ｈｉｍＡ発現の減少した組み換えザイモモナス株を使用する、キシロースを含む培地からエタノールを産生する方法
ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）変異体ライブラリーのスクリーニングを介して、ｈｉｍＡ遺伝子が、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）の性能に対するアセテートの阻害効果に関与することを見出した。キシロースを含む混合糖類培地において、および特に、アセテートの存在下で培養する場合、ｈｉｍＡ遺伝子の活性を減少させるようにさらに操作されたキシロース資化性ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株は、親株と比較して、エタノール産生が増加することを見出した。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２００７年１０月３０日に出願された米国仮特許出願第６０／９８３７６１号明細書（本明細書において参照により援用される）の利益を主張する。
【０００２】
政府の権利についての陳述
本発明は、エネルギー省から授与された契約番号０４−０３−ＣＡ−７０２２４，および米国エネルギー省とＡｌｌｉａｎｃｅ ｆｏｒ Ｓｕｓｔａｉｎａｂｌｅ Ｅｎｅｒｇｙ，ＬＬＣ（国立再生可能エネルギー研究所の管理運営者）との間の契約番号ＤＥ−ＡＣ３６−０８ＧＯ２８３０８に基づく米国政府の援助により行われた。米国政府は、本発明において所定の権利を有する。
【０００３】
本発明は、微生物学および遺伝子操作の分野に関する。さらに具体的には、組み込み宿主因子のαサブユニットをコードするｈｉｍＡ遺伝子が、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）の酢酸耐性に関与することを見出した。アセテートの存在下で改善されたエタノール産生を示すｈｉｍＡ遺伝子の遺伝子改変を有するキシロース資化性ザイモモナスの株を開発した。
【背景技術】
【０００４】
微生物によるエタノールの産生は、化石燃料に代わるエネルギー源を提供し、従って、現在の重要な研究の分野である。ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）は、グルコース、フルクトース、およびスクロース上で増殖する細菌性エタノロジェンであり、これらの糖を、エントナー−ドウデロフ（Ｅｎｔｎｅｒ−Ｄｏｕｄｅｒｏｆｆ）経路を介してＣＯ2およびエタノールに代謝する。
【０００５】
エタノール産生のための発酵に使用する多量に利用可能な低コストの炭素基質を提供することができる加水分解されたリグノセルロース系バイオマスを使用することが望ましい。キシロースは、加水分解されたリグノセルロース材料における主要ペントースである。Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）の野生型株は、キシロースを炭素源として使用することができないが、この糖上で増殖することが可能の組み換え株が操作されている（米国特許第５５１４５８３号明細書、米国特許第５７１２１３３号明細書、国際公開第９５／２８４７６号パンフレット、Ｆｅｌｄｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ３８：３５４−３６１、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ２６７：２４０−２４３）。これらの株が、キシロース代謝に必要な４つの酵素：１）キシロースからキシルロースへの変換を触媒するキシロースイソメラーゼ；２）キシルロースをリン酸化して、キシルロース５−リン酸を形成させるキシルロキナーゼ；３）トランスケトラーゼ；および４）トランスアルドラーゼの発現のために改変されている（米国特許第５５１４５８３号明細書、米国特許第６５６６１０７号明細書；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ２６７：２４０−２４３）。これらの４つの酵素および細胞の通常の代謝機構を備えることで、３分子のキシロースが、２分子のグルコース６−リン酸および１分子のグリセルアルデヒド３−リン酸に変換され、続いて、これらは、経路のグルコース側においてエタノールおよびＣＯ2に変換される（図１）。
【０００６】
キシロース代謝を対象にＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株を操作することに成功はしているが、この株は、キシロース上では、グルコースほど良好に増殖せず、そしてエタノールを産生しない。理想的な環境下であっても、キシロース代謝は、グルコース代謝より３〜４倍緩徐であり（Ｌａｗｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８４−８６：２７７−２９３）、そして悪条件下では、その差異がかなり大きくなる。炭素フラックスが緩徐であるため、ＡＴＰの定常状態レベルもまた、キシロース上での増殖ではより低く（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ６６（１）：１８６−１９３）、そして結果として、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）がこの糖上で増殖する場合、ストレスおよびインヒビターに対してかなり高い感受性を示す（Ｊｏａｃｈｉｍｓｔｈａｌ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８４−８６：３４３−３５６；Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８４−６：３５７−３７０）。加水分解されたリグノセルロース系バイオマスを発酵に使用する際に遭遇する特定のストレスは、アセテートの存在であり（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８４−８６：３５７−３７０）、これは、ヘミセルロース中のアセチル化キシロース残基から、前処置および糖化プロセス中に放出される。
【０００７】
Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）がアセテートおよび他の有機酸に関連するストレスに対処する機構については、未だ解明されておらず、そしてこのプロセスにおいて役割を果たす遺伝子に関する文献での報告はない。従って、アセテートに対してより高い耐性を有する株を遺伝子操作するための合理的な設計を使用することは、現在のところ選択肢に含まれていない。一方、アセテートに対してより大きな耐性を有するＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）変異体の記載がある（Ｊｏａｃｈｉｍｓｔｈａｌ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．２０（２）：１３７−１４２；Ｊｅｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．２４：８１９−８２４；米国特許出願公開第２００３０１６２２７１号明細書）。ニトロソグアジニン（ＮＴＧ）による無作為な化学的変異誘発後の選択を使用して、これらの変異体が作製されたが、酢酸耐性表現型を担う改変された遺伝子は、これらの場合のいずれとも同一ではなかった。また、アセテートの存在下におけるより良好な発酵性能には、１つの変異が必要であるのか、または複数の変異が必要であるのかについても決定されなかった。それ故、現在のところ、上記で引用した研究では、標的を定めた遺伝子操作を使用して、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）の他の株に酢酸耐性を付与する方法については見出されていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
エタノールを産生させるため、前処置および糖化されたリグノセルロース系バイオマスから生成される加水分解物の発酵のために、ザイモモナスの酢酸耐性株を生じるように改変することができる酢酸耐性に関与する遺伝子を同定する必要性がある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、アセテートの存在下で改善された性能を有するキシロース資化性ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）の株を使用してエタノールを産生させることに関する。本出願人らは、酢酸耐性が、組み込み宿主因子のαサブユニットをコードするｈｉｍＡ遺伝子の影響を受けることを発見した。グルコースとキシロースとの濃縮混合物中において、アセテートの存在を伴って培養する場合、ｈｉｍＡ遺伝子の遺伝子改変を有するキシロース資化性ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）の酢酸耐性が増加する。ｈｉｍＡを改変することにより、内因性ｈｉｍＡ遺伝子の発現が減少する。これらの条件下では、正常なｈｉｍＡ遺伝子発現を有する比較可能な株より、改変されたｈｉｍＡ株の方が、キシロース資化およびエタノール産生が有意に高い。
【００１０】
従って、本発明は、キシロースを含む混合糖培地からエタノールを産生する方法であって：
（ａ）キシロースを資化して、エタノールを産生することが可能な組み換えザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株を提供する工程であって、前記株は、組み込み宿主因子αサブユニットタンパク質（ＨｉｍＡ）の発現を減少させる少なくとも１つの遺伝子改変を含む工程と；
（ｂ）キシロースを含む混合糖類培地において（ａ）の株を培養する工程であって、それによって、キシロースは、前記株によってエタノールを産生するための炭素源として使用される工程と、
を含む方法を提供する。
【００１１】
図面の簡単な説明および配列表の説明
本発明は、以下の詳細な説明、図面、および本出願の一部をなす添付の配列の説明からさらに詳細に理解することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】キシロース資化のためにＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）を操作するために使用されている４つの酵素（枠内）およびキシロースを使用するエタノール産生の生化学的経路の図を示す。
【図２】ＺＷ８０１−４におけるトランスポゾン挿入ライブラリーを作製するために使用したプラスミドのプラスミド地図ｐＭＯＤｇａｐ／ａａｄａを示す。
【図３】２つの異なる量のアセテートを有するグルコースとキシロースとの濃縮混合物におけるＺＷ８０１−４の増殖のグラフを示す。
【図４】１００ｇ／Ｌグルコース、９０ｇ／Ｌキシロースおよび６ｇ／Ｌアセテート（Ａ）を有するか、または１０５ｇ／Ｌグルコース、１００ｇ／Ｌキシロース、および９ｇ／Ｌアセテート（Ｂ）を有する培地における、コントロール株、ＺＷ８０１−４と比較した、富化されたトランスポゾン挿入変異体ライブラリーの培養でのグルコース資化、キシロース資化、およびエタノール産生のグラフを示す。
【図５】異なる量の酢酸カリウムを有する、ＺＷ８０１−４（Ａ）およびトランスポゾン挿入変異、ＡｃＲ＃３（Ｂ）のグルコース含有培地における増殖のグラフを示す。
【図６】異なるアセテートを有する、ＺＷ８０１−４（Ａ）およびトランスポゾン挿入変異、ＡｃＲ＃３（Ｂ）の４３時間でのグルコース含有培地における増殖のエンドポイント値のグラフを示す。
【図７】１０５ｇ／Ｌグルコース、１００ｇ／Ｌキシロース、および９ｇ／Ｌアセテートを有する培地におけるＡｃＲ＃３ならびにＺＷ８０１−４のグルコース資化、キシロース資化、およびエタノール産生のグラフを示す。
【図８】１１０ｇ／Ｌグルコースおよび９０ｇ／Ｌキシロースを有する、約９．５ｇ／Ｌのアセテートおよび１９０ｍＭアンモニウムイオンを含有する１００％Ｍｏｃｋ Ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ培地におけるＺＷ８０１−４（Ａ）およびＡｃＲ＃３（Ｂ）のグルコース資化、キシロース資化、およびエタノール産生のグラフを示す。
【図９】ｈｉｍＡ遺伝子ノックアウトベクターｐＬＤＨＴｃ１３９＃７（Ａ）、ｐＬＤＨＴｃ１３９＃７−９ＷＷ（Ｂ）、およびｐＬＤＨＳｐ−９ＷＷ（Ｃ）の構築中に作製されたプラスミドのマップを示す。
【図１０】図１０ＡはｈｉｍＡ自殺ベクター、ｐＨｉｍＡへの挿入のためのｈｉｍＡフランキングＤＮＡを調製するために使用したプライマーの遺伝子の位置を示し、そしてｐＨｉｍＡプラスミドの環状マップを図１０Ｂに示す。
【図１１】１１０ｇ／Ｌグルコースおよび９０ｇ／Ｌキシロースを有する、約９．５ｇ／Ｌのアセテートおよび１９０ｍＭアンモニウムイオンを含有する１００％Ｍｏｃｋ Ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ培地におけるＺＷ８０１−４（Ａ）およびＺＷ８０１−４：：ΔｈｉｍＡ（Ｂ）のグルコース資化、キシロース資化、およびエタノール産生のグラフを示す。
【図１２】カリウム塩として添加された０または８ｇ／Ｌのアセテートを有する、ＺＷ８０１−４（Ａ）、ＡｃＲ＃３（Ｂ）、およびＺＷ８０１−４：：ΔｈｉｍＡ（Ｃ）のグルコース含有培地における増殖のグラフを示す。
【００１３】
本発明は、以下の詳細な説明、および本出願の一部をなす添付の配列の説明からさらに詳細に理解することができる。
【００１４】
以下の配列は、米国特許法施行規則第１．８２１〜１．８２５条（「ヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列の開示を含む特許出願の要件−配列規則」）に従い、そして世界知的所有権機関（ＷＩＰＯ）標準ＳＴ．２５（１９９８年）ならびにＥＰＯおよびＰＣＴの配列表の要件（規則５．２および４９．５（ａの２）、ならびに実施細則第２０８号および付属書Ｃ）に一致する。ヌクレオチドおよびアミノ酸の配列データに使用した記号および形式は米国特許法施行規則第１．８２２条に記載の規則に従う。
【００１５】
配列表は、コンパクトディスクによって提供される。配列表を含むコンパクトディスクの内容は、米国特許法施行規則第１．５２条第（ｅ）項に応従して、参照により本明細書に援用される。コンパクトディスクは、２枚提出され、これらは相互に同一である。ディスクには、「Ｃｏｐｙ１−Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｌｉｓｔｉｎｇ」および「Ｃｏｐｙ２Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｌｉｓｔｉｎｇ」のラベルが付されている。ディスクは、次のファイル：「ＣＬ４０４１ｓｅｑ ｌｉｓｔ．ＳＴ２５」を含有する。
【００１６】
配列番号１は、ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）ｈｉｍＡコーディング領域のヌクレオチド配列である。
配列番号２および３は、トランスポゾン挿入部位を配列決定するためのプライマーのヌクレオチド配列である。
配列番号４および５は、ｌｄｈ遺伝子およびいくつかの周囲のＤＮＡを含有するＤＮＡフラグメントのＰＣＲ増幅のためのプライマーのヌクレオチド配列である。
配列番号６および７は、ｐＡＣＹ１８４由来のテトラサイクリン耐性カセットを含有するＤＮＡフラグメントのＰＣＲ増幅のためのプライマーのヌクレオチド配列である。
配列番号８および９は、プラスミドｐＬＤＨＴｃ１３９＃７への挿入のためのｌｏｘＰ部位を調製するために使用されるｏｌｉｇｏのヌクレオチド配列である。
配列番号１０および１１は、プラスミドｐＬＤＨＴｃ１３９＃７−９Ｗへの挿入のためのｌｏｘＰ部位を調製するために使用されるｏｌｉｇｏのヌクレオチド配列である。
配列番号１２および１３は、プラスミドｐＨＰ１５５７８由来のスペクチノマイシン耐性カセットを含有するＤＮＡフラグメントのＰＣＲ増幅のためのプライマーのヌクレオチド配列である。
配列番号１４および１５は、３’ｈｉｍＡフランキングＤＮＡフラグメントのＰＣＲ増幅のためのプライマーのヌクレオチド配列である。
配列番号１６および１７は、５’ｈｉｍＡフランキングＤＮＡフラグメントのＰＣＲ増幅のためのプライマーのヌクレオチド配列である。
配列番号１８および１９は、ｐＨｉｍＡ中の５’ｈｉｍＡフランキングＤＮＡとその染色体対応物との間に生じた一重交差事象を確認するために使用されたＰＣＲプライマーのヌクレオチド配列である。
配列番号２０および２１は、ｐＨｉｍＡ中の３’ｈｉｍＡフランキングＤＮＡとその染色体対応物との間に生じた一重交差事象を確認するために使用されたＰＣＲプライマーのヌクレオチド配列である。
配列番号２２および２３は、ｐＨｉｍＡ中の５’および３’ｈｉｍＡフランキングＤＮＡ配列とその染色体中のｈｉｍＡ遺伝子との間に生じた二重交差事象を確認するために使用されたＰＣＲプライマーのヌクレオチド配列である。
配列番号２４は、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）のＧＦＯＲコーディング領域の完全ヌクレオチド配列である。
配列番号２５は、ＺＷ８０１−４における破壊されたＧＦＯＲコーディング領域の完全なヌクレオチド配列（本来の開始コドンから本来の終止コドンまで）である。
配列番号２６は、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ＨｉｍＡタンパク質のアミノ酸配列である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本開示物は、例えば、グルコース、キシロースのような糖類の混合物およびアセテートを含む培地においてキシロース資化性組み換えザイモモナス株を培養する工程を含むエタノールを産生する方法について説明しており；ここで、前記株は、前記株の内因性ｈｉｍＡ遺伝子に対する改変を含む。ｈｉｍＡ遺伝子を改変することにより、遺伝子の発現が減少し、そして本明細書に記載の培地において培養した場合、ｈｉｍＡが改変されたザイモモナス株の性能が改善される。ｈｉｍＡが改変されたザイモモナス株によって産生されるエタノールは、化石燃料に対する代替エネルギー源として使用してもよい。
【００１８】
明細書および請求の範囲の解釈ために、以下の略語および定義が使用される。
【００１９】
「組み込み宿主因子」は、ＩＨＦと略称する。
【００２０】
「遺伝子」は、コード配列の前（５’非コード配列）および後（３’非コード配列）に調節配列を含み得る特定のタンパク質を発現する核酸フラグメントを指す。「生来の遺伝子」または「野生型遺伝子」は、それ自体の調節配列と共に天然に見出されるような遺伝子を指す。「キメラ遺伝子」は、天然には一緒に見出されない調節およびコード配列を含む、生来の遺伝子ではない任意の遺伝子を指す。従って、キメラ遺伝子は、異なる起源に由来する調節配列およびコード配列、または同じ起源に由来するが、しかし天然に見出されるものとは異なる様式で配列される調節配列およびコード配列を含むことができる。「内因性遺伝子」は、生物体のゲノム内の天然の位置にある生来の遺伝子を指す。「外来」遺伝子は、宿主生物体内に通常は見出されない遺伝子を指すが、しかしこれは遺伝子導入により宿主生物体内に導入される。外来遺伝子は、非生来の生物体内に挿入された生来の遺伝子、またはキメラ遺伝子を含むことができる。
【００２１】
用語「遺伝子構築物」は、１つ以上の特定のタンパク質の発現をコードする核酸フラグメントを指す。遺伝子構築物において、遺伝子は、生来、キメラ、または自然にはない外来性のものであってもよい。典型的に、遺伝子構築物は、「コード配列」を含む。「コード配列」は、特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を指す。
【００２２】
「プロモーター」または「開始制御領域」は、コード配列または機能的ＲＮＡの発現を制御することが可能なＤＮＡ配列を指す。一般に、コード配列は、プロモーター配列の３’側に局在する。プロモーターは、そのままの形で生来の遺伝子から誘導することができるか、または天然に見出される多様なプロモーターから誘導される多様なエレメントからなるか、またはなお、合成ＤＮＡセグメントを含み得る。当業者であれば、多様なプロモーターは多様な組織もしくは細胞タイプ、または多様な発生段階において、あるいは多様な環境条件に応答して、遺伝子の発現を指令することができることを理解している。ほとんどの時期におけるほとんどの細胞タイプにおいて遺伝子を発現させるプロモーターを、通常、「構成性プロモーター」と呼ぶ。
【００２３】
本明細書において使用する用語「発現」は、遺伝子に由来するセンス（ｍＲＮＡ）またはアンチセンスＲＮＡの転写および安定な蓄積を指す。発現はまた、ｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳を指すことができる。「アンチセンス阻害」は、標的タンパク質の発現を抑制することが可能であるアンチセンスＲＮＡ転写物の産生を指す。「過剰発現」は、通常の産生レベルを超えるトランスジェニック生物体または非形質転換生物体における遺伝子産物の産生を指す。「共抑制」は、同一または実質的に類似する外来または内因性遺伝子の発現を抑制することが可能であるセンスＲＮＡ転写物または断片の産生を指す（米国特許第５，２３１，０２０号明細書）。
【００２４】
本明細書において使用する「メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）」は、イントロンを含まず、かつ細胞によってタンパク質に翻訳され得るＲＮＡを指す。
【００２５】
本明細書において使用する用語「非機能性遺伝子」は、コードされるタンパク質を、遺伝子が内因性である野生型株において通常発現されるようには発現しない遺伝子を指す。非機能性遺伝子の発現は、転写、ＲＮＡプロセシング、または翻訳のような任意のレベルで破壊され得る。非機能性遺伝子では、典型的に、コードされるタンパク質の発現がほとんど認められないか、または全く認められない。しかし、それはまた、野生型タンパク質より低い酵素活性を有する改変されたタンパク質をコードし得る。
【００２６】
本明細書において使用する「形質転換」は、遺伝的に安定に遺伝する核酸フラグメントの宿主生物体への伝達を指す。伝達された核酸は、宿主細胞において維持されるプラスミドの形態であってもよく、またはある伝達された核酸を、宿主細胞のゲノムに組込んでもよい。形質転換された核酸フラグメントを含有する宿主生物体を、「トランスジェニック」または「組み換え」または「形質転換された」生物体と呼ぶ。
【００２７】
本明細書において使用する用語「プラスミド」および「ベクター」は、しばしば細胞の中心的代謝の部分ではない遺伝子を担持する染色体外エレメントを指し、通常は、環状二本鎖ＤＮＡ分子の形態である。そのようなエレメントは、任意の起源に由来する一本鎖または二本鎖ＤＮＡあるいはＲＮＡの自律的反復配列、ゲノム組込み配列、ファージもしくはヌクレオチド配列で、線状あるいは環状であってもよく、ここで、プロモーターフラグメントおよび適切な３’非翻訳配列を有する選択された遺伝子産物に対するＤＮＡ配列を細胞に導入することが可能である独特な構築物に、多くのヌクレオチド配列が接続または組み換えられている。
【００２８】
用語「作動可能に連結される」は、一方の機能が他方によって影響されるような、単一の核酸フラグメントに対する核酸配列の会合を指す。例えば、プロモーターは、それがコード配列の発現に影響を及ぼすことが可能である場合、コード配列に作動可能に連結される（即ち、コード配列はプロモーターの転写制御下にある）。コード配列は、センスまたはアンチセンス配向で調節配列に作動可能に連結され得る。
【００２９】
用語「選択マーカー」は、同定因子、通常、マーカー遺伝子の効果、即ち、抗生物質に対する耐性に基づいて選択することが可能な抗生物質または化学耐性遺伝子を意味し、ここで、効果は、目的の核酸の遺伝を追跡する、および／または目的の核酸を受け継いでいる細胞もしくは生物体を同定するために使用される。
【００３０】
用語「高濃度の混合糖類」は、キシロース資化性ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）の増殖の阻害を生じる培地中の全糖濃度を指す。これは、典型的に、全体の糖濃度が約１００ｇ／Ｌを超える場合に生じ、そして影響の激しさは、糖の濃度が高いほど大きい。しかし、増殖阻害が生じ始める正確な糖濃度は、培地中の他の成分に高度に依存する。
【００３１】
用語「発酵可能な糖」は、発酵プロセスにおいて、微生物により炭素源として使用することができるオリゴ糖および単糖類を指す。
【００３２】
用語「リグノセルロース系」は、リグニンおよびセルロースの両方を含む組成物を指す。リグノセルロース系材料もまた、ヘミセルロースを含み得る。
【００３３】
用語「セルロース系」は、セルロース、およびヘミセルロースを含むさらなる成分を含む組成物を指す。
【００３４】
用語「糖化」は、多糖類からの発酵可能な糖類の生成を指す。
【００３５】
用語「前処置されたバイオマス」は、糖化前の前処置に供されているバイオマスを意味する。
【００３６】
「バイオマス」は、任意のセルロース系またはリグノセルロース系材料を指し、そしてセルロースを含み、そして場合により、ヘミセルロース、リグニン、デンプン、多糖、オリゴ糖類および／または単糖類をさらに含む材料を含む。バイオマスはまた、タンパク質および／または脂質のようなさらなる成分を含み得る。バイオマスは、単一の供給源から誘導されてもよく、またはバイオマスは、２つ以上の供給源から誘導される混合物を含み得る；例えば、バイオマスは、トウモロコシ穂軸およびコーンストーバまたは繊維の混合物、または草および葉の混合物を含み得る。バイオマスとして、バイオエネルギー作物、農業残渣、一般廃棄物、産業廃棄物、製紙スラッジ、庭ごみ、木材および林業廃棄物が挙げられるが、これらに限定されない。バイオマスの例として、トウモロコシ穀粒、トウモロコシ穂軸、穀物残渣、例えば、トウモロコシ皮、コーンストーバ、トウモロコシ繊維、草、コムギ、コムギわら、オオムギ、オオムギわら、乾草、イネわら、スイッチグラス、廃紙、サトウキビバガス、モロコシ、ダイズ、穀粒、木、枝、根、葉、木材チップ、おがくず、低木および潅木の粉砕から得られる成分、野菜、果物、花および動物性肥料が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３７】
「バイオマス加水分解物」は、バイオマスの糖化から生じる産物を指す。バイオマスはまた、糖化の前に前処置してもよい。
【００３８】
ここで使用した標準的な組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は当該技術分野において周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９（以後、「Ｍａｎｉａｔｉｓ」）；ならびにＳｉｌｈａｖｙ，Ｔ．Ｊ．，Ｂｅｎｎａｎ，Ｍ．Ｌ．ａｎｄ Ｅｎｑｕｉｓｔ，Ｌ．Ｗ． Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｇｅｎｅ Ｆｕｓｉｏｎｓ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８４；ならびにＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅにより出版、１９８７に記載されている。
【００３９】
本発明は、アセテートの存在下で改善された性能を有するキシロース資化性ザイモモナスの操作された株に関する。アセテートは、発酵中に存在する場合、ザイモモナスの増殖およびエタノール産生を減少させるインヒビターである。アセテートは、ザイモモナスにおける代謝副産物であり、そしてまた、前処置および糖化されたバイオマスの成分である。従って、発酵のためにバイオマス由来の糖類を使用する際の課題は、改善されたエタノール産生のための生体触媒に対するアセテートの阻害効果を克服することである。発酵培地がアセテートを含む場合、キシロース資化性Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）における内因性ｈｉｍＡ遺伝子の破壊を操作すると、キシロース資化およびエタノール産生を含む発酵性能が改善されることを本明細書において示す。さらに、本発明は、エタノールを産生する方法に関し、ここで、本ザイモモナス株は、キシロースを含む培地において培養される。
【００４０】
キシロース資化性ザイモモナス宿主株
キシロースを炭素源として資化することが可能である、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株を含むザイモモナスの任意の株を、本発明に使用する株を調製するための宿主として使用してもよい。エタノールへのキシロースの発酵のために操作されているザイモモナスの株が特に有用である。内因性遺伝子は、代謝経路の部分を提供してもよく、またはキシロース代謝に有用な酵素活性を有するタンパク質を提供するための任意の既知の遺伝子操作技術によって改変されてもよい。例えば、内因性トランスケトラーゼは、キシロース資化経路を作製するときに他の誘導された酵素活性を補い得る。典型的に、米国特許第５５１４５８３号明細書（参照により本明細書に援用される）に記載のように、キシロース代謝（図１）に関与する４つの酵素の発現のために、４つの遺伝子がＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）に導入されている。これらは、キシロースからキシルロースへの変換を触媒するキシロースイソメラーゼ、およびキシルロースをリン酸化して、キシルロース５−リン酸を形成させるキシルロキナーゼをコードする遺伝子を含む。さらに、トランスケトラーゼおよびトランスアルドラーゼ、ペントースリン酸経路の２つの酵素は、キシルロース５−リン酸を、キシロースからエタノールへの代謝を可能にする解糖系のエントナー−ドウドレフ（Ｅｎｔｎｅｒ−Ｄｏｕｄｅｒｏｆｆ）経路にペントース代謝を結合する中間体（フルクトース６−リン酸およびグリセルアルデヒド３−リン酸）に変換する。これらの酵素をコードするＤＮＡ配列は、腸内細菌、ならびにいくつかの酵母および真菌のようなキシロースを代謝することが可能である多数の微生物のいずれかから入手してもよい。コーディング領域の供給源として、ザントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、ロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）、フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、アセトバクター（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、グルコノバクター（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ）、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄｓ）、およびザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）が挙げられる。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のコーディング領域が特に有用である。
【００４１】
コードＤＮＡ配列は、ザイモモナスグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼのプロモーター（ＧＡＰプロモーター）、およびザイモモナスエノラーゼのプロモーター（ＥＮＯプロモーター）のようなザイモモナス細胞において発現されるプロモーターに作動可能に連結される。コーディング領域は、プロモーターから個々に発現されてもよく、または２つ以上のコーディング領域が、同じプロモーターからの発現を伴う１つのオペロン内で接続されていてもよい。得られるキメラ遺伝子は、ザイモモナスに導入し、そしてプラスミド上で維持してもよく、または例えば、相同組み換え、部位特異的組込み、もしくはランダム組込みを使用して、ゲノムに組込んでもよい。特に有用なキシロース資化株として、ＣＰ４（ｐＺＢ５）（米国特許第５５１４５８３号明細書）、ＡＴＣＣ３１８２１／ｐＺＢ５（米国特許第６５６６１０７号明細書）、８ｂ（米国特許出願公開第２００３／０１６２２７１号明細書；Ｍｏｈａｇｈｅｇｈｉ ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．２５；３２１−３２５）、およびＺＷ６５８（ＡＴＴＣＣ番号ＰＴＡ−７８５８）が挙げられる。
【００４２】
通常使用しないキシロース以外の糖類を資化するためにさらに操作されるザイモモナス株もまた、本方法に使用してもよい。例としては、米国特許第５８４３７６０号明細書（参照により本明細書に援用される）に記載のアラビノース資化のためにさらに操作されたＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）の株がある。
【００４３】
所望されない副産物キシリトールの産生の減少のためにさらに操作されるザイモモナス株もまた、使用してもよい。これらの株については、共有および同時係属中の米国特許出願第１１／８６２５６６号明細書ならびに係属中の米国特許出願公開第２００８／０１８７９７３Ａ１号明細書（参照により本明細書に援用される）に記載されている。記載の株ＺＷ８００、ＺＷ８０１−４、およびＺＷ８０１−６は、グルコース−フルクトースオキシドレダクターゼ（ＧＦＯＲ）をコードする破壊された遺伝子を有する。ＧＦＯＲ遺伝子の発現の破壊は、ｈｉｍＡ遺伝子を破壊するための以下に記載の同じ方法を使用し、ＧＦＯＲコーディング領域の既知の配列（配列番号２４）を使用して、達成してもよい。ＧＦＯＲコーディング配列の周囲のＤＮＡ配列はまた、いくつかの改変手順において有用であり、そして完全なゲノム配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＥ００８６９２）の形でザイモモナスに利用可能である。ＧＦＯＲの発現が減少すると、キシリトール産生が減少し、そしてエタノール産生が増強されることを見出した。
【００４４】
ｈｉｍＡが酢酸耐性に関与することの発見
ザイモモナスの増殖および産生性に対するアセテートの阻害効果の機構の基礎は、合理的に、良好に理解されている（Ｌａｗｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３９−４０：６８７−６９９；Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８４−８６：３５７−３７０）が、酢酸耐性において役割を果たす遺伝子は、この微生物では同定されていない。本出願人らは、驚くべきことに、ｈｉｍＡ遺伝子の遺伝子操作技術により、阻害濃度のアセテートの存在下でザイモモナスがより良好に挙動することが可能になることを見出した。具体的には、本出願人らは、ザイモモナスｈｉｍＡ遺伝子を破壊することにより、アセテート含有培地における増殖およびエタノール産生が改善されることを見出した。本明細書において実施例１および２に記載の酢酸耐性におけるｈｉｍＡの役割を発見するために使用した変異体ライブラリー富化方法は、全く偏りのないアプローチであり、そして予想されるどの結果にも基づかなかった。
【００４５】
ザイモモナスｈｉｍＡ遺伝子の破壊により、アセテート存在下における性能が改善されるという所見は、ザイモモナスまたは他の任意の微生物の酢酸耐性において、この遺伝子が役割を果たすこと示すまたは示唆する文献が認められていないため、意外である。本明細書において「ＨｉｍＡ」タンパク質と称される、ｈｉｍＡ遺伝子によってコードされるタンパク質は、組み込み宿主因子（ＩＨＦ）（ｈｉｍＤ遺伝子によってコードされるβサブユニットをも含むタンパク質）のαサブユニット（配列番号２６）である。それ故、ＩＨＦは、２つの緊密に関連するサブユニットからなるヘテロダイマータンパク質である。ＩＨＦは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において研究されており、そしてＤＮＡ組み換え、ＤＮＡ複製、および遺伝子発現の調節に関与するＤＮＡ結合性およびＤＮＡの折れ曲がりタンパク質であることが示されている（Ｆｒｉｅｄｍａｎ（１９８８）Ｃｅｌｌ ５５：５４５−５５４；Ａｒｆｉｎ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：２９６７２−２９６８４）。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における遺伝子発現プロファイリング実験により、ｈｉｍＡ遺伝子不活性化が、少なくとも１２０個の遺伝子の発現レベルを有意に変更し、そしてこの操作により活性化される遺伝子は、この操作により抑制される遺伝子より多いことが示された（Ａｒｆｉｎ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：２９６７２−２９６８４）。細胞が指数期から定常期に移る場合、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｈｉｍＡ遺伝子は、最も活発に転写されることもまた公知であり、そしてｈｉｍＡ遺伝子産物は、このプロセスにおいて役割を果たすと考えられる。それ故、ｈｉｍＡは、広範なＤＮＡのプロセスに影響を及ぼし、そして大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の遺伝子発現の調節因子であるが、調節すると考えられる多くの遺伝子のうち、明確に酢酸耐性に関連するものはない。さらに加えて、マイクロアレイを使用した阻害濃度のアセテートへの暴露後の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における遺伝子発現の全体解析が行われているが、この処置により影響を受けた８６個の遺伝子のうち、ｈｉｍＡ遺伝子に該当する遺伝子は認められなかった（Ａｒｎｏｌｄ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８３：２１７８−２１８６）。最終的に、ザイモモナスにおけるｈｉｍＡ遺伝子の役割については何も知られていない。また、本発明者らは、ｈｉｍＡ遺伝子不活性化が何らかのタイプの有益な効果をもたらすことを示す文献での報告を見ていない。実際、この操作によって、多くの遺伝子およびタンパク質がおそらく影響を受けることを考慮すると、これが事実であるのは、驚くべきことである。従って、ｈｉｍＡ遺伝子の不活化により、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）または他の任意の微生物にアセテートに対するより高い耐性が付与されることを当業者が予測できなかった、と結論付けることは合理的である。
【００４６】
ザイモモナスＨｉｍＡタンパク質は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）相同体（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿４１６２２７）に４６％同一である。最も緊密に関連する既知のタンパク質は、スフィンゴモナス ウィティチ（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｗｉｔｔｉｃｈｉｉ）（ＧｅｎＢａｎｋ 受託番号ＹＰ＿００１２６４０４１）のＨｉｍＡ相同体であり、これは、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ｈｉｍＡコーディング領域（配列番号１）を問い合わせ配列として使用して、ＮＣＢＩデータベースに対するｔＢＬＡＳＴｘ検索によって決定されるように、６７％同一である。
【００４７】
ｈｉｍＡ遺伝子発現の変更
本発明のキシロース資化性Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株は、組み込み宿主因子αサブユニットタンパク質（ＨｉｍＡ）の発現が減少するかまたは全く認められないように、遺伝子改変される。典型的に、ＨｉｍＡタンパク質発現の減少は、ｈｉｍＡ遺伝子の発現を減少させる改変を介して達成される。ＨｉｍＡタンパク質発現を減少させることは、例えば、コードするｍＲＮＡの翻訳を減少させるか、またはＨｉｍＡタンパク質の安定性を減少させる改変を含んでもよい。ＨｉｍＡタンパク質の発現を減少させると、アセテートの存在下での性能が改善される。タンパク質の発現を減少させるための当業者に既知の任意の遺伝子改変方法を使用して、ＨｉｍＡ発現を変更してもよい。方法として、ｈｉｍＡ遺伝子全体または一部の欠失、コードされるタンパク質が発現され得ないように（プロモーターもしくはコーディング領域のいずれかにおいて）ｈｉｍＡ遺伝子にＤＮＡフラグメントを挿入すること、ｈｉｍＡコーディング領域に変異を導入して、機能性タンパク質が発現されないように終止コドンまたはフレームシフトを付加すること、およびｈｉｍＡコーディング領域に１つ以上の変異を導入して、非機能性であるかまたはそれほど機能的に活性ではないタンパク質が発現されるようにアミノ酸を変更することが挙げられるが、これらに限定されない。さらに、アンチセンスＲＮＡまたは干渉ＲＮＡの発現によってｈｉｍＡ発現を阻止してもよく、そして共抑制を生じる構築物を挿入してもよい。当業者であれば、既知のｈｉｍＡコーディング配列（配列番号１）、ならびに完全なＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ゲノム配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＥ００８６９２）において利用可能であるｈｉｍＡコーディング配列の周囲のＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ＤＮＡ配列を利用して、これらの方法のすべてを容易に実践することができる。
【００４８】
本明細書の実施例５および６において例示されるように、遺伝子改変されたｈｉｍＡ株を作製するための特に適切な方法は、スペクチノマイシン耐性遺伝子または他の選択マーカー遺伝子に結合するｈｉｍＡフランキングＤＮＡ配列によって仲介される相同組み換えを使用して、機能性タンパク質が発現されないようなｈｉｍＡコーディング領域へのマーカー遺伝子の挿入をもたらすことである。さらに、対応する部位特異的リコンビナーゼの発現後、耐性遺伝子がｈｉｍＡ遺伝子から切り出されるように、マーカー遺伝子を部位特異的組み換え部位に結合させてもよい。部位特異的組み換えは、後に組み換え部位を残し、これがｈｉｍＡ遺伝子の発現を破壊する。相同組み換えベクターを構築して、マーカーの切り出し後にｈｉｍＡ遺伝子に欠失部を残してもよく、これは当業者に周知である。
【００４９】
ｈｉｍＡの発現を完全になくすことが好ましいが、しかし、ｈｉｍＡの発現を顕著に減少させることもまた、本発明の実施形態である。この場合、非機能性ｈｉｍＡ遺伝子とは、例えば通常より低いレベルのコードされたタンパク質が存在するというように、通常な様式では機能しないことを指す。遺伝子不活化のいくつかの方法では、発現が、共抑制のようないくらか低いレベルにとどまり得る。本明細書において、改変されたｈｉｍＡ株は、ＨｉｍＡ酵素活性が減少しているかまたは認められない遺伝子改変された株を指す。
【００５０】
ｈｉｍＡ改変株の性能
本発明のｈｉｍＡ改変キシロース資化性Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株は、ある量のキシロースを含む混合糖類培地において培養する場合、改善された性能を有する。培地はまた、ある量のアセテートを含有してもよい。キシロース資化性Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）では、培養培地におけるバイオマス糖化から産生される糖類を使用することが望ましい。典型的に、バイオマスは、例えば、国際公開第２００４／０８１１８５号パンフレットならびに共有および同時係属中の米国特許出願公開第２００７００３１９１８Ａ１号明細書に記載のように、前処置され、次いで、Ｌｙｎｄ，Ｌ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．（２００２）６６：５０６−５７７）によってレビューされているように、糖化酵素で処置される。キシロースおよび他の糖類を含有するバイオマス前処置および糖化の加水分解物産物（即ち、それは、「混合糖類培地」である）もまた、典型的に、アセテートを含有する。バイオマス中のヘミセルロースは、アセチル化キシロース残基を含有し、そしてアセテートは、極めて温和な条件下で放出される。処理されたバイオマスからアセテートを取り出すことは、問題を解決する１つの方法であるが、この工程を組み入れると、セルロース系エタノールの製造コストが大幅に増加する。結果的に、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株を操作して、アセテートに対してより高い耐性を提供することは、実質的な改善である。
【００５１】
本明細書においてアッセイされるアセテートの存在下における改善された性能として、増殖、キシロースの資化、およびエタノールの産生が挙げられる。ｈｉｍＡ改変キシロース資化性Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株の改善された性能は、同じ遺伝的特徴を有する（同質遺伝子株）が、ｈｉｍＡ遺伝子の改変を欠く株に関連する。ｈｉｍＡ遺伝子の遺伝子改変に使用される親株は、典型的に、この比較で使用される。非改変ｈｉｍＡ株がその可能な限りの増殖およびエタノール産生に到達しない任意のレベルのアセテートにおいて、改善が認められ得る。アセテートの濃度が約５ｇ／Ｌ以上である場合、培地の組成およびｐＨ制御に依存して、典型的に改善が生じる。阻害種は、実際には、酢酸であるため、「アセテート阻害」の程度もまた、ｐＨに依存し、そして酢酸とアセテートとの平衡は、ｐＨに依存的である。ｐＨの制御を伴わなくても、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）は、他のグラム陰性細菌と同様に、迅速に、培養培地を酸性化する。ｐＨを５．８から４．８に低下させると、酢酸の約４．８ｐＫAにより、酢酸の濃度は、５倍増加する。それ故、酢酸（インヒビター）の実際の濃度は、培養培地のｐＨ、ならびに培養培地に存在するプロトン化および非プロトン化種の合計量に依存する。
【００５２】
アセテートの存在を伴うグルコースとキシロースとの濃縮混合物において、非改変および改変ｈｉｍＡ株は、ｐＨ制御された条件下で同様にグルコースを資化し、キシロース消費の前に、グルコースが主に消費される。しかし、すべてのグルコースが枯渇した後の発酵の後期段階中に、ｈｉｍＡ改変株は、正常なｈｉｍＡ遺伝子発現を有する同質遺伝子親株より多くのキシロースをエタノールに変換することが可能である。
【００５３】
ｈｉｍＡ遺伝子改変によってもたらされるエタノール産生の増加のレベルは、複数のタイプの糖類のレベルおよび割合ならびに他のインヒビターの存在を含むｐＨ制御条件下の培養培地の成分に依存する。例えば、１２６ｇ／Ｌグルコース、１０７ｇ／Ｌキシロースおよび１０％アセテートの存在下、ｈｉｍＡ改変を有しない同質遺伝子株と比較して、ｈｉｍＡ改変株のエタノール力価は４％増加した。培養培地が他のインヒビターをも含有する場合、エタノール産生の増加は、なお大きくなり得る。例えば、１１０ｇ／Ｌグルコース、９０ｇ／Ｌキシロース、約９．５ｇ／Ｌ酢酸および１９０ｍＭアンモニウムイオン（この濃度でバイオマス加水分解物に存在し得るＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）増殖のもう１つのインヒビター（Ａｇｒａｗａｌ（１９８９）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ３４：２７８−２８１））を含むｍｏｃｋ ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ培地では、エタノール産生の約１１％の増加およびキシロースのより完全な資化が認められた。それ故、より厳しい条件下では、改変ｈｉｍＡ株と同質遺伝子の非改変ｈｉｍＡ株との間のエタノール産生の差異は、引用した例より、なおさらに大きくなり得る。例えば、より高い糖濃度において、またはアンモニウムイオンおよびアセテートに加えて、他の加水分解物由来のインヒビターも存在する場合である。従って、培養条件に依存して、エタノール産生の改善は、少なくとも約４％以上であり得る。
【００５４】
エタノール産生のための発酵
本発明の方法では、本ｈｉｍＡ改変キシロース資化株を、キシロースをも含む糖類の任意の混合物を含有する培地において培養する。特に、本株は、バイオマス加水分解物中で培養してもよく、またはバイオマス加水分解物の希釈物中で培養してもよい。バイオマス糖化では、バイオマス加水分解物において、典型的に、キシロースとグルコースとの混合物、フルクトース、スクロース、ガラクトース、マンノース、および／またはアラビノースを含み得る糖類を生成する。キシロースおよびグルコースを含む混合糖類組成物が好ましく、ここで、さらなる糖類が存在してもよい。多様な糖類の割合は、混合物において変動し得、キシロースでは、典型的に、糖類の全量の少なくとも約１０％である。好ましくは、キシロースは約４０％〜約６０％の間である。フルクトースは、サトウキビバガスのようないくつかのバイオマスの糖化によって生成される糖類に存在し、そしてキシロースが糖混合物の少なくとも約１０％を保持するように、キシロースまたはグルコースの一部をフルクトースに置き換えてもよい。さらに、アラビノースは、ヘミセルロースから誘導され、それ故、ヘミセルロースを含有する糖化バイオマスから誘導される混合糖類の典型的な成分である。本株による発酵中、キシロースは、エタノールの産生のための炭素源として使用される糖類の１つである。最大限のエタノール産生および発酵効率のために、キシロースを含む糖類の濃縮混合物を含有する培地において、本ｈｉｍＡ改変キシロース資化性株を培養することが望ましい。これにより、バイオマス糖化糖類の直接使用、またはほとんど希釈を伴わない使用が可能となり、それによって発酵容積が縮小され、これは商業的規模のエタノール産生において望ましい。より大きな濃度のエタノールが産生され得るように、高い糖類濃度が使用される。発酵培地における混合糖類濃度は、典型的に、少なくとも約１２０ｇ／Ｌおよび約３００ｇ／Ｌまでである。約１５０ｇ／Ｌ〜約２３５ｇ／Ｌの間にある高濃度の混合糖類が特に有用である。
【００５５】
エタノールの産生に望ましい高濃度の混合糖類条件では、共有および同時係属中の米国特許出願公開第２００８００８１３５８Ａ１号明細書（参照により本明細書に援用される）に記載のように、ソルビトールを、ｈｉｍＡ改変キシロース資化性Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）を培養するために使用される発酵培地に含めてもよい。ソルビトール（Ｄ−ソルビトールおよび／またはＬ−ソルビトール）は、約２ｍＭ〜２００ｍＭの濃度で培地に存在し得る。培地におけるより適切な最終濃度は、約２ｍＭ〜１００ｍＭの濃度であり、５ｍＭ〜２０ｍＭの濃度が好ましい。マンニトールを、ソルビトールの代わりに、またはソルビトールとの組み合わせで、培地において使用してもよい。さらに、ガラクチトールおよび／またはリビトールを、ソルビトールおよび／またはマンニトールの代わりに、あるいはソルビトールまたはマンニトールと組み合わせて使用することができることを見出した。ソルビトール、マンニトール、ガラクチトール、リビトールまたはそれらの組み合わせは、すべて、ソルビトールについて記載の濃度と同じ濃度で使用される。
【００５６】
Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）は、発酵が発生し、そしてエタノールが産生される培地で培養される。発酵は、空気、酸素、または他の気体の補充を伴わずに（嫌気性、微好気性（ｍｉｃｒｏａｅｒｏｂｉｃ）、または微好気性（ｍｉｃｒｏａｅｒｏｐｈｉｌｉｃ）発酵のような条件を含み得る）、少なくとも約２４時間行うが、４８時間以上行ってもよい。エタノール産生が最大に到達するタイミングは、発酵条件に依存してばらつきがある。典型的に、インヒビターが培地中に存在する場合、より長い発酵期間が必要である。発酵は、約２５℃〜約４０℃の範囲の温度、および約４．５〜約７．５のｐＨで行ってもよい。約３０℃〜約３７℃の温度が特に適切である。ｐＨを、酢酸のｐＫAより少なくとも約１ｐＨ単位超えて維持し、ｐＨを約５．８〜７．５の間にして、酢酸対アセテートの比を減少させることもまた、特に適切である。
【００５７】
ｈｉｍＡ改変キシロース資化性Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）は、キシロースを含む混合糖類を含有する培地中、実験規模の発酵槽、および商業的量のエタノールが産生される大規模化された発酵において培養させることができる。さらに、培地は上述のようにアセテートを含み得る。エタノールの商業的産生が所望される場合、さまざまな培養方法論を適用することができる。例えば、ｈｉｍＡ改変キシロース資化性Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）からの大規模産生を、バッチおよび連続培養方法論の両方によって、産生させることができる。古典的なバッチ培養方法は閉鎖系であり、ここで、培地の組成は培養の開始時に設定され、培養プロセス中に人工的に変更されることはない。それ故、培養プロセスの開始時に、培地に所望の生物体を接種し、増殖または代謝活動を可能にして、系には何も添加しない。しかし、典型的に、「バッチ」培養は、炭素源の添加についてのバッチ処理であり、しばしば、ｐＨおよび酸素濃度のような因子を制御することが試みられる。バッチ系では、系の代謝物およびバイオマス組成は、培養が終了する時点まで絶えず変化する。バッチ培養物内で、細胞は典型的に、静的な対数期を通過して増殖期に達し、最終的に、増殖速度が減少または停止する定常期へと加減する。処理を行わなければ、定常期の細胞は最終的に死滅する。対数期の細胞は、しばしば、いくつかの系の最終産物または中間体の大部分の産生を担う。定常期または指数期後の産生は他の系において得ることができる。
【００５８】
標準的なバッチ系の１つの変形例は流加培養系である。流加培養プロセスもまた、ｈｉｍＡ改変キシロース資化性Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）の培養に適切であり、培養の進行に伴って基質を増量しながら添加することを除いて、典型的なバッチ系を含む。異化代謝産物抑制が細胞の代謝を阻害し易い場合、および培地中の基質量を制限することが所望される場合、流加培養系が有用である。流加培養系における実際の基質濃度の測定は、困難であるため、これは、ｐＨ、およびＣＯ2のような排気体分圧のような測定可能な因子の変化に基づいて、見積もられる。バッチおよび流加培養方法は当該技術分野において一般的かつ周知であり、その例は、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｒｕｅｇｅｒ，Ｃｒｕｅｇｅｒ，ａｎｄ Ｂｒｏｃｋ，第２版（１９８９）Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ、またはＤｅｓｈｐａｎｄｅ，Ｍｕｋｕｎｄ Ｖ．，Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３６，２２７（１９９２）（参照により本明細書に援用される）に見出すことができる。
【００５９】
エタノールの商業的産生はまた、連続培養によっても達成することができる。連続培養は開放系であり、ここで、規定された培養培地を連続的にバイオリアクターに添加し、同時に等量の順化培地を処理のために取り出す。一般的に、連続培養は細胞を一定の高液体相密度で維持し、ここで、細胞は主に対数増殖期にある。あるいは、連続培養を固定化された細胞によって実施してもよく、ここで、炭素および栄養物が連続的に添加され、価値のある産物、副産物および不要産物が細胞塊から連続的に取り出される。細胞の固定化は、当業者に公知である天然および／または合成材料からなる広範な固相支持体を使用して実施することができる。
【００６０】
連続または半連続培養によって、細胞増殖、代謝、または最終産物の濃度に影響を及ぼす１つの因子またはいくつかの因子を調節することが可能である。例えば、１つの方法は、炭素源のような制限されている栄養物または窒素レベルを一定速度で維持し、そして他のすべてのパラメータを加減することが可能である。他の系では、培地の濁度によって測定される細胞濃度を一定に保ちながら、増殖または代謝に影響を及ぼす多くの因子を連続的に変更することができる。連続系は定常状態の増殖条件を維持しようとし、それ故、培地を抜き取ることによって起きる細胞の消失は、培養における細胞増殖速度に対して均衡を保たなければならない。連続培養プロセスのための栄養物および増殖因子を調節する方法ならびに産物形成の速度を最大限にするための技術については、産業微生物学の分野において周知であり、さまざまな方法がＢｒｏｃｋ、上掲によって詳述されている。
【００６１】
以下の発酵レジメンがエタノール産生に特に適切である。所望されるｈｉｍＡ改変キシロース資化性Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株を、オービタルシェーカー中、約１５０ｒｐｍで振盪しながら約３０℃〜約３７℃で振盪フラスコ中、半複合培地（ｓｅｍｉ−ｃｏｍｐｌｅｘ ｍｅｄｉｕｍ）において増殖させ、次いで、類似の培地を晩有する１０Ｌ種発酵槽に移す。発酵パラメータがエタノール産生に最適化されている産生発酵槽に種培養物を移す場合、ＯＤ600が３〜６の間になるまで、種培養物を、種発酵槽において嫌気的に増殖させる。種タンクから産生タンクに移される典型的な播種容積は、約２％〜約２０％ｖ／ｖの範囲である。典型的な発酵培地は、リン酸カリウム（１．０〜１０．０ｇ／ｌ）、硫酸アンモニウム（０〜２．０ｇ／ｌ）、硫酸マグネシウム（０〜５．０ｇ／ｌ）、酵母抽出物またはダイズを主材料とする製品（０〜１０ｇ／ｌ）のような複合窒素源のような最小培地成分を含有する。最終濃度で約５ｍＭのソルビトールまたはマンニトールが培地中に存在する。キシロース、およびグルコース（またはスクロース）のような少なくとも１つのさらなる糖を含む混合糖類は、炭素源を提供し、エタノールの率および力価を最大限にするために初期のバッチ処理された炭素源（５０〜２００ｇ／ｌ）の枯渇に際して発酵容器に連続的に添加する。炭素源供給速度は、培養物が、酢酸のような毒性の副産物の形成をもたらし得るグルコースの過渡の蓄積を生じないことを確実にするために、動力学的に調整する。利用する基質から産生されるエタノールの収率を最大限にするために、最初にバッチ処理するか、または発酵過程中に供給されるリン酸塩の量によって、バイオマスの増殖を制限する。発酵ブロスのｐＨは、水酸化アンモニウム、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、または他の強塩基を使用する自動化された塩基の添加によって制御／維持される。発酵槽の温度は、所望の範囲で制御される。発泡を最小限にするために、消泡剤（任意のクラス−シリコーンを主材料とするもの、有機物を主材料とするものなど）を、必要に応じて容器に添加する。汚染を最小限にするために、場合により、カナマイシンのような株において抗生物質耐性マーカーが存在する抗生物質を使用してもよい。
【００６２】
上記の条件の任意の組、および当業者に周知であるこれらの条件におけるさらなるバリエーションは、本キシロース資化性組み換えザイモモナス株によるエタノールの産生のための適切な条件である。
【実施例】
【００６３】
本発明を、以下の実施例においてさらに規定する。これらの実施例は、好適な実施形態を示す一方、あくまで例示として示されることが理解されるべきである。当業者であれば、上記の考察およびこれらの実施例から本発明の不可欠な特徴を確かめることが可能であり、また、その趣旨および範囲から逸脱することなく、それを多様な用途および条件に適合させるように本発明の多様な変更および改変をなすことが可能である。
【００６４】
一般的方法
ここで使用した標準的な組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は当該技術分野において周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａ，第２版；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）（１９８９）（以後、「Ｍａｎｉａｔｉｓ」）；ならびにＳｉｌｈａｖｙ，Ｔ．Ｊ．，Ｂｅｎｎａｎ，Ｍ．Ｌ．，ａｎｄ Ｅｎｑｕｉｓｔ，Ｌ．Ｗ． Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｇｅｎｅ Ｆｕｓｉｏｎｓ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８４）；ならびにＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ．ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅにより出版、Ｈｏｂｏｋｅｎ，ＮＪ（１９８７）に記載されている。
【００６５】
略語の意味は次のとおりである：「ｋｂ」はキロベースを意味し、「ｂｐ」は塩基対を意味し、「ｎｔ」はヌクレオチドを意味し、「ｈｒ」は時間を意味し、「ｍｉｎ」は分を意味し、「ｓｅｃ」は秒を意味し、「ｄ」は日を意味し、「Ｌ」はリットルを意味し、「ｍｌ」はミリリットルを意味し、「μＬ」はマイクロリットルを意味し、「μｇ」はマイクログラムを意味し、「ｎｇ」はナノグラムを意味し、「ｇ」はグラムを意味し、「ｍＭ」はミリモルを意味し、「μＭ」はマイクロモルを意味し、「ｎｍ」はナノメートルを意味し、「μｍｏｌ」はマイクロモルを意味し、「ｐｍｏｌ」ピコモルを意味し、「Ｃｍ」はクロラムフェニコールを意味し、「Ｃｍr」はクロラムフェニコール耐性を意味し、「Ｓｐｅｃr」はスペクチノマイシン耐性を意味し、「ｃｆｕ」はコロニー形成単位を意味し、「ＯＤ600」は６００ナノメートルの波長で測定される光学密度を意味し、「ＳＥ」は標準誤差を意味し、「ｒｐｍ」は１分間あたりの回転数を意味し、「〜」は約を意味する。
【００６６】
実施例１
ＺＷ８０１−４トランスポゾンに基づくノックアウト／過剰発現ライブラリーの作製
トランスポゾンに基づくゲノムノックアウト／過剰発現ライブラリーを、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）のキシロース資化性組み換え株において構築して、酢酸耐性変異体についてスクリーニングした。ライブラリーを作製するためにトランスポゾンを使用するのには、２つの原則的な理由があった。第１に、それは、酢酸耐性において役割を果たす遺伝子関する既存の知識を必要としない全く偏りのないアプローチである。第２に、選択マーカーによって「タグ付け」されるため、所望の表現型を担う破壊された遺伝子を同定することが容易である。ライブラリーを作製するために使用した株はＺＷ８０１−４であった。米国仮特許出願第６０／８４７８１３号明細書（参照により本明細書に援用される）に詳述されているように、中間株、ＺＷ８００を介して、ＺＷ６５８（ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−７８５８）からＺＷ８０１−４を誘導した。ＺＷ８００の株を、野生型ｌｏｘＰ部位によってフランキングされたスペクチノマイシン耐性カセット（Ｓｐｅｃr−カセット）の自殺プラスミドから、グルコース−フルクトースオキシドレダクターゼ（ＧＦＯＲ）をコードする遺伝子への二重交差挿入によって、構築した。得られたＧＦＯＲノックアウト変異体では、グルコースおよびキシロースによる混合糖発酵中に、キシリトールの産生の減少、キシロース代謝の有害な副産物、およびエタノールのより良好な産生が認められた。次いで、Ｓｐｅｃr−カセットのＣｒｅ仲介による切り出しを介して、ＺＷ８００をＺＷ８０１−４に変換した。選択マーカーの除去により、タンパク質の翻訳を未熟な状態で切り詰めるインフレーム終止コドンを生じるＧＦＯＲオープンリーディングフレームの中間において単一の野生型ｌｏｘＰ部位を残した。さらに、ＺＷ８０１−４中のＧＦＯＲコーディング配列は、自殺構築物の設計の結果として、ｌｏｘＰ部位の周囲の領域の約７２ｂｐの本来の野生型ＧＦＯＲヌクレオチド配列を含んでいない。ＺＷ８０１−４における変異体ＧＦＯＲコーディング領域の配列を配列番号２５に示す。その直前の形態（ＺＷ８００）と同様に、ＺＷ８０１−４は機能性ＧＦＯＲ酵素を産生しないため、それは、いずれの検出可能なキシリトールも作製しない。
【００６７】
ＺＷ８０１−４ゲノムノックアウト／過剰発現ライブラリーを作製するために使用した方法論は、ｐＭＯＤTM−２＜ＭＣＳ＞Ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒ（カタログ番号ＭＯＤ０６０２）を使用するＥｐｉｃｅｎｔｒｅ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）ｔｒａｎｓｐｏｓｏｍｅ技術に基づいた。このプラスミドは、アンピシリン耐性遺伝子（ａｍｐＲ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）複製開始点（ｏｒｉ）、およびＴｎ５トランスポサーゼが相互作用する２つのモザイク末端（ＭＥ）の間に位置するマルチクローニング部位を含む。本発明において適用するために、Ｓｐｅｃr−カセット（それ自身のプロモーターを有する）およびＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（Ｐｇａｐ）の強力な構成性プロモーターを、２つのＭＥの間に位置するマルチクローニング部位に挿入することによって、ｐＭＯＤTM−２＜ＭＣＳ＞を、図２に示すｐＭＯＤｇａｐ／ａａｄＡに変換した；ＰｇａｐプロモーターおよびＳｐｅｃr−カセットは、対向する方向で配向する。それ故、この構築物を使用して転位中にＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）の染色体に無作為に挿入されたＤＮＡフラグメントは、Ｓｐｅｃr−カセットおよびＰｇａｐプロモーターの両方を含有した。Ｐｇａｐプロモーターは、トランスポゾン挿入部位に隣接するＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）染色体遺伝子の発現を潜在的に変更することができるため、それをトランスポゾンに付加して、ライブラリーの遺伝子多様性を増加させた。
【００６８】
ＺＷ８０１−４ゲノムノックアウト／過剰発現ライブラリーは、約１７，５００個の独立した変異体からなり、そしてグリセロールストックの力価は、１ミリリットルあたり約７．１×１０8Ｓｐｅｃrコロニー形成単位（ｃｆｕ）であった。これは、約１トランスポゾン挿入事象／１１５ヌクレオチド（トランスポゾンおよび約１ｋｂの平均サイズの約２０００個の遺伝子の無作為挿入に基づいて、ゲノム全体の約８×カバリッジ（ｃｏｖｅｒａｇｅ）である）に翻訳する。Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）の形質転換頻度が低いため、２つ以上のトランスポゾン挿入を有する変異体は全くないか、または極めて少数であることが予想された。
【００６９】
実施例２
アセテートに対してより大きな耐性を有する変異体のＺＷ８０１−４トランスポゾンに基づくノックアウト／過剰発現ライブラリーのスクリーニング
下記の通り、ＺＷ８０１−４ゲノムノックアウト／過剰発現ライブラリーを、酢酸耐性変異体についてスクリーニングした。しかし、これを行う前に、変異体富化プロセスのための適切な選択条件を設定することが重要であった。目的は、より速く増殖する変異体が蓄積し得るように、増殖速度を少なくとも２倍遅くするが、いくらかの世代に細胞を分裂させることが可能なアセテートの濃度を見出すことであった。また、先の実験により、浸透圧ストレスおよびアセテートは両方とも、相乗的様式で増殖を阻害することが示されたため、グルコースとキシロースとの濃縮混合物においてプロセス関連条件下でこれを行うことも重要であった。最終的に、真の阻害化合物は酢酸であり、そしてプロトン化種対非プロトン化種の比は、ｐＨ制御を伴わなければ、細菌細胞が増殖培地を酸性化するにつれて劇的に増加するため、ｐＨを制御することは極めて重要であった。例えば、ｐＨが５．８から４．８に低下する場合、この弱有機酸のｐＫAは約４．８であるため、酢酸の濃度は約５倍に増加する。
【００７０】
図３は、ライブラリーを作製するために使用した株であるＺＷ８０１−４の増殖速度および最終バイオマス収量に対する２つの異なる濃度のアセテートの阻害効果を示す。酢酸カリウムをこれらの実験に使用したが、以下に示す最終濃度は、添加した塩の酢酸成分の１リットルあたりのグラム数に基づく。ｐＨ制御されたバイオリアクターは、ｍＲＭ３Ｓ培地（１０ｇ／Ｌ酵母抽出物、２ｇ／ＬのＫＨ2ＰＯ4、１ｇ／ＬのＭｇＳＯ4、５ｍＭソルビトール）＋１００ｇ／Ｌグルコース、９０ｇ／Ｌキシロースおよび５ｇ／Ｌまたは６ｇ／Ｌのアセテートを含有した；ｐＨおよび温度は５．８および３０℃であり、そして撹拌は１５０ｒｐｍであった。インヒビターのこの濃度は、上記の増殖の両方の基準を満たすため、図３および他の実験において示される結果に基づいて、ライブラリースクリーニングに、５ｇ／Ｌのアセテートを選択した。
【００７１】
酢酸耐性変異体を富化するために、以下のプロトコルを使用した。ライブラリーグリセロールストック（ＯＤ600＝４．３；約７．１×１０8Ｓｐｅｃr ｃｆｕ／ｍｌ）のアリコート（２ｍｌ）を、２０ｍｌのＳＭ培地（１０ｇ／Ｌ酵母抽出物、２ｇ／ＬのＫＨ2ＰＯ4、１ｇ／ＬのＭｇＳＯ4、７５ｇ／Ｌグルコース、２５ｇ／Ｌキシロース、初期ｐＨ５．８）に添加し、そして培養物を１．５時間、３０℃でインキュベートした。この回収期間後、細胞を遠心分離によって回収し、そして２．０ｍｌの同じ増殖培地に再懸濁した。次いで、細胞懸濁液（約７×１０6Ｓｐｅｃr ｃｆｕ）のアリコート（１０μｌ）を、１００ｇ／Ｌグルコース、９０ｇ／Ｌキシロース、およびｐＨ変化を最小限にするのに役立つ４ｇ／Ｌ重炭酸カリウムを含有する１５ｍｌのｍＲＭ３Ｓ培地に播種した；細胞を添加し、そして初期ＯＤ600を約０．００２５とする前に、濃リン酸で初期ｐＨを５．８に調整した。これは、変異体富化手順に使用した種培養物である。それを、３０℃で約０．５のＯＤ600まで増殖させ、そして７．５ｍｌをｐＨ制御したバイオリアクターに播種した。１５０ｍｌの最終培養物は、ｍＲＭ３Ｓ培地＋１００ｇ／Ｌグルコース、９０ｇ／Ｌキシロース、５ｇ／Ｌのアセテートを含有し、そして自動化されたＫＯＨの添加によって、ｐＨを５．８に維持した。３０℃での約２４時間の増殖後、培養物（ＯＤ600約０．５）のアリコートを、同じ組成を有する新鮮な増殖培地を含有する新たなバイオリアクターに継代して、約０．０２の初期ＯＤ600とした。上記のように、この工程を、本質的にあと６回反復した。一般に、細胞を、２４〜３６時間ごとに継代し、そしてバイオリアクター中の初期ＯＤは約０．０２〜約０．０３であった。それ故、継代の間に、少なくとも５世代が認められた。７回目の変異体富化手順後、培養物のグリセロールストックを、さらなる特徴付けのために調製した。
【００７２】
図４Ａは、７回目の継代後、富化された変異体培養物によって実施した高糖およびアセテートによるｐＨ制御されたバイオリアクター実験の結果を示す。この実験のコントロールは、親株、ＺＷ８０１−４であった。種培養物を、３０℃で、ＳＭ培地において、約４．５のＯＤ600まで増殖させ、そしてバイオリアクターを、１０％播種物で開始した。最終的な１５０ｍｌの培養物は、ｍＲＭ３Ｓ培地＋１００ｇ／Ｌグルコース、９０ｇ／Ｌキシロースおよび６ｇ／Ｌアセテートを含有した。撹拌は、１５０ｒｐｍであり、そしてｐＨおよび温度は、それぞれ、５．８および３０℃で維持した。様々な時間において、ＨＰＬＣ分析のために、屈折率検出器を具備するＨＰ１１００（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ））を使用して、培養物の１．０ｍｌアリコートを取り出し、発酵ブロス中に存在するグルコース、キシロース、およびエタノールの濃度を決定した。ＨＰＬＣ分析の前に、遠心分離によって細胞を取り出し、そして０．２２μｍ酢酸セルローススピンＳｐｉｎ−Ｘ遠心管フィルター（Ｃｏｓｔａｒ、カタログ番号８１６０）を介して上清をろ過して、小さな粒子を取り出した。化合物を、０．６ｍｌ／分の流速および移動相として０．０１ＮのＨ2Ｓ０4を使用する均一溶媒条件下、５５℃で稼動させたＡｍｉｎｅｘ ＨＰＸ−８７Ｈカラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）上で分離させた。既知濃度の標準物質を使用して、目的のピークを定量し、そして結果をｇ／Ｌで表した。
【００７３】
図４Ａに示す結果は、富化された変異体ライブラリー培養物が、発酵の後期段階中のキシロースのより速い資化およびエタノールのより迅速な産生を有したことを示す。これは、グルコースのすべてが枯渇した後に生じ、そしてエタノール濃度が毒性レベルに接近していたことに留意すること。それにもかかわらず、実験の終了までに、両方の培養物は、すべての糖を消費し、そして同じ量のエタノールを産生した。僅かにより高い濃度の糖（１０５ｇ／Ｌグルコースおよび１００ｇ／Ｌキシロース）ならびにさらなるアセテート（９ｇ／Ｌ）を使用して、この実験を反復した場合、類似の現象が観察され（図４Ｂ）、それ故、結果に再現性があることが実証された。
【００７４】
実施例３
変異体株の遺伝的特徴付け
選択プロセス中にどのタイプの変異体が富化されたかを調べるために、２回目のバイオリアクター実験中にライブラリー培養物から単一のコロニーを単離した（図４Ｂ）。培養物のアリコートを、２４時間の時間ポイントで取り出し、そして細胞を、ＭＭＧ培地（５０ｇ／Ｌグルコース、１０ｇ／Ｌ酵母抽出物、５ｇ／Ｌのトリプトン、２．５ｇ／Ｌの（ＮＨ4）2ＳＯ4、０．２ｇ／ＬのＫ2ＨＰＯ4、および１ｍＭのＭｇＳ０4）を含有する寒天プレート上で増殖させた。３０℃、嫌気条件下での４８時間のインキュベーション期間後、得られたコロニーのうち１７個を、ＤＮＡ配列解析のために無作為に選択して、トランスポゾン挿入の部位を決定した。以下の手順を、この解析に使用した。コロニーを５０μｌの水で希釈し、そしてゲノムＤＮＡを、ＧｅｎｏｍｉＰＨＩ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号２５−６６００−１）を使用して、増幅した。簡単に説明すると、１μｌの細胞懸濁液を９μｌのＬｙｓｉｓ Ｒｅａｇｅｎｔに添加し、そして混合物を、９５℃まで、３分間加熱し、そして直ちに４℃まで冷却した。次に、９μｌの酵素緩衝液および１μｌのＰｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼを、溶解したサンプルに添加した。３０℃で１８時間の増幅後、ポリメラーゼを、１０分間、６５℃で加熱不活化し、次いで、サンプルを直ちに４℃まで冷却した。
【００７５】
次いで、増幅したサンプルのアリコート（８μｌ）を、１６μｌのＢｉｇＤｙｅ ｖ３．１ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＰＮ＃４３３７４５７ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ））、１μｌのＴｈｅｒｍｏｆｉｄｅｌａｓｅ（Ｆｉｄｅｌｉｔｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ））、１２μｌのＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｇｒａｄｅ水（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．（Ｈｅｒｎｄｏｎ，ＶＡ））、および３μｌの１０μＭプライマー：ＳｐｅｃＴ−ＦＯＲ（配列番号２：ＧＴＧＡＡＡＧＧＣＧＡＧＡＴＣＡＣＣＡＡＧＧＴＡＧＴＣ）またはＳｐｅｃＴ−Ｒｅｖ（配列番号３：ＣＴＡＣＣＴＣＴＧＡＴＡＧＴＴＧＡＧＴＣＧＡＴＡＣＴＴＣＧＧ）のいずれか一方に添加した。これらのプライマーの両方とも、ＺＷ８０１−４ゲノムノックアウトライブラリーを作製するために使用したトランスポゾンの部分であるＳｐｅｃr−カセットにハイブリダイズするが、それらは、対向する方向で配向されることに留意すること。次いで、配列決定反応は、次の熱サイクルであった：９６℃で３分間、続いて、２００サイクルの（９５℃で３０秒間＋５５℃で２０秒間＋６０℃で２分間）、そして４℃で貯蔵した。配列決定の前に、Ｅｄｇｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）クリーンアッププレートを使用して、取り込まれなかったｄｄＮＴＰを取り出した。４０μｌの配列決定反応混合物の全体を、予めスピンした９６ウェルクリーンアッププレートの１つのウェルにピペッティングし、そしてプレートを、５分間、５０００×重力、Ｓｏｒｖａｌｌ ＲＴ−７冷却遠心分離機中でスピンした。次いで、クリーンアップされた反応物を、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ３７３０ＤＮＡシークエンサーに直接配置し、そして自動塩基呼び出しにより配列決定した。
【００７６】
特に、配列決定した１７個のすべてのコロニーでは、ｈｉｍＡオープンリーディングフレーム（Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ゲノムのヌクレオチド番号１１３８２２４〜番号１１３８５６５の逆相補配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＥ００８６９２））にトランスポゾンが挿入されており、そして異なる３つの挿入事象が同定された。コロニーのうち１１個（ＡｃＲ＃３を含む、以下を参照のこと）は、ｎｔ番号１１３８４１３においてトランスポゾンの挿入を有し、コロニーのうち４個はｎｔ番号１１３８２６７において挿入を有し、そしてコロニーのうち２個はｎｔ番号１１３８５０８において挿入を有した。それ故、３つのすべての挿入事象は、２５０ｂｐストレッチのＤＮＡ内で生じた。７回目の変異体富化手順後、ｈｉｍＡノックアウト変異体の６５％が、ｎｔ番号１１３８４１３においてトランスポゾン挿入を有したという事実から、この事象が、他の２つの挿入事象より速い増殖またはより大きな生存能を付与したことが示唆された。また、配列解析から、もう１つの興味深い観察が得られた。理論的には、Ｔｎ５トランスポゾンは、自体をいずれの方向にでもＤＮＡに挿入することができるが、選択プロセスから回収された３つのすべての挿入事象は、ＰｇａｐプロモーターがｈｉｍＡオープンリーディングフレームと対向する方向にある、同じ配向を有していた。
【００７７】
上記の配列決定の結果から、図４に示される実験は、細胞の混合集団によって実施されたものであり、精製された株によるものではないことが明らかである。それ故、ＡｃＲ＃３は、ｎｔ番号１１３８４１３においてトランスポゾン挿入を有し、これは、最も頻回に単離された事象であったため、この株を、ｈｉｍＡ表現型のさらなる特徴付けのために選択した。
【００７８】
実施例４
プロセス関連条件下での酢酸耐性および発酵性能に対するｈｉｍＡ遺伝子不活性化の影響
ＡｃＲ＃３は、ＺＷ８０１−４よりアセテートに対して耐性である
変異体選択プロセスに使用した増殖培地は、阻害レベルのアセテートに加えて、高濃度のグルコースおよびキシロースを含有した。従って、キシロースは、グルコースほどは資化されないため、７回目の富化後に観察された発酵性能の改善（図４）は、浸透圧ストレスまたはキシロースでのより良好な増殖に関連する可能性があった。エタノール耐性変異体もまた、用いた実験条件下でおそらくより速く増殖するか、またはより長く生存するため、それらが富化された可能性もあった。これらの無関連な可能性を除外し、そしてｈｉｍＡ遺伝子の不活化が現実にアセテートに対してより高い耐性を付与するかどうかについて調べるため、株ＡｃＲ＃３を、以下の条件下で親株、ＺＷ８０１−４と比較した。実験は、３３℃、振盪フラスコ（５０ｍｌチューブ中２０ｍｌ培養物）中で実施し、そして増殖培地は、１０ｇ／Ｌ酵母抽出物、２ｇ／ＬのＫＨ2ＰＯ4、１ｇ／ＬのＭｇＳＯ4、１０ｍＭのＫＨＣＯ3（ｐＨを維持するのに役立つため）、５０ｇ／Ｌグルコースおよびカリウム塩として添加した０、８、または１２ｇ／Ｌのアセテートを含有した；示されるアセテートの濃度は、カリウム塩の酢酸成分に基づく。細胞を添加し、そして培養物を往復振盪機（１５０ｒｐｍ）上で穏やかに振盪する前に、リン酸で初期ｐＨを５．８に調整した。種培養物を、アセテートを有さない同じ培地において指数後期（ＯＤ600約１．４）まで増殖させ、そして実験培養物の初期ＯＤ600は０．０３であった。浸透圧ストレスがなく、そして好適な基質のグルコースが炭素源であるため、これらは、アセテートの非存在下で、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）の増殖に理想的であることに留意することが重要である。さらに加えて、この実験で作製され得る最大濃度のエタノールは、＜２５ｇ／Ｌであり、これは、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）の増殖にほとんどまたは全く影響を及ぼさない。
【００７９】
アセテートの非存在下で、ＡｃＲ＃３およびＺＷ８０１−４は、類似した速度論で増殖し、そして図５に示すように、最終ＯＤ600値から判断されるものと同じ量のバイオマスを産生した。しかし、ＡｃＲ＃３株（図５Ｂ）は、アセテートに対して親株よりかなり高い耐性を有した（図５Ａ）。例えば、ＺＷ８０１−４の増殖は、８ｇ／Ｌのアセテートによってほぼ完全に達成された一方、ＡｃＲ＃３に対するこの濃度のインヒビターの影響は、ごく僅かであった。実際、ｈｉｍＡノックアウト変異体は、８ｇ／Ｌのアセテートに耐性であったＺＷ８０１−４を上回り、１２ｇ／Ｌのアセテートにさらなる耐性を示した。この実験を繰り返し行ったところ、同じ結果が得られた。図４に示されるバイオリアクター実験においても同様であったが、増殖培地のｐＨが制御されない場合、アセテートは、より強度に阻害的であることを想起することは重要である。ｐＨ制御を伴わない振盪フラスコ実験では、細胞は、増殖培地を酸性化し、そして酢酸／アセテートの割合が劇的に増加し、そしてそれは、既に認められたように、細菌増殖を阻害するのはプロトン化種である。
【００８０】
上記の実験において両方の株について観察された増殖の阻害にカリウムイオンが少なくとも部分的に寄与し得たため、アセテートの他の供給源を試験することが、重要であった。この組の実験に使用した条件は、上記の条件と同一であったが、酢酸ナトリウムおよび酢酸アンモニウムもまた分析に含まれた。酢酸アニオンの濃度は、すべての場合において８ｇ／Ｌ（上記で定義したとおり）であった。図６に、４３時間の時点での様々な培養物の最終ＯＤ600値を示す。ＺＷ８０１−４（図６Ａ）は、使用したアセテートが何かにかかわらず、８ｇ／Ｌのアセテートによって、強力に阻害された。この観察は、これらの実験における主要インヒビターが酢酸であったこと、およびアセテートの一価のカチオンが、使用した濃度では増殖にほとんどまたは全く影響を及ぼさなかったことを明確に示す。３つのすべてのアセテートもまた、ＡｃＲ＃３の増殖にネガティブな影響を及ぼした（図６Ｂ）が、アセテートの濃度が僅か８ｇ／Ｌであった場合、この株への阻害はそれほど劇的ではなかった。総合すると、図５および６に示す実験は、ＡｃＲ＃３が、親株、ＺＷ８０１−４より強度にアセテートに対して耐性である明確な証拠を提供する。
【００８１】
ＡｃＲ＃３は、高糖＋アセテート混合物において、ＺＷ８０１−４より良好な性能を示す
ＡｃＲ＃３は、「混合集団」の変異体に使用した同じ実験条件下で試験した場合（図４Ｂ）、ＡｃＲ＃３はＺＷ８０１−４より優れており、そして２つの培養物の間に、先の実験において認められるよりもかなり大きな差異が認められた（図７）。先の結果と一致して、すべてのグルコースが消費された後、そしてキシロースが唯一の残留する炭素源であった発酵の後期段階中にのみ、改善が明白であった。実際、図７に示す時間経過を綿密に調べることにより、グルコース資化およびエタノール産生の初期速度は、ＡｃＲ＃３では僅かに遅かったことが示された。しかし、すべてのグルコースが消費された後、キシロース資化曲線勾配から、ＡｃＲ＃３が、発酵の後期中にＺＷ８０１−４より速い速度でこの糖をエタノールに変換することが可能であったことは、明らかである。
【００８２】
コントロール株であっても、用いられた条件下で実験の終了までにすべての糖を使用することが可能であったため、上記の実験では、ＡｃＲ＃３の能力を十分に評価することができなかった。この制限を取り除くため、より厳しい条件を使用して、ＡｃＲ＃３およびＺＷ８０１−４を再度試験した。温度を、３０℃から３３℃に上昇させ、そしてより高い濃度のグルコースおよびキシロースを使用した。種培養物を、３０℃、ＳＭ培地において、約４．４のＯＤ600まで増殖させ、そして１０％播種物を使用して、バイオリアクターを開始した。最終的な１５０ｍｌの培養物は、ｍＲＭ３Ｓ培地＋１２６ｇ／Ｌグルコース、１０７ｇ／Ｌキシロースおよび１０ｇ／Ｌアセテートを含有した。撹拌を１５０ｒｐｍに設定し、そしてｐＨおよび温度は、それぞれ、５．８および３０℃で維持した。この実験は、ＺＷ８０１−４では３回反復およびＡｃＲ＃３では２回反復で行ったが、グルコース、キシロース、アセテートおよびエタノールのエンドポイント値（６７時間の時点）（平均±ＳＥ）を表１に示す。発酵ブロスのＨＰＬＣ分析については、実施例２で説明したが、表におけるすべての化合物の濃度を、ｇ／Ｌで表す。これらのより厳しい条件下では、ＡｃＲ＃３は、親株、ＺＷ８０１−４より約１０％多いキシロースを消費し、そして約４％多いエタノールを産生した。
【００８３】
表１．高糖およびアセテートにおいて増殖したＺＷ８０１−４株およびＡｃｒ＃３株について、ｐＨ制御された発酵槽におけるキシロース、エタノールおよびキシリトールのエンドポイント値。
【００８４】
１００％Ｍｏｃｋ ＨｙｄｒｏｌｙｓａｔｅにおいてＡｃＲ＃３はＺＷ８０１−４より良好な性能を示す
水酸化アンモニウム前処置プロセスを使用して生成されるバイオマス加水分解物中に存在することが予想される複数の濃度のアンモニウムイオンおよび酢酸イオンの存在下で、ＡｃＲ＃３およびＺＷ８０１−４の性能を評価した。水酸化アンモニウム前処置コーンストーバ加水分解物の発酵中のアンモニウムイオンの濃度は、１８０ｍＭを超え得、そして高濃度のアンモニウムイオンはＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）の増殖を阻害することが予測されている（Ａｇｒａｗａｌ（１９８９）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ３４：２７８−２８１）ため、これは、極めて重要な実験である。これらの実験に使用した合成の１００％Ｍｏｃｋ Ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ（１００％ＭＨ）培地は、５ｇ／Ｌ酵母抽出物、１５ｍＭ（ＮＨ4）2ＨＰＯ4、１６０ｍＭ酢酸アンモニウム、１ｇ／ＬのＭｇＳＯ4および１０ｍＭソルビトール（ｐＨ５．８）を含有する。それ故、種培養物の添加後の１００％ＭＨ中の酢酸イオンおよびアンモニウムイオンの最終濃度は、それぞれ、約９．５ｇ／Ｌおよび１９０ｍＭであった。実験は、ｐＨ制御されたバイオリアクターにおいて行った。種培養物を、３０℃、ＳＭ培地において、約４．４のＯＤ600まで増殖させ、そして１０％播種物を使用して、バイオリアクターを開始した。最終的な１５０ｍｌの培養物は、１００％ＭＨ＋１１０ｇ／Ｌグルコースおよび９０ｇ／Ｌキシロースを含有した。撹拌を１５０ｒｐｍに設定し、そしてｐＨおよび温度は、それぞれ、５．８および３３℃で維持した。様々な時間において、実施例２に記載されているのと同じ手順を使用して、発酵ブロスのＨＰＬＣ分析のためにアリコートを取り出した。同時に行った実験の代表的な対の結果を、図８：８ＡにおいてＺＷ８０１−４、および８ＢにおいてＡｃＲ＃３について示す。
【００８５】
先の観察に一致して、グルコースが代謝されている唯一の糖であった場合、ＡｃＲ＃３株では、エタノール産生の速度が増加しなかった。しかし、キシロースが唯一の残留する炭素源である場合、発酵の後期段階中のＡｃＲ＃３のより優れた性能が、極めて明白であった。ＺＷ８０１−４がすべてのグルコースを消費し終えた時までに、エタノール濃度は、既に、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）に対してさえ殺菌濃度である＞６５ｇ／Ｌであった。このような厳しい環境に、高濃度の酢酸イオンおよびアンモニウムイオン（両方とも、エタノールの毒性を強化する）が加えられた。エタノールレベルが継続して上昇するにつれ、キシロース代謝は、ますます緩徐になり、そして、最終的にゆっくりと停止した。同じ状況がＡｃＲ＃３でも認められたが、期間が延長した。ＡｃＲ＃３は、アセテートに対してより耐性であるため、それは、毒性環境においてより長く生存することが可能であり、従って、増殖倍地中の実質的にすべてのキシロースを消費し、そしてＺＷ８０１−４より多くのエタノールを産生することが可能であった。
【００８６】
１００％ＭＨによる実験を、両方の株についてさらに２回繰り返したが、結果は実質的に同一であった。グルコース、キシロース、アセテートおよびエタノールのエンドポイント値（４８時間の時点）を使用した３回の実験の統計解析を表２に示す；すべての濃度をｇ／Ｌ（平均±ＳＥ）で表す。６つのバイオリアクターのそれぞれに、独立して増殖させた種培養物を播種した。１００％ＭＨでは、ＡｃＲ＃３は、ＺＷ８０１−４より約１４ｇ／Ｌ多いキシロースを消費し、そしてこれは、最終的なエタノール力価を８２ｇ／Ｌから９１ｇ／Ｌに増加させたが、これは、１０％を超える増加である。これらの結果は、表１に示す高糖＋アセテート実験において得られる結果よりなお劇的である。アンモニウムイオンがアセテートを有する増殖倍地中に存在する場合、ストレスレベルは、より高いレベルにまで上昇し、そしてｈｉｍＡ遺伝子不活化の有益性が、より明らかになる。明らかに、アセテートに対してより高い耐性を有するＡｃＲ＃３のような株は、エタノールおよびアンモニウムイオンのようなその環境における他のインヒビターに対処することを、より良好に備えている。
【００８７】
表２．１００％Ｍｏｃｋ Ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅにおいて増殖したＺＷ８０１−４株およびＡｃＲ＃３株を伴うｐＨ制御された発酵槽におけるグルコース、キシロース、エタノール、およびアセテートのエンドポイント値。
【００８８】
実施例５
ＺＷ８０１−４におけるｈｉｍＡ遺伝子のノックアウトのための自殺構築物の作製
これまで示された結果から、ＡｃＲ＃３の酢酸耐性表現型がｈｉｍＡ遺伝子の破壊から生じたことがさらに強力に示唆されるが、他の２つの因子も、潜在的に寄与し得る。実施例１に記載のように、ＺＷ８０１−４ゲノムノックアウト／過剰発現ライブラリーを作製するために使用したトランスポゾンは、Ｓｐｅｃr−カセットおよびＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）Ｐｇａｐプロモーターを含有した。これらのエレメントは、対向する方向で配向され、そしてそれらの両方とも、転位中にｈｉｍＡオープンリーディングフレームに挿入された。Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）Ｐｇａｐプロモーターは強力な構成性プロモーターであるため、それは、ｈｉｍＡトランスポゾン挿入部位の直近に存在する遺伝子の発現レベルを変更した可能性がある。ＡｃＲ＃３の酢酸耐性表現型の少なくとも一部が他の遺伝子の自然突然変異から生じ、それもまたライブラリー変異体富化プロセス中のより速い増殖を可能にし得たことも考えられる（実施例２）。これらの可能性を除外し、そしてｈｉｍＡ遺伝子の不活化のみがＡｃＲ＃３のより高い酢酸耐性を担うかどうかについて調べるため、本発明者らは、ＺＷ８０１−４のｈｉｍＡ遺伝子をノックアウトするための自殺構築物を設計した。この非複製型プラスミドは、以下により詳細に説明するように、スペクチノマイシン耐性カセットを有するが、Ｐｇａｐプロモーターを含有しない。
【００８９】
ＺＷ８０１−４（「ｐＨｉｍＡ」）中のｈｉｍＡ遺伝子をノックアウトするため本発明において使用した自殺構築物は、究極的に、宿主経由、二重交差、相同組み換え、および選択マーカーとしてスペクチノマイシン耐性を使用して、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）のＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を挿入不活化するために以前に使用されたもう１つの自殺構築物（「ｐＬＤＨＳｐ−９ＷＷ」）から誘導した。ｐＬＤＨＳｐ−９ＷＷもまた、先に作製された他の多くの構築物から誘導した。これらの構築物のすべての最初の前駆体は、市販されているプラスミドベクターｐＮＥＢ１９３（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ ＃Ｎ３０５１Ｓ）であった。このプラスミドは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において複製することができるが、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）では複製することができないため、選択した。ｈｉｍＡノックアウト構築物を作製するのに関与したすべての工程および中間体について、プラスミドｐＮＥＢ１９３から開始して、年代順に以下に説明する。
【００９０】
ｐＬＤＨ１９３の構築
以下に説明するＤＮＡフラグメントの挿入のために、ｐＮＥＢ１９３をＳｂｆＩおよびＡｓｃＩで二重消化した。両方の制限部位は独特であり、そしてプラスミドのマルチクローニング領域に局在する。ＳｂｆＩ／ＡｓｃＩ−線状化ｐＮＥＢ１９３プラスミドＤＮＡフラグメントを、製造者のプロトコルに従い、Ｑｉａｇｅｎ社製ＱＩＡＱｕｉｃｋ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（カタログ番号２８１０４）を使用して、精製した。ｐＮＥＢ１９３にクローニングされたＤＮＡ挿入は、Ｑｉａｇｅｎ社製Ｂｌｏｏｄ ＆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｍａｘｉ Ｋｉｔ（カタログ番号１３３６２）を使用して、株ＺＷ１（ＡＴＣＣ番号３１８２１）から単離されたＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅された２２６８ｂｐフラグメントであった。このフラグメントのＰＣＲ増幅のために使用した合成オリゴヌクレオチドは、プライマー１および２であった。
【００９１】
プライマー１（配列番号４）：
ＣＴＡＣＴＣＡＴＴＴｃｃｔｇｃａｇｇＴＧＧＴＡＡＣＴＣＡＴＴＧＣＧＣＧＣＴＣ
プライマー２（配列番号５）：
ＣＡＴＣＴＴＡＣＴｇｇｃｇｃｇｃｃＡＡＡＡＡＴＣＴＧＣＧＧＣＴＧＡＣＡＴＡＣ
プライマー１（順方向プライマー）の下線を付した塩基は、ホスホグリセロムターゼ（ｐｇｍ）をコードするオープンリーディングフレームの３’末端でＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ゲノム（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＥ００８６９２）のヌクレオチド１２６２７３９〜１２６２７２０にハイブリダイズする一方、小文字は、プライマーの５’末端に付加されたＳｂｆＩ部位に対応する。プライマー２（逆方向プライマー）の下線を付した塩基は、アルコールデヒドロゲナーゼ Ｉ（ａｄｈＩ）をコードするオープンリーディングフレームの直ぐ上流であるＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ゲノムのヌクレオチド１２６０４９０〜１２６０４７２にハイブリダイズする一方、小文字は、プライマーの５’末端に付加されたＡｓｃＩ部位に対応する。従って、ＰＣＲ増幅の標的であった２２６８ｂｐのＤＮＡフラグメントは、ＳｂｆＩ部位から開始し、そしてＡｓｃＩ部位で終了する次のエレメントからなる：（ａ）ｐｇｍ遺伝子の３’末端、（ｂ）Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼをコードするｌｄｈ遺伝子全体、および（ｃ）遺伝子の５’非翻訳領域。ＰＣＲ産物をＳｂｆＩおよびＡｓｃＩで切断し、そして得られたＤＮＡフラグメントを、上記で説明したＳｂｆＩ／ＡｓｃＩ線状化ｐＮＥＢ１９３ベクターに連結した。連結反応混合物を使用して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＪＭ１１０を形質転換して、そして形質転換された細胞を、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢ培地上でプレート化した。正確なサイズの挿入物を有するプラスミドを含有するアンピシリン耐性形質転換体を、はじめに、再懸濁したコロニーを使用するＰＣＲ（「コロニーＰＣＲ」）ならびにプライマー１および２によって同定した。ポジティブクローンの以後の確認は、ＳｂｆＩおよびＡｓｃＩによるプラスミドＤＮＡの制限消化分析、ならびにアンピシリン耐性形質転換体によるコロニーＰＣＲによって作製した２２６８ｂｐフラグメントのＤＮＡ配列解析によって行った。さらなる操作のために選択したプラスミドを、「ｐＬＤＨ１９３」と称する。
【００９２】
ｐＬＤＨＴｃ１３９＃７の構築
プラスミドｐＬＤＨ１９３は、ｌｄｈオープンリーディングフレームの中間付近に局在する独特なＮｃｏＩ部位を有する。この部位を使用して、テトラサイクリンに対して耐性を付与するＤＮＡフラグメントを挿入した。この操作のために使用したテトラサイクリン耐性カセット（Ｔｃr−カセット）を、ＤＮＡテンプレートとしてプラスミドｐＡＣＹＣ１８４（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ０６４０３）、ならびにＰＣＲプライマーとしてプライマー３および４を使用しＰＣＲによって作製した。
【００９３】
プライマー３（配列番号６）：
ＡＣＴＣＡＴＴＴｃｃａｔｇｇＣＧＡＴＣＧＣＡＣＴＡＴｇｃｇｇｃｃｇｃＡＡＴＧＴＡＧＣＡＣＣＴＧＡＡＧＴＣＡＧＣＣ
プライマー４（配列番号７）：
ＡＴＣＴＣＡＣＴｃｃａｔｇｇＣＣＧＧＣＣＡＡＣＴＡｔｔａａｔｔａａＧＡＡＴＴＧＡＴＴＧＧＣＴＣＣＡＡＴＴＣＴＴＧ
プライマー３（順方向プライマー）の太い下線を付した塩基は、テトラサイクリン耐性遺伝子のプロモーターの直ぐ上流にハイブリダイズする。プライマー３はまた、その５’末端に付加された３つの制限部位（ＮｃｏＩ、ＡｓｉＳＩ、およびＮｏｔＩ）を有する。ＮｃｏＩ部位を標準の小文字で表す。ＡｓｉＳＩ部位には、細い下線が付されている。Ｎｏｔ Ｉ部位を斜体の小文字で表す。プライマー４（逆方向プライマー）の太い下線を付した塩基は、テトラサイクリン耐性遺伝子の終止コドンの直ぐ上流にハイブリダイズし、そしてこのプライマーはまた、その５’末端に付加された３つの制限部位（ＮｃｏＩ、ＦｓｅＩ、およびＰａｃＩ）を有する。上記の標識化と同様に、ＮｃｏＩ部位を標準の小文字で表し、ＦｓｅＩ部位に細い下線を付し、そしてＰａｃＩ部位を斜体の小文字で表す。プライマー３および４で作製した１４４８ｂｐのＴｃr−カセットを、ＮｃｏＩで切断し、そして分離用アガロースゲル電気泳動により精製した。次いで、得られたＤＮＡフラグメントを、プラスミド、ｐＬＤＨ１９３のｌｄｈオープンリーディングフレームに存在する独特なＮｃｏＩ部位に連結した。挿入を有しないベクターの再環状化の可能性を最小限にするために、連結の前に、ＮｃｏＩ消化ｐＮＥＢ１９３を仔ウシ小腸アルカリホスファターゼで脱リン酸化した。連結反応混合物を大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＪＭ１１０に導入し、そして形質転換された細胞を、２０μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含有するＬＢ培地上でプレート化した。正確な挿入を有するプラスミドを含有するテトラサイクリン耐性形質転換体を、ＮｃｏＩ、ＡｓｉＳＩ、ＮｏｔＩ、ＦｓｅＩ、およびＰａｃＩによる制限消化分析によって同定し、そしてＴｃr−カセットの配向を、適切なプライマーを使用しＰＣＲ分析によって確認した。さらなる操作のために選択したプラスミド（ｐＬＤＨＴｃ１３９＃７）の環状図を、図９Ａに示す。もう１つの計画では、宿主経由、二重交差、相同組み換え、および選択マーカーとしてテトラサイクリンに対する増殖を使用して、ＺＷ１におけるＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の（「破壊」または「ノックアウト」のための）挿入不活化のために、この自殺構築物を首尾よく使用した。
【００９４】
ｐＬＤＨＴｃ１３９＃７−９ＷＷの構築
ｐＬＤＨＴｃ１３９＃７を使用して、ＺＷ１におけるＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を「ノックアウト」し得ることを実証したことから、次に構築物を改変して、Ｃｒｅリコンビナーゼを使用して、遺伝子破壊後の染色体から選択マーカーを取り出すことが可能であるようにした。この目的を達成するために、Ｔｃr−カセットにフランキングする４つの独特な制限部位、即ち、５’末端におけるＡｓｉＳＩおよびＮｏｔＩならびに３’末端におけるＰａｃＩおよびＦｓｅＩを利用して、２つの野生型ｌｏｘＰ部位（ＬｅｅおよびＳａｉｔｏ、１９９８）をｐＬＤＨＴｃ１３９＃７に付加した。構築物を両方の酵素で切断し、そして得られる大きなＤＮＡフラグメントを精製した後、第１のｌｏｘＰ部位を、プラスミドｐＬＤＨＴｃ１３９＃７のＡｓｉＳＩおよびＮｏｔＩ部位の間に挿入した。この位置に挿入されたｌｏｘＰ部位は、それらの５’末端で両方ともリン酸化された２つの合成オリゴヌクレオチド（Ｏｌｉｇｏ５および６）から作製した。
【００９５】
Ｏｌｉｇｏ５（配列番号８）：
ｃｇｃＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡＡＴＧＴＡＴＧＣＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴｇｃ
Ｏｌｉｇｏ６（配列番号９）：
ｇｇｃｃｇｃＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡＧＣＡＴＡＣＡＴＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴｇｃｇａｔ
Ｏｌｉｇｏ５および６は相互に相補的であり、そして共にアニールする場合、ＤＮＡフラグメントがｐＬＤＨＴｃ１３９＃７のＡｓｉＳＩおよびＮｏｔＩ部位の間で連結することを可能にする両末端の一本鎖突出部を有する完全長の二本鎖野生型ｌｏｘＰ部位を形成する。Ｏｌｉｇｏ５および６の中の大文字は、完全長の野生型ｌｏｘＰ部位に対応する一方、小文字は、二本鎖ＤＮＡフラグメントをｐＬＤＨＴｃ１３９＃７のＡｓｉＳＩおよびＮｏｔＩ部位に連結するために使用したヌクレオチドを示す。
【００９６】
連結反応混合物を使用して、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＤＨ１０Ｂを形質転換して、そして形質転換された細胞を、２０μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含有するＬＢ培地上でプレート化した。ｐＬＤＨＴｃ１３９＃７のＡｓｉＳｉおよびＮｏｔＩ部位に正確に挿入されたｌｏｘＰ部位を有するプラスミドを含有するテトラサイクリン耐性形質転換体を、関連領域の制限消化分析、適切なプライマーを使用するコロニーＰＣＲ、およびＤＮＡ配列解析によって同定した。さらなる操作のために選択したプラスミドを、「ｐＬＤＨＴｃ１３９＃７−９Ｗ」と称する。
【００９７】
次に、両方の酵素でプラスミドを切断し、そして得られる大きなベクターフラグメントを精製した後、第２の野生型ｌｏｘＰ部位を、ｐＬＤＨＴｃ１３９＃７−９ＷにおけるＴｃr−カセットの他方の末端のＰａｃＩおよびＦｓｅＩ部位の間に挿入した。この位置に挿入されたｌｏｘＰ部位もまた、それらの５’末端で両方ともリン酸化された２つの合成オリゴヌクレオチド（Ｏｌｉｇｏ７および８）で作製した。
【００９８】
Ｏｌｉｇｏ７（配列番号１０）：
ｔａａＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡＡＴＧＴＡＴＧＣＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴｇｇｃｃｇｇ
Ｏｌｉｇｏ８（配列番号１１）：
ｃｃＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡＧＣＡＴＡＣＡＴＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴｔｔａａｔ
Ｏｌｉｇｏ７および８は相互に相補的であり、そしてハイブリダイズする場合、ＤＮＡフラグメントがｐＬＤＨＴｃ１３９＃７−９ＷのＰａｃＩおよびＦｓｅＩ部位の間で連結することを可能にする両末端の一本鎖突出部を有する完全長の二本鎖野生型ｌｏｘＰ部位を形成する。Ｏｌｉｇｏ７および８の中の大文字は、完全長のｌｏｘＰ部位に対応する一方、小文字は、二本鎖ＤＮＡフラグメントをｐＬＤＨＴｃ１３９＃７−９ＷのＰａｃＩおよびＦｓｅＩ部位に連結するために使用されるヌクレオチドを示す。
【００９９】
連結反応混合物を使用して、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＤＨ１０Ｂを形質転換して、そして形質転換された細胞を、２０μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含有するＬＢ培地上でプレート化した。ｐＬＤＨＴｃ１３９＃７−９ＷのＰａｃＩおよびＦｓｅＩ部位に正確に挿入された野生型ｌｏｘＰ部位を有するプラスミドを含有するテトラサイクリン耐性形質転換体を、関連領域の制限消化分析、適切なプライマーを使用するコロニーＰＣＲ、およびＤＮＡ配列解析によって同定した。さらなる操作のために選択したプラスミドを、ｐＬＤＨＴｃ１３９＃７−９ＷＷと称し、そしてこの構築物の環状図を図９Ｂに示す。
【０１００】
ｐＬＤＨＳｐ−９ＷＷの構築
ｐＬＤＨＳｐ−９ＷＷはｐＬＤＨＴｃ１３９＃７−９ＷＷと同一であるが、但し、後者の構築物のテトラサイクリン耐性カセットは、スペクチノマイシンに対する耐性を付与するＤＮＡフラグメント（即ち、Ｓｐｅｃr−カセット）で置き換えられた。後者は、テンプレートとしてプラスミドｐＨＰ１５５７８（Ｃａｈｏｏｎ ｅｔ．ａｌ．，２００３に記載）ならびにＰＣＲ増幅のためのプライマー９および１０を使用しＰＣＲによって作製した。ｐＨＰ１５５７８は、そのプロモーターを含むＳｐｅｃr−カセットの完全なヌクレオチド配列を含有し、３’（９）−Ｏ−ヌクレオチジルトランスフェラーゼをコードするトランスポゾンＴｎ７ ａａｄＡ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ０３４０３）の公開された配列に基づく。
【０１０１】
プライマー９（配列番号１２）：
ＡＴＡＡＡＡｇｃｇｇｃｃｇｃＡＧＣＡＣＡＧＧＡＴＧＡ
プライマー１０（配列番号１３）：
ＧＧＣＧｔｔａａｔｔａａＧＧＣＡＧＧＴＣＡＧＣＡＡＧ
プライマー９（順方向プライマー）の下線を付した塩基は、Ｓｐｅｃr−カセットのプロモーターの直ぐ上流（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ０３０４３のｎｔ６〜１７に）ハイブリダイズする一方、小文字は、プライマーの５’末端に付加されたＮｏｔＩ部位に対応する。プライマー１０（逆方向プライマー）の下線を付した塩基は、Ｓｐｅｃr−カセットの終止コドンから約１３０塩基下流（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ０３０４３のｎｔ１００６〜１０１９に）ハイブリダイズする一方、小文字は、プライマーの５’末端に付加されたＰａｃＩ部位に対応する。ＰＣＲにより作製された１０４０ｂｐのＳｐｅｃr−カセットを、ＮｏｔＩおよびＰａｃＩで二重消化し、そして得られたＤＮＡフラグメントをアガロースゲル電気泳動によって精製した。プラスミドｐＬＤＨＴｃ１３９＃７−９ＷＷもまた、同じ２つの制限酵素で切断して、Ｔｃr−カセットを取り出し、そして得られた大きなベクターフラグメントを、アガロースゲル電気泳動によって精製した。次いで、ＰＣＲおよびベクターフラグメントを共に連結し、そしてエレクトロポレーションを使用して、形質転換反応混合物を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ１０Ｂに導入した。形質転換体を、スペクチノマイシン（２００μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢ培地上でプレート化し、そして３７℃で増殖させた。正確なサイズの挿入を有するプラスミドを含有するスペクチノマイシン耐性形質転換体を、ＮｏｔＩおよびＰａｃＩによる制限消化分析によって同定し、そしてさらなる操作のために選択したプラスミドを、ｐＬＤＨＳｐ−９ＷＷと称し；この構築物の環状図を図９Ｃに示す。
【０１０２】
もう１つの計画では、ｐＬＤＨＳｐ−９ＷＷを使用して、宿主経由、二重交差、相同組み換えおよび選択としてスペクチノマイシンに対する増殖を使用し、ＺＷ１のＤ−乳酸デヒドロゲナーゼの遺伝子をノックアウトした。自殺構築物のＳｐｅｃr−カセットにフランキングする２つのＤＮＡフラグメントによって、二重交差事象の標的をｌｄｈ遺伝子に定めた。これらのフラグメントの一方（以降、５’ｌｄｈフランキングＤＮＡと称する）は、Ｓｐｅｃr−カセットの直ぐ上流にあり、そしてＳｂｆＩおよびＡｓｉＳＩ部位の間に局在する。この約１１００ｂｐのＤＮＡフラグメントのヌクレオチド配列は、ｐｇｍ遺伝子の３’末端およびｌｄｈオープンリーディングフレームのはじめのおよそ半分をコードするＺＷ１染色体ＤＮＡと同一である。他方のＤＮＡフラグメント（以降、３’ｌｄｈフランキングＤＮＡと称する）は、ＦｓｅＩおよびＡｓｃＩ部位の間のＳｐｅｃr−カセットの対向末端に局在する。３’ｌｄｈフランキングＤＮＡのヌクレオチド配列（これもまた、約１１００ｂｐである）は、ｌｄｈ遺伝子の他方の半分およびａｄｈＩ遺伝子の５’非翻訳領域の部分をコードする染色体ＤＮＡと同一である。５’および３’ｌｄｈフランキングＤＮＡフラグメントの両方がそれらの染色体対応物と相互作用し、そして相同組み換えを経験する場合、二重交差事象を生じる。本質的に不可逆的であり、そしてもっぱら、宿主の酵素的機構によって仲介されるこの現象は、オープンリーディングフレームの中間に、２つの野生型ｌｏｘＰ部位に隣接するＳｐｅｃr−カセットを挿入することによって、染色体ｌｄｈ遺伝子を不活化する。自殺構築物は、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）において複製することができず、（極めて低い頻度で生じる自然発生性の薬剤耐性変異体とは別の）ｐＬＤＨＳｐ−９ＷＷを有する安定なスペクチノマイシン耐性コロニーを作製するための唯一の方法は、相同組み換えを介する二重交差事象である。
【０１０３】
ｐＨｉｍＡの構築
ｈｉｍＡ遺伝子のノックアウト構築物を作製するために、ｐＬＤＨＳｐ−９ＷＷのｌｄｈフランキングＤＮＡを、ｈｉｍＡフランキングＤＮＡで置き換えて、選択マーカーおよび二重交差事象を染色体ｈｉｍＡ遺伝子に対する標的にした。下記のように、この操作には、４つのＤＮＡフラグメントが必要であった。
【０１０４】
フラグメント１は、プラスミドを、異なる４つの制限酵素：ＮｏｔＩ、ＢｓａＩ、ＳｂｆＩおよびＡｓｃＩで切断することによって、ｐＬＤＨＳｐ−９ＷＷ（図９Ｃ）から誘導した。ＮｏｔＩは、ｐＬＤＨＳｐ−９ＷＷをｎｔ２６４７において切断し、ＢｓａＩは、プラスミドをｎｔ１８１６において切断する。プラスミドＤＮＡを、４つの制限酵素で完全に消化した後、２６６６ｂｐのＳｂｆＩ-ＡｓｃＩのＤＮＡフラグメントを、１％アガロースゲルを使用する電気泳動およびＺｙｍｏｃｌｅａｎ Ｇｅｌ ＤＮＡ Ｒｅｃｏｖｅｒｙ Ｋｉｔ（カタログ番号Ｄ４００１，Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）によって精製した。フラグメント１と命名したこのフラグメントは、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）において機能的ではない大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）複製開始点、および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）においてアンピシリン耐性を付与する遺伝子を含有する。
【０１０５】
フラグメント２もまた、ｐＬＤＨＳｐ−９ＷＷから誘導した。プラスミドを、ＦｓｅＩおよびＡｓｉＳＩによって二重消化し、そして得られた１１０５ｂｐのＦｓｅＩ−ＡｓｉＳＩのＤＮＡフラグメントを、１％アガロースゲルを使用する電気泳動およびフラグメントを一掃するためのＺｙｍｏｃｌｅａｎ Ｇｅｌ ＤＮＡ Ｒｅｃｏｖｅｒｙ Ｋｉｔ（カタログ番号Ｄ４００１，Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）によって精製した。フラグメント２と命名したこのフラグメントは、２つの野生型ｌｏｘＰ部位（各末端に１つ）によってフランキングされるＳｐｅｃr−カセットを含有する。
【０１０６】
フラグメント３は、３’ｈｉｍＡフランキングＤＮＡを含有する。約１．１２Ｋｂｐのフラグメント３を、プライマーＡおよびＢを使用し、ＰＣＲによって作製した。ＰＣＲ増幅のテンプレートは、Ｗｉｚａｒｄ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（カタログ番号Ａ１１２５，Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、ＺＷ６５８（ＡＴＣＣ ＃ＰＴＡ−７８５８）から単離したゲノムＤＮＡであった。
【０１０７】
プライマーＡ（配列番号１４）：
ＣＴＡＣＴＣＡＴｃｃｔｇｃａｇｇＴＴＴＡＡＴＧＡＡＴＧＡＧＣＧＧＡＴＧＣＴＧ
プライマーＢ（配列番号１５）：
ＣＡＴＣＴＴＡＣＴｇｃｇａｔｃｇｃＴＧＡＣＴＴＴＣＣＧＴＧＣＣＡＧＣＣＡＧ
プライマーＡ（順方向プライマー）の下線を付した塩基は、ｈｉｍＡ遺伝子の下流にあるタンパク質のグルタチオンＳ−トランスフェラーゼファミリーの推定メンバーのコーディング領域の中間に位置するＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ゲノム（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＥ００８６９２）のヌクレオチド１１３７１５４〜１１３７１７５にハイブリダイズする（Ｓｅｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３（１），６３−６８（２００５））一方、小文字は、プライマーの５’末端に付加されたＳｂｆＩ部位に対応する。プライマーＢ（逆方向プライマー）の下線を付した塩基は、ｈｉｍＡオープンリーディングフレームの３’末端でＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ゲノムのヌクレオチド１１３８２７６〜１１３８２５７にハイブリダイズする一方、小文字は、プライマーの５’末端に付加されたＡｓｉＳＩ部位に対応する。プライマーＡおよびＢに対する染色体結合部位ならびに作製されるＰＣＲ産物（フラグメント３）を、図１０Ａに示す。ＰＣＲ産物をＳｂｆＩおよびＡｓｉＳＩで消化し、次いで、上記のように、得られた１１２３ｂｐのフラグメントを、アガロースゲル電気泳動によって精製した。
【０１０８】
フラグメント４は、５’ｈｉｍＡフランキングＤＮＡを含有する。約１．１６ｋｂのフラグメント４を、プライマーＣおよびＤを使用し、ＰＣＲによって作製した。ＰＣＲ増幅のテンプレートは、Ｗｉｚａｒｄ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（カタログ番号Ａ１１２５，Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、ＺＷ６５８（ＡＴＣＣ ＃ＰＴＡ−７８５８）から単離したゲノムＤＮＡであった。
【０１０９】
プライマーＣ（配列番号１６）：
ＴＣＡＣＴＣＡＴｇｇｃｃｇｇｃｃＧＧＧＡＴＡＴＣＡＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣＴＣ
プライマーＤ（配列番号１７）：
ＣＡＴＣＴＴＡＣＴｇｇｃｇｃｇｃｃＧＡＴＡＴＧＣＴＧＣＣＴＴＣＣＧＡＡＧＴＧ
プライマーＣ（順方向プライマー）の下線を付した塩基は、ｈｉｍＡオープンリーディングフレームの５’末端でＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ゲノムのヌクレオチド１１３８５１０〜１１３８５３０にハイブリダイズする一方、小文字は、プライマーの５’末端に付加されたＦｓｅＩ部位に対応する。プライマーＤ（逆方向プライマー）の下線を付した塩基は、２成分応答調節因子をおそらくコードする遺伝子の３’末端においてｈｉｍＡ遺伝子より上流のＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ゲノムのヌクレオチド１１３９６６８〜１１３９６４８にハイブリダイズする（Ｓｅｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３（１），６３−６８（２００５））一方、小文字は、プライマーの５’末端に付加されたＡｓｃＩ部位に対応する。プライマーＣおよびＤに対する染色体結合部位ならびに作製されるＰＣＲ産物（フラグメント４）を、図１０Ａに示す。ＰＣＲ産物をＦｓｅＩおよびＡｓｃＩで消化し、そして得られた１１５９ｂｐのフラグメントを、１％アガロースゲルを使用する電気泳動によって精製した。
【０１１０】
次いで、上記の４つのＤＮＡフラグメントを、４方向連結反応に供して、図１０Ｂに示すｈｉｍＡノックアウト構築物、ｐＨｉｍＡを集成した。この反応に使用したフラグメント１〜４のモル比は、約１：１：１：１であった。連結反応混合物のアリコートを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ１０Ｂにエレクトロポレートし、そして形質転換された細胞を、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）およびスペクチノマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢ培地上でプレート化した；プレートを３７℃でインキュベートした。はじめに、正確なサイズの挿入物を有するプラスミドを含有するアンピシリンおよびスペクチノマイシン二重耐性形質転換体を、異なる２つの対のプライマー：プライマーＡ／プライマーＢ、およびプライマーＣ／プライマーＤを使用するコロニーＰＣＲによって同定した。以降、ポジティブのクローンの確認は、ＳｂｆＩおよびＡｓｃＩによるプラスミドＤＮＡの制限消化分析、ならびにＰＣＲポジティブクローン由来のｐＨｉｍＡプラスミドＤＮＡのＤＮＡ配列解析によって行った。
【０１１１】
Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）の形質転換に必要な非メチル化プラスミドＤＮＡを得るために、ｐＨｉｍＡを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＳＣＳ１１０（ｄｃｍ-，ｄａｍ-）に導入し、そして形質転換された細胞を、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）およびスペクチノマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢ培地上にプレート化した；増殖は、３７℃であった。この操作に使用した化学的コンピテント細胞はＳｔｒａｔａｇｅｎｅ（カタログ番号２００２４７）から入手し、そして販売者のプロトコルに従った。ＤＨ１０Ｂのような大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の野生型株から単離されるメチル化プラスミドＤＮＡは、宿主の制限／改変系によって容易に破壊されるため、ＺＭ４から誘導されるＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株の形質転換のための非メチル化プラスミドＤＮＡの使用が、成功に極めて重要であることに留意することは重要である。最後の工程では、プラスミドＤＮＡをＱＩＡＧＥＮ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍａｘｉ Ｋｉｔ（カタログ番号１２１６２）を使用して、ＳＣＳ１１０形質転換体の１つから単離し、そしてＤＮＡの最終濃度は約２μｇ／μｌであった。
【０１１２】
実施例６
ＺＷ８０１−４のｈｉｍＡノックアウト変異体の作製
ＺＷ８０１−４のｈｉｍＡ遺伝子を不活化するために、本質的に米国特許第５，５１４，５８３号明細書に記載のように、エレクトロポレーションを使用して、非メチル化ｐＨｉｍＡプラスミドＤＮＡ（Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）において複製しない）を、ＺＷ８０１−４に導入した。簡単に説明すると、５０μｌの形質転換反応物は、１０％（ｖ／ｖ）グリセロール中の約１０10個の細胞／ｍｌおよび実施例５に記載のように大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＳＳＣ１１０から単離した約０．５μｇの非メチル化プラスミドＤＮＡを含有した。コントロール反応物も全く同様に処置したが、プラスミドＤＮＡを含まなかった。エレクトロポレーターの設定は、１．６ｋｖ／ｃｍ、２００Ω、および２５μＦ、およびキュベットのギャップ幅は０．１ｃｍであった。エレクトロポレーション後、形質転換物を１．０ｍｌのＭＭＧ培地（５０ｇ／Ｌグルコース、１０ｇ／Ｌ酵母抽出物、５ｇ／Ｌのトリプトン、２．５ｇ／Ｌの（ＮＨ4）2ＳＯ4、０．２ｇ／ＬのＫ2ＨＰＯ4、および１ｍＭのＭｇＳ０4）で希釈し、そして細胞を約３時間、３０℃で回復させた。次いで、細胞を、室温で、滅菌した１．５ｍｌ微量遠心管中、遠心分離（１３，０００×ｇ、５分間）によって回収し、そして上清を注意深く取り除いた。細胞ペレットを、２００□ｌの液体ＭＭＧ培地に再懸濁し、そして２５、５０および１００μｌアリコートの細胞懸濁液を、１．５％寒天および２００μｇ／ｍｌのスペクチノマイシンを含有するＭＭＧ培地上でプレート化した。プレートを嫌気チャンバ中、３０℃でインキュベートし、そして４８〜７２時間後、すべての実験プレート上において少なくとも１００個のコロニーが認められた。対照的に、コントロール反応では、１００μｌの細胞懸濁液を加えたプレート上に認められた１個のコロニーが得られたのみであった。以下に記載のさらなる操作のために、ｐＨｉｍＡノックアウト構築物による形質転換から生じたスペクチノマイシン耐性コロニーのうち２個を選択した。
【０１１３】
本発明者らの研究室におけるＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）およびｐＨｉｍＡに類似の自殺構築物による先の実験から、染色体とプラスミドＤＮＡとの間の初期の相互作用は２つのフランキングＤＮＡ配列のうちの１つにおいて生じる一重交差事象であること、および一重交差事象は最終的に二重交差事象を生じることが示されている。二重交差事象への移行は、普通、極めて迅速であり、そして通常、自殺構築物のための選択剤、今回の場合、スペクチノマイシンを含有する液体または固体培地における若干の連続的継代後に生じる。本発明の二重交差事象を容易にし、そして一重および二重交差事象の「混合集団」が得られる可能性を除外するために、上記の２個の一次形質転換体を、２００μｇ／ｍｌのスペクチノマイシンを含有するＭＭＧプレート上にパッチした。３３℃、嫌気条件下での３０時間のインキュベーション期間後、同じ増殖培地を含有する新鮮寒天プレートに細胞を画線することによって、両方のパッチから単一のコロニーを単離した。３３℃、嫌気条件下での３０時間のインキュベーション期間後、本来の一次形質転換体にそれぞれ由来する１個のコロニーを、スペクチノマイシン（２００μｇ／ｍｌ）を含有する新鮮ＭＭＧプレート上にパッチし、そして下記のように、これらの２つの株をさらに特徴付けた。
【０１１４】
二重交差事象が生じたこと、および単離された各株が細胞の均一集団からなることを、プライマーの３つの異なる対を使用するコロニーＰＣＲ実験により確認した。自殺構築物における５’ｈｉｍＡフランキングＤＮＡがその染色体対応物との一重交差事象を経験した場合、プライマー、ＧＴＴＣＴＧＣＧＣＣＴＧＴＴＡＴＴＣＴＧ（配列番号１８）およびＣＴＡＣＣＴＣＴＧＡＴＡＧＴＴＧＡＧＴＣＧ（配列番号１９）の第１の対は、正確なサイズのＰＣＲ産物のみを作製することができた。同様に、自殺構築物における３’ｈｉｍＡフランキングＤＮＡがその染色体対応物との一重交差事象を経験した場合、プライマー、ＧＡＴＡＴＴＣＣＡＧＴＧＣＴＧＡＴＣＧＡＣ（配列番号２０）およびＣＴＡＣＧＴＧＡＡＡＧＧＣＧＡＧＡＴＣＡＣ（配列番号２１）の第２の対は、正確なサイズのＰＣＲ産物のみを作製することができた。最後に、二重交差事象が正確な座位で生じた場合、プライマー、ＧＡＴＣＡＧＧＴＡＧＧＴＧＴＧＣＴＣＴＡ（配列番号２２）およびＧＣＡＴＣＡＧＡＧＡＧＣＡＴＡＣＴＧＣＴ（配列番号２３）の第３の対は、正確なサイズのＰＣＲ産物のみを作製することができた。プライマーのこの対もまた、それらがまた混入物として存在する場合、ｈｉｍＡ遺伝子の微量の破壊されていないコピーおよび／または一重交差事象を検出することが可能であった。試験したｈｉｍＡノックアウト変異体の両方とも、異なる３つの組のプライマーで予想される結果を生じ、そして識別不能であるように思われたため、それらのうちのただ１つを、さらなる特徴付けのために選択した。以下、この株を「Ｚ８０１−４：：ΔｈｉｍＡ」と称する。
【０１１５】
実施例７
ｈｉｍＡ遺伝子の不活化は、それ自体単独でＡｃＲ＃３の表現型を担う
ｐＨ制御されたバイオリアクターを使用した１００％ＭＨにおけるＺＷ８０１−４とＺＷ８０１−４：：ΔｈｉｍＡとの並列比較を図１１に示す。種培養物を、３０℃で、ＳＭ培地において、約４．４のＯＤ600まで増殖させ、そしてバイオリアクターを、１０％播種物で開始した。最終的な１５０ｍｌの培養物は、１００％ＭＨ＋１１０ｇ／Ｌグルコースおよび９０ｇ／Ｌキシロースを含有した。撹拌を１５０ｒｐｍに設定し、そしてｐＨおよび温度は、それぞれ、５．８および３３℃で維持した。様々な時間において、実施例２に記載の手順を使用して、発酵ブロスのＨＰＬＣ分析のためにバイオリアクターからアリコートを取り出した。これらは、図８および表２に示すＡｃＲ＃３およびＺＷ８０１−４による実験に使用したのと正確に同じ実験条件であることに有意すること（実施例４）。
【０１１６】
図１１に示される結果は、ＺＷ８０１−４：：ΔｈｉｍＡ（図１１Ｂ）が、１００％ＭＨにおいてＺＷ８０１−４よりかなり良好な性能を示したことを示す（図１１Ａ）。４８時間までに、それは、増殖培地中のすべてのグルコースおよびキシロースを使用し、そして約９０ｇ／Ｌのエタノールを作製した。対照的に、親株、ＺＷ８０１−４は、すべての糖を使用したわけではなく、実験の終了時に発酵ブロスにおいてなお約１７ｇ／Ｌの残留キシロースが認められた。ＺＷ８０１−４の最終エタノール力価もまた、有意に低かった（８１ｇ／Ｌ）。それ故、同じ実験場を使用して、ＡｃＲ＃３によって得られた結果と実質的に同一なプロセス関連条件下で、ｈｉｍＡ遺伝子の不活化により、エタノール産生が約１０％増加した。これらの結果は、ＡｃＲ＃３およびＺＷ８０１−４：：ΔｈｉｍＡが等価な株であることを強く示唆するが、並列実験でそれらの性能を試験することは重要であった。１００％ＭＨもまた、この比較に使用したが、両方の株とも、初期の実験において、すべての糖を使用することが可能であったため、グルコースおよびキシロースの初期濃度は、両方とも約１０％増加した。
【０１１７】
種培養物を、３０℃で、ＳＭ培地において、４．５のＯＤ600まで増殖させ、そしてバイオリアクターを、１０％播種物で開始した。最終的な１５０ｍｌの培養物は、１００％ＭＨ＋１１８ｇ／Ｌグルコースおよび９８ｇ／Ｌキシロースを含有した。撹拌を１５０ｒｐｍに設定し、そしてｐＨおよび温度は、それぞれ、５．８および３３℃で維持した。様々な時間において、実施例２に記載の手順を使用して、発酵ブロスのＨＰＬＣ分析のためにバイオリアクターからアリコートを取り出した。両方の株に対するグルコース、キシロース、アセテート、エタノールおよびバイオマス産生（ＯＤ600）の最終値を、表３に示す。
【０１１８】
表３．高糖の１００％Ｍｏｃｋ Ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅにおいて増殖したＺＷ８０１−４：：ΔｈｉｍＡおよびＡｃＲ＃３株を伴うｐＨ制御された発酵槽におけるグルコース、キシロース、エタノール、およびアセテートのエンドポイント値。
【０１１９】
この実験の結果は、ＺＷ８０１−４：：ΔｈｉｍＡおよびＡｃＲ＃３の両方とも、試験系において同一に挙動するため、ｈｉｍＡ遺伝子不活化が、それ自体単独で発酵性能の改善を担うことを実証する。これらの２つの株はまた、図５に示す実験に使用した同じ条件を使用して、酢酸耐性についてそれらを試験した場合（図１２）、識別不能であった。明らかに、ＡｃＲ＃３のｈｉｍＡ遺伝子へのＰｇａｐプロモーターの組み込み、およびこの株に施される変異体富化プロセスの延長は、所望のｈｉｍＡ表現型にほとんどまたは全く影響を及ぼさない。
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２００７年１０月３０日に出願された米国仮特許出願第６０／９８３７６１号明細書（本明細書において参照により援用される）の利益を主張する。
【０００２】
政府の権利についての陳述
本発明は、エネルギー省から授与された契約番号０４−０３−ＣＡ−７０２２４，および米国エネルギー省とＡｌｌｉａｎｃｅ ｆｏｒ Ｓｕｓｔａｉｎａｂｌｅ Ｅｎｅｒｇｙ，ＬＬＣ（国立再生可能エネルギー研究所の管理運営者）との間の契約番号ＤＥ−ＡＣ３６−０８ＧＯ２８３０８に基づく米国政府の援助により行われた。米国政府は、本発明において所定の権利を有する。
【０００３】
本発明は、微生物学および遺伝子操作の分野に関する。さらに具体的には、組み込み宿主因子のαサブユニットをコードするｈｉｍＡ遺伝子が、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）の酢酸耐性に関与することを見出した。アセテートの存在下で改善されたエタノール産生を示すｈｉｍＡ遺伝子の遺伝子改変を有するキシロース資化性ザイモモナスの株を開発した。
【背景技術】
【０００４】
微生物によるエタノールの産生は、化石燃料に代わるエネルギー源を提供し、従って、現在の重要な研究の分野である。ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）は、グルコース、フルクトース、およびスクロース上で増殖する細菌性エタノロジェンであり、これらの糖を、エントナー−ドウデロフ（Ｅｎｔｎｅｒ−Ｄｏｕｄｅｒｏｆｆ）経路を介してＣＯ2およびエタノールに代謝する。
【０００５】
エタノール産生のための発酵に使用する多量に利用可能な低コストの炭素基質を提供することができる加水分解されたリグノセルロース系バイオマスを使用することが望ましい。キシロースは、加水分解されたリグノセルロース材料における主要ペントースである。Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）の野生型株は、キシロースを炭素源として使用することができないが、この糖上で増殖することが可能の組み換え株が操作されている（米国特許第５５１４５８３号明細書、米国特許第５７１２１３３号明細書、国際公開第９５／２８４７６号パンフレット、Ｆｅｌｄｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ３８：３５４−３６１、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ２６７：２４０−２４３）。これらの株が、キシロース代謝に必要な４つの酵素：１）キシロースからキシルロースへの変換を触媒するキシロースイソメラーゼ；２）キシルロースをリン酸化して、キシルロース５−リン酸を形成させるキシルロキナーゼ；３）トランスケトラーゼ；および４）トランスアルドラーゼの発現のために改変されている（米国特許第５５１４５８３号明細書、米国特許第６５６６１０７号明細書；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ２６７：２４０−２４３）。これらの４つの酵素および細胞の通常の代謝機構を備えることで、３分子のキシロースが、２分子のグルコース６−リン酸および１分子のグリセルアルデヒド３−リン酸に変換され、続いて、これらは、経路のグルコース側においてエタノールおよびＣＯ2に変換される（図１）。
【０００６】
キシロース代謝を対象にＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株を操作することに成功はしているが、この株は、キシロース上では、グルコースほど良好に増殖せず、そしてエタノールを産生しない。理想的な環境下であっても、キシロース代謝は、グルコース代謝より３〜４倍緩徐であり（Ｌａｗｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８４−８６：２７７−２９３）、そして悪条件下では、その差異がかなり大きくなる。炭素フラックスが緩徐であるため、ＡＴＰの定常状態レベルもまた、キシロース上での増殖ではより低く（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ６６（１）：１８６−１９３）、そして結果として、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）がこの糖上で増殖する場合、ストレスおよびインヒビターに対してかなり高い感受性を示す（Ｊｏａｃｈｉｍｓｔｈａｌ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８４−８６：３４３−３５６；Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８４−６：３５７−３７０）。加水分解されたリグノセルロース系バイオマスを発酵に使用する際に遭遇する特定のストレスは、アセテートの存在であり（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８４−８６：３５７−３７０）、これは、ヘミセルロース中のアセチル化キシロース残基から、前処置および糖化プロセス中に放出される。
【０００７】
Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）がアセテートおよび他の有機酸に関連するストレスに対処する機構については、未だ解明されておらず、そしてこのプロセスにおいて役割を果たす遺伝子に関する文献での報告はない。従って、アセテートに対してより高い耐性を有する株を遺伝子操作するための合理的な設計を使用することは、現在のところ選択肢に含まれていない。一方、アセテートに対してより大きな耐性を有するＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）変異体の記載がある（Ｊｏａｃｈｉｍｓｔｈａｌ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．２０（２）：１３７−１４２；Ｊｅｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．２４：８１９−８２４；米国特許出願公開第２００３０１６２２７１号明細書）。ニトロソグアジニン（ＮＴＧ）による無作為な化学的変異誘発後の選択を使用して、これらの変異体が作製されたが、酢酸耐性表現型を担う改変された遺伝子は、これらの場合のいずれとも同一ではなかった。また、アセテートの存在下におけるより良好な発酵性能には、１つの変異が必要であるのか、または複数の変異が必要であるのかについても決定されなかった。それ故、現在のところ、上記で引用した研究では、標的を定めた遺伝子操作を使用して、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）の他の株に酢酸耐性を付与する方法については見出されていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
エタノールを産生させるため、前処置および糖化されたリグノセルロース系バイオマスから生成される加水分解物の発酵のために、ザイモモナスの酢酸耐性株を生じるように改変することができる酢酸耐性に関与する遺伝子を同定する必要性がある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、アセテートの存在下で改善された性能を有するキシロース資化性ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）の株を使用してエタノールを産生させることに関する。本出願人らは、酢酸耐性が、組み込み宿主因子のαサブユニットをコードするｈｉｍＡ遺伝子の影響を受けることを発見した。グルコースとキシロースとの濃縮混合物中において、アセテートの存在を伴って培養する場合、ｈｉｍＡ遺伝子の遺伝子改変を有するキシロース資化性ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）の酢酸耐性が増加する。ｈｉｍＡを改変することにより、内因性ｈｉｍＡ遺伝子の発現が減少する。これらの条件下では、正常なｈｉｍＡ遺伝子発現を有する比較可能な株より、改変されたｈｉｍＡ株の方が、キシロース資化およびエタノール産生が有意に高い。
【００１０】
従って、本発明は、キシロースを含む混合糖培地からエタノールを産生する方法であって：
（ａ）キシロースを資化して、エタノールを産生することが可能な組み換えザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株を提供する工程であって、前記株は、組み込み宿主因子αサブユニットタンパク質（ＨｉｍＡ）の発現を減少させる少なくとも１つの遺伝子改変を含む工程と；
（ｂ）キシロースを含む混合糖類培地において（ａ）の株を培養する工程であって、それによって、キシロースは、前記株によってエタノールを産生するための炭素源として使用される工程と、
を含む方法を提供する。
【００１１】
図面の簡単な説明および配列表の説明
本発明は、以下の詳細な説明、図面、および本出願の一部をなす添付の配列の説明からさらに詳細に理解することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】キシロース資化のためにＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）を操作するために使用されている４つの酵素（枠内）およびキシロースを使用するエタノール産生の生化学的経路の図を示す。
【図２】ＺＷ８０１−４におけるトランスポゾン挿入ライブラリーを作製するために使用したプラスミドのプラスミド地図ｐＭＯＤｇａｐ／ａａｄａを示す。
【図３】２つの異なる量のアセテートを有するグルコースとキシロースとの濃縮混合物におけるＺＷ８０１−４の増殖のグラフを示す。
【図４】１００ｇ／Ｌグルコース、９０ｇ／Ｌキシロースおよび６ｇ／Ｌアセテート（Ａ）を有するか、または１０５ｇ／Ｌグルコース、１００ｇ／Ｌキシロース、および９ｇ／Ｌアセテート（Ｂ）を有する培地における、コントロール株、ＺＷ８０１−４と比較した、富化されたトランスポゾン挿入変異体ライブラリーの培養でのグルコース資化、キシロース資化、およびエタノール産生のグラフを示す。
【図５】異なる量の酢酸カリウムを有する、ＺＷ８０１−４（Ａ）およびトランスポゾン挿入変異、ＡｃＲ＃３（Ｂ）のグルコース含有培地における増殖のグラフを示す。
【図６】異なるアセテートを有する、ＺＷ８０１−４（Ａ）およびトランスポゾン挿入変異、ＡｃＲ＃３（Ｂ）の４３時間でのグルコース含有培地における増殖のエンドポイント値のグラフを示す。
【図７】１０５ｇ／Ｌグルコース、１００ｇ／Ｌキシロース、および９ｇ／Ｌアセテートを有する培地におけるＡｃＲ＃３ならびにＺＷ８０１−４のグルコース資化、キシロース資化、およびエタノール産生のグラフを示す。
【図８】１１０ｇ／Ｌグルコースおよび９０ｇ／Ｌキシロースを有する、約９．５ｇ／Ｌのアセテートおよび１９０ｍＭアンモニウムイオンを含有する１００％Ｍｏｃｋ Ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ培地におけるＺＷ８０１−４（Ａ）およびＡｃＲ＃３（Ｂ）のグルコース資化、キシロース資化、およびエタノール産生のグラフを示す。
【図９】ｈｉｍＡ遺伝子ノックアウトベクターｐＬＤＨＴｃ１３９＃７（Ａ）、ｐＬＤＨＴｃ１３９＃７−９ＷＷ（Ｂ）、およびｐＬＤＨＳｐ−９ＷＷ（Ｃ）の構築中に作製されたプラスミドのマップを示す。
【図１０】図１０ＡはｈｉｍＡ自殺ベクター、ｐＨｉｍＡへの挿入のためのｈｉｍＡフランキングＤＮＡを調製するために使用したプライマーの遺伝子の位置を示し、そしてｐＨｉｍＡプラスミドの環状マップを図１０Ｂに示す。
【図１１】１１０ｇ／Ｌグルコースおよび９０ｇ／Ｌキシロースを有する、約９．５ｇ／Ｌのアセテートおよび１９０ｍＭアンモニウムイオンを含有する１００％Ｍｏｃｋ Ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ培地におけるＺＷ８０１−４（Ａ）およびＺＷ８０１−４：：ΔｈｉｍＡ（Ｂ）のグルコース資化、キシロース資化、およびエタノール産生のグラフを示す。
【図１２】カリウム塩として添加された０または８ｇ／Ｌのアセテートを有する、ＺＷ８０１−４（Ａ）、ＡｃＲ＃３（Ｂ）、およびＺＷ８０１−４：：ΔｈｉｍＡ（Ｃ）のグルコース含有培地における増殖のグラフを示す。
【００１３】
本発明は、以下の詳細な説明、および本出願の一部をなす添付の配列の説明からさらに詳細に理解することができる。
【００１４】
以下の配列は、米国特許法施行規則第１．８２１〜１．８２５条（「ヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列の開示を含む特許出願の要件−配列規則」）に従い、そして世界知的所有権機関（ＷＩＰＯ）標準ＳＴ．２５（１９９８年）ならびにＥＰＯおよびＰＣＴの配列表の要件（規則５．２および４９．５（ａの２）、ならびに実施細則第２０８号および付属書Ｃ）に一致する。ヌクレオチドおよびアミノ酸の配列データに使用した記号および形式は米国特許法施行規則第１．８２２条に記載の規則に従う。
【００１５】
配列表は、コンパクトディスクによって提供される。配列表を含むコンパクトディスクの内容は、米国特許法施行規則第１．５２条第（ｅ）項に応従して、参照により本明細書に援用される。コンパクトディスクは、２枚提出され、これらは相互に同一である。ディスクには、「Ｃｏｐｙ１−Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｌｉｓｔｉｎｇ」および「Ｃｏｐｙ２Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｌｉｓｔｉｎｇ」のラベルが付されている。ディスクは、次のファイル：「ＣＬ４０４１ｓｅｑ ｌｉｓｔ．ＳＴ２５」を含有する。
【００１６】
配列番号１は、ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）ｈｉｍＡコーディング領域のヌクレオチド配列である。
配列番号２および３は、トランスポゾン挿入部位を配列決定するためのプライマーのヌクレオチド配列である。
配列番号４および５は、ｌｄｈ遺伝子およびいくつかの周囲のＤＮＡを含有するＤＮＡフラグメントのＰＣＲ増幅のためのプライマーのヌクレオチド配列である。
配列番号６および７は、ｐＡＣＹ１８４由来のテトラサイクリン耐性カセットを含有するＤＮＡフラグメントのＰＣＲ増幅のためのプライマーのヌクレオチド配列である。
配列番号８および９は、プラスミドｐＬＤＨＴｃ１３９＃７への挿入のためのｌｏｘＰ部位を調製するために使用されるｏｌｉｇｏのヌクレオチド配列である。
配列番号１０および１１は、プラスミドｐＬＤＨＴｃ１３９＃７−９Ｗへの挿入のためのｌｏｘＰ部位を調製するために使用されるｏｌｉｇｏのヌクレオチド配列である。
配列番号１２および１３は、プラスミドｐＨＰ１５５７８由来のスペクチノマイシン耐性カセットを含有するＤＮＡフラグメントのＰＣＲ増幅のためのプライマーのヌクレオチド配列である。
配列番号１４および１５は、３’ｈｉｍＡフランキングＤＮＡフラグメントのＰＣＲ増幅のためのプライマーのヌクレオチド配列である。
配列番号１６および１７は、５’ｈｉｍＡフランキングＤＮＡフラグメントのＰＣＲ増幅のためのプライマーのヌクレオチド配列である。
配列番号１８および１９は、ｐＨｉｍＡ中の５’ｈｉｍＡフランキングＤＮＡとその染色体対応物との間に生じた一重交差事象を確認するために使用されたＰＣＲプライマーのヌクレオチド配列である。
配列番号２０および２１は、ｐＨｉｍＡ中の３’ｈｉｍＡフランキングＤＮＡとその染色体対応物との間に生じた一重交差事象を確認するために使用されたＰＣＲプライマーのヌクレオチド配列である。
配列番号２２および２３は、ｐＨｉｍＡ中の５’および３’ｈｉｍＡフランキングＤＮＡ配列とその染色体中のｈｉｍＡ遺伝子との間に生じた二重交差事象を確認するために使用されたＰＣＲプライマーのヌクレオチド配列である。
配列番号２４は、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）のＧＦＯＲコーディング領域の完全ヌクレオチド配列である。
配列番号２５は、ＺＷ８０１−４における破壊されたＧＦＯＲコーディング領域の完全なヌクレオチド配列（本来の開始コドンから本来の終止コドンまで）である。
配列番号２６は、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ＨｉｍＡタンパク質のアミノ酸配列である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本開示物は、例えば、グルコース、キシロースのような糖類の混合物およびアセテートを含む培地においてキシロース資化性組み換えザイモモナス株を培養する工程を含むエタノールを産生する方法について説明しており；ここで、前記株は、前記株の内因性ｈｉｍＡ遺伝子に対する改変を含む。ｈｉｍＡ遺伝子を改変することにより、遺伝子の発現が減少し、そして本明細書に記載の培地において培養した場合、ｈｉｍＡが改変されたザイモモナス株の性能が改善される。ｈｉｍＡが改変されたザイモモナス株によって産生されるエタノールは、化石燃料に対する代替エネルギー源として使用してもよい。
【００１８】
明細書および請求の範囲の解釈ために、以下の略語および定義が使用される。
【００１９】
「組み込み宿主因子」は、ＩＨＦと略称する。
【００２０】
「遺伝子」は、コード配列の前（５’非コード配列）および後（３’非コード配列）に調節配列を含み得る特定のタンパク質を発現する核酸フラグメントを指す。「生来の遺伝子」または「野生型遺伝子」は、それ自体の調節配列と共に天然に見出されるような遺伝子を指す。「キメラ遺伝子」は、天然には一緒に見出されない調節およびコード配列を含む、生来の遺伝子ではない任意の遺伝子を指す。従って、キメラ遺伝子は、異なる起源に由来する調節配列およびコード配列、または同じ起源に由来するが、しかし天然に見出されるものとは異なる様式で配列される調節配列およびコード配列を含むことができる。「内因性遺伝子」は、生物体のゲノム内の天然の位置にある生来の遺伝子を指す。「外来」遺伝子は、宿主生物体内に通常は見出されない遺伝子を指すが、しかしこれは遺伝子導入により宿主生物体内に導入される。外来遺伝子は、非生来の生物体内に挿入された生来の遺伝子、またはキメラ遺伝子を含むことができる。
【００２１】
用語「遺伝子構築物」は、１つ以上の特定のタンパク質の発現をコードする核酸フラグメントを指す。遺伝子構築物において、遺伝子は、生来、キメラ、または自然にはない外来性のものであってもよい。典型的に、遺伝子構築物は、「コード配列」を含む。「コード配列」は、特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を指す。
【００２２】
「プロモーター」または「開始制御領域」は、コード配列または機能的ＲＮＡの発現を制御することが可能なＤＮＡ配列を指す。一般に、コード配列は、プロモーター配列の３’側に局在する。プロモーターは、そのままの形で生来の遺伝子から誘導することができるか、または天然に見出される多様なプロモーターから誘導される多様なエレメントからなるか、またはなお、合成ＤＮＡセグメントを含み得る。当業者であれば、多様なプロモーターは多様な組織もしくは細胞タイプ、または多様な発生段階において、あるいは多様な環境条件に応答して、遺伝子の発現を指令することができることを理解している。ほとんどの時期におけるほとんどの細胞タイプにおいて遺伝子を発現させるプロモーターを、通常、「構成性プロモーター」と呼ぶ。
【００２３】
本明細書において使用する用語「発現」は、遺伝子に由来するセンス（ｍＲＮＡ）またはアンチセンスＲＮＡの転写および安定な蓄積を指す。発現はまた、ｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳を指すことができる。「アンチセンス阻害」は、標的タンパク質の発現を抑制することが可能であるアンチセンスＲＮＡ転写物の産生を指す。「過剰発現」は、通常の産生レベルを超えるトランスジェニック生物体または非形質転換生物体における遺伝子産物の産生を指す。「共抑制」は、同一または実質的に類似する外来または内因性遺伝子の発現を抑制することが可能であるセンスＲＮＡ転写物または断片の産生を指す（米国特許第５，２３１，０２０号明細書）。
【００２４】
本明細書において使用する「メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）」は、イントロンを含まず、かつ細胞によってタンパク質に翻訳され得るＲＮＡを指す。
【００２５】
本明細書において使用する用語「非機能性遺伝子」は、コードされるタンパク質を、遺伝子が内因性である野生型株において通常発現されるようには発現しない遺伝子を指す。非機能性遺伝子の発現は、転写、ＲＮＡプロセシング、または翻訳のような任意のレベルで破壊され得る。非機能性遺伝子では、典型的に、コードされるタンパク質の発現がほとんど認められないか、または全く認められない。しかし、それはまた、野生型タンパク質より低い酵素活性を有する改変されたタンパク質をコードし得る。
【００２６】
本明細書において使用する「形質転換」は、遺伝的に安定に遺伝する核酸フラグメントの宿主生物体への伝達を指す。伝達された核酸は、宿主細胞において維持されるプラスミドの形態であってもよく、またはある伝達された核酸を、宿主細胞のゲノムに組込んでもよい。形質転換された核酸フラグメントを含有する宿主生物体を、「トランスジェニック」または「組み換え」または「形質転換された」生物体と呼ぶ。
【００２７】
本明細書において使用する用語「プラスミド」および「ベクター」は、しばしば細胞の中心的代謝の部分ではない遺伝子を担持する染色体外エレメントを指し、通常は、環状二本鎖ＤＮＡ分子の形態である。そのようなエレメントは、任意の起源に由来する一本鎖または二本鎖ＤＮＡあるいはＲＮＡの自律的反復配列、ゲノム組込み配列、ファージもしくはヌクレオチド配列で、線状あるいは環状であってもよく、ここで、プロモーターフラグメントおよび適切な３’非翻訳配列を有する選択された遺伝子産物に対するＤＮＡ配列を細胞に導入することが可能である独特な構築物に、多くのヌクレオチド配列が接続または組み換えられている。
【００２８】
用語「作動可能に連結される」は、一方の機能が他方によって影響されるような、単一の核酸フラグメントに対する核酸配列の会合を指す。例えば、プロモーターは、それがコード配列の発現に影響を及ぼすことが可能である場合、コード配列に作動可能に連結される（即ち、コード配列はプロモーターの転写制御下にある）。コード配列は、センスまたはアンチセンス配向で調節配列に作動可能に連結され得る。
【００２９】
用語「選択マーカー」は、同定因子、通常、マーカー遺伝子の効果、即ち、抗生物質に対する耐性に基づいて選択することが可能な抗生物質または化学耐性遺伝子を意味し、ここで、効果は、目的の核酸の遺伝を追跡する、および／または目的の核酸を受け継いでいる細胞もしくは生物体を同定するために使用される。
【００３０】
用語「高濃度の混合糖類」は、キシロース資化性ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）の増殖の阻害を生じる培地中の全糖濃度を指す。これは、典型的に、全体の糖濃度が約１００ｇ／Ｌを超える場合に生じ、そして影響の激しさは、糖の濃度が高いほど大きい。しかし、増殖阻害が生じ始める正確な糖濃度は、培地中の他の成分に高度に依存する。
【００３１】
用語「発酵可能な糖」は、発酵プロセスにおいて、微生物により炭素源として使用することができるオリゴ糖および単糖類を指す。
【００３２】
用語「リグノセルロース系」は、リグニンおよびセルロースの両方を含む組成物を指す。リグノセルロース系材料もまた、ヘミセルロースを含み得る。
【００３３】
用語「セルロース系」は、セルロース、およびヘミセルロースを含むさらなる成分を含む組成物を指す。
【００３４】
用語「糖化」は、多糖類からの発酵可能な糖類の生成を指す。
【００３５】
用語「前処置されたバイオマス」は、糖化前の前処置に供されているバイオマスを意味する。
【００３６】
「バイオマス」は、任意のセルロース系またはリグノセルロース系材料を指し、そしてセルロースを含み、そして場合により、ヘミセルロース、リグニン、デンプン、多糖、オリゴ糖類および／または単糖類をさらに含む材料を含む。バイオマスはまた、タンパク質および／または脂質のようなさらなる成分を含み得る。バイオマスは、単一の供給源から誘導されてもよく、またはバイオマスは、２つ以上の供給源から誘導される混合物を含み得る；例えば、バイオマスは、トウモロコシ穂軸およびコーンストーバまたは繊維の混合物、または草および葉の混合物を含み得る。バイオマスとして、バイオエネルギー作物、農業残渣、一般廃棄物、産業廃棄物、製紙スラッジ、庭ごみ、木材および林業廃棄物が挙げられるが、これらに限定されない。バイオマスの例として、トウモロコシ穀粒、トウモロコシ穂軸、穀物残渣、例えば、トウモロコシ皮、コーンストーバ、トウモロコシ繊維、草、コムギ、コムギわら、オオムギ、オオムギわら、乾草、イネわら、スイッチグラス、廃紙、サトウキビバガス、モロコシ、ダイズ、穀粒、木、枝、根、葉、木材チップ、おがくず、低木および潅木の粉砕から得られる成分、野菜、果物、花および動物性肥料が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３７】
「バイオマス加水分解物」は、バイオマスの糖化から生じる産物を指す。バイオマスはまた、糖化の前に前処置してもよい。
【００３８】
ここで使用した標準的な組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は当該技術分野において周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９（以後、「Ｍａｎｉａｔｉｓ」）；ならびにＳｉｌｈａｖｙ，Ｔ．Ｊ．，Ｂｅｎｎａｎ，Ｍ．Ｌ．ａｎｄ Ｅｎｑｕｉｓｔ，Ｌ．Ｗ． Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｇｅｎｅ Ｆｕｓｉｏｎｓ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８４；ならびにＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅにより出版、１９８７に記載されている。
【００３９】
本発明は、アセテートの存在下で改善された性能を有するキシロース資化性ザイモモナスの操作された株に関する。アセテートは、発酵中に存在する場合、ザイモモナスの増殖およびエタノール産生を減少させるインヒビターである。アセテートは、ザイモモナスにおける代謝副産物であり、そしてまた、前処置および糖化されたバイオマスの成分である。従って、発酵のためにバイオマス由来の糖類を使用する際の課題は、改善されたエタノール産生のための生体触媒に対するアセテートの阻害効果を克服することである。発酵培地がアセテートを含む場合、キシロース資化性Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）における内因性ｈｉｍＡ遺伝子の破壊を操作すると、キシロース資化およびエタノール産生を含む発酵性能が改善されることを本明細書において示す。さらに、本発明は、エタノールを産生する方法に関し、ここで、本ザイモモナス株は、キシロースを含む培地において培養される。
【００４０】
キシロース資化性ザイモモナス宿主株
キシロースを炭素源として資化することが可能である、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株を含むザイモモナスの任意の株を、本発明に使用する株を調製するための宿主として使用してもよい。エタノールへのキシロースの発酵のために操作されているザイモモナスの株が特に有用である。内因性遺伝子は、代謝経路の部分を提供してもよく、またはキシロース代謝に有用な酵素活性を有するタンパク質を提供するための任意の既知の遺伝子操作技術によって改変されてもよい。例えば、内因性トランスケトラーゼは、キシロース資化経路を作製するときに他の誘導された酵素活性を補い得る。典型的に、米国特許第５５１４５８３号明細書（参照により本明細書に援用される）に記載のように、キシロース代謝（図１）に関与する４つの酵素の発現のために、４つの遺伝子がＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）に導入されている。これらは、キシロースからキシルロースへの変換を触媒するキシロースイソメラーゼ、およびキシルロースをリン酸化して、キシルロース５−リン酸を形成させるキシルロキナーゼをコードする遺伝子を含む。さらに、トランスケトラーゼおよびトランスアルドラーゼ、ペントースリン酸経路の２つの酵素は、キシルロース５−リン酸を、キシロースからエタノールへの代謝を可能にする解糖系のエントナー−ドウドレフ（Ｅｎｔｎｅｒ−Ｄｏｕｄｅｒｏｆｆ）経路にペントース代謝を結合する中間体（フルクトース６−リン酸およびグリセルアルデヒド３−リン酸）に変換する。これらの酵素をコードするＤＮＡ配列は、腸内細菌、ならびにいくつかの酵母および真菌のようなキシロースを代謝することが可能である多数の微生物のいずれかから入手してもよい。コーディング領域の供給源として、ザントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、ロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）、フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、アセトバクター（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、グルコノバクター（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ）、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄｓ）、およびザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）が挙げられる。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のコーディング領域が特に有用である。
【００４１】
コードＤＮＡ配列は、ザイモモナスグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼのプロモーター（ＧＡＰプロモーター）、およびザイモモナスエノラーゼのプロモーター（ＥＮＯプロモーター）のようなザイモモナス細胞において発現されるプロモーターに作動可能に連結される。コーディング領域は、プロモーターから個々に発現されてもよく、または２つ以上のコーディング領域が、同じプロモーターからの発現を伴う１つのオペロン内で接続されていてもよい。得られるキメラ遺伝子は、ザイモモナスに導入し、そしてプラスミド上で維持してもよく、または例えば、相同組み換え、部位特異的組込み、もしくはランダム組込みを使用して、ゲノムに組込んでもよい。特に有用なキシロース資化株として、ＣＰ４（ｐＺＢ５）（米国特許第５５１４５８３号明細書）、ＡＴＣＣ３１８２１／ｐＺＢ５（米国特許第６５６６１０７号明細書）、８ｂ（米国特許出願公開第２００３／０１６２２７１号明細書；Ｍｏｈａｇｈｅｇｈｉ ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．２５；３２１−３２５）、およびＺＷ６５８（ＡＴＴＣＣ番号ＰＴＡ−７８５８）が挙げられる。
【００４２】
通常使用しないキシロース以外の糖類を資化するためにさらに操作されるザイモモナス株もまた、本方法に使用してもよい。例としては、米国特許第５８４３７６０号明細書（参照により本明細書に援用される）に記載のアラビノース資化のためにさらに操作されたＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）の株がある。
【００４３】
所望されない副産物キシリトールの産生の減少のためにさらに操作されるザイモモナス株もまた、使用してもよい。これらの株については、共有および同時係属中の米国特許出願第１１／８６２５６６号明細書ならびに係属中の米国特許出願公開第２００８／０１８７９７３Ａ１号明細書（参照により本明細書に援用される）に記載されている。記載の株ＺＷ８００、ＺＷ８０１−４、およびＺＷ８０１−６は、グルコース−フルクトースオキシドレダクターゼ（ＧＦＯＲ）をコードする破壊された遺伝子を有する。ＧＦＯＲ遺伝子の発現の破壊は、ｈｉｍＡ遺伝子を破壊するための以下に記載の同じ方法を使用し、ＧＦＯＲコーディング領域の既知の配列（配列番号２４）を使用して、達成してもよい。ＧＦＯＲコーディング配列の周囲のＤＮＡ配列はまた、いくつかの改変手順において有用であり、そして完全なゲノム配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＥ００８６９２）の形でザイモモナスに利用可能である。ＧＦＯＲの発現が減少すると、キシリトール産生が減少し、そしてエタノール産生が増強されることを見出した。
【００４４】
ｈｉｍＡが酢酸耐性に関与することの発見
ザイモモナスの増殖および産生性に対するアセテートの阻害効果の機構の基礎は、合理的に、良好に理解されている（Ｌａｗｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３９−４０：６８７−６９９；Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８４−８６：３５７−３７０）が、酢酸耐性において役割を果たす遺伝子は、この微生物では同定されていない。本出願人らは、驚くべきことに、ｈｉｍＡ遺伝子の遺伝子操作技術により、阻害濃度のアセテートの存在下でザイモモナスがより良好に挙動することが可能になることを見出した。具体的には、本出願人らは、ザイモモナスｈｉｍＡ遺伝子を破壊することにより、アセテート含有培地における増殖およびエタノール産生が改善されることを見出した。本明細書において実施例１および２に記載の酢酸耐性におけるｈｉｍＡの役割を発見するために使用した変異体ライブラリー富化方法は、全く偏りのないアプローチであり、そして予想されるどの結果にも基づかなかった。
【００４５】
ザイモモナスｈｉｍＡ遺伝子の破壊により、アセテート存在下における性能が改善されるという所見は、ザイモモナスまたは他の任意の微生物の酢酸耐性において、この遺伝子が役割を果たすこと示すまたは示唆する文献が認められていないため、意外である。本明細書において「ＨｉｍＡ」タンパク質と称される、ｈｉｍＡ遺伝子によってコードされるタンパク質は、組み込み宿主因子（ＩＨＦ）（ｈｉｍＤ遺伝子によってコードされるβサブユニットをも含むタンパク質）のαサブユニット（配列番号２６）である。それ故、ＩＨＦは、２つの緊密に関連するサブユニットからなるヘテロダイマータンパク質である。ＩＨＦは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において研究されており、そしてＤＮＡ組み換え、ＤＮＡ複製、および遺伝子発現の調節に関与するＤＮＡ結合性およびＤＮＡの折れ曲がりタンパク質であることが示されている（Ｆｒｉｅｄｍａｎ（１９８８）Ｃｅｌｌ ５５：５４５−５５４；Ａｒｆｉｎ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：２９６７２−２９６８４）。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における遺伝子発現プロファイリング実験により、ｈｉｍＡ遺伝子不活性化が、少なくとも１２０個の遺伝子の発現レベルを有意に変更し、そしてこの操作により活性化される遺伝子は、この操作により抑制される遺伝子より多いことが示された（Ａｒｆｉｎ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：２９６７２−２９６８４）。細胞が指数期から定常期に移る場合、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｈｉｍＡ遺伝子は、最も活発に転写されることもまた公知であり、そしてｈｉｍＡ遺伝子産物は、このプロセスにおいて役割を果たすと考えられる。それ故、ｈｉｍＡは、広範なＤＮＡのプロセスに影響を及ぼし、そして大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の遺伝子発現の調節因子であるが、調節すると考えられる多くの遺伝子のうち、明確に酢酸耐性に関連するものはない。さらに加えて、マイクロアレイを使用した阻害濃度のアセテートへの暴露後の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における遺伝子発現の全体解析が行われているが、この処置により影響を受けた８６個の遺伝子のうち、ｈｉｍＡ遺伝子に該当する遺伝子は認められなかった（Ａｒｎｏｌｄ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８３：２１７８−２１８６）。最終的に、ザイモモナスにおけるｈｉｍＡ遺伝子の役割については何も知られていない。また、本発明者らは、ｈｉｍＡ遺伝子不活性化が何らかのタイプの有益な効果をもたらすことを示す文献での報告を見ていない。実際、この操作によって、多くの遺伝子およびタンパク質がおそらく影響を受けることを考慮すると、これが事実であるのは、驚くべきことである。従って、ｈｉｍＡ遺伝子の不活化により、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）または他の任意の微生物にアセテートに対するより高い耐性が付与されることを当業者が予測できなかった、と結論付けることは合理的である。
【００４６】
ザイモモナスＨｉｍＡタンパク質は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）相同体（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿４１６２２７）に４６％同一である。最も緊密に関連する既知のタンパク質は、スフィンゴモナス ウィティチ（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｗｉｔｔｉｃｈｉｉ）（ＧｅｎＢａｎｋ 受託番号ＹＰ＿００１２６４０４１）のＨｉｍＡ相同体であり、これは、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ｈｉｍＡコーディング領域（配列番号１）を問い合わせ配列として使用して、ＮＣＢＩデータベースに対するｔＢＬＡＳＴｘ検索によって決定されるように、６７％同一である。
【００４７】
ｈｉｍＡ遺伝子発現の変更
本発明のキシロース資化性Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株は、組み込み宿主因子αサブユニットタンパク質（ＨｉｍＡ）の発現が減少するかまたは全く認められないように、遺伝子改変される。典型的に、ＨｉｍＡタンパク質発現の減少は、ｈｉｍＡ遺伝子の発現を減少させる改変を介して達成される。ＨｉｍＡタンパク質発現を減少させることは、例えば、コードするｍＲＮＡの翻訳を減少させるか、またはＨｉｍＡタンパク質の安定性を減少させる改変を含んでもよい。ＨｉｍＡタンパク質の発現を減少させると、アセテートの存在下での性能が改善される。タンパク質の発現を減少させるための当業者に既知の任意の遺伝子改変方法を使用して、ＨｉｍＡ発現を変更してもよい。方法として、ｈｉｍＡ遺伝子全体または一部の欠失、コードされるタンパク質が発現され得ないように（プロモーターもしくはコーディング領域のいずれかにおいて）ｈｉｍＡ遺伝子にＤＮＡフラグメントを挿入すること、ｈｉｍＡコーディング領域に変異を導入して、機能性タンパク質が発現されないように終止コドンまたはフレームシフトを付加すること、およびｈｉｍＡコーディング領域に１つ以上の変異を導入して、非機能性であるかまたはそれほど機能的に活性ではないタンパク質が発現されるようにアミノ酸を変更することが挙げられるが、これらに限定されない。さらに、アンチセンスＲＮＡまたは干渉ＲＮＡの発現によってｈｉｍＡ発現を阻止してもよく、そして共抑制を生じる構築物を挿入してもよい。当業者であれば、既知のｈｉｍＡコーディング配列（配列番号１）、ならびに完全なＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ゲノム配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＥ００８６９２）において利用可能であるｈｉｍＡコーディング配列の周囲のＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ＤＮＡ配列を利用して、これらの方法のすべてを容易に実践することができる。
【００４８】
本明細書の実施例５および６において例示されるように、遺伝子改変されたｈｉｍＡ株を作製するための特に適切な方法は、スペクチノマイシン耐性遺伝子または他の選択マーカー遺伝子に結合するｈｉｍＡフランキングＤＮＡ配列によって仲介される相同組み換えを使用して、機能性タンパク質が発現されないようなｈｉｍＡコーディング領域へのマーカー遺伝子の挿入をもたらすことである。さらに、対応する部位特異的リコンビナーゼの発現後、耐性遺伝子がｈｉｍＡ遺伝子から切り出されるように、マーカー遺伝子を部位特異的組み換え部位に結合させてもよい。部位特異的組み換えは、後に組み換え部位を残し、これがｈｉｍＡ遺伝子の発現を破壊する。相同組み換えベクターを構築して、マーカーの切り出し後にｈｉｍＡ遺伝子に欠失部を残してもよく、これは当業者に周知である。
【００４９】
ｈｉｍＡの発現を完全になくすことが好ましいが、しかし、ｈｉｍＡの発現を顕著に減少させることもまた、本発明の実施形態である。この場合、非機能性ｈｉｍＡ遺伝子とは、例えば通常より低いレベルのコードされたタンパク質が存在するというように、通常な様式では機能しないことを指す。遺伝子不活化のいくつかの方法では、発現が、共抑制のようないくらか低いレベルにとどまり得る。本明細書において、改変されたｈｉｍＡ株は、ＨｉｍＡ酵素活性が減少しているかまたは認められない遺伝子改変された株を指す。
【００５０】
ｈｉｍＡ改変株の性能
本発明のｈｉｍＡ改変キシロース資化性Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株は、ある量のキシロースを含む混合糖類培地において培養する場合、改善された性能を有する。培地はまた、ある量のアセテートを含有してもよい。キシロース資化性Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）では、培養培地におけるバイオマス糖化から産生される糖類を使用することが望ましい。典型的に、バイオマスは、例えば、国際公開第２００４／０８１１８５号パンフレットならびに共有および同時係属中の米国特許出願公開第２００７００３１９１８Ａ１号明細書に記載のように、前処置され、次いで、Ｌｙｎｄ，Ｌ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．（２００２）６６：５０６−５７７）によってレビューされているように、糖化酵素で処置される。キシロースおよび他の糖類を含有するバイオマス前処置および糖化の加水分解物産物（即ち、それは、「混合糖類培地」である）もまた、典型的に、アセテートを含有する。バイオマス中のヘミセルロースは、アセチル化キシロース残基を含有し、そしてアセテートは、極めて温和な条件下で放出される。処理されたバイオマスからアセテートを取り出すことは、問題を解決する１つの方法であるが、この工程を組み入れると、セルロース系エタノールの製造コストが大幅に増加する。結果的に、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株を操作して、アセテートに対してより高い耐性を提供することは、実質的な改善である。
【００５１】
本明細書においてアッセイされるアセテートの存在下における改善された性能として、増殖、キシロースの資化、およびエタノールの産生が挙げられる。ｈｉｍＡ改変キシロース資化性Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株の改善された性能は、同じ遺伝的特徴を有する（同質遺伝子株）が、ｈｉｍＡ遺伝子の改変を欠く株に関連する。ｈｉｍＡ遺伝子の遺伝子改変に使用される親株は、典型的に、この比較で使用される。非改変ｈｉｍＡ株がその可能な限りの増殖およびエタノール産生に到達しない任意のレベルのアセテートにおいて、改善が認められ得る。アセテートの濃度が約５ｇ／Ｌ以上である場合、培地の組成およびｐＨ制御に依存して、典型的に改善が生じる。阻害種は、実際には、酢酸であるため、「アセテート阻害」の程度もまた、ｐＨに依存し、そして酢酸とアセテートとの平衡は、ｐＨに依存的である。ｐＨの制御を伴わなくても、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）は、他のグラム陰性細菌と同様に、迅速に、培養培地を酸性化する。ｐＨを５．８から４．８に低下させると、酢酸の約４．８ｐＫAにより、酢酸の濃度は、５倍増加する。それ故、酢酸（インヒビター）の実際の濃度は、培養培地のｐＨ、ならびに培養培地に存在するプロトン化および非プロトン化種の合計量に依存する。
【００５２】
アセテートの存在を伴うグルコースとキシロースとの濃縮混合物において、非改変および改変ｈｉｍＡ株は、ｐＨ制御された条件下で同様にグルコースを資化し、キシロース消費の前に、グルコースが主に消費される。しかし、すべてのグルコースが枯渇した後の発酵の後期段階中に、ｈｉｍＡ改変株は、正常なｈｉｍＡ遺伝子発現を有する同質遺伝子親株より多くのキシロースをエタノールに変換することが可能である。
【００５３】
ｈｉｍＡ遺伝子改変によってもたらされるエタノール産生の増加のレベルは、複数のタイプの糖類のレベルおよび割合ならびに他のインヒビターの存在を含むｐＨ制御条件下の培養培地の成分に依存する。例えば、１２６ｇ／Ｌグルコース、１０７ｇ／Ｌキシロースおよび１０％アセテートの存在下、ｈｉｍＡ改変を有しない同質遺伝子株と比較して、ｈｉｍＡ改変株のエタノール力価は４％増加した。培養培地が他のインヒビターをも含有する場合、エタノール産生の増加は、なお大きくなり得る。例えば、１１０ｇ／Ｌグルコース、９０ｇ／Ｌキシロース、約９．５ｇ／Ｌ酢酸および１９０ｍＭアンモニウムイオン（この濃度でバイオマス加水分解物に存在し得るＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）増殖のもう１つのインヒビター（Ａｇｒａｗａｌ（１９８９）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ３４：２７８−２８１））を含むｍｏｃｋ ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ培地では、エタノール産生の約１１％の増加およびキシロースのより完全な資化が認められた。それ故、より厳しい条件下では、改変ｈｉｍＡ株と同質遺伝子の非改変ｈｉｍＡ株との間のエタノール産生の差異は、引用した例より、なおさらに大きくなり得る。例えば、より高い糖濃度において、またはアンモニウムイオンおよびアセテートに加えて、他の加水分解物由来のインヒビターも存在する場合である。従って、培養条件に依存して、エタノール産生の改善は、少なくとも約４％以上であり得る。
【００５４】
エタノール産生のための発酵
本発明の方法では、本ｈｉｍＡ改変キシロース資化株を、キシロースをも含む糖類の任意の混合物を含有する培地において培養する。特に、本株は、バイオマス加水分解物中で培養してもよく、またはバイオマス加水分解物の希釈物中で培養してもよい。バイオマス糖化では、バイオマス加水分解物において、典型的に、キシロースとグルコースとの混合物、フルクトース、スクロース、ガラクトース、マンノース、および／またはアラビノースを含み得る糖類を生成する。キシロースおよびグルコースを含む混合糖類組成物が好ましく、ここで、さらなる糖類が存在してもよい。多様な糖類の割合は、混合物において変動し得、キシロースでは、典型的に、糖類の全量の少なくとも約１０％である。好ましくは、キシロースは約４０％〜約６０％の間である。フルクトースは、サトウキビバガスのようないくつかのバイオマスの糖化によって生成される糖類に存在し、そしてキシロースが糖混合物の少なくとも約１０％を保持するように、キシロースまたはグルコースの一部をフルクトースに置き換えてもよい。さらに、アラビノースは、ヘミセルロースから誘導され、それ故、ヘミセルロースを含有する糖化バイオマスから誘導される混合糖類の典型的な成分である。本株による発酵中、キシロースは、エタノールの産生のための炭素源として使用される糖類の１つである。最大限のエタノール産生および発酵効率のために、キシロースを含む糖類の濃縮混合物を含有する培地において、本ｈｉｍＡ改変キシロース資化性株を培養することが望ましい。これにより、バイオマス糖化糖類の直接使用、またはほとんど希釈を伴わない使用が可能となり、それによって発酵容積が縮小され、これは商業的規模のエタノール産生において望ましい。より大きな濃度のエタノールが産生され得るように、高い糖類濃度が使用される。発酵培地における混合糖類濃度は、典型的に、少なくとも約１２０ｇ／Ｌおよび約３００ｇ／Ｌまでである。約１５０ｇ／Ｌ〜約２３５ｇ／Ｌの間にある高濃度の混合糖類が特に有用である。
【００５５】
エタノールの産生に望ましい高濃度の混合糖類条件では、共有および同時係属中の米国特許出願公開第２００８００８１３５８Ａ１号明細書（参照により本明細書に援用される）に記載のように、ソルビトールを、ｈｉｍＡ改変キシロース資化性Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）を培養するために使用される発酵培地に含めてもよい。ソルビトール（Ｄ−ソルビトールおよび／またはＬ−ソルビトール）は、約２ｍＭ〜２００ｍＭの濃度で培地に存在し得る。培地におけるより適切な最終濃度は、約２ｍＭ〜１００ｍＭの濃度であり、５ｍＭ〜２０ｍＭの濃度が好ましい。マンニトールを、ソルビトールの代わりに、またはソルビトールとの組み合わせで、培地において使用してもよい。さらに、ガラクチトールおよび／またはリビトールを、ソルビトールおよび／またはマンニトールの代わりに、あるいはソルビトールまたはマンニトールと組み合わせて使用することができることを見出した。ソルビトール、マンニトール、ガラクチトール、リビトールまたはそれらの組み合わせは、すべて、ソルビトールについて記載の濃度と同じ濃度で使用される。
【００５６】
Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）は、発酵が発生し、そしてエタノールが産生される培地で培養される。発酵は、空気、酸素、または他の気体の補充を伴わずに（嫌気性、微好気性（ｍｉｃｒｏａｅｒｏｂｉｃ）、または微好気性（ｍｉｃｒｏａｅｒｏｐｈｉｌｉｃ）発酵のような条件を含み得る）、少なくとも約２４時間行うが、４８時間以上行ってもよい。エタノール産生が最大に到達するタイミングは、発酵条件に依存してばらつきがある。典型的に、インヒビターが培地中に存在する場合、より長い発酵期間が必要である。発酵は、約２５℃〜約４０℃の範囲の温度、および約４．５〜約７．５のｐＨで行ってもよい。約３０℃〜約３７℃の温度が特に適切である。ｐＨを、酢酸のｐＫAより少なくとも約１ｐＨ単位超えて維持し、ｐＨを約５．８〜７．５の間にして、酢酸対アセテートの比を減少させることもまた、特に適切である。
【００５７】
ｈｉｍＡ改変キシロース資化性Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）は、キシロースを含む混合糖類を含有する培地中、実験規模の発酵槽、および商業的量のエタノールが産生される大規模化された発酵において培養させることができる。さらに、培地は上述のようにアセテートを含み得る。エタノールの商業的産生が所望される場合、さまざまな培養方法論を適用することができる。例えば、ｈｉｍＡ改変キシロース資化性Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）からの大規模産生を、バッチおよび連続培養方法論の両方によって、産生させることができる。古典的なバッチ培養方法は閉鎖系であり、ここで、培地の組成は培養の開始時に設定され、培養プロセス中に人工的に変更されることはない。それ故、培養プロセスの開始時に、培地に所望の生物体を接種し、増殖または代謝活動を可能にして、系には何も添加しない。しかし、典型的に、「バッチ」培養は、炭素源の添加についてのバッチ処理であり、しばしば、ｐＨおよび酸素濃度のような因子を制御することが試みられる。バッチ系では、系の代謝物およびバイオマス組成は、培養が終了する時点まで絶えず変化する。バッチ培養物内で、細胞は典型的に、静的な対数期を通過して増殖期に達し、最終的に、増殖速度が減少または停止する定常期へと加減する。処理を行わなければ、定常期の細胞は最終的に死滅する。対数期の細胞は、しばしば、いくつかの系の最終産物または中間体の大部分の産生を担う。定常期または指数期後の産生は他の系において得ることができる。
【００５８】
標準的なバッチ系の１つの変形例は流加培養系である。流加培養プロセスもまた、ｈｉｍＡ改変キシロース資化性Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）の培養に適切であり、培養の進行に伴って基質を増量しながら添加することを除いて、典型的なバッチ系を含む。異化代謝産物抑制が細胞の代謝を阻害し易い場合、および培地中の基質量を制限することが所望される場合、流加培養系が有用である。流加培養系における実際の基質濃度の測定は、困難であるため、これは、ｐＨ、およびＣＯ2のような排気体分圧のような測定可能な因子の変化に基づいて、見積もられる。バッチおよび流加培養方法は当該技術分野において一般的かつ周知であり、その例は、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｒｕｅｇｅｒ，Ｃｒｕｅｇｅｒ，ａｎｄ Ｂｒｏｃｋ，第２版（１９８９）Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ、またはＤｅｓｈｐａｎｄｅ，Ｍｕｋｕｎｄ Ｖ．，Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３６，２２７（１９９２）（参照により本明細書に援用される）に見出すことができる。
【００５９】
エタノールの商業的産生はまた、連続培養によっても達成することができる。連続培養は開放系であり、ここで、規定された培養培地を連続的にバイオリアクターに添加し、同時に等量の順化培地を処理のために取り出す。一般的に、連続培養は細胞を一定の高液体相密度で維持し、ここで、細胞は主に対数増殖期にある。あるいは、連続培養を固定化された細胞によって実施してもよく、ここで、炭素および栄養物が連続的に添加され、価値のある産物、副産物および不要産物が細胞塊から連続的に取り出される。細胞の固定化は、当業者に公知である天然および／または合成材料からなる広範な固相支持体を使用して実施することができる。
【００６０】
連続または半連続培養によって、細胞増殖、代謝、または最終産物の濃度に影響を及ぼす１つの因子またはいくつかの因子を調節することが可能である。例えば、１つの方法は、炭素源のような制限されている栄養物または窒素レベルを一定速度で維持し、そして他のすべてのパラメータを加減することが可能である。他の系では、培地の濁度によって測定される細胞濃度を一定に保ちながら、増殖または代謝に影響を及ぼす多くの因子を連続的に変更することができる。連続系は定常状態の増殖条件を維持しようとし、それ故、培地を抜き取ることによって起きる細胞の消失は、培養における細胞増殖速度に対して均衡を保たなければならない。連続培養プロセスのための栄養物および増殖因子を調節する方法ならびに産物形成の速度を最大限にするための技術については、産業微生物学の分野において周知であり、さまざまな方法がＢｒｏｃｋ、上掲によって詳述されている。
【００６１】
以下の発酵レジメンがエタノール産生に特に適切である。所望されるｈｉｍＡ改変キシロース資化性Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株を、オービタルシェーカー中、約１５０ｒｐｍで振盪しながら約３０℃〜約３７℃で振盪フラスコ中、半複合培地（ｓｅｍｉ−ｃｏｍｐｌｅｘ ｍｅｄｉｕｍ）において増殖させ、次いで、類似の培地を晩有する１０Ｌ種発酵槽に移す。発酵パラメータがエタノール産生に最適化されている産生発酵槽に種培養物を移す場合、ＯＤ600が３〜６の間になるまで、種培養物を、種発酵槽において嫌気的に増殖させる。種タンクから産生タンクに移される典型的な播種容積は、約２％〜約２０％ｖ／ｖの範囲である。典型的な発酵培地は、リン酸カリウム（１．０〜１０．０ｇ／ｌ）、硫酸アンモニウム（０〜２．０ｇ／ｌ）、硫酸マグネシウム（０〜５．０ｇ／ｌ）、酵母抽出物またはダイズを主材料とする製品（０〜１０ｇ／ｌ）のような複合窒素源のような最小培地成分を含有する。最終濃度で約５ｍＭのソルビトールまたはマンニトールが培地中に存在する。キシロース、およびグルコース（またはスクロース）のような少なくとも１つのさらなる糖を含む混合糖類は、炭素源を提供し、エタノールの率および力価を最大限にするために初期のバッチ処理された炭素源（５０〜２００ｇ／ｌ）の枯渇に際して発酵容器に連続的に添加する。炭素源供給速度は、培養物が、酢酸のような毒性の副産物の形成をもたらし得るグルコースの過渡の蓄積を生じないことを確実にするために、動力学的に調整する。利用する基質から産生されるエタノールの収率を最大限にするために、最初にバッチ処理するか、または発酵過程中に供給されるリン酸塩の量によって、バイオマスの増殖を制限する。発酵ブロスのｐＨは、水酸化アンモニウム、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、または他の強塩基を使用する自動化された塩基の添加によって制御／維持される。発酵槽の温度は、所望の範囲で制御される。発泡を最小限にするために、消泡剤（任意のクラス−シリコーンを主材料とするもの、有機物を主材料とするものなど）を、必要に応じて容器に添加する。汚染を最小限にするために、場合により、カナマイシンのような株において抗生物質耐性マーカーが存在する抗生物質を使用してもよい。
【００６２】
上記の条件の任意の組、および当業者に周知であるこれらの条件におけるさらなるバリエーションは、本キシロース資化性組み換えザイモモナス株によるエタノールの産生のための適切な条件である。
【実施例】
【００６３】
本発明を、以下の実施例においてさらに規定する。これらの実施例は、好適な実施形態を示す一方、あくまで例示として示されることが理解されるべきである。当業者であれば、上記の考察およびこれらの実施例から本発明の不可欠な特徴を確かめることが可能であり、また、その趣旨および範囲から逸脱することなく、それを多様な用途および条件に適合させるように本発明の多様な変更および改変をなすことが可能である。
【００６４】
一般的方法
ここで使用した標準的な組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は当該技術分野において周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａ，第２版；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）（１９８９）（以後、「Ｍａｎｉａｔｉｓ」）；ならびにＳｉｌｈａｖｙ，Ｔ．Ｊ．，Ｂｅｎｎａｎ，Ｍ．Ｌ．，ａｎｄ Ｅｎｑｕｉｓｔ，Ｌ．Ｗ． Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｇｅｎｅ Ｆｕｓｉｏｎｓ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８４）；ならびにＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ．ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅにより出版、Ｈｏｂｏｋｅｎ，ＮＪ（１９８７）に記載されている。
【００６５】
略語の意味は次のとおりである：「ｋｂ」はキロベースを意味し、「ｂｐ」は塩基対を意味し、「ｎｔ」はヌクレオチドを意味し、「ｈｒ」は時間を意味し、「ｍｉｎ」は分を意味し、「ｓｅｃ」は秒を意味し、「ｄ」は日を意味し、「Ｌ」はリットルを意味し、「ｍｌ」はミリリットルを意味し、「μＬ」はマイクロリットルを意味し、「μｇ」はマイクログラムを意味し、「ｎｇ」はナノグラムを意味し、「ｇ」はグラムを意味し、「ｍＭ」はミリモルを意味し、「μＭ」はマイクロモルを意味し、「ｎｍ」はナノメートルを意味し、「μｍｏｌ」はマイクロモルを意味し、「ｐｍｏｌ」ピコモルを意味し、「Ｃｍ」はクロラムフェニコールを意味し、「Ｃｍr」はクロラムフェニコール耐性を意味し、「Ｓｐｅｃr」はスペクチノマイシン耐性を意味し、「ｃｆｕ」はコロニー形成単位を意味し、「ＯＤ600」は６００ナノメートルの波長で測定される光学密度を意味し、「ＳＥ」は標準誤差を意味し、「ｒｐｍ」は１分間あたりの回転数を意味し、「〜」は約を意味する。
【００６６】
実施例１
ＺＷ８０１−４トランスポゾンに基づくノックアウト／過剰発現ライブラリーの作製
トランスポゾンに基づくゲノムノックアウト／過剰発現ライブラリーを、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）のキシロース資化性組み換え株において構築して、酢酸耐性変異体についてスクリーニングした。ライブラリーを作製するためにトランスポゾンを使用するのには、２つの原則的な理由があった。第１に、それは、酢酸耐性において役割を果たす遺伝子関する既存の知識を必要としない全く偏りのないアプローチである。第２に、選択マーカーによって「タグ付け」されるため、所望の表現型を担う破壊された遺伝子を同定することが容易である。ライブラリーを作製するために使用した株はＺＷ８０１−４であった。米国仮特許出願第６０／８４７８１３号明細書（参照により本明細書に援用される）に詳述されているように、中間株、ＺＷ８００を介して、ＺＷ６５８（ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−７８５８）からＺＷ８０１−４を誘導した。ＺＷ８００の株を、野生型ｌｏｘＰ部位によってフランキングされたスペクチノマイシン耐性カセット（Ｓｐｅｃr−カセット）の自殺プラスミドから、グルコース−フルクトースオキシドレダクターゼ（ＧＦＯＲ）をコードする遺伝子への二重交差挿入によって、構築した。得られたＧＦＯＲノックアウト変異体では、グルコースおよびキシロースによる混合糖発酵中に、キシリトールの産生の減少、キシロース代謝の有害な副産物、およびエタノールのより良好な産生が認められた。次いで、Ｓｐｅｃr−カセットのＣｒｅ仲介による切り出しを介して、ＺＷ８００をＺＷ８０１−４に変換した。選択マーカーの除去により、タンパク質の翻訳を未熟な状態で切り詰めるインフレーム終止コドンを生じるＧＦＯＲオープンリーディングフレームの中間において単一の野生型ｌｏｘＰ部位を残した。さらに、ＺＷ８０１−４中のＧＦＯＲコーディング配列は、自殺構築物の設計の結果として、ｌｏｘＰ部位の周囲の領域の約７２ｂｐの本来の野生型ＧＦＯＲヌクレオチド配列を含んでいない。ＺＷ８０１−４における変異体ＧＦＯＲコーディング領域の配列を配列番号２５に示す。その直前の形態（ＺＷ８００）と同様に、ＺＷ８０１−４は機能性ＧＦＯＲ酵素を産生しないため、それは、いずれの検出可能なキシリトールも作製しない。
【００６７】
ＺＷ８０１−４ゲノムノックアウト／過剰発現ライブラリーを作製するために使用した方法論は、ｐＭＯＤTM−２＜ＭＣＳ＞Ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒ（カタログ番号ＭＯＤ０６０２）を使用するＥｐｉｃｅｎｔｒｅ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）ｔｒａｎｓｐｏｓｏｍｅ技術に基づいた。このプラスミドは、アンピシリン耐性遺伝子（ａｍｐＲ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）複製開始点（ｏｒｉ）、およびＴｎ５トランスポサーゼが相互作用する２つのモザイク末端（ＭＥ）の間に位置するマルチクローニング部位を含む。本発明において適用するために、Ｓｐｅｃr−カセット（それ自身のプロモーターを有する）およびＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（Ｐｇａｐ）の強力な構成性プロモーターを、２つのＭＥの間に位置するマルチクローニング部位に挿入することによって、ｐＭＯＤTM−２＜ＭＣＳ＞を、図２に示すｐＭＯＤｇａｐ／ａａｄＡに変換した；ＰｇａｐプロモーターおよびＳｐｅｃr−カセットは、対向する方向で配向する。それ故、この構築物を使用して転位中にＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）の染色体に無作為に挿入されたＤＮＡフラグメントは、Ｓｐｅｃr−カセットおよびＰｇａｐプロモーターの両方を含有した。Ｐｇａｐプロモーターは、トランスポゾン挿入部位に隣接するＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）染色体遺伝子の発現を潜在的に変更することができるため、それをトランスポゾンに付加して、ライブラリーの遺伝子多様性を増加させた。
【００６８】
ＺＷ８０１−４ゲノムノックアウト／過剰発現ライブラリーは、約１７，５００個の独立した変異体からなり、そしてグリセロールストックの力価は、１ミリリットルあたり約７．１×１０8Ｓｐｅｃrコロニー形成単位（ｃｆｕ）であった。これは、約１トランスポゾン挿入事象／１１５ヌクレオチド（トランスポゾンおよび約１ｋｂの平均サイズの約２０００個の遺伝子の無作為挿入に基づいて、ゲノム全体の約８×カバリッジ（ｃｏｖｅｒａｇｅ）である）に翻訳する。Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）の形質転換頻度が低いため、２つ以上のトランスポゾン挿入を有する変異体は全くないか、または極めて少数であることが予想された。
【００６９】
実施例２
アセテートに対してより大きな耐性を有する変異体のＺＷ８０１−４トランスポゾンに基づくノックアウト／過剰発現ライブラリーのスクリーニング
下記の通り、ＺＷ８０１−４ゲノムノックアウト／過剰発現ライブラリーを、酢酸耐性変異体についてスクリーニングした。しかし、これを行う前に、変異体富化プロセスのための適切な選択条件を設定することが重要であった。目的は、より速く増殖する変異体が蓄積し得るように、増殖速度を少なくとも２倍遅くするが、いくらかの世代に細胞を分裂させることが可能なアセテートの濃度を見出すことであった。また、先の実験により、浸透圧ストレスおよびアセテートは両方とも、相乗的様式で増殖を阻害することが示されたため、グルコースとキシロースとの濃縮混合物においてプロセス関連条件下でこれを行うことも重要であった。最終的に、真の阻害化合物は酢酸であり、そしてプロトン化種対非プロトン化種の比は、ｐＨ制御を伴わなければ、細菌細胞が増殖培地を酸性化するにつれて劇的に増加するため、ｐＨを制御することは極めて重要であった。例えば、ｐＨが５．８から４．８に低下する場合、この弱有機酸のｐＫAは約４．８であるため、酢酸の濃度は約５倍に増加する。
【００７０】
図３は、ライブラリーを作製するために使用した株であるＺＷ８０１−４の増殖速度および最終バイオマス収量に対する２つの異なる濃度のアセテートの阻害効果を示す。酢酸カリウムをこれらの実験に使用したが、以下に示す最終濃度は、添加した塩の酢酸成分の１リットルあたりのグラム数に基づく。ｐＨ制御されたバイオリアクターは、ｍＲＭ３Ｓ培地（１０ｇ／Ｌ酵母抽出物、２ｇ／ＬのＫＨ2ＰＯ4、１ｇ／ＬのＭｇＳＯ4、５ｍＭソルビトール）＋１００ｇ／Ｌグルコース、９０ｇ／Ｌキシロースおよび５ｇ／Ｌまたは６ｇ／Ｌのアセテートを含有した；ｐＨおよび温度は５．８および３０℃であり、そして撹拌は１５０ｒｐｍであった。インヒビターのこの濃度は、上記の増殖の両方の基準を満たすため、図３および他の実験において示される結果に基づいて、ライブラリースクリーニングに、５ｇ／Ｌのアセテートを選択した。
【００７１】
酢酸耐性変異体を富化するために、以下のプロトコルを使用した。ライブラリーグリセロールストック（ＯＤ600＝４．３；約７．１×１０8Ｓｐｅｃr ｃｆｕ／ｍｌ）のアリコート（２ｍｌ）を、２０ｍｌのＳＭ培地（１０ｇ／Ｌ酵母抽出物、２ｇ／ＬのＫＨ2ＰＯ4、１ｇ／ＬのＭｇＳＯ4、７５ｇ／Ｌグルコース、２５ｇ／Ｌキシロース、初期ｐＨ５．８）に添加し、そして培養物を１．５時間、３０℃でインキュベートした。この回収期間後、細胞を遠心分離によって回収し、そして２．０ｍｌの同じ増殖培地に再懸濁した。次いで、細胞懸濁液（約７×１０6Ｓｐｅｃr ｃｆｕ）のアリコート（１０μｌ）を、１００ｇ／Ｌグルコース、９０ｇ／Ｌキシロース、およびｐＨ変化を最小限にするのに役立つ４ｇ／Ｌ重炭酸カリウムを含有する１５ｍｌのｍＲＭ３Ｓ培地に播種した；細胞を添加し、そして初期ＯＤ600を約０．００２５とする前に、濃リン酸で初期ｐＨを５．８に調整した。これは、変異体富化手順に使用した種培養物である。それを、３０℃で約０．５のＯＤ600まで増殖させ、そして７．５ｍｌをｐＨ制御したバイオリアクターに播種した。１５０ｍｌの最終培養物は、ｍＲＭ３Ｓ培地＋１００ｇ／Ｌグルコース、９０ｇ／Ｌキシロース、５ｇ／Ｌのアセテートを含有し、そして自動化されたＫＯＨの添加によって、ｐＨを５．８に維持した。３０℃での約２４時間の増殖後、培養物（ＯＤ600約０．５）のアリコートを、同じ組成を有する新鮮な増殖培地を含有する新たなバイオリアクターに継代して、約０．０２の初期ＯＤ600とした。上記のように、この工程を、本質的にあと６回反復した。一般に、細胞を、２４〜３６時間ごとに継代し、そしてバイオリアクター中の初期ＯＤは約０．０２〜約０．０３であった。それ故、継代の間に、少なくとも５世代が認められた。７回目の変異体富化手順後、培養物のグリセロールストックを、さらなる特徴付けのために調製した。
【００７２】
図４Ａは、７回目の継代後、富化された変異体培養物によって実施した高糖およびアセテートによるｐＨ制御されたバイオリアクター実験の結果を示す。この実験のコントロールは、親株、ＺＷ８０１−４であった。種培養物を、３０℃で、ＳＭ培地において、約４．５のＯＤ600まで増殖させ、そしてバイオリアクターを、１０％播種物で開始した。最終的な１５０ｍｌの培養物は、ｍＲＭ３Ｓ培地＋１００ｇ／Ｌグルコース、９０ｇ／Ｌキシロースおよび６ｇ／Ｌアセテートを含有した。撹拌は、１５０ｒｐｍであり、そしてｐＨおよび温度は、それぞれ、５．８および３０℃で維持した。様々な時間において、ＨＰＬＣ分析のために、屈折率検出器を具備するＨＰ１１００（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ））を使用して、培養物の１．０ｍｌアリコートを取り出し、発酵ブロス中に存在するグルコース、キシロース、およびエタノールの濃度を決定した。ＨＰＬＣ分析の前に、遠心分離によって細胞を取り出し、そして０．２２μｍ酢酸セルローススピンＳｐｉｎ−Ｘ遠心管フィルター（Ｃｏｓｔａｒ、カタログ番号８１６０）を介して上清をろ過して、小さな粒子を取り出した。化合物を、０．６ｍｌ／分の流速および移動相として０．０１ＮのＨ2Ｓ０4を使用する均一溶媒条件下、５５℃で稼動させたＡｍｉｎｅｘ ＨＰＸ−８７Ｈカラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）上で分離させた。既知濃度の標準物質を使用して、目的のピークを定量し、そして結果をｇ／Ｌで表した。
【００７３】
図４Ａに示す結果は、富化された変異体ライブラリー培養物が、発酵の後期段階中のキシロースのより速い資化およびエタノールのより迅速な産生を有したことを示す。これは、グルコースのすべてが枯渇した後に生じ、そしてエタノール濃度が毒性レベルに接近していたことに留意すること。それにもかかわらず、実験の終了までに、両方の培養物は、すべての糖を消費し、そして同じ量のエタノールを産生した。僅かにより高い濃度の糖（１０５ｇ／Ｌグルコースおよび１００ｇ／Ｌキシロース）ならびにさらなるアセテート（９ｇ／Ｌ）を使用して、この実験を反復した場合、類似の現象が観察され（図４Ｂ）、それ故、結果に再現性があることが実証された。
【００７４】
実施例３
変異体株の遺伝的特徴付け
選択プロセス中にどのタイプの変異体が富化されたかを調べるために、２回目のバイオリアクター実験中にライブラリー培養物から単一のコロニーを単離した（図４Ｂ）。培養物のアリコートを、２４時間の時間ポイントで取り出し、そして細胞を、ＭＭＧ培地（５０ｇ／Ｌグルコース、１０ｇ／Ｌ酵母抽出物、５ｇ／Ｌのトリプトン、２．５ｇ／Ｌの（ＮＨ4）2ＳＯ4、０．２ｇ／ＬのＫ2ＨＰＯ4、および１ｍＭのＭｇＳ０4）を含有する寒天プレート上で増殖させた。３０℃、嫌気条件下での４８時間のインキュベーション期間後、得られたコロニーのうち１７個を、ＤＮＡ配列解析のために無作為に選択して、トランスポゾン挿入の部位を決定した。以下の手順を、この解析に使用した。コロニーを５０μｌの水で希釈し、そしてゲノムＤＮＡを、ＧｅｎｏｍｉＰＨＩ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号２５−６６００−１）を使用して、増幅した。簡単に説明すると、１μｌの細胞懸濁液を９μｌのＬｙｓｉｓ Ｒｅａｇｅｎｔに添加し、そして混合物を、９５℃まで、３分間加熱し、そして直ちに４℃まで冷却した。次に、９μｌの酵素緩衝液および１μｌのＰｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼを、溶解したサンプルに添加した。３０℃で１８時間の増幅後、ポリメラーゼを、１０分間、６５℃で加熱不活化し、次いで、サンプルを直ちに４℃まで冷却した。
【００７５】
次いで、増幅したサンプルのアリコート（８μｌ）を、１６μｌのＢｉｇＤｙｅ ｖ３．１ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＰＮ＃４３３７４５７ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ））、１μｌのＴｈｅｒｍｏｆｉｄｅｌａｓｅ（Ｆｉｄｅｌｉｔｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ））、１２μｌのＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｇｒａｄｅ水（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．（Ｈｅｒｎｄｏｎ，ＶＡ））、および３μｌの１０μＭプライマー：ＳｐｅｃＴ−ＦＯＲ（配列番号２：ＧＴＧＡＡＡＧＧＣＧＡＧＡＴＣＡＣＣＡＡＧＧＴＡＧＴＣ）またはＳｐｅｃＴ−Ｒｅｖ（配列番号３：ＣＴＡＣＣＴＣＴＧＡＴＡＧＴＴＧＡＧＴＣＧＡＴＡＣＴＴＣＧＧ）のいずれか一方に添加した。これらのプライマーの両方とも、ＺＷ８０１−４ゲノムノックアウトライブラリーを作製するために使用したトランスポゾンの部分であるＳｐｅｃr−カセットにハイブリダイズするが、それらは、対向する方向で配向されることに留意すること。次いで、配列決定反応は、次の熱サイクルであった：９６℃で３分間、続いて、２００サイクルの（９５℃で３０秒間＋５５℃で２０秒間＋６０℃で２分間）、そして４℃で貯蔵した。配列決定の前に、Ｅｄｇｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）クリーンアッププレートを使用して、取り込まれなかったｄｄＮＴＰを取り出した。４０μｌの配列決定反応混合物の全体を、予めスピンした９６ウェルクリーンアッププレートの１つのウェルにピペッティングし、そしてプレートを、５分間、５０００×重力、Ｓｏｒｖａｌｌ ＲＴ−７冷却遠心分離機中でスピンした。次いで、クリーンアップされた反応物を、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ３７３０ＤＮＡシークエンサーに直接配置し、そして自動塩基呼び出しにより配列決定した。
【００７６】
特に、配列決定した１７個のすべてのコロニーでは、ｈｉｍＡオープンリーディングフレーム（Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ゲノムのヌクレオチド番号１１３８２２４〜番号１１３８５６５の逆相補配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＥ００８６９２））にトランスポゾンが挿入されており、そして異なる３つの挿入事象が同定された。コロニーのうち１１個（ＡｃＲ＃３を含む、以下を参照のこと）は、ｎｔ番号１１３８４１３においてトランスポゾンの挿入を有し、コロニーのうち４個はｎｔ番号１１３８２６７において挿入を有し、そしてコロニーのうち２個はｎｔ番号１１３８５０８において挿入を有した。それ故、３つのすべての挿入事象は、２５０ｂｐストレッチのＤＮＡ内で生じた。７回目の変異体富化手順後、ｈｉｍＡノックアウト変異体の６５％が、ｎｔ番号１１３８４１３においてトランスポゾン挿入を有したという事実から、この事象が、他の２つの挿入事象より速い増殖またはより大きな生存能を付与したことが示唆された。また、配列解析から、もう１つの興味深い観察が得られた。理論的には、Ｔｎ５トランスポゾンは、自体をいずれの方向にでもＤＮＡに挿入することができるが、選択プロセスから回収された３つのすべての挿入事象は、ＰｇａｐプロモーターがｈｉｍＡオープンリーディングフレームと対向する方向にある、同じ配向を有していた。
【００７７】
上記の配列決定の結果から、図４に示される実験は、細胞の混合集団によって実施されたものであり、精製された株によるものではないことが明らかである。それ故、ＡｃＲ＃３は、ｎｔ番号１１３８４１３においてトランスポゾン挿入を有し、これは、最も頻回に単離された事象であったため、この株を、ｈｉｍＡ表現型のさらなる特徴付けのために選択した。
【００７８】
実施例４
プロセス関連条件下での酢酸耐性および発酵性能に対するｈｉｍＡ遺伝子不活性化の影響
ＡｃＲ＃３は、ＺＷ８０１−４よりアセテートに対して耐性である
変異体選択プロセスに使用した増殖培地は、阻害レベルのアセテートに加えて、高濃度のグルコースおよびキシロースを含有した。従って、キシロースは、グルコースほどは資化されないため、７回目の富化後に観察された発酵性能の改善（図４）は、浸透圧ストレスまたはキシロースでのより良好な増殖に関連する可能性があった。エタノール耐性変異体もまた、用いた実験条件下でおそらくより速く増殖するか、またはより長く生存するため、それらが富化された可能性もあった。これらの無関連な可能性を除外し、そしてｈｉｍＡ遺伝子の不活化が現実にアセテートに対してより高い耐性を付与するかどうかについて調べるため、株ＡｃＲ＃３を、以下の条件下で親株、ＺＷ８０１−４と比較した。実験は、３３℃、振盪フラスコ（５０ｍｌチューブ中２０ｍｌ培養物）中で実施し、そして増殖培地は、１０ｇ／Ｌ酵母抽出物、２ｇ／ＬのＫＨ2ＰＯ4、１ｇ／ＬのＭｇＳＯ4、１０ｍＭのＫＨＣＯ3（ｐＨを維持するのに役立つため）、５０ｇ／Ｌグルコースおよびカリウム塩として添加した０、８、または１２ｇ／Ｌのアセテートを含有した；示されるアセテートの濃度は、カリウム塩の酢酸成分に基づく。細胞を添加し、そして培養物を往復振盪機（１５０ｒｐｍ）上で穏やかに振盪する前に、リン酸で初期ｐＨを５．８に調整した。種培養物を、アセテートを有さない同じ培地において指数後期（ＯＤ600約１．４）まで増殖させ、そして実験培養物の初期ＯＤ600は０．０３であった。浸透圧ストレスがなく、そして好適な基質のグルコースが炭素源であるため、これらは、アセテートの非存在下で、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）の増殖に理想的であることに留意することが重要である。さらに加えて、この実験で作製され得る最大濃度のエタノールは、＜２５ｇ／Ｌであり、これは、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）の増殖にほとんどまたは全く影響を及ぼさない。
【００７９】
アセテートの非存在下で、ＡｃＲ＃３およびＺＷ８０１−４は、類似した速度論で増殖し、そして図５に示すように、最終ＯＤ600値から判断されるものと同じ量のバイオマスを産生した。しかし、ＡｃＲ＃３株（図５Ｂ）は、アセテートに対して親株よりかなり高い耐性を有した（図５Ａ）。例えば、ＺＷ８０１−４の増殖は、８ｇ／Ｌのアセテートによってほぼ完全に達成された一方、ＡｃＲ＃３に対するこの濃度のインヒビターの影響は、ごく僅かであった。実際、ｈｉｍＡノックアウト変異体は、８ｇ／Ｌのアセテートに耐性であったＺＷ８０１−４を上回り、１２ｇ／Ｌのアセテートにさらなる耐性を示した。この実験を繰り返し行ったところ、同じ結果が得られた。図４に示されるバイオリアクター実験においても同様であったが、増殖培地のｐＨが制御されない場合、アセテートは、より強度に阻害的であることを想起することは重要である。ｐＨ制御を伴わない振盪フラスコ実験では、細胞は、増殖培地を酸性化し、そして酢酸／アセテートの割合が劇的に増加し、そしてそれは、既に認められたように、細菌増殖を阻害するのはプロトン化種である。
【００８０】
上記の実験において両方の株について観察された増殖の阻害にカリウムイオンが少なくとも部分的に寄与し得たため、アセテートの他の供給源を試験することが、重要であった。この組の実験に使用した条件は、上記の条件と同一であったが、酢酸ナトリウムおよび酢酸アンモニウムもまた分析に含まれた。酢酸アニオンの濃度は、すべての場合において８ｇ／Ｌ（上記で定義したとおり）であった。図６に、４３時間の時点での様々な培養物の最終ＯＤ600値を示す。ＺＷ８０１−４（図６Ａ）は、使用したアセテートが何かにかかわらず、８ｇ／Ｌのアセテートによって、強力に阻害された。この観察は、これらの実験における主要インヒビターが酢酸であったこと、およびアセテートの一価のカチオンが、使用した濃度では増殖にほとんどまたは全く影響を及ぼさなかったことを明確に示す。３つのすべてのアセテートもまた、ＡｃＲ＃３の増殖にネガティブな影響を及ぼした（図６Ｂ）が、アセテートの濃度が僅か８ｇ／Ｌであった場合、この株への阻害はそれほど劇的ではなかった。総合すると、図５および６に示す実験は、ＡｃＲ＃３が、親株、ＺＷ８０１−４より強度にアセテートに対して耐性である明確な証拠を提供する。
【００８１】
ＡｃＲ＃３は、高糖＋アセテート混合物において、ＺＷ８０１−４より良好な性能を示す
ＡｃＲ＃３は、「混合集団」の変異体に使用した同じ実験条件下で試験した場合（図４Ｂ）、ＡｃＲ＃３はＺＷ８０１−４より優れており、そして２つの培養物の間に、先の実験において認められるよりもかなり大きな差異が認められた（図７）。先の結果と一致して、すべてのグルコースが消費された後、そしてキシロースが唯一の残留する炭素源であった発酵の後期段階中にのみ、改善が明白であった。実際、図７に示す時間経過を綿密に調べることにより、グルコース資化およびエタノール産生の初期速度は、ＡｃＲ＃３では僅かに遅かったことが示された。しかし、すべてのグルコースが消費された後、キシロース資化曲線勾配から、ＡｃＲ＃３が、発酵の後期中にＺＷ８０１−４より速い速度でこの糖をエタノールに変換することが可能であったことは、明らかである。
【００８２】
コントロール株であっても、用いられた条件下で実験の終了までにすべての糖を使用することが可能であったため、上記の実験では、ＡｃＲ＃３の能力を十分に評価することができなかった。この制限を取り除くため、より厳しい条件を使用して、ＡｃＲ＃３およびＺＷ８０１−４を再度試験した。温度を、３０℃から３３℃に上昇させ、そしてより高い濃度のグルコースおよびキシロースを使用した。種培養物を、３０℃、ＳＭ培地において、約４．４のＯＤ600まで増殖させ、そして１０％播種物を使用して、バイオリアクターを開始した。最終的な１５０ｍｌの培養物は、ｍＲＭ３Ｓ培地＋１２６ｇ／Ｌグルコース、１０７ｇ／Ｌキシロースおよび１０ｇ／Ｌアセテートを含有した。撹拌を１５０ｒｐｍに設定し、そしてｐＨおよび温度は、それぞれ、５．８および３０℃で維持した。この実験は、ＺＷ８０１−４では３回反復およびＡｃＲ＃３では２回反復で行ったが、グルコース、キシロース、アセテートおよびエタノールのエンドポイント値（６７時間の時点）（平均±ＳＥ）を表１に示す。発酵ブロスのＨＰＬＣ分析については、実施例２で説明したが、表におけるすべての化合物の濃度を、ｇ／Ｌで表す。これらのより厳しい条件下では、ＡｃＲ＃３は、親株、ＺＷ８０１−４より約１０％多いキシロースを消費し、そして約４％多いエタノールを産生した。
【００８３】
表１．高糖およびアセテートにおいて増殖したＺＷ８０１−４株およびＡｃｒ＃３株について、ｐＨ制御された発酵槽におけるキシロース、エタノールおよびキシリトールのエンドポイント値。
【００８４】
１００％Ｍｏｃｋ ＨｙｄｒｏｌｙｓａｔｅにおいてＡｃＲ＃３はＺＷ８０１−４より良好な性能を示す
水酸化アンモニウム前処置プロセスを使用して生成されるバイオマス加水分解物中に存在することが予想される複数の濃度のアンモニウムイオンおよび酢酸イオンの存在下で、ＡｃＲ＃３およびＺＷ８０１−４の性能を評価した。水酸化アンモニウム前処置コーンストーバ加水分解物の発酵中のアンモニウムイオンの濃度は、１８０ｍＭを超え得、そして高濃度のアンモニウムイオンはＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）の増殖を阻害することが予測されている（Ａｇｒａｗａｌ（１９８９）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ３４：２７８−２８１）ため、これは、極めて重要な実験である。これらの実験に使用した合成の１００％Ｍｏｃｋ Ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ（１００％ＭＨ）培地は、５ｇ／Ｌ酵母抽出物、１５ｍＭ（ＮＨ4）2ＨＰＯ4、１６０ｍＭ酢酸アンモニウム、１ｇ／ＬのＭｇＳＯ4および１０ｍＭソルビトール（ｐＨ５．８）を含有する。それ故、種培養物の添加後の１００％ＭＨ中の酢酸イオンおよびアンモニウムイオンの最終濃度は、それぞれ、約９．５ｇ／Ｌおよび１９０ｍＭであった。実験は、ｐＨ制御されたバイオリアクターにおいて行った。種培養物を、３０℃、ＳＭ培地において、約４．４のＯＤ600まで増殖させ、そして１０％播種物を使用して、バイオリアクターを開始した。最終的な１５０ｍｌの培養物は、１００％ＭＨ＋１１０ｇ／Ｌグルコースおよび９０ｇ／Ｌキシロースを含有した。撹拌を１５０ｒｐｍに設定し、そしてｐＨおよび温度は、それぞれ、５．８および３３℃で維持した。様々な時間において、実施例２に記載されているのと同じ手順を使用して、発酵ブロスのＨＰＬＣ分析のためにアリコートを取り出した。同時に行った実験の代表的な対の結果を、図８：８ＡにおいてＺＷ８０１−４、および８ＢにおいてＡｃＲ＃３について示す。
【００８５】
先の観察に一致して、グルコースが代謝されている唯一の糖であった場合、ＡｃＲ＃３株では、エタノール産生の速度が増加しなかった。しかし、キシロースが唯一の残留する炭素源である場合、発酵の後期段階中のＡｃＲ＃３のより優れた性能が、極めて明白であった。ＺＷ８０１−４がすべてのグルコースを消費し終えた時までに、エタノール濃度は、既に、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）に対してさえ殺菌濃度である＞６５ｇ／Ｌであった。このような厳しい環境に、高濃度の酢酸イオンおよびアンモニウムイオン（両方とも、エタノールの毒性を強化する）が加えられた。エタノールレベルが継続して上昇するにつれ、キシロース代謝は、ますます緩徐になり、そして、最終的にゆっくりと停止した。同じ状況がＡｃＲ＃３でも認められたが、期間が延長した。ＡｃＲ＃３は、アセテートに対してより耐性であるため、それは、毒性環境においてより長く生存することが可能であり、従って、増殖倍地中の実質的にすべてのキシロースを消費し、そしてＺＷ８０１−４より多くのエタノールを産生することが可能であった。
【００８６】
１００％ＭＨによる実験を、両方の株についてさらに２回繰り返したが、結果は実質的に同一であった。グルコース、キシロース、アセテートおよびエタノールのエンドポイント値（４８時間の時点）を使用した３回の実験の統計解析を表２に示す；すべての濃度をｇ／Ｌ（平均±ＳＥ）で表す。６つのバイオリアクターのそれぞれに、独立して増殖させた種培養物を播種した。１００％ＭＨでは、ＡｃＲ＃３は、ＺＷ８０１−４より約１４ｇ／Ｌ多いキシロースを消費し、そしてこれは、最終的なエタノール力価を８２ｇ／Ｌから９１ｇ／Ｌに増加させたが、これは、１０％を超える増加である。これらの結果は、表１に示す高糖＋アセテート実験において得られる結果よりなお劇的である。アンモニウムイオンがアセテートを有する増殖倍地中に存在する場合、ストレスレベルは、より高いレベルにまで上昇し、そしてｈｉｍＡ遺伝子不活化の有益性が、より明らかになる。明らかに、アセテートに対してより高い耐性を有するＡｃＲ＃３のような株は、エタノールおよびアンモニウムイオンのようなその環境における他のインヒビターに対処することを、より良好に備えている。
【００８７】
表２．１００％Ｍｏｃｋ Ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅにおいて増殖したＺＷ８０１−４株およびＡｃＲ＃３株を伴うｐＨ制御された発酵槽におけるグルコース、キシロース、エタノール、およびアセテートのエンドポイント値。
【００８８】
実施例５
ＺＷ８０１−４におけるｈｉｍＡ遺伝子のノックアウトのための自殺構築物の作製
これまで示された結果から、ＡｃＲ＃３の酢酸耐性表現型がｈｉｍＡ遺伝子の破壊から生じたことがさらに強力に示唆されるが、他の２つの因子も、潜在的に寄与し得る。実施例１に記載のように、ＺＷ８０１−４ゲノムノックアウト／過剰発現ライブラリーを作製するために使用したトランスポゾンは、Ｓｐｅｃr−カセットおよびＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）Ｐｇａｐプロモーターを含有した。これらのエレメントは、対向する方向で配向され、そしてそれらの両方とも、転位中にｈｉｍＡオープンリーディングフレームに挿入された。Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）Ｐｇａｐプロモーターは強力な構成性プロモーターであるため、それは、ｈｉｍＡトランスポゾン挿入部位の直近に存在する遺伝子の発現レベルを変更した可能性がある。ＡｃＲ＃３の酢酸耐性表現型の少なくとも一部が他の遺伝子の自然突然変異から生じ、それもまたライブラリー変異体富化プロセス中のより速い増殖を可能にし得たことも考えられる（実施例２）。これらの可能性を除外し、そしてｈｉｍＡ遺伝子の不活化のみがＡｃＲ＃３のより高い酢酸耐性を担うかどうかについて調べるため、本発明者らは、ＺＷ８０１−４のｈｉｍＡ遺伝子をノックアウトするための自殺構築物を設計した。この非複製型プラスミドは、以下により詳細に説明するように、スペクチノマイシン耐性カセットを有するが、Ｐｇａｐプロモーターを含有しない。
【００８９】
ＺＷ８０１−４（「ｐＨｉｍＡ」）中のｈｉｍＡ遺伝子をノックアウトするため本発明において使用した自殺構築物は、究極的に、宿主経由、二重交差、相同組み換え、および選択マーカーとしてスペクチノマイシン耐性を使用して、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）のＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を挿入不活化するために以前に使用されたもう１つの自殺構築物（「ｐＬＤＨＳｐ−９ＷＷ」）から誘導した。ｐＬＤＨＳｐ−９ＷＷもまた、先に作製された他の多くの構築物から誘導した。これらの構築物のすべての最初の前駆体は、市販されているプラスミドベクターｐＮＥＢ１９３（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ ＃Ｎ３０５１Ｓ）であった。このプラスミドは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において複製することができるが、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）では複製することができないため、選択した。ｈｉｍＡノックアウト構築物を作製するのに関与したすべての工程および中間体について、プラスミドｐＮＥＢ１９３から開始して、年代順に以下に説明する。
【００９０】
ｐＬＤＨ１９３の構築
以下に説明するＤＮＡフラグメントの挿入のために、ｐＮＥＢ１９３をＳｂｆＩおよびＡｓｃＩで二重消化した。両方の制限部位は独特であり、そしてプラスミドのマルチクローニング領域に局在する。ＳｂｆＩ／ＡｓｃＩ−線状化ｐＮＥＢ１９３プラスミドＤＮＡフラグメントを、製造者のプロトコルに従い、Ｑｉａｇｅｎ社製ＱＩＡＱｕｉｃｋ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（カタログ番号２８１０４）を使用して、精製した。ｐＮＥＢ１９３にクローニングされたＤＮＡ挿入は、Ｑｉａｇｅｎ社製Ｂｌｏｏｄ ＆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｍａｘｉ Ｋｉｔ（カタログ番号１３３６２）を使用して、株ＺＷ１（ＡＴＣＣ番号３１８２１）から単離されたＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅された２２６８ｂｐフラグメントであった。このフラグメントのＰＣＲ増幅のために使用した合成オリゴヌクレオチドは、プライマー１および２であった。
【００９１】
プライマー１（配列番号４）：
ＣＴＡＣＴＣＡＴＴＴｃｃｔｇｃａｇｇＴＧＧＴＡＡＣＴＣＡＴＴＧＣＧＣＧＣＴＣ
プライマー２（配列番号５）：
ＣＡＴＣＴＴＡＣＴｇｇｃｇｃｇｃｃＡＡＡＡＡＴＣＴＧＣＧＧＣＴＧＡＣＡＴＡＣ
プライマー１（順方向プライマー）の下線を付した塩基は、ホスホグリセロムターゼ（ｐｇｍ）をコードするオープンリーディングフレームの３’末端でＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ゲノム（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＥ００８６９２）のヌクレオチド１２６２７３９〜１２６２７２０にハイブリダイズする一方、小文字は、プライマーの５’末端に付加されたＳｂｆＩ部位に対応する。プライマー２（逆方向プライマー）の下線を付した塩基は、アルコールデヒドロゲナーゼ Ｉ（ａｄｈＩ）をコードするオープンリーディングフレームの直ぐ上流であるＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ゲノムのヌクレオチド１２６０４９０〜１２６０４７２にハイブリダイズする一方、小文字は、プライマーの５’末端に付加されたＡｓｃＩ部位に対応する。従って、ＰＣＲ増幅の標的であった２２６８ｂｐのＤＮＡフラグメントは、ＳｂｆＩ部位から開始し、そしてＡｓｃＩ部位で終了する次のエレメントからなる：（ａ）ｐｇｍ遺伝子の３’末端、（ｂ）Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼをコードするｌｄｈ遺伝子全体、および（ｃ）遺伝子の５’非翻訳領域。ＰＣＲ産物をＳｂｆＩおよびＡｓｃＩで切断し、そして得られたＤＮＡフラグメントを、上記で説明したＳｂｆＩ／ＡｓｃＩ線状化ｐＮＥＢ１９３ベクターに連結した。連結反応混合物を使用して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＪＭ１１０を形質転換して、そして形質転換された細胞を、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢ培地上でプレート化した。正確なサイズの挿入物を有するプラスミドを含有するアンピシリン耐性形質転換体を、はじめに、再懸濁したコロニーを使用するＰＣＲ（「コロニーＰＣＲ」）ならびにプライマー１および２によって同定した。ポジティブクローンの以後の確認は、ＳｂｆＩおよびＡｓｃＩによるプラスミドＤＮＡの制限消化分析、ならびにアンピシリン耐性形質転換体によるコロニーＰＣＲによって作製した２２６８ｂｐフラグメントのＤＮＡ配列解析によって行った。さらなる操作のために選択したプラスミドを、「ｐＬＤＨ１９３」と称する。
【００９２】
ｐＬＤＨＴｃ１３９＃７の構築
プラスミドｐＬＤＨ１９３は、ｌｄｈオープンリーディングフレームの中間付近に局在する独特なＮｃｏＩ部位を有する。この部位を使用して、テトラサイクリンに対して耐性を付与するＤＮＡフラグメントを挿入した。この操作のために使用したテトラサイクリン耐性カセット（Ｔｃr−カセット）を、ＤＮＡテンプレートとしてプラスミドｐＡＣＹＣ１８４（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ０６４０３）、ならびにＰＣＲプライマーとしてプライマー３および４を使用しＰＣＲによって作製した。
【００９３】
プライマー３（配列番号６）：
ＡＣＴＣＡＴＴＴｃｃａｔｇｇＣＧＡＴＣＧＣＡＣＴＡＴｇｃｇｇｃｃｇｃＡＡＴＧＴＡＧＣＡＣＣＴＧＡＡＧＴＣＡＧＣＣ
プライマー４（配列番号７）：
ＡＴＣＴＣＡＣＴｃｃａｔｇｇＣＣＧＧＣＣＡＡＣＴＡｔｔａａｔｔａａＧＡＡＴＴＧＡＴＴＧＧＣＴＣＣＡＡＴＴＣＴＴＧ
プライマー３（順方向プライマー）の太い下線を付した塩基は、テトラサイクリン耐性遺伝子のプロモーターの直ぐ上流にハイブリダイズする。プライマー３はまた、その５’末端に付加された３つの制限部位（ＮｃｏＩ、ＡｓｉＳＩ、およびＮｏｔＩ）を有する。ＮｃｏＩ部位を標準の小文字で表す。ＡｓｉＳＩ部位には、細い下線が付されている。Ｎｏｔ Ｉ部位を斜体の小文字で表す。プライマー４（逆方向プライマー）の太い下線を付した塩基は、テトラサイクリン耐性遺伝子の終止コドンの直ぐ上流にハイブリダイズし、そしてこのプライマーはまた、その５’末端に付加された３つの制限部位（ＮｃｏＩ、ＦｓｅＩ、およびＰａｃＩ）を有する。上記の標識化と同様に、ＮｃｏＩ部位を標準の小文字で表し、ＦｓｅＩ部位に細い下線を付し、そしてＰａｃＩ部位を斜体の小文字で表す。プライマー３および４で作製した１４４８ｂｐのＴｃr−カセットを、ＮｃｏＩで切断し、そして分離用アガロースゲル電気泳動により精製した。次いで、得られたＤＮＡフラグメントを、プラスミド、ｐＬＤＨ１９３のｌｄｈオープンリーディングフレームに存在する独特なＮｃｏＩ部位に連結した。挿入を有しないベクターの再環状化の可能性を最小限にするために、連結の前に、ＮｃｏＩ消化ｐＮＥＢ１９３を仔ウシ小腸アルカリホスファターゼで脱リン酸化した。連結反応混合物を大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＪＭ１１０に導入し、そして形質転換された細胞を、２０μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含有するＬＢ培地上でプレート化した。正確な挿入を有するプラスミドを含有するテトラサイクリン耐性形質転換体を、ＮｃｏＩ、ＡｓｉＳＩ、ＮｏｔＩ、ＦｓｅＩ、およびＰａｃＩによる制限消化分析によって同定し、そしてＴｃr−カセットの配向を、適切なプライマーを使用しＰＣＲ分析によって確認した。さらなる操作のために選択したプラスミド（ｐＬＤＨＴｃ１３９＃７）の環状図を、図９Ａに示す。もう１つの計画では、宿主経由、二重交差、相同組み換え、および選択マーカーとしてテトラサイクリンに対する増殖を使用して、ＺＷ１におけるＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の（「破壊」または「ノックアウト」のための）挿入不活化のために、この自殺構築物を首尾よく使用した。
【００９４】
ｐＬＤＨＴｃ１３９＃７−９ＷＷの構築
ｐＬＤＨＴｃ１３９＃７を使用して、ＺＷ１におけるＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を「ノックアウト」し得ることを実証したことから、次に構築物を改変して、Ｃｒｅリコンビナーゼを使用して、遺伝子破壊後の染色体から選択マーカーを取り出すことが可能であるようにした。この目的を達成するために、Ｔｃr−カセットにフランキングする４つの独特な制限部位、即ち、５’末端におけるＡｓｉＳＩおよびＮｏｔＩならびに３’末端におけるＰａｃＩおよびＦｓｅＩを利用して、２つの野生型ｌｏｘＰ部位（ＬｅｅおよびＳａｉｔｏ、１９９８）をｐＬＤＨＴｃ１３９＃７に付加した。構築物を両方の酵素で切断し、そして得られる大きなＤＮＡフラグメントを精製した後、第１のｌｏｘＰ部位を、プラスミドｐＬＤＨＴｃ１３９＃７のＡｓｉＳＩおよびＮｏｔＩ部位の間に挿入した。この位置に挿入されたｌｏｘＰ部位は、それらの５’末端で両方ともリン酸化された２つの合成オリゴヌクレオチド（Ｏｌｉｇｏ５および６）から作製した。
【００９５】
Ｏｌｉｇｏ５（配列番号８）：
ｃｇｃＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡＡＴＧＴＡＴＧＣＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴｇｃ
Ｏｌｉｇｏ６（配列番号９）：
ｇｇｃｃｇｃＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡＧＣＡＴＡＣＡＴＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴｇｃｇａｔ
Ｏｌｉｇｏ５および６は相互に相補的であり、そして共にアニールする場合、ＤＮＡフラグメントがｐＬＤＨＴｃ１３９＃７のＡｓｉＳＩおよびＮｏｔＩ部位の間で連結することを可能にする両末端の一本鎖突出部を有する完全長の二本鎖野生型ｌｏｘＰ部位を形成する。Ｏｌｉｇｏ５および６の中の大文字は、完全長の野生型ｌｏｘＰ部位に対応する一方、小文字は、二本鎖ＤＮＡフラグメントをｐＬＤＨＴｃ１３９＃７のＡｓｉＳＩおよびＮｏｔＩ部位に連結するために使用したヌクレオチドを示す。
【００９６】
連結反応混合物を使用して、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＤＨ１０Ｂを形質転換して、そして形質転換された細胞を、２０μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含有するＬＢ培地上でプレート化した。ｐＬＤＨＴｃ１３９＃７のＡｓｉＳｉおよびＮｏｔＩ部位に正確に挿入されたｌｏｘＰ部位を有するプラスミドを含有するテトラサイクリン耐性形質転換体を、関連領域の制限消化分析、適切なプライマーを使用するコロニーＰＣＲ、およびＤＮＡ配列解析によって同定した。さらなる操作のために選択したプラスミドを、「ｐＬＤＨＴｃ１３９＃７−９Ｗ」と称する。
【００９７】
次に、両方の酵素でプラスミドを切断し、そして得られる大きなベクターフラグメントを精製した後、第２の野生型ｌｏｘＰ部位を、ｐＬＤＨＴｃ１３９＃７−９ＷにおけるＴｃr−カセットの他方の末端のＰａｃＩおよびＦｓｅＩ部位の間に挿入した。この位置に挿入されたｌｏｘＰ部位もまた、それらの５’末端で両方ともリン酸化された２つの合成オリゴヌクレオチド（Ｏｌｉｇｏ７および８）で作製した。
【００９８】
Ｏｌｉｇｏ７（配列番号１０）：
ｔａａＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡＡＴＧＴＡＴＧＣＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴｇｇｃｃｇｇ
Ｏｌｉｇｏ８（配列番号１１）：
ｃｃＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡＧＣＡＴＡＣＡＴＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴｔｔａａｔ
Ｏｌｉｇｏ７および８は相互に相補的であり、そしてハイブリダイズする場合、ＤＮＡフラグメントがｐＬＤＨＴｃ１３９＃７−９ＷのＰａｃＩおよびＦｓｅＩ部位の間で連結することを可能にする両末端の一本鎖突出部を有する完全長の二本鎖野生型ｌｏｘＰ部位を形成する。Ｏｌｉｇｏ７および８の中の大文字は、完全長のｌｏｘＰ部位に対応する一方、小文字は、二本鎖ＤＮＡフラグメントをｐＬＤＨＴｃ１３９＃７−９ＷのＰａｃＩおよびＦｓｅＩ部位に連結するために使用されるヌクレオチドを示す。
【００９９】
連結反応混合物を使用して、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＤＨ１０Ｂを形質転換して、そして形質転換された細胞を、２０μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含有するＬＢ培地上でプレート化した。ｐＬＤＨＴｃ１３９＃７−９ＷのＰａｃＩおよびＦｓｅＩ部位に正確に挿入された野生型ｌｏｘＰ部位を有するプラスミドを含有するテトラサイクリン耐性形質転換体を、関連領域の制限消化分析、適切なプライマーを使用するコロニーＰＣＲ、およびＤＮＡ配列解析によって同定した。さらなる操作のために選択したプラスミドを、ｐＬＤＨＴｃ１３９＃７−９ＷＷと称し、そしてこの構築物の環状図を図９Ｂに示す。
【０１００】
ｐＬＤＨＳｐ−９ＷＷの構築
ｐＬＤＨＳｐ−９ＷＷはｐＬＤＨＴｃ１３９＃７−９ＷＷと同一であるが、但し、後者の構築物のテトラサイクリン耐性カセットは、スペクチノマイシンに対する耐性を付与するＤＮＡフラグメント（即ち、Ｓｐｅｃr−カセット）で置き換えられた。後者は、テンプレートとしてプラスミドｐＨＰ１５５７８（Ｃａｈｏｏｎ ｅｔ．ａｌ．，２００３に記載）ならびにＰＣＲ増幅のためのプライマー９および１０を使用しＰＣＲによって作製した。ｐＨＰ１５５７８は、そのプロモーターを含むＳｐｅｃr−カセットの完全なヌクレオチド配列を含有し、３’（９）−Ｏ−ヌクレオチジルトランスフェラーゼをコードするトランスポゾンＴｎ７ ａａｄＡ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ０３４０３）の公開された配列に基づく。
【０１０１】
プライマー９（配列番号１２）：
ＡＴＡＡＡＡｇｃｇｇｃｃｇｃＡＧＣＡＣＡＧＧＡＴＧＡ
プライマー１０（配列番号１３）：
ＧＧＣＧｔｔａａｔｔａａＧＧＣＡＧＧＴＣＡＧＣＡＡＧ
プライマー９（順方向プライマー）の下線を付した塩基は、Ｓｐｅｃr−カセットのプロモーターの直ぐ上流（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ０３０４３のｎｔ６〜１７に）ハイブリダイズする一方、小文字は、プライマーの５’末端に付加されたＮｏｔＩ部位に対応する。プライマー１０（逆方向プライマー）の下線を付した塩基は、Ｓｐｅｃr−カセットの終止コドンから約１３０塩基下流（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ０３０４３のｎｔ１００６〜１０１９に）ハイブリダイズする一方、小文字は、プライマーの５’末端に付加されたＰａｃＩ部位に対応する。ＰＣＲにより作製された１０４０ｂｐのＳｐｅｃr−カセットを、ＮｏｔＩおよびＰａｃＩで二重消化し、そして得られたＤＮＡフラグメントをアガロースゲル電気泳動によって精製した。プラスミドｐＬＤＨＴｃ１３９＃７−９ＷＷもまた、同じ２つの制限酵素で切断して、Ｔｃr−カセットを取り出し、そして得られた大きなベクターフラグメントを、アガロースゲル電気泳動によって精製した。次いで、ＰＣＲおよびベクターフラグメントを共に連結し、そしてエレクトロポレーションを使用して、形質転換反応混合物を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ１０Ｂに導入した。形質転換体を、スペクチノマイシン（２００μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢ培地上でプレート化し、そして３７℃で増殖させた。正確なサイズの挿入を有するプラスミドを含有するスペクチノマイシン耐性形質転換体を、ＮｏｔＩおよびＰａｃＩによる制限消化分析によって同定し、そしてさらなる操作のために選択したプラスミドを、ｐＬＤＨＳｐ−９ＷＷと称し；この構築物の環状図を図９Ｃに示す。
【０１０２】
もう１つの計画では、ｐＬＤＨＳｐ−９ＷＷを使用して、宿主経由、二重交差、相同組み換えおよび選択としてスペクチノマイシンに対する増殖を使用し、ＺＷ１のＤ−乳酸デヒドロゲナーゼの遺伝子をノックアウトした。自殺構築物のＳｐｅｃr−カセットにフランキングする２つのＤＮＡフラグメントによって、二重交差事象の標的をｌｄｈ遺伝子に定めた。これらのフラグメントの一方（以降、５’ｌｄｈフランキングＤＮＡと称する）は、Ｓｐｅｃr−カセットの直ぐ上流にあり、そしてＳｂｆＩおよびＡｓｉＳＩ部位の間に局在する。この約１１００ｂｐのＤＮＡフラグメントのヌクレオチド配列は、ｐｇｍ遺伝子の３’末端およびｌｄｈオープンリーディングフレームのはじめのおよそ半分をコードするＺＷ１染色体ＤＮＡと同一である。他方のＤＮＡフラグメント（以降、３’ｌｄｈフランキングＤＮＡと称する）は、ＦｓｅＩおよびＡｓｃＩ部位の間のＳｐｅｃr−カセットの対向末端に局在する。３’ｌｄｈフランキングＤＮＡのヌクレオチド配列（これもまた、約１１００ｂｐである）は、ｌｄｈ遺伝子の他方の半分およびａｄｈＩ遺伝子の５’非翻訳領域の部分をコードする染色体ＤＮＡと同一である。５’および３’ｌｄｈフランキングＤＮＡフラグメントの両方がそれらの染色体対応物と相互作用し、そして相同組み換えを経験する場合、二重交差事象を生じる。本質的に不可逆的であり、そしてもっぱら、宿主の酵素的機構によって仲介されるこの現象は、オープンリーディングフレームの中間に、２つの野生型ｌｏｘＰ部位に隣接するＳｐｅｃr−カセットを挿入することによって、染色体ｌｄｈ遺伝子を不活化する。自殺構築物は、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）において複製することができず、（極めて低い頻度で生じる自然発生性の薬剤耐性変異体とは別の）ｐＬＤＨＳｐ−９ＷＷを有する安定なスペクチノマイシン耐性コロニーを作製するための唯一の方法は、相同組み換えを介する二重交差事象である。
【０１０３】
ｐＨｉｍＡの構築
ｈｉｍＡ遺伝子のノックアウト構築物を作製するために、ｐＬＤＨＳｐ−９ＷＷのｌｄｈフランキングＤＮＡを、ｈｉｍＡフランキングＤＮＡで置き換えて、選択マーカーおよび二重交差事象を染色体ｈｉｍＡ遺伝子に対する標的にした。下記のように、この操作には、４つのＤＮＡフラグメントが必要であった。
【０１０４】
フラグメント１は、プラスミドを、異なる４つの制限酵素：ＮｏｔＩ、ＢｓａＩ、ＳｂｆＩおよびＡｓｃＩで切断することによって、ｐＬＤＨＳｐ−９ＷＷ（図９Ｃ）から誘導した。ＮｏｔＩは、ｐＬＤＨＳｐ−９ＷＷをｎｔ２６４７において切断し、ＢｓａＩは、プラスミドをｎｔ１８１６において切断する。プラスミドＤＮＡを、４つの制限酵素で完全に消化した後、２６６６ｂｐのＳｂｆＩ-ＡｓｃＩのＤＮＡフラグメントを、１％アガロースゲルを使用する電気泳動およびＺｙｍｏｃｌｅａｎ Ｇｅｌ ＤＮＡ Ｒｅｃｏｖｅｒｙ Ｋｉｔ（カタログ番号Ｄ４００１，Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）によって精製した。フラグメント１と命名したこのフラグメントは、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）において機能的ではない大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）複製開始点、および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）においてアンピシリン耐性を付与する遺伝子を含有する。
【０１０５】
フラグメント２もまた、ｐＬＤＨＳｐ−９ＷＷから誘導した。プラスミドを、ＦｓｅＩおよびＡｓｉＳＩによって二重消化し、そして得られた１１０５ｂｐのＦｓｅＩ−ＡｓｉＳＩのＤＮＡフラグメントを、１％アガロースゲルを使用する電気泳動およびフラグメントを一掃するためのＺｙｍｏｃｌｅａｎ Ｇｅｌ ＤＮＡ Ｒｅｃｏｖｅｒｙ Ｋｉｔ（カタログ番号Ｄ４００１，Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）によって精製した。フラグメント２と命名したこのフラグメントは、２つの野生型ｌｏｘＰ部位（各末端に１つ）によってフランキングされるＳｐｅｃr−カセットを含有する。
【０１０６】
フラグメント３は、３’ｈｉｍＡフランキングＤＮＡを含有する。約１．１２Ｋｂｐのフラグメント３を、プライマーＡおよびＢを使用し、ＰＣＲによって作製した。ＰＣＲ増幅のテンプレートは、Ｗｉｚａｒｄ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（カタログ番号Ａ１１２５，Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、ＺＷ６５８（ＡＴＣＣ ＃ＰＴＡ−７８５８）から単離したゲノムＤＮＡであった。
【０１０７】
プライマーＡ（配列番号１４）：
ＣＴＡＣＴＣＡＴｃｃｔｇｃａｇｇＴＴＴＡＡＴＧＡＡＴＧＡＧＣＧＧＡＴＧＣＴＧ
プライマーＢ（配列番号１５）：
ＣＡＴＣＴＴＡＣＴｇｃｇａｔｃｇｃＴＧＡＣＴＴＴＣＣＧＴＧＣＣＡＧＣＣＡＧ
プライマーＡ（順方向プライマー）の下線を付した塩基は、ｈｉｍＡ遺伝子の下流にあるタンパク質のグルタチオンＳ−トランスフェラーゼファミリーの推定メンバーのコーディング領域の中間に位置するＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ゲノム（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＥ００８６９２）のヌクレオチド１１３７１５４〜１１３７１７５にハイブリダイズする（Ｓｅｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３（１），６３−６８（２００５））一方、小文字は、プライマーの５’末端に付加されたＳｂｆＩ部位に対応する。プライマーＢ（逆方向プライマー）の下線を付した塩基は、ｈｉｍＡオープンリーディングフレームの３’末端でＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ゲノムのヌクレオチド１１３８２７６〜１１３８２５７にハイブリダイズする一方、小文字は、プライマーの５’末端に付加されたＡｓｉＳＩ部位に対応する。プライマーＡおよびＢに対する染色体結合部位ならびに作製されるＰＣＲ産物（フラグメント３）を、図１０Ａに示す。ＰＣＲ産物をＳｂｆＩおよびＡｓｉＳＩで消化し、次いで、上記のように、得られた１１２３ｂｐのフラグメントを、アガロースゲル電気泳動によって精製した。
【０１０８】
フラグメント４は、５’ｈｉｍＡフランキングＤＮＡを含有する。約１．１６ｋｂのフラグメント４を、プライマーＣおよびＤを使用し、ＰＣＲによって作製した。ＰＣＲ増幅のテンプレートは、Ｗｉｚａｒｄ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（カタログ番号Ａ１１２５，Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、ＺＷ６５８（ＡＴＣＣ ＃ＰＴＡ−７８５８）から単離したゲノムＤＮＡであった。
【０１０９】
プライマーＣ（配列番号１６）：
ＴＣＡＣＴＣＡＴｇｇｃｃｇｇｃｃＧＧＧＡＴＡＴＣＡＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣＴＣ
プライマーＤ（配列番号１７）：
ＣＡＴＣＴＴＡＣＴｇｇｃｇｃｇｃｃＧＡＴＡＴＧＣＴＧＣＣＴＴＣＣＧＡＡＧＴＧ
プライマーＣ（順方向プライマー）の下線を付した塩基は、ｈｉｍＡオープンリーディングフレームの５’末端でＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ゲノムのヌクレオチド１１３８５１０〜１１３８５３０にハイブリダイズする一方、小文字は、プライマーの５’末端に付加されたＦｓｅＩ部位に対応する。プライマーＤ（逆方向プライマー）の下線を付した塩基は、２成分応答調節因子をおそらくコードする遺伝子の３’末端においてｈｉｍＡ遺伝子より上流のＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ゲノムのヌクレオチド１１３９６６８〜１１３９６４８にハイブリダイズする（Ｓｅｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３（１），６３−６８（２００５））一方、小文字は、プライマーの５’末端に付加されたＡｓｃＩ部位に対応する。プライマーＣおよびＤに対する染色体結合部位ならびに作製されるＰＣＲ産物（フラグメント４）を、図１０Ａに示す。ＰＣＲ産物をＦｓｅＩおよびＡｓｃＩで消化し、そして得られた１１５９ｂｐのフラグメントを、１％アガロースゲルを使用する電気泳動によって精製した。
【０１１０】
次いで、上記の４つのＤＮＡフラグメントを、４方向連結反応に供して、図１０Ｂに示すｈｉｍＡノックアウト構築物、ｐＨｉｍＡを集成した。この反応に使用したフラグメント１〜４のモル比は、約１：１：１：１であった。連結反応混合物のアリコートを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ１０Ｂにエレクトロポレートし、そして形質転換された細胞を、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）およびスペクチノマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢ培地上でプレート化した；プレートを３７℃でインキュベートした。はじめに、正確なサイズの挿入物を有するプラスミドを含有するアンピシリンおよびスペクチノマイシン二重耐性形質転換体を、異なる２つの対のプライマー：プライマーＡ／プライマーＢ、およびプライマーＣ／プライマーＤを使用するコロニーＰＣＲによって同定した。以降、ポジティブのクローンの確認は、ＳｂｆＩおよびＡｓｃＩによるプラスミドＤＮＡの制限消化分析、ならびにＰＣＲポジティブクローン由来のｐＨｉｍＡプラスミドＤＮＡのＤＮＡ配列解析によって行った。
【０１１１】
Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）の形質転換に必要な非メチル化プラスミドＤＮＡを得るために、ｐＨｉｍＡを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＳＣＳ１１０（ｄｃｍ-，ｄａｍ-）に導入し、そして形質転換された細胞を、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）およびスペクチノマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢ培地上にプレート化した；増殖は、３７℃であった。この操作に使用した化学的コンピテント細胞はＳｔｒａｔａｇｅｎｅ（カタログ番号２００２４７）から入手し、そして販売者のプロトコルに従った。ＤＨ１０Ｂのような大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の野生型株から単離されるメチル化プラスミドＤＮＡは、宿主の制限／改変系によって容易に破壊されるため、ＺＭ４から誘導されるＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株の形質転換のための非メチル化プラスミドＤＮＡの使用が、成功に極めて重要であることに留意することは重要である。最後の工程では、プラスミドＤＮＡをＱＩＡＧＥＮ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍａｘｉ Ｋｉｔ（カタログ番号１２１６２）を使用して、ＳＣＳ１１０形質転換体の１つから単離し、そしてＤＮＡの最終濃度は約２μｇ／μｌであった。
【０１１２】
実施例６
ＺＷ８０１−４のｈｉｍＡノックアウト変異体の作製
ＺＷ８０１−４のｈｉｍＡ遺伝子を不活化するために、本質的に米国特許第５，５１４，５８３号明細書に記載のように、エレクトロポレーションを使用して、非メチル化ｐＨｉｍＡプラスミドＤＮＡ（Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）において複製しない）を、ＺＷ８０１−４に導入した。簡単に説明すると、５０μｌの形質転換反応物は、１０％（ｖ／ｖ）グリセロール中の約１０10個の細胞／ｍｌおよび実施例５に記載のように大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＳＳＣ１１０から単離した約０．５μｇの非メチル化プラスミドＤＮＡを含有した。コントロール反応物も全く同様に処置したが、プラスミドＤＮＡを含まなかった。エレクトロポレーターの設定は、１．６ｋｖ／ｃｍ、２００Ω、および２５μＦ、およびキュベットのギャップ幅は０．１ｃｍであった。エレクトロポレーション後、形質転換物を１．０ｍｌのＭＭＧ培地（５０ｇ／Ｌグルコース、１０ｇ／Ｌ酵母抽出物、５ｇ／Ｌのトリプトン、２．５ｇ／Ｌの（ＮＨ4）2ＳＯ4、０．２ｇ／ＬのＫ2ＨＰＯ4、および１ｍＭのＭｇＳ０4）で希釈し、そして細胞を約３時間、３０℃で回復させた。次いで、細胞を、室温で、滅菌した１．５ｍｌ微量遠心管中、遠心分離（１３，０００×ｇ、５分間）によって回収し、そして上清を注意深く取り除いた。細胞ペレットを、２００□ｌの液体ＭＭＧ培地に再懸濁し、そして２５、５０および１００μｌアリコートの細胞懸濁液を、１．５％寒天および２００μｇ／ｍｌのスペクチノマイシンを含有するＭＭＧ培地上でプレート化した。プレートを嫌気チャンバ中、３０℃でインキュベートし、そして４８〜７２時間後、すべての実験プレート上において少なくとも１００個のコロニーが認められた。対照的に、コントロール反応では、１００μｌの細胞懸濁液を加えたプレート上に認められた１個のコロニーが得られたのみであった。以下に記載のさらなる操作のために、ｐＨｉｍＡノックアウト構築物による形質転換から生じたスペクチノマイシン耐性コロニーのうち２個を選択した。
【０１１３】
本発明者らの研究室におけるＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）およびｐＨｉｍＡに類似の自殺構築物による先の実験から、染色体とプラスミドＤＮＡとの間の初期の相互作用は２つのフランキングＤＮＡ配列のうちの１つにおいて生じる一重交差事象であること、および一重交差事象は最終的に二重交差事象を生じることが示されている。二重交差事象への移行は、普通、極めて迅速であり、そして通常、自殺構築物のための選択剤、今回の場合、スペクチノマイシンを含有する液体または固体培地における若干の連続的継代後に生じる。本発明の二重交差事象を容易にし、そして一重および二重交差事象の「混合集団」が得られる可能性を除外するために、上記の２個の一次形質転換体を、２００μｇ／ｍｌのスペクチノマイシンを含有するＭＭＧプレート上にパッチした。３３℃、嫌気条件下での３０時間のインキュベーション期間後、同じ増殖培地を含有する新鮮寒天プレートに細胞を画線することによって、両方のパッチから単一のコロニーを単離した。３３℃、嫌気条件下での３０時間のインキュベーション期間後、本来の一次形質転換体にそれぞれ由来する１個のコロニーを、スペクチノマイシン（２００μｇ／ｍｌ）を含有する新鮮ＭＭＧプレート上にパッチし、そして下記のように、これらの２つの株をさらに特徴付けた。
【０１１４】
二重交差事象が生じたこと、および単離された各株が細胞の均一集団からなることを、プライマーの３つの異なる対を使用するコロニーＰＣＲ実験により確認した。自殺構築物における５’ｈｉｍＡフランキングＤＮＡがその染色体対応物との一重交差事象を経験した場合、プライマー、ＧＴＴＣＴＧＣＧＣＣＴＧＴＴＡＴＴＣＴＧ（配列番号１８）およびＣＴＡＣＣＴＣＴＧＡＴＡＧＴＴＧＡＧＴＣＧ（配列番号１９）の第１の対は、正確なサイズのＰＣＲ産物のみを作製することができた。同様に、自殺構築物における３’ｈｉｍＡフランキングＤＮＡがその染色体対応物との一重交差事象を経験した場合、プライマー、ＧＡＴＡＴＴＣＣＡＧＴＧＣＴＧＡＴＣＧＡＣ（配列番号２０）およびＣＴＡＣＧＴＧＡＡＡＧＧＣＧＡＧＡＴＣＡＣ（配列番号２１）の第２の対は、正確なサイズのＰＣＲ産物のみを作製することができた。最後に、二重交差事象が正確な座位で生じた場合、プライマー、ＧＡＴＣＡＧＧＴＡＧＧＴＧＴＧＣＴＣＴＡ（配列番号２２）およびＧＣＡＴＣＡＧＡＧＡＧＣＡＴＡＣＴＧＣＴ（配列番号２３）の第３の対は、正確なサイズのＰＣＲ産物のみを作製することができた。プライマーのこの対もまた、それらがまた混入物として存在する場合、ｈｉｍＡ遺伝子の微量の破壊されていないコピーおよび／または一重交差事象を検出することが可能であった。試験したｈｉｍＡノックアウト変異体の両方とも、異なる３つの組のプライマーで予想される結果を生じ、そして識別不能であるように思われたため、それらのうちのただ１つを、さらなる特徴付けのために選択した。以下、この株を「Ｚ８０１−４：：ΔｈｉｍＡ」と称する。
【０１１５】
実施例７
ｈｉｍＡ遺伝子の不活化は、それ自体単独でＡｃＲ＃３の表現型を担う
ｐＨ制御されたバイオリアクターを使用した１００％ＭＨにおけるＺＷ８０１−４とＺＷ８０１−４：：ΔｈｉｍＡとの並列比較を図１１に示す。種培養物を、３０℃で、ＳＭ培地において、約４．４のＯＤ600まで増殖させ、そしてバイオリアクターを、１０％播種物で開始した。最終的な１５０ｍｌの培養物は、１００％ＭＨ＋１１０ｇ／Ｌグルコースおよび９０ｇ／Ｌキシロースを含有した。撹拌を１５０ｒｐｍに設定し、そしてｐＨおよび温度は、それぞれ、５．８および３３℃で維持した。様々な時間において、実施例２に記載の手順を使用して、発酵ブロスのＨＰＬＣ分析のためにバイオリアクターからアリコートを取り出した。これらは、図８および表２に示すＡｃＲ＃３およびＺＷ８０１−４による実験に使用したのと正確に同じ実験条件であることに有意すること（実施例４）。
【０１１６】
図１１に示される結果は、ＺＷ８０１−４：：ΔｈｉｍＡ（図１１Ｂ）が、１００％ＭＨにおいてＺＷ８０１−４よりかなり良好な性能を示したことを示す（図１１Ａ）。４８時間までに、それは、増殖培地中のすべてのグルコースおよびキシロースを使用し、そして約９０ｇ／Ｌのエタノールを作製した。対照的に、親株、ＺＷ８０１−４は、すべての糖を使用したわけではなく、実験の終了時に発酵ブロスにおいてなお約１７ｇ／Ｌの残留キシロースが認められた。ＺＷ８０１−４の最終エタノール力価もまた、有意に低かった（８１ｇ／Ｌ）。それ故、同じ実験場を使用して、ＡｃＲ＃３によって得られた結果と実質的に同一なプロセス関連条件下で、ｈｉｍＡ遺伝子の不活化により、エタノール産生が約１０％増加した。これらの結果は、ＡｃＲ＃３およびＺＷ８０１−４：：ΔｈｉｍＡが等価な株であることを強く示唆するが、並列実験でそれらの性能を試験することは重要であった。１００％ＭＨもまた、この比較に使用したが、両方の株とも、初期の実験において、すべての糖を使用することが可能であったため、グルコースおよびキシロースの初期濃度は、両方とも約１０％増加した。
【０１１７】
種培養物を、３０℃で、ＳＭ培地において、４．５のＯＤ600まで増殖させ、そしてバイオリアクターを、１０％播種物で開始した。最終的な１５０ｍｌの培養物は、１００％ＭＨ＋１１８ｇ／Ｌグルコースおよび９８ｇ／Ｌキシロースを含有した。撹拌を１５０ｒｐｍに設定し、そしてｐＨおよび温度は、それぞれ、５．８および３３℃で維持した。様々な時間において、実施例２に記載の手順を使用して、発酵ブロスのＨＰＬＣ分析のためにバイオリアクターからアリコートを取り出した。両方の株に対するグルコース、キシロース、アセテート、エタノールおよびバイオマス産生（ＯＤ600）の最終値を、表３に示す。
【０１１８】
表３．高糖の１００％Ｍｏｃｋ Ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅにおいて増殖したＺＷ８０１−４：：ΔｈｉｍＡおよびＡｃＲ＃３株を伴うｐＨ制御された発酵槽におけるグルコース、キシロース、エタノール、およびアセテートのエンドポイント値。
【０１１９】
この実験の結果は、ＺＷ８０１−４：：ΔｈｉｍＡおよびＡｃＲ＃３の両方とも、試験系において同一に挙動するため、ｈｉｍＡ遺伝子不活化が、それ自体単独で発酵性能の改善を担うことを実証する。これらの２つの株はまた、図５に示す実験に使用した同じ条件を使用して、酢酸耐性についてそれらを試験した場合（図１２）、識別不能であった。明らかに、ＡｃＲ＃３のｈｉｍＡ遺伝子へのＰｇａｐプロモーターの組み込み、およびこの株に施される変異体富化プロセスの延長は、所望のｈｉｍＡ表現型にほとんどまたは全く影響を及ぼさない。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
キシロースを含む混合糖類培地からエタノールを産生する方法であって：
（ａ）キシロースを資化してエタノールを産生することが可能な組み換えザイモモナス株を提供する工程であって、前記株は、組み込み宿主因子αサブユニットタンパク質（ＨｉｍＡ）の発現を減少させる少なくとも１つの遺伝子改変を含む工程と；
（ｂ）キシロースを含む混合糖類培地において（ａ）の株を培養する工程であって、それによって、キシロースは、前記株によってエタノールを産生するための炭素源として使用される工程と、
を含む、方法。
【請求項２】
培養が、約４．５〜７．５の範囲のｐＨを有する培地において約２５℃〜約４０℃の温度範囲にある、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記温度が約３０℃〜３７℃である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ｐＨが約５．８〜７．０である、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記遺伝子改変が、挿入、欠失、変異、共抑制、およびアンチセンスＲＮＡ発現からなる群から選択されるｈｉｍＡ遺伝子の改変である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記遺伝子改変が、ｈｉｍＡ遺伝子を非機能的にする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記遺伝子改変が、相同組み換えによってｈｉｍＡ遺伝子に導入される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記組み換えザイモモナス株が、ＺＷ８０１−４：：ΔｈｉｍＡまたは株ＡｃＲ＃３である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記培地がアセテートをさらに含み、かつ、前記組み換えザイモモナス株が、ｈｉｍＡ発現を減少させる遺伝子改変を有しない親株のザイモモナス株と比較して増加した量のエタノールを産生する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
産生される前記増加した量のエタノールが、前記ザイモモナス株の酢酸耐性に起因する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記培地が、キシロースを含む少なくとも約１２０ｇ／Ｌの混合糖類、約２ｍＭ〜約１００ｍＭの最終濃度でソルビトール、マンニトール、ガラクチトール、リビトール、およびそれらの混合物からなる群から選択される糖アルコール、ならびに少なくとも約６ｇ／Ｌのアセテートを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記糖アルコールが、約５ｍＭ〜約２０ｍＭの濃度にある、請求項１１に記載の方法。
【請求項１】
キシロースを含む混合糖類培地からエタノールを産生する方法であって：
（ａ）キシロースを資化してエタノールを産生することが可能な組み換えザイモモナス株を提供する工程であって、前記株は、組み込み宿主因子αサブユニットタンパク質（ＨｉｍＡ）の発現を減少させる少なくとも１つの遺伝子改変を含む工程と；
（ｂ）キシロースを含む混合糖類培地において（ａ）の株を培養する工程であって、それによって、キシロースは、前記株によってエタノールを産生するための炭素源として使用される工程と、
を含む、方法。
【請求項２】
培養が、約４．５〜７．５の範囲のｐＨを有する培地において約２５℃〜約４０℃の温度範囲にある、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記温度が約３０℃〜３７℃である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ｐＨが約５．８〜７．０である、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記遺伝子改変が、挿入、欠失、変異、共抑制、およびアンチセンスＲＮＡ発現からなる群から選択されるｈｉｍＡ遺伝子の改変である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記遺伝子改変が、ｈｉｍＡ遺伝子を非機能的にする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記遺伝子改変が、相同組み換えによってｈｉｍＡ遺伝子に導入される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記組み換えザイモモナス株が、ＺＷ８０１−４：：ΔｈｉｍＡまたは株ＡｃＲ＃３である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記培地がアセテートをさらに含み、かつ、前記組み換えザイモモナス株が、ｈｉｍＡ発現を減少させる遺伝子改変を有しない親株のザイモモナス株と比較して増加した量のエタノールを産生する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
産生される前記増加した量のエタノールが、前記ザイモモナス株の酢酸耐性に起因する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記培地が、キシロースを含む少なくとも約１２０ｇ／Ｌの混合糖類、約２ｍＭ〜約１００ｍＭの最終濃度でソルビトール、マンニトール、ガラクチトール、リビトール、およびそれらの混合物からなる群から選択される糖アルコール、ならびに少なくとも約６ｇ／Ｌのアセテートを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記糖アルコールが、約５ｍＭ〜約２０ｍＭの濃度にある、請求項１１に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図７】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図９Ａ−Ｂ】
【図９Ｃ】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１１Ａ】
【図１１Ｂ】
【図１２Ａ】
【図１２Ｂ】
【図１２Ｃ】
【図２】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図７】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図９Ａ−Ｂ】
【図９Ｃ】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１１Ａ】
【図１１Ｂ】
【図１２Ａ】
【図１２Ｂ】
【図１２Ｃ】
【公表番号】特表２０１１−５１５０６７（Ｐ２０１１−５１５０６７Ａ）
【公表日】平成２３年５月１９日（２０１１．５．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５３２２２９（Ｐ２０１０−５３２２２９）
【出願日】平成２０年１０月３０日（２００８．１０．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０８１６９４
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０５８９３８
【国際公開日】平成２１年５月７日（２００９．５．７）
【出願人】（３９００２３６７４）イー・アイ・デュポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニー (2,692)
【氏名又は名称原語表記】Ｅ．Ｉ．ＤＵ ＰＯＮＴ ＤＥ ＮＥＭＯＵＲＳ ＡＮＤ ＣＯＭＰＡＮＹ
【出願人】（５１０１１９６８１）アライアンス フォア サステイナブル エナジー エルエルシー (5)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年５月１９日（２０１１．５．１９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１０月３０日（２００８．１０．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０８１６９４
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０５８９３８
【国際公開日】平成２１年５月７日（２００９．５．７）
【出願人】（３９００２３６７４）イー・アイ・デュポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニー (2,692)
【氏名又は名称原語表記】Ｅ．Ｉ．ＤＵ ＰＯＮＴ ＤＥ ＮＥＭＯＵＲＳ ＡＮＤ ＣＯＭＰＡＮＹ
【出願人】（５１０１１９６８１）アライアンス フォア サステイナブル エナジー エルエルシー (5)
【Ｆターム（参考）】
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