ｓｉＲＮＡおよびこれを用いたＣ２ＧｎＴ−ＩＲＮＡ合成阻害方法ならびに癌治療剤
【課題】正常組織に対しても毒性を有する抗癌剤とは異なる作用機序によって、より副作用の軽い癌治療に資する方法を提供する。
【解決手段】癌細胞の悪性度関連糖鎖コア２Ο−グリカンを合成する糖転移酵素ｃｏｒｅ２−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ−Ｉ：Ｃ２ＧｎＴ−Ｉ）のＲＮＡ合成を阻害するｓｉＲＮＡ（Ｃ２ＧｎＴのｓｉＲＮＡ）を癌治療剤に用いる。Ｃ２ＧｎＴのｓｉＲＮＡのＤＮＡ配列、およびそのａｎｔｉｓｅｎｓｅのＤＮＡ配列が導入されたプラスミド等のベクターを細胞に導入して、細胞内でｓｉＲＮＡを産生することができる。
【解決手段】癌細胞の悪性度関連糖鎖コア２Ο−グリカンを合成する糖転移酵素ｃｏｒｅ２−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ−Ｉ：Ｃ２ＧｎＴ−Ｉ）のＲＮＡ合成を阻害するｓｉＲＮＡ（Ｃ２ＧｎＴのｓｉＲＮＡ）を癌治療剤に用いる。Ｃ２ＧｎＴのｓｉＲＮＡのＤＮＡ配列、およびそのａｎｔｉｓｅｎｓｅのＤＮＡ配列が導入されたプラスミド等のベクターを細胞に導入して、細胞内でｓｉＲＮＡを産生することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はｓｉＲＮＡおよびこれを用いたＣ２ＧｎＴ−ＩＲＮＡ合成阻害方法ならびに癌治療剤に係り、特に、正常組織に対しても毒性を有する抗癌剤とは異なる作用機序によって、副作用の軽い治療を可能とする、ｓｉＲＮＡおよびこれを用いたＣ２ＧｎＴ−ＩＲＮＡ合成阻害方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗癌剤は癌細胞を死滅させるための薬剤であり、そのほとんどが化学療法剤である。抗癌剤の作用機序は、癌細胞のＤＮＡ合成を抑制したり、増殖を抑制するというものであり、現在、癌治療に広く用いられている。しかし抗癌剤は、正常細胞に対しても細胞毒性があるため、副作用を避けられない。それ故、癌の種類によっては、投与量の限界から、激しい副作用があるにも関わらず、満足のいく治療効果が得られない場合もある。また、比較的治療効果の高い種類の癌であっても、激しい副作用を回避できないことには変わりがない。
【０００３】
また、癌の種類に関わらず、抗癌剤の投与で減数した癌細胞が、抗癌剤継続中であっても再び増加してくることがある。これは、癌細胞が抗癌剤に対して耐性を帯びたためであるが、この場合、抗癌剤投与効果が無くなるだけではなく、逆に命を縮めることにもなりかねない。多剤併用等により耐性を抑える方法も使われているが、効果には限界がある。
【０００４】
したがって一般的には、癌抗癌剤は積極的に採用されているというよりも、他に効果的な治療法が無いために、激しい副作用にも関わらず用いられているというのが現状である。特に広範囲に浸潤した癌や転移した癌、外科手術その他の方法では根治不可能な部位に発生した癌の場合は、延命を図るには抗癌剤治療に頼るしかない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特許第３４５６７０４号公報「新規β１→６Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、そのアクセプター分子であるロイコシアリン、および酵素活性を有するタンパク質のクローニング方法」 なお、ここに開示された技術については、追って本発明との関連で言及する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
このように、激しい副作用を伴う抗癌剤に大きく依存せざるを得ない癌治療の現状を踏まえ、本発明が解決しようとする課題は、正常組織に対しても毒性を有する抗癌剤とは異なる作用機序によって、より副作用の軽い癌治療方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
さて本願発明者らは、上記課題について研究を重ねた結果、癌細胞の悪性度の源になる悪性度関連糖鎖を同定し、その糖鎖を合成する糖転移酵素（ｃｏｒｅ２−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ−Ｉ：Ｃ２ＧｎＴ−Ｉ）のＲＮＡ合成を阻害するｓｉＲＮＡを得ることにより、本発明の完成に至った。すなわち、上記課題を解決するための手段として本願で特許請求される発明、もしくは少なくとも開示される発明は、以下のとおりである。
【０００８】
〔その１〕 癌細胞の悪性度関連糖鎖コア２Ο−グリカンを合成する糖転移酵素ｃｏｒｅ２−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ−Ｉ：Ｃ２ＧｎＴ−Ｉ）のＲＮＡ合成を阻害する、ｓｉＲＮＡ。
〔その２〕 下記（１）ないし（３）のいずれかの塩基配列からなることを特徴とする、〔その１〕に記載のｓｉＲＮＡ。
（１）５’−ＧＡＡＵＣＣＵＡＧＵＡＧＵＧＡＵＡＵＵ−３’
（２）５’−ＧＵＡＡＡＧＣＵＵＧＡＧＡＵＣＣＵＡＡ−３’
（３）５’−ＣＡＡＵＡＧＣＡＵＡＵＵＣＵＡＵＡＧＵ−３’
〔その３〕 〔その１〕または〔その２〕に記載のｓｉＲＮＡを用いた、Ｃ２ＧｎＴ−ＩＲＮＡ合成阻害方法。
【０００９】
〔その４〕 〔その１〕または〔その２〕に記載のｓｉＲＮＡによる癌治療剤。
〔その５〕 〔その１〕または〔その２〕に記載のｓｉＲＮＡのＤＮＡ配列および該ｓｉＲＮＡのａｎｔｉｓｅｎｓｅのＤＮＡ配列が導入されたベクター。
なお、ｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）は、ＲＮＡ干渉に関与する低分子二本鎖ＲＮＡであり、ＲＮＡ合成を阻害するＲＮＡである。つまり、ｍＲＮＡの破壊によって配列特異的に遺伝子の発現を抑制する。
【００１０】
ところで、前掲特許文献１にはＣ２ＧｎＴの塩基配列およびアミノ酸配列が開示されている。しかしながら、ＲＮＡ干渉の利用、つまり転写したｍＲＮＡを分解することによって翻訳レベルでＣ２ＧｎＴの発現を抑制する方法については何ら開示されておらず、本願発明において初めて公に提供されるものである。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のｓｉＲＮＡおよびこれを用いたＣ２ＧｎＴ−ＩＲＮＡ合成阻害方法ならびに癌治療剤は上述のように構成されるため、これによれば、抗癌剤とは全く異なる作用機序によって、より副作用の軽い癌治療を行うことができる。また、抗癌剤との併用によって、副作用の軽減効果および治療効果がさらに優れた癌治療を実現することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ＹＴＳＣ２ＫＤなど各細胞株におけるＣ２ＧｎＴおよびＧＡＰＤＨの各ｍＲＮＡ量を示すグラフである。
【図２】ＹＴＳＣ２ＫＤ、ＹＴＳ各細胞株におけるＣ２ＧｎＴ酵素活性を示すグラフである。
【図３】ＹＴＳＣ２ＫＤ、ＹＴＳ各細胞の増殖曲線を示すグラフである。
【図４】ＹＴＳＣ２ＫＤ、ＹＴＳ各細胞の肺転移アッセイ結果を示すグラフである。
【図５】ＹＴＳＣ２ＫＤ、ＹＴＳ各細胞の細胞障害活性の測定結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明について、さらに詳細に説明する。
本発明を構成する発明群の中で、その基礎となる原理的発明は、癌細胞の悪性度関連糖鎖コア２Ο−グリカンを合成する糖転移酵素ｃｏｒｅ２−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ−Ｉ：Ｃ２ＧｎＴ−Ｉ）のＲＮＡ合成を阻害するｓｉＲＮＡ、つまり「Ｃ２ＧｎＴのｓｉＲＮＡ」である。その作用機序は、下記＜１＞〜＜３＞のとおりである。
【００１４】
＜１ 悪性度の高い癌細胞＞
悪性度の高い癌細胞では、悪性度関連糖鎖を合成する糖転移酵素であるところのＣ２ＧｎＴの発現によって合成された悪性度関連糖鎖コア２Ο−グリカンが、細胞表面に大量に存在する。Ｃ２ＧｎＴを発現した癌細胞は悪性度が高く、さらに合成されたコア２Ο−グリカンには、ＮＫ細胞による攻撃から癌細胞を防御する働きがある。このためコア２Ο−グリカンを持つ癌細胞は、本来浸潤能が高く、さらに宿主のＮＫ細胞による攻撃から逃れる性質があるため、体内で生存しやすくなり、総じて悪性度が高くなる。
【００１５】
＜２ Ｃ２ＧｎＴのｓｉＲＮＡを投与＞
かかるコア２Ο−グリカンが存在する癌細胞に、Ｃ２ＧｎＴに対するｓｉＲＮＡを与える。すると、当該癌細胞の細胞核の中で、Ｃ２ＧｎＴのｓｉＲＮＡはＲＮＡ干渉の現象を起こす。つまり、ｓｉＲＮＡはＣ２ＧｎＴのｍＲＮＡを分解し、Ｃ２ＧｎＴの発現を抑制する。その結果この癌細胞は、コア２Ο−グリカンを合成することができなくなる。
【００１６】
＜３ 癌細胞の悪性度低下と癌細胞死滅＞
コア２Ο−グリカンを合成することができなくなった癌細胞は、浸潤能や転移能を失う。さらに、それだけではなく、宿主のＮＫ細胞の攻撃から逃れることができなくなり、結局、癌細胞はＮＫ細胞の攻撃により死滅する。以上が、本発明「Ｃ２ＧｎＴのｓｉＲＮＡ」の作用機序である。
【００１７】
本発明「Ｃ２ＧｎＴのｓｉＲＮＡ」は、具体的には、下記（１）ないし（３）のいずれかの塩基配列のものを用いることができる。
（１）５’−ＧＡＡＵＣＣＵＡＧＵＡＧＵＧＡＵＡＵＵ−３’
（２）５’−ＧＵＡＡＡＧＣＵＵＧＡＧＡＵＣＣＵＡＡ−３’
（３）５’−ＣＡＡＵＡＧＣＡＵＡＵＵＣＵＡＵＡＧＵ−３’
【００１８】
本発明「Ｃ２ＧｎＴのｓｉＲＮＡ」により、Ｃ２ＧｎＴ−ＩＲＮＡ合成阻害方法は、具体的には当該ｓｉＲＮＡを用いた癌治療剤により実現できる。また、ｓｉＲＮＡの産生については、Ｃ２ＧｎＴのｓｉＲＮＡのＤＮＡ配列、およびそのａｎｔｉｓｅｎｓｅのＤＮＡ配列が導入されたプラスミド等のベクターを細胞に導入して、細胞内でｓｉＲＮＡを産生させればよい。
【実施例】
【００１９】
以下、本発明を実施例によってさらに詳細に説明するが、本発明がかかる実施例に限定されるものではない。なお実施例は、本願発明者による実験の概要を記すものである。
＜１ 実験方法＞
＜１−１ Ｃ２ＧｎＴのＲＮＡ干渉のための塩基配列＞
候補配列として、以下の３種類を選択した。
（１）５’−ＧＡＡＵＣＣＵＡＧＵＡＧＵＧＡＵＡＵＵ−３’
（２）５’−ＧＵＡＡＡＧＣＵＵＧＡＧＡＵＣＣＵＡＡ−３’
（３）５’−ＣＡＡＵＡＧＣＡＵＡＵＵＣＵＡＵＡＧＵ−３’
また、ｓｉＲＮＡ効果の検討のためには、以下の２本鎖ＲＮＡを細胞に導入して、Ｃ２ＧｎＴの発現の抑制を調べた。
５’−ＧＡＡＵＣＣＵＡＧＵＡＧＵＧＡＵＡＵＵＴＴ−３’
３’−ＴＴＣＵＵＡＧＧＡＵＣＡＵＣＡＣＵＡＵＡＡ−５’
なお、両鎖の３’末端のＴＴは、ａｄｄｉｔｉｏｎａｌ配列である。
【００２０】
安定発現株の樹立に際しては、
ＧＡＴＣＣＧＡＡＴＣＣＴＡＧＴＡＧＴＧＡＴＡＴＴＴＡＧＴＧＣＴＣＣＴＧＧＴＴＧＡＡＴＡＴＣＡＣＴＡＣＴＡＧＧＡＴＴＣＴＴＴＴＴＴＡ
というＤＮＡの配列をもったプラスミドを細胞に導入して、細胞内でｓｉＲＮＡを産生させた。この配列中、最初の下線が付されている部分は、上述の候補配列（１）のＤＮＡ配列であり、また２番目の下線が付されている部分は、候補配列（１）のａｎｔｉｓｎｓｅのＤＮＡ配列である。
ちなみに、対照のｓｉＲＮＡ（ｓｅｎｓｅ配列）は、次のとおりである。
５’−ＣＡＧＵＡＡＡＡＵＧＣＧＧＵＵＣＵＣＧ−３’
【００２１】
＜１−２ 高転移性膀胱癌細胞株ＹＴＳ−１のＣ２ＧｎＴ発現抑制株、およびそのコントロール細胞株の作製＞
６ウェルプレートにＹＴＳ−１細胞５ｘ１０５個／ウェルで細胞を播種し、２４時間培養したのち、ＴＡ０４７０−１プラスミド（Ｃ２ＧｎＴ ｓｉＲＮＡ発現プラスミド）、および、ｐＢＡｓｉ ｈＵ６ Ｎｅｏプラスミド（ｓｃｒａｍｂｌｅｄ ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｉＲＮＡ発現プラスミド）を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００試薬を用いて細胞に導入した。２４時間後、細胞を回収し、１／２０ 〜 １／６４０量の細胞を新しい６ｃｍディッシュに播種した。５時間培養したのち、選択薬剤Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎを最終濃度２００μｇ／ｍｌになるように添加し、薬剤選択を開始した。以後、３〜４日ごとに培地交換しながら、遺伝子導入細胞の選択を行った。薬剤選択開始１３日目から、増殖してきた細胞のコロニーをクローニングリングによりピックアップした。各遺伝子導入細胞は、２〜４ｘ１０６個まで増殖させたのち、凍結保存液を用いて細胞ストック、および、リアルタイムＰＣＲ解析用サンプルの調製を行い、−８０℃保存した。
【００２２】
＜１−３ 高転移性膀胱癌細胞株ＹＴＳ−１のＣ２ＧｎＴ発現抑制株、およびそのコントロール細胞株におけるＣ２ＧｎＴｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲによる定量＞
ＹＴＳ−１細胞の各安定発現株細胞３〜５ｘ１０５ｃｅｌｌｓより、ＦａｓｔＰｕｒｅ ＲＮＡキットを用いてｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。約５０μｌのＲＮＡ溶液を得た。各ｔｏｔａｌ ＲＮＡサンプルを１０ｎｇ／μｌに調製し、これらを鋳型にｒａｎｄｏｍプライマーを用いて逆転写反応を行い、ｃＤＮＡを得た。得られた各ｃＤＮＡサンプルを鋳型にＣｏｒｅ２ＧｎＴ遺伝子、および、ＧＡＰＤＨ遺伝子に対するＲｅａｌ Ｔｉｍｅ−ＰＣＲプライマーを用いてリアルタイムＰＣＲ装置Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ Ｄｉｃｅ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ Ｓｙｓｔｅｍにて定量リアルタイムＰＣＲ測定を行った。リアルタイムＰＣＲの結果から、Ｃｏｒｅ２ＧｎＴ遺伝子、および、ＧＡＰＤＨ遺伝子の発現相対量を求めた。ＹＴＳ−１（ｐａｒｅｎｔ）細胞における各遺伝子の相対発現量を１００とし、ＹＴＳ（ｓｃｒａｍｂｌｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｉＲＮＡ発現株）、および、ＹＴＳＣ２ＫＤ（Ｃ２ＧｎＴ ｓｉＲＮＡ発現株）における、ＧＡＰＤＨ遺伝子の発現相対量、および、Ｃｏｒｅ２ＧｎＴ遺伝子の発現相対量を求めた。
【００２３】
＜１−４ コア２ｂ−１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェレース（Ｃ２Ｇｎｔ）活性の測定＞
Ｃ２ＧｎＴ活性測定は、３ＨでラベルされたＵＤＰ−［３Ｈ］−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ（ＵＤＰ−［３Ｈ］−ＧｌｃＡｃ）を基質とし、パラニトロフェノール標識オリゴ糖（ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ−Ｇａｌｂ１−３ＧａｌＮＡｃ）への［３Ｈ］−ＧｌｃＡｃの転移反応を測定することで行った。
【００２４】
細胞を、０．４％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１５ｍＭＮａＣｌで破砕し、１６０００ｇで遠心分離した後、その上清を粗酵素抽出液とした。反応液の組成は、
５０ｍＭ ＭＥＳ、
ｐＨ７．０，１８．５ＧＢｑ ＵＤＰ−［３Ｈ］−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ（ＵＤＰ−［３Ｈ］−ＧｌｃＡｃ）（ＰｅｒｋｉｎｎＥｌｍｅｒ）、
１ｍＭ ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ、
０．１Ｍ ＧｌｃＮＡｃ、
１０ｍＭ ＥＤＴＡ、
１ｍＭ ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ−Ｇａｌｂ１−３ＧａｌＮＡｃ（Ｔｏｒｏｎｔｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）
であり、これに、粗酵素抽出液（２５０ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）を加え、３７℃で１時間反応を行った。反応後、反応液をＳｅｐＰａｋＣ１８カラム（Ｗａｔｅｒｓ）に通し、反応生成物であるｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ−Ｇａｌｂ１−３（［３Ｈ］−ＧｌｃＮＡｃｂ１−６）ＧａｌＮＡｃをカラムに吸着させ、その後、メタノールで生成物を溶出させ、溶出画分の放射活性を液体シンチレーションカウンターによって測定した。酵素活性は、粗酵素抽出液の１ｍｇタンパク質が、１時間に転移したＧｌｃＮＡｃのモル数で表した。
【００２５】
＜１−５ 高転移性膀胱癌細胞株ＹＴＳ−１のＣ２ＧｎＴ発現抑制株、およびそのコントロール細胞株の増殖能の測定＞
細胞数は、Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ−８（同仁化学）を用いて計数した。この測定法は、生細胞の脱水素酵素活性に基づく。各細胞を、９６穴プレートに１０００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種した。その後、各時間毎に脱水素酵素活性を測定した。
【００２６】
細胞を含む９６穴プレートのウェルに１０ｍｌのＣｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ−８の測定用溶液（ＣＣＫ−８溶液）を加え、４時間呈色反応を行い、マイクロプレートリーダーＥＩＡ ＲＥＡＤＥＲ Ｍｏｄｅｌ１２５５０（ＢＩＯ−ＲＡＤ）で４５０ｎｍの吸光度を測定した。脱水素酵素活性（吸光度）と細胞数は比例関係にあるため、細胞の増殖を吸光度の増加で表した。
【００２７】
＜１−６ マウスを用いた肺転移アッセイ＞
細胞をｓｅｒｕｍ−ｆｒｅｅのＲＰＭＩ−１６４０培地に、２×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度で懸濁した。細胞懸濁液１００ｍｌ（２×１０６ｃｅｌｌｓ）を、日本クレア社の７週齢のメスのＢａｌｂ／ｃヌードマウス（ｎｕ／ｎｕ）に、マイクロシリンジ（ＮＩＰＲＯ０．５ｍｌ）と、２３Ｇ×１３ｍｍ（ＮＩＰＲＯ）の注射針を使って、尾静脈から注入した。３週間後、各マウスの体重を測定後、マウスをサクリファイスし、肺を摘出し、重量を測定した。その後、肺を１０％ホルマリンで固定した。培地のみを注入したマウスの肺重量を対照とし、細胞を注入した各マウスの肺重量の対照に対する増加分を計算し、これを各細胞の肺転移として表した。
【００２８】
＜１−７ ＮＫ細胞による細胞障害活性の測定＞
細胞障害活性は、Ｐｒｏｍｅｇａ社のキット、ＣｙｔｏＴｏｘ ９６ Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ａｓｓａｙを用いて行った。このキットは、ＮＫ細胞によって障害を受けたターゲット細胞から漏出してくるＬａｃｔａｔｅ Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ＬＤＨ）の活性を測定することで、細胞障害活性を評価するものである。
【００２９】
末梢血５０ｍｌから、Ｆｉｃｏｌｌ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の密度勾配遠心によって単球画分を得た。この単球画分をグラスウールカラム（和光）に通し、吸着しなかった画分を回収し、この画分に含まれるＮＫ細胞を０．２ｍｇ／ｍｌのＩＬ−２（和光）で３日間刺激して、エフェクター細胞として用いた。エフェクター細胞と、ターゲット細胞である膀胱癌細胞を９６穴プレートで３７℃、４時間インキュベートした。インキュベート後、上清を回収し、上清中に細胞から漏出してきたＬＤＨの活性をＣｙｔｏＴｏｘ ９６ Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ａｓｓａｙを用いて測定した。ターゲット細胞中の全ＬＤＨ活性に対し、細胞障害によって漏出してきたＬＤＨ活性の割合を計算し、細胞障害活性を表した。
【００３０】
＜２ 実験結果＞
＜２−１ 高転移性膀胱癌細胞株ＹＴＳ−１のＣ２ＧｎＴ発現抑制株、およびそのコントロール細胞株の作製＞
上記＜１−２＞に述べた方法により、各遺伝子導入細胞の細胞ストックおよび、リアルタイムＰＣＲ解析用サンプルを調製、凍結保存した。
【００３１】
＜２−２ 高転移性膀胱癌細胞株ＹＴＳ−１のＣ２ＧｎＴ発現抑制株、およびそのコントロール細胞株におけるＣ２ＧｎＴｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲによる定量＞
図１は、ＹＴＳＣ２ＫＤなど各細胞株におけるＣ２ＧｎＴおよびＧＡＰＤＨの各ｍＲＮＡ量を示すグラフである。図示するように、Ｃ２ＧｎＴに対するｓｉＲＮＡ（ｓｉＣ２ＧｎＴ）を発現する細胞株、コントロールのｓｉＲＮＡ（ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ）を発現する細胞株、および、親株であるＹＴＳ−１（Ｐａｒｅｎｔ）、それぞれの間で、ハウスキーピング遺伝子であるグリセロアルデヒド脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）のｍＲＮＡ量には、有意な差は認められなかった。
【００３２】
これに対し、Ｃ２ＧｎＴに対するｓｉＲＮＡ（ｓｉＣ２ＧｎＴ）を発現する細胞株では、コントロールのｓｉＲＮＡ（ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ）、および親株ＹＴＳ−１（Ｐａｒｅｎｔ）を発現する細胞株に比べて、Ｃ２ＧｎＴのｍＲＮＡ量が著しく低下していた。Ｃ２ＧｎＴに対するｓｉＲＮＡ（ｓｉＣ２ＧｎＴ）は、Ｃ２ＧｎＴ発現を効率よく抑制したことがわかった。Ｃ２ＧｎＴに対するｓｉＲＮＡを発現する細胞株の代表として一つを選び、コントロールのｓｉＲＮＡを発現する細胞株としてはＮｅｇａ．ｐｏｏｌを選び、それぞれを、ＹＴＳＣ２ＫＤ、ＹＴＳと呼び、以下の実験に用いた。
【００３３】
＜２−３ コア２ｂ−１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェレース（Ｃ２Ｇｎｔ）活性の測定＞
図２は、ＹＴＳＣ２ＫＤ、ＹＴＳ各細胞株におけるＣ２ＧｎＴ酵素活性を示すグラフである。図示するように、ＹＴＳＣ２ＫＤではＹＴＳに比べて、Ｃ２Ｇｎｔ活性が著しく低下していた。このことによって、Ｃ２ＧｎＴに対するｓｉＲＮＡ（ｓｉＣ２ＧｎＴ）がＣ２ＧｎＴ発現を効率よく抑制したことが、Ｃ２ＧｎＴ活性によっても確認された。
【００３４】
＜２−４ 高転移性膀胱癌細胞株ＹＴＳ−１のＣ２ＧｎＴ発現抑制株、およびそのコントロール細胞株の増殖能の比較＞
図３は、ＹＴＳＣ２ＫＤ、ＹＴＳ各細胞の増殖曲線を示すグラフである。図示するように、両者の増殖には有意な差は見られなかった。Ｃ２ＧｎＴの発現量は、細胞の増殖能には全く影響を及ぼしていないことがわかった。
【００３５】
＜２−５ マウスを用いた肺転移アッセイ＞
図４は、ＹＴＳＣ２ＫＤ、ＹＴＳ各細胞の肺転移アッセイ結果を示すグラフである。図示するように、細胞をマウス尾静脈から注入した場合、ＹＴＳＣ２ＫＤはＹＴＳＣ２ＫＤに比べて肺転移が低かった。このことは、ＹＴＳＣ２ＫＤの方がＹＴＳに比べてマウス内で生き残りにくいことを意味し、Ｃ２ＧｎＴの発現を抑えると、ＹＴＳＣ２ＫＤはマウスの免疫システムによって排除されやすくなることがわかった。
【００３６】
＜２−６ ＮＫ細胞による細胞障害活性の測定＞
図５は、ＹＴＳＣ２ＫＤ、ＹＴＳ各細胞の細胞障害活性の測定結果を示すグラフである。図示するように、ＹＴＳＣ２ＫＤはＹＴＳに比べて、ＮＫ細胞による細胞障害活性が高かった。膀胱癌細胞では、Ｃ２ＧｎＴの発現を抑えるとＮＫ細胞の攻撃による障害を受けやすくなることがわかった。このことが、ＹＴＳＣ２ＫＤの方がＹＴＳに比べて肺転移が低くなる主要な原因であると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００３７】
本発明のｓｉＲＮＡおよびこれを用いたＣ２ＧｎＴ−ＩＲＮＡ合成阻害方法等によれば、激しい副作用を伴う抗癌剤に大きく依存せざるを得ない従来の癌治療の現状を改善することができる。つまり、副作用の軽い癌治療が可能となるため、医療関連産業上の利用性が高い発明である。
【技術分野】
【０００１】
本発明はｓｉＲＮＡおよびこれを用いたＣ２ＧｎＴ−ＩＲＮＡ合成阻害方法ならびに癌治療剤に係り、特に、正常組織に対しても毒性を有する抗癌剤とは異なる作用機序によって、副作用の軽い治療を可能とする、ｓｉＲＮＡおよびこれを用いたＣ２ＧｎＴ−ＩＲＮＡ合成阻害方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗癌剤は癌細胞を死滅させるための薬剤であり、そのほとんどが化学療法剤である。抗癌剤の作用機序は、癌細胞のＤＮＡ合成を抑制したり、増殖を抑制するというものであり、現在、癌治療に広く用いられている。しかし抗癌剤は、正常細胞に対しても細胞毒性があるため、副作用を避けられない。それ故、癌の種類によっては、投与量の限界から、激しい副作用があるにも関わらず、満足のいく治療効果が得られない場合もある。また、比較的治療効果の高い種類の癌であっても、激しい副作用を回避できないことには変わりがない。
【０００３】
また、癌の種類に関わらず、抗癌剤の投与で減数した癌細胞が、抗癌剤継続中であっても再び増加してくることがある。これは、癌細胞が抗癌剤に対して耐性を帯びたためであるが、この場合、抗癌剤投与効果が無くなるだけではなく、逆に命を縮めることにもなりかねない。多剤併用等により耐性を抑える方法も使われているが、効果には限界がある。
【０００４】
したがって一般的には、癌抗癌剤は積極的に採用されているというよりも、他に効果的な治療法が無いために、激しい副作用にも関わらず用いられているというのが現状である。特に広範囲に浸潤した癌や転移した癌、外科手術その他の方法では根治不可能な部位に発生した癌の場合は、延命を図るには抗癌剤治療に頼るしかない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特許第３４５６７０４号公報「新規β１→６Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、そのアクセプター分子であるロイコシアリン、および酵素活性を有するタンパク質のクローニング方法」 なお、ここに開示された技術については、追って本発明との関連で言及する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
このように、激しい副作用を伴う抗癌剤に大きく依存せざるを得ない癌治療の現状を踏まえ、本発明が解決しようとする課題は、正常組織に対しても毒性を有する抗癌剤とは異なる作用機序によって、より副作用の軽い癌治療方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
さて本願発明者らは、上記課題について研究を重ねた結果、癌細胞の悪性度の源になる悪性度関連糖鎖を同定し、その糖鎖を合成する糖転移酵素（ｃｏｒｅ２−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ−Ｉ：Ｃ２ＧｎＴ−Ｉ）のＲＮＡ合成を阻害するｓｉＲＮＡを得ることにより、本発明の完成に至った。すなわち、上記課題を解決するための手段として本願で特許請求される発明、もしくは少なくとも開示される発明は、以下のとおりである。
【０００８】
〔その１〕 癌細胞の悪性度関連糖鎖コア２Ο−グリカンを合成する糖転移酵素ｃｏｒｅ２−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ−Ｉ：Ｃ２ＧｎＴ−Ｉ）のＲＮＡ合成を阻害する、ｓｉＲＮＡ。
〔その２〕 下記（１）ないし（３）のいずれかの塩基配列からなることを特徴とする、〔その１〕に記載のｓｉＲＮＡ。
（１）５’−ＧＡＡＵＣＣＵＡＧＵＡＧＵＧＡＵＡＵＵ−３’
（２）５’−ＧＵＡＡＡＧＣＵＵＧＡＧＡＵＣＣＵＡＡ−３’
（３）５’−ＣＡＡＵＡＧＣＡＵＡＵＵＣＵＡＵＡＧＵ−３’
〔その３〕 〔その１〕または〔その２〕に記載のｓｉＲＮＡを用いた、Ｃ２ＧｎＴ−ＩＲＮＡ合成阻害方法。
【０００９】
〔その４〕 〔その１〕または〔その２〕に記載のｓｉＲＮＡによる癌治療剤。
〔その５〕 〔その１〕または〔その２〕に記載のｓｉＲＮＡのＤＮＡ配列および該ｓｉＲＮＡのａｎｔｉｓｅｎｓｅのＤＮＡ配列が導入されたベクター。
なお、ｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）は、ＲＮＡ干渉に関与する低分子二本鎖ＲＮＡであり、ＲＮＡ合成を阻害するＲＮＡである。つまり、ｍＲＮＡの破壊によって配列特異的に遺伝子の発現を抑制する。
【００１０】
ところで、前掲特許文献１にはＣ２ＧｎＴの塩基配列およびアミノ酸配列が開示されている。しかしながら、ＲＮＡ干渉の利用、つまり転写したｍＲＮＡを分解することによって翻訳レベルでＣ２ＧｎＴの発現を抑制する方法については何ら開示されておらず、本願発明において初めて公に提供されるものである。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のｓｉＲＮＡおよびこれを用いたＣ２ＧｎＴ−ＩＲＮＡ合成阻害方法ならびに癌治療剤は上述のように構成されるため、これによれば、抗癌剤とは全く異なる作用機序によって、より副作用の軽い癌治療を行うことができる。また、抗癌剤との併用によって、副作用の軽減効果および治療効果がさらに優れた癌治療を実現することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ＹＴＳＣ２ＫＤなど各細胞株におけるＣ２ＧｎＴおよびＧＡＰＤＨの各ｍＲＮＡ量を示すグラフである。
【図２】ＹＴＳＣ２ＫＤ、ＹＴＳ各細胞株におけるＣ２ＧｎＴ酵素活性を示すグラフである。
【図３】ＹＴＳＣ２ＫＤ、ＹＴＳ各細胞の増殖曲線を示すグラフである。
【図４】ＹＴＳＣ２ＫＤ、ＹＴＳ各細胞の肺転移アッセイ結果を示すグラフである。
【図５】ＹＴＳＣ２ＫＤ、ＹＴＳ各細胞の細胞障害活性の測定結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明について、さらに詳細に説明する。
本発明を構成する発明群の中で、その基礎となる原理的発明は、癌細胞の悪性度関連糖鎖コア２Ο−グリカンを合成する糖転移酵素ｃｏｒｅ２−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ−Ｉ：Ｃ２ＧｎＴ−Ｉ）のＲＮＡ合成を阻害するｓｉＲＮＡ、つまり「Ｃ２ＧｎＴのｓｉＲＮＡ」である。その作用機序は、下記＜１＞〜＜３＞のとおりである。
【００１４】
＜１ 悪性度の高い癌細胞＞
悪性度の高い癌細胞では、悪性度関連糖鎖を合成する糖転移酵素であるところのＣ２ＧｎＴの発現によって合成された悪性度関連糖鎖コア２Ο−グリカンが、細胞表面に大量に存在する。Ｃ２ＧｎＴを発現した癌細胞は悪性度が高く、さらに合成されたコア２Ο−グリカンには、ＮＫ細胞による攻撃から癌細胞を防御する働きがある。このためコア２Ο−グリカンを持つ癌細胞は、本来浸潤能が高く、さらに宿主のＮＫ細胞による攻撃から逃れる性質があるため、体内で生存しやすくなり、総じて悪性度が高くなる。
【００１５】
＜２ Ｃ２ＧｎＴのｓｉＲＮＡを投与＞
かかるコア２Ο−グリカンが存在する癌細胞に、Ｃ２ＧｎＴに対するｓｉＲＮＡを与える。すると、当該癌細胞の細胞核の中で、Ｃ２ＧｎＴのｓｉＲＮＡはＲＮＡ干渉の現象を起こす。つまり、ｓｉＲＮＡはＣ２ＧｎＴのｍＲＮＡを分解し、Ｃ２ＧｎＴの発現を抑制する。その結果この癌細胞は、コア２Ο−グリカンを合成することができなくなる。
【００１６】
＜３ 癌細胞の悪性度低下と癌細胞死滅＞
コア２Ο−グリカンを合成することができなくなった癌細胞は、浸潤能や転移能を失う。さらに、それだけではなく、宿主のＮＫ細胞の攻撃から逃れることができなくなり、結局、癌細胞はＮＫ細胞の攻撃により死滅する。以上が、本発明「Ｃ２ＧｎＴのｓｉＲＮＡ」の作用機序である。
【００１７】
本発明「Ｃ２ＧｎＴのｓｉＲＮＡ」は、具体的には、下記（１）ないし（３）のいずれかの塩基配列のものを用いることができる。
（１）５’−ＧＡＡＵＣＣＵＡＧＵＡＧＵＧＡＵＡＵＵ−３’
（２）５’−ＧＵＡＡＡＧＣＵＵＧＡＧＡＵＣＣＵＡＡ−３’
（３）５’−ＣＡＡＵＡＧＣＡＵＡＵＵＣＵＡＵＡＧＵ−３’
【００１８】
本発明「Ｃ２ＧｎＴのｓｉＲＮＡ」により、Ｃ２ＧｎＴ−ＩＲＮＡ合成阻害方法は、具体的には当該ｓｉＲＮＡを用いた癌治療剤により実現できる。また、ｓｉＲＮＡの産生については、Ｃ２ＧｎＴのｓｉＲＮＡのＤＮＡ配列、およびそのａｎｔｉｓｅｎｓｅのＤＮＡ配列が導入されたプラスミド等のベクターを細胞に導入して、細胞内でｓｉＲＮＡを産生させればよい。
【実施例】
【００１９】
以下、本発明を実施例によってさらに詳細に説明するが、本発明がかかる実施例に限定されるものではない。なお実施例は、本願発明者による実験の概要を記すものである。
＜１ 実験方法＞
＜１−１ Ｃ２ＧｎＴのＲＮＡ干渉のための塩基配列＞
候補配列として、以下の３種類を選択した。
（１）５’−ＧＡＡＵＣＣＵＡＧＵＡＧＵＧＡＵＡＵＵ−３’
（２）５’−ＧＵＡＡＡＧＣＵＵＧＡＧＡＵＣＣＵＡＡ−３’
（３）５’−ＣＡＡＵＡＧＣＡＵＡＵＵＣＵＡＵＡＧＵ−３’
また、ｓｉＲＮＡ効果の検討のためには、以下の２本鎖ＲＮＡを細胞に導入して、Ｃ２ＧｎＴの発現の抑制を調べた。
５’−ＧＡＡＵＣＣＵＡＧＵＡＧＵＧＡＵＡＵＵＴＴ−３’
３’−ＴＴＣＵＵＡＧＧＡＵＣＡＵＣＡＣＵＡＵＡＡ−５’
なお、両鎖の３’末端のＴＴは、ａｄｄｉｔｉｏｎａｌ配列である。
【００２０】
安定発現株の樹立に際しては、
ＧＡＴＣＣＧＡＡＴＣＣＴＡＧＴＡＧＴＧＡＴＡＴＴＴＡＧＴＧＣＴＣＣＴＧＧＴＴＧＡＡＴＡＴＣＡＣＴＡＣＴＡＧＧＡＴＴＣＴＴＴＴＴＴＡ
というＤＮＡの配列をもったプラスミドを細胞に導入して、細胞内でｓｉＲＮＡを産生させた。この配列中、最初の下線が付されている部分は、上述の候補配列（１）のＤＮＡ配列であり、また２番目の下線が付されている部分は、候補配列（１）のａｎｔｉｓｎｓｅのＤＮＡ配列である。
ちなみに、対照のｓｉＲＮＡ（ｓｅｎｓｅ配列）は、次のとおりである。
５’−ＣＡＧＵＡＡＡＡＵＧＣＧＧＵＵＣＵＣＧ−３’
【００２１】
＜１−２ 高転移性膀胱癌細胞株ＹＴＳ−１のＣ２ＧｎＴ発現抑制株、およびそのコントロール細胞株の作製＞
６ウェルプレートにＹＴＳ−１細胞５ｘ１０５個／ウェルで細胞を播種し、２４時間培養したのち、ＴＡ０４７０−１プラスミド（Ｃ２ＧｎＴ ｓｉＲＮＡ発現プラスミド）、および、ｐＢＡｓｉ ｈＵ６ Ｎｅｏプラスミド（ｓｃｒａｍｂｌｅｄ ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｉＲＮＡ発現プラスミド）を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００試薬を用いて細胞に導入した。２４時間後、細胞を回収し、１／２０ 〜 １／６４０量の細胞を新しい６ｃｍディッシュに播種した。５時間培養したのち、選択薬剤Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎを最終濃度２００μｇ／ｍｌになるように添加し、薬剤選択を開始した。以後、３〜４日ごとに培地交換しながら、遺伝子導入細胞の選択を行った。薬剤選択開始１３日目から、増殖してきた細胞のコロニーをクローニングリングによりピックアップした。各遺伝子導入細胞は、２〜４ｘ１０６個まで増殖させたのち、凍結保存液を用いて細胞ストック、および、リアルタイムＰＣＲ解析用サンプルの調製を行い、−８０℃保存した。
【００２２】
＜１−３ 高転移性膀胱癌細胞株ＹＴＳ−１のＣ２ＧｎＴ発現抑制株、およびそのコントロール細胞株におけるＣ２ＧｎＴｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲによる定量＞
ＹＴＳ−１細胞の各安定発現株細胞３〜５ｘ１０５ｃｅｌｌｓより、ＦａｓｔＰｕｒｅ ＲＮＡキットを用いてｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。約５０μｌのＲＮＡ溶液を得た。各ｔｏｔａｌ ＲＮＡサンプルを１０ｎｇ／μｌに調製し、これらを鋳型にｒａｎｄｏｍプライマーを用いて逆転写反応を行い、ｃＤＮＡを得た。得られた各ｃＤＮＡサンプルを鋳型にＣｏｒｅ２ＧｎＴ遺伝子、および、ＧＡＰＤＨ遺伝子に対するＲｅａｌ Ｔｉｍｅ−ＰＣＲプライマーを用いてリアルタイムＰＣＲ装置Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ Ｄｉｃｅ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ Ｓｙｓｔｅｍにて定量リアルタイムＰＣＲ測定を行った。リアルタイムＰＣＲの結果から、Ｃｏｒｅ２ＧｎＴ遺伝子、および、ＧＡＰＤＨ遺伝子の発現相対量を求めた。ＹＴＳ−１（ｐａｒｅｎｔ）細胞における各遺伝子の相対発現量を１００とし、ＹＴＳ（ｓｃｒａｍｂｌｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｉＲＮＡ発現株）、および、ＹＴＳＣ２ＫＤ（Ｃ２ＧｎＴ ｓｉＲＮＡ発現株）における、ＧＡＰＤＨ遺伝子の発現相対量、および、Ｃｏｒｅ２ＧｎＴ遺伝子の発現相対量を求めた。
【００２３】
＜１−４ コア２ｂ−１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェレース（Ｃ２Ｇｎｔ）活性の測定＞
Ｃ２ＧｎＴ活性測定は、３ＨでラベルされたＵＤＰ−［３Ｈ］−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ（ＵＤＰ−［３Ｈ］−ＧｌｃＡｃ）を基質とし、パラニトロフェノール標識オリゴ糖（ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ−Ｇａｌｂ１−３ＧａｌＮＡｃ）への［３Ｈ］−ＧｌｃＡｃの転移反応を測定することで行った。
【００２４】
細胞を、０．４％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１５ｍＭＮａＣｌで破砕し、１６０００ｇで遠心分離した後、その上清を粗酵素抽出液とした。反応液の組成は、
５０ｍＭ ＭＥＳ、
ｐＨ７．０，１８．５ＧＢｑ ＵＤＰ−［３Ｈ］−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ（ＵＤＰ−［３Ｈ］−ＧｌｃＡｃ）（ＰｅｒｋｉｎｎＥｌｍｅｒ）、
１ｍＭ ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ、
０．１Ｍ ＧｌｃＮＡｃ、
１０ｍＭ ＥＤＴＡ、
１ｍＭ ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ−Ｇａｌｂ１−３ＧａｌＮＡｃ（Ｔｏｒｏｎｔｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）
であり、これに、粗酵素抽出液（２５０ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）を加え、３７℃で１時間反応を行った。反応後、反応液をＳｅｐＰａｋＣ１８カラム（Ｗａｔｅｒｓ）に通し、反応生成物であるｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ−Ｇａｌｂ１−３（［３Ｈ］−ＧｌｃＮＡｃｂ１−６）ＧａｌＮＡｃをカラムに吸着させ、その後、メタノールで生成物を溶出させ、溶出画分の放射活性を液体シンチレーションカウンターによって測定した。酵素活性は、粗酵素抽出液の１ｍｇタンパク質が、１時間に転移したＧｌｃＮＡｃのモル数で表した。
【００２５】
＜１−５ 高転移性膀胱癌細胞株ＹＴＳ−１のＣ２ＧｎＴ発現抑制株、およびそのコントロール細胞株の増殖能の測定＞
細胞数は、Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ−８（同仁化学）を用いて計数した。この測定法は、生細胞の脱水素酵素活性に基づく。各細胞を、９６穴プレートに１０００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種した。その後、各時間毎に脱水素酵素活性を測定した。
【００２６】
細胞を含む９６穴プレートのウェルに１０ｍｌのＣｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ−８の測定用溶液（ＣＣＫ−８溶液）を加え、４時間呈色反応を行い、マイクロプレートリーダーＥＩＡ ＲＥＡＤＥＲ Ｍｏｄｅｌ１２５５０（ＢＩＯ−ＲＡＤ）で４５０ｎｍの吸光度を測定した。脱水素酵素活性（吸光度）と細胞数は比例関係にあるため、細胞の増殖を吸光度の増加で表した。
【００２７】
＜１−６ マウスを用いた肺転移アッセイ＞
細胞をｓｅｒｕｍ−ｆｒｅｅのＲＰＭＩ−１６４０培地に、２×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度で懸濁した。細胞懸濁液１００ｍｌ（２×１０６ｃｅｌｌｓ）を、日本クレア社の７週齢のメスのＢａｌｂ／ｃヌードマウス（ｎｕ／ｎｕ）に、マイクロシリンジ（ＮＩＰＲＯ０．５ｍｌ）と、２３Ｇ×１３ｍｍ（ＮＩＰＲＯ）の注射針を使って、尾静脈から注入した。３週間後、各マウスの体重を測定後、マウスをサクリファイスし、肺を摘出し、重量を測定した。その後、肺を１０％ホルマリンで固定した。培地のみを注入したマウスの肺重量を対照とし、細胞を注入した各マウスの肺重量の対照に対する増加分を計算し、これを各細胞の肺転移として表した。
【００２８】
＜１−７ ＮＫ細胞による細胞障害活性の測定＞
細胞障害活性は、Ｐｒｏｍｅｇａ社のキット、ＣｙｔｏＴｏｘ ９６ Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ａｓｓａｙを用いて行った。このキットは、ＮＫ細胞によって障害を受けたターゲット細胞から漏出してくるＬａｃｔａｔｅ Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ＬＤＨ）の活性を測定することで、細胞障害活性を評価するものである。
【００２９】
末梢血５０ｍｌから、Ｆｉｃｏｌｌ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の密度勾配遠心によって単球画分を得た。この単球画分をグラスウールカラム（和光）に通し、吸着しなかった画分を回収し、この画分に含まれるＮＫ細胞を０．２ｍｇ／ｍｌのＩＬ−２（和光）で３日間刺激して、エフェクター細胞として用いた。エフェクター細胞と、ターゲット細胞である膀胱癌細胞を９６穴プレートで３７℃、４時間インキュベートした。インキュベート後、上清を回収し、上清中に細胞から漏出してきたＬＤＨの活性をＣｙｔｏＴｏｘ ９６ Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ａｓｓａｙを用いて測定した。ターゲット細胞中の全ＬＤＨ活性に対し、細胞障害によって漏出してきたＬＤＨ活性の割合を計算し、細胞障害活性を表した。
【００３０】
＜２ 実験結果＞
＜２−１ 高転移性膀胱癌細胞株ＹＴＳ−１のＣ２ＧｎＴ発現抑制株、およびそのコントロール細胞株の作製＞
上記＜１−２＞に述べた方法により、各遺伝子導入細胞の細胞ストックおよび、リアルタイムＰＣＲ解析用サンプルを調製、凍結保存した。
【００３１】
＜２−２ 高転移性膀胱癌細胞株ＹＴＳ−１のＣ２ＧｎＴ発現抑制株、およびそのコントロール細胞株におけるＣ２ＧｎＴｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲによる定量＞
図１は、ＹＴＳＣ２ＫＤなど各細胞株におけるＣ２ＧｎＴおよびＧＡＰＤＨの各ｍＲＮＡ量を示すグラフである。図示するように、Ｃ２ＧｎＴに対するｓｉＲＮＡ（ｓｉＣ２ＧｎＴ）を発現する細胞株、コントロールのｓｉＲＮＡ（ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ）を発現する細胞株、および、親株であるＹＴＳ−１（Ｐａｒｅｎｔ）、それぞれの間で、ハウスキーピング遺伝子であるグリセロアルデヒド脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）のｍＲＮＡ量には、有意な差は認められなかった。
【００３２】
これに対し、Ｃ２ＧｎＴに対するｓｉＲＮＡ（ｓｉＣ２ＧｎＴ）を発現する細胞株では、コントロールのｓｉＲＮＡ（ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ）、および親株ＹＴＳ−１（Ｐａｒｅｎｔ）を発現する細胞株に比べて、Ｃ２ＧｎＴのｍＲＮＡ量が著しく低下していた。Ｃ２ＧｎＴに対するｓｉＲＮＡ（ｓｉＣ２ＧｎＴ）は、Ｃ２ＧｎＴ発現を効率よく抑制したことがわかった。Ｃ２ＧｎＴに対するｓｉＲＮＡを発現する細胞株の代表として一つを選び、コントロールのｓｉＲＮＡを発現する細胞株としてはＮｅｇａ．ｐｏｏｌを選び、それぞれを、ＹＴＳＣ２ＫＤ、ＹＴＳと呼び、以下の実験に用いた。
【００３３】
＜２−３ コア２ｂ−１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェレース（Ｃ２Ｇｎｔ）活性の測定＞
図２は、ＹＴＳＣ２ＫＤ、ＹＴＳ各細胞株におけるＣ２ＧｎＴ酵素活性を示すグラフである。図示するように、ＹＴＳＣ２ＫＤではＹＴＳに比べて、Ｃ２Ｇｎｔ活性が著しく低下していた。このことによって、Ｃ２ＧｎＴに対するｓｉＲＮＡ（ｓｉＣ２ＧｎＴ）がＣ２ＧｎＴ発現を効率よく抑制したことが、Ｃ２ＧｎＴ活性によっても確認された。
【００３４】
＜２−４ 高転移性膀胱癌細胞株ＹＴＳ−１のＣ２ＧｎＴ発現抑制株、およびそのコントロール細胞株の増殖能の比較＞
図３は、ＹＴＳＣ２ＫＤ、ＹＴＳ各細胞の増殖曲線を示すグラフである。図示するように、両者の増殖には有意な差は見られなかった。Ｃ２ＧｎＴの発現量は、細胞の増殖能には全く影響を及ぼしていないことがわかった。
【００３５】
＜２−５ マウスを用いた肺転移アッセイ＞
図４は、ＹＴＳＣ２ＫＤ、ＹＴＳ各細胞の肺転移アッセイ結果を示すグラフである。図示するように、細胞をマウス尾静脈から注入した場合、ＹＴＳＣ２ＫＤはＹＴＳＣ２ＫＤに比べて肺転移が低かった。このことは、ＹＴＳＣ２ＫＤの方がＹＴＳに比べてマウス内で生き残りにくいことを意味し、Ｃ２ＧｎＴの発現を抑えると、ＹＴＳＣ２ＫＤはマウスの免疫システムによって排除されやすくなることがわかった。
【００３６】
＜２−６ ＮＫ細胞による細胞障害活性の測定＞
図５は、ＹＴＳＣ２ＫＤ、ＹＴＳ各細胞の細胞障害活性の測定結果を示すグラフである。図示するように、ＹＴＳＣ２ＫＤはＹＴＳに比べて、ＮＫ細胞による細胞障害活性が高かった。膀胱癌細胞では、Ｃ２ＧｎＴの発現を抑えるとＮＫ細胞の攻撃による障害を受けやすくなることがわかった。このことが、ＹＴＳＣ２ＫＤの方がＹＴＳに比べて肺転移が低くなる主要な原因であると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００３７】
本発明のｓｉＲＮＡおよびこれを用いたＣ２ＧｎＴ−ＩＲＮＡ合成阻害方法等によれば、激しい副作用を伴う抗癌剤に大きく依存せざるを得ない従来の癌治療の現状を改善することができる。つまり、副作用の軽い癌治療が可能となるため、医療関連産業上の利用性が高い発明である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌細胞の悪性度関連糖鎖コア２Ο−グリカンを合成する糖転移酵素ｃｏｒｅ２−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ−Ｉ：Ｃ２ＧｎＴ−Ｉ）のＲＮＡ合成を阻害する、ｓｉＲＮＡ。
【請求項２】
下記（１）ないし（３）のいずれかの塩基配列からなることを特徴とする、請求項１に記載のｓｉＲＮＡ。
（１）５’−ＧＡＡＵＣＣＵＡＧＵＡＧＵＧＡＵＡＵＵ−３’
（２）５’−ＧＵＡＡＡＧＣＵＵＧＡＧＡＵＣＣＵＡＡ−３’
（３）５’−ＣＡＡＵＡＧＣＡＵＡＵＵＣＵＡＵＡＧＵ−３’
【請求項３】
請求項１または２に記載のｓｉＲＮＡを用いた、Ｃ２ＧｎＴ−ＩＲＮＡ合成阻害方法。
【請求項４】
請求項１または２に記載のｓｉＲＮＡによる癌治療剤。
【請求項５】
請求項１または２に記載のｓｉＲＮＡのＤＮＡ配列および該ｓｉＲＮＡのａｎｔｉｓｅｎｓｅのＤＮＡ配列が導入されたベクター。
【請求項１】
癌細胞の悪性度関連糖鎖コア２Ο−グリカンを合成する糖転移酵素ｃｏｒｅ２−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ−Ｉ：Ｃ２ＧｎＴ−Ｉ）のＲＮＡ合成を阻害する、ｓｉＲＮＡ。
【請求項２】
下記（１）ないし（３）のいずれかの塩基配列からなることを特徴とする、請求項１に記載のｓｉＲＮＡ。
（１）５’−ＧＡＡＵＣＣＵＡＧＵＡＧＵＧＡＵＡＵＵ−３’
（２）５’−ＧＵＡＡＡＧＣＵＵＧＡＧＡＵＣＣＵＡＡ−３’
（３）５’−ＣＡＡＵＡＧＣＡＵＡＵＵＣＵＡＵＡＧＵ−３’
【請求項３】
請求項１または２に記載のｓｉＲＮＡを用いた、Ｃ２ＧｎＴ−ＩＲＮＡ合成阻害方法。
【請求項４】
請求項１または２に記載のｓｉＲＮＡによる癌治療剤。
【請求項５】
請求項１または２に記載のｓｉＲＮＡのＤＮＡ配列および該ｓｉＲＮＡのａｎｔｉｓｅｎｓｅのＤＮＡ配列が導入されたベクター。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２０１２−３９９１１（Ｐ２０１２−３９９１１Ａ）
【公開日】平成２４年３月１日（２０１２．３．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１８２６４１（Ｐ２０１０−１８２６４１）
【出願日】平成２２年８月１７日（２０１０．８．１７）
【出願人】（５０４２２９２８４）国立大学法人弘前大学 (162)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年３月１日（２０１２．３．１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年８月１７日（２０１０．８．１７）
【出願人】（５０４２２９２８４）国立大学法人弘前大学 (162)
【Ｆターム（参考）】
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