ＰＣＲ精製とオリゴヌクレオチド除去のための方法
ポリメラーゼまたはリガーゼの反応混合物から組み込まれていないオリゴヌクレオチドを除去して、所望のポリヌクレオチド生成物を精製する方法が提供される。該方法は、（ａ）ＤＮＡポリメラーゼまたは核酸リガーゼ、ヌクレアーゼ、３’および５’部分を有する上流オリゴヌクレオチド、およびテンプレート核酸、を含む混合物を形成する工程、（ｂ）ヌクレアーゼを用いて上流オリゴヌクレオチドの３’部分を消化する工程、（ｃ）ポリメラーゼを用いて消化された上流オリゴヌクレオチドを伸長する工程、またはリガーゼを用いて消化された上流オリゴヌクレオチドを下流オリゴヌクレオチドに連結する工程であり、伸長または連結工程によりポリヌクレオチド生成物を形成する工程、ならびに（ｄ）組み込まれていない上流オリゴヌクレオチドを反応混合物から除去するために、混合物と３’認識基に結合する結合基を有する基質とを接触させる工程を包含する。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
（背景）
核酸配列解析は主な研究分野、医療分野、産業分野で非常に重要である。例として、ＣａｓＫｅｙ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３６：１２２３−１２２８（１９８７）；Ｌａｎｄｅｇｒｅｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：２２９−２３７（１９８８）；ならびに、Ａｒｎｈｅｉｍら，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６１：１３１−１５６（１９９２）を参照のこと。最も一般に使用されている配列解析の技術はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である。ＰＣＲおよびその他の配列決定技術には、ポリメラーゼを用いたオリゴヌクレオチドプライマーの伸長が含まれる。ポリメラーゼを用いたプライマーの伸長はまた、インビボにおいて、ＤＮＡ複製のときおよびＲＮＡを形成するためのＤＮＡの転写のときに起こる。
【０００２】
インビボでのＤＮＡ複製の忠実度は、部分的に、ＤＮＡポリメラーゼの３’→５’エキソヌクレアーゼプルーフリーディング活性により保たれている。誤ったヌクレオチドが組み込まれて、テンプレートとのミスマッチが形成される場合、それは３’→５’エキソヌクレアーゼにより除去される。しかしながら、最も広くＰＣＲに使用されている耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ）ポリメラーゼは、３’→５’エキソヌクレアーゼを欠いている。
【０００３】
その他の配列決定または核酸解析の方法は、オリゴヌクレオチドのライゲーションを含むか、またはオリゴヌクレオチドのライゲーションとオリゴヌクレオチドのポリメラーゼによる伸長の両方を含む。技術の１つは、Ｗｈｉｔｅｌｅｙらによる米国特許第４，８８３，７５０号の、オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（ＯＬＡ）である。この方法は、変性したテンプレート核酸試料の中に標的配列が存在するか否かを決定するために使用される。２本のオリゴヌクレオチドプローブが設計され、それらは一方のオリゴヌクレオチドの５’側塩基が他方の３’側塩基に隣接した状態で、標的配列にハイブリダイズする。これらの２つの塩基がテンプレートＤＮＡの標的配列と完全なハイブリッドを形成した場合、これらのオリゴヌクレオチドはＤＮＡリガーゼによって互いに連結される。テンプレートＤＮＡが標的配列上のこれら２つの塩基のうちの１つで突然変異を起こしていた場合、オリゴヌクレオチドは連結され得ない。耐熱性リガーゼを使用した場合、反応は、まさにＰＣＲのような繰返しサイクルの中で実施され得る。この方法により、シグナル／ノイズ比は大きく改善され得る（ＷｕとＷａｌｌａｃｅ，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ４：５６０（１９８９）；Ｂａｒａｎｙ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：１８９（１９９１）参照）。ＯＬＡとＰＣＲを組合わせたアッセイは、Ｅｇｇｅｒｄｉｎｇ，米国特許第６，１３０，０７３号；およびＮｉｃｋｅｒｓｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：８９２３−８９２７（１９９０）に記載されている。
【０００４】
ＰＣＲ、およびオリゴヌクレオチドを使用した、ポリメラーゼに基づく他のアッセイにおいて、ライゲーションに基づくアッセイにおいてと同様に、多くの場合、その後の解析工程に用いるため、反応混合物から、伸長されていない、もしくは連結されていないオリゴヌクレオチドを除去する必要がある。これは、例えば、入れ子の（ｎｅｓｔｅｄ）ＰＣＲとＰＣＲ産物の配列決定、または増幅産物が、プライマーが競合的にハイブリダイズする配列にハイブリダイズする場合に必要なことである。したがって、迅速かつ簡便に、ポリメラーゼおよびリガーゼの反応混合物から、伸長されていないオリゴヌクレオチドを除去する技術が必要とされる。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
（発明の要旨）
本発明の１つの実施形態は、組み込まれていないオリゴヌクレオチドを反応混合物から除去する方法を提供する。その方法は、以下の工程：（ａ）ＤＮＡポリメラーゼまたは核酸リガーゼ、ヌクレアーゼ、３’部分および５’部分を有する上流オリゴヌクレオチド（ここで、その３’部分は３’認識基および３’末端ヌクレオチドを有する）、およびテンプレート核酸、を含む混合物を形成する工程、（ｂ）ヌクレアーゼを用いて、上流オリゴヌクレオチドの３’部分を消化する工程、（ｃ）ポリメラーゼを用いて、その消化された上流オリゴヌクレオチドを伸長する工程、または、リガーゼを用いて、その消化された上流オリゴヌクレオチドを下流オリゴヌクレオチドに連結する工程であり、その伸長工程または連結工程により、ポリヌクレオチド生成物を形成する工程、ならびに（ｄ）組み込まれていない上流オリゴヌクレオチドを反応混合物から除去するために、その混合物と３’認識基に結合する結合基を有する基質とを接触させる工程、を包含する。この方法で使用されるＤＮＡポリメラーゼまたは核酸リガーゼ、およびヌクレアーゼは、同じまたは異なる酵素複合体であり得る。
【０００６】
この実施形態では、認識基は一般に上流オリゴヌクレオチドの３’末端ヌクレオチドに付着する。その認識基は、その３’認識基が除去されるまで、上流オリゴヌクレオチドが伸長または連結されることを防ぎ得る。上流オリゴヌクレオチドの３’部分はテンプレートと相補的でなくてもよく、その結果、その３’部分は、３’認識基とともに、３’→５’プルーフリーディングエキソヌクレアーゼにより除去される傾向がある。
【０００７】
本発明の別の実施形態は、組み込まれていないオリゴヌクレオチドを反応混合物から除去する方法を提供する。その方法は、以下の工程：（ａ）核酸リガーゼ、ヌクレアーゼ、３’部分および５’部分を有する下流オリゴヌクレオチド（ここで、その５’部分は５’認識基および５’末端ヌクレオチドを含む）、およびテンプレート核酸、を含む混合物を形成する工程、（ｂ）ヌクレアーゼを用いて、下流オリゴヌクレオチドの５’部分を消化する工程、（ｃ）リガーゼを用いて、その消化された下流オリゴヌクレオチドを上流オリゴヌクレオチドに連結する工程であり、その連結工程により、ポリヌクレオチド生成物を形成する工程、ならびに（ｄ）組み込まれていない下流オリゴヌクレオチドを反応混合物から除去するために、その混合物と５’認識基に結合する結合基を有する基質とを接触させる工程、を包含する。この核酸リガーゼおよびヌクレアーゼは、同じまたは異なる酵素複合体である。
【０００８】
この実施形態では、５’認識基は一般に下流オリゴヌクレオチドの５’末端ヌクレオチドに付着し、その５’認識基が除去されるまで、下流オリゴヌクレオチドが連結されることを防止する。
【０００９】
（発明の詳細な説明）
（定義）
「核酸ポリメラーゼ」は、ＤＮＡまたはＲＮＡテンプレートのいずれかを使用して、ヌクレオシド三リン酸からの核酸生成物の形成を触媒する酵素である。「核酸ポリメラーゼ」はＲＮＡポリメラーゼおよびＤＮＡポリメラーゼの両方を含む。
【００１０】
「ＤＮＡポリメラーゼ」は、ＤＮＡを合成するポリメラーゼを意味する。これは、ＤＮＡに依存性ＤＮＡポリメラーゼ（ＤＮＡをテンプレートとして使用する）、およびＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼすなわち逆転写酵素（ＲＮＡをテンプレートとして使用する）の両方を含む。
【００１１】
「オリゴヌクレオチド」とは、ポリ核酸、もしくは第二の核酸配列にハイブリダイズし得る、共有結合で連結された一連の核酸塩基を指す。適切な条件下でテンプレートにハイブリダイズする場合、ヌクレオチドを加えることで、オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡポリメラーゼにより伸長される基質として働き得る。オリゴヌクレオチドはまた、リガーゼの基質としても働き得る。上流オリゴヌクレオチドが下流オリゴヌクレオチドに接するテンプレートにハイブリダイズする場合、２つのオリゴヌクレオチドは連結され得る。そのオリゴヌクレオチドは、主に、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド、または両者の混合物から成り得る。そのオリゴヌクレオチドはまた、改変ヌクレオチドを含み得る。通常、モノマーは、ホスホジエステル結合により連結され、ポリヌクレオチドを形成する。しかしながら、そのオリゴヌクレオチドのヌクレオシドモノマーは、他の結合によっても連結され得る。オリゴヌクレオチドは、標的テンプレートに特異的にハイブリダイズし、ヌクレアーゼを用いた消化の後にポリメラーゼにより伸長、またはリガーゼにより連結されるのに十分な任意の長さであり得る。この長さは、６オリゴヌクレオチド程度から１０００ヌクレオチド以上に及び得る。代表的に、オリゴヌクレオチドは約９ヌクレオチドから約１００ヌクレオチド、約１０ヌクレオチドから約５０ヌクレオチド、または、約１０ヌクレオチドから約２５ヌクレオチドの長さに及ぶ。３’認識基を含むオリゴヌクレオチドの３’部分を除去するため（または、一部のライゲーション反応において５’部分に認識基が存在する場合、５’認識基を含むオリゴヌクレオチドの５’部分を除去するため）のヌクレアーゼによる切断の後、そのオリゴヌクレオチドは、ポリメラーゼによる伸長またはリガーゼによるライゲーションを可能にするのに十分安定にテンプレートにハイブリダイズするために十分な数の、ハイブリダイズしているヌクレオチドを含む。そのオリゴヌクレオチドにおけるヌクレオチドモノマーの配列は、認識基のようなその他の基により中断もしくは付加され得る。「オリゴヌクレオチド」という用語はまた、天然に存在するポリヌクレオチドのアナログを含む。そのようなアナログの例には、それらに限定されるものではないが、ペプチド核酸とＬＯＣＫＥＤ ＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤ（ＬＮＡ）が挙げられる。ペプチド核酸の開示については、Ｅｇｈｏｌｍら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４：１４９７（１９９１）；ＷＯ９２／２０７０２；ならびに米国特許第６，１８０，７６７号および第５，７１４，３３１号を参照のこと。ペプチド核酸は、塩基が結合する主鎖として、糖−リン酸の代わりに、ペプチド主鎖を有している。
【００１２】
「改変ヌクレオチド」は、例えば、Ｓｃｈｅｉｔ，Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ａｎａｌｏｇ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９８０）およびＵｈｌｍａｎとＰｅｙｍａｎ，Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ９０：５４３−５８４（１９９０）で記載されているような、ジデオキシリボヌクレオチドおよび改変塩基部分または改変糖部分を有する合成ヌクレオチドを含む。このようなアナログは、結合能を増強させ、変質を減らし、特異性を向上させるように設計された合成ヌクレオチドを含む。「改変ヌクレオチド」という用語はまた、３’−ジデオキシリボヌクレオチド、３’−デオキシリボヌクレオチド、３’−ＮＨ２、３’−ＳＨ、３’−ホスホグリコアルデヒド、および３’−Ｐｉヌクレオチドのような、３’末端をブロックし、伸長やライゲーションが起こらないようにしたヌクレオチド、および、その３’−ヒドロキシルにビオチンのような認識基が結合したヌクレオチドを含む。「改変ヌクレオチド」という用語はまた、５’−デオキシリボヌクレオチド、５’−ＮＨ２、５’−ＳＨのような、５’末端をブロックし、５’末端のライゲーションが起こらないようにしたヌクレオチド、および、その５’−ヒドロキシルにビオチンのような認識基が結合したヌクレオチドを含む。「改変ヌクレオチド」という用語はまた、３’−または５’−ヒドロキシル以外の部分に認識基が結合したヌクレオチドを含む。「改変ヌクレオチド」という用語はまた、ハイブリダイズする部分が主にＤＮＡであるオリゴヌクレオチドに関連した通常のリボヌクレオチドを含む。「改変ヌクレオチド」という用語はまた、「ＡＰヌクレオチド」として本明細書中で呼ばれる、塩基を欠いたヌクレオチドを含む。ＡＰは、欠けている塩基がピリミジンであるかプリンであるかによって、それぞれ脱ピリミジン（ａｐｙｒｉｍｉｄｉｎｉｃ）、または脱プリン（ａｐｕｒｉｎｉｃ）を意味する。
【００１３】
本明細書中で使用される場合、「ヌクレオチド」は本質的に、塩基、糖、リン酸またはポリリン酸から成る部分を含み、また同様に、それらの塩基、糖、リン酸が改変された部分を含む。それはまた、リン酸を有さないかまたは化学的に異なる基でリン酸が置換された部分を含む。例えば、本明細書中で使用される場合、「ポリヌクレオチド」は、そのヌクレオシドまたは改変ヌクレオシドが、メチルホスホネート結合、またはホスホロチオネート結合のような、改変ホスホジエステル結合によって連結されるポリマーを含む。「ヌクレオチド」という用語はまた、ＡＰヌクレオチドを含み、これは塩基を欠き、その塩基が、グリセロールのような脱塩基性基によって置換されたものである。
【００１４】
【化１】
「テンプレート核酸」とは、ＲＮＡおよびＤＮＡの両方を含む。それは、オリゴヌクレオチドが結合し、ポリメラーゼによるオリゴヌクレオチドの伸長、またはリガーゼによるオリゴヌクレオチドのライゲーションのためのテンプレートとして働く、ポリ核酸を指す。
【００１５】
「認識基」とは、結合基により認識され得、特異的に付加され得るオリゴヌクレオチドに結合した化学基を指す。認識基は共有結合、または非共有結合され得る。好ましくは、それは共有結合される。それが非共有結合される場合、その付加は、望ましくは、ポリメラーゼまたはリガーゼ反応条件下で、および結合基に接触する条件下で、非常に安定である。認識基は、オリゴヌクレオチドの任意のヌクレオチドまたはヌクレオシド残基上の合成可能な任意の部分に付加され得る。例えば、認識基は、３’末端ヌクレオチドの３’ヒドロキシルまたは５’末端ヌクレオチドの５’ヒドロキシルに付加され得る。認識基はまた、オリゴヌクレオチドの内部残基に付加され得る。認識基が付加のために２つの適切な部分を有している場合、その認識基は、ヌクレオチドまたはヌクレオシドの両側に隣接して、ポリ核酸の主鎖の一部を形成し得る。
【００１６】
本明細書中で使用される場合、「３’末端ヌクレオチド」は、オリゴヌクレオチドの３’方向の最も端にあるヌクレオチドを指す。このヌクレオチドは、遊離３’−ＯＨを有し得るか、または、ブロック基もしくは３’認識基に付加されているか、または３’デオキシヌクレオチドにおけるように存在しない、３’ヒドロキシルを有し得る。オリゴヌクレオチドはまた、環状であり得る、そのため、３’末端ヌクレオチドは、例えば自身の３’ヒドロキシルを介して、そのオリゴヌクレオチドの別のヌクレオチドに付加されている。
【００１７】
本明細書中で使用される場合、「５’末端ヌクレオチド」は、オリゴヌクレオチドの５’方向の最も端にあるヌクレオチドを指す。このヌクレオチドは、遊離５’−ＯＨもしくは５’−モノ、ジ、もしくはトリ−リン酸を有し得るか、または、ブロック基もしくは５’認識基に付加されているか、または５’デオキシヌクレオチドにおけるように存在しない、５’ヒドロキシルを有し得る。オリゴヌクレオチドはまた、環状であり得る、そのため、５’末端ヌクレオチドは、例えば自身の５’ヒドロキシルを介して、そのオリゴヌクレオチドの別のヌクレオチドに付加されている。
【００１８】
「サイズ排除クロマトグラフィー樹脂」は、天然材料もしくは合成材料で作製されており、サイズ排除クロマトグラフィーに適した、任意のタイプの固相マトリックスを指す。これには、例えば、デキストラン、アガロース、ポリアクリルアミド、およびそれらの混合物が挙げられる。
【００１９】
「結合基」は、その結合基を含む基質に反応混合物が接触する工程の条件下において、認識基に特異的に結合する化学基を指す。その結合は、共有結合性または非共有結合性相互作用により得る。非共有結合性相互作用は、例えば、イオン性または疎水性、またはそれらの混合であり得る。その相互作用は、認識基を含むオリゴヌクレオチドの大部分、または、さらに実質的に全てが、結合基を含む基質に結合し、それによって反応混合物から除去されるのに十分に強くあるべきである。ここでの「実質的に全て」は、少なくとも８０％を意味する。代替の実施形態では、認識基を含むオリゴヌクレオチドの少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％が結合基を含む基質に結合し、それによって反応混合物から除去される。結合基は、例えば、抗体、タンパク質、糖、金属カチオン、または他の化学基であり得る。
【００２０】
適切な認識基としては、ジゴキシゲニン、フルオレセイン、そしてビオチンが挙げられる。適切な結合基としては、ジゴキシゲニンに結合する抗ジゴキシゲニン抗体；フルオレセインに結合する抗フルオレセイン抗体；およびビオチンに結合する抗ビオチン抗体、ストレプトアビジン、またはアビジンが挙げられる。別の適切な認識基はポリヒスチジンである。この場合、適切な結合基はＮｉ２＋カチオンである。代表的には、Ｎｉカチオンはキレーターに結合している。ポリヒスチジンは、このペプチドがＮｉカチオンと安定的に相互作用する限り、ほぼ任意の長さの連続したヒスチジン残基を含み得る。代表的に、およそ６マーのヒスチジンが使用される。別の適切な認識基−結合基の対は、フェニルボロン酸（ＰＢＡ）を含む認識基およびサリチルヒドロキサム酸（ＳＨＡ）を含む結合基（逆も可）である。ＰＢＡ（左）、ＳＨＡ（右）を含む基を、それらのＰＢＡ−ＳＨＡ複合体を形成する反応とともに下に示す。Ｒは、オリゴヌクレオチドまたは結合基支持体への付加点を表す。付加点は、示されている点だけでなく、任意の化学的に付加可能な点であり得る。「フェニルボロン酸を含む基」という用語はまた、例えば、フェニル基が第２のボロン酸で置換された基のような、ＰＢＡ官能性を残している他の基を含む。同様に「サリチルヒドロキサム酸を含む基」という用語は、ＰＢＡ含有基およびＳＨＡ含有基が互いに結合する能力を保っている限り、例えばフェニル環が置換されているような、ＳＨＡ官能性を残している他の基を含む。Ｐｒｏｌｉｎｘ Ｉｎｃ．，Ｂｏｔｈｅｌｌ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎの製品を参照のこと。
【００２１】
【化２】
ＰＢＡ−ＳＨＡ結合は、フェニルボロン酸またはフェニル−１，３−ジボロン酸のような競合物を付加の際、可逆性である。例えば、米国特許第５，５９４，１１１号；同第６，１５６，８８４号；および同第５，６２３，０５５号、ならびにＰｒｏｌｉｎｘ，Ｉｎｃ．，Ｒｅｄｍｏｎｄ，Ｗａｓｈ．からの製品説明書を参照のこと。
【００２２】
本明細書中で使用される場合、「ＲＮＡｓｅ Ｈ」は、ＲＮＡ：ＤＮＡヘテロ２重鎖の一部であるＲＮＡを切断する酵素を意味する。１つもしくはそれ以上のＲＮＡ残基のオリゴヌクレオチドへの組み込みにより、そのオリゴヌクレオチドがＤＮＡテンプレート鎖にハイブリダイズした場合、そのオリゴヌクレオチドはハイブリダイズしたＲＮＡ残基で切断され得る。いくつかのＲＮＡｓｅ Ｈは、１つのオリゴヌクレオチドにただ１つののみのリボヌクレオチドを、基質として必要とする。他は、最大４つまでのリボヌクレオチドでできたセグメントを必要とする。ＲＮＡｓｅ Ｈ活性は、逆転写酵素を含む、いくつかのポリメラーゼにも見られ得る。ＲＮＡｓｅ Ｈはまた、別個の酵素でもよい。適切なＲＮＡｓｅ Ｈの１つは、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、またはＴｔｈ、ＲＮＡｓｅ Ｈである。その他の適切なＲＮＡｓｅ Ｈ酵素は、ヒトおよびＥ．ｃｏｌｉのＲＮＡｓｅ Ｈを含む。
【００２３】
本明細書中で使用される場合、「酵素複合体」は、タンパク質を意味する。そのタンパク質は、１つまたはそれ以上のポリペプチド鎖であり得る。それが１つ以上のポリペプチド鎖を有する場合、通常それらのポリペプチド鎖は共同で作用する。１つの酵素複合体は１つの酵素活性、または１つ以上の酵素活性を有し得る。例えば、１つの酵素複合体はポリメラーゼ活性とヌクレアーゼ活性の両方を有し得るか、またはリガーゼ活性とヌクレアーゼ活性の両方を有し得る。１つより多い酵素活性のための活性部位は、オーバーラップしているかもしくは同じ活性部位であり得るか、または、それらは酵素複合体上で空間的に分離され得る。
【００２４】
「５’キナーゼ」は、核酸の５’−ＯＨへリン酸を付加するキナーゼを指す。
【００２５】
「３’ホスファターゼ」は、３’−ホスホヌクレオチドからリン酸を除去して遊離３’−ＯＨを生じさせる酵素を指す。
【００２６】
「ＡＰエンドヌクレアーゼ」は、ＡＰヌクレオチド（塩基を欠いたヌクレオチド）の５’部分を切断し、遊離３’−ＯＨを隣接したヌクレオチドに生じさせ、ＡＰヌクレオチドに５’−リン酸を生じさせる、任意の酵素を指す。
【００２７】
本明細書中で使用される場合、「上流」はオリゴヌクレオチドの５’末端の方向を意味し、「下流」はオリゴヌクレオチドの３’末端の方向を意味する。２つのオリゴヌクレオチドがテンプレートにハイブリダイズした場合、最も５’位にあるオリゴヌクレオチド、すなわち、テンプレートの最も３’位にハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドは、上流オリゴヌクレオチドと呼ばれる。最も３’位にあるオリゴヌクレオチド、すなわち、テンプレートの最も５’位にハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドは、下流オリゴヌクレオチドと呼ばれる。
【００２８】
本明細書中で使用される場合、「ｄＲｐａｓｅ」は５’末端ＡＰエンドヌクレオチドを切り取る酵素を指す。
【００２９】
「ヌクレアーゼ」は、核酸を、ヌクレオシド間のホスホジエステル結合、または他の結合で切断する酵素を指す。ヌクレアーゼは、核酸基質の３’末端または５’末端から１度に１つのヌクレオチドを除去するエキソヌクレアーゼであり得、または、基質核酸の内部結合を切断し、各生成物中に少なくとも２つのヌクレオチドを有する２つの生成物を生成するエンドヌクレアーゼであり得る。
【００３０】
（説明）
本発明の１つの実施形態は、ビオチンのような認識基を有する上流オリゴヌクレオチドの３’部分を標識する工程に関連する。一般に、その認識基は３’末端ヌクレオチドに付加するが、それはまた、内部ヌクレオチドにも付加し得る。そのオリゴヌクレオチドはポリメラーゼまたはリガーゼ反応混合物において使用され、それはポリメラーゼにより伸長されるか、またはリガーゼにより下流オリゴヌクレオチドに連結される。上流オリゴヌクレオチドの３’末端ヌクレオチドは、その末端ヌクレオチドが除去されない限り伸長または連結され得ないように、ブロックされ得る。そのブロックは、認識基自体であるまたは別のブロック基であり得る。通常、認識基は３’末端ヌクレオチドに付加され、また上流オリゴヌクレオチドの伸長や連結をブロックする。上流オリゴヌクレオチドの３’部分は、その上流オリゴヌクレオチドが結合するテンプレート核酸の標的配列に対して非相補的であり得る。次いで、ヌクレアーゼは、ある種のポリメラーゼの３’→５’プルーフリーディングエキソヌクレアーゼ活性のように、３’認識基を含む上流オリゴヌクレオチドの３’部分を除去する。３’末端ヌクレオチドがブロックされている場合、少なくともそのヌクレオチドは、ポリメラーゼが上流オリゴヌクレオチドを伸長し得る前、またはリガーゼが上流オリゴヌクレオチドを下流オリゴヌクレオチドに連結し得る前に、除去されなければならない。上流オリゴヌクレオチドの３’部分がテンプレートに対して非相補的である場合、プルーフリーディングエキソヌクレアーゼはそれを除去する可能性が高い。上流オリゴヌクレオチドの、３’認識基を含む３’部分の除去に続いて、上流オリゴヌクレオチドはポリメラーゼによって伸長されるかまたは、リガーゼによって下流オリゴヌクレオチドに連結される。したがって、所望の伸長された、または連結された生成物は３’認識基を欠いており、一方で、未反応上流オリゴヌクレオチドは、まだ認識基を含んでいる。認識基に結合する基を含む基質に反応混合物を接触させることにより、認識基を含むオリゴヌクレオチドは、認識基を欠く所望の生成物から除去され得る。例えば、認識基がビオチンである場合、その混合物はアビジンまたはストレプトアビジンを含む基質に接触させることができる。本発明は、ＰＣＲ、逆転写酵素ＰＣＲ、ＲＮＡ生成物のランオフ解析、一塩基伸長、およびその他のアッセイを含む、全てのタイプの核酸ポリメラーゼ反応混合物に利用できる。本発明はまた、リガーゼ反応単独、またはポリメラーゼ反応と組合わせたリガーゼ反応に利用できる。
【００３１】
認識基を含む未反応オリゴヌクレオチドを除去するため、反応混合物を結合基を含む基質に接触させる。その結合基は、種々の支持体、例えば、ビーズ、マイクロチャネル、フィルター、またはアガロースまたはセルロースのような線維、に付加される。結合したオリゴヌクレオチドとその混合物のその他の物質との間の分離は、種々の方法によって実行され得る。例として、結合基を含む固相基質の重力による沈降、遠心分離、磁力による分離（この場合、結合基は磁性の基質に付加される）、クロマトグラフィー、結合基を含む基質を除去するための濾過、結合基を含むフィルターを通すことによるその混合物のろ過、および電気泳動が挙げられる。結合基を含む基質は、単量体の形態で結合基自体であり得る。この場合、結合基と、結合したオリゴヌクレオチドは、例えば、クロマトグラフィー、電気泳動、濾過、または凝集、および抗体抗原を含むオリゴヌクレオチドとクロスリンクした格子を形成する２価抗体の場合におけるように、結合基の沈降のような、種々の方法でその混合物から分離し得る。
【００３２】
別の実施形態は、ビオチンのような認識基を有する下流オリゴヌクレオチドの５’部分を標識する工程に関連する。その認識基は、５’末端ヌクレオチドまたは内部ヌクレオチドに付加され得る。その下流オリゴヌクレオチドは、リガーゼ反応において、上流オリゴヌクレオチドに連結されるために使用される。下流オリゴヌクレオチドの５’末端ヌクレオチドはブロックされ得、その結果、その末端ヌクレオチドが除去されない限り連結され得ない。ブロックは、認識基そのものであり得るか、または別のブロック基であり得る。通常、５’認識基は、５’末端ヌクレオチドに付加され、その５’認識基が除去されるまで、下流オリゴヌクレオチドの上流オリゴヌクレオチドへのライゲーションをブロックする。下流オリゴヌクレオチドの５’部分は、そのオリゴヌクレオチドが結合するテンプレート核酸の標的配列に対して非相補的であり得る。その反応において、５’→３’エキソヌクレアーゼのようなヌクレアーゼは、５’認識基を含む下流オリゴヌクレオチドの５’部分を除去する。５’末端ヌクレオチドがブロックされている場合、少なくともそのヌクレオチドは、リガーゼが下流オリゴヌクレオチドを連結し得る前に除去されなければならない。下流オリゴヌクレオチドおよび上流オリゴヌクレオチドは、その下流オリゴヌクレオチドの５’認識基を含む５’部分の除去に続いて、その下流オリゴヌクレオチドの遊離５’−リン酸が、その上流オリゴヌクレオチドの３’ヒドロキシルの隣に位置するように、設計される。このことにより、下流オリゴヌクレオチドは、リガーゼによって、上流オリゴヌクレオチドに効率よく連結されることが可能である。したがって、所望の連結された生成物は５’認識基を欠いており、一方、未反応の下流オリゴヌクレオチド、およびいくつかの所望でない生成物はまだ認識基を含んでいる。その認識基に結合する基を含む基質と反応混合物とを接触させることにより、認識基を含む未反応の下流オリゴヌクレオチドおよび所望でない生成物は、認識基を欠いた所望の生成物から除去され得る。例えば、認識基がビオチンである場合、その混合物はアビジンまたはストレプトアビジンを含む基質と接触させ得る。
【００３３】
本発明のいくつかの実施形態の利点としては、反応混合物から未反応のオリゴヌクレオチドを容易に除去し、それによって、所望のポリヌクレオチド生成物の部分的な精製を行うことが挙げられる。例えば、実験者がそのポリヌクレオチド生成物によって、最初の反応のオリゴヌクレオチドが干渉する第２の反応を行いたい場合、そのオリゴヌクレオチドを除去することは重要な工程である。これは例えば、入れ子のＰＣＲまたはＰＣＲ産物の配列決定における場合である。
【００３４】
本発明のいくつかの実施形態の別の利点は、本発明のヌクレアーゼ消化工程がプルーフリーディング機能を果たし得ることである、このことにより、所望の生成物の収量は、テンプレートの非標的位置にハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドの伸長またライゲーションの結果生じた収量と比較して、増加する。ポリメラーゼ連鎖反応において、これは例えば、プライマーダイマーおよび他の所望でない反応生成物の収量を減少させる結果をもたらす。
【００３５】
本発明のいくつかの実施形態の別の利点は、認識基が予め除去されることなく伸長または連結されたオリゴヌクレオチドもまた、反応混合物から除去されることである。このことは、これらの所望でない反応生成物を除去する工程により、所望のポリヌクレオチド生成物の純度を改善する。
【００３６】
（３’認識基法）
本発明の実施形態としては、組み込まれていないオリゴヌクレオチドを反応混合物から除去する方法が挙げられる。本方法は、工程（ａ）：以下（ｉ）ＤＮＡポリメラーゼまたは核酸リガーゼ、（ｉｉ）ヌクレアーゼ、（ｉｉｉ）３’部分および５’部分を有する上流オリゴヌクレオチド（その３’部分が３’認識基および３’末端ヌクレオチドを含む）、および（ｉｖ）テンプレート核酸、を含む混合物を形成する工程、を包含する。そのＤＮＡポリメラーゼまたは核酸リガーゼ、およびヌクレアーゼは、同じまたは別個の酵素複合体であり得る。本方法はまた、工程（ｂ）：ヌクレアーゼを用いて、上流オリゴヌクレオチドの３’部分を消化する工程、および工程（ｃ）：ポリメラーゼを用いて、消化された上流オリゴヌクレオチドを伸長させる工程、またはリガーゼを用いて、消化された上流オリゴヌクレオチドを下流オリゴヌクレオチドへ連結する工程（伸長工程または連結工程がポリヌクレオチド生成物を形成する）を包含する。その方法は、工程（ｄ）：その混合物と３’認識基に結合する結合基を含む基質とを接触させ、組み込まれていない上流オリゴヌクレオチドを反応混合物から除去する工程、をさらに包含する。本方法は、本明細書中において、以降は「３’認識基法」と呼ばれる。
【００３７】
３’認識基法の特定の実施形態において、混合物の構成要素（ｉ）は核酸ポリメラーゼであり、工程（ｃ）は、ポリメラーゼを用いて、上流オリゴヌクレオチドを伸長させ、ポリヌクレオチド生成物を形成する工程である。その混合物が核酸ポリメラーゼを含む場合、その混合物は２本のオリゴヌクレオチドを含み得る。これは、代表的に、その混合物がポリメラーゼ連鎖反応混合物である場合である。両方のオリゴヌクレオチドは、同じ３’認識基または異なる３’認識基を含み得るかまたは１本のオリゴヌクレオチドのみが３’認識基を含み得る。
【００３８】
３’認識基法の別の実施形態において、反応混合物は、逆転写酵素−ＰＣＲ反応混合物である。
【００３９】
３’認識基法の異なる実施形態において、ＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素であり得る。
【００４０】
ポリメラーゼとヌクレアーゼは、同じ酵素複合体または別個の酵素複合体の一部であり得る。
【００４１】
ポリメラーゼが逆転写酵素である１つの実施形態において、その混合物は、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼをさらに含む。逆転写酵素とＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼは、同じまたは別個の酵素複合体であり得る。それらが同じ酵素複合体である場合、特定の実施形態において、逆転写酵素とＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼは、以下である：例えば、Ａｎａｅｒｏｃｅｌｌｕｍ， ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｌｌｉｄｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｃａｒｂｏｘｙｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｆｏｒｍａｎｓ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｔｈｅｒｍｏｈｙｄｒｏｓｕｌｆｕｒｉｃｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ ａｆｒｉｃａｎｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ、またはＴｈｅｒｍｕｓ ＺＯ５ ＤＮＡポリメラーゼ。
【００４２】
ポリメラーゼおよびヌクレアーゼが同じ酵素複合体である１つの実施形態において、ヌクレアーゼは、３’→５’エキソヌクレアーゼである。この実施形態において、酵素複合体は、以下であり得る：例えば、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓポリメラーゼＴＨＥＲＭＡＬＡＣＥ、ＤＥＥＰ ＶＥＮＴ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＧＢ−Ｄ）、ＶＥＮＴ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ、９ｏＮｍＴＭＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．９ｏＮ−７株）、ＡＣＵＰＯＬ ＤＮＡポリメラーゼ、ＰＲＯＯＦＳＴＡＲＴ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｗｏｅｓｅｉ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ、ＡＭＰＬＩＴＨＥＲＭ ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒｅｎｓｉｓ）、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｍｉｃｏｌａｎｓ ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＹＮＡＺＹＭＥ ＥＸＴ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｂｒｏｃｋａｉａｎｕｓ）、Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ ａｆｒｉｃａｎｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｄｉｃｔｉｕｍ ｏｃｃｕｌｔｕｍ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒｅｎｓｉｓ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｌｌｉｄｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｃａｒｂｏｘｙｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｆｏｒｍａｎｓ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＧＢ−Ｄ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．９ｏＮ−７株ＤＮＡポリメラーゼ、またはＴｈｅｒｍｕｓ ｂｒｏｃｋａｉａｎｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ。
【００４３】
本発明の別の特定の実施形態において、ポリメラーゼおよびヌクレアーゼは別個の酵素複合体である。この場合の特定の実施形態において、ポリメラーゼは、以下である：Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ、ＺＯ５ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｓｐ．ＺＯ５）、ＳＰＳ１７ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｓｐ．ＳＰＳ１７）、Ｔｈｅｒｍｏａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｔｈｅｒｍｏｈｙｄｒｏｓｕｌｆｕｒｉｃｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ、Ａｎａｅｒｏｃｅｌｌｕｍ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ ＤＮＡポリメラーゼ、またはＦＹ７ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｔｈｅｒｍｏｈｙｄｒｏｓｕｌｆｕｒｉｃｕｓ ＦＹ７）。
【００４４】
ポリメラーゼおよびヌクレアーゼが別個の酵素複合体である場合の、別の特定の実施形態において、ヌクレアーゼは、そのポリメラーゼ活性を欠いた、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有する変異体ポリメラーゼである。そのヌクレアーゼは、以下の変異体であり得る：例えば、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓポリメラーゼＴＨＥＲＭＡＬＡＣＥ、ＤＥＥＰ ＶＥＮＴ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＧＢ−Ｄ）、ＶＥＮＴ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ、９ｏＮｍＴＭＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．９ｏＮ−７株）、ＡＣＵＰＯＬ ＤＮＡポリメラーゼ、ＰＲＯＯＦＳＴＡＲＴ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｗｏｅｓｅｉ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ、ＡＭＰＬＩＴＨＥＲＭ ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒｅｎｓｉｓ）、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｍｉｃｏｌａｎｓ ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＹＮＡＺＹＭＥ ＥＸＴ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｂｒｏｃｋａｉａｎｕｓ）、Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ ａｆｒｉｃａｎｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｄｉｃｔｉｕｍ ｏｃｃｕｌｔｕｍ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒｅｎｓｉｓ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｌｌｉｄｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｃａｒｂｏｘｙｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｆｏｒｍａｎｓ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＧＢ−Ｄ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．９ｏＮ−７株ＤＮＡポリメラーゼ、またはＴｈｅｒｍｕｓ ｂｒｏｃｋａｉａｎｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ。
【００４５】
ポリメラーゼおよびヌクレアーゼが別個の酵素複合体である場合の、本発明の別の特定の実施形態において、ポリメラーゼは、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有する野生型ポリメラーゼの変異体形態であり、その変異体形態はエキソヌクレアーゼ活性を失っている。この実施形態において、ポリメラーゼは、以下の変異体形態であり得る：例えば、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓポリメラーゼＴＨＥＲＭＡＬＡＣＥ、ＤＥＥＰ ＶＥＮＴ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＧＢ−Ｄ）、ＶＥＮＴ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ、９ｏＮｍＴＭＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．９ｏＮ−７株）、ＡＣＵＰＯＬ ＤＮＡポリメラーゼ、ＰＲＯＯＦＳＴＡＲＴ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｗｏｅｓｅｉ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ、ＡＭＰＬＩＴＨＥＲＭ ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒｅｎｓｉｓ）、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｍｉｃｏｌａｎｓ ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＹＮＡＺＹＭＥ ＥＸＴ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｂｒｏｃｋａｉａｎｕｓ）、Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ ａｆｒｉｃａｎｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｄｉｃｔｉｕｍ ｏｃｃｕｌｔｕｍ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒｅｎｓｉｓ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｌｌｉｄｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｃａｒｂｏｘｙｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｆｏｒｍａｎｓ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＧＢ−Ｄ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．９ｏＮ−７株ＤＮＡポリメラーゼ、またはＴｈｅｒｍｕｓ ｂｒｏｃｋａｉａｎｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ。
【００４６】
本発明の１つの特定の実施形態において、その混合物は、種々の量の３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有する、２つ以上のＤＮＡポリメラーゼの混合物を含む。
【００４７】
本発明において有用なＤＮＡポリメラーゼの参考文献は、以下の表に示されている。
【００４８】
（３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼ）
【００４９】
【表１−１】
【００５０】
【表１−２】
【００５１】
【表１−３】
（３’→５’ヌクレアーゼ活性を欠くＤＮＡポリメラーゼ）
【００５２】
【表２】
（３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を除去するＤＮＡポリメラーゼに対する変異体）
【００５３】
【表３】
（ＲＴ活性を有するＤＮＡポリメラーゼ）
【００５４】
【表４】
本発明の特定の実施形態において、ヌクレアーゼは活性化工程が適用されるまでは不活性である。このことは、遊離オリゴヌクレオチドがテンプレートにハイブリダイズする前に、遊離オリゴヌクレオチドの変質を防止するために有益であり得る。本発明の１つの実施形態において、ヌクレアーゼはＰＲＯＯＦＳＴＡＲＴ ＤＮＡポリメラーゼである。ヌクレアーゼの活性化を制御する手段としては、そのヌクレアーゼを不活性にするための酵素の化学改変が挙げられ、ここで、高温は、酵素を活性化するためにその化学改変を変化させる。米国特許第５，７７３，２５８号および同第５，６７７，１５２号等を参照のこと。これは、環状無水物を用いて酵素を誘導体化することによって達成され得る。環状無水物は、例えば、無水コハク酸、無水シトラコン酸、無水シス−アコニン酸（ｃｉｓ−ａｃｏｎｉｃ ａｎｈｙｄｒｉｄｅ）であり得る。制御された不活性化の別の方法は、ヌクレアーゼに抗体を結合させる工程であり、ここで、抗体は高温により不活性化される。別の不活性化の方法は、ヌクレアーゼに低温では結合し、高温では結合しないアプタマーまたはペプチドの使用である。別の不活性化の方法は、ヌクレアーゼを物理的バリアによってオリゴヌクレオチドから分離する工程である。例えば、高温で融解するワックスバリアが使用され得る。２価陽イオンのような酵素活性に必要な必須要素もまた、同様にして分離され得る。
【００５５】
３’認識基法の別の実施形態において、その混合物は核酸リガーゼを含み、その方法は、ポリヌクレオチド生成物を形成するため、そのリガーゼを用いて、消化された上流オリゴヌクレオチドを下流オリゴヌクレオチドに連結する工程を包含する。この実施形態は、例えば、オリゴヌクレオチドリガーゼアッセイに使用され得る。オリゴヌクレオチドリガーゼアッセイの説明に関しては、Ｗｈｉｔｅｌｅｙら、米国特許第４，８８３，７５０号を参照のこと。
【００５６】
３’認識基法の特定の実施形態において、上流オリゴヌクレオチドの３’末端ヌクレオチドは、未消化上流オリゴヌクレオチドの伸長またはライゲーションを防止するブロック基によって改変される。
【００５７】
特定の実施形態において、そのブロック基は、３’−デオキシヌクレオチドまたはジデオキシヌクレオチドである。その他の特定の実施形態において、そのブロック基は３’−ホスホグリコアルデヒド、３’−リン酸、３’−メルカプト、または３’−アミノである。ホスホグリコアルデヒドは、−ＯＰ（Ｏ）（ＯＨ）ＯＣＨ２ＣＨＯ基を指す。
【００５８】
特定の実施形態において、ブロック基は３’認識基を含む。
【００５９】
１つの特定の実施形態において、上流ヌクレオチドは３’認識基が除去されない限り伸長または連結され得ない。
【００６０】
３’認識基法の１つの特定の実施形態において、ヌクレアーゼは３’→５’エキソヌクレアーゼである。
【００６１】
３’認識基法の１つの特定の実施形態において、３’末端ヌクレオチドは３’認識基の全てまたは一部を含む。別の特定の実施形態において、内部ヌクレオチドは３’認識基の全てまたは一部を含む。
【００６２】
３’認識基法の１つの実施形態において、上流オリゴヌクレオチドの３’部分はテンプレートと非相補的である。「非相補的」とは、３’部分がテンプレートに対してヌクレオチド配列が完全には相補的でないことを意味する。３’部分はテンプレートに対する１塩基のミスマッチを有し得るか、またはテンプレートに対して相補的な、連続したヌクレオチドを有さないことが有り得るか、またはテンプレートに対して中間相補性の配列を有し得る。３’部分がテンプレートに対して非相補的である場合、上流オリゴヌクレオチドの５’部分は、一般にテンプレートに対して３’部分よりも相補的である。５’部分は一般にテンプレートに対して完全に相補的であるが、しかし、反応条件下で上流オリゴヌクレオチドがテンプレートにハイブリダイズし、また、伸長するためにポリメラーゼの基質として、または別のハイブリダイズするオリゴヌクレオチドへ連結するためにリガーゼの基質として働き得るように、テンプレートに対して十分に相補的な任意の配列を有し得る。
【００６３】
ハイブリダイゼーション条件は配列依存性であり、異なる環境パラメータ下で異なる。より長い配列はより高い温度で特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションの広範な指針は、Ｔｉｊｓｓｅｎの、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ，２章「Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｂｅ ａｓｓａｙｓ」，１ページ Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９３）に見られる。一般に、高ストリンジェントなハイブリダイゼーションと洗浄の条件は、規定のイオン強度とｐＨとにおける特定の配列に関する融点温度（Ｔｍ）より約５℃低い温度に選択される。代表的に、「ストリンジェントな条件」下において、プローブはその標的配列にハイブリダイズするが、他の配列にはハイブリダイズしない。例えば、「ストリンジェントな条件」または「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、プローブがその標的配列に対して、他の配列に対してよりも検出可能な程度に大きな度合い（例えば、少なくともバックグラウンドの２倍を超える）でハイブリダイズする条件を意図している。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーおよび／または洗浄の条件の制御により、プローブに対して１００％相補的な標的配列が同定され得る（相同プロービング）。あるいは、ストリンジェンシー条件は、低度の相似性が検出されるように、いくつかの配列のミスマッチを許容するように調整され得る（異種プロービング）。一般に、オリゴヌクレオチドプローブは、長さが約１０００ヌクレオチドよりも少ない、好ましくは、長さで５００ヌクレオチドよりも少ない。
【００６４】
代表的に、ストリンジェントな条件は、ｐＨ７．０〜８．３において、短いプローブ（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）では少なくとも約３０℃、長いプローブ（例えば、５０ヌクレオチドより長い）では少なくとも約６０℃の温度で、塩濃度が約１．５Ｍよりも少ないＮａイオン、代表的に約０．０１〜１．０ＭのＮａイオンを含む条件である。
【００６５】
特異性において重要な因子は、イオン強度と反応混合物の温度である。ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドに関しては、ＴｍはＭｅｉｎｋｏｔｈおよびＷａｈｌ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３８：２６７−２８４（１９８４）の式で近似され得る：Ｔｍ＝８１．５℃＋１６．６（ｌｏｇＭ）＋０．４１（％ＧＣ）−０．６１（％ｆｏｒｍ）−５００／Ｌ；ここで、Ｍは１価陽イオンのモル濃度、％ＧＣはＤＮＡにおけるグアノシンとシチジンヌクレオチドのパーセンテージ、％ｆｏｒｍはハイブリダイゼーション溶液中のホルムアルデヒドのパーセンテージ、そしてＬは塩基対でのハイブリッドの長さである。Ｔｍは（規定のイオン強度およびｐＨにおける）相補的な標的配列の５０％が、完全にマッチしたプローブにハイブリダイズする温度である。あるいは、Ｔｍは、ＰＲＩＭＥＲ ＥＸＰＲＥＳＳ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）のような、いくつかの商業的に入手可能なプログラムから決定され得る。Ｔｍはまた、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）に記載されているように、実験的に決定され得る。
【００６６】
非常に高度にストリンジェントな条件は、特定のプローブに関するＴｍと同等かまたはそれよりわずかに高くなるように選択される。
【００６７】
ストリンジェントな洗浄条件の例は、６５℃で、１５分間の０．２×ＳＳＣ洗浄である（ＳＳＣ緩衝液の記述については、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照）。
【００６８】
Ｔｍは１％のミスマッチごとに約１℃ずつ下げられる；したがって、Ｔｍ、ハイブリダイゼーション、および／または洗浄の条件は、所望の同一性配列にハイブリダイズするよう調整され得る。例えば、９０％の同一性を有した配列に関して、Ｔｍは約１０℃下げられる。したがって、９０％以上の同一性を有した配列が探索される場合、洗浄温度は、完全に相補的な配列を同定するために使用されるものよりも、一般的に約１０℃低い。
【００６９】
一般的に、ストリンジェントな条件は、規定のイオン強度およびｐＨにおける特定の配列とその相補鎖のＴｍよりも約５℃低い温度に選択される。しかしながら、高度にストリンジェントな条件は、Ｔｍよりも１、２、３、または４℃低い温度でハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を利用し得る；中程度にストリンジェントな条件は、Ｔｍよりも５、６、７、８、９または１０℃低い温度でハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を利用し得る；低ストリンジェンシー条件は、Ｔｍよりも１１、１２、１３、１４、１５または２０℃低い温度でハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を利用し得る。これらのパラメータ、ハイブリダイゼーション組成物および洗浄組成物、ならびに所望の温度を用いることで、当業者は、ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄溶液のストリンジェンシーにおけるバリエーションが本質的に記載されていることを理解する。核酸のハイブリダイゼーションの広範な指針は、Ｔｉｊｓｓｅｎ（１９９３）、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ，第１部 第２章（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）；Ａｕｓｕｂｅｌら（編）（１９９５）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第２章（Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）に見られる。また、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を参照のこと。
【００７０】
３’認識基法の１つの実施形態において、オリゴヌクレオチドの３’部分に含まれる全てのヌクレオシドは、ヌクレアーゼによる加水分解に耐性のある結合によりつながれる。この場合において、ヌクレアーゼがそのオリゴヌクレオチドを切断する場合、それは通常、オリゴヌクレオチドの３’部分全体を切断する。ヌクレアーゼ耐性のある結合としては、メチルホスホネート結合およびホスホロチオネート結合が挙げられる。
【００７１】
３’認識基法の別の実施形態において、上流オリゴヌクレオチドの３’部分に含まれる全てのヌクレオシドはホスホジエステル結合によって結合され、上流オリゴヌクレオチドの５’部分は加水分解に耐性のある結合を含む。例えば、加水分解に耐性のある結合は、メチルホスホネート結合またはホスホロチオネート結合であり得る。この実施形態では、３’→５’エキソヌクレアーゼは、加水分解に耐性のある結合で消化を停止させて、隣接するヌクレオチド上に３’末端ヒドロキシルを残す傾向がある。したがって、この結合は所望の消化点に配置され得る。
【００７２】
本発明の方法におけるテンプレート核酸はＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。
【００７３】
本発明の１つの実施形態において、結合基を含む基材は、サイズ排除クロマトグラフィー樹脂であり、混合物はその樹脂を通される。この方法は、３’認識基を含む未反応オリゴヌクレオチドが除去されると同時に、未反応のヌクレオチドのような低分子の除去を可能にする。本明細書中で使用される「樹脂」は、デキストラン、ポリアクリルアミド、アガロース等、およびその混合物のような、天然ポリマーおよび合成ポリマーの両方を指す。
【００７４】
本発明の１つの実施形態において、認識基は抗体によって認識される基であり、結合基は抗体である。例えば、認識基はジゴキシゲニン、フルオレセイン、またはビオチンであり得、結合基は適切な認識基を認識する抗体であり得る。
【００７５】
認識基がビオチンである場合、結合基はまた、例えば、アビジンまたはストレプトアビジンであり得る。
【００７６】
別の特定の実施形態において、認識基はフェニルボロン酸を含み、結合基はサリチルヒドロキサム酸を含む。別の特定の実施形態において、認識基はサリチルヒドロキサム酸を含み、結合基はフェニルボロン酸を含む。
【００７７】
別の特定の実施形態において、認識基はポリヒスチジンであり、結合基はニッケルカチオン−キレート錯体である。ニッケルカチオンのキレーターの例は、ニトリロ三酢酸またはＥＤＴＡである。認識基はまた、ニッケルカチオン−キレートを含み得、結合基はポリヒスチジンであり得る。
【００７８】
別の特定の実施形態において、認識基はオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列であり、結合基は相補的ヌクレオチド配列である。
【００７９】
３’認識基法の別の特定の実施形態において、上流オリゴヌクレオチドの３’部分はＬヌクレオチドから成り、これはＬ型立体配置を有するヌクレオチドを意味する。Ｌ核酸は一般的に、ポリメラーゼによってもリガーゼによっても認識されず、したがって、３’部分がＬヌクレオチドから成る上流オリゴヌクレオチドは通常、その３’部分が除去されない限り、ポリメラーゼによって伸長され得ず、リガーゼによっても連結され得ない。上流オリゴヌクレオチドの３’部分がＬヌクレオチドから成る場合、結合基は、３’Ｌヌクレオチドにハイブリダイズする相補的Ｌオリゴヌクレオチドであり得る。あるいは、他の結合基が３’Ｌヌクレオチド部分に組み込まれ得る。
【００８０】
３’認識基法の別の実施形態において、上流オリゴヌクレオチドの３’部分はペプチド核酸から成る。上流オリゴヌクレオチドの３’部分がペプチド核酸から成る場合、結合部分は、３’ペプチド核酸部位にハイブリダイズする相補的オリゴヌクレオチドであり得る。あるいは、他の結合基が３’ペプチド核酸部位に組み込まれ得る。
【００８１】
３’認識基法の別の特定の実施形態において、上流オリゴヌクレオチドは、３’認識基に対して５’側に改変ヌクレオチドを含み、ヌクレアーゼはその改変ヌクレオチドで上流オリゴヌクレオチドを切断する。１つの実施形態において、ヌクレアーゼは、改変ヌクレオチドが２重鎖中に存在する場合、それが２重鎖中にない場合よりも優先的に、改変ヌクレオチドで上流オリゴヌクレオチドを切断する。ヌクレアーゼが改変ヌクレオチドを、それが２重鎖中にある場合に、より優先的に切断する場合の特定の実施形態において、改変ヌクレオチドはリボヌクレオチドであり、ヌクレアーゼはＲＮＡｓｅ Ｈである。特定の実施形態において、そのＲＮＡｓｅ Ｈは、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＲＮＡｓｅ Ｈ、ヒトＲＮＡｓｅ Ｈ、またはＥ．ｃｏｌｉ ＲＮＡｓｅ Ｈである。
【００８２】
切断部位として使用され得る別の改変ヌクレオチドは、脱塩基性ヌクレオチドである。脱塩基性ヌクレオチド残基はＤＮＡグリコシラーゼにより生成され得る。ＤＮＡグリコシラーゼは、塩基をその糖に結合させているＮ−グリコシド結合の加水分解を介してＤＮＡ内の塩基を除去する酵素である。ほとんどのＤＮＡグリコシラーゼは、ウラシルグリコシラーゼを例外として、２本鎖ＤＮＡに対して非常に選択的である（Ｄｏｄｓｏｎ ＭＬ，Ｍｉｃｈａｅｌｓ ＭＬおよびＬｌｏｙｄ ＲＳ（１９９４）Ｕｎｉｆｉｅｄ Ｃａｔａｌｙｔｉｃ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｆｏｒ ＤＮＡ Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅｓ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６９（５２）：３２７０９−３２７１２）。ＤＮＡグリコシラーゼによって生成された脱塩基性部位は、除去された塩基がプリンであるかピリミジンであるかに依存して、それぞれ脱プリン部位または脱ピリミジン部位と呼ばれる。したがって、それらは本明細書中では、脱プリンまたは脱ピリミジンにちなんで、ＡＰヌクレオチドと呼ばれる。ＤＮＡグリコシラーゼにより生成されたようなＡＰヌクレオチド残基は、下図の中央の分子に示されている。
【００８３】
ＤＮＡグリコシラーゼは２つのグループに分類され得る。単機能性ＤＮＡグリコシラーゼは、グリコシド結合の加水分解を触媒し、脱塩基性部位を生成するのみである。二機能性ＤＮＡグリコシラーゼはさらなる脱塩基性部位リアーゼ活性を有し、β−脱離を介して３’Ｃ−Ｏ結合の切断をもたらす。これは、下図において右向き矢印で示されている。いくつかの二機能性酵素はまた、β−脱離を介して５’Ｃ−Ｏ結合を切断し、遊離４−ヒドロキシ−ペント−２，４−ジエナール、ならびに遊離５’−ホスホリル末端およびＡＰヌクレオチド残基に隣接するヌクレオチドにおける遊離３’−ホスホリル末端で終結する２つのＤＮＡ分子を産生する（Ｆｒｉｅｄｂｅｒｇ，Ｅ．Ｃ．；Ｗａｌｋｅｒ，Ｇ．Ｃ．，Ｓｉｅｄｅ，Ｗ．１９９５．ＤＮＡ Ｒｅｐａｉｒ ａｎｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ．Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．：ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ．，１５６ページ）。
【００８４】
ＡＰヌクレオチド残基を有するオリゴヌクレオチドは、下図において左向き矢印で示されているように、脱プリン／脱ピリミジンエンドヌクレアーゼ（ＡＰエンドヌクレアーゼ）によって、ＡＰヌクレオチドに対して５’側を切断され得る。これらは遊離３’−ＯＨ、ならびにＡＰヌクレオチド残基上において、５’−リン酸を残す。ＡＰエンドヌクレアーゼはまた、下図において上段右にある分子から、３’末端α，β−不飽和アルデヒドを切断し、３’−ＯＨ末端および遊離４−ヒドロキシ−５−ホスホ−２−ペンテナールを残す。
【００８５】
【化３】
２つのよく知られたＡＰエンドヌクレアーゼは、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のような、エキソヌクレアーゼＩＩＩ、およびＡＰＥ １ ＡＰエンドヌクレアーゼである。別のＡＰエンドヌクレアーゼは、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のエンドヌクレアーゼＩＶである。
【００８６】
例示的なＤＮＡグリコシラーゼおよびＡＰエンドヌクレアーゼ、ならびにそれらの活性についてのいくつかの詳細は、以下の表に示されている。
【００８７】
【表５】
【００８８】
【表６】
【００８９】
【表７】
【００９０】
【表８】
ヌクレアーゼは時に、３’末端リン酸を残し、これは上流オリゴヌクレオチドの伸長またはライゲーションを防止する。したがって、この３’末端リン酸を除去するため、その混合物に３’ホスファターゼを含むことが、時々必要である。特定の実施形態において、その混合物はさらに、３’ホスファターゼを含む。特定の実施形態において、３’ホスファターゼはエキソヌクレアーゼＩＩＩ、エキソヌクレアーゼＩＶ、または酵母ＡＰエンドヌクレアーゼである。
【００９１】
２重鎖中において優先的な改変ヌクレオチドでの切断を包含する方法の１つの特定の実施形態において、その改変ヌクレオチドは８−オキソー７，８−ジヒドロー２’−デオキシグアノシン；７−メチルグアニン；２，６−ジアミノ−４−ヒドロキシ−５−Ｎ−メチルホルムアミドピリミジン；４，６−ジアミノ−５−ホルムアミドピリミジン；５−ヒドロキシ−２’−デオキシシチジン；５−ヒドロキシ−２’−デオキシウリジン；またはＮ７−メチルグアニンを含む；およびヌクレアーゼはホルムアミド−ピリミジン−ＤＮＡグリコシダーゼである、そして、その混合物は３’ホスファターゼをさらに含む。
【００９２】
２重鎖中において優先的な改変ヌクレオチドでの切断を包含する方法の１つの特定の実施形態において、その改変ヌクレオチドは、７，８−ジヒドロ−８−オキソグアニン；ホルムアミドピリミジン；２，６−ジアミノ−４−ヒドロキシ−５−ホルムアミドピリミジン；または８−オキソグアニンを含む；およびヌクレアーゼは８−オキソグアニンＤＮＡグリコシダーゼであり、そしてその混合物はＡＰエンドヌクレアーゼをさらに含む。
【００９３】
２重鎖中において優先的な改変ヌクレオチドでの切断を包含する方法の１つの特定の実施形態において、その改変ヌクレオチドは、５，６−ジヒドロチミン；６−ヒドロキシ−５，６−ジヒドロチミン；シス−チミングリコール；トランス−チミングリコール；５−ヒドロキシ−５−メチルヒダントイン；メチルタルトロン尿素；尿素；５−ヒドロキシシトシン；５−ヒドロキシウラシル；ウラシルグリコール；ジヒドロウラシル；６−ヒドロキシウラシル；グリコール；β−ウレイドイソ酪酸；５−ヒドロキシ−６−ヒドロチミン；５，６−ジヒドロウラシル；５−ヒドロキシー６−ヒドロウラシル；５−ヒドロキシー２’−デオキシシチジン；または５−ヒドロキシ−２’−デオキシウリジンを含む；およびヌクレアーゼはエンドヌクレアーゼＩＩＩまたはチミングリコールＤＮＡグリコシダーゼであり、そして、その混合物は、ＡＰエンドヌクレアーゼをさらに含む。
【００９４】
別の特定の実施形態において、改変ヌクレオチドはＡＰヌクレオチドであり、ヌクレアーゼはＡＰエンドヌクレアーゼである。改変ヌクレオチドがＡＰヌクレオチドである場合の特定の実施形態において、ヌクレアーゼはエキソヌクレアーゼＩＩＩ、エンドヌクレアーゼＩＶ、ＡＰＥ １ ＡＰエンドヌクレアーゼ、または酵母ＡＰエンドヌクレアーゼである。
【００９５】
３’認識基法の特定の実施形態において、上流オリゴヌクレオチドの５’部分は、３’認識基とは異なる５’認識基を含む。反応後、所望の生成物は５’認識基を含むが、３’認識基を含まない、一方で上流オリゴヌクレオチドは両方の認識基を含む。したがって、反応混合物を３’認識基に結合する結合基を含む基質に接触させる工程は、未消化上流オリゴヌクレオチドを除去する。その混合物が５’認識基に結合する結合基を含む基質に接触される場合、所望の生成物は反応混合物から除去される。したがって、本発明の別の特定の実施形態は、上流オリゴヌクレオチドの５’部分が、３’認識基と異なる５’認識基を含む方法である。この実施形態において、その方法は、（その混合物を３’認識基に結合する結合基を含む基質に接触させる工程の後）その混合物を５’認識基に結合する結合基を含む基質に接触させる工程をさらに包含し得る。
【００９６】
（５’認識基法）
本発明は、組み込まれていないオリゴヌクレオチドを反応混合物から除去するための別の方法を提供する。本方法は、工程（ａ）：以下（ｉ）核酸リガーゼ、（ｉｉ）ヌクレアーゼ、（ｉｉｉ）３’部分および５’部分を有する下流オリゴヌクレオチド（その５’部分が５’認識基および５’末端ヌクレオチドを含む）、および（ｉｖ）テンプレート核酸、を含む混合物を形成する工程、を包含する。その核酸リガーゼ、およびヌクレアーゼは、同じまたは別個の酵素複合体である。本方法はまた、工程（ｂ）：ヌクレアーゼを用いて、下流オリゴヌクレオチドの５’部分を消化する工程、および工程（ｃ）：リガーゼを用いて、消化された下流オリゴヌクレオチドを上流オリゴヌクレオチドへ連結する工程（その連結工程がポリヌクレオチド生成物を形成する）を包含する。その方法は、工程（ｄ）：その混合物と５’認識基に結合する結合基を含む基質とを接触させ、組み込まれていない下流オリゴヌクレオチドを反応混合物から除去する工程、をさらに包含する。本方法は、本明細書中において、以降は「５’認識基法」と呼ばれる。
【００９７】
５’認識基法の特定の実施形態において、下流オリゴヌクレオチドの５’末端ヌクレオチドは、未消化下流オリゴヌクレオチドのライゲーションを防止する結合基で改変される。特定の実施形態において、結合基は、５−メルカプト、５’−アミノ、５’−二リン酸、５’−三リン酸、または５’−デオキシヌクレオチドである。
【００９８】
特定の実施形態において、結合基は５’認識基を含む。１つの特定の実施形態において、下流オリゴヌクレオチドは、５’認識基が除去されない限り、連結され得ない。
【００９９】
５’認識基法の１つの特定の実施形態において、ヌクレアーゼは５’→３’エキソヌクレアーゼである。１つの特定の実施形態において、５’→３’エキソヌクレアーゼは、優先的に１本鎖ＤＮＡを消化する。そのようなエキソヌクレアーゼの１つは、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓから入手可能であるＲｅｃＪｆである。
【０１００】
５’認識基法の別の特定の実施形態において、ヌクレアーゼは活性化工程が適用されるまでは不活性である。
【０１０１】
５’認識基法の別の特定の実施形態において、５’末端ヌクレオチドは５’認識基の全てまたは一部を含む。別の特定の実施形態において、内部ヌクレオチドは５’認識基の全てまたは一部を含む。
【０１０２】
５’認識基法の１つの特定の実施形態において、下流オリゴヌクレオチドの５’部分はテンプレートと非相補的である。「非相補的」により、５’部分がテンプレートに対してヌクレオチド配列が完全には相補的でないことが意味される。５’部分はテンプレートに対する１塩基のミスマッチを有し得るかもしくはテンプレートに対して相補的な、連続したヌクレオチドを有さないことが有り得るか、またはテンプレートに対して中間相補性の配列を有し得る。５’部分がテンプレートに対して非相補的である場合、下流オリゴヌクレオチドの３’部分は、一般にテンプレートに対して５’部分よりも相補的である。３’部分は一般にテンプレートに対して完全に相補的であるが、その反応条件下で下流オリゴヌクレオチドがそのテンプレートにハイブリダイズし、そして別のハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドへ連結するためにリガーゼの基質として働き得る、そのテンプレートに対して十分に相補的な任意の配列を有し得る。
【０１０３】
５’認識基法の１つの実施形態において、下流オリゴヌクレオチドの５’部分に含まれる全てのヌクレオシドは、ヌクレアーゼによる加水分解に耐性のある結合により連結される。この場合において、ヌクレアーゼがその下流オリゴヌクレオチドを切断する場合、それは通常、その下流オリゴヌクレオチドの５’部分全体を切断する。ヌクレアーゼ耐性のある結合としては、メチルホスホネート結合およびホスホロチオネート結合が挙げられる。
【０１０４】
５’認識基法の別の実施形態において、下流オリゴヌクレオチドの５’部分に含まれる全てのヌクレオシドはホスホジエステル結合によって結合され、下流オリゴヌクレオチドの３’部分は加水分解に耐性のある結合を含む。例えば、加水分解に耐性のある結合は、メチルホスホネート結合またはホスホロチオネート結合であり得る。この実施形態では、５’→３’エキソヌクレアーゼは、加水分解に耐性のある結合で消化を停止させて、隣接するヌクレオチド上に５’末端リン酸を残す傾向がある。したがって、この結合は消化の所望の終点に配置され得る。
【０１０５】
５’認識基法の１つの実施形態において、下流オリゴヌクレオチドの５’部分はＬヌクレオチドからなる。
【０１０６】
本発明の方法におけるテンプレート核酸はＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。
【０１０７】
５’認識基法の１つの実施形態において、結合基を含む基質は、サイズ排除クロマトグラフィー樹脂であり、その混合物はその樹脂を通される。この方法は、５’認識基を含む未反応オリゴヌクレオチドが除去されると同時に、未反応のヌクレオチドのような小分子の除去を可能にする。本明細書中で使用される場合、「樹脂」は、デキストラン、ポリアクリルアミド、アガロース等、およびそれらの混合物のような、天然ポリマーおよび合成ポリマーの両方を指す。
【０１０８】
５’認識基法の別の特定の実施形態において、下流オリゴヌクレオチドの５’部分はＬヌクレオチドから成る、これは、ヌクレオチドがＬ型立体配置であることを意味する。Ｌ核酸は一般的にリガーゼによって認識されない、したがって、５’部分がＬヌクレオチドからなる下流オリゴヌクレオチドは通常、その５’部分が除去されない限りリガーゼによってその５’部分に連結され得ない。５’認識基法の別の特定の実施形態において、下流オリゴヌクレオチドの５’部分はペプチド核酸である。
【０１０９】
５’認識基法の別の実施形態において、下流オリゴヌクレオチドは、改変ヌクレオチド３’→５’認識基を含み、ヌクレアーゼはその改変ヌクレオチドで下流オリゴヌクレオチドを切断する。１つの実施形態において、ヌクレアーゼは、改変ヌクレオチドが２重鎖中に存在する場合に、それが２重鎖中にない場合よりも優先的に改変ヌクレオチドで上流オリゴヌクレオチドを切断する。
【０１１０】
ヌクレアーゼが改変ヌクレオチドで、それが２重鎖中に存在する場合に、より優先的に切断する場合の１つの実施形態において、改変ヌクレオチドはリボヌクレオチドであり、ヌクレアーゼはＲＮＡｓｅ Ｈである。
【０１１１】
５’認識基法で、ヌクレアーゼが改変ヌクレオチドで、それが２重鎖中に存在する場合に、より優先的に切断する場合の１つの実施形態において、改変ヌクレオチドは、８−オキソ−７，８−ジヒドロ−２’−デオキシグアノシン；７−メチルグアニン；２，６−ジアミノ−４−ヒドロキシ−５−Ｎ−メチルホルムアミドピリミジン；４，６−ジアミノ−５−ホルムアミドピリミジン；５−ヒドロキシ−２’−デオキシシチジン；５−ヒドロキシ−２’−デオキシウリジン；またはＮ７−メチルグアニンであるかまたはそれらを含み；そしてヌクレアーゼはホルムアミド−ピリミジン−ＤＮＡグリコシダーゼである。
【０１１２】
５’認識基法で、ヌクレアーゼが改変ヌクレオチドで、それが２重鎖中に存在する場合に、より優先的に切断する場合の別の実施形態において、改変ヌクレオチドは８−ヒドロキシグアニンを含み、ヌクレアーゼは８−ヒドロキシグアニンエンドヌクレアーゼまたはＮ−メチルプリンＤＮＡグリコシダーゼである。
【０１１３】
５’認識基法で、ヌクレアーゼが改変ヌクレオチドを、それが２重鎖中に存在する場合に、より優先的に切断する場合の別の特定の実施形態において、改変ヌクレオチドは７，８−ジヒドロー８−オキソグアニン；ホルムアミドピリミジン；２，６−ジアミノ−４−ヒドロキシ−５−ホルムアミドピリミジン；または８−オキソグアニンを含み、そしてヌクレアーゼは８−オキソグアニン−ＤＮＡグリコシラーゼである。
【０１１４】
５’認識基法で、ヌクレアーゼが改変ヌクレオチドで、それが２重鎖中に存在する場合に、より優先的に切断する場合の別の特定の実施形態において、改変ヌクレオチドはＡＰヌクレオチドである。改変ヌクレオチドがＡＰヌクレオチドである場合の特定の実施形態において、ヌクレアーゼはリアーゼ活性を有するＤＮＡグリコシラーゼである。
【０１１５】
ヌクレアーゼは時に、遊離５’−ＯＨを残し、これはライゲーションの基質ではあり得ない。したがって、この５’−ＯＨにリン酸を１つ付加するために、その混合物に５’キナーゼを含めることは、時に必要である。特定の実施形態において、その混合物は５’キナーゼをさらに含む。
【０１１６】
５’認識基法の特定の実施形態において、下流オリゴヌクレオチドは、改変ヌクレオチド３’→５’認識基を含み、ヌクレアーゼはその改変ヌクレオチドで下流オリゴヌクレオチドを切断して５’末端ＡＰヌクレオチドを残し、その混合物はデオキシリボホスホジエステラーゼ（ｄＲｐａｓｅ）をさらに含む。「ｄＲｐａｓｅ」は、本明細書では５’末端ＡＰヌクレオチドを除去する酵素として定義される。一例として、Ｅ．ｃｏｌｉ ＲｅｃＪタンパク質（Ｆｒｉｅｄｂｅｒｇ，Ｅ．Ｃ．；Ｗａｌｋｅｒ，Ｇ．Ｃ．およびＳｉｅｄｅ，Ｗ．１９９５．ＤＮＡ Ｒｅｐａｉｒ ａｎｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ．Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．：ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ）がある。
【０１１７】
５’認識基法の特定の実施形態において、下流オリゴヌクレオチドの３’部分は５’認識基とは異なる３’認識基を含む。反応後、所望の生成物は３’認識基を含むが、５’認識基を含まない。他方、未消化下流オリゴヌクレオチドは両方の認識基を含む。したがって、反応混合物を５’認識基に結合する結合基を含む基質に接触させる工程は、未消化下流オリゴヌクレオチドを除去する。その混合物が３’認識基に結合する結合基を含む基質に接触される場合、所望の生成物は反応混合物から除去される。したがって、５’認識基法の別の特定の実施形態は、下流オリゴヌクレオチドの３’部分が、５’認識基と異なる３’認識基を含む方法である。この実施形態において、その方法は、（その混合物を５’認識基に結合する結合基を含む基質に接触させる工程の後）その混合物を３’認識基に結合する結合基を含む基質に接触させる工程をさらに包含し得る。
【０１１８】
（認識／結合基）
認識基はヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドに付加され得る、または当該分野で公知の技術により、合成可能な任意の部分においてオリゴヌクレオチドに組み込まれ得る。結合基もまた、合成可能な任意の部分において担体に付加され得る。例えば、適切な試薬と反応条件が、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，パートＢ：Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，第２版，ＣａｒｙおよびＳｕｎｄｂｅｒｇ（１９８３）；Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ，ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，第２版，Ｍａｒｃｈ（１９７７）；Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，第２版，Ｇｒｅｅｎｅ，Ｔ．Ｗ．およびＷｕｔｚ，Ｐ．Ｇ．Ｍ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；ならびにＣｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ，Ｌａｒｏｃｋ，Ｒ．Ｃ．，第２版，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９９）などで開示されている。標識試薬および予め標識されたヌクレオチドはまた、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｃｏｒｐ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ；Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐ．，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ；およびＰｒｏｌｉｎｘ，Ｉｎｃ．，Ｒｅｄｍｏｎｄ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎのような民間の業者からも入手可能である。認識基、または認識基が標識されたヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド合成装置により、オリゴヌクレオチドに組み込まれたヌクレオチド単位の１つとしてオリゴヌクレオチドに組み込まれ得る。
【０１１９】
結合基が付加された担体は、多くの民間業者から入手可能である。例えば、ストレプトアビジンでコーティングされた磁性ビーズは、Ｄｙｎａｌ，Ｏｓｌｏ，Ｎｏｒｗａｙから入手可能である。サリチルヒドロキサム酸およびフェニルボロン酸基を組み込んだ担体は、Ｐｒｏｌｉｎｘ，Ｒｅｄｍｏｎｄ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎから入手可能である。ニッケル−ＮＴＡ錯体でコーティングされた磁性アガロースビーズはＱｉａｇｅｎから入手可能である。
【０１２０】
適切な認識基で標識されたヌクレオチドには、下に示すように、６−ＦＡＭＴＭ−ｄＵ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）およびビオチン−ｄＵが挙げられる。
【０１２１】
【化４】
【０１２２】
【化５】
ヌクレオチドに付加できる状態にある別の適切な認識基は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド−テトラメチルローダミン（ＮＨＳ−ＴＡＭＲＡ）（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）である。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル化認識基は、付加物を形成するように、アミノ基と反応する。したがってＴＡＭＲＡ−ＮＨＳエステルは、オリゴヌクレオチドの３’末端ヌクレオチドへ認識基を付加するように、３’アミノオリゴヌクレオチドと反応し得る。
【０１２３】
【化６】
【実施例】
【０１２４】
本発明がより容易に理解され得るために、本発明を説明することが意図された以下の実施例が参照される。しかし発明はこれらの範囲に限定されない。
【０１２５】
（実施例１）
１００μｌのＰＣＲ反応を、ＰＣＲ緩衝液（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、各ｄＮＴＰ ２００μＭ、各プライマー０．２５μＭ、酵素２．５単位、およびファージラムダＤＮＡ ２５ｎｇを含む０．２ｍｌ ＭＩＣＲＯＡＭＰチューブ内で実行した。反応液を９５℃で１０分間加熱し、その後９４℃、１５秒間および６８℃、１分間の３０サイクルの温度サイクルに供し、その後、最後のサイクルを７２℃、７分間の伸長と４℃での最終保持にて行った。反応を非プルーフリーディング酵素（ＡＭＰＬＩＴＡＱ，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、またはプルーフリーディングポリメラーゼ（ＰＦＵ ＴＵＲＢＯ，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて行った。全ての反応は、ＴＡＭＲＡ−ＰＣ０２を逆方向プライマーとして使用した。ミスマッチ＃１のための順方向プライマーはＦ−ＰＣ０１−ＢｄＴであった。ここで２つの３’末端ヌクレオチド、ビオチン−ｄＴおよびＣ、はミスマッチである。ミスマッチ＃２のための順方向プライマーはＰＣ０１−ＦＡＭであった、ここで、２つの３’末端ヌクレオチド、Ｃおよび３’−フルオレセインｄＴ ＣＰＧ、はミスマッチである。マッチ＃１のための逆方向プライマーはＦ−ＰＣ０１であった。プライマー配列は、３’末端を右にして、以下に示されている。
【０１２６】
【化７】
予測された生成物は５００ｂｐであった。ゲル電気泳動は、非プルーフリーディング酵素が、マッチしたプライマーを用いて予測される生成物を生成することができたこと、しかしいずれのミスマッチされたプライマーを用いてもできなかったこと、を明らかにした。プルーフリーディング酵素は、対照的に、マッチした、およびミスマッチした逆方向プライマーの両方を用いて、期待される生成物をよい収量で生成した（データは示されていない）。
【０１２７】
（実施例２）
１００μｌのＰＣＲ反応を、２ｍＭ ＭｇＳＯ４、各ｄＮＴＰ ２００μＭ、各プライマー０．２５μＭ、ＰＦＵ ＴＵＲＢＯポリメラーゼ２．５単位、およびラムダＤＮＡ ２５ｎｇにおいて、ＰＣＲ緩衝液を含む０．２ｍｌ ＭＩＣＲＯＡＭＰチューブ内で実行した。温度サイクルプログラムは、例１と同様である。生成物反応混合物１μｌを、ＧＳ ＳＴＲ ＰＯＰ４（Ｃ）ランモジュール、１秒注入、７．５ｋＶ／注入、１５ｋＶ／ラン、６０℃、３０分間を利用して、ＡＢＩ３１０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて解析した。
【０１２８】
生成物反応混合物の一部を、組み込まれていないビオチン化プライマーを除去するため、磁性ストレプトアビジン−コーティングビーズ（Ｄｙｎａｌ，Ｏｓｌｏ，Ｎｏｒｗａｙ）に接触させた。磁性ストレプトアビジン−コーティングビーズに接触する前後の反応混合物のサンプルを、電気泳動および蛍光検出により解析した。これらの実験は、そのビーズが、組み込まれていないＴＡＭＲＡ標識されたプライマーを除去することも、ＴＡＭＲＡおよびＦＡＭ標識を有するがビオチンを有さない生成物を除去することもなしに、組み込まれていないビオチン化プライマーを除去することを示した。
【０１２９】
（参考文献）
【０１３０】
【化８】
本明細書中で引用された全ての参考文献は、本明細書中に参考として援用される。
【配列表】
【背景技術】
【０００１】
（背景）
核酸配列解析は主な研究分野、医療分野、産業分野で非常に重要である。例として、ＣａｓＫｅｙ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３６：１２２３−１２２８（１９８７）；Ｌａｎｄｅｇｒｅｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：２２９−２３７（１９８８）；ならびに、Ａｒｎｈｅｉｍら，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６１：１３１−１５６（１９９２）を参照のこと。最も一般に使用されている配列解析の技術はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である。ＰＣＲおよびその他の配列決定技術には、ポリメラーゼを用いたオリゴヌクレオチドプライマーの伸長が含まれる。ポリメラーゼを用いたプライマーの伸長はまた、インビボにおいて、ＤＮＡ複製のときおよびＲＮＡを形成するためのＤＮＡの転写のときに起こる。
【０００２】
インビボでのＤＮＡ複製の忠実度は、部分的に、ＤＮＡポリメラーゼの３’→５’エキソヌクレアーゼプルーフリーディング活性により保たれている。誤ったヌクレオチドが組み込まれて、テンプレートとのミスマッチが形成される場合、それは３’→５’エキソヌクレアーゼにより除去される。しかしながら、最も広くＰＣＲに使用されている耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ）ポリメラーゼは、３’→５’エキソヌクレアーゼを欠いている。
【０００３】
その他の配列決定または核酸解析の方法は、オリゴヌクレオチドのライゲーションを含むか、またはオリゴヌクレオチドのライゲーションとオリゴヌクレオチドのポリメラーゼによる伸長の両方を含む。技術の１つは、Ｗｈｉｔｅｌｅｙらによる米国特許第４，８８３，７５０号の、オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（ＯＬＡ）である。この方法は、変性したテンプレート核酸試料の中に標的配列が存在するか否かを決定するために使用される。２本のオリゴヌクレオチドプローブが設計され、それらは一方のオリゴヌクレオチドの５’側塩基が他方の３’側塩基に隣接した状態で、標的配列にハイブリダイズする。これらの２つの塩基がテンプレートＤＮＡの標的配列と完全なハイブリッドを形成した場合、これらのオリゴヌクレオチドはＤＮＡリガーゼによって互いに連結される。テンプレートＤＮＡが標的配列上のこれら２つの塩基のうちの１つで突然変異を起こしていた場合、オリゴヌクレオチドは連結され得ない。耐熱性リガーゼを使用した場合、反応は、まさにＰＣＲのような繰返しサイクルの中で実施され得る。この方法により、シグナル／ノイズ比は大きく改善され得る（ＷｕとＷａｌｌａｃｅ，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ４：５６０（１９８９）；Ｂａｒａｎｙ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：１８９（１９９１）参照）。ＯＬＡとＰＣＲを組合わせたアッセイは、Ｅｇｇｅｒｄｉｎｇ，米国特許第６，１３０，０７３号；およびＮｉｃｋｅｒｓｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：８９２３−８９２７（１９９０）に記載されている。
【０００４】
ＰＣＲ、およびオリゴヌクレオチドを使用した、ポリメラーゼに基づく他のアッセイにおいて、ライゲーションに基づくアッセイにおいてと同様に、多くの場合、その後の解析工程に用いるため、反応混合物から、伸長されていない、もしくは連結されていないオリゴヌクレオチドを除去する必要がある。これは、例えば、入れ子の（ｎｅｓｔｅｄ）ＰＣＲとＰＣＲ産物の配列決定、または増幅産物が、プライマーが競合的にハイブリダイズする配列にハイブリダイズする場合に必要なことである。したがって、迅速かつ簡便に、ポリメラーゼおよびリガーゼの反応混合物から、伸長されていないオリゴヌクレオチドを除去する技術が必要とされる。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
（発明の要旨）
本発明の１つの実施形態は、組み込まれていないオリゴヌクレオチドを反応混合物から除去する方法を提供する。その方法は、以下の工程：（ａ）ＤＮＡポリメラーゼまたは核酸リガーゼ、ヌクレアーゼ、３’部分および５’部分を有する上流オリゴヌクレオチド（ここで、その３’部分は３’認識基および３’末端ヌクレオチドを有する）、およびテンプレート核酸、を含む混合物を形成する工程、（ｂ）ヌクレアーゼを用いて、上流オリゴヌクレオチドの３’部分を消化する工程、（ｃ）ポリメラーゼを用いて、その消化された上流オリゴヌクレオチドを伸長する工程、または、リガーゼを用いて、その消化された上流オリゴヌクレオチドを下流オリゴヌクレオチドに連結する工程であり、その伸長工程または連結工程により、ポリヌクレオチド生成物を形成する工程、ならびに（ｄ）組み込まれていない上流オリゴヌクレオチドを反応混合物から除去するために、その混合物と３’認識基に結合する結合基を有する基質とを接触させる工程、を包含する。この方法で使用されるＤＮＡポリメラーゼまたは核酸リガーゼ、およびヌクレアーゼは、同じまたは異なる酵素複合体であり得る。
【０００６】
この実施形態では、認識基は一般に上流オリゴヌクレオチドの３’末端ヌクレオチドに付着する。その認識基は、その３’認識基が除去されるまで、上流オリゴヌクレオチドが伸長または連結されることを防ぎ得る。上流オリゴヌクレオチドの３’部分はテンプレートと相補的でなくてもよく、その結果、その３’部分は、３’認識基とともに、３’→５’プルーフリーディングエキソヌクレアーゼにより除去される傾向がある。
【０００７】
本発明の別の実施形態は、組み込まれていないオリゴヌクレオチドを反応混合物から除去する方法を提供する。その方法は、以下の工程：（ａ）核酸リガーゼ、ヌクレアーゼ、３’部分および５’部分を有する下流オリゴヌクレオチド（ここで、その５’部分は５’認識基および５’末端ヌクレオチドを含む）、およびテンプレート核酸、を含む混合物を形成する工程、（ｂ）ヌクレアーゼを用いて、下流オリゴヌクレオチドの５’部分を消化する工程、（ｃ）リガーゼを用いて、その消化された下流オリゴヌクレオチドを上流オリゴヌクレオチドに連結する工程であり、その連結工程により、ポリヌクレオチド生成物を形成する工程、ならびに（ｄ）組み込まれていない下流オリゴヌクレオチドを反応混合物から除去するために、その混合物と５’認識基に結合する結合基を有する基質とを接触させる工程、を包含する。この核酸リガーゼおよびヌクレアーゼは、同じまたは異なる酵素複合体である。
【０００８】
この実施形態では、５’認識基は一般に下流オリゴヌクレオチドの５’末端ヌクレオチドに付着し、その５’認識基が除去されるまで、下流オリゴヌクレオチドが連結されることを防止する。
【０００９】
（発明の詳細な説明）
（定義）
「核酸ポリメラーゼ」は、ＤＮＡまたはＲＮＡテンプレートのいずれかを使用して、ヌクレオシド三リン酸からの核酸生成物の形成を触媒する酵素である。「核酸ポリメラーゼ」はＲＮＡポリメラーゼおよびＤＮＡポリメラーゼの両方を含む。
【００１０】
「ＤＮＡポリメラーゼ」は、ＤＮＡを合成するポリメラーゼを意味する。これは、ＤＮＡに依存性ＤＮＡポリメラーゼ（ＤＮＡをテンプレートとして使用する）、およびＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼすなわち逆転写酵素（ＲＮＡをテンプレートとして使用する）の両方を含む。
【００１１】
「オリゴヌクレオチド」とは、ポリ核酸、もしくは第二の核酸配列にハイブリダイズし得る、共有結合で連結された一連の核酸塩基を指す。適切な条件下でテンプレートにハイブリダイズする場合、ヌクレオチドを加えることで、オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡポリメラーゼにより伸長される基質として働き得る。オリゴヌクレオチドはまた、リガーゼの基質としても働き得る。上流オリゴヌクレオチドが下流オリゴヌクレオチドに接するテンプレートにハイブリダイズする場合、２つのオリゴヌクレオチドは連結され得る。そのオリゴヌクレオチドは、主に、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド、または両者の混合物から成り得る。そのオリゴヌクレオチドはまた、改変ヌクレオチドを含み得る。通常、モノマーは、ホスホジエステル結合により連結され、ポリヌクレオチドを形成する。しかしながら、そのオリゴヌクレオチドのヌクレオシドモノマーは、他の結合によっても連結され得る。オリゴヌクレオチドは、標的テンプレートに特異的にハイブリダイズし、ヌクレアーゼを用いた消化の後にポリメラーゼにより伸長、またはリガーゼにより連結されるのに十分な任意の長さであり得る。この長さは、６オリゴヌクレオチド程度から１０００ヌクレオチド以上に及び得る。代表的に、オリゴヌクレオチドは約９ヌクレオチドから約１００ヌクレオチド、約１０ヌクレオチドから約５０ヌクレオチド、または、約１０ヌクレオチドから約２５ヌクレオチドの長さに及ぶ。３’認識基を含むオリゴヌクレオチドの３’部分を除去するため（または、一部のライゲーション反応において５’部分に認識基が存在する場合、５’認識基を含むオリゴヌクレオチドの５’部分を除去するため）のヌクレアーゼによる切断の後、そのオリゴヌクレオチドは、ポリメラーゼによる伸長またはリガーゼによるライゲーションを可能にするのに十分安定にテンプレートにハイブリダイズするために十分な数の、ハイブリダイズしているヌクレオチドを含む。そのオリゴヌクレオチドにおけるヌクレオチドモノマーの配列は、認識基のようなその他の基により中断もしくは付加され得る。「オリゴヌクレオチド」という用語はまた、天然に存在するポリヌクレオチドのアナログを含む。そのようなアナログの例には、それらに限定されるものではないが、ペプチド核酸とＬＯＣＫＥＤ ＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤ（ＬＮＡ）が挙げられる。ペプチド核酸の開示については、Ｅｇｈｏｌｍら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４：１４９７（１９９１）；ＷＯ９２／２０７０２；ならびに米国特許第６，１８０，７６７号および第５，７１４，３３１号を参照のこと。ペプチド核酸は、塩基が結合する主鎖として、糖−リン酸の代わりに、ペプチド主鎖を有している。
【００１２】
「改変ヌクレオチド」は、例えば、Ｓｃｈｅｉｔ，Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ａｎａｌｏｇ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９８０）およびＵｈｌｍａｎとＰｅｙｍａｎ，Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ９０：５４３−５８４（１９９０）で記載されているような、ジデオキシリボヌクレオチドおよび改変塩基部分または改変糖部分を有する合成ヌクレオチドを含む。このようなアナログは、結合能を増強させ、変質を減らし、特異性を向上させるように設計された合成ヌクレオチドを含む。「改変ヌクレオチド」という用語はまた、３’−ジデオキシリボヌクレオチド、３’−デオキシリボヌクレオチド、３’−ＮＨ２、３’−ＳＨ、３’−ホスホグリコアルデヒド、および３’−Ｐｉヌクレオチドのような、３’末端をブロックし、伸長やライゲーションが起こらないようにしたヌクレオチド、および、その３’−ヒドロキシルにビオチンのような認識基が結合したヌクレオチドを含む。「改変ヌクレオチド」という用語はまた、５’−デオキシリボヌクレオチド、５’−ＮＨ２、５’−ＳＨのような、５’末端をブロックし、５’末端のライゲーションが起こらないようにしたヌクレオチド、および、その５’−ヒドロキシルにビオチンのような認識基が結合したヌクレオチドを含む。「改変ヌクレオチド」という用語はまた、３’−または５’−ヒドロキシル以外の部分に認識基が結合したヌクレオチドを含む。「改変ヌクレオチド」という用語はまた、ハイブリダイズする部分が主にＤＮＡであるオリゴヌクレオチドに関連した通常のリボヌクレオチドを含む。「改変ヌクレオチド」という用語はまた、「ＡＰヌクレオチド」として本明細書中で呼ばれる、塩基を欠いたヌクレオチドを含む。ＡＰは、欠けている塩基がピリミジンであるかプリンであるかによって、それぞれ脱ピリミジン（ａｐｙｒｉｍｉｄｉｎｉｃ）、または脱プリン（ａｐｕｒｉｎｉｃ）を意味する。
【００１３】
本明細書中で使用される場合、「ヌクレオチド」は本質的に、塩基、糖、リン酸またはポリリン酸から成る部分を含み、また同様に、それらの塩基、糖、リン酸が改変された部分を含む。それはまた、リン酸を有さないかまたは化学的に異なる基でリン酸が置換された部分を含む。例えば、本明細書中で使用される場合、「ポリヌクレオチド」は、そのヌクレオシドまたは改変ヌクレオシドが、メチルホスホネート結合、またはホスホロチオネート結合のような、改変ホスホジエステル結合によって連結されるポリマーを含む。「ヌクレオチド」という用語はまた、ＡＰヌクレオチドを含み、これは塩基を欠き、その塩基が、グリセロールのような脱塩基性基によって置換されたものである。
【００１４】
【化１】
「テンプレート核酸」とは、ＲＮＡおよびＤＮＡの両方を含む。それは、オリゴヌクレオチドが結合し、ポリメラーゼによるオリゴヌクレオチドの伸長、またはリガーゼによるオリゴヌクレオチドのライゲーションのためのテンプレートとして働く、ポリ核酸を指す。
【００１５】
「認識基」とは、結合基により認識され得、特異的に付加され得るオリゴヌクレオチドに結合した化学基を指す。認識基は共有結合、または非共有結合され得る。好ましくは、それは共有結合される。それが非共有結合される場合、その付加は、望ましくは、ポリメラーゼまたはリガーゼ反応条件下で、および結合基に接触する条件下で、非常に安定である。認識基は、オリゴヌクレオチドの任意のヌクレオチドまたはヌクレオシド残基上の合成可能な任意の部分に付加され得る。例えば、認識基は、３’末端ヌクレオチドの３’ヒドロキシルまたは５’末端ヌクレオチドの５’ヒドロキシルに付加され得る。認識基はまた、オリゴヌクレオチドの内部残基に付加され得る。認識基が付加のために２つの適切な部分を有している場合、その認識基は、ヌクレオチドまたはヌクレオシドの両側に隣接して、ポリ核酸の主鎖の一部を形成し得る。
【００１６】
本明細書中で使用される場合、「３’末端ヌクレオチド」は、オリゴヌクレオチドの３’方向の最も端にあるヌクレオチドを指す。このヌクレオチドは、遊離３’−ＯＨを有し得るか、または、ブロック基もしくは３’認識基に付加されているか、または３’デオキシヌクレオチドにおけるように存在しない、３’ヒドロキシルを有し得る。オリゴヌクレオチドはまた、環状であり得る、そのため、３’末端ヌクレオチドは、例えば自身の３’ヒドロキシルを介して、そのオリゴヌクレオチドの別のヌクレオチドに付加されている。
【００１７】
本明細書中で使用される場合、「５’末端ヌクレオチド」は、オリゴヌクレオチドの５’方向の最も端にあるヌクレオチドを指す。このヌクレオチドは、遊離５’−ＯＨもしくは５’−モノ、ジ、もしくはトリ−リン酸を有し得るか、または、ブロック基もしくは５’認識基に付加されているか、または５’デオキシヌクレオチドにおけるように存在しない、５’ヒドロキシルを有し得る。オリゴヌクレオチドはまた、環状であり得る、そのため、５’末端ヌクレオチドは、例えば自身の５’ヒドロキシルを介して、そのオリゴヌクレオチドの別のヌクレオチドに付加されている。
【００１８】
「サイズ排除クロマトグラフィー樹脂」は、天然材料もしくは合成材料で作製されており、サイズ排除クロマトグラフィーに適した、任意のタイプの固相マトリックスを指す。これには、例えば、デキストラン、アガロース、ポリアクリルアミド、およびそれらの混合物が挙げられる。
【００１９】
「結合基」は、その結合基を含む基質に反応混合物が接触する工程の条件下において、認識基に特異的に結合する化学基を指す。その結合は、共有結合性または非共有結合性相互作用により得る。非共有結合性相互作用は、例えば、イオン性または疎水性、またはそれらの混合であり得る。その相互作用は、認識基を含むオリゴヌクレオチドの大部分、または、さらに実質的に全てが、結合基を含む基質に結合し、それによって反応混合物から除去されるのに十分に強くあるべきである。ここでの「実質的に全て」は、少なくとも８０％を意味する。代替の実施形態では、認識基を含むオリゴヌクレオチドの少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％が結合基を含む基質に結合し、それによって反応混合物から除去される。結合基は、例えば、抗体、タンパク質、糖、金属カチオン、または他の化学基であり得る。
【００２０】
適切な認識基としては、ジゴキシゲニン、フルオレセイン、そしてビオチンが挙げられる。適切な結合基としては、ジゴキシゲニンに結合する抗ジゴキシゲニン抗体；フルオレセインに結合する抗フルオレセイン抗体；およびビオチンに結合する抗ビオチン抗体、ストレプトアビジン、またはアビジンが挙げられる。別の適切な認識基はポリヒスチジンである。この場合、適切な結合基はＮｉ２＋カチオンである。代表的には、Ｎｉカチオンはキレーターに結合している。ポリヒスチジンは、このペプチドがＮｉカチオンと安定的に相互作用する限り、ほぼ任意の長さの連続したヒスチジン残基を含み得る。代表的に、およそ６マーのヒスチジンが使用される。別の適切な認識基−結合基の対は、フェニルボロン酸（ＰＢＡ）を含む認識基およびサリチルヒドロキサム酸（ＳＨＡ）を含む結合基（逆も可）である。ＰＢＡ（左）、ＳＨＡ（右）を含む基を、それらのＰＢＡ−ＳＨＡ複合体を形成する反応とともに下に示す。Ｒは、オリゴヌクレオチドまたは結合基支持体への付加点を表す。付加点は、示されている点だけでなく、任意の化学的に付加可能な点であり得る。「フェニルボロン酸を含む基」という用語はまた、例えば、フェニル基が第２のボロン酸で置換された基のような、ＰＢＡ官能性を残している他の基を含む。同様に「サリチルヒドロキサム酸を含む基」という用語は、ＰＢＡ含有基およびＳＨＡ含有基が互いに結合する能力を保っている限り、例えばフェニル環が置換されているような、ＳＨＡ官能性を残している他の基を含む。Ｐｒｏｌｉｎｘ Ｉｎｃ．，Ｂｏｔｈｅｌｌ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎの製品を参照のこと。
【００２１】
【化２】
ＰＢＡ−ＳＨＡ結合は、フェニルボロン酸またはフェニル−１，３−ジボロン酸のような競合物を付加の際、可逆性である。例えば、米国特許第５，５９４，１１１号；同第６，１５６，８８４号；および同第５，６２３，０５５号、ならびにＰｒｏｌｉｎｘ，Ｉｎｃ．，Ｒｅｄｍｏｎｄ，Ｗａｓｈ．からの製品説明書を参照のこと。
【００２２】
本明細書中で使用される場合、「ＲＮＡｓｅ Ｈ」は、ＲＮＡ：ＤＮＡヘテロ２重鎖の一部であるＲＮＡを切断する酵素を意味する。１つもしくはそれ以上のＲＮＡ残基のオリゴヌクレオチドへの組み込みにより、そのオリゴヌクレオチドがＤＮＡテンプレート鎖にハイブリダイズした場合、そのオリゴヌクレオチドはハイブリダイズしたＲＮＡ残基で切断され得る。いくつかのＲＮＡｓｅ Ｈは、１つのオリゴヌクレオチドにただ１つののみのリボヌクレオチドを、基質として必要とする。他は、最大４つまでのリボヌクレオチドでできたセグメントを必要とする。ＲＮＡｓｅ Ｈ活性は、逆転写酵素を含む、いくつかのポリメラーゼにも見られ得る。ＲＮＡｓｅ Ｈはまた、別個の酵素でもよい。適切なＲＮＡｓｅ Ｈの１つは、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、またはＴｔｈ、ＲＮＡｓｅ Ｈである。その他の適切なＲＮＡｓｅ Ｈ酵素は、ヒトおよびＥ．ｃｏｌｉのＲＮＡｓｅ Ｈを含む。
【００２３】
本明細書中で使用される場合、「酵素複合体」は、タンパク質を意味する。そのタンパク質は、１つまたはそれ以上のポリペプチド鎖であり得る。それが１つ以上のポリペプチド鎖を有する場合、通常それらのポリペプチド鎖は共同で作用する。１つの酵素複合体は１つの酵素活性、または１つ以上の酵素活性を有し得る。例えば、１つの酵素複合体はポリメラーゼ活性とヌクレアーゼ活性の両方を有し得るか、またはリガーゼ活性とヌクレアーゼ活性の両方を有し得る。１つより多い酵素活性のための活性部位は、オーバーラップしているかもしくは同じ活性部位であり得るか、または、それらは酵素複合体上で空間的に分離され得る。
【００２４】
「５’キナーゼ」は、核酸の５’−ＯＨへリン酸を付加するキナーゼを指す。
【００２５】
「３’ホスファターゼ」は、３’−ホスホヌクレオチドからリン酸を除去して遊離３’−ＯＨを生じさせる酵素を指す。
【００２６】
「ＡＰエンドヌクレアーゼ」は、ＡＰヌクレオチド（塩基を欠いたヌクレオチド）の５’部分を切断し、遊離３’−ＯＨを隣接したヌクレオチドに生じさせ、ＡＰヌクレオチドに５’−リン酸を生じさせる、任意の酵素を指す。
【００２７】
本明細書中で使用される場合、「上流」はオリゴヌクレオチドの５’末端の方向を意味し、「下流」はオリゴヌクレオチドの３’末端の方向を意味する。２つのオリゴヌクレオチドがテンプレートにハイブリダイズした場合、最も５’位にあるオリゴヌクレオチド、すなわち、テンプレートの最も３’位にハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドは、上流オリゴヌクレオチドと呼ばれる。最も３’位にあるオリゴヌクレオチド、すなわち、テンプレートの最も５’位にハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドは、下流オリゴヌクレオチドと呼ばれる。
【００２８】
本明細書中で使用される場合、「ｄＲｐａｓｅ」は５’末端ＡＰエンドヌクレオチドを切り取る酵素を指す。
【００２９】
「ヌクレアーゼ」は、核酸を、ヌクレオシド間のホスホジエステル結合、または他の結合で切断する酵素を指す。ヌクレアーゼは、核酸基質の３’末端または５’末端から１度に１つのヌクレオチドを除去するエキソヌクレアーゼであり得、または、基質核酸の内部結合を切断し、各生成物中に少なくとも２つのヌクレオチドを有する２つの生成物を生成するエンドヌクレアーゼであり得る。
【００３０】
（説明）
本発明の１つの実施形態は、ビオチンのような認識基を有する上流オリゴヌクレオチドの３’部分を標識する工程に関連する。一般に、その認識基は３’末端ヌクレオチドに付加するが、それはまた、内部ヌクレオチドにも付加し得る。そのオリゴヌクレオチドはポリメラーゼまたはリガーゼ反応混合物において使用され、それはポリメラーゼにより伸長されるか、またはリガーゼにより下流オリゴヌクレオチドに連結される。上流オリゴヌクレオチドの３’末端ヌクレオチドは、その末端ヌクレオチドが除去されない限り伸長または連結され得ないように、ブロックされ得る。そのブロックは、認識基自体であるまたは別のブロック基であり得る。通常、認識基は３’末端ヌクレオチドに付加され、また上流オリゴヌクレオチドの伸長や連結をブロックする。上流オリゴヌクレオチドの３’部分は、その上流オリゴヌクレオチドが結合するテンプレート核酸の標的配列に対して非相補的であり得る。次いで、ヌクレアーゼは、ある種のポリメラーゼの３’→５’プルーフリーディングエキソヌクレアーゼ活性のように、３’認識基を含む上流オリゴヌクレオチドの３’部分を除去する。３’末端ヌクレオチドがブロックされている場合、少なくともそのヌクレオチドは、ポリメラーゼが上流オリゴヌクレオチドを伸長し得る前、またはリガーゼが上流オリゴヌクレオチドを下流オリゴヌクレオチドに連結し得る前に、除去されなければならない。上流オリゴヌクレオチドの３’部分がテンプレートに対して非相補的である場合、プルーフリーディングエキソヌクレアーゼはそれを除去する可能性が高い。上流オリゴヌクレオチドの、３’認識基を含む３’部分の除去に続いて、上流オリゴヌクレオチドはポリメラーゼによって伸長されるかまたは、リガーゼによって下流オリゴヌクレオチドに連結される。したがって、所望の伸長された、または連結された生成物は３’認識基を欠いており、一方で、未反応上流オリゴヌクレオチドは、まだ認識基を含んでいる。認識基に結合する基を含む基質に反応混合物を接触させることにより、認識基を含むオリゴヌクレオチドは、認識基を欠く所望の生成物から除去され得る。例えば、認識基がビオチンである場合、その混合物はアビジンまたはストレプトアビジンを含む基質に接触させることができる。本発明は、ＰＣＲ、逆転写酵素ＰＣＲ、ＲＮＡ生成物のランオフ解析、一塩基伸長、およびその他のアッセイを含む、全てのタイプの核酸ポリメラーゼ反応混合物に利用できる。本発明はまた、リガーゼ反応単独、またはポリメラーゼ反応と組合わせたリガーゼ反応に利用できる。
【００３１】
認識基を含む未反応オリゴヌクレオチドを除去するため、反応混合物を結合基を含む基質に接触させる。その結合基は、種々の支持体、例えば、ビーズ、マイクロチャネル、フィルター、またはアガロースまたはセルロースのような線維、に付加される。結合したオリゴヌクレオチドとその混合物のその他の物質との間の分離は、種々の方法によって実行され得る。例として、結合基を含む固相基質の重力による沈降、遠心分離、磁力による分離（この場合、結合基は磁性の基質に付加される）、クロマトグラフィー、結合基を含む基質を除去するための濾過、結合基を含むフィルターを通すことによるその混合物のろ過、および電気泳動が挙げられる。結合基を含む基質は、単量体の形態で結合基自体であり得る。この場合、結合基と、結合したオリゴヌクレオチドは、例えば、クロマトグラフィー、電気泳動、濾過、または凝集、および抗体抗原を含むオリゴヌクレオチドとクロスリンクした格子を形成する２価抗体の場合におけるように、結合基の沈降のような、種々の方法でその混合物から分離し得る。
【００３２】
別の実施形態は、ビオチンのような認識基を有する下流オリゴヌクレオチドの５’部分を標識する工程に関連する。その認識基は、５’末端ヌクレオチドまたは内部ヌクレオチドに付加され得る。その下流オリゴヌクレオチドは、リガーゼ反応において、上流オリゴヌクレオチドに連結されるために使用される。下流オリゴヌクレオチドの５’末端ヌクレオチドはブロックされ得、その結果、その末端ヌクレオチドが除去されない限り連結され得ない。ブロックは、認識基そのものであり得るか、または別のブロック基であり得る。通常、５’認識基は、５’末端ヌクレオチドに付加され、その５’認識基が除去されるまで、下流オリゴヌクレオチドの上流オリゴヌクレオチドへのライゲーションをブロックする。下流オリゴヌクレオチドの５’部分は、そのオリゴヌクレオチドが結合するテンプレート核酸の標的配列に対して非相補的であり得る。その反応において、５’→３’エキソヌクレアーゼのようなヌクレアーゼは、５’認識基を含む下流オリゴヌクレオチドの５’部分を除去する。５’末端ヌクレオチドがブロックされている場合、少なくともそのヌクレオチドは、リガーゼが下流オリゴヌクレオチドを連結し得る前に除去されなければならない。下流オリゴヌクレオチドおよび上流オリゴヌクレオチドは、その下流オリゴヌクレオチドの５’認識基を含む５’部分の除去に続いて、その下流オリゴヌクレオチドの遊離５’−リン酸が、その上流オリゴヌクレオチドの３’ヒドロキシルの隣に位置するように、設計される。このことにより、下流オリゴヌクレオチドは、リガーゼによって、上流オリゴヌクレオチドに効率よく連結されることが可能である。したがって、所望の連結された生成物は５’認識基を欠いており、一方、未反応の下流オリゴヌクレオチド、およびいくつかの所望でない生成物はまだ認識基を含んでいる。その認識基に結合する基を含む基質と反応混合物とを接触させることにより、認識基を含む未反応の下流オリゴヌクレオチドおよび所望でない生成物は、認識基を欠いた所望の生成物から除去され得る。例えば、認識基がビオチンである場合、その混合物はアビジンまたはストレプトアビジンを含む基質と接触させ得る。
【００３３】
本発明のいくつかの実施形態の利点としては、反応混合物から未反応のオリゴヌクレオチドを容易に除去し、それによって、所望のポリヌクレオチド生成物の部分的な精製を行うことが挙げられる。例えば、実験者がそのポリヌクレオチド生成物によって、最初の反応のオリゴヌクレオチドが干渉する第２の反応を行いたい場合、そのオリゴヌクレオチドを除去することは重要な工程である。これは例えば、入れ子のＰＣＲまたはＰＣＲ産物の配列決定における場合である。
【００３４】
本発明のいくつかの実施形態の別の利点は、本発明のヌクレアーゼ消化工程がプルーフリーディング機能を果たし得ることである、このことにより、所望の生成物の収量は、テンプレートの非標的位置にハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドの伸長またライゲーションの結果生じた収量と比較して、増加する。ポリメラーゼ連鎖反応において、これは例えば、プライマーダイマーおよび他の所望でない反応生成物の収量を減少させる結果をもたらす。
【００３５】
本発明のいくつかの実施形態の別の利点は、認識基が予め除去されることなく伸長または連結されたオリゴヌクレオチドもまた、反応混合物から除去されることである。このことは、これらの所望でない反応生成物を除去する工程により、所望のポリヌクレオチド生成物の純度を改善する。
【００３６】
（３’認識基法）
本発明の実施形態としては、組み込まれていないオリゴヌクレオチドを反応混合物から除去する方法が挙げられる。本方法は、工程（ａ）：以下（ｉ）ＤＮＡポリメラーゼまたは核酸リガーゼ、（ｉｉ）ヌクレアーゼ、（ｉｉｉ）３’部分および５’部分を有する上流オリゴヌクレオチド（その３’部分が３’認識基および３’末端ヌクレオチドを含む）、および（ｉｖ）テンプレート核酸、を含む混合物を形成する工程、を包含する。そのＤＮＡポリメラーゼまたは核酸リガーゼ、およびヌクレアーゼは、同じまたは別個の酵素複合体であり得る。本方法はまた、工程（ｂ）：ヌクレアーゼを用いて、上流オリゴヌクレオチドの３’部分を消化する工程、および工程（ｃ）：ポリメラーゼを用いて、消化された上流オリゴヌクレオチドを伸長させる工程、またはリガーゼを用いて、消化された上流オリゴヌクレオチドを下流オリゴヌクレオチドへ連結する工程（伸長工程または連結工程がポリヌクレオチド生成物を形成する）を包含する。その方法は、工程（ｄ）：その混合物と３’認識基に結合する結合基を含む基質とを接触させ、組み込まれていない上流オリゴヌクレオチドを反応混合物から除去する工程、をさらに包含する。本方法は、本明細書中において、以降は「３’認識基法」と呼ばれる。
【００３７】
３’認識基法の特定の実施形態において、混合物の構成要素（ｉ）は核酸ポリメラーゼであり、工程（ｃ）は、ポリメラーゼを用いて、上流オリゴヌクレオチドを伸長させ、ポリヌクレオチド生成物を形成する工程である。その混合物が核酸ポリメラーゼを含む場合、その混合物は２本のオリゴヌクレオチドを含み得る。これは、代表的に、その混合物がポリメラーゼ連鎖反応混合物である場合である。両方のオリゴヌクレオチドは、同じ３’認識基または異なる３’認識基を含み得るかまたは１本のオリゴヌクレオチドのみが３’認識基を含み得る。
【００３８】
３’認識基法の別の実施形態において、反応混合物は、逆転写酵素−ＰＣＲ反応混合物である。
【００３９】
３’認識基法の異なる実施形態において、ＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素であり得る。
【００４０】
ポリメラーゼとヌクレアーゼは、同じ酵素複合体または別個の酵素複合体の一部であり得る。
【００４１】
ポリメラーゼが逆転写酵素である１つの実施形態において、その混合物は、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼをさらに含む。逆転写酵素とＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼは、同じまたは別個の酵素複合体であり得る。それらが同じ酵素複合体である場合、特定の実施形態において、逆転写酵素とＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼは、以下である：例えば、Ａｎａｅｒｏｃｅｌｌｕｍ， ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｌｌｉｄｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｃａｒｂｏｘｙｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｆｏｒｍａｎｓ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｔｈｅｒｍｏｈｙｄｒｏｓｕｌｆｕｒｉｃｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ ａｆｒｉｃａｎｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ、またはＴｈｅｒｍｕｓ ＺＯ５ ＤＮＡポリメラーゼ。
【００４２】
ポリメラーゼおよびヌクレアーゼが同じ酵素複合体である１つの実施形態において、ヌクレアーゼは、３’→５’エキソヌクレアーゼである。この実施形態において、酵素複合体は、以下であり得る：例えば、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓポリメラーゼＴＨＥＲＭＡＬＡＣＥ、ＤＥＥＰ ＶＥＮＴ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＧＢ−Ｄ）、ＶＥＮＴ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ、９ｏＮｍＴＭＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．９ｏＮ−７株）、ＡＣＵＰＯＬ ＤＮＡポリメラーゼ、ＰＲＯＯＦＳＴＡＲＴ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｗｏｅｓｅｉ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ、ＡＭＰＬＩＴＨＥＲＭ ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒｅｎｓｉｓ）、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｍｉｃｏｌａｎｓ ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＹＮＡＺＹＭＥ ＥＸＴ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｂｒｏｃｋａｉａｎｕｓ）、Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ ａｆｒｉｃａｎｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｄｉｃｔｉｕｍ ｏｃｃｕｌｔｕｍ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒｅｎｓｉｓ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｌｌｉｄｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｃａｒｂｏｘｙｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｆｏｒｍａｎｓ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＧＢ−Ｄ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．９ｏＮ−７株ＤＮＡポリメラーゼ、またはＴｈｅｒｍｕｓ ｂｒｏｃｋａｉａｎｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ。
【００４３】
本発明の別の特定の実施形態において、ポリメラーゼおよびヌクレアーゼは別個の酵素複合体である。この場合の特定の実施形態において、ポリメラーゼは、以下である：Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ、ＺＯ５ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｓｐ．ＺＯ５）、ＳＰＳ１７ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｓｐ．ＳＰＳ１７）、Ｔｈｅｒｍｏａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｔｈｅｒｍｏｈｙｄｒｏｓｕｌｆｕｒｉｃｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ、Ａｎａｅｒｏｃｅｌｌｕｍ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ ＤＮＡポリメラーゼ、またはＦＹ７ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｔｈｅｒｍｏｈｙｄｒｏｓｕｌｆｕｒｉｃｕｓ ＦＹ７）。
【００４４】
ポリメラーゼおよびヌクレアーゼが別個の酵素複合体である場合の、別の特定の実施形態において、ヌクレアーゼは、そのポリメラーゼ活性を欠いた、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有する変異体ポリメラーゼである。そのヌクレアーゼは、以下の変異体であり得る：例えば、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓポリメラーゼＴＨＥＲＭＡＬＡＣＥ、ＤＥＥＰ ＶＥＮＴ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＧＢ−Ｄ）、ＶＥＮＴ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ、９ｏＮｍＴＭＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．９ｏＮ−７株）、ＡＣＵＰＯＬ ＤＮＡポリメラーゼ、ＰＲＯＯＦＳＴＡＲＴ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｗｏｅｓｅｉ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ、ＡＭＰＬＩＴＨＥＲＭ ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒｅｎｓｉｓ）、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｍｉｃｏｌａｎｓ ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＹＮＡＺＹＭＥ ＥＸＴ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｂｒｏｃｋａｉａｎｕｓ）、Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ ａｆｒｉｃａｎｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｄｉｃｔｉｕｍ ｏｃｃｕｌｔｕｍ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒｅｎｓｉｓ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｌｌｉｄｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｃａｒｂｏｘｙｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｆｏｒｍａｎｓ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＧＢ−Ｄ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．９ｏＮ−７株ＤＮＡポリメラーゼ、またはＴｈｅｒｍｕｓ ｂｒｏｃｋａｉａｎｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ。
【００４５】
ポリメラーゼおよびヌクレアーゼが別個の酵素複合体である場合の、本発明の別の特定の実施形態において、ポリメラーゼは、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有する野生型ポリメラーゼの変異体形態であり、その変異体形態はエキソヌクレアーゼ活性を失っている。この実施形態において、ポリメラーゼは、以下の変異体形態であり得る：例えば、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓポリメラーゼＴＨＥＲＭＡＬＡＣＥ、ＤＥＥＰ ＶＥＮＴ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＧＢ−Ｄ）、ＶＥＮＴ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ、９ｏＮｍＴＭＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．９ｏＮ−７株）、ＡＣＵＰＯＬ ＤＮＡポリメラーゼ、ＰＲＯＯＦＳＴＡＲＴ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｗｏｅｓｅｉ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ、ＡＭＰＬＩＴＨＥＲＭ ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒｅｎｓｉｓ）、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｍｉｃｏｌａｎｓ ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＹＮＡＺＹＭＥ ＥＸＴ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｂｒｏｃｋａｉａｎｕｓ）、Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ ａｆｒｉｃａｎｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｄｉｃｔｉｕｍ ｏｃｃｕｌｔｕｍ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒｅｎｓｉｓ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｌｌｉｄｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｃａｒｂｏｘｙｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｆｏｒｍａｎｓ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＧＢ−Ｄ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．９ｏＮ−７株ＤＮＡポリメラーゼ、またはＴｈｅｒｍｕｓ ｂｒｏｃｋａｉａｎｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ。
【００４６】
本発明の１つの特定の実施形態において、その混合物は、種々の量の３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有する、２つ以上のＤＮＡポリメラーゼの混合物を含む。
【００４７】
本発明において有用なＤＮＡポリメラーゼの参考文献は、以下の表に示されている。
【００４８】
（３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼ）
【００４９】
【表１−１】
【００５０】
【表１−２】
【００５１】
【表１−３】
（３’→５’ヌクレアーゼ活性を欠くＤＮＡポリメラーゼ）
【００５２】
【表２】
（３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を除去するＤＮＡポリメラーゼに対する変異体）
【００５３】
【表３】
（ＲＴ活性を有するＤＮＡポリメラーゼ）
【００５４】
【表４】
本発明の特定の実施形態において、ヌクレアーゼは活性化工程が適用されるまでは不活性である。このことは、遊離オリゴヌクレオチドがテンプレートにハイブリダイズする前に、遊離オリゴヌクレオチドの変質を防止するために有益であり得る。本発明の１つの実施形態において、ヌクレアーゼはＰＲＯＯＦＳＴＡＲＴ ＤＮＡポリメラーゼである。ヌクレアーゼの活性化を制御する手段としては、そのヌクレアーゼを不活性にするための酵素の化学改変が挙げられ、ここで、高温は、酵素を活性化するためにその化学改変を変化させる。米国特許第５，７７３，２５８号および同第５，６７７，１５２号等を参照のこと。これは、環状無水物を用いて酵素を誘導体化することによって達成され得る。環状無水物は、例えば、無水コハク酸、無水シトラコン酸、無水シス−アコニン酸（ｃｉｓ−ａｃｏｎｉｃ ａｎｈｙｄｒｉｄｅ）であり得る。制御された不活性化の別の方法は、ヌクレアーゼに抗体を結合させる工程であり、ここで、抗体は高温により不活性化される。別の不活性化の方法は、ヌクレアーゼに低温では結合し、高温では結合しないアプタマーまたはペプチドの使用である。別の不活性化の方法は、ヌクレアーゼを物理的バリアによってオリゴヌクレオチドから分離する工程である。例えば、高温で融解するワックスバリアが使用され得る。２価陽イオンのような酵素活性に必要な必須要素もまた、同様にして分離され得る。
【００５５】
３’認識基法の別の実施形態において、その混合物は核酸リガーゼを含み、その方法は、ポリヌクレオチド生成物を形成するため、そのリガーゼを用いて、消化された上流オリゴヌクレオチドを下流オリゴヌクレオチドに連結する工程を包含する。この実施形態は、例えば、オリゴヌクレオチドリガーゼアッセイに使用され得る。オリゴヌクレオチドリガーゼアッセイの説明に関しては、Ｗｈｉｔｅｌｅｙら、米国特許第４，８８３，７５０号を参照のこと。
【００５６】
３’認識基法の特定の実施形態において、上流オリゴヌクレオチドの３’末端ヌクレオチドは、未消化上流オリゴヌクレオチドの伸長またはライゲーションを防止するブロック基によって改変される。
【００５７】
特定の実施形態において、そのブロック基は、３’−デオキシヌクレオチドまたはジデオキシヌクレオチドである。その他の特定の実施形態において、そのブロック基は３’−ホスホグリコアルデヒド、３’−リン酸、３’−メルカプト、または３’−アミノである。ホスホグリコアルデヒドは、−ＯＰ（Ｏ）（ＯＨ）ＯＣＨ２ＣＨＯ基を指す。
【００５８】
特定の実施形態において、ブロック基は３’認識基を含む。
【００５９】
１つの特定の実施形態において、上流ヌクレオチドは３’認識基が除去されない限り伸長または連結され得ない。
【００６０】
３’認識基法の１つの特定の実施形態において、ヌクレアーゼは３’→５’エキソヌクレアーゼである。
【００６１】
３’認識基法の１つの特定の実施形態において、３’末端ヌクレオチドは３’認識基の全てまたは一部を含む。別の特定の実施形態において、内部ヌクレオチドは３’認識基の全てまたは一部を含む。
【００６２】
３’認識基法の１つの実施形態において、上流オリゴヌクレオチドの３’部分はテンプレートと非相補的である。「非相補的」とは、３’部分がテンプレートに対してヌクレオチド配列が完全には相補的でないことを意味する。３’部分はテンプレートに対する１塩基のミスマッチを有し得るか、またはテンプレートに対して相補的な、連続したヌクレオチドを有さないことが有り得るか、またはテンプレートに対して中間相補性の配列を有し得る。３’部分がテンプレートに対して非相補的である場合、上流オリゴヌクレオチドの５’部分は、一般にテンプレートに対して３’部分よりも相補的である。５’部分は一般にテンプレートに対して完全に相補的であるが、しかし、反応条件下で上流オリゴヌクレオチドがテンプレートにハイブリダイズし、また、伸長するためにポリメラーゼの基質として、または別のハイブリダイズするオリゴヌクレオチドへ連結するためにリガーゼの基質として働き得るように、テンプレートに対して十分に相補的な任意の配列を有し得る。
【００６３】
ハイブリダイゼーション条件は配列依存性であり、異なる環境パラメータ下で異なる。より長い配列はより高い温度で特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションの広範な指針は、Ｔｉｊｓｓｅｎの、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ，２章「Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｂｅ ａｓｓａｙｓ」，１ページ Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９３）に見られる。一般に、高ストリンジェントなハイブリダイゼーションと洗浄の条件は、規定のイオン強度とｐＨとにおける特定の配列に関する融点温度（Ｔｍ）より約５℃低い温度に選択される。代表的に、「ストリンジェントな条件」下において、プローブはその標的配列にハイブリダイズするが、他の配列にはハイブリダイズしない。例えば、「ストリンジェントな条件」または「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、プローブがその標的配列に対して、他の配列に対してよりも検出可能な程度に大きな度合い（例えば、少なくともバックグラウンドの２倍を超える）でハイブリダイズする条件を意図している。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーおよび／または洗浄の条件の制御により、プローブに対して１００％相補的な標的配列が同定され得る（相同プロービング）。あるいは、ストリンジェンシー条件は、低度の相似性が検出されるように、いくつかの配列のミスマッチを許容するように調整され得る（異種プロービング）。一般に、オリゴヌクレオチドプローブは、長さが約１０００ヌクレオチドよりも少ない、好ましくは、長さで５００ヌクレオチドよりも少ない。
【００６４】
代表的に、ストリンジェントな条件は、ｐＨ７．０〜８．３において、短いプローブ（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）では少なくとも約３０℃、長いプローブ（例えば、５０ヌクレオチドより長い）では少なくとも約６０℃の温度で、塩濃度が約１．５Ｍよりも少ないＮａイオン、代表的に約０．０１〜１．０ＭのＮａイオンを含む条件である。
【００６５】
特異性において重要な因子は、イオン強度と反応混合物の温度である。ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドに関しては、ＴｍはＭｅｉｎｋｏｔｈおよびＷａｈｌ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３８：２６７−２８４（１９８４）の式で近似され得る：Ｔｍ＝８１．５℃＋１６．６（ｌｏｇＭ）＋０．４１（％ＧＣ）−０．６１（％ｆｏｒｍ）−５００／Ｌ；ここで、Ｍは１価陽イオンのモル濃度、％ＧＣはＤＮＡにおけるグアノシンとシチジンヌクレオチドのパーセンテージ、％ｆｏｒｍはハイブリダイゼーション溶液中のホルムアルデヒドのパーセンテージ、そしてＬは塩基対でのハイブリッドの長さである。Ｔｍは（規定のイオン強度およびｐＨにおける）相補的な標的配列の５０％が、完全にマッチしたプローブにハイブリダイズする温度である。あるいは、Ｔｍは、ＰＲＩＭＥＲ ＥＸＰＲＥＳＳ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）のような、いくつかの商業的に入手可能なプログラムから決定され得る。Ｔｍはまた、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）に記載されているように、実験的に決定され得る。
【００６６】
非常に高度にストリンジェントな条件は、特定のプローブに関するＴｍと同等かまたはそれよりわずかに高くなるように選択される。
【００６７】
ストリンジェントな洗浄条件の例は、６５℃で、１５分間の０．２×ＳＳＣ洗浄である（ＳＳＣ緩衝液の記述については、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照）。
【００６８】
Ｔｍは１％のミスマッチごとに約１℃ずつ下げられる；したがって、Ｔｍ、ハイブリダイゼーション、および／または洗浄の条件は、所望の同一性配列にハイブリダイズするよう調整され得る。例えば、９０％の同一性を有した配列に関して、Ｔｍは約１０℃下げられる。したがって、９０％以上の同一性を有した配列が探索される場合、洗浄温度は、完全に相補的な配列を同定するために使用されるものよりも、一般的に約１０℃低い。
【００６９】
一般的に、ストリンジェントな条件は、規定のイオン強度およびｐＨにおける特定の配列とその相補鎖のＴｍよりも約５℃低い温度に選択される。しかしながら、高度にストリンジェントな条件は、Ｔｍよりも１、２、３、または４℃低い温度でハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を利用し得る；中程度にストリンジェントな条件は、Ｔｍよりも５、６、７、８、９または１０℃低い温度でハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を利用し得る；低ストリンジェンシー条件は、Ｔｍよりも１１、１２、１３、１４、１５または２０℃低い温度でハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を利用し得る。これらのパラメータ、ハイブリダイゼーション組成物および洗浄組成物、ならびに所望の温度を用いることで、当業者は、ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄溶液のストリンジェンシーにおけるバリエーションが本質的に記載されていることを理解する。核酸のハイブリダイゼーションの広範な指針は、Ｔｉｊｓｓｅｎ（１９９３）、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ，第１部 第２章（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）；Ａｕｓｕｂｅｌら（編）（１９９５）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第２章（Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）に見られる。また、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を参照のこと。
【００７０】
３’認識基法の１つの実施形態において、オリゴヌクレオチドの３’部分に含まれる全てのヌクレオシドは、ヌクレアーゼによる加水分解に耐性のある結合によりつながれる。この場合において、ヌクレアーゼがそのオリゴヌクレオチドを切断する場合、それは通常、オリゴヌクレオチドの３’部分全体を切断する。ヌクレアーゼ耐性のある結合としては、メチルホスホネート結合およびホスホロチオネート結合が挙げられる。
【００７１】
３’認識基法の別の実施形態において、上流オリゴヌクレオチドの３’部分に含まれる全てのヌクレオシドはホスホジエステル結合によって結合され、上流オリゴヌクレオチドの５’部分は加水分解に耐性のある結合を含む。例えば、加水分解に耐性のある結合は、メチルホスホネート結合またはホスホロチオネート結合であり得る。この実施形態では、３’→５’エキソヌクレアーゼは、加水分解に耐性のある結合で消化を停止させて、隣接するヌクレオチド上に３’末端ヒドロキシルを残す傾向がある。したがって、この結合は所望の消化点に配置され得る。
【００７２】
本発明の方法におけるテンプレート核酸はＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。
【００７３】
本発明の１つの実施形態において、結合基を含む基材は、サイズ排除クロマトグラフィー樹脂であり、混合物はその樹脂を通される。この方法は、３’認識基を含む未反応オリゴヌクレオチドが除去されると同時に、未反応のヌクレオチドのような低分子の除去を可能にする。本明細書中で使用される「樹脂」は、デキストラン、ポリアクリルアミド、アガロース等、およびその混合物のような、天然ポリマーおよび合成ポリマーの両方を指す。
【００７４】
本発明の１つの実施形態において、認識基は抗体によって認識される基であり、結合基は抗体である。例えば、認識基はジゴキシゲニン、フルオレセイン、またはビオチンであり得、結合基は適切な認識基を認識する抗体であり得る。
【００７５】
認識基がビオチンである場合、結合基はまた、例えば、アビジンまたはストレプトアビジンであり得る。
【００７６】
別の特定の実施形態において、認識基はフェニルボロン酸を含み、結合基はサリチルヒドロキサム酸を含む。別の特定の実施形態において、認識基はサリチルヒドロキサム酸を含み、結合基はフェニルボロン酸を含む。
【００７７】
別の特定の実施形態において、認識基はポリヒスチジンであり、結合基はニッケルカチオン−キレート錯体である。ニッケルカチオンのキレーターの例は、ニトリロ三酢酸またはＥＤＴＡである。認識基はまた、ニッケルカチオン−キレートを含み得、結合基はポリヒスチジンであり得る。
【００７８】
別の特定の実施形態において、認識基はオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列であり、結合基は相補的ヌクレオチド配列である。
【００７９】
３’認識基法の別の特定の実施形態において、上流オリゴヌクレオチドの３’部分はＬヌクレオチドから成り、これはＬ型立体配置を有するヌクレオチドを意味する。Ｌ核酸は一般的に、ポリメラーゼによってもリガーゼによっても認識されず、したがって、３’部分がＬヌクレオチドから成る上流オリゴヌクレオチドは通常、その３’部分が除去されない限り、ポリメラーゼによって伸長され得ず、リガーゼによっても連結され得ない。上流オリゴヌクレオチドの３’部分がＬヌクレオチドから成る場合、結合基は、３’Ｌヌクレオチドにハイブリダイズする相補的Ｌオリゴヌクレオチドであり得る。あるいは、他の結合基が３’Ｌヌクレオチド部分に組み込まれ得る。
【００８０】
３’認識基法の別の実施形態において、上流オリゴヌクレオチドの３’部分はペプチド核酸から成る。上流オリゴヌクレオチドの３’部分がペプチド核酸から成る場合、結合部分は、３’ペプチド核酸部位にハイブリダイズする相補的オリゴヌクレオチドであり得る。あるいは、他の結合基が３’ペプチド核酸部位に組み込まれ得る。
【００８１】
３’認識基法の別の特定の実施形態において、上流オリゴヌクレオチドは、３’認識基に対して５’側に改変ヌクレオチドを含み、ヌクレアーゼはその改変ヌクレオチドで上流オリゴヌクレオチドを切断する。１つの実施形態において、ヌクレアーゼは、改変ヌクレオチドが２重鎖中に存在する場合、それが２重鎖中にない場合よりも優先的に、改変ヌクレオチドで上流オリゴヌクレオチドを切断する。ヌクレアーゼが改変ヌクレオチドを、それが２重鎖中にある場合に、より優先的に切断する場合の特定の実施形態において、改変ヌクレオチドはリボヌクレオチドであり、ヌクレアーゼはＲＮＡｓｅ Ｈである。特定の実施形態において、そのＲＮＡｓｅ Ｈは、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＲＮＡｓｅ Ｈ、ヒトＲＮＡｓｅ Ｈ、またはＥ．ｃｏｌｉ ＲＮＡｓｅ Ｈである。
【００８２】
切断部位として使用され得る別の改変ヌクレオチドは、脱塩基性ヌクレオチドである。脱塩基性ヌクレオチド残基はＤＮＡグリコシラーゼにより生成され得る。ＤＮＡグリコシラーゼは、塩基をその糖に結合させているＮ−グリコシド結合の加水分解を介してＤＮＡ内の塩基を除去する酵素である。ほとんどのＤＮＡグリコシラーゼは、ウラシルグリコシラーゼを例外として、２本鎖ＤＮＡに対して非常に選択的である（Ｄｏｄｓｏｎ ＭＬ，Ｍｉｃｈａｅｌｓ ＭＬおよびＬｌｏｙｄ ＲＳ（１９９４）Ｕｎｉｆｉｅｄ Ｃａｔａｌｙｔｉｃ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｆｏｒ ＤＮＡ Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅｓ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６９（５２）：３２７０９−３２７１２）。ＤＮＡグリコシラーゼによって生成された脱塩基性部位は、除去された塩基がプリンであるかピリミジンであるかに依存して、それぞれ脱プリン部位または脱ピリミジン部位と呼ばれる。したがって、それらは本明細書中では、脱プリンまたは脱ピリミジンにちなんで、ＡＰヌクレオチドと呼ばれる。ＤＮＡグリコシラーゼにより生成されたようなＡＰヌクレオチド残基は、下図の中央の分子に示されている。
【００８３】
ＤＮＡグリコシラーゼは２つのグループに分類され得る。単機能性ＤＮＡグリコシラーゼは、グリコシド結合の加水分解を触媒し、脱塩基性部位を生成するのみである。二機能性ＤＮＡグリコシラーゼはさらなる脱塩基性部位リアーゼ活性を有し、β−脱離を介して３’Ｃ−Ｏ結合の切断をもたらす。これは、下図において右向き矢印で示されている。いくつかの二機能性酵素はまた、β−脱離を介して５’Ｃ−Ｏ結合を切断し、遊離４−ヒドロキシ−ペント−２，４−ジエナール、ならびに遊離５’−ホスホリル末端およびＡＰヌクレオチド残基に隣接するヌクレオチドにおける遊離３’−ホスホリル末端で終結する２つのＤＮＡ分子を産生する（Ｆｒｉｅｄｂｅｒｇ，Ｅ．Ｃ．；Ｗａｌｋｅｒ，Ｇ．Ｃ．，Ｓｉｅｄｅ，Ｗ．１９９５．ＤＮＡ Ｒｅｐａｉｒ ａｎｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ．Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．：ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ．，１５６ページ）。
【００８４】
ＡＰヌクレオチド残基を有するオリゴヌクレオチドは、下図において左向き矢印で示されているように、脱プリン／脱ピリミジンエンドヌクレアーゼ（ＡＰエンドヌクレアーゼ）によって、ＡＰヌクレオチドに対して５’側を切断され得る。これらは遊離３’−ＯＨ、ならびにＡＰヌクレオチド残基上において、５’−リン酸を残す。ＡＰエンドヌクレアーゼはまた、下図において上段右にある分子から、３’末端α，β−不飽和アルデヒドを切断し、３’−ＯＨ末端および遊離４−ヒドロキシ−５−ホスホ−２−ペンテナールを残す。
【００８５】
【化３】
２つのよく知られたＡＰエンドヌクレアーゼは、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のような、エキソヌクレアーゼＩＩＩ、およびＡＰＥ １ ＡＰエンドヌクレアーゼである。別のＡＰエンドヌクレアーゼは、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のエンドヌクレアーゼＩＶである。
【００８６】
例示的なＤＮＡグリコシラーゼおよびＡＰエンドヌクレアーゼ、ならびにそれらの活性についてのいくつかの詳細は、以下の表に示されている。
【００８７】
【表５】
【００８８】
【表６】
【００８９】
【表７】
【００９０】
【表８】
ヌクレアーゼは時に、３’末端リン酸を残し、これは上流オリゴヌクレオチドの伸長またはライゲーションを防止する。したがって、この３’末端リン酸を除去するため、その混合物に３’ホスファターゼを含むことが、時々必要である。特定の実施形態において、その混合物はさらに、３’ホスファターゼを含む。特定の実施形態において、３’ホスファターゼはエキソヌクレアーゼＩＩＩ、エキソヌクレアーゼＩＶ、または酵母ＡＰエンドヌクレアーゼである。
【００９１】
２重鎖中において優先的な改変ヌクレオチドでの切断を包含する方法の１つの特定の実施形態において、その改変ヌクレオチドは８−オキソー７，８−ジヒドロー２’−デオキシグアノシン；７−メチルグアニン；２，６−ジアミノ−４−ヒドロキシ−５−Ｎ−メチルホルムアミドピリミジン；４，６−ジアミノ−５−ホルムアミドピリミジン；５−ヒドロキシ−２’−デオキシシチジン；５−ヒドロキシ−２’−デオキシウリジン；またはＮ７−メチルグアニンを含む；およびヌクレアーゼはホルムアミド−ピリミジン−ＤＮＡグリコシダーゼである、そして、その混合物は３’ホスファターゼをさらに含む。
【００９２】
２重鎖中において優先的な改変ヌクレオチドでの切断を包含する方法の１つの特定の実施形態において、その改変ヌクレオチドは、７，８−ジヒドロ−８−オキソグアニン；ホルムアミドピリミジン；２，６−ジアミノ−４−ヒドロキシ−５−ホルムアミドピリミジン；または８−オキソグアニンを含む；およびヌクレアーゼは８−オキソグアニンＤＮＡグリコシダーゼであり、そしてその混合物はＡＰエンドヌクレアーゼをさらに含む。
【００９３】
２重鎖中において優先的な改変ヌクレオチドでの切断を包含する方法の１つの特定の実施形態において、その改変ヌクレオチドは、５，６−ジヒドロチミン；６−ヒドロキシ−５，６−ジヒドロチミン；シス−チミングリコール；トランス−チミングリコール；５−ヒドロキシ−５−メチルヒダントイン；メチルタルトロン尿素；尿素；５−ヒドロキシシトシン；５−ヒドロキシウラシル；ウラシルグリコール；ジヒドロウラシル；６−ヒドロキシウラシル；グリコール；β−ウレイドイソ酪酸；５−ヒドロキシ−６−ヒドロチミン；５，６−ジヒドロウラシル；５−ヒドロキシー６−ヒドロウラシル；５−ヒドロキシー２’−デオキシシチジン；または５−ヒドロキシ−２’−デオキシウリジンを含む；およびヌクレアーゼはエンドヌクレアーゼＩＩＩまたはチミングリコールＤＮＡグリコシダーゼであり、そして、その混合物は、ＡＰエンドヌクレアーゼをさらに含む。
【００９４】
別の特定の実施形態において、改変ヌクレオチドはＡＰヌクレオチドであり、ヌクレアーゼはＡＰエンドヌクレアーゼである。改変ヌクレオチドがＡＰヌクレオチドである場合の特定の実施形態において、ヌクレアーゼはエキソヌクレアーゼＩＩＩ、エンドヌクレアーゼＩＶ、ＡＰＥ １ ＡＰエンドヌクレアーゼ、または酵母ＡＰエンドヌクレアーゼである。
【００９５】
３’認識基法の特定の実施形態において、上流オリゴヌクレオチドの５’部分は、３’認識基とは異なる５’認識基を含む。反応後、所望の生成物は５’認識基を含むが、３’認識基を含まない、一方で上流オリゴヌクレオチドは両方の認識基を含む。したがって、反応混合物を３’認識基に結合する結合基を含む基質に接触させる工程は、未消化上流オリゴヌクレオチドを除去する。その混合物が５’認識基に結合する結合基を含む基質に接触される場合、所望の生成物は反応混合物から除去される。したがって、本発明の別の特定の実施形態は、上流オリゴヌクレオチドの５’部分が、３’認識基と異なる５’認識基を含む方法である。この実施形態において、その方法は、（その混合物を３’認識基に結合する結合基を含む基質に接触させる工程の後）その混合物を５’認識基に結合する結合基を含む基質に接触させる工程をさらに包含し得る。
【００９６】
（５’認識基法）
本発明は、組み込まれていないオリゴヌクレオチドを反応混合物から除去するための別の方法を提供する。本方法は、工程（ａ）：以下（ｉ）核酸リガーゼ、（ｉｉ）ヌクレアーゼ、（ｉｉｉ）３’部分および５’部分を有する下流オリゴヌクレオチド（その５’部分が５’認識基および５’末端ヌクレオチドを含む）、および（ｉｖ）テンプレート核酸、を含む混合物を形成する工程、を包含する。その核酸リガーゼ、およびヌクレアーゼは、同じまたは別個の酵素複合体である。本方法はまた、工程（ｂ）：ヌクレアーゼを用いて、下流オリゴヌクレオチドの５’部分を消化する工程、および工程（ｃ）：リガーゼを用いて、消化された下流オリゴヌクレオチドを上流オリゴヌクレオチドへ連結する工程（その連結工程がポリヌクレオチド生成物を形成する）を包含する。その方法は、工程（ｄ）：その混合物と５’認識基に結合する結合基を含む基質とを接触させ、組み込まれていない下流オリゴヌクレオチドを反応混合物から除去する工程、をさらに包含する。本方法は、本明細書中において、以降は「５’認識基法」と呼ばれる。
【００９７】
５’認識基法の特定の実施形態において、下流オリゴヌクレオチドの５’末端ヌクレオチドは、未消化下流オリゴヌクレオチドのライゲーションを防止する結合基で改変される。特定の実施形態において、結合基は、５−メルカプト、５’−アミノ、５’−二リン酸、５’−三リン酸、または５’−デオキシヌクレオチドである。
【００９８】
特定の実施形態において、結合基は５’認識基を含む。１つの特定の実施形態において、下流オリゴヌクレオチドは、５’認識基が除去されない限り、連結され得ない。
【００９９】
５’認識基法の１つの特定の実施形態において、ヌクレアーゼは５’→３’エキソヌクレアーゼである。１つの特定の実施形態において、５’→３’エキソヌクレアーゼは、優先的に１本鎖ＤＮＡを消化する。そのようなエキソヌクレアーゼの１つは、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓから入手可能であるＲｅｃＪｆである。
【０１００】
５’認識基法の別の特定の実施形態において、ヌクレアーゼは活性化工程が適用されるまでは不活性である。
【０１０１】
５’認識基法の別の特定の実施形態において、５’末端ヌクレオチドは５’認識基の全てまたは一部を含む。別の特定の実施形態において、内部ヌクレオチドは５’認識基の全てまたは一部を含む。
【０１０２】
５’認識基法の１つの特定の実施形態において、下流オリゴヌクレオチドの５’部分はテンプレートと非相補的である。「非相補的」により、５’部分がテンプレートに対してヌクレオチド配列が完全には相補的でないことが意味される。５’部分はテンプレートに対する１塩基のミスマッチを有し得るかもしくはテンプレートに対して相補的な、連続したヌクレオチドを有さないことが有り得るか、またはテンプレートに対して中間相補性の配列を有し得る。５’部分がテンプレートに対して非相補的である場合、下流オリゴヌクレオチドの３’部分は、一般にテンプレートに対して５’部分よりも相補的である。３’部分は一般にテンプレートに対して完全に相補的であるが、その反応条件下で下流オリゴヌクレオチドがそのテンプレートにハイブリダイズし、そして別のハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドへ連結するためにリガーゼの基質として働き得る、そのテンプレートに対して十分に相補的な任意の配列を有し得る。
【０１０３】
５’認識基法の１つの実施形態において、下流オリゴヌクレオチドの５’部分に含まれる全てのヌクレオシドは、ヌクレアーゼによる加水分解に耐性のある結合により連結される。この場合において、ヌクレアーゼがその下流オリゴヌクレオチドを切断する場合、それは通常、その下流オリゴヌクレオチドの５’部分全体を切断する。ヌクレアーゼ耐性のある結合としては、メチルホスホネート結合およびホスホロチオネート結合が挙げられる。
【０１０４】
５’認識基法の別の実施形態において、下流オリゴヌクレオチドの５’部分に含まれる全てのヌクレオシドはホスホジエステル結合によって結合され、下流オリゴヌクレオチドの３’部分は加水分解に耐性のある結合を含む。例えば、加水分解に耐性のある結合は、メチルホスホネート結合またはホスホロチオネート結合であり得る。この実施形態では、５’→３’エキソヌクレアーゼは、加水分解に耐性のある結合で消化を停止させて、隣接するヌクレオチド上に５’末端リン酸を残す傾向がある。したがって、この結合は消化の所望の終点に配置され得る。
【０１０５】
５’認識基法の１つの実施形態において、下流オリゴヌクレオチドの５’部分はＬヌクレオチドからなる。
【０１０６】
本発明の方法におけるテンプレート核酸はＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。
【０１０７】
５’認識基法の１つの実施形態において、結合基を含む基質は、サイズ排除クロマトグラフィー樹脂であり、その混合物はその樹脂を通される。この方法は、５’認識基を含む未反応オリゴヌクレオチドが除去されると同時に、未反応のヌクレオチドのような小分子の除去を可能にする。本明細書中で使用される場合、「樹脂」は、デキストラン、ポリアクリルアミド、アガロース等、およびそれらの混合物のような、天然ポリマーおよび合成ポリマーの両方を指す。
【０１０８】
５’認識基法の別の特定の実施形態において、下流オリゴヌクレオチドの５’部分はＬヌクレオチドから成る、これは、ヌクレオチドがＬ型立体配置であることを意味する。Ｌ核酸は一般的にリガーゼによって認識されない、したがって、５’部分がＬヌクレオチドからなる下流オリゴヌクレオチドは通常、その５’部分が除去されない限りリガーゼによってその５’部分に連結され得ない。５’認識基法の別の特定の実施形態において、下流オリゴヌクレオチドの５’部分はペプチド核酸である。
【０１０９】
５’認識基法の別の実施形態において、下流オリゴヌクレオチドは、改変ヌクレオチド３’→５’認識基を含み、ヌクレアーゼはその改変ヌクレオチドで下流オリゴヌクレオチドを切断する。１つの実施形態において、ヌクレアーゼは、改変ヌクレオチドが２重鎖中に存在する場合に、それが２重鎖中にない場合よりも優先的に改変ヌクレオチドで上流オリゴヌクレオチドを切断する。
【０１１０】
ヌクレアーゼが改変ヌクレオチドで、それが２重鎖中に存在する場合に、より優先的に切断する場合の１つの実施形態において、改変ヌクレオチドはリボヌクレオチドであり、ヌクレアーゼはＲＮＡｓｅ Ｈである。
【０１１１】
５’認識基法で、ヌクレアーゼが改変ヌクレオチドで、それが２重鎖中に存在する場合に、より優先的に切断する場合の１つの実施形態において、改変ヌクレオチドは、８−オキソ−７，８−ジヒドロ−２’−デオキシグアノシン；７−メチルグアニン；２，６−ジアミノ−４−ヒドロキシ−５−Ｎ−メチルホルムアミドピリミジン；４，６−ジアミノ−５−ホルムアミドピリミジン；５−ヒドロキシ−２’−デオキシシチジン；５−ヒドロキシ−２’−デオキシウリジン；またはＮ７−メチルグアニンであるかまたはそれらを含み；そしてヌクレアーゼはホルムアミド−ピリミジン−ＤＮＡグリコシダーゼである。
【０１１２】
５’認識基法で、ヌクレアーゼが改変ヌクレオチドで、それが２重鎖中に存在する場合に、より優先的に切断する場合の別の実施形態において、改変ヌクレオチドは８−ヒドロキシグアニンを含み、ヌクレアーゼは８−ヒドロキシグアニンエンドヌクレアーゼまたはＮ−メチルプリンＤＮＡグリコシダーゼである。
【０１１３】
５’認識基法で、ヌクレアーゼが改変ヌクレオチドを、それが２重鎖中に存在する場合に、より優先的に切断する場合の別の特定の実施形態において、改変ヌクレオチドは７，８−ジヒドロー８−オキソグアニン；ホルムアミドピリミジン；２，６−ジアミノ−４−ヒドロキシ−５−ホルムアミドピリミジン；または８−オキソグアニンを含み、そしてヌクレアーゼは８−オキソグアニン−ＤＮＡグリコシラーゼである。
【０１１４】
５’認識基法で、ヌクレアーゼが改変ヌクレオチドで、それが２重鎖中に存在する場合に、より優先的に切断する場合の別の特定の実施形態において、改変ヌクレオチドはＡＰヌクレオチドである。改変ヌクレオチドがＡＰヌクレオチドである場合の特定の実施形態において、ヌクレアーゼはリアーゼ活性を有するＤＮＡグリコシラーゼである。
【０１１５】
ヌクレアーゼは時に、遊離５’−ＯＨを残し、これはライゲーションの基質ではあり得ない。したがって、この５’−ＯＨにリン酸を１つ付加するために、その混合物に５’キナーゼを含めることは、時に必要である。特定の実施形態において、その混合物は５’キナーゼをさらに含む。
【０１１６】
５’認識基法の特定の実施形態において、下流オリゴヌクレオチドは、改変ヌクレオチド３’→５’認識基を含み、ヌクレアーゼはその改変ヌクレオチドで下流オリゴヌクレオチドを切断して５’末端ＡＰヌクレオチドを残し、その混合物はデオキシリボホスホジエステラーゼ（ｄＲｐａｓｅ）をさらに含む。「ｄＲｐａｓｅ」は、本明細書では５’末端ＡＰヌクレオチドを除去する酵素として定義される。一例として、Ｅ．ｃｏｌｉ ＲｅｃＪタンパク質（Ｆｒｉｅｄｂｅｒｇ，Ｅ．Ｃ．；Ｗａｌｋｅｒ，Ｇ．Ｃ．およびＳｉｅｄｅ，Ｗ．１９９５．ＤＮＡ Ｒｅｐａｉｒ ａｎｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ．Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．：ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ）がある。
【０１１７】
５’認識基法の特定の実施形態において、下流オリゴヌクレオチドの３’部分は５’認識基とは異なる３’認識基を含む。反応後、所望の生成物は３’認識基を含むが、５’認識基を含まない。他方、未消化下流オリゴヌクレオチドは両方の認識基を含む。したがって、反応混合物を５’認識基に結合する結合基を含む基質に接触させる工程は、未消化下流オリゴヌクレオチドを除去する。その混合物が３’認識基に結合する結合基を含む基質に接触される場合、所望の生成物は反応混合物から除去される。したがって、５’認識基法の別の特定の実施形態は、下流オリゴヌクレオチドの３’部分が、５’認識基と異なる３’認識基を含む方法である。この実施形態において、その方法は、（その混合物を５’認識基に結合する結合基を含む基質に接触させる工程の後）その混合物を３’認識基に結合する結合基を含む基質に接触させる工程をさらに包含し得る。
【０１１８】
（認識／結合基）
認識基はヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドに付加され得る、または当該分野で公知の技術により、合成可能な任意の部分においてオリゴヌクレオチドに組み込まれ得る。結合基もまた、合成可能な任意の部分において担体に付加され得る。例えば、適切な試薬と反応条件が、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，パートＢ：Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，第２版，ＣａｒｙおよびＳｕｎｄｂｅｒｇ（１９８３）；Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ，ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，第２版，Ｍａｒｃｈ（１９７７）；Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，第２版，Ｇｒｅｅｎｅ，Ｔ．Ｗ．およびＷｕｔｚ，Ｐ．Ｇ．Ｍ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；ならびにＣｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ，Ｌａｒｏｃｋ，Ｒ．Ｃ．，第２版，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９９）などで開示されている。標識試薬および予め標識されたヌクレオチドはまた、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｃｏｒｐ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ；Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐ．，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ；およびＰｒｏｌｉｎｘ，Ｉｎｃ．，Ｒｅｄｍｏｎｄ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎのような民間の業者からも入手可能である。認識基、または認識基が標識されたヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド合成装置により、オリゴヌクレオチドに組み込まれたヌクレオチド単位の１つとしてオリゴヌクレオチドに組み込まれ得る。
【０１１９】
結合基が付加された担体は、多くの民間業者から入手可能である。例えば、ストレプトアビジンでコーティングされた磁性ビーズは、Ｄｙｎａｌ，Ｏｓｌｏ，Ｎｏｒｗａｙから入手可能である。サリチルヒドロキサム酸およびフェニルボロン酸基を組み込んだ担体は、Ｐｒｏｌｉｎｘ，Ｒｅｄｍｏｎｄ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎから入手可能である。ニッケル−ＮＴＡ錯体でコーティングされた磁性アガロースビーズはＱｉａｇｅｎから入手可能である。
【０１２０】
適切な認識基で標識されたヌクレオチドには、下に示すように、６−ＦＡＭＴＭ−ｄＵ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）およびビオチン−ｄＵが挙げられる。
【０１２１】
【化４】
【０１２２】
【化５】
ヌクレオチドに付加できる状態にある別の適切な認識基は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド−テトラメチルローダミン（ＮＨＳ−ＴＡＭＲＡ）（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）である。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル化認識基は、付加物を形成するように、アミノ基と反応する。したがってＴＡＭＲＡ−ＮＨＳエステルは、オリゴヌクレオチドの３’末端ヌクレオチドへ認識基を付加するように、３’アミノオリゴヌクレオチドと反応し得る。
【０１２３】
【化６】
【実施例】
【０１２４】
本発明がより容易に理解され得るために、本発明を説明することが意図された以下の実施例が参照される。しかし発明はこれらの範囲に限定されない。
【０１２５】
（実施例１）
１００μｌのＰＣＲ反応を、ＰＣＲ緩衝液（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、各ｄＮＴＰ ２００μＭ、各プライマー０．２５μＭ、酵素２．５単位、およびファージラムダＤＮＡ ２５ｎｇを含む０．２ｍｌ ＭＩＣＲＯＡＭＰチューブ内で実行した。反応液を９５℃で１０分間加熱し、その後９４℃、１５秒間および６８℃、１分間の３０サイクルの温度サイクルに供し、その後、最後のサイクルを７２℃、７分間の伸長と４℃での最終保持にて行った。反応を非プルーフリーディング酵素（ＡＭＰＬＩＴＡＱ，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、またはプルーフリーディングポリメラーゼ（ＰＦＵ ＴＵＲＢＯ，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて行った。全ての反応は、ＴＡＭＲＡ−ＰＣ０２を逆方向プライマーとして使用した。ミスマッチ＃１のための順方向プライマーはＦ−ＰＣ０１−ＢｄＴであった。ここで２つの３’末端ヌクレオチド、ビオチン−ｄＴおよびＣ、はミスマッチである。ミスマッチ＃２のための順方向プライマーはＰＣ０１−ＦＡＭであった、ここで、２つの３’末端ヌクレオチド、Ｃおよび３’−フルオレセインｄＴ ＣＰＧ、はミスマッチである。マッチ＃１のための逆方向プライマーはＦ−ＰＣ０１であった。プライマー配列は、３’末端を右にして、以下に示されている。
【０１２６】
【化７】
予測された生成物は５００ｂｐであった。ゲル電気泳動は、非プルーフリーディング酵素が、マッチしたプライマーを用いて予測される生成物を生成することができたこと、しかしいずれのミスマッチされたプライマーを用いてもできなかったこと、を明らかにした。プルーフリーディング酵素は、対照的に、マッチした、およびミスマッチした逆方向プライマーの両方を用いて、期待される生成物をよい収量で生成した（データは示されていない）。
【０１２７】
（実施例２）
１００μｌのＰＣＲ反応を、２ｍＭ ＭｇＳＯ４、各ｄＮＴＰ ２００μＭ、各プライマー０．２５μＭ、ＰＦＵ ＴＵＲＢＯポリメラーゼ２．５単位、およびラムダＤＮＡ ２５ｎｇにおいて、ＰＣＲ緩衝液を含む０．２ｍｌ ＭＩＣＲＯＡＭＰチューブ内で実行した。温度サイクルプログラムは、例１と同様である。生成物反応混合物１μｌを、ＧＳ ＳＴＲ ＰＯＰ４（Ｃ）ランモジュール、１秒注入、７．５ｋＶ／注入、１５ｋＶ／ラン、６０℃、３０分間を利用して、ＡＢＩ３１０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて解析した。
【０１２８】
生成物反応混合物の一部を、組み込まれていないビオチン化プライマーを除去するため、磁性ストレプトアビジン−コーティングビーズ（Ｄｙｎａｌ，Ｏｓｌｏ，Ｎｏｒｗａｙ）に接触させた。磁性ストレプトアビジン−コーティングビーズに接触する前後の反応混合物のサンプルを、電気泳動および蛍光検出により解析した。これらの実験は、そのビーズが、組み込まれていないＴＡＭＲＡ標識されたプライマーを除去することも、ＴＡＭＲＡおよびＦＡＭ標識を有するがビオチンを有さない生成物を除去することもなしに、組み込まれていないビオチン化プライマーを除去することを示した。
【０１２９】
（参考文献）
【０１３０】
【化８】
本明細書中で引用された全ての参考文献は、本明細書中に参考として援用される。
【配列表】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
反応混合物から組み込まれていないオリゴヌクレオチドを除去する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）以下：
（ｉ） ＤＮＡポリメラーゼまたは核酸リガーゼ；
（ｉｉ） ヌクレアーゼ；
（ｉｉｉ） ３’部分および５’部分を有する上流オリゴヌクレオチドであって、該３’部分は３’認識基および３’末端ヌクレオチドを含む、オリゴヌクレオチド；および
（ｉｖ） テンプレート核酸；
を含む混合物を形成する工程であって、ここで（ｉ）および（ｉｉ）は同じかまたは別個の酵素の複合体である、工程；
（ｂ）該ヌクレアーゼを用いて、該上流オリゴヌクレオチドの該３’部分を消化する工程；
（ｃ）該ポリメラーゼを用いて、該消化された上流オリゴヌクレオチドを伸長させる工程、または該リガーゼを用いて、該消化された上流オリゴヌクレオチドを下流オリゴヌクレオチドへ連結させる工程であって、該伸長工程または該連結工程がポリヌクレオチド生成物を形成する、工程；ならびに
（ｄ）組み込まれていない上流オリゴヌクレオチドを該反応混合物から除去するために、該混合物と該３’認識基に結合する結合基を含む基質とを接触させる工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
前記（ｉ）がＤＮＡポリメラーゼであり、工程（ｃ）は、前記ポリヌクレオチド生成物を形成するために、該ポリメラーゼを用いて、前記消化された上流オリゴヌクレオチドを伸長させる工程である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
請求項２に記載の方法であって、ここで前記混合物が、３’部分および５’部分を有するプライマーをさらに含み、ここで、該３’部分は３’認識基および３’末端ヌクレオチドを含み；そして、前記上流オリゴヌクレオチドおよび該プライマーが同じ３’認識基を含み、前記テンプレート核酸は２本鎖であり、該上流オリゴヌクレオチドおよび該プライマーは、該テンプレート核酸の反対鎖にハイブリダイズし；ここで該方法は、以下：
前記ヌクレアーゼを用いて、該プライマーの３’部分を消化する工程；
ポリヌクレオチド生成物の生成のために、前記ポリメラーゼを用いて、該消化されたプライマーを伸長させる工程；ならびに、
組み込まれていないプライマーを該反応混合物から除去するために、該混合物と該３’認識基に結合する結合基を含む基質とを接触させる工程、
をさらに包含する、方法。
【請求項４】
請求項２に記載の方法であって、ここで前記混合物が、３’部分および５’部分を有するプライマーをさらに含み、ここで、該３’部分は３’認識基および３’末端ヌクレオチドを含み；そして、前記上流オリゴヌクレオチドおよび該プライマーが異なる３’認識基を含み、前記テンプレート核酸は２本鎖であり、該上流オリゴヌクレオチドおよび該プライマーは、該テンプレート核酸の反対鎖にハイブリダイズし；ここで該方法は、以下：
前記ヌクレアーゼを用いて、該プライマーの３’部分を消化する工程；
ポリヌクレオチド生成物の生成のために、前記ポリメラーゼを用いて、該消化されたプライマーを伸長させる工程；ならびに、
組み込まれていないプライマーを該反応混合物から除去するために、該混合物と該プライマーの該３’認識基に結合する結合基を含む基質とを接触させる工程、
をさらに包含する、方法。
【請求項５】
前記混合物が、３’認識基を含まないプライマーをさらに含み、前記テンプレート核酸は２本鎖であり、前記上流オリゴヌクレオチドおよび該プライマーが該テンプレート核酸の反対鎖にハイブリダイズする、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記ポリメラーゼがＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼである、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記ポリメラーゼが逆転写酵素である、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
前記混合物が、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼをさらに含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記逆転写酵素およびＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼが同じ酵素複合体である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記酵素複合体が、Ａｎａｅｒｏｃｅｌｌｕｍ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍＤＮＡポリメラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｌｌｉｄｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｃａｒｂｏｘｙｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｆｏｒｍａｎｓ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｔｈｅｒｍｏｈｙｄｒｏｓｕｌｆｕｒｉｃｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ ａｆｒｉｃａｎｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ、またはＴｈｅｒｍｕｓ ＺＯ５ ＤＮＡポリメラーゼである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＤＮＡポリメラーゼおよびヌクレアーゼが同じ酵素複合体である、請求項２に記載の方法。
【請求項１２】
前記ヌクレアーゼが３’→５’エキソヌクレアーゼである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記酵素複合体が、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓポリメラーゼＴＨＥＲＭＡＬＡＣＥ、ＤＥＥＰ ＶＥＮＴ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＧＢ−Ｄ）、ＶＥＮＴ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ、９ｏＮｍＴＭ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．９ｏＮ−７株）、ＡＣＵＰＯＬ ＤＮＡポリメラーゼ、ＰＲＯＯＦＳＴＡＲＴ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｗｏｅｓｅｉ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ、ＡＭＰＬＩＴＨＥＲＭ ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒｅｎｓｉｓ）、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｍｉｃｏｌａｎｓ ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＹＮＡＺＹＭＥ ＥＸＴ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｂｒｏｃｋａｉａｎｕｓ）、Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ ａｆｒｉｃａｎｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｄｉｃｔｉｕｍ ｏｃｃｕｌｔｕｍ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒｅｎｓｉｓ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｌｌｉｄｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｃａｒｂｏｘｙｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｆｏｒｍａｎｓ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＧＢ−Ｄ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．９ｏＮ−７株ＤＮＡポリメラーゼ、またはＴｈｅｒｍｕｓ ｂｒｏｃｋａｉａｎｕｓ ＤＮＡポリメラーゼである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＤＮＡポリメラーゼおよびヌクレアーゼが別個の酵素複合体である、請求項２に記載の方法。
【請求項１５】
前記ポリメラーゼが、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ、ＺＯ５ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｓｐ．ＺＯ５）、ＳＰＳ１７ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｓｐ．ＳＰＳ１７）、Ｔｈｅｒｍｏａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｔｈｅｒｍｏｈｙｄｒｏｓｕｌｆｕｒｉｃｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ、Ａｎａｅｒｏｃｅｌｌｕｍ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ ＤＮＡポリメラーゼ、または、ＦＹ７ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｔｈｅｒｍｏｈｙｄｒｏｓｕｌｆｕｒｉｃｕｓ ＦＹ７）である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ヌクレアーゼが、ポリメラーゼ活性が失われた、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有する変異体ポリメラーゼである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記ヌクレアーゼが、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓポリメラーゼ ＴＨＥＲＭＡＬＡＣＥ、ＤＥＥＰ ＶＥＮＴ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＧＢ−Ｄ）、ＶＥＮＴ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ、９ｏＮｍＴＭＤＮＡポリメラーゼ、（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．９ｏＮ−７株）、ＡＣＵＰＯＬ ＤＮＡポリメラーゼ、ＰＲＯＯＦＳＴＡＲＴ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｗｏｅｓｅｉ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ、ＡＭＰＬＩＴＨＥＲＭ ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒｅｎｓｉｓ）、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｍｉｃｏｌａｎｓ ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＹＮＡＺＹＭＥ ＥＸＴ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｂｒｏｃｋａｉａｎｕｓ），Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ ａｆｒｉｃａｎｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｄｉｃｔｉｕｍ ｏｃｃｕｌｔｕｍ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒｅｎｓｉｓ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｌｌｉｄｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｃａｒｂｏｘｙｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｆｏｒｍａｎｓ ＤＮＡポリメラーゼ、 Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ、 Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＧＢ−Ｄ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．９ｏＮ−７株ＤＮＡポリメラーゼ、または、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｂｒｏｃｋａｉａｎｕｓ ＤＮＡポリメラーゼの変異体である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ポリメラーゼが、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有する野生型ポリメラーゼの変異体形態であり、ここで、該変異体形態はエキソヌクレアーゼ活性が失われている、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
前記ポリメラーゼが、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ ポリメラーゼ ＴＨＥＲＭＡＬＡＣＥ、ＤＥＥＰ ＶＥＮＴ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＧＢ−Ｄ）、ＶＥＮＴ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ９ｏＮｍＴＭ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．９ｏＮ−７株）、ＡＣＵＰＯＬ ＤＮＡポリメラーゼ、 ＰＲＯＯＦＳＴＡＲＴ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｗｏｅｓｅｉ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ、ＡＭＰＬＩＴＨＥＲＭ ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒｅｎｓｉｓ）、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｍｉｃｏｌａｎｓ ＤＮＡポリメラーゼ、 ＤＹＮＡＺＹＭＥ ＥＸＴ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｂｒｏｃｋａｉａｎｕｓ）、Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ ａｆｒｉｃａｎｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｄｉｃｔｉｕｍ ｏｃｃｕｌｔｕｍ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒｅｎｓｉｓ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｌｌｉｄｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｃａｒｂｏｘｙｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｆｏｒｍａｎｓ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＧＢ−Ｄ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．９ｏＮ−７株ＤＮＡポリメラーゼ、または、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｂｒｏｃｋａｉａｎｕｓ ＤＮＡポリメラーゼの変異体形態である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記混合物が、様々な量の３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼを、２種類またはそれ以上含む、請求項２に記載の方法。
【請求項２１】
前記ヌクレアーゼが、活性化工程が適用されるまでは不活性である、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記ヌクレアーゼが、ＰＲＯＯＦＳＴＡＲＴ ＤＮＡポリメラーゼである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記（ｉ）が核酸リガーゼであり、工程（ｃ）は、前記ポリヌクレオチド生成物を形成するために、該リガーゼを用いて、前記消化された上流オリゴヌクレオチドを下流オリゴヌクレオチドへ連結する工程である、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記上流オリゴヌクレオチドの３’末端ヌクレオチドが、前記未消化上流オリゴヌクレオチドの伸長またはライゲーションを防止するブロック基で改変されている、請求項２または２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記ブロック基が、３’−デオキシヌクレオチドである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記ブロック基が、３’−ホスホグリコアルデヒド、３’−リン酸、３’−メルカプト、または３’−アミノである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記ブロック基が、３’認識基を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
前記上流オリゴヌクレオチドが、前記３’認識基を除去しない限り伸長または連結され得ない方法である、請求項２または２３に記載の方法。
【請求項２９】
前記ヌクレアーゼが３’→５’エキソヌクレアーゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項３０】
前記３’末端ヌクレオチドが前記３’認識基の全てまたは一部を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３１】
前記上流オリゴヌクレオチドの内部ヌクレオチドが、前記３’認識基の全てまたは一部を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３２】
前記上流オリゴヌクレオチドの３’部分が前記テンプレートと相補的ではない、請求項１に記載の方法。
【請求項３３】
前記上流オリゴヌクレオチドの３’部分内の全てのヌクレオシドが、前記ヌクレアーゼによる加水分解に耐性がある結合により連結される、請求項１に記載の方法。
【請求項３４】
前記結合が、メチルホスホネート結合である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記結合が、ホスホロチオネート結合である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
前記上流オリゴヌクレオチドの３’部分内の全てのヌクレオシドが、ホスホジエステル結合により連結されており、そして前記上流オリゴヌクレオチドの５’部分が、加水分解に耐性がある結合を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３７】
前記加水分解に耐性のある結合が、メチルホスホネート結合、またはホスホロチオネート結合である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記上流オリゴヌクレオチドの３’部分がＬヌクレオチドから構成されている、請求項１に記載の方法。
【請求項３９】
前記テンプレート核酸がＤＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項４０】
前記テンプレート核酸がＲＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項４１】
前記基質が、サイズ排除クロマトグラフィー樹脂である、請求項１に記載の方法。
【請求項４２】
前記認識基が抗体により認識される基であり、前記結合基が抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項４３】
前記認識基がジゴキシゲニンである、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記認識基がフルオレセインである、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
前記認識基がビオチンである、請求項４２に記載の方法。
【請求項４６】
前記認識基がビオチンであり、前記結合基がアビジンまたはストレプトアビジンである、請求項１に記載の方法。
【請求項４７】
前記認識基がフェニルボロン酸を含み、前記結合基がサリチルヒドロキサム酸を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４８】
前記認識基がサリチルヒドロキサム酸を含み、前記結合基がフェニルボロン酸を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４９】
前記認識基がポリヒスチジンであり、前記結合基がニッケルカチオンである、請求項１に記載の方法。
【請求項５０】
前記認識基が前記上流オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列であり、前記結合基が相補的なヌクレオチド配列である、請求項１に記載の方法。
【請求項５１】
前記上流オリゴヌクレオチドが、前記３’認識基に対して５’側に改変ヌクレオチドを含み、前記ヌクレアーゼが、該上流オリゴヌクレオチドを該改変ヌクレオチドで切断する、請求項１に記載の方法。
【請求項５２】
前記改変ヌクレオチドが２重鎖中に存在する場合に、２重鎖中にない場合よりも優先して、前記ヌクレアーゼが、前記上流オリゴヌクレオチドを該改変ヌクレオチドで切断する、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記改変ヌクレオチドがリボヌクレオチドであり、前記ヌクレアーゼがＲＮＡｓｅ Ｈである、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記ＲＮＡｓｅ Ｈが、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＲＮＡｓｅ Ｈ、ヒトＲＮＡｓｅ Ｈ、またはＥ．ｃｏｌｉ ＲＮＡｓｅ Ｈである、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記改変ヌクレオチドが、８オキソ−７，８−ジヒドロ−２’−デオキシグアノジン；７−メチルグアニン；２，６−ジアミノ−４−ヒドロキシ−５−Ｎ−メチルホルムアミドピリミジン；４，６−ジアミノ−５−ホルムアミドピリミジン；５−ヒドロキシ−２’−デオキシシチジン；５−ヒドロキシ−２’−デオキシウリジン；または、Ｎ７−メチルグアニンを含み；そして
前記ヌクレアーゼが、ホルムアミドピリミジン−ＤＮＡグリコシラーゼであり；そして
前記混合物が、３’ホスファターゼをさらに含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５６】
前記改変ヌクレオチドが、７，８−ジヒドロ−８−オキソグアニン；ホルムアミドピリミジン；２，６−ジアミノ−４−ヒドロキシ−５−ホルムアミドピリミジン；または、８−オキソグアニンを含み；そして
前記ヌクレアーゼが、８−オキソグアニンＤＮＡグリコシラーゼであり；そして
前記混合物が、ＡＰエンドヌクレアーゼをさらに含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５７】
前記改変ヌクレオチドが、５，６−ジヒドロチミン；６−ヒドロキシ−５，６−ジヒドロチミン；シス−チミングリコール；トランス−チミングリコール；５−ヒドロキシ−５−メチルヒダントイン；メチルタルトニル尿素；尿素；５−ヒドロキシシトシン；５−ヒドロキシウラシル；ウラシルグリコール；ジヒドロウラシル；６−ヒドロキシウラシル；グリコール；β−ウレイドイソ酪酸；５−ヒドロキシ−６−ヒドロチミン；５，６−ジヒドロウラシル；５−ヒドロキシ−６−ヒドロウラシル；５−ヒドロキシ−２’−デオキシシチジン；５−ヒドロキシ−２’−デオキシウリジンを含み；そして
前記ヌクレアーゼが、エンドヌクレアーゼＩＩＩ、またはチミングリコールＤＮＡグリコシラーゼであり；そして
前記混合物が、ＡＰエンドヌクレアーゼをさらに含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５８】
前記改変ヌクレオチドが、ＡＰヌクレオチドであり、前記ヌクレアーゼが、ＡＰエンドヌクレアーゼである、請求項５２に記載の方法。
【請求項５９】
前記混合物が、３’ホスファターゼをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６０】
前記３’ホスファターゼがエキソヌクレアーゼＩＩＩ、エキソヌクレアーゼＩＶ、または、酵母ＡＰエンドヌクレアーゼである、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記上流オリゴヌクレオチドの５’部分が、前記３’認識基とは異なる５’認識基を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６２】
請求項６１に記載の方法であって、以下の工程（ｅ）：前記混合物と前記５’認識基に結合する結合基を含む基質とを接触させる工程、をさらに包含する、方法。
【請求項６３】
反応混合物から組み込まれていないオリゴヌクレオチドを除去する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）以下：
（ｉ） 核酸リガーゼ；
（ｉｉ） ヌクレアーゼ；
（ｉｉｉ） ３’部分および５’部分を有する下流オリゴヌクレオチドであって、該５’部分は５’認識基および５’末端ヌクレオチドを含む、オリゴヌクレオチド；および
（ｉｖ） テンプレート核酸；
を含む混合物を形成する工程であって、ここで（ｉ）および（ｉｉ）は同じかまたは別個の酵素の複合体である、工程；
（ｂ）該ヌクレアーゼを用いて、該下流オリゴヌクレオチドの該５’部分を消化する工程；
（ｃ）該リガーゼを用いて、該消化された下流オリゴヌクレオチドを上流オリゴヌクレオチドへ連結させる工程であって、該連結工程がポリヌクレオチド生成物を形成する、工程；ならびに
（ｄ）組み込まれていない下流オリゴヌクレオチドを該反応混合物から除去するために、該混合物と該５’認識基に結合する結合基を含む基質とを接触させる工程、
を包含する、方法。
【請求項６４】
前記下流オリゴヌクレオチドの５’末端ヌクレオチドが、前記未消化下流オリゴヌクレオチドのライゲーションを防止するブロック基で改変されている、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記ブロック基が、５’−メルカプト、５’−アミノ、５’−ジホスフェート、５’−トリホスフェート、または５’−デオキシヌクレオチドである、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記ブロック基が、５’認識基を含む請求項６４に記載の方法。
【請求項６７】
前記下流オリゴヌクレオチドが、前記５’認識基を除去しない限り連結され得ない方法である、請求項６３に記載の方法。
【請求項６８】
前記ヌクレアーゼが５’→３’エキソヌクレアーゼである、請求項６３に記載の方法。
【請求項６９】
前記ヌクレアーゼがＲｅｃＪｆである、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記ヌクレアーゼが、活性化工程が適用されるまでは不活性である、請求項６３に記載の方法。
【請求項７１】
前記５’末端ヌクレオチドが前記５’認識基の全てまたは一部を含む、請求項６３に記載の方法。
【請求項７２】
前記下流オリゴヌクレオチドの内部ヌクレオチドが、前記５’認識基の全てまたは一部を含む、請求項６３に記載の方法。
【請求項７３】
前記下流オリゴヌクレオチドの５’部分が前記テンプレートと相補的ではない、請求項６３に記載の方法。
【請求項７４】
前記下流オリゴヌクレオチドの５’部分内の全てのヌクレオシドが、前記ヌクレアーゼによる加水分解に耐性がある結合により連結される、請求項６３に記載の方法。
【請求項７５】
前記結合が、メチルホスホネート結合である、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
前記結合が、ホスホロチオネート結合である、請求項７４に記載の方法。
【請求項７７】
前記下流オリゴヌクレオチドの５’部分内の全てのヌクレオシドが、ホスホジエステル結合により連結されており、前記上流オリゴヌクレオチドの３’部分が、加水分解に耐性がある結合を含む、請求項６３に記載の方法。
【請求項７８】
前記加水分解に耐性のある結合が、メチルホスホネート結合、またはホスホロチオネート結合である、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
前記下流オリゴヌクレオチドの５’部分がＬヌクレオチドから成る、請求項６３に記載の方法。
【請求項８０】
前記テンプレート核酸がＤＮＡである、請求項６３に記載の方法。
【請求項８１】
前記テンプレート核酸がＲＮＡである、請求項６３に記載の方法。
【請求項８２】
前記基質が、サイズ排除クロマトグラフィー樹脂である、請求項６３に記載の方法。
【請求項８３】
前記認識基が抗体により認識される基であり、前記結合基が該抗体である、請求項６３に記載の方法。
【請求項８４】
前記認識基がジゴキシゲニンである、請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
前記認識基がフルオレセインである、請求項８３に記載の方法。
【請求項８６】
前記認識基がビオチンである、請求項８３に記載の方法。
【請求項８７】
前記認識基がビオチンであり、前記結合基がアビジンまたはストレプトアビジンである、請求項６３に記載の方法。
【請求項８８】
前記認識基がフェニルボロン酸を含み、前記結合基がサリチルヒドロキサム酸を含む、請求項６３に記載の方法。
【請求項８９】
前記認識基がサリチルヒドロキサム酸を含み、前記結合基がフェニルボロン酸を含む、請求項６３に記載の方法。
【請求項９０】
前記認識基がポリヒスチジンであり、前記結合基がニッケルカチオン−キレート錯体である、請求項６３に記載の方法。
【請求項９１】
前記認識基が前記下流オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列であり、前記結合基が相補的なヌクレオチド配列である、請求項６３に記載の方法。
【請求項９２】
前記下流オリゴヌクレオチドが、前記５’認識基に対して３’側に改変ヌクレオチドを含み、前記ヌクレアーゼが、該下流オリゴヌクレオチドを該改変ヌクレオチドで切断する、請求項６３に記載の方法。
【請求項９３】
前記改変ヌクレオチドが２重鎖中に存在する場合に、２重鎖中にない場合よりも優先して、前記ヌクレアーゼが、前記下流オリゴヌクレオチドを該改変ヌクレオチドの部分で切断する、請求項９２に記載の方法。
【請求項９４】
前記改変ヌクレオチドがリボヌクレオチドであり、前記ヌクレアーゼがＲＮＡｓｅ Ｈである、請求項９３に記載の方法。
【請求項９５】
前記ＲＮＡｓｅ Ｈが、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＲＮＡｓｅ Ｈ、ヒトＲＮＡｓｅ Ｈ、またはＥ．ｃｏｌｉ ＲＮＡｓｅ Ｈである、請求項９４に記載の方法。
【請求項９６】
前記改変ヌクレオチドが、８オキソ−７，８−ジヒドロ−２’−デオキシグアノシン；７−メチルグアニン；２，６−ジアミノ−４−ヒドロキシ−５−Ｎ−メチルホルムアミドピリミジン；４，６−ジアミノ−５−ホルムアミドピリミジン；５−ヒドロキシ−２’−デオキシシチジン；５−ヒドロキシ−２’−デオキシウリジン；または、Ｎ７−メチルグアニンを含み；そして
前記ヌクレアーゼが、ホルムアミドピリミジン−ＤＮＡグリコシラーゼである、請求項９３に記載の方法。
【請求項９７】
前記改変ヌクレオチドが、８−ヒドロキシグアニンを含み、前記ヌクレアーゼが、８−ヒドロキシグアニンエンドヌクレアーゼ、またはＮ−メチルプリンＤＮＡグリコシラーゼである、請求項９３に記載の方法。
【請求項９８】
前記改変ヌクレオチドが、７，８−ジヒドロ−８−オキソグアニン；ホルムアミドピリミジン；２，６−ジアミノ−４−ヒドロキシ−５−ホルムアミドピリミジン；または、８−オキソグアニンを含み；そして
前記ヌクレアーゼが、８−オキソグアニン−ＤＮＡグリコシラーゼである、請求項９３に記載の方法。
【請求項９９】
前記改変ヌクレオチドが、ＡＰヌクレオチドであり、前記ヌクレアーゼが、リアーゼ活性を有するＤＮＡグリコシラーゼである、請求項９３に記載の方法。
【請求項１００】
消化工程後に、前記ヌクレアーゼが、５’末端ＡＰヌクレオチドを残し、前記混合物が、ｄＲｐａｓｅをさらに含む、請求項９２に記載の方法。
【請求項１０１】
前記下流オリゴヌクレオチドの３’部分が、前記５’認識基とは異なる３’認識基を含む、請求項６３に記載の方法。
【請求項１０２】
請求項１０１に記載の方法であって、工程（ｄ）の後に、以下の工程（ｅ）：前記混合物と前記３’認識基に結合する結合基を含む基質とを接触させる工程、をさらに包含する、方法。
【請求項１】
反応混合物から組み込まれていないオリゴヌクレオチドを除去する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）以下：
（ｉ） ＤＮＡポリメラーゼまたは核酸リガーゼ；
（ｉｉ） ヌクレアーゼ；
（ｉｉｉ） ３’部分および５’部分を有する上流オリゴヌクレオチドであって、該３’部分は３’認識基および３’末端ヌクレオチドを含む、オリゴヌクレオチド；および
（ｉｖ） テンプレート核酸；
を含む混合物を形成する工程であって、ここで（ｉ）および（ｉｉ）は同じかまたは別個の酵素の複合体である、工程；
（ｂ）該ヌクレアーゼを用いて、該上流オリゴヌクレオチドの該３’部分を消化する工程；
（ｃ）該ポリメラーゼを用いて、該消化された上流オリゴヌクレオチドを伸長させる工程、または該リガーゼを用いて、該消化された上流オリゴヌクレオチドを下流オリゴヌクレオチドへ連結させる工程であって、該伸長工程または該連結工程がポリヌクレオチド生成物を形成する、工程；ならびに
（ｄ）組み込まれていない上流オリゴヌクレオチドを該反応混合物から除去するために、該混合物と該３’認識基に結合する結合基を含む基質とを接触させる工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
前記（ｉ）がＤＮＡポリメラーゼであり、工程（ｃ）は、前記ポリヌクレオチド生成物を形成するために、該ポリメラーゼを用いて、前記消化された上流オリゴヌクレオチドを伸長させる工程である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
請求項２に記載の方法であって、ここで前記混合物が、３’部分および５’部分を有するプライマーをさらに含み、ここで、該３’部分は３’認識基および３’末端ヌクレオチドを含み；そして、前記上流オリゴヌクレオチドおよび該プライマーが同じ３’認識基を含み、前記テンプレート核酸は２本鎖であり、該上流オリゴヌクレオチドおよび該プライマーは、該テンプレート核酸の反対鎖にハイブリダイズし；ここで該方法は、以下：
前記ヌクレアーゼを用いて、該プライマーの３’部分を消化する工程；
ポリヌクレオチド生成物の生成のために、前記ポリメラーゼを用いて、該消化されたプライマーを伸長させる工程；ならびに、
組み込まれていないプライマーを該反応混合物から除去するために、該混合物と該３’認識基に結合する結合基を含む基質とを接触させる工程、
をさらに包含する、方法。
【請求項４】
請求項２に記載の方法であって、ここで前記混合物が、３’部分および５’部分を有するプライマーをさらに含み、ここで、該３’部分は３’認識基および３’末端ヌクレオチドを含み；そして、前記上流オリゴヌクレオチドおよび該プライマーが異なる３’認識基を含み、前記テンプレート核酸は２本鎖であり、該上流オリゴヌクレオチドおよび該プライマーは、該テンプレート核酸の反対鎖にハイブリダイズし；ここで該方法は、以下：
前記ヌクレアーゼを用いて、該プライマーの３’部分を消化する工程；
ポリヌクレオチド生成物の生成のために、前記ポリメラーゼを用いて、該消化されたプライマーを伸長させる工程；ならびに、
組み込まれていないプライマーを該反応混合物から除去するために、該混合物と該プライマーの該３’認識基に結合する結合基を含む基質とを接触させる工程、
をさらに包含する、方法。
【請求項５】
前記混合物が、３’認識基を含まないプライマーをさらに含み、前記テンプレート核酸は２本鎖であり、前記上流オリゴヌクレオチドおよび該プライマーが該テンプレート核酸の反対鎖にハイブリダイズする、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記ポリメラーゼがＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼである、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記ポリメラーゼが逆転写酵素である、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
前記混合物が、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼをさらに含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記逆転写酵素およびＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼが同じ酵素複合体である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記酵素複合体が、Ａｎａｅｒｏｃｅｌｌｕｍ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍＤＮＡポリメラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｌｌｉｄｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｃａｒｂｏｘｙｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｆｏｒｍａｎｓ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｔｈｅｒｍｏｈｙｄｒｏｓｕｌｆｕｒｉｃｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ ａｆｒｉｃａｎｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ、またはＴｈｅｒｍｕｓ ＺＯ５ ＤＮＡポリメラーゼである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＤＮＡポリメラーゼおよびヌクレアーゼが同じ酵素複合体である、請求項２に記載の方法。
【請求項１２】
前記ヌクレアーゼが３’→５’エキソヌクレアーゼである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記酵素複合体が、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓポリメラーゼＴＨＥＲＭＡＬＡＣＥ、ＤＥＥＰ ＶＥＮＴ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＧＢ−Ｄ）、ＶＥＮＴ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ、９ｏＮｍＴＭ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．９ｏＮ−７株）、ＡＣＵＰＯＬ ＤＮＡポリメラーゼ、ＰＲＯＯＦＳＴＡＲＴ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｗｏｅｓｅｉ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ、ＡＭＰＬＩＴＨＥＲＭ ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒｅｎｓｉｓ）、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｍｉｃｏｌａｎｓ ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＹＮＡＺＹＭＥ ＥＸＴ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｂｒｏｃｋａｉａｎｕｓ）、Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ ａｆｒｉｃａｎｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｄｉｃｔｉｕｍ ｏｃｃｕｌｔｕｍ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒｅｎｓｉｓ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｌｌｉｄｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｃａｒｂｏｘｙｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｆｏｒｍａｎｓ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＧＢ−Ｄ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．９ｏＮ−７株ＤＮＡポリメラーゼ、またはＴｈｅｒｍｕｓ ｂｒｏｃｋａｉａｎｕｓ ＤＮＡポリメラーゼである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＤＮＡポリメラーゼおよびヌクレアーゼが別個の酵素複合体である、請求項２に記載の方法。
【請求項１５】
前記ポリメラーゼが、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ、ＺＯ５ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｓｐ．ＺＯ５）、ＳＰＳ１７ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｓｐ．ＳＰＳ１７）、Ｔｈｅｒｍｏａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｔｈｅｒｍｏｈｙｄｒｏｓｕｌｆｕｒｉｃｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ、Ａｎａｅｒｏｃｅｌｌｕｍ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ ＤＮＡポリメラーゼ、または、ＦＹ７ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｔｈｅｒｍｏｈｙｄｒｏｓｕｌｆｕｒｉｃｕｓ ＦＹ７）である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ヌクレアーゼが、ポリメラーゼ活性が失われた、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有する変異体ポリメラーゼである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記ヌクレアーゼが、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓポリメラーゼ ＴＨＥＲＭＡＬＡＣＥ、ＤＥＥＰ ＶＥＮＴ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＧＢ−Ｄ）、ＶＥＮＴ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ、９ｏＮｍＴＭＤＮＡポリメラーゼ、（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．９ｏＮ−７株）、ＡＣＵＰＯＬ ＤＮＡポリメラーゼ、ＰＲＯＯＦＳＴＡＲＴ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｗｏｅｓｅｉ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ、ＡＭＰＬＩＴＨＥＲＭ ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒｅｎｓｉｓ）、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｍｉｃｏｌａｎｓ ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＹＮＡＺＹＭＥ ＥＸＴ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｂｒｏｃｋａｉａｎｕｓ），Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ ａｆｒｉｃａｎｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｄｉｃｔｉｕｍ ｏｃｃｕｌｔｕｍ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒｅｎｓｉｓ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｌｌｉｄｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｃａｒｂｏｘｙｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｆｏｒｍａｎｓ ＤＮＡポリメラーゼ、 Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ、 Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＧＢ−Ｄ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．９ｏＮ−７株ＤＮＡポリメラーゼ、または、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｂｒｏｃｋａｉａｎｕｓ ＤＮＡポリメラーゼの変異体である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ポリメラーゼが、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有する野生型ポリメラーゼの変異体形態であり、ここで、該変異体形態はエキソヌクレアーゼ活性が失われている、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
前記ポリメラーゼが、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ ポリメラーゼ ＴＨＥＲＭＡＬＡＣＥ、ＤＥＥＰ ＶＥＮＴ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＧＢ−Ｄ）、ＶＥＮＴ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ９ｏＮｍＴＭ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．９ｏＮ−７株）、ＡＣＵＰＯＬ ＤＮＡポリメラーゼ、 ＰＲＯＯＦＳＴＡＲＴ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｗｏｅｓｅｉ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ、ＡＭＰＬＩＴＨＥＲＭ ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒｅｎｓｉｓ）、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｍｉｃｏｌａｎｓ ＤＮＡポリメラーゼ、 ＤＹＮＡＺＹＭＥ ＥＸＴ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｂｒｏｃｋａｉａｎｕｓ）、Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ ａｆｒｉｃａｎｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｄｉｃｔｉｕｍ ｏｃｃｕｌｔｕｍ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒｅｎｓｉｓ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｌｌｉｄｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｃａｒｂｏｘｙｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｆｏｒｍａｎｓ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＧＢ−Ｄ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．９ｏＮ−７株ＤＮＡポリメラーゼ、または、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｂｒｏｃｋａｉａｎｕｓ ＤＮＡポリメラーゼの変異体形態である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記混合物が、様々な量の３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼを、２種類またはそれ以上含む、請求項２に記載の方法。
【請求項２１】
前記ヌクレアーゼが、活性化工程が適用されるまでは不活性である、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記ヌクレアーゼが、ＰＲＯＯＦＳＴＡＲＴ ＤＮＡポリメラーゼである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記（ｉ）が核酸リガーゼであり、工程（ｃ）は、前記ポリヌクレオチド生成物を形成するために、該リガーゼを用いて、前記消化された上流オリゴヌクレオチドを下流オリゴヌクレオチドへ連結する工程である、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記上流オリゴヌクレオチドの３’末端ヌクレオチドが、前記未消化上流オリゴヌクレオチドの伸長またはライゲーションを防止するブロック基で改変されている、請求項２または２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記ブロック基が、３’−デオキシヌクレオチドである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記ブロック基が、３’−ホスホグリコアルデヒド、３’−リン酸、３’−メルカプト、または３’−アミノである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記ブロック基が、３’認識基を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
前記上流オリゴヌクレオチドが、前記３’認識基を除去しない限り伸長または連結され得ない方法である、請求項２または２３に記載の方法。
【請求項２９】
前記ヌクレアーゼが３’→５’エキソヌクレアーゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項３０】
前記３’末端ヌクレオチドが前記３’認識基の全てまたは一部を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３１】
前記上流オリゴヌクレオチドの内部ヌクレオチドが、前記３’認識基の全てまたは一部を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３２】
前記上流オリゴヌクレオチドの３’部分が前記テンプレートと相補的ではない、請求項１に記載の方法。
【請求項３３】
前記上流オリゴヌクレオチドの３’部分内の全てのヌクレオシドが、前記ヌクレアーゼによる加水分解に耐性がある結合により連結される、請求項１に記載の方法。
【請求項３４】
前記結合が、メチルホスホネート結合である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記結合が、ホスホロチオネート結合である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
前記上流オリゴヌクレオチドの３’部分内の全てのヌクレオシドが、ホスホジエステル結合により連結されており、そして前記上流オリゴヌクレオチドの５’部分が、加水分解に耐性がある結合を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３７】
前記加水分解に耐性のある結合が、メチルホスホネート結合、またはホスホロチオネート結合である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記上流オリゴヌクレオチドの３’部分がＬヌクレオチドから構成されている、請求項１に記載の方法。
【請求項３９】
前記テンプレート核酸がＤＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項４０】
前記テンプレート核酸がＲＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項４１】
前記基質が、サイズ排除クロマトグラフィー樹脂である、請求項１に記載の方法。
【請求項４２】
前記認識基が抗体により認識される基であり、前記結合基が抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項４３】
前記認識基がジゴキシゲニンである、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記認識基がフルオレセインである、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
前記認識基がビオチンである、請求項４２に記載の方法。
【請求項４６】
前記認識基がビオチンであり、前記結合基がアビジンまたはストレプトアビジンである、請求項１に記載の方法。
【請求項４７】
前記認識基がフェニルボロン酸を含み、前記結合基がサリチルヒドロキサム酸を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４８】
前記認識基がサリチルヒドロキサム酸を含み、前記結合基がフェニルボロン酸を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４９】
前記認識基がポリヒスチジンであり、前記結合基がニッケルカチオンである、請求項１に記載の方法。
【請求項５０】
前記認識基が前記上流オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列であり、前記結合基が相補的なヌクレオチド配列である、請求項１に記載の方法。
【請求項５１】
前記上流オリゴヌクレオチドが、前記３’認識基に対して５’側に改変ヌクレオチドを含み、前記ヌクレアーゼが、該上流オリゴヌクレオチドを該改変ヌクレオチドで切断する、請求項１に記載の方法。
【請求項５２】
前記改変ヌクレオチドが２重鎖中に存在する場合に、２重鎖中にない場合よりも優先して、前記ヌクレアーゼが、前記上流オリゴヌクレオチドを該改変ヌクレオチドで切断する、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記改変ヌクレオチドがリボヌクレオチドであり、前記ヌクレアーゼがＲＮＡｓｅ Ｈである、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記ＲＮＡｓｅ Ｈが、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＲＮＡｓｅ Ｈ、ヒトＲＮＡｓｅ Ｈ、またはＥ．ｃｏｌｉ ＲＮＡｓｅ Ｈである、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記改変ヌクレオチドが、８オキソ−７，８−ジヒドロ−２’−デオキシグアノジン；７−メチルグアニン；２，６−ジアミノ−４−ヒドロキシ−５−Ｎ−メチルホルムアミドピリミジン；４，６−ジアミノ−５−ホルムアミドピリミジン；５−ヒドロキシ−２’−デオキシシチジン；５−ヒドロキシ−２’−デオキシウリジン；または、Ｎ７−メチルグアニンを含み；そして
前記ヌクレアーゼが、ホルムアミドピリミジン−ＤＮＡグリコシラーゼであり；そして
前記混合物が、３’ホスファターゼをさらに含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５６】
前記改変ヌクレオチドが、７，８−ジヒドロ−８−オキソグアニン；ホルムアミドピリミジン；２，６−ジアミノ−４−ヒドロキシ−５−ホルムアミドピリミジン；または、８−オキソグアニンを含み；そして
前記ヌクレアーゼが、８−オキソグアニンＤＮＡグリコシラーゼであり；そして
前記混合物が、ＡＰエンドヌクレアーゼをさらに含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５７】
前記改変ヌクレオチドが、５，６−ジヒドロチミン；６−ヒドロキシ−５，６−ジヒドロチミン；シス−チミングリコール；トランス−チミングリコール；５−ヒドロキシ−５−メチルヒダントイン；メチルタルトニル尿素；尿素；５−ヒドロキシシトシン；５−ヒドロキシウラシル；ウラシルグリコール；ジヒドロウラシル；６−ヒドロキシウラシル；グリコール；β−ウレイドイソ酪酸；５−ヒドロキシ−６−ヒドロチミン；５，６−ジヒドロウラシル；５−ヒドロキシ−６−ヒドロウラシル；５−ヒドロキシ−２’−デオキシシチジン；５−ヒドロキシ−２’−デオキシウリジンを含み；そして
前記ヌクレアーゼが、エンドヌクレアーゼＩＩＩ、またはチミングリコールＤＮＡグリコシラーゼであり；そして
前記混合物が、ＡＰエンドヌクレアーゼをさらに含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５８】
前記改変ヌクレオチドが、ＡＰヌクレオチドであり、前記ヌクレアーゼが、ＡＰエンドヌクレアーゼである、請求項５２に記載の方法。
【請求項５９】
前記混合物が、３’ホスファターゼをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６０】
前記３’ホスファターゼがエキソヌクレアーゼＩＩＩ、エキソヌクレアーゼＩＶ、または、酵母ＡＰエンドヌクレアーゼである、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記上流オリゴヌクレオチドの５’部分が、前記３’認識基とは異なる５’認識基を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６２】
請求項６１に記載の方法であって、以下の工程（ｅ）：前記混合物と前記５’認識基に結合する結合基を含む基質とを接触させる工程、をさらに包含する、方法。
【請求項６３】
反応混合物から組み込まれていないオリゴヌクレオチドを除去する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）以下：
（ｉ） 核酸リガーゼ；
（ｉｉ） ヌクレアーゼ；
（ｉｉｉ） ３’部分および５’部分を有する下流オリゴヌクレオチドであって、該５’部分は５’認識基および５’末端ヌクレオチドを含む、オリゴヌクレオチド；および
（ｉｖ） テンプレート核酸；
を含む混合物を形成する工程であって、ここで（ｉ）および（ｉｉ）は同じかまたは別個の酵素の複合体である、工程；
（ｂ）該ヌクレアーゼを用いて、該下流オリゴヌクレオチドの該５’部分を消化する工程；
（ｃ）該リガーゼを用いて、該消化された下流オリゴヌクレオチドを上流オリゴヌクレオチドへ連結させる工程であって、該連結工程がポリヌクレオチド生成物を形成する、工程；ならびに
（ｄ）組み込まれていない下流オリゴヌクレオチドを該反応混合物から除去するために、該混合物と該５’認識基に結合する結合基を含む基質とを接触させる工程、
を包含する、方法。
【請求項６４】
前記下流オリゴヌクレオチドの５’末端ヌクレオチドが、前記未消化下流オリゴヌクレオチドのライゲーションを防止するブロック基で改変されている、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記ブロック基が、５’−メルカプト、５’−アミノ、５’−ジホスフェート、５’−トリホスフェート、または５’−デオキシヌクレオチドである、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記ブロック基が、５’認識基を含む請求項６４に記載の方法。
【請求項６７】
前記下流オリゴヌクレオチドが、前記５’認識基を除去しない限り連結され得ない方法である、請求項６３に記載の方法。
【請求項６８】
前記ヌクレアーゼが５’→３’エキソヌクレアーゼである、請求項６３に記載の方法。
【請求項６９】
前記ヌクレアーゼがＲｅｃＪｆである、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記ヌクレアーゼが、活性化工程が適用されるまでは不活性である、請求項６３に記載の方法。
【請求項７１】
前記５’末端ヌクレオチドが前記５’認識基の全てまたは一部を含む、請求項６３に記載の方法。
【請求項７２】
前記下流オリゴヌクレオチドの内部ヌクレオチドが、前記５’認識基の全てまたは一部を含む、請求項６３に記載の方法。
【請求項７３】
前記下流オリゴヌクレオチドの５’部分が前記テンプレートと相補的ではない、請求項６３に記載の方法。
【請求項７４】
前記下流オリゴヌクレオチドの５’部分内の全てのヌクレオシドが、前記ヌクレアーゼによる加水分解に耐性がある結合により連結される、請求項６３に記載の方法。
【請求項７５】
前記結合が、メチルホスホネート結合である、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
前記結合が、ホスホロチオネート結合である、請求項７４に記載の方法。
【請求項７７】
前記下流オリゴヌクレオチドの５’部分内の全てのヌクレオシドが、ホスホジエステル結合により連結されており、前記上流オリゴヌクレオチドの３’部分が、加水分解に耐性がある結合を含む、請求項６３に記載の方法。
【請求項７８】
前記加水分解に耐性のある結合が、メチルホスホネート結合、またはホスホロチオネート結合である、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
前記下流オリゴヌクレオチドの５’部分がＬヌクレオチドから成る、請求項６３に記載の方法。
【請求項８０】
前記テンプレート核酸がＤＮＡである、請求項６３に記載の方法。
【請求項８１】
前記テンプレート核酸がＲＮＡである、請求項６３に記載の方法。
【請求項８２】
前記基質が、サイズ排除クロマトグラフィー樹脂である、請求項６３に記載の方法。
【請求項８３】
前記認識基が抗体により認識される基であり、前記結合基が該抗体である、請求項６３に記載の方法。
【請求項８４】
前記認識基がジゴキシゲニンである、請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
前記認識基がフルオレセインである、請求項８３に記載の方法。
【請求項８６】
前記認識基がビオチンである、請求項８３に記載の方法。
【請求項８７】
前記認識基がビオチンであり、前記結合基がアビジンまたはストレプトアビジンである、請求項６３に記載の方法。
【請求項８８】
前記認識基がフェニルボロン酸を含み、前記結合基がサリチルヒドロキサム酸を含む、請求項６３に記載の方法。
【請求項８９】
前記認識基がサリチルヒドロキサム酸を含み、前記結合基がフェニルボロン酸を含む、請求項６３に記載の方法。
【請求項９０】
前記認識基がポリヒスチジンであり、前記結合基がニッケルカチオン−キレート錯体である、請求項６３に記載の方法。
【請求項９１】
前記認識基が前記下流オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列であり、前記結合基が相補的なヌクレオチド配列である、請求項６３に記載の方法。
【請求項９２】
前記下流オリゴヌクレオチドが、前記５’認識基に対して３’側に改変ヌクレオチドを含み、前記ヌクレアーゼが、該下流オリゴヌクレオチドを該改変ヌクレオチドで切断する、請求項６３に記載の方法。
【請求項９３】
前記改変ヌクレオチドが２重鎖中に存在する場合に、２重鎖中にない場合よりも優先して、前記ヌクレアーゼが、前記下流オリゴヌクレオチドを該改変ヌクレオチドの部分で切断する、請求項９２に記載の方法。
【請求項９４】
前記改変ヌクレオチドがリボヌクレオチドであり、前記ヌクレアーゼがＲＮＡｓｅ Ｈである、請求項９３に記載の方法。
【請求項９５】
前記ＲＮＡｓｅ Ｈが、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＲＮＡｓｅ Ｈ、ヒトＲＮＡｓｅ Ｈ、またはＥ．ｃｏｌｉ ＲＮＡｓｅ Ｈである、請求項９４に記載の方法。
【請求項９６】
前記改変ヌクレオチドが、８オキソ−７，８−ジヒドロ−２’−デオキシグアノシン；７−メチルグアニン；２，６−ジアミノ−４−ヒドロキシ−５−Ｎ−メチルホルムアミドピリミジン；４，６−ジアミノ−５−ホルムアミドピリミジン；５−ヒドロキシ−２’−デオキシシチジン；５−ヒドロキシ−２’−デオキシウリジン；または、Ｎ７−メチルグアニンを含み；そして
前記ヌクレアーゼが、ホルムアミドピリミジン−ＤＮＡグリコシラーゼである、請求項９３に記載の方法。
【請求項９７】
前記改変ヌクレオチドが、８−ヒドロキシグアニンを含み、前記ヌクレアーゼが、８−ヒドロキシグアニンエンドヌクレアーゼ、またはＮ−メチルプリンＤＮＡグリコシラーゼである、請求項９３に記載の方法。
【請求項９８】
前記改変ヌクレオチドが、７，８−ジヒドロ−８−オキソグアニン；ホルムアミドピリミジン；２，６−ジアミノ−４−ヒドロキシ−５−ホルムアミドピリミジン；または、８−オキソグアニンを含み；そして
前記ヌクレアーゼが、８−オキソグアニン−ＤＮＡグリコシラーゼである、請求項９３に記載の方法。
【請求項９９】
前記改変ヌクレオチドが、ＡＰヌクレオチドであり、前記ヌクレアーゼが、リアーゼ活性を有するＤＮＡグリコシラーゼである、請求項９３に記載の方法。
【請求項１００】
消化工程後に、前記ヌクレアーゼが、５’末端ＡＰヌクレオチドを残し、前記混合物が、ｄＲｐａｓｅをさらに含む、請求項９２に記載の方法。
【請求項１０１】
前記下流オリゴヌクレオチドの３’部分が、前記５’認識基とは異なる３’認識基を含む、請求項６３に記載の方法。
【請求項１０２】
請求項１０１に記載の方法であって、工程（ｄ）の後に、以下の工程（ｅ）：前記混合物と前記３’認識基に結合する結合基を含む基質とを接触させる工程、をさらに包含する、方法。
【公表番号】特表２００６−５０００１１（Ｐ２００６−５０００１１Ａ）
【公表日】平成１８年１月５日（２００６．１．５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−５２３３４４（Ｐ２００４−５２３３４４）
【出願日】平成１５年７月２０日（２００３．７．２０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０２３０２２
【国際公開番号】ＷＯ２００４／００９８５１
【国際公開日】平成１６年１月２９日（２００４．１．２９）
【出願人】（５０００６９０５７）アプレラ コーポレイション (120)
【住所又は居所原語表記】８５０ Ｌｉｎｃｏｌｎ Ｃｅｎｔｒｅ Ｄｒｉｖｅ Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ ＣＡＬＩＦＯＲＮＩＡ ９４４０４ Ｕ．Ｓ．Ａ．
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年１月５日（２００６．１．５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１５年７月２０日（２００３．７．２０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０２３０２２
【国際公開番号】ＷＯ２００４／００９８５１
【国際公開日】平成１６年１月２９日（２００４．１．２９）
【出願人】（５０００６９０５７）アプレラ コーポレイション (120)
【住所又は居所原語表記】８５０ Ｌｉｎｃｏｌｎ Ｃｅｎｔｒｅ Ｄｒｉｖｅ Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ ＣＡＬＩＦＯＲＮＩＡ ９４４０４ Ｕ．Ｓ．Ａ．
【Ｆターム（参考）】
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