ＳＡＲＳコロナウイルスの検出法
【課題】 重症急性呼吸器症候群の診断のために、その病原ウイルスであるＳＡＲＳコロナウイルスを高感度かつ迅速に検出する方法を提供すること。
【解決手段】 ＳＡＲＳコロナウイルスのＲＮＡポリメラーゼの塩基配列から設計された任意の塩基配列と特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマー、該プライマーを用いた核酸増幅法、核酸増幅の検出によるＳＡＲＳコロナウイルス感染の診断方法、並びに重症急性呼吸器症候群診断用キット。
【解決手段】 ＳＡＲＳコロナウイルスのＲＮＡポリメラーゼの塩基配列から設計された任意の塩基配列と特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマー、該プライマーを用いた核酸増幅法、核酸増幅の検出によるＳＡＲＳコロナウイルス感染の診断方法、並びに重症急性呼吸器症候群診断用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＳＡＲＳコロナウイルスの検出方法に関し、さらに詳しくは遺伝子の、高感度な検出法を利用した重症急性呼吸器症候群の診断方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳと略す）は、２００２年１１月から中国広東省に端を発し、香港、台湾、カナダなどの国で爆発的な感染を引き起こした感染症である。世界保健機関（ＷＨＯ）によると、ＳＡＲＳ感染者の死亡率は平均１５％、６５歳以上の高齢者では５０％以上と推計されている。ＳＡＲＳの病原ウイルスであるＳＡＲＳコロナウイルスは、１本鎖ＲＮＡウイルスである（例えば、非特許文献１参照）。またこのウイルスは、ヒト以外の動物でも感染する事が知られている。
【０００３】
ＳＡＲＳの主な臨床症状は３８℃以上の発熱、咳、呼吸困難等の呼吸器症状であり、ほかに頭痛、悪寒戦慄、食欲不振、全身倦怠感、下痢、意識混濁などの症状が見られることもある。しかしこれらの症状は、他の呼吸器疾患、例えばインフルエンザなどとほとんど同じで、症状のみから他の疾患と鑑別する事は難しい。
【０００４】
臨床検査法として免疫学的方法が知られている。これは血液、血清、尿あるいは唾液中のウイルスの抗原に対する抗体の存在を調べるもので、ＳＡＲＳコロナウイルスでは酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）と免疫蛍光法（ＩＦＡ）の二つの方法が知られている。しかし、これらはいずれも発病初期には検出されず、ＥＬＩＳＡでは発病後２０日以降、ＩＦＡでは発病後１０日以降でないと抗体が検出されない（例えば、非特許文献２参照）。
【０００５】
この他にウイルスの遺伝子をＰＣＲ法で増幅する事で検出する方法も知られている。しかしこの方法は、増幅と検出に１時間以上必要であり、検出感度が低いという問題が示唆されていた。そこで、迅速かつ高感度にＳＡＲＳコロナウイルスを検出できる検査法が望まれていた。（例えば、非特許文献３、４参照）
【０００６】
本発明者らは、現在知られている方法、免疫学的測定法やＰＣＲ法より高感度で特異的かつ所要時間が短い検出方法、すなわちＬＡＭＰ法を用いることで、本発明の目的を達成できた。
【０００７】
【非特許文献１】Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ Ｕｐｄａｔｅ ４９−ＳＡＲＳ ｃａｓｅ ｆａｔａｌｉｔｙ ｒａｔｉｏ，ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ ｐｅｒｉｏｄ ７ Ｍａｙ ２００３ Ｃａｓｅ ｆａｔａｌｉｔｙ ｒａｔｉｏ 平成１５年６月２４日検索、インターネット＜ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｗｈｏ．ｉｎｔ／ｃｓｒ／ｓａｒｓ／ａｒｃｈｉｖｅ／２００３＿０５＿０７ａ／ｅｎ／＞
【非特許文献２】国立感染症研究所感染症情報センター、ＳＡＲＳ：診断検査法（４月２９日 ４訂−１）平成１５年６月２４日検索、インターネット＜ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｉｄｓｃ．ｎｉｈ．ｇｏ．ｊｐ／ｏｔｈｅｒｓ／ｕｒｇｅｎｔ／ｕｐｄａｔｅ４１−Ｎｏ１．ｈｔｍｌ＞
【非特許文献３】Ｄｒｏｓｔｅｎ Ｃ．，ｅｔ ａｌ．「Ｎｅｗ Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．」２００３年、３４８巻、Ｐ．１９６７−１９７６
【非特許文献４】国立感染症研究所感染症情報センター、国立感染症研究所ウイルス第三部第１室 ＲＴ−ＰＣＲ法によるＳＡＲＳコロナウイルス遺伝子の検出（２００３年５月１６日更新）平成１５年６月２４日検索、インターネット＜ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｉｄｓｃ．ｎｉｈ．ｇｏ．ｊｐ／ｏｔｈｅｒｓ／ｕｒｇｅｎｔ／ｕｐｄａｔｅ５６−ｂ．ｈｔｍｌ＞
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、ＳＡＲＳの早期診断のために、その病原ウイルスであるＳＡＲＳコロナウイルスを高感度に検出させることを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、ＳＡＲＳコロナウイルスに特異的な塩基配列と選択的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマーを作製し、ＬＡＭＰ法によりＳＡＲＳコロナウイルスに特異的な塩基配列を増幅することで、ＳＡＲＳコロナウイルスを高感度に検出できることを見出し、本発明を完成した。
【００１０】
すなわち、本発明は以下の構成からなる。
（１）配列番号１で示されるＳＡＲＳコロナウイルスのＲＮＡポリメラーゼ塩基配列の、４１番〜２５６番の塩基配列から選ばれた任意の塩基配列、又はそれらと相補的な塩基配列から設計されたオリゴヌクレオチドプライマー。
（２）ＳＡＲＳコロナウイルスのＲＮＡポリメラーゼ塩基配列から選ばれた配列番号２〜１３で示される塩基配列又はそれらと相補的な塩基配列から選ばれた、少なくとも連続する１５塩基を含む（１）記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
（３）ＳＡＲＳコロナウイルスの標的核酸上の３’末端側からＦ３ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ１ｃという塩基配列領域を、５’末端側からＲ３、Ｒ２、Ｒ１という塩基配列領域を選択し、それぞれの相補的塩基配列をＦ３、Ｆ２、Ｆ１、そしてＲ３ｃ、Ｒ２ｃ、Ｒ１ｃとしたときに、以下の（ａ）〜（ｄ）から選ばれた塩基配列から成ることを特徴とする（１）〜（２）記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
（ａ）標的核酸のＦ２領域を３’末端側に有し、５’末端側に標的核酸のＦ１ｃ領域を有する塩基配列。
（ｂ）標的核酸のＦ３領域を有する塩基配列。
（ｃ）標的核酸のＲ２領域を３’末端側に有し、５’末端側に標的核酸のＲ１ｃ領域を有する塩基配列。
（ｄ）標的核酸のＲ３領域を有する塩基配列。
（４）ＳＡＲＳコロナウイルスに特異的な塩基配列を増幅でき、５’末端から３’末端に向かい以下の（ｅ）〜（ｈ）から選ばれた塩基配列から成ることを特徴とする（１）〜（３）記載のオリゴヌクレオチプライマー。
（ｅ）５’−（配列番号２の塩基配列に相補的な塩基配列）−（塩基数０〜５０の任意の塩基配列）−（配列番号３の塩基配列）−３’
（ｆ）５’−（配列番号５の塩基配列）−（塩基数０〜５０の任意の塩基配列）−（配列番号６の塩基配列に相補的な塩基配列）−３’
（ｇ）５’−（配列番号８の塩基配列に相補的な塩基配列）−（塩基数０〜５０の任意の塩基配列）−（配列番号９の塩基配列）−３’
（ｈ）５’−（配列番号１１の塩基配列）〜（塩基数０〜５０の任意の塩基配列）−（配列番号１２の塩基配列に相補的な塩基配列）−３’
（５）（１）〜（４）記載のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ＳＡＲＳコロナウイルスの標的核酸領域の増幅反応を行うことを特徴とするＳＡＲＳコロナウイルスの検出方法。
（６）ＳＡＲＳコロナウイルスの標的核酸領域の増幅反応がＬＡＭＰ法であることを特徴とする（５）記載のＳＡＲＳコロナウイルスの検出方法。
（７）（１）〜（４）記載のオリゴヌクレオチドプライマーを用いてＳＡＲＳコロナウイルスの標的核酸領域の増幅を検出することにより、ＳＡＲＳコロナウイルス感染の有無を診断することを特徴とする重症急性呼吸器症候群の診断方法。
（８）重症急性呼吸器症候群の診断方法において、（１）〜（４）記載のオリゴヌクレオチドプライマーを含むことを特徴とするキット。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、ＳＡＲＳコロナウイルスに特異的な塩基配列と選択的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマーを作製し、ＬＡＭＰ法によりＳＡＲＳコロナウイルスに特異的な塩基配列を増幅することで、ＳＡＲＳコロナウイルスを高感度かつ迅速に検出することができる。
以下、本発明を詳細に説明する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明において使用される試料としては、ＳＡＲＳ感染を疑われる人間あるいは他の動物の生体由来の検体、例えば喀痰、気管支肺胞洗浄液、鼻汁、鼻腔吸引液、鼻腔洗浄液、鼻腔拭い液、咽頭拭い液、うがい液、唾液、血液、血清、血漿、髄液、尿、糞便、組織などが挙げられる。また、感染実験などに用いられた細胞やその培養液、あるいは生体由来の検体や培養細胞などから分離したウイルスを含む検体なども試料となりうる。これらの試料は分離、抽出、濃縮、精製などの前処理を行っても良い。
【００１３】
このような核酸の増幅は、納富らが開発した、ＰＣＲ法で不可欠とされる温度制御が不要な新しい核酸増幅法：ＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法と呼ばれるループ媒介等温増幅法（特許公報国際公開第００／２８０８２号パンフレット）で達成される。この方法は、鋳型となるヌクレオチドに自身の３’末端をアニールさせて相補鎖合成の起点とするとともに、このとき形成されるループにアニールするプライマーを組み合わせることにより、等温での相補鎖合成反応を可能とした核酸増幅法である。また、ＬＡＭＰ法では、プライマーの３’末端が常に試料に由来する領域に対してアニールするために、塩基配列の相補的結合によるチェック機構が繰り返し機能するため、その結果として、高感度にかつ特異性の高い核酸増幅反応を可能としている。
【００１４】
ＬＡＭＰ反応で使用されるオリゴヌクレオチドプライマーは、鋳型核酸の塩基配列の計６領域、すなわち３’末端側からＦ３ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ１ｃという領域と、５’末端側からＲ３、Ｒ２、Ｒ１という領域の塩基配列を認識する少なくとも４種類のプライマーであって、各々インナープライマーＦ及びＲとアウタープライマーＦ及びＲと呼ぶ。また、Ｆ１ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ３ｃの相補配列をそれぞれＦ１、Ｆ２、Ｆ３、またＲ１、Ｒ２、Ｒ３の相補鎖をＲ１ｃ、Ｒ２ｃ、Ｒ３ｃと呼ぶ。インナープライマーとは、標的塩基配列上の「ある特定のヌクレオチド配列領域」を認識し、かつ合成起点を与える塩基配列を３’末端に有し、同時にこのプライマーを起点とする核酸合成反応生成物の任意の領域に対して相補的な塩基配列を５’末端に有するオリゴヌクレオチドである。ここで、「Ｆ２より選ばれた塩基配列」及び「Ｆ１ｃより選ばれた塩基配列」を含むプライマーをインナープライマーＦ（以下ＩＰＦ）、そして「Ｒ２より選ばれた塩基配列」と「Ｒ１ｃより選ばれた塩基配列」を含むプライマーをインナープライマーＲ（以下ＩＰＲ）と呼ぶ。一方、アウタープライマーとは、標的塩基配列上の『「ある特定のヌクレオチド配列領域」の３’末端側に存在するある特定のヌクレオチド配列領域』を認識かつ合成起点を与える塩基配列を有するオリゴヌクレオチドである。ここで、「Ｆ３より選ばれた塩基配列」を含むプライマーをアウタープライマーＦ（以下ＯＰＦ）、「Ｒ３より選ばれた塩基配列」を含むプライマーをアウタープライマーＲ（以下ＯＰＲ）と呼ぶ。ここで、各プライマーにおけるＦとは、標的塩基配列のセンス鎖と相補的に結合し、合成起点を提供するプライマー表示であり、一方Ｒとは、標的塩基配列のアンチセンス鎖と相補的に結合し、合成起点を提供するプライマー表示である。ここで、プライマーとして用いられるオリゴヌクレオチドの長さは、１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上で、化学合成あるいは天然のどちらでも良く、各プライマーは単一のオリゴヌクレオチドであってもよく、複数のオリゴヌクレオチドの混合物であってもよい。
【００１５】
ＬＡＭＰ法においては、インナープライマーとアウタープライマーに加え、さらにこれとは別のプライマー、すなわちループプライマーを用いる事ができる。ループプライマー（Ｌｏｏｐ Ｐｒｉｍｅｒ）は、ダンベル構造の５’末端側のループ構造の一本鎖部分の塩基配列に相補的な塩基配列を持つプライマーである。このプライマーを用いると、核酸合成の起点が増加し、反応時間の短縮と検出感度の上昇が可能となる（特許文献国際公開第０２／２４９０２号パンフレット）。ループプライマーの塩基配列は上述のダンベル構造の５’末端側のループ構造の一本鎖部分の塩基配列に相補的であれば、標的遺伝子の塩基配列あるいはその相補鎖から選ばれても良く、他の塩基配列でも良い。また、ループプライマーは１種類でも２種類でも良い。
【００１６】
ＳＡＲＳコロナウイルスはＲＮＡウイルスである。ＬＡＭＰ法は鋳型がＲＮＡの場合には、鋳型がＤＮＡの場合の反応液に逆転写酵素を添加する事で、同様に核酸増幅反応を進めることができる（ＲＴ−ＬＡＭＰ法）。
【００１７】
本発明者らはＳＡＲＳコロナウイルスに特異的な塩基配列を迅速に増幅できるＬＡＭＰ法のプライマーの塩基配列とその組み合わせを鋭意研究した結果、ＳＡＲＳコロナウイルスのＲＮＡポリメラーゼの塩基配列（非特許文献３）より配列番号１で示される塩基配列から、プライマーセットとして次のＡ、Ｂの２組を選定した。
（プライマーセットＡ）
ＩＰＦ−Ａ：５’−ＴＡＣＡＴＣＡＡＡＧＣＣＡＡＴＣＣＡＣＧＣＡＡＴＡＴＧＴＴＴＡＴＣＡＣＣＣＧＣＧＡＡＧＡ−３’ （配列番号１４）
ＯＰＦ−Ａ：５’−ＡＣＣＡＡＧＴＣＡＡＴＧＧＴＴＡＣＣＣＴ−３’ （配列番号４）
ＩＰＲ−Ａ：５’−
ＧＣＴＧＴＣＡＴＧＣＡＡＣＴＡＧＡＧＡＴＧＣＴＡＣＡＧＣＴＡＣＴＡＡＧＴＴＡＡＣＡＣＣＴＧ−３’ （配列番号１５）
ＯＰＲ−Ａ：５’−ＧＴＧＴＣＡＡＣＡＴＡＡＣＣＡＧＴＣＧＧ−３’ （配列番号１６）
ＬＰＦ−Ａ：５’−ＡＣＧＡＡＣＧＴＧＡＣＧＡＡＴＡＧＣＴ−３’ （配列番号２０）
ＬＰＲ−Ａ：５’−ＧＴＡＣＴＡＡＣＣＴＡＣＣＴＣＴＣＣＡＧＣ−３’ （配列番号２１）
（プライマーセットＢ）
ＩＰＦ−Ｂ：５’−ＴＧＣＡＴＧＡＣＡＧＣＣＣＴＣＧＡＡＧＡＡＧＣＴＡＴＴＣＧＴＣＡＣ−３’ （配列番号１７）
ＯＰＦ−Ｂ：５’−ＣＴＡＡＴＡＴＧＴＴＴＡＴＣＡＣＣＣＧＣ−３’ （配列番号１０）
ＩＰＲ−Ｂ：５’−ＧＣＴＧＴＧＧＧＴＡＣＴＡＡＣＣＴＡＣＣＴＧＴＣＡＡＣＡＴＡＡＣＣＡＧＴＣＧＧ−３’ （配列番号１８）
ＯＰＲ−Ｂ：５’−ＣＴＣＴＧＧＴＧＡＡＴＴＣＴＧＴＧＴＴ−３’ （配列番号１９）
ＬＰＦ−Ｂ：５’−ＡＡＡＧＣＣＡＡＴＣＣＡＣＧＣ−３’ （配列番号２２）
ＬＰＲ−Ｂ：５’−ＣＣＡＧＣＴＡＧＧＡＴＴＴＴＣＴＡＣＡＧＧ−３’ （配列番号２３）
【００１８】
核酸合成で使用する酵素は、鎖置換活性を有する鋳型依存性核酸合成酵素であれば特に限定されない。このような酵素としては、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ（ラージフラグメント）、Ｂｃａ（ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメント等が挙げられ、好ましくはＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ（ラージフラグメント）が挙げられる。
【００１９】
ＲＴ−ＬＡＭＰ法に用いる逆転写酵素としては、ＲＮＡを鋳型としてＤＮＡを合成する活性を有する酵素であれば特に限定されない。このような酵素としては、ＡＭＶ、Ｃｌｏｎｅｄ ＡＭＶ、ＭＭＬＶの逆転写酵素、ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ、ＲｅｖｅｒＴｒａＡｃｅ、Ｔｈｅｒｍｏｓｃｒｉｐｔ等が挙げられ、好ましくは、ＡＭＶあるいはＣｌｏｎｅｄ ＡＭＶ逆転写酵素が挙げられる。またＢｃａ ＤＮＡポリメラーゼのように、逆転写酵素活性とＤＮＡポリメラーゼ活性の両活性を有する酵素を用いると、ＲＴ−ＬＡＭＰ反応を１つの酵素で行う事ができる。
核酸合成で使用する酵素や逆転写酵素は、ウイルスや細菌などから精製されたものでも良く、遺伝子組み換え技術によって作製されたものでも良い。またこれらの酵素はフラグメント化やアミノ酸の置換などの改変をされたものでも良い。
【００２０】
ＬＡＭＰ反応後の核酸増幅産物の検出には公知の技術が適用できる。例えば、増幅された塩基配列を特異的に認識する標識オリゴヌクレオチドや蛍光性インターカレーター法（特許文献特開２００１−２４２１６９号公報）を用いたり、あるいは反応終了後の反応液をそのままアガロースゲル電気泳動にかけても容易に検出できる。アガロースゲル電気泳動では、ＬＡＭＰ増幅産物は、塩基長の異なる多数のバンドがラダー（はしご）状に検出される。また、ＬＡＭＰ法では核酸の合成により基質が大量に消費され、副産物であるピロリン酸が、共存するマグネシウムと反応してピロリン酸マグネシウムとなり、反応液が肉眼でも確認できる程に白濁する。したがって、この白濁を、反応終了後あるいは反応中の濁度上昇を経時的に光学的に観察できる測定機器、例えば４００ｎｍの吸光度変化を通常の分光光度計を用いて確認することで、核酸増幅反応を検出することも可能である（特許文献国際公開第０１／８３８１７号パンフレット）。
【００２１】
本発明のプライマーを用いて核酸増幅の検出を行う際に必要な各種の試薬類は、あらかじめパッケージングしてキット化する事ができる。具体的には、本発明のプライマーあるいはループプライマーとして必要な各種のオリゴヌクレオチド、核酸合成の基質となる４種類のｄＮＴＰ、核酸合成を行うＤＮＡポリメラーゼ、逆転写活性を持つ酵素、酵素反応に好適な条件を与える緩衝液や塩類、酵素や鋳型を安定化する保護剤、さらに必要に応じて反応生成物の検出に必要な試薬類がキットとして提供される。
【実施例】
【００２２】
以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらにより何ら限定されるものではない。
実施例１．検出感度の確認
ＬＡＭＰ法と、ＰＣＲ法との検出感度の比較を行った。
１．試料及び試薬の調製
１）試料
ＳＡＲＳコロナウイルスのＲＮＡポリメラーゼの配列より選ばれた配列番号１のＲＮＡをＹｅａｓｔ ＲＮＡ（Ａｍｂｉｏｎ社製）溶液（５０ｎｇ／μＬ）に溶解し、１μＬあたり１０コピーから１０４コピーまでの希釈液と、２．５、５、１０コピーの希釈液を作製し、試料溶液とした。また同Ｙｅａｓｔ ＲＮＡ溶液を０コピーの試料溶液とした。
【００２３】
２）ＰＣＲ法に用いる試薬組成及び濃度
ＰＣＲ法で使用するＳＡＲＳコロナウイルス検出用プライマーとして、ＲＮＡポリメラーゼゲノムの１９５ｂｐを増幅する配列番号２４および２５で示される塩基配列からなる２種類のプライマーを使用した、非特許文献４記載の方法に準じて行った。
ｃＤＮＡの合成反応溶液組成
・５×Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ） ４μＬ
・１０ｍＭ ｄＮＴＰｓ １μＬ
・０．１Ｍ ＤＴＴ ２μＬ
・Ｒａｎｄｏｍ ｐｒｉｍｅｒ（５０ｎｇ／μｌ，ＴＡＫＡＲＡ） １μＬ
・ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（４０Ｕ／μｌ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ） １μＬ
・ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ（２００Ｕ／μｌ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ） １μＬ
・Ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ ｗａｔｅｒ ５μＬ
・試料溶液 ５μＬ
ＰＣＲ反応溶液組成
・１０×Ｅｘ Ｔａｑ ｂｕｆｆｅｒ（Ｍｇ ｆｒｅｅ）（ＴＡＫＡＲＡ） ５μＬ
・２５ｍＭ ＭｇＣｌ２ ４μＬ
・２．５ｍＭ ｄＮＴＰｓ ４μＬ
・１０ｐｍｏｌ／μＬプライマー 各１μＬ
・Ｅｘ Ｔａｑ（５Ｕ／μＬ，ＴＡＫＡＲＡ） ０．５μＬ
・Ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ ｗａｔｅｒ ３３．５μＬ
・ｃＤＮＡ合成溶液 １μＬ
【００２４】
３）ＬＡＭＰ法に用いる試薬組成及び濃度
プライマーセットＡを用いたＬＡＭＰ法による増幅のため、最終反応溶液２５μＬ中の各試薬濃度が下記になるよう調製した。
反応溶液組成
・２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．８
・１０ｍＭ ＫＣｌ
・８ｍＭ ＭｇＳＯ４
・１．４ｍＭ ｄＮＴＰｓ
・１０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４
・０．８Ｍ Ｂｅｔａｉｎｅ（Ｓｉｇｍａ）
・０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０
・１．６μＭ ＩＰＦ及びＩＰＲ
・０．２μＭ ＯＰＦ及びＯＰＲ
・０．８μＭ ＬＰＦ及びＬＰＲ
・ＡＭＶ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ ０．６２５Ｕ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）
・Ｂｓｔ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ８Ｕ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）
・０．２５μｇ／ｍＬ ＥｔＢｒ（ニッポンジーン）
プライマーセットＢを用いた反応ではＡＭＶ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ ０．６２５Ｕに代えてＣｌｏｎｅｄ ＡＭＶ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）２Ｕを用いた。
【００２５】
２．核酸増幅法による反応
１）ＰＣＲ法による反応
ｃＤＮＡ合成反応は、標的配列０または１０〜１０３コピーを含む試料溶液５μＬを上記のｃＤＮＡ合成反応溶液に加え、４２℃５０分その後７０℃１５分で行った。ＰＣＲ反応は、上記ＰＣＲ反応溶液に、ｃＤＮＡ合成した溶液１μＬを加え、最終反応溶液５０μＬとし、０．２ｍＬの専用チューブ内でサーマルサイクラーＰＴＣ−２００（ＭＪリサーチ社製）を用い、熱変性９５℃３０秒、アニーリング５６℃３０秒、ポリメラーゼ伸長反応７２℃３０秒を１サイクルとして計４０サイクル行った。所要時間は約１時間だった。反応終了後の反応溶液５μＬを２％アガロースゲルで電気泳動を行った。
２）ＬＡＭＰ法による反応
プライマーセットＡを用いたＬＡＭＰ用試薬に、標的配列０または１０〜１０３コピーを含む試料溶液１μＬを加え、最終反応溶液２５μＬとし、０．２ｍＬの専用チューブ内で、６３℃で６０分ＬＡＭＰ反応を行った。反応終了後の反応溶液５μＬを２％アガロースゲルで電気泳動を行った。
３．電気泳動法による各増幅反応の検出感度の比較結果
ＰＣＲ法の電気泳動の結果を図１に、プライマーセットＡを用いたＬＡＭＰ法の電気泳動の結果を図２に示す。その結果、ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法とも増幅産物の確認ができた。ＰＣＲ法では、１０２コピーまでは１９５ｂｐの特異的バンドが明瞭に認められたが、１０コピーでは薄いバンドとして観察された。これに対しＬＡＭＰ法では、１０コピーまで特異的増幅のラダー状のバンドを確認することができた。
【００２６】
実施例２．ＬＡＭＰ法のリアルタイム測定法による検出時間の検討
プライマーセットＡを用いたＬＡＭＰ法の検出時間の検討は、実施例１．のＬＡＭＰ法の組成２５μＬを用い、リアルタイム蛍光測定装置ＰＲＩＳＭ ７７００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）によって反応温度を６３℃に固定して行った。図３に結果を示す。
この結果、０コピーでは６０分でも蛍光の増加は見られず、１０コピー以上では２０分以内に蛍光の増加が確認され、２０分で１０コピーの存在を検出できた。
プライマーセットＢを用いたＬＡＭＰ法の検出時間の検討は、リアルタイム濁度測定装置ＬＡ−２００（テラメックス社製）を用いてリアルタイム濁度測定法によって行った。実施例１．のＬＡＭＰ法の組成２５μＬを用い、反応温度を６３℃に固定して行った。図４に結果を示す。
この結果、０コピーでは６０分でも濁度の増加は見られず、２．５コピー以上では３５分以内に濁度の増加が確認され、３５分で２．５コピーの存在を検出できた。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】電気泳動法によるＰＣＲ法の検出感度を示す。レーン１と７はマーカーレーン２は試薬ブランクレーン３は０コピーレーン４は１０コピーレーン５は１０２コピーレーン６は１０３コピー
【図２】電気泳動法によるプライマーセットＡを用いたＬＡＭＰ法の検出感度を示す。レーン１は０コピーレーン２は１０コピーレーン３は１０２コピーレーン４は１０３コピーレーン５は１０４コピーレーン６はマーカー
【図３】プライマーセットＡを用いたリアルタイム蛍光測定法の検出時間を示す。
【図４】プライマーセットＢを用いたリアルタイム濁度測定法の検出時間を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＳＡＲＳコロナウイルスの検出方法に関し、さらに詳しくは遺伝子の、高感度な検出法を利用した重症急性呼吸器症候群の診断方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳと略す）は、２００２年１１月から中国広東省に端を発し、香港、台湾、カナダなどの国で爆発的な感染を引き起こした感染症である。世界保健機関（ＷＨＯ）によると、ＳＡＲＳ感染者の死亡率は平均１５％、６５歳以上の高齢者では５０％以上と推計されている。ＳＡＲＳの病原ウイルスであるＳＡＲＳコロナウイルスは、１本鎖ＲＮＡウイルスである（例えば、非特許文献１参照）。またこのウイルスは、ヒト以外の動物でも感染する事が知られている。
【０００３】
ＳＡＲＳの主な臨床症状は３８℃以上の発熱、咳、呼吸困難等の呼吸器症状であり、ほかに頭痛、悪寒戦慄、食欲不振、全身倦怠感、下痢、意識混濁などの症状が見られることもある。しかしこれらの症状は、他の呼吸器疾患、例えばインフルエンザなどとほとんど同じで、症状のみから他の疾患と鑑別する事は難しい。
【０００４】
臨床検査法として免疫学的方法が知られている。これは血液、血清、尿あるいは唾液中のウイルスの抗原に対する抗体の存在を調べるもので、ＳＡＲＳコロナウイルスでは酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）と免疫蛍光法（ＩＦＡ）の二つの方法が知られている。しかし、これらはいずれも発病初期には検出されず、ＥＬＩＳＡでは発病後２０日以降、ＩＦＡでは発病後１０日以降でないと抗体が検出されない（例えば、非特許文献２参照）。
【０００５】
この他にウイルスの遺伝子をＰＣＲ法で増幅する事で検出する方法も知られている。しかしこの方法は、増幅と検出に１時間以上必要であり、検出感度が低いという問題が示唆されていた。そこで、迅速かつ高感度にＳＡＲＳコロナウイルスを検出できる検査法が望まれていた。（例えば、非特許文献３、４参照）
【０００６】
本発明者らは、現在知られている方法、免疫学的測定法やＰＣＲ法より高感度で特異的かつ所要時間が短い検出方法、すなわちＬＡＭＰ法を用いることで、本発明の目的を達成できた。
【０００７】
【非特許文献１】Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ Ｕｐｄａｔｅ ４９−ＳＡＲＳ ｃａｓｅ ｆａｔａｌｉｔｙ ｒａｔｉｏ，ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ ｐｅｒｉｏｄ ７ Ｍａｙ ２００３ Ｃａｓｅ ｆａｔａｌｉｔｙ ｒａｔｉｏ 平成１５年６月２４日検索、インターネット＜ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｗｈｏ．ｉｎｔ／ｃｓｒ／ｓａｒｓ／ａｒｃｈｉｖｅ／２００３＿０５＿０７ａ／ｅｎ／＞
【非特許文献２】国立感染症研究所感染症情報センター、ＳＡＲＳ：診断検査法（４月２９日 ４訂−１）平成１５年６月２４日検索、インターネット＜ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｉｄｓｃ．ｎｉｈ．ｇｏ．ｊｐ／ｏｔｈｅｒｓ／ｕｒｇｅｎｔ／ｕｐｄａｔｅ４１−Ｎｏ１．ｈｔｍｌ＞
【非特許文献３】Ｄｒｏｓｔｅｎ Ｃ．，ｅｔ ａｌ．「Ｎｅｗ Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．」２００３年、３４８巻、Ｐ．１９６７−１９７６
【非特許文献４】国立感染症研究所感染症情報センター、国立感染症研究所ウイルス第三部第１室 ＲＴ−ＰＣＲ法によるＳＡＲＳコロナウイルス遺伝子の検出（２００３年５月１６日更新）平成１５年６月２４日検索、インターネット＜ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｉｄｓｃ．ｎｉｈ．ｇｏ．ｊｐ／ｏｔｈｅｒｓ／ｕｒｇｅｎｔ／ｕｐｄａｔｅ５６−ｂ．ｈｔｍｌ＞
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、ＳＡＲＳの早期診断のために、その病原ウイルスであるＳＡＲＳコロナウイルスを高感度に検出させることを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、ＳＡＲＳコロナウイルスに特異的な塩基配列と選択的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマーを作製し、ＬＡＭＰ法によりＳＡＲＳコロナウイルスに特異的な塩基配列を増幅することで、ＳＡＲＳコロナウイルスを高感度に検出できることを見出し、本発明を完成した。
【００１０】
すなわち、本発明は以下の構成からなる。
（１）配列番号１で示されるＳＡＲＳコロナウイルスのＲＮＡポリメラーゼ塩基配列の、４１番〜２５６番の塩基配列から選ばれた任意の塩基配列、又はそれらと相補的な塩基配列から設計されたオリゴヌクレオチドプライマー。
（２）ＳＡＲＳコロナウイルスのＲＮＡポリメラーゼ塩基配列から選ばれた配列番号２〜１３で示される塩基配列又はそれらと相補的な塩基配列から選ばれた、少なくとも連続する１５塩基を含む（１）記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
（３）ＳＡＲＳコロナウイルスの標的核酸上の３’末端側からＦ３ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ１ｃという塩基配列領域を、５’末端側からＲ３、Ｒ２、Ｒ１という塩基配列領域を選択し、それぞれの相補的塩基配列をＦ３、Ｆ２、Ｆ１、そしてＲ３ｃ、Ｒ２ｃ、Ｒ１ｃとしたときに、以下の（ａ）〜（ｄ）から選ばれた塩基配列から成ることを特徴とする（１）〜（２）記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
（ａ）標的核酸のＦ２領域を３’末端側に有し、５’末端側に標的核酸のＦ１ｃ領域を有する塩基配列。
（ｂ）標的核酸のＦ３領域を有する塩基配列。
（ｃ）標的核酸のＲ２領域を３’末端側に有し、５’末端側に標的核酸のＲ１ｃ領域を有する塩基配列。
（ｄ）標的核酸のＲ３領域を有する塩基配列。
（４）ＳＡＲＳコロナウイルスに特異的な塩基配列を増幅でき、５’末端から３’末端に向かい以下の（ｅ）〜（ｈ）から選ばれた塩基配列から成ることを特徴とする（１）〜（３）記載のオリゴヌクレオチプライマー。
（ｅ）５’−（配列番号２の塩基配列に相補的な塩基配列）−（塩基数０〜５０の任意の塩基配列）−（配列番号３の塩基配列）−３’
（ｆ）５’−（配列番号５の塩基配列）−（塩基数０〜５０の任意の塩基配列）−（配列番号６の塩基配列に相補的な塩基配列）−３’
（ｇ）５’−（配列番号８の塩基配列に相補的な塩基配列）−（塩基数０〜５０の任意の塩基配列）−（配列番号９の塩基配列）−３’
（ｈ）５’−（配列番号１１の塩基配列）〜（塩基数０〜５０の任意の塩基配列）−（配列番号１２の塩基配列に相補的な塩基配列）−３’
（５）（１）〜（４）記載のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ＳＡＲＳコロナウイルスの標的核酸領域の増幅反応を行うことを特徴とするＳＡＲＳコロナウイルスの検出方法。
（６）ＳＡＲＳコロナウイルスの標的核酸領域の増幅反応がＬＡＭＰ法であることを特徴とする（５）記載のＳＡＲＳコロナウイルスの検出方法。
（７）（１）〜（４）記載のオリゴヌクレオチドプライマーを用いてＳＡＲＳコロナウイルスの標的核酸領域の増幅を検出することにより、ＳＡＲＳコロナウイルス感染の有無を診断することを特徴とする重症急性呼吸器症候群の診断方法。
（８）重症急性呼吸器症候群の診断方法において、（１）〜（４）記載のオリゴヌクレオチドプライマーを含むことを特徴とするキット。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、ＳＡＲＳコロナウイルスに特異的な塩基配列と選択的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマーを作製し、ＬＡＭＰ法によりＳＡＲＳコロナウイルスに特異的な塩基配列を増幅することで、ＳＡＲＳコロナウイルスを高感度かつ迅速に検出することができる。
以下、本発明を詳細に説明する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明において使用される試料としては、ＳＡＲＳ感染を疑われる人間あるいは他の動物の生体由来の検体、例えば喀痰、気管支肺胞洗浄液、鼻汁、鼻腔吸引液、鼻腔洗浄液、鼻腔拭い液、咽頭拭い液、うがい液、唾液、血液、血清、血漿、髄液、尿、糞便、組織などが挙げられる。また、感染実験などに用いられた細胞やその培養液、あるいは生体由来の検体や培養細胞などから分離したウイルスを含む検体なども試料となりうる。これらの試料は分離、抽出、濃縮、精製などの前処理を行っても良い。
【００１３】
このような核酸の増幅は、納富らが開発した、ＰＣＲ法で不可欠とされる温度制御が不要な新しい核酸増幅法：ＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法と呼ばれるループ媒介等温増幅法（特許公報国際公開第００／２８０８２号パンフレット）で達成される。この方法は、鋳型となるヌクレオチドに自身の３’末端をアニールさせて相補鎖合成の起点とするとともに、このとき形成されるループにアニールするプライマーを組み合わせることにより、等温での相補鎖合成反応を可能とした核酸増幅法である。また、ＬＡＭＰ法では、プライマーの３’末端が常に試料に由来する領域に対してアニールするために、塩基配列の相補的結合によるチェック機構が繰り返し機能するため、その結果として、高感度にかつ特異性の高い核酸増幅反応を可能としている。
【００１４】
ＬＡＭＰ反応で使用されるオリゴヌクレオチドプライマーは、鋳型核酸の塩基配列の計６領域、すなわち３’末端側からＦ３ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ１ｃという領域と、５’末端側からＲ３、Ｒ２、Ｒ１という領域の塩基配列を認識する少なくとも４種類のプライマーであって、各々インナープライマーＦ及びＲとアウタープライマーＦ及びＲと呼ぶ。また、Ｆ１ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ３ｃの相補配列をそれぞれＦ１、Ｆ２、Ｆ３、またＲ１、Ｒ２、Ｒ３の相補鎖をＲ１ｃ、Ｒ２ｃ、Ｒ３ｃと呼ぶ。インナープライマーとは、標的塩基配列上の「ある特定のヌクレオチド配列領域」を認識し、かつ合成起点を与える塩基配列を３’末端に有し、同時にこのプライマーを起点とする核酸合成反応生成物の任意の領域に対して相補的な塩基配列を５’末端に有するオリゴヌクレオチドである。ここで、「Ｆ２より選ばれた塩基配列」及び「Ｆ１ｃより選ばれた塩基配列」を含むプライマーをインナープライマーＦ（以下ＩＰＦ）、そして「Ｒ２より選ばれた塩基配列」と「Ｒ１ｃより選ばれた塩基配列」を含むプライマーをインナープライマーＲ（以下ＩＰＲ）と呼ぶ。一方、アウタープライマーとは、標的塩基配列上の『「ある特定のヌクレオチド配列領域」の３’末端側に存在するある特定のヌクレオチド配列領域』を認識かつ合成起点を与える塩基配列を有するオリゴヌクレオチドである。ここで、「Ｆ３より選ばれた塩基配列」を含むプライマーをアウタープライマーＦ（以下ＯＰＦ）、「Ｒ３より選ばれた塩基配列」を含むプライマーをアウタープライマーＲ（以下ＯＰＲ）と呼ぶ。ここで、各プライマーにおけるＦとは、標的塩基配列のセンス鎖と相補的に結合し、合成起点を提供するプライマー表示であり、一方Ｒとは、標的塩基配列のアンチセンス鎖と相補的に結合し、合成起点を提供するプライマー表示である。ここで、プライマーとして用いられるオリゴヌクレオチドの長さは、１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上で、化学合成あるいは天然のどちらでも良く、各プライマーは単一のオリゴヌクレオチドであってもよく、複数のオリゴヌクレオチドの混合物であってもよい。
【００１５】
ＬＡＭＰ法においては、インナープライマーとアウタープライマーに加え、さらにこれとは別のプライマー、すなわちループプライマーを用いる事ができる。ループプライマー（Ｌｏｏｐ Ｐｒｉｍｅｒ）は、ダンベル構造の５’末端側のループ構造の一本鎖部分の塩基配列に相補的な塩基配列を持つプライマーである。このプライマーを用いると、核酸合成の起点が増加し、反応時間の短縮と検出感度の上昇が可能となる（特許文献国際公開第０２／２４９０２号パンフレット）。ループプライマーの塩基配列は上述のダンベル構造の５’末端側のループ構造の一本鎖部分の塩基配列に相補的であれば、標的遺伝子の塩基配列あるいはその相補鎖から選ばれても良く、他の塩基配列でも良い。また、ループプライマーは１種類でも２種類でも良い。
【００１６】
ＳＡＲＳコロナウイルスはＲＮＡウイルスである。ＬＡＭＰ法は鋳型がＲＮＡの場合には、鋳型がＤＮＡの場合の反応液に逆転写酵素を添加する事で、同様に核酸増幅反応を進めることができる（ＲＴ−ＬＡＭＰ法）。
【００１７】
本発明者らはＳＡＲＳコロナウイルスに特異的な塩基配列を迅速に増幅できるＬＡＭＰ法のプライマーの塩基配列とその組み合わせを鋭意研究した結果、ＳＡＲＳコロナウイルスのＲＮＡポリメラーゼの塩基配列（非特許文献３）より配列番号１で示される塩基配列から、プライマーセットとして次のＡ、Ｂの２組を選定した。
（プライマーセットＡ）
ＩＰＦ−Ａ：５’−ＴＡＣＡＴＣＡＡＡＧＣＣＡＡＴＣＣＡＣＧＣＡＡＴＡＴＧＴＴＴＡＴＣＡＣＣＣＧＣＧＡＡＧＡ−３’ （配列番号１４）
ＯＰＦ−Ａ：５’−ＡＣＣＡＡＧＴＣＡＡＴＧＧＴＴＡＣＣＣＴ−３’ （配列番号４）
ＩＰＲ−Ａ：５’−
ＧＣＴＧＴＣＡＴＧＣＡＡＣＴＡＧＡＧＡＴＧＣＴＡＣＡＧＣＴＡＣＴＡＡＧＴＴＡＡＣＡＣＣＴＧ−３’ （配列番号１５）
ＯＰＲ−Ａ：５’−ＧＴＧＴＣＡＡＣＡＴＡＡＣＣＡＧＴＣＧＧ−３’ （配列番号１６）
ＬＰＦ−Ａ：５’−ＡＣＧＡＡＣＧＴＧＡＣＧＡＡＴＡＧＣＴ−３’ （配列番号２０）
ＬＰＲ−Ａ：５’−ＧＴＡＣＴＡＡＣＣＴＡＣＣＴＣＴＣＣＡＧＣ−３’ （配列番号２１）
（プライマーセットＢ）
ＩＰＦ−Ｂ：５’−ＴＧＣＡＴＧＡＣＡＧＣＣＣＴＣＧＡＡＧＡＡＧＣＴＡＴＴＣＧＴＣＡＣ−３’ （配列番号１７）
ＯＰＦ−Ｂ：５’−ＣＴＡＡＴＡＴＧＴＴＴＡＴＣＡＣＣＣＧＣ−３’ （配列番号１０）
ＩＰＲ−Ｂ：５’−ＧＣＴＧＴＧＧＧＴＡＣＴＡＡＣＣＴＡＣＣＴＧＴＣＡＡＣＡＴＡＡＣＣＡＧＴＣＧＧ−３’ （配列番号１８）
ＯＰＲ−Ｂ：５’−ＣＴＣＴＧＧＴＧＡＡＴＴＣＴＧＴＧＴＴ−３’ （配列番号１９）
ＬＰＦ−Ｂ：５’−ＡＡＡＧＣＣＡＡＴＣＣＡＣＧＣ−３’ （配列番号２２）
ＬＰＲ−Ｂ：５’−ＣＣＡＧＣＴＡＧＧＡＴＴＴＴＣＴＡＣＡＧＧ−３’ （配列番号２３）
【００１８】
核酸合成で使用する酵素は、鎖置換活性を有する鋳型依存性核酸合成酵素であれば特に限定されない。このような酵素としては、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ（ラージフラグメント）、Ｂｃａ（ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメント等が挙げられ、好ましくはＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ（ラージフラグメント）が挙げられる。
【００１９】
ＲＴ−ＬＡＭＰ法に用いる逆転写酵素としては、ＲＮＡを鋳型としてＤＮＡを合成する活性を有する酵素であれば特に限定されない。このような酵素としては、ＡＭＶ、Ｃｌｏｎｅｄ ＡＭＶ、ＭＭＬＶの逆転写酵素、ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ、ＲｅｖｅｒＴｒａＡｃｅ、Ｔｈｅｒｍｏｓｃｒｉｐｔ等が挙げられ、好ましくは、ＡＭＶあるいはＣｌｏｎｅｄ ＡＭＶ逆転写酵素が挙げられる。またＢｃａ ＤＮＡポリメラーゼのように、逆転写酵素活性とＤＮＡポリメラーゼ活性の両活性を有する酵素を用いると、ＲＴ−ＬＡＭＰ反応を１つの酵素で行う事ができる。
核酸合成で使用する酵素や逆転写酵素は、ウイルスや細菌などから精製されたものでも良く、遺伝子組み換え技術によって作製されたものでも良い。またこれらの酵素はフラグメント化やアミノ酸の置換などの改変をされたものでも良い。
【００２０】
ＬＡＭＰ反応後の核酸増幅産物の検出には公知の技術が適用できる。例えば、増幅された塩基配列を特異的に認識する標識オリゴヌクレオチドや蛍光性インターカレーター法（特許文献特開２００１−２４２１６９号公報）を用いたり、あるいは反応終了後の反応液をそのままアガロースゲル電気泳動にかけても容易に検出できる。アガロースゲル電気泳動では、ＬＡＭＰ増幅産物は、塩基長の異なる多数のバンドがラダー（はしご）状に検出される。また、ＬＡＭＰ法では核酸の合成により基質が大量に消費され、副産物であるピロリン酸が、共存するマグネシウムと反応してピロリン酸マグネシウムとなり、反応液が肉眼でも確認できる程に白濁する。したがって、この白濁を、反応終了後あるいは反応中の濁度上昇を経時的に光学的に観察できる測定機器、例えば４００ｎｍの吸光度変化を通常の分光光度計を用いて確認することで、核酸増幅反応を検出することも可能である（特許文献国際公開第０１／８３８１７号パンフレット）。
【００２１】
本発明のプライマーを用いて核酸増幅の検出を行う際に必要な各種の試薬類は、あらかじめパッケージングしてキット化する事ができる。具体的には、本発明のプライマーあるいはループプライマーとして必要な各種のオリゴヌクレオチド、核酸合成の基質となる４種類のｄＮＴＰ、核酸合成を行うＤＮＡポリメラーゼ、逆転写活性を持つ酵素、酵素反応に好適な条件を与える緩衝液や塩類、酵素や鋳型を安定化する保護剤、さらに必要に応じて反応生成物の検出に必要な試薬類がキットとして提供される。
【実施例】
【００２２】
以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらにより何ら限定されるものではない。
実施例１．検出感度の確認
ＬＡＭＰ法と、ＰＣＲ法との検出感度の比較を行った。
１．試料及び試薬の調製
１）試料
ＳＡＲＳコロナウイルスのＲＮＡポリメラーゼの配列より選ばれた配列番号１のＲＮＡをＹｅａｓｔ ＲＮＡ（Ａｍｂｉｏｎ社製）溶液（５０ｎｇ／μＬ）に溶解し、１μＬあたり１０コピーから１０４コピーまでの希釈液と、２．５、５、１０コピーの希釈液を作製し、試料溶液とした。また同Ｙｅａｓｔ ＲＮＡ溶液を０コピーの試料溶液とした。
【００２３】
２）ＰＣＲ法に用いる試薬組成及び濃度
ＰＣＲ法で使用するＳＡＲＳコロナウイルス検出用プライマーとして、ＲＮＡポリメラーゼゲノムの１９５ｂｐを増幅する配列番号２４および２５で示される塩基配列からなる２種類のプライマーを使用した、非特許文献４記載の方法に準じて行った。
ｃＤＮＡの合成反応溶液組成
・５×Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ） ４μＬ
・１０ｍＭ ｄＮＴＰｓ １μＬ
・０．１Ｍ ＤＴＴ ２μＬ
・Ｒａｎｄｏｍ ｐｒｉｍｅｒ（５０ｎｇ／μｌ，ＴＡＫＡＲＡ） １μＬ
・ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（４０Ｕ／μｌ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ） １μＬ
・ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ（２００Ｕ／μｌ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ） １μＬ
・Ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ ｗａｔｅｒ ５μＬ
・試料溶液 ５μＬ
ＰＣＲ反応溶液組成
・１０×Ｅｘ Ｔａｑ ｂｕｆｆｅｒ（Ｍｇ ｆｒｅｅ）（ＴＡＫＡＲＡ） ５μＬ
・２５ｍＭ ＭｇＣｌ２ ４μＬ
・２．５ｍＭ ｄＮＴＰｓ ４μＬ
・１０ｐｍｏｌ／μＬプライマー 各１μＬ
・Ｅｘ Ｔａｑ（５Ｕ／μＬ，ＴＡＫＡＲＡ） ０．５μＬ
・Ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ ｗａｔｅｒ ３３．５μＬ
・ｃＤＮＡ合成溶液 １μＬ
【００２４】
３）ＬＡＭＰ法に用いる試薬組成及び濃度
プライマーセットＡを用いたＬＡＭＰ法による増幅のため、最終反応溶液２５μＬ中の各試薬濃度が下記になるよう調製した。
反応溶液組成
・２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．８
・１０ｍＭ ＫＣｌ
・８ｍＭ ＭｇＳＯ４
・１．４ｍＭ ｄＮＴＰｓ
・１０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４
・０．８Ｍ Ｂｅｔａｉｎｅ（Ｓｉｇｍａ）
・０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０
・１．６μＭ ＩＰＦ及びＩＰＲ
・０．２μＭ ＯＰＦ及びＯＰＲ
・０．８μＭ ＬＰＦ及びＬＰＲ
・ＡＭＶ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ ０．６２５Ｕ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）
・Ｂｓｔ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ８Ｕ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）
・０．２５μｇ／ｍＬ ＥｔＢｒ（ニッポンジーン）
プライマーセットＢを用いた反応ではＡＭＶ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ ０．６２５Ｕに代えてＣｌｏｎｅｄ ＡＭＶ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）２Ｕを用いた。
【００２５】
２．核酸増幅法による反応
１）ＰＣＲ法による反応
ｃＤＮＡ合成反応は、標的配列０または１０〜１０３コピーを含む試料溶液５μＬを上記のｃＤＮＡ合成反応溶液に加え、４２℃５０分その後７０℃１５分で行った。ＰＣＲ反応は、上記ＰＣＲ反応溶液に、ｃＤＮＡ合成した溶液１μＬを加え、最終反応溶液５０μＬとし、０．２ｍＬの専用チューブ内でサーマルサイクラーＰＴＣ−２００（ＭＪリサーチ社製）を用い、熱変性９５℃３０秒、アニーリング５６℃３０秒、ポリメラーゼ伸長反応７２℃３０秒を１サイクルとして計４０サイクル行った。所要時間は約１時間だった。反応終了後の反応溶液５μＬを２％アガロースゲルで電気泳動を行った。
２）ＬＡＭＰ法による反応
プライマーセットＡを用いたＬＡＭＰ用試薬に、標的配列０または１０〜１０３コピーを含む試料溶液１μＬを加え、最終反応溶液２５μＬとし、０．２ｍＬの専用チューブ内で、６３℃で６０分ＬＡＭＰ反応を行った。反応終了後の反応溶液５μＬを２％アガロースゲルで電気泳動を行った。
３．電気泳動法による各増幅反応の検出感度の比較結果
ＰＣＲ法の電気泳動の結果を図１に、プライマーセットＡを用いたＬＡＭＰ法の電気泳動の結果を図２に示す。その結果、ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法とも増幅産物の確認ができた。ＰＣＲ法では、１０２コピーまでは１９５ｂｐの特異的バンドが明瞭に認められたが、１０コピーでは薄いバンドとして観察された。これに対しＬＡＭＰ法では、１０コピーまで特異的増幅のラダー状のバンドを確認することができた。
【００２６】
実施例２．ＬＡＭＰ法のリアルタイム測定法による検出時間の検討
プライマーセットＡを用いたＬＡＭＰ法の検出時間の検討は、実施例１．のＬＡＭＰ法の組成２５μＬを用い、リアルタイム蛍光測定装置ＰＲＩＳＭ ７７００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）によって反応温度を６３℃に固定して行った。図３に結果を示す。
この結果、０コピーでは６０分でも蛍光の増加は見られず、１０コピー以上では２０分以内に蛍光の増加が確認され、２０分で１０コピーの存在を検出できた。
プライマーセットＢを用いたＬＡＭＰ法の検出時間の検討は、リアルタイム濁度測定装置ＬＡ−２００（テラメックス社製）を用いてリアルタイム濁度測定法によって行った。実施例１．のＬＡＭＰ法の組成２５μＬを用い、反応温度を６３℃に固定して行った。図４に結果を示す。
この結果、０コピーでは６０分でも濁度の増加は見られず、２．５コピー以上では３５分以内に濁度の増加が確認され、３５分で２．５コピーの存在を検出できた。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】電気泳動法によるＰＣＲ法の検出感度を示す。レーン１と７はマーカーレーン２は試薬ブランクレーン３は０コピーレーン４は１０コピーレーン５は１０２コピーレーン６は１０３コピー
【図２】電気泳動法によるプライマーセットＡを用いたＬＡＭＰ法の検出感度を示す。レーン１は０コピーレーン２は１０コピーレーン３は１０２コピーレーン４は１０３コピーレーン５は１０４コピーレーン６はマーカー
【図３】プライマーセットＡを用いたリアルタイム蛍光測定法の検出時間を示す。
【図４】プライマーセットＢを用いたリアルタイム濁度測定法の検出時間を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で示されるＳＡＲＳコロナウイルスのＲＮＡポリメラーゼ塩基配列の、４１番〜２５６番の塩基配列から選ばれた任意の塩基配列、又はそれらと相補的な塩基配列から設計されたオリゴヌクレオチドプライマー。
【請求項２】
ＳＡＲＳコロナウイルスのＲＮＡポリメラーゼ塩基配列から選ばれた配列番号２〜１３で示される塩基配列又はそれらと相補的な塩基配列から選ばれた、少なくとも連続する１５塩基を含む請求項１記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
【請求項３】
ＳＡＲＳコロナウイルスの標的核酸上の３’末端側からＦ３ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ１ｃという塩基配列領域を、５’末端側からＲ３、Ｒ２、Ｒ１という塩基配列領域を選択し、それぞれの相補的塩基配列をＦ３、Ｆ２、Ｆ１、そしてＲ３ｃ、Ｒ２ｃ、Ｒ１ｃとしたときに、以下の（ａ）〜（ｄ）から選ばれた塩基配列から成ることを特徴とする請求項１〜２記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
（ａ）標的核酸のＦ２領域を３’末端側に有し、５’末端側に標的核酸のＦ１ｃ領域を有する塩基配列。
（ｂ）標的核酸のＦ３領域を有する塩基配列。
（ｃ）標的核酸のＲ２領域を３’末端側に有し、５’末端側に標的核酸のＲ１ｃ領域を有する塩基配列。
（ｄ）標的核酸のＲ３領域を有する塩基配列。
【請求項４】
ＳＡＲＳコロナウイルスに特異的な塩基配列を増幅でき、５’末端から３’末端に向かい以下の（ｅ）〜（ｈ）から選ばれた塩基配列から成ることを特徴とする請求項１〜３記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
（ｅ）５’−（配列番号２の塩基配列に相補的な塩基配列）−（塩基数０〜５０の任意の塩基配列）〜（配列番号３の塩基配列）−３’
（ｆ）５’−（配列番号５の塩基配列）−（塩基数０〜５０の任意の塩基配列）−（配列番号６の塩基配列に相補的な塩基配列）−３’
（ｇ）５’−（配列番号８の塩基配列に相補的な塩基配列）−（塩基数０〜５０の任意の塩基配列）−（配列番号９の塩基配列）−３’
（ｈ）５’−（配列番号１１の塩基配列）−（塩基数０〜５０の任意の塩基配列）−（配列番号１２の塩基配列に相補的な塩基配列）−３’
【請求項５】
請求項１〜４記載のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ＳＡＲＳコロナウイルスの標的核酸領域の増幅反応を行うことを特徴とするＳＡＲＳコロナウイルスの検出方法。
【請求項６】
ＳＡＲＳコロナウイルスの標的核酸領域の増幅反応がＬＡＭＰ法であることを特徴とする請求項５記載のＳＡＲＳコロナウイルスの検出方法。
【請求項７】
請求項１〜４記載のオリゴヌクレオチドプライマーを用いてＳＡＲＳコロナウイルスの標的核酸領域の増幅を検出することにより、ＳＡＲＳコロナウイルス感染の有無を診断することを特徴とする重症急性呼吸器症候群の診断方法。
【請求項８】
重症急性呼吸器症候群の診断方法において、請求項１〜４記載のオリゴヌクレオチドプライマーを含むことを特徴とするキット。
【請求項１】
配列番号１で示されるＳＡＲＳコロナウイルスのＲＮＡポリメラーゼ塩基配列の、４１番〜２５６番の塩基配列から選ばれた任意の塩基配列、又はそれらと相補的な塩基配列から設計されたオリゴヌクレオチドプライマー。
【請求項２】
ＳＡＲＳコロナウイルスのＲＮＡポリメラーゼ塩基配列から選ばれた配列番号２〜１３で示される塩基配列又はそれらと相補的な塩基配列から選ばれた、少なくとも連続する１５塩基を含む請求項１記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
【請求項３】
ＳＡＲＳコロナウイルスの標的核酸上の３’末端側からＦ３ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ１ｃという塩基配列領域を、５’末端側からＲ３、Ｒ２、Ｒ１という塩基配列領域を選択し、それぞれの相補的塩基配列をＦ３、Ｆ２、Ｆ１、そしてＲ３ｃ、Ｒ２ｃ、Ｒ１ｃとしたときに、以下の（ａ）〜（ｄ）から選ばれた塩基配列から成ることを特徴とする請求項１〜２記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
（ａ）標的核酸のＦ２領域を３’末端側に有し、５’末端側に標的核酸のＦ１ｃ領域を有する塩基配列。
（ｂ）標的核酸のＦ３領域を有する塩基配列。
（ｃ）標的核酸のＲ２領域を３’末端側に有し、５’末端側に標的核酸のＲ１ｃ領域を有する塩基配列。
（ｄ）標的核酸のＲ３領域を有する塩基配列。
【請求項４】
ＳＡＲＳコロナウイルスに特異的な塩基配列を増幅でき、５’末端から３’末端に向かい以下の（ｅ）〜（ｈ）から選ばれた塩基配列から成ることを特徴とする請求項１〜３記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
（ｅ）５’−（配列番号２の塩基配列に相補的な塩基配列）−（塩基数０〜５０の任意の塩基配列）〜（配列番号３の塩基配列）−３’
（ｆ）５’−（配列番号５の塩基配列）−（塩基数０〜５０の任意の塩基配列）−（配列番号６の塩基配列に相補的な塩基配列）−３’
（ｇ）５’−（配列番号８の塩基配列に相補的な塩基配列）−（塩基数０〜５０の任意の塩基配列）−（配列番号９の塩基配列）−３’
（ｈ）５’−（配列番号１１の塩基配列）−（塩基数０〜５０の任意の塩基配列）−（配列番号１２の塩基配列に相補的な塩基配列）−３’
【請求項５】
請求項１〜４記載のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ＳＡＲＳコロナウイルスの標的核酸領域の増幅反応を行うことを特徴とするＳＡＲＳコロナウイルスの検出方法。
【請求項６】
ＳＡＲＳコロナウイルスの標的核酸領域の増幅反応がＬＡＭＰ法であることを特徴とする請求項５記載のＳＡＲＳコロナウイルスの検出方法。
【請求項７】
請求項１〜４記載のオリゴヌクレオチドプライマーを用いてＳＡＲＳコロナウイルスの標的核酸領域の増幅を検出することにより、ＳＡＲＳコロナウイルス感染の有無を診断することを特徴とする重症急性呼吸器症候群の診断方法。
【請求項８】
重症急性呼吸器症候群の診断方法において、請求項１〜４記載のオリゴヌクレオチドプライマーを含むことを特徴とするキット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【国際公開番号】ＷＯ２００５／００１０９７
【国際公開日】平成１７年１月６日（２００５．１．６）
【発行日】平成１８年１０月１９日（２００６．１０．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５１０９９５（Ｐ２００５−５１０９９５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／００８３５５
【国際出願日】平成１６年６月１５日（２００４．６．１５）
【出願人】（０００１２０４５６）栄研化学株式会社 (67)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１７年１月６日（２００５．１．６）
【発行日】平成１８年１０月１９日（２００６．１０．１９）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／００８３５５
【国際出願日】平成１６年６月１５日（２００４．６．１５）
【出願人】（０００１２０４５６）栄研化学株式会社 (67)
【Ｆターム（参考）】
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