【課題】組織もしくは細胞から得られたＤＮＡのサンプル中のＡＡＶ配列の検出および単離方法を提供する。本方法により同定されるＡＡＶ配列およびこれらの方法を使用して構築されるベクターを提供する。
【解決手段】ヘルパーウイルスの共感染の非存在下でのＡＡＶの潜伏性および組込みの性質に基づく生物情報学分析、ＰＣＲに基づく遺伝子増幅、およびクローニング技術を使用する多様なヒトおよび非ヒト霊長類（ＮＨＰ）組織の細胞ＤＮＡからのＡＡＶ配列の新規検出および同定方法。新規ＡＡＶ配列の単離方法。新規ＡＡＶ血清型に基づくベクターの生成方法。

【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
パルボウイルス科のファミリーの１メンバー、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は４．７キロ塩基（ｋｂ）ないし６ｋｂの一本鎖直鎖状ＤＮＡゲノムをもつ小型のエンベロープを持たない二十面体ウイルスである。ＡＡＶは、精製されたアデノウイルスのストック中の汚染物質として該ウイルスが発見されたためデペンドウイルス属に割り当てられている。ＡＡＶの生活環はＡＡＶゲノムが感染後に宿主染色体中に部位特異的に組込まれる潜伏期、ならびに組込まれたゲノムがアデノウイルスもしくは単純疱疹ウイルスのいずれかの感染後にその後レスキュー、複製され、そして感染性ウイルス中にパッケージングされる感染期を包含する。非病原性の特性、非分裂細胞を包含する広範な感染の宿主範囲および潜在的な部位特異的染色体組込みは、ＡＡＶを遺伝子移入のための魅力的なツールにする。
【０００２】
最近の研究はＡＡＶベクターが遺伝子治療に好ましいベヒクルであるかもしれないことを示唆している。今日まで、ヒトもしくは非ヒト霊長類（ＮＨＰ）から単離されかつ十分に特徴づけられた６種の異なる血清型のＡＡＶが存在する。それらのなかで、ヒト血清型２は遺伝子移入ベクターとして開発された最初のＡＡＶであり；それは多様な標的組織および動物モデルにおける効率的な遺伝子移入実験に広範に使用されている。いくつかのヒト疾患のモデルへのＡＡＶ２に基づくベクターの実験的応用の臨床試験が進行中であり、そして嚢胞性線維症および血友病Ｂのような疾患を包含する。
【０００３】
望ましいものは遺伝子送達のためのＡＡＶに基づく構築物である。
【発明の概要】
【０００４】
［発明の要約］
一局面において、本発明は、ヘルパーウイルスの共感染の非存在下でのＡＡＶの潜伏性および組込みの性質に基づく生物情報学分析、ＰＣＲに基づく遺伝子増幅、およびクローニング技術を使用する多様なヒトおよび非ヒト霊長類（ＮＨＰ）組織の細胞ＤＮＡからのＡＡＶ配列の新規検出および同定方法を提供する。
【０００５】
別の局面において、本発明は、本発明の上述された方法を使用して検出される新規ＡＡＶ配列の単離方法を提供する。本発明はさらに、キャプシド遺伝子配列およびｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子連結部の利用可能性にのみ基づく血清学および遺伝子移入研究のためのこれら新規ＡＡＶ血清型に基づくベクターの生成方法を含んでなる。
【０００６】
なお別の局面において、本発明は包括的な組のプライマー／プローブおよび定量的リアルタイムＰＣＲを包含する本発明の試薬を使用する血清学、疫学、生物分布および伝播様式の研究の新規実施方法を提供する。
【０００７】
なお別の局面において、本発明はＲＡＣＥおよび他の分子技術を使用する多様な起源の細胞ＤＮＡからの新規ＡＡＶ血清型の完全なかつ感染性のゲノムの単離方法を提供する。
【０００８】
さらなる一局面において、本発明は多様な起源のアデノウイルスヘルパーを使用するヒトおよびＮＨＰ細胞系からのＡＡＶゲノムの新規血清型のレスキュー方法を提供する。
【０００９】
なおさらなる一局面において、本発明は新規ＡＡＶ血清型、それらを含有するベクターおよびそれらの使用方法を提供する。
【００１０】
これらおよび本発明の他の局面は本発明の以下の詳細な記述から容易に明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１Ａ−１ＡＡＡＲ】ＡＡＶ血清型の少なくともｃａｐタンパク質をコードする核酸配列のアライメントを提供する。ＩＴＲ、ｒｅｐ領域およびキャプシド領域を包含する完全長配列が、新規ＡＡＶ血清型７［配列番号１］、ならびに以前に公表されたＡＡＶ１［配列番号６］、ＡＡＶ２［配列番号７］；およびＡＡＶ３［配列番号８］について提供される。新規ＡＡＶ血清型ＡＡＶ８［配列番号４］およびＡＡＶ９［配列番号５］は同時出願される出願の主題である。本アライメントで提供される本発明の他の新規クローンは：４２−２［配列番号９］、４２−８［配列番号２７］、４２−１５［配列番号２８］、４２−５ｂ［配列番号２９］、４２−１ｂ［配列番号３０］；４２−１３［配列番号３１］、４２−３ａ［配列番号３２］、４２−４［配列番号３３］、４２−５ａ［配列番号３４］、４２−１０［配列番号３５］、４２−３ｂ［配列番号３６］、４２−１１［配列番号３７］、４２−６ｂ［配列番号３８］、４３−１［配列番号３９］、４３−５［配列番号４０］、４３−１２［配列番号４１］、４３−２０［配列番号４２］、４３−２１［配列番号４３］、４３−２３［配列番号４４］、４３−２５［配列番号４５］、４４．１［配列番号４７］、４４．５［配列番号４７］、２２３．１０［配列番号４８］、２２３．２［配列番号４９］、２２３．４［配列番号５０］、２２３．５［配列番号５１］、２２３．６［配列番号５２］、２２３．７［配列番号５３］、Ａ３．４［配列番号５４］、Ａ３．５［配列番号５５］、Ａ３．７［配列番号５６］、Ａ３．３［配列番号５７］、４２．１２［配列番号５８］、４４．２［配列番号５９］を包含する。ＡＡＶ１０［配列番号１１７］、ＡＡＶ１１［配列番号１１８］およびＡＡＶ１２［配列番号１１９］のシグネチャ領域のヌクレオチド配列が本図中に提供される。ＡＡＶゲノムの構造中の決定的に重要な目印を示す。ギャップは点により示す。ＡＡＶ１［配列番号６］の３’ＩＴＲは公表された配列中と同一の相対的配列で示す。ＴＲＳは末端解離部位（ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｓｉｔｅ）を表す。ＡＡＶ７はＶＰ３の開始コドンとしてＧＴＧを使用することが報告された唯一のＡＡＶであることに注意されたい。
【図２Ａ−２Ｆ】以前に公表されたＡＡＶ血清型１［配列番号６４］、ＡＡＶ２［配列番号７０］、ＡＡＶ３［配列番号７１］、ＡＡＶ４［配列番号６３］、ＡＡＶ５［配列番号１１４］およびＡＡＶ６［配列番号６５］のｖｐ１キャプシドタンパク質のタンパク質のアミノ酸配列、ならびに：Ｃ１［配列番号６０］、Ｃ２［配列番号６１］、Ｃ５［配列番号６２］、Ａ３−３［配列番号６６］、Ａ３−７［配列番号６７］、Ａ３−４［配列番号６８］、Ａ３−５［配列番号６９］、３．３ｂ［配列番号６２］、２２３．４［配列番号７３］、２２３−５［配列番号７４］、２２３−１０［配列番号７５］、２２３−２［配列番号７６］、２２３−７［配列番号７７］、２２３−６［配列番号７８］、４４−１［配列番号７９］、４４−５［配列番号８０］、４４−２［配列番号８１］、４２−１５［配列番号８４］、４２−８［配列番号８５］、４２−１３［配列番号８６］、４２−３Ａ［配列番号８７］、４２−４［配列番号８８］、４２−５Ａ［配列番号８９］、４２−１Ｂ［配列番号９０］、４２−５Ｂ［配列番号９１］、４３−１［配列番号９２］、４３−１２［配列番号９３］、４３−５［配列番号９４］、４３−２１［配列番号９６］、４３−２５［配列番号９７］、４３−２０［配列番号９９］、２４．１［配列番号１０１］、４２．２［配列番号１０２］、７．２［配列番号１０３］、２７．３［配列番号１０４］、１６．３［配列番号１０５］、４２．１０［配列番号１０６］、４２−３Ｂ［配列番号１０７］、４２−１１［配列番号１０８］、Ｆ１［配列番号１０９］、Ｆ５［配列番号１１０］、Ｆ３［配列番号１１１］、４２−６Ｂ［配列番号１１２］、４２−１２［配列番号１１３］を包含する本発明の新規ＡＡＶ配列のアライメントである。新規血清型８［配列番号９５］およびＡＡＶ９［配列番号１００］は同時出願される特許出願の主題である。
【図３Ａ−３Ｃ】ＡＡＶ７ ｒｅｐタンパク質［配列番号３］のアミノ酸配列を提供する。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
［発明の詳細な説明］
本発明において、発明者は、核に侵入しならびにヘルパーウイルスの共感染の非存在下で細胞ＤＮＡ中に組込み、そして潜在性感染を確立するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の能力を利用する方法を見出した。本方法はヒトおよび非ヒト霊長類起源の組織ならびに他の供給源からのＤＮＡからのＡＡＶの配列の検出、同定および／もしくは単離のためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づく戦略を利用する。有利には、本方法は下述されるとおり他の組込まれたウイルスおよび非ウイルス配列の検出、同定および／もしくは単離にもまた適する。
【００１３】
本発明はさらに本発明の方法により同定される核酸配列を提供する。１つのこうしたアデノ随伴ウイルスは新規血清型のものであり、本明細書で血清型７（ＡＡＶ７）と命名される。本明細書で提供される他の新規アデノ随伴ウイルスの血清型はＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１およびＡＡＶ１２を包含する。本発明の方法により同定されるなお他の新規ＡＡＶ血清型が本明細中で提供される。図および配列表（引用することにより組込まれる）を参照されたい。
【００１４】
これらのＡＡＶ配列のフラグメントもまた提供される。とりわけ望ましいＡＡＶフラグメントのなかに、ｖｐ１、ｖｐ２、ｖｐ３を包含するｃａｐタンパク質、超可変領域、ｒｅｐ ７８、ｒｅｐ ６８、ｒｅｐ ５２およびｒｅｐ ４０を包含するｒｅｐタンパク質、ならびにこれらのタンパク質をコードする配列がある。これらのフラグメントのそれぞれは多様なベクター系および宿主細胞中で容易に利用されるかもしれない。こうしたフラグメントは単独で、他のＡＡＶ配列もしくはフラグメントとともに、または他のＡＡＶもしくは非ＡＡＶウイルス配列からの要素とともに使用してよい。とりわけ望ましい一態様において、ベクターは本発明のＡＡＶ ｃａｐおよび／もしくはｒｅｐ配列を含有する。
【００１５】
本明細書に記述されるところのアライメントは、インターネットのウェブサーバーによりアクセス可能な「Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ」のような、多様な公的にもしくは商業的に利用可能なマルチプルアライメントプログラム（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｐｒｏｇｒａｍ）のいずれかを使用して実施する。あるいはＶｅｃｔｏｒ ＮＴＩユーティリティーもまた使用される。上述されたプログラム中に含有されるものを包含するヌクレオチド配列の同一性を測定するのに使用可能である当該技術分野で既知の多数のアルゴリズムもまた存在する。別の例として、ポリヌクレオチド配列はＧＣＧ
バージョン６．１中のプログラムＦａｓｔａを使用して比較可能である。Ｆａｓｔａはクエリ配列と検索配列との間の最良の重複の領域のアライメントおよび配列の同一性パーセントを提供する。例えば、核酸配列間の配列の同一性パーセントは、ＧＣＧ バージョン６．１（引用することにより本明細書に組込まれる）中で提供されるところのそのデフォルトのパラメータワードサイズ６およびスコアリングマトリックスのＮＯＰＡＭ因子）を用いるＦａｓｔａを使用して決定できる。類似のプログラム、例えば「Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ」プログラムがアミノ酸配列に利用可能である。一般にこれらのプログラムのいずれもデフォルトの設定で使用するが、とは言え当業者はこれらの設定を必要とされるとおり変更可能である。あるいは、当業者は、言及されるアルゴリズムおよびプログラムにより提供されるもののような同一性もしくはアライメントのレベルを少なくとも提供する別のアルゴリズムもしくはコンピュータプログラムを利用可能である。
【００１６】
核酸もしくはそのフラグメントを指す場合の「実質的相同性」もしくは「実質的類似性」という用語は、適切なヌクレオチド挿入もしくは欠失を伴いもう１つの核酸（もしくはその相補鎖）と至適にアライメントされる場合に、アライメントされた配列の最低約９５ないし９９％のヌクレオチド配列の同一性が存在することを示す。好ましくは、相同性は完全長の配列もしくはその１つの読み取り枠、または長さが最低１５ヌクレオチドである別の適するフラグメントにわたる。適するフラグメントの例は本明細書に記述する。
【００１７】
アミノ酸もしくはそのフラグメントを指す場合の「実質的的相同性」もしくは「実質的類似性」という用語は、適切なアミノ酸挿入もしくは欠失を伴いもう１つのアミノ酸と至適にアライメントされる場合に、アライメントされた配列の最低約９５ないし９９％のアミノ酸配列の同一性が存在することを示す。好ましくは、相同性は完全長の配列もしくはその１つタンパク質、例えばｃａｐタンパク質、ｒｅｐタンパク質、または長さが最低８アミノ酸、あるいはより望ましくは最低１５アミノ酸であるそのフラグメントにわたる。適するフラグメントの例は本明細書に記述する。
【００１８】
「高度に保存される」という用語により、最低８０％の同一性、好ましくは最低９０％の同一性、およびより好ましくは９７％を越える同一性を意味する。同一性は、当業者により既知のアルゴリズムおよびコンピュータプログラムに頼ることにより当業者により容易に決定される。
【００１９】
核酸配列の情況における「配列の同一性パーセント」もしくは「同一の」という用語は、最大の対応についてアライメントされる場合に同一である２種の配列中の残基を指す。配列の同一性の比較の長さはゲノムの完全長、遺伝子コーディング配列の完全長にわたるかもしれないか、または、最低約５００ないし５０００ヌクレオチドのフラグメントが望ましい。しかしながら、例えば最低約９ヌクレオチド、通常最低約２０ないし２４ヌクレオチド、最低約２８ないし３２ヌクレオチド、最低約３６もしくはそれ以上のヌクレオチドのより小さいフラグメントのあいだでの同一性もまた望ましいかもしれない。同様に、「配列の同一性パーセント」は、アミノ酸配列についてタンパク質の完全長もしくはそのフラグメントにわたって容易に決定されるかもしれない。適しては、フラグメントは長さ最低約８アミノ酸でありかつ約７００アミノ酸までであってよい。適するフラグメントの例は本明細書に記述する。
【００２０】
ＡＡＶ配列およびそのフラグメントはｒＡＡＶの製造に有用であり、そしてまたアンチセンス送達ベクター、遺伝子治療ベクターもしくはワクチンベクターとしても有用である。本発明はさらに、本発明のＡＡＶ配列を含有する核酸分子、遺伝子送達ベクターおよび宿主細胞を提供する。
【００２１】
本明細書に記述されるところの、本発明のＡＡＶキャプシドタンパク質を含有する本発明のベクターは、中和抗体が他のＡＡＶ血清型に基づくベクターならびに他のウイルスベクターの有効性を減少させる応用における使用にとりわけ良好に適する。本発明のｒＡＡＶベクターはｒＡＡＶ再投与および反復遺伝子治療でとりわけ有利である。
【００２２】
本発明のこれらおよび他の態様および利点を下により詳細に記述する。本明細および請求の範囲を通じて使用されるところの「含んでなること」および「包含すること」という用語、ならびにそれらの変形は、他の成分、要素、整数、段階などを包含する。逆に、「なること」という用語およびその変形は、他の成分、要素、整数、段階などを除外する。
【００２３】
Ｉ．本発明の方法
Ａ．分子クローニングを介する配列の検出
一局面において、本発明はサンプル中の標的核酸配列の検出および／もしくは同定方法を提供する。本方法は細胞の染色体中に組込まれるウイルス配列、例えばとりわけアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）およびレトロウイルスの検出にとりわけ良好に適する。本明細は本明細書で例示されるＡＡＶへの言及をなす。しかしながら、本情報に基づき、当業者は
とりわけレトロウイルス［例えばネコ白血病ウイルス（ＦｅＬＶ）、ＨＴＬＶＩおよびＨＴＬＶＩＩ］ならびにレンチウイルス亜科（ｌｅｎｔｉｖｉｒｉｎａｅ）［例えばヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルスおよびスプマウイルス亜科の（ｓｐｕｍａｖｉｒｉｎａｌ）］で本発明の方法を容易に実施するかもしれない。さらに、本発明の方法は、宿主細胞のゲノム中に組込まれようと組込まれなかろうと、他のウイルスおよび非ウイルス配列の検出にもまた使用されてよい。
【００２４】
本明細書で使用されるところのサンプルは、核酸を含有するいずれかの供給源、例えば組織、組織培養物、細胞、細胞培養物、ならびに、制限なしに、尿および血液を包含する生物学的液体である。これらの核酸配列は、細菌、酵母、ウイルスおよび植物もしくは動物のような高等生物体を包含するいずれかの供給源からのプラスミド、天然のＤＮＡもしくはＲＮＡからのＤＮＡもしくはＲＮＡであってよい。ＤＮＡもしくはＲＮＡはＳａｍｂｒｏｏｋ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（ニューヨーク：コールド スプリング ハーバー ラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ））により記述されるもののような当業者に既知の多様な技術によりサンプルから抽出する。サンプルの起源および本発明の方法の応用のために核酸を得る方法は本発明の制限でない。場合によっては、本発明の方法はＤＮＡの供給源もしくは供給源から得られた（例えば抽出された）核酸で直接実施可能である。
【００２５】
本発明の方法は、ＤＮＡを含有するサンプルを、二本鎖核酸配列の第一の領域に特異的な第一の組のプライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を介する増幅にかけてそれにより増幅された配列を得ることを必要とする。
【００２６】
本明細書で使用されるところの「領域」のそれぞれは、最低２種の血清型（例えばＡＡＶ）もしくは系統（例えばレンチウイルス）の核酸配列のアライメントに基づき予め決定され、また、前記領域のそれぞれは、高度に保存されている５’端、好ましくはしかし必ず可変性である中央、および高度に保存されている３’端を有する配列から構成され、これらのそれぞれは少なくとも２種のアライメントされたＡＡＶ血清型の配列に関して保存されるかもしくは可変性である。好ましくは、５’および／もしくは３’端は最低約９、およびより好ましくは最低１８塩基対（ｂｐ）にわたって高度に保存されている。しかしながら、５’もしくは３’端の配列の一方もしくは双方が１８ｂｐ以上、２５ｂｐ以上、３０ｂｐ以上もしくは５’端で５０ｂｐ以上にわたって保存されてよい。可変領域に関しては保存された配列に対する要件は存在せず、これらの配列は比較的保存されていてよいか、またはアライメントされた血清型もしくは系統のあいだで９０、８０もしくは７０％未満の同一性を有してよい。
【００２７】
領域のそれぞれは長さ約１００ｂｐないし約１０キロ塩基対にわたってよい。しかしながら、領域の一方が「シグネチャ領域」すなわち増幅された配列を標的供給源からであると正に同定するのに十分に独特である領域であることがとりわけ望ましい。例えば、一態様において、第一の領域は長さが約２５０ｂｐであり、かつ、既知のＡＡＶ配列のあいだで十分に独特であり、それは該増幅された領域をＡＡＶ起源のものであると正に同定する。さらに、増幅された配列がそれから発する血清型を同定するのに使用可能であるこの領域内の可変配列は十分に独特である。一旦増幅（かつそれにより検出）されれば、該配列は慣習的制限消化を実施すること、ならびにＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５もしくはＡＡＶ６のいずれか中の本領域の制限消化パターンまたはＡＡＶ７、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２もしくは本発明により予め決定されかつ提供される本発明により同定される他の新規血清型のいずれかのものとの比較により同定可能である。
【００２８】
本明細書で提供される手引きを与えられれば、当業者は他の組込まれたウイルスのなかでこうした領域を容易に同定してこれらの配列の用意のできた検出および同定を可能にし得る。その後、高度に保存された端内に配置された至適の組の包括的プライマーを設計しかつサンプルからの該選択された領域の効率的増幅について試験し得る。本発明の本局面は、標的配列（例えばＡＡＶ）の存在の検出のため、および本明細書に記述されるかもしくは本明細書に記述される技術を使用して単離されるＡＡＶ血清型の制限パターンを包含する標準を使用するＡＡＶ血清型の同定のための診断キットに容易に適合される。例えば、ＰＣＲ産物の迅速同定もしくは分子血清型分類はＰＣＲ産物を消化することおよび制限パターンを比較することにより達成し得る。
【００２９】
従って、一態様において、ＡＡＶの「シグネチャ領域」は、ＡＡＶ１［配列番号６］の約ｂｐ２８００ないし約３２００、ならびにＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５およびＡＡＶ６中の対応する塩基対にわたる。より望ましくは、該領域はＡＡＶ１［配列番号６］のｂｐ２８８６ないし約３１４３ｂｐならびにＡＡＶ２［配列番号７］、ＡＡＶ３［配列番号８］および他のＡＡＶ血清型中の対応する塩基対内に位置する約２５０ｂｐである。図１を参照されたい。サンプル中のＡＡＶの迅速検出を可能にするために、本シグネチャ領域を特異的に増幅するプライマーを利用する。しかしながら、本発明は該ＡＡＶシグネチャ領域について本明細書で同定される正確な配列に制限されない。当業者は本シグネチャ領域のより短いフラグメントもしくはより大きなフラグメントを包含するように本領域を容易に変更してよいためである。
【００３０】
ＰＣＲプライマーは当業者に既知の技術を使用して生成する。ＰＣＲプライマーの組のそれぞれは５’プライマーおよび３’プライマーより構成される。例えば本明細書に引用されるＳａｍｂｒｏｏｋらを参照されたい。「プライマー」という用語はある核酸鎖に相補的であるプライマー伸長産物の合成が誘導される条件下に置かれる場合に合成の開始の点として作用するオリゴヌクレオチドを指す。プライマーは好ましくは一本鎖である。しかしながら、二本鎖プライマーを利用する場合は伸長生成物を製造するために使用する前にその鎖を分離するようにそれを処理する。プライマーは約１５ないし２５ヌクレオチドもしくはそれ以上、および好ましくは最低１８ヌクレオチドであってよい。しかしながらある種の応用にはより短いヌクレオチド、例えば７ないし１５ヌクレオチドを利用する。
【００３１】
プライマーはそれらのそれぞれの鎖とハイブリダイズするために、増幅されるべき各特定の配列の異なる鎖に対し十分に相補的であるよう選択する。従って、プライマー配列は増幅されている領域の正確な配列を反映する必要はない。例えば、非相補的ヌクレオチドフラグメントをプライマーの５’端に結合してよく、該プライマー配列の残部は該鎖に対し完全に相補的である。あるいは、非相補的塩基もしくはより長い配列をプライマー中に点在させ得るが、但し該プライマー配列はそれとハイブリダイズしかつ他のプライマーの伸長生成物の合成のための鋳型を形成するために、増幅されるべき鎖の配列と十分な相補性を有する。
【００３２】
本発明のシグネチャ領域のＰＣＲプライマーは２種もしくはそれ以上のアライメントされた配列（例えば２種もしくはそれ以上のＡＡＶ血清型）の高度に保存される配列に基づく。プライマーは、５’端もしくは中央で、２種もしくはそれ以上のアライメントされたＡＡＶ血清型の間で正確未満の同一性を適応させ得る。しかしながら、プライマーの３’端の配列は、プライマーの３’端で最低５、好ましくは最低９塩基対、およびより好ましくは最低１８塩基対にわたり正確な同一性が存在する２種もしくはそれ以上のアライメントされたＡＡＶ血清型の一領域に対応する。従って、プライマーの３’端は最低５ヌクレオチドにわってアライメントされた配列に対する１００％同一性をもつ配列から構成される。しかしながら、プライマーの３’端で１、２もしくはそれ以上の縮重ヌクレオチドを場合によっては利用し得る。
【００３３】
例えば、ＡＡＶのシグネチャ領域のプライマーの組は以下のとおりＡＡＶキャプシド内の独特の領域に基づいて設計した。５’プライマーはＡＡＶ２［配列番号７］のｎｔ２８６７〜２８９１、５’−ＧＧＴＡＡＴＴＣＣＴＣＣＧＧＡＡＡＴＴＧＧＣＡＴＴ３’に基づいた。図１を参照されたい。３’プライマーはＡＡＶ２［配列番号７］のｎｔ３０９６〜３１２２、５’−ＧＡＣＴＣＡＴＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＴＧＧＧＧＡＴＴＣ−３’に基づき設計した。しかしながら、当業者は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６の対応する領域に基づき、または本明細書に提供される情報、ＡＡＶ７、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２もしくは本発明の別の新規ＡＡＶに基づきプライマーの組を容易に設計していたかもしれない。加えて、本シグネチャ領域を増幅するためのなお他のプライマーの組は当業者に既知の技術を使用して容易に設計し得る。
【００３４】
Ｂ．標的配列の単離
本明細書に記述されるとおり、本発明は標的の検出を可能にするための標的配列例えばＡＡＶ血清型のシグネチャ領域を特異的に増幅する第一のプライマーの組を提供する。さらなる配列が望ましい状況において、例えば新規ＡＡＶ血清型が同定される場合、シグネチャ領域領域は伸長されるかもしれない。従って、本発明は１種もしくはそれ以上の付加的なプライマーの組をさらに利用してよい。
【００３５】
適しては、これらのプライマーの組は、第一のプライマーの組の５’もしくは３’いずれかのプライマーおよび該プライマーの組に独特の第二のプライマーを包含するよう設計され、その結果該プライマーの組はシグネチャ領域の５’端もしくは３’端いずれかにアニーリングするシグネチャ領域に対し５’もしくは３’の領域を増幅する。例えば、第一のプライマーの組はシグネチャ領域を増幅するための５’プライマーＰ１および３’プライマーＰ２より構成される。シグネチャ領域をその３’端で伸長するために、第二のプライマーの組はプライマーＰ１および３’プライマーＰ４から構成され、シグネチャ領域およびシグネチャ領域の下流の連続する配列を増幅する。シグネチャ領域をその５’端で伸長するために、第三のプライマーの組が５’プライマーＰ５およびプライマーＰ２から構成され、その結果シグネチャ領域およびシグネチャ領域の上流の連続する配列を増幅する。これらの伸長段階を、必要とされるもしくは所望のとおり反復（もしくは同時に実施）する。その後、これらの増幅段階から生じる産物を慣習的段階を使用して融合して所望の長さの単離された配列を製造する。
【００３６】
第二および第三のプライマーの組はアライメントされた配列のあいだで高度に保存される配列を有する領域を増幅するように、シグネチャ領域のプライマーの組でのとおり設計する。「第二」もしくは「第三」のプライマーの組という用語への本明細書での言及は、考察のそれぞれのみのためであり、そしてこれらのプライマーを反応混合物に添加するかもしくは増幅に使用する順序に関係しない。第二のプライマーの組により増幅される領域は増幅に際してそれがその５’端でシグネチャ領域の３’端にアニーリングするように選択する。同様に、第三のプライマーの組により増幅される領域は増幅に際してそれがその３’端でシグネチャ領域の５’端にアニーリングするように選択する。それらが増幅する領域が第二もしくは第三のプライマーの組またはその後のプライマーの組により形成される伸長生成物の５’端もしくは３’端いずれかにアニーリングするような付加的なプライマーの組が設計可能である。
【００３７】
例えば、ＡＡＶが標的配列である場合はプライマーの第一の組（Ｐ１およびＰ２）を使用してサンプルからシグネチャ領域を増幅する。望ましい一態様において、本シグネチャ領域はＡＡＶキャプシド内に位置する。プライマーの第二の組（Ｐ１およびＰ４）を使用して、ＡＡＶ ３’ＩＴＲの直前であるＡＡＶ配列中のある位置までシグネチャ領域の３’端を伸長する、すなわちアンカーとしてシグネチャ領域を使用する場合にＡＡＶキャプ
シドの３’端全体を含有する伸長生成物を提供する。一態様において、Ｐ４プライマーはＡＡＶ２［配列番号７］のｎｔ４４３５ないし４４６２および他のＡＡＶ血清型中の対応する配列に対応する。これは約１．６ｋｂの領域の増幅をもたらし、これは０．２５ｋｂのシグネチャ領域を含有する。プライマーの第三の組（Ｐ３およびＰ２）を使用してｒｅｐ遺伝子の３’端にあるＡＡＶ配列中のある位置までシグネチャ領域の５’端を伸長する、すなわちアンカーとしてシグネチャ領域を使用する場合にＡＡＶキャプシドの５’端全体を含有する伸長生成物を提供する。一態様において、Ｐ３プライマーはＡＡＶ２［配列番号７］のｎｔ１３８４ないし１４０９および他のＡＡＶ血清型中の対応する配列に対応する。これは約１．７ｋｂの領域の増幅をもたらし、これは０．２５ｋｂのシグネチャ領域を含有する。場合によっては、プライマーの第四の組を使用してＡＡＶキャプシドの５’端全体を含有する伸長生成物をｒｅｐ配列もまた包含するようにさらに伸長させる。一態様において、Ｐ５と呼称されるプライマーはＡＡＶ２［配列番号７］のｎｔ１０８ないし１３３および他のＡＡＶ血清型中の対応する配列に対応し、かつ、Ｐ２プライマーとともに使用される。
【００３８】
所望の数の伸長段階の完了後に、アンカーもしくはマーカーとしてシグネチャ領域を利用して多様な伸長生成物を融合して無傷の配列を構築する。本明細書に提供される例において、最低でも無傷のＡＡＶ ｃａｐ遺伝子を含有するＡＡＶ配列が得られる。実施される伸長段階の数に依存してより大きな配列が得られるかもしれない。
【００３９】
適しては、伸長生成物は、当業者に既知の方法を使用して無傷のＡＡＶ配列に集成する。例えば、シグネチャ領域内に位置するＤｒａＩＩＩ部位で切断するＤｒａＩＩＩで伸長生成物を消化して制限フラグメントを提供してよく、これを再連結して無傷のＡＡＶ ｃａｐ遺伝子を（最低でも）含有する生成物を提供する。しかしながら、伸長生成物を無傷の配列に集成するための他の適する技術を利用してよい。全般として、本明細書で引用されるＳａｍｂｒｏｏｋらを参照されたい。
【００４０】
上述された複数の伸長段階に対する一代替として、本発明の別の態様は完全長のｃａｐ配列の単離を可能にする３．１ｋｂのフラグメントの直接増幅を提供する。ＮＨＰ組織および血液ＤＮＡから３．１ｋｂの完全長のｃａｐフラグメントを直接増幅するために、２個の他の高度に保存された領域を、大きなフラグメントのＰＣＲ増幅での使用のためＡＡＶゲノム中で同定した。ｒｅｐ遺伝子の中央に位置する保存された領域内のプライマー（ＡＶ１ｎｓ：５’ＧＣＴＧＣＧＴＣＡＡＣＴＧＧＡＣＣＡＡＴＧＡＧＡＡＣ３’、配列番号６のｎｔ）を、完全長のＡＡＶ ｃａｐを包含するＡＡＶ配列の増幅のためのＣａｐ遺伝子の下流の別の保存された領域中に位置する３’プライマー（ＡＶ２ｃａｓ：５’ＣＧＣＡＧＡＧＡＣＣＡＡＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＡＡＡＣＧＡ３’、配列番号７）とともに利用する。典型的には、増幅後に産物をクローン化しそして配列分析を≧９９．９％の正確さを伴い実施する。本方法を使用して、発明者は最低５０のキャプシドクローンを単離しそれらをその後特徴づけした。それらのなかで３７クローンはアカゲザル組織（ｒｈ．１〜ｒｈ．３７）、６クローンはカニクイザル（ｃｙｎｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｍａｃａｑｕｅ）（ｃｙ．１〜ｃｙ．６）、２クローンはヒヒ（ｂｂ．１およびｂｂ．２）ならびに５クローンはチンパンジー（ｃｈ．１〜ｃｈ．５）由来であった。これらのクローンは、それらが同定された動物の種およびこれら新規の配列が位置を突き止められたその動物の組織と一緒に本明細の別の場所で同定する。
【００４１】
Ｃ．新規ＡＡＶの代替単離方法
別の局面において、本発明は細胞からの新規ＡＡＶの代替の一単離方法を提供する。本方法は、ＡＡＶに対するヘルパー機能を提供するベクターに細胞を感染させること；ＡＡＶを含有する感染性クローンを単離すること；単離されたＡＡＶを配列決定すること；および単離されたＡＡＶの配列を既知のＡＡＶ血清型と比較すること（それにより単離され
たＡＡＶおよび既知のＡＡＶ血清型の配列中の差異が新規ＡＡＶの存在を示す）を必要とする。
【００４２】
一態様において、ヘルパー機能を提供するベクターは例えばＥ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ２ａ、Ｅ４ＯＲＦ６を包含する必須のアデノウイルス機能を提供する。一態様においてヘルパー機能はアデノウイルスにより提供される。アデノウイルスは野性型アデノウイルスであってよく、そしてヒトもしくは非ヒト起源、好ましくは非ヒト霊長類（ＮＨＰ）起源のものであってよい。タイプＡｄ５［ジェンバンク（Ｇｅｎｂａｎｋ）受託番号Ｍ７３２６０］を包含する多数のアデノウイルス型のＤＮＡ配列がジェンバンク（Ｇｅｎｂａｎｋ）から入手可能である。アデノウイルス配列は血清型２、３、４、７、１２および４０のような、ならびにさらに現在同定されているヒト型［例えば上で引用されるＨｏｒｗｉｔｚを参照されたい］のいずれかを包含するいずれかの既知のアデノウイルス血清型から得てよい。同様に、非ヒト動物（例えばチンパンジー）を感染させることが既知のアデノウイルスもまた本発明のベクター構築物で使用してもよい。例えば米国特許第６，０８３，７１６号明細書を参照されたい。野性型アデノウイルスに加え、必要なヘルパー機能を運搬する組換えウイルスもしくは非ウイルスベクター（例えばプラスミド、エピソームなど）を利用してもよい。こうした組換えウイルスは当該技術分野で既知でありかつ公表された技術に従って製造してよい。例えばハイブリッドＡｄ／ＡＡＶウイルスを記述する米国特許第５，８７１，９８２号および同第６，２５１，６７７号明細書を参照されたい。アデノウイルス型の選択は以下の発明を制限することを予期されない。多様なアデノウイルス株がアメリカン タイプ カルチャー コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、バージニア州マナサスから入手可能であるか、もしくは要求により多様な商業的および機関の供給源から入手可能である。さらに、多くのこうした株の配列は例えばパブメッド（ＰｕｂＭｅｄ）およびジェンバンク（Ｇｅｎｂａｎｋ）を包含する多様なデータベースから入手可能である。
【００４３】
別の代替において、感染性ＡＡＶはゲノム歩行（ｗａｌｋｉｎｇ）技術を使用して単離されるかもしれない（Ｓｉｅｂｅｒｔら、１９９５、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２３：１０８７−１０８８、Ｆｒｉｅｚｎｅｒ−Ｄｅｇｅｎら、１９８６、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：６９７２−６９８５、ＢＤ バイオサイエンシーズ クロンテック（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、カリフォルニア州パロアルト）。ゲノム歩行は本発明の方法により同定される新規配列に隣接する配列を同定かつ単離するのにとりわけ良好に適する。例えば、本技術は、本発明の方法を使用して同定される新規ＡＡＶキャプシドおよび／もしくはｒｅｐ配列に基づき新規ＡＡＶ血清型の逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）を単離するのに有用であるかもしれない。本技術は本発明により同定かつ単離される他のＡＡＶおよび非ＡＡＶ配列に隣接する配列を単離するのにもまた有用である。実施例３および４を参照されたい。
【００４４】
本発明の方法は、多様な疫学研究、生物分布の研究、ＡＡＶベクターおよび他の組込まれたウイルス由来のベクターを介する遺伝子治療のモニタリングに容易に使用されるかもしれない。従って、該方法は、臨床家、研究者および疫学者による使用のための予め包装されたキットでの使用に良好に適する。
【００４５】
ＩＩ．診断キット
別の局面において、本発明はサンプル中の既知もしくは未知のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の存在を検出するための診断キットを提供する。こうしたキットはＡＡＶ核酸配列のシグネチャ領域に特異的な５’および３’ＰＣＲプライマーの第一の組を含有してよい。あるいは、もしくは加えて、こうしたキットは本明細書で同定される完全長のＡＡＶキャプシド核酸配列を包含する３．１ｋｂのフラグメントに特異的な５’および３’ＰＣＲプライマーの第一の組（例えばＡＶ１ｎｓおよびＡＶ２ｃａｓプライマー）を含有し得る
。場合によっては、本発明のキットは、本明細書に記述されるところの５’および３’プライマーならびに／もしくはＰＣＲプローブの２もしくはそれ以上の付加的な組をさらに含有するかもしれない。これらのプライマーおよびプローブは、例えば定量的ＰＣＲを使用して各ＡＡＶ血清型のシグネチャ領域を増幅するために本発明に従って使用される。
【００４６】
本発明はさらに、本発明の方法により検出されるＡＡＶ血清型を同定しかつ／もしくは新規ＡＡＶを既知のＡＡＶと識別するのに有用なキットを提供する。こうしたキットは１種もしくはそれ以上の制限酵素、それらの「シグネチャ制限酵素消化分析」を提供するＡＡＶ血清型の標準、および／または検出されたＡＡＶの血清型を決定するための他の手段をさらに包含してよい。
【００４７】
加えて、本発明のキットは、説明書、陰性および／もしくは陽性対照、容器、サンプルの希釈剤および緩衝剤、シグネチャ比較のための指標図、使い捨て手袋、除染の説明書、アプリケーター棒状物もしくは容器、ならびにサンプル調製器カップ、ならびに媒体、洗浄試薬および濃縮試薬を包含するいかなる所望の試薬も包含しうる。こうした試薬は本明細書に記述される試薬のなかからおよび慣習的な濃縮試薬のなかから容易に選択されうる。望ましい一態様において、洗浄試薬はリン酸緩衝生理的食塩水（ＰＢＳ）のような生理学的ｐＨに緩衝されている等張の生理的食塩水溶液であり；溶出試薬は０．４Ｍ ＮａＣｌを含有するＰＢＳならびに濃縮試薬および装置である。例えば、当業者はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）もしくはＮＨ_４ＳＯ_４のような試薬、またはフィルター装置のような装置が有用であるかもしれないことを認識するであろう。例えば１００Ｋメンブレンを伴うフィルター装置はｒＡＡＶを濃縮するとみられる。
【００４８】
本発明により提供されるキットは、本明細書に記述される方法を実施するため、ならびにヒトおよびＮＨＰにおける新規ＡＡＶ血清型の生物分布、疫学、伝播様式の研究に有用である。
【００４９】
従って、本発明の方法およびキットは標的ウイルス配列、とりわけ組込まれたウイルス配列の検出、同定および単離を可能にする。該方法およびキットは新規ＡＡＶ血清型を包含するかもしれないＡＡＶ配列の検出、同定および単離での使用にとりわけ良好に適する。
【００５０】
１つの注目すべき例において、本発明の方法は、多様な動物からのクローン化されたフラグメント間のプロウイルス配列の不均一性を示した発明者によるクローン化されたＡＡＶ配列の分析を助長し、その全部は既知の６種のＡＡＶ血清型と異なり、変異の大多数はキャプシドタンパク質の超可変領域に位置していた。ＡＡＶ配列の驚くべき相違が一個体のアカゲザルからのリンパ節のような単一組織源から単離されたクローンで示された。この不均一性は制限された数の共感染する腸管外（ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ）ウイルス間の広範囲の相同的組換えに部分的による個々の動物内でのＡＡＶ配列の見かけの進化により最良に説明される。これらの研究はその一系列のキャプシドの超可変領域中で相互と異なる一群の疑似種の形成におそらく至る天然のＡＡＶ感染の経過の間の広範に散在するウイルスの配列進化を示唆する。これは、ＲＮＡウイルスに制限されると以前は考えられていた様式でのＤＮＡウイルスの迅速な分子進化の最初の例である。
【００５１】
本発明の方法により同定されたいくつかの新規ＡＡＶ血清型の配列およびこれらの血清型の特徴づけを提供する。
【００５２】
ＩＩＩ．新規ＡＡＶ血清型
Ａ．核酸配列
本発明の方法により同定された新規ＡＡＶ血清型の核酸配列を提供する。配列番号１、
９〜５９および１１７〜１２０（本明細書に引用することにより組込まれる）を参照されたい。また図１および配列表も参照されたい。
【００５３】
新規血清型ＡＡＶ７について、ＡＡＶ ５’ＩＴＲ、キャプシド、ｒｅｐおよびＡＡＶ３’ＩＴＲを包含する完全長の配列を配列番号１に提供する。
【００５４】
本発明の他の新規ＡＡＶ血清型について、本発明の方法により単離されるおよそ３．１ｋｂのフラグメントが提供される。本フラグメントは完全長のキャプシドタンパク質をコードする配列およびｒｅｐタンパク質をコードする配列の全部もしくは一部を含有する。これらの配列は下で同定されるクローンを包含する。
【００５５】
なお他の新規ＡＡＶ血清型について、キャプシドタンパク質をコードするシグネチャ領域が提供される。例えば、本発明のＡＡＶ１０の核酸配列は図１に具体的に説明されるものを包含する［２５５塩基にわたる配列番号１１７を参照されたい］。本発明のＡＡＶ１１核酸配列は図１に具体的に説明されるＤＮＡ配列を包含する［２５８塩基にわたる配列番号１１８を参照されたい］。本発明のＡＡＶ１２の核酸配列は図１に具体的に説明されるＤＮＡ配列を包含する［２５５塩基よりなる配列番号１１９を参照されたい］。上述された方法論を使用して、さらなるＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１およびＡＡＶ１２配列が容易に同定可能であり、そしてＡＡＶ７および本明細書の他の新規血清型について記述されたものを包含する多様な目的上使用可能である。
【００５６】
図１は以前に公表されたＡＡＶ血清型すなわちＡＡＶ１［配列番号６］、ＡＡＶ２［配列番号７］およびＡＡＶ３［配列番号８］とのアライメントにおける本発明の非ヒト霊長類（ＮＨＰ）ＡＡＶ核酸配列を提供する。これら新規ＮＨＰ配列は以下の表１中に提供されるもの（クローン番号により同定される）を包含する：
【００５７】
【表１】

【００５８】
【表２】

【００５９】
【表３】

【００６０】
新規ＮＨＰクローンは、２種のチンパンジーアデノウイルスのキャプシドフラグメントをＡＡＶ２ ｒｅｐ構築物へと継ぎ合わせることにより作成した。この新たなクローンＡ３．１はＣｈ．５［配列番号２０］ともまた命名される。加えて、本発明はＨ６［配列番号２５］およびＨ２［配列番号２６］と命名された２種のヒトＡＡＶ配列を包含する。
【００６１】
本発明のＡＡＶ核酸配列は、図１および配列表［配列番号１、９〜５９、１１７〜１２０］に提供される配列中に提供される鎖に対し相補的である鎖、核酸配列、ならびに図１および配列表［配列番号１、９〜５９、１１７〜１２０］に提供される配列に対応するＲＮＡおよびｃＤＮＡ配列、ならびにそれらの相補鎖をさらに包含する。図１および配列表［配列番号１、９〜５９、１１７〜１２０］の配列の天然の変異体および工作された改変、ならびにそれらの相補鎖もまた本発明の核酸配列に包含される。こうした改変は、例えば当該技術分野で既知である標識、メチル化、および天然に存在するヌクレオチドの１個もしくはそれ以上の縮重ヌクレオチドでの置換を包含する。
【００６２】
図１および配列表［配列番号１、９〜５９、１１７〜１２０］を包含する本発明の配列に対し８５％以上、好ましくは最低約９０％、より好ましくは最低約９５％および最も好ましくは最低約９８ないし９９％同一もしくは相同である核酸配列が本発明にさらに包含される。これらの用語は本明細書で定義されるとおりである。
【００６３】
本明細書に記述される方法により同定される新規ＡＡＶ配列のフラグメントもまた本発明内に包含される。適するフラグメントは長さが最低１５ヌクレオチドであり、そして機能的フラグメント、すなわち生物学的に興味深いフラグメントを包含する。一態様において、これらのフラグメントは図１および配列表［配列番号１、９〜５９、１１７〜１２０］の新規配列のフラグメント、それらの相補鎖、それらに相補的なｃＤＮＡおよびＲＮＡである。
【００６４】
適するフラグメントの例をＡＡＶ１、ＡＡＶ２もしくはＡＡＶ７上のこれらのフラグメントの位置に関して提供する。しかしながら、本明細書で提供されるアライメント（デフォルトの設定でＣｌｕｓｔａｌ Ｗプログラムを使用して得られる）もしくは本発明の他の新規血清型とのアライメントを生成させるための類似の技術を使用して、当業者は所望のフラグメントの正確なヌクレオチドの開始および終止コドンを容易に同定可能である。
【００６５】
適するフラグメントの例は、選択的スプライス変異体であるＡＡＶキャプシドの３種の可変性タンパク質（ｖｐ）、すなわちｖｐ１［例えばＡＡＶ７、配列番号１のｎｔ８２５ないし３０４９］；ｖｐ２［例えばＡＡＶ７、配列番号１のｎｔ１２３４〜３０４９］；およびｖｐ３［例えばＡＡＶ７、配列番号１のｎｔ１４３４〜３０４９］をコードする配列を包含する。ＡＡＶ７が異常なＧＴＧ開始コドンを有することは注目すべきである。いくつかのハウスキーピング遺伝子を除き、こうした開始コドンは以前にＤＮＡウイルス中で報告されていない。他のＡＡＶ血清型のｖｐ１、ｖｐ２およびｖｐ３の開始コドンは、それらはビリオンの効率的集成を可能にするためにそれらが存する宿主細胞の細胞機構にｖｐ１、ｖｐ２およびｖｐ３をそれぞれ１０％：１０％：８０％の比で産生させるようであると考えられていた。しかしながら、ＡＡＶ７ビリオンはこのまれなＧＴＧ開始コドンを伴ってさえ効率的に集成することが見出された。従って、発明者は、他のＡＡＶ血清型のパッケージング効率を向上させ、ビリオン構造を変え、かつ／もしくはエピトープの位置を変える（例えば抗体エピトープを中和すること）ためにこのまれなＧＴＧ開始コドンを含有するように他のＡＡＶ血清型のｖｐ３の開始コドンを変えることが望ましいことを予期する。開始コドンは例えば部位特異的突然変異誘発を包含する慣習的技術を使用して変えてよい。従って、本発明はＧＴＧに変えられた開始コドンを有するｖｐ３ならびに／または場合によってはｖｐ１および／もしくはｖｐ２より構成されるいずれかの選択された血清型の変えられたＡＡＶビリオンを包含する。
【００６６】
ＡＡＶの他の適するフラグメントはＡＡＶキャプシドタンパク質の開始コドンを含有するフラグメント［例えばＡＡＶ７、配列番号１のｎｔ４６８ないし３０９０、ＡＡＶ７、配列番号１のｎｔ７２５ないし３０９０および他のＡＡＶ血清型の対応する領域］を包含する。ＡＡＶ７および本明細書に記述される方法を使用して同定される他の新規ＡＡＶ血清型のなお他のフラグメントは、ｒｅｐ ７８［例えばＡＡＶ７について図１の開始コドン３３４］、ｒｅｐ ６８［ＡＡＶ７について図１の開始コドンｎｔ３３４］、ｒｅｐ ５２［ＡＡＶ７について図１の開始コドン１００６］およびｒｅｐ ４０［ＡＡＶ７について図１の開始コドン１００６］を包含するｒｅｐタンパク質をコードするものを包含する。目的の他のフラグメントはＡＡＶ ５’逆方向末端反復配列ＩＴＲ、［ＡＡＶ７について図１のｎｔ１ないし１０７］；ＡＡＶ ３’ＩＴＲ［ＡＡＶ７について図１のｎｔ４７０４ないし４７２１］、Ｐ１９配列、ＡＡＶ Ｐ４０配列、ｒｅｐ結合部位および末端解離部位（ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｓｏｌｕｔｅ ｓｉｔｅ）（ＴＲＳ）を包含しうる。なお他の適するフラグメントは当業者に容易に明らかであろう。本発明の他の新規血清型中の対応する領域は、図１への言及により、もしくは本明細書に提供される配列との慣習的アライメント技術を利用することにより容易に決定し得る。
【００６７】
図および配列表中に提供される核酸配列を包含することに加え、本発明は本発明のＡＡ
Ｖ血清型のアミノ酸配列、タンパク質およびペプチドを発現するよう設計される核酸分子および配列を包含する。従って、本発明は以下の新規ＡＡＶアミノ酸配列すなわちＣ１［配列番号６０］、Ｃ２［配列番号６１］、Ｃ５［配列番号６２］、Ａ３−３［配列番号６６］、Ａ３−７［配列番号６７］、Ａ３−４［配列番号６８］、Ａ３−５［配列番号６９］、３．３ｂ［配列番号６２］、２２３．４［配列番号７３］、２２３−５［配列番号７４］、２２３−１０［配列番号７５］、２２３−２［配列番号７６］、２２３−７［配列番号７７］、２２３−６［配列番号７８］、４４−１［配列番号７９］、４４−５［配列番号８０］、４４−２［配列番号８１］、４２−１５［配列番号８４］、４２−８［配列番号８５］、４２−１３［配列番号８６］、４２−３Ａ［配列番号８７］、４２−４［配列番号８８］、４２−５Ａ［配列番号８９］、４２−１Ｂ［配列番号９０］、４２−５Ｂ［配列番号９１］、４３−１［配列番号９２］、４３−１２［配列番号９３］、４３−５［配列番号９４］、４３−２１［配列番号９６］、４３−２５［配列番号９７］、４３−２０［配列番号９９］、２４．１［配列番号１０１］、４２．２［配列番号１０２］、７．２［配列番号１０３］、２７．３［配列番号１０４］、１６．３［配列番号１０５］、４２．１０［配列番号１０６］、４２−３Ｂ［配列番号１０７］、４２−１１［配列番号１０８］、Ｆ１［配列番号１０９］、Ｆ５［配列番号１１０］、Ｆ３［配列番号１１１］、４２−６Ｂ［配列番号１１２］、および／もしくは４２−１２［配列番号１１３］をコードする核酸配列、ならびにこれらの配列および／もしくはそれらの独特のフラグメントを使用して生成される人工的ＡＡＶ血清型を包含する。
【００６８】
本明細書で使用されるところの人工的ＡＡＶ血清型は、制限なしに、天然に存在しないキャプシドタンパク質をもつＡＡＶを包含する。こうした人工的キャプシドは、別のＡＡＶ血清型（既知もしくは新規）、同一のＡＡＶ血清型の非連続的部分、非ＡＡＶウイルス供給源または非ウイルス供給源から得られるかもしれない異種配列とともに本発明の新規ＡＡＶ配列（例えばｖｐ１キャプシドタンパク質のフラグメント）を使用していずれかの適する技術により生成されるかもしれない。人工的ＡＡＶ血清型は、制限なしに、キメラＡＡＶキャプシド、組換えＡＡＶキャプシドもしくは「ヒト化」ＡＡＶキャプシドであってよい。
【００６９】
Ｂ．ＡＡＶアミノ酸配列、タンパク質およびペプチド
本発明は、例えばＡＡＶ７［ＡＡＶ７、配列番号１のｎｔ８２５ないし３０４９］本明細書に提供される他の新規血清型を包含する本明細書で同定される新規ＡＡＶ血清型の核酸配列によりコードされるタンパク質およびそれらのフラグメントを提供する。従って：Ｈ６［配列番号２５］、Ｈ２［配列番号２６］、４２−２［配列番号９］、４２−８［配列番号２７］、４２−１５［配列番号２８］、４２−５ｂ［配列番号２９］、４２−１ｂ［配列番号３０］；４２−１３［配列番号３１］、４２−３ａ［配列番号３２］、４２−４［配列番号３３］、４２−５ａ［配列番号３４］、４２−１０［配列番号３５］、４２−３ｂ［配列番号３６］、４２−１１［配列番号３７］、４２−６ｂ［配列番号３８］、４３−１［配列番号３９］、４３−５［配列番号４０］、４３−１２［配列番号４１］、４３−２０［配列番号４２］、４３−２１［配列番号４３］、４３−２３［配列番号４４］、４３−２５［配列番号４５］、４４．１［配列番号４７］、４４．５［配列番号４７］、２２３．１０［配列番号４８］、２２３．２［配列番号４９］、２２３．４［配列番号５０］、２２３．５［配列番号５１］、２２３．６［配列番号５２］、２２３．７［配列番号５３］、Ａ３．４［配列番号５４］、Ａ３．５［配列番号５５］、Ａ３．７［配列番号５６］、Ａ３．３［配列番号５７］、４２．１２［配列番号５８］および４４．２［配列番号５９］を包含する本発明の新規血清型のキャプシドタンパク質は、上に列挙されたクローンに提供される読み取り枠から慣習的技術を使用して容易に生成し得る。
【００７０】
本発明はさらに、本発明の新規ＡＡＶ血清型の配列を使用して生成されるＡＡＶ血清型を包含し、それらは当業者に既知の合成、組換えもしくは他の技術を使用して生成される
。本発明は、本発明の新規ＡＡＶ核酸配列から発現される新規ＡＡＶアミノ酸配列、ペプチドおよびタンパク質に制限されず、そして例えば化学合成、他の合成技術もしくは他の方法によりを包含する当該技術分野で既知の他の方法により生成されるアミノ酸配列、ペプチドおよびタンパク質を包含する。例えば、Ｃ１［配列番号６０］、Ｃ２［配列番号６１］、Ｃ５［配列番号６２］、Ａ３−３［配列番号６６］、Ａ３−７［配列番号６７］、Ａ３−４［配列番号６８］、Ａ３−５［配列番号６９］、３．３ｂ［配列番号６２］、２２３．４［配列番号７３］、２２３−５［配列番号７４］、２２３−１０［配列番号７５］、２２３−２［配列番号７６］、２２３−７［配列番号７７］、２２３−６［配列番号７８］、４４−１［配列番号７９］、４４−５［配列番号８０］、４４−２［配列番号８１］、４２−１５［配列番号８４］、４２−８［配列番号８５］、４２−１３［配列番号８６］、４２−３Ａ［配列番号８７］、４２−４［配列番号８８］、４２−５Ａ［配列番号８９］、４２−１Ｂ［配列番号９０］、４２−５Ｂ［配列番号９１］、４３−１［配列番号９２］、４３−１２［配列番号９３］、４３−５［配列番号９４］、４３−２１［配列番号９６］、４３−２５［配列番号９７］、４３−２０［配列番号９９］、２４．１［配列番号１０１］、４２．２［配列番号１０２］、７．２［配列番号１０３］、２７．３［配列番号１０４］、１６．３［配列番号１０５］、４２．１０［配列番号１０６］、４３−３Ｂ［配列番号１０７］、４２−１１［配列番号１０８］、Ｆ１［配列番号１０９］、Ｆ５［配列番号１１０］、Ｆ３［配列番号１１１］、４２−６Ｂ［配列番号１１２］および／もしくは４２−１２［配列番号１１３］のいずれの配列も多様な技術を使用して容易に生成されるにより。
【００７１】
適する製造技術は当業者に公知である。例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、コールド スプリング
ハーバー プレス（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ）（ニューヨーク州コールドスプリングハーバー）を参照されたい。あるいは、ペプチドは公知の固相ペプチド合成方法（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、８５：２１４９（１９６２）；ＳｔｅｗａｒｔとＹｏｕｎｇ、Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（フリーマン（Ｆｒｅｅｍａｎ）、サンフランシスコ、１９６９）ｐｐ．２７−６２）によってもまた合成可能である。これらおよび他の適する製造方法は当業者の知識内にありかつ本発明の制限でない。
【００７２】
とりわけ望ましいタンパク質はＡＡＶキャプシドタンパク質を包含し、これらは上で同定されたヌクレオチド配列によりコードされる。本発明のキャプシドタンパク質の多くの配列は図２のアライメントにおよび／もしくは配列表、配列番号２および６０ないし１１５（引用することにより本明細書に組込まれる）に提供される。ＡＡＶキャプシドは選択的スプライス変異体である３種のタンパク質ｖｐ１、ｖｐ２およびｖｐ３から構成される。これらの図中で提供される完全長の配列はｖｐ１のものである。ＡＡＶ７キャプシド［配列番号２］の番号づけに基づき、ｖｐ２の配列はＡＡＶ７のアミノ酸１３８〜７３７にわたり、かつ、ｖｐ３の配列はＡＡＶ７のアミノ酸２０３〜７３７にわたる。この情報を用い、当業者は本発明の他の新規血清型のｖｐ２およびｖｐ３タンパク質の位置を容易に決定し得る。
【００７３】
キャプシドタンパク質の他の望ましいタンパク質およびフラグメントは超可変領域（ＨＰＶ）間に位置する定常および可変領域ならびにＨＰＶ領域それら自身の配列を包含する。ＡＡＶ２中の配列の相違の領域を決定するために開発されたアルゴリズムは１２の超可変領域（ＨＶＲ）を生じ、そのうち５種は４種の以前に記述された可変領域と重複するかもしくはその一部である。［Ｃｈｉｏｒｉｎｉら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ、７３：１３０９−１９（１９９９）；Ｒｕｔｌｅｄｇｅら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７２：３０９−３１９］このアルゴリズムおよび／もしくは本明細書に記述されるアライメント技術を使用して新規ＡＡＶ血清型のＨＶＲを決定する。例えばＡＡＶ２ ｖｐ１［配列番号７０］の番号に関し
て、ＨＶＲは以下のとおり位置を突き止められている：ＨＶＲ１、ａａ１４６〜１５２；ＨＶＲ２、ａａ１８２〜１８６；ＨＶＲ３、ａａ２６２〜２６４；ＨＶＲ４、ａａ３８１〜３８３；ＨＶＲ５、ａａ４５０〜４７４；ＨＶＲ６、ａａ４９０〜４９５；ＨＶＲ７、ａａ５００〜５０４；ＨＶＲ８、ａａ５１４〜５２２；ＨＶＲ９、ａａ５３４〜５５５；ＨＶＲ１０、ａａ５８１〜５９４；ＨＶＲ１１、ａａ６５８〜６６７；およびＨＶＲ１２、ａａ７０５〜７１９。慣習的方法に従って準備されるアライメントおよび本明細書に提供される新規配列［例えば図２を参照されたい］を利用して本発明の新規ＡＡＶ血清型中のＨＶＲの位置を容易に決定し得る。例えば、図２を利用してＡＡＶ７［配列番号２］についてのものを容易に決定可能である。ＨＶＲ１はａａ１４６〜１５２に位置し；ＨＶＲ２はａａ１８２〜１８７に位置し；ＨＶＲ３はａａ２６３〜２６６に位置し、ＨＶＲ４はａａ３８３〜３８５に位置し、ＨＶＲ５はａａ４５１〜４７５に位置し；ＨＶＲ６はＡＡＶ７のａａ４９１〜４９６に位置し；ＨＶＲ７はａａ５０１〜５０５に位置し；ＨＶＲ８はａａ５１３〜５２１に位置し；ＨＶＲ９は５３３〜５５６に位置し；ＨＶＲ１０はａａ５８３〜５９６に位置し；ＨＶＲ１１はａａ６６０〜６６９に位置し；ＨＶＲ１２はａａ７０７〜７２１に位置する。本明細書に提供される情報を使用して本発明の他の新規血清型のＨＶＲを容易に決定し得る。
【００７４】
加えて、キャプシド内で同一のアミノ酸カセットが同定された。これらのカセットは、それらが例えば別の血清型のＨＶＲ１カセットで選択された血清型のＨＶＲ１カセットを置き換えることにより人工的血清型の構築で有用であるためとりわけ興味深い。同一のこれらのカセットのあるものを図２に示す。Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘのアライメントを提供する図２を参照されたい。これは第一の残基位置について１で開始するルーラーが配列の下に表示されているを有する。ルーラーの上の線は強く保存される位置に印を付けるのに使用されている。３種の記号（*、：、．）が使用されている。「*」は単一の完全に保存された残基を有する位置を示す。「：」は「強い」群が完全に保存されることを示す。「．」は「より弱い」群が完全に保存されることを示す。これらは全部Ｇｏｎｎｅｔ Ｐａｍ２５０マトリックス中に存在する正に得点する群である。強い群は強い得点＞０．５と定義され、また、弱い群は弱い得点＜０．５と定義される。
【００７５】
加えて、ＡＡＶキャプシドの他の適するフラグメントの例は、ＡＡＶ２［配列番号７０］の番号づけに関して、ａａ２４〜４２、ａａ２５〜２８；ａａ８１〜８５；ａａ１３３〜１６５；ａａ１３４〜１６５；ａａ１３７〜１４３；ａａ１５４〜１５６；ａａ１９４〜２０８；ａａ２６１〜２７４；ａａ２６２〜２７４；ａａ１７１〜１７３；ａａ４１３〜４１７；ａａ４４９〜４７８；ａａ４９４〜５２５；ａａ５３４〜５７１；ａａ５８１〜６０１；ａａ６６０〜６７１；ａａ７０９〜７２３を包含する。なお他の望ましいフラグメントは、例えばＡＡＶ７中で配列番号２２のアミノ酸１ないし１８４、アミノ酸１９９ないし２５９；アミノ酸２７４ないし４４６；アミノ酸６０３ないし６５９；アミノ酸６７０ないし７０６；アミノ酸７２４ないし７３６；ａａ１８５ないし１９８；ａａ２６０ないし２７３；ａａ４４７ないし４７７；ａａ４９５ないし６０２；ａａ６６０ないし６６９；およびａａ７０７ないし７２３を包含する。ＡＡＶ７［配列番号２］の番号づけに基づくなお他の望ましい領域は、ａａ１８５ないし１９８；ａａ２６０ないし２７３；ａａ４４７ないし４７７；ａａ４９５ないし６０２；ａａ６６０ないし６６９；およびａａ７０７ないし７２３よりなる群のなかから選択される。Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘプログラムをデフォルトの設定で使用して実施される本明細書に提供されるアライメントを使用して、または他の商業的にもしくは公的に利用可能なアライメントプログラムをデフォルトの設定で使用して、当業者は本発明の新規ＡＡＶキャプシドの対応するフラグメントを容易に決定し得る。
【００７６】
他の望ましいタンパク質はＡＡＶ ｒｅｐタンパク質［ＡＡＶ７について配列番号３のａａ１ないし６２３］、ならびにとりわけ例えば配列番号３のａａ１ないし１７１、ａａ
１７２ないし３７２、ａａ３７３ないし４４４、ａａ４４５ないし６２３を包含するそれらの機能的フラグメントである。適してはこうしたフラグメントは長さが最低８アミノ酸である。図３を参照されたい。匹敵する領域は、本明細書に記述される技術および当該技術分野で既知であるものを使用して本発明の他の新規ＡＡＶのタンパク質中で同定され得る。加えて、他の所望の長さのフラグメントが容易に利用されるかもしれない。こうしたフラグメントは組換え的にもしくは他の適する手段例えば化学合成により製造されるかもしれない。
【００７７】
本発明の配列、タンパク質およびフラグメントは組換え製造、化学合成もしくは他の合成手段を包含するいずれの適する手段により製造してもよい。こうした製造方法は当業者の知識内にありかつ本発明の制限でない。
【００７８】
ＩＶ．新規ＡＡＶキャプシドをもつｒＡＡＶの製造
本発明は本発明により同定される新規野性型ＡＡＶ血清型を包含し、この野性型ＡＡＶ血清型の配列はこれらのウイルスが天然で会合されているＤＮＡおよび／もしくは細胞性物質を含まない。別の局面において、本発明は標的細胞への異種遺伝子もしくは他の核酸配列の送達で有用な分子の製造のためのそれらのフラグメントを包含する本発明の新規ＡＡＶ配列を利用する分子を提供する。
【００７９】
本発明の新規ＡＡＶ血清型の配列を含有する本発明の分子は、宿主細胞に送達されうるいかなる遺伝因子（ベクター）、例えばその上で運搬される配列を移入する裸のＤＮＡ、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、エピソーム、非ウイルス送達ベヒクル（例えば脂質に基づく担体）中のタンパク質、ウイルスなども包含する。選択されたベクターはトランスフェクション、電気穿孔法、リポソーム送達、膜融合技術、高速のＤＮＡ被覆ペレット、ウイルス感染およびプロトプラスト融合を包含するいかなる適する方法により送達してもよい。本発明のいずれかの態様を構築するのに使用される方法は核酸操作の当業者に既知でありかつ遺伝子工学、組換え工学および合成技術を包含する。例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ、コールド スプリング ハーバー プレス（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク州コールドスプリングハーバーを参照されたい。
【００８０】
一態様において、本発明のベクターは本発明の新規ＡＡＶキャプシド（例えばＡＡＶ７キャプシド、ＡＡＶ７ ４４−２（ｒｈ．１０）、ＡＡＶ１０キャプシド、ＡＡＶ１１キャプシド、ＡＡＶ１２キャプシド）をコードする配列またはこれらのＡＡＶキャプシドの１種もしくはそれ以上のフラグメントを含有する。あるいは、該ベクターはキャプシドタンパク質もしくはそのフラグメントそれ自身を含有してもよい。
【００８１】
場合によっては、本発明のベクターはＡＡＶ ｒｅｐタンパク質をコードする配列を含有してよい。こうしたｒｅｐ配列はｃａｐ配列を提供している同一のＡＡＶ血清型からであってよい。あるいは、本発明は、ｒｅｐ配列がｃａｐ配列を提供しているものと異なるＡＡＶ血清型からであるベクターを提供する。一態様において、ｒｅｐおよびｃａｐ配列は別個の供給源（例えば別個のベクターもしくは宿主細胞およびベクター）から発現される。別の態様においてこれらのｒｅｐ配列はｃａｐ配列と同一の供給源から発現される。本態様において、ｒｅｐ配列は異なるＡＡＶ血清型のｃａｐ配列に同じ読み枠で融合されてキメラＡＡＶベクターを形成するかもしれない。場合によっては、本発明のベクターはＡＡＶ ５’ＩＴＲおよびＡＡＶ ３’ＩＴＲにより隣接される選択されたトランスジーンを含んでなるミニ遺伝子をさらに含有する。
【００８２】
従って、一態様において、本明細書に記述されるベクターは単一のＡＡＶ血清型（例え
ばＡＡＶ７もしくは別の新規ＡＡＶ）からでありうる無傷のＡＡＶキャプシドをコードする核酸配列を含有する。あるいは、これらのベクターは、異種ＡＡＶもしくは非ＡＡＶキャプシドタンパク質（またはそれらのフラグメント）に融合されたＡＡＶ７（もしくは別の新規ＡＡＶ）キャプシドの１種もしくはそれ以上のフラグメントを含有する人工的キャプシドをコードする配列を含有する。これらの人工的キャプシドタンパク質はＡＡＶ７（もしくは別の新規ＡＡＶ）キャプシドの非連続的部分または他のＡＡＶ血清型のキャプシドから選択される。例えば、例えば超可変領域（すなわちＨＰＶ１−１２）の１個もしくはそれ以上中のＡＡＶ ｖｐ１あるいはｖｐ２および／またはｖｐ３の１種もしくはそれ以上のコーディング領域を改変することが望ましいかもしれない。別の例ではｖｐ３タンパク質の開始コドンをＧＴＧに変えることが望ましいかもしれない。これらの改変は選択された発現系における発現、収量を増大させかつ／もしくは精製を向上させるため、または別の所望の目的（例えば向性を変えるかもしくは中和抗体エピトープを変える）上であってよい。
【００８３】
本明細書に記述されるベクター、例えばプラスミドは多様な目的上有用であるが、しかし、ＡＡＶ配列もしくはそれらのフラグメントを含んでなるキャプシドを含有するｒＡＡＶの製造における使用にとりわけ良好に適する。ｒＡＡＶを包含するこれらのベクター、それらの要素、構成および用途を本明細書に詳細に記述する。
【００８４】
一局面において、本発明はＡＡＶ血清型７（もしくは別の新規ＡＡＶ）のキャプシドまたはその一部分を有する組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の生成方法を提供する。こうした方法は、本明細書に定義されるところのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）血清型７（もしくは別の新規ＡＡＶ）のキャプシドタンパク質またはそのフラグメント；機能的ｒｅｐ遺伝子；最低でもＡＡＶ逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）およびトランスジーンから構成されるミニ遺伝子；ならびにミニ遺伝子のＡＡＶ７（もしくは別の新規ＡＡＶ）のキャプシドタンパク質中へのパッケージングを可能にするのに十分なヘルパー機能をコードする核酸配列を含有する宿主細胞を培養することを必要とする。
【００８５】
ＡＡＶキャプシド中にＡＡＶミニ遺伝子をパッケージングするために宿主細胞中で培養されるのに必要とされる成分は宿主細胞にｔｒａｎｓで提供してもよい。あるいは、必要とされる成分（例えばミニ遺伝子、ｒｅｐ配列、ｃａｐ配列および／もしくはヘルパー機能）のいずれか１種もしくはそれ以上を、当業者に既知の方法を使用して必要とされる成分の１種もしくはそれ以上を含有するよう工作された安定な宿主細胞により提供してもよい。最も適しては、こうした安定な宿主細胞は誘導可能なプロモーターの制御下に必要とされる成分（１種もしくは複数）を含有することができる。しかしながら必要とされる成分（１種もしくは複数）は構成的プロモーターの制御下にあってもよい。適する誘導可能なおよび構成的プロモーターの例は、トランスジーンとの使用に適する調節要素の考察において本明細書に提供される。なお別の代替において、選択された安定な宿主細胞は構成的プロモーターの制御下の選択された成分（１種もしくは複数）および１種もしくはそれ以上の誘導可能なプロモーターの制御下の他の選択された成分（１種もしくは複数）を含有してもよい。例えば、２９３細胞（構成的プロモーターの制御下にＥ１ヘルパー機能を含有する）由来であるがしかし誘導可能なプロモーターの制御下にｒｅｐおよび／もしくはｃａｐタンパク質を含有する安定な宿主細胞を生成させうる。なお他の安定な宿主細胞が当業者により生成されうる。
【００８６】
本発明のｒＡＡＶを製造するのに必要とされるミニ遺伝子、ｒｅｐ配列、ｃａｐ配列およびヘルパー機能は、その上で運搬される配列を移入するいずれかの遺伝因子の形態でパッケージング宿主細胞に送達してよい。選択された遺伝因子は本明細書に記述されるものを包含するいずれの適する方法により送達してもよい。本発明のいずれかの態様を構築するのに使用される方法は核酸操作の当業者に既知でありかつ遺伝子工学、組換え工学およ
び合成技術を包含する。例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、コールド スプリング ハーバー プレス（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク州コールドスプリングハーバーを参照されたい。同様にｒＡＡＶビリオンの生成方法は公知でありそして適する方法の選択は本発明に対する制限でない。例えばＫ．Ｆｉｓｈｅｒら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７０：５２０−５３２（１９９３）および米国特許第５，４７８，７４５号明細書を参照されたい。
【００８７】
Ａ．ミニ遺伝子
ミニ遺伝子は、最低でもトランスジーンおよびその調節配列ならびに５’および３’ＡＡＶ逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）より構成される。キャプシドタンパク質中にパッケージングされかつ選択された宿主細胞に送達されるのはこのミニ遺伝子である。
【００８８】
１．トランスジーン
トランスジーンは、目的のポリペプチド、タンパク質もしくは他の産物をコードする、トランスジーンに隣接するベクター配列に対し異種の核酸配列である。核酸のコーディング配列は宿主細胞中でのトランスジーンの転写、翻訳および／もしくは発現を可能にする様式で調節成分に効果的に連結される。
【００８９】
トランスジーン配列の組成は生じるベクターが置かれることができる使用に依存することができる。例えば、１つの型のトランスジーン配列は発現に際して検出可能なシグナルを生じるレポーター配列を包含する。こうしたレポーター配列は、制限なしに、それに向けられる高親和性抗体が存在するかもしくは慣習的手段により生じられる可能性のある、β−ラクタマーゼ、β−ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、アルカリホスファターゼ、チミジンキナーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ルシフェラーゼ、例えばＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ８を包含する膜結合型タンパク質、インフルエンザヘマグルチニンタンパク質および当該技術分野で公知の他者、ならびにとりわけヘマグルチニンもしくはＭｙｃからの抗原標識ドメインに適切に融合された膜結合型タンパク質を含んでなる融合タンパク質をコードするＤＮＡを包含する。
【００９０】
これらのコーディング配列はそれらの発現を駆動する調節要素と会合される場合に酵素的、Ｘ線撮影的、比色的、蛍光もしくは他の分光的アッセイ、蛍光標示式細胞分取アッセイ、ならびに酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）および免疫組織化学を包含する免疫学的アッセイを包含する慣習的手段により検出可能なシグナルを提供する。例えば、マーカー配列がＬａｃＺ遺伝子である場合、該シグナルを運搬するベクターの存在はβ−ガラクトシダーゼ活性についてのアッセイにより検出される。トランスジーンが緑色蛍光タンパク質もしくはルシフェラーゼである場合、該シグナルを運搬するベクターはルミノメーターで色もしくは光産生により視覚的に測定しうる。
【００９１】
しかしながら、望ましくは、トランスジーンはタンパク質、ペプチド、ＲＮＡ、酵素もしくは触媒的ＲＮＡのような生物学および医学で有用である産物をコードする非マーカー配列である。望ましいＲＮＡ分子はｔＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、触媒的ＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡを包含する。有用なＲＮＡ配列の一例は処置された動物中で標的とされた核酸配列の発現を失わせる配列である。
【００９２】
トランスジーンは遺伝子欠損を是正すなわち改善するのに使用されるかもしれず、これは正常遺伝子が正常レベルより少なく発現される欠損もしくは機能的遺伝子産物が発現されない欠損を包含しうる。好ましい型のトランスジーン配列は宿主細胞中で発現される治療的タンパク質もしくはポリペプチドをコードする。本発明はさらに、例えば多サブユニ
ットタンパク質により引き起こされる遺伝子の欠陥を是正すなわち改善するために複数のトランスジーンを使用することを包含する。ある状況においては、１タンパク質の各サブユニットをコードする、または多様なペプチドもしくはタンパク質をコードするのに異なるトランスジーンが使用されるかもしれない。これはタンパク質サブユニットをコードするＤＮＡの大きさが大きい場合、例えば免疫グロブリン、血小板由来増殖因子もしくはジストロフィンタンパク質について望ましい。細胞に多サブユニットタンパク質を産生させるためには細胞を多様なサブユニットのそれぞれを含有する組換えウイルスに感染させる。あるいは、１タンパク質の多様なサブユニットが同一のトランスジーンによりコードされるかもしれない。この場合、単一のトランスジーンはサブユニットのそれぞれをコードするＤＮＡを包含し、各サブユニットのＤＮＡは配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）により分離される。これは、サブユニットのそれぞれをコードするＤＮＡの大きさが小さい、例えばサブユニットおよびＩＲＥＳをコードするＤＮＡ全体の大きさが５キロ塩基未満である場合に望ましい。ＩＲＥＳに対する一代替として、ＤＮＡは、転写後事象において自己切断する２Ａペプチドをコードする配列により分離されてよい。例えば、Ｍ．Ｌ．Ｄｏｎｎｅｌｌｙら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．、７８（Ｐｔ１）：１３−２１（Ｊａｎ
１９９７）；Ｆｕｒｌｅｒ，Ｓ．ら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、８（１１）：８６４−８７３（Ｊｕｎｅ ２００１）；Ｋｌｕｍｐ Ｈ．ら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、８（１０）：８１１−８１７（Ｍａｙ ２００１）を参照されたい。この２ＡペプチドはＩＲＥＳより有意に小さく、空間が制限因子である場合にそれを使用に十分に適するようにする。しかしながら、選択されたトランスジーンはいかなる生物学的に活性の産物もしくは他の産物、例えば研究に望ましい産物をコードしてもよい。
【００９３】
適するトランスジーンは当業者により容易に選択されうる。トランスジーンの選択は本発明の制限であるとみなされない。
【００９４】
２．調節要素
ミニ遺伝子について上で同定された主要な要素に加え、該ベクターはまた該プラスミドベクターでトランスフェクトされたかもしくは本発明により製造されるウイルスに感染した細胞中でのその転写、翻訳および／もしくは発現を可能にする様式でトランスジーンに操作可能に連結される必要な慣習的調節領域も包含する。本明細書で使用されるところの「操作可能に連結される」配列は、目的の遺伝子と連続する発現制御配列および目的の遺伝子を制御するのにｔｒａｎｓでもしくは離れて作用する発現制御配列双方を包含する。
【００９５】
発現制御配列は、適切な転写開始、終止、プロモーターおよびエンハンサー配列；スプライシングおよびポリアデニル化（ポリＡ）シグナルのような効率的なＲＮＡプロセシングシグナル；細胞質のｍＲＮＡを安定化する配列；翻訳効率を高める配列（すなわちコザックコンセンサス配列）；タンパク質の安定性を高める配列；ならびに所望の場合はコードされる産物の分泌を高める配列を包含する。天然の、構成的、誘導可能なおよび／もしくは組織特異的であるプロモーターを包含する多数の発現制御配列が当該技術分野で既知でありかつ利用されうる。
【００９６】
構成的プロモーターの例は、制限なしに、レトロウイルスのラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）のＬＴＲプロモーター（場合によってはＲＳＶエンハンサーを伴う）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（場合によってはＣＭＶエンハンサーを伴う）［例えばＢｏｓｈａｒｔら、Ｃｅｌｌ、４１：５２１−５３０（１９８５）を参照されたい］、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸還元酵素プロモーター、β−アクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターおよびＥＦ１αプロモーター［インヴィトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）］を包含する。
【００９７】
誘導可能なプロモーターは遺伝子発現の調節を可能にしかつ外因性に供給される化合物
、温度のような環境因子、もしくは特定の生理学的状態の存在、例えば急性期、細胞の特定の分化状態により、または複製細胞中でのみ調節され得る。誘導可能なプロモーターおよび誘導可能な系は、制限なしに、インヴィトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）およびアライアド（Ａｒｉａｄ）を包含する多様な商業的供給源から入手可能である。多くの他の系が記述されておりそして当業者により容易に選択可能である。外因性に供給されるプロモーターにより調節される誘導可能なプロモーターの例は、亜鉛で誘導可能なヒツジメタロチオニン（ＭＴ）プロモーター、デキサメサゾン（Ｄｅｘ）で誘導可能なマウス乳腺癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、Ｔ７ポリメラーゼプロモーター系［第ＷＯ ９８／１００８８号明細書］；エクダイソン昆虫プロモーター［Ｎｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９３：３３４６−３３５１（１９９６）］、テトラサイクリンで抑制可能な系［Ｇｏｓｓｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：５５４７−５５５１（１９９２）］、テトラサイクリンで誘導可能な系［Ｇｏｓｓｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６８：１７６６−１７６９（１９９５）、Ｈａｒｖｅｙら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．、２：５１２−５１８（１９９８）もまた参照されたい］、ＲＵ４８６で誘導可能な系［Ｗａｎｇら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．、１５：２３９−２４３（１９９７）およびＷａｎｇら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、４：４３２−４４１（１９９７）］、ならびにラパマイシンで誘導可能な系［Ｍａｇａｒｉら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、１００：２８６５−２８７２（１９９７）］を包含する。この情況で有用でありうるなお他の型の誘導可能なプロモーターは、特定の生理学的状態、例えば温度、急性期、細胞の特定の分化状態により、もしくは複製細胞中でのみ調節されるものである。
【００９８】
別の態様においてトランスジーンの天然のプロモーターを使用することができる。天然のプロモーターはトランスジーンの発現が天然の発現を模倣すべきであることが望ましい場合に好ましいかもしれない。天然のプロモーターは、トランスジーンの発現が一時的にもしくは発達的に、または組織特異的様式で、あるいは特定の転写刺激に応答して調節されなければならない場合に使用しうる。さらなる一態様において、エンハンサー要素、ポリアデニル化部位もしくはコザックコンセンサス配列のような他の天然の発現調節領域もまた、天然の発現を模倣するのに使用してもよい。
【００９９】
トランスジーンの別の態様は組織特異的プロモーターに操作可能に連結されたトランスジーンを包含する。例えば、骨格筋中での発現が望ましい場合は、筋中で活性のプロモーターを使用すべきである。これらは、骨格β−アクチン、ミオシンＬ鎖２Ａ、ジストロフィン、筋クレアチンキナーゼ、ならびに天然に存在するプロモーターより高い活性をもつ合成の筋プロモーター（Ｌｉら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．、１７：２４１−２４５（１９９９）を参照されたい）をコードする遺伝子からのプロモーターを包含する。組織特異的であるプロモーターの例は、とりわけ、肝（アルブミン、Ｍｉｙａｔａｋｅら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７１；５１２４−３２（１９９７）；Ｂ型肝炎ウイルスコアプロモーター、Ｓａｎｄｉｇら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、３；１００２−９（１９９６）；α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、Ａｒｂｕｔｈｎｏｔら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、７：１５０３−１４（１９９６））、骨オステオカルシン（Ｓｔｅｉｎら、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．、２４：１８５−９６（１９９７））；骨シアロタンパク質（Ｃｈｅｎら、Ｊ．Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．、１１：６５４−６４（１９９６））、リンパ球（ＣＤ２、Ｈａｎｓａｌら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６１：１０６３−８（１９９８）；免疫グロブリンＨ鎖；Ｔ細胞受容体α鎖）、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモーター（Ａｎｄｅｒｓｅｎら、Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．、１３：５０３−１５（１９９３））、神経細糸Ｌ鎖遺伝子（Ｐｉｃｃｉｏｌｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８８：５６１１−５（１９９１））およびニューロン特異的ｖｇｆ遺伝子（Ｐｉｃｃｉｏｌｉら、Ｎｅｕｒｏｎ、１５：３７３−８４（１９９５））のようなニューロンのものについて既知である。
【０１００】
場合によっては、治療上有用なトランスジーンを運搬するプラスミドは選択可能なマーカーもまた包含しうるか、またはレポーター遺伝子はとりわけジェネチシン、ヒグロミシン（ｈｙｇｒｏｍｉｃｉｎ）もしくはピューリマイシン（ｐｕｒｉｍｙｃｉｎ）耐性をコードする配列を包含してよい。こうした選択可能なレポーターもしくはマーカー遺伝子（好ましくは本発明の方法によりレスキューされるべきウイルスゲノムの外側に配置される）を、細菌細胞中のプラスミドの存在を知らせるのに使用し得る（アンピシリン耐性のように）。プラスミドの他の成分は複製起点を包含してもよい。これらおよび他のプロモーターおよびベクター要素の選択は慣習的であり、そして多くのこうした配列が利用可能である［例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、およびその中に引用される参考文献を参照されたい］。
【０１０１】
トランスジーン、プロモーター／エンハンサー、ならびに５’および３’ＩＴＲの組合せは本明細書で言及の容易さのため「ミニ遺伝子」と称する。本発明の教示を提供されれば、こうしたミニ遺伝子の設計は慣習的技術を頼ることにより行い得る。
【０１０２】
３．パッケージング宿主細胞へのミニ遺伝子の送達
ミニ遺伝子は宿主細胞に送達されるいかなる適するベクター、例えばプラスミド上でも運搬され得る。それらが複製および場合によっては原核生物細胞、哺乳動物細胞もしくは双方中への組込みに適するような本発明で有用なプラスミドを工作してよい。これらのプラスミド（もしくは５’ＡＡＶ ＩＴＲ−異種分子−３’ＩＴＲを運搬する他のベクター）は真核生物および／もしくは原核生物における該ミニ遺伝子の複製を可能にする配列ならびにこれらの系の選択マーカーを含有する。選択可能なマーカーもしくはレポーター遺伝子はとりわけジェネチシン、ヒグロミシン（ｈｙｇｒｏｍｉｃｉｎ）もしくはピューリマイシン（ｐｕｒｉｍｙｃｉｎ）耐性をコードする配列を包含してよい。プラスミドは、細菌細胞中での該ベクターの存在を知らせるのに使用し得るある種の選択可能なレポーターもしくはマーカー遺伝子もまた含有してよい（アンピシリン耐性のような）。プラスミドの他の成分は複製起点およびエプスタイン−バーウイルス核抗原を使用するアンプリコン系のようなアンプリコンを包含してよい。このアンプリコン系もしくは他の類似のアンプリコン成分は細胞中での高コピーのエピソーム複製を可能にする。好ましくは、ミニ遺伝子を運搬する分子をそれが一時的に存在しうる細胞中にトランスフェクトする。あるいは、ミニ遺伝子（５’ＡＡＶ ＩＴＲ−異種分子−３’ＩＴＲを運搬する）は染色体でもしくはエピソームとしてのいずれかで宿主細胞のゲノム中に安定に組込まれるかもしれない。ある態様において、ミニ遺伝子は場合によっては頭部から頭部、頭部から尾部もしくは尾部から尾部のコンカテマーで複数コピーで存在しうる。適するトランスフェクション技術は既知でありかつミニ遺伝子を宿主細胞に送達するのに容易に利用しうる。
【０１０３】
一般に、ミニ遺伝子を含んでなるベクターをトランスフェクションにより送達させる場合、ベクターは、約１×１０^４細胞ないし約１×１０^１３細胞および好ましくは約１０^５細胞に対し約５μｇから約１００μｇまでのＤＮＡ、および好ましくは約１０ないし約５０μｇのＤＮＡの量で送達される。しかしながら宿主細胞に対するベクターＤＮＡの相対量は、選択されたベクター、送達方法および選択された宿主細胞のような因子を考慮に入れて調節してよい。
【０１０４】
Ｂ．ｒｅｐおよびｃａｐ配列
ミニ遺伝子に加え、宿主細胞は、宿主細胞中での新規ＡＡＶキャプシドタンパク質（例えばＡＡＶ７もしくは他の新規ＡＡＶキャプシド、またはこれらのキャプシドの１種もしくはそれ以上のフラグメントを含んでなる人工的キャプシドタンパク質）の発現を駆動する配列、およびミニ遺伝子中に見出されるＡＡＶ ＩＴＲの血清型と同一の血清型のｒｅｐ配列を含有する。ＡＡＶのｃａｐおよびｒｅｐ配列は上述されたところのＡＡＶ供給源
から独立に得てよく、そして上述されたところの当業者に既知のいずれかの様式で宿主細胞中に導入してよい。加えて、本発明の新規ＡＡＶキャプシドをシュードタイピングする（ｐｓｅｕｄｏｔｙｐｉｎｇ）場合に、必須のｒｅｐタンパク質のそれぞれをコードする配列は同一のＡＡＶ血清型により供給されうるか、もしくはｒｅｐタンパク質をコードする配列を異なるＡＡＶ血清型（例えばＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡ５、ＡＡＶ６もしくは本明細書で同定される新規血清型の１つ）により供給しうる。例えば、ｒｅｐ７８／６８配列はＡＡＶ２からでありうる一方、ｒｅｐ５２／４０配列はＡＡＶ１からかもしれない。
【０１０５】
一態様において、宿主細胞は上述されたもののような適するプロモーターの制御下にキャプシドタンパク質を安定に含有する。最も望ましくは、本態様においてキャプシドタンパク質は誘導可能なプロモーターの制御下に発現される。別の態様においてキャプシドタンパク質はｔｒａｎｓで宿主細胞に供給される。宿主細胞にｔｒａｎｓで送達される場合、キャプシドタンパク質は該宿主細胞中での選択されたキャプシドタンパク質の発現を指図するのに必要な配列を含有するプラスミドを介して送達してよい。最も望ましくは、宿主細胞にｔｒａｎｓで送達される場合、キャプシドタンパク質を運搬するプラスミドはｒＡＡＶのパッケージングに必要とされる他の配列、例えばｒｅｐ配列もまた運搬する。
【０１０６】
別の態様において、宿主細胞は上述されたもののような適するプロモーターの制御下にｒｅｐ配列を安定に含有する。最も望ましくは、本態様において必須のｒｅｐタンパク質は誘導可能なプロモーターの制御下に発現される。別の態様においてｒｅｐタンパク質はｔｒａｎｓで宿主細胞に供給される。宿主細胞にｔｒａｎｓで送達される場合、ｒｅｐタンパク質は宿主細胞中での選択されたｒｅｐタンパク質の発現を指図するのに必要な配列を含有するプラスミドを介して送達してよい。最も望ましくは、宿主細胞にｔｒａｎｓで送達される場合、キャプシドタンパク質を運搬するプラスミドはｒＡＡＶをパッケージングするのに必要とされる他の配列、例えばｒｅｐおよびｃａｐ配列もまた運搬する。
【０１０７】
従って、一態様においてｒｅｐおよびｃａｐ配列は単一の核酸分子上で宿主細胞にトランスフェクトしてよく、そしてエピソームとして細胞中に安定に存在するかもしれない。別の態様においてｒｅｐおよびｃａｐ配列は細胞のゲノム中に安定に組込まれる。別の態様は宿主細胞中で一過性に発現されるｒｅｐおよびｃａｐ配列を有する。例えば、こうしたトランスフェクションに有用な核酸分子は、５’から３’へ、プロモーター、プロモーターとｒｅｐ遺伝子配列の開始部位との間に挟まれた任意のスペーサー、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子配列およびＡＡＶ ｃａｐ遺伝子配列を含んでなる。
【０１０８】
場合によっては、ｒｅｐおよび／もしくはｃａｐ配列は宿主細胞中に導入されるべきである他のＤＮＡ配列を含有するベクター上で供給されるかもしれない。例えばベクターはミニ遺伝子を含んでなるｒＡＡＶ構築物を含有しうる。該ベクターはヘルパー機能をコードする遺伝子、例えばアデノウイルスタンパク質Ｅ１、Ｅ２ａおよびＥ４ＯＲＦ６ならびにＶＡＩ ＲＮＡの遺伝子の１種もしくはそれ以上を含むかもしれない。
【０１０９】
好ましくは、本構築物中で使用されるプロモーターは、当業者に既知のもしくは上で論考されたところの構成的、誘導可能なもしくは天然のプロモーターのいずれであってもよい。一態様においてＡＡＶ Ｐ５プロモーター配列を使用する。これらの配列のいずれかを提供するためのＡＡＶの選択は本発明を制限しない。
【０１１０】
別の好ましい態様において、ｒｅｐのプロモーターは誘導可能なプロモーターであり、これはトランスジーンの調節要素に関して上で論考されるとおりである。ｒｅｐ発現のための１つの好ましいプロモーターはＴ７プロモーターである。Ｔ７プロモーターにより調節されるｒｅｐ遺伝子、およびｃａｐ遺伝子を含んでなるベクターは、Ｔ７ポリメラーゼ
を構成的にもしくは誘導可能にのいずれかで発現する細胞にトランスフェクトもしくは形質転換される。１９９８年３月１２日公開の第ＷＯ ９８／１００８８号明細書を参照されたい。
【０１１１】
スペーサーはベクターの設計において任意の要素である。スペーサーはプロモーターとｒｅｐ遺伝子のＡＴＧ開始コドンとの間に挟まれるＤＮＡ配列である。スペーサーはいかなる所望の設計を有してもよく；すなわち、それはヌクレオチドの無作為の配列であってもよいか、あるいは、それはマーカー遺伝子のような遺伝子産物をコードしてもよい。スペーサーは開始／終止およびポリＡ部位を典型的に組込む遺伝子を含有してよい。スペーサーは原核生物もしくは真核生物からの非コーディングＤＮＡ配列、反復性の非コーディング配列、転写制御を伴わないコーディング配列もしくは転写制御を伴うコーディング配列であってよい。スペーサー配列の２つの例示的供給源はλファージラダー配列もしくは酵母ラダー配列であり、これらはとりわけ例えばギブコ（Ｇｉｂｃｏ）もしくはインヴィトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から商業的に入手可能である。スペーサーは、ｒｅｐ５２、ｒｅｐ４０およびｃａｐ遺伝子産物を正常レベルで発現されるまま残し、ｒｅｐ７８およびｒｅｐ６８遺伝子産物の発現を低下させるのに十分ないかなる大きさのものであってもよい。スペーサーの長さは従って約１０ｂｐから約１０．０ｋｂｐまで、好ましくは約１００ｂｐないし約８．０ｋｐｂの範囲の範囲にわたってよい。組換えの可能性を低下させるために、スペーサーは好ましくは長さが２ｋｂｐ未満であるが；しかしながら本発明はそのように制限されない。
【０１１２】
ｒｅｐおよびｃａｐを提供する分子（１種もしくは複数）が宿主細胞中に一過性に（すなわちトランスフェクションにより）存在しうるとは言え、ｒｅｐおよびｃａｐタンパク質の一方もしくは双方ならびにそれらの発現を制御するプロモーター（１種もしくは複数）が例えばエピソームとしてもしくは宿主細胞の染色体中への組込みにより宿主細胞中で安定に発現されることが好ましい。本発明の態様を構築するのに使用される方法は上の参考文献で記述されたもののような慣習的遺伝子工学もしくは組換え工学技術である。本明細は本明細書に提供される情報を使用して特定の構築物の具体的に説明する例を提供する一方、当業者はスペーサー、Ｐ５プロモーター、ならびに最低１種の転写開始および終止シグナルを包含する他の要素ならびにポリアデニル化部位の任意の付加の選択を使用して他の適する構築物を選択かつ設計しうる。
【０１１３】
本発明の別の態様において、ｒｅｐもしくはｃａｐタンパク質は宿主細胞により安定に提供されるかもしれない。
【０１１４】
Ｃ．ヘルパー機能
パッケージング宿主細胞は本発明のｒＡＡＶをパッケージングするためにヘルパー機能もまた必要とする。場合によってはこれらの機能はヘルペスウイルスにより供給されるかもしれない。最も望ましくは、必要なヘルパー機能はそれぞれ上述されたもののようなヒトもしくは非ヒト霊長類のアデノウイルス供給源から供給され、かつ／またはアメリカン
タイプ カルチャー コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ＡＴＣＣ）、バージニア州マナサス（米国）を包含する多様な供給源から入手可能である。現在好ましい一態様において、宿主細胞はＥ１ａ遺伝子産物、Ｅ１ｂ遺伝子産物、Ｅ２ａ遺伝子産物および／もしくはＥ４ ＯＲＦ６遺伝子産物を提供されかつ／もしくは含有する。宿主細胞はＶＡＩ ＲＮＡのような他のアデノウイルス遺伝子を含有してもよいがしかしこれらの遺伝子は必要とされない。好ましい一態様において他のアデノウイルス遺伝子もしくは遺伝子機能は宿主細胞中に存在しない。
【０１１５】
「Ｅ１ａ遺伝子産物を発現するアデノウイルスＤＮＡ」により、Ｅ１ａもしくはいずれかの機能的Ｅ１ａ部分をコードするいかなるアデノウイルス配列も意味している。Ｅ２ａ
遺伝子産物を発現するアデノウイルスＤＮＡおよびＥ４ ＯＲＦ６遺伝子産物を発現するアデノウイルスＤＮＡは同様に定義される。アデノウイルス遺伝子もしくはその機能的部分のいかなる対立遺伝子もしくは他の改変もまた包含される。こうした改変は、何らかの様式でアデノウイルスの機能を高める慣習的遺伝子工学もしくは突然変異誘発技術、ならびにその天然に存在する対立遺伝子変異体に頼ることにより慎重に導入しうる。こうした改変およびこれらのアデノウイルス遺伝子機能を達成するためのＤＮＡの操作方法は当業者に既知である。
【０１１６】
アデノウイルスのＥ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ２ａおよび／もしくはＥ４ＯＲＦ６遺伝子産物、ならびにいかなる他の所望のヘルパー機能も、細胞中でのそれらの発現を可能にするいずれかの手段を使用して提供し得る。これらの産物をコードする配列のそれぞれは別個のベクター上にあってよいか、または１種もしくはそれ以上の遺伝子が同一のベクター上にあってよい。ベクターは、プラスミド、コスミドおよびウイルスを包含する当該技術分野で既知もしくは上に開示されたいかなるベクターであってもよい。ベクターの宿主細胞中への導入は、とりわけ、トランスフェクション、感染、電気穿孔法、リポソーム送達、膜融合技術、高速のＤＮＡ被覆ペレット、ウイルス感染およびプロトプラスト融合を包含する当該技術分野で既知もしくは上で開示されたところのいずれかの手段により達成しうる。アデノウイルス遺伝子の１種もしくはそれ以上は、宿主細胞のゲノム中に安定に組込まれるか、エピソームとして安定に発現されるか、もしくは一過性に発現されうる。遺伝子産物は全部エピソーム上で一過性に発現されるかもしくは安定に組込まれるかもれしれないか、または遺伝子産物のいくつかは安定に発現されるかもしれない一方で他者は一過性に発現される。さらに、アデノウイルス遺伝子のそれぞれのプロモーターは構成的プロモーター、誘導可能なプロモーターもしくは天然のアデノウイルスプロモーターから独立に選択しうる。プロモーターは生物体もしくは細胞の特定の生理学的状態により（すなわち分化状態により、または複製中もしくは静止期の細胞中で）あるいは例えば外因性に添加される因子により調節しうる。
【０１１７】
Ｄ．宿主細胞およびパッケージング細胞系
宿主細胞それ自身は、原核生物（例えば細菌）細胞、ならびに昆虫細胞、酵母細胞および哺乳動物細胞を包含する真核生物細胞を包含するいかなる生物学的生物体から選択してもよい。とりわけ望ましい宿主細胞は、制限なしに、Ａ５４９、ＷＥＨＩ、３Ｔ３、１０Ｔ１／２、ＢＨＫ、ＭＤＣＫ、ＣＯＳ １、ＣＯＳ ７、ＢＳＣ １、ＢＳＣ ４０、ＢＭＴ １０、ＶＥＲＯ、ＷＩ３８、ＨｅＬａ、２９３細胞（機能的アデノウイルスＥ１を発現する）、Ｓａｏｓ、Ｃ２Ｃ１２、Ｌ細胞、ＨＴ１０８０、ＨｅｐＧ２、ならびにヒト、サル、マウス、ラット、ウサギおよびハムスターを包含する哺乳動物由来の初代線維芽細胞、肝細胞および筋芽細胞のような細胞を包含するいずれかの哺乳動物種のなかから選択される。細胞を提供する哺乳動物種の選択は本発明の制限でなく；哺乳動物細胞の型すなわち線維芽細胞、肝細胞、腫瘍細胞などもそうでない。最も望ましい細胞は、Ｅ１、Ｅ２ａおよび／もしくはＥ４ＯＲＦ６以外のいかなるアデノウイルス遺伝子も運搬せず；それらはｒＡＡＶの製造の間に汚染するウイルスの相同的組換えをもたらす可能性のあるいかなる他のウイルス遺伝子も含有せず；かつ、それはＤＮＡの感染もしくはトランスフェクションおよびトランスフェクトされたＤＮＡの発現が可能である。好ましい一態様において、宿主細胞は細胞中に安定にトランスフェクトされたｒｅｐおよびｃａｐを有するものである。
【０１１８】
本発明で有用な１宿主細胞は、ｒｅｐおよびｃａｐをコードする配列で安定に形質転換されかつアデノウイルスのＥ１、Ｅ２ａおよびＥ４ＯＲＦ６ ＤＮＡならびに上述されたところのミニ遺伝子を運搬する構築物でトランスフェクトされる宿主細胞である。Ｂ−５０（第ＰＣＴ／ＵＳ９８／１９４６３号明細書）のような安定なｒｅｐおよび／もしくはｃａｐ発現細胞系または米国特許第５，６５８，７８５号明細書に記述されるものもまた
同様に使用してよい。別の望ましい宿主細胞はＥ４ ＯＲＦ６を発現するのに十分である最小限のアデノウイルスＤＮＡを含有する。なお他の細胞系は本発明の新規ＡＡＶ ｒｅｐおよび／もしくは新規ＡＡＶ ｃａｐ配列を使用して構築可能である。
【０１１９】
本発明の宿主細胞の製造は選択されたＤＮＡ配列の集成のような技術を必要とする。この集成は慣習的技術を利用して達成しうる。こうした技術は、公知でありかつ上で引用されるＳａｍｂｒｏｏｋらに記述されるｃＤＮＡおよびゲノムクローニング、ポリメラーゼ連鎖反応、合成方法および所望のヌクレオチド配列を提供するいずれかの他の適する方法と組合せたアデノウイルスおよびＡＡＶゲノムの重複オリゴヌクレオチド配列の使用を包含する。
【０１２０】
宿主細胞中への（プラスミドもしくはウイルスとしての）分子の導入は当業者に既知かつ本明細全体で論考されるところの技術を使用してもまた達成しうる。好ましい態様において、標準的トランスフェクション技術、例えばＣａＰＯ_４トランスフェクションもしくは電気穿孔法および／またはヒト胚腎細胞系ＨＥＫ２９３（ｔｒａｎｓに作用するＥ１タンパク質を提供する機能的アデノウイルスＥ１遺伝子を含有するヒト腎細胞系）のような細胞系中へのハイブリッドアデノウイルス／ＡＡＶベクターによる感染が使用される。
【０１２１】
当業者により生成されるこれら新規のＡＡＶに基づくベクターは、ＡＡＶ７に対する中和抗体がヒト集団で見出されていないため、選択された宿主細胞への遺伝子送達および遺伝子治療患者に有益である。さらに、初期の研究はカニクイザル（ｃｙｎｏ ｍｏｎｋｅｙ）およびチンパンジー集団で中和抗体を示さず、また、アカゲザル（該血清型が単離された種）でＡＡＶ７の１５％未満の交差反応性を示す。当業者は、本明細書に提供されるＡＡＶ７キャプシドタンパク質を含有する他のｒＡＡＶウイルスベクターを、当業者に既知の多様な技術を使用して容易に製造しうる。ＡＡＶ７配列および別の血清型のＡＡＶキャプシドを含有するなお他のｒＡＡＶウイルスベクターを同様に製造しうる。類似の利点が本発明の他の新規ＡＡＶに基づくベクターにより賦与される。
【０１２２】
従って、当業者は、本発明のＡＡＶ７配列がこれらおよびｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏもしくはｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子送達のための他のウイルスベクター系における使用に容易に適合され得ることを容易に理解するであろう。同様に、当業者は、多様なｒＡＡＶおよび非ｒＡＡＶベクター系における使用に本発明の新規ＡＡＶゲノムの他のフラグメントを容易に選択し得る。こうしたベクター系は例えばレンチウイルス、レトロウイルス、ポックスウイルス、ワクシニアウイルスおよびとりわけアデノウイルス系を包含してよい。これらのベクター系の選択は本発明の制限でない。
【０１２３】
従って、本発明はさらに本発明の新規ＡＡＶの核酸およびアミノ酸配列を使用して生成されたベクターを提供する。こうしたベクターは、治療的分子の送達およびワクチンレジメンにおける使用のためを包含する多様な目的上有用である。本発明の新規ＡＡＶのキャプシドを含有する組換えＡＡＶが治療的分子の送達にとりわけ望ましい。これらもしくは本発明の新規ＡＡＶ配列を含有する他のベクター構築物を例えばサイトカインの共送達もしくは免疫原それ自身の送達のためのワクチンレジメンで使用してよい。
【０１２４】
Ｖ．組換えウイルスおよびそれらの用途
本明細書に記述される技術を使用して、当業者は本発明の新規血清型のキャプシド、または本発明の方法により同定されるＡＡＶ血清型の１種もしくはそれ以上の新規フラグメントを含有する新規キャプシドを有するｒＡＡＶを生成しうる。一態様において、単一血清型例えばＡＡＶ７［配列番号２］からの完全長のキャプシドを利用し得る。別の態様において、別の選択されたＡＡＶ血清型からの配列と同じ読み枠で融合された本発明の新規血清型の１種もしくはそれ以上のフラグメントを含有する完全長のキャプシドが生成され
るかもしれない。例えば、ｒＡＡＶは本発明のＡＡＶ血清型の新規超可変領域配列の１種もしくはそれ以上を含有しうる。あるいは、本発明の独特のＡＡＶ血清型を他のウイルスもしくは非ウイルス配列を含有する構築物中で使用してよい。
【０１２５】
本発明のある血清型がある用途にとりわけ良好に適するであろうことが当該技術分野の一態様の当業者に容易に明らかであろう。例えば、本発明のＡＡＶ７キャプシドに基づくベクターは筋での使用にとりわけ良好に適し；一方で本発明のｒｈ．１０（４４−２）キャプシドに基づくベクターは肺での使用にとりわけ良好に適する。こうしたベクターの用途はそのように制限されず、また、当業者はこれらのベクターを他の細胞型、組織もしくは器官への送達に利用しうる。さらに、本発明の他のキャプシドに基づくベクターは、これらまたは他の細胞、組織もしくは器官への送達に使用しうる。
【０１２６】
Ａ．トランスジーンの送達
別の局面において、本発明は、選択された宿主細胞を本発明のＡＡＶの配列を用いて生成されたベクターでトランスフェクトもしくは感染させることを必要とする宿主へのトランスジーンの送達方法を提供する。送達方法は当業者に公知でありかつ本発明の制限でない。
【０１２７】
望ましい一態様において、本発明は宿主へのトランスジーンのＡＡＶに媒介される送達方法を提供する。本方法は、その発現を指図する配列の制御下の選択されたトランスジーンおよびＡＡＶキャプシドタンパク質を含有する組換えウイルスベクターで選択された宿主細胞をトランスフェクトもしくは感染させることを必要とする。
【０１２８】
場合によっては、宿主からのサンプルを選択されたＡＡＶ血清型に対する抗体の存在について最初にアッセイしてよい。中和抗体を検出するための多様なアッセイ形式が当業者に公知である。こうしたアッセイの選択は本発明の制限でない。例えばＦｉｓｈｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．、３（３）：３０６−３１２（Ｍａｒｃｈ １９９７）およびＷ．Ｃ．Ｍａｎｎｉｎｇら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、９：４７７−４８５（Ｍａｒｃｈ １、１９９８）を参照されたい。本アッセイの結果を使用して、例えばそのキャプシド血清型に特異的な中和抗体の非存在により特定の血清型のキャプシドタンパク質を含有するどのＡＡＶベクターが送達に好ましいかが決定されるかもしれない。
【０１２９】
本方法の一局面において、選択されたＡＡＶキャプシドタンパク質を含むベクターの送達は異なる血清型のＡＡＶキャプシドタンパク質を含むベクターを介する遺伝子の送達に先行してももしくは後に続いてもよい。同様に、本発明の他の新規ＡＡＶキャプシドタンパク質を含むベクターの送達は、異なる血清型のＡＡＶキャプシドタンパク質を含むベクターを介する遺伝子の送達に先行してももしくは後に続いてもよい。従って、ｒＡＡＶベクターを介する遺伝子送達を選択された宿主細胞への反復遺伝子送達に使用してもよい。望ましくは、後に投与されるｒＡＡＶベクターは第一のｒＡＡＶベクターと同一のトランスジーンを運搬するがしかし後に投与されるベクターは第一のベクターと異なる血清型のキャプシドタンパク質を含有する。例えば、第一のベクターがＡＡＶ７キャプシドタンパク質［配列番号２］を有する場合は、後に投与されるベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３Ａ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ６、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１およびＡＡＶ１２、または、限定されるものでないが：Ａ３．１、Ｈ２、Ｈ６、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ５、Ａ３−３、Ａ３−７、Ａ３−４、Ａ３−５、３．３ｂ、２２３．４、２２３−５、２２３−１０、２２３−２、２２３−７、２２３−６、４４−１、４４−５、４４−２、４２−１５、４２−８、４２−１３、４２−３Ａ、４２−４、４２−５Ａ、４２−１Ｂ、４２−５Ｂ、４３−１、４３−１２、４３−５、４３−２１、４３−２５、４３−２０、２４．１、４２．２、７．２、２７．３、１６．３、４２．１０、４２−３Ｂ、４２−１１、Ｆ１、Ｆ５、Ｆ３、４２−６Ｂおよび／もしくは４２−１２を挙げることができる本明細書で同
定される他の新規ＡＡＶキャプシドのいずれかを包含する他の血清型のなかから選択されるキャプシドタンパク質を有してよい。
【０１３０】
上述された組換えベクターは公開された方法に従って宿主細胞に送達しうる。好ましくは生理学的に適合性の担体に懸濁されるｒＡＡＶはヒトもしくは非ヒト哺乳動物患者に投与してよい。適する担体は、移入ウイルスが向けられる適応症を考慮して当業者により容易に選択されうる。例えば、１つの適する担体は生理的食塩水を包含し、これは多様な緩衝溶液とともに処方してよい（例えばリン酸緩衝生理的食塩水）。他の例示的担体は滅菌生理的食塩水、乳糖、ショ糖、リン酸カルシウム、ゼラチン、デキストラン、寒天、ペクチン、ラッカセイ油、ゴマ油および水を包含する。担体の選択は本発明の制限でない。
【０１３１】
場合によっては、本発明の組成物はｒＡＡＶおよび担体（１種もしくは複数）に加えて保存剤もしくは化学物質安定剤のような他の慣習的製薬学的成分を含有してよい。適する例示的保存剤はクロロブタノール、ソルビン酸カリウム、ソルビン酸、二酸化イオウ、没食子酸プロピル、パラベン、エチルバニリン、グリセリン、フェノールおよびパラクロロフェノールを包含する。適する化学物質安定剤はゼラチンおよびアルブミンを包含する。
【０１３２】
ウイルスベクターは、細胞をトランスフェクトしかつ医学分野の当業者により測定し得る過度の有害な影響を伴わないかもしくは医学的に許容できる生理学的影響を伴う治療上の利益を提供するのに十分なレベルの遺伝子移入および発現を提供するのに十分な量で投与される。慣習的なかつ製薬学的に許容できる投与経路は、限定されるものでないが選択された器官への直接送達（例えば肝への門脈内送達）、経口、吸入（鼻内および気管内送達を包含する）、眼内、静脈内、筋肉内、皮下、皮内ならびに他の非経口の（ｐａｒｅｎｔａｌ）投与経路を挙げることができる。投与経路は所望の場合は組合せてよい。
【０１３３】
ウイルスベクターの投薬量は治療されている状態、患者の齢、重量および健康状態のような因子に主として依存することができ、そして従って患者間で変動しうる。例えば、ウイルスベクターの治療上有効なヒト投薬量は一般に約１×１０^９から１×１０^１６ゲノムまでのウイルスベクターの濃度を含有する約１ｍｌから約１００ｍｌまでの溶液の範囲にある。好ましいヒト投薬量は約１×１０^１３ないし１×１０^１６ＡＡＶゲノムであってよい。投薬量はいかなる副作用に対しても治療上の利益の均衡を図るように調節することができ、そしてこうした投薬量は組換えベクターを使用する治療上の応用に依存して変動してよい。トランスジーンの発現のレベルをモニターしてミニ遺伝子を含有するウイルスベクター、好ましくはＡＡＶベクターをもたらす投薬量の頻度を決定し得る。場合によっては、治療の目的上記述されるものに類似の投薬レジメンを本発明の組成物を使用する免疫感作に利用してよい。
【０１３４】
本発明のＡＡＶを含有するベクターによる送達のための治療的産物および免疫原性産物の例を下に提供する。これらのベクターを本明細書に記述されるところの多様な治療もしくはワクチンレジメンに使用してよい。加えて、これらのベクターは所望の治療および／もしくはワクチンレジメンで１種もしくはそれ以上の他のベクターもしくは有効成分とともに送達してよい。
【０１３５】
Ｂ．治療的トランスジーン
トランスジーンによりコードされる有用な治療的産物は、制限なしに、インスリン、グルカゴン、成長ホルモン（ＧＨ）、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、成長ホルモン放出因子（ＧＲＦ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、黄体化ホルモン（ＬＨ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、アンジオポエチン、アンジオスタチン、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、酸性線維芽細胞増殖因子
（ａＦＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子α（ＴＧＦα）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、インスリン成長因子ＩおよびＩＩ（ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ）、ＴＧＦβ、アクチビン、インヒビンを包含するトランスフォーミング増殖因子βスーパーファミリーのいずれか１つ、もしくは骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）ＢＭＰ１〜１５のいずれか、成長因子、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィンＮＴ−３およびＮＴ−４／５、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、膠細胞系由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニューツリン、アグリンのヘレグルイン（ｈｅｒｅｇｌｕｉｎ）／ニューレグリン／ＡＲＩＡ／ｎｅｕ分化因子（ＮＤＦ）ファミリーのいずれか１つ、セマフォリン／コラプシン、ネツリン−１およびネツリン−２、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、エフリン、ノギン、ソニックヘッジホッグおよびチロシン加水分解酵素のファミリーのいずれか１つを包含するホルモンならびに増殖および分化因子を包含する。
【０１３６】
他の有用なトランスジーン産物は、制限なしに、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、インターロイキン（ＩＬ）ＩＬ−１からＩＬ−２５（ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１２およびＩＬ−１８を包含する）、単球走化性因子、白血病阻害因子、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子、Ｆａｓリガンド、腫瘍壊死因子αおよびβ、インターフェロンα、βおよびγ、幹細胞因子、ｆｌｋ−２／ｆｌｔ３リガンドを包含する免疫系を調節するタンパク質を包含する。免疫系により産生される遺伝子産物もまた本発明で有用である。これらは、制限なしに、免疫グロブリンＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥ、キメラ免疫グロブリン、ヒト化抗体、一本鎖抗体、Ｔ細胞受容体、キメラＴ細胞受容体、一本鎖Ｔ細胞受容体、クラスＩおよびクラスＩＩ ＭＨＣ分子ならびに工作された免疫グロブリンおよびＭＨＣ分子を包含する。有用な遺伝子産物は補体調節タンパク質、膜補助因子タンパク質（ＭＣＰ）、崩壊促進因子（ＤＡＦ）、ＣＲ１、ＣＦ２およびＣＤ５９のような補体調節タンパク質もまた包含する。
【０１３７】
なお他の有用な遺伝子産物はホルモン、成長因子、サイトカイン、リンホカイン、制御タンパク質および免疫系タンパク質の受容体のいずれか１つを包含する。本発明は低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）受容体、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）受容体、超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）受容体およびスカベンジャー受容体を包含するコレステロール調節のための受容体を包含する。本発明は、グルココルチコイド受容体およびエストロゲン受容体、ビタミンＤ受容体および他の核受容体を包含するステロイドホルモン受容体スーパーファミリーのメンバーのような遺伝子産物もまた包含する。加えて、有用な遺伝子産物は、ｊｕｎ、ｆｏｓ、ｍａｘ、ｍａｄ、血清応答因子（ＳＲＦ）、ＡＰ−１、ＡＰ２、ｍｙｂ、ＭｙｏＤおよびミオゲニン、ＥＴＳボックス含有タンパク質、ＴＦＥ３、Ｅ２Ｆ、ＡＴＦ１、ＡＴＦ２、ＡＴＦ３、ＡＴＦ４、ＺＦ５、ＮＦＡＴ、ＣＲＥＢ、ＨＮＦ−４、Ｃ／ＥＢＰ、ＳＰ１、ＣＣＡＡＴボックス結合タンパク質、インターフェロン調節因子（ＩＲＦ−１）、ウィルムス腫瘍タンパク質、ＥＴＳ結合タンパク質、ＳＴＡＴ、ＧＡＴＡボックス結合タンパク質、例えばＧＡＴＡ−３ならびに翼状らせん（ｗｉｎｇｅｄ ｈｅｌｉｘ）タンパク質のフォークヘッドファミリーのような転写因子を包含する。
【０１３８】
他の有用な遺伝子産物は、カルバモイル合成酵素Ｉ、オルニチントランスカルバミラーゼ、アルギノコハク酸合成酵素、アルギノコハク酸分解酵素、アルギナーゼ、フマリルアセト酢酸加水分解酵素、フェニルアラニン水酸化酵素、α−１アンチトリプシン、グルコース−６−ホスファターゼ、ポルホビリノーゲン脱アミノ酵素、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、シスタチオンβ合成酵素、分枝鎖ケト酸脱炭酸酵素、アルブミン、イソバレリル−ｃｏＡ脱水素酵素、プロピオニルＣｏＡカルボキシラーゼ、メチルマロニルＣｏＡ転位酵素、グルタリルＣｏＡ脱水素酵素、インスリン、β−グルコシダーゼ、ピルビン酸カルボン酸（ｐｙｒｕｖａｔｅ ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ）、肝ホスホリラーゼ、ホスホリラーゼキナーゼ、グリシン脱炭酸酵素、Ｈ−プロテイン、Ｔ−プロテイン、嚢胞性線維症膜貫
通調節物質（ＣＦＴＲ）配列およびジストロフィンｃＤＮＡ配列を包含する。なお他の有用な遺伝子産物は、酵素置換療法（不十分な酵素活性から生じる多様な状態で有用である）で有用でありうるような酵素を包含する。例えば、マンノース−６−リン酸を含有する酵素はリソゾーム蓄積症（例えば適する遺伝子はβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳＢ）をコードするものを包含する）の治療で利用されるかもしれない。
【０１３９】
他の有用な遺伝子産物は、挿入、欠失もしくはアミノ酸置換を含有する天然に存在しないアミノ酸配列を有するキメラもしくはハイブリッドポリペプチドのような天然に存在しないポリペプチドを包含する。例えば、一本鎖の工作された免疫グロブリンはある種の免疫無防備状態の患者において有用であり得る。他の型の天然に存在しない遺伝子配列は、アンチセンス分子および標的の過剰発現を低下させるのに使用し得るリボザイムのような触媒的核酸を包含する。
【０１４０】
遺伝子の発現の低下および／もしくは調節は癌および乾癬がそうであるように過剰増殖性細胞を特徴とする過剰増殖状態の治療にとりわけ望ましい。標的ポリペプチドは正常細胞に比較して過剰増殖性細胞中で独占的にもしくはより高レベルで産生されるポリペプチドを包含する。標的抗原はｍｙｂ、ｍｙｃ、ｆｙｎのような癌遺伝子ならびにトランスロケーション遺伝子ｂｃｒ／ａｂｌ、ｒａｓ、ｓｒｃ、Ｐ５３、ｎｅｕ、ｔｒｋおよびＥＧＲＦによりコードされるポリペプチドを包含する。標的抗原としての癌遺伝子産物に加え、抗癌処置および保護レジメンの標的ポリペプチドは、Ｂ細胞リンパ腫により作成される抗体の可変領域およびＴ細胞リンパ腫のＴ細胞受容体の可変領域を包含し、これらはいくつかの態様において自己免疫疾患の標的抗原としてもまた使用される。モノクローナル抗体１７−１Ａにより認識されるポリペプチドおよび葉酸結合ポリペプチドを包含する腫瘍細胞中でより高レベルで見出されるポリペプチドのような他の腫瘍関連ポリペプチドを標的ポリペプチドとして使用し得る。
【０１４１】
他の適する治療的ポリペプチドおよびタンパク質は、細胞受容体および「自己」に向けられる抗体を産生する細胞を包含する自己免疫と関連する標的に対する広範な保護免疫応答を賦与することにより自己免疫疾患および障害に罹っている個体を治療するのに有用であるかもしれないものを包含する。Ｔ細胞媒介性自己免疫疾患は慢性関節リウマチ（ＲＡ）、多発性硬化症（ＭＳ）、シェーグレン症候群、サルコイドーシス、インスリン依存型糖尿病（ＩＤＤＭ）、自己免疫性甲状腺炎、反応性関節炎、強直性脊椎炎、強皮症、多発性筋炎、皮膚筋炎、乾癬、血管炎、ヴェグナー肉芽腫、クローン病および潰瘍性大腸炎を包含する。これらの疾患のそれぞれは内因性抗原に結合しかつ自己免疫疾患に関連する炎症カスケードを開始するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を特徴とする。
【０１４２】
Ｃ．免疫原性トランスジーン
あるいは、もしくは加えて、本発明のベクターは、本発明のＡＡＶ配列および選択された免疫原に対する免疫応答を誘導するペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質をコードするトランスジーンを含有してよい。例えば、免疫原は多様なウイルスファミリーから選択しうる。それに対する免疫応答が望ましいとみられる望ましいウイルスファミリーの例は、ライノウイルス属（普遍的感冒症例の約５０％の原因である）を包含するピコルナウイルスファミリー；ポリオウイルス、コクサッキーウイルス、ＥＣＨＯウイルス、およびＡ型肝炎ウイルスのようなヒトエンテロウイルスを包含するエンテロウイルス属；ならびに主として非ヒト動物における口蹄疫の原因であるアフトウイルス（ａｐｔｈｏｖｉｒｕｓｅｓ）属を包含する。ウイルスのピコルナウイルスファミリー内の標的抗原はＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ４およびＶＰＧを包含する。別のウイルスファミリーはウイルスのノーウォーク（Ｎｏｒｗａｌｋ）グループ（流行性胃腸炎の重要な原因病原体である）を包含するカリシウイルス（ｃａｌｃｉｖｉｒｕｓ）ファミリーを包含する。ヒトおよび非ヒト動物において免疫応答を誘導するための抗原に標的を定める使用に望ましいなお別
のウイルスファミリーは、アルファウイルス属（シンドビスウイルス、ロスリバーウイルスならびにベネズエラ、東部および西部ウマ脳炎を包含する）ならびにルベラウイルスを包含するルビウイルスを包含するトガウイルスファミリーである。フラビウイルス科（ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）ファミリーはデング熱、黄熱病、日本脳炎、セントルイス脳炎およびダニ媒介性脳炎を包含する。他の標的抗原はＣ型肝炎もしくはコロナウイルスファミリーから生成されるかもしれない。これらは伝染性気管支炎ウイルス（家禽）、ブタ伝染性胃腸炎ウイルス（ブタ）、ブタ赤血球凝集性脳脊髄炎ウイルス（ブタ）、ネコ伝染性腹膜炎ウイルス（ネコ）、ネコ腸コロナウイルス（ネコ）、イヌコロナウイルス（イヌ）のような多数の非ヒトウイルスならびにヒト呼吸器コロナウイルス（普遍的感冒および／または非Ａ、ＢもしくはＣ型肝炎を引き起こすかもしれない）を包含する。コロナウイルスファミリー内の標的抗原は、Ｅ１（Ｍすなわちマトリックスタンパク質ともまた呼ばれる）、Ｅ２（Ｓすなわちスパイクタンパク質ともまた呼ばれる）、Ｅ３（ＨＥすなわちヘマグルチンエルテロース（Ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎ−ｅｌｔｅｒｏｓｅ）ともまた呼ばれる）糖タンパク質（全部のコロナウイルスに存在するわけでない）もしくはＮ（ヌクレオキャプシド）を包含する。なお他の抗原は、ベシクロウイルス属（例えば水疱性口内炎ウイルス）および一般的リッサウイルス（例えば狂犬病）を包含するラブドウイルスファミリーに対し標的を定めるとみられる。ラブドウイルスファミリー内で適する抗原はＧタンパク質もしくはＮタンパク質由来であるかもしれない。マールブルグおよびエボラウイルスのような出血熱ウイルスを包含するフィロウイルス科（ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ）ファミリーが抗原の適する供給源となりうる。パラミクソウイルスファミリーはパラインフルエンザウイルス１型、パラインフルエンザウイルス３型、ウシパラインフルエンザウイルス３型、ルブラウイルス（流行性耳下腺炎ウイルス、パラインフルエンザウイルス２型、パラインフルエンザウイルス４型、ニューカッスル病ウイルス（ニワトリ）、牛疫、麻疹ウイルス属（ｍｏｒｂｉｌｌｉｖｉｒｕｓ）（麻疹（ｍｅａｓｌｅｓ）およびイヌジステンパーを包含する）ならびに肺炎ウイルス属（ｐｎｅｕｍｏｖｉｒｕｓ）（ＲＳウイルスを包含する）を包含する。インフルエンザウイルスはオルトミクソウイルスファミリー内に分類されかつ抗原の適する供給源である（例えばＨＡタンパク質、Ｎ１タンパク質）。ブンヤウイルスファミリーはブンヤウイルス属（カリフォルニア脳炎、ラクロス）、フレボウイルス属（リフトバレー熱）、ハンタウイルス属（プレマラ（ｐｕｒｅｍａｌａ）はヘマハギン（ｈｅｍａｈａｇｉｎ）熱ウイルスである）、ナイロウイルス属（ナイロビ羊病）および多様な割り当てられていないブンガウイルス属を包含する。アレナウイルスファミリーはＬＣＭおよびラッサ熱ウイルスに対する抗原の供給源を提供する。レオウイルスファミリーはレオウイルス属、ロタウイルス属（小児で急性胃腸炎を引き起こす）、オルビウイルス属およびコルティウイルス属（ｃｕｌｔｉｖｉｒｕｓ）（コロラドダニ熱、レボンボ（Ｌｅｂｏｍｂｏ）（ヒト）、ウマ脳症、ブルータング）を包含する。
【０１４３】
レトロウイルスファミリーは、ネコ白血病ウイルス、ＨＴＬＶＩおよびＨＴＬＶＩＩのようなヒトおよび家畜の疾患を包含するオンコウイルス亜科のもの（ｏｎｃｏｒｉｖｉｒｉｎａｌ）、レンチウイルス亜科のもの（ｌｅｎｔｉｖｉｒｉｎａｌ）（ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルスおよびスプマウイルス亜科のもの（ｓｐｕｍａｖｉｒｉｎａｌ）を包含する）を包含する。ＨＩＶとＳＩＶとの間に多くの適する抗原が記述されておりかつ容易に選択し得る。適するＨＩＶおよびＳＩＶ抗原の例は、制限なしに、ｇａｇ、ｐｏｌ、Ｖｉｆ、Ｖｐｘ、ＶＰＲ、Ｅｎｖ、ＴａｔおよびＲｅｖタンパク質ならびにそれらの多様なフラグメントを包含する。加えてこれらの抗原に対する多様な改変が記述されている。この目的上適する抗原は当業者に既知である。例えば、他のタンパク質のなかからｇａｇ、ｐｏｌ、Ｖｉｆ、およびＶｐｒ、Ｅｎｖ、ＴａｔならびにＲｅｖをコードする配列を選択してよい。例えば米国特許第５，９７２，５９６号明細書に記述される改変ｇａｇタンパク質を参照されたい。Ｄ．Ｈ．Ｂａｒｏｕｃｈら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７５（５）：２４６２−２４６７（Ｍａｒｃｈ ２００１）およびＲ．Ｒ．Ａｍａｒａら、Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ、２９２：６９−７４（６ Ａｐｒｉｌ ２００１）に記述されるＨＩＶおよびＳＩＶタンパク質もまた参照されたい。これらのタンパク質もしくはそれらのサブユニットは単独でまたは別個のベクターを介する組合せでもしくは単一のベクターから送達してよい。
【０１４４】
パポーバウイルスファミリーはポリオーマウイルス亜科（ＢＫＵおよびＪＣＵウイルス）ならびにパピローマウイルス亜科（癌もしくはパピローマの悪性進行と関連する）を包含する。アデノウイルスファミリーは呼吸器疾患および／もしくは腸炎を引き起こすウイルス（ＥＸ、ＡＤ７、ＡＲＤ、Ｏ．Ｂ．）を包含する。パルボウイルスファミリーのネコパルボウイルス（ネコ腸炎）、ネコ汎白血球減少症ウイルス、イヌパルボウイルスおよびブタパルボウイルス。ヘルペスウイルスファミリーは、単純疱疹属（ｇｅｎｅｒａ ｓｉｍｐｌｅｘｖｉｒｕｓ）（ＨＳＶＩ、ＨＳＶＩＩ）、水痘ウイルス（偽性狂犬病、水痘帯状疱疹）を包含するアルファヘルペスウイルス亜科（ｓｕｂ−ｆａｍｉｌｙ ａｌｐｈａｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｎａｅ）、ならびにサイトメガロウイルス属（ＨＣＭＶ、ムロメガロウイルス）を包含するベータヘルペスウイルス亜科、ならびにリンパ球潜伏ウイルス属（ｌｙｍｐｈｏｃｒｙｐｔｏｖｉｒｕｓ）、ＥＢＶ（バーキットリンパ腫）、伝染性鼻気管炎、マレック病ウイルスおよびラジノウイルスを包含するガンマヘルペスウイルス亜科を包含する。ポックスウイルスファミリーは、オルトポックスウイルス属（天然痘（Ｖａｒｉｏｌａ）（天然痘（Ｓｍａｌｌｐｏｘ））および痘疹（牛痘））、パラポックスウイルス属、アビポックスウイルス属、カプリポックスウイルス属、レポリポックスウイルス属、スイポックスウイルス属を包含するコルドポックスウイルス亜科ならびにエントモポックスウイルス亜科を包含する。ヘパドナウイルスファミリーはＢ型肝炎ウイルスを包含する。抗原の適する供給源となりうる１未分類のウイルスはＤ型肝炎ウイルスである。なお他のウイルス供給源はトリ伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスおよびブタ呼吸器・生殖器症候群ウイルスを包含するかもしれない。アルファウイルスファミリーはウマ動脈炎ウイルスおよび多様な脳炎ウイルスを包含する。
【０１４５】
本発明は、ヒトおよび非ヒト脊椎動物を感染させる細菌、真菌、寄生性微生物もしくは多細胞性寄生虫を包含する他の病原体に対してヒトもしくは非ヒト動物を免疫するのに有用であるかまたは癌細胞もしくは腫瘍細胞からの免疫原もまた包含しうる。細菌性病原体の例は、肺炎球菌；ブドウ球菌；および連鎖球菌を包含する病原性グラム陽性球菌を包含する。病原性グラム陰性球菌は髄膜炎菌；淋菌を包含する。病原性腸管グラム陰性杆菌は腸内細菌科；シュードモナス、アシネトバクテリア（ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒｉａ）およびエイケネラ；類鼻疽；サルモネラ；シゲラ；ヘモフィルス；モラクセラ；Ｈ．デュクレイイ（Ｈ．ｄｕｃｒｅｙｉ）（軟性下疳を引き起こす）；ブルセラ；野兎病菌（Ｆｒａｎｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）（野兎病を引き起こす）；エルシニア（パスツレラ）；ストレプトバチラス モニリフォルミス（ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｉｓ）およびスピリルム（ｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）を包含し；グラム陽性杆菌はリステリア菌（ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）；ブタ丹毒菌（ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ）；ジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ）（ジフテリア）；コレラ；炭疽菌（Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ）（炭疽菌）；ドノヴァン症（鼠径部肉芽腫）；およびバルトネラ症を包含する。病原性嫌気性細菌により引き起こされる疾患は、破傷風；ボツリヌス；他のクロストリジア（ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ）；結核；らい；および他のミコバクテリウムを包含する。病原性スピロヘータ疾患は梅毒；トレポネーマ症；フランベシア、ピンタおよび風土病性梅毒；ならびにレプトスピラ症を包含する。高等病原性細菌および病原性真菌により引き起こされる他の感染症は、アクチノミセス症；ノカルジア症；クリプトコッカス症、分芽菌症、ヒストプラスマ症およびコクシジオイデス症；カンジダ症、アスペルギルス症ならびにムコール菌症；スポロトリクム症；パラコクシジオイドミコーシス、ペトリエリジア症（ｐｅｔｒｉｅｌｌｉｄｉｏｓｉｓ）、トルロプシス症、菌腫およ
びクロモミコーシス；ならびに皮膚糸状菌症を包含する。リケッチア感染症は発疹チフス、ロッキー山熱、Ｑ熱およびリケッチア痘を包含する。マイコプラスマおよびクラミジア感染症の例は：肺炎マイコプラスマ（ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）；鼠径リンパ肉芽腫；オウム病；および周産期クラミジア感染症を包含する。病原性真核生物は病原性原生動物および蠕虫を包含し、そしてそれらにより生じられる感染症は：アメーバ症；マラリア；リーシュマニア症；トリパノソーマ症；トキソプラスマ症；ニューモシスチス カリニ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｃａｒｉｎｉｉ）；トリカンス（Ｔｒｉｃｈａｎｓ）；トキソプラスマ原虫（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ）；バベシア症；ランブル鞭毛虫症；旋毛虫症；フィラリア症；住血吸虫症；線虫（ｎｅｍａｔｏｄｅｓ）；吸虫（ｔｒｅｍａｔｏｄｅｓ）もしくは吸虫類；および条虫（ｃｅｓｔｏｄｅ）（サナダムシ（ｔａｐｅｗｏｒｍ））感染症を包含する。
【０１４６】
これらの生物体および／もしくはそれらにより産生されるトキシンの多くは疾病予防センター（Ｃｅｎｔｅｒｓ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ［（ＣＤＣ）、米国厚生省（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＵＳＡ）］）により生物学的攻撃における使用についての潜在性を有する病原体として同定された。例えば、これらの生物学的病原体のいくつかは、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ）（炭疽）、ボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）およびそのトキシン（ボツリヌス中毒）、ペスト菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ）（悪疫）、大痘瘡（ｖａｒｉｏｌａ ｍａｊｏｒ）（牛痘）、野兎病菌（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）（野兎病）およびウイルス性出血熱（その全部は現在カテゴリーＡ病原体として分類される）；Ｑ熱リケッチア（Ｃｏｘｉｅｌｌａ ｂｕｒｎｅｔｔｉ）（Ｑ熱）；ブルセラ属（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）の種（ブルセラ症）、鼻疽菌（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｍａｌｌｅｉ）（鼻疽）、ヒマシ（Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ）およびそのトキシン（リシントキシン）、ウェルシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）およびそのトキシン（εトキシン）、ブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）の種およびそれらのトキシン（エンテロトキシンＢ）（その全部は現在カテゴリーＢ病原体として分類される）；ならびにニパン（Ｎｉｐａｎ）ウイルスおよびハンタウイルス（現在カテゴリーＣの病原体として分類される）を包含する。加えて、そのように分類されるかもしくは異なって分類される他の生物体が将来同定されかつ／もしくはこうした目的上使用されるかもしれない。ウイルスベクターおよび本明細書に記述される他の構築物がこれらの生物学的病原体への感染もしくはそれらとの他の有害反応を予防かつ／もしくは治療することができるこれらの生物体、ウイルス、それらのトキシンもしくは他の副生成物からの抗原を送達するのに有用であることが容易に理解されるであろう。
【０１４７】
Ｔ細胞の可変領域に対する免疫原を送達するための本発明のベクターの投与はそれらのＴ細胞を排除するＣＴＬを包含する免疫応答を導き出す。慢性関節リウマチ（ＲＡ）において該疾患に関与するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）のいくつかの特定の可変領域が特徴づけられている。これらのＴＣＲはＶ−３、Ｖ−１４、Ｖ−１７およびＶα−１７を包含する。従って、これらのポリペプチドの最低１種をコードする核酸配列の送達はＲＡに関与するＴ細胞を標的とすることができる免疫応答を導き出すことができる。多発性硬化症（ＭＳ）において該疾患に関与するＴＣＲのいくつかの特定の可変領域が特徴づけられている。これらのＴＣＲはＶ−７およびＶα−１０を包含する。従って、これらのポリペプチドの最低１種をコードする核酸配列の送達はＭＳに関与するＴ細胞を標的とすることができる免疫応答を導き出すことができる。強皮症において該疾患に関与するＴＣＲのいくつかの特定の可変領域が特徴づけられている。これらのＴＣＲはＶ−６、Ｖ−８、Ｖ−１４およびＶα−１６、Ｖα−３Ｃ、Ｖα−７、Ｖα−１４、Ｖα−１５、Ｖα−１６、Ｖα−２８ならびにＶα−１２を包含する。従って、これらのポリペプチドの最低１種をコードする核酸分子の送達は強皮症に関与するＴ細胞を標的とすることができる免疫応答を導き出
すことができる。
【０１４８】
場合によっては本発明のＡＡＶ配列を含有するベクターは初回抗原刺激−追加免疫レジメンを使用して送達してもよい。多様なこうしたレジメンが当該技術分野で記述されておりかつ容易に選択されうる。例えば２０００年３月２日公開の第ＷＯ ００／１１１４０号明細書（引用することにより組込まれる）を参照されたい。
【０１４９】
こうした初回抗原刺激−追加免疫レジメンは、典型的には、免疫系を初回抗原刺激するためのＤＮＡ（例えばプラスミド）に基づくベクターの投与ないしタンパク質もしくはこうした抗原をコードする配列を運搬する組換えウイルスのような伝統的抗原を用いる第二の追加免疫投与を必要とする。一態様において、本発明は、前記抗原を運搬するプラスミドＤＮＡベクターを送達すること、次いで例えば本発明のＡＡＶ配列を含有するベクターで追加免疫することによる選択された抗原に対する免疫応答の初回抗原刺激および追加免疫方法を提供する。
【０１５０】
一態様において、該初回抗原刺激−追加免疫レジメンは初回抗原刺激および／もしくは追加免疫ベヒクルからの多タンパク質の発現を必要とする。例えばＲ．Ｒ．Ａｍａｒａ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９２：６９−７４（６ Ａｐｒｉｌ ２００１）を参照されたい。これはＨＩＶおよびＳＩＶに対する免疫応答を生成させるのに有用なタンパク質サブユニットの発現のための多タンパク質レジメンを記述する。例えばＤＮＡ初回抗原刺激は単一転写物からのＧａｇ、Ｐｏｌ、Ｖｉｆ、ＶＰＸおよびＶｐｒならびにＥｎｖ、ＴａｔならびにＲｅｖを送達しうる。あるいは、ＳＩＶ Ｇａｇ、ＰｏｌおよびＨＩＶ−１ Ｅｎｖが送達される。
【０１５１】
しかしながら、該初回抗原刺激−追加免疫レジメンはＨＩＶのための免疫感作もしくはこれらの抗原の送達に制限されない。例えば、初回抗原刺激は本発明の第一のチンパンジーベクターで送達すること、次いで第二のチンパンジーベクターもしくは抗原それ自身をタンパク質の形態で含有する組成物で追加免疫することを必要とするかもしれない。１つの例において、初回抗原刺激−追加免疫レジメンは該抗原が由来するウイルス、細菌もしくは他の生物体に対する保護免疫応答を提供し得る。別の望ましい態様において、初回抗原刺激−追加免疫レジメンは、治療が投与されている状態の存在の検出のための慣例アッセイを使用して測定し得る治療効果を提供する。
【０１５２】
初回抗原刺激ワクチンは用量依存性の様式で身体中の多様な部位に投与してよく、それは所望の免疫応答の標的とされる抗原に依存する。本発明は注入（１回もしくは複数）の量もしくは部位または製薬学的担体に制限されない。むしろ、初回抗原刺激段階は単回用量あるいは毎時、毎日、毎週もしくは毎月または毎年投与される投薬量を包含する処置レジメンを包含する。一例として、哺乳動物は担体中に約１０μｇないし約５０μｇの間のプラスミドを含有する１もしくは２回の初回抗原刺激注入を受領するかもしれない。初回抗原刺激ＤＮＡワクチン組成物の望ましい初回抗原刺激の量もしくは投薬量は約１μｇないし約１０，０００μｇの間のＤＮＡワクチンの範囲にわたる。投薬量は被験体の体重１ｋｇあたり約１μｇから１０００μｇのＤＮＡまで変動してもよい。注入の量もしくは部位は、望ましくは、ワクチン接種されている哺乳動物の個性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）および状態に基づき選択する。
【０１５３】
哺乳動物への抗原の送達に適するＤＮＡワクチンの投薬量単位は本明細書に記述する。ＤＮＡワクチンは等張生理的食塩水、等張塩溶液もしくはこうした投与の当業者に明らかであろう他の処方のような製薬学的もしくは生理学的に許容できる担体中に懸濁もしくは溶解することにより投与のため調製する。適切な担体は当業者に明らかであることができ、また、大部分は投与経路に依存することができる。本発明の組成物は、上述された経路
により、生物分解可能な生物適合性ポリマーを使用する持続性製剤中で、もしくはミセル、ゲルおよびリポソームを使用する現場の（ｏｎ−ｓｉｔｅ）送達により哺乳動物に投与してよい。
【０１５４】
場合によっては、本発明の初回抗原刺激段階は、本明細書で定義されるような適する量のアジュバントを初回抗原刺激ＤＮＡワクチン組成物とともに投与することもまた包含する。
【０１５５】
好ましくは、追加免疫組成物は哺乳動物被験体に初回抗原刺激ＤＮＡワクチンを投与した約２ないし約２７週後に投与する。追加免疫組成物の投与は初回抗原刺激ＤＮＡワクチンにより投与されたと同一の抗原を含有するかもしくは送達することが可能な有効量の追加免疫ワクチン組成物を使用して達成される。追加免疫組成物は同一のウイルス供給源もしくは別の供給源由来の組換えウイルスベクターより構成されてよい。あるいは、「追加免疫組成物」は、初回抗原刺激ＤＮＡワクチン中にコードされると同一の抗原をしかしタンパク質もしくはペプチドの形態で含有する組成物であり得、この組成物は宿主中で免疫応答を誘導する。別の態様において、追加免疫ワクチン組成物は哺乳動物細胞中でのその発現を指図する調節配列の制御下に抗原をコードするＤＮＡ配列を含有する組成物、例えば公知の細菌もしくはウイルスベクターのようなベクターを包含する。追加免疫ワクチン組成物の第一の要件は、ワクチン組成物の抗原が該ＤＮＡワクチンによりコードされるものと同一の抗原もしくは交差反応性抗原であることである。
【０１５６】
適しては、本発明のベクターは非ＡＡＶベクターならびにタンパク質、ペプチドおよび／または他の生物学的に有用な治療的もしくは免疫原性の化合物を使用するレジメンにおける使用にもまた良好に適する。これらのレジメンは保護免疫を誘導することを包含する治療的容態（ｐｏｓｅ）および免疫感作のための遺伝子送達にとりわけ良好に適する。こうした用途は当業者に容易に明らかであろう。
【０１５７】
さらに、本発明のベクターは生物体が１種もしくはそれ以上のＡＡＶ血清型に対する中和抗体を有する場合であってもｉｎ ｖｉｖｏもしくはｅｘ ｖｉｖｏで選択された宿主細胞に選択されたトランスジーンを送達し得る効率的な遺伝子移入ベヒクルを提供する。一態様において、ベクター（例えばｒＡＡＶ）および細胞をｅｘ ｖｉｖｏで混合し；感染した細胞は慣習的方法論を使用して培養し；そして形質導入された細胞を患者に再注入する。さらに、本発明のベクターはｉｎ ｖｉｔｒｏでの所望の遺伝子産物の産生にもまた使用されるかもしれない。ｉｎ ｖｉｔｒｏ産生のためには、所望の産物（例えばタンパク質）は、所望の産物をコードする分子を含有するｒＡＡＶでの宿主細胞のトランスフェクションおよび発現を可能にする条件下で細胞培養物を培養することの後に所望の培養物から得られるかもしれない。発現された産物はその後所望のとおり精製および単離してよい。トランスフェクション、細胞培養、精製および単離に適する技術は当業者に既知である。
【０１５８】
以下の実施例は本発明のいくつかの局面および態様を具体的に説明する。
【実施例】
【０１５９】
実施例１：新規ＡＡＶ配列のＰＣＲ増幅、クローニングおよび特徴づけ。
非ヒト霊長類からの組織を既知のＡＡＶの高度に保存された領域に対するオリゴヌクレオチドに基づくＰＣＲ法を使用してＡＡＶ配列についてスクリーニングした。ＡＡＶ１［配列番号６］の２８８６ないし３１４３ｂｐにわたるＡＡＶ配列の伸長をＰＣＲアンプリコンとして選択した。ここでは「シグネチャ領域」と本明細書で命名される各既知のＡＡＶ血清型に独特であるキャプシドタンパク質（Ｃａｐ）の超可変領域が、保存された配列により隣接される。後の分析でこのシグネチャ領域は超可変領域３にわたる保存された領
域の間に位置することが示された。
【０１６０】
多数の非ヒト霊長類種の末梢血の初期調査はアカゲザル、カニクイザル、チンパンジーおよびヒヒのような種からの動物のサブセットにおける検出可能なＡＡＶを示した。しかしながら、ニホンザル、ブタオザルおよびリスザルを包含する試験された若干の他の種で検出されたＡＡＶ配列は存在しなかった。ベクター分布のより徹底的な分析を、剖検で回収されたペンシルバニア大学およびチューレーン（ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ
Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ ａｎｄ Ｔｕｌａｎｅ）のコロニーのアカゲザルの組織中で実施した。
【０１６１】
Ａ．ＡＡＶシグネチャ領域の増幅
ＡＡＶ１−６ならびにガチョウおよびアヒルから単離されたＡＡＶのＤＮＡ配列をデフォルトの設定で「Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ」を使用して相互にアライメントした。ＡＡＶ１−６についておよび新規ＡＡＶ７についての情報を包含するアライメントを図１に提供する。ＡＡＶ間の配列の類似性を比較した。
【０１６２】
一連の研究において、ＡＡＶ１［配列番号６］の２８８６ｂｐないし３１４３ｂｐにわたる２５７ｂｐの領域およびＡＡＶ２〜６ゲノムのゲノム中の対応する領域［図１を参照されたい］が発明者により同定された。この領域はＡＡＶキャプシド遺伝子とともに位置し、そして５’および３’双方の端の間で高度に保存された配列を有し、かつ、中央で比較的変動性の配列である。加えてこの領域はＤｒａＩＩＩ制限酵素部位（ＣＡＣＣＡＣＧＴＡ、配列番号１５）を含有する。発明者はこの領域が各既知の型のＡＡＶ ＤＮＡの特異的シグネチャとしてはたらくことを見出した。言い換えれば、ＰＣＲ反応、各既知の血清型に特異的であるエンドヌクレアーゼでの消化およびゲル電気泳動分析後に、この領域を使用して、増幅されたＤＮＡを血清型１、２、３、４、５、６もしくは別の血清型からであると決定的に同定し得る。
【０１６３】
プライマーを設計し、確認しかつＡＡＶ１、２および５ ＤＮＡ対照を用いてＰＣＲ条件を至適化した。プライマーはＡＡＶ２の配列に基づいた。すなわち、５’プライマー、１Ｓ：ＡＡＶ２（配列番号７）のｂｐ２８６７〜２８９１および３’プライマー、１８ａｓ、ＡＡＶ２（配列番号７）のｂｐ３０９５〜３１２１。
【０１６４】
異なるアカゲザルの血液、脳、肝、肺、精巣などを包含する多様な組織からの細胞ＤＮＡを上述された戦略を利用して研究した。該結果は、これらのサルの多様な組織からのＤＮＡが強いＰＣＲ増幅を生じさせることを示した。ＰＣＲ産物のさらなる制限分析はそれらがいずれの公表されたＡＡＶ配列とも異なるＡＡＶ配列から増幅されたことを示した。
【０１６５】
多様なサル組織のＤＮＡからのＰＣＲ産物（大きさ約２５５ｂｐ）をクローン化しかつ配列決定した。これらの新規ＡＡＶ配列の生物情報学研究はそれらがキャプシド遺伝子の新規ＡＡＶ配列でありかつ相互に異なることを示した。図１はアライメントにおけるＡＡＶ１０〜１２［それぞれ配列番号１１７、１１８および１１９］の新規ＡＡＶシグネチャ領域を包含する。Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ（１．８１）プログラムを使用してマルチプルアライメント分析を実施した。ＡＡＶ １〜７およびＡＡＶ １０〜１２ゲノムのシグネチャ領域間の配列の同一性パーセントを下に提供する。
【０１６６】
【表４】

【０１６７】
【表５】

【０１６８】
選択された２５７ｂｐの領域にわたる新規ＡＡＶ血清型配列を含有する３００を超える
クローンを単離かつ配列決定した。これら３００超のクローンの生物情報学分析は、この２５７ｂｐの領域が新規ＡＡＶ血清型の迅速単離および同定の良好な目印すなわちシグネチャ配列としてはたらくことにおいて決定的に重要であることを示唆する。
【０１６９】
Ｂ．ＰＣＲ増幅のためのシグネチャ領域の使用。
該２５７ｂｐのシグネチャ領域をＰＣＲアンカーとして使用してｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子の連結領域をカバーするためゲノムの５’（１３９８〜３１４３ｂｐ、配列番号６）およびｃａｐ遺伝子配列全体を得るためゲノムの３’（２８６６ｂｐ〜４６００ｂｐ、配列番号６）までＰＣＲ増幅を延長した。ＰＣＲ増幅は、９５℃で０．５〜１分間の変性、６０〜６５℃で０．５〜１分間のアニーリングおよび７２℃で１ｋｂあたり１分の伸長を包含する標準的条件を使用して実施し、増幅サイクルの総数は２８から４２までの範囲にわたった。
【０１７０】
「Ａ」で記述されたところのアライメントされた配列を使用して、２種の他の相対保存された領域が、ｒｅｐ遺伝子の３’端および２５７ｂｐの領域に対し５’ならびに２５７ｂｐフラグメントの下流の配列中しかしＡＡＶ’３ＩＴＲの前に位置する配列中で同定された。２組の新しいプライマーを設計し、また、ＰＣＲ条件は新規ＡＡＶ血清型のキャプシド全体およびｒｅｐ配列の一部の回収について至適化した。より具体的には、５’増幅について５’プライマーＡＶ１ＮｓはＧＣＴＧＣＧＴＣＡＡＣＴＧＧＡＣＣＡＡＴＧＡＧＡＡＣ［ＡＡＶ１、配列番号６のｎｔ１３９８〜１４２３］でありかつ３’プライマーは上で同定された１８ａｓであった。３’増幅について５’プライマーは上で同定された１ｓであり、そして３’プライマーはＡＶ２Ｌａｓ、ＴＣＧＴＴＴＣＡＧＴＴＧＡＡＣＴＴＴＧＧＴＣＴＣＴＧＣＧ［ＡＡＶ２、配列番号７のｎｔ４４３５〜４４６２］であった。
【０１７１】
これらのＰＣＲ増幅において、２５７ｂｐの領域は、本明細書で記述されるとおり得られた５’および３’伸長フラグメントの増幅後のシグネチャ領域中のＤｒａＩＩＩ部位での融合により完全なキャプシド遺伝子を構築するための重複フラグメントを生成させるためのＰＣＲアンカーおよび目印として使用した。より具体的には、無傷のＡＡＶ７ ｃａｐ遺伝子を生成させるために、３種の増幅産物（ａ）シグネチャ領域の配列；（ｂ）５’伸長の配列；および（ｃ）３’伸長の配列を製造元の説明書に従ってｐＣＲ４−Ｔｏｐｏ［インヴィトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）］プラスミドバックボーンにクローン化した。その後、該プラスミドをＤｒａＩＩＩで消化しかつ組換えて無傷のｃａｐ遺伝子を形成した。
【０１７２】
この一連の作業でＡＡＶ７およびＡＡＶ８のキャプシド配列の約８０％を単離かつ分析した。別の新規血清型ＡＡＶ９もまたサル＃２から発見された。
【０１７３】
上述されたＰＣＲ条件を使用してＡＡＶ７のｒｅｐ遺伝子配列の残存する部分を単離し、そしてＡＡＶゲノムの１０８ｂｐないし１４６１ｂｐ（ＡＡＶ２、配列番号７の番号づけに基づき計算した）を増幅するプライマーを使用してクローン化する。本クローンはＩＴＲを伴わない完全なＡＡＶ７ゲノムの構築のため配列決定する。
【０１７４】
Ｃ．３．１ｋｂのＣａｐフラグメントの直接増幅
ＮＨＰ組織および血液ＤＮＡからの３．１ｋｂの完全長のＣａｐフラグメントを直接増幅するために、２種の他の高度に保存された領域を大型フラグメントのＰＣＲ増幅での使用のためＡＡＶゲノム中で同定した。ｒｅｐ遺伝子の中央に位置する保存された領域内のプライマー（ＡＶ１ｎｓ：５’ＧＣＴＧＣＧＴＣＡＡＣＴＧＧＡＣＣＡＡＴＧＡＧＡＡＣ３’、配列番号６のｎｔ１３９８〜１４２３）を、Ｃａｐ遺伝子の下流の別の保存された領域中に位置する３’プライマー（ＡＶ２ｃａｓ：５’ＣＧＣＡＧＡＧＡＣＣＡＡＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＡＡＡＣＧＡ３’、配列番号７）とともに完全長ｃａｐフラグメントの増
幅のため選択した。ＰＣＲ産物を製造元の説明書（インヴィトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））に従ってＴｏｐｏクローン化し、そしてキアゲンゲノミックス（Ｑｉａｇｅｎｇｅｎｏｍｉｃｓ）（キアゲンゲノミックス（Ｑｉａｇｅｎｇｅｎｏｍｉｃｓ）、ワシントン州シアトル）により配列分析が≧９９．９％の正確さを伴い実施された。合計５０種のキャプシドクローンを単離かつ特徴づけした。それらのなかで３７クローンがアカゲザル組織（ｒｈ．１〜ｒｈ．３７）、６クローンがカニクイザル（ｃｙ．１〜ｃｙ．６）、２クローンがヒヒ（ｂｂ．１およびｂｂ．２）ならびに５クローンがチンパンジー（ｃｈ．１〜ｃｈ．５）由来であった。
【０１７５】
新規ＡＡＶファミリー内の配列の相違が、相同な配列をもつ多様な部分的ＤＮＡ鋳型間の重複伸長によるＰＣＲ媒介性遺伝子スプライシングのようなＰＣＲの人工産物もしくは細菌中での組換え過程の結果でなかったという可能性を排除するために、一連の実験をＶＰ１増幅について同一条件下で全細胞ＤＮＡを使用して実施した。最初に無傷のＡＡＶ７およびＡＡＶ８プラスミドを等モル比で混合し次いで連続希釈した。連続的に希釈した混合物を、ユニバーサルプライマーおよびいずれかのハイブリッドＰＣＲ産物が生成されたかどうかをみるためのＤＮＡ増幅に使用したものに同一のＰＣＲ条件を使用する３．１ｋｂのＶＰ１フラグメントのＰＣＲ増幅の鋳型として使用した。該混合物を細菌に形質転換しそして形質転換体を単離しておそらく細菌細胞中での組換え過程由来のハイブリッドクローンを探した。異なる実験では、われわれはＡＡＶ７およびＡＡＶ８プラスミドをＭｓｐ Ｉ、Ａｖａ ＩおよびＨａｅＩ（その全部は異なる位置で双方のゲノムを複数回切断する）で制限し、消化物を異なる組合せで混合し、そしていずれかのＰＣＲ産物が部分的ＡＡＶ配列の重複配列伸長により生成され得たかどうかを試験するための同一条件下でのＶＰ１フラグメントのＰＣＲ増幅にそれらを使用した。別の実験ではシグネチャ領域中に重複をもつゲル精製した５’の１．５ｋｂのＡＡＶ７ ＶＰ１フラグメントおよび３’の１．７ｋｂのＡＡＶ８ ＶＰ１フラグメントの混合物を連続的に希釈し、そしてタックマン（ＴａｑＭａｎ）分析によりＡＡＶ配列を含まなかったサル細胞系から抽出した２００ｎｇの細胞ＤＮＡの存在および非存在下でのＰＣＲ増幅に使用した。これらの実験のいずれも、ゲノムＤＮＡのＣａｐ増幅の条件下で効率的なＰＣＲ媒介性の重複配列産生を示さなかった（データは示されない）。さらなる確認として、クローン４２ｓが単離されたアカゲザルＦ９５３からの腸間膜リンパ節（ＭＬＮ）ＤＮＡからのより短いフラグメントを増幅するための多様な組合せの、異なるＨＶＲに位置しかつＦ９５３からのクローン４２ｓの変異体に配列特異的であった３対のプライマーを設計した。完全長のＣａｐクローン中で同定された全部の配列の変動がこれらの短いフラグメント中で見出された（データは示されない）。
【０１７６】
実施例２：アデノ随伴ウイルスは自然感染の間に霊長類において実質的進化を受ける
選択されたＡＡＶ単離物の配列分析はゲノム全体での相違を示し、それはキャプシドタンパク質の超可変領域中に最も集中されている。疫学的データは全部の既知の血清型が霊長類に固有であることを示すとは言え、臨床単離物の単離は、ヒト乳児の肛門および咽喉スワブからのＡＡＶ２およびＡＡＶ３ならびにヒトコンジローム様疣贅からのＡＡＶ５に制限されている。既知の臨床的続発症はＡＡＶ感染と関連しない。
【０１７７】
ＡＡＶの生物学をより良好に理解するための試みにおいて、非ヒト霊長類を自然感染の続発症を特徴づけるためのモデルとして使用した。非ヒト霊長類からの組織を、既知のＡＡＶの高度に保存された領域に対するオリゴヌクレオチドに基づく本発明のＰＣＲ法を使用してＡＡＶ配列についてスクリーニングした（実施例１を参照されたい）。ＡＡＶ１［配列番号６］の２８８６ないし３１４３ｂｐにわたるＡＡＶ配列の一伸長をＰＣＲアンプリコンとして選択し、ここでは保存された配列が本明細書で「シグネチャ領域」と命名される各既知のＡＡＶ血清型に独特である超可変領域により隣接されている。
【０１７８】
アカゲザル、カニクイザル、チンパンジーおよびヒヒを包含する多数の非ヒト霊長類種の末梢血の初期調査は全部の種からの動物のサブセットにおける検出可能なＡＡＶを示した。ベクター分布のより広範囲の分析を剖検で回収されたペンシルバニア大学およびチューレーン（ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ ａｎｄ Ｔｕｌａｎｅ）のコロニーのアカゲザルの組織中で実施した。これは広範な系列の組織全体でＡＡＶ配列を示した。
【０１７９】
増幅されたシグネチャ配列をプラスミドにサブクローニングしそして個々の形質転換体を配列分析にかけた。これは多様な動物由来のクローンのヌクレオチド配列中の実質的変動を示した。シグネチャ配列中の変動は個々の動物内で得られたクローンでもまた示された。独特のシグネチャ配列が同定された２動物から収集した組織（すなわち９８Ｅ０４４からの結腸および９８Ｅ０５６からの心臓）を、高度に保存された配列に対するオリゴヌクレオチドを使用するＰＣＲにより増幅された配列を拡大することによりさらに特徴づけした。こうして、完全なプロウイルス構造を、本明細書で記述されるとおり双方の組織からのウイルスゲノムについて再構築した。これらのプロウイルスは他の既知のＡＡＶと異なり、最大の配列の相違はＣａｐ遺伝子の領域中に示される。
【０１８０】
追加実験を実施して、非ヒト霊長類組織に固有のＡＡＶ配列が、レスキューされることが可能でありかつビリオンを形成する感染性ウイルスのプロウイルスゲノムを表したことを確認した。ＡＡＶ８のシグネチャ配列が検出された動物９８Ｅ０５６の肝組織からのゲノムＤＮＡを、ＡＡＶ配列内に部位を有しないエンドヌクレアーゼで消化し、そしてヘルパー機能の供給源としてのヒトアデノウイルス血清型５のＥ１が欠失されたゲノムを含有するプラスミドを２９３細胞中にトランスフェクトした。生じるライセートを２９３細胞上で１回継代し、そしてライセートを回収しかつＣａｐタンパク質に対する広範に反応するポリクローナル抗体を使用してＡＡＶ Ｃａｐタンパク質の存在について、ならびにＡＡＶ８が由来したＰＣＲ増幅されたＡＡＶプロウイルスからのＤＮＡ配列の存在および豊富さについて分析した。エンドヌクレアーゼで制限した心ＤＮＡおよびアデノウイルスヘルパープラスミドのトランスフェクションは、ウェスタンブロット分析によるＣａｐタンパク質の検出および２９３細胞あたり１０^４ＡＡＶ８ベクターゲノムの存在により示されるとおり多量のＡＡＶ８ウイルスを生じた。ライセートを大スケール調製から生成させそしてＡＡＶをセシウム沈降により精製した。精製された調製物はＡＡＶ血清型２のものに同一に見える２６ｎｍの二十面体構造を示した。アデノウイルスヘルパー単独でのトランスフェクションはＡＡＶタンパク質もしくはゲノムを生じず、レスキューされたＡＡＶの供給源としての汚染を排除した。
【０１８１】
ＡＡＶシグネチャ配列の動物間および動物内の変動をさらに特徴づけるため、選択された組織を拡大ＰＣＲ（ｅｘｔｅｎｄｅｄ ＰＣＲ）にかけてＣａｐ読み取り枠全体を増幅した。
【０１８２】
生じるフラグメントを細菌プラスミドにクローン化しそして個々の形質転換体を単離かつ完全に配列決定した。この分析は、３匹のアカゲザルからの腸間膜リンパ節（Ｔｕｌａｎｅ／Ｖ２２３−６クローン；Ｔｕｌａｎｅ／Ｔ６１２−７クローン；Ｔｕｌａｎｅ／Ｆ９５３−１４クローン）、２匹のアカゲザルからの肝（Ｔｕｌａｎｅ／Ｖ２５１−３クローン；Ｐｅｎｎ／００Ｅ０３３−３クローン）、１匹のアカゲザルからの脾（Ｐｅｎｎ／９７Ｅ０４３−３クローン）、１匹のアカゲザルからの心（ＩＨＧＴ／９８Ｅ０４６−１クローン）ならびに１匹のチンパンジー（Ｎｅｗ Ｉｂｅｒｉａ／Ｘ１３３−５クローン）、６匹のカニクイザル（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ／Ａ１３７８、Ａ３０９９、Ａ３３８８、Ａ３４４２、Ａ２８２１、Ａ３２４２−合計６クローン）および１匹のヒヒ（ＳＦＲＢ／８６４４−２クローン）からの末梢血を伴った。１５匹の異なる動物から配列決定した５０クローンのうち３０は相互からの最低７アミノ酸の差異の知見に基づき非冗長とみなした。非冗長ＶＰ１クローンはそれらが単離されたとおりに連続して番号づけられ、接頭辞はそれらが由来した非ヒト霊長類の種を示す。これら３０の非冗長クローンと以前に記述された８種のＡＡＶ血清型との間の構造的関係を、分割分解（ｓｐｌｉｔ ｄｅｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）の方法の実施を伴うＳｐｌｉｔｓＴｒｅｅプログラム［Ｈｕｓｏｎ、Ｄ．Ｈ．ＳｐｌｉｓＴｒｅｅ：ａｎａｌｙｚｉｎｇ ａｎｄ ｖｉｓｕａｌｉｚｉｎｇ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｙ ｄａｔａ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ １４、６８−７３（１９９８）］を使用して決定した。該分析は一組の配列間のホモプラシーを分岐樹よりむしろ樹様網状構造に描く。利点はグループ分け（収束の結果である）の検出を可能にすることおよびそれらが平行する事象により歪められる場合でもなお系統発生学的関係を表すことである。広範囲の系統発生学的研究がＡＡＶの進化を解明するために必要とされるであろう一方で、ここでの意図は多様なクローンをそれらの配列類似性に関してグループ分けすることのみである。
【０１８３】
新規ＶＰ１配列が感染性ウイルスゲノム由来であったことを確認するために、ウイルスＤＮＡの高い豊富さを伴う組織からの細胞ＤＮＡをＡＡＶ内で切断しないエンドヌクレアーゼで制限しそして２９３細胞にトランスフェクトし、次いでアデノウイルスに感染させた。これは２種の異なる動物からの組織のＤＮＡからのＡＡＶゲノムのレスキューおよび増幅をもたらした（データは示されない）。
【０１８４】
新規ＡＡＶのＶＰ１配列をアミノ酸配列の変動の性質および位置に関してさらに特徴づけした。１％より大きいだけのアミノ酸配列が相互と異なることが示された全３０のＶＰ１クローンをアライメントしそして各残基の変動について評価した。配列の相違の領域を決定するために開発されたアルゴリズムは１２の超可変領域（ＨＶＲ）を生じ、そのうち５種は４種の以前に記述された可変領域と重複するかもしくはその一部である［Ｋｏｔｉｎ、上に引用される；Ｒｕｔｌｅｄｇｅ、上に引用される］。３倍近位の（ｔｈｒｅｅ−ｆｏｌｄ−ｐｒｏｘｉｍａｌ）ピークが変動性の大部分を含有する（ＨＶＲ５−１０）。興味深いことに、２および５倍軸（２ ａｎｄ ５ ｆｏｌｄ ａｘｉｓ）に位置するループが同様に強い変動を示す。ＨＶＲ１および２はキャプシドタンパク質のＮ末端領域（Ｘ線構造中で分離されない）中にあり、ＶＰ１タンパク質のＮ末端がビリオンの表面上に露出されていることを示唆する。
【０１８５】
リアルタイムＰＣＲを使用して、既知のＡＡＶのＲｅｐ（一組）およびＣａｐ（二組）の高度に保存された領域に対するプライマーおよびプローブを使用して２１匹のアカゲザルの組織からのＡＡＶ配列を定量した。各データ点は個々の動物からの組織ＤＮＡからの分析を表す。これはＡＡＶ配列の広範な分布を確認したとは言え、量的分布は個々の動物間で異なった。動物の供給源および以前の病歴もしくは処置はアカゲザル中のＡＡＶ配列の分布に影響すると思われなかった。ＡＡＶを定量するのに使用した３つの異なる組のプライマーおよびプローブは一貫する結果を生じた。最高レベルのＡＡＶは陽性であった１３匹の動物について二倍体ゲノムあたり平均０．０１コピーで腸間膜リンパ節中で一貫して見出された。肝および脾もまたウイルスＤＮＡの高い豊富さを含有した。アカゲザル９８Ｅ０５６の心、アカゲザル９７Ｅ０４３の脾およびアカゲザルＲＱ４４０７の肝中のような非常に高いＡＡＶの例が存在し、これらはそれぞれ二倍体ゲノムあたり１．５、３および２０コピーのＡＡＶ配列を示した。比較的低レベルのウイルスＤＮＡが末梢血単核細胞中で示され、組織中のデータが内在する血液成分によらないことを示唆した（データは示されない）。この方法は、検出がオリゴヌクレオチドおよびリアルタイムＰＣＲプローブ双方に対する高い相同性を必要とするために、非ヒト霊長類に固有の全部のＡＡＶを必ずしも捕捉できないことに注意すべきである。高い豊富さのＡＡＶ ＤＮＡを伴う動物からの組織をＤＮＡハイブリダイゼーション技術により該ＤＮＡの分子状態についておよびｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによりその細胞分布についてさらに分析した。
【０１８６】
多様な動物から単離されたおよび同一動物の組織内のＡＡＶプロウイルスフラグメント中で示される配列の変動の種類は、汎流行病の間もしくは一個体の感染内でさえ多くのＲＮＡウイルスに関して起こる進化を連想させる。いくつかの状況において、野性型ウイルスの概念は迅速な複製および選択圧の存在下での突然変異の結果として進化する疑似種の群の存在により置き換えられた。一例は免疫学的および薬理学的圧に応答して進化するＨＩＶによる感染である。逆転写酵素の低い忠実性およびプルーフリーディング能力の欠如ならびに非相同的および相同的組換えを包含するいくつかの機構がＲＮＡウイルスにおける高い突然変異率に寄与する。
【０１８７】
ＡＡＶの疑似種の形成についての証拠は複数のクローン化されたプロウイルスフラグメントの系統的配列決定により本研究で具体的に説明された。事実、同一の配列は動物間もしくは動物内で単離されたいかなる伸長されたクローン内でも見出され得なかった。配列のこの進化の重要な一機構はより制限された数の腸管外（ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ）ウイルス間の高い相同的組換え率であるようである。正味の結果は、異なる向性および血清学的特異性（すなわちとりわけそれが中和抗体に関する際に免疫学的応答を逃れる能力）を有し得る多数のキメラに至るＣａｐタンパク質の超可変領域の広範囲の交換である。相同的組換えが起こり得る機構は不明である。１つの可能性は、ＡＡＶ組み換え体への高感染多重度の間に記述されたとおり、多様な一本鎖ＡＡＶゲノムの＋および−鎖が複製の間にアニーリングすることである。他の機構がＡＡＶ感染における配列進化に寄与しているかどうかは不明である。ＡＡＶ複製の間に起こる全体的突然変異率は比較的低いようであり、また、データは高頻度の複製の誤りを示唆していない。しかしながら、ＡＡＶゲノムの実質的な再配列が不完全な干渉ウイルス粒子の形成につながる溶解感染の間に記述されている。配列の相違につながる機構に関係なく、いくつかを除いては、疑似種のｖｐ１構造はフレームシフトもしくはナンセンス突然変異を伴わず無傷のままであり、適応度の最も好都合の特徴を伴うウイルスの競合的選択が個体群動態学に寄与することを示唆した。
【０１８８】
これらの研究は生物学および医学のいくつかの領域において意味を有する。以前はＲＮＡウイルスに制限された特性であると考えられた迅速なウイルス進化の概念を、血清学的アッセイにより古典的に特徴づけられていたＤＮＡウイルスで考慮すべきである。クレードと呼ばれる類似の構造および機能の一般的一群として分類される、ＨＩＶでのようなその構造および生物学の複雑さを捉えるウイルス単離物の新たな記述方法を開発することが、パルボウイルスに関して重要であろう。代替の一戦略は血清学的特異性に関して単離物を分類しかつ血清学的グループ内の変異体を記述するための基準を開発することを継続することである。
【０１８９】
実施例３：多様な動物モデルにおける血清学的および遺伝子移入研究のためのＡＡＶ２ ｒｅｐおよび新規ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子を含有するキメラプラスミドを使用するＡＡＶ２ ＩＴＲを装備した組換えＡＡＶゲノムのベクター学。
キメラパッケージング構築物を、ＡＡＶ２ ｒｅｐを新規ＡＡＶ血清型のｃａｐ配列と融合させることにより生成する。これらのキメラパッケージング構築物は、最初に、Ａｄ５ヘルパープラスミドを使用する２９３細胞における三重トランスフェクションによりＡＡＶ２ ＩＴＲを運搬する組換えＡＡＶゲノムをシュードタイピングするために使用する。これらのシュードタイピングされたベクターを使用して、これらの新規血清型の無傷のかつ感染性のウイルスが単離される前に、ＮＨＰおよびげっ歯類を包含する多様な動物モデルにおいて形質導入に基づく血清学的研究における性能を評価しかつ新規ＡＡＶ血清型の遺伝子移入効率を評価する。
【０１９０】
Ａ．ｐＡＡＶ２ＧＦＰ
構成的プロモーターの制御下で発現されるＡＡＶ２ ＩＴＲおよび緑色蛍光タンパク質を含有するＡＡＶ２プラスミド。本プラスミドは以下の要素すなわちＡＡＶ２ ＩＴＲ、ＣＭＶプロモーターおよびＧＦＰコーディング配列を含有する。
【０１９１】
Ｂ．ｔｒａｎｓプラスミドのクローニング
組換えのシュードタイピングされたＡＡＶ７ベクターの産生のためのキメラｔｒａｎｓプラスミドを構築するために、ｐ５Ｅ１８プラスミド（Ｘｉａｏら、１９９９、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ ７３：３９９４−４００３）をＸｈｏ Ｉで部分的に消化して３１６９ｂｐの位置のＸｈｏ Ｉ部位でのみプラスミドを直鎖状にした。Ｘｈｏ Ｉ切断端をその後埋めかつ戻し連結した。この改変されたｐ５Ｅ１８プラスミドを完全な消化にてＸｂａ ＩおよびＸｈｏ Ｉで制限してＡＡＶ２ ｃａｐ遺伝子配列を除去しかつｐＣＲＡＡＶ７ ６−５＋１５−４プラスミドから単離したＡＡＶ７ ｃａｐ遺伝子を含有する２２６７ｂｐのＳｐｅ Ｉ／Ｘｈｏ Ｉフラグメントで置き換えた。
【０１９２】
生じるプラスミドはＡＡＶ２ Ｐ５プロモーターの制御下にＲｅｐ７８／６８のＡＡＶ２ ｒｅｐ配列およびＡＡＶ２ Ｐ１９プロモーターの制御下にＲｅｐ５２／４０のＡＡＶ２ ｒｅｐ配列を含有する。ＡＡＶ７キャプシド配列はＲｅｐ配列内に配置されているＡＡＶ２ Ｐ４０プロモーターの制御下にある。このプラスミドはｒｅｐ ＯＲＤの５’のスペーサーをさらに含有する。
【０１９３】
Ｃ．シュードタイピングされたｒＡＡＶの産生
アデノウイルスを用いない方法を使用してｒＡＡＶ粒子（ＡＡＶ７キャプシド中のＡＡＶ２ベクター）を生成させる。簡潔には、ｃｉｓプラスミド（ＡＡＶ２ ＩＴＲを含有するｐＡＡＶ２．１ ｌａｃＺプラスミド）ならびにｔｒａｎｓプラスミドｐＣＲＡＡＶ７
６−５＋１５−４（ＡＡＶ２ ｒｅｐおよびＡＡＶ７ ｃａｐを含有する）ならびにヘルパープラスミドそれぞれをリン酸カルシウム沈殿法により１：１：２の比で２９３細胞に同時にコトランスフェクトした。
【０１９４】
ｐＡｄヘルパープラスミドの構築のため、ｐＢＧ１０プラスミドをマイクロビックス（Ｍｉｃｒｏｂｉｘ）（カナダ）から購入した。Ｌ２およびＬ３を含有するＲｓｒＩＩフラグメントをｐＢＨＧ１０から欠失させて第一のヘルパープラスミドｐＡｄΔＦ１３をもたらした。プラスミドＡｄΔＦ１は、ｐＢＨＧ１０から単離するＰｍｅＩ／ＳｇｆＩ欠失を伴うＡｓｐ７００／ＳａｌＩフラグメントをＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにクローン化することにより構築した。ＭＬＰ、Ｌ２、Ｌ２およびＬ３をｐＡｄΔＦ１中で欠失させた。２．３ｋｂのＮｒｕＩフラグメントおよびその後０．５ｋｂのＲｓｒＩＩ／ＮｒｕＩフラグメントのさらなる欠失はそれぞれヘルパープラスミドｐＡｄΔＦ５およびｐＡｄΔＦ６を生成させた。ｐΔＦ６と命名されたヘルパープラスミドは、Ｅ１を発現するヘルパー細胞により提供されないＥ２ａおよびＥ４ ＯＲＦ６の必須のヘルパー機能を提供するがしかしアデノウイルスキャプシドタンパク質および機能的Ｅ１領域が欠失されている）。
【０１９５】
典型的には、５０μｇのＤＮＡ（ｃｉｓ：ｔｒａｎｓ：ヘルパー）を１５０ｍｍ組織培養皿上でトランスフェクトした。２９３細胞をトランスフェクション７２時間後に収集し、超音波処理しかつ０．５％デオキシコール酸ナトリウムで処理した（３７℃１０分間）。細胞ライセートをその後２回のＣｓＣｌ勾配にかけた。ｒＡＡＶベクターを含有するピーク画分を収集し、プールしかつＰＢＳに対し透析した。
【０１９６】
実施例４：ヒトおよびＮＨＰ由来細胞系における基本的ウイルス学の研究ならびにＮＨＰおよび他の動物モデルにおける新規ＡＡＶ血清型の病因の評価のための無傷の新規ＡＡＶ血清型を運搬する感染性クローンの創製。
本最終目標を達成するためにゲノム歩行体（ｇｅｎｏｍｅ ｗａｌｋｅｒ）系を使用して５’および３’末端配列（ＩＴＲ）ならびに無傷の新規ＡＡＶ血清型のゲノムを含有するクローンの完全な構築を得る。
【０１９７】
簡潔には、商業的に入手可能なユニバーサルゲノムウォーカーキット（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｇｅｎｏｍｅ Ｗａｌｋｅｒ Ｋｉｔ）［クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）］を利用して、ＡＡＶ７配列の存在について陽性と同定されるサル組織もしくは細胞系からのゲノムＤＮＡをＤｒａ Ｉ、ＥｃｏＲ Ｖ、Ｐｖｕ ＩＩおよびＳｔｕ Ｉエンドヌクレアーゼで消化しそしてゲノムウォーカーアダプター（Ｇｅｎｏｍｅ Ｗａｌｋｅｒ Ａｄａｐｔｏｒ）に連結して４個の個別のゲノムウォーカーライブラリー（Ｇｅｎｏｍｅ Ｗａｌｋｅｒ Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ）（ＧＷＬ）を生成させる。ＧＷＬからのＤＮＡを鋳型として使用して、ＡＡＶ７および隣接ゲノム配列を、アダプタープライマー１（ＡＰ１、キット中で提供される）およびＡＡＶ７特異的プライマー１によりＰＣＲ増幅し、次いでアダプタープライマー２（ＡＰ２）および別のＡＡＶ７特異的プライマー２（この双方は第一の組のプライマーに対し内的である）を使用してネステッドＰＣＲを行うことができる。ネステッドＰＣＲからの主要ＰＣＲ産物をクローン化しかつ配列決定分析により特徴づけする。
【０１９８】
本実験において、包括的ＡＡＶゲノムの２５７ｂｐもしくは他のシグネチャフラグメントを包含するプライマーをヒトおよびＮＨＰ由来細胞系から抽出された細胞ＤＮＡのＰＣＲ増幅に使用して、潜在ＡＡＶ配列を同定かつ特徴づけする。同定された潜在ＡＡＶゲノムを異なる種および株のアデノウイルスヘルパーを使用して陽性細胞系からレスキューする。
【０１９９】
ＮＨＰ由来細胞系から感染性ＡＡＶクローンを単離するために、所望の細胞系をＡＴＣＣから得かつＰＣＲによりスクリーニングして２５７ｂｐのアンプリコンすなわち本発明のシグネチャ領域を同定する。該２５７ｂｐのＰＣＲ産物をクローン化しそして配列決定分析により血清型分類する。ＡＡＶ７配列を含有するこれらの細胞系について、細胞をＳＶ−１５（ＡＴＣＣから購入したサルアデノウイルス）、ヒトＡｄ５に感染させるか、もしくはＡＡＶヘルパー機能を司るヒトＡｄ遺伝子を収容するプラスミド構築物でトランスフェクトする。感染もしくはトランスフェクション４８時間後に細胞を収集しかつＡＡＶ７ゲノムのクローニングのためにＸｉａｏら、１９９９、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ、７３：３９９４−４００３に従ってＨｉｒｔ ＤＮＡを調製する。
【０２００】
実施例５：ＡＡＶベクターの製造
ＡＡＶ１／７についての実施例３のものに類似のシュードタイピング戦略を使用してＡＡＶＩ、ＡＡＶ５およびＡＡＶ８キャプシドタンパク質でパッケージングされたＡＡＶ２ベクターを製造した。簡潔には、ＡＡＶ２ ＩＴＲを装備した組換えＡＡＶゲノムを、ｃｉｓプラスミド、アデノウイルスヘルパープラスミド、およびＡＡＶ２ ｒｅｐ遺伝子が新規ＡＡＶ血清型のｃａｐ遺伝子に融合されているキメラパッケージング構築物での２９３細胞の三重トランスフェクションによりパッケージングした。キメラパッケージング構築物を創製するために、３１６９ｂｐのｐ５Ｅ１８プラスミドのＸｈｏ Ｉ部位を除去しかつ改変されたプラスミドをＸｂａＩおよびＸｈｏ Ｉで完全消化にて制限してＡＡＶ ｃａｐ遺伝子を除去し、そしてＡＡＶ８ ｃａｐ遺伝子を含有する２２６７ｂｐのＳｐｅ Ｉ／Ｘｈｏ Ｉフラグメントでそれを置き換えた［Ｘｉａｏ，Ｗ．ら、（１９９９）Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７３、３９９４−４００３］。類似のクローニング戦略をＡＡＶ２／１およびＡＡＶ２／５のキメラパッケージングプラスミドの創製に使用した。全部の組換えベクターは、単一段階ヘパリンクロマトグラフィーにより精製したＡＡＶ２／２を除き標準的ＣｓＣｌ_２沈降法により精製した。
【０２０１】
ＡＡＶベクターのゲノムコピー（ＧＣ）力価を、以前に記述された［Ｇａｏ，Ｇ．ら、（２０００）Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １１、２０７９−９１］ところのＳＶ４０ポリＡ領域を標的とするプローブおよびプライマーを使用するタックマン（ＴａｑＭａｎ）分析により測定した。
【０２０２】
ベクターは多数のｉｎ ｖｉｔｒｏおよび ｉｎ ｖｉｖｏ研究のため各血清型について構築した。８種の異なるトランスジーンカセットをベクター中に組込みそして組換えビリオンを各血清型について産生させた。ゲノムコピーに基づくウイルスの回収を下の表４に要約する。ベクターの収量は血清型間で一貫した差異を伴わず各血清型について高かった。該表に提示されるデータは５０枚のプレート（１５０ｍｍ）のトランスフェクションの複数の製造ロットの標準誤差を伴う平均のゲノムコピー収量×１０^１３である。
【０２０３】
【表６】

【０２０４】
実施例６：シュードタイピングされたベクターの血清学的分析
Ｃ５７ＢＬ／６マウスに多様な血清型のＡＡＶＣＢＡ１ＡＴベクターのベクターを筋肉内に注入し（５×１０^１１ＧＣ）そして血清サンプルを３４日後に収集した。各血清型のＡＡＶに対する血清の中和および交差中和活性を試験するために、血清を形質導入に基づく中和抗体アッセイ［Ｇａｏ，Ｇ．Ｐ．ら、（１９９６）Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７０、８９３４−４３］で分析した。より具体的には、中和抗体の存在は８４−３１細胞の形質導入を阻害する血清の能力を多様な血清型のレポーターウイルス（ＡＡＶＣＭＶＥＧＦＰ）により評価することにより測定した。とりわけ、［指標細胞の９０％の形質導入に至った感染多重度（ＭＯＩ）の］各血清型のレポーターウイルスＡＡＶＣＭＶＥＧＦＰは、多様な血清型のＡＡＶを受領した動物もしくはナイーブなマウスからの熱不活性化血清とともに前インキュベートした。３７℃で１時間インキュベーション後にウイルスを９６ウェルプレート中の８４−３１細胞にウイルスの血清型に依存して４８もしくは７２時間添加した。ＧＦＰの発現をフルオロイメージン（ＦｌｕｏｒｏＩｍａｇｉｎ）（モレキュラー ダイナミックス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ））により測定しそしてＩｍａｇｅ Ｑｕａｎｔソフトウェアにより定量した。中和抗体力価は、形質導入を５０％未満まで阻害した最高の血清希釈として報告した。
【０２０５】
ＧＦＰを発現するベクターの利用可能性は、許容性細胞系（すなわちＡｄ５からのＥ４を安定に発現する２９３細胞）における形質導入の阻害に基づく中和抗体に関するアッセイの開発を単純化した。選択されたＡＡＶ血清型に対する血清が組換えウイルスの筋肉内注入により生成された。抗血清の１：２０および１：８０希釈によるＡＡＶ形質導入の中和を評価した（下の表５を参照されたい）。ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５およびＡＡＶ８に対する抗血清は、それに対し抗血清が生成された血清型の形質導入を中和した（ＡＡＶ５およびＡＡＶ８はＡＡＶ１およびＡＡＶ２より少ない程度まで）が、しかし他の血清型に対してはしなかった（すなわち、交差中和の証拠は存在せず、ＡＡＶ８が真に独特の血清型であることを示唆した）。
【０２０６】
【表７】

【０２０７】
５２名の正常被験体からのヒト血清を選択された血清型に対する中和についてスクリーニングした。いずれの血清サンプルもＡＡＶ２／７およびＡＡＶ２／８を中和することは見出されなかった一方、ＡＡＶ２／２およびＡＡＶ２／１ベクターはそれぞれ血清の２０％および１０％で中和された。６０，０００の個別サンプルの収集物を代表するヒトのプールされたＩｇＧの一画分はＡＡＶ２／７およびＡＡＶ２／８を中和しなかった一方、ＡＡＶ２／２およびＡＡＶ２／１ベクターはそれぞれ１／１２８０および１／６４０に等しい血清力価で中和された。
【０２０８】
実施例７：多様な血清型のＡＡＶベクターのｉｎ ｖｉｖｏ評価
本研究において、組換えＡＡＶゲノム、ＡＡＶ２ＣＢｈＡ１ＡＴ、ＡＡＶ２ＡｌｂｈＡ１ＡＴ、ＡＡＶ２ＣＭＶｒｈＣＧ、ＡＡＶ２ＴＢＧｒｈＣＧ、ＡＡＶ２ＴＢＧｃＦＩＸ、ＡＡＶ２ＣＭＶＬａｃＺおよびＡＡＶ２ＴＢＧＬａｃＺを多様な血清型のキャプシドタンパク質でパッケージングした。全７種の構築物中でミニ遺伝子カセットはＡＡＶ２ ＩＴＲで隣接された。ヒトα−アンチトリプシン（Ａ１ＡＴ）［Ｘｉａｏ，Ｗ．ら、（１９９９）Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７３、３９９４−４００３］アカゲザル絨毛性ゴナドトロピンホルモンのβ−サブユニット（ＣＧ）［Ｚｏｌｔｉｃｋ，Ｐ．Ｗ．とＷｉｌｓｏｎ，Ｊ．Ｍ．（２０００）Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ２、６５７−９］イヌ第ＩＸ因子［Ｗａｎｇ，Ｌ．ら、（１９９７）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ９４、１１５６３−６］および細菌β−ガラクトシダーゼ（すなわちＬａｃＺ）遺伝子のｃＤＮＡをレポーター遺伝子として使用した。肝に向けられた遺伝子移入については、マウスアルブミン遺伝子プロモーター（Ａｌｂ）［Ｘｉａｏ，Ｗ．（１９９９）、上で引用される］もしくはヒト甲状腺ホルモン結合グロブリン遺伝子プロモーター（ＴＢＧ）［Ｗａｎｇ（１９９７）、上で引用される］のいずれかを使用してレポーター遺伝子の肝特異的発現を駆動した。筋に向けられた遺伝子移入実験においては、サイトメガロウイルス初期プロモーター（ＣＭＶ）もしくはＣＭＶエンハンサーを伴うニワトリβ−アクチンプロモーター（ＣＢ）のいずれかを使用してレポーターの発現を指図した。
【０２０９】
筋に向けられた遺伝子移入のため、ベクターを４〜６週齢のＮＣＲヌードもしくはＣ５７ＢＬ／６マウス（タコニック（Ｔａｃｏｎｉｃ）、ニューヨーク州ジャーマンタウン）の右前脛骨筋に注入した。肝に向けられた遺伝子移入研究では、ベクターを７〜９週齢のＮＣＲヌードもしくはＣ５７ＢＬ／６マウス（タコニック（Ｔａｃｏｎｉｃ）、ニューヨーク州ジャーマンタウン）に腹腔内に注入した。血清サンプルをベクター投与後の多様な時間点に眼窩内で収集した。筋および肝組織を、ｌａｃＺベクターを受領した動物から低温切開およびＸｇａｌ組織化学的染色のため多様な時間点に収集した。再投与実験のため、Ｃ５７ＢＬ／６マウスは当初ＡＡＶ２／１、２／２、２／５、２／７および２／８ＣＢＡ１ＡＴベクターを筋肉内に受領しそしてＡ１ＡＴ遺伝子発現について７週間追跡した。その後動物をＡＡＶ２／８ＴＢＧｃＦＩＸで門脈内で処理しかつｃＦＩＸ遺伝子発現について研究した。
【０２１０】
ＥＬＩＳＡに基づくアッセイを実施して以前に記述されたとおり［Ｇａｏ，Ｇ．Ｐ．ら、（１９９６）Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７０、８９３４−４３；Ｚｏｌｔｉｃｋ，Ｐ．Ｗ．とＷｉｌｓｏｎ，Ｊ．Ｍ．（２０００）Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ２、６５７−９；Ｗａｎｇ，Ｌ．ら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ９４、１１５６３−６］ｈＡ１ＡＴ、ｒｈＣＧおよびｃＦＩＸタンパク質の血清レベルを定量した。該実験は、ＤＮＡ抽出、ならびにベクター調製物の力価測定［Ｚｈａｎｇ，Ｙ．ら、（２００１）Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ３、６９７−７０７］でと同一の組のプライマーおよびプローブを使用するタックマン（ＴａｑＭａｎ）による標的組織中に存在するベクターのゲノムコピーの定量分析のための筋および肝組織の収集のために動物を殺して完了した。
【０２１１】
新たな血清型に基づくベクターの性能を筋および肝に向けられた遺伝子移入のマウスモデルで評価し、そして既知の血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２およびＡＡＶ５に基づくベクターと比較した。分泌型タンパク質（α−アンチトリプシン（Ａ１ＡＴ）および絨毛性ゴナドトロピン（ＣＧ））を発現するベクターを使用して、血清のＥＬＩＳＡ分析により異なる
血清型間の相対的形質導入効率を定量化した。標的器官内の形質導入の細胞分布はｌａｃＺ発現ベクターおよびＸ−ｇａｌ組織化学を使用して評価した。
【０２１２】
骨格筋におけるＡＡＶベクターの性能を前脛骨筋への直接注入後に分析した。ベクターは、トランスジーンの発現を駆動するＣＭＶの前初期遺伝子もしくはＣＭＶで増強されたβ−アクチンプロモーターを伴う同一のＡＡＶ２に基づくゲノムを含有した。以前の研究は、免疫適格性のＣ５７ＢＬ／６マウスはＡＡＶベクターから発現される場合にヒトＡ１ＡＴタンパク質に対する制限された体液性応答を導き出すことを示した［Ｘｉａｏ，Ｗ．ら、（１９９９）Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７３、３９９４−４００３］。
【０２１３】
各系統において、ＡＡＶ２／１ベクターは最高レベルのＡ１ＡＴおよび最低のＡＡＶ２／２ベクターを産生し、ＡＡＶ２／７およびＡＡＶ２／８ベクターは中間レベルの発現を示した。ｎｕ／ｎｕ ＮＣＲマウスの注入２８日後のＣＧのピークレベルはＡＡＶ２／７からの最高レベルおよびＡＡＶ２／２からの最低を示し、ＡＡＶ２／８およびＡＡＶ２／１は中間であった。ＡＡＶ２／１およびＡＡＶ２／７ ｌａｃＺベクターの注入は全筋線維中で注入部位で遺伝子発現を生じさせ、実質的により少ないｌａｃＺ陽性線維がＡＡＶ２／２およびＡＡＶ２／８ベクターで観察された。これらのデータは、骨格筋におけるＡＡＶ２／７ベクターでの形質導入の効率が、以前に記述された血清型のうち骨格筋で最も効率的であるＡＡＶ２／１［Ｘｉａｏ，Ｗ．（１９９９）、上で引用される；Ｃｈａｏ，Ｈ．ら、（２００１）Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ４、２１７−２２；Ｃｈａｏ，Ｈ．ら、（２０００）Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ２、６１９−２３］で得られたものに類似であることを示す。
【０２１４】
同様のマウスモデルを使用して肝に向けられた遺伝子移入を評価した。同一用量の、ゲノムコピーに基づくベクターをマウスの門脈に注入し、これをその後トランスジーンの発現について分析した。各ベクターは、トランスジーンの発現を駆動するために以前に記述された肝特異的プロモーター（すなわちアルブミンもしくは甲状腺ホルモン結合グロブリン）を使用するＡＡＶ２に基づくゲノムを含有した。より具体的には、ＣＭＶＣＧおよびＴＢＧＣＧミニ遺伝子カセットをそれぞれ筋および肝に向けられた遺伝子移入に使用した。ｒｈＣＧのレベルを相対単位（ＲＵ×１０^３）として定義した。データはベクター投与後第２８日に収集した血清サンプルをアッセイすることからであった（１群あたり４動物）。表３に示されるとおり、ｎｕ／ｎｕおよびＣ５７ＢＬ／６マウスにおけるＡ１ＡＴベクターならびにＣ５７ＢＬ／６マウスにおけるＣＧベクターの形質導入の効率に対するキャプシドタンパク質の影響は一貫していた（表６を参照されたい）。
【０２１５】
【表８】

【０２１６】
全部の場合で、ＡＡＶ２／８ベクターは、ＡＡＶ２／２ベクターで得られたものより１６から１１０まで大きい範囲にわたる最高レベルのトランスジーン発現を生じ；ＡＡＶ２／５およびＡＡＶ２／７ベクターからの発現は中間であり、ＡＡＶ２／７がＡＡＶ２／５より高かった。対応するｌａｃＺベクターを受領した動物のＸ−Ｇａｌ染色された肝切片の分析は、形質導入された細胞の数とトランスジーン発現の全体的レベルとの間の相関を示した。Ａ１ＡＴベクターを受領したＣ５７ＢＬ／６マウスの肝から抽出されたＤＮＡをリアルタイムＰＣＲ技術を使用してベクターＤＮＡの豊富さについて分析した。
【０２１７】
注入５６日後の肝で見出されたベクターＤＮＡの量はトランスジーン発現のレベルと相関した（表７を参照されたい）。本実験について、ベクターゲノムのＳＶ４０ポリＡ領域を標的とする一組のプローブおよびプライマーをタックマン（ＴａｑＭａｎ）ＰＣＲに使用した。示される値は３個体の動物の標準偏差を伴う平均である。動物を第５６日に殺してＤＮＡ抽出のため肝組織を収集した。これらの研究は、ＡＡＶ８が、形質導入された肝細胞の増大された数により、肝に向けられた遺伝子移入に最も効率的なベクターであるこ
とを示す。
【０２１８】
【表９】

【０２１９】
上述された血清学的データはＡＡＶ２／８ベクターが他の血清型での免疫感作後にｉｎ
ｖｉｖｏで中和されないことを示唆する。Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、それらが多様な血清型のＡ１ＡＴベクターの筋肉内注入を受領した５６日後にイヌ第ＩＸ因子を発現するＡＡＶ２／８ベクター（１０^１１ゲノムコピー）の門脈内注入を受領した。高レベルの第ＩＸ因子発現がナイーブな動物へのＡＡＶ２／８の注入１４日後に得られ（１７±２μｇ／ｍｌ、ｎ＝４）、これはＡＡＶ２／１（３１±２３μｇ／ｍｌ、ｎ＝４）、ＡＡＶ２／２（１６μｇ／ｍｌ、ｎ＝２）およびＡＡＶ２／７（１２μｇ／ｍｌ、ｎ＝２）で免役した動物で観察されたものと有意に異ならなかった。これは、検出可能な第ＩＸ因子が観察されなかった（＜０．１μｇ／ｍｌ、ｎ＝４）ＡＡＶ２／８ 第ＩＸ因子ベクターを注入したＡＡＶ２／８で免疫した動物で観察されたものと対照をなす。
【０２２０】
ｃａｐ遺伝子の保存された領域に対するオリゴヌクレオチドは独特のＡＡＶを表すアカゲザルからの配列を増幅した。同一のｃａｐシグネチャ配列が最低２個の異なるコロニー由来のアカゲザルからの複数の組織で見出された。完全長のｒｅｐおよびｃａｐ読み取り枠を単一供給源から単離しかつ配列決定した。新規ＡＡＶのｃａｐ読み取り枠のみがベクターとしてのそれらの潜在能力を評価するのに必要であった。ＡＡＶ７もしくはＡＡＶ８キャプシドをもつベクターはＡＡＶ２からのＩＴＲおよびｒｅｐを使用して生成されたためである。実際のベクターゲノムは異なるベクター血清型間で同一であるため、これは多様なベクターの比較もまた単純化する。事実、このアプローチを使用して生成された組換えベクターの収量は血清型間で異ならなかった。
【０２２１】
ＡＡＶ７およびＡＡＶ８に基づくベクターは免疫学的に異なる（すなわちそれらは他の血清型に対し生成された抗体により中和されない）ようである。さらに、ヒトからの血清はＡＡＶ７およびＡＡＶ８ベクターによる形質導入を中和せず、これは、それに対してヒト集団のかなりの比率が中和する既存の免疫を有する現在開発中のヒト由来ＡＡＶを上回る大きな利点である［Ｃｈｉｒｍｕｌｅ，Ｎ．ら、（１９９９）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ６、１５７４−８３］。
【０２２２】
各新たなベクターの向性はｉｎ ｖｉｖｏの応用に好都合である。ＡＡＶ２／７ベクターは、今日まで試験された霊長類ＡＡＶの骨格筋で最高レベルの形質導入を賦与する血清型であるＡＡＶ２／１と同じくらい効率的に骨格筋を形質導入するようである［Ｘｉａｏ，Ｗ．、上に引用される；Ｃｈｏｕ（２００１）、上に引用される、およびＣｈｏｕ（２０００）、上に引用される］。重要なことに、ＡＡＶ２／８は、安定に形質導入された肝細胞の数に関して現在まで比較的失望させるものであった肝への遺伝子移入の効率に関して他の血清型を上回る大きな利点を提供する。ＡＡＶ２／８は他のベクターに比較して遺伝子移入効率の１０ないし１００倍の向上を一貫して達成した。ＡＡＶ２／８の向上された効率の基礎は不明であるが、とは言えそれはおそらく肝細胞の基底外側表面上でより活性である異なる受容体を介する取り込みによるであろう。この向上された効率は、尿素回路障害および家族性高コレステロール血症のような形質導入される細胞の数が決定的に重要である肝に向けられた遺伝子移入の開発において極めて有用であろう。
【０２２３】
従って、本発明はゲノム配列のＰＣＲ回復に基づく新たなＡＡＶを単離するための新規アプローチを提供する。増幅された配列はベクター中に容易に組込まれそして動物中で試験された。ＡＡＶ７に対する既存の免疫の欠如および筋に対する該ベクターの好都合の向性は、ＡＡＶ７がヒト遺伝子治療および他のｉｎ ｖｉｖｏの応用におけるベクターとしての使用に適することを示す。同様に、本発明のＡＡＶ血清型に対する既存の免疫の欠如
およびそれらの向性は、それらを治療的分子および他の有用な分子の送達において有用にする。
【０２２４】
実施例９：組織向性研究
新規ＡＡＶ構築物のための高スループット機能的スクリーニングスキームの設計において、非組織特異的および高度に活性のプロモーター、ＣＢプロモーター（ＣＭＶで増強されたニワトリβアクチンプロモーター）を、容易に検出可能かつ定量可能なレポーター遺伝子、ヒトαアンチトリプシン遺伝子を駆動するために選択した。かように、各新たなＡＡＶクローンについて唯一のベクターを、特定のＡＡＶ構築物の組織向性についてスクリーニングするための３つの異なる組織すなわち肝、肺および筋を標的とする遺伝子移入研究のために作成する必要がある。以下の表は組織向性研究における４種の新規ＡＡＶベクターから生成されたデータを要約し（ＡＡＶＣＢＡ１ＡＴ）、これから新規ＡＡＶキャプシドクローン４４．２が、とりわけ肺組織での大きな優勢を伴い全３組織中で非常に強力な遺伝子移入ベヒクルであることが見出された。表８は試験の第１４日に得られたデータ（μｇ Ａ１ＡＴ／ｍＬ血清で）を報告する。
【０２２５】
【表１０】

【０２２６】
一対の他の実験をその後実施して肺組織中でのＡＡＶ ４４．２の優れた向性を確認した。最初に、肺特異的発現のためのＣＣ１０ｈＡ１ＡＴミニ遺伝子を運搬する新規ＡＡＶのキャプシドでシュードタイピングしたＡＡＶベクターを、以下の表で提供されるところの気管内注入を介して等容量（希釈を伴わない元の調製物各５０μｌ）で免疫不全動物（ＮＣＲヌード）に投与した。表９において、マウスあたり各元の調製物５０μｌ、ＮＣＲヌード、検出限界≧０．０３３μｇ／ｍｌ、第２８日
【０２２７】
【表１１】

【０２２８】
該ベクターを表１０に示されるとおり等ゲノムコピー（１×１０^１１ＧＣ）で免疫適格性の動物（Ｃ５７ＢＬ／６）にもまた投与した。（動物あたり１×１０^１１ＧＣ、Ｃ５７ＢＬ／６、第１４日、検出限界≧０．０３３μｇ／ｍｌ）
【０２２９】
【表１２】

【０２３０】
双方の実験からのデータは肺に向けられた遺伝子移入におけるクローン４４．２の優秀な向性を確認した。
【０２３１】
興味深いことに、肝および筋に向けられた遺伝子移入におけるクローン４４．２の性能もまた、最良の肝の形質導入体ＡＡＶ８および最良の筋の形質導入体ＡＡＶ１のものに近く傑出しており、この新規ＡＡＶが何らかの魅力的な生物学的意義を有することを示唆した。
【０２３２】
それら新規ＡＡＶの血清学的特性を研究するために、シュードタイピングされたＡＡＶＧＦＰベクターを、ウサギの免疫感作ならびに多様なキャプシドに対する抗血清の存在および非存在下での８４−３１細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ形質導入のため創製した。データを下に要約する：
【０２３３】
【表１３】

【０２３４】
【表１４】

【０２３５】
【表１５】

【０２３６】
【表１６】

【０２３７】
【表１７】

【０２３８】
実施例１０：家族性高コレステロール血症のマウスモデル
以下の実験は本発明のＡＡＶ２／７構築物が家族性高コレステロール血症の動物モデルにおいて血漿コレステロールおよびトリグリセリドのレベルを低下させるのに十分な量でＬＤＬ受容体を送達しかつＬＤＬ受容体を発現することを示す。
【０２３９】
Ａ．ベクター構築
ＡＡＶ７もしくはＡＡＶ８キャプシドタンパク質でパッケージングされたＡＡＶベクターをシュードタイピング戦略［Ｈｉｌｄｉｎｇｅｒ Ｍら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ ２００１；７５：６１９９−６２０３］を使用して構築した。ＡＡＶ２逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）をもつ組換えＡＡＶゲノムを、ｃｉｓプラスミド、アデノウイルスヘルパープラスミドおよびキメラパッケージング構築物すなわち新規ＡＡＶ血清型のキャプシドのＡＡＶ２のｒｅｐ遺伝子との融合物での２９３細胞の三重トランスフェクションによりパッケージングした。キメラパッケージングプラスミドは以前に記述されたとおり［Ｈｉｌｄｉｎｇｅｒら、上に引用される］構築した。組換えベクターは標準的ＣｓＣｌ_２沈降法により精製した。収量を決定するために、ベクターのＳＶ４０ポリ（Ａ）領域を標的とするプローブおよびプライマー［Ｇａｏ ＧＰら、Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２０００ Ｏｃｔ １０；１１（１５）：２０７９−９１］を使用してタックマン（ＴａｑＭａｎ）（アプライド バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ））分析を実施した。生じるベクターはヒト甲状腺ホルモン結合グロブリン遺伝子プロモーター（ＴＢＧ）の制御下にトランスジーンを発現する。
【０２４０】
Ｂ．動物
Ｃ５７Ｂｌ／６背景のＬＤＬ受容体欠損マウスはジャクソン ラボラトリー（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）（米国メーン州バーハーバー）から購入し、そして繁殖コロニーとして維持した。マウスはベクター注入３週間前に開始して水への制限されない接近手段を与えられかつ高脂肪ウェスタンダイエット（Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｄｉｅｔ）（高％コレステロール）を得た。第−７日ならびに第０日に後眼窩出血を介して血液を得そして脂質プロフィルを評価した。マウスを７群に無作為に分割した。ベクターは以前に記述されたとおり（［Ｃｈｅｎ ＳＪら、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒａｐｙ ２０００；２（３）、２５６−２６１］門脈内注入を介して注入した。簡潔には、マウスをケタミンおよびキシラジンで麻酔した。開腹術を実施しかつ門脈を露出させた。３０ｇの針を使用して１００μｌのＰＢＳで希釈した適切な用量のベクターを門脈中に直接注入した。注入部位に圧を適用して出血の停止を確実にした。皮膚創傷を閉鎖しかつ滅菌した布で覆い、そしてマウスをその後の日の間慎重にモニターした。血液脂質を測定するために、肝に向けられた遺伝子移入後第１４日に開始して毎週採血を実施した。各群の２動物をベクター注入後第６週および第１２週の時点で殺してアテローム硬化性プラークの大きさならびに受容体発現を検査した。残存するマウスは第２０週にプラーク測定およびトランスジーン発現の測定のため殺した。
【０２４１】
【表１８】

【０２４２】
Ｃ．血清リポタンパク質および肝機能分析
血液サンプルは６時間の絶食期間後に後眼窩叢から得た。遠心分離により血漿から血清を分離した。血漿リポタンパク質および血清中の肝トランスアミナーゼの量を自動化臨床検査分析装置（ＡＣＥ、スキャパレリ バイオシステムズ（Ｓｃｈｉａｐｐａｒｅｌｌｉ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、アルファ ワッセルマン（Ａｌｐｈａ Ｗａｓｓｅｒｍａｎｎ））を使用して検出した。
【０２４３】
Ｄ．トランスジーン発現の検出
ＬＤＬ受容体発現を免疫蛍光染色およびウェスタンブロッティングにより評価した。ウェスタンブロッティングのためには、凍結肝組織を溶解緩衝液（２０ｍＭトリス、ｐＨ７．４、１３０ｍＭ ＮａＣｌ、１％トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ １００、プロテイナーゼインヒビター（完全、ＥＤＴＡを含まない、ロシュ（Ｒｏｃｈｅ）、ドイツ・マンハイム）とともにホモジェナイズした。タンパク質濃度はマイクロＢＣＡタンパク質アッセイ試薬キット（ピアース（Ｐｉｅｒｃｅ）、イリノイ州ロックフォード）を使用して測定した。４０μｇのタンパク質を４〜１５％トリス−ＨＣｌレディゲル（Ｒｅａｄｙ Ｇｅｌ）（バイオラッド（Ｂｉｏｒａｄ）、カリフォルニア州ハーキュリーズ）上で分離しそしてニトロセルロースメンブレン（インヴィトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、）に転写した。抗ｈＬＤＬ受容体抗体を生成させるため、ウサギにＡｄｈＬＤＬｒ調製物（１×１０^１３ＧＣ）を静脈内に注入した。４週後にウサギ血清を得そしてウェスタンブロットに使用した。血清の１００倍希釈物を一次抗体として、次いでＨＲＰ結合抗ウサギＩｇＧおよびＥＣＬ化学発光検出（ＥＣＬ ウェスタンブロット検出キット、アマーシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）、イリノイ州アーリントンハイツ）を使用した。
【０２４４】
Ｅ．免疫細胞化学
凍結肝切片中のＬＤＬ受容体発現の測定のために免疫組織化学分析を実施した。１０μｍのクライオスタット切片は、アセトン中で５分間固定したかもしくは固定しないかのどちらかであった。ブロッキングは１０％のヤギ血清との１時間のインキュベーション期間を介して得た。その後切片を一次抗体とともに室温で１時間インキュベートした。ウサギポリクローナル抗体抗ヒトＬＤＬ（バイオメディカル テクノロジーズ インク（Ｂｉｏｍｅｄｈｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）、マサチューセッツ州スタウトン）を製造元の説明書に従って使用し希釈した。切片をＰＢＳで洗浄しそして１００倍希釈されたフルオレセインヤギ抗ウサギＩｇＧ（シグマ（Ｓｉｇｍａ）、ミズーリ州セントルイス）とともにインキュベートした。試料を最後に蛍光顕微鏡ニコン（Ｎｉｋｏｎ）マイクロフォト（Ｍｉｃｒｏｐｈｏｔ）−ＦＸＡ下で検査した。全部の場合で各インキュベーション後にＰＢＳで徹底的に洗浄した。陰性対照はＰＢＳでの前インキュベーション、一次抗体の省略、およびアイソタイプを適合させた非免疫対照抗体による一次抗体の置換よりなった。上で挙げられた３つの型の対照は各実験について同一日に実施した。
【０２４５】
Ｆ．遺伝子移入効率
肝組織を指定された時点でマウスを殺した後に得た。組織を液体窒素中でショック凍結させ（ｓｈｏｃｋ ｆｒｏｚｅｎ）そしてさらなる処理（ｐｒｏｃｅｓｉｎｇ）まで−８０℃で保存した。ＤＮＡを製造元のプロトコルに従いキアアンプ（ＱＩＡａｍｐ）ＤＮＡミニキット（キアゲン有限責任会社（ＱＩＡＧＥＮ ＧｍｂＨ）、ドイツ）を使用して肝組織から抽出した。肝組織中のＡＡＶベクターのゲノムコピーを、上述されたところのＳＶ４０ポリ（Ａ）尾部に対するプローブおよびプライマーを使用するタックマン（Ｔａｑｍａｎ）分析を使用して評価した。
【０２４６】
Ｇ．アテローム硬化性プラーク測定
マウス大動脈中のアテローム硬化性プラークの定量化のためにマウスを麻酔し（１０％ケタミンおよびキシラジン、ｉｐ）、開胸しかつ動脈系を氷冷リン酸緩衝生理的食塩水で左心室を通して灌流した。その後大動脈を慎重に採取し、大動脈弓から大腿動脈まで腹側正中線に沿って細長く切りかつホルマリン中で固定した。脂質豊富なアテローム硬化性プラークをズダンＩＶ（シグマ（Ｓｉｇｍａ）、ドイツ）で染色しそして大動脈を黒色蝋表面上に平坦にピンで止めた。画像をソニー（Ｓｏｎｙ）ＤＸＣ−９６０ＭＤカラービデオカメラで記録した。プラークならびに完全な大動脈表面の面積をフェーズ３イメージングシステム（Ｐｈａｓｅ ３ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ）（メディア サイバネティックス（Ｍｅｄｉａ Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ））を使用して測定した。
【０２４７】
Ｈ．Ｉ^１２５ＬＤＬの消失
実験群あたり２動物を試験した。Ｉ^１２５標識ＬＤＬ（Ｄａｎ Ｒａｄｅｒ、ペンシルバニア大学より恵与された）のボーラスを３０秒の期間にわたり尾静脈を通してゆっくりと注入した（動物あたり１００μｌの滅菌ＰＢＳで希釈された１，０００，０００カウントの［Ｉ^１２５］−ＬＤＬ）。注入後の時間点３分、３０分、１．５時間、３時間、６時間に後眼窩叢を介して血液サンプルを得た。血漿を全血から分離しそして１０μｌの血漿をガンマカウンターで計測した。最後に、分別（ｆｒａｃｔｉｏｎａｌ）異化速度をリポタンパク質消失データから計算した。
【０２４８】
Ｉ．肝脂質蓄積の評価
凍結肝切片のオイルレッド染色を実施して脂質蓄積を測定した。凍結肝切片を蒸留水中で手短にすすぎ、次いで無水プロピレングリコール中で２分インキュベートした。その後、切片をオイルレッド溶液（プロピレングリコール中０．５％）中で１６時間染色し、次いでマイヤーのヘマトキシリン溶液で３０秒間対染色し、そして加温グリセリンゼリー溶液中で標本にした。
【０２４９】
肝コレステロールおよびトリグリセリド含量の定量のために、肝切片をホモジェナイズしかつクロロホルム／メタノール（２：１）中で一夜インキュベートした。０．０５％Ｈ_２ＳＯ_４の添加および１０分間の遠心分離後に各サンプルの下層を収集し、２アリコートに分割しそして窒素下に乾燥した。コレステロール測定のため、第一のアリコートの乾燥された脂質をクロロホルム中１％トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００に溶解した。一旦溶解したら、溶液を窒素下に乾燥した。脂質をｄｄＨ_２Ｏに溶解しかつ３７℃で３０分間のインキュベーション後に、トータルコレステロールキット（ワコー ディアグノスティックス（Ｗａｋｏ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ））を使用して総コレステロール濃度を測定した。第二のアリコートについて、乾燥した脂質をアルコール性ＫＯＨに溶解し、そして６０℃で３０分間インキュベートした。その後１Ｍ ＭｇＣｌ_２を添加し、次いで氷上で１０分間インキュベートし、そして１４，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。最後に上清をトリグリセリドについて評価した（ワコー ディアグノスティックス（Ｗａｋｏ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ））。
【０２５０】
ＡＡＶ２／８もしくはＡＡＶ２／７キャプシドにシュードタイピングされたベクターの全部が、対照に比較して総コレステロール、ＬＤＬおよびトリグリセリドを低下させた。これらの試験ベクターは高コレステロール血症の表現型もまた用量依存性の様式で是正した。ＡＡＶ２／８およびＡＡＶ２／７マウスのプラーク面積の減少は、処置されたマウスで最初の試験（２ヶ月）で観察され、そして該効果は実験の長さ（６ヶ月）にわたって持続することが観察された。
【０２５１】
実施例１０：機能的第ＩＸ因子発現および血友病の是正
Ａ．ノックアウトマウス
機能的イヌ第ＩＸ因子（ＦＩＸ）発現を血友病Ｂマウスで評価した。ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ７もしくはＡＡＶ８のキャプシドを伴うベクターを、ＡＡＶ２ ５’ＩＴＲ−肝特異的プロモーター［ＬＳＰ］−イヌＦＩＸ−ウッドチャック肝炎後調節要素（ＷＰＲＥ）−ＡＡＶ２ ３’ＩＴＲを送達するように構築した。該ベクターは適切なキャプシドを使用してＷａｎｇら、２０００、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ２：１５４−１５８）に記述されるとおり構築した。
【０２５２】
ノックアウトマウスはＷａｎｇら、１９９７．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９４：１１５６３−１１５６６に記述されるとおり生成させた。このモデルはヒトの血友病Ｂの表現型を厳密に模倣する。
【０２５３】
多様な血清型（ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ７およびＡＡＶ８）のベクターを、５種の異なる血清型について１×１０^１１ＧＣ／マウスの用量で成体血友病Ｃ５７Ｂｌ／６マウスの肝中に単回門脈内注入として送達し、また、１群はより低用量すなわち１×１０^１０ＧＣ／マウスでのＡＡＶ８ベクターを受領した。対照群には１×１０^１１ＧＣのＡＡＶ２／８ ＴＢＧ ＬａｃＺ３を注入した。各群は５〜１０雄性および雌性マウスを含有する。マウスはベクター投与後２週間おきに採血した。
【０２５４】
１．ＥＬＩＳＡ
マウス血漿中のイヌＦＩＸ濃度は、改変を伴い本質的にはＡｘｅｌｒｏｄら、１９９０、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８７：５１７３−５１７７により記述されたとおり実施されるイヌ第ＩＸ因子に特異的なＥＬＩＳＡアッセイにより測定した。ヒツジ抗イヌ第ＩＸ因子（エンザイム リサーチ ラボラトリーズ（Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ））を一次抗体として使用し、そしてウサギ抗イヌ第ＩＸ因子（（エンザイム リサーチ ラボラトリーズ（Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ））を二次抗体として使用した。注入２週間後に開始して、ｃＦＩＸの増大された血漿レベルが全試験ベクターについて検出された。増大されたレベルは実験の長さ全体で（すなわち１２週間まで）治療的レベルで持続した。治療的レベルは正常レベルの５％すなわち約２５０ｎｇ／ｍＬであるとみなされる。
【０２５５】
最高レベルの発現は、持続性の超生理学（ｓｕｐｅｒｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ）レベルのｃＦＩＸレベル（正常レベルより１０倍より高い）を伴い、ＡＡＶ２／８（１０^１１の）およびＡＡＶ２／７構築物について観察された。ＡＡＶ２／８（１０^１１）の発現レベルはＡＡＶ２／２およびＡＡＶ２／８（１０^１０）について観察されたものよりおよそ１０倍より高かった。最低の発現レベル（とはいえなお治療的範囲より上）がＡＡＶ２／５について観察された。
【０２５６】
２．ｉｎ ｖｉｔｒｏ活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）アッセイ
ＦＩＸノックアウトマウスの血漿中での機能的第ＩＸ因子活性をｉｎ ｖｉｔｒｏ活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）アッセイにより測定した−マウス血液サンプルを１／１０容量のクエン酸緩衝液中に後眼窩叢から収集した。ａＰＴＴアッセイはＷａｎｇら、１９９７、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４：１１５６３−１１５６６により記述されたとおり実施した。
【０２５７】
全部のベクターが注入されたマウスの血漿サンプルでのａＰＴＴによる凝固時間は、注入後２週間に測定された場合に正常範囲（およそ６０秒）内であり、そして試験期間（１２週間）を通じて正常もしくは正常範囲より短い凝固時間を持続した。
【０２５８】
最低の持続した凝固時間はＡＡＶ２／８（１０^１１）およびＡＡＶ２／７を受領する動物で観察された。第１２週までに、ＡＡＶ２／２もまたＡＡＶ２／８およびＡＡＶ２／７
のものに類似の凝固時間を誘導した。しかしながらこの短縮された凝固時間はＡＡＶ２／２について第１２週まで観察されなかった一方、短縮された凝固時間（２５〜４０秒範囲で）がＡＡＶ２／８およびＡＡＶ２／７について第２週の始めに観察された。
【０２５９】
処置されたマウスの数匹から採取した肝組織での免疫組織化学染色を現在実施している。肝細胞の約７０〜８０％がＡＡＶ２／８．ｃＦＩＸベクターを注入されたマウスにおいてイヌＦＩＸについて陽性に染色される。
【０２６０】
Ｂ．血友病Ｂイヌ
Ｆ．ＩＸ遺伝子の触媒ドメイン中に一個の点突然変異（モデリング研究に基づけば該タンパク質を不安定にするようである）を有するイヌは血友病Ｂに罹る［Ｅｖａｎｓら、１９８９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８６：１００９５−１００９９］。こうしたイヌのコロニーを北カリフォルニア大学（ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ
ｏｆ Ｎｏｒｔｈ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）、チャペルヒルにて２０年以上の間維持している。これらのイヌの恒常性パラメータは十分に記述されており、そして血漿Ｆ．ＩＸ抗原の非存在、６０分を超える全血凝固時間（一方で正常イヌは６〜８分である）、および５０〜８０秒という延長された活性化部分トロンボプラスチン時間（一方で正常イヌは１３〜２８秒である）を包含する。これらのイヌは再発性自発性出血を経験する。典型的には、重大な出血エピソードは１０ｍｌ／ｋｇの正常イヌ血漿の単回静脈内注入により成功裏に管理され；ときに、出血を管理するために反復注入が必要とされる。
【０２６１】
４匹のイヌに下のスケジュールに従ってＡＡＶ．ｃＦＩＸを門脈内に注入する。第一のイヌは３．７×１０^１１ゲノムコピー（ＧＣ）／ｋｇの用量のＡＡＶ２／２．ｃＴＩＸの単回注入を受領する。第二のイヌはＡＡＶ２／２．ｃＦＩＸ（２．８×１０^１１ＧＣ／ｋｇ）の第一の注入、次いで第１１８０日にＡＡＶ２／７．ｃＦＩＸ（２．３×１０^１３ＧＣ／ｋｇ）の第二の注入を受領する。第三のイヌは４．６×１０^１２ＧＣ／ｋｇの用量のＡＡＶ２／２．ｃＦＩＸの単回注入を受領する。第四のイヌはＡＡＶ２／２．ｃＦＩＸ（２．８×１０^１２ＧＣ／ｋｇ）の注入および第９９５日にＡＡＶ２／７．ｃＦＩＸ（５×１０^１２ＧＣ／ｋｇ）の注入を受領する。
【０２６２】
血友病イヌの腹部を全身麻酔下に無菌的かつ外科的に開放し、そしてベクターの単回注入を門脈中に投与する。動物を正常イヌ血漿の静脈内投与により周術期の出血から保護する。イヌを鎮静し、挿管して全身麻酔を誘発し、そして腹部の毛を剃りかつ準備する。腹部を開放した後に脾を手術野に移動させる。脾静脈の位置を突き止めかつ縫合糸を静脈の小さな遠位切開に対し近位に緩く置く。針を迅速に静脈中に挿入し、その後縫合糸を緩めかつ５Ｆカニューレを門脈分岐近くの静脈内位置まで通す。止血を確保しかつカテーテルバルーンを膨張させた後にＰＢＳで希釈したベクターおよそ５．０ｍｌを５分間隔にわたって門脈中に注入する。ベクター注入後に生理的食塩水５．０ｍｌを注入する。その後バルーンをしぼませ、カニューレを除去しそして静脈の止血を確保する。その後脾を元の位置に戻し、出血している血管を焼灼しかつ術創を閉鎖する。動物から抜管し、外科的処置に良好に耐えさせる。血液サンプルを記述されたとおり分析する。［Ｗａｎｇら、２０００、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ２：１５４−１５８］
是正もしくは部分的是正を示す結果がＡＡＶ２／７について予期される。
【０２６３】
本明細で引用される全部の刊行物は引用することにより本明細書に組込まれる。本発明はとりわけ好ましい態様に関して記述した一方、本発明の技術思想から離れることなく改変を行い得ることが予期されるであろう。こうした改変は請求の範囲の範囲内にあることを意図している。
【図１Ａ】

【図１Ｂ】

【図１Ｃ】

【図１Ｄ】

【図１Ｅ】

【図１Ｆ】

【図１Ｇ】

【図１Ｈ】

【図１Ｉ】

【図１Ｊ】

【図１Ｋ】

【図１Ｌ】

【図１Ｍ】

【図１Ｎ】

【図１Ｏ】

【図１Ｐ】

【図１Ｑ】

【図１Ｒ】

【図１Ｓ】

【図１Ｔ】

【図１Ｕ】

【図１Ｖ】

【図１Ｗ】

【図１Ｘ】

【図１Ｙ】

【図１Ｚ】

【図１ＡＡ】

【図１ＡＢ】

【図１ＡＣ】

【図１ＡＤ】

【図１ＡＥ】

【図１ＡＦ】

【図１ＡＧ】

【図１ＡＨ】

【図１ＡＩ】

【図１ＡＪ】

【図１ＡＫ】

【図１ＡＬ】

【図１ＡＭ】

【図１ＡＮ】

【図１ＡＯ】

【図１ＡＰ】

【図１ＡＱ】

【図１ＡＲ】

【図１ＡＳ】

【図１ＡＴ】

【図１ＡＵ】

【図１ＡＶ】

【図１ＡＷ】

【図１ＡＸ】

【図１ＡＹ】

【図１ＡＺ】

【図１ＡＡＡ】

【図１ＡＡＢ】

【図１ＡＡＣ】

【図１ＡＡＤ】

【図１ＡＡＥ】

【図１ＡＡＦ】

【図１ＡＡＧ】

【図１ＡＡＨ】

【図１ＡＡＩ】

【図１ＡＡＪ】

【図１ＡＡＫ】

【図１ＡＡＬ】

【図１ＡＡＭ】

【図１ＡＡＮ】

【図１ＡＡＯ】

【図１ＡＡＰ】

【図１ＡＡＱ】

【図１ＡＡＲ】

【図１ＡＡＳ】

【図１ＡＡＴ】

【図１ＡＡＵ】

【図１ＡＡＶ】

【図１ＡＡＷ】

【図１ＡＡＸ】

【図１ＡＡＹ】

【図１ＡＡＺ】

【図１ＡＡＡＡ】

【図１ＡＡＡＢ】

【図１ＡＡＡＣ】

【図１ＡＡＡＤ】

【図１ＡＡＡＥ】

【図１ＡＡＡＦ】

【図１ＡＡＡＧ】

【図１ＡＡＡＨ】

【図１ＡＡＡＩ】

【図１ＡＡＡＪ】

【図１ＡＡＡＫ】

【図１ＡＡＡＬ】

【図１ＡＡＡＭ】

【図１ＡＡＡＮ】

【図１ＡＡＡＯ】

【図１ＡＡＡＰ】

【図１ＡＡＡＱ】

【図１ＡＡＡＲ】

【図２Ａ】

【図２Ｂ】

【図２Ｃ】

【図２Ｄ】

【図２Ｅ】

【図２Ｆ】

【図３Ａ】

【図３Ｂ】

【図３Ｃ】

【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）ＤＮＡを含有するサンプルを、ＡＡＶ核酸配列の第一の領域を特異的に増幅する第一の組のプライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を介する増幅にかける段階；
（ｂ）場合によっては、該ＤＮＡを、ＡＡＶ配列の第一の領域および第一の領域に対し５’である配列を含んでなる第二の領域を特異的に増幅する第二の組のプライマーを使用するさらなる増幅にかけて、その結果第一の領域のプライマーにより増幅されるＡＡＶ配列の５’端にアニーリングするＡＡＶ ５’伸長配列が得られる段階；
（ｃ）場合によっては、該ＤＮＡを、ＡＡＶ配列の第一の領域および第一の領域に対し３’である配列を含んでなる第三の領域を特異的に増幅する第三の組のプライマーを使用するさらなる増幅にかけて、その結果第一の領域のプライマーにより増幅されるＡＡＶ配列の３’端にアニーリングするＡＡＶ ３’伸長配列が得られる段階；
を含んでなり、
前記領域のそれぞれは最低２種のＡＡＶ血清型の核酸配列のアライメントに基づき予め決定され、かつ、前記領域のそれぞれが、該最低２種のアライメントされたＡＡＶ血清型の配列に関して、５’端の最低１８塩基対にわたって高度に保存されている核酸配列、場合によっては中央の可変配列、および該領域の配列の３’端の最低１８塩基対にわたって高度に保存されている配列を含んでなり；そして
プライマーの組のそれぞれが５’プライマーおよび３’プライマーよりなり；
増幅された配列の存在がサンプル中でのＡＡＶの存在を示す、
サンプル中のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）配列の検出方法。
【請求項２】
段階（ｂ）および（ｃ）が実施され、かつ、
（ｄ）増幅された配列を使用して部分的および／もしくは完全なＡＡＶ遺伝子を含んでなる配列を構築してそれによりサンプルからＡＡＶ遺伝子配列を単離する段階
をさらに含んでなる、請求項１記載の方法。
【請求項３】
第一の領域がＡＡＶキャプシド中にあり、第二の領域がｒｅｐ遺伝子の３’端まで伸長し、そして第三の領域がＡＡＶ ３’ＩＴＲの５’まで伸長し、その結果段階（ｄ）が完全なＡＡＶキャプシド遺伝子を含んでなるＡＡＶ遺伝子配列の構築を可能にする、請求項２記載の方法。
【請求項４】
該ＤＮＡを、第三の領域に対し５’に伸長する第四の領域を特異的に増幅する第四の組のプライマーを用いる増幅にかける段階をさらに含んでなる、請求項２記載の方法。
【請求項５】
第四の領域がＡＡＶ ５’ＩＴＲの３’まで伸長して、その結果段階（ｄ）が完全なＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を含んでなるＡＡＶ遺伝子配列の構築を可能にする、請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記サンプルが細胞もしくはゲノムＤＮＡを含んでなる、請求項１もしくは請求項２記載の方法。
【請求項７】
前記ＤＮＡが、細胞、細胞培養物、組織、組織培養物および生物学的液体よりなる群から抽出された、請求項１もしくは請求項２記載の方法。
【請求項８】
第一の領域が長さ約２５０塩基対である、請求項１もしくは請求項２記載の方法。
【請求項９】
第一の領域が、該領域の５’および／もしくは３’端の最低約２５塩基対にわたって高度に保存されている、請求項１もしくは２記載の方法。
【請求項１０】
第一の領域が、該領域の５’および／もしくは３’端の最低約３０塩基対にわたって高度に保存されている、請求項１もしくは２記載の方法。
【請求項１１】
第一の領域の高度に保存されている配列が、アライメントされたＡＡＶ血清型のあいだで該領域の５’および／もしくは３’端で最低８０％の同一性を有する、請求項１もしくは請求項２記載の方法。
【請求項１２】
第一の領域の高度に保存されている配列が、アライメントされたＡＡＶ血清型のあいだで該領域の５’および／もしくは３’端で最低９０％の同一性を有する、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
第一の領域の中央の可変配列が、アライメントされたＡＡＶ血清型のあいだで７０％未満の同一性を有する、請求項１もしくは請求項２記載の方法。
【請求項１４】
第一の領域が、ＡＡＶ １、配列番号６の約ｂｐ２８００ないし約３２００および他のＡＡＶ血清型中の対応する塩基対にわたる、請求項１もしくは請求項２記載の方法。
【請求項１５】
第一の領域が、ＡＡＶ １、配列番号６のｂｐ２８８６ないし約３１４３ｂｐにわたる２５７ｂｐおよび他のＡＡＶ血清型中の対応する塩基対である、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
プライマーがＡＶ１ｎｓおよびＡＶ２ｃａｓである、請求項１記載の方法。
【請求項１７】
（ａ）ＡＡＶ１、配列番号１のｂｐ２８８６ないし３１４３の全部もしくは一部分にわたるＡＡＶ配列および他のＡＡＶ血清型の対応する領域を含んでなるＤＮＡ分子を含有するサンプルの酵素消化分析を得る段階；ならびに
（ｂ）サンプルからの酵素消化分析を１種もしくはそれ以上のＡＡＶ血清型の対応する領域についての酵素消化分析と比較して、それにより該サンプル中のＡＡＶ配列を該１種もしくはそれ以上のＡＡＶ血清型の１つまたは未知の血清型からのものであると同定する段階
を含んでなる、サンプル中のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）配列の血清型の既知もしくは未知としての同定方法。
【請求項１８】
ＡＡＶ配列が請求項１記載の方法により得られたものである請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
（ａ）ＡＡＶ核酸配列の第一の領域を特異的に増幅する第一の組のプライマー；
（ｂ）場合によっては、第一の領域のプライマーにより増幅されるＡＡＶ配列の５’端にアニーリングするＡＡＶ ５’伸長配列が得られるような、ＡＡＶ配列の第一の領域および該第一の領域に対し５’である配列を含んでなるＡＡＶ核酸配列の第二の領域に特異的な第二の組のプライマー；
（ｃ）場合によっては、第一の領域のプライマーにより増幅されるＡＡＶ配列の３’端にアニーリングするＡＡＶ ３’伸長配列が得られるような、ＡＡＶ配列の第一の領域および該第一の領域に対し３’である配列を含んでなる第三の領域を特異的に増幅する第三の組のプライマー
を含んでなり、
前記領域のそれぞれは最低２種のＡＡＶ血清型の核酸配列のアライメントに基づき予め決定され、かつ、前記領域のそれぞれが、該最低２種のアライメントされたＡＡＶ血清型の配列に関して、５’端の最低１８塩基対にわたって高度に保存されている核酸配列、場合によっては中央の可変配列、および該領域の配列の３’端の最低１８塩基対にわたって高度に保存されている配列を含んでなり、
プライマーの組のそれぞれが５’プライマーおよび３’プライマーよりなる、
サンプル中の未知のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の存在を検出するための診断キット。
【請求項２０】
（ａ）前記ＡＡＶにヘルパー機能を提供するウイルスで細胞を感染させる段階；（ｂ）ＡＡＶを含有する感染性クローンを単離する段階；（ｃ）単離されたＡＡＶを配列決定する段階；ならびに（ｄ）単離されたＡＡＶの配列を既知のＡＡＶの血清型と比較してそれにより単離されたＡＡＶおよび既知のＡＡＶ血清型の配列中の差異が新規ＡＡＶの存在を示す段階、を含んでなる、細胞からの新規アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の単離方法。
【請求項２１】
前記ウイルスがアデノウイルスである、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
前記アデノウイルスがヒトもしくは非ヒト霊長類起源のものである、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
請求項２もしくは請求項２０記載の方法により同定される新規アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）血清型。
【請求項２４】
ＡＡＶ７、配列番号２のアミノ酸１ないし７３７；Ｃ１、配列番号６０；Ｃ２、配列番号６１；Ｃ５、配列番号６２；Ａ３−３、配列番号６６；Ａ３−７、配列番号６７；Ａ３−４、配列番号６８；Ａ３−５、配列番号６９；３．３ｂ、配列番号６２；２２３．４、配列番号７３；２２３−５、配列番号７４；２２３−１０、配列番号７５；２２３−２、配列番号７６；２２３−７、配列番号７７；２２３−６、配列番号７８；４４−１、配列番号７９；４４−５、配列番号８０；４４−２、配列番号８１；４２−１５、配列番号８４；４２−８、配列番号８５；４２−１３、配列番号８６；４２−３Ａ、配列番号８７；４２−４、配列番号８８；４２−５Ａ、配列番号８９；４２−１Ｂ、配列番号９０；４２−５Ｂ、配列番号９１；４３−１、配列番号９２；４３−１２、配列番号９３；４３−５、配列番号９４；４３−２１、配列番号９６；４３−２５、配列番号９７；４３−２０、配列番号９９；２４．１、配列番号１０１；４２．２、配列番号１０２；７．２、配列番号１０３；２７．３、配列番号１０４；１６．３、配列番号１０５；４２．１０、配列番号１０６；４３−３Ｂ、配列番号１０７；４２−１１、配列番号１０８；Ｆ１、配列番号１０９；Ｆ５、配列番号１１０；Ｆ３、配列番号１１１；４２−６Ｂ、配列番号１１２；および４２−１２、配列番号１１３
よりなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＡＡＶキャプシドを含んでなる単離されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）。
【請求項２５】
ｖｐ２キャプシドタンパク質、アミノ酸（ａａ）１３８ないし７３７；
ｖｐ３キャプシドタンパク質、ａａ２０３ないし７３７；
超可変領域（ＨＶＲ）１から１２：ａａ１４６ないし１５２；ａａ１８２ないし１８７；ａａ２６２ないし２６４；ａａ２６３ないし２６６；ａａ２６３ないし２６６；ａａ３８１ないし３８３；ａａ３８３ないし３８５；ａａ４５０ないし４７４；ａａ４５１ないし４７５；ａａ４９０ないし４９５；ａａ４９１ないし４９６；ａａ５００ないし５０４；ａａ５０１ないし５０５；ａａ５１４ないし５２２；ａａ５３３ないし５５４；ａａ５３４ないし５５５；ａａ５８１ないし５９４；ａａ５８３ないし５９６；ａａ６５８ないし６６７；ａａ６６０ないし６６９；およびａａ７０５ないし７１９；ａａ７０７ないし７７２；
ａａ２４〜４２、ａａ２５〜２８；ａａ８１〜８５；ａａ１３３ないし１６５；ａａ１３４〜１６５；ａａ１３７ないし１４３；ａａ１５４ないし１５６；ａａ１９４ないし２０８；ａａ２６１ないし２７４；ａａ２６２ないし２７４；ａａ１７１ないし１７３；ａａ４１３ないし４１７；ａａ４４９ないし４７８；ａａ４９４ないし５２５；ａａ５３４ないし５７１；ａａ５８１ないし６０１；ａａ６６０ないし６７１；ａａ７０９ないし７２
３；ならびに
ａａ１ないし１８４；ａａ１９９ないし２５９；ａａ２７４ないし４４６；ａａ６０３ないし６５９；ａａ６７０ないし７０６；ａａ７２４ないし７３６；ａａ１８５ないし１９８；ａａ２６０ないし２７３；ａａ４４７ないし４７７；ａａ４９５ないし６０２；ａａ６６０ないし６６９；ならびにａａ７０７ないし７２３、
よりなる群から選択され、
ここで該アミノ酸番号は、ＡＡＶ７キャプシド、配列番号２、ならびに対応するＣ１、配列番号６０；Ｃ２、配列番号６１；Ｃ５、配列番号６２；Ａ３−３、配列番号６６；Ａ３−７、配列番号６７；Ａ３−４、配列番号６８；Ａ３−５、配列番号６９；３．３ｂ、配列番号６２；２２３．４、配列番号７３；２２３−５、配列番号７４；２２３−１０、配列番号７５；２２３−２、配列番号７６；２２３−７、配列番号７７；２２３−６、配列番号７８；４４−１、配列番号７９；４４−５、配列番号８０；４４−２、配列番号８１；４２−１５、配列番号８４；４２−８、配列番号８５；４２−１３、配列番号８６；４２−３Ａ、配列番号８７；４２−４、配列番号８８；４２−５Ａ、配列番号８９；４２−１Ｂ、配列番号９０；４２−５Ｂ、配列番号９１；４３−１、配列番号９２；４３−１２、配列番号９３；４３−５、配列番号９４；４３−２１、配列番号９６；４３−２５、配列番号９７；４３−２０、配列番号９９；２４．１、配列番号１０１；４２．２、配列番号１０２；７．２、配列番号１０３；２７．３、配列番号１０４；１６．３、配列番号１０５；４２．１０、配列番号１０６；４２−３Ｂ、配列番号１０７；４２−１１、配列番号１０８；Ｆ１、配列番号１０９；Ｆ５、配列番号１１０；Ｆ３、配列番号１１１；４２−６Ｂ、配列番号１１２；および４２−１２、配列番号１１３のキャプシド中の領域のものである、
ＡＡＶキャプシドタンパク質のフラグメントを含んでなるタンパク質。
【請求項２６】
請求項２５記載のタンパク質フラグメントの１種もしくはそれ以上を含んでなる人工的アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドタンパク質。
【請求項２７】
請求項２６記載の人工的キャプシドを含んでなる組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）。
【請求項２８】
請求項２５ないし２６記載のタンパク質をコードする核酸配列を含んでなる分子。
【請求項２９】
ＡＡＶ７、配列番号２のアミノ酸１ないし７３７；Ｃ１、配列番号６０；Ｃ２、配列番号６１；Ｃ５、配列番号６２；Ａ３−３、配列番号６６；Ａ３−７、配列番号６７；Ａ３−４、配列番号６８；Ａ３−５、配列番号６９；３．３ｂ、配列番号６２；２２３．４、配列番号７３；２２３−５、配列番号７４；２２３−１０、配列番号７５；２２３−２、配列番号７６；２２３−７、配列番号７７；２２３−６、配列番号７８；４４−１、配列番号７９；４４−５、配列番号８０；４４−２、配列番号８１；４２−１５、配列番号８４；４２−８、配列番号８５；４２−１３、配列番号８６；４２−３Ａ、配列番号８７；４２−４、配列番号８８；４２−５Ａ、配列番号８９；４２−１Ｂ、配列番号９０；４２−５Ｂ、配列番号９１；４３−１、配列番号９２；４３−１２、配列番号９３；４３−５、配列番号９４；４３−２１、配列番号９６；４３−２５、配列番号９７；４３−２０、配列番号９９；２４．１、配列番号１０１；４２．２、配列番号１０２；７．２、配列番号１０３；２７．３、配列番号１０４；１６．３、配列番号１０５；４２．１０、配列番号１０６；４３−３Ｂ、配列番号１０７；４２−１１、配列番号１０８；Ｆ１、配列番号１０９；Ｆ５、配列番号１１０；Ｆ３、配列番号１１１；４２−６Ｂ、配列番号１１２；および４２−１２、配列番号１１３よりなる群から選択されるアミノ酸配列を有する新規アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）血清型キャプシドタンパク質をコードする核酸配列を含んでなる分子。
【請求項３０】
ＡＡＶ５、配列番号２；４２−２、配列番号９；４２−８、配列番号２７；４２−１５、配列番号２８；４２−５ｂ、配列番号２９；４２−１ｂ、配列番号３０；４２−１３、配列番号３１；４２−３ａ、配列番号３２；４２−４、配列番号３３；４２−５ａ、配列番号３４；４２−１０、配列番号３５；４２−３ｂ、配列番号３６；４２−１１、配列番号３７；４２−６ｂ、配列番号３８；４３−１、配列番号３９；４３−５、配列番号４０；４３−１２、配列番号４１；４３−２０、配列番号４２；４３−２１、配列番号４３；４３−２３、配列番号４４；４３−２５、配列番号４５；４４．１、配列番号４７；４４．５、配列番号４７；２２３．１０、配列番号４８；２２３．２、配列番号４９；２２３．４、配列番号５０；２２３．５、配列番号５１；２２３．６、配列番号５２；２２３．７、配列番号５３；Ａ３．４、配列番号５４；Ａ３．５、配列番号５５；Ａ３．７、配列番号５６；Ａ３．３、配列番号５７；４２．１２、配列番号５８；４４．２、配列番号５９；ＡＡＶ１０、配列番号１１７；ＡＡＶ１１、配列番号１１８；ＡＡＶ１２、配列番号１１９；Ａ３．１、配列番号１２０；およびＨ６、配列番号２５よりなる群から選択される、新規アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）血清型キャプシドタンパク質をコードする核酸配列を含んでなる分子。
【請求項３１】
ｖｐ１、ｎｔ８２５ないし３０４９；
ｖｐ２、ｎｔ１２３４ないし３０４９；
ｖｐ ３、ｎｔ１４３４ないし３０４９；
ｎｔ４６８ないし３０９０；および
ｎｔ７２５ないし３０９０
よりなる群から選択され、
該ヌクレオチド番号は、ＡＡＶ７、配列番号１のものであり、かつ、４２−２、配列番号９；４２−８、配列番号２７；４２−１５、配列番号２８；４２−５ｂ、配列番号２９；４２−１ｂ、配列番号３０；４２−１３、配列番号３１；４２−３ａ、配列番号３２；４２−４、配列番号３３；４２−５ａ、配列番号３４；４２−１０、配列番号３５；４２−３ｂ、配列番号３６；４２−１１、配列番号３７；４２−６ｂ、配列番号３８；４３−１、配列番号３９；４３−５、配列番号４０；４３−１２、配列番号４１；４３−２０、配列番号４２；４３−２１、配列番号４３；４３−２３、配列番号４４；４３−２５、配列番号４５；４４．１、配列番号４７；４４．５、配列番号４７；２２３．１０、配列番号４８；２２３．２、配列番号４９；２２３．４、配列番号５０；２２３．５、配列番号５１；２２３．６、配列番号５２；２２３．７、配列番号５３；Ａ３．４、配列番号５４；Ａ３．５、配列番号５５；Ａ３．７、配列番号５６；Ａ３．３、配列番号５７；４２．１２、配列番号５８；４４．２、配列番号５９；ＡＡＶ１０、配列番号１１７；ＡＡＶ１１、配列番号１１８；ＡＡＶ１２、配列番号１１９、Ａ３．１、配列番号１２０；およびＨ６、配列番号２５中の配列に対応する、
アデノ随伴ウイルスキャプシドタンパク質のフラグメントをコードする核酸配列を含んでなる分子。
【請求項３２】
前記分子がプラスミドである、請求項２６もしくは請求項２８ないし３１記載の分子。
【請求項３３】
前記分子が機能的ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子をさらに含んでなる、請求項２６もしくは請求項２８ないし３１記載の分子。
【請求項３４】
前記核酸配列がＡＡＶ７配列、配列番号１である、請求項３０記載の分子。
【請求項３５】
（ａ）アデノ随伴ウイルスキャプシドをコードする請求項２６もしくは請求項２８ないし３１のいずれか記載の分子；（ｂ）機能的ｒｅｐ遺伝子；（ｃ）ＡＡＶ逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）およびトランスジーンを含んでなるミニ遺伝子；ならびに（ｄ）ＡＡＶキャプシドタンパク質中へのミニ遺伝子のパッケージングを可能にするのに十分なヘルパー
機能、を含有する宿主細胞を培養する段階を含んでなる、ＡＡＶ血清型キャプシドを含んでなる組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の生成方法。
【請求項３６】
請求項２４記載のアデノ随伴ウイルスまたは請求項２６もしくは請求項２８ないし３１のいずれか記載の分子でトランスフェクトされた宿主細胞。
【請求項３７】
請求項２４もしくは請求項２７記載のＡＡＶおよび生理学的に適合性の担体を含んでなる組成物。
【請求項３８】
請求項２６もしくは請求項２８ないし３１のいずれか記載の分子および生理学的に適合性の担体を含んでなる組成物。
【請求項３９】
細胞を請求項２４もしくは請求項２７記載のＡＡＶと接触させる段階を含んでなり、前記ｒＡＡＶがトランスジーンを含んでなる、細胞へのトランスジーンの送達方法。
【請求項４０】
配列番号１のヌクレオチド（ｎｔ）１ないし１０７；
配列番号１のｎｔ１０７ないし２２１５；
配列番号１のｎｔ３３４ないし２２１５；
配列番号１のｎｔ２２２２ないし４４３５；
配列番号１のｎｔ２６３３ないし４４３５；
配列番号１のｎｔ２８３１ないし４４３５；および
配列番号１のｎｔ４７０４ないし４７２１
を含んでなる、ヘテロロガスなアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）血清型７核酸配列を含んでなる分子。
【請求項４１】
配列番号３のアミノ酸（ａａ）１ないし６２３、ａａ１ないし１７１；ａａ１７２ないし３７２、ａａ３７３ないし４４４およびａａ４４５ないし６２３
よりなる群から選択される、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）血清型７のｒｅｐタンパク質もしくはそのフラグメントをコードする分子。
【請求項４２】
請求項４０もしくは４１記載の分子を含有する宿主細胞。

【公開番号】特開２００９−１９５２３７（Ｐ２００９−１９５２３７Ａ）
【公開日】平成２１年９月３日（２００９．９．３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１０２９８８（Ｐ２００９−１０２９８８）
【出願日】平成２１年４月２１日（２００９．４．２１）
【分割の表示】特願２００３−５４４２１１（Ｐ２００３−５４４２１１）の分割
【原出願日】平成１４年１１月１２日（２００２．１１．１２）
【出願人】（５０２４０９８１３）ザ・トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア (37)
【Ｆターム（参考）】