Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ融合蛋白質
【課題】Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼと異種蛋白質を融合してなる融合蛋白質、該融合蛋白質を精製する方法、及び該融合蛋白質から異種蛋白質を製造する方法を提供する。
【解決手段】Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼのカルボキシル末端に、直接に、または１残基以上のアミノ酸を介して、異種蛋白質を融合したＴ７ＲＮＡポリメラーゼ融合蛋白質は、シバクロンブルー固定化樹脂を用いて簡便に精製でき、さらに、プロテアーゼを用いて位置特異的に加水分解し、所望の異種蛋白質を製造することができる。
【解決手段】Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼのカルボキシル末端に、直接に、または１残基以上のアミノ酸を介して、異種蛋白質を融合したＴ７ＲＮＡポリメラーゼ融合蛋白質は、シバクロンブルー固定化樹脂を用いて簡便に精製でき、さらに、プロテアーゼを用いて位置特異的に加水分解し、所望の異種蛋白質を製造することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼのカルボキシル末端に、直接に、または１残基以上のアミノ酸からなるリンカーを介して、異種蛋白質が融合したＴ７ＲＮＡポリメラーゼ融合蛋白質並びに当該Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ融合蛋白質をコードしたポリヌクレオチドに関する。また本発明は、当該ポリヌクレオチドを有し、かつ、それを発現して本発明のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ融合蛋白質を生産することができるＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属の細菌、並びに当該Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属の細菌を使用する本発明のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ融合蛋白質の製造法に関する。さらに本発明は、本発明のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ融合蛋白質をプロテアーゼで加水分解することを特徴とする異種蛋白質の製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）を用いた蛋白質生産において、宿主である大腸菌とは異種の生物等に由来する外来の蛋白質、いわゆる異種蛋白質を生産させた場合に、生産された異種蛋白質は菌体内に蓄積され封入体を形成することが多い。封入体を形成した異種蛋白質は、その存在状態故に生物学的あるいは生化学的に不活性であるため、活性型の蛋白質を得るためには、可溶化、再生の操作がさらに必要となる。
【０００３】
これらの問題を解決するため、異種蛋白質に大腸菌菌体内で可溶性蛋白質として発現する蛋白質を融合させて発現する方法が知られている。異種蛋白質に融合させる蛋白質としては、Ｔ７ファージの１０Ｂ配列のＣ末端部位からなるＳｏｌｕｂｉｌｉｔｙ ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｔａｇ（ＳＥＴ）やＧＢ１ドメイン、ユビキチン、Ｓｍａｌｌ ｕｂｉｑｕｔｉｎ−ｒｅｌａｔｅｄ ｍｏｄｉｆｅｒ（ＳＵＭＯ）、チオレドキシン（ＴＲＸ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合蛋白質（ＭＢＰ）、Ｎ−ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｓｕｂｓｔａｎｃｅ Ａ（Ｎｕｓ Ａ）を用いた融合発現（非特許文献１）やカルボキシル末端が欠損したシャペロニンを用いた融合発現（特許文献１）が知られている。
【０００４】
バクテリオファージであるＴ７ファージに由来するＲＮＡポリメラーゼであるＴ７ＲＮＡポリメラーゼを、異種蛋白質に融合させて発現させた例に関しては、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを酵母内で機能させる目的で、酵母ＧＡＬ４蛋白質をＴ７ＲＮＡポリメラーゼのアミノ末端に融合させた発現させた例が知られている（非特許文献２）。なおＧＡＬ４蛋白質自体は大腸菌菌体内でも機能を有する蛋白質として発現することが知られている。
【０００５】
一方、これまでにＴ７ＲＮＡポリメラーゼのカルボキシル末端に脊椎動物由来のポリペプチドや、脊椎動物由来のポリペプチドを連結した融合蛋白質を可溶性の蛋白質として発現させた例はない。
【０００６】
また、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼのカルボキシル末端に脊椎動物由来のポリペプチドや、脊椎動物由来のポリペプチドの１残基以上のアミノ酸を、他のアミノ酸に置換、及び／又は欠失、及び／又は付加したポリペプチドを連結した融合蛋白質を可溶性の蛋白質として発現させた例はない。
【０００７】
またシバクロンブルー（ＣｉｂａｃｒｏｎＢｌｕｅ）を固定化した樹脂が、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの精製に利用できることが知られている（非特許文献３）が、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼが融合した蛋白質の精製に利用した例はない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００４−３２１１４１号公報
【特許文献２】特開２００９−１３６１５３号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】加藤 淳ら，生物物理，Ｖｏｌ．４８，１８５−１８９（２００８）
【非特許文献２】Ｏｓｔｒａｎｄｅｒ Ｅ．Ａ．ら．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９，１２６１−１２６５（１９９０）
【非特許文献３】Ｄａｓ Ｍ．ら，Ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２８，３３９−３４８（１９９８）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、宿主に対して異種の蛋白質を、可溶化や再生の操作を必要としない可溶性の蛋白質として発現させるための融合蛋白質として有用なＴ７ＲＮＡポリメラーゼ融合蛋白質、該Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ融合蛋白質を純度よく製造する方法、該Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ融合蛋白質を位置特異的に加水分解して異種蛋白質を純度よく簡便に製造する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼのカルボキシル末端に、場合によってはリンカーを介して異種蛋白質を連結したＴ７ＲＮＡポリメラーゼ融合蛋白質が、大腸菌の細胞質中に可溶性蛋白質として発現すること、またその融合蛋白質の性質が、融合蛋白質及び融合蛋白質から異種蛋白質を精製するときに有利であることを見出し、本発明を完成させた。
【００１２】
すなわち本発明は、配列番号１で示したＴ７ＲＮＡポリメラーゼのカルボキシル末端に、直接に、または１残基以上のアミノ酸からなるリンカーを介して、異種蛋白質が融合したＴ７ＲＮＡポリメラーゼ融合蛋白質に関するものである。異種蛋白質は、当該蛋白質の全長を指すこともあれば、その一部である機能を有するポリペプチドを指すこともある。
【００１３】
また、本発明は、配列番号１で示したＴ７ＲＮＡポリメラーゼのカルボキシル末端に、直接に、または１残基以上のアミノ酸からなるリンカーを介して、脊椎動物由来のポリペプチドが融合したＴ７ＲＮＡポリメラーゼ融合蛋白質、あるいは配列番号１で示したＴ７ＲＮＡポリメラーゼのカルボキシル末端に、直接に、または１残基以上のアミノ酸からなるリンカーを介して、脊椎動物由来のポリペプチドの１残基以上のアミノ酸を、他のアミノ酸に置換、及び／又は欠失、及び／又は付加したポリペプチドが融合したＴ７ＲＮＡポリメラーゼ融合蛋白質に関するものである。
【００１４】
また、本発明は配列番号１で示したＴ７ＲＮＡポリメラーゼのカルボキシル末端に、直接に、または１残基以上のアミノ酸からなるリンカーを介して、配列番号２で示したヒトエリスロポエチンレセプターの１位から２２５位からなるポリペプチド、配列番号３で示したヒトエリスロポエチンの１位から１６６位からなるポリペプチド、配列番号４で示したヒトＦｃγＲＩの１位から２７４位からなるポリペプチド、あるいは配列番号５で示したヒト成長ホルモンレセプターの１位から２３８位からなるポリペプチドを融合したＴ７ＲＮＡポリメラーゼ融合蛋白質に関するものである。
【００１５】
また、本発明は配列番号１で示したＴ７ＲＮＡポリメラーゼのカルボキシル末端に、直接に、または１残基以上のアミノ酸からなるリンカーを介して、配列番号２で示したヒトエリスロポエチンレセプターの１位から２２５位からなるポリペプチド、配列番号３で示したヒトエリスロポエチンの１位から１６６位からなるポリペプチド、配列番号４で示したヒトＦｃγＲＩの１位から２７４位からなるポリペプチド、あるいは配列番号５で示したヒト成長ホルモンレセプターの１位から２３８位からなるポリペプチドの、１残基以上のアミノ酸を、他のアミノ酸に置換、及び／又は欠失、及び／又は付加したポリペプチドを融合したＴ７ＲＮＡポリメラーゼ融合蛋白質に関するものである。
【００１６】
また、本発明は、本発明のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ融合蛋白質をコードしたポリヌクレオチドと、そのポリヌクレオチドを発現し、該融合蛋白質を生産するＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属の細菌に関するものである。
【００１７】
また、本発明は、本発明のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属の細菌を使用するＴ７ＲＮＡポリメラーゼ融合蛋白質の製造法に関するものである。
【００１８】
さらに、本発明はＴ７ＲＮＡポリメラーゼ融合蛋白質を１種類以上のプロテアーゼで加水分解することを特徴とする異種蛋白質の製造法に関するものである。
【００１９】
また、本発明は、シバクロンブルー固定化樹脂を用いることを特徴とするＴ７ＲＮＡポリメラーゼ融合蛋白質の製造法に関するものである。
【００２０】
また、本発明は本発明のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ融合蛋白質を加水分解して生じた異種蛋白質を、シバクロンブルー固定化樹脂を用いて分離することを特徴とする異種蛋白質の製造法に関するものであり、本発明のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ融合蛋白質をプロテアーゼで加水分解して生じた異種蛋白質を、シバクロンブルー固定化樹脂を用いて分離することを特徴とする異種蛋白質の製造法に関するものである。
【発明の効果】
【００２１】
本発明のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ融合蛋白質を用いれば、目的の異種蛋白質を、例えば、大腸菌を用いて、可溶性の融合蛋白質として製造することができる。本発明のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ融合蛋白質は、シバクロンブルー固定化樹脂を用いて精製することも可能である。特に、目的の異種蛋白質を、例えばプロテアーゼによって位置特異的な加水分解が可能なリンカーを介してＴ７ＲＮＡポリメラーゼに連結した本発明のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ融合蛋白質は、所望の位置でＴ７ＲＮＡポリメラーゼを切除することにより、目的の異種蛋白質を効率よく製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、ヒトエリスロポエチンレセプター（ｈＥＰＯＲ）、実施例１、２及び３のＥＰＯｂｐｆ４０、実施例４及び５のＥＰＯｂｐｆ４０Ｈ、実施例１２のＥＰＯｂｐｆ５０、実施例６、７、８及び９のＥＰＯｂｐｆ５０Ｈ、及び、実施例１３及び１４のＥＰＯｂｐｆ６０Ｈの一次構造の模式図
【図２】Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、ヒトエリスロポエチンレセプター（ｈＥＰＯＲ）、 実施例１、４及び６のＥＰＯｂｐｆ２Ｈ、ヒトエリスロポエチン（ｈＥＰＯ）、実施例１６のＥＰＯｆ２の一次構造の模式図
【図３】実施例１で調製したプラスミドの模式図
【図４】実施例３のＥＰＯｂｐｆ４０のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図
【図５】実施例４で調製したプラスミドの模式図
【図６】実施例５のＥＰＯｂｐｆ４０ＨのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図
【図７】実施例６で調製したプラスミドの模式図
【図８】実施例７のＥＰＯｂｐｆ５０ＨのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図
【図９】実施例１０のＥＰＯｂｐＨのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図
【図１０】実施例１０のＥＰＯｂｐＨのウエスタンブロッティングの結果を示す図
【図１１】実施例１２で調製したプラスミドの模式図
【図１２】実施例１３で調製したプラスミドの模式図
【図１３】実施例１４のＥＰＯｂｐｆ６０ＨのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図
【図１４】Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、ヒトエリスロポエチン（ｈＥＰＯ）、実施例１６、１７及び１８のＥＰＯｆ６０の一次構造の模式図
【図１５】実施例１６で調製したプラスミドの模式図
【図１６】実施例１７のＥＰＯｆ６０のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図
【図１７】実施例１８のＥＰＯｆ６０のウエスタンブロッティングの結果を示す図
【図１８】実施例１９のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ、ＦｃγＲＩ及びＦｃＢＰｆ５１Ｈの一次構造の模式図
【図１９】実施例１９で調製したプラスミドの模式図
【図２０】実施例２０のＦｃＢＰｆ５１ＨのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図
【図２１】実施例２１のエンテロキナーゼを用いて加水分解したＦｃＢＰｆ５１Ｈのウエスタンブロッティングの結果を示す図
【図２２】実施例２１のエンテロキナーゼを用いて加水分解したＦｃＢＰｆ５１Ｈのエンザイムイムノアッセイの結果を示す図
【図２３】実施例２２のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ、ｈＧＨＲ及びｈＧＨｂｐｆ５１Ｈの一次構造の模式図
【図２４】実施例２２で調製したプラスミドの模式図
【図２５】実施例２３のｈＧＨｂｐｆ５１Ｈのエンザイムイムノアッセイの結果を示す図
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明に関わる配列番号１に示したＴ７ＲＮＡポリメラーゼと直接、あるいは、１残基以上のアミノ酸からなるリンカーを介して融合する異種蛋白質は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）に対して異種の生物等に由来する外来の蛋白質を挙げることができ、具体的には、脊椎動物である哺乳類、鳥類、爬虫類、両性類、魚類に由来するポリペプチドを例示することができる。
【００２４】
さらに具体的には、異種蛋白質としては、成長ホルモン、エリスロポエチン、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−３（ＩＬ−３）、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、インターロイキン−５（ＩＬ−５）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターロイキン−７（ＩＬ−７）、インターロイキン−９（ＩＬ−９）、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）、インターロイキン−１１（ＩＬ−１１）、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）のサブユニットｐ３５、インターロイキン−１３（ＩＬ−１３）、インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、カルジオトロフィン−１（ＣＴ−１）、白血球阻害因子（ＬＩＦ）、オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）、インターフェロンα（ＩＦＮα）、インターフェロンβ（ＩＦＮβ）、インターフェロンγ（ＩＦＮγ）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）、腫瘍壊死因子β（ＴＮＦβ）、レプチン、プロラクチンなどのポリペプチド、あるいは、それらのポリペプチドの各レセプターの細胞外ドメインなどの、脊椎動物に由来するポリペプチドが例示できる。
【００２５】
また、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩIａ（ＣＤ３２Ａ）、ＦｃγＲＩIｂ（ＣＤ３２Ｂ）、ＦｃγＲＩIＩａ（ＣＤ１６Ａ）、ＦｃγＲＩＩIｂ（ＣＤ１６Ｂ）、ＦｃεＲＩ、ＦｃεＲＩＩ（ＣＤ２３）、ＦｃαＲＩ（ＣＤ８９）、Ｆｃα/μＲ、ＦｃＲｎ、ポリメリックＩｇレセプターなどの抗体レセプターの細胞外ドメイン、細胞接着分子（カドヘリン、インテグリン、セレクチンなど）の細胞外ドメイン、抗体のＨ鎖やＬ鎖などの、脊椎動物に由来するポリペプチドが例示できる。また脊椎動物に由来する、酵素、オリゴマー酵素の構成要素であるポリペプチド、酵素阻害蛋白質、膜結合型酵素の可溶性ドメインなどのポリペプチドが例示できる。
【００２６】
また本発明で用いる異種蛋白質は、例えば上記のような、脊椎動物に由来するポリペプチドに加えて、当該ポリペプチドに対して以下の（ア）から（ウ）から選択される一以上の変異を加えたものであって、当該異種蛋白質の活性、例えば酵素活性や結合活性などを有するものであっても良い。
（ア）上記ポリペプチドを構成するアミノ酸残基の配列中の一残基以上のアミノ酸を欠失したもの
（イ）上記ポリペプチドを構成するアミノ酸残基の配列中の一残基以上のアミノ酸を他のアミノ酸に置換したもの
（ウ）上記ポリペプチドを構成するアミノ酸残基の配列について、一残基以上のアミノ酸を付加したもの。
【００２７】
異種蛋白質のカルボキシル末端には、例えばポリヒスチジン、Ｓ−ペプチド、あるいはｃ−ｍｙｃペプチドなどの付加配列を連結してもよい。
【００２８】
異種蛋白質をコードしたポリヌクレオチドは、公知の方法により調製できる。例えば目的の異種蛋白質をコードしたポリヌクレオチドは、公知の情報を利用してオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットを作製し、目的の異種蛋白質をコードしたポリヌクレオチドを含んだ、市販のｃＤＮＡやｃＤＮＡライブラリー、あるいは、公知の方法で調製したｃＤＮＡを鋳型としてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行い、目的のポリヌクレオチドを増幅して調製すればよい。
【００２９】
ＰＣＲによるポリヌクレオチドの増幅反応は、例えば、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（商品名、タカラバイオ社製）を利用することができ、付属のプロトコールに従って実験的に、目的のポリヌクレオチドが増幅する条件を探せばよい。例えば付属の緩衝液を用いた反応溶液中で、例えば、０．０１Ｕ／μＬ ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ、反応に使用するプライマーの濃度は、最大０．３μＭ、鋳型となるプラスミドＤＮＡ０．２〜２０ｐｇ／ｍＬで反応を検討すればよい。反応の温度と時間は、例えば、９８℃で１０秒間、５５℃で５秒間、ついで７２℃で、増幅したいＤＮＡの塩基対の数に０．０６を乗じた秒数の時間を、１サイクルとして、２５サイクルから３０サイクルの反応をおこなえばよい。また反応サイクルにおいて５５℃で５秒間の設定を、５６℃から７２℃の間のいずれかの温度に設定して、増幅したいＤＮＡが得られる温度を実験的に定めてもよい。
【００３０】
ＰＣＲによるポリヌクレオチドの増幅反応は公知の方法に基づいて行えばよく、上述の方法に限定されない。
【００３１】
また上述の調製方法で調製したポリヌクレオチドを鋳型に、アミノ酸の置換、及び／又は欠失、及び／又は付加するように設計したプライマーセットを用いてＰＣＲで増幅を行なう、またはエラープローンＰＣＲにて増幅を行なうことで、１残基以上のアミノ酸の置換、及び／又は欠失、及び／又は付加された、異種蛋白質をコードしたポリヌクレオチドを調製することができる。
【００３２】
ＰＣＲで増幅した目的のＤＮＡは、そのＤＮＡを含んだＰＣＲ反応液を、例えば、アガロース電気泳動したのち、そのゲルを臭化エチジウムで染色し、例えば波長３０２ｎｍあるいは波長３１２ｎｍの紫外線を照射して目的のＤＮＡを検出して、目的のＤＮＡを含んだ部分のゲルを切り出し、そこから、ＤＮＡを精製すればよい。ＤＮＡの精製は、市販のキットを利用して精製すればよく、例えば、ＭＥＲｍａｉｄ Ｋｉｔ（商品名、Ｑｂｉｏｇｅｎｅ社）やＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ，１５,ＵｌｔｒａＣｌｅａｎ（商品名、ＭＯ Ｂｉｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を精製したいＤＮＡの長さに応じて利用すればよい。ＤＮＡの検出方法や精製の方法はこれらに限定されるものではない。
【００３３】
本発明のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ融合蛋白質を遺伝子工学的に製造するために用いるポリヌクレオチドは、本発明のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ融合蛋白質をコードしたポリヌクレオチドであればよく、当業者であれば公知の方法により調製することができる。
【００３４】
ポリヌクレオチドの調製法の一例としてはＰＣＲを利用した方法がある。例えばＴ７ファージからＴ７ファージＤＮＡを調製して、それを鋳型に用いて、適当なオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーとリバースプライマーでＰＣＲを行ってポリヌクレオチドを得ることができる。例えばＴ７ファージからＴ７ファージＤＮＡを調製して、それを鋳型に用いて、適当なオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーとリバースプライマーでＰＣＲを行って所望のポリヌクレオチドを得ることができる。ＰＣＲに用いるフォワードプライマーとリバースプライマーは、例えばＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ＿０４１９６０に登録されているＴ７ＲＮＡポリメラーゼの塩基配列を参考にして作製すればよい。
【００３５】
次に、例えば、下記の（Ａ）から（Ｆ）をひとつの反応溶液中にて反応させるＰＣＲを行うことで、本発明のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ融合蛋白質をコードしたポリヌクレオチドを調製することができる。
【００３６】
すなわち、ＰＣＲで増幅して得たＴ７ＲＮＡポリメラーゼをコードした塩基配列からなるポリヌクレオチドとその相補鎖からなる二本鎖ポリヌクレオチド（Ａ）、連結させようとする異種蛋白質をコードした塩基からなるポリヌクレオチドとその相補鎖からなる二本鎖ポリヌクレオチド（Ｂ）、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの１位メチオニンから数アミノ酸をコードしたオリゴヌクレオチドのフォワードプライマー（Ｃ）、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの８８３位アラニンから数残基上流までのアミノ酸と、例えば、それに連結させようとする異種蛋白質のアミノ末端から数残基下流までの数アミノ酸の両者に跨る部分をコードしたオリゴヌクレオチドに相補的なオリゴヌクレオチドのリバースプライマー（Ｄ）、５’端側が（Ｄ）の５’端側と相補的な配列であり、その配列がコードした異種蛋白質のアミノ末端部分に続く配列のアミノ酸をコードしたオリゴヌクレオチド、すなわち、（Ｄ）と（Ｂ）の相補鎖側の、両者に跨る部分をコードしたオリゴヌクレオチドのフォワードプライマー（Ｅ）及び、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼと連結させようとする異種蛋白質の、例えば、カルボキシル末端を含んだカルボキシル末端側の数アミノ酸をコードしたオリゴヌクレオチドに相補的なオリゴヌクレオチドのリバースプライマー（Ｆ）をひとつの反応溶液中にて反応させるＰＣＲを行うことで、本発明のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ融合蛋白質をコードしたポリヌクレオチドを調製することができる。
【００３７】
またＴ７ＲＮＡポリメラーゼのカルボキシル末端に、１残基以上のアミノ酸からなるリンカーを介して、異種蛋白質が融合した本発明のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ融合蛋白質をコードしたポリヌクレオチドは、先述の（Ｄ）のプライマーの代わりに、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼに由来するカルボキシル末端と異種蛋白質のアミノ末端をコードしたポリヌクレオチドの間に１残基以上のアミノ酸をコードしたポリヌクレオチドに相補的なオリゴヌクレオチドのリバースプライマー（Ｇ）を用いれば調製することができる。
【００３８】
またＴ７ＲＮＡポリメラーゼと連結させようとする異種蛋白質のカルボキシル末端に付加配列を有する本発明のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ融合蛋白質をコードしたポリヌクレオチドは、先述の（Ｆ）のプライマーの代わりに、融合させる異種蛋白質のカルボキシル末端を含むカルボキシル末端側の数アミノ酸と、そのカルボキシル末端に付加させる配列をコードしたオリゴヌクレオチドに相補的なオリゴヌクレオチド（Ｈ）を用いれば調製することができる。
【００３９】
また例えば、（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｅ）、（Ｇ）および（Ｈ）をひとつの反応溶液中にて反応させるＰＣＲを行うことで、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼのカルボキシル末端に、１残基以上のアミノ酸からなるリンカーを介して、カルボキシル末端に付加配列を有する異種蛋白質が融合した本発明のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ融合蛋白質をコードしたポリヌクレオチドを調製することができる。
【００４０】
また本発明のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ融合蛋白質をコードしたポリヌクレオチドの調製には、例えば特許文献２に記載のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ＿０４１９６０）をコードした、プラスミドｐＴｒｃ９９Ａ−Ｔ７ＲＰやｐＣＤＦ２−Ｔ７ＲＰを調製して、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ融合蛋白質をコードしたポリヌクレオチドを作製するためのＰＣＲの鋳型として利用してもよく、さらには本発明のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ融合蛋白質をコードしたポリヌクレオチドをコードするプラスミドの作製に用いてもよい。
【００４１】
またＴ７ＲＮＡポリメラーゼと異種蛋白質の間には、場合によっては１残基以上のアミノ酸からなるリンカーを挿入してもよい。「１残基以上のアミノ酸からなるリンカー」は、本発明のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ融合蛋白質を可溶性で発現できるリンカーであれば何でもよく、好ましくは１〜５０のアミノ酸からなるリンカーを指し、さらに好ましくは、１〜２０のアミノ酸から成るリンカーを指す。さらに好ましくは、１〜１０のアミノ酸からなるリンカー、又は１若しくは数残基のアミノ酸からなるリンカーを指す。
【００４２】
該リンカーには、例えばＡｓｐ−Ｐｒｏ配列及び／又はＡｓｎ−Ｇｌｙ配列を含んだアミノ酸配列を有するリンカーを用いてもよい。
【００４３】
Ａｓｐ−Ｐｒｏ配列は例えば７０％ ギ酸水溶液（ｐＨ２．５）で、アスパラギン酸（Ａｓｐ）とプロリン（Ｐｒｏ）の間の結合が加水分解されることが知られている。またＡｓｎ−Ｇｌｙ配列は、例えば２Ｍ ヒドロキシルアミン水溶液（ｐＨ９）で、アスパラギン（Ａｓｎ）とグリシン（Ｇｌｙ）の間の結合が加水分解されることが知られている。
【００４４】
異種蛋白質の分子内にＡｓｐ−Ｐｒｏ配列やＡｓｎ−Ｇｌｙ配列がある場合には、その箇所のアミノ酸を予め置換しておいてもよい。異種蛋白質の分子内にあるＡｓｐ−Ｐｒｏ配列のアスパラギン酸（Ａｓｐ）は、例えばグルタミン酸（Ｇｌｕ）にアミノ酸置換すればよい。また異種蛋白質の分子内にあるＡｓｎ−Ｇｌｙ配列のアスパラギン（Ａｓｎ）は、例えばグルタミン（Ｇｌｎ）、また例えばアスパラギン酸（Ａｓｐ）に、アミノ酸置換すればよい。
【００４５】
また、本発明に用いるリンカーには、例えば１種類以上のプロテアーゼの基質となるアミノ酸配列（以下、基質アミノ酸配列と称する。）からなるペプチドを用いてもよい。特に、加水分解の位置特異性が高いプロテアーゼは、特定のアミノ酸配列を基質として認識し、特定のペプチド結合を選択的に加水分解することができることから、このようなプロテアーゼの基質アミノ酸配列からなるリンカーを有する本発明のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ融合蛋白質は、対応するプロテアーゼで加水分解すれば、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼと異種蛋白質を所望の位置で切り離すことができる。
【００４６】
加水分解の位置特異性が高いプロテアーゼとその基質アミノ酸配列としては、例えば、エンテロキナーゼは４個の連続したアスパラギン酸残基（Ａｓｐ）の後にリジン残基（Ｌｙｓ）がつながったＡｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓのアミノ酸配列を、トロンビンはロイシン残基−バリン残基−プロリン残基−アルギニン残基（Ｌｕｅ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ）のアミノ酸配列を、活性化血液凝固Ｘ因子はイソロイシン残基−グルタミン酸残基−グリシン残基−アルギニン残基（Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ）のアミノ酸配列を、ウロキナーゼはプロリン残基−グリシン残基−アルギニン残基（Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ）のアミノ酸配列を基質として認識し、それぞれの基質アミノ酸配列のカルボキシル末端側に結合したアミノ酸との間のペプチド結合を選択的に加水分解する。したがってこれらの基質アミノ酸配列のカルボキシル末端側に異種蛋白質のアミノ末端を結合させた場合には、対応するプロテアーゼで加水分解することにより、容易に異種蛋白質を切り出すことができる。
【００４７】
また例えば、ＨＲＶ ３Ｃプロテアーゼは、ロイシン残基−グルタミン酸残基−バリン残基−ロイシン残基−フェニルアラニン残基−グルタミン残基−グリシン残基−プロリン残基（Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ）からなる基質アミノ酸配列を認識し、その配列のＧｌｎとＧｌｙの間のペプチド結合を位置特異的に加水分解する。したがって、例えばＬｅｕ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏからなる基質アミノ酸配列のカルボキシル末端側に異種蛋白質のアミノ末端を結合させた場合には、ＨＲＶ ３Ｃプロテアーゼで加水分解することにより、アミノ末端にＧｌｙ−Ｐｒｏが付加した異種蛋白質が得られるが、本発明はこれらの異種蛋白質も包含するものである。
【００４８】
加水分解の位置特異性が高いプロテアーゼとその基質アミノ酸配列の組み合わせは、特にこれらに限定されるものではない。
【００４９】
さらに、本発明に用いるリンカーとして、上述の加水分解の位置特異性が高いプロテアーゼの基質アミノ酸配列のアミノ末端側及び／又はカルボキシル末端側に１残基以上のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなるリンカーを用いてもよく、基質アミノ酸配列の少なくともカルボキシル末端側に１残基以上のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなるリンカーを用いた場合には、対応するプロテアーゼで加水分解すると、少なくとも１残基以上のアミノ酸がアミノ末端に付加した異種蛋白質が得られるが、本発明はこれらの異種蛋白質も包含するものである。
【００５０】
また、複数種類のプロテアーゼの基質となるアミノ酸配列からなるリンカーを用いる場合には、異種蛋白質のアミノ末端に最も近い基質アミノ酸配列を対応するプロテアーゼで加水分解すればよく、その結果、１残基以上のアミノ酸がアミノ末端に付加した異種蛋白質が得られる場合であっても、本発明はこれらの異種蛋白質を包含するものである。
【００５１】
基質アミノ酸配列のカルボキシル末端側にプロリンがあると加水分解が起こらない場合があり、使用するプロテアーゼの性質とその基質配列については、公知の文献等で調べてから用いることが望ましい。
【００５２】
プロテアーゼを用いた加水分解においては、使用するプロテアーゼ、本発明のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ融合蛋白質およびそれが加水分解されて生じる異種蛋白質が不溶化を起こさずに、該プロテアーゼが反応するように反応条件等を定めればよい。例えば、反応のｐＨは５から８、反応温度は４℃から４０℃から適宜選ばれた条件で行えばよく、本発明はこれらに限定されない。例えばアスパルティックプロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、チオールプロテアーゼ、あるいはそれらのプロテアーゼに分類されるプロテアーゼであり耐熱性を有するプロテアーゼなどを用いる場合にはそれに応じた反応条件を探して用いればよい。
【００５３】
また反応溶液への添加物の添加については、塩の種類（例えばナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩あるいはカルシウム塩など）とその濃度（例えば０Ｍから１Ｍ）、界面活性剤の種類（例えば、Ｔｗｅｅｎ２０（商品名）、Ｔｗｅｅｎ８０（商品名）、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（商品名）、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコシド、ｎ−オクチル−β−Ｄ−マンノシド、ｎ−デシル−β−Ｄ−マンノシドなど）とその濃度（例えば０％から１％）、還元剤の種類（例えばジチオスレイトール、メルカプトエタノール、グルタチオンなど）とその濃度（０ｍＭから１０ｍＭ）、変性剤の種類（例えば尿素、塩酸グアニジンなど）とその濃度（０Ｍから２Ｍ）など、あるいはそれらの組み合わせを、位置特異的な加水分解に使用するプロテアーゼ、本発明のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ融合蛋白質およびそれが位置特異的な加水分解されて生じる異種蛋白質が不溶化を起こさずに該プロテアーゼが反応するように定めればよい。
【００５４】
さらに具体的には、特異性が高いプロテアーゼとして、例えば、エンテロキナーゼを用いる場合には、Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓのアミノ酸配列からなるリンカーを有する、本発明のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ融合蛋白質（すなわちエンテロキナーゼの基質となる本発明のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ融合蛋白質）を、例えば、０．０２Ｍ〜０．１Ｍの濃度のトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）の溶液中で反応させればよい。また反応を行う溶液には、０．００１Ｍ〜０．０２Ｍ塩化カルシウム、及び／又は、１Ｍ以下の濃度の塩化ナトリウム、より好ましくは０．３Ｍ以下の濃度の塩化ナトリウム、及び／又は、界面活性剤、例えばＴｗｅｅｎ２０（商品名）を０．０１％〜０．２％濃度加えることもできる。
【００５５】
反応温度は４℃〜４０℃から適宜選ばれた温度で、反応時間は数分間〜数日間から適宜選ばれた時間で、エンテロキナーゼの基質となる本発明のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ融合蛋白質の蛋白質濃度とエンテロキナーゼの蛋白質濃度の比は、例えば、１：１０から１：１００００で行えばよい。
【００５６】
さらに、例えばニッケルキレート樹脂にアフィニティーがあるポリヒスチジン、Ｓ−プロテインにアフィニティーがあるＳ−ペプチド、あるいはｃ−ｍｙｃ抗体にアフィニティーがあるｃ−ｍｙｃペプチドなどのアフィニティーリガンドをリンカーにしてもよい。
【００５７】
Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼと異種蛋白質を連結するリンカーは、上記のような複数種類のリンカーを組み合わせて用いてもよい。
【００５８】
本発明のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ融合蛋白質をコードしたポリヌクレオチドは、通常の遺伝子工学の分野で使用される相応のプラスミドを用いれば種々の宿主で発現することが可能であるが、取扱い易さ、培養の容易性、高密度培養の可否、更には遺伝子操作における宿主／ベクター系が整備されている細菌、中でもエシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属細菌である大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）が好ましい。
【００５９】
本発明のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ融合蛋白質を発現するためのプラスミドは、例えばｐＴｒｃ９９a（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｕ１３８７２）、ｐＳＴＶ２８（商品名、（株）タカラバイオ社製）、ｐＣＤＦ−１ｂ、ｐＲＳＦ−１ｂ（以上は、商品名、メルク（株）社製）等のプラスミドを例示できる。
【００６０】
本発明のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ融合蛋白質を発現するためのプラスミドで形質転換させる大腸菌としては、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９、Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬＲ（ＤＥ３）などの菌株が例示できるが、本発明はこれらに限定されない。また本発明のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ融合蛋白質を発現するためのプラスミドで形質転換する前の大腸菌が薬剤耐性を有する大腸菌である場合には、本発明のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ融合蛋白質を発現するためのプラスミド上の薬剤耐性マーカー遺伝子は、宿主となる大腸菌の薬剤耐性とは異なるものを選択すればよい。またＴ７ＲＮＡポリメラーゼ融合蛋白質の発現にＴ７プロモーターを利用したプラスミドを使用する場合には、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬＲ（ＤＥ３）のようにＴ７ＲＮＡポリメラーゼの遺伝子をもち、それを発現する大腸菌を宿主にすればよい。
【００６１】
形質転換した大腸菌はプラスミドにコードされている薬剤耐性マーカー遺伝子に対応する薬剤を加えた寒天培地で培養して選別すればよい。
【００６２】
本発明のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ融合蛋白質をコードしたポリヌクレオチドを組み込んだ発現用プラスミドで形質転換した大腸菌は、宿主に用いた大腸菌を培養するための公知の培地、例えばＬＢ培地や２ｘＹＴ培地に、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ融合蛋白質をコードしたポリヌクレオチドを組み込んだ発現用プラスミド上の薬剤マーカー遺伝子に対応する薬剤を添加して培養すればよい。培養温度は１５℃から３７℃で実験的に定めればよい。本発明のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ融合蛋白質をコードしたポリヌクレオチドを組み込んだ発現用プラスミドで形質転換した大腸菌に、本発明のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ融合蛋白質を可溶性の蛋白質として発現させるためには、１５℃〜３７℃から適宜選ばれた温度、好ましくは２５℃〜３０℃から適宜選ばれた温度で培養を行うとよい。
【００６３】
本発明のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ融合蛋白質は、それをコードしたポリヌクレオチドを組み込んだ発現用プラスミドで形質転換した大腸菌を適切に培養して、増殖させ、必要に応じて適当な誘導剤を培地に加えて遺伝子発現を誘導しながら更に培養した後、その菌を集菌して凍結融解、リゾチーム消化処理、超音波処理あるいはそれらの組み合わせにより、菌を破砕すれば、可溶性画分に得ることができる。
【００６４】
可溶性画分に含まれる本発明のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ融合蛋白質は、イオン交換クロマトグラフィーやゲルろ過クロマトグラフィー用いて精製することができる。
【００６５】
また例えば、Ｓ−ペプチドタグを付加したＴ７ＲＮＡポリメラーゼ融合蛋白質であればＳ−プロテインを固定化した担体、例えば、Ｓ−プロテインアガロース（商品名、メルク社製）を用いて精製できる。
【００６６】
またポリヒスチジンからなるいわゆるヒスチジンタグが付加したＴ７ＲＮＡポリメラーゼ融合蛋白質の場合には、ニッケルイオンやコバルトイオンなどの金属イオンをキレートした樹脂、例えばＨｉｓ・Ｂｉｎｄ Ｒｅｓｉｎ（商品名、メルク社製）、Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（商品名、ＧＥヘルスケア バイオサイエンス社製）などを用いて精製することができる。
【００６７】
また本発明のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ融合蛋白質は、シバクロンブルー（Ｃｉｂａｃｒｏｎ Ｂｌｕｅ）をリガンドとして固定化した樹脂（シバクロンブルー固定化樹脂と称する）に吸着させることができる。シバクロンブルーには、Ｃｉｂａｃｒｏｎ Ｂｌｕｅ Ｆ３Ｇ−Ａ［１２２３６−８２−７］やＣｉｂａｃｒｏｎ Ｂｌｕｅ ３Ｇ−Ａ［８４１１６−１３−２］がある。
【００６８】
本発明のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ融合蛋白質のシバクロンブルー固定化樹脂への吸着は、ポリヌクレオチドの共存下では妨害されることから、本発明のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ融合蛋白質の溶液にポリヌクレオチドが混在する場合には予めポリヌクレオチドを除いておくことが望ましい。
【００６９】
例えばポリヌクレオチドを含んでいる本発明のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ融合蛋白質溶液のポリヌクレオチドは、塩類の共存下でポリエチレンイミンを添加することで沈殿させることができる。このとき加える塩類は、ポリエチレンイミンへのＴ７ＲＮＡポリメラーゼ融合蛋白質の吸着、及びポリエチレンイミンとの共沈を防ぐことができればよい。加える塩類は、例えば塩化ナトリウム、塩化カリウムあるいは硫安が例示でき、使用する濃度、及び、使用するポリエチレンイミンの濃度は、本発明のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ融合蛋白質が不溶化しない条件を実験して定めればよい。例えば塩濃度０．１Ｍから０．５Ｍ、ポリエチレンイミン濃度０．１％から１％で検討すればよい。
【００７０】
例えばＴ７ＲＮＡポリメラーゼ融合蛋白質を含んだ大腸菌破砕液で、菌密度 Ｏ．Ｄ．600が約３６の菌懸濁液から調製した破砕液の場合、０．２Ｍの硫安存在下でポリエチレンイミンを濃度１ｍｇ／ｍＬになるようを加えて、氷冷下で、３０分間から６０分間インキュベーションしたのちに、遠心分離して沈殿を除けばよい。
【００７１】
除核酸の方法はこれに限定されず、公知のいかなる方法を利用してもよい。
【００７２】
本発明のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ融合蛋白質を吸着するシバクロンブルー固定化樹脂としてはＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＡＦ−Ｂｌｕｅ ＨＣ−６５０Ｍ（商品名、東ソ−社）やＢｌｕｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（商品名、ＧＥヘルスケア社）が例示できる。
【００７３】
本発明のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ融合蛋白質で、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼと異種蛋白質との間に位置特異的な加水分解が可能な配列、例えば、プロテアーゼの基質アミノ配列を有する場合には、対応するプロテアーゼで加水分解したのちに、シバクロンブルー固定化樹脂を用いて精製を行えばよい。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを含んだポリペプチドはシバクロンブルー固定化樹脂に吸着するため、この樹脂に吸着しない異種蛋白質を、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを含んだポリペプチドや、未消化の融合蛋白質と分離することができる。
【００７４】
例えばエンテロキナーゼの基質となるアミノ酸配列である、Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ配列をリンカーにもつ本発明の融合蛋白質の場合には、その融合蛋白質を、エンテロキナーゼを用いて、カルボキシル末端側にＡｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ配列を有するＴ７ＲＮＡポリメラーゼと、異種蛋白質とに加水分解したのちに、例えば、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＡＦ−Ｂｌｕｅ ＨＣ−６５０Ｍ（商品名、東ソ−社）を用いて精製を行えばよい。このとき、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを含んだポリペプチドはＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＡＦ−Ｂｌｕｅ ＨＣ−６５０Ｍに吸着する。異種蛋白質が樹脂に吸着した場合であっても、０Ｍから２Ｍ塩化ナトリウムの塩濃度勾配で溶出を行って、カルボキシル末端側にＡｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ配列を有するＴ７ＲＮＡポリメラーゼとの分離を検討して、分離可能であれば精製に採用すればよい。
【００７５】
また、例えばＡｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ配列をリンカーにもち、異種蛋白質のカルボキシル末端にポリヒスチジンタグを付加した本発明の融合蛋白質であれば、エンテロキナーゼを用いて加水分解したのち、シバクロンブルー固定化樹脂で精製し、さらに、例えばニッケルキレート樹脂を用いた精製を行えば、カルボキシル末端にポリヒスチジンタグが付加した異種蛋白質を精製することができる。
【００７６】
また必要があればリンカーの加水分解に用いたプロテアーゼに結合する、プロテアーゼインヒビターあるいは抗体を、固定化した樹脂を利用して、使用したプロテアーゼを除去してもよい。
【００７７】
また融合した異種蛋白質に対する抗体やアフィニティーリガンドを固定化した樹脂があればそれを利用して異種蛋白質を精製してもよい。
また上記の精製方法を組み合わせて行ってもよい。
【００７８】
以下に本発明を更に詳細に説明するために実施例を示すが、これら実施例は本発明の一例を示すものであり、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００７９】
実施例１ プラスミドｐＣＤＦ２０−ＥＰＯｂｐｆ４０の作製
Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ（配列番号１）のカルボキシル末端に、ヒトエリスロポエチンレセプター（配列番号２）の１位から２２５位までからなるポリペプチドを連結した融合蛋白質（ＥＰＯｂｐｆ４０、配列番号７、図１参照）をコードしたポリヌクレオチド（配列番号８）をコードした、プラスミドｐＣＤＦ２０−ＥＰＯｂｐｆ４０（図３）を作製した。
【００８０】
まず特許文献２に記載のプラスミドｐＣＤＦ２−Ｔ７ＲＰを制限酵素ＸｂａIで消化して得た５．９ｋｂｐの直鎖ＤＮＡを、ＤＮＡ Ｂｌｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ（商品名、タカラバイオ社製）を用いてＤＮＡの末端を平滑化したのち、ＤＮＡリガーゼを用いてライゲーションして環化して、制限酵素ＸｂａIサイトを含まない、５．９ｋｂｐのプラスミドｐＣＤＦ２０−Ｔ７ＲＰを作製した。そのプラスミドを鋳型にして、配列番号１１と配列番号１２のプライマーをプライマーセットにしてＰＣＲを行い、０．１ｋｂｐのＤＮＡ（ＤＮＡ−１と称する）を得た。
【００８１】
プラスミドｐＣＤＦ２０−Ｔ７ＲＰを制限酵素ＢｌｎＩで消化後、ウシ小腸アルカリホスファターゼで脱リン酸化処理して得られた直鎖状ＤＮＡを、さらに制限酵素ＭｆｅＩで消化して、５．８ｋｂｐのＤＮＡ（ＤＮＡ−２と称する）を得た。一方、ヒトエリスロポエチンレセプターｃＤＮＡをコードしたプラスミド（ＯｒｉＧｅｎｅ社製、品番ＳＣ１２５４４０）を鋳型にして、配列番号１３と配列番号１４のプライマーセットを用いてＰＣＲを行い、０．７ｋｂｐのＤＮＡを合成し、そのＤＮＡを制限酵素ＭｆｅＩとＸｂａＩで二重消化して得た０．７ｋｂｐのＤＮＡ（ＤＮＡ−３と称する）を得た。
【００８２】
得られたＤＮＡ−２とＤＮＡ−３を、ＤＮＡリガーゼを用いてライゲーションして環化させ、プラスミドｐＣＤＦ２０−ＥＰＯｂｐｆ２Ｈを調製した。
【００８３】
プラスミドｐＣＤＦ２０−ＥＰＯｂｐｆ２Ｈは、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの１位メチオニンから８５９位アスパラギン酸までのアミノ酸配列に続き、Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓの４残基を介して、配列番号２に示したヒトエリスロポエチンレセプターの１位アラニンから２２５位アスパラギン酸までと、それに続けて６個のヒスチジンを連結した融合蛋白質（ＥＰＯｂｐｆ２Ｈ、配列番号９、図２参照）をコードしたポリヌクレオチド（配列番号１０）をコードしたプラスミドである。
【００８４】
そのｐＣＤＦ２ＤＦ２０−ＥＰＯｂｐｆ２ＨとＤＮＡ−１（０．１ｋｂｐ）のセットを鋳型にして、配列番号１１と配列番号１３のプライマーをプライマーセットにしてＰＣＲを行い、０．８ｋｂｐのＤＮＡを得た。そのＤＮＡを制限酵素ＭｆｅＩ、ついで制限酵素ＸｂａＩで消化して０．８ｋｂｐのＤＮＡ（ＤＮＡ−４と称する）を得た。
【００８５】
そのＤＮＡ−４を、プラスミドｐＣＤＦ２０−Ｔ７ＲＰを制限酵素ＢｌｎＩ消化後、ウシ小腸アルカリホスファターゼで脱リン酸化処理して得られた直鎖状ＤＮＡを、さらに制限酵素ＭｆｅＩで消化して得た５．８ｋｂｐのＤＮＡ（ＤＮＡ−５と称する）と、ライゲーションして環化させ、プラスミドを調製した。
【００８６】
そのプラスミドにより大腸菌ＨＢ１０１を形質転換し、５０μｇ／ｍＬ カルベニシリンナトリウム、５ｇ／Ｌ 酵母エキス、１０ｇ／Ｌ トリプトン及び１０ｇ／Ｌ 塩化ナトリウムを含む２０ｇ／Ｌ 寒天の固体培地（ＬＢ／Ｃａｒｂ寒天培地と称する）で培養して、目的のプラスミドを有する大腸菌ＨＢ１０１／ｐＣＤＦ２０−ＥＰＯｂｐｆ４０を得た。
【００８７】
実施例２ 融合蛋白質ＥＰＯｂｐｆ４０の調製
大腸菌ＨＢ１０１／ｐＣＤＦ２０−ＥＰＯｂｐｆ４０を、５０ｍｇ／Ｌ カルベニシリンナトリウム、１０ｇ／Ｌ 酵母エキス、１６ｇ／Ｌ トリプトン、５ｇ／Ｌ 塩化ナトリウムを含む培地（２ｘＹＴ／Ｃａｒｂ培地と称する）に植菌して２５℃で１６時間培養して、菌密度（Ｏ．Ｄ．600）が６．８の培養液、０．１２Ｌを得た。
【００８８】
その培養液から大腸菌ＨＢ１０１／ｐＣＤＦ２０−ＥＰＯｂｐｆ４０を、遠心分離して集菌したのち、０．００１Ｍ エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含む０．０５Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁したのち、遠心分離して菌を洗浄後、菌密度（Ｏ．Ｄ．600）の値がおよそ３６になるように、０．１ｍｇ／ｍＬ 卵白リゾチーム、０．０００１Ｍ ４−（アミノエチル）ベンゼンスルオニルフルオリド、０．０００１Ｍ フェニルメタンスルオニルフルオリド、１％（Ｖ／Ｖ） ジメチルスルホキシド及び０．００１Ｍ ＥＤＴＡを含む０．０５Ｍ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に、菌を懸濁した。その懸濁液を０℃で１時間インキュベーションしたのち、１／５００容量の０．５Ｍ ジチオスレイトールを混合して、−８０℃で凍結した。それを解凍後、超音波破砕機に供したのち、破砕して得た液を遠心分離して可溶性画分を得た。
【００８９】
実施例３ シバクロンブルー固定化樹脂を用いた融合蛋白質ＥＰＯｂｐｆ４０の精製
実施例２と同様にして得られた可溶性画分をカートリッジフィルター（ポアサイズ０．２μｍ）で滅菌ろ過したのち、そのろ液に１／１０容量の０．２２Ｍ 硫安水溶液を混合し、その混合液の１／５０容量の５０ｍｇ／ｍＬ ポリエチレンイミン水溶液を混合した。それを０℃で１時間インキュベーションしたのち、遠心分離して不溶化した核酸を除去して可溶性画分を得て、それを０．３Ｍ 塩化ナトリウムを含む０．０２Ｍ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）（平衡化緩衝液１と称する）中で４℃、一晩透析した。透析後に遠心分離をして可溶性画分を得て、それを滅菌ろ過してろ液２２．７ｍＬを得た。
【００９０】
その溶液の２０ｍＬを平衡化緩衝液１で平衡化したＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＡＦ−Ｂｌｕｅ ＨＣ−６５０Ｍ樹脂を４ｍＬ充填したカラムにロードした。その樹脂を、平衡化緩衝液１を１回あたり８ｍＬロードして３回洗浄したのち、２Ｍ 塩化ナトリウムを含む０．０２Ｍ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）で吸着画分を溶出し、フラクションサイズ２ｍＬで分取した。
【００９１】
得られた画分のそれぞれを等容量の２０ｍｇ／ｍＬ ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、４０ｍｇ／ｍＬ ２−メルカプトエタノール、５７０ｍｇ／ｍＬ グリセリン及び１ｍｇ／ｍＬ ブロモフェノールブルーを含む０．２５Ｍ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ６．８）（ＳＤＳサンプル緩衝液と称する）を加えて９８℃で５分間加熱してＳＤＳ化したのち、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で分析した。
【００９２】
図４は、レーン１と１４に分子量マーカー蛋白質（上から順に１７５ｋＤａ、８０ｋＤａ、５８ｋＤａ、４６ｋＤａ、３０ｋＤａ、２５ｋＤａ）、大腸菌ＨＢ１０１／ｐＣＤＦ２０−Ｔ７ＲＰ（実施例１参照）のライセート（レーン２；サイズ比較試料）、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＡＦ−Ｂｌｕｅ ＨＣ−６５０Ｍ樹脂による分画前の試料（レーン３）、樹脂を素通りした画分（レーン４）、樹脂を洗浄して得た画分（レーン５、６及び７）、樹脂に吸着した画分を溶出して得た画分（溶出した順に、レーン８から１３）を電気泳動したのち、Ｃｏｏｍａｓｉｅ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｂｌｕｅ Ｒ−２５０で染色（ＣＢＢ染色と称する）して蛋白質を検出した結果である。
【００９３】
図４のレーン９と１０にアローヘッド（黒三角）が指し示すＥＰＯｂｐｆ４０（分子量１２４ｋＤａ）が検出され、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＡＦ−Ｂｌｕｅ ＨＣ−６５０Ｍ樹脂に吸着したことがわかる。
【００９４】
得られた画分の蛋白質濃度をγ−グロブリンを標準蛋白質に用いて、プロテインアッセイ（商品名、バイオラッド社）で比色定量した結果、分画した試料全量１５９ｍｇ（１００％）に対して、樹脂を素通りした画分と樹脂を洗浄して得た画分を合わせた量の不純蛋白質８７ｍｇ（５５％）を除去した、ＥＰＯｂｐｆ４０を含んだ画分３５ｍｇ（２２％）を得ることができた。
【００９５】
実施例４ プラスミドｐＣＤＦ２０−ＥＰＯｂｐｆ４０Ｈの作製
Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ（配列番号１）のカルボキシル末端にヒトエリスロポエチンレセプター（配列番号２）の１位から２２５位までからなるポリペプチドを連結し、それに続けて６個のヒスチジンを連結した融合蛋白質をコードした配列（ＥＰＯｂｐｆ４０Ｈ、配列番号１５、図１参照）からなるポリヌクレオチド（配列番号１６）をコードした、プラスミドｐＣＤＦ２０−ＥＰＯｂｐｆ４０Ｈ（図５）を作製した。
【００９６】
プラスミドｐＣＤＦ２０−ＥＰＯｂｐｆ２Ｈと実施例１のＤＮＡ−１（０．１ｋｂｐ）のセットを鋳型にして、配列番号１１と配列番号１７のプライマーをプライマーセットにしてＰＣＲを行い、０．８ｋｂｐのＤＮＡを得た。そのＤＮＡを制限酵素ＭｆｅＩ、ついで制限酵素ＢｌｎＩで消化して０．８ｋｂｐのＤＮＡ（ＤＮＡ−６と称する）を得た。ついでＤＮＡ−６を実施例１のＤＮＡ−５とライゲーションして環化させ、プラスミドを調製した。
【００９７】
そのプラスミドにより大腸菌ＨＢ１０１を形質転換し、ＬＢ／Ｃａｒｂ寒天培地で培養して、目的のプラスミドを有する大腸菌ＨＢ１０１／ｐＣＤＦ２０−ＥＰＯｂｐｆ４０Ｈを得た。
【００９８】
実施例５ 融合蛋白質ＥＰＯｂｐｆ４０Ｈの精製
実施例２と同様にして大腸菌ＨＢ１０１／ｐＣＤＦ２０−ＥＰＯｂｐｆ４０Ｈを培養し菌密度（Ｏ．Ｄ．600）が６．６の培養液、０．１２Ｌを得た。その培養液から得た大腸菌から、実施例２と同様にして、可溶性画分を得た。
【００９９】
その可溶性画分（ＥＰＯｂｐｆ４０Ｈを含んでいる画分）を、カートリッジフィルター（ポアサイズ０．２μｍ）で滅菌ろ過したのち、１／１０容量の０．２２Ｍ 硫安水溶液を混合したのち、その混合液の１／４９容量の５０ｍｇ／ｍＬ ポリエチレンイミン水溶液を混合した。それを０℃で１時間インキュベーションしたのち、遠心分離して可溶性画分を得た。それを０．３Ｍ 塩化ナトリウムを含んだ０．０２Ｍ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）中で、４℃で一晩透析したのち、１／１９容量の１Ｍ イミダゾール水溶液を添加した。その溶液を０．０５Ｍ イミダゾール及び０．３Ｍ 塩化ナトリウムを含んだ０．０２Ｍ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）（平衡化緩衝液２と称する）で平衡化したニッケルキレート樹脂（Ｈｉｓ・Ｂｉｎｄ Ｒｅｓｉｎ、商品名、メルク社製）を２ｍＬ充填したカラムにロードしたのち、５ｍＬの平衡化緩衝液２をロードして樹脂を洗い込み、素通り画分としてプールした。その樹脂をさらに１５ｍＬの平衡化緩衝液２を ロードして洗浄したのち、０．２Ｍ イミダゾール及び０．３Ｍ 塩化ナトリウムを含んだ０．０２Ｍ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）で、フラクションサイズ１ｍＬで吸着画分を溶出して分取した。
【０１００】
図６は、レーン１と１１は分子量マーカー蛋白質、ニッケルキレート樹脂による分画前の試料（レーン２）、樹脂を素通りした画分（レーン３）、樹脂を洗浄して得た画分（レーン４）、樹脂に吸着した画分を溶出して得た画分（溶出した順に、レーン５から１０）を電気泳動したのち、ＣＢＢ染色をして蛋白質を検出した結果である。ＥＰＯｂｐｆ４０Ｈはレーン６から９に検出され、レーン２の試料に比べて精製されたことがわかる。
【０１０１】
ニッケルキレート樹脂に吸着したＥＰＯｂｐｆ４０Ｈ（分子量１２４ｋＤａ）の画分の蛋白質濃度は、γ−グロブリンを標準蛋白質に用いてプロテインアッセイで比色定量した。
【０１０２】
本実施例で得られたＥＰＯｂｐｆ４０Ｈは２．０ｍｇであった。
【０１０３】
実施例６ プラスミドｐＣＤＦ２０−ＥＰＯｂｐｆ５０Ｈの作製
Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ（配列番号１）のカルボキシル末端に、Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓの６残基を介して、ヒトエリスロポエチンレセプター（配列番号２）の１位から２２５位までからなるポリペプチドを連結し、それに続けて６個のヒスチジンを連結した融合蛋白質（ＥＰＯｂｐｆ５０Ｈ、配列番号１８、図１参照）をコードしたポリヌクレオチド（配列番号１９）をコードした、プラスミドｐＣＤＦ２０−ＥＰＯｂｐｆ５０Ｈ（図７）を作製した。
【０１０４】
プラスミドｐＣＤＦ２０−Ｔ７ＲＰを鋳型にして、配列番号１１と配列番号２０のプライマーをプライマーセットにしてＰＣＲを行い０．１ｋｂｐのＤＮＡ（ＤＮＡ−７と称する）を得た。
【０１０５】
プラスミドｐＣＤＦ２０−ＥＰＯｂｐｆ２Ｈを鋳型にして、配列番号１７のプライマーと上記ＤＮＡ−７をプライマーセットとして用いてＰＣＲを行い、０．８ｋｂｐのＤＮＡを得た。そのＤＮＡを制限酵素ＭｆｅＩ、ついで制限酵素ＢｌｎＩで消化して０．８ｋｂｐのＤＮＡ（ＤＮＡ−８と称する）を得た。
【０１０６】
ＤＮＡ−８を実施例１のＤＮＡ−５とライゲーションして環化させ、プラスミドを調製した。
【０１０７】
そのプラスミドにより大腸菌ＨＢ１０１を形質転換し、ＬＢ／Ｃａｒｂ寒天培地で培養して、目的のプラスミドを有する大腸菌ＨＢ１０１／ｐＣＤＦ２０−ＥＰＯｂｐｆ５０Ｈを得た。
【０１０８】
実施例７ 融合蛋白質ＥＰＯｂｐｆ５０Ｈの精製
実施例２と同様にして大腸菌ＨＢ１０１／ｐＣＤＦ２０−ＥＰＯｂｐｆ５０Ｈを培養し菌密度（Ｏ．Ｄ．600）が６．６の培養液、０．１２Ｌを得た。その培養液から得た大腸菌から、実施例２と同様にして、ただし、ジチオスレイトールは使用せずに可溶性画分を得た。
【０１０９】
その可溶性画分（ＥＰＯｂｐｆ５０Ｈを含んでいる画分）を、実施例５と同様にしてニッケルキレート樹脂を用いて精製した。
【０１１０】
図８のレーン１と１１は分子量マーカー蛋白質、ニッケルキレート樹脂による分画前の試料（レーン２）、樹脂を素通りした画分（レーン３）、樹脂を洗浄して得た画分（レーン４）、樹脂に吸着した画分を溶出して得た画分（溶出した順に、レーン５から１０）を電気泳動したのち、ＣＢＢ染色をして蛋白質を検出した結果であり、図中のアローヘッドが指し示すレーン６と７に電気泳動した画分がＥＰＯｂｐｆ５０Ｈを多く含んでいた。
【０１１１】
ニッケルキレート樹脂に吸着したＥＰＯｂｐｆ５０Ｈ（分子量１２５ｋＤａ）の画分の蛋白質濃度をγ−グロブリンを標準蛋白質に用いてプロテインアッセイで比色定量した。
【０１１２】
本実施例で得られたＥＰＯｂｐｆ５０Ｈは１ｍｇであった。
【０１１３】
実施例８ エンテロキナーゼによる融合蛋白質ＥＰＯｂｐｆ５０Ｈの加水分解
実施例７と同様にして得られた可溶性画分（ＥＰＯｂｐｆ５０Ｈを含んでいる画分）をカートリッジフィルター（ポアサイズ０．２μｍ）で滅菌ろ過したのち、そのろ液９ｍＬにエンテロキナーゼ（Ｅｎｔｅｒｏｋｉｎａｓｅ，ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ、商品名、ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢｉｏＬａｂｓ社）３６ｎｇを加えて、２５℃で１８時間インキュベーションした。
【０１１４】
実施例９ ＥＰＯｂｐＨの精製
融合蛋白質ＥＰＯｂｐｆ５０Ｈをエンテロキナーゼで加水分解し、すなわち配列番号１８の８８９位と８９０位の間で加水分解して生じた、配列番号１８の８９０位から１１２０位の配列からなるポリペプチド、すなわち、ヒトエリスロポエチンレセプターの１位アラニンから２２５位グルタミン酸にヒスチジン６残基が付加したポリペプチド（ＥＰＯｂｐＨと称する）を以下のように精製した。
【０１１５】
実施例８のエンテロキナーゼを加えてインキュベーションした可溶性画分に、１／１０容量の０．２２Ｍ 硫安水溶液を混合したのち、その混合液の１／５０容量の５０ｍｇ／ｍＬ ポリエチレンイミン水溶液を混合した。それを０℃で１時間インキュベーションしたのち、遠心分離して不溶化した核酸を除去して可溶性画分を得て、それを平衡化緩衝液１中で４℃、一晩透析した。その透析後に遠心分離をして可溶性画分を得た。
【０１１６】
その可溶性画分９ｍＬを平衡化緩衝液１で平衡化したＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＡＦ−Ｂｌｕｅ ＨＣ−６５０Ｍ樹脂を１．８ｍＬ充填したカラムにロードし、カラム非吸着画分を得た。その画分の総蛋白質量は１７．２ｍｇであった。
【０１１７】
そのカラム非吸着画分に１／１９容量の１Ｍ イミダゾール水溶液を添加したのち、平衡化緩衝液２で平衡化したニッケルキレート樹脂（Ｈｉｓ・Ｂｉｎｄ Ｒｅｓｉｎ）を２ｍＬ充填したカラムにロードした。その樹脂を、平衡化緩衝液２を１０ｍＬロードして洗浄したのち、０．２Ｍ イミダゾール及び０．３Ｍ 塩化ナトリウムを含む０．０２Ｍ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）で吸着画分を溶出し、フラクションサイズ１ｍＬで分取した。
【０１１８】
実施例１０ ＥＰＯｂｐＨの分析
実施例９で得た画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供したのち、１０％（Ｖ／Ｖ） メタノールを含んだ０．０１Ｍ シクロヘキシルアミノプロピパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ１１）（ＣＡＰＳ緩衝液と称する）中で電気泳動して、ＰＶＤＦ膜に転写した。その膜を０．１５Ｍ 塩化ナトリウム及び０．５ｍｇ／ｍＬ Ｔｗｅｅｎ２０を含んだ０．０５Ｍ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）（ＴＢＳ−Ｔと称する）で調製した５ｍｇ／ｍＬ ウシ血清アルブミン溶液（ＢＳＡ／ＴＢＳ−Ｔ溶液と称する）でブロッキングしたのち、ウエスタンブロッティングを行い、抗ヒトエリスロポエチンレセプター抗体を用いて検出した。
【０１１９】
ウエスタンブロッティングの手順はまずブロッキングした膜を、１μｇ／ｍＬ マウス抗ヒトエリスロポエチン抗体を含むＢＳＡ／ＴＢＳ−Ｔ溶液中に浸漬して、室温で１時間振とうしたのち、ＴＢＳ―Ｔで洗浄して、Ｂ／Ｆ分離した。次にその膜を濃度が１μｇ／ｍＬの、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識されたヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体を含むＢＳＡ／ＴＢＳ−Ｔ溶液中に浸漬して、室温で１時間振とうしたのち、Ｂ／Ｆ分離した。次にその膜に結合したＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体のＨＲＰ活性を、０．１％ 過酸化水素及び５ｍＭ ４−クロロナフトール含む２４．３ｍＭクエン酸−５１．４ｍＭリン酸水素二ナトリウム緩衝液（ｐＨ５）を基質溶液として用いて室温で２０分間呈色反応を行って、ＥＰＯｂｐｆ５０ＨおよびＥＰＯｂｐＨの検出を行った。
【０１２０】
図９はＳＤＳ−ＰＡＧＥ、図１０はウエスタンブロッティングの結果である。
【０１２１】
それぞれのレーン１と１５は分子量マーカー蛋白質、レーン２は、エンテロキナーゼ処理前の可溶性画分、レーン３はエンテロキナーゼ処理後の可溶性画分、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＡＦ−Ｂｌｕｅ ＨＣ−６５０Ｍ樹脂のカラム非吸着画分（レーン４）、実施例３と同様に洗浄して得られた全画分（レーン５）、及び実施例３と同様に得られた吸着した画分（溶出順にレーン６から９）、ニッケルキレート樹脂にロードした画分（レーン１０；レーン４と同じ画分）、ニッケルキレート樹脂のカラム非吸着画分（レーン１１）及び吸着した画分（溶出順にレーン１２から１４）であり、図９と１０の結果からレーン１３と１４に精製されたＥＰＯｂｐＨがあることがわかる。
【０１２２】
蛋白質濃度をγ−グロブリンを標準蛋白質に用いて、プロテインアッセイで比色定量した結果、得られたＥＰＯｂｐＨは０．２９ｍｇであった。
【０１２３】
実施例１１ ＥＰＯｂｐＨ結合樹脂へのヒトエリスロポエチンの吸着
大腸菌ＨＢ１０１／ｐＣＤＦ２０−ＥＰＯｂｐｆ５０Ｈを培養し菌密度（Ｏ．Ｄ．600）が５．３の培養液、０．５Ｌから得た菌から、実施例９と同様にしてＥＰＯｂｐＨの画分（総蛋白質量１ｍｇ）を得た。そのＥＰＯｂｐＨの溶液（２．８ｍＬ）を０．２Ｍ イミダゾール及び０．３Ｍ 塩化ナトリウムを含む０．０２Ｍ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化したＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＡＦ−Ｂｌｕｅ ＨＣ−６５０Ｍ樹脂を０．２ｍＬ充填したカラムにロードし、カラム非吸着画分にＥＰＯｂｐＨは０．４ｍｇを得た。
【０１２４】
そのＥＰＯｂｐＨ（０．２４ｍｇ）溶液の緩衝液組成を、０．０５Ｍ イミダゾール及び０．３Ｍ 塩化ナトリウムを含む０．０２Ｍ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）に調整したのち、ニッケルキレート樹脂を０．１ｍＬ充填したカラムにロードした。その樹脂を、２０ｍＬの平衡化緩衝液２で洗浄した。その樹脂に０．２５ｍｇ／ｍＬに調製したＣＨＯ細胞由来リコンビナント・ヒトエリスロポエチン（メルク社製）を０．２ｍＬロードしたのち、同組成の緩衝液１０ｍＬで樹脂を洗浄した。そののち、８Ｍ 尿素、０．２Ｍイミダゾール及び０．３Ｍ 塩化ナトリウムを含む０．０２Ｍ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）、５ｍＬで溶出を行った。カラムへの通液は流速を０．１ｍＬ／ｍｉｎで行った。
【０１２５】
なお同様の操作を、ＥＰＯｂｐＨを結合していない樹脂を用いて行った場合にはＣＨＯ細胞由来リコンビナント・ヒトエリスロポエチンは樹脂に吸着しなかった。
【０１２６】
ＥＰＯｂｐＨを結合した樹脂を用いて得られたフラクション（分画サイズ１ｍＬ）は、エンザイムイムノアッセイを行って分析した。
【０１２７】
エンザイムイムノアッセイは、９６穴イムノプレートに４μｇ／ｍＬウサギ抗エリスロポエチンポリクローナル抗体を、０．０５Ｍ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を１ウエルあたり１００μＬ加えて、４℃で１８時間インキュベーションしたのち、ＴＢＳ−ＴでリンスしてＢ／Ｆ分離し、ついでＢＳＡ／ＴＢＳ−Ｔを１ウエルあたり２００μＬ加えて、３０℃で２時間インキュベーションしてブロッキングしてから行った。
【０１２８】
ブロッキングしたプレートはＴＢＳ−ＴでリンスしてＢ／Ｆ分離したのち、ＢＳＡ／ＴＢＳ−Ｔで希釈して調製した試料を１ウエルあたり１００μＬ加えて、３０℃で１時間インキュベーションしたのち、Ｂ／Ｆ分離した。次いで０．８μｇ／ｍＬビオチン標識抗エリスロポエチンモノクローナル抗体を１ウエルあたり１００μＬ加えて、３０℃で１時間インキュベーションしたのち、Ｂ／Ｆ分離し、さらに０．６μｇ／ｍＬ ＨＲＰ標識ストレプトアビジンを１ウエルあたり１００μＬ加えて、３０℃で３０分間インキュベーションした。
【０１２９】
それをＢ／Ｆ分離したのち、ＴＭＢ Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（２−Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ）（製品名、Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ＆ Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を１ウエルあたり１００μＬ加えて３７℃で２０分間反応し、それに１Ｍリン酸水溶液を１ウエルあたり５０μＬ加えて反応停止後、波長４５０ｎｍの吸光度（Ｏ．Ｄ．４５０）を測定した。
【０１３０】
分析の結果、ＥＰＯｂｐＨを結合した樹脂を素通りした画分にＣＨＯ細胞由来リコンビナント・ヒトエリスロポエチンは約３５μｇ検出されたが、８Ｍ 尿素、０．２Ｍ イミダゾール及び０．３Ｍ 塩化ナトリウムを含む０．０２Ｍ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）で溶出した画分に約１５μｇが検出され、樹脂上のＥＰＯｂｐＨにＣＨＯ細胞由来リコンビナント・ヒトエリスロポエチンが吸着したことがわかった。
【０１３１】
実施例１２ プラスミドｐＣＤＦ２０−ＥＰＯｂｐｆ５０の作製
Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ（配列番号１）のカルボキシル末端に、Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓの６残基を介して、ヒトエリスロポエチンレセプター（配列番号２）の１位から２２５位までからなるポリペプチドを連結した融合蛋白質（ＥＰＯｂｐｆ５０、配列番号２１、図１参照）をコードしたポリヌクレオチド（配列番号２２）をコードした、プラスミドｐＣＤＦ２０−ＥＰＯｂｐｆ５０（図１１）を作製した。
【０１３２】
プラスミドｐＣＤＦ２０−ＥＰＯｂｐｆ５０Ｈを、制限酵素ＭｆｅＩついでＥｃｏＲＶで消化し０．４ｋｂｐのＤＮＡ（ＤＮＡ−９と称する）得た。
【０１３３】
一方プラスミドｐＣＤＦ２０−ＥＰＯｂｐｆ４０を、制限酵素ＭｆｅＩついでＥｃｏＲＶで消化して６．２ｋｂｐのＤＮＡ（ＤＮＡ−１０と称する）を得た。
【０１３４】
ＤＮＡ−９を上記のＤＮＡ−１０とライゲーションして環化させ、プラスミドを調製した。
【０１３５】
そのプラスミドにより大腸菌ＨＢ１０１を形質転換し、ＬＢ／Ｃａｒｂ寒天培地で培養して、目的のプラスミドを有する大腸菌ＨＢ１０１／ｐＣＤＦ２０−ＥＰＯｂｐｆ５０を得た。
【０１３６】
実施例１３ プラスミドｐＣＤＦ２０−ＥＰＯｂｐｆ６０Ｈの作製
Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ（配列番号１）のカルボキシル末端に、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｒｇの５残基を介してヒトエリスロポエチンレセプター（配列番号２）の１位から２２５位までからなるポリペプチドを連結し、それに続けて６個のヒスチジンを連結した融合蛋白質（ＥＰＯｂｐｆ６０Ｈ、配列番号２３、図１参照）をコードしたポリヌクレオチド（配列番号２４）をコードした、プラスミドｐＣＤＦ２０−ＥＰＯｂｐｆ６０Ｈ（図１２）を作製した。
【０１３７】
まず実施例６のプラスミドｐＣＤＦ２０−ＥＰＯｂｐ５０Ｈを鋳型にして、配列番号１７と配列番号２５のプライマーをプライマーセットにしてＰＣＲを行い、０．７ｋｂｐのＤＮＡを得た。そのＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩで消化して０．７ｋｂｐのＤＮＡ（ＤＮＡ−１１と称する）を得た。
【０１３８】
一方、プラスミドｐＣＤＦ２０−Ｔ７ＲＰを鋳型にして、配列番号１１と配列番号２６のプライマーをプライマーセットにしてＰＣＲを行い、０．１ｋｂｐのＤＮＡを得た。そのＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩで消化して０．１ｋｂｐのＤＮＡ（ＤＮＡ−１２と称する）を得た。
【０１３９】
ＤＮＡ−１１とＤＮＡ−１２をライゲーションしたのち、配列番号１１と配列番号１７のプライマーをプライマーセットにしてＰＣＲを行い、０．８ｋｂｐのＤＮＡを得た。そのＤＮＡを制限酵素ＭｆｅＩ、ついで制限酵素ＢｌｎＩで消化して０．８ｋｂｐのＤＮＡ（ＤＮＡ−１３）を得た。
【０１４０】
ＤＮＡ−１３を実施例１のＤＮＡ−５とライゲーションして環化させ、プラスミドを調製した。
【０１４１】
そのプラスミドにより大腸菌ＨＢ１０１を形質転換し、ＬＢ／Ｃａｒｂ寒天培地で培養して、目的のプラスミドｐＣＤＦ２０−ＥＰＯｂｐｆ６０Ｈを有する大腸菌ＨＢ１０１／ｐＣＤＦ２０−ＥＰＯｂｐｆ６０Ｈを得た。
【０１４２】
実施例１４ 融合蛋白質ＥＰＯｂｐｆ６０Ｈの発現
大腸菌ＨＢ１０１／ｐＣＤＦ２０−ＥＰＯｂｐｆ６０Ｈを２ｘＹＴ／Ｃａｒｂ培地に植菌して、３０℃で一晩、培養した。その培養液を２つに分け、その一方に濃度が０．１ｍＭになるようにＩＰＴＧを添加し、それぞれを２５℃で２時間培養した。
【０１４３】
得られた菌体を０．００１Ｍ ＥＤＴＡを含む０．０５Ｍ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）でリンスしたのち、同組成の緩衝液にＯ．Ｄ．600が１０になるように再懸濁し、同容量のＳＤＳサンプル緩衝液を加えて９８℃で５分間加熱してＳＤＳ化したのち、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。
【０１４４】
図１３のレーン１は分子量マーカー蛋白質、ＥＰＯｂｐｆ５０Ｈ（比較試料、レーン２、ＩＰＴＧなし）、ＥＰＯｂｐｆ５０Ｈ（比較試料、レーン３、ＩＰＴＧあり）、ＥＰＯｂｐｆ６０Ｈ（レーン４、ＩＰＴＧなし）、ＥＰＯｂｐｆ６０Ｈ（レーン５、ＩＰＴＧあり）であり、レーン４と５にＥＰＯｂｐｆ６０Ｈ（１２５ｋＤａ）がＩＰＴＧの添加の有無によらず発現していることがわかる。
【０１４５】
実施例１５ 融合蛋白質ＥＰＯｂｐｆ６０Ｈの精製
実施例２と同様にして大腸菌ＨＢ１０１／ｐＣＤＦ２０−ＥＰＯｂｐｆ６０Ｈを培養し菌密度（Ｏ．Ｄ．600）が４．８の培養液、約１Ｌを得た。
その培養液から得た大腸菌（湿菌体重量４．６ｇ）から、実施例２と同様にして、可溶性画分を得た。
その可溶画分を平衡化緩衝液１中で、４℃で一晩透析したのち、イミダゾールを終濃度０．０５Ｍになるように添加した。
その溶液（ＥＰＯｂｐｆ６０Ｈの溶液）を２回にわけて、以下のように精製した。
平衡化緩衝液２（実施例５参照）で平衡化したニッケルキレート樹脂（Ｈｉｓ・Ｂｉｎｄ Ｒｅｓｉｎ、商品名、メルク社製）１０ｍＬを充填したカラムに、ＥＰＯｂｐｆ６０Ｈの溶液をロードしたのち、５０ｍＬの平衡化緩衝液２で洗浄したのち、０．２Ｍ イミダゾール及び０．３Ｍ塩化ナトリウムを含む０．０２Ｍ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）で、フラクションサイズ５ｍＬで吸着画分を溶出して分取した。
吸着画分の蛋白質濃度をγ−グロブリンを標準蛋白質に用いて、プロテインアッセイで比色定量した結果、得られたＥＰＯｂｐｆ６０Ｈの合計量は６８．８ｍｇであった。
【０１４６】
実施例１６ プラスミドｐＣＤＦ２０−ＥＰＯｆ６０の作製
Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ（配列番号１）のカルボキシル末端に、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｒｇの５残基を介して、エリスロポエチン（配列番号３）を連結した融合蛋白質（ＥＰＯｆ６０、配列番号２７、図１４）をコードしたポリヌクレオチド（配列番号２８）をコードした、プラスミドｐＣＤＦ２０−ＥＰＯｆ６０（図１５）を作製した。
【０１４７】
まず、配列番号３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７及び４８のプライマーセットを用いてＰＣＲで増幅した、０．３４ｋｂｐのＤＮＡを制限酵素ＭｆｅＩとＰｓｔＩで二重消化したＤＮＡ（ＤＮＡ−１４と称する）を得た。
【０１４８】
またプライマー配列番号４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９及び６０のプライマーセットを用いてＰＣＲで増幅した、０．２５ｋｂｐのＤＮＡを制限酵素ＰｓｔＩとＢｌｎＩで二重消化したＤＮＡ（ＤＮＡ−１５と称する）を得た。実施例１に記載のＤＮＡ−５と、ＤＮＡ−１４およびＤＮＡ−１５を、ＤＮＡリガーゼを用いてライゲーションして環化させ、プラスミドｐＣＤＦ２０−ＥＰＯｆ２を作製した。
【０１４９】
プラスミドｐＣＤＦ２０−ＥＰＯｆ２は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ（配列番号１）の１位メチオニンから８５９位アスパラギン酸までのアミノ酸配列に続き、Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓの４残基を介して、配列番号３に示したヒトエリスロポエチンの１位アラニンから１６６位アルギニンまでを連結した融合蛋白質（ＥＰＯｂｐｆ２、配列番号２９、図２参照）をコードしたポリヌクレオチド（配列番号３０）をコードした、プラスミドである。
【０１５０】
プラスミドｐＣＤＦ２０−ＥＰＯｆ２鋳型にして、配列番号６０と配列番号６１のプライマーセットを用いてＰＣＲを行い、０．５ｋｂｐのＤＮＡを得て、そのＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩで消化して０．５ｋｂｐのＤＮＡ（ＤＮＡ−１６と称する）を得た。
【０１５１】
実施例１３のＤＮＡ−１２と、ＤＮＡ−１６をライゲーションしたのち、配列番号１１と配列番号６０のプライマーセットにしてＰＣＲを行い、０．６ｋｂｐのＤＮＡを得た。そのＤＮＡを制限酵素ＭｆｅＩ、ついで制限酵素ＢｌｎＩで消化して０．６ｋｂｐのＤＮＡ（ＤＮＡ−１７と称する）を得た。
【０１５２】
ＤＮＡ−１７を実施例１のＤＮＡ−５とライゲーションして環化させ、プラスミドを調製した。
【０１５３】
そのプラスミドにより大腸菌ＨＢ１０１を形質転換し、ＬＢ／Ｃａｒｂ寒天培地で培養して、目的のプラスミドを有する大腸菌ＨＢ１０１／ｐＣＤＦ２０−ＥＰＯｆ６０を得た。
【０１５４】
実施例１７ 融合蛋白質ＥＰＯｆ６０の発現
大腸菌ＨＢ１０１／ｐＣＤＦ２０−ＥＰＯｆ６０を２ｘＹＴ／Ｃａｒｂ培地に植菌して、３０℃で一晩、培養した。その培養液を２つに分け、その一方に濃度が０．１ｍＭになるようにイソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）を添加し、それぞれを２５℃で２時間培養した。
【０１５５】
得られた菌体を０．００１Ｍ ＥＤＴＡを含む０．０５Ｍ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）でリンスしたのち、同組成の緩衝液に菌密度がＯ．Ｄ．600で１０になるように再懸濁し、同容量のＳＤＳサンプル緩衝液を加えて９８℃で５分間加熱してＳＤＳ化したのち、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。
【０１５６】
図１６のレーン１は分子量マーカー蛋白質、レーン２はＥＰＯｆ６０（ＩＰＴＧなし）、レーン３はＥＰＯｆ６０（ＩＰＴＧあり）である。レーン３の矢印が指し示す位置にＥＰＯｆ６０（１１８ｋＤａ）が発現していることがわかった。
【０１５７】
実施例１８ ウロキナーゼによる融合蛋白質ＥＰＯｆ６０の加水分解
大腸菌ＨＢ１０１／ｐＣＤＦ２０−ＥＰＯｆ６０を菌密度がＯ．Ｄ．600で０．２になるように２ｘＹＴ／Ｃａｒｂ培地に植菌して、３７℃で３時間培養したのち、０．１ｍＭの濃度になるようにＩＰＴＧを加えて、さらに２５℃で３時間培養した。
【０１５８】
得られた菌体を０．００１Ｍ ＥＤＴＡを含む０．０５Ｍ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）でリンスしたのち、０．１ｍｇ／ｍＬ 卵白リゾチーム、０．００１Ｍ ＥＤＴＡを含む０．０５Ｍ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）にＯ．Ｄ．600が３６になるように再懸濁し、氷冷下で１時間インキュベーションしたのち、−８０℃に凍結した。それを解凍したのち、超音波破砕し、ついで遠心分離して上清を得た。それをカートリッジフィルター（ポアサイズ０．２μｍ）で滅菌ろ過して、そのろ液を可溶性画分とした。その可溶性画分２００μＬに、０．３ｍｇ／ｍＬ 天然型ウロキナーゼ（特開昭６２−１４３６８６に記載の天然型プロウロキナーゼ様ポリペプチドを活性化した酵素）あるいは、０．３ｍｇ／ｍｌ 変異型ウロキナーゼ（特開昭６２−１４３６８６に記載の変異体（Ｑ１３５Ｄ１５７）プロウロキナーゼ様ポリペプチドを活性化した酵素）を、５０μＬ加えて、４℃でインキュベーションした。
【０１５９】
４℃で６８時間インキュベーションした液の一部を、それぞれ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供したのち、ＣＡＰＳ緩衝液中で電気泳動して、ＰＶＤＦ膜に転写した。その膜をＢＳＡ／ＴＢＳ−Ｔ溶液中でブロッキングしたのち、ウエスタンブロッティング分析を行い、抗ヒトエリスロポエチン抗体を用いて検出した。
【０１６０】
ウエスタンブロッティングの手順は、まずブロッキングした膜を、０．５μｇ／ｍＬ ビオチン標識マウス抗ヒトエリスロポエチン抗体を含むＢＳＡ／ＴＢＳ−Ｔ溶液中に浸漬して、室温で１時間振とうしたのち、ＴＢＳ−Ｔで洗浄してＢ／Ｆ分離した。次にその膜を０．６μｇ／ｍＬ 西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識ストレプトアビジンを含むＢＳＡ／ＴＢＳ−Ｔ溶液中に浸漬して、室温で１時間振とうしたのち、Ｂ／Ｆ分離した。次にその膜に結合したＨＲＰ標識ストレプトアビジンのＨＲＰ活性を、０．１％ 過酸化水素及び５ｍＭ ４−クロロナフトールを含む２４．３ｍＭ クエン酸−５１．４ｍＭ リン酸水素二ナトリウム緩衝液（ｐＨ５）を基質溶液として用いて室温で２０分間呈色反応を行って検出し、エリスロポエチンの検出を行った。
【０１６１】
図１７のレーン１は６８時間インキュベーションした大腸菌ＨＢ１０１／ｐＣＤＦ２０-ＥＰＯｆ６０の可溶性画分（ウロキナーゼなし）、レーン２は天然型ウロキナーゼを加えて６８時間インキュベーションした大腸菌ＨＢ１０１／ｐＣＤＦ２０-ＥＰＯｆ６０の可溶性画分、レーン３は変異型ウロキナーゼを加えて６８時間インキュベーションした大腸菌ＨＢ１０１／ｐＣＤＦ２０-ＥＰＯｆ６０の可溶性画分をそれぞれ分析した結果である。矢印で示した位置にエリスロポエチン（１８ｋＤａ）が検出された。
【０１６２】
実施例１９ プラスミドｐＣＤＦ２０−ＦｃＢＰｆ５１Ｈの作製
Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ（配列番号１）のカルボキシル末端に、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓの７残基を介して、抗体レセプター（ＦｃγＲＩ）（配列番号４）の１位から２７４位までからなるポリペプチドを連結し、それに続けて６個のヒスチジンを連結した融合蛋白質（ＦｃＢＰｆ５１Ｈ、配列番号６２、図１８）をコードしたポリヌクレオチド（配列番号６３）をコードした、プラスミドｐＣＤＦ２０−ＦｃＢＰｆ５１Ｈ（図１９）を作製した。
【０１６３】
まず、第一段階目のＰＣＲを、特開２００８−２４５５８０に記載のプラスミドｐＥＣＦｃＲを鋳型にして、配列番号６４と配列番号６５のプライマーセットを用いて行い、０．８ｋｂｐのＤＮＡ（ＤＮＡ−１８と称する）を得た。
【０１６４】
次に第二段階目のＰＣＲを、プラスミドｐＥＣＦｃＲを鋳型にして、ＤＮＡ−１８と配列番号６６のプライマーセットを用いて行い、０．９ｋｂｐのＤＮＡ（ＤＮＡ−１９と称する）を得た。
【０１６５】
次に第三段階目のＰＣＲを、ＤＮＡ−１９を鋳型にして、配列番号６４と配列番号６７のプライマーセットを用いて行い、０．９ｋｂｐのＤＮＡを得て、それを制限酵素ＢａｍＨＩで消化して０．９ｋｂｐのＤＮＡ（ＤＮＡ−２０と称する）を得た。
【０１６６】
そのＤＮＡ−２０を、プラスミドｐＣＤＦ２０−ＥＰＯｂｐｆ６０Ｈを制限酵素ＮａｅＩとＢａｍＨＩで消化して得た６．１ｋｂｐのＤＮＡ（ＤＮＡ−２１と称する）とライゲーションして環化させ、プラスミドを調製した。
【０１６７】
そのプラスミドにより大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、ＬＢ／Ｃａｒｂ寒天培地で培養して、目的のプラスミドを有する大腸菌ＪＭ１０９／ｐＣＤＦ２０−ＦｃＢＰｆ５１Ｈを得た。
【０１６８】
実施例２０ ＦｃＢＰｆ５１Ｈの調製
大腸菌ＪＭ１０９／ｐＣＤＦ２０−ＦｃＢＰｆ５１Ｈを２ｘＹＴ／Ｃａｒｂ培地に植菌して２８℃で１５時間培養して、菌密度（Ｏ．Ｄ．600）が８．３の培養液、０．１２Ｌを得た。
【０１６９】
その培養液から大腸菌ＪＭ１０９／ｐＣＤＦ２０−ＦｃＢＰｆ５１Ｈを、遠心分離して集菌したのち、０．００１Ｍ ＥＤＴＡを含む０．０５Ｍ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、２５ｍＬに懸濁したのち、遠心分離して菌を洗浄した。次にその菌を０．０５Ｍ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、２５ｍＬで洗浄した。
【０１７０】
その菌を菌密度（Ｏ．Ｄ．600）の値がおよそ７２になるように、０．２ｍｇ／ｍＬ 卵白リゾチ−ム、０．０５Ｍ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に、菌を懸濁した。その懸濁液を０℃で１時間インキュベーションしたのち、−８０℃で凍結した。それを解凍後、超音波破砕機に供したのち、破砕して得た液を遠心分離して可溶性画分を得た。
【０１７１】
得られた可溶性画分をカートリッジフィルター（ポアサイズ０．２μｍ）で滅菌ろ過したのち、そのろ液１２．４ｍＬに１／５９容量の３Ｍ イミダゾール（ｐＨ６）を混合した。
【０１７２】
その液の１２．４ｍＬを、０．０５Ｍ イミダゾール及び０．３Ｍ 塩化ナトリウムを含む０．０５Ｍ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）（平衡化緩衝液３と称する）で平衡化したニッケルキレート樹脂（Ｈｉｓ・Ｂｉｎｄ Ｒｅｓｉｎ、商品名、メルク社製）を４ｍＬ充填したカラムにロードしたのち、４ｍＬの平衡化緩衝液３で樹脂を洗い込み、素通り画分としてプールした。その樹脂をさらに１６ｍＬの平衡化緩衝液３で洗浄したのち、０．２Ｍ イミダゾール及び０．３Ｍ 塩化ナトリウムを含む０．０５Ｍ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で、フラクションサイズ２ｍＬで吸着画分を溶出して分取し、フラクションは実施例３と同様にしてＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。
【０１７３】
図２０のレーン１は分子量マーカー蛋白質、レーン２はニッケルキレート樹脂による分画前の可溶性画分、レーン３は素通り画分、レーン４から８は０．２Ｍイミダゾール及び０．３Ｍ 塩化ナトリウムを含む０．０５Ｍ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で溶出された画分であり、レーン６の、矢印で示された位置にＦｃＢＰｆ５１Ｈ（分子量１３１ｋＤａ）が検出された。
【０１７４】
実施例２１ エンテロキナーゼを用いて加水分解したＦｃＢＰｆ５１Ｈ
実施例２０で得たＦｃＢＰｆ５１Ｈを含んだフラクションを、０．２Ｍ 塩化ナトリウムを含む０．０５Ｍ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）中で透析した。透析後のＦｃＢＰｆ５１Ｈ溶液を、γ−グロブリンを標準蛋白質に用いて、プロテインアッセイ（商品名、バイオラッド社）で比色定量して定めた。そのＦｃＢＰｆ５１Ｈ溶液（０．２４ｍｇ／ｍＬ）に、１／５００容量の１Ｍ 塩化カルシウムを加えたのち、それぞれの溶液に含まれる蛋白質量（重量）の１／１００００重量のエンテロキナーゼを添加して４℃でインキュベーションした。
【０１７５】
インキュベート１８時間後、６４時間後、１１２時間後に一部をサンプリングし、反応の阻害剤として、１／２００容量の０．０２Ｍ Ｎ−α−Ｔｏｓｙｌ−Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ ｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈｙｌ ｋｅｔｏｎｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅを混合した。
【０１７６】
それぞれの溶液の一部はウエスタンブロッティングとエンザイムイムノアッセイで分析した。
【０１７７】
ウエスタンブロッティングには、ＨＲＰ標識ウサギａｎｔｉ−６−Ｈｉｓ（Ｂｅｔｈｙｌ社製）を用いた。
【０１７８】
エンザイムイムノアッセイは、９６穴イムノプレートに１０μｇ／ｍＬ ヒト免疫グロブリン（ガンマグロブリン）（製品名、財団法人化学及血清療法研究所製）、０．０５Ｍ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を１ウエルあたり１００μＬ加えて、４℃で１８時間インキュベーションしたのち、ＴＢＳ−ＴでリンスしてＢ／Ｆ分離し、ついでＢＳＡ／ＴＢＳ−Ｔを１ウエルあたり２００μＬ加えて、３０℃で２時間ンキュベーションしてブロッキングしてから行った。
【０１７９】
ブロッキングしたプレートはＴＢＳ−ＴでリンスしてＢ／Ｆ分離したのち、ＢＳＡ／ＴＢＳ−Ｔで希釈して調製した試料を１ウエルあたり１００μＬ加えて、３０℃で１時間インキュベーションしたのち、Ｂ／Ｆ分離し、ついでＢＳＡ／ＴＢＳ−Ｔで５０００倍希釈したＨＲＰ標識抗６ｘＨｉｓ抗体（Ｂｅｔｈｙｌ社製）を１ウエルあたり１００μＬ加えて、３０℃で１時間インキュベーションした。それをＢ／Ｆ分離したのち、ＴＭＢ Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（２−Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ）（製品名、Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ＆ Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を１ウエルあたり１００μＬ加えて室温で３０分間反応し、それに１Ｍリン酸水溶液を１ウエルあたり５０μＬ加えて反応停止後、波長４５０ｎｍの吸光度（Ｏ．Ｄ．450）を測定した。
【０１８０】
図２１のウエスタンブロテッィングのレーン１は分子量マーカー蛋白質であり、レーン２から５の試料はエンテロキナーゼを添加せず、レーン６から８はエンテロキナーゼを添加した試料で、レーン２はインキュベーションする前、レーン３と６はインキュベーション１８時間後、レーン４と７はインキュベーション６４時間後、レーン５と８はインキュベーション１１２時間後の試料を分析した結果である。
【０１８１】
図２１に示したようにエンテロキナーゼを加えて１１２時間の試料（レーン８）にはＦｃＢＰｆ５１Ｈほとんどなくなっていた。またエンテロキナーゼを加えた試料では基質となるアミノ酸配列で加水分解されてＴ７ＲＮＡポリメラーゼの部分が除かれたと考えられる生成物（蛋白質）のバンドを検出した。
【０１８２】
一方、図２２に示したように、エンテロキナーゼを加えずに６４時間インキュベーションしたＦｃＢＰｆ５１Ｈ（６４ｈ−）と、エンテロキナーゼを加えずに１１２時間インキュベーションしたＦｃＢＰｆ５１Ｈ（１１２ｈ−）の結果から、融合蛋白質はその濃度に依存してヒトイムノグロブリンに吸着することがわかった。
【０１８３】
また図２２のエンテロキナーゼを加えて６４時間インキュベーションしたＦｃＢＰｆ５１Ｈ（６４ｈ＋）と、エンテロキナーゼを加えて１１２時間インキュベーションしたＦｃＢＰｆ５１Ｈ（１１２ｈ＋）の結果から、エンテロキナーゼで加水分解されＴ７ＲＮＡポリメラーゼの部分が除かれた蛋白質も、濃度に依存してヒトイムノグロブリンに吸着することがわかった。
【０１８４】
実施例２２ プラスミドｐＣＤＦ２０−ｈＧＨｂｐｆ５１Ｈの作製
Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ（配列番号１）のカルボキシル末端に、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓの７残基を介して、ヒト成長ホルモンレセプター（配列番号５）の１位から２３８位までからなるポリペプチドを連結し、それに続けて６個のヒスチジンを連結した融合蛋白質（ｈＧＨｂｐｆ５１Ｈ、配列番号６８、図２３）をコードしたポリヌクレオチド（配列番号６９）をコードした、プラスミドｐＣＤＦ２０−ｈＧＨｂｐｆ５１Ｈ（図２４）を作製した。
【０１８５】
まず、第一段階目のＰＣＲを、特願２００９−０２５９０１に記載のプラスミドｐＥＴ−ｈＧＨｂｐ２５８を鋳型にして、配列番号７０と配列番号７１のプライマーセットを用いてＰＣＲを行い、０．７ｋｂｐのＤＮＡ（ＤＮＡ−２２と称する）を得た。
【０１８６】
次に第二段階目のＰＣＲを、ＤＮＡ−２２を鋳型にして、配列番号７１と配列番号７２のプライマーセットを用いて行い、０．８ｋｂｐのＤＮＡを得て、それを制限酵素ＢｇｌＩＩとＢｌｎＩで消化して０．８ｋｂｐのＤＮＡ（ＤＮＡ−２３と称する）を得た。そのＤＮＡ−２３を、プラスミドｐＣＤＦ２０−ＥＰＯｂｐｆ６０Ｈを制限酵素ＢａｍＨＩとＢｌｎＩで消化して得た５．９ｋｂｐのＤＮＡとライゲーションして環化させ、プラスミドを調製した。
【０１８７】
そのプラスミドにより大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、ＬＢ／Ｃａｒｂ寒天培地で培養して、目的のプラスミドを有する大腸菌ＪＭ１０９／ｐＣＤＦ２０−ｈＧＨｂｐｆ５１Ｈを得た。
【０１８８】
実施例２３ ヒト成長ホルモンへの融合蛋白質ｈＧＨｂｐｆ５１Ｈの吸着
大腸菌ＪＭ１０９／ｐＣＤＦ２０−ｈＧＨｂｐｆ５１Ｈを２ｘＹＴ／Ｃａｒｂ培地に植菌して２８℃で１６時間培養して、菌密度（Ｏ．Ｄ．600）が４．２の培養液を１０ｍＬ得た。
【０１８９】
その培養液から大腸菌ＪＭ１０９／ｐＣＤＦ２０−ｈＧＨｂｐｆ５１Ｈを、遠心分離して集菌した。得られた菌を１ｍＬの０．００１Ｍ ＥＤＴＡを含む０．０５Ｍ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁したのち、遠心分離して菌を洗浄した。次にその菌を１ｍＬの０．０５Ｍ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で洗浄した。その菌を菌密度（Ｏ．Ｄ．600）の値が３６になるように、０．１ｍｇ／ｍＬ 卵白リゾチ−ム、０．０５Ｍ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に、菌を懸濁した。その懸濁液を０℃で３０分間インキュベーションしたのち、−８０℃で凍結した。それを解凍後、超音波破砕機に供したのち、破砕して得た液を遠心分離して可溶性画分を得た。
【０１９０】
その可溶性画分に含まれるｈＧＨｂｐｆ５１Ｈがヒト成長ホルモンに吸着することを、エンザイムイムノアッセイを行って調べた。
【０１９１】
エンザイムイムノアッセイは、９６穴イムノプレートに１μｇ／ｍＬ ヒト成長ホルモンを、０．０５Ｍ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を１ウエルあたり１００μＬ加えて、４℃で１８時間インキュベーションしたのち、ＴＢＳ−ＴでリンスしてＢ／Ｆ分離し、ついでＢＳＡ／ＴＢＳ−Ｔを１ウエルあたり２００μＬ加えて、３０℃で２時間インキュベーションしてブロッキングしてから行った。
【０１９２】
ブロッキングしたプレートはＴＢＳ−ＴでリンスしてＢ／Ｆ分離したのち、ＢＳＡ／ＴＢＳ−Ｔで希釈して調製した試料を１ウエルあたり１００μＬ加えて、３０℃で１時間インキュベーションしたのち、Ｂ／Ｆ分離した。次いで０．５μｇ／ｍＬ マウス抗ヒト成長ホルモンレセプター抗体（ＩｇＧ２ｂ）を１ウエルあたり１００μＬ加えて、３０℃で１時間インキュベーションしたのち、Ｂ／Ｆ分離し、さらに０．２５μｇ／ｍＬ ＨＲＰ標識ウサギ抗マウスＩｇＧ２ｂ抗体を１ウエルあたり１００μＬ加えて、３０℃で１時間インキュベーションした。それをＢ／Ｆ分離したのち、ＴＭＢ Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（２−Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ）（製品名、Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ＆ Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を１ウエルあたり１００μＬ加えて室温で９０秒間反応し、それに１Ｍ リン酸水溶液を１ウエルあたり５０μＬ加えて反応停止後、波長４５０ｎｍの吸光度（Ｏ．Ｄ．４５０）を測定した。
【０１９３】
図２５に示したようにｈＧＨｂｐｆ５１Ｈの濃度に依存してヒト成長ホルモンに吸着することがわかった。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼのカルボキシル末端に、直接に、または１残基以上のアミノ酸からなるリンカーを介して、異種蛋白質が融合したＴ７ＲＮＡポリメラーゼ融合蛋白質並びに当該Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ融合蛋白質をコードしたポリヌクレオチドに関する。また本発明は、当該ポリヌクレオチドを有し、かつ、それを発現して本発明のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ融合蛋白質を生産することができるＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属の細菌、並びに当該Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属の細菌を使用する本発明のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ融合蛋白質の製造法に関する。さらに本発明は、本発明のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ融合蛋白質をプロテアーゼで加水分解することを特徴とする異種蛋白質の製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）を用いた蛋白質生産において、宿主である大腸菌とは異種の生物等に由来する外来の蛋白質、いわゆる異種蛋白質を生産させた場合に、生産された異種蛋白質は菌体内に蓄積され封入体を形成することが多い。封入体を形成した異種蛋白質は、その存在状態故に生物学的あるいは生化学的に不活性であるため、活性型の蛋白質を得るためには、可溶化、再生の操作がさらに必要となる。
【０００３】
これらの問題を解決するため、異種蛋白質に大腸菌菌体内で可溶性蛋白質として発現する蛋白質を融合させて発現する方法が知られている。異種蛋白質に融合させる蛋白質としては、Ｔ７ファージの１０Ｂ配列のＣ末端部位からなるＳｏｌｕｂｉｌｉｔｙ ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｔａｇ（ＳＥＴ）やＧＢ１ドメイン、ユビキチン、Ｓｍａｌｌ ｕｂｉｑｕｔｉｎ−ｒｅｌａｔｅｄ ｍｏｄｉｆｅｒ（ＳＵＭＯ）、チオレドキシン（ＴＲＸ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合蛋白質（ＭＢＰ）、Ｎ−ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｓｕｂｓｔａｎｃｅ Ａ（Ｎｕｓ Ａ）を用いた融合発現（非特許文献１）やカルボキシル末端が欠損したシャペロニンを用いた融合発現（特許文献１）が知られている。
【０００４】
バクテリオファージであるＴ７ファージに由来するＲＮＡポリメラーゼであるＴ７ＲＮＡポリメラーゼを、異種蛋白質に融合させて発現させた例に関しては、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを酵母内で機能させる目的で、酵母ＧＡＬ４蛋白質をＴ７ＲＮＡポリメラーゼのアミノ末端に融合させた発現させた例が知られている（非特許文献２）。なおＧＡＬ４蛋白質自体は大腸菌菌体内でも機能を有する蛋白質として発現することが知られている。
【０００５】
一方、これまでにＴ７ＲＮＡポリメラーゼのカルボキシル末端に脊椎動物由来のポリペプチドや、脊椎動物由来のポリペプチドを連結した融合蛋白質を可溶性の蛋白質として発現させた例はない。
【０００６】
また、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼのカルボキシル末端に脊椎動物由来のポリペプチドや、脊椎動物由来のポリペプチドの１残基以上のアミノ酸を、他のアミノ酸に置換、及び／又は欠失、及び／又は付加したポリペプチドを連結した融合蛋白質を可溶性の蛋白質として発現させた例はない。
【０００７】
またシバクロンブルー（ＣｉｂａｃｒｏｎＢｌｕｅ）を固定化した樹脂が、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの精製に利用できることが知られている（非特許文献３）が、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼが融合した蛋白質の精製に利用した例はない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００４−３２１１４１号公報
【特許文献２】特開２００９−１３６１５３号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】加藤 淳ら，生物物理，Ｖｏｌ．４８，１８５−１８９（２００８）
【非特許文献２】Ｏｓｔｒａｎｄｅｒ Ｅ．Ａ．ら．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９，１２６１−１２６５（１９９０）
【非特許文献３】Ｄａｓ Ｍ．ら，Ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２８，３３９−３４８（１９９８）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、宿主に対して異種の蛋白質を、可溶化や再生の操作を必要としない可溶性の蛋白質として発現させるための融合蛋白質として有用なＴ７ＲＮＡポリメラーゼ融合蛋白質、該Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ融合蛋白質を純度よく製造する方法、該Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ融合蛋白質を位置特異的に加水分解して異種蛋白質を純度よく簡便に製造する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼのカルボキシル末端に、場合によってはリンカーを介して異種蛋白質を連結したＴ７ＲＮＡポリメラーゼ融合蛋白質が、大腸菌の細胞質中に可溶性蛋白質として発現すること、またその融合蛋白質の性質が、融合蛋白質及び融合蛋白質から異種蛋白質を精製するときに有利であることを見出し、本発明を完成させた。
【００１２】
すなわち本発明は、配列番号１で示したＴ７ＲＮＡポリメラーゼのカルボキシル末端に、直接に、または１残基以上のアミノ酸からなるリンカーを介して、異種蛋白質が融合したＴ７ＲＮＡポリメラーゼ融合蛋白質に関するものである。異種蛋白質は、当該蛋白質の全長を指すこともあれば、その一部である機能を有するポリペプチドを指すこともある。
【００１３】
また、本発明は、配列番号１で示したＴ７ＲＮＡポリメラーゼのカルボキシル末端に、直接に、または１残基以上のアミノ酸からなるリンカーを介して、脊椎動物由来のポリペプチドが融合したＴ７ＲＮＡポリメラーゼ融合蛋白質、あるいは配列番号１で示したＴ７ＲＮＡポリメラーゼのカルボキシル末端に、直接に、または１残基以上のアミノ酸からなるリンカーを介して、脊椎動物由来のポリペプチドの１残基以上のアミノ酸を、他のアミノ酸に置換、及び／又は欠失、及び／又は付加したポリペプチドが融合したＴ７ＲＮＡポリメラーゼ融合蛋白質に関するものである。
【００１４】
また、本発明は配列番号１で示したＴ７ＲＮＡポリメラーゼのカルボキシル末端に、直接に、または１残基以上のアミノ酸からなるリンカーを介して、配列番号２で示したヒトエリスロポエチンレセプターの１位から２２５位からなるポリペプチド、配列番号３で示したヒトエリスロポエチンの１位から１６６位からなるポリペプチド、配列番号４で示したヒトＦｃγＲＩの１位から２７４位からなるポリペプチド、あるいは配列番号５で示したヒト成長ホルモンレセプターの１位から２３８位からなるポリペプチドを融合したＴ７ＲＮＡポリメラーゼ融合蛋白質に関するものである。
【００１５】
また、本発明は配列番号１で示したＴ７ＲＮＡポリメラーゼのカルボキシル末端に、直接に、または１残基以上のアミノ酸からなるリンカーを介して、配列番号２で示したヒトエリスロポエチンレセプターの１位から２２５位からなるポリペプチド、配列番号３で示したヒトエリスロポエチンの１位から１６６位からなるポリペプチド、配列番号４で示したヒトＦｃγＲＩの１位から２７４位からなるポリペプチド、あるいは配列番号５で示したヒト成長ホルモンレセプターの１位から２３８位からなるポリペプチドの、１残基以上のアミノ酸を、他のアミノ酸に置換、及び／又は欠失、及び／又は付加したポリペプチドを融合したＴ７ＲＮＡポリメラーゼ融合蛋白質に関するものである。
【００１６】
また、本発明は、本発明のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ融合蛋白質をコードしたポリヌクレオチドと、そのポリヌクレオチドを発現し、該融合蛋白質を生産するＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属の細菌に関するものである。
【００１７】
また、本発明は、本発明のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属の細菌を使用するＴ７ＲＮＡポリメラーゼ融合蛋白質の製造法に関するものである。
【００１８】
さらに、本発明はＴ７ＲＮＡポリメラーゼ融合蛋白質を１種類以上のプロテアーゼで加水分解することを特徴とする異種蛋白質の製造法に関するものである。
【００１９】
また、本発明は、シバクロンブルー固定化樹脂を用いることを特徴とするＴ７ＲＮＡポリメラーゼ融合蛋白質の製造法に関するものである。
【００２０】
また、本発明は本発明のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ融合蛋白質を加水分解して生じた異種蛋白質を、シバクロンブルー固定化樹脂を用いて分離することを特徴とする異種蛋白質の製造法に関するものであり、本発明のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ融合蛋白質をプロテアーゼで加水分解して生じた異種蛋白質を、シバクロンブルー固定化樹脂を用いて分離することを特徴とする異種蛋白質の製造法に関するものである。
【発明の効果】
【００２１】
本発明のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ融合蛋白質を用いれば、目的の異種蛋白質を、例えば、大腸菌を用いて、可溶性の融合蛋白質として製造することができる。本発明のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ融合蛋白質は、シバクロンブルー固定化樹脂を用いて精製することも可能である。特に、目的の異種蛋白質を、例えばプロテアーゼによって位置特異的な加水分解が可能なリンカーを介してＴ７ＲＮＡポリメラーゼに連結した本発明のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ融合蛋白質は、所望の位置でＴ７ＲＮＡポリメラーゼを切除することにより、目的の異種蛋白質を効率よく製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、ヒトエリスロポエチンレセプター（ｈＥＰＯＲ）、実施例１、２及び３のＥＰＯｂｐｆ４０、実施例４及び５のＥＰＯｂｐｆ４０Ｈ、実施例１２のＥＰＯｂｐｆ５０、実施例６、７、８及び９のＥＰＯｂｐｆ５０Ｈ、及び、実施例１３及び１４のＥＰＯｂｐｆ６０Ｈの一次構造の模式図
【図２】Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、ヒトエリスロポエチンレセプター（ｈＥＰＯＲ）、 実施例１、４及び６のＥＰＯｂｐｆ２Ｈ、ヒトエリスロポエチン（ｈＥＰＯ）、実施例１６のＥＰＯｆ２の一次構造の模式図
【図３】実施例１で調製したプラスミドの模式図
【図４】実施例３のＥＰＯｂｐｆ４０のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図
【図５】実施例４で調製したプラスミドの模式図
【図６】実施例５のＥＰＯｂｐｆ４０ＨのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図
【図７】実施例６で調製したプラスミドの模式図
【図８】実施例７のＥＰＯｂｐｆ５０ＨのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図
【図９】実施例１０のＥＰＯｂｐＨのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図
【図１０】実施例１０のＥＰＯｂｐＨのウエスタンブロッティングの結果を示す図
【図１１】実施例１２で調製したプラスミドの模式図
【図１２】実施例１３で調製したプラスミドの模式図
【図１３】実施例１４のＥＰＯｂｐｆ６０ＨのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図
【図１４】Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、ヒトエリスロポエチン（ｈＥＰＯ）、実施例１６、１７及び１８のＥＰＯｆ６０の一次構造の模式図
【図１５】実施例１６で調製したプラスミドの模式図
【図１６】実施例１７のＥＰＯｆ６０のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図
【図１７】実施例１８のＥＰＯｆ６０のウエスタンブロッティングの結果を示す図
【図１８】実施例１９のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ、ＦｃγＲＩ及びＦｃＢＰｆ５１Ｈの一次構造の模式図
【図１９】実施例１９で調製したプラスミドの模式図
【図２０】実施例２０のＦｃＢＰｆ５１ＨのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図
【図２１】実施例２１のエンテロキナーゼを用いて加水分解したＦｃＢＰｆ５１Ｈのウエスタンブロッティングの結果を示す図
【図２２】実施例２１のエンテロキナーゼを用いて加水分解したＦｃＢＰｆ５１Ｈのエンザイムイムノアッセイの結果を示す図
【図２３】実施例２２のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ、ｈＧＨＲ及びｈＧＨｂｐｆ５１Ｈの一次構造の模式図
【図２４】実施例２２で調製したプラスミドの模式図
【図２５】実施例２３のｈＧＨｂｐｆ５１Ｈのエンザイムイムノアッセイの結果を示す図
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明に関わる配列番号１に示したＴ７ＲＮＡポリメラーゼと直接、あるいは、１残基以上のアミノ酸からなるリンカーを介して融合する異種蛋白質は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）に対して異種の生物等に由来する外来の蛋白質を挙げることができ、具体的には、脊椎動物である哺乳類、鳥類、爬虫類、両性類、魚類に由来するポリペプチドを例示することができる。
【００２４】
さらに具体的には、異種蛋白質としては、成長ホルモン、エリスロポエチン、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−３（ＩＬ−３）、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、インターロイキン−５（ＩＬ−５）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターロイキン−７（ＩＬ−７）、インターロイキン−９（ＩＬ−９）、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）、インターロイキン−１１（ＩＬ−１１）、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）のサブユニットｐ３５、インターロイキン−１３（ＩＬ−１３）、インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、カルジオトロフィン−１（ＣＴ−１）、白血球阻害因子（ＬＩＦ）、オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）、インターフェロンα（ＩＦＮα）、インターフェロンβ（ＩＦＮβ）、インターフェロンγ（ＩＦＮγ）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）、腫瘍壊死因子β（ＴＮＦβ）、レプチン、プロラクチンなどのポリペプチド、あるいは、それらのポリペプチドの各レセプターの細胞外ドメインなどの、脊椎動物に由来するポリペプチドが例示できる。
【００２５】
また、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩIａ（ＣＤ３２Ａ）、ＦｃγＲＩIｂ（ＣＤ３２Ｂ）、ＦｃγＲＩIＩａ（ＣＤ１６Ａ）、ＦｃγＲＩＩIｂ（ＣＤ１６Ｂ）、ＦｃεＲＩ、ＦｃεＲＩＩ（ＣＤ２３）、ＦｃαＲＩ（ＣＤ８９）、Ｆｃα/μＲ、ＦｃＲｎ、ポリメリックＩｇレセプターなどの抗体レセプターの細胞外ドメイン、細胞接着分子（カドヘリン、インテグリン、セレクチンなど）の細胞外ドメイン、抗体のＨ鎖やＬ鎖などの、脊椎動物に由来するポリペプチドが例示できる。また脊椎動物に由来する、酵素、オリゴマー酵素の構成要素であるポリペプチド、酵素阻害蛋白質、膜結合型酵素の可溶性ドメインなどのポリペプチドが例示できる。
【００２６】
また本発明で用いる異種蛋白質は、例えば上記のような、脊椎動物に由来するポリペプチドに加えて、当該ポリペプチドに対して以下の（ア）から（ウ）から選択される一以上の変異を加えたものであって、当該異種蛋白質の活性、例えば酵素活性や結合活性などを有するものであっても良い。
（ア）上記ポリペプチドを構成するアミノ酸残基の配列中の一残基以上のアミノ酸を欠失したもの
（イ）上記ポリペプチドを構成するアミノ酸残基の配列中の一残基以上のアミノ酸を他のアミノ酸に置換したもの
（ウ）上記ポリペプチドを構成するアミノ酸残基の配列について、一残基以上のアミノ酸を付加したもの。
【００２７】
異種蛋白質のカルボキシル末端には、例えばポリヒスチジン、Ｓ−ペプチド、あるいはｃ−ｍｙｃペプチドなどの付加配列を連結してもよい。
【００２８】
異種蛋白質をコードしたポリヌクレオチドは、公知の方法により調製できる。例えば目的の異種蛋白質をコードしたポリヌクレオチドは、公知の情報を利用してオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットを作製し、目的の異種蛋白質をコードしたポリヌクレオチドを含んだ、市販のｃＤＮＡやｃＤＮＡライブラリー、あるいは、公知の方法で調製したｃＤＮＡを鋳型としてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行い、目的のポリヌクレオチドを増幅して調製すればよい。
【００２９】
ＰＣＲによるポリヌクレオチドの増幅反応は、例えば、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（商品名、タカラバイオ社製）を利用することができ、付属のプロトコールに従って実験的に、目的のポリヌクレオチドが増幅する条件を探せばよい。例えば付属の緩衝液を用いた反応溶液中で、例えば、０．０１Ｕ／μＬ ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ、反応に使用するプライマーの濃度は、最大０．３μＭ、鋳型となるプラスミドＤＮＡ０．２〜２０ｐｇ／ｍＬで反応を検討すればよい。反応の温度と時間は、例えば、９８℃で１０秒間、５５℃で５秒間、ついで７２℃で、増幅したいＤＮＡの塩基対の数に０．０６を乗じた秒数の時間を、１サイクルとして、２５サイクルから３０サイクルの反応をおこなえばよい。また反応サイクルにおいて５５℃で５秒間の設定を、５６℃から７２℃の間のいずれかの温度に設定して、増幅したいＤＮＡが得られる温度を実験的に定めてもよい。
【００３０】
ＰＣＲによるポリヌクレオチドの増幅反応は公知の方法に基づいて行えばよく、上述の方法に限定されない。
【００３１】
また上述の調製方法で調製したポリヌクレオチドを鋳型に、アミノ酸の置換、及び／又は欠失、及び／又は付加するように設計したプライマーセットを用いてＰＣＲで増幅を行なう、またはエラープローンＰＣＲにて増幅を行なうことで、１残基以上のアミノ酸の置換、及び／又は欠失、及び／又は付加された、異種蛋白質をコードしたポリヌクレオチドを調製することができる。
【００３２】
ＰＣＲで増幅した目的のＤＮＡは、そのＤＮＡを含んだＰＣＲ反応液を、例えば、アガロース電気泳動したのち、そのゲルを臭化エチジウムで染色し、例えば波長３０２ｎｍあるいは波長３１２ｎｍの紫外線を照射して目的のＤＮＡを検出して、目的のＤＮＡを含んだ部分のゲルを切り出し、そこから、ＤＮＡを精製すればよい。ＤＮＡの精製は、市販のキットを利用して精製すればよく、例えば、ＭＥＲｍａｉｄ Ｋｉｔ（商品名、Ｑｂｉｏｇｅｎｅ社）やＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ，１５,ＵｌｔｒａＣｌｅａｎ（商品名、ＭＯ Ｂｉｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を精製したいＤＮＡの長さに応じて利用すればよい。ＤＮＡの検出方法や精製の方法はこれらに限定されるものではない。
【００３３】
本発明のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ融合蛋白質を遺伝子工学的に製造するために用いるポリヌクレオチドは、本発明のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ融合蛋白質をコードしたポリヌクレオチドであればよく、当業者であれば公知の方法により調製することができる。
【００３４】
ポリヌクレオチドの調製法の一例としてはＰＣＲを利用した方法がある。例えばＴ７ファージからＴ７ファージＤＮＡを調製して、それを鋳型に用いて、適当なオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーとリバースプライマーでＰＣＲを行ってポリヌクレオチドを得ることができる。例えばＴ７ファージからＴ７ファージＤＮＡを調製して、それを鋳型に用いて、適当なオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーとリバースプライマーでＰＣＲを行って所望のポリヌクレオチドを得ることができる。ＰＣＲに用いるフォワードプライマーとリバースプライマーは、例えばＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ＿０４１９６０に登録されているＴ７ＲＮＡポリメラーゼの塩基配列を参考にして作製すればよい。
【００３５】
次に、例えば、下記の（Ａ）から（Ｆ）をひとつの反応溶液中にて反応させるＰＣＲを行うことで、本発明のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ融合蛋白質をコードしたポリヌクレオチドを調製することができる。
【００３６】
すなわち、ＰＣＲで増幅して得たＴ７ＲＮＡポリメラーゼをコードした塩基配列からなるポリヌクレオチドとその相補鎖からなる二本鎖ポリヌクレオチド（Ａ）、連結させようとする異種蛋白質をコードした塩基からなるポリヌクレオチドとその相補鎖からなる二本鎖ポリヌクレオチド（Ｂ）、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの１位メチオニンから数アミノ酸をコードしたオリゴヌクレオチドのフォワードプライマー（Ｃ）、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの８８３位アラニンから数残基上流までのアミノ酸と、例えば、それに連結させようとする異種蛋白質のアミノ末端から数残基下流までの数アミノ酸の両者に跨る部分をコードしたオリゴヌクレオチドに相補的なオリゴヌクレオチドのリバースプライマー（Ｄ）、５’端側が（Ｄ）の５’端側と相補的な配列であり、その配列がコードした異種蛋白質のアミノ末端部分に続く配列のアミノ酸をコードしたオリゴヌクレオチド、すなわち、（Ｄ）と（Ｂ）の相補鎖側の、両者に跨る部分をコードしたオリゴヌクレオチドのフォワードプライマー（Ｅ）及び、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼと連結させようとする異種蛋白質の、例えば、カルボキシル末端を含んだカルボキシル末端側の数アミノ酸をコードしたオリゴヌクレオチドに相補的なオリゴヌクレオチドのリバースプライマー（Ｆ）をひとつの反応溶液中にて反応させるＰＣＲを行うことで、本発明のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ融合蛋白質をコードしたポリヌクレオチドを調製することができる。
【００３７】
またＴ７ＲＮＡポリメラーゼのカルボキシル末端に、１残基以上のアミノ酸からなるリンカーを介して、異種蛋白質が融合した本発明のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ融合蛋白質をコードしたポリヌクレオチドは、先述の（Ｄ）のプライマーの代わりに、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼに由来するカルボキシル末端と異種蛋白質のアミノ末端をコードしたポリヌクレオチドの間に１残基以上のアミノ酸をコードしたポリヌクレオチドに相補的なオリゴヌクレオチドのリバースプライマー（Ｇ）を用いれば調製することができる。
【００３８】
またＴ７ＲＮＡポリメラーゼと連結させようとする異種蛋白質のカルボキシル末端に付加配列を有する本発明のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ融合蛋白質をコードしたポリヌクレオチドは、先述の（Ｆ）のプライマーの代わりに、融合させる異種蛋白質のカルボキシル末端を含むカルボキシル末端側の数アミノ酸と、そのカルボキシル末端に付加させる配列をコードしたオリゴヌクレオチドに相補的なオリゴヌクレオチド（Ｈ）を用いれば調製することができる。
【００３９】
また例えば、（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｅ）、（Ｇ）および（Ｈ）をひとつの反応溶液中にて反応させるＰＣＲを行うことで、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼのカルボキシル末端に、１残基以上のアミノ酸からなるリンカーを介して、カルボキシル末端に付加配列を有する異種蛋白質が融合した本発明のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ融合蛋白質をコードしたポリヌクレオチドを調製することができる。
【００４０】
また本発明のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ融合蛋白質をコードしたポリヌクレオチドの調製には、例えば特許文献２に記載のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ＿０４１９６０）をコードした、プラスミドｐＴｒｃ９９Ａ−Ｔ７ＲＰやｐＣＤＦ２−Ｔ７ＲＰを調製して、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ融合蛋白質をコードしたポリヌクレオチドを作製するためのＰＣＲの鋳型として利用してもよく、さらには本発明のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ融合蛋白質をコードしたポリヌクレオチドをコードするプラスミドの作製に用いてもよい。
【００４１】
またＴ７ＲＮＡポリメラーゼと異種蛋白質の間には、場合によっては１残基以上のアミノ酸からなるリンカーを挿入してもよい。「１残基以上のアミノ酸からなるリンカー」は、本発明のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ融合蛋白質を可溶性で発現できるリンカーであれば何でもよく、好ましくは１〜５０のアミノ酸からなるリンカーを指し、さらに好ましくは、１〜２０のアミノ酸から成るリンカーを指す。さらに好ましくは、１〜１０のアミノ酸からなるリンカー、又は１若しくは数残基のアミノ酸からなるリンカーを指す。
【００４２】
該リンカーには、例えばＡｓｐ−Ｐｒｏ配列及び／又はＡｓｎ−Ｇｌｙ配列を含んだアミノ酸配列を有するリンカーを用いてもよい。
【００４３】
Ａｓｐ−Ｐｒｏ配列は例えば７０％ ギ酸水溶液（ｐＨ２．５）で、アスパラギン酸（Ａｓｐ）とプロリン（Ｐｒｏ）の間の結合が加水分解されることが知られている。またＡｓｎ−Ｇｌｙ配列は、例えば２Ｍ ヒドロキシルアミン水溶液（ｐＨ９）で、アスパラギン（Ａｓｎ）とグリシン（Ｇｌｙ）の間の結合が加水分解されることが知られている。
【００４４】
異種蛋白質の分子内にＡｓｐ−Ｐｒｏ配列やＡｓｎ−Ｇｌｙ配列がある場合には、その箇所のアミノ酸を予め置換しておいてもよい。異種蛋白質の分子内にあるＡｓｐ−Ｐｒｏ配列のアスパラギン酸（Ａｓｐ）は、例えばグルタミン酸（Ｇｌｕ）にアミノ酸置換すればよい。また異種蛋白質の分子内にあるＡｓｎ−Ｇｌｙ配列のアスパラギン（Ａｓｎ）は、例えばグルタミン（Ｇｌｎ）、また例えばアスパラギン酸（Ａｓｐ）に、アミノ酸置換すればよい。
【００４５】
また、本発明に用いるリンカーには、例えば１種類以上のプロテアーゼの基質となるアミノ酸配列（以下、基質アミノ酸配列と称する。）からなるペプチドを用いてもよい。特に、加水分解の位置特異性が高いプロテアーゼは、特定のアミノ酸配列を基質として認識し、特定のペプチド結合を選択的に加水分解することができることから、このようなプロテアーゼの基質アミノ酸配列からなるリンカーを有する本発明のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ融合蛋白質は、対応するプロテアーゼで加水分解すれば、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼと異種蛋白質を所望の位置で切り離すことができる。
【００４６】
加水分解の位置特異性が高いプロテアーゼとその基質アミノ酸配列としては、例えば、エンテロキナーゼは４個の連続したアスパラギン酸残基（Ａｓｐ）の後にリジン残基（Ｌｙｓ）がつながったＡｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓのアミノ酸配列を、トロンビンはロイシン残基−バリン残基−プロリン残基−アルギニン残基（Ｌｕｅ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ）のアミノ酸配列を、活性化血液凝固Ｘ因子はイソロイシン残基−グルタミン酸残基−グリシン残基−アルギニン残基（Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ）のアミノ酸配列を、ウロキナーゼはプロリン残基−グリシン残基−アルギニン残基（Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ）のアミノ酸配列を基質として認識し、それぞれの基質アミノ酸配列のカルボキシル末端側に結合したアミノ酸との間のペプチド結合を選択的に加水分解する。したがってこれらの基質アミノ酸配列のカルボキシル末端側に異種蛋白質のアミノ末端を結合させた場合には、対応するプロテアーゼで加水分解することにより、容易に異種蛋白質を切り出すことができる。
【００４７】
また例えば、ＨＲＶ ３Ｃプロテアーゼは、ロイシン残基−グルタミン酸残基−バリン残基−ロイシン残基−フェニルアラニン残基−グルタミン残基−グリシン残基−プロリン残基（Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ）からなる基質アミノ酸配列を認識し、その配列のＧｌｎとＧｌｙの間のペプチド結合を位置特異的に加水分解する。したがって、例えばＬｅｕ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏからなる基質アミノ酸配列のカルボキシル末端側に異種蛋白質のアミノ末端を結合させた場合には、ＨＲＶ ３Ｃプロテアーゼで加水分解することにより、アミノ末端にＧｌｙ−Ｐｒｏが付加した異種蛋白質が得られるが、本発明はこれらの異種蛋白質も包含するものである。
【００４８】
加水分解の位置特異性が高いプロテアーゼとその基質アミノ酸配列の組み合わせは、特にこれらに限定されるものではない。
【００４９】
さらに、本発明に用いるリンカーとして、上述の加水分解の位置特異性が高いプロテアーゼの基質アミノ酸配列のアミノ末端側及び／又はカルボキシル末端側に１残基以上のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなるリンカーを用いてもよく、基質アミノ酸配列の少なくともカルボキシル末端側に１残基以上のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなるリンカーを用いた場合には、対応するプロテアーゼで加水分解すると、少なくとも１残基以上のアミノ酸がアミノ末端に付加した異種蛋白質が得られるが、本発明はこれらの異種蛋白質も包含するものである。
【００５０】
また、複数種類のプロテアーゼの基質となるアミノ酸配列からなるリンカーを用いる場合には、異種蛋白質のアミノ末端に最も近い基質アミノ酸配列を対応するプロテアーゼで加水分解すればよく、その結果、１残基以上のアミノ酸がアミノ末端に付加した異種蛋白質が得られる場合であっても、本発明はこれらの異種蛋白質を包含するものである。
【００５１】
基質アミノ酸配列のカルボキシル末端側にプロリンがあると加水分解が起こらない場合があり、使用するプロテアーゼの性質とその基質配列については、公知の文献等で調べてから用いることが望ましい。
【００５２】
プロテアーゼを用いた加水分解においては、使用するプロテアーゼ、本発明のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ融合蛋白質およびそれが加水分解されて生じる異種蛋白質が不溶化を起こさずに、該プロテアーゼが反応するように反応条件等を定めればよい。例えば、反応のｐＨは５から８、反応温度は４℃から４０℃から適宜選ばれた条件で行えばよく、本発明はこれらに限定されない。例えばアスパルティックプロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、チオールプロテアーゼ、あるいはそれらのプロテアーゼに分類されるプロテアーゼであり耐熱性を有するプロテアーゼなどを用いる場合にはそれに応じた反応条件を探して用いればよい。
【００５３】
また反応溶液への添加物の添加については、塩の種類（例えばナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩あるいはカルシウム塩など）とその濃度（例えば０Ｍから１Ｍ）、界面活性剤の種類（例えば、Ｔｗｅｅｎ２０（商品名）、Ｔｗｅｅｎ８０（商品名）、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（商品名）、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコシド、ｎ−オクチル−β−Ｄ−マンノシド、ｎ−デシル−β−Ｄ−マンノシドなど）とその濃度（例えば０％から１％）、還元剤の種類（例えばジチオスレイトール、メルカプトエタノール、グルタチオンなど）とその濃度（０ｍＭから１０ｍＭ）、変性剤の種類（例えば尿素、塩酸グアニジンなど）とその濃度（０Ｍから２Ｍ）など、あるいはそれらの組み合わせを、位置特異的な加水分解に使用するプロテアーゼ、本発明のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ融合蛋白質およびそれが位置特異的な加水分解されて生じる異種蛋白質が不溶化を起こさずに該プロテアーゼが反応するように定めればよい。
【００５４】
さらに具体的には、特異性が高いプロテアーゼとして、例えば、エンテロキナーゼを用いる場合には、Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓのアミノ酸配列からなるリンカーを有する、本発明のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ融合蛋白質（すなわちエンテロキナーゼの基質となる本発明のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ融合蛋白質）を、例えば、０．０２Ｍ〜０．１Ｍの濃度のトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）の溶液中で反応させればよい。また反応を行う溶液には、０．００１Ｍ〜０．０２Ｍ塩化カルシウム、及び／又は、１Ｍ以下の濃度の塩化ナトリウム、より好ましくは０．３Ｍ以下の濃度の塩化ナトリウム、及び／又は、界面活性剤、例えばＴｗｅｅｎ２０（商品名）を０．０１％〜０．２％濃度加えることもできる。
【００５５】
反応温度は４℃〜４０℃から適宜選ばれた温度で、反応時間は数分間〜数日間から適宜選ばれた時間で、エンテロキナーゼの基質となる本発明のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ融合蛋白質の蛋白質濃度とエンテロキナーゼの蛋白質濃度の比は、例えば、１：１０から１：１００００で行えばよい。
【００５６】
さらに、例えばニッケルキレート樹脂にアフィニティーがあるポリヒスチジン、Ｓ−プロテインにアフィニティーがあるＳ−ペプチド、あるいはｃ−ｍｙｃ抗体にアフィニティーがあるｃ−ｍｙｃペプチドなどのアフィニティーリガンドをリンカーにしてもよい。
【００５７】
Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼと異種蛋白質を連結するリンカーは、上記のような複数種類のリンカーを組み合わせて用いてもよい。
【００５８】
本発明のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ融合蛋白質をコードしたポリヌクレオチドは、通常の遺伝子工学の分野で使用される相応のプラスミドを用いれば種々の宿主で発現することが可能であるが、取扱い易さ、培養の容易性、高密度培養の可否、更には遺伝子操作における宿主／ベクター系が整備されている細菌、中でもエシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属細菌である大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）が好ましい。
【００５９】
本発明のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ融合蛋白質を発現するためのプラスミドは、例えばｐＴｒｃ９９a（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｕ１３８７２）、ｐＳＴＶ２８（商品名、（株）タカラバイオ社製）、ｐＣＤＦ−１ｂ、ｐＲＳＦ−１ｂ（以上は、商品名、メルク（株）社製）等のプラスミドを例示できる。
【００６０】
本発明のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ融合蛋白質を発現するためのプラスミドで形質転換させる大腸菌としては、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９、Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬＲ（ＤＥ３）などの菌株が例示できるが、本発明はこれらに限定されない。また本発明のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ融合蛋白質を発現するためのプラスミドで形質転換する前の大腸菌が薬剤耐性を有する大腸菌である場合には、本発明のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ融合蛋白質を発現するためのプラスミド上の薬剤耐性マーカー遺伝子は、宿主となる大腸菌の薬剤耐性とは異なるものを選択すればよい。またＴ７ＲＮＡポリメラーゼ融合蛋白質の発現にＴ７プロモーターを利用したプラスミドを使用する場合には、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬＲ（ＤＥ３）のようにＴ７ＲＮＡポリメラーゼの遺伝子をもち、それを発現する大腸菌を宿主にすればよい。
【００６１】
形質転換した大腸菌はプラスミドにコードされている薬剤耐性マーカー遺伝子に対応する薬剤を加えた寒天培地で培養して選別すればよい。
【００６２】
本発明のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ融合蛋白質をコードしたポリヌクレオチドを組み込んだ発現用プラスミドで形質転換した大腸菌は、宿主に用いた大腸菌を培養するための公知の培地、例えばＬＢ培地や２ｘＹＴ培地に、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ融合蛋白質をコードしたポリヌクレオチドを組み込んだ発現用プラスミド上の薬剤マーカー遺伝子に対応する薬剤を添加して培養すればよい。培養温度は１５℃から３７℃で実験的に定めればよい。本発明のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ融合蛋白質をコードしたポリヌクレオチドを組み込んだ発現用プラスミドで形質転換した大腸菌に、本発明のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ融合蛋白質を可溶性の蛋白質として発現させるためには、１５℃〜３７℃から適宜選ばれた温度、好ましくは２５℃〜３０℃から適宜選ばれた温度で培養を行うとよい。
【００６３】
本発明のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ融合蛋白質は、それをコードしたポリヌクレオチドを組み込んだ発現用プラスミドで形質転換した大腸菌を適切に培養して、増殖させ、必要に応じて適当な誘導剤を培地に加えて遺伝子発現を誘導しながら更に培養した後、その菌を集菌して凍結融解、リゾチーム消化処理、超音波処理あるいはそれらの組み合わせにより、菌を破砕すれば、可溶性画分に得ることができる。
【００６４】
可溶性画分に含まれる本発明のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ融合蛋白質は、イオン交換クロマトグラフィーやゲルろ過クロマトグラフィー用いて精製することができる。
【００６５】
また例えば、Ｓ−ペプチドタグを付加したＴ７ＲＮＡポリメラーゼ融合蛋白質であればＳ−プロテインを固定化した担体、例えば、Ｓ−プロテインアガロース（商品名、メルク社製）を用いて精製できる。
【００６６】
またポリヒスチジンからなるいわゆるヒスチジンタグが付加したＴ７ＲＮＡポリメラーゼ融合蛋白質の場合には、ニッケルイオンやコバルトイオンなどの金属イオンをキレートした樹脂、例えばＨｉｓ・Ｂｉｎｄ Ｒｅｓｉｎ（商品名、メルク社製）、Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（商品名、ＧＥヘルスケア バイオサイエンス社製）などを用いて精製することができる。
【００６７】
また本発明のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ融合蛋白質は、シバクロンブルー（Ｃｉｂａｃｒｏｎ Ｂｌｕｅ）をリガンドとして固定化した樹脂（シバクロンブルー固定化樹脂と称する）に吸着させることができる。シバクロンブルーには、Ｃｉｂａｃｒｏｎ Ｂｌｕｅ Ｆ３Ｇ−Ａ［１２２３６−８２−７］やＣｉｂａｃｒｏｎ Ｂｌｕｅ ３Ｇ−Ａ［８４１１６−１３−２］がある。
【００６８】
本発明のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ融合蛋白質のシバクロンブルー固定化樹脂への吸着は、ポリヌクレオチドの共存下では妨害されることから、本発明のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ融合蛋白質の溶液にポリヌクレオチドが混在する場合には予めポリヌクレオチドを除いておくことが望ましい。
【００６９】
例えばポリヌクレオチドを含んでいる本発明のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ融合蛋白質溶液のポリヌクレオチドは、塩類の共存下でポリエチレンイミンを添加することで沈殿させることができる。このとき加える塩類は、ポリエチレンイミンへのＴ７ＲＮＡポリメラーゼ融合蛋白質の吸着、及びポリエチレンイミンとの共沈を防ぐことができればよい。加える塩類は、例えば塩化ナトリウム、塩化カリウムあるいは硫安が例示でき、使用する濃度、及び、使用するポリエチレンイミンの濃度は、本発明のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ融合蛋白質が不溶化しない条件を実験して定めればよい。例えば塩濃度０．１Ｍから０．５Ｍ、ポリエチレンイミン濃度０．１％から１％で検討すればよい。
【００７０】
例えばＴ７ＲＮＡポリメラーゼ融合蛋白質を含んだ大腸菌破砕液で、菌密度 Ｏ．Ｄ．600が約３６の菌懸濁液から調製した破砕液の場合、０．２Ｍの硫安存在下でポリエチレンイミンを濃度１ｍｇ／ｍＬになるようを加えて、氷冷下で、３０分間から６０分間インキュベーションしたのちに、遠心分離して沈殿を除けばよい。
【００７１】
除核酸の方法はこれに限定されず、公知のいかなる方法を利用してもよい。
【００７２】
本発明のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ融合蛋白質を吸着するシバクロンブルー固定化樹脂としてはＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＡＦ−Ｂｌｕｅ ＨＣ−６５０Ｍ（商品名、東ソ−社）やＢｌｕｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（商品名、ＧＥヘルスケア社）が例示できる。
【００７３】
本発明のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ融合蛋白質で、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼと異種蛋白質との間に位置特異的な加水分解が可能な配列、例えば、プロテアーゼの基質アミノ配列を有する場合には、対応するプロテアーゼで加水分解したのちに、シバクロンブルー固定化樹脂を用いて精製を行えばよい。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを含んだポリペプチドはシバクロンブルー固定化樹脂に吸着するため、この樹脂に吸着しない異種蛋白質を、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを含んだポリペプチドや、未消化の融合蛋白質と分離することができる。
【００７４】
例えばエンテロキナーゼの基質となるアミノ酸配列である、Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ配列をリンカーにもつ本発明の融合蛋白質の場合には、その融合蛋白質を、エンテロキナーゼを用いて、カルボキシル末端側にＡｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ配列を有するＴ７ＲＮＡポリメラーゼと、異種蛋白質とに加水分解したのちに、例えば、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＡＦ−Ｂｌｕｅ ＨＣ−６５０Ｍ（商品名、東ソ−社）を用いて精製を行えばよい。このとき、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを含んだポリペプチドはＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＡＦ−Ｂｌｕｅ ＨＣ−６５０Ｍに吸着する。異種蛋白質が樹脂に吸着した場合であっても、０Ｍから２Ｍ塩化ナトリウムの塩濃度勾配で溶出を行って、カルボキシル末端側にＡｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ配列を有するＴ７ＲＮＡポリメラーゼとの分離を検討して、分離可能であれば精製に採用すればよい。
【００７５】
また、例えばＡｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ配列をリンカーにもち、異種蛋白質のカルボキシル末端にポリヒスチジンタグを付加した本発明の融合蛋白質であれば、エンテロキナーゼを用いて加水分解したのち、シバクロンブルー固定化樹脂で精製し、さらに、例えばニッケルキレート樹脂を用いた精製を行えば、カルボキシル末端にポリヒスチジンタグが付加した異種蛋白質を精製することができる。
【００７６】
また必要があればリンカーの加水分解に用いたプロテアーゼに結合する、プロテアーゼインヒビターあるいは抗体を、固定化した樹脂を利用して、使用したプロテアーゼを除去してもよい。
【００７７】
また融合した異種蛋白質に対する抗体やアフィニティーリガンドを固定化した樹脂があればそれを利用して異種蛋白質を精製してもよい。
また上記の精製方法を組み合わせて行ってもよい。
【００７８】
以下に本発明を更に詳細に説明するために実施例を示すが、これら実施例は本発明の一例を示すものであり、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００７９】
実施例１ プラスミドｐＣＤＦ２０−ＥＰＯｂｐｆ４０の作製
Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ（配列番号１）のカルボキシル末端に、ヒトエリスロポエチンレセプター（配列番号２）の１位から２２５位までからなるポリペプチドを連結した融合蛋白質（ＥＰＯｂｐｆ４０、配列番号７、図１参照）をコードしたポリヌクレオチド（配列番号８）をコードした、プラスミドｐＣＤＦ２０−ＥＰＯｂｐｆ４０（図３）を作製した。
【００８０】
まず特許文献２に記載のプラスミドｐＣＤＦ２−Ｔ７ＲＰを制限酵素ＸｂａIで消化して得た５．９ｋｂｐの直鎖ＤＮＡを、ＤＮＡ Ｂｌｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ（商品名、タカラバイオ社製）を用いてＤＮＡの末端を平滑化したのち、ＤＮＡリガーゼを用いてライゲーションして環化して、制限酵素ＸｂａIサイトを含まない、５．９ｋｂｐのプラスミドｐＣＤＦ２０−Ｔ７ＲＰを作製した。そのプラスミドを鋳型にして、配列番号１１と配列番号１２のプライマーをプライマーセットにしてＰＣＲを行い、０．１ｋｂｐのＤＮＡ（ＤＮＡ−１と称する）を得た。
【００８１】
プラスミドｐＣＤＦ２０−Ｔ７ＲＰを制限酵素ＢｌｎＩで消化後、ウシ小腸アルカリホスファターゼで脱リン酸化処理して得られた直鎖状ＤＮＡを、さらに制限酵素ＭｆｅＩで消化して、５．８ｋｂｐのＤＮＡ（ＤＮＡ−２と称する）を得た。一方、ヒトエリスロポエチンレセプターｃＤＮＡをコードしたプラスミド（ＯｒｉＧｅｎｅ社製、品番ＳＣ１２５４４０）を鋳型にして、配列番号１３と配列番号１４のプライマーセットを用いてＰＣＲを行い、０．７ｋｂｐのＤＮＡを合成し、そのＤＮＡを制限酵素ＭｆｅＩとＸｂａＩで二重消化して得た０．７ｋｂｐのＤＮＡ（ＤＮＡ−３と称する）を得た。
【００８２】
得られたＤＮＡ−２とＤＮＡ−３を、ＤＮＡリガーゼを用いてライゲーションして環化させ、プラスミドｐＣＤＦ２０−ＥＰＯｂｐｆ２Ｈを調製した。
【００８３】
プラスミドｐＣＤＦ２０−ＥＰＯｂｐｆ２Ｈは、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの１位メチオニンから８５９位アスパラギン酸までのアミノ酸配列に続き、Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓの４残基を介して、配列番号２に示したヒトエリスロポエチンレセプターの１位アラニンから２２５位アスパラギン酸までと、それに続けて６個のヒスチジンを連結した融合蛋白質（ＥＰＯｂｐｆ２Ｈ、配列番号９、図２参照）をコードしたポリヌクレオチド（配列番号１０）をコードしたプラスミドである。
【００８４】
そのｐＣＤＦ２ＤＦ２０−ＥＰＯｂｐｆ２ＨとＤＮＡ−１（０．１ｋｂｐ）のセットを鋳型にして、配列番号１１と配列番号１３のプライマーをプライマーセットにしてＰＣＲを行い、０．８ｋｂｐのＤＮＡを得た。そのＤＮＡを制限酵素ＭｆｅＩ、ついで制限酵素ＸｂａＩで消化して０．８ｋｂｐのＤＮＡ（ＤＮＡ−４と称する）を得た。
【００８５】
そのＤＮＡ−４を、プラスミドｐＣＤＦ２０−Ｔ７ＲＰを制限酵素ＢｌｎＩ消化後、ウシ小腸アルカリホスファターゼで脱リン酸化処理して得られた直鎖状ＤＮＡを、さらに制限酵素ＭｆｅＩで消化して得た５．８ｋｂｐのＤＮＡ（ＤＮＡ−５と称する）と、ライゲーションして環化させ、プラスミドを調製した。
【００８６】
そのプラスミドにより大腸菌ＨＢ１０１を形質転換し、５０μｇ／ｍＬ カルベニシリンナトリウム、５ｇ／Ｌ 酵母エキス、１０ｇ／Ｌ トリプトン及び１０ｇ／Ｌ 塩化ナトリウムを含む２０ｇ／Ｌ 寒天の固体培地（ＬＢ／Ｃａｒｂ寒天培地と称する）で培養して、目的のプラスミドを有する大腸菌ＨＢ１０１／ｐＣＤＦ２０−ＥＰＯｂｐｆ４０を得た。
【００８７】
実施例２ 融合蛋白質ＥＰＯｂｐｆ４０の調製
大腸菌ＨＢ１０１／ｐＣＤＦ２０−ＥＰＯｂｐｆ４０を、５０ｍｇ／Ｌ カルベニシリンナトリウム、１０ｇ／Ｌ 酵母エキス、１６ｇ／Ｌ トリプトン、５ｇ／Ｌ 塩化ナトリウムを含む培地（２ｘＹＴ／Ｃａｒｂ培地と称する）に植菌して２５℃で１６時間培養して、菌密度（Ｏ．Ｄ．600）が６．８の培養液、０．１２Ｌを得た。
【００８８】
その培養液から大腸菌ＨＢ１０１／ｐＣＤＦ２０−ＥＰＯｂｐｆ４０を、遠心分離して集菌したのち、０．００１Ｍ エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含む０．０５Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁したのち、遠心分離して菌を洗浄後、菌密度（Ｏ．Ｄ．600）の値がおよそ３６になるように、０．１ｍｇ／ｍＬ 卵白リゾチーム、０．０００１Ｍ ４−（アミノエチル）ベンゼンスルオニルフルオリド、０．０００１Ｍ フェニルメタンスルオニルフルオリド、１％（Ｖ／Ｖ） ジメチルスルホキシド及び０．００１Ｍ ＥＤＴＡを含む０．０５Ｍ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に、菌を懸濁した。その懸濁液を０℃で１時間インキュベーションしたのち、１／５００容量の０．５Ｍ ジチオスレイトールを混合して、−８０℃で凍結した。それを解凍後、超音波破砕機に供したのち、破砕して得た液を遠心分離して可溶性画分を得た。
【００８９】
実施例３ シバクロンブルー固定化樹脂を用いた融合蛋白質ＥＰＯｂｐｆ４０の精製
実施例２と同様にして得られた可溶性画分をカートリッジフィルター（ポアサイズ０．２μｍ）で滅菌ろ過したのち、そのろ液に１／１０容量の０．２２Ｍ 硫安水溶液を混合し、その混合液の１／５０容量の５０ｍｇ／ｍＬ ポリエチレンイミン水溶液を混合した。それを０℃で１時間インキュベーションしたのち、遠心分離して不溶化した核酸を除去して可溶性画分を得て、それを０．３Ｍ 塩化ナトリウムを含む０．０２Ｍ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）（平衡化緩衝液１と称する）中で４℃、一晩透析した。透析後に遠心分離をして可溶性画分を得て、それを滅菌ろ過してろ液２２．７ｍＬを得た。
【００９０】
その溶液の２０ｍＬを平衡化緩衝液１で平衡化したＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＡＦ−Ｂｌｕｅ ＨＣ−６５０Ｍ樹脂を４ｍＬ充填したカラムにロードした。その樹脂を、平衡化緩衝液１を１回あたり８ｍＬロードして３回洗浄したのち、２Ｍ 塩化ナトリウムを含む０．０２Ｍ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）で吸着画分を溶出し、フラクションサイズ２ｍＬで分取した。
【００９１】
得られた画分のそれぞれを等容量の２０ｍｇ／ｍＬ ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、４０ｍｇ／ｍＬ ２−メルカプトエタノール、５７０ｍｇ／ｍＬ グリセリン及び１ｍｇ／ｍＬ ブロモフェノールブルーを含む０．２５Ｍ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ６．８）（ＳＤＳサンプル緩衝液と称する）を加えて９８℃で５分間加熱してＳＤＳ化したのち、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で分析した。
【００９２】
図４は、レーン１と１４に分子量マーカー蛋白質（上から順に１７５ｋＤａ、８０ｋＤａ、５８ｋＤａ、４６ｋＤａ、３０ｋＤａ、２５ｋＤａ）、大腸菌ＨＢ１０１／ｐＣＤＦ２０−Ｔ７ＲＰ（実施例１参照）のライセート（レーン２；サイズ比較試料）、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＡＦ−Ｂｌｕｅ ＨＣ−６５０Ｍ樹脂による分画前の試料（レーン３）、樹脂を素通りした画分（レーン４）、樹脂を洗浄して得た画分（レーン５、６及び７）、樹脂に吸着した画分を溶出して得た画分（溶出した順に、レーン８から１３）を電気泳動したのち、Ｃｏｏｍａｓｉｅ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｂｌｕｅ Ｒ−２５０で染色（ＣＢＢ染色と称する）して蛋白質を検出した結果である。
【００９３】
図４のレーン９と１０にアローヘッド（黒三角）が指し示すＥＰＯｂｐｆ４０（分子量１２４ｋＤａ）が検出され、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＡＦ−Ｂｌｕｅ ＨＣ−６５０Ｍ樹脂に吸着したことがわかる。
【００９４】
得られた画分の蛋白質濃度をγ−グロブリンを標準蛋白質に用いて、プロテインアッセイ（商品名、バイオラッド社）で比色定量した結果、分画した試料全量１５９ｍｇ（１００％）に対して、樹脂を素通りした画分と樹脂を洗浄して得た画分を合わせた量の不純蛋白質８７ｍｇ（５５％）を除去した、ＥＰＯｂｐｆ４０を含んだ画分３５ｍｇ（２２％）を得ることができた。
【００９５】
実施例４ プラスミドｐＣＤＦ２０−ＥＰＯｂｐｆ４０Ｈの作製
Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ（配列番号１）のカルボキシル末端にヒトエリスロポエチンレセプター（配列番号２）の１位から２２５位までからなるポリペプチドを連結し、それに続けて６個のヒスチジンを連結した融合蛋白質をコードした配列（ＥＰＯｂｐｆ４０Ｈ、配列番号１５、図１参照）からなるポリヌクレオチド（配列番号１６）をコードした、プラスミドｐＣＤＦ２０−ＥＰＯｂｐｆ４０Ｈ（図５）を作製した。
【００９６】
プラスミドｐＣＤＦ２０−ＥＰＯｂｐｆ２Ｈと実施例１のＤＮＡ−１（０．１ｋｂｐ）のセットを鋳型にして、配列番号１１と配列番号１７のプライマーをプライマーセットにしてＰＣＲを行い、０．８ｋｂｐのＤＮＡを得た。そのＤＮＡを制限酵素ＭｆｅＩ、ついで制限酵素ＢｌｎＩで消化して０．８ｋｂｐのＤＮＡ（ＤＮＡ−６と称する）を得た。ついでＤＮＡ−６を実施例１のＤＮＡ−５とライゲーションして環化させ、プラスミドを調製した。
【００９７】
そのプラスミドにより大腸菌ＨＢ１０１を形質転換し、ＬＢ／Ｃａｒｂ寒天培地で培養して、目的のプラスミドを有する大腸菌ＨＢ１０１／ｐＣＤＦ２０−ＥＰＯｂｐｆ４０Ｈを得た。
【００９８】
実施例５ 融合蛋白質ＥＰＯｂｐｆ４０Ｈの精製
実施例２と同様にして大腸菌ＨＢ１０１／ｐＣＤＦ２０−ＥＰＯｂｐｆ４０Ｈを培養し菌密度（Ｏ．Ｄ．600）が６．６の培養液、０．１２Ｌを得た。その培養液から得た大腸菌から、実施例２と同様にして、可溶性画分を得た。
【００９９】
その可溶性画分（ＥＰＯｂｐｆ４０Ｈを含んでいる画分）を、カートリッジフィルター（ポアサイズ０．２μｍ）で滅菌ろ過したのち、１／１０容量の０．２２Ｍ 硫安水溶液を混合したのち、その混合液の１／４９容量の５０ｍｇ／ｍＬ ポリエチレンイミン水溶液を混合した。それを０℃で１時間インキュベーションしたのち、遠心分離して可溶性画分を得た。それを０．３Ｍ 塩化ナトリウムを含んだ０．０２Ｍ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）中で、４℃で一晩透析したのち、１／１９容量の１Ｍ イミダゾール水溶液を添加した。その溶液を０．０５Ｍ イミダゾール及び０．３Ｍ 塩化ナトリウムを含んだ０．０２Ｍ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）（平衡化緩衝液２と称する）で平衡化したニッケルキレート樹脂（Ｈｉｓ・Ｂｉｎｄ Ｒｅｓｉｎ、商品名、メルク社製）を２ｍＬ充填したカラムにロードしたのち、５ｍＬの平衡化緩衝液２をロードして樹脂を洗い込み、素通り画分としてプールした。その樹脂をさらに１５ｍＬの平衡化緩衝液２を ロードして洗浄したのち、０．２Ｍ イミダゾール及び０．３Ｍ 塩化ナトリウムを含んだ０．０２Ｍ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）で、フラクションサイズ１ｍＬで吸着画分を溶出して分取した。
【０１００】
図６は、レーン１と１１は分子量マーカー蛋白質、ニッケルキレート樹脂による分画前の試料（レーン２）、樹脂を素通りした画分（レーン３）、樹脂を洗浄して得た画分（レーン４）、樹脂に吸着した画分を溶出して得た画分（溶出した順に、レーン５から１０）を電気泳動したのち、ＣＢＢ染色をして蛋白質を検出した結果である。ＥＰＯｂｐｆ４０Ｈはレーン６から９に検出され、レーン２の試料に比べて精製されたことがわかる。
【０１０１】
ニッケルキレート樹脂に吸着したＥＰＯｂｐｆ４０Ｈ（分子量１２４ｋＤａ）の画分の蛋白質濃度は、γ−グロブリンを標準蛋白質に用いてプロテインアッセイで比色定量した。
【０１０２】
本実施例で得られたＥＰＯｂｐｆ４０Ｈは２．０ｍｇであった。
【０１０３】
実施例６ プラスミドｐＣＤＦ２０−ＥＰＯｂｐｆ５０Ｈの作製
Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ（配列番号１）のカルボキシル末端に、Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓの６残基を介して、ヒトエリスロポエチンレセプター（配列番号２）の１位から２２５位までからなるポリペプチドを連結し、それに続けて６個のヒスチジンを連結した融合蛋白質（ＥＰＯｂｐｆ５０Ｈ、配列番号１８、図１参照）をコードしたポリヌクレオチド（配列番号１９）をコードした、プラスミドｐＣＤＦ２０−ＥＰＯｂｐｆ５０Ｈ（図７）を作製した。
【０１０４】
プラスミドｐＣＤＦ２０−Ｔ７ＲＰを鋳型にして、配列番号１１と配列番号２０のプライマーをプライマーセットにしてＰＣＲを行い０．１ｋｂｐのＤＮＡ（ＤＮＡ−７と称する）を得た。
【０１０５】
プラスミドｐＣＤＦ２０−ＥＰＯｂｐｆ２Ｈを鋳型にして、配列番号１７のプライマーと上記ＤＮＡ−７をプライマーセットとして用いてＰＣＲを行い、０．８ｋｂｐのＤＮＡを得た。そのＤＮＡを制限酵素ＭｆｅＩ、ついで制限酵素ＢｌｎＩで消化して０．８ｋｂｐのＤＮＡ（ＤＮＡ−８と称する）を得た。
【０１０６】
ＤＮＡ−８を実施例１のＤＮＡ−５とライゲーションして環化させ、プラスミドを調製した。
【０１０７】
そのプラスミドにより大腸菌ＨＢ１０１を形質転換し、ＬＢ／Ｃａｒｂ寒天培地で培養して、目的のプラスミドを有する大腸菌ＨＢ１０１／ｐＣＤＦ２０−ＥＰＯｂｐｆ５０Ｈを得た。
【０１０８】
実施例７ 融合蛋白質ＥＰＯｂｐｆ５０Ｈの精製
実施例２と同様にして大腸菌ＨＢ１０１／ｐＣＤＦ２０−ＥＰＯｂｐｆ５０Ｈを培養し菌密度（Ｏ．Ｄ．600）が６．６の培養液、０．１２Ｌを得た。その培養液から得た大腸菌から、実施例２と同様にして、ただし、ジチオスレイトールは使用せずに可溶性画分を得た。
【０１０９】
その可溶性画分（ＥＰＯｂｐｆ５０Ｈを含んでいる画分）を、実施例５と同様にしてニッケルキレート樹脂を用いて精製した。
【０１１０】
図８のレーン１と１１は分子量マーカー蛋白質、ニッケルキレート樹脂による分画前の試料（レーン２）、樹脂を素通りした画分（レーン３）、樹脂を洗浄して得た画分（レーン４）、樹脂に吸着した画分を溶出して得た画分（溶出した順に、レーン５から１０）を電気泳動したのち、ＣＢＢ染色をして蛋白質を検出した結果であり、図中のアローヘッドが指し示すレーン６と７に電気泳動した画分がＥＰＯｂｐｆ５０Ｈを多く含んでいた。
【０１１１】
ニッケルキレート樹脂に吸着したＥＰＯｂｐｆ５０Ｈ（分子量１２５ｋＤａ）の画分の蛋白質濃度をγ−グロブリンを標準蛋白質に用いてプロテインアッセイで比色定量した。
【０１１２】
本実施例で得られたＥＰＯｂｐｆ５０Ｈは１ｍｇであった。
【０１１３】
実施例８ エンテロキナーゼによる融合蛋白質ＥＰＯｂｐｆ５０Ｈの加水分解
実施例７と同様にして得られた可溶性画分（ＥＰＯｂｐｆ５０Ｈを含んでいる画分）をカートリッジフィルター（ポアサイズ０．２μｍ）で滅菌ろ過したのち、そのろ液９ｍＬにエンテロキナーゼ（Ｅｎｔｅｒｏｋｉｎａｓｅ，ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ、商品名、ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢｉｏＬａｂｓ社）３６ｎｇを加えて、２５℃で１８時間インキュベーションした。
【０１１４】
実施例９ ＥＰＯｂｐＨの精製
融合蛋白質ＥＰＯｂｐｆ５０Ｈをエンテロキナーゼで加水分解し、すなわち配列番号１８の８８９位と８９０位の間で加水分解して生じた、配列番号１８の８９０位から１１２０位の配列からなるポリペプチド、すなわち、ヒトエリスロポエチンレセプターの１位アラニンから２２５位グルタミン酸にヒスチジン６残基が付加したポリペプチド（ＥＰＯｂｐＨと称する）を以下のように精製した。
【０１１５】
実施例８のエンテロキナーゼを加えてインキュベーションした可溶性画分に、１／１０容量の０．２２Ｍ 硫安水溶液を混合したのち、その混合液の１／５０容量の５０ｍｇ／ｍＬ ポリエチレンイミン水溶液を混合した。それを０℃で１時間インキュベーションしたのち、遠心分離して不溶化した核酸を除去して可溶性画分を得て、それを平衡化緩衝液１中で４℃、一晩透析した。その透析後に遠心分離をして可溶性画分を得た。
【０１１６】
その可溶性画分９ｍＬを平衡化緩衝液１で平衡化したＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＡＦ−Ｂｌｕｅ ＨＣ−６５０Ｍ樹脂を１．８ｍＬ充填したカラムにロードし、カラム非吸着画分を得た。その画分の総蛋白質量は１７．２ｍｇであった。
【０１１７】
そのカラム非吸着画分に１／１９容量の１Ｍ イミダゾール水溶液を添加したのち、平衡化緩衝液２で平衡化したニッケルキレート樹脂（Ｈｉｓ・Ｂｉｎｄ Ｒｅｓｉｎ）を２ｍＬ充填したカラムにロードした。その樹脂を、平衡化緩衝液２を１０ｍＬロードして洗浄したのち、０．２Ｍ イミダゾール及び０．３Ｍ 塩化ナトリウムを含む０．０２Ｍ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）で吸着画分を溶出し、フラクションサイズ１ｍＬで分取した。
【０１１８】
実施例１０ ＥＰＯｂｐＨの分析
実施例９で得た画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供したのち、１０％（Ｖ／Ｖ） メタノールを含んだ０．０１Ｍ シクロヘキシルアミノプロピパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ１１）（ＣＡＰＳ緩衝液と称する）中で電気泳動して、ＰＶＤＦ膜に転写した。その膜を０．１５Ｍ 塩化ナトリウム及び０．５ｍｇ／ｍＬ Ｔｗｅｅｎ２０を含んだ０．０５Ｍ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）（ＴＢＳ−Ｔと称する）で調製した５ｍｇ／ｍＬ ウシ血清アルブミン溶液（ＢＳＡ／ＴＢＳ−Ｔ溶液と称する）でブロッキングしたのち、ウエスタンブロッティングを行い、抗ヒトエリスロポエチンレセプター抗体を用いて検出した。
【０１１９】
ウエスタンブロッティングの手順はまずブロッキングした膜を、１μｇ／ｍＬ マウス抗ヒトエリスロポエチン抗体を含むＢＳＡ／ＴＢＳ−Ｔ溶液中に浸漬して、室温で１時間振とうしたのち、ＴＢＳ―Ｔで洗浄して、Ｂ／Ｆ分離した。次にその膜を濃度が１μｇ／ｍＬの、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識されたヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体を含むＢＳＡ／ＴＢＳ−Ｔ溶液中に浸漬して、室温で１時間振とうしたのち、Ｂ／Ｆ分離した。次にその膜に結合したＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体のＨＲＰ活性を、０．１％ 過酸化水素及び５ｍＭ ４−クロロナフトール含む２４．３ｍＭクエン酸−５１．４ｍＭリン酸水素二ナトリウム緩衝液（ｐＨ５）を基質溶液として用いて室温で２０分間呈色反応を行って、ＥＰＯｂｐｆ５０ＨおよびＥＰＯｂｐＨの検出を行った。
【０１２０】
図９はＳＤＳ−ＰＡＧＥ、図１０はウエスタンブロッティングの結果である。
【０１２１】
それぞれのレーン１と１５は分子量マーカー蛋白質、レーン２は、エンテロキナーゼ処理前の可溶性画分、レーン３はエンテロキナーゼ処理後の可溶性画分、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＡＦ−Ｂｌｕｅ ＨＣ−６５０Ｍ樹脂のカラム非吸着画分（レーン４）、実施例３と同様に洗浄して得られた全画分（レーン５）、及び実施例３と同様に得られた吸着した画分（溶出順にレーン６から９）、ニッケルキレート樹脂にロードした画分（レーン１０；レーン４と同じ画分）、ニッケルキレート樹脂のカラム非吸着画分（レーン１１）及び吸着した画分（溶出順にレーン１２から１４）であり、図９と１０の結果からレーン１３と１４に精製されたＥＰＯｂｐＨがあることがわかる。
【０１２２】
蛋白質濃度をγ−グロブリンを標準蛋白質に用いて、プロテインアッセイで比色定量した結果、得られたＥＰＯｂｐＨは０．２９ｍｇであった。
【０１２３】
実施例１１ ＥＰＯｂｐＨ結合樹脂へのヒトエリスロポエチンの吸着
大腸菌ＨＢ１０１／ｐＣＤＦ２０−ＥＰＯｂｐｆ５０Ｈを培養し菌密度（Ｏ．Ｄ．600）が５．３の培養液、０．５Ｌから得た菌から、実施例９と同様にしてＥＰＯｂｐＨの画分（総蛋白質量１ｍｇ）を得た。そのＥＰＯｂｐＨの溶液（２．８ｍＬ）を０．２Ｍ イミダゾール及び０．３Ｍ 塩化ナトリウムを含む０．０２Ｍ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化したＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＡＦ−Ｂｌｕｅ ＨＣ−６５０Ｍ樹脂を０．２ｍＬ充填したカラムにロードし、カラム非吸着画分にＥＰＯｂｐＨは０．４ｍｇを得た。
【０１２４】
そのＥＰＯｂｐＨ（０．２４ｍｇ）溶液の緩衝液組成を、０．０５Ｍ イミダゾール及び０．３Ｍ 塩化ナトリウムを含む０．０２Ｍ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）に調整したのち、ニッケルキレート樹脂を０．１ｍＬ充填したカラムにロードした。その樹脂を、２０ｍＬの平衡化緩衝液２で洗浄した。その樹脂に０．２５ｍｇ／ｍＬに調製したＣＨＯ細胞由来リコンビナント・ヒトエリスロポエチン（メルク社製）を０．２ｍＬロードしたのち、同組成の緩衝液１０ｍＬで樹脂を洗浄した。そののち、８Ｍ 尿素、０．２Ｍイミダゾール及び０．３Ｍ 塩化ナトリウムを含む０．０２Ｍ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）、５ｍＬで溶出を行った。カラムへの通液は流速を０．１ｍＬ／ｍｉｎで行った。
【０１２５】
なお同様の操作を、ＥＰＯｂｐＨを結合していない樹脂を用いて行った場合にはＣＨＯ細胞由来リコンビナント・ヒトエリスロポエチンは樹脂に吸着しなかった。
【０１２６】
ＥＰＯｂｐＨを結合した樹脂を用いて得られたフラクション（分画サイズ１ｍＬ）は、エンザイムイムノアッセイを行って分析した。
【０１２７】
エンザイムイムノアッセイは、９６穴イムノプレートに４μｇ／ｍＬウサギ抗エリスロポエチンポリクローナル抗体を、０．０５Ｍ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を１ウエルあたり１００μＬ加えて、４℃で１８時間インキュベーションしたのち、ＴＢＳ−ＴでリンスしてＢ／Ｆ分離し、ついでＢＳＡ／ＴＢＳ−Ｔを１ウエルあたり２００μＬ加えて、３０℃で２時間インキュベーションしてブロッキングしてから行った。
【０１２８】
ブロッキングしたプレートはＴＢＳ−ＴでリンスしてＢ／Ｆ分離したのち、ＢＳＡ／ＴＢＳ−Ｔで希釈して調製した試料を１ウエルあたり１００μＬ加えて、３０℃で１時間インキュベーションしたのち、Ｂ／Ｆ分離した。次いで０．８μｇ／ｍＬビオチン標識抗エリスロポエチンモノクローナル抗体を１ウエルあたり１００μＬ加えて、３０℃で１時間インキュベーションしたのち、Ｂ／Ｆ分離し、さらに０．６μｇ／ｍＬ ＨＲＰ標識ストレプトアビジンを１ウエルあたり１００μＬ加えて、３０℃で３０分間インキュベーションした。
【０１２９】
それをＢ／Ｆ分離したのち、ＴＭＢ Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（２−Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ）（製品名、Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ＆ Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を１ウエルあたり１００μＬ加えて３７℃で２０分間反応し、それに１Ｍリン酸水溶液を１ウエルあたり５０μＬ加えて反応停止後、波長４５０ｎｍの吸光度（Ｏ．Ｄ．４５０）を測定した。
【０１３０】
分析の結果、ＥＰＯｂｐＨを結合した樹脂を素通りした画分にＣＨＯ細胞由来リコンビナント・ヒトエリスロポエチンは約３５μｇ検出されたが、８Ｍ 尿素、０．２Ｍ イミダゾール及び０．３Ｍ 塩化ナトリウムを含む０．０２Ｍ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）で溶出した画分に約１５μｇが検出され、樹脂上のＥＰＯｂｐＨにＣＨＯ細胞由来リコンビナント・ヒトエリスロポエチンが吸着したことがわかった。
【０１３１】
実施例１２ プラスミドｐＣＤＦ２０−ＥＰＯｂｐｆ５０の作製
Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ（配列番号１）のカルボキシル末端に、Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓの６残基を介して、ヒトエリスロポエチンレセプター（配列番号２）の１位から２２５位までからなるポリペプチドを連結した融合蛋白質（ＥＰＯｂｐｆ５０、配列番号２１、図１参照）をコードしたポリヌクレオチド（配列番号２２）をコードした、プラスミドｐＣＤＦ２０−ＥＰＯｂｐｆ５０（図１１）を作製した。
【０１３２】
プラスミドｐＣＤＦ２０−ＥＰＯｂｐｆ５０Ｈを、制限酵素ＭｆｅＩついでＥｃｏＲＶで消化し０．４ｋｂｐのＤＮＡ（ＤＮＡ−９と称する）得た。
【０１３３】
一方プラスミドｐＣＤＦ２０−ＥＰＯｂｐｆ４０を、制限酵素ＭｆｅＩついでＥｃｏＲＶで消化して６．２ｋｂｐのＤＮＡ（ＤＮＡ−１０と称する）を得た。
【０１３４】
ＤＮＡ−９を上記のＤＮＡ−１０とライゲーションして環化させ、プラスミドを調製した。
【０１３５】
そのプラスミドにより大腸菌ＨＢ１０１を形質転換し、ＬＢ／Ｃａｒｂ寒天培地で培養して、目的のプラスミドを有する大腸菌ＨＢ１０１／ｐＣＤＦ２０−ＥＰＯｂｐｆ５０を得た。
【０１３６】
実施例１３ プラスミドｐＣＤＦ２０−ＥＰＯｂｐｆ６０Ｈの作製
Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ（配列番号１）のカルボキシル末端に、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｒｇの５残基を介してヒトエリスロポエチンレセプター（配列番号２）の１位から２２５位までからなるポリペプチドを連結し、それに続けて６個のヒスチジンを連結した融合蛋白質（ＥＰＯｂｐｆ６０Ｈ、配列番号２３、図１参照）をコードしたポリヌクレオチド（配列番号２４）をコードした、プラスミドｐＣＤＦ２０−ＥＰＯｂｐｆ６０Ｈ（図１２）を作製した。
【０１３７】
まず実施例６のプラスミドｐＣＤＦ２０−ＥＰＯｂｐ５０Ｈを鋳型にして、配列番号１７と配列番号２５のプライマーをプライマーセットにしてＰＣＲを行い、０．７ｋｂｐのＤＮＡを得た。そのＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩで消化して０．７ｋｂｐのＤＮＡ（ＤＮＡ−１１と称する）を得た。
【０１３８】
一方、プラスミドｐＣＤＦ２０−Ｔ７ＲＰを鋳型にして、配列番号１１と配列番号２６のプライマーをプライマーセットにしてＰＣＲを行い、０．１ｋｂｐのＤＮＡを得た。そのＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩで消化して０．１ｋｂｐのＤＮＡ（ＤＮＡ−１２と称する）を得た。
【０１３９】
ＤＮＡ−１１とＤＮＡ−１２をライゲーションしたのち、配列番号１１と配列番号１７のプライマーをプライマーセットにしてＰＣＲを行い、０．８ｋｂｐのＤＮＡを得た。そのＤＮＡを制限酵素ＭｆｅＩ、ついで制限酵素ＢｌｎＩで消化して０．８ｋｂｐのＤＮＡ（ＤＮＡ−１３）を得た。
【０１４０】
ＤＮＡ−１３を実施例１のＤＮＡ−５とライゲーションして環化させ、プラスミドを調製した。
【０１４１】
そのプラスミドにより大腸菌ＨＢ１０１を形質転換し、ＬＢ／Ｃａｒｂ寒天培地で培養して、目的のプラスミドｐＣＤＦ２０−ＥＰＯｂｐｆ６０Ｈを有する大腸菌ＨＢ１０１／ｐＣＤＦ２０−ＥＰＯｂｐｆ６０Ｈを得た。
【０１４２】
実施例１４ 融合蛋白質ＥＰＯｂｐｆ６０Ｈの発現
大腸菌ＨＢ１０１／ｐＣＤＦ２０−ＥＰＯｂｐｆ６０Ｈを２ｘＹＴ／Ｃａｒｂ培地に植菌して、３０℃で一晩、培養した。その培養液を２つに分け、その一方に濃度が０．１ｍＭになるようにＩＰＴＧを添加し、それぞれを２５℃で２時間培養した。
【０１４３】
得られた菌体を０．００１Ｍ ＥＤＴＡを含む０．０５Ｍ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）でリンスしたのち、同組成の緩衝液にＯ．Ｄ．600が１０になるように再懸濁し、同容量のＳＤＳサンプル緩衝液を加えて９８℃で５分間加熱してＳＤＳ化したのち、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。
【０１４４】
図１３のレーン１は分子量マーカー蛋白質、ＥＰＯｂｐｆ５０Ｈ（比較試料、レーン２、ＩＰＴＧなし）、ＥＰＯｂｐｆ５０Ｈ（比較試料、レーン３、ＩＰＴＧあり）、ＥＰＯｂｐｆ６０Ｈ（レーン４、ＩＰＴＧなし）、ＥＰＯｂｐｆ６０Ｈ（レーン５、ＩＰＴＧあり）であり、レーン４と５にＥＰＯｂｐｆ６０Ｈ（１２５ｋＤａ）がＩＰＴＧの添加の有無によらず発現していることがわかる。
【０１４５】
実施例１５ 融合蛋白質ＥＰＯｂｐｆ６０Ｈの精製
実施例２と同様にして大腸菌ＨＢ１０１／ｐＣＤＦ２０−ＥＰＯｂｐｆ６０Ｈを培養し菌密度（Ｏ．Ｄ．600）が４．８の培養液、約１Ｌを得た。
その培養液から得た大腸菌（湿菌体重量４．６ｇ）から、実施例２と同様にして、可溶性画分を得た。
その可溶画分を平衡化緩衝液１中で、４℃で一晩透析したのち、イミダゾールを終濃度０．０５Ｍになるように添加した。
その溶液（ＥＰＯｂｐｆ６０Ｈの溶液）を２回にわけて、以下のように精製した。
平衡化緩衝液２（実施例５参照）で平衡化したニッケルキレート樹脂（Ｈｉｓ・Ｂｉｎｄ Ｒｅｓｉｎ、商品名、メルク社製）１０ｍＬを充填したカラムに、ＥＰＯｂｐｆ６０Ｈの溶液をロードしたのち、５０ｍＬの平衡化緩衝液２で洗浄したのち、０．２Ｍ イミダゾール及び０．３Ｍ塩化ナトリウムを含む０．０２Ｍ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）で、フラクションサイズ５ｍＬで吸着画分を溶出して分取した。
吸着画分の蛋白質濃度をγ−グロブリンを標準蛋白質に用いて、プロテインアッセイで比色定量した結果、得られたＥＰＯｂｐｆ６０Ｈの合計量は６８．８ｍｇであった。
【０１４６】
実施例１６ プラスミドｐＣＤＦ２０−ＥＰＯｆ６０の作製
Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ（配列番号１）のカルボキシル末端に、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｒｇの５残基を介して、エリスロポエチン（配列番号３）を連結した融合蛋白質（ＥＰＯｆ６０、配列番号２７、図１４）をコードしたポリヌクレオチド（配列番号２８）をコードした、プラスミドｐＣＤＦ２０−ＥＰＯｆ６０（図１５）を作製した。
【０１４７】
まず、配列番号３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７及び４８のプライマーセットを用いてＰＣＲで増幅した、０．３４ｋｂｐのＤＮＡを制限酵素ＭｆｅＩとＰｓｔＩで二重消化したＤＮＡ（ＤＮＡ−１４と称する）を得た。
【０１４８】
またプライマー配列番号４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９及び６０のプライマーセットを用いてＰＣＲで増幅した、０．２５ｋｂｐのＤＮＡを制限酵素ＰｓｔＩとＢｌｎＩで二重消化したＤＮＡ（ＤＮＡ−１５と称する）を得た。実施例１に記載のＤＮＡ−５と、ＤＮＡ−１４およびＤＮＡ−１５を、ＤＮＡリガーゼを用いてライゲーションして環化させ、プラスミドｐＣＤＦ２０−ＥＰＯｆ２を作製した。
【０１４９】
プラスミドｐＣＤＦ２０−ＥＰＯｆ２は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ（配列番号１）の１位メチオニンから８５９位アスパラギン酸までのアミノ酸配列に続き、Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓの４残基を介して、配列番号３に示したヒトエリスロポエチンの１位アラニンから１６６位アルギニンまでを連結した融合蛋白質（ＥＰＯｂｐｆ２、配列番号２９、図２参照）をコードしたポリヌクレオチド（配列番号３０）をコードした、プラスミドである。
【０１５０】
プラスミドｐＣＤＦ２０−ＥＰＯｆ２鋳型にして、配列番号６０と配列番号６１のプライマーセットを用いてＰＣＲを行い、０．５ｋｂｐのＤＮＡを得て、そのＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩで消化して０．５ｋｂｐのＤＮＡ（ＤＮＡ−１６と称する）を得た。
【０１５１】
実施例１３のＤＮＡ−１２と、ＤＮＡ−１６をライゲーションしたのち、配列番号１１と配列番号６０のプライマーセットにしてＰＣＲを行い、０．６ｋｂｐのＤＮＡを得た。そのＤＮＡを制限酵素ＭｆｅＩ、ついで制限酵素ＢｌｎＩで消化して０．６ｋｂｐのＤＮＡ（ＤＮＡ−１７と称する）を得た。
【０１５２】
ＤＮＡ−１７を実施例１のＤＮＡ−５とライゲーションして環化させ、プラスミドを調製した。
【０１５３】
そのプラスミドにより大腸菌ＨＢ１０１を形質転換し、ＬＢ／Ｃａｒｂ寒天培地で培養して、目的のプラスミドを有する大腸菌ＨＢ１０１／ｐＣＤＦ２０−ＥＰＯｆ６０を得た。
【０１５４】
実施例１７ 融合蛋白質ＥＰＯｆ６０の発現
大腸菌ＨＢ１０１／ｐＣＤＦ２０−ＥＰＯｆ６０を２ｘＹＴ／Ｃａｒｂ培地に植菌して、３０℃で一晩、培養した。その培養液を２つに分け、その一方に濃度が０．１ｍＭになるようにイソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）を添加し、それぞれを２５℃で２時間培養した。
【０１５５】
得られた菌体を０．００１Ｍ ＥＤＴＡを含む０．０５Ｍ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）でリンスしたのち、同組成の緩衝液に菌密度がＯ．Ｄ．600で１０になるように再懸濁し、同容量のＳＤＳサンプル緩衝液を加えて９８℃で５分間加熱してＳＤＳ化したのち、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。
【０１５６】
図１６のレーン１は分子量マーカー蛋白質、レーン２はＥＰＯｆ６０（ＩＰＴＧなし）、レーン３はＥＰＯｆ６０（ＩＰＴＧあり）である。レーン３の矢印が指し示す位置にＥＰＯｆ６０（１１８ｋＤａ）が発現していることがわかった。
【０１５７】
実施例１８ ウロキナーゼによる融合蛋白質ＥＰＯｆ６０の加水分解
大腸菌ＨＢ１０１／ｐＣＤＦ２０−ＥＰＯｆ６０を菌密度がＯ．Ｄ．600で０．２になるように２ｘＹＴ／Ｃａｒｂ培地に植菌して、３７℃で３時間培養したのち、０．１ｍＭの濃度になるようにＩＰＴＧを加えて、さらに２５℃で３時間培養した。
【０１５８】
得られた菌体を０．００１Ｍ ＥＤＴＡを含む０．０５Ｍ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）でリンスしたのち、０．１ｍｇ／ｍＬ 卵白リゾチーム、０．００１Ｍ ＥＤＴＡを含む０．０５Ｍ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）にＯ．Ｄ．600が３６になるように再懸濁し、氷冷下で１時間インキュベーションしたのち、−８０℃に凍結した。それを解凍したのち、超音波破砕し、ついで遠心分離して上清を得た。それをカートリッジフィルター（ポアサイズ０．２μｍ）で滅菌ろ過して、そのろ液を可溶性画分とした。その可溶性画分２００μＬに、０．３ｍｇ／ｍＬ 天然型ウロキナーゼ（特開昭６２−１４３６８６に記載の天然型プロウロキナーゼ様ポリペプチドを活性化した酵素）あるいは、０．３ｍｇ／ｍｌ 変異型ウロキナーゼ（特開昭６２−１４３６８６に記載の変異体（Ｑ１３５Ｄ１５７）プロウロキナーゼ様ポリペプチドを活性化した酵素）を、５０μＬ加えて、４℃でインキュベーションした。
【０１５９】
４℃で６８時間インキュベーションした液の一部を、それぞれ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供したのち、ＣＡＰＳ緩衝液中で電気泳動して、ＰＶＤＦ膜に転写した。その膜をＢＳＡ／ＴＢＳ−Ｔ溶液中でブロッキングしたのち、ウエスタンブロッティング分析を行い、抗ヒトエリスロポエチン抗体を用いて検出した。
【０１６０】
ウエスタンブロッティングの手順は、まずブロッキングした膜を、０．５μｇ／ｍＬ ビオチン標識マウス抗ヒトエリスロポエチン抗体を含むＢＳＡ／ＴＢＳ−Ｔ溶液中に浸漬して、室温で１時間振とうしたのち、ＴＢＳ−Ｔで洗浄してＢ／Ｆ分離した。次にその膜を０．６μｇ／ｍＬ 西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識ストレプトアビジンを含むＢＳＡ／ＴＢＳ−Ｔ溶液中に浸漬して、室温で１時間振とうしたのち、Ｂ／Ｆ分離した。次にその膜に結合したＨＲＰ標識ストレプトアビジンのＨＲＰ活性を、０．１％ 過酸化水素及び５ｍＭ ４−クロロナフトールを含む２４．３ｍＭ クエン酸−５１．４ｍＭ リン酸水素二ナトリウム緩衝液（ｐＨ５）を基質溶液として用いて室温で２０分間呈色反応を行って検出し、エリスロポエチンの検出を行った。
【０１６１】
図１７のレーン１は６８時間インキュベーションした大腸菌ＨＢ１０１／ｐＣＤＦ２０-ＥＰＯｆ６０の可溶性画分（ウロキナーゼなし）、レーン２は天然型ウロキナーゼを加えて６８時間インキュベーションした大腸菌ＨＢ１０１／ｐＣＤＦ２０-ＥＰＯｆ６０の可溶性画分、レーン３は変異型ウロキナーゼを加えて６８時間インキュベーションした大腸菌ＨＢ１０１／ｐＣＤＦ２０-ＥＰＯｆ６０の可溶性画分をそれぞれ分析した結果である。矢印で示した位置にエリスロポエチン（１８ｋＤａ）が検出された。
【０１６２】
実施例１９ プラスミドｐＣＤＦ２０−ＦｃＢＰｆ５１Ｈの作製
Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ（配列番号１）のカルボキシル末端に、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓの７残基を介して、抗体レセプター（ＦｃγＲＩ）（配列番号４）の１位から２７４位までからなるポリペプチドを連結し、それに続けて６個のヒスチジンを連結した融合蛋白質（ＦｃＢＰｆ５１Ｈ、配列番号６２、図１８）をコードしたポリヌクレオチド（配列番号６３）をコードした、プラスミドｐＣＤＦ２０−ＦｃＢＰｆ５１Ｈ（図１９）を作製した。
【０１６３】
まず、第一段階目のＰＣＲを、特開２００８−２４５５８０に記載のプラスミドｐＥＣＦｃＲを鋳型にして、配列番号６４と配列番号６５のプライマーセットを用いて行い、０．８ｋｂｐのＤＮＡ（ＤＮＡ−１８と称する）を得た。
【０１６４】
次に第二段階目のＰＣＲを、プラスミドｐＥＣＦｃＲを鋳型にして、ＤＮＡ−１８と配列番号６６のプライマーセットを用いて行い、０．９ｋｂｐのＤＮＡ（ＤＮＡ−１９と称する）を得た。
【０１６５】
次に第三段階目のＰＣＲを、ＤＮＡ−１９を鋳型にして、配列番号６４と配列番号６７のプライマーセットを用いて行い、０．９ｋｂｐのＤＮＡを得て、それを制限酵素ＢａｍＨＩで消化して０．９ｋｂｐのＤＮＡ（ＤＮＡ−２０と称する）を得た。
【０１６６】
そのＤＮＡ−２０を、プラスミドｐＣＤＦ２０−ＥＰＯｂｐｆ６０Ｈを制限酵素ＮａｅＩとＢａｍＨＩで消化して得た６．１ｋｂｐのＤＮＡ（ＤＮＡ−２１と称する）とライゲーションして環化させ、プラスミドを調製した。
【０１６７】
そのプラスミドにより大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、ＬＢ／Ｃａｒｂ寒天培地で培養して、目的のプラスミドを有する大腸菌ＪＭ１０９／ｐＣＤＦ２０−ＦｃＢＰｆ５１Ｈを得た。
【０１６８】
実施例２０ ＦｃＢＰｆ５１Ｈの調製
大腸菌ＪＭ１０９／ｐＣＤＦ２０−ＦｃＢＰｆ５１Ｈを２ｘＹＴ／Ｃａｒｂ培地に植菌して２８℃で１５時間培養して、菌密度（Ｏ．Ｄ．600）が８．３の培養液、０．１２Ｌを得た。
【０１６９】
その培養液から大腸菌ＪＭ１０９／ｐＣＤＦ２０−ＦｃＢＰｆ５１Ｈを、遠心分離して集菌したのち、０．００１Ｍ ＥＤＴＡを含む０．０５Ｍ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、２５ｍＬに懸濁したのち、遠心分離して菌を洗浄した。次にその菌を０．０５Ｍ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、２５ｍＬで洗浄した。
【０１７０】
その菌を菌密度（Ｏ．Ｄ．600）の値がおよそ７２になるように、０．２ｍｇ／ｍＬ 卵白リゾチ−ム、０．０５Ｍ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に、菌を懸濁した。その懸濁液を０℃で１時間インキュベーションしたのち、−８０℃で凍結した。それを解凍後、超音波破砕機に供したのち、破砕して得た液を遠心分離して可溶性画分を得た。
【０１７１】
得られた可溶性画分をカートリッジフィルター（ポアサイズ０．２μｍ）で滅菌ろ過したのち、そのろ液１２．４ｍＬに１／５９容量の３Ｍ イミダゾール（ｐＨ６）を混合した。
【０１７２】
その液の１２．４ｍＬを、０．０５Ｍ イミダゾール及び０．３Ｍ 塩化ナトリウムを含む０．０５Ｍ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）（平衡化緩衝液３と称する）で平衡化したニッケルキレート樹脂（Ｈｉｓ・Ｂｉｎｄ Ｒｅｓｉｎ、商品名、メルク社製）を４ｍＬ充填したカラムにロードしたのち、４ｍＬの平衡化緩衝液３で樹脂を洗い込み、素通り画分としてプールした。その樹脂をさらに１６ｍＬの平衡化緩衝液３で洗浄したのち、０．２Ｍ イミダゾール及び０．３Ｍ 塩化ナトリウムを含む０．０５Ｍ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で、フラクションサイズ２ｍＬで吸着画分を溶出して分取し、フラクションは実施例３と同様にしてＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。
【０１７３】
図２０のレーン１は分子量マーカー蛋白質、レーン２はニッケルキレート樹脂による分画前の可溶性画分、レーン３は素通り画分、レーン４から８は０．２Ｍイミダゾール及び０．３Ｍ 塩化ナトリウムを含む０．０５Ｍ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で溶出された画分であり、レーン６の、矢印で示された位置にＦｃＢＰｆ５１Ｈ（分子量１３１ｋＤａ）が検出された。
【０１７４】
実施例２１ エンテロキナーゼを用いて加水分解したＦｃＢＰｆ５１Ｈ
実施例２０で得たＦｃＢＰｆ５１Ｈを含んだフラクションを、０．２Ｍ 塩化ナトリウムを含む０．０５Ｍ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）中で透析した。透析後のＦｃＢＰｆ５１Ｈ溶液を、γ−グロブリンを標準蛋白質に用いて、プロテインアッセイ（商品名、バイオラッド社）で比色定量して定めた。そのＦｃＢＰｆ５１Ｈ溶液（０．２４ｍｇ／ｍＬ）に、１／５００容量の１Ｍ 塩化カルシウムを加えたのち、それぞれの溶液に含まれる蛋白質量（重量）の１／１００００重量のエンテロキナーゼを添加して４℃でインキュベーションした。
【０１７５】
インキュベート１８時間後、６４時間後、１１２時間後に一部をサンプリングし、反応の阻害剤として、１／２００容量の０．０２Ｍ Ｎ−α−Ｔｏｓｙｌ−Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ ｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈｙｌ ｋｅｔｏｎｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅを混合した。
【０１７６】
それぞれの溶液の一部はウエスタンブロッティングとエンザイムイムノアッセイで分析した。
【０１７７】
ウエスタンブロッティングには、ＨＲＰ標識ウサギａｎｔｉ−６−Ｈｉｓ（Ｂｅｔｈｙｌ社製）を用いた。
【０１７８】
エンザイムイムノアッセイは、９６穴イムノプレートに１０μｇ／ｍＬ ヒト免疫グロブリン（ガンマグロブリン）（製品名、財団法人化学及血清療法研究所製）、０．０５Ｍ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を１ウエルあたり１００μＬ加えて、４℃で１８時間インキュベーションしたのち、ＴＢＳ−ＴでリンスしてＢ／Ｆ分離し、ついでＢＳＡ／ＴＢＳ−Ｔを１ウエルあたり２００μＬ加えて、３０℃で２時間ンキュベーションしてブロッキングしてから行った。
【０１７９】
ブロッキングしたプレートはＴＢＳ−ＴでリンスしてＢ／Ｆ分離したのち、ＢＳＡ／ＴＢＳ−Ｔで希釈して調製した試料を１ウエルあたり１００μＬ加えて、３０℃で１時間インキュベーションしたのち、Ｂ／Ｆ分離し、ついでＢＳＡ／ＴＢＳ−Ｔで５０００倍希釈したＨＲＰ標識抗６ｘＨｉｓ抗体（Ｂｅｔｈｙｌ社製）を１ウエルあたり１００μＬ加えて、３０℃で１時間インキュベーションした。それをＢ／Ｆ分離したのち、ＴＭＢ Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（２−Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ）（製品名、Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ＆ Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を１ウエルあたり１００μＬ加えて室温で３０分間反応し、それに１Ｍリン酸水溶液を１ウエルあたり５０μＬ加えて反応停止後、波長４５０ｎｍの吸光度（Ｏ．Ｄ．450）を測定した。
【０１８０】
図２１のウエスタンブロテッィングのレーン１は分子量マーカー蛋白質であり、レーン２から５の試料はエンテロキナーゼを添加せず、レーン６から８はエンテロキナーゼを添加した試料で、レーン２はインキュベーションする前、レーン３と６はインキュベーション１８時間後、レーン４と７はインキュベーション６４時間後、レーン５と８はインキュベーション１１２時間後の試料を分析した結果である。
【０１８１】
図２１に示したようにエンテロキナーゼを加えて１１２時間の試料（レーン８）にはＦｃＢＰｆ５１Ｈほとんどなくなっていた。またエンテロキナーゼを加えた試料では基質となるアミノ酸配列で加水分解されてＴ７ＲＮＡポリメラーゼの部分が除かれたと考えられる生成物（蛋白質）のバンドを検出した。
【０１８２】
一方、図２２に示したように、エンテロキナーゼを加えずに６４時間インキュベーションしたＦｃＢＰｆ５１Ｈ（６４ｈ−）と、エンテロキナーゼを加えずに１１２時間インキュベーションしたＦｃＢＰｆ５１Ｈ（１１２ｈ−）の結果から、融合蛋白質はその濃度に依存してヒトイムノグロブリンに吸着することがわかった。
【０１８３】
また図２２のエンテロキナーゼを加えて６４時間インキュベーションしたＦｃＢＰｆ５１Ｈ（６４ｈ＋）と、エンテロキナーゼを加えて１１２時間インキュベーションしたＦｃＢＰｆ５１Ｈ（１１２ｈ＋）の結果から、エンテロキナーゼで加水分解されＴ７ＲＮＡポリメラーゼの部分が除かれた蛋白質も、濃度に依存してヒトイムノグロブリンに吸着することがわかった。
【０１８４】
実施例２２ プラスミドｐＣＤＦ２０−ｈＧＨｂｐｆ５１Ｈの作製
Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ（配列番号１）のカルボキシル末端に、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓの７残基を介して、ヒト成長ホルモンレセプター（配列番号５）の１位から２３８位までからなるポリペプチドを連結し、それに続けて６個のヒスチジンを連結した融合蛋白質（ｈＧＨｂｐｆ５１Ｈ、配列番号６８、図２３）をコードしたポリヌクレオチド（配列番号６９）をコードした、プラスミドｐＣＤＦ２０−ｈＧＨｂｐｆ５１Ｈ（図２４）を作製した。
【０１８５】
まず、第一段階目のＰＣＲを、特願２００９−０２５９０１に記載のプラスミドｐＥＴ−ｈＧＨｂｐ２５８を鋳型にして、配列番号７０と配列番号７１のプライマーセットを用いてＰＣＲを行い、０．７ｋｂｐのＤＮＡ（ＤＮＡ−２２と称する）を得た。
【０１８６】
次に第二段階目のＰＣＲを、ＤＮＡ−２２を鋳型にして、配列番号７１と配列番号７２のプライマーセットを用いて行い、０．８ｋｂｐのＤＮＡを得て、それを制限酵素ＢｇｌＩＩとＢｌｎＩで消化して０．８ｋｂｐのＤＮＡ（ＤＮＡ−２３と称する）を得た。そのＤＮＡ−２３を、プラスミドｐＣＤＦ２０−ＥＰＯｂｐｆ６０Ｈを制限酵素ＢａｍＨＩとＢｌｎＩで消化して得た５．９ｋｂｐのＤＮＡとライゲーションして環化させ、プラスミドを調製した。
【０１８７】
そのプラスミドにより大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、ＬＢ／Ｃａｒｂ寒天培地で培養して、目的のプラスミドを有する大腸菌ＪＭ１０９／ｐＣＤＦ２０−ｈＧＨｂｐｆ５１Ｈを得た。
【０１８８】
実施例２３ ヒト成長ホルモンへの融合蛋白質ｈＧＨｂｐｆ５１Ｈの吸着
大腸菌ＪＭ１０９／ｐＣＤＦ２０−ｈＧＨｂｐｆ５１Ｈを２ｘＹＴ／Ｃａｒｂ培地に植菌して２８℃で１６時間培養して、菌密度（Ｏ．Ｄ．600）が４．２の培養液を１０ｍＬ得た。
【０１８９】
その培養液から大腸菌ＪＭ１０９／ｐＣＤＦ２０−ｈＧＨｂｐｆ５１Ｈを、遠心分離して集菌した。得られた菌を１ｍＬの０．００１Ｍ ＥＤＴＡを含む０．０５Ｍ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁したのち、遠心分離して菌を洗浄した。次にその菌を１ｍＬの０．０５Ｍ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で洗浄した。その菌を菌密度（Ｏ．Ｄ．600）の値が３６になるように、０．１ｍｇ／ｍＬ 卵白リゾチ−ム、０．０５Ｍ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に、菌を懸濁した。その懸濁液を０℃で３０分間インキュベーションしたのち、−８０℃で凍結した。それを解凍後、超音波破砕機に供したのち、破砕して得た液を遠心分離して可溶性画分を得た。
【０１９０】
その可溶性画分に含まれるｈＧＨｂｐｆ５１Ｈがヒト成長ホルモンに吸着することを、エンザイムイムノアッセイを行って調べた。
【０１９１】
エンザイムイムノアッセイは、９６穴イムノプレートに１μｇ／ｍＬ ヒト成長ホルモンを、０．０５Ｍ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を１ウエルあたり１００μＬ加えて、４℃で１８時間インキュベーションしたのち、ＴＢＳ−ＴでリンスしてＢ／Ｆ分離し、ついでＢＳＡ／ＴＢＳ−Ｔを１ウエルあたり２００μＬ加えて、３０℃で２時間インキュベーションしてブロッキングしてから行った。
【０１９２】
ブロッキングしたプレートはＴＢＳ−ＴでリンスしてＢ／Ｆ分離したのち、ＢＳＡ／ＴＢＳ−Ｔで希釈して調製した試料を１ウエルあたり１００μＬ加えて、３０℃で１時間インキュベーションしたのち、Ｂ／Ｆ分離した。次いで０．５μｇ／ｍＬ マウス抗ヒト成長ホルモンレセプター抗体（ＩｇＧ２ｂ）を１ウエルあたり１００μＬ加えて、３０℃で１時間インキュベーションしたのち、Ｂ／Ｆ分離し、さらに０．２５μｇ／ｍＬ ＨＲＰ標識ウサギ抗マウスＩｇＧ２ｂ抗体を１ウエルあたり１００μＬ加えて、３０℃で１時間インキュベーションした。それをＢ／Ｆ分離したのち、ＴＭＢ Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（２−Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ）（製品名、Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ＆ Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を１ウエルあたり１００μＬ加えて室温で９０秒間反応し、それに１Ｍ リン酸水溶液を１ウエルあたり５０μＬ加えて反応停止後、波長４５０ｎｍの吸光度（Ｏ．Ｄ．４５０）を測定した。
【０１９３】
図２５に示したようにｈＧＨｂｐｆ５１Ｈの濃度に依存してヒト成長ホルモンに吸着することがわかった。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で示したＴ７ＲＮＡポリメラーゼのカルボキシル末端に、直接に、または１残基以上のアミノ酸からなるリンカーを介して、異種蛋白質を融合したＴ７ＲＮＡポリメラーゼ融合蛋白質。
【請求項２】
異種蛋白質が、脊椎動物由来のポリペプチド、あるいは脊椎動物由来のポリペプチドの１残基以上のアミノ酸を、他のアミノ酸に置換、及び／又は欠失、及び／又は付加したポリペプチドであることを特徴とする請求項１に記載のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ融合蛋白質。
【請求項３】
前記異種蛋白質が、蛋白質精製用の付加配列からなるペプチドを含む、請求項1又は２に記載のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ融合蛋白質。
【請求項４】
前記蛋白質精製用の付加配列からなるペプチドが、ポリヒスチジン、Ｓ−ペプチド、及びｃ−ｍｙｃペプチドからなる群から選ばれる、請求項３に記載のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ融合蛋白質。
【請求項５】
脊椎動物由来のポリペプチドが、配列番号２で示したヒトエリスロポエチンレセプターの１位から２２５位からなるポリペプチド、配列番号３で示したヒトエリスロポエチン、配列番号４で示したＦｃγＲＩの１位から２７４位からなるポリペプチド又は配列番号５で示したヒト成長ホルモンレセプターの１位から２３８位からなるポリペプチドのいずれかである請求項１から４のいずれかに記載のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ融合蛋白質。
【請求項６】
リンカーが、１種類以上のプロテアーゼの基質となるアミノ酸配列を有するリンカーであることを特徴とする請求項１から５のいずれかに記載のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ融合蛋白質。
【請求項７】
プロテアーゼが、エンテロキナーゼ、トロンビン、活性化血液凝固Ｘ因子、ウロキナーゼ又はＨＲＶ ３Ｃプロテアーゼである請求項６に記載のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ融合蛋白質。
【請求項８】
リンカーが、エンテロキナーゼ、トロンビン、活性化血液凝固Ｘ因子、ウロキナーゼ又はＨＲＶ ３Ｃプロテアーゼのいずれかの基質となるアミノ酸配列を有するリンカーであることを特徴とする請求項１から５のいずれかに記載のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ融合蛋白質。
【請求項９】
プロテアーゼの基質となるアミノ酸配列が、Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ、Ｌｕｅ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ、Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ、Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ又はＬｅｕ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏである請求項６に記載のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ融合蛋白質。
【請求項１０】
リンカーが、Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ、Ｌｕｅ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ、Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ、Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ又はＬｅｕ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏのいずれかのアミノ酸配列を有するリンカーであることを特徴とする請求項１から５のいずれかに記載のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ融合蛋白質。
【請求項１１】
請求項１から１０のいずれかに記載のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ融合蛋白質をコードしたポリヌクレオチド。
【請求項１２】
請求項１から１０のいずれかに記載のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ融合蛋白質を生産するＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属の細菌。
【請求項１３】
請求項１から１０のいずれかに記載のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ融合蛋白質をプロテアーゼで加水分解することを特徴とする異種蛋白質の製造方法。
【請求項１４】
プロテアーゼがエンテロキナーゼ、トロンビン、活性化血液凝固Ｘ因子、ウロキナーゼ又はＨＲＶ ３Ｃプロテアーゼである請求項１３に記載の製造方法。
【請求項１５】
Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ融合蛋白質を、請求項１２に記載のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属の細菌を使用して製造することを特徴とする請求項１３または１４に記載の異種蛋白質の製造方法。
【請求項１６】
シバクロンブルー固定化樹脂を用いることを特徴とする請求項１５に記載の製造方法。
【請求項１７】
請求項１から１０のいずれかに記載のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ融合蛋白質又は請求項１から８のいずれかに記載のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ融合蛋白質をプロテアーゼで加水分解して生じた異種蛋白質を、シバクロンブルー固定化樹脂を用いて分離することを特徴とする請求項１３〜１６のいずれかに記載の異種蛋白質の製造方法。
【請求項１】
配列番号１で示したＴ７ＲＮＡポリメラーゼのカルボキシル末端に、直接に、または１残基以上のアミノ酸からなるリンカーを介して、異種蛋白質を融合したＴ７ＲＮＡポリメラーゼ融合蛋白質。
【請求項２】
異種蛋白質が、脊椎動物由来のポリペプチド、あるいは脊椎動物由来のポリペプチドの１残基以上のアミノ酸を、他のアミノ酸に置換、及び／又は欠失、及び／又は付加したポリペプチドであることを特徴とする請求項１に記載のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ融合蛋白質。
【請求項３】
前記異種蛋白質が、蛋白質精製用の付加配列からなるペプチドを含む、請求項1又は２に記載のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ融合蛋白質。
【請求項４】
前記蛋白質精製用の付加配列からなるペプチドが、ポリヒスチジン、Ｓ−ペプチド、及びｃ−ｍｙｃペプチドからなる群から選ばれる、請求項３に記載のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ融合蛋白質。
【請求項５】
脊椎動物由来のポリペプチドが、配列番号２で示したヒトエリスロポエチンレセプターの１位から２２５位からなるポリペプチド、配列番号３で示したヒトエリスロポエチン、配列番号４で示したＦｃγＲＩの１位から２７４位からなるポリペプチド又は配列番号５で示したヒト成長ホルモンレセプターの１位から２３８位からなるポリペプチドのいずれかである請求項１から４のいずれかに記載のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ融合蛋白質。
【請求項６】
リンカーが、１種類以上のプロテアーゼの基質となるアミノ酸配列を有するリンカーであることを特徴とする請求項１から５のいずれかに記載のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ融合蛋白質。
【請求項７】
プロテアーゼが、エンテロキナーゼ、トロンビン、活性化血液凝固Ｘ因子、ウロキナーゼ又はＨＲＶ ３Ｃプロテアーゼである請求項６に記載のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ融合蛋白質。
【請求項８】
リンカーが、エンテロキナーゼ、トロンビン、活性化血液凝固Ｘ因子、ウロキナーゼ又はＨＲＶ ３Ｃプロテアーゼのいずれかの基質となるアミノ酸配列を有するリンカーであることを特徴とする請求項１から５のいずれかに記載のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ融合蛋白質。
【請求項９】
プロテアーゼの基質となるアミノ酸配列が、Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ、Ｌｕｅ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ、Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ、Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ又はＬｅｕ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏである請求項６に記載のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ融合蛋白質。
【請求項１０】
リンカーが、Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ、Ｌｕｅ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ、Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ、Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ又はＬｅｕ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏのいずれかのアミノ酸配列を有するリンカーであることを特徴とする請求項１から５のいずれかに記載のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ融合蛋白質。
【請求項１１】
請求項１から１０のいずれかに記載のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ融合蛋白質をコードしたポリヌクレオチド。
【請求項１２】
請求項１から１０のいずれかに記載のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ融合蛋白質を生産するＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属の細菌。
【請求項１３】
請求項１から１０のいずれかに記載のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ融合蛋白質をプロテアーゼで加水分解することを特徴とする異種蛋白質の製造方法。
【請求項１４】
プロテアーゼがエンテロキナーゼ、トロンビン、活性化血液凝固Ｘ因子、ウロキナーゼ又はＨＲＶ ３Ｃプロテアーゼである請求項１３に記載の製造方法。
【請求項１５】
Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ融合蛋白質を、請求項１２に記載のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属の細菌を使用して製造することを特徴とする請求項１３または１４に記載の異種蛋白質の製造方法。
【請求項１６】
シバクロンブルー固定化樹脂を用いることを特徴とする請求項１５に記載の製造方法。
【請求項１７】
請求項１から１０のいずれかに記載のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ融合蛋白質又は請求項１から８のいずれかに記載のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ融合蛋白質をプロテアーゼで加水分解して生じた異種蛋白質を、シバクロンブルー固定化樹脂を用いて分離することを特徴とする請求項１３〜１６のいずれかに記載の異種蛋白質の製造方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図５】
【図７】
【図１１】
【図１２】
【図１４】
【図１５】
【図１８】
【図１９】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図４】
【図６】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１３】
【図１６】
【図１７】
【図２０】
【図２１】
【図２】
【図３】
【図５】
【図７】
【図１１】
【図１２】
【図１４】
【図１５】
【図１８】
【図１９】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図４】
【図６】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１３】
【図１６】
【図１７】
【図２０】
【図２１】
【公開番号】特開２０１１−２２３９８２（Ｐ２０１１−２２３９８２Ａ）
【公開日】平成２３年１１月１０日（２０１１．１１．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−２９３８９８（Ｐ２０１０−２９３８９８）
【出願日】平成２２年１２月２８日（２０１０．１２．２８）
【出願人】（０００００３３００）東ソー株式会社 (1,901)
【出願人】（０００１７３７６２）公益財団法人相模中央化学研究所 (151)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年１１月１０日（２０１１．１１．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１２月２８日（２０１０．１２．２８）
【出願人】（０００００３３００）東ソー株式会社 (1,901)
【出願人】（０００１７３７６２）公益財団法人相模中央化学研究所 (151)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]