ｍＲＮＡの絶対量を測定する方法及びシステム
【課題】 本発明は、ｍＲＮＡの絶対量を測定する方法及びシステム、特に、ｃＤＮＡマイクロアレイ上のｍＲＮＡの絶対量を測定する方法及びシステムの提供を目的とする。
【解決手段】 下記工程及び各手段が提供される：マイクロアレイを用意する；このマイクロアレイ上に少なくとも一組の連続稀釈コントロールスポットを用意する；既知の濃度の対応するコントロールｃＤＮＡとハイブリダイゼーションを行う；前記ハイブリダイゼーションから参照データを導き出し、前記参照データを用いて、使用した１以上のサンプルにおけるｍＲＮＡの絶対量を計算する。
【解決手段】 下記工程及び各手段が提供される：マイクロアレイを用意する；このマイクロアレイ上に少なくとも一組の連続稀釈コントロールスポットを用意する；既知の濃度の対応するコントロールｃＤＮＡとハイブリダイゼーションを行う；前記ハイブリダイゼーションから参照データを導き出し、前記参照データを用いて、使用した１以上のサンプルにおけるｍＲＮＡの絶対量を計算する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ｃＤＮＡがスポットされたマイクロアレイによってｍＲＮＡの絶対量を測定する方法及びシステムに関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡマイクロアレイは、数千の異なる転写産物に対してｍＲＮＡ量を同時に測定できる能力ゆえに、遺伝子発現の研究を革命的に変化させてきた（非特許文献１〜１６参照）。簡単には、増幅産物(representative)である一本鎖ＤＮＡ断片を、例えば、スライドガラス等の固形支持体上に固定し、相補ｃＤＮＡ又はｃＲＮＡに対するプローブとする。これらは、生体サンプルからｍＲＮＡプールの増幅産物(representation)として調製する。その調製は、逆転写を含み、また、ｃＲＮＡの場合には、さらに、増幅手段として、インビトロでの転写を含む。付随して、ｃＤＮＡ又はｃＲＮＡを、放射性同位体の取込み又は蛍光ダイを結合して修飾したヌクレオチドの取込みにより標識する。マイクロアレイへのハイブリダイゼーションの後、弱い結合若しくは非特異的な結合のｃＤＮＡ又はｃＲＮＡを洗い流し、ホスホイメージャー（phosphorimager；放射性ラベルの場合）又は共焦点レーザー走査装置(蛍光ラベルの場合)によりシグナルを読み取る。コンピュータ画像解析により前記アレイ上の各特徴部分（“スポット”ともいう）の位置（及びその同一性）、並びに、シグナル強度を測定する。前記シグナル強度は、この特徴部分により表される種類（species）の本来のｃＤＮＡ又はｃＲＮＡ量に対して直線性を有すると信じられている。
【０００３】
ＤＮＡマイクロアレイを用いることで、一回の実験で、数千の異なる分子に対して、ｍＲＮＡレベルの変化をモニタすることが可能となった。ｃＤＮＡがスポットされたチップの技術は、広範な用途があることが分かったが、現時点では、細胞内のｍＲＮＡ濃度の相対的変化しか測定できない。その上、製造工程における技術的限界のため、結果は、同じ製造シリーズに由来するチップに対してしか比較できない。すなわち、現時点では、実験が、約50〜200ハイブリダイゼーションに制限されている。
【０００４】
後のデータ解析において、修正しなければならない技術的問題点も、まだ多く存在する。最も突出した問題は、正規化(normalization)又は標準化(standardization）である。正規化又は標準化は、２つのサンプル間の標識化効率及びｍＲＮＡ量の違いを明らかにするものであって、２つのサンプルのｃＤＮＡ増幅産物が、２つの異なるチップにハイブリダイズされる場合、又は、同じチップにハイブリダイズされるがＵＶレーザー光により励起されると異なる色の光を発する蛍光タグで標識されて識別されるものである場合に行われる（非特許文献17〜25参照）。
【非特許文献１】Case-Green, S.C., Mir, K.U., Pritchard, C.E. & Southern, E.M. Analysing genetic information with DNA arrays. Curr. Opin. Chem. Biol. 2, 404-410 (1998).
【非特許文献２】DeRisi, J. et al. Use of a cDNA microarray to analyse gene expression patterns in human cancer. Nat. Genet. 14, 457-460 (1996).
【非特許文献３】DeRisi, J.L., Iyer, V.R. &: Brown, P.O. Exploring the metabolic and genetic control of gene expression on a genomic scale. Science 278, 680-686 (1997).
【非特許文献４】Duggan, D.J., Bittner, M., Chen, Y., Meltzer, P. & Trent, J.M. Expression profiling using cDNA microarrays. Nat. Genet. 21, 10-14 (1999).
【非特許文献５】Golub, T.R. et al. Molecular classification of cancer: class discovery and class prediction by gene expression monitoring. Science 286, 531-537 (1999).
【非特許文献６】Hegde, P. et al. A concise guide to cDNA microarray analysis. Biotechniques 29, 548-550,552-554,556 passim (2000).
【非特許文献７】Hughes, T.R. et al. Functional discovery via a compendium of expression profiles. Cell 102, 109-126 (2000).
【非特許文献８】Iyer, V.R. et al. The transcriptional program in the response of human fibroblasts to serum. Science 283, 83-87 (1999).
【非特許文献９】Khan, J., Bittner, M., Chen, Y., Meltzer, P.S. & Trent, J.M. DNA microarray technology: the anticipated impact on the study of human disease. Biochim. Biophys. Acta 1423, M17-M28 (1999).
【非特許文献１０】Lipshutz, R.J., Fodor, S.P., Gingeras, T.R. & Lockhart, D.J. High density synthetic oligonucleotide arrays. Nat. Genet. 21,20-24 (1999).
【非特許文献１１】Lockhart, D.J. et al. Expression monitoring by hybridization to high-density oligonucleotide arrays. Nat. Biotechnol. 14, 1675-1680 (1996)
【非特許文献１２】Lockhart, D.J. & Winzeler, E.A. Genomics, gene expression and DNA arrays. Nature 405, 827-836 (2000).
【非特許文献１３】Schena, M. Genome analysis with gene expression microarrays. BioEssays 18, 427-431 (1996).
【非特許文献１４】Schena, M., Shalon, D., Davis, R.W. & Brown, P.O. Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray. Science 270, 467-470 (1995).
【非特許文献１５】Shalon, D., Smith, S.J. & Brown, P.O. A DNA microarray system for analyzing complex DNA samples using two-color fluorescent probe hybridization. Genome Res. 6, 639-645 (1996).
【非特許文献１６】Spellman, P.T. et al. Comprehensive identification of cell cycle-regulated genes of the yeast Sacclzarornyces cerevisiae by microarray hybridization. Mol. Biol. Cell 9, 3273-3297 (1998).
【非特許文献１７】BeiBbarth, T. et al. Processing and quality control of DNA array hybridization data. Bioinformatics 16, 1014- 1022 (2000).
【非特許文献１８】Chudin, E. et al. Assessment of the relationship between signal intensities and transcript concentration for Affymetrix GeneChip(R) arrays. Genome Biol. 3, research0005.0001-0005 .OO10 (2001).
【非特許文献１９】Eickhoff, B., Korn, B., Schick, M., Poustka, A. & Bosch, J.v.d. Normalization of array hybridization experiments in differential gene expression analysis. Nucl. Acids Res. 27, e33 (1999).
【非特許文献２０】Lee, M.-L.T., Kuo, F.C., Whitmore, G.A. & Sklar, J. Importance of replication in microarray gene expression studies: statistical methods and evidence from repetitive cDNA hybridizations. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 9834-9839 (2000).
【非特許文献２１】Newton, M.A., Kendziorski, C.M., Richmond, C.S., Blattner, F.R. & Tsui, K.W. On differential variability of expression ratios: improving statistical inference about gene expression changes from microarray data. J. Comput. Biol. 8, 37-52 (2001).
【非特許文献２２】Chen, Y., Dougherty, E.R. & Bittner, M. Ratio-based decisions and the quantitative analysis of cDNA microarray images. J. Biomed. Opt. 2, 364-374 (1997).
【非特許文献２３】Schadt, E.E., Li, C., Su, C. & Wong, W.H. Analyzing high-density oligonucleotide gene expression array data. J. Cell. Biochem. 80, 192-202 (2000).
【非特許文献２４】Schuchhardt, J. et al. Normalization strategies for cDNA microarrays. Nucl. Acids Res. 28, E47 (2000).
【非特許文献２５】ue, H. et al. An evaluation of the performance of cDNA microarrays for detecting changes in global mRNA expression. Nzd Acids Res. 29, E41 (2001).
【非特許文献２６】Hughes, T.R. et al. Expression profiling using microarrays fabricated by an ink-jet oligonucleotide synthesizer. Nut Biotechnol 19, 342-347 (2001).
【非特許文献２７】Velculescu, V.E., Zhang, L., Vogelstein, B. & Kinzler, K.W. Serial analysis of gene expression. Science 270,484-487 (1995).
【非特許文献２８】Velculescu, V.E. et al. Analysis of human transcriptomes. Nat. Genet. 23, 387- 388 (1999).
【非特許文献２９】Bustin, S.A. Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays. J Mol Endocrinol 25, 169-193. (2000).
【非特許文献３０】Freeman, W.M., Walker, S.J. & Vrana, K.E. Quantitative RT-PCR: pitfalls and potential. Biotechniques 26, 112-122, 124-115. (1999).
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、ｍＲＮＡの絶対量を測定する改良された方法及びシステムを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
この目的は、特許請求の範囲に列挙された主題によって達成される。
【０００７】
本発明は、前述の技術的限界を克服し、ｍＲＮＡの絶対量を測定する方法を提供する。そして、前記ｍＲＮＡの絶対量は、使用されるチップのシリーズとは無関係に比較可能である。本発明の方法は、マイクロアレイ上の一組の連続稀釈したコントロールスポット、及び、既知の濃度の対応するコントロールＤＮＡ/ｃＤＮＡとのハイブリダイゼーションを含む。好ましい態様によれば、次に、モデルカーブを、前記コントロールについて得られたシグナルに適合する。そして、このモデルカーブを利用することで、使用したサンプルにおけるｍＲＮＡの絶対濃度を算出できる。これらの測定は、ｃＤＮＡマイクロアレイで行われるため、一回のハイブリダイゼーション実験で、25,000もの異なる種類のｍＲＮＡを盛り込むことができる。
【０００８】
未だ解決されていないもう一つの問題は、“スポッティング(spotting)”により製造されるチップが、個々のスポットにおけるＤＮＡ断片の表面濃度について、バッチ間で高い変化量を示すことである。この方法は、まず、プローブとされる遺伝子のｃＤＮＡテンプレートが、大規模なマルチプレックスＰＣＲ(multiplex polymerase chain reaction)により増幅される。そして、増幅された断片が、ロボット装置(roboting devices)により、マイクロアレイ支持体（ほとんどの場合、化学的に修飾された表面を有するガラスチップ）上に移される。このロボット装置は、１００μｍよりもよい空間精度で、ナノリッターの量を配置することができる。最近では、同じ目的のために、インクジェット様プリント装置が用いられている（非特許文献２６参照）。いずれのケースでも、一旦、製造したＰＣＲ断片が底をつくと、マスターテンプレートから新しいＰＣＲ調製をスタートしなければならない。数千の異なるテンプレートに対して同時に行うＰＣＲ反応の収率をコントロールすることは、現在のところ、不可能である。ＰＣＲ反応後にＤＮＡ濃度は測定できる。しかしながら、転写率(transfer rates)及び結合効率(coupling efficency)は、この方法では得ることはできない。このようにして、異なるバッチのスポッティングマイクロアレイは、それより前の生産シリーズのマイクロアレイと比較すると個々のスポットＤＮＡ濃度の変化量が１００倍に達するチップとなる。スポットＤＮＡ濃度がハイブリダイゼーション後の記録済みのシグナル強度に及ぼす影響は、ただちに明白であり、競合ハイブリダイゼーションによって克服できない。ここで、前記競合ハイブリダイゼーションとは、２つのサンプルの転写レベルの比率のみを測定するハイブリダイゼーションであって、前記サンプルの１つは、ｃＤＮＡ増幅産物が内部参照として機能するサンプルであり、１つは、調査されることとなるｍＲＮＡプールのサンプルである。このような比較困難性は、Yueとその同僚により決定的に示されている。彼等は、前記比率が、スポットＤＮＡ濃度にかなり依存しており、スポットＤＮＡ濃度が小さくなればなるほど、前記比率がより“圧縮”される（１により近くなる）であろうことを示した（非特許文献２５参照）。
【０００９】
ここで、我々は、スポットＤＮＡ濃度の影響を、その後にコンピュータにより修正することが可能となる新しい方法を提示する。この方法は、アレイ上に提示される連続稀釈したコントロールＤＮＡ、及び、アレイ上の全てのスポットに結合する規定濃度のユニバーサルターゲットを用いた数回のハイブリダイゼーションを必要とする。前記ユニバーサルターゲットを用いたハイブリダイゼーションから得られたデータに、モデルカーブを適合させることにより、修正が必要な換算値を有する一部のスポットを同定できる。他方、残りのスポットの修正は、利よりも害が大きい。本発明の方法は、現在のマイクロアレイの用途を２つの方向において適用を拡大する。第１に、マイクロアレイにより異なるｍＲＮＡの絶対量の測定を可能とする。第２に、より重要なことであるが、異なるシリーズのチップで行われた実験の比較を可能とし、さらには、例えば、ｃＤＮＡチップ、オリゴヌクレオチドチップ(非特許文献１０及び１１参照)、ＳＡＧＥ(serial analysis of gene expression、非特許文献２７及び２８参照)及びマルチプレックスリアルタイム逆転写(ＲＴ)ＰＣＲ(非特許文献２９及び３０参照)等の異なる転写レベル測定系間の比較をも可能とする。このことは、比較可能性の範囲(horizon)を拡大する。すなわち、現在、約５０〜２００チップに限られている前記範囲を、例えば、遺伝子発現プロファイルによるガンのサブタイプの分類等の、５００サンプルに達する調査を要する新たな用途に必要なレベルまで拡大できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本明細書において、下記用語を使用する；
・アレイ、マイクロアレイ、チップ：多数の特徴部分（スポット）を含み、前記スポットはそれぞれ単一種のＤＮＡ断片を含む固形支持体（例えば、化学的修飾されたガラス又はナイロン/ポリプロピレン膜）。
・特徴部分、スポット：単一種のＤＮＡ断片のみが結合するマイクロアレイ上の単一の位置。
・ハイブリダイゼーション：２つの相補ＤＮＡ分子が、ワトソン・クリック型塩基対を形成することにより、互いに結合するプロセス。
・プローブ：特定の転写を探査することとなるアレイに結合したＤＮＡ断片の一つ。
・（溶質[solute]）ターゲット：生体サンプルから調製されたｃＤＮＡ又はｃＲＮＡである。前記サンプルのｍＲＮＡプールの増幅産物であることが意図される。
・シグナル強度：単一のスポットごとに読み取られる、放射性放射線の強度又はレーザー励起による蛍光の強度。
・（生体）サンプル：規定条件下で調製される研究に用いられる生命体からの試料。例えば、培養酵母、培養細胞からのサンプル、ガン標本、生検サンプル、血液サンプルからのサンプル等があげられる。
・ユニバーサルターゲット：アレイ上の各スポットに結合する、例えば、ユニバーサルオリゴヌクレオチド等の規定の配列のＤＮＡ断片。
【００１１】
なお、本発明を実証する好ましい形態についての図面を、図１〜図３に示す。
【００１２】
（コンピュータによる処理）
ユニバーサルターゲットのハイブリダイゼーションから得られた値、すなわち、連続稀釈したスポットから読み取られたシグナル強度は、非線形最小二乗法による適合によるモデル関数のパラメータ計算の基礎として用いられる。モデル関数として、我々は下記式（１）のロジスティック関数を使用する。
【００１３】
【数４】
上記式（１）において、
【００１４】
【数５】
は、モデル化されたシグナル強度であり、ｃpは、プローブ（又はスポットＤＮＡ）濃度であり、Ｋは、ｃp→∞とした場合の漸近的シグナル強度であり、I0 は、ｃp→０とした場合の漸近的シグナル強度であり、ｒは、形状パラメータである。我々は、ｒが、溶質ターゲットｃＤＮＡ濃度にも、プローブの配列の性質にも依存ぜず、ゆえに、アレイ上の各スポットで同一であることを示すことができた（結果参照）。非線形適合における適合は、標準勾配最適化(standard gradient optimization)手順により行われるが、我々は、商品名MATLABTM(Math Works Inc., Natick, MA, U.S.A.)に導入されているニュートン・ラプソン(Newton-Raphson)法を使用した。適合手順の信頼性は、チップ上に前記連続稀釈をいくつか複製したものを使用することで、著しく向上する。我々は、少なくとも５つを使用することをすすめる。
【００１５】
前記モデル関数は、スポットＤＮＡ濃度の影響の修正が必要な値を示す一組のスポットを決定することに使用される。臨界プローブ濃度(critical probe concentration)は、下記式（２）、又は、分析的には下記式（３）により決定できる。
【００１６】
【数６】
【００１７】
【数７】
【００１８】
ユニバーサルターゲットとのハイブリダイゼーションは、所定の一組のアレイについて、前記連続稀釈から得られる値に基づき前記関数のパラメータを算出すること、及び、前記アレイ上の各スポットについてスポットＤＮＡ濃度が前記臨界プローブ濃度よりも低いか又は高いかについて決定することが可能となる。前記スポットＤＮＡ濃度が前記臨界プローブ濃度よりも高い場合は、修正の必要はない。プローブ濃度がシグナル強度に影響を及ぼさないからである。前記スポットＤＮＡ濃度が前記臨界プローブ濃度よりも低い場合には、最初に得られる近似においては、シグナル強度は、前記スポットＤＮＡ濃度に線形従属する。そして、その後のハイブリダイゼーションにおける値は、ユニバーサルターゲットとのハイブリダイゼーションからプローブ濃度を決定することにより修正することができる。
【実施例１】
【００１９】
（ナイロン膜及びポリプロピレン膜上での実施）
プローブ配列として、酵母ＯＲＦ由来の１６の異なるＰＣＲ断片（表３）を、９つの異なる濃度（表１）で、ナイロン膜及びポリプロピレン膜上にスポットした。これらのアレイと８つの異なる濃度（表２）のユニバーサルオリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションの実施は、４回行い、その後、シグナル強度を平均した。
【００２０】
（表１） 使用したスポットＤＮＡ量
固定化ＤＮＡ量
10 amol, 50 amol, 100 amol, 500 amol, 1 fmol, 5 fmol, 10 fmol, 25 fmol, 50 fmol
【００２１】
（表２） 試みたターゲット濃度
ターゲット（放射性標識したユニバーサルオリゴヌクレオチド）の濃度
2 pM, 8 pM, 20 pM, 40 pM, 80 pM, 120 pM, 160 pM, 200 pM.
【００２２】
（表３）使用したプローブ配列
ORF識別名 長さ[bp] ORF識別名 長さ[bp] ORF識別名 長さ[bp] ORF識別名 長さ[bp]
YAR030C 342 YALO55W 543 YCR045C 1476 YDR422C 2592
YAR043C 350 YARO37W 600 YCR024C 1479 YCR030C 2613
YCRO25C 411 YCLO31C 894 YCR048W 1833 YDR430C 2790
YCLO22C 516 YCR034W 1044 YBR280C 1929 YALO35W 3009
【００２３】
図１から明らかなように、測定されるシグナル強度は、スポットＤＮＡ濃度及び溶質ターゲット濃度の双方に、非線形式で依存する。スポットＤＮＡ濃度への依存性は、低スポット濃度におけるほぼ線形な区間に最もよく表されており、スポット濃度が増加してもシグナル強度が増加しない飽和領域が、それに続く。
【００２４】
他のプローブ及びポリプロピレン膜からのデータに対しても、主要な形状に相違はなかった（データは示さない）。
【実施例２】
【００２５】
（スライドガラス上での実施）
ポリ-L-リジンでコートされたスライドガラスを固形支持体として用いた。前述の１６種のＰＣＲ断片（表３）を、８つの異なる濃度（表４）で、それぞれ４個づつ前記スライド上にスポットした。このアレイを、５つの異なる濃度の蛍光標識されたユニバーサルオリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせた（表５）。
【００２６】
（表４） 使用したスポットＤＮＡ量
固定化ＤＮＡ量
0.1 amol, 0.5 amol, 1 amol, 5 amol, 10 amol, 50 amol, 100 amol, 300 amol
【００２７】
（表５） 使用した溶質ターゲット濃度
溶質ターゲットの濃度
20 pM, 200 pM, 2 nM, 20 nM, 200 nM
【００２８】
図２のデータは、同一スライド上の４つのスポット及び独立して４回繰り返したハイブリダイゼーションの平均値を示す。高スポットＤＮＡ濃度についての粗い分解能及びデータの高い変動性を除けば、ナイロン又はポリプロピレン膜における実施と比較して明らかな相違点はない。
【実施例３】
【００２９】
（モデルカーブのデータへの適合）
非線形最適化により、前記式（１）をデータに適合させた。ここでの主要な関心は、形状パラメータｒの評価である。このパラメータが、カーブの勾配を表し、従って、スポットＤＮＡ濃度の臨界スポット濃度を決定する。前記臨界スポット濃度は、スポットＤＮＡ濃度の領域を、高スポット濃度の影響が及ばない部分と、シグナルがスポット濃度に依存する部分とに分割する。ナイロン膜及びスライドガラスについて、代表的なプローブ断片のデータを図３に示す。モデル関数は、影響が及ぶ領域から影響が及ばない領域への転換点について、よく前記データに適合する。一方で、低スポット濃度の領域ではかなり逸脱した。しかしながら、使用目的からすれば、この領域における良好な適合は必要ない。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】図１は、スポットＤＮＡ濃度及び溶質ターゲット濃度に依存したナイロン膜のシグナル強度を示す。示すデータは、４回の独立した測定の平均である。代表的な４つのプローブ種についてのデータを示す。
【図２】図２は、スポットＤＮＡ濃度及び溶質ターゲット濃度に依存したスライドガラスのシグナル強度を示す。示すデータは、４回の独立した測定の平均である。代表的な４つのプローブ種についてのデータを示す。
【図３】図３は、ナイロン膜（ａ）及びスライドガラス（ｂ）上の代表的なプローブ断片についてのデータ（青）及び適合させたモデルカーブ（赤）を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ｃＤＮＡがスポットされたマイクロアレイによってｍＲＮＡの絶対量を測定する方法及びシステムに関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡマイクロアレイは、数千の異なる転写産物に対してｍＲＮＡ量を同時に測定できる能力ゆえに、遺伝子発現の研究を革命的に変化させてきた（非特許文献１〜１６参照）。簡単には、増幅産物(representative)である一本鎖ＤＮＡ断片を、例えば、スライドガラス等の固形支持体上に固定し、相補ｃＤＮＡ又はｃＲＮＡに対するプローブとする。これらは、生体サンプルからｍＲＮＡプールの増幅産物(representation)として調製する。その調製は、逆転写を含み、また、ｃＲＮＡの場合には、さらに、増幅手段として、インビトロでの転写を含む。付随して、ｃＤＮＡ又はｃＲＮＡを、放射性同位体の取込み又は蛍光ダイを結合して修飾したヌクレオチドの取込みにより標識する。マイクロアレイへのハイブリダイゼーションの後、弱い結合若しくは非特異的な結合のｃＤＮＡ又はｃＲＮＡを洗い流し、ホスホイメージャー（phosphorimager；放射性ラベルの場合）又は共焦点レーザー走査装置(蛍光ラベルの場合)によりシグナルを読み取る。コンピュータ画像解析により前記アレイ上の各特徴部分（“スポット”ともいう）の位置（及びその同一性）、並びに、シグナル強度を測定する。前記シグナル強度は、この特徴部分により表される種類（species）の本来のｃＤＮＡ又はｃＲＮＡ量に対して直線性を有すると信じられている。
【０００３】
ＤＮＡマイクロアレイを用いることで、一回の実験で、数千の異なる分子に対して、ｍＲＮＡレベルの変化をモニタすることが可能となった。ｃＤＮＡがスポットされたチップの技術は、広範な用途があることが分かったが、現時点では、細胞内のｍＲＮＡ濃度の相対的変化しか測定できない。その上、製造工程における技術的限界のため、結果は、同じ製造シリーズに由来するチップに対してしか比較できない。すなわち、現時点では、実験が、約50〜200ハイブリダイゼーションに制限されている。
【０００４】
後のデータ解析において、修正しなければならない技術的問題点も、まだ多く存在する。最も突出した問題は、正規化(normalization)又は標準化(standardization）である。正規化又は標準化は、２つのサンプル間の標識化効率及びｍＲＮＡ量の違いを明らかにするものであって、２つのサンプルのｃＤＮＡ増幅産物が、２つの異なるチップにハイブリダイズされる場合、又は、同じチップにハイブリダイズされるがＵＶレーザー光により励起されると異なる色の光を発する蛍光タグで標識されて識別されるものである場合に行われる（非特許文献17〜25参照）。
【非特許文献１】Case-Green, S.C., Mir, K.U., Pritchard, C.E. & Southern, E.M. Analysing genetic information with DNA arrays. Curr. Opin. Chem. Biol. 2, 404-410 (1998).
【非特許文献２】DeRisi, J. et al. Use of a cDNA microarray to analyse gene expression patterns in human cancer. Nat. Genet. 14, 457-460 (1996).
【非特許文献３】DeRisi, J.L., Iyer, V.R. &: Brown, P.O. Exploring the metabolic and genetic control of gene expression on a genomic scale. Science 278, 680-686 (1997).
【非特許文献４】Duggan, D.J., Bittner, M., Chen, Y., Meltzer, P. & Trent, J.M. Expression profiling using cDNA microarrays. Nat. Genet. 21, 10-14 (1999).
【非特許文献５】Golub, T.R. et al. Molecular classification of cancer: class discovery and class prediction by gene expression monitoring. Science 286, 531-537 (1999).
【非特許文献６】Hegde, P. et al. A concise guide to cDNA microarray analysis. Biotechniques 29, 548-550,552-554,556 passim (2000).
【非特許文献７】Hughes, T.R. et al. Functional discovery via a compendium of expression profiles. Cell 102, 109-126 (2000).
【非特許文献８】Iyer, V.R. et al. The transcriptional program in the response of human fibroblasts to serum. Science 283, 83-87 (1999).
【非特許文献９】Khan, J., Bittner, M., Chen, Y., Meltzer, P.S. & Trent, J.M. DNA microarray technology: the anticipated impact on the study of human disease. Biochim. Biophys. Acta 1423, M17-M28 (1999).
【非特許文献１０】Lipshutz, R.J., Fodor, S.P., Gingeras, T.R. & Lockhart, D.J. High density synthetic oligonucleotide arrays. Nat. Genet. 21,20-24 (1999).
【非特許文献１１】Lockhart, D.J. et al. Expression monitoring by hybridization to high-density oligonucleotide arrays. Nat. Biotechnol. 14, 1675-1680 (1996)
【非特許文献１２】Lockhart, D.J. & Winzeler, E.A. Genomics, gene expression and DNA arrays. Nature 405, 827-836 (2000).
【非特許文献１３】Schena, M. Genome analysis with gene expression microarrays. BioEssays 18, 427-431 (1996).
【非特許文献１４】Schena, M., Shalon, D., Davis, R.W. & Brown, P.O. Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray. Science 270, 467-470 (1995).
【非特許文献１５】Shalon, D., Smith, S.J. & Brown, P.O. A DNA microarray system for analyzing complex DNA samples using two-color fluorescent probe hybridization. Genome Res. 6, 639-645 (1996).
【非特許文献１６】Spellman, P.T. et al. Comprehensive identification of cell cycle-regulated genes of the yeast Sacclzarornyces cerevisiae by microarray hybridization. Mol. Biol. Cell 9, 3273-3297 (1998).
【非特許文献１７】BeiBbarth, T. et al. Processing and quality control of DNA array hybridization data. Bioinformatics 16, 1014- 1022 (2000).
【非特許文献１８】Chudin, E. et al. Assessment of the relationship between signal intensities and transcript concentration for Affymetrix GeneChip(R) arrays. Genome Biol. 3, research0005.0001-0005 .OO10 (2001).
【非特許文献１９】Eickhoff, B., Korn, B., Schick, M., Poustka, A. & Bosch, J.v.d. Normalization of array hybridization experiments in differential gene expression analysis. Nucl. Acids Res. 27, e33 (1999).
【非特許文献２０】Lee, M.-L.T., Kuo, F.C., Whitmore, G.A. & Sklar, J. Importance of replication in microarray gene expression studies: statistical methods and evidence from repetitive cDNA hybridizations. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 9834-9839 (2000).
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【非特許文献２２】Chen, Y., Dougherty, E.R. & Bittner, M. Ratio-based decisions and the quantitative analysis of cDNA microarray images. J. Biomed. Opt. 2, 364-374 (1997).
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【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、ｍＲＮＡの絶対量を測定する改良された方法及びシステムを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
この目的は、特許請求の範囲に列挙された主題によって達成される。
【０００７】
本発明は、前述の技術的限界を克服し、ｍＲＮＡの絶対量を測定する方法を提供する。そして、前記ｍＲＮＡの絶対量は、使用されるチップのシリーズとは無関係に比較可能である。本発明の方法は、マイクロアレイ上の一組の連続稀釈したコントロールスポット、及び、既知の濃度の対応するコントロールＤＮＡ/ｃＤＮＡとのハイブリダイゼーションを含む。好ましい態様によれば、次に、モデルカーブを、前記コントロールについて得られたシグナルに適合する。そして、このモデルカーブを利用することで、使用したサンプルにおけるｍＲＮＡの絶対濃度を算出できる。これらの測定は、ｃＤＮＡマイクロアレイで行われるため、一回のハイブリダイゼーション実験で、25,000もの異なる種類のｍＲＮＡを盛り込むことができる。
【０００８】
未だ解決されていないもう一つの問題は、“スポッティング(spotting)”により製造されるチップが、個々のスポットにおけるＤＮＡ断片の表面濃度について、バッチ間で高い変化量を示すことである。この方法は、まず、プローブとされる遺伝子のｃＤＮＡテンプレートが、大規模なマルチプレックスＰＣＲ(multiplex polymerase chain reaction)により増幅される。そして、増幅された断片が、ロボット装置(roboting devices)により、マイクロアレイ支持体（ほとんどの場合、化学的に修飾された表面を有するガラスチップ）上に移される。このロボット装置は、１００μｍよりもよい空間精度で、ナノリッターの量を配置することができる。最近では、同じ目的のために、インクジェット様プリント装置が用いられている（非特許文献２６参照）。いずれのケースでも、一旦、製造したＰＣＲ断片が底をつくと、マスターテンプレートから新しいＰＣＲ調製をスタートしなければならない。数千の異なるテンプレートに対して同時に行うＰＣＲ反応の収率をコントロールすることは、現在のところ、不可能である。ＰＣＲ反応後にＤＮＡ濃度は測定できる。しかしながら、転写率(transfer rates)及び結合効率(coupling efficency)は、この方法では得ることはできない。このようにして、異なるバッチのスポッティングマイクロアレイは、それより前の生産シリーズのマイクロアレイと比較すると個々のスポットＤＮＡ濃度の変化量が１００倍に達するチップとなる。スポットＤＮＡ濃度がハイブリダイゼーション後の記録済みのシグナル強度に及ぼす影響は、ただちに明白であり、競合ハイブリダイゼーションによって克服できない。ここで、前記競合ハイブリダイゼーションとは、２つのサンプルの転写レベルの比率のみを測定するハイブリダイゼーションであって、前記サンプルの１つは、ｃＤＮＡ増幅産物が内部参照として機能するサンプルであり、１つは、調査されることとなるｍＲＮＡプールのサンプルである。このような比較困難性は、Yueとその同僚により決定的に示されている。彼等は、前記比率が、スポットＤＮＡ濃度にかなり依存しており、スポットＤＮＡ濃度が小さくなればなるほど、前記比率がより“圧縮”される（１により近くなる）であろうことを示した（非特許文献２５参照）。
【０００９】
ここで、我々は、スポットＤＮＡ濃度の影響を、その後にコンピュータにより修正することが可能となる新しい方法を提示する。この方法は、アレイ上に提示される連続稀釈したコントロールＤＮＡ、及び、アレイ上の全てのスポットに結合する規定濃度のユニバーサルターゲットを用いた数回のハイブリダイゼーションを必要とする。前記ユニバーサルターゲットを用いたハイブリダイゼーションから得られたデータに、モデルカーブを適合させることにより、修正が必要な換算値を有する一部のスポットを同定できる。他方、残りのスポットの修正は、利よりも害が大きい。本発明の方法は、現在のマイクロアレイの用途を２つの方向において適用を拡大する。第１に、マイクロアレイにより異なるｍＲＮＡの絶対量の測定を可能とする。第２に、より重要なことであるが、異なるシリーズのチップで行われた実験の比較を可能とし、さらには、例えば、ｃＤＮＡチップ、オリゴヌクレオチドチップ(非特許文献１０及び１１参照)、ＳＡＧＥ(serial analysis of gene expression、非特許文献２７及び２８参照)及びマルチプレックスリアルタイム逆転写(ＲＴ)ＰＣＲ(非特許文献２９及び３０参照)等の異なる転写レベル測定系間の比較をも可能とする。このことは、比較可能性の範囲(horizon)を拡大する。すなわち、現在、約５０〜２００チップに限られている前記範囲を、例えば、遺伝子発現プロファイルによるガンのサブタイプの分類等の、５００サンプルに達する調査を要する新たな用途に必要なレベルまで拡大できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本明細書において、下記用語を使用する；
・アレイ、マイクロアレイ、チップ：多数の特徴部分（スポット）を含み、前記スポットはそれぞれ単一種のＤＮＡ断片を含む固形支持体（例えば、化学的修飾されたガラス又はナイロン/ポリプロピレン膜）。
・特徴部分、スポット：単一種のＤＮＡ断片のみが結合するマイクロアレイ上の単一の位置。
・ハイブリダイゼーション：２つの相補ＤＮＡ分子が、ワトソン・クリック型塩基対を形成することにより、互いに結合するプロセス。
・プローブ：特定の転写を探査することとなるアレイに結合したＤＮＡ断片の一つ。
・（溶質[solute]）ターゲット：生体サンプルから調製されたｃＤＮＡ又はｃＲＮＡである。前記サンプルのｍＲＮＡプールの増幅産物であることが意図される。
・シグナル強度：単一のスポットごとに読み取られる、放射性放射線の強度又はレーザー励起による蛍光の強度。
・（生体）サンプル：規定条件下で調製される研究に用いられる生命体からの試料。例えば、培養酵母、培養細胞からのサンプル、ガン標本、生検サンプル、血液サンプルからのサンプル等があげられる。
・ユニバーサルターゲット：アレイ上の各スポットに結合する、例えば、ユニバーサルオリゴヌクレオチド等の規定の配列のＤＮＡ断片。
【００１１】
なお、本発明を実証する好ましい形態についての図面を、図１〜図３に示す。
【００１２】
（コンピュータによる処理）
ユニバーサルターゲットのハイブリダイゼーションから得られた値、すなわち、連続稀釈したスポットから読み取られたシグナル強度は、非線形最小二乗法による適合によるモデル関数のパラメータ計算の基礎として用いられる。モデル関数として、我々は下記式（１）のロジスティック関数を使用する。
【００１３】
【数４】
上記式（１）において、
【００１４】
【数５】
は、モデル化されたシグナル強度であり、ｃpは、プローブ（又はスポットＤＮＡ）濃度であり、Ｋは、ｃp→∞とした場合の漸近的シグナル強度であり、I0 は、ｃp→０とした場合の漸近的シグナル強度であり、ｒは、形状パラメータである。我々は、ｒが、溶質ターゲットｃＤＮＡ濃度にも、プローブの配列の性質にも依存ぜず、ゆえに、アレイ上の各スポットで同一であることを示すことができた（結果参照）。非線形適合における適合は、標準勾配最適化(standard gradient optimization)手順により行われるが、我々は、商品名MATLABTM(Math Works Inc., Natick, MA, U.S.A.)に導入されているニュートン・ラプソン(Newton-Raphson)法を使用した。適合手順の信頼性は、チップ上に前記連続稀釈をいくつか複製したものを使用することで、著しく向上する。我々は、少なくとも５つを使用することをすすめる。
【００１５】
前記モデル関数は、スポットＤＮＡ濃度の影響の修正が必要な値を示す一組のスポットを決定することに使用される。臨界プローブ濃度(critical probe concentration)は、下記式（２）、又は、分析的には下記式（３）により決定できる。
【００１６】
【数６】
【００１７】
【数７】
【００１８】
ユニバーサルターゲットとのハイブリダイゼーションは、所定の一組のアレイについて、前記連続稀釈から得られる値に基づき前記関数のパラメータを算出すること、及び、前記アレイ上の各スポットについてスポットＤＮＡ濃度が前記臨界プローブ濃度よりも低いか又は高いかについて決定することが可能となる。前記スポットＤＮＡ濃度が前記臨界プローブ濃度よりも高い場合は、修正の必要はない。プローブ濃度がシグナル強度に影響を及ぼさないからである。前記スポットＤＮＡ濃度が前記臨界プローブ濃度よりも低い場合には、最初に得られる近似においては、シグナル強度は、前記スポットＤＮＡ濃度に線形従属する。そして、その後のハイブリダイゼーションにおける値は、ユニバーサルターゲットとのハイブリダイゼーションからプローブ濃度を決定することにより修正することができる。
【実施例１】
【００１９】
（ナイロン膜及びポリプロピレン膜上での実施）
プローブ配列として、酵母ＯＲＦ由来の１６の異なるＰＣＲ断片（表３）を、９つの異なる濃度（表１）で、ナイロン膜及びポリプロピレン膜上にスポットした。これらのアレイと８つの異なる濃度（表２）のユニバーサルオリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションの実施は、４回行い、その後、シグナル強度を平均した。
【００２０】
（表１） 使用したスポットＤＮＡ量
固定化ＤＮＡ量
10 amol, 50 amol, 100 amol, 500 amol, 1 fmol, 5 fmol, 10 fmol, 25 fmol, 50 fmol
【００２１】
（表２） 試みたターゲット濃度
ターゲット（放射性標識したユニバーサルオリゴヌクレオチド）の濃度
2 pM, 8 pM, 20 pM, 40 pM, 80 pM, 120 pM, 160 pM, 200 pM.
【００２２】
（表３）使用したプローブ配列
ORF識別名 長さ[bp] ORF識別名 長さ[bp] ORF識別名 長さ[bp] ORF識別名 長さ[bp]
YAR030C 342 YALO55W 543 YCR045C 1476 YDR422C 2592
YAR043C 350 YARO37W 600 YCR024C 1479 YCR030C 2613
YCRO25C 411 YCLO31C 894 YCR048W 1833 YDR430C 2790
YCLO22C 516 YCR034W 1044 YBR280C 1929 YALO35W 3009
【００２３】
図１から明らかなように、測定されるシグナル強度は、スポットＤＮＡ濃度及び溶質ターゲット濃度の双方に、非線形式で依存する。スポットＤＮＡ濃度への依存性は、低スポット濃度におけるほぼ線形な区間に最もよく表されており、スポット濃度が増加してもシグナル強度が増加しない飽和領域が、それに続く。
【００２４】
他のプローブ及びポリプロピレン膜からのデータに対しても、主要な形状に相違はなかった（データは示さない）。
【実施例２】
【００２５】
（スライドガラス上での実施）
ポリ-L-リジンでコートされたスライドガラスを固形支持体として用いた。前述の１６種のＰＣＲ断片（表３）を、８つの異なる濃度（表４）で、それぞれ４個づつ前記スライド上にスポットした。このアレイを、５つの異なる濃度の蛍光標識されたユニバーサルオリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせた（表５）。
【００２６】
（表４） 使用したスポットＤＮＡ量
固定化ＤＮＡ量
0.1 amol, 0.5 amol, 1 amol, 5 amol, 10 amol, 50 amol, 100 amol, 300 amol
【００２７】
（表５） 使用した溶質ターゲット濃度
溶質ターゲットの濃度
20 pM, 200 pM, 2 nM, 20 nM, 200 nM
【００２８】
図２のデータは、同一スライド上の４つのスポット及び独立して４回繰り返したハイブリダイゼーションの平均値を示す。高スポットＤＮＡ濃度についての粗い分解能及びデータの高い変動性を除けば、ナイロン又はポリプロピレン膜における実施と比較して明らかな相違点はない。
【実施例３】
【００２９】
（モデルカーブのデータへの適合）
非線形最適化により、前記式（１）をデータに適合させた。ここでの主要な関心は、形状パラメータｒの評価である。このパラメータが、カーブの勾配を表し、従って、スポットＤＮＡ濃度の臨界スポット濃度を決定する。前記臨界スポット濃度は、スポットＤＮＡ濃度の領域を、高スポット濃度の影響が及ばない部分と、シグナルがスポット濃度に依存する部分とに分割する。ナイロン膜及びスライドガラスについて、代表的なプローブ断片のデータを図３に示す。モデル関数は、影響が及ぶ領域から影響が及ばない領域への転換点について、よく前記データに適合する。一方で、低スポット濃度の領域ではかなり逸脱した。しかしながら、使用目的からすれば、この領域における良好な適合は必要ない。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】図１は、スポットＤＮＡ濃度及び溶質ターゲット濃度に依存したナイロン膜のシグナル強度を示す。示すデータは、４回の独立した測定の平均である。代表的な４つのプローブ種についてのデータを示す。
【図２】図２は、スポットＤＮＡ濃度及び溶質ターゲット濃度に依存したスライドガラスのシグナル強度を示す。示すデータは、４回の独立した測定の平均である。代表的な４つのプローブ種についてのデータを示す。
【図３】図３は、ナイロン膜（ａ）及びスライドガラス（ｂ）上の代表的なプローブ断片についてのデータ（青）及び適合させたモデルカーブ（赤）を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｍＲＮＡの絶対量を測定する方法であって、ＤＮＡマイクロアレイを用いた下記工程により測定する方法。
ａ．マイクロアレイを用意し、
ｂ．前記マクロアレイ上に、少なくとも一組の連続稀釈コントロールスポットを用意し、
ｃ．既知の濃度の対応するコントロールＤＮＡとハイブリダイゼーションをし、
ｄ．前記ハイブリダイゼーションから参照データを導き、
ｅ．前記参照データを利用して、１つ以上の使用したサンプルにおけるｍＲＮＡの絶対量を算出する。
【請求項２】
さらに、定量に使用するために、前記アレイ上の固定化されたプローブそれぞれについてユニバーサルタグを用意する工程を含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＤＮＡマイクロアレイがｃＤＮＡマイクロアレイであり、及び／又は、前記コントロールＤＮＡがコントロールｃＤＮＡである請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記参照データが、得られたコントロールのシグナルに適合又は適応されるモデルカーブを含む前記いずれかの請求項に記載の方法。
【請求項５】
プローブとされる遺伝子のｃＤＮＡの鋳型を、最初に、大規模なマルチプレックスポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)により増幅し、増幅断片を得る前記いずれかの請求項に記載の方法。
【請求項６】
前記増幅断片が、次に、１００μｍよりもよい空間精度でナノリッターの量を配置することができるロボット装置により、前記マイクロアレイ上に移される請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ハイブリダイゼーションから得られる前記参照データ、例えば、前記連続稀釈スポットから読み取られたシグナル強度が、非線形最小二乗法の適合によるモデル関数のパラメータの算出の基礎として用いられる前記いずれかの請求項に記載の方法。
【請求項８】
前記モデル関数として、下記関数が使用される請求項７に記載の方法。
【数１】
上記式において、
【数２】
は、モデル化されたシグナル強度であり、ｃpは、プローブ（又はスポットＤＮＡ）濃度であり、Ｋは、ｃp→∞とした場合の漸近的シグナル強度であり、I0 は、ｃp→０とした場合の漸近的シグナル強度であり、ｒは、形状パラメータである。
【請求項９】
前記参照データの適合が、勾配最適化手順によって行われる請求項４から８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
非線形の適合に、ニュートン・ラプソン法が使用される請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
臨界プローブ関数が、スポットＤＮＡ濃度の影響の修正が必要な値を示す一組のスポットを決定するために使用され、前記臨界プローブ濃度関数が、下記式で規定される前記いずれかの請求項に記載の方法。
【数３】
【請求項１２】
コンピュータコード手段を含むコンピュータプログラム産物であって、コンピュータで前記プログラム産物を作動させた場合に、前記請求項に記載の少なくとも１つの方法における計算可能な部分を実行する、コンピュータ読み取り可能な媒体に保存されたコンピュータプログラム産物。
【請求項１３】
システム、特に、請求項１から１１の少なくとも一項に記載の方法を実行するためのシステムであって、
ａ．少なくとも一組の連続稀釈コントロールスポットを含むマイクロアレイ、
ｂ．既知の濃度の相補コントロールＤＮＡとハイブリダイゼーションする手段、
ｃ．前記ハイブリダイゼーションから参照データを導く手段、及び
ｄ．１つ以上のサンプルにおけるｍＲＮＡの絶対量を算出するために前記参照データを利用する手段を含むシステム。
【請求項１４】
さらに、定量に使用するために、前記アレイ上の固定化されたプローブそれぞれについてユニバーサルタグを備える手段を含む請求項１３に記載のシステム。
【請求項１５】
請求項１から１１の少なくとも一項に記載の方法、請求項１２に記載のコンピュータプログラム産物、及び/又は、請求項１３又は１４の少なくとも一項に記載のシステムの使用であって、ｃＤＮＡマイクロアレイ上のｍＲＮＡの絶対量の測定における使用。
【請求項１６】
請求項１から１１のいずれかに記載の方法により、複合サンプル中のＤＮＡ又はタンパク質と同様なその他の生体分子の絶対的定量を行う方法。
【請求項１】
ｍＲＮＡの絶対量を測定する方法であって、ＤＮＡマイクロアレイを用いた下記工程により測定する方法。
ａ．マイクロアレイを用意し、
ｂ．前記マクロアレイ上に、少なくとも一組の連続稀釈コントロールスポットを用意し、
ｃ．既知の濃度の対応するコントロールＤＮＡとハイブリダイゼーションをし、
ｄ．前記ハイブリダイゼーションから参照データを導き、
ｅ．前記参照データを利用して、１つ以上の使用したサンプルにおけるｍＲＮＡの絶対量を算出する。
【請求項２】
さらに、定量に使用するために、前記アレイ上の固定化されたプローブそれぞれについてユニバーサルタグを用意する工程を含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＤＮＡマイクロアレイがｃＤＮＡマイクロアレイであり、及び／又は、前記コントロールＤＮＡがコントロールｃＤＮＡである請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記参照データが、得られたコントロールのシグナルに適合又は適応されるモデルカーブを含む前記いずれかの請求項に記載の方法。
【請求項５】
プローブとされる遺伝子のｃＤＮＡの鋳型を、最初に、大規模なマルチプレックスポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)により増幅し、増幅断片を得る前記いずれかの請求項に記載の方法。
【請求項６】
前記増幅断片が、次に、１００μｍよりもよい空間精度でナノリッターの量を配置することができるロボット装置により、前記マイクロアレイ上に移される請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ハイブリダイゼーションから得られる前記参照データ、例えば、前記連続稀釈スポットから読み取られたシグナル強度が、非線形最小二乗法の適合によるモデル関数のパラメータの算出の基礎として用いられる前記いずれかの請求項に記載の方法。
【請求項８】
前記モデル関数として、下記関数が使用される請求項７に記載の方法。
【数１】
上記式において、
【数２】
は、モデル化されたシグナル強度であり、ｃpは、プローブ（又はスポットＤＮＡ）濃度であり、Ｋは、ｃp→∞とした場合の漸近的シグナル強度であり、I0 は、ｃp→０とした場合の漸近的シグナル強度であり、ｒは、形状パラメータである。
【請求項９】
前記参照データの適合が、勾配最適化手順によって行われる請求項４から８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
非線形の適合に、ニュートン・ラプソン法が使用される請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
臨界プローブ関数が、スポットＤＮＡ濃度の影響の修正が必要な値を示す一組のスポットを決定するために使用され、前記臨界プローブ濃度関数が、下記式で規定される前記いずれかの請求項に記載の方法。
【数３】
【請求項１２】
コンピュータコード手段を含むコンピュータプログラム産物であって、コンピュータで前記プログラム産物を作動させた場合に、前記請求項に記載の少なくとも１つの方法における計算可能な部分を実行する、コンピュータ読み取り可能な媒体に保存されたコンピュータプログラム産物。
【請求項１３】
システム、特に、請求項１から１１の少なくとも一項に記載の方法を実行するためのシステムであって、
ａ．少なくとも一組の連続稀釈コントロールスポットを含むマイクロアレイ、
ｂ．既知の濃度の相補コントロールＤＮＡとハイブリダイゼーションする手段、
ｃ．前記ハイブリダイゼーションから参照データを導く手段、及び
ｄ．１つ以上のサンプルにおけるｍＲＮＡの絶対量を算出するために前記参照データを利用する手段を含むシステム。
【請求項１４】
さらに、定量に使用するために、前記アレイ上の固定化されたプローブそれぞれについてユニバーサルタグを備える手段を含む請求項１３に記載のシステム。
【請求項１５】
請求項１から１１の少なくとも一項に記載の方法、請求項１２に記載のコンピュータプログラム産物、及び/又は、請求項１３又は１４の少なくとも一項に記載のシステムの使用であって、ｃＤＮＡマイクロアレイ上のｍＲＮＡの絶対量の測定における使用。
【請求項１６】
請求項１から１１のいずれかに記載の方法により、複合サンプル中のＤＮＡ又はタンパク質と同様なその他の生体分子の絶対的定量を行う方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公表番号】特表２００６−５０６６０５（Ｐ２００６−５０６６０５Ａ）
【公表日】平成１８年２月２３日（２００６．２．２３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００３−５８０５６０（Ｐ２００３−５８０５６０）
【出願日】平成１５年３月２８日（２００３．３．２８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００３／００３２９１
【国際公開番号】ＷＯ２００３／０８３１２７
【国際公開日】平成１５年１０月９日（２００３．１０．９）
【出願人】（５０４３６３８３２）
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年２月２３日（２００６．２．２３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１５年３月２８日（２００３．３．２８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００３／００３２９１
【国際公開番号】ＷＯ２００３／０８３１２７
【国際公開日】平成１５年１０月９日（２００３．１０．９）
【出願人】（５０４３６３８３２）
【Ｆターム（参考）】
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