ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼに標的化する化合物の同定方法、および該化合物の抗増殖剤としての使用
本発明は、ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性をモジュレートする化合物のスクリーニングおよび同定方法に関する。特に本発明は、動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼを阻害する化合物を同定するためのアッセイを提供する。本発明の方法は、化合物ライブラリーをハイスループットでスクリーニングして癌を治療および／または予防するために有用な医薬品のリードを同定するための簡便な高感度アッセイを提供する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ活性をモジュレートする化合物の同定方法であって、
（ａ）細胞においてレポーター遺伝子を含む核酸を発現させるステップであって、該レポーター遺伝子がｔＲＮＡイントロンを含むものである、上記ステップ；
（ｂ）上記細胞を化合物ライブラリのメンバーと接触させるステップ；
（ｃ）上記レポーター遺伝子の発現を検出するステップであって、化合物の存在下における上記レポーター遺伝子の発現が、上記化合物の非存在下または対照の存在下における上記レポーター遺伝子の発現と比較して変化する場合に、ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ活性をモジュレートする化合物が同定される、上記ステップ
を含む、上記方法。
【請求項２】
動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ活性をモジュレートする化合物の同定方法であって、
（ａ）化合物ライブラリのメンバーを、無細胞抽出物及びレポーター遺伝子を含む核酸と接触させるステップであって、該レポーター遺伝子がｔＲＮＡイントロンを含むものである、上記ステップ；
（ｂ）上記レポーター遺伝子の発現を検出するステップであって、化合物の存在下における上記レポーター遺伝子の発現が、上記化合物の非存在下または対照の存在下における上記レポーター遺伝子の発現と比較して変化する場合に、ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ活性をモジュレートする化合物が同定される、上記ステップ
を含む、上記方法。
【請求項３】
動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ活性をモジュレートする化合物の同定方法であって、
（ａ）化合物ライブラリのメンバーを、レポーター遺伝子を含む核酸を含有する細胞と接触させるステップであって、該レポーター遺伝子がｔＲＮＡイントロンを含むものである、上記ステップ；
（ｂ）上記レポーター遺伝子の発現を検出するステップであって、化合物の存在下における上記レポーター遺伝子の発現が、上記化合物の非存在下または対照の存在下における上記レポーター遺伝子の発現と比較して変化する場合に、ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ活性をモジュレートする化合物が同定される、上記ステップ
を含む、上記方法。
【請求項４】
動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ活性を阻害または低減する抗増殖性化合物の同定方法であって、
（ａ）ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの基質を動物界の細胞中に微量注入するステップであって、該基質は５’末端がフルオロフォアで標識され、３’末端がクエンチャーで標識されているものである、上記ステップ；
（ｂ）上記細胞を化合物ライブラリのメンバーと接触させるステップ；
（ｃ）ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性を測定するステップであって、化合物の存在下における蛍光シグナルが、化合物の非存在下または対照の存在下と比較して検出可能でないまたは低減している場合に、ｔＲＮＡスプライシング活性を阻害または低減する抗増殖性化合物が同定される、上記ステップ
を含む、上記方法。
【請求項５】
動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ活性を阻害または低減する抗増殖性化合物の同定方法であって、
（ａ）ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの基質を動物界の細胞中にトランスフェクトするステップであって、該基質は５’末端がフルオロフォアで標識され、３’末端がクエンチャーで標識されているものである、上記ステップ；
（ｂ）上記細胞を化合物ライブラリのメンバーと接触させるステップ；
（ｃ）ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性を測定するステップであって、化合物の存在下における蛍光シグナルが、化合物の非存在下または対照の存在下と比較して検出可能でないまたは低減している場合に、ｔＲＮＡスプライシング活性を阻害または低減する抗増殖性化合物が同定される、上記ステップ
を含む、上記方法。
【請求項６】
動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ活性を阻害または低減する抗増殖性化合物の同定方法であって、
（ａ）ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの基質を含む動物界の細胞を化合物ライブラリーのメンバーと接触させるステップであって、該基質は５’末端がフルオロフォアで標識され、３’末端がクエンチャーで標識されているものである、上記ステップ；
（ｂ）ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性を測定するステップであって、化合物の存在下における蛍光シグナルが、化合物の非存在下または対照の存在下と比較して検出可能でないまたは低減している場合に、ｔＲＮＡスプライシング活性を阻害または低減する抗増殖性化合物が同定される、上記ステップ
を含む、上記方法。
【請求項７】
動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ活性を阻害または低減する抗増殖性化合物の同定方法であって、
（ａ）ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの基質を動物界の細胞中に微量注入するステップであって、該基質は５’末端が蛍光ドナー部分で標識され、３’末端が蛍光アクセプター部分で標識されているものである、上記ステップ；
（ｂ）上記細胞を化合物ライブラリのメンバーと接触させるステップ；
（ｃ）ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性を測定するステップであって、化合物の存在下における蛍光ドナー部分の波長における蛍光アクセプター部分の蛍光発光が、化合物の非存在下または対照の存在下と比較して増大している場合に、ｔＲＮＡスプライシング活性を阻害または低減する抗増殖性化合物が同定される、上記ステップ
を含む、上記方法。
【請求項８】
動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ活性を阻害または低減する抗増殖性化合物の同定方法であって、
（ａ）ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの基質を動物界の細胞中にトランスフェクトするステップであって、該基質は５’末端が蛍光ドナー部分で標識され、３’末端が蛍光アクセプター部分で標識されているものである、上記ステップ；
（ｂ）上記細胞を化合物ライブラリのメンバーと接触させるステップ；
（ｃ）ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性を測定するステップであって、化合物の存在下における蛍光ドナー部分の波長における蛍光アクセプター部分の蛍光発光が、化合物の非存在下または対照の存在下と比較して増大している場合に、ｔＲＮＡスプライシング活性を阻害または低減する抗増殖性化合物が同定される、上記ステップ
を含む、上記方法。
【請求項９】
動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ活性を阻害または低減する抗増殖性化合物の同定方法であって、
（ａ）ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの基質を含む動物界の細胞を化合物ライブラリのメンバーと接触させるステップであって、該基質は５’末端が蛍光ドナー部分で標識され、３’末端が蛍光アクセプター部分で標識されているものである、上記ステップ；
（ｂ）ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性を測定するステップであって、化合物の存在下における蛍光ドナー部分の波長における蛍光アクセプター部分の蛍光発光が、化合物の非存在下または対照の存在下と比較して増大している場合に、ｔＲＮＡスプライシング活性を阻害または低減する抗増殖性化合物が同定される、上記ステップ
を含む、上記方法。
【請求項１０】
動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ活性を阻害または低減する抗増殖性化合物の同定方法であって、
（ａ）動物界の無細胞抽出物をｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの基質および化合物ライブラリーのメンバーと接触させるステップであって、該基質は５’末端がフルオロフォアで標識され、３’末端がクエンチャーで標識されているものである、上記ステップ；
（ｂ）ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性を測定するステップであって、化合物の存在下における蛍光シグナルが、化合物の非存在下または対照の存在下と比較して検出可能でないまたは低減している場合に，ｔＲＮＡスプライシング活性を阻害または低減する抗増殖性化合物が同定される、上記ステップ
を含む、上記方法。
【請求項１１】
動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ活性を阻害または低減する抗増殖性化合物の同定方法であって、
（ａ）動物界の無細胞抽出物をｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの基質および化合物ライブラリーのメンバーと接触させるステップであって、該基質は５’末端が蛍光ドナー部分で標識され、３’末端が蛍光アクセプター部分で標識されているものである、上記ステップ；
（ｂ）ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性を測定するステップであって、化合物の存在下における蛍光ドナー部分の波長における蛍光アクセプター部分の蛍光発光が、化合物の非存在下または対照の存在下と比較して増大している場合に、ｔＲＮＡスプライシング活性を阻害または低減する抗増殖性化合物が同定される、上記ステップ
を含む、上記方法。
【請求項１２】
化合物がｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ活性を阻害する、請求項１、２または３に記載の方法。
【請求項１３】
化合物がｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ活性を増強する、請求項１、２または３に記載の方法。
【請求項１４】
ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ活性をモジュレートする化合物の構造を決定するステップをさらに含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
レポーター遺伝子が、ホタルルシフェラーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼ、コメツキムシルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、シアン蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコロニダーゼ、β−ラクタマーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、またはアルカリホスファターゼをコードする、請求項１、２または３に記載の方法。
【請求項１６】
細胞が、２９３Ｔ、ＨｅＬａ、ＭＣＦ７、Ｗｉ−３８、ＳｋＢｒ３、ジャーカット、ＣＥＭ、ＴＨＰ１、３Ｔ３およびＲａｗ２６４．７細胞からなる群より選択される、請求項１または３に記載の方法。
【請求項１７】
無細胞抽出物が細胞抽出物である、請求項２、１０または１１に記載の方法。
【請求項１８】
化合物が、ペプトイド；ランダムバイオオリゴマー；ヒダントイン、ベンゾジアゼピンおよびジペプチドなどのダイバーソマー（Diversomer）；ビニル性ポリペプチド；非ペプチド性ペプチド模倣体；オリゴカルバメート；ペプチジルホスホネート；ペプチド核酸ライブラリ；抗体ライブラリ；炭水化物ライブラリ；ならびに有機小分子ライブラリを含むコンビナトリアル化合物ライブラリから選択される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
有機小分子ライブラリが、ベンゾジアゼピン、イソプレノイド、チアゾリジノン、メタチアザノン、ピロリジン、モルホリノ化合物、またはジアゼピンジオンのライブラリである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
化合物ライブラリを細胞と接触させるステップが、緩衝液および塩の組み合わせを含む水溶液中で行われる、請求項１または３に記載の方法。
【請求項２１】
水溶液が生理的条件に近似するまたはそれを模倣する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
水溶液がさらに界面活性剤またはサーファクタントを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
化合物の構造を質量分析、ＮＭＲ、振動分光分析、またはＸ線結晶構造解析によって決定する、請求項１４に記載の方法。
【請求項２４】
化合物がｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼと直接結合する、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
化合物が上記レポーター遺伝子から転写されたＲＮＡと結合する、請求項１、２または３に記載の方法。
【請求項２６】
化合物が基質と結合する、請求項４、５、６、７、８、９、１０または１１に記載の方法。
【請求項２７】
化合物がｔＲＮＡイントロンと結合する、請求項１、２または３に記載の方法。
【請求項２８】
化合物がｔＲＮＡとｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼとの相互作用を破壊する、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
化合物がｔＲＮＡイントロンとｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼとの相互作用を破壊する、請求項１、２または３に記載の方法。
【請求項３０】
細胞が上記核酸で安定にトランスフェクトされている、請求項１または３に記載の方法。
【請求項３１】
細胞が上記核酸で一過性にトランスフェクトされている、請求項１または３に記載の方法。
【請求項３２】
細胞が上記核酸を含むエピソーム性発現ベクターでトランスフェクトされている、請求項１または３に記載の方法。
【請求項３３】
増殖性疾患またはその症状を予防、治療、管理または寛解するための方法であって、それを必要とする対象に、請求項１２に記載の方法により同定される化合物またはその製薬上許容される塩の治療上または予防上有効な量を投与することを含む、上記方法。
【請求項３４】
増殖性疾患またはその症状を予防、治療、管理または寛解するための方法であって、それを必要とする対象に、請求項１２に記載の方法により同定される化合物またはその製薬上許容される塩の有効量を投与することを含み、該有効量がｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ活性を低減するものである、上記方法。
【請求項３５】
増殖性疾患が癌である、請求項３３または３４に記載の方法。
【請求項３６】
増殖性疾患またはその症状を予防、治療、管理または寛解するための方法であって、それを必要とする対象に、請求項４、５、６、７、８、９、１０または１１に記載の方法により同定される抗増殖性化合物またはその製薬上許容される塩の治療上または予防上有効な量を投与することを含む、上記方法。
【請求項３７】
増殖性疾患またはその症状を予防、治療、管理または寛解するための方法であって、それを必要とする対象に、請求項４、５、６、７、８、１０または１１に記載の方法により同定される抗増殖性化合物またはその製薬上許容される塩の有効量を投与することを含み、該有効量がｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ活性を低減するものである、上記方法。
【請求項３８】
増殖性疾患が癌である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
増殖性疾患が癌である、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
癌の治療もしくは予防、またはその症状の寛解のための治療薬を同定する方法であって、
（ａ）化合物ライブラリのメンバーをレポーター遺伝子を含む核酸を含有する細胞と接触させるステップであって、該レポーター遺伝子がｔＲＮＡイントロンを含むものである、上記ステップ；
（ｂ）上記レポーター遺伝子の発現を検出するステップであって、
化合物の非存在下または対照の存在下における上記レポーター遺伝子の発現と比較して上記レポーター遺伝子の発現を低減する化合物が（ｂ）で検出された場合には、続いて、
（ｃ）上記化合物を癌細胞または新生物細胞と接触させ、該癌細胞または新生物細胞の増殖を検出するステップ
を含み、上記化合物が上記癌細胞または新生物細胞の増殖を低減または阻害する場合には、上記化合物を抗増殖性化合物と同定する、上記方法。
【請求項４１】
（ｄ）上記化合物を癌の動物モデルで試験するステップであって、該試験が、上記化合物を該動物モデルに投与し、該化合物が該動物モデルにおける癌細胞の増殖または拡大の低減に有効であることを検証することを含む、上記ステップをさらに含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
化合物が動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ活性を阻害する能力を検証する方法であって、
（ａ）細胞においてレポーター遺伝子を含む核酸を発現させるステップであって、該レポーター遺伝子がｔＲＮＡイントロンを含むものである、上記ステップ、
（ｂ）該細胞を化合物を接触させるステップ、
（ｃ）上記レポーター遺伝子の発現を検出するステップであって、化合物の存在下における上記レポーター遺伝子の発現が、化合物の非存在下または対照の存在下における上記レポーター遺伝子の発現と比較して低減している場合に、ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ活性を阻害する化合物が検証される、上記ステップ
を含む、上記方法。
【請求項４３】
化合物が動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ活性を阻害する能力を検証する方法であって、
（ａ）化合物を、無細胞抽出物およびレポーター遺伝子を含む核酸と接触させるステップであって、該レポーター遺伝子がイントロンを含むものである、上記ステップ、
（ｂ）上記レポーター遺伝子の発現を検出するステップであって、化合物の存在下における上記レポーター遺伝子の発現が、化合物の非存在下または対照の存在下における上記レポーター遺伝子の発現と比較して低減している場合に、ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ活性を阻害する化合物が検証される、上記ステップ
を含む、上記方法。
【請求項４４】
化合物が動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ活性を阻害する能力を検証する方法であって、
（ａ）化合物ライブラリのメンバーを、レポーター遺伝子を含む核酸を含有する細胞と接触させるステップであって、該レポーター遺伝子がｔＲＮＡイントロンを含むものである、上記ステップ、
（ｂ）上記レポーター遺伝子の発現を検出するステップであって、化合物の存在下における上記レポーター遺伝子の発現が、化合物の非存在下または対照の存在下における上記レポーター遺伝子の発現と比較して低減している場合に、ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ活性を阻害する化合物が検証される、上記ステップ
を含む、上記方法。
【請求項４５】
基質が成熟ドメインを含む、請求項４、５、６、７、８、９、１０または１１に記載の方法。
【請求項４６】
（ｄ）化合物の細胞毒性活性を測定するステップをさらに含む、請求項１、４、５、７または８に記載の方法。
【請求項４７】
（ｃ）化合物の細胞毒性活性を測定するステップをさらに含む、請求項２、３、６、９、１０または１１に記載の方法。
【請求項４８】
（ｄ）化合物の細胞増殖抑制活性を測定するステップをさらに含む、請求項１、４、５、７または８に記載の方法。
【請求項４９】
（ｃ）化合物の細胞増殖抑制活性を測定するステップをさらに含む、請求項２、３、６、９、１０または１１に記載の方法。
【請求項５０】
（ｄ）酵母のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼに対する化合物の効果を測定するステップをさらに含む、請求項１、４、５、７または８に記載の方法。
【請求項５１】
（ｃ）酵母のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼに対する化合物の効果を測定するステップをさらに含む、請求項２、３、６、９、１０または１１に記載の方法。
【請求項５２】
対象がヒトである、請求項３３または３４に記載の方法。
【請求項５３】
対象がヒトである、請求項３６に記載の方法。
【請求項５４】
対象がヒトである、請求項３７に記載の方法。
【請求項１】
動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ活性をモジュレートする化合物の同定方法であって、
（ａ）細胞においてレポーター遺伝子を含む核酸を発現させるステップであって、該レポーター遺伝子がｔＲＮＡイントロンを含むものである、上記ステップ；
（ｂ）上記細胞を化合物ライブラリのメンバーと接触させるステップ；
（ｃ）上記レポーター遺伝子の発現を検出するステップであって、化合物の存在下における上記レポーター遺伝子の発現が、上記化合物の非存在下または対照の存在下における上記レポーター遺伝子の発現と比較して変化する場合に、ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ活性をモジュレートする化合物が同定される、上記ステップ
を含む、上記方法。
【請求項２】
動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ活性をモジュレートする化合物の同定方法であって、
（ａ）化合物ライブラリのメンバーを、無細胞抽出物及びレポーター遺伝子を含む核酸と接触させるステップであって、該レポーター遺伝子がｔＲＮＡイントロンを含むものである、上記ステップ；
（ｂ）上記レポーター遺伝子の発現を検出するステップであって、化合物の存在下における上記レポーター遺伝子の発現が、上記化合物の非存在下または対照の存在下における上記レポーター遺伝子の発現と比較して変化する場合に、ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ活性をモジュレートする化合物が同定される、上記ステップ
を含む、上記方法。
【請求項３】
動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ活性をモジュレートする化合物の同定方法であって、
（ａ）化合物ライブラリのメンバーを、レポーター遺伝子を含む核酸を含有する細胞と接触させるステップであって、該レポーター遺伝子がｔＲＮＡイントロンを含むものである、上記ステップ；
（ｂ）上記レポーター遺伝子の発現を検出するステップであって、化合物の存在下における上記レポーター遺伝子の発現が、上記化合物の非存在下または対照の存在下における上記レポーター遺伝子の発現と比較して変化する場合に、ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ活性をモジュレートする化合物が同定される、上記ステップ
を含む、上記方法。
【請求項４】
動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ活性を阻害または低減する抗増殖性化合物の同定方法であって、
（ａ）ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの基質を動物界の細胞中に微量注入するステップであって、該基質は５’末端がフルオロフォアで標識され、３’末端がクエンチャーで標識されているものである、上記ステップ；
（ｂ）上記細胞を化合物ライブラリのメンバーと接触させるステップ；
（ｃ）ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性を測定するステップであって、化合物の存在下における蛍光シグナルが、化合物の非存在下または対照の存在下と比較して検出可能でないまたは低減している場合に、ｔＲＮＡスプライシング活性を阻害または低減する抗増殖性化合物が同定される、上記ステップ
を含む、上記方法。
【請求項５】
動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ活性を阻害または低減する抗増殖性化合物の同定方法であって、
（ａ）ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの基質を動物界の細胞中にトランスフェクトするステップであって、該基質は５’末端がフルオロフォアで標識され、３’末端がクエンチャーで標識されているものである、上記ステップ；
（ｂ）上記細胞を化合物ライブラリのメンバーと接触させるステップ；
（ｃ）ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性を測定するステップであって、化合物の存在下における蛍光シグナルが、化合物の非存在下または対照の存在下と比較して検出可能でないまたは低減している場合に、ｔＲＮＡスプライシング活性を阻害または低減する抗増殖性化合物が同定される、上記ステップ
を含む、上記方法。
【請求項６】
動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ活性を阻害または低減する抗増殖性化合物の同定方法であって、
（ａ）ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの基質を含む動物界の細胞を化合物ライブラリーのメンバーと接触させるステップであって、該基質は５’末端がフルオロフォアで標識され、３’末端がクエンチャーで標識されているものである、上記ステップ；
（ｂ）ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性を測定するステップであって、化合物の存在下における蛍光シグナルが、化合物の非存在下または対照の存在下と比較して検出可能でないまたは低減している場合に、ｔＲＮＡスプライシング活性を阻害または低減する抗増殖性化合物が同定される、上記ステップ
を含む、上記方法。
【請求項７】
動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ活性を阻害または低減する抗増殖性化合物の同定方法であって、
（ａ）ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの基質を動物界の細胞中に微量注入するステップであって、該基質は５’末端が蛍光ドナー部分で標識され、３’末端が蛍光アクセプター部分で標識されているものである、上記ステップ；
（ｂ）上記細胞を化合物ライブラリのメンバーと接触させるステップ；
（ｃ）ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性を測定するステップであって、化合物の存在下における蛍光ドナー部分の波長における蛍光アクセプター部分の蛍光発光が、化合物の非存在下または対照の存在下と比較して増大している場合に、ｔＲＮＡスプライシング活性を阻害または低減する抗増殖性化合物が同定される、上記ステップ
を含む、上記方法。
【請求項８】
動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ活性を阻害または低減する抗増殖性化合物の同定方法であって、
（ａ）ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの基質を動物界の細胞中にトランスフェクトするステップであって、該基質は５’末端が蛍光ドナー部分で標識され、３’末端が蛍光アクセプター部分で標識されているものである、上記ステップ；
（ｂ）上記細胞を化合物ライブラリのメンバーと接触させるステップ；
（ｃ）ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性を測定するステップであって、化合物の存在下における蛍光ドナー部分の波長における蛍光アクセプター部分の蛍光発光が、化合物の非存在下または対照の存在下と比較して増大している場合に、ｔＲＮＡスプライシング活性を阻害または低減する抗増殖性化合物が同定される、上記ステップ
を含む、上記方法。
【請求項９】
動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ活性を阻害または低減する抗増殖性化合物の同定方法であって、
（ａ）ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの基質を含む動物界の細胞を化合物ライブラリのメンバーと接触させるステップであって、該基質は５’末端が蛍光ドナー部分で標識され、３’末端が蛍光アクセプター部分で標識されているものである、上記ステップ；
（ｂ）ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性を測定するステップであって、化合物の存在下における蛍光ドナー部分の波長における蛍光アクセプター部分の蛍光発光が、化合物の非存在下または対照の存在下と比較して増大している場合に、ｔＲＮＡスプライシング活性を阻害または低減する抗増殖性化合物が同定される、上記ステップ
を含む、上記方法。
【請求項１０】
動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ活性を阻害または低減する抗増殖性化合物の同定方法であって、
（ａ）動物界の無細胞抽出物をｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの基質および化合物ライブラリーのメンバーと接触させるステップであって、該基質は５’末端がフルオロフォアで標識され、３’末端がクエンチャーで標識されているものである、上記ステップ；
（ｂ）ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性を測定するステップであって、化合物の存在下における蛍光シグナルが、化合物の非存在下または対照の存在下と比較して検出可能でないまたは低減している場合に，ｔＲＮＡスプライシング活性を阻害または低減する抗増殖性化合物が同定される、上記ステップ
を含む、上記方法。
【請求項１１】
動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ活性を阻害または低減する抗増殖性化合物の同定方法であって、
（ａ）動物界の無細胞抽出物をｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの基質および化合物ライブラリーのメンバーと接触させるステップであって、該基質は５’末端が蛍光ドナー部分で標識され、３’末端が蛍光アクセプター部分で標識されているものである、上記ステップ；
（ｂ）ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼの活性を測定するステップであって、化合物の存在下における蛍光ドナー部分の波長における蛍光アクセプター部分の蛍光発光が、化合物の非存在下または対照の存在下と比較して増大している場合に、ｔＲＮＡスプライシング活性を阻害または低減する抗増殖性化合物が同定される、上記ステップ
を含む、上記方法。
【請求項１２】
化合物がｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ活性を阻害する、請求項１、２または３に記載の方法。
【請求項１３】
化合物がｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ活性を増強する、請求項１、２または３に記載の方法。
【請求項１４】
ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ活性をモジュレートする化合物の構造を決定するステップをさらに含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
レポーター遺伝子が、ホタルルシフェラーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼ、コメツキムシルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、シアン蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコロニダーゼ、β−ラクタマーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、またはアルカリホスファターゼをコードする、請求項１、２または３に記載の方法。
【請求項１６】
細胞が、２９３Ｔ、ＨｅＬａ、ＭＣＦ７、Ｗｉ−３８、ＳｋＢｒ３、ジャーカット、ＣＥＭ、ＴＨＰ１、３Ｔ３およびＲａｗ２６４．７細胞からなる群より選択される、請求項１または３に記載の方法。
【請求項１７】
無細胞抽出物が細胞抽出物である、請求項２、１０または１１に記載の方法。
【請求項１８】
化合物が、ペプトイド；ランダムバイオオリゴマー；ヒダントイン、ベンゾジアゼピンおよびジペプチドなどのダイバーソマー（Diversomer）；ビニル性ポリペプチド；非ペプチド性ペプチド模倣体；オリゴカルバメート；ペプチジルホスホネート；ペプチド核酸ライブラリ；抗体ライブラリ；炭水化物ライブラリ；ならびに有機小分子ライブラリを含むコンビナトリアル化合物ライブラリから選択される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
有機小分子ライブラリが、ベンゾジアゼピン、イソプレノイド、チアゾリジノン、メタチアザノン、ピロリジン、モルホリノ化合物、またはジアゼピンジオンのライブラリである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
化合物ライブラリを細胞と接触させるステップが、緩衝液および塩の組み合わせを含む水溶液中で行われる、請求項１または３に記載の方法。
【請求項２１】
水溶液が生理的条件に近似するまたはそれを模倣する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
水溶液がさらに界面活性剤またはサーファクタントを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
化合物の構造を質量分析、ＮＭＲ、振動分光分析、またはＸ線結晶構造解析によって決定する、請求項１４に記載の方法。
【請求項２４】
化合物がｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼと直接結合する、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
化合物が上記レポーター遺伝子から転写されたＲＮＡと結合する、請求項１、２または３に記載の方法。
【請求項２６】
化合物が基質と結合する、請求項４、５、６、７、８、９、１０または１１に記載の方法。
【請求項２７】
化合物がｔＲＮＡイントロンと結合する、請求項１、２または３に記載の方法。
【請求項２８】
化合物がｔＲＮＡとｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼとの相互作用を破壊する、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
化合物がｔＲＮＡイントロンとｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼとの相互作用を破壊する、請求項１、２または３に記載の方法。
【請求項３０】
細胞が上記核酸で安定にトランスフェクトされている、請求項１または３に記載の方法。
【請求項３１】
細胞が上記核酸で一過性にトランスフェクトされている、請求項１または３に記載の方法。
【請求項３２】
細胞が上記核酸を含むエピソーム性発現ベクターでトランスフェクトされている、請求項１または３に記載の方法。
【請求項３３】
増殖性疾患またはその症状を予防、治療、管理または寛解するための方法であって、それを必要とする対象に、請求項１２に記載の方法により同定される化合物またはその製薬上許容される塩の治療上または予防上有効な量を投与することを含む、上記方法。
【請求項３４】
増殖性疾患またはその症状を予防、治療、管理または寛解するための方法であって、それを必要とする対象に、請求項１２に記載の方法により同定される化合物またはその製薬上許容される塩の有効量を投与することを含み、該有効量がｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ活性を低減するものである、上記方法。
【請求項３５】
増殖性疾患が癌である、請求項３３または３４に記載の方法。
【請求項３６】
増殖性疾患またはその症状を予防、治療、管理または寛解するための方法であって、それを必要とする対象に、請求項４、５、６、７、８、９、１０または１１に記載の方法により同定される抗増殖性化合物またはその製薬上許容される塩の治療上または予防上有効な量を投与することを含む、上記方法。
【請求項３７】
増殖性疾患またはその症状を予防、治療、管理または寛解するための方法であって、それを必要とする対象に、請求項４、５、６、７、８、１０または１１に記載の方法により同定される抗増殖性化合物またはその製薬上許容される塩の有効量を投与することを含み、該有効量がｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ活性を低減するものである、上記方法。
【請求項３８】
増殖性疾患が癌である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
増殖性疾患が癌である、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
癌の治療もしくは予防、またはその症状の寛解のための治療薬を同定する方法であって、
（ａ）化合物ライブラリのメンバーをレポーター遺伝子を含む核酸を含有する細胞と接触させるステップであって、該レポーター遺伝子がｔＲＮＡイントロンを含むものである、上記ステップ；
（ｂ）上記レポーター遺伝子の発現を検出するステップであって、
化合物の非存在下または対照の存在下における上記レポーター遺伝子の発現と比較して上記レポーター遺伝子の発現を低減する化合物が（ｂ）で検出された場合には、続いて、
（ｃ）上記化合物を癌細胞または新生物細胞と接触させ、該癌細胞または新生物細胞の増殖を検出するステップ
を含み、上記化合物が上記癌細胞または新生物細胞の増殖を低減または阻害する場合には、上記化合物を抗増殖性化合物と同定する、上記方法。
【請求項４１】
（ｄ）上記化合物を癌の動物モデルで試験するステップであって、該試験が、上記化合物を該動物モデルに投与し、該化合物が該動物モデルにおける癌細胞の増殖または拡大の低減に有効であることを検証することを含む、上記ステップをさらに含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
化合物が動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ活性を阻害する能力を検証する方法であって、
（ａ）細胞においてレポーター遺伝子を含む核酸を発現させるステップであって、該レポーター遺伝子がｔＲＮＡイントロンを含むものである、上記ステップ、
（ｂ）該細胞を化合物を接触させるステップ、
（ｃ）上記レポーター遺伝子の発現を検出するステップであって、化合物の存在下における上記レポーター遺伝子の発現が、化合物の非存在下または対照の存在下における上記レポーター遺伝子の発現と比較して低減している場合に、ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ活性を阻害する化合物が検証される、上記ステップ
を含む、上記方法。
【請求項４３】
化合物が動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ活性を阻害する能力を検証する方法であって、
（ａ）化合物を、無細胞抽出物およびレポーター遺伝子を含む核酸と接触させるステップであって、該レポーター遺伝子がイントロンを含むものである、上記ステップ、
（ｂ）上記レポーター遺伝子の発現を検出するステップであって、化合物の存在下における上記レポーター遺伝子の発現が、化合物の非存在下または対照の存在下における上記レポーター遺伝子の発現と比較して低減している場合に、ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ活性を阻害する化合物が検証される、上記ステップ
を含む、上記方法。
【請求項４４】
化合物が動物界のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ活性を阻害する能力を検証する方法であって、
（ａ）化合物ライブラリのメンバーを、レポーター遺伝子を含む核酸を含有する細胞と接触させるステップであって、該レポーター遺伝子がｔＲＮＡイントロンを含むものである、上記ステップ、
（ｂ）上記レポーター遺伝子の発現を検出するステップであって、化合物の存在下における上記レポーター遺伝子の発現が、化合物の非存在下または対照の存在下における上記レポーター遺伝子の発現と比較して低減している場合に、ｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼ活性を阻害する化合物が検証される、上記ステップ
を含む、上記方法。
【請求項４５】
基質が成熟ドメインを含む、請求項４、５、６、７、８、９、１０または１１に記載の方法。
【請求項４６】
（ｄ）化合物の細胞毒性活性を測定するステップをさらに含む、請求項１、４、５、７または８に記載の方法。
【請求項４７】
（ｃ）化合物の細胞毒性活性を測定するステップをさらに含む、請求項２、３、６、９、１０または１１に記載の方法。
【請求項４８】
（ｄ）化合物の細胞増殖抑制活性を測定するステップをさらに含む、請求項１、４、５、７または８に記載の方法。
【請求項４９】
（ｃ）化合物の細胞増殖抑制活性を測定するステップをさらに含む、請求項２、３、６、９、１０または１１に記載の方法。
【請求項５０】
（ｄ）酵母のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼに対する化合物の効果を測定するステップをさらに含む、請求項１、４、５、７または８に記載の方法。
【請求項５１】
（ｃ）酵母のｔＲＮＡスプライシングエンドヌクレアーゼに対する化合物の効果を測定するステップをさらに含む、請求項２、３、６、９、１０または１１に記載の方法。
【請求項５２】
対象がヒトである、請求項３３または３４に記載の方法。
【請求項５３】
対象がヒトである、請求項３６に記載の方法。
【請求項５４】
対象がヒトである、請求項３７に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図２】
【公表番号】特表２００６−５２５０１７（Ｐ２００６−５２５０１７Ａ）
【公表日】平成１８年１１月９日（２００６．１１．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５０９４３１（Ｐ２００６−５０９４３１）
【出願日】平成１６年３月２６日（２００４．３．２６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／００９５７２
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０８７０６９
【国際公開日】平成１６年１０月１４日（２００４．１０．１４）
【出願人】（５０３３６９７０５）ピーティーシー セラピューティクス，インコーポレーテッド (31)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年１１月９日（２００６．１１．９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年３月２６日（２００４．３．２６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／００９５７２
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０８７０６９
【国際公開日】平成１６年１０月１４日（２００４．１０．１４）
【出願人】（５０３３６９７０５）ピーティーシー セラピューティクス，インコーポレーテッド (31)
【Ｆターム（参考）】
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