α１アンチトリプシンの精製法
Ｃｏｈｎ分画ＩＶ、沈殿物のようなＡＡＴ含有タンパク混合物よりα１アンチトリプシン（ＡＡＴ）を精製するための能率化した方法を提供する。本発明の方法では、ＡＡＴに影響を及ぼさない、ジチオールのような還元剤でのジスルフィド結合の切断によって、汚染タンパク質を不安定化させる。次いで、不安定化したタンパク質を、沈殿剤としての塩を加えずに、固形タンパク吸着材料に選好的に吸着させる。溶液より固形吸着剤を分離すると、精製されたＡＡＴ溶液が残り、これはそのままクロマトグラフィー精製に適していて、先行技術の方法のような徹底した脱塩を必要としない。医薬品グレードのＡＡＴを工業スケールで高収率に提供する、上記の手法を組み込んだ方法についても記載する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、タンパク質の分離および精製の方法に関する。より具体的には、本発明は、血漿分画のような複雑なタンパク混合物からのα１アンチトリプシン（ＡＡＴ、α１プロテイナーゼ阻害剤、ＡＰＩ、およびＡ１−ＰＩとしても知られている）の分離と、医薬使用に適した組成物を提供するための、分離したＡＡＴのさらなる精製の方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景技術
α１アンチトリプシン（ＡＡＴ）は、プロテアーゼの糖ペプチド阻害剤であり、ヒトの血清および他の体液に見出されている。ＡＡＴによるプロテアーゼ阻害は、組織タンパク分解の調節の必須要素であり、ＡＡＴ欠損症は、いくつかの疾患の病理に関連している。例えば、α１アンチトリプシン欠損症を遺伝により受け継いだ個体は、ヒト白血球エラスターゼによる肺組織の非調節性の破壊の結果として、重篤な早期発症肺気腫に罹患する高いリスクを有する。外因性ヒトＡＡＴの投与は、エラスターゼを阻害することが示されていて、ＡＡＴ欠損患者の生存の向上とその肺機能低下速度の抑制に関連づけられている（Ｃｒｙｓｔａｌら，Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ Ｍｅｄ．１５８：４９−５９（１９９８）；概説については、Ｒ．ＭａｈａｄｅｖａおよびＤ．Ｌｏｍａｓ，Ｔｈｏｒａｘ ５３：５０１−５０５（１９９８）を参照のこと）。
【０００３】
その治療上の有用性のために、工業用ＡＡＴの生産は、重要な研究主題となってきた。組換えＡＡＴの大腸菌（Ｒ．Ｂｉｓｃｈｏｆｆら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３０：３４６４−３４７２（１９９１））、酵母（Ｋ．Ｋｗｏｎら，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ４２：１９１−１９５（１９９５）；Ｂｏｌｌｅｎら，米国特許第４，６２９，５６７号）、および植物（Ｊ．Ｈｕａｎｇら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．１７：１２６−３３（２００１））における産生と、トランスジェニック哺乳動物（Ｇ．Ｗｒｉｇｈｔら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９：８３０−８３４（１９９１）；Ａ．Ｌ．Ａｒｃｈｉｂａｌｄ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：５１７８−５１８２（１９９０））の乳分泌による産生ではかなりの進歩がなされた。しかしながら、ＡＡＴのヒト血漿からの単離は、今日、ＡＡＴを大量に入手する最も効率的で実践的な方法であり、ヒト血漿は、そして唯一ＦＤＡ承認された供給源である。
【０００４】
沈殿、吸着、抽出、およびクロマトグラフィーの工程の組合せを伴う、ヒト血漿分画よりＡＡＴを単離および精製するためのいくつかの方法が記載されている。病原体混入のリスクを最小化するために、治療使用のためのヒトＡＡＴの産生に企図されるプールしたヒト血漿について、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原と、ヒト免疫不全ウイルスに対する抗体をスクリーニングする。感染病原体の伝播に抗する追加の予防処置として、精製産物は、通常、６０℃まで１０時間加熱することによって低温殺菌して（Ｍｉｔｒａら，Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．８４（ｓｕｐ．６Ａ）：８７−９０（１９８８））、滅菌濾過する。
【０００５】
ＡＡＴ単離についてのほとんどの公表された方法は、一連のエタノール沈殿およびｐＨ調整の後のペーストとして血漿より入手される、Ｃｏｈｎ分画ＩＶ沈殿物、例えばＣｏｈｎ分画ＩＶ１または分画ＩＶ１−４として知られる１以上のヒト血漿分画より始める（Ｅ．Ｊ．Ｃｏｈｎら，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，６８：４５９−４７５（１９４６））。
【０００６】
米国特許第３，３０１，８４２号は、Ｃｏｈｎ分画ＩＶ１からのＡＡＴの単離の方法を記載し、ここでは、アクリジンまたはキノリン誘導体をｐＨ６で緩衝液中のペーストへ加え、沈殿物を捨て、ｐＨを７．０へ調整する。追加のアクリジンまたはキノリンを加え、沈殿物を採取する。この沈殿物をｐＨ５．０の緩衝液に溶かし、塩化ナトリウムを加え、生じる沈殿物を捨てる。ＡＡＴを含有する溶液をメタノール沈殿によってさらに処理する。あるいは、血漿についてｐＨ８とｐＨ５で硫酸アンモニウム沈殿を実施して、ｐＨ５の上清を上記のようにキノリンまたはアクリジン添加剤でさらに処理する。
【０００７】
Ｇｌａｓｅｒら，Ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５：３３３−３４８（１９７５）は、Ｃｏｈｎ分画ＩＶ１ペーストよりＡＡＴを単離する方法を開示した。Ｃｏｈｎ分画化に利用した５．２というｐＨによって概ね不活性化したＡＡＴを再活性化するために、ペーストをリン酸緩衝液においてｐＨ８．５で撹拌する。透析と遠心分離の後で、上清を２ラウンドのアニオン交換クロマトグラフィーへｐＨ６．０〜７．６およびｐＨ８．６で処して、続いてｐＨ７．６とｐＨ８．０でさらにクロマトグラフィー処理して、ＡＡＴを約３０％の全体収率で産生する。
【０００８】
Ｍ．Ｈ．Ｃｏａｎら，は、米国特許第４，３７９，０８７号および４，４３９，３５８号（Ｍ．Ｈ．Ｃｏａｎら，Ｖｏｘ Ｓａｎｇ．，４８：３３３−３４２（１９８５）；Ｍ．Ｈ．Ｃｏａｎ，Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｍｅｄ．，８４（ｓｕｐ ６Ａ）：３２−３６（１９８８）；および、Ｒ．Ｈ．Ｈｅｉｎら，Ｅｕｒ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｊ．，３（ｓｕｐ９）：１６ｓ−２０ｓ（１９９０）も参照のこと）において、Ｃｏｈｎ分画ＩＶ１ペーストをｐＨ６．５〜８．５の緩衝液に溶かし、ポリエチレングリコールを加え、そしてｐＨを４．６〜５．７の範囲へ下げて、望まれないタンパク質を沈殿させる手順を開示した。遠心分離の後で、上清よりアニオン交換クロマトグラフィーによってＡＡＴを単離する。さらなる処理によって、４５％収率のＡＡＴを約６０％の純度で得る。沈殿剤としてポリエチレングリコールを利用する方法が、以下に記載の米国特許第４，６９７，００３号、米国特許第４，６５６，２５４号、および日本特許、ＪＰ０８０９９９９９にも記載され；そして、Ｈａｏら，「タンパク分離技術と血漿分画法の改善に関する国際報告ワークショップ（Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔｌ．Ｗｏｒｋｓｈｏｐ ｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｂｌｏｏｄ Ｐｌａｓｍａ Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ），１９７７年９月７−９日、ヴァージニア州レストン」によっても記載されている。
【０００９】
Ｄｕｂｉｎら，Ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０：６３−７０（１９９０）は、最初にＡＡＴをＢｌｕｅ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥＴＭより溶出させてから、次いでゲル濾過クロマトグラフィーにより精製する、２工程のクロマトグラフィー精製法を開示した。
【００１０】
ＳｃｈｕｌｔｚｅとＨｅｉｍｂｕｒｇｅｒは、米国特許第３，２９３，２３６号において、ヒト血漿の硫酸アンモニウム分画化と組み合わせてクエン酸塩緩衝液でのカチオン交換クロマトグラフィーを使用する、ＡＡＴの精製を開示した。
【００１１】
ＬｅｂｉｎｇとＣｈｅｎは、米国特許第５，６１０，２８５号において、始めのアニオン交換クロマトグラフィーに続き、低ｐＨおよび低イオン強度でのカチオン交換クロマトグラフィーを利用して、血漿および血漿分画よりヒトＡＡＴを精製する精製法を開示した。このカチオンクロマトグラフィーは、これらの条件下では、変性ＡＡＴとアルブミンが含まれる汚染タンパク質が保持される一方で、活性ＡＡＴはイオン交換カラムへ結合しないという事実を利用する。
【００１２】
Ｊｏｒｄａｎら，は、米国特許第４，７４９，７８３号において、モノクローナル抗体でのアフィニティークロマトグラフィーを使用する、ヒト血漿からのＡＡＴの単離について記載した。Ｐｏｄｉａｒｅｎｅら，Ｖｏｐｒ．Ｍｅｄ．Ｋｈｉｍ．３５：９６−９９（１９８９）も参照のこと。
【００１３】
Ｓｈｅａｒｅｒら，は、ヨーロッパ特許出願ＥＰ０ ２２４ ８１１と対応する米国特許第４，６５６，２５４号において、Ｃｏｈｎ分画ＩＶペーストよりＡＡＴを抽出するための改善法を開示し、ここで改善は、先行技術において慣例であったものより高いｐＨにおいてより高い容量の緩衝液でペーストを処理することからなった。より高い容量とより高いｐＨの組合せにより、ペーストより抽出されるＡＡＴの量が高まった。望まれないタンパク質は、ポリエチレングリコールの添加と、それに続く遠心分離によって沈殿した。本質的にはＣｏａｎらの手順である代わりの手順が開示されていて、ここでは、ポリエチレングリコールの添加後にｐＨを４．６〜５．７の範囲へ調整し、そして酸性化した混合物を１〜６０分放置して、望まれないタンパク質をさらに沈殿させる。追加のポリエチレングリコールの添加によりＡＡＴを沈殿させ、そしてアニオン交換クロマトグラフィーによりさらに精製する。
【００１４】
Ａｒｒｉｇｈｉら，は、ヨーロッパ特許出願ＥＰ ０７１７０４９において、分画ＩＶ１ペーストをｐＨ８．２緩衝液において４０℃で１時間撹拌することに続いて、望まれないタンパク質を硫酸アンモニウムで沈殿させる方法を開示する。ＡＡＴは、ｐＨ７での疎水性相互作用クロマトグラフィーによって上清より単離する。
【００１５】
Ｋｒｅｓｓら，は、Ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３：５４１−５５２（１９７３）において、ヒト血漿の８０％硫酸アンモニウム処理からの沈殿物を透析してから、次いでそれをＤＥＡＥ−セルロースでクロマトグラフ処理した。この産物を再び透析し、そしてＳＥＰＨＡＤＥＸＴＭＧ−１００でゲル濾過した。次いで、ＡＡＴ含有分画をＤＥ−５２セルロースでクロマトグラフ処理して、ＡＡＴを得た。
【００１６】
日本特許５９−１２８３３５は、５と７の間のｐＨでのポリエチレングリコールの添加に続くアニオン交換クロマトグラフィーによる、望まれないタンパク質の血漿分画からの沈殿を開示する。
【００１７】
Ｂｏｌｌｅｎら，は、米国特許第４，６２９，５６７号において、ＡＡＴを発現する組換えプラスミドを担う酵母の培養物からのＡＡＴの単離を開示する。この方法は、汚染タンパク質を除去するためのｐＨ６．５でのポリエチレングリコール沈殿より始め、ｐＨ６．５でのアニオン交換クロマトグラフィーと、後続のクロマトグラフィー工程を続ける。
【００１８】
ＤｏｖｅとＭｉｔｒａは、米国特許第４，６８４，７２３号において、Ｃｏａｎら（米国特許第４，３７９，０８７号および米国特許第４，４３９，３５８号）の方法の変法を開示し、ここでは、（ａ）ＡＡＴを含有する溶液を６．５〜８．５のｐＨで２４時間まで放置する工程、（ｂ）ポリエチレングリコールと無機塩を加えて、２相混合物を入手する工程、および（ｃ）精製ＡＡＴを含有する、水性塩の相を単離する工程を含んでなる方法によってＡＡＴを精製する。
【００１９】
Ｔａｎｉｇｕｃｈｉら，は、ＰＣＴ特許出願ＷＯ９５／３５３０６において、塩化亜鉛の存在下にポリエチレングリコールを用いる沈殿と、それに続くアニオン交換クロマトグラフィーと金属キレート樹脂でのクロマトグラフィーを伴う、類似の方法を開示する。
【００２０】
Ｖａｎ Ｗｉｅｔｎｅｎｄａｅｌｅら，はまた、米国特許第４，８５７，３１７号において、工学処理した酵母培養物の粗製抽出物よりＡＡＴを単離する方法を開示し、これは、ポリエチレングリコールのｐＨ６．１での添加、沈殿タンパク質を除去するための遠心分離、塩化カルシウムの添加、ｐＨ７．０で２４時間の保存、およびさらに汚染物を除去するための遠心分離を含む。次いで、後続のクロマトグラフィー工程によって、上清よりＡＡＴを単離する。
【００２１】
Ｃｏａｎは、米国特許第４，６９７，００３号において、様々なＣｏｈｎ血漿分画よりＡＡＴを単離する方法を開示し、該方法は、ＡＡＴ含有分画からのエタノールおよび塩の除去と、それに続く、望まれないタンパク質が溶出される一方でＡＡＴがカラムに保持されるような条件下でのＤＥＡＥセルロースまたは類似の材料でのアニオン交換クロマトグラフィーを含む。Ｃｏａｎはまた、約６０℃以上で約１０時間の「低温殺菌」について記載し、これは肝炎ウイルスを非感染性にするのに十分であると述べている。
【００２２】
Ｃｏａｎは、低温殺菌温度でＡＡＴを安定化するために、安定化剤としての炭水化物を単独で、またはクエン酸ナトリウムとともに加えることを開示する。好適な炭水化物は、単糖、二糖、および三糖、並びにソルビトールおよびマンニトールのような糖アルコールであると述べている。ＡＡＴは、加熱時に、重合化だけでなく、不活性コンホメーションを採りやすいので、安定化剤の存在により、熱不活性化は阻止されないが、抑制はされる（Ｄ．Ｌｏｍａｓら，Ｅｕｒ．Ｒｅｓｐ．Ｊ．１０：６７２−６７５（１９９７））。サイズ排除ＨＰＬＣ分析は、Ｃｏａｎの方法に従って低温殺菌を行うとき、１０％の単量体ＡＡＴが重合化または凝集することを示した（Ｍ．Ｈ．Ｃｏａｎら，Ｖｏｘ Ｓａｎｇ．，４８：３３３−３４２（１９８５））。
【００２３】
Ｔ．Ｂｕｒｎｏｕｆら，Ｖｏｘ Ｓａｎｇ．，５２：２９１−２９７（１９８７）は、Ｋｉｓｔｌｅｒ−Ｎｉｔｓｃｈｍａｎｎ上清ＡよりＡＡＴを単離するための実質的に同じ手順を開示した。Ｃｏｈｎ分画ＩＩ＋ＩＩＩのＤＥＡＥクロマトグラフィーとサイズ排除クロマトグラフィーにより、純度が３６倍増加した、８０〜９０％純粋である（ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる）ＡＡＴが産生された。回収は６５−７０％であった。
【００２４】
Ｔｈｉｅｒｒｙはまた、ヨーロッパ特許出願ＥＰ ０２８２３６３において、Ｋｉｓｔｌｅｒ−Ｎｉｔｓｃｈｍａｎｎ血漿分画よりＡＡＴを入手する方法を開示する。簡潔に言えば、血漿をｐＨ７．４において１０％エタノールで沈殿させ、そして上清をｐＨ５．８５において１９％エタノールで再び沈殿させる。第二の沈殿物からの上清をＤＥＡＥアニオン交換カラムへ適用し、そしてｐＨ５．２で溶出させて、約９０％の純度のＡＡＴを得る。
【００２５】
Ｓｔｒａｎｃａｒら，は、ＰＣＴ特許出願ＷＯ９５／２４４２８において、特別な種類の機能化アニオン交換媒体を利用する、非常に似た方法を開示する。このカラムへ脱塩済みＣｏｈｎ分画ＩＶ１を適用し、「酢酸のｐＫａに近い」ｐＨにおいて低塩緩衝液で汚染タンパク質を溶出させる（酢酸のｐＫａは、４．７４である）。次いで、ｐＨ７．４〜９．２において５０〜３００ｍＭ ＮａＣｌでＡＡＴを溶出させる。
【００２６】
日本特許ＪＰ ０８０９９９９９は、Ｃｏｈｎ分画ＩＶまたはＩＶ１よりＡＡＴを入手する方法を開示し、これは、塩濃度の約０．０２Ｍ未満への低下、ｐＨを４．５〜５．５へ調整すること、そして汚染タンパク質を吸着させるためにカチオン交換体と溶液を接触させることを伴う。
【００２７】
Ｍ．Ｅ．ＳｖｏｂｏｄａとＪ．Ｊ．ｖａｎ Ｗｙｋは、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１０９：７９８−８１６（１９８５）において、Ｃｏｈｎ分画ＩＶペーストのリン酸、ギ酸、および酢酸での酸抽出を開示する。
【００２８】
Ｇｌａｓｅｒら，は、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１２４：３６４−３７１（１９８２）において、またヨーロッパ特許出願ＥＰ ０ ０６７ ２９３において、Ｃｏｈｎ分画ＩＶ１沈殿物よりＡＡＴを単離する方法のいくつかの変法を開示し、該方法は、（ａ）このペーストをｐＨ８．５緩衝液に溶かす工程、（ｂ）濾過する工程、（ｃ）ＤＴＴのようなジチオールを加える工程、および（ｄ）変性タンパク質の硫酸アンモニウムでの沈殿の工程を含む。Ｇｌａｓｅｒは、「加塩、加熱、ｐＨ変更、溶媒追加、等のような好適な技術」によって脱安定化（ＤＴＴ還元）タンパク質を沈殿させることができると述べている。
【００２９】
Ｇｌａｓｅｒら，は、５０％飽和硫酸アンモニウムでの沈殿に先立って、ＤＴＴでの処理を２．５％ ＡＥＲＯＳＩＬＴＭフュームドシリカの存在下に行う、１つの変法について記載している。ＡＡＴの回収は、このシリカの非存在時と同じくらい良好であり、精製倍率は約７０％向上した。いずれの参考文献においても、著者は、このシリカに二次的な役割、硫酸アンモニウム沈殿の結果を向上させる添加物の役割しか認めていない。硫酸アンモニウム沈殿に伴わないシリカ単独の有効性については、認知も記載もされていない。タンパク溶液の濃度が約５０ｍｇタンパク質／ｍｌをかなり超えるならば、沈殿中での吸蔵によってＡＡＴが失われると報告されている。
【００３０】
ＲａｌｓｔｏｎとＤｒｏｈａｎは、米国特許第６，０９３，８０４において、初期タンパク懸濁液からの「脂質除去剤」によるリポタンパク質の除去に続く、アニオン交換媒体からのクエン酸塩緩衝液での溶出による「不活性ＡＡＴ」の除去を伴う方法を開示する。脂質除去剤は、ＭＩＣＲＯ ＣＥＬＴＭＥ、合成の含水ケイ酸カルシウムであると述べられている。非クエン酸塩緩衝液の存在下では、このアニオン交換媒体は、「不活性ＡＡＴ」を通過させる一方で、活性ＡＡＴへ結合する。アニオン交換媒体からのＡＡＴの後続の溶出と、さらに、カチオン交換媒体からのその後の溶出にはクエン酸緩衝液が指定されている。ＲａｌｓｔｏｎとＤｒｏｈａｎは、ジスルフィド還元剤の使用について記載していない。この方法は、＞９０％の産物純度のＡＡＴと、＞７０％の製造スケール収率をもたらすと述べられている。
【００３１】
Ｗ．Ｓｔｅｐｈａｎは、Ｖｏｘ Ｓａｎｇｕｉｎｉｓ ２０：４４２−４５７（１９７１）において、ヒト血漿溶液由来のリポタンパク質を吸着させるためのフュームドシリカの使用について記載している。ＡＡＴが含まれるいくつかの血漿タンパク質の濃度に対するシリカ吸着の効果が評価され、そしてＡＡＴの有意な損失はなかった。
【００３２】
Ｍａｔｔｅｓら，は、Ｖｏｘ Ｓａｎｇｕｉｎｉｓ ８１：２９−３６（２００１）とＰＣＴ特許出願ＷＯ９８／５６８２１、および公開された米国特許出願２００２／００８２２１４において、エタノール沈殿、アニオン交換クロマトグラフィー、およびハイドロキシアパタイトでの吸着クロマトグラフィーを伴う、Ｃｏｈｎ分画ＩＶよりＡＡＴを単離する方法を開示する。後者の工程は、不活性ＡＡＴを除去し、比活性がきわめて高い産物をもたらすと報告されている。
【００３３】
ＡＡＴは、α１アンチトリプシン欠損症による肺気腫に有効な治療であるが、限定された供給と複雑な製造法により、治療は非常に高額である（現行では、年あたり約２５，０００ドル）。血漿およびＡＡＴを含有する他の複雑なタンパク混合物よりヒトＡＡＴを単離するためのより効率的で費用効果の高い方法へのニーズが依然としてある。特に、硫酸アンモニウム沈殿に続く透析は、時間を浪費させる方法であり、実質量の廃水を産み出すので、高収率の高活性、高純度ＡＡＴを提供する一方で、大量の透析を必要としないスケール調整可能な（ｓｃａｌａｂｌｅ）方法へのニーズがある。ＡＡＴの加熱低温殺菌は、ウイルス汚染を低減させるが、それは不活性なＡＡＴ凝集物および重合体の形成をもたらす。従って、ウイルス汚染が低減して、有意な量の不活性ＡＡＴ凝集物および重合体を含まない、きわめて純粋なＡＡＴへのニーズもある。本発明は、これらのニーズへ対処する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００３４】
発明の簡単な説明
本発明は、粗製ＡＡＴ含有タンパク沈殿物よりＡＡＴを精製する方法を提供し、該方法は、本質的に以下の工程よりなる：（ａ）ＡＡＴが溶けることを可能にする条件下でＡＡＴ含有タンパク混合物を緩衝液に懸濁する工程；（ｂ）生じる懸濁液をジスルフィド還元剤と接触させて、還元懸濁液を産生する工程；（ｃ）還元懸濁液を不溶性タンパク吸着材料と接触させる工程；および（ｄ）不溶性材料を懸濁液より除去する工程。この方法は、先行技術の方法より低下したコストとより少ない時間で、クロマトグラフィー処理にそのまま適している濃縮ＡＡＴ調製物を提供する。追加の精製工程は、以下にさらに記載するように、実施者の考え次第で実施してよい。
【００３５】
より具体的には、本方法は：（ａ）ＡＡＴが溶けることを可能にする条件下で粗製ＡＡＴ含有タンパク沈殿物を緩衝液に懸濁する工程；（ｂ）生じる懸濁液を、ジスルフィド還元剤によるタンパク内ジスルフィド結合の還元を可能にする条件下で該還元剤と接触させて、還元懸濁液を産生する工程；（ｃ）実質量の追加塩の添加をせずに、還元懸濁液を不溶性タンパク吸着材料と接触させる工程；および（ｄ）不溶性材料を懸濁液より除去して、浄化されたタンパク溶液を入手する工程を含む。
【００３６】
「実質量の追加塩」は、それが存在しなければ可溶性であるタンパク質の溶液からの有意な量での沈殿を開始させる、可溶性塩または塩類の量を意味する。具体的には、このような目的のために通常使用される量においてある度合いのタンパク沈殿を引き起こすのに通常使用される塩が含まれる。
【００３７】
本発明の方法は、ＥＰ０ ０６７ ２９３においてＧｌａｓｅｒが教示した塩析工程を排除するので、徹底的な透析により濾液を脱塩することの必要性に関連した時間およびコストが回避される。さらに、Ｇｌａｓｅｒの利用する硫酸アンモニウム沈殿法は、処理可能であるタンパク溶液の濃度を限定した。Ｇｌａｓｅｒの方法では、タンパク濃度が約５０ｍｇ／ｍｌをかなり超えるならば、Ａｅｒｏｓｉｌ／タンパク質の沈殿中での吸蔵によってＡＡＴが失われると報告されている。硫酸アンモニウムの非存在下では、より高い濃度のタンパク質がＡＡＴの沈殿および吸蔵を伴うことなく使用可能であるので、これに関連して試薬と処理時間が節約され、バッチあたりの処理量が高まる。本発明の方法は、硫酸アンモニウムの非存在下でタンパク濃度が１００ｍｇ／ｍｌを超えて、そしてＡＡＴの沈殿は認めない、２つの工程を伴う。
【００３８】
本発明によるジスルフィド還元剤および不溶性タンパク吸着材料の組合せは、Ｃｏｈｎ分画ＩＶ沈殿物のような血漿由来の粗製ＡＡＴ調製物において主要なタンパク不純物である、アルブミンとトランスフェリンを除去するのに特に有効である。タンパク吸着材料の濾過による除去の後で、アルブミンとトランスフェリンの両方のレベルは、本明細書に記載のように実施するとき、比濁分析の検出限界以下である。本明細書に記載するさらなる処理は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（還元型）によれば９８％の平均純度で、平均して１．０６ｍｇの機能性ＡＡＴ／ｍｇという高い比活性のＡＡＴをもたらす。本明細書に開示する方法によって、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによれば９９％より高い純度で、１．１２ｍｇの機能性ＡＡＴ／ｍｇタンパク質までの比活性を有する組成物が入手可能である。
【００３９】
粗製ＡＡＴ含有タンパク沈殿物は、様々な供給源に由来してよく、限定されないが、ヒト血清、ヒトＡＡＴを発現するトランスジェニック哺乳動物からの血清、またはヒトＡＡＴをその乳汁に分泌するトランスジェニック哺乳動物からの乳汁が含まれる。供給源は、好ましくは血清である。この供給源が血清であれば、沈殿物は、好ましくは、Ｃｏｈｎ分画ＩＶ沈殿物、より好ましくはＣｏｈｎ分画ＩＶ１、そして最も好ましくは、Ｃｏｈｎ分画ＩＶ１−４である。Ｃｏｈｎ分画を調製する方法には、当業者に知られている、いくつかの変法があり、そしてそのいずれも本発明において利用可能である。
【００４０】
懸濁緩衝液は、ＡＡＴが溶けるどんな水性緩衝液でもよく、沈殿物に存在するＡＡＴのほとんどまたは全部を溶かすのに十分な容量で使用する。Ｃｏｈｎ分画ＩＶ１−４の懸濁に好ましい容量は、１ｋｇの沈殿ペーストにつき６と１０リットルの間である。緩衝液の例には、限定されないが、クエン酸塩、リン酸塩、およびＴｒｉｓの緩衝液が含まれる。好ましい緩衝液はＴｒｉｓ、好ましくは２０ｍＭ ＮａＣｌ入り１００ｍＭ Ｔｒｉｓである。好ましいｐＨは、８．８０と８．９５の間である。
【００４１】
ジスルフィド還元剤は、タンパク質中のジスルフィド結合を還元するために一般的に使用されるどのジチオールでもよく、限定されないが、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ジチオエリスリトール（ＤＴＥ）、１，２−エタンジチオール、１，２−プロパンジチオール、１，３−プロパンジチオール、等；またはトリブチルホスフィンまたはトリメチルホスフィンのようなホスフィンが含まれる。ジスルフィド還元剤は、好ましくはジチオール、最も好ましくはジチオスレイトールである。
【００４２】
不溶性のタンパク吸着材料は、フュームドシリカ；シリカヒドロゲル、キセロゲル、およびエーロゲル；カルシウム、アルミニウムおよびマグネシウムのケイ酸塩；ある種の粘土または鉱物；および、これらの混合物といった、疎水性タンパク質の様々な既知吸着剤のいずれでもよい。こうした材料は、通常、食用オイルおよび飲料の浄化に使用され、当業者によく知られている。好ましくは、タンパク吸着材料はシリカ吸着剤、より好ましくは、商品名ＡＥＲＯＳＩＬＴＭで販売されているようなフュームドシリカである。
【００４３】
本発明はまた、精製とウイルスの低減および不活性化の工程の新規組合せを提供し、これにより医薬使用に適した高安全かつ高純度のＡＡＴが産生される。具体的に言えば、ＡＡＴ精製方法におけるジチオスレイトールおよびフュームドシリカの使用についてはすでに記載されているが、高温または硫酸アンモニウムのような沈殿剤の非存在下におけるこの両者の組合せについては、これまで記載されていない。驚くべきことに、ジチオスレイトール−ＡＥＲＯＳＩＬＴＭ処理工程より沈殿剤を省略すると、きわめて有効な精製段階の提供されることを見出した。さらに、ジチオスレイトール、ＡＥＲＯＳＩＬＴＭ、アニオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、低温殺菌、およびナノ濾過の使用は、それぞれすでに文献に記載されているが、これらの特別な工程は、医薬グレードＡＡＴの工業製造に適した精製法において、今回初めて組み合わされた。
【００４４】
本発明は、以下の特性を特徴とするＡＡＴの調製物を提供する：
（ａ）α１アンチトリプシンは、ＳＤＳによれば、６％未満、好ましくは２％未満、そして最も好ましくは１％未満の汚染タンパク質を含有し、そして、
（ｂ）０．１％未満のアルブミン；
（ｃ）０．８％未満、そして好ましくは０．２％以下のα１酸性糖タンパク質；
（ｄ）０．１％未満のα２マクログロブリン；
（ｅ）０．１％未満のアポリポタンパク質Ａ１；
（ｆ）０．５％未満、そして好ましくは０．１％以下のアンチトロンビンＩＩＩ；
（ｇ）０．１％未満のセルロプラスミン；
（ｈ）０．５％未満、そして好ましくは０．１％未満のハプトグロビン；
（ｉ）０．２％未満、そして好ましくは０．１％未満のＩｇＡ；
（ｊ）０．１％未満のＩｇＧ；
（ｋ）０．１％未満のトランスフェリンを含有し；
（ｌ）α１アンチトリプシンの比活性は、減衰係数としてＥ１％１ｃｍ，２８０ｎｍ＝５．３を使用するとき、１ミリグラムのタンパク質につき少なくとも０．９９ｍｇの機能性ＡＡＴであり；
（ｍ）本産物の８％未満、そして好ましくは、５％未満は、単量体ＡＡＴより高い分子量であり；
（ｎ）活性ＡＡＴの抗原性ＡＡＴに対する見かけの比は、終点比濁分析により測定するとき、１．０８より大きい、好ましくは１．１６より大きい、そして最も好ましくは１．２３より大きい；
（ｏ）広範囲の物理化学特性を代表するヒトおよびモデルウイルスを使用するスパイク試験において測定するとき、エンベロープウイルスは少なくとも１１ｌｏｇ１０単位低減し、非エンベロープウイルスは、少なくとも６ｌｏｇ１０単位低減している；そして
（ｐ）該産物は、凍結乾燥して、２５℃以下で保存するとき、少なくとも２年間安定である。
【００４５】
本発明の産物における活性ＡＡＴの抗原性ＡＡＴに対する見かけの比が１（ユニティ）より大きいのは、本発明の産物の純度および／または活性が、先行技術の組成物である基準標品のそれより高いためである。終点比濁分析によって定量される抗原性レベルは、現行のタンパク標準品（製品番号ＯＱＩＭ１５，供給元：Ｄａｄｅ−Ｂｅｈｒｉｎｇ，イリノイ州ディアフィールド）に対して測定し、Ｄａｄｅ−Ｂｅｈｒｉｎｇ Ｎｅｐｈｅｌｏｍｅｔｅｒ １００用に供給される試薬およびＡＡＴ抗体（Ｄａｄｅ−Ｂｅｈｒｉｎｇ製品番号ＯＳＡＺ１５）を使用して、国際的に認知されたＣｅｒｔｉｆｉｅｄ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｍａｔｅｒｉａｌ（証明済み基準材料）４７０（ヒト血清タンパク質の基準調製品；Ｊ．Ｔ．Ｗｈｉｃｈｅｒら，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４０：９３４−９３８（１９９４）を参照のこと）に対してこれを直接較正する。
【００４６】
本明細書において具体的に参照されるすべての公表文献および特許出願は、そのまま参照により本明細書に組み込まれる。他に定義しなければ、本明細書に使用するすべての技術および科学の用語は、本発明が属する技術分野の当業者が通常理解するのと同じ意味を有する。用語「ＡＡＴ」は、不均質であれ均質であれ、ヒト血清より単離しても組換え生物より単離しても、ヒトＡＡＴを概して意味する。この用語には、薬理学的に有効な天然に存在する変異体（例えば、Ｂｒａｎｔｌｙら，Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．８４（ｓｕｐ．６Ａ）：１３−３１（１９８８）を参照のこと）、並びに薬理学的に有効な非天然型のヒトＡＡＴ（限定されないが、非ヒトのグリコシル化パターン、Ｎ末端メチオニン、または改変アミノ酸を有するものが含まれる）が含まれるものとする。当業者には、本明細書の記載に類似または同等の方法および材料が本発明の実施に使用可能であると理解され、そうした同等物も本発明の範囲内にあると予測される。以下に記載する好ましい態様は、実施例としてのみ提供し、本発明の範囲は、記載する特別な態様に限定されない。
【課題を解決するための手段】
【００４７】
発明の詳細な説明
以下に例示する本発明の特別な態様は、特別なＣｏｈｎ分画ＩＶペーストを出発材料として利用するが、同様の血漿分画の使用も本発明の範囲内にあると考慮される。代わりの出発材料には、限定されないが、他のＡＡＴ含有Ｃｏｈｎ分画（米国特許第４，６９７，００３号を参照のこと）、Ｋｉｓｔｌｅｒ−Ｎｉｔｓｃｈｍａｎｎ上清ＡまたはＡ＋Ｉ由来の沈殿物（Ｐ．Ｋｉｓｔｌｅｒ，Ｈ．Ｓ．Ｎｉｔｓｃｈｍａｎｎ，Ｖｏｘ Ｓａｎｇ．，７：４１４−４２４（１９６２））、およびＳｃｈｕｌｔｚｅら，により米国特許第３，３０１，８４２号に記載されるような血漿由来の硫酸アンモニウム沈殿物が含まれる。ＡＡＴ産生組換え細胞または生物の培養物に由来するタンパク沈殿物、またはトランスジェニック哺乳動物の乳汁または血清に由来する沈殿物の使用も、本発明の範囲内にあると考慮される。
【００４８】
当該技術分野には、冷却と様々なｐＨ調整としばしば組み合わされる、塩、アルコール、およびポリエチレングリコールの添加によるといった、溶液よりタンパク質を選択的に沈殿させる多くの方法が知られている。本発明は、その最初の調製法にかかわらず、回収可能なＡＡＴ活性を含有するほとんどのＡＡＴ含有タンパク沈殿物に適用可能であると予測される。用語「粗製ＡＡＴ含有タンパク沈殿物」は、本明細書において、血漿、乳汁、細胞培養物、または他の元の供給源のいずれであれ、これらの既知の方法の１以上によって調製されるあらゆるＡＡＴ含有タンパク沈殿物を意味するために使用する。
【００４９】
以下に記載する好ましい態様では、粗製ＡＡＴ含有タンパク沈殿物をＴｒｉｓ緩衝液に懸濁させ、ジチオスレイトール（ＤＴＴ、好ましいジスルフィド還元剤）とフュームドシリカ（好ましいタンパク吸着材料）で処理して、汚染するタンパク質および脂質を除去する。沈殿物がＣｏｈｎ分画ＩＶである場合、このようにして除去される２つの主要タンパク汚染物は、アルブミンとトランスフェリンである。ＤＴＴと他のジチオールは、ホスフィンと同様に、当該技術分野において、鎖内および鎖間のジスルフィド結合を還元することが知られている。構造的に重要なジスルフィド結合の切断は、ジスルフィド結合を有するこれら汚染タンパク質の部分変性（アンフォールディング）および不安定化を引き起こす。ＡＡＴそれ自体は、鎖内ジスルフィド結合を有さないので、ＤＴＴ処理によって不安定化しない。
【００５０】
フュームドシリカは、疎水性タンパク質へ選好的に結合することが知られている。本発明の方法において、不安定化した汚染タンパク質は、ジスルフィド結合の切断により引き起こされる部分変性によりこのタンパク質の疎水性残基の内部コアが曝露されるので、フュームドシリカのようなタンパク吸着材料へ結合すると理論化される。しかしながら、本発明の範囲は、どの特別な作業仮説にも限定されない。
【００５１】
以下に記載する好ましい態様では、タンパク吸着材料を、吸着した汚染タンパク質、脂質、および他の不溶性材料と一緒に、濾過により懸濁液より除去して、浄化したＡＡＴ含有タンパク溶液を得る。濾過は、好ましくは、ＣｅｌｉｔｅＴＭ珪藻土のような濾過補助剤を利用して行って、そして好ましくは、１０未満の比濁度単位（ＮＴＵ）／ｍｌの明瞭度に達するまで、フィルターを通して懸濁液を再循環させる。濾液をクロマトグラフィー技術によってさらに処理して、高純度で高活性のＡＡＴを得る。当該技術分野において知られる他の分離法（例えば遠心分離）も濾過の代わりに利用可能である。実施者は、操作のスケールとタンパク吸着材料の性質に適した方法を選択してよい。
【００５２】
不溶性材料の除去後、ＡＡＴ含有溶液は、当該技術分野において知られるいずれかのタンパク精製の方法、特にＡＡＴの精製に適していることがすでに知られている方法によってさらに処理してよい。以下に記載する好ましい態様では、はじめに、塩勾配溶出を伴うイオン交換クロマトグラフィー（「ＩＥＣ」）へ濾液を処する。クロマトグラフィーカラムは、陽電荷の基が共有結合している有孔の樹脂支持体マトリックスからなるアニオン交換樹脂を含有する。これらの陽電荷基は、ＡＡＴのようなアニオン基のあるタンパク質を含め、アニオンと可逆的に結合する。
【００５３】
ＡＡＴと、溶出緩衝液のｐＨで正味陰電荷を有する他のタンパク質は、ＩＥＣカラムへ結合する。陰電荷をほとんどまたはまったく有さない汚染タンパク質は、結合することなくアニオン交換樹脂カラムを素通りし、カラム溶出液とともに出る。従って、このカラムへ結合しないこれらの汚染タンパク質は、勾配溶出によってＡＡＴより分離される。カラムを溶出させるときに塩濃度を徐々に高めて、この樹脂へ結合している様々なタンパク質を順次遊離させる。
【００５４】
以下に記載する好ましい態様では、ＩＥＣカラムからのＡＡＴ含有溶出液を疎水性相互作用クロマトグラフィー（「ＨＩＣ」）へ処する。この種のクロマトグラフィーは、部分（ｍｏｉｅｔｉｅｓ）が共有結合している支持体マトリックスを利用する。水系環境において、これらの疎水性部分は、ＩＥＣ溶出液中に残存する汚染タンパク質のような疎水性タンパク質へ可逆的に結合する。ＡＡＴは相対的に非疎水性であるので、ＡＡＴの大部分は、このカラムの緩衝液での溶出の間にカラムより流出するが、その一方で、より疎水性の汚染タンパク質は、カラムへ結合したままである。従って、カラム流出液は、精製されたＡＡＴを含有する。実際は、ＡＡＴにはある種のＨＩＣカラム媒体へわずかなアフィニティーを有することがわかっていて、そのような場合は、元の適用試料中のＡＡＴのすべてを実質的に回収するためには、数倍容量の洗浄緩衝液でのさらなる溶出が望ましい場合がある。
【００５５】
所望されるレベルの純度および活性に達するために必要とされるような追加の精製工程の後で、ＡＡＴ溶液を濃縮し、滅菌する。以下に記載する好ましい態様において、ＡＡＴは、疎水性相互作用クロマトグラフィーの後で医薬的に許容される純度および活性のレベルにあり、追加の工程は必要でない。以下に記載する好ましい態様では、限外濾過に続く透析濾過（ダイアフィルトレーション）によって濃縮を達成する。これらの技術では、溶媒と溶解塩と低分子が濾過膜を素通りし、より濃縮したタンパク溶液が後に残る。次いで、数倍容量の新たな緩衝液をこの産物へ連続追加して、タンパク溶液に残存する塩および低分子を異なる緩衝液と交換するが、この間、同じ膜へ溶液を連続的に通過させることによって一定の産物容量を維持する。
【００５６】
次いで、ＡＡＴに医薬的に許容される緩衝液を提供し、当該技術分野で知られている方法によって、好ましくはＡＡＴ治療用製剤を調製するのに適していることが知られている方法によって、凍結乾燥する。
【００５７】
哺乳動物供給源より単離されるタンパク質は、病原性ウイルス汚染物を含有する場合があり、医薬組成物ではこのような汚染を低減または一掃することが望ましい。ウイルス低減の方法は、関連技術分野の当業者に知られている。本発明に適用可能であると考慮される方法には、限定されないが、低温殺菌、照射、溶媒／洗浄剤処理、消毒、濾過、および超臨界流体での処理が含まれる。溶媒／洗浄剤処理は、例えば、タンパク溶液をポリオキシエチレンソルビタンエステルおよびリン酸トリブチルと接触させることによって実行可能である（米国特許第４，８２０，８０５号を参照のこと；また、この方法のＡＡＴ組成物への適用については、ＷＯ９５／３５３０６も参照のこと）。タンパク溶液の消毒は、例えば米国特許第６，１０６，７７３号、６，３６９，０４８号、および６，４３６，３４４号に開示されるように、この溶液を可溶性の病原体不活性化剤へ曝露することによって行っても、また例えば米国特許第６，０９６，２１６号とその参考文献に開示されるように、不溶性の病原体不活性化マトリックスとの接触によって行ってもよい。濾過は、１５〜７０ｎｍの限外フィルター（例えば、ＶｉｒＡＧａｒｄＴＭフィルター、Ａ／Ｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐ．；ＰｌａｎｏｖａＴＭフィルター、旭化成株式会社；ＶｉｒｅｓｏｌｖｅＴＭフィルター、Ｍｉｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．，；ＤＶ ａｎｄ ＯｍｅｇａＴＭフィルター、Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐ．）を通過させてよい。照射は、紫外線でもγ線でもよい；例えば、米国特許第６，１８７，５７２号とその参考文献を参照のこと。超臨界流体での処理によるウイルスの不活性化については、米国特許第６４６５１６８号に記載されている。タンパク溶液の低温殺菌は、処理すべきタンパク質の熱安定性により指定される限度内で加熱することによって達成可能である。ＡＡＴの場合、低温殺菌は、通常、約６０〜７０℃まで加熱することによって達成される。以下に記載する好ましい態様において、ＡＡＴ濃縮物のウイルス低減は、低温殺菌と限外濾過によって行う。例えば、米国特許第４，８７６，２４１号に開示されるように、低温殺菌工程の間に熱分解からＡＡＴを保護するために、安定化添加剤を加えてよい。好ましくは、ショ糖と酢酸カリウムを安定化剤として加えて、次いで、安定化したＡＡＴ溶液を約６０℃で低温殺菌して、ウイルス汚染を低減する。ショ糖の量は、好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、そして最も好ましくは約６０重量％である。４０％未満のショ糖の使用は、望まれないレベルのＡＡＴ凝集をもたらすことがわかった。酢酸カリウムの量は、好ましくは少なくとも４％、より好ましくは少なくとも５％、そして最も好ましくは約６重量％である。
【００５８】
ウイルス低減の後で、ＡＡＴ溶液は、随意に希釈して限外濾過してから、再濃縮して、例えば濾過により滅菌してよい。次いで、滅菌済みＡＡＴ含有濃縮物を凍結乾燥させて、治療用製品を生成することができる。凍結乾燥ＡＡＴ散剤を調製するのに適した組成を表１に示す。
【００５９】
【表１】
【００６０】
最終製剤は、選択されるウイルス不活性化工程と企図される投与の形式に左右される。ＡＡＴが注射によって、エアゾール剤として、または局所的に投与されるかどうかに依存して、ＡＡＴは、凍結乾燥散剤、液剤、または懸濁液剤として保存してよい。表１に示す組成は注射に適していて、滅菌水での後の復元のために、凍結乾燥させて、硝子バイアルに保存してよい。吸入に適した乾燥粉末製剤の組成を表２に示す。こうした製剤は、米国特許第５，７８０，０１４号に記載されるように、目盛り付き投薬吸入器、または米国特許第６，１３８，６６８号に開示されるような肺送達デバイスでの吸入投与に適している。
【００６１】
【表２】
【００６２】
ＡＡＴの量および質を決定するためのアッセイが当該技術分野で知られていて、本方法の効率を評価するために利用可能である。生物学的流体中のＡＡＴを測定または検出するために使用する、ＡＡＴに特異的なモノクローナル抗体を伴うイムノアッセイの例が、米国特許第５，１１４，８６３号に開示されている。速度比濁分析の使用の例がＬ．Ｇａｉｄｕｌｉｓら，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．２９：１８３８（１９８３）に開示されている。ＡＡＴ機能活性は、米国特許第４，６９７，００３号に記載されるように、エラスターゼの発色基質を使用してそのエラスターゼ阻害能力を測定することによってアッセイすることができる。ＡＡＴはまた、類似のやり方でそのトリプシン阻害能力を測定することによってアッセイしてもよい。好ましい態様において、ＡＡＴは、本明細書の他所に記載のように、終点比濁分析によってアッセイする。
【００６３】
タンパク質の量は、当該技術分野で知られた方法、例えばＢｒａｄｆｏｒｄアッセイによって、または減衰係数としてＥ１％１ｃｍ，２８０ｎｍ＝５．３を使用する２８０ｎｍでの吸光度によって決定可能である（Ｒ．Ｐａｎｎｅｌｌ，Ｄ．Ｊｏｈｎｓｏｎ，およびＪ．Ｔｒａｖｉｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １３：５４３９−５４４５（１９７４））。染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥとデンシトメトリーも、試料の純度を評価し、汚染タンパク質の存在を検出するために使用可能である。好ましくは、ジチオスレイトールのような還元剤をＳＤＳ−ＰＡＧＥで使用して、あらゆるジスルフィド連結重合体を切断して、それによってＡＡＴ全体の非ＡＡＴタンパク質全体に対する比較を促進する。サイズ排除ＨＰＬＣも試料の純度を評価して、汚染タンパク質と凝集または重合型ＡＡＴの両方の存在を検出するために使用可能である。本発明の方法により調製した４つのロットの分析により、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（還元型）によればＡＡＴタンパク質純度が少なくとも９８％であり、ＡＡＴ単量体含量が少なくとも９５％であり、比活性が平均して１．０６ｍｇの機能性ＡＡＴ／ｍｇタンパク質であることが示された（表３）。
【００６４】
【表３】
【００６５】
本発明の方法に好ましい条件は以下の通りである：
１．Ｃｏｈｎ分画ＩＶ１−４の調製
ヒト血漿を−２〜２℃へ冷やし、そして６．９〜７．５のｐＨへ調整する。冷エタノールを加えて６〜１０％の濃度とし、そして温度を−４〜０℃へ下げる。生じる沈殿物（「分画Ｉ」）を遠心分離または濾過により除去する。
【００６６】
上記の手順からの濾液または上清をｐＨ６．７〜７．１へ調整し、冷エタノールを加えて１８〜２２％の濃度とする。温度を−７〜−３℃へ下げて、そしてこの混合物を再び遠心分離または濾過に処す。生じる沈殿物（「分画ＩＩ＋ＩＩＩ」）を他の目的のために取っておく。
【００６７】
上記の手順からの濾液または上清をｐＨ４．９〜５．３へ調整し、そしてエタノール濃度を１６〜２０％へ調整する。温度を−７〜−３℃へ調整する。この懸濁液が安定した後で、これをｐＨ５．７〜６．１へ調整し、そしてエタノール濃度を４０〜４４％へ調整する。生じる沈殿物（「分画ＩＶ１−４」）を遠心分離または濾過により除去し、ペーストの形態で必要とされるまで保存する。分画ＩＶ１−４は、ＡＡＴだけでなく、汚染タンパク質および脂質を含有する。
【００６８】
２．ＤＴＴおよびシリカでの精製
分画ＩＶ１−４ペーストを懸濁緩衝液（例えば、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ，２０ｍＭ ＮａＣｌ，約７．５と約９．５の間、好ましくは約８と約９の間のｐＨ）に懸濁させ、低温で少なくとも１時間撹拌する。使用する緩衝液の量は、１ｋｇの血漿含有分画につき６〜１０ｋｇの緩衝液に及ぶ。
【００６９】
次いで、このＴｒｉｓ緩衝液の懸濁液をジチオスレイトール（ＤＴＴ）とフュームドシリカで処理する。Ｔｒｉｓ緩衝液の懸濁液へＤＴＴを約１０〜５０ｍＭの範囲の濃度で加える。この溶液を低温で少なくとも３０分間、好ましくは２〜４時間、そして好ましくは約８〜９のｐＨで撹拌する。フュームドシリカは、１ｋｇの分画ＩＶ沈殿物につきほぼ１００〜３００ｇのフュームドシリカの濃度で加える。この懸濁液を低温で少なくとも３０分間、好ましくは１〜４時間、約８〜９のｐＨで撹拌する。ＣｅｌｉｔｅＴＭのような濾過補助剤を、シリカ１に対して濾過補助剤５の重量比で加え、この混合物をほぼ１５分間撹拌する。フィルタ・プレスを使用して、沈殿したフュームドシリカと汚染タンパク質より可溶性のＡＡＴ産物を分離して、ＡＡＴ最終濾液を得る。好ましくは、所望されるレベルの明瞭度が得られるまで、フィルタ・プレスを通して懸濁液を再循環させる。次いで、ＡＡＴ最終濾液をさらに以下のように処理する。
【００７０】
３．イオン交換クロマトグラフィー
ＩＥＣ平衡緩衝液で平衡化したアニオン交換樹脂を含有するクロマトグラフィーカラムへＡＡＴ最終濾液をそのまま適用する。ＩＥＣ洗浄緩衝液でカラムを洗浄することによって汚染物をカラムより除去し、引き続き、ＩＥＣ溶出緩衝液を使用してＡＡＴを溶出させる。
【００７１】
４．疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）
硫酸アンモニウムを加えて約１Ｍの最終濃度とすることによって、ＩＥＣカラムからの溶出液をＨＩＣのために調製する。次いで、この溶液を濾過し、そしてＨＩＣ洗浄緩衝液に平衡化した疎水性相互作用クロマトグラフィーカラムへ適用する。洗浄緩衝液での初期溶出によりＡＡＴ含有流出液を得て、そして追加の洗浄緩衝液での溶出によってカラムに保持されたＡＡＴを除去する。流出液と洗液を合わせて限外濾過により濃縮し、そしてリン酸緩衝液へ透析濾過する。最終ＡＡＴ濃度は、好ましくは、７％以下のタンパク質である。
【００７２】
５．低温殺菌
ショ糖および酢酸カリウムの添加によりＡＡＴ濃縮物を低温殺菌のために安定化させて、そして約６０℃で１０〜１１時間低温殺菌する。低温殺菌した溶液は、さらなる処理までは２〜８℃に保つ。
【００７３】
６．ナノ濾過
低温殺菌済みＡＡＴ溶液を最終製剤緩衝液で希釈する。次いで、この希釈した低温殺菌済みＡＡＴ溶液を２つの新しいＹＭ−１００（Ａｍｉｃｏｎ）らせん巻き限外濾過カートリッジに通して濾過する。このナノ濾過工程は、第二の主要なウイルス低減工程として役立つ。公称１００，０００ダルトンの分子量カットオフを有する膜によりウイルスが保持されるのに対し、ほぼ５０ｋＤの分子量を有するＡＡＴは素通りする。この第二フィルターの透過液とフィルター後洗液にＡＡＴを採取する。この最終濾液をバルク受け器に採取して、２〜８℃に保つ。
【００７４】
７．滅菌濾過と凍結乾燥
ＡＡＴ含有最終濾液を濃縮し、そして１５℃以下の温度で最終製剤緩衝液へ透析濾過して、最終バルク溶液を生成する。一連の滅菌、細菌保持フィルターの通過により、この溶液を浄化して滅菌する。この無菌バルク溶液を滅菌済みのガラス最終容器へ充填する。充填した容器を凍結乾燥させてから、真空で密封する。
【００７５】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥとＥＬＩＳＡのような免疫学的アッセイまたは比濁分析の両方により決定されるように、この産物は９６％以上純粋なＡＡＴであり、そしてサイズ排除ＨＰＬＣによれば９３％以上の単量体である。Ｃｏｈｎ分画ＩＶペーストの機能活性ＡＡＴ含量に基づいた回収率は、７０％である。
【実施例】
【００７６】
実施例
９０２６リットルのヒト血漿より、Ｃｏｈｎ血漿分画法により分画ＩＶ１−４沈殿物（６６７ｋｇ）を単離した。この材料をそれぞれほぼ７５ｋｇの９つのバッチへ分割した。プレスケーク（ｐｒｅｓｓｃａｋｅ）に対して６〜１０（ｗ／ｗ）の緩衝液を使用して、各バッチをＴｒｉｓ緩衝液に懸濁させた。この懸濁液を少なくとも１５分間撹拌し、温度を２°〜８℃へ調整し、そして１Ｎ水酸化ナトリウムまたは１Ｎ塩酸を必要に応じて用いて、各懸濁液のｐＨを８．８０〜８．９５へ調整した。この懸濁液を１５〜１０５分（平均４５分）間撹拌し、そしてタンパク質（Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイ）と効力をモニターした。各バッチの比活性は、０．０２７〜０．０４５の範囲にあり、平均して０．０３７ｍｇの機能性ＡＡＴ／ｍｇタンパク質であった。タンパク質全体のほぼ１２％がアルブミンであり、ほぼ２２％がトランスフェリンであった。
【００７７】
ジチオスレイトール（ＤＴＴ）を加え、各バッチ中のＴｒｉｓ緩衝液の量に基づいて０．０１〜０．０５Ｍ ＤＴＴ（平均０．０３Ｍ）の最終濃度とした。少なくとも１５分のプレミックス時間の後で、温度を２°〜８℃へ調整し、そしてｐＨを８．８０〜８．９５へ再調整して、そしてこの溶液を２〜８時間（平均３時間）の間撹拌した。必要ならば、ｐＨを再び８．８０〜８．９５へ調整した。
【００７８】
ＡｅｒｏｓｉｌＴＭ３８０（ＤｅｇｕｓｓａＡＧ，フランクフルト・マイン）を１リットルの血漿インプットにつき１３．４〜１８．６ｇ（平均１６．７ｇ）の割合で加えた。この懸濁液を２〜８℃で１〜４時間（平均１時間）の間撹拌した。
【００７９】
ＣｅｌｉｔｅＴＭ５４５を、Ａｅｒｏｓｉｌ１に対してＣｅｌｉｔｅ５の割合で各懸濁液へ加え、そしてこの懸濁液を２〜８℃で撹拌した。次いで、各懸濁液を、２５ｘ２５インチのＣｕｎｏＴＭＡ２６０５−１０ＣＰフィルターパッド（無機フィルター補助剤入りのセルロースパッド；公称１ミクロンのカットオフ）を支える、プルートおよびフレームフィルタ・プレスに通して再循環させた。濁度が比濁分析（少なくとも１５分）により１０ＮＴＵ以下になったときに、再循環を中止して、濾液を採取した。フィルタ・プレスを２〜８℃のＴＲＩＳ抽出緩衝液で後洗浄した。この後洗液を最初の濾過溶液と合わせ、そして溶液中の全タンパク質をＢｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイにより定量した。濾液は、１９時間以下の間、２〜８℃に保った。ＡＡＴ活性に基づけば、この濾液は、全量で１５７７ｇのＡＡＴを含有し、分画ＩＶペーストの元の懸濁液に存在する活性の収率５９％、１．５の精製倍率に相当した。（後続の処理後に存在する活性に照らすと、これらの数値は低いように見えるが、おそらくはＡＡＴアッセイに干渉する未同定の因子が存在するためであろう。）９つのバッチのそれぞれの比活性は、０．０４２〜０．０６４に及び、そして平均して１ｍｇのタンパク質につき０．０５６ｍｇの機能性ＡＡＴであった。アルブミンとトランスフェリンは、検出限界以下であった（全タンパク質は、０．５％未満のアルブミンと２．５％未満のトランスフェリンを含有した）。
【００８０】
ＴＭＡＥ ＦｒａｃｔｏｇｅｌＴＭ（ＥＭ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，ニューヨーク州ホーソーン）をロードした、９２リットル、高さ３０ｃｍのイオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＣ）カラムをＩＥＣ平衡緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ，ｐＨ８．３〜９．３，２０〜２５℃）で平衡化した。平衡化に続き、流出液の伝導率が１．２５ｍＳ／ｃｍ以下であることを実証した。先の工程からの各濾液を２０〜２５℃へ温めて、そしてＣｕｎｏ Ｚｅｔａ ＰｌｕｓＴＭ９０ＳＰカートリッジ（４５１１５−１２−９０ＳＰ，公称０．１ミクロンのＭＷカットオフ）に通して濾過した後で、流速（≦３．０ｃｍ／分）およびカラム圧力（≦２０ｐｓｉ）を制御したカラム上へロードした。ＩＥＣカラム上へロードする全タンパク質は樹脂容量の７０％以下に制限した。次いで、２０〜２５℃で流速（≦３．０ｃｍ／分）およびカラム圧力（≦２０ｐｓｉ）を制御して、このカラムを５カラム容量のＩＥＣ洗浄緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ，２５〜７０ｍＭ ＮａＣｌ勾配液、ｐＨ７．１〜７．７）で洗浄した。流出液をＢｒａｄｆｏｒｄタンパク定量、ＡＡＴ活性のアッセイ、および２８０ｎｍでのＵＶ吸光度によりモニターした。
【００８１】
２０〜２５℃で流速（≦３．０ｃｍ／分）およびカラム圧力（≦２０ｐｓｉ）を制御して、ほぼ３カラム容量のＩＥＣ溶出緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ，７５〜１２０ｍＭ ＮａＣｌ勾配液、ｐＨ７．１〜７．７）でＡＡＴを溶出させた。流出液をＢｒａｄｆｏｒｄタンパク定量、ＡＡＴ活性のアッセイ、および２８０ｎｍでのＵＶ吸光度によりモニターした。溶出緩衝液の適用後に溶出したピーク全体をさらなる処理のために採取した。
【００８２】
全９バッチの濾液を処理するために、上記の手順を９回繰り返した。このＩＥＣ溶出液へ硫酸アンモニウムを加え、０．９〜１．１Ｍの最終濃度とした。生じる溶液は、すぐに使用するか、または１５〜２５℃で７日以下の間保存した。ＡＡＴ活性に基づけば、ＩＥＣ溶出液は、全量で２２４１ｇのＡＡＴを含有し、分画ＩＶペーストの元の懸濁液に存在する活性の収率８４％、１６．２の精製倍率に相当した。９つのバッチのそれぞれの比活性は、０．４１６〜０．９７５に及び、平均して１ｍｇのタンパク質につき０．５９２ｍｇの機能性ＡＡＴであった。
【００８３】
ＣｕｎｏＴＭフィルター（Ｚｅｔａ ＰｌｕｓＴＭ９０ＳＰカートリッジ（４５１１５−１２−９０ＳＰ，公称０．１ミクロンのＭＷカットオフ））を温ＷＦＩフラッシュに続く冷ＷＦＩリンス（ＷＦＩ＝注射用水）で準備した。圧縮空気でこのフィルターより水分を穏やかに吹き出した。硫酸アンモニウムを含有する３つのＩＥＣ溶出液をプールし、そして準備したＣｕｎｏフィルターに通して濾過し、引き続いて合わせて、「濾過済みＩＥＣ溶液」を得た。フィルターをほぼ２０リットルのＨＩＣ洗浄緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ，１Ｍ硫酸アンモニウム、ｐＨ７．１〜７．７）で後洗浄した。この後洗液と濾液を合わせて、秤量した。この方法を３回繰り返して、９バッチのＩＥＣ溶出液を処理した。
【００８４】
疎水性相互作用カラム（ＨＩＣ）にＰｈｅｎｙｌ ＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭＦａｓｔ Ｆｌｏｗ ＨＳ樹脂（ファルマシア、ニュージャージー州ピスカタウェイ）を４９リットルの容量（３２ｃｍの床高さ）まで充填し、そしてＨＩＣ洗浄緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ，１Ｍ硫酸アンモニウム、ｐＨ７．１〜７．７）で平衡化した。上記とすべてのカラムローディング、並びに後続の溶出は、流速（≦４ｃｍ／分）、カラム圧力（≦２０ｐｓｉ）、および溶液温度（２０〜２５℃）を制御しながら行った。
【００８５】
濾過済みＩＥＣ溶液の３バッチのそれぞれをＨＩＣカラム上にロードした。カラムにロードする全タンパク質は、樹脂１リットルにつき３９ｇ以下のタンパク質へ制限した。流出液の光学密度（ＯＤ２８０）をモニターし、そしてＯＤ２８０がベースライン値より０．０４単位上昇するときに採取をはじめた。このカラムをＨＩＣ洗浄緩衝液で洗浄して追加のＡＡＴをカラムより溶出させたが、この間、非ＡＡＴ汚染物は、カラムへ結合したままであった。ほぼ１０カラム容量のＨＩＣ洗浄緩衝液をカラムへ適用し、Ａ２８０がベースライン上０．０５単位未満へ低下するまで流出液を採取した。ＡＡＴ流出液とカラム洗液を合わせて、秤量した。Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク定量、ＯＤタンパク定量、効力、およびＬＡＬ（カブトガニ変形細胞溶解液）試験のために試料を取った。ＨＩＣ流出液は、７２時間以下の間１５〜２５℃に保った。ＡＡＴ活性に基づけば、この３バッチのＨＩＣ流出液は、全量で２０９０ｇのＡＡＴを含有し、分画ＩＶペーストの元の懸濁液に存在する活性の収率７９％、２５．６の精製倍率に相当した。３つのバッチのそれぞれの比活性は、０．９０８〜０．９８６に及び、平均して１ｍｇのタンパク質につき０．９３７ｍｇの機能性ＡＡＴであった。
【００８６】
分子量カットオフ範囲が５，０００〜３０，０００である、ポリエーテルスルホン膜（表面積：５０ｆｔ２）を含有する接流限外濾過（ＵＦ）ユニットの完全性試験を行って、１２５０ｍｌ／分未満の泡立ち点を確認した。透析濾過緩衝液（４０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．２〜７．６；少なくとも１０ｋｇ）を少なくとも５分間このユニットに通して再循環させた。再循環した緩衝溶液をサンプリングして、適正なｐＨ（７．２〜７．６）およびＬＡＬ（＜０．２５ＥＵ／ｍｌ）を実証した。ｐＨおよびＬＡＬの必要条件が満たされていなければ、前洗浄工程の繰り返しを実施した。このＵＦユニットは、ＨＩＣ流出液の適用に先立って、１２時間以下の間２〜８℃に保った。
【００８７】
限外濾過ユニットへの適用に先立って、先の処理工程からのＨＩＣ流出液を混合し、そして温度を１５〜２５℃へ調整した。入口圧力を≦４０ｐｓｉに維持し、そして出口圧力と試料重量を濃縮プロセスの間モニターした。濃縮物の重量がほぼ１０ｋｇになるまで濃縮を実施した。
【００８８】
濃縮に続き、このＨＩＣ流出液濃縮物を透析濾過して、Ｔｒｉｓ緩衝化硫酸アンモニウム溶液をリン酸ナトリウム緩衝液に交換した。ＨＩＣ流出液濃縮物の重量の１０倍容量で透析濾過緩衝液（４０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．２〜７．６）を適用した。入口圧力を≦４０ｐｓｉに維持し、そして出口圧力をモニターした。すべての透析濾過緩衝液を加えた後で、透過液のナトリウム濃度を定量した。透過液のナトリウム濃度が透析濾過緩衝液のそれの１０％以内であれば、透析濾過を完了とみなした。追加の透析濾過緩衝液（濃縮物の重量の５倍）を加え、必要ならば、透過液のナトリウム濃度が透析濾過緩衝液のそれの１０％以内になるまで、透析濾過を延長した。
【００８９】
透析濾過に続き、濃縮物がほぼ６ｋｇの重量になるまで、限外濾過を続けた。次いで、産物をＵＦユニットから外へ穏やかに（≦２５ｐｓｉ）吹き出した。限外濾過ユニットを１．５ｋｇの透析濾過緩衝液で２回後洗浄した。このＵＦ後洗液を透析濾過済み濃縮物へ加えた。濃縮物の全体重量を決定し、そしてタンパク濃度を定量した（２８０ｎｍでのＯＤ）。
【００９０】
観測したＯＤタンパク質に基づいて、ＡＡＴタンパク濃度を定量し、必要ならば、２．９〜６．８％の範囲へ調整した。ＬＡＬ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質、効力、および生物負荷（ｂｉｏｂｕｒｄｅｎ）についての分析を実施した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、≧９８％ ＡＡＴを示した。ＡＡＴ活性に基づけば、この濃縮物は全量２０９６ｇのＡＡＴを含有し、Ｃｏｈｎペースト懸濁液に存在する活性の収率７９％であり、２６．６の精製倍率であった。３つのバッチのそれぞれの比活性は０．８８６〜１．０４の範囲であり、平均して１ｍｇのタンパク質につき０．９７４ｍｇの機能性ＡＡＴであった。
【００９１】
このＡＡＴ濃縮物（２．９〜６．８％のタンパク質）を２０〜２５℃へ調整し、そしてショ糖（１ｋｇのＡＡＴ濃縮物につき１．７５ｋｇ）と酢酸カリウム（１ｋｇのＡＡＴ濃縮物につき０．１７５ｋｇ）を加えた。ショ糖の最終濃度は５９．８％±６％（ｗ／ｗ）で、酢酸カリウムの最終濃度は５．９８％±０．６％（ｗ／ｗ）であった。混合後、安定した濃縮物を１リットルの密封血漿ボトルへ移した。このボトルを２〜８℃で１０週以下の間（そして、１５〜２５℃で４８時間以下の間）保存した後で、加熱処理（低温殺菌）した。６０±１℃での低温殺菌を１０〜１１時間実施した。低温殺菌済みＡＡＴ溶液は、さらなる処理に先立って、１０週以下の間２〜８℃に、そして７２時間以下の間１５〜２５℃に保った。
【００９２】
低温殺菌済みＡＡＴ溶液をＨＥＰＡ濾過空気下に２つのバッチへプールし、透析濾過緩衝液（２０ｍＭリン酸ナトリウム，４５ｍＭ ＮａＣｌ，３％マンニトール，ｐＨ６．６〜７．４）により５：１の緩衝液：ＡＡＴ溶液（ｗ／ｗ）の割合で希釈した。この希釈溶液をＬＡＬ、タンパク質、および効力のためにサンプリングした。ＡＡＴ活性に基づけば、この低温殺菌済みの希釈溶液は全量１９４１ｇのＡＡＴを含有し、Ｃｏｈｎペースト懸濁液に存在する活性の収率７３％であり、２６．６の精製倍率であった。２つの低温殺菌済みバッチの比活性は０．９５４と０．９９３であり、平均して１ｍｇのタンパク質につき０．９７３ｍｇの機能性ＡＡＴであった。このＡＡＴ溶液の単量体百分率を低温殺菌の前後でサイズ排除クロマトグラフィーにより測定した。ＡＡＴ濃縮物（低温殺菌前）の単量体分画は９７．１％〜９８．５％で、平均９７．７％であった。２つの低温殺菌済み希釈溶液の単量体分画は９５．９％と９７．５％で、平均９６．７％であった。低温殺菌工程の間に重合化または凝集化したＡＡＴの単量体型は、１．０％にすぎなかった。
【００９３】
２つのＹＭ１００フィルターカートリッジ（ミリポア、マサチューセッツ州ベドフォード）をＹＭ１００ ＵＦシステムへ直列に設置し、第一カートリッジは接流モードで作動させ、第二カートリッジは行き止まりとした。このＵＦシステムを少なくとも５ｋｇの透析濾過緩衝液で再循環させた。再循環に続き、透析濾過緩衝液を試験して、ｐＨ（６．８〜７．２）とＬＡＬ（＜０．２５ＥＵ／ｍｌ）を実証した。透析緩衝液と、凍結乾燥までの後続のすべての処理は、２〜８℃であった。
【００９４】
プールしたＡＡＴ溶液のそれぞれを≦４５ｐｓｉの入口圧力で、２〜８℃でＹＭ１００カートリッジに通過させた。ロード量は１３３９グラムのタンパク質を超えず、ＹＭ１００濾液＋後洗液の重量は３３７ｋｇを超えなかった。次いで、ＹＭ１００濾液を、低温殺菌後プロセスに専用である１０，０００Ｍ．Ｗ．膜（≧２５ｆｔ２表面積）を含有する限外濾過装置を使用して、透析濾過緩衝液（１．６０〜１．９０ｍｇ／ｍｌのナトリウム、ＹＭ１００濃縮物の１０倍重量）に対して≦５０ｐｓｉの入口圧力で限外濾過して、透析濾過した。
【００９５】
透析濾過した溶液をインラインでサンプリングして、ナトリウムを試験した。透過液のナトリウムレベルが透析濾過緩衝液ナトリウム濃度の±１０％であれば、透析濾過を完了とみなした。このナトリウムレベルが透析濾過緩衝液ナトリウム濃度の±１０％でなければ、追加の透析濾過緩衝液（ＹＭ１００濾液重量の５倍）で透析濾過を繰り返した。
【００９６】
ほぼ６ｋｇの溶液が得られるまで最終濃縮を実施した。１．５ｋｇの透析濾過緩衝液を毎回使用して、２回の後洗浄を実施した。透析濾過済みＹＭ１００濾液の全容量の決定のために、後洗液を先の濃縮物と合わせた。透析濾過済みＹＭ１００濾液は、さらなる処理の前に、１２日以下の間２〜８℃に保った。ＡＡＴ活性に基づけば、この透析濾液は全量１９６０ｇのＡＡＴを含有し、Ｃｏｈｎペースト懸濁液に存在する活性の収率７４％であり、２７．５の精製倍率であった。２つのバッチの比活性は０．９８４と１．０３であり、平均して１ｍｇのタンパク質につき１．０１ｍｇの機能性ＡＡＴであった。
【００９７】
５０ｍｇの機能性ＡＡＴ／ｍｌという最終製剤目標を得るために透析濾過緩衝液を加えた後で、ＹＭ１００濾過溶液のｐＨを必要に応じてｐＨ６．８〜７．２へ調整した。０．２ミクロンのＰａｌｌ ＳＬＫ−７００２−ＮＲＰ Ｆｉｌｔｅｒ（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐ．，ニューヨーク州イーストヒルズ）で浄化を行った。浄化されたならば、この非滅菌バルクＡＡＴ溶液を合わせ、秤量し、ＬＡＬ、タンパク質、効力、および生物負荷（≦１００ＣＦＵ／ｍｌ）のためにサンプリングした。この非滅菌バルクＡＡＴを、滅菌濾過までの間、７３．５時間以下の間２〜８℃に保った。ＡＡＴ活性に基づけば、この非滅菌バルクＡＡＴ溶液は全量１８２２ｇのＡＡＴを含有し、Ｃｏｈｎペースト懸濁液に存在する活性の収率６９％であり、２６．８の精製倍率であった。比活性は、１ｍｇのタンパク質につき０．９８１ｍｇの機能性ＡＡＴであった。
【００９８】
滅菌濾過の準備として、６０Ｌバルク受け器、Ｐａｌｌ ０．２ミクロンＫＡ１ＮＦＰ２滅菌フィルター、および２つのミリポア０．２ Ｍｉｃｒｏｎ ＡｅｒｖｅｎｔＴＭ５０通気フィルターからなる滅菌バルクアセンブリーを用意した。このアセンブリーをオートクレーブ処理し、そしてオートクレーブ処理の７日以内に使用した。温度（２〜８℃）、圧力（≦２０ｐｓｉ）、濾過時間（≦１２０分）、並びに後洗浄を含めたロード量（１ｃｍ２のフィルター面積につき、≦０．２６ｋｇの非滅菌バルク）を制御して、この非滅菌バルク溶液を滅菌濾過した。６６７ｋｇのＣｏｈｎ分画ＩＶペーストより最終的に入手した無菌濾液は、最初のＣｏｈｎ分画ＩＶ１−４懸濁液の活性に基づけば６７％の全体収率と２９．８の精製倍率に相当する、１．７８ｋｇの機能性ＡＡＴを含有した。比活性は、１ｍｇのタンパク質につき１．０９ｍｇの機能性ＡＡＴであった。この産物は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによれば＞９９％ ＡＡＴで、サイズ排除ＨＰＬＣによれば＞９５％の単量体であった。
【００９９】
バイアルあたりほぼ１０００ｍｇの機能性ＡＡＴ活性（即ち、バイアルあたり２０．８ｇ±０．２ｇの溶液）を達成することを目標にした充填量を使用して、ＡＡＴ無菌バルクを５０ｍｌのＩ型硝子バイアルへ無菌的に充填し、バイアルの中身を凍結させ、凍結乾燥させた。
【０１００】
【表４】
【０１０１】
上記の各工程での機能性ＡＡＴの収量と、得られるＡＡＴ分画の諸特性を表４に示す。本発明を行うための上記の方法（ｍｏｄｅｓ）の諸変更は、タンパク精製、分析化学、医学の分野、および関連分野の当業者には明らかであり、そのような代用および変更も本発明の範囲内にあると考慮される。上記に記載の詳細な態様は、例示のためにのみ提供するのであって、以下の特許請求項の範囲を制限するものではない。
【図面の簡単な説明】
【０１０２】
【図１】図１は、本発明が組み込まれる全体のＡＡＴ精製法を示すフローチャートである。
【図２】図２は、本発明の方法により様々な段階で産生される産物に存在するタンパク質を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルである。レーン１，分子量マーカー；レーン２，血漿（Ｃｙｒｏ−Ｐｏｏｒ）；レーン３，分画ＩＶ１，４抽出物；レーン４，ＤＴＴ／Ａｅｒｏｓｉｌ処理後の抽出物濾液；レーン５，ＩＥＣ溶出液；レーン６；ＨＩＣ流出液；レーン７，最終内容物。
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、タンパク質の分離および精製の方法に関する。より具体的には、本発明は、血漿分画のような複雑なタンパク混合物からのα１アンチトリプシン（ＡＡＴ、α１プロテイナーゼ阻害剤、ＡＰＩ、およびＡ１−ＰＩとしても知られている）の分離と、医薬使用に適した組成物を提供するための、分離したＡＡＴのさらなる精製の方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景技術
α１アンチトリプシン（ＡＡＴ）は、プロテアーゼの糖ペプチド阻害剤であり、ヒトの血清および他の体液に見出されている。ＡＡＴによるプロテアーゼ阻害は、組織タンパク分解の調節の必須要素であり、ＡＡＴ欠損症は、いくつかの疾患の病理に関連している。例えば、α１アンチトリプシン欠損症を遺伝により受け継いだ個体は、ヒト白血球エラスターゼによる肺組織の非調節性の破壊の結果として、重篤な早期発症肺気腫に罹患する高いリスクを有する。外因性ヒトＡＡＴの投与は、エラスターゼを阻害することが示されていて、ＡＡＴ欠損患者の生存の向上とその肺機能低下速度の抑制に関連づけられている（Ｃｒｙｓｔａｌら，Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ Ｍｅｄ．１５８：４９−５９（１９９８）；概説については、Ｒ．ＭａｈａｄｅｖａおよびＤ．Ｌｏｍａｓ，Ｔｈｏｒａｘ ５３：５０１−５０５（１９９８）を参照のこと）。
【０００３】
その治療上の有用性のために、工業用ＡＡＴの生産は、重要な研究主題となってきた。組換えＡＡＴの大腸菌（Ｒ．Ｂｉｓｃｈｏｆｆら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３０：３４６４−３４７２（１９９１））、酵母（Ｋ．Ｋｗｏｎら，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ４２：１９１−１９５（１９９５）；Ｂｏｌｌｅｎら，米国特許第４，６２９，５６７号）、および植物（Ｊ．Ｈｕａｎｇら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．１７：１２６−３３（２００１））における産生と、トランスジェニック哺乳動物（Ｇ．Ｗｒｉｇｈｔら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９：８３０−８３４（１９９１）；Ａ．Ｌ．Ａｒｃｈｉｂａｌｄ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：５１７８−５１８２（１９９０））の乳分泌による産生ではかなりの進歩がなされた。しかしながら、ＡＡＴのヒト血漿からの単離は、今日、ＡＡＴを大量に入手する最も効率的で実践的な方法であり、ヒト血漿は、そして唯一ＦＤＡ承認された供給源である。
【０００４】
沈殿、吸着、抽出、およびクロマトグラフィーの工程の組合せを伴う、ヒト血漿分画よりＡＡＴを単離および精製するためのいくつかの方法が記載されている。病原体混入のリスクを最小化するために、治療使用のためのヒトＡＡＴの産生に企図されるプールしたヒト血漿について、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原と、ヒト免疫不全ウイルスに対する抗体をスクリーニングする。感染病原体の伝播に抗する追加の予防処置として、精製産物は、通常、６０℃まで１０時間加熱することによって低温殺菌して（Ｍｉｔｒａら，Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．８４（ｓｕｐ．６Ａ）：８７−９０（１９８８））、滅菌濾過する。
【０００５】
ＡＡＴ単離についてのほとんどの公表された方法は、一連のエタノール沈殿およびｐＨ調整の後のペーストとして血漿より入手される、Ｃｏｈｎ分画ＩＶ沈殿物、例えばＣｏｈｎ分画ＩＶ１または分画ＩＶ１−４として知られる１以上のヒト血漿分画より始める（Ｅ．Ｊ．Ｃｏｈｎら，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，６８：４５９−４７５（１９４６））。
【０００６】
米国特許第３，３０１，８４２号は、Ｃｏｈｎ分画ＩＶ１からのＡＡＴの単離の方法を記載し、ここでは、アクリジンまたはキノリン誘導体をｐＨ６で緩衝液中のペーストへ加え、沈殿物を捨て、ｐＨを７．０へ調整する。追加のアクリジンまたはキノリンを加え、沈殿物を採取する。この沈殿物をｐＨ５．０の緩衝液に溶かし、塩化ナトリウムを加え、生じる沈殿物を捨てる。ＡＡＴを含有する溶液をメタノール沈殿によってさらに処理する。あるいは、血漿についてｐＨ８とｐＨ５で硫酸アンモニウム沈殿を実施して、ｐＨ５の上清を上記のようにキノリンまたはアクリジン添加剤でさらに処理する。
【０００７】
Ｇｌａｓｅｒら，Ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５：３３３−３４８（１９７５）は、Ｃｏｈｎ分画ＩＶ１ペーストよりＡＡＴを単離する方法を開示した。Ｃｏｈｎ分画化に利用した５．２というｐＨによって概ね不活性化したＡＡＴを再活性化するために、ペーストをリン酸緩衝液においてｐＨ８．５で撹拌する。透析と遠心分離の後で、上清を２ラウンドのアニオン交換クロマトグラフィーへｐＨ６．０〜７．６およびｐＨ８．６で処して、続いてｐＨ７．６とｐＨ８．０でさらにクロマトグラフィー処理して、ＡＡＴを約３０％の全体収率で産生する。
【０００８】
Ｍ．Ｈ．Ｃｏａｎら，は、米国特許第４，３７９，０８７号および４，４３９，３５８号（Ｍ．Ｈ．Ｃｏａｎら，Ｖｏｘ Ｓａｎｇ．，４８：３３３−３４２（１９８５）；Ｍ．Ｈ．Ｃｏａｎ，Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｍｅｄ．，８４（ｓｕｐ ６Ａ）：３２−３６（１９８８）；および、Ｒ．Ｈ．Ｈｅｉｎら，Ｅｕｒ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｊ．，３（ｓｕｐ９）：１６ｓ−２０ｓ（１９９０）も参照のこと）において、Ｃｏｈｎ分画ＩＶ１ペーストをｐＨ６．５〜８．５の緩衝液に溶かし、ポリエチレングリコールを加え、そしてｐＨを４．６〜５．７の範囲へ下げて、望まれないタンパク質を沈殿させる手順を開示した。遠心分離の後で、上清よりアニオン交換クロマトグラフィーによってＡＡＴを単離する。さらなる処理によって、４５％収率のＡＡＴを約６０％の純度で得る。沈殿剤としてポリエチレングリコールを利用する方法が、以下に記載の米国特許第４，６９７，００３号、米国特許第４，６５６，２５４号、および日本特許、ＪＰ０８０９９９９９にも記載され；そして、Ｈａｏら，「タンパク分離技術と血漿分画法の改善に関する国際報告ワークショップ（Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔｌ．Ｗｏｒｋｓｈｏｐ ｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｂｌｏｏｄ Ｐｌａｓｍａ Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ），１９７７年９月７−９日、ヴァージニア州レストン」によっても記載されている。
【０００９】
Ｄｕｂｉｎら，Ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０：６３−７０（１９９０）は、最初にＡＡＴをＢｌｕｅ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥＴＭより溶出させてから、次いでゲル濾過クロマトグラフィーにより精製する、２工程のクロマトグラフィー精製法を開示した。
【００１０】
ＳｃｈｕｌｔｚｅとＨｅｉｍｂｕｒｇｅｒは、米国特許第３，２９３，２３６号において、ヒト血漿の硫酸アンモニウム分画化と組み合わせてクエン酸塩緩衝液でのカチオン交換クロマトグラフィーを使用する、ＡＡＴの精製を開示した。
【００１１】
ＬｅｂｉｎｇとＣｈｅｎは、米国特許第５，６１０，２８５号において、始めのアニオン交換クロマトグラフィーに続き、低ｐＨおよび低イオン強度でのカチオン交換クロマトグラフィーを利用して、血漿および血漿分画よりヒトＡＡＴを精製する精製法を開示した。このカチオンクロマトグラフィーは、これらの条件下では、変性ＡＡＴとアルブミンが含まれる汚染タンパク質が保持される一方で、活性ＡＡＴはイオン交換カラムへ結合しないという事実を利用する。
【００１２】
Ｊｏｒｄａｎら，は、米国特許第４，７４９，７８３号において、モノクローナル抗体でのアフィニティークロマトグラフィーを使用する、ヒト血漿からのＡＡＴの単離について記載した。Ｐｏｄｉａｒｅｎｅら，Ｖｏｐｒ．Ｍｅｄ．Ｋｈｉｍ．３５：９６−９９（１９８９）も参照のこと。
【００１３】
Ｓｈｅａｒｅｒら，は、ヨーロッパ特許出願ＥＰ０ ２２４ ８１１と対応する米国特許第４，６５６，２５４号において、Ｃｏｈｎ分画ＩＶペーストよりＡＡＴを抽出するための改善法を開示し、ここで改善は、先行技術において慣例であったものより高いｐＨにおいてより高い容量の緩衝液でペーストを処理することからなった。より高い容量とより高いｐＨの組合せにより、ペーストより抽出されるＡＡＴの量が高まった。望まれないタンパク質は、ポリエチレングリコールの添加と、それに続く遠心分離によって沈殿した。本質的にはＣｏａｎらの手順である代わりの手順が開示されていて、ここでは、ポリエチレングリコールの添加後にｐＨを４．６〜５．７の範囲へ調整し、そして酸性化した混合物を１〜６０分放置して、望まれないタンパク質をさらに沈殿させる。追加のポリエチレングリコールの添加によりＡＡＴを沈殿させ、そしてアニオン交換クロマトグラフィーによりさらに精製する。
【００１４】
Ａｒｒｉｇｈｉら，は、ヨーロッパ特許出願ＥＰ ０７１７０４９において、分画ＩＶ１ペーストをｐＨ８．２緩衝液において４０℃で１時間撹拌することに続いて、望まれないタンパク質を硫酸アンモニウムで沈殿させる方法を開示する。ＡＡＴは、ｐＨ７での疎水性相互作用クロマトグラフィーによって上清より単離する。
【００１５】
Ｋｒｅｓｓら，は、Ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３：５４１−５５２（１９７３）において、ヒト血漿の８０％硫酸アンモニウム処理からの沈殿物を透析してから、次いでそれをＤＥＡＥ−セルロースでクロマトグラフ処理した。この産物を再び透析し、そしてＳＥＰＨＡＤＥＸＴＭＧ−１００でゲル濾過した。次いで、ＡＡＴ含有分画をＤＥ−５２セルロースでクロマトグラフ処理して、ＡＡＴを得た。
【００１６】
日本特許５９−１２８３３５は、５と７の間のｐＨでのポリエチレングリコールの添加に続くアニオン交換クロマトグラフィーによる、望まれないタンパク質の血漿分画からの沈殿を開示する。
【００１７】
Ｂｏｌｌｅｎら，は、米国特許第４，６２９，５６７号において、ＡＡＴを発現する組換えプラスミドを担う酵母の培養物からのＡＡＴの単離を開示する。この方法は、汚染タンパク質を除去するためのｐＨ６．５でのポリエチレングリコール沈殿より始め、ｐＨ６．５でのアニオン交換クロマトグラフィーと、後続のクロマトグラフィー工程を続ける。
【００１８】
ＤｏｖｅとＭｉｔｒａは、米国特許第４，６８４，７２３号において、Ｃｏａｎら（米国特許第４，３７９，０８７号および米国特許第４，４３９，３５８号）の方法の変法を開示し、ここでは、（ａ）ＡＡＴを含有する溶液を６．５〜８．５のｐＨで２４時間まで放置する工程、（ｂ）ポリエチレングリコールと無機塩を加えて、２相混合物を入手する工程、および（ｃ）精製ＡＡＴを含有する、水性塩の相を単離する工程を含んでなる方法によってＡＡＴを精製する。
【００１９】
Ｔａｎｉｇｕｃｈｉら，は、ＰＣＴ特許出願ＷＯ９５／３５３０６において、塩化亜鉛の存在下にポリエチレングリコールを用いる沈殿と、それに続くアニオン交換クロマトグラフィーと金属キレート樹脂でのクロマトグラフィーを伴う、類似の方法を開示する。
【００２０】
Ｖａｎ Ｗｉｅｔｎｅｎｄａｅｌｅら，はまた、米国特許第４，８５７，３１７号において、工学処理した酵母培養物の粗製抽出物よりＡＡＴを単離する方法を開示し、これは、ポリエチレングリコールのｐＨ６．１での添加、沈殿タンパク質を除去するための遠心分離、塩化カルシウムの添加、ｐＨ７．０で２４時間の保存、およびさらに汚染物を除去するための遠心分離を含む。次いで、後続のクロマトグラフィー工程によって、上清よりＡＡＴを単離する。
【００２１】
Ｃｏａｎは、米国特許第４，６９７，００３号において、様々なＣｏｈｎ血漿分画よりＡＡＴを単離する方法を開示し、該方法は、ＡＡＴ含有分画からのエタノールおよび塩の除去と、それに続く、望まれないタンパク質が溶出される一方でＡＡＴがカラムに保持されるような条件下でのＤＥＡＥセルロースまたは類似の材料でのアニオン交換クロマトグラフィーを含む。Ｃｏａｎはまた、約６０℃以上で約１０時間の「低温殺菌」について記載し、これは肝炎ウイルスを非感染性にするのに十分であると述べている。
【００２２】
Ｃｏａｎは、低温殺菌温度でＡＡＴを安定化するために、安定化剤としての炭水化物を単独で、またはクエン酸ナトリウムとともに加えることを開示する。好適な炭水化物は、単糖、二糖、および三糖、並びにソルビトールおよびマンニトールのような糖アルコールであると述べている。ＡＡＴは、加熱時に、重合化だけでなく、不活性コンホメーションを採りやすいので、安定化剤の存在により、熱不活性化は阻止されないが、抑制はされる（Ｄ．Ｌｏｍａｓら，Ｅｕｒ．Ｒｅｓｐ．Ｊ．１０：６７２−６７５（１９９７））。サイズ排除ＨＰＬＣ分析は、Ｃｏａｎの方法に従って低温殺菌を行うとき、１０％の単量体ＡＡＴが重合化または凝集することを示した（Ｍ．Ｈ．Ｃｏａｎら，Ｖｏｘ Ｓａｎｇ．，４８：３３３−３４２（１９８５））。
【００２３】
Ｔ．Ｂｕｒｎｏｕｆら，Ｖｏｘ Ｓａｎｇ．，５２：２９１−２９７（１９８７）は、Ｋｉｓｔｌｅｒ−Ｎｉｔｓｃｈｍａｎｎ上清ＡよりＡＡＴを単離するための実質的に同じ手順を開示した。Ｃｏｈｎ分画ＩＩ＋ＩＩＩのＤＥＡＥクロマトグラフィーとサイズ排除クロマトグラフィーにより、純度が３６倍増加した、８０〜９０％純粋である（ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる）ＡＡＴが産生された。回収は６５−７０％であった。
【００２４】
Ｔｈｉｅｒｒｙはまた、ヨーロッパ特許出願ＥＰ ０２８２３６３において、Ｋｉｓｔｌｅｒ−Ｎｉｔｓｃｈｍａｎｎ血漿分画よりＡＡＴを入手する方法を開示する。簡潔に言えば、血漿をｐＨ７．４において１０％エタノールで沈殿させ、そして上清をｐＨ５．８５において１９％エタノールで再び沈殿させる。第二の沈殿物からの上清をＤＥＡＥアニオン交換カラムへ適用し、そしてｐＨ５．２で溶出させて、約９０％の純度のＡＡＴを得る。
【００２５】
Ｓｔｒａｎｃａｒら，は、ＰＣＴ特許出願ＷＯ９５／２４４２８において、特別な種類の機能化アニオン交換媒体を利用する、非常に似た方法を開示する。このカラムへ脱塩済みＣｏｈｎ分画ＩＶ１を適用し、「酢酸のｐＫａに近い」ｐＨにおいて低塩緩衝液で汚染タンパク質を溶出させる（酢酸のｐＫａは、４．７４である）。次いで、ｐＨ７．４〜９．２において５０〜３００ｍＭ ＮａＣｌでＡＡＴを溶出させる。
【００２６】
日本特許ＪＰ ０８０９９９９９は、Ｃｏｈｎ分画ＩＶまたはＩＶ１よりＡＡＴを入手する方法を開示し、これは、塩濃度の約０．０２Ｍ未満への低下、ｐＨを４．５〜５．５へ調整すること、そして汚染タンパク質を吸着させるためにカチオン交換体と溶液を接触させることを伴う。
【００２７】
Ｍ．Ｅ．ＳｖｏｂｏｄａとＪ．Ｊ．ｖａｎ Ｗｙｋは、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１０９：７９８−８１６（１９８５）において、Ｃｏｈｎ分画ＩＶペーストのリン酸、ギ酸、および酢酸での酸抽出を開示する。
【００２８】
Ｇｌａｓｅｒら，は、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１２４：３６４−３７１（１９８２）において、またヨーロッパ特許出願ＥＰ ０ ０６７ ２９３において、Ｃｏｈｎ分画ＩＶ１沈殿物よりＡＡＴを単離する方法のいくつかの変法を開示し、該方法は、（ａ）このペーストをｐＨ８．５緩衝液に溶かす工程、（ｂ）濾過する工程、（ｃ）ＤＴＴのようなジチオールを加える工程、および（ｄ）変性タンパク質の硫酸アンモニウムでの沈殿の工程を含む。Ｇｌａｓｅｒは、「加塩、加熱、ｐＨ変更、溶媒追加、等のような好適な技術」によって脱安定化（ＤＴＴ還元）タンパク質を沈殿させることができると述べている。
【００２９】
Ｇｌａｓｅｒら，は、５０％飽和硫酸アンモニウムでの沈殿に先立って、ＤＴＴでの処理を２．５％ ＡＥＲＯＳＩＬＴＭフュームドシリカの存在下に行う、１つの変法について記載している。ＡＡＴの回収は、このシリカの非存在時と同じくらい良好であり、精製倍率は約７０％向上した。いずれの参考文献においても、著者は、このシリカに二次的な役割、硫酸アンモニウム沈殿の結果を向上させる添加物の役割しか認めていない。硫酸アンモニウム沈殿に伴わないシリカ単独の有効性については、認知も記載もされていない。タンパク溶液の濃度が約５０ｍｇタンパク質／ｍｌをかなり超えるならば、沈殿中での吸蔵によってＡＡＴが失われると報告されている。
【００３０】
ＲａｌｓｔｏｎとＤｒｏｈａｎは、米国特許第６，０９３，８０４において、初期タンパク懸濁液からの「脂質除去剤」によるリポタンパク質の除去に続く、アニオン交換媒体からのクエン酸塩緩衝液での溶出による「不活性ＡＡＴ」の除去を伴う方法を開示する。脂質除去剤は、ＭＩＣＲＯ ＣＥＬＴＭＥ、合成の含水ケイ酸カルシウムであると述べられている。非クエン酸塩緩衝液の存在下では、このアニオン交換媒体は、「不活性ＡＡＴ」を通過させる一方で、活性ＡＡＴへ結合する。アニオン交換媒体からのＡＡＴの後続の溶出と、さらに、カチオン交換媒体からのその後の溶出にはクエン酸緩衝液が指定されている。ＲａｌｓｔｏｎとＤｒｏｈａｎは、ジスルフィド還元剤の使用について記載していない。この方法は、＞９０％の産物純度のＡＡＴと、＞７０％の製造スケール収率をもたらすと述べられている。
【００３１】
Ｗ．Ｓｔｅｐｈａｎは、Ｖｏｘ Ｓａｎｇｕｉｎｉｓ ２０：４４２−４５７（１９７１）において、ヒト血漿溶液由来のリポタンパク質を吸着させるためのフュームドシリカの使用について記載している。ＡＡＴが含まれるいくつかの血漿タンパク質の濃度に対するシリカ吸着の効果が評価され、そしてＡＡＴの有意な損失はなかった。
【００３２】
Ｍａｔｔｅｓら，は、Ｖｏｘ Ｓａｎｇｕｉｎｉｓ ８１：２９−３６（２００１）とＰＣＴ特許出願ＷＯ９８／５６８２１、および公開された米国特許出願２００２／００８２２１４において、エタノール沈殿、アニオン交換クロマトグラフィー、およびハイドロキシアパタイトでの吸着クロマトグラフィーを伴う、Ｃｏｈｎ分画ＩＶよりＡＡＴを単離する方法を開示する。後者の工程は、不活性ＡＡＴを除去し、比活性がきわめて高い産物をもたらすと報告されている。
【００３３】
ＡＡＴは、α１アンチトリプシン欠損症による肺気腫に有効な治療であるが、限定された供給と複雑な製造法により、治療は非常に高額である（現行では、年あたり約２５，０００ドル）。血漿およびＡＡＴを含有する他の複雑なタンパク混合物よりヒトＡＡＴを単離するためのより効率的で費用効果の高い方法へのニーズが依然としてある。特に、硫酸アンモニウム沈殿に続く透析は、時間を浪費させる方法であり、実質量の廃水を産み出すので、高収率の高活性、高純度ＡＡＴを提供する一方で、大量の透析を必要としないスケール調整可能な（ｓｃａｌａｂｌｅ）方法へのニーズがある。ＡＡＴの加熱低温殺菌は、ウイルス汚染を低減させるが、それは不活性なＡＡＴ凝集物および重合体の形成をもたらす。従って、ウイルス汚染が低減して、有意な量の不活性ＡＡＴ凝集物および重合体を含まない、きわめて純粋なＡＡＴへのニーズもある。本発明は、これらのニーズへ対処する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００３４】
発明の簡単な説明
本発明は、粗製ＡＡＴ含有タンパク沈殿物よりＡＡＴを精製する方法を提供し、該方法は、本質的に以下の工程よりなる：（ａ）ＡＡＴが溶けることを可能にする条件下でＡＡＴ含有タンパク混合物を緩衝液に懸濁する工程；（ｂ）生じる懸濁液をジスルフィド還元剤と接触させて、還元懸濁液を産生する工程；（ｃ）還元懸濁液を不溶性タンパク吸着材料と接触させる工程；および（ｄ）不溶性材料を懸濁液より除去する工程。この方法は、先行技術の方法より低下したコストとより少ない時間で、クロマトグラフィー処理にそのまま適している濃縮ＡＡＴ調製物を提供する。追加の精製工程は、以下にさらに記載するように、実施者の考え次第で実施してよい。
【００３５】
より具体的には、本方法は：（ａ）ＡＡＴが溶けることを可能にする条件下で粗製ＡＡＴ含有タンパク沈殿物を緩衝液に懸濁する工程；（ｂ）生じる懸濁液を、ジスルフィド還元剤によるタンパク内ジスルフィド結合の還元を可能にする条件下で該還元剤と接触させて、還元懸濁液を産生する工程；（ｃ）実質量の追加塩の添加をせずに、還元懸濁液を不溶性タンパク吸着材料と接触させる工程；および（ｄ）不溶性材料を懸濁液より除去して、浄化されたタンパク溶液を入手する工程を含む。
【００３６】
「実質量の追加塩」は、それが存在しなければ可溶性であるタンパク質の溶液からの有意な量での沈殿を開始させる、可溶性塩または塩類の量を意味する。具体的には、このような目的のために通常使用される量においてある度合いのタンパク沈殿を引き起こすのに通常使用される塩が含まれる。
【００３７】
本発明の方法は、ＥＰ０ ０６７ ２９３においてＧｌａｓｅｒが教示した塩析工程を排除するので、徹底的な透析により濾液を脱塩することの必要性に関連した時間およびコストが回避される。さらに、Ｇｌａｓｅｒの利用する硫酸アンモニウム沈殿法は、処理可能であるタンパク溶液の濃度を限定した。Ｇｌａｓｅｒの方法では、タンパク濃度が約５０ｍｇ／ｍｌをかなり超えるならば、Ａｅｒｏｓｉｌ／タンパク質の沈殿中での吸蔵によってＡＡＴが失われると報告されている。硫酸アンモニウムの非存在下では、より高い濃度のタンパク質がＡＡＴの沈殿および吸蔵を伴うことなく使用可能であるので、これに関連して試薬と処理時間が節約され、バッチあたりの処理量が高まる。本発明の方法は、硫酸アンモニウムの非存在下でタンパク濃度が１００ｍｇ／ｍｌを超えて、そしてＡＡＴの沈殿は認めない、２つの工程を伴う。
【００３８】
本発明によるジスルフィド還元剤および不溶性タンパク吸着材料の組合せは、Ｃｏｈｎ分画ＩＶ沈殿物のような血漿由来の粗製ＡＡＴ調製物において主要なタンパク不純物である、アルブミンとトランスフェリンを除去するのに特に有効である。タンパク吸着材料の濾過による除去の後で、アルブミンとトランスフェリンの両方のレベルは、本明細書に記載のように実施するとき、比濁分析の検出限界以下である。本明細書に記載するさらなる処理は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（還元型）によれば９８％の平均純度で、平均して１．０６ｍｇの機能性ＡＡＴ／ｍｇという高い比活性のＡＡＴをもたらす。本明細書に開示する方法によって、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによれば９９％より高い純度で、１．１２ｍｇの機能性ＡＡＴ／ｍｇタンパク質までの比活性を有する組成物が入手可能である。
【００３９】
粗製ＡＡＴ含有タンパク沈殿物は、様々な供給源に由来してよく、限定されないが、ヒト血清、ヒトＡＡＴを発現するトランスジェニック哺乳動物からの血清、またはヒトＡＡＴをその乳汁に分泌するトランスジェニック哺乳動物からの乳汁が含まれる。供給源は、好ましくは血清である。この供給源が血清であれば、沈殿物は、好ましくは、Ｃｏｈｎ分画ＩＶ沈殿物、より好ましくはＣｏｈｎ分画ＩＶ１、そして最も好ましくは、Ｃｏｈｎ分画ＩＶ１−４である。Ｃｏｈｎ分画を調製する方法には、当業者に知られている、いくつかの変法があり、そしてそのいずれも本発明において利用可能である。
【００４０】
懸濁緩衝液は、ＡＡＴが溶けるどんな水性緩衝液でもよく、沈殿物に存在するＡＡＴのほとんどまたは全部を溶かすのに十分な容量で使用する。Ｃｏｈｎ分画ＩＶ１−４の懸濁に好ましい容量は、１ｋｇの沈殿ペーストにつき６と１０リットルの間である。緩衝液の例には、限定されないが、クエン酸塩、リン酸塩、およびＴｒｉｓの緩衝液が含まれる。好ましい緩衝液はＴｒｉｓ、好ましくは２０ｍＭ ＮａＣｌ入り１００ｍＭ Ｔｒｉｓである。好ましいｐＨは、８．８０と８．９５の間である。
【００４１】
ジスルフィド還元剤は、タンパク質中のジスルフィド結合を還元するために一般的に使用されるどのジチオールでもよく、限定されないが、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ジチオエリスリトール（ＤＴＥ）、１，２−エタンジチオール、１，２−プロパンジチオール、１，３−プロパンジチオール、等；またはトリブチルホスフィンまたはトリメチルホスフィンのようなホスフィンが含まれる。ジスルフィド還元剤は、好ましくはジチオール、最も好ましくはジチオスレイトールである。
【００４２】
不溶性のタンパク吸着材料は、フュームドシリカ；シリカヒドロゲル、キセロゲル、およびエーロゲル；カルシウム、アルミニウムおよびマグネシウムのケイ酸塩；ある種の粘土または鉱物；および、これらの混合物といった、疎水性タンパク質の様々な既知吸着剤のいずれでもよい。こうした材料は、通常、食用オイルおよび飲料の浄化に使用され、当業者によく知られている。好ましくは、タンパク吸着材料はシリカ吸着剤、より好ましくは、商品名ＡＥＲＯＳＩＬＴＭで販売されているようなフュームドシリカである。
【００４３】
本発明はまた、精製とウイルスの低減および不活性化の工程の新規組合せを提供し、これにより医薬使用に適した高安全かつ高純度のＡＡＴが産生される。具体的に言えば、ＡＡＴ精製方法におけるジチオスレイトールおよびフュームドシリカの使用についてはすでに記載されているが、高温または硫酸アンモニウムのような沈殿剤の非存在下におけるこの両者の組合せについては、これまで記載されていない。驚くべきことに、ジチオスレイトール−ＡＥＲＯＳＩＬＴＭ処理工程より沈殿剤を省略すると、きわめて有効な精製段階の提供されることを見出した。さらに、ジチオスレイトール、ＡＥＲＯＳＩＬＴＭ、アニオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、低温殺菌、およびナノ濾過の使用は、それぞれすでに文献に記載されているが、これらの特別な工程は、医薬グレードＡＡＴの工業製造に適した精製法において、今回初めて組み合わされた。
【００４４】
本発明は、以下の特性を特徴とするＡＡＴの調製物を提供する：
（ａ）α１アンチトリプシンは、ＳＤＳによれば、６％未満、好ましくは２％未満、そして最も好ましくは１％未満の汚染タンパク質を含有し、そして、
（ｂ）０．１％未満のアルブミン；
（ｃ）０．８％未満、そして好ましくは０．２％以下のα１酸性糖タンパク質；
（ｄ）０．１％未満のα２マクログロブリン；
（ｅ）０．１％未満のアポリポタンパク質Ａ１；
（ｆ）０．５％未満、そして好ましくは０．１％以下のアンチトロンビンＩＩＩ；
（ｇ）０．１％未満のセルロプラスミン；
（ｈ）０．５％未満、そして好ましくは０．１％未満のハプトグロビン；
（ｉ）０．２％未満、そして好ましくは０．１％未満のＩｇＡ；
（ｊ）０．１％未満のＩｇＧ；
（ｋ）０．１％未満のトランスフェリンを含有し；
（ｌ）α１アンチトリプシンの比活性は、減衰係数としてＥ１％１ｃｍ，２８０ｎｍ＝５．３を使用するとき、１ミリグラムのタンパク質につき少なくとも０．９９ｍｇの機能性ＡＡＴであり；
（ｍ）本産物の８％未満、そして好ましくは、５％未満は、単量体ＡＡＴより高い分子量であり；
（ｎ）活性ＡＡＴの抗原性ＡＡＴに対する見かけの比は、終点比濁分析により測定するとき、１．０８より大きい、好ましくは１．１６より大きい、そして最も好ましくは１．２３より大きい；
（ｏ）広範囲の物理化学特性を代表するヒトおよびモデルウイルスを使用するスパイク試験において測定するとき、エンベロープウイルスは少なくとも１１ｌｏｇ１０単位低減し、非エンベロープウイルスは、少なくとも６ｌｏｇ１０単位低減している；そして
（ｐ）該産物は、凍結乾燥して、２５℃以下で保存するとき、少なくとも２年間安定である。
【００４５】
本発明の産物における活性ＡＡＴの抗原性ＡＡＴに対する見かけの比が１（ユニティ）より大きいのは、本発明の産物の純度および／または活性が、先行技術の組成物である基準標品のそれより高いためである。終点比濁分析によって定量される抗原性レベルは、現行のタンパク標準品（製品番号ＯＱＩＭ１５，供給元：Ｄａｄｅ−Ｂｅｈｒｉｎｇ，イリノイ州ディアフィールド）に対して測定し、Ｄａｄｅ−Ｂｅｈｒｉｎｇ Ｎｅｐｈｅｌｏｍｅｔｅｒ １００用に供給される試薬およびＡＡＴ抗体（Ｄａｄｅ−Ｂｅｈｒｉｎｇ製品番号ＯＳＡＺ１５）を使用して、国際的に認知されたＣｅｒｔｉｆｉｅｄ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｍａｔｅｒｉａｌ（証明済み基準材料）４７０（ヒト血清タンパク質の基準調製品；Ｊ．Ｔ．Ｗｈｉｃｈｅｒら，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４０：９３４−９３８（１９９４）を参照のこと）に対してこれを直接較正する。
【００４６】
本明細書において具体的に参照されるすべての公表文献および特許出願は、そのまま参照により本明細書に組み込まれる。他に定義しなければ、本明細書に使用するすべての技術および科学の用語は、本発明が属する技術分野の当業者が通常理解するのと同じ意味を有する。用語「ＡＡＴ」は、不均質であれ均質であれ、ヒト血清より単離しても組換え生物より単離しても、ヒトＡＡＴを概して意味する。この用語には、薬理学的に有効な天然に存在する変異体（例えば、Ｂｒａｎｔｌｙら，Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．８４（ｓｕｐ．６Ａ）：１３−３１（１９８８）を参照のこと）、並びに薬理学的に有効な非天然型のヒトＡＡＴ（限定されないが、非ヒトのグリコシル化パターン、Ｎ末端メチオニン、または改変アミノ酸を有するものが含まれる）が含まれるものとする。当業者には、本明細書の記載に類似または同等の方法および材料が本発明の実施に使用可能であると理解され、そうした同等物も本発明の範囲内にあると予測される。以下に記載する好ましい態様は、実施例としてのみ提供し、本発明の範囲は、記載する特別な態様に限定されない。
【課題を解決するための手段】
【００４７】
発明の詳細な説明
以下に例示する本発明の特別な態様は、特別なＣｏｈｎ分画ＩＶペーストを出発材料として利用するが、同様の血漿分画の使用も本発明の範囲内にあると考慮される。代わりの出発材料には、限定されないが、他のＡＡＴ含有Ｃｏｈｎ分画（米国特許第４，６９７，００３号を参照のこと）、Ｋｉｓｔｌｅｒ−Ｎｉｔｓｃｈｍａｎｎ上清ＡまたはＡ＋Ｉ由来の沈殿物（Ｐ．Ｋｉｓｔｌｅｒ，Ｈ．Ｓ．Ｎｉｔｓｃｈｍａｎｎ，Ｖｏｘ Ｓａｎｇ．，７：４１４−４２４（１９６２））、およびＳｃｈｕｌｔｚｅら，により米国特許第３，３０１，８４２号に記載されるような血漿由来の硫酸アンモニウム沈殿物が含まれる。ＡＡＴ産生組換え細胞または生物の培養物に由来するタンパク沈殿物、またはトランスジェニック哺乳動物の乳汁または血清に由来する沈殿物の使用も、本発明の範囲内にあると考慮される。
【００４８】
当該技術分野には、冷却と様々なｐＨ調整としばしば組み合わされる、塩、アルコール、およびポリエチレングリコールの添加によるといった、溶液よりタンパク質を選択的に沈殿させる多くの方法が知られている。本発明は、その最初の調製法にかかわらず、回収可能なＡＡＴ活性を含有するほとんどのＡＡＴ含有タンパク沈殿物に適用可能であると予測される。用語「粗製ＡＡＴ含有タンパク沈殿物」は、本明細書において、血漿、乳汁、細胞培養物、または他の元の供給源のいずれであれ、これらの既知の方法の１以上によって調製されるあらゆるＡＡＴ含有タンパク沈殿物を意味するために使用する。
【００４９】
以下に記載する好ましい態様では、粗製ＡＡＴ含有タンパク沈殿物をＴｒｉｓ緩衝液に懸濁させ、ジチオスレイトール（ＤＴＴ、好ましいジスルフィド還元剤）とフュームドシリカ（好ましいタンパク吸着材料）で処理して、汚染するタンパク質および脂質を除去する。沈殿物がＣｏｈｎ分画ＩＶである場合、このようにして除去される２つの主要タンパク汚染物は、アルブミンとトランスフェリンである。ＤＴＴと他のジチオールは、ホスフィンと同様に、当該技術分野において、鎖内および鎖間のジスルフィド結合を還元することが知られている。構造的に重要なジスルフィド結合の切断は、ジスルフィド結合を有するこれら汚染タンパク質の部分変性（アンフォールディング）および不安定化を引き起こす。ＡＡＴそれ自体は、鎖内ジスルフィド結合を有さないので、ＤＴＴ処理によって不安定化しない。
【００５０】
フュームドシリカは、疎水性タンパク質へ選好的に結合することが知られている。本発明の方法において、不安定化した汚染タンパク質は、ジスルフィド結合の切断により引き起こされる部分変性によりこのタンパク質の疎水性残基の内部コアが曝露されるので、フュームドシリカのようなタンパク吸着材料へ結合すると理論化される。しかしながら、本発明の範囲は、どの特別な作業仮説にも限定されない。
【００５１】
以下に記載する好ましい態様では、タンパク吸着材料を、吸着した汚染タンパク質、脂質、および他の不溶性材料と一緒に、濾過により懸濁液より除去して、浄化したＡＡＴ含有タンパク溶液を得る。濾過は、好ましくは、ＣｅｌｉｔｅＴＭ珪藻土のような濾過補助剤を利用して行って、そして好ましくは、１０未満の比濁度単位（ＮＴＵ）／ｍｌの明瞭度に達するまで、フィルターを通して懸濁液を再循環させる。濾液をクロマトグラフィー技術によってさらに処理して、高純度で高活性のＡＡＴを得る。当該技術分野において知られる他の分離法（例えば遠心分離）も濾過の代わりに利用可能である。実施者は、操作のスケールとタンパク吸着材料の性質に適した方法を選択してよい。
【００５２】
不溶性材料の除去後、ＡＡＴ含有溶液は、当該技術分野において知られるいずれかのタンパク精製の方法、特にＡＡＴの精製に適していることがすでに知られている方法によってさらに処理してよい。以下に記載する好ましい態様では、はじめに、塩勾配溶出を伴うイオン交換クロマトグラフィー（「ＩＥＣ」）へ濾液を処する。クロマトグラフィーカラムは、陽電荷の基が共有結合している有孔の樹脂支持体マトリックスからなるアニオン交換樹脂を含有する。これらの陽電荷基は、ＡＡＴのようなアニオン基のあるタンパク質を含め、アニオンと可逆的に結合する。
【００５３】
ＡＡＴと、溶出緩衝液のｐＨで正味陰電荷を有する他のタンパク質は、ＩＥＣカラムへ結合する。陰電荷をほとんどまたはまったく有さない汚染タンパク質は、結合することなくアニオン交換樹脂カラムを素通りし、カラム溶出液とともに出る。従って、このカラムへ結合しないこれらの汚染タンパク質は、勾配溶出によってＡＡＴより分離される。カラムを溶出させるときに塩濃度を徐々に高めて、この樹脂へ結合している様々なタンパク質を順次遊離させる。
【００５４】
以下に記載する好ましい態様では、ＩＥＣカラムからのＡＡＴ含有溶出液を疎水性相互作用クロマトグラフィー（「ＨＩＣ」）へ処する。この種のクロマトグラフィーは、部分（ｍｏｉｅｔｉｅｓ）が共有結合している支持体マトリックスを利用する。水系環境において、これらの疎水性部分は、ＩＥＣ溶出液中に残存する汚染タンパク質のような疎水性タンパク質へ可逆的に結合する。ＡＡＴは相対的に非疎水性であるので、ＡＡＴの大部分は、このカラムの緩衝液での溶出の間にカラムより流出するが、その一方で、より疎水性の汚染タンパク質は、カラムへ結合したままである。従って、カラム流出液は、精製されたＡＡＴを含有する。実際は、ＡＡＴにはある種のＨＩＣカラム媒体へわずかなアフィニティーを有することがわかっていて、そのような場合は、元の適用試料中のＡＡＴのすべてを実質的に回収するためには、数倍容量の洗浄緩衝液でのさらなる溶出が望ましい場合がある。
【００５５】
所望されるレベルの純度および活性に達するために必要とされるような追加の精製工程の後で、ＡＡＴ溶液を濃縮し、滅菌する。以下に記載する好ましい態様において、ＡＡＴは、疎水性相互作用クロマトグラフィーの後で医薬的に許容される純度および活性のレベルにあり、追加の工程は必要でない。以下に記載する好ましい態様では、限外濾過に続く透析濾過（ダイアフィルトレーション）によって濃縮を達成する。これらの技術では、溶媒と溶解塩と低分子が濾過膜を素通りし、より濃縮したタンパク溶液が後に残る。次いで、数倍容量の新たな緩衝液をこの産物へ連続追加して、タンパク溶液に残存する塩および低分子を異なる緩衝液と交換するが、この間、同じ膜へ溶液を連続的に通過させることによって一定の産物容量を維持する。
【００５６】
次いで、ＡＡＴに医薬的に許容される緩衝液を提供し、当該技術分野で知られている方法によって、好ましくはＡＡＴ治療用製剤を調製するのに適していることが知られている方法によって、凍結乾燥する。
【００５７】
哺乳動物供給源より単離されるタンパク質は、病原性ウイルス汚染物を含有する場合があり、医薬組成物ではこのような汚染を低減または一掃することが望ましい。ウイルス低減の方法は、関連技術分野の当業者に知られている。本発明に適用可能であると考慮される方法には、限定されないが、低温殺菌、照射、溶媒／洗浄剤処理、消毒、濾過、および超臨界流体での処理が含まれる。溶媒／洗浄剤処理は、例えば、タンパク溶液をポリオキシエチレンソルビタンエステルおよびリン酸トリブチルと接触させることによって実行可能である（米国特許第４，８２０，８０５号を参照のこと；また、この方法のＡＡＴ組成物への適用については、ＷＯ９５／３５３０６も参照のこと）。タンパク溶液の消毒は、例えば米国特許第６，１０６，７７３号、６，３６９，０４８号、および６，４３６，３４４号に開示されるように、この溶液を可溶性の病原体不活性化剤へ曝露することによって行っても、また例えば米国特許第６，０９６，２１６号とその参考文献に開示されるように、不溶性の病原体不活性化マトリックスとの接触によって行ってもよい。濾過は、１５〜７０ｎｍの限外フィルター（例えば、ＶｉｒＡＧａｒｄＴＭフィルター、Ａ／Ｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐ．；ＰｌａｎｏｖａＴＭフィルター、旭化成株式会社；ＶｉｒｅｓｏｌｖｅＴＭフィルター、Ｍｉｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．，；ＤＶ ａｎｄ ＯｍｅｇａＴＭフィルター、Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐ．）を通過させてよい。照射は、紫外線でもγ線でもよい；例えば、米国特許第６，１８７，５７２号とその参考文献を参照のこと。超臨界流体での処理によるウイルスの不活性化については、米国特許第６４６５１６８号に記載されている。タンパク溶液の低温殺菌は、処理すべきタンパク質の熱安定性により指定される限度内で加熱することによって達成可能である。ＡＡＴの場合、低温殺菌は、通常、約６０〜７０℃まで加熱することによって達成される。以下に記載する好ましい態様において、ＡＡＴ濃縮物のウイルス低減は、低温殺菌と限外濾過によって行う。例えば、米国特許第４，８７６，２４１号に開示されるように、低温殺菌工程の間に熱分解からＡＡＴを保護するために、安定化添加剤を加えてよい。好ましくは、ショ糖と酢酸カリウムを安定化剤として加えて、次いで、安定化したＡＡＴ溶液を約６０℃で低温殺菌して、ウイルス汚染を低減する。ショ糖の量は、好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、そして最も好ましくは約６０重量％である。４０％未満のショ糖の使用は、望まれないレベルのＡＡＴ凝集をもたらすことがわかった。酢酸カリウムの量は、好ましくは少なくとも４％、より好ましくは少なくとも５％、そして最も好ましくは約６重量％である。
【００５８】
ウイルス低減の後で、ＡＡＴ溶液は、随意に希釈して限外濾過してから、再濃縮して、例えば濾過により滅菌してよい。次いで、滅菌済みＡＡＴ含有濃縮物を凍結乾燥させて、治療用製品を生成することができる。凍結乾燥ＡＡＴ散剤を調製するのに適した組成を表１に示す。
【００５９】
【表１】
【００６０】
最終製剤は、選択されるウイルス不活性化工程と企図される投与の形式に左右される。ＡＡＴが注射によって、エアゾール剤として、または局所的に投与されるかどうかに依存して、ＡＡＴは、凍結乾燥散剤、液剤、または懸濁液剤として保存してよい。表１に示す組成は注射に適していて、滅菌水での後の復元のために、凍結乾燥させて、硝子バイアルに保存してよい。吸入に適した乾燥粉末製剤の組成を表２に示す。こうした製剤は、米国特許第５，７８０，０１４号に記載されるように、目盛り付き投薬吸入器、または米国特許第６，１３８，６６８号に開示されるような肺送達デバイスでの吸入投与に適している。
【００６１】
【表２】
【００６２】
ＡＡＴの量および質を決定するためのアッセイが当該技術分野で知られていて、本方法の効率を評価するために利用可能である。生物学的流体中のＡＡＴを測定または検出するために使用する、ＡＡＴに特異的なモノクローナル抗体を伴うイムノアッセイの例が、米国特許第５，１１４，８６３号に開示されている。速度比濁分析の使用の例がＬ．Ｇａｉｄｕｌｉｓら，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．２９：１８３８（１９８３）に開示されている。ＡＡＴ機能活性は、米国特許第４，６９７，００３号に記載されるように、エラスターゼの発色基質を使用してそのエラスターゼ阻害能力を測定することによってアッセイすることができる。ＡＡＴはまた、類似のやり方でそのトリプシン阻害能力を測定することによってアッセイしてもよい。好ましい態様において、ＡＡＴは、本明細書の他所に記載のように、終点比濁分析によってアッセイする。
【００６３】
タンパク質の量は、当該技術分野で知られた方法、例えばＢｒａｄｆｏｒｄアッセイによって、または減衰係数としてＥ１％１ｃｍ，２８０ｎｍ＝５．３を使用する２８０ｎｍでの吸光度によって決定可能である（Ｒ．Ｐａｎｎｅｌｌ，Ｄ．Ｊｏｈｎｓｏｎ，およびＪ．Ｔｒａｖｉｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １３：５４３９−５４４５（１９７４））。染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥとデンシトメトリーも、試料の純度を評価し、汚染タンパク質の存在を検出するために使用可能である。好ましくは、ジチオスレイトールのような還元剤をＳＤＳ−ＰＡＧＥで使用して、あらゆるジスルフィド連結重合体を切断して、それによってＡＡＴ全体の非ＡＡＴタンパク質全体に対する比較を促進する。サイズ排除ＨＰＬＣも試料の純度を評価して、汚染タンパク質と凝集または重合型ＡＡＴの両方の存在を検出するために使用可能である。本発明の方法により調製した４つのロットの分析により、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（還元型）によればＡＡＴタンパク質純度が少なくとも９８％であり、ＡＡＴ単量体含量が少なくとも９５％であり、比活性が平均して１．０６ｍｇの機能性ＡＡＴ／ｍｇタンパク質であることが示された（表３）。
【００６４】
【表３】
【００６５】
本発明の方法に好ましい条件は以下の通りである：
１．Ｃｏｈｎ分画ＩＶ１−４の調製
ヒト血漿を−２〜２℃へ冷やし、そして６．９〜７．５のｐＨへ調整する。冷エタノールを加えて６〜１０％の濃度とし、そして温度を−４〜０℃へ下げる。生じる沈殿物（「分画Ｉ」）を遠心分離または濾過により除去する。
【００６６】
上記の手順からの濾液または上清をｐＨ６．７〜７．１へ調整し、冷エタノールを加えて１８〜２２％の濃度とする。温度を−７〜−３℃へ下げて、そしてこの混合物を再び遠心分離または濾過に処す。生じる沈殿物（「分画ＩＩ＋ＩＩＩ」）を他の目的のために取っておく。
【００６７】
上記の手順からの濾液または上清をｐＨ４．９〜５．３へ調整し、そしてエタノール濃度を１６〜２０％へ調整する。温度を−７〜−３℃へ調整する。この懸濁液が安定した後で、これをｐＨ５．７〜６．１へ調整し、そしてエタノール濃度を４０〜４４％へ調整する。生じる沈殿物（「分画ＩＶ１−４」）を遠心分離または濾過により除去し、ペーストの形態で必要とされるまで保存する。分画ＩＶ１−４は、ＡＡＴだけでなく、汚染タンパク質および脂質を含有する。
【００６８】
２．ＤＴＴおよびシリカでの精製
分画ＩＶ１−４ペーストを懸濁緩衝液（例えば、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ，２０ｍＭ ＮａＣｌ，約７．５と約９．５の間、好ましくは約８と約９の間のｐＨ）に懸濁させ、低温で少なくとも１時間撹拌する。使用する緩衝液の量は、１ｋｇの血漿含有分画につき６〜１０ｋｇの緩衝液に及ぶ。
【００６９】
次いで、このＴｒｉｓ緩衝液の懸濁液をジチオスレイトール（ＤＴＴ）とフュームドシリカで処理する。Ｔｒｉｓ緩衝液の懸濁液へＤＴＴを約１０〜５０ｍＭの範囲の濃度で加える。この溶液を低温で少なくとも３０分間、好ましくは２〜４時間、そして好ましくは約８〜９のｐＨで撹拌する。フュームドシリカは、１ｋｇの分画ＩＶ沈殿物につきほぼ１００〜３００ｇのフュームドシリカの濃度で加える。この懸濁液を低温で少なくとも３０分間、好ましくは１〜４時間、約８〜９のｐＨで撹拌する。ＣｅｌｉｔｅＴＭのような濾過補助剤を、シリカ１に対して濾過補助剤５の重量比で加え、この混合物をほぼ１５分間撹拌する。フィルタ・プレスを使用して、沈殿したフュームドシリカと汚染タンパク質より可溶性のＡＡＴ産物を分離して、ＡＡＴ最終濾液を得る。好ましくは、所望されるレベルの明瞭度が得られるまで、フィルタ・プレスを通して懸濁液を再循環させる。次いで、ＡＡＴ最終濾液をさらに以下のように処理する。
【００７０】
３．イオン交換クロマトグラフィー
ＩＥＣ平衡緩衝液で平衡化したアニオン交換樹脂を含有するクロマトグラフィーカラムへＡＡＴ最終濾液をそのまま適用する。ＩＥＣ洗浄緩衝液でカラムを洗浄することによって汚染物をカラムより除去し、引き続き、ＩＥＣ溶出緩衝液を使用してＡＡＴを溶出させる。
【００７１】
４．疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）
硫酸アンモニウムを加えて約１Ｍの最終濃度とすることによって、ＩＥＣカラムからの溶出液をＨＩＣのために調製する。次いで、この溶液を濾過し、そしてＨＩＣ洗浄緩衝液に平衡化した疎水性相互作用クロマトグラフィーカラムへ適用する。洗浄緩衝液での初期溶出によりＡＡＴ含有流出液を得て、そして追加の洗浄緩衝液での溶出によってカラムに保持されたＡＡＴを除去する。流出液と洗液を合わせて限外濾過により濃縮し、そしてリン酸緩衝液へ透析濾過する。最終ＡＡＴ濃度は、好ましくは、７％以下のタンパク質である。
【００７２】
５．低温殺菌
ショ糖および酢酸カリウムの添加によりＡＡＴ濃縮物を低温殺菌のために安定化させて、そして約６０℃で１０〜１１時間低温殺菌する。低温殺菌した溶液は、さらなる処理までは２〜８℃に保つ。
【００７３】
６．ナノ濾過
低温殺菌済みＡＡＴ溶液を最終製剤緩衝液で希釈する。次いで、この希釈した低温殺菌済みＡＡＴ溶液を２つの新しいＹＭ−１００（Ａｍｉｃｏｎ）らせん巻き限外濾過カートリッジに通して濾過する。このナノ濾過工程は、第二の主要なウイルス低減工程として役立つ。公称１００，０００ダルトンの分子量カットオフを有する膜によりウイルスが保持されるのに対し、ほぼ５０ｋＤの分子量を有するＡＡＴは素通りする。この第二フィルターの透過液とフィルター後洗液にＡＡＴを採取する。この最終濾液をバルク受け器に採取して、２〜８℃に保つ。
【００７４】
７．滅菌濾過と凍結乾燥
ＡＡＴ含有最終濾液を濃縮し、そして１５℃以下の温度で最終製剤緩衝液へ透析濾過して、最終バルク溶液を生成する。一連の滅菌、細菌保持フィルターの通過により、この溶液を浄化して滅菌する。この無菌バルク溶液を滅菌済みのガラス最終容器へ充填する。充填した容器を凍結乾燥させてから、真空で密封する。
【００７５】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥとＥＬＩＳＡのような免疫学的アッセイまたは比濁分析の両方により決定されるように、この産物は９６％以上純粋なＡＡＴであり、そしてサイズ排除ＨＰＬＣによれば９３％以上の単量体である。Ｃｏｈｎ分画ＩＶペーストの機能活性ＡＡＴ含量に基づいた回収率は、７０％である。
【実施例】
【００７６】
実施例
９０２６リットルのヒト血漿より、Ｃｏｈｎ血漿分画法により分画ＩＶ１−４沈殿物（６６７ｋｇ）を単離した。この材料をそれぞれほぼ７５ｋｇの９つのバッチへ分割した。プレスケーク（ｐｒｅｓｓｃａｋｅ）に対して６〜１０（ｗ／ｗ）の緩衝液を使用して、各バッチをＴｒｉｓ緩衝液に懸濁させた。この懸濁液を少なくとも１５分間撹拌し、温度を２°〜８℃へ調整し、そして１Ｎ水酸化ナトリウムまたは１Ｎ塩酸を必要に応じて用いて、各懸濁液のｐＨを８．８０〜８．９５へ調整した。この懸濁液を１５〜１０５分（平均４５分）間撹拌し、そしてタンパク質（Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイ）と効力をモニターした。各バッチの比活性は、０．０２７〜０．０４５の範囲にあり、平均して０．０３７ｍｇの機能性ＡＡＴ／ｍｇタンパク質であった。タンパク質全体のほぼ１２％がアルブミンであり、ほぼ２２％がトランスフェリンであった。
【００７７】
ジチオスレイトール（ＤＴＴ）を加え、各バッチ中のＴｒｉｓ緩衝液の量に基づいて０．０１〜０．０５Ｍ ＤＴＴ（平均０．０３Ｍ）の最終濃度とした。少なくとも１５分のプレミックス時間の後で、温度を２°〜８℃へ調整し、そしてｐＨを８．８０〜８．９５へ再調整して、そしてこの溶液を２〜８時間（平均３時間）の間撹拌した。必要ならば、ｐＨを再び８．８０〜８．９５へ調整した。
【００７８】
ＡｅｒｏｓｉｌＴＭ３８０（ＤｅｇｕｓｓａＡＧ，フランクフルト・マイン）を１リットルの血漿インプットにつき１３．４〜１８．６ｇ（平均１６．７ｇ）の割合で加えた。この懸濁液を２〜８℃で１〜４時間（平均１時間）の間撹拌した。
【００７９】
ＣｅｌｉｔｅＴＭ５４５を、Ａｅｒｏｓｉｌ１に対してＣｅｌｉｔｅ５の割合で各懸濁液へ加え、そしてこの懸濁液を２〜８℃で撹拌した。次いで、各懸濁液を、２５ｘ２５インチのＣｕｎｏＴＭＡ２６０５−１０ＣＰフィルターパッド（無機フィルター補助剤入りのセルロースパッド；公称１ミクロンのカットオフ）を支える、プルートおよびフレームフィルタ・プレスに通して再循環させた。濁度が比濁分析（少なくとも１５分）により１０ＮＴＵ以下になったときに、再循環を中止して、濾液を採取した。フィルタ・プレスを２〜８℃のＴＲＩＳ抽出緩衝液で後洗浄した。この後洗液を最初の濾過溶液と合わせ、そして溶液中の全タンパク質をＢｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイにより定量した。濾液は、１９時間以下の間、２〜８℃に保った。ＡＡＴ活性に基づけば、この濾液は、全量で１５７７ｇのＡＡＴを含有し、分画ＩＶペーストの元の懸濁液に存在する活性の収率５９％、１．５の精製倍率に相当した。（後続の処理後に存在する活性に照らすと、これらの数値は低いように見えるが、おそらくはＡＡＴアッセイに干渉する未同定の因子が存在するためであろう。）９つのバッチのそれぞれの比活性は、０．０４２〜０．０６４に及び、そして平均して１ｍｇのタンパク質につき０．０５６ｍｇの機能性ＡＡＴであった。アルブミンとトランスフェリンは、検出限界以下であった（全タンパク質は、０．５％未満のアルブミンと２．５％未満のトランスフェリンを含有した）。
【００８０】
ＴＭＡＥ ＦｒａｃｔｏｇｅｌＴＭ（ＥＭ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，ニューヨーク州ホーソーン）をロードした、９２リットル、高さ３０ｃｍのイオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＣ）カラムをＩＥＣ平衡緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ，ｐＨ８．３〜９．３，２０〜２５℃）で平衡化した。平衡化に続き、流出液の伝導率が１．２５ｍＳ／ｃｍ以下であることを実証した。先の工程からの各濾液を２０〜２５℃へ温めて、そしてＣｕｎｏ Ｚｅｔａ ＰｌｕｓＴＭ９０ＳＰカートリッジ（４５１１５−１２−９０ＳＰ，公称０．１ミクロンのＭＷカットオフ）に通して濾過した後で、流速（≦３．０ｃｍ／分）およびカラム圧力（≦２０ｐｓｉ）を制御したカラム上へロードした。ＩＥＣカラム上へロードする全タンパク質は樹脂容量の７０％以下に制限した。次いで、２０〜２５℃で流速（≦３．０ｃｍ／分）およびカラム圧力（≦２０ｐｓｉ）を制御して、このカラムを５カラム容量のＩＥＣ洗浄緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ，２５〜７０ｍＭ ＮａＣｌ勾配液、ｐＨ７．１〜７．７）で洗浄した。流出液をＢｒａｄｆｏｒｄタンパク定量、ＡＡＴ活性のアッセイ、および２８０ｎｍでのＵＶ吸光度によりモニターした。
【００８１】
２０〜２５℃で流速（≦３．０ｃｍ／分）およびカラム圧力（≦２０ｐｓｉ）を制御して、ほぼ３カラム容量のＩＥＣ溶出緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ，７５〜１２０ｍＭ ＮａＣｌ勾配液、ｐＨ７．１〜７．７）でＡＡＴを溶出させた。流出液をＢｒａｄｆｏｒｄタンパク定量、ＡＡＴ活性のアッセイ、および２８０ｎｍでのＵＶ吸光度によりモニターした。溶出緩衝液の適用後に溶出したピーク全体をさらなる処理のために採取した。
【００８２】
全９バッチの濾液を処理するために、上記の手順を９回繰り返した。このＩＥＣ溶出液へ硫酸アンモニウムを加え、０．９〜１．１Ｍの最終濃度とした。生じる溶液は、すぐに使用するか、または１５〜２５℃で７日以下の間保存した。ＡＡＴ活性に基づけば、ＩＥＣ溶出液は、全量で２２４１ｇのＡＡＴを含有し、分画ＩＶペーストの元の懸濁液に存在する活性の収率８４％、１６．２の精製倍率に相当した。９つのバッチのそれぞれの比活性は、０．４１６〜０．９７５に及び、平均して１ｍｇのタンパク質につき０．５９２ｍｇの機能性ＡＡＴであった。
【００８３】
ＣｕｎｏＴＭフィルター（Ｚｅｔａ ＰｌｕｓＴＭ９０ＳＰカートリッジ（４５１１５−１２−９０ＳＰ，公称０．１ミクロンのＭＷカットオフ））を温ＷＦＩフラッシュに続く冷ＷＦＩリンス（ＷＦＩ＝注射用水）で準備した。圧縮空気でこのフィルターより水分を穏やかに吹き出した。硫酸アンモニウムを含有する３つのＩＥＣ溶出液をプールし、そして準備したＣｕｎｏフィルターに通して濾過し、引き続いて合わせて、「濾過済みＩＥＣ溶液」を得た。フィルターをほぼ２０リットルのＨＩＣ洗浄緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ，１Ｍ硫酸アンモニウム、ｐＨ７．１〜７．７）で後洗浄した。この後洗液と濾液を合わせて、秤量した。この方法を３回繰り返して、９バッチのＩＥＣ溶出液を処理した。
【００８４】
疎水性相互作用カラム（ＨＩＣ）にＰｈｅｎｙｌ ＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭＦａｓｔ Ｆｌｏｗ ＨＳ樹脂（ファルマシア、ニュージャージー州ピスカタウェイ）を４９リットルの容量（３２ｃｍの床高さ）まで充填し、そしてＨＩＣ洗浄緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ，１Ｍ硫酸アンモニウム、ｐＨ７．１〜７．７）で平衡化した。上記とすべてのカラムローディング、並びに後続の溶出は、流速（≦４ｃｍ／分）、カラム圧力（≦２０ｐｓｉ）、および溶液温度（２０〜２５℃）を制御しながら行った。
【００８５】
濾過済みＩＥＣ溶液の３バッチのそれぞれをＨＩＣカラム上にロードした。カラムにロードする全タンパク質は、樹脂１リットルにつき３９ｇ以下のタンパク質へ制限した。流出液の光学密度（ＯＤ２８０）をモニターし、そしてＯＤ２８０がベースライン値より０．０４単位上昇するときに採取をはじめた。このカラムをＨＩＣ洗浄緩衝液で洗浄して追加のＡＡＴをカラムより溶出させたが、この間、非ＡＡＴ汚染物は、カラムへ結合したままであった。ほぼ１０カラム容量のＨＩＣ洗浄緩衝液をカラムへ適用し、Ａ２８０がベースライン上０．０５単位未満へ低下するまで流出液を採取した。ＡＡＴ流出液とカラム洗液を合わせて、秤量した。Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク定量、ＯＤタンパク定量、効力、およびＬＡＬ（カブトガニ変形細胞溶解液）試験のために試料を取った。ＨＩＣ流出液は、７２時間以下の間１５〜２５℃に保った。ＡＡＴ活性に基づけば、この３バッチのＨＩＣ流出液は、全量で２０９０ｇのＡＡＴを含有し、分画ＩＶペーストの元の懸濁液に存在する活性の収率７９％、２５．６の精製倍率に相当した。３つのバッチのそれぞれの比活性は、０．９０８〜０．９８６に及び、平均して１ｍｇのタンパク質につき０．９３７ｍｇの機能性ＡＡＴであった。
【００８６】
分子量カットオフ範囲が５，０００〜３０，０００である、ポリエーテルスルホン膜（表面積：５０ｆｔ２）を含有する接流限外濾過（ＵＦ）ユニットの完全性試験を行って、１２５０ｍｌ／分未満の泡立ち点を確認した。透析濾過緩衝液（４０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．２〜７．６；少なくとも１０ｋｇ）を少なくとも５分間このユニットに通して再循環させた。再循環した緩衝溶液をサンプリングして、適正なｐＨ（７．２〜７．６）およびＬＡＬ（＜０．２５ＥＵ／ｍｌ）を実証した。ｐＨおよびＬＡＬの必要条件が満たされていなければ、前洗浄工程の繰り返しを実施した。このＵＦユニットは、ＨＩＣ流出液の適用に先立って、１２時間以下の間２〜８℃に保った。
【００８７】
限外濾過ユニットへの適用に先立って、先の処理工程からのＨＩＣ流出液を混合し、そして温度を１５〜２５℃へ調整した。入口圧力を≦４０ｐｓｉに維持し、そして出口圧力と試料重量を濃縮プロセスの間モニターした。濃縮物の重量がほぼ１０ｋｇになるまで濃縮を実施した。
【００８８】
濃縮に続き、このＨＩＣ流出液濃縮物を透析濾過して、Ｔｒｉｓ緩衝化硫酸アンモニウム溶液をリン酸ナトリウム緩衝液に交換した。ＨＩＣ流出液濃縮物の重量の１０倍容量で透析濾過緩衝液（４０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．２〜７．６）を適用した。入口圧力を≦４０ｐｓｉに維持し、そして出口圧力をモニターした。すべての透析濾過緩衝液を加えた後で、透過液のナトリウム濃度を定量した。透過液のナトリウム濃度が透析濾過緩衝液のそれの１０％以内であれば、透析濾過を完了とみなした。追加の透析濾過緩衝液（濃縮物の重量の５倍）を加え、必要ならば、透過液のナトリウム濃度が透析濾過緩衝液のそれの１０％以内になるまで、透析濾過を延長した。
【００８９】
透析濾過に続き、濃縮物がほぼ６ｋｇの重量になるまで、限外濾過を続けた。次いで、産物をＵＦユニットから外へ穏やかに（≦２５ｐｓｉ）吹き出した。限外濾過ユニットを１．５ｋｇの透析濾過緩衝液で２回後洗浄した。このＵＦ後洗液を透析濾過済み濃縮物へ加えた。濃縮物の全体重量を決定し、そしてタンパク濃度を定量した（２８０ｎｍでのＯＤ）。
【００９０】
観測したＯＤタンパク質に基づいて、ＡＡＴタンパク濃度を定量し、必要ならば、２．９〜６．８％の範囲へ調整した。ＬＡＬ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質、効力、および生物負荷（ｂｉｏｂｕｒｄｅｎ）についての分析を実施した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、≧９８％ ＡＡＴを示した。ＡＡＴ活性に基づけば、この濃縮物は全量２０９６ｇのＡＡＴを含有し、Ｃｏｈｎペースト懸濁液に存在する活性の収率７９％であり、２６．６の精製倍率であった。３つのバッチのそれぞれの比活性は０．８８６〜１．０４の範囲であり、平均して１ｍｇのタンパク質につき０．９７４ｍｇの機能性ＡＡＴであった。
【００９１】
このＡＡＴ濃縮物（２．９〜６．８％のタンパク質）を２０〜２５℃へ調整し、そしてショ糖（１ｋｇのＡＡＴ濃縮物につき１．７５ｋｇ）と酢酸カリウム（１ｋｇのＡＡＴ濃縮物につき０．１７５ｋｇ）を加えた。ショ糖の最終濃度は５９．８％±６％（ｗ／ｗ）で、酢酸カリウムの最終濃度は５．９８％±０．６％（ｗ／ｗ）であった。混合後、安定した濃縮物を１リットルの密封血漿ボトルへ移した。このボトルを２〜８℃で１０週以下の間（そして、１５〜２５℃で４８時間以下の間）保存した後で、加熱処理（低温殺菌）した。６０±１℃での低温殺菌を１０〜１１時間実施した。低温殺菌済みＡＡＴ溶液は、さらなる処理に先立って、１０週以下の間２〜８℃に、そして７２時間以下の間１５〜２５℃に保った。
【００９２】
低温殺菌済みＡＡＴ溶液をＨＥＰＡ濾過空気下に２つのバッチへプールし、透析濾過緩衝液（２０ｍＭリン酸ナトリウム，４５ｍＭ ＮａＣｌ，３％マンニトール，ｐＨ６．６〜７．４）により５：１の緩衝液：ＡＡＴ溶液（ｗ／ｗ）の割合で希釈した。この希釈溶液をＬＡＬ、タンパク質、および効力のためにサンプリングした。ＡＡＴ活性に基づけば、この低温殺菌済みの希釈溶液は全量１９４１ｇのＡＡＴを含有し、Ｃｏｈｎペースト懸濁液に存在する活性の収率７３％であり、２６．６の精製倍率であった。２つの低温殺菌済みバッチの比活性は０．９５４と０．９９３であり、平均して１ｍｇのタンパク質につき０．９７３ｍｇの機能性ＡＡＴであった。このＡＡＴ溶液の単量体百分率を低温殺菌の前後でサイズ排除クロマトグラフィーにより測定した。ＡＡＴ濃縮物（低温殺菌前）の単量体分画は９７．１％〜９８．５％で、平均９７．７％であった。２つの低温殺菌済み希釈溶液の単量体分画は９５．９％と９７．５％で、平均９６．７％であった。低温殺菌工程の間に重合化または凝集化したＡＡＴの単量体型は、１．０％にすぎなかった。
【００９３】
２つのＹＭ１００フィルターカートリッジ（ミリポア、マサチューセッツ州ベドフォード）をＹＭ１００ ＵＦシステムへ直列に設置し、第一カートリッジは接流モードで作動させ、第二カートリッジは行き止まりとした。このＵＦシステムを少なくとも５ｋｇの透析濾過緩衝液で再循環させた。再循環に続き、透析濾過緩衝液を試験して、ｐＨ（６．８〜７．２）とＬＡＬ（＜０．２５ＥＵ／ｍｌ）を実証した。透析緩衝液と、凍結乾燥までの後続のすべての処理は、２〜８℃であった。
【００９４】
プールしたＡＡＴ溶液のそれぞれを≦４５ｐｓｉの入口圧力で、２〜８℃でＹＭ１００カートリッジに通過させた。ロード量は１３３９グラムのタンパク質を超えず、ＹＭ１００濾液＋後洗液の重量は３３７ｋｇを超えなかった。次いで、ＹＭ１００濾液を、低温殺菌後プロセスに専用である１０，０００Ｍ．Ｗ．膜（≧２５ｆｔ２表面積）を含有する限外濾過装置を使用して、透析濾過緩衝液（１．６０〜１．９０ｍｇ／ｍｌのナトリウム、ＹＭ１００濃縮物の１０倍重量）に対して≦５０ｐｓｉの入口圧力で限外濾過して、透析濾過した。
【００９５】
透析濾過した溶液をインラインでサンプリングして、ナトリウムを試験した。透過液のナトリウムレベルが透析濾過緩衝液ナトリウム濃度の±１０％であれば、透析濾過を完了とみなした。このナトリウムレベルが透析濾過緩衝液ナトリウム濃度の±１０％でなければ、追加の透析濾過緩衝液（ＹＭ１００濾液重量の５倍）で透析濾過を繰り返した。
【００９６】
ほぼ６ｋｇの溶液が得られるまで最終濃縮を実施した。１．５ｋｇの透析濾過緩衝液を毎回使用して、２回の後洗浄を実施した。透析濾過済みＹＭ１００濾液の全容量の決定のために、後洗液を先の濃縮物と合わせた。透析濾過済みＹＭ１００濾液は、さらなる処理の前に、１２日以下の間２〜８℃に保った。ＡＡＴ活性に基づけば、この透析濾液は全量１９６０ｇのＡＡＴを含有し、Ｃｏｈｎペースト懸濁液に存在する活性の収率７４％であり、２７．５の精製倍率であった。２つのバッチの比活性は０．９８４と１．０３であり、平均して１ｍｇのタンパク質につき１．０１ｍｇの機能性ＡＡＴであった。
【００９７】
５０ｍｇの機能性ＡＡＴ／ｍｌという最終製剤目標を得るために透析濾過緩衝液を加えた後で、ＹＭ１００濾過溶液のｐＨを必要に応じてｐＨ６．８〜７．２へ調整した。０．２ミクロンのＰａｌｌ ＳＬＫ−７００２−ＮＲＰ Ｆｉｌｔｅｒ（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐ．，ニューヨーク州イーストヒルズ）で浄化を行った。浄化されたならば、この非滅菌バルクＡＡＴ溶液を合わせ、秤量し、ＬＡＬ、タンパク質、効力、および生物負荷（≦１００ＣＦＵ／ｍｌ）のためにサンプリングした。この非滅菌バルクＡＡＴを、滅菌濾過までの間、７３．５時間以下の間２〜８℃に保った。ＡＡＴ活性に基づけば、この非滅菌バルクＡＡＴ溶液は全量１８２２ｇのＡＡＴを含有し、Ｃｏｈｎペースト懸濁液に存在する活性の収率６９％であり、２６．８の精製倍率であった。比活性は、１ｍｇのタンパク質につき０．９８１ｍｇの機能性ＡＡＴであった。
【００９８】
滅菌濾過の準備として、６０Ｌバルク受け器、Ｐａｌｌ ０．２ミクロンＫＡ１ＮＦＰ２滅菌フィルター、および２つのミリポア０．２ Ｍｉｃｒｏｎ ＡｅｒｖｅｎｔＴＭ５０通気フィルターからなる滅菌バルクアセンブリーを用意した。このアセンブリーをオートクレーブ処理し、そしてオートクレーブ処理の７日以内に使用した。温度（２〜８℃）、圧力（≦２０ｐｓｉ）、濾過時間（≦１２０分）、並びに後洗浄を含めたロード量（１ｃｍ２のフィルター面積につき、≦０．２６ｋｇの非滅菌バルク）を制御して、この非滅菌バルク溶液を滅菌濾過した。６６７ｋｇのＣｏｈｎ分画ＩＶペーストより最終的に入手した無菌濾液は、最初のＣｏｈｎ分画ＩＶ１−４懸濁液の活性に基づけば６７％の全体収率と２９．８の精製倍率に相当する、１．７８ｋｇの機能性ＡＡＴを含有した。比活性は、１ｍｇのタンパク質につき１．０９ｍｇの機能性ＡＡＴであった。この産物は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによれば＞９９％ ＡＡＴで、サイズ排除ＨＰＬＣによれば＞９５％の単量体であった。
【００９９】
バイアルあたりほぼ１０００ｍｇの機能性ＡＡＴ活性（即ち、バイアルあたり２０．８ｇ±０．２ｇの溶液）を達成することを目標にした充填量を使用して、ＡＡＴ無菌バルクを５０ｍｌのＩ型硝子バイアルへ無菌的に充填し、バイアルの中身を凍結させ、凍結乾燥させた。
【０１００】
【表４】
【０１０１】
上記の各工程での機能性ＡＡＴの収量と、得られるＡＡＴ分画の諸特性を表４に示す。本発明を行うための上記の方法（ｍｏｄｅｓ）の諸変更は、タンパク精製、分析化学、医学の分野、および関連分野の当業者には明らかであり、そのような代用および変更も本発明の範囲内にあると考慮される。上記に記載の詳細な態様は、例示のためにのみ提供するのであって、以下の特許請求項の範囲を制限するものではない。
【図面の簡単な説明】
【０１０２】
【図１】図１は、本発明が組み込まれる全体のＡＡＴ精製法を示すフローチャートである。
【図２】図２は、本発明の方法により様々な段階で産生される産物に存在するタンパク質を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルである。レーン１，分子量マーカー；レーン２，血漿（Ｃｙｒｏ−Ｐｏｏｒ）；レーン３，分画ＩＶ１，４抽出物；レーン４，ＤＴＴ／Ａｅｒｏｓｉｌ処理後の抽出物濾液；レーン５，ＩＥＣ溶出液；レーン６；ＨＩＣ流出液；レーン７，最終内容物。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＡＡＴ含有タンパク質混合物よりＡＡＴを精製する方法であって：
（ａ）ジスルフィド還元剤とＡＡＴ含有タンパク質混合物を接触させて、還元ＡＡＴ含有混合物を産生する工程；
（ｂ）還元ＡＡＴ含有タンパク質混合物を不溶性タンパク質吸着材料と接触させる工程；および
（ｃ）生じるＡＡＴ含有産物を単離する工程；
を含んでなる、前記方法。
【請求項２】
ＡＡＴ含有タンパク質沈殿物よりＡＡＴを精製する方法であって：
（ａ）ＡＡＴが溶けることを可能にする条件下でＡＡＴ含有タンパク質沈殿物を緩衝液に懸濁する工程；
（ｂ）ＡＡＴ含有懸濁液をジスルフィド還元剤と接触させて、還元ＡＡＴ含有懸濁液を産生する工程；
（ｃ）還元ＡＡＴ含有懸濁液を不溶性タンパク質吸着材料と接触させる工程；および
（ｄ）生じるＡＡＴ含有産物を単離する工程；
を含んでなる、前記方法。
【請求項３】
ジスルフィド還元剤がジチオールである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ジチオールがジチオスレイトールである、請求項３の方法。
【請求項５】
タンパク質吸着材料がシリカ吸着剤である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項６】
タンパク質吸着材料がフュームド（ｆｕｍｅｄ）シリカである、請求項５の方法。
【請求項７】
アニオン交換クロマトグラフィー工程をさらに含んでなる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項８】
疎水性相互作用クロマトグラフィー工程をさらに含んでなる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項９】
ウイルスの低減工程をさらに含んでなる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１０】
ウイルスの低減工程が約６０〜約７０℃での低温殺菌を含む、請求項９の方法。
【請求項１１】
少なくとも４０％（重量／重量）のショ糖を含有するＡＡＴの溶液に対して低温殺菌工程を行う、請求項１０の方法。
【請求項１２】
ウイルスの低減工程がウイルス粒子を除去するのに有効な濾過をさらに含む、請求項１１の方法。
【請求項１３】
滅菌工程をさらに含んでなる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１４】
滅菌工程が細菌を除去するのに有効な濾過を含む、請求項１３の方法。
【請求項１５】
ＡＡＴ含有タンパク質混合物がＣｏｈｎ分画ＩＶ沈殿物またはＣｏｈｎＩＩ＋ＩＩＩ上清である、請求項１の方法。
【請求項１６】
ＡＡＴ含有タンパク質沈殿物がＣｏｈｎ分画ＩＶ沈殿物である、請求項２の方法。
【請求項１７】
ジスルフィド還元剤を含む緩衝液を工程（ａ）に提供することによって工程（ｂ）を実行する、請求項２の方法。
【請求項１８】
（ａ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより定量される全タンパク質重量に基づいて６％以下の汚染タンパク質；および
（ｂ）０．２％未満のＩｇＡ；
を含んでなるα１アンチトリプシン組成物であって、ここでα１アンチトリプシンの比活性は、減衰係数としてＥ１％１ｃｍ，２８０ｎｍ＝５．３を使用するとき、１ミリグラムのタンパク質につき少なくとも０．９９ｍｇの機能性ＡＡＴであり；そして該組成物の８％未満は、単量体ＡＡＴより高い分子量である、前記組成物。
【請求項１９】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥによれば２％未満の汚染タンパク質を含有し、そしてここで活性ＡＡＴの抗原性ＡＡＴに対する見かけの比は１．１６より大きい、請求項１８の組成物。
【請求項２０】
組成物が、
（ａ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより定量される全タンパク質重量に基づいて１％未満の汚染タンパク質；
（ｂ）０．１％未満のＩｇＡ；
を含有し、そしてその組成物の５％未満は、単量体ＡＡＴより高い分子量である、請求項１８の組成物。
【請求項２１】
医薬的に許容されるレベルの活性および純度を有するＡＡＴの溶液よりウイルス汚染物を不活性化または除去する方法であって、
（ａ）前記ＡＡＴの溶液を約６０〜７０℃で低温殺菌に処すること；および
（ｂ）前記溶液を限外濾過に処すること；
を含んでなる、前記方法。
【請求項１】
ＡＡＴ含有タンパク質混合物よりＡＡＴを精製する方法であって：
（ａ）ジスルフィド還元剤とＡＡＴ含有タンパク質混合物を接触させて、還元ＡＡＴ含有混合物を産生する工程；
（ｂ）還元ＡＡＴ含有タンパク質混合物を不溶性タンパク質吸着材料と接触させる工程；および
（ｃ）生じるＡＡＴ含有産物を単離する工程；
を含んでなる、前記方法。
【請求項２】
ＡＡＴ含有タンパク質沈殿物よりＡＡＴを精製する方法であって：
（ａ）ＡＡＴが溶けることを可能にする条件下でＡＡＴ含有タンパク質沈殿物を緩衝液に懸濁する工程；
（ｂ）ＡＡＴ含有懸濁液をジスルフィド還元剤と接触させて、還元ＡＡＴ含有懸濁液を産生する工程；
（ｃ）還元ＡＡＴ含有懸濁液を不溶性タンパク質吸着材料と接触させる工程；および
（ｄ）生じるＡＡＴ含有産物を単離する工程；
を含んでなる、前記方法。
【請求項３】
ジスルフィド還元剤がジチオールである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ジチオールがジチオスレイトールである、請求項３の方法。
【請求項５】
タンパク質吸着材料がシリカ吸着剤である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項６】
タンパク質吸着材料がフュームド（ｆｕｍｅｄ）シリカである、請求項５の方法。
【請求項７】
アニオン交換クロマトグラフィー工程をさらに含んでなる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項８】
疎水性相互作用クロマトグラフィー工程をさらに含んでなる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項９】
ウイルスの低減工程をさらに含んでなる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１０】
ウイルスの低減工程が約６０〜約７０℃での低温殺菌を含む、請求項９の方法。
【請求項１１】
少なくとも４０％（重量／重量）のショ糖を含有するＡＡＴの溶液に対して低温殺菌工程を行う、請求項１０の方法。
【請求項１２】
ウイルスの低減工程がウイルス粒子を除去するのに有効な濾過をさらに含む、請求項１１の方法。
【請求項１３】
滅菌工程をさらに含んでなる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１４】
滅菌工程が細菌を除去するのに有効な濾過を含む、請求項１３の方法。
【請求項１５】
ＡＡＴ含有タンパク質混合物がＣｏｈｎ分画ＩＶ沈殿物またはＣｏｈｎＩＩ＋ＩＩＩ上清である、請求項１の方法。
【請求項１６】
ＡＡＴ含有タンパク質沈殿物がＣｏｈｎ分画ＩＶ沈殿物である、請求項２の方法。
【請求項１７】
ジスルフィド還元剤を含む緩衝液を工程（ａ）に提供することによって工程（ｂ）を実行する、請求項２の方法。
【請求項１８】
（ａ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより定量される全タンパク質重量に基づいて６％以下の汚染タンパク質；および
（ｂ）０．２％未満のＩｇＡ；
を含んでなるα１アンチトリプシン組成物であって、ここでα１アンチトリプシンの比活性は、減衰係数としてＥ１％１ｃｍ，２８０ｎｍ＝５．３を使用するとき、１ミリグラムのタンパク質につき少なくとも０．９９ｍｇの機能性ＡＡＴであり；そして該組成物の８％未満は、単量体ＡＡＴより高い分子量である、前記組成物。
【請求項１９】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥによれば２％未満の汚染タンパク質を含有し、そしてここで活性ＡＡＴの抗原性ＡＡＴに対する見かけの比は１．１６より大きい、請求項１８の組成物。
【請求項２０】
組成物が、
（ａ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより定量される全タンパク質重量に基づいて１％未満の汚染タンパク質；
（ｂ）０．１％未満のＩｇＡ；
を含有し、そしてその組成物の５％未満は、単量体ＡＡＴより高い分子量である、請求項１８の組成物。
【請求項２１】
医薬的に許容されるレベルの活性および純度を有するＡＡＴの溶液よりウイルス汚染物を不活性化または除去する方法であって、
（ａ）前記ＡＡＴの溶液を約６０〜７０℃で低温殺菌に処すること；および
（ｂ）前記溶液を限外濾過に処すること；
を含んでなる、前記方法。
【図１】
【図２】
【図２】
【公表番号】特表２００６−５１２３９４（Ｐ２００６−５１２３９４Ａ）
【公表日】平成１８年４月１３日（２００６．４．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−５６５５８９（Ｐ２００４−５６５５８９）
【出願日】平成１５年１２月１９日（２００３．１２．１９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０４０５６０
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０６０５２８
【国際公開日】平成１６年７月２２日（２００４．７．２２）
【出願人】（５０５２５０１２２）ズィーエルビー・ベアリング・エルエルシー (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年４月１３日（２００６．４．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１５年１２月１９日（２００３．１２．１９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０４０５６０
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０６０５２８
【国際公開日】平成１６年７月２２日（２００４．７．２２）
【出願人】（５０５２５０１２２）ズィーエルビー・ベアリング・エルエルシー (1)
【Ｆターム（参考）】
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