ｐ５３の状態と遺伝子発現プロファイルとの関連性に基づき、癌を分類し、予後を予測し、そして診断する方法、システム、およびアレイ
本発明は、ｐ５３の変異状態と、所定の遺伝子セットの遺伝子発現プロファイルとを関連付けることに基づく、患者で疾患感受性を予測するための方法、システム、および組成を提供する。いくつかの実施形態では、癌を分類し、予後を予測し、そして診断する方法を提供する。他の実施形態では、本発明は、患者で疾患感受性を予測し、癌腫を分類し、そして臨床結果の予後を予測するのに使用しうる、遺伝子発現を基にした分類指標を構築するための統計法を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概括的に、患者で疾患感受性を予測するためのシステム、組成、および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
５０％を超えるヒト癌でｐ５３内変異は生じると考えられ、その変異はＤＮＡ結合ドメインおよびトランス活性化ドメインで観察されることが非常に多く、腫瘍発生の抑制においてその転写活性が重要であることを強く示している。ほとんどの癌種とは異なり、孤発性乳癌では、ｐ５３変異は約２０％の事例で観察されるに過ぎない。しかし、ｐ５３生殖細胞系列変異を有する個人（すなわちリフラウメニ症候群）で、乳癌が多く観察されることは、乳癌の発生においてｐ５３の不活化が特に重要な役割を担い、そしておそらく同様にｐ５３の機能を損ないうる他の因子も重要な役割を担うことを示唆している。
【０００３】
例えば、近年、ＨＯＸＡ５転写因子の過剰メチル化と、その後の阻害に続いて、ｐ５３の転写活性化が減少することは、ありうるエピジェネティック機序として、乳癌でのｐ５３の発現の減少に関係付けられてきた。両胸部腫瘍および他の癌種では、その産生物がｐ５３の分解を促進するＭＤＭ２遺伝子の増幅と過剰発現が、発癌に関係付けられてきた。さらに、ＭＤＭ２の負の制御因子であるｐ１４ＡＲＦ遺伝子の欠失およびエピジェネティックサイレンシングは、様々な癌種で観察されている。従って、乳癌の発癌におけるｐ５３の欠陥は、潜在的にｐ５３遺伝子変異以外のいくつかの機序から生じうる。
【０００４】
ｐ５３の状態は、いくつかの癌種で、特に乳癌で、予後の予測に重要であるという証拠がある。乳癌では、ｐ５３変異は、他の危険因子とは無関係に、全体的な無病生存期間を低下させ、腫瘍が再発する頻度を上昇させる。近年の証拠は、ｐ５３の不活化が、おそらくｐ５３依存性アポトーシスを喪失させることにより、胸部腫瘍をある種のＤＮＡ損傷性化学療法および内分泌療法に耐性にすることを示唆している。
【０００５】
しかし、これらの研究の全てにおいて、ｐ５３突然変異体の予後予測の可能性および治療耐性度は、変異の種類または変異が生じる正確なドメインなど、突然変異体の特定の特質に多く依存していることが判明した。重要なことには、この後者の観察は、ｐ５３の全ての変異の影響が等しいわけではなく、つまりあるものは単に機能を喪失させるだけであり、またあるものは優性阻害効果（野生型ｐ５３のトランス優性の抑制または発癌機能獲得など）を有し、さらにあるものは、例えば、ｐ５３下流転写標的遺伝子の小サブセットだけを調節不全にして、部分的にのみ機能を喪失させるという従来の研究から得た知見に一致する。こうした理由で、どの一つのｐ５３の状態の分子評価も、ｐ５３の完全な機能の絶対的指標になっていないと思われる。
【非特許文献１】Bergh, J.、 Norberg, T.、Sjogren, S.、Lindgren, A. および Holmberg, L. “Complete sequencing of the p53 gene provides prognostic information in breast cancer patients, particularly in relation to adjuvant systemic therapy and radiotherapy（ｐ５３遺伝子完全シーケンシングによる、乳癌患者で、特に、アジュバント全身治療および放射線治療と関連する予後予測情報の提供）” Nat Med 1, 1029-34 (1995)
【非特許文献２】Elston, C. W. および Ellis, I. O. “Pathological prognostic factors in breast cancer. I. The value of histological grade in breast cancer: experience from a large study with long-term follow-up（乳癌における病理学的予後予測要因．Ｉ 乳癌における組織学的等級値：長期追跡による大研究から得た経験）” Histopathology 19, 403-10 (1991)
【非特許文献３】Egyhazi, S.ら、”Proteinase K added to the extraction procedure markedly increases RNA yield from primary breast tumors for use in microarray studies（抽出手順に添加したプロテイナーゼＫが、マイクロアレイ研究で使用する胸部原発腫瘍から得たＲＮＡの収量を顕著に増大）” Clin Chem 50, 975-6(2004)
【非特許文献４】Cattoretti, G.、Rilke, F.、Andreola, S.、D'Amato, L. および Delia, D. “P53 expression in breast cancer（乳癌でのＰ５３の発現）”. Int J Cancer. 41,178-83 (1988)
【非特許文献５】Isola, J.、Visakorpi, T.、Holli, K. および Xallioniemi, O. P. “Association of overexpression of tumor suppressor protein p53 with rapid cell proliferation and poor prognosis in node-negative breast cancer patients（リンパ節陰性乳癌患者における癌抑制タンパク質ｐ５３の過剰発現と迅速な細胞増殖および不十分な予後予測との関連性）” J Natl Cancer Inst 84, 1109-14. (1992)
【非特許文献６】Andersen, T. I.ら、”Prognostic significance of TP53 alterations in breast carcinoma（乳癌におけるＴＰ５３改変の予後予測の重要性）.”Br J Cancer 68, 540-8 (1993)
【非特許文献７】Bhargava, V.ら、”The association of p53 immunopositivity with tumor proliferation and other prognostic indicators in breast cancer（乳癌におけるｐ５３免疫陽性と、腫瘍増殖および他の予後予測指標との関連性）” Mod Pathol 7, 361-8 (1994)
【非特許文献８】Dudoit, S., Frilyand, J. および Speed, T. P. “Comparison of discrimination methods for the classification of tumors using gene expression data（遺伝子発現データを使用する、腫瘍を分類するための判別法比較）”、Journal of the American Statistical Association 97, 77-87. (2002)
【非特許文献９】Sorlie, T.ら、”Repeated observation of breast tumor subtypes in independent gene expression data sets（独立した遺伝子発現データセットにおける胸部腫瘍サブタイプの反復観察）” Proc Natl Acad Sci USA 100, 8418-23 (2003)
【非特許文献１０】Chen, X.ら、”Gene expression patterns in human liver cancers（ヒト肝臓癌での遺伝子発現パターン）”、Mol Biol. Cell 13, 1929-39 (2002)
【非特許文献１１】Chen, X.ら、”Gene expression patterns in human liver cancers（ヒト肝臓癌における遺伝子発現パターン）” Mol Biol Cell 13,1929-39 (2002)
【非特許文献１２】Kel, A. E.ら、ＭＡＴＣＨ：A tool for searching transcription factor binding sites in DNA sequences （ＤＮＡ配列中の転写因子結合部位を探索するツール）、Nucleic Acids Res 31, 3576-9 (2003)
【非特許文献１３】el-Deiry, W. S., Kern, S. E., Pietenpol, J. A., Kinzler, K. W. および Vogelstein, B. “ Definition of a consensus binding site for p53（ｐ５３のコンセンサス結合部位定義）”、Nat Genet 1, 45-9 (1992)
【非特許文献１４】Berns, E. M.ら、”Complete sequencing of TP53 predicts poor response to systemic therapy of advanced breast cancer（ＴＰ５３の完全シーケンシングが、進行した乳癌の全身療法に対して不十分な応答を予測）”、Cancer Res 60, 2155-62 (2000)
【非特許文献１５】van't Veer, L. J.ら、”Gene expression profiling predicts clinical outcome of breast cancer（遺伝子発現プロファイリングによって乳癌の臨床結果を予測する）” Nature 415, 530-6 (2002)
【非特許文献１６】Forozan, F.ら、”Comparative genomic hybridization analysis of 38 breast cancer cell lines: a basis for interpreting complementary DNA microarray data（３８乳癌細胞系統の比較ゲノムハイブリダイゼーション分析：相補的ＤＮＡマイクロアレイデータを解釈するための基本)”、Cancer Res 60, 4519-25 (2000)
【非特許文献１７】Tanner, M. M.ら、”Frequent amplification of chromosomal region 20ql2-ql3 in ovarian cancer（卵巣癌中の染色体領域２０ｑ１２−ｑ１３の高頻度増幅）”、Clin Cancer Res 6, 1833-9 (2000)
【非特許文献１８】Krop, I. E.ら、”HIN-1, a putative cytokine highly expressed in normal but not cancerous mammary epithelial cells（ＨＩＮ−１、正常であり癌ではない乳房上皮細胞中高度に発現した推定サイトカイン)”、Proc Natl Acad Sci USA 98, 9796-801(2001)
【非特許文献１９】SetubalおよびMeidanisら、『Introduction to Coniputational Biology Methods （コンピューターによる生物学的方法の手引き）』(PWS Publishing Corripany, Boston, 1997)
【非特許文献２０】Salzberg、Searles、Kasif、（編）、『Computational Methods in Molecular Biology（分子生物学におけるコンピューターによる方法）』、(Elsevier, Amsterdam, 1998)
【非特許文献２１】RashidiおよびBuehlei、『Bioinformatics Basics: Application in Biological Science and Medicine（バイオインフォマティクスの基礎：生物科学および医薬における応用）』(CRC Press, London, 2000)
【非特許文献２２】OueletteおよびBzevanis、『Bioinformatics: A Practical Guide for Analysis of Gene and Proteins（バイオインフォマティクス：遺伝子およびタンパク質分析用実用的ガイド）』(Wiley & Sons, Inc., 第２版,2001)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
癌の予後予測および診断を向上させる努力の中では、異なるｐ５３変異が、一般的に細胞機能に、特に、遺伝子発現に及ぼす影響をより正しく評価する方法が必要とされている。
【０００７】
概要
【課題を解決するための手段】
【０００８】
従って、本発明は、ｐ５３のｉｎ ｖｉｖｏ機能性をより有用に測定する方法、システム、および組成を提供する。これらの方法、システム、および組成は、癌の分類、予後予測、および診断に使用しうる。
【０００９】
本発明の一態様では、患者で疾患の結果を予測する方法であって、ｐ５３遺伝子の突然変異体または野生型でありうる腫瘍試料の複数の遺伝子から遺伝子発現プロファイルを得るステップ、突然変異腫瘍または野生型腫瘍中でどの遺伝子が差次的に発現しているのかを判定するために、該遺伝子発現プロファイルを比較するステップ、差次的に発現した該遺伝子から、ｐ５３の変異状態を予測するための遺伝子セットを抽出するステップ、および患者で疾患の結果を予測するために、該遺伝子セットを使用するステップを含む上記方法を提供する。
【００１０】
本発明の別の態様では、後期乳癌患者で疾患の結果を予測する方法であって、ｐ５３遺伝子の突然変異体または野生型でありうる腫瘍試料の複数の遺伝子から遺伝子発現プロファイルを得るステップ、突然変異腫瘍または野生型腫瘍中でどの遺伝子が差次的に発現しているのかを判定するために、該遺伝子発現プロファイルを比較するステップ、差次的に発現した該遺伝子から、ｐ５３の変異状態を予測するための遺伝子セットを抽出するステップ、および後期乳癌患者で疾患の結果を予測するために、該遺伝子セットを使用するステップであって、該遺伝子セットがGenBank受託番号：ＢＧ２７１９２３（配列番号２２）、ＮＭ_００２４６６（配列番号３１）、Ｄ３８５５３（配列番号１１）、ＮＭ_０００９０９（配列番号９）、ＮＭ_０２４８４３（配列番号１）、Ｒ７３０３０（配列番号２９）、ＮＭ_００３２２６（配列番号２８）、ＡＷ２９９５３８（配列番号５）、およびＡＩ９９０４６５（配列番号２５）からなる群から選択されるステップ含む方法を提供する。
【００１１】
本発明のさらに別の態様では、初期であり局所治療を受けた乳癌患者で臨床結果を予測する方法であって、ｐ５３遺伝子の突然変異体または野生型でありうる腫瘍試料の複数の遺伝子から遺伝子発現プロファイルを得るステップ、突然変異腫瘍または野生型腫瘍中でどの遺伝子が差次的に発現しているのかを判定するために、該遺伝子発現プロファイルを比較するステップ、差次的に発現した該遺伝子から、ｐ５３の変異状態を予測するための遺伝子セットを抽出するステップ、および初期であり局所治療を受けた乳癌患者で疾患の結果を予測するために、該遺伝子セットを使用するステップであって、該遺伝子セットがGenBank受託番号：ＡＩ９６１２３５（配列番号２３）、ＢＧ２７１９２３（配列番号２２）、ＮＭ_００２４６６（配列番号３１）、ＢＣ００１６５１（配列番号１４）、Ｄ３８５５３（配列番号１１）、ＡＫ０００３４５（配列番号２６）、ＢＣ００４５０４（配列番号８）、ＮＭ_０００９０９（配列番号９）、ＮＭ_０２４８４３（配列番号１）、Ｒ７３０３０（配列番号２９）、ＡＩ４３５８２８（配列番号２０）、ＡＩ８１０７６４（配列番号２４）、ＡＩ９２２３２３（配列番号１０）、ＮＭ_００３２２５（配列番号３２）、ＮＭ_００３２２６（配列番号２８）、ＡＷ２９９５３８（配列番号５）、ＮＭ_００３４６２（配列番号１６）、ＡＩ９９０４６５（配列番号２５）、ＮＭ_００４３９２（配列番号１５）、ＮＭ_００１２６７（配列番号７）、およびＡＩ８２６４３７（配列番号３）からなる群から選択されるステップを含む上記方法を提供する。
【００１２】
本発明の別の態様では、肝臓癌患者で臨床結果を予測する方法であって、ｐ５３遺伝子の突然変異体または野生型でありうる腫瘍試料の複数の遺伝子から遺伝子発現プロファイルを得るステップ、突然変異腫瘍または野生型腫瘍中でどの遺伝子が差次的に発現しているのかを判定するために、該遺伝子発現プロファイルを比較するステップ、差次的に発現した該遺伝子から、ｐ５３の変異状態を予測するための遺伝子セットを抽出するステップ、および肝臓癌患者で疾患の結果を予測するために、該遺伝子セットを使用するステップであって、該遺伝子セットが、GenBank受託番号：ＮＭ_００２４６６（配列番号３１）、ＢＣ００１６５１（配列番号１４）、Ｄ３８５５３（配列番号１１）、ＮＭ_０２４８４３（配列番号１）、ＡＩ４３５８２８（配列番号２０）、ＡＩ８１０７６４（配列番号２４）、ＮＭ_００３２２６（配列番号２８）、およびＡＷ２９９５３８（配列番号５）からなる群から選択されるステップを含む上記方法を提供する。
【００１３】
本発明のさらに別の態様では、患者で疾患の結果を予測するための遺伝子群を同定する方法であって、ｐ５３遺伝子の突然変異体または野生型でありうる腫瘍試料の複数の遺伝子から遺伝子発現プロファイルを得るステップ、突然変異腫瘍または野生型腫瘍中でどの遺伝子が差次的に発現しているのかを判定するために、該遺伝子発現プロファイルを比較するステップ、ｐ５３の変異状態を予測するために、差次的に発現した該遺伝子をその能力に従ってランク付けるステップ、突然変異体および野生型のｐ５３遺伝子発現プロファイルを識別するために、ランク付けしたそれらの遺伝子を訓練するステップ、ｐ５３の変異状態を予測する能力がある遺伝子セットを含むｐ５３分類指標を得るステップ、独立したデータセット中の該ｐ５３分類指標を確証するステップ、および患者で疾患の結果を予測するために、該ｐ５３分類指標の能力を評価するステップを含む上記方法を提供する。
【００１４】
本発明の別の態様では、患者で疾患の結果を予測するためのコンピューターシステムであって、プロセッサとメモリとを有するコンピューターを備え、該メモリ上には、ｐ５３遺伝子の突然変異体または野生型でありうる腫瘍試料の複数の遺伝子から遺伝子発現プロファイルを得るステップ、突然変異腫瘍または野生型腫瘍中でどの遺伝子が差次的に発現しているのかを判定するために、該遺伝子発現プロファイルを比較するステップ、差次的に発現した該遺伝子から、ｐ５３の変異状態を予測するための遺伝子セットを抽出するステップ、および患者で疾患の結果を予測するために、該遺伝子セットを使用するステップを実施するために、プロセッサに実行させる実行可能コードが保存されている上記コンピューターシステムを提供する。
【００１５】
本発明のさらに別の態様ではｐ５３の変異状態を予測する能力がある複数の遺伝子を固体支持体に固定させた、患者で疾患感受性を予測するための診断ツールを提供する。
【００１６】
本発明のさらに別の態様では、固体支持体と、その上にディスプレイさせた、患者でｐ５３の変異状態を予測する能力がある遺伝子に対応する核酸プローブとを有する、患者で疾患感受性を予測するための核酸アレイを提供する。
【００１７】
これらの態様および実施形態を以下にさらに詳しく述べる。
【００１８】
定義
本出願で使用されるように、単数形の「a」、「an」、および「the」は、前後関係から明瞭にそうではないと指摘されない限り複数の意味を包含する。例えば、「（an）薬剤」という用語は、複数の薬剤を含み、それらの混合物も含む。
【００１９】
個体は、ヒトだけには限らず、哺乳動物、無脊椎動物、植物、真菌、ウイルス、細菌を含むが、それだけには限らない他の生物、あるいは上記のいずれかに由来する一つまたは複数の細胞であってもよい。
【００２０】
本明細書で使用する「comprising」という用語は、「including」を意味する。「comprising」という語の変形、例えば、「comprise」および「comprises」は、対応して変化した意味を持つ。
【００２１】
本開示全体にわたって、本発明の様々な態様を一範囲型式で示す。範囲型式での記述は、単に便宜、簡潔さのためと理解すべきであり、本発明の範囲を柔軟性なく制限するものと解釈すべきではない。従って、範囲の記述は、具体的に開示した全ての可能な下位範囲およびその範囲内の個々の数値を含むと考えるべきである。例えば、１〜６などの範囲の記述は、具体的に開示した下位範囲、例えば、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６、およびその範囲内の個々の番号、例えば、１、２、３、４、５、および６を含むと考えるべきである。これは、範囲の幅に関わらず該当する。
【００２２】
本明細書で使用する「組織学的等級」または「腫瘍等級」という用語は、Elston-Ellis系腫瘍等級法に従い分類した腫瘍特性をさす。
【００２３】
本明細書で使用する「ｐ５３の状態」は、ｐ５３遺伝子の変異状態をさす。ｐ５３突然変異腫瘍は、ｐ５３遺伝子中に、そのタンパク質の機能を変化させる変異を含む。ｐ５３野生型腫瘍は、ｐ５３遺伝子中に検出可能な変異を含まない。
【００２４】
本明細書で使用する「原病生存期間」、すなわちＤＳＳは、試験の終着が、疾患、例えば、乳癌を原因とする死である生存評価である。
【００２５】
本明細書で使用する「無病生存期間」、すなわちＤＦＳは、終着が、腫瘍再発（すなわち、癌が、体内の他の部位への遠隔転移の結果として再発する）、または遠隔転移の形跡のない乳癌を原因とする死である生存評価である。
【００２６】
本明細書で使用する「アレイ」は、意図的に作成した分子コレクションであり、このコレクションは合成または生合成により調製することができる。アレイ中の分子は、互いに同一または異なっていてよい。アレイは、様々な型式、例えば、可溶性分子ライブラリー、樹脂ビーズ、シリカチップ、または他の固体支持体に結合させた化合物のライブラリーを想定することができる。
【００２７】
本明細書で使用する「核酸ライブラリーまたはアレイ」は、様々な異なる型式で意図的に作成した核酸コレクション（例えば、可溶性分子ライブラリー、および樹脂ビーズ、シリカチップ、または他の固体支持体に結合させたオリゴヌクレオチドのライブラリー）であり、このコレクションは合成または生合成により調製することができる。さらに、「アレイ」という用語は、基本的に任意の長さ（例えば、１〜約１０００ヌクレオチドモノマー長）の核酸を基板にスポットすることによって調製することができる、これらの核酸ライブラリーも含むものとする。本明細書で使用する「核酸」という用語は、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形、つまりリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、またはペプチド核酸（ＰＮＡ）をさし、プリン塩基およびピリミジン塩基、または他の天然、化学的もしくは生化学的に改変された、非天然、または誘導体化されたヌクレオチド塩基を含む。このポリヌクレオチドの主鎖は、典型的にはＲＮＡもしくはＤＮＡ中に見られるような糖類およびリン酸基、または修飾しもしくは置換した糖またはリン酸基を含むことができる。ポリヌクレオチドは、メチル化したヌクレオチドなどの修飾ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体を含みうる。ヌクレオチド配列は、非ヌクレオチド成分によって中断されうる。従って、ヌクレオシド、ヌクレオチド、デオキシヌクレオシド、およびデオキシヌクレオチドという用語は、一般的に、本明細書に記載したものなどの類似体を含む。これらの類似体は、自然に存在するヌクレオシドまたはヌクレオチドと同様に幾つかの構造的特徴を有する分子であり、その結果、核酸またはオリゴヌクレオチド配列中に組み込まれた場合、溶液中で自然に存在する核酸配列とハイブリダイズするようになる。典型的には、これらの類似体は、その塩基、リボース、またはリン酸ジエステル部分を置換し、かつ／または修飾することによって、自然に存在するヌクレオシドおよびヌクレオチドから派生させる。それらの変化は、ハイブリダイゼーションを安定化し、または脱安定化させるために目的に合わせて作成し、あるいは相補的核酸配列によって所望したように、ハイブリダイゼーションの特異性を増強することができる。
【００２８】
本明細書で使用する「相補的」という用語は、配列決定しまたは増幅するためのヌクレオチドと核酸間、例えば、二本鎖ＤＮＡ分子の二本鎖間、または一本鎖核酸上のオリゴヌクレオチドプライマーとプライマー結合部位間のハイブリダイゼーションまたは塩基対形成をさす。相補的ヌクレオチドは、一般的に、ＡとＴ（またはＡとＵ）、またはＣとＧである。最適に整列させ比較した、そして適当なヌクレオチドの挿入または欠失を伴う一鎖のヌクレオチドと、他方の鎖のヌクレオチドの少なくとも約８０％、通常、他方の鎖のヌクレオチドの少なくとも約９０％〜９５％、より好ましくは約９８〜１００％が対をなす場合、二本の一本鎖ＲＮＡ分子または一本鎖ＤＮＡ分子は相補的であるという。あるいは、選択的ハイブリダイゼーション条件下で、ＲＮＡ鎖またはＤＮＡ鎖がその相補鎖とハイブリダイズする場合に相補性は存在する。典型的には、少なくとも１４〜２５のヌクレオチドの一配列に対して、少なくとも約６５％の相補性、好ましくは少なくとも約７５％、より好ましくは少なくとも約９０％の相補性が存在する場合に、選択的ハイブリダイゼーションが生じる。
【００２９】
本明細書で使用する「フラグメント」、「セグメント」、または「ＤＮＡセグメント」は、大型のＤＮＡポリヌクレオチドまたはＤＮＡの一部をさす。ポリヌクレオチドは、例えば、分解し、または複数のセグメントに細分化することができる。核酸を細分化する様々な方法は、当技術分野で周知である。その方法は、本来、例えば化学的または物理的でありうる。化学的細分化は、ＤＮＡ分解酵素による部分的分解、酸による部分的脱プリン、制限酵素の使用、イントロンにコードされたエンドヌクレアーゼ、三重鎖形成法およびハイブリッド形成法など、ＤＮＡを基にした切断法を含んでよく、これらの切断法は、切断媒介物を核酸分子中の特定の位置に局在化させる、核酸セグメントの特異的ハイブリダイゼーション、あるいは既知または未知の位置にあるＤＮＡを切断する他の酵素または化合物に依存する。物理的細分化法は、ＤＮＡに高剪断を加えることを含みうる。高剪断は、例えば、ピットまたはスパイクを備えたチャンバまたはチャンネル内にＤＮＡを通し、または制限されたサイズフロー経路、例えば、開口部の断面寸法がミクロまたはサブミクロ規模である経路にＤＮＡ試料を強制的に通して生じさせることができる。他の物理的方法には、超音波処理および噴霧が含まれる。例えば、熱とイオンが媒介する加水分解による細分化など、物理的および化学的細分化法の組合せも同様に使用しうる。例えば、Sambrookら、『Molecular Cloning: A Laboratory Manual』第３版、Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001)（Sambrookら）を参照されたい。これをあらゆる目的において参照により本明細書に組み込む。こうした方法を最適化して選択したサイズ範囲のフラグメントに核酸を消化することができる。有用なサイズ範囲は、１００、２００、４００、７００、または１０００から５００、８００、１５００、２０００、４０００、または１０，０００塩基対でありうる。しかし、４０００、１０，０００、または２０，０００から１０，０００、２０，０００、または５００，０００塩基対など、大きいサイズ範囲も有用でありうる。
【００３０】
本明細書で使用する「ハイブリダイゼーション」という用語は、２本の一本鎖ポリヌクレオチドが、非共有結合的に結合して安定した二本鎖ポリヌクレオチドを形成する過程をさす。「ハイブリダイゼーション」という用語は、三重鎖ハイブリダイゼーションをもさしうる。得られた（通常）二本鎖ポリヌクレオチドが「ハイブリッド」である。安定したハイブリッドを形成するポリヌクレオチド集団の比率を本明細書では「ハイブリダイゼーション度」と呼ぶ。ハイブリダイゼーション条件は、典型的には、塩濃度約１Ｍ未満、より一般的には約５００ｍＭ未満、および約２００ｍＭ未満を含む。ハイブリダイゼーション温度は、５℃程度と低くてもよいが、典型的には２２℃超、より典型的には約３０℃超、好ましくは約３７℃超である。ハイブリダイゼーションは、通常、ストリンジェント条件下で、すなわち、プローブが、その標的下位配列とハイブリダイズする条件下で実施される。ストリンジェント条件は、配列に依存し、様々な状況において異なる。特異的ハイブリダイゼーションには、フラグメントが長くなるほど、ハイブリダイゼーション温度を高める必要があるであろう。相補鎖の塩基組成および長さ、有機溶媒の存在、および塩基ミスマッチング度を含め、他の要因もハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに作用しうるので、どれか一つのみの絶対的測定よりもパラメーターを組み合わせることが重要である。一般的には、所定のイオン強度およびｐＨで、特異的配列の熱融点（Ｔｍ）よりも約５℃低いストリンジェント条件が選択される。Ｔｍは、（所定のイオン強度、ｐＨ、および核酸組成下で）標的配列に相補するプローブの５０％が、平衡時に標的配列とハイブリダイズする温度である。
【００３１】
典型的には、ストリンジェント条件は、ｐＨが７．０〜８．３、温度が低くても２５℃で、塩濃度が少なくとも０．０１Ｍから、わずか１Ｍ Ｎａイオン濃度（または他の塩）を含む。例えば、５×ＳＳＰＥ（７５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭリン酸Ｎａ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）、および温度２５〜３０℃の条件が、対立遺伝子特異的プローブハイブリダイゼーションに適している。ストリンジェント条件には、例えば、Sambrook、Fritsche、およびManiatisの『Molecular Cloning A Laboratory Manual』第２版、Cold Spring Harbor Press (1989)、およびAndersonの『Nucleic Acid Hybridization』初版、BIOS Scientific Publishers Limited (1999)を参照されたい。上記あらゆる目的において、これらをこれによりその全体を参照により組み込む。
【００３２】
本明細書で使用する「ハイブリダイゼーションプローブ」は、塩基特異的方式で核酸の相補鎖と結合できる核酸（オリゴヌクレオチドなど）のことである。そのようなプローブには、Nielsenら、Science 254:1497-1500 (1991)、Nielsen Curr. Opin. Biotechnol., 10:71-75 (1999)に記載されているペプチド核酸、ならびに他の核酸類似体、および核酸模倣体が含まれる。
【００３３】
本明細書で使用する「ｍＲＮＡ」または「ｍＲＮＡ転写産物」には、それだけには限らないが、前駆体（ｐｒｅ）ｍＲＮＡ転写産物、転写産物処理中間体、翻訳準備の整った成熟ｍＲＮＡ、および単数もしくは複数の遺伝子転写産物、またはｍＲＮＡ転写産物から派生した核酸が含まれる。転写産物処理には、スプライシング、編集、および分解が含まれる。本明細書で使用するｍＲＮＡ転写産物から派生した核酸は、その合成に、ｍＲＮＡ転写産物またはその下位配列が鋳型として最終的に役立つ核酸をさす。従って、ｍＲＮＡから逆転写したｃＤＮＡ、そのｃＤＮＡから転写したｃＲＮＡ、ｃＤＮＡから増幅したＤＮＡ、その増幅したＤＮＡから転写したＲＮＡなどは全て、ｍＲＮＡ転写産物から派生し、派生したそのような産生物を検出することは、試料中に元の転写産物が存在するかどうか、かつ／または存在量を示すものである。従って、ｍＲＮＡから派生した試料には、それだけには限らないが、単数または複数の遺伝子のｍＲＮＡ転写産物、そのｍＲＮＡから逆転写したｃＤＮＡ、そのｃＤＮＡから転写したｃＲＮＡ、その遺伝子から増幅したＤＮＡ、増幅したＤＮＡから転写したＲＮＡなどが含まれる。
【００３４】
そこで使用されるように、「プローブ」は、特定の標的が認識できる分子である。いくつかの実施形態では、プローブは表面固定することができる。本発明が調査できるプローブの例には、それだけには限らないが、細胞膜受容体のアゴニストおよびアンタゴニスト、毒素および毒液、ウイルスのエピトープ、ホルモン（例えば、オピオイドのペプチド、ステロイドなど）、ホルモン受容体、ペプチド、酵素、酵素基質、補因子、薬物、レクチン、糖類、オリゴヌクレオチド、核酸、オリゴ糖、タンパク質、およびモノクローナル抗体が含まれる。
【００３５】
本明細書で使用する「標的」は、所与のプローブに親和性を有する分子である。標的は、自然に存在する分子または人工分子でありうる。また、これらの分子は、未変化状態で、または他の種との凝集体として使用することができる。標的は、直接また特異的結合物質を介在させて、結合メンバーに共有結合的に、または非共有結合的に付着させることができる。本発明が使用することができる標的の例には、それだけには限らないが、抗体、細胞膜受容体、（例えば、ウイルス、細胞、または他の物質上の）特異的抗原決定基と反応するモノクローナル抗体および抗血清、薬物、オリゴヌクレオチド、核酸、ペプチド、補因子、レクチン、糖類、多糖類、細胞、細胞膜、およびオルガネラが含まれる。当技術分野では、標的を抗プローブと呼ぶ場合もある。標的という用語は、本明細書で使用するように、意味における違いはないものとする。２つの巨大分子が分子認識によって結合し複合体を形成すると、「プローブ標的対」が形成される。
【００３６】
図面の簡単な説明
本特許または出願ファイルには、少なくとも一枚のカラーで作成した図面が含まれる。カラー図面を伴う本特許または特許出願公開公報の束は、請求し必要手数料の支払いがあれば特許庁から提供される。
【００３７】
本明細書に組み込まれ、その一部を形成する添付図面は、本発明の実施形態を図示し、その記述と共に開示した本発明の原理を説明するのに役立つ。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３８】
本発明は、多くの好ましい実施形態を有し、詳細については当業者に公知の多くの特許、出願、および他の参照文献に依存する。従って、特許、出願、または他の参照を以下に引用し、または繰り返す場合、それは、あらゆる目的において、および述べた提案について、その全体を参照により組み込むと理解されるものとする。
【００３９】
開示した、癌を分類し、予後を予測し、診断する方法、システム、および組成の実施形態を次に記載する。これらの方法、システム、および組成によって、ｐ５３のｉｎ ｖｉｖｏ機能性のより有用な測定法が提供され、それによってｐ５３の変異状態単独と比較して、患者結果の優れた予後予測指標がもたらされる。開示した方法、システム、および組成の実施形態に元々備わっている他の利点は以下の記述から明らかになる。
【００４０】
癌の発生と進行におけるｐ５３変異は、野生型ｐ５３対立遺伝子のトランス優性抑制を生じかねず、この抑制はｐ５３活性を喪失させ、または野生型ｐ５３とは無関係な機能を発癌的に獲得させる。加えて、ｐ５３の発現に直接影響するような活性を含め、数種のｐ５３機能エフェクターの活性の変化は、ｐ５３変異体の表現型を反復させるｐ５３の欠陥の一因となりうる。乳癌では、このような影響は、より攻撃的な腫瘍、治療耐性、および不十分な臨床結果において現われる。
【００４１】
より有用なｐ５３のｉｎ ｖｉｖｏ機能性の測定を提供することに伴い、本明細書に開示するのは「ｐ５３分類指標」、つまりｐ５３野生型腫瘍と突然変異腫瘍の分子立体配置の違いから推定される発現サインである。分類指標は、所定数の遺伝子、例えば、少なくとも３遺伝子を含みうる。他の実施形態では、分類指標は、約３遺伝子から約５００遺伝子を含みうる。表１に５００の遺伝子リストを示す。いくつかの実施形態では、最適化させたｐ５３分類指標には３２の遺伝子が含まれる（表２）。最適化させた３２遺伝子分類指標によって、有意な精度でｐ５３突然変異体腫瘍と野生型腫瘍を識別でき、全治療群に相当する集団中の再発および生存を予測することができた。さらに、ｐ５３分類指標は、ｐ５３の変異状態単独よりも有意な生存予測器であり、他の臨床予測器とは無関係に多変量解析によっても有意なままであったが、ｐ５３の変異状態は有意ではなかった。さらに、変異の不在下でｐ５３の発現が下方制御されることは、転写活性および臨床結果において、突然変異体（ｍｔ）表現型の腫瘍挙動を誘発するのに十分であった。
【００４２】
乳癌および肝臓癌の独立したデータセットで、そして他の臨床特徴を無視して、最適化させたｐ５３分類指標のサブセットは、有意な精度でｐ５３の状態を予測することができた。原病生存期間（ＤＳＳ）の予測器として、不均質な治療を施した大きい患者コホート、および術後アジュバント内分泌療法のみを施した患者セットで、分類指標はｐ５３の変異状態単独より有意に優れていた。
【００４３】
さらに、ネオアジュバント設定で化学療法を施した第３期患者が大部分を占める独立したｃＤＮＡマイクロアレイ研究では、ｐ５３分類指標の９遺伝子サブセットは、原病生存期間および無病生存期間の極めて有意な予測器であった。ｐ５３分類指標の遺伝子は、化学療法後にどの患者が再発し死亡するかだけでなく、どの後期患者が癌から生還するかを正確に見極めることができた。
【００４４】
分類指標の２１遺伝子サブセットもまた、進行して５年以内に遠隔転移を発生した初期照射治療患者の分子下位群と、発生しない同群を有意に識別することができた。
【００４５】
従って、他の態様よりも特に、本明細書に記載したｐ５３分類指標を定義することによって、予め認識していたよりもｐ５３の極めて大きな影響がヒト腫瘍挙動に与えられることを本発明の方法、システム、および組成が実証し、それによってｐ５３の機能を臨床評価する優れた手法が提供される。
【００４６】
本発明の一態様は、患者で疾患の結果を予測する方法であって、ｐ５３遺伝子の突然変異体または野生型でありうる腫瘍試料の複数の遺伝子から遺伝子発現プロファイルを得るステップ、突然変異腫瘍または野生型腫瘍中でどの遺伝子が差次的に発現しているのかを判定するために、該遺伝子発現プロファイルを比較するステップ、差次的に発現した該遺伝子から、ｐ５３の変異状態を予測するための遺伝子セットを抽出するステップ、および患者で疾患の結果を予測するために、該遺伝子セットを使用するステップを含む方法を提供する。その疾患の結果は、原病生存期間、無病生存期間、腫瘍再発、および治療応答からなる群から選択されうる。疾患は、任意の癌であってよいが、乳癌または肝臓癌であることが好ましい。
【００４７】
予想したｐ５３の変異状態は、差次的に発現した遺伝子と、ｐ５３の変異状態、ＥＲ（エストロゲン受容体）の状態、および腫瘍の組織学的等級との関連性に従って、該遺伝子をランク付けることによって得られる。遺伝子のランク付けに線形モデル適合などの多変量ランク付け手順を使用することができる。ランク付けした遺伝子に管理学習（supervised learning）を施し、それらが突然変異体遺伝子発現プロファイルと野生型遺伝子発現プロファイルを識別できるようにすることができる。使用しうる管理学習法の一例は、対角線形判別分析（Diagonal Linear Discriminant Analysis：ＤＬＤＡ）である。
【００４８】
いくつかの実施形態では、ｐ５３の変異状態を予測する能力を備えた遺伝子セットは、少なくとも３遺伝子、好ましくは約３〜５００の遺伝子、最も好ましくは約３２の遺伝子を含みうる。最適化させたｐ５３分類指標を構成する３２の遺伝子は、表１の遺伝子リストを含む群から選択することができる。いくつかの実施形態では、３２の遺伝子は、GeｎBank受託番号：ＡＩ９６１２３５（配列番号２３）、ＢＧ２７１９２３（配列番号２２）、ＮＭ_００２４６６（配列番号３１）、ＢＣ００１６５１（配列番号１４）、Ｄ３８５５３（配列番号１１）、ＡＫ０００３４５（配列番号２６）、ＡＡ７４２６９７（配列番号２１）、ＡＬ０８０１７０（配列番号３０）、ＢＦ２４５２８４（配列番号２７）、ＢＣ００４５０４（配列番号８）、Ｈ１５２６１（配列番号２）、ＮＭ_０００９０９（配列番号９）、ＮＭ_０２４８４３（配列番号１）、Ｒ７３０３０（配列番号２９）、ＮＭ_０３０８９６（配列番号１７）、ＡＩ４３５８２８（配列番号２０）、ＡＬ５１２７２７（配列番号６）、ＡＷ２４２９９７（配列番号１８）、ＡＩ８１０７６４（配列番号２４）、ＡＩ９２２３２３（配列番号１０）、ＡＬ３６０２０４（配列番号１３）、ＮＭ_００３２２５（配列番号３２）、ＮＭ_００３２２６（配列番号２８）、ＡＷ２９９５３８（配列番号５）、ＮＭ_００３４６２（配列番号１６）、ＡＩ９９０４６５（配列番号２５）、ＮＭ_００４３９２（配列番号１５）、ＮＭ_００１２６７（配列番号７）、ＡＦ２６９０８７（配列番号４）、ＡＩ８２６４３７（配列番号３）、ＡＬ３５５３９２（配列番号１２）、およびＡＵ１５６４２１（配列番号１９）を含みうる。
【００４９】
本発明はまた、後期乳癌患者で疾患の結果を予測する方法であって、ｐ５３遺伝子の突然変異体または野生型でありうる腫瘍試料の複数の遺伝子から遺伝子発現プロファイルを得るステップ、突然変異腫瘍または野生型腫瘍中でどの遺伝子が差次的に発現しているのかを判定するために、該遺伝子発現プロファイルを比較するステップ、差次的に発現した該遺伝子から、ｐ５３の変異状態を予測するための遺伝子セットを抽出するステップ、および後期乳癌患者で疾患の結果を予測するために、該遺伝子セットを使用するステップであって、該遺伝子セットがGenBank受託番号：ＢＧ２７１９２３、ＮＭ_００２４６６、Ｄ３８５５３、ＮＭ_０００９０９、ＮＭ_０２４８４３、Ｒ７３０３０、ＮＭ_００３２２６、ＡＷ２９９５３８、およびＡＩ９９０４６５からなる群から選択されるステップを含む上記方法も提供する。全てのGenBank受託番号は、図９〜５０８に示すように配列および配列番号に関するものである。
【００５０】
本発明はまた、初期であり局所治療を受けた乳癌患者で臨床結果を予測する方法であって、ｐ５３遺伝子の突然変異体または野生型でありうる腫瘍試料の複数の遺伝子から遺伝子発現プロファイルを得るステップ、突然変異腫瘍または野生型腫瘍中でどの遺伝子が差次的に発現しているのかを判定するために、該遺伝子発現プロファイルを比較するステップ、差次的に発現した該遺伝子から、ｐ５３の変異状態を予測するための遺伝子セットを抽出するステップ、および初期であり局所治療を受けた乳癌患者で疾患の結果を予測するために、該遺伝子セットを使用するステップであって、該遺伝子セットが、GenBank受託番号：ＡＩ９６１２３５、ＢＧ２７１９２３、ＮＭ_００２４６６、ＢＣ００１６５１、Ｄ３８５５３、ＡＫ０００３４５、ＢＣ００４５０４、ＮＭ_０００９０９、ＮＭ_０２４８４３、Ｒ７３０３０、ＡＩ４３５８２８、ＡＩ８１０７６４、ＡＩ９２２３２３、ＮＭ_００３２２５、ＮＭ_００３２２６、ＡＷ２９９５３８、ＮＭ_００３４６２、ＡＩ９９０４６５、ＮＭ_００４３９２、ＮＭ_００１２６７、およびＡＩ８２６４３７からなる群から選択されるステップを含む上記方法も提供する。
【００５１】
本発明はまた、肝臓癌患者で臨床結果を予測する方法であって、ｐ５３遺伝子の突然変異体または野生型でありうる腫瘍試料の複数の遺伝子から遺伝子発現プロファイルを得るステップ、突然変異腫瘍または野生型腫瘍中でどの遺伝子が差次的に発現しているのかを判定するために、該遺伝子発現プロファイルを比較するステップ、差次的に発現した該遺伝子から、ｐ５３の変異状態を予測するための遺伝子セットを抽出するステップ、および肝臓癌患者で疾患の結果を予測するために、該遺伝子セットを使用するステップであって、該遺伝子セットがGenBank受託番号：ＮＭ_００２４６６、ＢＣ００１６５１、Ｄ３８５５３、ＮＭ_０２４８４３、ＡＩ４３５８２８、ＡＩ８１０７６４、ＮＭ_００３２２６、およびＡＷ２９９５３８からなる群から選択されるステップを含む方法も提供する。
【００５２】
本発明はまた、患者で疾患の結果を予測するための遺伝子群を同定する方法であって、ｐ５３遺伝子の突然変異体または野生型でありうる腫瘍試料の複数の遺伝子から遺伝子発現プロファイルを得るステップ、突然変異腫瘍または野生型腫瘍中でどの遺伝子が差次的に発現しているのかを判定するために、該遺伝子発現プロファイルを比較するステップ、ｐ５３の変異状態を予測するために、差次的に発現した該遺伝子をその能力に従ってランク付けるステップ、突然変異体および野生型のｐ５３遺伝子発現プロファイルを識別するために、ランク付けしたそれらの遺伝子を訓練するステップ、ｐ５３の変異状態を予測する能力がある遺伝子セットを含むｐ５３分類指標を得るステップ、独立したデータセット中の該ｐ５３分類指標を確証するステップ、および患者で疾患の結果を予測するために、該ｐ５３分類指標の能力を評価するステップを含む上記方法も提供する。
【００５３】
先に開示した、患者で疾患の結果を予測するための遺伝子群を同定する方法では、差次的に発現した遺伝子と、ｐ５３の状態、ＥＲ（エストロゲン受容体）の状態、および腫瘍の組織学的等級との関連性に従って、該遺伝子を多変量ランク付け手順によりランク付けることができる。多変量ランク付け手順は、線形モデル適合（Linear Model-Fit）方法または当業者に公知の他のいかなる方法であってよい。訓練するステップは、対角線形判別分析（ＤＬＤＡ）などの管理学習法または当業者に公知の他のいかなる管理学習法の使用を含みうる。
【００５４】
上に開示したｐ５３分類指標は、少なくとも３遺伝子、好ましくは約３〜５００の遺伝子、より好ましくは約３２の遺伝子を含みうる。この３２の遺伝子のｐ５３分類指標は、GenBank受託番号：ＡＩ９６１２３５、ＢＧ２７１９２３、ＮＭ_００２４６６、ＢＣ００１６５１、Ｄ３８５５３、ＡＫ０００３４５、ＡＡ７４２６９７、ＡＬ０８０１７０、ＢＦ２４５２８４、ＢＣ００４５０４、Ｈ１５２６１、ＮＭ_０００９０９、ＮＭ_０２４８４３、Ｒ７３０３０、ＮＭ_０３０８９６、ＡＩ４３５８２８、ＡＬ５１２７２７、ＡＷ２４２９９７、ＡＩ８１０７６４、ＡＩ９２２３２３、ＡＬ３６０２０４、ＮＭ_００３２２５、ＮＭ_００３２２６、ＡＷ２９９５３８、ＮＭ_００３４６２、ＡＩ９９０４６５、ＮＭ_００４３９２、ＮＭ_００１２６７、ＡＦ２６９０８７、ＡＩ８２６４３７、ＡＬ３５５３９２、およびＡＵ１５６４２１からなる群から選択される遺伝子を含みうる「最適化された分類指標」である。
【００５５】
その疾患の結果は、原病生存期間、無病生存期間、腫瘍再発、および治療応答からなる群から選択されうる。開示した一実施形態では、９遺伝子の部分的分類指標によって、後期乳癌患者で臨床結果を予測することができる。その９遺伝子の部分的分類指標は、GenBank受託番号：ＢＧ２７１９２３、ＮＭ_００２４６６、Ｄ３８５５３、ＮＭ_０００９０９、ＮＭ_０２４８４３、Ｒ７３０３０、ＮＭ_００３２２６、ＡＷ２９９５３８、およびＡＩ９９０４６５からなる群から選択される遺伝子を含みうる。
【００５６】
別の開示した実施形態では、２１遺伝子の部分的分類指標によって、初期であり局所治療を受けた乳癌患者で臨床結果を予測することができる。その２１遺伝子の部分的分類指標は、GenBank受託番号：ＡＩ９６１２３５、ＢＧ２７１９２３、ＮＭ_００２４６６、ＢＣ００１６５１、Ｄ３８５５３、ＡＫ０００３４５、ＢＣ００４５０４、ＮＭ_０００９０９、ＮＭ_０２４８４３、Ｒ７３０３０、ＡＩ４３５８２８；ＡＩ８１０７６４、ＡＩ９２２３２３、ＮＭ_００３２２５、ＮＭ_００３２２６、ＡＷ２９９５３８、ＮＭ_００３４６２、ＡＩ９９０４６５、ＮＭ_００４３９２、ＮＭ_００１２６７、およびＡＩ８２６４３７からなる群から選択される遺伝子を含みうる。
【００５７】
さらに別の開示した実施形態では、８遺伝子の部分的分類指標によって、肝臓癌患者で臨床結果を予測することができる。その８遺伝子の部分的分類指標は、GenBank受託番号：ＮＭ_００２４６６、ＢＣ００１６５１、Ｄ３８５５３、ＮＭ_０２４８４３、ＡＩ４３５８２８、ＡＩ８１０７６４、ＮＭ_００３２２６、およびＡＷ２９９５３８からなる群から選択される遺伝子を含みうる。
【００５８】
本発明はまた、患者で疾患の結果を予測するためのコンピューターシステムであって、プロセッサとメモリとを有するコンピューターを備え、該メモリ上には、ｐ５３遺伝子の突然変異体または野生型でありうる腫瘍試料の複数の遺伝子から遺伝子発現プロファイルを得るステップ、突然変異腫瘍または野生型腫瘍中でどの遺伝子が差次的に発現しているのかを判定するために、該遺伝子発現プロファイルを比較するステップ、差次的に発現した該遺伝子から、ｐ５３の変異状態を予測するための遺伝子セットを抽出するステップ、および患者で疾患の結果を予測するために、該遺伝子セットを使用するステップを実施するために、プロセッサに実行させる実行可能コードが保存されている上記コンピューターシステムも提供する。
【００５９】
本発明はまた、ｐ５３の変異状態を予測する能力がある複数の遺伝子を固体支持体に固定させた、患者で疾患感受性を予測するための診断ツールも提供する。固体支持体は、例えば、マイクロアレイであってよい。一実施形態では、複数の遺伝子固体支持体に固定したは、GenBank受託番号：ＡＩ９６１２３５、ＢＧ２７１９２３、ＮＭ_００２４６６、ＢＣ００１６５１、Ｄ３８５５３、ＡＫ０００３４５、ＡＡ７４２６９７、ＡＬ０８０１７０、ＢＦ２４５２８４、ＢＣ００４５０４、Ｈ１５２６１、ＮＭ_０００９０９、ＮＭ_０２４８４３、Ｒ７３０３０、ＮＭ_０３０８９６、ＡＩ４３５８２８、ＡＬ５１２７２７、ＡＷ２４２９９７、ＡＩ８１０７６４、ＡＩ９２２３２３、ＡＬ３６０２０４、ＮＭ_００３２２５、ＮＭ_００３２２６、ＡＷ２９９５３８、ＮＭ_００３４６２、ＡＩ９９０４６５、ＮＭ_００４３９２、ＮＭ_００１２６７、ＡＦ２６９０８７、ＡＩ８２６４３７、ＡＬ３５５３９２、およびＡＵ１５６４２１からなる群から選択される遺伝子を含みうる。別の実施形態では、固体支持体に固定した複数の遺伝子は、GenBank受託番号：ＢＧ２７１９２３、ＮＭ_００２４６６、Ｄ３８５５３、ＮＭ_０００９０９、ＮＭ_０２４８４３、Ｒ７３０３０、ＮＭ_００３２２６、ＡＷ２９９５３８、およびＡＩ９９０４６５からなる群から選択される遺伝子を含みうる。さらに別の実施形態では、固体支持体に固定した複数の遺伝子は、GenBank受託番号：ＡＩ９６１２３５、ＢＧ２７１９２３、ＮＭ_００２４６６、ＢＣ００１６５１、Ｄ３８５５３、ＡＫ０００３４５、ＢＣ００４５０４、ＮＭ_０００９０９、ＮＭ_０２４８４３、Ｒ７３０３０、ＡＩ４３５８２８、ＡＩ８１０７６４、ＡＩ９２２３２３、ＮＭ_００３２２５、ＮＭ_００３２２６、ＡＷ２９９５３８、ＮＭ_００３４６２、ＡＩ９９０４６５、ＮＭ_００４３９２、ＮＭ_００１２６７、およびＡＩ８２６４３７からなる群から選択される遺伝子を含みうる。さらに別の実施形態では、固体支持体に固定した複数の遺伝子は、GenBank受託番号：ＮＭ_００２４６６、ＢＣ００１６５１、Ｄ３８５５３、ＮＭ_０２４８４３、ＡＩ４３５８２８、ＡＩ８１０７６４、ＮＭ_００３２２６、およびＡＷ２９９５３８からなる群から選択される遺伝子を含みうる。
【００６０】
本発明はまた、固体支持体と、その上にディスプレイさせた、患者でｐ５３の変異状態を予測する能力がある遺伝子に対応する核酸プローブとを有する、患者で疾患感受性を予測するための核酸アレイも提供する。核酸アレイは、少なくとも８、３２、１００、２５０、または５００の核酸プローブを含みうる。
【００６１】
従って、開示した方法、システム、および組成は、ｐ５３欠陥胸部腫瘍とｐ５３誘導胸部腫瘍を見極めることができ、他の癌種でもｐ５３活性の計測に有効であろう。そうでないとしてもＤＮＡ配列レベルでｐ５３野生型である胸部腫瘍の１４％ほどが、他の手段によりｐ５３を欠くと思われる。さらに、分類指標は、原病生存期間および様々な乳癌集団における再発の有意な予測器であり、従って、その集団の終了点の予測において、特に、その機能が主にｐ５３依存性細胞死経路による治療剤と関連して臨床有用性を有する。
【００６２】
実施例
【実施例１】
【００６３】
ｐ５３突然変異体腫瘍およびｐ５３野生型腫瘍の分子立体配置は異なる。
【００６４】
ｐ５３突然変異体（ｍｔ）胸部腫瘍とｐ５３野生型（ｗｔ）胸部腫瘍の間の分子的差異を洞察するために、高密度オリゴヌクレオチドマイクロアレイを使用し、２５７の生検試料の集団ベースシリーズを分析したが、それらの全ては予めｐ５３コード領域の変異について配列決定した（Bergh, J.、 Norberg, T.、Sjogren, S.、Lindgren, A. および Holmberg, L. “Complete sequencing of the p53 gene provides prognostic information in breast cancer patients, particularly in relation to adjuvant systemic therapy and radiotherapy（ｐ５３遺伝子完全シーケンシングによる、乳癌患者で、特に、アジュバント全身治療および放射線治療と関連する予後予測情報の提供）” Nat Med 1, 1029-34 (1995)。参照により本明細書に組み込む）。
【００６５】
患者の原物質は、１９８７年１月１日〜１９８９年１２月３１日の間にUppsala郡で摘出された全乳癌の６５％に相当する、女性３１５名の集団をベースとしたコホートから得た新鮮凍結胸部腫瘍から構成された（Berghら、既に参照により組み込む）。術後、新鮮腫瘍の生存可能部分を２分割し、一部は直ちにイソペンタンで凍結して分析まで−７０℃で保存し、他方は１０％ホルマリンで固定し病理組織検査用に調製した。凍結腫瘍組織は、当初の３１５名の患者のうち２９９名から入手することができた。このうち、２７０組織にはマイクロアレイ実験に十分な量および質のＲＮＡが含まれ、Affymetrixの品質管理後、２６０腫瘍の発現プロファイルをさらに分析した。本発明の研究は、Karolinska研究所倫理委員会の認可を受けている。
【００６６】
既にBerghらにより記載（既に参照により組み込む）されている通り、元の３１５腫瘍でｐ５３遺伝子（ＴＰ５３）の変異分析を実施した。本発明の研究に含めた２６０腫瘍のうち、エクソン２〜１１をｃＤＮＡ配列分析することにより（Berghら、既に参照により組み込む）、５９個にｐ５３変異を見出した。３試料ではｐ５３の状態を評価できなかった。臨床病理学的特性を患者記録および慣例の診断時臨床測定から導き出した。エストロゲン受容体の状態は、慣例の臨床手順の一部として、リガンド結合アッセイによって定量した。経験豊かな病理学者が、腫瘍を低度、中度、および高度腫瘍に分類し、腫瘍のElston-Ellis等級を決定した（Elston, C. W. および Ellis, I. O. “Pathological prognostic factors in breast cancer. I. The value of histological grade in breast cancer: experience from a large study with long-term follow-up（乳癌における病理学的予後予測要因．Ｉ 乳癌における組織学的等級値：長期追跡による大研究から得た経験）” Histopathology 19, 403-10 (1991)、参照により本明細書に組み込む）。彼ら２６０名の患者のうち８４名で腋下リンパ節転移が見つかり、１６６名はリンパ節転移陰性であった。１０名の患者はリンパ節の状態が不明であった。高齢により、または重大な随伴性疾患のために腋下検査を実施しなかったからである。全リンパ節転移陽性患者に、全身アジュバント治療を行った。一般に、閉経前女性には化学療法を施し、閉経後女性には内分泌治療を施した。本発明の研究に含めた２６０名の患者のうち、１４９名がアジュバント治療を受けなかった。患者の全体的生存率は、スウェーデン住民登記所から得た情報に基づき、死亡日および死亡原因は１９９９年末に患者記録概要から得た。
【００６７】
結果としてアミノ酸レベルを変化させるｐ５３変異を含むことが知られる５９腫瘍から得たＲＮＡ、および野生型ｐ５３を有することが知られている１９８腫瘍から得たＲＮＡをAffymetrix Ｕ１３３ＡおよびＵ１３３Ｂアレイで分析した。
【００６８】
Qiagen RNeasy Mini Kit（Qiagen、ドイツ国）を使用し全ＲＮＡを抽出した。凍結腫瘍を小片に切断し、ＲＬＴ緩衝液（ＲＮｅａｓｙ溶解緩衝液）とメルカプトエタノールを含む試験管（最高４０ｍｇ／試験管）中で約３０〜４０秒間ホモジナイズした。次いで、混合物を５５℃で１０分間プロテイナーゼＫにより処理したが、その処理は前回のＲＮＡ抽出でＲＮＡ収量を改善することを実証した（Egyhazi, S.ら、”Proteinase K added to the extraction procedure markedly increases RNA yield from primary breast tumors for use in microarray studies（抽出手順に添加したプロテイナーゼＫが、マイクロアレイ研究で使用する胸部原発腫瘍から得たＲＮＡの収量を顕著に増大）” Clin Chem 50, 975-6(2004)、参照により本明細書に組み込む）。以下のＲＮｅａｓｙカラムでの遠心分離ステップでは、ＲＮＡの質を高めるためにＤＮＡ分解酵素処理も含めた。ＲＮＡ抽出物の統合性をAgilent 2100 Bioanalyzer（Agilent Technologies、米国メリーランド州ロックビル）で試験し、２８Ｓ：１８ＳのリボソームＲＮＡ率を計測した。高品質ＲＮＡ抽出物は、マイクロアレイ分析まで−７０℃で貯蔵した。
【００６９】
ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）産生物（すなわち標的）の調製、オリゴヌクレオチドアレイハイブリダイゼーション、および走査をAffymetrixプロトコル（Affymetrix Inc., 米国カリフォルニア州サンタクララ）に従って実施した。Ｔ７結合オリゴ−ｄＴプライマーを使用し、２〜５μｇの全ＲＮＡ出発量から第１鎖ｃＤＮＡを合成し、続いてフェノール／クロロホルム抽出とPhase Lock Gelを使用して第２鎖の合成二本鎖ｃＤＮＡを精製した。ＩＶＴ反応にてビオチン化したｃＲＮＡ標的をそのｃＤＮＡ鋳型から調製した。Qiagen RNeasy Mini Kitを使用してその標識したｃＲＮＡ標的を精製し、続いて化学的細分化した。細分化しビオチン化したｃＲＮＡ１０μｇをAffymetrixオリゴヌクレオチドヒトアレイセットのHG-Ｕ１３３ＡおよびＢにハイブリダイズしたが、このアレイセットには、十分に実証したヒト遺伝子約３３，０００個から派生させた３９，０００個超の転写産物に相当する４５，０００のプローブセットが含まれる。ハイブリダイゼーションオーブンを４５℃にし、遠心を６０ｒｐｍで１６時間に設定して、ハイブリダイゼーションを実施した。Affymetrixプロトコルに従い、Fluidics Station 400（Affymetrix Inc., 米国カリフォルニア州サンタクララ）中でアレイを洗浄し染色した。ストレプトアビジンフィコエリトリン（ＳＡＰＥ、終濃度１０μｇ／ｍｌ）を使用し染色し、ビオチン化抗ストレプトアビジン抗体でシグナル増幅を行い、そして２回目のＳＡＰＥ染色を行った。製造業者の使用説明書に従ってアレイを洗浄しスキャンした。
【００７０】
発現生データは、Microarray Suite 5.0ソフトウェア（Affymetrix Inc.,米国カリフォルニア州サンタクララ）を使用して処理し、総平均法を使用して規準化した。各マイクロアレイについては、平均対数強度を標的シグナル値の５００に調整することによって、プローブセットシグナル値を計る。平均シグナル強度が次善の試料を再標識し、新規なアレイに再度ハイブリダイズした。マイクロアレイ人為産物が視認できるのであれば、細分化した同じプローブを使用し、その試料を新規なチップにハイブリダイズし、または別法として、欠陥領域が小さい場合は、影響を受けているプローブをさらに分析して調査した。Ｕ１３３ＡおよびＢチップから得た規準化した発現データを組み合わせ、自然対数に変換した。
【００７１】
遺伝子発現パターンがｐ５３ｍｔとｗｔ腫瘍をどの程度識別できたかを初めて調査した。ウィルコクソン順位和検定によって、約２，７７０の別個の遺伝子（UniGene build #167による）を代表する３，３３０のAffymetrixプローブセットを同定したが、その発現パターンは、偽発見率（ＦＤＲ：false discovery rate）を調整したｐ値、ｐ＜０．００１でｐ５３ｍｔおよびｗｔ腫瘍を識別した。これらの遺伝子のいくつかは、ＰＥＲＰ、ＲＲＭ２、ＳＥＭＡ３Ｂ、ＴＡＰ１、ＧＴＳＥ１、ＣＨＥＣＫ１、およびＣＨＥＫ２を含むｐ５３の既知の転写標的であることが判明した。図１に示す物は、上位２５０遺伝子を使用する階層的クラスタ分析の結果であり、それらの遺伝子の全てがＦＤＲ ｐ＜５．９×１０−８でｐ５３の状態に関連する。遺伝子選択判定基準から予想された通りに、ｐ５３ｍｔおよびｗｔ腫瘍の大部分を別々の腫瘍群にクラスタ化した。２つの主なクラスタノードのうち、ｐ５３突然変異体の９０％が一つのクラスタ（すなわち「変異体様」クラスタ）で見つかり、ｐ５３ｗｔ腫瘍の７７％は他方（「野生型様」クラスタ）によって分離された。
【００７２】
次に、遺伝子発現プロファイルの階層的構造を調査した。腫瘍の場合には、２つの主なクラスタが観察された。一つは突然変異体様腫瘍クラスタ内でより高度に発現した約２００の遺伝子からなり、他方は、野生型様クラスタ内でより高度に発現した約５０の遺伝子を表す。前者の中でｐ５３突然変異体状態最も高度と相関した遺伝子は、ＣＤＣ２、ＣＤＣ２０、ＣＣＮＢ１、ＣＣＮＢ２、ＣＫＳ２、ＣＤＣＡ１、ＣＤＣＡ３、ＣＤＣＡ８、ＣＥＮＰＡ、ＴＯＰ２Ａ、ＰＴＴＧ１、およびＭＣＭ６を含み、細胞周期の進行に関連した。この知見は、ｗｔのｐ５３が細胞周期遺伝子に対して負の調節効果を有するという観察に一致する。野生型様クラスタ内でより高度に発現した遺伝子の中では、数個のエストロゲンに調節された遺伝子、およびＳＴＣ２、ＮＣＯＲ１、およびＡＤＲＡ２Ａを含む、ＥＲの状態に関連する遺伝子の存在が観察された。
【００７３】
腫瘍をさらに検査することによって、ｐ５３の状態に加えて、主な腫瘍クラスタは、他の臨床特徴、すなわち、エストロゲン受容体（ＥＲ）の状態および腫瘍等級とも相関することが判明した。細胞のエストロゲン受容体状態は、いくつかの場合において癌と相関することが判明していた。正常な胸部細胞は、通常、エストロゲン受容体を有する。しかし、乳房で生じる癌細胞は、必ずしもエストロゲン受容体を有しているわけではない。エストロゲン受容体を有する乳癌は、「エストロゲン受容体陽性」と呼ばれ、エストロゲン受容体を有しない乳癌は「エストロゲン受容体陰性」と呼ばれる。エストロゲン受容体陽性癌では、癌細胞の増殖はエストロゲンに制御される。それに反して、エストロゲン受容体陰性癌細胞の増殖はエストロゲンによって支配されない。
【００７４】
図１は、ｐ５３の状態と統計学的に相関した上位２５０遺伝子を使用する２５７腫瘍の階層的クラスタリングを示す。腫瘍を縦軸に表し、遺伝子を横軸に表す。彩度は、対数発現シグナルの強度を反映し、赤色相は発現レベルが高いこと示し、緑色相は発現レベルが低いことを示す。最上段の黒色垂直棒は、胸部腫瘍がｐ５３変異を有することを示す。２行目の棒はＥＲ陽性腫瘍を示す。３行目の棒は、組織学的等級（Elston-Ellis段階評価法）を反映し、緑棒＝Ｉ等級、青棒＝ＩＩ等級、および赤棒＝ＩＩＩ等級である。
【００７５】
突然変異体様クラスタによる分離は、エストロゲン受容体陰性（ＥＲ−）腫瘍の８６％（ｐｃｓ＝１．７×１０−１０）、ＩＩＩ等級腫瘍の９６％（ｐｃｓ＝２．５×１０−１９）、およびＩ等級腫瘍のわずか３％（ｐｆｅ＝６．９×１０−１５）で観察された。この結果は、部分的に、この研究のｐ５３突然変異体が積極的にＥＲ陰性と相関（ｐｃｓ＝１．７×１０−６）し、ＩＩＩ等級の状態とも相関（ｐｃｓ＝１．２×１０−１１）するという事実のためであり、そしてｐ５３突然変異乳癌が陰性ＥＲ状態および高腫瘍等級と著しく相関すると実証した先の報告に一致する。例えば、Cattoretti, G.、Rilke, F.、Andreola, S.、D'Amato, L. および Delia, D. “P53 expression in breast cancer（乳癌でのＰ５３の発現）”. Int J Cancer. 41,178-83 (1988)、Isola, J.、Visakorpi, T.、Holli, K. および Xallioniemi, O. P. “Association of overexpression of tumor suppressor protein p53 with rapid cell proliferation and poor prognosis in node-negative breast cancer patients（リンパ節陰性乳癌患者における癌抑制タンパク質ｐ５３の過剰発現と迅速な細胞増殖および不十分な予後予測との関連性）” J Natl Cancer Inst 84, 1109-14. (1992)、Andersen, T. I.ら、”Prognostic significance of TP53 alterations in breast carcinoma（乳癌におけるＴＰ５３改変の予後予測の重要性）” Br J Cancer 68, 540-8 (1993)、およびBhargava, V.ら、”The association of p53 immunopositivity with tumor proliferation and other prognostic indicators in breast cancer（乳癌におけるｐ５３免疫陽性と、腫瘍増殖および他の予後予測指標との関連性）” Mod Pathol 7, 361-8 (1994)を参照されたい。それらの全てを参照により本明細書に組み込む。
【００７６】
しかし、突然変異体様クラスタ内の１１５３のｗｔ腫瘍のうち、顕著な過剰提示がＥＲ（ｐｃｓ＝２．０×１０−６）、およびＩＩＩ等級腫瘍（ｐｆｅ＝７．１×１０−１１）で同様に観察された。それによって、一変量統計分析により、ｐ５３の状態と高度に関連する多数の遺伝子が同定され、それらの遺伝子はｐ５３の状態とは相関するが、組織学的等級およびＥＲの状態とは相関しないという方式で腫瘍を分離することができる。
【実施例２】
【００７７】
ｐ５３の欠陥を予測する遺伝子発現分類指標
ｐ５３ｗｔ腫瘍画分は、ｐ５３突然変異体の大部分と共にクラスタを形成することが判明したという知見は、これらの腫瘍が、実際、ｐ５３変異以外の機序によるｐ５３の欠陥であろうという可能性を示唆する。これに反して、ほとんどのｗｔ腫瘍を連想させる分子立体配置を有するｐ５３突然変異体を発見したことは、これらの腫瘍が、実際、機能的に無傷のｐ５３を発現するらしいことを示唆している。しかし、この場合の腫瘍群の割り当ては、一変量ランク付け手順により選択した遺伝子に基づくものであり、この手順はｐ５３の状態と、ＥＲおよび等級状態との関連性によるものではなかった。これにより、選択した遺伝子が、ほとんど等級および／またはＥＲ関連ものを含むという可能性がある程度生じ、その可能性は、腫瘍クラスタリングをｐ５３の状態それ自体ではなく、これらの特性に向かって偏らせたかもしれない。
【００７８】
従って、組織学的等級およびＥＲの状態とは無関係に、ｐ５３の状態に相関する遺伝子をランク付ける線形モデル適合（ＬＭＦ）として知られる多変量線形回帰法を含む、予測モデルを設計することによって、ｐ５３の状態を予測するための、確固たる遺伝子発現を基にした分類指標が開発された。
【００７９】
図２は、ｐ５３の状態用の遺伝子を基にした分類指標の最適化および結果を示す。線形モデル適合法によりランク付けした遺伝子発現プロファイルを使用し、ｐ５３の状態の管理学習に対角線形判別分析（ＤＬＤＡ）を使用した。（Ａ）：等級／エストロゲン受容体（ＥＲ）相関遺伝子と、ウィルコクソン順位和検定または線形モデル適合によりランク付けしたｐ５３相関遺伝子との間の重複の分析。ヒートマップは、１００遺伝子ビン（横列）の腫瘍等級（上図ヒートマップ）またはＥＲの状態（下図ヒートマップ）と相関した遺伝子数、さらにｐ５３の状態（縦行；５０遺伝子ビンでランク付け）と相関した遺伝子数を示し、ｐ５３相関遺伝子をＬＭＦ＝線形モデル適合またはＷＲ＝ウィルコクソン順位和によりランク付けし、等級相関遺伝子をＫＷ＝Kruskal-Wallisにより、そしてＥＲ相関遺伝子をＷＲによりランク付けした。（Ｂ）：分類指標の精度は、分類指標を構築するのに使用した遺伝子数の関数としてプロットし、最適分類指標は３２遺伝子からなり、そして延べ４０腫瘍が誤分類された。（Ｃ）：一点除外（leave−one−out）交差検証を使用して、Uppsalaデータセット（２５７腫瘍）に適用した分類指標の結果。Unigene記号、（build #167）、Genbank受託番号、およびAffymetrixプローブＩＤ（Ａ．＝Ｕ１３３Ａ；Ｂ．＝Ｕ１３３Ｂ）を示す。
【００８０】
遺伝子の選択には、発現レベルをその応答として、かつＰ５３の状態、ＥＲの状態、および等級状態を予測器変数として、直線モデルをその遺伝子発現データに適合させた。予測器変数と首尾よく相関しなかった遺伝子を除去するための初期フィルタとして、ｐ値適合が０．００１超える遺伝子全てを除外した。追加の予測器としてＥＲおよび等級を使用することによって、発現パターンがＥＲまたは等級状態によってほとんど説明がつくと思われる遺伝子を選別除去できるようになった。ＬＭＦランク付け手順を適用すると、一変量のウィルコクソン順位和（ＷＲ）法と比較して、細胞周期により調節される多くの既知遺伝子のランクが顕著に低下され、これらの遺伝子がｐ５３の状態ではなく、高等級によって最も説明されることを示した（図２Ａ、上図）。これに反して、ＥＲ関連遺伝子は、ＬＭＦによるｐ５３関連遺伝子上位ランクに入ったことが観察された。それは、おそらく、ＷＲによるそれらの低いランキングは、より高くランク付けされた等級関連遺伝子が多かったためであろう（図２Ａ、下図）。
【００８１】
クラス予測目的には、ｐ５３の状態係数の絶対値の降順で遺伝子をランク付けする。分類指標の構築には、最尤法の変形であるＤＬＤＡ（対角線形判別分析）を使用した。例えば、参照により本明細書に組み込むDudoit, S., Frilyand, J. および Speed, T. P. “Comparison of discrimination methods for the classification of tumors using gene expression data（遺伝子発現データを使用する、腫瘍を分類するための判別法比較）”、Journal of the American Statistical Association 97, 77-87. (2002)に記載されている、マイクロアレイデータを使用するクラス決定問題にこれを予め適用させておく。最高の分類精度を有する予測器遺伝子セットは、一点除外交差検証により選択した。
【００８２】
含まれる遺伝子数の関数としての分類指標の精度を図２Ｂにプロットする。特筆すべきは、分類指標が７遺伝子を含むか、または５００遺伝子を含むかに関わらず、この腫瘍分類の精度が、わずか２．７％（すなわち７腫瘍）の変動をもって高度に安定していると観察されたことであった。５００遺伝子分類指標中の遺伝子を下表１に示す。しかし、最適の分類指標は、３２の遺伝子で得られたが（表２）、一方で４０腫瘍（１５．６％）が誤分類された。ｗｔ腫瘍の２８個（１４％）は、突然変異体様として分類され、他方で１２個（２０％）の突然変異体は野生型様として誤分類された（図２Ｃ）。
【表１】
【００８３】
５００遺伝子分類指標：遺伝子をｐ５３の状態とその相関に従ってランク付ける。GenBank受託番号、Affymetrix プローブセット ID、Unigene ID、Unigene名、およびUnigene記号によって遺伝子を同定する。
【００８４】
表１に記載した遺伝子の配列および配列番号については、上記遺伝子の配列の各々を示し、GenBank受託番号、Unigene ID、および／またはUnigene名、および配列番号に関連付けた図９〜５０８を参照されたい。
【実施例３】
【００８５】
ｐ５３分類指標は、２個の独立したデータセットで有意な精度を示す。
【００８６】
次いで、独立したデータセットと関連してｐ５３分類指標の性能を評価した。図３は、独立したｃＤＮＡマイクロアレイデータセットで、分類指標遺伝子がｐ５３の状態を予測できることを示す。（Ａ）独立した乳癌データセットで、３２遺伝子分類指標のうち９遺伝子サブセットが、ｐ５３の状態を予測することができる。本発明者らの分類指標の９遺伝子は、腫瘍の５０％以上にそれらの遺伝子が存在することに基づいて選択された。分析に使用した腫瘍は、これらの遺伝子の＞５０％に存在する発現データを有する必要があった。（Ｂ）独立した肝臓癌データセットで、ｐ５３分類指標の８遺伝子サブセットが、ｐ５３の状態を予測することができる。８個の重複する遺伝子は、腫瘍の９０％以上にそれらの遺伝子が存在することに基づいて選択された。分析に使用した腫瘍は、これらの遺伝子の＞５０％で存在する発現データを有する必要があった。（ＡおよびＢ）黒色垂直棒は、ｐ５３突然変異体の状態を示す。遺伝子記号（Unigene build #167）、および対応するＩＭＡＧＥクローンＩＤ（元の研究から）を収載する。階層的クラスタグラムを示す。遺伝子（横列）、および腫瘍（縦行）をクラスタ化した。腫瘍デンドログラムでは、緑の枝は野生型様立体配置を示し、赤い枝は突然変異体様プロファイルを示す。
【００８７】
従って、ｐ５３の状態が判明している公的に入手可能な２個のマイクロアレイデータセット：Sorlieらによる乳癌研究（Sorlie, T.ら、”Repeated observation of breast tumor subtypes in independent gene expression data sets（独立した遺伝子発現データセットにおける胸部腫瘍サブタイプの反復観察）” Proc Natl Acad Sci USA 100, 8418-23 (2003)、参照により本明細書に組み込む）、およびChenらによる肝臓癌研究（Chen, X.ら、”Gene expression patterns in human liver cancers（ヒト肝臓癌での遺伝子発現パターン）”、Mol Biol. Cell 13, 1929-39 (2002)、参照により本明細書に組み込む）を利用した。両研究は、ｃＤＮＡマイクロアレイプラットフォームで行った。Sorlieデータセットでは、ｐ５３変異用に６９の胸部腫瘍を配列決定した。分類指標遺伝子に対応する発現データの利用能について、この腫瘍サブセットをクエリーした。分類指標の２８の遺伝子がUniGene ID（build #167）に位置づけられた。これらの遺伝子の半分以上が、Sorlieらのマイクロアレイに位置づけられたが、大半の腫瘍でほとんど発現せず、その遺伝子の半数以下ついて、いくつかの腫瘍の測定値が得られた。分類指標中のわずか９遺伝子が、腫瘍の＞５０％に存在する発現測定値を有するｃＤＮＡプローブ（異なる９遺伝子を表す）に対応することが判明し、その際、腫瘍は遺伝子の＞５０％（結果として４４ウェルの採取した腫瘍サブセットになる）について測定値を有した。腫瘍を階層的にクラスタ化（図３Ａ）するために分類指標のこの９遺伝子サブセットを使用して、ｐ５３ｍｔ腫瘍の７７％を一つの枝にクラスタ化し、野生型の７７％を他方の枝にクラスタ化（ｐｃｓ＝３．０×１０−４）し、分類指標の確固たる予測能を反復した。
【００８８】
次に、免疫組織化学、ＩＨＣ（Chen, X.ら、”Gene expression patterns in human liver cancers（ヒト肝臓癌における遺伝子発現パターン）” Mol Biol Cell 13,1929-39 (2002)、参照により本明細書に組み込む）によってｐ５３の状態を確認したｃＤＮＡマイクロアレイベースの肝臓癌データセットを分析した。この研究では、ＩＨＣによりｐ５３タンパク質レベルを確認した。ここで、ｐ５３の状態についてアッセイした全５９腫瘍に８分類指標遺伝子を位置づけることができた（各遺伝子は全腫瘍の９０％以上に存在するデータを有し、そして各腫瘍は遺伝子の＞５０％のデータを含有した）。乳癌データセット（すなわち、ｐｆｅ＝３．５×１０−４）で見られた統計上の有意性と同様の有意性をもって、この８分類指標遺伝子サブセットは、ｐ５３の状態と相関する２個の主要なクラスタにＨＣＣ試料をクラスタ化することができ、つまり、一クラスタに突然変異体の８７％、および他方のクラスタに野生型６１％にクラスタ化することができた（図３Ｂ）。合わせて、ｐ５３分類指標を含む遺伝子は、ｐ５３の状態に基づき胸部腫瘍のみならず肝臓癌をも分類する能力が確固としており、従って他の癌種でもｐ５３の状態を予測する一般化可能な有用性を有しうることがこれらの観察から示唆される。
【表２】
【００８９】
最適化させた３２遺伝子ｐ５３分類指標。GenBank受託番号、Affymetrix プローブセット ID、Unigene ID、Unigene名、およびUnigene記号によって遺伝子を同定する。
【実施例４】
【００９０】
ｐ５３分類指標は、ｐ５３の変異状態単独よりも優れた患者結果の予後予測指標である。
【００９１】
乳癌および他の腫瘍型では、ｐ５３の状態が、腫瘍再発、患者生存、および治療応答など、臨床結果の予後を予測することは広く受け入れられている。臨床結果の予後予測指標として、ｐ５３の活性に基づく分類指標は、ｐ５３の変異状態単独より優れているという仮説を試験した。図４は、ｐ５３分類指標が、ｐ５３の変異状態単独よりも予後予測の重要性が高いということを示す。（Ａ）ｐ５３の変異状態、（ＢおよびＣ）ｐ５３分類指標、または（Ｄ）両方に従って分類した、患者のカプラン−マイヤー生存曲線を示す。臨床終了点は、乳癌による死であった（すなわち原病生存期間）。Ａ、Ｂ、およびＤでは全２５７名の患者を評価し、Ｃではｐ５３野生型腫瘍の１９８名の患者のみを評価した。危険率（ＨＲ）の有意性の評価にワルド検定（ｐＷ）を使用した。
【００９２】
治療の種類または臨床段階に関わらず、Uppsalaコホートの全２５７名の患者で、原病生存期間（ＤＳＳ）の予測能について、分類指標および配列レベルのｐ５３の変異状態を比較した。
【００９３】
患者を分けるためにｐ５３分類指標を使用して得られた危険率の有意性は、ｐ５３の変異状態単独を使用して得られた危険率の有意性よりも桁違いに高く（それぞれ、ｐｗ＝０．０００５７：ｐｗ＝０．０１２）（図４ＡおよびＢ）、特に、この改善されたｐ値はｐｍｃ＝０．００４６で統計上有意であった。
【００９４】
さらに、シーケンシングによって野生型ｐ５３を有していると確認された１９８名の女性サブセットで、ｐ５３分類指標は、低危険群および高危険群に患者を有意に分離することもでき（ｐｗ＝０．０１６）（図４Ｃ）、突然変異体様として分類されたｐ５３ｗｔ腫瘍を有する患者は、ｗｔ様クラスのｗｔ腫瘍を有する患者よりもＤＳＳが低いことが示唆された。図４Ｄでは、４つ全ての腫瘍下位群で生存曲線を比較した。特に、ｐ５３ｍｔまたはｍｔ様と分類されたｗｔ腫瘍を有する患者（それぞれ、緑色および青色曲線）は、全体的生存率曲線が似ていたが、ｗｔ様と分類されたｐ５３ｍｔ腫瘍を有する１２名（赤色曲線）は、突然変異体様ｐ５３ｍｔ腫瘍群（緑色曲線）の生存率曲線と、ｗｔ様ｐ５３ｗｔ腫瘍群（黒色曲線）の生存率曲線に分類される生存曲線を示し、どちらの曲線とも有意には異ならなかった（ｍｔ／ｍｔ様比較ｐｗ＝０．４７およびｗｔ／ｗｔ様比較ｐｗ＝０．３７）ことが観察された。
【００９５】
次に、SorlieらのｃＤＮＡマイクロアレイデータセットで分類指標の予後予測の重要性を試験した（Sorlie, T.ら、Repeated observation of breast tumor subtypes in independent gene expression data sets（独立した遺伝子発現データセットにおける胸部腫瘍サブタイプの反復観察）、Proc Natl Acad Sci USA 100, 8418-23 (2003)、参照により本明細書に組み込む）。図５は、独立した後期腫瘍データセットで、ｐ５３分類指標の予後予測の重要性が極めて高いことを示す。図３に記載されている９遺伝子の部分的分類指標にしたがって腫瘍を階層的に分類し、生存結果との相関について分析した。（Ａ）Sorlieらのデータセットから得た７６腫瘍の階層的クラスタグラム；腫瘍デンドログラムの黒の枝は野生型様立体配置を示し、赤い分枝は突然変異体様プロファイルを示す。表示は、（Ｂ）原病生存期間および（Ｃ）無病生存期間に対するカプラン−マイヤー評価であり、（Ａ）の腫瘍デンドログラムの緑の枝および赤の枝に従って患者群を決定した。
【００９６】
ここで、７７％の精度でｍｔ腫瘍とｗｔ腫瘍を識別することができる９遺伝子の部分的分類指標を使用し、関連する患者生存情報により、７６ウェルの採取した腫瘍試料を階層的にクラスタ化した（図５Ａ）。重要なことに、大多数のこれらの腫瘍（＞８０％）は、局所的に進行した乳癌を有するＩＩＩ期患者（Ｔ３／Ｔ４および／またはＮ２）の化学療法応答に対する、２つの独立した予測研究から得た。腫瘍を２つの主要な枝、３１腫瘍をｗｔ様クラスタに、および４４腫瘍を突然変異体様クラスタにクラスタ化した。これらの腫瘍プロファイルに従って患者をグループ分けすると、原病生存期間および無病生存期間（図５ＢおよびＣ）のカプラン−マイヤー生存曲線は、このコホートで共に高度に有意であった（ｐｗ＝０．００００８（ＤＳＳ）、およびｐｗ＝０．００００５（ＤＦＳ））。注目すべきことに、ｐ５３ｍｔ様群の４４名の患者の７年生存率３５％と比較して、ｐ５３ｗｔ様クラスタの３１名の患者は、乳癌の７年生存率９０％を示した（図５Ｂ）。すなわち、この大多数の第ＩＩＩ期患者集団では、部分的分類指標は、どの患者が、再発し死亡するかだけでなく、どの後期患者が癌から生存するかを正確に予測することができる。階層的クラスタ分析には、対数発現値を平均中央化し規準化し、ピアソン相関計量および平均連結法（Dr. Michael Eisenの好意によるCluster and TreeViewソフトウェア；ソフトウェアは、UC Berkeley校ウェブサイト、Lawrence Berkeley National Laboratoryで得ることができる）を使用して、遺伝子および腫瘍をクラスタ化した。生存分析するために、ｐ５３分類指標の結果に従って、または一事例では、ｐ５３の変異状態に従って患者を層別化した。異なる患者群の生存曲線を算出するためにカプラン−マイヤー評価を使用し、得られた危険率の統計上の有意性を評価するためにワルド検定を使用した。図４の生存分析は、偶然のみによる達成率を評価し、ｐ５３の状態単独を使用して得られたｐ＝０．０１２と比較して（パネルＡ）、より有意なワルドｐ値０．０００５７（パネルＢ）は、ｐ５３分類指標によって決定されたグループ指定を使用し得られた。１００，０００回の繰り返しランでは、４０腫瘍を無作為に選択し（すなわち、パネルＡとＢではグループ指定で腫瘍数が異なった）、それらのｐ５３の状態を逆にし、ワルドｐ値を各ランで算出した。ｐ値≦０．０００５７は、５６４回しか得られなかった。この観察のモンテカルロｐ値は、０．００４６であると推定される。
【００９７】
関連性試験（すなわち、２個以上の群において観察した事象数の有意性を確認するため）には、カイ２乗検定を使用した。任意のカテゴリーで事象数が極めてさい（＜５）場合、カイ２乗検定の代わりにフィッシャーの正確確率検定を使用した。
【００９８】
ｐ５３下流標的遺伝子および上流エフェクターの発現レベルの統計分析には、ｐ５３ｗｔおよびｍｔ腫瘍間で差次的に発現した遺伝子を判定するために、両側２群Ｔ検定を使用した（図８）。ｍｔ様クラス中のｐ５３ｗｔ腫瘍と、ｗｔ様クラス中のｐ５３ｗｔ腫瘍の間の比較（逆も同様）には片側２群ｔ検定を実施して、ｐ５３野生型および突然変異体間で観察したように、遺伝子が同じ方向（または反対方向）で有意に差次的に発現したかどうかを試験した。
【００９９】
本発明の方法の実施形態が、本明細書に開示した統計方法のみには限らないことは当業者には明白であろう。本発明の実施形態は同等の分析法を包含する。本明細書で使用したｐ値の略語には以下のものがある。
【０１００】
ｐＷＴ＝ウィルコクソン順位和検定
ｐｔ＝Ｔ検定
ｐｃｓ＝カイ２乗検定
ｐｆｅ＝フィッシャーの正確確率検定
ｐＷ＝ワルド検定
ｐｍｃ＝モンテカルロ評価
既知の転写開始部位（ＴＳＳ）を有する分類指標遺伝子のそれぞれで、ｐ５３結合部位のプロモーター分析を実施した。ＢＥＡＲＲ（Vega, V. B., Bangarusamy, D. K., Miller, L. D., Liu, E. T. & Lin, C. Y. ＢＥＡＲＲ：Batch Extraction and Analysis of cis-Regulatory Regions（バッチ抽出およびシス調節領域の分析）Nucleic Acids Res 32, W257-60 (2004)、参照により本明細書に組み込む）を使用して、プロモーター配列（ＴＳＳの３０００ｂｐ上流〜５００ｂｐ下流）を抽出し、そしてＴＲＡＮＳＦＡＣ（Kel, A. E.ら、ＭＡＴＣＨ：A tool for searching transcription factor binding sites in DNA sequences （ＤＮＡ配列中の転写因子結合部位を探索するツール）、Nucleic Acids Res 31, 3576-9 (2003)、参照により本明細書に組み込む）バージョン６．０（マトリックスアクセッション：Ｍ００２７２）、および基準のｐ５３結合部位コンセンサス ５’−ＲＲＲＣＷＷＧＹＹＹＮ（０−１３）ＲＲＲＣＷＷＧＹＹＹ−３’（el-Deiry, W. S., Kern, S. E., Pietenpol, J. A., Kinzler, K. W. および Vogelstein, B. “ Definition of a consensus binding site for p53（ｐ５３のコンセンサス結合部位定義）”、Nat Genet 1, 45-9 (1992)、参照により本明細書に組み込む）に基づく単純なパターン調査から得られたＰ５３位置重み行列（position weight matrix）を使用して、推定結合部位を予測した。
【実施例５】
【０１０１】
ｐ５３欠陥分類指標は、内分泌治療を行った患者での結果と有意に相関するが、ｐ５３の状態単独ではない。
【０１０２】
患者の結果を予測する分類指標の確実性をさらに試験するために、他の関連する治療群におけるその性能も分析した。近年、ｐ５３ｍｔ胸部腫瘍は、ｐ５３ｗｔ腫瘍よりも内分泌療法に対して耐性が高いことが観察されており、これは耐性腫瘍中のｐ５３依存性アポトーシスの脱共役によって部分的に説明された（Berns, E. M.ら、”Complete sequencing of TP53 predicts poor response to systemic therapy of advanced breast cancer（ＴＰ５３の完全シーケンシングが、進行した乳癌の全身療法に対して不十分な応答を予測）”、Cancer Res 60, 2155-62 (2000)、参照により本明細書に組み込む）。ホルモン療法特異的患者コホートで、結果を予測する分類指標の能力を試験するために、術後アジュバントタモキシフェン治療のみを受けた６８名のＥＲ＋患者から構成したUppsalaコホートの亜集団を検査した。図６は、内分泌治療を行った患者で、ｐ５３分類指標が、ｐ５３の変異状態よりも予後予測の重要性が高いことを示す。６８名のＥＲ＋であり内分泌治療を行った患者を（Ａ）ｐ５３の変異状態または（Ｂ）ｐ５３分類指標に従って分類し、原病生存期間（ＤＳＳ）との相関を分析した。カプラン−マイヤー生存評価を示す。図６ＡおよびＢの生存分析に示されるように、この分類指標は、原病生存期間の有意な予測器（ｐｗ＝０．０４７）であったが、ｐ５３の変異状態単独はそうではなかった（ｐｗ＝０．３９５）ことが観察された。
【０１０３】
次に、van't Veerらによって公にされた９７の胸部腫瘍セット（van't Veer, L. J.ら、”Gene expression profiling predicts clinical outcome of breast cancer（遺伝子発現プロファイリングによって乳癌の臨床結果を予測）” Nature 415, 530-6 (2002)、参照により本明細書に組み込む）での分類指標の予後予測の性能を検査した。図７は、ｐ５３分類指標が、初期であり局所治療を受けた胸部腫瘍の独立したセットで遠隔再発の予後を予測することを示す。
【０１０４】
最適化させた分類指標の２１遺伝子に相当するプローブセットを使用して、術後アジュバント放射線療法で治療し、少なくとも５年間追跡した初期患者のオランダ人コホートから得た９７腫瘍（van't Veer, L. J.ら、”Gene expression profiling predicts clinical outcome of breast cancer （遺伝子発現プロファイリングによって乳癌の臨床結果を予測）”、Nature 415, 530-6 (2002)、参照により本明細書に組み込む）を階層的にクラスタ化した。色および「Ｃ」の名称（すなわち、Ｃ１〜Ｃ５）によって、主要なクラスタノードの境界を画定する。黒色の矢印は、５年以内に遠隔転移（ＤＭ）に発達した患者から得た腫瘍に相当する。遺伝子記号および対応するGenbank受託番号を示す。既に記載されている通りに階層的クラスタリングを実施した。
【０１０５】
ここで、試料の全ては、臨床的に均一になるように制御され、すなわち、サイズが＜５ｃｍであり（Ｔｌ／Ｔ２）、進行した疾患がなく（ｐＮ０）、診断時の年齢が５５歳未満であり、手術と続く放射線治療のみによって治療した患者（アジュバント全身療法を受けた５名の患者の除く）から得たものであった。３２の遺伝子分類指標から、２１の遺伝子に対応する２４のプローブを生存情報がある全９７腫瘍に位置づけることができた。腫瘍クラスタリング後、類似する平均距離相関を有する約４個のクラスタが観察され、そのクラスタは５年以内に遠隔転移を生じたであろう患者を有意に識別した（ｐｆｅ＝２．２×１０−４）（図７）。特に、ｐ５３ｗｔ様分子立体配置に最も近似するクラスタ３の３９腫瘍のうちの２６％と比較して、分子立体配置がｐ５３ｍｔ様腫瘍であるクラスタ１の２６腫瘍のうちの７３％が５年以内に遠隔転移した。これらの知見から、ｐ５３分類指標は、初期であり局所治療を受けた乳癌で腫瘍再発を予後予測するということが示唆される。
【実施例６】
【０１０６】
分類指標遺伝子の機能の分析
いくつかの機構的な洞察を得るために、その発現レベルおよびｐ５３の状態と、患者の結果との間の相関を説明する手がかりを求めて、分類指標遺伝子の機能性アノテーションを分析した。驚くべきことに、分類指標遺伝子のどれも既知のｐ５３の転写標的ではないばかりか、以前にはｐ５３経路に関与していなかったことが判明した。所定のプロモーター領域を有する２１の遺伝子のプロモーターを分析することによって、これらのプロモーターのどれにも、基準のｐ５３結合部位、または近年記載された新規なｐ５３結合部位の形跡がないことが判明した。
【０１０７】
これらの遺伝子のうち１２個は機能が未知である。しかし、特徴づけられた遺伝子のうち、いくつかは、細胞増殖および増殖（ＭＹＢＬ２、ＴＦＦ１、ＢＲＲＮ１、ＣＨＡＤ、ＳＣＧＢ３Ａ１、ＤＡＣＨ、ＣＤＣＡ８）、転写（ＬＡＦ４、ＮＹ−ＢＲ−１、ＤＡＣＨ、ＭＹＢＬ２）、イオン輸送（ＣＡＣＮＧ４、ＣＹＢＲＤ１、ＬＲＰ２）、ならびに乳癌生物学（ＳＣＧＢ３Ａ１、ＴＦＦ１、ＳＴＣ２、ＮＹ−ＢＲ−１、ＡＧＲ２）に関連付けられる。推測では、これらの遺伝子のいくつかは、機構的に、ｐ５３突然変異体様腫瘍の不十分な予後予測を引き起こしうる。例えば、ｐ５３突然変異体様腫瘍で上方制御されるのが観察されたＭＹＢＬ２は、ｃ−ＭＹＢ発癌遺伝子に密接に関係する増殖促進転写因子である。それは、しばしば、乳癌（２０ｑ１３）で増幅する染色体領域に位置づけられ、乳癌細胞系統および孤発性卵巣癌で過剰に発現することが既に報告されている（Forozan, F.ら、”Comparative genomic hybridization analysis of 38 breast cancer cell lines: a basis for interpreting complementary DNA microarray data（３８乳癌細胞系統の比較ゲノムハイブリダイゼーション分析：相補的ＤＮＡマイクロアレイデータの解釈の基礎)”、Cancer Res 60, 4519-25 (2000)、およびTanner, M. M.ら、”Frequent amplification of chromosomal region 20q12-q13 in ovarian cancer（卵巣癌中の染色体領域２０ｑ１２−ｑ１３の高頻度増幅）”、Clin Cancer Res 6, 1833-9 (2000)、この両方を参照により本明細書に組み込む）。ｐ５３突然変異体様腫瘍で下方制御されることが観察されたＳＣＧＢ３Ａ１（ＨＩＮ１）は、仮想腫瘍サプレッサー遺伝子であり、過剰に発現した場合、乳癌細胞の増殖を阻害することができ、乳房腫瘍形成初期にそのプロモーターが過剰メチル化することによって、転写的にサイレンスされることが判明している（Krop, I. E.ら、”HIN-1, a putative cytokine highly expressed in normal but not cancerous mammary epithelial cells（ＨＩＮ−１、正常であり癌ではない乳房上皮細胞中高度に発現した推定サイトカイン)”、Proc Natl Acad Sci USA 98, 9796-801(2001)、参照により本明細書に組み込む）。
【実施例７】
【０１０８】
誤分類された腫瘍の性質。
【０１０９】
野生型ｐ５３配列状態を有するいくつかの癌が、３２遺伝子分類指標を使用する発現プロファイリングによって、ｐ５３突然変異体として分類されることが観察された。この「誤分類」されたｐ５３ｗｔ腫瘍が、実際にｐ５３の欠陥であったならば、これらは、ｐ５３経路の混乱を反映する何らかの分子特性を有し、これらの特性がｐ５３突然変異腫瘍の大多数に見られるはずである。第一に、ｐ５３遺伝子の転写阻止（ＴＰ５３）により、またはそのｍＲＮＡ半減期の短縮により低下した転写産物レベルから、ｐ５３の欠陥が生じうる可能性を考えてみた。異なる腫瘍クラスで、（マイクロアレイに存在するＴＰ５３プローブセットを用いて）ｔ検定を使用し、ＴＰ５３の相対的発現レベルを比較した（図８）。実際、この仮定に一致して、ｗｔ様として分類された残りの１７０のｗｔ腫瘍と比較して、ｍｔ様と分類された２８のｗｔ腫瘍で、ＴＰ５３の全体的発現レベルは有意に減少するのが観察された（ｐｔ＝１．４×１０−４）。一般に、ｐ５３突然変異乳癌では、ＴＰ５３のｍＲＮＡレベルは減少しないのと一致して、正確にｍｔ様と分類されたｐ５３ｍｔ腫瘍と、全ｗｔ腫瘍との間には、発現レベルにおいて統計上の有意差は観察されなかった。
【０１１０】
図８は、ｐ５３の転写産物レベル、その転写標的、およびその上流エフェクターが、既知の予想したクラスを識別することを示す。ｐ５３経路関連遺伝子の発現レベルを試験した。ｔ検定によって、異なる腫瘍クラス間の転写産物レベルの統計上の有意性を定量し、図右のまとめの表に示す。４つの腫瘍クラスは以下通りである。１）突然変異体として分類されたｐ５３ｍｔ腫瘍４７、２）突然変異体として分類されたｐ５３ｗｔ腫瘍２８、３）野生型として分類されたｐ５３ｗｔ腫瘍１７０、および４）野生型として分類されたｐ５３ｍｔ腫瘍１２。グレーで示したまとめの統計的測定値は、有意性がｐ＜０．０５に達しなかった。
【０１１１】
表３は、ｐ５３変異の比較分析を示す。（Ｉ）重大な変異を挿入、欠失、または終止コドンとして定義した。残りのミスセンス点変異（ｍｐｍ；ｗｔ様群中１１、ｍｔ様群中２７）のうち、ＩＡＲＣ ＴＰ５３変異データベース（国際がん研究機関ＩＡＲＣのウェブサイトでオンラインにより入手可能）によって定義されている通り、（ＩＩ）ｐ５３中最もありふれたミスセンス点変異、および（ＩＩＩ）ｉｎ ｖｉｔｒｏで優性阻害活性を有することが既に示されている突然変異体の出現頻度を本発明者らは定量した。Ｐ値は、フィッシャーの正確確率検定を使用し算出した。
【０１１２】
ｐ５３欠陥腫瘍の変化した転写をある程度示すと仮定した既知のｐ５３転写標的にこのやり方を適用した。実際、いくつかのｐ５３標的遺伝子は変化した発現パターンを示した（図８）。その全てがプロモーターに機能性ｐ５３結合部位を含む、ＴＰ５３誘発遺伝子であるＴＰ５３ＩＮＰ１、ＳＥＭＡ３Ｂ、ＰＭＡＩＰ１（ＮＯＸＡ）、ＦＤＸＲ、ＣＣＮＧ１、およびＬＲＤＤは、ｍｔ様と分類された２８のｗｔ腫瘍で、他方の野生型と比較して発現が有意に減少した（全てｐｔ＜０．０５）。さらにまた、一つを除きこれらの遺伝子は全て、ｍｔ様と分類されたｐ５３ｍｔ腫瘍で（全ｗｔ腫瘍と比較して）有意に減少し、そして２事例を除く全てにおいて、他方の突然変異体と比較した場合、これらの遺伝子は１２のｗｔ様として分類されたｍｔ腫瘍でより有意に高発現した。
【０１１３】
ｐ５３をリン酸化し、それによって安定化を促進するｐ５３陽性上流エフェクターであるＣＨＥＫ１およびＣＨＥＫ２は、ｐ５３によって転写的に抑制されることが知られている。突然変異体様クラスのｐ５３ｗｔおよびｍｔ腫瘍で、これらの遺伝子のｍＲＮＡレベルが有意に上昇することが観察された。また、野生型様として誤分類された１２のｍｔ腫瘍では、その他の４７のｐ５３突然変異体と比較して、これらの遺伝子の発現が有意に減少したことも観察された。特に、これらの胸部腫瘍試料では、ｐ５３に調節される遺伝子ＣＤＫＮ１Ａ（ｐ２１）、ＧＡＤＤ４５、ＰＰＭ１Ｄ（ＷＩＰ１）、ＴＰ５３Ｉ３（ＰＩＧ３）、ＴＮＦＲＳＦ６、ＢＢＣ３（ＰＵＭＡ）、ＡＰＡＦ１、またはＢＣＬ２は差次的に発現されないことが観察された。
【０１１４】
総合すると、分類指標はｐ５３転写活性のいくつかの態様に基づいて腫瘍を識別でき、この活性は、突然変異体様クラスのｐ５３突然変異体腫瘍および野生型腫瘍で阻害されるが、野生型様クラスのｐ５３野生型腫瘍（およびある程度１２のｐ５３突然変異腫瘍）では作動していることをこれらのデータは示唆している。
【０１１５】
おそらく逆説的に、ｐ５３を誘導する遺伝子ＰＥＲＰ、ＢＡＸ、およびＳＦＮ（１４−３−３σ）は全て、２８の誤分類されたｗｔ腫瘍で、上記の誘導性遺伝子対応物のように低レベルではなく、有意により高いレベルで発現することが観察された。しかし、突然変異体様として分類されたＰ５３ｍｔ腫瘍で、これらの遺伝子が有意に過剰発現することも観察され、乳癌では、突然変異体または欠陥ｐ５３と関連して調節機序を変えることにより、これらの遺伝子が誘発されうることが示唆された。
【０１１６】
興味深いことに、ＣＨＥＫ１およびＣＨＥＫ２の方法と似た方法でｐ５３活性を増強すると思われる、ｐ５３の別の陽性上流エフェクターＡＴＲもまた、たとえこの遺伝子がｐ５３依存性方式で調節されるかどうか不明であっても、ｐ５３突然変異体および突然変異体様クラスのｐ５３ｗｔ腫瘍で、より有意に高いレベル発現することが判明した。留意すべきは、上流エフェクターＡＴＭまたはＰＲＫＤＣ（ＤＮＡ−ＰＫ）の発現レベルで有意差は観察されなかった。
【０１１７】
次いで、それによって突然変異体様ｐ５３ｗｔ腫瘍でｐ５３の発現および活性が減少するかもしれない機序が、変更される可能性を確認するために、ｐ５３活性の他の上流モジュレーターの発現レベルを試験した。第一に、ＨＯＸＡ５、ＵＳＦ１、ＥＧＲ１、およびＴＰ５３ＢＰ１を含む突然変異体様クラスの野生型および突然変異体で、数個の既知のｐ５３トランス活性化陽性レギュレーターが有意に減少することが観察された。ＨＯＸＡ５、ＵＳＦ１、およびＥＧＲ１は全て、ｐ５３プロモーターに結合し、その発現を高めることが知られている転写因子である。興味深いことに、３つ全ての欠陥は、乳癌の発癌に既に関与していた。近年、ｐ５３およびＨＯＸＡ５ ｍＲＮＡの同調的な喪失およびタンパク質の発現が、ヒト乳癌細胞系統パネルで観察され、ＨＯＸＡ５プロモーターが、２０のｐ５３陰性ヒト胸部腫瘍の１６でメチル化することが判明した。ｃ−Ｍｙｃ腫瘍性タンパク質に構造的に関与するＵＳＦ１は、乳癌細胞系統で転写活性を減少させることが判明しており、近年、エストロゲン受容体αの発現を活性化することが示された。抗増殖機能およびアポトーシス機能を有するＤＮＡ傷害性応答遺伝子であるＥＧＲ１は、ヒト乳癌細胞で外来的に発現させた場合、腫瘍形成能を阻害することができ、ヒトおよびマウス乳癌細胞系統ならびに腫瘍で発現が減少することが観察されている。ＴＰ５３ＢＰ１は、転写因子というよりもＤＮＡ傷害に応答してリン酸化するＡＴＭのＢＲＣＴドメイン含有基質であると考えられている。この遺伝子産物は、ｐ５３の中心ＤＮＡ結合ドメインに結合し、それによってｐ５３標的遺伝子の転写活性化を増強することが知られている。２８の突然変異体として分類されたｐ５３ｗｔ腫瘍では、全４個の遺伝子の発現が有意に減少し、ＵＳＦ１およびＴＰ５３ＢＰ１の事例においては、野生型様として分類されたｐ５３突然変異体で発現は有意に高かった。興味深いことに、４７の突然変異体様として分類されたｐ５３ｍｔ腫瘍では、可能な陽性フィードバックループを示唆して、それらの発現レベルも有意に低く、それによって野生型ｐ５３はこれらの遺伝子の発現を増強することができるが、損なわれたｐ５３はそのようにできないことも観察された。これらの観察が別々にまたは組み合わせて作用する可能性を示唆しているのに合わせて、これらの遺伝子は乳房で無傷のｐ５３活性には重要であり、転写的にサイレンスされた場合には、ｐ５３の欠陥の一因となりうる。
【０１１８】
最後に、数個の既知のｐ５３活性陰性レギュレーター発現を検査した。特に、リン酸化が介在するｐ５３タンパク質の分解によって、ｐ５３を消極的に調節し、タンパク質レベルでのその過剰発現が様々な癌に関与してきたＭＤＭ２は、本明細書に記載した実験では、転写産物レベルで差次的に発現しないことが判明した。しかし、ＰＬＫ１およびＧＴＳＥ１は発現した。近年、Ｍ相レギュレーターＰＬＫ１は、ｐ５３のＤＮＡ結合ドメインに結合し、それによってｉｎ ｖｉｔｒｏでその転写活性を阻害するするように見えた。ＧＴＳＥ１（Ｂ９９）は、ｐ５３のＣ末端調節ドメインに結合し、ｐ５３トランス活性化機能を阻害し、ｐ５３タンパク質の細胞内レベルを減少させる。興味深いことに、両遺伝子の転写産物レベルは、ｍｔ様クラスのｐ５３ｗｔおよびｍｔ腫瘍の中で最高に有意に過剰発現し、乳癌の発癌でのｐ５３の機能抑制における、これらの遺伝子産物の可能な役割を示唆した。
【０１１９】
次に、野生型様として１２のｐ５３突然変異腫瘍が誤分類されたことを説明しうる相関についてｐ５３変異のスペクトルを分析した。まず、わずか一つの変異が野生型様および突然変異体様腫瘍に共通することが観察された。ＤＮＡ結合ドメイン中のアミノ酸２２０にあるＴｙｒ＞Ｃｙｓである。突然変異体として正確に分類された４７のｐ５３ｍｔ腫瘍の中で、４２％（２０／４７）がフレームシフトと続く切断をもたらす、挿入（ｎ＝２）、欠失（ｎ＝１１）、および終止コドン（ｎ＝７）（表３−Ｉ）として定義された「重大な」変異を有し、それに対して野生型様として分類された１２の突然変異体では、わずか１個（８％）が重大な変異である、グリシン残基のインフレーム付加をもたらすＤＮＡ結合ドメインへの３ｂｐの挿入を含有する（ｐｆｅ＝０．０２５）ことが観察された。２００３年６月現在、１８，５８５の体細胞変異および２２５のｐ５３の生殖細胞系列変異インデックスを有するＩＡＲＣ ＴＰ５３変異データベース（国際がん研究機関ＩＡＲＣのウェブサイトでオンラインにより入手可能）を使用し、ヒト癌において、１２のｗｔ様突然変異体および４７のｍｔ様突然変異体中の最も共通するｐ５３変異（全ｐ５３変異の約２０％を表す；表１−ＩＩ）の出現頻度を比較した。ｍｔ様群の２７のうち９と比較して、共通する変異のどれも、ｗｔ様群中の１１のミスセンス点変異（ｍｐｍ）サブセットと重複しないことが判明した（ｐｆｅ＝０．０２９）。次いで、各腫瘍群のｍｐｍと、ＩＡＲＣ ＴＰ５３変異データベースの包括的リストの４１８の突然変異体とを交差比較したが、これらの突然変異体は、既に公にされた４４の研究の少なくとも一つで、優性阻害機能について予め分析されている。表２−ＩＩＩに示すように、ｍｔ様群の２７うちの１２と比較して、１２のｗｔ様突然変異体のうち１１のｍｐｍのわずか１つが、優性阻害活性を有していることが既に実証されていることが判明した（ｐｆｅ＝０．０３９）。総合すると、これらのデータは、配列レベルでは、野生型様として分類された１２のｐ５３突然変異体は、突然変異体様として分類された４７のｐ５３突然変異体と比較して、ほとんど「良性」のｐ５３突然変異体を実際に含みうることが示唆され、本発明者らの発現分析におけるｐ５３ｗｔ腫瘍の大多数と、それらが分子的に一致することとも一致する。
【表３】
【０１２０】
ｐ５３変異の比較分析。（Ｉ）重大な変異を挿入、欠失、または終止コドンとして定義した。残りのミスセンス点変異（ｍｐｍ；ｗｔ様群中１１、ｍｔ様群中２７）のうち、ＩＡＲＣ ＴＰ５３変異データベース（http://www.iarc.fr/p53/index.html）によってに定義されている通り、（ＩＩ）ｐ５３中、最もありふれたミスセンス点変異、および（ＩＩＩ）ｉｎ ｖｉｔｒｏで優性阻害活性を有することが既に示されている突然変異体の出現頻度を本発明者らは定量した。Ｐ値は、フィッシャーの正確確率検定を使用し算出した。
【０１２１】
本発明の実施には、当業者に公知の慣用の生物学的方法、ソフトウェア、およびシステムを使用しうる。前述の実施例は、患者で疾患の結果を予測する方法を記載した。別の態様では、患者で疾患の結果を予測するためのコンピューターシステムを提供する。そのコンピューターシステムは、プロセッサとメモリを備えることができ、該メモリには、ｐ５３遺伝子の突然変異体または野生型でありうる腫瘍試料の複数の遺伝子から遺伝子発現プロファイルを得るステップ、突然変異腫瘍または野生型腫瘍中でどの遺伝子が差次的に発現しているのかを判定するために、該遺伝子発現プロファイルを比較するステップ、差次的に発現した該遺伝子から、ｐ５３の変異状態を予測するための遺伝子セットを抽出するステップ、および患者で疾患の結果を予測するために、該遺伝子セットを使用するステップを実施するために、プロセッサに実行させる実行可能コードが保存されている。
【０１２２】
適当なコンピューターシステムは、例えば、ＰＣやマッキントッシュなど、一般的な汎用コンピューターであってよい。典型的には、本発明のコンピューターソフトウエア製品には、本発明の方法の論理ステップを実施するためのコンピューターが実施することができる指示を含む、コンピューターが読み取り可能な媒体が含まれる。適当なコンピューターが読み取り可能な媒体には、フロッピーディスク、ＣＤ−ＲＯＭ／ＤＶＤ／ＤＶＤ−ＲＯＭ、ハードディスクドライブ、フラッシュメモリー、ＲＯＭ／RAM、磁気テープなどが含まれる。コンピューターが実施可能な指示は、適当なコンピューター言語または数種の言語の組合せで書かれていてよい。基礎的なコンピューター生物学的方法は、例えば、SetubalおよびMeidanisら、『Introduction to Coniputational Biology Methods （コンピューターによる生物学的方法の手引き）』(PWS Publishing Corripany, Boston, 1997)、Salzberg、Searles、Kasif、（編）、『Computational Methods in Molecular Biology（分子生物学におけるコンピューターによる方法）』、(Elsevier, Amsterdam, 1998)、 RashidiおよびBuehlei、『Bioinformatics Basics: Application in Biological Science and Medicine（バイオインフォマティクスの基礎：生物科学および医薬における応用）』(CRC Press, London, 2000)、およびOueletteおよびBzevanis、『Bioinformatics: A Practical Guide for Analysis of Gene and Proteins（バイオインフォマティクス：遺伝子およびタンパク質分析用実用的ガイド）』(Wiley & Sons, Inc., 第２版,2001)に記載されている。
【０１２３】
さらに、本発明は、インターネットなどのネットワークを通して遺伝情報を提供する方法を含む好ましい実施形態を含みうる。
【０１２４】
さらに、本発明のいくつかの実施形態は、多様な癌に対する化学療法剤を設計するための複数の医薬標的を提供しうる。例えば、ｐ５３の変異状態に最も相関する３２遺伝子は、化学療法用の潜在的分子標的として役立つであろう。化学療法薬物（細胞毒剤）および抗ホルモン治療は、癌を治療するために通常使用されている。しかし、数名の患者では、細胞毒剤および抗ホルモン剤を含む治療レジメンは、軽度から重度の副作用を引き起こすことが知られている。例えば、乳癌では、これらの副作用には嘔吐、嘔気、脱毛症、および疲労が含まれる。従って、有効な癌治療の未来は、その標的に高特異的な薬物と共に存在する。いくつかの研究に従って、臨床開発のパイプラインにおける乳癌薬物の約６８％は標的化したクラスのものである。従って、本発明のある態様で具体化させたものなどの分子サインは、重要な手がかりを提供し、または標的化した化学療法剤で他に依存しない標的であることが証明されるであろう。
【０１２５】
最後に、開示した本発明の実施形態は、ｐ５３の状態およびヒト乳房腫瘍での生存を予測することができる遺伝子発現サインを定義する（ｐ５３サインまたは分類指標）。乳癌および肝臓癌の独立したデータセット、そして他の臨床特徴に関わらず、そのｐ５３サインのサブセットによって、有意な精度をもってｐ５３の状態を予測することができる。原病生存期間（ＤＳＳ）の予測器として、このサインは、不均一に治療された患者大コホートで、ｐ５３の変異状態単独より有意に優れていた。ｐ５３サインは、全身アジュバント療法および局所領域的放射線治療から多少の利益を得た患者を有意に識別できるであろう。ほとんどのヒト癌のあるレベルでｐ５３経路は損傷を受けうるが、ｐ５３経路に関与する転写産物の分析によって、ｐ５３発現サインが、患者生存および治療応答に影響を与える、胸部腫瘍のこの経路の操作立体配置を定義する（ｐ５３の変異状態単独よりもそのようである）ことが示唆される。癌では、全てのｐ５３変異が等しい効果を有するとは限らないことは明らかであり、あるものは単純に機能を喪失させ、あるものは優性阻害効果（野生型ｐ５３のトランス優性抑制または発癌機能の獲得など）を有し、またあるものは部分的機能喪失を示し、例えば、ｐ５３下流転写標的遺伝子の小サブセットだけが調節不全になる。こうした理由で、ｐ５３の状態のただ一つの分子評価が、完全なｐ５３の機能の絶対的指標を提供するとは思われない。本明細書に開示した実施形態は、ｐ５３の機能の下流指標を見ることによって、シーケンシングまたは生化学的手段の使用よりも、ｐ５３の機能状態を正確に確認しうることをを示唆する。
【０１２６】
上記説明は、例示を目的とし、限定するものではないことは理解されよう。本発明の多くの変形形態は、上記説明を再考することにより当業者には明白である。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲、およびそのような請求項が権利を受ける同等物の全範囲に関して決定される。特許文献および非特許文献を含め、引用した参照文献は全て、参照によりその全体をあらゆる目的において本明細書に組み込む。
【図面の簡単な説明】
【０１２７】
【図１】開示した本発明の一実施形態で使用するための、ｐ５３の状態と統計学的に相関する上位２５０遺伝子を使用する、２５７腫瘍の階層的クラスタリングを示す図である。
【図２Ａ−Ｂ】開示した本発明の実施形態に一致して、ｐ５３の状態に対する遺伝子分類指標の最適化および結果を示す図である。
【図２Ｃ】開示した本発明の実施形態に一致して、ｐ５３の状態に対する遺伝子分類指標の最適化および結果を示す図である。
【図３】開示した本発明の実施形態に一致して、分類指標遺伝子が、独立したｃＤＮＡマイクロアレイデータセットでｐ５３の状態を予測できることを示す図である。
【図４】開示した本発明の実施形態に一致して、ｐ５３分類指標が、ｐ５３の変異状態単独よりも予後予測の重要性が高いことを示す図である。
【図５】開示した本発明の実施形態に一致して、後期腫瘍の独立したデータセットで、ｐ５３分類指標の予後予測の重要性が極めて高いことを示す図である。
【図６】開示した本発明の実施形態に一致して、内分泌治療を行った患者で、ｐ５３分類指標が、ｐ５３の変異状態よりも予後予測の重要性が高いことを示す図である。
【図７】開示した本発明の実施形態に一致して、初期であり局所治療を施した胸部腫瘍の独立したセットで、ｐ５３分類指標が、遠隔再発の予後徴候であることを示す図である。
【図８】開示した本発明の実施形態に一致して、ｐ５３の転写産物レベル、その転写標的、およびその上流エフェクターが、既知の予想されるクラスを識別することを示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概括的に、患者で疾患感受性を予測するためのシステム、組成、および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
５０％を超えるヒト癌でｐ５３内変異は生じると考えられ、その変異はＤＮＡ結合ドメインおよびトランス活性化ドメインで観察されることが非常に多く、腫瘍発生の抑制においてその転写活性が重要であることを強く示している。ほとんどの癌種とは異なり、孤発性乳癌では、ｐ５３変異は約２０％の事例で観察されるに過ぎない。しかし、ｐ５３生殖細胞系列変異を有する個人（すなわちリフラウメニ症候群）で、乳癌が多く観察されることは、乳癌の発生においてｐ５３の不活化が特に重要な役割を担い、そしておそらく同様にｐ５３の機能を損ないうる他の因子も重要な役割を担うことを示唆している。
【０００３】
例えば、近年、ＨＯＸＡ５転写因子の過剰メチル化と、その後の阻害に続いて、ｐ５３の転写活性化が減少することは、ありうるエピジェネティック機序として、乳癌でのｐ５３の発現の減少に関係付けられてきた。両胸部腫瘍および他の癌種では、その産生物がｐ５３の分解を促進するＭＤＭ２遺伝子の増幅と過剰発現が、発癌に関係付けられてきた。さらに、ＭＤＭ２の負の制御因子であるｐ１４ＡＲＦ遺伝子の欠失およびエピジェネティックサイレンシングは、様々な癌種で観察されている。従って、乳癌の発癌におけるｐ５３の欠陥は、潜在的にｐ５３遺伝子変異以外のいくつかの機序から生じうる。
【０００４】
ｐ５３の状態は、いくつかの癌種で、特に乳癌で、予後の予測に重要であるという証拠がある。乳癌では、ｐ５３変異は、他の危険因子とは無関係に、全体的な無病生存期間を低下させ、腫瘍が再発する頻度を上昇させる。近年の証拠は、ｐ５３の不活化が、おそらくｐ５３依存性アポトーシスを喪失させることにより、胸部腫瘍をある種のＤＮＡ損傷性化学療法および内分泌療法に耐性にすることを示唆している。
【０００５】
しかし、これらの研究の全てにおいて、ｐ５３突然変異体の予後予測の可能性および治療耐性度は、変異の種類または変異が生じる正確なドメインなど、突然変異体の特定の特質に多く依存していることが判明した。重要なことには、この後者の観察は、ｐ５３の全ての変異の影響が等しいわけではなく、つまりあるものは単に機能を喪失させるだけであり、またあるものは優性阻害効果（野生型ｐ５３のトランス優性の抑制または発癌機能獲得など）を有し、さらにあるものは、例えば、ｐ５３下流転写標的遺伝子の小サブセットだけを調節不全にして、部分的にのみ機能を喪失させるという従来の研究から得た知見に一致する。こうした理由で、どの一つのｐ５３の状態の分子評価も、ｐ５３の完全な機能の絶対的指標になっていないと思われる。
【非特許文献１】Bergh, J.、 Norberg, T.、Sjogren, S.、Lindgren, A. および Holmberg, L. “Complete sequencing of the p53 gene provides prognostic information in breast cancer patients, particularly in relation to adjuvant systemic therapy and radiotherapy（ｐ５３遺伝子完全シーケンシングによる、乳癌患者で、特に、アジュバント全身治療および放射線治療と関連する予後予測情報の提供）” Nat Med 1, 1029-34 (1995)
【非特許文献２】Elston, C. W. および Ellis, I. O. “Pathological prognostic factors in breast cancer. I. The value of histological grade in breast cancer: experience from a large study with long-term follow-up（乳癌における病理学的予後予測要因．Ｉ 乳癌における組織学的等級値：長期追跡による大研究から得た経験）” Histopathology 19, 403-10 (1991)
【非特許文献３】Egyhazi, S.ら、”Proteinase K added to the extraction procedure markedly increases RNA yield from primary breast tumors for use in microarray studies（抽出手順に添加したプロテイナーゼＫが、マイクロアレイ研究で使用する胸部原発腫瘍から得たＲＮＡの収量を顕著に増大）” Clin Chem 50, 975-6(2004)
【非特許文献４】Cattoretti, G.、Rilke, F.、Andreola, S.、D'Amato, L. および Delia, D. “P53 expression in breast cancer（乳癌でのＰ５３の発現）”. Int J Cancer. 41,178-83 (1988)
【非特許文献５】Isola, J.、Visakorpi, T.、Holli, K. および Xallioniemi, O. P. “Association of overexpression of tumor suppressor protein p53 with rapid cell proliferation and poor prognosis in node-negative breast cancer patients（リンパ節陰性乳癌患者における癌抑制タンパク質ｐ５３の過剰発現と迅速な細胞増殖および不十分な予後予測との関連性）” J Natl Cancer Inst 84, 1109-14. (1992)
【非特許文献６】Andersen, T. I.ら、”Prognostic significance of TP53 alterations in breast carcinoma（乳癌におけるＴＰ５３改変の予後予測の重要性）.”Br J Cancer 68, 540-8 (1993)
【非特許文献７】Bhargava, V.ら、”The association of p53 immunopositivity with tumor proliferation and other prognostic indicators in breast cancer（乳癌におけるｐ５３免疫陽性と、腫瘍増殖および他の予後予測指標との関連性）” Mod Pathol 7, 361-8 (1994)
【非特許文献８】Dudoit, S., Frilyand, J. および Speed, T. P. “Comparison of discrimination methods for the classification of tumors using gene expression data（遺伝子発現データを使用する、腫瘍を分類するための判別法比較）”、Journal of the American Statistical Association 97, 77-87. (2002)
【非特許文献９】Sorlie, T.ら、”Repeated observation of breast tumor subtypes in independent gene expression data sets（独立した遺伝子発現データセットにおける胸部腫瘍サブタイプの反復観察）” Proc Natl Acad Sci USA 100, 8418-23 (2003)
【非特許文献１０】Chen, X.ら、”Gene expression patterns in human liver cancers（ヒト肝臓癌での遺伝子発現パターン）”、Mol Biol. Cell 13, 1929-39 (2002)
【非特許文献１１】Chen, X.ら、”Gene expression patterns in human liver cancers（ヒト肝臓癌における遺伝子発現パターン）” Mol Biol Cell 13,1929-39 (2002)
【非特許文献１２】Kel, A. E.ら、ＭＡＴＣＨ：A tool for searching transcription factor binding sites in DNA sequences （ＤＮＡ配列中の転写因子結合部位を探索するツール）、Nucleic Acids Res 31, 3576-9 (2003)
【非特許文献１３】el-Deiry, W. S., Kern, S. E., Pietenpol, J. A., Kinzler, K. W. および Vogelstein, B. “ Definition of a consensus binding site for p53（ｐ５３のコンセンサス結合部位定義）”、Nat Genet 1, 45-9 (1992)
【非特許文献１４】Berns, E. M.ら、”Complete sequencing of TP53 predicts poor response to systemic therapy of advanced breast cancer（ＴＰ５３の完全シーケンシングが、進行した乳癌の全身療法に対して不十分な応答を予測）”、Cancer Res 60, 2155-62 (2000)
【非特許文献１５】van't Veer, L. J.ら、”Gene expression profiling predicts clinical outcome of breast cancer（遺伝子発現プロファイリングによって乳癌の臨床結果を予測する）” Nature 415, 530-6 (2002)
【非特許文献１６】Forozan, F.ら、”Comparative genomic hybridization analysis of 38 breast cancer cell lines: a basis for interpreting complementary DNA microarray data（３８乳癌細胞系統の比較ゲノムハイブリダイゼーション分析：相補的ＤＮＡマイクロアレイデータを解釈するための基本)”、Cancer Res 60, 4519-25 (2000)
【非特許文献１７】Tanner, M. M.ら、”Frequent amplification of chromosomal region 20ql2-ql3 in ovarian cancer（卵巣癌中の染色体領域２０ｑ１２−ｑ１３の高頻度増幅）”、Clin Cancer Res 6, 1833-9 (2000)
【非特許文献１８】Krop, I. E.ら、”HIN-1, a putative cytokine highly expressed in normal but not cancerous mammary epithelial cells（ＨＩＮ−１、正常であり癌ではない乳房上皮細胞中高度に発現した推定サイトカイン)”、Proc Natl Acad Sci USA 98, 9796-801(2001)
【非特許文献１９】SetubalおよびMeidanisら、『Introduction to Coniputational Biology Methods （コンピューターによる生物学的方法の手引き）』(PWS Publishing Corripany, Boston, 1997)
【非特許文献２０】Salzberg、Searles、Kasif、（編）、『Computational Methods in Molecular Biology（分子生物学におけるコンピューターによる方法）』、(Elsevier, Amsterdam, 1998)
【非特許文献２１】RashidiおよびBuehlei、『Bioinformatics Basics: Application in Biological Science and Medicine（バイオインフォマティクスの基礎：生物科学および医薬における応用）』(CRC Press, London, 2000)
【非特許文献２２】OueletteおよびBzevanis、『Bioinformatics: A Practical Guide for Analysis of Gene and Proteins（バイオインフォマティクス：遺伝子およびタンパク質分析用実用的ガイド）』(Wiley & Sons, Inc., 第２版,2001)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
癌の予後予測および診断を向上させる努力の中では、異なるｐ５３変異が、一般的に細胞機能に、特に、遺伝子発現に及ぼす影響をより正しく評価する方法が必要とされている。
【０００７】
概要
【課題を解決するための手段】
【０００８】
従って、本発明は、ｐ５３のｉｎ ｖｉｖｏ機能性をより有用に測定する方法、システム、および組成を提供する。これらの方法、システム、および組成は、癌の分類、予後予測、および診断に使用しうる。
【０００９】
本発明の一態様では、患者で疾患の結果を予測する方法であって、ｐ５３遺伝子の突然変異体または野生型でありうる腫瘍試料の複数の遺伝子から遺伝子発現プロファイルを得るステップ、突然変異腫瘍または野生型腫瘍中でどの遺伝子が差次的に発現しているのかを判定するために、該遺伝子発現プロファイルを比較するステップ、差次的に発現した該遺伝子から、ｐ５３の変異状態を予測するための遺伝子セットを抽出するステップ、および患者で疾患の結果を予測するために、該遺伝子セットを使用するステップを含む上記方法を提供する。
【００１０】
本発明の別の態様では、後期乳癌患者で疾患の結果を予測する方法であって、ｐ５３遺伝子の突然変異体または野生型でありうる腫瘍試料の複数の遺伝子から遺伝子発現プロファイルを得るステップ、突然変異腫瘍または野生型腫瘍中でどの遺伝子が差次的に発現しているのかを判定するために、該遺伝子発現プロファイルを比較するステップ、差次的に発現した該遺伝子から、ｐ５３の変異状態を予測するための遺伝子セットを抽出するステップ、および後期乳癌患者で疾患の結果を予測するために、該遺伝子セットを使用するステップであって、該遺伝子セットがGenBank受託番号：ＢＧ２７１９２３（配列番号２２）、ＮＭ_００２４６６（配列番号３１）、Ｄ３８５５３（配列番号１１）、ＮＭ_０００９０９（配列番号９）、ＮＭ_０２４８４３（配列番号１）、Ｒ７３０３０（配列番号２９）、ＮＭ_００３２２６（配列番号２８）、ＡＷ２９９５３８（配列番号５）、およびＡＩ９９０４６５（配列番号２５）からなる群から選択されるステップ含む方法を提供する。
【００１１】
本発明のさらに別の態様では、初期であり局所治療を受けた乳癌患者で臨床結果を予測する方法であって、ｐ５３遺伝子の突然変異体または野生型でありうる腫瘍試料の複数の遺伝子から遺伝子発現プロファイルを得るステップ、突然変異腫瘍または野生型腫瘍中でどの遺伝子が差次的に発現しているのかを判定するために、該遺伝子発現プロファイルを比較するステップ、差次的に発現した該遺伝子から、ｐ５３の変異状態を予測するための遺伝子セットを抽出するステップ、および初期であり局所治療を受けた乳癌患者で疾患の結果を予測するために、該遺伝子セットを使用するステップであって、該遺伝子セットがGenBank受託番号：ＡＩ９６１２３５（配列番号２３）、ＢＧ２７１９２３（配列番号２２）、ＮＭ_００２４６６（配列番号３１）、ＢＣ００１６５１（配列番号１４）、Ｄ３８５５３（配列番号１１）、ＡＫ０００３４５（配列番号２６）、ＢＣ００４５０４（配列番号８）、ＮＭ_０００９０９（配列番号９）、ＮＭ_０２４８４３（配列番号１）、Ｒ７３０３０（配列番号２９）、ＡＩ４３５８２８（配列番号２０）、ＡＩ８１０７６４（配列番号２４）、ＡＩ９２２３２３（配列番号１０）、ＮＭ_００３２２５（配列番号３２）、ＮＭ_００３２２６（配列番号２８）、ＡＷ２９９５３８（配列番号５）、ＮＭ_００３４６２（配列番号１６）、ＡＩ９９０４６５（配列番号２５）、ＮＭ_００４３９２（配列番号１５）、ＮＭ_００１２６７（配列番号７）、およびＡＩ８２６４３７（配列番号３）からなる群から選択されるステップを含む上記方法を提供する。
【００１２】
本発明の別の態様では、肝臓癌患者で臨床結果を予測する方法であって、ｐ５３遺伝子の突然変異体または野生型でありうる腫瘍試料の複数の遺伝子から遺伝子発現プロファイルを得るステップ、突然変異腫瘍または野生型腫瘍中でどの遺伝子が差次的に発現しているのかを判定するために、該遺伝子発現プロファイルを比較するステップ、差次的に発現した該遺伝子から、ｐ５３の変異状態を予測するための遺伝子セットを抽出するステップ、および肝臓癌患者で疾患の結果を予測するために、該遺伝子セットを使用するステップであって、該遺伝子セットが、GenBank受託番号：ＮＭ_００２４６６（配列番号３１）、ＢＣ００１６５１（配列番号１４）、Ｄ３８５５３（配列番号１１）、ＮＭ_０２４８４３（配列番号１）、ＡＩ４３５８２８（配列番号２０）、ＡＩ８１０７６４（配列番号２４）、ＮＭ_００３２２６（配列番号２８）、およびＡＷ２９９５３８（配列番号５）からなる群から選択されるステップを含む上記方法を提供する。
【００１３】
本発明のさらに別の態様では、患者で疾患の結果を予測するための遺伝子群を同定する方法であって、ｐ５３遺伝子の突然変異体または野生型でありうる腫瘍試料の複数の遺伝子から遺伝子発現プロファイルを得るステップ、突然変異腫瘍または野生型腫瘍中でどの遺伝子が差次的に発現しているのかを判定するために、該遺伝子発現プロファイルを比較するステップ、ｐ５３の変異状態を予測するために、差次的に発現した該遺伝子をその能力に従ってランク付けるステップ、突然変異体および野生型のｐ５３遺伝子発現プロファイルを識別するために、ランク付けしたそれらの遺伝子を訓練するステップ、ｐ５３の変異状態を予測する能力がある遺伝子セットを含むｐ５３分類指標を得るステップ、独立したデータセット中の該ｐ５３分類指標を確証するステップ、および患者で疾患の結果を予測するために、該ｐ５３分類指標の能力を評価するステップを含む上記方法を提供する。
【００１４】
本発明の別の態様では、患者で疾患の結果を予測するためのコンピューターシステムであって、プロセッサとメモリとを有するコンピューターを備え、該メモリ上には、ｐ５３遺伝子の突然変異体または野生型でありうる腫瘍試料の複数の遺伝子から遺伝子発現プロファイルを得るステップ、突然変異腫瘍または野生型腫瘍中でどの遺伝子が差次的に発現しているのかを判定するために、該遺伝子発現プロファイルを比較するステップ、差次的に発現した該遺伝子から、ｐ５３の変異状態を予測するための遺伝子セットを抽出するステップ、および患者で疾患の結果を予測するために、該遺伝子セットを使用するステップを実施するために、プロセッサに実行させる実行可能コードが保存されている上記コンピューターシステムを提供する。
【００１５】
本発明のさらに別の態様ではｐ５３の変異状態を予測する能力がある複数の遺伝子を固体支持体に固定させた、患者で疾患感受性を予測するための診断ツールを提供する。
【００１６】
本発明のさらに別の態様では、固体支持体と、その上にディスプレイさせた、患者でｐ５３の変異状態を予測する能力がある遺伝子に対応する核酸プローブとを有する、患者で疾患感受性を予測するための核酸アレイを提供する。
【００１７】
これらの態様および実施形態を以下にさらに詳しく述べる。
【００１８】
定義
本出願で使用されるように、単数形の「a」、「an」、および「the」は、前後関係から明瞭にそうではないと指摘されない限り複数の意味を包含する。例えば、「（an）薬剤」という用語は、複数の薬剤を含み、それらの混合物も含む。
【００１９】
個体は、ヒトだけには限らず、哺乳動物、無脊椎動物、植物、真菌、ウイルス、細菌を含むが、それだけには限らない他の生物、あるいは上記のいずれかに由来する一つまたは複数の細胞であってもよい。
【００２０】
本明細書で使用する「comprising」という用語は、「including」を意味する。「comprising」という語の変形、例えば、「comprise」および「comprises」は、対応して変化した意味を持つ。
【００２１】
本開示全体にわたって、本発明の様々な態様を一範囲型式で示す。範囲型式での記述は、単に便宜、簡潔さのためと理解すべきであり、本発明の範囲を柔軟性なく制限するものと解釈すべきではない。従って、範囲の記述は、具体的に開示した全ての可能な下位範囲およびその範囲内の個々の数値を含むと考えるべきである。例えば、１〜６などの範囲の記述は、具体的に開示した下位範囲、例えば、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６、およびその範囲内の個々の番号、例えば、１、２、３、４、５、および６を含むと考えるべきである。これは、範囲の幅に関わらず該当する。
【００２２】
本明細書で使用する「組織学的等級」または「腫瘍等級」という用語は、Elston-Ellis系腫瘍等級法に従い分類した腫瘍特性をさす。
【００２３】
本明細書で使用する「ｐ５３の状態」は、ｐ５３遺伝子の変異状態をさす。ｐ５３突然変異腫瘍は、ｐ５３遺伝子中に、そのタンパク質の機能を変化させる変異を含む。ｐ５３野生型腫瘍は、ｐ５３遺伝子中に検出可能な変異を含まない。
【００２４】
本明細書で使用する「原病生存期間」、すなわちＤＳＳは、試験の終着が、疾患、例えば、乳癌を原因とする死である生存評価である。
【００２５】
本明細書で使用する「無病生存期間」、すなわちＤＦＳは、終着が、腫瘍再発（すなわち、癌が、体内の他の部位への遠隔転移の結果として再発する）、または遠隔転移の形跡のない乳癌を原因とする死である生存評価である。
【００２６】
本明細書で使用する「アレイ」は、意図的に作成した分子コレクションであり、このコレクションは合成または生合成により調製することができる。アレイ中の分子は、互いに同一または異なっていてよい。アレイは、様々な型式、例えば、可溶性分子ライブラリー、樹脂ビーズ、シリカチップ、または他の固体支持体に結合させた化合物のライブラリーを想定することができる。
【００２７】
本明細書で使用する「核酸ライブラリーまたはアレイ」は、様々な異なる型式で意図的に作成した核酸コレクション（例えば、可溶性分子ライブラリー、および樹脂ビーズ、シリカチップ、または他の固体支持体に結合させたオリゴヌクレオチドのライブラリー）であり、このコレクションは合成または生合成により調製することができる。さらに、「アレイ」という用語は、基本的に任意の長さ（例えば、１〜約１０００ヌクレオチドモノマー長）の核酸を基板にスポットすることによって調製することができる、これらの核酸ライブラリーも含むものとする。本明細書で使用する「核酸」という用語は、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形、つまりリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、またはペプチド核酸（ＰＮＡ）をさし、プリン塩基およびピリミジン塩基、または他の天然、化学的もしくは生化学的に改変された、非天然、または誘導体化されたヌクレオチド塩基を含む。このポリヌクレオチドの主鎖は、典型的にはＲＮＡもしくはＤＮＡ中に見られるような糖類およびリン酸基、または修飾しもしくは置換した糖またはリン酸基を含むことができる。ポリヌクレオチドは、メチル化したヌクレオチドなどの修飾ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体を含みうる。ヌクレオチド配列は、非ヌクレオチド成分によって中断されうる。従って、ヌクレオシド、ヌクレオチド、デオキシヌクレオシド、およびデオキシヌクレオチドという用語は、一般的に、本明細書に記載したものなどの類似体を含む。これらの類似体は、自然に存在するヌクレオシドまたはヌクレオチドと同様に幾つかの構造的特徴を有する分子であり、その結果、核酸またはオリゴヌクレオチド配列中に組み込まれた場合、溶液中で自然に存在する核酸配列とハイブリダイズするようになる。典型的には、これらの類似体は、その塩基、リボース、またはリン酸ジエステル部分を置換し、かつ／または修飾することによって、自然に存在するヌクレオシドおよびヌクレオチドから派生させる。それらの変化は、ハイブリダイゼーションを安定化し、または脱安定化させるために目的に合わせて作成し、あるいは相補的核酸配列によって所望したように、ハイブリダイゼーションの特異性を増強することができる。
【００２８】
本明細書で使用する「相補的」という用語は、配列決定しまたは増幅するためのヌクレオチドと核酸間、例えば、二本鎖ＤＮＡ分子の二本鎖間、または一本鎖核酸上のオリゴヌクレオチドプライマーとプライマー結合部位間のハイブリダイゼーションまたは塩基対形成をさす。相補的ヌクレオチドは、一般的に、ＡとＴ（またはＡとＵ）、またはＣとＧである。最適に整列させ比較した、そして適当なヌクレオチドの挿入または欠失を伴う一鎖のヌクレオチドと、他方の鎖のヌクレオチドの少なくとも約８０％、通常、他方の鎖のヌクレオチドの少なくとも約９０％〜９５％、より好ましくは約９８〜１００％が対をなす場合、二本の一本鎖ＲＮＡ分子または一本鎖ＤＮＡ分子は相補的であるという。あるいは、選択的ハイブリダイゼーション条件下で、ＲＮＡ鎖またはＤＮＡ鎖がその相補鎖とハイブリダイズする場合に相補性は存在する。典型的には、少なくとも１４〜２５のヌクレオチドの一配列に対して、少なくとも約６５％の相補性、好ましくは少なくとも約７５％、より好ましくは少なくとも約９０％の相補性が存在する場合に、選択的ハイブリダイゼーションが生じる。
【００２９】
本明細書で使用する「フラグメント」、「セグメント」、または「ＤＮＡセグメント」は、大型のＤＮＡポリヌクレオチドまたはＤＮＡの一部をさす。ポリヌクレオチドは、例えば、分解し、または複数のセグメントに細分化することができる。核酸を細分化する様々な方法は、当技術分野で周知である。その方法は、本来、例えば化学的または物理的でありうる。化学的細分化は、ＤＮＡ分解酵素による部分的分解、酸による部分的脱プリン、制限酵素の使用、イントロンにコードされたエンドヌクレアーゼ、三重鎖形成法およびハイブリッド形成法など、ＤＮＡを基にした切断法を含んでよく、これらの切断法は、切断媒介物を核酸分子中の特定の位置に局在化させる、核酸セグメントの特異的ハイブリダイゼーション、あるいは既知または未知の位置にあるＤＮＡを切断する他の酵素または化合物に依存する。物理的細分化法は、ＤＮＡに高剪断を加えることを含みうる。高剪断は、例えば、ピットまたはスパイクを備えたチャンバまたはチャンネル内にＤＮＡを通し、または制限されたサイズフロー経路、例えば、開口部の断面寸法がミクロまたはサブミクロ規模である経路にＤＮＡ試料を強制的に通して生じさせることができる。他の物理的方法には、超音波処理および噴霧が含まれる。例えば、熱とイオンが媒介する加水分解による細分化など、物理的および化学的細分化法の組合せも同様に使用しうる。例えば、Sambrookら、『Molecular Cloning: A Laboratory Manual』第３版、Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001)（Sambrookら）を参照されたい。これをあらゆる目的において参照により本明細書に組み込む。こうした方法を最適化して選択したサイズ範囲のフラグメントに核酸を消化することができる。有用なサイズ範囲は、１００、２００、４００、７００、または１０００から５００、８００、１５００、２０００、４０００、または１０，０００塩基対でありうる。しかし、４０００、１０，０００、または２０，０００から１０，０００、２０，０００、または５００，０００塩基対など、大きいサイズ範囲も有用でありうる。
【００３０】
本明細書で使用する「ハイブリダイゼーション」という用語は、２本の一本鎖ポリヌクレオチドが、非共有結合的に結合して安定した二本鎖ポリヌクレオチドを形成する過程をさす。「ハイブリダイゼーション」という用語は、三重鎖ハイブリダイゼーションをもさしうる。得られた（通常）二本鎖ポリヌクレオチドが「ハイブリッド」である。安定したハイブリッドを形成するポリヌクレオチド集団の比率を本明細書では「ハイブリダイゼーション度」と呼ぶ。ハイブリダイゼーション条件は、典型的には、塩濃度約１Ｍ未満、より一般的には約５００ｍＭ未満、および約２００ｍＭ未満を含む。ハイブリダイゼーション温度は、５℃程度と低くてもよいが、典型的には２２℃超、より典型的には約３０℃超、好ましくは約３７℃超である。ハイブリダイゼーションは、通常、ストリンジェント条件下で、すなわち、プローブが、その標的下位配列とハイブリダイズする条件下で実施される。ストリンジェント条件は、配列に依存し、様々な状況において異なる。特異的ハイブリダイゼーションには、フラグメントが長くなるほど、ハイブリダイゼーション温度を高める必要があるであろう。相補鎖の塩基組成および長さ、有機溶媒の存在、および塩基ミスマッチング度を含め、他の要因もハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに作用しうるので、どれか一つのみの絶対的測定よりもパラメーターを組み合わせることが重要である。一般的には、所定のイオン強度およびｐＨで、特異的配列の熱融点（Ｔｍ）よりも約５℃低いストリンジェント条件が選択される。Ｔｍは、（所定のイオン強度、ｐＨ、および核酸組成下で）標的配列に相補するプローブの５０％が、平衡時に標的配列とハイブリダイズする温度である。
【００３１】
典型的には、ストリンジェント条件は、ｐＨが７．０〜８．３、温度が低くても２５℃で、塩濃度が少なくとも０．０１Ｍから、わずか１Ｍ Ｎａイオン濃度（または他の塩）を含む。例えば、５×ＳＳＰＥ（７５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭリン酸Ｎａ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）、および温度２５〜３０℃の条件が、対立遺伝子特異的プローブハイブリダイゼーションに適している。ストリンジェント条件には、例えば、Sambrook、Fritsche、およびManiatisの『Molecular Cloning A Laboratory Manual』第２版、Cold Spring Harbor Press (1989)、およびAndersonの『Nucleic Acid Hybridization』初版、BIOS Scientific Publishers Limited (1999)を参照されたい。上記あらゆる目的において、これらをこれによりその全体を参照により組み込む。
【００３２】
本明細書で使用する「ハイブリダイゼーションプローブ」は、塩基特異的方式で核酸の相補鎖と結合できる核酸（オリゴヌクレオチドなど）のことである。そのようなプローブには、Nielsenら、Science 254:1497-1500 (1991)、Nielsen Curr. Opin. Biotechnol., 10:71-75 (1999)に記載されているペプチド核酸、ならびに他の核酸類似体、および核酸模倣体が含まれる。
【００３３】
本明細書で使用する「ｍＲＮＡ」または「ｍＲＮＡ転写産物」には、それだけには限らないが、前駆体（ｐｒｅ）ｍＲＮＡ転写産物、転写産物処理中間体、翻訳準備の整った成熟ｍＲＮＡ、および単数もしくは複数の遺伝子転写産物、またはｍＲＮＡ転写産物から派生した核酸が含まれる。転写産物処理には、スプライシング、編集、および分解が含まれる。本明細書で使用するｍＲＮＡ転写産物から派生した核酸は、その合成に、ｍＲＮＡ転写産物またはその下位配列が鋳型として最終的に役立つ核酸をさす。従って、ｍＲＮＡから逆転写したｃＤＮＡ、そのｃＤＮＡから転写したｃＲＮＡ、ｃＤＮＡから増幅したＤＮＡ、その増幅したＤＮＡから転写したＲＮＡなどは全て、ｍＲＮＡ転写産物から派生し、派生したそのような産生物を検出することは、試料中に元の転写産物が存在するかどうか、かつ／または存在量を示すものである。従って、ｍＲＮＡから派生した試料には、それだけには限らないが、単数または複数の遺伝子のｍＲＮＡ転写産物、そのｍＲＮＡから逆転写したｃＤＮＡ、そのｃＤＮＡから転写したｃＲＮＡ、その遺伝子から増幅したＤＮＡ、増幅したＤＮＡから転写したＲＮＡなどが含まれる。
【００３４】
そこで使用されるように、「プローブ」は、特定の標的が認識できる分子である。いくつかの実施形態では、プローブは表面固定することができる。本発明が調査できるプローブの例には、それだけには限らないが、細胞膜受容体のアゴニストおよびアンタゴニスト、毒素および毒液、ウイルスのエピトープ、ホルモン（例えば、オピオイドのペプチド、ステロイドなど）、ホルモン受容体、ペプチド、酵素、酵素基質、補因子、薬物、レクチン、糖類、オリゴヌクレオチド、核酸、オリゴ糖、タンパク質、およびモノクローナル抗体が含まれる。
【００３５】
本明細書で使用する「標的」は、所与のプローブに親和性を有する分子である。標的は、自然に存在する分子または人工分子でありうる。また、これらの分子は、未変化状態で、または他の種との凝集体として使用することができる。標的は、直接また特異的結合物質を介在させて、結合メンバーに共有結合的に、または非共有結合的に付着させることができる。本発明が使用することができる標的の例には、それだけには限らないが、抗体、細胞膜受容体、（例えば、ウイルス、細胞、または他の物質上の）特異的抗原決定基と反応するモノクローナル抗体および抗血清、薬物、オリゴヌクレオチド、核酸、ペプチド、補因子、レクチン、糖類、多糖類、細胞、細胞膜、およびオルガネラが含まれる。当技術分野では、標的を抗プローブと呼ぶ場合もある。標的という用語は、本明細書で使用するように、意味における違いはないものとする。２つの巨大分子が分子認識によって結合し複合体を形成すると、「プローブ標的対」が形成される。
【００３６】
図面の簡単な説明
本特許または出願ファイルには、少なくとも一枚のカラーで作成した図面が含まれる。カラー図面を伴う本特許または特許出願公開公報の束は、請求し必要手数料の支払いがあれば特許庁から提供される。
【００３７】
本明細書に組み込まれ、その一部を形成する添付図面は、本発明の実施形態を図示し、その記述と共に開示した本発明の原理を説明するのに役立つ。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３８】
本発明は、多くの好ましい実施形態を有し、詳細については当業者に公知の多くの特許、出願、および他の参照文献に依存する。従って、特許、出願、または他の参照を以下に引用し、または繰り返す場合、それは、あらゆる目的において、および述べた提案について、その全体を参照により組み込むと理解されるものとする。
【００３９】
開示した、癌を分類し、予後を予測し、診断する方法、システム、および組成の実施形態を次に記載する。これらの方法、システム、および組成によって、ｐ５３のｉｎ ｖｉｖｏ機能性のより有用な測定法が提供され、それによってｐ５３の変異状態単独と比較して、患者結果の優れた予後予測指標がもたらされる。開示した方法、システム、および組成の実施形態に元々備わっている他の利点は以下の記述から明らかになる。
【００４０】
癌の発生と進行におけるｐ５３変異は、野生型ｐ５３対立遺伝子のトランス優性抑制を生じかねず、この抑制はｐ５３活性を喪失させ、または野生型ｐ５３とは無関係な機能を発癌的に獲得させる。加えて、ｐ５３の発現に直接影響するような活性を含め、数種のｐ５３機能エフェクターの活性の変化は、ｐ５３変異体の表現型を反復させるｐ５３の欠陥の一因となりうる。乳癌では、このような影響は、より攻撃的な腫瘍、治療耐性、および不十分な臨床結果において現われる。
【００４１】
より有用なｐ５３のｉｎ ｖｉｖｏ機能性の測定を提供することに伴い、本明細書に開示するのは「ｐ５３分類指標」、つまりｐ５３野生型腫瘍と突然変異腫瘍の分子立体配置の違いから推定される発現サインである。分類指標は、所定数の遺伝子、例えば、少なくとも３遺伝子を含みうる。他の実施形態では、分類指標は、約３遺伝子から約５００遺伝子を含みうる。表１に５００の遺伝子リストを示す。いくつかの実施形態では、最適化させたｐ５３分類指標には３２の遺伝子が含まれる（表２）。最適化させた３２遺伝子分類指標によって、有意な精度でｐ５３突然変異体腫瘍と野生型腫瘍を識別でき、全治療群に相当する集団中の再発および生存を予測することができた。さらに、ｐ５３分類指標は、ｐ５３の変異状態単独よりも有意な生存予測器であり、他の臨床予測器とは無関係に多変量解析によっても有意なままであったが、ｐ５３の変異状態は有意ではなかった。さらに、変異の不在下でｐ５３の発現が下方制御されることは、転写活性および臨床結果において、突然変異体（ｍｔ）表現型の腫瘍挙動を誘発するのに十分であった。
【００４２】
乳癌および肝臓癌の独立したデータセットで、そして他の臨床特徴を無視して、最適化させたｐ５３分類指標のサブセットは、有意な精度でｐ５３の状態を予測することができた。原病生存期間（ＤＳＳ）の予測器として、不均質な治療を施した大きい患者コホート、および術後アジュバント内分泌療法のみを施した患者セットで、分類指標はｐ５３の変異状態単独より有意に優れていた。
【００４３】
さらに、ネオアジュバント設定で化学療法を施した第３期患者が大部分を占める独立したｃＤＮＡマイクロアレイ研究では、ｐ５３分類指標の９遺伝子サブセットは、原病生存期間および無病生存期間の極めて有意な予測器であった。ｐ５３分類指標の遺伝子は、化学療法後にどの患者が再発し死亡するかだけでなく、どの後期患者が癌から生還するかを正確に見極めることができた。
【００４４】
分類指標の２１遺伝子サブセットもまた、進行して５年以内に遠隔転移を発生した初期照射治療患者の分子下位群と、発生しない同群を有意に識別することができた。
【００４５】
従って、他の態様よりも特に、本明細書に記載したｐ５３分類指標を定義することによって、予め認識していたよりもｐ５３の極めて大きな影響がヒト腫瘍挙動に与えられることを本発明の方法、システム、および組成が実証し、それによってｐ５３の機能を臨床評価する優れた手法が提供される。
【００４６】
本発明の一態様は、患者で疾患の結果を予測する方法であって、ｐ５３遺伝子の突然変異体または野生型でありうる腫瘍試料の複数の遺伝子から遺伝子発現プロファイルを得るステップ、突然変異腫瘍または野生型腫瘍中でどの遺伝子が差次的に発現しているのかを判定するために、該遺伝子発現プロファイルを比較するステップ、差次的に発現した該遺伝子から、ｐ５３の変異状態を予測するための遺伝子セットを抽出するステップ、および患者で疾患の結果を予測するために、該遺伝子セットを使用するステップを含む方法を提供する。その疾患の結果は、原病生存期間、無病生存期間、腫瘍再発、および治療応答からなる群から選択されうる。疾患は、任意の癌であってよいが、乳癌または肝臓癌であることが好ましい。
【００４７】
予想したｐ５３の変異状態は、差次的に発現した遺伝子と、ｐ５３の変異状態、ＥＲ（エストロゲン受容体）の状態、および腫瘍の組織学的等級との関連性に従って、該遺伝子をランク付けることによって得られる。遺伝子のランク付けに線形モデル適合などの多変量ランク付け手順を使用することができる。ランク付けした遺伝子に管理学習（supervised learning）を施し、それらが突然変異体遺伝子発現プロファイルと野生型遺伝子発現プロファイルを識別できるようにすることができる。使用しうる管理学習法の一例は、対角線形判別分析（Diagonal Linear Discriminant Analysis：ＤＬＤＡ）である。
【００４８】
いくつかの実施形態では、ｐ５３の変異状態を予測する能力を備えた遺伝子セットは、少なくとも３遺伝子、好ましくは約３〜５００の遺伝子、最も好ましくは約３２の遺伝子を含みうる。最適化させたｐ５３分類指標を構成する３２の遺伝子は、表１の遺伝子リストを含む群から選択することができる。いくつかの実施形態では、３２の遺伝子は、GeｎBank受託番号：ＡＩ９６１２３５（配列番号２３）、ＢＧ２７１９２３（配列番号２２）、ＮＭ_００２４６６（配列番号３１）、ＢＣ００１６５１（配列番号１４）、Ｄ３８５５３（配列番号１１）、ＡＫ０００３４５（配列番号２６）、ＡＡ７４２６９７（配列番号２１）、ＡＬ０８０１７０（配列番号３０）、ＢＦ２４５２８４（配列番号２７）、ＢＣ００４５０４（配列番号８）、Ｈ１５２６１（配列番号２）、ＮＭ_０００９０９（配列番号９）、ＮＭ_０２４８４３（配列番号１）、Ｒ７３０３０（配列番号２９）、ＮＭ_０３０８９６（配列番号１７）、ＡＩ４３５８２８（配列番号２０）、ＡＬ５１２７２７（配列番号６）、ＡＷ２４２９９７（配列番号１８）、ＡＩ８１０７６４（配列番号２４）、ＡＩ９２２３２３（配列番号１０）、ＡＬ３６０２０４（配列番号１３）、ＮＭ_００３２２５（配列番号３２）、ＮＭ_００３２２６（配列番号２８）、ＡＷ２９９５３８（配列番号５）、ＮＭ_００３４６２（配列番号１６）、ＡＩ９９０４６５（配列番号２５）、ＮＭ_００４３９２（配列番号１５）、ＮＭ_００１２６７（配列番号７）、ＡＦ２６９０８７（配列番号４）、ＡＩ８２６４３７（配列番号３）、ＡＬ３５５３９２（配列番号１２）、およびＡＵ１５６４２１（配列番号１９）を含みうる。
【００４９】
本発明はまた、後期乳癌患者で疾患の結果を予測する方法であって、ｐ５３遺伝子の突然変異体または野生型でありうる腫瘍試料の複数の遺伝子から遺伝子発現プロファイルを得るステップ、突然変異腫瘍または野生型腫瘍中でどの遺伝子が差次的に発現しているのかを判定するために、該遺伝子発現プロファイルを比較するステップ、差次的に発現した該遺伝子から、ｐ５３の変異状態を予測するための遺伝子セットを抽出するステップ、および後期乳癌患者で疾患の結果を予測するために、該遺伝子セットを使用するステップであって、該遺伝子セットがGenBank受託番号：ＢＧ２７１９２３、ＮＭ_００２４６６、Ｄ３８５５３、ＮＭ_０００９０９、ＮＭ_０２４８４３、Ｒ７３０３０、ＮＭ_００３２２６、ＡＷ２９９５３８、およびＡＩ９９０４６５からなる群から選択されるステップを含む上記方法も提供する。全てのGenBank受託番号は、図９〜５０８に示すように配列および配列番号に関するものである。
【００５０】
本発明はまた、初期であり局所治療を受けた乳癌患者で臨床結果を予測する方法であって、ｐ５３遺伝子の突然変異体または野生型でありうる腫瘍試料の複数の遺伝子から遺伝子発現プロファイルを得るステップ、突然変異腫瘍または野生型腫瘍中でどの遺伝子が差次的に発現しているのかを判定するために、該遺伝子発現プロファイルを比較するステップ、差次的に発現した該遺伝子から、ｐ５３の変異状態を予測するための遺伝子セットを抽出するステップ、および初期であり局所治療を受けた乳癌患者で疾患の結果を予測するために、該遺伝子セットを使用するステップであって、該遺伝子セットが、GenBank受託番号：ＡＩ９６１２３５、ＢＧ２７１９２３、ＮＭ_００２４６６、ＢＣ００１６５１、Ｄ３８５５３、ＡＫ０００３４５、ＢＣ００４５０４、ＮＭ_０００９０９、ＮＭ_０２４８４３、Ｒ７３０３０、ＡＩ４３５８２８、ＡＩ８１０７６４、ＡＩ９２２３２３、ＮＭ_００３２２５、ＮＭ_００３２２６、ＡＷ２９９５３８、ＮＭ_００３４６２、ＡＩ９９０４６５、ＮＭ_００４３９２、ＮＭ_００１２６７、およびＡＩ８２６４３７からなる群から選択されるステップを含む上記方法も提供する。
【００５１】
本発明はまた、肝臓癌患者で臨床結果を予測する方法であって、ｐ５３遺伝子の突然変異体または野生型でありうる腫瘍試料の複数の遺伝子から遺伝子発現プロファイルを得るステップ、突然変異腫瘍または野生型腫瘍中でどの遺伝子が差次的に発現しているのかを判定するために、該遺伝子発現プロファイルを比較するステップ、差次的に発現した該遺伝子から、ｐ５３の変異状態を予測するための遺伝子セットを抽出するステップ、および肝臓癌患者で疾患の結果を予測するために、該遺伝子セットを使用するステップであって、該遺伝子セットがGenBank受託番号：ＮＭ_００２４６６、ＢＣ００１６５１、Ｄ３８５５３、ＮＭ_０２４８４３、ＡＩ４３５８２８、ＡＩ８１０７６４、ＮＭ_００３２２６、およびＡＷ２９９５３８からなる群から選択されるステップを含む方法も提供する。
【００５２】
本発明はまた、患者で疾患の結果を予測するための遺伝子群を同定する方法であって、ｐ５３遺伝子の突然変異体または野生型でありうる腫瘍試料の複数の遺伝子から遺伝子発現プロファイルを得るステップ、突然変異腫瘍または野生型腫瘍中でどの遺伝子が差次的に発現しているのかを判定するために、該遺伝子発現プロファイルを比較するステップ、ｐ５３の変異状態を予測するために、差次的に発現した該遺伝子をその能力に従ってランク付けるステップ、突然変異体および野生型のｐ５３遺伝子発現プロファイルを識別するために、ランク付けしたそれらの遺伝子を訓練するステップ、ｐ５３の変異状態を予測する能力がある遺伝子セットを含むｐ５３分類指標を得るステップ、独立したデータセット中の該ｐ５３分類指標を確証するステップ、および患者で疾患の結果を予測するために、該ｐ５３分類指標の能力を評価するステップを含む上記方法も提供する。
【００５３】
先に開示した、患者で疾患の結果を予測するための遺伝子群を同定する方法では、差次的に発現した遺伝子と、ｐ５３の状態、ＥＲ（エストロゲン受容体）の状態、および腫瘍の組織学的等級との関連性に従って、該遺伝子を多変量ランク付け手順によりランク付けることができる。多変量ランク付け手順は、線形モデル適合（Linear Model-Fit）方法または当業者に公知の他のいかなる方法であってよい。訓練するステップは、対角線形判別分析（ＤＬＤＡ）などの管理学習法または当業者に公知の他のいかなる管理学習法の使用を含みうる。
【００５４】
上に開示したｐ５３分類指標は、少なくとも３遺伝子、好ましくは約３〜５００の遺伝子、より好ましくは約３２の遺伝子を含みうる。この３２の遺伝子のｐ５３分類指標は、GenBank受託番号：ＡＩ９６１２３５、ＢＧ２７１９２３、ＮＭ_００２４６６、ＢＣ００１６５１、Ｄ３８５５３、ＡＫ０００３４５、ＡＡ７４２６９７、ＡＬ０８０１７０、ＢＦ２４５２８４、ＢＣ００４５０４、Ｈ１５２６１、ＮＭ_０００９０９、ＮＭ_０２４８４３、Ｒ７３０３０、ＮＭ_０３０８９６、ＡＩ４３５８２８、ＡＬ５１２７２７、ＡＷ２４２９９７、ＡＩ８１０７６４、ＡＩ９２２３２３、ＡＬ３６０２０４、ＮＭ_００３２２５、ＮＭ_００３２２６、ＡＷ２９９５３８、ＮＭ_００３４６２、ＡＩ９９０４６５、ＮＭ_００４３９２、ＮＭ_００１２６７、ＡＦ２６９０８７、ＡＩ８２６４３７、ＡＬ３５５３９２、およびＡＵ１５６４２１からなる群から選択される遺伝子を含みうる「最適化された分類指標」である。
【００５５】
その疾患の結果は、原病生存期間、無病生存期間、腫瘍再発、および治療応答からなる群から選択されうる。開示した一実施形態では、９遺伝子の部分的分類指標によって、後期乳癌患者で臨床結果を予測することができる。その９遺伝子の部分的分類指標は、GenBank受託番号：ＢＧ２７１９２３、ＮＭ_００２４６６、Ｄ３８５５３、ＮＭ_０００９０９、ＮＭ_０２４８４３、Ｒ７３０３０、ＮＭ_００３２２６、ＡＷ２９９５３８、およびＡＩ９９０４６５からなる群から選択される遺伝子を含みうる。
【００５６】
別の開示した実施形態では、２１遺伝子の部分的分類指標によって、初期であり局所治療を受けた乳癌患者で臨床結果を予測することができる。その２１遺伝子の部分的分類指標は、GenBank受託番号：ＡＩ９６１２３５、ＢＧ２７１９２３、ＮＭ_００２４６６、ＢＣ００１６５１、Ｄ３８５５３、ＡＫ０００３４５、ＢＣ００４５０４、ＮＭ_０００９０９、ＮＭ_０２４８４３、Ｒ７３０３０、ＡＩ４３５８２８；ＡＩ８１０７６４、ＡＩ９２２３２３、ＮＭ_００３２２５、ＮＭ_００３２２６、ＡＷ２９９５３８、ＮＭ_００３４６２、ＡＩ９９０４６５、ＮＭ_００４３９２、ＮＭ_００１２６７、およびＡＩ８２６４３７からなる群から選択される遺伝子を含みうる。
【００５７】
さらに別の開示した実施形態では、８遺伝子の部分的分類指標によって、肝臓癌患者で臨床結果を予測することができる。その８遺伝子の部分的分類指標は、GenBank受託番号：ＮＭ_００２４６６、ＢＣ００１６５１、Ｄ３８５５３、ＮＭ_０２４８４３、ＡＩ４３５８２８、ＡＩ８１０７６４、ＮＭ_００３２２６、およびＡＷ２９９５３８からなる群から選択される遺伝子を含みうる。
【００５８】
本発明はまた、患者で疾患の結果を予測するためのコンピューターシステムであって、プロセッサとメモリとを有するコンピューターを備え、該メモリ上には、ｐ５３遺伝子の突然変異体または野生型でありうる腫瘍試料の複数の遺伝子から遺伝子発現プロファイルを得るステップ、突然変異腫瘍または野生型腫瘍中でどの遺伝子が差次的に発現しているのかを判定するために、該遺伝子発現プロファイルを比較するステップ、差次的に発現した該遺伝子から、ｐ５３の変異状態を予測するための遺伝子セットを抽出するステップ、および患者で疾患の結果を予測するために、該遺伝子セットを使用するステップを実施するために、プロセッサに実行させる実行可能コードが保存されている上記コンピューターシステムも提供する。
【００５９】
本発明はまた、ｐ５３の変異状態を予測する能力がある複数の遺伝子を固体支持体に固定させた、患者で疾患感受性を予測するための診断ツールも提供する。固体支持体は、例えば、マイクロアレイであってよい。一実施形態では、複数の遺伝子固体支持体に固定したは、GenBank受託番号：ＡＩ９６１２３５、ＢＧ２７１９２３、ＮＭ_００２４６６、ＢＣ００１６５１、Ｄ３８５５３、ＡＫ０００３４５、ＡＡ７４２６９７、ＡＬ０８０１７０、ＢＦ２４５２８４、ＢＣ００４５０４、Ｈ１５２６１、ＮＭ_０００９０９、ＮＭ_０２４８４３、Ｒ７３０３０、ＮＭ_０３０８９６、ＡＩ４３５８２８、ＡＬ５１２７２７、ＡＷ２４２９９７、ＡＩ８１０７６４、ＡＩ９２２３２３、ＡＬ３６０２０４、ＮＭ_００３２２５、ＮＭ_００３２２６、ＡＷ２９９５３８、ＮＭ_００３４６２、ＡＩ９９０４６５、ＮＭ_００４３９２、ＮＭ_００１２６７、ＡＦ２６９０８７、ＡＩ８２６４３７、ＡＬ３５５３９２、およびＡＵ１５６４２１からなる群から選択される遺伝子を含みうる。別の実施形態では、固体支持体に固定した複数の遺伝子は、GenBank受託番号：ＢＧ２７１９２３、ＮＭ_００２４６６、Ｄ３８５５３、ＮＭ_０００９０９、ＮＭ_０２４８４３、Ｒ７３０３０、ＮＭ_００３２２６、ＡＷ２９９５３８、およびＡＩ９９０４６５からなる群から選択される遺伝子を含みうる。さらに別の実施形態では、固体支持体に固定した複数の遺伝子は、GenBank受託番号：ＡＩ９６１２３５、ＢＧ２７１９２３、ＮＭ_００２４６６、ＢＣ００１６５１、Ｄ３８５５３、ＡＫ０００３４５、ＢＣ００４５０４、ＮＭ_０００９０９、ＮＭ_０２４８４３、Ｒ７３０３０、ＡＩ４３５８２８、ＡＩ８１０７６４、ＡＩ９２２３２３、ＮＭ_００３２２５、ＮＭ_００３２２６、ＡＷ２９９５３８、ＮＭ_００３４６２、ＡＩ９９０４６５、ＮＭ_００４３９２、ＮＭ_００１２６７、およびＡＩ８２６４３７からなる群から選択される遺伝子を含みうる。さらに別の実施形態では、固体支持体に固定した複数の遺伝子は、GenBank受託番号：ＮＭ_００２４６６、ＢＣ００１６５１、Ｄ３８５５３、ＮＭ_０２４８４３、ＡＩ４３５８２８、ＡＩ８１０７６４、ＮＭ_００３２２６、およびＡＷ２９９５３８からなる群から選択される遺伝子を含みうる。
【００６０】
本発明はまた、固体支持体と、その上にディスプレイさせた、患者でｐ５３の変異状態を予測する能力がある遺伝子に対応する核酸プローブとを有する、患者で疾患感受性を予測するための核酸アレイも提供する。核酸アレイは、少なくとも８、３２、１００、２５０、または５００の核酸プローブを含みうる。
【００６１】
従って、開示した方法、システム、および組成は、ｐ５３欠陥胸部腫瘍とｐ５３誘導胸部腫瘍を見極めることができ、他の癌種でもｐ５３活性の計測に有効であろう。そうでないとしてもＤＮＡ配列レベルでｐ５３野生型である胸部腫瘍の１４％ほどが、他の手段によりｐ５３を欠くと思われる。さらに、分類指標は、原病生存期間および様々な乳癌集団における再発の有意な予測器であり、従って、その集団の終了点の予測において、特に、その機能が主にｐ５３依存性細胞死経路による治療剤と関連して臨床有用性を有する。
【００６２】
実施例
【実施例１】
【００６３】
ｐ５３突然変異体腫瘍およびｐ５３野生型腫瘍の分子立体配置は異なる。
【００６４】
ｐ５３突然変異体（ｍｔ）胸部腫瘍とｐ５３野生型（ｗｔ）胸部腫瘍の間の分子的差異を洞察するために、高密度オリゴヌクレオチドマイクロアレイを使用し、２５７の生検試料の集団ベースシリーズを分析したが、それらの全ては予めｐ５３コード領域の変異について配列決定した（Bergh, J.、 Norberg, T.、Sjogren, S.、Lindgren, A. および Holmberg, L. “Complete sequencing of the p53 gene provides prognostic information in breast cancer patients, particularly in relation to adjuvant systemic therapy and radiotherapy（ｐ５３遺伝子完全シーケンシングによる、乳癌患者で、特に、アジュバント全身治療および放射線治療と関連する予後予測情報の提供）” Nat Med 1, 1029-34 (1995)。参照により本明細書に組み込む）。
【００６５】
患者の原物質は、１９８７年１月１日〜１９８９年１２月３１日の間にUppsala郡で摘出された全乳癌の６５％に相当する、女性３１５名の集団をベースとしたコホートから得た新鮮凍結胸部腫瘍から構成された（Berghら、既に参照により組み込む）。術後、新鮮腫瘍の生存可能部分を２分割し、一部は直ちにイソペンタンで凍結して分析まで−７０℃で保存し、他方は１０％ホルマリンで固定し病理組織検査用に調製した。凍結腫瘍組織は、当初の３１５名の患者のうち２９９名から入手することができた。このうち、２７０組織にはマイクロアレイ実験に十分な量および質のＲＮＡが含まれ、Affymetrixの品質管理後、２６０腫瘍の発現プロファイルをさらに分析した。本発明の研究は、Karolinska研究所倫理委員会の認可を受けている。
【００６６】
既にBerghらにより記載（既に参照により組み込む）されている通り、元の３１５腫瘍でｐ５３遺伝子（ＴＰ５３）の変異分析を実施した。本発明の研究に含めた２６０腫瘍のうち、エクソン２〜１１をｃＤＮＡ配列分析することにより（Berghら、既に参照により組み込む）、５９個にｐ５３変異を見出した。３試料ではｐ５３の状態を評価できなかった。臨床病理学的特性を患者記録および慣例の診断時臨床測定から導き出した。エストロゲン受容体の状態は、慣例の臨床手順の一部として、リガンド結合アッセイによって定量した。経験豊かな病理学者が、腫瘍を低度、中度、および高度腫瘍に分類し、腫瘍のElston-Ellis等級を決定した（Elston, C. W. および Ellis, I. O. “Pathological prognostic factors in breast cancer. I. The value of histological grade in breast cancer: experience from a large study with long-term follow-up（乳癌における病理学的予後予測要因．Ｉ 乳癌における組織学的等級値：長期追跡による大研究から得た経験）” Histopathology 19, 403-10 (1991)、参照により本明細書に組み込む）。彼ら２６０名の患者のうち８４名で腋下リンパ節転移が見つかり、１６６名はリンパ節転移陰性であった。１０名の患者はリンパ節の状態が不明であった。高齢により、または重大な随伴性疾患のために腋下検査を実施しなかったからである。全リンパ節転移陽性患者に、全身アジュバント治療を行った。一般に、閉経前女性には化学療法を施し、閉経後女性には内分泌治療を施した。本発明の研究に含めた２６０名の患者のうち、１４９名がアジュバント治療を受けなかった。患者の全体的生存率は、スウェーデン住民登記所から得た情報に基づき、死亡日および死亡原因は１９９９年末に患者記録概要から得た。
【００６７】
結果としてアミノ酸レベルを変化させるｐ５３変異を含むことが知られる５９腫瘍から得たＲＮＡ、および野生型ｐ５３を有することが知られている１９８腫瘍から得たＲＮＡをAffymetrix Ｕ１３３ＡおよびＵ１３３Ｂアレイで分析した。
【００６８】
Qiagen RNeasy Mini Kit（Qiagen、ドイツ国）を使用し全ＲＮＡを抽出した。凍結腫瘍を小片に切断し、ＲＬＴ緩衝液（ＲＮｅａｓｙ溶解緩衝液）とメルカプトエタノールを含む試験管（最高４０ｍｇ／試験管）中で約３０〜４０秒間ホモジナイズした。次いで、混合物を５５℃で１０分間プロテイナーゼＫにより処理したが、その処理は前回のＲＮＡ抽出でＲＮＡ収量を改善することを実証した（Egyhazi, S.ら、”Proteinase K added to the extraction procedure markedly increases RNA yield from primary breast tumors for use in microarray studies（抽出手順に添加したプロテイナーゼＫが、マイクロアレイ研究で使用する胸部原発腫瘍から得たＲＮＡの収量を顕著に増大）” Clin Chem 50, 975-6(2004)、参照により本明細書に組み込む）。以下のＲＮｅａｓｙカラムでの遠心分離ステップでは、ＲＮＡの質を高めるためにＤＮＡ分解酵素処理も含めた。ＲＮＡ抽出物の統合性をAgilent 2100 Bioanalyzer（Agilent Technologies、米国メリーランド州ロックビル）で試験し、２８Ｓ：１８ＳのリボソームＲＮＡ率を計測した。高品質ＲＮＡ抽出物は、マイクロアレイ分析まで−７０℃で貯蔵した。
【００６９】
ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）産生物（すなわち標的）の調製、オリゴヌクレオチドアレイハイブリダイゼーション、および走査をAffymetrixプロトコル（Affymetrix Inc., 米国カリフォルニア州サンタクララ）に従って実施した。Ｔ７結合オリゴ−ｄＴプライマーを使用し、２〜５μｇの全ＲＮＡ出発量から第１鎖ｃＤＮＡを合成し、続いてフェノール／クロロホルム抽出とPhase Lock Gelを使用して第２鎖の合成二本鎖ｃＤＮＡを精製した。ＩＶＴ反応にてビオチン化したｃＲＮＡ標的をそのｃＤＮＡ鋳型から調製した。Qiagen RNeasy Mini Kitを使用してその標識したｃＲＮＡ標的を精製し、続いて化学的細分化した。細分化しビオチン化したｃＲＮＡ１０μｇをAffymetrixオリゴヌクレオチドヒトアレイセットのHG-Ｕ１３３ＡおよびＢにハイブリダイズしたが、このアレイセットには、十分に実証したヒト遺伝子約３３，０００個から派生させた３９，０００個超の転写産物に相当する４５，０００のプローブセットが含まれる。ハイブリダイゼーションオーブンを４５℃にし、遠心を６０ｒｐｍで１６時間に設定して、ハイブリダイゼーションを実施した。Affymetrixプロトコルに従い、Fluidics Station 400（Affymetrix Inc., 米国カリフォルニア州サンタクララ）中でアレイを洗浄し染色した。ストレプトアビジンフィコエリトリン（ＳＡＰＥ、終濃度１０μｇ／ｍｌ）を使用し染色し、ビオチン化抗ストレプトアビジン抗体でシグナル増幅を行い、そして２回目のＳＡＰＥ染色を行った。製造業者の使用説明書に従ってアレイを洗浄しスキャンした。
【００７０】
発現生データは、Microarray Suite 5.0ソフトウェア（Affymetrix Inc.,米国カリフォルニア州サンタクララ）を使用して処理し、総平均法を使用して規準化した。各マイクロアレイについては、平均対数強度を標的シグナル値の５００に調整することによって、プローブセットシグナル値を計る。平均シグナル強度が次善の試料を再標識し、新規なアレイに再度ハイブリダイズした。マイクロアレイ人為産物が視認できるのであれば、細分化した同じプローブを使用し、その試料を新規なチップにハイブリダイズし、または別法として、欠陥領域が小さい場合は、影響を受けているプローブをさらに分析して調査した。Ｕ１３３ＡおよびＢチップから得た規準化した発現データを組み合わせ、自然対数に変換した。
【００７１】
遺伝子発現パターンがｐ５３ｍｔとｗｔ腫瘍をどの程度識別できたかを初めて調査した。ウィルコクソン順位和検定によって、約２，７７０の別個の遺伝子（UniGene build #167による）を代表する３，３３０のAffymetrixプローブセットを同定したが、その発現パターンは、偽発見率（ＦＤＲ：false discovery rate）を調整したｐ値、ｐ＜０．００１でｐ５３ｍｔおよびｗｔ腫瘍を識別した。これらの遺伝子のいくつかは、ＰＥＲＰ、ＲＲＭ２、ＳＥＭＡ３Ｂ、ＴＡＰ１、ＧＴＳＥ１、ＣＨＥＣＫ１、およびＣＨＥＫ２を含むｐ５３の既知の転写標的であることが判明した。図１に示す物は、上位２５０遺伝子を使用する階層的クラスタ分析の結果であり、それらの遺伝子の全てがＦＤＲ ｐ＜５．９×１０−８でｐ５３の状態に関連する。遺伝子選択判定基準から予想された通りに、ｐ５３ｍｔおよびｗｔ腫瘍の大部分を別々の腫瘍群にクラスタ化した。２つの主なクラスタノードのうち、ｐ５３突然変異体の９０％が一つのクラスタ（すなわち「変異体様」クラスタ）で見つかり、ｐ５３ｗｔ腫瘍の７７％は他方（「野生型様」クラスタ）によって分離された。
【００７２】
次に、遺伝子発現プロファイルの階層的構造を調査した。腫瘍の場合には、２つの主なクラスタが観察された。一つは突然変異体様腫瘍クラスタ内でより高度に発現した約２００の遺伝子からなり、他方は、野生型様クラスタ内でより高度に発現した約５０の遺伝子を表す。前者の中でｐ５３突然変異体状態最も高度と相関した遺伝子は、ＣＤＣ２、ＣＤＣ２０、ＣＣＮＢ１、ＣＣＮＢ２、ＣＫＳ２、ＣＤＣＡ１、ＣＤＣＡ３、ＣＤＣＡ８、ＣＥＮＰＡ、ＴＯＰ２Ａ、ＰＴＴＧ１、およびＭＣＭ６を含み、細胞周期の進行に関連した。この知見は、ｗｔのｐ５３が細胞周期遺伝子に対して負の調節効果を有するという観察に一致する。野生型様クラスタ内でより高度に発現した遺伝子の中では、数個のエストロゲンに調節された遺伝子、およびＳＴＣ２、ＮＣＯＲ１、およびＡＤＲＡ２Ａを含む、ＥＲの状態に関連する遺伝子の存在が観察された。
【００７３】
腫瘍をさらに検査することによって、ｐ５３の状態に加えて、主な腫瘍クラスタは、他の臨床特徴、すなわち、エストロゲン受容体（ＥＲ）の状態および腫瘍等級とも相関することが判明した。細胞のエストロゲン受容体状態は、いくつかの場合において癌と相関することが判明していた。正常な胸部細胞は、通常、エストロゲン受容体を有する。しかし、乳房で生じる癌細胞は、必ずしもエストロゲン受容体を有しているわけではない。エストロゲン受容体を有する乳癌は、「エストロゲン受容体陽性」と呼ばれ、エストロゲン受容体を有しない乳癌は「エストロゲン受容体陰性」と呼ばれる。エストロゲン受容体陽性癌では、癌細胞の増殖はエストロゲンに制御される。それに反して、エストロゲン受容体陰性癌細胞の増殖はエストロゲンによって支配されない。
【００７４】
図１は、ｐ５３の状態と統計学的に相関した上位２５０遺伝子を使用する２５７腫瘍の階層的クラスタリングを示す。腫瘍を縦軸に表し、遺伝子を横軸に表す。彩度は、対数発現シグナルの強度を反映し、赤色相は発現レベルが高いこと示し、緑色相は発現レベルが低いことを示す。最上段の黒色垂直棒は、胸部腫瘍がｐ５３変異を有することを示す。２行目の棒はＥＲ陽性腫瘍を示す。３行目の棒は、組織学的等級（Elston-Ellis段階評価法）を反映し、緑棒＝Ｉ等級、青棒＝ＩＩ等級、および赤棒＝ＩＩＩ等級である。
【００７５】
突然変異体様クラスタによる分離は、エストロゲン受容体陰性（ＥＲ−）腫瘍の８６％（ｐｃｓ＝１．７×１０−１０）、ＩＩＩ等級腫瘍の９６％（ｐｃｓ＝２．５×１０−１９）、およびＩ等級腫瘍のわずか３％（ｐｆｅ＝６．９×１０−１５）で観察された。この結果は、部分的に、この研究のｐ５３突然変異体が積極的にＥＲ陰性と相関（ｐｃｓ＝１．７×１０−６）し、ＩＩＩ等級の状態とも相関（ｐｃｓ＝１．２×１０−１１）するという事実のためであり、そしてｐ５３突然変異乳癌が陰性ＥＲ状態および高腫瘍等級と著しく相関すると実証した先の報告に一致する。例えば、Cattoretti, G.、Rilke, F.、Andreola, S.、D'Amato, L. および Delia, D. “P53 expression in breast cancer（乳癌でのＰ５３の発現）”. Int J Cancer. 41,178-83 (1988)、Isola, J.、Visakorpi, T.、Holli, K. および Xallioniemi, O. P. “Association of overexpression of tumor suppressor protein p53 with rapid cell proliferation and poor prognosis in node-negative breast cancer patients（リンパ節陰性乳癌患者における癌抑制タンパク質ｐ５３の過剰発現と迅速な細胞増殖および不十分な予後予測との関連性）” J Natl Cancer Inst 84, 1109-14. (1992)、Andersen, T. I.ら、”Prognostic significance of TP53 alterations in breast carcinoma（乳癌におけるＴＰ５３改変の予後予測の重要性）” Br J Cancer 68, 540-8 (1993)、およびBhargava, V.ら、”The association of p53 immunopositivity with tumor proliferation and other prognostic indicators in breast cancer（乳癌におけるｐ５３免疫陽性と、腫瘍増殖および他の予後予測指標との関連性）” Mod Pathol 7, 361-8 (1994)を参照されたい。それらの全てを参照により本明細書に組み込む。
【００７６】
しかし、突然変異体様クラスタ内の１１５３のｗｔ腫瘍のうち、顕著な過剰提示がＥＲ（ｐｃｓ＝２．０×１０−６）、およびＩＩＩ等級腫瘍（ｐｆｅ＝７．１×１０−１１）で同様に観察された。それによって、一変量統計分析により、ｐ５３の状態と高度に関連する多数の遺伝子が同定され、それらの遺伝子はｐ５３の状態とは相関するが、組織学的等級およびＥＲの状態とは相関しないという方式で腫瘍を分離することができる。
【実施例２】
【００７７】
ｐ５３の欠陥を予測する遺伝子発現分類指標
ｐ５３ｗｔ腫瘍画分は、ｐ５３突然変異体の大部分と共にクラスタを形成することが判明したという知見は、これらの腫瘍が、実際、ｐ５３変異以外の機序によるｐ５３の欠陥であろうという可能性を示唆する。これに反して、ほとんどのｗｔ腫瘍を連想させる分子立体配置を有するｐ５３突然変異体を発見したことは、これらの腫瘍が、実際、機能的に無傷のｐ５３を発現するらしいことを示唆している。しかし、この場合の腫瘍群の割り当ては、一変量ランク付け手順により選択した遺伝子に基づくものであり、この手順はｐ５３の状態と、ＥＲおよび等級状態との関連性によるものではなかった。これにより、選択した遺伝子が、ほとんど等級および／またはＥＲ関連ものを含むという可能性がある程度生じ、その可能性は、腫瘍クラスタリングをｐ５３の状態それ自体ではなく、これらの特性に向かって偏らせたかもしれない。
【００７８】
従って、組織学的等級およびＥＲの状態とは無関係に、ｐ５３の状態に相関する遺伝子をランク付ける線形モデル適合（ＬＭＦ）として知られる多変量線形回帰法を含む、予測モデルを設計することによって、ｐ５３の状態を予測するための、確固たる遺伝子発現を基にした分類指標が開発された。
【００７９】
図２は、ｐ５３の状態用の遺伝子を基にした分類指標の最適化および結果を示す。線形モデル適合法によりランク付けした遺伝子発現プロファイルを使用し、ｐ５３の状態の管理学習に対角線形判別分析（ＤＬＤＡ）を使用した。（Ａ）：等級／エストロゲン受容体（ＥＲ）相関遺伝子と、ウィルコクソン順位和検定または線形モデル適合によりランク付けしたｐ５３相関遺伝子との間の重複の分析。ヒートマップは、１００遺伝子ビン（横列）の腫瘍等級（上図ヒートマップ）またはＥＲの状態（下図ヒートマップ）と相関した遺伝子数、さらにｐ５３の状態（縦行；５０遺伝子ビンでランク付け）と相関した遺伝子数を示し、ｐ５３相関遺伝子をＬＭＦ＝線形モデル適合またはＷＲ＝ウィルコクソン順位和によりランク付けし、等級相関遺伝子をＫＷ＝Kruskal-Wallisにより、そしてＥＲ相関遺伝子をＷＲによりランク付けした。（Ｂ）：分類指標の精度は、分類指標を構築するのに使用した遺伝子数の関数としてプロットし、最適分類指標は３２遺伝子からなり、そして延べ４０腫瘍が誤分類された。（Ｃ）：一点除外（leave−one−out）交差検証を使用して、Uppsalaデータセット（２５７腫瘍）に適用した分類指標の結果。Unigene記号、（build #167）、Genbank受託番号、およびAffymetrixプローブＩＤ（Ａ．＝Ｕ１３３Ａ；Ｂ．＝Ｕ１３３Ｂ）を示す。
【００８０】
遺伝子の選択には、発現レベルをその応答として、かつＰ５３の状態、ＥＲの状態、および等級状態を予測器変数として、直線モデルをその遺伝子発現データに適合させた。予測器変数と首尾よく相関しなかった遺伝子を除去するための初期フィルタとして、ｐ値適合が０．００１超える遺伝子全てを除外した。追加の予測器としてＥＲおよび等級を使用することによって、発現パターンがＥＲまたは等級状態によってほとんど説明がつくと思われる遺伝子を選別除去できるようになった。ＬＭＦランク付け手順を適用すると、一変量のウィルコクソン順位和（ＷＲ）法と比較して、細胞周期により調節される多くの既知遺伝子のランクが顕著に低下され、これらの遺伝子がｐ５３の状態ではなく、高等級によって最も説明されることを示した（図２Ａ、上図）。これに反して、ＥＲ関連遺伝子は、ＬＭＦによるｐ５３関連遺伝子上位ランクに入ったことが観察された。それは、おそらく、ＷＲによるそれらの低いランキングは、より高くランク付けされた等級関連遺伝子が多かったためであろう（図２Ａ、下図）。
【００８１】
クラス予測目的には、ｐ５３の状態係数の絶対値の降順で遺伝子をランク付けする。分類指標の構築には、最尤法の変形であるＤＬＤＡ（対角線形判別分析）を使用した。例えば、参照により本明細書に組み込むDudoit, S., Frilyand, J. および Speed, T. P. “Comparison of discrimination methods for the classification of tumors using gene expression data（遺伝子発現データを使用する、腫瘍を分類するための判別法比較）”、Journal of the American Statistical Association 97, 77-87. (2002)に記載されている、マイクロアレイデータを使用するクラス決定問題にこれを予め適用させておく。最高の分類精度を有する予測器遺伝子セットは、一点除外交差検証により選択した。
【００８２】
含まれる遺伝子数の関数としての分類指標の精度を図２Ｂにプロットする。特筆すべきは、分類指標が７遺伝子を含むか、または５００遺伝子を含むかに関わらず、この腫瘍分類の精度が、わずか２．７％（すなわち７腫瘍）の変動をもって高度に安定していると観察されたことであった。５００遺伝子分類指標中の遺伝子を下表１に示す。しかし、最適の分類指標は、３２の遺伝子で得られたが（表２）、一方で４０腫瘍（１５．６％）が誤分類された。ｗｔ腫瘍の２８個（１４％）は、突然変異体様として分類され、他方で１２個（２０％）の突然変異体は野生型様として誤分類された（図２Ｃ）。
【表１】
【００８３】
５００遺伝子分類指標：遺伝子をｐ５３の状態とその相関に従ってランク付ける。GenBank受託番号、Affymetrix プローブセット ID、Unigene ID、Unigene名、およびUnigene記号によって遺伝子を同定する。
【００８４】
表１に記載した遺伝子の配列および配列番号については、上記遺伝子の配列の各々を示し、GenBank受託番号、Unigene ID、および／またはUnigene名、および配列番号に関連付けた図９〜５０８を参照されたい。
【実施例３】
【００８５】
ｐ５３分類指標は、２個の独立したデータセットで有意な精度を示す。
【００８６】
次いで、独立したデータセットと関連してｐ５３分類指標の性能を評価した。図３は、独立したｃＤＮＡマイクロアレイデータセットで、分類指標遺伝子がｐ５３の状態を予測できることを示す。（Ａ）独立した乳癌データセットで、３２遺伝子分類指標のうち９遺伝子サブセットが、ｐ５３の状態を予測することができる。本発明者らの分類指標の９遺伝子は、腫瘍の５０％以上にそれらの遺伝子が存在することに基づいて選択された。分析に使用した腫瘍は、これらの遺伝子の＞５０％に存在する発現データを有する必要があった。（Ｂ）独立した肝臓癌データセットで、ｐ５３分類指標の８遺伝子サブセットが、ｐ５３の状態を予測することができる。８個の重複する遺伝子は、腫瘍の９０％以上にそれらの遺伝子が存在することに基づいて選択された。分析に使用した腫瘍は、これらの遺伝子の＞５０％で存在する発現データを有する必要があった。（ＡおよびＢ）黒色垂直棒は、ｐ５３突然変異体の状態を示す。遺伝子記号（Unigene build #167）、および対応するＩＭＡＧＥクローンＩＤ（元の研究から）を収載する。階層的クラスタグラムを示す。遺伝子（横列）、および腫瘍（縦行）をクラスタ化した。腫瘍デンドログラムでは、緑の枝は野生型様立体配置を示し、赤い枝は突然変異体様プロファイルを示す。
【００８７】
従って、ｐ５３の状態が判明している公的に入手可能な２個のマイクロアレイデータセット：Sorlieらによる乳癌研究（Sorlie, T.ら、”Repeated observation of breast tumor subtypes in independent gene expression data sets（独立した遺伝子発現データセットにおける胸部腫瘍サブタイプの反復観察）” Proc Natl Acad Sci USA 100, 8418-23 (2003)、参照により本明細書に組み込む）、およびChenらによる肝臓癌研究（Chen, X.ら、”Gene expression patterns in human liver cancers（ヒト肝臓癌での遺伝子発現パターン）”、Mol Biol. Cell 13, 1929-39 (2002)、参照により本明細書に組み込む）を利用した。両研究は、ｃＤＮＡマイクロアレイプラットフォームで行った。Sorlieデータセットでは、ｐ５３変異用に６９の胸部腫瘍を配列決定した。分類指標遺伝子に対応する発現データの利用能について、この腫瘍サブセットをクエリーした。分類指標の２８の遺伝子がUniGene ID（build #167）に位置づけられた。これらの遺伝子の半分以上が、Sorlieらのマイクロアレイに位置づけられたが、大半の腫瘍でほとんど発現せず、その遺伝子の半数以下ついて、いくつかの腫瘍の測定値が得られた。分類指標中のわずか９遺伝子が、腫瘍の＞５０％に存在する発現測定値を有するｃＤＮＡプローブ（異なる９遺伝子を表す）に対応することが判明し、その際、腫瘍は遺伝子の＞５０％（結果として４４ウェルの採取した腫瘍サブセットになる）について測定値を有した。腫瘍を階層的にクラスタ化（図３Ａ）するために分類指標のこの９遺伝子サブセットを使用して、ｐ５３ｍｔ腫瘍の７７％を一つの枝にクラスタ化し、野生型の７７％を他方の枝にクラスタ化（ｐｃｓ＝３．０×１０−４）し、分類指標の確固たる予測能を反復した。
【００８８】
次に、免疫組織化学、ＩＨＣ（Chen, X.ら、”Gene expression patterns in human liver cancers（ヒト肝臓癌における遺伝子発現パターン）” Mol Biol Cell 13,1929-39 (2002)、参照により本明細書に組み込む）によってｐ５３の状態を確認したｃＤＮＡマイクロアレイベースの肝臓癌データセットを分析した。この研究では、ＩＨＣによりｐ５３タンパク質レベルを確認した。ここで、ｐ５３の状態についてアッセイした全５９腫瘍に８分類指標遺伝子を位置づけることができた（各遺伝子は全腫瘍の９０％以上に存在するデータを有し、そして各腫瘍は遺伝子の＞５０％のデータを含有した）。乳癌データセット（すなわち、ｐｆｅ＝３．５×１０−４）で見られた統計上の有意性と同様の有意性をもって、この８分類指標遺伝子サブセットは、ｐ５３の状態と相関する２個の主要なクラスタにＨＣＣ試料をクラスタ化することができ、つまり、一クラスタに突然変異体の８７％、および他方のクラスタに野生型６１％にクラスタ化することができた（図３Ｂ）。合わせて、ｐ５３分類指標を含む遺伝子は、ｐ５３の状態に基づき胸部腫瘍のみならず肝臓癌をも分類する能力が確固としており、従って他の癌種でもｐ５３の状態を予測する一般化可能な有用性を有しうることがこれらの観察から示唆される。
【表２】
【００８９】
最適化させた３２遺伝子ｐ５３分類指標。GenBank受託番号、Affymetrix プローブセット ID、Unigene ID、Unigene名、およびUnigene記号によって遺伝子を同定する。
【実施例４】
【００９０】
ｐ５３分類指標は、ｐ５３の変異状態単独よりも優れた患者結果の予後予測指標である。
【００９１】
乳癌および他の腫瘍型では、ｐ５３の状態が、腫瘍再発、患者生存、および治療応答など、臨床結果の予後を予測することは広く受け入れられている。臨床結果の予後予測指標として、ｐ５３の活性に基づく分類指標は、ｐ５３の変異状態単独より優れているという仮説を試験した。図４は、ｐ５３分類指標が、ｐ５３の変異状態単独よりも予後予測の重要性が高いということを示す。（Ａ）ｐ５３の変異状態、（ＢおよびＣ）ｐ５３分類指標、または（Ｄ）両方に従って分類した、患者のカプラン−マイヤー生存曲線を示す。臨床終了点は、乳癌による死であった（すなわち原病生存期間）。Ａ、Ｂ、およびＤでは全２５７名の患者を評価し、Ｃではｐ５３野生型腫瘍の１９８名の患者のみを評価した。危険率（ＨＲ）の有意性の評価にワルド検定（ｐＷ）を使用した。
【００９２】
治療の種類または臨床段階に関わらず、Uppsalaコホートの全２５７名の患者で、原病生存期間（ＤＳＳ）の予測能について、分類指標および配列レベルのｐ５３の変異状態を比較した。
【００９３】
患者を分けるためにｐ５３分類指標を使用して得られた危険率の有意性は、ｐ５３の変異状態単独を使用して得られた危険率の有意性よりも桁違いに高く（それぞれ、ｐｗ＝０．０００５７：ｐｗ＝０．０１２）（図４ＡおよびＢ）、特に、この改善されたｐ値はｐｍｃ＝０．００４６で統計上有意であった。
【００９４】
さらに、シーケンシングによって野生型ｐ５３を有していると確認された１９８名の女性サブセットで、ｐ５３分類指標は、低危険群および高危険群に患者を有意に分離することもでき（ｐｗ＝０．０１６）（図４Ｃ）、突然変異体様として分類されたｐ５３ｗｔ腫瘍を有する患者は、ｗｔ様クラスのｗｔ腫瘍を有する患者よりもＤＳＳが低いことが示唆された。図４Ｄでは、４つ全ての腫瘍下位群で生存曲線を比較した。特に、ｐ５３ｍｔまたはｍｔ様と分類されたｗｔ腫瘍を有する患者（それぞれ、緑色および青色曲線）は、全体的生存率曲線が似ていたが、ｗｔ様と分類されたｐ５３ｍｔ腫瘍を有する１２名（赤色曲線）は、突然変異体様ｐ５３ｍｔ腫瘍群（緑色曲線）の生存率曲線と、ｗｔ様ｐ５３ｗｔ腫瘍群（黒色曲線）の生存率曲線に分類される生存曲線を示し、どちらの曲線とも有意には異ならなかった（ｍｔ／ｍｔ様比較ｐｗ＝０．４７およびｗｔ／ｗｔ様比較ｐｗ＝０．３７）ことが観察された。
【００９５】
次に、SorlieらのｃＤＮＡマイクロアレイデータセットで分類指標の予後予測の重要性を試験した（Sorlie, T.ら、Repeated observation of breast tumor subtypes in independent gene expression data sets（独立した遺伝子発現データセットにおける胸部腫瘍サブタイプの反復観察）、Proc Natl Acad Sci USA 100, 8418-23 (2003)、参照により本明細書に組み込む）。図５は、独立した後期腫瘍データセットで、ｐ５３分類指標の予後予測の重要性が極めて高いことを示す。図３に記載されている９遺伝子の部分的分類指標にしたがって腫瘍を階層的に分類し、生存結果との相関について分析した。（Ａ）Sorlieらのデータセットから得た７６腫瘍の階層的クラスタグラム；腫瘍デンドログラムの黒の枝は野生型様立体配置を示し、赤い分枝は突然変異体様プロファイルを示す。表示は、（Ｂ）原病生存期間および（Ｃ）無病生存期間に対するカプラン−マイヤー評価であり、（Ａ）の腫瘍デンドログラムの緑の枝および赤の枝に従って患者群を決定した。
【００９６】
ここで、７７％の精度でｍｔ腫瘍とｗｔ腫瘍を識別することができる９遺伝子の部分的分類指標を使用し、関連する患者生存情報により、７６ウェルの採取した腫瘍試料を階層的にクラスタ化した（図５Ａ）。重要なことに、大多数のこれらの腫瘍（＞８０％）は、局所的に進行した乳癌を有するＩＩＩ期患者（Ｔ３／Ｔ４および／またはＮ２）の化学療法応答に対する、２つの独立した予測研究から得た。腫瘍を２つの主要な枝、３１腫瘍をｗｔ様クラスタに、および４４腫瘍を突然変異体様クラスタにクラスタ化した。これらの腫瘍プロファイルに従って患者をグループ分けすると、原病生存期間および無病生存期間（図５ＢおよびＣ）のカプラン−マイヤー生存曲線は、このコホートで共に高度に有意であった（ｐｗ＝０．００００８（ＤＳＳ）、およびｐｗ＝０．００００５（ＤＦＳ））。注目すべきことに、ｐ５３ｍｔ様群の４４名の患者の７年生存率３５％と比較して、ｐ５３ｗｔ様クラスタの３１名の患者は、乳癌の７年生存率９０％を示した（図５Ｂ）。すなわち、この大多数の第ＩＩＩ期患者集団では、部分的分類指標は、どの患者が、再発し死亡するかだけでなく、どの後期患者が癌から生存するかを正確に予測することができる。階層的クラスタ分析には、対数発現値を平均中央化し規準化し、ピアソン相関計量および平均連結法（Dr. Michael Eisenの好意によるCluster and TreeViewソフトウェア；ソフトウェアは、UC Berkeley校ウェブサイト、Lawrence Berkeley National Laboratoryで得ることができる）を使用して、遺伝子および腫瘍をクラスタ化した。生存分析するために、ｐ５３分類指標の結果に従って、または一事例では、ｐ５３の変異状態に従って患者を層別化した。異なる患者群の生存曲線を算出するためにカプラン−マイヤー評価を使用し、得られた危険率の統計上の有意性を評価するためにワルド検定を使用した。図４の生存分析は、偶然のみによる達成率を評価し、ｐ５３の状態単独を使用して得られたｐ＝０．０１２と比較して（パネルＡ）、より有意なワルドｐ値０．０００５７（パネルＢ）は、ｐ５３分類指標によって決定されたグループ指定を使用し得られた。１００，０００回の繰り返しランでは、４０腫瘍を無作為に選択し（すなわち、パネルＡとＢではグループ指定で腫瘍数が異なった）、それらのｐ５３の状態を逆にし、ワルドｐ値を各ランで算出した。ｐ値≦０．０００５７は、５６４回しか得られなかった。この観察のモンテカルロｐ値は、０．００４６であると推定される。
【００９７】
関連性試験（すなわち、２個以上の群において観察した事象数の有意性を確認するため）には、カイ２乗検定を使用した。任意のカテゴリーで事象数が極めてさい（＜５）場合、カイ２乗検定の代わりにフィッシャーの正確確率検定を使用した。
【００９８】
ｐ５３下流標的遺伝子および上流エフェクターの発現レベルの統計分析には、ｐ５３ｗｔおよびｍｔ腫瘍間で差次的に発現した遺伝子を判定するために、両側２群Ｔ検定を使用した（図８）。ｍｔ様クラス中のｐ５３ｗｔ腫瘍と、ｗｔ様クラス中のｐ５３ｗｔ腫瘍の間の比較（逆も同様）には片側２群ｔ検定を実施して、ｐ５３野生型および突然変異体間で観察したように、遺伝子が同じ方向（または反対方向）で有意に差次的に発現したかどうかを試験した。
【００９９】
本発明の方法の実施形態が、本明細書に開示した統計方法のみには限らないことは当業者には明白であろう。本発明の実施形態は同等の分析法を包含する。本明細書で使用したｐ値の略語には以下のものがある。
【０１００】
ｐＷＴ＝ウィルコクソン順位和検定
ｐｔ＝Ｔ検定
ｐｃｓ＝カイ２乗検定
ｐｆｅ＝フィッシャーの正確確率検定
ｐＷ＝ワルド検定
ｐｍｃ＝モンテカルロ評価
既知の転写開始部位（ＴＳＳ）を有する分類指標遺伝子のそれぞれで、ｐ５３結合部位のプロモーター分析を実施した。ＢＥＡＲＲ（Vega, V. B., Bangarusamy, D. K., Miller, L. D., Liu, E. T. & Lin, C. Y. ＢＥＡＲＲ：Batch Extraction and Analysis of cis-Regulatory Regions（バッチ抽出およびシス調節領域の分析）Nucleic Acids Res 32, W257-60 (2004)、参照により本明細書に組み込む）を使用して、プロモーター配列（ＴＳＳの３０００ｂｐ上流〜５００ｂｐ下流）を抽出し、そしてＴＲＡＮＳＦＡＣ（Kel, A. E.ら、ＭＡＴＣＨ：A tool for searching transcription factor binding sites in DNA sequences （ＤＮＡ配列中の転写因子結合部位を探索するツール）、Nucleic Acids Res 31, 3576-9 (2003)、参照により本明細書に組み込む）バージョン６．０（マトリックスアクセッション：Ｍ００２７２）、および基準のｐ５３結合部位コンセンサス ５’−ＲＲＲＣＷＷＧＹＹＹＮ（０−１３）ＲＲＲＣＷＷＧＹＹＹ−３’（el-Deiry, W. S., Kern, S. E., Pietenpol, J. A., Kinzler, K. W. および Vogelstein, B. “ Definition of a consensus binding site for p53（ｐ５３のコンセンサス結合部位定義）”、Nat Genet 1, 45-9 (1992)、参照により本明細書に組み込む）に基づく単純なパターン調査から得られたＰ５３位置重み行列（position weight matrix）を使用して、推定結合部位を予測した。
【実施例５】
【０１０１】
ｐ５３欠陥分類指標は、内分泌治療を行った患者での結果と有意に相関するが、ｐ５３の状態単独ではない。
【０１０２】
患者の結果を予測する分類指標の確実性をさらに試験するために、他の関連する治療群におけるその性能も分析した。近年、ｐ５３ｍｔ胸部腫瘍は、ｐ５３ｗｔ腫瘍よりも内分泌療法に対して耐性が高いことが観察されており、これは耐性腫瘍中のｐ５３依存性アポトーシスの脱共役によって部分的に説明された（Berns, E. M.ら、”Complete sequencing of TP53 predicts poor response to systemic therapy of advanced breast cancer（ＴＰ５３の完全シーケンシングが、進行した乳癌の全身療法に対して不十分な応答を予測）”、Cancer Res 60, 2155-62 (2000)、参照により本明細書に組み込む）。ホルモン療法特異的患者コホートで、結果を予測する分類指標の能力を試験するために、術後アジュバントタモキシフェン治療のみを受けた６８名のＥＲ＋患者から構成したUppsalaコホートの亜集団を検査した。図６は、内分泌治療を行った患者で、ｐ５３分類指標が、ｐ５３の変異状態よりも予後予測の重要性が高いことを示す。６８名のＥＲ＋であり内分泌治療を行った患者を（Ａ）ｐ５３の変異状態または（Ｂ）ｐ５３分類指標に従って分類し、原病生存期間（ＤＳＳ）との相関を分析した。カプラン−マイヤー生存評価を示す。図６ＡおよびＢの生存分析に示されるように、この分類指標は、原病生存期間の有意な予測器（ｐｗ＝０．０４７）であったが、ｐ５３の変異状態単独はそうではなかった（ｐｗ＝０．３９５）ことが観察された。
【０１０３】
次に、van't Veerらによって公にされた９７の胸部腫瘍セット（van't Veer, L. J.ら、”Gene expression profiling predicts clinical outcome of breast cancer（遺伝子発現プロファイリングによって乳癌の臨床結果を予測）” Nature 415, 530-6 (2002)、参照により本明細書に組み込む）での分類指標の予後予測の性能を検査した。図７は、ｐ５３分類指標が、初期であり局所治療を受けた胸部腫瘍の独立したセットで遠隔再発の予後を予測することを示す。
【０１０４】
最適化させた分類指標の２１遺伝子に相当するプローブセットを使用して、術後アジュバント放射線療法で治療し、少なくとも５年間追跡した初期患者のオランダ人コホートから得た９７腫瘍（van't Veer, L. J.ら、”Gene expression profiling predicts clinical outcome of breast cancer （遺伝子発現プロファイリングによって乳癌の臨床結果を予測）”、Nature 415, 530-6 (2002)、参照により本明細書に組み込む）を階層的にクラスタ化した。色および「Ｃ」の名称（すなわち、Ｃ１〜Ｃ５）によって、主要なクラスタノードの境界を画定する。黒色の矢印は、５年以内に遠隔転移（ＤＭ）に発達した患者から得た腫瘍に相当する。遺伝子記号および対応するGenbank受託番号を示す。既に記載されている通りに階層的クラスタリングを実施した。
【０１０５】
ここで、試料の全ては、臨床的に均一になるように制御され、すなわち、サイズが＜５ｃｍであり（Ｔｌ／Ｔ２）、進行した疾患がなく（ｐＮ０）、診断時の年齢が５５歳未満であり、手術と続く放射線治療のみによって治療した患者（アジュバント全身療法を受けた５名の患者の除く）から得たものであった。３２の遺伝子分類指標から、２１の遺伝子に対応する２４のプローブを生存情報がある全９７腫瘍に位置づけることができた。腫瘍クラスタリング後、類似する平均距離相関を有する約４個のクラスタが観察され、そのクラスタは５年以内に遠隔転移を生じたであろう患者を有意に識別した（ｐｆｅ＝２．２×１０−４）（図７）。特に、ｐ５３ｗｔ様分子立体配置に最も近似するクラスタ３の３９腫瘍のうちの２６％と比較して、分子立体配置がｐ５３ｍｔ様腫瘍であるクラスタ１の２６腫瘍のうちの７３％が５年以内に遠隔転移した。これらの知見から、ｐ５３分類指標は、初期であり局所治療を受けた乳癌で腫瘍再発を予後予測するということが示唆される。
【実施例６】
【０１０６】
分類指標遺伝子の機能の分析
いくつかの機構的な洞察を得るために、その発現レベルおよびｐ５３の状態と、患者の結果との間の相関を説明する手がかりを求めて、分類指標遺伝子の機能性アノテーションを分析した。驚くべきことに、分類指標遺伝子のどれも既知のｐ５３の転写標的ではないばかりか、以前にはｐ５３経路に関与していなかったことが判明した。所定のプロモーター領域を有する２１の遺伝子のプロモーターを分析することによって、これらのプロモーターのどれにも、基準のｐ５３結合部位、または近年記載された新規なｐ５３結合部位の形跡がないことが判明した。
【０１０７】
これらの遺伝子のうち１２個は機能が未知である。しかし、特徴づけられた遺伝子のうち、いくつかは、細胞増殖および増殖（ＭＹＢＬ２、ＴＦＦ１、ＢＲＲＮ１、ＣＨＡＤ、ＳＣＧＢ３Ａ１、ＤＡＣＨ、ＣＤＣＡ８）、転写（ＬＡＦ４、ＮＹ−ＢＲ−１、ＤＡＣＨ、ＭＹＢＬ２）、イオン輸送（ＣＡＣＮＧ４、ＣＹＢＲＤ１、ＬＲＰ２）、ならびに乳癌生物学（ＳＣＧＢ３Ａ１、ＴＦＦ１、ＳＴＣ２、ＮＹ−ＢＲ−１、ＡＧＲ２）に関連付けられる。推測では、これらの遺伝子のいくつかは、機構的に、ｐ５３突然変異体様腫瘍の不十分な予後予測を引き起こしうる。例えば、ｐ５３突然変異体様腫瘍で上方制御されるのが観察されたＭＹＢＬ２は、ｃ−ＭＹＢ発癌遺伝子に密接に関係する増殖促進転写因子である。それは、しばしば、乳癌（２０ｑ１３）で増幅する染色体領域に位置づけられ、乳癌細胞系統および孤発性卵巣癌で過剰に発現することが既に報告されている（Forozan, F.ら、”Comparative genomic hybridization analysis of 38 breast cancer cell lines: a basis for interpreting complementary DNA microarray data（３８乳癌細胞系統の比較ゲノムハイブリダイゼーション分析：相補的ＤＮＡマイクロアレイデータの解釈の基礎)”、Cancer Res 60, 4519-25 (2000)、およびTanner, M. M.ら、”Frequent amplification of chromosomal region 20q12-q13 in ovarian cancer（卵巣癌中の染色体領域２０ｑ１２−ｑ１３の高頻度増幅）”、Clin Cancer Res 6, 1833-9 (2000)、この両方を参照により本明細書に組み込む）。ｐ５３突然変異体様腫瘍で下方制御されることが観察されたＳＣＧＢ３Ａ１（ＨＩＮ１）は、仮想腫瘍サプレッサー遺伝子であり、過剰に発現した場合、乳癌細胞の増殖を阻害することができ、乳房腫瘍形成初期にそのプロモーターが過剰メチル化することによって、転写的にサイレンスされることが判明している（Krop, I. E.ら、”HIN-1, a putative cytokine highly expressed in normal but not cancerous mammary epithelial cells（ＨＩＮ−１、正常であり癌ではない乳房上皮細胞中高度に発現した推定サイトカイン)”、Proc Natl Acad Sci USA 98, 9796-801(2001)、参照により本明細書に組み込む）。
【実施例７】
【０１０８】
誤分類された腫瘍の性質。
【０１０９】
野生型ｐ５３配列状態を有するいくつかの癌が、３２遺伝子分類指標を使用する発現プロファイリングによって、ｐ５３突然変異体として分類されることが観察された。この「誤分類」されたｐ５３ｗｔ腫瘍が、実際にｐ５３の欠陥であったならば、これらは、ｐ５３経路の混乱を反映する何らかの分子特性を有し、これらの特性がｐ５３突然変異腫瘍の大多数に見られるはずである。第一に、ｐ５３遺伝子の転写阻止（ＴＰ５３）により、またはそのｍＲＮＡ半減期の短縮により低下した転写産物レベルから、ｐ５３の欠陥が生じうる可能性を考えてみた。異なる腫瘍クラスで、（マイクロアレイに存在するＴＰ５３プローブセットを用いて）ｔ検定を使用し、ＴＰ５３の相対的発現レベルを比較した（図８）。実際、この仮定に一致して、ｗｔ様として分類された残りの１７０のｗｔ腫瘍と比較して、ｍｔ様と分類された２８のｗｔ腫瘍で、ＴＰ５３の全体的発現レベルは有意に減少するのが観察された（ｐｔ＝１．４×１０−４）。一般に、ｐ５３突然変異乳癌では、ＴＰ５３のｍＲＮＡレベルは減少しないのと一致して、正確にｍｔ様と分類されたｐ５３ｍｔ腫瘍と、全ｗｔ腫瘍との間には、発現レベルにおいて統計上の有意差は観察されなかった。
【０１１０】
図８は、ｐ５３の転写産物レベル、その転写標的、およびその上流エフェクターが、既知の予想したクラスを識別することを示す。ｐ５３経路関連遺伝子の発現レベルを試験した。ｔ検定によって、異なる腫瘍クラス間の転写産物レベルの統計上の有意性を定量し、図右のまとめの表に示す。４つの腫瘍クラスは以下通りである。１）突然変異体として分類されたｐ５３ｍｔ腫瘍４７、２）突然変異体として分類されたｐ５３ｗｔ腫瘍２８、３）野生型として分類されたｐ５３ｗｔ腫瘍１７０、および４）野生型として分類されたｐ５３ｍｔ腫瘍１２。グレーで示したまとめの統計的測定値は、有意性がｐ＜０．０５に達しなかった。
【０１１１】
表３は、ｐ５３変異の比較分析を示す。（Ｉ）重大な変異を挿入、欠失、または終止コドンとして定義した。残りのミスセンス点変異（ｍｐｍ；ｗｔ様群中１１、ｍｔ様群中２７）のうち、ＩＡＲＣ ＴＰ５３変異データベース（国際がん研究機関ＩＡＲＣのウェブサイトでオンラインにより入手可能）によって定義されている通り、（ＩＩ）ｐ５３中最もありふれたミスセンス点変異、および（ＩＩＩ）ｉｎ ｖｉｔｒｏで優性阻害活性を有することが既に示されている突然変異体の出現頻度を本発明者らは定量した。Ｐ値は、フィッシャーの正確確率検定を使用し算出した。
【０１１２】
ｐ５３欠陥腫瘍の変化した転写をある程度示すと仮定した既知のｐ５３転写標的にこのやり方を適用した。実際、いくつかのｐ５３標的遺伝子は変化した発現パターンを示した（図８）。その全てがプロモーターに機能性ｐ５３結合部位を含む、ＴＰ５３誘発遺伝子であるＴＰ５３ＩＮＰ１、ＳＥＭＡ３Ｂ、ＰＭＡＩＰ１（ＮＯＸＡ）、ＦＤＸＲ、ＣＣＮＧ１、およびＬＲＤＤは、ｍｔ様と分類された２８のｗｔ腫瘍で、他方の野生型と比較して発現が有意に減少した（全てｐｔ＜０．０５）。さらにまた、一つを除きこれらの遺伝子は全て、ｍｔ様と分類されたｐ５３ｍｔ腫瘍で（全ｗｔ腫瘍と比較して）有意に減少し、そして２事例を除く全てにおいて、他方の突然変異体と比較した場合、これらの遺伝子は１２のｗｔ様として分類されたｍｔ腫瘍でより有意に高発現した。
【０１１３】
ｐ５３をリン酸化し、それによって安定化を促進するｐ５３陽性上流エフェクターであるＣＨＥＫ１およびＣＨＥＫ２は、ｐ５３によって転写的に抑制されることが知られている。突然変異体様クラスのｐ５３ｗｔおよびｍｔ腫瘍で、これらの遺伝子のｍＲＮＡレベルが有意に上昇することが観察された。また、野生型様として誤分類された１２のｍｔ腫瘍では、その他の４７のｐ５３突然変異体と比較して、これらの遺伝子の発現が有意に減少したことも観察された。特に、これらの胸部腫瘍試料では、ｐ５３に調節される遺伝子ＣＤＫＮ１Ａ（ｐ２１）、ＧＡＤＤ４５、ＰＰＭ１Ｄ（ＷＩＰ１）、ＴＰ５３Ｉ３（ＰＩＧ３）、ＴＮＦＲＳＦ６、ＢＢＣ３（ＰＵＭＡ）、ＡＰＡＦ１、またはＢＣＬ２は差次的に発現されないことが観察された。
【０１１４】
総合すると、分類指標はｐ５３転写活性のいくつかの態様に基づいて腫瘍を識別でき、この活性は、突然変異体様クラスのｐ５３突然変異体腫瘍および野生型腫瘍で阻害されるが、野生型様クラスのｐ５３野生型腫瘍（およびある程度１２のｐ５３突然変異腫瘍）では作動していることをこれらのデータは示唆している。
【０１１５】
おそらく逆説的に、ｐ５３を誘導する遺伝子ＰＥＲＰ、ＢＡＸ、およびＳＦＮ（１４−３−３σ）は全て、２８の誤分類されたｗｔ腫瘍で、上記の誘導性遺伝子対応物のように低レベルではなく、有意により高いレベルで発現することが観察された。しかし、突然変異体様として分類されたＰ５３ｍｔ腫瘍で、これらの遺伝子が有意に過剰発現することも観察され、乳癌では、突然変異体または欠陥ｐ５３と関連して調節機序を変えることにより、これらの遺伝子が誘発されうることが示唆された。
【０１１６】
興味深いことに、ＣＨＥＫ１およびＣＨＥＫ２の方法と似た方法でｐ５３活性を増強すると思われる、ｐ５３の別の陽性上流エフェクターＡＴＲもまた、たとえこの遺伝子がｐ５３依存性方式で調節されるかどうか不明であっても、ｐ５３突然変異体および突然変異体様クラスのｐ５３ｗｔ腫瘍で、より有意に高いレベル発現することが判明した。留意すべきは、上流エフェクターＡＴＭまたはＰＲＫＤＣ（ＤＮＡ−ＰＫ）の発現レベルで有意差は観察されなかった。
【０１１７】
次いで、それによって突然変異体様ｐ５３ｗｔ腫瘍でｐ５３の発現および活性が減少するかもしれない機序が、変更される可能性を確認するために、ｐ５３活性の他の上流モジュレーターの発現レベルを試験した。第一に、ＨＯＸＡ５、ＵＳＦ１、ＥＧＲ１、およびＴＰ５３ＢＰ１を含む突然変異体様クラスの野生型および突然変異体で、数個の既知のｐ５３トランス活性化陽性レギュレーターが有意に減少することが観察された。ＨＯＸＡ５、ＵＳＦ１、およびＥＧＲ１は全て、ｐ５３プロモーターに結合し、その発現を高めることが知られている転写因子である。興味深いことに、３つ全ての欠陥は、乳癌の発癌に既に関与していた。近年、ｐ５３およびＨＯＸＡ５ ｍＲＮＡの同調的な喪失およびタンパク質の発現が、ヒト乳癌細胞系統パネルで観察され、ＨＯＸＡ５プロモーターが、２０のｐ５３陰性ヒト胸部腫瘍の１６でメチル化することが判明した。ｃ−Ｍｙｃ腫瘍性タンパク質に構造的に関与するＵＳＦ１は、乳癌細胞系統で転写活性を減少させることが判明しており、近年、エストロゲン受容体αの発現を活性化することが示された。抗増殖機能およびアポトーシス機能を有するＤＮＡ傷害性応答遺伝子であるＥＧＲ１は、ヒト乳癌細胞で外来的に発現させた場合、腫瘍形成能を阻害することができ、ヒトおよびマウス乳癌細胞系統ならびに腫瘍で発現が減少することが観察されている。ＴＰ５３ＢＰ１は、転写因子というよりもＤＮＡ傷害に応答してリン酸化するＡＴＭのＢＲＣＴドメイン含有基質であると考えられている。この遺伝子産物は、ｐ５３の中心ＤＮＡ結合ドメインに結合し、それによってｐ５３標的遺伝子の転写活性化を増強することが知られている。２８の突然変異体として分類されたｐ５３ｗｔ腫瘍では、全４個の遺伝子の発現が有意に減少し、ＵＳＦ１およびＴＰ５３ＢＰ１の事例においては、野生型様として分類されたｐ５３突然変異体で発現は有意に高かった。興味深いことに、４７の突然変異体様として分類されたｐ５３ｍｔ腫瘍では、可能な陽性フィードバックループを示唆して、それらの発現レベルも有意に低く、それによって野生型ｐ５３はこれらの遺伝子の発現を増強することができるが、損なわれたｐ５３はそのようにできないことも観察された。これらの観察が別々にまたは組み合わせて作用する可能性を示唆しているのに合わせて、これらの遺伝子は乳房で無傷のｐ５３活性には重要であり、転写的にサイレンスされた場合には、ｐ５３の欠陥の一因となりうる。
【０１１８】
最後に、数個の既知のｐ５３活性陰性レギュレーター発現を検査した。特に、リン酸化が介在するｐ５３タンパク質の分解によって、ｐ５３を消極的に調節し、タンパク質レベルでのその過剰発現が様々な癌に関与してきたＭＤＭ２は、本明細書に記載した実験では、転写産物レベルで差次的に発現しないことが判明した。しかし、ＰＬＫ１およびＧＴＳＥ１は発現した。近年、Ｍ相レギュレーターＰＬＫ１は、ｐ５３のＤＮＡ結合ドメインに結合し、それによってｉｎ ｖｉｔｒｏでその転写活性を阻害するするように見えた。ＧＴＳＥ１（Ｂ９９）は、ｐ５３のＣ末端調節ドメインに結合し、ｐ５３トランス活性化機能を阻害し、ｐ５３タンパク質の細胞内レベルを減少させる。興味深いことに、両遺伝子の転写産物レベルは、ｍｔ様クラスのｐ５３ｗｔおよびｍｔ腫瘍の中で最高に有意に過剰発現し、乳癌の発癌でのｐ５３の機能抑制における、これらの遺伝子産物の可能な役割を示唆した。
【０１１９】
次に、野生型様として１２のｐ５３突然変異腫瘍が誤分類されたことを説明しうる相関についてｐ５３変異のスペクトルを分析した。まず、わずか一つの変異が野生型様および突然変異体様腫瘍に共通することが観察された。ＤＮＡ結合ドメイン中のアミノ酸２２０にあるＴｙｒ＞Ｃｙｓである。突然変異体として正確に分類された４７のｐ５３ｍｔ腫瘍の中で、４２％（２０／４７）がフレームシフトと続く切断をもたらす、挿入（ｎ＝２）、欠失（ｎ＝１１）、および終止コドン（ｎ＝７）（表３−Ｉ）として定義された「重大な」変異を有し、それに対して野生型様として分類された１２の突然変異体では、わずか１個（８％）が重大な変異である、グリシン残基のインフレーム付加をもたらすＤＮＡ結合ドメインへの３ｂｐの挿入を含有する（ｐｆｅ＝０．０２５）ことが観察された。２００３年６月現在、１８，５８５の体細胞変異および２２５のｐ５３の生殖細胞系列変異インデックスを有するＩＡＲＣ ＴＰ５３変異データベース（国際がん研究機関ＩＡＲＣのウェブサイトでオンラインにより入手可能）を使用し、ヒト癌において、１２のｗｔ様突然変異体および４７のｍｔ様突然変異体中の最も共通するｐ５３変異（全ｐ５３変異の約２０％を表す；表１−ＩＩ）の出現頻度を比較した。ｍｔ様群の２７のうち９と比較して、共通する変異のどれも、ｗｔ様群中の１１のミスセンス点変異（ｍｐｍ）サブセットと重複しないことが判明した（ｐｆｅ＝０．０２９）。次いで、各腫瘍群のｍｐｍと、ＩＡＲＣ ＴＰ５３変異データベースの包括的リストの４１８の突然変異体とを交差比較したが、これらの突然変異体は、既に公にされた４４の研究の少なくとも一つで、優性阻害機能について予め分析されている。表２−ＩＩＩに示すように、ｍｔ様群の２７うちの１２と比較して、１２のｗｔ様突然変異体のうち１１のｍｐｍのわずか１つが、優性阻害活性を有していることが既に実証されていることが判明した（ｐｆｅ＝０．０３９）。総合すると、これらのデータは、配列レベルでは、野生型様として分類された１２のｐ５３突然変異体は、突然変異体様として分類された４７のｐ５３突然変異体と比較して、ほとんど「良性」のｐ５３突然変異体を実際に含みうることが示唆され、本発明者らの発現分析におけるｐ５３ｗｔ腫瘍の大多数と、それらが分子的に一致することとも一致する。
【表３】
【０１２０】
ｐ５３変異の比較分析。（Ｉ）重大な変異を挿入、欠失、または終止コドンとして定義した。残りのミスセンス点変異（ｍｐｍ；ｗｔ様群中１１、ｍｔ様群中２７）のうち、ＩＡＲＣ ＴＰ５３変異データベース（http://www.iarc.fr/p53/index.html）によってに定義されている通り、（ＩＩ）ｐ５３中、最もありふれたミスセンス点変異、および（ＩＩＩ）ｉｎ ｖｉｔｒｏで優性阻害活性を有することが既に示されている突然変異体の出現頻度を本発明者らは定量した。Ｐ値は、フィッシャーの正確確率検定を使用し算出した。
【０１２１】
本発明の実施には、当業者に公知の慣用の生物学的方法、ソフトウェア、およびシステムを使用しうる。前述の実施例は、患者で疾患の結果を予測する方法を記載した。別の態様では、患者で疾患の結果を予測するためのコンピューターシステムを提供する。そのコンピューターシステムは、プロセッサとメモリを備えることができ、該メモリには、ｐ５３遺伝子の突然変異体または野生型でありうる腫瘍試料の複数の遺伝子から遺伝子発現プロファイルを得るステップ、突然変異腫瘍または野生型腫瘍中でどの遺伝子が差次的に発現しているのかを判定するために、該遺伝子発現プロファイルを比較するステップ、差次的に発現した該遺伝子から、ｐ５３の変異状態を予測するための遺伝子セットを抽出するステップ、および患者で疾患の結果を予測するために、該遺伝子セットを使用するステップを実施するために、プロセッサに実行させる実行可能コードが保存されている。
【０１２２】
適当なコンピューターシステムは、例えば、ＰＣやマッキントッシュなど、一般的な汎用コンピューターであってよい。典型的には、本発明のコンピューターソフトウエア製品には、本発明の方法の論理ステップを実施するためのコンピューターが実施することができる指示を含む、コンピューターが読み取り可能な媒体が含まれる。適当なコンピューターが読み取り可能な媒体には、フロッピーディスク、ＣＤ−ＲＯＭ／ＤＶＤ／ＤＶＤ−ＲＯＭ、ハードディスクドライブ、フラッシュメモリー、ＲＯＭ／RAM、磁気テープなどが含まれる。コンピューターが実施可能な指示は、適当なコンピューター言語または数種の言語の組合せで書かれていてよい。基礎的なコンピューター生物学的方法は、例えば、SetubalおよびMeidanisら、『Introduction to Coniputational Biology Methods （コンピューターによる生物学的方法の手引き）』(PWS Publishing Corripany, Boston, 1997)、Salzberg、Searles、Kasif、（編）、『Computational Methods in Molecular Biology（分子生物学におけるコンピューターによる方法）』、(Elsevier, Amsterdam, 1998)、 RashidiおよびBuehlei、『Bioinformatics Basics: Application in Biological Science and Medicine（バイオインフォマティクスの基礎：生物科学および医薬における応用）』(CRC Press, London, 2000)、およびOueletteおよびBzevanis、『Bioinformatics: A Practical Guide for Analysis of Gene and Proteins（バイオインフォマティクス：遺伝子およびタンパク質分析用実用的ガイド）』(Wiley & Sons, Inc., 第２版,2001)に記載されている。
【０１２３】
さらに、本発明は、インターネットなどのネットワークを通して遺伝情報を提供する方法を含む好ましい実施形態を含みうる。
【０１２４】
さらに、本発明のいくつかの実施形態は、多様な癌に対する化学療法剤を設計するための複数の医薬標的を提供しうる。例えば、ｐ５３の変異状態に最も相関する３２遺伝子は、化学療法用の潜在的分子標的として役立つであろう。化学療法薬物（細胞毒剤）および抗ホルモン治療は、癌を治療するために通常使用されている。しかし、数名の患者では、細胞毒剤および抗ホルモン剤を含む治療レジメンは、軽度から重度の副作用を引き起こすことが知られている。例えば、乳癌では、これらの副作用には嘔吐、嘔気、脱毛症、および疲労が含まれる。従って、有効な癌治療の未来は、その標的に高特異的な薬物と共に存在する。いくつかの研究に従って、臨床開発のパイプラインにおける乳癌薬物の約６８％は標的化したクラスのものである。従って、本発明のある態様で具体化させたものなどの分子サインは、重要な手がかりを提供し、または標的化した化学療法剤で他に依存しない標的であることが証明されるであろう。
【０１２５】
最後に、開示した本発明の実施形態は、ｐ５３の状態およびヒト乳房腫瘍での生存を予測することができる遺伝子発現サインを定義する（ｐ５３サインまたは分類指標）。乳癌および肝臓癌の独立したデータセット、そして他の臨床特徴に関わらず、そのｐ５３サインのサブセットによって、有意な精度をもってｐ５３の状態を予測することができる。原病生存期間（ＤＳＳ）の予測器として、このサインは、不均一に治療された患者大コホートで、ｐ５３の変異状態単独より有意に優れていた。ｐ５３サインは、全身アジュバント療法および局所領域的放射線治療から多少の利益を得た患者を有意に識別できるであろう。ほとんどのヒト癌のあるレベルでｐ５３経路は損傷を受けうるが、ｐ５３経路に関与する転写産物の分析によって、ｐ５３発現サインが、患者生存および治療応答に影響を与える、胸部腫瘍のこの経路の操作立体配置を定義する（ｐ５３の変異状態単独よりもそのようである）ことが示唆される。癌では、全てのｐ５３変異が等しい効果を有するとは限らないことは明らかであり、あるものは単純に機能を喪失させ、あるものは優性阻害効果（野生型ｐ５３のトランス優性抑制または発癌機能の獲得など）を有し、またあるものは部分的機能喪失を示し、例えば、ｐ５３下流転写標的遺伝子の小サブセットだけが調節不全になる。こうした理由で、ｐ５３の状態のただ一つの分子評価が、完全なｐ５３の機能の絶対的指標を提供するとは思われない。本明細書に開示した実施形態は、ｐ５３の機能の下流指標を見ることによって、シーケンシングまたは生化学的手段の使用よりも、ｐ５３の機能状態を正確に確認しうることをを示唆する。
【０１２６】
上記説明は、例示を目的とし、限定するものではないことは理解されよう。本発明の多くの変形形態は、上記説明を再考することにより当業者には明白である。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲、およびそのような請求項が権利を受ける同等物の全範囲に関して決定される。特許文献および非特許文献を含め、引用した参照文献は全て、参照によりその全体をあらゆる目的において本明細書に組み込む。
【図面の簡単な説明】
【０１２７】
【図１】開示した本発明の一実施形態で使用するための、ｐ５３の状態と統計学的に相関する上位２５０遺伝子を使用する、２５７腫瘍の階層的クラスタリングを示す図である。
【図２Ａ−Ｂ】開示した本発明の実施形態に一致して、ｐ５３の状態に対する遺伝子分類指標の最適化および結果を示す図である。
【図２Ｃ】開示した本発明の実施形態に一致して、ｐ５３の状態に対する遺伝子分類指標の最適化および結果を示す図である。
【図３】開示した本発明の実施形態に一致して、分類指標遺伝子が、独立したｃＤＮＡマイクロアレイデータセットでｐ５３の状態を予測できることを示す図である。
【図４】開示した本発明の実施形態に一致して、ｐ５３分類指標が、ｐ５３の変異状態単独よりも予後予測の重要性が高いことを示す図である。
【図５】開示した本発明の実施形態に一致して、後期腫瘍の独立したデータセットで、ｐ５３分類指標の予後予測の重要性が極めて高いことを示す図である。
【図６】開示した本発明の実施形態に一致して、内分泌治療を行った患者で、ｐ５３分類指標が、ｐ５３の変異状態よりも予後予測の重要性が高いことを示す図である。
【図７】開示した本発明の実施形態に一致して、初期であり局所治療を施した胸部腫瘍の独立したセットで、ｐ５３分類指標が、遠隔再発の予後徴候であることを示す図である。
【図８】開示した本発明の実施形態に一致して、ｐ５３の転写産物レベル、その転写標的、およびその上流エフェクターが、既知の予想されるクラスを識別することを示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者で疾患の結果を予測する方法であって、
ｐ５３遺伝子の突然変異体または野生型でありうる腫瘍試料の複数の遺伝子から遺伝子発現プロファイルを得るステップ、
突然変異腫瘍または野生型腫瘍中でどの遺伝子が差次的に発現しているのかを判定するために、該遺伝子発現プロファイルを比較するステップ、
差次的に発現した該遺伝子から、ｐ５３の変異状態を予測するための遺伝子セットを抽出するステップ、および
患者で疾患の結果を予測するために、該遺伝子セットを使用するステップ
を含む上記方法。
【請求項２】
疾患の結果が、原病生存期間、無病生存期間、腫瘍再発、および治療応答からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
疾患が乳癌である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
疾患が肝臓癌である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
差次的に発現した遺伝子と、ｐ５３の変異状態、ＥＲの状態、および腫瘍の組織学的等級との関連性に従って該差次的に発現した遺伝子をランク付けることによって、予想したｐ５３の変異状態を得る、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記遺伝子を多変量ランク付け手順に従ってランク付ける、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記多変量ランク付け手順が線形モデル適合（Linear Model-Fit）である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
予想したｐ５３の変異状態が、管理学習（supervised learning）法の使用によって得られる、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記管理学習法が対角線形判別分析（Diagonal Linear Discriminant Analysis）である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ｐ５３の変異状態を予測するための遺伝子セットが、少なくとも３遺伝子を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
ｐ５３の変異状態を予測するための遺伝子セットが、３〜５００の遺伝子を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ｐ５３の変異状態を予測するための遺伝子セットが、３２の遺伝子を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記３２の遺伝子が、表１の遺伝子リストを含む群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記３２の遺伝子が、配列番号２３、配列番号２２、配列番号３１、配列番号１４、配列番号１１、配列番号２６、配列番号２１、配列番号３０、配列番号２７、配列番号８、配列番号２、配列番号９、配列番号１、配列番号２９、配列番号１７、配列番号２０、配列番号６、配列番号１８、配列番号２４、配列番号１０、配列番号１３、配列番号３２、配列番号２８、配列番号５、配列番号１６、配列番号２５、配列番号１５、配列番号７、配列番号４、配列番号３、配列番号１２、および配列番号１９からなる群から選択された配列である遺伝子を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
後期乳癌患者で疾患の結果を予測する方法であって、
ｐ５３遺伝子の突然変異体または野生型でありうる腫瘍試料の複数の遺伝子から遺伝子発現プロファイルを得るステップ、
突然変異腫瘍または野生型腫瘍中でどの遺伝子が差次的に発現しているのかを判定するために、該遺伝子発現プロファイルを比較するステップ、
差次的に発現した該遺伝子から、ｐ５３の変異状態を予測するための遺伝子セットを抽出するステップ、および
後期乳癌患者で疾患の結果を予測するために、該遺伝子セットを使用するステップであって、該遺伝子セットをコードする配列が、配列番号２２、配列番号３１、配列番号１１、配列番号９、配列番号１、配列番号２９、配列番号２８、配列番号５、および配列番号２５からなる群から選択されるステップ
を含む上記方法。
【請求項１６】
初期であり局所治療を受けた乳癌患者で臨床結果を予測する方法であって、
ｐ５３遺伝子の突然変異体または野生型でありうる腫瘍試料の複数の遺伝子から遺伝子発現プロファイルを得るステップ、
突然変異腫瘍または野生型腫瘍中でどの遺伝子が差次的に発現しているのかを判定するために、該遺伝子発現プロファイルを比較するステップ、
差次的に発現した該遺伝子から、ｐ５３の変異状態を予測するための遺伝子セットを抽出するステップ、および
初期であり局所治療を受けた乳癌患者で疾患の結果を予測するために、該遺伝子セットを使用するステップであって、該遺伝子セットが、配列番号２３、配列番号２２、配列番号３１、配列番号１４、配列番号１１、配列番号２６、配列番号８、配列番号９、配列番号１、配列番号２９、配列番号２０、配列番号２４、配列番号１０、配列番号３２、配列番号２８、配列番号５、配列番号１６、配列番号２５、配列番号１５、配列番号７、および配列番号３からなる群から選択された配列である遺伝子から選択されるステップ
を含む上記方法。
【請求項１７】
肝臓癌患者で臨床結果を予測する方法であって、
ｐ５３遺伝子の突然変異体または野生型でありうる腫瘍試料の複数の遺伝子から遺伝子発現プロファイルを得るステップ、
突然変異腫瘍または野生型腫瘍中でどの遺伝子が差次的に発現しているのかを判定するために、該遺伝子発現プロファイルを比較するステップ、
差次的に発現した該遺伝子から、ｐ５３の変異状態を予測するための遺伝子セットを抽出するステップ、および
肝臓癌患者で疾患の結果を予測するために、該遺伝子セットを使用するステップであって、該遺伝子セットが、配列番号３１、配列番号１４、配列番号１１、配列番号１、配列番号２０、配列番号２４、配列番号２８、および配列番号５からなる群から選択された配列を含むステップ
を含む上記方法。
【請求項１８】
患者で疾患の結果を予測するための遺伝子群を同定する方法であって、
ｐ５３遺伝子の突然変異体または野生型でありうる腫瘍試料の複数の遺伝子から遺伝子発現プロファイルを得るステップ、
突然変異腫瘍または野生型腫瘍中でどの遺伝子が差次的に発現しているのかを判定するために、該遺伝子発現プロファイルを比較するステップ、
ｐ５３の変異状態を予測するために、差次的に発現した該遺伝子をその能力に従ってランク付けるステップ、
突然変異体および野生型のｐ５３遺伝子発現プロファイルを識別するために、ランク付けしたそれらの遺伝子を訓練するステップ、
ｐ５３の変異状態を予測する能力がある遺伝子セットを含むｐ５３分類指標を得るステップ、
独立したデータセット中の該ｐ５３分類指標を確証するステップ、および
患者で疾患の結果を予測するために、該ｐ５３分類指標の能力を評価するステップ
を含む上記方法。
【請求項１９】
前記差次的に発現した遺伝子と、ｐ５３の状態、ＥＲの状態、および腫瘍の組織学的等級との関連性に従って、該遺伝子を多変量ランク付け手順によりランク付ける、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記多変量ランク付け手順が線形モデル適合である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記訓練するステップが、管理学習法の使用を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
前記管理学習法が対角線形判別分析である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記ｐ５３分類指標が少なくとも３遺伝子を含む、請求１８に記載の方法。
【請求項２４】
前記ｐ５３分類指標が３〜５００の遺伝子を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
最適化させたｐ５３分類指標が３２の遺伝子を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記最適化させたｐ５３分類指標が、配列番号２３、配列番号２２、配列番号３１、配列番号１４、配列番号１１、配列番号２６、配列番号２１、配列番号３０、配列番号２７、配列番号８、配列番号２、配列番号９、配列番号１、配列番号２９、配列番号１７、配列番号２０、配列番号６、配列番号１８、配列番号２４、配列番号１０、配列番号１３、配列番号３２、配列番号２８、配列番号５、配列番号１６、配列番号２５、配列番号１５、配列番号７、配列番号４、配列番号３、配列番号１２、および配列番号１９からなる群から選択された配列である遺伝子を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
疾患の結果が、原病生存期間、無病生存期間、腫瘍再発、および治療応答からなる群から選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２８】
９遺伝子の部分的分類指標によって、後期乳癌患者で臨床結果を予測することができる、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記９遺伝子の部分的分類指標が、配列番号２２、配列番号３１、配列番号１１、配列番号９、配列番号１、配列番号２９、配列番号２８、配列番号５、および配列番号２５からなる群から選択された配列である遺伝子を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
２１遺伝子の部分的分類指標によって、初期であり局所治療を受けた乳癌患者で臨床結果を予測することができる、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
前記２１遺伝子の部分的分類指標が、配列番号２３、配列番号２２、配列番号３１、配列番号１４、配列番号１１、配列番号２６、配列番号８、配列番号９、配列番号１、配列番号２９、配列番号２０、配列番号２４、配列番号１０、配列番号３２、配列番号２８、配列番号５、配列番号１６、配列番号２５、配列番号１５、配列番号７、および配列番号３からなる群から選択された配列である遺伝子を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
８遺伝子の部分的分類指標によって、肝臓癌患者で臨床結果を予測することができる、請求項２７に記載の方法。
【請求項３３】
前記８遺伝子の部分的分類指標が、配列番号３１、配列番号１４、配列番号１１、配列番号１、配列番号２０、配列番号２４、配列番号２８、および配列番号５からなる群から選択された配列である遺伝子を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
患者で疾患の結果を予測するためのコンピューターシステムであって、プロセッサとメモリとを有するコンピューターを備え、該メモリ上には、
ｐ５３遺伝子の突然変異体または野生型でありうる腫瘍試料の複数の遺伝子から遺伝子発現プロファイルを得るステップ、
突然変異腫瘍または野生型腫瘍中でどの遺伝子が差次的に発現しているのかを判定するために、該遺伝子発現プロファイルを比較するステップ、
差次的に発現した該遺伝子から、ｐ５３の変異状態を予測するための遺伝子セットを抽出するステップ、および
患者で疾患の結果を予測するために、該遺伝子セットを使用するステップ
を実施するために、プロセッサに実行させる実行可能コードが保存されている上記コンピューターシステム。
【請求項３５】
ｐ５３の変異状態を予測する能力がある複数の遺伝子を固体支持体に固定させた、患者で疾患感受性を予測するための診断ツール。
【請求項３６】
前記固体支持体がマイクロアレイである、請求項３５に記載の診断ツール。
【請求項３７】
前記複数の遺伝子が、GenBank受託番号：配列番号２３、配列番号２２、配列番号３１、配列番号１４、配列番号１１、配列番号２６、配列番号２１、配列番号３０、配列番号２７、配列番号８、配列番号２、配列番号９、配列番号１、配列番号２９、配列番号１７、配列番号２０、配列番号６、配列番号１８、配列番号２４、配列番号１０、配列番号１３、配列番号３２、配列番号２８、配列番号５、配列番号１６、配列番号２５、配列番号１５、配列番号７、配列番号４、配列番号３、配列番号１２、および配列番号１９からなる群から選択される遺伝子を含む、請求項３５に記載の診断ツール。
【請求項３８】
前記複数の遺伝子が、配列番号２２、配列番号３１、配列番号１１、配列番号９、配列番号１、配列番号２９、配列番号２８、配列番号５、および配列番号２５からなる群から選択された配列である遺伝子を含む、請求項３７に記載の診断ツール。
【請求項３９】
前記複数の遺伝子が、配列番号２３、配列番号２２、配列番号３１、配列番号１４、配列番号１１、配列番号２６、配列番号８、配列番号９、配列番号１、配列番号２９、配列番号２０、配列番号２４、配列番号１０、配列番号３２、配列番号２８、配列番号５、配列番号１６、配列番号２５、配列番号１５、配列番号７、および配列番号３からなる群から選択された配列である遺伝子を含む、請求項３７に記載の診断ツール。
【請求項４０】
前記複数の遺伝子が、配列番号３１、配列番号１４、配列番号１１、配列番号１、配列番号２０、配列番号２４、配列番号２８、および配列番号５からなる群から選択された配列である遺伝子を含む、請求項３７に記載の診断ツール。
【請求項４１】
固体支持体と、その上にディスプレイさせた、患者でｐ５３の変異状態を予測する能力がある遺伝子に対応する核酸プローブとを有する、患者で疾患感受性を予測するための核酸アレイ。
【請求項４２】
少なくとも８の核酸プローブを有する、請求項４１に記載の核酸アレイ。
【請求項４３】
少なくとも３２の核酸プローブを有する、請求項４２に記載の核酸アレイ。
【請求項４４】
少なくとも５００の核酸プローブを有する、請求項４３に記載の核酸アレイ。
【請求項１】
患者で疾患の結果を予測する方法であって、
ｐ５３遺伝子の突然変異体または野生型でありうる腫瘍試料の複数の遺伝子から遺伝子発現プロファイルを得るステップ、
突然変異腫瘍または野生型腫瘍中でどの遺伝子が差次的に発現しているのかを判定するために、該遺伝子発現プロファイルを比較するステップ、
差次的に発現した該遺伝子から、ｐ５３の変異状態を予測するための遺伝子セットを抽出するステップ、および
患者で疾患の結果を予測するために、該遺伝子セットを使用するステップ
を含む上記方法。
【請求項２】
疾患の結果が、原病生存期間、無病生存期間、腫瘍再発、および治療応答からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
疾患が乳癌である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
疾患が肝臓癌である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
差次的に発現した遺伝子と、ｐ５３の変異状態、ＥＲの状態、および腫瘍の組織学的等級との関連性に従って該差次的に発現した遺伝子をランク付けることによって、予想したｐ５３の変異状態を得る、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記遺伝子を多変量ランク付け手順に従ってランク付ける、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記多変量ランク付け手順が線形モデル適合（Linear Model-Fit）である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
予想したｐ５３の変異状態が、管理学習（supervised learning）法の使用によって得られる、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記管理学習法が対角線形判別分析（Diagonal Linear Discriminant Analysis）である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ｐ５３の変異状態を予測するための遺伝子セットが、少なくとも３遺伝子を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
ｐ５３の変異状態を予測するための遺伝子セットが、３〜５００の遺伝子を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ｐ５３の変異状態を予測するための遺伝子セットが、３２の遺伝子を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記３２の遺伝子が、表１の遺伝子リストを含む群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記３２の遺伝子が、配列番号２３、配列番号２２、配列番号３１、配列番号１４、配列番号１１、配列番号２６、配列番号２１、配列番号３０、配列番号２７、配列番号８、配列番号２、配列番号９、配列番号１、配列番号２９、配列番号１７、配列番号２０、配列番号６、配列番号１８、配列番号２４、配列番号１０、配列番号１３、配列番号３２、配列番号２８、配列番号５、配列番号１６、配列番号２５、配列番号１５、配列番号７、配列番号４、配列番号３、配列番号１２、および配列番号１９からなる群から選択された配列である遺伝子を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
後期乳癌患者で疾患の結果を予測する方法であって、
ｐ５３遺伝子の突然変異体または野生型でありうる腫瘍試料の複数の遺伝子から遺伝子発現プロファイルを得るステップ、
突然変異腫瘍または野生型腫瘍中でどの遺伝子が差次的に発現しているのかを判定するために、該遺伝子発現プロファイルを比較するステップ、
差次的に発現した該遺伝子から、ｐ５３の変異状態を予測するための遺伝子セットを抽出するステップ、および
後期乳癌患者で疾患の結果を予測するために、該遺伝子セットを使用するステップであって、該遺伝子セットをコードする配列が、配列番号２２、配列番号３１、配列番号１１、配列番号９、配列番号１、配列番号２９、配列番号２８、配列番号５、および配列番号２５からなる群から選択されるステップ
を含む上記方法。
【請求項１６】
初期であり局所治療を受けた乳癌患者で臨床結果を予測する方法であって、
ｐ５３遺伝子の突然変異体または野生型でありうる腫瘍試料の複数の遺伝子から遺伝子発現プロファイルを得るステップ、
突然変異腫瘍または野生型腫瘍中でどの遺伝子が差次的に発現しているのかを判定するために、該遺伝子発現プロファイルを比較するステップ、
差次的に発現した該遺伝子から、ｐ５３の変異状態を予測するための遺伝子セットを抽出するステップ、および
初期であり局所治療を受けた乳癌患者で疾患の結果を予測するために、該遺伝子セットを使用するステップであって、該遺伝子セットが、配列番号２３、配列番号２２、配列番号３１、配列番号１４、配列番号１１、配列番号２６、配列番号８、配列番号９、配列番号１、配列番号２９、配列番号２０、配列番号２４、配列番号１０、配列番号３２、配列番号２８、配列番号５、配列番号１６、配列番号２５、配列番号１５、配列番号７、および配列番号３からなる群から選択された配列である遺伝子から選択されるステップ
を含む上記方法。
【請求項１７】
肝臓癌患者で臨床結果を予測する方法であって、
ｐ５３遺伝子の突然変異体または野生型でありうる腫瘍試料の複数の遺伝子から遺伝子発現プロファイルを得るステップ、
突然変異腫瘍または野生型腫瘍中でどの遺伝子が差次的に発現しているのかを判定するために、該遺伝子発現プロファイルを比較するステップ、
差次的に発現した該遺伝子から、ｐ５３の変異状態を予測するための遺伝子セットを抽出するステップ、および
肝臓癌患者で疾患の結果を予測するために、該遺伝子セットを使用するステップであって、該遺伝子セットが、配列番号３１、配列番号１４、配列番号１１、配列番号１、配列番号２０、配列番号２４、配列番号２８、および配列番号５からなる群から選択された配列を含むステップ
を含む上記方法。
【請求項１８】
患者で疾患の結果を予測するための遺伝子群を同定する方法であって、
ｐ５３遺伝子の突然変異体または野生型でありうる腫瘍試料の複数の遺伝子から遺伝子発現プロファイルを得るステップ、
突然変異腫瘍または野生型腫瘍中でどの遺伝子が差次的に発現しているのかを判定するために、該遺伝子発現プロファイルを比較するステップ、
ｐ５３の変異状態を予測するために、差次的に発現した該遺伝子をその能力に従ってランク付けるステップ、
突然変異体および野生型のｐ５３遺伝子発現プロファイルを識別するために、ランク付けしたそれらの遺伝子を訓練するステップ、
ｐ５３の変異状態を予測する能力がある遺伝子セットを含むｐ５３分類指標を得るステップ、
独立したデータセット中の該ｐ５３分類指標を確証するステップ、および
患者で疾患の結果を予測するために、該ｐ５３分類指標の能力を評価するステップ
を含む上記方法。
【請求項１９】
前記差次的に発現した遺伝子と、ｐ５３の状態、ＥＲの状態、および腫瘍の組織学的等級との関連性に従って、該遺伝子を多変量ランク付け手順によりランク付ける、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記多変量ランク付け手順が線形モデル適合である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記訓練するステップが、管理学習法の使用を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
前記管理学習法が対角線形判別分析である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記ｐ５３分類指標が少なくとも３遺伝子を含む、請求１８に記載の方法。
【請求項２４】
前記ｐ５３分類指標が３〜５００の遺伝子を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
最適化させたｐ５３分類指標が３２の遺伝子を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記最適化させたｐ５３分類指標が、配列番号２３、配列番号２２、配列番号３１、配列番号１４、配列番号１１、配列番号２６、配列番号２１、配列番号３０、配列番号２７、配列番号８、配列番号２、配列番号９、配列番号１、配列番号２９、配列番号１７、配列番号２０、配列番号６、配列番号１８、配列番号２４、配列番号１０、配列番号１３、配列番号３２、配列番号２８、配列番号５、配列番号１６、配列番号２５、配列番号１５、配列番号７、配列番号４、配列番号３、配列番号１２、および配列番号１９からなる群から選択された配列である遺伝子を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
疾患の結果が、原病生存期間、無病生存期間、腫瘍再発、および治療応答からなる群から選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２８】
９遺伝子の部分的分類指標によって、後期乳癌患者で臨床結果を予測することができる、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記９遺伝子の部分的分類指標が、配列番号２２、配列番号３１、配列番号１１、配列番号９、配列番号１、配列番号２９、配列番号２８、配列番号５、および配列番号２５からなる群から選択された配列である遺伝子を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
２１遺伝子の部分的分類指標によって、初期であり局所治療を受けた乳癌患者で臨床結果を予測することができる、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
前記２１遺伝子の部分的分類指標が、配列番号２３、配列番号２２、配列番号３１、配列番号１４、配列番号１１、配列番号２６、配列番号８、配列番号９、配列番号１、配列番号２９、配列番号２０、配列番号２４、配列番号１０、配列番号３２、配列番号２８、配列番号５、配列番号１６、配列番号２５、配列番号１５、配列番号７、および配列番号３からなる群から選択された配列である遺伝子を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
８遺伝子の部分的分類指標によって、肝臓癌患者で臨床結果を予測することができる、請求項２７に記載の方法。
【請求項３３】
前記８遺伝子の部分的分類指標が、配列番号３１、配列番号１４、配列番号１１、配列番号１、配列番号２０、配列番号２４、配列番号２８、および配列番号５からなる群から選択された配列である遺伝子を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
患者で疾患の結果を予測するためのコンピューターシステムであって、プロセッサとメモリとを有するコンピューターを備え、該メモリ上には、
ｐ５３遺伝子の突然変異体または野生型でありうる腫瘍試料の複数の遺伝子から遺伝子発現プロファイルを得るステップ、
突然変異腫瘍または野生型腫瘍中でどの遺伝子が差次的に発現しているのかを判定するために、該遺伝子発現プロファイルを比較するステップ、
差次的に発現した該遺伝子から、ｐ５３の変異状態を予測するための遺伝子セットを抽出するステップ、および
患者で疾患の結果を予測するために、該遺伝子セットを使用するステップ
を実施するために、プロセッサに実行させる実行可能コードが保存されている上記コンピューターシステム。
【請求項３５】
ｐ５３の変異状態を予測する能力がある複数の遺伝子を固体支持体に固定させた、患者で疾患感受性を予測するための診断ツール。
【請求項３６】
前記固体支持体がマイクロアレイである、請求項３５に記載の診断ツール。
【請求項３７】
前記複数の遺伝子が、GenBank受託番号：配列番号２３、配列番号２２、配列番号３１、配列番号１４、配列番号１１、配列番号２６、配列番号２１、配列番号３０、配列番号２７、配列番号８、配列番号２、配列番号９、配列番号１、配列番号２９、配列番号１７、配列番号２０、配列番号６、配列番号１８、配列番号２４、配列番号１０、配列番号１３、配列番号３２、配列番号２８、配列番号５、配列番号１６、配列番号２５、配列番号１５、配列番号７、配列番号４、配列番号３、配列番号１２、および配列番号１９からなる群から選択される遺伝子を含む、請求項３５に記載の診断ツール。
【請求項３８】
前記複数の遺伝子が、配列番号２２、配列番号３１、配列番号１１、配列番号９、配列番号１、配列番号２９、配列番号２８、配列番号５、および配列番号２５からなる群から選択された配列である遺伝子を含む、請求項３７に記載の診断ツール。
【請求項３９】
前記複数の遺伝子が、配列番号２３、配列番号２２、配列番号３１、配列番号１４、配列番号１１、配列番号２６、配列番号８、配列番号９、配列番号１、配列番号２９、配列番号２０、配列番号２４、配列番号１０、配列番号３２、配列番号２８、配列番号５、配列番号１６、配列番号２５、配列番号１５、配列番号７、および配列番号３からなる群から選択された配列である遺伝子を含む、請求項３７に記載の診断ツール。
【請求項４０】
前記複数の遺伝子が、配列番号３１、配列番号１４、配列番号１１、配列番号１、配列番号２０、配列番号２４、配列番号２８、および配列番号５からなる群から選択された配列である遺伝子を含む、請求項３７に記載の診断ツール。
【請求項４１】
固体支持体と、その上にディスプレイさせた、患者でｐ５３の変異状態を予測する能力がある遺伝子に対応する核酸プローブとを有する、患者で疾患感受性を予測するための核酸アレイ。
【請求項４２】
少なくとも８の核酸プローブを有する、請求項４１に記載の核酸アレイ。
【請求項４３】
少なくとも３２の核酸プローブを有する、請求項４２に記載の核酸アレイ。
【請求項４４】
少なくとも５００の核酸プローブを有する、請求項４３に記載の核酸アレイ。
【図１】
【図２Ａ−Ｂ】
【図２Ｃ】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２Ａ−Ｂ】
【図２Ｃ】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公表番号】特表２００８−５２１３８３（Ｐ２００８−５２１３８３Ａ）
【公表日】平成２０年６月２６日（２００８．６．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５３５６４８（Ｐ２００７−５３５６４８）
【出願日】平成１７年１０月５日（２００５．１０．５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＳＧ２００５／０００３３８
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０５２２１８
【国際公開日】平成１８年５月１８日（２００６．５．１８）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．フロッピー
【出願人】（５０６２０５１０３）エージェンシー フォー サイエンス，テクノロジー アンド リサーチ (26)
【氏名又は名称原語表記】ＡＧＥＮＣＹ ＦＯＲ ＳＣＩＥＮＣＥ，ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＡＮＤ ＲＥＳＥＡＲＣＨ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年６月２６日（２００８．６．２６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１０月５日（２００５．１０．５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＳＧ２００５／０００３３８
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０５２２１８
【国際公開日】平成１８年５月１８日（２００６．５．１８）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．フロッピー
【出願人】（５０６２０５１０３）エージェンシー フォー サイエンス，テクノロジー アンド リサーチ (26)
【氏名又は名称原語表記】ＡＧＥＮＣＹ ＦＯＲ ＳＣＩＥＮＣＥ，ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＡＮＤ ＲＥＳＥＡＲＣＨ
【Ｆターム（参考）】
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