生物学的シグナル導入の調節にかかわる短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）ポリヌクレオチドに関係する組成物および方法が提供される。シグナル導入を媒介する酵素類のタンパク質チトシンホスファターゼ（ＰＴＰ）群のメンバーであるＰＴＰ１Ｂの発現を干渉するｓｉＲＮＡポリヌクレオチドが示される。或る好ましい実施形態において、ｓｉＲＮＡはヒトまたはネズミＰＴＰ−１Ｂを含むシグナル導入経路を調節し、また或る別の実施形態においてはインスリンレセプターおよび／またはＪａｋ２を含むシグナル導入経路を調節する。ＰＴＰ１Ｂ媒介性生物学的シグナル導入の調節は、細胞増殖、細胞分化および／または細胞生存の欠陥に関連する疾患、例えば、代謝障害（糖尿病や肥満など）、癌、自己免疫病、感染症および炎症性疾患およびその他の諸疾患に有用である。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は２００２年５月２３日に出願された米国仮特許出願第６０／３８３，２４９号および２００３年４月１４日に出願された米国仮特許出願第６０／４６２，９４２号の利益を主張する。これらは、その全体が参考として本明細書で援用される。
【０００２】
（発明の背景）
（技術的分野）
本発明は全体として細胞増殖、細胞分化および細胞生存の欠陥に関連する疾患を治療するのに有用な組成物および方法に関するものである。特に、本発明は、タンパク質チロシンホスファターゼであるＰＴＰ１Ｂ、およびそのポリペプチド変異体の発現を干渉する二本鎖ＲＮＡポリヌクレオチド類に、関するものである。本発明は、このようなＲＮＡポリヌクレオチドの使用によりシグナル導入（ｓｉｇｎａｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）経路のコンポーネント類の活性化を変化させ、または増殖反応、細胞の分化および発達、および細胞生存に導く細胞代謝プロセスを変化させることにも関係する。
【背景技術】
【０００３】
（関連技術の説明）
ポリペプチド中の特定のチロシン残基をリン酸化するタンパク質チロシンキナーゼ（ＰＴＫ）と、特定のホスホチロシン残基を脱リン酸化するタンパク質チロシンホスファターゼ（ＰＴＰ）との作用によって調整される可逆的タンパク質チロシンリン酸化は、多くの細胞性活性を調節する重要なメカニズムである。ＰＴＰおよびＰＴＫの多様性および複雑さは同等であり、ポジティブおよびネガティブ両方のシグナルを送達して細胞機構が正しく機能するためにはＰＴＰも同様に重要であることが次第に明らかになってきた。調節されたチロシンリン酸化は、生物学的シグナル導入のための特殊な経路、例えば、細胞分裂、細胞生存、アポトーシス、増殖および分化に関連する経路に関与する。これらの経路の欠陥および／または機能異常が、有効な治療手段が解明されていない幾つかの病的状態、例えば、悪性腫瘍、自己免疫病、糖尿病、肥満および感染症などの根底にあるかも知れない。
【０００４】
酵素類のなかのタンパク質チロシンホスファターゼ（ＰＴＰ）ファミリは脊椎動物では構造的に多様な１００種類以上のタンパク質からなる；そのなかの約４０種類のヒトＰＴＰは保存された２５０アミノ酸ＰＴＰ触媒ドメインを共通して有するが、非触媒部分にはかなりの変動がみられる（Ｃｈａｒｂｏｎｎｅａｕ ａｎｄ Ｔｏｎｋｓ，１９９２ Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．８：４６３−４９３；Ｔｏｎｋｓ，１９９３ Ｓｅｍｉｎ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．４：３７３−４５３；Ａｎｄｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２１：７１１７−３６（２００１））。この構造的多様性は個々のＰＴＰファミリのメンバーの生理学的役割の多様性を反映するものと考えられ、それらは或る場合には増殖、発達および分化に特異的機能を有することが証明されている（Ｄｅｓａｉ ｅｔ ａｌ．，１９９６ Ｃｅｌｌ ８４：５９９−６０９；Ｋｉｓｈｉｈａｒａ ｅｔ ａｌ．，１９９３ Ｃｅｌｌ ７４：１４３−１５６；Ｐｅｒｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，１９９２ Ｃｅｌｌ ７０：２２５−２３６；Ｐｉｎｇｅｌ ａｎｄ Ｔｈｏｍａｓ，１９８９ Ｃｅｌｌ ５８：１０５５−１０６５；Ｓｃｈｕｌｔｚ ｅｔ ａｌ．，１９９３ Ｃｅｌｌ ７３：１４４５−１４５４）。ＰＴＰファミリには、インビトロで精巧な基質特異性をあらわし、種々様々の細胞シグナル伝達経路の調節にかかわるレセプター様の非経膜的酵素が含まれる（Ａｎｄｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．２１：７１１７（２００１）；Ｔｏｎｋｓ ａｎｄ Ｎｅｅｌ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１３：１８２（２００１））。このようにＰＴＰは種々の生理学的機能に関係し、ＰＴＰの活性を変化させ（すなわち、統計的に有意な増加または減少）または調節（例えば、アップ−レギュレーションまたはダウン−レギュレーション）させることによって生理学的プロセスに対する治療行為の機会が増える。
【０００５】
最近の研究からＰＴＰの構造、発現および調節に関してかなり多くの情報が得られたとはいえ、ＰＴＰがそれらの効果を発揮するための多くのチロシンリン酸化基質の性質はまだ確認されていない。限られた数の合成ホスホペプチド基質に関する研究により、異なるＰＴＰでは基質選択性に若干の差があることが証明されている（Ｃｈｏ ｅｔ ａｌ．，１９９３ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ． ２：９７７−９８４；Ｄｅｃｈｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，１９９５ Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２３１：６７３−６８１）。ＰＴＰ基質のＰＴＰ−媒介性脱リン酸化の分析によると、触媒活性は、リン酸化チロシン残基に対して基質ポリペプチド中の特異的位置にある或るアミノ酸残基の存在によって高まることが示唆されている（Ｓａｌｍｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０００ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ ６：１４０１；Ｍｙｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，２００１ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：４７７７１；Ｍｙｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，１９９７ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４：９０５２；Ｒｕｚｚｅｎｅ ｅｔ ａｌ．，１９９３ Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１１：２８９−２９５；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９４ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３３：２２８５−２２９０）。したがって、これらの研究に使用された基質の生理学的有効性は不明であるとはいえ、ＰＴＰはインビトロにおいて或るレベルの基質選択性を示す。
【０００６】
酵素のＰＴＰファミリは進化の過程で共通して保存されているＰＴＰ触媒ドメインとして知られる約２５０アミノ酸のセグメントを含む。この保存されたドメイン内には特殊なシグニチャ（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）配列モチーフ、ＣＸ_５Ｒ（配列番号＿）がある。これは全てのＰＴＰの中で不変である。大部分のＰＴＰには、上記のシグニチャー配列モチーフを含む１１アミノ酸保存配列（［Ｉ／Ｖ］ＨＣＸＡＧＸＸＲ［Ｓ／Ｔ］）Ｇ（配列番号１）が見いだされる。このモチーフ中のシステイン残基はこのファミリのメンバーでは不変であり、ホスホチロシン脱リン酸反応を触媒するために必須である。それは入ってくる基質のホスホチロシン残基上に存在するリン酸部分を攻撃する求核剤として機能する。システイン残基が部位特異的突然変異によってセリンに（例えば、システインからセリンへの突然変異体、または「ＣＳ」突然変異体）またはアラニン（例えば、システインからアラニンへの突然変異体または「ＣＡ」突然変異体）に変化している場合、生成するＰＴＰは触媒としては不完全であるが、少なくともインビトロでは、その基質と複合体を形成するかまたはその基質に結合する能力を保持している。
【０００７】
ＰＴＰファミリのあるメンバーのＣＳ突然変異体、例えば、ＭＫＰ−１（Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．，１９９３ Ｃｅｌｌ ７５：４８７）はインビトロでホスホチロシルポリペプチド基質に効果的に結合し、安定な酵素−基質複合体を形成し、それによって「基質捕獲」突然変異体ＰＴＰとして機能する。このような複合体を突然変異体ＰＴＰおよびホスホチロシルポリペプチド基質の両方が存在する細胞から分離することができる。非制限的理論により、このようなＣＳ突然変異体ＰＴＰの発現は、ＣＳ突然変異体が基質に結合し、その基質を差し押さえるメカニズムによって、例えば、対応する野生型ＰＴＰ（およびＰＴＰシグナル伝達経路のその他のＰＴＰおよび／またはその他のコンポーネント類）の正常機能と拮抗し、基質と触媒的な活性のある野生型酵素との相互作用を排除する（Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．，１９９３、など）。
【０００８】
しかし、その他のあるＰＴＰファミリメンバーのＣＳ突然変異体はホスホチロシルポリペプチド基質に結合し、複合体を形成する；これら複合体の存在は一過性であり、ＣＳ突然変異体がインビボで細胞に発現する際には不安定である。あるＰＴＰのＣＳ突然変異体、ＰＴＰ１Ｂ（ＰＴＰ−１Ｂ）、はこのようなＰＴＰの一例である。ホスホチロシルポリペプチド基質と安定な複合体を形成できるこのような酵素類の触媒的に不完全な突然変異体は、野生型タンパク質チロシンホスファターゼ触媒ドメインの不変アスパルテート残基を突然変異させ、それを、酵素のＫｍの顕著な変化は起こさないがＫｃａｔを減少させるアミノ酸で置換することによって誘導される。これについては米国特許第５９１２１３８号および第５９５１９７９号、米国特許出願第０９／３２３４２６号およびＰＣＴ／ＵＳ９７／１３０１６およびＰＣＴ／ＵＳ００／１４２１１などに開示されている。例えば、ＰＴＰ１ＢのＡｓｐ１８１がアラニンに突然変異してアスパルテート→アラニン（Ｄ ｔｏ ＡまたはＤＡ）突然変異体ＰＴＰ１Ｂ−Ｄ１８１Ａを形成すると、そのホスホチロシルポリペプチド基質と安定な複合体を形成するＰＴＰ１Ｂ「基質捕獲」突然変異体酵素が生成する（Ｆｌｉｎｔ ｅｔ ａｌ．，１９９７ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９４：１６８０）。その他のＰＴＰの基質が同様な基質捕獲アプローチを使用して確認でき、例えば、ＰＴＰファミリメンバーＰＴＰ−ＰＥＳＴ（Ｇａｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１６：６４０８）、ＴＣＰＴＰ（Ｔｉｇａｎｉｓ ｅｔ ａｌ．，１９９８ Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．１８：１６２２）、ＰＴＰ−ＨＳＣＦ（Ｓｐｅｎｃｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９７ Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１３８：８４５）およびＰＴＰ−Ｈ１（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９９ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：１７８０６）の基質類がある。
【０００９】
非経膜的ＰＴＰの一つであるＰＴＰ１Ｂは数種のチロシンリン酸化タンパク質を基質として認識し、それらタンパク質の多くはヒトの病気に関係がある。例えば、インスリンシグナル伝達経路におけるＰＴＰ１Ｂの治療的阻害はインスリン作用の増強に役立ち、それによってＩＩ 型糖尿病患者に共通するインスリン抵抗状態を緩和する。ＰＴＰ１Ｂは数種の増殖因子／ホルモンレセプターＰＴＫ、例えば、ｐ２１０Ｂｃｒ−Ａｂ１（ＬａＭｏｎｔａｇｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１８：２９６５−７５（１９９８）；ＬａＭｏｎｔａｇｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９５：１４０９４−９９（１９９８））、ＥＧＦレセプター、ＰＤＧＦレセプターおよびインスリンレセプター（ＩＲ）などのレセプターチロシンキナーゼ類（Ｔｏｎｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１３：１８２−９５（２００１））、およびＪａｋ２などのＪＡＫファミリメンバー類（Ｍｙｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：４７７７１−７４（２００１））、ならびにサイトカイン類によって誘導されるシグナル伝達事象（Ｔｏｎｋｓ ａｎｄ Ｎｅｅｌ，２００１）などによって開始するシグナル伝達のネガティブレギュレータとして作用する。ＰＴＰ１Ｂの活性は数種のアミノ酸残基の修飾によって調節される；例えば、Ｓｅｒ残基のリン酸化（Ｂｒａｕｔｉｇａｎ ａｎｄ Ｐｉｎａｕｌｔ、１９９３；Ｄａｄｋｅ ｅｔ ａｌ．，２００１；Ｆｌｉｎｔ ｅｔ ａｌ．，１９９３）および触媒的モチーフ中の活性Ｃｙｓ残基の酸化（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，１９９８；Ｍｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００２）など。これはタンパク質チロシンホスファターゼおよび二重鎖ホスファターゼファミリメンバーに進化過程で保存される（Ａｎｄｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００１）。その上、ＰＴＰ１Ｂの発現レベルの変化が、数種のヒト疾患、特にチロシンリン酸化の正常パターンの崩壊に関連する疾患に認められている。例えば、インスリンシグナル伝達経路におけるＰＴＰ１ＢのようなＰＴＰ類の治療的阻害がインスリン作用の増強に役立ち、それによって２型糖尿病患者に共通するインスリン抵抗状態を緩和させることができる。
【００１０】
真性糖尿病は開発国における人口の５−１０％が侵される一般的消耗性疾患であり、多くの国々では五大死因の一つである。世界の人口の約２％が糖尿病患者であり、その症例の圧倒的部分（＞９７％）が２型糖尿病で、残りが１型糖尿病である。子供や若年者に診断されることが多い１型糖尿病では、膵島のベータ細胞によるインスリン産生が破壊される。２型糖尿病、すなわち、「遅発性」または「成人型」の糖尿病は、細胞および組織が、供給されるインスリンを有効に使用できない複雑な代謝疾患である；ある症例ではインスリン産生も不十分である。細胞レベルにおいては、遅発性真性糖尿病を特徴づける消耗性表現型として例えば、インスリン分泌障害およびインスリン感受性低下、すなわち、インスリンに対する反応の障害がある。
【００１１】
研究の結果、患者は真性糖尿病の前に関連疾患にかかっており、または糖尿病が関連疾患と合併して起きることが判明している。例えば、米国では推定４０００万人が遅発性耐糖障害（ＩＧＴ）にかかっている。ＩＧＴ患者はインスリン分泌の増加によって糖に反応することができない。毎年、ＩＧＴ患者の数パーセント（５〜１０％）がインスリン欠乏性インスリン非依存型糖尿病（ＮＩＤＤＭ）に進行する。これらの患者の若干はさらに進行してインスリン依存型真性糖尿病（ＩＤＤＭ）になる。ＮＩＤＤＭおよびＩＤＤＭは、膵ベータ細胞によるインスリン放出の減少および／または通常はインスリン感受性を示す細胞および組織のインスリン反応性の低下と関連がある。真性糖尿病のその他の症状や真性糖尿病に先行するまたは関連する異常には、肥満、血管の病変、および盲目および難聴を含む種々の末梢神経障害がある。
【００１２】
１型糖尿病は生涯続くインスリン治療を必要とし、それは体重増加および低血糖のリスク増加などの好ましくない副作用を伴うことが多い。２型糖尿病（ＮＩＤＤＭ）の現在の治療は食事療法、運動療法およびインスリン注射または血糖値を下げるように処方された経口薬剤による薬物療法がある。このような現在使用できる経口薬剤の例はスルホニル尿素類、ビグアニド類、チアゾリジンジオン類、レパグリニド、およびアカルボースなどを含み、その各々はインスリンおよび／または糖レベルを変化させる。しかし現在の薬物療法はいずれもこの疾患をその全過程にわたってコントロールすることはできず、現在の治療のいずれも２型ＮＩＤＤＭにおけるインスリン分泌障害、インスリン抵抗および過剰肝グルコース産生などの生理的異常の全てを正常にすることはできない。その上これらの薬剤を用いても治療の失敗することが多く、多剤治療が必要になることが多い。
【００１３】
特定の種の代謝性疾患または異常において、一つ以上の生化学的プロセスが、同化的であれ異化的であれ（例えば、それぞれ物質の形成または破壊）、変化し（例えば、統計的有意に増加または減少する）、または病気のない人または健常者、例えば、適切にコントロールされている人々にあらわれるレベルに比べて調節する（例えば、統計的有意な程度にアップレギュレートまたはダウンレギュレートされる）。この変化は基質、酵素、補因子または特定のプロセスに含まれる生化学反応における他の任意の成分の増加または減少に起因する。ある種の疾患の根底にはＰＴＰ活性の変化（すなわち、正常状態に比較して統計的有意な増加または減少した）があり、ある種の代謝性疾患におけるＰＴＰの役割を示唆している。
【００１４】
例えば、ノックアウト・マウス・モデルのマウスＰＴＰ１Ｂ遺伝子相同体の破壊は、少なくとも一つの機能的ＰＴＰ１Ｂ遺伝子を有する対照（コントロール）動物に比較して高いインスリン感受性、低濃度の循環インスリンおよびグルコース、および高脂肪食においても体重増加抵抗性を有するＰＴＰ１Ｂ^−／−マウスを生ずる（Ｅｌｃｈｅｂｌｙ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８３：１５４４（１９９９））。インスリンレセプターの高リン酸化は、ＰＴＰ１Ｂ欠乏マウスの或る種の組織にも見いだされた。これはインスリンおよびグルコース代謝の生理的調節にＰＴＰ１Ｂが関与するという知見と一致する（同文献）。ＰＴＰ１Ｂ欠乏マウスは肥満の低下（脂肪細胞量は減少するが脂肪細胞数は減少しない）、基礎代謝速度およびエネルギー消費の増加およびインスリン刺激グルコース利用の増加を示す（Ｋｌａｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２０００ Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２０：５４７９）。さらに、変化したＰＴＰ活性はその他の生物系における糖代謝の異常と相関関係にあった（例えば、 ＭｃＧｕｉｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｄｉａｂｅｔｅｓ ４０：９３９（１９９１）；Ｍｙｅｒｏｖｉｔｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８４：９７６（１９８９）；Ｓｒｅｄｙ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ４４：１０７４（１９９５））；例えば、インスリンレセプターを介する生物学的シグナル導入にＰＴＰが関係しているなど（ＷＯ９９／４６２６８および本明細書に記載の参考文献などを参照）。
【００１５】
結晶学的、動態的およびＰＴＰ１Ｂ−ペプチド結合アッセイを統合すると、ＰＴＰ１Ｂとインスリンレセプター（ＩＲ）との相互作用が証明された（Ｓａｌｍｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ ６：１４０１−１２（２０００））。インスリンレセプター（ＩＲ）は２つの細胞外αサブユニットおよび２つの経膜的βサブユニットを含む。レセプターの活性化は、両方のβサブユニットのチロシン残基の自己リン酸化を起こす。上記サブユニットの各々はタンパク質キナーゼドメインを含む。ＰＴＰ１Ｂとインスリンレセプターキナーゼ（ＩＲＫ）との間に起こる広範囲の相互作用はＩＲＫの位置１１６２および１１６３に、ｐＴｙｒ−１１６２がＰＴＰ１Ｂの活性部位に位置するように、タンデムｐＴｙｒ残基を含む（同上）。ＰＴＰ１ＢによってＩＲＫが最適に認識されるためには、Ａｓｐ／Ｇｌｕ−ｐＴｙｒ−ｐＴｙｒ−Ａｒｇ／Ｌｙｓモチーフが関係している。このモチーフはＴｒｋ、ＦＧＦＲ、およびＡｘｌを含むその他のレセプターＰＴＫにも存在する。さらにこのモチーフはＰＴＫのＪＡＫファミリに見いだされる。このファミリのメンバーはサイトカインレセプター（満腹ホルモン・レプチンによって認識される典型的サイトカインレセプターを含める）からのシグナルを伝達する（Ｔｏｕｗ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１６０：１−９（２０００））。
【００１６】
ＰＴＰ１Ｂの発現レベルにおける変化が、数種のヒト疾患、特に、チロシンリン酸化の正常パターンの破壊と関係する疾患で認められている。例えば、ＰＴＰ１Ｂの発現は、ｐ２１０ Ｂｃｒ−Ａｂｌ、慢性骨髄性白血球（ＣＭＬ）の初期症状発現を直接引き起こすＰＴＫによって特異的に誘導される（ＬａＭｏｎｔａｇｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１８：２９６５−７５（１９９８）；ＬａＭｏｎｔａｇｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：１４０９４−９９（１９９８））。この腫瘍タンパク質に反応したＰＴＰ１Ｂの発現は一部は転写因子Ｓｐ１、Ｓｐ３およびＥｇｒ−１によって調節される（Ｆｕｋｕｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：２５５１２−１９（２００１））。これらの転写因子は、転写開始部位から−４９ないしー３７塩基対の間に位置するヒトＰＴＰ１Ｂプロモータ中のｐ２１０ Ｂｃｒ−Ａｂｌ反応性配列（ＰＲＳ）に結合することが示されているが、幾つかの追加的独立的ＰＴＰ１Ｂ転写事象（これに関する転写因子（類）も転写因子識別因子（類）も確認されていない）を媒介するようにはみえない（同文献）。
【００１７】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、二本鎖ＲＮＡによってもたらされるポリヌクレオチド配列特異的、転写後遺伝子サイレンシング・メカニズムであり、このメカニズムは特異的メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の分解を起こし、それによって前記ｍＲＮＡによってコードされる所望標的ポリペプチドの発現を減少させる（例えば、ＷＯ９９／３２６１９；ＷＯ０１／７５１６４；米国特許第６５０６５５９号；Ｆｉｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３９１：８０６−１１（１９９８）；Ｓｈａｒｐ，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１３：１３９−４１（１９９９）；Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４１１：４９４−９８（２００１）；Ｈａｒｂｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．１１４：４５５７−６５（２００１））。ＲＮＡｉは以下にも記載されるように、発現が阻害されているポリペプチドの部分をコードするエキソン配列に対応する配列を有する二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）などの二本鎖ポリヌクレオチド類によって媒介される。報告によると、ＲＮＡｉはイントロンまたはプロモータ配列と同一の配列を有する二本鎖ＲＮＡポリヌクレオチドによっては生じない（Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．，２００１）。ＲＮＡｉ経路はショウジョウバエ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）およびケノルハブディティス・エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ）によって最もよく特徴づけられるが、哺乳動物（ヒトを含む）のような比較的高等な真核生物においても特殊なポリペプチドの発現を妨害する「短い干渉ＲＮＡ」（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ＲＮＡ；ｓｉＲＮＡ）ポリヌクレオチドが議論されている（例えば、 Ｔｕｓｃｈｌ ２００１ Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ．２：２３９−２４５；Ｓｈａｒｐ，２００１ Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１５：４８５；Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，２００１ ＲＮＡ７：１５０９；Ｚａｍｏｒｅ， ２００２ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９６：１２６５；Ｐｌａｓｔｅｒｋ，２００２ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９６：１２６３；Ｚａｍｏｒｅ， ２００１ Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．８：７４６；Ｍａｔｚｋｅ ｅｔ ａｌ．，２００１ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９３：１０８０；Ｓｃａｄｄｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００１ ＥＭＢＯ Ｒｅｐ．２：１１０７）。
【００１８】
現在の非制限的モデルによると、ＲＮＡｉ経路は、長いｄｓＲＮＡがＡＴＰ依存性、選択的（ｐｒｏｃｅｓｓｉｖｅ）切断により短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）と呼ばれる約１８−２７（例えば、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６など）ヌクレオチド塩基対長の二本鎖フラグメントになることによって開始する（Ｈｕｔｖａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎ．Ｄｅｖ．１２：２２５−３２（２００２）；Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ．ａｌ．， ２００１；Ｎｙｋａｅｎｅｎ ｅｔ．ａｌ．， Ｃｅｌｌ １０７：３０９−２１（２００１）；Ｂａｓｓ， Ｃｅｌｌ １０１：２３５−３８（２０００）；Ｚａｍｏｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １０１：２５−３３（２０００）を参照されたい）。Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａにおいて、「ダイサー」として知られる酵素が長い二本鎖ＲＮＡをｓｉＲＮＡに切断する；ダイサーはｄｓＲＮＡ−特異的エンドヌクレアーゼのＲＮａｓｅＩＩＩファミリに属する（ＷＯ０１／６８８３６；Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４０９：３６３−６６（２００１））。さらにこの非制限的モデルによると、ｓｉＲＮＡ二本鎖はタンパク質複合体に組み込まれ、その後上記ｓｉＲＮＡのＡＴＰ−依存性巻き戻しが起こり、ｓｉＲＮＡはその後活性ＲＮＡ誘導性サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）を生成する（ＷＯ０１／６８８３６）。上記複合体はｓｉＲＮＡのガイド・ストランドに相補的な標的ＲＮＡを認識し、切断し、これによって特異的タンパク質の発現を阻害する（Ｈｕｔｖａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，上記と同じ文献）。
【００１９】
Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓおよびＤｒｏｓｏｐｈｉｌａにおいて、ＲＮＡｉは長い二本鎖ＲＮＡポリヌクレオチドによって媒介される（ＷＯ９９／３２６１９；ＷＯ０１／７５１６４；Ｆｉｒｅ ｅｔ ａｌ．，１９９８；Ｃｌｅｍｅｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７：６４９９−６５０３（２０００）；Ｋｉｓｉｅｌｏｗ ｅｔ．ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３６３：１−５（２００２）；ＷＯ０１／９２５１３（酵母中のＲＮＡｉ媒介性サイレンシング）も参照されたい）。しかし、哺乳動物細胞においては、長いｄｓＲＮＡポリヌクレオチド（すなわち、３０塩基対より長い）によるトランスフェクションは、タンパク質合成の開始を全体的にブロックし、ｍＲＮＡの分解を起こす非特異的配列反応を活性化する（Ｂａｓｓ，Ｎａｔｕｒｅ ４１１：４２８−２９（２００１））。ヒトおよびその他の哺乳動物細胞への約１８−２７ヌクレオチド塩基対長の二本鎖ＲＮＡのトランスフェクションは、対応するヌクレオチド配列を含むメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）によってコードされる特定のポリペプチドの発現を配列特異的様態で阻害する（ＷＯ０１／７５１６４；Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．，２００１；Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１５：１８８−２００（２００１）；Ｈａｒｂｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．１１４：４５５７−６５（２００１）；Ｃａｒｔｈｅｗ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１３：２４４−４８（２００１）；Ｍａｉｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．Ａｄｖａｎｃｅ Ｏｎｌｉｎｅ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ（Ｍａｒ．１８，２００２）；Ｍａｉｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，２００２ Ｎａｔｕｒｅ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．４：３１７）。
【００２０】
ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドは、遺伝子発現を配列特異的に改変または調節し、特定のコードされたポリペプチド産物の産生量の変化を得るために使用する場合、当業者に公知のその他のポリヌクレオチド類にまさる利点を幾つか提供する。これらの利点としては、このようなポリヌクレオチド（例えば、アンチセンス、リボザイム、または三重鎖ポリヌクレオチド類）に比較して有効ｓｉＲＮＡポリヌクレオチド濃度が低く、ｓｉＲＮＡポリヌクレオチド安定性が高く、ｓｉＲＮＡポリヌクレオチド オリゴヌクレオチド長が短いことなどが挙げられる。簡単な基礎知識として、「アンチセンス」ポリヌクレオチドは配列特異的様態でｍＲＮＡまたはＤＮＡなどの標的核酸に結合し、ＤＮＡの転写またはｍＲＮＡの翻訳を阻害する（米国特許第５１６８０５３号；米国特許第５１９０９３１号；米国特許第５１３５９１７号、米国特許第５０８７６１７号などを参照；「ダンベル」アンチセンス・オリゴヌクレオチドを記載しているＣｌｕｓｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９３ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２１：３４０５−１１も参照されたい）。「リボザイム」ポリヌクレオチドは任意のＲＮＡ転写体を標的とすることができ、そのような転写体を触媒的に切断することができ、ｍＲＮＡの翻訳を妨害する（米国特許第５２７２２６２号、第５１４４０１９号および米国特許第５１６８０５３号；第５１８０８１８号、第５１１６７４２号および第５０９３２４６号；Ｕ．Ｓ．２００２／１９３５７９などを参照）。「三重鎖」ＤＮＡ分子とは、二重鎖ＤＮＡに結合して共直線的な三重鎖分子を形成し、それによって転写を阻止する一重鎖ＤＮＡストランドをいう（二重鎖ＤＮＡ上の標的部位に結合する合成オリゴヌクレオチドを作製する方法を記載した米国特許第５１７６９９６号などを参照されたい）。このような三本鎖構造は不安定で、生理的条件下で一過的に形成されるに過ぎない。一本鎖ポリヌクレオチドは容易に細胞内に拡散せず、そのためヌクレアーゼ消化を受けやすいから、アンチセンスまたは三重鎖テクノロジーのための一本鎖ＤＮＡの作製は、安定性および細胞による吸収を改善するために化学的に修飾したヌクレオチドを必要とすることが多い。対照的に、ｓｉＲＮＡは完全細胞によって容易に取り込まれ、アンチセンスまたはリボザイムポリヌクレオチドに必要な濃度より数桁低い濃度で特殊なポリペプチドの発現を有効に妨害し、化学的修飾ヌクレオチドの使用を必要としない。
【００２１】
重要なことは、所望の標的ｍＲＮＡ配列の特徴（ＧＣ含有量パーセント、翻訳開始コドンからの位置、指定されたｓｉＲＮＡのホモログのインシリコ配列データベース検索に基づく配列類似性など）に基づきｓｉＲＮＡに有効なオリゴヌクレオチド配列を確認するための選択基準を案出する多数の試みにもかかわらず、現在のところ、所望の標的ｍＲＮＡに対応するヌクレオチド配列として生成し得る無数の可能の候補ｓｉＲＮＡ（例えば、約１８−２７ヌクレオチド塩基対のｄｓＲＮＡ）のどれが実際にｓｉＲＮＡ活性（すなわち、上記ｍＲＮＡによってコードされるポリペプチドの発現の干渉）を表すかを、信頼性の程度にかかわらず予測できないことである。その代わりに、個々の具体的な候補ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド配列を作製し、試験して所望ポリペプチド標的の発現の干渉が起きるかどうかを確認しなければならない。よって、所定のＰＴＰポリペプチドの発現を確実に特異的に変えることができｓｉＲＮＡポリヌクレオチドを設計するための通常使用されるような方法は存在せず、したがって、ＰＴＰの圧倒的多数にとって効果的なｓｉＲＮＡポリヌクレオチド配列は現在のところ知られていない。
【００２２】
したがって、現在、生物学的シグナル導入の治療的調節のために望ましい目標としては、ＰＴＰ１Ｂ媒介性細胞性事象を調節すること、特にＰＴＰ１Ｂ結合分子、基質および結合相手の相互作用の阻害または増強すること、またはまたはＰＴＰ１Ｂ活性を調節するその他の作用物質の阻害または増強が挙げられる。よって、当該分野において、ホスホチロシン・シグナル伝達の調節に介入する能力の改善に対する必要性である；例えば、ＰＴＰ１Ｂ触媒活性、ＰＴＰ１Ｂ基質分子へのＰＴＰ１Ｂ結合および／またはＰＴＰ１Ｂコーディング遺伝子発現の変化によってＰＴＰ１Ｂを調節することが必要になる。ＰＴＰ１Ｂをこのように調節する能力が高まれば、ホスホチロシンシグナル伝達経路に関係するタンパク質の活性を調節し、このような経路に関連する病気を治療する方法の開発は容易になる。本発明はこれらの必要性に応え、さらにその他の関連する利益をもたらすものである。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００２３】
（発明の概要）
本発明は、ＰＴＰ１Ｂを調節するための、本明細書に開示されるヌクレオチド配列などの特殊のｓｉＲＮＡポリヌクレオチドを含む組成物および方法に関するものである。そのため、ある実施形態において配列番号８３−８６、８８−９１、９３−９６、９８−１０１、１０４−１０５および１０８−１０９から選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含み、ある実施形態においては配列番号８３−８６、８８−９１、９３−９６、９８−１０１およびこれらの相補的ポリヌクレオチドから選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む単離された短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）ポリヌクレオチドを提供することが本発明の一局面である。また別の実施形態において、いずれの短い干渉ＲＮＡポリヌクレオチドもＰＴＰ１Ｂポリペプチドの発現を干渉することができ、その際に、ＰＴＰ−１Ｂポリペプチドは、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｍ３１７２４、ＮＭ＿００２８２７、またはＭ３３６８９に示されるアミノ酸発現を含む。また別の実施形態において、ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドのヌクレオチド配列は、配列番号８３−８６、８８−９１、９３−９６、９８−１０１から選択される配列の位置１−１９の任意の位置において、または配列番号１０４、１０５、１０８および１０９から選択される配列の任意の位置において１、２、３または４個のヌクレオチドが異なる。その他の実施形態において、ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が配列番号８３−８６、８８−９１、９３−９６、９８−１０１から選択される配列の位置１−１９の任意の位置において、または配列番号１０４、１０５、１０８および１０９から選択される配列の任意の位置において少なくとも２、３または４個のヌクレオチドが異なる。
【００２４】
特定の好ましい実施形態において、本発明は配列番号８３によるヌクレオチド配列を含む単離されたｓｉＲＮＡポリヌクレオチドまたはその相補体、または配列番号８８によるヌクレオチド配列を含む単離されたｓｉＲＮＡポリヌクレオチドまたはその相補体、または配列番号９３によるヌクレオチド配列を含む単離されたｓｉＲＮＡポリヌクレオチドまたはその相補体、または配列番号９８によるヌクレオチド配列を含む単離されたｓｉＲＮＡポリヌクレオチドまたはその相補体、または配列番号１０４または１０５によるヌクレオチド配列を含む単離されたｓｉＲＮＡポリヌクレオチド、または配列番号１０８または１０９によるヌクレオチド配列を含む単離されたｓｉＲＮＡポリヌクレオチドを提供する。
【００２５】
上記の発明のその他の幾つかの実施形態によると、上記ポリヌクレオチドは天然に発生するヌクレオチドの合成ヌクレオチドアナログを少なくとも１つは含む。また別の実施形態において、上記ポリヌクレオチドは検出可能標識に連結され、さらに別の実施形態においては、上記標識は色素、放射性核種、発光基、蛍光基、およびビオチンから選択されるレポーター分子であり、さらに別の実施形態において上記蛍光基はフルオレセインイソチオシアネートである。また別の実施形態において、検出可能標識は磁気粒子である。関連実施形態によると、上記のｓｉＲＮＡポリヌクレオチドのいずれかと、生理学的に容認される担体とを含む薬学的組成物が提供され、ある実施形態においては担体はリポソームを含む。
【００２６】
本発明は、短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を転写することができるポリヌクレオチドを含む組換え核酸構築物も提供し、上記ポリヌクレオチドは（ｉ）第一のプロモータ；（ｉｉ）第二のプロモータ；および（ｉｉｉ）配列番号８３−８６、８８−９１、９３−９６、９８−１０１から選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む少なくとも１つのＤＮＡポリヌクレオチド・セグメントまたはその相補体を含んでなり、その際各ＤＮＡポリヌクレオチド・セグメントおよびその相補体は上記第一および第二プロモータの少なくとも１つに作動可能に結合し、上記プロモータ類は上記ＤＮＡポリヌクレオチド・セグメントおよびその逆相補体（ｒｅｖｅｒｓｅ ｃｏｍｐｌｍｅｎｔ）の転写をおこすような位置にある。また別の実施形態は、短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を転写に向かわせるポリヌクレオチドを含む組換え核酸構築物を提供する；上記ポリヌクレオチドは配列番号１０２、１０３、１０６および１０７から選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む少なくとも１つのＤＮＡポリヌクレオチド・セグメントに作動可能に結合するプロモータを含む。その他の一実施形態において、組換え核酸構築物は第一プロモータに作動可能に結合する第一エンハンサと、第二プロモータに作動可能に結合する第二エンハンサとから選択される少なくとも一つのエンハンサを含む。ある実施形態において、組換え核酸構築物は（ｉ）上記構築物中に位置し、第一プロモータによって指示される転写を終止させる第一転写ターミネータと（ｉｉ）上記構築物中に位置し、第二プロモータによって指示される転写を終止させる第二転写ターミネータとから選択される少なくとも１つの転写ターミネータを含む。その他の実施形態において、ｓｉＲＮＡはＰＴＰ１Ｂポリペプチドの発現を干渉することができ、その際ＰＴＰ１ＢポリペプチドはＧｅｎｂａｎｋ登録番号Ｍ３１７２４、ＮＭ＿００２８２７およびＭ３３６８９からなる群から選択される配列に示されるようなアミノ酸配列を含む。また別の実施形態において、本発明は短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を転写に向けることができるポリヌクレオチドを含む組換え核酸構築物を提供し、上記ポリヌクレオチドは少なくとも１つのプロモータとＤＮＡポリヌクレオチド・セグメントとを含み、上記ＤＮＡポリヌクレオチド・セグメントは上記プロモータに作動可能に結合し、上記ＤＮＡポリヌクレオチド・セグメントは（ｉ）配列番号８３−８６、８８−９１、９３−９６、９８−１０１から選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む少なくとも１つのＤＮＡポリヌクレオチドまたはその相補体；（ｉｉ）上記（ｉ）のＤＮＡポリヌクレオチドに作動可能に結合する少なくとも４つのヌクレオチドを含むスペーサ配列；および（ｉｉｉ）上記スペーサ配列に作動可能に結合する（ｉ）のＤＮＡポリヌクレオチドの逆相補体を含んでなる。その他のある実施形態において、ｓｉＲＮＡは少なくとも１つ、そして４つ以下のヌクレオチドのオーバーハングを有し、そのオーバーハングは（ｉｉｉ）の３’のすぐ近くに位置する。その他の実施形態において、スペーサ配列は少なくとも９ヌクレオチドを含む。さらに別の実施形態において、スペーサ配列は（ｉｉｉ）に隣接する２つのウリジンヌクレオチドを含む。また別の実施形態において、組換え核酸構築物はＤＮＡポリヌクレオチド・セグメントに作動可能に結合する少なくとも１つの転写ターミネータを含む。関連実施形態により、本発明は上記の組換え核酸構築物でトランスフォームまたはトランスフェクトされた宿主細胞を提供する。
【００２７】
本発明の幾つかの実施形態は、ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドと生理学的に容認される担体とを含む薬学的組成物を提供し、その組成物においてｓｉＲＮＡポリヌクレオチドが（ｉ）配列番号８３−８６、８８−９１、９３−９６、９８−１０１、１０４−１０５、および１０８−１０９から選択される少なくとも一つのヌクレオチド配列を含むＲＮＡポリヌクレオチド、（ｉｉ）配列番号８３−８６、８８−９１、９３−９６、９８−１０１から選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むＲＮＡポリヌクレオチドおよびその相補的ポリヌクレオチド、（ｉｉｉ）（ｉ）または（ｉｉ）によるＲＮＡポリヌクレオチドであって、ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が、配列番号８３−８６、８８−９１、９３−９６、９８−１０１に示される配列から選択される配列の位置１−１９の任意の位置、または配列番号１０４、１０５、１０８および１０９に示される配列から選択される配列の任意の位置の、１、２または３個のヌクレオチドによって異なるＲＮＡポリヌクレオチド、および（ｉｖ）（ｉ）または（ｉｉ）によるＲＮＡポリヌクレオチドであって、ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が配列番号８３−８６、８８−９１、９３−９６、９８−１０１に示される配列から選択される配列の１−１９位置の任意の位置、または配列番号１０４、１０５、１０８および１０９に示される配列から選択される配列の任意の位置の２、３または４個のヌクレオチドによって異なるｓｉＲＮＡポリヌクレオチドから選択される。また別の実施形態において、担体はリポソームを含む。
【００２８】
本発明のまた別の局面に目を向けると、ＰＴＰ１Ｂポリペプチドまたはその変異体の発現を干渉する方法であって、ＰＴＰ１Ｂポリペプチドを発現できる少なくとも１つの細胞を含む対象と、ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドとを、ＰＴＰ１Ｂポリペプチドの発現を干渉するのに十分な時間および十分な条件で接触させ、その際（ａ）ＰＴＰ１ＢポリペプチドがＧｅｎｂａｎｋ登録番号Ｍ３１７２４、ＮＭ＿００２８２７、ＮＭ＿０１１２０１およびＭ３３６８９から選択される配列に示されるようなアミノ酸配列を含み、（ｂ）ｓｉＲＮＡポリペプチドが（ｉ）配列番号８３−８６、８８−９１、９３−９６、９８−１０１、１０４−１０５、および１０８−１０９から選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むＲＮＡポリペプチド、（ｉｉ）配列番号８３−８６、８８−９１、９３−９６、９８−１０１から選択される少なくとも１つの配列を含むＲＮＡポリヌクレオチドおよびその相補的ポリヌクレオチド、（ｉｉｉ）ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が、配列番号８３−８６、８８−９１、９３−９６、９８−１０１に示される配列から選択される配列の位置１−１９の任意の位置、または配列番号１０４、１０５、１０８および１０９に示される配列から選択される配列の任意の位置の、１、２または３個のヌクレオチドによって異なる（ｉ）または（ｉｉ）に記載のＲＮＡポリヌクレオチド、および（ｉｖ）ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が配列番号；８３−８６、８８−９１、９３−９６、９８−１０１に示される諸配列から選択される配列の位置１−１９の任意の位置、または配列番号１０４、１０５、１０８および１０９に示される諸配列から選択される配列の任意の位置の２、３または４個のヌクレオチドによって異なる（ｉ）または（ｉｉ）に記載のＲＮＡポリヌクレオチド、から選択される前記方法が提供される。
【００２９】
本発明は、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｍ３１７２４、ＮＭ＿００２８２７、およびＭ３３６８９から選択される配列に示されるアミノ酸配列を含むＰＴＰ１ＢポリペプチドまたはこのＰＴＰ１Ｂポリペプチドの変異体の発現を干渉する方法であって、（ｉ）ＰＴＰ１Ｂポリペプチドを発現できる少なくとも１つの細胞を含む対象と、（ｉｉ）上記のような組換え核酸構築物とを、ＰＴＰ１Ｂポリペプチドの発現を干渉するのに十分な時間および十分な条件下で接触させることを含む前記方法も提供する。また別の実施形態においては、ＰＴＰ１Ｂシグナル導入経路のあるコンポーネントを確認するための、以下の諸工程を含む方法が提供される：Ａ．ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドと、ＰＴＰ１ＢポリペプチドまたはＰＴＰ１Ｂポリペプチド変異体を発現できる少なくとも１つの細胞を含む第一の生物学的サンプルとを、ｓｉＲＮＡが存在しない場合のＰＴＰ１Ｂの発現に十分な条件下で十分な時間接触させる；その際（１）上記ＰＴＰ１ＢポリペプチドはＧｅｎｂａｎｋ登録番号Ｍ３１７２４、ＮＭ＿００２８２７、およびＭ３３６８９から選択される配列に示されるようなアミノ酸配列を含み、（２）ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドは（ｉ）配列番号８３−８６、８８−９１、９３−９６、９８−１０１、１０４−１０５、および１０８−１０９から選択される少なくとも１つのヌクレオチドを含むＲＮＡポリヌクレオチド、（ｉｉ）配列番号８３−８６、８８−９１、９３−９６、９８−１０１から選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むＲＮＡポリヌクレオチドおよびその相補的ポリヌクレオチド、（ｉｉｉ）ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が、配列番号８３−８６、８８−９１、９３−９６、９８−１０１に示される配列から選択される配列の位置１−１９の任意の位置、または配列番号１０４、１０５、１０８および１０９に示される配列から選択される配列の任意の位置の、１、２または３個のヌクレオチドによって異なる（ｉ）または（ｉｉ）に記載のＲＮＡポリヌクレオチド、および（ｉｖ）ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が配列番号；８３−８６、８８−９１、９３−９６、９８−１０１に示される諸配列から選択される配列の１−１９位置の任意の位置、または配列番号１０４、１０５、１０８および１０９に示される諸配列から選択される配列の任意の位置の２、３または４個のヌクレオチドによって異なる（ｉ）または（ｉｉ）に記載のＲＮＡポリヌクレオチド、から選択され；Ｂ．上記細胞中のリン酸化され得る少なくとも１種類のタンパク質のリン酸化レベルと、ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドと接触させなかった対照サンプル中のそのタンパク質のリン酸化レベルとを比較し、その際ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドが存在しない場合のタンパク質のリン酸化レベルに比較したｓｉＲＮＡポリヌクレオチドの存在下における上記タンパク質のリン酸化レベルの変化は、そのタンパク質がＰＴＰ１Ｂシグナル導入経路の一コンポーネントであることを示唆する。さらに別の実施形態において、上記シグナル導入経路はＪａｋ２キナーゼを含む。
【００３０】
また別の局面において、本発明は細胞内のインスリンレセプタータンパク質のリン酸化状態を調節するための方法であって、上記細胞とｓｉＲＮＡポリヌクレオチドとをＰＴＰ１Ｂポリペプチドの発現を干渉するのに十分な条件下で十分な時間接触させ、その際（ａ）ＰＴＰ１ＢポリペプチドはｆＧｅｎｂａｎｋ登録番号Ｍ３１７２４、ＮＭ＿００２８２７、ＮＭ＿０１１２０１、およびＭ３３６８９から選択される配列で示されるようなアミノ酸配列を含み、（ｂ）ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドが（ｉ）配列番号８３−８６、８８−９１、９３−９６、９８−１０１またはその相補体および配列番号１０４、１０５、１０８、および１０９から選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むＲＮＡポリヌクレオチド、（ｉｉ）配列番号８３−８６、８８−９１、９３−９６、９８−１０１から選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むＲＮＡポリヌクレオチドおよびその相補的ポリヌクレオチド、（ｉｉｉ）ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が、配列番号８３−８６、８８−９１、９３−９６、９８−１０１に示される諸配列から選択される配列の位置１−１９の任意の位置、または配列番号１０４、１０５、１０８および１０９に示される諸配列から選択される配列の任意の位置の、１、２または３個のヌクレオチドによって異なる（ｉ）または（ｉｉ）に記載のＲＮＡポリヌクレオチド、および（ｉｖ）ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が、配列番号；８３−８６、８８−９１、９３−９６、９８−１０１に示される諸配列から選択される配列の１−１９位置の任意の位置、または配列番号１０４、１０５、１０８および１０９に示される諸配列から選択される配列の任意の位置にある２、３または４個のヌクレオチドによって異なる（ｉ）または（ｉｉ）に記載のＲＮＡポリヌクレオチド、から選択され、（ｃ）インスリンレセプタータンパク質が、配列番号＿−＿からなる群から選択されるアミノ酸配列またはその変異体を含むポリペプチドを有する前記方法を提供する。
【００３１】
また別の実施形態において、細胞内のＪａｋ２タンパク質のリン酸化状態を変化させる方法であって、上記細胞とｓｉＲＮＡポリヌクレオチドとを、ＰＴＰ１Ｂポリペプチドの発現を干渉するのに十分な条件下で十分な時間接触させることを含む方法が提供される；その際（ａ）ＰＴＰ１ＢポリペプチドはＧｅｎｂａｎｋ登録番号Ｍ３１７２４、ＮＭ＿００２８２７、ＮＭ＿０１１２０１およびＭ３３６８９から選択される配列で示されるアミノ酸配列を含み、（ｂ）ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドは、（ｉ）配列番号８３−８６、８８−９１、９３−９６および９８−１０１またはその相補体および配列番号１０４、１０５、１０８および１０９から選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むＲＮＡポリヌクレオチド、（ｉｉ）配列番号８３−８６、８８−９１、９３−９６および９８−１０１から選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むＲＮＡポリヌクレオチドおよびその相補的ポリヌクレオチド、（ｉｉｉ）ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が、配列番号８３−８６、８８−９１、９３−９６、９８−１０１に示される諸配列から選択される配列の位置１−１９の任意の位置、または配列番号１０４、１０５、１０８および１０９に示される諸配列から選択される配列の任意の位置にある１、２または３個のヌクレオチドによって異なる（ｉ）または（ｉｉ）に記載のＲＮＡポリヌクレオチド、および（ｉｖ）ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が、配列番号；８３−８６、８８−９１、９３−９６、９８−１０１に示される諸配列から選択される配列の１−１９位置の任意の位置、または配列番号１０４、１０５、１０８および１０９に示される諸配列から選択される配列の任意の位置にある２、３または４個ののヌクレオチドによって異なる（ｉ）または（ｉｉ）に記載のＲＮＡポリヌクレオチド、から選択され、（ｃ）Ｊａｋ２タンパク質は、配列番号＿−＿からなる群から選択されるアミノ酸配列またはその変異体を含むポリペプチドを有する。本発明のまた別の実施形態はＪａｋ２関連性疾患を治療する方法であって、その治療を必要とする対象に上記の薬学的組成物を投与し、その際ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドはＰＴＰ１Ｂポリペプチドまたはその変異体の発現を阻害するという方法を提供する。ある実施形態において、Ｊａｋ２関連性疾患は糖尿病、肥満、高血糖性アポトーシス、炎症または神経変性疾患である。また別の局面において、本発明は短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）ポリヌクレオチドを提供する：このｓｉＲＮＡは、ある実施形態では配列番号８３−８６、８８−９１、９３−９６、９８−１０１、１０４−１０５、および１０８−１０９から選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含み、ある別の実施形態では配列番号８３−８６、８８−９１、９３−９６、９８−１０１およびその相補的ポリヌクレオチドから選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む。本発明は配列番号１８−２１、３３−３６、４３−４６、５３−５６および５８−６１から選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むＲＮＡポリヌクレオチドを含む短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）も提供する。その他のある実施形態は、上記の配列番号を有するヌクレオチド配列を含む単離されたｓｉＲＮＡ類に関連するものであり、このようなｓｉＲＮＡを作り、治療に使用するための組成物および方法も含む。
【００３２】
本発明のこれらのおよびその他の実施形態は下記の詳細な説明および添付の図面を参照することによって明らかとなる。ここに開示される全ての参考文献は、個別に組み込めるように、参考としてそのまま本明細書に組み込まれる。同時に出願された同時係属出願、出願番号＿＿および出願番号＿＿（それぞれ弁理士整理番号２００１２５．４４１Ｄ１および２００１２５．４４８）も参考として組み込まれる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３３】
（発明の詳細な説明）
本発明は、一部は、ヒトまたはマウスＰＴＰ１Ｂポリペプチドのような所望のＰＴＰ１Ｂポリペプチド（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｍ３１７２４、ＮＭ＿００２８２７、ＮＭ＿０１１２０１、Ｍ３３６８９、ＮＭ＿０１２６３７、ＮＭ＿０１２６３７、Ｍ３３９６２；発明番号：＿−＿；Ａｎｄｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００１ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２１：７１１７）またはその変異体の発現を特異的に調節することができる短いＲＮＡポリヌクレオチド配列の予期せざる発見に関する。理論によって束縛されるものではないが、本発明のＲＮＡポリヌクレオチドは短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）のメカニズムを加えることによって所望標的ポリペプチドの発現を特異的に低減する。とりわけ、そして本明細書に非常に詳細に記載するように、本発明によって、所望ＰＴＰ１Ｂ標的ポリペプチドをコードする対応ポリヌクレオチド配列から誘導される、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６または２７ヌクレオチドを含む幾つかの特殊なＲＮＡｉオリゴヌクレオチド配列の驚くべき確認に関係する組成物および方法が提供される。これらの配列は任意のアルゴリズム、配列アラインメント実験またはその他の系統的パラダイムによって予想することはできず、本明細書に始めて開示されるオリゴヌクレオチドのような、実際的候補オリゴヌクレオチドの生成、およびそれらのＲＮＡｉ活性の機能的試験によって決定しなければならない。
【００３４】
本発明の好ましい実施形態において、ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドはＰＴＰ１Ｂ標的ポリペプチドまたはその変異体の発現を干渉し、ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドはそのヌクレオチド塩基配列が、標的ポリペプチドをコードする標的ポリヌクレオチド、例えば、標的ｍＲＮＡ配列またはそのようなｍＲＮＡをコードするエキソン配列の、一部分の配列に特異的に対応するＲＮＡオリゴヌクレオチドまたはＲＮＡポリヌクレオチドを含む。好ましい実施形態において、本発明は哺乳動物（ある特に好ましい実施形態ではヒトであり、ある特に好ましい実施形態では非ヒト哺乳動物である）の特殊なポリペプチドの発現を干渉するｓｉＲＮＡポリヌクレオチドに関係する。したがって、非制限的理論によると、本発明のｓｉＲＮＡポリヌクレオチドは、所望ＰＴＰ１ＢをコードするｍＲＮＡの配列特異的分解に導く。
【００３５】
（ｓｉＲＮＡポリヌクレオチド）
ここに使用する用語「ｓｉＲＮＡ」は（ｉ）長さが１８塩基対、１９塩基対、２０塩基対、２１塩基対、２２塩基対、２３塩基対、２４塩基対、２５塩基対、２６塩基対、２７塩基対、２８塩基対、２９塩基対または３０塩基対であり、ＰＴＰ−１ＢポリペプチドまたはＰＴＰ−１Ｂポリペプチド変異体の発現および活性を干渉することができる、二本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチド、またはポリヌクレオチドであって、その際ｓｉＲＮＡの一本鎖がＰＴＰ−１Ｂポリペプチド、その変異体、またはその相補的配列をコードするＲＮＡポリヌクレオチド配列の一部を含む、上記二本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド；（ｉｉ）１８ヌクレオチド、１９ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、２１ヌクレオチド、２２ヌクレオチド、２３ヌクレオチド、２４ヌクレオチド、２５ヌクレオチド、２６ヌクレオチド、２７ヌクレオチド、２８ヌクレオチド、２９ヌクレオチドまたは３０ヌクレオチドの長さを有し、標的ＰＴＰ−１Ｂポリペプチド、またはＰＴＰ−１Ｂポリペプチド変異体の発現および／または活性を干渉することができるか、または相補的配列にアニールして標的ポリペプチド発現を干渉できるｄｓＲＮＡを形成するか、いずれかである一本鎖オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドであって、その際そのような一本鎖オリゴヌクレオチドはＰＴＰ−１Ｂポリペプチド、その変異体、またはその相補的配列をコードするＲＮＡポリヌクレオチド配列の一部を構成する上記一本鎖オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド；または（ｉｉｉ）このようなオリゴヌクレオチド、またはポリヌクレオチドが１、２、３または４個の核酸の変化または置換を有する上記（ｉ）または（ｉｉ）のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのいずれかを意味する。以下に記載される幾つかのＲＮＡｉオリゴヌクレオチド配列はＰＴＰ１Ｂポリペプチドをコードする標的ｍＲＮＡの３’非コーディング領域に相補的である。
【００３６】
ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドは、ＲＮＡ干渉、転写後遺伝子サイレンシングメカニズム、の効果を媒介するＲＮＡ核酸分子である。ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドは二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を含むのが好ましいが、それに限定するものではなく、一本鎖ＲＮＡを含むこともできる（Ｍａｒｔｉｎｅｚ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １１０：５６３−７４（２００２））。ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドはここに提供されるようなヌクレオチド類（リボヌクレオチド類またはデオキシリボヌクレオチド類または両者の組み合わせ）および／またはヌクレオチドアナログのその他の天然発生性、組換え、または合成一本鎖または二本鎖ポリマー（例えば、５’→３’ホスホジエステル結合をしたオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドなど）を含む。よって、本発明のｓｉＲＮＡポリヌクレオチドの転写に導くことができるＤＮＡ配列として本明細書に開示される幾つかの例示的配列は、相補的ヌクレオチド塩基ペアリングの原理が十分確立されているならば、対応するＲＮＡ配列およびそれらの相補体も含めて記載するものであることは当然である。ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡポリメラーゼプロモータ、例えば、Ｕ６プロモータまたはＨ１ ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモータなどを含むＤＮＡ（ゲノム、ｃＤＮＡまたは合成）をテンプレートとして用いて転写される。あるいは、ｓｉＲＮＡは合成的に誘導されたＲＮＡ分子でもよい。特定の実施形態において、本発明のｓｉＲＮＡポリヌクレオチドは平滑末端を有する、すなわち、二本鎖において一本の鎖の各ヌクレオチドは対置する鎖のヌクレオチドと完全に相補的である（例えば、ワトソン−クリック塩基対）。その他のある実施形態において、本発明のｓｉＲＮＡポリヌクレオチドの少なくとも一つの鎖は、ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドのいずれかの鎖、より好ましくは両方の鎖の３’末端において「オーバーハング」した（すなわち、対置鎖の相補的塩基と塩基対を形成していない）少なくとも１つ、より好ましくは２つのヌクレオチドを有する。本発明の好ましい実施形態において、ｓｉＲＮＡポリヌクレオチド二本鎖の各鎖は３’末端に２ヌクレオチド−オーバーハングを有する。２ヌクレオチド−オーバーハングは好ましくはチミジン・ジヌクレオチド（ＴＴ）であるが、その他の塩基を含んでもよい、例えば、ＴＣジヌクレオチドまたはＴＧジヌクレオチド、またはその他の任意のジヌクレオチドなど。ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドの３’末端の検討のためにはＷＯ０１／７５１６４などを参照されたい。
【００３７】
好ましいｓｉＲＮＡポリヌクレオチドとしては、約１８−３０ヌクレオチド塩基対、より好ましくは約１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６または２７塩基対、その他の好ましい実施形態では約１９、２０、２１、２２、または２３塩基対、または約２７塩基対の二本鎖オリゴマーヌクレオチドが含まれる。ここで上に記した「約（ａｂｏｕｔ）」という語の使用は、ある実施形態において、ある条件下では、選択されたポリペプチドの発現を干渉することができる機能的ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドを生成する操作的切断過程は無条件には効率的でないことを示唆する。例えば、「約」１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５塩基対のｓｉＲＮＡポリヌクレオチドは、非制限的理論によるプロセッシング、生合成または人工的合成における変動性の結果として、長さが１、２、３または４個の塩基対だけ異なる（例えば、ヌクレオチド挿入または欠失によって）ｓｉＲＮＡポリヌクレオチド分子を１つ以上含む。考慮される本発明のｓｉＲＮＡポリヌクレオチドも、特定の配列から１、２、３または４つのヌクレオチドだけ異なる（例えば、ヌクレオチド置換（移動または転換を含む）によって）ことによって多様性を示すポリヌクレオチド配列を含む。その差異は、二本鎖ポリヌクレオチドのセンス鎖に位置するかアンチセンス鎖に位置するかには無関係に、分子の長さによって、特定のｓｉＲＮＡポリヌクレオチド配列の位置１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８または１９の任意の位置に、またはｓｉＲＮＡポリヌクレオチドの位置２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６または２７に起きる。ヌクレオチド置換は二本鎖ポリヌクレオチドの一つの鎖だけに、例えば、アンチセンス鎖だけに見いだされ、上記置換されたヌクレオチドが一般的には水素結合塩基対を形成する相補的ヌクレオチドは、必ずしもこれに対応してセンス鎖が置換されていなくともよい。好ましい実施形態において、ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドはある特殊なヌクレオチド配列に関して相同である。ここに記載されるように、好ましいｓｉＲＮＡポリヌクレオチドはＰＴＰ−１Ｂポリペプチドの発現を干渉する。これらのポリヌクレオチド類はプローブまたはプライマーとしても使用される。
【００３８】
本発明のｓｉＲＮＡポリヌクレオチドであるポリヌクレオチド類は、ある実施形態において、一本鎖オリゴヌクレオチド・フラグメント（例えば、約１８−３０ヌクレオチド；これは１８から３０までの任意の整数のヌクレオチドを含むものと理解すべきである）および普通はスペーサ配列によって分離されているその逆相補体を含む一本鎖ポリヌクレオチドから誘導される。そのようなある実施形態によると、上記スペーサの切断は一本鎖オリゴヌクレオチド・フラグメントとその逆相補体とを与え、それらがアニールして本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドを形成（任意に、どちらかの鎖または両方の鎖の３’末端および／または５’末端から１、２、３またはそれ以上のヌクレオチドの付加または除去をおこす追加的プロセッシング工程で）できるようにする。ある実施形態において、スペーサの切断前（任意に、どちらかの鎖または両方の鎖の３’末端および／または５’末端から１、２、３またはそれ以上のヌクレオチドの付加または除去をおこす追加的プロセッシング工程の前）には、そのスペーサは上記フラグメントおよびその逆相補体がアニールして二本鎖構造（例えば、ヘアピンポリヌクレオチドのような構造）を形成できるような長さである。そのためスペーサ配列は、本発明において作られるような、２つの相補的ポリヌクレオチド配列領域（これらの領域はアニールして二本鎖核酸を形成した際にｓｉＲＮＡポリヌクレオチドを構成する）の間に位置する任意のポリヌクレオチド配列でよい。スペーサ配列は少なくとも４つのヌクレオチドを含むのが好ましいが、ある実施形態においては、そのスペーサは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１−２５、２６−３０、３１−４０、４１−５０、５１−７０、７１−９０、９１−１１０、１１１−１５０、１５１−２００またはそれ以上のヌクレオチドを含み得る。スペーサによって分離された２つの相補的ヌクレオチド配列を含む一本鎖ヌクレオチドから誘導されるｓｉＲＮＡポリヌクレオチドの例が、記載されている（Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ ｅｔ ａｌ．，２００２ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９６：５５０；Ｐａｄｄｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００２ Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖｅｌｏｐ．１６：９４８；Ｐａｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：５０５−５０８（２００２）；Ｇｒａｂａｒｅｋ ｅｔ ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ３４：７３４−４４（２００３））。
【００３９】
ポリヌクレオチド変異体は、ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドの活性が実質的に低下しないように、上記のように１つ以上の置換、付加、欠失および／または挿入を含むことができる。ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドの活性に対する効果は、概ね、ここに記載されるようにして、または一般的方法によって評価される。変異体は、天然（ネイティブ）ＰＴＰ−１Ｂをコードするポリヌクレオチド配列の部分の少なくとも７５％、７８％、８０％、８５％、８７％、８８％または８９％の同一性を示すのが好ましく、少なくとも約９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を示すのがより好ましい。パーセント同一性は、ポリヌクレオチド類の配列と、完全ＰＴＰ１Ｂポリヌクレオチドの対応部分とを、当業者には公知のように、しかも本明細書に記載のように、ＡｌｉｇｎアルゴリズムまたはＢＬＡＳＴアルゴリズムなどの当業者に公知のコンピューターアルゴリズムの使用を含む任意の方法を用いて比較することによって容易に決定できる（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１９：５５５−５６５、１９９１；Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ａｎｄ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５−１０９１９，１９９２）。上記アルゴリズムはＮＣＢＩウェブサイトで使用できる（［ｏｎｌｉｎｅ］Ｉｎｔｅｒｎｅｔ：＜ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ／ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ＢＬＡＳＴを参照）。既定のパラメータを使用できる。
【００４０】
特定のｓｉＲＮＡポリヌクレオチド変異体は、天然ＰＴＰ１Ｂ遺伝子の一部分に実質的に相同である。このようなポリヌクレオチド変異体から誘導される（例えば、熱変性によって）一本鎖核酸はおだやかなストリンジェント条件下でハイブリッド化し、天然ＰＴＰ１Ｂポリペプチド（または相補的配列）をコードする天然発生性ＤＮＡまたはＲＮＡ配列を形成することができる。おだやかなストリンジェント条件下で検出可能にハイブリッド化するポリヌクレオチドは、ある特定のポリヌクレオチドに相補的な、少なくとも１０連続ヌクレオチドを含むヌクレオチド配列、より好ましくは１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０の連続ヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を有する。ある好ましい実施形態において、このような配列（またはその相補体）は、発現の干渉が望まれるＰＴＰ１Ｂポリペプチドに特異的であり、ある別の実施形態においては、ＰＴＰ１Ｂ、およびポリペプチド発現の干渉が望まれる１種類以上のＰＴＰがその配列（またはその相補体）を共有している。
【００４１】
適切なおだやかなストリンジェント条件とは、例えば、５Ｘ ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、１．０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の溶液中で予備的洗浄；５０℃〜７０℃、５Ｘ ＳＳＣで１〜１６時間（例えば、一晩）ハイブリダイゼーション；その後２２−６５℃で、０．０５〜０．１％ＳＤＳを含む２Ｘ、０．５Ｘおよび０．２Ｘ ＳＳＣのうちの１種類以上によって、２０〜４０分間、１または２回洗浄することを含む。付加的ストリンジェンシーのためには、条件は、５０〜６０℃の０．１Ｘ ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ中で１５−４０分洗浄することを含む。当業者には公知のように、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーの変動は、プレ−ハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーションおよび洗浄過程に使用される時間、温度、および／または溶液の濃度を変えることによって実現する。適切な条件は一部には、使用するプローブの、およびブロットされた発端核酸サンプルの特殊なヌクレオチド配列にも依存する。よって、プローブの所望の選択性が確認される場合は、そのプローブが１つ以上のある発端配列にはハイブリッド化することができ、その他の発端配列にはハイブリッド化できないという特性に基づいて、余計な実験を行うことなく適切なストリンジェント条件を容易に選択できることは当然である。
本発明の配列特異的ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドは、数種の基準のうちの１種類以上を使用して設計される。例えば、対象のポリペプチド（例えば、本明細書に記載のＰＴＰ１Ｂおよびその他のポリペプチド）をコードする配列に同一の１９連続ヌクレオチドを有するｓｉＲＮＡポリヌクレオチドを設計するために、そのポリヌクレオチド配列のオープン・リーディング・フレームを、下記の特性の一つ以上を有する２１塩基配列について走査する：（１）比 Ａ＋Ｔ／Ｇ＋Ｃが約１：１で、２：１または１：２より大きくない；（２）５’末端にＡＡジヌクレオチドまたはＣＡジヌクレオチド；（３）内部ヘアピンループの融点が５５℃未満；（４）ホモダイマー融点が３７℃未満（（３）および（４）に記載した融点の計算は、当業者に公知のコンピュータソフトウエアを使用して決定できる）；（５）少なくとも１６連続ヌクレオチドの配列がその他のあらゆる公知のポリヌクレオチド配列に存在することが確認されていない（このような評価は、市販されるデータベースを検索するためのＢＬＡＳＴなど当業者が使用できるコンピュータプログラムを用いて容易に確認できる）。あるいは、ｓｉＲＮＡポリヌクレオチド配列は、種々の販売会社（オリゴエンジン（ＯｌｉｇｏＥｎｇｉｎｅ）（商標）（シアトル、ＷＡ）；ダルマコン社（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ，Ｉｎｃ．）（ラファイエット、ＣＯ）；アンビオン社（Ａｍｂｉｏｎ Ｉｎｃ．）（オースチン、ＴＸ）；およびキアゲン社（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．）（バレンシア、ＣＡ）など）から市販されるコンピュータソフトウェアを使用して設計および選択できる。（Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １５：１８８−２００（２０００）；Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４１１：４９４−９８（２０００）；および［ｏｎｌｉｎｅ］Ｉｎｔｅｒｎｅｔ：＜ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ／．ｍｐｉｂｐｃ．ｇｗｄｇ．ｄｅ／ａｂｔｅｉｌｕｎｇｅｎ／／１００／１０５／Ｔｕｓｃｈｌ＿ＭＩＶ２（３）＿２００２．ｐｄｆ．も参照されたい）。その後ｓｉＲＮＡポリヌクレオチド類を、それらの標的ポリペプチドの発現を干渉する能力について当業者に公知の、ここに記載される方法によって試験することができる。ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドの効果の測定は、そのポリペプチド発現干渉能力の考察だけでなく、そのｓｉＲＮＡポリヌクレオチドが有害な毒性作用、例えば、細胞のアポトーシスなどを示すかどうかの考察も含む；細胞死はＲＮＡ干渉（例えば、細胞内のＰＴＰ１Ｂ発現の干渉）の望ましい効果ではない。
【００４２】
上記の方法を使用して設計された全てのｓｉＲＮＡがＰＴＰ１Ｂ標的ポリペプチドの発現のサイレンシングまたは干渉において有効であるとは限らないことを認めなければならない。さらに、上記のｓｉＲＮＡ類は種々異なる程度にサイレンシングをおこす。このようなｓｉＲＮＡ類をそれらの有効性について試験し、与えられたｓｉＲＮＡの、ＰＴＰ１Ｂの発現を干渉または調節する（例えば、統計的に有意に減少させるなど）能力に基づいて選択を行わなければならない。よって、ＰＴＰ１Ｂポリペプチドの発現を干渉することができる特殊なｓｉＲＮＡポリヌクレオチドの確認には、以下により詳細に示すように、各ｓｉＲＮＡの作製および試験が必要である（実施例参照）。
【００４３】
さらに、タンパク質発現を干渉する全てのｓｉＲＮＡが生理的に重要な効果を有するとは限らない。発明者はここに、細胞増殖、アポトーシス誘発および／またはタンパク質チロシンリン酸化（インスリンレセプターリン酸化など）レベルの変化など、調節した標的ポリペプチドの発現の影響を測定して、本発明のｓｉＲＮＡの使用によって認められる標的タンパク質発現の干渉レベルが臨床的に適切な重要性を有するかどうかを決定するための、生理学的に適切なアッセイを考案し、ここに記載する。さらに、非制限的理論により、本発明は対象とする１種類以上のポリペプチドの変化した（例えば、統計的に有意に減少または増加した）発現レベルおよび／または対象とする１種類以上のリンタンパク質の変化した（すなわち、増加または減少した）リン酸化レベルを企図する。上記変化したレベルは、特異的標的ポリペプチド発現のＲＮＡｉ媒介性阻害に反応して誘発されるＰＴＰ１Ｂタンパク質発現および／または細胞代償メカニズムの障害に起因し得る。
【００４４】
当業者は、遺伝コードの変性の結果、ここに記載される一つのポリペプチドを多くのヌクレオチド配列がコードし得ることを容易に理解する。すなわち、あるアミノ酸は数種のコドンの一つによってコードされることもあり、ある特定のヌクレオチド配列が他とは異なる（これはここに開示され、当業者に公知のアラインメント法によって確認できる）一方、それらの配列が同一アミノ酸配列を有するポリペプチドをコードできることを当業者は容易に確認することができる。例を挙げると、ポリペプチド中のアミノ酸ロイシンは６種類のコドン（ＴＴＡ、ＴＴＧ、ＣＴＴ、ＣＴＣ、ＣＴＡおよびＣＴＧ）の一つによってコードされる。それはセリンも同様である（ＴＣＴ、ＴＣＣ、ＴＣＡ、ＴＣＧ、ＡＧＴおよびＡＧＣ）。その他のアミノ酸、例えば、プロリン、アラニン、バリンなどは４種類のコドン（プロリンではＣＣＴ、ＣＣＣ、ＣＣＡ、ＣＣＧ；アラニンではＧＣＴ、ＧＣＣ、ＧＣＡ、ＧＣＧ；バリンではＧＴＴ、ＧＴＣ，ＧＴＡ、ＧＴＧ）の任意の１種類によってコードされる。これらのポリヌクレオチドの幾つかは、任意の天然遺伝子のヌクレオチド配列に対して最小の相同性を有する。それにもかかわらず、コドン利用の差によって変動するポリヌクレオチド類を本発明は詳細に考慮する。
【００４５】
標的ポリヌクレオチド（例えば、対象とする標的ポリペプチドをコードすることができるポリヌクレオチド）を含むポリヌクレオチド類を、特に所望されるｓｉＲＮＡポリヌクレオチドの作製のために、およびｓｉＲＮＡポリヌクレオチドに使用される所望配列の同定および選択のために有用な種々の方法の中の任意の方法を使用して作ることができる。例えば、ポリヌクレオチドを適切な細胞または組織型から作られたｃＤＮＡから増幅することができる。このようなポリヌクレオチドはポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）によって増幅される。このアプローチでは、配列特異的プライマーをここに提供される配列に基づいて設計してもよいし、購入または合成することもできる。増幅部分を利用して、公知の方法によって適切なライブラリー（例えば、ヒト骨格筋ｃＤＮＡ）から完全長の遺伝子またはその所望部分を分離することができる。このような方法では、ライブラリー（ｃＤＮＡまたはゲノムのライブラリー）を増幅に適した１種類以上のポリヌクレオチドプローブまたはプライマーを使用してスクリーニングする。好ましくはライブラリーは比較的大きい分子を含むようにサイズで選択する。ランダム・プライムド・ライブラリーも遺伝子の５’および上流領域を確認するためには好ましい。本発明によって考慮されるｓｉＲＮＡポリヌクレオチドのための適切な配列もｓｉＲＮＡポリヌクレオチド配列のライブラリーから選択できる。
【００４６】
ハイブリダイゼーション法では、部分的配列を公知の方法によって標識化する（例えば、ニック−トランスレーション法または^３２Ｐによる末端標識化）。細菌またはバクテリオファージ・ライブラリーをその後変性細菌コロニーを含むフィルター（またはファージ・プラークを含むローン（ｌａｗｎｓ））を標識化プローブとハイブリッド化することによってスクリーニングすることができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，２００１ などを参照されたい）。ハイブリダイジング・コロニーまたはプラーク類を選択し、増殖させ、ＤＮＡを単離してその後分析する。クローン類を分析し、部分的配列からのプライマーとベクターからのプライマーを用いるＰＣＲなどによって追加的配列の量を決定することができる。制限地図および部分的配列を作り、１種類以上の重なり合うクローンを確認することができる。完全長のｃＤＮＡ分子は、公知の方法を用いて適切なフラグメントを結合することによって作ることができる。
【００４７】
あるいは、部分的ｃＤＮＡ配列から完全長コーディング配列を得るための多数の増幅法が当業者には公知である。このような方法の中で、増幅はＰＣＲによって行われるのが普通である。このような一方法は「急速ｃＤＮＡ末端増幅」またはＲＡＣＥとして知られている。この方法は内部プライマーおよび外部プライマーの使用を含む。これはポリＡ領域またはベクター配列にハイブリッド化し、既知配列の５’および３’である配列を確認する。種々の市販キットのうちの任意のキットを使用して増幅工程を行うことができる。プライマー類は例えば、当業者に公知のソフトウェアを使用して設計できる。プライマー類（またはここに考慮されるその他の用途のためのオリゴヌクレオチド、例えば、プローブ類およびアンチセンスオリゴヌクレオチド類）は、長さが好ましくは１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、または３２ヌクレオチドであり、少なくとも４０％のＧＣ含有量を有し、約５４℃ないし７２℃の温度で標的配列にアニールする。増幅領域は上記のように配列決定され、オーバーラッピング配列は連続配列に組み立てられる。本発明によって考慮されるある種のオリゴヌクレオチドはある好ましい実施形態では１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３−３５、３５−４０、４１−４５、４６−５０、５６−６０、６１−７０、７１−８０、８１−９０またはそれ以上のヌクレオチド長を有する。
【００４８】
ＰＴＰ１Ｂポリペプチド発現を干渉するために有用な多数の特異的ｓｉＲＮＡポリヌクレオチド配列が実施例、図面および配列表に示される。ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドは一般的に、固相化学合成などを含む当業者に公知の任意の方法によって作られる。ポリヌクレオチド配列の修飾もオリゴヌクレオチド指向性部位特異的突然変異誘発などの標準的突然変異誘発法を使用して挿入される。さらに、ｓｉＲＮＡは化学的に修飾されまたは結合して、それらの血清中安定性および／または送達性を改善することができる。本発明の一局面として、リボースが除去されたここに記載のｓｉＲＮＡが含まれる。あるいは、ｓｉＲＮＡポリヌクレオチド分子が適切なＤＮＡ配列（例えば、ＰＴＰをコードするポリヌクレオチド配列、またはその所望部分）のインビトロまたはインビボ転写によって作られる。その際上記ＤＮＡが、適切なＲＮＡポリメラーゼプロモータ（Ｔ７、Ｕ６、Ｈ１またはＳＰ６など）を有するベクターに組み込まれることが条件である。さらに、ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドは、所望ｓｉＲＮＡがインビボで生成できるような転写（および任意に適切なプロセッシング過程）を助長するＤＮＡ配列（例えば、ここに提供される組換え核酸構築物など）のように、患者に投与することができる。
【００４９】
よって、ＰＴＰ１Ｂコーディング配列の少なくとも部分に相補的なｓｉＲＮＡポリヌクレオチドは、遺伝子発現を調節するために使用され、またはプローブまたはプライマーとして使用される。ｓｉＲＮＡポリヌクレオチド配列およびそれらを標的に送達するためのＤＮＡコーディング遺伝子の確認は、ＰＴＰ１Ｂに関連してここに記載される方法に関係する。このようなｓｉＲＮＡポリヌクレオチド配列およびそれらを標的に送達するためのＤＮＡコーディング遺伝子の確認も、ここに記載される方法に関係する。上に述べたように、ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドは好ましい安定性特性を示し、必ずしも必要ではないがホスホロチオエート、メチルホスホネート、スルホン、スルフェート、ケチル、ホスホロジチオエート、ホスホルアミデート、リン酸エステル、およびこの種のその他の結合などの結合の使用によって内因性核酸分解酵素による分解に抵抗するようにさらに設計してもよい（Ａｇｒｗａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．２８：３５３９−３５４２（１９８７）；Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．９３：６６５７−６６６５（１９７１）；Ｓｔｅｃ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．２６：２１９１−２１９４（１９８５）；Ｍｏｏｄｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２：４７６９−４７８２（１９８９）；Ｕｚａｎａｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９８９）；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ４０：１３７−１４３（１９８４）；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５４：３６７−４０２（１９８５）；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｔｒｅｎｄ Ｂｉｏｌ．Ｓｃｉ．１４：９７−１００（１９８９）；Ｓｔｅｉｎ，Ｉｎ：Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ｃｏｈｅｎ，ｅｄ．，Ｍａｃｍｉｌｌａｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，ｐｐ．９７−１１７（１９８９）；Ｊａｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７：７２３７−７２４６（１９８８））。
【００５０】
本発明の任意のポリヌクレオチドをさらに修飾してインビボ安定性を高めることができる。可能な修飾は、非制限的に、５’および／または３’末端へのフランキング配列の付加；主鎖におけるホスホジエステル結合よりむしろホスホロチオエートまたは２’Ｏ−メチル結合の使用；および／またはイノシン、クエオシン、およびワイブトシンなどの非伝統的塩基類、ならびにアデニン、シチジン、グアニン、チミンおよびウリジンのアセチル−、メチル−、チオ−およびその他の修飾された型の挿入を含む。
【００５１】
本明細書に記載されるヌクレオチド配列は、確立された組換えＤＮＡ法によってその他の種々の配列に結合することができる。例えば、あるポリヌクレオチドを、プラスミド、ファージミド、ラムダファージ誘導体、およびコスミドなど、種々のクローニングベクターのいずれかにクローン化することができる。特に興味深いベクターには、発現ベクター、複製ベクター、プローブ生成ベクターおよびシークエンシング・ベクターなどがある。概して適切なベクターは少なくとも１種類の生体において機能する複製開始点、適切な（ｃｏｎｖｅｎｉｅｎｔ）制限酵素部位、および１つ以上の選択可能マーカーを含む。（ＷＯ０１／９６５８４；ＷＯ０１／２９０５８；米国特許第６３２６１９３号；Ｕ．Ｓ．２００２／０００７０５１などを参照されたい）。その他の因子は所望の用途に依存し、当業者には明らかである。例えば、本発明は、インビボでＰＴＰ１Ｂポリペプチドのような所望標的ポリペプチドの発現を干渉するためのベクターを含む組換え核酸構築物の作製にｓｉＲＮＡポリヌクレオチド配列を使用することを考慮する；本発明は、ｓｉＲＮＡトランスジェニックまたは「ノックアウト」動物および細胞（１種類以上の所望ポリペプチド（標的ポリペプチドなど）の発現が完全または部分的に抑制されている細胞、細胞クローン、系、系統または生体など）の生成も考慮する。本明細書に記載されるような所望ポリペプチドの発現に干渉できるｓｉＲＮＡポリヌクレオチドとは、ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドの不在下で標的ポリペプチド発現が十分に起きる条件で、十分な時間、ここに提供される対象または生物学的ソースと接触させた際に、検出できる標的ポリペプチドの発現レベルの統計的有意な減少（あるいは、発現の「ノックダウン」とも言う）を起こす任意のｓｉＲＮＡポリヌクレオチドなどである。その減少は、当業者に公知の、本明細書に提供される一般的ポリペプチド発現測定法を使用して、ｓｉＲＮＡの不在下で検出されるポリペプチドの発現レベルに対して１０％より大きいのが好ましく、２０％より大きいのがより好ましく、３０％より大きいのがより好ましく、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９８％より大きいのがより好ましい。細胞中のｓｉＲＮＡポリヌクレオチドの存在が細胞のアポトーシスまたは細胞死などの不都合な毒性作用を起こさないのが好ましい（この場合細胞のアポトーシスはＲＮＡ干渉の所望効果ではない）。
【００５２】
特定の実施形態において、ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドは哺乳動物の細胞に入り、そこで発現できるように作られる。このような構造は以下に記載するように治療的目的のためには特に有用である。当業者は標的細胞中でポリヌクレオチドを発現させる多くの方法があることを認めており、任意の適切な方法を使用できる。例えば、ポリヌクレオチドを公知の方法を使用してウィルスベクターに挿入することができる（Ｕ．Ｓ．２００３／００６８８２１なども参照されたい）。ウィルスベクターは付加的に遺伝子を運搬し、または取り込み、選択可能マーカー（形質導入された細胞の同定または選択に役立つ）および／またはターゲティング部分、例えば、特殊な標的細胞上のレセプターのためのリガンドをコードする遺伝子など、が上記ベクターを標的特異的にする。ターゲティングは当業者に公知の方法によって抗体を用いて達成することもできる。
【００５３】
治療的目的のためのその他の組成物は、コロイド分散系、例えば、高分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、および水中油乳濁液、ミセル、混合ミセルおよびリポソームを含む脂質性の系を含む。インビトロおよびインビボ送達ビヒクルとして使用する好ましいコロイド系はリポソーム（すなわち、人工膜の小胞）である。このような系の製法および使用は当業者には公知である。
【００５４】
他の実施形態において、１つ以上のプロモータが確認され、分離され、および／または標準的手法により本発明の組換え核酸構築物に組み込まれる。本発明はそのようなプロモータ配列、またはその一つ以上のシス作用性調節因子またはトランス作用性調節因子を含む核酸分子を提供する。そのような調節因子はｓｉＲＮＡの発現を高め、或いは抑制する。５’−フランキング領域はここに提供されるゲノム配列に基づき、標準的手法によって作製される。必要ならば、ＰＣＲまたはその他の標準的方法を使用して追加的５’配列を生成することができる。５’領域を標準的方法を使用してサブクローン化し、配列決定する。プライマーの伸長および／またはＲＮａｓｅ保護分析を使用してｃＤＮＡから導き出される転写開始部位を明らかにすることができる。
【００５５】
プロモータ領域の境界を決めるために、種々のサイズの推定プロモータ・インサートを、適切なレポーター遺伝子を含み、プロモータまたはエンハンサーは含まない異種発現系にサブクローンする。適切なレポーター遺伝子は、ルシフェラーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコール・アセチル・トランスフェラーゼ、分泌アルカリ性ホスファターゼをコードする遺伝子、または緑色蛍光タンパク質遺伝子を含む（Ｕｉ−Ｔｅｉ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．４７９：７９−８２（２０００）などを参照されたい）。適切な発現系はよく知られており、公知の技術で作ることもできるし市場で購入することもできる。内部欠失構築物は特異的内部制限部位を使用して、または非特異的制限部位の部分消化によって作られる。その後構築物は、高レベルのｓｉＲＮＡポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチド発現をあらわす細胞にトランスフェクトする。概して、レポーター遺伝子の高レベル発現を示す最小５’フランキング領域を有する構築物はプロモータとして確認される。このようなプロモータ領域をレポーター遺伝子に結合し、これを使用して物質類の、プロモータによる転写を調節する能力を測定する。
【００５６】
機能的プロモータが決定されると、シス作用性因子およびトランス作用性因子が配置される。シス作用性配列は前以て特徴づけられた転写モチーフに対する相同性に基づいて確認されるのが普通である。決定された配列内にその後点突然変異を作り、このような配列の調節的役割を評価する。このような突然変異は部位特異的突然変異誘発技術またはＰＣＲに基づく方法によって作られる。変化したプロモータを上記のようにレポーター遺伝子発現ベクターにクローン化し、その突然変異がレポーター遺伝子発現に与える効果を評価する。
【００５７】
概して、ここに記載されるポリペプチドおよびポリヌクレオチドは分離されている。「分離された」ポリペプチドまたはポリヌクレオチドとは、本来の環境から取り出されたものである。例えば、天然発生性タンパク質は、もしも天然系において共存する物質類の若干または全てから分離されているならば、分離されていると言える。このようなポリペプチド類は少なくとも９０％純度であるのが好ましく、少なくとも約９５％純度であるのがより好ましく、少なくとも約９９％純度であるのが最も好ましい。ポリヌクレオチドは、例えば、それが天然環境の一部ではないベクターにクローン化される場合、分離されたと考えられる。「遺伝子」はポリペプチド鎖の産生に関係するＤＮＡのセグメントを含む；さらにそれはコーディング領域に先行する領域およびコーディング領域に続く領域「リーダーおよびトレイラー」、例えば、プロモータおよび／またはエンハンサーおよび／またはその他の調節配列など、ならびに個々のコーディングセグメント（エキソン）間の介入配列（イントロン）を含む。
【００５８】
例えば、インスリンによって誘導されるシグナル導入経路におけるあるコンポーネントの発現を干渉するｓｉＲＮＡの効果は、インスリンレセプターベータ（ＩＲ−β）、および／または下流シグナル伝達分子ＰＫＢ／Ａｋｔ、および／または本明細書に提供される特定のシグナル導入経路のコンポーネントであるその他の任意の下流ポリペプチド、のチロシンリン酸化レベルを測定することによって評価される。
【００５９】
上記のように、調節されたチロシンリン酸化は、細胞分裂、細胞生存、アポトーシス、増殖および分化に関係するものを含めた、生物学的シグナル導入のための特殊な経路に貢献する。本発明に関連する「生物学的シグナル導入経路」または「誘導性シグナル伝達経路」は細胞内のこれらのおよび類似のプロセスの制御に関係する分子コンポーネント類間の一過性または安定的関係または相互作用を含む。対象とする特定の経路に依って、このような経路の誘導を測定するための適切なパラメータが選択される。例えば、細胞増殖と関係するシグナル伝達経路では、次のような種々の公知の方法を使用して増殖を定量することができる；例えば、トリチウム化チミジンの細胞内ＤＮＡへの挿入、細胞呼吸活性の検出可能の（例えば、蛍光法または比色法）インディケータ（例えば、テトラゾリウム塩（黄色）―３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）または３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム（ＭＴＳ）―からホルマザン色素（紫）への変換）のモニタリング、または細胞の計数など。細胞生物学分野でも同様に、細胞生存の評価（ウィルス染料、代謝的インディケータなど）およびアポトーシスの測定（アネキシンＶ結合、ＤＮＡフラグメント化アッセイ、カスパス活性化、マーカー分析など、ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）など）のための複数の方法が知られている。その他のシグナル伝達経路は特殊な細胞表現型［例えば、遺伝子発現の特異的誘導（転写または翻訳生成物として検出可能、またはそのような生成物のバイオアッセイによって、または細胞形質因子の核への局在として検出可能）、細胞内メディエータのレベルの変化（統計的有意な増加または減少）（例えば、活性化キナーゼ、またはホスファターゼ、環状ヌクレオチドまたは生理的活性イオン種などのレベルの変化）、変化した細胞周期プロフィール、または変化した細胞形態など］と関連し、ここに提供される特定の刺激に対する細胞の応答性が容易に確認され、特定の細胞が誘導可能のシグナル伝達経路を含むかどうかを明らかにすることができる。
【００６０】
（ＰＴＰ１Ｂ）
本発明に使用するＰＴＰ１Ｂの配列は、必要の範囲では、下記の群、（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｍ３１７２４（配列番号＿−＿）；ＮＭ＿００２８２７（配列番号＿−＿）；ＮＭ＿０１１２０１（配列番号＿−＿）；Ｍ３１７２４（配列番号＿−＿）；Ｍ３３６８９（配列番号＿−＿）；Ｍ３３９６２（配列番号＿−＿））から選択される任意の配列を意味する。本発明は単一ヌクレオチド多型性（ＳＮＰｓ）を含むＰＴＰ１Ｂの変異体または突然変異型、または対立型も含む。
【００６１】
部位特異的突然変異による個々のアミノ酸の特異的置換は公知であり、当業者が熟知する方法によって行われる。生成した突然変異体ＰＴＰの触媒活性に与える効果は、本明細書に示され、またこれまでに開示されているように（例えば、ＷＯ９８／０４７１２；Ｆｌｉｎｔ ｅｔ ａｌ．，１９９７ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４：１６８０）、生成した修飾タンパク質をＫｍの保存およびＫｃａｔの１分間あたり１未満の減少について試験することによって実験的に測定される。さらに生成した突然変異体ＰＴＰ分子の、１個以上のチロシン残基をリン酸化する能力に与える効果も、そのような突然変異体を、例えば、その突然変異体がタンパク質チロシンキナーゼのためのリン酸アクセプタとして作用するインビトロまたはインビボ条件下にその突然変異体をさらした後、ホスホチロシンの存在について試験するだけで、実験的に決定される。
【００６２】
より詳細には、アミノ酸位置のナンバーによって１つのＰＴＰ１Ｂ配列に番号をつけ、それから匹敵するアミノ酸または保存残基であるアミノ酸、例えば、各位置の、極性（Ｄ、Ｅ、Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑなど）、疎水性（Ａ、Ｐ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｆ、Ｗ、Ｙなど）または中性（Ｃ、Ｇなど）アミノ酸残基の数を最大にするようにその配列をアライニングして比較するというきまりに基づくと、２つのＰＴＰ１Ｂポリペプチド配列の部分は「対応する」アミノ酸配列、領域、フラグメントとみなされる。同様に、公知の野生型ＰＴＰ１Ｂ ＤＮＡ配列中の核酸配列の位置に番号をつけ、それによって候補ＰＴＰ ＤＮＡ配列と公知のＰＴＰ ＤＮＡとを、少なくとも２０の連続ヌクレオチドを有する所定の配列中のヌクレオチドの少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％およびより好ましくは少なくとも９０％が一致するように整列させるという慣習により、ここに提供される突然変異すべき候補ＰＴＰ、またはある部分、領域、フラグメントなどをコードするＤＮＡ配列も、公知の野生型ＰＴＰ１ＢコーディングＤＮＡ配列に対応する。ある好ましい実施形態において、候補ＰＴＰ ＤＮＡ配列は対応する公知のＰＴＰ１Ｂ ＤＮＡ配列に９５％以上一致する。ある特に好ましい実施形態において、候補ＰＴＰ ＤＮＡ配列の部分、領域またはフラグメントは対応する公知のＰＴＰ１Ｂ ＤＮＡ配列に一致する。当業者には公知のように、ＤＮＡが、ある特徴を起こす特定の遺伝子において不規則性（例えば、一般的または広まった形）を含まない個体はその遺伝子については野生型遺伝子相補体（遺伝子型）を有すると言える一方、その遺伝子に関してＤＮＡに突然変異と知られる不規則性の存在、例えば、ヌクレオチドの１つ以上における置換、挿入または欠失の存在は、変化した、または突然変異遺伝子型を示唆する。
【００６３】
ＤＮＡの修飾は種々の方法、例えば、対象のポリペプチドをコードするＤＮＡの部位特異的（ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ またはｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ）突然変異誘発および、プライマーを使用してＤＮＡテンプレートに変化を導入し増幅するＤＮＡ増幅法、例えば、オーバーラップ伸長によるＰＣＲスプライシング（ＳＯＥ）の使用などによって行われる。部位特異的突然変異誘発は一般的には一本鎖および二本鎖型を有するファージベクター、例えば、公知の、市販されているＭ１３ファージベクターなどを使用して行われる。一本鎖ファージ複製開始点を含むその他の適切なベクター類を使用してもよい（Ｖｅｉｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５：３，１９８７）。概して、部位特異的突然変異誘発は対象のタンパク質（例えば、ＰＴＰ１Ｂ）をコードする一本鎖ベクターの構築によって行われる。一本鎖ベクター中のＤＮＡに相同の領域内に所望の突然変異を含むオリゴヌクレオチドプライマーを、大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノウ・フラグメント）のようなＤＮＡポリメラーゼの添加によって上記ベクターにアニールする。それはプライマーとして二本鎖領域を用い、一つの鎖は変化した配列をコードし、他の鎖は元の配列をコードするヘテロ二本鎖を生成する。部位特異的突然変異誘発に関する追加的開示は例えば、 Ｋｕｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ．，（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３６７，１９８７）および米国特許第４５１８５８４号および第４７３７４６２号に見いだされる。ヘテロ二本鎖は適切な細菌細胞に導入され、所望突然変異を含むクローンが選択される。生成する変化したＤＮＡ分子が適切な宿主細胞に組換えによって発現し、修飾タンパク質を産生する。
【００６４】
本発明のｓｉＲＮＡを他のヌクレオチド分子またはポリペプチドに融合させ、それらを運搬するかまたはその他の機能を実現させてもよい。例えば、ＰＴＰ１Ｂの発現を特異的に干渉することができるｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む融合タンパク質はアフィニティ・タグ・ポリペプチド配列を含むことができる。上記ポリペプチド配列は、リガンドの特異的アフィニティ干渉を介してそのようなポリペプチドの検出および分離を容易にするポリペプチドまたはペプチドを指す。上記リガンドは、ここに提供される特異的結合相互作用によってアフィニティ・タグが相互作用する任意の分子、レセプター、対レセプター、抗体などである。このようなペプチドには、例えば、米国特許第５０１１９１２号および Ｈｏｐｐ ｅｔ ａｌ．，（１９８８Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１２０４）に記載されている抗原性識別ペプチドなどのポリ−ヒス（ｐｏｌｙ−Ｈｉｓ）または「ＦＬＡＧ（商標）」など、またはＸＰＲＥＳＳ（商標）エピトープ・タグ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）がある。上記アフィニティ配列は、細菌性宿主の際にマーカーに融合する成熟ポリペプチドの精製を行うための例えば、ｐＢＡＤ／Ｈｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）またはｐＱＥ−９ベクターによって供給されるヘキサ−ヒスチジンであり、または例えば、上記アフィニティ配列は、哺乳動物宿主、例えば、ＣＯＳ−７細胞を使用する場合にはヘマグルチニン（ＨＡ）タグでもよい。ＨＡタグはインフルエンザ・ヘマグルチニンタンパク質から誘導される抗体識別エピトープに対応する（Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８４ Ｃｅｌｌ ３７：７６７）。
【００６５】
本発明はベクター類にも関係し、ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドを含みまたはコードする構築物にも関係する。特に、転写されて、上記のような本発明によるＰＴＰ１Ｂポリヌクレオチド特異的ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドを与えるＤＮＡポリヌクレオチド・セグメントのような任意の核酸を含む「組換え核酸構築物」に関係し；本発明のベクターおよび／または構築物で遺伝子的に操作される宿主細胞、および本発明のｓｉＲＮＡポリヌクレオチド、ポリペプチドおよび／または融合蛋白、または組換え技術によるそれらのフラグメントまたは変異体の産生に関係する。ここにＲＮＡポリペプチドヌクレオチドとして開示されるｓｉＲＮＡ配列は、ここに開示されるものなど、十分確立された方法を使用して対応するＤＮＡ配列を産生するように設計される。こうして、例えば、あるＤＮＡポリヌクレオチドは、ここ（配列リストを含む）に記載される任意のｓｉＲＮＡ配列から作られ、その際本発明のｓｉＲＮＡ配列が、対応するＤＮＡポリヌクレオチド（およびそれらの相補体）も提供するとして認識される。したがってこれらのポリヌクレオチド類は、考慮される本発明の範囲内に含まれ、例えば、主題の発明の組換え核酸構築物（これからｓｉＲＮＡが転写される）に組み込まれる。
【００６６】
本発明により、ベクターはＲＮＡ分子の転写のための１つ以上のプロモータ、例えば、ヒトＵ６ｓｎＲＮＡプロモータ（Ｍｉｙａｇｉｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：４９７−５００（２００２）；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：５００−５０５（２００２）；Ｐａｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：５０５−５０８（２００２）；Ｇｒａｂａｒｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ３４：７３５４４（２００３）などを参照；Ｓｕｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９９：５５１５−２０（２００２）も参照されたい）。ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドの各鎖は分離したプロモータの方向で各別々に転写され、その後細胞内でハイブリッド化してｓｉＲＮＡポリヌクレオチド二本鎖を形成する。各鎖は別々のベクターから転写されてもよい（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，同上）。あるいは、ＰＴＰ１Ｂ配列に特異的なセンスまたはアンチセンス配列が単一プロモータのコントロール下、ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドがヘアピン分子を形成するように転写される（Ｐａｕｌ ｅｔ ａｌ．，同上）。このような一例において、ｓｉＲＮＡ特異的配列の相補的鎖は少なくとも４個のヌクレオチドを含むが、ここに記載のように少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１６、９４ １８ヌクレオチドまたはそれより多いヌクレオチドを含むスペーサによって分離される。さらに、ヘアピンを形成するＵ６プロモータのコントロール下で転写したｓｉＲＮＡは、転写終止シグナルとして機能する３’末端に約４個のウリジン伸長を有する（Ｍｉｙａｇｉｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，同上；Ｐａｕｌ ｅｔ ａｌ．，同上）。説明のために、標的配列が１９ヌクレオチドであるならば、ｓｉＲＮＡヘアピンポリヌクレオチド（５’末端に始まる）は１９ヌクレオチドセンス配列を有し、その後にスペーサが（１９ヌクレオチドセンス配列の３’末端に隣接する２個のウリジン・ヌクレオチドとして）続き、そのスペーサは１９ヌクレオチドアンチセンス配列に結合し、その後に４−ウリジン・ターミネータ配列が続き、それはオーバーハングとなる。このようなオーバーハングを有するｓｉＲＮＡポリヌクレオチドは標的ポリペプチドの発現を効果的に干渉する（ｉｄ）。組換え構築物も、ｓｉＲＮＡポリヌクレオチド特異的配列に作動可能に結合するまた別のＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモータ、Ｈ１ ＲＮＡプロモータ、を使用して作られる。上記ｓｉＲＮＡポリメラーゼ特異的配列はｓｉＲＮＡ特異的配列を含むヘアピン構造の転写にまたはｓｉＲＮＡ二本鎖ポリヌクレオチドの各鎖の別々の転写に使用される（Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９６：５５０−５３（２００２）；Ｐａｄｄｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，同上などを参照されたい）。ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドの転写のための配列の挿入に有用なＤＮＡベクター類には、ｐＳＵＰＥＲベクター（Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ ｅｔ ａｌ．，同上，参照）；ｐＣＷＲＳＶＮから誘導れるｐＡＶベクター（Ｐａｕｌ ｅｔ ａｌ．，同上，参照）；およびｐＩＮＤ（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，同上 参照）などがある。
【００６７】
ＰＴＰ１Ｂポリペプチドは適切なプロモータの制御下で哺乳動物細胞、酵母、細菌またはその他の細胞に発現することができ、ここに記載のようなポリペプチド発現を干渉できるｓｉＲＮＡポリヌクレオチドを確認するための容易に使える系をもたらす。原核および真核宿主において使用するための適切なクローニングおよび発現ベクターは例えば、 Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｔｈｉｅｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，（２００１）に記載されている。
【００６８】
概して、本発明の組換え核酸構築物またはベクター類の構築に使用するための組換え発現ベクターは、宿主細胞の形質転換を可能にする複製開始点および選択可能マーカーを含む：例えば、大腸菌のアンピシリン耐性遺伝子および Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＴＲＰ１遺伝子、および下流の構造配列（ｓｉＲＮＡポリヌクレオチド配列など）の転写に向ける高度に発現した遺伝子から誘導されるプロモータを含む。このようなプロモータは、３−ホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ）、α−因子、酸性ホスファターゼ、または熱ショックタンパク質などの糖分解酵素をコードするオペロンから誘導できる。ＰＴＰポリペプチド発現（ＰＴＰ融合タンパク質および基質トラッピング突然変異体ＰＴＰを含む）のために、および対象のその他のポリペプチドのその他の発現のために、翻訳開始配列および翻訳終止配列を有する適切な相に非相同性構造配列が組み立てられる。任意に上記の非相同性配列は、所望の特徴、例えば、発現した組換え産物の安定化または簡単な精製などを与えるＮ−末端識別ペプチドを含む融合タンパク質をコードすることができる。
【００６９】
細菌を使用するための有用な発現構築物は、発現ベクターに、所望のｓｉＲＮＡポリヌクレオチドをコードする構造ＤＮＡ配列を、例えば、機能的プロモータと作動可能に結合した適切な転写開始および転写終止シグナルと共に挿入することによって構成される。その構築物は１つ以上の表現型選択可能マーカーおよび複製開始点を含み、ベクター構築物を確実に維持し、所望ならばその宿主内で増幅することができる。形質転換のための適した原核生物宿主としては、大腸菌、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、マウスチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）およびシュードモナス属の種々の種、およびブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）がある、ただしその他のものもすぐれた材料として使用できる。その他の任意のプラスミドまたはベクターも、宿主内で複製でき、生育可能である限り、使用できる。
【００７０】
代表的な、だが非制限的な例として、細菌使用のための有用な発現ベクターは、公知のクローニングベクターｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ３７０１７）の遺伝因子類を含む市販のプラスミドから誘導される選択可能マーカーおよび細菌性複製開始点を含むことができる。このような市販のベクターは例えば、ｐＫＫ２２３−３（ファルマシア・ファイン・ケミカル（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ），アプザラ，スエーデン）およびＧＥＭ１（プロメガ・バイオテック，マジソン，ウィスコンシン、ＵＳＡ）を含む。これらのｐＢＲ３２２の「主鎖」部分を適切なプロモータと結合させ、構造配列を発現させる。
【００７１】
適切な宿主系を形質転換し、宿主系を適切な細胞密度に増殖させた後、選択されるプロモータがここに記載される調節プロモータである場合は、その選択されたプロモータを適切な手段（例えば、温度シフトまたは化学的誘発）によって誘導し、細胞を追加的期間培養する。通常は、細胞を遠心分離によって採取し、物理的または化学的手段によって破壊し、生成した粗抽出物を保存してその後精製する。タンパク質の発現に使用する微生物細胞は任意の便利な方法、例えば、凍結−融解循環、超音波処理、機械的破壊、または細胞溶解剤の使用によって破壊する；このような方法は当業者には公知である。
【００７２】
例えば、ここに記載の本発明の核酸（例えば、ＤＮＡ配列であって、これからｓｉＲＮＡが転写されるというＤＮＡ配列）は、ここに記載の組換え核酸構築物としての種々の発現ベクター構築物のいずれにも含まれる。このようなベクターおよび構築物には、染色体性、非染色体性および合成ＤＮＡ配列、例えば、ＳＶ４０の誘導体類；細菌性プラスミド；ファージＤＮＡ；バキュロウィルス；酵母プラスミド；プラスミドと、ワクシニア、アデノウィルス、鶏痘ウィルスおよびシュードラビーなどファージＤＮＡ、ウィルスＤＮＡとの組合わせから誘導されるベクターがある。しかしその他の任意のベクターも、それが宿主内で複製でき、生育可能である限り、組換え核酸構築物の作製のために使用できる。
適切なＤＮＡ配列（類）を種々の操作法によってベクターに挿入することができる。概して、ＤＮＡ配列は適切な制限酵素部位に、当業者に公知の方法によって挿入される。ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、制限酵素などを含む酵素的反応のための、クローニング、ＤＮＡ分離、増幅および精製の標準的技術、および種々の分離法は当業者には公知であり、当業者によって一般的に使用される。つぎのような多数の標準的技術が報告されている；Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９９３ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌ．Ａｓｓｏｃ．Ｉｎｃ．＆ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）； Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．（２００１ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｔｈｉｅｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）；Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，（１９８２ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）；など。
【００７３】
発現ベクターにおけるＤＮＡ配列は少なくとも１つの適切な発現制御配列（例えば、プロモータまたは調節されたプロモータ）に操作可能に連結し、ｍＲＮＡ合成に向かう。このような発現制御配列の代表的例は、ＬＴＲまたはＳＶ４０プロモータ、大腸菌ｌａｃまたはｔｒｐ、ファージラムダ Ｐ_Ｌプロモータおよび、原核または真核細胞またはそれらのウィルスにおける遺伝子の発現を制御することが知られているその他のプロモータ類などである。プロモータ領域はＣＡＴ（クロラムフェニコールトランスフェラーゼ）ベクターまたは選択可能マーカーを有するその他のベクターを使用して任意の所望遺伝子から選択できる。２つの適切なベクターはｐＫＫ２３２−８およびｐＣＭ７である。特に有名な細菌性プロモータには、ｌａｃＩ、ｌａｃＺ、Ｔ３、Ｔ７、ｇｐｔ、ラムダＰ_Ｒ、Ｐ_Ｌおよびｔｒｐなどがある。真核細胞プロモータはＣＭＶ最初期プロモータＨＳＶチミジンキナーゼ、初期および後期ＳＶ４０、レトロウィルスからのＬＴＲｓ、およびマウスメタロチオネイン−Ｉなどがある。適切なベクターおよびプロモータの選択は当業者のレベルの範囲内であり、ＰＴＰ１Ｂポリペプチドをコードする核酸に作動可能に結合する少なくとも１つのプロモータまたは調節されたプロモータを含む特に好ましい組換え発現構築物の製法がここに記載される。
【００７４】
上記のように、ある実施形態において、ベクターはレトロウィルスベクターのようなウィルスベクターでよい。例えば、レトロウィルスプラスミドベクター類を誘導できるレトロウィルスは、非制限的に、モロニーのマウス白血病ウィルス、脾臓壊死ウィルス、次のようなレトロウィルス類；ラウス肉腫ウィルス、ハーベイ肉腫ウィルス、トリ白血病ウィルス、ギボンサル白血病ウィルス、ヒト免疫不全ウィルス、アデノウィルス、骨髄増殖性肉腫ウィルス、および乳癌ウィルスなどである。
【００７５】
ウィルスベクターは１つ以上のプロモータを含む。使用できる適切なプロモータは、非制限的に、レトロウィルスＬＴＲ；ＳＶ４０プロモータ；および Ｍｉｌｌｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ７：９８０−９９０（１９８９）に記載されるヒトサイトメガロウィルス（ＣＭＶ）プロモータ、またはその他の任意のプロモータ（例えば、非制限的にヒストン、ポルＩＩＩ、およびβ−アクチンプロモータなどの真核細胞性プロモータ）を含む。その他の使用できるウィルスプロモータには、非制限的に、アデノウィルスプロモータ類、チミジンキナーゼ（ＴＫ）プロモータ類、およびＢ１９パルボウィルスプロモータ類がある。適切なプロモータの選択は、ここに含まれる教示から当業者には理解でき、調節されたプロモータ類または上記のプロモータ類の中から選択される。
【００７６】
レトロウィルスプラスミドベクターを用いてパッケージング細胞系を形質転換し、プロデューサ細胞系を形成する。トランスフェクトされるパッケージング細胞の例は非制限的に、ＰＥ５０１、ＰＡ３１７、ψ−２、ψ−ＡＭ、ＰＡ１２、Ｔ１９−１４Ｘ、ＶＴ−１９−１７−Ｈ２、ψＣＲＥ、ψＣＲＩＰ、ＧＰ＋Ｅ−８６、ＧＰ＋ｅｎｖＡＭ１２、およびＭｉｌｌｅｒ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，１：５−１４（１９９０）（これは参考としてそのまま本明細書に組み込まれる）に記載されるＤＡＮ細胞系などがある。ベクターは当業者に公知の任意の手段によってパッケージング細胞を形質転換する。このような手段には、非制限的に、エレクトロポレーション、リポソームの使用およびリン酸カルシウム沈殿などがある。これらに代わる一つの方法において、レトロウィルスプラスミドベクターはリポソームに封入され、または脂質に結合し、その後宿主に投与される。
【００７７】
プロデューサ細胞系はＰＴＰ１Ｂポリペプチドおよびその変異体および融合タンパク質をコードする核酸配列（類）を含む感染性レトロウィルスベクター粒子を生成する。このようなレトロウィルスベクター粒子をその後使用してインビトロまたはインビボで真核細胞を形質転換する。形質転換された真核細胞は、ポリペプチドまたは融合タンパク質の発現を特異的に干渉することができるｓｉＲＮＡポリヌクレオチドをコードする核酸配列（類）を発現する。形質転換される真核細胞は、非制限的に、胚幹細胞、胚性癌細胞、ならびに造血幹細胞、肝細胞、線維芽細胞、筋芽細胞、ケラチノサイト、内皮細胞、気管上皮細胞および種々の損他の培養適応細胞系を含む。
【００７８】
また別の局面において、本発明は上記の組換えＰＴＰ１Ｂ発現構築物を含む宿主細胞に関連する。宿主細胞は一般的には本発明のベクターおよび／または発現構築物、例えば、クローニングベクター、シャトルベクターまたは発現構築物などで遺伝子的に操作（形質導入、形質転換まはトランスフェクト）される。ベクターまたは構築物は、例えば、プラスミド、ウィルス粒子、ファージなどである。操作された宿主細胞は、プロモータ類、選択トランスフォーマントまたは増幅する特定の遺伝子、例えば、ｓｉＲＮＡポリヌクレオチド類をコードする遺伝子またはその融合タンパク質などを適切に活性化するように改変された一般的栄養培地に培養できる。発現のために選択された特定の宿主細胞の培養条件、例えば、温度、ｐＨなどは、当業者は容易に理解する。
【００７９】
宿主細胞は哺乳動物細胞のような比較的高等な真核細胞、または酵母細胞のような比較的低級の真核細胞でよく、または宿主細胞は細菌細胞のような原核細胞でよい。本発明による適切な宿主細胞の代表的例には、非制限的に、大腸菌、ストレプトマイセス属、マウスチフス菌などの細菌細胞；酵母などの真菌細胞；ＤｒｏｓｏｐｈｉｌａＳ２およびスポドプテラＳｆ９などの昆虫細胞；ＣＨＯ、ＣＯＳまたは２９３細胞などの動物細胞；アデノウィルス；植物細胞、またはインビトロ増幅にすでに適応した、または新たに確立された任意の適切な細胞が含まれる。適切な宿主の選択はここに示す教示により、当業者の範囲内であるようにみえる。
【００８０】
本発明の組換え核酸構築物からｓｉＲＮＡポリヌクレオチドを産生するために、種々の哺乳動物細胞培養系も使用できる。したがって本発明は一部には、ＰＴＰ１Ｂポリペプチドに特異的なｓｉＲＮＡポリヌクレオチドをコードする核酸配列に作動可能に結合した少なくとも１つのプロモータを含む組換え核酸構築物を含む宿主細胞を培養することによって、ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドを生産する方法に関係する。幾つかの実施形態において、プロモータは、ここに示すような調節されたプロモータ、例えば、テトラサイクリン抑制性プロモータである。幾つかの実施形態において、組換え発現構築物はここに提供されるような組換えウィルス発現構築物である。哺乳動物発現系の例には、Ｇｌｕｚｍａｎ，Ｃｅｌｌ ２３：１７５（１９８１）が報告したサル腎臓線維芽細胞のＣＯＳ−７系、および適合するベクター、例えば、Ｃ１２７細胞系、３Ｔ３細胞系、ＣＨＯ細胞系、ＨｅＬａ細胞系、ＨＥＫ細胞系およびＢＨＫ細胞系などを発現し得るその他の細胞系が含まれる。哺乳動物発現ベクターは複製開始点、適切なプロモータ、エンハンサを含み、組換えｓｉＲＮＡポリヌクレオチド構築物の作製に関して本明細書に記載されるような任意の必要なリボソーム結合部位、ポリアデニレーション部位、スプライスのドナーおよびアクセプタ部位、転写終止配列、５’フランキング非転写配列なども含む。ＳＶ４０スプライスから誘導されるＤＮＡ配列、およびポリアデニレーション部位を用いて必要な非転写性遺伝因子を提供できる。上記構築物の宿主細胞への導入は当業者には公知の種々の方法、例えば、非制限的に、カチオン性リポソームを含むリポソーム類、リン酸カルシウム・トランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性トランスフェクション、またはエレクトロポレーション（Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．，１９８６ Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、またはその他の適切な技術がある。
【００８１】
発現した組換えｓｉＲＮＡポリヌクレオチドは完全宿主細胞；完全細胞小器官、例えば、細胞膜、細胞内小胞またはその他の細胞小器官；または破壊された細胞調製物、例えば、非制限的に、細胞ホモジネートまたは溶解物、ミクロソーム、単層および多重層膜小胞またはその他の調製物において有用である。あるいは、発現した組換えｓｉＲＮＡポリヌクレオチドは、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィ、ホスホセルロースクロマトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィ、アフィニティクロマトグラフィ、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよびレシチンクロマトグラフィを含む方法によって、組換え細胞培養物から回収され精製される。細胞に高性能液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）を最終的精製工程に使用することができる。
【００８２】
（サンプル）
本発明により、ここに示されるようなＰＴＰ１Ｂポリペプチドの発現を干渉する方法が提供される。ＰＴＰ１Ｂポリペプチドの発現を干渉する方法であって、ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドを、一般的には生物学的サンプルまたは対象または生物学的ソースにＰＴＰ１Ｂを発現できる細胞と接触させることを含んでなる方法も提供される。ここで使用する用語「サンプル」はＰＴＰ１Ｂを含む生物学的サンプルであり、対象または生物学的ソースから血液サンプル、生検標本、組織外植体、器官培養物、任意のその他の組織または細胞調製物を得ることによって提供される。サンプルはさらに形態学的一体性または物理的状態が例えば、切開、解離、溶解、フラグメント化、ホモゲナイゼーション、生化学的または化学的抽出、粉末化、凍結乾燥、超音波法または、対象または生物学的ソースから誘導されるサンプルをプロセッシングするためのその他の任意の手段によって破壊された、組織または細胞調製物を言う。ある好ましい実施形態において、サンプルは、少なくとも１つのＰＴＰ１Ｂポリペプチドを含む細胞であり、ある特に好ましい実施形態において上記細胞は誘導性生物学的シグナル伝達経路を含み、少なくともその１つのコンポーネントはＰＴＰ１Ｂである。特に好ましい実施形態において、細胞は哺乳動物細胞、例えば、Ｒａｔ−１線維芽細胞、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ−２９３細胞、ＨｅｐＧ２、ＨＩＩ４Ｅ−Ｃ３、Ｌ６、および３Ｔ３−Ｌ１、またはその他の公知のモデル細胞系（それらはアメリカ培養コレクション（ＡＴＣＣ、マナサス、ＶＡ）から入手できる）である。その他の好ましい実施形態において、細胞系はＰＴＰ１Ｂノックアウト動物から誘導され、それにヒトインスリンレセプター（ＨＩＲ）、例えば、１ＢＫＯマウス胚線維芽細胞がトランスフェクトされる。
【００８３】
対象または生物学的ソースはヒトまたは非ヒト動物、一次細胞培養物または培養に適応した細胞系、例えば、非制限的に、染色体に組み込まれたまたはエピソームの組換え核酸配列、固定されたまたは固定可能の細胞系、体細胞ハイブリッド細胞系、分化したまたは分化可能の細胞系、形質転換された細胞系などを含む遺伝的に設計された細胞系である。任意に、ある状況においては、生物学的サンプル中の細胞を過酸化水素および／または、反応性酸素種（ＲＯＳ）発生を直接または間接に促進するその他の作用物質、ここに記載される生物学的刺激などで処理することが好ましく；あるその他の状況では生物学的サンプル中の細胞を、Ｎ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）またはスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）などのＲＯＳ掃去剤、または当業者に公知のその他のＲＯＳ掃去剤で処理することが好ましい；その他の状況において細胞性グルタチオン（ＧＳＨ）は、細胞をＬ−ブチオニン−ＳＲ−スルホキシミン（Ｂｓｏ）で処理することによって除去される；またその他の環境においては、細胞をペルバナデートで処理し、サンプル中のチロシンリン酸化タンパク質を豊富にする。サンプル中のチロシンリン酸化タンパク質を増加させるために、タンパク質チロシンキナーゼをコードする少なくとも一つの遺伝子をトランスフェクトした細胞系である対象または生物学的ソースを使用するなど、その他の手段も利用できる。
【００８４】
それに加えて、またはその他に、生物学的シグナル伝達経路は、このような細胞と、研究下のシグナル伝達経路に依って種々様々である公知または未知の適切な刺激とを接触させることによって誘導される。例えば、誘導された際にタンパク質チロシンリン酸化および／またはタンパク質チロシン脱リン酸化を起こすシグナル伝達経路は、対象または生物学的ソースの細胞中で、タンパク質チロシンキナーゼ（ＰＴＫ）および／またはＰＴＰ活性を刺激することが当業者には知られている種々の方法および組成物のうちの１種類以上を使用して刺激される。これらの刺激としては非制限的に、細胞を、サイトカイン類、増殖因子類、ホルモン類、ペプチド類、低分子メディエータ類、細胞ストレッサ類（例えば、紫外線；温度シフト；浸透圧性ショック；ＲＯＳ、またはそれらのソース、例えば、過酸化水素、スーパーオキシド、オゾンなど、またはＲＯＳ産生を誘発しまたは促進する任意の作用物質（Ｈａｌｌｉｗｅｌｌ ａｎｄ Ｇｕｔｔｅｒｉｄｇｅ，Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃａｌｓ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（第３版）１９９９ Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ）；重金属類；アルコール）またはＰＴＫ媒介性タンパク質チロシンリン酸化および／またはＰＴＰ媒介性リンタンパク質チロシン脱リン酸化を誘導するその他の作用物質に曝露することをなどを含む。このような作用物質には、例えば、インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−３）、インターフェロン（例えば、ＩＦＮ−γ）、ヒト成長ホルモン、インスリン、上皮成長因子（ＥＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、顆粒球コロニー形成刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球−巨核球コロニー形成刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、変換増殖因子（ＴＧＦ−β１など）、腫瘍壊死因子（ＴＧＦ−αなど）および線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ；例えば、塩基性ＦＧＦ（ｂＦＧＦ））、抗原を認識するＴ細胞レセプターを介してＴ−リンパ球活性化をトリガーできる任意の作用物質またはこれら作用物質の組み合わせ（ＴＣＲ；ＴＣＲ誘導性作用物質にはスーパー抗原類、特に組換え香華および／またはＭＨＣ由来ペプチド類、ＭＨＣペプチドテトラマー類（Ａｌｔｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４：９４−９６）；ＴＣＲ特異的抗体類またはそのフラグメント類または誘導体類）、レクチン（ＰＨＡ、ＰＷＭ、ＣｏｎＡなど）、マイトジェン、Ｇ−タンパク質結合レセプターアゴニスト、例えば、アンギオテンシン−２、トロンビン、チロトロピン、副甲状腺ホルモン、リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）、スフィンゴシン−１−リン酸、セロトニン、エンドセリン、アセチルコリン、血小板活性化因子（ＰＡＦ）またはブラジキニン、ならびに当業者に公知のその他の作用物質（Ｒｈｅｅ ｅｔ ａｌ．，［ｏｎｌｉｎｅ］１０ Ｏｃｔｏｂｅｒ ２０００ Ｓｃｉｅｎｃｅ’ｓ ｓｔｋｅ，Ｉｎｔｅｒｎｅｔ：ＵＲＬ＜ｗｗｗ．ｓｔｋｅ．ｏｒｇ／ｃｇｌ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｆｕｌｌ／ ＯＣ＿ｓｉｇｔｒａｎｓ；２０００／５３／ｐｅｌ＞、およびその中に記載の参考文献を参照）などがある。
【００８５】
上記のように、調節されたチロシンリン酸化は生物学的シグナル導入のための特異的経路、例えば、細胞分裂、細胞生存、アポトーシス、増殖および分化などに関係する経路に貢献し、本発明に関連する「誘導性シグナル伝達経路」は細胞内のこれらおよび類似のプロセスの制御に関係する一過性または安定的関係または相互作用を含む。対象とする特定経路に依って、このような経路の誘導を決定する適切なパラメーターを選択することができる。例えば、細胞増殖に関連するシグナル伝達経路については、増殖、例えば、トリチウム化チミジンの細胞性ＤＮＡへの挿入、細胞性呼吸活性の検出可能指標のモニター（ＭＴＴアッセイなど）または細胞計数など、種々の公知の方法を使用できる。同様に、細胞生物学分野では細胞生存の評価（例えば、生体色素、代謝インジケータなど）およびアポトーシスの測定（例えば、アネキシンＶ結合、ＤＮＡフラグメンテーション・アッセイ、カスパス活性化、ＰＡＲＰ切断など）のための多数の方法が知られている。その他のシグナル伝達経路は特定の細胞表現型と関係している、たとえば遺伝子発現の特異的誘導（転写産物または翻訳生成物とて、またはこのような生成物のバイオアッセイによって、または細胞形質因子の核内局所化として検出できるような）、細胞内メディエータ（活性化キナーゼまたはホスファターゼ、または環状ヌクレオチドまたは生理学的活性イオン種など）の変化した（例えば、統計的有意な増加または減少）レベル、変化した細胞周期プロフィール、または変化した細胞形態などと関係し、ここに示されるような特殊な刺激に対する細胞性反応性が容易に確認され、特定の細胞が誘導性シグナル伝達経路を含むかどうかを決定できる。
【００８６】
好ましい実施形態において、ＰＴＰ１Ｂ基質は、ＰＴＰ１Ｂに特異的に結合しおよび／またはＰＴＰ１Ｂによって脱リン酸化される、天然にまたは非天然に発生する任意のリン酸化ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質である。
【００８７】
本発明に使用するための、ここに示されるようなＰＴＰ１Ｂ基質の確認および選択は当業者が熟知する方法によって行ってもよいし、例えば、ＷＯ００／７５３３９、米国特許出願第０９／３３４５７５号または米国特許出願第１０／３６６５４７号およびこれらの記載されている参考文献の開示によって行ってもよい。リン酸化タンパク質／ＰＴＰ複合体は例えば、米国特許第５３５２６６０号に記載されている一般的分離法、例えば、塩折、クロマトグラフィ、電気泳動、ゲル濾過、分画化、吸収、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、凝集反応、それらの組み合わせまたはその他の方法によって分離できる。公知のＰＴＰ１Ｂ基質は、分子生物学および／またはペプチド合成の原理を利用する公知の方法によって作成することもできる（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌ．Ａｓｓｏｃ．Ｉｎｃ．＆ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓｅ，Ｉｎｃ．，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ（１９９３）； Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｔｈｉｅｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，ＮＹ（２００１）；Ｆｏｘ，Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３：２４９（１９９５）；Ｍａｅｊｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｅｐｔ．Ｒｅｓ．８：３３（１９９５）など）。
【００８８】
したがって、本発明のＰＴＰ１Ｂ基質ペプチド類は、当業者に公知のチロシンリン酸化ＰＴＰ１Ｂ基質配列に一致するかまたは類似のアミノ酸配列を有するここに示すようなＰＴＰ１Ｂ基質タンパク質、ポリペプチドおよびペプチドから誘導される。例えば、説明のために、そして非制限的に、上に参照される公知のＰＴＰ１Ｂ基質タンパク質は本発明による使用のためには、ここに記される参考文献および実施例に記載されるポリペプチド類に、およびここに開示されるその種のポリペプチドの部分に、少なくとも７０％の類似性（好ましくは７０％同一性）、より好ましくは８０％の類似性（より好ましくは８０％同一性）、より好ましくは９０％の類似性（より好ましくは９０％同一性）およびさらにより好ましくは９５％の類似性（さらに好ましくは９５％同一性）を有するペプチド類と考えられる。当業者には公知のように、２つのポリペプチド間の「類似性」は、ポリペプチドのアミノ酸配列およびその保存されたアミノ酸置換基を、第二のポリペプチドの配列と比較する（例えば、ＧＥＮＥＷＯＲＫＳ、ＡｌｉｇｎアルゴリズムまたはＢＬＡＳＴアルゴリズム、またはこの他の上記のアルゴリズムを使用）ことによって決定される。
【００８９】
本発明のいくつかの好ましい実施形態において、ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドおよび／またはＰＴＰ１Ｂ基質は検出可能に標識化され、特に好ましい実施形態においてはｓｉＲＮＡポリヌクレオチドおよび／またはＰＴＰ基質は放射性または蛍光シグナルを発生することができる。ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドおよび／またはＰＴＰ基質は適切なレポーター分子または部分、例えば、^３２Ｐのような放射性核種（Ｐｅｓｔｋａ ｅｔ ａｌ．，１９９９ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．１７：２０３−１４）、ヨウ素［^１２５Ｉまたは^１３１Ｉ］のようなラジオハロゲン（Ｗｉｌｂｕｒ，１９９２ Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．３：４３３−７０）またはトリチウム［^３Ｈ］；酵素；または当業者に公知の、本開示に基づいて使用される特定の蛍光検出法によって選択される種々の発光材料（例えば、化学発光材料）または蛍光材料（例えば、フルオロファオ）など、に共有または非共有結合することによって検出可能に標識化される。ここに示されるｓｉＲＮＡポリヌクレオチドおよび／またはＰＴＰ基質を標識化するための蛍光レポーター部分および方法は、例えば、 Ｈａｕｇｌａｎｄ（１９９６ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ−Ｓｉｘｔｈ Ｅｄ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ；１９９９ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ− Ｓｅｖｅｎｔｈ Ｅｄ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ．［Ｉｎｔｅｒｎｅｔ］＜：ｈｔｔｐ：／ｗｗｗ．ｐｒｏｂｅｓ．ｃｏｍ／ｌｉｔ／＞）およびここに記載の参考文献に見いだされる。本発明の方法におけるフルオロファオなどとして使用するのに特に好ましいのはフルオレセイン、ローダミン、テキサスレッド、アレキサフルオル−５９４（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ−５９４）、アレキサフルオル−４８８、オレゴングリーン、ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ、ウンベリフェロン、ジクロロトリアジニルアミン・フルオレセイン、ダンシルクロリド、フィコエリスリンまたはＣｙ−５である。適切な酵素の例は、非制限的に、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ、ビオチン、アルカリ性ホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼおよびアセチルコリンエステラーゼなどである。適切な発光材料はルミノールなどであり、適切な放射性材料は放射性燐［^３２Ｐ］などである。本発明のその他の幾つかの好ましい実施形態において、検出可能に標識化されたｓｉＲＮＡポリヌクレオチドは、磁気粒子、例えば、常磁性または反磁性粒子またはその他の磁気粒子または当業者に公知で、目的の用途に適したその他のもの（好ましくはマイクロ粒子）などを含む。理論によって束縛されるものではないが、幾つかのこのような実施形態において、磁気粒子を含むｓｉＲＮＡポリヌクレオチドに結合し、吸着し、吸収され、内包され、またはその他の方法によって結合した細胞を選択する方法が提供される。例えば、１つ以上のＰＴＰ１Ｂ−特異的ＳｉＲＮＡポリヌクレオチド磁気粒子共役体を含む細胞の集団またはサブ集団の選択的分離はその後のＰＴＰシグナル伝達経路の特徴づけまたは調節にある利益を与える。
【００９０】
本発明の幾つかの実施形態において、対象とする特殊なＰＴＰ１Ｂ−特異的ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドは、候補ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドと、ＰＴＰ１Ｂ遺伝子を含み、ＰＴＢ１Ｂ遺伝子の転写または発現を可能にすることができる細胞を含むサンプルとを、ＰＴＢ１Ｂ転写または発現（例えば、翻訳）を検出するのに十分な条件下で十分な時間接触させ、ＰＴＢ１Ｂ転写レベル、ＰＴＢ１Ｂポリペプチド発現および／またはＰＴＢ１Ｂ機能的発現（例えば、ＰＴＢ１Ｂ触媒活性）を候補ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドの不在下と存在下とで比較することによって確認される。ＰＴＢ１Ｂ転写または発現がｓｉＲＮＡポリヌクレオチドの存在下では減少するのが好ましい。それによってＰＴＢ１Ｂ活性を調節するＰＴＰ活性部位特異的アプローチの代わりとなる。（しかし本発明はこのように制限される必要はなく、ｓｉＲＮＡの特異的標的となるもの以外のシグナル形質転換コンポーネントの転写および／または発現レベルが、あるＰＴＢ１Ｂ特異的ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドの存在下では増加するというその他の実施形態も考慮する。非制限的理論によれば、そのような増加はｓｉＲＮＡの結果として誘導される細胞性代償（ｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｏｍｐｅｎｓａｔｏｒｙ）メカニズムに起因する）。
【００９１】
ＰＴＢ１Ｂを発現し、ＩＲ−βのようなインスリンレセプターを含む細胞では、ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドは、非制限的理論によると、ＰＴＢ１Ｂ発現の干渉を介してＰＴＢ１Ｂレベルを低下させることによってインスリンレセプターのリン酸化の増加を起こす。インスリンレセプターリン酸化の測定法は当業者には公知であり（例えば、Ｃｈｅａｔｈａｍ ｅｔ ａｌ．，１９９５ Ｅｎｄｏｃｒ．Ｒｅｖ．１６：１１７−１４２）、以下に詳細に説明される。細胞がインスリンレセプターを含むその他の幾つかの実施形態において、その他の種々の細胞インスリン反応は全て、非制限的に、糖取り込み（Ｅｌｃｈｅｂｌｙ ｅｔ ａｌ．，１９９９ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８３：１５４４；ＭｃＧｕｉｒｅ ｅｔ ａｌ．，１９９９１ Ｄｉａｂｅｔｅｓ ４０：９３９；Ｍｙｅｒｏｖｉｔｃｈ ｅｔ ａｌ．，１９８９ Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８４：９７６；Ｓｒｅｄｙ ｅｔ ａｌ．，１９９５ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｕｍ ４４：１０７４；ＷＯ９９／４６２６８）；糖合成（Ｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９８ Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６１：１５９）、Ｇｌｕｔ４の細胞膜への動員現象（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９２ Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１７：１１８１）；肝転写事象、またはアミノ酸輸入（Ｈｙｄｅ ｅｔ ａｌ．，２００２、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：１３６２８−３４（２００２））などを含む技術的に確立された方法によってモニターできる。細胞がインスリンレセプターを含むその他の幾つかの実施形態において、モニターできる細胞性インスリン反応は、ＭＡＰキナーゼリン酸化、ＡＫＴリン酸化、およびインスリンレセプターの下流のその他のインスリン刺激リン酸化事象、例えば、Ｐ１３キナーゼ、ｐｅｒｋ、ｐＳＴＡＴ５およびＩＲＳ１など、およびホスホエノールピルベート・カルボキシキナーゼ転写（Ｆｏｒｅｓｔ ｅｔ ａｌ．，１９９０ Ｍｏｌｅｃ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．４：１３０２）、ホスファチジルイノシトール三リン酸キナーゼ活性化（Ｅｎｄｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９０ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：３９６）、脂質生成（Ｍｏｏｄｙ ｅｔ ａｌ．，１９７４ Ｈｏｒｍ．Ｍｅｔａｂ．Ｒｅｓ．６：１２）、脂質分解（Ｈｅｓｓ ｅｔ ａｌ．，１９９１ Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４５：３７４）、ＴＹＫ２脱リン酸化およびＪＡＫ２（Ｇｅｎｂａｎｋ番号：ＮＭ＿００４９７２、ＡＦ０５８９２５、ＡＦ００５２１６、ＮＭ＿０３１５１４、およびＮＭ＿００８２６１）脱リン酸化（Ｍｙｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，２００１ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：４７７７１）、インターフェロン刺激ｐＳＴＡＴ１およびｐＳＴＡＴ３、およびＥＧＦまたはＰＤＧＲＦリン酸化（Ｕｌｌｒｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，１９９０ Ｃｅｌｌ ６１：２０３）などである。それに加えてインスリンレセプターの例えば、位置ｔｙｒ１１６２／ｔｙｒ１１６３および位置ｔｙｒ９７２などにおけるリン酸化は、ｔｙｒ１１６２／ｔｙｒ１１６３またはｔｙｒ９７２に部位特異的である抗ホスホチロシン抗体で検出することができる。
【００９２】
ＰＴＰ１Ｂ活性は、適切な基質の活性化に依って発現するレポーター遺伝子をトランスフェクトした全細胞においても測定できる。例えば、適切な細胞（すなわち、ＰＴＰ１Ｂを発現することができ、ＰＴＰ１Ｂポリペプチド発現を干渉できることが知られているかまたは予想されるＰＴＰ１Ｂ特異的ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドをトランスフェクトした細胞）にレポーター遺伝子に結合した基質依存性プロモータをトランスフェクトする。このような系において、前記レポーター遺伝子の発現（これは当業者に公知の方法を使用して容易に検出できる）は、基質の活性化に依存する。基質の脱リン酸化はレポーター活性の減少に基づいて検出される。ＰＴＰ１Ｂに特異的な候補ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドをこのような系に加えて、ＰＴＰ１Ｂ活性に対するそれらの効果を評価することができる。
【００９３】
その他の局面において、本発明は動物モデルを提供する：その際動物は、適切なＰＴＰ１Ｂ特異的ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドを例えば、導入遺伝子として導入することによって、機能的ＰＴＰ１Ｂを発現しない（または有意に減少した量を発現する）。このような動物は、例えば、標準的相同組換え技術によって、または別の方法として例えば、適したプロモータ（例えば、偏在するか、または組織特異的なプロモータ）によって調節されるｓｉＲＮＡコーディング配列を含むプラスミドを卵母細胞にマイクロインジェクションし、その後代理母に移植するという方法によってつくられる。この方法によって作られた動物モデルを使用してＰＴＰシグナル伝達経路のコンポーネント類および調節物質類の活性をインビボで研究することができる。
【００９４】
（治療法）
ＰＴＰ１Ｂポリペプチドの発現を干渉し、上記の方法によって確認される１種類以上のｓｉＲＮＡポリヌクレオチドを、患者のＰＴＰ１Ｂ活性を調節（例えば、抑制または増強）するために使用することができる。ここに使用する用語「患者」はヒトを含む任意の哺乳動物であり、上記「患者」は不都合なＰＴＰ１Ｂ活性に関連する病気にかかっているものでも、疾患が検出されないものでもよい。よって、治療は存在する病気の治療でも、予防的治療でもよい。シグナル導入および／またはＰＴＰ１Ｂ活性と関係する病気としては、細胞増殖に関連する任意の病気、例えば、癌、移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）、自己免疫病、アレルギーまたは、非調節ＰＴＰ１Ｂ活性が関係しているその他の病気などがある。
【００９５】
患者に投与するためには、１種類以上の特異的ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドを、そのまま単独で、または化学的修飾またはリボース除去を加え、または加えずに、またはここに記載のような適切なベクター（例えば、ＤＮＡ配列を含むベクターであって、そのＤＮＡ配列から特異的ｓｉＲＮＡを転写できる上記ベクター）に組み込んで、薬学的組成物として処方するのが普通である。薬学的組成物は滅菌水溶液または非水溶液、懸濁液または乳濁液でよく、追加的に、生理的に容認できる担体（すなわち、活性成分の活性を阻害しない無毒性物質）を含む。このような組成物は固体、液体またはガス（エアロゾル）の形でよい。あるいは、本発明の組成物は凍結乾燥物として処方されてもよく、化合物類を公知の技術によってリポソームに封入することもできる。本発明の範囲内の薬学的組成物は生物学的に活性または不活性のその他の成分も含むことができる。そのような成分には非制限的に、緩衝剤（例えば、中性緩衝食塩液またはリン酸緩衝食塩液）、炭水化物類（グルコース、マンノースまたはデキストラン類）、マンニット、タンパク質類、ポリペプチド類または、グリシンのようなアミノ酸類、抗酸化剤、ＥＤＴＡまたはグルタチオンのようなキレート化剤、安定剤、色素、芳香剤および懸濁剤および／または保存料などがある。
【００９６】
当業者に公知の任意の適切な担体を本発明の薬学的組成物に使用することができる。治療的使用のための担体は公知であり、例えば、 Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ ｅｄ．１９８５）に記載されている。概して、担体の種類は投与法によって選択される。薬学的組成物は任意の適切な投与法、例えば、局所的、経口的、鼻孔内、髄腔内、直腸内、膣内、舌下または、皮下、静脈内、筋肉内、胸骨内、腔内、道内または尿道内注射または注入のような非経口投与のために処方される。非経口投与では担体は好ましくは、水、食塩液、アルコール、脂肪、ワックスまたは緩衝液などである。経口投与では、上記の担体のいずれかまたは固体担体、例えば、マンニット、ラクトース、澱粉、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、カオリン、グリセリン、デキストリン澱粉、アルギン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロース、エチルセルロース、グルコース、スクロースおよび／または炭酸マグネシウムなどが使用される。
【００９７】
薬学的組成物（例えば、経口投与または注射による送達などのための）は液体の形でもよい（例えば、エリキシル、シロップ、溶液、乳濁液または懸濁液など）。液体薬学的組成物は例えば、下記の１種類以上を含むことができる：滅菌希釈剤、例えば、注射用水、食塩液、好ましくは生理的食塩液、リンゲル溶液、等張塩化ナトリウム、溶媒または懸濁媒質として働く合成モノ−またはジグリセリドのような固定油、ポリエチレングリコール類、グリセリン、プロピレングリコールまたはその他の溶媒類；ベンジルグリコールまたはメチルパラベンなどの抗菌剤；アスコルビン酸または重亜硫酸ナトリウムなどの抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸などのキレート化剤；酢酸化合物、クエン酸化合物またはリン酸化合物などの緩衝剤および毒性を調節するために塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの作用物質類。非経口製剤はガラスまたはプラスチック製のアンプル、使い捨て注射器または多数回投与用バイアルに封入することができる。生理的食塩液の使用が好ましく、注射用薬学的組成物は無菌であるのが好ましい。
【００９８】
ここに記載される組成物は持続的放出のために処方することができる（すなわち、投与後化合物が徐々に放出されるカプセルまたはスポンジとしての組成物）。このような組成物は概して公知の技術によって調製され、例えば、経口的、経腸的または皮下移植によって、または所望標的部位に移植することによって投与される。徐放性組成物は担体基質に分散した作用物質および／または速度調節膜によって包囲された貯蔵器内に含まれた作用物質を含むことができる。このような組成物内に使用する担体は生体適合性であり、生体内分解性でもよい；活性成分放出度が比較的一定である組成物が好ましい。徐放性組成物内に含まれる活性化合物の量は移植部位、放出速度および期待持続時間、および治療または予防すべき病気の性質に依存する。
【００９９】
薬学的組成物のなかで、本明細書に記載のようなポリペプチド特異的ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドを含む治療薬（またはｓｉＲＮＡポリヌクレオチドをコードする組換え核酸構築物など）を種々の化合物のいずれかに結合させる。例えば、そのような作用物質を、その作用物質の標的部位への送達を容易にする標的化部分（モノクローナルまたはポリクローナル抗体、タンパク質またはリポソーム）に結合する。ここに使用する用語「標的化部分」とは、ある作用物質に結合して標的細胞または標的組織へのその作用物質の運搬を高め、それによってその作用物質の局所的濃度を高める任意の物質（化合物または細胞など）である。標的化部分は抗体類またはそれらのフラグメント、レセプター、リガンドおよび標的組織の細胞、または標的細胞近くの細胞に結合するその他の分子を含む。抗体標的化剤は完全（全）分子、そのフラグメント、またはその機能的同等物でよい。抗体フラグメントの例はＦ（ａｂ’）_２、Ｆａｂ’、ＦａｂおよびＦ［ｖ］フラグメントであり、それらは一般的方法または遺伝子工学またはタンパク質工学によって作ることができる。結合は一般的に共有結合であり、例えば、直接縮合またはその他の反応によって、または二−または多官能価リンカーによって形成される。標的化部分は、作用物質が治療効果をあらわすと予測される細胞（類）または組織（類）に基づいて選択される。
【０１００】
薬学的組成物は治療（または予防）すべき疾患に適するやり方で投与される。適切な投与量および適切な持続時間および投与頻度は、患者の状態、患者の疾患の種類および重症度、活性成分の特定の型および投与法などの諸要因によって決定される。一般に、適切な投与量および適切な治療法では、治療および／または予防効果（完全−または部分的軽快の頻度の増加、またはより長い無病状態および／または生存、または症状の緩和など、臨床的結果が改善される）をもたらす十分な量の作用物質（類）が提供される。予防的使用においては、用量は細胞増殖関連性疾患の発生を阻止し、遅らせ、またはその重症度を軽減するのに十分な量でなければならない。
【０１０１】
最適用量は実験モデルおよび／または臨床試験を用いて決定するのが普通である。概して、１用量に存在するｓｉＲＮＡポリヌクレオチドの量または１用量中に存在するＤＮＡによって現場で生成する（例えば、ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドを含む組換え核酸構築物から）ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドの量は宿主体重１ｋｇあたり約０．０１μｇないし約１００μｇ、典型的には約０．１μｇないし約１０μｇの範囲である。一般には効果的治療をもたらす最小用量の使用が好ましい。患者は通常、治療または予防する病気に適した、当業者に公知のアッセイによって治療効果または予防効果をモニターされる。適切な用量サイズは患者のからだの大きさによって変動するが、一般的には体重１０−６０ｋｇの動物では約１０ｍＬないし約５００ｍＬの範囲である。
【０１０２】
下記の実施例は説明のために記載されるもので、制限するためのものではない。
【実施例】
【０１０３】
（実施例１）
（特異的ｓｉＲＮＡによるＰＴＰ１Ｂの干渉）
この実施例は配列特異的ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドをトランスフェクトした細胞におけるＰＴＰ−１Ｂ発現に与える効果を記載する。
【０１０４】
マウス線維芽細胞におけるマウスＰＴＰ１Ｂ内因性発現の、配列特異的なｓｉＲＮＡポリヌクレオチドによる干渉
マウスＰＴＰ１Ｂポリペプチド（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＭ＿０１１２０１、配列番号；＿）をコードするマウスＰＴＰ１Ｂポリヌクレオチド（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＭ＿０１１２０１、配列番号＿）に特異的な３種類のｓｉＲＮＡ配列、およびヒトＰＴＰ１Ｂポリペプチド（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＭ＿００２８２７、配列番号＿）をコードするヒトＰＴＰ１Ｂポリヌクレオチド（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＭ＿００２８２７、配列番号ＮＭ＿）に特異的な１種類のｓｉＲＮＡ配列を下記のように設計した。２個のアデニン塩基（ＡＡ）が５’末端にフランクし、ほぼ１：１のＡ＋Ｔ／Ｇ＋Ｃ比を有する２１−塩基配列のための標的ｃＤＮＡのオープン・リーディング・フレームを先ず最初に走査することによって、各ＰＴＰ１Ｂに特異的なｓｉＲＮＡヌクレオチド配列を選んだ。Ａ＋Ｔ／Ｇ＋Ｃ比が２：１または１：２より大きい２１塩基配列は排除した。この基準に合う２１−塩基配列が確認されなかった場合は、ＰＴＰ１Ｂをコードするポリヌクレオチド配列から、５’末端に塩基ＣＡを有する２１塩基配列を探し出した。各２１マーの特異性を、一般的データベースのＢＬＡＳＴ検索を実施することによって確認した。２１のうち少なくとも１６の連続ヌクレオチドが標的配列以外のポリヌクレオチド配列と１００％一致する配列はこの実験には使用しなかった。
【０１０５】
ＴＣＰＴＰ分析のためのセンスおよびアンチセンスオリゴヌクレオチド類を製造者（ダルマコン・リサーチ社、ラファイエット、ＣＯ）の標準プロトコルにしたがって合成した。この実施例およびその他の実施例に記載されるいくつかの実験のために、製造者は二本鎖ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドをゲル精製し、それをその後使用した。製造者が二本鎖ｓｉＲＮＡを提供しなかった場合は、トランスフェクションの直前に、センスおよびアンチセンスオリゴヌクレオチド類をアニーリング緩衝液（１００ｍＭ酢酸カリウム、３０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、ｐＨ７．４、２ｍＭ酢酸マグネシウム）中で９０℃で１分間、その後３７℃で６０分間インキュベートしてアニーリングすることによって二本鎖ｓｉＲＮＡを作った。
【０１０６】
各実施例において、各ｓｉＲＮＡ配列はｓｉＲＮＡポリヌクレオチドのセンス鎖およびその対応する配列識別名をあらわす。特に記載されていない限り、細胞にトランスフェクトされたｓｉＲＮＡはセンス鎖およびその相補的アンチセンス鎖からなり、それらの鎖は二本鎖ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドを形成する。
【０１０７】
マウスＣ５７Ｂ１６＃３細胞、クローン３および１０を標準的細胞培養法によって細胞培養基に保持した。各Ｃ５７Ｂ１６＃３クローンに２００ｎＭの下記ｓｉＲＮＡをトランスフェクトした：ｍＰＴＰ１Ｂ．１（配列番号＿）、ｍＰＴＰ１Ｂ．２（配列番号＿）ｍＰＴＰ１Ｂ．３（配列番号＿）およびｈＰＴＰ１Ｂ．１（配列番号＿）。各ｓｉＲＮＡを５０μｌＯ_ＰＴＩＭＥＭ（商標）に希釈して、最終濃度２００ｎＭ／ウェルにした。別のチューブにおいて、リポフェクタミン（商標）３μｌをＯ_ＰＴＩＭＥＭ（商標）１０μｌと一緒にした。各溶液を７分間インキュベートした。それから２溶液を混合し、室温で２２分間インキュベートした。混合溶液の最終容量を１００μｌに調節し、その後Ｃ５７Ｂ１６＃３細胞を加えた。細胞に特異的ｓｉＲＮＡ、ヒトＰＴＰ１ＢｓｉＲＮＡ、またはアニーリング緩衝液のみをトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞をｓｉＲＮＡと共に６日間インキュベートした。
【０１０８】
ＥＬＩＳＡ抽出緩衝液（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５（室温）；２ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７−８；１ｍＭリン酸化合物（ポリリン酸）；１ｍＭ ＮａＶＯ４（モノマー）、ｐＨ１０；０．１％トリトン Ｘ−１００；プロテアーゼ・インヒビタ・カクテル・セットＩＩＩ、（カルビオヘム、サンジエゴ、カリフォルニア、カタログ番号＃５３９１３４））中に抽出することによって細胞溶解物を調製した。溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルによって分離し、イムノブロットによって分析した。溶解物を遠心分離し、トランスフェクした各細胞培養物サンプルからの上澄液部分（１０μｌ）を１０μｌのＳＤＳ−ＰＡＧＥ還元サンプル緩衝液と合一した。そのサンプルを５分間９５℃で加熱しそれから１４％トリス−グリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（インビトロゲン・ライフ・テクノロジース、カールスバド、ＣＡ、からのＮＯＶＥＸ（商標））に塗布した。電気泳動後、分離されたタンパク質を電気泳動によってゲルからイモビロン（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ）−Ｐ ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜（ミリポア社、ベドフォード、マサチューセッツ）に移した。ＰＶＤＦ膜をＴＢＳＴ（２０ｍＭ トリスｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％ツイーン−２０）中５％ミルク中でブロックし；抗マウスＰＴＰ１Ｂモノクローナル抗体（Ｄｒ．Ｂｅｎ Ｎｅｅｌ、ハーバード大学、ケンブリッジ、マサチューセッツ）と共に室温で２−１６時間インキュベートし；ＴＢＳＴで３×１０分間洗浄した；その後適切なホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）共役ＩｇＧ（１：１０，０００）（アマーシャム・ビオサイエンシス社、ピスカタウェイ、ニュージャージー）と共に室温で３０分間インキュベートした。結合は、製造者のインストラクション（アマーシャム・ビオサネンシス社、ピスカタウェイ、ニュージャージー）にしたがってＥＣＬ化学発光試薬で検出された。図１に示すように、内因性ＰＴＰ１Ｂの発現レベルは、マウスＰＴＰ１Ｂ配列特異的ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドをトランスフェクトしたＣ５７Ｂ１６細胞においてのみ減少した。
【０１０９】
第二のマウス細胞系においてマウスＰＴＰ１Ｂの内因性発現に対するＲＮＡｉの影響を調べた。ここに記載の方法によって、マウスＰＴＰ１Ｂ：３Ｔ３ＩＲ線維芽細胞に２０ｎＭ ｍＰＴＰ１Ｂ１．１（配列番号＿）；ｍＰＴＰ１Ｂ１．６（配列番号＿）；およびｍＰＴＰ１Ｂ１．８（配列番号＿）をトランスフェクトした。ｍＰＴＰ１Ｂ１．１をトランスフェクトした細胞におけるマウスＰＴＰ１Ｂ発現レベルは、非特異的ｓｉＲＮＡ（ｈＰＴＰ１Ｂ１．３（配列番号＿））をトランスフェクトした細胞に比較して約８０％減少した；ｍＰＴＰ１Ｂ１．６をトランスフェクトした細胞は約４０％減少し；ｍＰＴＰ１Ｂ１．８をトランスフェクトした細胞は約６０％減少した。
【０１１０】
（同時トランスフェクション・アッセイにおけるｓｉＲＮＡによるマウスＰＴＰ１Ｂ発現の干渉）
野生型マウスＰＴＰ１Ｂ（ｍＰＴＰ１Ｂ）（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＭ＿０１１２０１、配列番号＿および＿）をコードする組換え発現構築物を作製した。下記のオリゴヌクレオチド・プライマー類を野生型構築物のために使用した。ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ制限部位の配列には下線を引く。
ｍＰＴＰ１Ｂセンス（ｍＰＴＰ１Ｂ５’ＢａｍＨＩ）
５’−ＧＧＧＧＧＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＡＧＡＴＧＧＡＧＡＡＧＧＡＧＴＴＣＧＡＧＧ−３’（配列番号＿）
ｍＰＴＰ１Ｂアンチセンス（ｍＰＴＰ１Ｂ３’ＥｃｏＲＩ）
５’−ＧＧＧＧＧＡＡＴＴＣＴＣＡＧＴＧＡＡＡＡＣＡＣＡＣＣＣＧＧＴＡＧＣＡＣ−３’（配列番号＿）
ベクターｐＣＭＶＴａｇ２Ｂ（ストラタジーン社、ラジョラ、カリフォルニア）を制限酵素ＢａｍＨＩ（ニューイングランド・ビオラボ、ビバリー、ＭＡ）で３７℃で３時間消化した。消化したベクターをクレノー・ポリメラーゼ（ニューイングランド・ビオラボ社）と共に２５℃で１５分間インキュベートして、後退した（ｒｅｃｅｓｓｅｄ）３’末端を満たし、その後コウシ腸ホスファターゼ（ニューイングランド・ビオラボ）と共に３７℃で３０分間インキュベートした。提供者のインストラクションにより、Ｔ４リガーゼ（インビトロゲン・ライフ・テクノロジース）を用いて１６℃、一晩のリゲーションによって、ゲイトウエイ（商標）リーディング・フレーム・カセットＢ（インビトロゲン・ライフ・テクノロジース、カールスバド、カリフォルニア）をｐＣＭＶＴａｇ２Ｂベクターに挿入した。ＤＢ３．１（商標）コンピテント大腸菌細胞を結合したベクター（ＧＷｐＣＭＶＴａｇ２）で形質転換し、標準的分子生物学的方法によってＤＮＡを分離した。
ｍＰＴＰ１Ｂ野生型の発現のためのベクターを次のように構築した。２０μｌ ｍＰＴＰ１ＢｃＤＮＡまたは２０μｌのｐＥＮＴＲ３Ｃ（商標）ベクターを１μｌのＢａｍＨＩ（ニューイングランド・ビオラボ）；１μｌ ＥｃｏＲＩ（ニューイングランド・ビオラボ）；５μｌ １０Ｘ ＥｃｏＲＩ緩衝液（ニューイングランド・ビオラボ）；５μｌ １０ Ｘ ＢＳＡ（ニューイングランド・ビオラボ）；および１８μｌ蒸留水で３７℃で３時間消化することによって、ｍＰＴＰ１Ｂ構築物をゲイトウエイ（商標）エントリーベクターｐＥＮＴＲ３Ｃ（商標）（インビトロゲン・ライフ・テクノロジース）にサブクローニングした。消化したＤＮＡを１％アガロースゲル上を移動させ、消化したバンドを切り取り、キアゲン（ＱＩＡＧＥＮ）・ゲル抽出キット（キアゲン社、バレンシア、カリフォルニア）を使用してＤＮＡをゲル精製した。１μｌの１０Ｘ リゲーション緩衝液（インビトロゲン・ライフ・テクノロジース）、１μｌ Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（４Ｕ／μｌ）（インビトロゲン、カールスバド、カリフォルニア）および２μｌの蒸留水を用いて、４μｌのｍＰＴＰ１Ｂ ｃＤＮＡを１６℃で一晩、２μｌのｐＥＮＴＲ３Ｃ（商標）ベクターに結合させた。この構築物をライブラリー・エフィシェンシー（Ｌｉｂｒａｒｙ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）（商標）ＤＨ５α（商標）細胞に形質転換した。ｐＥＮＴＲ３Ｃ（商標）ｍＰＴＰ１Ｂ ＷＴ構築物をＧＷｐＣＭＶＴａｇ２ベクターにクローニングすることによって、フラグ（ＦＬＡＧ）（商標）エピトープ−タグつきｍＰＴＰ１Ｂ構築物を作製した。ｍＰＴＰ１Ｂポリヌクレオチドを含むｐＥＮＴＲ３Ｃ（商標）構築物を、ＶｓｐＩ（プロメガ社、マジソン、ウィスコンシン）で３７℃で２時間消化することによって線状にした。そのＤＮＡをキアゲンＰＣＲ精製キット（キアゲン社）を用いて精製した。３μｌ（１００ｎｇ／μｌ）のＧＷｐＣＭＶＴａｇ２ベクターをゲイトウエイ（商標）ＬＲ反応反応液中で、６μｌの線状ｐＥＮＴＲ３Ｃ（商標）ｍＰＴＰ１Ｂ ＷＴ、３μｌのＴＥ緩衝液、４μｌのクロナーゼ（商標）酵素、および４μｌのＬＲ反応緩衝液（インビトロゲン・ライフ・テクノロジース）と、室温で１時間一緒にした。この反応液に１０分間プロテイナーゼＫ（インビトロゲン・ライフ・テクノロジース）を添加後、ライブラリー・エフィシエンシー（商標）ＤＨ５α（商標）細胞を発現構築物で形質転換した。
マウスＰＴＰ１Ｂ発現ベクター（０．５μｇ）を２０ｎＭマウスＰＴＰ１Ｂ配列特異的ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドと共に、ＰＴＰ１Ｂノックアウトマウス線維芽細胞に同時トランスフェクトした（ＰＴＰ１Ｂ ＫＯマウス胚線維芽細胞をＰＴＰ１Ｂ．ノックアウトマウスからの１３日胎児からつくり、細胞系を確立し、それにヒトインスリンレセプターをトランスフェクトした（１ＢＫＯ＋ＨＩＲ）（ＨＩＲ、ジュリーモイヤーズ、エリリリー社（Ｊｕｌｉｅ Ｍｏｙｅｒｓ，Ｅｌｉ Ｌｉｌｙ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ）、インディアナポリス、インディアナ））。細胞にｓｉＲＮＡまたはアニーリング緩衝液のみをトランスフェクトした。各ｓｉＲＮＡを２５０μｌ ＯＰＴＩＭＥＭ（商標）低血清メジウム（ギプコ社）で希釈し、細胞濃度を２０ｎＭとした。別のチューブにおいて、リポフェクタミン（商標）２０００（インビトロゲン・ライフ・テクノロジース、カールスバド、カリフォルニア）を２５０μｌ ＯＰＴＩＭＥＭ（商標）と合一した。各溶液を７分間インキュベートした。２溶液を混合し、室温で２２分間インキュベートした。混合溶液の最終容量を１００μｌに調節し、それから細胞を加えた。トランスフェクトした細胞を３７℃で１８時間インキュベートした後、細胞溶解物を調製し、４−１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、抗−ＰＴＰ１Ｂマウスモノクローナル抗体を使用してイムノブロットを行った（上記参照）。結果を表１にまとめる。下の各２１ｍｅｒ配列は３’末端にジヌクレオチドの「オーバーハング」を含むこと、および、ここに記載の本発明の幾つかの好ましい実施形態は、５’末端から始まる１９−ｍｅｒポリヌクレオチド配列ならびに表に示される２１−ｍｅｒポリヌクレオチドを含むと考えなければならないことがわかる。
【０１１１】
（表１．同時トランスフェクション・アッセイにおけるｓｉＲＮＡによるマウスＰＴＰ−１Ｂ発現の干渉）
【０１１２】
【表１−１】

【０１１３】
【表１−２】

【０１１４】
（同時トランスフェクション・アッセイにおけるｓｉＲＮＡによるラットＰＴＰ１Ｂ発現の干渉）
同時トランスフェクション・アッセイを上記のように行った；この際１ＢＫＯ＋ＨＩＲマウス線維芽細胞にラットＰＴＰ１Ｂポリペプチド（配列番号＿）（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＭ＿０１２６３７）をコードする配列を含む発現ベクターおよび配列特異的ｓｉＲＮＡ、ｒＰＴＰ１Ｂ１．１（５’−ａｇａａｇａａａａａｇａｇａｕｇｇｕｃｔｔ−３’（配列番号＿））（２０ｎＭ）を同時トランスフェクトした。同時トランスフェクションアッセイで試験したその他のラットＰＴＰ１Ｂ特異的ｓｉＲＮＡポリヌクレオチド類は、ｒＰＴＰ１Ｂ１．２（５’−ｃｇｇａｕｇｇｕｇｇｇｕｇｇａｇｇｕｃｔｔ−３’（配列番号＿））；ｒＰＴＰ１Ｂ１．３（５’−ｕｇｇｃａａｇｕｇｃａａｇｇａｇｃｕｃｔｔ−３’（配列番号＿））；およびｒＰＴＰ１Ｂ１．４（５’−ｃｕａｃａｃｃａｃｃｕｇｇｃｃｕｇａｃｔｔ−３’（配列番号＿））を含む。ラットＰＴＰ１Ｂポリペプチドの発現レベルは、細胞溶解物を抗−ヒトＰＴＰ１Ｂ抗体（これもラットＰＴＰ１Ｂに特異的に結合する）（ＰＨＯ２、オンコジーン・リサーチ・プロダクト^ＴＭ社、サンジエゴ、カリフォルニア）と共にイムノブロッティングすることによって測定した。
【０１１５】
（同時トランスフェクション・アッセイにおけるｓｉＲＮＡによるヒトＰＴＰ−１Ｂ発現の干渉）
ヒトＰＴＰ１Ｂコーディング配列を標準的分子生物学的方法によってＰｍｔベクターにクローン化した（Ｆｌｉｎｔ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．１２：１９３７−４６（１９９３）を参照）。１ＢＫＯ＋ＨＩＲ細胞にヒトＰＴＰ１Ｂ発現ベクターおよびヒトＰＴＰ−１Ｂ配列に特異的なｓｉＲＮＡポリヌクレオチド（２０ｎＭ）をリポフェクタミン２０００を使用して一晩同時トランスフェクトした。細胞を上記のように溶解し、溶解物を４−１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ＰＤＶＦ膜上に移した。ヒトＰＴＰ−１Ｂの発現レベルを抗ヒトＰＴＰ−１Ｂ抗体（ＰＨＯ２、オンコジーン・リサーチ・プロダクト（商標）社、サンジエゴ、カリフォルニア）と共にイムノブロッティングすることによって測定した。ヒトＰＴＰ１Ｂの発現の干渉が、表２に示すように４種類のｓｉＲＮＡポリヌクレオチドで認められた。下に示す各２１−ｍｅｒ配列が３’末端にジヌクレオチドの「オーバーハング」を含むことおよび本発明が５’−末端に始まる１９−ｍｅｒポリヌクレオチド配列ならびに表に示す２１−ｍｅｒポリヌクレオチドを含むと考えなければならないことが認められる。
【０１１６】
（表２．同時トランスフェクション・アッセイにおけるヒトＰＴＰ１Ｂ発現のｓｉＲＮＡ干渉）
【０１１７】
【表２】

【０１１８】
（ｓｉＲＮＡによるヒトＰＴＰ１Ｂの内因性発現の干渉）
ヒトＰＴＰ１Ｂの内因性発現に与える配列特異的ｓｉＲＮＡの影響を２種類の細胞系で試験した。ＨｅＬａ細胞に上記のようにリポフェクタミン２０００を用いて、ｈＰＴＰ１Ｂ１．１、ｈＰＴＰ１Ｂ１．２、ｈＰＴＰ１Ｂ１．３、ｈＰＴＰ１Ｂ１．４およびｈＰＴＰ１Ｂ１．５を２０ｎＭでトランスフェクトし、３日後、ＰＴＰ１Ｂの発現レベルをイムノブロッティングによって分析した。ｓｉＲＮＡ ｈＰＴＰ１Ｂ１．１をトランスフェクトしたＨｅＬａ細胞において、ヒトＰＴＰ１Ｂの発現の有意な減少は認められなかった。ｈＰＴＰ１Ｂ１．２およびｈＰＴＰ１Ｂ１．４をトランスフェクトしたＨｅＬａ細胞ではヒトＰＴＰ１Ｂの発現レベルは８０％減少し、ｈＰＴＰ１Ｂ１．３をトランスフェクトした細胞では発現レベルは９０％減少した。配列特異的ｓｉＲＮＡ ｈＰＴＰ１Ｂ１．２、ｈＰＴＰ１Ｂ１．３、ｈＰＴＰ１Ｂ１．４、ｈＰＴＰ１Ｂ１．５（２０ｎＭ）をトランスフェクトした第二の細胞系、２９３−ＨＥＫ−ＨＩＲ（ジュリーモイヤーズ、エリリリー社から寄贈された）ではヒトＰＴＰ１Ｂの内因性発現は９０％減少した。
【０１１９】
ヒトＰＴＰ１Ｂおよび配列特異的ヘアピンベクター類の一過性トランスフェクション
ヘアピン挿入物の形のヒトＰＴＰ１Ｂ配列特異的ｓｉＲＮＡの効果を一過性同時トランスフェクション・アッセイにおいて試験した。細胞（１ＢＫＯ＋ＨＩＲマウス線維芽細胞）にヒトＰＴＰ１Ｂ発現ベクター（上を参照）をトランスフェクトし、上記のトランスフェクション法によりｈＰＴＰ１Ｂヘアピンベクター（１、０．５および０．２５μｇ）を同時トランスフェクトした。ヒトＰＴＰ１Ｂ特異的配列をヒトＵ６小核ＲＮＡプロモータを有するフレームにおいてベクターに導入した。このベクターは Ｄａｖｉｄ Ｅｎｇｅｌｋｅ（ミシガン大学、アンアーバー、ミシガン）からの贈り物であった（Ｐａｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：４４６−４８（２００２）も参照されたい）。ヘアピンベクターに導入された各鎖の配列は次のようであった。
【０１２０】
【化１】

【０１２１】
細胞にトランスフェクトし、２４時間後に細胞溶解物を調製し、ヒトＰＴＰ１Ｂの発現を抗ヒトＰＴＰ１Ｂ抗体と共にイムノブロッティングすることによって測定した（上を参照）。細胞溶解物をヒトインスリンレセプターベータ鎖（ＩＲβ）（Ｃ−１９、カタログ番号ＳＣ−７１１、サンタクルーズ・バイオテクノロジー）に特異的な抗体と共にイムノブロッティングした。結果を図２に示す。
【０１２２】
マウスＰＴＰ１Ｂに特異的な配列を含むヘアピンベクターも構築する。各鎖の下記の配列がヘアピンベクターに挿入される。
【０１２３】
【化２】

【０１２４】
（実施例２）
（ＰＴＰ１Ｂに特異的なｓｉＲＮＡの、インスリンレセプターチロシンリン酸化に与える影響）
この実施例は、細胞シグナル伝達経路におけるコンポーネント類の機能に対するＲＮＡｉの効果を説明するものである。インスリンシグナル伝達のダウンレギュレーションにおけるＰＴＰ１Ｂの役割は、ＰＴＰ１Ｂノックアウトマウスの表現型（Ｅｌｃｈｅｂｌｙ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８３：１５４４−４８（１９９９）；Ｋｌａｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２０：５４７９−８９（２０００）；米国特許出願第１０／３６６，５４７号も参照されたい）などを含む種々のアプローチから引き出されるデータによって説明されている（Ｃｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６９：１０５０−５９（２００２））。
【０１２５】
ヒトＰＴＰ１ＢｓｉＲＮＡのＩＲ−βリン酸化レベルに与える効果をＥＬＩＳＡ法によって評価した。２９２−ＨＥＫ ＨＩＲ細胞に０、１、５および１０ｎＭ ｈＰＴＰ１Ｂ１．３（配列番号＿）またはｍＰＴＰ１Ｂ１．１（配列番号＿）をトランスフェクトした。トランスフェクション後７２時間目に細胞を濃度０、２０、５０および１００ｎＭのインスリンに７分間曝露した。細胞溶解物を実施例１のように調製し、総細胞タンパク質を製造者のインストラクション（ビオーラド、ヘラクレス、ＣＡ）によるビオーラドタンパク質アッセイによって定量した。ＥＬＩＳＡは次のように行った。ダイネックス・イムロン（Ｄｙｎｅｘ Ｉｍｍｕｌｏｎ）ＨＢ４Ｘプレートに、５μｇ／ｍｌ無脂肪酸ＢＳＡ（ｆａｆ−ＢＳＡ）を含むＣＭＦ（カルシウムマグネシウムを含まない）−ＰＢＳで１：１０００に希釈した抗インスリンレセプター抗体Ａｂ−１（１ｍｇ／ｍｌ；ネオマーカーズ社（ＮｅｏＭａｒｋｅｒｓ，Ｉｎｃ．）、フレモント、カリフォルニア）を塗布した。プレートを４℃で少なくとも４時間インキュベートした。抗体溶液を吸引によって除去し、その後３％ｆａｆ−ＢＳＡ＋ＣＭＦ−ＰＢＳを３００μｌを添加した。プレートを室温でボルテックス・プラットフォーム・シェーカー（設定＃５）で撹拌しながら１時間インキュベートした。吸引後、３％ｆａｆ−ＢＳＡ＋ＣＭＦ−ＰＢＳ溶液、約１０−２０μｇの溶解物をウェルに加え、室温で１時間インキュベートした。プレートをＴＢＳＴ（２０ｍＭトリス、−ＨＣｌ、ｐＨ７．５ １５０ｍＭ ＮａＣｌ；０．０５％ツイーン２０）で３回洗った。抗インキュベートレセプターホスホチロシン特異的抗体（ｐＴｙｒ１１６２／６３、ビオソース・インターナショナル社（Ｂｉｏｓｏｕｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）、カマリロ、カリフォルニア、カタログ番号＃４４−８０４）をＴＢＳＴで１：２０００に希釈し、室温でプレートに１時間加えた。それらのプレートをＴＢＳＴで３回洗った。その後ＨＲＰ共役抗ウサギ抗体（アマーシャム・ビオサイエンシス、カタログ番号＃ＮＡ９３４Ｖ）（ＴＢＳＴで１：２０００に希釈）をウェルに加え、室温で１時間インキュベートした。プレートをＴＢＳＴで３回洗い、脱イオン化無菌水で１回洗った。ＴＭＢ溶液（シグマ・アルドリッヒ）（１００μｌ／ウェル）を加え、色がわずか変化するまで（細胞型およびインスリン反応によって１０−３０分）展開させた。反応を１．８Ｎ Ｈ_２ＳＯ_４ １００μｌ添加によって停止し、混合した。各ウェルの光学密度をスペクトラマックス・プレート・リーダー（モレキュラー・デバイセス社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｃｏｒｐ．）、サニーベイル、カリフォルニア）において４５０ｎＭで測定した。データを図３に示す。各細胞溶解物のＰＴＰ１Ｂ発現レベルを上記のようにイムノブロットによって測定した。ＰＴＰ１Ｂポリペプチドを抗ヒトＰＴＰ−１Ｂ抗体を使用して検出した（ＰＨＯ２、オンコジーン・リサーチ・プロダクト（商標）社）。種々の濃度のどちらかのｓｉＲＮＡをトランスフェクトした細胞に発現したＰＴＰ１Ｂの量をイムノブロットの濃度分析によって定量した。ヒトＰＴＰ１Ｂの発現レベルは、ｈＰＴＰ１Ｂ１．３ｓｉＲＮＡをトランスフェクトしなかった細胞の発現レベルのパーセントとしてあらわされる（すなわち、非トランスフェクト細胞のレベルは１００パーセントである）（図３の表を参照されたい）。
【０１２６】
第二の実験では、２９２−ＨＥＫ ＨＩＲ細胞に０、０．０５、３または１０ｎＭ ｓｉＲＮＡをトランスフェクトした。これらの細胞にトランスフェクトされたｓｉＲＮＡポリヌクレオチドとしてはｈＰＴＰ１Ｂ１．２（配列番号＿）、ｈＰＴＰ１Ｂ１．３（配列番号＿）、ｍＰＴＰ１Ｂ１．１（配列番号＿）、およびｒＰＴＰ１Ｂ１．２（配列番号＿）がある。トランスフェクションの７２時間後に細胞を濃度０、１、５、１０、５０および１００ｎＭのインスリンに７分間曝露した。細胞溶解物を調製し、総細胞タンパク質を上記のように定量した。上記のようにＥＬＩＳＡを行った。細胞溶解物を９６ウェルプレートに塗布し、ブロックし、抗ｐＹｐＹ^{１１６２／１１６３}−ＩＲ−β抗体で試験した。結合を酵素共役二次試薬を使用して検出した。図４に示すように、ｈＰＴＰ１Ｂ１．３をトランスフェクトした細胞にインスリンレセプターのリン酸化の増加が認められた。
ＰＴＰ１Ｂ発現レベルのパーセント減少をインスリンレセプターのリン酸化レベルと比較した。個別の３実験において、２９２−ＨＥＫ ＨＩＲ細胞に０、０．５、３または１０ｎＭ ｈＰＴＰ１Ｂ１．３ ｓｉＲＮＡをトランスフェクトし、その後濃度０、５、１０、２０、５０および１００ｎＭのインスリンに７分間曝露した。細胞溶解物のＥＬＩＳＡおよびイムノブロットを上記のように行った。インスリンレセプターのリン酸化状態に与えるｈＰＴＰ１Ｂ１．３の効果を図５にまとめる。各データ点は２個づつのウェルで測定した平均光学密度をあらわす。
【０１２７】
（実施例３）
ヒトおよびマウスＰＴＰ１Ｂ特異的ｓｉＲＮＡポリヌクレオチド
ヒトＰＴＰ１Ｂを発現することができ、下記のｓｉＲＮＡのいずれかをトランスフェクトした細胞において、ヒトＰＴＰ１Ｂの発現レベルを実施例１に記載の方法および操作法によって測定する。インスリンレセプターチロシンリン酸化に及ぼすヒトＰＴＰ１Ｂ特異的ｓｉＲＮＡの効果を実施例２に記載される方法によって測定する。ベクター（このベクターからヘアピンベクターが転写される）に組み込まれる、および／または実施例１に記載の方法によってリポソームを介してトランスフェクトされるｓｉＲＮＡ配列を表３−５に示す。ヒトＰＴＰ１Ｂ標的配列はＧｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＭ＿００２８２７（配列番号＿）に示されるヒトＰＴＰ１Ｂヌクレオチド配列から誘導された。表３は、ＡＡジヌクレオチド・リーダー配列が先行する１９−塩基対ヒトＰＴＰ１Ｂ標的配列を示す。表４はＣＡジヌクレオチド・リーダー配列が先行する１９−塩基対ヒトＰＴＰ１Ｂ標的配列を示す。リーダー配列とは、５’と１９塩基対標的ｍＲＮＡ配列との間にある２つのヌクレオチドを言い、「終止配列（エンディング配列）」とは３’直前のｍＲＮＡ配列である２個のヌクレオチドを言う。位置番号は１９−ヌクレオチド標的配列の第一ヌクレオチドの、またはその周囲のヌクレオチド位置を意味する。ｍＲＮＡの領域はコーディング領域（ＣＲ）またはオープン・リーディング・フレーム／コーディング領域（ＯＲＦ／ＣＦ）および非翻訳領域（ＵＴＲ）と呼ばれる。配列中に存在する終結コドン（ＵＡＧ）には下線を引き、太字にする。表５はダルマコン（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）ｓｉＲＮＡシステムを用いて選択したヒトＰＴＰ１ＢｓｉＲＮＡポリヌクレオチド配列を示す。これらの配列は下記のパラメーターを用いて作成された：（１）リーダー配列はジヌクレオチドＡＡ、ＣＡ、ＴＡおよびＧＡを含んでいた；（２）５’ＵＴＲ、コーディング領域、および３’ＵＴＲは走査された；（４）Ｇ＋Ｃ含有量は約３１−６３％の間に変動した；（５）異なる１９ヌクレオチド配列内の諸配列のオーバーラップが容認された。これらの配列をＢＬＡＳＴプログラムを使用して既知ヒトゲノム配列と比較した。可能性のある標的配列は、１９−ヌクレオチド標的配列のなかの１６以上の連続ヌクレオチドが他のヒトポリヌクレオチド配列と同一である場合には除外された。残る１９−ヌクレオチドｓｉＲＮＡ配列を表５に示す。表中、暗くなっている列の配列もその他の方法によって決定された。
【０１２８】
同様に、配列特異的ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドをトランスフェクトした細胞におけるマウスまたはラットＰＴＰ１Ｂの発現レベルも実施例１に記載される方法および操作によって測定される。インスリンレセプターリン酸化に与えるマウスまたはラットＰＴＰ１Ｂ特異的ｓｉＲＮＡの効果を実施例２に記載の方法によって確認する。表６および表７は、ＡＡジヌクレオチドリーダー配列およびＣＡジヌクレオチドリーダー配列をそれぞれ有するマウスＰＴＰ１Ｂ（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＭ＿０１１２０１、配列番号＿）に特異的な１９−ヌクレオチド ｓｉＲＮＡ配列を示す。表８は、これら配列を既知マウスゲノム配列と比較したことを除けば、上の記載と同様に、ダルマコンｓｉＤＥＳＩＧＮおよびＢＬＡＳＴプログラムを使用して選択された、１９−ヌクレオチドｓｉＲＮＡ配列を示す。表９は、これら配列が既知ラットゲノム配列と比較されたことを除けば上記と同様に、ダルマコンｓｉＤＥＳＩＧＮおよびＢＬＡＳＴプログラムを使用して選択された、１９−ヌクレオチドｓｉＲＮＡ配列を示す。
【０１２９】
表３−９に示された各ｓｉＲＮＡ配列は、ｓｉＲＮＡのセンス鎖の配列およびその対応する配列確認体のリストである。ここに記載されるｓｉＲＮＡポリヌクレオチドは１９のヌクレオチドのセンス鎖とその相補的（またはアンチセンス）鎖からなると理解される。さらに、本発明のｓｉＲＮＡポリヌクレオチドは一般的には各鎖の３’末端にジヌクレオチド・オーバーハング（それは任意の２個のヌクレオチドである）を有する。
【０１３０】
（表３．ヒトＰＴＰ１Ｂ ｓｉＲＮＡポリヌクレオチド配列）
【０１３１】
【表３−１】

【０１３２】
【表３−２】

【０１３３】
【表３−３】

【０１３４】
（表４．ヒトＰＴＰ１Ｂ ｓｉＲＮＡポリヌクレオチド配列（ＣＡリーダー））
【０１３５】
【表４−１】

【０１３６】
【表４−２】

【０１３７】
【表４−３】

【０１３８】
（表５．ヒトＰＴＰ１Ｂ ｓｉＲＮＡポリヌクレオチド配列（ＢＬＡＳＴ後））
【０１３９】
【表５−１】

【０１４０】
【表５−２】

【０１４１】
（表６．マウスＰＴＰ１Ｂ ｓｉＲＮＡポリヌクレオチド配列（ＡＡリーダー））
【０１４２】
【表６−１】

【０１４３】
【表６−２】

【０１４４】
【表６−３】

【０１４５】
（表７．マウスＰＴＰ１Ｂ ｓｉＲＮＡポリヌクレオチド配列（ＣＡリーダー）
【０１４６】
【表７−１】

【０１４７】
【表７−２】

【表７−３】

【０１４８】
表８．マウスＰＴＰ１Ｂ ｓｉＲＮＡポリヌクレオチド配列（ＢＬＡＳＴ後）
【０１４９】
【表８−１】

【０１５０】
【表８−２】

【０１５１】
表９．ラットＰＴＰ１ＢｓｉＲＮＡポリヌクレオチド配列（ＢＬＡＳＴ後）
【０１５２】
【表９−１】

【０１５３】
【表９−２】

【０１５４】
【表１０−１】

【０１５５】
【表１０−２】

【０１５６】
【表１０−３】

【０１５７】
前述のことから、説明の目的で本発明の特殊な実施態様をここに記載したが、本発明の精神および範囲を逸脱することなく種々の変更が行われ得ることは当然である。よって、本発明は添付の請求項によってのみ制限される。
【図面の簡単な説明】
【０１５８】
【図１】図１は、マウスＰＴＰ１ＢまたはヒトＰＴＰ１Ｂポリヌクレオチド配列に特異的なｓｉＲＮＡによるマウスＰＴＰ１Ｂの内因性発現に与える効果のイムノブロットを示す。発現はマウス抗−ＰＴＰ１Ｂモノクローナル抗体を使用して検出された。データはＣ５７Ｂ１６＃３マウス細胞の２種類のクローンに関して示される。両方のクローンにｍＰＴＰ１Ｂ１．１ｓｉＲＮＡ（レーン３および８）；ｍＰＴＰ１Ｂ１．２（レーン４および９）；ｍＰＴＰ１Ｂ１．３（レーン５および１０）をトランスフェクトした。一つのクローン、Ｃ５７Ｂ１６＃３クローン３にｈＰＴＰ１Ｂ１．１をトランスフェクトした（レーン６）。レーン２：トランスフェクトしていないＣ５７Ｂ１６＃３、クローン３（ＮＴ）；レーン７：トランスフェクトしていないＣ５７Ｂ１６＃３、クローン１０。
【図２】図２は、ヒトＰＴＰ−１ＢｓｉＲＮＡヘアピンベクターと共に１ＢＫＯ＋ＨＩＲマウス線維芽細胞に同時トランスフェクトしたヒトＰＴＰ１Ｂの発現のイムノブロット分析を描く。発現は抗ヒトＰＴＰ１Ｂ抗体（ｈ１Ｂ）で検出した（下方のイムノブロット）。タンパク質発現の対照として、細胞溶解物を抗ヒトインスリンレセプター（ＩＲ）抗体で検査した（上方のイムノブロット）。
【図３】図３は、インスリンレセプター（ＩＲ）リン酸化チロシンのレベルを、０、０．５、３または１０ｎＭ ｈＰＴＰ１Ｂ１．３（Ｈ１．３、配列番号＿）（図３Ａ）またはｍＰＴＰ１Ｂ１．１ｂ（Ｍ１．１、配列番号＿）（図３Ｂ）ｓｉＲＮＡをトランスフェクトした２９３−ＨＥＫ ＨＩＲ細胞において測定したＥＬＩＳＡ検定の結果である。細胞におけるヒトＰＴＰ１Ｂの発現レベルをイムノブロットによって比較した（各図の右の表を参照されたい）。
【図４】図４は、インスリンレセプター（ＩＲ）リン酸化チロシンのレベルを、０、０．５、３または１０ｎＭ ｓｉＲＮＡをトランスフェクトした２９３−ＨＥＫ ＨＩＲ細胞において測定したＥＬＩＳＡ検定の結果である。細胞にトランスフェクトされたｓｉＲＮＡポリヌクレオチドは、ｍＰＴＰ１Ｂ１．１ｂ（Ｍ１．１、配列番号＿）（図４Ａ）；ｈＰＴＰ１Ｂ１．２（Ｈ１．２、配列番号＿）（図４Ｂ）；ｈＰＴＰ１Ｂ１．３（Ｈ１．３、配列番号＿）（図４Ｃ）；およびｒＰＴＰ１Ｂ１．２（Ｒ１．２、配列番号＿）（図４Ｄ）を含んでいた。トランスフェクション後７２時間目に、細胞を指示された濃度でインスリンに７分間曝露した。細胞溶解物を調製し、９６ウェルプレート上に塗布し、抗−ｐＹ−ＩＲ−β抗体で検定した。
【図５】図５は、ｈＰＴＰ１Ｂ１．３をトランスフェクトし、５０ｎＭインスリン（Ｉｎｓ）で刺激した細胞におけるインスリンレセプターリン酸化レベルをあらわす別々の３実験（Ｅｘｐ．１、２、３）からのＥＬＩＳＡデータである。
【配列表】

【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号８３−８６、８８−９１、９３−９６、９８−１０１、１０４−１０５、および１０８−１０９からなる群から選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む単離された短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）ポリヌクレオチド。
【請求項２】
配列番号８３−８６、８８−９１、９３−９６、９８−１０１からなる群から選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む請求項１記載の短い干渉ＲＮＡポリヌクレオチドおよびその相補的ポリヌクレオチド。
【請求項３】
Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｍ３１７２４、ＮＭ＿００２８２７、およびＭ３３６８９からなる群から選択される配列に示されるようなアミノ酸配列を含んでなるＰＴＰ１Ｂポリペプチドの発現を干渉することができる請求項１または請求項２のいずれかの項に記載の短い干渉ＲＮＡポリヌクレオチド。
【請求項４】
ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドのヌクレオチド配列は、配列番号８３−８６、８８−９１、９３−９６および９８−１０１に示される諸配列からなる群から選択される配列の位置１−１９のいずれかの位置、または１０４、１０５、１０８および１０９に示される諸配列からなる群から選択される配列の任意の位置における１、２、３または４個のヌクレオチドが異なる請求項１または請求項２のいずれかの項に記載のｓｉＲＮＡポリヌクレオチド。
【請求項５】
ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドのヌクレオチド配列は、配列番号８３−８６、８８−９１、９３−９６および９８−１０１に示される諸配列からなる群から選択される配列の位置１−１９のいずれかの位置、または１０４、１０５、１０８および１０９に示される諸配列からなる群から選択される配列の任意の位置における少なくとも２、３または４個のヌクレオチドが異なる請求項１または請求項２のいずれかの項に記載のｓｉＲＮＡポリヌクレオチド。
【請求項６】
配列番号８３によるヌクレオチド配列を含む単離されたｓｉＲＮＡポリヌクレオチドまたはその相補体。
【請求項７】
配列番号８８によるヌクレオチド配列を含む単離されたｓｉＲＮＡポリヌクレオチドまたはその相補体を。
【請求項８】
配列番号９３によるヌクレオチド配列を含む単離されたｓｉＲＮＡポリヌクレオチドまたはその相補体。
【請求項９】
配列番号９８によるヌクレオチド配列を含む単離されたｓｉＲＮＡポリヌクレオチドまたはその相補体。
【請求項１０】
配列番号１０４または１０５によるヌクレオチド配列を含む単離されたｓｉＲＮＡポリヌクレオチド。
【請求項１１】
配列番号１０８または１０９によるヌクレオチド配列を含む単離されたｓｉＲＮＡポリヌクレオチド。
【請求項１２】
ポリヌクレオチドが天然に発生するヌクレオチドの少なくとも１つの合成ヌクレオチドアナログを含む請求項１または請求項２に記載のｓｉＲＮＡポリヌクレオチド。
【請求項１３】
ポリヌクレオチドが検出可能標識に結合される請求項１または請求項２に記載のｓｉＲＮＡポリヌクレオチド。
【請求項１４】
前記検出可能標識がレポーター分子である請求項１３記載のｓｉＲＮＡポリヌクレオチド。
【請求項１５】
前記レポーター分子が、色素、放射性核種、発光基、蛍光基およびビオチンからなる群から選択される請求項１４記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項１６】
前記蛍光基がフルオレセイン・イソチオシアネートである請求項１５記載のｓｉＲＮＡポリヌクレオチド。
【請求項１７】
前記検出可能標識が磁気粒子である、請求項１３記載のｓｉＲＮＡポリヌクレオチド。
【請求項１８】
請求項１または請求項２のいずれかの項に記載のｓｉＲＮＡポリヌクレオチドおよび生理学的に容認される担体を含む薬学的組成物。
【請求項１９】
担体がリポソームを含む、請求項１８記載の薬学的組成物。
【請求項２０】
短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を転写させることができるポリヌクレオチドを含む組換え核酸構築物であって、該ポリヌクレオチドは
（ｉ）第一のプロモータ；（ｉｉ）第二のプロモータ；および（ｉｉｉ）配列番号８３−８６、８８−９１、９３−９６、９８−１０１からなる群から選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む少なくとも１つのＤＮＡポリヌクレオチドセグメントまたはその相補体からなり、各ＤＮＡポリヌクレオチドセグメントおよびその相補体は第一および第二プロモータの少なくとも１つに作動可能に結合し、前記プロモータ類はＤＮＡポリヌクレオチドセグメントおよびその逆相補体を転写させるように方向づける
前記組換え核酸構築物。
【請求項２１】
短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を転写させることができるポリヌクレオチドを含む組換え核酸構築物であって、該ポリヌクレオチドは、配列番号１０２、１０３、１０６および１０７からなる群から選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む少なくとも１つのＤＮＡポリヌクレオチドセグメントに作動可能に結合するプロモータを含む
前記組換え核酸構築物。
【請求項２２】
第一プロモータに作動可能に結合する第一エンハンサーおよび第二プロモータに作動可能に結合する第二エンハンサーから選択される少なくとも１つのエンハンサーを含む請求項２０または請求項２１のいずれかの項に記載の組換え核酸構築物。
【請求項２３】
（ｉ）構築物中に位置し、第一プロモータによる転写を停止させる第一転写ターミネータおよび（ｉｉ）構築物中に位置し、第二プロモータによる転写を停止させる第二転写ターミネータから選択される少なくとも１つの転写ターミネータを含む請求項２０に記載の組換え核酸構築物。
【請求項２４】
前記ｓｉＲＮＡがＰＴＰ１Ｂの発現を干渉することができ、該ＰＴＰ１ＢポリペプチドがＧｅｎｂａｎｋ登録番号Ｍ３１７２４、ＮＭ＿００２８２７、およびＭ３３６８９からなる群から選択される配列に示されるアミノ酸配列を含む請求項２０または請求項２１のいずれかの項に記載の組換え核酸構築物。
【請求項２５】
短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を転写させることができるポリヌクレオチドを含む組換え核酸構築物であって、該ポリヌクレオチドは少なくとも１つのプロモータとＤＮＡポリヌクレオチドセグメントとを含み、該ＤＮＡポリヌクレオチドセグメントは該プロモータに作動可能に結合し、該ＤＮＡポリヌクレオチドセグメントは（ｉ）配列番号８３−８６、８８−９１、９３−９６、９８−１０１からなる群から選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む少なくとも１つのＤＮＡポリヌクレオチドまたはその相補体；（ｉｉ）（ｉ）のＤＮＡポリヌクレオチドに作動可能に結合する少なくとも４つのヌクレオチドを含むスペーサ配列；および（ｉｉｉ）スペーサ配列に作動可能に結合する（ｉ）のＤＮＡポリヌクレオチドの逆相補体を含む、組換え核酸構築物。
【請求項２６】
ｓｉＲＮＡが少なくとも１個かつ４個未満のヌクレオチドのオーバーハングを含み、前記オーバーハングは（ｉｉｉ）の３’直前に位置する請求項２５記載の組換え核酸構築物。
【請求項２７】
スペーサ配列が少なくとも９ヌクレオチドを含む請求項２５記載の組換え核酸構築物。
【請求項２８】
スペーサ配列が（ｉｉｉ）と隣接する２個のウリジンヌクレオチドを含む請求項２５記載の組換え核酸構築物。
【請求項２９】
ＤＮＡポリヌクレオチドセグメントに作動可能に結合する少なくとも１個の転写ターミネータを含む請求項２５記載の組換え核酸構築物。
【請求項３０】
請求項２０、２１、２３および２５−２９のいずれかの項に記載の組換え核酸構築物で形質転換された、またはトランスフェクトされた宿主細胞。
【請求項３１】
ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドおよび生理学的に容認される担体を含む薬学的組成物であって、前記ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドが
（ｉ）配列番号８３−８６、８８−９１、９３−９６、９８−１０１、１０４−１０５、および１０８−１０９からなる群から選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むＲＮＡポリヌクレオチド、
（ｉｉ）配列番号８３−８６、８８−９１、９３−９６、９８−１０１から選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むＲＮＡポリヌクレオチドおよびその相補的ポリヌクレオチド、
（ｉｉｉ）前記ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドのヌクレオチド配列は、配列番号８３−８６、８８−９１、９３−９６および９８−１０１に示される諸配列からなる群から選択される配列の位置１−１９のいずれかの位置における、または配列番号１０４、１０５、１０８および１０９に示される諸配列からなる群から選択される配列の任意の位置における１、２、または３個のヌクレオチドが異なる、（ｉ）または（ｉｉ）によるＲＮＡポリヌクレオチド、
（ｉｖ）前記ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドのヌクレオチド配列は、配列番号８３−８６、８８−９１、９３−９６および９８−１０１に示される諸配列からなる群から選択される配列の位置１−１９のいずれかの位置における、または配列番号１０４、１０５、１０８および１０９に示される諸配列からなる群から選択される配列の任意の位置における２、３または４個のヌクレオチドが異なる、（ｉ）または（ｉｉ）によるＲＮＡポリヌクレオチド
からなる群から選択される
薬学的組成物。
【請求項３２】
担体がリポソームを含む請求項３１記載の薬学的組成物。
【請求項３３】
ＰＴＰ１Ｂポリペプチドまたはその変異体の発現を干渉するための方法であって、ＰＴＰ１Ｂポリペプチドを発現できる少なくとも１つの細胞を含む対象と、ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドとを、ＰＴＰ１Ｂポリペプチドの発現を干渉するのに十分な時間および十分な条件下で接触させることを含んでなり、
（ａ）ＰＴＰ１ＢポリペプチドはＧｅｎｂａｎｋ登録番号Ｍ３１７２４、ＮＭ＿００２８２７、ＮＭ＿０１１２０１、およびＭ３３６８９からなる群から選択される配列に示されるアミノ酸配列を含み、
（ｂ）ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドは
（ｉ）配列番号８３−８６、８８−９１、９３−９６、９８−１０１、１０４−１０５および１０８−１０９からなる群から選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むＲＮＡポリヌクレオチド、
（ｉｉ）配列番号８３−８６、８８−９１、９８−１０１からなる群から選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むＲＮＡポリヌクレオチド、およびその相補的ポリヌクレオチド、
（ｉｉｉ）ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドのヌクレオチド配列は、配列番号８３−８６、８８−９１、９３−９６および９８−１０１に示される諸配列からなる群から選択される配列の位置１−１９のいずれかの位置における、または配列番号１０４、１０５、１０８および１０９に示される諸配列からなる群から選択される配列の任意の位置における１、２、または３つのヌクレオチドが異なる、（ｉ）または（ｉｉ）によるＲＮＡポリヌクレオチド、
（ｉｖ）ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドのヌクレオチド配列は、配列番号８３−８６、８８−９１、９３−９６および９８−１０１に示される諸配列からなる群から選択される配列の位置１−１９のいずれかの位置における、または配列番号１０４、１０５、１０８および１０９に示される諸配列からなる群から選択される配列の任意の位置における２、３または４つのヌクレオチドが異なる、（ｉ）または（ｉｉ）によるＲＮＡポリヌクレオチド
からなる群から選択される
方法。
【請求項３４】
Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｍ３１７２４、ＮＭ＿００２８２７、およびＭ３３６８９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＰＴＰ１Ｂポリペプチドまたは前記ＰＴＰ１Ｂポリペプチドの変異体の発現を干渉する方法であって、ＰＴＰ１Ｂポリペプチド発現を干渉するのに十分な条件下で十分な時間、（ｉ）ＰＴＰ１Ｂポリペプチドを発現できる少なくとも１つの細胞を含む対象と（ｉｉ）請求項１８または請求項２２のいずれかに記載の組換え核酸構築物とを接触させることを含んでなる方法。
【請求項３５】
ＰＴＰ１Ｂシグナル導入経路の成分を確認する方法であって：
Ａ．ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドと、ＰＴＰ１Ｂポリペプチドまたは前記ＰＴＰ１Ｂポリペプチドの変異体を発現することができる少なくとも１つの細胞を含む第一の生物学的サンプルとを、ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドが存在しない場合のＰＴＰ１Ｂ発現のために十分な条件下で、十分な時間接触させ、
ＰＴＰ１ＢポリペプチドはＧｅｎｂａｎｋ登録番号Ｍ３１７２４、ＮＭ＿００２８２７、およびＭ３３６８９からなる群から選択される配列に示されるアミノ酸配列を含み、
ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドは
（ｉ）配列番号８３−８６、８８−９１、９３−９６、９８−１０１、１０４−１０５および１０８−１０９からなる群から選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むＲＮＡポリヌクレオチド、
（ｉｉ）配列番号８３−８６、８８−９１、９８−１０１からなる群から選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むＲＮＡポリヌクレオチド、およびその相補的ポリヌクレオチド、
（ｉｉｉ）ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドのヌクレオチド配列は、配列番号８３−８６、８８−９１、９３−９６および９８−１０１に示される諸配列からなる群から選択される配列の位置１−１９のいずれかの位置における、または配列番号１０４、１０５、１０８および１０９に示される諸配列からなる群から選択される配列の任意の位置における１、２、または３個のヌクレオチドが異なる、（ｉ）または（ｉｉ）によるＲＮＡポリヌクレオチド、
（ｉｖ）ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドのヌクレオチド配列は、配列番号８３−８６、８８−９１、９３−９６および９８−１０１に示される諸配列からなる群から選択される配列の位置１−１９のいずれかの位置における、または配列番号１０４、１０５、１０８および１０９に示される諸配列からなる群から選択される配列の任意の位置における２、３または４個のヌクレオチドが異なる、（ｉ）または（ｉｉ）によるＲＮＡポリヌクレオチド
からなる群から選択され；
Ｂ．前記細胞においてリン酸化され得る少なくとも１種類のタンパク質のリン酸化レベルをｓｉＲＮＡポリヌクレオチドと接触しなかった対照サンプル中の前記タンパク質のリン酸化レベルと比較する
ことを含み、
ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドが存在しない場合のタンパク質のリン酸化レベルに比較してｓｉＲＮＡポリヌクレオチドの存在下におけるタンパク質の変化したリン酸化レベルは、前記タンパク質がＰＴＰ１Ｂシグナル導入経路の成分であることを示唆する
方法。
【請求項３６】
シグナル導入経路がＪａｋ２キナーゼを含む請求項３５記載の方法。
【請求項３７】
細胞内のインスリンレセプタータンパク質リン酸化状態を調整する方法であって、
前記細胞とｓｉＲＮＡポリヌクレオチドとを、ＰＴＰ１Ｂポリペプチドの発現を干渉するのに十分な条件下で十分な時間接触させ、その際
（ａ）ＰＴＰ１ＢポリペプチドがＧｅｎｂａｎｋ登録番号Ｍ３１７２４、ＮＭ＿００２８２７、ＮＭ＿０１１２０１、およびＭ３３６８９からなる群から選択される配列に示されるアミノ酸配列を含み、
（ｂ）ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドは
（ｉ）配列番号８３−８６、８８−９１、９３−９６、９８−１０１またはそれらの相補体および配列番号１０４、１０５、１０８および１０９からなる群から選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むＲＮＡポリヌクレオチド、
（ｉｉ）配列番号８３−８６、８８−９１、９３−９６、９８−１０１からなる群から選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むＲＮＡポリヌクレオチド、およびその相補的ポリヌクレオチド、
（ｉｉｉ）ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドのヌクレオチド配列は、配列番号８３−８６、８８−９１、９３−９６および９８−１０１に示される諸配列からなる群から選択される配列の位置１−１９のいずれかの位置における、または配列番号１０４、１０５、１０８および１０９に示される諸配列からなる群から選択される配列の任意の位置における１、２、または３個のヌクレオチドが異なる、（ｉ）または（ｉｉ）によるＲＮＡポリヌクレオチド、
（ｉｖ）ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドのヌクレオチド配列は、配列番号８３−８６、８８−９１、９３−９６および９８−１０１に示される諸配列からなる群から選択される配列の位置１−１９のいずれかの位置における、または配列番号１０４、１０５、１０８および１０９に示される諸配列からなる群から選択される配列の任意の位置における２、３または４個のヌクレオチドが異なる、（ｉ）または（ｉｉ）によるＲＮＡポリヌクレオチド
からなる群から選択され；
（ｃ）前記インスリンレセプタータンパク質が配列番号＿−＿からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはその変異体を含む
方法。
【請求項３８】
細胞内のＪａｋ２タンパク質リン酸化状態を変える方法であって、該細胞とｓｉＲＮＡポリヌクレオチドとを、ＰＴＰ１Ｂポリペプチドの発現を干渉するのに十分な条件下で十分な時間接触させることを含み、その際
（ａ）ＰＴＰ１ＢポリペプチドはＧｅｎｂａｎｋ登録番号Ｍ３１７２４、ＮＭ＿００２８２７、ＮＭ＿０１１２０１、およびＭ３３６８９からなる群から選択される配列に示されるアミノ酸配列を含み、
（ｂ）ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドは、
（ｉ）配列番号８３−８６、８８−９１、９３−９６、９８−１０１またはそれらの相補体、および配列番号１０４、１０５、１０８および１０９からなる群から選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むＲＮＡポリヌクレオチド、
（ｉｉ）配列番号８３−８６、８８−９１、９３−９６、９８−１０１からなる群から選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むＲＮＡポリヌクレオチド、およびその相補的ポリヌクレオチド、
（ｉｉｉ）ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドのヌクレオチド配列は、配列番号８３−８６、８８−９１、９３−９６および９８−１０１に示される諸配列からなる群から選択される配列の位置１−１９のいずれかの位置における、または配列番号１０４、１０５、１０８および１０９に示される諸配列からなる群から選択される配列の任意の位置における１、２、または３個のヌクレオチドが異なる、（ｉ）または（ｉｉ）によるＲＮＡポリヌクレオチド、
（ｉｖ）ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドのヌクレオチド配列は、配列番号８３−８６、８８−９１、９３−９６および９８−１０１に示される諸配列からなる群から選択される配列の位置１−１９のいずれかの位置における、または配列番号１０４、１０５、１０８および１０９に示される諸配列からなる群から選択される配列の任意の位置における２、３または４個のヌクレオチドが異なる、（ｉ）または（ｉｉ）によるＲＮＡポリヌクレオチド
からなる群から選択され、
（ｃ）Ｊａｋ２タンパク質が、配列番号＿−＿からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはその変異体を含む
方法。
【請求項３９】
請求項３１に記載の薬学的組成物をそれを必要とする対象に投与することを含む、Ｊａｋ２関連性疾患を治療する方法であって、ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドがＰＴＰ１Ｂポリペプチドまたはその変異体の発現を抑制する方法。
【請求項４０】
Ｊａｋ２関連性疾患が糖尿病、肥満、高血糖性アポトーシス、炎症、および神経変性疾患からなる群から選択される請求項３９記載の方法。
【請求項４１】
配列番号１８−２１、３３−３６、４３−４６、５３−５６および５８−６１からなる群から選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むＲＮＡポリヌクレオチドを含む単離された短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）ポリヌクレオチド。

【図１】

【図２】

【図３】


【図５】

【公表番号】特表２００６−５０６９６１（Ｐ２００６−５０６９６１Ａ）
【公表日】平成１８年３月２日（２００６．３．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−５０６７５４（Ｐ２００４−５０６７５４）
【出願日】平成１５年５月２３日（２００３．５．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０１６６５１
【国際公開番号】ＷＯ２００３／０９９２２７
【国際公開日】平成１５年１２月４日（２００３．１２．４）
【出願人】（５０４３０８２１３）セプティア，　インコーポレイテッド (1)
【Ｆターム（参考）】