ｓｈＲＮＡ発現ライブラリーの製造方法
【課題】ランダムな塩基配列を有するｓｈＲＮＡを発現するライブラリーの製造方法を提供すること。
【解決手段】５’末端から３’末端の方向に、第一の制限酵素による認識配列および切断部位を含む第一の領域、６塩基以上のランダムな配列からなる第二の領域、および５’側領域と３’側領域の塩基配列は相補的であって、第一の制限酵素と異なる第二の制限酵素による認識配列および切断部位を含む第三の領域を含む一本鎖ポリヌクレオチドをセルフアニーリングさせ、前記第三の領域の３’末端から相補的なポリヌクレオチドを合成し、第一の制限酵素を用いて切断処理し、５’末端を脱リン酸化処理し、３’末端にリンカーＤＮＡを結合させ、リンカーＤＮＡ領域に結合するプライマーを用いて相補的なポリヌクレオチドを合成し、発現ベクターに挿入する。
【解決手段】５’末端から３’末端の方向に、第一の制限酵素による認識配列および切断部位を含む第一の領域、６塩基以上のランダムな配列からなる第二の領域、および５’側領域と３’側領域の塩基配列は相補的であって、第一の制限酵素と異なる第二の制限酵素による認識配列および切断部位を含む第三の領域を含む一本鎖ポリヌクレオチドをセルフアニーリングさせ、前記第三の領域の３’末端から相補的なポリヌクレオチドを合成し、第一の制限酵素を用いて切断処理し、５’末端を脱リン酸化処理し、３’末端にリンカーＤＮＡを結合させ、リンカーＤＮＡ領域に結合するプライマーを用いて相補的なポリヌクレオチドを合成し、発現ベクターに挿入する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ｓｈＲＮＡ発現ライブラリーの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＲＮＡ干渉（例えば、非特許文献１参照）のためのｓｈＲＮＡ（短鎖ヘアピンＲＮＡ）は、二本鎖であるｓｉＲＮＡのいずれか一方の末端にループを有する一本鎖ＲＮＡであり、細胞内にｓｈＲＮＡをコードするＤＮＡを導入して発現させることができるので、ｓｉＲＮＡを導入するよりも長期的、安定的に細胞における遺伝子発現を抑制することができる（例えば、非特許文献２参照）。
【０００３】
ここで、ランダムに遺伝子を抑制するｓｈＲＮＡライブラリーを用い、その抑制により生じる細胞の表現型の変化を検証することによって、抑制されている遺伝子と表現型を対応づけることができれば、その遺伝子の細胞における機能を見出すことが可能になる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Fire A. et al., Nature 391, 806-811, 1998
【非特許文献１】Sandy P. et al., BioTechniques 39, 215-224, 2005
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
そこで、本発明は、ランダムなヌクレオチド配列を有するｓｈＲＮＡを発現するライブラリーの製造方法を提供することを目的としてなされた。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明に係る一本鎖ポリヌクレオチドは、５’末端から３’末端の方向に、第一の領域、第二の領域、および第三の領域を含む一本鎖ポリヌクレオチドであって、前記第一の領域は、該第一の領域が相補鎖を有する場合に第一の制限酵素により認識される塩基配列、および第一の制限酵素による切断部位を含み、第二の領域は、６塩基以上から成り、前記第三の領域の５’側領域と３’側領域の塩基配列は相補的であって、第一の制限酵素は３’突出を形成する制限酵素であることを特徴とする。
【０００７】
本発明に係るＤＮＡライブラリーの製造方法は、第二の領域がランダムな塩基配列を有する、本発明に係る一本鎖ポリヌクレオチドの集団を用いることを特徴とする。本方法は、（１）セルフアニーリングした前記第三の領域の３’末端から、前記第二の領域および前記第一の領域に相補的なポリヌクレオチドを合成し、ヘアピン状ポリヌクレオチドを作製する工程と、（２）前記工程（１）で得られた前記ヘアピン状ポリヌクレオチドを第一の制限酵素を用いて切断処理する工程と、（３）前記工程（２）で得られた、前記第二の領域および前記第三の領域を含む産物の５’末端を、脱リン酸化処理する工程と、（４）前記工程（３）の産物の３’末端に、二本鎖リンカーＤＮＡを構成するいずれか一方のリンカーＤＮＡ鎖の５’末端を結合させる工程と、（５）前記工程（４）で得られた二重鎖ＤＮＡを、前記第二の領域、前記第三の領域、および一本鎖リンカーＤＮＡ領域を含む一本鎖ポリヌクレオチドと、前記二本鎖リンカーＤＮＡのもう一方のＤＮＡ鎖に解離する工程と、（６）前記工程（５）で得られた前記一本鎖ポリヌクレオチドを構成する一本鎖リンカーＤＮＡ領域の少なくとも一部にプライミングするポリヌクレオチドをプライマーとして、当該一本鎖ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドを合成する工程と、を含むことを特徴とする。
【０００８】
ここで、本発明に係るＤＮＡライブラリーの製造方法において、第一の制限酵素はＫｐｎＩであることが好ましく、第一の領域の塩基配列が、5'-TCTTGGTACC-3'（配列番号１）であることがさらに好ましい。
【０００９】
また、工程（６）における、相補的ポリヌクレオチドの合成のための反応温度が、７５℃以上であることが好ましく、９８℃、８５℃、および７５℃の各温度に連続して設定されていてもよい。
【００１０】
第二の領域におけるランダムな塩基配列が、１６〜３０塩基から構成されていてもよい。
【００１１】
第三の領域は、前記５’ 側領域と、前記３’ 側領域とがセルフアニーリングしている場合に、第二の制限酵素によって認識される塩基配列、および第二の制限酵素による切断部位を含み、前記第一の制限酵素と第二の制限酵素は互いに異なる制限酵素であることが好ましい。
【００１２】
第二の制限酵素がＨｉｎｄＩＩＩであることが好ましく、第三の領域の塩基配列が、5'-AAGCTTCACTGANNNNNNNNNTCAGTGAAGCTT-3'（配列番号２）であることがさらに好ましい。
【００１３】
工程（４）に記載の二本鎖リンカーＤＮＡは、第三の制限酵素により認識される塩基配列を含み、工程（６）のプライマーは、前記一本鎖リンカーＤＮＡ領域と、該プライマーを用いて合成した該一本鎖リンカーＤＮＡ領域に相補的なポリヌクレオチド領域とを含む二重鎖ポリヌクレオチド領域が、第三の制限酵素によって認識される塩基配列を含むように設計されていてもよい。
【００１４】
第三の制限酵素がＭｌｙＩであることが好ましく、二本鎖リンカーＤＮＡが、
5'-TTCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAGAGTCGTAC-3'（配列番号３）
3'- AGGTCCCAAAAGGGTCAGTGCTGCAACATCTCAG -5'（配列番号４）であることがさらに好ましい。
【００１５】
本発明に係るｓｈＲＮＡ発現ライブラリーの製造方法は、上記工程（１）〜（６）を含み、さらに、（７）工程（６）で得られた、前記一本鎖ポリヌクレオチドと、当該一本鎖ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドから構成される二重鎖ＤＮＡに対し、第二の制限酵素を用いて、該二重鎖ＤＮＡにおける第二の制限酵素による切断部位に挟まれた領域を除去する工程と、（８）前記（７）で得られた二重鎖ＤＮＡを、該ＤＮＡを転写することのできる発現ベクターに挿入する工程と、を含むことを特徴とする。
【００１６】
本発明に係る別のｓｈＲＮＡ発現ライブラリーの製造方法は、上記工程（１）〜（６）を含み、さらに、（７）工程（６）で得られた、前記一本鎖ポリヌクレオチドと、当該一本鎖ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドから構成される二重鎖ＤＮＡをベクターに挿入する工程と、（８）前記工程（７）でベクターに挿入された二重鎖ＤＮＡ領域に対し、第二の制限酵素を用いて、該二重鎖ＤＮＡにおける第二の制限酵素による切断部位に挟まれた領域を除去する工程と、を含むことを特徴とする。
【００１７】
ここで、本発明に係るｓｈＲＮＡ発現ライブラリーの製造方法において、ベクターが、ウイルスベクターであることが好ましく、レンチウイルスベクターであることがさらに好ましい。
【００１８】
本発明に係る遺伝子のスクリーニング方法は、本発明に係るｓｈＲＮＡ発現ライブラリーを用いた方法であって、ｓｈＲＮＡ発現ライブラリーが導入された第１の細胞集団と、前記ｓｈＲＮＡ発現ライブラリーが導入されていない第２の細胞集団との間の表現型の差異を検出し、前記差異の原因である、ｓｈＲＮＡを同定することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によって、ランダムな塩基配列を有するｓｈＲＮＡを発現するライブラリーの製造方法を提供することが可能となった。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】本発明の一実施形態における、ＤＮＡライブラリーの製造工程、およびｓｈＲＮＡ発現ライブラリーの製造工程を示した図である。
【図２】本発明の一実施形態における、ＤＮＡライブラリーの製造工程を示した図である。
【図３】本発明の一実施形態における、ｓｈＲＮＡ発現ライブラリーの製造工程を示した図である。
【図４】本発明の一実施形態におけるＤＮＡライブラリーの製造工程において、配列番号７の塩基配列を有するヘアピン状ポリヌクレオチドをＫｐｎＩで切断することにより得られたＤＮＡを示す電気泳動図（Ａ、矢印）；Ａの矢印で示されるバンドに含まれるＤＮＡに二本鎖リンカーＤＮＡをライゲーション、ＢｓｉＷＩ切断して得られた、ＤＮＡを示す電気泳動図（Ｂ、矢印）；配列番号８の塩基配列を有するヘアピン状ポリヌクレオチドをＢｇｌＩＩで切断することにより得られたＤＮＡを示す電気泳動図（Ｃ、矢印）；Ｃで示される、ＢｇｌＩＩ切断したヘアピン状ポリヌクレオチドに二本鎖リンカーＤＮＡをライゲーションして得られたＤＮＡを示す電気泳動図（Ｄ：矢印は、得られるべきＤＮＡを示す）である。
【図５】本発明の一実施形態において、Ｔａｑポリメラーゼあるいはｐｙｒｏｂｅｓｔを用いてポリヌクレオチド鎖の合成を行った場合に得られた二重鎖ＤＮＡを示す電気泳動写真である。
【図６】本発明の一実施形態において製造したｓｈＲＮＡ発現ライブラリーにおいて、抽出して検定したＤＮＡの塩基番号と塩基の種類を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
以下、上記知見に基づき完成した本発明の実施の形態を、実施例を挙げながら詳細に説明する。
【００２２】
実施の形態及び実施例に特に説明がない場合には、J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2001); F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J.G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd.等の標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれを修飾したり、改変した方法を用いる。また、市販の試薬キットや測定装置を用いる場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコールを用いる。
【００２３】
なお、本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的な実施例等は、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図ならびに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々に修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
【００２４】
本明細書において「ポリヌクレオチド」は、ポリヌクレオチド鎖、およびポリヌクレオチド鎖を構成する一部の領域のいずれも指すものとする。
【００２５】
また、本明細書において、「制限酵素による切断部位」とは、その制限酵素を用いた切断処理によって分断される、互いに隣接する塩基と塩基の間を指す。そして、領域、ポリヌクレオチド鎖、あるいはＤＮＡ鎖が「制限酵素により切断される部位を含む」とは、領域、ポリヌクレオチド鎖、あるいはＤＮＡ鎖の内部に上記「制限酵素による切断部位」を含むこと、および、領域、ポリヌクレオチド鎖、あるいはＤＮＡ鎖の末端に上記「制限酵素による切断部位」を含むこと、のどちらであってもよい。
【００２６】
＝＝一本鎖ポリヌクレオチド＝＝
本発明に係る一本鎖ポリヌクレオチドは、５’末端から３’末端の方向に、第一の領域、第二の領域、および第三の領域を含む一本鎖ポリヌクレオチドである。この一本鎖ポリヌクレオチドは、以下に説明するような配列を有する範囲内でその取得方法によって制限されず、例えば、固相ホスホラミイダイトトリエステル法（Beaucage and Caruthres, Tetrahedron Letts., 22(20): 1859-1862, 1981）や自動合成機（Needham-VanDavanter et al., Neucleic Acids Res., 12: 6159-6168, 2984）により合成することができる。また、当業者に周知の市販供給元に外注して製造することもできる。
【００２７】
第一の領域の塩基配列は、この第一の領域がその相補鎖を有する場合に、第一の制限酵素によって認識される塩基配列を含む。なお、第一の制限酵素によって切断される部位は第一の領域と第二の領域の間に挟まれる領域に含まれていてもよく、または、第三の領域側の末端以外であれば、第二の領域に含まれていてもよい。第一の領域を構成する塩基配列数は制限されないが、４塩基以上であることが好ましく、４〜２０００塩基であることがより好ましく、４〜３０塩基であることが最も好ましい。第一の制限酵素は、Ｉ型制限酵素、ＩＩ型制限酵素、ＩＩＩ型制限酵素のいずれであってもよい。第一の制限酵素によって認識される塩基配列は、回文配列であっても、あるいは非対称配列であっても制限されない。また、制限酵素の切断型も特に制限されず、ＳａｃＩ、ＳａｌＩ、ＸｈｏＩ、ＫｐｎＩ等の３’突出型であっても、ＥｃｏＲＩ、ＡｃｉＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ等の５’突出型であっても、あるいはＨｐａＩ、ＡｃｃＩＩ、ＡｆａＩ等の平滑末端型であってもよいが、３’突出型であることが好ましく、ＫｐｎＩであることが特に好ましい。第一の領域の塩基配列として、例えば、以下の塩基配列を使用することができる。
5'-TCTTGGTACC-3'（配列番号１）
【００２８】
第二の領域は、この領域を構成する塩基数によって制限されないが、６塩基以上であることが好ましく、１０〜５００塩基であることがより好ましく、１６〜３０塩基であることがさらに好ましい。
【００２９】
第三の領域は、この領域を構成する塩基数によって制限されないが、１０塩基以上であることが好ましく、２０塩基〜６０塩基であることがより好ましい。第三の領域は、その領域内の５’側領域と３’側領域とが相補的な塩基配列を有している。この５’側領域と３’側領域における相補的なポリヌクレオチド領域は、互いにアニーリングした場合に第二の制限酵素によって認識される塩基配列、および第二の制限酵素による切断部位を含んでいてもよい。なお、第二の制限酵素による切断部位は、第二の領域と第三の領域の間に挟まれる領域に含まれていてもよく、あるいは、第一の領域側の末端以外であれば、第二の領域に含まれていてもよい。第二の制限酵素は、第一の制限酵素とは異なる制限酵素であれば制限されず、Ｉ型制限酵素、ＩＩ型制限酵素、ＩＩＩ型制限酵素のいずれであってもよい。第二の制限酵素によって認識される塩基配列は、回文配列であっても、あるいは非対称配列であっても制限されない。また、制限酵素の切断型も特に制限されず、ＳａｃＩ、ＳａｌＩ、ＸｈｏＩ、ＫｐｎＩ等の３’突出型であっても、ＥｃｏＲＩ、ＡｃｉＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ等の５’突出型であっても、あるいはＨｐａＩ、ＡｃｃＩＩ、ＡｆａＩ等の平滑末端型であってもよいが、第二の制限酵素はＨｉｎｄＩＩＩであることが好ましい。このような第三の領域の塩基配列として、例えば、ＨｉｎｄＩＩＩによって認識される塩基配列および切断部位を含む、
5'-AAGCTTCACTGANNNNNNNNNTCAGTGAAGCTT-3'（配列番号２）
が例示できる。
【００３０】
＝＝ＤＮＡライブラリーの製造方法＝＝
上述したような、第一の領域、第二の領域、および第三の領域を含む一本鎖ポリヌクレオチドを用い、ｓｈＲＮＡを発現させるためのＤＮＡを製造することができる。特に、第二の領域がランダムな塩基配列を有する一本鎖ポリヌクレオチドの集団を用いることによって、ランダムなｓｈＲＮＡを細胞内で発現させるためのＤＮＡライブラリーを製造することができる。第二の領域のランダムな塩基配列の種類が多い場合に、より優れたＤＮＡライブラリーを製造することができる。なお、ＤＮＡライブラリーとは、少なくとも２種類以上の異なる塩基配列を有するＤＮＡの集団を指す。
【００３１】
以下に説明するＤＮＡライブラリーの製造方法（図１参照）において、加熱、冷却等の工程は、当業者に周知の機器を使用して適宜行うことができる。例えば、サーマルサイクラ−、温度調節器付ウォーターバス、インキュベーター等を使用すればよい。
【００３２】
（工程１）
まず、上述したような、第一の領域、第二の領域、および第三の領域を含む一本鎖ポリヌクレオチドの第三の領域の、５’側領域と３’側領域における相補的なポリヌクレオチド領域をセルフアニーリングさせ、第三の領域の３’側末端から、ＤＮＡポリメラーゼを用いて、第二の領域および第一の領域に相補的なポリヌクレオチドを合成する。これによって、ヘアピン状ポリヌクレオチドが合成される。第三の領域のセルフアニーリング、および、第三の領域の３’側末端からのポリヌクレオチド合成のための反応温度は、第三の領域における５’側領域と３’側領域を構成するポリヌクレオチドの塩基配列を考慮し、当業者が適宜設定することができるが、４〜９９℃であることが好ましく、２５〜８０℃であることがより好ましく、３０〜４５℃であることがさらに好ましい。また、使用するＤＮＡポリメラーゼは、所望のヘアピン状ポリヌクレオチドが合成される範囲で制限されず、例えば、ＤＮＡポリメラーゼＩ、ＤＮＡポリメラーゼＩＩ、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ、ＤＮＡポリメラーゼα、ＤＮＡポリメラーゼβ、ＤＮＡポリメラーゼγ等の周知のＤＮＡポリメラーゼから正確性や反応条件等を考慮して当業者が適宜選択できる。特に入手や取扱いが容易な市販のＤＮＡポリメラーゼＩとしては、ＴａｑポリメラーゼやＫｌｅｎｏｗ断片等が挙げられる。
【００３３】
（工程２）
次に、工程１で得られたヘアピン状ポリヌクレオチドにおいて第一の領域に対応する二重鎖が、その認識塩基配列および切断部位を有する第一の制限酵素を用いて、ヘアピン状ポリヌクレオチドを切断処理する。切断処理の条件は特に限定されないが、第一の制限酵素の至適温度で行えばよく、反応時間は当業者が適宜設定することができる。この切断処理によって、切断された二本鎖からなる第一の領域の一部と、第二の領域と第三の領域を含む一本鎖からなるポリヌクレオチド鎖とが生じる。
【００３４】
（工程３）
続いて、工程２で得られた、第二の領域と第三の領域を含むポリヌクレオチド鎖に対し、５’末端の脱リン酸化処理を行う。脱リン酸化は、例えばＢＡＰ（骨型アルカリフォスファターゼ）やＣＩＡＰ（子ウシ小腸由来アルカリフォスファターゼ）等の市販のアルカリフォスファターゼを用いて行うことができる。反応に使用するアルカリフォスファターゼの量、反応温度、反応時間等は、当業者が適宜決定すればよい。
【００３５】
（工程４）
次に、この５’末端が脱リン酸化されたポリヌクレオチド鎖の３’末端に、二本鎖リンカーＤＮＡを構成するいずれか一方のリンカーＤＮＡ鎖の５’末端を結合させる。この反応では、二本鎖リンカーＤＮＡを構成する他方のリンカーＤＮＡ鎖は、結合しないままである。なお、５’末端が脱リン酸化されたポリヌクレオチド鎖と二本鎖リンカーＤＮＡのモル比、使用するリガーゼの種類、量、バッファー等の反応条件は、当業者が適宜決定すればよい。
本工程の二本鎖リンカーＤＮＡの塩基配列は、特に制限されないが、第一および第二の制限酵素とは異なる第三の制限酵素によって認識される塩基配列を有していることが好ましい。第三の制限酵素によって切断される部位は、二本鎖リンカーＤＮＡの塩基配列に含まれていてもよいが、リンカーＤＮＡが結合したポリヌクレオチド鎖において、リンカーＤＮＡとポリヌクレオチド鎖の間に挟まれる領域、あるいは、第三の領域側の末端でない限り、第二の領域に含まれていてもよい。これにより、二本鎖リンカーＤＮＡ領域を制限酵素で切断できるようになる。第三の制限酵素の種類は、第一および第二の制限酵素と異なっていれば特に限定されないが、ＭｌｙＩであることが特に好ましい。
以上のような二本鎖リンカーＤＮＡとして、ＭｌｙＩによって認識される塩基配列を含む、
5'-TTCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAGAGTCGTAC-3'（配列番号３）
3'- AGGTCCCAAAAGGGTCAGTGCTGCAACATCTCAG -5'（配列番号４）
が例示できる。
また、二本鎖リンカーＤＮＡ領域に、プロモーターや転写開始シグナル、あるいは転写終結シグナルなどの発現に必要なシグナルを含ませてもよい。それによって、本発明の方法で製造されたＤＮＡライブラリーを発現ベクターに挿入して使用する場合、ＤＮＡライブラリーの側から、転写に必要なシグナルを供給することが可能になる。この場合、同時に第三の制限酵素による認識配列及び切断部位を含ませようとすると、第三の制限酵素による切断後もシグナルが残るように、第三の制限酵素の内側にシグナルを配置するのが好ましい。
【００３６】
（工程５）
このようにして得られたポリヌクレオチド鎖は、５’末端から３’末端の方向に、第二の領域、第三の領域、第二の領域に相補的な塩基配列を有する領域、一本鎖リンカーＤＮＡ領域を含むが、一本鎖リンカーＤＮＡ領域は、二本鎖リンカーＤＮＡにおける他方の一本鎖ＤＮＡ領域とアニーリングしたままである。そこで、本工程では、これら２つのＤＮＡを、第二の領域、第三の領域、第二の領域に相補的な塩基配列を有する領域、および一本鎖リンカーＤＮＡ領域を含むポリヌクレオチド鎖と、もう一方の一本鎖リンカーＤＮＡ鎖とに解離する処理を行う。具体的な方法は特に限定されず、アルカリ処理でも加熱処理でもよいが、処理の簡便さから加熱処理が好ましい。加熱温度および時間は、二本鎖リンカーＤＮＡ領域が解離する温度であれば特に制限されない。
【００３７】
（工程６）
次に、第二の領域、第三の領域、第二の領域に相補的な塩基配列を有する領域、および一本鎖リンカーＤＮＡ領域を含むポリヌクレオチド鎖に対し、一本鎖リンカーＤＮＡ領域にアニールするオリゴヌクレオチドをプライマーとして、このポリヌクレオチド鎖に相補的なポリヌクレオチドを合成し、本発明のＤＮＡライブラリーを製造することができる。
本工程では、プライマーが一本鎖リンカーＤＮＡ領域にアニールする一方で、このポリヌクレオチド鎖が高次構造をとらない、例えば、第二の領域と第二の領域に相補的な塩基配列を有する領域、および、第三の領域はアニーリングしない条件下で反応を行う必要がある。従って、一本鎖リンカーＤＮＡ領域と、プライマーとのＴｍ値（Ｔｍ−１）が、第二の領域と第二の領域に相補的な塩基配列を有する領域、および、第三の領域の相補的ポリヌクレオチド領域のＴｍ値（Ｔｍ−２）よりも低くなるように、一本鎖リンカーＤＮＡ領域とプライマーの配列が設計されている必要がある。そして、本工程でのＤＮＡ合成の反応温度を、Ｔｍ−１とＴｍ−２の間に設定すればよい。第二の領域がランダムな塩基配列を有することを考慮すると、反応温度は例えば７５℃以上であることが好ましく、８５℃以上であることがより好ましく、９８℃以上であることがさらに好ましいが、複数の温度で多段階に反応させてもよい。例えば、７５℃、８５℃、９８℃の各温度に連続して温度設定して反応を行ってもよい。また、第二の領域と第二の領域に相補的な塩基配列を有する領域、および、第三の領域の相補的ポリヌクレオチド領域が変性していることを確実にするため、反応前に加熱−急冷等の処理を行うことが好ましい。
ここで使用するＤＮＡポリメラーゼは、本工程の温度条件、合成するヌクレオチド鎖の長さ、正確性等を考慮して当業者が適宜選択することができ、ＤＮＡポリメラーゼＩ、ＤＮＡポリメラーゼＩＩ、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ、ＤＮＡポリメラーゼα、ＤＮＡポリメラーゼβ、ＤＮＡポリメラーゼγ等の周知のＤＮＡポリメラーゼのいずれであってもよいが、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼであることが好ましい。特に、３’から５’側へのエンドヌクレアーゼ活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼであることが好ましく、耐熱性α型ＤＮＡポリメラーゼであることがさらに好ましい。使用するＤＮＡポリメラーゼの反応至適温度は６５℃以上であることが好ましく、７５℃以上であることがより好ましく、８５℃以上であることがさらに好ましい。７５℃以上の高温で安定して反応を行えるＤＮＡポリメラーゼとして、例えばｐｙｒｏｂｅｓｔ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ株式会社）が挙げられる。ｐｙｒｏｂｅｓｔは、Pyrococcus sp. 由来の３’側から５’側へのエンドヌクレアーゼ活性を有する耐熱性α型ＤＮＡポリメラーゼであり、４０〜５０℃付近でのＤＮＡポリメラーゼ活性は２〜９％、反応至適温度は約７５℃である。
なお、リンカーＤＮＡ領域が、第三の制限酵素によって認識される塩基配列、あるいは第三の制限酵素による切断部位を含む塩基配列を有している場合、製造したＤＮＡライブラリーを第三の制限酵素によって切断できるようにするため、合成したＤＮＡがその認識配列および切断部位を含むように、本工程で使用するプライマーの位置を決めることが好ましい。このようなプライマーとして、例えば、
5'-TCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAGAGTCGTACC-3'（配列番号５）の塩基配列を有するプライマーを使用することができ、反応時間や反応時間等の反応条件は当業者が適宜設定することができる。
【００３８】
＝＝ｓｈＲＮＡ発現ライブラリーの製造方法＝＝
以上のように製造したＤＮＡライブラリーをベクターに挿入して、ｓｈＲＮＡ発現ライブラリーを製造することができる。挿入方法は特に限定されないが、ＤＮＡライブラリーが第三の制限酵素の認識配列及び切断部位を有していれば、第三の制限酵素で切断し、同じ酵素で切断したベクターに挿入するのが好ましい。なお、プロモーターや転写開始シグナル、あるいは転写終結シグナルなどの発現に必要なシグナルは、ＤＮＡライブラリー側から供給しても、ベクター側から供給しても構わない。
【００３９】
ＤＮＡライブラリーを挿入するベクターは、ＤＮＡを転写することのできるベクター（発現ベクター）であれば特に制限されず、例えば当業者に周知のウイルスベクターであっても、プラスミドベクターであってもよい。ベクターの選択には、製造するｓｈＲＮＡ発現ライブラリーを使用する対象の細胞等を考慮すればよく、例えば、哺乳類の細胞に対して使用する場合には、レンチウイルスベクターに挿入してもよい。
【００４０】
第一の領域、第二の領域、および第三の領域を含む一本鎖ポリヌクレオチドの第三の領域において、５’側領域と３’側領域における相補的なポリヌクレオチド領域が互いにアニーリングした場合に第二の制限酵素によって認識される塩基配列、および第二の制限酵素による切断部位を含んでいる場合には、ＤＮＡライブラリーを、発現ベクターに挿入する前、あるいは挿入した後に、第二の制限酵素による切断部位に挟まれた領域を除去することができる。ＤＮＡライブラリーを発現ベクターに挿入する前に、第二の制限酵素による切断部位に挟まれた領域を除去する場合、例えば、発現ベクターとは異なる好適なベクターにＤＮＡライブラリーを挿入し、第二の制限酵素によって切断、セルフライゲーションすればよい。このようにして第二の制限酵素による切断部位に挟まれた領域が除去されたＤＮＡライブラリーを、適切な制限酵素によりベクターから切り出した後、発現ベクターに挿入することができる。一方、ＤＮＡライブラリーを発現ベクターに挿入した後に、第二の制限酵素による切断部位に挟まれた領域を除去する場合、ＤＮＡライブラリーを発現ベクターに挿入した後に、第二の制限酵素で切断処理を行い、セルフライゲーションすればよい。
【００４１】
＝＝ｓｈＲＮＡ発現ライブラリーの使用＝＝
以上のように製造したｓｈＲＮＡ発現ライブラリーは、特定の機能を有する遺伝子のスクリーニングに使用することができる。
例えば、ｓｈＲＮＡ発現ライブラリーが導入された第１の細胞集団と、ｓｈＲＮＡが導入されていない第２の細胞集団との間の表現型の差異を検出する。そして、その差を有する細胞を同定し、ｓｈＲＮＡを回収することにより、その表現型の差異を生じさせているｓｈＲＮＡを同定できる。このｓｈＲＮＡにより発現が抑制されている遺伝子を特定することにより、ある機能に結びついた遺伝子を発見することができる。
ここで、表現型の差異とは、例えば形態学的差異や生化学的差異のことである。形態学的差異は、第一の細胞集団と、第二の細胞集団とを肉眼、あるいは顕微鏡等を用いて観察することによって調べることができる。生化学的差異は、例えば、第一の細胞集団と、第二の細胞集団とにおけるタンパク質の発現パターンや酵素活性の差異等を、当業者に周知の手法を用いて検出することによって調べることができる。
このようなスクリーニングの具体例として、例えば腫瘍細胞に対してこのスクリーニングを行い、特定の遺伝子の発現の抑制が腫瘍細胞の増殖を抑制した場合には、その腫瘍細胞の増殖に関わる遺伝子を特定することができ、さらに、その遺伝子発現を抑制するｓｉＲＮＡを抗腫瘍剤として使用することもできる。
【実施例】
【００４２】
本実施例では、以下に説明するようにＤＮＡライブラリーおよびｓｈＲＮＡ発現ライブラリーを調製した（図２、３参照）。
【００４３】
＝＝ＤＮＡライブラリーの調製＝＝
まず、５’末端から３’末端の方向に、TCTTGGTACC（配列番号１）、ランダムな１９塩基、AAGCTTCACTGATCCTTCGCTTCAGTGAAGCTT（配列番号６）の塩基配列を有する一本鎖ポリヌクレオチド集団を化学合成した。この１μＭ 一本鎖ポリヌクレオチド１ｍｌ、１Ｍ ＭｇＣｌ２ １０μｌ、１０ｍＭ ｄＮＴＰｓ １０μｌ、およびＫｌｅｎｏｗ断片 １０μｌ（２ユニット／μｌ、タカラバイオ株式会社）を混合し、３７℃で２時間インキュベートした。得られた産物をアクリルアミドゲルによる電気泳動により確認した。得られた産物をＭＥＲｍａｉｄ ＳＰＩＮ Ｋｉｔ（Qbiogene 社）の３カラムを用い、計３００μｌの溶出バッファーにＤＮＡを溶出させ、回収した。本工程では、
5'-TCTTGGTACC-(N)19-AAGCTTCACTGATCCTTCGCTTCAGTGAAGCTT-(N)19-GGTACCAAGA-3'（配列番号７）の塩基配列を有するヘアピン状ポリヌクレオチドが得られる（図２参照）。
【００４４】
次に、上記ヘアピン状ポリヌクレオチド ３００μｌ、純水 ５２５μｌ、１０×ＮＥＢバッファー１ （New England Biolabs 社）１００μｌ、ＫｐｎＩ（１０ユニット／μｌ） ７５μｌを混合し、３７℃で一晩インキュベートした。この反応溶液にさらに２５μｌのＫｐｎＩを加え、３７℃で２時間インキュベートした後、試料をアクリルアミドゲルによる電気泳動により確認した（図４Ａ）。末端が切断されたヘアピン状ポリヌクレオチドをＭＥＲｍａｉｄ ＳＰＩＮ Ｋｉｔ（Qbiogene 社）の３カラムを用いて精製し、計２２５μｌの溶出バッファーにＤＮＡを溶出させ、回収した。この溶出試料２２５μｌ、１Ｍ Ｔｒｉｓバッファー（ｐＨ８．５） ２５０μｌ、１０×ＣＩＡＰバッファー １００μｌ、ＣＩＡＰ（１０ユニット／μｌ） ３０μｌに純水を加えて１ｍｌの反応溶液を調製し、５０℃で１時間インキュベートした。この反応試料を２分割し、それぞれエタノール沈殿法によってＤＮＡの沈殿を得た。このＤＮＡの沈殿を、０．７ｍｌのＴ１０バッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ８．０））に溶解した後、ＭＥＲｍａｉｄ ＳＰＩＮ Ｋｉｔ（Qbiogene 社）の２カラムを用い、計２００μｌの溶出バッファーにＤＮＡを溶出させた。
【００４５】
続いて、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ２．１（タカラバイオ株式会社）を用い、下記二本鎖リンカーＤＮＡ（配列番号４のポリヌクレオチド鎖の５’末端をリン酸化処理した後、配列番号３のポリヌクレオチド鎖とアニーリングしたもの、２０μＭ）１９０μｌ、Ｉ液７６０μｌ、ＩＩ液３８０μｌを混合し、１６℃で一晩インキュベートすることにより、リンカーＤＮＡのヘアピン状ポリヌクレオチドへのライゲーション反応を行った。次に、エタノール沈殿法によりＤＮＡを沈殿させ、５００μｌのＴ１０バッファーに溶解した。
二本鎖リンカーＤＮＡ：
5'-TTCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAGAGTCGTAC-3'（配列番号３）
3'- AGGTCCCAAAAGGGTCAGTGCTGCAACATCTCAG -5'（配列番号４）
【００４６】
このようにして得られたＤＮＡ試料 ５００μｌ、１０×ＮＥＢバッファー３ （New England Biolabs 社）６０μｌ、ＢｓｉＷＩ（１０ユニット／μｌ） ４０μｌを混合し、５５℃で一晩インキュベートした。この処理により、二本鎖リンカーＤＮＡが複数結合してできた反応副産物が切断される。このＤＮＡ試料を、アクリルアミドゲルで電気泳動し（図４Ｂ、矢印）、第二の領域、第三の領域、および一本鎖リンカーＤＮＡ領域を含む一本鎖ポリヌクレオチドに対応するバンドを含むゲルを切り出した後、ｃｒｕｓｈ ａｎｄ ｓｏａｋ法（BioTechniques 18, 33-35）によってＤＮＡをゲルから回収し、さらにエタノール沈殿法によってＤＮＡを沈殿させた。このＤＮＡをＴ１０バッファーに溶解した。
【００４７】
このＤＮＡ溶液を、数分間煮沸した後、氷上で冷却した。この変性処理により、二本鎖リンカーＤＮＡのうち、ヘアピン状ポリヌクレオチドに共有結合していないＤＮＡ鎖が解離し、また、第二の領域、第三の領域、および一本鎖リンカーＤＮＡ領域を含む一本鎖ポリヌクレオチドにおけるヘアピン状構造が解離する。
【００４８】
ここで、本方法「ＤＮＡライブラリーの調製」における上記一連の工程に関し、配列番号７の塩基配列を有するヘアピン状ポリヌクレオチドの代わりに、TATAGATCT-(N)19-ATTAATCACTGATCCTTCGCTTCAGTGATTAAT-(N)19-AGATCTATA（配列番号８）の塩基配列を有する等量のヘアピン状ポリヌクレオチドを用い、ＫｐｎＩに代わって、ＢｇｌＩＩ（１０００ユニット）を用い、ＫｐｎＩの場合と同条件でインキュベートした場合、ヘアピン状ポリヌクレオチドの切断は不完全であった（図４Ｃ）。その後、ＫｐｎＩの場合と同様に処理し、二本鎖リンカーＤＮＡを結合したところ、ヘアピン状ポリヌクレオチドに二本鎖リンカーＤＮＡが結合した目的の産物以外に、目的としない副産物が同時に得られた（図４Ｄ）。従って、ＫｐｎＩの方が、ＢｇｌＩＩより、ここでの処理に適しているため、以下の工程には、ＫｐｎＩで処理することによって得られたＤＮＡを用いた。
【００４９】
加熱変性させた一重鎖ＤＮＡおよび１０μｌに対し、１００μＭプライマー（配列番号５）２μｌ、ｄＮＴＰｓ（２．５ｍＭ）４μｌ、純水２８μｌ、ｐｙｒｏｂｅｓｔ（５ユニット／μｌ、タカラバイオ株式会社）あるいはｒＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（ｒＴａｑ、５ユニット／μｌ、東洋紡ライフサイエンス社）１μｌ、１０×ＰＣＲ用バッファー ５μｌを含む５０μｌのサンプルを混合し、９８℃で５分、８５℃で５分、さらに７５℃で５分インキュベートし、二重鎖ＤＮＡを合成した。なお、９８℃から８５℃、８５℃から７５℃の間は、１秒当たり０．１℃で温度を下降させた。この反応を、計４７チューブ分繰り返し、反応溶液をアクリルアミドゲルによる電気泳動に供し、合成された二重鎖ＤＮＡに対応するバンドを含むゲルを切り出した後、ｃｒｕｓｈ ａｎｄ ｓｏａｋ法（BioTechniques 18, 33-35）によってＤＮＡをゲルから回収し、さらにエタノール沈殿法によってＤＮＡを沈殿させた。このＤＮＡを２００μｌのＴ１０バッファーに溶解した。
【００５０】
なお、ここで、ｒＴａｑを用いて伸長反応を行った場合には、十分な二重鎖ＤＮＡを得ることができなかった（図５）。従って、以下のｓｈＲＮＡ発現ライブラリー調製の工程はｐｙｒｏｂｅｓｔを用いて得られた二重鎖ＤＮＡを用いて行った。
【００５１】
＝＝ｓｈＲＮＡ発現ライブラリーの調製方法＝＝
得られた二重鎖ＤＮＡ２００μｌ当たり、ＭｌｙＩ（１０ユニット／μｌ、New England Biolabs 社）４０μｌ、１０×ＮＥＢバッファー４（New England Biolabs 社） ９０μｌ、純水 ５７０μｌを加えて混合し、３７℃で一晩インキュベートした。この反応溶液を、アクリルアミドゲルによる電気泳動に供し、リンカーＤＮＡが除去された二重鎖ＤＮＡに対応するバンドを含むゲルからｃｒｕｓｈ ａｎｄ ｓｏａｋ法（BioTechniques 18, 33-35）によってＤＮＡを回収した。さらにエタノール沈殿法によってＤＮＡを沈殿させ、沈殿したＤＮＡを４００μｌのＴ１０バッファーに溶解した。この工程により、リンカーＤＮＡが除去された二重鎖ＤＮＡの集合体が得られる。得られた４００μｌのＤＮＡ試料に対し、Ｔａｋａｒａ ＢＫＬ ｋｉｔ（タカラバイオ株式会社）の１０×バッファー、Ｂｌｕｎｔｉｎｇ ｋｉｎａｔｉｏｎ Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｘ ２０μｌを混合し、３７℃で１０分間インキュベートした。反応後、反応溶液についてフェノール精製、クロロホルム精製を行った後、ＤＮＡをエタノール沈殿法によって沈殿させた。得られたＤＮＡの沈殿を５００μｌのＴ１０バッファーに溶解させた。これにより、リンカーＤＮＡが除去された二重鎖ＤＮＡの集合体に含まれるＤＮＡの両末端が平滑化され、５’末端がリン酸化された。
【００５２】
終結シグナルが挿入されたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ−ベクター（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ−ベクターのＢａｍＨＩ、ＳａｌＩ制限酵素部位に、終結シグナルを含むＤＮＡ（配列番号９、１０）を挿入して作成）２００ μｇ、Ｎｓｉ Ｉ（New England Biolabs 社）１０００ユニット、１０×ＮＥＢバッファー３（New England Biolabs 社）２００μｌ、純水を混合して反応液２ｍｌを調製し、３７℃で３時間反応させた。その後、６５℃で２０分熱処理し、エタノール沈殿法によりＤＮＡを精製した。このＤＮＡ全量、ＳｍａＩ（New England Biolabs 社）１２００ユニット、１０×ＮＥＢバッファー４（New England Biolabs 社）、純水を混合し、反応液２ｍｌを２５℃で一晩インキュベートし、エタノール沈殿法によりＤＮＡを精製した。その後、Ｔａｋａｒａ ｂｌｕｎｔｉｎｇ ｋｉｔ（タカラバイオ株式会社）を用い、上記のように制限酵素によって切断されたベクターの末端を平滑化し、ＱＩＡＧＥＮ Ｑｉａｑｕｉｃｋ ｇｅｌ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Qiagen 社）で精製した後、１０×ＣＩＡＰバッファー、および、ＣＩＡＰ（１０ユニット／μｌ）に純水を加えて反応溶液を調製し、５０℃で１時間インキュベートしてベクター末端の脱リン酸化処理を行った。その後、ベクターをアガロースゲル電気泳動後に供し、ＤＮＡを含むバンドを切り出し、ＱＩＡＧＥＮ Ｑｉａｑｕｉｃｋ ｇｅｌ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔで精製し、直鎖化終結シグナル挿入ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ−ベクターを得た。
終結シグナルを含むＤＮＡ：
5'-GATCCCCGGGCTTATGCATTTTTGGAAAAG -3'（配列番号９）
3'- GGGCCCGAATACGTAAAAACCTTTTCAGCT-5'（配列番号１０）
【００５３】
次に、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ２．１（タカラバイオ株式会社）を用い、リンカーＤＮＡが除去された二重鎖ＤＮＡの集合体１５０μｌ、直鎖化終結シグナル挿入ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ−ベクター１２０μｌ（２００ｎｇ/μｌ）、Ｉ液３．５ｍｌを純水で７ｍｌに調製した混合液を１６℃で一晩インキュベートした。反応液を、ＱＩＡＧＥＮ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Qiagen 社）の２２カラムを用いて、二重鎖ＤＮＡの集合体が挿入されたベクターに対応するバンドを含むゲルからＤＮＡを回収し、計３ｍｌのＤＮＡ溶液を得た。
【００５４】
以上のように得られた、組み換えＤＮＡを有するｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクターのＤＮＡ試料１．０５ｍｌに対し、ＨｉｎｄＩＩＩ（１００ユニット／μｌ）３０μｌ １０×ＮＥＢバッファー２（New England Biolabs 社） １２０μｌを混合し、３７℃で４時間インキュベートした。反応液をＱＩＡＧＥＮ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔの１６カラムを用いて精製し、計１．６ｍｌのＤＮＡ溶液を得た。得られたＤＮＡは、二重鎖ＤＮＡの集合体からＨｉｎｄＩＩＩによる切断部位に挟まれる領域が除去されたベクターである。このＤＮＡ試料１．５ｍｌに対し、１０×バッファー７．５ｍｌ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ７５０μｌ、純水６５ｍｌを加え、１６℃で一晩インキュベートした。反応液を、ＱＩＡＧＥＮ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔの１６カラムを用いて、環状化したプラスミドＤＮＡを精製し、計２．４ｍｌのＤＮＡ−Ｔ１０溶液を得た。以上のＨｉｎｄＩＩＩ処理およびライゲーション処理により、組み換えＤＮＡを有するｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクターにおいて、組み換えＤＮＡ領域のＨｉｎｄＩＩＩ切断部位に挟まれる領域が除去された。
【００５５】
１チューブ当たり、以上のように得られた組み換えｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター試料３μｌ、ＳＴＢＬ４コンピテントセル（インビトロジェン株式会社）２５μｌを混合し、形質転換を行った。同様に１００チューブで形質転換を行い、全ての形質転換体をプールし、ここにＬＢ培地を加えて液量を１００ｍｌとした。この液に含まれる独立コロニー数は、７．１×１０８であった。
【００５６】
ＱＩＡＧＥＮ ｐｌａｓｍｉｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Qiagen 社）で精製したＤＮＡ２００μｌ（１ｍｇ）、ＢａｍＨＩ（New England Biolabs 社） １０００ユニット、ＳａｌＩ（New England Biolabs 社） １０００ユニット、１０×ＮＥＢバッファー２（New England Biolabs 社） １００μｌ、純水８００μｌを混合し、３７℃で６時間インキュベートした。反応液をアガロースゲルによる電気泳動に供し、バンドを含むゲルからＤＮＡを精製し、計１ｍｌのＤＮＡ溶液を得た。
【００５７】
レンチウイルスベクター（ＦＩＶベースのベクターに、Ｈ１ ｐｒｏｍｏｔｅｒとＢｌａｓｔｉｃｉｄｉｎ耐性遺伝子をクローニングしたベクター）を、ＢａｍＨＩ（New England Biolabs 社） ３０００ユニットで３７℃、２時間処理し、アガロースゲル電気泳動後、バンドを切り出し、ＱＩＡＧＥＮ Ｑｉａｑｕｉｃｋ ｇｅｌ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔで精製した。引き続きＳａｌＩ（New England Biolabs 社） ３０００ユニット、１０×ＮＥＢバッファー２（New England Biolabs 社） １００μｌ、純水８００μｌを混合し、３７℃で６時間インキュベートした。反応液をアガロースゲルによる電気泳動に供し、ＱＩＡＧＥＮ ｐｌａｓｍｉｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔを用いてバンドを含むゲルからＤＮＡを精製し、計３．３ｍｌの直鎖化レンチウイルスベクターを得た。
【００５８】
ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ２．１（タカラバイオ株式会社）を用い、以上のようにして得られたＤＮＡ溶液１ｍｌおよび直鎖化レンチウイルスベクター５００μｇ、Ｉ液 ３．７５ｍｌを混合し、純水で全反応液量を７．５ｍｌに調製し、１６℃で一晩インキュベートした。この工程により、レンチウイルスベクターに、ランダムＤＮＡ配列が挿入される。反応液を、ＱＩＡＧＥＮ ｇｅｌ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Qiagen 社）で精製し、２ｍｌのｓｈＲＮＡ発現ライブラリーを得た。
【００５９】
＝＝ｓｈＲＮＡ発現ベクターの検定＝＝
上記のように得られたｓｈＲＮＡ発現ライブラリー溶液６．３μｌ、ＳＴＢＬ４コンピテントセル（インビトロジェン株式会社）３３μｌをチューブに混合し、形質転換を行った。１２０チューブの反応を同様にして行い、全チューブの反応液をプールした。ここに、ＬＢ培地を加え、全反応液量を１４０ｍｌとした。全反応液中に含まれる独立コロニー数は１．４×１０８であった。アンピシリン含有ＬＢ培地で培養したコロニーから８４コロニーをランダムに選択してＤＮＡを精製し、塩基配列を決定した。
【００６０】
上記８４クローンのうち、異常な配列を持つ２クローンを除いた８２クローンの塩基配列をＦＡＳＴＡで解析した。表１に示す様に、８２クローンの全てにおいて、１６塩基以上（連続していないものも含む）が既知のヒト遺伝子と一致した。また、Ｇが３つ以上、Ｃが４つ以上、ＧまたはＣが５つ以上、Ｔが４つ以上、Ａが４つ以上連続していないというｓｈＲＮＡの設計のルールに当てはまるクローンは、全体の４５％であった。さらに、図６に示す様に、１〜１９番目までの塩基において塩基の種類に偏りが見られず、ランダムな配列であった。従って、構築したｓｈＲＮＡ発現ライブラリーは、遺伝子スクリーニングに十分使用できるものである。
【表１】
【００６１】
＝＝レンチウイルスライブラリー＝＝
上記のように得られたｓｈＲＮＡ発現ライブラリー１．２ ｍｇを、パッケージングプラスミド（ＳＢＩ社）３．６ ｍｇと共に２９３Ｔ細胞に導入した。培養上清８Ｌを回収し、これをレンチウイルスライブラリーとした。このレンチウイルスライブラリーのタイターは、１．３×１０９であった。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ｓｈＲＮＡ発現ライブラリーの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＲＮＡ干渉（例えば、非特許文献１参照）のためのｓｈＲＮＡ（短鎖ヘアピンＲＮＡ）は、二本鎖であるｓｉＲＮＡのいずれか一方の末端にループを有する一本鎖ＲＮＡであり、細胞内にｓｈＲＮＡをコードするＤＮＡを導入して発現させることができるので、ｓｉＲＮＡを導入するよりも長期的、安定的に細胞における遺伝子発現を抑制することができる（例えば、非特許文献２参照）。
【０００３】
ここで、ランダムに遺伝子を抑制するｓｈＲＮＡライブラリーを用い、その抑制により生じる細胞の表現型の変化を検証することによって、抑制されている遺伝子と表現型を対応づけることができれば、その遺伝子の細胞における機能を見出すことが可能になる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Fire A. et al., Nature 391, 806-811, 1998
【非特許文献１】Sandy P. et al., BioTechniques 39, 215-224, 2005
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
そこで、本発明は、ランダムなヌクレオチド配列を有するｓｈＲＮＡを発現するライブラリーの製造方法を提供することを目的としてなされた。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明に係る一本鎖ポリヌクレオチドは、５’末端から３’末端の方向に、第一の領域、第二の領域、および第三の領域を含む一本鎖ポリヌクレオチドであって、前記第一の領域は、該第一の領域が相補鎖を有する場合に第一の制限酵素により認識される塩基配列、および第一の制限酵素による切断部位を含み、第二の領域は、６塩基以上から成り、前記第三の領域の５’側領域と３’側領域の塩基配列は相補的であって、第一の制限酵素は３’突出を形成する制限酵素であることを特徴とする。
【０００７】
本発明に係るＤＮＡライブラリーの製造方法は、第二の領域がランダムな塩基配列を有する、本発明に係る一本鎖ポリヌクレオチドの集団を用いることを特徴とする。本方法は、（１）セルフアニーリングした前記第三の領域の３’末端から、前記第二の領域および前記第一の領域に相補的なポリヌクレオチドを合成し、ヘアピン状ポリヌクレオチドを作製する工程と、（２）前記工程（１）で得られた前記ヘアピン状ポリヌクレオチドを第一の制限酵素を用いて切断処理する工程と、（３）前記工程（２）で得られた、前記第二の領域および前記第三の領域を含む産物の５’末端を、脱リン酸化処理する工程と、（４）前記工程（３）の産物の３’末端に、二本鎖リンカーＤＮＡを構成するいずれか一方のリンカーＤＮＡ鎖の５’末端を結合させる工程と、（５）前記工程（４）で得られた二重鎖ＤＮＡを、前記第二の領域、前記第三の領域、および一本鎖リンカーＤＮＡ領域を含む一本鎖ポリヌクレオチドと、前記二本鎖リンカーＤＮＡのもう一方のＤＮＡ鎖に解離する工程と、（６）前記工程（５）で得られた前記一本鎖ポリヌクレオチドを構成する一本鎖リンカーＤＮＡ領域の少なくとも一部にプライミングするポリヌクレオチドをプライマーとして、当該一本鎖ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドを合成する工程と、を含むことを特徴とする。
【０００８】
ここで、本発明に係るＤＮＡライブラリーの製造方法において、第一の制限酵素はＫｐｎＩであることが好ましく、第一の領域の塩基配列が、5'-TCTTGGTACC-3'（配列番号１）であることがさらに好ましい。
【０００９】
また、工程（６）における、相補的ポリヌクレオチドの合成のための反応温度が、７５℃以上であることが好ましく、９８℃、８５℃、および７５℃の各温度に連続して設定されていてもよい。
【００１０】
第二の領域におけるランダムな塩基配列が、１６〜３０塩基から構成されていてもよい。
【００１１】
第三の領域は、前記５’ 側領域と、前記３’ 側領域とがセルフアニーリングしている場合に、第二の制限酵素によって認識される塩基配列、および第二の制限酵素による切断部位を含み、前記第一の制限酵素と第二の制限酵素は互いに異なる制限酵素であることが好ましい。
【００１２】
第二の制限酵素がＨｉｎｄＩＩＩであることが好ましく、第三の領域の塩基配列が、5'-AAGCTTCACTGANNNNNNNNNTCAGTGAAGCTT-3'（配列番号２）であることがさらに好ましい。
【００１３】
工程（４）に記載の二本鎖リンカーＤＮＡは、第三の制限酵素により認識される塩基配列を含み、工程（６）のプライマーは、前記一本鎖リンカーＤＮＡ領域と、該プライマーを用いて合成した該一本鎖リンカーＤＮＡ領域に相補的なポリヌクレオチド領域とを含む二重鎖ポリヌクレオチド領域が、第三の制限酵素によって認識される塩基配列を含むように設計されていてもよい。
【００１４】
第三の制限酵素がＭｌｙＩであることが好ましく、二本鎖リンカーＤＮＡが、
5'-TTCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAGAGTCGTAC-3'（配列番号３）
3'- AGGTCCCAAAAGGGTCAGTGCTGCAACATCTCAG -5'（配列番号４）であることがさらに好ましい。
【００１５】
本発明に係るｓｈＲＮＡ発現ライブラリーの製造方法は、上記工程（１）〜（６）を含み、さらに、（７）工程（６）で得られた、前記一本鎖ポリヌクレオチドと、当該一本鎖ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドから構成される二重鎖ＤＮＡに対し、第二の制限酵素を用いて、該二重鎖ＤＮＡにおける第二の制限酵素による切断部位に挟まれた領域を除去する工程と、（８）前記（７）で得られた二重鎖ＤＮＡを、該ＤＮＡを転写することのできる発現ベクターに挿入する工程と、を含むことを特徴とする。
【００１６】
本発明に係る別のｓｈＲＮＡ発現ライブラリーの製造方法は、上記工程（１）〜（６）を含み、さらに、（７）工程（６）で得られた、前記一本鎖ポリヌクレオチドと、当該一本鎖ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドから構成される二重鎖ＤＮＡをベクターに挿入する工程と、（８）前記工程（７）でベクターに挿入された二重鎖ＤＮＡ領域に対し、第二の制限酵素を用いて、該二重鎖ＤＮＡにおける第二の制限酵素による切断部位に挟まれた領域を除去する工程と、を含むことを特徴とする。
【００１７】
ここで、本発明に係るｓｈＲＮＡ発現ライブラリーの製造方法において、ベクターが、ウイルスベクターであることが好ましく、レンチウイルスベクターであることがさらに好ましい。
【００１８】
本発明に係る遺伝子のスクリーニング方法は、本発明に係るｓｈＲＮＡ発現ライブラリーを用いた方法であって、ｓｈＲＮＡ発現ライブラリーが導入された第１の細胞集団と、前記ｓｈＲＮＡ発現ライブラリーが導入されていない第２の細胞集団との間の表現型の差異を検出し、前記差異の原因である、ｓｈＲＮＡを同定することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によって、ランダムな塩基配列を有するｓｈＲＮＡを発現するライブラリーの製造方法を提供することが可能となった。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】本発明の一実施形態における、ＤＮＡライブラリーの製造工程、およびｓｈＲＮＡ発現ライブラリーの製造工程を示した図である。
【図２】本発明の一実施形態における、ＤＮＡライブラリーの製造工程を示した図である。
【図３】本発明の一実施形態における、ｓｈＲＮＡ発現ライブラリーの製造工程を示した図である。
【図４】本発明の一実施形態におけるＤＮＡライブラリーの製造工程において、配列番号７の塩基配列を有するヘアピン状ポリヌクレオチドをＫｐｎＩで切断することにより得られたＤＮＡを示す電気泳動図（Ａ、矢印）；Ａの矢印で示されるバンドに含まれるＤＮＡに二本鎖リンカーＤＮＡをライゲーション、ＢｓｉＷＩ切断して得られた、ＤＮＡを示す電気泳動図（Ｂ、矢印）；配列番号８の塩基配列を有するヘアピン状ポリヌクレオチドをＢｇｌＩＩで切断することにより得られたＤＮＡを示す電気泳動図（Ｃ、矢印）；Ｃで示される、ＢｇｌＩＩ切断したヘアピン状ポリヌクレオチドに二本鎖リンカーＤＮＡをライゲーションして得られたＤＮＡを示す電気泳動図（Ｄ：矢印は、得られるべきＤＮＡを示す）である。
【図５】本発明の一実施形態において、Ｔａｑポリメラーゼあるいはｐｙｒｏｂｅｓｔを用いてポリヌクレオチド鎖の合成を行った場合に得られた二重鎖ＤＮＡを示す電気泳動写真である。
【図６】本発明の一実施形態において製造したｓｈＲＮＡ発現ライブラリーにおいて、抽出して検定したＤＮＡの塩基番号と塩基の種類を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
以下、上記知見に基づき完成した本発明の実施の形態を、実施例を挙げながら詳細に説明する。
【００２２】
実施の形態及び実施例に特に説明がない場合には、J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2001); F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J.G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd.等の標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれを修飾したり、改変した方法を用いる。また、市販の試薬キットや測定装置を用いる場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコールを用いる。
【００２３】
なお、本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的な実施例等は、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図ならびに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々に修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
【００２４】
本明細書において「ポリヌクレオチド」は、ポリヌクレオチド鎖、およびポリヌクレオチド鎖を構成する一部の領域のいずれも指すものとする。
【００２５】
また、本明細書において、「制限酵素による切断部位」とは、その制限酵素を用いた切断処理によって分断される、互いに隣接する塩基と塩基の間を指す。そして、領域、ポリヌクレオチド鎖、あるいはＤＮＡ鎖が「制限酵素により切断される部位を含む」とは、領域、ポリヌクレオチド鎖、あるいはＤＮＡ鎖の内部に上記「制限酵素による切断部位」を含むこと、および、領域、ポリヌクレオチド鎖、あるいはＤＮＡ鎖の末端に上記「制限酵素による切断部位」を含むこと、のどちらであってもよい。
【００２６】
＝＝一本鎖ポリヌクレオチド＝＝
本発明に係る一本鎖ポリヌクレオチドは、５’末端から３’末端の方向に、第一の領域、第二の領域、および第三の領域を含む一本鎖ポリヌクレオチドである。この一本鎖ポリヌクレオチドは、以下に説明するような配列を有する範囲内でその取得方法によって制限されず、例えば、固相ホスホラミイダイトトリエステル法（Beaucage and Caruthres, Tetrahedron Letts., 22(20): 1859-1862, 1981）や自動合成機（Needham-VanDavanter et al., Neucleic Acids Res., 12: 6159-6168, 2984）により合成することができる。また、当業者に周知の市販供給元に外注して製造することもできる。
【００２７】
第一の領域の塩基配列は、この第一の領域がその相補鎖を有する場合に、第一の制限酵素によって認識される塩基配列を含む。なお、第一の制限酵素によって切断される部位は第一の領域と第二の領域の間に挟まれる領域に含まれていてもよく、または、第三の領域側の末端以外であれば、第二の領域に含まれていてもよい。第一の領域を構成する塩基配列数は制限されないが、４塩基以上であることが好ましく、４〜２０００塩基であることがより好ましく、４〜３０塩基であることが最も好ましい。第一の制限酵素は、Ｉ型制限酵素、ＩＩ型制限酵素、ＩＩＩ型制限酵素のいずれであってもよい。第一の制限酵素によって認識される塩基配列は、回文配列であっても、あるいは非対称配列であっても制限されない。また、制限酵素の切断型も特に制限されず、ＳａｃＩ、ＳａｌＩ、ＸｈｏＩ、ＫｐｎＩ等の３’突出型であっても、ＥｃｏＲＩ、ＡｃｉＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ等の５’突出型であっても、あるいはＨｐａＩ、ＡｃｃＩＩ、ＡｆａＩ等の平滑末端型であってもよいが、３’突出型であることが好ましく、ＫｐｎＩであることが特に好ましい。第一の領域の塩基配列として、例えば、以下の塩基配列を使用することができる。
5'-TCTTGGTACC-3'（配列番号１）
【００２８】
第二の領域は、この領域を構成する塩基数によって制限されないが、６塩基以上であることが好ましく、１０〜５００塩基であることがより好ましく、１６〜３０塩基であることがさらに好ましい。
【００２９】
第三の領域は、この領域を構成する塩基数によって制限されないが、１０塩基以上であることが好ましく、２０塩基〜６０塩基であることがより好ましい。第三の領域は、その領域内の５’側領域と３’側領域とが相補的な塩基配列を有している。この５’側領域と３’側領域における相補的なポリヌクレオチド領域は、互いにアニーリングした場合に第二の制限酵素によって認識される塩基配列、および第二の制限酵素による切断部位を含んでいてもよい。なお、第二の制限酵素による切断部位は、第二の領域と第三の領域の間に挟まれる領域に含まれていてもよく、あるいは、第一の領域側の末端以外であれば、第二の領域に含まれていてもよい。第二の制限酵素は、第一の制限酵素とは異なる制限酵素であれば制限されず、Ｉ型制限酵素、ＩＩ型制限酵素、ＩＩＩ型制限酵素のいずれであってもよい。第二の制限酵素によって認識される塩基配列は、回文配列であっても、あるいは非対称配列であっても制限されない。また、制限酵素の切断型も特に制限されず、ＳａｃＩ、ＳａｌＩ、ＸｈｏＩ、ＫｐｎＩ等の３’突出型であっても、ＥｃｏＲＩ、ＡｃｉＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ等の５’突出型であっても、あるいはＨｐａＩ、ＡｃｃＩＩ、ＡｆａＩ等の平滑末端型であってもよいが、第二の制限酵素はＨｉｎｄＩＩＩであることが好ましい。このような第三の領域の塩基配列として、例えば、ＨｉｎｄＩＩＩによって認識される塩基配列および切断部位を含む、
5'-AAGCTTCACTGANNNNNNNNNTCAGTGAAGCTT-3'（配列番号２）
が例示できる。
【００３０】
＝＝ＤＮＡライブラリーの製造方法＝＝
上述したような、第一の領域、第二の領域、および第三の領域を含む一本鎖ポリヌクレオチドを用い、ｓｈＲＮＡを発現させるためのＤＮＡを製造することができる。特に、第二の領域がランダムな塩基配列を有する一本鎖ポリヌクレオチドの集団を用いることによって、ランダムなｓｈＲＮＡを細胞内で発現させるためのＤＮＡライブラリーを製造することができる。第二の領域のランダムな塩基配列の種類が多い場合に、より優れたＤＮＡライブラリーを製造することができる。なお、ＤＮＡライブラリーとは、少なくとも２種類以上の異なる塩基配列を有するＤＮＡの集団を指す。
【００３１】
以下に説明するＤＮＡライブラリーの製造方法（図１参照）において、加熱、冷却等の工程は、当業者に周知の機器を使用して適宜行うことができる。例えば、サーマルサイクラ−、温度調節器付ウォーターバス、インキュベーター等を使用すればよい。
【００３２】
（工程１）
まず、上述したような、第一の領域、第二の領域、および第三の領域を含む一本鎖ポリヌクレオチドの第三の領域の、５’側領域と３’側領域における相補的なポリヌクレオチド領域をセルフアニーリングさせ、第三の領域の３’側末端から、ＤＮＡポリメラーゼを用いて、第二の領域および第一の領域に相補的なポリヌクレオチドを合成する。これによって、ヘアピン状ポリヌクレオチドが合成される。第三の領域のセルフアニーリング、および、第三の領域の３’側末端からのポリヌクレオチド合成のための反応温度は、第三の領域における５’側領域と３’側領域を構成するポリヌクレオチドの塩基配列を考慮し、当業者が適宜設定することができるが、４〜９９℃であることが好ましく、２５〜８０℃であることがより好ましく、３０〜４５℃であることがさらに好ましい。また、使用するＤＮＡポリメラーゼは、所望のヘアピン状ポリヌクレオチドが合成される範囲で制限されず、例えば、ＤＮＡポリメラーゼＩ、ＤＮＡポリメラーゼＩＩ、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ、ＤＮＡポリメラーゼα、ＤＮＡポリメラーゼβ、ＤＮＡポリメラーゼγ等の周知のＤＮＡポリメラーゼから正確性や反応条件等を考慮して当業者が適宜選択できる。特に入手や取扱いが容易な市販のＤＮＡポリメラーゼＩとしては、ＴａｑポリメラーゼやＫｌｅｎｏｗ断片等が挙げられる。
【００３３】
（工程２）
次に、工程１で得られたヘアピン状ポリヌクレオチドにおいて第一の領域に対応する二重鎖が、その認識塩基配列および切断部位を有する第一の制限酵素を用いて、ヘアピン状ポリヌクレオチドを切断処理する。切断処理の条件は特に限定されないが、第一の制限酵素の至適温度で行えばよく、反応時間は当業者が適宜設定することができる。この切断処理によって、切断された二本鎖からなる第一の領域の一部と、第二の領域と第三の領域を含む一本鎖からなるポリヌクレオチド鎖とが生じる。
【００３４】
（工程３）
続いて、工程２で得られた、第二の領域と第三の領域を含むポリヌクレオチド鎖に対し、５’末端の脱リン酸化処理を行う。脱リン酸化は、例えばＢＡＰ（骨型アルカリフォスファターゼ）やＣＩＡＰ（子ウシ小腸由来アルカリフォスファターゼ）等の市販のアルカリフォスファターゼを用いて行うことができる。反応に使用するアルカリフォスファターゼの量、反応温度、反応時間等は、当業者が適宜決定すればよい。
【００３５】
（工程４）
次に、この５’末端が脱リン酸化されたポリヌクレオチド鎖の３’末端に、二本鎖リンカーＤＮＡを構成するいずれか一方のリンカーＤＮＡ鎖の５’末端を結合させる。この反応では、二本鎖リンカーＤＮＡを構成する他方のリンカーＤＮＡ鎖は、結合しないままである。なお、５’末端が脱リン酸化されたポリヌクレオチド鎖と二本鎖リンカーＤＮＡのモル比、使用するリガーゼの種類、量、バッファー等の反応条件は、当業者が適宜決定すればよい。
本工程の二本鎖リンカーＤＮＡの塩基配列は、特に制限されないが、第一および第二の制限酵素とは異なる第三の制限酵素によって認識される塩基配列を有していることが好ましい。第三の制限酵素によって切断される部位は、二本鎖リンカーＤＮＡの塩基配列に含まれていてもよいが、リンカーＤＮＡが結合したポリヌクレオチド鎖において、リンカーＤＮＡとポリヌクレオチド鎖の間に挟まれる領域、あるいは、第三の領域側の末端でない限り、第二の領域に含まれていてもよい。これにより、二本鎖リンカーＤＮＡ領域を制限酵素で切断できるようになる。第三の制限酵素の種類は、第一および第二の制限酵素と異なっていれば特に限定されないが、ＭｌｙＩであることが特に好ましい。
以上のような二本鎖リンカーＤＮＡとして、ＭｌｙＩによって認識される塩基配列を含む、
5'-TTCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAGAGTCGTAC-3'（配列番号３）
3'- AGGTCCCAAAAGGGTCAGTGCTGCAACATCTCAG -5'（配列番号４）
が例示できる。
また、二本鎖リンカーＤＮＡ領域に、プロモーターや転写開始シグナル、あるいは転写終結シグナルなどの発現に必要なシグナルを含ませてもよい。それによって、本発明の方法で製造されたＤＮＡライブラリーを発現ベクターに挿入して使用する場合、ＤＮＡライブラリーの側から、転写に必要なシグナルを供給することが可能になる。この場合、同時に第三の制限酵素による認識配列及び切断部位を含ませようとすると、第三の制限酵素による切断後もシグナルが残るように、第三の制限酵素の内側にシグナルを配置するのが好ましい。
【００３６】
（工程５）
このようにして得られたポリヌクレオチド鎖は、５’末端から３’末端の方向に、第二の領域、第三の領域、第二の領域に相補的な塩基配列を有する領域、一本鎖リンカーＤＮＡ領域を含むが、一本鎖リンカーＤＮＡ領域は、二本鎖リンカーＤＮＡにおける他方の一本鎖ＤＮＡ領域とアニーリングしたままである。そこで、本工程では、これら２つのＤＮＡを、第二の領域、第三の領域、第二の領域に相補的な塩基配列を有する領域、および一本鎖リンカーＤＮＡ領域を含むポリヌクレオチド鎖と、もう一方の一本鎖リンカーＤＮＡ鎖とに解離する処理を行う。具体的な方法は特に限定されず、アルカリ処理でも加熱処理でもよいが、処理の簡便さから加熱処理が好ましい。加熱温度および時間は、二本鎖リンカーＤＮＡ領域が解離する温度であれば特に制限されない。
【００３７】
（工程６）
次に、第二の領域、第三の領域、第二の領域に相補的な塩基配列を有する領域、および一本鎖リンカーＤＮＡ領域を含むポリヌクレオチド鎖に対し、一本鎖リンカーＤＮＡ領域にアニールするオリゴヌクレオチドをプライマーとして、このポリヌクレオチド鎖に相補的なポリヌクレオチドを合成し、本発明のＤＮＡライブラリーを製造することができる。
本工程では、プライマーが一本鎖リンカーＤＮＡ領域にアニールする一方で、このポリヌクレオチド鎖が高次構造をとらない、例えば、第二の領域と第二の領域に相補的な塩基配列を有する領域、および、第三の領域はアニーリングしない条件下で反応を行う必要がある。従って、一本鎖リンカーＤＮＡ領域と、プライマーとのＴｍ値（Ｔｍ−１）が、第二の領域と第二の領域に相補的な塩基配列を有する領域、および、第三の領域の相補的ポリヌクレオチド領域のＴｍ値（Ｔｍ−２）よりも低くなるように、一本鎖リンカーＤＮＡ領域とプライマーの配列が設計されている必要がある。そして、本工程でのＤＮＡ合成の反応温度を、Ｔｍ−１とＴｍ−２の間に設定すればよい。第二の領域がランダムな塩基配列を有することを考慮すると、反応温度は例えば７５℃以上であることが好ましく、８５℃以上であることがより好ましく、９８℃以上であることがさらに好ましいが、複数の温度で多段階に反応させてもよい。例えば、７５℃、８５℃、９８℃の各温度に連続して温度設定して反応を行ってもよい。また、第二の領域と第二の領域に相補的な塩基配列を有する領域、および、第三の領域の相補的ポリヌクレオチド領域が変性していることを確実にするため、反応前に加熱−急冷等の処理を行うことが好ましい。
ここで使用するＤＮＡポリメラーゼは、本工程の温度条件、合成するヌクレオチド鎖の長さ、正確性等を考慮して当業者が適宜選択することができ、ＤＮＡポリメラーゼＩ、ＤＮＡポリメラーゼＩＩ、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ、ＤＮＡポリメラーゼα、ＤＮＡポリメラーゼβ、ＤＮＡポリメラーゼγ等の周知のＤＮＡポリメラーゼのいずれであってもよいが、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼであることが好ましい。特に、３’から５’側へのエンドヌクレアーゼ活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼであることが好ましく、耐熱性α型ＤＮＡポリメラーゼであることがさらに好ましい。使用するＤＮＡポリメラーゼの反応至適温度は６５℃以上であることが好ましく、７５℃以上であることがより好ましく、８５℃以上であることがさらに好ましい。７５℃以上の高温で安定して反応を行えるＤＮＡポリメラーゼとして、例えばｐｙｒｏｂｅｓｔ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ株式会社）が挙げられる。ｐｙｒｏｂｅｓｔは、Pyrococcus sp. 由来の３’側から５’側へのエンドヌクレアーゼ活性を有する耐熱性α型ＤＮＡポリメラーゼであり、４０〜５０℃付近でのＤＮＡポリメラーゼ活性は２〜９％、反応至適温度は約７５℃である。
なお、リンカーＤＮＡ領域が、第三の制限酵素によって認識される塩基配列、あるいは第三の制限酵素による切断部位を含む塩基配列を有している場合、製造したＤＮＡライブラリーを第三の制限酵素によって切断できるようにするため、合成したＤＮＡがその認識配列および切断部位を含むように、本工程で使用するプライマーの位置を決めることが好ましい。このようなプライマーとして、例えば、
5'-TCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAGAGTCGTACC-3'（配列番号５）の塩基配列を有するプライマーを使用することができ、反応時間や反応時間等の反応条件は当業者が適宜設定することができる。
【００３８】
＝＝ｓｈＲＮＡ発現ライブラリーの製造方法＝＝
以上のように製造したＤＮＡライブラリーをベクターに挿入して、ｓｈＲＮＡ発現ライブラリーを製造することができる。挿入方法は特に限定されないが、ＤＮＡライブラリーが第三の制限酵素の認識配列及び切断部位を有していれば、第三の制限酵素で切断し、同じ酵素で切断したベクターに挿入するのが好ましい。なお、プロモーターや転写開始シグナル、あるいは転写終結シグナルなどの発現に必要なシグナルは、ＤＮＡライブラリー側から供給しても、ベクター側から供給しても構わない。
【００３９】
ＤＮＡライブラリーを挿入するベクターは、ＤＮＡを転写することのできるベクター（発現ベクター）であれば特に制限されず、例えば当業者に周知のウイルスベクターであっても、プラスミドベクターであってもよい。ベクターの選択には、製造するｓｈＲＮＡ発現ライブラリーを使用する対象の細胞等を考慮すればよく、例えば、哺乳類の細胞に対して使用する場合には、レンチウイルスベクターに挿入してもよい。
【００４０】
第一の領域、第二の領域、および第三の領域を含む一本鎖ポリヌクレオチドの第三の領域において、５’側領域と３’側領域における相補的なポリヌクレオチド領域が互いにアニーリングした場合に第二の制限酵素によって認識される塩基配列、および第二の制限酵素による切断部位を含んでいる場合には、ＤＮＡライブラリーを、発現ベクターに挿入する前、あるいは挿入した後に、第二の制限酵素による切断部位に挟まれた領域を除去することができる。ＤＮＡライブラリーを発現ベクターに挿入する前に、第二の制限酵素による切断部位に挟まれた領域を除去する場合、例えば、発現ベクターとは異なる好適なベクターにＤＮＡライブラリーを挿入し、第二の制限酵素によって切断、セルフライゲーションすればよい。このようにして第二の制限酵素による切断部位に挟まれた領域が除去されたＤＮＡライブラリーを、適切な制限酵素によりベクターから切り出した後、発現ベクターに挿入することができる。一方、ＤＮＡライブラリーを発現ベクターに挿入した後に、第二の制限酵素による切断部位に挟まれた領域を除去する場合、ＤＮＡライブラリーを発現ベクターに挿入した後に、第二の制限酵素で切断処理を行い、セルフライゲーションすればよい。
【００４１】
＝＝ｓｈＲＮＡ発現ライブラリーの使用＝＝
以上のように製造したｓｈＲＮＡ発現ライブラリーは、特定の機能を有する遺伝子のスクリーニングに使用することができる。
例えば、ｓｈＲＮＡ発現ライブラリーが導入された第１の細胞集団と、ｓｈＲＮＡが導入されていない第２の細胞集団との間の表現型の差異を検出する。そして、その差を有する細胞を同定し、ｓｈＲＮＡを回収することにより、その表現型の差異を生じさせているｓｈＲＮＡを同定できる。このｓｈＲＮＡにより発現が抑制されている遺伝子を特定することにより、ある機能に結びついた遺伝子を発見することができる。
ここで、表現型の差異とは、例えば形態学的差異や生化学的差異のことである。形態学的差異は、第一の細胞集団と、第二の細胞集団とを肉眼、あるいは顕微鏡等を用いて観察することによって調べることができる。生化学的差異は、例えば、第一の細胞集団と、第二の細胞集団とにおけるタンパク質の発現パターンや酵素活性の差異等を、当業者に周知の手法を用いて検出することによって調べることができる。
このようなスクリーニングの具体例として、例えば腫瘍細胞に対してこのスクリーニングを行い、特定の遺伝子の発現の抑制が腫瘍細胞の増殖を抑制した場合には、その腫瘍細胞の増殖に関わる遺伝子を特定することができ、さらに、その遺伝子発現を抑制するｓｉＲＮＡを抗腫瘍剤として使用することもできる。
【実施例】
【００４２】
本実施例では、以下に説明するようにＤＮＡライブラリーおよびｓｈＲＮＡ発現ライブラリーを調製した（図２、３参照）。
【００４３】
＝＝ＤＮＡライブラリーの調製＝＝
まず、５’末端から３’末端の方向に、TCTTGGTACC（配列番号１）、ランダムな１９塩基、AAGCTTCACTGATCCTTCGCTTCAGTGAAGCTT（配列番号６）の塩基配列を有する一本鎖ポリヌクレオチド集団を化学合成した。この１μＭ 一本鎖ポリヌクレオチド１ｍｌ、１Ｍ ＭｇＣｌ２ １０μｌ、１０ｍＭ ｄＮＴＰｓ １０μｌ、およびＫｌｅｎｏｗ断片 １０μｌ（２ユニット／μｌ、タカラバイオ株式会社）を混合し、３７℃で２時間インキュベートした。得られた産物をアクリルアミドゲルによる電気泳動により確認した。得られた産物をＭＥＲｍａｉｄ ＳＰＩＮ Ｋｉｔ（Qbiogene 社）の３カラムを用い、計３００μｌの溶出バッファーにＤＮＡを溶出させ、回収した。本工程では、
5'-TCTTGGTACC-(N)19-AAGCTTCACTGATCCTTCGCTTCAGTGAAGCTT-(N)19-GGTACCAAGA-3'（配列番号７）の塩基配列を有するヘアピン状ポリヌクレオチドが得られる（図２参照）。
【００４４】
次に、上記ヘアピン状ポリヌクレオチド ３００μｌ、純水 ５２５μｌ、１０×ＮＥＢバッファー１ （New England Biolabs 社）１００μｌ、ＫｐｎＩ（１０ユニット／μｌ） ７５μｌを混合し、３７℃で一晩インキュベートした。この反応溶液にさらに２５μｌのＫｐｎＩを加え、３７℃で２時間インキュベートした後、試料をアクリルアミドゲルによる電気泳動により確認した（図４Ａ）。末端が切断されたヘアピン状ポリヌクレオチドをＭＥＲｍａｉｄ ＳＰＩＮ Ｋｉｔ（Qbiogene 社）の３カラムを用いて精製し、計２２５μｌの溶出バッファーにＤＮＡを溶出させ、回収した。この溶出試料２２５μｌ、１Ｍ Ｔｒｉｓバッファー（ｐＨ８．５） ２５０μｌ、１０×ＣＩＡＰバッファー １００μｌ、ＣＩＡＰ（１０ユニット／μｌ） ３０μｌに純水を加えて１ｍｌの反応溶液を調製し、５０℃で１時間インキュベートした。この反応試料を２分割し、それぞれエタノール沈殿法によってＤＮＡの沈殿を得た。このＤＮＡの沈殿を、０．７ｍｌのＴ１０バッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ８．０））に溶解した後、ＭＥＲｍａｉｄ ＳＰＩＮ Ｋｉｔ（Qbiogene 社）の２カラムを用い、計２００μｌの溶出バッファーにＤＮＡを溶出させた。
【００４５】
続いて、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ２．１（タカラバイオ株式会社）を用い、下記二本鎖リンカーＤＮＡ（配列番号４のポリヌクレオチド鎖の５’末端をリン酸化処理した後、配列番号３のポリヌクレオチド鎖とアニーリングしたもの、２０μＭ）１９０μｌ、Ｉ液７６０μｌ、ＩＩ液３８０μｌを混合し、１６℃で一晩インキュベートすることにより、リンカーＤＮＡのヘアピン状ポリヌクレオチドへのライゲーション反応を行った。次に、エタノール沈殿法によりＤＮＡを沈殿させ、５００μｌのＴ１０バッファーに溶解した。
二本鎖リンカーＤＮＡ：
5'-TTCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAGAGTCGTAC-3'（配列番号３）
3'- AGGTCCCAAAAGGGTCAGTGCTGCAACATCTCAG -5'（配列番号４）
【００４６】
このようにして得られたＤＮＡ試料 ５００μｌ、１０×ＮＥＢバッファー３ （New England Biolabs 社）６０μｌ、ＢｓｉＷＩ（１０ユニット／μｌ） ４０μｌを混合し、５５℃で一晩インキュベートした。この処理により、二本鎖リンカーＤＮＡが複数結合してできた反応副産物が切断される。このＤＮＡ試料を、アクリルアミドゲルで電気泳動し（図４Ｂ、矢印）、第二の領域、第三の領域、および一本鎖リンカーＤＮＡ領域を含む一本鎖ポリヌクレオチドに対応するバンドを含むゲルを切り出した後、ｃｒｕｓｈ ａｎｄ ｓｏａｋ法（BioTechniques 18, 33-35）によってＤＮＡをゲルから回収し、さらにエタノール沈殿法によってＤＮＡを沈殿させた。このＤＮＡをＴ１０バッファーに溶解した。
【００４７】
このＤＮＡ溶液を、数分間煮沸した後、氷上で冷却した。この変性処理により、二本鎖リンカーＤＮＡのうち、ヘアピン状ポリヌクレオチドに共有結合していないＤＮＡ鎖が解離し、また、第二の領域、第三の領域、および一本鎖リンカーＤＮＡ領域を含む一本鎖ポリヌクレオチドにおけるヘアピン状構造が解離する。
【００４８】
ここで、本方法「ＤＮＡライブラリーの調製」における上記一連の工程に関し、配列番号７の塩基配列を有するヘアピン状ポリヌクレオチドの代わりに、TATAGATCT-(N)19-ATTAATCACTGATCCTTCGCTTCAGTGATTAAT-(N)19-AGATCTATA（配列番号８）の塩基配列を有する等量のヘアピン状ポリヌクレオチドを用い、ＫｐｎＩに代わって、ＢｇｌＩＩ（１０００ユニット）を用い、ＫｐｎＩの場合と同条件でインキュベートした場合、ヘアピン状ポリヌクレオチドの切断は不完全であった（図４Ｃ）。その後、ＫｐｎＩの場合と同様に処理し、二本鎖リンカーＤＮＡを結合したところ、ヘアピン状ポリヌクレオチドに二本鎖リンカーＤＮＡが結合した目的の産物以外に、目的としない副産物が同時に得られた（図４Ｄ）。従って、ＫｐｎＩの方が、ＢｇｌＩＩより、ここでの処理に適しているため、以下の工程には、ＫｐｎＩで処理することによって得られたＤＮＡを用いた。
【００４９】
加熱変性させた一重鎖ＤＮＡおよび１０μｌに対し、１００μＭプライマー（配列番号５）２μｌ、ｄＮＴＰｓ（２．５ｍＭ）４μｌ、純水２８μｌ、ｐｙｒｏｂｅｓｔ（５ユニット／μｌ、タカラバイオ株式会社）あるいはｒＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（ｒＴａｑ、５ユニット／μｌ、東洋紡ライフサイエンス社）１μｌ、１０×ＰＣＲ用バッファー ５μｌを含む５０μｌのサンプルを混合し、９８℃で５分、８５℃で５分、さらに７５℃で５分インキュベートし、二重鎖ＤＮＡを合成した。なお、９８℃から８５℃、８５℃から７５℃の間は、１秒当たり０．１℃で温度を下降させた。この反応を、計４７チューブ分繰り返し、反応溶液をアクリルアミドゲルによる電気泳動に供し、合成された二重鎖ＤＮＡに対応するバンドを含むゲルを切り出した後、ｃｒｕｓｈ ａｎｄ ｓｏａｋ法（BioTechniques 18, 33-35）によってＤＮＡをゲルから回収し、さらにエタノール沈殿法によってＤＮＡを沈殿させた。このＤＮＡを２００μｌのＴ１０バッファーに溶解した。
【００５０】
なお、ここで、ｒＴａｑを用いて伸長反応を行った場合には、十分な二重鎖ＤＮＡを得ることができなかった（図５）。従って、以下のｓｈＲＮＡ発現ライブラリー調製の工程はｐｙｒｏｂｅｓｔを用いて得られた二重鎖ＤＮＡを用いて行った。
【００５１】
＝＝ｓｈＲＮＡ発現ライブラリーの調製方法＝＝
得られた二重鎖ＤＮＡ２００μｌ当たり、ＭｌｙＩ（１０ユニット／μｌ、New England Biolabs 社）４０μｌ、１０×ＮＥＢバッファー４（New England Biolabs 社） ９０μｌ、純水 ５７０μｌを加えて混合し、３７℃で一晩インキュベートした。この反応溶液を、アクリルアミドゲルによる電気泳動に供し、リンカーＤＮＡが除去された二重鎖ＤＮＡに対応するバンドを含むゲルからｃｒｕｓｈ ａｎｄ ｓｏａｋ法（BioTechniques 18, 33-35）によってＤＮＡを回収した。さらにエタノール沈殿法によってＤＮＡを沈殿させ、沈殿したＤＮＡを４００μｌのＴ１０バッファーに溶解した。この工程により、リンカーＤＮＡが除去された二重鎖ＤＮＡの集合体が得られる。得られた４００μｌのＤＮＡ試料に対し、Ｔａｋａｒａ ＢＫＬ ｋｉｔ（タカラバイオ株式会社）の１０×バッファー、Ｂｌｕｎｔｉｎｇ ｋｉｎａｔｉｏｎ Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｘ ２０μｌを混合し、３７℃で１０分間インキュベートした。反応後、反応溶液についてフェノール精製、クロロホルム精製を行った後、ＤＮＡをエタノール沈殿法によって沈殿させた。得られたＤＮＡの沈殿を５００μｌのＴ１０バッファーに溶解させた。これにより、リンカーＤＮＡが除去された二重鎖ＤＮＡの集合体に含まれるＤＮＡの両末端が平滑化され、５’末端がリン酸化された。
【００５２】
終結シグナルが挿入されたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ−ベクター（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ−ベクターのＢａｍＨＩ、ＳａｌＩ制限酵素部位に、終結シグナルを含むＤＮＡ（配列番号９、１０）を挿入して作成）２００ μｇ、Ｎｓｉ Ｉ（New England Biolabs 社）１０００ユニット、１０×ＮＥＢバッファー３（New England Biolabs 社）２００μｌ、純水を混合して反応液２ｍｌを調製し、３７℃で３時間反応させた。その後、６５℃で２０分熱処理し、エタノール沈殿法によりＤＮＡを精製した。このＤＮＡ全量、ＳｍａＩ（New England Biolabs 社）１２００ユニット、１０×ＮＥＢバッファー４（New England Biolabs 社）、純水を混合し、反応液２ｍｌを２５℃で一晩インキュベートし、エタノール沈殿法によりＤＮＡを精製した。その後、Ｔａｋａｒａ ｂｌｕｎｔｉｎｇ ｋｉｔ（タカラバイオ株式会社）を用い、上記のように制限酵素によって切断されたベクターの末端を平滑化し、ＱＩＡＧＥＮ Ｑｉａｑｕｉｃｋ ｇｅｌ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Qiagen 社）で精製した後、１０×ＣＩＡＰバッファー、および、ＣＩＡＰ（１０ユニット／μｌ）に純水を加えて反応溶液を調製し、５０℃で１時間インキュベートしてベクター末端の脱リン酸化処理を行った。その後、ベクターをアガロースゲル電気泳動後に供し、ＤＮＡを含むバンドを切り出し、ＱＩＡＧＥＮ Ｑｉａｑｕｉｃｋ ｇｅｌ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔで精製し、直鎖化終結シグナル挿入ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ−ベクターを得た。
終結シグナルを含むＤＮＡ：
5'-GATCCCCGGGCTTATGCATTTTTGGAAAAG -3'（配列番号９）
3'- GGGCCCGAATACGTAAAAACCTTTTCAGCT-5'（配列番号１０）
【００５３】
次に、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ２．１（タカラバイオ株式会社）を用い、リンカーＤＮＡが除去された二重鎖ＤＮＡの集合体１５０μｌ、直鎖化終結シグナル挿入ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ−ベクター１２０μｌ（２００ｎｇ/μｌ）、Ｉ液３．５ｍｌを純水で７ｍｌに調製した混合液を１６℃で一晩インキュベートした。反応液を、ＱＩＡＧＥＮ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Qiagen 社）の２２カラムを用いて、二重鎖ＤＮＡの集合体が挿入されたベクターに対応するバンドを含むゲルからＤＮＡを回収し、計３ｍｌのＤＮＡ溶液を得た。
【００５４】
以上のように得られた、組み換えＤＮＡを有するｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクターのＤＮＡ試料１．０５ｍｌに対し、ＨｉｎｄＩＩＩ（１００ユニット／μｌ）３０μｌ １０×ＮＥＢバッファー２（New England Biolabs 社） １２０μｌを混合し、３７℃で４時間インキュベートした。反応液をＱＩＡＧＥＮ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔの１６カラムを用いて精製し、計１．６ｍｌのＤＮＡ溶液を得た。得られたＤＮＡは、二重鎖ＤＮＡの集合体からＨｉｎｄＩＩＩによる切断部位に挟まれる領域が除去されたベクターである。このＤＮＡ試料１．５ｍｌに対し、１０×バッファー７．５ｍｌ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ７５０μｌ、純水６５ｍｌを加え、１６℃で一晩インキュベートした。反応液を、ＱＩＡＧＥＮ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔの１６カラムを用いて、環状化したプラスミドＤＮＡを精製し、計２．４ｍｌのＤＮＡ−Ｔ１０溶液を得た。以上のＨｉｎｄＩＩＩ処理およびライゲーション処理により、組み換えＤＮＡを有するｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクターにおいて、組み換えＤＮＡ領域のＨｉｎｄＩＩＩ切断部位に挟まれる領域が除去された。
【００５５】
１チューブ当たり、以上のように得られた組み換えｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター試料３μｌ、ＳＴＢＬ４コンピテントセル（インビトロジェン株式会社）２５μｌを混合し、形質転換を行った。同様に１００チューブで形質転換を行い、全ての形質転換体をプールし、ここにＬＢ培地を加えて液量を１００ｍｌとした。この液に含まれる独立コロニー数は、７．１×１０８であった。
【００５６】
ＱＩＡＧＥＮ ｐｌａｓｍｉｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Qiagen 社）で精製したＤＮＡ２００μｌ（１ｍｇ）、ＢａｍＨＩ（New England Biolabs 社） １０００ユニット、ＳａｌＩ（New England Biolabs 社） １０００ユニット、１０×ＮＥＢバッファー２（New England Biolabs 社） １００μｌ、純水８００μｌを混合し、３７℃で６時間インキュベートした。反応液をアガロースゲルによる電気泳動に供し、バンドを含むゲルからＤＮＡを精製し、計１ｍｌのＤＮＡ溶液を得た。
【００５７】
レンチウイルスベクター（ＦＩＶベースのベクターに、Ｈ１ ｐｒｏｍｏｔｅｒとＢｌａｓｔｉｃｉｄｉｎ耐性遺伝子をクローニングしたベクター）を、ＢａｍＨＩ（New England Biolabs 社） ３０００ユニットで３７℃、２時間処理し、アガロースゲル電気泳動後、バンドを切り出し、ＱＩＡＧＥＮ Ｑｉａｑｕｉｃｋ ｇｅｌ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔで精製した。引き続きＳａｌＩ（New England Biolabs 社） ３０００ユニット、１０×ＮＥＢバッファー２（New England Biolabs 社） １００μｌ、純水８００μｌを混合し、３７℃で６時間インキュベートした。反応液をアガロースゲルによる電気泳動に供し、ＱＩＡＧＥＮ ｐｌａｓｍｉｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔを用いてバンドを含むゲルからＤＮＡを精製し、計３．３ｍｌの直鎖化レンチウイルスベクターを得た。
【００５８】
ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ２．１（タカラバイオ株式会社）を用い、以上のようにして得られたＤＮＡ溶液１ｍｌおよび直鎖化レンチウイルスベクター５００μｇ、Ｉ液 ３．７５ｍｌを混合し、純水で全反応液量を７．５ｍｌに調製し、１６℃で一晩インキュベートした。この工程により、レンチウイルスベクターに、ランダムＤＮＡ配列が挿入される。反応液を、ＱＩＡＧＥＮ ｇｅｌ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Qiagen 社）で精製し、２ｍｌのｓｈＲＮＡ発現ライブラリーを得た。
【００５９】
＝＝ｓｈＲＮＡ発現ベクターの検定＝＝
上記のように得られたｓｈＲＮＡ発現ライブラリー溶液６．３μｌ、ＳＴＢＬ４コンピテントセル（インビトロジェン株式会社）３３μｌをチューブに混合し、形質転換を行った。１２０チューブの反応を同様にして行い、全チューブの反応液をプールした。ここに、ＬＢ培地を加え、全反応液量を１４０ｍｌとした。全反応液中に含まれる独立コロニー数は１．４×１０８であった。アンピシリン含有ＬＢ培地で培養したコロニーから８４コロニーをランダムに選択してＤＮＡを精製し、塩基配列を決定した。
【００６０】
上記８４クローンのうち、異常な配列を持つ２クローンを除いた８２クローンの塩基配列をＦＡＳＴＡで解析した。表１に示す様に、８２クローンの全てにおいて、１６塩基以上（連続していないものも含む）が既知のヒト遺伝子と一致した。また、Ｇが３つ以上、Ｃが４つ以上、ＧまたはＣが５つ以上、Ｔが４つ以上、Ａが４つ以上連続していないというｓｈＲＮＡの設計のルールに当てはまるクローンは、全体の４５％であった。さらに、図６に示す様に、１〜１９番目までの塩基において塩基の種類に偏りが見られず、ランダムな配列であった。従って、構築したｓｈＲＮＡ発現ライブラリーは、遺伝子スクリーニングに十分使用できるものである。
【表１】
【００６１】
＝＝レンチウイルスライブラリー＝＝
上記のように得られたｓｈＲＮＡ発現ライブラリー１．２ ｍｇを、パッケージングプラスミド（ＳＢＩ社）３．６ ｍｇと共に２９３Ｔ細胞に導入した。培養上清８Ｌを回収し、これをレンチウイルスライブラリーとした。このレンチウイルスライブラリーのタイターは、１．３×１０９であった。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
５’末端から３’末端の方向に、第一の領域、第二の領域、および第三の領域を含む一本鎖ポリヌクレオチドであって、
前記第一の領域は、該第一の領域が相補鎖を有する場合に第一の制限酵素により認識される塩基配列、および第一の制限酵素による切断部位を含み、
第二の領域は、６塩基以上から成り、
前記第三の領域の５’側領域と３’側領域の塩基配列は相補的であって、
第一の制限酵素は３’突出を形成する制限酵素であることを特徴とする、一本鎖ポリヌクレオチド。
【請求項２】
請求項１に記載の一本鎖ポリヌクレオチドの集団を用いた、ＤＮＡライブラリーの製造方法であって、
前記一本鎖ポリヌクレオチドの集団は、前記第二の領域がランダムな塩基配列を有することを特徴とし、
該方法は、
（１）セルフアニーリングした前記第三の領域の３’末端から、前記第二の領域および前記第一の領域に相補的なポリヌクレオチドを合成し、ヘアピン状ポリヌクレオチドを作製する工程と、
（２）前記工程（１）で得られた前記ヘアピン状ポリヌクレオチドを第一の制限酵素を用いて切断処理する工程と、
（３）前記工程（２）で得られた、前記第二の領域および前記第三の領域を含む産物の５’末端を、脱リン酸化処理する工程と、
（４）前記工程（３）の産物の３’末端に、二本鎖リンカーＤＮＡを構成するいずれか一方のリンカーＤＮＡ鎖の５’末端を結合させる工程と、
（５）前記工程（４）で得られた二重鎖ＤＮＡを、前記第二の領域、前記第三の領域、および一本鎖リンカーＤＮＡ領域を含む一本鎖ポリヌクレオチドと、前記二本鎖リンカーＤＮＡのもう一方のＤＮＡ鎖に解離する工程と、
（６）前記工程（５）で得られた前記一本鎖ポリヌクレオチドを構成する一本鎖リンカーＤＮＡ領域の少なくとも一部にプライミングするポリヌクレオチドをプライマーとして、当該一本鎖ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドを合成する工程と、
を含むことを特徴とする、製造方法。
【請求項３】
請求項２に記載の製造方法であって、
前記第一の制限酵素がＫｐｎＩであることを特徴とする、製造方法。
【請求項４】
請求項２または３に記載の製造方法であって、
前記第一の領域の塩基配列が、
5'-TCTTGGTACC-3'であることを特徴とする、製造方法。
【請求項５】
請求項２〜４のいずれかに記載の製造方法であって、
工程（６）における、相補的ポリヌクレオチドの合成のための反応温度が、７５℃以上であることを特徴とする、製造方法。
【請求項６】
請求項５に記載の製造方法であって、
前記反応温度が、９８℃、８５℃、および７５℃の各温度に連続して設定されることを特徴とする、製造方法。
【請求項７】
請求項２〜６のいずれかに記載の製造方法であって、
前記ランダムな塩基配列が、１６〜３０塩基からなることを特徴とする、製造方法。
【請求項８】
請求項２〜７のいずれかに記載の製造方法であって、
前記第三の領域は、前記５’ 側領域と、前記３’ 側領域とがセルフアニーリングしている場合に、第二の制限酵素によって認識される塩基配列、および第二の制限酵素による切断部位を含み、
前記第一の制限酵素と第二の制限酵素は互いに異なる制限酵素であることを特徴とする、製造方法。
【請求項９】
請求項２〜８のいずれかに記載の製造方法であって、
前記第二の制限酵素がＨｉｎｄＩＩＩであることを特徴とする、製造方法。
【請求項１０】
請求項２〜９のいずれかに記載の製造方法であって、
前記第三の領域の塩基配列が、
5'-AAGCTTCACTGANNNNNNNNNTCAGTGAAGCTT-3'であることを特徴とする、製造方法。
【請求項１１】
請求項２〜１０のいずれかに記載の製造方法であって、
前記工程（４）に記載の二本鎖リンカーＤＮＡは、第三の制限酵素により認識される塩基配列を含み、
前記工程（６）のプライマーは、前記一本鎖リンカーＤＮＡ領域と、該プライマーを用いて合成した該一本鎖リンカーＤＮＡ領域に相補的なポリヌクレオチド領域とを含む二重鎖ポリヌクレオチド領域が、第三の制限酵素によって認識される塩基配列を含むように設計されていることを特徴とする、製造方法。
【請求項１２】
請求項２〜１１のいずれかに記載の製造方法であって、前記第三の制限酵素がＭｌｙＩであることを特徴とする、製造方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の製造方法であって、
前記二本鎖リンカーＤＮＡが、
5'-TTCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAGAGTCGTAC-3'
3'- AGGTCCCAAAAGGGTCAGTGCTGCAACATCTCAG -5'であることを特徴とする、製造方法。
【請求項１４】
ｓｈＲＮＡ発現ライブラリーの製造方法であって、
請求項２〜１３のいずれかに記載の工程（１）〜（６）を含み、さらに、
（７）前記工程（６）で得られた、前記一本鎖ポリヌクレオチドと、当該一本鎖ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドから構成される二重鎖ＤＮＡに対し、第二の制限酵素を用いて、該二重鎖ＤＮＡにおける第二の制限酵素による切断部位に挟まれた領域を除去する工程と、
（８）前記工程（７）で得られた二重鎖ＤＮＡを、該ＤＮＡを転写することのできるベクターに挿入する工程と、
を含むことを特徴とする、製造方法。
【請求項１５】
ｓｈＲＮＡ発現ライブラリーの製造方法であって、
請求項２〜１３のいずれかに記載の工程（１）〜（６）を含み、さらに、
（７）前記工程（６）で得られた、前記一本鎖ポリヌクレオチドと、当該一本鎖ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドから構成される二重鎖ＤＮＡを、該ＤＮＡを転写することのできるベクターに挿入する工程と、
（８）前記工程（７）でベクターに挿入された二重鎖ＤＮＡ領域に対し、第二の制限酵素を用いて、該二重鎖ＤＮＡにおける第二の制限酵素による切断部位に挟まれた領域を除去する工程と、
を含むことを特徴とする、製造方法。
【請求項１６】
請求項１４または１５に記載の製造方法であって、
前記ベクターが、ウイルスベクターであることを特徴とする、製造方法。
【請求項１７】
請求項１６に記載の製造方法であって、
前記ウイルスベクターが、レンチウイルスベクターであることを特徴とする、製造方法。
【請求項１８】
請求項１４〜１７のいずれかに記載の方法で製造されたｓｈＲＮＡ発現ライブラリーを用いた遺伝子のスクリーニング方法であって、
前記ｓｈＲＮＡ発現ライブラリーが導入された第１の細胞集団と、前記ｓｈＲＮＡ発現ライブラリーが導入されていない第２の細胞集団との間の表現型の差異を検出し、
前記差異の原因である、ｓｈＲＮＡを同定することを特徴とする、方法。
【請求項１】
５’末端から３’末端の方向に、第一の領域、第二の領域、および第三の領域を含む一本鎖ポリヌクレオチドであって、
前記第一の領域は、該第一の領域が相補鎖を有する場合に第一の制限酵素により認識される塩基配列、および第一の制限酵素による切断部位を含み、
第二の領域は、６塩基以上から成り、
前記第三の領域の５’側領域と３’側領域の塩基配列は相補的であって、
第一の制限酵素は３’突出を形成する制限酵素であることを特徴とする、一本鎖ポリヌクレオチド。
【請求項２】
請求項１に記載の一本鎖ポリヌクレオチドの集団を用いた、ＤＮＡライブラリーの製造方法であって、
前記一本鎖ポリヌクレオチドの集団は、前記第二の領域がランダムな塩基配列を有することを特徴とし、
該方法は、
（１）セルフアニーリングした前記第三の領域の３’末端から、前記第二の領域および前記第一の領域に相補的なポリヌクレオチドを合成し、ヘアピン状ポリヌクレオチドを作製する工程と、
（２）前記工程（１）で得られた前記ヘアピン状ポリヌクレオチドを第一の制限酵素を用いて切断処理する工程と、
（３）前記工程（２）で得られた、前記第二の領域および前記第三の領域を含む産物の５’末端を、脱リン酸化処理する工程と、
（４）前記工程（３）の産物の３’末端に、二本鎖リンカーＤＮＡを構成するいずれか一方のリンカーＤＮＡ鎖の５’末端を結合させる工程と、
（５）前記工程（４）で得られた二重鎖ＤＮＡを、前記第二の領域、前記第三の領域、および一本鎖リンカーＤＮＡ領域を含む一本鎖ポリヌクレオチドと、前記二本鎖リンカーＤＮＡのもう一方のＤＮＡ鎖に解離する工程と、
（６）前記工程（５）で得られた前記一本鎖ポリヌクレオチドを構成する一本鎖リンカーＤＮＡ領域の少なくとも一部にプライミングするポリヌクレオチドをプライマーとして、当該一本鎖ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドを合成する工程と、
を含むことを特徴とする、製造方法。
【請求項３】
請求項２に記載の製造方法であって、
前記第一の制限酵素がＫｐｎＩであることを特徴とする、製造方法。
【請求項４】
請求項２または３に記載の製造方法であって、
前記第一の領域の塩基配列が、
5'-TCTTGGTACC-3'であることを特徴とする、製造方法。
【請求項５】
請求項２〜４のいずれかに記載の製造方法であって、
工程（６）における、相補的ポリヌクレオチドの合成のための反応温度が、７５℃以上であることを特徴とする、製造方法。
【請求項６】
請求項５に記載の製造方法であって、
前記反応温度が、９８℃、８５℃、および７５℃の各温度に連続して設定されることを特徴とする、製造方法。
【請求項７】
請求項２〜６のいずれかに記載の製造方法であって、
前記ランダムな塩基配列が、１６〜３０塩基からなることを特徴とする、製造方法。
【請求項８】
請求項２〜７のいずれかに記載の製造方法であって、
前記第三の領域は、前記５’ 側領域と、前記３’ 側領域とがセルフアニーリングしている場合に、第二の制限酵素によって認識される塩基配列、および第二の制限酵素による切断部位を含み、
前記第一の制限酵素と第二の制限酵素は互いに異なる制限酵素であることを特徴とする、製造方法。
【請求項９】
請求項２〜８のいずれかに記載の製造方法であって、
前記第二の制限酵素がＨｉｎｄＩＩＩであることを特徴とする、製造方法。
【請求項１０】
請求項２〜９のいずれかに記載の製造方法であって、
前記第三の領域の塩基配列が、
5'-AAGCTTCACTGANNNNNNNNNTCAGTGAAGCTT-3'であることを特徴とする、製造方法。
【請求項１１】
請求項２〜１０のいずれかに記載の製造方法であって、
前記工程（４）に記載の二本鎖リンカーＤＮＡは、第三の制限酵素により認識される塩基配列を含み、
前記工程（６）のプライマーは、前記一本鎖リンカーＤＮＡ領域と、該プライマーを用いて合成した該一本鎖リンカーＤＮＡ領域に相補的なポリヌクレオチド領域とを含む二重鎖ポリヌクレオチド領域が、第三の制限酵素によって認識される塩基配列を含むように設計されていることを特徴とする、製造方法。
【請求項１２】
請求項２〜１１のいずれかに記載の製造方法であって、前記第三の制限酵素がＭｌｙＩであることを特徴とする、製造方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の製造方法であって、
前記二本鎖リンカーＤＮＡが、
5'-TTCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAGAGTCGTAC-3'
3'- AGGTCCCAAAAGGGTCAGTGCTGCAACATCTCAG -5'であることを特徴とする、製造方法。
【請求項１４】
ｓｈＲＮＡ発現ライブラリーの製造方法であって、
請求項２〜１３のいずれかに記載の工程（１）〜（６）を含み、さらに、
（７）前記工程（６）で得られた、前記一本鎖ポリヌクレオチドと、当該一本鎖ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドから構成される二重鎖ＤＮＡに対し、第二の制限酵素を用いて、該二重鎖ＤＮＡにおける第二の制限酵素による切断部位に挟まれた領域を除去する工程と、
（８）前記工程（７）で得られた二重鎖ＤＮＡを、該ＤＮＡを転写することのできるベクターに挿入する工程と、
を含むことを特徴とする、製造方法。
【請求項１５】
ｓｈＲＮＡ発現ライブラリーの製造方法であって、
請求項２〜１３のいずれかに記載の工程（１）〜（６）を含み、さらに、
（７）前記工程（６）で得られた、前記一本鎖ポリヌクレオチドと、当該一本鎖ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドから構成される二重鎖ＤＮＡを、該ＤＮＡを転写することのできるベクターに挿入する工程と、
（８）前記工程（７）でベクターに挿入された二重鎖ＤＮＡ領域に対し、第二の制限酵素を用いて、該二重鎖ＤＮＡにおける第二の制限酵素による切断部位に挟まれた領域を除去する工程と、
を含むことを特徴とする、製造方法。
【請求項１６】
請求項１４または１５に記載の製造方法であって、
前記ベクターが、ウイルスベクターであることを特徴とする、製造方法。
【請求項１７】
請求項１６に記載の製造方法であって、
前記ウイルスベクターが、レンチウイルスベクターであることを特徴とする、製造方法。
【請求項１８】
請求項１４〜１７のいずれかに記載の方法で製造されたｓｈＲＮＡ発現ライブラリーを用いた遺伝子のスクリーニング方法であって、
前記ｓｈＲＮＡ発現ライブラリーが導入された第１の細胞集団と、前記ｓｈＲＮＡ発現ライブラリーが導入されていない第２の細胞集団との間の表現型の差異を検出し、
前記差異の原因である、ｓｈＲＮＡを同定することを特徴とする、方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２０１２−１０６８３（Ｐ２０１２−１０６８３Ａ）
【公開日】平成２４年１月１９日（２０１２．１．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１５３３０９（Ｐ２０１０−１５３３０９）
【出願日】平成２２年７月５日（２０１０．７．５）
【出願人】（８０３００００５６）財団法人ヒューマンサイエンス振興財団 (341)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１月１９日（２０１２．１．１９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年７月５日（２０１０．７．５）
【出願人】（８０３００００５６）財団法人ヒューマンサイエンス振興財団 (341)
【Ｆターム（参考）】
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