ＴＮＦ受容体の可溶性変異体
可溶性の腫瘍壊死因子受容体２（ＴＮＦＲＩＩ）変異体は、野生ＴＮＦＲＩＩと比較して９２位のＧｌｕにアミノ酸の置換を有する。該ＴＮＦＲＩＩ変異体の、ＴＮＦα及びリンホトキシンによる細胞毒性を中和する能力が改善される。該ＴＮＦＲＩＩ変異体及びこれを含む融合タンパク質は、ＴＮＦα及びリンホトキシン関連疾患の治療に有用である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオ医薬技術の分野に属し、具体的には、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体の誘導体及びその医薬における使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
腫瘍壊死因子スーパーファミリーのメンバーである腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）は、免疫応答、細胞アポトーシス、細胞分化などを調節する生物活性を有する。ＴＮＦαは２つの細胞内受容体、すなわちＴＮＦ受容体１（ＴＮＦＲｐ５５）及びＴＮＦ受容体２（ＴＮＦＲｐ７５）を有する。ＴＮＦαの過剰産生は、自己免疫疾患を引き起こす重要な原因である。現在、国際的に関節リウマチを治療するための主流のタンパク質類薬物は、ＴＮＦの生物学的機能を直接的に遮断するキメラ型抗体（インフリキシマブ；Ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ）及び可溶性ＴＮＦＲｐ７５：Ｆｃ融合タンパク質（エタネルセプト；Ｅｔａｎｅｒｃｅｐｔ）である。両者とも顕著な治療効果を示している。
【０００３】
エタネルセプトは、同時にＴＮＦα及びリンホトキシン（ＬＴ）に結合できるが、約２５〜５０ｍｇという比較的多くの臨床用量を必要とし、皮下注射により投与したときに、紅斑を引き起こす傾向がある。従って、高親和性でＴＮＦ及びリンホトキシンに結合できるＴＮＦＲｐ７５を開発し、次いで抗体薬物としてＴＮＦＲｐ７５：Ｆｃ融合タンパク質を開発することが非常に要求されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の目的の１つは、ＴＮＦα及び／又はリンホトキシンに対する高い中和活性を有する可溶性受容体を提供し、それによって、ＴＮＦαの中和に必要な可溶性受容体の用量を減らし、自己免疫疾患への治療効果を改善し、薬物の製造コストを下げることである。
【０００５】
本発明の別の目的は、より高い中和活性を有する可溶性受容体と、他のアミノ酸断片との間に形成される融合タンパク質を提供することである。
【０００６】
本発明のさらなる別の目的は、上記の可溶性受容体又は融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列を提供することである。
【０００７】
本発明のさらなる別の目的は、ＴＮＦα及び／又はリンホトキシンに対するより高い中和活性を有する可溶性受容体、又はその融合タンパク質の医薬における使用を提供することである。
【０００８】
本発明のさらなる別の目的は、上記の可溶性受容体又はその融合タンパク質を含む医薬組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の発明者等は、分子構造モデリングによりＴＮＦ受容体２、ＴＮＦα及びＬＴの構造について研究を重ね、ＴＮＦ受容体２の９２位アミノ酸が、ＴＮＦα及びＬＴとの結合に必須であることを見出した。次いで、本発明者等は合理的なデザインによって、アミノ酸９２位で点突然変異を生じさせ、ＴＮＦα及びリンホトキシンに対して高い中和活性を有する、ＴＮＦ受容体２の可溶性変異体を得た。
【００１０】
本発明の第１の態様では、野生型配列（配列番号１）のアミノ酸９２位で、アミノ酸の置換を有する可溶性ＴＮＦＲｐ７５変異体を開示する。これによって、ＴＮＦα及びリンホトキシンの細胞毒性に対する該変異体の中和活性は、野生型と比較して３０％より高く上昇する。
【００１１】
好ましい実施形態では、アミノ酸９２位のグルタミン酸（Ｅ）は、Ａｓｎ、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｌｙｓ又はＧｌｎのうちの１つによって置換される。すなわち、配列番号１に示す配列の９２位アミノ酸Ｅは、Ｎ、Ｈ、Ｓ、Ａ、Ｋ又はＱのそれぞれによって置換される。典型的な例は次の通りである。
【００１２】
ＴＮＦＲｐ７５（Ｅ９２Ｈ）変異体のアミノ酸配列は配列番号２に示し、９２位がヒスチジン（Ｈｉｓ）であり、Ｎ末端の１〜２２位アミノ酸がシグナルペプチドである。
【００１３】
ＴＮＦＲｐ７５（Ｅ９２Ａ）変異体のアミノ酸配列は配列番号３に示し、９２位がアラニン（Ａｌａ）であり、Ｎ末端の１〜２２位アミノ酸がシグナルペプチドである。
【００１４】
ＴＮＦＲｐ７５（Ｅ９２Ｎ）変異体のアミノ酸配列は配列番号４に示し、９２位がアスパラギン酸（Ａｓｎ）であり、Ｎ末端の１〜２２位アミノ酸がシグナルペプチドである。
【００１５】
ＴＮＦＲｐ７５（Ｅ９２Ｓ）変異体のアミノ酸配列は配列番号５に示し、９２位がセリン（Ｓｅｒ）であり、Ｎ末端の１〜２２位アミノ酸がシグナルペプチドである。
【００１６】
いくつかの好ましい実施形態では、９２位のＧｌｕ（Ｅ）の置換に加えて、８９位のトリプトファン（Ｔｒｐ）が、Ｔｒｙ、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ又はＬｅｕによってさらに置換される。典型的な例は次の通りである。
【００１７】
ＴＮＦＲｐ７５（Ｅ９２Ｎ、Ｗ８９Ｙ）変異体のアミノ酸配列は配列番号６に示し、８９位がチロシン（Ｔｒｙ）、９２位がアスパラギン酸（Ａｓｎ）であり、Ｎ末端の１〜２２位アミノ酸がシグナルペプチドである。
【００１８】
ＴＮＦＲｐ７５（Ｅ９２Ｓ、Ｗ８９Ｙ）変異体のアミノ酸配列は配列番号７に示し、８９位がチロシン（Ｔｒｙ）、９２位がセリン（Ｓｅｒ）であり、Ｎ末端の１〜２２位アミノ酸がシグナルペプチドである。
【００１９】
ＴＮＦＲｐ７５（Ｅ９２Ｎ、Ｗ８９Ｆ）変異体のアミノ酸配列は配列番号８に示し、８９位がフェニルアラニン（Ｐｈｅ）、９２位がアスパラギン酸（Ａｓｎ）であり、Ｎ末端の１〜２２位アミノ酸がシグナルペプチドである。
【００２０】
本発明の第２の態様では、可溶性ＴＮＦＲｐ７５変異体及び別のアミノ酸断片を含む融合タンパク質を開示する。前記別のアミノ酸断片はＴＮＦＲｐ７５変異体の安定性を高め、その生物学的半減期を改善するように働く。
【００２１】
前記別のアミノ酸断片は、ヒト免疫グロブリン（ＩｇＧ）の定常部（Ｆｃ）、又はアルブミンの５つの機能領域のうちの１つから選択される。
【００２２】
前記別のアミノ酸断片は、ＴＮＦＲｐ７５変異体のＣ末端に位置する。
【００２３】
好ましい実施形態では、前記別のアミノ酸断片は、ヒト免疫グロブリン（ＩｇＧ）の定常部（Ｆｃ）の２３２個アミノ酸である。融合タンパク質は、可溶性ＴＮＦＲｐ７５変異体とヒトＩｇＧのＣ末端にあるＦｃ断片の２３２個アミノ酸とによって形成され、両者の間に別の連結断片があってもなくてもよいが、別の連結断片がない方が好ましい。典型的な例は次の通りである。
配列番号９に示すＴＮＦＲｐ７５（Ｅ９２Ｈ）：Ｆｃ変異体アミノ酸配列、
配列番号１０に示すＴＮＦＲｐ７５（Ｅ９２Ａ）：Ｆｃ変異体アミノ酸配列、
配列番号１１に示すＴＮＦＲｐ７５（Ｅ９２Ｎ）：Ｆｃ変異体アミノ酸配列、
配列番号１２に示すＴＮＦＲｐ７５（Ｅ９２Ｓ）：Ｆｃ変異体アミノ酸配列、
配列番号１３に示すＴＮＦＲｐ７５（Ｅ９２Ｎ、Ｗ８９Ｙ）：Ｆｃ変異体アミノ酸配列、
配列番号１４に示すＴＮＦＲｐ７５（Ｅ９２Ｓ、Ｗ８９Ｙ）：Ｆｃ変異体アミノ酸配列、
配列番号１５に示すＴＮＦＲｐ７５（Ｅ９２Ｎ、Ｗ８９Ｆ）：Ｆｃ変異体アミノ酸配列。
【００２４】
本発明の第３の態様では、上記の可溶性受容体又は融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列を開示する。当技術分野ではよく知られているように、本発明による可溶性受容体又は融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列は、コドンの縮重及び異なる宿主細胞のコドンバイアスによって変わり得るが、これらのＤＮＡ配列によってコードされるアミノ酸配列が変化しない限り、これらのＤＮＡ配列も本発明の範囲内である。
【００２５】
本発明の第４の態様では、上記の可溶性ＴＮＦＲｐ７５変異体又はその融合タンパク質の医薬における使用、具体的には、関節リウマチ、乾癬、強皮症、シェーグレン症候群、強直性脊椎炎、エリテマトーデス、皮膚筋炎及び全身性エリテマトーデス様症候群が挙げられるがこれに限定されない、ＴＮＦα及び／又はリンホトキシンの過剰発現に関連する疾患の治療における使用を開示する。
【００２６】
本発明の第５の態様では、上記の可溶性ＴＮＦＲｐ７５変異体又はその融合タンパク質を含む医薬組成物を開示する。
【発明の効果】
【００２７】
本発明におけるＴＮＦＲｐ７５変異体及びその融合タンパク質は、ＴＮＦ及びリンホトキシンに対する増加した結合能を有する。例えば、ＴＮＦαに対する可溶性ＴＮＦＲｐ７５（Ｅ９２Ｎ）：Ｆｃの中和活性は、野生型可溶性ＴＮＦＲｐ７５：Ｆｃ（ＡＭＧＥＮ社のエンブレル（ＥＮＢＲＥＬ））の場合の１．３３倍であり、リンホトキシンに対する中和活性は、野生型可溶性ＴＮＦＲｐ７５：Ｆｃ（ＡＭＧＥＮ社のエンブレル）の場合の２．７７倍である。本発明におけるＴＮＦＲｐ７５変異体及びその融合タンパク質は、ＴＮＦα及びＬＴに関連する疾患の治療に有用である。活性が上昇したため、臨床用量を減らすことにより、薬物を皮下注射により投与したときに紅斑が生じる確率を低下できよう。さらに、結合ＴＮＦαの解離時間を増やすことは、薬物の作用時間を延ばすのに有利であろう。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１Ａ】図１〜６は、ＴＮＦα又はＬＴ２８−１７１の細胞毒性に対するＴＮＦＲｐ７５変異体：Ｆｃ融合タンパク質、及び各実験で対照として用いる野生型ＴＮＦＲｐ７５：Ｆｃ融合タンパク質の中和を示す図である。図１Ａは、ＴＮＦαの細胞毒性に対するＴＮＦＲｐ７５（Ｅ９２Ａ）：Ｆｃ融合タンパク質の中和を示す図である。
【図１Ｂ】図１Ｂは、ＬＴ２８−１７１の細胞毒性に対するＴＮＦＲｐ７５（Ｅ９２Ａ）：Ｆｃ融合タンパク質の中和を示す図である。
【図２Ａ】図２Ａは、ＴＮＦαの細胞毒性に対するＴＮＦＲｐ７５（Ｅ９２Ｈ）：Ｆｃ融合タンパク質の中和を示す図である。
【図２Ｂ】図２Ｂは、ＬＴ２８−１７１の細胞毒性に対するＴＮＦＲｐ７５（Ｅ９２Ｈ）：Ｆｃ融合タンパク質の中和を示す図である。
【図３Ａ】図３Ａは、ＴＮＦαの細胞毒性に対するＴＮＦＲｐ７５（Ｅ９２Ｎ）：Ｆｃ融合タンパク質の中和を示す図である。
【図３Ｂ】図３Ｂは、ＬＴ２８−１７１の細胞毒性に対するＴＮＦＲｐ７５（Ｅ９２Ｎ）：Ｆｃ融合タンパク質の中和を示す図である。
【図４Ａ】図４Ａは、ＴＮＦαの細胞毒性に対するＴＮＦＲｐ７５（Ｅ９２Ｎ、Ｗ８９Ｙ）：Ｆｃ融合タンパク質の中和を示す図である。
【図４Ｂ】図４Ｂは、ＬＴ２８−１７１の細胞毒性に対するＴＮＦＲｐ７５（Ｅ９２Ｎ、Ｗ８９Ｙ）：Ｆｃ融合タンパク質の中和を示す図である。
【図５Ａ】図５Ａは、ＴＮＦαの細胞毒性に対するＴＮＦＲｐ７５（Ｅ９２Ｓ、Ｗ８９Ｙ）：Ｆｃ融合タンパク質の中和を示す図である。
【図５Ｂ】図５Ｂは、ＬＴ２８−１７１の細胞毒性に対するＴＮＦＲｐ７５（Ｅ９２Ｓ、Ｗ８９Ｙ）：Ｆｃ融合タンパク質の中和を示す図である。
【図６Ａ】図６Ａは、ＴＮＦαの細胞毒性に対するＴＮＦＲｐ７５（Ｅ９２Ｎ、Ｗ８９Ｆ）：Ｆｃ融合タンパク質の中和を示す図である。
【図６Ｂ】図６Ｂは、ＬＴ２８−１７１の細胞毒性に対するＴＮＦＲｐ７５（Ｅ９２Ｎ、Ｗ８９Ｆ）：Ｆｃ融合タンパク質の中和を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
以下の実施例を参照しながら本発明をさらに説明する。実施例は本発明を説明するためだけのものであり、本発明の範囲を限定することを意図するものではないと理解されたい。以下の実施例において、特定の実験条件を示していないものは、通常の条件下、又はメーカ推薦の条件に従って行う。特に説明がない限り、比率及びパーセンテージは重量に基づく。
【００３０】
本明細書において、互換的に使用できる用語「ＴＮＦ受容体２」、「ＴＮＦＲｐ７５」及び「ＴＮＦＲｐ７５受容体」とは、ヒトに由来するＴＮＦＲｐ７５受容体、及びネズミ、ブタ、ウマ又はウシに由来するそのホモログを含む。好ましくは、ヒトＴＮＦＲｐ７５受容体である。天然の野生型ヒトＴＮＦＲｐ７５受容体のアミノ酸配列は、配列番号１に示す。
【００３１】
本明細書において、「可溶性ＴＮＦｐ７５受容体」とは、ＴＮＦｐ７５受容体の細胞外領域、すなわち、野生型ヒトＴＮＦｐ７５受容体のＮ末端１〜２５７位のアミノ酸からなるリガンド結合ドメインを言い、そのうちＮ末端１〜２２位のアミノ酸がシグナルペプチドである。
【００３２】
本明細書において、「可溶性ＴＮＦｐ７５受容体」又は「本発明における可溶性ＴＮＦｐ７５受容体変異体」とは、好ましくは野生型より少なくとも２倍増加した、ＴＮＦに対する結合能を有し、好ましくは少なくとも１０倍増加した、ＬＴに対する結合能を有するＴＮＦｐ７５受容体変異体を意味する。かかる変異体は、アミノ酸の挿入、欠失又は置換によってつくることができ、好ましくはアミノ酸の置換である。例えば、Ｅ９２Ｈは、野生型配列の９２位のＧｌｕが、変異体ではＨｉｓに置換されることを意味しており、アミノ酸の番号は野生型配列に従う。
【００３３】
「アミノ酸の置換」とは、遺伝子工学又は人工合成技術によって、ポリペプチド、タンパク質又はタンパク質の断片中の１つ又は複数のアミノ酸を、別の種類のアミノ酸又は別のいくつかの種類のアミノ酸に置き換えることを言う。
【００３４】
本発明におけるＴＮＦｐ７５受容体変異タンパク質は、当技術分野ですでに知られているヒト可溶性ＴＮＦｐ７５受容体配列に従ってプライマーを合成し、次いでＰＣＲ法により可溶性ＴＮＦｐ７５受容体のコード配列を増幅するか、或いは可溶性ＴＮＦｐ７５受容体のコード配列は人工的に合成することもできる。可溶性ＴＮＦｐ７５受容体のコード配列を遺伝的に改変するための点突然変異誘発技術などの技術は、当業者によく知られている。例えば、部位特異的突然変異誘発、カセット突然変異誘発及び突然変異誘発性ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）がその中に挙げられている、「Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ」、Ｍ．Ｊ．ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ編（ＩＲＬ出版局、オックスフォード、英国（１９９１））を例えば参照されたい。
【００３５】
可溶性ＴＮＦｐ７５受容体をコードする断片と、他のアミノ酸をコードする断片とをコンジュゲートするための手法は、当業者にはよく知られている。例えば、融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列は、制限酵素による消化、ライゲーション、又は相補的な突出末端のライゲーションなどの方法によって得ることができる。
【００３６】
上記のようにして得た、本発明による変異タンパク質をコードする部位特異的変異体のＤＮＡ配列は、次いで適切な発現ベクターに挿入し、続いて適切な宿主細胞に形質転換する。最後に、形質転換した宿主細胞を培養し、分離及び精製することによって融合タンパク質を得る。
【００３７】
本発明に有用な発現ベクターは、市販のベクターなど広範囲から選択できる。例えば、市販のベクターを選択し、本発明による変異タンパク質をコードするヌクレオチド配列が発現制御配列に機能的に結合し、それによってタンパク質発現ベクターをつくる。
【００３８】
本明細書において、「機能的に結合する」とは、直鎖ＤＮＡ配列のいくつかの部分が、同じＤＮＡ配列の他の部分の活性に作用できるような状況を意味する。例えば、もしシグナルペプチドＤＮＡが前駆体としてペプチド分泌に関与すれば、それ（分泌のためのリーダー配列）はポリペプチドをコードするＤＮＡに「機能的に結合」し、もしプロモーターがＤＮＡ配列の転写を制御すれば、プロモーターはコード配列に「機能的に結合」し、もしリボソーム結合部位がその翻訳を可能にする位置にあれば、リボソーム結合部位はコード配列に「機能的に結合する」。一般的に、「機能的に結合する」とは、隣接することを意味するが、分泌のためのリーダー配列に関しては、リーディングフレーム内で隣接することを意味する。
【００３９】
本発明に関して使用するとき、「宿主細胞」とは、真核生物細胞及び原核生物細胞を含む。一般に使用する原核生物細胞には、大腸菌及び枯草菌などが挙げられる。一般に使用する真核生物細胞には、酵母細胞、昆虫細胞及び哺乳類動物細胞が挙げられる。
【００４０】
本発明の実施例における、可溶性ＴＮＦＲｐ７５受容体：Ｆｃ融合タンパク質を調製するための方法は、
ｉ．野生型可溶性ＴＮＦｐ７５受容体をコードする配列を改変して９２位アミノ酸を置換し、改変した配列とＦｃ断片をコードする断片とをコンジュゲートし、それによって融合タンパク質をコードする遺伝子を得るステップと、
ｉｉ．上記で得た、改変した可溶性ＴＮＦｐ７５受容体：Ｆｃ融合タンパク質をコードする遺伝子を、発現プラスミドにクローン化するステップと、
ｉｉｉ．改変した可溶性ＴＮＦｐ７５受容体：Ｆｃ融合タンパク質をコードする遺伝子を保有する発現プラスミドで宿主細胞を形質転換するステップと、
ｉｖ．形質転換した宿主細胞を培養するステップと、
ｖ．宿主細胞及び培養液を採取し、次いで可溶性ＴＮＦｐ７５受容体：Ｆｃ融合タンパク質を分離及び精製するステップとを含む。
【００４１】
本発明にかかる可溶性ＴＮＦｐ７５受容体：Ｆｃ融合タンパク質は、関節リウマチ、乾癬、強皮症、シェーグレン症候群、強直性脊椎炎、エリテマトーデス、皮膚筋炎、全身性エリテマトーデス様症候群などが挙げられるがこれに限定されない、ＴＮＦ過剰発現に関連する疾患の治療に有用である。
【００４２】
本発明における前記可溶性ＴＮＦｐ７５受容体：Ｆｃ融合タンパク質は、単独で又は化学療法薬などの他の薬物と組み合わせて使用することができる。
【００４３】
本発明は、有効量の１つ又は複数の本発明の可溶性ＴＮＦｐ７５受容体：Ｆｃ融合タンパク質、及び少なくとも１つの薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤を含む医薬組成物をさらに提供する。一般的に、上記の組成物は、活性成分及び賦形剤を混合する、又は賦形剤とともに活性成分を希釈する、又は例えばカプセル又は小袋の形態で担体中の活性成分をカプセル封入することによって調製することができる。希釈剤は、固体、半固体又は液体でもよい。組成物は、錠剤、丸薬、散剤、水薬、シロップ及び無菌注射溶液の形態でもよい。適切な賦形剤の例は、ラクトース、グルコース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、結晶セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水などからなる群から選択される１つ又は複数の薬剤を含むことができる。かかる組成物は、希釈剤、乳化剤、保存料（ヒドロキシ安息香酸メチル及びヒドロキシ安息香酸プロピルなど）及び甘味剤からなる群から選択される１つ又は複数の薬剤も含むことができる。
【００４４】
本発明による可溶性ＴＮＦｐ７５受容体：Ｆｃ融合タンパク質及び医薬組成物の投与経路は特に限定されず、筋肉内注射、静脈内注射、皮下注射、吸入又は噴霧などの、経口投与、非経口投与又は局所投与に適した形態でもよい。好ましくは経口投与である。
【００４５】
錠剤又はカプセル剤の形態で経口投与するとき、可溶性ＴＮＦｐ７５受容体：Ｆｃ融合タンパク質は、通常、平均体重６０〜７０ｋｇの成人に対して１ｍｇ〜１０００ｍｇの範囲内の用量で投与でき、或いは０．１〜５００ｍｇの範囲内の用量で非経口的に注射することができる。可溶性ＴＮＦｐ７５受容体：Ｆｃ融合タンパク質は１日に１回又は数回投与することができる。単位用量の医薬組成物は、一般的に１ｍｇ〜５００ｍｇの範囲内の活性成分を含み、通常は１ｍｇ、５ｍｇ、１０ｍｇ、２５ｍｇ、５０ｍｇ、１００ｍｇ、２００ｍｇ、３００ｍｇ、４００ｍｇ又は５００ｍｇである。
【００４６】
本発明の組成物を用いて具体的な疾患を治療する場合、活性成分の用量及び投与計画は、体重、年齢、性別、症状、治療する病気の重症度、並びに特定の投与経路及び投与頻度を含む様々な因子によって決めることになるが、医療関係者が決め得る。
【００４７】
本発明で使用する野生型ヒト可溶性ＴＮＦｐ７５受容体：Ｆｃ融合タンパク質は、商品名エンブレル（ＥＮＢＲＥＬ）としてＡＭＧＥＮから入手される。本発明で使用するＴＮＦαは、Ｂ＆Ｄ社から入手される。本発明で使用するＬＴ２８−１７１は、中国特許出願公開公報第００１１１８８４．６号に開示されている方法に従って調製される。
【００４８】
以下の実施例を参照しながら本発明をさらに説明する。実施例は本発明を説明するためだけのものであり、本発明の範囲を限定することを意図するものではないと理解されたい。以下の実施例において、特定の実験条件を示していないものは、通常の条件下、例えばＳａｍｂｒｏｏｋらのＭｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｇｉｎｇ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ（ニューヨーク：コールドスプリングハーバー研究所出版局、１９９２）に記載されている条件下、又はメーカ推薦の条件に従って行う。
【実施例】
【００４９】
実施例１．ＴＮＦＲ７５（Ｅ９２Ｈ）：Ｆｃ融合タンパク質の調製
（１）ＴＮＦＲｐ７５（Ｅ９２Ｈ）：Ｆｃ融合タンパク質をコードする遺伝子の調製
野生型ヒト可溶性ＴＮＦＲｐ７５：Ｆｃ融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を鋳型として用いて、ＳＯＥ−ＰＣＲ（Ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｂｙ Ｏｖｅｒｌａｐｐｅｄ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ＰＣＲ）技術によって可溶性ＴＮＦｐ７５受容体をコードする変異体ＤＮＡ配列を得た。変異部位を含む、可溶性ＴＮＦｐ７５受容体をコードするＤＮＡ断片の前半を、鋳型として野生型可溶性ＴＮＦＲｐ７５：Ｆｃ融合タンパク質のコードＤＮＡ、及び以下のプライマー：
ＴＮＦＲｐ７５ｐ：ａａｇｃｔｔａｔｇｇｃｔｃｃｃｇｔｃｇｃｃｇｔｃｔｇｇｇ（配列番号１６）
Ｅ９２ＨｐＦ１：ＴＧＣＴＴＧＡＧＣＴＧＴＧＧＣＴＣＣＣＧ（配列番号１７）
を用いて増幅した。
【００５０】
次いで、変異部位及びＦｃ断片の両方を含む、可溶性ＴＮＦｐ７５受容体をコードするＤＮＡ断片の後半を、以下のプライマー：
Ｆｃｐ：ｇａａｔｔｃｃｔａｔｔｔａｃｃｃｇｇａｇａｃａｇｇｇ（配列番号１８）
Ｅ９２ＨｐＲ１：ＣＧＧＧＡＧＣＣＡＣＡＧＣＴＣＡＡＧＣＡｇｔｇＧＧＧＡＡ（配列番号１９）
を用いて増幅した。
【００５１】
最後に、ＴＮＦＲｐ７５（Ｅ９２Ｈ）：Ｆｃ融合タンパク質をコードするＤＮＡ断片を、上記で得た２つのＰＣＲ産物を鋳型として、並びにプライマーＴＮＦＲｐ７５及びＦｃｐを用いてＰＣＲで増幅して得た。
【００５２】
（２）発現ベクターの構築
配列決定により検証した後、上述のようにして得たＰＣＲ産物をＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩで消化し、次いで市販の発現ベクターｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に挿入した。制限酵素による消化及びライゲーションは、製品説明書に従って行った。
【００５３】
（３）トランスフェクション
可溶性ＴＮＦｐ７５受容体：Ｆｃ融合タンパク質をコードする発現ベクターを大腸菌ＤＨ５αに形質転換した。陽性クローンを５００ｍｌのＬＢ培養フラスコ中で増殖させ、次いで製品説明書に従ってＱｉａｇｅｎ社の超高純度プラスミドＤＮＡ精製キット（Ｕｌｔｒａｐｕｒｅ Ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）により、ＤＮＡを抽出及び精製した。上述のようにして得たプラスミドＤＮＡを、製品説明書に従ってＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から入手したリポフェクタミンキットを使用して、ＣＨＯ−Ｋ１細胞（ＡＴＣＣから入手したチャイニーズハムスター卵巣細胞）にトランスフェクトした。
【００５４】
（４）クローンの選別
トランスフェクションから２４〜４８時間後、培養液を、Ｇ４１８（Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ）を含む選別用培養液に交換した。細胞クローンが形成されるまで、選別用培養液を３〜４日毎に交換した。細胞クローンが直径１〜２ｍｍに増殖したとき、モノクローンを２４穴プレートに移した。細胞が集密度５０〜７０％に達した後、各穴中の上澄をＥＬＩＳＡアッセイにより試験し、ＴＮＦＲｐ７５変異体：Ｆｃ融合タンパク質の高い発現を有するクローンを、薬物による選別のために選択した。薬物の濃度が最大値に達したとき、各クローンにおけるＴＮＦＲｐ７５変異体：Ｆｃ融合タンパク質の発現濃度を測定し、高い発現濃度及び十分な増殖を有する２つのモノクローナル細胞株を播種用貯蔵のために選択した。
【００５５】
ＥＬＩＳＡアッセイは次のように行った。抗体（抗ヒトＴＮＦＲｐ７５特異的モノクローナル抗体、Ｂ＆Ｄ社）を、コーティング緩衝液（ＣＢＳ、ｐＨ９．６）中で１μｇ／ｍｌに希釈し、９６穴プレート（１００μｌ／穴）に加え、５℃で一晩放置した。穴中の液体を除去し、穴をＰＢＳＴで３回洗浄した。乾燥させた後、４００μｌ／穴のブロッキング溶液（１％ＢＳＡ ＰＢＳＴ）をプレートに添加し、室温で２時間インキュベートし、次いでＰＢＳＴで３回洗浄し、乾燥させた。標準試料（Ａｍｇｅｎ、商品名エンブレル）を希釈液中で連続的に希釈した。発現したタンパク質を含む上澄みを１μｇ／ｍｌに希釈し、９６穴プレート（１００μｌ／穴）の対の穴に添加した。プレートを３７℃で１時間インキュベートした。その後、穴中の液体を除去し、穴を３回洗浄して乾燥させた。酵素結合抗体（ＨＲＰ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ特異的抗体、ＰＩＥＲＣＥ）を希釈液中で一定の濃度（１：２００００）に希釈し、９６穴プレート（１００μｌ／穴）に添加し、３７℃で１時間インキュベートした。次いで穴中の液体を除去し、穴を５回洗浄して乾燥させた。調製した基質混合液を９６穴プレート（１００μｌ／穴）に添加し、３７℃で１０分間インキュベートした。停止液（５０μｌ／穴）を穴に添加して反応を停止させた。ＯＤ値を４９０ｎｍで読み出し、試料中のタンパク質含有量を標準曲線に従って導いた。
【００５６】
（５）細胞培養
１×１０５個／ｍｌの細胞を３７℃で３〜４日間、５００ｍｌ培養フラスコ中でぞ職させた。継代：細胞密度が２×１０５個／ｍｌに達したとき、細胞を７２０ｃｍ２のローラーボトルに移し、３〜４日間培養した。継代：４×１０７個の細胞を１４４５ｃｍ２のローラーボトルに移し、６日間培養した。培養液の交換：細胞培養がプラットフォームに達したとき、培養液を無血清培地（ＳＦＭ、Ｇｉｂｃｏ社）に交換した。培養液の回収：ＳＦＭ中での増殖から６日後、上澄液を採取し、プロテインＡアフィニティクロマトグラフィーにより精製して、８．７ｍｇのＴＮＦＲｐ７５（Ｅ９２Ｈ）：Ｆｃ融合タンパク質を精製した。
【００５７】
実施例２〜７．他のＴＮＦＲｐ７５変異体：Ｆｃ融合タンパク質の産生
ＴＮＦＲｐ７５（Ｅ９２Ａ）：Ｆｃ、ＴＮＦＲｐ７５（Ｅ９２Ｎ）：Ｆｃ、ＴＮＦＲｐ７５（Ｅ９２Ｓ）：Ｆｃ、ＴＮＦＲｐ７５（Ｅ９２Ｎ、Ｗ８９Ｙ）：Ｆｃ、ＴＮＦＲｐ７５（Ｅ９２Ｓ、Ｗ８９Ｙ）：Ｆｃ及びＴＮＦＲｐ７５（Ｅ９２Ｎ、Ｗ８９Ｆ）：Ｆｃをコードするヌクレオチド配列を産生するための共通プライマーを以下に示す。
ＴＮＦＲｐ７５Ｆ：ａａｇｃｔｔａｔｇｇｃｔｃｃｃｇｔｃｇｃｃｇｔｃｔｇｇｇ（配列番号１６）
Ｆｃｐ：ｇａａｔｔｃｃｔａｔｔｔａｃｃｃｇｇａｇａｃａｇｇｇ（配列番号１８）
【００５８】
ＴＮＦＲｐ７５（Ｅ９２Ａ）：Ｆｃ、ＴＮＦＲｐ７５（Ｅ９２Ｎ）：Ｆｃ、ＴＮＦＲｐ７５（Ｅ９２Ｓ）：Ｆｃ、ＴＮＦＲｐ７５（Ｅ９２Ｑ）：Ｆｃ、ＴＮＦＲｐ７５（Ｅ９２Ｎ、Ｗ８９Ｙ）：Ｆｃ、ＴＮＦＲｐ７５（Ｅ９２Ｓ、Ｗ８９Ｙ）：Ｆｃ及びＴＮＦＲｐ７５（Ｅ９２Ｎ、Ｗ８９Ｆ）：Ｆｃをコードするヌクレオチド配列を産生するための特異的プライマーを以下の表に示した。
【００５９】
【表１】
他の手順は実施例１と同様に行った。
【００６０】
実施例８．ＬＴ２８−１７１に対するＴＮＦＲｐ７５変異体：Ｆｃ融合タンパク質の中和活性のアッセイ
（１）細胞播種
Ｌ９２９細胞を１．０×１０６個／穴の密度で９６穴マイクロタイタープレートに播種した。アクチノマイシンＤ、１ｎｇ／ｍｌのＬＴ２８−１７１、及び勾配濃度のＴＮＦＲｐ７５（Ｅ９２Ａ）：Ｆｃを実験群の各細胞に添加し、アクチノマイシンＤ，１ｎｇ／ｍｌのＬＴ２８−１７１、及び勾配濃度の野生型ｒｈＴＮＦＲｐ７５：Ｆｃを対照群の各細胞に添加した。９６穴プレートを３７℃、５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。
【００６１】
（２）終点の測定
培養液を９６穴プレートから完全に除去した。４０μｌの染色液を各穴に添加した。１０分後、染色液を除去し、使用した水が無色になるまでプレートを水で３回洗浄した。
【００６２】
残留水を可能な限り乾燥させることができた。１００μｌ／穴の脱色液を９６穴プレートの各穴に添加し、充分に混合させた。プレートを酵素標識メーターにより５７０ｎｍで読み出した。
【００６３】
（３）結果解析
データ処理ソフトウェアのグラフパッドプリズム４．０（ＰｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ４．０）における４パラメータ式により、結果を自動的に解析した。ｘ軸は標準試料濃度の対数であり、ｙ軸はＯＤ５７０値である。最大効果の５０％に対する濃度（ＥＣ５０）もこのソフトウェアで導かれ、ＬＴに対するＴＮＦＲｐ７５（Ｅ９２Ａ）：Ｆｃの中和活性については７．９３ｎｇ／ｍｌ、ＬＴに対する野生型ｒｈＴＮＦＲｐ７５：Ｆｃの中和活性については２２．３１ｎｇ／ｍｌであった。ＬＴに対する変異体の中和活性は、２９１％に上昇した。実験結果に従ってプロットした「Ｓ」字曲線を図１に示した。
【００６４】
ＬＴ２８−１７１の細胞毒性に対する他のＴＮＦＲｐ７５：Ｆｃ変異体の中和活性のアッセイを同じ方法で行った。結果を以下の表に示した。実験結果に従ってプロットした「Ｓ」字曲線を図２〜６に示した。
【００６５】
【表２】
【００６６】
実施例９．ＴＮＦαの細胞毒性に対するＴＮＦＲｐ７５：Ｆｃ変異体の中和活性のアッセイ
Ｌ９２９細胞を１．０×１０６個／穴の密度で９６穴マイクロタイタープレートに播種した。アクチノマイシンＤ、１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦα、及び勾配濃度のＴＮＦＲｐ７５：Ｆｃ又はその変異体をプレートの各細胞に添加した。９６穴プレートを３７℃、５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。
【００６７】
他の手順及びデータ処理は、実施例８に記載したように行った。
【００６８】
結果を以下の表に示した。図中のｘ軸は融合タンパク質濃度（ｎｇ／ｍｌ）の対数であり、ｙ軸は５７０ｎｍでの光吸収である。
【００６９】
【表３】
【００７０】
図１〜６に示すように、グラフパッドプリズム４．０ソフトウェアを用いた実験結果に従って「Ｓ」字曲線をプロットした。
【００７１】
実施例１０．ＴＮＦα及びＬＴに対するＴＮＦＲｐ７５（Ｅ９２Ｎ、Ｗ８９Ｙ）：Ｆｃの結合定数の測定
（１）材料及び器具
Ａ．リガンドであるＴＮＦ−α及びＬＴ、受容体であるｒｈＴＮＦＲｐ７５：Ｆｃ、及びＴＮＦＲｐ７５（Ｅ９２Ｎ、Ｗ８９Ｙ）：Ｆｃ３．８ｍｇ／ｍＬ
Ｂ．ＨＢＳ−Ｐ緩衝液（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．００５％（ｖ／ｖ）の界面活性剤Ｐ２０、ｐＨ７．４）
Ｃ．全てＳｉｇｍａ社から購入した、活性化剤であるＮ−エチル―Ｎ’−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド（ＥＤＣ）、Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド（ＮＨＳ）、エタノールアミンなど
Ｄ．生体高分子間の相互作用を測定するための装置：ＧＥ社から購入したビアコア３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ３０００）、カルボキシメチルセルロースセンサーチップ（ＣＭ５）（Ｇ．Ｅ．社）
【００７２】
（２）方法
Ａ．ｒｈＴＮＦＲｐ７５：Ｆｃのコンジュゲーション
ビアコア３０００のソフトウェアウィザード（Ｗｉｚａｒｄ）で提供された、アミノ基コンジュゲーション法を用いて、ｒｈＴＮＦＲｐ７５：ＦｃをＣＭ５チップのＦＣ２チャンネルにコンジュゲートさせた。ＨＢＳ−Ｐをランニング緩衝液として使用し、１ｍｇ／ｍＬのｒｈＴＮＦＲｐ７５：ＦｃをＮａＡＣ溶液（１０ｍＭ、ｐＨ４．０）中で最終濃度１００μｇ／ｍＬに希釈した。ＥＤＣ（０．２Ｍ）及びＮＨＳ（５０ｍＭ）を１：１の比率で混合し、次いで１０μＬ／分の流速で７分間、チップの表面上に加えた。その後、受容体の溶液を加え、次いでエタノールアミン（１Ｍ、ｐＨ８．５）を加えてチップの活性化表面を遮断した。ＴＮＦＲｐ７５の最終コンジュゲーション量は７０４３．６ＲＵであった。
【００７３】
Ｂ．ＴＮＦＲｐ７５（Ｅ９２Ｎ、Ｗ８９Ｙ）：Ｆｃのコンジュゲーション
ビアコア３０００のソフトウェアウィザード（Ｗｉｚａｒｄ）で提供された、アミノ基コンジュゲーション法を用いて、ＴＮＦＲｐ７５（Ｅ９２Ｎ、Ｗ８９Ｙ）：ＦｃをＣＭ５チップのＦＣ４チャンネルにコンジュゲートさせた。ＨＢＳ−Ｐをランニング緩衝液として使用し、３．８ｍｇ／ｍＬのＴＮＦＲｐ７５（Ｅ９２Ｎ、Ｗ８９Ｙ）：ＦｃをＮａＡＣ溶液（１０ｍＭ、ｐＨ４．０）中で最終濃度１００μｇ／ｍＬに希釈した。ＥＤＣ（０．２Ｍ）及びＮＨＳ（５０ｍＭ）を１：１の比率で混合し、次いで１０μＬ／分の流速で７分間、チップの表面上に加えた。その後、受容体の溶液を加え、次いでエタノールアミン（１Ｍ、ｐＨ８．５）を加えてチップの活性化表面を遮断した。ＴＮＦＲｐ７５（Ｅ９２Ｎ、Ｗ８９Ｙ）：Ｆｃの最終コンジュゲーション量は６２７５．０ＲＵであった。
【００７４】
Ｃ．ｒｈＴＮＦＲｐ７５：Ｆｃの１次選別及び反応速度アッセイ
受容体ＴＮＦＲｐ７５：ＦｃとＴＮＦ又はＬＴとの結合活性をＳＰＲ（表面プラズマ共鳴法）により測定した。リガンドをＨＢＳ−Ｐ緩衝液中で１ｎｍ又は１０ｎｍの濃度にそれぞれ希釈し、次いで遠心分離及び注入して、受容体ＴＮＦＲｐ７５と様々な濃度のリガンドとの結合活性を自動的に測定した。結合活性を示すリガンドに反応速度アッセイを行った。
【００７５】
１０μｇ／ｍＬ（５７５ｎＭ）の濃度におけるＴＮＦαの保存液を、ＨＢＳ−Ｐ緩衝液中で、０、０．３１２５、０．６２５、１．２５、２．５、５．０、１０．０及び２０．０ｎＭに連続的に希釈した。
【００７６】
２．２５ｍｇ／ｍＬ（１３７μＭ）の濃度におけるＬＴの保存液を、ＨＢＳ−Ｐ緩衝液中で、０、０．３１２５、０．６２５、１．２５、２．５、５．０、１０．０及び２０．０ｎＭに連続的に希釈した。
【００７７】
ビアコア３０００のウィザードを用いて、受容体及びリガンドの相互作用を反応速度アッセイで測定した。全てのリガンドを４０μＬ／分の流速で１分間加え、２分間解離させ、次いで５０ｍＭのＮａＯＨ及びＨＢＳ−Ｐ緩衝液を１００μＬ／分の流速で１５秒間及び６０秒間加えてリガンドを再生させた（１次選別では、５０ｍＭのＮａＯＨ及びＨＢＳ−Ｐ緩衝液を１００μＬ／分の流速で１０秒間及び３０秒間加えて再生させた）。実験データを、ビアコア３０００の解析ソフトウェアにおいて１：１のラングミュア結合モデルに一致させ、特定の速度定数を導いた。
【００７８】
Ｄ．ＴＮＦＲｐ７５（Ｅ９２Ｎ、Ｗ８９Ｙ）：Ｆｃの１次選別及び反応速度アッセイ
受容体ＴＮＦＲｐ７５（Ｅ９２Ｎ、Ｗ８９Ｙ）：ＦｃとＴＮＦ又はＬＴとの結合活性をＳＰＲ（表面プラズマ共鳴法）により測定した。リガンドをＨＢＳ−Ｐ緩衝液中で１ｎｍ又は１０ｎｍの濃度にそれぞれ希釈し、次いで遠心分離及び注入して、受容体ＴＮＦＲｐ７５（Ｅ９２Ｎ、Ｗ８９Ｙ）：Ｆｃと様々な濃度のリガンドとの結合活性を自動的に測定した。結合活性を示すリガンドに反応速度アッセイを行った。
【００７９】
１０μｇ／ｍＬ（５７５ｎＭ）の濃度におけるＴＮＦαの保存液を、ＨＢＳ−Ｐ緩衝液中で、０、０．３１２５、０．６２５、１．２５、２．５、５．０、１０．０及び２０．０ｎＭに連続的に希釈した。
【００８０】
２．２５ｍｇ／ｍＬ（１３７μＭ）の濃度におけるＬＴの保存液を、ＨＢＳ−Ｐ緩衝液中で、０、０．３１２５、０．６２５、１．２５、２．５、５．０、１０．０及び２０．０ｎＭに連続的に希釈した。
【００８１】
ビアコア３０００のウィザードを用いて、受容体及びリガンドの相互作用を反応速度アッセイで測定した。全てのリガンドを４０μＬ／分の流速で１分間加え、２分間解離させ、次いで５０ｍＭのＮａＯＨ及びＨＢＳ−Ｐ緩衝液を１００μＬ／分の流速で１５秒間及び６０秒間加えてリガンドを再生させた（１次選別では、５０ｍＭのＮａＯＨ及びＨＢＳ−Ｐ緩衝液を１００μＬ／分の流速で１０秒間及び３０秒間加えて再生させた）。実験データを、ビアコア３０００の解析ソフトウェアにおいて１：１のラングミュア結合モデルに一致させ、特定の速度定数を導いた。
【００８２】
（３）結果
Ａ．ＴＮＦα（ＴＮＦと省略）及びＬＴに対するｒｈＴＮＦＲｐ７５：Ｆｃの結合反応速度データを以下に示した。
【表４】
【００８３】
Ｂ．ＴＮＦα（ＴＮＦと省略）及びＬＴに対するＴＮＦＲｐ７５（Ｅ９２Ｎ、Ｗ８９Ｙ）：Ｆｃの結合反応速度データを以下に示した。
【表５】
【００８４】
ＴＮＦＲｐ７５：Ｆｃと比較すると、ＴＮＦα又はＬＴに対するＴＮＦＲｐ７５（Ｅ９２Ｎ、Ｗ８９Ｙ）の平衡解離定数（ＫＤ）は２〜３倍の減少を示し、ＴＮＦＲｐ７５（Ｅ９２Ｎ、Ｗ８９Ｙ）とＴＮＦα又はＬＴとの結合親和性が増強されたことを示した。さらに、ＴＮＦαに対するＴＮＦＲｐ７５（Ｅ９２Ｎ、Ｗ８９Ｙ）の解離定数（Ｋｄ）は、ＴＮＦＲｐ７５：Ｆｃの解離定数より顕著に小さく、ＴＮＦＲｐ７５（Ｅ９２Ｎ、Ｗ８９Ｙ）及びＴＮＦαの複合体がインビトロでより安定であることを示し、インビボでのＴＮＦＲｐ７５（Ｅ９２Ｎ、Ｗ８９Ｙ）の半減期を改善することができる。
【００８５】
上記の特定の実施形態は、本発明を例示するものに過ぎず、本発明の範囲を制限することを意図するものではない。本発明はまた、機能的に同等の方法及び成分も包含する。本明細書の説明及び添付図面に照らして、当業者は様々な変更及び改良をすぐに行うことができ、これも本発明の範囲に含まれるであろう。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオ医薬技術の分野に属し、具体的には、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体の誘導体及びその医薬における使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
腫瘍壊死因子スーパーファミリーのメンバーである腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）は、免疫応答、細胞アポトーシス、細胞分化などを調節する生物活性を有する。ＴＮＦαは２つの細胞内受容体、すなわちＴＮＦ受容体１（ＴＮＦＲｐ５５）及びＴＮＦ受容体２（ＴＮＦＲｐ７５）を有する。ＴＮＦαの過剰産生は、自己免疫疾患を引き起こす重要な原因である。現在、国際的に関節リウマチを治療するための主流のタンパク質類薬物は、ＴＮＦの生物学的機能を直接的に遮断するキメラ型抗体（インフリキシマブ；Ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ）及び可溶性ＴＮＦＲｐ７５：Ｆｃ融合タンパク質（エタネルセプト；Ｅｔａｎｅｒｃｅｐｔ）である。両者とも顕著な治療効果を示している。
【０００３】
エタネルセプトは、同時にＴＮＦα及びリンホトキシン（ＬＴ）に結合できるが、約２５〜５０ｍｇという比較的多くの臨床用量を必要とし、皮下注射により投与したときに、紅斑を引き起こす傾向がある。従って、高親和性でＴＮＦ及びリンホトキシンに結合できるＴＮＦＲｐ７５を開発し、次いで抗体薬物としてＴＮＦＲｐ７５：Ｆｃ融合タンパク質を開発することが非常に要求されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の目的の１つは、ＴＮＦα及び／又はリンホトキシンに対する高い中和活性を有する可溶性受容体を提供し、それによって、ＴＮＦαの中和に必要な可溶性受容体の用量を減らし、自己免疫疾患への治療効果を改善し、薬物の製造コストを下げることである。
【０００５】
本発明の別の目的は、より高い中和活性を有する可溶性受容体と、他のアミノ酸断片との間に形成される融合タンパク質を提供することである。
【０００６】
本発明のさらなる別の目的は、上記の可溶性受容体又は融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列を提供することである。
【０００７】
本発明のさらなる別の目的は、ＴＮＦα及び／又はリンホトキシンに対するより高い中和活性を有する可溶性受容体、又はその融合タンパク質の医薬における使用を提供することである。
【０００８】
本発明のさらなる別の目的は、上記の可溶性受容体又はその融合タンパク質を含む医薬組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の発明者等は、分子構造モデリングによりＴＮＦ受容体２、ＴＮＦα及びＬＴの構造について研究を重ね、ＴＮＦ受容体２の９２位アミノ酸が、ＴＮＦα及びＬＴとの結合に必須であることを見出した。次いで、本発明者等は合理的なデザインによって、アミノ酸９２位で点突然変異を生じさせ、ＴＮＦα及びリンホトキシンに対して高い中和活性を有する、ＴＮＦ受容体２の可溶性変異体を得た。
【００１０】
本発明の第１の態様では、野生型配列（配列番号１）のアミノ酸９２位で、アミノ酸の置換を有する可溶性ＴＮＦＲｐ７５変異体を開示する。これによって、ＴＮＦα及びリンホトキシンの細胞毒性に対する該変異体の中和活性は、野生型と比較して３０％より高く上昇する。
【００１１】
好ましい実施形態では、アミノ酸９２位のグルタミン酸（Ｅ）は、Ａｓｎ、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｌｙｓ又はＧｌｎのうちの１つによって置換される。すなわち、配列番号１に示す配列の９２位アミノ酸Ｅは、Ｎ、Ｈ、Ｓ、Ａ、Ｋ又はＱのそれぞれによって置換される。典型的な例は次の通りである。
【００１２】
ＴＮＦＲｐ７５（Ｅ９２Ｈ）変異体のアミノ酸配列は配列番号２に示し、９２位がヒスチジン（Ｈｉｓ）であり、Ｎ末端の１〜２２位アミノ酸がシグナルペプチドである。
【００１３】
ＴＮＦＲｐ７５（Ｅ９２Ａ）変異体のアミノ酸配列は配列番号３に示し、９２位がアラニン（Ａｌａ）であり、Ｎ末端の１〜２２位アミノ酸がシグナルペプチドである。
【００１４】
ＴＮＦＲｐ７５（Ｅ９２Ｎ）変異体のアミノ酸配列は配列番号４に示し、９２位がアスパラギン酸（Ａｓｎ）であり、Ｎ末端の１〜２２位アミノ酸がシグナルペプチドである。
【００１５】
ＴＮＦＲｐ７５（Ｅ９２Ｓ）変異体のアミノ酸配列は配列番号５に示し、９２位がセリン（Ｓｅｒ）であり、Ｎ末端の１〜２２位アミノ酸がシグナルペプチドである。
【００１６】
いくつかの好ましい実施形態では、９２位のＧｌｕ（Ｅ）の置換に加えて、８９位のトリプトファン（Ｔｒｐ）が、Ｔｒｙ、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ又はＬｅｕによってさらに置換される。典型的な例は次の通りである。
【００１７】
ＴＮＦＲｐ７５（Ｅ９２Ｎ、Ｗ８９Ｙ）変異体のアミノ酸配列は配列番号６に示し、８９位がチロシン（Ｔｒｙ）、９２位がアスパラギン酸（Ａｓｎ）であり、Ｎ末端の１〜２２位アミノ酸がシグナルペプチドである。
【００１８】
ＴＮＦＲｐ７５（Ｅ９２Ｓ、Ｗ８９Ｙ）変異体のアミノ酸配列は配列番号７に示し、８９位がチロシン（Ｔｒｙ）、９２位がセリン（Ｓｅｒ）であり、Ｎ末端の１〜２２位アミノ酸がシグナルペプチドである。
【００１９】
ＴＮＦＲｐ７５（Ｅ９２Ｎ、Ｗ８９Ｆ）変異体のアミノ酸配列は配列番号８に示し、８９位がフェニルアラニン（Ｐｈｅ）、９２位がアスパラギン酸（Ａｓｎ）であり、Ｎ末端の１〜２２位アミノ酸がシグナルペプチドである。
【００２０】
本発明の第２の態様では、可溶性ＴＮＦＲｐ７５変異体及び別のアミノ酸断片を含む融合タンパク質を開示する。前記別のアミノ酸断片はＴＮＦＲｐ７５変異体の安定性を高め、その生物学的半減期を改善するように働く。
【００２１】
前記別のアミノ酸断片は、ヒト免疫グロブリン（ＩｇＧ）の定常部（Ｆｃ）、又はアルブミンの５つの機能領域のうちの１つから選択される。
【００２２】
前記別のアミノ酸断片は、ＴＮＦＲｐ７５変異体のＣ末端に位置する。
【００２３】
好ましい実施形態では、前記別のアミノ酸断片は、ヒト免疫グロブリン（ＩｇＧ）の定常部（Ｆｃ）の２３２個アミノ酸である。融合タンパク質は、可溶性ＴＮＦＲｐ７５変異体とヒトＩｇＧのＣ末端にあるＦｃ断片の２３２個アミノ酸とによって形成され、両者の間に別の連結断片があってもなくてもよいが、別の連結断片がない方が好ましい。典型的な例は次の通りである。
配列番号９に示すＴＮＦＲｐ７５（Ｅ９２Ｈ）：Ｆｃ変異体アミノ酸配列、
配列番号１０に示すＴＮＦＲｐ７５（Ｅ９２Ａ）：Ｆｃ変異体アミノ酸配列、
配列番号１１に示すＴＮＦＲｐ７５（Ｅ９２Ｎ）：Ｆｃ変異体アミノ酸配列、
配列番号１２に示すＴＮＦＲｐ７５（Ｅ９２Ｓ）：Ｆｃ変異体アミノ酸配列、
配列番号１３に示すＴＮＦＲｐ７５（Ｅ９２Ｎ、Ｗ８９Ｙ）：Ｆｃ変異体アミノ酸配列、
配列番号１４に示すＴＮＦＲｐ７５（Ｅ９２Ｓ、Ｗ８９Ｙ）：Ｆｃ変異体アミノ酸配列、
配列番号１５に示すＴＮＦＲｐ７５（Ｅ９２Ｎ、Ｗ８９Ｆ）：Ｆｃ変異体アミノ酸配列。
【００２４】
本発明の第３の態様では、上記の可溶性受容体又は融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列を開示する。当技術分野ではよく知られているように、本発明による可溶性受容体又は融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列は、コドンの縮重及び異なる宿主細胞のコドンバイアスによって変わり得るが、これらのＤＮＡ配列によってコードされるアミノ酸配列が変化しない限り、これらのＤＮＡ配列も本発明の範囲内である。
【００２５】
本発明の第４の態様では、上記の可溶性ＴＮＦＲｐ７５変異体又はその融合タンパク質の医薬における使用、具体的には、関節リウマチ、乾癬、強皮症、シェーグレン症候群、強直性脊椎炎、エリテマトーデス、皮膚筋炎及び全身性エリテマトーデス様症候群が挙げられるがこれに限定されない、ＴＮＦα及び／又はリンホトキシンの過剰発現に関連する疾患の治療における使用を開示する。
【００２６】
本発明の第５の態様では、上記の可溶性ＴＮＦＲｐ７５変異体又はその融合タンパク質を含む医薬組成物を開示する。
【発明の効果】
【００２７】
本発明におけるＴＮＦＲｐ７５変異体及びその融合タンパク質は、ＴＮＦ及びリンホトキシンに対する増加した結合能を有する。例えば、ＴＮＦαに対する可溶性ＴＮＦＲｐ７５（Ｅ９２Ｎ）：Ｆｃの中和活性は、野生型可溶性ＴＮＦＲｐ７５：Ｆｃ（ＡＭＧＥＮ社のエンブレル（ＥＮＢＲＥＬ））の場合の１．３３倍であり、リンホトキシンに対する中和活性は、野生型可溶性ＴＮＦＲｐ７５：Ｆｃ（ＡＭＧＥＮ社のエンブレル）の場合の２．７７倍である。本発明におけるＴＮＦＲｐ７５変異体及びその融合タンパク質は、ＴＮＦα及びＬＴに関連する疾患の治療に有用である。活性が上昇したため、臨床用量を減らすことにより、薬物を皮下注射により投与したときに紅斑が生じる確率を低下できよう。さらに、結合ＴＮＦαの解離時間を増やすことは、薬物の作用時間を延ばすのに有利であろう。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１Ａ】図１〜６は、ＴＮＦα又はＬＴ２８−１７１の細胞毒性に対するＴＮＦＲｐ７５変異体：Ｆｃ融合タンパク質、及び各実験で対照として用いる野生型ＴＮＦＲｐ７５：Ｆｃ融合タンパク質の中和を示す図である。図１Ａは、ＴＮＦαの細胞毒性に対するＴＮＦＲｐ７５（Ｅ９２Ａ）：Ｆｃ融合タンパク質の中和を示す図である。
【図１Ｂ】図１Ｂは、ＬＴ２８−１７１の細胞毒性に対するＴＮＦＲｐ７５（Ｅ９２Ａ）：Ｆｃ融合タンパク質の中和を示す図である。
【図２Ａ】図２Ａは、ＴＮＦαの細胞毒性に対するＴＮＦＲｐ７５（Ｅ９２Ｈ）：Ｆｃ融合タンパク質の中和を示す図である。
【図２Ｂ】図２Ｂは、ＬＴ２８−１７１の細胞毒性に対するＴＮＦＲｐ７５（Ｅ９２Ｈ）：Ｆｃ融合タンパク質の中和を示す図である。
【図３Ａ】図３Ａは、ＴＮＦαの細胞毒性に対するＴＮＦＲｐ７５（Ｅ９２Ｎ）：Ｆｃ融合タンパク質の中和を示す図である。
【図３Ｂ】図３Ｂは、ＬＴ２８−１７１の細胞毒性に対するＴＮＦＲｐ７５（Ｅ９２Ｎ）：Ｆｃ融合タンパク質の中和を示す図である。
【図４Ａ】図４Ａは、ＴＮＦαの細胞毒性に対するＴＮＦＲｐ７５（Ｅ９２Ｎ、Ｗ８９Ｙ）：Ｆｃ融合タンパク質の中和を示す図である。
【図４Ｂ】図４Ｂは、ＬＴ２８−１７１の細胞毒性に対するＴＮＦＲｐ７５（Ｅ９２Ｎ、Ｗ８９Ｙ）：Ｆｃ融合タンパク質の中和を示す図である。
【図５Ａ】図５Ａは、ＴＮＦαの細胞毒性に対するＴＮＦＲｐ７５（Ｅ９２Ｓ、Ｗ８９Ｙ）：Ｆｃ融合タンパク質の中和を示す図である。
【図５Ｂ】図５Ｂは、ＬＴ２８−１７１の細胞毒性に対するＴＮＦＲｐ７５（Ｅ９２Ｓ、Ｗ８９Ｙ）：Ｆｃ融合タンパク質の中和を示す図である。
【図６Ａ】図６Ａは、ＴＮＦαの細胞毒性に対するＴＮＦＲｐ７５（Ｅ９２Ｎ、Ｗ８９Ｆ）：Ｆｃ融合タンパク質の中和を示す図である。
【図６Ｂ】図６Ｂは、ＬＴ２８−１７１の細胞毒性に対するＴＮＦＲｐ７５（Ｅ９２Ｎ、Ｗ８９Ｆ）：Ｆｃ融合タンパク質の中和を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
以下の実施例を参照しながら本発明をさらに説明する。実施例は本発明を説明するためだけのものであり、本発明の範囲を限定することを意図するものではないと理解されたい。以下の実施例において、特定の実験条件を示していないものは、通常の条件下、又はメーカ推薦の条件に従って行う。特に説明がない限り、比率及びパーセンテージは重量に基づく。
【００３０】
本明細書において、互換的に使用できる用語「ＴＮＦ受容体２」、「ＴＮＦＲｐ７５」及び「ＴＮＦＲｐ７５受容体」とは、ヒトに由来するＴＮＦＲｐ７５受容体、及びネズミ、ブタ、ウマ又はウシに由来するそのホモログを含む。好ましくは、ヒトＴＮＦＲｐ７５受容体である。天然の野生型ヒトＴＮＦＲｐ７５受容体のアミノ酸配列は、配列番号１に示す。
【００３１】
本明細書において、「可溶性ＴＮＦｐ７５受容体」とは、ＴＮＦｐ７５受容体の細胞外領域、すなわち、野生型ヒトＴＮＦｐ７５受容体のＮ末端１〜２５７位のアミノ酸からなるリガンド結合ドメインを言い、そのうちＮ末端１〜２２位のアミノ酸がシグナルペプチドである。
【００３２】
本明細書において、「可溶性ＴＮＦｐ７５受容体」又は「本発明における可溶性ＴＮＦｐ７５受容体変異体」とは、好ましくは野生型より少なくとも２倍増加した、ＴＮＦに対する結合能を有し、好ましくは少なくとも１０倍増加した、ＬＴに対する結合能を有するＴＮＦｐ７５受容体変異体を意味する。かかる変異体は、アミノ酸の挿入、欠失又は置換によってつくることができ、好ましくはアミノ酸の置換である。例えば、Ｅ９２Ｈは、野生型配列の９２位のＧｌｕが、変異体ではＨｉｓに置換されることを意味しており、アミノ酸の番号は野生型配列に従う。
【００３３】
「アミノ酸の置換」とは、遺伝子工学又は人工合成技術によって、ポリペプチド、タンパク質又はタンパク質の断片中の１つ又は複数のアミノ酸を、別の種類のアミノ酸又は別のいくつかの種類のアミノ酸に置き換えることを言う。
【００３４】
本発明におけるＴＮＦｐ７５受容体変異タンパク質は、当技術分野ですでに知られているヒト可溶性ＴＮＦｐ７５受容体配列に従ってプライマーを合成し、次いでＰＣＲ法により可溶性ＴＮＦｐ７５受容体のコード配列を増幅するか、或いは可溶性ＴＮＦｐ７５受容体のコード配列は人工的に合成することもできる。可溶性ＴＮＦｐ７５受容体のコード配列を遺伝的に改変するための点突然変異誘発技術などの技術は、当業者によく知られている。例えば、部位特異的突然変異誘発、カセット突然変異誘発及び突然変異誘発性ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）がその中に挙げられている、「Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ」、Ｍ．Ｊ．ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ編（ＩＲＬ出版局、オックスフォード、英国（１９９１））を例えば参照されたい。
【００３５】
可溶性ＴＮＦｐ７５受容体をコードする断片と、他のアミノ酸をコードする断片とをコンジュゲートするための手法は、当業者にはよく知られている。例えば、融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列は、制限酵素による消化、ライゲーション、又は相補的な突出末端のライゲーションなどの方法によって得ることができる。
【００３６】
上記のようにして得た、本発明による変異タンパク質をコードする部位特異的変異体のＤＮＡ配列は、次いで適切な発現ベクターに挿入し、続いて適切な宿主細胞に形質転換する。最後に、形質転換した宿主細胞を培養し、分離及び精製することによって融合タンパク質を得る。
【００３７】
本発明に有用な発現ベクターは、市販のベクターなど広範囲から選択できる。例えば、市販のベクターを選択し、本発明による変異タンパク質をコードするヌクレオチド配列が発現制御配列に機能的に結合し、それによってタンパク質発現ベクターをつくる。
【００３８】
本明細書において、「機能的に結合する」とは、直鎖ＤＮＡ配列のいくつかの部分が、同じＤＮＡ配列の他の部分の活性に作用できるような状況を意味する。例えば、もしシグナルペプチドＤＮＡが前駆体としてペプチド分泌に関与すれば、それ（分泌のためのリーダー配列）はポリペプチドをコードするＤＮＡに「機能的に結合」し、もしプロモーターがＤＮＡ配列の転写を制御すれば、プロモーターはコード配列に「機能的に結合」し、もしリボソーム結合部位がその翻訳を可能にする位置にあれば、リボソーム結合部位はコード配列に「機能的に結合する」。一般的に、「機能的に結合する」とは、隣接することを意味するが、分泌のためのリーダー配列に関しては、リーディングフレーム内で隣接することを意味する。
【００３９】
本発明に関して使用するとき、「宿主細胞」とは、真核生物細胞及び原核生物細胞を含む。一般に使用する原核生物細胞には、大腸菌及び枯草菌などが挙げられる。一般に使用する真核生物細胞には、酵母細胞、昆虫細胞及び哺乳類動物細胞が挙げられる。
【００４０】
本発明の実施例における、可溶性ＴＮＦＲｐ７５受容体：Ｆｃ融合タンパク質を調製するための方法は、
ｉ．野生型可溶性ＴＮＦｐ７５受容体をコードする配列を改変して９２位アミノ酸を置換し、改変した配列とＦｃ断片をコードする断片とをコンジュゲートし、それによって融合タンパク質をコードする遺伝子を得るステップと、
ｉｉ．上記で得た、改変した可溶性ＴＮＦｐ７５受容体：Ｆｃ融合タンパク質をコードする遺伝子を、発現プラスミドにクローン化するステップと、
ｉｉｉ．改変した可溶性ＴＮＦｐ７５受容体：Ｆｃ融合タンパク質をコードする遺伝子を保有する発現プラスミドで宿主細胞を形質転換するステップと、
ｉｖ．形質転換した宿主細胞を培養するステップと、
ｖ．宿主細胞及び培養液を採取し、次いで可溶性ＴＮＦｐ７５受容体：Ｆｃ融合タンパク質を分離及び精製するステップとを含む。
【００４１】
本発明にかかる可溶性ＴＮＦｐ７５受容体：Ｆｃ融合タンパク質は、関節リウマチ、乾癬、強皮症、シェーグレン症候群、強直性脊椎炎、エリテマトーデス、皮膚筋炎、全身性エリテマトーデス様症候群などが挙げられるがこれに限定されない、ＴＮＦ過剰発現に関連する疾患の治療に有用である。
【００４２】
本発明における前記可溶性ＴＮＦｐ７５受容体：Ｆｃ融合タンパク質は、単独で又は化学療法薬などの他の薬物と組み合わせて使用することができる。
【００４３】
本発明は、有効量の１つ又は複数の本発明の可溶性ＴＮＦｐ７５受容体：Ｆｃ融合タンパク質、及び少なくとも１つの薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤を含む医薬組成物をさらに提供する。一般的に、上記の組成物は、活性成分及び賦形剤を混合する、又は賦形剤とともに活性成分を希釈する、又は例えばカプセル又は小袋の形態で担体中の活性成分をカプセル封入することによって調製することができる。希釈剤は、固体、半固体又は液体でもよい。組成物は、錠剤、丸薬、散剤、水薬、シロップ及び無菌注射溶液の形態でもよい。適切な賦形剤の例は、ラクトース、グルコース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、結晶セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水などからなる群から選択される１つ又は複数の薬剤を含むことができる。かかる組成物は、希釈剤、乳化剤、保存料（ヒドロキシ安息香酸メチル及びヒドロキシ安息香酸プロピルなど）及び甘味剤からなる群から選択される１つ又は複数の薬剤も含むことができる。
【００４４】
本発明による可溶性ＴＮＦｐ７５受容体：Ｆｃ融合タンパク質及び医薬組成物の投与経路は特に限定されず、筋肉内注射、静脈内注射、皮下注射、吸入又は噴霧などの、経口投与、非経口投与又は局所投与に適した形態でもよい。好ましくは経口投与である。
【００４５】
錠剤又はカプセル剤の形態で経口投与するとき、可溶性ＴＮＦｐ７５受容体：Ｆｃ融合タンパク質は、通常、平均体重６０〜７０ｋｇの成人に対して１ｍｇ〜１０００ｍｇの範囲内の用量で投与でき、或いは０．１〜５００ｍｇの範囲内の用量で非経口的に注射することができる。可溶性ＴＮＦｐ７５受容体：Ｆｃ融合タンパク質は１日に１回又は数回投与することができる。単位用量の医薬組成物は、一般的に１ｍｇ〜５００ｍｇの範囲内の活性成分を含み、通常は１ｍｇ、５ｍｇ、１０ｍｇ、２５ｍｇ、５０ｍｇ、１００ｍｇ、２００ｍｇ、３００ｍｇ、４００ｍｇ又は５００ｍｇである。
【００４６】
本発明の組成物を用いて具体的な疾患を治療する場合、活性成分の用量及び投与計画は、体重、年齢、性別、症状、治療する病気の重症度、並びに特定の投与経路及び投与頻度を含む様々な因子によって決めることになるが、医療関係者が決め得る。
【００４７】
本発明で使用する野生型ヒト可溶性ＴＮＦｐ７５受容体：Ｆｃ融合タンパク質は、商品名エンブレル（ＥＮＢＲＥＬ）としてＡＭＧＥＮから入手される。本発明で使用するＴＮＦαは、Ｂ＆Ｄ社から入手される。本発明で使用するＬＴ２８−１７１は、中国特許出願公開公報第００１１１８８４．６号に開示されている方法に従って調製される。
【００４８】
以下の実施例を参照しながら本発明をさらに説明する。実施例は本発明を説明するためだけのものであり、本発明の範囲を限定することを意図するものではないと理解されたい。以下の実施例において、特定の実験条件を示していないものは、通常の条件下、例えばＳａｍｂｒｏｏｋらのＭｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｇｉｎｇ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ（ニューヨーク：コールドスプリングハーバー研究所出版局、１９９２）に記載されている条件下、又はメーカ推薦の条件に従って行う。
【実施例】
【００４９】
実施例１．ＴＮＦＲ７５（Ｅ９２Ｈ）：Ｆｃ融合タンパク質の調製
（１）ＴＮＦＲｐ７５（Ｅ９２Ｈ）：Ｆｃ融合タンパク質をコードする遺伝子の調製
野生型ヒト可溶性ＴＮＦＲｐ７５：Ｆｃ融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を鋳型として用いて、ＳＯＥ−ＰＣＲ（Ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｂｙ Ｏｖｅｒｌａｐｐｅｄ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ＰＣＲ）技術によって可溶性ＴＮＦｐ７５受容体をコードする変異体ＤＮＡ配列を得た。変異部位を含む、可溶性ＴＮＦｐ７５受容体をコードするＤＮＡ断片の前半を、鋳型として野生型可溶性ＴＮＦＲｐ７５：Ｆｃ融合タンパク質のコードＤＮＡ、及び以下のプライマー：
ＴＮＦＲｐ７５ｐ：ａａｇｃｔｔａｔｇｇｃｔｃｃｃｇｔｃｇｃｃｇｔｃｔｇｇｇ（配列番号１６）
Ｅ９２ＨｐＦ１：ＴＧＣＴＴＧＡＧＣＴＧＴＧＧＣＴＣＣＣＧ（配列番号１７）
を用いて増幅した。
【００５０】
次いで、変異部位及びＦｃ断片の両方を含む、可溶性ＴＮＦｐ７５受容体をコードするＤＮＡ断片の後半を、以下のプライマー：
Ｆｃｐ：ｇａａｔｔｃｃｔａｔｔｔａｃｃｃｇｇａｇａｃａｇｇｇ（配列番号１８）
Ｅ９２ＨｐＲ１：ＣＧＧＧＡＧＣＣＡＣＡＧＣＴＣＡＡＧＣＡｇｔｇＧＧＧＡＡ（配列番号１９）
を用いて増幅した。
【００５１】
最後に、ＴＮＦＲｐ７５（Ｅ９２Ｈ）：Ｆｃ融合タンパク質をコードするＤＮＡ断片を、上記で得た２つのＰＣＲ産物を鋳型として、並びにプライマーＴＮＦＲｐ７５及びＦｃｐを用いてＰＣＲで増幅して得た。
【００５２】
（２）発現ベクターの構築
配列決定により検証した後、上述のようにして得たＰＣＲ産物をＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩで消化し、次いで市販の発現ベクターｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に挿入した。制限酵素による消化及びライゲーションは、製品説明書に従って行った。
【００５３】
（３）トランスフェクション
可溶性ＴＮＦｐ７５受容体：Ｆｃ融合タンパク質をコードする発現ベクターを大腸菌ＤＨ５αに形質転換した。陽性クローンを５００ｍｌのＬＢ培養フラスコ中で増殖させ、次いで製品説明書に従ってＱｉａｇｅｎ社の超高純度プラスミドＤＮＡ精製キット（Ｕｌｔｒａｐｕｒｅ Ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）により、ＤＮＡを抽出及び精製した。上述のようにして得たプラスミドＤＮＡを、製品説明書に従ってＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から入手したリポフェクタミンキットを使用して、ＣＨＯ−Ｋ１細胞（ＡＴＣＣから入手したチャイニーズハムスター卵巣細胞）にトランスフェクトした。
【００５４】
（４）クローンの選別
トランスフェクションから２４〜４８時間後、培養液を、Ｇ４１８（Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ）を含む選別用培養液に交換した。細胞クローンが形成されるまで、選別用培養液を３〜４日毎に交換した。細胞クローンが直径１〜２ｍｍに増殖したとき、モノクローンを２４穴プレートに移した。細胞が集密度５０〜７０％に達した後、各穴中の上澄をＥＬＩＳＡアッセイにより試験し、ＴＮＦＲｐ７５変異体：Ｆｃ融合タンパク質の高い発現を有するクローンを、薬物による選別のために選択した。薬物の濃度が最大値に達したとき、各クローンにおけるＴＮＦＲｐ７５変異体：Ｆｃ融合タンパク質の発現濃度を測定し、高い発現濃度及び十分な増殖を有する２つのモノクローナル細胞株を播種用貯蔵のために選択した。
【００５５】
ＥＬＩＳＡアッセイは次のように行った。抗体（抗ヒトＴＮＦＲｐ７５特異的モノクローナル抗体、Ｂ＆Ｄ社）を、コーティング緩衝液（ＣＢＳ、ｐＨ９．６）中で１μｇ／ｍｌに希釈し、９６穴プレート（１００μｌ／穴）に加え、５℃で一晩放置した。穴中の液体を除去し、穴をＰＢＳＴで３回洗浄した。乾燥させた後、４００μｌ／穴のブロッキング溶液（１％ＢＳＡ ＰＢＳＴ）をプレートに添加し、室温で２時間インキュベートし、次いでＰＢＳＴで３回洗浄し、乾燥させた。標準試料（Ａｍｇｅｎ、商品名エンブレル）を希釈液中で連続的に希釈した。発現したタンパク質を含む上澄みを１μｇ／ｍｌに希釈し、９６穴プレート（１００μｌ／穴）の対の穴に添加した。プレートを３７℃で１時間インキュベートした。その後、穴中の液体を除去し、穴を３回洗浄して乾燥させた。酵素結合抗体（ＨＲＰ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ特異的抗体、ＰＩＥＲＣＥ）を希釈液中で一定の濃度（１：２００００）に希釈し、９６穴プレート（１００μｌ／穴）に添加し、３７℃で１時間インキュベートした。次いで穴中の液体を除去し、穴を５回洗浄して乾燥させた。調製した基質混合液を９６穴プレート（１００μｌ／穴）に添加し、３７℃で１０分間インキュベートした。停止液（５０μｌ／穴）を穴に添加して反応を停止させた。ＯＤ値を４９０ｎｍで読み出し、試料中のタンパク質含有量を標準曲線に従って導いた。
【００５６】
（５）細胞培養
１×１０５個／ｍｌの細胞を３７℃で３〜４日間、５００ｍｌ培養フラスコ中でぞ職させた。継代：細胞密度が２×１０５個／ｍｌに達したとき、細胞を７２０ｃｍ２のローラーボトルに移し、３〜４日間培養した。継代：４×１０７個の細胞を１４４５ｃｍ２のローラーボトルに移し、６日間培養した。培養液の交換：細胞培養がプラットフォームに達したとき、培養液を無血清培地（ＳＦＭ、Ｇｉｂｃｏ社）に交換した。培養液の回収：ＳＦＭ中での増殖から６日後、上澄液を採取し、プロテインＡアフィニティクロマトグラフィーにより精製して、８．７ｍｇのＴＮＦＲｐ７５（Ｅ９２Ｈ）：Ｆｃ融合タンパク質を精製した。
【００５７】
実施例２〜７．他のＴＮＦＲｐ７５変異体：Ｆｃ融合タンパク質の産生
ＴＮＦＲｐ７５（Ｅ９２Ａ）：Ｆｃ、ＴＮＦＲｐ７５（Ｅ９２Ｎ）：Ｆｃ、ＴＮＦＲｐ７５（Ｅ９２Ｓ）：Ｆｃ、ＴＮＦＲｐ７５（Ｅ９２Ｎ、Ｗ８９Ｙ）：Ｆｃ、ＴＮＦＲｐ７５（Ｅ９２Ｓ、Ｗ８９Ｙ）：Ｆｃ及びＴＮＦＲｐ７５（Ｅ９２Ｎ、Ｗ８９Ｆ）：Ｆｃをコードするヌクレオチド配列を産生するための共通プライマーを以下に示す。
ＴＮＦＲｐ７５Ｆ：ａａｇｃｔｔａｔｇｇｃｔｃｃｃｇｔｃｇｃｃｇｔｃｔｇｇｇ（配列番号１６）
Ｆｃｐ：ｇａａｔｔｃｃｔａｔｔｔａｃｃｃｇｇａｇａｃａｇｇｇ（配列番号１８）
【００５８】
ＴＮＦＲｐ７５（Ｅ９２Ａ）：Ｆｃ、ＴＮＦＲｐ７５（Ｅ９２Ｎ）：Ｆｃ、ＴＮＦＲｐ７５（Ｅ９２Ｓ）：Ｆｃ、ＴＮＦＲｐ７５（Ｅ９２Ｑ）：Ｆｃ、ＴＮＦＲｐ７５（Ｅ９２Ｎ、Ｗ８９Ｙ）：Ｆｃ、ＴＮＦＲｐ７５（Ｅ９２Ｓ、Ｗ８９Ｙ）：Ｆｃ及びＴＮＦＲｐ７５（Ｅ９２Ｎ、Ｗ８９Ｆ）：Ｆｃをコードするヌクレオチド配列を産生するための特異的プライマーを以下の表に示した。
【００５９】
【表１】
他の手順は実施例１と同様に行った。
【００６０】
実施例８．ＬＴ２８−１７１に対するＴＮＦＲｐ７５変異体：Ｆｃ融合タンパク質の中和活性のアッセイ
（１）細胞播種
Ｌ９２９細胞を１．０×１０６個／穴の密度で９６穴マイクロタイタープレートに播種した。アクチノマイシンＤ、１ｎｇ／ｍｌのＬＴ２８−１７１、及び勾配濃度のＴＮＦＲｐ７５（Ｅ９２Ａ）：Ｆｃを実験群の各細胞に添加し、アクチノマイシンＤ，１ｎｇ／ｍｌのＬＴ２８−１７１、及び勾配濃度の野生型ｒｈＴＮＦＲｐ７５：Ｆｃを対照群の各細胞に添加した。９６穴プレートを３７℃、５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。
【００６１】
（２）終点の測定
培養液を９６穴プレートから完全に除去した。４０μｌの染色液を各穴に添加した。１０分後、染色液を除去し、使用した水が無色になるまでプレートを水で３回洗浄した。
【００６２】
残留水を可能な限り乾燥させることができた。１００μｌ／穴の脱色液を９６穴プレートの各穴に添加し、充分に混合させた。プレートを酵素標識メーターにより５７０ｎｍで読み出した。
【００６３】
（３）結果解析
データ処理ソフトウェアのグラフパッドプリズム４．０（ＰｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ４．０）における４パラメータ式により、結果を自動的に解析した。ｘ軸は標準試料濃度の対数であり、ｙ軸はＯＤ５７０値である。最大効果の５０％に対する濃度（ＥＣ５０）もこのソフトウェアで導かれ、ＬＴに対するＴＮＦＲｐ７５（Ｅ９２Ａ）：Ｆｃの中和活性については７．９３ｎｇ／ｍｌ、ＬＴに対する野生型ｒｈＴＮＦＲｐ７５：Ｆｃの中和活性については２２．３１ｎｇ／ｍｌであった。ＬＴに対する変異体の中和活性は、２９１％に上昇した。実験結果に従ってプロットした「Ｓ」字曲線を図１に示した。
【００６４】
ＬＴ２８−１７１の細胞毒性に対する他のＴＮＦＲｐ７５：Ｆｃ変異体の中和活性のアッセイを同じ方法で行った。結果を以下の表に示した。実験結果に従ってプロットした「Ｓ」字曲線を図２〜６に示した。
【００６５】
【表２】
【００６６】
実施例９．ＴＮＦαの細胞毒性に対するＴＮＦＲｐ７５：Ｆｃ変異体の中和活性のアッセイ
Ｌ９２９細胞を１．０×１０６個／穴の密度で９６穴マイクロタイタープレートに播種した。アクチノマイシンＤ、１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦα、及び勾配濃度のＴＮＦＲｐ７５：Ｆｃ又はその変異体をプレートの各細胞に添加した。９６穴プレートを３７℃、５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。
【００６７】
他の手順及びデータ処理は、実施例８に記載したように行った。
【００６８】
結果を以下の表に示した。図中のｘ軸は融合タンパク質濃度（ｎｇ／ｍｌ）の対数であり、ｙ軸は５７０ｎｍでの光吸収である。
【００６９】
【表３】
【００７０】
図１〜６に示すように、グラフパッドプリズム４．０ソフトウェアを用いた実験結果に従って「Ｓ」字曲線をプロットした。
【００７１】
実施例１０．ＴＮＦα及びＬＴに対するＴＮＦＲｐ７５（Ｅ９２Ｎ、Ｗ８９Ｙ）：Ｆｃの結合定数の測定
（１）材料及び器具
Ａ．リガンドであるＴＮＦ−α及びＬＴ、受容体であるｒｈＴＮＦＲｐ７５：Ｆｃ、及びＴＮＦＲｐ７５（Ｅ９２Ｎ、Ｗ８９Ｙ）：Ｆｃ３．８ｍｇ／ｍＬ
Ｂ．ＨＢＳ−Ｐ緩衝液（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．００５％（ｖ／ｖ）の界面活性剤Ｐ２０、ｐＨ７．４）
Ｃ．全てＳｉｇｍａ社から購入した、活性化剤であるＮ−エチル―Ｎ’−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド（ＥＤＣ）、Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド（ＮＨＳ）、エタノールアミンなど
Ｄ．生体高分子間の相互作用を測定するための装置：ＧＥ社から購入したビアコア３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ３０００）、カルボキシメチルセルロースセンサーチップ（ＣＭ５）（Ｇ．Ｅ．社）
【００７２】
（２）方法
Ａ．ｒｈＴＮＦＲｐ７５：Ｆｃのコンジュゲーション
ビアコア３０００のソフトウェアウィザード（Ｗｉｚａｒｄ）で提供された、アミノ基コンジュゲーション法を用いて、ｒｈＴＮＦＲｐ７５：ＦｃをＣＭ５チップのＦＣ２チャンネルにコンジュゲートさせた。ＨＢＳ−Ｐをランニング緩衝液として使用し、１ｍｇ／ｍＬのｒｈＴＮＦＲｐ７５：ＦｃをＮａＡＣ溶液（１０ｍＭ、ｐＨ４．０）中で最終濃度１００μｇ／ｍＬに希釈した。ＥＤＣ（０．２Ｍ）及びＮＨＳ（５０ｍＭ）を１：１の比率で混合し、次いで１０μＬ／分の流速で７分間、チップの表面上に加えた。その後、受容体の溶液を加え、次いでエタノールアミン（１Ｍ、ｐＨ８．５）を加えてチップの活性化表面を遮断した。ＴＮＦＲｐ７５の最終コンジュゲーション量は７０４３．６ＲＵであった。
【００７３】
Ｂ．ＴＮＦＲｐ７５（Ｅ９２Ｎ、Ｗ８９Ｙ）：Ｆｃのコンジュゲーション
ビアコア３０００のソフトウェアウィザード（Ｗｉｚａｒｄ）で提供された、アミノ基コンジュゲーション法を用いて、ＴＮＦＲｐ７５（Ｅ９２Ｎ、Ｗ８９Ｙ）：ＦｃをＣＭ５チップのＦＣ４チャンネルにコンジュゲートさせた。ＨＢＳ−Ｐをランニング緩衝液として使用し、３．８ｍｇ／ｍＬのＴＮＦＲｐ７５（Ｅ９２Ｎ、Ｗ８９Ｙ）：ＦｃをＮａＡＣ溶液（１０ｍＭ、ｐＨ４．０）中で最終濃度１００μｇ／ｍＬに希釈した。ＥＤＣ（０．２Ｍ）及びＮＨＳ（５０ｍＭ）を１：１の比率で混合し、次いで１０μＬ／分の流速で７分間、チップの表面上に加えた。その後、受容体の溶液を加え、次いでエタノールアミン（１Ｍ、ｐＨ８．５）を加えてチップの活性化表面を遮断した。ＴＮＦＲｐ７５（Ｅ９２Ｎ、Ｗ８９Ｙ）：Ｆｃの最終コンジュゲーション量は６２７５．０ＲＵであった。
【００７４】
Ｃ．ｒｈＴＮＦＲｐ７５：Ｆｃの１次選別及び反応速度アッセイ
受容体ＴＮＦＲｐ７５：ＦｃとＴＮＦ又はＬＴとの結合活性をＳＰＲ（表面プラズマ共鳴法）により測定した。リガンドをＨＢＳ−Ｐ緩衝液中で１ｎｍ又は１０ｎｍの濃度にそれぞれ希釈し、次いで遠心分離及び注入して、受容体ＴＮＦＲｐ７５と様々な濃度のリガンドとの結合活性を自動的に測定した。結合活性を示すリガンドに反応速度アッセイを行った。
【００７５】
１０μｇ／ｍＬ（５７５ｎＭ）の濃度におけるＴＮＦαの保存液を、ＨＢＳ−Ｐ緩衝液中で、０、０．３１２５、０．６２５、１．２５、２．５、５．０、１０．０及び２０．０ｎＭに連続的に希釈した。
【００７６】
２．２５ｍｇ／ｍＬ（１３７μＭ）の濃度におけるＬＴの保存液を、ＨＢＳ−Ｐ緩衝液中で、０、０．３１２５、０．６２５、１．２５、２．５、５．０、１０．０及び２０．０ｎＭに連続的に希釈した。
【００７７】
ビアコア３０００のウィザードを用いて、受容体及びリガンドの相互作用を反応速度アッセイで測定した。全てのリガンドを４０μＬ／分の流速で１分間加え、２分間解離させ、次いで５０ｍＭのＮａＯＨ及びＨＢＳ−Ｐ緩衝液を１００μＬ／分の流速で１５秒間及び６０秒間加えてリガンドを再生させた（１次選別では、５０ｍＭのＮａＯＨ及びＨＢＳ−Ｐ緩衝液を１００μＬ／分の流速で１０秒間及び３０秒間加えて再生させた）。実験データを、ビアコア３０００の解析ソフトウェアにおいて１：１のラングミュア結合モデルに一致させ、特定の速度定数を導いた。
【００７８】
Ｄ．ＴＮＦＲｐ７５（Ｅ９２Ｎ、Ｗ８９Ｙ）：Ｆｃの１次選別及び反応速度アッセイ
受容体ＴＮＦＲｐ７５（Ｅ９２Ｎ、Ｗ８９Ｙ）：ＦｃとＴＮＦ又はＬＴとの結合活性をＳＰＲ（表面プラズマ共鳴法）により測定した。リガンドをＨＢＳ−Ｐ緩衝液中で１ｎｍ又は１０ｎｍの濃度にそれぞれ希釈し、次いで遠心分離及び注入して、受容体ＴＮＦＲｐ７５（Ｅ９２Ｎ、Ｗ８９Ｙ）：Ｆｃと様々な濃度のリガンドとの結合活性を自動的に測定した。結合活性を示すリガンドに反応速度アッセイを行った。
【００７９】
１０μｇ／ｍＬ（５７５ｎＭ）の濃度におけるＴＮＦαの保存液を、ＨＢＳ−Ｐ緩衝液中で、０、０．３１２５、０．６２５、１．２５、２．５、５．０、１０．０及び２０．０ｎＭに連続的に希釈した。
【００８０】
２．２５ｍｇ／ｍＬ（１３７μＭ）の濃度におけるＬＴの保存液を、ＨＢＳ−Ｐ緩衝液中で、０、０．３１２５、０．６２５、１．２５、２．５、５．０、１０．０及び２０．０ｎＭに連続的に希釈した。
【００８１】
ビアコア３０００のウィザードを用いて、受容体及びリガンドの相互作用を反応速度アッセイで測定した。全てのリガンドを４０μＬ／分の流速で１分間加え、２分間解離させ、次いで５０ｍＭのＮａＯＨ及びＨＢＳ−Ｐ緩衝液を１００μＬ／分の流速で１５秒間及び６０秒間加えてリガンドを再生させた（１次選別では、５０ｍＭのＮａＯＨ及びＨＢＳ−Ｐ緩衝液を１００μＬ／分の流速で１０秒間及び３０秒間加えて再生させた）。実験データを、ビアコア３０００の解析ソフトウェアにおいて１：１のラングミュア結合モデルに一致させ、特定の速度定数を導いた。
【００８２】
（３）結果
Ａ．ＴＮＦα（ＴＮＦと省略）及びＬＴに対するｒｈＴＮＦＲｐ７５：Ｆｃの結合反応速度データを以下に示した。
【表４】
【００８３】
Ｂ．ＴＮＦα（ＴＮＦと省略）及びＬＴに対するＴＮＦＲｐ７５（Ｅ９２Ｎ、Ｗ８９Ｙ）：Ｆｃの結合反応速度データを以下に示した。
【表５】
【００８４】
ＴＮＦＲｐ７５：Ｆｃと比較すると、ＴＮＦα又はＬＴに対するＴＮＦＲｐ７５（Ｅ９２Ｎ、Ｗ８９Ｙ）の平衡解離定数（ＫＤ）は２〜３倍の減少を示し、ＴＮＦＲｐ７５（Ｅ９２Ｎ、Ｗ８９Ｙ）とＴＮＦα又はＬＴとの結合親和性が増強されたことを示した。さらに、ＴＮＦαに対するＴＮＦＲｐ７５（Ｅ９２Ｎ、Ｗ８９Ｙ）の解離定数（Ｋｄ）は、ＴＮＦＲｐ７５：Ｆｃの解離定数より顕著に小さく、ＴＮＦＲｐ７５（Ｅ９２Ｎ、Ｗ８９Ｙ）及びＴＮＦαの複合体がインビトロでより安定であることを示し、インビボでのＴＮＦＲｐ７５（Ｅ９２Ｎ、Ｗ８９Ｙ）の半減期を改善することができる。
【００８５】
上記の特定の実施形態は、本発明を例示するものに過ぎず、本発明の範囲を制限することを意図するものではない。本発明はまた、機能的に同等の方法及び成分も包含する。本明細書の説明及び添付図面に照らして、当業者は様々な変更及び改良をすぐに行うことができ、これも本発明の範囲に含まれるであろう。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に示すＴＮＦＲｐ７５のＮ末端の２５７個アミノ酸を含む可溶性ＴＮＦＲｐ７５変異体であって、配列番号１に示すアミノ酸配列のＮ末端９２位のＧｌｕが置換されている、可溶性ＴＮＦＲｐ７５変異体。
【請求項２】
配列番号１に示すアミノ酸配列のＮ末端９２位のＧｌｕが、Ａｓｎ、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｌｙｓ又はＧｌｎのうちの１つによって置換されている、請求項１に記載の可溶性ＴＮＦＲｐ７５変異体。
【請求項３】
配列番号１に示すアミノ酸配列のＮ末端８９位のＴｒｐが置換されている、請求項１に記載の可溶性ＴＮＦＲｐ７５変異体。
【請求項４】
配列番号１に示すアミノ酸配列のＮ末端９２位のＧｌｕが、Ａｓｎ、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｌｙｓ又はＧｌｎのうちの１つによって置換されると同時に、配列番号１に示すアミノ酸配列のＮ末端８９位のＴｒｐが、Ｔｒｙ、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ及びＬｅｕのうちの１つによって置換されている、請求項３に記載の可溶性ＴＮＦＲｐ７５変異体。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の可溶性ＴＮＦＲｐ７５変異体と、別のアミノ酸断片とが形成する融合タンパク質であって、前記別のアミノ酸断片が、ヒト免疫グロブリンの定常部、又はアルブミンの５つの機能領域のうち１つから選択され、かつ、可溶性ＴＮＦＲｐ７５変異体のＣ末端に位置する、融合タンパク質。
【請求項６】
前記別のアミノ酸断片が、ヒト免疫グロブリンの定常部の２３２個アミノ酸である、請求項５に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の可溶性ＴＮＦＲｐ７５変異体をコードするＤＮＡ配列。
【請求項８】
請求項５又は６に記載の融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列。
【請求項９】
関節リウマチ、乾癬、強皮症、シェーグレン症候群、強直性脊椎炎、エリテマトーデス、皮膚筋炎及び全身性エリテマトーデス様症候群を含む、ＴＮＦα及び／又はリンホトキシン関連疾患の治療のための薬剤製造における、請求項１〜４のいずれか一項に記載の可溶性ＴＮＦＲｐ７５変異体の使用。
【請求項１０】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の可溶性ＴＮＦＲｐ７５変異体の治療有効量、及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項１１】
関節リウマチ、乾癬、強皮症、シェーグレン症候群、強直性脊椎炎、エリテマトーデス、皮膚筋炎及び全身性エリテマトーデス様症候群を含む、ＴＮＦα及び／又はリンホトキシン関連疾患の治療のための薬剤製造における、請求項５又は６に記載の融合タンパク質の使用。
【請求項１２】
請求項５又は６に記載の融合タンパク質の治療有効量、及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項１】
配列番号１に示すＴＮＦＲｐ７５のＮ末端の２５７個アミノ酸を含む可溶性ＴＮＦＲｐ７５変異体であって、配列番号１に示すアミノ酸配列のＮ末端９２位のＧｌｕが置換されている、可溶性ＴＮＦＲｐ７５変異体。
【請求項２】
配列番号１に示すアミノ酸配列のＮ末端９２位のＧｌｕが、Ａｓｎ、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｌｙｓ又はＧｌｎのうちの１つによって置換されている、請求項１に記載の可溶性ＴＮＦＲｐ７５変異体。
【請求項３】
配列番号１に示すアミノ酸配列のＮ末端８９位のＴｒｐが置換されている、請求項１に記載の可溶性ＴＮＦＲｐ７５変異体。
【請求項４】
配列番号１に示すアミノ酸配列のＮ末端９２位のＧｌｕが、Ａｓｎ、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｌｙｓ又はＧｌｎのうちの１つによって置換されると同時に、配列番号１に示すアミノ酸配列のＮ末端８９位のＴｒｐが、Ｔｒｙ、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ及びＬｅｕのうちの１つによって置換されている、請求項３に記載の可溶性ＴＮＦＲｐ７５変異体。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の可溶性ＴＮＦＲｐ７５変異体と、別のアミノ酸断片とが形成する融合タンパク質であって、前記別のアミノ酸断片が、ヒト免疫グロブリンの定常部、又はアルブミンの５つの機能領域のうち１つから選択され、かつ、可溶性ＴＮＦＲｐ７５変異体のＣ末端に位置する、融合タンパク質。
【請求項６】
前記別のアミノ酸断片が、ヒト免疫グロブリンの定常部の２３２個アミノ酸である、請求項５に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の可溶性ＴＮＦＲｐ７５変異体をコードするＤＮＡ配列。
【請求項８】
請求項５又は６に記載の融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列。
【請求項９】
関節リウマチ、乾癬、強皮症、シェーグレン症候群、強直性脊椎炎、エリテマトーデス、皮膚筋炎及び全身性エリテマトーデス様症候群を含む、ＴＮＦα及び／又はリンホトキシン関連疾患の治療のための薬剤製造における、請求項１〜４のいずれか一項に記載の可溶性ＴＮＦＲｐ７５変異体の使用。
【請求項１０】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の可溶性ＴＮＦＲｐ７５変異体の治療有効量、及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項１１】
関節リウマチ、乾癬、強皮症、シェーグレン症候群、強直性脊椎炎、エリテマトーデス、皮膚筋炎及び全身性エリテマトーデス様症候群を含む、ＴＮＦα及び／又はリンホトキシン関連疾患の治療のための薬剤製造における、請求項５又は６に記載の融合タンパク質の使用。
【請求項１２】
請求項５又は６に記載の融合タンパク質の治療有効量、及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図１Ｂ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【公表番号】特表２０１１−５１１６２７（Ｐ２０１１−５１１６２７Ａ）
【公表日】平成２３年４月１４日（２０１１．４．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５４４５６２（Ｐ２０１０−５４４５６２）
【出願日】平成２１年１月１２日（２００９．１．１２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＮ２００９／００００３７
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１４３６８９
【国際公開日】平成２１年１２月３日（２００９．１２．３）
【出願人】（５１０１５７４７６）シャンハイ フダン−チャンジャン バイオ−ファーマシューティカル カンパニー リミテッド (1)
【出願人】（５１０１５７４８７）タイツォウ フダン−チャンジャン ファーマシューティカル カンパニー リミテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年４月１４日（２０１１．４．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１月１２日（２００９．１．１２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＮ２００９／００００３７
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１４３６８９
【国際公開日】平成２１年１２月３日（２００９．１２．３）
【出願人】（５１０１５７４７６）シャンハイ フダン−チャンジャン バイオ−ファーマシューティカル カンパニー リミテッド (1)
【出願人】（５１０１５７４８７）タイツォウ フダン−チャンジャン ファーマシューティカル カンパニー リミテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
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