ＰＱＱＧＤＨ製造法
【課題】 ＰＱＱＧＤＨ、特に活性型であるホロ型ＰＱＱＧＤＨの生産性向上、及び／またはホロ型ＰＱＱＧＤＨの割合が向上したＰＱＱＧＤＨを提供する。
【解決手段】 ＰＱＱ生産能を有する宿主を用いた組換えタンパク質の生産において、培地中に有機溶媒、特にモノオール類を添加することを特徴とする組換えＰＱＱＧＤＨの生産方法、及び／または該方法により生産されるＰＱＱＧＤＨ。
【解決手段】 ＰＱＱ生産能を有する宿主を用いた組換えタンパク質の生産において、培地中に有機溶媒、特にモノオール類を添加することを特徴とする組換えＰＱＱＧＤＨの生産方法、及び／または該方法により生産されるＰＱＱＧＤＨ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）を補酵素とするグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）（以下ＰＱＱＧＤＨとも略記する。）の製造法及びそれを用いたグルコースセンサーに関する。本発明のＰＱＱＧＤＨは、臨床検査や食品分析などにおけるグルコースの定量に有用である。
【背景技術】
【０００２】
ＰＱＱＧＤＨは、ピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）を補酵素とするグルコースデヒドロゲナーゼである。グルコースを酸化してグルコノラクトンを生成する反応を触媒するから、血糖の測定に用いることができる。血中グルコース濃度は、糖尿病の重要なマーカーとして臨床診断上きわめて重要な指標である。現在、血中グルコース濃度の測定は、グルコースオキシダーゼを使用したバイオセンサーを用いる方法が主流となっているが、反応が溶存酸素濃度に影響されるから、測定値に誤差が生じる可能性があった。このグルコースオキシダーゼにかわる新たな酵素としてＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼが注目されている。
【０００３】
我々のグループは、アシネトバクター・バウマンニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ） ＮＣＩＭＢ１１５１７株が、ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素を産生することを見出し，遺伝子のクローニングならびに発現系を構築した（特許文献１参照）。しかしながら、その生産性は工業用途としては十分とは言い難く、特に工業的観点からは、活性型であるホロ型ＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼの生産性を上げる必要性があった（特許文献１未記載内容）。
【特許文献１】特開平１１−２４３９４９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、従来技術の課題を背景になされたもので、ＰＱＱＧＤＨ、特に活性型のホロ型ＰＱＱＧＤＨの生産性向上を課題としてその改良に関するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは上記課題を解決するため、鋭意研究した結果、遂に本発明を完成するに到った。即ち本発明は、
項１．
ＰＱＱ生産能を有する宿主を用いた組換えタンパク質の生産において、培地中に有機溶媒を添加することを特徴とする組換えＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼの生産方法
項２．
ＰＱＱ生産能を有する宿主を用いた組換えタンパク質の生産において、培地中に有機溶媒を添加することでＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼのタンパク生産量が向上することを特徴とする組換えＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼの生産方法
項３．
ＰＱＱ生産能を有する宿主を用いた組換えタンパク質の生産において、培地中に有機溶媒を添加することで、ホロ型ＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼのタンパク生産量が向上することを特徴とするＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼの生産方法
項４．
ＰＱＱ生産能を有する宿主を用いた組換えタンパク質の生産において、培地中に有機溶媒を添加することで、ホロ型ＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼの全ＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼに占める割合が向上することを特徴とするＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼの生産方法
項５．
有機溶媒がモノオール類より選ばれる項１〜４いずれかに記載のＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼの生産方法
項６．
有機溶媒がメタノール、エタノール、プロパノール、ブタノールより選ばれる項１〜４いずれかに記載のＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼの生産方法
項７．
ホロ型ＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼが全ＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼの４５％以上の割合で生産されることを特徴とする項１〜６いずれかに記載の方法
項８．
ホロ型ＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼが全ＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼの７０％以上の割合で生産されることを特徴とする項１〜６いずれかに記載の方法
項９．
ＰＱＱ生産能を有する宿主を用いた組換えタンパク質の生産において、ホロ型ＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼが全ＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼの４５％以上の割合で生産されることを特徴とするＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼの生産方法
項１０．
ＰＱＱ生産能を有する宿主を用いた組換えタンパク質の生産において、ホロ型ＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼが全ＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼの７０％以上の割合で生産されることを特徴とするＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼの生産方法
項１１．
項１〜１０いずれかの方法で生産されたＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼ
項１２．
項１〜１０いずれかの方法で生産されたＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼを含むグルコースアッセイキット
項１３．
項１〜１０いずれかの方法で生産されたＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼを含むグルコースセンサー。
項１４．
項１〜１０いずれかの方法で生産されたＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼを含むグルコース測定方法。
である。
【発明の効果】
【０００６】
本発明によるＰＱＱＧＤＨ生産性の向上、特にホロ型ＰＱＱＧＤＨとしての生産性の向上は製造コストの低減をもたらす。さらに、ホロ型ＰＱＱＧＤＨの割合が向上することにより、活性型のＰＱＱＧＤＨを得るためにＰＱＱを添加しホロ化する必要性もなくなることも、製造コストの低減をもたらす。これらは、ＰＱＱＧＤＨを廉価に製造することを可能にする。また、さらにはグルコースアッセイキット及びグルコースセンサを廉価で提供することも可能にする。
【０００７】
またホロ型ＰＱＱＧＤＨの割合が向上することによりＰＱＱＧＤＨの単位タンパク質重量あたりの活性値が向上するので、グルコースアッセイキット及びグルコースセンサへのタンパク質添加量の減少も可能にする。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
以下、本発明を詳細に説明する。
【０００９】
本発明で使用するＰＱＱＧＤＨとは、ピロロキノリンキノンを補酵素として配位し、Ｄ−グルコースを酸化してＤ−グルコノ−１，５−ラクトンを生成するという反応を触媒する酵素であり、由来や構造に関しては特に限定するものではない。
なお、現時点において、ＰＱＱＧＤＨのクローニングは、アシネトバクター・カルコアセティカス（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ）ＬＭＤ７９．４１（Ａ．Ｍ．Ｃｌｅｔｏｎ−Ｊａｎｓｅｎら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７０，２１２１（１９８８）およびＭｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２１７，４３０（１９８９））、エシェリヒア・コり（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）（Ａ．Ｍ．Ｃｌｅｔｏｎ−Ｊａｎｓｅｎら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７２，６３０８（１９９０））、グルコノバクター・オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ）（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２２９，２０６（１９９１））、及び特許文献１で報告されているアシネトバクター・バウマンニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉ） ＮＣＩＭＢ１１５１７より実施されている。ただし、エシェリヒア・コリなどに存在する膜型酵素を改変して可溶型にすることは困難であり、起源としてはアシネトバクター・カルコアセティカスもしくはアシネトバクター・バウマンニなどの可溶性ＰＱＱＧＤＨを選択することが好ましい。
アシネトバクター・バウマンニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ）ＮＣＩＭＢ１１５１７株は、以前、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓに分類されていた。
【００１０】
上記のＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属由来ＰＱＱＧＤＨのアミノ酸配列は、好ましくはＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓまたはＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ由来ＰＱＱＧＤＨのアミノ酸配列である。中でも好ましくは配列番号１である。配列番号１で示される野生型ＰＱＱＧＤＨタンパク質及び配列番号２で示されるその塩基配列は、アシネトバクター・バウマンニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ）ＮＣＩＭＢ１１５１７株を起源とするものであり、特開平１１−２４３９４９号公報に開示されている。なお、上記および配列番号１において、アミノ酸の表記は、シグナル配列が除かれたアスパラギン酸を１として番号付けされている。
【００１１】
例えば、配列番号１のアミノ酸配列と、アシネトバクター・カルコアセティカス（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ）ＬＭＤ７９．４１株由来酵素のアミノ酸配列を比較すると、相違箇所はわずかで、相同性は９２．３％（シグナル配列含む）となり、非常に類似しているので、配列番号１におけるある残基が、他起源の酵素のどのアミノ酸残基に該当するかを容易に認識することができる。これらのＰＱＱＧＤＨも本発明の範囲内に含まれる。
【００１２】
グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有する限り、さらに他のアミノ酸残基の一部が欠失または置換されていてもよく、また他のアミノ酸残基が付加されていてもよい。
【００１３】
作製された改変タンパク質の遺伝情報を有するＤＮＡは、プラスミドと連結された状態にて宿主微生物中に移入され、改変タンパク質を生産する形質転換体となる。この際のプラスミドとしては、例えば、エシェリヒア・コリー（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）を宿主微生物とする場合にはｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ，ｐＵＣ１８などが使用できる。宿主微生物としては、例えば、エシェリヒア・コリー Ｗ３１１０、エシェリヒア・コリーＣ６００、エシェリヒア・コリーＪＭ１０９、エシェリヒア・コリーＤＨ５αなどが利用できる。宿主微生物に組換えベクターを移入する方法としては、例えば宿主微生物がエシェリヒア属に属する微生物の場合には、カルシウムイオンの存在下で組換えＤＮＡの移入を行なう方法などを採用することができ、更にエレクトロポレーション法を用いても良い。更には、市販のコンピテントセル（例えば、コンピテントハイＪＭ１０９；東洋紡績製）を用いても良い。
【００１４】
このような遺伝子はこれらの菌株より抽出してもよく、また化学的に合成することもできる。さらに、ＰＣＲ法の利用により、ＰＱＱＧＤＨ遺伝子を含むＤＮＡ断片を得ることも可能である。
【００１５】
本発明において、ＰＱＱＧＤＨをコードする遺伝子を得る方法としては、次のような方法が挙げられる。例えばアシネトバクター・カルコアセティカスＮＣＩＢ１１５１７ の染色体を分離、精製した後、超音波処理、制限酵素処理等を用いてＤＮＡを切断したものと、リニアーな発現ベクターと両ＤＮＡの平滑末端または付着末端においてＤＮＡリガーゼなどにより結合閉鎖させて組換えベクターを構築する。該組換えベクターを複製可能な宿主微生物に移入した後、ベクターのマーカーと酵素活性の発現を指標としてスクリーニングして、ＰＱＱを補欠分子族とするＧＤＨをコードする遺伝子を含有する組換えベクターを保持する微生物を得る。
【００１６】
次いで、上記組換えベクターを保持する微生物を培養して、該培養微生物の菌体から該組換えベクターを分離、精製し、該発現ベクターからＧＤＨをコードする遺伝子を採取することができる。例えば、遺伝子供与体であるアシネトバクター・カルコアセティカスＮＣＩＢ１１５１７ の染色体ＤＮＡは、具体的には以下のようにして採取される。
【００１７】
該遺伝子供与微生物を例えば１〜３日間攪拌培養して得られた培養液を遠心分離により集菌し、次いで、これを溶菌させることによりＰＱＱを補欠分子族とするＧＤＨ遺伝子の含有溶菌物を調製することができる。溶菌の方法としては、例えばリゾチーム等の溶菌酵素により処理が施され、必要に応じてプロテアーゼや他の酵素やラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）等の界面活性剤が併用される。さらに、凍結融解やフレンチプレス処理のような物理的破砕方法と組み合わせてもよい。
【００１８】
上記のようにして得られた溶菌物からＤＮＡを分離精製するには、常法に従って、例えばフェノール処理やプロテアーゼ処理による除蛋白処理や、リボヌクレアーゼ処理、アルコール沈殿処理などの方法を適宜組み合わせることにより行うことができる。
【００１９】
微生物から分離、精製されたＤＮＡを切断する方法は、例えば超音波処理、制限酵素処理などにより行うことができる。好ましくは特定のヌクレオチド配列に作用するＩＩ型制限酵素が適している。
【００２０】
クローニングする際のベクターとしては、宿主微生物内で自律的に増殖し得るファージまたはプラスミドから遺伝子組換え用として構築されたものが適している。ファージとしては、例えばエシェリヒア・コリを宿主微生物とする場合にはＬａｍｂｄａ ｇｔ１０ 、Ｌａｍｂｄａ ｇｔ１１ などが例示される。また、プラスミドとしては、例えば、エシェリヒア・コリを宿主微生物とする場合には、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９ 、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ などが例示される。
【００２１】
クローニングの際、上記のようなベクターを、上述したＧＤＨをコードする遺伝子供与体である微生物ＤＮＡの切断に使用した制限酵素で切断してベクター断片を得ることができるが、必ずしも該微生物ＤＮＡの切断に使用した制限酵素と同一の制限酵素を用いる必要はない。微生物ＤＮＡ断片とベクターＤＮＡ断片とを結合させる方法は、公知のＤＮＡリガーゼを用いる方法であればよく、例えば微生物ＤＮＡ断片の付着末端とベクター断片の付着末端とのアニーリングの後、適当なＤＮＡリガーゼの使用により微生物ＤＮＡ断片とベクターＤＮＡ断片との組換えベクターを作成する。必要に応じて、アニーリングの後、宿主微生物に移入して生体内のＤＮＡリガーゼを利用し組換えベクターを作製することもできる。
【００２２】
クローニングに使用する宿主微生物としては、組換えベクターが安定であり、かつ自律増殖可能で外来性遺伝子の形質発現できるものであれば特に制限されない。一般的には、エシェリヒア・コリＷ３１１０ 、エシェリヒア・コリＣ６００、エシェリヒア・コリＨＢ１０１ 、エシェリヒア・コリＪＭ１０９ 、エシェリヒア・コリＤＨ５ αなどを用いることができる。
【００２３】
宿主微生物に組換えベクターを移入する方法としては、例えば宿主微生物がエシェリヒア・コリの場合には、カルシウム処理によるコンピテントセル法やエレクトロポーレーション法などを用いることができる。
【００２４】
上記のように得られた形質転換体である微生物は、栄養培地で培養されることにより、多量のＧＤＨを安定に生産し得る。宿主微生物への目的組換えベクターの移入の有無についての選択は、目的とするＤＮＡを保持するベクターの薬剤耐性マーカーとＰＱＱの添加によりＧＤＨ活性を同時に発現する微生物を検索すればよい。例えば、薬剤耐性マーカーに基づく選択培地で生育し、かつＧＤＨを生成する微生物を選択すればよい。
【００２５】
上記の方法により得られたＰＱＱを補欠分子族とするＧＤＨ遺伝子の塩基配列は、Ｓｃｉｅｎｃｅ ，第２１４巻，１２０５（１９８１）に記載されたジデオキシ法により解読した。また、ＧＤＨのアミノ酸配列は上記のように決定された塩基配列より推定した。
【００２６】
上記のようにして、一度選択されたＰＱＱを補欠分子族とするＧＤＨ遺伝子を保有する組換えベクターより、ＰＱＱ生産能を有する微生物にて複製できる組換えベクターへの移入は、ＧＤＨ遺伝子を保持する組換えベクターから制限酵素やＰＣＲ法によりＧＤＨ遺伝子であるＤＮＡを回収し、他のベクター断片と結合させることにより容易に実施できる。また、これらのベクターによるＰＱＱ生産能を有する微生物の形質転換は、カルシウム処理によるコンピテントセル法やエレクトロポーレーション法などを用いることができる。
【００２７】
ＰＱＱ生産能を有する微生物としては、メチロバクテリウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属等のメタノール資化性細菌、アセトバクター（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ）属やグルコノバクター（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ）属の酢酸菌、フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、シュードモナス属、アシネトバクター属等の細菌を挙げることができる。なかでも、シュードモナス属細菌とアシネトバクター属細菌が利用できる宿主−ベクター系が確立されており利用しやすいので好ましい。
【００２８】
シュードモナス属細菌では、シュードモナス・エルギノサ、シュードモナス・フルオレッセンス、シュードモナス・プチダなどを用いることができる。また、アシネトバクター属細菌ではアシネトバクター・カルコアセティカス、アシネトバクター・バウマンニ等を用いることができる。
【００２９】
上記微生物にて複製できる組換えベクターとしては、ＲＳＦ１０１０ 由来のベクターもしくはとその類似のレプリコンを有するベクターがシュードモナス属細菌に利用可能である。例えば、ｐＫＴ２４０、ｐＭＭＢ２４等（Ｍ．Ｍ．Ｂａｇｄａｓａｒｉａｎ ら，Ｇｅｎｅ，２６，２７３（１９８３））、ｐＣＮ４０ 、ｐＣＮ６０ 等（Ｃ．Ｃ．Ｎｉｅｔｏ ら，Ｇｅｎｅ，８７，１４５（１９９０））やｐＴＳ１１３７（遺伝子組換え実用化技術技術，第４集，ｐ７３から８５，昭和５８年，（株）サイレンスフォーラム発行）等を挙げることができる。また、ｐＭＥ２９０等（Ｙ．Ｉｔｏｈら、Ｇｅｎｅ，３６，２７（１９８５））、ｐＮＩ１１１、ｐＮＩ２０Ｃ（Ｎ．Ｉｔｏｈら，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１０，６１４（１９９１））も利用できる。
【００３０】
アシネトバクター属細菌では、ｐＷＭ４３ 等（Ｗ．Ｍｉｎａｓ ら，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ，５９，２８０７（１９９３））、ｐＫＴ２３０、ｐＷＨ１２６６ 等（Ｍ．Ｈｕｎｇｅｒら，Ｇｅｎｅ，８７，４５（１９９０））がベクターとして利用可能である。
【００３１】
こうして得られた形質転換体である微生物は、栄養培地で培養されることにより、ＰＱＱＧＤＨタンパク質を生産し得るが、培地中に有機溶媒を添加することにより、全ＰＱＱＧＤＨタンパク質としての生産性向上及びホロ型ＰＱＱＧＤＨタンパク質としての生産性向上、いずれも可能になる。形質転換体である宿主微生物の培養形態は、宿主の栄養生理的性質を考慮して培養条件を選択すればよく、多くの場合は液体培養で行う。工業的には通気攪拌培養を行うのが有利である。
【００３２】
本発明においてホロ型ＰＱＱＧＤＨとはＧＤＨタンパク質に補酵素ＰＱＱが結合したＰＱＱＧＤＨ酵素自身及びその状態をさし、ＰＱＱの添加なしでＧＤＨ活性を有する酵素及びその状態である。一方、全ＰＱＱＧＤＨとは、ホロ型ＰＱＱＧＤＨ及びＧＤＨタンパク質に補酵素ＰＱＱが結合していないアポ型ＰＱＱＧＤＨをあわせた全ＧＤＨ酵素タンパク質及びその状態をさす。
【００３３】
培地の栄養源としては，微生物の培養に通常用いられるものが広く使用され得る。炭素源としては資化可能な炭素化合物であればよく、例えば、グルコース、シュークロース、ラクトース、マルトース、ラクトース、糖蜜、ピルビン酸などが使用される。また、窒素源としては利用可能な窒素化合物であればよく、例えば、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分解物、大豆粕アルカリ抽出物などが使用される。その他、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガン、亜鉛などの塩類、特定のアミノ酸、特定のビタミンなどが必要に応じて使用される。
【００３４】
有機溶媒の種類及び添加量を特に限定するものではないが、望ましくはモノオール類であり、さらに望ましくはメタノール、エタノール、２−プロパノールである。一方添加量は、望ましくは培地に対して体積比で０．１〜５％、より望ましくは０．５〜２％の範囲である。
【００３５】
本発明においてモノオール類とは、分子内に１分子の水酸基を有するアルコール類の総称であり、具体的には１級アルコールであるメタノール、エタノールや２級アルコールである２−プロパノールなどがある。分子内に２分子の水酸基を有するジオール類以上とは明確に区別される。
【００３６】
培養温度は菌が成育し、ＰＱＱＧＤＨを生産する範囲で適宜変更し得るが、上記のようなＰＱＱ生産能を有する微生物の場合、好ましくは２０〜４２℃、より好ましくは３０〜３７℃程度である。培養時間は条件によって多少異なるが、ＰＱＱＧＤＨが最高収量に達する時期を見計らって適当時期に培養を完了すればよく、通常は６〜４８時間、好ましくは１６〜３６時間程度である。培地のｐＨは菌が発育し、ＰＱＱＧＤＨを生産する範囲で適宜変更し得るが、好ましくはｐＨ６．０〜９．０程度、より好ましくはｐＨ６．５〜８．０の範囲である。
【００３７】
培養物中のＰＱＱＧＤＨを生産する菌体を含む培養液をそのまま採取し、利用することもできるが、一般には、常法に従って、ＰＱＱＧＤＨが培養液中に存在する場合はろ過、遠心分離などにより、ＰＱＱＧＤＨ含有溶液と微生物菌体とを分離した後に利用される。ＰＱＱＧＤＨが菌体内に存在する場合には、得られた培養物からろ過または遠心分離などの手段により菌体を採取し、次いで、この菌体を機械的方法またはリゾチームなどの酵素的方法で破壊し、また、必要に応じて、ＥＤＴＡ等のキレート剤及び界面活性剤を添加してＧＤＨを可溶化し、水溶液として分離採取する。
【００３８】
上記のようにして得られたＰＱＱＧＤＨ含有溶液を、例えば減圧濃縮、膜濃縮、さらに硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウムなどの塩析処理、あるいは親水性有機溶媒、例えばメタノール、エタノール、アセトンなどによる分別沈殿法により沈殿せしめればよい。また、加熱処理や等電点処理も有効な精製手段である。その後、吸着剤あるいはゲルろ過剤などによるゲルろ過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィーを行うことにより、精製されたＰＱＱＧＤＨを得ることができる。
【００３９】
例えば、セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）ゲル（ファルマシアバイオテク）などによるゲルろ過、ＤＥＡＥセファロースＣＬ−６Ｂ （ファルマシアバイオテク）、オクチルセファロースＣＬ−６Ｂ （ファルマシアバイオテク）等のカラムクロマトグラフィーにより分離、精製し、精製酵素標品を得ることができる。該精製酵素標品は、電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）的に単一のバンドを示す程度に純化されていることが好ましい。
【００４０】
上記のようにして得られた精製酵素を、例えば凍結乾燥、真空乾燥やスプレードライなどにより粉末化して流通させることが可能である。その際、精製酵素はリン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液やＧＯＯＤの緩衝液に溶解しているものを用いることができる。好適なものはＧＯＯＤの緩衝液であり、なかでも、ＰＩＰＥＳ、ＭＥＳもしくはＭＯＰＳ緩衝液が特に好ましい。また、カルシウムイオンまたはその塩、およびグルタミン酸、グルタミン、リジン等のアミノ酸類、さらに血清アルブミン等を添加することによりＰＱＱＧＤＨをより安定化することができる。
【００４１】
ＰＱＱＧＤＨタンパク質は、液状（水溶液、懸濁液等）、粉末、凍結乾燥など種々の形態をとることができる。凍結乾燥法としては、特に制限されるものではなく常法に従って行えばよい。本発明の酵素を含む組成物は凍結乾燥物に限られず、凍結乾燥物を再溶解した溶液状態であってもよい。また、グルコース測定を行なう際には、グルコースアッセイキット、グルコースセンサーなどの種々の形態をとることができる。この様にして得られた精製された改変タンパク質は、以下のような方法により安定化することができる。
【００４２】
精製された改変タンパク質に（１）アスパラギン酸、グルタミン酸、α−ケトグルタル酸、リンゴ酸、α−ケトグルコン酸、α−サイクロデキストリンおよびそれらの塩からなる群から選ばれた１種または２種以上の化合物および（２）アルブミンを共存せしめることにより、改変タンパク質をさらに安定化することができる。
【００４３】
凍結乾燥組成物中においては、ＰＱＱＧＤＨ含有量は、酵素の起源によっても異なるが、通常は約５〜５０％（重量比）の範囲で好適に用いられる。酵素活性に換算すると、１００〜２０００Ｕ／ｍｇの範囲で好適に用いられる。
【００４４】
アスパラギン酸、グルタミン酸、αーケトグルタル酸、リンゴ酸、及びαーケトグルコン酸の塩としては、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、及びマグネシウム等の塩が挙げられるが特に限定されるものではない。上記化合物とその塩及びα−シクロデキストリンの添加量は、１〜９０％（重量比）の範囲で添加することが好ましい。これらの物質は単独で用いてもよいし、複数組み合わせてもよい。
【００４５】
含有される緩衝液としては特に限定されるものではないが、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、ＧＯＯＤ緩衝液などが挙げられる。該緩衝液のｐＨは５．０〜９．０程度の範囲で使用目的に応じて調整される。凍結乾燥物中においては緩衝剤の含有量は、特に限定されるものではないが、好ましくは０．１％（重量比）以上、特に好ましくは０．１〜３０％（重量比）の範囲で使用される。
【００４６】
使用できるアルブミンとしては、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、卵白アルブミン（ＯＶＡ）などが挙げられる。特にＢＳＡが好ましい。該アルブミンの含有量は、好ましくは１〜８０％（重量比）、より好ましくは５〜７０％（重量比）の範囲で使用される。
【００４７】
組成物には、さらに他の安定化剤などをＰＱＱＧＤＨの反応に特に悪い影響を及ぼさないような範囲で添加してもよい。本発明の安定化剤の配合法は特に制限されるものではない。例えばＰＱＱＧＤＨを含む緩衝液に安定化剤を配合する方法、安定化剤を含む緩衝液にＰＱＱＧＤＨを配合する方法、あるいはＰＱＱＧＤＨと安定化剤を緩衝液に同時に配合する方法などが挙げられる。
【００４８】
また、カルシウムイオンを添加しても安定化効果が得られる。すなわち、カルシウムイオンまたはカルシウム塩を含有させることにより、改変タンパク質を安定化させることができる。カルシウム塩としては、塩化カルシウムまたは酢酸カルシウムもしくはクエン酸カルシウム等の無機酸または有機酸のカルシウム塩などが例示される。また、水性組成物において、カルシウムイオンの含有量は、１×１０−４〜１×１０−２Ｍであることが好ましい。
【００４９】
カルシウムイオンまたはカルシウム塩を含有させることによる安定化効果は、グルタミン酸、グルタミンおよびリジンからなる群から選択されたアミノ酸を含有させることにより、さらに向上する。
【００５０】
グルタミン酸、グルタミンおよびリジンからなる群から選択されるアミノ酸は、１種または２種以上であってもよい。前記の水性組成物において、グルタミン酸、グルタミンおよびリジンからなる群から選択されたアミノ酸の含有量は、０．０１〜０．２重量％であることが好ましい。
【００５１】
さらに血清アルブミンを含有させてもよい。前記の水性組成物に血清アルブミンを添加する場合、その含有量は０．０５〜０．５重量％であることが好ましい。
【００５２】
緩衝剤としては、通常のものが使用され、通常、組成物のｐＨを５〜１０とするものが好ましい。具体的にはトリス塩酸、ホウ酸、グッド緩衝液が用いられるが、カルシウムと不溶性の塩を形成しない緩衝液はすべて使用できる。
【００５３】
前記の水性組成物には、必要により他の成分、例えば界面活性剤、安定化剤、賦形剤などを添加しても良い。
【００５４】
本発明においては以下の種々の方法によりグルコースを測定することができる。
グルコースアッセイキット
本発明はまた、本発明に従うＰＱＱＧＤＨを含むグルコースアッセイキットを特徴とする。本発明のグルコースアッセイキットは、本発明に従うＰＱＱＧＤＨを少なくとも１回のアッセイに十分な量で含む。典型的には、キットは、本発明のＰＱＱＧＤＨに加えて、アッセイに必要な緩衝液、メディエーター、キャリブレーションカーブ作製のためのグルコース標準溶液、ならびに使用の指針を含む。本発明に従うＰＱＱＧＤＨは種々の形態で、例えば、凍結乾燥された試薬として、または適切な保存溶液中の溶液として提供することができる。好ましくは本発明のＰＱＱＧＤＨはホロ化した形態で提供されるが、アポ酵素の形態で提供し、使用時にホロ化することもできる。
【００５５】
グルコースセンサー
本発明はまた、本発明に従うＰＱＱＧＤＨを用いるグルコースセンサーを特徴とする。電極としては、カーボン電極、金電極、白金電極などを用い、この電極上に本発明の酵素を固定化する。固定化方法としては、架橋試薬を用いる方法、高分子マトリックス中に封入する方法、透析膜で被覆する方法、光架橋性ポリマー、導電性ポリマー、酸化還元ポリマーなどがあり、あるいはフェロセンあるいはその誘導体に代表される電子メディエーターとともにポリマー中に固定あるいは電極上に吸着固定してもよく、またこれらを組み合わせて用いてもよい。好ましくは本発明のＰＱＱＧＤＨはホロ化した形態で電極上に固定化するが、アポ酵素の形態で固定化し、ＰＱＱを別の層としてまたは溶液中で提供することもできる。典型的には、グルタルアルデヒドを用いて本発明のＰＱＱＧＤＨをカーボン電極上に固定化した後、アミン基を有する試薬で処理してグルタルアルデヒドをブロッキングする。
【００５６】
グルコース濃度の測定は、以下のようにして行うことができる。恒温セルに緩衝液を入れ、ＰＱＱおよびＣａＣｌ２、およびメディエーターを加えて一定温度に維持する。メディエーターとしては、フェリシアン化カリウム、フェナジンメトサルフェートなどを用いることができる。作用電極として本発明のＰＱＱＧＤＨを固定化した電極を用い、対極（例えば白金電極）および参照電極（例えばＡｇ／ＡｇＣｌ電極）を用いる。カーボン電極に一定の電圧を印加して、電流が定常になった後、グルコースを含む試料を加えて電流の増加を測定する。標準濃度のグルコース溶液により作製したキャリブレーションカーブに従い、試料中のグルコース濃度を計算することができる。
【００５７】
なお、有機溶媒を添加した培地中でＰＱＱ生産能を有する微生物を培養することにより、ＰＱＱやＰＱＱを補酵素とする酵素を生産した例としては、特許文献２や非特許文献１が挙げられる。特許文献２では、ＰＱＱ生産能が確認されているメタノール資化性菌を、メタノールを主炭素源とする培地中で培養することによりＰＱＱが培養液中に蓄積する内容が記載されている。また、非特許文献１では、種々のＰＱＱ生産能を有する微生物を、有機溶媒等を炭素源として培養したところ、いくつかの微生物で、メタノール等を添加することにより、その炭素源を基質としＰＱＱを補酵素とするメタノール脱水素酵素やアルコール脱水素酵素の生産性が確認されたとの内容が記載されている。
しかしながら、これらの例では、メタノール等の有機溶媒を炭素源として用いて培養した時に、ＰＱＱの生産や、その有機溶媒を基質として用いる酵素の生産が確認されたことを述べているにすぎない。非特許文献１に記載されているように、メタノール等はそれを基質とする酵素やＰＱＱの生産に必須というわけではない（有機溶媒非存在でも、酵素やＰＱＱは存在しうる）。またこれまでに、有機溶媒を培地中に添加することで、それを基質としＰＱＱを補酵素とする酵素の生産性が向上したという直接の報告もない。ましてや、有機溶媒を培地中に添加することで、基質でもなく代謝系も異なるグルコース脱水素酵素の生産性が向上したという報告などなく、さらにそのグルコース脱水素酵素が遺伝子組換えにより外部から導入された場合において、有機溶媒を培地中に添加することで、基質でもなく代謝系も異なるグルコース脱水素酵素の生産性が向上したという報告などない。
この意味から、今回、ＰＱＱ生産能を有する宿主を用いた組換え生産を行うにあたり、有機溶媒を添加した培地中で培養することで、基質として有機溶媒は無関係であるグルコース脱水素酵素の生産性が向上したことは驚くべきことであった。また、仮に培地中への有機溶媒添加により宿主のＰＱＱの生産性が向上するようなことがあるとしても、同時に有機溶媒を基質とする宿主のＰＱＱ依存性酵素（例えばメタノールの場合メタノール脱水素酵素）も向上するであろうから、グルコース脱水素酵素の生産性向上と併せて、結果として宿主中のＰＱＱは不足しがちになると考えていただけに、グルコース脱水素酵素のタンパク質量としの生産性が向上しただけでなく、ホロ型としての割合も向上していたことは全くの予想外の出来事であった。
【特許文献２】特公平５−１００７７
【非特許文献１】ＡＰＰＬＩＥＤ ＡＮＤ ＥＮＶＩＲＯＮＭＥＮＴＡＬ ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ，Ｍａｙ １９８９，ｐ１２０９−１２１３
【実施例】
【００５８】
以下、本発明を実施例に基づきより詳細に説明する。
実施例１ ：ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素遺伝子の発現プラスミドの構築
野生型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素の発現プラスミドｐＮＰＧ５は、ベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（−）のマルチクローニング部位にアシネトバクター・バウマンニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ） ＮＣＩＭＢ１１５１７株由来のＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする構造遺伝子を挿入したものである。その塩基配列を配列表の配列番号２に、また該塩基配列から推定されるＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素のアミノ酸配列を配列表の配列番号１に示す。
【００５９】
実施例２：シュードモナス属細菌で複製できる発現ベクターの構築
実施例１で得た組換えプラスミドｐＮＰＧ５のＤＮＡ５μｇを制限酵素ＢａｍＨＩおよびＸＨｏＩ（東洋紡績製）で切断して、ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素の構造遺伝子部分を単離した。単離したＤＮＡとＢａｍＨＩおよびＸＨｏＩで切断したｐＴＳ１１３７（１μｇ）とをＴ４ＤＮＡリガーゼ１単位で１６℃、１６時間反応させ、ＤＮＡを連結した。連結したＤＮＡはエシェリヒア・コリＤＨ５αのコンピテントセルを用いて形質転換を行った。得られた発現プラスミドをｐＮＰＧ６と命名した。
【００６０】
実施例３：シュードモナス属細菌の形質転換体の作製
シュードモナス・プチダＴＥ３４９３（微工研寄１２２９８号）をＬＢＧ培地（ＬＢ培地＋０．３％グリセロール）で３０℃、１６時間培養し、遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、１０分間）により菌体を回収し、この菌体に氷冷した３００ｍＭシュークロースを含む５ｍＭＫ−リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）８ｍｌを加え、菌体を懸濁した。再度遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、１０分間）により菌体を回収し、この菌体に氷冷した３００ｍＭシュークロースを含む５ｍＭＫ−リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）０．４ｍｌを加え、菌体を懸濁した。
該懸濁液に実施例２で得た発現プラスミドｐＮＰＧ６を０．５μｇ加え、エレクトロポレーション法により形質転換した。１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含むＬＢ寒天培地に生育したコロニーより、目的とする形質転換体を得た。
【００６１】
試験例１
ホロ型ＰＱＱＧＤＨの活性測定方法
測定原理
Ｄ−グルコース＋ＰＭＳ＋ＰＱＱＧＤＨ → Ｄ−グルコノ−１，５−ラクトン ＋ ＰＭＳ（ｒｅｄ）
２ＰＭＳ（ｒｅｄ） ＋ ＮＴＢ → ２ＰＭＳ ＋ ジホルマザン
フェナジンメトサルフェート（ＰＭＳ）（ｒｅｄ）によるニトロテトラゾリウムブルー（ＮＴＢ）の還元により形成されたジホルマザンの存在は、５７０ｎｍで分光光度法により測定した。
単位の定義
１単位は、以下に記載の条件下で１分当たりジホルマザンを０．５ミリモル形成させるＰＱＱＧＤＨの酵素量をいう。
（３）方法
試薬
Ａ．Ｄ−グルコース溶液：０．５Ｍ（０．９ｇ Ｄ−グルコース（分子量１８０．１６）／１０ｍｌ Ｈ２Ｏ）
Ｂ．ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液， ｐＨ６．５：５０ｍＭ（６０ｍＬの水中に懸濁した１．５１ｇのＰＩＰＥＳ（分子量３０２．３６）を、５Ｎ ＮａＯＨに溶解し、２．２ｍｌの１０％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を加える。５Ｎ ＮａＯＨを用いて２５℃でｐＨを６．５±０．０５に調整し、水を加えて１００ｍｌとした。）
Ｃ．ＰＭＳ溶液：３．０ｍＭ（９．１９ｍｇのフェナジンメトサルフェート（分子量８１７．６５）／１０ｍｌＨ２Ｏ）
Ｄ．ＮＴＢ溶液：６．６ｍＭ（５３．９６ｍｇのニトロテトラゾリウムブルー（分子量８１７．６５）／１０ｍｌＨ２Ｏ）
Ｅ．酵素希釈液：１ｍＭ ＣａＣｌ２， ０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００， ０．１％ ＢＳＡを含む５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６．５）
手順
遮光ビンに以下の反応混合物を調製し、氷上で貯蔵した（用時調製）
１．８ｍｌ Ｄ−グルコース溶液 （Ａ）
２４．６ｍｌ ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６．５） （Ｂ）
２．０ｍｌ ＰＭＳ溶液 （Ｃ）
１．０ｍｌ ＮＴＢ溶液 （Ｄ）
【００６２】
【表１】
【００６３】
３．０ｍｌの反応混合液を試験管（プラスチック製）に入れ、３７℃で５分間予備加温した。
０．１ｍｌの酵素溶液を加え、穏やかに反転して混合した。
５７０ｎｍでの水に対する吸光度の増加を３７℃に維持しながら分光光度計で４〜５分間記録し、曲線の初期直線部分からの１分当たりのΔＯＤを計算した（ＯＤテスト）。
同時に、酵素溶液に代えて酵素希釈液（Ｅ）加えることを除いては同一の方法を繰り返し、ブランク（ΔＯＤブランク）を測定した。
アッセイの直前に氷冷した酵素希釈液（Ｅ）で酵素粉末を溶解し、同一の緩衝液で０．１−０．８Ｕ／ｍｌに希釈した（該酵素の接着性のためにプラスチックチューブの使用が好ましい）。
計算
活性を以下の式を用いて計算する：
Ｕ／ｍｌ＝｛ΔＯＤ／ｍｉｎ（ΔＯＤテスト− ΔＯＤブランク）×Ｖｔ×ｄｆ｝／（２０．１×１．０×Ｖｓ）
Ｕ／ｍｇ＝（Ｕ／ｍｌ）×１／Ｃ
Ｖｔ：総体積（３．１ｍｌ）
Ｖｓ：サンプル体積（１．０ｍｌ）
２０．１：ジホルマザンの１／２ミリモル分子吸光係数
１．０：光路長（ｃｍ）
ｄｆ：希釈係数
Ｃ：溶液中の酵素濃度（ｃ ｍｇ／ｍｌ）
【００６４】
試験例２
全ＰＱＱＧＤＨの活性測定方法
試験例１において、酵素希釈液（Ｅ）の代わりに酵素希釈液（Ｆ）：１ｍＭ ＣａＣｌ２， ０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００， ０．１％ ＢＳＡ，１μＭ ＰＱＱを含む５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６．５）を用いて酵素を希釈後、同様に測定を実施した。
【００６５】
実施例４ ＰＱＱＧＤＨ発現においてＰＱＱ生産性が律速となっていることの確認
２５ｍｌのＧＤＨ生産培地（１．５％グリセロール，４％酵母エキス，１．２５％Ｋ２ＨＰＯ４，０．２３％ＫＨ２ＰＯ４，ｐＨ６．８）を５００ｍｌ坂口フラスコに分注し、１２１℃、２０分間オートクレーブを行い、培地を滅菌した。放冷後、別途無菌濾過したストレプトマイシンを１００μｇ／ｍｌになるように添加した。また別途、５ｍｌの追添培地（１６．８％グリセロール、４．８％酵母エキス）を調製し、同様に滅菌した。実施例３で得た形質転換体を、ＧＤＨ生産培地中で３３℃にて振とう培養し、１６時間後５ｍｌの追添培地を添加後、培養を継続し、２４時間培養後、遠心分離（１２０００ｒｐｍ、５分間）により菌体を回収した。対照として追添培地未添加の培養も実施した。該菌体を２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁した後、超音波処理により破砕し、更に遠心分離を行い、上清液を粗酵素液として得、試験例１，２に従いＰＱＱＧＤＨ活性を測定した。測定結果を表２に示す。
【００６６】
【表２】
【００６７】
実施例４の結果において、追添培地添加により粗酵素液の全ＰＱＱＧＤＨの活性が、未添加のそれと比較して、大幅に向上しているのに対し、ホロ型ＰＱＱＧＤＨの活性向上はわずかである。この現象は、ＰＱＱＧＤＨ生産において、ＧＤＨタンパク質の生産性向上に対して、補酵素ＰＱＱの生産性が律速となっていることを表し、ＰＱＱＧＤＨ生産向上においては、補酵素ＰＱＱの生産性向上が必要であることを表す。
【００６８】
実施例５ 培地への有機溶媒添加による形質転換体のＰＱＱＧＤＨ発現量の比較
２５ｍｌのＧＤＨ生産培地（１．５％グリセロール，４％酵母エキス，１．２５％Ｋ２ＨＰＯ４，０．２３％ＫＨ２ＰＯ４，ｐＨ６．８）を５００ｍｌ坂口フラスコに分注し、１２１℃、２０分間オートクレーブを行い、培地を滅菌した。放冷後、別途無菌濾過したストレプトマイシンを１００μｇ／ｍｌになるように添加した。また別途、５ｍｌの追添培地（１６．８％グリセロール、４．８％酵母エキス）を調製し、同様に滅菌し、放冷後、０．２５ｍｌずつ検討に使用した有機溶媒を添加した。対照として有機溶媒未添加の追添培地も同時に調製し、液量補正のため０．２５ｍｌの滅菌水を添加した。実施例３で得た形質転換体を、ＧＤＨ生産培地中で３３℃にて振とう培養し、１６時間後５．２５ｍｌの追添培地を添加後、培養を継続し、２４時間培養後、遠心分離（１２０００ｒｐｍ、５分間）により菌体を回収した。該菌体を２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁した後、超音波処理により破砕し、更に遠心分離を行い、上清液を粗酵素液として得、試験例１，２に従いＰＱＱＧＤＨ活性を測定した。生産性は、単位培養液量あたりのＰＱＱＧＤＨ活性（Ｕ／ｍｌ）を培養終了時の培養液濁度（ＯＤ６６０）で割り、単位菌体量換算（Ｕ／ｍｌ／ＯＤ６６０）にて算出した。また、ホロ型ＰＱＱＧＤＨの発現量の割合は、単位液量あたりに発現したホロ型ＰＱＱＧＤＨ活性（Ｕ／ｍｌ）を全ＰＱＱＧＤＨ活性（Ｕ／ｍｌ）で割ることで算出した。なお、ＰＱＱＧＤＨ活性とＰＱＱＧＤＨタンパク量は、ＰＱＱＧＤＨタンパク量が２倍になればＰＱＱＧＤＨ活性も２倍になるというように、正の相関を持つことから、ＰＱＱＧＤＨ生産性の向上とはＰＱＱＧＤＨタンパク生産量の向上と同義である。測定結果を表３に、算出結果を表４に示す。
【００６９】
【表３】
【００７０】
【表４】
【００７１】
培地への有機溶媒、特にモノオール類、の添加により、培地追添以上のさらなるＧＤＨタンパク質の生産性向上が確認されるだけでなく、ＰＱＱ生産性の向上によると思われるホロ型ＰＱＱＧＤＨ生産性の大幅な向上が認められ、さらには有機溶媒未添加と比較したホロ型ＰＱＱＧＤＨの発現量の割合も大きく向上している。
【産業上の利用可能性】
【００７２】
本発明によれば、ＰＱＱＧＤＨ、特にホロ型ＰＱＱＧＤＨとしての生産性の向上を図ることができ、ＰＱＱＧＤＨを廉価に製造することを可能にする。また、さらにはグルコースアッセイキット及びグルコースセンサを廉価で提供することも可能にする。一方、ホロ型ＰＱＱＧＤＨの割合が向上することによりＰＱＱＧＤＨの単位タンパク質重量あたりの活性値が向上する。グルコースアッセイキット及びグルコースセンサへのタンパク質添加量の減少を可能にすることから、用途上、好ましいＰＱＱＧＤＨである。
【技術分野】
【０００１】
本発明はピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）を補酵素とするグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）（以下ＰＱＱＧＤＨとも略記する。）の製造法及びそれを用いたグルコースセンサーに関する。本発明のＰＱＱＧＤＨは、臨床検査や食品分析などにおけるグルコースの定量に有用である。
【背景技術】
【０００２】
ＰＱＱＧＤＨは、ピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）を補酵素とするグルコースデヒドロゲナーゼである。グルコースを酸化してグルコノラクトンを生成する反応を触媒するから、血糖の測定に用いることができる。血中グルコース濃度は、糖尿病の重要なマーカーとして臨床診断上きわめて重要な指標である。現在、血中グルコース濃度の測定は、グルコースオキシダーゼを使用したバイオセンサーを用いる方法が主流となっているが、反応が溶存酸素濃度に影響されるから、測定値に誤差が生じる可能性があった。このグルコースオキシダーゼにかわる新たな酵素としてＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼが注目されている。
【０００３】
我々のグループは、アシネトバクター・バウマンニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ） ＮＣＩＭＢ１１５１７株が、ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素を産生することを見出し，遺伝子のクローニングならびに発現系を構築した（特許文献１参照）。しかしながら、その生産性は工業用途としては十分とは言い難く、特に工業的観点からは、活性型であるホロ型ＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼの生産性を上げる必要性があった（特許文献１未記載内容）。
【特許文献１】特開平１１−２４３９４９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、従来技術の課題を背景になされたもので、ＰＱＱＧＤＨ、特に活性型のホロ型ＰＱＱＧＤＨの生産性向上を課題としてその改良に関するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは上記課題を解決するため、鋭意研究した結果、遂に本発明を完成するに到った。即ち本発明は、
項１．
ＰＱＱ生産能を有する宿主を用いた組換えタンパク質の生産において、培地中に有機溶媒を添加することを特徴とする組換えＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼの生産方法
項２．
ＰＱＱ生産能を有する宿主を用いた組換えタンパク質の生産において、培地中に有機溶媒を添加することでＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼのタンパク生産量が向上することを特徴とする組換えＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼの生産方法
項３．
ＰＱＱ生産能を有する宿主を用いた組換えタンパク質の生産において、培地中に有機溶媒を添加することで、ホロ型ＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼのタンパク生産量が向上することを特徴とするＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼの生産方法
項４．
ＰＱＱ生産能を有する宿主を用いた組換えタンパク質の生産において、培地中に有機溶媒を添加することで、ホロ型ＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼの全ＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼに占める割合が向上することを特徴とするＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼの生産方法
項５．
有機溶媒がモノオール類より選ばれる項１〜４いずれかに記載のＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼの生産方法
項６．
有機溶媒がメタノール、エタノール、プロパノール、ブタノールより選ばれる項１〜４いずれかに記載のＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼの生産方法
項７．
ホロ型ＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼが全ＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼの４５％以上の割合で生産されることを特徴とする項１〜６いずれかに記載の方法
項８．
ホロ型ＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼが全ＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼの７０％以上の割合で生産されることを特徴とする項１〜６いずれかに記載の方法
項９．
ＰＱＱ生産能を有する宿主を用いた組換えタンパク質の生産において、ホロ型ＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼが全ＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼの４５％以上の割合で生産されることを特徴とするＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼの生産方法
項１０．
ＰＱＱ生産能を有する宿主を用いた組換えタンパク質の生産において、ホロ型ＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼが全ＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼの７０％以上の割合で生産されることを特徴とするＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼの生産方法
項１１．
項１〜１０いずれかの方法で生産されたＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼ
項１２．
項１〜１０いずれかの方法で生産されたＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼを含むグルコースアッセイキット
項１３．
項１〜１０いずれかの方法で生産されたＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼを含むグルコースセンサー。
項１４．
項１〜１０いずれかの方法で生産されたＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼを含むグルコース測定方法。
である。
【発明の効果】
【０００６】
本発明によるＰＱＱＧＤＨ生産性の向上、特にホロ型ＰＱＱＧＤＨとしての生産性の向上は製造コストの低減をもたらす。さらに、ホロ型ＰＱＱＧＤＨの割合が向上することにより、活性型のＰＱＱＧＤＨを得るためにＰＱＱを添加しホロ化する必要性もなくなることも、製造コストの低減をもたらす。これらは、ＰＱＱＧＤＨを廉価に製造することを可能にする。また、さらにはグルコースアッセイキット及びグルコースセンサを廉価で提供することも可能にする。
【０００７】
またホロ型ＰＱＱＧＤＨの割合が向上することによりＰＱＱＧＤＨの単位タンパク質重量あたりの活性値が向上するので、グルコースアッセイキット及びグルコースセンサへのタンパク質添加量の減少も可能にする。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
以下、本発明を詳細に説明する。
【０００９】
本発明で使用するＰＱＱＧＤＨとは、ピロロキノリンキノンを補酵素として配位し、Ｄ−グルコースを酸化してＤ−グルコノ−１，５−ラクトンを生成するという反応を触媒する酵素であり、由来や構造に関しては特に限定するものではない。
なお、現時点において、ＰＱＱＧＤＨのクローニングは、アシネトバクター・カルコアセティカス（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ）ＬＭＤ７９．４１（Ａ．Ｍ．Ｃｌｅｔｏｎ−Ｊａｎｓｅｎら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７０，２１２１（１９８８）およびＭｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２１７，４３０（１９８９））、エシェリヒア・コり（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）（Ａ．Ｍ．Ｃｌｅｔｏｎ−Ｊａｎｓｅｎら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７２，６３０８（１９９０））、グルコノバクター・オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ）（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２２９，２０６（１９９１））、及び特許文献１で報告されているアシネトバクター・バウマンニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉ） ＮＣＩＭＢ１１５１７より実施されている。ただし、エシェリヒア・コリなどに存在する膜型酵素を改変して可溶型にすることは困難であり、起源としてはアシネトバクター・カルコアセティカスもしくはアシネトバクター・バウマンニなどの可溶性ＰＱＱＧＤＨを選択することが好ましい。
アシネトバクター・バウマンニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ）ＮＣＩＭＢ１１５１７株は、以前、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓに分類されていた。
【００１０】
上記のＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属由来ＰＱＱＧＤＨのアミノ酸配列は、好ましくはＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓまたはＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ由来ＰＱＱＧＤＨのアミノ酸配列である。中でも好ましくは配列番号１である。配列番号１で示される野生型ＰＱＱＧＤＨタンパク質及び配列番号２で示されるその塩基配列は、アシネトバクター・バウマンニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ）ＮＣＩＭＢ１１５１７株を起源とするものであり、特開平１１−２４３９４９号公報に開示されている。なお、上記および配列番号１において、アミノ酸の表記は、シグナル配列が除かれたアスパラギン酸を１として番号付けされている。
【００１１】
例えば、配列番号１のアミノ酸配列と、アシネトバクター・カルコアセティカス（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ）ＬＭＤ７９．４１株由来酵素のアミノ酸配列を比較すると、相違箇所はわずかで、相同性は９２．３％（シグナル配列含む）となり、非常に類似しているので、配列番号１におけるある残基が、他起源の酵素のどのアミノ酸残基に該当するかを容易に認識することができる。これらのＰＱＱＧＤＨも本発明の範囲内に含まれる。
【００１２】
グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有する限り、さらに他のアミノ酸残基の一部が欠失または置換されていてもよく、また他のアミノ酸残基が付加されていてもよい。
【００１３】
作製された改変タンパク質の遺伝情報を有するＤＮＡは、プラスミドと連結された状態にて宿主微生物中に移入され、改変タンパク質を生産する形質転換体となる。この際のプラスミドとしては、例えば、エシェリヒア・コリー（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）を宿主微生物とする場合にはｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ，ｐＵＣ１８などが使用できる。宿主微生物としては、例えば、エシェリヒア・コリー Ｗ３１１０、エシェリヒア・コリーＣ６００、エシェリヒア・コリーＪＭ１０９、エシェリヒア・コリーＤＨ５αなどが利用できる。宿主微生物に組換えベクターを移入する方法としては、例えば宿主微生物がエシェリヒア属に属する微生物の場合には、カルシウムイオンの存在下で組換えＤＮＡの移入を行なう方法などを採用することができ、更にエレクトロポレーション法を用いても良い。更には、市販のコンピテントセル（例えば、コンピテントハイＪＭ１０９；東洋紡績製）を用いても良い。
【００１４】
このような遺伝子はこれらの菌株より抽出してもよく、また化学的に合成することもできる。さらに、ＰＣＲ法の利用により、ＰＱＱＧＤＨ遺伝子を含むＤＮＡ断片を得ることも可能である。
【００１５】
本発明において、ＰＱＱＧＤＨをコードする遺伝子を得る方法としては、次のような方法が挙げられる。例えばアシネトバクター・カルコアセティカスＮＣＩＢ１１５１７ の染色体を分離、精製した後、超音波処理、制限酵素処理等を用いてＤＮＡを切断したものと、リニアーな発現ベクターと両ＤＮＡの平滑末端または付着末端においてＤＮＡリガーゼなどにより結合閉鎖させて組換えベクターを構築する。該組換えベクターを複製可能な宿主微生物に移入した後、ベクターのマーカーと酵素活性の発現を指標としてスクリーニングして、ＰＱＱを補欠分子族とするＧＤＨをコードする遺伝子を含有する組換えベクターを保持する微生物を得る。
【００１６】
次いで、上記組換えベクターを保持する微生物を培養して、該培養微生物の菌体から該組換えベクターを分離、精製し、該発現ベクターからＧＤＨをコードする遺伝子を採取することができる。例えば、遺伝子供与体であるアシネトバクター・カルコアセティカスＮＣＩＢ１１５１７ の染色体ＤＮＡは、具体的には以下のようにして採取される。
【００１７】
該遺伝子供与微生物を例えば１〜３日間攪拌培養して得られた培養液を遠心分離により集菌し、次いで、これを溶菌させることによりＰＱＱを補欠分子族とするＧＤＨ遺伝子の含有溶菌物を調製することができる。溶菌の方法としては、例えばリゾチーム等の溶菌酵素により処理が施され、必要に応じてプロテアーゼや他の酵素やラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）等の界面活性剤が併用される。さらに、凍結融解やフレンチプレス処理のような物理的破砕方法と組み合わせてもよい。
【００１８】
上記のようにして得られた溶菌物からＤＮＡを分離精製するには、常法に従って、例えばフェノール処理やプロテアーゼ処理による除蛋白処理や、リボヌクレアーゼ処理、アルコール沈殿処理などの方法を適宜組み合わせることにより行うことができる。
【００１９】
微生物から分離、精製されたＤＮＡを切断する方法は、例えば超音波処理、制限酵素処理などにより行うことができる。好ましくは特定のヌクレオチド配列に作用するＩＩ型制限酵素が適している。
【００２０】
クローニングする際のベクターとしては、宿主微生物内で自律的に増殖し得るファージまたはプラスミドから遺伝子組換え用として構築されたものが適している。ファージとしては、例えばエシェリヒア・コリを宿主微生物とする場合にはＬａｍｂｄａ ｇｔ１０ 、Ｌａｍｂｄａ ｇｔ１１ などが例示される。また、プラスミドとしては、例えば、エシェリヒア・コリを宿主微生物とする場合には、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９ 、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ などが例示される。
【００２１】
クローニングの際、上記のようなベクターを、上述したＧＤＨをコードする遺伝子供与体である微生物ＤＮＡの切断に使用した制限酵素で切断してベクター断片を得ることができるが、必ずしも該微生物ＤＮＡの切断に使用した制限酵素と同一の制限酵素を用いる必要はない。微生物ＤＮＡ断片とベクターＤＮＡ断片とを結合させる方法は、公知のＤＮＡリガーゼを用いる方法であればよく、例えば微生物ＤＮＡ断片の付着末端とベクター断片の付着末端とのアニーリングの後、適当なＤＮＡリガーゼの使用により微生物ＤＮＡ断片とベクターＤＮＡ断片との組換えベクターを作成する。必要に応じて、アニーリングの後、宿主微生物に移入して生体内のＤＮＡリガーゼを利用し組換えベクターを作製することもできる。
【００２２】
クローニングに使用する宿主微生物としては、組換えベクターが安定であり、かつ自律増殖可能で外来性遺伝子の形質発現できるものであれば特に制限されない。一般的には、エシェリヒア・コリＷ３１１０ 、エシェリヒア・コリＣ６００、エシェリヒア・コリＨＢ１０１ 、エシェリヒア・コリＪＭ１０９ 、エシェリヒア・コリＤＨ５ αなどを用いることができる。
【００２３】
宿主微生物に組換えベクターを移入する方法としては、例えば宿主微生物がエシェリヒア・コリの場合には、カルシウム処理によるコンピテントセル法やエレクトロポーレーション法などを用いることができる。
【００２４】
上記のように得られた形質転換体である微生物は、栄養培地で培養されることにより、多量のＧＤＨを安定に生産し得る。宿主微生物への目的組換えベクターの移入の有無についての選択は、目的とするＤＮＡを保持するベクターの薬剤耐性マーカーとＰＱＱの添加によりＧＤＨ活性を同時に発現する微生物を検索すればよい。例えば、薬剤耐性マーカーに基づく選択培地で生育し、かつＧＤＨを生成する微生物を選択すればよい。
【００２５】
上記の方法により得られたＰＱＱを補欠分子族とするＧＤＨ遺伝子の塩基配列は、Ｓｃｉｅｎｃｅ ，第２１４巻，１２０５（１９８１）に記載されたジデオキシ法により解読した。また、ＧＤＨのアミノ酸配列は上記のように決定された塩基配列より推定した。
【００２６】
上記のようにして、一度選択されたＰＱＱを補欠分子族とするＧＤＨ遺伝子を保有する組換えベクターより、ＰＱＱ生産能を有する微生物にて複製できる組換えベクターへの移入は、ＧＤＨ遺伝子を保持する組換えベクターから制限酵素やＰＣＲ法によりＧＤＨ遺伝子であるＤＮＡを回収し、他のベクター断片と結合させることにより容易に実施できる。また、これらのベクターによるＰＱＱ生産能を有する微生物の形質転換は、カルシウム処理によるコンピテントセル法やエレクトロポーレーション法などを用いることができる。
【００２７】
ＰＱＱ生産能を有する微生物としては、メチロバクテリウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属等のメタノール資化性細菌、アセトバクター（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ）属やグルコノバクター（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ）属の酢酸菌、フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、シュードモナス属、アシネトバクター属等の細菌を挙げることができる。なかでも、シュードモナス属細菌とアシネトバクター属細菌が利用できる宿主−ベクター系が確立されており利用しやすいので好ましい。
【００２８】
シュードモナス属細菌では、シュードモナス・エルギノサ、シュードモナス・フルオレッセンス、シュードモナス・プチダなどを用いることができる。また、アシネトバクター属細菌ではアシネトバクター・カルコアセティカス、アシネトバクター・バウマンニ等を用いることができる。
【００２９】
上記微生物にて複製できる組換えベクターとしては、ＲＳＦ１０１０ 由来のベクターもしくはとその類似のレプリコンを有するベクターがシュードモナス属細菌に利用可能である。例えば、ｐＫＴ２４０、ｐＭＭＢ２４等（Ｍ．Ｍ．Ｂａｇｄａｓａｒｉａｎ ら，Ｇｅｎｅ，２６，２７３（１９８３））、ｐＣＮ４０ 、ｐＣＮ６０ 等（Ｃ．Ｃ．Ｎｉｅｔｏ ら，Ｇｅｎｅ，８７，１４５（１９９０））やｐＴＳ１１３７（遺伝子組換え実用化技術技術，第４集，ｐ７３から８５，昭和５８年，（株）サイレンスフォーラム発行）等を挙げることができる。また、ｐＭＥ２９０等（Ｙ．Ｉｔｏｈら、Ｇｅｎｅ，３６，２７（１９８５））、ｐＮＩ１１１、ｐＮＩ２０Ｃ（Ｎ．Ｉｔｏｈら，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１０，６１４（１９９１））も利用できる。
【００３０】
アシネトバクター属細菌では、ｐＷＭ４３ 等（Ｗ．Ｍｉｎａｓ ら，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ，５９，２８０７（１９９３））、ｐＫＴ２３０、ｐＷＨ１２６６ 等（Ｍ．Ｈｕｎｇｅｒら，Ｇｅｎｅ，８７，４５（１９９０））がベクターとして利用可能である。
【００３１】
こうして得られた形質転換体である微生物は、栄養培地で培養されることにより、ＰＱＱＧＤＨタンパク質を生産し得るが、培地中に有機溶媒を添加することにより、全ＰＱＱＧＤＨタンパク質としての生産性向上及びホロ型ＰＱＱＧＤＨタンパク質としての生産性向上、いずれも可能になる。形質転換体である宿主微生物の培養形態は、宿主の栄養生理的性質を考慮して培養条件を選択すればよく、多くの場合は液体培養で行う。工業的には通気攪拌培養を行うのが有利である。
【００３２】
本発明においてホロ型ＰＱＱＧＤＨとはＧＤＨタンパク質に補酵素ＰＱＱが結合したＰＱＱＧＤＨ酵素自身及びその状態をさし、ＰＱＱの添加なしでＧＤＨ活性を有する酵素及びその状態である。一方、全ＰＱＱＧＤＨとは、ホロ型ＰＱＱＧＤＨ及びＧＤＨタンパク質に補酵素ＰＱＱが結合していないアポ型ＰＱＱＧＤＨをあわせた全ＧＤＨ酵素タンパク質及びその状態をさす。
【００３３】
培地の栄養源としては，微生物の培養に通常用いられるものが広く使用され得る。炭素源としては資化可能な炭素化合物であればよく、例えば、グルコース、シュークロース、ラクトース、マルトース、ラクトース、糖蜜、ピルビン酸などが使用される。また、窒素源としては利用可能な窒素化合物であればよく、例えば、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分解物、大豆粕アルカリ抽出物などが使用される。その他、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガン、亜鉛などの塩類、特定のアミノ酸、特定のビタミンなどが必要に応じて使用される。
【００３４】
有機溶媒の種類及び添加量を特に限定するものではないが、望ましくはモノオール類であり、さらに望ましくはメタノール、エタノール、２−プロパノールである。一方添加量は、望ましくは培地に対して体積比で０．１〜５％、より望ましくは０．５〜２％の範囲である。
【００３５】
本発明においてモノオール類とは、分子内に１分子の水酸基を有するアルコール類の総称であり、具体的には１級アルコールであるメタノール、エタノールや２級アルコールである２−プロパノールなどがある。分子内に２分子の水酸基を有するジオール類以上とは明確に区別される。
【００３６】
培養温度は菌が成育し、ＰＱＱＧＤＨを生産する範囲で適宜変更し得るが、上記のようなＰＱＱ生産能を有する微生物の場合、好ましくは２０〜４２℃、より好ましくは３０〜３７℃程度である。培養時間は条件によって多少異なるが、ＰＱＱＧＤＨが最高収量に達する時期を見計らって適当時期に培養を完了すればよく、通常は６〜４８時間、好ましくは１６〜３６時間程度である。培地のｐＨは菌が発育し、ＰＱＱＧＤＨを生産する範囲で適宜変更し得るが、好ましくはｐＨ６．０〜９．０程度、より好ましくはｐＨ６．５〜８．０の範囲である。
【００３７】
培養物中のＰＱＱＧＤＨを生産する菌体を含む培養液をそのまま採取し、利用することもできるが、一般には、常法に従って、ＰＱＱＧＤＨが培養液中に存在する場合はろ過、遠心分離などにより、ＰＱＱＧＤＨ含有溶液と微生物菌体とを分離した後に利用される。ＰＱＱＧＤＨが菌体内に存在する場合には、得られた培養物からろ過または遠心分離などの手段により菌体を採取し、次いで、この菌体を機械的方法またはリゾチームなどの酵素的方法で破壊し、また、必要に応じて、ＥＤＴＡ等のキレート剤及び界面活性剤を添加してＧＤＨを可溶化し、水溶液として分離採取する。
【００３８】
上記のようにして得られたＰＱＱＧＤＨ含有溶液を、例えば減圧濃縮、膜濃縮、さらに硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウムなどの塩析処理、あるいは親水性有機溶媒、例えばメタノール、エタノール、アセトンなどによる分別沈殿法により沈殿せしめればよい。また、加熱処理や等電点処理も有効な精製手段である。その後、吸着剤あるいはゲルろ過剤などによるゲルろ過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィーを行うことにより、精製されたＰＱＱＧＤＨを得ることができる。
【００３９】
例えば、セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）ゲル（ファルマシアバイオテク）などによるゲルろ過、ＤＥＡＥセファロースＣＬ−６Ｂ （ファルマシアバイオテク）、オクチルセファロースＣＬ−６Ｂ （ファルマシアバイオテク）等のカラムクロマトグラフィーにより分離、精製し、精製酵素標品を得ることができる。該精製酵素標品は、電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）的に単一のバンドを示す程度に純化されていることが好ましい。
【００４０】
上記のようにして得られた精製酵素を、例えば凍結乾燥、真空乾燥やスプレードライなどにより粉末化して流通させることが可能である。その際、精製酵素はリン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液やＧＯＯＤの緩衝液に溶解しているものを用いることができる。好適なものはＧＯＯＤの緩衝液であり、なかでも、ＰＩＰＥＳ、ＭＥＳもしくはＭＯＰＳ緩衝液が特に好ましい。また、カルシウムイオンまたはその塩、およびグルタミン酸、グルタミン、リジン等のアミノ酸類、さらに血清アルブミン等を添加することによりＰＱＱＧＤＨをより安定化することができる。
【００４１】
ＰＱＱＧＤＨタンパク質は、液状（水溶液、懸濁液等）、粉末、凍結乾燥など種々の形態をとることができる。凍結乾燥法としては、特に制限されるものではなく常法に従って行えばよい。本発明の酵素を含む組成物は凍結乾燥物に限られず、凍結乾燥物を再溶解した溶液状態であってもよい。また、グルコース測定を行なう際には、グルコースアッセイキット、グルコースセンサーなどの種々の形態をとることができる。この様にして得られた精製された改変タンパク質は、以下のような方法により安定化することができる。
【００４２】
精製された改変タンパク質に（１）アスパラギン酸、グルタミン酸、α−ケトグルタル酸、リンゴ酸、α−ケトグルコン酸、α−サイクロデキストリンおよびそれらの塩からなる群から選ばれた１種または２種以上の化合物および（２）アルブミンを共存せしめることにより、改変タンパク質をさらに安定化することができる。
【００４３】
凍結乾燥組成物中においては、ＰＱＱＧＤＨ含有量は、酵素の起源によっても異なるが、通常は約５〜５０％（重量比）の範囲で好適に用いられる。酵素活性に換算すると、１００〜２０００Ｕ／ｍｇの範囲で好適に用いられる。
【００４４】
アスパラギン酸、グルタミン酸、αーケトグルタル酸、リンゴ酸、及びαーケトグルコン酸の塩としては、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、及びマグネシウム等の塩が挙げられるが特に限定されるものではない。上記化合物とその塩及びα−シクロデキストリンの添加量は、１〜９０％（重量比）の範囲で添加することが好ましい。これらの物質は単独で用いてもよいし、複数組み合わせてもよい。
【００４５】
含有される緩衝液としては特に限定されるものではないが、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、ＧＯＯＤ緩衝液などが挙げられる。該緩衝液のｐＨは５．０〜９．０程度の範囲で使用目的に応じて調整される。凍結乾燥物中においては緩衝剤の含有量は、特に限定されるものではないが、好ましくは０．１％（重量比）以上、特に好ましくは０．１〜３０％（重量比）の範囲で使用される。
【００４６】
使用できるアルブミンとしては、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、卵白アルブミン（ＯＶＡ）などが挙げられる。特にＢＳＡが好ましい。該アルブミンの含有量は、好ましくは１〜８０％（重量比）、より好ましくは５〜７０％（重量比）の範囲で使用される。
【００４７】
組成物には、さらに他の安定化剤などをＰＱＱＧＤＨの反応に特に悪い影響を及ぼさないような範囲で添加してもよい。本発明の安定化剤の配合法は特に制限されるものではない。例えばＰＱＱＧＤＨを含む緩衝液に安定化剤を配合する方法、安定化剤を含む緩衝液にＰＱＱＧＤＨを配合する方法、あるいはＰＱＱＧＤＨと安定化剤を緩衝液に同時に配合する方法などが挙げられる。
【００４８】
また、カルシウムイオンを添加しても安定化効果が得られる。すなわち、カルシウムイオンまたはカルシウム塩を含有させることにより、改変タンパク質を安定化させることができる。カルシウム塩としては、塩化カルシウムまたは酢酸カルシウムもしくはクエン酸カルシウム等の無機酸または有機酸のカルシウム塩などが例示される。また、水性組成物において、カルシウムイオンの含有量は、１×１０−４〜１×１０−２Ｍであることが好ましい。
【００４９】
カルシウムイオンまたはカルシウム塩を含有させることによる安定化効果は、グルタミン酸、グルタミンおよびリジンからなる群から選択されたアミノ酸を含有させることにより、さらに向上する。
【００５０】
グルタミン酸、グルタミンおよびリジンからなる群から選択されるアミノ酸は、１種または２種以上であってもよい。前記の水性組成物において、グルタミン酸、グルタミンおよびリジンからなる群から選択されたアミノ酸の含有量は、０．０１〜０．２重量％であることが好ましい。
【００５１】
さらに血清アルブミンを含有させてもよい。前記の水性組成物に血清アルブミンを添加する場合、その含有量は０．０５〜０．５重量％であることが好ましい。
【００５２】
緩衝剤としては、通常のものが使用され、通常、組成物のｐＨを５〜１０とするものが好ましい。具体的にはトリス塩酸、ホウ酸、グッド緩衝液が用いられるが、カルシウムと不溶性の塩を形成しない緩衝液はすべて使用できる。
【００５３】
前記の水性組成物には、必要により他の成分、例えば界面活性剤、安定化剤、賦形剤などを添加しても良い。
【００５４】
本発明においては以下の種々の方法によりグルコースを測定することができる。
グルコースアッセイキット
本発明はまた、本発明に従うＰＱＱＧＤＨを含むグルコースアッセイキットを特徴とする。本発明のグルコースアッセイキットは、本発明に従うＰＱＱＧＤＨを少なくとも１回のアッセイに十分な量で含む。典型的には、キットは、本発明のＰＱＱＧＤＨに加えて、アッセイに必要な緩衝液、メディエーター、キャリブレーションカーブ作製のためのグルコース標準溶液、ならびに使用の指針を含む。本発明に従うＰＱＱＧＤＨは種々の形態で、例えば、凍結乾燥された試薬として、または適切な保存溶液中の溶液として提供することができる。好ましくは本発明のＰＱＱＧＤＨはホロ化した形態で提供されるが、アポ酵素の形態で提供し、使用時にホロ化することもできる。
【００５５】
グルコースセンサー
本発明はまた、本発明に従うＰＱＱＧＤＨを用いるグルコースセンサーを特徴とする。電極としては、カーボン電極、金電極、白金電極などを用い、この電極上に本発明の酵素を固定化する。固定化方法としては、架橋試薬を用いる方法、高分子マトリックス中に封入する方法、透析膜で被覆する方法、光架橋性ポリマー、導電性ポリマー、酸化還元ポリマーなどがあり、あるいはフェロセンあるいはその誘導体に代表される電子メディエーターとともにポリマー中に固定あるいは電極上に吸着固定してもよく、またこれらを組み合わせて用いてもよい。好ましくは本発明のＰＱＱＧＤＨはホロ化した形態で電極上に固定化するが、アポ酵素の形態で固定化し、ＰＱＱを別の層としてまたは溶液中で提供することもできる。典型的には、グルタルアルデヒドを用いて本発明のＰＱＱＧＤＨをカーボン電極上に固定化した後、アミン基を有する試薬で処理してグルタルアルデヒドをブロッキングする。
【００５６】
グルコース濃度の測定は、以下のようにして行うことができる。恒温セルに緩衝液を入れ、ＰＱＱおよびＣａＣｌ２、およびメディエーターを加えて一定温度に維持する。メディエーターとしては、フェリシアン化カリウム、フェナジンメトサルフェートなどを用いることができる。作用電極として本発明のＰＱＱＧＤＨを固定化した電極を用い、対極（例えば白金電極）および参照電極（例えばＡｇ／ＡｇＣｌ電極）を用いる。カーボン電極に一定の電圧を印加して、電流が定常になった後、グルコースを含む試料を加えて電流の増加を測定する。標準濃度のグルコース溶液により作製したキャリブレーションカーブに従い、試料中のグルコース濃度を計算することができる。
【００５７】
なお、有機溶媒を添加した培地中でＰＱＱ生産能を有する微生物を培養することにより、ＰＱＱやＰＱＱを補酵素とする酵素を生産した例としては、特許文献２や非特許文献１が挙げられる。特許文献２では、ＰＱＱ生産能が確認されているメタノール資化性菌を、メタノールを主炭素源とする培地中で培養することによりＰＱＱが培養液中に蓄積する内容が記載されている。また、非特許文献１では、種々のＰＱＱ生産能を有する微生物を、有機溶媒等を炭素源として培養したところ、いくつかの微生物で、メタノール等を添加することにより、その炭素源を基質としＰＱＱを補酵素とするメタノール脱水素酵素やアルコール脱水素酵素の生産性が確認されたとの内容が記載されている。
しかしながら、これらの例では、メタノール等の有機溶媒を炭素源として用いて培養した時に、ＰＱＱの生産や、その有機溶媒を基質として用いる酵素の生産が確認されたことを述べているにすぎない。非特許文献１に記載されているように、メタノール等はそれを基質とする酵素やＰＱＱの生産に必須というわけではない（有機溶媒非存在でも、酵素やＰＱＱは存在しうる）。またこれまでに、有機溶媒を培地中に添加することで、それを基質としＰＱＱを補酵素とする酵素の生産性が向上したという直接の報告もない。ましてや、有機溶媒を培地中に添加することで、基質でもなく代謝系も異なるグルコース脱水素酵素の生産性が向上したという報告などなく、さらにそのグルコース脱水素酵素が遺伝子組換えにより外部から導入された場合において、有機溶媒を培地中に添加することで、基質でもなく代謝系も異なるグルコース脱水素酵素の生産性が向上したという報告などない。
この意味から、今回、ＰＱＱ生産能を有する宿主を用いた組換え生産を行うにあたり、有機溶媒を添加した培地中で培養することで、基質として有機溶媒は無関係であるグルコース脱水素酵素の生産性が向上したことは驚くべきことであった。また、仮に培地中への有機溶媒添加により宿主のＰＱＱの生産性が向上するようなことがあるとしても、同時に有機溶媒を基質とする宿主のＰＱＱ依存性酵素（例えばメタノールの場合メタノール脱水素酵素）も向上するであろうから、グルコース脱水素酵素の生産性向上と併せて、結果として宿主中のＰＱＱは不足しがちになると考えていただけに、グルコース脱水素酵素のタンパク質量としの生産性が向上しただけでなく、ホロ型としての割合も向上していたことは全くの予想外の出来事であった。
【特許文献２】特公平５−１００７７
【非特許文献１】ＡＰＰＬＩＥＤ ＡＮＤ ＥＮＶＩＲＯＮＭＥＮＴＡＬ ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ，Ｍａｙ １９８９，ｐ１２０９−１２１３
【実施例】
【００５８】
以下、本発明を実施例に基づきより詳細に説明する。
実施例１ ：ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素遺伝子の発現プラスミドの構築
野生型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素の発現プラスミドｐＮＰＧ５は、ベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（−）のマルチクローニング部位にアシネトバクター・バウマンニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ） ＮＣＩＭＢ１１５１７株由来のＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする構造遺伝子を挿入したものである。その塩基配列を配列表の配列番号２に、また該塩基配列から推定されるＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素のアミノ酸配列を配列表の配列番号１に示す。
【００５９】
実施例２：シュードモナス属細菌で複製できる発現ベクターの構築
実施例１で得た組換えプラスミドｐＮＰＧ５のＤＮＡ５μｇを制限酵素ＢａｍＨＩおよびＸＨｏＩ（東洋紡績製）で切断して、ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素の構造遺伝子部分を単離した。単離したＤＮＡとＢａｍＨＩおよびＸＨｏＩで切断したｐＴＳ１１３７（１μｇ）とをＴ４ＤＮＡリガーゼ１単位で１６℃、１６時間反応させ、ＤＮＡを連結した。連結したＤＮＡはエシェリヒア・コリＤＨ５αのコンピテントセルを用いて形質転換を行った。得られた発現プラスミドをｐＮＰＧ６と命名した。
【００６０】
実施例３：シュードモナス属細菌の形質転換体の作製
シュードモナス・プチダＴＥ３４９３（微工研寄１２２９８号）をＬＢＧ培地（ＬＢ培地＋０．３％グリセロール）で３０℃、１６時間培養し、遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、１０分間）により菌体を回収し、この菌体に氷冷した３００ｍＭシュークロースを含む５ｍＭＫ−リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）８ｍｌを加え、菌体を懸濁した。再度遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、１０分間）により菌体を回収し、この菌体に氷冷した３００ｍＭシュークロースを含む５ｍＭＫ−リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）０．４ｍｌを加え、菌体を懸濁した。
該懸濁液に実施例２で得た発現プラスミドｐＮＰＧ６を０．５μｇ加え、エレクトロポレーション法により形質転換した。１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含むＬＢ寒天培地に生育したコロニーより、目的とする形質転換体を得た。
【００６１】
試験例１
ホロ型ＰＱＱＧＤＨの活性測定方法
測定原理
Ｄ−グルコース＋ＰＭＳ＋ＰＱＱＧＤＨ → Ｄ−グルコノ−１，５−ラクトン ＋ ＰＭＳ（ｒｅｄ）
２ＰＭＳ（ｒｅｄ） ＋ ＮＴＢ → ２ＰＭＳ ＋ ジホルマザン
フェナジンメトサルフェート（ＰＭＳ）（ｒｅｄ）によるニトロテトラゾリウムブルー（ＮＴＢ）の還元により形成されたジホルマザンの存在は、５７０ｎｍで分光光度法により測定した。
単位の定義
１単位は、以下に記載の条件下で１分当たりジホルマザンを０．５ミリモル形成させるＰＱＱＧＤＨの酵素量をいう。
（３）方法
試薬
Ａ．Ｄ−グルコース溶液：０．５Ｍ（０．９ｇ Ｄ−グルコース（分子量１８０．１６）／１０ｍｌ Ｈ２Ｏ）
Ｂ．ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液， ｐＨ６．５：５０ｍＭ（６０ｍＬの水中に懸濁した１．５１ｇのＰＩＰＥＳ（分子量３０２．３６）を、５Ｎ ＮａＯＨに溶解し、２．２ｍｌの１０％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を加える。５Ｎ ＮａＯＨを用いて２５℃でｐＨを６．５±０．０５に調整し、水を加えて１００ｍｌとした。）
Ｃ．ＰＭＳ溶液：３．０ｍＭ（９．１９ｍｇのフェナジンメトサルフェート（分子量８１７．６５）／１０ｍｌＨ２Ｏ）
Ｄ．ＮＴＢ溶液：６．６ｍＭ（５３．９６ｍｇのニトロテトラゾリウムブルー（分子量８１７．６５）／１０ｍｌＨ２Ｏ）
Ｅ．酵素希釈液：１ｍＭ ＣａＣｌ２， ０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００， ０．１％ ＢＳＡを含む５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６．５）
手順
遮光ビンに以下の反応混合物を調製し、氷上で貯蔵した（用時調製）
１．８ｍｌ Ｄ−グルコース溶液 （Ａ）
２４．６ｍｌ ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６．５） （Ｂ）
２．０ｍｌ ＰＭＳ溶液 （Ｃ）
１．０ｍｌ ＮＴＢ溶液 （Ｄ）
【００６２】
【表１】
【００６３】
３．０ｍｌの反応混合液を試験管（プラスチック製）に入れ、３７℃で５分間予備加温した。
０．１ｍｌの酵素溶液を加え、穏やかに反転して混合した。
５７０ｎｍでの水に対する吸光度の増加を３７℃に維持しながら分光光度計で４〜５分間記録し、曲線の初期直線部分からの１分当たりのΔＯＤを計算した（ＯＤテスト）。
同時に、酵素溶液に代えて酵素希釈液（Ｅ）加えることを除いては同一の方法を繰り返し、ブランク（ΔＯＤブランク）を測定した。
アッセイの直前に氷冷した酵素希釈液（Ｅ）で酵素粉末を溶解し、同一の緩衝液で０．１−０．８Ｕ／ｍｌに希釈した（該酵素の接着性のためにプラスチックチューブの使用が好ましい）。
計算
活性を以下の式を用いて計算する：
Ｕ／ｍｌ＝｛ΔＯＤ／ｍｉｎ（ΔＯＤテスト− ΔＯＤブランク）×Ｖｔ×ｄｆ｝／（２０．１×１．０×Ｖｓ）
Ｕ／ｍｇ＝（Ｕ／ｍｌ）×１／Ｃ
Ｖｔ：総体積（３．１ｍｌ）
Ｖｓ：サンプル体積（１．０ｍｌ）
２０．１：ジホルマザンの１／２ミリモル分子吸光係数
１．０：光路長（ｃｍ）
ｄｆ：希釈係数
Ｃ：溶液中の酵素濃度（ｃ ｍｇ／ｍｌ）
【００６４】
試験例２
全ＰＱＱＧＤＨの活性測定方法
試験例１において、酵素希釈液（Ｅ）の代わりに酵素希釈液（Ｆ）：１ｍＭ ＣａＣｌ２， ０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００， ０．１％ ＢＳＡ，１μＭ ＰＱＱを含む５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６．５）を用いて酵素を希釈後、同様に測定を実施した。
【００６５】
実施例４ ＰＱＱＧＤＨ発現においてＰＱＱ生産性が律速となっていることの確認
２５ｍｌのＧＤＨ生産培地（１．５％グリセロール，４％酵母エキス，１．２５％Ｋ２ＨＰＯ４，０．２３％ＫＨ２ＰＯ４，ｐＨ６．８）を５００ｍｌ坂口フラスコに分注し、１２１℃、２０分間オートクレーブを行い、培地を滅菌した。放冷後、別途無菌濾過したストレプトマイシンを１００μｇ／ｍｌになるように添加した。また別途、５ｍｌの追添培地（１６．８％グリセロール、４．８％酵母エキス）を調製し、同様に滅菌した。実施例３で得た形質転換体を、ＧＤＨ生産培地中で３３℃にて振とう培養し、１６時間後５ｍｌの追添培地を添加後、培養を継続し、２４時間培養後、遠心分離（１２０００ｒｐｍ、５分間）により菌体を回収した。対照として追添培地未添加の培養も実施した。該菌体を２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁した後、超音波処理により破砕し、更に遠心分離を行い、上清液を粗酵素液として得、試験例１，２に従いＰＱＱＧＤＨ活性を測定した。測定結果を表２に示す。
【００６６】
【表２】
【００６７】
実施例４の結果において、追添培地添加により粗酵素液の全ＰＱＱＧＤＨの活性が、未添加のそれと比較して、大幅に向上しているのに対し、ホロ型ＰＱＱＧＤＨの活性向上はわずかである。この現象は、ＰＱＱＧＤＨ生産において、ＧＤＨタンパク質の生産性向上に対して、補酵素ＰＱＱの生産性が律速となっていることを表し、ＰＱＱＧＤＨ生産向上においては、補酵素ＰＱＱの生産性向上が必要であることを表す。
【００６８】
実施例５ 培地への有機溶媒添加による形質転換体のＰＱＱＧＤＨ発現量の比較
２５ｍｌのＧＤＨ生産培地（１．５％グリセロール，４％酵母エキス，１．２５％Ｋ２ＨＰＯ４，０．２３％ＫＨ２ＰＯ４，ｐＨ６．８）を５００ｍｌ坂口フラスコに分注し、１２１℃、２０分間オートクレーブを行い、培地を滅菌した。放冷後、別途無菌濾過したストレプトマイシンを１００μｇ／ｍｌになるように添加した。また別途、５ｍｌの追添培地（１６．８％グリセロール、４．８％酵母エキス）を調製し、同様に滅菌し、放冷後、０．２５ｍｌずつ検討に使用した有機溶媒を添加した。対照として有機溶媒未添加の追添培地も同時に調製し、液量補正のため０．２５ｍｌの滅菌水を添加した。実施例３で得た形質転換体を、ＧＤＨ生産培地中で３３℃にて振とう培養し、１６時間後５．２５ｍｌの追添培地を添加後、培養を継続し、２４時間培養後、遠心分離（１２０００ｒｐｍ、５分間）により菌体を回収した。該菌体を２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁した後、超音波処理により破砕し、更に遠心分離を行い、上清液を粗酵素液として得、試験例１，２に従いＰＱＱＧＤＨ活性を測定した。生産性は、単位培養液量あたりのＰＱＱＧＤＨ活性（Ｕ／ｍｌ）を培養終了時の培養液濁度（ＯＤ６６０）で割り、単位菌体量換算（Ｕ／ｍｌ／ＯＤ６６０）にて算出した。また、ホロ型ＰＱＱＧＤＨの発現量の割合は、単位液量あたりに発現したホロ型ＰＱＱＧＤＨ活性（Ｕ／ｍｌ）を全ＰＱＱＧＤＨ活性（Ｕ／ｍｌ）で割ることで算出した。なお、ＰＱＱＧＤＨ活性とＰＱＱＧＤＨタンパク量は、ＰＱＱＧＤＨタンパク量が２倍になればＰＱＱＧＤＨ活性も２倍になるというように、正の相関を持つことから、ＰＱＱＧＤＨ生産性の向上とはＰＱＱＧＤＨタンパク生産量の向上と同義である。測定結果を表３に、算出結果を表４に示す。
【００６９】
【表３】
【００７０】
【表４】
【００７１】
培地への有機溶媒、特にモノオール類、の添加により、培地追添以上のさらなるＧＤＨタンパク質の生産性向上が確認されるだけでなく、ＰＱＱ生産性の向上によると思われるホロ型ＰＱＱＧＤＨ生産性の大幅な向上が認められ、さらには有機溶媒未添加と比較したホロ型ＰＱＱＧＤＨの発現量の割合も大きく向上している。
【産業上の利用可能性】
【００７２】
本発明によれば、ＰＱＱＧＤＨ、特にホロ型ＰＱＱＧＤＨとしての生産性の向上を図ることができ、ＰＱＱＧＤＨを廉価に製造することを可能にする。また、さらにはグルコースアッセイキット及びグルコースセンサを廉価で提供することも可能にする。一方、ホロ型ＰＱＱＧＤＨの割合が向上することによりＰＱＱＧＤＨの単位タンパク質重量あたりの活性値が向上する。グルコースアッセイキット及びグルコースセンサへのタンパク質添加量の減少を可能にすることから、用途上、好ましいＰＱＱＧＤＨである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰＱＱ生産能を有する宿主を用いた組換えタンパク質の生産において、培地中に有機溶媒を添加することを特徴とする組換えＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼの生産方法
【請求項２】
ＰＱＱ生産能を有する宿主を用いた組換えタンパク質の生産において、培地中に有機溶媒を添加することでＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼのタンパク生産量が向上することを特徴とする組換えＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼの生産方法
【請求項３】
ＰＱＱ生産能を有する宿主を用いた組換えタンパク質の生産において、培地中に有機溶媒を添加することで、ホロ型ＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼのタンパク生産量が向上することを特徴とするＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼの生産方法
【請求項４】
ＰＱＱ生産能を有する宿主を用いた組換えタンパク質の生産において、培地中に有機溶媒を添加することで、ホロ型ＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼの全ＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼに占める割合が向上することを特徴とするＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼの生産方法
【請求項５】
有機溶媒がモノオール類より選ばれる請求項１〜４いずれかに記載のＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼの生産方法
【請求項６】
有機溶媒がメタノール、エタノール、プロパノール、ブタノールより選ばれる請求項１〜４いずれかに記載のＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼの生産方法
【請求項７】
ホロ型ＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼが全ＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼの４５％以上の割合で生産されることを特徴とする請求項１〜６いずれかに記載の方法
【請求項８】
ホロ型ＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼが全ＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼの７０％以上の割合で生産されることを特徴とする請求項１〜６いずれかに記載の方法
【請求項９】
ＰＱＱ生産能を有する宿主を用いた組換えタンパク質の生産において、ホロ型ＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼが全ＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼの４５％以上の割合で生産されることを特徴とするＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼの生産方法
【請求項１０】
ＰＱＱ生産能を有する宿主を用いた組換えタンパク質の生産において、ホロ型ＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼが全ＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼの７０％以上の割合で生産されることを特徴とするＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼの生産方法
【請求項１１】
請求項１〜１０いずれかの方法で生産されたＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼ
【請求項１２】
請求項１〜１０いずれかの方法で生産されたＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼを含むグルコースアッセイキット
【請求項１３】
請求項１〜１０いずれかの方法で生産されたＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼを含むグルコースセンサー。
【請求項１４】
請求項１〜１０いずれかの方法で生産されたＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼを含むグルコース測定方法。
【請求項１】
ＰＱＱ生産能を有する宿主を用いた組換えタンパク質の生産において、培地中に有機溶媒を添加することを特徴とする組換えＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼの生産方法
【請求項２】
ＰＱＱ生産能を有する宿主を用いた組換えタンパク質の生産において、培地中に有機溶媒を添加することでＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼのタンパク生産量が向上することを特徴とする組換えＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼの生産方法
【請求項３】
ＰＱＱ生産能を有する宿主を用いた組換えタンパク質の生産において、培地中に有機溶媒を添加することで、ホロ型ＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼのタンパク生産量が向上することを特徴とするＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼの生産方法
【請求項４】
ＰＱＱ生産能を有する宿主を用いた組換えタンパク質の生産において、培地中に有機溶媒を添加することで、ホロ型ＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼの全ＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼに占める割合が向上することを特徴とするＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼの生産方法
【請求項５】
有機溶媒がモノオール類より選ばれる請求項１〜４いずれかに記載のＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼの生産方法
【請求項６】
有機溶媒がメタノール、エタノール、プロパノール、ブタノールより選ばれる請求項１〜４いずれかに記載のＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼの生産方法
【請求項７】
ホロ型ＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼが全ＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼの４５％以上の割合で生産されることを特徴とする請求項１〜６いずれかに記載の方法
【請求項８】
ホロ型ＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼが全ＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼの７０％以上の割合で生産されることを特徴とする請求項１〜６いずれかに記載の方法
【請求項９】
ＰＱＱ生産能を有する宿主を用いた組換えタンパク質の生産において、ホロ型ＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼが全ＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼの４５％以上の割合で生産されることを特徴とするＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼの生産方法
【請求項１０】
ＰＱＱ生産能を有する宿主を用いた組換えタンパク質の生産において、ホロ型ＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼが全ＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼの７０％以上の割合で生産されることを特徴とするＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼの生産方法
【請求項１１】
請求項１〜１０いずれかの方法で生産されたＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼ
【請求項１２】
請求項１〜１０いずれかの方法で生産されたＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼを含むグルコースアッセイキット
【請求項１３】
請求項１〜１０いずれかの方法で生産されたＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼを含むグルコースセンサー。
【請求項１４】
請求項１〜１０いずれかの方法で生産されたＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼを含むグルコース測定方法。
【公開番号】特開２００６−３４１６５（Ｐ２００６−３４１６５Ａ）
【公開日】平成１８年２月９日（２００６．２．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−２１８４６８（Ｐ２００４−２１８４６８）
【出願日】平成１６年７月２７日（２００４．７．２７）
【出願人】（０００００３１６０）東洋紡績株式会社 (3,622)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年２月９日（２００６．２．９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年７月２７日（２００４．７．２７）
【出願人】（０００００３１６０）東洋紡績株式会社 (3,622)
【Ｆターム（参考）】
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