アジュバントを含むスプリットインフルエンザワクチンにおけるＴＨ１／ＴＨ２バランスの変化
本発明は、過剰なＴｈ２応答を引き起こし得るスプリットワクチン中の成分を回避することを模索する。したがって、本発明は、スプリットインフルエンザウイルス抗原とＴｈ１アジュバントとを含む免疫原性組成物を提供し、その抗原は、好ましくは、細胞培養物において増殖されたウイルスから調製される（例えば、卵タンパク質を含まない）。本発明はまた、（ｉ）細胞培養物において増殖されたウイルスから調製されたスプリットインフルエンザウイルス抗原；と（ｉｉ）完全にアルミニウム塩から構成されないアジュバント；とを合わせる工程を包含する、免疫原性組成物を調製するための方法を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書中に引用される全ての文書は、その全体が参考として援用される。
【０００２】
（技術分野）
本発明は、インフルエンザウイルス感染を防御するためのワクチン、そして特に、スプリットワクチン（ｓｐｌｉｔ ｖａｃｃｉｎｅ）の分野にある。
【背景技術】
【０００３】
（背景技術）
インフルエンザワクチンは、参考文献１の第１７章および第１８章において記載される。それらのワクチンは、生ウイルス（ｌｉｖｅ ｖｉｒｕｓ）または不活化ウイルスに基づき、そして不活化ワクチンは、全ウイルス（ｗｈｏｌｅ ｖｉｒｕｓ）、「スプリット」ウイルス（「ｓｐｌｉｔ」ｖｉｒｕｓ）または精製された表面抗原（赤血球凝集素およびノイラミニダーゼを含む）に基づき得る。赤血球凝集素（ＨＡ）は、不活化インフルエンザワクチンにおける主要な免疫原であり、そしてワクチン用量は、ＨＡレベルへの参照によって標準化され、そのワクチンは、代表的に、１株あたり約１５μｇのＨＡを含む。
【０００４】
「スプリット」ワクチンは、「Ｔｗｅｅｎ−エーテル」分解（ｓｐｌｉｔｔｉｎｇ）プロセスなどの方法を使用し、ビリオンを洗浄剤により処理して、サブビリオン調製物を産生することによって得られる。スプリットワクチンは、一般に、インフルエンザビリオン由来の複数の抗原を含む。ＢＥＧＲＩＶＡＣＴＭ製品、ＦＬＵＡＲＩＸＴＭ製品、ＦＬＵＺＯＮＥＴＭ製品およびＦＬＵＳＨＩＥＬＤＴＭ製品は、スプリットワクチンである。
【０００５】
カナダにおいて２０００年〜２００１年の時期の間に、新たに同定された眼呼吸器症候群（ｏｃｕｌｏｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）（ＯＲＳ）が、スプリットワクチンを受容した患者において観察された。上記ＯＲＳは、高い割合の分解されていない（ｕｎｓｐｌｉｔ）ビリオンの微小凝集体を有する組成物を与える、製造の間のビリオンの不完全な分解に関連している［非特許文献１］。
【非特許文献１】Ｓｃｈｅｉｆｅｌｅら、Ｃｌｉｎ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ、２００３年、第３６巻、ｐ．８５０〜８５７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
スプリットインフルエンザがＯＲＳを誘発し得る危険性を最小化することが、本発明の目的である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の開示）
スプリットワクチンとＯＲＳとの間の関連の原因説明は存在しないが、ＯＲＳの臨床的特徴および疫学的特徴は、過敏症を示すので、そのワクチンは自然なＴｈ１／Ｔｈ２バランスを撹乱し得、分解されていない微粒子のビリオンはＴｈ２表現型への偏りをもたらすことが、提唱されている。参考文献３において、例えば、スプリットインフルエンザワクチンにおける凝集体の存在は、免疫応答をより大きいＴｈ２サイトカインパターンへと逸脱させることが見出された。しかし、参考文献４において、ＯＲＳとＴｈ１／Ｔｈ２バランスとの間の関連は、確認できなかった。
【０００８】
ＯＲＳおよびＴｈ２の偏りに関連する任意の正しい証拠がないことにかかわらず、本発明は、スプリットワクチンが過剰なＴｈ２応答を引き起こし得る可能性を最小化することを模索する。インフルエンザワクチンが早急に生産されなければならない状況（例えば、流行の発生後）において、製造業者に対する圧力は、うかつにも、２０００年〜２００１年の部分的に分解していない凝集したＣａｎａｄｉａｎバッチと同じ懸案事項にみまわれるワクチンの放出をもたらし得る。実際に、非特許文献２は、「分解していないビリオンおよび凝集体を必ずしも排除することができない可能性がある」こと、および「眼および呼吸器の症状を誘発するいくつかの低いレベルの危険性を、避けられない可能性がある」ことを報告する。
【０００９】
したがって、本発明は、過剰なＴｈ２応答を引き起こし得るスプリットワクチン中の成分を回避することを模索する。Ｔｈ２応答は、必ずしも完全に回避されない。なぜならば、それらは、防御に重要であり得るが、強力なＴｈ２偏向に重要ではない可能性があるからである。不完全な分解が製造の間にうかつにも生じる場合、またはスプリットワクチンが保存の間に凝集を受ける場合、Ｔｈ２偏向に関連する任意の有害効果（例えば、ＯＲＳ）が、回避され得る。
【００１０】
Ｔｈ２偏向を回避するために、２つのアプローチが、好ましくは組み合わせて行われる。最初に、スプリットワクチンがアジュバントを含む場合、そのアジュバントは、少なくとも部分的なＴｈ１型応答を刺激するために選択される（例えば、スプリットインフルエンザワクチンへの専らアルミニウム塩を用いたアジュバント添加（ａｄｊｕｖａｎｔｉｎｇ）を回避することが、好ましい）。第２に、アレルゲンの存在が、スプリットワクチンにおいて回避される。インフルエンザワクチンは時期毎の投与において特有であるので、複数回用量を受容する患者は、存在する任意の不純物に対して感作され、そしてアレルゲンは、感作された患者においてＴｈ２応答を引き起こすことが報告されている［５］。アレルゲンを回避するために、インフルエンザウイルスを増殖させるための現在の卵ベースの方法は、細胞培養物を使用する方法に置換され、それによって混入する卵アレルゲン（例えば、オボアルブミンおよびオボムコイド）の存在を回避する。
【００１１】
したがって、本発明は、スプリットインフルエンザウイルス抗原とアジュバントとを含む免疫原性組成物を提供し、（ａ）その抗原は、細胞培養物において増殖されたウイルスから調製され、そして（ｂ）そのアジュバントは、完全にアルミニウム塩から構成されない。
【００１２】
本発明はまた、（ｉ）細胞培養物において増殖されたウイルスから調製されたスプリットインフルエンザウイルス抗原；と（ｉｉ）完全にアルミニウム塩から構成されないアジュバント；とを合わせる工程を包含する、免疫原性組成物を調製するための方法を提供する。
【００１３】
本発明はまた、（ｉ）細胞培養物において増殖されたウイルスから調製されたスプリットインフルエンザウイルス抗原を含む第１のキット成分；と（ｉｉ）完全にアルミニウム塩から構成されないアジュバントを含む第２のキット成分とを備えるキットを提供する。
【００１４】
さらに、本発明は、スプリットインフルエンザウイルス抗原とアジュバントとを含む免疫原性組成物を提供し、（ａ）その組成物は、卵タンパク質を全く含まず、そして（ｂ）そのアジュバントは、完全にアルミニウム塩から構成されない。
【００１５】
本発明はまた、（ｉ）卵タンパク質を全く含まない組成物；と（ｉｉ）完全にアルミニウム塩から構成されないアジュバント；とを合わせる工程を包含する、免疫原性組成物を調製するための方法を提供する。
【００１６】
本発明はまた、（ｉ）スプリットインフルエンザウイルス抗原を含むが、卵タンパク質を全く含まない第１のキット成分；と（ｉｉ）完全にアルミニウム塩から構成されないアジュバントを含む第２のキット成分；とを備えるキットを提供する。
【００１７】
さらに、本発明は、スプリットインフルエンザウイルス抗原とＴｈ１アジュバントとを含む免疫原性組成物を提供し、その抗原は、細胞培養物において増殖されたウイルスから調製される。
【００１８】
本発明はまた、（ｉ）細胞培養物において増殖されたウイルスから調製されたスプリットインフルエンザウイルス抗原；と（ｉｉ）Ｔｈ１アジュバント；とを合わせる工程を包含する、免疫原性組成物を調製するための方法を提供する。
【００１９】
本発明はまた、（ｉ）細胞培養物において増殖されたウイルスから調製されたスプリットインフルエンザウイルス抗原を含む第１のキット成分；と（ｉｉ）Ｔｈ１アジュバントを含む第２のキット成分；とを備えるキットを提供する。
【００２０】
さらに、本発明は、スプリットインフルエンザウイルス抗原とＴｈ１アジュバントとを含む免疫原性組成物を提供し、その組成物は、卵タンパク質を全く含まない。
【００２１】
本発明はまた、（ｉ）卵タンパク質を全く含まないスプリットインフルエンザ抗原；と（ｉｉ）Ｔｈ１アジュバント；とを合わせる工程を包含する、免疫原性組成物を調製するための方法を提供する。
【００２２】
本発明はまた、（ｉ）スプリットインフルエンザウイルス抗原を含むが、卵タンパク質を全く含まない第１のキット成分；と（ｉｉ）Ｔｈ１アジュバントを含む第２のキット成分；とを備えるキットを提供する。
【００２３】
（スプリットインフルエンザウイルス抗原）
本発明の組成物は、細胞培養物におけるウイルス増殖によって得られるインフルエンザビリオンを分解することによって得られる抗原を含む。上記スプリットビリオン（ｓｐｌｉｔ ｖｉｒｉｏｎ）は、代表的に、上記インフルエンザビリオン由来の複数の抗原を含み、それらとしては、赤血球凝集素、ノイラミニダーゼ、マトリックスおよび核タンパク質が挙げられる。本発明は、生ウイルスワクチン（例えば、ＦＬＵＭＩＳＴＴＭ製品）、全ビリオン不活化ワクチン（例えば、ＩＮＦＬＥＸＡＬＴＭ製品）、精製された表面抗原ワクチン（それは、精製された赤血球凝集素表面糖タンパク質およびノイラミニダーゼ表面糖タンパク質に基づく（例えば、ＦＬＵＶＩＲＩＮＴＭ製品、ＡＧＲＩＰＰＡＬＴＭ製品およびＩＮＦＬＵＶＡＣＴＭ製品））またはビロソームワクチン（ｖｉｒｏｓｏｍａｌ ｖａｃｃｉｎｅ）（それは、ＩＮＦＬＥＸＡＬ ＶＴＭ製品およびＩＮＶＡＶＡＣＴＭ製品のような、核酸を含まないウイルス様リポソーム粒子の形態をとる［６］）を包含しない。
【００２４】
ビリオンは、種々の方法によってウイルス含有流体から回収され得る。例えば、精製プロセスは、ビリオンを破壊するための洗浄剤を含む直線ショ糖勾配溶液を使用したゾーン遠心分離を含み得る。
【００２５】
スプリットビリオンは、ビリオンを洗浄剤（例えば、エチルエーテル、ポリソルベート８０、デオキシコール酸塩、トリ−Ｎ−ブチルホスフェート、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、Ｔｒｉｔｏｎ Ｎ１０１、臭化セチルトリメチルアンモニウム、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ ＮＰ９など）により処理（「Ｔｗｅｅｎ−エーテル」分解プロセスを含む）してサブビリオン調製物を産生することによって得られる。インフルエンザウイルスを分解する方法は、当該分野において周知である（例えば、参考文献７〜１２などを参照のこと）。ウイルスの分解は、代表的に、破壊する濃度の分解剤（ｓｐｌｉｔｔｉｎｇ ａｇｅｎｔ）によって全ウイルスを破壊または断片化する（感染性であっても非感染性であってもよい）ことによって行われる。上記破壊は、ウイルスタンパク質の完全または部分的な可溶化をもたらし、ウイルスの完全性を変化させる。好ましい分解剤は、非イオン性界面活性剤およびイオン性（例えば、カチオン性）界面活性剤（例えば、アルキルグリコシド、アルキルチオグリコシド、アシル糖（ａｃｙｌ ｓｕｇａｒ）、スルホベタイン、ベタイン、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、Ｎ，Ｎ−ジアルキル−グルカミド（Ｇｌｕｃａｍｉｄｅ）、Ｈｅｃａｍｅｇ、アルキルフェノキシ−ポリエトキシエタノール、第四級アンモニウム化合物、サルコシル、ＣＴＡＢ（臭化セチルトリメチルアンモニウム）、トリ−Ｎ−ブチルホスフェート、Ｃｅｔａｖｌｏｎ、ミリスチルトリメチルアンモニウム塩、リポフェクチン（ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ）、リポフェクタミン（ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）、およびＤＯＴ−ＭＡ、オクチル−またはノニルフェノキシポリオキシエタノール（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００またはＴｒｉｔｏｎ Ｎ１０１などのＴｒｉｔｏｎ界面活性剤）、ポリオキシエチレンソルビタンエステル（Ｔｗｅｅｎ界面活性剤）、ポリオキシエチレンエーテル、ポリオキシエチレンエステルなどである。１つの有用な分解手順は、デオキシコール酸ナトリウムおよびホルムアルデヒドの継続的な効果を使用し、そして分解は、（例えば、ショ糖密度勾配溶液における）最初のビリオン精製の間に行われ得る。スプリットビリオンは、通常、リン酸ナトリウムによって緩衝化された等張塩化ナトリウム溶液に再懸濁され得る。
【００２６】
上記インフルエンザウイルスは、弱毒化され得る。上記インフルエンザウイルスは、温度感受性であり得る。上記インフルエンザウイルスは、低温適応性であり得る。
【００２７】
ワクチンに使用するためのインフルエンザウイルス株は、季節により変化する。最近の大流行間期において、２種のインフルエンザＡ型株（Ｈ１Ｎ１およびＨ３Ｎ２）および１種のインフルエンザＢ型株を含む三価ワクチンが、代表的である。本発明は、この型の大流行間期株（ｉｎｔｅｒ−ｐａｎｄｅｍｉｃ ｓｔｒａｉｎ）と一緒に使用され得るが、本発明はまた、（特に、インフルエンザＡ型ウイルスの）Ｈ２サブタイプ株、Ｈ５サブタイプ株、Ｈ７サブタイプ株またはＨ９サブタイプ株などの流行株（すなわちワクチンのレシピエントおよび一般的なヒト集団が免疫学的にナイーブである株）由来のウイルスと一緒に使用され得、そして流行株に対するインフルエンザワクチンは、一価であっても、例えば、流行株によって補充された通常の三価ワクチンに基づいてもよい。しかし、季節および上記ワクチンに含まれる抗原の性質に依存して、本発明は、インフルエンザＡ型ウイルスのＨＡサブタイプであるＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５またはＨ１６の１種以上を防御し得る。本発明は、インフルエンザＡ型ウイルスのＮＡサブタイプであるＮ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７、Ｎ８またはＮ９の１種以上を防御し得る。
【００２８】
大流行間期の株に対して免疫感作するために適切であることと同様に、本発明の組成物は、流行株に対して免疫感作するために特に有用である。流行の発生を引き起こす可能性をインフルエンザ株に与えるインフルエンザ株の特性は、以下である：（ａ）そのインフルエンザ株が、最近広まっているヒト株におけるＨＡと比較して新規のＨＡ（すなわち、１０年以上にわたってヒト集団において顕性でないＨＡ（例えばＨ２））を含むか、またはヒト集団において先に全く見出されていない（例えば、一般には鳥類集団においてのみ見出されているＨ５、Ｈ６またはＨ９）ことにより、ヒト集団がその株のＨＡに対して免疫学的にナイーブであること；（ｂ）そのインフルエンザ株が、ヒト集団において水平伝播し得ること；および（ｃ）そのインフルエンザ株が、ヒトに対して病原性であること。Ｈ５型赤血球凝集素を有するウイルスは、流行性インフルエンザ（例えば、Ｈ５Ｎ１株）に対する免疫感作のために好ましい。他の可能性のある株としては、Ｈ５Ｎ３、Ｈ９Ｎ２、Ｈ２Ｎ２、Ｈ７Ｎ１およびＨ７Ｎ７、および任意の他の顕在する潜在的な流行株が挙げられる。Ｈ５サブタイプにおいて、ウイルスは、ＨＡクレード１、ＨＡクレード１’、ＨＡクレード２またはＨＡクレード３に分類され得［１３］、クレード１およびクレード３は、特に、関連性がある。
【００２９】
本発明によって使用されるインフルエンザウイルス株は、抗ウイルス療法に対して抵抗性（例えば、オセルタミビル［１４］および／またはザナミビルに対して抵抗性）であり得、その株は、抵抗性の流行株を含む［１５］。
【００３０】
本発明の組成物は、インフルエンザＡ型ウイルスおよび／またはインフルエンザＢ型ウイルスを含む１種以上（例えば１種、２種、３種、４種またはそれ以上）のインフルエンザウイルス株由来の抗原を含み得る。ワクチンが、１種より多い株のインフルエンザを含む場合、それらの異なる株は、代表的に、別個に増殖され、かつそれらのウイルスが回収および分解された後に混合される。したがって、本発明の方法は、１種より多いインフルエンザ株由来の抗原を混合する工程を含み得る。２種のインフルエンザＡ型ウイルス株および１種のインフルエンザＢ型ウイルス株由来の抗原を含む三価ワクチンが、好ましい。
【００３１】
本発明のいくつかの実施形態において、上記組成物は、単一のインフルエンザＡ型株由来の抗原を含み得る。いくつかの実施形態において、上記組成物は、２種のインフルエンザＡ型株由来の抗原を含み得るが、但し、これらの２種の株は、Ｈ１Ｎ１およびＨ３Ｎ２ではない。いくつかの実施形態において、上記組成物は、２種より多いインフルエンザＡ型株由来の抗原を含み得る。
【００３２】
上記インフルエンザウイルスは、リアソータント（ｒｅａｓｓｏｒｔａｎｔ）株であり得、そして逆方向遺伝学技術によって得ることができた。逆方向遺伝学技術［例えば、１６〜２０］は、プラスミドを使用してインビトロで調製される所望のゲノムセグメントを有するインフルエンザウイルスを可能にする。代表的に、それは、（ａ）例えば、ｐｏｌＩプロモーターにより、所望のウイルスＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ分子を発現すること、および（ｂ）例えば、ｐｏｌＩＩプロモーターにより、ウイルスタンパク質をコードするＤＮＡ分子を発現することを含むことで、細胞における両方の型のＤＮＡの発現が、完全なインタクト感染性ビリオンの構築を生じる。上記ＤＮＡは、好ましくは、全ての上記ウイルスＲＮＡおよびウイルスタンパク質の全てを提供するが、そのＲＮＡおよびタンパク質のいくつかを提供するためにヘルパーウイルスを使用することもまた、可能である。各ウイルスＲＮＡを産生するために別個のプラスミドを使用するプラスミドベースの方法が、好ましく［２１〜２３］、そしてこれらの方法はまた、上記ウイルスタンパク質の全てまたはいくつか（例えば、ＰＢ１タンパク質、ＰＢ２タンパク質、ＰＡタンパク質およびＮＰタンパク質だけ）を発現するためのプラスミドの使用を包含し、１２種のプラスミドが、いくつかの方法において使用される。
【００３３】
必要とされるプラスミドの数を減少させるために、最近のアプローチ［２４］は、（ウイルスＲＮＡ合成のための）同じプラスミド上の複数のＲＮＡポリメラーゼＩ転写カセット（例えば、１種、２種、３種、４種、５種、６種、７種または８種全てのインフルエンザＡ型ｖＲＮＡセグメントをコードする配列）と、別のプラスミド上のＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターを有する複数のタンパク質コード領域（例えば、１種、２種、３種、４種、５種、６種、７種または８種全てのインフルエンザＡ型ｍＲＮＡ転写物をコードする配列）を合わせる。参考文献２４の方法の好ましい局面は、以下を含む：（ａ）単一プラスミド上のＰＢ１ ｍＲＮＡコード領域、ＰＢ２ ｍＲＮＡコード領域およびＰＡ ｍＲＮＡコード領域；および（ｂ）単一プラスミド上の全８種のｖＲＮＡコードセグメント。１つのプラスミド上にＮＡセグメントおよびＨＡセグメントを含み、そして別のプラスミド上に６種の他のセグメントを含むこともまた、問題を容易にし得る。
【００３４】
上記ウイルスＲＮＡセグメントをコードするためにｐｏｌＩプロモーターを使用する代わりに、バクテリオファージポリメラーゼプロモーターを使用することが、可能である［２５］。例えば、ＳＰ６ポリメラーゼ、Ｔ３ポリメラーゼまたはＴ７ポリメラーゼのためのプロモーターが、慣用的に使用され得る。ｐｏｌＩプロモーターの種特異性に起因して、バクテリオファージポリメラーゼプロモーターは、多くの細胞型（例えばＭＤＣＫ）に関してより慣用的であり得るが、細胞はまた、外因性ポリメラーゼ酵素をコードするプラスミドによってトランスフェクトされる必要がある。
【００３５】
他の技術において、単一の鋳型に由来して上記ウイルスＲＮＡおよび発現可能なｍＲＮＡを同時にコードするために二重のｐｏｌＩプロモーターおよびｐｏｌＩＩプロモーターを使用することが、可能である［２６、２７］。
【００３６】
したがって、インフルエンザＡ型ウイルスは、特に、ウイルスが卵において増殖される場合、Ａ／ＰＲ／８／３４ウイルス由来の１種以上のＲＮＡセグメント（代表的に、６セグメントは、Ａ／ＰＲ／８／３４に由来し、上記ＨＡセグメントおよびＮセグメントは、ワクチン株に由来する、すなわち、６：２リアソータント）を含み得る。それはまた、ワクチン調製物のためのリアソータントウイルスを産生するために、Ａ／ＷＳＮ／３３ウイルス由来の１種以上のＲＮＡセグメント、または有用な任意の他のウイルス株の１種以上のＲＮＡセグメントを含み得る。代表的に、上記株のゲノムは、通常、哺乳動物（例えば、ヒト）インフルエンザウイルスに由来する少なくとも１種のＲＮＡセグメントを含むので、本発明は、ヒト同士の伝染が可能である株から防御する。それは、鳥インフルエンザウイルスに由来するＮＳセグメントを含み得る。
【００３７】
上記抗原の供給源として使用されるウイルスは、細胞培養物において増殖される。ウイルス増殖培養基は、代表的に、哺乳動物起源の細胞株である。適切な哺乳動物細胞の起源としては、ハムスター細胞、ウシ細胞、霊長類細胞（ヒト細胞およびサル細胞を含む）およびイヌ細胞が挙げられるが、これらに限定されない。腎細胞、線維芽細胞、網膜細胞、肺細胞などのような種々の細胞型が、使用され得る。適切なハムスター細胞の例は、ＢＨＫ２１またはＨＫＣＣの名前を有する細胞株である。適切なサル細胞は、例えば、アフリカミドリザル細胞（例えば、Ｖｅｒｏ細胞株のような腎細胞）である。適切なイヌ細胞は、例えば、ＭＤＣＫ細胞株のような腎細胞株である。したがって、適切な細胞株としては、ＭＤＣＫ；ＣＨＯ；２９３Ｔ；ＢＨＫ；Ｖｅｒｏ；ＭＲＣ−５；ＰＥＲ．Ｃ６；ＷＩ−３８；などが挙げられるが、これらに限定されない。インフルエンザウイルスを増殖させるために好ましい哺乳動物細胞株としては、以下が挙げられる：Ｍａｄｉｎ Ｄａｒｂｙイヌ腎臓に由来するＭＤＣＫ細胞［２８〜３１］；アフリカミドリザル（Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓ ａｅｔｈｉｏｐｓ）腎臓に由来するＶｅｒｏ細胞［３２〜３４］；またはヒト胚性網膜芽細胞に由来するＰＥＲ．Ｃ６細胞［３５］。これらの細胞株は、例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（ＡＴＣＣ）コレクション［３６］、Ｃｏｒｉｅｌｌ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｉｅｓ［３７］、またはＥｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）から広範に入手可能である。例えば、ＡＴＣＣは、カタログ番号ＣＣＬ−８１、ＣＣＬ−８１．２、ＣＲＬ−１５８６およびＣＲＬ−１５８７の種々の異なるＶｅｒｏ細胞を提供し、そしてＡＴＣＣは、カタログ番号ＣＣＬ−３４のＭＤＣＫ細胞を提供する。ＰＥＲ．Ｃ６は、寄託番号９６０２２９４０においてＥＣＡＣＣから入手可能である。あまり好ましくない哺乳動物細胞株の代替物として、ウイルスは、アヒル（例えば、アヒル網膜）または雌鶏（例えば、ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ））などに由来する細胞株を含む鳥類細胞株［例えば、参考文献３８〜４０］において増殖され得る。例としては、ニワトリ胚性幹細胞、ＥＢ４５、ＥＢ１４、およびＥＢ１４−０７４に由来するＥＢｘ細胞株［４２］を含む鳥類胚性幹細胞［３８、４１］が挙げられる。
【００３８】
インフルエンザウイルスを増殖させるために最も好ましい細胞株は、ＭＤＣＫ細胞株である。元のＭＤＣＫ細胞株は、ＣＣＬ−３４としてＡＴＣＣから入手可能であるが、この細胞株の派生物もまた、使用され得る。例えば、参考文献２８は、懸濁培養物における増殖に適合したＭＤＣＫ細胞株（ＤＳＭ ＡＣＣ ２２１９として寄託された「ＭＤＣＫ ３３０１６」）を開示する。同様に、参考文献４３は、無血清培養の懸濁物において増殖するＭＤＣＫ由来細胞株（ＦＥＲＭ ＢＰ−７４４９として寄託された「Ｂ−７０２」）を開示する。参考文献４４は、非腫瘍形成性ＭＤＣＫ細胞（「ＭＤＣＫ−Ｓ」（ＡＴＣＣ ＰＴＡ−６５００）、「ＭＤＣＫ−ＳＦ１０１」（ＡＴＣＣ ＰＴＡ−６５０１）、「ＭＤＣＫ−ＳＦ１０２」（ＡＴＣＣ ＰＴＡ−６５０２）および「ＭＤＣＫ−ＳＦ１０３」（ＰＴＡ−６５０３）を含む）を開示する。参考文献４５は、感染に対して高い感受性を有するＭＤＣＫ細胞株（「ＭＤＣＫ．５Ｆ１」細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１２０４２）を含む）を開示する。任意のこれらのＭＤＣＫ細胞株が、使用され得る。
【００３９】
ウイルスは、懸濁物における細胞［２８、４６、４７］または付着培養（ａｄｈｅｒｅｎｔ ｃｕｌｔｕｒｅ）中の細胞において増殖され得る。懸濁培養のための１つの適切なＭＤＣＫ細胞株は、ＭＤＣＫ ３３０１６（ＤＳＭ ＡＣＣ ２２１９として寄託された）である。
【００４０】
インフルエンザウイルス複製を補助する細胞株は、好ましくは、無血清培地および／またはタンパク質を含まない培地において増殖される。培地は、ヒト起源または動物起源の血清に由来する添加物が存在しない本発明の文脈において、無血清培地と称される。タンパク質を含まないことは、上記細胞の増殖がタンパク質、成長因子、他のタンパク質添加物および非血清タンパク質を排除して生じる培養を意味すると理解されるが、ウイルス増殖に必要であり得るトリプシンまたは他のプロテアーゼなどのタンパク質を必要に応じて含み得る。そのような培養物において増殖する細胞は、細胞自体のタンパク質をもちろん含む。
【００４１】
増殖に使用される細胞培養物、およびまた、培養を開始するために使用されるウイルス接種物は、好ましくは、単純ヘルペスウイルス、ＲＳウイルス、パラインフルエンザウイルス３型、ＳＡＲＳコロナウイルス、アデノウイルス、ライノウイルス、レオウイルス、ポリオーマウイルス、ビルナウイルス、サーコウイルス、および／またはパルボウイルスを含まない［４８］（すなわち、それらの培養物および接種物は、これらのウイルスについて試験され、そしてこれらのウイルスによる汚染についてネガティブな結果を得る）。単純ヘルペスウイルスが無いことは、特に好ましい。
【００４２】
インフルエンザウイルス複製を補助する細胞株は、好ましくは、ウイルス複製の間に、３７℃未満（例えば、３０〜３６℃）にて、増殖のために培養される［４９］。
【００４３】
本発明のワクチンは、好ましくは、１用量あたり１０ｎｇ未満（好ましくは、１ｎｇ未満、およびより好ましくは、１００ｐｇ未満）の残留宿主細胞ＤＮＡを含むが、微量の宿主細胞ＤＮＡが、存在し得る。一般に、上記宿主細胞ＤＮＡ（それは、本発明の組成物から取り除くことが望ましい）は、１００ｂｐよりも長いＤＮＡである。
【００４４】
残留宿主細胞ＤＮＡの測定は、現在、生物製剤についての慣用的な管理要件（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ）であり、そして当業者の通常の能力の範囲内である。ＤＮＡを測定するために使用されるアッセイは、代表的に、確認されたアッセイである［５０、５１］。確認されたアッセイの性能の特徴は、数学的項目および定量可能な項目において記載され得、そしてその考えられる誤差の供給源は、同定されている。上記アッセイは、一般に、正確度、精度、特異性などの特徴について試験された。一旦アッセイが、（例えば、宿主細胞ＤＮＡの既知の標準量に対して）較正され、そして試験された場合、定量的ＤＮＡ測定は、慣用的に行われ得る。ＤＮＡ定量についての以下の３つの主要な技術が、使用され得る：サザンブロットまたはスロットブロットなどのハイブリダイゼーション法［５２］；ＴｈｒｅｓｈｏｌｄＴＭ Ｓｙｓｔｅｍなどのイムノアッセイ法［５３］；および定量的ＰＣＲ［５４］。これらの方法は全て、当業者によく知られているが、各方法の正確な特徴は、目的とする宿主細胞に依存し得る（例えば、ハイブリダイゼーションのためのプローブの選択、増幅のためのプライマーおよび／またはプローブの選択など）。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ製のＴｈｒｅｓｈｏｌｄＴＭシステムは、ピコグラムレベルの全ＤＮＡについての定量的アッセイであり、そして生物製剤中の混入したＤＮＡのレベルをモニタリングするために使用されている［５３］。代表的なアッセイは、ビオチン化ｓｓＤＮＡ結合タンパク質と、ウレアーゼ結合体化抗ｓｓＤＮＡ抗体と、ＤＮＡとの間における反応複合体の配列非特異的形成を包含する。全てのアッセイ成分は、上記製造業者から入手可能である完全なＴｏｔａｌ ＤＮＡ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔに含まれる。種々の商業的な製造業者は、残留宿主細胞ＤＮＡを検出するための定量的ＰＣＲアッセイを提供する（例えば、ＡｐｐＴｅｃＴＭ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＢｉｏＲｅｌｉａｎｃｅＴＭ、Ａｌｔｈｅａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓなど）。ヒトウイルスワクチンの宿主細胞ＤＮＡの混入を測定することについての化学発光ハイブリダイゼーションアッセイと全ＤＮＡ ＴｈｒｅｓｈｏｌｄＴＭシステムとの比較は、参考文献５５に見出され得る。
【００４５】
混入したＤＮＡは、標準的な精製手順（例えば、クロマトグラフィーなど）を使用して、ワクチン調製の間に除去され得る。残留宿主細胞ＤＮＡの除去は、例えば、ＤＮａｓｅを使用することによるヌクレアーゼ処理によって増強され得る。宿主細胞ＤＮＡの混入を減少させるために好都合な方法は、参考文献５６および５７に開示され、その方法は、最初に、ウイルス増殖の間に使用され得るＤＮａｓｅ（例えば、ベンゾナーゼ（Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ））を使用し、次いで、ビリオンの破壊の間に使用され得るカチオン性洗浄剤（例えばＣＴＡＢ）を使用する、２工程の処理を含む。アルキル化剤（例えば、β−プロピオラクトン）による処理がまた、宿主細胞ＤＮＡを除去するために使用され得、そしてまた、有益に、ビリオンを不活化するために使用され得る［５８］。
【００４６】
０．２５ｍｌ容量あたり＜１０ｎｇ（例えば＜１ｎｇ、＜１００ｐｇ）の宿主細胞ＤＮＡを含むワクチンであるような、１５μｇの赤血球凝集素あたり＜１０ｎｇ（例えば、＜１ｎｇ、＜１００ｐｇ）の宿主細胞ＤＮＡを含むワクチンが、好ましい。０．５ｍｌ容量あたり＜１０ｎｇ（例えば、＜１ｎｇ、＜１００ｐｇ）の宿主細胞ＤＮＡを含むワクチンであるような、５０μｇの赤血球凝集素あたり＜１０ｎｇ（例えば、＜１ｎｇ、＜１００ｐｇ）の宿主細胞ＤＮＡを含むワクチンが、より好ましい。
【００４７】
培養された細胞においてウイルスを増殖させるための方法は、一般に、その培養された細胞に培養されるべき株を接種する工程、ウイルス増殖（例えば、ウイルス力価または抗原発現によって決定される）のために所望の期間（例えば、接種の２４時間後と１６８時間後との間）にわたって、感染された細胞を培養する工程、および増殖されたウイルスを回収する工程を包含する。上記培養された細胞は、１：５００〜１：１、好ましくは、１：１００〜１：５、より好ましくは、１：５０〜１：１０の細胞比まで、ウイルス（ＰＦＵまたはＴＣＩＤ５０によって測定される）を接種される。上記ウイルスは、上記細胞の懸濁物に添加されるか、または上記細胞の単一層に適用され、そしてそのウイルスは、２５℃〜４０℃（好ましくは、２８℃〜３７℃）にて、少なくとも６０分間（しかし通常は、３００分未満（好ましくは、９０分間と２４０分間との間））にわたってその細胞上に吸着される。上記感染された細胞の培養物（例えば、単一層）は、回収される培養上清のウイルス含量を増大させるために、凍結解凍または酵素作用のいずれかによって除去され得る。次いで、上記回収された流体は、凍結されて不活化または保存のいずれかが行われる。培養された細胞は、約０．０００１〜１０、好ましくは、０．００２〜５、より好ましくは、０．００１〜２の感染多重度（「ｍ．ｏ．ｉ．」）にて感染され得る。よりさらに好ましくは、上記細胞は、約０．０１のｍ．ｏ．ｉにて感染される。感染された細胞は、感染後３０時間〜６０時間で回収され得る。好ましくは、上記細胞は、感染後３４時間〜４８時間で回収される。よりさらに好ましくは、上記細胞は、感染後３８時間〜４０時間で回収される。プロテアーゼ（代表的に、トリプシン）は、一般に、ウイルスの放出を可能にするために細胞培養の間に添加され、そしてそのプロテアーゼは、その培養の間の任意の適切な段階において添加され得る。
【００４８】
赤血球凝集素（ＨＡ）は、不活化インフルエンザワクチン（スプリットワクチンを含む）中の主要な免疫原であり、そしてワクチン用量は、代表的に、一次元放射状免疫拡散（ＳＲＩＤ）アッセイによって測定されるようなＨＡレベルを参照することによって標準化される。ワクチンは、代表的に、１株あたり約１５μｇのＨＡを含むが、より低い用量がまた、例えば、小児のためかまたは流行性の状況において使用される。１／２（すなわち、１株あたり７．５μｇのＨＡ）、１／４および１／８のような分割量が、より高い用量（例えば、３×用量または９×用量［５９、６０］）を有する場合に使用されている［６３、６４］。したがって、ワクチンは、１つのインフルエンザ株あたり０．１μｇと１５０μｇとの間のＨＡ、好ましくは、０．１μｇと５０μｇとの間（例えば、０．１μｇ〜２０μｇ、０．１μｇ〜１５μｇ、０．１μｇ〜１０μｇ、０．１μｇ〜７．５μｇ、０．５μｇ〜５μｇなど）のＨＡを含み得る。特定の用量は、例えば、１株あたり約４５、約３０、約１５、約１０、約７．５、約５、約３．８、約１．９、約１．５などを含む。上記ワクチン中にアジュバントを含むことは、これらのより低い用量におけるより低い固有の免疫原性を補い得る。
【００４９】
本発明で使用されるＨＡは、ウイルスにおいて見出されるような天然のＨＡであっても、改変されていてもよい。例えば、ウイルスを鳥類種において非常に病原性にする決定因子（例えば、ＨＡ１とＨＡ２との切断部位周辺の超塩基性領域（ｈｙｐｅｒ−ｂａｓｉｃ ｒｅｇｉｏｎ））を除去するためにＨＡを改変することが、公知である。
【００５０】
本発明の組成物は、特に、スプリットワクチンまたは表面抗原ワクチンのために、洗浄剤（例えば、ポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（「Ｔｗｅｅｎｓ」として公知である）、オクトキシノール（例えば、オクトキシノール−９（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）またはｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール）、臭化セチルトリメチルアンモニウム（「ＣＴＡＢ」）、またはデオキシコール酸ナトリウム）を含み得る。上記洗浄剤は、微量でのみ存在し得る。したがって、上記ワクチンは、各々１ｍｇ／ｍｌ未満のオクトキシノール−１０、およびポリソルベート８０を含み得る。残りの他の微量成分は、抗生物質（例えば、ネオマイシン、カナマイシン、ポリミキシンＢ）であり得る。
【００５１】
（アジュバント）
アジュバントとインフルエンザワクチンとの使用は、公知である。例えば、精製された表面抗原に基づくＦＬＵＡＤＴＭ製品は、ＭＦ５９エマルションアジュバントを含む。さらに、参考文献６１〜６４は、単一のインフルエンザワクチン用量に必要とされる抗原の量を減少させる（したがって、増加した量の用量が固定された量の抗原から産生されることを可能にする）ため、全ビリオン（ｗｈｏｌｅ ｖｉｒｉｏｎ）インフルエンザワクチンにアジュバント添加するためのアルミニウム塩の使用を開示する。現在、アジュバント添加（ａｄｊｕｖａｎｔｅｄ）したスプリットインフルエンザワクチンは、市販されていない。
【００５２】
アルミニウム塩（参考文献６１〜６４において使用されるような）が、単独で使用されるときにＴｈ２型免疫応答を促すので、本発明は、この手段でスプリットインフルエンザウイルスにアジュバント添加しない。代わりに、代替的なアジュバントが、使用される（例えば、Ｔｈ１アジュバント）。
【００５３】
Ｔｈ１ Ｔヘルパー細胞とＴｈ２ Ｔヘルパー細胞との間の区別は、周知である。Ｔｈ１アジュバントおよびＴｈ２アジュバントは、同時投与された抗原に対する免疫応答を、それぞれ、Ｔｈ１型応答またはＴｈ２型応答に偏らせる。したがって、Ｔｈ１アジュバントが、ＩＬ−２およびインターフェロン−γ（ＩｇＧ２ａ抗体を引き出す）などのサイトカインならびにＴＮＦ−αを放出する抗原特異的Ｔ細胞の産生をもたらすのに対して、Ｔｈ２アジュバントは、ＩＬ−４（ＩｇＧ１を引き出す）およびＩＬ−５などのサイトカインを放出する抗原特異的Ｔ細胞の産生をもたらす。特定のアジュバントのＴｈ１／Ｔｈ２バランスは、公知のアッセイ（以下参照）によって評価され得るが、送達経路または同時投与された物質の存在などの因子に依存して変動し得る。本発明によって使用されるアジュバントは、患者に送達される場合に、インフルエンザ抗原に対して専らＴｈ１型応答を誘発し得るが、好ましくは、混合型のＴｈ１／Ｔｈ２型応答を誘発する。Ｔｈ０細胞もまた、誘発され得るが、偏向したＴｈ２応答は、回避される。
【００５４】
専らアルミニウム塩を使用した先行技術と比較して、本発明に使用するのに適した代替的なアジュバントは、アルミニウム塩を完全に回避し得るか、またはそれは、アルミニウム塩と、全体的なアジュバント効果をＴｈ１型応答に移行させる第２のアジュバント成分との混合物に基づき得る。例えば、ＩＬ−１２［６５］または免疫刺激性オリゴヌクレオチド［６６］とアルミニウム塩との同時投与は、免疫応答をＴｈ１へと再度指向させ得る。
【００５５】
Ｔｈ１型応答は、当然に、細菌感染に関連し、それ故、本発明に使用されるアジュバントは、一般に、細菌物質を模倣する物質を含む。Ｔｈ１アジュバントは、Ｔｏｌｌ様レセプター（ＴＬＲ）のモジュレーターおよび／またはアゴニストであり得る。例えば、それらは、ヒトＴＬＲ１タンパク質、ヒトＴＬＲ２タンパク質、ヒトＴＬＲ３タンパク質、ヒトＴＬＲ４タンパク質、ヒトＴＬＲ７タンパク質、ヒトＴＬＲ８タンパク質、および／またはヒトＴＬＲ９タンパク質のうちの１つ以上のアゴニストであり得る。好ましい薬剤は、ＴＬＲ７のアゴニスト（例えば、イミダゾキノリン）および／またはＴＬＲ９のアゴニスト（例えば、ＣｐＧオリゴヌクレオチド）である。これらの薬剤は、先天免疫経路を活性化するために有用である。
【００５６】
完全にアルミニウム塩から構成されない特定の「Ｔｈ１アジュバント」としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：
−免疫刺激性オリゴヌクレオチド（例えば、ＣｐＧモチーフ（リン酸結合によってグアノシンに結合された非メチル化シトシンを含むジヌクレオチド配列）または二本鎖ＲＮＡを含むもの、あるいはパリンドローム配列を含むオリゴヌクレオチド、あるいはポリ（ｄＧ）配列を含むオリゴヌクレオチド）。これらのオリゴヌクレオチドアジュバントは、Ｔｈ１型応答を誘発するために非常に有用である［６７］。
−３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡ（「ＭＰＬＴＭ」としても公知である「３ｄＭＰＬ」）［６８〜７１］。３ｄＭＰＬは、Ｔｈ１型応答を促す［７２］。
−広範な植物種の樹皮、葉、茎、根および花においてさえも見出されるステロールグリコシドおよびトリテルペノイドグリコシドの異種群であるサポニン［参考文献１０８の第２２章］。Ｑｕｉｌｌａｉａ ｓａｐｏｎａｒｉａ Ｍｏｌｉｎａ ｔｒｅｅの樹皮由来のサポニンは、アジュバントとして広範に研究されている。サポニンはまた、Ｓｍｉｌａｘ ｏｒｎａｔａ（サルサパリラ）、Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌｌａ ｐａｎｉｃｕｌａｔａ（ブライダルベール）、およびＳａｐｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉａｎａｌｉｓ（サボンソウ根（ｓｏａｐ ｒｏｏｔ））から商業的に得られ得る。サポニンアジュバント処方物としては、精製された処方物（例えば、ＱＳ２１）、および脂質処方物（例えば、ＩＳＣＯＭ）が挙げられる。ＱＳ２１は、ＳｔｉｍｕｌｏｎＴＭとして市販されている。サポニン組成物は、ＨＰＬＣおよびＲＰ−ＨＰＬＣを使用して精製されている。これらの技術を使用した特定の精製された分画が、同定されており、それとしては、ＱＳ７、ＱＳ１７、ＱＳ１８、ＱＳ２１、ＱＨ−Ａ、ＱＨ−ＢおよびＱＨ−Ｃが挙げられる。好ましくは、上記サポニンは、ＱＳ２１である。ＱＳ２１の産生の方法は、参考文献７３に開示される。サポニン処方物はまた、ステロール（例えば、コレステロール）を含み得る［７４］。サポニンとコレステロールとの組み合わせは、免疫刺激性複合体（ＩＳＣＯＭ）と称される固有の粒子を形成するために使用され得る［参考文献１０８の第２３章］。ＩＳＣＯＭはまた、代表的に、リン脂質（例えば、ホスファチジルエタノールアミンまたはホスファチジルコリン）を含む。任意の公知のサポニンは、ＩＳＣＯＭにおいて使用され得る。好ましくは、ＩＳＣＯＭは、ＱｕｉｌＡ、ＱＨＡおよびＱＨＣのうちの１つ以上を含む。ＩＳＣＯＭは、参考文献７４〜７６にさらに記載される。必要に応じて、ＩＳＣＯＭＳは、さらなる洗浄剤を欠き得る［７７］。サポニンベースのアジュバントの開発の概説は、参考文献７８および７９において見出され得る。ＩＳＣＯＭおよび遊離ＱＳ２１は両方とも、Ｔｈ１応答をアップレギュレートすることが報告されている。
−細菌ＡＤＰリボシル化毒素（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ熱不安定性エンテロトキシン「ＬＴ」、コレラ毒素「ＣＴ」、または百日咳毒素「ＰＴ」）およびその無毒化された誘導体（例えば、ＬＴ−Ｋ６３として公知である変異体毒素［８０］）。無毒化されたＡＤＰリボシル化毒素の粘膜アジュバントとしての使用は、参考文献８１に記載され、そして非経口アジュバントとしての使用は、参考文献８２に記載される。いくつかの変異体は、偏向したＴｈ２型応答（例えば、参考文献８３におけるＬＴ−Ｒ７２；しかし、参考文献８４）を誘導することが報告されているが、その他の変異体は、混合型のＴｈ１／Ｔｈ２型応答（例えば、ＬＴ−Ｋ６３）またはＴｈ１型応答（例えば、ＬＴ−Ｇ１９２）を誘導することが報告されている。上記Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスは、選択された経路によってスプリット抗原を用いて与えられる場合、任意の特定の変異体によって達成され、そしてスケジュールは、容易に評価され得る。
−生分解性かつ非毒性である材料（例えば、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリ無水物、ポリカプロラクトンなど（ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコシド）が好ましい））から形成された微粒子（すなわち、約１００ｎｍ〜約１５０μｍの直径（より好ましくは、約２００ｎｍ〜約３０μｍの直径、または約５００ｎｍ〜約１０μｍの直径）の粒子）（負に荷電した表面（例えば、ＳＤＳを用いる）または正に荷電した表面（例えば、カチオン性洗浄剤（例えば、ＣＴＡＢ）を用いる）を有するように必要に応じて処理される）。ＭＦ５９と比較した場合、ＰＬＧ微粒子中への抗原の封入は、Ｔｈ１型応答を促進することが報告されている［８５］。
−リポソーム（参考文献１０８の第１３章および第１４章）。リポソームは、強力なＴｈ１応答を誘発し得る（特に、ミコバクテリア脂質を含むカチオン性リポソーム）［８６］。
−カルシウム塩（例えば、リン酸カルシウム（例えば、参考文献８７に開示される「ＣＡＰ」粒子））。これらの塩への吸着が、好ましい。カルシウム塩は、Ｔｈ１応答を提供することが報告されている［８８］。
−式：
【００５７】
【化１】
【００５８】
を有するもの（Ｒは、水素、直鎖または分枝鎖であり、非置換または置換であり、飽和または不飽和である、アシル基、アルキル基（例えば、シクロアルキル基）、アルケニル基、アルキニル基およびアリール基、あるいはそれらの薬学的に受容可能な塩または誘導体からなる群より選択される）などのポリヒドロキシル化ピロリジン化合物［８９］。例としては、カスアリン（ｃａｓｕａｒｉｎｅ）、カスアリン−６−α−Ｄ−グルコピラノース、３−エピ−カスアリン、７−エピ−カスアリン、３，７−ジエピ−カスアリンなどが挙げられるが、これらに限定されない。これらの化合物は、Ｔｈ１応答を増強する。
−γイヌリン［９０］またはその誘導体（例えば、アルガムリン（ａｌｇａｍｍｕｌｉｎ））。これらのアジュバントは、Ｔｈ１免疫応答およびＴｈ２免疫応答の両方を促進し得る［９１］。
−イミダゾキノリン化合物（例えば、イミキモッド（Ｉｍｉｑｕｉｍｏｄ）（「Ｒ−８３７」）［９２、９３］、レシキモッド（Ｒｅｓｉｑｕｉｍｏｄ）（「Ｒ−８４８」）［９４］、およびそれらのアナログ；ならびにそれらの塩（例えば、塩酸塩）。免疫刺激性イミダゾキノリンについてのさらなる詳細は、参考文献９５〜９９に見出され得る。これらの化合物は、応答をＴｈ１へと移行させる［９７］。
−ロキソリビン（Ｌｏｘｏｒｉｂｉｎｅ）（７−アリル−８−オキソグアノシン）［１００］。
−アミノアルキルグルコサミニドホスフェート誘導体（例えば、ＲＣ−５２９［１０１、１０２］）。これらの誘導体は、Ｔｈ１応答を刺激する［１０３］。
−ビタミンＥ化合物。ビタミンＥは、Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスに関与する遺伝子の発現に対して顕著な影響を有し、そして免疫細胞のビタミンＥ刺激は、増大したＩＬ−２産生（すなわち、Ｔｈ１型応答）を直接的にもたらし得る［１０４］。獣医学的なウイルスワクチンにおけるアジュバントとしてのその使用は、例えば、ニワトリワクチンにおいて公知である［１０５］。
−特定の水中油型エマルション（以下参照）。
−ＴＬＲ４アンタゴニストＥ５５６４［１０６、１０７］：
【００５９】
【化２】
【００６０】
などの、ホスフェート含有非環式骨格に結合された脂質を含む化合物。
【００６１】
これらアジュバント活性物質および他のアジュバント活性物質は、参考文献１０８および１０９においてより詳細に考察される。
【００６２】
組成物は、上記アジュバントの２種以上を含み得る。例えば、サポニンが、Ｔｈ１型応答およびＴｈ２型応答の両方を増強するのに対して、上記サポニンへの３ｄＭＰＬの添加は、Ｔｈ１応答の優勢な誘導を与えることが報告されている［１１０］。さらなる組合せは、以下で考察される。
【００６３】
３つの好ましいアジュバントは、免疫刺激性オリゴヌクレオチド、３ｄＭＰＬ、およびビタミンＥ化合物である。いくつかの水中油型エマルションもまた、好ましいアジュバントである。
【００６４】
（免疫刺激性オリゴヌクレオチド）
免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド改変／アナログ（例えば、ホスホロチオエート改変）を含み得、そして二本鎖であっても（ｄｓＲＮＡを除いて）一本鎖であってもよい。参考文献１１１、１１２および１１３は、可能なアナログ置換（例えば、２’−デオキシ−７−デアザグアノシンによるグアノシンの置換）を開示する。ＣｐＧオリゴヌクレオチドのアジュバント効果は、参考文献１１４〜１１９においてさらに考察される。上記ＣｐＧ配列は、ＴＬＲ９に関し得る（例えば、モチーフＧＴＣＧＴＴまたはＴＴＣＧＴＴ）［１２０］。上記ＣｐＧ配列は、Ｔｈ１免疫応答の誘導について特異的であり得る（例えば、ＣｐＧ−Ａ ＯＤＮ（オリゴデオキシヌクレオチド））か、またはその配列は、Ｂ細胞応答の誘導について、より特異的であり得る（例えば、ＣｐＧ−Ｂ ＯＤＮ）。ＣｐＧ−Ａ ＯＤＮおよびＣｐＧ−Ｂ ＯＤＮは、参考文献１２１〜１２３において考察される。好ましくは、上記ＣｐＧは、ＣｐＧ−Ａ ＯＤＮである。好ましくは、上記ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、その５’末端がレセプター認識を達成可能であるように構築される。必要に応じて、２つのＣｐＧオリゴヌクレオチド配列は、「イムノマー（ｉｍｍｕｎｏｍｅｒ）」を形成するようにそれらの３’末端において結合され得る。例えば、参考文献１２０および参考文献１２４〜１２６を参照のこと。有用なＣｐＧアジュバントは、ＰｒｏＭｕｎｅＴＭ（Ｃｏｌｅｙ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｃ．）としても公知であるＣｐＧ７９０９である。
【００６５】
ＣｐＧ配列を使用する代わりか、またはそれに加えて、ＴｐＧ配列が、使用され得る［１２７］。これらのオリゴヌクレオチドは、非メチル化ＣｐＧモチーフを含まない可能性がある。
【００６６】
上記免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、ピリミジンが豊富であり得る。例えば、その免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、１個より多くの連続したチミジンヌクレオチド（例えば、参考文献１２７に開示されるようなＴＴＴＴ）を含み得るか、そして／または免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、＞２５％（例えば、＞３５％、＞４０％、＞５０％、＞６０％、＞８０％など）のチミジンを含むヌクレオチド組成を有し得る。例えば、その免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、１個より多くの連続したシトシンヌクレオチド（例えば、参考文献１６１に開示されるようなＣＣＣＣ）を含み得るか、そして／またはその免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、＞２５％（例えば、＞３５％、＞４０％、＞５０％、＞６０％、＞８０％など）のシトシンを含むヌクレオチド組成を有し得る。これらのオリゴヌクレオチドは、非メチル化ＣｐＧモチーフを含まない可能性がある。
【００６７】
免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、代表的に、少なくとも２０個のヌクレオチドを含む。それらは、１００個よりも少ないヌクレオチドを含み得る。
【００６８】
リポソームと免疫刺激性オリゴヌクレオチドとの組合せが、特に、そのオリゴヌクレオチドがそのリポソーム内に封入される場合に使用され得る。この組合せは、強力なＴｈ１免疫応答を誘導し得る［１２８］。
【００６９】
（３ｄＭＰＬ）
３ｄＭＰＬ（また、３脱−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡまたは３−Ｏ−脱アシル−４’−モノホスホリルリピドＡとしても公知である）は、モノホスホリルリピドＡ中の還元末端グルコサミンの３位が脱アシル化されるアジュバントである。３ｄＭＰＬは、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｍｉｎｎｅｓｏｔａのヘプトース欠損（ｈｅｐｔｏｓｅｌｅｓｓ）変異体から調製され、そして化学的にリピドＡに類似しているが、酸に不安定なホスホリル基および塩基に不安定なアシル基を欠いている。それは、単球／マクロファージ系統の細胞を活性化し、そしてＩＬ−１、ＩＬ−１２、ＴＮＦ−αおよびＧＭ−ＣＳＦを含む数種のサイトカインの放出を刺激する（参考文献１０３も参照のこと）。３ｄＭＰＬの調製は、最初に、参考文献１２９に記載された。
【００７０】
３ｄＭＰＬは、それらのアシル化によって変動する（例えば、異なる長さであり得る３、４、５または６のアシル鎖を有する）関連分子の混合物の形態をとり得る。２つのグルコサミン（２−デオキシ−２−アミノ−グルコースとしても公知の）単糖は、それらの２位の炭素（すなわち、２位および２’位）でＮ−アシル化され、そしてまた３’位でＯ−アシル化されている。炭素２に結合する基は、式−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ２−ＣＲ１Ｒ１’を有する。炭素２’に結合する基は、式−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ２−ＣＲ２Ｒ２’を有する。炭素３’に結合する基は、式−Ｏ−ＣＯ−ＣＨ２−ＣＲ３Ｒ３’を有する。代表的な構造は以下：
【００７１】
【化３】
【００７２】
である。
【００７３】
基Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、各々独立して−（ＣＨ２）ｎ−ＣＨ３である。ｎの値は、好ましくは、８と１６との間であり、より好ましくは、９と１２との間であり、そして最も好ましくは、１０である。
【００７４】
基Ｒ１’、Ｒ２’およびＲ３’は、各々独立して、（ａ）−Ｈ；（ｂ）−ＯＨ；または（ｃ）−Ｏ−ＣＯ−Ｒ４；であり得、ここでＲ４は−Ｈまたは−（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ３のいずれかであり、ここでｍの値は、好ましくは、８と１６との間であり、そしてより好ましくは、１０、１２または１４である。２位では、ｍは、好ましくは、１４である。２’位では、ｍは、好ましくは、１０である。３’位では、ｍは、好ましくは、１２である。したがって、基Ｒ１’、Ｒ２’およびＲ３’は、好ましくは、ドデカン酸、テトラデカン酸またはヘキサデカン酸由来の−Ｏ−アシル基である。
【００７５】
Ｒ１’、Ｒ２’およびＲ３’のすべてが−Ｈである場合、上記３ｄＭＰＬは３つのアシル鎖のみを有する（２位、２’位および３’位の各々に１つ）。Ｒ１’、Ｒ２’およびＲ３’のうち２つのみが−Ｈである場合、上記３ｄＭＰＬは４つのアシル鎖を有し得る。Ｒ１’、Ｒ２’およびＲ３’のうち１つのみが−Ｈである場合、上記３ｄＭＰＬは５つのアシル鎖を有し得る。Ｒ１’、Ｒ２’およびＲ３’のいずれもが−Ｈではない場合、上記３ｄＭＰＬは、６つのアシル鎖を有し得る。本発明に従って用いられる３ｄＭＰＬアジュバントは、３〜６つのアシル鎖を備えたこれらの形態の混合物であり得るが、この混合物中に６つのアシル鎖をもつ３ｄＭＰＬを含むことが好ましく、そして特に６つのアシル鎖形態が総３ｄＭＰＬの少なくとも１０重量％、例えば、２０重量％以上、３０重量％以上、４０重量％以上、５０重量％以上またはさらに多くを占めることが好ましい。６つのアシル鎖を備えた３ｄＭＰＬは、最もアジュバント活性な形態であることが見出された。
【００７６】
従って、本発明の組成物に含めるために３ｄＭＰＬの最も好ましい形態は、図２のものである。
【００７７】
３ｄＭＰＬが混合物の形態で使用される場合、本発明の組成物中の３ｄＭＰＬの量または濃度に関する言及は、混合物中の合わせた３ｄＭＰＬ種をいう。
【００７８】
水性条件では、３ｄＭＰＬは、異なるサイズを備えた（例えば、直径＜１５０ｎｍまたは＞５００ｎｍを備えた）ミセル凝集体または粒子を形成し得る。これらのいずれか、または両方は、本発明とともに使用され得、そしてより良好な粒子が通常のアッセイによって選択され得る。より小さな粒子（例えば、３ｄＭＰＬの透明な水性懸濁物を与えるに十分小さい）が、より優れた活性［１３０］に起因して、本発明に従う使用に好ましい。好ましい粒子は、２２０ｎｍより小さいか、より好ましくは２００ｎｍより小さいか、１５０ｎｍより小さいか、あるいは１２０ｎｍより小さい平均直径を有し、１００ｎｍより小さい平均直径を有しさえし得る。しかしながら、大部分の場合において、この平均直径は、５０ｎｍより小さくはない。これらの粒子は、濾過滅菌に適するほどに十分小さい。粒子直径は、通常の動的光散乱法の技法によって評価され得、平均粒子直径が明らかとなる。粒子がｘｎｍの直径を有するといわれる場合、一般的にはおおよそこの平均の粒子の分布が存在するが、粒子の数で少なくとも５０％（例えば、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、またはそれより多く）がｘ±２５％の範囲内の直径を有する。
【００７９】
３ｄＭＰＬは、有益に、水中油型エマルションと組み合わせて使用され得る。実質的に全ての３ｄＭＰＬは、上記エマルションの水相に位置し得る。
【００８０】
ワクチン中の３ｄＭＰＬの代表的な量は、１０〜１００μｇ／用量（例えば、約２５μｇまたは約５０μｇ）である。
【００８１】
３ｄＭＰＬは単独で使用され得るか、またはさらに１つ以上の化合物と組み合わせて使用され得る。例えば、ＱＳ２１サポニン［１３１］（水中油型エマルション［１３２］を含む）、免疫刺激性オリゴヌクレオチド、ＱＳ２１および免疫刺激性オリゴヌクレオチドの両方、リン酸アルミニウム［１３３］、水酸化アルミニウム［１３４］またはリン酸アルミニウムおよび水酸化アルミニウムの両方と組み合わせて３ｄＭＰＬを使用することが公知である。
【００８２】
（ビタミンＥ化合物）
参考文献１３５は、ビタミンＥ補充がＴｈ１型応答を増強することを報告する。ビタミンＥ補充による体液性免疫および細胞性免疫の改良はまた、参考文献１３６において報告されるが、ワクチンアジュバントとしての投与は、ずっと大きい効果を有することが報告される。さらに、参考文献１０４は、ビタミンＥがＴｈ１／Ｔｈ２バランスに関与する遺伝子の発現に対して顕著な影響を有することを報告する。例えば、免疫細胞のビタミンＥ刺激は、増大したＩＬ−２産生（すなわち、Ｔｈ１型応答）を直接的にもたらし得る。
【００８３】
天然のビタミンＥは、８種の異なる形態または異性体で存在する：４種のトコフェロールおよび４種のトコトリエノール。全ての異性体は、フリーラジカルを減少させる水素原子を与え得る水酸基と、生物学的な膜への貫入を可能にする疎水性側鎖とを有するクロマノール環を有する。トコフェロールおよびトコトリエノールの両方のα、β、γおよびδ形態（クロマノール環上のメチル基の数によって決定される）が、存在する。各形態は、単独で、身体における生物学的活性、効力の尺度または機能的用途を有する。
【００８４】
本発明の組成物に含めるための好ましいビタミンＥ化合物は、トコフェロールであり、そして任意のα、β、γ、δ、εまたはζトコフェロールが、使用され得る。α−トコフェロールが、好ましい。有益なトコフェロールは、組成物（特に、エマルション）を安定化するために役立ち得る抗酸化剤特性を有する［１３７］。
【００８５】
上記トコフェロールは、いくつかの形態をとり得る（例えば、異なる塩および／または異性体）。塩として、有機塩（例えば、コハク酸塩、酢酸塩、ニコチン酸塩など）が挙げられる。Ｄ−α−トコフェロールおよびＤＬ−α−トコフェロールの両方が使用され得る。好ましいα−トコフェロールは、ＤＬ−α−トコフェロールであり、そしてこのトコフェロールの好ましい塩は、コハク酸塩である。有益に、コハク酸α−トコフェロールは、インフルエンザワクチンと適合性であること、および水銀化合物に代わるものとして有用な保存剤であることが公知である［１１］。
【００８６】
ビタミンＥ化合物は、通常、油であるので、それらは、従来、水中油型エマルション中の成分として含まれ得、それ故、エマルションは、インフルエンザワクチンと適合性であることが公知であり（以下参照）、そしてトコフェロールを含む水中油型エマルションは、Ｔｈ１誘導性アジュバントであることが、参考文献１３８において報告される。
【００８７】
（水中油型エマルションアジュバント）
水中油型エマルションは、インフルエンザウイルスワクチンにアジュバント添加するために適切であることが公知である（例えば、ＦＬＵＡＤＴＭ製品は、ＭＦ５９エマルションアジュバントを含む）。これらのエマルションは、代表的に、少なくとも１種の油および少なくとも１種の界面活性剤を含み、その油および界面活性剤は、生分解性（代謝可能）かつ生体適合性である。上記エマルションの成分は、Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスに影響を及ぼすので、全てのエマルションは、本発明による使用に適していない。例えば、上記ＭＦ５９アジュバントは、優勢に、免疫応答をＴｈ２型応答へと偏らせるので、本発明は、上記ＭＦ５９アジュバントを単独で使用しない（しかし、それは、ＭＦ５９を免疫増強物質（例えば、免疫刺激性オリゴヌクレオチド）と組み合わせて使用し得る）。対照的に、参考文献１３８に開示されるトコフェロール含有エマルションは、Ｔｈ１型応答を誘発するので、本発明によって使用され得る。特定のエマルションのＴｈ１／Ｔｈ２バランスは、従来のアッセイ（例えば、参考文献１３９および１４０の二重色（ｄｕａｌ−ｃｏｌｏｒ）ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ、参考文献１４１のマイクロスフェアベースの多重アッセイ、または参考文献１４２の急速フローサイトメトリーアッセイ（ｒａｐｉｄ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ ａｓｓａｙ））によって評価され得る。
【００８８】
適切なエマルション中の油滴は、一般に、５μｍ未満の直径であり、そしてサブミクロンの直径でさえも有し得、これらの小さいサイズは、安定なエマルションを提供するために、マイクロフルイダイザー（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｓｅｒ）を用いて達成される。２２０ｎｍ未満のサイズを有する小滴は、それらが濾過滅菌に供され得る場合に好ましい。
【００８９】
本発明は、油（例えば、動物（例えば、魚）または植物供給源由来の油）を含み得る。植物油についての供給源としては、ナッツ類、種子類および穀物類が挙げられる。ピーナッツ油、ダイズ油、ココナッツ油およびオリーブ油が最も一般的に入手可能な代表的なナッツ油である。例えば、ホホバ豆から得られるホホバ油が使用され得る。種子油として、ベニバナ油、綿実油、ヒマワリ種子油、ゴマ油などが挙げられる。穀物群において、トウモロコシ油が最も容易に入手可能であるが、小麦、燕麦、ライ麦、イネ、テフ、トリチカレなどの他のシリアル穀物類の油もまた使用され得る。グリセロールおよび１，２−プロパンジオールの６〜１０炭素の脂肪酸エステルは、種子油内には天然に存在しないが、ナッツ油および種子油から出発した適切な物質の加水分解、分離およびエステル化により調製され得る。哺乳動物のミルク由来の脂肪および油は代謝可能であり、従って、本発明の実施において使用され得る。動物供給源から純粋な油を得るために必要な分離、精製、けん化および他の方法に関する手順は、当該分野において周知である。ほとんどの魚は、容易に回収され得る代謝可能な油を含む。例えば、タラの肝油、サメの肝油、および鯨ろうのようなクジラ油が代表的な種々の魚油であり、本明細書中において使用され得る。いくつかの分枝鎖油は、５炭素イソプレン単位で生化学的に合成され、一般的にテルペノイドといわれる。サメの肝油は、スクアレン、２，６，１０，１５，１９，２３−ヘキサメチル−２，６，１０，１４，１８，２２−テトラコサヘキサンとして公知の分枝、不飽和テルペノイドを含み、本明細書において特に好ましい。スクアレンの飽和アナログであるスクアランもまた好ましい油である。スクアレンおよびスクアランを含む魚油は、市販の供給源から容易に入手可能であるか、または当該分野において公知の方法により得られ得る。他の好ましい油は、トコフェロール（以下参照）である。油の混合物が使用され得る。
【００９０】
界面活性剤は、それらの「ＨＬＢ」（親水性／親油性バランス）により分類され得る。本発明の好ましい界面活性剤は、少なくとも１０、好ましくは少なくとも１５、そしてより好ましくは少なくとも１６のＨＬＢを有する。本発明は、ポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（一般的にＴｗｅｅｎといわれる）、特にポリソルベート２０およびポリソルベート８０；エチレンオキシド（ＥＯ）、プロピレンオキシド（ＰＯ）および／またはブチレンオキシド（ＢＯ）のコポリマー（例えば、ＤＯＷＦＡＸＴＭ商標名で販売される直線状ＥＯ／ＰＯブロックコポリマー）；エトキシ（オキシ−１，２−エタンジイル）基の繰返し数が変動し得るオクトキシノール、特にオクトキシノール−９（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、またはｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール）に関心がある；（オクチルフェノキシ）ポリエトキシエタノール（ＩＧＥＰＡＬ ＣＡ−６３０／ＮＰ−４０）；ホスファチジルコリン（レシチン）のようなリン脂質；ＴｅｒｇｉｔｏｌＴＭ ＮＰシリーズのようなノニルフェノールエトキシレート；ラウリル、セチル、ステアリルおよびオレイルアルコール由来のポリオキシエチレン脂肪エーテル（Ｂｒｉｊ界面活性剤として公知）（例えば、トリエチレングリコールモノラウリルエーテル（Ｂｒｉｊ ３０））；およびソルビタンエステル（一般的にＳＰＡＮとして公知）（例えば、ソルビタントリオレアート（Ｓｐａｎ ８５）およびソルビタンモノラウレート）を含む界面活性剤を用いて使用され得るが、これらに限定されない。非イオン性界面活性剤が、好ましい。エマルション中に含む好ましい界面活性剤は、Ｔｗｅｅｎ ８０（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート）、Ｓｐａｎ ８５（ソルビタントリオレアート）、レシチンおよびＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００である。
【００９１】
界面活性剤の混合物は、例えば、Ｔｗｅｅｎ ８０／Ｓｐａｎ ８５混合物が使用され得る。ポリオキシエチレンソルビタンエステル（例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（Ｔｗｅｅｎ ８０））とオクトキシノール（例えば、ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００））との組合せもまた、適切である。別の有用な組合せは、ラウレス９にポリオキシエチレンソルビタンエステルおよび／またはオクトキシノールを加えたものを含む。
【００９２】
界面活性剤の好ましい量（重量％）は、以下である：ポリオキシエチレンソルビタンエステル（例えば、Ｔｗｅｅｎ ８０）の０．０１〜１％（特に、約０．１％）；オクチル−またはノニルフェノキシポリオキシエタノール（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、またはＴｒｉｔｏｎシリーズにおける他の洗浄剤）の０．００１〜０．１％（特に、０．００５〜０．０２％）；ポリオキシエチレンエーテル（例えば、ラウレス９）の０．１〜２０％（好ましくは、０．１〜１０％、そして特に、０．１〜１％または約０．５％）。
【００９３】
本発明によってアジュバントとして有用な３つの特定の水中油型エマルションは、以下である：
−スクアレン、トコフェロールおよびＴｗｅｅｎ ８０のエマルション。このエマルションは、リン酸緩衝化生理食塩水を含み得る。またＳｐａｎ ８５（例えば、１％で）および／またはレシチンも含み得る。これらのエマルションは、２〜１０％スクアレン、２〜１０％トコフェロールおよび０．３〜３％Ｔｗｅｅｎ ８０を有し得、これがより安定なエマルションを提供する場合、スクアレン：トコフェロールの重量比は、１以下が好ましい。スクアレンおよびＴｗｅｅｎ ８０は、約５：２の容量比で存在し得る。そのようなエマルションの１つは、２％溶液を与えるためにＰＢＳ中にＴｗｅｅｎ ８０を溶解し、次いでこの溶液９０ｍｌを（５ｇのＤＬ−α−トコフェロールおよび５ｍｌのスクアレンの）混合物とともに混合し、次いでこの混合物を微細流動化することにより作製され得る。この生じたエマルションは、サブミクロンの油滴（例えば、平均直径が１００ｎｍと２５０ｎｍの間、好ましくは約１８０ｎｍ）を有し得る。
−スクアレン、トコフェロールおよびＴｒｉｔｏｎ洗浄剤（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）のエマルション。そのエマルションはまた、３ｄ−ＭＰＬ（以下参照）を含み得る。そのエマルションは、リン酸緩衝剤を含み得る。
−免疫刺激性オリゴヌクレオチドをまた含む、スクアレン、Ｔｗｅｅｎ ８０、およびＳｐａｎ ８５のサブミクロンエマルション［１４３〜１４５］。容量によるエマルションの組成は、約５％のスクアレン、約０．５％のポリソルベート８０および約０．５％のＳｐａｎ ８５であり得る。重量の項目（ｔｅｒｍ）に関して、これらの比は、参考文献１４６の第１０章および参考文献１４７の第１２章により詳細に記載されるように、４．３％のスクアレン、０．５％のポリソルベート８０および０．４８％のＳｐａｎ ８５になる。エマルションは、有益に、クエン酸イオン（例えば、１０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝剤）を含む。
−ポリソルベート（例えば、ポリソルベート８０）、Ｔｒｉｔｏｎ洗浄剤（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）およびトコフェロール（例えば、コハク酸α−トコフェロール）を含むエマルション。そのエマルションは、約７５：１１：１０（例えば、７５０μｇ／ｍｌのポリソルベート８０、１１０μｇ／ｍｌのＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００および１００μｇ／ｍｌのコハク酸α−トコフェロール）の質量比でこれら３つの成分を含み得、そしてこれらの濃度は、抗原由来のこれらの成分の任意の寄与を含むべきである。そのエマルションはまた、スクアレンを含み得る。そのエマルションはまた、３ｄ−ＭＰＬ（以下参照）を含み得る。その水相は、リン酸緩衝剤を含み得る。
【００９４】
これらの３つの好ましいエマルションは、参考文献１３８に記載されるように、３ｄＭＰＬおよび／またはサポニンを補充され得る。
【００９５】
エマルションは、配布前に抗原と混合され得るか、またはエマルションは、好ましくは、送達時、即時に抗原と混合される。従って、アジュバントおよび抗原は、代表的に包装されたワクチンまたは配布されたワクチンに別個に保たれ、使用時に最終処方物に準備される。この抗原は一般的に水性の形態であり、このワクチンは最終的に２つの液体の混合により調製される。混合のための２つの液体の容量比は、変更し得る（例えば、５：１と１：５の間で）が、一般的に約１：１である。上記抗原およびアジュバントが混合された後、赤血球凝集素抗原は、一般に、水溶液中に残るが、その赤血球凝集素抗原は、それ自体、油／水界面付近に分布し得る。一般に、任意の赤血球凝集素が上記エマルションの油相に進入することは、ほとんどない。
【００９６】
（薬学的組成物）
本発明の組成物は、薬学的に受容可能である。それらの組成物は、スプリット抗原、およびアジュバントに加えて、成分を含み得る（例えば、それらの組成物は、代表的に、１つ以上の薬学的キャリアおよび／または賦形剤を含有する）。そのような成分の徹底的な考察は、参考文献１４８において入手可能である。
【００９７】
組成物は、一般に、水性形態である。上記スプリット抗原およびアジュバントは、代表的に、混合物中にある。
【００９８】
上記組成物は、チオメルサールまたは２−フェノキシエタノールなどの保存剤を含み得る。しかし、上記ワクチンは実質的に水銀物質を含まない（すなわち、５μｇ／ｍｌ未満）（例えば、チオメルサールを含まない）べき［１１、１４９］であることが、好ましい。水銀を含まないワクチンが、より好ましく、そしてこれは、参考文献１１に従ってトコフェロール含有アジュバントを使用する場合、従来通り達成され得る。保存剤を含まないワクチンが、特に好ましい。
【００９９】
張度を制御するために、生理的塩（例えば、ナトリウム塩）を含有することが好ましい。塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）が好ましく、その塩化ナトリウムは、１ｍｇ／ｍｌと２０ｍｇ／ｍｌとの間で存在し得る。存在し得る他の塩としては、塩化カリウム、二水素リン酸カリウム、無水二ナトリウムリン酸塩、塩化マグネシウム、塩化カルシウムなどが挙げられる。
【０１００】
組成物は、一般に２００ｍＯｓｍ／ｋｇと４００ｍＯｓｍ／ｋｇとの間、好ましくは２４０ｍＯｓｍ／ｋｇ〜３６０ｍＯｓｍ／ｋｇの間の浸透圧モル濃度を有し、より好ましくは２９０〜３１０ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲内となる。浸透圧モル濃度は、ワクチン接種により引き起こされる痛みに対して影響を有しないことが以前に報告されている［１５０］が、この範囲に浸透圧モル濃度を維持することが、やはり好ましい。
【０１０１】
組成物は、１つ以上の緩衝剤を含有し得る。代表的な緩衝剤としては、以下が挙げられる：リン酸緩衝剤；Ｔｒｉｓ緩衝剤；ホウ酸緩衝剤；コハク酸緩衝剤；ヒスチジン緩衝剤（特に、水酸化アルミニウムアジュバントを含む）；またはクエン酸緩衝剤。緩衝剤は、代表的に５〜２０ｍＭの範囲で含有される。リン酸緩衝化生理食塩水中に形成されるエマルションが、便宜的に使用され得る。
【０１０２】
組成物のｐＨは、一般に、５．０と８．１との間、より代表的には６．０と８．０との間、例えば、６．５と７．５との間、または７．０と７．８との間である。したがって、本発明の方法は、包装前にバルクワクチンのｐＨを調整する工程を包含し得る。
【０１０３】
上記組成物は、好ましくは、無菌である。上記組成物は、好ましくは、非発熱性である（例えば、１用量あたり＜１ＥＵ（エンドトキシン単位、標準的な測定単位）、そして好ましくは１用量あたり＜０．１ＥＵを含む）。上記組成物は、好ましくは、グルテンを含まない。
【０１０４】
上記組成物は、単回免疫感作のための物質を含んでも、複数回免疫感作（すなわち、「複数回用量」キット）のための物質を含んでもよい。保存剤を含むことが、複数回用量の準備において好ましい。複数回用量組成物中に保存剤を含むことの代わりとして（またはそれに加えて）、その組成物は、物質を除去するための無菌のアダプターを有する容器中に含まれ得る。
【０１０５】
インフルエンザワクチンは、代表的に、約０．５ｍｌの投薬容量で投与されるが、半用量（すなわち、約０．２５ｍｌ）が、小児に投与され得る。
【０１０６】
組成物およびキットは、好ましくは、２℃と８℃との間にて保存される。それらは、凍結されるべきではない。それらは、理想的には、直接的な光から免れるべきである。
【０１０７】
（本発明のキット）
本発明の組成物は、送達時において即座に調製され得る。したがって、本発明は、混合のために調整された種々の成分を備えるキットを提供する。上記キットは、上記アジュバントおよび上記抗原が使用時まで別々に保持されることを可能にし、そのことは、水中油型エマルションアジュバントを使用する場合に有用であり得る。
【０１０８】
上記成分は、上記キット内で、互いから物理的に分離した形態であり、そしてこの分離は、種々の手段で達成され得る。例えば、上記２つの成分は、２つの分離したバイアルなどの容器中にあり得る。次いで、上記２つのバイアルの成分は、例えば、一方のバイアルの成分を取り出し、そしてそれらを他方のバイアルに添加すること、または両方のバイアルの成分を別々に取り出し、そしてそれらを第３の容器中で混合することによって混合され得る。
【０１０９】
好ましい構成（ａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ）において、キット成分のうちの一方は、注射器中にあり、そして他方は、バイアルなどの容器中にある。注射器（例えば、針を有する）が、その成分を混合のための第２の容器中に挿入するために使用され得、次いでその混合物は、その注射器中に引かれ得る。次いで、その注射器の混合された成分は、代表的に、新規の滅菌針を通して患者に投与され得る。注射器中に１つの成分を包装することは、患者への投与のために別個の注射器を使用する必要性を排除する。
【０１１０】
別の好ましい構成において、上記２つのキット成分は、同じ注射器（例えば、二重室注射器（ｄｕａｌ−ｃｈａｍｂｅｒ ｓｙｒｉｎｇｅ）（例えば、参考文献１５１〜１５８などに開示されるもの））において、一緒であるが分離して保持される。その注射器が、作動される場合（例えば、患者に対する投与の間）、その２つの室の成分は、混合される。この構成は、使用時における別個の混合工程に対する必要性を回避する。
【０１１１】
上記キット成分は、一般に、水性形態である。いくつかの構成において、一方の成分（代表的に、アジュバント成分よりもむしろ抗原成分）は、乾燥形態（例えば、凍結乾燥された形態）であり、他方の成分は、水性形態である。上記２つの成分は、上記乾燥成分を再活性化し、そして患者に対する投与のための水性組成物を得るために混合され得る。凍結乾燥された成分は、代表的に、注射器よりもむしろバイアル内におかれる。乾燥された成分は、安定剤（例えば、乳糖、ショ糖またはマンニトール、およびそれらの混合物（例えば、乳糖／ショ糖混合物、ショ糖／マンニトール混合物）など）を含み得る。１つの可能な構成は、予め充填された注射器中の水性アジュバント成分およびバイアル中の凍結乾燥された抗原成分を使用する。
【０１１２】
（組成物またはキット成分の包装）
本発明の組成物（またはキット成分）に適した容器としては、バイアル、注射器（例えば、使い捨て可能な注射器）、点鼻スプレーなどが挙げられる。これらの容器は、無菌であるべきである。
【０１１３】
組成物／成分が、バイアル中におかれる場合、そのバイアルは、ガラス材料またはプラスチック材料から作製される。上記バイアルは、好ましくは、上記組成物／成分がそのバイアルに添加される前に滅菌される。ラテックス感受性患者に関する懸案事項を回避するために、バイアルは、ラテックスを含まないストッパーによって密封され得、そして全ての包装用物質中にラテックスが存在しないことが、好ましい。上記バイアルは、単回用量のワクチンを含み得るか、またはそのバイアルは、１つよりも多い用量（例えば１０用量）を含み得る（「複数回用量」バイアル）。好ましいバイアルは、無色のガラスから作製される。
【０１１４】
バイアルは、予め充填された注射器がそのキャップ中に挿入され得るように適合したキャップ（例えば、Ｌｕｅｒロック）を有し得、その注射器の内容物は、（例えば、その中の凍結乾燥された物質を再構成するために）そのバイアル中に排出され得、そしてそのバイアルの内容物は、その注射器中に戻され得る。上記バイアルから上記注射器を取り外した後、次いで針が、接続され得、そして組成物が、患者に投与され得る。上記キャップが、好ましくは、シールまたはカバーの内側に配置されて、そのシールまたはカバーは、そのキャップが接触され得る前に取り外される必要がある。バイアルは、特に、複数回用量バイアルに関して、その内容物の無菌的な取り出しを可能にするキャップを有し得る。
【０１１５】
成分が、注射器中に包装される場合、その注射器は、それに接続された針を有し得る。針が接続されない場合、別個の針が、組み立ておよび使用のために注射器とともに提供され得る。そのような針は、シースで覆う（ｓｈｅａｔｈｅ）ことができる。安全針が、好ましい。１インチ２３ゲージの針、１インチ２５ゲージの針および５／８インチ２５ゲージの針が、代表的である。注射器には、その上に内容物のロット番号、インフルエンザの時期および使用期限日がプリントされ得る剥ぎ取りラベルが提供され得、記録維持を容易にする。上記注射器中のプランジャーは、好ましくは、ストッパーを有し、プランジャーが吸引の間に偶発的に外れることを防ぐ。上記注射器は、ラテックスゴムキャップおよび／またはプランジャーを有し得る。使い捨て可能な注射器は、単回用量のワクチンを含む。上記注射器は、一般に、針の接続前に先端を密封するために先端キャップを有し、そしてその先端キャップは、好ましくは、ブチルゴムから作製される。上記注射器と針とが別個に包装される場合、その針は、好ましくは、ブチルゴムシールドが取り付けられる。好ましい注射器は、商標名「Ｔｉｐ−Ｌｏｋ」ＴＭで市販されるものである。
【０１１６】
容器は、半用量の容量を示して、例えば、小児に対する送達を容易にするために、標識され得る。例えば、０．５ｍｌ用量を含む注射器は、０．２５ｍｌ容量を示す標識を有し得る。
【０１１７】
ガラス容器（例えば、注射器またはバイアル）が使用される場合、ソーダ石灰ガラス製の容器よりもホウケイ酸ガラス製の容器を用いることが好ましい。
【０１１８】
キットまたは組成物は、上記ワクチンの詳細（例えば、投与のための指示書、ワクチン内の抗原の詳細など）を含む印刷物と一緒に（例えば、同じ箱中に）含まれ得る。その指示書はまた、警告、例えば、ワクチン接種の後のアナフィラキシー反応の場合、直ちに利用できるようにアドレナリンの溶液を準備しておくことなどを含み得る。
【０１１９】
（処置およびワクチンの投与の方法）
本発明の組成物は、ヒト患者への投与に適しており、そして本発明は、患者における免疫応答を惹起する方法を提供し、本発明の組成物をその患者に投与する工程を包含する。
【０１２０】
本発明はまた、医薬として使用するための本発明のキットまたは組成物を提供する。
【０１２１】
本発明はまた、患者における免疫応答を惹起するための医薬の製造における、（ｉ）細胞培養物において増殖されたウイルスから調製されたスプリットインフルエンザウイルス抗原および（ｉｉ）完全にアルミニウム塩から構成されないアジュバントの使用を提供する。
【０１２２】
本発明はまた、患者における免疫応答を惹起するための医薬の製造における、（ｉ）卵タンパク質を全く含まないスプリットインフルエンザウイルス抗原および（ｉｉ）完全にアルミニウム塩から構成されないアジュバントの使用を提供する。
【０１２３】
本発明はまた、患者における免疫応答を惹起するための医薬の製造における、（ｉ）細胞培養物において増殖されたウイルスから調製されたスプリットインフルエンザウイルス抗原および（ｉｉ）Ｔｈ１アジュバントの使用を提供する。
【０１２４】
本発明はまた、患者における免疫応答を惹起するための医薬の製造における、（ｉ）卵タンパク質を全く含まないスプリットインフルエンザウイルス抗原および（ｉｉ）Ｔｈ１アジュバントの使用を提供する。
【０１２５】
これらの方法および使用によって惹起された免疫応答は、一般に、抗体応答（好ましくは、防御的な抗体応答）を含む。インフルエンザウイルスワクチン接種後の抗体応答、中和能力および防御を評価するための方法は、当該分野において周知である。ヒト研究は、ヒトインフルエンザウイルスの赤血球凝集素に対する抗体力価が防御と相関することを示している（約３０〜４０の血清サンプル赤血球凝集−抑制力価は、同種のウイルスによる感染に対する約５０％の防御を与える）［１５９］。抗体応答は、代表的に、赤血球凝集抑制、マイクロ中和、一次元放射状免疫拡散（ＳＲＩＤ）、および／または単純放射溶血（ｓｉｎｇｌｅ ｒａｄｉａｌ ｈｅｍｏｌｙｓｉｓ）（ＳＲＨ）によって測定される。これらのアッセイ技術は、当該分野において周知である。
【０１２６】
本発明の組成物は、種々の手段で投与され得る。最も好ましい免疫感作経路は、筋肉内注射（例えば、腕または脚）によるものであるが、他の利用可能な経路としては、皮下注射、鼻腔内［１６０〜１６２］、経口［１６３］、皮内［１６４、１６５］、経皮（ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ）、経皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）［１６６］などが挙げられる。
【０１２７】
本発明に従って調製されるワクチンは、小児および成人の両方を処置するために使用され得る。インフルエンザワクチンは、最近、小児および成人の免疫感作における６月齢からの使用について推奨される。したがって、上記患者は、１歳未満、１〜５歳、５〜１５歳、１５〜５５歳、または少なくとも５５歳であり得る。上記ワクチンを受容するための好ましい患者は、高齢者（例えば、５０歳以上、６０歳以上、および好ましくは６５歳以上）、若年者（例えば５歳以下）、入院患者、医療従事者、国軍および軍人、妊婦、慢性疾患患者、免疫不全患者、そのワクチンを受容する前の７日間において抗ウイルス化合物（例えば、オセルタミビルまたはザナミビル化合物；以下を参照のこと）を摂取している患者、卵アレルギーを有する者および海外渡航者である。上記ワクチンは、これらの群に対してのみ適しているわけではないが、より一般的には集団において使用され得る。流行株に関して、全ての年齢群に対する投与が、好ましい。
【０１２８】
本発明の好ましい組成物は、効力に関してＣＰＭＰ判定基準の１、２または３を満たす。成人（１８〜６０歳）において、これらの基準は、（１）７０％以上のセロプロテクション（ｓｅｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ）；（２）４０％以上のセロコンバージョン；および／または（３）２．５倍以上のＧＭＴ増加である。高齢者（＞６０歳）において、これらの判定基準は、（１）６０％以上のセロプロテクション；（２）３０％以上のセロコンバージョン；および／または（３）２倍以上のＧＭＴ増加である。これらの判定基準は、少なくとも５０人の患者による非盲検研究に基づく。
【０１２９】
処置は、単回用量スケジュールまたは複数回用量スケジュールによるものであり得る。複数回用量は、一次免疫感作スケジュールおよび／または追加免疫感作スケジュールにおいて使用され得る。複数回用量スケジュールにおいて、種々の用量は、同じかまたは異なる経路（例えば、非経口によるプライム（ｐｒｉｍｅ）および粘膜によるブースト（ｂｏｏｓｔ）、粘膜によるプライムおよび非経口によるブーストなど）によって与えられ得る。１つより多い用量（代表的に、２用量）の投与は、特に、免疫学的にナイーブな患者において有用である（例えば、以前にインフルエンザワクチンを受容したことがない者のためか、または新規のＨＡサブタイプに対してワクチン接種するため（流行の発生において））。複数回用量は、代表的に、少なくとも１週間（例えば、約２週間、約３週間、約４週間、約６週間、約８週間、約１０週間、約１２週間、約１６週間など）の間隔を空けて投与される。
【０１３０】
本発明によって産生されるワクチンは、他のワクチン（麻疹ワクチン、流行耳下腺炎ワクチン、風疹ワクチン、ＭＭＲワクチン、水痘ワクチン、ＭＭＲＶワクチン、ジフテリアワクチン、破傷風ワクチン、百日咳ワクチン、ＤＴＰワクチン、結合体化ｂ型Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅワクチン、不活性化ポリオウイルスワクチン、Ｂ型肝炎ウイルスワクチン、髄膜炎菌結合体ワクチン（例えば、四価Ａ−Ｃ−Ｗ１３５−Ｙワクチン）、ＲＳウイルスワクチン、肺炎球菌結合体ワクチンなど）と実質的に同時（例えば、医療専門家またはワクチン接種センターへの同一の医学的な対診または診察の間）に患者に対して投与され得る。肺炎球菌ワクチンおよび／または髄膜炎菌ワクチンと実質的に同時の投与は、特に、高齢患者において有用である。
【０１３１】
同様に、本発明のワクチンは、抗ウイルス化合物、および特に、インフルエンザウイルスに対して活性な抗ウイルス化合物（例えば、オセルタミビルおよび／またはザナミビル）と実質的に同時（例えば、医療専門家による同一の医学的な対診または診察の間）に患者に対して投与され得る。これらの抗ウイルス剤としては、ノイラミニダーゼインヒビター（例えば、（３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）−４−アセチルアミノ−５−アミノ−３（１−エチルプロポキシ）−１−シクロヘキセン−１−カルボン酸、または５−（アセチルアミノ）−４−［（アミノイミノメチル）−アミノ］−２，６−アンヒドロ−３，４，５−トリデオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクトノン−２−エノン酸（そのエステル（例えば、エチルエステル）およびその塩（例えば、リン酸塩）を含む））が挙げられる。好ましい抗ウイルス剤は、（３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）−４−アセチルアミノ−５−アミノ−３（１−エチルプロポキシ）−１−シクロヘキセン−１−カルボン酸，エチルエステル，ホスフェート（１：１）（リン酸オセルタミビル（ＴＡＭＩＦＬＵＴＭ）としても公知である）である。
【０１３２】
（一般）
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「含有する（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「からなる」を包含し、例えば、Ｘを「含む」組成物は、専らＸからなり得るか、またはさらなる何かを含有し得る（例えば、Ｘ＋Ｙ）。
【０１３３】
語「実質的に」は、「完全に」を排除せず、例えば、Ｙを「実質的に含まない」組成物は、Ｙを完全に含まなくても良い。必要である場合、語「実質的に」は、本発明の定義から省略され得る。
【０１３４】
数値ｘに関する用語「約」は、例えば、ｘ±１０％を意味する。
【０１３５】
詳細に述べられていなければ、２つ以上の成分を混合する工程を含むプロセスは、混合の任意の特定の順序を要求しない。したがって、成分は任意の順序で混合され得る。３つの成分が存在するとき、そのときは、２つの成分が互いと組み合わされ得、そして次にこの組み合わせが、第３の成分と組み合わされ得るなどである。
【０１３６】
動物（および特にウシ）材料が細胞の培養に使用される場合、それらを、伝染性海綿状脳症（ＴＳＥ）のない、および特にウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）のない供給源から取得しなければならない。総合的に、動物に由来する材料の完全な非存在下で細胞を培養することが、好ましい。
【０１３７】
化合物が、組成物の部分として投与される場合、その化合物は、代替的に、適切なプロドラッグによって置換され得る。
【０１３８】
細胞基質が、リアソータント手順または逆方向遺伝学手順のために使用される場合、それは、好ましくは、例えば、Ｐｈ Ｅｕｒ総論（ｇｅｎｅｒａｌ ｃｈａｐｔｅｒ）５．２．３にあるようなヒトワクチン生産における使用について承認されているものである。
【実施例】
【０１３９】
（本発明を実施するための様式）
（Ｔｈ１応答を促す水中油型エマルションアジュバント）
２種の市販のアジュバント添加しなかったスプリットビリオン三価インフルエンザワクチン（「ＳＰＬＩＴ（Ａ）」および「ＳＰＬＩＴ（Ｂ）」）を、入手し、そしてマウスを免疫感作するために０．２μｇのＨＡの用量で使用した。ワクチンは、アジュバント添加されなかったか、または（ｉ）水酸化アルミニウム、もしくは（ｉｉ）ＭＦ５９エマルションと１０μｇの免疫刺激性ＣｐＧオリゴヌクレオチドとの混合物を用いてアジュバント添加されたかのいずれかで使用した。８匹の雌Ｂａｌｂ／Ｃマウス（８週齢）の群を、０日目および２８日目において、５０μｌ用量の上記ワクチンを用いて筋肉内に免疫感作した。血清を、１４日目および４２日目に入手し、そしてその血清を、抗ＨＡ力価（ＩｇＧ）、ＨＩ力価およびＴ細胞について分析した。
【０１４０】
４２日目における血清ＩｇＧ抗体力価（ＥＬＩＳＡ）は、各ウイルスを個別に見て、以下の通りであった：
【０１４１】
【化４】
【０１４２】
４２日目におけるＨＩ血清抗体力価は、以下の通りであった：
【０１４３】
【化５】
【０１４４】
図１に示した通り、アジュバントされていないワクチンは、非常に低いレベルの抗原特異的Ｔ細胞を誘発した。水酸化アルミニウム（ａｌｕｍ）アジュバントは、Ｔｈ２に偏った様式でレベルを増大させ：１匹のマウスにおいて、水酸化アルミニウムは、ＩＬ−５＋ ＩＦＮ−γ− ＴＮＦ−α− Ｔ細胞（すなわち、Ｔｈ２型）の大きな増加を引き起こしたが、ＩＬ−５− ＩＦＮ−γ＋ ＴＮＦ−α＋細胞（すなわち、Ｔｈ１型）は、見られなかった。対照的に、ＭＦ５９とＣｐＧオリゴヌクレオチドとの組合せは、抗原特異的Ｔ細胞の数の大きな増加、およびまた、Ｔｈ１型応答への移行の両方を引き起こした。
【０１４５】
したがって、スプリットインフルエンザワクチンによって誘発される抗原特異的Ｔ細胞の数を上昇させるため、およびまた、免疫応答をＴｈ１型応答へと移行させるために、水中油型エマルションアジュバントを使用することが、可能である。対照的に、水酸化アルミニウムアジュバントは、Ｔｈ２型応答を伴って低いレベルのＴ細胞を誘発する。
【０１４６】
（ヒト試験［参考文献１６７］）
参考文献１６７に記載される通り、スプリットインフルエンザワクチンを、２種の油（α−トコフェロールおよびスクアレン）から作製した有機相と、乳化剤としてＴｗｅｅｎ ８０を含むリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）の水性相とを有する水中油型エマルションを用いてアジュバント添加した。それは、２．５％のスクアレン（ｖ／ｖ）、２．５％のα−トコフェロール（ｖ／ｖ）、および０．９％のポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート（ｖ／ｖ）（Ｔｗｅｅｎ ８０）の最終濃度を有する。それを、最初に、インフルエンザ抗原との混合のために２倍濃縮物として調製した。このエマルションは、Ｔｈ１誘導性アジュバントであることが報告される。
【０１４７】
上記エマルションを、２％溶液を与えるようにＴｗｅｅｎ ８０をＰＢＳに溶解することによって調製した。１００ｍｌの２倍濃縮物を提供するために、５ｇのＤ，Ｌ−α−トコフェロールおよび５ｍｌのスクアレンを、ボルテックスして、それらを徹底的に混合した。９０ｍｌのＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ溶液を、その油混合物に添加し、そして徹底的に混合した。次いで、得られたエマルションを、注射器に通し、そして最終的に、微細流動化した。得られた油滴は、約１２０〜１８０ｎｍのサイズ（Ｚ平均）を有する。
【０１４８】
コントロール実験において、上記エマルションは、含まれなかった。
【０１４９】
三価ワクチンを、ヒト高齢患者に投与した。体液性免疫応答および細胞性免疫応答を、参考文献１６７に記載されるように、その患者において測定した。セロプロテクションおよびセロコンバージョンを、決定した。
【０１５０】
セロプロテクション率およびセロコンバージョン率は、以下の通りであった（左＝コントロール；右＝アジュバント添加）：
【０１５１】
【化６】
【０１５２】
抗ＨＡ抗体応答は、以下の通りであった：
【０１５３】
【化７】
【０１５４】
アジュバント添加していないコントロールワクチンとエマルションアジュバント添加したワクチンとの間のＴｈ１応答およびＴｈ２応答を比較するために、サイトカイン応答を、アッセイした。免疫感作した患者から採取したＣＤ４＋ Ｔ細胞を、スプリット抗原によって再刺激し、そして（ｉ）少なくともインターフェロン−γ（Ｔｈ１応答を示す）、および１つの他のＩＬ−２、ＴＮＦαまたはＣＤ４０Ｌを分泌する数；あるいは（ｉｉ）少なくともＩＬ−２（再び、Ｔｈ１応答を示す）、および１つの他のＩＦＮ−γ、ＴＮＦαまたはＣＤ４０Ｌを分泌する数；について評価した。結果（免疫感作の前後における違いとして示した）は、以下の通りである：
【０１５５】
【化８】
【０１５６】
上記アジュバント添加したワクチンは、アジュバントしていないコントロールよりも大きいＴｈ１型応答を示す。したがって、上記トコフェロール含有アジュバントは、スプリットインフルエンザワクチンのＴｈ１／Ｔｈ２バランスをモジュレートし得る。
【０１５７】
本発明は例示のみによって記載され、そして改変は本発明の範囲および精神の中にあるままでもなされ得ることが、理解される。
【０１５８】
（参考文献（その内容は、本明細書によって参考として援用される））
【０１５９】
【化９】
【０１６０】
【化１０】
【０１６１】
【化１１−１】
【０１６２】
［９８］米国特許第４６８９３３８号、同第４９２９６２４号、同第５２３８９４４号、同第５２６６５７５号、同第５２６８３７６号、同第５３４６９０５号、同第５３５２７８４号、同第５３８９６４０号、同第５３９５９３７号、同第５４８２９３６号、同第５４９４９１６号、同第５５２５６１２号、同第６０８３５０５号、同第６４４０９９２号、同第６６２７６４０号、同第６６５６９３８号、同第６６６０７３５号、同第６６６０７４７号、同第６６６４２６０号、同第６６６４２６４号、同第６６６４２６５号、同第６６６７３１２号、同第６６７０３７２号、同第６６７７３４７号、同第６６７７３４８号、同第６６７７３４９号、同第６６８３０８８号、同第６７０３４０２号、同第６７４３９２０号、同第６８００６２４号、同第６８０９２０３号、同第６８８８０００号および６９２４２９３号．
【０１６３】
【化１１−２】
【０１６４】
【化１２】
【図面の簡単な説明】
【０１６５】
【図１】図１は、サイトカイン陽性細胞の数を、全ＣＤ４＋細胞のうちの％として示す。２匹の個々のマウス由来の応答が、示される。マウスは、アジュバントされていないか、あるいは（ｉ）水酸化アルミニウム（ａｌｕｍ）または（ｉｉ）ＣｐＧオリゴヌクレオチドを伴うＭＦ５９を用いてアジュバント添加されたかのいずれかであるスプリットワクチン「Ａ」またはスプリットワクチン「Ｂ」によって免疫感作された。
【図２】図２は、本発明と一緒に使用するための３ｄＭＰＬの最も好ましい形態の式を示す。
【技術分野】
【０００１】
本明細書中に引用される全ての文書は、その全体が参考として援用される。
【０００２】
（技術分野）
本発明は、インフルエンザウイルス感染を防御するためのワクチン、そして特に、スプリットワクチン（ｓｐｌｉｔ ｖａｃｃｉｎｅ）の分野にある。
【背景技術】
【０００３】
（背景技術）
インフルエンザワクチンは、参考文献１の第１７章および第１８章において記載される。それらのワクチンは、生ウイルス（ｌｉｖｅ ｖｉｒｕｓ）または不活化ウイルスに基づき、そして不活化ワクチンは、全ウイルス（ｗｈｏｌｅ ｖｉｒｕｓ）、「スプリット」ウイルス（「ｓｐｌｉｔ」ｖｉｒｕｓ）または精製された表面抗原（赤血球凝集素およびノイラミニダーゼを含む）に基づき得る。赤血球凝集素（ＨＡ）は、不活化インフルエンザワクチンにおける主要な免疫原であり、そしてワクチン用量は、ＨＡレベルへの参照によって標準化され、そのワクチンは、代表的に、１株あたり約１５μｇのＨＡを含む。
【０００４】
「スプリット」ワクチンは、「Ｔｗｅｅｎ−エーテル」分解（ｓｐｌｉｔｔｉｎｇ）プロセスなどの方法を使用し、ビリオンを洗浄剤により処理して、サブビリオン調製物を産生することによって得られる。スプリットワクチンは、一般に、インフルエンザビリオン由来の複数の抗原を含む。ＢＥＧＲＩＶＡＣＴＭ製品、ＦＬＵＡＲＩＸＴＭ製品、ＦＬＵＺＯＮＥＴＭ製品およびＦＬＵＳＨＩＥＬＤＴＭ製品は、スプリットワクチンである。
【０００５】
カナダにおいて２０００年〜２００１年の時期の間に、新たに同定された眼呼吸器症候群（ｏｃｕｌｏｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）（ＯＲＳ）が、スプリットワクチンを受容した患者において観察された。上記ＯＲＳは、高い割合の分解されていない（ｕｎｓｐｌｉｔ）ビリオンの微小凝集体を有する組成物を与える、製造の間のビリオンの不完全な分解に関連している［非特許文献１］。
【非特許文献１】Ｓｃｈｅｉｆｅｌｅら、Ｃｌｉｎ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ、２００３年、第３６巻、ｐ．８５０〜８５７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
スプリットインフルエンザがＯＲＳを誘発し得る危険性を最小化することが、本発明の目的である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の開示）
スプリットワクチンとＯＲＳとの間の関連の原因説明は存在しないが、ＯＲＳの臨床的特徴および疫学的特徴は、過敏症を示すので、そのワクチンは自然なＴｈ１／Ｔｈ２バランスを撹乱し得、分解されていない微粒子のビリオンはＴｈ２表現型への偏りをもたらすことが、提唱されている。参考文献３において、例えば、スプリットインフルエンザワクチンにおける凝集体の存在は、免疫応答をより大きいＴｈ２サイトカインパターンへと逸脱させることが見出された。しかし、参考文献４において、ＯＲＳとＴｈ１／Ｔｈ２バランスとの間の関連は、確認できなかった。
【０００８】
ＯＲＳおよびＴｈ２の偏りに関連する任意の正しい証拠がないことにかかわらず、本発明は、スプリットワクチンが過剰なＴｈ２応答を引き起こし得る可能性を最小化することを模索する。インフルエンザワクチンが早急に生産されなければならない状況（例えば、流行の発生後）において、製造業者に対する圧力は、うかつにも、２０００年〜２００１年の部分的に分解していない凝集したＣａｎａｄｉａｎバッチと同じ懸案事項にみまわれるワクチンの放出をもたらし得る。実際に、非特許文献２は、「分解していないビリオンおよび凝集体を必ずしも排除することができない可能性がある」こと、および「眼および呼吸器の症状を誘発するいくつかの低いレベルの危険性を、避けられない可能性がある」ことを報告する。
【０００９】
したがって、本発明は、過剰なＴｈ２応答を引き起こし得るスプリットワクチン中の成分を回避することを模索する。Ｔｈ２応答は、必ずしも完全に回避されない。なぜならば、それらは、防御に重要であり得るが、強力なＴｈ２偏向に重要ではない可能性があるからである。不完全な分解が製造の間にうかつにも生じる場合、またはスプリットワクチンが保存の間に凝集を受ける場合、Ｔｈ２偏向に関連する任意の有害効果（例えば、ＯＲＳ）が、回避され得る。
【００１０】
Ｔｈ２偏向を回避するために、２つのアプローチが、好ましくは組み合わせて行われる。最初に、スプリットワクチンがアジュバントを含む場合、そのアジュバントは、少なくとも部分的なＴｈ１型応答を刺激するために選択される（例えば、スプリットインフルエンザワクチンへの専らアルミニウム塩を用いたアジュバント添加（ａｄｊｕｖａｎｔｉｎｇ）を回避することが、好ましい）。第２に、アレルゲンの存在が、スプリットワクチンにおいて回避される。インフルエンザワクチンは時期毎の投与において特有であるので、複数回用量を受容する患者は、存在する任意の不純物に対して感作され、そしてアレルゲンは、感作された患者においてＴｈ２応答を引き起こすことが報告されている［５］。アレルゲンを回避するために、インフルエンザウイルスを増殖させるための現在の卵ベースの方法は、細胞培養物を使用する方法に置換され、それによって混入する卵アレルゲン（例えば、オボアルブミンおよびオボムコイド）の存在を回避する。
【００１１】
したがって、本発明は、スプリットインフルエンザウイルス抗原とアジュバントとを含む免疫原性組成物を提供し、（ａ）その抗原は、細胞培養物において増殖されたウイルスから調製され、そして（ｂ）そのアジュバントは、完全にアルミニウム塩から構成されない。
【００１２】
本発明はまた、（ｉ）細胞培養物において増殖されたウイルスから調製されたスプリットインフルエンザウイルス抗原；と（ｉｉ）完全にアルミニウム塩から構成されないアジュバント；とを合わせる工程を包含する、免疫原性組成物を調製するための方法を提供する。
【００１３】
本発明はまた、（ｉ）細胞培養物において増殖されたウイルスから調製されたスプリットインフルエンザウイルス抗原を含む第１のキット成分；と（ｉｉ）完全にアルミニウム塩から構成されないアジュバントを含む第２のキット成分とを備えるキットを提供する。
【００１４】
さらに、本発明は、スプリットインフルエンザウイルス抗原とアジュバントとを含む免疫原性組成物を提供し、（ａ）その組成物は、卵タンパク質を全く含まず、そして（ｂ）そのアジュバントは、完全にアルミニウム塩から構成されない。
【００１５】
本発明はまた、（ｉ）卵タンパク質を全く含まない組成物；と（ｉｉ）完全にアルミニウム塩から構成されないアジュバント；とを合わせる工程を包含する、免疫原性組成物を調製するための方法を提供する。
【００１６】
本発明はまた、（ｉ）スプリットインフルエンザウイルス抗原を含むが、卵タンパク質を全く含まない第１のキット成分；と（ｉｉ）完全にアルミニウム塩から構成されないアジュバントを含む第２のキット成分；とを備えるキットを提供する。
【００１７】
さらに、本発明は、スプリットインフルエンザウイルス抗原とＴｈ１アジュバントとを含む免疫原性組成物を提供し、その抗原は、細胞培養物において増殖されたウイルスから調製される。
【００１８】
本発明はまた、（ｉ）細胞培養物において増殖されたウイルスから調製されたスプリットインフルエンザウイルス抗原；と（ｉｉ）Ｔｈ１アジュバント；とを合わせる工程を包含する、免疫原性組成物を調製するための方法を提供する。
【００１９】
本発明はまた、（ｉ）細胞培養物において増殖されたウイルスから調製されたスプリットインフルエンザウイルス抗原を含む第１のキット成分；と（ｉｉ）Ｔｈ１アジュバントを含む第２のキット成分；とを備えるキットを提供する。
【００２０】
さらに、本発明は、スプリットインフルエンザウイルス抗原とＴｈ１アジュバントとを含む免疫原性組成物を提供し、その組成物は、卵タンパク質を全く含まない。
【００２１】
本発明はまた、（ｉ）卵タンパク質を全く含まないスプリットインフルエンザ抗原；と（ｉｉ）Ｔｈ１アジュバント；とを合わせる工程を包含する、免疫原性組成物を調製するための方法を提供する。
【００２２】
本発明はまた、（ｉ）スプリットインフルエンザウイルス抗原を含むが、卵タンパク質を全く含まない第１のキット成分；と（ｉｉ）Ｔｈ１アジュバントを含む第２のキット成分；とを備えるキットを提供する。
【００２３】
（スプリットインフルエンザウイルス抗原）
本発明の組成物は、細胞培養物におけるウイルス増殖によって得られるインフルエンザビリオンを分解することによって得られる抗原を含む。上記スプリットビリオン（ｓｐｌｉｔ ｖｉｒｉｏｎ）は、代表的に、上記インフルエンザビリオン由来の複数の抗原を含み、それらとしては、赤血球凝集素、ノイラミニダーゼ、マトリックスおよび核タンパク質が挙げられる。本発明は、生ウイルスワクチン（例えば、ＦＬＵＭＩＳＴＴＭ製品）、全ビリオン不活化ワクチン（例えば、ＩＮＦＬＥＸＡＬＴＭ製品）、精製された表面抗原ワクチン（それは、精製された赤血球凝集素表面糖タンパク質およびノイラミニダーゼ表面糖タンパク質に基づく（例えば、ＦＬＵＶＩＲＩＮＴＭ製品、ＡＧＲＩＰＰＡＬＴＭ製品およびＩＮＦＬＵＶＡＣＴＭ製品））またはビロソームワクチン（ｖｉｒｏｓｏｍａｌ ｖａｃｃｉｎｅ）（それは、ＩＮＦＬＥＸＡＬ ＶＴＭ製品およびＩＮＶＡＶＡＣＴＭ製品のような、核酸を含まないウイルス様リポソーム粒子の形態をとる［６］）を包含しない。
【００２４】
ビリオンは、種々の方法によってウイルス含有流体から回収され得る。例えば、精製プロセスは、ビリオンを破壊するための洗浄剤を含む直線ショ糖勾配溶液を使用したゾーン遠心分離を含み得る。
【００２５】
スプリットビリオンは、ビリオンを洗浄剤（例えば、エチルエーテル、ポリソルベート８０、デオキシコール酸塩、トリ−Ｎ−ブチルホスフェート、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、Ｔｒｉｔｏｎ Ｎ１０１、臭化セチルトリメチルアンモニウム、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ ＮＰ９など）により処理（「Ｔｗｅｅｎ−エーテル」分解プロセスを含む）してサブビリオン調製物を産生することによって得られる。インフルエンザウイルスを分解する方法は、当該分野において周知である（例えば、参考文献７〜１２などを参照のこと）。ウイルスの分解は、代表的に、破壊する濃度の分解剤（ｓｐｌｉｔｔｉｎｇ ａｇｅｎｔ）によって全ウイルスを破壊または断片化する（感染性であっても非感染性であってもよい）ことによって行われる。上記破壊は、ウイルスタンパク質の完全または部分的な可溶化をもたらし、ウイルスの完全性を変化させる。好ましい分解剤は、非イオン性界面活性剤およびイオン性（例えば、カチオン性）界面活性剤（例えば、アルキルグリコシド、アルキルチオグリコシド、アシル糖（ａｃｙｌ ｓｕｇａｒ）、スルホベタイン、ベタイン、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、Ｎ，Ｎ−ジアルキル−グルカミド（Ｇｌｕｃａｍｉｄｅ）、Ｈｅｃａｍｅｇ、アルキルフェノキシ−ポリエトキシエタノール、第四級アンモニウム化合物、サルコシル、ＣＴＡＢ（臭化セチルトリメチルアンモニウム）、トリ−Ｎ−ブチルホスフェート、Ｃｅｔａｖｌｏｎ、ミリスチルトリメチルアンモニウム塩、リポフェクチン（ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ）、リポフェクタミン（ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）、およびＤＯＴ−ＭＡ、オクチル−またはノニルフェノキシポリオキシエタノール（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００またはＴｒｉｔｏｎ Ｎ１０１などのＴｒｉｔｏｎ界面活性剤）、ポリオキシエチレンソルビタンエステル（Ｔｗｅｅｎ界面活性剤）、ポリオキシエチレンエーテル、ポリオキシエチレンエステルなどである。１つの有用な分解手順は、デオキシコール酸ナトリウムおよびホルムアルデヒドの継続的な効果を使用し、そして分解は、（例えば、ショ糖密度勾配溶液における）最初のビリオン精製の間に行われ得る。スプリットビリオンは、通常、リン酸ナトリウムによって緩衝化された等張塩化ナトリウム溶液に再懸濁され得る。
【００２６】
上記インフルエンザウイルスは、弱毒化され得る。上記インフルエンザウイルスは、温度感受性であり得る。上記インフルエンザウイルスは、低温適応性であり得る。
【００２７】
ワクチンに使用するためのインフルエンザウイルス株は、季節により変化する。最近の大流行間期において、２種のインフルエンザＡ型株（Ｈ１Ｎ１およびＨ３Ｎ２）および１種のインフルエンザＢ型株を含む三価ワクチンが、代表的である。本発明は、この型の大流行間期株（ｉｎｔｅｒ−ｐａｎｄｅｍｉｃ ｓｔｒａｉｎ）と一緒に使用され得るが、本発明はまた、（特に、インフルエンザＡ型ウイルスの）Ｈ２サブタイプ株、Ｈ５サブタイプ株、Ｈ７サブタイプ株またはＨ９サブタイプ株などの流行株（すなわちワクチンのレシピエントおよび一般的なヒト集団が免疫学的にナイーブである株）由来のウイルスと一緒に使用され得、そして流行株に対するインフルエンザワクチンは、一価であっても、例えば、流行株によって補充された通常の三価ワクチンに基づいてもよい。しかし、季節および上記ワクチンに含まれる抗原の性質に依存して、本発明は、インフルエンザＡ型ウイルスのＨＡサブタイプであるＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５またはＨ１６の１種以上を防御し得る。本発明は、インフルエンザＡ型ウイルスのＮＡサブタイプであるＮ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７、Ｎ８またはＮ９の１種以上を防御し得る。
【００２８】
大流行間期の株に対して免疫感作するために適切であることと同様に、本発明の組成物は、流行株に対して免疫感作するために特に有用である。流行の発生を引き起こす可能性をインフルエンザ株に与えるインフルエンザ株の特性は、以下である：（ａ）そのインフルエンザ株が、最近広まっているヒト株におけるＨＡと比較して新規のＨＡ（すなわち、１０年以上にわたってヒト集団において顕性でないＨＡ（例えばＨ２））を含むか、またはヒト集団において先に全く見出されていない（例えば、一般には鳥類集団においてのみ見出されているＨ５、Ｈ６またはＨ９）ことにより、ヒト集団がその株のＨＡに対して免疫学的にナイーブであること；（ｂ）そのインフルエンザ株が、ヒト集団において水平伝播し得ること；および（ｃ）そのインフルエンザ株が、ヒトに対して病原性であること。Ｈ５型赤血球凝集素を有するウイルスは、流行性インフルエンザ（例えば、Ｈ５Ｎ１株）に対する免疫感作のために好ましい。他の可能性のある株としては、Ｈ５Ｎ３、Ｈ９Ｎ２、Ｈ２Ｎ２、Ｈ７Ｎ１およびＨ７Ｎ７、および任意の他の顕在する潜在的な流行株が挙げられる。Ｈ５サブタイプにおいて、ウイルスは、ＨＡクレード１、ＨＡクレード１’、ＨＡクレード２またはＨＡクレード３に分類され得［１３］、クレード１およびクレード３は、特に、関連性がある。
【００２９】
本発明によって使用されるインフルエンザウイルス株は、抗ウイルス療法に対して抵抗性（例えば、オセルタミビル［１４］および／またはザナミビルに対して抵抗性）であり得、その株は、抵抗性の流行株を含む［１５］。
【００３０】
本発明の組成物は、インフルエンザＡ型ウイルスおよび／またはインフルエンザＢ型ウイルスを含む１種以上（例えば１種、２種、３種、４種またはそれ以上）のインフルエンザウイルス株由来の抗原を含み得る。ワクチンが、１種より多い株のインフルエンザを含む場合、それらの異なる株は、代表的に、別個に増殖され、かつそれらのウイルスが回収および分解された後に混合される。したがって、本発明の方法は、１種より多いインフルエンザ株由来の抗原を混合する工程を含み得る。２種のインフルエンザＡ型ウイルス株および１種のインフルエンザＢ型ウイルス株由来の抗原を含む三価ワクチンが、好ましい。
【００３１】
本発明のいくつかの実施形態において、上記組成物は、単一のインフルエンザＡ型株由来の抗原を含み得る。いくつかの実施形態において、上記組成物は、２種のインフルエンザＡ型株由来の抗原を含み得るが、但し、これらの２種の株は、Ｈ１Ｎ１およびＨ３Ｎ２ではない。いくつかの実施形態において、上記組成物は、２種より多いインフルエンザＡ型株由来の抗原を含み得る。
【００３２】
上記インフルエンザウイルスは、リアソータント（ｒｅａｓｓｏｒｔａｎｔ）株であり得、そして逆方向遺伝学技術によって得ることができた。逆方向遺伝学技術［例えば、１６〜２０］は、プラスミドを使用してインビトロで調製される所望のゲノムセグメントを有するインフルエンザウイルスを可能にする。代表的に、それは、（ａ）例えば、ｐｏｌＩプロモーターにより、所望のウイルスＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ分子を発現すること、および（ｂ）例えば、ｐｏｌＩＩプロモーターにより、ウイルスタンパク質をコードするＤＮＡ分子を発現することを含むことで、細胞における両方の型のＤＮＡの発現が、完全なインタクト感染性ビリオンの構築を生じる。上記ＤＮＡは、好ましくは、全ての上記ウイルスＲＮＡおよびウイルスタンパク質の全てを提供するが、そのＲＮＡおよびタンパク質のいくつかを提供するためにヘルパーウイルスを使用することもまた、可能である。各ウイルスＲＮＡを産生するために別個のプラスミドを使用するプラスミドベースの方法が、好ましく［２１〜２３］、そしてこれらの方法はまた、上記ウイルスタンパク質の全てまたはいくつか（例えば、ＰＢ１タンパク質、ＰＢ２タンパク質、ＰＡタンパク質およびＮＰタンパク質だけ）を発現するためのプラスミドの使用を包含し、１２種のプラスミドが、いくつかの方法において使用される。
【００３３】
必要とされるプラスミドの数を減少させるために、最近のアプローチ［２４］は、（ウイルスＲＮＡ合成のための）同じプラスミド上の複数のＲＮＡポリメラーゼＩ転写カセット（例えば、１種、２種、３種、４種、５種、６種、７種または８種全てのインフルエンザＡ型ｖＲＮＡセグメントをコードする配列）と、別のプラスミド上のＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターを有する複数のタンパク質コード領域（例えば、１種、２種、３種、４種、５種、６種、７種または８種全てのインフルエンザＡ型ｍＲＮＡ転写物をコードする配列）を合わせる。参考文献２４の方法の好ましい局面は、以下を含む：（ａ）単一プラスミド上のＰＢ１ ｍＲＮＡコード領域、ＰＢ２ ｍＲＮＡコード領域およびＰＡ ｍＲＮＡコード領域；および（ｂ）単一プラスミド上の全８種のｖＲＮＡコードセグメント。１つのプラスミド上にＮＡセグメントおよびＨＡセグメントを含み、そして別のプラスミド上に６種の他のセグメントを含むこともまた、問題を容易にし得る。
【００３４】
上記ウイルスＲＮＡセグメントをコードするためにｐｏｌＩプロモーターを使用する代わりに、バクテリオファージポリメラーゼプロモーターを使用することが、可能である［２５］。例えば、ＳＰ６ポリメラーゼ、Ｔ３ポリメラーゼまたはＴ７ポリメラーゼのためのプロモーターが、慣用的に使用され得る。ｐｏｌＩプロモーターの種特異性に起因して、バクテリオファージポリメラーゼプロモーターは、多くの細胞型（例えばＭＤＣＫ）に関してより慣用的であり得るが、細胞はまた、外因性ポリメラーゼ酵素をコードするプラスミドによってトランスフェクトされる必要がある。
【００３５】
他の技術において、単一の鋳型に由来して上記ウイルスＲＮＡおよび発現可能なｍＲＮＡを同時にコードするために二重のｐｏｌＩプロモーターおよびｐｏｌＩＩプロモーターを使用することが、可能である［２６、２７］。
【００３６】
したがって、インフルエンザＡ型ウイルスは、特に、ウイルスが卵において増殖される場合、Ａ／ＰＲ／８／３４ウイルス由来の１種以上のＲＮＡセグメント（代表的に、６セグメントは、Ａ／ＰＲ／８／３４に由来し、上記ＨＡセグメントおよびＮセグメントは、ワクチン株に由来する、すなわち、６：２リアソータント）を含み得る。それはまた、ワクチン調製物のためのリアソータントウイルスを産生するために、Ａ／ＷＳＮ／３３ウイルス由来の１種以上のＲＮＡセグメント、または有用な任意の他のウイルス株の１種以上のＲＮＡセグメントを含み得る。代表的に、上記株のゲノムは、通常、哺乳動物（例えば、ヒト）インフルエンザウイルスに由来する少なくとも１種のＲＮＡセグメントを含むので、本発明は、ヒト同士の伝染が可能である株から防御する。それは、鳥インフルエンザウイルスに由来するＮＳセグメントを含み得る。
【００３７】
上記抗原の供給源として使用されるウイルスは、細胞培養物において増殖される。ウイルス増殖培養基は、代表的に、哺乳動物起源の細胞株である。適切な哺乳動物細胞の起源としては、ハムスター細胞、ウシ細胞、霊長類細胞（ヒト細胞およびサル細胞を含む）およびイヌ細胞が挙げられるが、これらに限定されない。腎細胞、線維芽細胞、網膜細胞、肺細胞などのような種々の細胞型が、使用され得る。適切なハムスター細胞の例は、ＢＨＫ２１またはＨＫＣＣの名前を有する細胞株である。適切なサル細胞は、例えば、アフリカミドリザル細胞（例えば、Ｖｅｒｏ細胞株のような腎細胞）である。適切なイヌ細胞は、例えば、ＭＤＣＫ細胞株のような腎細胞株である。したがって、適切な細胞株としては、ＭＤＣＫ；ＣＨＯ；２９３Ｔ；ＢＨＫ；Ｖｅｒｏ；ＭＲＣ−５；ＰＥＲ．Ｃ６；ＷＩ−３８；などが挙げられるが、これらに限定されない。インフルエンザウイルスを増殖させるために好ましい哺乳動物細胞株としては、以下が挙げられる：Ｍａｄｉｎ Ｄａｒｂｙイヌ腎臓に由来するＭＤＣＫ細胞［２８〜３１］；アフリカミドリザル（Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓ ａｅｔｈｉｏｐｓ）腎臓に由来するＶｅｒｏ細胞［３２〜３４］；またはヒト胚性網膜芽細胞に由来するＰＥＲ．Ｃ６細胞［３５］。これらの細胞株は、例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（ＡＴＣＣ）コレクション［３６］、Ｃｏｒｉｅｌｌ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｉｅｓ［３７］、またはＥｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）から広範に入手可能である。例えば、ＡＴＣＣは、カタログ番号ＣＣＬ−８１、ＣＣＬ−８１．２、ＣＲＬ−１５８６およびＣＲＬ−１５８７の種々の異なるＶｅｒｏ細胞を提供し、そしてＡＴＣＣは、カタログ番号ＣＣＬ−３４のＭＤＣＫ細胞を提供する。ＰＥＲ．Ｃ６は、寄託番号９６０２２９４０においてＥＣＡＣＣから入手可能である。あまり好ましくない哺乳動物細胞株の代替物として、ウイルスは、アヒル（例えば、アヒル網膜）または雌鶏（例えば、ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ））などに由来する細胞株を含む鳥類細胞株［例えば、参考文献３８〜４０］において増殖され得る。例としては、ニワトリ胚性幹細胞、ＥＢ４５、ＥＢ１４、およびＥＢ１４−０７４に由来するＥＢｘ細胞株［４２］を含む鳥類胚性幹細胞［３８、４１］が挙げられる。
【００３８】
インフルエンザウイルスを増殖させるために最も好ましい細胞株は、ＭＤＣＫ細胞株である。元のＭＤＣＫ細胞株は、ＣＣＬ−３４としてＡＴＣＣから入手可能であるが、この細胞株の派生物もまた、使用され得る。例えば、参考文献２８は、懸濁培養物における増殖に適合したＭＤＣＫ細胞株（ＤＳＭ ＡＣＣ ２２１９として寄託された「ＭＤＣＫ ３３０１６」）を開示する。同様に、参考文献４３は、無血清培養の懸濁物において増殖するＭＤＣＫ由来細胞株（ＦＥＲＭ ＢＰ−７４４９として寄託された「Ｂ−７０２」）を開示する。参考文献４４は、非腫瘍形成性ＭＤＣＫ細胞（「ＭＤＣＫ−Ｓ」（ＡＴＣＣ ＰＴＡ−６５００）、「ＭＤＣＫ−ＳＦ１０１」（ＡＴＣＣ ＰＴＡ−６５０１）、「ＭＤＣＫ−ＳＦ１０２」（ＡＴＣＣ ＰＴＡ−６５０２）および「ＭＤＣＫ−ＳＦ１０３」（ＰＴＡ−６５０３）を含む）を開示する。参考文献４５は、感染に対して高い感受性を有するＭＤＣＫ細胞株（「ＭＤＣＫ．５Ｆ１」細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１２０４２）を含む）を開示する。任意のこれらのＭＤＣＫ細胞株が、使用され得る。
【００３９】
ウイルスは、懸濁物における細胞［２８、４６、４７］または付着培養（ａｄｈｅｒｅｎｔ ｃｕｌｔｕｒｅ）中の細胞において増殖され得る。懸濁培養のための１つの適切なＭＤＣＫ細胞株は、ＭＤＣＫ ３３０１６（ＤＳＭ ＡＣＣ ２２１９として寄託された）である。
【００４０】
インフルエンザウイルス複製を補助する細胞株は、好ましくは、無血清培地および／またはタンパク質を含まない培地において増殖される。培地は、ヒト起源または動物起源の血清に由来する添加物が存在しない本発明の文脈において、無血清培地と称される。タンパク質を含まないことは、上記細胞の増殖がタンパク質、成長因子、他のタンパク質添加物および非血清タンパク質を排除して生じる培養を意味すると理解されるが、ウイルス増殖に必要であり得るトリプシンまたは他のプロテアーゼなどのタンパク質を必要に応じて含み得る。そのような培養物において増殖する細胞は、細胞自体のタンパク質をもちろん含む。
【００４１】
増殖に使用される細胞培養物、およびまた、培養を開始するために使用されるウイルス接種物は、好ましくは、単純ヘルペスウイルス、ＲＳウイルス、パラインフルエンザウイルス３型、ＳＡＲＳコロナウイルス、アデノウイルス、ライノウイルス、レオウイルス、ポリオーマウイルス、ビルナウイルス、サーコウイルス、および／またはパルボウイルスを含まない［４８］（すなわち、それらの培養物および接種物は、これらのウイルスについて試験され、そしてこれらのウイルスによる汚染についてネガティブな結果を得る）。単純ヘルペスウイルスが無いことは、特に好ましい。
【００４２】
インフルエンザウイルス複製を補助する細胞株は、好ましくは、ウイルス複製の間に、３７℃未満（例えば、３０〜３６℃）にて、増殖のために培養される［４９］。
【００４３】
本発明のワクチンは、好ましくは、１用量あたり１０ｎｇ未満（好ましくは、１ｎｇ未満、およびより好ましくは、１００ｐｇ未満）の残留宿主細胞ＤＮＡを含むが、微量の宿主細胞ＤＮＡが、存在し得る。一般に、上記宿主細胞ＤＮＡ（それは、本発明の組成物から取り除くことが望ましい）は、１００ｂｐよりも長いＤＮＡである。
【００４４】
残留宿主細胞ＤＮＡの測定は、現在、生物製剤についての慣用的な管理要件（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ）であり、そして当業者の通常の能力の範囲内である。ＤＮＡを測定するために使用されるアッセイは、代表的に、確認されたアッセイである［５０、５１］。確認されたアッセイの性能の特徴は、数学的項目および定量可能な項目において記載され得、そしてその考えられる誤差の供給源は、同定されている。上記アッセイは、一般に、正確度、精度、特異性などの特徴について試験された。一旦アッセイが、（例えば、宿主細胞ＤＮＡの既知の標準量に対して）較正され、そして試験された場合、定量的ＤＮＡ測定は、慣用的に行われ得る。ＤＮＡ定量についての以下の３つの主要な技術が、使用され得る：サザンブロットまたはスロットブロットなどのハイブリダイゼーション法［５２］；ＴｈｒｅｓｈｏｌｄＴＭ Ｓｙｓｔｅｍなどのイムノアッセイ法［５３］；および定量的ＰＣＲ［５４］。これらの方法は全て、当業者によく知られているが、各方法の正確な特徴は、目的とする宿主細胞に依存し得る（例えば、ハイブリダイゼーションのためのプローブの選択、増幅のためのプライマーおよび／またはプローブの選択など）。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ製のＴｈｒｅｓｈｏｌｄＴＭシステムは、ピコグラムレベルの全ＤＮＡについての定量的アッセイであり、そして生物製剤中の混入したＤＮＡのレベルをモニタリングするために使用されている［５３］。代表的なアッセイは、ビオチン化ｓｓＤＮＡ結合タンパク質と、ウレアーゼ結合体化抗ｓｓＤＮＡ抗体と、ＤＮＡとの間における反応複合体の配列非特異的形成を包含する。全てのアッセイ成分は、上記製造業者から入手可能である完全なＴｏｔａｌ ＤＮＡ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔに含まれる。種々の商業的な製造業者は、残留宿主細胞ＤＮＡを検出するための定量的ＰＣＲアッセイを提供する（例えば、ＡｐｐＴｅｃＴＭ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＢｉｏＲｅｌｉａｎｃｅＴＭ、Ａｌｔｈｅａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓなど）。ヒトウイルスワクチンの宿主細胞ＤＮＡの混入を測定することについての化学発光ハイブリダイゼーションアッセイと全ＤＮＡ ＴｈｒｅｓｈｏｌｄＴＭシステムとの比較は、参考文献５５に見出され得る。
【００４５】
混入したＤＮＡは、標準的な精製手順（例えば、クロマトグラフィーなど）を使用して、ワクチン調製の間に除去され得る。残留宿主細胞ＤＮＡの除去は、例えば、ＤＮａｓｅを使用することによるヌクレアーゼ処理によって増強され得る。宿主細胞ＤＮＡの混入を減少させるために好都合な方法は、参考文献５６および５７に開示され、その方法は、最初に、ウイルス増殖の間に使用され得るＤＮａｓｅ（例えば、ベンゾナーゼ（Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ））を使用し、次いで、ビリオンの破壊の間に使用され得るカチオン性洗浄剤（例えばＣＴＡＢ）を使用する、２工程の処理を含む。アルキル化剤（例えば、β−プロピオラクトン）による処理がまた、宿主細胞ＤＮＡを除去するために使用され得、そしてまた、有益に、ビリオンを不活化するために使用され得る［５８］。
【００４６】
０．２５ｍｌ容量あたり＜１０ｎｇ（例えば＜１ｎｇ、＜１００ｐｇ）の宿主細胞ＤＮＡを含むワクチンであるような、１５μｇの赤血球凝集素あたり＜１０ｎｇ（例えば、＜１ｎｇ、＜１００ｐｇ）の宿主細胞ＤＮＡを含むワクチンが、好ましい。０．５ｍｌ容量あたり＜１０ｎｇ（例えば、＜１ｎｇ、＜１００ｐｇ）の宿主細胞ＤＮＡを含むワクチンであるような、５０μｇの赤血球凝集素あたり＜１０ｎｇ（例えば、＜１ｎｇ、＜１００ｐｇ）の宿主細胞ＤＮＡを含むワクチンが、より好ましい。
【００４７】
培養された細胞においてウイルスを増殖させるための方法は、一般に、その培養された細胞に培養されるべき株を接種する工程、ウイルス増殖（例えば、ウイルス力価または抗原発現によって決定される）のために所望の期間（例えば、接種の２４時間後と１６８時間後との間）にわたって、感染された細胞を培養する工程、および増殖されたウイルスを回収する工程を包含する。上記培養された細胞は、１：５００〜１：１、好ましくは、１：１００〜１：５、より好ましくは、１：５０〜１：１０の細胞比まで、ウイルス（ＰＦＵまたはＴＣＩＤ５０によって測定される）を接種される。上記ウイルスは、上記細胞の懸濁物に添加されるか、または上記細胞の単一層に適用され、そしてそのウイルスは、２５℃〜４０℃（好ましくは、２８℃〜３７℃）にて、少なくとも６０分間（しかし通常は、３００分未満（好ましくは、９０分間と２４０分間との間））にわたってその細胞上に吸着される。上記感染された細胞の培養物（例えば、単一層）は、回収される培養上清のウイルス含量を増大させるために、凍結解凍または酵素作用のいずれかによって除去され得る。次いで、上記回収された流体は、凍結されて不活化または保存のいずれかが行われる。培養された細胞は、約０．０００１〜１０、好ましくは、０．００２〜５、より好ましくは、０．００１〜２の感染多重度（「ｍ．ｏ．ｉ．」）にて感染され得る。よりさらに好ましくは、上記細胞は、約０．０１のｍ．ｏ．ｉにて感染される。感染された細胞は、感染後３０時間〜６０時間で回収され得る。好ましくは、上記細胞は、感染後３４時間〜４８時間で回収される。よりさらに好ましくは、上記細胞は、感染後３８時間〜４０時間で回収される。プロテアーゼ（代表的に、トリプシン）は、一般に、ウイルスの放出を可能にするために細胞培養の間に添加され、そしてそのプロテアーゼは、その培養の間の任意の適切な段階において添加され得る。
【００４８】
赤血球凝集素（ＨＡ）は、不活化インフルエンザワクチン（スプリットワクチンを含む）中の主要な免疫原であり、そしてワクチン用量は、代表的に、一次元放射状免疫拡散（ＳＲＩＤ）アッセイによって測定されるようなＨＡレベルを参照することによって標準化される。ワクチンは、代表的に、１株あたり約１５μｇのＨＡを含むが、より低い用量がまた、例えば、小児のためかまたは流行性の状況において使用される。１／２（すなわち、１株あたり７．５μｇのＨＡ）、１／４および１／８のような分割量が、より高い用量（例えば、３×用量または９×用量［５９、６０］）を有する場合に使用されている［６３、６４］。したがって、ワクチンは、１つのインフルエンザ株あたり０．１μｇと１５０μｇとの間のＨＡ、好ましくは、０．１μｇと５０μｇとの間（例えば、０．１μｇ〜２０μｇ、０．１μｇ〜１５μｇ、０．１μｇ〜１０μｇ、０．１μｇ〜７．５μｇ、０．５μｇ〜５μｇなど）のＨＡを含み得る。特定の用量は、例えば、１株あたり約４５、約３０、約１５、約１０、約７．５、約５、約３．８、約１．９、約１．５などを含む。上記ワクチン中にアジュバントを含むことは、これらのより低い用量におけるより低い固有の免疫原性を補い得る。
【００４９】
本発明で使用されるＨＡは、ウイルスにおいて見出されるような天然のＨＡであっても、改変されていてもよい。例えば、ウイルスを鳥類種において非常に病原性にする決定因子（例えば、ＨＡ１とＨＡ２との切断部位周辺の超塩基性領域（ｈｙｐｅｒ−ｂａｓｉｃ ｒｅｇｉｏｎ））を除去するためにＨＡを改変することが、公知である。
【００５０】
本発明の組成物は、特に、スプリットワクチンまたは表面抗原ワクチンのために、洗浄剤（例えば、ポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（「Ｔｗｅｅｎｓ」として公知である）、オクトキシノール（例えば、オクトキシノール−９（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）またはｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール）、臭化セチルトリメチルアンモニウム（「ＣＴＡＢ」）、またはデオキシコール酸ナトリウム）を含み得る。上記洗浄剤は、微量でのみ存在し得る。したがって、上記ワクチンは、各々１ｍｇ／ｍｌ未満のオクトキシノール−１０、およびポリソルベート８０を含み得る。残りの他の微量成分は、抗生物質（例えば、ネオマイシン、カナマイシン、ポリミキシンＢ）であり得る。
【００５１】
（アジュバント）
アジュバントとインフルエンザワクチンとの使用は、公知である。例えば、精製された表面抗原に基づくＦＬＵＡＤＴＭ製品は、ＭＦ５９エマルションアジュバントを含む。さらに、参考文献６１〜６４は、単一のインフルエンザワクチン用量に必要とされる抗原の量を減少させる（したがって、増加した量の用量が固定された量の抗原から産生されることを可能にする）ため、全ビリオン（ｗｈｏｌｅ ｖｉｒｉｏｎ）インフルエンザワクチンにアジュバント添加するためのアルミニウム塩の使用を開示する。現在、アジュバント添加（ａｄｊｕｖａｎｔｅｄ）したスプリットインフルエンザワクチンは、市販されていない。
【００５２】
アルミニウム塩（参考文献６１〜６４において使用されるような）が、単独で使用されるときにＴｈ２型免疫応答を促すので、本発明は、この手段でスプリットインフルエンザウイルスにアジュバント添加しない。代わりに、代替的なアジュバントが、使用される（例えば、Ｔｈ１アジュバント）。
【００５３】
Ｔｈ１ Ｔヘルパー細胞とＴｈ２ Ｔヘルパー細胞との間の区別は、周知である。Ｔｈ１アジュバントおよびＴｈ２アジュバントは、同時投与された抗原に対する免疫応答を、それぞれ、Ｔｈ１型応答またはＴｈ２型応答に偏らせる。したがって、Ｔｈ１アジュバントが、ＩＬ−２およびインターフェロン−γ（ＩｇＧ２ａ抗体を引き出す）などのサイトカインならびにＴＮＦ−αを放出する抗原特異的Ｔ細胞の産生をもたらすのに対して、Ｔｈ２アジュバントは、ＩＬ−４（ＩｇＧ１を引き出す）およびＩＬ−５などのサイトカインを放出する抗原特異的Ｔ細胞の産生をもたらす。特定のアジュバントのＴｈ１／Ｔｈ２バランスは、公知のアッセイ（以下参照）によって評価され得るが、送達経路または同時投与された物質の存在などの因子に依存して変動し得る。本発明によって使用されるアジュバントは、患者に送達される場合に、インフルエンザ抗原に対して専らＴｈ１型応答を誘発し得るが、好ましくは、混合型のＴｈ１／Ｔｈ２型応答を誘発する。Ｔｈ０細胞もまた、誘発され得るが、偏向したＴｈ２応答は、回避される。
【００５４】
専らアルミニウム塩を使用した先行技術と比較して、本発明に使用するのに適した代替的なアジュバントは、アルミニウム塩を完全に回避し得るか、またはそれは、アルミニウム塩と、全体的なアジュバント効果をＴｈ１型応答に移行させる第２のアジュバント成分との混合物に基づき得る。例えば、ＩＬ−１２［６５］または免疫刺激性オリゴヌクレオチド［６６］とアルミニウム塩との同時投与は、免疫応答をＴｈ１へと再度指向させ得る。
【００５５】
Ｔｈ１型応答は、当然に、細菌感染に関連し、それ故、本発明に使用されるアジュバントは、一般に、細菌物質を模倣する物質を含む。Ｔｈ１アジュバントは、Ｔｏｌｌ様レセプター（ＴＬＲ）のモジュレーターおよび／またはアゴニストであり得る。例えば、それらは、ヒトＴＬＲ１タンパク質、ヒトＴＬＲ２タンパク質、ヒトＴＬＲ３タンパク質、ヒトＴＬＲ４タンパク質、ヒトＴＬＲ７タンパク質、ヒトＴＬＲ８タンパク質、および／またはヒトＴＬＲ９タンパク質のうちの１つ以上のアゴニストであり得る。好ましい薬剤は、ＴＬＲ７のアゴニスト（例えば、イミダゾキノリン）および／またはＴＬＲ９のアゴニスト（例えば、ＣｐＧオリゴヌクレオチド）である。これらの薬剤は、先天免疫経路を活性化するために有用である。
【００５６】
完全にアルミニウム塩から構成されない特定の「Ｔｈ１アジュバント」としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：
−免疫刺激性オリゴヌクレオチド（例えば、ＣｐＧモチーフ（リン酸結合によってグアノシンに結合された非メチル化シトシンを含むジヌクレオチド配列）または二本鎖ＲＮＡを含むもの、あるいはパリンドローム配列を含むオリゴヌクレオチド、あるいはポリ（ｄＧ）配列を含むオリゴヌクレオチド）。これらのオリゴヌクレオチドアジュバントは、Ｔｈ１型応答を誘発するために非常に有用である［６７］。
−３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡ（「ＭＰＬＴＭ」としても公知である「３ｄＭＰＬ」）［６８〜７１］。３ｄＭＰＬは、Ｔｈ１型応答を促す［７２］。
−広範な植物種の樹皮、葉、茎、根および花においてさえも見出されるステロールグリコシドおよびトリテルペノイドグリコシドの異種群であるサポニン［参考文献１０８の第２２章］。Ｑｕｉｌｌａｉａ ｓａｐｏｎａｒｉａ Ｍｏｌｉｎａ ｔｒｅｅの樹皮由来のサポニンは、アジュバントとして広範に研究されている。サポニンはまた、Ｓｍｉｌａｘ ｏｒｎａｔａ（サルサパリラ）、Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌｌａ ｐａｎｉｃｕｌａｔａ（ブライダルベール）、およびＳａｐｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉａｎａｌｉｓ（サボンソウ根（ｓｏａｐ ｒｏｏｔ））から商業的に得られ得る。サポニンアジュバント処方物としては、精製された処方物（例えば、ＱＳ２１）、および脂質処方物（例えば、ＩＳＣＯＭ）が挙げられる。ＱＳ２１は、ＳｔｉｍｕｌｏｎＴＭとして市販されている。サポニン組成物は、ＨＰＬＣおよびＲＰ−ＨＰＬＣを使用して精製されている。これらの技術を使用した特定の精製された分画が、同定されており、それとしては、ＱＳ７、ＱＳ１７、ＱＳ１８、ＱＳ２１、ＱＨ−Ａ、ＱＨ−ＢおよびＱＨ−Ｃが挙げられる。好ましくは、上記サポニンは、ＱＳ２１である。ＱＳ２１の産生の方法は、参考文献７３に開示される。サポニン処方物はまた、ステロール（例えば、コレステロール）を含み得る［７４］。サポニンとコレステロールとの組み合わせは、免疫刺激性複合体（ＩＳＣＯＭ）と称される固有の粒子を形成するために使用され得る［参考文献１０８の第２３章］。ＩＳＣＯＭはまた、代表的に、リン脂質（例えば、ホスファチジルエタノールアミンまたはホスファチジルコリン）を含む。任意の公知のサポニンは、ＩＳＣＯＭにおいて使用され得る。好ましくは、ＩＳＣＯＭは、ＱｕｉｌＡ、ＱＨＡおよびＱＨＣのうちの１つ以上を含む。ＩＳＣＯＭは、参考文献７４〜７６にさらに記載される。必要に応じて、ＩＳＣＯＭＳは、さらなる洗浄剤を欠き得る［７７］。サポニンベースのアジュバントの開発の概説は、参考文献７８および７９において見出され得る。ＩＳＣＯＭおよび遊離ＱＳ２１は両方とも、Ｔｈ１応答をアップレギュレートすることが報告されている。
−細菌ＡＤＰリボシル化毒素（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ熱不安定性エンテロトキシン「ＬＴ」、コレラ毒素「ＣＴ」、または百日咳毒素「ＰＴ」）およびその無毒化された誘導体（例えば、ＬＴ−Ｋ６３として公知である変異体毒素［８０］）。無毒化されたＡＤＰリボシル化毒素の粘膜アジュバントとしての使用は、参考文献８１に記載され、そして非経口アジュバントとしての使用は、参考文献８２に記載される。いくつかの変異体は、偏向したＴｈ２型応答（例えば、参考文献８３におけるＬＴ−Ｒ７２；しかし、参考文献８４）を誘導することが報告されているが、その他の変異体は、混合型のＴｈ１／Ｔｈ２型応答（例えば、ＬＴ−Ｋ６３）またはＴｈ１型応答（例えば、ＬＴ−Ｇ１９２）を誘導することが報告されている。上記Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスは、選択された経路によってスプリット抗原を用いて与えられる場合、任意の特定の変異体によって達成され、そしてスケジュールは、容易に評価され得る。
−生分解性かつ非毒性である材料（例えば、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリ無水物、ポリカプロラクトンなど（ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコシド）が好ましい））から形成された微粒子（すなわち、約１００ｎｍ〜約１５０μｍの直径（より好ましくは、約２００ｎｍ〜約３０μｍの直径、または約５００ｎｍ〜約１０μｍの直径）の粒子）（負に荷電した表面（例えば、ＳＤＳを用いる）または正に荷電した表面（例えば、カチオン性洗浄剤（例えば、ＣＴＡＢ）を用いる）を有するように必要に応じて処理される）。ＭＦ５９と比較した場合、ＰＬＧ微粒子中への抗原の封入は、Ｔｈ１型応答を促進することが報告されている［８５］。
−リポソーム（参考文献１０８の第１３章および第１４章）。リポソームは、強力なＴｈ１応答を誘発し得る（特に、ミコバクテリア脂質を含むカチオン性リポソーム）［８６］。
−カルシウム塩（例えば、リン酸カルシウム（例えば、参考文献８７に開示される「ＣＡＰ」粒子））。これらの塩への吸着が、好ましい。カルシウム塩は、Ｔｈ１応答を提供することが報告されている［８８］。
−式：
【００５７】
【化１】
【００５８】
を有するもの（Ｒは、水素、直鎖または分枝鎖であり、非置換または置換であり、飽和または不飽和である、アシル基、アルキル基（例えば、シクロアルキル基）、アルケニル基、アルキニル基およびアリール基、あるいはそれらの薬学的に受容可能な塩または誘導体からなる群より選択される）などのポリヒドロキシル化ピロリジン化合物［８９］。例としては、カスアリン（ｃａｓｕａｒｉｎｅ）、カスアリン−６−α−Ｄ−グルコピラノース、３−エピ−カスアリン、７−エピ−カスアリン、３，７−ジエピ−カスアリンなどが挙げられるが、これらに限定されない。これらの化合物は、Ｔｈ１応答を増強する。
−γイヌリン［９０］またはその誘導体（例えば、アルガムリン（ａｌｇａｍｍｕｌｉｎ））。これらのアジュバントは、Ｔｈ１免疫応答およびＴｈ２免疫応答の両方を促進し得る［９１］。
−イミダゾキノリン化合物（例えば、イミキモッド（Ｉｍｉｑｕｉｍｏｄ）（「Ｒ−８３７」）［９２、９３］、レシキモッド（Ｒｅｓｉｑｕｉｍｏｄ）（「Ｒ−８４８」）［９４］、およびそれらのアナログ；ならびにそれらの塩（例えば、塩酸塩）。免疫刺激性イミダゾキノリンについてのさらなる詳細は、参考文献９５〜９９に見出され得る。これらの化合物は、応答をＴｈ１へと移行させる［９７］。
−ロキソリビン（Ｌｏｘｏｒｉｂｉｎｅ）（７−アリル−８−オキソグアノシン）［１００］。
−アミノアルキルグルコサミニドホスフェート誘導体（例えば、ＲＣ−５２９［１０１、１０２］）。これらの誘導体は、Ｔｈ１応答を刺激する［１０３］。
−ビタミンＥ化合物。ビタミンＥは、Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスに関与する遺伝子の発現に対して顕著な影響を有し、そして免疫細胞のビタミンＥ刺激は、増大したＩＬ−２産生（すなわち、Ｔｈ１型応答）を直接的にもたらし得る［１０４］。獣医学的なウイルスワクチンにおけるアジュバントとしてのその使用は、例えば、ニワトリワクチンにおいて公知である［１０５］。
−特定の水中油型エマルション（以下参照）。
−ＴＬＲ４アンタゴニストＥ５５６４［１０６、１０７］：
【００５９】
【化２】
【００６０】
などの、ホスフェート含有非環式骨格に結合された脂質を含む化合物。
【００６１】
これらアジュバント活性物質および他のアジュバント活性物質は、参考文献１０８および１０９においてより詳細に考察される。
【００６２】
組成物は、上記アジュバントの２種以上を含み得る。例えば、サポニンが、Ｔｈ１型応答およびＴｈ２型応答の両方を増強するのに対して、上記サポニンへの３ｄＭＰＬの添加は、Ｔｈ１応答の優勢な誘導を与えることが報告されている［１１０］。さらなる組合せは、以下で考察される。
【００６３】
３つの好ましいアジュバントは、免疫刺激性オリゴヌクレオチド、３ｄＭＰＬ、およびビタミンＥ化合物である。いくつかの水中油型エマルションもまた、好ましいアジュバントである。
【００６４】
（免疫刺激性オリゴヌクレオチド）
免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド改変／アナログ（例えば、ホスホロチオエート改変）を含み得、そして二本鎖であっても（ｄｓＲＮＡを除いて）一本鎖であってもよい。参考文献１１１、１１２および１１３は、可能なアナログ置換（例えば、２’−デオキシ−７−デアザグアノシンによるグアノシンの置換）を開示する。ＣｐＧオリゴヌクレオチドのアジュバント効果は、参考文献１１４〜１１９においてさらに考察される。上記ＣｐＧ配列は、ＴＬＲ９に関し得る（例えば、モチーフＧＴＣＧＴＴまたはＴＴＣＧＴＴ）［１２０］。上記ＣｐＧ配列は、Ｔｈ１免疫応答の誘導について特異的であり得る（例えば、ＣｐＧ−Ａ ＯＤＮ（オリゴデオキシヌクレオチド））か、またはその配列は、Ｂ細胞応答の誘導について、より特異的であり得る（例えば、ＣｐＧ−Ｂ ＯＤＮ）。ＣｐＧ−Ａ ＯＤＮおよびＣｐＧ−Ｂ ＯＤＮは、参考文献１２１〜１２３において考察される。好ましくは、上記ＣｐＧは、ＣｐＧ−Ａ ＯＤＮである。好ましくは、上記ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、その５’末端がレセプター認識を達成可能であるように構築される。必要に応じて、２つのＣｐＧオリゴヌクレオチド配列は、「イムノマー（ｉｍｍｕｎｏｍｅｒ）」を形成するようにそれらの３’末端において結合され得る。例えば、参考文献１２０および参考文献１２４〜１２６を参照のこと。有用なＣｐＧアジュバントは、ＰｒｏＭｕｎｅＴＭ（Ｃｏｌｅｙ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｃ．）としても公知であるＣｐＧ７９０９である。
【００６５】
ＣｐＧ配列を使用する代わりか、またはそれに加えて、ＴｐＧ配列が、使用され得る［１２７］。これらのオリゴヌクレオチドは、非メチル化ＣｐＧモチーフを含まない可能性がある。
【００６６】
上記免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、ピリミジンが豊富であり得る。例えば、その免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、１個より多くの連続したチミジンヌクレオチド（例えば、参考文献１２７に開示されるようなＴＴＴＴ）を含み得るか、そして／または免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、＞２５％（例えば、＞３５％、＞４０％、＞５０％、＞６０％、＞８０％など）のチミジンを含むヌクレオチド組成を有し得る。例えば、その免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、１個より多くの連続したシトシンヌクレオチド（例えば、参考文献１６１に開示されるようなＣＣＣＣ）を含み得るか、そして／またはその免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、＞２５％（例えば、＞３５％、＞４０％、＞５０％、＞６０％、＞８０％など）のシトシンを含むヌクレオチド組成を有し得る。これらのオリゴヌクレオチドは、非メチル化ＣｐＧモチーフを含まない可能性がある。
【００６７】
免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、代表的に、少なくとも２０個のヌクレオチドを含む。それらは、１００個よりも少ないヌクレオチドを含み得る。
【００６８】
リポソームと免疫刺激性オリゴヌクレオチドとの組合せが、特に、そのオリゴヌクレオチドがそのリポソーム内に封入される場合に使用され得る。この組合せは、強力なＴｈ１免疫応答を誘導し得る［１２８］。
【００６９】
（３ｄＭＰＬ）
３ｄＭＰＬ（また、３脱−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡまたは３−Ｏ−脱アシル−４’−モノホスホリルリピドＡとしても公知である）は、モノホスホリルリピドＡ中の還元末端グルコサミンの３位が脱アシル化されるアジュバントである。３ｄＭＰＬは、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｍｉｎｎｅｓｏｔａのヘプトース欠損（ｈｅｐｔｏｓｅｌｅｓｓ）変異体から調製され、そして化学的にリピドＡに類似しているが、酸に不安定なホスホリル基および塩基に不安定なアシル基を欠いている。それは、単球／マクロファージ系統の細胞を活性化し、そしてＩＬ−１、ＩＬ−１２、ＴＮＦ−αおよびＧＭ−ＣＳＦを含む数種のサイトカインの放出を刺激する（参考文献１０３も参照のこと）。３ｄＭＰＬの調製は、最初に、参考文献１２９に記載された。
【００７０】
３ｄＭＰＬは、それらのアシル化によって変動する（例えば、異なる長さであり得る３、４、５または６のアシル鎖を有する）関連分子の混合物の形態をとり得る。２つのグルコサミン（２−デオキシ−２−アミノ−グルコースとしても公知の）単糖は、それらの２位の炭素（すなわち、２位および２’位）でＮ−アシル化され、そしてまた３’位でＯ−アシル化されている。炭素２に結合する基は、式−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ２−ＣＲ１Ｒ１’を有する。炭素２’に結合する基は、式−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ２−ＣＲ２Ｒ２’を有する。炭素３’に結合する基は、式−Ｏ−ＣＯ−ＣＨ２−ＣＲ３Ｒ３’を有する。代表的な構造は以下：
【００７１】
【化３】
【００７２】
である。
【００７３】
基Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、各々独立して−（ＣＨ２）ｎ−ＣＨ３である。ｎの値は、好ましくは、８と１６との間であり、より好ましくは、９と１２との間であり、そして最も好ましくは、１０である。
【００７４】
基Ｒ１’、Ｒ２’およびＲ３’は、各々独立して、（ａ）−Ｈ；（ｂ）−ＯＨ；または（ｃ）−Ｏ−ＣＯ−Ｒ４；であり得、ここでＲ４は−Ｈまたは−（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ３のいずれかであり、ここでｍの値は、好ましくは、８と１６との間であり、そしてより好ましくは、１０、１２または１４である。２位では、ｍは、好ましくは、１４である。２’位では、ｍは、好ましくは、１０である。３’位では、ｍは、好ましくは、１２である。したがって、基Ｒ１’、Ｒ２’およびＲ３’は、好ましくは、ドデカン酸、テトラデカン酸またはヘキサデカン酸由来の−Ｏ−アシル基である。
【００７５】
Ｒ１’、Ｒ２’およびＲ３’のすべてが−Ｈである場合、上記３ｄＭＰＬは３つのアシル鎖のみを有する（２位、２’位および３’位の各々に１つ）。Ｒ１’、Ｒ２’およびＲ３’のうち２つのみが−Ｈである場合、上記３ｄＭＰＬは４つのアシル鎖を有し得る。Ｒ１’、Ｒ２’およびＲ３’のうち１つのみが−Ｈである場合、上記３ｄＭＰＬは５つのアシル鎖を有し得る。Ｒ１’、Ｒ２’およびＲ３’のいずれもが−Ｈではない場合、上記３ｄＭＰＬは、６つのアシル鎖を有し得る。本発明に従って用いられる３ｄＭＰＬアジュバントは、３〜６つのアシル鎖を備えたこれらの形態の混合物であり得るが、この混合物中に６つのアシル鎖をもつ３ｄＭＰＬを含むことが好ましく、そして特に６つのアシル鎖形態が総３ｄＭＰＬの少なくとも１０重量％、例えば、２０重量％以上、３０重量％以上、４０重量％以上、５０重量％以上またはさらに多くを占めることが好ましい。６つのアシル鎖を備えた３ｄＭＰＬは、最もアジュバント活性な形態であることが見出された。
【００７６】
従って、本発明の組成物に含めるために３ｄＭＰＬの最も好ましい形態は、図２のものである。
【００７７】
３ｄＭＰＬが混合物の形態で使用される場合、本発明の組成物中の３ｄＭＰＬの量または濃度に関する言及は、混合物中の合わせた３ｄＭＰＬ種をいう。
【００７８】
水性条件では、３ｄＭＰＬは、異なるサイズを備えた（例えば、直径＜１５０ｎｍまたは＞５００ｎｍを備えた）ミセル凝集体または粒子を形成し得る。これらのいずれか、または両方は、本発明とともに使用され得、そしてより良好な粒子が通常のアッセイによって選択され得る。より小さな粒子（例えば、３ｄＭＰＬの透明な水性懸濁物を与えるに十分小さい）が、より優れた活性［１３０］に起因して、本発明に従う使用に好ましい。好ましい粒子は、２２０ｎｍより小さいか、より好ましくは２００ｎｍより小さいか、１５０ｎｍより小さいか、あるいは１２０ｎｍより小さい平均直径を有し、１００ｎｍより小さい平均直径を有しさえし得る。しかしながら、大部分の場合において、この平均直径は、５０ｎｍより小さくはない。これらの粒子は、濾過滅菌に適するほどに十分小さい。粒子直径は、通常の動的光散乱法の技法によって評価され得、平均粒子直径が明らかとなる。粒子がｘｎｍの直径を有するといわれる場合、一般的にはおおよそこの平均の粒子の分布が存在するが、粒子の数で少なくとも５０％（例えば、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、またはそれより多く）がｘ±２５％の範囲内の直径を有する。
【００７９】
３ｄＭＰＬは、有益に、水中油型エマルションと組み合わせて使用され得る。実質的に全ての３ｄＭＰＬは、上記エマルションの水相に位置し得る。
【００８０】
ワクチン中の３ｄＭＰＬの代表的な量は、１０〜１００μｇ／用量（例えば、約２５μｇまたは約５０μｇ）である。
【００８１】
３ｄＭＰＬは単独で使用され得るか、またはさらに１つ以上の化合物と組み合わせて使用され得る。例えば、ＱＳ２１サポニン［１３１］（水中油型エマルション［１３２］を含む）、免疫刺激性オリゴヌクレオチド、ＱＳ２１および免疫刺激性オリゴヌクレオチドの両方、リン酸アルミニウム［１３３］、水酸化アルミニウム［１３４］またはリン酸アルミニウムおよび水酸化アルミニウムの両方と組み合わせて３ｄＭＰＬを使用することが公知である。
【００８２】
（ビタミンＥ化合物）
参考文献１３５は、ビタミンＥ補充がＴｈ１型応答を増強することを報告する。ビタミンＥ補充による体液性免疫および細胞性免疫の改良はまた、参考文献１３６において報告されるが、ワクチンアジュバントとしての投与は、ずっと大きい効果を有することが報告される。さらに、参考文献１０４は、ビタミンＥがＴｈ１／Ｔｈ２バランスに関与する遺伝子の発現に対して顕著な影響を有することを報告する。例えば、免疫細胞のビタミンＥ刺激は、増大したＩＬ−２産生（すなわち、Ｔｈ１型応答）を直接的にもたらし得る。
【００８３】
天然のビタミンＥは、８種の異なる形態または異性体で存在する：４種のトコフェロールおよび４種のトコトリエノール。全ての異性体は、フリーラジカルを減少させる水素原子を与え得る水酸基と、生物学的な膜への貫入を可能にする疎水性側鎖とを有するクロマノール環を有する。トコフェロールおよびトコトリエノールの両方のα、β、γおよびδ形態（クロマノール環上のメチル基の数によって決定される）が、存在する。各形態は、単独で、身体における生物学的活性、効力の尺度または機能的用途を有する。
【００８４】
本発明の組成物に含めるための好ましいビタミンＥ化合物は、トコフェロールであり、そして任意のα、β、γ、δ、εまたはζトコフェロールが、使用され得る。α−トコフェロールが、好ましい。有益なトコフェロールは、組成物（特に、エマルション）を安定化するために役立ち得る抗酸化剤特性を有する［１３７］。
【００８５】
上記トコフェロールは、いくつかの形態をとり得る（例えば、異なる塩および／または異性体）。塩として、有機塩（例えば、コハク酸塩、酢酸塩、ニコチン酸塩など）が挙げられる。Ｄ−α−トコフェロールおよびＤＬ−α−トコフェロールの両方が使用され得る。好ましいα−トコフェロールは、ＤＬ−α−トコフェロールであり、そしてこのトコフェロールの好ましい塩は、コハク酸塩である。有益に、コハク酸α−トコフェロールは、インフルエンザワクチンと適合性であること、および水銀化合物に代わるものとして有用な保存剤であることが公知である［１１］。
【００８６】
ビタミンＥ化合物は、通常、油であるので、それらは、従来、水中油型エマルション中の成分として含まれ得、それ故、エマルションは、インフルエンザワクチンと適合性であることが公知であり（以下参照）、そしてトコフェロールを含む水中油型エマルションは、Ｔｈ１誘導性アジュバントであることが、参考文献１３８において報告される。
【００８７】
（水中油型エマルションアジュバント）
水中油型エマルションは、インフルエンザウイルスワクチンにアジュバント添加するために適切であることが公知である（例えば、ＦＬＵＡＤＴＭ製品は、ＭＦ５９エマルションアジュバントを含む）。これらのエマルションは、代表的に、少なくとも１種の油および少なくとも１種の界面活性剤を含み、その油および界面活性剤は、生分解性（代謝可能）かつ生体適合性である。上記エマルションの成分は、Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスに影響を及ぼすので、全てのエマルションは、本発明による使用に適していない。例えば、上記ＭＦ５９アジュバントは、優勢に、免疫応答をＴｈ２型応答へと偏らせるので、本発明は、上記ＭＦ５９アジュバントを単独で使用しない（しかし、それは、ＭＦ５９を免疫増強物質（例えば、免疫刺激性オリゴヌクレオチド）と組み合わせて使用し得る）。対照的に、参考文献１３８に開示されるトコフェロール含有エマルションは、Ｔｈ１型応答を誘発するので、本発明によって使用され得る。特定のエマルションのＴｈ１／Ｔｈ２バランスは、従来のアッセイ（例えば、参考文献１３９および１４０の二重色（ｄｕａｌ−ｃｏｌｏｒ）ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ、参考文献１４１のマイクロスフェアベースの多重アッセイ、または参考文献１４２の急速フローサイトメトリーアッセイ（ｒａｐｉｄ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ ａｓｓａｙ））によって評価され得る。
【００８８】
適切なエマルション中の油滴は、一般に、５μｍ未満の直径であり、そしてサブミクロンの直径でさえも有し得、これらの小さいサイズは、安定なエマルションを提供するために、マイクロフルイダイザー（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｓｅｒ）を用いて達成される。２２０ｎｍ未満のサイズを有する小滴は、それらが濾過滅菌に供され得る場合に好ましい。
【００８９】
本発明は、油（例えば、動物（例えば、魚）または植物供給源由来の油）を含み得る。植物油についての供給源としては、ナッツ類、種子類および穀物類が挙げられる。ピーナッツ油、ダイズ油、ココナッツ油およびオリーブ油が最も一般的に入手可能な代表的なナッツ油である。例えば、ホホバ豆から得られるホホバ油が使用され得る。種子油として、ベニバナ油、綿実油、ヒマワリ種子油、ゴマ油などが挙げられる。穀物群において、トウモロコシ油が最も容易に入手可能であるが、小麦、燕麦、ライ麦、イネ、テフ、トリチカレなどの他のシリアル穀物類の油もまた使用され得る。グリセロールおよび１，２−プロパンジオールの６〜１０炭素の脂肪酸エステルは、種子油内には天然に存在しないが、ナッツ油および種子油から出発した適切な物質の加水分解、分離およびエステル化により調製され得る。哺乳動物のミルク由来の脂肪および油は代謝可能であり、従って、本発明の実施において使用され得る。動物供給源から純粋な油を得るために必要な分離、精製、けん化および他の方法に関する手順は、当該分野において周知である。ほとんどの魚は、容易に回収され得る代謝可能な油を含む。例えば、タラの肝油、サメの肝油、および鯨ろうのようなクジラ油が代表的な種々の魚油であり、本明細書中において使用され得る。いくつかの分枝鎖油は、５炭素イソプレン単位で生化学的に合成され、一般的にテルペノイドといわれる。サメの肝油は、スクアレン、２，６，１０，１５，１９，２３−ヘキサメチル−２，６，１０，１４，１８，２２−テトラコサヘキサンとして公知の分枝、不飽和テルペノイドを含み、本明細書において特に好ましい。スクアレンの飽和アナログであるスクアランもまた好ましい油である。スクアレンおよびスクアランを含む魚油は、市販の供給源から容易に入手可能であるか、または当該分野において公知の方法により得られ得る。他の好ましい油は、トコフェロール（以下参照）である。油の混合物が使用され得る。
【００９０】
界面活性剤は、それらの「ＨＬＢ」（親水性／親油性バランス）により分類され得る。本発明の好ましい界面活性剤は、少なくとも１０、好ましくは少なくとも１５、そしてより好ましくは少なくとも１６のＨＬＢを有する。本発明は、ポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（一般的にＴｗｅｅｎといわれる）、特にポリソルベート２０およびポリソルベート８０；エチレンオキシド（ＥＯ）、プロピレンオキシド（ＰＯ）および／またはブチレンオキシド（ＢＯ）のコポリマー（例えば、ＤＯＷＦＡＸＴＭ商標名で販売される直線状ＥＯ／ＰＯブロックコポリマー）；エトキシ（オキシ−１，２−エタンジイル）基の繰返し数が変動し得るオクトキシノール、特にオクトキシノール−９（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、またはｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール）に関心がある；（オクチルフェノキシ）ポリエトキシエタノール（ＩＧＥＰＡＬ ＣＡ−６３０／ＮＰ−４０）；ホスファチジルコリン（レシチン）のようなリン脂質；ＴｅｒｇｉｔｏｌＴＭ ＮＰシリーズのようなノニルフェノールエトキシレート；ラウリル、セチル、ステアリルおよびオレイルアルコール由来のポリオキシエチレン脂肪エーテル（Ｂｒｉｊ界面活性剤として公知）（例えば、トリエチレングリコールモノラウリルエーテル（Ｂｒｉｊ ３０））；およびソルビタンエステル（一般的にＳＰＡＮとして公知）（例えば、ソルビタントリオレアート（Ｓｐａｎ ８５）およびソルビタンモノラウレート）を含む界面活性剤を用いて使用され得るが、これらに限定されない。非イオン性界面活性剤が、好ましい。エマルション中に含む好ましい界面活性剤は、Ｔｗｅｅｎ ８０（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート）、Ｓｐａｎ ８５（ソルビタントリオレアート）、レシチンおよびＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００である。
【００９１】
界面活性剤の混合物は、例えば、Ｔｗｅｅｎ ８０／Ｓｐａｎ ８５混合物が使用され得る。ポリオキシエチレンソルビタンエステル（例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（Ｔｗｅｅｎ ８０））とオクトキシノール（例えば、ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００））との組合せもまた、適切である。別の有用な組合せは、ラウレス９にポリオキシエチレンソルビタンエステルおよび／またはオクトキシノールを加えたものを含む。
【００９２】
界面活性剤の好ましい量（重量％）は、以下である：ポリオキシエチレンソルビタンエステル（例えば、Ｔｗｅｅｎ ８０）の０．０１〜１％（特に、約０．１％）；オクチル−またはノニルフェノキシポリオキシエタノール（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、またはＴｒｉｔｏｎシリーズにおける他の洗浄剤）の０．００１〜０．１％（特に、０．００５〜０．０２％）；ポリオキシエチレンエーテル（例えば、ラウレス９）の０．１〜２０％（好ましくは、０．１〜１０％、そして特に、０．１〜１％または約０．５％）。
【００９３】
本発明によってアジュバントとして有用な３つの特定の水中油型エマルションは、以下である：
−スクアレン、トコフェロールおよびＴｗｅｅｎ ８０のエマルション。このエマルションは、リン酸緩衝化生理食塩水を含み得る。またＳｐａｎ ８５（例えば、１％で）および／またはレシチンも含み得る。これらのエマルションは、２〜１０％スクアレン、２〜１０％トコフェロールおよび０．３〜３％Ｔｗｅｅｎ ８０を有し得、これがより安定なエマルションを提供する場合、スクアレン：トコフェロールの重量比は、１以下が好ましい。スクアレンおよびＴｗｅｅｎ ８０は、約５：２の容量比で存在し得る。そのようなエマルションの１つは、２％溶液を与えるためにＰＢＳ中にＴｗｅｅｎ ８０を溶解し、次いでこの溶液９０ｍｌを（５ｇのＤＬ−α−トコフェロールおよび５ｍｌのスクアレンの）混合物とともに混合し、次いでこの混合物を微細流動化することにより作製され得る。この生じたエマルションは、サブミクロンの油滴（例えば、平均直径が１００ｎｍと２５０ｎｍの間、好ましくは約１８０ｎｍ）を有し得る。
−スクアレン、トコフェロールおよびＴｒｉｔｏｎ洗浄剤（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）のエマルション。そのエマルションはまた、３ｄ−ＭＰＬ（以下参照）を含み得る。そのエマルションは、リン酸緩衝剤を含み得る。
−免疫刺激性オリゴヌクレオチドをまた含む、スクアレン、Ｔｗｅｅｎ ８０、およびＳｐａｎ ８５のサブミクロンエマルション［１４３〜１４５］。容量によるエマルションの組成は、約５％のスクアレン、約０．５％のポリソルベート８０および約０．５％のＳｐａｎ ８５であり得る。重量の項目（ｔｅｒｍ）に関して、これらの比は、参考文献１４６の第１０章および参考文献１４７の第１２章により詳細に記載されるように、４．３％のスクアレン、０．５％のポリソルベート８０および０．４８％のＳｐａｎ ８５になる。エマルションは、有益に、クエン酸イオン（例えば、１０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝剤）を含む。
−ポリソルベート（例えば、ポリソルベート８０）、Ｔｒｉｔｏｎ洗浄剤（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）およびトコフェロール（例えば、コハク酸α−トコフェロール）を含むエマルション。そのエマルションは、約７５：１１：１０（例えば、７５０μｇ／ｍｌのポリソルベート８０、１１０μｇ／ｍｌのＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００および１００μｇ／ｍｌのコハク酸α−トコフェロール）の質量比でこれら３つの成分を含み得、そしてこれらの濃度は、抗原由来のこれらの成分の任意の寄与を含むべきである。そのエマルションはまた、スクアレンを含み得る。そのエマルションはまた、３ｄ−ＭＰＬ（以下参照）を含み得る。その水相は、リン酸緩衝剤を含み得る。
【００９４】
これらの３つの好ましいエマルションは、参考文献１３８に記載されるように、３ｄＭＰＬおよび／またはサポニンを補充され得る。
【００９５】
エマルションは、配布前に抗原と混合され得るか、またはエマルションは、好ましくは、送達時、即時に抗原と混合される。従って、アジュバントおよび抗原は、代表的に包装されたワクチンまたは配布されたワクチンに別個に保たれ、使用時に最終処方物に準備される。この抗原は一般的に水性の形態であり、このワクチンは最終的に２つの液体の混合により調製される。混合のための２つの液体の容量比は、変更し得る（例えば、５：１と１：５の間で）が、一般的に約１：１である。上記抗原およびアジュバントが混合された後、赤血球凝集素抗原は、一般に、水溶液中に残るが、その赤血球凝集素抗原は、それ自体、油／水界面付近に分布し得る。一般に、任意の赤血球凝集素が上記エマルションの油相に進入することは、ほとんどない。
【００９６】
（薬学的組成物）
本発明の組成物は、薬学的に受容可能である。それらの組成物は、スプリット抗原、およびアジュバントに加えて、成分を含み得る（例えば、それらの組成物は、代表的に、１つ以上の薬学的キャリアおよび／または賦形剤を含有する）。そのような成分の徹底的な考察は、参考文献１４８において入手可能である。
【００９７】
組成物は、一般に、水性形態である。上記スプリット抗原およびアジュバントは、代表的に、混合物中にある。
【００９８】
上記組成物は、チオメルサールまたは２−フェノキシエタノールなどの保存剤を含み得る。しかし、上記ワクチンは実質的に水銀物質を含まない（すなわち、５μｇ／ｍｌ未満）（例えば、チオメルサールを含まない）べき［１１、１４９］であることが、好ましい。水銀を含まないワクチンが、より好ましく、そしてこれは、参考文献１１に従ってトコフェロール含有アジュバントを使用する場合、従来通り達成され得る。保存剤を含まないワクチンが、特に好ましい。
【００９９】
張度を制御するために、生理的塩（例えば、ナトリウム塩）を含有することが好ましい。塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）が好ましく、その塩化ナトリウムは、１ｍｇ／ｍｌと２０ｍｇ／ｍｌとの間で存在し得る。存在し得る他の塩としては、塩化カリウム、二水素リン酸カリウム、無水二ナトリウムリン酸塩、塩化マグネシウム、塩化カルシウムなどが挙げられる。
【０１００】
組成物は、一般に２００ｍＯｓｍ／ｋｇと４００ｍＯｓｍ／ｋｇとの間、好ましくは２４０ｍＯｓｍ／ｋｇ〜３６０ｍＯｓｍ／ｋｇの間の浸透圧モル濃度を有し、より好ましくは２９０〜３１０ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲内となる。浸透圧モル濃度は、ワクチン接種により引き起こされる痛みに対して影響を有しないことが以前に報告されている［１５０］が、この範囲に浸透圧モル濃度を維持することが、やはり好ましい。
【０１０１】
組成物は、１つ以上の緩衝剤を含有し得る。代表的な緩衝剤としては、以下が挙げられる：リン酸緩衝剤；Ｔｒｉｓ緩衝剤；ホウ酸緩衝剤；コハク酸緩衝剤；ヒスチジン緩衝剤（特に、水酸化アルミニウムアジュバントを含む）；またはクエン酸緩衝剤。緩衝剤は、代表的に５〜２０ｍＭの範囲で含有される。リン酸緩衝化生理食塩水中に形成されるエマルションが、便宜的に使用され得る。
【０１０２】
組成物のｐＨは、一般に、５．０と８．１との間、より代表的には６．０と８．０との間、例えば、６．５と７．５との間、または７．０と７．８との間である。したがって、本発明の方法は、包装前にバルクワクチンのｐＨを調整する工程を包含し得る。
【０１０３】
上記組成物は、好ましくは、無菌である。上記組成物は、好ましくは、非発熱性である（例えば、１用量あたり＜１ＥＵ（エンドトキシン単位、標準的な測定単位）、そして好ましくは１用量あたり＜０．１ＥＵを含む）。上記組成物は、好ましくは、グルテンを含まない。
【０１０４】
上記組成物は、単回免疫感作のための物質を含んでも、複数回免疫感作（すなわち、「複数回用量」キット）のための物質を含んでもよい。保存剤を含むことが、複数回用量の準備において好ましい。複数回用量組成物中に保存剤を含むことの代わりとして（またはそれに加えて）、その組成物は、物質を除去するための無菌のアダプターを有する容器中に含まれ得る。
【０１０５】
インフルエンザワクチンは、代表的に、約０．５ｍｌの投薬容量で投与されるが、半用量（すなわち、約０．２５ｍｌ）が、小児に投与され得る。
【０１０６】
組成物およびキットは、好ましくは、２℃と８℃との間にて保存される。それらは、凍結されるべきではない。それらは、理想的には、直接的な光から免れるべきである。
【０１０７】
（本発明のキット）
本発明の組成物は、送達時において即座に調製され得る。したがって、本発明は、混合のために調整された種々の成分を備えるキットを提供する。上記キットは、上記アジュバントおよび上記抗原が使用時まで別々に保持されることを可能にし、そのことは、水中油型エマルションアジュバントを使用する場合に有用であり得る。
【０１０８】
上記成分は、上記キット内で、互いから物理的に分離した形態であり、そしてこの分離は、種々の手段で達成され得る。例えば、上記２つの成分は、２つの分離したバイアルなどの容器中にあり得る。次いで、上記２つのバイアルの成分は、例えば、一方のバイアルの成分を取り出し、そしてそれらを他方のバイアルに添加すること、または両方のバイアルの成分を別々に取り出し、そしてそれらを第３の容器中で混合することによって混合され得る。
【０１０９】
好ましい構成（ａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ）において、キット成分のうちの一方は、注射器中にあり、そして他方は、バイアルなどの容器中にある。注射器（例えば、針を有する）が、その成分を混合のための第２の容器中に挿入するために使用され得、次いでその混合物は、その注射器中に引かれ得る。次いで、その注射器の混合された成分は、代表的に、新規の滅菌針を通して患者に投与され得る。注射器中に１つの成分を包装することは、患者への投与のために別個の注射器を使用する必要性を排除する。
【０１１０】
別の好ましい構成において、上記２つのキット成分は、同じ注射器（例えば、二重室注射器（ｄｕａｌ−ｃｈａｍｂｅｒ ｓｙｒｉｎｇｅ）（例えば、参考文献１５１〜１５８などに開示されるもの））において、一緒であるが分離して保持される。その注射器が、作動される場合（例えば、患者に対する投与の間）、その２つの室の成分は、混合される。この構成は、使用時における別個の混合工程に対する必要性を回避する。
【０１１１】
上記キット成分は、一般に、水性形態である。いくつかの構成において、一方の成分（代表的に、アジュバント成分よりもむしろ抗原成分）は、乾燥形態（例えば、凍結乾燥された形態）であり、他方の成分は、水性形態である。上記２つの成分は、上記乾燥成分を再活性化し、そして患者に対する投与のための水性組成物を得るために混合され得る。凍結乾燥された成分は、代表的に、注射器よりもむしろバイアル内におかれる。乾燥された成分は、安定剤（例えば、乳糖、ショ糖またはマンニトール、およびそれらの混合物（例えば、乳糖／ショ糖混合物、ショ糖／マンニトール混合物）など）を含み得る。１つの可能な構成は、予め充填された注射器中の水性アジュバント成分およびバイアル中の凍結乾燥された抗原成分を使用する。
【０１１２】
（組成物またはキット成分の包装）
本発明の組成物（またはキット成分）に適した容器としては、バイアル、注射器（例えば、使い捨て可能な注射器）、点鼻スプレーなどが挙げられる。これらの容器は、無菌であるべきである。
【０１１３】
組成物／成分が、バイアル中におかれる場合、そのバイアルは、ガラス材料またはプラスチック材料から作製される。上記バイアルは、好ましくは、上記組成物／成分がそのバイアルに添加される前に滅菌される。ラテックス感受性患者に関する懸案事項を回避するために、バイアルは、ラテックスを含まないストッパーによって密封され得、そして全ての包装用物質中にラテックスが存在しないことが、好ましい。上記バイアルは、単回用量のワクチンを含み得るか、またはそのバイアルは、１つよりも多い用量（例えば１０用量）を含み得る（「複数回用量」バイアル）。好ましいバイアルは、無色のガラスから作製される。
【０１１４】
バイアルは、予め充填された注射器がそのキャップ中に挿入され得るように適合したキャップ（例えば、Ｌｕｅｒロック）を有し得、その注射器の内容物は、（例えば、その中の凍結乾燥された物質を再構成するために）そのバイアル中に排出され得、そしてそのバイアルの内容物は、その注射器中に戻され得る。上記バイアルから上記注射器を取り外した後、次いで針が、接続され得、そして組成物が、患者に投与され得る。上記キャップが、好ましくは、シールまたはカバーの内側に配置されて、そのシールまたはカバーは、そのキャップが接触され得る前に取り外される必要がある。バイアルは、特に、複数回用量バイアルに関して、その内容物の無菌的な取り出しを可能にするキャップを有し得る。
【０１１５】
成分が、注射器中に包装される場合、その注射器は、それに接続された針を有し得る。針が接続されない場合、別個の針が、組み立ておよび使用のために注射器とともに提供され得る。そのような針は、シースで覆う（ｓｈｅａｔｈｅ）ことができる。安全針が、好ましい。１インチ２３ゲージの針、１インチ２５ゲージの針および５／８インチ２５ゲージの針が、代表的である。注射器には、その上に内容物のロット番号、インフルエンザの時期および使用期限日がプリントされ得る剥ぎ取りラベルが提供され得、記録維持を容易にする。上記注射器中のプランジャーは、好ましくは、ストッパーを有し、プランジャーが吸引の間に偶発的に外れることを防ぐ。上記注射器は、ラテックスゴムキャップおよび／またはプランジャーを有し得る。使い捨て可能な注射器は、単回用量のワクチンを含む。上記注射器は、一般に、針の接続前に先端を密封するために先端キャップを有し、そしてその先端キャップは、好ましくは、ブチルゴムから作製される。上記注射器と針とが別個に包装される場合、その針は、好ましくは、ブチルゴムシールドが取り付けられる。好ましい注射器は、商標名「Ｔｉｐ−Ｌｏｋ」ＴＭで市販されるものである。
【０１１６】
容器は、半用量の容量を示して、例えば、小児に対する送達を容易にするために、標識され得る。例えば、０．５ｍｌ用量を含む注射器は、０．２５ｍｌ容量を示す標識を有し得る。
【０１１７】
ガラス容器（例えば、注射器またはバイアル）が使用される場合、ソーダ石灰ガラス製の容器よりもホウケイ酸ガラス製の容器を用いることが好ましい。
【０１１８】
キットまたは組成物は、上記ワクチンの詳細（例えば、投与のための指示書、ワクチン内の抗原の詳細など）を含む印刷物と一緒に（例えば、同じ箱中に）含まれ得る。その指示書はまた、警告、例えば、ワクチン接種の後のアナフィラキシー反応の場合、直ちに利用できるようにアドレナリンの溶液を準備しておくことなどを含み得る。
【０１１９】
（処置およびワクチンの投与の方法）
本発明の組成物は、ヒト患者への投与に適しており、そして本発明は、患者における免疫応答を惹起する方法を提供し、本発明の組成物をその患者に投与する工程を包含する。
【０１２０】
本発明はまた、医薬として使用するための本発明のキットまたは組成物を提供する。
【０１２１】
本発明はまた、患者における免疫応答を惹起するための医薬の製造における、（ｉ）細胞培養物において増殖されたウイルスから調製されたスプリットインフルエンザウイルス抗原および（ｉｉ）完全にアルミニウム塩から構成されないアジュバントの使用を提供する。
【０１２２】
本発明はまた、患者における免疫応答を惹起するための医薬の製造における、（ｉ）卵タンパク質を全く含まないスプリットインフルエンザウイルス抗原および（ｉｉ）完全にアルミニウム塩から構成されないアジュバントの使用を提供する。
【０１２３】
本発明はまた、患者における免疫応答を惹起するための医薬の製造における、（ｉ）細胞培養物において増殖されたウイルスから調製されたスプリットインフルエンザウイルス抗原および（ｉｉ）Ｔｈ１アジュバントの使用を提供する。
【０１２４】
本発明はまた、患者における免疫応答を惹起するための医薬の製造における、（ｉ）卵タンパク質を全く含まないスプリットインフルエンザウイルス抗原および（ｉｉ）Ｔｈ１アジュバントの使用を提供する。
【０１２５】
これらの方法および使用によって惹起された免疫応答は、一般に、抗体応答（好ましくは、防御的な抗体応答）を含む。インフルエンザウイルスワクチン接種後の抗体応答、中和能力および防御を評価するための方法は、当該分野において周知である。ヒト研究は、ヒトインフルエンザウイルスの赤血球凝集素に対する抗体力価が防御と相関することを示している（約３０〜４０の血清サンプル赤血球凝集−抑制力価は、同種のウイルスによる感染に対する約５０％の防御を与える）［１５９］。抗体応答は、代表的に、赤血球凝集抑制、マイクロ中和、一次元放射状免疫拡散（ＳＲＩＤ）、および／または単純放射溶血（ｓｉｎｇｌｅ ｒａｄｉａｌ ｈｅｍｏｌｙｓｉｓ）（ＳＲＨ）によって測定される。これらのアッセイ技術は、当該分野において周知である。
【０１２６】
本発明の組成物は、種々の手段で投与され得る。最も好ましい免疫感作経路は、筋肉内注射（例えば、腕または脚）によるものであるが、他の利用可能な経路としては、皮下注射、鼻腔内［１６０〜１６２］、経口［１６３］、皮内［１６４、１６５］、経皮（ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ）、経皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）［１６６］などが挙げられる。
【０１２７】
本発明に従って調製されるワクチンは、小児および成人の両方を処置するために使用され得る。インフルエンザワクチンは、最近、小児および成人の免疫感作における６月齢からの使用について推奨される。したがって、上記患者は、１歳未満、１〜５歳、５〜１５歳、１５〜５５歳、または少なくとも５５歳であり得る。上記ワクチンを受容するための好ましい患者は、高齢者（例えば、５０歳以上、６０歳以上、および好ましくは６５歳以上）、若年者（例えば５歳以下）、入院患者、医療従事者、国軍および軍人、妊婦、慢性疾患患者、免疫不全患者、そのワクチンを受容する前の７日間において抗ウイルス化合物（例えば、オセルタミビルまたはザナミビル化合物；以下を参照のこと）を摂取している患者、卵アレルギーを有する者および海外渡航者である。上記ワクチンは、これらの群に対してのみ適しているわけではないが、より一般的には集団において使用され得る。流行株に関して、全ての年齢群に対する投与が、好ましい。
【０１２８】
本発明の好ましい組成物は、効力に関してＣＰＭＰ判定基準の１、２または３を満たす。成人（１８〜６０歳）において、これらの基準は、（１）７０％以上のセロプロテクション（ｓｅｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ）；（２）４０％以上のセロコンバージョン；および／または（３）２．５倍以上のＧＭＴ増加である。高齢者（＞６０歳）において、これらの判定基準は、（１）６０％以上のセロプロテクション；（２）３０％以上のセロコンバージョン；および／または（３）２倍以上のＧＭＴ増加である。これらの判定基準は、少なくとも５０人の患者による非盲検研究に基づく。
【０１２９】
処置は、単回用量スケジュールまたは複数回用量スケジュールによるものであり得る。複数回用量は、一次免疫感作スケジュールおよび／または追加免疫感作スケジュールにおいて使用され得る。複数回用量スケジュールにおいて、種々の用量は、同じかまたは異なる経路（例えば、非経口によるプライム（ｐｒｉｍｅ）および粘膜によるブースト（ｂｏｏｓｔ）、粘膜によるプライムおよび非経口によるブーストなど）によって与えられ得る。１つより多い用量（代表的に、２用量）の投与は、特に、免疫学的にナイーブな患者において有用である（例えば、以前にインフルエンザワクチンを受容したことがない者のためか、または新規のＨＡサブタイプに対してワクチン接種するため（流行の発生において））。複数回用量は、代表的に、少なくとも１週間（例えば、約２週間、約３週間、約４週間、約６週間、約８週間、約１０週間、約１２週間、約１６週間など）の間隔を空けて投与される。
【０１３０】
本発明によって産生されるワクチンは、他のワクチン（麻疹ワクチン、流行耳下腺炎ワクチン、風疹ワクチン、ＭＭＲワクチン、水痘ワクチン、ＭＭＲＶワクチン、ジフテリアワクチン、破傷風ワクチン、百日咳ワクチン、ＤＴＰワクチン、結合体化ｂ型Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅワクチン、不活性化ポリオウイルスワクチン、Ｂ型肝炎ウイルスワクチン、髄膜炎菌結合体ワクチン（例えば、四価Ａ−Ｃ−Ｗ１３５−Ｙワクチン）、ＲＳウイルスワクチン、肺炎球菌結合体ワクチンなど）と実質的に同時（例えば、医療専門家またはワクチン接種センターへの同一の医学的な対診または診察の間）に患者に対して投与され得る。肺炎球菌ワクチンおよび／または髄膜炎菌ワクチンと実質的に同時の投与は、特に、高齢患者において有用である。
【０１３１】
同様に、本発明のワクチンは、抗ウイルス化合物、および特に、インフルエンザウイルスに対して活性な抗ウイルス化合物（例えば、オセルタミビルおよび／またはザナミビル）と実質的に同時（例えば、医療専門家による同一の医学的な対診または診察の間）に患者に対して投与され得る。これらの抗ウイルス剤としては、ノイラミニダーゼインヒビター（例えば、（３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）−４−アセチルアミノ−５−アミノ−３（１−エチルプロポキシ）−１−シクロヘキセン−１−カルボン酸、または５−（アセチルアミノ）−４−［（アミノイミノメチル）−アミノ］−２，６−アンヒドロ−３，４，５−トリデオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクトノン−２−エノン酸（そのエステル（例えば、エチルエステル）およびその塩（例えば、リン酸塩）を含む））が挙げられる。好ましい抗ウイルス剤は、（３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）−４−アセチルアミノ−５−アミノ−３（１−エチルプロポキシ）−１−シクロヘキセン−１−カルボン酸，エチルエステル，ホスフェート（１：１）（リン酸オセルタミビル（ＴＡＭＩＦＬＵＴＭ）としても公知である）である。
【０１３２】
（一般）
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「含有する（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「からなる」を包含し、例えば、Ｘを「含む」組成物は、専らＸからなり得るか、またはさらなる何かを含有し得る（例えば、Ｘ＋Ｙ）。
【０１３３】
語「実質的に」は、「完全に」を排除せず、例えば、Ｙを「実質的に含まない」組成物は、Ｙを完全に含まなくても良い。必要である場合、語「実質的に」は、本発明の定義から省略され得る。
【０１３４】
数値ｘに関する用語「約」は、例えば、ｘ±１０％を意味する。
【０１３５】
詳細に述べられていなければ、２つ以上の成分を混合する工程を含むプロセスは、混合の任意の特定の順序を要求しない。したがって、成分は任意の順序で混合され得る。３つの成分が存在するとき、そのときは、２つの成分が互いと組み合わされ得、そして次にこの組み合わせが、第３の成分と組み合わされ得るなどである。
【０１３６】
動物（および特にウシ）材料が細胞の培養に使用される場合、それらを、伝染性海綿状脳症（ＴＳＥ）のない、および特にウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）のない供給源から取得しなければならない。総合的に、動物に由来する材料の完全な非存在下で細胞を培養することが、好ましい。
【０１３７】
化合物が、組成物の部分として投与される場合、その化合物は、代替的に、適切なプロドラッグによって置換され得る。
【０１３８】
細胞基質が、リアソータント手順または逆方向遺伝学手順のために使用される場合、それは、好ましくは、例えば、Ｐｈ Ｅｕｒ総論（ｇｅｎｅｒａｌ ｃｈａｐｔｅｒ）５．２．３にあるようなヒトワクチン生産における使用について承認されているものである。
【実施例】
【０１３９】
（本発明を実施するための様式）
（Ｔｈ１応答を促す水中油型エマルションアジュバント）
２種の市販のアジュバント添加しなかったスプリットビリオン三価インフルエンザワクチン（「ＳＰＬＩＴ（Ａ）」および「ＳＰＬＩＴ（Ｂ）」）を、入手し、そしてマウスを免疫感作するために０．２μｇのＨＡの用量で使用した。ワクチンは、アジュバント添加されなかったか、または（ｉ）水酸化アルミニウム、もしくは（ｉｉ）ＭＦ５９エマルションと１０μｇの免疫刺激性ＣｐＧオリゴヌクレオチドとの混合物を用いてアジュバント添加されたかのいずれかで使用した。８匹の雌Ｂａｌｂ／Ｃマウス（８週齢）の群を、０日目および２８日目において、５０μｌ用量の上記ワクチンを用いて筋肉内に免疫感作した。血清を、１４日目および４２日目に入手し、そしてその血清を、抗ＨＡ力価（ＩｇＧ）、ＨＩ力価およびＴ細胞について分析した。
【０１４０】
４２日目における血清ＩｇＧ抗体力価（ＥＬＩＳＡ）は、各ウイルスを個別に見て、以下の通りであった：
【０１４１】
【化４】
【０１４２】
４２日目におけるＨＩ血清抗体力価は、以下の通りであった：
【０１４３】
【化５】
【０１４４】
図１に示した通り、アジュバントされていないワクチンは、非常に低いレベルの抗原特異的Ｔ細胞を誘発した。水酸化アルミニウム（ａｌｕｍ）アジュバントは、Ｔｈ２に偏った様式でレベルを増大させ：１匹のマウスにおいて、水酸化アルミニウムは、ＩＬ−５＋ ＩＦＮ−γ− ＴＮＦ−α− Ｔ細胞（すなわち、Ｔｈ２型）の大きな増加を引き起こしたが、ＩＬ−５− ＩＦＮ−γ＋ ＴＮＦ−α＋細胞（すなわち、Ｔｈ１型）は、見られなかった。対照的に、ＭＦ５９とＣｐＧオリゴヌクレオチドとの組合せは、抗原特異的Ｔ細胞の数の大きな増加、およびまた、Ｔｈ１型応答への移行の両方を引き起こした。
【０１４５】
したがって、スプリットインフルエンザワクチンによって誘発される抗原特異的Ｔ細胞の数を上昇させるため、およびまた、免疫応答をＴｈ１型応答へと移行させるために、水中油型エマルションアジュバントを使用することが、可能である。対照的に、水酸化アルミニウムアジュバントは、Ｔｈ２型応答を伴って低いレベルのＴ細胞を誘発する。
【０１４６】
（ヒト試験［参考文献１６７］）
参考文献１６７に記載される通り、スプリットインフルエンザワクチンを、２種の油（α−トコフェロールおよびスクアレン）から作製した有機相と、乳化剤としてＴｗｅｅｎ ８０を含むリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）の水性相とを有する水中油型エマルションを用いてアジュバント添加した。それは、２．５％のスクアレン（ｖ／ｖ）、２．５％のα−トコフェロール（ｖ／ｖ）、および０．９％のポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート（ｖ／ｖ）（Ｔｗｅｅｎ ８０）の最終濃度を有する。それを、最初に、インフルエンザ抗原との混合のために２倍濃縮物として調製した。このエマルションは、Ｔｈ１誘導性アジュバントであることが報告される。
【０１４７】
上記エマルションを、２％溶液を与えるようにＴｗｅｅｎ ８０をＰＢＳに溶解することによって調製した。１００ｍｌの２倍濃縮物を提供するために、５ｇのＤ，Ｌ−α−トコフェロールおよび５ｍｌのスクアレンを、ボルテックスして、それらを徹底的に混合した。９０ｍｌのＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ溶液を、その油混合物に添加し、そして徹底的に混合した。次いで、得られたエマルションを、注射器に通し、そして最終的に、微細流動化した。得られた油滴は、約１２０〜１８０ｎｍのサイズ（Ｚ平均）を有する。
【０１４８】
コントロール実験において、上記エマルションは、含まれなかった。
【０１４９】
三価ワクチンを、ヒト高齢患者に投与した。体液性免疫応答および細胞性免疫応答を、参考文献１６７に記載されるように、その患者において測定した。セロプロテクションおよびセロコンバージョンを、決定した。
【０１５０】
セロプロテクション率およびセロコンバージョン率は、以下の通りであった（左＝コントロール；右＝アジュバント添加）：
【０１５１】
【化６】
【０１５２】
抗ＨＡ抗体応答は、以下の通りであった：
【０１５３】
【化７】
【０１５４】
アジュバント添加していないコントロールワクチンとエマルションアジュバント添加したワクチンとの間のＴｈ１応答およびＴｈ２応答を比較するために、サイトカイン応答を、アッセイした。免疫感作した患者から採取したＣＤ４＋ Ｔ細胞を、スプリット抗原によって再刺激し、そして（ｉ）少なくともインターフェロン−γ（Ｔｈ１応答を示す）、および１つの他のＩＬ−２、ＴＮＦαまたはＣＤ４０Ｌを分泌する数；あるいは（ｉｉ）少なくともＩＬ−２（再び、Ｔｈ１応答を示す）、および１つの他のＩＦＮ−γ、ＴＮＦαまたはＣＤ４０Ｌを分泌する数；について評価した。結果（免疫感作の前後における違いとして示した）は、以下の通りである：
【０１５５】
【化８】
【０１５６】
上記アジュバント添加したワクチンは、アジュバントしていないコントロールよりも大きいＴｈ１型応答を示す。したがって、上記トコフェロール含有アジュバントは、スプリットインフルエンザワクチンのＴｈ１／Ｔｈ２バランスをモジュレートし得る。
【０１５７】
本発明は例示のみによって記載され、そして改変は本発明の範囲および精神の中にあるままでもなされ得ることが、理解される。
【０１５８】
（参考文献（その内容は、本明細書によって参考として援用される））
【０１５９】
【化９】
【０１６０】
【化１０】
【０１６１】
【化１１−１】
【０１６２】
［９８］米国特許第４６８９３３８号、同第４９２９６２４号、同第５２３８９４４号、同第５２６６５７５号、同第５２６８３７６号、同第５３４６９０５号、同第５３５２７８４号、同第５３８９６４０号、同第５３９５９３７号、同第５４８２９３６号、同第５４９４９１６号、同第５５２５６１２号、同第６０８３５０５号、同第６４４０９９２号、同第６６２７６４０号、同第６６５６９３８号、同第６６６０７３５号、同第６６６０７４７号、同第６６６４２６０号、同第６６６４２６４号、同第６６６４２６５号、同第６６６７３１２号、同第６６７０３７２号、同第６６７７３４７号、同第６６７７３４８号、同第６６７７３４９号、同第６６８３０８８号、同第６７０３４０２号、同第６７４３９２０号、同第６８００６２４号、同第６８０９２０３号、同第６８８８０００号および６９２４２９３号．
【０１６３】
【化１１−２】
【０１６４】
【化１２】
【図面の簡単な説明】
【０１６５】
【図１】図１は、サイトカイン陽性細胞の数を、全ＣＤ４＋細胞のうちの％として示す。２匹の個々のマウス由来の応答が、示される。マウスは、アジュバントされていないか、あるいは（ｉ）水酸化アルミニウム（ａｌｕｍ）または（ｉｉ）ＣｐＧオリゴヌクレオチドを伴うＭＦ５９を用いてアジュバント添加されたかのいずれかであるスプリットワクチン「Ａ」またはスプリットワクチン「Ｂ」によって免疫感作された。
【図２】図２は、本発明と一緒に使用するための３ｄＭＰＬの最も好ましい形態の式を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
スプリットインフルエンザウイルス抗原とＴｈ１アジュバントとを含む免疫原性組成物であって、該抗原は、細胞培養物において増殖されたウイルスから調製され、そしていかなる卵タンパク質も含まない、免疫原性組成物。
【請求項２】
前記インフルエンザウイルス抗原は、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ７またはＨ９のインフルエンザＡ型ウイルスサブタイプ由来である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記組成物は、オボアルブミン、オボムコイドおよびニワトリＤＮＡを含まない、請求項１または請求項２の組成物。
【請求項４】
前記ウイルスは、ＭＤＣＫ；Ｖｅｒｏ；およびＰＥＲ．Ｃ６からなる群より選択される細胞株の細胞培養物において増殖される、請求項１〜３のいずれかに記載の組成物。
【請求項５】
前記組成物は、前記細胞培養物の宿主由来の１０ｎｇ未満の細胞ＤＮＡを含む、請求項１〜４のいずれかに記載の組成物。
【請求項６】
前記組成物は、１００ヌクレオチド以上である１０ｎｇ未満のＤＮＡを含む、請求項１〜５のいずれかに記載の組成物。
【請求項７】
前記組成物は、１ウイルス株あたり０．１μｇと２０μｇとの間の赤血球凝集素を含む、請求項１〜６のいずれかに記載の組成物。
【請求項８】
前記アジュバントは、トコフェロールを含む、請求項１〜７のいずれかに記載の組成物。
【請求項９】
前記トコフェロールは、ＤＬ−α−トコフェロールである、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記アジュバントは、水中油型エマルションの形態である、請求項１〜９のいずれかに記載の組成物。
【請求項１１】
前記エマルションは、サブミクロンの直径を有する小滴を有する、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記インフルエンザウイルス抗原は、Ａ／ＰＲ／８／３４インフルエンザウイルス由来の１種以上のＲＮＡセグメントを有するインフルエンザウイルスから調製される、請求項１〜１１のいずれかに記載の組成物。
【請求項１３】
前記インフルエンザウイルス抗原は、逆方向遺伝学技術によって得られたインフルエンザウイルスから調製される、請求項１〜１２のいずれかに記載の組成物。
【請求項１４】
前記細胞培養は、マイクロキャリア培養、付着培養、または懸濁培養である、請求項１〜１３のいずれかに記載の組成物。
【請求項１５】
前記細胞培養物は、血清を含まない、請求項１〜１４のいずれかに記載の組成物。
【請求項１６】
前記アジュバントは、３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡ（３ｄＭＰＬ）を含む、請求項１〜１５のいずれかに記載の組成物。
【請求項１７】
前記３ｄＭＰＬのうち少なくとも１０重量％は、ヘキサアシル鎖形態である、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
前記３ｄＭＰＬは、１５０ｎｍ未満の直径を有する粒子の形態である、請求項１６または請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
水銀物質を実質的に含まない、請求項１〜１８のいずれかに記載の組成物。
【請求項２０】
１ｍｇ／ｍｌと２０ｍｇ／ｍｌとの間の塩化ナトリウムを含む、請求項１〜１９のいずれかに記載の組成物。
【請求項２１】
２００ｍＯｓｍ／ｋｇと４００ｍＯｓｍ／ｋｇとの間の浸透圧モル濃度を有する、請求項１〜２０のいずれかに記載の組成物。
【請求項２２】
１種以上の緩衝剤を含む、請求項１〜２１のいずれかに記載の組成物。
【請求項２３】
前記緩衝剤は、リン酸緩衝剤；Ｔｒｉｓ緩衝剤；ホウ酸緩衝剤；コハク酸緩衝剤；ヒスチジン緩衝剤；またはクエン酸緩衝剤を含む、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
５．０と８．１との間のｐＨを有する、請求項１〜２３のいずれかに記載の組成物。
【請求項２５】
１用量あたり１未満のエンドトキシン単位を含む、請求項１〜２４のいずれかに記載の組成物。
【請求項２６】
グルテンを含まない、請求項１〜２５のいずれかに記載の組成物。
【請求項２７】
前記組成物は、２種のインフルエンザＡ型株および１種のインフルエンザＢ型株を含む、請求項１〜２６のいずれかに記載の組成物。
【請求項２８】
前記組成物は、流行性インフルエンザウイルス株に対する一価ワクチンである、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２９】
スプリットインフルエンザウイルス抗原と水中油型エマルションとを含む免疫原性組成物であって、（ａ）該抗原は、細胞培養物において増殖されたウイルスから調製され、かつ（ｂ）該水中油型エマルションは、トコフェロールを含む、免疫原性組成物。
【請求項３０】
前記エマルションは、スクアレン、トコフェロール、およびポリソルベート８０を含む、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１】
スプリットインフルエンザウイルス抗原とＴｈ１アジュバントとを含む免疫原性組成物であって、該抗原は、細胞培養物において増殖されたウイルスから調製され、そしていかなる卵タンパク質も含まない、免疫原性組成物。
【請求項２】
前記インフルエンザウイルス抗原は、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ７またはＨ９のインフルエンザＡ型ウイルスサブタイプ由来である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記組成物は、オボアルブミン、オボムコイドおよびニワトリＤＮＡを含まない、請求項１または請求項２の組成物。
【請求項４】
前記ウイルスは、ＭＤＣＫ；Ｖｅｒｏ；およびＰＥＲ．Ｃ６からなる群より選択される細胞株の細胞培養物において増殖される、請求項１〜３のいずれかに記載の組成物。
【請求項５】
前記組成物は、前記細胞培養物の宿主由来の１０ｎｇ未満の細胞ＤＮＡを含む、請求項１〜４のいずれかに記載の組成物。
【請求項６】
前記組成物は、１００ヌクレオチド以上である１０ｎｇ未満のＤＮＡを含む、請求項１〜５のいずれかに記載の組成物。
【請求項７】
前記組成物は、１ウイルス株あたり０．１μｇと２０μｇとの間の赤血球凝集素を含む、請求項１〜６のいずれかに記載の組成物。
【請求項８】
前記アジュバントは、トコフェロールを含む、請求項１〜７のいずれかに記載の組成物。
【請求項９】
前記トコフェロールは、ＤＬ−α−トコフェロールである、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記アジュバントは、水中油型エマルションの形態である、請求項１〜９のいずれかに記載の組成物。
【請求項１１】
前記エマルションは、サブミクロンの直径を有する小滴を有する、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記インフルエンザウイルス抗原は、Ａ／ＰＲ／８／３４インフルエンザウイルス由来の１種以上のＲＮＡセグメントを有するインフルエンザウイルスから調製される、請求項１〜１１のいずれかに記載の組成物。
【請求項１３】
前記インフルエンザウイルス抗原は、逆方向遺伝学技術によって得られたインフルエンザウイルスから調製される、請求項１〜１２のいずれかに記載の組成物。
【請求項１４】
前記細胞培養は、マイクロキャリア培養、付着培養、または懸濁培養である、請求項１〜１３のいずれかに記載の組成物。
【請求項１５】
前記細胞培養物は、血清を含まない、請求項１〜１４のいずれかに記載の組成物。
【請求項１６】
前記アジュバントは、３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡ（３ｄＭＰＬ）を含む、請求項１〜１５のいずれかに記載の組成物。
【請求項１７】
前記３ｄＭＰＬのうち少なくとも１０重量％は、ヘキサアシル鎖形態である、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
前記３ｄＭＰＬは、１５０ｎｍ未満の直径を有する粒子の形態である、請求項１６または請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
水銀物質を実質的に含まない、請求項１〜１８のいずれかに記載の組成物。
【請求項２０】
１ｍｇ／ｍｌと２０ｍｇ／ｍｌとの間の塩化ナトリウムを含む、請求項１〜１９のいずれかに記載の組成物。
【請求項２１】
２００ｍＯｓｍ／ｋｇと４００ｍＯｓｍ／ｋｇとの間の浸透圧モル濃度を有する、請求項１〜２０のいずれかに記載の組成物。
【請求項２２】
１種以上の緩衝剤を含む、請求項１〜２１のいずれかに記載の組成物。
【請求項２３】
前記緩衝剤は、リン酸緩衝剤；Ｔｒｉｓ緩衝剤；ホウ酸緩衝剤；コハク酸緩衝剤；ヒスチジン緩衝剤；またはクエン酸緩衝剤を含む、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
５．０と８．１との間のｐＨを有する、請求項１〜２３のいずれかに記載の組成物。
【請求項２５】
１用量あたり１未満のエンドトキシン単位を含む、請求項１〜２４のいずれかに記載の組成物。
【請求項２６】
グルテンを含まない、請求項１〜２５のいずれかに記載の組成物。
【請求項２７】
前記組成物は、２種のインフルエンザＡ型株および１種のインフルエンザＢ型株を含む、請求項１〜２６のいずれかに記載の組成物。
【請求項２８】
前記組成物は、流行性インフルエンザウイルス株に対する一価ワクチンである、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２９】
スプリットインフルエンザウイルス抗原と水中油型エマルションとを含む免疫原性組成物であって、（ａ）該抗原は、細胞培養物において増殖されたウイルスから調製され、かつ（ｂ）該水中油型エマルションは、トコフェロールを含む、免疫原性組成物。
【請求項３０】
前記エマルションは、スクアレン、トコフェロール、およびポリソルベート８０を含む、請求項１１に記載の組成物。
【図１】
【図２】
【図２】
【公表番号】特表２００９−５１４８４２（Ｐ２００９−５１４８４２Ａ）
【公表日】平成２１年４月９日（２００９．４．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５３８４２１（Ｐ２００８−５３８４２１）
【出願日】平成１８年１１月６日（２００６．１１．６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００６／００４１３６
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０５２０５９
【国際公開日】平成１９年５月１０日（２００７．５．１０）
【出願人】（５０７２３８２８５）ノバルティス ヴァクシンズ アンド ダイアグノスティクス エスアールエル (35)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年４月９日（２００９．４．９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１１月６日（２００６．１１．６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００６／００４１３６
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０５２０５９
【国際公開日】平成１９年５月１０日（２００７．５．１０）
【出願人】（５０７２３８２８５）ノバルティス ヴァクシンズ アンド ダイアグノスティクス エスアールエル (35)
【Ｆターム（参考）】
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