アジュバントとしての髄膜炎菌ｌｇｔＢＬＯＳ
本発明は、樹状細胞上のＤＣ−ＳＩＧＮ受容体へ結合性の増強を示す三糖の外部コアを有するナイセリア属菌リポオリゴ糖（ＬＯＳ）に関する。かかる結合性の増強の結果として、本発明のナイセリア属菌ＬＯＳは、免疫賦活活性が増強している。かかるナイセリア属菌ＬＯＳの三糖の外部コアと毒性が低下したリピドＡ部分との組合せは、ワクチン製剤におけるアジュバントとして有用である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫賦活作用が増強された、ナイセリア属菌の（Neisserial）リポオリゴ糖（ＬＯＳ）に関する。本発明のナイセリア属菌ＬＯＳは、樹状細胞上の受容体への結合性の増強を示す三糖の外部コア（outer core）を含む。前記ナイセリア属菌ＬＯＳの三糖の外部コアと毒性が低下したリピドＡ部分との組合せは、ワクチン製剤におけるアジュバントとして有用である。
【背景技術】
【０００２】
髄膜炎菌ＬＰＳ（Neisseria meningitidis LPS）は、強力なアジュバントであるだけでなく、そのＬＰＳ特異的免疫応答誘導能によっても、潜在的なワクチン候補として注目を集めている。しかし、ＬＰＳの内毒素活性のため、ワクチンにおけるその使用は今のところ限定されている。
【０００３】
髄膜炎菌ＬＰＳ（Meningococcal LPS）は、細菌の外膜に自身を固定（anchor）する疎水性リピドＡ部分と、細菌の表面に露出（exposed）する親水性のオリゴ糖のコアとで構成される（図１）。天然のオリゴ糖鎖は宿主の糖脂質抗原に構造的に類似しているため、ワクチン製剤に含有させることは望ましくない。ＬＰＳのオリゴ糖生合成経路の遺伝子組換えにより、切断型（truncated）オリゴ糖鎖を発現する髄膜炎菌変異体の系（series）の製造が可能となっている（図１）。ＬＰＳの内毒素及びアジュバント特性は、かかる分子のリピドＡ部分によって決定されると考えられる。本発明者らは先に、極めて向上した薬理学的特性を有する髄膜炎菌リピドＡ変異株の固有の系（unique set）を作製している。具体的には、リピドＡのアシルオキシアシル化に関連するｌｐｘＬ１（ｈｔｒＢ１）遺伝子を不活化すると、ヘキサアシル化リピドＡではなくペンタアシル化リピドＡを発現するリピドＡ変異株を単離することができた。かかる変異株は、内毒素活性が低下していながら、アジュバント活性を維持していた。さらに、髄膜炎菌ｌｐｘＡ遺伝子の不活化により、ＬＰＳを完全に欠如する髄膜炎菌変異株も単離した。このように、髄膜炎菌ＬＰＳのオリゴ糖部分のみならず、リピドＡ部分の修飾によっても、髄膜炎菌ワクチンの開発における新たな可能性が拓かれた。
【０００４】
樹状細胞（ＤＣ）は、天然の感染症における免疫応答とワクチン接種に対する免疫応答との両方の開始において、その役割を果たしているため、大きな関心を集めている。細菌に対する免疫応答は、ＤＣによって開始される。ＤＣは、細菌性抗原を貪食して処理し、Ｔ細胞に提示する。本発明者らは近年、髄膜炎菌ＬＰＳが、ヒトＤＣとの相互作用の間に重要な役割を果たすことを示した。さらに、細菌の内部移行（internalization）及びＤＣの完全な活性化にも、ＬＰＳが必要とされる。
【発明の開示】
【０００５】
定義
本明細書においてアジュバントとは、抗原と組み合せて用いられる場合、哺乳動物、好ましくはヒトを免疫し、免疫システムを刺激し、それにより好ましくはアジュバント自体に対する特異的免疫応答を生じさせることなく、前記抗原に対する免疫応答を誘発、増強、又は促進するあらゆる物質又は化合物を含むと定義される。好適なアジュバントは、所与の抗原に対する免疫応答を増強し、同様の但しアジュバントが非存在の条件下で前記抗原に対して生じる免疫応答に比較して、少なくとも１．５、２、２．５、５、１０、又は２０倍の強さに免疫応答を増強する。本技術分野においては、アジュバントによって動物又はヒトの集団に生じる、所与の抗原に対する免疫応答の統計学的な平均増強値を、対応する対照集団に照らして決定する分析法を用いることができる。前記アジュバントは、好ましくは少なくとも２つの相違する抗原に対する免疫応答増強能がある。本発明のアジュバントは通常、哺乳動物にとって外来の化合物であり、したがってインターロイキン、インターフェロン及びその他のホルモン等の、哺乳動物にとって内因性の免疫賦活化合物は除外される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
本発明は、特定の三糖の外部コア構造を有するナイセリア属菌ＬＰＳでは、ヒト樹状細胞（ＤＣ）への結合及び内部移行（internalisation）が増強するという、意外な発見に基づく。三糖を含むＬＰＳ、より厳密にいえば三糖を含むＬＯＳ（リポオリゴ糖）の結合及び内部移行は、ヒトＤＣに発現するＣ型レクチンＤＣ−ＳＩＧＮ介在性であり、ＤＣの活性化及び成熟化の速度を高める。この新規な三糖を含むナイセリア属菌ＬＯＳは、その向上した免疫賦活作用により、免疫及びワクチン接種における強力なアジュバントとして用いることができる。
【０００７】
すなわち本発明の第一の態様は、抗原で哺乳動物を免疫又はワクチン接種する方法であって、前記方法が、（哺乳動物に対して）抗原を投与することを含み、ナイセリア属菌ＬＯＳが、次式（Ｉ）
【化１】
で表され、式中、ＬＡが、好ましくはナイセイア属菌株由来の野生型リピドＡ部分、又はより好ましくは毒性が低下したリピドＡ部分であることを特徴とする方法に関する。
【０００８】
式（１）中、ＧｌｃＮＡｃはＤ−グルコサミン、ＧａｌはＤ−ガラクトース、ＧｌｃはＤ−グルコース、ＨｅｐはＤ−ヘプトース、ＫＤＯは３−デオキシ−Ｄ−マンノオクツロソン酸、ＰＥＡはホスホエタノールアミン、β１→４は、１位と４位との間のβ−グリコシド結合、β１→３は、１位と３位との間のβ−グリコシド結合、α１→５は、１位と５位との間のα−グリコシド結合、α１→３は、１位と３位との間のα−グリコシド結合、α１→２は、１位と２位との間のα−グリコシド結合、α２→４は、２位と４位との間のα−グリコシド結合であり、さらにＰＥＡ（３又は６）は、ホスホエタノールアミンが、ヘプトースの３位若しくは６位で結合していてもよく、又は全く存在しなくてもよいことを示している。
【０００９】
すなわち本発明は、哺乳動物の免疫又はワクチン接種用の薬剤の製造における上記に定義されるナイセリア属菌ＬＯＳの使用に関する。本発明のナイセリア属菌ＬＯＳは、好ましくはアジュバントとして使用される。前記ナイセリア属菌ＬＯＳは、より好ましくは哺乳動物における抗原（又は抗原を用いたワクチンの接種）に対する免疫応答を惹起するための薬剤の製造において、抗原と組み合せて用いられる。
【００１０】
本発明の方法及び使用において、哺乳動物は好ましくはヒトであり、抗原は好ましくは細菌、ウイルス、真菌類（fungus）、寄生虫、がん細胞、若しくは下記に定義されるアレルゲンに由来するか、又はそれらから産生される。前記抗原及びナイセリア属菌ＬＯＳは、細菌、ウイルス、真菌類若しくは寄生虫によって惹起される感染症、がん細胞によって生じる腫瘍、又はアレルゲンによって惹起されるアレルギーの治療及び／又は予防に用いられることが好ましい。
【００１１】
本発明の好適な実施形態において、本発明のナイセリア属菌ＬＯＳは、毒性が低下した、修飾されたリピドＡ部分（ＬＡ）を有する。かかる修飾されたＬＡの毒性は、好ましくは対応する野生型ＬＡの毒性よりも低く、より好ましくは野生型ＬＡの毒性の９０、８０、６０、４０、２０、１０、５、２、１、０．５又は０．２％未満である。前記野生型の毒性、及び毒性が低下した種々の修飾ＬＡの毒性は、当技術分野で公知の適切なアッセイを用いて決定することができる。前記毒性、即ち本発明のＬＡ又はナイセリア属菌ＬＯＳの生物活性を決定するための好適なアッセイは、ＭＭ６マクロファージ細胞株におけるＴＮＦ−アルファ誘導を調べるＷＥＨＩ試験である（Espevik and Niessen, 1986, J. Immunol. Methods 95:99-105; Ziegler-Heitbrock et al., 1988, Int. J. Cancer 41:456-461）。
【００１２】
毒性が低下したＬＡを有する本発明のナイセリア属菌ＬＯＳは、一方で十分な免疫賦活活性、即ちアジュバント活性を維持している。毒性が低下した本発明のナイセリア属菌ＬＯＳは、野生型ＬＡをもった対応するナイセリア属菌ＬＯＳの、少なくとも１０、２０、４０、８０、９０、又は１００％の免疫賦活活性を有することが好ましく、かかる免疫賦活活性は、本明細書の実施例３に記載の少なくとも一つのサイトカインの産生又は少なくとも一つの共刺激分子の発現を測定することにより決定される。
【００１３】
毒性が低下したリピドＡ部分を有する、但しアジュバント特性を（部分的に）維持するナイセリア属菌ＬＯＳは、例えばＷＯ０２／０９７４６に概説される遺伝的に改変したグラム陰性病原菌から得ることができる。毒性が低下したＬＡを有するナイセリア属菌ＬＯＳの好適な例として具体的には、（ａ）ｌｐｘＬ１遺伝子及びｌｐｘＬ２遺伝子（以前の呼称はｈｔｒＢ遺伝子及びｍｓｂＢ遺伝子）又はそれらの相同体の、１又は２以上の発現を低下又は不活化する変異を有するナイセリア属菌株から得ることができるリピドＡ部分を有するＬＯＳ（例えばＥＰ１，１２７，１３７及びＵＳ５，９９７，８８１参照）、（ｂ）アシルオキシ加水分解酵素（acyloxyhydrolase）を用いた処理又はアルカリ加水分解処理により、野生型リピドＡ部分から１又は２以上の二級Ｏ結合型エステル化脂肪酸を除去することにより得ることができるリピドＡ部分を有するＬＯＳ（ＵＳ５，１０３，６６１及びErwin et al., 1991, Infect, Immun, 59:1881-87）、（ｃ）野生型リピドＡ部分をヒドラジン処理することにより得ることができるリピドＡ部分を有するＬＯＳ（Gu et al., 1996, Infect. Immun. 64:4047-53、Polotsky et al., 1994, Infect Immun, 62:210-14、及びGu et al., 1998, Infect, Immun, 66:1891-97, 1998）、（ｄ）アルカリホスファターゼを用いてリピドＡ部分を脱リン酸化することにより得ることができるリピドＡ部分を有するＬＯＳ（ＵＳ６，２９０，９５２）、及び（ｅ）非相同の（heterologous）ｌｐｘＥ遺伝子又はｐａｇＬ遺伝子が発現しているナイセリア属菌宿主において産生されたＬＯＳを酵素的に脱リン酸化又は脱アシル化することにより得ることができるＬＯＳが挙げられる。本明細書において発現の低下とは、対応する野生型菌株と比較した場合の増減を意味すると理解され、発現レベルは、好ましくは対応する野生型菌株と、少なくとも２倍、５倍又は１０倍相違する。
【００１４】
したがって、毒性が低下した好適なＬＡとしては、還元グルコサミンにのみ二級Ｃ１２−アシルを有するＬＡ、非還元グルコサミンにのみ二級Ｃ１２−アシルを有するＬＡ、いずれの二級Ｃ１２−アシル基も欠如するＬＡ、１又は４’位のいずれかで、１又は２以上のリン酸基を欠如するＬＡ、及び上記脱アシル化と脱リン酸化との組合せを有するＬＡが挙げられる。
【００１５】
さらなる態様において本発明は、次式（Ｉ）
【化２】
で表されるナイセリア属菌ＬＯＳであって、式中、好ましくはＬＡが、上記に定義した、毒性が低下したリピドＡ部分であることを特徴とするナイセリア属菌ＬＯＳに関する。
【００１６】
本発明のさらに別の態様は、本明細書において上記に定義したナイセリア属菌ＬＯＳと薬学的に許容される担体とを含む組成物に関する。前記組成物は、細菌、ウイルス、真菌類、寄生虫、がん細胞、若しくはアレルゲンに由来するか、又はそれらから産生される抗原をさらに含むことが好ましい。前記医薬組成物は、薬学的に許容される安定化剤、浸透圧薬剤（osmotic agent）、緩衝剤、分散剤等をさらに含む場合がある。前記医薬組成物の好適な形態は、所望の投与方法及び治療の用途によって決まる。前記医薬用担体は、有効成分、即ちナイセリア属菌ＬＯＳ及び抗原を患者に投与（deliver）するのに適した相溶性（compatible）かつ無毒な物質であれば、どのようなものでもよい。鼻腔内投与用の薬学的に許容される担体の例としては、水、緩衝生理食塩水、グリセリン、ポリソルベート２０（polysorbate 20）、クレモフォルＥＬ(cremophor EL)、カプリル酸／カプリン酸グリセリドの混合水溶液を挙げることができ、中性のｐＨ環境をもたらすために、緩衝液で処理してもよい。非経口投与用の薬学的に許容される担体の例としては、必要に応じて２０％のアルブミンを添加した０．９％の塩化ナトリウム無菌緩衝液又は５％のグルコース緩衝液が挙げられる。非経口投与用の調製剤は、無菌でなくてはならない。周知の方法による有効成分の非経口の投与経路としては、例えば皮下、静脈内、腹腔内、筋肉内、動脈内若しくは病巣内の経路による注射又は注入が挙げられる。本発明の組成物は、好ましくはボーラス注入法（bolus injection）により投与される。筋肉内注射用の典型的な医薬組成物は、例えば１〜１０ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水、１〜１００μｇ、好ましくは１５〜４５μｇの抗原、及び１〜１００μｇ、好ましくは１５〜４５μｇの本発明のナイセリア属菌ＬＯＳを含有する。経口投与の場合、有効成分は、エリキシル剤、シロップ剤、及び懸濁剤等の液剤の形態で投与することができる。経口投与用の液剤は、患者の許容性を高めるために、着色剤及び香料を含有させることができる。非経口、経口、又は鼻腔内投与が可能な組成物の調製方法は、当技術分野で周知であり、例えばRemington’s Pharmaceutical Science (15th ed., Mack Publishing, Easton, PA, 1980)(参照により該文献全体を本明細書に援用する)を含む各種の出典に詳細が記載されている。
【００１７】
本発明の組成物における抗原は、細菌、ウイルス、真菌類、寄生虫、がん細胞、若しくはアレルゲンに由来するか、又はそれらから産生される抗原であることが好ましい。本発明のナイセリア属菌ＬＯＳと組み合せることができるウイルス抗原は、あらゆるウイルスから得ることができる。限定するものではないが、前記ウイルスの例としては、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）等のレトロウイルス科と、風疹ウイルスと、インフルエンザウイルス、麻疹、流行性耳下炎、呼吸器合胞体ウイルス、ヒトメタ肺炎ウイルス等のパラミクソウイルス科と、黄熱病ウイルス、デング・ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、日本脳炎ウイルス（ＪＥＶ）、ダニ媒介脳炎ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、又は西ナイルウイルス等のフラビ・ウイルス科（flaviviridae）と、単純ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、エプスタイン・バール・ウイルス等のヘルペスウイルス科（herpesviridae）と、ブニヤウイルス科と、アレナウイルス科と、ハンターン等のハンタウイルス科と、コロナウイルス科と、ヒト乳頭腫ウイルス等のパポバウイルス科と、狂犬病ウイルス等のラブドウイルス科と、ヒトコロナウイルス等のコロナウイルス科と、アルファウイルス科と、アルテリウイルス科と、エボラウイルス等のフィロウイルス科と、アレナウイルス科と、天然痘ウイルス等のポックスウイルス科と、アフリカブタ熱ウイルスとが挙げられる。同様に、本発明のナイセリア属菌ＬＯＳは、病原菌、（酵母を含む）真菌類、又は寄生虫由来の抗原と組み合せる場合がある。かかる抗原としては、例えば、ヘリコバクター・ピロリ等のヘリコバクター属、髄膜炎菌等のナイセリア属、ヘモフィルス・インフルエンザ等のヘモフィルス属、百日咳菌等のボルデテラ属、クラミジア属、Ａ血清型レンサ球菌（streptococcus sp. serotype A）等のストレプトコッカス属、ビブリオ・コレラ等のビブリオ属、例えばサルモネラ属、シゲラ属、カンピロバクター属、及びエシェリキア属等を含むグラム陰性腸内病原菌の細菌性抗原、並びに炭疽病、ハンセン病、結核、ジフテリア、ライム病、梅毒、腸チフス、及び淋病の原因菌由来の抗原が挙げられる。寄生虫由来の抗原としては例えば、バベオシス・ボビス（Babeosis bovis）、プラズモディウム属、リーシュマニア属、トキソプラズマ原虫、及びクルーズ・トリパノソーマ等のトリパノソーマ属等の原生動物が挙げられる。真菌類の抗原としては、アスペルギルス属、カンジダ・アルビカンス、例えばクリプトコッカス・ネオフォルマンス等のクリプトコッカス属、及びヒストプラズマ・カプスラーツム（Histoplasma capsulatum）といった真菌類由来の抗原を挙げることができる。
【００１８】
ワクチン接種は通常、病原菌に対する予防的防御、又は病原性感染症に引き続く疾患の治療に適用されるが、ワクチンが腫瘍の治療に適用されることも当業者には周知である。さらに、ヒト又はヒト化された抗体により標的とされ得る適切な存在（entity）として、多くの腫瘍特異的タンパク質が見い出されている。かかる腫瘍特異的タンパク質もまた、本発明の範囲に含まれる。当技術分野においては、多くの腫瘍特異的抗原が周知である。したがって、一つの好適な実施形態において本発明は、腫瘍特異的抗原と上記に定義したナイセリア属菌ＬＯＳとを含む組成物を提供する。適切な腫瘍抗原としては例えば、がん胎児性抗原、前立腺特異的膜抗原、前立腺特異的抗原、ＭＺ２−Ｅタンパク質、多形上皮性ムチン（ＰＥＭ）、葉酸結合タンパク質ＬＫ２６、切断型（truncated）表皮増殖因子受容体（ＥＧＲＦ）、ＨＥＲ２、Thomasen-Friedenreich (Ｔ) 抗原、ＧＭ−２及びＧＤ２ガングリオシド、Ｅｐ−ＣＡＭ、ムチン−１、上皮糖タンパク質−２、及び結腸特異的抗原（colon specific antigen）が挙げられる。
【００１９】
さらに自己免疫疾患の予防において寛容を誘導するために、樹状細胞を抗原の標的とすることもできる。かかるアレルゲンもまた、本発明の範囲に含まれる。
【００２０】
本発明の別の態様は、上記に定義されたナイセリア属菌ＬＯＳの製造方法に関する。好適な方法は、（ａ）免疫型Ｌ２、Ｌ３、若しくはＬ４のナイセリア属菌ＬＯＳを発現し、且つ活性のｌｇｔＢ遺伝子を欠如する髄膜炎菌株、又は免疫型Ｌ６のナイセリア属菌ＬＯＳを発現する髄膜炎菌株であって、加えて１又は２以上のｌｐｘＬ１遺伝子若しくはｌｐｘＬ２遺伝子又はそれらの相同体の発現を不活化又は低減する変異を有する髄膜炎菌株を培養するステップと、（ｂ）前記ナイセリア属菌ＬＯＳを回収するステップとを含む。別法として前記方法は、（ａ）免疫型Ｌ２、Ｌ３、若しくはＬ４のナイセリア属菌ＬＯＳを発現し、且つ活性のｌｇｔＢ遺伝子を欠如する髄膜炎菌株、又は、免疫型Ｌ６のナイセリア属菌ＬＯＳを発現する髄膜炎菌株を培養するステップと、（ｂ）前記ナイセリア属菌ＬＯＳを回収するステップと、（ｃ）ヒドラジン、アルカリホスファターゼ、又はアシルオキシ加水分解酵素からなる群から選択される少なくとも１つを用いてナイセリア属菌ＬＯＳを処理し、リピドＡ部分の毒性を低下させるステップとを含む。前記方法において、ステップ（ｂ）及びステップ（ｃ）の順番を入れ替える場合がある。好適な方法では、ステップ（ｃ）において毒性は、上記のＷＥＨＩアッセイで決定された、野生型ナイセリア属菌ＬＯＳの毒性の８０％未満まで低下する。
【００２１】
本発明のさらに別の態様は、上記に定義したナイセリア属菌ＬＯＳを含むグラム陰性ＯＭＶ（外膜小胞）又はブレブ（blebs）に関する。グラム陰性ＯＭＶ又はブレブの製造手段及び方法は、ＷＯ０２／０９７４６に記載されている。このようにして得られたグラム陰性ブレブを本発明のナイセリア属菌ＬＯＳと組み合せ、ナイセリア属菌ＬＯＳを含むグラム陰性ブレブを製造することができる。別法として前記ブレブは、上記に定義した、本発明のナイセリア属菌ＬＯＳを産生する能力を有するナイセリア株から製造される場合がある。ナイセリア属菌ＬＯＳを含むグラム陰性ブレブは、上記の抗原及び／又は上記の薬学的に許容される担体とさらに組み合せる場合がある。
【実施例１】
【００２２】
１ 材料及び方法
１．１ 菌株
先に記載の髄膜炎菌野生株（ＷＴ）Ｈ４４／７６集団Ｂからオリゴ糖のコア変異体及びリピドＡ変異体を得た。
【００２３】
本研究において用いたオリゴ糖のコア変異体の構造を、図１に示す。菌株は全て、６％のＣＯ２を含む空気の雰囲気下で、ビトックス（英国ベージングストーク、Oxoid社製）を添加した淋菌寒天培地（英国ベージングストーク、Difco社製）において、３６℃で増殖させた。前記細菌は、１８時間培養した後の静止期で使用した。フェノールレッド不含ＲＰＭＩ１６４０培地（英国ペーズリー、Gibco社製）で細菌を懸濁し、その吸光度を５４０ｎｍで測定した。吸光度１は、１ｍｌ当たり１０９の微生物に相当すると算出された。０．５％のパラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）を含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に細菌を１５分間固定し、ＲＰＭＩ培地で十分に洗浄した。０．５ｍｇ／ｍｌのＦＩＴＣ（英国プール、Sigma社製）を用いて３７℃で２０分間インキュベートし、その後十分に洗浄し、ＦＩＴＣ標識細菌を調製した。
【００２４】
１．２ 細胞
先に記載のように、ヒト末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）からＤＣを製造した（F. Sallusto and A. Lanzavecchia, 1994, J. Exp. Med. 179:1109-1118; H. Uronen-Hansson et al., 2004, Immunology 111: 173-178）。簡潔にいえば、多段パーコール勾配遠心法により、ＰＢＭＣから単球を調製した。かかる単球の画分は、＞９５％ＣＤ１４＋／ＣＤ３−／ＣＤ１９−であった。１０％の加熱不活化ＦＣＳ、２．４ｍＭのＬ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン−ストレプトマイシン（全て英国ペーズリー、Gibco社製）、１００ｎｇ／ｍｌのヒト組換えＧＭ−ＣＳＦ及び５０ｎｇ／ｍｌのヒト組換えＩＬ４（英国ハーツ、ウェルウィンガーデンシティ、Schering-Plough社製、）を添加したＲＰＭＩにて単球を７日間インキュベートし、ＤＣを作出した。このようにして調製した未成熟ＤＣは、ＣＤ１４ｌｏｗ、ＣＤ８３−ｖｅ、ＣＤ８６ｌｏｗ、ＣＤ２５−ｖｅであった。これらのＣＤはまた、ＨＬＡ、ＤＲ、ＨＬＡ、ＤＱ、ＨＬＡクラスＩ、ＣＤ４０及びＣＤ１ａを発現し、ＣＤ１９及びＣＤ３の両方については陰性であった。
【００２５】
１０％ＦＣＳを添加したＲＰＭＩ１６４０にて、（図面の説明に述べるように）ＤＣ／細菌比率１：５０及び１：２００で、５×１０５／ｍｌの濃度のＤＣを髄膜炎菌Ｈ４４／７６菌体とともに培養した。細胞内サイトカインの測定時に、１０μｇ／ｍＬのタンパク質輸送阻害剤ブレフェルディンＡ（英国プール、Sigma社製）を添加した。
【００２６】
未成熟ＤＣを、２０μｇ／ｍｌの抗ＤＣ−ＳＩＧＮ ｍＡｂ ＡＺＮ−Ｄ１と共に３７℃で３０分間インキュベートし、その後、野生型細菌及び変異細菌と共に３７℃で４５分間インキュベートすることにより、ｌｇｔＢ変異細菌のＤＣに対する結合特異性を検討した。
【００２７】
１．３ ＤＣへの結合及び内部移行
ＤＣに対する細菌の結合及び内部移行は、フローサイトメトリー法と共焦点顕微鏡法とを併用して検討した。フローサイトメトリー法による検出では、ＤＣをＦＩＴＣ標識細菌とともに３０分〜２４時間の間で異なる時間インキュベートし、ＦＡＣＳＦｉx（Becton Dickinson社製）に固定し、ＦＡＣＳカリバー上で洗浄及び解析した。ゲートをかけたＤＣ集団（DC gated population）では、細菌が結合したＤＣは、蛍光により容易に同定できた。共焦点顕微鏡法では、ＦＩＴＣで標識した髄膜炎菌で刺激したＤＣを、接着スライド（adhesion slide）（英国ハーツBio-Rado Laboratories 社製）に１０分間置き接着させた。内部移行を停止させるため、４％のＰＦＡで１０分間ＤＣを固定した。５μｇ／ｍｌの抗ＭＨＣクラスIIモノクローナル抗体（デンマーク、グロストラップ、Dako社製）で染色し、ＤＣを視覚化した。洗浄後、結合した抗体について、テキサスレッドコンジュゲートヤギ抗マウス抗体（Molecular probes社製）５μｇ／ｍｌで１時間の検出を行った。前記スライドを洗浄し、Citifluor(英国、Citifluor社製)に配置した。適切なフィルターセットを備えた、ライカＳＰ２共焦点レーザー走査顕微鏡システム（英国ミルトンキーンズ、Leica社製）を用い、共焦点画像を得た。細胞内細菌を同定するため、ライカ共焦点画像ソフトウェアを用いてＤＣ全域の１５〜２０の光学切片（０．２〜０．５μｍ）を写し、重ね合わせた。
【００２８】
１．４ サイトカイン測定
細胞内のサイトカイン産生を測定するため、４％のＰＦＡを含むＰＢＳでＤＣを固定し、０．１％のアジ化ナトリウム及び０．５％のＢＳＡ（全てSigma社製）を含有するＰＢＳ中で洗浄し、２５μｌの浸透化溶液（Caltag社製）で浸透処理した。次に細胞を、抗ＴＮＦ−αモノクローナル抗体（英国オックスフォード、Becton Dickinson社製）及びＩＬ−１２ ｐ４０／７０（Pharmingen社製）又はアイソタイプ（isotype）が適合する対照を用いて室温の暗室で３０分間インキュベートした。続いてＰＢＳ中で前記細胞を２回洗浄し、セルフィックス（CellFix(Becton Dickinson社製)）中で固定し、セル・クエスト・ソフトウェア（Cell Quest Software(Becton Dickinson社製)）を用いてＦＡＣＳカリバー上でフローサイトメトリー法により解析した。ＤＣは、前方及び右方向（forward and right angle）の分散によって同定される顕著な集団を構成した。かかる集団の細胞の少なくとも９５％は、ＭＨＣII、ＣＤ１ａ、ＣＤ２５、ＣＤ８０、ＣＤ８３及びＣＤ８６の発現によりＤＣと確定した。ＤＣに対応するゲートにおいて、少なくとも３０００のイベント（event）についてデータ収集して解析した。可溶性サイトカインのＥＬＩＳＡアッセイのため、ヒトＩＬ−１２、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１０、ＩＬ６及びＩＬ１βについて、サイトセット（CytoSets(商標)）ＥＬＩＳＡキット（ベルギー、ニベル、Biosource Europe S.A. 社製）を製造元の取扱説明書に従って用いた。
【００２９】
１．５ 可溶性Ｃ型レクチンＦｃ接着アッセイ
Ｃ型レクチンＦｃ分子は、ＣＯＯＨ末端においてヒトＩｇＧ１−Ｆｃ断片に融合するＣ型レクチン受容体（ＤＣ−ＳＩＧＮ、ＭＧＬ及びデクチン−１Ｂ）の細胞外部分からなる（T. Geijtenbeek et al., 2003, J. Exp. Med. 197:7-17）。可溶性Ｃ型レクチンＦｃ接着アッセイを次のように行った。全ての細胞（ＯＤ５４０＝０．１）を、室温で１８時間、ＥＬＩＳＡプレート（１００μｌ／ウェル）上にコーティングした。次に１％のＢＳＡを用い、３７℃で３０分間ブロッキングした。可溶性Ｃ型レクチンＦｃの上清を添加し、室温に２時間置いた。結合していないＣ型レクチンＦｃを洗い流し、抗ＩｇＧ１抗体を用い、ＥＬＩＺＡ法で結合を測定した。
【００３０】
１．６ ＤＣによるＴｈ１／Ｔｈ２の分化
１０％のＦＣＳ（ベルギー、ベルビエ、Bio Withaker社製）、５００Ｕ／ｍｌのＩＬ−４及び８００Ｕ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦ（共にSchering-Plough社製）を添加したイスコフ改変ダルベッコ培地（Gibco社製）において、健常ドナーの単球からＤＣを培養した。６日目に、感染多重度１０で、髄膜炎菌野生株及びｌｇｔＢ変異株を用いてＤＣの成熟を誘導した。（ｉ）混合Ｔｈ１／Ｔｈ２反応アッセイでは、１０ｎｇ／ｍｌの大腸菌ＬＰＳ（ミズーリ州セントルイス、Sigma-Aldrich社製）（ii）Ｔｈ１の分化アッセイでは、２０μｇ／ｍｌのｐｏｌｙＩ：Ｃ（Sigma-Aldrich社製）、及び（iii）Ｔｈ２の分化アッセイでは、１０μｇ／ｍｌのＰＥＧ２、１０ｎｇ／ｍｌのＬＰＳ（Sigma-Aldrich社製）を陽性対照（positive control）として用いた。２日目に、フローサイトメトリー法により、ＤＣの成熟マーカー（ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６及びＨＬＡ−ＤＲ）を解析した。Ｔ細胞の分化を評価するため、成熟ＤＣを、ＣＤ４５ＲＡ＋／ＣＤ４＋Ｔ細胞とともにインキュベートした（５．１０３Ｔ細胞／２０．１０３ＤＣ）。１２〜１５日目に、１０ｎｇ／ｍｌのＰＭＡ（Sigma-Aldrich社製）及び１μｇ／ｍｌのイオノマイシン（Sigma-Aldrich社製）で、静止Ｔ細胞を６時間再刺激した。１時間後、前記Ｔ細胞に１０μｇ／ｍｌのブレフェルディンＡ（Sigma-Aldrich社製）を添加した。ＩＬ−４及びＩＦＮ−γの単一細胞産生を、細胞内フローサイトメトリー解析で測定した。細胞を２％のＰＦＡ中で固定し、０．５％のサポニン（Sigma-Aldrich社製）で浸透処理し、抗ヒトＩＦＮ−γ−ＦＩＴＣ及び抗ヒトＩＬ−４−ＰＥ（カルフォルニア州サンディエゴ、Becton Dickinson Pharmigen社製）で染色した。
【実施例２】
【００３１】
髄膜炎菌のオリゴ糖コア変異株の樹状細胞への結合及び内部移行
フローサイトメトリー法を用い、髄膜炎菌野生株、オリゴ糖変異株、及びＬＰＳ欠損変異株のヒトＤＣへの結合及び内部移行について調べた。未成熟ＤＣを、髄膜炎菌野生株Ｈ４４／７６由来のＦＩＴＣ標識変異株とともに、ＤＣ／細菌比率１：５０（図２）及び１：２００（データ示さず）で共培養し、ＤＣに結合したＦＩＴＣ標識細菌の存在を、ＦＡＣＳにより解析した。野生株及びオリゴ糖変異株の両方について、時間及び用量依存的なＤＣとの結合が観察された。ＬＰＳ欠損変異株については、時間経過の最初の６時間において、ＤＣとの結合がほとんど見られなかった。ｌｇｔＢ変異株はどちらの濃度でも一貫して、野生株又はｇａｌＥ変異株よりも、ＤＣへの結合性が高かった。
【００３２】
次に、細菌の結合と内部移行とを区別するために、共焦点顕微鏡を用い、髄膜炎菌野生株及び変異株のＤＣへの内部移行について検討した（データは示さず）。ＦＩＴＣ細菌は、スライド上で緑色の小粒子として容易に認めることができた。ＤＣを可視化するために、ＭＨＣクラスIIによる染色を用いた。大部分のＤＣでは、１時間のインキュベート後すでに、野生型細菌又はｇａｌＥ変異細菌に比較してより多くのｌｇｔＢが内部移行していた。ＬＰＳ欠損変異細菌については、ほとんど内部移行がみられなかった。ｌｇｔＢ変異細菌については、高レベルの内部移行に加え、時間的経過中を通じて、高い表面接着を維持するのが典型であった。これらの結果は、ＦＡＣＳによる結果、即ちＤＣに対する細菌の結合性の増強は、細菌の内部移行の増強をもたらすという結果を裏付けるものである。
【実施例３】
【００３３】
髄膜炎菌変異株に対する応答としてのＤＣの活性化及び成熟化
細菌の内部移行とサイトカイン産生との関係について検討するため、野生株及び変異株に対する応答として樹状細胞が産生したＩＬ１２及びＴＮＦ−αについて細胞内測定を行い、内部移行について一斉分析（simultaneous analysis）した（図３）。ＤＣを、１：５０の比率でＦＩＴＣ標識細菌とともに１８時間共培養し、次にＴＮＦ−α及びＩＬ１２の細胞内産生を調べるために染色した。ＦＩＴＣ細菌が結合した細胞とＦＩＴＣ細菌が結合していない細胞とを区別するために、四象限（quadrants）を設定した。パーセンテージは、細菌の内部移行後に細胞内サイトカインを産生しているＤＣ（右上象限）又は産生していないＤＣ（右下象限）の割合である。野生株、ｌｇｔＢ及びｇａｌＥ変異株は全て、ＤＣによるＴＮＦ−α及びＩＬ−１２産生の強力な誘導因子であったが、ＬＰＳ欠損型変異株は違った。髄膜炎菌野生株、ｌｇｔＢ、及びｇａｌＥ変異株が内部移行したＤＣでは実質的にその全てが、高レベルのＴＮＦ−αを産生していた。ＩＬ−１２については、ＦＩＴＣ標識細菌が内部移行したＤＣの約５０％で産生がみられた。
【００３４】
細胞内のサイトカインの測定に加え、髄膜炎菌に対する応答としてＤＣから分泌されたサイトカインのレベルも測定した（図４）。ＤＣを、１：２００の比率で変異細菌及び野生型細菌とともに１８時間共培養し、上清を回収して分泌されたＩＬ１２、ＩＬ１０、ＴＮＦ−α、ＩＬ６及びＩＬ−１βについて解析した。野生型（野生型＝１００％）と比較したサイトカイン産生のパーセンテージを、結果として示す。ｌｇｔＢ及びｇａｌＥ変異細菌はともに、ＩＬ１２、ＴＮＦ−α、及びＩＬ−１βの誘導について、野生型細菌をやや下回った。ＩＬ−１０及びＩＬ−６については、ｌｇｔＢ及びｇａｌＥともに、野生株と同様であった。ＬＰＳ欠損株には、サイトカイン産生がほとんどみられなかった。
【００３５】
最後に、共刺激分子ＣＤ４０及びＣＤ８６の発現を測定し（図５）、野生型細菌及び変異細菌で刺激したＤＣの成熟化について検討した。野生型細菌又はｇａｌＥ変異細菌で刺激したＤＣと比較して、ｌｇｔＢ変異細菌で刺激したＤＣの場合には、ＣＤ４０及び特にＣＤ８６の発現が高かった。ｌｐｘＡ変異細菌で刺激したＤＣでは、ＣＤ４０及びＣＤ８６の発現はほとんどみられなかった。
【００３６】
結論としてこれらのデータは、ｌｇｔＢ変異細菌がＤＣに結合及び内部移行すると、野生型細菌が誘導するＤＣ活性化及び成熟化のレベルと同程度のＤＣ活性化及び成熟化をもたらすことを示している。
【実施例４】
【００３７】
ｌｇｔＢ変異細菌の結合及び内部移行を仲介する受容体の同定
ＤＣがｌｇｔＢ変異細菌を高度に結合及び吸収するということが、かかる結合及び内部移行が、特異的なＤＣ受容体によって仲介されているかどうかを調べるきっかけとなった。したがって本発明者らは、野生株及び変異株について、オリゴ糖認識能を有し、未成熟ＤＣに高度に発現するＣ型レクチン受容体を結合する能力を解析した。野生型細菌及び変異型細菌の細胞全体に対するＣ型レクチンＦｃキメラのパネル（panel）の結合を、可溶性接着アッセイ（soluble adhesion assay）において検討した（図６）。前記Ｃ型レクチンＦｃキメラは、野生型細菌、ｇａｌＥ変異細菌、及びＬＰＳ欠損変異細菌には結合しなかったが、ｌｇｔＢ変異細菌はＤＣ−ＳＩＧＮ−Ｆｃを強く結合した。ｌｇｔＢ変異細菌とＤＣ−ＳＩＧＮとの結合は、ＤＣ−ＳＩＧＮ又はＤＣ−ＳＩＧＮを安定的に発現するＫ５６２細胞を一過性に形質移入したＨＥＫ２９３Ｔ細胞にもみられた（データ示さず）。さらに、抗ＤＣ−ＳＩＧＮ遮断抗体ＡＺＮ−Ｄ１の存在下又は非存在下で、ＤＣによるｌｇｔＢ変異細菌の貪食について検討したところ、ＤＣ−ＳＩＧＮに対するｌｇｔＢ ＬＰＳの特異性が実証された（図７）。ＡＺＮ−Ｄ１の存在下では、ＤＣによるｌｇｔＢの貪食は、野生型についてみられる結合のレベルまで減少し、これは明らかに、ＤＣ−ＳＩＧＮがｌｇｔＢ変異細菌を結合及び内部移行させることを実証するものである。
【実施例５】
【００３８】
ＴＨ１の免疫応答を惹起する、ＤＣ−ＳＩＧＮに対するｌｇｔＢ変異細菌のターゲティング
ｌｇｔＢ変異細菌ＬＰＳとＤＣ−ＳＩＧＮとの相互作用に機能的関連性があるとすれば、それを評価するべく、ＰＦＡで固定した野生型細菌又はｌｇｔＢ変異細菌のいずれかを未成熟ＤＣにパルスした後、ＤＣにより誘導されるＴ細胞の応答について検討した。野生型細菌又はｌｇｔＢ変異細菌をパルスしたＤＣを、共刺激分子及び成熟マーカーの発現により評価したところ、ＤＣの成熟に相違はみられなかった（図８ａ）。しかし、これらの株により誘導されるＴＨ１／ＴＨ２のプロファイルには、顕著な相違がみられた（図８ｂ）。髄膜炎菌の野生型細菌をパルスしたＤＣでは、大部分のＴ細胞がＩＬ−４を産生していたため、主にＴＨ２型の免疫応答を生じた。ｌｇｔＢ変異細菌をパルスしたＤＣは主に、ＩＦＮ−γ−産生Ｔ細胞を誘起（evoke）し、したがってＴＨ１細胞対ＴＨ２細胞の均衡を、ＴＨ１細胞寄りに変えた。かかるＴＨ１／ＴＨ２の均衡の変化は、３つの異なるドナーで観察された。これらのデータは、ｌｇｔＢ ＬＰＳをＤＣ−ＳＩＧＮ特異的にターゲティングすると、ＤＣシグナルが生じ、このシグナルが、免疫応答をＴＨ１へと誘導することを示しており、これは、アジュバントにとって非常に望ましい現象である。P. Moingeon et al. (2001) Vaccine 19:4363-4372についても参照のこと。
【実施例６】
【００３９】
髄膜炎菌のオリゴ糖／リピドＡ二重変異株のＤＣへの結合及び内部移行
髄膜炎菌野生株、ｌｇｔＡ及びｌｇｔＢオリゴ糖変異株、それらのｌｐｘＬ１二重変異株、及びＬＰＳ欠損変異株のヒトＤＣへの結合及び内部移行を、フローサイトメトリー法を用いて調べた。未成熟ＤＣを、ＤＣ／細菌比率１：１００で髄膜炎菌野生株Ｈ４４／７６由来のＦＩＴＣ標識変異株と共培養し、ＤＣに結合したＦＩＴＣ標識細菌の存在について、ＦＡＣＳで解析した（図９）。ｌｇｔＢ単一変異株は一貫して、野生株及びｌｇｔＡ単一変異株よりも、ＤＣとの結合性が高かった。さらにまたｌｇｔＢ変異株は、ｌｐｘＬ１変異背景においても野生型オリゴ糖構造体又はｌｇｔＡオリゴ糖構造体よりも高い結合性を生じた。この結果は、ペンタアシル化されたｌｐｘＬ１リピドＡを含むＬＰＳでも、ｌｇｔＢの仲介によるＤＣ−ＳＩＧＮへの結合が増強し得ることを示している。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】髄膜炎菌野生株Ｌ３ ＬＰＳ及びそのオリゴ糖変異株の概略図である。かかる変異株は、糖転移酵素をコードする遺伝子（イタリック体表示）の挿入不活性化により作製できる。
【図２】樹状細胞（ＤＣ）を１:５０の比率で、ＦＩＴＣ標識細菌とともに２４時間培養した。ＤＣに対する細菌の結合をＦＡＣＳで測定するために、表示の時間の時点で、試料を採取した。３つの異なるドナーついての独立した代表的な試験結果を示す。
【図３】ＤＣを１:５０の比率で、ＦＩＴＣ標識細菌を用いてブレフェルディンＡの存在下に１８時間刺激し、細胞内のＴＮＦ−α及びＩＬ−１２を調べるために染色した。ドットプロット（dot plot）は、細菌が結合したＤＣについて、細胞内サイトカインを産生していない（右下象限）又はしている（右上象限）ＤＣの割合を示す。
【図４】１８時間の共培養の後、野生型髄膜炎菌及び変異体に対する応答としてＤＣが産生したＴＮＦ−α、ＩＬ−１２、ＩＬ−１β、ＩＬ−１０及びＩＬ−６を、培養上清中でＥＬＩＳＡにより測定した。独立した３つの異なる試験結果について、平均値及びＳＥＭ値を示す。
【図５】野生型髄膜炎菌及び髄膜炎菌変異体とＤＣとを１８時間共培養した後の、ＣＤ４０及びＣＤ８６の発現を、蛍光強度中央値（ＭＦＩ）によって示す。
【図６】可溶性接着アッセイにおける、Ｃ型レクチンＦｃ分子の髄膜炎菌野生株及び変異株への結合。
【図７】１ｍｌあたり２０μｇの抗ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体ＡＺＮ−Ｄ１の存在下及び非存在下における、髄膜炎菌野生株及びｌｇｔＢ変異株のＤＣへの結合。
【図８】ＤＣが誘導するＴｈ１／Ｔｈ２細胞の増殖。髄膜炎菌野生株Ｈ４４／７６、ｌｇｔＢ変異株、大腸菌ＬＰＳ、ｐｏｌｙＩ:Ｃ又はＰＥＧ２とともにＤＣを４８時間培養し、洗浄し、（Ａ）成熟マーカー（独立した３つの異なる試験結果について平均値及びＳＥＭ値）を分析するか、又は（Ｂ）高純度のＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞と共培養し、静止Ｔ細胞をＰＭＡ及びイオノマイシンで再刺激し、フローサイトメトリー法で細胞内ＩＬ−４（グレー）及びＩＦＮ−γ（黒）を単一細胞ベースで解析した。３つの別々のドナーから得たデータを示す。
【図９】生菌のＤＣへの結合及びサイトカイン誘導。樹状細胞（ＤＣ）を、１：１００の比率で、ＦＩＴＣ標識した髄膜炎菌野生株及びＬＰＳ変異株とともに培養した。表示された時間の時点で、ＤＣへの細菌の結合をＦＡＣＳにより測定するため、試料を採取した。２つの別々のドナー由来の細胞について結果を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫賦活作用が増強された、ナイセリア属菌の（Neisserial）リポオリゴ糖（ＬＯＳ）に関する。本発明のナイセリア属菌ＬＯＳは、樹状細胞上の受容体への結合性の増強を示す三糖の外部コア（outer core）を含む。前記ナイセリア属菌ＬＯＳの三糖の外部コアと毒性が低下したリピドＡ部分との組合せは、ワクチン製剤におけるアジュバントとして有用である。
【背景技術】
【０００２】
髄膜炎菌ＬＰＳ（Neisseria meningitidis LPS）は、強力なアジュバントであるだけでなく、そのＬＰＳ特異的免疫応答誘導能によっても、潜在的なワクチン候補として注目を集めている。しかし、ＬＰＳの内毒素活性のため、ワクチンにおけるその使用は今のところ限定されている。
【０００３】
髄膜炎菌ＬＰＳ（Meningococcal LPS）は、細菌の外膜に自身を固定（anchor）する疎水性リピドＡ部分と、細菌の表面に露出（exposed）する親水性のオリゴ糖のコアとで構成される（図１）。天然のオリゴ糖鎖は宿主の糖脂質抗原に構造的に類似しているため、ワクチン製剤に含有させることは望ましくない。ＬＰＳのオリゴ糖生合成経路の遺伝子組換えにより、切断型（truncated）オリゴ糖鎖を発現する髄膜炎菌変異体の系（series）の製造が可能となっている（図１）。ＬＰＳの内毒素及びアジュバント特性は、かかる分子のリピドＡ部分によって決定されると考えられる。本発明者らは先に、極めて向上した薬理学的特性を有する髄膜炎菌リピドＡ変異株の固有の系（unique set）を作製している。具体的には、リピドＡのアシルオキシアシル化に関連するｌｐｘＬ１（ｈｔｒＢ１）遺伝子を不活化すると、ヘキサアシル化リピドＡではなくペンタアシル化リピドＡを発現するリピドＡ変異株を単離することができた。かかる変異株は、内毒素活性が低下していながら、アジュバント活性を維持していた。さらに、髄膜炎菌ｌｐｘＡ遺伝子の不活化により、ＬＰＳを完全に欠如する髄膜炎菌変異株も単離した。このように、髄膜炎菌ＬＰＳのオリゴ糖部分のみならず、リピドＡ部分の修飾によっても、髄膜炎菌ワクチンの開発における新たな可能性が拓かれた。
【０００４】
樹状細胞（ＤＣ）は、天然の感染症における免疫応答とワクチン接種に対する免疫応答との両方の開始において、その役割を果たしているため、大きな関心を集めている。細菌に対する免疫応答は、ＤＣによって開始される。ＤＣは、細菌性抗原を貪食して処理し、Ｔ細胞に提示する。本発明者らは近年、髄膜炎菌ＬＰＳが、ヒトＤＣとの相互作用の間に重要な役割を果たすことを示した。さらに、細菌の内部移行（internalization）及びＤＣの完全な活性化にも、ＬＰＳが必要とされる。
【発明の開示】
【０００５】
定義
本明細書においてアジュバントとは、抗原と組み合せて用いられる場合、哺乳動物、好ましくはヒトを免疫し、免疫システムを刺激し、それにより好ましくはアジュバント自体に対する特異的免疫応答を生じさせることなく、前記抗原に対する免疫応答を誘発、増強、又は促進するあらゆる物質又は化合物を含むと定義される。好適なアジュバントは、所与の抗原に対する免疫応答を増強し、同様の但しアジュバントが非存在の条件下で前記抗原に対して生じる免疫応答に比較して、少なくとも１．５、２、２．５、５、１０、又は２０倍の強さに免疫応答を増強する。本技術分野においては、アジュバントによって動物又はヒトの集団に生じる、所与の抗原に対する免疫応答の統計学的な平均増強値を、対応する対照集団に照らして決定する分析法を用いることができる。前記アジュバントは、好ましくは少なくとも２つの相違する抗原に対する免疫応答増強能がある。本発明のアジュバントは通常、哺乳動物にとって外来の化合物であり、したがってインターロイキン、インターフェロン及びその他のホルモン等の、哺乳動物にとって内因性の免疫賦活化合物は除外される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
本発明は、特定の三糖の外部コア構造を有するナイセリア属菌ＬＰＳでは、ヒト樹状細胞（ＤＣ）への結合及び内部移行（internalisation）が増強するという、意外な発見に基づく。三糖を含むＬＰＳ、より厳密にいえば三糖を含むＬＯＳ（リポオリゴ糖）の結合及び内部移行は、ヒトＤＣに発現するＣ型レクチンＤＣ−ＳＩＧＮ介在性であり、ＤＣの活性化及び成熟化の速度を高める。この新規な三糖を含むナイセリア属菌ＬＯＳは、その向上した免疫賦活作用により、免疫及びワクチン接種における強力なアジュバントとして用いることができる。
【０００７】
すなわち本発明の第一の態様は、抗原で哺乳動物を免疫又はワクチン接種する方法であって、前記方法が、（哺乳動物に対して）抗原を投与することを含み、ナイセリア属菌ＬＯＳが、次式（Ｉ）
【化１】
で表され、式中、ＬＡが、好ましくはナイセイア属菌株由来の野生型リピドＡ部分、又はより好ましくは毒性が低下したリピドＡ部分であることを特徴とする方法に関する。
【０００８】
式（１）中、ＧｌｃＮＡｃはＤ−グルコサミン、ＧａｌはＤ−ガラクトース、ＧｌｃはＤ−グルコース、ＨｅｐはＤ−ヘプトース、ＫＤＯは３−デオキシ−Ｄ−マンノオクツロソン酸、ＰＥＡはホスホエタノールアミン、β１→４は、１位と４位との間のβ−グリコシド結合、β１→３は、１位と３位との間のβ−グリコシド結合、α１→５は、１位と５位との間のα−グリコシド結合、α１→３は、１位と３位との間のα−グリコシド結合、α１→２は、１位と２位との間のα−グリコシド結合、α２→４は、２位と４位との間のα−グリコシド結合であり、さらにＰＥＡ（３又は６）は、ホスホエタノールアミンが、ヘプトースの３位若しくは６位で結合していてもよく、又は全く存在しなくてもよいことを示している。
【０００９】
すなわち本発明は、哺乳動物の免疫又はワクチン接種用の薬剤の製造における上記に定義されるナイセリア属菌ＬＯＳの使用に関する。本発明のナイセリア属菌ＬＯＳは、好ましくはアジュバントとして使用される。前記ナイセリア属菌ＬＯＳは、より好ましくは哺乳動物における抗原（又は抗原を用いたワクチンの接種）に対する免疫応答を惹起するための薬剤の製造において、抗原と組み合せて用いられる。
【００１０】
本発明の方法及び使用において、哺乳動物は好ましくはヒトであり、抗原は好ましくは細菌、ウイルス、真菌類（fungus）、寄生虫、がん細胞、若しくは下記に定義されるアレルゲンに由来するか、又はそれらから産生される。前記抗原及びナイセリア属菌ＬＯＳは、細菌、ウイルス、真菌類若しくは寄生虫によって惹起される感染症、がん細胞によって生じる腫瘍、又はアレルゲンによって惹起されるアレルギーの治療及び／又は予防に用いられることが好ましい。
【００１１】
本発明の好適な実施形態において、本発明のナイセリア属菌ＬＯＳは、毒性が低下した、修飾されたリピドＡ部分（ＬＡ）を有する。かかる修飾されたＬＡの毒性は、好ましくは対応する野生型ＬＡの毒性よりも低く、より好ましくは野生型ＬＡの毒性の９０、８０、６０、４０、２０、１０、５、２、１、０．５又は０．２％未満である。前記野生型の毒性、及び毒性が低下した種々の修飾ＬＡの毒性は、当技術分野で公知の適切なアッセイを用いて決定することができる。前記毒性、即ち本発明のＬＡ又はナイセリア属菌ＬＯＳの生物活性を決定するための好適なアッセイは、ＭＭ６マクロファージ細胞株におけるＴＮＦ−アルファ誘導を調べるＷＥＨＩ試験である（Espevik and Niessen, 1986, J. Immunol. Methods 95:99-105; Ziegler-Heitbrock et al., 1988, Int. J. Cancer 41:456-461）。
【００１２】
毒性が低下したＬＡを有する本発明のナイセリア属菌ＬＯＳは、一方で十分な免疫賦活活性、即ちアジュバント活性を維持している。毒性が低下した本発明のナイセリア属菌ＬＯＳは、野生型ＬＡをもった対応するナイセリア属菌ＬＯＳの、少なくとも１０、２０、４０、８０、９０、又は１００％の免疫賦活活性を有することが好ましく、かかる免疫賦活活性は、本明細書の実施例３に記載の少なくとも一つのサイトカインの産生又は少なくとも一つの共刺激分子の発現を測定することにより決定される。
【００１３】
毒性が低下したリピドＡ部分を有する、但しアジュバント特性を（部分的に）維持するナイセリア属菌ＬＯＳは、例えばＷＯ０２／０９７４６に概説される遺伝的に改変したグラム陰性病原菌から得ることができる。毒性が低下したＬＡを有するナイセリア属菌ＬＯＳの好適な例として具体的には、（ａ）ｌｐｘＬ１遺伝子及びｌｐｘＬ２遺伝子（以前の呼称はｈｔｒＢ遺伝子及びｍｓｂＢ遺伝子）又はそれらの相同体の、１又は２以上の発現を低下又は不活化する変異を有するナイセリア属菌株から得ることができるリピドＡ部分を有するＬＯＳ（例えばＥＰ１，１２７，１３７及びＵＳ５，９９７，８８１参照）、（ｂ）アシルオキシ加水分解酵素（acyloxyhydrolase）を用いた処理又はアルカリ加水分解処理により、野生型リピドＡ部分から１又は２以上の二級Ｏ結合型エステル化脂肪酸を除去することにより得ることができるリピドＡ部分を有するＬＯＳ（ＵＳ５，１０３，６６１及びErwin et al., 1991, Infect, Immun, 59:1881-87）、（ｃ）野生型リピドＡ部分をヒドラジン処理することにより得ることができるリピドＡ部分を有するＬＯＳ（Gu et al., 1996, Infect. Immun. 64:4047-53、Polotsky et al., 1994, Infect Immun, 62:210-14、及びGu et al., 1998, Infect, Immun, 66:1891-97, 1998）、（ｄ）アルカリホスファターゼを用いてリピドＡ部分を脱リン酸化することにより得ることができるリピドＡ部分を有するＬＯＳ（ＵＳ６，２９０，９５２）、及び（ｅ）非相同の（heterologous）ｌｐｘＥ遺伝子又はｐａｇＬ遺伝子が発現しているナイセリア属菌宿主において産生されたＬＯＳを酵素的に脱リン酸化又は脱アシル化することにより得ることができるＬＯＳが挙げられる。本明細書において発現の低下とは、対応する野生型菌株と比較した場合の増減を意味すると理解され、発現レベルは、好ましくは対応する野生型菌株と、少なくとも２倍、５倍又は１０倍相違する。
【００１４】
したがって、毒性が低下した好適なＬＡとしては、還元グルコサミンにのみ二級Ｃ１２−アシルを有するＬＡ、非還元グルコサミンにのみ二級Ｃ１２−アシルを有するＬＡ、いずれの二級Ｃ１２−アシル基も欠如するＬＡ、１又は４’位のいずれかで、１又は２以上のリン酸基を欠如するＬＡ、及び上記脱アシル化と脱リン酸化との組合せを有するＬＡが挙げられる。
【００１５】
さらなる態様において本発明は、次式（Ｉ）
【化２】
で表されるナイセリア属菌ＬＯＳであって、式中、好ましくはＬＡが、上記に定義した、毒性が低下したリピドＡ部分であることを特徴とするナイセリア属菌ＬＯＳに関する。
【００１６】
本発明のさらに別の態様は、本明細書において上記に定義したナイセリア属菌ＬＯＳと薬学的に許容される担体とを含む組成物に関する。前記組成物は、細菌、ウイルス、真菌類、寄生虫、がん細胞、若しくはアレルゲンに由来するか、又はそれらから産生される抗原をさらに含むことが好ましい。前記医薬組成物は、薬学的に許容される安定化剤、浸透圧薬剤（osmotic agent）、緩衝剤、分散剤等をさらに含む場合がある。前記医薬組成物の好適な形態は、所望の投与方法及び治療の用途によって決まる。前記医薬用担体は、有効成分、即ちナイセリア属菌ＬＯＳ及び抗原を患者に投与（deliver）するのに適した相溶性（compatible）かつ無毒な物質であれば、どのようなものでもよい。鼻腔内投与用の薬学的に許容される担体の例としては、水、緩衝生理食塩水、グリセリン、ポリソルベート２０（polysorbate 20）、クレモフォルＥＬ(cremophor EL)、カプリル酸／カプリン酸グリセリドの混合水溶液を挙げることができ、中性のｐＨ環境をもたらすために、緩衝液で処理してもよい。非経口投与用の薬学的に許容される担体の例としては、必要に応じて２０％のアルブミンを添加した０．９％の塩化ナトリウム無菌緩衝液又は５％のグルコース緩衝液が挙げられる。非経口投与用の調製剤は、無菌でなくてはならない。周知の方法による有効成分の非経口の投与経路としては、例えば皮下、静脈内、腹腔内、筋肉内、動脈内若しくは病巣内の経路による注射又は注入が挙げられる。本発明の組成物は、好ましくはボーラス注入法（bolus injection）により投与される。筋肉内注射用の典型的な医薬組成物は、例えば１〜１０ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水、１〜１００μｇ、好ましくは１５〜４５μｇの抗原、及び１〜１００μｇ、好ましくは１５〜４５μｇの本発明のナイセリア属菌ＬＯＳを含有する。経口投与の場合、有効成分は、エリキシル剤、シロップ剤、及び懸濁剤等の液剤の形態で投与することができる。経口投与用の液剤は、患者の許容性を高めるために、着色剤及び香料を含有させることができる。非経口、経口、又は鼻腔内投与が可能な組成物の調製方法は、当技術分野で周知であり、例えばRemington’s Pharmaceutical Science (15th ed., Mack Publishing, Easton, PA, 1980)(参照により該文献全体を本明細書に援用する)を含む各種の出典に詳細が記載されている。
【００１７】
本発明の組成物における抗原は、細菌、ウイルス、真菌類、寄生虫、がん細胞、若しくはアレルゲンに由来するか、又はそれらから産生される抗原であることが好ましい。本発明のナイセリア属菌ＬＯＳと組み合せることができるウイルス抗原は、あらゆるウイルスから得ることができる。限定するものではないが、前記ウイルスの例としては、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）等のレトロウイルス科と、風疹ウイルスと、インフルエンザウイルス、麻疹、流行性耳下炎、呼吸器合胞体ウイルス、ヒトメタ肺炎ウイルス等のパラミクソウイルス科と、黄熱病ウイルス、デング・ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、日本脳炎ウイルス（ＪＥＶ）、ダニ媒介脳炎ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、又は西ナイルウイルス等のフラビ・ウイルス科（flaviviridae）と、単純ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、エプスタイン・バール・ウイルス等のヘルペスウイルス科（herpesviridae）と、ブニヤウイルス科と、アレナウイルス科と、ハンターン等のハンタウイルス科と、コロナウイルス科と、ヒト乳頭腫ウイルス等のパポバウイルス科と、狂犬病ウイルス等のラブドウイルス科と、ヒトコロナウイルス等のコロナウイルス科と、アルファウイルス科と、アルテリウイルス科と、エボラウイルス等のフィロウイルス科と、アレナウイルス科と、天然痘ウイルス等のポックスウイルス科と、アフリカブタ熱ウイルスとが挙げられる。同様に、本発明のナイセリア属菌ＬＯＳは、病原菌、（酵母を含む）真菌類、又は寄生虫由来の抗原と組み合せる場合がある。かかる抗原としては、例えば、ヘリコバクター・ピロリ等のヘリコバクター属、髄膜炎菌等のナイセリア属、ヘモフィルス・インフルエンザ等のヘモフィルス属、百日咳菌等のボルデテラ属、クラミジア属、Ａ血清型レンサ球菌（streptococcus sp. serotype A）等のストレプトコッカス属、ビブリオ・コレラ等のビブリオ属、例えばサルモネラ属、シゲラ属、カンピロバクター属、及びエシェリキア属等を含むグラム陰性腸内病原菌の細菌性抗原、並びに炭疽病、ハンセン病、結核、ジフテリア、ライム病、梅毒、腸チフス、及び淋病の原因菌由来の抗原が挙げられる。寄生虫由来の抗原としては例えば、バベオシス・ボビス（Babeosis bovis）、プラズモディウム属、リーシュマニア属、トキソプラズマ原虫、及びクルーズ・トリパノソーマ等のトリパノソーマ属等の原生動物が挙げられる。真菌類の抗原としては、アスペルギルス属、カンジダ・アルビカンス、例えばクリプトコッカス・ネオフォルマンス等のクリプトコッカス属、及びヒストプラズマ・カプスラーツム（Histoplasma capsulatum）といった真菌類由来の抗原を挙げることができる。
【００１８】
ワクチン接種は通常、病原菌に対する予防的防御、又は病原性感染症に引き続く疾患の治療に適用されるが、ワクチンが腫瘍の治療に適用されることも当業者には周知である。さらに、ヒト又はヒト化された抗体により標的とされ得る適切な存在（entity）として、多くの腫瘍特異的タンパク質が見い出されている。かかる腫瘍特異的タンパク質もまた、本発明の範囲に含まれる。当技術分野においては、多くの腫瘍特異的抗原が周知である。したがって、一つの好適な実施形態において本発明は、腫瘍特異的抗原と上記に定義したナイセリア属菌ＬＯＳとを含む組成物を提供する。適切な腫瘍抗原としては例えば、がん胎児性抗原、前立腺特異的膜抗原、前立腺特異的抗原、ＭＺ２−Ｅタンパク質、多形上皮性ムチン（ＰＥＭ）、葉酸結合タンパク質ＬＫ２６、切断型（truncated）表皮増殖因子受容体（ＥＧＲＦ）、ＨＥＲ２、Thomasen-Friedenreich (Ｔ) 抗原、ＧＭ−２及びＧＤ２ガングリオシド、Ｅｐ−ＣＡＭ、ムチン−１、上皮糖タンパク質−２、及び結腸特異的抗原（colon specific antigen）が挙げられる。
【００１９】
さらに自己免疫疾患の予防において寛容を誘導するために、樹状細胞を抗原の標的とすることもできる。かかるアレルゲンもまた、本発明の範囲に含まれる。
【００２０】
本発明の別の態様は、上記に定義されたナイセリア属菌ＬＯＳの製造方法に関する。好適な方法は、（ａ）免疫型Ｌ２、Ｌ３、若しくはＬ４のナイセリア属菌ＬＯＳを発現し、且つ活性のｌｇｔＢ遺伝子を欠如する髄膜炎菌株、又は免疫型Ｌ６のナイセリア属菌ＬＯＳを発現する髄膜炎菌株であって、加えて１又は２以上のｌｐｘＬ１遺伝子若しくはｌｐｘＬ２遺伝子又はそれらの相同体の発現を不活化又は低減する変異を有する髄膜炎菌株を培養するステップと、（ｂ）前記ナイセリア属菌ＬＯＳを回収するステップとを含む。別法として前記方法は、（ａ）免疫型Ｌ２、Ｌ３、若しくはＬ４のナイセリア属菌ＬＯＳを発現し、且つ活性のｌｇｔＢ遺伝子を欠如する髄膜炎菌株、又は、免疫型Ｌ６のナイセリア属菌ＬＯＳを発現する髄膜炎菌株を培養するステップと、（ｂ）前記ナイセリア属菌ＬＯＳを回収するステップと、（ｃ）ヒドラジン、アルカリホスファターゼ、又はアシルオキシ加水分解酵素からなる群から選択される少なくとも１つを用いてナイセリア属菌ＬＯＳを処理し、リピドＡ部分の毒性を低下させるステップとを含む。前記方法において、ステップ（ｂ）及びステップ（ｃ）の順番を入れ替える場合がある。好適な方法では、ステップ（ｃ）において毒性は、上記のＷＥＨＩアッセイで決定された、野生型ナイセリア属菌ＬＯＳの毒性の８０％未満まで低下する。
【００２１】
本発明のさらに別の態様は、上記に定義したナイセリア属菌ＬＯＳを含むグラム陰性ＯＭＶ（外膜小胞）又はブレブ（blebs）に関する。グラム陰性ＯＭＶ又はブレブの製造手段及び方法は、ＷＯ０２／０９７４６に記載されている。このようにして得られたグラム陰性ブレブを本発明のナイセリア属菌ＬＯＳと組み合せ、ナイセリア属菌ＬＯＳを含むグラム陰性ブレブを製造することができる。別法として前記ブレブは、上記に定義した、本発明のナイセリア属菌ＬＯＳを産生する能力を有するナイセリア株から製造される場合がある。ナイセリア属菌ＬＯＳを含むグラム陰性ブレブは、上記の抗原及び／又は上記の薬学的に許容される担体とさらに組み合せる場合がある。
【実施例１】
【００２２】
１ 材料及び方法
１．１ 菌株
先に記載の髄膜炎菌野生株（ＷＴ）Ｈ４４／７６集団Ｂからオリゴ糖のコア変異体及びリピドＡ変異体を得た。
【００２３】
本研究において用いたオリゴ糖のコア変異体の構造を、図１に示す。菌株は全て、６％のＣＯ２を含む空気の雰囲気下で、ビトックス（英国ベージングストーク、Oxoid社製）を添加した淋菌寒天培地（英国ベージングストーク、Difco社製）において、３６℃で増殖させた。前記細菌は、１８時間培養した後の静止期で使用した。フェノールレッド不含ＲＰＭＩ１６４０培地（英国ペーズリー、Gibco社製）で細菌を懸濁し、その吸光度を５４０ｎｍで測定した。吸光度１は、１ｍｌ当たり１０９の微生物に相当すると算出された。０．５％のパラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）を含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に細菌を１５分間固定し、ＲＰＭＩ培地で十分に洗浄した。０．５ｍｇ／ｍｌのＦＩＴＣ（英国プール、Sigma社製）を用いて３７℃で２０分間インキュベートし、その後十分に洗浄し、ＦＩＴＣ標識細菌を調製した。
【００２４】
１．２ 細胞
先に記載のように、ヒト末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）からＤＣを製造した（F. Sallusto and A. Lanzavecchia, 1994, J. Exp. Med. 179:1109-1118; H. Uronen-Hansson et al., 2004, Immunology 111: 173-178）。簡潔にいえば、多段パーコール勾配遠心法により、ＰＢＭＣから単球を調製した。かかる単球の画分は、＞９５％ＣＤ１４＋／ＣＤ３−／ＣＤ１９−であった。１０％の加熱不活化ＦＣＳ、２．４ｍＭのＬ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン−ストレプトマイシン（全て英国ペーズリー、Gibco社製）、１００ｎｇ／ｍｌのヒト組換えＧＭ−ＣＳＦ及び５０ｎｇ／ｍｌのヒト組換えＩＬ４（英国ハーツ、ウェルウィンガーデンシティ、Schering-Plough社製、）を添加したＲＰＭＩにて単球を７日間インキュベートし、ＤＣを作出した。このようにして調製した未成熟ＤＣは、ＣＤ１４ｌｏｗ、ＣＤ８３−ｖｅ、ＣＤ８６ｌｏｗ、ＣＤ２５−ｖｅであった。これらのＣＤはまた、ＨＬＡ、ＤＲ、ＨＬＡ、ＤＱ、ＨＬＡクラスＩ、ＣＤ４０及びＣＤ１ａを発現し、ＣＤ１９及びＣＤ３の両方については陰性であった。
【００２５】
１０％ＦＣＳを添加したＲＰＭＩ１６４０にて、（図面の説明に述べるように）ＤＣ／細菌比率１：５０及び１：２００で、５×１０５／ｍｌの濃度のＤＣを髄膜炎菌Ｈ４４／７６菌体とともに培養した。細胞内サイトカインの測定時に、１０μｇ／ｍＬのタンパク質輸送阻害剤ブレフェルディンＡ（英国プール、Sigma社製）を添加した。
【００２６】
未成熟ＤＣを、２０μｇ／ｍｌの抗ＤＣ−ＳＩＧＮ ｍＡｂ ＡＺＮ−Ｄ１と共に３７℃で３０分間インキュベートし、その後、野生型細菌及び変異細菌と共に３７℃で４５分間インキュベートすることにより、ｌｇｔＢ変異細菌のＤＣに対する結合特異性を検討した。
【００２７】
１．３ ＤＣへの結合及び内部移行
ＤＣに対する細菌の結合及び内部移行は、フローサイトメトリー法と共焦点顕微鏡法とを併用して検討した。フローサイトメトリー法による検出では、ＤＣをＦＩＴＣ標識細菌とともに３０分〜２４時間の間で異なる時間インキュベートし、ＦＡＣＳＦｉx（Becton Dickinson社製）に固定し、ＦＡＣＳカリバー上で洗浄及び解析した。ゲートをかけたＤＣ集団（DC gated population）では、細菌が結合したＤＣは、蛍光により容易に同定できた。共焦点顕微鏡法では、ＦＩＴＣで標識した髄膜炎菌で刺激したＤＣを、接着スライド（adhesion slide）（英国ハーツBio-Rado Laboratories 社製）に１０分間置き接着させた。内部移行を停止させるため、４％のＰＦＡで１０分間ＤＣを固定した。５μｇ／ｍｌの抗ＭＨＣクラスIIモノクローナル抗体（デンマーク、グロストラップ、Dako社製）で染色し、ＤＣを視覚化した。洗浄後、結合した抗体について、テキサスレッドコンジュゲートヤギ抗マウス抗体（Molecular probes社製）５μｇ／ｍｌで１時間の検出を行った。前記スライドを洗浄し、Citifluor(英国、Citifluor社製)に配置した。適切なフィルターセットを備えた、ライカＳＰ２共焦点レーザー走査顕微鏡システム（英国ミルトンキーンズ、Leica社製）を用い、共焦点画像を得た。細胞内細菌を同定するため、ライカ共焦点画像ソフトウェアを用いてＤＣ全域の１５〜２０の光学切片（０．２〜０．５μｍ）を写し、重ね合わせた。
【００２８】
１．４ サイトカイン測定
細胞内のサイトカイン産生を測定するため、４％のＰＦＡを含むＰＢＳでＤＣを固定し、０．１％のアジ化ナトリウム及び０．５％のＢＳＡ（全てSigma社製）を含有するＰＢＳ中で洗浄し、２５μｌの浸透化溶液（Caltag社製）で浸透処理した。次に細胞を、抗ＴＮＦ−αモノクローナル抗体（英国オックスフォード、Becton Dickinson社製）及びＩＬ−１２ ｐ４０／７０（Pharmingen社製）又はアイソタイプ（isotype）が適合する対照を用いて室温の暗室で３０分間インキュベートした。続いてＰＢＳ中で前記細胞を２回洗浄し、セルフィックス（CellFix(Becton Dickinson社製)）中で固定し、セル・クエスト・ソフトウェア（Cell Quest Software(Becton Dickinson社製)）を用いてＦＡＣＳカリバー上でフローサイトメトリー法により解析した。ＤＣは、前方及び右方向（forward and right angle）の分散によって同定される顕著な集団を構成した。かかる集団の細胞の少なくとも９５％は、ＭＨＣII、ＣＤ１ａ、ＣＤ２５、ＣＤ８０、ＣＤ８３及びＣＤ８６の発現によりＤＣと確定した。ＤＣに対応するゲートにおいて、少なくとも３０００のイベント（event）についてデータ収集して解析した。可溶性サイトカインのＥＬＩＳＡアッセイのため、ヒトＩＬ−１２、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１０、ＩＬ６及びＩＬ１βについて、サイトセット（CytoSets(商標)）ＥＬＩＳＡキット（ベルギー、ニベル、Biosource Europe S.A. 社製）を製造元の取扱説明書に従って用いた。
【００２９】
１．５ 可溶性Ｃ型レクチンＦｃ接着アッセイ
Ｃ型レクチンＦｃ分子は、ＣＯＯＨ末端においてヒトＩｇＧ１−Ｆｃ断片に融合するＣ型レクチン受容体（ＤＣ−ＳＩＧＮ、ＭＧＬ及びデクチン−１Ｂ）の細胞外部分からなる（T. Geijtenbeek et al., 2003, J. Exp. Med. 197:7-17）。可溶性Ｃ型レクチンＦｃ接着アッセイを次のように行った。全ての細胞（ＯＤ５４０＝０．１）を、室温で１８時間、ＥＬＩＳＡプレート（１００μｌ／ウェル）上にコーティングした。次に１％のＢＳＡを用い、３７℃で３０分間ブロッキングした。可溶性Ｃ型レクチンＦｃの上清を添加し、室温に２時間置いた。結合していないＣ型レクチンＦｃを洗い流し、抗ＩｇＧ１抗体を用い、ＥＬＩＺＡ法で結合を測定した。
【００３０】
１．６ ＤＣによるＴｈ１／Ｔｈ２の分化
１０％のＦＣＳ（ベルギー、ベルビエ、Bio Withaker社製）、５００Ｕ／ｍｌのＩＬ−４及び８００Ｕ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦ（共にSchering-Plough社製）を添加したイスコフ改変ダルベッコ培地（Gibco社製）において、健常ドナーの単球からＤＣを培養した。６日目に、感染多重度１０で、髄膜炎菌野生株及びｌｇｔＢ変異株を用いてＤＣの成熟を誘導した。（ｉ）混合Ｔｈ１／Ｔｈ２反応アッセイでは、１０ｎｇ／ｍｌの大腸菌ＬＰＳ（ミズーリ州セントルイス、Sigma-Aldrich社製）（ii）Ｔｈ１の分化アッセイでは、２０μｇ／ｍｌのｐｏｌｙＩ：Ｃ（Sigma-Aldrich社製）、及び（iii）Ｔｈ２の分化アッセイでは、１０μｇ／ｍｌのＰＥＧ２、１０ｎｇ／ｍｌのＬＰＳ（Sigma-Aldrich社製）を陽性対照（positive control）として用いた。２日目に、フローサイトメトリー法により、ＤＣの成熟マーカー（ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６及びＨＬＡ−ＤＲ）を解析した。Ｔ細胞の分化を評価するため、成熟ＤＣを、ＣＤ４５ＲＡ＋／ＣＤ４＋Ｔ細胞とともにインキュベートした（５．１０３Ｔ細胞／２０．１０３ＤＣ）。１２〜１５日目に、１０ｎｇ／ｍｌのＰＭＡ（Sigma-Aldrich社製）及び１μｇ／ｍｌのイオノマイシン（Sigma-Aldrich社製）で、静止Ｔ細胞を６時間再刺激した。１時間後、前記Ｔ細胞に１０μｇ／ｍｌのブレフェルディンＡ（Sigma-Aldrich社製）を添加した。ＩＬ−４及びＩＦＮ−γの単一細胞産生を、細胞内フローサイトメトリー解析で測定した。細胞を２％のＰＦＡ中で固定し、０．５％のサポニン（Sigma-Aldrich社製）で浸透処理し、抗ヒトＩＦＮ−γ−ＦＩＴＣ及び抗ヒトＩＬ−４−ＰＥ（カルフォルニア州サンディエゴ、Becton Dickinson Pharmigen社製）で染色した。
【実施例２】
【００３１】
髄膜炎菌のオリゴ糖コア変異株の樹状細胞への結合及び内部移行
フローサイトメトリー法を用い、髄膜炎菌野生株、オリゴ糖変異株、及びＬＰＳ欠損変異株のヒトＤＣへの結合及び内部移行について調べた。未成熟ＤＣを、髄膜炎菌野生株Ｈ４４／７６由来のＦＩＴＣ標識変異株とともに、ＤＣ／細菌比率１：５０（図２）及び１：２００（データ示さず）で共培養し、ＤＣに結合したＦＩＴＣ標識細菌の存在を、ＦＡＣＳにより解析した。野生株及びオリゴ糖変異株の両方について、時間及び用量依存的なＤＣとの結合が観察された。ＬＰＳ欠損変異株については、時間経過の最初の６時間において、ＤＣとの結合がほとんど見られなかった。ｌｇｔＢ変異株はどちらの濃度でも一貫して、野生株又はｇａｌＥ変異株よりも、ＤＣへの結合性が高かった。
【００３２】
次に、細菌の結合と内部移行とを区別するために、共焦点顕微鏡を用い、髄膜炎菌野生株及び変異株のＤＣへの内部移行について検討した（データは示さず）。ＦＩＴＣ細菌は、スライド上で緑色の小粒子として容易に認めることができた。ＤＣを可視化するために、ＭＨＣクラスIIによる染色を用いた。大部分のＤＣでは、１時間のインキュベート後すでに、野生型細菌又はｇａｌＥ変異細菌に比較してより多くのｌｇｔＢが内部移行していた。ＬＰＳ欠損変異細菌については、ほとんど内部移行がみられなかった。ｌｇｔＢ変異細菌については、高レベルの内部移行に加え、時間的経過中を通じて、高い表面接着を維持するのが典型であった。これらの結果は、ＦＡＣＳによる結果、即ちＤＣに対する細菌の結合性の増強は、細菌の内部移行の増強をもたらすという結果を裏付けるものである。
【実施例３】
【００３３】
髄膜炎菌変異株に対する応答としてのＤＣの活性化及び成熟化
細菌の内部移行とサイトカイン産生との関係について検討するため、野生株及び変異株に対する応答として樹状細胞が産生したＩＬ１２及びＴＮＦ−αについて細胞内測定を行い、内部移行について一斉分析（simultaneous analysis）した（図３）。ＤＣを、１：５０の比率でＦＩＴＣ標識細菌とともに１８時間共培養し、次にＴＮＦ−α及びＩＬ１２の細胞内産生を調べるために染色した。ＦＩＴＣ細菌が結合した細胞とＦＩＴＣ細菌が結合していない細胞とを区別するために、四象限（quadrants）を設定した。パーセンテージは、細菌の内部移行後に細胞内サイトカインを産生しているＤＣ（右上象限）又は産生していないＤＣ（右下象限）の割合である。野生株、ｌｇｔＢ及びｇａｌＥ変異株は全て、ＤＣによるＴＮＦ−α及びＩＬ−１２産生の強力な誘導因子であったが、ＬＰＳ欠損型変異株は違った。髄膜炎菌野生株、ｌｇｔＢ、及びｇａｌＥ変異株が内部移行したＤＣでは実質的にその全てが、高レベルのＴＮＦ−αを産生していた。ＩＬ−１２については、ＦＩＴＣ標識細菌が内部移行したＤＣの約５０％で産生がみられた。
【００３４】
細胞内のサイトカインの測定に加え、髄膜炎菌に対する応答としてＤＣから分泌されたサイトカインのレベルも測定した（図４）。ＤＣを、１：２００の比率で変異細菌及び野生型細菌とともに１８時間共培養し、上清を回収して分泌されたＩＬ１２、ＩＬ１０、ＴＮＦ−α、ＩＬ６及びＩＬ−１βについて解析した。野生型（野生型＝１００％）と比較したサイトカイン産生のパーセンテージを、結果として示す。ｌｇｔＢ及びｇａｌＥ変異細菌はともに、ＩＬ１２、ＴＮＦ−α、及びＩＬ−１βの誘導について、野生型細菌をやや下回った。ＩＬ−１０及びＩＬ−６については、ｌｇｔＢ及びｇａｌＥともに、野生株と同様であった。ＬＰＳ欠損株には、サイトカイン産生がほとんどみられなかった。
【００３５】
最後に、共刺激分子ＣＤ４０及びＣＤ８６の発現を測定し（図５）、野生型細菌及び変異細菌で刺激したＤＣの成熟化について検討した。野生型細菌又はｇａｌＥ変異細菌で刺激したＤＣと比較して、ｌｇｔＢ変異細菌で刺激したＤＣの場合には、ＣＤ４０及び特にＣＤ８６の発現が高かった。ｌｐｘＡ変異細菌で刺激したＤＣでは、ＣＤ４０及びＣＤ８６の発現はほとんどみられなかった。
【００３６】
結論としてこれらのデータは、ｌｇｔＢ変異細菌がＤＣに結合及び内部移行すると、野生型細菌が誘導するＤＣ活性化及び成熟化のレベルと同程度のＤＣ活性化及び成熟化をもたらすことを示している。
【実施例４】
【００３７】
ｌｇｔＢ変異細菌の結合及び内部移行を仲介する受容体の同定
ＤＣがｌｇｔＢ変異細菌を高度に結合及び吸収するということが、かかる結合及び内部移行が、特異的なＤＣ受容体によって仲介されているかどうかを調べるきっかけとなった。したがって本発明者らは、野生株及び変異株について、オリゴ糖認識能を有し、未成熟ＤＣに高度に発現するＣ型レクチン受容体を結合する能力を解析した。野生型細菌及び変異型細菌の細胞全体に対するＣ型レクチンＦｃキメラのパネル（panel）の結合を、可溶性接着アッセイ（soluble adhesion assay）において検討した（図６）。前記Ｃ型レクチンＦｃキメラは、野生型細菌、ｇａｌＥ変異細菌、及びＬＰＳ欠損変異細菌には結合しなかったが、ｌｇｔＢ変異細菌はＤＣ−ＳＩＧＮ−Ｆｃを強く結合した。ｌｇｔＢ変異細菌とＤＣ−ＳＩＧＮとの結合は、ＤＣ−ＳＩＧＮ又はＤＣ−ＳＩＧＮを安定的に発現するＫ５６２細胞を一過性に形質移入したＨＥＫ２９３Ｔ細胞にもみられた（データ示さず）。さらに、抗ＤＣ−ＳＩＧＮ遮断抗体ＡＺＮ−Ｄ１の存在下又は非存在下で、ＤＣによるｌｇｔＢ変異細菌の貪食について検討したところ、ＤＣ−ＳＩＧＮに対するｌｇｔＢ ＬＰＳの特異性が実証された（図７）。ＡＺＮ−Ｄ１の存在下では、ＤＣによるｌｇｔＢの貪食は、野生型についてみられる結合のレベルまで減少し、これは明らかに、ＤＣ−ＳＩＧＮがｌｇｔＢ変異細菌を結合及び内部移行させることを実証するものである。
【実施例５】
【００３８】
ＴＨ１の免疫応答を惹起する、ＤＣ−ＳＩＧＮに対するｌｇｔＢ変異細菌のターゲティング
ｌｇｔＢ変異細菌ＬＰＳとＤＣ−ＳＩＧＮとの相互作用に機能的関連性があるとすれば、それを評価するべく、ＰＦＡで固定した野生型細菌又はｌｇｔＢ変異細菌のいずれかを未成熟ＤＣにパルスした後、ＤＣにより誘導されるＴ細胞の応答について検討した。野生型細菌又はｌｇｔＢ変異細菌をパルスしたＤＣを、共刺激分子及び成熟マーカーの発現により評価したところ、ＤＣの成熟に相違はみられなかった（図８ａ）。しかし、これらの株により誘導されるＴＨ１／ＴＨ２のプロファイルには、顕著な相違がみられた（図８ｂ）。髄膜炎菌の野生型細菌をパルスしたＤＣでは、大部分のＴ細胞がＩＬ−４を産生していたため、主にＴＨ２型の免疫応答を生じた。ｌｇｔＢ変異細菌をパルスしたＤＣは主に、ＩＦＮ−γ−産生Ｔ細胞を誘起（evoke）し、したがってＴＨ１細胞対ＴＨ２細胞の均衡を、ＴＨ１細胞寄りに変えた。かかるＴＨ１／ＴＨ２の均衡の変化は、３つの異なるドナーで観察された。これらのデータは、ｌｇｔＢ ＬＰＳをＤＣ−ＳＩＧＮ特異的にターゲティングすると、ＤＣシグナルが生じ、このシグナルが、免疫応答をＴＨ１へと誘導することを示しており、これは、アジュバントにとって非常に望ましい現象である。P. Moingeon et al. (2001) Vaccine 19:4363-4372についても参照のこと。
【実施例６】
【００３９】
髄膜炎菌のオリゴ糖／リピドＡ二重変異株のＤＣへの結合及び内部移行
髄膜炎菌野生株、ｌｇｔＡ及びｌｇｔＢオリゴ糖変異株、それらのｌｐｘＬ１二重変異株、及びＬＰＳ欠損変異株のヒトＤＣへの結合及び内部移行を、フローサイトメトリー法を用いて調べた。未成熟ＤＣを、ＤＣ／細菌比率１：１００で髄膜炎菌野生株Ｈ４４／７６由来のＦＩＴＣ標識変異株と共培養し、ＤＣに結合したＦＩＴＣ標識細菌の存在について、ＦＡＣＳで解析した（図９）。ｌｇｔＢ単一変異株は一貫して、野生株及びｌｇｔＡ単一変異株よりも、ＤＣとの結合性が高かった。さらにまたｌｇｔＢ変異株は、ｌｐｘＬ１変異背景においても野生型オリゴ糖構造体又はｌｇｔＡオリゴ糖構造体よりも高い結合性を生じた。この結果は、ペンタアシル化されたｌｐｘＬ１リピドＡを含むＬＰＳでも、ｌｇｔＢの仲介によるＤＣ−ＳＩＧＮへの結合が増強し得ることを示している。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】髄膜炎菌野生株Ｌ３ ＬＰＳ及びそのオリゴ糖変異株の概略図である。かかる変異株は、糖転移酵素をコードする遺伝子（イタリック体表示）の挿入不活性化により作製できる。
【図２】樹状細胞（ＤＣ）を１:５０の比率で、ＦＩＴＣ標識細菌とともに２４時間培養した。ＤＣに対する細菌の結合をＦＡＣＳで測定するために、表示の時間の時点で、試料を採取した。３つの異なるドナーついての独立した代表的な試験結果を示す。
【図３】ＤＣを１:５０の比率で、ＦＩＴＣ標識細菌を用いてブレフェルディンＡの存在下に１８時間刺激し、細胞内のＴＮＦ−α及びＩＬ−１２を調べるために染色した。ドットプロット（dot plot）は、細菌が結合したＤＣについて、細胞内サイトカインを産生していない（右下象限）又はしている（右上象限）ＤＣの割合を示す。
【図４】１８時間の共培養の後、野生型髄膜炎菌及び変異体に対する応答としてＤＣが産生したＴＮＦ−α、ＩＬ−１２、ＩＬ−１β、ＩＬ−１０及びＩＬ−６を、培養上清中でＥＬＩＳＡにより測定した。独立した３つの異なる試験結果について、平均値及びＳＥＭ値を示す。
【図５】野生型髄膜炎菌及び髄膜炎菌変異体とＤＣとを１８時間共培養した後の、ＣＤ４０及びＣＤ８６の発現を、蛍光強度中央値（ＭＦＩ）によって示す。
【図６】可溶性接着アッセイにおける、Ｃ型レクチンＦｃ分子の髄膜炎菌野生株及び変異株への結合。
【図７】１ｍｌあたり２０μｇの抗ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体ＡＺＮ−Ｄ１の存在下及び非存在下における、髄膜炎菌野生株及びｌｇｔＢ変異株のＤＣへの結合。
【図８】ＤＣが誘導するＴｈ１／Ｔｈ２細胞の増殖。髄膜炎菌野生株Ｈ４４／７６、ｌｇｔＢ変異株、大腸菌ＬＰＳ、ｐｏｌｙＩ:Ｃ又はＰＥＧ２とともにＤＣを４８時間培養し、洗浄し、（Ａ）成熟マーカー（独立した３つの異なる試験結果について平均値及びＳＥＭ値）を分析するか、又は（Ｂ）高純度のＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞と共培養し、静止Ｔ細胞をＰＭＡ及びイオノマイシンで再刺激し、フローサイトメトリー法で細胞内ＩＬ−４（グレー）及びＩＦＮ−γ（黒）を単一細胞ベースで解析した。３つの別々のドナーから得たデータを示す。
【図９】生菌のＤＣへの結合及びサイトカイン誘導。樹状細胞（ＤＣ）を、１：１００の比率で、ＦＩＴＣ標識した髄膜炎菌野生株及びＬＰＳ変異株とともに培養した。表示された時間の時点で、ＤＣへの細菌の結合をＦＡＣＳにより測定するため、試料を採取した。２つの別々のドナー由来の細胞について結果を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物の免疫用薬剤の製造におけるナイセリア属菌ＬＯＳの使用であって、前記ナイセリア属菌ＬＯＳが次式（Ｉ）
【化１】
で表され、式中、ＬＡが野生型リピドＡ部分又は毒性が低下したリピドＡ部分であることを特徴とする使用。
【請求項２】
ナイセリア属菌ＬＯＳが、アジュバントとして用いられることを特徴とする請求項１記載の使用。
【請求項３】
哺乳動物における抗原に対する免疫反応を増強させるための薬剤の製造において、ナイセリア属菌ＬＯＳが、抗原と組み合せて用いられることを特徴とする請求項１又は２記載の使用。
【請求項４】
抗原が、細菌、ウイルス、真菌類、寄生虫、ガン細胞、若しくはアレルゲンに由来するか、又はそれらから産生されることを特徴とする請求項３記載の使用。
【請求項５】
ＬＡが、ＷＥＨＩアッセイにおいて決定された、野生型リピドＡ部分の毒性の８０％未満の毒性のリピドＡ部分であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載の使用。
【請求項６】
リピドＡ部分が、
（ａ）ｌｐｘＬ１遺伝子若しくはｌｐｘＬ２遺伝子又はそれらの相同体を低活性化又は不活化する変異を有するナイセリア属菌株から得ることができるリピドＡ部分、
（ｂ）アシルオキシ加水分解酵素を用いた処理により、野生型リピドＡ部分から１又は２以上の二級Ｏ結合型エステル化脂肪酸を除去することにより得ることができるリピドＡ部分、
（ｃ）野生型リピドＡ部分をヒドラジンで処理することにより得ることができるリピドＡ部分、
（ｄ）アルカリホスファターゼを用いて脱リン酸化することにより得ることができるリピドＡ部分、
からなる群から選択されることを特徴とする請求項１〜５のいずれか記載の使用。
【請求項７】
リピドＡ部分が、
（ａ）還元グルコサミンにのみ二級Ｃ１２−アシルを有するリピドＡ部分、
（ｂ）非還元グルコサミンにのみ二級Ｃ１２−アシルを有するリピドＡ部分、
（ｃ）いずれの二級Ｃ１２−アシル基も欠如するリピドＡ部分、
（ｄ）１又は４’位のいずれかで、１又は２以上のリン酸基を欠如するリピドＡ部分、
（ｅ）前記（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）における脱アシル化と前記（ｄ）における脱リン酸化との組合せを有するリピドＡ部分、
からなる群から選択されることを特徴とする請求項１〜６のいずれか記載の使用。
【請求項８】
次式（Ｉ）
【化２】
で表され、式中、ＬＡは毒性が低下したリピドＡ部分であることを特徴とするナイセリア属菌ＬＯＳ。
【請求項９】
リピドＡ部分の毒性が、ＷＥＨＩアッセイにおいて決定された、野生型リピドＡ部分の毒性の８０％未満であることを特徴とする請求項８記載のナイセリア属菌ＬＯＳ。
【請求項１０】
リピドＡ部分が、
（ａ）ｌｐｘＬ１遺伝子若しくはｌｐｘＬ２遺伝子又はそれらの相同体を低活性化又は不活化する変異を有するナイセリア属菌株から得ることができるリピドＡ部分、
（ｂ）アシルオキシ加水分解酵素を用いた処理により、野生型リピドＡ部分から１又は２以上の二級Ｏ結合型エステル化脂肪酸を除去することにより得ることができるリピドＡ部分、
（ｃ）野生型リピドＡ部分をヒドラジンで処理することにより得ることができるリピドＡ部分、
（ｄ）アルカリホスファターゼを用いて脱リン酸化することにより得ることができるリピドＡ部分、
からなる群から選択されることを特徴とする請求項８又は９記載のナイセリア属菌ＬＯＳ。
【請求項１１】
リピドＡ部分が、
（ａ）還元グルコサミンにのみ二級Ｃ１２−アシルを有するリピドＡ部分、
（ｂ）非還元グルコサミンにのみ二級Ｃ１２−アシルを有するリピドＡ部分、
（ｃ）いずれの二級Ｃ１２−アシル基も欠如するリピドＡ部分、
（ｄ）１又は４’位のいずれかで、１又は２以上のリン酸基を欠如するリピドＡ部分、及び
（ｅ）前記（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）における脱アシル化と前記（ｄ）における脱リン酸化との組合せを有するリピドＡ部分、
からなる群から選択されることを特徴とする請求項８〜１０のいずれか記載のナイセリア属菌ＬＯＳ。
【請求項１２】
請求項８〜１１のいずれかに定義されるナイセリア属菌ＬＯＳと薬学的に許容される担体とを含む組成物。
【請求項１３】
細菌、ウイルス、真菌類、寄生虫、ガン細胞、若しくはアレルゲンに由来するか、又はそれらに産生される抗原をさらに含むことを特徴とする請求項１２記載の組成物。
【請求項１４】
請求項８〜１１のいずれかに定義されるナイセリア属菌ＬＯＳの製造方法であって、前記方法が、
（ａ）免疫型Ｌ２、Ｌ３、若しくはＬ４の免疫型のナイセリア属菌ＬＯＳを発現し、且つ活性のｌｇｔＢ遺伝子を欠如する髄膜炎菌株、又は免疫型Ｌ６のナイセリア属菌ＬＯＳを発現する髄膜炎菌株であって、加えて１又は２以上のｌｐｘＬ１遺伝子若しくはｌｐｘＬ２遺伝子又はそれらの相同体の発現を不活化又は低減する変異を有する髄膜炎菌株を培養するステップと、
（ｂ）前記ナイセリア属菌ＬＯＳを回収するステップと
を含む方法。
【請求項１５】
請求項８〜１１のいずれかに定義されるナイセリア属菌ＬＯＳの製造方法であって、前記方法が、
（ａ）免疫型Ｌ２、Ｌ３、若しくはＬ４のナイセリア属菌ＬＯＳを発現し、且つ活性のｌｇｔＢ遺伝子を欠如する髄膜炎菌株、又は、免疫型Ｌ６のナイセリア属菌ＬＯＳを発現する髄膜炎菌株を培養するステップと、
（ｂ）前記ナイセリア属菌ＬＯＳを回収するステップと、
（ｃ）ヒドラジン、アルカリホスファターゼ、又はアシルオキシ加水分解酵素のうちの少なくとも１つを用いてナイセリア属菌ＬＯＳを処理してリピドＡ部分の毒性を低下させるステップと
を含む方法。
【請求項１６】
ステップ（ｃ）において毒性が、ＷＥＨＩアッセイにおいて決定された、野生型ナイセリア属菌ＬＯＳの毒性の８０％未満まで低下することを特徴とする請求項１５記載の方法。
【請求項１】
哺乳動物の免疫用薬剤の製造におけるナイセリア属菌ＬＯＳの使用であって、前記ナイセリア属菌ＬＯＳが次式（Ｉ）
【化１】
で表され、式中、ＬＡが野生型リピドＡ部分又は毒性が低下したリピドＡ部分であることを特徴とする使用。
【請求項２】
ナイセリア属菌ＬＯＳが、アジュバントとして用いられることを特徴とする請求項１記載の使用。
【請求項３】
哺乳動物における抗原に対する免疫反応を増強させるための薬剤の製造において、ナイセリア属菌ＬＯＳが、抗原と組み合せて用いられることを特徴とする請求項１又は２記載の使用。
【請求項４】
抗原が、細菌、ウイルス、真菌類、寄生虫、ガン細胞、若しくはアレルゲンに由来するか、又はそれらから産生されることを特徴とする請求項３記載の使用。
【請求項５】
ＬＡが、ＷＥＨＩアッセイにおいて決定された、野生型リピドＡ部分の毒性の８０％未満の毒性のリピドＡ部分であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載の使用。
【請求項６】
リピドＡ部分が、
（ａ）ｌｐｘＬ１遺伝子若しくはｌｐｘＬ２遺伝子又はそれらの相同体を低活性化又は不活化する変異を有するナイセリア属菌株から得ることができるリピドＡ部分、
（ｂ）アシルオキシ加水分解酵素を用いた処理により、野生型リピドＡ部分から１又は２以上の二級Ｏ結合型エステル化脂肪酸を除去することにより得ることができるリピドＡ部分、
（ｃ）野生型リピドＡ部分をヒドラジンで処理することにより得ることができるリピドＡ部分、
（ｄ）アルカリホスファターゼを用いて脱リン酸化することにより得ることができるリピドＡ部分、
からなる群から選択されることを特徴とする請求項１〜５のいずれか記載の使用。
【請求項７】
リピドＡ部分が、
（ａ）還元グルコサミンにのみ二級Ｃ１２−アシルを有するリピドＡ部分、
（ｂ）非還元グルコサミンにのみ二級Ｃ１２−アシルを有するリピドＡ部分、
（ｃ）いずれの二級Ｃ１２−アシル基も欠如するリピドＡ部分、
（ｄ）１又は４’位のいずれかで、１又は２以上のリン酸基を欠如するリピドＡ部分、
（ｅ）前記（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）における脱アシル化と前記（ｄ）における脱リン酸化との組合せを有するリピドＡ部分、
からなる群から選択されることを特徴とする請求項１〜６のいずれか記載の使用。
【請求項８】
次式（Ｉ）
【化２】
で表され、式中、ＬＡは毒性が低下したリピドＡ部分であることを特徴とするナイセリア属菌ＬＯＳ。
【請求項９】
リピドＡ部分の毒性が、ＷＥＨＩアッセイにおいて決定された、野生型リピドＡ部分の毒性の８０％未満であることを特徴とする請求項８記載のナイセリア属菌ＬＯＳ。
【請求項１０】
リピドＡ部分が、
（ａ）ｌｐｘＬ１遺伝子若しくはｌｐｘＬ２遺伝子又はそれらの相同体を低活性化又は不活化する変異を有するナイセリア属菌株から得ることができるリピドＡ部分、
（ｂ）アシルオキシ加水分解酵素を用いた処理により、野生型リピドＡ部分から１又は２以上の二級Ｏ結合型エステル化脂肪酸を除去することにより得ることができるリピドＡ部分、
（ｃ）野生型リピドＡ部分をヒドラジンで処理することにより得ることができるリピドＡ部分、
（ｄ）アルカリホスファターゼを用いて脱リン酸化することにより得ることができるリピドＡ部分、
からなる群から選択されることを特徴とする請求項８又は９記載のナイセリア属菌ＬＯＳ。
【請求項１１】
リピドＡ部分が、
（ａ）還元グルコサミンにのみ二級Ｃ１２−アシルを有するリピドＡ部分、
（ｂ）非還元グルコサミンにのみ二級Ｃ１２−アシルを有するリピドＡ部分、
（ｃ）いずれの二級Ｃ１２−アシル基も欠如するリピドＡ部分、
（ｄ）１又は４’位のいずれかで、１又は２以上のリン酸基を欠如するリピドＡ部分、及び
（ｅ）前記（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）における脱アシル化と前記（ｄ）における脱リン酸化との組合せを有するリピドＡ部分、
からなる群から選択されることを特徴とする請求項８〜１０のいずれか記載のナイセリア属菌ＬＯＳ。
【請求項１２】
請求項８〜１１のいずれかに定義されるナイセリア属菌ＬＯＳと薬学的に許容される担体とを含む組成物。
【請求項１３】
細菌、ウイルス、真菌類、寄生虫、ガン細胞、若しくはアレルゲンに由来するか、又はそれらに産生される抗原をさらに含むことを特徴とする請求項１２記載の組成物。
【請求項１４】
請求項８〜１１のいずれかに定義されるナイセリア属菌ＬＯＳの製造方法であって、前記方法が、
（ａ）免疫型Ｌ２、Ｌ３、若しくはＬ４の免疫型のナイセリア属菌ＬＯＳを発現し、且つ活性のｌｇｔＢ遺伝子を欠如する髄膜炎菌株、又は免疫型Ｌ６のナイセリア属菌ＬＯＳを発現する髄膜炎菌株であって、加えて１又は２以上のｌｐｘＬ１遺伝子若しくはｌｐｘＬ２遺伝子又はそれらの相同体の発現を不活化又は低減する変異を有する髄膜炎菌株を培養するステップと、
（ｂ）前記ナイセリア属菌ＬＯＳを回収するステップと
を含む方法。
【請求項１５】
請求項８〜１１のいずれかに定義されるナイセリア属菌ＬＯＳの製造方法であって、前記方法が、
（ａ）免疫型Ｌ２、Ｌ３、若しくはＬ４のナイセリア属菌ＬＯＳを発現し、且つ活性のｌｇｔＢ遺伝子を欠如する髄膜炎菌株、又は、免疫型Ｌ６のナイセリア属菌ＬＯＳを発現する髄膜炎菌株を培養するステップと、
（ｂ）前記ナイセリア属菌ＬＯＳを回収するステップと、
（ｃ）ヒドラジン、アルカリホスファターゼ、又はアシルオキシ加水分解酵素のうちの少なくとも１つを用いてナイセリア属菌ＬＯＳを処理してリピドＡ部分の毒性を低下させるステップと
を含む方法。
【請求項１６】
ステップ（ｃ）において毒性が、ＷＥＨＩアッセイにおいて決定された、野生型ナイセリア属菌ＬＯＳの毒性の８０％未満まで低下することを特徴とする請求項１５記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公表番号】特表２００７−５３７２４８（Ｐ２００７−５３７２４８Ａ）
【公表日】平成１９年１２月２０日（２００７．１２．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５１３０８７（Ｐ２００７−５１３０８７）
【出願日】平成１７年５月１１日（２００５．５．１１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＮＬ２００５／０００３５８
【国際公開番号】ＷＯ２００５／１０７７９８
【国際公開日】平成１７年１１月１７日（２００５．１１．１７）
【出願人】（５０６２１９５９１）
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年１２月２０日（２００７．１２．２０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年５月１１日（２００５．５．１１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＮＬ２００５／０００３５８
【国際公開番号】ＷＯ２００５／１０７７９８
【国際公開日】平成１７年１１月１７日（２００５．１１．１７）
【出願人】（５０６２１９５９１）
【Ｆターム（参考）】
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