を含む核酸分子は、プロモーター配列と作動可能に連結されたレポータータンパク質コード配列をさらに含むことが好ましい。このような場合、本発明の細胞は、内因性のＮｏｔｃｈタンパク質を発現する細胞であってもよく、または構成的に活性なＮｏｔｃｈタンパク質を発現する細胞であってもよい。特定の実施形態では、内因性のＮｏｔｃｈタンパク質を発現する細胞であることが好ましい。内因性のＮｏｔｃｈタンパク質を発現する細胞であれば、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達系の調節活性をさらにより正確に調べることができる。別の実施形態では、構成的に活性なＮｏｔｃｈタンパク質を発現する細胞であることが好ましい。構成的に活性なＮｏｔｃｈタンパク質を発現する細胞であれば、レポータータンパク質の発現量が非常に多くなるという利点を有する。
【０１２８】
本発明の細胞は、本発明の核酸分子を目的の細胞に導入することによって得られ得る。
【０１２９】
本発明の核酸分子を導入する細胞（宿主ともいう）の例としては、原核生物および真核生物が挙げられる。核酸分子を導入する細胞は、内因性のＮｏｔｃｈタンパク質を発現するか否か、レポータータンパク質の発現の容易さ、培養の容易さ、増殖の速さ、安全性などの種々の条件を考慮して容易に選択され得る。
【０１３０】
本発明の方法において、本発明の核酸分子を細胞に導入する技術は、当該分野で公知の任意の技術であり得る。また、個々の細胞に対してではなく、組織、器官に対して導入してもよい。このような技術の例としては、例えば、形質転換、形質導入、トランスフェクションなどが挙げられる。例えば、リポフェクトアミンを用いるリポフェクションによって行われてもよい。核酸分子の生物細胞への導入は、一過的（トランジェント）であっても恒常的であってもよい。一過性または恒常性の遺伝子導入の技術はそれぞれ当該分野において周知である。本発明において用いられる細胞を分化させる技術もまた当該分野において周知である。そのような核酸分子の導入技術は、当該分野において周知であり、かつ、慣用されるものであり、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ Ｆ．Ａ．ら編（１９８８）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊら（１９８７）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載される。
【０１３１】
「形質転換体」とは、形質転換によって作製された細胞などの生物体の全部または一部をいう。形質転換体は、その対象に依存して、形質転換細胞、形質転換組織、形質転換宿主などともいわれ、本明細書においてそれらの形態をすべて包含するが、特定の文脈において特定の形態を指し得る。
【０１３２】
本発明の細胞において、本発明の核酸分子（すなわち、少なくとも３つのＲＢＰ−Ｊκ結合配列を含む核酸分子）は、細胞の染色体に導入されていても、導入されていなくてもよい。
【０１３３】
形質転換処理をする際には、必要により、選択マーカーの配列が使用される。選択マーカーとその選択マーカーに適切な選択因子（例えば、抗生物質、色素など）とを組合せて用いることにより、形質転換処理が施された細胞の中から、本発明の核酸分子が導入された細胞をより効率よく選択することができる。しかし、この工程は、本発明において必ずしも必須というわけではない。このような選択方法は、導入された核酸分子が有する選択マーカーの特性によって変動し、例えば、抗生物質（例えば、ネオマイシン（Ｎｅｏｍｙｃｉｎ）、ピューロマイシン（Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ）など）に対する耐性遺伝子が選択マーカーとして導入された場合は、その特定の抗生物質を用いて目的の細胞を選択することができる。あるいは、選択マーカーとして標識遺伝子（例えば、グリーン蛍光遺伝子など）を用いれば、そのような標識を目安に目的の細胞を選択することができる。ただし、少なくとも３つのＲＢＰ−Ｊκ結合配列に連結するレポータータンパク質と選択マーカーとは異なるものであることが好ましい。あるいは、外来遺伝子そのものが表現型に識別可能な差異を生じさせる場合は、そのような差異を目安に遺伝子導入細胞を選択してもよい。そのような識別可能な差異としては、例えば、色素の発現の有無などがあるがそれに限定されない。
【０１３４】
本発明の細胞は、組織を形成していない、単なる細胞として用いられてもよく、あるいは、組織、器官および生物体へと分化したものであってもよい。
【０１３５】
本明細書において、生物の「組織」とは、細胞の集団であって、その集団において一定の同様の作用を有するものをいう。従って、組織は、器官の一部であり得る。器官内では、同じ働きを有する細胞を有することが多いが、微妙に異なる働きを有するものが混在することもあることから、本明細書において組織は、一定の特性を共有する限り、種々の細胞を混在して有していてもよい。通常「組織」は、同じ起源を有するが、異なる起源を持つ細胞集団であっても、同一の機能および／または形態を有するのであれば、組織と呼ばれ得る。通常、組織は、器官の一部を構成する。
【０１３６】
本明細書において、「器官」とは、１つ独立した形態をもち、１種以上の組織が組み合わさって特定の機能を営む構造体を形成したものをいう。本発明が対象とする器官はどのような器官でもよく、また本発明が対象とする組織または細胞は、生物のどの器官に由来するものでもよい。一般に多細胞生物（例えば、動物）では器官は特定の空間的配置をもついくつかの組織からなり、組織は多数の細胞からなる。本発明の器官は、当該分野で周知の形質転換方法に従って作出された細胞を用いて、当該分野で公知の方法に従って組織分化させ、そして器官を形成させることによって入手され得る。
【０１３７】
本明細書において「生物体」とは、当該分野における最も広義に用いられ、生命現象を営むものをいい、代表的には、細胞構造、増殖（自己再生産）、成長、調節性、物質代謝、修復能力など種々の特性を有し、通常、核酸のつかさどる遺伝と、タンパク質のつかさどる代謝の関与する増殖を基本的な属性として有する。生物には、原核生物、真核生物（植物、動物など）などが包含される。好ましくは、本発明では、生物は、動物であり得る。本発明の生物体は、当該分野で周知の形質転換方法に従って作出された細胞を用いて、当該分野で公知の方法に従って再分化させることによって入手され得る。あるいは、本発明の生物体は、当該分野で周知の形質転換方法に従って作出された細胞を再分化させ、形質転換個体を得て、その個体を交配することによって得た子孫から得られる生物体であり得る。
【０１３８】
（４．Ｎｏｔｃｈシグナル伝達系を調節する物質のスクリーニング方法）
本発明によれば、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達系を調節する物質のスクリーニング方法が提供される。この方法は、（ａ）本発明の細胞と候補物質とを接触させる工程；および（ｂ）この細胞中での該レポータータンパク質の発現量を測定する工程を包含する。
【０１３９】
このスクリーニング方法において、候補物質は任意の物質であり得る。候補物質は例えば、化学的に合成された化合物であってもよく、天然から抽出された物質であってもよく、天然から抽出された物質を修飾することにより得られる物質であってもよい。候補物質は、種々の化合物ライブラリーであってもよい。
【０１４０】
候補物質は直接細胞に添加されてもよいが、利便性の面から、候補物質は例えば、溶液中に溶解され、この溶液を細胞に添加することによって、本発明の細胞と接触し得る。
【０１４１】
スクリーニングは、任意のフォーマットで行われ得る。例えば、９６ウェルプレートのような多穴プレートの各ウェルに細胞を入れ、この細胞に、候補物質を含む溶液を添加することによって、本発明の細胞と候補物質とを接触させ得る。次いで、これらの各ウェル中でのレポータータンパク質の発現量が測定され得る。本発明のスクリーニングはインビトロまたはインビボのいずれで行ってもよいが、好ましくはインビトロで行われる。
【０１４２】
より好ましい実施形態では、本発明の、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達系を調節する物質のスクリーニング方法は、（ａ’）本発明の細胞中での前記レポータータンパク質の発現量を測定する工程；（ｂ’）該細胞と候補物質とを接触させる工程；（ｃ’）該細胞中での該レポータータンパク質の発現量を測定する工程；および（ｄ’）工程（ｃ’）での該レポータータンパク質の発現量が工程（ａ’）での該レポータータンパク質の発現量よりも増加したかまたは減少した場合、該候補物質をＮｏｔｃｈシグナル伝達系を調節する物質として選択する工程を包含する。
【０１４３】
工程（ａ’）で発現量を測定する代わりに、細胞と、候補物質を含まないコントロール溶液とを接触させた場合のレポータータンパク質の発現量を測定してもよい。この場合の本発明のスクリーニング方法は、（ａ”）候補物質の存在下での本発明の細胞中でのレポータータンパク質の発現量を測定する工程；（ｂ”）候補物質の非存在下での本発明の細胞中でのレポータータンパク質の発現量を測定する工程；および（ｃ”）工程（ａ”）での発現量と工程（ｂ”）での発現量とを比較する工程を包含する。
【０１４４】
このようにして、候補物質の存在下と非存在下とでレポータータンパク質の発現量が変化（すなわち、増加または減少）した場合、その候補物質は、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達系を調節する物質である。
【０１４５】
本発明のスクリーニング方法を用いて、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達系を調節する物質を選択するだけでなく、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達系に実質的に影響を与えない物質を選択することもできる。本明細書において「Ｎｏｔｃｈシグナル伝達系に実質的に影響を与えない物質」とは、その物質の存在下と非存在下とでのレポータータンパク質の発現量が実質的に同じである物質をいう。「発現量が実質的に同じである」とは、その物質の非存在下での発現量を１００％としたときの１０μＭのその物質の存在下での発現量が、８０％より高く１２０％以下であることをいう。
【０１４６】
レポータータンパク質が発光タンパク質である場合、その発現量は、特定の波長の光を測定することにより測定され得る。特定の発光タンパク質についての特徴的な波長は当業者に公知であり、その測定方法もまた当業者に公知である。
【０１４７】
レポータータンパク質が蛍光タンパク質である場合、その発現量は、適切な波長の光を細胞に当てて蛍光タンパク質を励起し、特定の波長の発光を測定することにより測定され得る。特定の蛍光タンパク質についての特徴的な波長は当業者に公知であり、その測定方法もまた当業者に公知である。
【０１４８】
レポータータンパク質が他の特性を有するタンパク質である場合もそのレポータータンパク質についての発現量の測定法は当業者に公知であり、適切に選択され得る。
【０１４９】
特に好ましい実施形態では、本発明の方法において工程（ｃ’）での該レポータータンパク質の発現量が工程（ａ’）での該レポータータンパク質の発現量よりも増加した場合、あるいは、工程（ａ”）での該レポータータンパク質の発現量が工程（ｂ”）での該レポータータンパク質の発現量よりも増加した場合、この候補物質をＮｏｔｃｈシグナル伝達系の活性化剤として選択する。好ましくは、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達系の活性化剤は、その物質の非存在下での発現量を１００％としたときの１０μＭのその物質の存在下での発現量が、１２０％以上である物質であり、より好ましくは約１５０％以上である物質であり、さらに好ましくは約２００％以上である物質であり、特に好ましくは約３００％以上である物質である。Ｎｏｔｃｈシグナル伝達系の活性化剤は例えば、その物質の非存在下での発現量を１００％としたときの１０μＭのその物質の存在下での発現量が、約５００％以下である物質であり、より好ましくは約４００％以下である物質であり、さらに好ましくは約３００％以下である物質であり、特に好ましくは約２００％以下である物質である。Ｎｏｔｃｈシグナル伝達系の活性化剤は、例えば、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達が抑制された状態を改善するための薬剤として有用である。
【０１５０】
特に好ましい実施形態では、本発明の方法において工程（ｃ’）での該レポータータンパク質の発現量が工程（ａ’）での該レポータータンパク質の発現量よりも減少した場合、あるいは、工程（ａ”）での該レポータータンパク質の発現量が工程（ｂ”）での該レポータータンパク質の発現量よりも減少した場合、この候補物質をＮｏｔｃｈシグナル伝達系の抑制剤として選択する。好ましくは、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達系の抑制剤は、その物質の非存在下での発現量を１００％としたときの１０μＭのその物質の存在下での発現量が、８０％以下である物質であり、より好ましくは約７０％以下である物質であり、さらに好ましくは約６０％以下である物質であり、特に好ましくは約５０％以下である物質である。Ｎｏｔｃｈシグナル伝達系の抑制剤は例えば、その物質の非存在下での発現量を１００％としたときの１０μＭのその物質の存在下での発現量が、約１０％以上である物質であり、より好ましくは約２０％以上である物質であり、さらに好ましくは約３０％以上である物質であり、特に好ましくは約４０％以上である物質である。Ｎｏｔｃｈシグナル伝達系の抑制剤は、例えば、癌などのＮｏｔｃｈシグナル伝達が異常に活性化された状態を改善するための薬剤（すなわち、例えば、抗癌剤）として有用である。
【０１５１】
（５．γ−セクレターゼ阻害薬候補物質から、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達系を抑制しないγ−セクレターゼ阻害薬を選択するためのスクリーニング方法）
本発明によれば、γ−セクレターゼ阻害薬候補物質から、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達系を抑制しないγ−セクレターゼ阻害薬を選択するためのスクリーニング方法が提供される。
【０１５２】
γ−セクレターゼ阻害薬候補物質から、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達系を抑制しないγ−セクレターゼ阻害薬を選択するためのスクリーニング方法は、（ａ）本発明の細胞と該候補物質とを接触させる工程；および（ｂ）該細胞中での該レポータータンパク質の発現量を測定する工程を包含する。
【０１５３】
このスクリーニング方法において、γ−セクレターゼ阻害薬候補物質は任意の物質であり得る。γ−セクレターゼ阻害薬候補物質は例えば、化学的に合成された化合物であってもよく、天然から抽出された物質であってもよく、天然から抽出された物質を修飾することにより得られる物質であってもよい。候補物質は、種々の化合物ライブラリーであってもよい。
【０１５４】
γ−セクレターゼ阻害薬候補物質は直接細胞に添加されてもよいが、利便性の面から、γ−セクレターゼ阻害薬候補物質は例えば、溶液中に溶解され、この溶液を細胞に添加することによって、本発明の細胞と接触し得る。
【０１５５】
スクリーニングは、任意のフォーマットで行われ得る。例えば、９６ウェルプレートのような多穴プレートの各ウェルに細胞を入れ、この細胞に、γ−セクレターゼ阻害薬候補物質を含む溶液を添加することによって、本発明の細胞とγ−セクレターゼ阻害薬候補物質とを接触させ得る。次いで、これらの各ウェル中でのレポータータンパク質の発現量が測定され得る。本発明のスクリーニングはインビトロまたはインビボのいずれで行ってもよいが、好ましくはインビトロで行われる。
【０１５６】
より好ましい実施形態では、本発明の、γ−セクレターゼ阻害薬候補物質から、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達系を抑制しないγ−セクレターゼ阻害薬を選択するためのスクリーニング方法は、（ａ’）本発明の細胞中での前記レポータータンパク質の発現量を測定する工程；（ｂ’）該細胞と候補物質とを接触させる工程；（ｃ’）該細胞中での該レポータータンパク質の発現量を測定する工程；および（ｄ’）工程（ｃ’）での該レポータータンパク質の発現量が工程（ａ’）での該レポータータンパク質の発現量と実質的に同じである場合、該候補物質をＮｏｔｃｈシグナル伝達系を抑制しないγ−セクレターゼ阻害薬として選択する工程を包含する。
【０１５７】
工程（ａ’）で発現量を測定する代わりに、細胞と、γ−セクレターゼ阻害薬候補物質を含まないコントロール溶液とを接触させた場合のレポータータンパク質の発現量を測定してもよい。この場合の本発明のスクリーニング方法は、（ａ”）候補物質の存在下での本発明の細胞中でのレポータータンパク質の発現量を測定する工程；（ｂ”）候補物質の非存在下での本発明の細胞中でのレポータータンパク質の発現量を測定する工程；および（ｃ”）工程（ａ”）での発現量と工程（ｂ”）での発現量とを比較する工程を包含する。
【０１５８】
このようにして、γ−セクレターゼ阻害薬候補物質の存在下と非存在下とでレポータータンパク質の発現量が減少した場合、その候補物質は、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達系を抑制する物質であり、レポータータンパク質の発現量が変化しないかまたは増加した場合、その候補物質は、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達系を抑制しない物質である。
【０１５９】
好ましくは、γ−セクレターゼ阻害薬は、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達系を実質的に抑制しない物質である。「Ｎｏｔｃｈシグナル伝達系を実質的に抑制しない物質」とは、その物質の存在下でのレポータータンパク質の発現量が、その物質の非存在下でのレポータータンパク質の発現量と実質的に同じであるかまたは多い物質をいう。さらに好ましくは、γ−セクレターゼ阻害薬は、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達系に実質的に影響を与えない物質である。好ましくは、γ−セクレターゼ阻害薬は、この物質の非存在下での発現量を１００％としたときのこの物質の存在下での発現量が、８０％〜約１２０％である物質であり、より好ましくは約９０％〜約１１０％である物質である。
【０１６０】
本発明のスクリーニング方法を用いることにより、アルツハイマー病治療薬候補であるγ−セクレターゼ阻害薬の副作用の検討を行うことができる。本発明のスクリーニング方法によれば、このような検討を、特に、ハイスループットスクリーニング（ｈｉｇｈ ｔｈｒｏｕｇｈ−ｐｕｔ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）によって行うことができるという顕著な効果を有する。
【０１６１】
本発明のスクリーニング方法を用いることにより、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達阻害型抗がん剤の主作用の検討を行うことができる。本発明のスクローニング方法によれば、このような検討を、特に、ハイスループットスクリーニングによって行うことができるという顕著な効果を有する。
【０１６２】
（６．Ａβ４２の産生を抑制するアルツハイマー病治療薬候補物質から、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達系を抑制しないアルツハイマー病治療薬を選択するためのスクリーニング方法）
本発明によれば、Ａβ４２の産生を抑制するアルツハイマー病治療薬候補物質から、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達系を抑制しないアルツハイマー病治療薬を選択するためのスクリーニング方法が提供される。
【０１６３】
Ａβ４２の産生を抑制するアルツハイマー病治療薬候補物質から、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達系を抑制しないアルツハイマー病治療薬を選択するためのスクリーニング方法は、（ａ）本発明の細胞と該候補物質とを接触させる工程；および（ｂ）該細胞中での該レポータータンパク質の発現量を測定する工程を包含する。
【０１６４】
このスクリーニング方法において、Ａβ４２の産生を抑制するアルツハイマー病治療薬候補物質は、Ａβ４２の産生を抑制する任意の物質であり得る。Ａβ４２の産生を抑制するアルツハイマー病治療薬候補物質は例えば、化学的に合成された化合物であってもよく、天然から抽出された物質であってもよく、天然から抽出された物質を修飾することにより得られる物質であってもよい。候補物質は、種々の化合物ライブラリーであってもよい。
【０１６５】
Ａβ４２の産生を抑制するアルツハイマー病治療薬候補物質は直接細胞に添加されてもよいが、利便性の面から、Ａβ４２の産生を抑制するアルツハイマー病治療薬候補物質は例えば、溶液中に溶解され、この溶液を細胞に添加することによって、本発明の細胞と接触し得る。
【０１６６】
スクリーニングは、任意のフォーマットで行われ得る。例えば、９６ウェルプレートのような多穴プレートの各ウェルに細胞を入れ、この細胞に、Ａβ４２の産生を抑制するアルツハイマー病治療薬候補物質を含む溶液を添加することによって、本発明の細胞とＡβ４２の産生を抑制するアルツハイマー病治療薬候補物質とを接触させ得る。次いで、これらの各ウェル中でのレポータータンパク質の発現量が測定され得る。本発明のスクリーニングはインビトロまたはインビボのいずれで行ってもよいが、好ましくはインビトロで行われる。
【０１６７】
より好ましい実施形態では、本発明の、Ａβ４２の産生を抑制するアルツハイマー病治療薬候補物質から、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達系を抑制しないアルツハイマー病治療薬を選択するためのスクリーニング方法は、（ａ’）本発明の細胞中での前記レポータータンパク質の発現量を測定する工程；（ｂ’）該細胞と候補物質とを接触させる工程；（ｃ’）該細胞中での該レポータータンパク質の発現量を測定する工程；および（ｄ’）工程（ｃ’）での該レポータータンパク質の発現量が工程（ａ’）での該レポータータンパク質の発現量と実質的に同じである場合、該候補物質をＮｏｔｃｈシグナル伝達系を抑制しないＡβ４２産生阻害薬として選択する工程を包含する。
【０１６８】
工程（ａ’）で発現量を測定する代わりに、細胞と、Ａβ４２の産生を抑制するアルツハイマー病治療薬候補物質を含まないコントロール溶液とを接触させた場合のレポータータンパク質の発現量を測定してもよい。この場合の本発明のスクリーニング方法は、（ａ”）候補物質の存在下での本発明の細胞中でのレポータータンパク質の発現量を測定する工程；（ｂ”）候補物質の非存在下での本発明の細胞中でのレポータータンパク質の発現量を測定する工程；および（ｃ”）工程（ａ”）での発現量と工程（ｂ”）での発現量とを比較する工程を包含する。
【０１６９】
このようにして、Ａβ４２の産生を抑制するアルツハイマー病治療薬候補物質の存在下と非存在下とでレポータータンパク質の発現量が減少した場合、その候補物質は、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達系を抑制する物質であり、レポータータンパク質の発現量が変化しないかまたは増加した場合、その候補物質は、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達系を抑制しない物質である。
【０１７０】
好ましくは、この候補物質は、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達系を実質的に抑制しない物質である。「Ｎｏｔｃｈシグナル伝達系を実質的に抑制しない物質」とは、その物質の存在下でのレポータータンパク質の発現量が、その物質の非存在下でのレポータータンパク質の発現量と実質的に同じであるかまたは多い物質をいう。さらに好ましくは、アルツハイマー病治療薬は、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達系に実質的に影響を与えない物質である。好ましくは、アルツハイマー病治療薬は、この物質の非存在下での発現量を１００％としたときのこの物質の存在下での発現量が、約８０％〜約１２０％である物質であり、より好ましくは約９０％〜約１１０％である物質である。
【０１７１】
本発明のスクリーニング方法を用いることにより、アルツハイマー病治療薬候補であるＡβ４２産生抑制薬の副作用の検討を行うことができる。本発明のスクリーニング方法によれば、このような検討を、特に、ハイスループットスクリーニング（ｈｉｇｈ ｔｈｒｏｕｇｈ−ｐｕｔ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）によって行うことができるという顕著な効果を有する。本発明のスクリーニング方法を用いることにより、Ａβ４２の産生を抑制しながらも、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達に実質的に影響を与えないアルツハイマー病治療薬を得ることができる。
【０１７２】
本発明のスクリーニング方法を用いることにより、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達阻害型抗がん剤の主作用の検討を行うことができる。本発明のスクローニング方法によれば、このような検討を、特に、ハイスループットスクリーニングによって行うことができるという顕著な効果を有する。
【０１７３】
（７．キット）
本発明によれば、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達系を調節する物質のスクリーニング方法において使用するためのキットが提供される。このキットは、本発明の細胞およびレポータータンパク質の発現量を測定するための試薬を備える。
【０１７４】
本発明によれば、γ−セクレターゼ阻害薬候補物質あるいはＡβ４２産生抑制薬候補物質から、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達系を抑制しないγ−セクレターゼ阻害薬あるいはＡβ４２産生抑制薬を選択するためのスクリーニング方法において使用するためのキットもまた提供される。このキットは、本発明の細胞；レポータータンパク質の発現量を測定するための試薬を備える。このキットはまた、使用説明書、ポジティブコントロール（例えば、ＤＡＰＴ、Ｌ−６８５４５８）、ネガティブコントロール（例えば、スリンダクスルフィド、インドメタシン、イブプロフェン，Ｒ−フルビプロフェン）などを備え得る。
【０１７５】
ＤＡＰＴは、Ｎ−［Ｎ−（３，５−ジフルオロフェナセチル−Ｌ−アラニル）］−Ｓ−フェニルグリシン ｔ−ブチルエステル（Ｎ−［Ｎ−（３，５−Ｄｉｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎａｃｅｔｙｌ−Ｌ−ａｌａｎｙｌ）］−Ｓ−ｐｈｅｎｙｌｇｌｙｃｉｎｅ ｔ−Ｂｕｔｙｌ Ｅｓｔｅｒ）であり、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達系も阻害するγ−セクレターゼ阻害剤として公知である（Ｄｏｖｅｙ ｅｔ ａｌ． （２００１） Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｇａｍｍａ−ｓｅｃｒｅｔａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｒｅｄｕｃｅ ｂｅｔａ−ａｍｙｌｏｉｄ ｐｅｐｔｉｄｅ ｌｅｖｅｌｓ ｉｎ ｂｒａｉｎ． Ｊ． Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ． ７６， １７３-１８１．）。
【０１７６】
Ｌ−６８５４５８は、｛１Ｓ−Ｂｅｎｚｙｌ−４Ｒ−［１−（１Ｓ−ｃａｒｂａｍｏｙｌ−２−ｐｈｅｎｙｌｅｔｈｙｌｃａｒｂａｍｏｙｌ）−１Ｓ−３−ｍｅｔｈｙｌｂｕｔｙｌｃａｒｂａｍｏｙｌ］−２Ｒ−ｈｙｄｒｏｘｙ−５−ｐｈｅｎｙｌｐｅｎｔｙｌ｝ｃａｒｂａｍｉｃ ａｃｉｄ ｔｅｒｔ−ｂｕｔｙｌ ｅｓｔｅｒであり、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達系も阻害するγ−セクレターゼ阻害剤として公知である（Ｓｈｅａｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｌ−６８５，４５８， ａｎ ａｓｐａｒｔｙｌ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ ｓｔａｔｅ ｍｉｍｉｃ， ｉｓ ａ ｐｏｔｅｎｔ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ａｍｙｌｏｉｄ ｂｅｔａ−ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｇａｍｍａ−ｓｅｃｒｅｔａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ． ２０００ Ａｕｇ １；３９（３０）：８６９８−７０４．)。
【０１７７】
スリンダクスルフィドは、（Ｚ）−５−フルオロ−２−メチル−１−［ｐ−（メチルチオ）ベンジリデン］インデン−３−酢酸（（Ｚ）−５−Ｆｌｕｏｒｏ−２−ｍｅｔｈｙｌ−１−［ｐ−（ｍｅｔｈｙｌｔｈｉｏ）ｂｅｎｚｙｌｉｄｅｎｅ］ｉｎｄｅｎｅ−３−ａｃｅｔｉｃ Ａｃｉｄ）であり、Ａβ４２産生抑制活性があるが、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達系に何の影響も与えないことが公知である(Ｗｅｇｇｅｎ Ｓ ｅｔ ａｌ．， Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｔｈａｔ ｎｏｎｓｔｅｒｏｉｄａｌ ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｄｒｕｇｓ ｄｅｃｒｅａｓｅ ａｍｙｌｏｉｄ ｂｅｔａ ４２ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ ｄｉｒｅｃｔ ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｇａｍｍａ−ｓｅｃｒｅｔａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． ２００３ Ａｕｇ ２２，２７８（３４）：３１８３１−７；Ｗｅｇｇｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ａｂｅｔａ４２−ｌｏｗｅｒｉｎｇ ｎｏｎｓｔｅｒｏｉｄａｌ ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｄｒｕｇｓ ｐｒｅｓｅｒｖｅ ｉｎｔｒａｍｅｍｂｒａｎｅ ｃｌｅａｖａｇｅ ｏｆ ｔｈｅ ａｍｙｌｏｉｄ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ （ＡＰＰ） ａｎｄ ＥｒｂＢ−４ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｎｄ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ ＡＰＰ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｏｍａｉｎ． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． ２００３ Ａｕｇ １５，２７８（３３）：３０７４８−５４；Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．， Ｓｕｌｉｎｄａｃ ｓｕｌｆｉｄｅ ｉｓ ａ ｎｏｎｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ｇａｍｍａ−ｓｅｃｒｅｔａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｔｈａｔ ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｒｅｄｕｃｅｓ Ａｂｅｔａ ４２ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． ２００３ Ｍａｙ １６，２７８（２０）：１８６６４−７０；Ｗｅｇｇｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ａ ｓｕｂｓｅｔ ｏｆ ＮＳＡＩＤｓ ｌｏｗｅｒ ａｍｙｌｏｉｄｏｇｅｎｉｃ Ａｂｅｔａ４２ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ ｏｆ ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ． Ｎａｔｕｒｅ． ２００１ Ｎｏｖ ８，４１４（６８６０）：２１２−６）。
【０１７８】
（８．組成物）
本発明の組成物は、内因性のＮｏｔｃｈシグナルの調節を測定するための組成物である。本発明の組成物は、少なくとも３つのＲＢＰ−Ｊκ結合配列を含む核酸分子を含み、該ＲＢＰ−Ｊκ結合配列が、ＴＧＧＧＡＡである。
【０１７９】
本発明の組成物に含まれる核酸分子については、上記（１．少なくとも３つのＲＢＰ−Ｊκ結合配列を含む核酸分子）の項目に記載したとおりである。
【０１８０】
本発明の組成物は、液体であっても固体であってもよい。
【実施例】
【０１８１】
（実施例１．各種プラスミドの作製）
（実施例１−１：Ｈｅｓ１−ｌｕｃ ｘ２、Ｈｅｓ１−ｌｕｃ ｘ３、およびＨｅｓ１−ｌｕｃ ｘ４の作製）
Ｈｅｓ１ｐ−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ（Ｊａｒｒｉａｕｌｔ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ３７７，３５５−３５８，１９９５）にＱｕｉｋｃｈａｎｇｅ ＩＩ ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）およびプライマー１：ＣＧＴＧＴＣＴＣＴＴＣＣＴＣＣＣＧＣＴＡＧＣＴＧＡＡＡＧＴＴＡＣＴＧ（配列番号９）；プライマー２：ＣＡＧＴＡＡＣＴＴＴＣＡＧＣＴＡＧＣＧＧＧＡＧＧＡＡＧＡＧＡＣＡＣＧ（配列番号１０）を用いて９５℃ ３０秒、５５℃ １分、６８℃ ６分を１６回繰り返す条件でＰＣＲを行うことにより、ＮｈｅＩ 制限酵素部位を導入し、Ｈｅｓ１−ｌｕｃ−ＮｈｅＩを作製した。このプラスミドのＲＢＰ−Ｊκ結合部位を下記のプライマーを用い、９４℃ ３０秒、６０℃ ３０秒、７２℃ ３０秒を２０回繰り返すの条件でＰＣＲで増幅した：
プライマー３：ＣＧＣＴＡＧＣＴＧＡＡＡＧＴＴＡＣＴＧＧＴＧＧ（配列番号１１）；および
プライマー４：ＧＴＣＴＡＧＡＧＧＣＴＣＧＴＧＴＧＡＡＡＣＴＴＣＣ（配列番号１２）。増幅した断片をｐＧＥＭ−Ｔ Ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）に挿入して連結してプラスミドを得た。このプラスミドを制限酵素ＮｈｅＩおよびＸｂａＩで処理することにより、ＲＢＰ−Ｊκ配列を２つ含むＮｈｅＩ−ＸｂａＩ断片を作製した。この作成した断片を、Ｈｅｓ１−ｌｕｃ−ＮｈｅＩのＮｈｅＩ部位にそれぞれ１〜３個挿入することにより、Ｈｅｓ１−ｌｕｃ ｘ２、Ｈｅｓ１−ｌｕｃ ｘ３、およびＨｅｓ１−ｌｕｃ ｘ４（Ｈｅｓ−Ｙとも記載する）を作製した。これらのプラスミドの構造の模式図を図７ａおよび図１３（ａ）に示す。Ｈｅｓ１−ｌｕｃ ｘ４（Ｈｅｓ−Ｙ）のＮｈｅＩ部位の２６塩基上流の部位からＨｉｎｄＩＩＩ部位までの配列を図１３（ｂ）に示す。Ｈｅｓ１−ｌｕｃ ｘ２は、４つのＲＢＰ−Ｊκ結合配列を含む。Ｈｅｓ１−ｌｕｃ ｘ３は、６つのＲＢＰ−Ｊκ結合配列を含む。Ｈｅｓ１−ｌｕｃ ｘ４は、８つのＲＢＰ−Ｊκ結合配列を含む。
【０１８２】
（実施例１−２：Ｈｅｓ−ＹＰ ＮｅｏおよびＨｅｓ−ＹＰ Ｐｕｒｏの作製）
Ｈｅｓ−ＹをＮｈｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで処理することにより、８つのＲＢＰ−Ｊκ配列を含むＮｈｅＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を得た。このＮｈｅＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片をｐＧＬ４．１８（ｌｕｃ２Ｐ／Ｎｅｏ）ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社）およびｐＧＬ４．２１（ｌｕｃ２Ｐ／Ｐｕｒｏ）ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社）にそれぞれ導入することにより、Ｈｅｓ−ＹＰ ＮｅｏおよびＨｅｓ−ＹＰ Ｐｕｒｏを作製した。これらのプラスミドの構造の模式図を図８ａに示す。ｐＧＬ４．１８およびｐＧＬ４．２１にはもともとルシフェラーゼコード配列の下流にＰＥＳＴ配列が含まれているため、得られたＨｅｓ−ＹＰ ＮｅｏおよびＨｅｓ−ＹＰ Ｐｕｒｏにも、ＰＥＳＴ配列コード配列が含まれている。
【０１８３】
（実施例１−３：ＴＰ−Ｙの作製）
ｐＧＡ９８１−６（Ｍｉｎｏｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１７（５），２６７９−８７，１９９７）のＲＢＰ−Ｊκ結合部位を下記のプライマーを用い、９４℃ ３０秒、６０℃ ３０秒、７２℃ １分を２０回繰り返す条件を用いてＰＣＲで増幅した：
プライマー５：ＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＴＣＴＡＧ（配列番号１３）および
プライマー６：ＡＧＡＴＣＴＣＣＡＡＧＡＴＧＣＡＴＡＣＡＧＴＧＧＡＴＣ（配列番号１４）。
【０１８４】
増幅した断片をｐＧＥＭ−Ｔ Ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）に挿入し、制限酵素ＢａｍＨＩ−ＢｇｌＩＩで処理することにより作成した断片を、ｐＧＡ９８１−６のＢａｍＨＩ部位に挿入し、ＴＰ−Ｙを作製した。ＴＰ−Ｙは、２４個のＲＢＰ−Ｊκ配列を含む。ＴＰ−Ｙの構造の模式図を図７ａに示す。ＴＰ−Ｙの２４個のＲＢＰ−Ｊκ配列を含む領域とｐＵＣ１８ベクター、ウサギβ−グロビン最小プロモーターおよびルシフェラーゼ遺伝子との連結部の配列を図９に示す。
【０１８５】
（実施例２．Ｎｏｔｃｈシグナル伝達系活性化に対する各プロモーターの反応）
培養細胞におけるトランジェント・アッセイを用い、Ｈｅｓ１−ｌｕｃ ｘ２、Ｈｅｓ１−ｌｕｃ ｘ３、Ｈｅｓ−ＹおよびＴＰ−ＹのＮｏｔｃｈシグナル伝達系活性化に対する反応を調べた。比較のために、プラスミドＨｅｓ１−ｌｕｃおよびｐＧＡ９８１−６を用いた。
【０１８６】
１０％ＦＣＳ（ウシ胎仔血清）を含有するＤＭＥＭ（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８，３９６（１９５９））を用い、５％ＣＯ２、３７℃の条件下でＨｅＬａ細胞を培養した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ社）を用い、添付のプロトコールに従って、レポーターとしてＨｅｓ１−ｌｕｃ、Ｈｅｓ１−ｌｕｃ ｘ２、Ｈｅｓ１−ｌｕｃ ｘ３、Ｈｅｓ−Ｙ、ｐＧＡ９８１−６またはＴＰ−Ｙと、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達系を活性化するための活性型ＮｏｔｃｈコンストラクトであるＣＣ＞ＳＳ（Ｍｕｍｍ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ ５，１９７−２０６，２０００）と内部コントロールレポーターとしてウミシイタケルシフェラーゼを発現するベクターであるｐＲＬ−Ｔｋベクターを導入した。この工程を、本明細書中ではリポフェクション（ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎ）という。
【０１８７】
ネガティブコントロールとして、ＣＣ＞ＳＳを導入せず、ｐｃＤＮＡ３．１ Ｈｙｇｒｏ（＋）ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を導入する実験も行った。
【０１８８】
リポフェクションを行ってから２４時間後、それぞれの細胞を溶解し、Ｄｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いて、蛍光強度を測った。結果を図７（ｂ）に示す。この図においては、Ｈｅｓ１−ｌｕｃをＣＣ＞ＳＳとともに共発現したときの蛍光活性（図中ではＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ活性と示す）を１として他のコンストラクトを用いたときの蛍光活性の相対値を示した。
【０１８９】
この結果、ＲＢＰ−Ｊκ結合配列の増加とともにルシフェラーゼ活性の増加が認められた。しかも、原理はわからないが、ＲＢＰ−Ｊκ結合配列を複数連結することにより、ネガティブコントロールを用いた場合の蛍光強度（すなわち、バックグラウンド）が顕著に低下した。これは驚くべき結果であった。これらの各コンストラクトを用いたときのＳ／Ｎ比は、Ｈｅｓ１−ｌｕｃの場合が１．５４であるのに対して、Ｈｅｓ１−ｌｕｃ ｘ２の場合に８．６７、Ｈｅｓ１−ｌｕｃ ｘ３の場合に１３．９０、Ｈｅｓ−Ｙの場合に１８．６４であった。また、ｐＧＡ９８１−６の場合が５．９８であるのに対して、ＴＰ−Ｙのい場合が２７．１２であった。Ｓ／Ｎ比は、ＣＣ＞ＳＳプラスミドと共発現した場合の蛍光強度をｐｃＤＮＡ３．１ Ｈｙｇｒｏ（＋）ベクターと共発現下場合の蛍光強度で除算することにより得られる。このように、ＲＢＰ−Ｊκ結合配列を複数連結することにより、ＳＮ比が飛躍的に向上した。
【０１９０】
（実施例３．Ｎｏｔｃｈシグナル伝達系活性化に対する各プロモーターの反応）
培養細胞におけるトランジェント・アッセイを用い、Ｈｅｓ１−ｌｕｃ、Ｈｅｓ−Ｙ、Ｈｅｓ−ＹＰ ＮｅｏおよびＨｅｓ−ＹＰ ＰｕｒｏのＮｏｔｃｈシグナル伝達系活性化に対する反応を調べた。
【０１９１】
１０％ＦＣＳを含有するＤＭＥＭを用い、５％ＣＯ２、３７℃の条件下でＨｅＬａ細胞を培養した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ社）を用い、添付のプロトコールに従って、レポーターとしてＨｅｓ１−ｌｕｃ、Ｈｅｓ−Ｙ、Ｈｅｓ−ＹＰ ＮｅｏまたはＨｅｓ−ＹＰ Ｐｕｒｏと、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達系を活性化するための活性型ＮｏｔｃｈコンストラクトのＣＣ＞ＳＳ（Ｍｕｍｍ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ ５，１９７−２０６，２０００）と内部コントロールレポーターとしてウミシイタケルシフェラーゼを発現するベクターであるｐＧＬ４．７４［ｈＲｌｕｃ／ＴＫ］ベクターをを導入した。
【０１９２】
ネガティブコントロールとして、ＣＣ＞ＳＳを導入せず、ｐｃＤＮＡ３．１ Ｈｙｇｒｏ（＋）ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を導入する実験も行った。
【０１９３】
リポフェクションを行ってから２４時間後、それぞれの細胞を溶解し、Ｄｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いて、蛍光強度を測った。結果を図８（ｂ）に示す。図８（ｂ）は、これらのＮｏｔｃｈレポーターアッセイ用コンストラクトと、活性型Ｎｏｔｃｈとを共発現した時のルシフェラーゼ活性を示すグラフである。図８（ｃ）は、これらのＮｏｔｃｈレポーターアッセイ用コンストラクトと、活性型Ｎｏｔｃｈとを共発現した時のルシフェラーゼ活性を、活性型Ｎｏｔｃｈを用いた場合のそれぞれの活性を１として示すグラフである。
【０１９４】
Ｈｅｓ１−ｌｕｃを用いた場合と比較して、Ｈｅｓ−Ｙ、Ｈｅｓ−ＹＰ ＮｅｏまたはＨｅｓ−ＹＰ Ｐｕｒｏを用いた場合は、蛍光強度（図８（ｂ）中ではＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ活性と記載する）が著しく改善し、特に、Ｈｅｓ−ＹＰ ＮｅｏまたはＨｅｓ−ＹＰ Ｐｕｒｏを用いた場合の蛍光強度は非常に高かった。このことから、ｐＧＬ２ベクターからｐＧＬ４ベクターに入れ替えることによって蛍光強度の顕著な増強が得られることがわかった。
【０１９５】
しかも、原理はわからないが、図８（ｃ）からわかるように、Ｈｅｓ−Ｙ、Ｈｅｓ−ＹＰ ＮｅｏまたはＨｅｓ−ＹＰ Ｐｕｒｏを用いた場合には、ネガティブコントロールを用いた場合の蛍光強度（すなわち、バックグラウンド）が顕著に低下した。これは驚くべき結果であった。このように、ＲＢＰ−Ｊκ結合配列を複数連結し、ＰＥＳＴ配列をもつルシフェラーゼレポータープラスミドに挿入した結果、感度が著しく上昇した。
【０１９６】
（実施例４．内因性Ｎｏｔｃｈシグナル伝達の阻害の測定）
培養細胞におけるトランジェント・アッセイを用い、Ｈｅｓ−ＹおよびＨｅｓ−ＹＰ Ｎｅｏが内因性のＮｏｔｃｈシグナル伝達の阻害を測定できるかどうか調べた。
【０１９７】
１０％ＦＣＳを含有するＤＭＥＭを用い、５％ＣＯ２、３７℃の条件下でＨｅＬａ細胞を培養した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ社）を用い、添付のプロトコールに従って、レポーターとしてＨｅｓ−ＹまたはＨｅｓ−ＹＰ Ｎｅｏと、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達系を活性化するための活性型ＮｏｔｃｈコンストラクトのＣＣ＞ＳＳ（Ｍｕｍｍ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ ５，１９７−２０６，２０００）とを導入した。
【０１９８】
ネガティブコントロールとして、ＣＣ＞ＳＳを導入せず、ｐｃＤＮＡ３．１ Ｈｙｇｒｏ（＋）ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を導入する実験も行った。
【０１９９】
リポフェクションを行ってから２４時間後、γ−セクレターゼ阻害剤であるＤＡＰＴを１０μＭ含むＤＭＥＭ培地を２５０μｌ添加し、３７℃にてインキュベートしながら０時間から２４時間後の蛍光強度を測定して、ＤＡＰＴのＮｏｔｃｈシグナル伝達系への影響を調べた。これらの実験を９６ウェルプレートを用いて行った。Ｈｅｓ−ＹおよびＨｅｓ−ＹＰ ｎｅｏを用いた場合の結果を図１０に示す。
【０２００】
この結果、活性型Ｎｏｔｃｈ１を共発現させた場合も共発現させなかった場合も、添加後の蛍光強度（図中ではＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ活性と示す）の低下が見られた。このことは、ＤＡＰＴによってＮｏｔｃｈシグナルの伝達が阻害されたことを示す。従って、活性型Ｎｏｔｃｈ１を共発現させなくても、ＤＡＰＴによる内因性のＮｏｔｃｈシグナルの阻害を測定できることがわかった。また、Ｈｅｓ−ＹおよびＨｅｓ−ＹＰ Ｎｅｏのいずれを用いた場合も、内因性のＮｏｔｃｈシグナルの阻害を測定できることがわかった。それゆえ、これらのプラスミドを用いれば、内因性のＮｏｔｃｈシグナル伝達系に影響を与える物質をスクリーニングすることができる。
【０２０１】
（実施例５．薬剤によるＨＥＫ２９３細胞の内因性Ｎｏｔｃｈシグナルの影響）
培養細胞におけるトランジェント・アッセイを用い、Ｈｅｓ−ＹＰ ｎｅｏを用いて、薬剤による内因性のＮｏｔｃｈシグナル伝達系への影響を調べた。
【０２０２】
１０％ＦＣＳを含有するＤＭＥＭを用い、５％ＣＯ２、３７℃の条件下でＨＥＫ２９３細胞を培養した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ社）を用い、添付のプロトコールに従って、レポーターとしてＨｅｓ−ＹＰ ｎｅｏを導入した。
【０２０３】
リポフェクションを行ってから２４時間後、Ａβ４２の産生もＮｏｔｃｈシグナル伝達系も抑制するγ−セクレターゼ阻害薬であるＤＡＰＴ（０．００１μＭ、０．００３μＭ，０．０１μＭ、０．０３μＭ、 ０．１ μＭ、０．３μＭ、１μＭ、３μＭまたは１０μＭ）またはＬ−６８５４５８（０．００３μＭ，０．０１μＭ、０．０３μＭ、 ０．１ μＭ、０．３μＭ、１μＭ、３μＭ、１０μＭ、または３０μＭ）、あるいはＡβ４２の産生を抑制するがＮｏｔｃｈシグナル伝達系を抑制しないγ−セクレターゼ阻害薬であるスリンダクスルフィド（Ｓｕｌｉｎｄａｃ ｓｕｌｆｉｄｅ）（０．８０μＭ、１．５７μＭ、３．１３μＭ、６．２５μＭ、１２．５μＭ、２５μＭ、５０μＭまたは１００μＭ）を各種濃度で添加して３７℃にて２４時間インキュベートした。
【０２０４】
添加から２４時間後の蛍光強度を測定して、各種薬剤のＮｏｔｃｈシグナル伝達系への影響を調べた。また、コントロールとして、各種薬剤を添加せず、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）を添加した場合の蛍光強度も測定した。ＤＡＰＴを１０μＭ添加した場合およびコントロールの結果を図１１（ａ）に示す。図１１（ａ）からわかるように、活性型Ｎｏｔｃｈを共発現させなくても蛍光強度の測定ができ、しかも、γ−セクレターゼ阻害薬による蛍光強度の減少を測定できる。このように、この系を用いれば、各種薬物が内因性のＮｏｔｃｈシグナルに対して与える影響を確認することができる。
【０２０５】
Ｈｅｓ−ＹＰ ｎｅｏコンストラクトを用い、各薬剤を添加した場合のルシフェラーゼ活性の蛍光強度を、図１１（ｂ）に示す。図１１（ｂ）においては、コントロールの蛍光強度を１００％としたときの相対強度を示す。この結果、γ−セクレターゼ阻害薬（ＤＡＰＴまたはＬ−６８５４５８）の添加により、内因性のＮｏｔｃｈシグナルが阻害され、阻害薬でなく修飾薬（スリンダクスルフィド）を用いた場合には内因性のＮｏｔｃｈシグナルは影響を受けないことが確認された。このことから、本発明により、各種薬物が内因性のＮｏｔｃｈシグナルに対して与える影響を正しく確認することができる。従って、本発明の方法を、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達系に影響を与えない物質のスクリーニングに用いることができること、特に、Ａβ４２産生を阻害するがＮｏｔｃｈシグナル伝達系に影響を与えない物質のスクリーニングに用いることができることがわかった。既存技術ではＮｏｔｃｈコンストラクトを人工的に共発現させて初めてシグナルの検知が可能であった。しかし本発明によればＮｏｔｃｈコンストラクトを発現させることなく内因性シグナルの検知が可能となった。また上記のように、本発明によれば、薬剤による内因性シグナルへの影響も検知することが可能である。
【０２０６】
（実施例６：各プロモーターでのＮｏｔｃｈシグナルアッセイ系パラメーターの挙動）
培養細胞におけるトランジェント・アッセイを用い、Ｈｅｓ１−ｌｕｃ ｘ２、Ｈｅｓ１−ｌｕｃ ｘ３、Ｈｅｓ−ＹおよびＨｅｓ−ＹＰ ＮｅｏのＮｏｔｃｈシグナルアッセイ系パラメーターであるＳ／ＢおよびＺ’ ｆａｃｔｏｒ（Ｊｉ−Ｈｕ Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｃｒｅｅｎ．５，６７−７３，１９９９）について調べた。比較のために、プラスミドＨｓｅ１−ｌｕｃを用いた。
【０２０７】
１０％ＦＣＳを含有するＤＭＥＭを用い、５％ＣＯ２、３７℃の条件下でＨｅＬａ細胞を培養した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ社）を用い、添付のプロトコールに従って、レポーターとしてＨｅｓ１−ｌｕｃ、Ｈｅｓ１−ｌｕｃ ｘ２、Ｈｅｓ１−ｌｕｃ ｘ３、Ｈｅｓ−ＹまたはＨｅｓ−ＹＰ Ｎｅｏと、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達系を活性化するための活性型ＮｏｔｃｈコンストラクトのＣＣ＞ＳＳ（Ｍｕｍｍ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ ５，１９７−２０６，２０００）とを導入した。
【０２０８】
リポフェクションを行ってから２４時間後、、ＤＡＰＴ濃度１０μＭのＤＭＥＭ培養液（ＤＭＳＯ濃度０．１％）および無添加のＤＭＥＭ培養液（ＤＭＳＯ濃度０．１％）を３７℃にて２４時間インキュベートした後、細胞を溶解し、Ｄｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いて、蛍光強度を測った。シグナルとしてＤＭＳＯのみ添加したもの、またバックグラウンドとしてＮｏｔｃｈシグナル伝達系を阻害するのに十分量のＤＡＰＴ（１０μＭ）を添加したものの蛍光強度を測った。本系においては９６ウェルプレートを用いた。得られた結果を図１２（ａ）〜図１２（ｅ）に示す。Ｈｅｓ−１コンストラクトを用い、ＤＡＰＴを１０μＭ添加した場合およびコントロールの結果を図１２（ａ）に示す。Ｈｅｓ−ＹＰ ｎｅｏコンストラクトを用い、ＤＡＰＴを１０μＭ添加した場合およびコントロールの結果を図１２（ｂ）に示す。Ｈｅｓ１−ｌｕｃｘ２コンストラクトを用い、ＤＡＰＴを１０μＭ添加した場合およびコントロールの結果を図１２（ｃ）に示す。Ｈｅｓ−１−ｌｕｃｘ３コンストラクトを用い、ＤＡＰＴを１０μＭ添加した場合およびコントロールの結果を図１２（ｄ）に示す。Ｈｅｓ−Ｙコンストラクトを用い、ＤＡＰＴを１０μＭ添加した場合およびコントロールの結果を図１２（ｅ）に示す。
【０２０９】
この結果、ＲＢＰ−Ｊκ結合配列の数が増加するにつれ、Ｓ／ＢおよびＺ’ ｆａｃｔｏｒも増加した。またＲＢＰ−Ｊ結合配列の数が増加するにつれ、Ｚ’ ｆａｃｔｏｒが理想値である１に近づいた。ＲＢＰ−Ｊκ結合配列の増加とともにルシフェラーゼ活性の増加が認められる。複数連結することにより、予想以上にバックグラウンドが下がりＺ’ｆａｃｔｏｒが飛躍的に向上した。既存技術では十分なＳ／Ｂ比および少ないばらつきが確保できず、Ｚ’ ｆａｃｔｏｒが０．５には程遠く、そのため、ＨＴＳ（ｈｉｇｈ ｔｈｒｏｕｇｈ−ｐｕｔ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ；ハイスループットスクリーニング）を行うことができなかった。しかし本発明によって十分なＳ／Ｂ比および少ないばらつきが確保でき、Ｚ’ ｆａｃｔｏｒが０．５以上になったことにより、ＨＴＳへの使用が可能である。これに伴い、本発明を薬剤がＮｏｔｃｈシグナルに及ぼす影響を正確に検討することができる。また、本発明では、ＨＴＳを構築する際にミニチュア化した場合においても、より精度の高いアッセイ系を構築することが可能である。
【０２１０】
また、Ｈｅｓ−ＹＰ ｎｅｏコンストラクトでの形質転換細胞については、各種薬剤の濃度の影響についても試験した。リポフェクションを行ってから２４時間後、γ−セクレターゼ阻害剤であるＤＡＰＴ（０．００１μＭ、０．００３μＭ，０．０１μＭ、０．０３μＭ、 ０．１ μＭ、０．３μＭ、１μＭ、３μＭまたは１０μＭ）またはＬ−６８５４５８（０．００３μＭ，０．０１μＭ、０．０３μＭ、０．１μＭ、０．３μＭ、１μＭ、３μＭ、１０μＭ、または３０μＭ）、あるいはγ−セクレターゼ修飾薬であるスリンダクスルフィド（Ｓｕｌｉｎｄａｃ ｓｕｌｆｉｄｅ）（０．８０μＭ、１．５７μＭ、３．１３μＭ、６．２５μＭ、１２．５μＭ、２５μＭ、５０μＭまたは１００μＭ）を各種濃度で添加し、添加から２４時間後の蛍光強度を測定して、各種薬剤のＮｏｔｃｈシグナル伝達系への影響を調べた。また、コントロールとして、各種薬剤を添加しない場合の蛍光強度も測定した。Ｈｅｓ−ＹＰ ｎｅｏコンストラクトを用い、各薬剤を添加した場合の結果を図１２（ｆ）に示す。図１２（ｆ）においては、コントロールの蛍光強度を１００％としたときの相対強度を示す。
【０２１１】
この結果、本発明のコンストラクトを用いることにより、γ−セクレターゼ阻害剤の添加により、内因性のＮｏｔｃｈシグナルが阻害され、阻害剤でない薬剤を用いた場合には内因性のＮｏｔｃｈシグナルは影響を受けないことが確認された。本発明のコンストラクトを用いれば、高感度に高い精度でＮｏｔｃｈシグナル伝達系に対する物質の影響を確認することができる。
【０２１２】
（実施例７：Ｎｏｔｃｈシグナル伝達系に実質的に影響を与えない物質のスクリーニング）
培養細胞におけるトランジェント・アッセイを用い、Ｈｅｓ−ＹＰ ｎｅｏまたはＨｅｓ−ＹＰ ｐｕｒｏを用いて、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達系に実質的に影響を与えない物質をスクリーニングする。
【０２１３】
１０％ＦＣＳを含有するＤＭＥＭを用い、５％ＣＯ２、３７℃の条件下でＨｅＬａ細胞を培養する。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ社）を用い、添付のプロトコールに従って、レポーターとしてＨｅｓ−ＹＰ ｎｅｏまたはＨｅｓ−ＹＰ ｐｕｒｏと、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達系を活性化するために、活性型ＮｏｔｃｈコンストラクトのＣＣ＞ＳＳ（Ｍｕｍｍ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ ５，１９７−２０６，２０００）とを導入する。
【０２１４】
リポフェクションを行ってから２４時間後、候補物質またはγ−セクレターゼ阻害剤であるＤＡＰＴ（コントロール）を含むＤＭＳＯ溶液を添加するか、あるいはＤＭＳＯを添加する。添加の２４時間後に細胞を溶解し、Ｄｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いて、蛍光強度を測定して、ＤＡＰＴのＮｏｔｃｈシグナル伝達系への影響を調べる。Ｈｅｓ−ＹＰ ｎｅｏまたはＨｅｓ−ＹＰ ｐｕｒｏとＣＣ＞ＳＳとを共発現する細胞に水を添加した場合の蛍光強度を１００％として、Ｈｅｓ−ＹＰ ｎｅｏまたはＨｅｓ−ＹＰ ｐｕｒｏとＣＣ＞ＳＳとを共発現する細胞に候補物質を添加した場合の蛍光強度が９０〜１１０％となる候補物質を選択する。このようにして、蛍光強度が実質的に変化しない候補物質が選択される。
【０２１５】
（実施例８：Ａβ４２産生を抑制するγ−セクレターゼ阻害薬候補物質から、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達系を抑制しないγ−セクレターゼ阻害薬を選択するためのスクリーニング）
培養細胞におけるトランジェント・アッセイを用い、Ｈｅｓ−ＹＰ ｎｅｏまたはＨｅｓ−ＹＰ ｐｕｒｏを用いて、γ−セクレターゼ阻害薬候補物質から、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達系を抑制しないγ−セクレターゼ阻害薬をスクリーニングする。
【０２１６】
１０％ＦＣＳを含有するＤＭＥＭを用い、５％ＣＯ２、３７℃の条件下でＨｅＬａ細胞を培養する。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ社）を用い、添付のプロトコールに従って、レポーターとしてＨｅｓ−ＹＰ ｎｅｏまたはＨｅｓ−ＹＰ ｐｕｒｏと、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達系を活性化するために、活性型ＮｏｔｃｈコンストラクトのＣＣ＞ＳＳ（Ｍｕｍｍ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ ５，１９７−２０６，２０００）とを導入する。
【０２１７】
リポフェクションを行ってから２４時間後、γ−セクレターゼ阻害薬候補物質またはγ−セクレターゼ阻害薬であるＤＡＰＴ（コントロール）を含むＤＭＳＯ溶液を添加するか、あるいはＤＭＳＯを添加する。２４時間後に細胞を溶解し、Ｄｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いて、蛍光強度を測定して、ＤＡＰＴのＮｏｔｃｈシグナル伝達系への影響を調べる。候補物質としてγ−セクレターゼ阻害薬候補物質を使用する。これらの候補物質は基質ＡＰＰ（アミロイド前駆体タンパク質）を安定発現させたＨＥＫ細胞においてＡβ４２の産生を抑制する化合物群である。
【０２１８】
Ｈｅｓ−ＹＰ ｎｅｏまたはＨｅｓ−ＹＰ ｐｕｒｏとＣＣ＞ＳＳとを共発現する細胞にＤＭＳＯを添加した場合の蛍光強度を１００％として、Ｈｅｓ−ＹＰ ｎｅｏまたはＨｅｓ−ＹＰ ｐｕｒｏとＣＣ＞ＳＳとを共発現する細胞に候補物質を添加した場合の蛍光強度が９０〜１１０％となる候補物質を選択する。このようにして、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達系を抑制しない候補物質が選択される。
【０２１９】
このようにして、Ａβ４２産生を抑制するγ−セクレターゼ阻害薬候補物質から、Ａβ４２産生を抑制し、かつＮｏｔｃｈシグナル伝達系を抑制しないγ−セクレターゼ阻害薬が選択される。
【０２２０】
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、この実施形態に限定して解釈されるべきものではない。本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。当業者は、本発明の具体的な好ましい実施形態の記載から、本発明の記載および技術常識に基づいて等価な範囲を実施することができることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。
【産業上の利用可能性】
【０２２１】
本発明の核酸分子およびスクリーニング方法は、種々の用途に応用できる。例えば、アルツハイマー病治療薬候補であるγ−セクレターゼ阻害修飾薬の副作用の検討（例えば、ハイスループットスクリーニング時）、およびＮｏｔｃｈシグナル伝達阻害型抗がん剤の主作用の検討（ハイスループットスクリーニング時）に利用できる。
【図面の簡単な説明】
【０２２２】
【図１】図１は、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達系の模式図を示す。
【図２】図２は、ヒトＮＯＴＣＨ１の模式図を示す。
【図３】図３は、γ−セクレターゼ阻害薬によるＮｏｔｃｈシグナル伝達の阻害の模式図を示す。
【図４】図４は、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達系の活性化を検知するための既存の技術の模式図を示す。
【図５】図５は、ΔＳＮ１のアミノ酸配列におけるシグナル配列、Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４サイトの位置を示す図である。
【図６】図６（ａ）は、Ｚ’ｆａｃｔｏｒの計算式およびその概念図を示す。図６（ｂ）は、Ｓ／Ｂ＝１０でかつＺ’＝０．４の場合のデータ例を示す。図６（ｃ）は、Ｓ／Ｂ＝２でかつＺ’＝０．８の場合のデータ例を示す。
【図７】図７（ａ）は、今回作製したＮｏｔｃｈレポーターアッセイ用のコンストラクトおよび従来公知のコンストラクトの模式図である。図７（ｂ）は、これらのＮｏｔｃｈレポーターアッセイ用コンストラクトと、活性型ＮｏｔｃｈまたはネガティブコントロールであるｐｃＤＮＡ３．１ Ｈｙｇｒｏ（＋）ベクターとを共発現した時のルシフェラーゼ活性を示すグラフである。
【図８】図８（ａ）は、Ｈｅｓ−ＹおよびＨｅｓ−ＹにさらにＰＥＳＴ配列を導入したＮｏｔｃｈレポーターアッセイ用のコンストラクトの模式図である。図８（ｂ）は、これらのＮｏｔｃｈレポーターアッセイ用コンストラクトと、活性型Ｎｏｔｃｈとを共発現した時のルシフェラーゼ活性を示すグラフである。図８（ｃ）は、これらのＮｏｔｃｈレポーターアッセイ用コンストラクトと、活性型Ｎｏｔｃｈとを共発現した時のルシフェラーゼ活性を、活性型Ｎｏｔｃｈを用いた場合のそれぞれの活性を１として示すグラフである。図８（ｂ）および図８（ｃ）において、ＣＣ＞ＳＳは、活性型Ｎｏｔｃｈを示す。ｐｃＤＮＡは、コントロールである空のプラスミドを示す。
【図９】図９は、ＴＰ−Ｙの２４個のＲＢＰ−Ｊκ配列を含む領域とｐＵＣ１８ベクター、ウサギβ−グロビン最小プロモーターおよびルシフェラーゼ遺伝子との連結部の配列を示す。
【図１０】図１０は、本発明のＮｏｔｃｈレポーターアッセイ用コンストラクトを、活性型Ｎｏｔｃｈとともに共発現させた場合またはコントロールのｐｃＤＮＡとともに共発現させた場合のルシフェラーゼ活性を添加から０〜２４時間にわたって示すグラフである。Ｈｅｓ−ＹとｐｃＤＮＡとを共発現させ、ＤＡＰＴを添加時のルシフェラーゼ活性を１として示すグラフである。
【図１１】図１１（ａ）は、コントロール（ｃｏｎｔｒｏｌ）またはＤＡＰＴ １０μＭでのルシフェラーゼ活性を示す棒グラフである。図１１（ｂ）は、薬剤によるＨＥＫ２９３細胞の内因性Ｎｏｔｃｈシグナルの影響を示すグラフである。
【図１２】図１２（ａ）は、Ｈｅｓ−１コンストラクトを、ＤＡＰＴを添加したかまたは添加しなかった（ＤＭＳＯのみ）場合のルシフェラーゼ活性を示す棒グラフである。このときのＳ／Ｂ比は１．３９であり、Ｚ’ｆａｃｔｏｒは０．３３である。図１２（ｂ）は、Ｈｅｓ−ＹＰ ｎｅｏコンストラクトを、ＤＡＰＴを添加したかまたは添加しなかった（ＤＭＳＯのみ）場合のルシフェラーゼ活性を示す棒グラフである。このときのＳ／Ｂ比は９．９８であり、Ｚ’ｆａｃｔｏｒは０．７２である。図１２（ｃ）は、Ｈｅｓ−Ｙコンストラクトを、ＤＡＰＴを添加したかまたは添加しなかった（ＤＭＳＯのみ）場合のルシフェラーゼ活性を示す棒グラフである。このときのＳ／Ｂ比は８．４６であり、Ｚ’ｆａｃｔｏｒは０．６０である。図１２（ｄ）は、Ｈｅｓ１−ｌｕｃｘ２コンストラクトを、ＤＡＰＴを添加したかまたは添加しなかった（ＤＭＳＯのみ）場合のルシフェラーゼ活性を示す棒グラフである。このときのＳ／Ｂ比は３．７１であり、Ｚ’ｆａｃｔｏｒは０．５０である。図１２（ｅ）は、Ｈｅｓ１−ｌｕｃｘ３コンストラクトを、ＤＡＰＴを添加したかまたは添加しなかった（ＤＭＳＯのみ）場合のルシフェラーゼ活性を示す棒グラフである。このときのＳ／Ｂ比は７．２２であり、Ｚ’ｆａｃｔｏｒは０．５４である。図１２（ｆ）は、各薬剤（ＤＡＰＴ、Ｌ−６８５４５８またはスリンダクスルフィド）による活性型Ｎｏｔｃｈを共発現したときのＮｏｔｃｈシグナルの阻害曲線を示すグラフである。
【図１３】図１３（ａ）は、Ｈｅｓ−Ｙ、Ｈｅｓ−ＹＰ ＮｅｏおよびＨｅｓ−ＹＰ Ｐｕｒｏのコンストラクトの模式図を示す。図１３（ｂ）は、Ｈｅｓ−ＹＰ，Ｈｅｓ−ＹＰ ＮｅｏおよびＨｅｓ−ＹＰ Ｐｕｒｏにおいて用いた、８個のＲＢＰ−Ｊκ配列を含む領域とベクターおよびプロモーターとの連結部の配列を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも３つのＲＢＰ−Ｊκ結合配列を含む核酸分子であって、該ＲＢＰ−Ｊκ結合配列が、ＴＧＧＧＡＡである、核酸分子。
【請求項２】
前記少なくとも３つのＲＢＰ−Ｊκ結合配列のそれぞれが、５塩基〜４０塩基の塩基配列によりタンデムに連結されている、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項３】
配列番号１の配列を少なくとも２つ含む、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項４】
配列番号２の配列を少なくとも２つ含む、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項５】
配列番号３〜６のいずれかの配列を含む、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項６】
前記少なくとも３つのＲＢＰ−Ｊκ結合配列と作動可能に連結されたプロモーター配列をさらに含む、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項７】
前記プロモーター配列と作動可能に連結されたレポータータンパク質コード配列をさらに含む、請求項６に記載の核酸分子。
【請求項８】
前記レポータータンパク質コード配列が、発光タンパク質または蛍光タンパク質をコードする、請求項７に記載の核酸分子。
【請求項９】
前記レポータータンパク質コード配列の下流にＰＥＳＴ配列コード配列が連結されている、請求項８に記載の核酸分子。
【請求項１０】
直鎖状分子またはプラスミドである、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項１１】
（ａ）プロモーター配列と作動可能に連結された構成的に活性なＮｏｔｃｈタンパク質をコードする配列を含む核酸分子とともに細胞内に導入して発現させた場合の前記レポータータンパク質の発現量と、（ｂ）該Ｎｏｔｃｈタンパク質コード配列を含まない核酸分子とともに細胞内に導入して発現させた場合の該レポータータンパク質の発現量とを比較したときの、Ｚ’ ｆａｃｔｏｒ値が０．５以上である、請求項８に記載の核酸分子。
【請求項１２】
請求項１に記載の核酸分子を含む、細胞。
【請求項１３】
前記核酸分子が、前記プロモーター配列と作動可能に連結されたレポータータンパク質コード配列をさらに含む、請求項１２に記載の細胞。
【請求項１４】
内因性のＮｏｔｃｈタンパク質または構成的に活性なＮｏｔｃｈタンパク質を発現する、請求項１３に記載の細胞。
【請求項１５】
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達系を調節する物質のスクリーニング方法であって、該方法は、
（ａ）請求項１４に記載の細胞と候補物質とを接触させる工程；および
（ｂ）該細胞中での該レポータータンパク質の発現量を測定する工程
を包含する、方法。
【請求項１６】
γ−セクレターゼ阻害薬候補物質から、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達系を抑制しないγ−セクレターゼ阻害薬を選択するためのスクリーニング方法であって、該方法は、
（ａ）請求項１４に記載の細胞と該候補物質とを接触させる工程；および
（ｂ）該細胞中での該レポータータンパク質の発現量を測定する工程
を包含する、方法。
【請求項１７】
Ａβ４２の産生を抑制するアルツハイマー病治療薬候補物質から、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達系を抑制しないアルツハイマー病治療薬を選択するためのスクリーニング方法であって、該方法は、
（ａ）請求項１４に記載の細胞と該候補物質とを接触させる工程；および
（ｂ）該細胞中での該レポータータンパク質の発現量を測定する工程
を包含する、方法。
【請求項１】
少なくとも３つのＲＢＰ−Ｊκ結合配列を含む核酸分子であって、該ＲＢＰ−Ｊκ結合配列が、ＴＧＧＧＡＡである、核酸分子。
【請求項２】
前記少なくとも３つのＲＢＰ−Ｊκ結合配列のそれぞれが、５塩基〜４０塩基の塩基配列によりタンデムに連結されている、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項３】
配列番号１の配列を少なくとも２つ含む、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項４】
配列番号２の配列を少なくとも２つ含む、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項５】
配列番号３〜６のいずれかの配列を含む、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項６】
前記少なくとも３つのＲＢＰ−Ｊκ結合配列と作動可能に連結されたプロモーター配列をさらに含む、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項７】
前記プロモーター配列と作動可能に連結されたレポータータンパク質コード配列をさらに含む、請求項６に記載の核酸分子。
【請求項８】
前記レポータータンパク質コード配列が、発光タンパク質または蛍光タンパク質をコードする、請求項７に記載の核酸分子。
【請求項９】
前記レポータータンパク質コード配列の下流にＰＥＳＴ配列コード配列が連結されている、請求項８に記載の核酸分子。
【請求項１０】
直鎖状分子またはプラスミドである、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項１１】
（ａ）プロモーター配列と作動可能に連結された構成的に活性なＮｏｔｃｈタンパク質をコードする配列を含む核酸分子とともに細胞内に導入して発現させた場合の前記レポータータンパク質の発現量と、（ｂ）該Ｎｏｔｃｈタンパク質コード配列を含まない核酸分子とともに細胞内に導入して発現させた場合の該レポータータンパク質の発現量とを比較したときの、Ｚ’ ｆａｃｔｏｒ値が０．５以上である、請求項８に記載の核酸分子。
【請求項１２】
請求項１に記載の核酸分子を含む、細胞。
【請求項１３】
前記核酸分子が、前記プロモーター配列と作動可能に連結されたレポータータンパク質コード配列をさらに含む、請求項１２に記載の細胞。
【請求項１４】
内因性のＮｏｔｃｈタンパク質または構成的に活性なＮｏｔｃｈタンパク質を発現する、請求項１３に記載の細胞。
【請求項１５】
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達系を調節する物質のスクリーニング方法であって、該方法は、
（ａ）請求項１４に記載の細胞と候補物質とを接触させる工程；および
（ｂ）該細胞中での該レポータータンパク質の発現量を測定する工程
を包含する、方法。
【請求項１６】
γ−セクレターゼ阻害薬候補物質から、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達系を抑制しないγ−セクレターゼ阻害薬を選択するためのスクリーニング方法であって、該方法は、
（ａ）請求項１４に記載の細胞と該候補物質とを接触させる工程；および
（ｂ）該細胞中での該レポータータンパク質の発現量を測定する工程
を包含する、方法。
【請求項１７】
Ａβ４２の産生を抑制するアルツハイマー病治療薬候補物質から、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達系を抑制しないアルツハイマー病治療薬を選択するためのスクリーニング方法であって、該方法は、
（ａ）請求項１４に記載の細胞と該候補物質とを接触させる工程；および
（ｂ）該細胞中での該レポータータンパク質の発現量を測定する工程
を包含する、方法。
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１３】
【図１１】
【図１２】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１３】
【公開番号】特開２００８−２３７０６８（Ｐ２００８−２３７０６８Ａ）
【公開日】平成２０年１０月９日（２００８．１０．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−８０２６９（Ｐ２００７−８０２６９）
【出願日】平成１９年３月２６日（２００７．３．２６）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成１８年度、独立行政法人医薬基盤研究所委託研究「アルツハイマー病関連遺伝子解析研究に基づく診断治療法開発」、産業活力再生特別措置法第３０条の適用を受ける特許出願
【出願人】（５０４１７６９１１）国立大学法人大阪大学 (1,536)
【出願人】（０００００１９２６）塩野義製薬株式会社 (229)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年１０月９日（２００８．１０．９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年３月２６日（２００７．３．２６）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成１８年度、独立行政法人医薬基盤研究所委託研究「アルツハイマー病関連遺伝子解析研究に基づく診断治療法開発」、産業活力再生特別措置法第３０条の適用を受ける特許出願
【出願人】（５０４１７６９１１）国立大学法人大阪大学 (1,536)
【出願人】（０００００１９２６）塩野義製薬株式会社 (229)
【Ｆターム（参考）】
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