ＲＮＡの分析方法
【課題】固定液により固定された組織から抽出したＲＮＡの分析方法を確立することを課題とする。
【解決手段】表面に凹部及び凸部からなる凹凸部を有し、該凸部の上端面に選択結合性物質が固定化されてなる基板と、該基板と接着されたカバー部材とを備え、該基板と該カバー部材との間に空隙を有し、該空隙に微粒子が移動可能に格納された分析用チップに、固定液により固定された組織から抽出したＲＮＡを非増幅または１回増幅した核酸を含む反応液を接触させて、該選択結合性物質に選択的に結合した該核酸量を測定する、ＲＮＡの分析方法。
【解決手段】表面に凹部及び凸部からなる凹凸部を有し、該凸部の上端面に選択結合性物質が固定化されてなる基板と、該基板と接着されたカバー部材とを備え、該基板と該カバー部材との間に空隙を有し、該空隙に微粒子が移動可能に格納された分析用チップに、固定液により固定された組織から抽出したＲＮＡを非増幅または１回増幅した核酸を含む反応液を接触させて、該選択結合性物質に選択的に結合した該核酸量を測定する、ＲＮＡの分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、固定液により固定された組織から抽出したＲＮＡの分析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子、タンパク質等の発現プロファイルを調べるのに有用なバイオツールの一態様として、マイクロアレイがある。マイクロアレイとは、基板上にＤＮＡ、タンパク質等の分子が高密度に配置されたもので、数十〜数万という多数の分子の発現量、発現の有無を同時に測定することができる。マイクロアレイを使用することで、各種疾患動物モデルや細胞生物学現象における体系的かつ網羅的な発現解析を行うことができる。例えば、生物の細胞又は組織レベルでの遺伝子発現の変動をＤＮＡマイクロアレイによって解析し、生理学的、細胞生物学的、生化学的事象データと組み合わせて遺伝子発現プロファイルデータベースを構築することによって、疾患遺伝子、治療関連遺伝子の検索や治療方法の探索が可能になると考えられている。
【０００３】
近年、病院や研究機関等で莫大な数の検体が保管されている、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織に代表される固定液により固定された組織の遺伝子を解析する技術に対して、期待が高まっている。ＦＦＰＥ組織に対する膨大な疾患データが蓄積されていることから、ＦＦＰＥ組織から遺伝子を抽出し、マイクロアレイを用いて解析する技術が確立すれば、長期間保存された組織の遡及的な研究が可能となることから、症例対照研究（ケースコントロールスタディー）等に利用することができ、よって医療界に大きく貢献する技術となり得る。
【０００４】
しかしながら、固定組織から抽出したＲＮＡをマイクロアレイで分析する場合、抽出されるＲＮＡが断片化していることが大きな課題となっている。検出対象となるｍＲＮＡは、３´末端に５０〜２００塩基程度のアデニンヌクレオチドが付加されているのが特徴であり、ポリ（Ａ）鎖と呼ばれている。ｍＲＮＡを増幅する場合、プライマーとして、ポリ（Ａ）鎖と相補的な配列を有するオリゴｄＴプライマーが一般に使用され、オリゴｄＴプライマーにより、ｍＲＮＡの３´末端から選択的にｃＤＮＡを合成する。しかしながら、ｍＲＮＡが断片化されていると、３´末端にポリ（Ａ）鎖を持たないものも存在することになり、それらに対してオリゴｄＴプライマーが結合しないため、逆転写反応することができない。その結果、増幅効率が非常に悪くなり、マイクロアレイに必要となる量のＲＮＡを確保するのが困難であった。
【０００５】
その問題を解消するため、ランダムプライマーを用いることでＦＦＰＥ組織から抽出したＲＮＡでも増幅を可能とする方法が開示されている。例えば特許文献１には、６〜９個のランダムヌクレオチドを含むランダムプライマーを用いた、非バイアス核酸増幅方法について開示されている。しかしながら、本方法によっても固定組織から抽出したＲＮＡは断片化が進んでいるため、増幅効率が低い。よって、マイクロアレイでの分析を行うのに必要なＲＮＡ量を確保するためには、複数回の増幅操作が必要となるため、それに伴って生じる増幅バイアスの影響を避けられない。さらに、増幅用の試薬は高価であるため、実験にかかるコストが膨大になる上、実験に要する時間も長くなる。
【特許文献１】特表２００６−５２０６０３
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
固定組織から抽出した、断片化が進んでいるＲＮＡを、非増幅、あるいは最小限の増幅回数でマイクロアレイ分析を可能とする技術を開発することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記課題に鑑みて、本発明者らは鋭意検討した結果、表面に凹部及び凸部からなる凹凸部を有し、該凸部の上端面に選択結合性物質が固定化されてなる基板と、該基板と接着されたカバー部材とを備え、該基板と該カバー部材との間に空隙を有し、該空隙に微粒子が移動可能に格納された分析用チップを用いることで、固定組織から抽出したＲＮＡの発現量を非増幅、または１回の増幅のみで分析できることを見出し、本発明を完成させた。
【０００８】
すなわち本発明は、表面に凹部及び凸部からなる凹凸部を有し、該凸部の上端面に選択結合性物質が固定化されてなる基板と、該基板と接着されたカバー部材とを備え、該基板と該カバー部材との間に空隙を有し、該空隙に微粒子が移動可能に格納された分析用チップに、固定液により固定された組織から抽出したＲＮＡを非増幅または１回増幅した核酸を含む溶液を接触させて、該選択結合性物質に選択的に結合した該核酸量を測定する、ＲＮＡの分析方法である。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の分析方法により、固定組織から抽出したＲＮＡを分析する場合に必須となっていた複数回の増幅操作を必要としないため、解析のバラツキの原因となる増幅バイアスを最小限に抑制できる結果、従来の分析方法と比較して分析結果の精度、再現性を大きく向上させることができる。また、増幅する場合でも１回の増幅で十分量のＲＮＡが得られるため、実験に要する時間を短縮できる。さらに、増幅操作に使用する試薬量を減らせるため、１サンプル当たりの分析にかかるコストを抑えることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下に、本発明をさらに具体的に説明する。
【００１１】
本発明で用いられる分析用チップは、ガラス、セラミックス、シリコンなどの無機材料、ステンレス、金（めっき）などの金属類、ポリエチレンテレフタレート、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、酢酸セルロース、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリジメチルシロキサン、シリコンゴムなどの高分子材料からなる基板の表面に凹部及び凸部からなる凹凸部を形成し、該凸部の上端面に選択結合性物質を結合させたものである。ここで選択結合性物質とは、ＲＮＡと直接的又は間接的に選択的に結合しうる物質をいう。その例として、核酸または他の抗原性化合物が挙げられる。核酸は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、相補的ＲＮＡ（ｃＲＮＡ）などを含む。他の抗原性化合物としては、低分子化合物を含む。特に好ましい選択結合性物質は核酸である。このような選択結合性物質は、市販のものでもよいし、あるいは、合成したもの、生体組織又は細胞などの天然源から調製したものでもよい。
【００１２】
また、本発明で用いられる分析用チップは、前記基板表面の凹凸部を覆うカバーを接着することを特徴とする。このとき、凸部の上面とカバーとの間には、選択結合物質と核酸とが結合しうるための空間を設ける必要があり、そのサイズは高さ方向で１〜５００μｍであることが好ましい。空間サイズが１μｍより小さいと、固定された選択結合性物質にＲＮＡが接触する機会が極端に少なくなり、選択結合性物質と核酸の結合後のシグナルが著しく小さくなるため、一方、５００μｍを超えると、多くの液量が必要となり、微量な検体を用いる場合、核酸溶液の濃度が薄くなって選択結合性物質と核酸の反応性が低下し、検出時のシグナルが弱くなるため、それぞれ好ましくない。さらに、ハイブリダイゼーション後にそのシグナル（蛍光）を測定することを考慮すると、カバーはハイブリダイゼーション後に脱離できることが好ましいため、固定手段としては両面テープやＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）による接着が好適に用いられる。また、カバーには、空隙に連通する１つ以上の貫通孔を備えることが好ましい。この孔は、核酸溶液、結合用バッファーなどの液体を注入するためのものであり、また同時に、基板内部の圧力を大気圧に保持するためのものでもある。貫通孔は、一つの空隙に対して複数あることが好ましく、中でも３〜６個とすることにより、検体溶液の充填が容易となるので特に好ましい。なお、上記のようなカバーの製造方法は特に限定されず、例えば、樹脂の場合は射出成形法、ホットエンボス法等、削り出し等の方法、ガラスやセラミックの場合はサンドブラスト法、シリコンの場合は公知の半導体プロセスで使用される方法等が好ましく用いられる。
【００１３】
さらに、本発明で用いられる分析用チップは基板とカバーの間の空隙に微粒子を含むことを特徴とする。空隙に検体溶液をアプライして、検体溶液に振動を伝播させると、微粒子が液中で激しく動き回り、攪拌効率が著しく高くなる。その結果、ハイブリダイゼーションの反応促進効果がもたらされる。ここで、微粒子の材質は特に限定されないが、例えばガラス、セラミックス（例えばイットリア安定化ジルコニア）、ステンレス等の金属類、ナイロン、ポリスチレン等のポリマー、磁性体などが好適に用いられる。中でも、物理的、化学的に安定であり、かつ比重が大きいことから、セラミックの微粒子が好ましく用いられる。さらに、基板を回転させて重力方向に微粒子を落下させる方法や、基板を振盪させる方法、磁性微粒子を用いて磁力により微粒子を移動させる方法などを併用することで、より一層攪拌効率が向上する。
【００１４】
本発明のＲＮＡの分析方法は、固定液により固定された組織（固定組織ともいう）から抽出されたＲＮＡを分析することを特徴とする。固定組織からＲＮＡを抽出する方法としては、各社から上市されている抽出キットを用いる方法が挙げられ、例えば、“ＲｅｃｏｖｅｒＡｌｌ（ＴＭ） Ｔｏｔａｌ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ｆｏｒ ＦＦＰＥ”（Ａｍｂｉｏｎ）、“ＲＮｅａｓｙ ＦＦＰＥ Ｋｉｔ”（Ｑｉａｇｅｎ）、“ＩＳＯＧＥＮ ＰＢ Ｋｉｔ”（ニッポンジーン）、“ＦＦＰＥ ＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ”（Ｎｏｒｇｅｎ）、“Ａｒｃｔｕｒｕｓ（登録商標） Ｐａｒａｄｉｓｅ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ”（ＭＤＳ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、“ＰｕｒｅＬｉｎｋ（ＴＭ） ＦＦＰＥ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ”（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、“Ｈｉｇｈ Ｐｕｒｅ ＦＦＰＥ ＲＮＡ Ｍｉｃｒｏ”（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を好適に用いることができる。
【００１５】
本発明においては、固定組織から抽出されたＲＮＡを、そのまま非増幅ＲＮＡとして反応液に溶解して前記分析用チップの選択結合性物質と結合させるか、増幅する場合は、１回増幅した核酸を反応液に溶解して該選択結合性物質と結合させる。固定組織から抽出されたＲＮＡ由来の核酸と選択結合性物質の結合させる方法としては当業者に公知の方法が採用され、特に選択結合性物質が核酸である場合、当業者に公知のハイブリダイゼーション方法によって結合させることができる。また、核酸と選択結合性物質を結合させる場合の反応液についても、当業者に公知の組成が採用され、特に選択結合性物質が核酸である場合、当業者に公知のハイブリダイゼーション緩衝液を使用することができる。
【００１６】
固定組織から抽出されたＲＮＡを、そのまま非増幅ＲＮＡとして分析を実施する場合、蛍光標識方法は特に限定されず、当業者に公知の方法で標識を行うことができる。標識試薬としては、例えばＵＬＹＳＩＳ（登録商標）核酸標識キット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）、Ｌａｂｅｌ ＩＴ（登録商標） Ｎｏｎ−ＲＩ Ｌａｂｅｌｉｎｇ ＆ Ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ Ｋｉｔｓ（タカラバイオ）、Ａｒｒａｙ ９００ ＭＰＸ（ＴＭ） Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｒｒａｙ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｇｅｎｉｓｐｈｅｒｅ）等が好適に用いられる。
【００１７】
固定組織から抽出されたＲＮＡを１回増幅して分析を実施する場合、各社から上市されているキットを用いて操作することが好ましい。該増幅キットとしては、アンチセンス鎖のＲＮＡ（ａＲＮＡ）を増幅するもの、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を増幅するものであれば特に限定されず、例えば、“ＥｘｐｒｅｓｓＡｒｔ ＦＦＰＥ ｍＲＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ”（ＡｍｐＴｅｃ）、“Ｐａｒａｄｉｓｅ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ” （ＭＤＳ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、“ＳｅｎｓｅＡＭＰ Ｐｌｕｓ”（Ｇｅｎｉｓｐｈｅｒｅ）が好適に用いられる。ａＲＮＡ増幅のキットを用いる場合、増幅時にアミノアリル基やビオチンを導入することが好ましい。アミノアリル基やビオチンを導入することで、ターゲット分子のＲＮＡに蛍光標識することができる。
【００１８】
選択結合性物質と結合した核酸量を検出する方法としては、特に限定されないが、当業者に公知の蛍光スキャナー装置により、核酸に標識した蛍光の強度を読み取るのが好ましい。分析用チップのサイズがスライドガラスと略同一である場合は、当業者に公知のマイクロアレイ用スキャナーを用いることが好ましい。
【００１９】
本発明の分析方法では、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）等、塩基長が１００塩基以下の短塩基長ＲＮＡの分析においても好ましく利用できる。短塩基長ＲＮＡの場合、非増幅で分析することが好ましい。
【００２０】
本発明で使用される固定組織はパラフィンで包埋された組織であることが好ましい。固定組織をパラフィン包理する場合は、一般的に行われる手法で操作すればよい。すなわち、アルコールで置換することにより組織を脱水し、次いでキシレン、ベンゼン等で置換した後、熱して液化したパラフィンを流し入れた型枠に組織を入れて包埋しパラフィンブロックとする。パラフィン包埋した組織からＲＮＡを抽出するときは、パラフィンブロックの組織を５〜２０μｍ程度の厚さに薄切して使用する。
【００２１】
本発明で使用される固定組織を作製する際に用いられる固定液としては、ホルムアルデヒド溶液（ホルマリン）、パラホルムアルデヒド溶液、エタノール等のアルコール類、アセトン等が使用され、また、ピクリン酸、重クロム酸カリウム等の酸を含む固定液、酢酸亜鉛、塩化亜鉛、硫酸亜鉛等の金属を含む固定液も使用できるが、ホルマリンが好ましく用いられる。ホルマリンは、精製水で希釈したものを使用してもよいし、炭酸カルシウム、炭酸マグネシウム等でｐＨを中性に調整したものや、リン酸緩衝液で希釈してｐＨを中性に調整したものを使用してもよい。なお、ホルマリンの濃度は、５〜２０％が好ましく、１０〜１５％がより好ましい。
【実施例】
【００２２】
本発明を以下の実施例によってさらに詳細に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００２３】
実施例１
（分析用チップの作製）
基板として、外形が縦７６ｍｍ、横２６ｍｍ、厚み１ｍｍであり、基板の中央部に縦３９．４ｍｍ、横１９．０ｍｍ、深さ０．１５ｍｍの凹部を設け、この凹部の中に、直径０．１ｍｍ、高さ０．１５ｍｍの凸部を９２４８箇所設けた基板（以下「基板Ａ」とする）を用いた。この基板Ａにおいて、凸部上面と平坦部上面との高さの差（凸部は高さの平均値）は、３μｍ以下であった。また、凸部上面の高さのばらつき（最も高い凸部上面の高さと最も低い凸部上面との高さの差）は、３μｍ以下であった。また、凸部のピッチ（凸部中央部から隣接した凸部中央部までの距離）を０．５ｍｍとした。上記基板Ａを１０Ｎの水酸化ナトリウム水溶液に７０℃で１２時間浸漬した。これを、純水、０．１ＮのＨＣｌ水溶液、純水の順で洗浄し、基板表面にカルボキシル基を生成させた。
【００２４】
基板Ａに対し、以下の条件で、それぞれ選択結合性物質（プローブＤＮＡ）としてオリゴヌクレオチドを固定化した。オリゴヌクレオチドとしては、オペロン社製ＤＮＡマイクロアレイ用オリゴヌクレオチドセット“Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ（Ｈｕｍａｎ）ＡＲＯＳ Ｖ４．０（各６０塩基）”を用いた。このオリゴヌクレオチドを、純水に０．３ｎｍｏｌ／μＬの濃度となるよう溶解させて、ストック溶液とした。このストック溶液を基板にスポット（点着）する際は、ＰＢＳ（８ｇのＮａＣｌ、２．９ｇのＮａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、０．２ｇのＫＣｌ、及び０．２ｇのＫＨ２ＰＯ４を合わせて純水に溶かし、１Ｌにメスアップしたものに、塩酸を加えてｐＨ５．５に調製したもの）で１０倍希釈して、プローブＤＮＡの終濃度を０．０３ｎｍｏｌ／μＬとし、かつ、ＰＭＭＡ製基板表面に生成させたカルボキシル基とプローブＤＮＡの末端アミノ基とを縮合させるため、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）を加え、この終濃度を５０ｍｇ／ｍＬとした。この溶液をアレイヤー（スポッター）（日本レーザー電子製；Ｇｅｎｅ Ｓｔａｍｐ−ＩＩ）を用いて、基板Ａの全ての凸部上面にスポットした。次いで、スポットした基板を密閉したプラスチック容器に入れて、３７℃、湿度１００％の条件で２０時間程度インキュベートした。最後に純水で基板を洗浄し、スピンドライヤーで遠心して乾燥した。
【００２５】
選択結合性物質を固定化した上記基板Ａに対し、次のようにカバー部材を貼付した。カバー部材としては、縦４１．４ｍｍ、横２１ｍｍ、厚さ１ｍｍのＰＭＭＡ平板を切削加工により作製してカバー部材とした。作製した該カバー部材には、貫通孔および液面駐止用チャンバーを図４の５、７に例示するように設けた。そして接着部材として縦４１．４ｍｍ、横２１ｍｍ、幅１ｍｍ、厚さ２５μｍの両面テープを、カバー部材を縁取るようなサイズにカットし、厚さ（クリアランス）が５０μｍとなるように積層させて貼り付けたのち、該カバー部材を基板Ａに貼付した。
【００２６】
上記でカバー部材を貼付した基板Ａに、直径１８０μｍのジルコニア製微粒子１２０ｍｇを、基板Ａとカバー部材とで形成される空隙（基板Ａ表面の凹凸構造の凹部）に封入した。なお、微粒子の封入は、カバー部材の貫通孔（図２または図４に例示される貫通孔５）から行った。以上のようにして得られた分析用チップを、「分析用チップ１」とした。
【００２７】
（凍結組織からのＲＮＡの抽出）
マウス小脳および肝臓の凍結組織各３０ｍｇから、ＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、キットのプロトコールに従ってＲＮＡを抽出した。
【００２８】
（ＦＦＰＥ組織からのＲＮＡ抽出）
マウス小脳および肝臓のホルマリン固定パラフィン包埋組織切片（厚さ１０μｍ）各５枚をそれぞれ２ｍＬのチューブに入れた。キシレン１ｍＬを加えて１０秒間ボルテックスミキサーで攪拌し、パラフィンを溶解させた。１５，０００×ｇで２分間遠心した後、ピペットを用いて組織を吸わないよう注意深くキシレンを除いた。次いで、エタノール１ｍＬを加えて１０秒間ボルテックスミキサーで攪拌した後、１５，０００×ｇで２分間遠心した。ピペットで組織を吸わないよう注意深くエタノールを除去し、風乾してエタノールを完全に除いた。組織をプロテイナーゼＫ溶液（５００μｇ／ｍＬ）に懸濁し、３７℃で１６時間静置してタンパクを消化させた。シリカカラムを用いて、ＲＮＡを精製した。
【００２９】
（ＲＮＡ増幅、標識、ハイブリダイゼーション）
凍結組織、ＦＦＰＥ組織それぞれから抽出したトータルＲＮＡ１００ｎｇを、キットのプロトコールに従って、アミノアリル化アンチセンスＲＮＡ（以下、ＡＡ−ａＲＮＡ）として増幅した。マウス小脳由来ＲＮＡから増幅したＡＡ−ａＲＮＡをＣｙ３−ＮＨＳ（ＧＥヘルスケア）で、マウス肝臓由来ＲＮＡから増幅したＡＡ−ａＲＮＡをＣｙ５−ＮＨＳ（ＧＥヘルスケア）でそれぞれ標識し、カラム（マイクロコンＹＭ−３０）で未反応のＣｙ３、Ｃｙ５を除去、精製した。凍結組織抽出ＲＮＡ、ＦＦＰＥ組織抽出ＲＮＡそれぞれについて、小脳、肝臓各５００ｎｇ分のＲＮＡを含む溶液を、１重量％ＢＳＡ、５×ＳＳＣ、０．０１重量％サケ精子ＤＮＡ、０．１重量％ＳＤＳの溶液（各濃度はいずれも終濃度））に溶解させて、２５０μＬの検体溶液を調製した。脱気後、分析用チップのオリゴヌクレオチドがスポットされた面、すなわち基板とカバー部材の空隙部分に、マイクロピペットを用いて貫通孔から２１０μＬアプライした。カバーに備えられた４箇所の貫通孔をシールして塞ぎ、バイオシェーカー（東京理化器械株式会社；ＭＭＳ−２１０）の天板に固定したハイブリダイゼーションチャンバー（タカラバイオ株式会社；ＴＸ７１１）にセットした。設定温度を３７℃とし、２５０ｒｐｍで旋回回転させて攪拌しながら、１６時間反応させた。
【００３０】
（蛍光シグナル値の測定）
反応後、分析用チップのカバー部材および両面テープを脱離させ、基板を洗浄、乾燥した。ＤＮＡチップ用のスキャナー（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製 ＧｅｎｅＰｉｘ ４０００Ｂ）に上記基板をセットし、レーザー出力３３％、フォトマルチプライヤーの電圧設定を５００にした状態で、ハイブリダイゼーション反応した蛍光標識ＲＮＡのシグナル値（蛍光強度）、バックグラウンドノイズを測定した。全２５３９２個のスポットのうち、４８個をバックグラウンド蛍光値測定用のネガティブコントロールスポットとし、個々のシグナル値からバックグラウンドシグナル値を差し引いて各スポットの真のシグナル値を算出した。ここで、真のシグナル値が正の場合を「有効スポット」とする。
【００３１】
有効スポット数、および全てのスポットの平均シグナル強度を表１に示す。また、小脳と肝臓の共通有効スポットを抽出して、シグナル強度の比をとり（小脳／肝臓）、凍結組織から抽出したＲＮＡとＦＦＰＥ組織から抽出したＲＮＡの相関係数を算定すると０．９１であり、凹凸構造の基板を用いることで、両者の高い相関を得ることができた（表１参照）。
【００３２】
【表１】
【００３３】
実施例２
（ＲＮＡの抽出）
マウス小脳の凍結組織およびＦＦＰＥから、実施例１と同様にしてＲＮＡを抽出した。
【００３４】
（逆転写反応、捕捉配列のライゲーション、ハイブリダイゼーション）
各ＲＮＡ１μｇから、Ａｒｒａｙ ９００ ＭＰＸ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｒｒａｙ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔのプロトコールに従って逆転写反応、捕捉配列のライゲーションを行った。各５００ｎｇ分のＲＮＡを含む溶液を、１重量％ＢＳＡ、５×ＳＳＣ、０．０１重量％サケ精子ＤＮＡ、０．１重量％ＳＤＳの溶液（各濃度はいずれも終濃度））に溶解させて、２５０μＬの検体溶液を調製した。脱気後、分析用チップのオリゴヌクレオチドがスポットされた面、すなわち基板とカバー部材の空隙部分に、マイクロピペットを用いて貫通孔から２１０μＬアプライした。カバーに備えられた４箇所の貫通孔をシールして塞ぎ、バイオシェーカー（東京理化器械株式会社；ＭＭＳ−２１０）の天板に固定したハイブリダイゼーションチャンバー（タカラバイオ株式会社；ＴＸ７１１）にセットした。設定温度を３７℃とし、２５０ｒｐｍで旋回回転させて攪拌しながら、１６時間反応させた。
【００３５】
（洗浄、染色）
反応後、分析用チップのカバー部材および両面テープを脱離させ、基板を洗浄、乾燥した。接着部材として縦４１．４ｍｍ、横２１ｍｍ、幅１ｍｍ、厚さ２５μｍの両面テープを、カバー部材を縁取るようなサイズにカットし、厚さ（クリアランス）が５０μｍとなるように積層させて貼り付けたのち、該カバー部材を基板に貼付した。上記でカバー部材を貼付した基板に、直径１８０μｍのジルコニア製微粒子１２０ｍｇを、基板とカバー部材とで形成される空隙（基板表面の凹凸構造の凹部）に封入した。なお、微粒子の封入は、カバー部材の貫通孔（図２または図４に例示される貫通孔５）から行った。キット添付のＣｙ５で標識された捕捉試薬を含む溶液を、マイクロピペットを用いて貫通孔から２１０μＬアプライした。カバーに備えられた４箇所の貫通孔をシールして塞ぎ、バイオシェーカー（東京理化器械株式会社；ＭＭＳ−２１０）の天板に固定したハイブリダイゼーションチャンバー（タカラバイオ株式会社；ＴＸ７１１）にセットした。設定温度を３７℃とし、２５０ｒｐｍで旋回回転させて攪拌しながら、４時間反応させた。
【００３６】
（蛍光シグナル値の測定）
反応後、分析用チップのカバー部材および両面テープを脱離させ、基板を洗浄、乾燥した。ＤＮＡチップ用のスキャナー（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製 ＧｅｎｅＰｉｘ ４０００Ｂ）に上記基板をセットし、レーザー出力３３％、フォトマルチプライヤーの電圧設定を５００にした状態で、ハイブリダイゼーション反応した蛍光標識ＲＮＡのシグナル値（蛍光強度）、バックグラウンドノイズを測定した。全２５３９２個のスポットのうち、４８個をバックグラウンド蛍光値測定用のネガティブコントロールスポットとし、個々のシグナル値からバックグラウンドシグナル値を差し引いて各スポットの真のシグナル値を算出した。ここで、真のシグナル値が正の場合を「有効スポット」とする。
【００３７】
有効スポット数、および全てのスポットの平均シグナル強度を表２に示す。共通の有効スポットを抽出して、凍結組織から抽出したＲＮＡとＦＦＰＥ組織から抽出したＲＮＡの相関係数を算定すると０．９３であり、凹凸構造の基板を用いることで、両者の高い相関を得ることができた（表２参照）。
【００３８】
【表２】
【００３９】
比較例１
（分析用チップの作製）
基板として、ＤＮＡマイクロアレイ用コートスライドガラス（松浪硝子）を用いた。以下の条件で、それぞれ選択結合性物質（プローブＤＮＡ）としてオリゴヌクレオチドを固定化した。オリゴヌクレオチドとしては、オペロン社製ＤＮＡマイクロアレイ用オリゴヌクレオチドセット“Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ（Ｍｏｕｓｅ）ＡＲＯＳ Ｖｅｒｓｉｏｎ ４．０（各７０塩基）”を用いた。このオリゴヌクレオチドを、終濃度が０．０３ｎｍｏｌおよびμＬとなるようにＤＮＡマイクロアレイ用Ｓｐｏｔｔｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（松浪硝子）に溶解した。この溶液をアレイヤー（スポッター）（日本レーザー電子製；Ｇｅｎｅ Ｓｔａｍｐ−ＩＩ）を用いて、計２５３９２点（短軸方向に９２スポット、長軸方向に２７６スポット）スポットした。以上のようにして得られた分析用チップを、「分析用チップ２」とした。
【００４０】
（ＲＮＡ増幅、標識、ハイブリダイゼーション）
実施例１で記載した方法と同様にして、ＲＮＡの抽出、増幅、標識の操作を行い、マウス小脳、マウス肝臓各５００ｎｇ分のＲＮＡを含む検体溶液を調製した。マイクロピペットを用いて分析用チップ２のオリゴヌクレオチドがスポットされた面に２１０μＬアプライした。ギャップカバーガラス（松浪硝子）を検体溶液がアプライされた面に載せて、ハイブリダイゼーションチャンバー（タカラバイオ株式会社；ＴＸ７１１）にセットし、３７℃で１６時間反応させた。
【００４１】
（蛍光シグナル値の測定）
分析用チップを洗浄、乾燥した。ＤＮＡチップ用のスキャナー（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製 ＧｅｎｅＰｉｘ ４０００Ｂ）に上記処理後の基板をセットし、レーザー出力３３％、フォトマルチプライヤーの電圧設定を５００にした状態において、ハイブリダイゼーション反応した被験物質の標識体シグナル値（蛍光強度）、バックグラウンドノイズを測定した。全２５３９２個のスポットのうち、４８個をバックグラウンド蛍光値測定用のネガティブコントロールスポットとし、個々のシグナル値からバックグラウンドシグナル値を差し引いて、各スポットの真のシグナル値を算出した。ここで、真のシグナル値が正の場合を「有効スポット」とする。
【００４２】
有効スポット数、および全てのスポットの平均シグナル強度を表１に示す。凹凸構造を有する基板を用いたときと比較してシグナル強度がかなり弱く、有効スポットが少ないことが示された。また、有効スポットを抽出して、小脳と肝臓のシグナル強度の比をとり（小脳／肝臓）、凍結組織から抽出したＲＮＡとＦＦＰＥ組織から抽出したＲＮＡの相関係数を算定すると０．６６であり、両者の相関は凹凸構造を有する基板を用いたときと比べてかなり低値であった（表１参照）。
【産業上の利用可能性】
【００４３】
本発明の分析方法により、解析のバラツキの原因となる増幅バイアスを最小限に抑制し、従来の分析方法と比較して分析結果の精度、再現性を大きく向上させることができるため、病院、研究機関に莫大な数保存されたホルマリン固定パラフィン包埋等の検体を用いた研究において、正確な結果を得ることができる。さらに、実験に要する時間を短縮でき、増幅操作に使用する試薬量を減らせるため、１サンプル当たりの分析にかかるコストを抑えることができる。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】本発明で使用する分析用チップを構成する基板の一例を概略的に示す俯瞰図。
【図２】本発明で使用する分析用チップの一例を概略的に示す縦断面図。
【図３】本発明で使用する分析用チップの一例の概略的に示す俯瞰図。
【図４】本発明で使用する分析用チップを構成するカバーにおける貫通孔及び液面駐止反応容器の一例を示す部分断面図。
【符号の説明】
【００４５】
１ 基板
２ 基板に固定された選択結合性物質
３ カバー
４ 接着層
５ 貫通孔
６ 微粒子（ビーズ）
７ 液面駐止チャンバー
【技術分野】
【０００１】
本発明は、固定液により固定された組織から抽出したＲＮＡの分析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子、タンパク質等の発現プロファイルを調べるのに有用なバイオツールの一態様として、マイクロアレイがある。マイクロアレイとは、基板上にＤＮＡ、タンパク質等の分子が高密度に配置されたもので、数十〜数万という多数の分子の発現量、発現の有無を同時に測定することができる。マイクロアレイを使用することで、各種疾患動物モデルや細胞生物学現象における体系的かつ網羅的な発現解析を行うことができる。例えば、生物の細胞又は組織レベルでの遺伝子発現の変動をＤＮＡマイクロアレイによって解析し、生理学的、細胞生物学的、生化学的事象データと組み合わせて遺伝子発現プロファイルデータベースを構築することによって、疾患遺伝子、治療関連遺伝子の検索や治療方法の探索が可能になると考えられている。
【０００３】
近年、病院や研究機関等で莫大な数の検体が保管されている、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織に代表される固定液により固定された組織の遺伝子を解析する技術に対して、期待が高まっている。ＦＦＰＥ組織に対する膨大な疾患データが蓄積されていることから、ＦＦＰＥ組織から遺伝子を抽出し、マイクロアレイを用いて解析する技術が確立すれば、長期間保存された組織の遡及的な研究が可能となることから、症例対照研究（ケースコントロールスタディー）等に利用することができ、よって医療界に大きく貢献する技術となり得る。
【０００４】
しかしながら、固定組織から抽出したＲＮＡをマイクロアレイで分析する場合、抽出されるＲＮＡが断片化していることが大きな課題となっている。検出対象となるｍＲＮＡは、３´末端に５０〜２００塩基程度のアデニンヌクレオチドが付加されているのが特徴であり、ポリ（Ａ）鎖と呼ばれている。ｍＲＮＡを増幅する場合、プライマーとして、ポリ（Ａ）鎖と相補的な配列を有するオリゴｄＴプライマーが一般に使用され、オリゴｄＴプライマーにより、ｍＲＮＡの３´末端から選択的にｃＤＮＡを合成する。しかしながら、ｍＲＮＡが断片化されていると、３´末端にポリ（Ａ）鎖を持たないものも存在することになり、それらに対してオリゴｄＴプライマーが結合しないため、逆転写反応することができない。その結果、増幅効率が非常に悪くなり、マイクロアレイに必要となる量のＲＮＡを確保するのが困難であった。
【０００５】
その問題を解消するため、ランダムプライマーを用いることでＦＦＰＥ組織から抽出したＲＮＡでも増幅を可能とする方法が開示されている。例えば特許文献１には、６〜９個のランダムヌクレオチドを含むランダムプライマーを用いた、非バイアス核酸増幅方法について開示されている。しかしながら、本方法によっても固定組織から抽出したＲＮＡは断片化が進んでいるため、増幅効率が低い。よって、マイクロアレイでの分析を行うのに必要なＲＮＡ量を確保するためには、複数回の増幅操作が必要となるため、それに伴って生じる増幅バイアスの影響を避けられない。さらに、増幅用の試薬は高価であるため、実験にかかるコストが膨大になる上、実験に要する時間も長くなる。
【特許文献１】特表２００６−５２０６０３
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
固定組織から抽出した、断片化が進んでいるＲＮＡを、非増幅、あるいは最小限の増幅回数でマイクロアレイ分析を可能とする技術を開発することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記課題に鑑みて、本発明者らは鋭意検討した結果、表面に凹部及び凸部からなる凹凸部を有し、該凸部の上端面に選択結合性物質が固定化されてなる基板と、該基板と接着されたカバー部材とを備え、該基板と該カバー部材との間に空隙を有し、該空隙に微粒子が移動可能に格納された分析用チップを用いることで、固定組織から抽出したＲＮＡの発現量を非増幅、または１回の増幅のみで分析できることを見出し、本発明を完成させた。
【０００８】
すなわち本発明は、表面に凹部及び凸部からなる凹凸部を有し、該凸部の上端面に選択結合性物質が固定化されてなる基板と、該基板と接着されたカバー部材とを備え、該基板と該カバー部材との間に空隙を有し、該空隙に微粒子が移動可能に格納された分析用チップに、固定液により固定された組織から抽出したＲＮＡを非増幅または１回増幅した核酸を含む溶液を接触させて、該選択結合性物質に選択的に結合した該核酸量を測定する、ＲＮＡの分析方法である。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の分析方法により、固定組織から抽出したＲＮＡを分析する場合に必須となっていた複数回の増幅操作を必要としないため、解析のバラツキの原因となる増幅バイアスを最小限に抑制できる結果、従来の分析方法と比較して分析結果の精度、再現性を大きく向上させることができる。また、増幅する場合でも１回の増幅で十分量のＲＮＡが得られるため、実験に要する時間を短縮できる。さらに、増幅操作に使用する試薬量を減らせるため、１サンプル当たりの分析にかかるコストを抑えることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下に、本発明をさらに具体的に説明する。
【００１１】
本発明で用いられる分析用チップは、ガラス、セラミックス、シリコンなどの無機材料、ステンレス、金（めっき）などの金属類、ポリエチレンテレフタレート、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、酢酸セルロース、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリジメチルシロキサン、シリコンゴムなどの高分子材料からなる基板の表面に凹部及び凸部からなる凹凸部を形成し、該凸部の上端面に選択結合性物質を結合させたものである。ここで選択結合性物質とは、ＲＮＡと直接的又は間接的に選択的に結合しうる物質をいう。その例として、核酸または他の抗原性化合物が挙げられる。核酸は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、相補的ＲＮＡ（ｃＲＮＡ）などを含む。他の抗原性化合物としては、低分子化合物を含む。特に好ましい選択結合性物質は核酸である。このような選択結合性物質は、市販のものでもよいし、あるいは、合成したもの、生体組織又は細胞などの天然源から調製したものでもよい。
【００１２】
また、本発明で用いられる分析用チップは、前記基板表面の凹凸部を覆うカバーを接着することを特徴とする。このとき、凸部の上面とカバーとの間には、選択結合物質と核酸とが結合しうるための空間を設ける必要があり、そのサイズは高さ方向で１〜５００μｍであることが好ましい。空間サイズが１μｍより小さいと、固定された選択結合性物質にＲＮＡが接触する機会が極端に少なくなり、選択結合性物質と核酸の結合後のシグナルが著しく小さくなるため、一方、５００μｍを超えると、多くの液量が必要となり、微量な検体を用いる場合、核酸溶液の濃度が薄くなって選択結合性物質と核酸の反応性が低下し、検出時のシグナルが弱くなるため、それぞれ好ましくない。さらに、ハイブリダイゼーション後にそのシグナル（蛍光）を測定することを考慮すると、カバーはハイブリダイゼーション後に脱離できることが好ましいため、固定手段としては両面テープやＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）による接着が好適に用いられる。また、カバーには、空隙に連通する１つ以上の貫通孔を備えることが好ましい。この孔は、核酸溶液、結合用バッファーなどの液体を注入するためのものであり、また同時に、基板内部の圧力を大気圧に保持するためのものでもある。貫通孔は、一つの空隙に対して複数あることが好ましく、中でも３〜６個とすることにより、検体溶液の充填が容易となるので特に好ましい。なお、上記のようなカバーの製造方法は特に限定されず、例えば、樹脂の場合は射出成形法、ホットエンボス法等、削り出し等の方法、ガラスやセラミックの場合はサンドブラスト法、シリコンの場合は公知の半導体プロセスで使用される方法等が好ましく用いられる。
【００１３】
さらに、本発明で用いられる分析用チップは基板とカバーの間の空隙に微粒子を含むことを特徴とする。空隙に検体溶液をアプライして、検体溶液に振動を伝播させると、微粒子が液中で激しく動き回り、攪拌効率が著しく高くなる。その結果、ハイブリダイゼーションの反応促進効果がもたらされる。ここで、微粒子の材質は特に限定されないが、例えばガラス、セラミックス（例えばイットリア安定化ジルコニア）、ステンレス等の金属類、ナイロン、ポリスチレン等のポリマー、磁性体などが好適に用いられる。中でも、物理的、化学的に安定であり、かつ比重が大きいことから、セラミックの微粒子が好ましく用いられる。さらに、基板を回転させて重力方向に微粒子を落下させる方法や、基板を振盪させる方法、磁性微粒子を用いて磁力により微粒子を移動させる方法などを併用することで、より一層攪拌効率が向上する。
【００１４】
本発明のＲＮＡの分析方法は、固定液により固定された組織（固定組織ともいう）から抽出されたＲＮＡを分析することを特徴とする。固定組織からＲＮＡを抽出する方法としては、各社から上市されている抽出キットを用いる方法が挙げられ、例えば、“ＲｅｃｏｖｅｒＡｌｌ（ＴＭ） Ｔｏｔａｌ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ｆｏｒ ＦＦＰＥ”（Ａｍｂｉｏｎ）、“ＲＮｅａｓｙ ＦＦＰＥ Ｋｉｔ”（Ｑｉａｇｅｎ）、“ＩＳＯＧＥＮ ＰＢ Ｋｉｔ”（ニッポンジーン）、“ＦＦＰＥ ＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ”（Ｎｏｒｇｅｎ）、“Ａｒｃｔｕｒｕｓ（登録商標） Ｐａｒａｄｉｓｅ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ”（ＭＤＳ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、“ＰｕｒｅＬｉｎｋ（ＴＭ） ＦＦＰＥ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ”（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、“Ｈｉｇｈ Ｐｕｒｅ ＦＦＰＥ ＲＮＡ Ｍｉｃｒｏ”（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を好適に用いることができる。
【００１５】
本発明においては、固定組織から抽出されたＲＮＡを、そのまま非増幅ＲＮＡとして反応液に溶解して前記分析用チップの選択結合性物質と結合させるか、増幅する場合は、１回増幅した核酸を反応液に溶解して該選択結合性物質と結合させる。固定組織から抽出されたＲＮＡ由来の核酸と選択結合性物質の結合させる方法としては当業者に公知の方法が採用され、特に選択結合性物質が核酸である場合、当業者に公知のハイブリダイゼーション方法によって結合させることができる。また、核酸と選択結合性物質を結合させる場合の反応液についても、当業者に公知の組成が採用され、特に選択結合性物質が核酸である場合、当業者に公知のハイブリダイゼーション緩衝液を使用することができる。
【００１６】
固定組織から抽出されたＲＮＡを、そのまま非増幅ＲＮＡとして分析を実施する場合、蛍光標識方法は特に限定されず、当業者に公知の方法で標識を行うことができる。標識試薬としては、例えばＵＬＹＳＩＳ（登録商標）核酸標識キット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）、Ｌａｂｅｌ ＩＴ（登録商標） Ｎｏｎ−ＲＩ Ｌａｂｅｌｉｎｇ ＆ Ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ Ｋｉｔｓ（タカラバイオ）、Ａｒｒａｙ ９００ ＭＰＸ（ＴＭ） Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｒｒａｙ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｇｅｎｉｓｐｈｅｒｅ）等が好適に用いられる。
【００１７】
固定組織から抽出されたＲＮＡを１回増幅して分析を実施する場合、各社から上市されているキットを用いて操作することが好ましい。該増幅キットとしては、アンチセンス鎖のＲＮＡ（ａＲＮＡ）を増幅するもの、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を増幅するものであれば特に限定されず、例えば、“ＥｘｐｒｅｓｓＡｒｔ ＦＦＰＥ ｍＲＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ”（ＡｍｐＴｅｃ）、“Ｐａｒａｄｉｓｅ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ” （ＭＤＳ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、“ＳｅｎｓｅＡＭＰ Ｐｌｕｓ”（Ｇｅｎｉｓｐｈｅｒｅ）が好適に用いられる。ａＲＮＡ増幅のキットを用いる場合、増幅時にアミノアリル基やビオチンを導入することが好ましい。アミノアリル基やビオチンを導入することで、ターゲット分子のＲＮＡに蛍光標識することができる。
【００１８】
選択結合性物質と結合した核酸量を検出する方法としては、特に限定されないが、当業者に公知の蛍光スキャナー装置により、核酸に標識した蛍光の強度を読み取るのが好ましい。分析用チップのサイズがスライドガラスと略同一である場合は、当業者に公知のマイクロアレイ用スキャナーを用いることが好ましい。
【００１９】
本発明の分析方法では、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）等、塩基長が１００塩基以下の短塩基長ＲＮＡの分析においても好ましく利用できる。短塩基長ＲＮＡの場合、非増幅で分析することが好ましい。
【００２０】
本発明で使用される固定組織はパラフィンで包埋された組織であることが好ましい。固定組織をパラフィン包理する場合は、一般的に行われる手法で操作すればよい。すなわち、アルコールで置換することにより組織を脱水し、次いでキシレン、ベンゼン等で置換した後、熱して液化したパラフィンを流し入れた型枠に組織を入れて包埋しパラフィンブロックとする。パラフィン包埋した組織からＲＮＡを抽出するときは、パラフィンブロックの組織を５〜２０μｍ程度の厚さに薄切して使用する。
【００２１】
本発明で使用される固定組織を作製する際に用いられる固定液としては、ホルムアルデヒド溶液（ホルマリン）、パラホルムアルデヒド溶液、エタノール等のアルコール類、アセトン等が使用され、また、ピクリン酸、重クロム酸カリウム等の酸を含む固定液、酢酸亜鉛、塩化亜鉛、硫酸亜鉛等の金属を含む固定液も使用できるが、ホルマリンが好ましく用いられる。ホルマリンは、精製水で希釈したものを使用してもよいし、炭酸カルシウム、炭酸マグネシウム等でｐＨを中性に調整したものや、リン酸緩衝液で希釈してｐＨを中性に調整したものを使用してもよい。なお、ホルマリンの濃度は、５〜２０％が好ましく、１０〜１５％がより好ましい。
【実施例】
【００２２】
本発明を以下の実施例によってさらに詳細に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００２３】
実施例１
（分析用チップの作製）
基板として、外形が縦７６ｍｍ、横２６ｍｍ、厚み１ｍｍであり、基板の中央部に縦３９．４ｍｍ、横１９．０ｍｍ、深さ０．１５ｍｍの凹部を設け、この凹部の中に、直径０．１ｍｍ、高さ０．１５ｍｍの凸部を９２４８箇所設けた基板（以下「基板Ａ」とする）を用いた。この基板Ａにおいて、凸部上面と平坦部上面との高さの差（凸部は高さの平均値）は、３μｍ以下であった。また、凸部上面の高さのばらつき（最も高い凸部上面の高さと最も低い凸部上面との高さの差）は、３μｍ以下であった。また、凸部のピッチ（凸部中央部から隣接した凸部中央部までの距離）を０．５ｍｍとした。上記基板Ａを１０Ｎの水酸化ナトリウム水溶液に７０℃で１２時間浸漬した。これを、純水、０．１ＮのＨＣｌ水溶液、純水の順で洗浄し、基板表面にカルボキシル基を生成させた。
【００２４】
基板Ａに対し、以下の条件で、それぞれ選択結合性物質（プローブＤＮＡ）としてオリゴヌクレオチドを固定化した。オリゴヌクレオチドとしては、オペロン社製ＤＮＡマイクロアレイ用オリゴヌクレオチドセット“Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ（Ｈｕｍａｎ）ＡＲＯＳ Ｖ４．０（各６０塩基）”を用いた。このオリゴヌクレオチドを、純水に０．３ｎｍｏｌ／μＬの濃度となるよう溶解させて、ストック溶液とした。このストック溶液を基板にスポット（点着）する際は、ＰＢＳ（８ｇのＮａＣｌ、２．９ｇのＮａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、０．２ｇのＫＣｌ、及び０．２ｇのＫＨ２ＰＯ４を合わせて純水に溶かし、１Ｌにメスアップしたものに、塩酸を加えてｐＨ５．５に調製したもの）で１０倍希釈して、プローブＤＮＡの終濃度を０．０３ｎｍｏｌ／μＬとし、かつ、ＰＭＭＡ製基板表面に生成させたカルボキシル基とプローブＤＮＡの末端アミノ基とを縮合させるため、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）を加え、この終濃度を５０ｍｇ／ｍＬとした。この溶液をアレイヤー（スポッター）（日本レーザー電子製；Ｇｅｎｅ Ｓｔａｍｐ−ＩＩ）を用いて、基板Ａの全ての凸部上面にスポットした。次いで、スポットした基板を密閉したプラスチック容器に入れて、３７℃、湿度１００％の条件で２０時間程度インキュベートした。最後に純水で基板を洗浄し、スピンドライヤーで遠心して乾燥した。
【００２５】
選択結合性物質を固定化した上記基板Ａに対し、次のようにカバー部材を貼付した。カバー部材としては、縦４１．４ｍｍ、横２１ｍｍ、厚さ１ｍｍのＰＭＭＡ平板を切削加工により作製してカバー部材とした。作製した該カバー部材には、貫通孔および液面駐止用チャンバーを図４の５、７に例示するように設けた。そして接着部材として縦４１．４ｍｍ、横２１ｍｍ、幅１ｍｍ、厚さ２５μｍの両面テープを、カバー部材を縁取るようなサイズにカットし、厚さ（クリアランス）が５０μｍとなるように積層させて貼り付けたのち、該カバー部材を基板Ａに貼付した。
【００２６】
上記でカバー部材を貼付した基板Ａに、直径１８０μｍのジルコニア製微粒子１２０ｍｇを、基板Ａとカバー部材とで形成される空隙（基板Ａ表面の凹凸構造の凹部）に封入した。なお、微粒子の封入は、カバー部材の貫通孔（図２または図４に例示される貫通孔５）から行った。以上のようにして得られた分析用チップを、「分析用チップ１」とした。
【００２７】
（凍結組織からのＲＮＡの抽出）
マウス小脳および肝臓の凍結組織各３０ｍｇから、ＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、キットのプロトコールに従ってＲＮＡを抽出した。
【００２８】
（ＦＦＰＥ組織からのＲＮＡ抽出）
マウス小脳および肝臓のホルマリン固定パラフィン包埋組織切片（厚さ１０μｍ）各５枚をそれぞれ２ｍＬのチューブに入れた。キシレン１ｍＬを加えて１０秒間ボルテックスミキサーで攪拌し、パラフィンを溶解させた。１５，０００×ｇで２分間遠心した後、ピペットを用いて組織を吸わないよう注意深くキシレンを除いた。次いで、エタノール１ｍＬを加えて１０秒間ボルテックスミキサーで攪拌した後、１５，０００×ｇで２分間遠心した。ピペットで組織を吸わないよう注意深くエタノールを除去し、風乾してエタノールを完全に除いた。組織をプロテイナーゼＫ溶液（５００μｇ／ｍＬ）に懸濁し、３７℃で１６時間静置してタンパクを消化させた。シリカカラムを用いて、ＲＮＡを精製した。
【００２９】
（ＲＮＡ増幅、標識、ハイブリダイゼーション）
凍結組織、ＦＦＰＥ組織それぞれから抽出したトータルＲＮＡ１００ｎｇを、キットのプロトコールに従って、アミノアリル化アンチセンスＲＮＡ（以下、ＡＡ−ａＲＮＡ）として増幅した。マウス小脳由来ＲＮＡから増幅したＡＡ−ａＲＮＡをＣｙ３−ＮＨＳ（ＧＥヘルスケア）で、マウス肝臓由来ＲＮＡから増幅したＡＡ−ａＲＮＡをＣｙ５−ＮＨＳ（ＧＥヘルスケア）でそれぞれ標識し、カラム（マイクロコンＹＭ−３０）で未反応のＣｙ３、Ｃｙ５を除去、精製した。凍結組織抽出ＲＮＡ、ＦＦＰＥ組織抽出ＲＮＡそれぞれについて、小脳、肝臓各５００ｎｇ分のＲＮＡを含む溶液を、１重量％ＢＳＡ、５×ＳＳＣ、０．０１重量％サケ精子ＤＮＡ、０．１重量％ＳＤＳの溶液（各濃度はいずれも終濃度））に溶解させて、２５０μＬの検体溶液を調製した。脱気後、分析用チップのオリゴヌクレオチドがスポットされた面、すなわち基板とカバー部材の空隙部分に、マイクロピペットを用いて貫通孔から２１０μＬアプライした。カバーに備えられた４箇所の貫通孔をシールして塞ぎ、バイオシェーカー（東京理化器械株式会社；ＭＭＳ−２１０）の天板に固定したハイブリダイゼーションチャンバー（タカラバイオ株式会社；ＴＸ７１１）にセットした。設定温度を３７℃とし、２５０ｒｐｍで旋回回転させて攪拌しながら、１６時間反応させた。
【００３０】
（蛍光シグナル値の測定）
反応後、分析用チップのカバー部材および両面テープを脱離させ、基板を洗浄、乾燥した。ＤＮＡチップ用のスキャナー（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製 ＧｅｎｅＰｉｘ ４０００Ｂ）に上記基板をセットし、レーザー出力３３％、フォトマルチプライヤーの電圧設定を５００にした状態で、ハイブリダイゼーション反応した蛍光標識ＲＮＡのシグナル値（蛍光強度）、バックグラウンドノイズを測定した。全２５３９２個のスポットのうち、４８個をバックグラウンド蛍光値測定用のネガティブコントロールスポットとし、個々のシグナル値からバックグラウンドシグナル値を差し引いて各スポットの真のシグナル値を算出した。ここで、真のシグナル値が正の場合を「有効スポット」とする。
【００３１】
有効スポット数、および全てのスポットの平均シグナル強度を表１に示す。また、小脳と肝臓の共通有効スポットを抽出して、シグナル強度の比をとり（小脳／肝臓）、凍結組織から抽出したＲＮＡとＦＦＰＥ組織から抽出したＲＮＡの相関係数を算定すると０．９１であり、凹凸構造の基板を用いることで、両者の高い相関を得ることができた（表１参照）。
【００３２】
【表１】
【００３３】
実施例２
（ＲＮＡの抽出）
マウス小脳の凍結組織およびＦＦＰＥから、実施例１と同様にしてＲＮＡを抽出した。
【００３４】
（逆転写反応、捕捉配列のライゲーション、ハイブリダイゼーション）
各ＲＮＡ１μｇから、Ａｒｒａｙ ９００ ＭＰＸ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｒｒａｙ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔのプロトコールに従って逆転写反応、捕捉配列のライゲーションを行った。各５００ｎｇ分のＲＮＡを含む溶液を、１重量％ＢＳＡ、５×ＳＳＣ、０．０１重量％サケ精子ＤＮＡ、０．１重量％ＳＤＳの溶液（各濃度はいずれも終濃度））に溶解させて、２５０μＬの検体溶液を調製した。脱気後、分析用チップのオリゴヌクレオチドがスポットされた面、すなわち基板とカバー部材の空隙部分に、マイクロピペットを用いて貫通孔から２１０μＬアプライした。カバーに備えられた４箇所の貫通孔をシールして塞ぎ、バイオシェーカー（東京理化器械株式会社；ＭＭＳ−２１０）の天板に固定したハイブリダイゼーションチャンバー（タカラバイオ株式会社；ＴＸ７１１）にセットした。設定温度を３７℃とし、２５０ｒｐｍで旋回回転させて攪拌しながら、１６時間反応させた。
【００３５】
（洗浄、染色）
反応後、分析用チップのカバー部材および両面テープを脱離させ、基板を洗浄、乾燥した。接着部材として縦４１．４ｍｍ、横２１ｍｍ、幅１ｍｍ、厚さ２５μｍの両面テープを、カバー部材を縁取るようなサイズにカットし、厚さ（クリアランス）が５０μｍとなるように積層させて貼り付けたのち、該カバー部材を基板に貼付した。上記でカバー部材を貼付した基板に、直径１８０μｍのジルコニア製微粒子１２０ｍｇを、基板とカバー部材とで形成される空隙（基板表面の凹凸構造の凹部）に封入した。なお、微粒子の封入は、カバー部材の貫通孔（図２または図４に例示される貫通孔５）から行った。キット添付のＣｙ５で標識された捕捉試薬を含む溶液を、マイクロピペットを用いて貫通孔から２１０μＬアプライした。カバーに備えられた４箇所の貫通孔をシールして塞ぎ、バイオシェーカー（東京理化器械株式会社；ＭＭＳ−２１０）の天板に固定したハイブリダイゼーションチャンバー（タカラバイオ株式会社；ＴＸ７１１）にセットした。設定温度を３７℃とし、２５０ｒｐｍで旋回回転させて攪拌しながら、４時間反応させた。
【００３６】
（蛍光シグナル値の測定）
反応後、分析用チップのカバー部材および両面テープを脱離させ、基板を洗浄、乾燥した。ＤＮＡチップ用のスキャナー（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製 ＧｅｎｅＰｉｘ ４０００Ｂ）に上記基板をセットし、レーザー出力３３％、フォトマルチプライヤーの電圧設定を５００にした状態で、ハイブリダイゼーション反応した蛍光標識ＲＮＡのシグナル値（蛍光強度）、バックグラウンドノイズを測定した。全２５３９２個のスポットのうち、４８個をバックグラウンド蛍光値測定用のネガティブコントロールスポットとし、個々のシグナル値からバックグラウンドシグナル値を差し引いて各スポットの真のシグナル値を算出した。ここで、真のシグナル値が正の場合を「有効スポット」とする。
【００３７】
有効スポット数、および全てのスポットの平均シグナル強度を表２に示す。共通の有効スポットを抽出して、凍結組織から抽出したＲＮＡとＦＦＰＥ組織から抽出したＲＮＡの相関係数を算定すると０．９３であり、凹凸構造の基板を用いることで、両者の高い相関を得ることができた（表２参照）。
【００３８】
【表２】
【００３９】
比較例１
（分析用チップの作製）
基板として、ＤＮＡマイクロアレイ用コートスライドガラス（松浪硝子）を用いた。以下の条件で、それぞれ選択結合性物質（プローブＤＮＡ）としてオリゴヌクレオチドを固定化した。オリゴヌクレオチドとしては、オペロン社製ＤＮＡマイクロアレイ用オリゴヌクレオチドセット“Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ（Ｍｏｕｓｅ）ＡＲＯＳ Ｖｅｒｓｉｏｎ ４．０（各７０塩基）”を用いた。このオリゴヌクレオチドを、終濃度が０．０３ｎｍｏｌおよびμＬとなるようにＤＮＡマイクロアレイ用Ｓｐｏｔｔｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（松浪硝子）に溶解した。この溶液をアレイヤー（スポッター）（日本レーザー電子製；Ｇｅｎｅ Ｓｔａｍｐ−ＩＩ）を用いて、計２５３９２点（短軸方向に９２スポット、長軸方向に２７６スポット）スポットした。以上のようにして得られた分析用チップを、「分析用チップ２」とした。
【００４０】
（ＲＮＡ増幅、標識、ハイブリダイゼーション）
実施例１で記載した方法と同様にして、ＲＮＡの抽出、増幅、標識の操作を行い、マウス小脳、マウス肝臓各５００ｎｇ分のＲＮＡを含む検体溶液を調製した。マイクロピペットを用いて分析用チップ２のオリゴヌクレオチドがスポットされた面に２１０μＬアプライした。ギャップカバーガラス（松浪硝子）を検体溶液がアプライされた面に載せて、ハイブリダイゼーションチャンバー（タカラバイオ株式会社；ＴＸ７１１）にセットし、３７℃で１６時間反応させた。
【００４１】
（蛍光シグナル値の測定）
分析用チップを洗浄、乾燥した。ＤＮＡチップ用のスキャナー（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製 ＧｅｎｅＰｉｘ ４０００Ｂ）に上記処理後の基板をセットし、レーザー出力３３％、フォトマルチプライヤーの電圧設定を５００にした状態において、ハイブリダイゼーション反応した被験物質の標識体シグナル値（蛍光強度）、バックグラウンドノイズを測定した。全２５３９２個のスポットのうち、４８個をバックグラウンド蛍光値測定用のネガティブコントロールスポットとし、個々のシグナル値からバックグラウンドシグナル値を差し引いて、各スポットの真のシグナル値を算出した。ここで、真のシグナル値が正の場合を「有効スポット」とする。
【００４２】
有効スポット数、および全てのスポットの平均シグナル強度を表１に示す。凹凸構造を有する基板を用いたときと比較してシグナル強度がかなり弱く、有効スポットが少ないことが示された。また、有効スポットを抽出して、小脳と肝臓のシグナル強度の比をとり（小脳／肝臓）、凍結組織から抽出したＲＮＡとＦＦＰＥ組織から抽出したＲＮＡの相関係数を算定すると０．６６であり、両者の相関は凹凸構造を有する基板を用いたときと比べてかなり低値であった（表１参照）。
【産業上の利用可能性】
【００４３】
本発明の分析方法により、解析のバラツキの原因となる増幅バイアスを最小限に抑制し、従来の分析方法と比較して分析結果の精度、再現性を大きく向上させることができるため、病院、研究機関に莫大な数保存されたホルマリン固定パラフィン包埋等の検体を用いた研究において、正確な結果を得ることができる。さらに、実験に要する時間を短縮でき、増幅操作に使用する試薬量を減らせるため、１サンプル当たりの分析にかかるコストを抑えることができる。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】本発明で使用する分析用チップを構成する基板の一例を概略的に示す俯瞰図。
【図２】本発明で使用する分析用チップの一例を概略的に示す縦断面図。
【図３】本発明で使用する分析用チップの一例の概略的に示す俯瞰図。
【図４】本発明で使用する分析用チップを構成するカバーにおける貫通孔及び液面駐止反応容器の一例を示す部分断面図。
【符号の説明】
【００４５】
１ 基板
２ 基板に固定された選択結合性物質
３ カバー
４ 接着層
５ 貫通孔
６ 微粒子（ビーズ）
７ 液面駐止チャンバー
【特許請求の範囲】
【請求項１】
表面に凹部及び凸部からなる凹凸部を有し、該凸部の上端面に選択結合性物質が固定化されてなる基板と、該基板と接着されたカバー部材とを備え、該基板と該カバー部材との間に空隙を有し、該空隙に微粒子が移動可能に格納された分析用チップに、固定液により固定された組織から抽出したＲＮＡを非増幅または１回増幅した核酸を含む反応液を接触させて、該選択結合性物質に選択的に結合した該核酸量を測定する、ＲＮＡの分析方法。
【請求項２】
固定液により固定された組織がパラフィン包埋されてなる、請求項１に記載のＲＮＡの分析方法。
【請求項３】
固定液がホルムアルデヒドを含む、請求項１または２に記載のＲＮＡの分析方法。
【請求項１】
表面に凹部及び凸部からなる凹凸部を有し、該凸部の上端面に選択結合性物質が固定化されてなる基板と、該基板と接着されたカバー部材とを備え、該基板と該カバー部材との間に空隙を有し、該空隙に微粒子が移動可能に格納された分析用チップに、固定液により固定された組織から抽出したＲＮＡを非増幅または１回増幅した核酸を含む反応液を接触させて、該選択結合性物質に選択的に結合した該核酸量を測定する、ＲＮＡの分析方法。
【請求項２】
固定液により固定された組織がパラフィン包埋されてなる、請求項１に記載のＲＮＡの分析方法。
【請求項３】
固定液がホルムアルデヒドを含む、請求項１または２に記載のＲＮＡの分析方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２０１０−１０１６３２（Ｐ２０１０−１０１６３２Ａ）
【公開日】平成２２年５月６日（２０１０．５．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−２７０６３０（Ｐ２００８−２７０６３０）
【出願日】平成２０年１０月２１日（２００８．１０．２１）
【出願人】（０００００３１５９）東レ株式会社 (7,677)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年５月６日（２０１０．５．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１０月２１日（２００８．１０．２１）
【出願人】（０００００３１５９）東レ株式会社 (7,677)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]