ＶＣＡＭ−１に特異的に結合し、白血球と内皮細胞間の接合及び透過を阻害する組換えヒト単一クローン抗体
本発明は、ヒト血管細胞接合分子−１(ＶＣＡＭ−１)に特異的に結合して白血球及び活性化された内皮細胞間の接合及び前記活性化された内皮細胞への白血球の透過を阻害することを特徴とする組換えヒト単一クローン抗体及びそれを含む炎症性疾患または癌の予防及び治療用組成物に関する。本発明による組換えヒト単一クローン抗体は、ヒト内皮細胞で発現されたＶＣＡＭ−１に対して強い親和力を示し、ＶＣＡＭ−１で媒介される白血球及び活性化された内皮細胞間の接合及び前記活性化された内皮細胞への白血球の透過を効果的に阻害するので、喘息及び関節炎のような炎症性疾患、臓器移植拒否、心血管疾患及び癌のような疾患の予防及び治療に使用され得る。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト血管細胞接合分子−１(ＶＣＡＭ−１)に特異的に結合して白血球と活性化された内皮細胞との間の接合及び前記活性化された内皮細胞への白血球の透過を阻害する組換えヒト単一クローン抗体、並びにこれを含む炎症性疾患または癌の予防及び治療用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
白血球を含む兔疫細胞などは、血管から組織へ移動する間、活性化された内皮細胞を通過して免疫反応を起こすようになり、このような白血球の内皮細胞への接合と組織への移動にはインテグリン(integrin)、セレクチン(selectin)、ＩＣＡＭ(intracellular adhesion molecule)、ＶＣＡＭ(vascular cell adhesion molecule)などの多くの細胞接合分子(ＣＡＭｓ)が関与する。細胞接合分子は、機能的に白血球と内皮細胞間の相互作用に関与するセレクチン類、白血球の内皮細胞への接合に関与するインテグリン類、そして、ＩＣＡＭ、ＶＣＡＭのような兔疫グロブリンなどに分けられる。これらの細胞接合分子などは、免疫作用、炎症、血栓症のような多くの生理反応に重要な役割を果たしている。
【０００３】
ＶＣＡＭ−１は好中球を除いたほとんどの白血球の表面に発現されるインテグリン(ＶＬＡ−４)と相互作用する血管内皮細胞接合分子の一種である。ＶＣＡＭ−１は炎症信号などによって発現され、白血球の血管内皮細胞への付着を固定させ、以後、白血球のダメージ組織への血管外遊出(transendothelial migration)を誘発する。
【０００４】
ＶＣＡＭ−１−ＶＬＡ−４相互作用に対する最近の関心にもかかわらず、ＶＣＡＭ−１を中和させる抗体の開発は盛んに研究されていない。最近、マウスＶＣＡＭ−１に対する単一クローン抗体であるＭ／Ｋ−２．７が開発され、コラーゲン誘導性関節炎マウスモデルにおいて関節炎を抑制する効果を示したが、この抗体はマウスモデルのみに特異的であるので、臨床適用のための抗体の有用性がさらに研究されなければならない。
【０００５】
また、ＶＣＡＭ−１は、ＩｇＧ−類似ドメインの７つから構成され、ドメイン１とドメイン４のリガンドであるインテグリン(α４β１またはα４β７)と結合する時、実質的にドメイン１とドメイン４が関与する(1995, PNAS, 92:p5714; 1995, The journal of immunology, 155: p3135 et al.)。
【０００６】
このような観点で、ＶＣＡＭ−１抗原とインテグリンとの間の相互作用を阻害して白血球の内皮細胞への接合及び透過を効果的に阻害しながら、免疫原性リスクを最小限に抑えることができる完全ヒト単一クローン抗体の開発が至急である。
【発明の概要】
【０００７】
従って、本発明者らは、ヒト内皮細胞の表面に発現されたＶＣＡＭ−１を特異的に認識し、ＶＣＡＭ−１抗原のドメイン１または２に結合しながらＵ９３７前単核白血球(promonocytic leukocyte)及び活性化された内皮細胞間の相互作用を阻害する強い活性を有するヒト由来の重鎖(ＶＨ)及び軽鎖(ＶＬ)ドメインを有したヒトＶＣＡＭ−１に特異的な組換えヒト単一クローン抗体を開発し、本発明を完成するようになった。
【０００８】
本発明の目的は、ヒト血管細胞接合分子−１(ＶＣＡＭ−１)に特異的に結合して白血球及び活性化された内皮細胞との間の接合並びに前記活性化された内皮細胞への白血球の透過を阻害することを特徴とする組換えヒト単一クローン抗体を提供することである。
【０００９】
本発明の別の目的は、炎症性疾患または癌が疑われる個体の生物学的試料で組換えヒト単一クローン抗体とＶＣＡＭ−１との間の抗原−抗体反応を介して検出する段階を含む炎症性疾患、心血管疾患や癌の診断に必要な情報の提供方法を提供することである。
【００１０】
本発明のまだ別の目的は、組換えヒト単一クローン抗体を用いて白血球と活性化された内皮細胞の間の接合及び前記活性化された内皮細胞への白血球の透過を阻害する方法を提供することである。
【００１１】
本発明のまだ別の目的は、組換えヒト単一クローン抗体を含む炎症性疾患、心血管疾患や癌の診断用組成物を提供することである。
【００１２】
本発明のまだ別の目的は、組換えヒト単一クローン抗体及び薬剤学的に許容可能な担体を含む炎症性疾患、心血管疾患や癌の予防または治療用組成物を提供することである。
【００１３】
本発明のまだ別の目的は、炎症性疾患や癌の予防または治療用組成物を投与する段階を含む炎症性疾患、心血管疾患や癌の治療方法を提供することである。
【００１４】
本発明による組換えヒト単一クローン抗体は、ヒト内皮細胞で発現されたＶＣＡＭ−１に対して強い親和力を示し、ＶＣＡＭ−１で媒介される白血球と活性化された内皮細胞との間の接合及び前記活性化された内皮細胞への白血球の透過を効果的に阻害するので、喘息及び関節炎のような炎症性疾患、臓器移植拒否、心血管疾患及び癌のような疾患の予防及び治療に有用に使用され得る。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、本発明の一実施形態による組換えヒト単一クローン抗体の可変領域のアミノ酸配列を示したものである。
【図２】図２は、ヒトＶＣＡＭ−１ドメインによって抗原に特異的な抗ＶＣＡＭ−１ヒト単一クローン抗体などの抗原に対する親和度を示したＥＬＩＳＡ(Enzyme-linked immuno-sorbent assay)の結果であり、ここで、ＶＤ２は、組換えヒトＶＣＡＭ−１ドメインＤ１−Ｄ２／Ｆｃキメラを示し、ＶＤ４は、組換えヒトＶＣＡＭ−１ドメインＤ１１−Ｄ４４／Ｆｃキメラを示し、ＶＤ７は、組換えヒトＶＣＡＭ−１ドメインＤ１−Ｄ７／Ｆｃキメラを示したものである。
【図３】図３は、ヒトＶＣＡＭ−１抗原に特異的な抗ＶＣＡＭ−１ヒト単一クローン抗体などの抗原に対する結合能または親和度を示したものであって、ビアコア(BIACORE AB, Sweden)を用いて抗原−抗体親和度を１：１結合モード方法で測定し、該当抗原−抗体間の親和度定数であるＫＤ値を計算した。
【図４】図４は、抗ＶＣＡＭ−１ヒト単一クローン抗体によって精製されたヒト組換えＶＣＡＭ−１抗原とヒト白血球細胞間の接合阻害能を分析したものであって、抗体を処理しない群に比べて蛍光強度がどのくらい減少したかを計算して阻害能を決定した。
【図５】図５は、ＴＮＦ−α(Tumor necrosis factor-α)によって活性化されたヒト内皮細胞とヒト白血球細胞間の接合に対する抗ＶＣＡＭ−１ヒト単一クローン抗体の阻害能を分析した結果であって、抗体を処理しない群に比べて蛍光強度がどのくらい減少したかを計算して阻害能程度を決定した。
【図６】図６は、ＴＮＦ−α(Tumor necrosis factor-α)によって活性化されたヒト内皮細胞の間をヒト白血球細胞が透過することに対する抗ＶＣＡＭ−１ヒト単一クローン抗体の阻害能を分析した結果であって、抗体を処理しない群に比べて透過した白血球細胞の数がどのくらい減少したかを測定して阻害能を決定した。
【図７】図７は、本発明の一実施形態によるＲｈｏＡ(Ras homolog gene family，member A)活性阻害能を分析した結果を示した図である。
【図８】図８は、本発明の一実施形態によるＲＯＳ(Reactive oxygen species)活性阻害能を分析した結果を示した図である。
【図９】図９は、本発明の一実施形態による内在化(internalization)確認実験結果を示したものである。
【図１０】図１０は、本発明の一実施形態による組換えヒト単一クローン抗体の重鎖配列及びＣＤＲ配列を示す。
【図１１】図１１は、本発明の一実施形態による組換えヒト単一クローン抗体の軽鎖配列及びＣＤＲ配列を示す。
【図１２】図１２は、本発明の一実施形態による動物実験の概要を示した模式図である。
【図１３】図１３は、本発明の一実施形態によるインビトロ(in vitro)付着分析を介したＶＣＡＭ−１Ａｂの炎症細胞付着抑制効果を分析した結果を示したものである。（Ａ）付着した単核球細胞数のグラフ（Ｂ）代表写真。
【図１４】図１４は、本発明の一実施形態によるインビトロ透過分析を介したＶＣＡＭ−１Ａｂの炎症細胞透過抑制効果を分析した結果を示したものである。（Ａ）４時間後に透過された細胞数のグラフ（Ｂ）１８時間後に透過された細胞数のグラフ。
【図１５】図１５は、本発明の一実施形態によるＶＣＡＭ−１Ａｂ(７ＨＴ)のインビボ(in vivo)結合力テストのためのエンフェース(en face)共焦点顕微鏡の結果を示したものである。（Ａ）ＰＢＳ、（Ｂ）高用量対照群抗体、（Ｃ）低用量ＶＣＡＭ−１抗体、（Ｄ）高用量ＶＣＡＭ−１抗体。
【図１６】図１６は、本発明の一実施形態によるマウスの体重変化及び飼料消費量の変化を測定した結果を示したものである。
【図１７】図１７は、本発明の一実施形態によるマウス血液分析結果を示したものである。（Ａ）総コレステロール水準(Ｔ−ＣＨＯ)、ＨＤＬ−コレステロール水準(ＨＤＬ−Ｃ)及びＬＤＬ−コレステロール水準(ＬＤＬ−Ｃ)。（Ｂ）トリグリセリド水準(ＴＧ)及びグルコース水準(ＧＬＵ)。（Ｃ）グルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼ水準(ＧＯＴ)及びグルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ水準(ＧＰＴ)。（Ｄ）アルブミン水準(ＡＬＢ)。
【図１８】図１８は、本発明の一実施形態による大動脈弓に形成された粥状硬化斑の確認及びそのサイズを測定した結果を示したものである。
【図１９】図１９は、本発明の一実施形態による大動脈に形成された粥状硬化斑のエンフェース技法を介して病変を分析した結果をグラフで示したものである。
【図２０】図２０は、本発明の一実施形態による大動脈に形成された粥状硬化斑のエンフェース技法を介して病変を分析した結果を示したグラフである。
【図２１】図２１は、本発明の一実施形態によるＶＣＡＭ−１抗体投与による毒性可否を確認するための肝臓切片のＨ＆Ｅ染色による病理学的分析結果を示したものである。
【図２２】図２２は、本発明の一実施形態によるＶＣＡＭ−１抗体投与による毒性可否を確認するための腎臓切片のＨ＆Ｅ染色による病理学的分析結果を示したものである。
【図２３】図２３は、本発明の一実施形態によるＶＣＡＭ−１抗体投与による毒性可否を確認するための脾臓切片のＨ＆Ｅ染色による病理学的分析結果を示したものである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、実施例を参照して本発明を詳細に説明する。しかし、下記の実施例はただ本発明を例示するための目的として提供されるものであって、それに応じて本発明の内容が実施例に限定されるのではない。
【００１７】
前記の目的を達成するための一つの態様において、本発明は、ヒト血管細胞接合分子−１(ＶＣＡＭ−１)に特異的に結合して白血球及び活性化された内皮細胞の間の接合並びに前記活性化された内皮細胞への白血球の透過を阻害することを特徴とする組換えヒト単一クローン抗体に関する。
【００１８】
下記用語の定義は、本明細書をより深く理解するようにするために提供されるものであって、本願で使用された用語は、ただ特定実施形態を記述するためのものであり、これらの用語に限定することに意図されない。本明細書及び添付された特許請求の範囲で使用された単数形の用語は、文脈的で明確に別に指示しない限り複数の指示対象を含むことを周知しなければならない。
【００１９】
本明細書で使用される用語“抗体”とは、特定抗原と免疫学的に反応する兔疫グロブリン分子に対する言及を含み、多クーロン抗体及び単一クローン抗体を全て含む。また、前記用語は、キメラ性抗体(例えば、ヒト化ミューリン抗体)及びヘテロ共役抗体(例えば、二重特異性抗体)のような遺伝工学によって生産された形態を含む。
【００２０】
また、用語“抗体”は、抗原結合能力を有する断片(例えば、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆｖ及びｒＩｇＧ)を含む、抗体の抗原結合形態を含む。また、前記用語は、組換え単一鎖Ｆｖ断片(ｓｃＦｖ)を指す。また、用語“抗体”とは、二価または二重特異性分子、ダイアボディー、トリアボディー及びテトラボディーを含む。二価及び二重特異性分子は、例えば、Kostelny et al. (1992, J. Immunol. 148:15467), Pack and Pluckthun (1992, Biochemistry 31:1579), Hollinger et al. (1993, supra), Gruber et al. (1994, J. Immunol.: 5368), Zhu et al. (1997, Protein Sci. 6:781), Hu et al. (1996, Cancer Res. 56:3055), Adams et al. (1993, Cancer Res. 53:4026 and McCartney et al. (1995, Protein Eng. 8:301)に記述されている。
【００２１】
また、本明細書で使用される用語“単一クローン抗体”とは、実質的に同一の抗体集団から得られた抗体分子を指し、このような単一クローン抗体は、特定エピトープに対して単一結合特異性及び親和度を示す。
【００２２】
典型的に、兔疫グロブリンは重鎖及び軽鎖を持つ。各々の重鎖及び軽鎖は、不変領域及び可変領域(前記領域は、“ドメイン”としてまた知られている)を含む。軽鎖及び重鎖の可変領域は、“相補性決定領域”(以下、“ＣＤＲ”という)と呼ばれる３つの高度可変領域及び４つの“構造領域”を含む。前記ＣＤＲは、主に抗原のエピトープに結合する役割を果たす。各々の鎖のＣＤＲは、典型的にＮ−末端から始めて順次にＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３と呼ばれ、また、特定ＣＤＲが位置している鎖によって識別される。
【００２３】
また、本願で使用される用語“ヒト化抗体”とは、ヒト兔疫グロブリンから由来する分子であって、相補性決定領域及び構造領域を含む抗体を構成するすべてのアミノ酸配列全体がヒトの兔疫グロブリンから構成されていることを意味する。用語、“組換えヒト単一クローン抗体”とは、ヒト兔疫グロブリンから由来する単一分子組成の抗体分子を指す。
【００２４】
ヒト化抗体は、一般的にヒトの治療に使用するのに当たって少なくとも３つ以上の潜在的な利点を持つ。先ず、これはヒト免疫体系とより良好に相互作用して、例えば、補体−依存性細胞毒性(ＣＤＣ)または抗体−依存性細胞性細胞毒性(ＡＤＣＣ)によって目的細胞をより効率的に破壊する。第二に、ヒト免疫体系は前記抗体を異物として認識しない。第三に、ヒト循環系内半減期が天然発生ヒト抗体と似ているため、より少ない量、より少ない頻度の薬物を投与することができるようにする。従って、本発明によるヒト単一クローン抗体などは、ヒト内皮細胞に発現されたＶＣＡＭ−１に対して強い親和力を示し、ＶＣＡＭ−１を発現する活性化された内皮細胞に白血球が接合することを効果的に阻害する。それだけでなく、重鎖及び軽鎖ドメインのすべてがヒト由来であるから低い免疫原性を示すので、本発明によるヒト単一クローン抗体は、炎症性疾患または癌の治療に使用されることができ、前記炎症性疾患は、腫瘍壊死因子−α(ＴＮＦ−α)媒介性疾患、大腸疾患、動脈硬化、及び心筋梗塞から選択されることができ、好ましくは、喘息、糖尿病、ブドウ膜炎、強直性脊椎炎、敗血症、内毒素ショック、血流力学ショック、敗血症症侯群、虚血性再灌流損傷、マラリア感染、マイコバクテリア感染、髄膜炎、乾癬、うっ血性心不全、線維症疾病、カヘキシー、移植拒否、癌、自己免疫疾病、エイズ関連日和見感染症、関節炎、リウマチ性脊椎炎、痛風、強直性痛風炎、クローン疾病、潰瘍性膀胱三角炎、多発性硬化症、癩性結節性紅斑(ＥＮＬ)、放射線障害及び酸素過多性肺胞損傷からなる群から選択され得る。
【００２５】
本発明の好ましい実施形態によれば、本発明の組換えヒト単一クローン抗体は、配列番号２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１；配列番号３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２；及び配列番号４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含むことができる。一方、本発明の組換えヒト単一クローン抗体は、前記の相補性決定領域(ＣＤＲ)に公知の治療用抗体の構造領域(ＦＲ)を接合させて製造することができる。より好ましくは、本発明の組換えヒト単一クローン抗体は、配列番号１で定義される重鎖アミノ酸配列を含む組換えヒト単一クローン抗体であり得る(図１参照)。
【００２６】
また、本発明の好ましい実施形態によれば、本発明の組換えヒト単一クローン抗体は、配列番号６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１；配列番号７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２；及び配列番号８のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含むことができる。一方、本発明の組換えヒト単一クローン抗体は、前記の相補性決定領域(ＣＤＲ)に公知の治療用抗体の構造領域(ＦＲ)を接合させて製造することができる。より好ましくは、本発明の組換えヒト単一クローン抗体は、配列番号５で定義される軽鎖アミノ酸配列を含む組換えヒト単一クローン抗体であり得る(図１参照)。
【００２７】
より好ましくは、本発明の組換えヒト単一クローン抗体は、前記の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域をすべて含むヒト単一クローン抗体であるかも知れない。すなわち、本発明の組換えヒト単一クローン抗体は、配列番号２で定義された重鎖ＣＤＲ１；配列番号３で定義された重鎖ＣＤＲ２；及び配列番号４で定義された重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号６で定義された軽鎖ＣＤＲ１；配列番号７で定義された軽鎖ＣＤＲ２；及び配列番号８で定義された軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含むことができる。一方、本発明の組換えヒト単一クローン抗体は、前記の相補性決定領域(ＣＤＲ)に公知の治療用抗体の構造領域(ＦＲ)を接合させて製造することができる。最も好ましくは、本発明の組換えヒト単一クローン抗体は、配列番号１で定義された重鎖アミノ酸配列と配列番号５で定義された軽鎖アミノ酸配列を含む組換えヒト単一クローン抗体であり得る(図１参照)。
【００２８】
さらに、本発明の好ましい実施形態によれば、本発明の組換えヒト単一クローン抗体は、配列番号１０のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１；配列番号１１のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２；及び配列番号１２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含むことができる。一方、本発明の組換えヒト単一クローン抗体は、前記の相補性決定領域(ＣＤＲ)に公知の治療用抗体の構造領域(ＦＲ)を接合させて製造することができる。より好ましくは、本発明の組換えヒト単一クローン抗体は、配列番号９で定義される重鎖アミノ酸配列を含む組換えヒト単一クローン抗体であり得る(図１０参照)。
【００２９】
さらに、本発明の好ましい実施形態によれば、本発明の組換えヒト単一クローン抗体は、配列番号１４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１；配列番号１５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２；及び配列番号１６のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含むことができる。一方、本発明の組換えヒト単一クローン抗体は、前記の相補性決定領域(ＣＤＲ)に公知の治療用抗体の構造領域(ＦＲ)を接合させて製造することができる。より好ましくは、本発明の組換えヒト単一クローン抗体は、配列番号１３で定義される軽鎖アミノ酸配列を含む組換えヒト単一クローン抗体であり得る(図１１参照)。
【００３０】
より好ましくは、本発明の組換えヒト単一クローン抗体は、前記の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域をすべて含むヒト単一クローン抗体であるかも知れない。すなわち、本発明の組換えヒト単一クローン抗体は、配列番号１０で定義された重鎖ＣＤＲ１；配列番号１１で定義された重鎖ＣＤＲ２；及び配列番号１２で定義された重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号１４で定義された軽鎖ＣＤＲ１；配列番号１５で定義された軽鎖ＣＤＲ２；及び配列番号１６で定義された軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含むことができる。一方、本発明の組換えヒト単一クローン抗体は、前記の相補性決定領域(ＣＤＲ)に公知の治療用抗体の構造領域(ＦＲ)を接合させて製造することができる。最も好ましくは、本発明の組換えヒト単一クローン抗体は、配列番号９で定義された重鎖アミノ酸配列と配列番号１３で定義された軽鎖アミノ酸配列を含む組換えヒト単一クローン抗体であり得る(図１１参照)。
【００３１】
これに関して、前記組換えヒト単一クローン抗体は、ヒトＶＣＡＭ−１に対する親和度を提供する。本発明の一実施形態によれば、組換えヒト単一クローン抗体のヒトＶＣＡＭ−１抗原に対する結合／解離定数(ＫＤ値)は、０．１×１０-9Ｍ−７．０×１０-9Ｍであることができ、これは、ビアコア分析を用いて各抗体などとヒトＶＣＡＭ−１に対する結合／解離定数(ＫＤ値)を求めることによって得られることができる。すなわち、ビアコア機器を用いてヒトＶＣＡＭ−１抗原をリガンドとしてセンサーチップ(Sensor chip CM5, BIACORE, BR-1003-99)に固定化させた後、抗体を濃度別に希釈し、固定化されたリガンドに適用して抗原−抗体間の結合及び解離を誘導することによって、結合(Ｋa)／解離(Ｋd)定数ＫＤ値を確認し、分析の信頼度に関連した統計学的数値であるカイ二乗△(χ2)値を確認した。
【００３２】
本発明の組換えヒト単一クローン抗体は、公知の単一クローン抗体製造技術で容易に製造され得る。例えば、単一クローン抗体を製造する方法は、兔疫された動物から得られたＢ白血球を用いてハイブリドーマを製造することにおって行われることができるとか(Koeher and Milstein，1976，Nature，256:495)、ファージディスプレイ方法を用いることによって行われることができるが、これに制限されるのではない。
【００３３】
ファージディスプレイを用いた抗体ライブラリーは、ハイブリドーマを製作なしにすぐＢリンパ球から抗体遺伝子を得てファージ表面に抗体を発現させる方法である。ファージディスプレイ技術を用いると、Ｂ−細胞不滅化によって単一クローン抗体を生成するのに関連付けられている多い難しさなどが克服され得る。
【００３４】
従来のファージディスプレイ技術は、１）ファージの外皮タンパク質ｐIII (またはｐIV)Ｎ−末端に該当する遺伝子部位にランダムな配列を有したオリゴヌクレオチドを挿入する段階；２）天然型の外皮タンパク質の一部と前記ランダムな配列を有したオリゴヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの融合タンパク質を発現させる段階；３）前記オリゴヌクレオチドによってコードされたポリペプチドと結合できる受容体物質を処理する段階；４）受容体に結合されたペプチド−ファージ粒子などを低いｐＨまたは結合競争力を有する分子を用いて溶出させる段階；５）パニングによって溶出されたファージを宿主細胞内で増幅させる段階；６）所望のファージの量を得るために前記方法を繰り返す段階；及び７）パニングによって選別されたファージクローンなどのＤＮＡ配列から活性があるペプチドの配列を決定する段階から構成される。
【００３５】
好ましい一つの実施形態において、本発明の組換えヒト単一クローン抗体の製造方法は、ファージディスプレイ方法を用いて行われることができる。当業者は公知のファージディスプレイ技術、例えば、Ｂａｒｂａｓら(METHODS : A Companion to Methods in Enzymology 2: 119，1991 and J．Virol．2001 Jul;75(14):6692-9)及びＷｉｎｔｅｒら(Ann．Rev．Immunol．12:433、 1994)の論文などに公知された方法を参考して、前記本発明の製造方法の各段階を容易に行うことができる。抗体ライブラリーを構築するために使用され得るファージは、例えば、フィラメント性ファージとして、ｆｄ、Ｍ１３、ｆ１、Ｉｆ１、Ｉｋｅ、Ｚｊ／Ｚ、Ｆｆ、Ｘｆ、Ｐｆ１及びＰｆ３があるが、これに制限されるのではない。また、前記フィラメント性ファージの表面上に異種遺伝子の発現のために使用され得るベクターには、例えば、ｆＵＳＥ５、ｆＡＦＦ１、ｆｄ−ＣＡＴ１またはｆｄｔｅｔＤＯＧなどのファージベクター、またはｐＨＥＮ１、ｐＣｏｍｂ３、ｐＣｏｍｂ８またはｐＳＥＸなどのファージミドベクターがあるが、これに制限されるのではない。
【００３６】
さらに、増幅のための組換えファージの成功的な再感染のために要求される野生型外皮タンパク質を提供するために使用され得るヘルパーファージには、例えば、Ｍ１３Ｋ０７またはＶＳＣＭ１３などがあるが、これに制限されるのではない。
【００３７】
本発明の具体的な実施例では、ヒトＶＣＡＭ−１に特異的なヒト抗体をファージ表出技術を用いてｓｃＦｖとして取得し、単一ファージクローン形態でスクリーニングすることによって、ヒトＶＣＡＭ−１に特異的な２０種の単一クローンファージを取得した。
【００３８】
本発明の具体的な実施例では、組換え技術で取得したＶＣＡＭ−１の分子量及び純度を確認した後、単一クローン抗体の製造に用いた。前記ＶＣＡＭ−１を多様性を有したヒト未加工ｓｃＦｖライブラリー細胞から製造したライブラリーファージと反応した後、パニングとＶＣＡＭ−１抗原に強く結合する単一クローン抗体をスクリーニングした(表１参照)。前記選別された単一クローン抗体などをフィンガープリントによって確認した後、それぞれの配列を分析して抗体のＶＨとＶＬのＣＤＲ領域を確認した。前記抗体と生殖系列抗体群との間の相同性をＮＣＢＩウェブサイトのＩｇ ＢＬＡＳＴプログラム(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)を用いて確認した。その結果、ＶＣＡＭ−１に特異的な２０種のファージ抗体を得た。
【００３９】
さらに、本発明の具体的な実施例によれば、前記選別された２０種のヒト抗体ファージの重鎖及び軽鎖またはその免疫学的に活性を有した断片をエンコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを製作した。前記発現ベクターの製作時には、前記ヒト抗体の軽鎖及び重鎖またはその断片を生産しようとする宿主細胞の種類に応じてプロモーター、ターミネーター、エンハンサーのような発現調節因子及び膜標的化または分泌のための配列を適切に選択し、目的のために多様に組み合わせるのに使用することができる。
【００４０】
本発明の発現ベクターは、プラスミドベクター、コズミドベクター、バクテリオファージベクター及びウイルスベクターなどを含むが、これに制限されない。適当な発現ベクターは、プロモーター、オペレータ、開始コドン、終結コドン、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサーのような発現調節因子の他にも膜標的化または分泌のためのシグナル配列またはリーダー配列を含み、その目的に応じて多様な形態で製造され得る。
【００４１】
さらに、本発明の一つの実施形態によれば、本発明は、前記組換えヒト単一クローン抗体と結合するヒトＶＣＡＭ−１抗原のドメインの位置を確認する方法を提供する。ＶＣＡＭ−１は、ＩｇＧ−類似ドメイン７つから構成されており、実質的に、その相手リガンドであるインテグリン(α４β１またはα４β７)と結合する時は、そのドメイン１とドメイン４が主に関与する。従って、本発明による組換えヒト単一クローン抗体に対するＶＣＡＭ−１抗原のエピトープを確認するために、下記の過程が具体的な実施例で行われた。
【００４２】
本発明者らは、ヒトＶＣＡＭ−１抗原をドメイン別(ＶＤ２、ＶＤ４、ＶＤ７)で発現及び精製した後、酵素免疫吸着法(ＥＬＩＳＡ)を用いて２０種に対する抗体などの抗原結合領域を分析した。その結果、抗体種類によって抗原結合領域が異なり、それらのうち、ドメイン１または２に結合する抗体Ｈ６及び７ＨＴを得た(図２参照)。
【００４３】
さらに、本発明による組換えヒト単一クローン抗体は、ヒトＶＣＡＭ−１抗原に対する親和度を提供する。本発明の具体的な実施例で、ビアコア分析によって抗体のヒトＶＣＡＭ−１抗原に対する結合／解離定数(ＫＤ)を求めることによって、親和度を確認することができた。Ｈ６抗体及び７ＨＴ抗体は、ヒトＶＣＡＭ−１に強い親和度を有していることと確認された(図３参照)。その結果、ヒトＶＣＡＭ−１抗原に対してＨ６抗体が約０．６ｎＭ水準の優れた結合力を有しており、７ＨＴ抗体はヒトＶＣＡＭ−１抗原に対して約６．３ｎＭ水準の結合力を有することと確認された。
【００４４】
従って、本発明による組換えヒト単一クローン抗体は、生物学的試料内の組換えヒト単一クローン抗体とＶＣＡＭ−１の間の抗原−抗体反応を介して検出する段階を含むＶＣＡＭ−１検出方法及び検出用組成物で使用することができる。
【００４５】
さらに、本発明の具体的な実施例では、白血球と活性化された内皮細胞間の相互作用がＶＣＡＭ−１によって媒介されるから、本発明による組換えヒト単一クローン抗体(Ｈ６)がヒト白血球(Ｕ９３７細胞)と組換えヒトＶＣＡＭ−１またはヒトＴＮＦ−αで刺激したヒト内皮細胞(ＨＵＶＥＣ)間の接合を阻害させ得ることを確認した。本発明の一つの実施形態によれば、ヒトＶＣＡＭ−１が固定化された固体支持体であるプレートまたはＨＵＶＥＣ単層プレートに前記の抗体などを濃度別に処理する。蛍光標識されたＵ９３７細胞が抗原に結合することを阻害することができるかどうかを確認してみるために、蛍光強度を測定した。その結果、前記抗体が接合阻害能を示した。特に、前記抗体は低い抗体濃度でも強い阻害能を示した(図４及び図５参照)。
【００４６】
また、本発明では、白血球と活性化された内皮細胞間の相互作用がＶＣＡＭ−１によって媒介されるから、本発明による組換えヒト単一クローン抗体がヒト白血球(Ｕ９３７細胞)とヒトＴＮＦ−αで刺激させたヒト内皮細胞(ＨＵＶＥＣ)間の相互作用の中でヒト白血球細胞のヒト内皮細胞単層透過を阻害させ得ることを確認した。本発明の実施例において、トランスウェル(transwell)プレートに敷かれたＨＵＶＥＣ単層に前記の抗体を処理した後、Ｕ９３７細胞による ＨＵＶＥＣ単層透過性をトランスウェルの下端に集められたＵ９３７細胞数を計数して確認した。その結果、前記抗体が強い透過阻害能を示した(図６参照)。
【００４７】
さらに、ＶＣＡＭ−１抗体(７ＨＴ)をＶＣＡＭ−１を発現するマウス大動脈内皮細胞に処理した時、炎症細胞の付着及び透過が効果的に抑制されることを確認した。その後、高脂質食餌を実施したマウスにＶＣＡＭ−１抗体(７ＨＴ)を腹腔投与時、大動脈内皮細胞に特異的に付着することを確認した(図１１)。ＶＣＡＭ−１抗体(７ＨＴ)の心血管疾患での治療効果可否を調査するために、ＡｐｏＥ−／−マウスを４つのグループに分けた。１グループでは、一般食餌と共にＰＢＳを週２回投与し、２グループは、高脂質食餌と共に対照群抗体として４ＢＴ(１０ｍｇ／ｋｇ)を週２回投与し、３グループは、高脂質食餌と共にＶＣＡＭ−１抗体として７ＨＴ(低濃度である１ｍｇ／ｋｇ)を週２回投与し、４グループは、高脂質食餌とＶＣＡＭ−１抗体として７ＨＴ(高濃度である１０ｍｇ／ｋｇ)を週２回ずつ１２週間投与した。その後、動脈硬化症分析のために、大動脈病変に対するエンフェース技法を行い、２グループに比べて４グループで動脈硬化症が有意的に減少することを確認することができた(図１７及び１８)。また、大動脈弓に形成された動脈硬化症を確認するために、心臓凍結切片を順次に用意して分析した。その結果、３、４グループで動脈硬化症が減少したことを確認した(図１９〜図２１)。血液分析によってこのような結果がコレステロール代謝／排出による影響ではないということを確認した(図１５)。また、実験期間中に測定した体重及び食餌飼料量の有意的な差がなかった(図１４)。実験後、抗体によって肝臓毒性を示すのか確認するために、毒性テストを実施した(図１５)。ＶＣＡＭ−１抗体(７ＨＴ)がＶＣＡＭ−１機能を抑制することによって、動脈硬化症を緩和させたこととして確認した。
【００４８】
従って、このような本発明の組換えヒト単一クローン抗体は、ヒト内皮細胞に発現されるＶＣＡＭ−１と強い親和度を有するため、ＶＣＡＭ−１に対する抗原認識を要求する任意の適用で使用され得る。特に、活性化された内皮細胞に対する白血球の接合と透過を効果的に阻害させるので、炎症性疾患、心血管疾患及び癌などのようなＶＣＡＭ−１媒介性疾患に対する効果的な診断及び治療方法を提供する。
【００４９】
従って、別の実施形態によって、本発明は、炎症性疾患または癌が疑われる個体の生物学的試料内で組換えヒト単一クローン抗体とＶＣＡＭ−１との間の抗原−抗体反応を介して検出する段階を含む炎症性疾患、心血管疾患または癌の診断に必要な情報の提供方法及び炎症性疾患、心血管疾患または癌の診断用組成物を提供する。
【００５０】
つまり、ヒトＶＣＡＭ−１に特異的に結合する単一クローン抗体を含む診断用組成物を使用してＶＣＡＭ−１の発現と関連した疾患またはＶＣＡＭ−１媒介される疾患、例えば、炎症性疾患、心血管疾患または癌を診断することができる。
【００５１】
前記炎症性疾患は、腫瘍壊死因子−α(ＴＮＦ−α)媒介性疾患及び大腸疾患から構成される群から選択され得るが、これに制限されるのではない。好ましくは、前記腫瘍壊死因子−α(ＴＮＦ−α)媒介性疾患は、喘息、糖尿病、ブドウ膜炎、強直性脊椎炎、敗血症、内毒素ショック、血流力学ショック、敗血症症侯群、虚血性再灌流損傷、マラリア感染、マイコバクテリア感染、髄膜炎、乾癬、うっ血性心不全、線維症疾病、カヘキシー、移植拒否、自己免疫疾病、エイズ関連日和見感染症、関節炎、リウマチ性脊椎炎、痛風、強直性痛風炎、クローン疾病、潰瘍性膀胱三角炎、多発性硬化症、癩性結節性紅斑(ＥＮＬ)、放射線障害及び酸素過多性肺胞損傷からなる群から選択され得る。
【００５２】
さらに、前記心血管疾患は、心筋梗塞、心臓麻痺、脳卒中、不整脈、高血圧、高脂血症及び動脈硬化から構成される群から選択され得る。
【００５３】
さらに、前記癌は、脳脊髓腫瘍、頭頸部癌、肺癌、乳房癌、胸腺種、中皮腫、食道癌、胃癌、大腸癌、肝臓癌、膵臓癌、胆嚢癌、腎臓癌、前立腺癌、睾丸癌、生殖細胞腫、卵巣癌、子宮頚部癌、子宮内膜癌、リンパ腫、急性白血病、慢性白血病、多発性骨髄腫、肉腫、悪性黒色腫、及び皮膚癌からなる群から選択され得る。
【００５４】
さらに、前記診断用組成物には、本発明による組換えヒト単一クローン抗体を含むことができる。
【００５５】
本明細書で使用された用語“生物学的試料”とは、組織、細胞、全血、血清、血漿、組織剖検試料(脳、皮膚、リンパ節、脊髓など)、細胞培養上澄液、破裂した真核細胞及び細菌発現系を挙げることができるが、これに制限されるのではない。これらの生物学的試料を操作するとか操作しない状態で本発明の抗体と反応させ、ＶＣＡＭ−１タンパク質の存在またはＶＣＡＭ−１媒介性疾患の有無を確認することができる。
【００５６】
本明細書で使用された用語“抗原−抗体複合体”とは、試料中のＶＣＡＭ−１抗原とこの抗原を認識する本発明による単一クローン抗体の結合物を意味する。このような抗原−抗体複合体の形成は、比色法、電気化学法、蛍光法、発光法 (luminometry)、粒子計数法、目視測定法(visual assessment)及び閃光計数法(scintillation counting method)からなる群から選択される任意の方法で検出することができる。しかし、この方法は、前記例などに制限されず多様な応用が可能である。
【００５７】
本発明では、抗原−抗体複合体を検出するために様々な標識体を使用することができる。その具体的な例としては、酵素、蛍光物、リガンド、発光物、微粒子及び放射性同位元素からなる群から選択され得るが、それらに限定されるのではない。
【００５８】
標識として使用され得る物質などの好適な例は、酵素としてアセチルコリンエステラーゼ、アルカリホスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ及びβ−ラクタマーゼ；蛍光物としてフルオレセイン、Ｅｕ3+、Ｅｕ3+キレート及びクリブテート；リガンドとしてビオチン誘導体；発光物としてアクリジニウムエステル、イソルミノール誘導体；微粒子としてコロイド金、着色されたラテックス；放射性同位元素として５７Ｃｏ、３Ｈ、１２５Ｉ、１２５Ｉ−ボルトンハンター(Bonton Hunter)試薬を含む。
【００５９】
好ましくは、抗原−抗体複合体を酵素免疫吸着法(ＥＬＩＳＡ)を用いて検出することができる。ＥＬＩＳＡ技法には、支持体に付着した抗原を認識する標識された抗体を用いる直接的ＥＬＩＳＡ；支持体に付着した抗原である抗原−抗体の複合体で捕獲抗体を認識する標識された２次抗体を用いる間接的ＥＬＩＳＡ；支持体に付着した抗原−抗体の複合体で抗原を認識する標識された別の抗体を用いる直接的サンドイッチＥＬＩＳＡ；及び固体支持体に付着した抗体と抗原の複合体で抗原を認識する別の抗体と反応させた後、この抗体を認識する標識された２次抗体を用いる間接的サンドイッチＥＬＩＳＡを含む。前記単一クローン抗体は、検出標識を持つことができ、検出標識を持たない場合はこれらの単一クローン抗体を捕獲することができ、検出標識を持つ他の抗体を処理して抗原−抗体複合体を確認することができる。
【００６０】
ヒトのＶＣＡＭ−１と特異的に結合する本発明の組換えヒト単一クローン抗体は、単独で、または通常の薬剤学的に許容される担体とともに炎症性疾患、心血管疾患または癌に対する予防及び治療用薬剤学的組成物の形態で使用可能である。
【００６１】
従って、さらに別の実施形態において、本発明は、組換えヒト単一クローン抗体及び薬剤学的に許容可能な担体を含む炎症性疾患、心血管疾患または癌の予防または治療用組成物及び前記組成物を個体に投与する段階を含む炎症性疾患、心血管疾患または癌の治療方法を提供する。
【００６２】
本明細書で使用された用語“個体”とは、ウマ、イヌ、ネコ、ブタ、ヤギ、ウサギ、ハムスター、サル、モルモット(guinea pigs)、ラット、マウス、トカゲ、ヘビ、羊、牛、魚及び鳥を含んで任意の動物(例えば、ヒト)を意味する。
【００６３】
本明細書で使用される用語“予防”とは、本発明による組換えヒト単一クローン抗体及び薬剤学的に許容可能な担体を含む組成物の投与によって前記疾患の発病を抑制または遅延させるすべての行為を意味する。
【００６４】
本明細書で使用される用語“治療”とは、本発明による組換えヒト単一クローン抗体及び薬剤学的に許容可能な担体を含む組成物の投与によって前記疾患の症状が好転するとか良いに変更するすべての行為を意味する。
【００６５】
本発明の組換えヒト単一クローン抗体は、多様な目的のために他の抗体、生物学的活性を有する製剤または物質と組み合わせて使用され得る。例えば、本発明の組換えヒト単一クローン抗体は、内皮細胞でＶＣＡＭ−１発現によって特徴付けられる疾患などの治療で他の抗ＶＣＡＭ−１抗体と組み合わせて使用され得る。また、本発明の組換えヒト単一クローン抗体は、炎症反応で示される他の内皮細胞受容体(例えば、ＥＬＡＭ１、ＩＣＡＭ１など)を認識する抗体などと公知の炎症性疾患治療薬物と組み合わせて使用され得る。
【００６６】
前記炎症性疾患は、腫瘍壊死因子−α(ＴＮＦ−α)媒介性疾患、及び大腸疾患から構成される群から選択されるものであり得るが、これに制限されるのではない。好ましくは、前記腫瘍壊死因子−α(ＴＮＦ−α)媒介性疾患は、喘息、糖尿病、ブドウ膜炎、強直性脊椎炎、敗血症、内毒素ショック、血流力学ショック、敗血症症侯群、虚血性再灌流損傷、マラリア感染、マイコバクテリア感染、髄膜炎、乾癬、うっ血性心不全、線維症疾病、カヘキシー、移植拒否、自己免疫疾病、エイズ関連日和見感染症、関節炎、リウマチ性脊椎炎、痛風、強直性痛風炎、クローン疾病、潰瘍性膀胱三角炎、多発性硬化症、癩性結節性紅斑(ＥＮＬ)、放射線障害及び酸素過多性肺胞損傷からなる群から選択され得る。
【００６７】
さらに、前記心血管疾患は、心筋梗塞、心臓麻痺、脳卒中、不整脈、高血圧、高脂血症及び動脈硬化から構成される群から選択され得る。
【００６８】
さらに、前記癌は、脳脊髓腫瘍、頭頸部癌、肺癌、乳房癌、胸腺種、中皮腫、食道癌、胃癌、大腸癌、肝臓癌、膵臓癌、胆嚢癌、腎臓癌、前立腺癌、睾丸癌、生殖細胞腫、卵巣癌、子宮頚部癌、子宮内膜癌、リンパ腫、急性白血病、慢性白血病、多発性骨髄腫、肉腫、悪性黒色腫、及び皮膚癌からなる群から選択され得る。
【００６９】
本発明の組換えヒト単一クローン抗体を含む組成物は、薬剤学的に有効な量で単一または複数回用量投与され得る。この時、組成物は、液剤、散剤、エアロゾル、カプセル剤、腸溶皮錠剤またはカプセル剤または坐剤の形態で投与することができる。多様な種類の投与経路としては、腹腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下内投与、内皮投与、経口投与、局所投与、鼻内投与、肺内投与及び直腸内投与が考慮され得るが、本発明はこれらの例示された投与方法に制限されない。しかし、経口投与の時、ペプチドは消化されるから経口用組成物は活性薬剤をコーティングするとか胃での分解から保護されるように製剤化されなければならない。
【００７０】
さらに、製薬組成物は、活性物質が標的細胞に移動することができる任意の装置を使用して投与され得る。
【００７１】
本発明の組換えヒト単一クローン抗体を含む組成物は、薬剤学的に有効な量で投与され得る。“薬剤学的に有効な量”とは、医学的治療または予防に適用可能な合理的なアドバンテージ／リスクの割合で疾患を治療または予防するのに十分な量を意味する。有効用量水準は、疾患の重症度；薬物の活性；患者の年齢、体重、健康及び性別；患者の薬物に対する敏感度；使用された本発明組成物の投与時間、投与経路及び排出の割合；治療期間；または使用された本発明の組成物と配合または同時に使用される薬物を含んだ要素及びその他の医学分野によく知られている他の要素に応じて決定され得る。さらに、本発明の単一クローン抗体組成物は、個別治療剤で投与するとか他の治療剤と組み合わせて投与されることができ、また、従来の治療剤とは順次または同時に投与され得る。
【００７２】
本発明の薬剤学的組成物を薬剤学的に有効な量で投与する場合、ＶＣＡＭ−１と強い親和度を有した本発明の組換えヒト単一クローン抗体が内皮細胞に発現されたＶＣＡＭ−１に特異的に結合することによって、ＶＣＡＭ−１を中和させる。結局、本発明の組換えヒト単一抗体が前記内皮細胞に白血球が接合することを阻害し、内皮細胞内に白血球が透過することを阻害することによって、炎症性疾患、心血管疾患及び癌を治療することができる。前記炎症性疾患は、腫瘍壊死因子−α(ＴＮＦ−α)媒介性疾患、及び大腸疾患から構成される群から選択されることができ、これに制限されるのではない。好ましくは、前記腫瘍壊死因子−α(ＴＮＦ−α)媒介性疾患は、喘息、糖尿病、ブドウ膜炎、強直性脊椎炎、敗血症、内毒素ショック、血流力学ショック、敗血症症侯群、虚血性再灌流損傷、マラリア感染、マイコバクテリア感染、髄膜炎、乾癬、うっ血性心不全、線維症疾病、カヘキシー、移植拒否、自己免疫疾病、エイズ関連日和見感染症、関節炎、リウマチ性脊椎炎、痛風、強直性痛風炎、クローン疾病、潰瘍性膀胱三角炎、多発性硬化症、癩性結節性紅斑(ＥＮＬ)、放射線障害及び酸素過多性肺胞損傷からなる群から選択され得る。
【００７３】
さらに、前記心血管疾患は、心筋梗塞、心臓麻痺、脳卒中、不整脈、高血圧、高脂血症及び動脈硬化から構成される群から選択され得る。
【００７４】
さらに、前記癌は、脳脊髓腫瘍、頭頸部癌、肺癌、乳房癌、胸腺種、中皮腫、食道癌、胃癌、大腸癌、肝臓癌、膵臓癌、胆嚢癌、腎臓癌、前立腺癌、睾丸癌、生殖細胞腫、卵巣癌、子宮頚部癌、子宮内膜癌、リンパ腫、急性白血病、慢性白血病、多発性骨髄腫、肉腫、悪性黒色腫、及び皮膚癌からなる群から選択され得る。
【００７５】
さらに、本発明のさらに別の実施形態によれば、本発明は、本発明による組換えヒト単一クローン抗体を用いて白血球及び活性化された内皮細胞間の接合及び前記活性化された内皮細胞への白血球の透過を阻害する方法を提供する。つまり、ＶＣＡＭ−１は炎症及び免疫拒否において活性化された白血球上に発現されるＶＬＡ−４(very late antigen-4)及びα４β１インテグリンと結合し、内皮細胞と単核球及びＴ細胞を含む白血球の間の相互作用を促進させる重要な役割を果たす。本発明による単一クローン抗体は、このようなＶＣＡＭ−１に特異的に結合して、白血球及び活性化された内皮細胞間の接合及び前記活性化された内皮細胞への白血球の透過を阻害させる。
【００７６】
本明細書で引用された多様な文献などは、その全部が参考文献として組み込まれる。当該技術の分野における熟練者らはただ通常的な実験によって、多数の均等な実施形態などが本明細書で考慮され得ることを認識または認めるだろう。従って、このような均等なものなどは本特許請求の範囲に含まれる。
【実施例】
【００７７】
以下、実施例によって本発明をより詳細に説明する。しかし、下記の実施例は、ただし、本発明を例示するための目的として提供されるもので、本発明が下記実施例に限定されるのではない。
【００７８】
１．ヒト及びマウスＶＣＡＭ−１抗原の製作
１．１．ヒトＶＣＡＭ−１のクローニング
韓国生命工学研究院(ＫＲＩＢＢ)人間遺伝体機能研究事業団のＫＵＧＩ(Korean UniGene Information)からヒトＶＣＡＭ−１遺伝子を含有するプラスミド(ｈＭＵ０１２６５０)(Ｋｕｇｉ ＃ ＩＲＡＵ−７５−Ｇ０２)を分譲受けた。前記プラスミドを鋳型ＤＮＡとして使用し、前記ＶＣＡＭ−１のＤ１−Ｄ２ドメインとＤ１−Ｄ４ドメインのみを発現させるために、ＶＣＡＭ−１のＤ１−Ｄ２ドメインの場合、正方向プライマー(５’−ＣＡＧＧＧＧＧＣＣＧＴＧＧＧＧＧＣＣＴＴＴＡＡＡＡＴＣＧＡＧＡＣＣＡＣＣＣＣ−３’)及び逆方向プライマー(５’−ＴＡＧＣＧＧＣＣＧＡＣＧＣＧＧＣＣＡＡＴＴＧＣＡＡＴＴＣＴＴＴＴＡＣＡＧＣＣＴＧ−３’)を使用し、ＶＣＡＭ−１のＤ１−Ｄ４の場合、正方向プライマー(５’−ＣＡＧＧＧＧＧＣＣＧＴＧＧＧＧＧＣＣＴＴＴＡＡＡＡＴＣＧＡＧＡＣＣＡＣＣＣＣ−３’)と逆方向プライマー(５’−ＴＡＧＣＧＧＣＣＧＡＣＧＣＧＧＣＣＡＡＧＡＧＣＴＣＣＡＣＣＴＧＧＡＴＴＣＣＣＴ−３’)を使用して各遺伝子を増幅した。ｓｆｉＩで処理した後、リガーゼを用いてｐＹＫ６０２−ＦｃベクターとｐＹＫ６０２−Ｈｉｓ ｏｎｌｙベクター(ＫＲＩＢＢで製造したベクター)にそれぞれクローニングした。ＰＣＲ産物などは、次のような条件で取得した：全体反応液が５０μｌの時、鋳型は１００ｎｇになるように入れ、９４℃で２分間反応させた後、９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分３０秒(Ｄ１−Ｄ４)、４５秒(Ｄ１−Ｄ２)で３０サイクル、その後、７２℃で１０分間反応させた。また、前記クローニングされたｐＹＫ６０２−ＦＣ−ＶＣＡＭ−１−Ｄ１−Ｄ２、ｐＹＫ６０２−Ｈｉｓ−ＶＣＡＭ−１−Ｄ１−Ｄ２、ｐＹＫ６０２−ＦＣ−ＶＣＡＭ−１−Ｄ１−Ｄ４及びｐＹＫ６０２−Ｈｉｓ−ＶＣＡＭ−１−Ｄ１−Ｄ４ベクターなどの塩基配列を確認した。
【００７９】
１．２．ＶＣＡＭ−１タンパク質の発現及び精製
様々なタンパク質のうち、分子全体を含むｈＶＣＡＭ−Ｆｃ−キメラ(R&D system, cat#: 862-VC)とｍＶＣＡＭ−１−Ｆｃキメラ(R&D systems, Cat#: 643-VM)とは、商業的に購買し、ＶＣＡＭ−１ドメイン別の断片の発現及び精製は以下のように行われた。
【００８０】
先ず、１５０ｍｍ直径ディッシュ１０枚に５×１０6２９３Ｅ細胞を播いた後、翌日に前記クローニングされたｐＹＫ６０２−ＶＣＡＭ−１−Ｄ１−Ｄ２ベクターとｐＹＫ６０２−ＶＣＡＭ−１−Ｄ１−Ｄ４ベクターとをそれぞれ２０μｇずつＰＥＩ(23966:Polysciences,Inc, USA)を処理して形質転換した。翌日培地を無血清ＤＭＥＭに置き換えた後、二日ごとに上澄液を得て１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで電気泳動した後、ウエスタンブロットで発現量を確認した。
【００８１】
ｈＶＣＡＭ−１−Ｄ１−Ｄ２−ＦｃとｈＶＣＡＭ−１−Ｄ１−Ｄ４−Ｆｃとの発現が確認された上澄液を集めた後、０．２２μｍトップフィルター(Millipore，Cat#:SCGP T05 RE)を使用してろ過した後、先ず、十分なタンパク質量を確保した。前記タンパク質などは精製した後に使用し、精製過程は次の通りである。まず、エコノカラム(Econo-column)(Bio-Rad Cat．No 737-1006，1×5cm)をＰＢＳで洗浄した後、タンパク質Ａ(Amersham Cat．No．17-1279-30)５００μｌをパッキングする。パッキングする間、ＰＢＳ(ｐＨ７．４)１０ｍｌをカラムに適用させ、ビーズを洗浄し、結合バッファーである２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー(ｐＨ７．０)３０ｍｌを流した。その後、得られた上澄液をペリスタルティック・ポンプ(Peri-staltic pump)(Bio-Rad Cat．No．731-8142)を用いて流量０．５ｍｌ／分程度に適用させた。カラムに結合させた後、ＰＢＳで流量２ｍｌ／分で１時間程度洗浄した後、溶出した。０．１Ｍグリシン−ＨＣｌ(ｐＨ２．５)５００μｌで溶出し、１／１０体積の１Ｍトリス−ＨＣｌ(ｐＨ９．０）を入れて中和させた。６つの溶出分画の中でタンパク質は＃１〜＃２分画に大部分溶出された。これら２つの分画は、１０Ｋ透析膜に入れて４ＬのＰＢＳでｏ／ｎ透析した。前記のすべての過程は、４℃のコールドルームで行われた。定量後、生成物などをアリコットして−７０℃に保管した。精製した後、生成物を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで確認した。ｈＶＣＡＭ−１−Ｄ１−Ｄ２−ＦｃとｈＶＣＡＭ−１−Ｄ１−Ｄ４−Ｆｃに対して、それぞれ２．８ｍｇと８００μｇの量を得た。ｈＶＣＡＭ−１−Ｄ１−Ｄ２−ｈｉｓとｈＶＣＡＭ−１−Ｄ１−Ｄ４−ｈｉｓの発現が確認された上澄液を収集した後、０．２２μｍのトップフィルター(Millipore，Cat#: SCGP T05 RE)を使用してろ過した後、ＬａｂＳｃａｌｅ ＴＦＦ Ｓｙｓｔｅｍ(Millipore，Cat#: XX42LSS11)のｐｅｌｌｉｃｏｎ ＸＬ ｍｅｍｂｒａｎｅ(Millipore，8K，cat #: PXB0 08A 50)を用いて１／１０体積で濃縮した。１０倍体積のＩＭＡＣ緩衝溶液(３００ｍＭのＫＣｌ、５０ｍＭのＫＨ2ＰＯ4、５ｍＭのイミダゾール、ｐＨ８．０)を濃縮物に添加し、ＩＭＡＣ緩衝溶液に置き換えた。ＰｒｏｆｉｎｉａＴＭタンパク質精製システム(Bio-Rad)のＢｉｏ−Ｓｃｌｅ Ｍｉｎｉ ｐｒｏｆｉｎｉｔｙ ＩＭＡＣ ｃａｒｔｒｉｄｇｅ(cat#:732-4610)を使用して１ｍｌ／分の速度で製造社のマニュアルによって精製した。前記溶出液をメンブレン(10K，132574:SPECTRAPOR，USA)に入れた後、４℃で４ＬのＰＢＳ溶液に４時間以上緩衝溶液を置き換えた後、再び予め冷たくしておいた４ＬのＰＢＳ溶液に入れて一晩透析して緩衝溶液を置き換えた。一晩透析した後、その産物をｅ−チューブに移し、ブラッドフォード(Bradford)方法でタンパク質濃度を測定した。その結果、４００μｇのｈＶＣＡＭ−１−Ｄ１−Ｄ４−ｈｉｓ、ｈＶＣＡＭ−１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃタンパク質を得り、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで確認した。
【００８２】
２．ライブラリーファージの製造
多様性を持ったヒトｓｃＦｖライブラリー細胞２×１０10個をアンピシリン５０μｇ／ｍｌ、２％グルコースを含むＳＢ培地［バクトトリプトン３０ｇ、イースト抽出物２０ｇ、ＭＯＰＳ１０ｇ、ｐＨ７．０］で３７℃で２〜３時間培養した（ＯＤ600＝０．５）。その後、細胞をＶＣＳＭ１３ヘルパーファージに感染させた後、カナマイシンを７０μｇ／ｍｌで追加した培地で１ｍＭのＩＰＴＧを添加して３０℃で１６時間培養した。培養した細胞を遠心分離(４５００ｒｐｍ、１５分、４℃)した後、上澄液を得て、４％ＰＥＧ６０００と３％のＮａＣｌが添加された溶液に溶解した後、氷中で１時間反応させた。前記反応物を再び遠心分離(８０００ｒｐｍ、２０分、４℃)した。ペレットにＰＢＳを添加して溶解した後、遠心分離(１２０００ｒｐｍ、１０分、４℃)した。その結果、ライブラリーファージを含む上澄液を得り、これを新しいチューブに入れて４℃で保管した。
【００８３】
３．ファージディスプレイによるバイオパニング
７つのＩｇＧ−類似ドメインから構成されているＶＣＡＭ−１は、そのリガンドであるα４β１インテグリン(α4β1 integrin)と結合する時、そのドメイン１とドメイン４が結合モチーフとして機能をすると知られている。従って、ＶＣＡＭ−１全体分子だけでなくヒトＶＣＡＭ−１−Ｄ１−Ｄ４(ｈＶＣＡＭ−１−Ｄ１−Ｄ４)を用いてパニングを進行した。本実施例では、ｈＶＣＡＭ−１−Ｄ１−Ｄ４に対するパニング方法と結果が記載されるだろう。
【００８４】
３．１．ｈＶＣＡＭ−１−Ｄ１−Ｄ２抗原とｈＶＣＡＭ−１−Ｄ１−Ｄ４抗原に対するバイオパニング
ヒト組換えＶＡＣＭ−１(R&D system，809-VR)抗原が１０μｇ／ｍｌでコーティングされたＩｍｍｕｎｏｓｏｒｂチューブ(Ｎｕｎｃ４７０３１９)をスキムミルク／ＰＢＳで先に遮断させた後、室温で１〜２時間上記で製造したライブラリーファージ(１×１０12ｃｆｕ)とともに培養した。前記チューブをＴＢＳＴ(０．０５％)で３回洗浄した。結合されたファージを室温で１０分間１ｍｌの新たに製造した１００ｍＭのトリエチルアミンの溶液を使用して溶出させた。溶出されたファージなどを１Ｍのトリス(ｐＨ７．４)溶液で中和した後、大腸菌(ＥＲ２５３７)に感染させて３７℃で１時間培養した。感染された大腸菌は、２％グルコースとアンピシリンが含まれたＬＢ−アガロース培地プレート(直径１５ｃｍ)に塗布して、３７℃で１６時間培養した。培養された大腸菌を５ｍｌのＳＢに分散し、このうち、５０ｍｌをＳＢ−アンピシリン−グルコース２０ｍｌに接種し、＜１．ライブラリーファージの製造＞の方法によって結合型ファージを含む溶液を得て次数のパニングに使用した。１次パニングの以後２次〜４次パニングではＩｍｍｕｎｏｓｏｒｂチューブにｈＶＣＡＭ−１−Ｄ１−Ｄ２抗原とｈＶＣＡＭ−１−Ｄ１−Ｄ４抗原をそれぞれコーティングして、それぞれのパニングを進行した(表１参照)。
【００８５】
【表１】
【００８６】
３．２．ｈＶＣＡＭ−１−Ｄ１−Ｄ４抗原に対する単一クローン抗体選別
４次パニングの後、アウトプットタイタープレートから単一コロニーを滅菌されたトゥースピック(toothpick)を使用してそれぞれ抜き取って、ＳＢ−アンピシリン培地(２００μｌ／ウェル)が入っている９６ウェルプレートにそれぞれ接種した後、３７℃で２〜３時間(ＯＤ600＝０．５〜０．７)培養した。以後、各ウェルに２０μｌの１０ｍＭのＩＰＴＧを入れて３０℃で１６時間培養した。９６ウェル免疫プレート(Ｃｏｓｔａｒ３６９０)の各ウェルにｈＶＣＡＭ−１−Ｄ１−Ｄ４抗原をウェル当り２５０ｎｇずつ３７℃で１時間コーティング緩衝溶液で処理してコーティングした後、ＰＢＳに溶解したスキムミルク(３％)を使用して各ウェルを遮断した。４次パニングｓｃＦｖファージを先に遠心分離した後(３０００ｒｐｍ、１５分)、上澄液を除去した。ＴＥＳバッファー６０μｌずつ各ウェルに添加した後、氷中で３０分間培養した。その後、遠心分離し(３０００ｒｐｍ、１５分)、それぞれの上澄液を３％スキムミルク／ＰＢＳが除去されたＶＣＡＭ−１−Ｄ１−Ｄ４抗原がコーディングされた９６ウェル免疫プレートにウェル当り２５μｌずつ入れた。
【００８７】
各ウェルごとにＰＢＳ−ｔｗｅｅｎ２０(０．０５％)０．２ｍｌで４回洗浄した後、３％スキムミルク／ＰＢＳに１：３０００の割合で希釈された二次抗体抗−ＨＡ−ＨＲＰ(Santa Cruz，SC-7392)を各ウェルごとに２５μｌずつ添加した後、１時間反応じた。ＰＢＳ−ｔｗｅｅｎ２０(０．０５％)０．２ｍｌで４回洗浄した後にＴＭＢ溶液を各ウェル当り２５μｌずつ添加した後、５分間放置した。反応後、すぐに１ＭのＨ2ＳＯ4溶液を２５μｌずつ各ウェルに入れて反応を停止させた後、４５０ｎｍで吸光度を分光光度計(MolecularDevice，USA)を用いて測定した。
【００８８】
その結果、ｈＶＣＡＭ−１−Ｄ１−Ｄ４抗原に対する７８個の単一ファージクローンなどの結合能を比較確認し、それらの種類をフィンガープリントと配列分析で確認した。最後に、２０種の互いに異なるファージ抗体を選別した。
【００８９】
４．全体ＩｇＧ形態へのクローニング
ｈＶＣＡＭ−１に対する単一クローンファージ抗体などをファージからＩｇＧ全体ベクターに転換するために、重鎖を得るために単一クローンＤＮＡ１μｌと１０ｐｍｏｌｅ／μｌの重鎖正方向プライマーと重鎖逆方向プライマー、１０×バッファー５μｌ、１０ｍＭのｄＮＴＰミックス１μｌ、ｐｆｕＤＮＡ重合酵素(Solgent，２．５Ｕ／μｌ)０．５μｌ及び蒸溜水を使用してコロニーＰＣＲ(iCycler iQ，BIO-RAD)を行った。また、軽鎖を得るために軽鎖正方向及び逆方向プライマー を使用して同様の方法でコロニーＰＣＲを行った。
【００９０】
ＰＣＲから取得した重鎖ＤＮＡをＤＮＡ−ゲル抽出キット(Qiagen)を用いて精製した後、ｐＮＡＴＡＢ Ｈベクター１μｌ(１０ｎｇ)、重鎖(１００〜２００ｎｇ)１５μｌ、１０×バッファー２μｌ、リガーゼ(１Ｕ／μｌ)１μｌ、及び蒸溜水を混合し、室温で１〜２時間放置して前記ベクターと連結した。前記ベクターをコンピテント細胞(ＸＬ１−ｂｌｕｅ)に添加した後、氷に３０分間放置した後、４２℃で９０秒間ヒートショックを与えて形質導入した。この混合物を再び氷に５分間放置した後、ＬＢ培地１ｍｌを追加した。３７℃で１時間培養した後、細胞をＬＢ Ａｍｐ固体培地に塗抹した後、３７℃で１６時間培養した。得られた単一コロニーをＬＢ Ａｍｐ液体培地５ｍｌに接種した後、３７℃で１６時間培養した。前記培養培地からＤＮＡ−ｐｒｅｐ．キット(Nuclogen)を用いてＤＮＡを抽出した。また、軽鎖ＤＮＡは、ｐＮＡＴＡＢ Ｌベクターを使用して前記と同様の方法でＤＮＡを抽出した。前記取得したＤＮＡの塩基配列分析は、ＣＭＶｐｒｏＦプライマー(ＡＡＡ ＴＧＧ ＧＣＧ ＧＴＡ ＧＧＣ ＧＴＧ)(Solgent)を用いて行われた。その結果、全体ＩｇＧに転換した多様なＶＣＡＭ−１に対する９個のクローンの重鎖と軽鎖の配列がファージ抗体の配列と同一であることを確認した。
【００９１】
５．抗体の臨時遺伝子発現
前記クローニングされた全体ＩｇＧ重鎖ＤＮＡと軽鎖ＤＮＡから臨時遺伝子発現を行った。
【００９２】
臨時遺伝子発現に対する宿主細胞としてＣＨＯ(Chinese Hamster Ovary)−Ｓ細胞を使用してリポフェクタミン２０００(Cat no.11668-019，Invitrogen)：ＤＮＡの１：１割合でＯｐｔｉ−ＭＥＭＩ(GIBCO31985，Invitrogen)混合溶液から形質転換を誘導した。臨時発現を最大化させるために、重鎖と軽鎖のＤＮＡ量の割合は１：１で構成した。形質転換用培地としては、ＲＰＭＩ１６４０(GIBCO 22400，Invitrogen)培地を使用し、細胞濃度は２×１０6細胞／ｍｌで使用した。混合溶液を２０分間反応した後、形質転換用培地に１：９割合で混合し、これをＣＯ2５％、３７℃に設定された培養器に１１０ｒｐｍで４時間培養させた。以後、８ｍＭグルタミン(GIBCO 25030, L-Glutamine 200 mM, 100×, Invitrogen)とＨＴＳ(GIBCO, HT Supplement, Cat no. 11067-030, Invitrogen)が含まれたＣＤ−ＣＨＯ培地(GIBCO 10743，Invitrogen)に形質転換された体積と同一体積の培地を添加した。フラスコはＣＯ2８％、３７℃に設定された培養器で１００ｒｐｍで４日間培養した。このように培養試料は、８、０００ｇで１５分間遠心分離して細胞残骸を除去した後、上澄液は０．２２μｍのろ過器(Corning)でろ過して抗体の分離及び精製のための培養液を準備した。
【００９３】
６．抗体の分離及び精製
実施例５で準備した上澄液を平衡化緩衝液(５０ｍＭトリス−ＨＣｌ(ｐＨ７．４)、１００ｍＭのＮａＣｌ)で平衡化させた組換えタンパク質−Ａセファロースカラム(Hitrap rProteinA FF, 5 mL, GE healthcare)に通過させた。カラムに結合された抗体を０．１ＭのＮａ−シトラート(citrate)(ｐＨ３．０)、１００ｍＭのＮａＣｌ溶液で溶出させた後、１Ｍのトリス−ＨＣｌ(ｐＨ９．０)で中和させ、ＰＢＳ(phosphate buffered saline，pH7.4，Welgene)緩衝液で透析させた。精製された抗体をＢｉｓ−トリス ４−１２％濃度勾配ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル(NuPAGE gel，Invitrogen)上で還元条件で電気泳動した。その結果、約５５ｋＤａの重鎖と約２５ｋＤａの軽鎖が観察された。
【００９４】
７．抗体の抗原親和度分析
７．１．抗原ドメインに対する親和度
７つのドメインから構成されたＶＣＡＭ−１で抗ＶＣＡＭ−１抗体が結合する位置をＥＬＩＳＡによって確認した。組換えヒトＶＣＡＭ−１ドメイン１〜２／Ｆｃキメラ(以下、‘ＶＤ２’という、A&R therapeutics)、ＶＣＡＭ−１ドメイン１〜４／Ｆｃキメラ(以下、‘ＶＤ４’という、A&R therapeutics)及びＶＣＡＭ−１ドメイン１〜７／Ｆｃキメラ(以下、‘ＶＤ７’という、R&D，862-VC)をそれぞれ２μｇ／ｍｌ濃度でマイクロプレートのウェルに一晩４℃でコーティングした。ＰＢＳを使用して前記プレートを１回洗浄した後、３％ＢＳＡ(bovine serum albumin)が添加されたＰＢＳを使用して２時間３７℃で遮断させ、７Ｈ抗体を含んでいる細胞培養培地(１：５０)を入れて２時間３７℃で培養した。０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳを使用してプレートを４回洗浄した後、組換えヒトＶＣＡＭ−１抗原に結合した抗ＶＣＡＭ−１抗体の量を抗−Ｆａｂ単一クローン抗体ホースラディッシュペルオキシダーゼが共役された(conjugated)抗−Ｆ（ａｂ′）２抗体で検出した。プレートはＴＭＢ基質溶液(３、３、５、５−テトラメチルベンジジン)を使用して室温で約５分間反応させ、１Ｎ(ノーマル)硫酸溶液で反応を止めた後、光学密度４５０ｎｍで測定した。Ｈ６抗体の場合、精製された抗体を１００〜１２５ｎｇ／ｍｌに希釈し、反応させた後、ホースラディッシュペルオキシダーゼが共役された抗−カッパ軽鎖抗体の作用によって検出した。
【００９５】
図２に示されたように、Ｈ６は、ＶＣＡＭ−１ドメイン１〜２(ＶＤ２)、１〜４(ＶＤ４)、１〜７(ＶＤ７)のすべてに強い結合能を持っていることを確認した。特に、Ｈ６抗体は、ＶＣＡＭ−１の７つドメインのうち、１〜２ドメイン(ＶＤ２)に優れた結合能を持っていることを確認した。また、７Ｈ抗体もＶＣＡＭ−１ドメインのうち、１〜２ドメイン(ＶＤ２)に優れた結合能を持っていることとして確認された。
【００９６】
７．２．ビアコアによる親和度分析
ヒトＶＣＡＭ−１抗原に対する抗ＶＣＡＭ−１抗体Ｈ６と７ＨＴの結合親和度を確認するために、各抗原をリガンドとしてセンサーチップ(Sensor chip CM5，BIACORE，BR-1003-99)に固定化させた後、ヒト抗体を濃度別に希釈してビアコアを用いて固定化されたリガンドに適用させて抗原−抗体間の結合及び解離反応を誘導することによって、該当抗原−抗体間の結合力を示す結合／解離定数Ｋｄ値を確認した。これに対する結果を図３に示した(参考文献：Thomas Hofer, Wisit Tangkeangsirisin, Michael G. Kennedy, Rose G. Mage, Stephen J. Raiker, Karthik Venkatesh, Hakjoo Lee, Roman J. Giger, Christoph Rader Chimeric rabbit/human Fab and IgG specific for members of the Nogo-66 receptor family selected for species cross-reactivity with an improved phage display vector Journal of Immunological Methods 318 (2007) 75.87; Paula Gomes a, David Andreu Direct kinetic assay of interactions between small peptides and immobilized antibodies using a surface plasmon resonance biosensor Journal of Immunological Methods 259, 2002.217-230, and Kikuchi Y, Uno S, Nanami M, Yoshimura Y, Iida S, Fukushima N, Tsuchiya M. Determination of concentration and binding affinity of antibody fragments by use of surface plasmon resonance. Journal of Bioscience and Bioengineering Vol. 100, No. 3, 311-317, 2005)。
【００９７】
ビアコア分析は、１）センサーチップとリガンド間のカップリング条件を決定する緩衝液選別段階；２）リガンドをセンサーチップに固定化させる段階；及び３）固定化されたリガンドに分析物質を結合させる段階の３段階から構成される。
【００９８】
１）緩衝液選別段階
本試験で、通常該当の実験用として使用されるビアコアセンサーチップであるＣＭ５センサーチップ(BIACORE，BR-1003-99)を使用し、リガンドをチップに固定化させる前に、リガンドとセンサー表面間の静電気的相互作用をカップリング緩衝液として使用するｐＨ４．０〜５．５間の酢酸ナトリウム溶液を用いて決定した。
【００９９】
２）リガンド固定化段階
センサーチップＣＭ５にリガンドを固定化させるために、最初にチップを活性化させなければならず、このためにN-ヒドロキシスクシンイミド(ＮＨＳ)とＮ−エチル−Ｎ’−(ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(ＥＤＣ)(Amine Coupling Kit，BR-1000-50)を混合してアミノ基と非常に反応性が良いＮＨＳ−エステル活性化されたチップに作った。固定化させようとする１ｍｇ／ｍｌ濃度リガンドを酢酸ナトリウム溶液(ｐＨ４．０〜５．５間)９７μｌに３／１００の希釈割合で希釈した後、流速を１０μｌ／分にして約３分間注入した(陰性対照群としてリガンドをランニングバッファー(running buffer)であるＨＢＳ−ＥＰ緩衝液(BIACORE AB, Sweden)を用いて同一の方式で希釈する)。リガンドを予め設定した値であるターゲットＲＵ(resonance unit)で固定化させるために、ターゲットＲＵに逹するまで自動で順次に注入される。リガンドが固定化されたチップを不活性化させるために、１Ｍエタノールアミン(Amine Coupling Kit, BR-1000-50)を流速１０μｌ／分にして約３分間注入した。最終のＲＵ値は、エタノールアミン注入前後のＲＵ値の差に対して提供する固定化レポートによって決定された。
【０１００】
３）固定化されたリガンドに分析物質を結合させる段階
該当の試験で非特異的結合を除去させるために、ビアコア機器によって提供されるフローセル２−フローセル１方法を使用した。この時、フローセル２にはリガンドとして組換えＶＣＡＭ１／Ｆｃ抗原を固定化させ、フローセル１にはＢＳＡ(Bovine Serum Albumin)を固定化させた。その後、分析試料である抗ＶＣＡＭ−１抗体であるＨ６を同時にフローセル１及び２に流した。フローセル２のセンソグラム(sensogram)ＲＵからフローセル１のセンソグラムＲＵを自動的に除去した。以後、流速を３０μｌ／分にして約３分間分析試料を適用し、再び１２０秒間解離を誘導させた。このような過程を介して、該当抗原と抗体との結合／解離曲線を得り、以後、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎプログラム(BIACORE AB, Sweden)によって図３のように、結合／解離定数ＫＤ値を算出した。その結果、ヒトＶＣＡＭ−１抗原に対してＨ６抗体が約０．６ｎＭの優れた結合力を持っており、７ＨＴ抗体は約６．３ｎＭ水準の結合力を有することとして確認された。
【０１０１】
８．抗体の白血球細胞接合阻害効果
８．１．ヒトＶＣＡＭ−１抗原と白血球との間の接合阻害効果
９６−ウェルプレート(Maxisorp，Nunc)の各ウェルに組換えヒトＶＣＡＭ−１(10μg/ml, Cat. No.: 809-VR-200, R&D systems)１００μｌを入れて１時間コーティングした後、抗体Ｈ６をそれぞれ０．０１、０．１、１．０及び１０．０μｇずつＶＣＡＭ−１がコーティングされたウェルに添加して１時間抗原に結合するようにした。この時、陽性対照群として４Ｂ２マウス抗−ヒトＶＣＡＭ−１単一クローン抗体(Cat．No.:BBA5，R&D)を使用し、陰性対照群として抗体処理をせず抗原のみを処理した。抗原と抗体間の結合が進行される間に、ヒト白血球細胞であるＵ９３７(Cat．No.:CRL-1593.2，ATCC)の蛍光染色を５μＭのＢＣＥＣＦ−ＡＭ(Cat．No.:216254，Calbiochem)を使用して行った。次に、Ｕ９３７細胞表面にあるＦｃ受容体を不活性化させるためにＵ９３７細胞に１００％ヒト血清(Cat．No.:H4522，Sigma)を処理した。蛍光染色とＦｃ受容体不活性化過程を経た白血球細胞を１％子牛血清が含まれたＲＰＭＩ１６４０(Cat．No.:22400-089，Invitrogen)培地に１．０×１０6細胞／ｍｌの密度になるように浮遊させた。準備されたＵ９３７細胞を抗原と抗体が処理されたプレートに各ウェルに１００μｌずつ入れて３７℃、５％ＣＯ2培養器で１５分間培養させた後、１％子牛血清が含まれたＲＰＭＩ１６４０培地をウェルに満ちるまで入れてシールテープで培地を密閉した。プレートをひっくり返した後、２００×重力で５分間遠心分離した。ひっくり返られた遠心分離したプレートからシールテープを除去した。培地及び接着していないＵ９３７細胞を完全に除去した後、細胞溶解緩衝液(５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ(ｐＨ８．５)、０．１％ＳＤＳ)を各ウェルに１５０μｌずつ入れて１５分間接着されているＵ９３７細胞を溶解した。その後、プレートを蛍光分析機(GeminiX，Molecular Device)に挿入し、吸収波長４８５ｎｍ／放出波長５３０ｎｍで蛍光強度を測定した。３回測定(各実験条件当り)の平均値を算出し、抗体を処理しない群に比べて蛍光強度がどのくらい減少したかを計算して阻害率を分析した。その結果、Ｈ６抗体は１μｇ以上で８０％以上の阻害を示した(図４参照)。
【０１０２】
８．２．ヒト内皮細胞と白血球細胞との間の接合阻害効果
９６−ウェルプレート(Microtest tissue culture 96-well plate，BD-Falcon)の各ウェルにヒト内皮細胞であるＨＵＶＥＣ細胞を２×１０4個ずつ施し、約３日間ＥＧＭ−２培地(Lonza)で製造社の指示に従って培養した。顕微鏡で細胞単層が観察される時、ヒトＴＮＦ−αを２０ｎｇ／ｍｌの濃度で２４時間細胞を刺激させた。以後に、ＴＮＦ−αを除去するために、各ウェルをＥＧＭ−２培地２００μｌで２回洗浄した後、抗体Ｈ６をそれぞれ０．０１、０．１、１．０、１０．０μｇずつＨＵＶＥＣ単層が施されたウェルに添加した。前記プレートを抗原−抗体結合を誘導するために１時間培養した。この時、陽性対照群として０．５及び５．０μｇの４Ｂ２マウス抗−ヒトＶＣＡＭ−１単一クローン抗体(Cat. No.:BBA5，R&D)とマウス抗−α４インテグリン抗体を使用し、陰性対照群として抗体処理をせず抗原のみを処理した。抗体と抗原間の結合が進行される間にヒト白血球細胞であるＵ９３７(Cat. No.:CRL-1593.2，ATCC)の蛍光染色を５μＭのＢＣＥＣＦ−ＡＭ(Cat. No.:216254，Calbiochem)を用いて行った。次に、Ｕ９３７細胞表面にあるＦｃ受容体を不活性化させるためにＵ９３７細胞に１００％ヒト血清(Cat. No.:H4522，Sigma)を処理した。蛍光染色とＦｃ受容体不活性化過程を経たＵ９３７細胞を１％子牛血清が含まれたＲＰＭＩ１６４０(Cat．No.:22400-089，Invitrogen)培地に１．０×１０6細胞／ｍｌの密度になるように浮遊させた。準備されたＵ９３７細胞を抗体が結合されたＨＵＶＥＣにウェル当り１００μｌずつ入れてアルミホイル で光を遮断した。プレートを３７℃、５％ＣＯ2培養器で１０分間培養した後、培地及び接着しない細胞を除去するためにプレートをひっくり返した。１％牛胎児血清が含まれたＲＰＭＩ１６４０培地を各ウェルに満ちるまで入れ、シールテープでしっかりと密封した。プレートをひっくり返したまま４００×重力で５分間遠心分離した。遠心分離したプレートをひっくり返したままシールテープを除去した。培地及び接着しないＵ９３７細胞を完全に除去した後、細胞溶解緩衝液(５０ｍＭトリス−ＨＣｌ(ｐＨ８．５)、０．１％ＳＤＳ)を各ウェルに１５０μｌずつ入れて１５分間接着されたＵ９３７細胞を溶解した。その後、プレートを蛍光分析機(GeminiX，Molecular Device)に挿入し、吸収波長４８５ｎｍ／放出波長５３０ｎｍで蛍光強度を測定した。３回測定(各実験条件当り)の平均値を算出し、抗体を処理しない群に比べて蛍光強度がどのくらい減少したかを計算して阻害率を分析した。その結果、Ｈ６は０．１〜１０．０μｇで約２５〜６５％の阻害を示した(図５参照）。この結果は、実施例８．１のＶＣＡＭ−１抗原と白血球細胞接合阻害効果分析結果と類似した。
【０１０３】
９．白血球のヒト内皮細胞への透過阻害効果
ヒト内皮細胞(human umbilical vein endothelial cell)(HUVEC)，Cambrex，C2517A)２×１０4細胞／３００μｌ(ＥＧＭ−２培地)をトランスウェル(6.5mm insert, 5μm polycarbonate membrane, Corning, 3421)のインサートで約４日間単一膜を形成するまで培養した。ＶＣＡＭ−１の発現誘導因子であるヒトＴＮＦ−α(20ng/ml，abcam，ab9642)を細胞に処理して、１４〜１６時間ＶＣＡＭ−１の発現を誘導させた。継代１〜５の間のＨＵＶＥＣ細胞を使用した。
【０１０４】
ヒト前単球(U937，CRL-1593.2 TM)は、１％ＦＢＳ／ＲＰＭＩ１６４０(Gibco， 22400)培地で２回洗浄(１１００ｒｐｍ、３分間遠心分離)した後、５×１０6細胞／ｍｌの密度でヒト血清(Sigma，H4522)に懸濁し、室温で１５分間培養してＦｃ受容体を遮断した。ＨＵＶＥＣがあるインサートからＴＮＦ−αが添加された培地を除去した後、抗体Ｈ６をそれぞれ１％ＦＢＳ／ＲＰＭＩ培地１００μｌに入れ、Ｆｃ受容体が遮断されたＵ９３７細胞の一部は、抗−α４インテグリン抗体または組換えヒトＶＣＡＭ−１抗原に懸濁して、３０分間３７℃で前処理した。前処理が終わったＨＵＶＥＣに１％ＦＢＳ／ＲＰＭＩ培地のＵ９３７細胞(５×１０5細胞／２００μｌ)を添加し、抗−α４インテグリン抗体に懸濁したＵ９３７も同じ細胞数をまたＨＵＶＥＣに添加した。この時、Ｕ９３７白血球の内皮透過移動を誘導するために、各ウェルに１０ｎＭのＣ５ａ(R&D，2037C5)４００μｌずつ入れ、３７℃培養器で２〜６時間培養した。以後、インサートを除去し、底ウェルに移動した白血球をｅ−チューブに回収した。１、５００ｒｐｍで３分間遠心分離して培地を除去した後、１×ＰＢＳ６００μｌに細胞ペレットを懸濁して細胞数を数えた(細胞計数器、Beckman Coulter TM，Vi-Cell XR 2.03)。
【０１０５】
ＴＮＦ−αを処理したＨＵＶＥＣ実験群(ヒトＩｇＧ対照群処理群)のＣ５ａ処理による白血球の移動数から未処理実験群(ＴＮＦ−α及びＣ５ａ未処理)の非特異的に移動した白血球数を差し引いて、これを１００％移動として計算した。各試験抗体の移動阻害(％)を算出した。その結果、Ｈ６抗体が２５％程度の透過阻害を示すことを確認した(図６参照)。
【０１０６】
１０．ＲｈｏＡ(Ras homolog gene family，member A)活性阻害効果
ＨＵＶＥＣ(ヒト臍帯血管内皮細胞)２×１０5個を６−ウェルプレートに接種し、単一膜を形成するまで約３日間培養した。培養培地に存在する血清を除去するために、ＥＢＭ−２培地(Cat. No.:CC-3156，Lonza)で１回洗浄し、ヒトＴＮＦ−αを２０ｎｇ／ｍｌの濃度で０．２５％の牛胎児血清が含まれたＥＢＭ−２培地に希釈して入れた後、１４〜１６時間処理してＶＣＡＭ−１の発現を誘導した。培養液を除去した後、抗体Ｈ６と対照抗体(IgG4，Cat．No.:I4764，Sigma)を１０μｇ／ｍｌ濃度で入れた後、３０分間３７℃で培養した。細胞表面のＶＣＡＭ−１をクロスリンクさせるのに使用される抗ＶＣＡＭ−１抗体(Cat. No.:BBA5，R&D)を１０μｇ／ｍｌ濃度で添加して３０分間３７℃で培養した。ＨＲＰ 共役された抗−マウス抗体(Cat. No.:A9917，Sigma)を１：１００の割合で添加して１５分間３７℃で培養させた。反応が完全に終わった後、すぐ氷の上にプレートを移して培地を除去した後、冷たいＰＢＳで１回洗浄した。プレートから残余ＰＢＳを完全に除去した後、ＲｈｏＡ活性キット(Cat. No.:BK124，Cytoskeleton)に含まれた細胞溶解緩衝液を各ウェルに１００μｌずつ入れて溶解された細胞を回収した。以後の過程はキットのマニュアルに従って実験を進行し、３回繰り返した。
【０１０７】
その結果、細胞表面に発現されたＶＣＡＭ−１をクロスリンクさせることによって、誘導されたＲｈｏＡ活性はＨ６抗体によって約５６％阻害されることとして確認された。
【０１０８】
１１．ＲＯＳ(Reactive oxygen species)活性阻害効果
ＨＵＶＥＣ(ヒト臍帯血管内皮細胞)２×１０5個を６−ウェルプレートに接種し、単一膜を形成するまで約３日間培養した。培養培地に存在する血清を除去するために、ＥＢＭ−２培地(Cat. No.:CC-3156，Lonza)で１回洗浄し、ヒトＴＮＦ−αを２０ｎｇ／ｍｌの濃度で０．２５％の牛胎児血清が含まれたＥＢＭ−２培地に希釈して入れた後、１４〜１６時間ＶＣＡＭ−１の発現を誘導した。培養液を除去し、ＥＢＭ−２培地で２回洗浄した後、抗体Ｈ６と対照抗体(IgG4，Cat. No.:I4764，Sigma)を１０μｇ／ｍｌ濃度で入れた後、３０分間３７℃で培養した。各ウェルをＥＢＭ−２培地で２回洗浄した後、細胞表面のＶＣＡＭ−１をクロスリンクさせるのに使用される抗ＶＣＡＭ−１抗体(Cat. No.:BBA5，R&D)を１０μｇ／ｍｌ濃度で入れて３０分間３７℃で培養した。各ウェルをＥＢＭ−２培地で２回洗浄し、ＨＲＰ 共役された抗−マウス抗体(Cat. No.:A9917，Sigma)を１：１００の割合で入れた後、３７℃で３０分間培養した。各ウェルをＥＢＭ−２培地で２回洗浄した。培地を完壁に除去した後、ＥＢＭ−２培地に希釈した１０μＭのＤＣＦ(２’，７’−ジクロロフルオレセインジアセテート)を１５０μｌずつ各ウェルに処理した。その後、蛍光値(測定波長４９５ｎｍ−５２７ｎｍ)を１０分ごとに３時間観察して、３時間目に測定された値で抗体の効能を評価した。前記実験を３回繰り返した。
【０１０９】
その結果、細胞表面に発現されたＶＣＡＭ−１をクロスリンクさせることによって、誘導されたＲＯＳ活性はＨ６抗体によって約３３％阻害率を示すことを確認した。
【０１１０】
１２．内在化分析
ＨＵＶＥＣ(ヒト臍帯血管内皮細胞)２×１０5個を６−ウェルプレートに接種し、単一膜を形成するまで約３日間培養した。ヒトＴＮＦ−α(20ng/ml，Cat. No.:ab9642，abcam)を１４〜１６時間処理してＶＣＡＭ−１の発現を誘導した。１〜５継代の間のＨＵＶＥＣを使用した。ヒトＴＮＦ−αを除去するために、細胞をＰＢＳで１回洗浄した後、プレートを４℃に２０分間放置した。ＢＳＡが添加されたＰＢＳに希釈した抗体Ｈ６(１０μｇ／ｍｌ)をＨＵＶＥＣに処理した後、結合を誘導するために４℃で３０分間培養した。その後、細胞をＰＢＳで１回洗浄した。プレートを３７℃でそれぞれ２、１０、３０、６０分間放置してＶＣＡＭ−１に結合された抗体の内在化を誘導した後、洗浄した。ＶＣＡＭ−１発現確認実験の実験群を除いて、各実験群に酸性ＰＢＳ(ｐＨ２．５)１ｍｌを入れ、５分間室温に放置して細胞表面の抗体を除去した後、洗浄した。細胞をトリプシン(Cat. No.:CC-5034，Clonetics)処理して回収した後、４％ホルムアルデヒド(ＰＢＳに希釈)を入れて室温で１０分間反応させた。ＰＢＳで細胞を１回洗浄した後、０．２％トリトンＸ−１００(ＰＢＳに希釈)を入れて１０分間反応させ、ＰＢＳで１回洗浄した。ＦＩＴＣが共役されたヤギ抗−ヒトＩｇＧ抗体(Cat. No.:F9512，Sigma)を入れて４℃で３０分間結合を誘導した。その後、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、フローサイトメトリーで分析した。本実験は、２回繰り返した。
【０１１１】
その結果、アイソタイプコントロール(isotype control)(グレー)に比べて細胞表面にＶＣＡＭ−１が発現された(矢印、スカイブルー)程度が明らかだった。また、各時間別に内在化を誘導した結果、ＶＣＡＭ−１に抗体が結合してから２分目から内在化が進行されて３０分目に最大に達することを確認した。
【０１１２】
１３．インビトロ接合分析を通したＶＣＡＭ−１抗体の炎症細胞付着抑制効果分析
ＶＣＡＭ−１抗体が血管内皮細胞に付着することによって、炎症細胞の接合を抑制することができるかどうかを確認するために、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの大動脈血管内皮細胞をマトリゲル方法で分離した後、培養した。その後、２４ウェル培養ディッシュに１×１０5個細胞を接種した後、ＴＮＦ−αを処理してＶＣＡＭ−１発現を誘導した。ＧＦＰ(緑色蛍光タンパク質(green fluorescence protein))形質転換マウスの骨髓から由来した単核球をその表面マーカーであるＣＤ１１ｂを取るマグネチックビーズを使用して分離し、血管内皮細胞に１×１０6個ずつ処理した。３０分間培養した後、結合しない細胞をＰＢＳ洗浄によって除去した。４％パラホルムアルデヒドで１０分間固定し、再びＰＢＳで洗浄した。その後、結合した単核球のイメージを蛍光顕微鏡によって獲得し、イメージ分析ソフトウェアによって細胞数を計数して分析した。
【０１１３】
その結果、対照群抗体を(４ＢＴ、１０μｇ／ｍｌ)処理した血管内皮細胞よりＶＣＡＭ−１抗体を(７ＨＴ、１０μｇ／ｍｌ)処理した血管内皮細胞で結合された単核球の数が約２０％減少したことを確認した(図９)。
【０１１４】
１４．インビトロ透過分析を介したＶＣＡＭ−１抗体の炎症細胞透過抑制効果分析
ＶＣＡＭ−１Ａｂが血管内皮細胞に付着することによって、炎症細胞の透過を抑制することができるかどうかを確認するために、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの大動脈血管内皮細胞をマトリゲル方法で分離して培養した。トランスウェルの上部チャンバーに５×１０4個の細胞を接種し、ＴＮＦ−αを処理してＶＣＡＭ−１発現を誘導した。マウスの骨髓細胞を分離して血管内皮細胞に１×１０5個細胞を処理した後、４時間と１８時間後に下部チャンバーに透過した細胞数を数えた。その結果、４時間後に細胞数を数えた時、対照群抗体を(４ＢＴ、１０μｇ／ｍｌ)処理した群よりＶＣＡＭ−１抗体(７ＨＴ、１０μｇ／ｍｌ)を処理した群で約２５％の減少を示し、１８時間後では約２９％の減少を示すことを確認することができた(図１０)。
【０１１５】
１５．ＶＣＡＭ−１抗体(７ＨＴ)のインビボ付着検査のためのエンフェース共焦点顕微鏡分析
ＶＣＡＭ−１抗体の心血管疾病に対する治療剤としての効果を確認するために、実験群をＰＢＳ、対照群抗体(４ＢＴ、１０ｍｇ／ｋｇ)、ＶＣＡＭ−１抗体(７ＨＴ、１ｍｇ／ｋｇ)、ＶＣＡＭ−１抗体(７ＨＴ、１０ｍｇ／ｋｇ)の４つのグループに分け、ＶＣＡＭ−１抗体をマウスに注入時、ＶＣＡＭ−１を発現する動脈血管内皮細胞に特異的に結合するかどうかを確認した。２週間４回を腹腔内注射を介する注入と高脂質食餌を並行した後、各マウスの動脈を回収してＡｌｅｘａ５９４標識された抗−ヒトＩｇＧ２次抗体と反応させた。血管内皮細胞のＶＣＡＭ−１発現可否を再確認するために、動脈をヤギ抗−ｍＶＣＡＭ−１抗体とＡｌｅｘａ４８８が標識された抗−ヤギＩｇＧ２次抗体と反応させた。その後、動脈の薄片を共焦点顕微鏡で確認した。その結果、各マウスの動脈でＶＣＡＭ−１の発現が明確に観察され、ただ高濃度のＶＣＡＭ−１抗体(７ＨＴ、１０ｍｇ／ｋｇ)を注入したマウスにおいてのみが抗体がよく付いていることを確認することができた(図１１)。
【０１１６】
１６．体重及び食餌飼料量の変化測定
１２週間抗体投与によるマウスの食餌飼料量及び体重の変化を測定するために、週１回各グループのマウス体重と食餌飼料量を測定した。その結果、一般食餌を実施した１グループを除いて高脂質食餌を実施した２〜４グループは、グループ間の差は示さなかった。食餌飼料量も有意的な差を示さなかった(図１２)。
【０１１７】
１７．血液分析結果
各実験群の動物の血液を分離するために、ヘパリン処理されたチューブで血液を採取して１３、０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。血液内総コレステロール(ＣＨＬ)、トリグリセリド(ＴＧ)、高密度リポタンパク質(ＨＤＬ)、低密度リポタンパク質(ＬＤＬ)の測定は自動生化学分析器(HITACHI 7150，Japan)を用いて分析した。
【０１１８】
【表２】
【０１１９】
一般食餌とＰＢＳ投与を実施した１グループでは、総コレステロール(Ｔ−ＣＨＯ)平均及び標準偏差が６１５．２０±６１．６７(ｍｇ／ｄｌ)で最も少ない水準を示し、高脂質食餌と４ＢＴ抗体(１０ｍｇ／ｋｇ)を投与した２グループでは、総コレステロール(Ｔ−ＣＨＯ)平均及び標準偏差が１３８０．００±２３７．０３(ｍｇ／ｄｌ)、高脂質食餌と７ＨＴ抗体(１ｍｇ／ｋｇ)を投与した３グループでは、総コレステロール(Ｔ−ＣＨＯ)平均及び標準偏差が１３６７．２０±１４３．６８(ｍｇ／ｄｌ)、そして、高脂質食餌と７ＨＴ抗体(１０ｍｇ／ｋｇ)を投与した４グループでは、総コレステロール(Ｔ−ＣＨＯ)平均及び標準偏差が１３２３．６０±２０９．３８(ｍｇ／ｄｌ)を示した。対照群(２グループ)に比べて、総コレステロールが減少する有意的な差を示さなかったし、ＨＤＬ−及びＬＤＬ−コレステロールも有意的な差を示さなくて７ＨＴ抗体の投与によるコレステロール代謝／排出には影響がないことを確認した。しかし、中性脂質及びブドウ糖数値が４グループで減少し、肝臓毒性確認のためのＧＯＴ、ＧＰＴ及びＡＬＢ水準では差を示さなかった(図１３)。
【０１２０】
１８．大動脈弓に形成された粥状硬化斑の確認及び面積測定
１２週間高脂質(脂肪２０％、コレステロール０．１５％)食餌を投与したＡｐｏＥ−／−マウスを犠牲させ、心臓及び上行大動脈から胸部大動脈まで切除してホルマリンで固定した。その後、心臓をトリミングした後、ＯＣＴ化合物に包埋して超低温冷凍庫で凍結させた。大動脈弓を凍結切片機で６の厚さで切ってスライドを製作した。脂肪染色のために、スライドを蒸溜水に浸漬してから、純粋プロピレングリコールに１分間浸漬した後、オイルレッド(Oil-red)溶液で１６時間染色した。その後、８５％プロピレングリコールに２分間浸漬し、蒸溜水で洗浄した後、水性封入剤で封入して光学顕微鏡で観察した。粥状硬化斑の面積測定のために、それぞれの組織を撮影した後、イメージ測定ソフトウェア(Axio Vision，Carl Zeiss)を用いて面積を測定して比較した。
【０１２１】
一般食餌とＰＢＳ投与を実施した１グループでは、平均病変面積及び標準偏差が８８．５５±２１．６５(１０3μｍ2)で最も少ない病変を形成し、高脂質食餌と４ＢＴ Ａｂ(１０ｍｇ／ｋｇ)を投与した２グループでは、平均病変面積及び標準偏差が３４５．２０±７４．０３(１０3μｍ2)で最大の病変形成率を示し、高脂質食餌と７ＨＴ Ａｂ(１ｍｇ／ｋｇ)を投与した３グループでは、平均病変面積及び標準偏差が３２３．６８±８６．０２(１０3μｍ2)、高脂質食餌と７ＨＴ Ａｂ(１０ｍｇ／ｋｇ)を投与した４グループでは、平均病変面積及び標準偏差が２９４．７８±２．６２(１０3μｍ2)で対照群(２グループ)に比べて面積が減少する傾向性を確認した(図１４)。
【０１２２】
１９．動脈に形成された粥状硬化斑のエンフェース方法による病変分析
心臓から大腿動脈まで切除した後、周辺の脂肪組織と外膜部位を完全に除去し、心臓基底部の動脈を切断して心臓と分離した。微細はさみと微細ピンセットを用いて動脈を切開して、動脈内部が見えるように広げた後ピンで固定した。動脈を１０％中性緩衝ホルマリン溶液で１６時間固定した後、純粋プロピレングリコールに１分間浸漬した後、オイルレッド溶液で１６時間染色した。その後、標本を８５％プロピレングリコールに２分間浸漬し、蒸溜水で洗浄した。解剖顕微鏡(Leica)を用いてイメージを獲得した後、アキシオビジョン(Axio Vision)ＡＣイメージプログラムで動脈総面積に対する病変割合を測定した。
【０１２３】
一般食餌とＰＢＳ投与を実施した１グループでは、平均病変面積及び標準偏差が１．７５±０．４７(％)で最も少ない値を示し、高脂質食餌と４ＢＴ抗体(１０ｍｇ／ｋｇ)を投与した２グループでは、平均病変面積及び標準偏差が８．０１±４．２５(％)で最大値を示し、高脂質食餌と７ＨＴ抗体(１ｍｇ／ｋｇ)を投与した３グループでは、平均病変面積及び標準偏差が７．０２±３．６４(％)、そして、高脂質食餌と７ＨＴ抗体(１０ｍｇ／ｋｇ)を投与した４グループでは、平均病変面積及び標準偏差が５．４３±１．６１(１０3μｍ2)で対照群(２グループ)に比べて有意的に減少することを確認した(Ｐ＜０．０５)(図１５及び図１６)。
【０１２４】
２０．ＶＣＡＭ−１抗体投与による毒性可否を確認するための主要臓器の病理学的分析
腹腔に注射した抗体による毒性可否を判別するために、各グループの肝臓、腎臓及び脾臓を１０％ホルムアルデヒドに固定してパラフィンブロックを製作し、ミクロトーム(microtome)を使用して組織切片を得た。核と細胞質染色のためにヘマトキシリン＆エオシン染色を実施した後、観察した。その結果、高脂質食餌を介して肝臓で見える脂肪肝以外の炎症細胞浸潤または組織壊死のような毒性による表現型は見えなかった(図１７)。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト血管細胞接合分子−１(ＶＣＡＭ−１)に特異的に結合して白血球と活性化された内皮細胞との間の接合及び前記活性化された内皮細胞への白血球の透過を阻害する組換えヒト単一クローン抗体、並びにこれを含む炎症性疾患または癌の予防及び治療用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
白血球を含む兔疫細胞などは、血管から組織へ移動する間、活性化された内皮細胞を通過して免疫反応を起こすようになり、このような白血球の内皮細胞への接合と組織への移動にはインテグリン(integrin)、セレクチン(selectin)、ＩＣＡＭ(intracellular adhesion molecule)、ＶＣＡＭ(vascular cell adhesion molecule)などの多くの細胞接合分子(ＣＡＭｓ)が関与する。細胞接合分子は、機能的に白血球と内皮細胞間の相互作用に関与するセレクチン類、白血球の内皮細胞への接合に関与するインテグリン類、そして、ＩＣＡＭ、ＶＣＡＭのような兔疫グロブリンなどに分けられる。これらの細胞接合分子などは、免疫作用、炎症、血栓症のような多くの生理反応に重要な役割を果たしている。
【０００３】
ＶＣＡＭ−１は好中球を除いたほとんどの白血球の表面に発現されるインテグリン(ＶＬＡ−４)と相互作用する血管内皮細胞接合分子の一種である。ＶＣＡＭ−１は炎症信号などによって発現され、白血球の血管内皮細胞への付着を固定させ、以後、白血球のダメージ組織への血管外遊出(transendothelial migration)を誘発する。
【０００４】
ＶＣＡＭ−１−ＶＬＡ−４相互作用に対する最近の関心にもかかわらず、ＶＣＡＭ−１を中和させる抗体の開発は盛んに研究されていない。最近、マウスＶＣＡＭ−１に対する単一クローン抗体であるＭ／Ｋ−２．７が開発され、コラーゲン誘導性関節炎マウスモデルにおいて関節炎を抑制する効果を示したが、この抗体はマウスモデルのみに特異的であるので、臨床適用のための抗体の有用性がさらに研究されなければならない。
【０００５】
また、ＶＣＡＭ−１は、ＩｇＧ−類似ドメインの７つから構成され、ドメイン１とドメイン４のリガンドであるインテグリン(α４β１またはα４β７)と結合する時、実質的にドメイン１とドメイン４が関与する(1995, PNAS, 92:p5714; 1995, The journal of immunology, 155: p3135 et al.)。
【０００６】
このような観点で、ＶＣＡＭ−１抗原とインテグリンとの間の相互作用を阻害して白血球の内皮細胞への接合及び透過を効果的に阻害しながら、免疫原性リスクを最小限に抑えることができる完全ヒト単一クローン抗体の開発が至急である。
【発明の概要】
【０００７】
従って、本発明者らは、ヒト内皮細胞の表面に発現されたＶＣＡＭ−１を特異的に認識し、ＶＣＡＭ−１抗原のドメイン１または２に結合しながらＵ９３７前単核白血球(promonocytic leukocyte)及び活性化された内皮細胞間の相互作用を阻害する強い活性を有するヒト由来の重鎖(ＶＨ)及び軽鎖(ＶＬ)ドメインを有したヒトＶＣＡＭ−１に特異的な組換えヒト単一クローン抗体を開発し、本発明を完成するようになった。
【０００８】
本発明の目的は、ヒト血管細胞接合分子−１(ＶＣＡＭ−１)に特異的に結合して白血球及び活性化された内皮細胞との間の接合並びに前記活性化された内皮細胞への白血球の透過を阻害することを特徴とする組換えヒト単一クローン抗体を提供することである。
【０００９】
本発明の別の目的は、炎症性疾患または癌が疑われる個体の生物学的試料で組換えヒト単一クローン抗体とＶＣＡＭ−１との間の抗原−抗体反応を介して検出する段階を含む炎症性疾患、心血管疾患や癌の診断に必要な情報の提供方法を提供することである。
【００１０】
本発明のまだ別の目的は、組換えヒト単一クローン抗体を用いて白血球と活性化された内皮細胞の間の接合及び前記活性化された内皮細胞への白血球の透過を阻害する方法を提供することである。
【００１１】
本発明のまだ別の目的は、組換えヒト単一クローン抗体を含む炎症性疾患、心血管疾患や癌の診断用組成物を提供することである。
【００１２】
本発明のまだ別の目的は、組換えヒト単一クローン抗体及び薬剤学的に許容可能な担体を含む炎症性疾患、心血管疾患や癌の予防または治療用組成物を提供することである。
【００１３】
本発明のまだ別の目的は、炎症性疾患や癌の予防または治療用組成物を投与する段階を含む炎症性疾患、心血管疾患や癌の治療方法を提供することである。
【００１４】
本発明による組換えヒト単一クローン抗体は、ヒト内皮細胞で発現されたＶＣＡＭ−１に対して強い親和力を示し、ＶＣＡＭ−１で媒介される白血球と活性化された内皮細胞との間の接合及び前記活性化された内皮細胞への白血球の透過を効果的に阻害するので、喘息及び関節炎のような炎症性疾患、臓器移植拒否、心血管疾患及び癌のような疾患の予防及び治療に有用に使用され得る。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、本発明の一実施形態による組換えヒト単一クローン抗体の可変領域のアミノ酸配列を示したものである。
【図２】図２は、ヒトＶＣＡＭ−１ドメインによって抗原に特異的な抗ＶＣＡＭ−１ヒト単一クローン抗体などの抗原に対する親和度を示したＥＬＩＳＡ(Enzyme-linked immuno-sorbent assay)の結果であり、ここで、ＶＤ２は、組換えヒトＶＣＡＭ−１ドメインＤ１−Ｄ２／Ｆｃキメラを示し、ＶＤ４は、組換えヒトＶＣＡＭ−１ドメインＤ１１−Ｄ４４／Ｆｃキメラを示し、ＶＤ７は、組換えヒトＶＣＡＭ−１ドメインＤ１−Ｄ７／Ｆｃキメラを示したものである。
【図３】図３は、ヒトＶＣＡＭ−１抗原に特異的な抗ＶＣＡＭ−１ヒト単一クローン抗体などの抗原に対する結合能または親和度を示したものであって、ビアコア(BIACORE AB, Sweden)を用いて抗原−抗体親和度を１：１結合モード方法で測定し、該当抗原−抗体間の親和度定数であるＫＤ値を計算した。
【図４】図４は、抗ＶＣＡＭ−１ヒト単一クローン抗体によって精製されたヒト組換えＶＣＡＭ−１抗原とヒト白血球細胞間の接合阻害能を分析したものであって、抗体を処理しない群に比べて蛍光強度がどのくらい減少したかを計算して阻害能を決定した。
【図５】図５は、ＴＮＦ−α(Tumor necrosis factor-α)によって活性化されたヒト内皮細胞とヒト白血球細胞間の接合に対する抗ＶＣＡＭ−１ヒト単一クローン抗体の阻害能を分析した結果であって、抗体を処理しない群に比べて蛍光強度がどのくらい減少したかを計算して阻害能程度を決定した。
【図６】図６は、ＴＮＦ−α(Tumor necrosis factor-α)によって活性化されたヒト内皮細胞の間をヒト白血球細胞が透過することに対する抗ＶＣＡＭ−１ヒト単一クローン抗体の阻害能を分析した結果であって、抗体を処理しない群に比べて透過した白血球細胞の数がどのくらい減少したかを測定して阻害能を決定した。
【図７】図７は、本発明の一実施形態によるＲｈｏＡ(Ras homolog gene family，member A)活性阻害能を分析した結果を示した図である。
【図８】図８は、本発明の一実施形態によるＲＯＳ(Reactive oxygen species)活性阻害能を分析した結果を示した図である。
【図９】図９は、本発明の一実施形態による内在化(internalization)確認実験結果を示したものである。
【図１０】図１０は、本発明の一実施形態による組換えヒト単一クローン抗体の重鎖配列及びＣＤＲ配列を示す。
【図１１】図１１は、本発明の一実施形態による組換えヒト単一クローン抗体の軽鎖配列及びＣＤＲ配列を示す。
【図１２】図１２は、本発明の一実施形態による動物実験の概要を示した模式図である。
【図１３】図１３は、本発明の一実施形態によるインビトロ(in vitro)付着分析を介したＶＣＡＭ−１Ａｂの炎症細胞付着抑制効果を分析した結果を示したものである。（Ａ）付着した単核球細胞数のグラフ（Ｂ）代表写真。
【図１４】図１４は、本発明の一実施形態によるインビトロ透過分析を介したＶＣＡＭ−１Ａｂの炎症細胞透過抑制効果を分析した結果を示したものである。（Ａ）４時間後に透過された細胞数のグラフ（Ｂ）１８時間後に透過された細胞数のグラフ。
【図１５】図１５は、本発明の一実施形態によるＶＣＡＭ−１Ａｂ(７ＨＴ)のインビボ(in vivo)結合力テストのためのエンフェース(en face)共焦点顕微鏡の結果を示したものである。（Ａ）ＰＢＳ、（Ｂ）高用量対照群抗体、（Ｃ）低用量ＶＣＡＭ−１抗体、（Ｄ）高用量ＶＣＡＭ−１抗体。
【図１６】図１６は、本発明の一実施形態によるマウスの体重変化及び飼料消費量の変化を測定した結果を示したものである。
【図１７】図１７は、本発明の一実施形態によるマウス血液分析結果を示したものである。（Ａ）総コレステロール水準(Ｔ−ＣＨＯ)、ＨＤＬ−コレステロール水準(ＨＤＬ−Ｃ)及びＬＤＬ−コレステロール水準(ＬＤＬ−Ｃ)。（Ｂ）トリグリセリド水準(ＴＧ)及びグルコース水準(ＧＬＵ)。（Ｃ）グルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼ水準(ＧＯＴ)及びグルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ水準(ＧＰＴ)。（Ｄ）アルブミン水準(ＡＬＢ)。
【図１８】図１８は、本発明の一実施形態による大動脈弓に形成された粥状硬化斑の確認及びそのサイズを測定した結果を示したものである。
【図１９】図１９は、本発明の一実施形態による大動脈に形成された粥状硬化斑のエンフェース技法を介して病変を分析した結果をグラフで示したものである。
【図２０】図２０は、本発明の一実施形態による大動脈に形成された粥状硬化斑のエンフェース技法を介して病変を分析した結果を示したグラフである。
【図２１】図２１は、本発明の一実施形態によるＶＣＡＭ−１抗体投与による毒性可否を確認するための肝臓切片のＨ＆Ｅ染色による病理学的分析結果を示したものである。
【図２２】図２２は、本発明の一実施形態によるＶＣＡＭ−１抗体投与による毒性可否を確認するための腎臓切片のＨ＆Ｅ染色による病理学的分析結果を示したものである。
【図２３】図２３は、本発明の一実施形態によるＶＣＡＭ−１抗体投与による毒性可否を確認するための脾臓切片のＨ＆Ｅ染色による病理学的分析結果を示したものである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、実施例を参照して本発明を詳細に説明する。しかし、下記の実施例はただ本発明を例示するための目的として提供されるものであって、それに応じて本発明の内容が実施例に限定されるのではない。
【００１７】
前記の目的を達成するための一つの態様において、本発明は、ヒト血管細胞接合分子−１(ＶＣＡＭ−１)に特異的に結合して白血球及び活性化された内皮細胞の間の接合並びに前記活性化された内皮細胞への白血球の透過を阻害することを特徴とする組換えヒト単一クローン抗体に関する。
【００１８】
下記用語の定義は、本明細書をより深く理解するようにするために提供されるものであって、本願で使用された用語は、ただ特定実施形態を記述するためのものであり、これらの用語に限定することに意図されない。本明細書及び添付された特許請求の範囲で使用された単数形の用語は、文脈的で明確に別に指示しない限り複数の指示対象を含むことを周知しなければならない。
【００１９】
本明細書で使用される用語“抗体”とは、特定抗原と免疫学的に反応する兔疫グロブリン分子に対する言及を含み、多クーロン抗体及び単一クローン抗体を全て含む。また、前記用語は、キメラ性抗体(例えば、ヒト化ミューリン抗体)及びヘテロ共役抗体(例えば、二重特異性抗体)のような遺伝工学によって生産された形態を含む。
【００２０】
また、用語“抗体”は、抗原結合能力を有する断片(例えば、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆｖ及びｒＩｇＧ)を含む、抗体の抗原結合形態を含む。また、前記用語は、組換え単一鎖Ｆｖ断片(ｓｃＦｖ)を指す。また、用語“抗体”とは、二価または二重特異性分子、ダイアボディー、トリアボディー及びテトラボディーを含む。二価及び二重特異性分子は、例えば、Kostelny et al. (1992, J. Immunol. 148:15467), Pack and Pluckthun (1992, Biochemistry 31:1579), Hollinger et al. (1993, supra), Gruber et al. (1994, J. Immunol.: 5368), Zhu et al. (1997, Protein Sci. 6:781), Hu et al. (1996, Cancer Res. 56:3055), Adams et al. (1993, Cancer Res. 53:4026 and McCartney et al. (1995, Protein Eng. 8:301)に記述されている。
【００２１】
また、本明細書で使用される用語“単一クローン抗体”とは、実質的に同一の抗体集団から得られた抗体分子を指し、このような単一クローン抗体は、特定エピトープに対して単一結合特異性及び親和度を示す。
【００２２】
典型的に、兔疫グロブリンは重鎖及び軽鎖を持つ。各々の重鎖及び軽鎖は、不変領域及び可変領域(前記領域は、“ドメイン”としてまた知られている)を含む。軽鎖及び重鎖の可変領域は、“相補性決定領域”(以下、“ＣＤＲ”という)と呼ばれる３つの高度可変領域及び４つの“構造領域”を含む。前記ＣＤＲは、主に抗原のエピトープに結合する役割を果たす。各々の鎖のＣＤＲは、典型的にＮ−末端から始めて順次にＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３と呼ばれ、また、特定ＣＤＲが位置している鎖によって識別される。
【００２３】
また、本願で使用される用語“ヒト化抗体”とは、ヒト兔疫グロブリンから由来する分子であって、相補性決定領域及び構造領域を含む抗体を構成するすべてのアミノ酸配列全体がヒトの兔疫グロブリンから構成されていることを意味する。用語、“組換えヒト単一クローン抗体”とは、ヒト兔疫グロブリンから由来する単一分子組成の抗体分子を指す。
【００２４】
ヒト化抗体は、一般的にヒトの治療に使用するのに当たって少なくとも３つ以上の潜在的な利点を持つ。先ず、これはヒト免疫体系とより良好に相互作用して、例えば、補体−依存性細胞毒性(ＣＤＣ)または抗体−依存性細胞性細胞毒性(ＡＤＣＣ)によって目的細胞をより効率的に破壊する。第二に、ヒト免疫体系は前記抗体を異物として認識しない。第三に、ヒト循環系内半減期が天然発生ヒト抗体と似ているため、より少ない量、より少ない頻度の薬物を投与することができるようにする。従って、本発明によるヒト単一クローン抗体などは、ヒト内皮細胞に発現されたＶＣＡＭ−１に対して強い親和力を示し、ＶＣＡＭ−１を発現する活性化された内皮細胞に白血球が接合することを効果的に阻害する。それだけでなく、重鎖及び軽鎖ドメインのすべてがヒト由来であるから低い免疫原性を示すので、本発明によるヒト単一クローン抗体は、炎症性疾患または癌の治療に使用されることができ、前記炎症性疾患は、腫瘍壊死因子−α(ＴＮＦ−α)媒介性疾患、大腸疾患、動脈硬化、及び心筋梗塞から選択されることができ、好ましくは、喘息、糖尿病、ブドウ膜炎、強直性脊椎炎、敗血症、内毒素ショック、血流力学ショック、敗血症症侯群、虚血性再灌流損傷、マラリア感染、マイコバクテリア感染、髄膜炎、乾癬、うっ血性心不全、線維症疾病、カヘキシー、移植拒否、癌、自己免疫疾病、エイズ関連日和見感染症、関節炎、リウマチ性脊椎炎、痛風、強直性痛風炎、クローン疾病、潰瘍性膀胱三角炎、多発性硬化症、癩性結節性紅斑(ＥＮＬ)、放射線障害及び酸素過多性肺胞損傷からなる群から選択され得る。
【００２５】
本発明の好ましい実施形態によれば、本発明の組換えヒト単一クローン抗体は、配列番号２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１；配列番号３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２；及び配列番号４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含むことができる。一方、本発明の組換えヒト単一クローン抗体は、前記の相補性決定領域(ＣＤＲ)に公知の治療用抗体の構造領域(ＦＲ)を接合させて製造することができる。より好ましくは、本発明の組換えヒト単一クローン抗体は、配列番号１で定義される重鎖アミノ酸配列を含む組換えヒト単一クローン抗体であり得る(図１参照)。
【００２６】
また、本発明の好ましい実施形態によれば、本発明の組換えヒト単一クローン抗体は、配列番号６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１；配列番号７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２；及び配列番号８のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含むことができる。一方、本発明の組換えヒト単一クローン抗体は、前記の相補性決定領域(ＣＤＲ)に公知の治療用抗体の構造領域(ＦＲ)を接合させて製造することができる。より好ましくは、本発明の組換えヒト単一クローン抗体は、配列番号５で定義される軽鎖アミノ酸配列を含む組換えヒト単一クローン抗体であり得る(図１参照)。
【００２７】
より好ましくは、本発明の組換えヒト単一クローン抗体は、前記の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域をすべて含むヒト単一クローン抗体であるかも知れない。すなわち、本発明の組換えヒト単一クローン抗体は、配列番号２で定義された重鎖ＣＤＲ１；配列番号３で定義された重鎖ＣＤＲ２；及び配列番号４で定義された重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号６で定義された軽鎖ＣＤＲ１；配列番号７で定義された軽鎖ＣＤＲ２；及び配列番号８で定義された軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含むことができる。一方、本発明の組換えヒト単一クローン抗体は、前記の相補性決定領域(ＣＤＲ)に公知の治療用抗体の構造領域(ＦＲ)を接合させて製造することができる。最も好ましくは、本発明の組換えヒト単一クローン抗体は、配列番号１で定義された重鎖アミノ酸配列と配列番号５で定義された軽鎖アミノ酸配列を含む組換えヒト単一クローン抗体であり得る(図１参照)。
【００２８】
さらに、本発明の好ましい実施形態によれば、本発明の組換えヒト単一クローン抗体は、配列番号１０のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１；配列番号１１のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２；及び配列番号１２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含むことができる。一方、本発明の組換えヒト単一クローン抗体は、前記の相補性決定領域(ＣＤＲ)に公知の治療用抗体の構造領域(ＦＲ)を接合させて製造することができる。より好ましくは、本発明の組換えヒト単一クローン抗体は、配列番号９で定義される重鎖アミノ酸配列を含む組換えヒト単一クローン抗体であり得る(図１０参照)。
【００２９】
さらに、本発明の好ましい実施形態によれば、本発明の組換えヒト単一クローン抗体は、配列番号１４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１；配列番号１５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２；及び配列番号１６のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含むことができる。一方、本発明の組換えヒト単一クローン抗体は、前記の相補性決定領域(ＣＤＲ)に公知の治療用抗体の構造領域(ＦＲ)を接合させて製造することができる。より好ましくは、本発明の組換えヒト単一クローン抗体は、配列番号１３で定義される軽鎖アミノ酸配列を含む組換えヒト単一クローン抗体であり得る(図１１参照)。
【００３０】
より好ましくは、本発明の組換えヒト単一クローン抗体は、前記の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域をすべて含むヒト単一クローン抗体であるかも知れない。すなわち、本発明の組換えヒト単一クローン抗体は、配列番号１０で定義された重鎖ＣＤＲ１；配列番号１１で定義された重鎖ＣＤＲ２；及び配列番号１２で定義された重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号１４で定義された軽鎖ＣＤＲ１；配列番号１５で定義された軽鎖ＣＤＲ２；及び配列番号１６で定義された軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含むことができる。一方、本発明の組換えヒト単一クローン抗体は、前記の相補性決定領域(ＣＤＲ)に公知の治療用抗体の構造領域(ＦＲ)を接合させて製造することができる。最も好ましくは、本発明の組換えヒト単一クローン抗体は、配列番号９で定義された重鎖アミノ酸配列と配列番号１３で定義された軽鎖アミノ酸配列を含む組換えヒト単一クローン抗体であり得る(図１１参照)。
【００３１】
これに関して、前記組換えヒト単一クローン抗体は、ヒトＶＣＡＭ−１に対する親和度を提供する。本発明の一実施形態によれば、組換えヒト単一クローン抗体のヒトＶＣＡＭ−１抗原に対する結合／解離定数(ＫＤ値)は、０．１×１０-9Ｍ−７．０×１０-9Ｍであることができ、これは、ビアコア分析を用いて各抗体などとヒトＶＣＡＭ−１に対する結合／解離定数(ＫＤ値)を求めることによって得られることができる。すなわち、ビアコア機器を用いてヒトＶＣＡＭ−１抗原をリガンドとしてセンサーチップ(Sensor chip CM5, BIACORE, BR-1003-99)に固定化させた後、抗体を濃度別に希釈し、固定化されたリガンドに適用して抗原−抗体間の結合及び解離を誘導することによって、結合(Ｋa)／解離(Ｋd)定数ＫＤ値を確認し、分析の信頼度に関連した統計学的数値であるカイ二乗△(χ2)値を確認した。
【００３２】
本発明の組換えヒト単一クローン抗体は、公知の単一クローン抗体製造技術で容易に製造され得る。例えば、単一クローン抗体を製造する方法は、兔疫された動物から得られたＢ白血球を用いてハイブリドーマを製造することにおって行われることができるとか(Koeher and Milstein，1976，Nature，256:495)、ファージディスプレイ方法を用いることによって行われることができるが、これに制限されるのではない。
【００３３】
ファージディスプレイを用いた抗体ライブラリーは、ハイブリドーマを製作なしにすぐＢリンパ球から抗体遺伝子を得てファージ表面に抗体を発現させる方法である。ファージディスプレイ技術を用いると、Ｂ−細胞不滅化によって単一クローン抗体を生成するのに関連付けられている多い難しさなどが克服され得る。
【００３４】
従来のファージディスプレイ技術は、１）ファージの外皮タンパク質ｐIII (またはｐIV)Ｎ−末端に該当する遺伝子部位にランダムな配列を有したオリゴヌクレオチドを挿入する段階；２）天然型の外皮タンパク質の一部と前記ランダムな配列を有したオリゴヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの融合タンパク質を発現させる段階；３）前記オリゴヌクレオチドによってコードされたポリペプチドと結合できる受容体物質を処理する段階；４）受容体に結合されたペプチド−ファージ粒子などを低いｐＨまたは結合競争力を有する分子を用いて溶出させる段階；５）パニングによって溶出されたファージを宿主細胞内で増幅させる段階；６）所望のファージの量を得るために前記方法を繰り返す段階；及び７）パニングによって選別されたファージクローンなどのＤＮＡ配列から活性があるペプチドの配列を決定する段階から構成される。
【００３５】
好ましい一つの実施形態において、本発明の組換えヒト単一クローン抗体の製造方法は、ファージディスプレイ方法を用いて行われることができる。当業者は公知のファージディスプレイ技術、例えば、Ｂａｒｂａｓら(METHODS : A Companion to Methods in Enzymology 2: 119，1991 and J．Virol．2001 Jul;75(14):6692-9)及びＷｉｎｔｅｒら(Ann．Rev．Immunol．12:433、 1994)の論文などに公知された方法を参考して、前記本発明の製造方法の各段階を容易に行うことができる。抗体ライブラリーを構築するために使用され得るファージは、例えば、フィラメント性ファージとして、ｆｄ、Ｍ１３、ｆ１、Ｉｆ１、Ｉｋｅ、Ｚｊ／Ｚ、Ｆｆ、Ｘｆ、Ｐｆ１及びＰｆ３があるが、これに制限されるのではない。また、前記フィラメント性ファージの表面上に異種遺伝子の発現のために使用され得るベクターには、例えば、ｆＵＳＥ５、ｆＡＦＦ１、ｆｄ−ＣＡＴ１またはｆｄｔｅｔＤＯＧなどのファージベクター、またはｐＨＥＮ１、ｐＣｏｍｂ３、ｐＣｏｍｂ８またはｐＳＥＸなどのファージミドベクターがあるが、これに制限されるのではない。
【００３６】
さらに、増幅のための組換えファージの成功的な再感染のために要求される野生型外皮タンパク質を提供するために使用され得るヘルパーファージには、例えば、Ｍ１３Ｋ０７またはＶＳＣＭ１３などがあるが、これに制限されるのではない。
【００３７】
本発明の具体的な実施例では、ヒトＶＣＡＭ−１に特異的なヒト抗体をファージ表出技術を用いてｓｃＦｖとして取得し、単一ファージクローン形態でスクリーニングすることによって、ヒトＶＣＡＭ−１に特異的な２０種の単一クローンファージを取得した。
【００３８】
本発明の具体的な実施例では、組換え技術で取得したＶＣＡＭ−１の分子量及び純度を確認した後、単一クローン抗体の製造に用いた。前記ＶＣＡＭ−１を多様性を有したヒト未加工ｓｃＦｖライブラリー細胞から製造したライブラリーファージと反応した後、パニングとＶＣＡＭ−１抗原に強く結合する単一クローン抗体をスクリーニングした(表１参照)。前記選別された単一クローン抗体などをフィンガープリントによって確認した後、それぞれの配列を分析して抗体のＶＨとＶＬのＣＤＲ領域を確認した。前記抗体と生殖系列抗体群との間の相同性をＮＣＢＩウェブサイトのＩｇ ＢＬＡＳＴプログラム(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)を用いて確認した。その結果、ＶＣＡＭ−１に特異的な２０種のファージ抗体を得た。
【００３９】
さらに、本発明の具体的な実施例によれば、前記選別された２０種のヒト抗体ファージの重鎖及び軽鎖またはその免疫学的に活性を有した断片をエンコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを製作した。前記発現ベクターの製作時には、前記ヒト抗体の軽鎖及び重鎖またはその断片を生産しようとする宿主細胞の種類に応じてプロモーター、ターミネーター、エンハンサーのような発現調節因子及び膜標的化または分泌のための配列を適切に選択し、目的のために多様に組み合わせるのに使用することができる。
【００４０】
本発明の発現ベクターは、プラスミドベクター、コズミドベクター、バクテリオファージベクター及びウイルスベクターなどを含むが、これに制限されない。適当な発現ベクターは、プロモーター、オペレータ、開始コドン、終結コドン、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサーのような発現調節因子の他にも膜標的化または分泌のためのシグナル配列またはリーダー配列を含み、その目的に応じて多様な形態で製造され得る。
【００４１】
さらに、本発明の一つの実施形態によれば、本発明は、前記組換えヒト単一クローン抗体と結合するヒトＶＣＡＭ−１抗原のドメインの位置を確認する方法を提供する。ＶＣＡＭ−１は、ＩｇＧ−類似ドメイン７つから構成されており、実質的に、その相手リガンドであるインテグリン(α４β１またはα４β７)と結合する時は、そのドメイン１とドメイン４が主に関与する。従って、本発明による組換えヒト単一クローン抗体に対するＶＣＡＭ−１抗原のエピトープを確認するために、下記の過程が具体的な実施例で行われた。
【００４２】
本発明者らは、ヒトＶＣＡＭ−１抗原をドメイン別(ＶＤ２、ＶＤ４、ＶＤ７)で発現及び精製した後、酵素免疫吸着法(ＥＬＩＳＡ)を用いて２０種に対する抗体などの抗原結合領域を分析した。その結果、抗体種類によって抗原結合領域が異なり、それらのうち、ドメイン１または２に結合する抗体Ｈ６及び７ＨＴを得た(図２参照)。
【００４３】
さらに、本発明による組換えヒト単一クローン抗体は、ヒトＶＣＡＭ−１抗原に対する親和度を提供する。本発明の具体的な実施例で、ビアコア分析によって抗体のヒトＶＣＡＭ−１抗原に対する結合／解離定数(ＫＤ)を求めることによって、親和度を確認することができた。Ｈ６抗体及び７ＨＴ抗体は、ヒトＶＣＡＭ−１に強い親和度を有していることと確認された(図３参照)。その結果、ヒトＶＣＡＭ−１抗原に対してＨ６抗体が約０．６ｎＭ水準の優れた結合力を有しており、７ＨＴ抗体はヒトＶＣＡＭ−１抗原に対して約６．３ｎＭ水準の結合力を有することと確認された。
【００４４】
従って、本発明による組換えヒト単一クローン抗体は、生物学的試料内の組換えヒト単一クローン抗体とＶＣＡＭ−１の間の抗原−抗体反応を介して検出する段階を含むＶＣＡＭ−１検出方法及び検出用組成物で使用することができる。
【００４５】
さらに、本発明の具体的な実施例では、白血球と活性化された内皮細胞間の相互作用がＶＣＡＭ−１によって媒介されるから、本発明による組換えヒト単一クローン抗体(Ｈ６)がヒト白血球(Ｕ９３７細胞)と組換えヒトＶＣＡＭ−１またはヒトＴＮＦ−αで刺激したヒト内皮細胞(ＨＵＶＥＣ)間の接合を阻害させ得ることを確認した。本発明の一つの実施形態によれば、ヒトＶＣＡＭ−１が固定化された固体支持体であるプレートまたはＨＵＶＥＣ単層プレートに前記の抗体などを濃度別に処理する。蛍光標識されたＵ９３７細胞が抗原に結合することを阻害することができるかどうかを確認してみるために、蛍光強度を測定した。その結果、前記抗体が接合阻害能を示した。特に、前記抗体は低い抗体濃度でも強い阻害能を示した(図４及び図５参照)。
【００４６】
また、本発明では、白血球と活性化された内皮細胞間の相互作用がＶＣＡＭ−１によって媒介されるから、本発明による組換えヒト単一クローン抗体がヒト白血球(Ｕ９３７細胞)とヒトＴＮＦ−αで刺激させたヒト内皮細胞(ＨＵＶＥＣ)間の相互作用の中でヒト白血球細胞のヒト内皮細胞単層透過を阻害させ得ることを確認した。本発明の実施例において、トランスウェル(transwell)プレートに敷かれたＨＵＶＥＣ単層に前記の抗体を処理した後、Ｕ９３７細胞による ＨＵＶＥＣ単層透過性をトランスウェルの下端に集められたＵ９３７細胞数を計数して確認した。その結果、前記抗体が強い透過阻害能を示した(図６参照)。
【００４７】
さらに、ＶＣＡＭ−１抗体(７ＨＴ)をＶＣＡＭ−１を発現するマウス大動脈内皮細胞に処理した時、炎症細胞の付着及び透過が効果的に抑制されることを確認した。その後、高脂質食餌を実施したマウスにＶＣＡＭ−１抗体(７ＨＴ)を腹腔投与時、大動脈内皮細胞に特異的に付着することを確認した(図１１)。ＶＣＡＭ−１抗体(７ＨＴ)の心血管疾患での治療効果可否を調査するために、ＡｐｏＥ−／−マウスを４つのグループに分けた。１グループでは、一般食餌と共にＰＢＳを週２回投与し、２グループは、高脂質食餌と共に対照群抗体として４ＢＴ(１０ｍｇ／ｋｇ)を週２回投与し、３グループは、高脂質食餌と共にＶＣＡＭ−１抗体として７ＨＴ(低濃度である１ｍｇ／ｋｇ)を週２回投与し、４グループは、高脂質食餌とＶＣＡＭ−１抗体として７ＨＴ(高濃度である１０ｍｇ／ｋｇ)を週２回ずつ１２週間投与した。その後、動脈硬化症分析のために、大動脈病変に対するエンフェース技法を行い、２グループに比べて４グループで動脈硬化症が有意的に減少することを確認することができた(図１７及び１８)。また、大動脈弓に形成された動脈硬化症を確認するために、心臓凍結切片を順次に用意して分析した。その結果、３、４グループで動脈硬化症が減少したことを確認した(図１９〜図２１)。血液分析によってこのような結果がコレステロール代謝／排出による影響ではないということを確認した(図１５)。また、実験期間中に測定した体重及び食餌飼料量の有意的な差がなかった(図１４)。実験後、抗体によって肝臓毒性を示すのか確認するために、毒性テストを実施した(図１５)。ＶＣＡＭ−１抗体(７ＨＴ)がＶＣＡＭ−１機能を抑制することによって、動脈硬化症を緩和させたこととして確認した。
【００４８】
従って、このような本発明の組換えヒト単一クローン抗体は、ヒト内皮細胞に発現されるＶＣＡＭ−１と強い親和度を有するため、ＶＣＡＭ−１に対する抗原認識を要求する任意の適用で使用され得る。特に、活性化された内皮細胞に対する白血球の接合と透過を効果的に阻害させるので、炎症性疾患、心血管疾患及び癌などのようなＶＣＡＭ−１媒介性疾患に対する効果的な診断及び治療方法を提供する。
【００４９】
従って、別の実施形態によって、本発明は、炎症性疾患または癌が疑われる個体の生物学的試料内で組換えヒト単一クローン抗体とＶＣＡＭ−１との間の抗原−抗体反応を介して検出する段階を含む炎症性疾患、心血管疾患または癌の診断に必要な情報の提供方法及び炎症性疾患、心血管疾患または癌の診断用組成物を提供する。
【００５０】
つまり、ヒトＶＣＡＭ−１に特異的に結合する単一クローン抗体を含む診断用組成物を使用してＶＣＡＭ−１の発現と関連した疾患またはＶＣＡＭ−１媒介される疾患、例えば、炎症性疾患、心血管疾患または癌を診断することができる。
【００５１】
前記炎症性疾患は、腫瘍壊死因子−α(ＴＮＦ−α)媒介性疾患及び大腸疾患から構成される群から選択され得るが、これに制限されるのではない。好ましくは、前記腫瘍壊死因子−α(ＴＮＦ−α)媒介性疾患は、喘息、糖尿病、ブドウ膜炎、強直性脊椎炎、敗血症、内毒素ショック、血流力学ショック、敗血症症侯群、虚血性再灌流損傷、マラリア感染、マイコバクテリア感染、髄膜炎、乾癬、うっ血性心不全、線維症疾病、カヘキシー、移植拒否、自己免疫疾病、エイズ関連日和見感染症、関節炎、リウマチ性脊椎炎、痛風、強直性痛風炎、クローン疾病、潰瘍性膀胱三角炎、多発性硬化症、癩性結節性紅斑(ＥＮＬ)、放射線障害及び酸素過多性肺胞損傷からなる群から選択され得る。
【００５２】
さらに、前記心血管疾患は、心筋梗塞、心臓麻痺、脳卒中、不整脈、高血圧、高脂血症及び動脈硬化から構成される群から選択され得る。
【００５３】
さらに、前記癌は、脳脊髓腫瘍、頭頸部癌、肺癌、乳房癌、胸腺種、中皮腫、食道癌、胃癌、大腸癌、肝臓癌、膵臓癌、胆嚢癌、腎臓癌、前立腺癌、睾丸癌、生殖細胞腫、卵巣癌、子宮頚部癌、子宮内膜癌、リンパ腫、急性白血病、慢性白血病、多発性骨髄腫、肉腫、悪性黒色腫、及び皮膚癌からなる群から選択され得る。
【００５４】
さらに、前記診断用組成物には、本発明による組換えヒト単一クローン抗体を含むことができる。
【００５５】
本明細書で使用された用語“生物学的試料”とは、組織、細胞、全血、血清、血漿、組織剖検試料(脳、皮膚、リンパ節、脊髓など)、細胞培養上澄液、破裂した真核細胞及び細菌発現系を挙げることができるが、これに制限されるのではない。これらの生物学的試料を操作するとか操作しない状態で本発明の抗体と反応させ、ＶＣＡＭ−１タンパク質の存在またはＶＣＡＭ−１媒介性疾患の有無を確認することができる。
【００５６】
本明細書で使用された用語“抗原−抗体複合体”とは、試料中のＶＣＡＭ−１抗原とこの抗原を認識する本発明による単一クローン抗体の結合物を意味する。このような抗原−抗体複合体の形成は、比色法、電気化学法、蛍光法、発光法 (luminometry)、粒子計数法、目視測定法(visual assessment)及び閃光計数法(scintillation counting method)からなる群から選択される任意の方法で検出することができる。しかし、この方法は、前記例などに制限されず多様な応用が可能である。
【００５７】
本発明では、抗原−抗体複合体を検出するために様々な標識体を使用することができる。その具体的な例としては、酵素、蛍光物、リガンド、発光物、微粒子及び放射性同位元素からなる群から選択され得るが、それらに限定されるのではない。
【００５８】
標識として使用され得る物質などの好適な例は、酵素としてアセチルコリンエステラーゼ、アルカリホスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ及びβ−ラクタマーゼ；蛍光物としてフルオレセイン、Ｅｕ3+、Ｅｕ3+キレート及びクリブテート；リガンドとしてビオチン誘導体；発光物としてアクリジニウムエステル、イソルミノール誘導体；微粒子としてコロイド金、着色されたラテックス；放射性同位元素として５７Ｃｏ、３Ｈ、１２５Ｉ、１２５Ｉ−ボルトンハンター(Bonton Hunter)試薬を含む。
【００５９】
好ましくは、抗原−抗体複合体を酵素免疫吸着法(ＥＬＩＳＡ)を用いて検出することができる。ＥＬＩＳＡ技法には、支持体に付着した抗原を認識する標識された抗体を用いる直接的ＥＬＩＳＡ；支持体に付着した抗原である抗原−抗体の複合体で捕獲抗体を認識する標識された２次抗体を用いる間接的ＥＬＩＳＡ；支持体に付着した抗原−抗体の複合体で抗原を認識する標識された別の抗体を用いる直接的サンドイッチＥＬＩＳＡ；及び固体支持体に付着した抗体と抗原の複合体で抗原を認識する別の抗体と反応させた後、この抗体を認識する標識された２次抗体を用いる間接的サンドイッチＥＬＩＳＡを含む。前記単一クローン抗体は、検出標識を持つことができ、検出標識を持たない場合はこれらの単一クローン抗体を捕獲することができ、検出標識を持つ他の抗体を処理して抗原−抗体複合体を確認することができる。
【００６０】
ヒトのＶＣＡＭ−１と特異的に結合する本発明の組換えヒト単一クローン抗体は、単独で、または通常の薬剤学的に許容される担体とともに炎症性疾患、心血管疾患または癌に対する予防及び治療用薬剤学的組成物の形態で使用可能である。
【００６１】
従って、さらに別の実施形態において、本発明は、組換えヒト単一クローン抗体及び薬剤学的に許容可能な担体を含む炎症性疾患、心血管疾患または癌の予防または治療用組成物及び前記組成物を個体に投与する段階を含む炎症性疾患、心血管疾患または癌の治療方法を提供する。
【００６２】
本明細書で使用された用語“個体”とは、ウマ、イヌ、ネコ、ブタ、ヤギ、ウサギ、ハムスター、サル、モルモット(guinea pigs)、ラット、マウス、トカゲ、ヘビ、羊、牛、魚及び鳥を含んで任意の動物(例えば、ヒト)を意味する。
【００６３】
本明細書で使用される用語“予防”とは、本発明による組換えヒト単一クローン抗体及び薬剤学的に許容可能な担体を含む組成物の投与によって前記疾患の発病を抑制または遅延させるすべての行為を意味する。
【００６４】
本明細書で使用される用語“治療”とは、本発明による組換えヒト単一クローン抗体及び薬剤学的に許容可能な担体を含む組成物の投与によって前記疾患の症状が好転するとか良いに変更するすべての行為を意味する。
【００６５】
本発明の組換えヒト単一クローン抗体は、多様な目的のために他の抗体、生物学的活性を有する製剤または物質と組み合わせて使用され得る。例えば、本発明の組換えヒト単一クローン抗体は、内皮細胞でＶＣＡＭ−１発現によって特徴付けられる疾患などの治療で他の抗ＶＣＡＭ−１抗体と組み合わせて使用され得る。また、本発明の組換えヒト単一クローン抗体は、炎症反応で示される他の内皮細胞受容体(例えば、ＥＬＡＭ１、ＩＣＡＭ１など)を認識する抗体などと公知の炎症性疾患治療薬物と組み合わせて使用され得る。
【００６６】
前記炎症性疾患は、腫瘍壊死因子−α(ＴＮＦ−α)媒介性疾患、及び大腸疾患から構成される群から選択されるものであり得るが、これに制限されるのではない。好ましくは、前記腫瘍壊死因子−α(ＴＮＦ−α)媒介性疾患は、喘息、糖尿病、ブドウ膜炎、強直性脊椎炎、敗血症、内毒素ショック、血流力学ショック、敗血症症侯群、虚血性再灌流損傷、マラリア感染、マイコバクテリア感染、髄膜炎、乾癬、うっ血性心不全、線維症疾病、カヘキシー、移植拒否、自己免疫疾病、エイズ関連日和見感染症、関節炎、リウマチ性脊椎炎、痛風、強直性痛風炎、クローン疾病、潰瘍性膀胱三角炎、多発性硬化症、癩性結節性紅斑(ＥＮＬ)、放射線障害及び酸素過多性肺胞損傷からなる群から選択され得る。
【００６７】
さらに、前記心血管疾患は、心筋梗塞、心臓麻痺、脳卒中、不整脈、高血圧、高脂血症及び動脈硬化から構成される群から選択され得る。
【００６８】
さらに、前記癌は、脳脊髓腫瘍、頭頸部癌、肺癌、乳房癌、胸腺種、中皮腫、食道癌、胃癌、大腸癌、肝臓癌、膵臓癌、胆嚢癌、腎臓癌、前立腺癌、睾丸癌、生殖細胞腫、卵巣癌、子宮頚部癌、子宮内膜癌、リンパ腫、急性白血病、慢性白血病、多発性骨髄腫、肉腫、悪性黒色腫、及び皮膚癌からなる群から選択され得る。
【００６９】
本発明の組換えヒト単一クローン抗体を含む組成物は、薬剤学的に有効な量で単一または複数回用量投与され得る。この時、組成物は、液剤、散剤、エアロゾル、カプセル剤、腸溶皮錠剤またはカプセル剤または坐剤の形態で投与することができる。多様な種類の投与経路としては、腹腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下内投与、内皮投与、経口投与、局所投与、鼻内投与、肺内投与及び直腸内投与が考慮され得るが、本発明はこれらの例示された投与方法に制限されない。しかし、経口投与の時、ペプチドは消化されるから経口用組成物は活性薬剤をコーティングするとか胃での分解から保護されるように製剤化されなければならない。
【００７０】
さらに、製薬組成物は、活性物質が標的細胞に移動することができる任意の装置を使用して投与され得る。
【００７１】
本発明の組換えヒト単一クローン抗体を含む組成物は、薬剤学的に有効な量で投与され得る。“薬剤学的に有効な量”とは、医学的治療または予防に適用可能な合理的なアドバンテージ／リスクの割合で疾患を治療または予防するのに十分な量を意味する。有効用量水準は、疾患の重症度；薬物の活性；患者の年齢、体重、健康及び性別；患者の薬物に対する敏感度；使用された本発明組成物の投与時間、投与経路及び排出の割合；治療期間；または使用された本発明の組成物と配合または同時に使用される薬物を含んだ要素及びその他の医学分野によく知られている他の要素に応じて決定され得る。さらに、本発明の単一クローン抗体組成物は、個別治療剤で投与するとか他の治療剤と組み合わせて投与されることができ、また、従来の治療剤とは順次または同時に投与され得る。
【００７２】
本発明の薬剤学的組成物を薬剤学的に有効な量で投与する場合、ＶＣＡＭ−１と強い親和度を有した本発明の組換えヒト単一クローン抗体が内皮細胞に発現されたＶＣＡＭ−１に特異的に結合することによって、ＶＣＡＭ−１を中和させる。結局、本発明の組換えヒト単一抗体が前記内皮細胞に白血球が接合することを阻害し、内皮細胞内に白血球が透過することを阻害することによって、炎症性疾患、心血管疾患及び癌を治療することができる。前記炎症性疾患は、腫瘍壊死因子−α(ＴＮＦ−α)媒介性疾患、及び大腸疾患から構成される群から選択されることができ、これに制限されるのではない。好ましくは、前記腫瘍壊死因子−α(ＴＮＦ−α)媒介性疾患は、喘息、糖尿病、ブドウ膜炎、強直性脊椎炎、敗血症、内毒素ショック、血流力学ショック、敗血症症侯群、虚血性再灌流損傷、マラリア感染、マイコバクテリア感染、髄膜炎、乾癬、うっ血性心不全、線維症疾病、カヘキシー、移植拒否、自己免疫疾病、エイズ関連日和見感染症、関節炎、リウマチ性脊椎炎、痛風、強直性痛風炎、クローン疾病、潰瘍性膀胱三角炎、多発性硬化症、癩性結節性紅斑(ＥＮＬ)、放射線障害及び酸素過多性肺胞損傷からなる群から選択され得る。
【００７３】
さらに、前記心血管疾患は、心筋梗塞、心臓麻痺、脳卒中、不整脈、高血圧、高脂血症及び動脈硬化から構成される群から選択され得る。
【００７４】
さらに、前記癌は、脳脊髓腫瘍、頭頸部癌、肺癌、乳房癌、胸腺種、中皮腫、食道癌、胃癌、大腸癌、肝臓癌、膵臓癌、胆嚢癌、腎臓癌、前立腺癌、睾丸癌、生殖細胞腫、卵巣癌、子宮頚部癌、子宮内膜癌、リンパ腫、急性白血病、慢性白血病、多発性骨髄腫、肉腫、悪性黒色腫、及び皮膚癌からなる群から選択され得る。
【００７５】
さらに、本発明のさらに別の実施形態によれば、本発明は、本発明による組換えヒト単一クローン抗体を用いて白血球及び活性化された内皮細胞間の接合及び前記活性化された内皮細胞への白血球の透過を阻害する方法を提供する。つまり、ＶＣＡＭ−１は炎症及び免疫拒否において活性化された白血球上に発現されるＶＬＡ−４(very late antigen-4)及びα４β１インテグリンと結合し、内皮細胞と単核球及びＴ細胞を含む白血球の間の相互作用を促進させる重要な役割を果たす。本発明による単一クローン抗体は、このようなＶＣＡＭ−１に特異的に結合して、白血球及び活性化された内皮細胞間の接合及び前記活性化された内皮細胞への白血球の透過を阻害させる。
【００７６】
本明細書で引用された多様な文献などは、その全部が参考文献として組み込まれる。当該技術の分野における熟練者らはただ通常的な実験によって、多数の均等な実施形態などが本明細書で考慮され得ることを認識または認めるだろう。従って、このような均等なものなどは本特許請求の範囲に含まれる。
【実施例】
【００７７】
以下、実施例によって本発明をより詳細に説明する。しかし、下記の実施例は、ただし、本発明を例示するための目的として提供されるもので、本発明が下記実施例に限定されるのではない。
【００７８】
１．ヒト及びマウスＶＣＡＭ−１抗原の製作
１．１．ヒトＶＣＡＭ−１のクローニング
韓国生命工学研究院(ＫＲＩＢＢ)人間遺伝体機能研究事業団のＫＵＧＩ(Korean UniGene Information)からヒトＶＣＡＭ−１遺伝子を含有するプラスミド(ｈＭＵ０１２６５０)(Ｋｕｇｉ ＃ ＩＲＡＵ−７５−Ｇ０２)を分譲受けた。前記プラスミドを鋳型ＤＮＡとして使用し、前記ＶＣＡＭ−１のＤ１−Ｄ２ドメインとＤ１−Ｄ４ドメインのみを発現させるために、ＶＣＡＭ−１のＤ１−Ｄ２ドメインの場合、正方向プライマー(５’−ＣＡＧＧＧＧＧＣＣＧＴＧＧＧＧＧＣＣＴＴＴＡＡＡＡＴＣＧＡＧＡＣＣＡＣＣＣＣ−３’)及び逆方向プライマー(５’−ＴＡＧＣＧＧＣＣＧＡＣＧＣＧＧＣＣＡＡＴＴＧＣＡＡＴＴＣＴＴＴＴＡＣＡＧＣＣＴＧ−３’)を使用し、ＶＣＡＭ−１のＤ１−Ｄ４の場合、正方向プライマー(５’−ＣＡＧＧＧＧＧＣＣＧＴＧＧＧＧＧＣＣＴＴＴＡＡＡＡＴＣＧＡＧＡＣＣＡＣＣＣＣ−３’)と逆方向プライマー(５’−ＴＡＧＣＧＧＣＣＧＡＣＧＣＧＧＣＣＡＡＧＡＧＣＴＣＣＡＣＣＴＧＧＡＴＴＣＣＣＴ−３’)を使用して各遺伝子を増幅した。ｓｆｉＩで処理した後、リガーゼを用いてｐＹＫ６０２−ＦｃベクターとｐＹＫ６０２−Ｈｉｓ ｏｎｌｙベクター(ＫＲＩＢＢで製造したベクター)にそれぞれクローニングした。ＰＣＲ産物などは、次のような条件で取得した：全体反応液が５０μｌの時、鋳型は１００ｎｇになるように入れ、９４℃で２分間反応させた後、９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分３０秒(Ｄ１−Ｄ４)、４５秒(Ｄ１−Ｄ２)で３０サイクル、その後、７２℃で１０分間反応させた。また、前記クローニングされたｐＹＫ６０２−ＦＣ−ＶＣＡＭ−１−Ｄ１−Ｄ２、ｐＹＫ６０２−Ｈｉｓ−ＶＣＡＭ−１−Ｄ１−Ｄ２、ｐＹＫ６０２−ＦＣ−ＶＣＡＭ−１−Ｄ１−Ｄ４及びｐＹＫ６０２−Ｈｉｓ−ＶＣＡＭ−１−Ｄ１−Ｄ４ベクターなどの塩基配列を確認した。
【００７９】
１．２．ＶＣＡＭ−１タンパク質の発現及び精製
様々なタンパク質のうち、分子全体を含むｈＶＣＡＭ−Ｆｃ−キメラ(R&D system, cat#: 862-VC)とｍＶＣＡＭ−１−Ｆｃキメラ(R&D systems, Cat#: 643-VM)とは、商業的に購買し、ＶＣＡＭ−１ドメイン別の断片の発現及び精製は以下のように行われた。
【００８０】
先ず、１５０ｍｍ直径ディッシュ１０枚に５×１０6２９３Ｅ細胞を播いた後、翌日に前記クローニングされたｐＹＫ６０２−ＶＣＡＭ−１−Ｄ１−Ｄ２ベクターとｐＹＫ６０２−ＶＣＡＭ−１−Ｄ１−Ｄ４ベクターとをそれぞれ２０μｇずつＰＥＩ(23966:Polysciences,Inc, USA)を処理して形質転換した。翌日培地を無血清ＤＭＥＭに置き換えた後、二日ごとに上澄液を得て１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで電気泳動した後、ウエスタンブロットで発現量を確認した。
【００８１】
ｈＶＣＡＭ−１−Ｄ１−Ｄ２−ＦｃとｈＶＣＡＭ−１−Ｄ１−Ｄ４−Ｆｃとの発現が確認された上澄液を集めた後、０．２２μｍトップフィルター(Millipore，Cat#:SCGP T05 RE)を使用してろ過した後、先ず、十分なタンパク質量を確保した。前記タンパク質などは精製した後に使用し、精製過程は次の通りである。まず、エコノカラム(Econo-column)(Bio-Rad Cat．No 737-1006，1×5cm)をＰＢＳで洗浄した後、タンパク質Ａ(Amersham Cat．No．17-1279-30)５００μｌをパッキングする。パッキングする間、ＰＢＳ(ｐＨ７．４)１０ｍｌをカラムに適用させ、ビーズを洗浄し、結合バッファーである２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー(ｐＨ７．０)３０ｍｌを流した。その後、得られた上澄液をペリスタルティック・ポンプ(Peri-staltic pump)(Bio-Rad Cat．No．731-8142)を用いて流量０．５ｍｌ／分程度に適用させた。カラムに結合させた後、ＰＢＳで流量２ｍｌ／分で１時間程度洗浄した後、溶出した。０．１Ｍグリシン−ＨＣｌ(ｐＨ２．５)５００μｌで溶出し、１／１０体積の１Ｍトリス−ＨＣｌ(ｐＨ９．０）を入れて中和させた。６つの溶出分画の中でタンパク質は＃１〜＃２分画に大部分溶出された。これら２つの分画は、１０Ｋ透析膜に入れて４ＬのＰＢＳでｏ／ｎ透析した。前記のすべての過程は、４℃のコールドルームで行われた。定量後、生成物などをアリコットして−７０℃に保管した。精製した後、生成物を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで確認した。ｈＶＣＡＭ−１−Ｄ１−Ｄ２−ＦｃとｈＶＣＡＭ−１−Ｄ１−Ｄ４−Ｆｃに対して、それぞれ２．８ｍｇと８００μｇの量を得た。ｈＶＣＡＭ−１−Ｄ１−Ｄ２−ｈｉｓとｈＶＣＡＭ−１−Ｄ１−Ｄ４−ｈｉｓの発現が確認された上澄液を収集した後、０．２２μｍのトップフィルター(Millipore，Cat#: SCGP T05 RE)を使用してろ過した後、ＬａｂＳｃａｌｅ ＴＦＦ Ｓｙｓｔｅｍ(Millipore，Cat#: XX42LSS11)のｐｅｌｌｉｃｏｎ ＸＬ ｍｅｍｂｒａｎｅ(Millipore，8K，cat #: PXB0 08A 50)を用いて１／１０体積で濃縮した。１０倍体積のＩＭＡＣ緩衝溶液(３００ｍＭのＫＣｌ、５０ｍＭのＫＨ2ＰＯ4、５ｍＭのイミダゾール、ｐＨ８．０)を濃縮物に添加し、ＩＭＡＣ緩衝溶液に置き換えた。ＰｒｏｆｉｎｉａＴＭタンパク質精製システム(Bio-Rad)のＢｉｏ−Ｓｃｌｅ Ｍｉｎｉ ｐｒｏｆｉｎｉｔｙ ＩＭＡＣ ｃａｒｔｒｉｄｇｅ(cat#:732-4610)を使用して１ｍｌ／分の速度で製造社のマニュアルによって精製した。前記溶出液をメンブレン(10K，132574:SPECTRAPOR，USA)に入れた後、４℃で４ＬのＰＢＳ溶液に４時間以上緩衝溶液を置き換えた後、再び予め冷たくしておいた４ＬのＰＢＳ溶液に入れて一晩透析して緩衝溶液を置き換えた。一晩透析した後、その産物をｅ−チューブに移し、ブラッドフォード(Bradford)方法でタンパク質濃度を測定した。その結果、４００μｇのｈＶＣＡＭ−１−Ｄ１−Ｄ４−ｈｉｓ、ｈＶＣＡＭ−１−Ｄ１−Ｄ２−Ｆｃタンパク質を得り、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで確認した。
【００８２】
２．ライブラリーファージの製造
多様性を持ったヒトｓｃＦｖライブラリー細胞２×１０10個をアンピシリン５０μｇ／ｍｌ、２％グルコースを含むＳＢ培地［バクトトリプトン３０ｇ、イースト抽出物２０ｇ、ＭＯＰＳ１０ｇ、ｐＨ７．０］で３７℃で２〜３時間培養した（ＯＤ600＝０．５）。その後、細胞をＶＣＳＭ１３ヘルパーファージに感染させた後、カナマイシンを７０μｇ／ｍｌで追加した培地で１ｍＭのＩＰＴＧを添加して３０℃で１６時間培養した。培養した細胞を遠心分離(４５００ｒｐｍ、１５分、４℃)した後、上澄液を得て、４％ＰＥＧ６０００と３％のＮａＣｌが添加された溶液に溶解した後、氷中で１時間反応させた。前記反応物を再び遠心分離(８０００ｒｐｍ、２０分、４℃)した。ペレットにＰＢＳを添加して溶解した後、遠心分離(１２０００ｒｐｍ、１０分、４℃)した。その結果、ライブラリーファージを含む上澄液を得り、これを新しいチューブに入れて４℃で保管した。
【００８３】
３．ファージディスプレイによるバイオパニング
７つのＩｇＧ−類似ドメインから構成されているＶＣＡＭ−１は、そのリガンドであるα４β１インテグリン(α4β1 integrin)と結合する時、そのドメイン１とドメイン４が結合モチーフとして機能をすると知られている。従って、ＶＣＡＭ−１全体分子だけでなくヒトＶＣＡＭ−１−Ｄ１−Ｄ４(ｈＶＣＡＭ−１−Ｄ１−Ｄ４)を用いてパニングを進行した。本実施例では、ｈＶＣＡＭ−１−Ｄ１−Ｄ４に対するパニング方法と結果が記載されるだろう。
【００８４】
３．１．ｈＶＣＡＭ−１−Ｄ１−Ｄ２抗原とｈＶＣＡＭ−１−Ｄ１−Ｄ４抗原に対するバイオパニング
ヒト組換えＶＡＣＭ−１(R&D system，809-VR)抗原が１０μｇ／ｍｌでコーティングされたＩｍｍｕｎｏｓｏｒｂチューブ(Ｎｕｎｃ４７０３１９)をスキムミルク／ＰＢＳで先に遮断させた後、室温で１〜２時間上記で製造したライブラリーファージ(１×１０12ｃｆｕ)とともに培養した。前記チューブをＴＢＳＴ(０．０５％)で３回洗浄した。結合されたファージを室温で１０分間１ｍｌの新たに製造した１００ｍＭのトリエチルアミンの溶液を使用して溶出させた。溶出されたファージなどを１Ｍのトリス(ｐＨ７．４)溶液で中和した後、大腸菌(ＥＲ２５３７)に感染させて３７℃で１時間培養した。感染された大腸菌は、２％グルコースとアンピシリンが含まれたＬＢ−アガロース培地プレート(直径１５ｃｍ)に塗布して、３７℃で１６時間培養した。培養された大腸菌を５ｍｌのＳＢに分散し、このうち、５０ｍｌをＳＢ−アンピシリン−グルコース２０ｍｌに接種し、＜１．ライブラリーファージの製造＞の方法によって結合型ファージを含む溶液を得て次数のパニングに使用した。１次パニングの以後２次〜４次パニングではＩｍｍｕｎｏｓｏｒｂチューブにｈＶＣＡＭ−１−Ｄ１−Ｄ２抗原とｈＶＣＡＭ−１−Ｄ１−Ｄ４抗原をそれぞれコーティングして、それぞれのパニングを進行した(表１参照)。
【００８５】
【表１】
【００８６】
３．２．ｈＶＣＡＭ−１−Ｄ１−Ｄ４抗原に対する単一クローン抗体選別
４次パニングの後、アウトプットタイタープレートから単一コロニーを滅菌されたトゥースピック(toothpick)を使用してそれぞれ抜き取って、ＳＢ−アンピシリン培地(２００μｌ／ウェル)が入っている９６ウェルプレートにそれぞれ接種した後、３７℃で２〜３時間(ＯＤ600＝０．５〜０．７)培養した。以後、各ウェルに２０μｌの１０ｍＭのＩＰＴＧを入れて３０℃で１６時間培養した。９６ウェル免疫プレート(Ｃｏｓｔａｒ３６９０)の各ウェルにｈＶＣＡＭ−１−Ｄ１−Ｄ４抗原をウェル当り２５０ｎｇずつ３７℃で１時間コーティング緩衝溶液で処理してコーティングした後、ＰＢＳに溶解したスキムミルク(３％)を使用して各ウェルを遮断した。４次パニングｓｃＦｖファージを先に遠心分離した後(３０００ｒｐｍ、１５分)、上澄液を除去した。ＴＥＳバッファー６０μｌずつ各ウェルに添加した後、氷中で３０分間培養した。その後、遠心分離し(３０００ｒｐｍ、１５分)、それぞれの上澄液を３％スキムミルク／ＰＢＳが除去されたＶＣＡＭ−１−Ｄ１−Ｄ４抗原がコーディングされた９６ウェル免疫プレートにウェル当り２５μｌずつ入れた。
【００８７】
各ウェルごとにＰＢＳ−ｔｗｅｅｎ２０(０．０５％)０．２ｍｌで４回洗浄した後、３％スキムミルク／ＰＢＳに１：３０００の割合で希釈された二次抗体抗−ＨＡ−ＨＲＰ(Santa Cruz，SC-7392)を各ウェルごとに２５μｌずつ添加した後、１時間反応じた。ＰＢＳ−ｔｗｅｅｎ２０(０．０５％)０．２ｍｌで４回洗浄した後にＴＭＢ溶液を各ウェル当り２５μｌずつ添加した後、５分間放置した。反応後、すぐに１ＭのＨ2ＳＯ4溶液を２５μｌずつ各ウェルに入れて反応を停止させた後、４５０ｎｍで吸光度を分光光度計(MolecularDevice，USA)を用いて測定した。
【００８８】
その結果、ｈＶＣＡＭ−１−Ｄ１−Ｄ４抗原に対する７８個の単一ファージクローンなどの結合能を比較確認し、それらの種類をフィンガープリントと配列分析で確認した。最後に、２０種の互いに異なるファージ抗体を選別した。
【００８９】
４．全体ＩｇＧ形態へのクローニング
ｈＶＣＡＭ−１に対する単一クローンファージ抗体などをファージからＩｇＧ全体ベクターに転換するために、重鎖を得るために単一クローンＤＮＡ１μｌと１０ｐｍｏｌｅ／μｌの重鎖正方向プライマーと重鎖逆方向プライマー、１０×バッファー５μｌ、１０ｍＭのｄＮＴＰミックス１μｌ、ｐｆｕＤＮＡ重合酵素(Solgent，２．５Ｕ／μｌ)０．５μｌ及び蒸溜水を使用してコロニーＰＣＲ(iCycler iQ，BIO-RAD)を行った。また、軽鎖を得るために軽鎖正方向及び逆方向プライマー を使用して同様の方法でコロニーＰＣＲを行った。
【００９０】
ＰＣＲから取得した重鎖ＤＮＡをＤＮＡ−ゲル抽出キット(Qiagen)を用いて精製した後、ｐＮＡＴＡＢ Ｈベクター１μｌ(１０ｎｇ)、重鎖(１００〜２００ｎｇ)１５μｌ、１０×バッファー２μｌ、リガーゼ(１Ｕ／μｌ)１μｌ、及び蒸溜水を混合し、室温で１〜２時間放置して前記ベクターと連結した。前記ベクターをコンピテント細胞(ＸＬ１−ｂｌｕｅ)に添加した後、氷に３０分間放置した後、４２℃で９０秒間ヒートショックを与えて形質導入した。この混合物を再び氷に５分間放置した後、ＬＢ培地１ｍｌを追加した。３７℃で１時間培養した後、細胞をＬＢ Ａｍｐ固体培地に塗抹した後、３７℃で１６時間培養した。得られた単一コロニーをＬＢ Ａｍｐ液体培地５ｍｌに接種した後、３７℃で１６時間培養した。前記培養培地からＤＮＡ−ｐｒｅｐ．キット(Nuclogen)を用いてＤＮＡを抽出した。また、軽鎖ＤＮＡは、ｐＮＡＴＡＢ Ｌベクターを使用して前記と同様の方法でＤＮＡを抽出した。前記取得したＤＮＡの塩基配列分析は、ＣＭＶｐｒｏＦプライマー(ＡＡＡ ＴＧＧ ＧＣＧ ＧＴＡ ＧＧＣ ＧＴＧ)(Solgent)を用いて行われた。その結果、全体ＩｇＧに転換した多様なＶＣＡＭ−１に対する９個のクローンの重鎖と軽鎖の配列がファージ抗体の配列と同一であることを確認した。
【００９１】
５．抗体の臨時遺伝子発現
前記クローニングされた全体ＩｇＧ重鎖ＤＮＡと軽鎖ＤＮＡから臨時遺伝子発現を行った。
【００９２】
臨時遺伝子発現に対する宿主細胞としてＣＨＯ(Chinese Hamster Ovary)−Ｓ細胞を使用してリポフェクタミン２０００(Cat no.11668-019，Invitrogen)：ＤＮＡの１：１割合でＯｐｔｉ−ＭＥＭＩ(GIBCO31985，Invitrogen)混合溶液から形質転換を誘導した。臨時発現を最大化させるために、重鎖と軽鎖のＤＮＡ量の割合は１：１で構成した。形質転換用培地としては、ＲＰＭＩ１６４０(GIBCO 22400，Invitrogen)培地を使用し、細胞濃度は２×１０6細胞／ｍｌで使用した。混合溶液を２０分間反応した後、形質転換用培地に１：９割合で混合し、これをＣＯ2５％、３７℃に設定された培養器に１１０ｒｐｍで４時間培養させた。以後、８ｍＭグルタミン(GIBCO 25030, L-Glutamine 200 mM, 100×, Invitrogen)とＨＴＳ(GIBCO, HT Supplement, Cat no. 11067-030, Invitrogen)が含まれたＣＤ−ＣＨＯ培地(GIBCO 10743，Invitrogen)に形質転換された体積と同一体積の培地を添加した。フラスコはＣＯ2８％、３７℃に設定された培養器で１００ｒｐｍで４日間培養した。このように培養試料は、８、０００ｇで１５分間遠心分離して細胞残骸を除去した後、上澄液は０．２２μｍのろ過器(Corning)でろ過して抗体の分離及び精製のための培養液を準備した。
【００９３】
６．抗体の分離及び精製
実施例５で準備した上澄液を平衡化緩衝液(５０ｍＭトリス−ＨＣｌ(ｐＨ７．４)、１００ｍＭのＮａＣｌ)で平衡化させた組換えタンパク質−Ａセファロースカラム(Hitrap rProteinA FF, 5 mL, GE healthcare)に通過させた。カラムに結合された抗体を０．１ＭのＮａ−シトラート(citrate)(ｐＨ３．０)、１００ｍＭのＮａＣｌ溶液で溶出させた後、１Ｍのトリス−ＨＣｌ(ｐＨ９．０)で中和させ、ＰＢＳ(phosphate buffered saline，pH7.4，Welgene)緩衝液で透析させた。精製された抗体をＢｉｓ−トリス ４−１２％濃度勾配ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル(NuPAGE gel，Invitrogen)上で還元条件で電気泳動した。その結果、約５５ｋＤａの重鎖と約２５ｋＤａの軽鎖が観察された。
【００９４】
７．抗体の抗原親和度分析
７．１．抗原ドメインに対する親和度
７つのドメインから構成されたＶＣＡＭ−１で抗ＶＣＡＭ−１抗体が結合する位置をＥＬＩＳＡによって確認した。組換えヒトＶＣＡＭ−１ドメイン１〜２／Ｆｃキメラ(以下、‘ＶＤ２’という、A&R therapeutics)、ＶＣＡＭ−１ドメイン１〜４／Ｆｃキメラ(以下、‘ＶＤ４’という、A&R therapeutics)及びＶＣＡＭ−１ドメイン１〜７／Ｆｃキメラ(以下、‘ＶＤ７’という、R&D，862-VC)をそれぞれ２μｇ／ｍｌ濃度でマイクロプレートのウェルに一晩４℃でコーティングした。ＰＢＳを使用して前記プレートを１回洗浄した後、３％ＢＳＡ(bovine serum albumin)が添加されたＰＢＳを使用して２時間３７℃で遮断させ、７Ｈ抗体を含んでいる細胞培養培地(１：５０)を入れて２時間３７℃で培養した。０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳを使用してプレートを４回洗浄した後、組換えヒトＶＣＡＭ−１抗原に結合した抗ＶＣＡＭ−１抗体の量を抗−Ｆａｂ単一クローン抗体ホースラディッシュペルオキシダーゼが共役された(conjugated)抗−Ｆ（ａｂ′）２抗体で検出した。プレートはＴＭＢ基質溶液(３、３、５、５−テトラメチルベンジジン)を使用して室温で約５分間反応させ、１Ｎ(ノーマル)硫酸溶液で反応を止めた後、光学密度４５０ｎｍで測定した。Ｈ６抗体の場合、精製された抗体を１００〜１２５ｎｇ／ｍｌに希釈し、反応させた後、ホースラディッシュペルオキシダーゼが共役された抗−カッパ軽鎖抗体の作用によって検出した。
【００９５】
図２に示されたように、Ｈ６は、ＶＣＡＭ−１ドメイン１〜２(ＶＤ２)、１〜４(ＶＤ４)、１〜７(ＶＤ７)のすべてに強い結合能を持っていることを確認した。特に、Ｈ６抗体は、ＶＣＡＭ−１の７つドメインのうち、１〜２ドメイン(ＶＤ２)に優れた結合能を持っていることを確認した。また、７Ｈ抗体もＶＣＡＭ−１ドメインのうち、１〜２ドメイン(ＶＤ２)に優れた結合能を持っていることとして確認された。
【００９６】
７．２．ビアコアによる親和度分析
ヒトＶＣＡＭ−１抗原に対する抗ＶＣＡＭ−１抗体Ｈ６と７ＨＴの結合親和度を確認するために、各抗原をリガンドとしてセンサーチップ(Sensor chip CM5，BIACORE，BR-1003-99)に固定化させた後、ヒト抗体を濃度別に希釈してビアコアを用いて固定化されたリガンドに適用させて抗原−抗体間の結合及び解離反応を誘導することによって、該当抗原−抗体間の結合力を示す結合／解離定数Ｋｄ値を確認した。これに対する結果を図３に示した(参考文献：Thomas Hofer, Wisit Tangkeangsirisin, Michael G. Kennedy, Rose G. Mage, Stephen J. Raiker, Karthik Venkatesh, Hakjoo Lee, Roman J. Giger, Christoph Rader Chimeric rabbit/human Fab and IgG specific for members of the Nogo-66 receptor family selected for species cross-reactivity with an improved phage display vector Journal of Immunological Methods 318 (2007) 75.87; Paula Gomes a, David Andreu Direct kinetic assay of interactions between small peptides and immobilized antibodies using a surface plasmon resonance biosensor Journal of Immunological Methods 259, 2002.217-230, and Kikuchi Y, Uno S, Nanami M, Yoshimura Y, Iida S, Fukushima N, Tsuchiya M. Determination of concentration and binding affinity of antibody fragments by use of surface plasmon resonance. Journal of Bioscience and Bioengineering Vol. 100, No. 3, 311-317, 2005)。
【００９７】
ビアコア分析は、１）センサーチップとリガンド間のカップリング条件を決定する緩衝液選別段階；２）リガンドをセンサーチップに固定化させる段階；及び３）固定化されたリガンドに分析物質を結合させる段階の３段階から構成される。
【００９８】
１）緩衝液選別段階
本試験で、通常該当の実験用として使用されるビアコアセンサーチップであるＣＭ５センサーチップ(BIACORE，BR-1003-99)を使用し、リガンドをチップに固定化させる前に、リガンドとセンサー表面間の静電気的相互作用をカップリング緩衝液として使用するｐＨ４．０〜５．５間の酢酸ナトリウム溶液を用いて決定した。
【００９９】
２）リガンド固定化段階
センサーチップＣＭ５にリガンドを固定化させるために、最初にチップを活性化させなければならず、このためにN-ヒドロキシスクシンイミド(ＮＨＳ)とＮ−エチル−Ｎ’−(ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(ＥＤＣ)(Amine Coupling Kit，BR-1000-50)を混合してアミノ基と非常に反応性が良いＮＨＳ−エステル活性化されたチップに作った。固定化させようとする１ｍｇ／ｍｌ濃度リガンドを酢酸ナトリウム溶液(ｐＨ４．０〜５．５間)９７μｌに３／１００の希釈割合で希釈した後、流速を１０μｌ／分にして約３分間注入した(陰性対照群としてリガンドをランニングバッファー(running buffer)であるＨＢＳ−ＥＰ緩衝液(BIACORE AB, Sweden)を用いて同一の方式で希釈する)。リガンドを予め設定した値であるターゲットＲＵ(resonance unit)で固定化させるために、ターゲットＲＵに逹するまで自動で順次に注入される。リガンドが固定化されたチップを不活性化させるために、１Ｍエタノールアミン(Amine Coupling Kit, BR-1000-50)を流速１０μｌ／分にして約３分間注入した。最終のＲＵ値は、エタノールアミン注入前後のＲＵ値の差に対して提供する固定化レポートによって決定された。
【０１００】
３）固定化されたリガンドに分析物質を結合させる段階
該当の試験で非特異的結合を除去させるために、ビアコア機器によって提供されるフローセル２−フローセル１方法を使用した。この時、フローセル２にはリガンドとして組換えＶＣＡＭ１／Ｆｃ抗原を固定化させ、フローセル１にはＢＳＡ(Bovine Serum Albumin)を固定化させた。その後、分析試料である抗ＶＣＡＭ−１抗体であるＨ６を同時にフローセル１及び２に流した。フローセル２のセンソグラム(sensogram)ＲＵからフローセル１のセンソグラムＲＵを自動的に除去した。以後、流速を３０μｌ／分にして約３分間分析試料を適用し、再び１２０秒間解離を誘導させた。このような過程を介して、該当抗原と抗体との結合／解離曲線を得り、以後、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎプログラム(BIACORE AB, Sweden)によって図３のように、結合／解離定数ＫＤ値を算出した。その結果、ヒトＶＣＡＭ−１抗原に対してＨ６抗体が約０．６ｎＭの優れた結合力を持っており、７ＨＴ抗体は約６．３ｎＭ水準の結合力を有することとして確認された。
【０１０１】
８．抗体の白血球細胞接合阻害効果
８．１．ヒトＶＣＡＭ−１抗原と白血球との間の接合阻害効果
９６−ウェルプレート(Maxisorp，Nunc)の各ウェルに組換えヒトＶＣＡＭ−１(10μg/ml, Cat. No.: 809-VR-200, R&D systems)１００μｌを入れて１時間コーティングした後、抗体Ｈ６をそれぞれ０．０１、０．１、１．０及び１０．０μｇずつＶＣＡＭ−１がコーティングされたウェルに添加して１時間抗原に結合するようにした。この時、陽性対照群として４Ｂ２マウス抗−ヒトＶＣＡＭ−１単一クローン抗体(Cat．No.:BBA5，R&D)を使用し、陰性対照群として抗体処理をせず抗原のみを処理した。抗原と抗体間の結合が進行される間に、ヒト白血球細胞であるＵ９３７(Cat．No.:CRL-1593.2，ATCC)の蛍光染色を５μＭのＢＣＥＣＦ−ＡＭ(Cat．No.:216254，Calbiochem)を使用して行った。次に、Ｕ９３７細胞表面にあるＦｃ受容体を不活性化させるためにＵ９３７細胞に１００％ヒト血清(Cat．No.:H4522，Sigma)を処理した。蛍光染色とＦｃ受容体不活性化過程を経た白血球細胞を１％子牛血清が含まれたＲＰＭＩ１６４０(Cat．No.:22400-089，Invitrogen)培地に１．０×１０6細胞／ｍｌの密度になるように浮遊させた。準備されたＵ９３７細胞を抗原と抗体が処理されたプレートに各ウェルに１００μｌずつ入れて３７℃、５％ＣＯ2培養器で１５分間培養させた後、１％子牛血清が含まれたＲＰＭＩ１６４０培地をウェルに満ちるまで入れてシールテープで培地を密閉した。プレートをひっくり返した後、２００×重力で５分間遠心分離した。ひっくり返られた遠心分離したプレートからシールテープを除去した。培地及び接着していないＵ９３７細胞を完全に除去した後、細胞溶解緩衝液(５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ(ｐＨ８．５)、０．１％ＳＤＳ)を各ウェルに１５０μｌずつ入れて１５分間接着されているＵ９３７細胞を溶解した。その後、プレートを蛍光分析機(GeminiX，Molecular Device)に挿入し、吸収波長４８５ｎｍ／放出波長５３０ｎｍで蛍光強度を測定した。３回測定(各実験条件当り)の平均値を算出し、抗体を処理しない群に比べて蛍光強度がどのくらい減少したかを計算して阻害率を分析した。その結果、Ｈ６抗体は１μｇ以上で８０％以上の阻害を示した(図４参照)。
【０１０２】
８．２．ヒト内皮細胞と白血球細胞との間の接合阻害効果
９６−ウェルプレート(Microtest tissue culture 96-well plate，BD-Falcon)の各ウェルにヒト内皮細胞であるＨＵＶＥＣ細胞を２×１０4個ずつ施し、約３日間ＥＧＭ−２培地(Lonza)で製造社の指示に従って培養した。顕微鏡で細胞単層が観察される時、ヒトＴＮＦ−αを２０ｎｇ／ｍｌの濃度で２４時間細胞を刺激させた。以後に、ＴＮＦ−αを除去するために、各ウェルをＥＧＭ−２培地２００μｌで２回洗浄した後、抗体Ｈ６をそれぞれ０．０１、０．１、１．０、１０．０μｇずつＨＵＶＥＣ単層が施されたウェルに添加した。前記プレートを抗原−抗体結合を誘導するために１時間培養した。この時、陽性対照群として０．５及び５．０μｇの４Ｂ２マウス抗−ヒトＶＣＡＭ−１単一クローン抗体(Cat. No.:BBA5，R&D)とマウス抗−α４インテグリン抗体を使用し、陰性対照群として抗体処理をせず抗原のみを処理した。抗体と抗原間の結合が進行される間にヒト白血球細胞であるＵ９３７(Cat. No.:CRL-1593.2，ATCC)の蛍光染色を５μＭのＢＣＥＣＦ−ＡＭ(Cat. No.:216254，Calbiochem)を用いて行った。次に、Ｕ９３７細胞表面にあるＦｃ受容体を不活性化させるためにＵ９３７細胞に１００％ヒト血清(Cat. No.:H4522，Sigma)を処理した。蛍光染色とＦｃ受容体不活性化過程を経たＵ９３７細胞を１％子牛血清が含まれたＲＰＭＩ１６４０(Cat．No.:22400-089，Invitrogen)培地に１．０×１０6細胞／ｍｌの密度になるように浮遊させた。準備されたＵ９３７細胞を抗体が結合されたＨＵＶＥＣにウェル当り１００μｌずつ入れてアルミホイル で光を遮断した。プレートを３７℃、５％ＣＯ2培養器で１０分間培養した後、培地及び接着しない細胞を除去するためにプレートをひっくり返した。１％牛胎児血清が含まれたＲＰＭＩ１６４０培地を各ウェルに満ちるまで入れ、シールテープでしっかりと密封した。プレートをひっくり返したまま４００×重力で５分間遠心分離した。遠心分離したプレートをひっくり返したままシールテープを除去した。培地及び接着しないＵ９３７細胞を完全に除去した後、細胞溶解緩衝液(５０ｍＭトリス−ＨＣｌ(ｐＨ８．５)、０．１％ＳＤＳ)を各ウェルに１５０μｌずつ入れて１５分間接着されたＵ９３７細胞を溶解した。その後、プレートを蛍光分析機(GeminiX，Molecular Device)に挿入し、吸収波長４８５ｎｍ／放出波長５３０ｎｍで蛍光強度を測定した。３回測定(各実験条件当り)の平均値を算出し、抗体を処理しない群に比べて蛍光強度がどのくらい減少したかを計算して阻害率を分析した。その結果、Ｈ６は０．１〜１０．０μｇで約２５〜６５％の阻害を示した(図５参照）。この結果は、実施例８．１のＶＣＡＭ−１抗原と白血球細胞接合阻害効果分析結果と類似した。
【０１０３】
９．白血球のヒト内皮細胞への透過阻害効果
ヒト内皮細胞(human umbilical vein endothelial cell)(HUVEC)，Cambrex，C2517A)２×１０4細胞／３００μｌ(ＥＧＭ−２培地)をトランスウェル(6.5mm insert, 5μm polycarbonate membrane, Corning, 3421)のインサートで約４日間単一膜を形成するまで培養した。ＶＣＡＭ−１の発現誘導因子であるヒトＴＮＦ−α(20ng/ml，abcam，ab9642)を細胞に処理して、１４〜１６時間ＶＣＡＭ−１の発現を誘導させた。継代１〜５の間のＨＵＶＥＣ細胞を使用した。
【０１０４】
ヒト前単球(U937，CRL-1593.2 TM)は、１％ＦＢＳ／ＲＰＭＩ１６４０(Gibco， 22400)培地で２回洗浄(１１００ｒｐｍ、３分間遠心分離)した後、５×１０6細胞／ｍｌの密度でヒト血清(Sigma，H4522)に懸濁し、室温で１５分間培養してＦｃ受容体を遮断した。ＨＵＶＥＣがあるインサートからＴＮＦ−αが添加された培地を除去した後、抗体Ｈ６をそれぞれ１％ＦＢＳ／ＲＰＭＩ培地１００μｌに入れ、Ｆｃ受容体が遮断されたＵ９３７細胞の一部は、抗−α４インテグリン抗体または組換えヒトＶＣＡＭ−１抗原に懸濁して、３０分間３７℃で前処理した。前処理が終わったＨＵＶＥＣに１％ＦＢＳ／ＲＰＭＩ培地のＵ９３７細胞(５×１０5細胞／２００μｌ)を添加し、抗−α４インテグリン抗体に懸濁したＵ９３７も同じ細胞数をまたＨＵＶＥＣに添加した。この時、Ｕ９３７白血球の内皮透過移動を誘導するために、各ウェルに１０ｎＭのＣ５ａ(R&D，2037C5)４００μｌずつ入れ、３７℃培養器で２〜６時間培養した。以後、インサートを除去し、底ウェルに移動した白血球をｅ−チューブに回収した。１、５００ｒｐｍで３分間遠心分離して培地を除去した後、１×ＰＢＳ６００μｌに細胞ペレットを懸濁して細胞数を数えた(細胞計数器、Beckman Coulter TM，Vi-Cell XR 2.03)。
【０１０５】
ＴＮＦ−αを処理したＨＵＶＥＣ実験群(ヒトＩｇＧ対照群処理群)のＣ５ａ処理による白血球の移動数から未処理実験群(ＴＮＦ−α及びＣ５ａ未処理)の非特異的に移動した白血球数を差し引いて、これを１００％移動として計算した。各試験抗体の移動阻害(％)を算出した。その結果、Ｈ６抗体が２５％程度の透過阻害を示すことを確認した(図６参照)。
【０１０６】
１０．ＲｈｏＡ(Ras homolog gene family，member A)活性阻害効果
ＨＵＶＥＣ(ヒト臍帯血管内皮細胞)２×１０5個を６−ウェルプレートに接種し、単一膜を形成するまで約３日間培養した。培養培地に存在する血清を除去するために、ＥＢＭ−２培地(Cat. No.:CC-3156，Lonza)で１回洗浄し、ヒトＴＮＦ−αを２０ｎｇ／ｍｌの濃度で０．２５％の牛胎児血清が含まれたＥＢＭ−２培地に希釈して入れた後、１４〜１６時間処理してＶＣＡＭ−１の発現を誘導した。培養液を除去した後、抗体Ｈ６と対照抗体(IgG4，Cat．No.:I4764，Sigma)を１０μｇ／ｍｌ濃度で入れた後、３０分間３７℃で培養した。細胞表面のＶＣＡＭ−１をクロスリンクさせるのに使用される抗ＶＣＡＭ−１抗体(Cat. No.:BBA5，R&D)を１０μｇ／ｍｌ濃度で添加して３０分間３７℃で培養した。ＨＲＰ 共役された抗−マウス抗体(Cat. No.:A9917，Sigma)を１：１００の割合で添加して１５分間３７℃で培養させた。反応が完全に終わった後、すぐ氷の上にプレートを移して培地を除去した後、冷たいＰＢＳで１回洗浄した。プレートから残余ＰＢＳを完全に除去した後、ＲｈｏＡ活性キット(Cat. No.:BK124，Cytoskeleton)に含まれた細胞溶解緩衝液を各ウェルに１００μｌずつ入れて溶解された細胞を回収した。以後の過程はキットのマニュアルに従って実験を進行し、３回繰り返した。
【０１０７】
その結果、細胞表面に発現されたＶＣＡＭ−１をクロスリンクさせることによって、誘導されたＲｈｏＡ活性はＨ６抗体によって約５６％阻害されることとして確認された。
【０１０８】
１１．ＲＯＳ(Reactive oxygen species)活性阻害効果
ＨＵＶＥＣ(ヒト臍帯血管内皮細胞)２×１０5個を６−ウェルプレートに接種し、単一膜を形成するまで約３日間培養した。培養培地に存在する血清を除去するために、ＥＢＭ−２培地(Cat. No.:CC-3156，Lonza)で１回洗浄し、ヒトＴＮＦ−αを２０ｎｇ／ｍｌの濃度で０．２５％の牛胎児血清が含まれたＥＢＭ−２培地に希釈して入れた後、１４〜１６時間ＶＣＡＭ−１の発現を誘導した。培養液を除去し、ＥＢＭ−２培地で２回洗浄した後、抗体Ｈ６と対照抗体(IgG4，Cat. No.:I4764，Sigma)を１０μｇ／ｍｌ濃度で入れた後、３０分間３７℃で培養した。各ウェルをＥＢＭ−２培地で２回洗浄した後、細胞表面のＶＣＡＭ−１をクロスリンクさせるのに使用される抗ＶＣＡＭ−１抗体(Cat. No.:BBA5，R&D)を１０μｇ／ｍｌ濃度で入れて３０分間３７℃で培養した。各ウェルをＥＢＭ−２培地で２回洗浄し、ＨＲＰ 共役された抗−マウス抗体(Cat. No.:A9917，Sigma)を１：１００の割合で入れた後、３７℃で３０分間培養した。各ウェルをＥＢＭ−２培地で２回洗浄した。培地を完壁に除去した後、ＥＢＭ−２培地に希釈した１０μＭのＤＣＦ(２’，７’−ジクロロフルオレセインジアセテート)を１５０μｌずつ各ウェルに処理した。その後、蛍光値(測定波長４９５ｎｍ−５２７ｎｍ)を１０分ごとに３時間観察して、３時間目に測定された値で抗体の効能を評価した。前記実験を３回繰り返した。
【０１０９】
その結果、細胞表面に発現されたＶＣＡＭ−１をクロスリンクさせることによって、誘導されたＲＯＳ活性はＨ６抗体によって約３３％阻害率を示すことを確認した。
【０１１０】
１２．内在化分析
ＨＵＶＥＣ(ヒト臍帯血管内皮細胞)２×１０5個を６−ウェルプレートに接種し、単一膜を形成するまで約３日間培養した。ヒトＴＮＦ−α(20ng/ml，Cat. No.:ab9642，abcam)を１４〜１６時間処理してＶＣＡＭ−１の発現を誘導した。１〜５継代の間のＨＵＶＥＣを使用した。ヒトＴＮＦ−αを除去するために、細胞をＰＢＳで１回洗浄した後、プレートを４℃に２０分間放置した。ＢＳＡが添加されたＰＢＳに希釈した抗体Ｈ６(１０μｇ／ｍｌ)をＨＵＶＥＣに処理した後、結合を誘導するために４℃で３０分間培養した。その後、細胞をＰＢＳで１回洗浄した。プレートを３７℃でそれぞれ２、１０、３０、６０分間放置してＶＣＡＭ−１に結合された抗体の内在化を誘導した後、洗浄した。ＶＣＡＭ−１発現確認実験の実験群を除いて、各実験群に酸性ＰＢＳ(ｐＨ２．５)１ｍｌを入れ、５分間室温に放置して細胞表面の抗体を除去した後、洗浄した。細胞をトリプシン(Cat. No.:CC-5034，Clonetics)処理して回収した後、４％ホルムアルデヒド(ＰＢＳに希釈)を入れて室温で１０分間反応させた。ＰＢＳで細胞を１回洗浄した後、０．２％トリトンＸ−１００(ＰＢＳに希釈)を入れて１０分間反応させ、ＰＢＳで１回洗浄した。ＦＩＴＣが共役されたヤギ抗−ヒトＩｇＧ抗体(Cat. No.:F9512，Sigma)を入れて４℃で３０分間結合を誘導した。その後、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、フローサイトメトリーで分析した。本実験は、２回繰り返した。
【０１１１】
その結果、アイソタイプコントロール(isotype control)(グレー)に比べて細胞表面にＶＣＡＭ−１が発現された(矢印、スカイブルー)程度が明らかだった。また、各時間別に内在化を誘導した結果、ＶＣＡＭ−１に抗体が結合してから２分目から内在化が進行されて３０分目に最大に達することを確認した。
【０１１２】
１３．インビトロ接合分析を通したＶＣＡＭ−１抗体の炎症細胞付着抑制効果分析
ＶＣＡＭ−１抗体が血管内皮細胞に付着することによって、炎症細胞の接合を抑制することができるかどうかを確認するために、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの大動脈血管内皮細胞をマトリゲル方法で分離した後、培養した。その後、２４ウェル培養ディッシュに１×１０5個細胞を接種した後、ＴＮＦ−αを処理してＶＣＡＭ−１発現を誘導した。ＧＦＰ(緑色蛍光タンパク質(green fluorescence protein))形質転換マウスの骨髓から由来した単核球をその表面マーカーであるＣＤ１１ｂを取るマグネチックビーズを使用して分離し、血管内皮細胞に１×１０6個ずつ処理した。３０分間培養した後、結合しない細胞をＰＢＳ洗浄によって除去した。４％パラホルムアルデヒドで１０分間固定し、再びＰＢＳで洗浄した。その後、結合した単核球のイメージを蛍光顕微鏡によって獲得し、イメージ分析ソフトウェアによって細胞数を計数して分析した。
【０１１３】
その結果、対照群抗体を(４ＢＴ、１０μｇ／ｍｌ)処理した血管内皮細胞よりＶＣＡＭ−１抗体を(７ＨＴ、１０μｇ／ｍｌ)処理した血管内皮細胞で結合された単核球の数が約２０％減少したことを確認した(図９)。
【０１１４】
１４．インビトロ透過分析を介したＶＣＡＭ−１抗体の炎症細胞透過抑制効果分析
ＶＣＡＭ−１Ａｂが血管内皮細胞に付着することによって、炎症細胞の透過を抑制することができるかどうかを確認するために、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの大動脈血管内皮細胞をマトリゲル方法で分離して培養した。トランスウェルの上部チャンバーに５×１０4個の細胞を接種し、ＴＮＦ−αを処理してＶＣＡＭ−１発現を誘導した。マウスの骨髓細胞を分離して血管内皮細胞に１×１０5個細胞を処理した後、４時間と１８時間後に下部チャンバーに透過した細胞数を数えた。その結果、４時間後に細胞数を数えた時、対照群抗体を(４ＢＴ、１０μｇ／ｍｌ)処理した群よりＶＣＡＭ−１抗体(７ＨＴ、１０μｇ／ｍｌ)を処理した群で約２５％の減少を示し、１８時間後では約２９％の減少を示すことを確認することができた(図１０)。
【０１１５】
１５．ＶＣＡＭ−１抗体(７ＨＴ)のインビボ付着検査のためのエンフェース共焦点顕微鏡分析
ＶＣＡＭ−１抗体の心血管疾病に対する治療剤としての効果を確認するために、実験群をＰＢＳ、対照群抗体(４ＢＴ、１０ｍｇ／ｋｇ)、ＶＣＡＭ−１抗体(７ＨＴ、１ｍｇ／ｋｇ)、ＶＣＡＭ−１抗体(７ＨＴ、１０ｍｇ／ｋｇ)の４つのグループに分け、ＶＣＡＭ−１抗体をマウスに注入時、ＶＣＡＭ−１を発現する動脈血管内皮細胞に特異的に結合するかどうかを確認した。２週間４回を腹腔内注射を介する注入と高脂質食餌を並行した後、各マウスの動脈を回収してＡｌｅｘａ５９４標識された抗−ヒトＩｇＧ２次抗体と反応させた。血管内皮細胞のＶＣＡＭ−１発現可否を再確認するために、動脈をヤギ抗−ｍＶＣＡＭ−１抗体とＡｌｅｘａ４８８が標識された抗−ヤギＩｇＧ２次抗体と反応させた。その後、動脈の薄片を共焦点顕微鏡で確認した。その結果、各マウスの動脈でＶＣＡＭ−１の発現が明確に観察され、ただ高濃度のＶＣＡＭ−１抗体(７ＨＴ、１０ｍｇ／ｋｇ)を注入したマウスにおいてのみが抗体がよく付いていることを確認することができた(図１１)。
【０１１６】
１６．体重及び食餌飼料量の変化測定
１２週間抗体投与によるマウスの食餌飼料量及び体重の変化を測定するために、週１回各グループのマウス体重と食餌飼料量を測定した。その結果、一般食餌を実施した１グループを除いて高脂質食餌を実施した２〜４グループは、グループ間の差は示さなかった。食餌飼料量も有意的な差を示さなかった(図１２)。
【０１１７】
１７．血液分析結果
各実験群の動物の血液を分離するために、ヘパリン処理されたチューブで血液を採取して１３、０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。血液内総コレステロール(ＣＨＬ)、トリグリセリド(ＴＧ)、高密度リポタンパク質(ＨＤＬ)、低密度リポタンパク質(ＬＤＬ)の測定は自動生化学分析器(HITACHI 7150，Japan)を用いて分析した。
【０１１８】
【表２】
【０１１９】
一般食餌とＰＢＳ投与を実施した１グループでは、総コレステロール(Ｔ−ＣＨＯ)平均及び標準偏差が６１５．２０±６１．６７(ｍｇ／ｄｌ)で最も少ない水準を示し、高脂質食餌と４ＢＴ抗体(１０ｍｇ／ｋｇ)を投与した２グループでは、総コレステロール(Ｔ−ＣＨＯ)平均及び標準偏差が１３８０．００±２３７．０３(ｍｇ／ｄｌ)、高脂質食餌と７ＨＴ抗体(１ｍｇ／ｋｇ)を投与した３グループでは、総コレステロール(Ｔ−ＣＨＯ)平均及び標準偏差が１３６７．２０±１４３．６８(ｍｇ／ｄｌ)、そして、高脂質食餌と７ＨＴ抗体(１０ｍｇ／ｋｇ)を投与した４グループでは、総コレステロール(Ｔ−ＣＨＯ)平均及び標準偏差が１３２３．６０±２０９．３８(ｍｇ／ｄｌ)を示した。対照群(２グループ)に比べて、総コレステロールが減少する有意的な差を示さなかったし、ＨＤＬ−及びＬＤＬ−コレステロールも有意的な差を示さなくて７ＨＴ抗体の投与によるコレステロール代謝／排出には影響がないことを確認した。しかし、中性脂質及びブドウ糖数値が４グループで減少し、肝臓毒性確認のためのＧＯＴ、ＧＰＴ及びＡＬＢ水準では差を示さなかった(図１３)。
【０１２０】
１８．大動脈弓に形成された粥状硬化斑の確認及び面積測定
１２週間高脂質(脂肪２０％、コレステロール０．１５％)食餌を投与したＡｐｏＥ−／−マウスを犠牲させ、心臓及び上行大動脈から胸部大動脈まで切除してホルマリンで固定した。その後、心臓をトリミングした後、ＯＣＴ化合物に包埋して超低温冷凍庫で凍結させた。大動脈弓を凍結切片機で６の厚さで切ってスライドを製作した。脂肪染色のために、スライドを蒸溜水に浸漬してから、純粋プロピレングリコールに１分間浸漬した後、オイルレッド(Oil-red)溶液で１６時間染色した。その後、８５％プロピレングリコールに２分間浸漬し、蒸溜水で洗浄した後、水性封入剤で封入して光学顕微鏡で観察した。粥状硬化斑の面積測定のために、それぞれの組織を撮影した後、イメージ測定ソフトウェア(Axio Vision，Carl Zeiss)を用いて面積を測定して比較した。
【０１２１】
一般食餌とＰＢＳ投与を実施した１グループでは、平均病変面積及び標準偏差が８８．５５±２１．６５(１０3μｍ2)で最も少ない病変を形成し、高脂質食餌と４ＢＴ Ａｂ(１０ｍｇ／ｋｇ)を投与した２グループでは、平均病変面積及び標準偏差が３４５．２０±７４．０３(１０3μｍ2)で最大の病変形成率を示し、高脂質食餌と７ＨＴ Ａｂ(１ｍｇ／ｋｇ)を投与した３グループでは、平均病変面積及び標準偏差が３２３．６８±８６．０２(１０3μｍ2)、高脂質食餌と７ＨＴ Ａｂ(１０ｍｇ／ｋｇ)を投与した４グループでは、平均病変面積及び標準偏差が２９４．７８±２．６２(１０3μｍ2)で対照群(２グループ)に比べて面積が減少する傾向性を確認した(図１４)。
【０１２２】
１９．動脈に形成された粥状硬化斑のエンフェース方法による病変分析
心臓から大腿動脈まで切除した後、周辺の脂肪組織と外膜部位を完全に除去し、心臓基底部の動脈を切断して心臓と分離した。微細はさみと微細ピンセットを用いて動脈を切開して、動脈内部が見えるように広げた後ピンで固定した。動脈を１０％中性緩衝ホルマリン溶液で１６時間固定した後、純粋プロピレングリコールに１分間浸漬した後、オイルレッド溶液で１６時間染色した。その後、標本を８５％プロピレングリコールに２分間浸漬し、蒸溜水で洗浄した。解剖顕微鏡(Leica)を用いてイメージを獲得した後、アキシオビジョン(Axio Vision)ＡＣイメージプログラムで動脈総面積に対する病変割合を測定した。
【０１２３】
一般食餌とＰＢＳ投与を実施した１グループでは、平均病変面積及び標準偏差が１．７５±０．４７(％)で最も少ない値を示し、高脂質食餌と４ＢＴ抗体(１０ｍｇ／ｋｇ)を投与した２グループでは、平均病変面積及び標準偏差が８．０１±４．２５(％)で最大値を示し、高脂質食餌と７ＨＴ抗体(１ｍｇ／ｋｇ)を投与した３グループでは、平均病変面積及び標準偏差が７．０２±３．６４(％)、そして、高脂質食餌と７ＨＴ抗体(１０ｍｇ／ｋｇ)を投与した４グループでは、平均病変面積及び標準偏差が５．４３±１．６１(１０3μｍ2)で対照群(２グループ)に比べて有意的に減少することを確認した(Ｐ＜０．０５)(図１５及び図１６)。
【０１２４】
２０．ＶＣＡＭ−１抗体投与による毒性可否を確認するための主要臓器の病理学的分析
腹腔に注射した抗体による毒性可否を判別するために、各グループの肝臓、腎臓及び脾臓を１０％ホルムアルデヒドに固定してパラフィンブロックを製作し、ミクロトーム(microtome)を使用して組織切片を得た。核と細胞質染色のためにヘマトキシリン＆エオシン染色を実施した後、観察した。その結果、高脂質食餌を介して肝臓で見える脂肪肝以外の炎症細胞浸潤または組織壊死のような毒性による表現型は見えなかった(図１７)。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト血管細胞接合分子−１(ＶＣＡＭ−１)に特異的に結合して白血球及び活性化された内皮細胞との間の接合及び前記活性化された内皮細胞への白血球の透過を阻害することを特徴とする組換えヒト単一クローン抗体。
【請求項２】
前記組換えヒト単一クローン抗体は、ヒト血管細胞接合分子−１(ＶＣＡＭ−１)のドメイン１または２に結合することを特徴とする、請求項１に記載の組換えヒト単一クローン抗体。
【請求項３】
前記組換えヒト単一クローン抗体は、配列番号２で定義される重鎖ＣＤＲ１；配列番号３で定義される重鎖ＣＤＲ２；及び配列番号４で定義される重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号６で定義される軽鎖ＣＤＲ１；配列番号７で定義される軽鎖ＣＤＲ２；及び配列番号８で定義される軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域と、を含む、請求項２に記載の組換えヒト単一クローン抗体。
【請求項４】
前記組換えヒト単一クローン抗体は、配列番号１で定義される重鎖アミノ酸配列を含む、請求項２に記載の組換えヒト単一クローン抗体。
【請求項５】
前記組換えヒト単一クローン抗体は、配列番号５で定義される軽鎖アミノ酸配列を含む、請求項２に記載の組換えヒト単一クローン抗体。
【請求項６】
前記組換えヒト単一クローン抗体のヒトＶＣＡＭ−１抗原に対する結合／解離定数(ＫＤ値)が０．１×１０-9Ｍ〜７．０×１０-9Ｍであることを特徴とする、請求項２に記載の組換えヒト単一クローン抗体。
【請求項７】
前記組換えヒト単一クローン抗体は、配列番号１０で定義される重鎖ＣＤＲ１；配列番号１１で定義される重鎖ＣＤＲ２；及び配列番号１２で定義される重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号１４で定義される軽鎖ＣＤＲ１；配列番号１５で定義される軽鎖ＣＤＲ２；及び配列番号１６で定義される軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域と、を含む、請求項２に記載の組換えヒト単一クローン抗体。
【請求項８】
前記組換えヒト単一クローン抗体は、配列番号９で定義される重鎖アミノ酸配列を含む、請求項２に記載の組換えヒト単一クローン抗体。
【請求項９】
前記組換えヒト単一クローン抗体は、配列番号１３で定義される軽鎖アミノ酸配列を含む、請求項２に記載の組換えヒト単一クローン抗体。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項の組換えヒト単一クローン抗体を用いて炎症性疾患または癌が疑われる個体の生物学的試料内のＶＣＡＭ−１を抗原−抗体反応を介して検出する段階を含む、炎症性疾患、心血管疾患または癌の診断に必要な情報の提供方法。
【請求項１１】
前記炎症性疾患は、腫瘍壊死因子−α(ＴＮＦ−α)媒介性疾患、及び大腸疾患からなる群から選択されるものである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記腫瘍壊死因子−α(ＴＮＦ−α)媒介性疾患は、喘息、糖尿病、ブドウ膜炎、強直性脊椎炎、敗血症、内毒素ショック、血流力学ショック、敗血症症侯群、虚血性再灌流損傷、マラリア感染、マイコバクテリア感染、髄膜炎、乾癬、うっ血性心不全、線維症疾病、カヘキシー、移植拒否、癌、自己免疫疾病、エイズ関連日和見感染症、関節炎、リウマチ性脊椎炎、痛風、強直性痛風炎、クローン疾病、潰瘍性膀胱三角炎、多発性硬化症、癩性結節性紅斑(ＥＮＬ)、放射線障害及び酸素過多性肺胞損傷からなる群から選択されるものである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記心血管疾患は、心筋梗塞、心臓麻痺、脳卒中、不整脈、高血圧、高脂血症及び動脈硬化から構成される群から選択されるものである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１〜９のいずれか一項の組換えヒト単一クローン抗体を用いて白血球及び活性化された内皮細胞間の接合及び前記活性化された内皮細胞への白血球の透過を阻害する方法。
【請求項１５】
請求項１〜９のいずれか一項の組換えヒト単一クローン抗体を含む、炎症性疾患、心血管疾患または癌の診断用組成物。
【請求項１６】
前記炎症性疾患は、腫瘍壊死因子−α(ＴＮＦ−α)媒介性疾患、及び大腸疾患からなる群から選択されるものである、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
前記腫瘍壊死因子−α(ＴＮＦ−α)媒介性疾患は、喘息、糖尿病、ブドウ膜炎、強直性脊椎炎、敗血症、内毒素ショック、血流力学ショック、敗血症症侯群、虚血性再灌流損傷、マラリア感染、マイコバクテリア感染、髄膜炎、乾癬、うっ血性心不全、線維症疾病、カヘキシー、移植拒否、癌、自己免疫疾病、エイズ関連日和見感染症、関節炎、リウマチ性脊椎炎、痛風、強直性痛風炎、クローン疾病、潰瘍性膀胱三角炎、多発性硬化症、癩性結節性紅斑(ＥＮＬ)、放射線障害及び酸素過多性肺胞損傷からなる群から選択されるものである、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
前記心血管疾患は、心筋梗塞、心臓麻痺、脳卒中、不整脈、高血圧、高脂血症及び動脈硬化からなる群から選択されるものである、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１９】
請求項１〜９のいずれか一項の組換えヒト単一クローン抗体及び薬剤学的に許容可能な担体を含む、炎症性疾患、心血管疾患または癌の予防または治療用組成物。
【請求項２０】
前記炎症性疾患は、腫瘍壊死因子−α(ＴＮＦ−α)媒介性疾患及び大腸疾患からなる群から選択されるものである、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
前記腫瘍壊死因子−α(ＴＮＦ−α)媒介性疾患は、喘息、糖尿病、ブドウ膜炎、強直性脊椎炎、敗血症、内毒素ショック、血流力学ショック、敗血症症侯群、虚血性再灌流損傷、マラリア感染、マイコバクテリア感染、髄膜炎、乾癬、うっ血性心不全、線維症疾病、カヘキシー、移植拒否、癌、自己免疫疾病、エイズ関連日和見感染症、関節炎、リウマチ性脊椎炎、痛風、強直性痛風炎、クローン疾病、潰瘍性膀胱三角炎、多発性硬化症、癩性結節性紅斑(ＥＮＬ)、放射線障害及び酸素過多性肺胞損傷からなる群から選択されるものである、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
前記心血管疾患は、心筋梗塞、心臓麻痺、脳卒中、不整脈、高血圧、高脂血症及び動脈硬化からなる群から選択されるものである、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２３】
請求項１９に記載の組成物を個体に投与する段階を含む炎症性疾患、心血管疾患または癌の治療方法。
【請求項１】
ヒト血管細胞接合分子−１(ＶＣＡＭ−１)に特異的に結合して白血球及び活性化された内皮細胞との間の接合及び前記活性化された内皮細胞への白血球の透過を阻害することを特徴とする組換えヒト単一クローン抗体。
【請求項２】
前記組換えヒト単一クローン抗体は、ヒト血管細胞接合分子−１(ＶＣＡＭ−１)のドメイン１または２に結合することを特徴とする、請求項１に記載の組換えヒト単一クローン抗体。
【請求項３】
前記組換えヒト単一クローン抗体は、配列番号２で定義される重鎖ＣＤＲ１；配列番号３で定義される重鎖ＣＤＲ２；及び配列番号４で定義される重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号６で定義される軽鎖ＣＤＲ１；配列番号７で定義される軽鎖ＣＤＲ２；及び配列番号８で定義される軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域と、を含む、請求項２に記載の組換えヒト単一クローン抗体。
【請求項４】
前記組換えヒト単一クローン抗体は、配列番号１で定義される重鎖アミノ酸配列を含む、請求項２に記載の組換えヒト単一クローン抗体。
【請求項５】
前記組換えヒト単一クローン抗体は、配列番号５で定義される軽鎖アミノ酸配列を含む、請求項２に記載の組換えヒト単一クローン抗体。
【請求項６】
前記組換えヒト単一クローン抗体のヒトＶＣＡＭ−１抗原に対する結合／解離定数(ＫＤ値)が０．１×１０-9Ｍ〜７．０×１０-9Ｍであることを特徴とする、請求項２に記載の組換えヒト単一クローン抗体。
【請求項７】
前記組換えヒト単一クローン抗体は、配列番号１０で定義される重鎖ＣＤＲ１；配列番号１１で定義される重鎖ＣＤＲ２；及び配列番号１２で定義される重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号１４で定義される軽鎖ＣＤＲ１；配列番号１５で定義される軽鎖ＣＤＲ２；及び配列番号１６で定義される軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域と、を含む、請求項２に記載の組換えヒト単一クローン抗体。
【請求項８】
前記組換えヒト単一クローン抗体は、配列番号９で定義される重鎖アミノ酸配列を含む、請求項２に記載の組換えヒト単一クローン抗体。
【請求項９】
前記組換えヒト単一クローン抗体は、配列番号１３で定義される軽鎖アミノ酸配列を含む、請求項２に記載の組換えヒト単一クローン抗体。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項の組換えヒト単一クローン抗体を用いて炎症性疾患または癌が疑われる個体の生物学的試料内のＶＣＡＭ−１を抗原−抗体反応を介して検出する段階を含む、炎症性疾患、心血管疾患または癌の診断に必要な情報の提供方法。
【請求項１１】
前記炎症性疾患は、腫瘍壊死因子−α(ＴＮＦ−α)媒介性疾患、及び大腸疾患からなる群から選択されるものである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記腫瘍壊死因子−α(ＴＮＦ−α)媒介性疾患は、喘息、糖尿病、ブドウ膜炎、強直性脊椎炎、敗血症、内毒素ショック、血流力学ショック、敗血症症侯群、虚血性再灌流損傷、マラリア感染、マイコバクテリア感染、髄膜炎、乾癬、うっ血性心不全、線維症疾病、カヘキシー、移植拒否、癌、自己免疫疾病、エイズ関連日和見感染症、関節炎、リウマチ性脊椎炎、痛風、強直性痛風炎、クローン疾病、潰瘍性膀胱三角炎、多発性硬化症、癩性結節性紅斑(ＥＮＬ)、放射線障害及び酸素過多性肺胞損傷からなる群から選択されるものである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記心血管疾患は、心筋梗塞、心臓麻痺、脳卒中、不整脈、高血圧、高脂血症及び動脈硬化から構成される群から選択されるものである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１〜９のいずれか一項の組換えヒト単一クローン抗体を用いて白血球及び活性化された内皮細胞間の接合及び前記活性化された内皮細胞への白血球の透過を阻害する方法。
【請求項１５】
請求項１〜９のいずれか一項の組換えヒト単一クローン抗体を含む、炎症性疾患、心血管疾患または癌の診断用組成物。
【請求項１６】
前記炎症性疾患は、腫瘍壊死因子−α(ＴＮＦ−α)媒介性疾患、及び大腸疾患からなる群から選択されるものである、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
前記腫瘍壊死因子−α(ＴＮＦ−α)媒介性疾患は、喘息、糖尿病、ブドウ膜炎、強直性脊椎炎、敗血症、内毒素ショック、血流力学ショック、敗血症症侯群、虚血性再灌流損傷、マラリア感染、マイコバクテリア感染、髄膜炎、乾癬、うっ血性心不全、線維症疾病、カヘキシー、移植拒否、癌、自己免疫疾病、エイズ関連日和見感染症、関節炎、リウマチ性脊椎炎、痛風、強直性痛風炎、クローン疾病、潰瘍性膀胱三角炎、多発性硬化症、癩性結節性紅斑(ＥＮＬ)、放射線障害及び酸素過多性肺胞損傷からなる群から選択されるものである、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
前記心血管疾患は、心筋梗塞、心臓麻痺、脳卒中、不整脈、高血圧、高脂血症及び動脈硬化からなる群から選択されるものである、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１９】
請求項１〜９のいずれか一項の組換えヒト単一クローン抗体及び薬剤学的に許容可能な担体を含む、炎症性疾患、心血管疾患または癌の予防または治療用組成物。
【請求項２０】
前記炎症性疾患は、腫瘍壊死因子−α(ＴＮＦ−α)媒介性疾患及び大腸疾患からなる群から選択されるものである、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
前記腫瘍壊死因子−α(ＴＮＦ−α)媒介性疾患は、喘息、糖尿病、ブドウ膜炎、強直性脊椎炎、敗血症、内毒素ショック、血流力学ショック、敗血症症侯群、虚血性再灌流損傷、マラリア感染、マイコバクテリア感染、髄膜炎、乾癬、うっ血性心不全、線維症疾病、カヘキシー、移植拒否、癌、自己免疫疾病、エイズ関連日和見感染症、関節炎、リウマチ性脊椎炎、痛風、強直性痛風炎、クローン疾病、潰瘍性膀胱三角炎、多発性硬化症、癩性結節性紅斑(ＥＮＬ)、放射線障害及び酸素過多性肺胞損傷からなる群から選択されるものである、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
前記心血管疾患は、心筋梗塞、心臓麻痺、脳卒中、不整脈、高血圧、高脂血症及び動脈硬化からなる群から選択されるものである、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２３】
請求項１９に記載の組成物を個体に投与する段階を含む炎症性疾患、心血管疾患または癌の治療方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７Ａ】
【図１７Ｂ】
【図１７Ｃ】
【図１７Ｄ】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７Ａ】
【図１７Ｂ】
【図１７Ｃ】
【図１７Ｄ】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【公表番号】特表２０１３−５０８３５６（Ｐ２０１３−５０８３５６Ａ）
【公表日】平成２５年３月７日（２０１３．３．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５３５１３９（Ｐ２０１２−５３５１３９）
【出願日】平成２２年１０月２２日（２０１０．１０．２２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２０１０／００７３０３
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０４９４１２
【国際公開日】平成２３年４月２８日（２０１１．４．２８）
【出願人】（５０１２４２６６４）ハンファ ケミカル コーポレイション (5)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年３月７日（２０１３．３．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１０月２２日（２０１０．１０．２２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２０１０／００７３０３
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０４９４１２
【国際公開日】平成２３年４月２８日（２０１１．４．２８）
【出願人】（５０１２４２６６４）ハンファ ケミカル コーポレイション (5)
【Ｆターム（参考）】
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