アポトーシス誘導能を有する組成物
【課題】 安全性が高く、ガン細胞増殖抑制効果の強い、アポトーシス誘導組成物と、該組成物を含有する、アポトーシス誘導能を有する飲食品と、ガンの進行の抑制能及び／又はガンの発生の予防能を有する、アポトーシス誘導能を有する組成物と、を提供すること。
【解決手段】 酢酸菌体の脂溶性有機溶剤抽出物を有効成分として含有する、アポトーシス誘導能を有する組成物と、前記組成物を含有する、アポトーシス誘導能を有する飲食品を提供する。
【解決手段】 酢酸菌体の脂溶性有機溶剤抽出物を有効成分として含有する、アポトーシス誘導能を有する組成物と、前記組成物を含有する、アポトーシス誘導能を有する飲食品を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アポトーシス誘導能（誘導作用）を有する組成物に関し、さらに詳細には、酢酸菌体の脂溶性有機溶媒抽出物を有効成分とする、アポトーシス誘導能を有する組成物と、前記アポトーシス誘導能を有する組成物を含有する、アポトーシス誘導能を有する飲食品と、に関する。
【背景技術】
【０００２】
ガンは、男女ともに死亡数が戦後増加し続け、２００４年のガン死亡数は、１９６０年の３倍以上、１９８０年の約２倍となっており、現代人の生活習慣病のひとつとして、非常に問題となっている。そのため研究が盛んに行われているが、抗ガン剤として使用されている医薬品は、吐き気や、脱毛、下痢などの様々な副作用があるものが多く、副作用のない治療薬の開発が望まれている。
【０００３】
抗ガン活性を示す物質の中には、培養細胞でアポトーシスを誘導することが知られており、アポトーシス誘導がガン抑制に結びつくと考えられている。アポトーシス誘導による抗ガン作用は、ネクローシス（壊死）のように周囲の細胞や組織に炎症を起こさせないため、アポトーシスを誘導する物質を用いてガン細胞を細胞死に誘導することは、有効にガン細胞の増殖を抑制すると考えられる。また、アポトーシス誘導能を有する物質を飲食品として日常的に摂取することができれば、ガンの予防につながることが期待される。
また、アルツハイマー症のような神経疾患などにもアポトーシスは関係していることから、これらの疾患の予防につながることも期待される。
これまでに種々のアポトーシス誘導物質が見出されてきているが、物質の安全性を考えると、食品中に存在する成分や食品製造に使用されている微生物が含有する成分であればその懸念が少なく、特に歴史的に食品製造に長く使用されてきた醸造微生物は有望と考えられる。
【０００４】
醸造微生物の中で、特に酢酸菌は、古くから食酢製造に用いられており、ナタデココ、紅茶きのこなどの製造にも使用されており、またヨーロッパの伝統食であるカスピ海ヨーグルトにおいても発酵に関与し、ヨーグルト中に存在していることから、歴史的に安全性が高いことが知られており、酢酸菌を利用することが注目されている。
酢酸菌を使用して製造した醸造酢にアポトーシス誘導活性物質が含まれていることが知られている。
例えば、酢酸菌体を除去した黒酢の酢酸エチルで抽出することによって得られる抗酸化組成物がガン細胞増殖抑制効果を示すことが知られており（例えば、特許文献１参照）、アポトーシス誘導能を有する可能性が示唆されている（例えば、非特許文献１参照）。
しかしながら、この効果は、ジヒドロフェルラ酸及びジヒドロシナピンによるものであることが明らかにされており、いずれも黒酢原料に由来する物質とされ、酢酸菌体に由来するものではない。
また、サトウキビ酢を吸着クロマトグラフィーに供し、１００％メタノールで溶出される画分にアポトーシスを誘導する活性が見出されているが（例えば、非特許文献２参照）、前記黒酢の場合と同様に、特定の原料を使用したことによって見出された活性であり、アポトーシスの誘導能も低いものであった。
【０００５】
一方、酢酸菌に属する微生物またはその菌体内酵素産生物を有効成分とする抗腫瘍剤が開示されており（例えば、特許文献２参照）、ガン細胞のアポトーシス誘導活性が見出されているが、実際には菌体を除去したろ過液に見出された活性であり、さらに該活性の本体はＦ−２７０２と命名された水溶性の物質であり、菌体成分というよりは菌体代謝産物とすべきものであり、また、もともと抗かび物質として発見された物質であるため、副作用の恐れがあった。
【０００６】
上記以外にも、酢酸菌体或いは酢酸菌菌体破砕物や細胞膜画分や水溶性画分に抗腫瘍性が見出されているが（例えば、特許文献３〜７参照）、免疫系を介しての抗腫瘍性であると推定され、ガン細胞特異的ではなかった。また、夾雑物を含むため十分な効果がなく、投与量も多量になるため摂取者の負担も大きく、夾雑蛋白質等によって免疫応答が引き起こされるため、発熱などの副作用の懸念があった。
【０００７】
このように、醸造酢や酢酸菌分泌物において、アポトーシス誘導活性を有する物質が知られているが、いずれもその効果は充分満足できるものではなかった。
即ち、安全性が高く、より効果の強いガン細胞のアポトーシスを誘導する組成物の開発が求められていた。
【０００８】
【非特許文献１】「ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・クリニカル・キャンサー・リサーチ」（Ｊ. Ｅｘｐ．Ｃｌｉｎ. Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．）２３巻，６９頁〜７５頁（２００４年）
【非特許文献２】「九州沖縄農業研究センターにおける最近の主要研究成果 第７集 平成１６年」，１４頁（２００４年）
【特許文献１】特開２００３−９５９７６号公報
【特許文献２】特開２００１−９７８６９号公報
【特許文献３】特開昭５７−７０８２１号公報
【特許文献４】特開昭５７−７０８２２号公報
【特許文献５】特開昭５７−１４４２２０号公報
【特許文献６】特開昭５７−１４４２２１号公報
【特許文献７】特開昭５８−１８０４２６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、安全性が高く、ガン細胞増殖抑制効果の強い、アポトーシス誘導組成物と、該組成物を含有する、アポトーシス誘導能を有する飲食品と、ガンの進行の抑制能及び／又はガンの発生の予防能を有する、アポトーシス誘導能を有する組成物と、を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記課題に鑑み、本発明者らは、食品製造に古来より使用されており、安全性が高いことが認知されている酢酸菌の菌体について、従来、全く検討されていなかった脂溶性物質に着目し、有機溶剤で抽出した脂溶性抽出物に、アポトーシス誘導能があることを見出し、さらに、アポトーシス誘導能を有する脂溶性抽出物にはガン細胞の増殖抑制活性があることを見出した。
また、前記脂溶性抽出物を有機溶剤で抽出する方法において、特定の有機溶剤を使用して抽出した脂溶性組成物が有効であること、さらに抽出した脂溶性抽出物を特定の方法で分離精製した場合に、特定の画分に高いガン細胞の増殖抑制活性があることを見出した。
加えて、前記脂溶性の有機溶剤抽出物のアポトーシス誘導活性、さらにはガン細胞の増殖抑制活性を有する組成物を飲食品に応用する方法を見出した。
本発明は、かかる知見に基づいて完成されたものである。
【００１１】
即ち、本発明は、次の（１）〜（９）に関する。
（１）酢酸菌体の脂溶性有機溶剤抽出物を有効成分として含有する、アポトーシス誘導能を有する組成物。
（２）脂溶性有機溶剤抽出物が、酢酸菌体のアセトン抽出物である、（１）に記載のアポトーシス誘導能を有する組成物。
（３）脂溶性有機溶剤抽出物が、前記酢酸菌体のアセトン抽出物を、さらに酢酸エチルで抽出した抽出物である、（２）に記載のアポトーシス誘導能を有する組成物。
（４）脂溶性有機溶剤抽出物が、前記アセトン抽出物又は前記酢酸エチル抽出物を、さらにシリカゲルに吸着し、クロロホルム及びメタノールの容量比が、クロロホルム：メタノール＝９９：１〜８１：１９である溶液を用いて溶出させて得られる画分である、（２）又は（３）に記載のアポトーシス誘導能を有する組成物。
（５）脂溶性有機溶剤抽出物が、クロロホルム及びメタノールの容量比が、クロロホルム：メタノール＝９５：５〜９０：１０である溶液を用いて溶出させて得られる画分である、（４）に記載のアポトーシス誘導能を有する組成物。
（６）（１）〜（５）のいずれかに記載のアポトーシス誘導能を有する組成物を含有する、アポトーシス誘導能を有する飲食品。
（７）飲食品が食酢である、（６）に記載のアポトーシス誘導能を有する飲食品。
（８）（１）〜（５）のいずれかに記載のアポトーシス誘導組成物を添加することを特徴とする、アポトーシス誘導能を有する飲食品の製造方法。
（９）ガンの進行の抑制能及び／又はガンの発生の予防能を有する、（１）〜（５）のいずれかに記載のガン細胞のアポトーシス誘導能を有する組成物。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、酢酸菌体の脂溶性有機溶剤抽出物を有効成分として含有する、安全性が高く、強いガン細胞増殖抑制効果を示す、アポトーシス誘導能を有する組成物が提供される。
また、本発明によれば、該組成物を含有する、アポトーシス誘導能を有する飲食品が提供され、さらに、ガンの進行の抑制能及び／又はガンの発生の予防能を有する、アポトーシス誘導能を有する組成物が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明は、酢酸菌体の脂溶性有機溶剤抽出物を有効成分として含有する、アポトーシス誘導組成物と、該組成物を含有する、アポトーシス誘導能を有する飲食品と、ガンの進行の抑制能及び／又はガンの発生の予防能を有する、アポトーシス誘導能を有する組成物と、に関するものである。
【００１４】
本発明において用いられる酢酸菌としては、酢酸菌であれば特に限定はないが、例えば、グルコンアセトバクター（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属、アセトバクター（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属、グルコノバクター（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ）属、アサイア（Ａｓａｉａ）属、アシドモナス（Ａｃｉｄｏｍｏｎａｓ）属などに属する酢酸菌が例示される。
【００１５】
グルコンアセトバクター（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属の酢酸菌としては、グルコンアセトバクター・ザイリナス（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｘｙｌｉｎｕｓ）、グルコンアセトバクター・ハンゼニイ（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｈａｎｓｅｎｉｉ）、グルコンアセトバクター・ジアゾトロフィカス（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）、グルコンアセトバクター・インタメデイウス（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ）、グルコンアセトバクター・サッカリ（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｓａｃｃｈａｒｉ）などが例示される。
【００１６】
アセトバクター（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属の酢酸菌としては、アセトバクター・トロピカリス（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、アセトバクター・インドネシエンシス（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｉｎｄｏｎｅｓｉｅｎｓｉｓ）、アセトバクター・シジギイ（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｓｙｚｙｇｉｉ）、アセトバクター・シビノンゲンシス（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃｉｂｉｎｏｎｇｅｎｓｉｓ）、アセトバクター・オリエンタリス（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）、アセトバクター・パスツリアヌス（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｓ）、アセトバクター・オルレアネンシス（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｏｒｌｅａｎｅｎｓｉｓ）、アセトバクター・ロバニエンシス（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｌｏｖａｎｉｅｎｓｉｓ）、アセトバクター・アセチ（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ａｃｅｔｉ）、アセトバクター・ポモラム（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｐｏｍｏｒｕｍ）などが例示される。
【００１７】
また、グルコノバクター（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ）属としては、グルコノバクター・フラトウリ（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｆｒａｔｅｕｒｉｉ）、グルコノバクター・セリナス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｃｅｒｉｎｕｓ）などが例示される。
【００１８】
さらに、アサイア（Ａｓａｉａ）属の酢酸菌としては、アサイア・ボゴレンシス（Ａｓａｉａ ｂｏｇｏｒｅｎｓｉｓ）、アサイア・シアメンシス（Ａｓａｉａ ｓｉａｍｅｎｓｉｓ）などが例示される。
【００１９】
また、アシドモナス（Ａｃｉｄｏｍｏｎａｓ）属の酢酸菌は、アシドモナス・メタノリカ（Ａｃｉｄｏｍｏｎａｓ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）が例示される。
【００２０】
さらに、酢酸菌としては、上記の他、食酢製造やヨーグルトなどの発酵食品に用いられている酢酸菌や、自然界より分離されたもの、また、既存の微生物保存機関に保存されていて分譲可能な保存菌株などが適宜利用可能である。
なお、上記酢酸菌は、単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて使用してもよいが、具体的には、グルコンアセトバクター・ザイリナスを用いることが好ましく、特には、グルコンアセトバクター・ザイリナス ＮＢＲＣ１５２３７株を用いることがさらに好ましい。
【００２１】
本発明に用いる酢酸菌の培養は通常の方法で行えばよく、生育可能な培地及び培養条件であれば、特に限定はなく、得られた培養液をろ過や遠心分離などの一般的な方法で固液分離して菌体を得る。
具体的には、培地としては、炭素源、窒素源、無機物、微量栄養源等、使用する菌株が生育するのに必要な成分を含有していれば特にその組成に限定はなく、炭素源としてはグルコースをはじめ各種炭水化物が用いられるが、特にグルコースが好適である。窒素源としては、酵母エキスやペプトンなどが使用されるが、酵母エキスやペプトンは無機栄養物や微量栄養源も含有することから、好適に使用される。培地のｐＨは通常２．５〜６．５の範囲である。培地としては、エタノールを含有する酢酸発酵用の培地も好適に使用することができる。培養方法は、静置培養、振とう培養、通気攪拌培養等の好気的な条件で培養することが必要で、培養温度は、通常は２５〜３５℃にて、１日〜２１日間培養する。培養終了後、固液分離することで、本発明に用いる酢酸菌体を得ることができる。
また、食酢製造における酢酸発酵工程を終了後、固液分離等によって除去され、廃棄されている菌体も使用することができる。
【００２２】
本発明において、酢酸菌体からアポトーシス誘導能を有する脂溶性有機溶剤抽出物を製造するには、例えば、酢酸菌体を破砕した後、脂溶性有機溶剤溶液で抽出することによって行うことができる。
【００２３】
本発明の原料である酢酸菌体は、上記の固液分離した酢酸菌体をそのまま用いてもよいが、凍結乾燥機などを用いて乾燥させた、乾燥菌体を用いることが望ましい。
酢酸菌体の破砕は、超音波破砕処理、高圧ホモジナイザー処理、圧力式細胞破砕処理などにより行うことができる。
具体的な酢酸菌体の破砕方法としては、原料として用いる酢酸菌体の乾燥質量に対して、１〜１００質量倍、好ましくは２０質量倍程度（例えば、乾燥菌体１ｋｇに対して水２０Ｌ程度）の水で懸濁し、フレンチプレス圧力式細胞破砕機を用いて、５００〜５０，０００ｐｓｉ、好ましくは１０，０００〜２０，０００ｐｓｉ程度の破砕圧力で、１〜３回破砕する方法が挙げられ、これによって、次工程の脂溶性有機溶剤抽出に用いることのできる、酢酸菌体破砕物を得ることができる。
【００２４】
なお、上記工程は、酢酸菌体を破砕しない方法で行ってもよい。
例えば、上記の固液分離した酢酸菌体を凍結乾燥し、この凍結乾燥菌体に対して、エタノールを加え、ソックスレー抽出器を用いて加熱還流し、凍結乾燥機，減圧乾燥機，エバポレーターなど、好ましくはエバポレーターを用いて濃縮乾固させることによって、次工程の脂溶性有機溶剤抽出に用いることのできる酢酸菌体エタノール抽出濃縮乾固物を得ることができる。
【００２５】
本発明で使用される脂溶性有機溶剤としては、具体的には、アセトン，酢酸エチル，プロパノール，イソプルパノール，ブタノールなどのアルコール類、酢酸メチル，酢酸エチルなどの脂肪族カルボン酸エステル、その他アセトンなどの有機溶剤又はそれらを組み合わせた溶剤、或いはそれらを含有する水溶液と定義される。
【００２６】
本発明では、上記脂溶性有機溶剤のうちの１種を単独で、もしくは２種以上を混合して用いることができ、常法に従って抽出することで、目的とするアポトーシス誘導能を有する組成物を得ることができる。好ましくは、アセトンを単独、より好ましくは、アセトンで抽出した後、酢酸エチルを用い、以下に記載の方法で抽出を行うことが望ましい。
【００２７】
上記工程で得られた酢酸菌体破砕物が、細胞破砕処理などによって、水又は溶液に懸濁されたものである場合、脂溶性有機溶剤の添加量は、酢酸菌体破砕物を含む溶液量の１質量倍以上、好ましくは４〜９０質量倍程度であることが望ましい。
なお、この場合の脂溶性有機溶剤の添加量が、１倍量より少ない場合、夾雑物により分離ができなかったり、抽出効率が低下するため好ましくない。
【００２８】
一方、上記工程で得られた酢酸菌体の破砕物が乾固物の場合、もしくは酢酸菌体エタノール粗抽出濃縮乾固物である場合、脂溶性有機溶剤の添加量は、原料として用いた酢酸菌体の乾燥質量に対して、１質量倍以上、好ましくは３〜３２質量倍（例えば、アセトンを用いる場合、乾燥菌体１ｋｇに対して、アセトン（比重０．７９）３．８〜４１Ｌ）であることが望ましい。
なお、この場合の脂溶性有機溶剤の添加量が、１質量倍より少ない場合、夾雑物により分離ができなかったり、抽出効率が低下するため好ましくない。
【００２９】
本工程の脂溶性有機溶剤による抽出は、前記酢酸菌体の破砕物もしくは酢酸菌体エタノール粗抽出濃縮乾固物と脂溶性有機溶剤とをよく混合し、０．１〜１０時間の攪拌、振盪又は静置することによって、行うことができる。なお、好ましくは、前記酢酸菌体の破砕物もしくは酢酸菌体エタノール粗抽出濃縮乾固物と脂溶性有機溶剤とをよく混合し、１時間程度の攪拌をすることによって行うことが望ましい。
振盪や攪拌などの操作は、ローテーター、シェーカー、ボルテックスなどで行ってもよい。
【００３０】
得られた脂溶性有機溶剤抽出液は、ろ紙、布、ガーゼなどでろ過することで残渣を分離し、ろ液を抽出液として回収してもよいし、遠心分離により、上清を抽出液として回収してもよい。
脂溶性有機溶剤層と水層とを分離する場合は、分液漏斗などによって分液し、脂溶性有機溶剤層を回収してもよいし、或いは遠心分離により、脂溶性有機溶剤層を回収してもよい。
【００３１】
また、前記ろ過により分離した残渣、又は前記遠心分離により分離した沈殿に対して、アセトンの再抽出を行なうこともできる。残渣又は沈殿に対する脂溶性有機溶剤の再抽出は、原料として用いた酢酸菌体の乾燥質量に対して、１質量倍以上、好ましくは３〜３２質量倍の脂溶性有機溶剤（例えば、アセトンを用いる場合、乾燥菌体１ｋｇに対して、アセトン（比重０．７９）３．８〜４１Ｌ）を用いて行うことができる。
なお、残渣又は沈殿に対する脂溶性有機溶剤の再抽出は、回収率の向上の観点から、１〜１０回、好ましくは２回、繰り返して行うことが望ましい。
このようにして得られた脂溶性有機溶剤の再抽出液は、上記１回目の脂溶性有機溶剤抽出液と混合し、次の濃縮工程に用いることができる。
【００３２】
本発明において、「濃縮する」とは、有機溶剤抽出液を行った後に、該抽出液に含まれる有機溶剤を完全に気化させる工程を意味しており、酢酸菌体の破砕物の懸濁液に含まれた水分が残存する状態も含有する。
即ち、本発明における「濃縮物」とは、有機溶剤及び水分が完全に気化した「濃縮乾固物」と「有機溶剤は気化したが水分は残存した濃縮液」を含むものであるが、好ましくは、「濃縮乾固物」になるまで有機溶剤及び水分を気化したものであることが望ましい。なお、濃縮乾固物は、通常、油脂状、粉末状であるが、砕粒状の形態のものも含まれる。
【００３３】
従って、上記工程で得られた脂溶性有機溶剤抽出液に含まれる脂溶性有機溶剤を気化し、濃縮するには、該抽出液に含まれる脂溶性有機溶剤が完全に気化するまで行えばよいが、好ましくは、乾固するまで脂溶性有機溶剤及び水分を気化させた「濃縮乾固物」にすることが望ましい。
本発明における脂溶性有機溶剤抽出液の濃縮は、減圧乾燥機、エバポレーター、凍結乾燥機、恒温機などを用いることで行うことができるが、具体的には、遠心エバポレーター（型式ＣＶＥ２００Ｄ（ＥＹＥLＡ社製））を用いて、減圧濃縮を行うことができる。
また、脂溶性有機溶剤抽出物の濃縮の後、得られた濃縮物に１〜１０質量倍のエタノールを添加し、再度濃縮することで、脂溶性有機溶剤及び水分の気化をより完全に行うことで、濃縮乾固物を得ることができる。
【００３４】
上記工程を経ることにより、本発明の酢酸菌体の酢酸菌体の脂溶性有機溶剤抽出物を得ることができる。
なお、本発明において、脂溶性有機溶剤による抽出は、例えばアセトンを用いて１回目の抽出を行い濃縮乾固した後、前記したアセトン以外の脂溶性有機溶剤を用いて、２回目の抽出を行ってもよい。特に酢酸エチルが好適に使用される。
なお、２回目の脂溶性有機溶剤抽出として、酢酸エチルを用いて抽出を行う場合、添加する酢酸エチルの容液量に対して、０．５〜１質量倍の水を、同時に加えて抽出操作を行うことがさらに望ましい。抽出操作の後、水層を分液除去することで、水溶性成分を積極的に分離することが可能となり、より純度の高い脂溶性有機溶剤抽出物を得ることができる。
【００３５】
上記工程を経て得られた、本発明の脂溶性有機溶剤抽出物は、そのまま、或いは濃縮してアポトーシス誘導組成物として用いることもできるが、さらに、該抽出物中に含有される、アポトーシス誘導能を有する成分を分離精製し採取し、純度及び活性のより高い、アポトーシス誘導組成物を得ることもできる。
【００３６】
分離精製の方法としては、イオン交換樹脂や疎水性樹脂クロマトグラフィー、膜やゲルろ過による分子量分画など一般的な方法を用いることができるが、シリカゲルを充填したカラムに吸着させた後、脂溶性有機溶媒を用いて通液し、分画する方法により行うことが好ましい。
即ち、本発明において、純度及び活性のより高い、ガン細胞のアポトーシス誘導組成物を分離精製する方法としては、シリカゲルを充填したカラムに吸着させた後、脂溶性有機溶媒を用いて通液し、分画する方法により行うことができる。
具体的には、シリカゲルカラム（Ｗａｋｏｇｅｌ Ｃ−３００、径４ｃｍ×長さ５５ｃｍ）を用いることができるが、カラムの径や長さは任意のものを用いることができる。
【００３７】
シリカゲル充填カラムへの吸着物を溶出させる溶媒としては、クロロホルム、メタノール、酢酸エチル、アセトン、エタノール、ブタノール、１−プロパノール、ジエチルエーテルなど挙げることができるが、これらの中で、好適なものは、クロロホルムとメタノールであり、より好ましくはクロロホルムとメタノールの混合液である。
本発明において、シリカゲル充填カラムに吸着した酢酸菌体の脂溶性有機溶剤抽出物から、アポトーシス誘導能を持つ有効成分の含有画分を分画するためには、クロロホルムとメタノールの容量比が、クロロホルム：メタノール＝９９：１〜８１：１９の混合液、好ましくは、クロロホルム：メタノール＝９５：５〜９０：１０の混合液を通液し、溶出液を回収することによって、当該画分を回収できることができる。
【００３８】
また、シリカゲル充填カラムに吸着した後、前記容量比のクロロホルムとメタノールの混合液を通液する前に、クロロホルム、クロロホルム：メタノール＝１００：１の溶液を順に通液することが、低極性の不純物を除去することができるため、純度を上げる観点から望ましい。
【００３９】
本発明の酢酸菌体の脂溶性有機溶剤抽出物のカラム精製画分は、カラム精製前の酢酸菌体の脂溶性有機溶剤抽出物よりも、純度及び活性のより高い、アポトーシス誘導能を有する組成物として、用いることができる。
【００４０】
なお、酢酸菌体の脂溶性有機溶剤抽出物のカラム精製画分は、クロロホルム及びメタノールが完全に気化するまで濃縮した濃縮物、好ましくは濃縮乾固物として、用いることがさらに望ましい。
カラム精製画分の濃縮は、減圧乾燥機、エバポレーター、凍結乾燥機、恒温機などを用いることで行うことができる。具体的には、ロータリーエバポレーター（型式 ニュー・ロータリー・バキューム・エバポレーター ＮＥ（ＥＹＥＬＡ社製））を用いて、減圧濃縮を行うことができる。
また、カラム精製画分の濃縮の後、もしくは濃縮の途中において、得られた濃縮物にエタノールを添加し、再度濃縮することで、有機溶剤及び水分の気化をより完全にすることができる。
【００４１】
本発明においては、上記の酢酸菌体中から脂溶性有機溶剤を用いて抽出した有効成分を含む抽出物を用いて、アポトーシス誘導能を有する組成物が構成され、該抽出物を有効成分として含有するものであれば、摂取した場合に十分な誘導効果を示し、発熱作用などの副作用がない場合には、菌体や破砕処理した菌体などを含んでいてもよい。
【００４２】
本発明の酢酸菌体脂溶性有機溶剤抽出物が奏する、アポトーシス誘導効果やガン細胞増殖抑制効果については、常法で確認することができ、例えば、アポトーシスの誘導効果については、ガン細胞の培養系において、本発明の酢酸菌体脂溶性有機溶剤抽出物を添加し、アポトーシスに特徴的に見られる核ＤＮＡの断片化を観察すればよい。
また、ガン細胞増殖抑制効果は、ガン細胞の培養系において、本発明の酢酸菌体脂溶性有機溶剤抽出物を添加し、トリパンブルー色素排除能を示す細胞数を血球計算盤を用いて測定することにより全細胞数に対する生細胞数の割合を算出することによって確認できる。
【００４３】
本発明のアポトーシス誘導組成物は、酢酸菌の菌体の脂溶性有機溶剤抽出物を有効成分として含有するが、それ以外の各種原料と混合・均一化した後に、必要に応じて界面活性剤を混合して、安定化を図ることもできる。
これらの界面活性剤としては、ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル及びレシチンなどを用いることができる。
さらに、例えば、ビタミンＥ，コエンザイムＱ１０などの抗酸化物質、海草抽出物、サメなどの魚類、大豆などの植物、牛乳などの乳製品、メシマコブ，アガリクス，ヤマブシタケなどのキノコ類を原料とした破砕物や抽出物を併用して、本発明のアポトーシス誘導組成物とすることもできる。
【００４４】
本発明のアポトーシス誘導組成物の形態としては、粉末状、砕粒状、顆粒状などとすることができ、さらにこのような形態のアポトーシス誘導組成物をそのままカプセルに充填する形態の他、水やエタノールに分散した溶液の形態、又は脂溶性有機溶剤抽出物を賦型剤等と混和して得られる錠剤の形態などとして用いることができる。
【００４５】
さらに、健康補助食品、飲食品、医薬品など、その形態は特に限定されるものではない。飲食品の形態としては、具体的にはトマト，にんじん，セロリ，たまねぎ，紫蘇，キャベツ等を原料とした野菜ジュース、キノコ類を原料としたジュース、リンゴ，ブドウ，パイナップル，グレープフルーツ，レモン，オレンジ，桃等を原料とした果物ジュース、又は野菜ジュースと果物ジュースとの混合品、アルコール飲料、牛乳、ヨーグルト、チーズ等の乳製品及び乳酸菌、スポーツ飲料、コーヒー、紅茶，緑茶，ウーロン茶などの茶製品、又は黒酢、穀物酢、米酢、玄米酢、アルコール酢、リンゴ酢やぶどう酢など果実を原料に含む果実酢、野菜を原料に含む野菜酢などの食酢製品、キャンデイ，ガム，ゼリー，アイスクリーム，クッキー，チョコレート，スナック等の菓子類、食パン，米飯，麺等の主食品等に混合することが挙げられる。
【００４６】
上記の如き形態でアポトーシス誘導能を有する組成物を添加することで、その他の天然物由来の健康機能成分が含有され、相加或いは相乗効果が期待できる。
即ち、上記の如き形態でアポトーシス誘導能を有する組成物を添加することによって、その他の天然物由来の健康機能成分が含有され、相加或いは相乗効果の期待できる、本発明のアポトーシス誘導能を有する組成物を含有する、錠剤や飲食品を製造することができる。
【００４７】
上記製剤や飲食品の例として、具体的には、本発明のアポトーシス誘導能を有する組成物を含有する錠剤を製造する場合、本発明のアポトーシス誘導能を有する組成物を０．００１〜９５％（ｗ／ｗ）、好ましくは０．７％（ｗ／ｗ）程度含有する形態で製造し、提供することができる。
また、本発明のアポトーシス誘導能を有する組成物を含有する飲料を製造する場合、本発明のアポトーシス誘導能を有する組成物を０．００１〜３０（ｗ／ｖ）％、好ましくは０．０４％（ｗ／ｖ）程度（例えば、５００ｍｌの飲料中に０．２ｇ程度の本発明のガン細胞のアポトーシス誘導能を有する組成物を含む）を含有する形態で製造し、提供することができる。
【００４８】
なお、本発明のアポトーシス誘導能を有する組成物としての酢酸菌体中の脂溶性有機溶剤抽出物の投与量は、成人１日当たり０．００１ｍｇ〜１００ｇ、好ましくは０．１ｍｇ〜１０ｇである。
【００４９】
本発明のアポトーシス誘導能を有する組成物は、ガン細胞増殖抑制作用を有しており、ガンの進行の抑制ないしはガンの発生の予防に有効であることが期待される。対象となるガンとしては、胃、大腸、乳房、肺、咽頭、舌、皮膚、脳、肝臓、すい臓、食道、骨髄、前立腺、子宮、滑膜などが例示されるが、特に大腸ガンに有効であることが期待される。
また、アポトーシスが関与するアルツハイマー病等の神経疾患にも有効であることが期待される。
【実施例】
【００５０】
以下、本発明を実施例等によって詳しく説明するが、本発明の範囲はこれらにより何ら限定されるものである。
【００５１】
製造例１（酢酸菌体脂溶性有機溶剤抽出物の調製）
酢酸菌体の脂溶性有機溶剤抽出物の調製は、以下のようにして行った。
酢酸菌として、グルコンアセトバクター・ザイリナスＮＢＲＣ１５２３７（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｘｙｌｉｎｕｓ ＮＢＲＣ１５２３７）株を用いた。この株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジー本部生物遺伝資源部門（千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に保存されており、譲受可能な酢酸菌である。
【００５２】
酢酸菌の乾燥菌体１．８Ｋｇを水３５Ｌに懸濁し、フレンチプレス圧力式細胞破砕機（Ｎｉｒｏ Ｓｏａｖｉ社製）を用い、１０，０００ｐｓｉの破砕圧力で破砕後、菌体波砕物懸濁溶液の４倍量のアセトンと混合する。その後、混合によってできた夾雑物を除去するため濾過を行い、ろ液を回収した。その後、再度、残渣にアセトン７Ｌを混合して、濾過を行い夾雑物を除去し、ろ液を回収した。この再抽出を合計２回繰り返した。
得られた濾過液をロータリーエバポレーター（型式ＴＮ Ｎ−Ｎ（ＥＹＥＬＡ社製））を用いて減圧濃縮し乾固させ、この濃縮乾固物を酢酸エチル３５Ｌおよび水１７．５Ｌを加えて混合した後、分液を行い、有機層を得た。再度水層に酢酸エチルを加えて、同様に分液し有機層を回収した。
得られた有機層を上記ロータリーエバポレーターを用いて減圧濃縮し乾固させ、エタノールに溶解した後、再度、上記ロータリーエバポレーターを用いて減圧濃縮し乾固させ、酢酸菌体の脂溶性有機溶剤抽出物１０８ｇを得た。これを本発明実施品１とした。
【００５３】
製造例２（酢酸菌体脂溶性有機溶剤抽出物のシリカゲルカラムクロマトグラフィー分画物の調製）
シリカゲルカラム（Ｗａｋｏｇｅｌ Ｃ−３００、径４ｃｍ×長さ５５ｃｍ）に、製造例１で得られた酢酸菌体の脂溶性有機溶剤抽出物（本発明実施品１）２gを負荷した後、クロロホルムを通液し、得られた溶出液の画分を濃縮乾固したものを比較製造品１とした。
次いで、クロロホルムとメタノールの容量比が、クロロホルム：メタノール＝１００：１の溶液を通液し、得られた溶出液の画分を濃縮乾固したものを比較製造品２とした。
次いで、クロロホルムとメタノールの容量比が、クロロホルム：メタノール＝９５：５〜９０：１０の溶液を通液し、得られた溶出液の画分を濃縮乾固したものを「本発明実施品２」とした。ここでクロロホルム：メタノール＝９５：５〜９０：１０の溶液を通液し、得られた溶出液の画分とは、クロロホルム：メタノール＝９５：５の溶液を通液して得られた溶出液の画分と、次にクロロホルム：メタノール＝９０：１０の溶液を通液して得られた溶出液の画分とを合わせたものを指す。
次いで、クロロホルムとメタノールの容量比が、クロロホルム：メタノール＝８０：２０の溶液を通液し、得られた溶出液の画分を濃縮乾固したものを比較製造品３とした。
次いで、クロロホルムとメタノールの容量比が、クロロホルム：メタノール＝７０：３０〜０：１００の溶液を通液し、得られた溶出液の画分を濃縮乾固したものを比較製造品４とした。ここでクロロホルム：メタノール＝７０：３０〜０：１００の溶液を通液し、得られた溶出液の画分とは、クロロホルム：メタノール＝７０：３０の溶液を通液して得られた溶出液の画分と、次にクロロホルム：メタノール＝０：１００の溶液を通液して得られた溶出液の画分とを合わせたものを指す。
【００５４】
製造例３（酢酸菌体脂溶性有機溶剤抽出物（アセトン抽出物）の調製）
酢酸発酵液１０キロリッターを、高速遠心機器を用いて、回転数８０００ｒｐｍで２０分間、遠心分離を行って集菌し、湿菌体１０Ｋｇを得た。得られた湿菌体１０Ｋｇを等量の蒸留水に分散させた。この酢酸菌分散液２０ｋｇを高圧ホモジナイザー（処理条件２００００ｐｓｉ）に３回通過させて、細胞破壊処理を施した後に、大型凍結乾燥機で凍結減圧乾固し、乾燥菌体粉末１．５Ｋｇを得た。
得られた乾燥菌体粉末５ｇを、アセトン２００ｍｌに懸濁し、１時間攪拌した後、懸濁液を３５００ｒｐｍで１０分間遠心し、上清を回収した。
回収した上清を減圧乾固した後、エタノール１００ｍｌに溶解し、再度蒸発乾固を行い、酢酸菌体の脂溶性有機溶剤抽出物（アセトン抽出物）０．２４ｇを得た。これを本発明実施品３とした。
【００５５】
実施例１（酢酸菌体脂溶性有機溶剤抽出物のガン細胞のアポトーシス誘導能）
ヒト結腸ガン細胞ＨＴ−２９細胞を直径６ｃｍのディッシュ（コーニング社製）を用いて、３７℃、５％二酸化炭素に設定したインキュベーター中で培養した。培地は、ＤＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社製、Ｌ-グルタミン４ｍＭ、グルコース２５ｍＭ含有）１Ｌ中に、ペニシリンＧカリウム（明治製菓）１００,０００Ｕ、ストレプトマイシン硫酸塩（和光純薬工業）１００ｍｇ、ゲンタマイシン硫酸塩（和光純薬工業）５０ｍｇを加えた後、８％炭酸水素ナトリウムでｐＨ７．０に調整し、これに細胞培養用ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を１０％となるように混合したものを用いた。
培地交換は、細胞の状態に応じて２日に１回行った。
培養して、６０〜７０％コンフルエントになった状態で、製造例１で得た酢酸菌体の脂溶性有機溶剤抽出物（本発明実施品１）を１００μｇ／ｍｌの濃度となるようにジメチルスルホキサイド（ＤＭＳＯ）に溶解し、溶解した液を添加し、添加３日後にリン酸緩衝整生理食塩水１０ｍｌにトリプシン０．０２５ｇを溶解して調製したトリプシン溶液を数滴加えて、３７℃で数分間インキュベートし、細胞をディッシュから遊離させたのち、血清入り培地を加えて、トリプシンの反応を止めた。次に、遠心して培地を取り除いて細胞を回収した。
【００５６】
なお、酢酸菌の脂溶性有機溶剤抽出物の代わりに、該抽出物と等量のＤＭＳＯを前記培地に添加し、ＨＴ−２９を培養したものをネガティブコントロール（陰性対照）とした。
また、前記培地の代わりに、２００ｍＭ 酪酸ナトリウム溶液２００μＬを４０ｍｌの５％ＦＣＳを溶解したＤＭＥＭ培地に添加した培地を用いて、ＨＴ−２９を培養したものをポジティブコントロール（陽性対照）とした。
【００５７】
次いで、回収した細胞をリン酸緩衝整生理食塩水によって洗浄後、１００μＬのｃｅｌｌ ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ７．５、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）を添加後、４℃で１０分間静置後、１５，０００ｒｐｍで２０分遠心し、上清を０．５ｍｌチューブに移して、４μlのＲＮＡａｓｅ(１０ｍｇ／ｍＬ、Ｗａｋｏ製)を加えた。３７℃で１時間置いた後、２μlのプロテナーゼＫ(２０ｍｇ／ｍｌをｃｅｌｌ ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒに溶解)を加え、さらに１時間静置した。２０μＬの５Ｍ ＮａＣｌと１２０μＬのイソプロパノールを加え、一晩フリーザーに置いた。
その後、１５０００ｒｐｍで３０分遠心し上清を取り除きＴＥバッファーを１０μＬ加えて、ピペッティング後、２μＬのローディングバッファー（ブロムフェノールブルー（ＢＰＢ）を含む）を加えて、２％のアガロースゲル電気泳動に供した。ＢＰＢが５ｍｍ移動するまでの間、電気泳動にかけ、Ｔｒｉｓ―酢酸―ＥＤＴＡ溶液（ＴＡＥバッファー）を加え、ＢＰＢがゲルの端に到達したところで電気泳動を止め、ＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社製、５０μＬ／５０ｍＬ）で４０分間染色して、ゲルの写真撮影を行った。結果を図１に示す。
【００５８】
図１が示すように、酢酸菌の脂溶性有機溶剤抽出物（本発明実施品１）を添加した場合、ヒト結腸ガン細胞ＨＴ−２９細胞のゲノムＤＮＡに、アポトーシスに特徴的なＤＮＡ断片化が起こっていることが検出された。
なお、ネガティブコントロール（陰性対照）では、ＤＮＡの断片化が見られないのに対し、ポジティブコントロール（陽性対照）ではアポトーシスに伴っておこるＤＮＡの断片化を示す特徴的なＤＮＡのラダーが検出された。
この結果から、酢酸菌の脂溶性有機溶剤抽出物（本発明実施品１）には、ヒト結腸ガン細胞ＨＴ−２９のアポトーシスを誘導する作用があることが明らかになった。
【００５９】
実施例２（酢酸菌体脂溶性有機溶剤抽出物のガン細胞増殖抑制効果）
実施例１と同様に、ヒト結腸ガン細胞ＨＴ−２９を培養し、６０〜７０％コンフルエントになった状態で、製造例１で得た酢酸菌体の脂溶性有機溶剤抽出物（本発明実施品１）を１００μｇ／ｍｌの濃度となるように溶解して添加し、培養１日後、２日後、３日後にＰＢＳ１０ｍｌにトリプシン０．０２５ｇを溶解したトリプシン溶液を数滴加えて、３７℃で数分間インキュベートし、細胞をディッシュから遊離させ、血清入り培地を加え、トリプシンの反応を止めた。
遠心して培地を取り除いてから、一定量のＰＢＳに懸濁させた状態でトリパンブルーを用いて、細胞を染色し細胞数を観測し、細胞生存率を調べた。細胞数の観測は血球計算板を用いて行った。なお、酢酸菌の脂溶性有機溶剤抽出物の代わりに、抽出物と等量のＤＭＳＯを添加したものをネガティブコントロール（陰性対照）として用いた。結果を図２に示す。
【００６０】
図２が示すように、酢酸菌体の脂溶性有機溶剤抽出物（本発明実施品１）を添加した場合、添加しない場合（陰性対照）に比べ、ヒト結腸ガン細胞ＨＴ−２９の生存率が顕著に低くなることが明らかになった。
この結果から、酢酸菌体の脂溶性有機溶剤抽出物（本発明実施品１）には、ガン細胞増殖抑制作用があることが確認された。
【００６１】
実施例３（酢酸菌体脂溶性有機溶剤抽出物のシリカゲルカラムクロマトグラフィー分画物のガン細胞増殖抑制効果）
製造例２で得られた各溶出液画分（本発明実施品２及び比較製造品１〜４）について、ヒト結腸ガン細胞ＨＴ−２９の増殖に対する影響を調べた。
実施例１と同様に、ヒト結腸ガン細胞ＨＴ−２９を培養し、６０〜７０％コンフルエントになった状態で、製造例２で得た酢酸菌体の脂溶性有機溶剤抽出物の各溶出液画分（本発明実施品２及び比較製造品１〜４）を、１００μｇ／ｍｌの濃度となるように各々溶解して添加し、培養３日後にＰＢＳ１０ｍｌにトリプシン０．０２５ｇを溶解したトリプシン溶液を数滴加えて、３７℃で数分間インキュベートし、細胞をディッシュから遊離させ、血清入り培地を加え、トリプシンの反応を止めた。
遠心して培地を取り除いてから、一定量のＰＢＳに懸濁させた状態でトリパンブルーを用いて、細胞を染色し細胞数を観測し、細胞生存率を調べた。細胞数の観測は血球計算板を用いて行った。なお、酢酸菌の脂溶性有機溶剤抽出物の代わりに、抽出物と等量のＤＭＳＯを添加したものをネガティブコントロール（陰性対照）として用いた。結果を図３に示す。
【００６２】
図３の結果から、酢酸菌体の脂溶性有機溶剤抽出物をシリカゲルカラムに負荷し、クロロホルム：メタノール＝９５：５〜９０：１０の溶液を通液し得られた抽出物（本発明実施品２）を添加した場合、クロロホルム、クロロホルム：メタノール＝１００：１、クロロホルム：メタノール＝８０：２０、クロロホルム：メタノール＝７０：３０〜０：１００の溶液を通液し得られた抽出物（比較製造品１〜４）やＤＭＳＯのみを添加した場合（陰性対照）と比べ、ヒト結腸ガン細胞ＨＴ−２９の生存率が顕著に低くなることが明らかになった。
この結果から、酢酸菌の脂溶性有機溶剤抽出物をシリカゲルカラムに負荷し、クロロホルム：メタノール＝９５：５〜９０：１０の溶液を通液し得られた画分（本発明実施品２）には、ガン細胞増殖抑制作用があることが分かった。
【００６３】
実施例４（錠剤の調製）
酢酸発酵液１０キロリッターを高速遠心機器（８０００ｒｐｍ、２０分）で集菌し、湿菌体１０Ｋｇを得た。得られた湿菌体１０Ｋｇを蒸留水にて洗浄後に大型凍結乾燥機で凍結減圧乾固し、乾燥菌体１．８Ｋｇを得た。
得られた乾燥菌体１Ｋｇをエタノール１０リッターと共にソックスレー抽出器に仕込み、２０時間加熱還流した。得られた抽出液を減圧乾固し、５リットルのアセトンに溶解した。沈殿物をろ過で除去し、ろ液をロータリーエバポレーターで蒸発乾固した後、５Ｌの酢酸エチルと５Ｌの蒸留水を添加し、分液して有機層をロータリーエバポレーターで蒸発乾固した後、淡黄褐色の酢酸菌体の脂溶性有機溶剤抽出物、約２００ｇを得た。
得られた酢酸菌体の脂溶性有機溶剤抽出物１ｇ（０．７重量％）、結晶セルロース３５ｇ（２６．９重量％）、乾燥コーンスターチ６７ｇ（５１．５重量％）、乳糖２２ｇ（１６．９重量％）、ステアリン酸カルシウム２ｇ（１．５重量％）、及び結合剤としてポリビニルピロリドン３ｇ（２．３重量％）を加え、混合粉末化した後に、ゼラチン硬カプセルに充填した。調製された錠剤は、アポトーシス誘導組成物として、有効であることが期待できる。
【００６４】
実施例５（食酢飲料の製造）
製造例３で得られた酢酸菌体の脂溶性有機溶剤抽出物（本発明実施品３）０．２ｇを、りんご酢７５ｍｌ、りんご果汁１００ｍｌ、はちみつ２２．５ｇ、果糖４１．６ｇ、グラニュー糖１０．４ｇ、レモン果汁５ｍからなる溶液に加え、水を加えて全容量を５００ｍｌとした。
この溶液を超音波ホモジナイザー（ＢＲＡＮＳＯＮ社製、型式４５０）にて超音波処理し、該抽出物を十分に分散させた。
その後、全量５００ｍｌを５００ｍｌ容の瓶に分注し、７５℃まで加熱して殺菌し、酢酸菌体の脂溶性有機溶剤抽出物を含有する食酢飲料を得た。調製された食酢は、アポトーシス誘導組成物を有する食品として有効であることが期待できる。
【産業上の利用可能性】
【００６５】
本発明は、食品製造に古来より使用されており、安全性が高いことが認知されている酢酸菌の菌体から、安全性が高く、且つ、ガン細胞増殖抑制効果の強い、アポトーシス誘導組成物を提供することを可能にする。
さらに、本発明は、前記のアポトーシス誘導組成物を、摂取のしやすい飲食品に含有させて、提供することを可能にする。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】実施例１における、酢酸菌体の脂溶性有機溶剤抽出物のガン細胞のアポトーシス誘導能を示す電気泳動図である。１００ｂｐラダーは、分子量マーカーを示す。
【図２】実施例２における、酢酸菌体の脂溶性有機溶剤抽出物のガン細胞生存率への影響を示す図である。横軸は、脂溶性有機溶剤抽出物で処理した後の経過日数（日目）を示し、縦軸はガン細胞の生存率（％）を示す。
【図３】実施例３における、酢酸菌体の脂溶性有機溶剤抽出物を分画した各画分のガン細胞生存率を示す図である。縦軸はガン細胞の生存率（％）を示す
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アポトーシス誘導能（誘導作用）を有する組成物に関し、さらに詳細には、酢酸菌体の脂溶性有機溶媒抽出物を有効成分とする、アポトーシス誘導能を有する組成物と、前記アポトーシス誘導能を有する組成物を含有する、アポトーシス誘導能を有する飲食品と、に関する。
【背景技術】
【０００２】
ガンは、男女ともに死亡数が戦後増加し続け、２００４年のガン死亡数は、１９６０年の３倍以上、１９８０年の約２倍となっており、現代人の生活習慣病のひとつとして、非常に問題となっている。そのため研究が盛んに行われているが、抗ガン剤として使用されている医薬品は、吐き気や、脱毛、下痢などの様々な副作用があるものが多く、副作用のない治療薬の開発が望まれている。
【０００３】
抗ガン活性を示す物質の中には、培養細胞でアポトーシスを誘導することが知られており、アポトーシス誘導がガン抑制に結びつくと考えられている。アポトーシス誘導による抗ガン作用は、ネクローシス（壊死）のように周囲の細胞や組織に炎症を起こさせないため、アポトーシスを誘導する物質を用いてガン細胞を細胞死に誘導することは、有効にガン細胞の増殖を抑制すると考えられる。また、アポトーシス誘導能を有する物質を飲食品として日常的に摂取することができれば、ガンの予防につながることが期待される。
また、アルツハイマー症のような神経疾患などにもアポトーシスは関係していることから、これらの疾患の予防につながることも期待される。
これまでに種々のアポトーシス誘導物質が見出されてきているが、物質の安全性を考えると、食品中に存在する成分や食品製造に使用されている微生物が含有する成分であればその懸念が少なく、特に歴史的に食品製造に長く使用されてきた醸造微生物は有望と考えられる。
【０００４】
醸造微生物の中で、特に酢酸菌は、古くから食酢製造に用いられており、ナタデココ、紅茶きのこなどの製造にも使用されており、またヨーロッパの伝統食であるカスピ海ヨーグルトにおいても発酵に関与し、ヨーグルト中に存在していることから、歴史的に安全性が高いことが知られており、酢酸菌を利用することが注目されている。
酢酸菌を使用して製造した醸造酢にアポトーシス誘導活性物質が含まれていることが知られている。
例えば、酢酸菌体を除去した黒酢の酢酸エチルで抽出することによって得られる抗酸化組成物がガン細胞増殖抑制効果を示すことが知られており（例えば、特許文献１参照）、アポトーシス誘導能を有する可能性が示唆されている（例えば、非特許文献１参照）。
しかしながら、この効果は、ジヒドロフェルラ酸及びジヒドロシナピンによるものであることが明らかにされており、いずれも黒酢原料に由来する物質とされ、酢酸菌体に由来するものではない。
また、サトウキビ酢を吸着クロマトグラフィーに供し、１００％メタノールで溶出される画分にアポトーシスを誘導する活性が見出されているが（例えば、非特許文献２参照）、前記黒酢の場合と同様に、特定の原料を使用したことによって見出された活性であり、アポトーシスの誘導能も低いものであった。
【０００５】
一方、酢酸菌に属する微生物またはその菌体内酵素産生物を有効成分とする抗腫瘍剤が開示されており（例えば、特許文献２参照）、ガン細胞のアポトーシス誘導活性が見出されているが、実際には菌体を除去したろ過液に見出された活性であり、さらに該活性の本体はＦ−２７０２と命名された水溶性の物質であり、菌体成分というよりは菌体代謝産物とすべきものであり、また、もともと抗かび物質として発見された物質であるため、副作用の恐れがあった。
【０００６】
上記以外にも、酢酸菌体或いは酢酸菌菌体破砕物や細胞膜画分や水溶性画分に抗腫瘍性が見出されているが（例えば、特許文献３〜７参照）、免疫系を介しての抗腫瘍性であると推定され、ガン細胞特異的ではなかった。また、夾雑物を含むため十分な効果がなく、投与量も多量になるため摂取者の負担も大きく、夾雑蛋白質等によって免疫応答が引き起こされるため、発熱などの副作用の懸念があった。
【０００７】
このように、醸造酢や酢酸菌分泌物において、アポトーシス誘導活性を有する物質が知られているが、いずれもその効果は充分満足できるものではなかった。
即ち、安全性が高く、より効果の強いガン細胞のアポトーシスを誘導する組成物の開発が求められていた。
【０００８】
【非特許文献１】「ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・クリニカル・キャンサー・リサーチ」（Ｊ. Ｅｘｐ．Ｃｌｉｎ. Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．）２３巻，６９頁〜７５頁（２００４年）
【非特許文献２】「九州沖縄農業研究センターにおける最近の主要研究成果 第７集 平成１６年」，１４頁（２００４年）
【特許文献１】特開２００３−９５９７６号公報
【特許文献２】特開２００１−９７８６９号公報
【特許文献３】特開昭５７−７０８２１号公報
【特許文献４】特開昭５７−７０８２２号公報
【特許文献５】特開昭５７−１４４２２０号公報
【特許文献６】特開昭５７−１４４２２１号公報
【特許文献７】特開昭５８−１８０４２６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、安全性が高く、ガン細胞増殖抑制効果の強い、アポトーシス誘導組成物と、該組成物を含有する、アポトーシス誘導能を有する飲食品と、ガンの進行の抑制能及び／又はガンの発生の予防能を有する、アポトーシス誘導能を有する組成物と、を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記課題に鑑み、本発明者らは、食品製造に古来より使用されており、安全性が高いことが認知されている酢酸菌の菌体について、従来、全く検討されていなかった脂溶性物質に着目し、有機溶剤で抽出した脂溶性抽出物に、アポトーシス誘導能があることを見出し、さらに、アポトーシス誘導能を有する脂溶性抽出物にはガン細胞の増殖抑制活性があることを見出した。
また、前記脂溶性抽出物を有機溶剤で抽出する方法において、特定の有機溶剤を使用して抽出した脂溶性組成物が有効であること、さらに抽出した脂溶性抽出物を特定の方法で分離精製した場合に、特定の画分に高いガン細胞の増殖抑制活性があることを見出した。
加えて、前記脂溶性の有機溶剤抽出物のアポトーシス誘導活性、さらにはガン細胞の増殖抑制活性を有する組成物を飲食品に応用する方法を見出した。
本発明は、かかる知見に基づいて完成されたものである。
【００１１】
即ち、本発明は、次の（１）〜（９）に関する。
（１）酢酸菌体の脂溶性有機溶剤抽出物を有効成分として含有する、アポトーシス誘導能を有する組成物。
（２）脂溶性有機溶剤抽出物が、酢酸菌体のアセトン抽出物である、（１）に記載のアポトーシス誘導能を有する組成物。
（３）脂溶性有機溶剤抽出物が、前記酢酸菌体のアセトン抽出物を、さらに酢酸エチルで抽出した抽出物である、（２）に記載のアポトーシス誘導能を有する組成物。
（４）脂溶性有機溶剤抽出物が、前記アセトン抽出物又は前記酢酸エチル抽出物を、さらにシリカゲルに吸着し、クロロホルム及びメタノールの容量比が、クロロホルム：メタノール＝９９：１〜８１：１９である溶液を用いて溶出させて得られる画分である、（２）又は（３）に記載のアポトーシス誘導能を有する組成物。
（５）脂溶性有機溶剤抽出物が、クロロホルム及びメタノールの容量比が、クロロホルム：メタノール＝９５：５〜９０：１０である溶液を用いて溶出させて得られる画分である、（４）に記載のアポトーシス誘導能を有する組成物。
（６）（１）〜（５）のいずれかに記載のアポトーシス誘導能を有する組成物を含有する、アポトーシス誘導能を有する飲食品。
（７）飲食品が食酢である、（６）に記載のアポトーシス誘導能を有する飲食品。
（８）（１）〜（５）のいずれかに記載のアポトーシス誘導組成物を添加することを特徴とする、アポトーシス誘導能を有する飲食品の製造方法。
（９）ガンの進行の抑制能及び／又はガンの発生の予防能を有する、（１）〜（５）のいずれかに記載のガン細胞のアポトーシス誘導能を有する組成物。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、酢酸菌体の脂溶性有機溶剤抽出物を有効成分として含有する、安全性が高く、強いガン細胞増殖抑制効果を示す、アポトーシス誘導能を有する組成物が提供される。
また、本発明によれば、該組成物を含有する、アポトーシス誘導能を有する飲食品が提供され、さらに、ガンの進行の抑制能及び／又はガンの発生の予防能を有する、アポトーシス誘導能を有する組成物が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明は、酢酸菌体の脂溶性有機溶剤抽出物を有効成分として含有する、アポトーシス誘導組成物と、該組成物を含有する、アポトーシス誘導能を有する飲食品と、ガンの進行の抑制能及び／又はガンの発生の予防能を有する、アポトーシス誘導能を有する組成物と、に関するものである。
【００１４】
本発明において用いられる酢酸菌としては、酢酸菌であれば特に限定はないが、例えば、グルコンアセトバクター（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属、アセトバクター（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属、グルコノバクター（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ）属、アサイア（Ａｓａｉａ）属、アシドモナス（Ａｃｉｄｏｍｏｎａｓ）属などに属する酢酸菌が例示される。
【００１５】
グルコンアセトバクター（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属の酢酸菌としては、グルコンアセトバクター・ザイリナス（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｘｙｌｉｎｕｓ）、グルコンアセトバクター・ハンゼニイ（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｈａｎｓｅｎｉｉ）、グルコンアセトバクター・ジアゾトロフィカス（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）、グルコンアセトバクター・インタメデイウス（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ）、グルコンアセトバクター・サッカリ（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｓａｃｃｈａｒｉ）などが例示される。
【００１６】
アセトバクター（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属の酢酸菌としては、アセトバクター・トロピカリス（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、アセトバクター・インドネシエンシス（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｉｎｄｏｎｅｓｉｅｎｓｉｓ）、アセトバクター・シジギイ（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｓｙｚｙｇｉｉ）、アセトバクター・シビノンゲンシス（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃｉｂｉｎｏｎｇｅｎｓｉｓ）、アセトバクター・オリエンタリス（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）、アセトバクター・パスツリアヌス（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｓ）、アセトバクター・オルレアネンシス（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｏｒｌｅａｎｅｎｓｉｓ）、アセトバクター・ロバニエンシス（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｌｏｖａｎｉｅｎｓｉｓ）、アセトバクター・アセチ（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ａｃｅｔｉ）、アセトバクター・ポモラム（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｐｏｍｏｒｕｍ）などが例示される。
【００１７】
また、グルコノバクター（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ）属としては、グルコノバクター・フラトウリ（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｆｒａｔｅｕｒｉｉ）、グルコノバクター・セリナス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｃｅｒｉｎｕｓ）などが例示される。
【００１８】
さらに、アサイア（Ａｓａｉａ）属の酢酸菌としては、アサイア・ボゴレンシス（Ａｓａｉａ ｂｏｇｏｒｅｎｓｉｓ）、アサイア・シアメンシス（Ａｓａｉａ ｓｉａｍｅｎｓｉｓ）などが例示される。
【００１９】
また、アシドモナス（Ａｃｉｄｏｍｏｎａｓ）属の酢酸菌は、アシドモナス・メタノリカ（Ａｃｉｄｏｍｏｎａｓ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）が例示される。
【００２０】
さらに、酢酸菌としては、上記の他、食酢製造やヨーグルトなどの発酵食品に用いられている酢酸菌や、自然界より分離されたもの、また、既存の微生物保存機関に保存されていて分譲可能な保存菌株などが適宜利用可能である。
なお、上記酢酸菌は、単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて使用してもよいが、具体的には、グルコンアセトバクター・ザイリナスを用いることが好ましく、特には、グルコンアセトバクター・ザイリナス ＮＢＲＣ１５２３７株を用いることがさらに好ましい。
【００２１】
本発明に用いる酢酸菌の培養は通常の方法で行えばよく、生育可能な培地及び培養条件であれば、特に限定はなく、得られた培養液をろ過や遠心分離などの一般的な方法で固液分離して菌体を得る。
具体的には、培地としては、炭素源、窒素源、無機物、微量栄養源等、使用する菌株が生育するのに必要な成分を含有していれば特にその組成に限定はなく、炭素源としてはグルコースをはじめ各種炭水化物が用いられるが、特にグルコースが好適である。窒素源としては、酵母エキスやペプトンなどが使用されるが、酵母エキスやペプトンは無機栄養物や微量栄養源も含有することから、好適に使用される。培地のｐＨは通常２．５〜６．５の範囲である。培地としては、エタノールを含有する酢酸発酵用の培地も好適に使用することができる。培養方法は、静置培養、振とう培養、通気攪拌培養等の好気的な条件で培養することが必要で、培養温度は、通常は２５〜３５℃にて、１日〜２１日間培養する。培養終了後、固液分離することで、本発明に用いる酢酸菌体を得ることができる。
また、食酢製造における酢酸発酵工程を終了後、固液分離等によって除去され、廃棄されている菌体も使用することができる。
【００２２】
本発明において、酢酸菌体からアポトーシス誘導能を有する脂溶性有機溶剤抽出物を製造するには、例えば、酢酸菌体を破砕した後、脂溶性有機溶剤溶液で抽出することによって行うことができる。
【００２３】
本発明の原料である酢酸菌体は、上記の固液分離した酢酸菌体をそのまま用いてもよいが、凍結乾燥機などを用いて乾燥させた、乾燥菌体を用いることが望ましい。
酢酸菌体の破砕は、超音波破砕処理、高圧ホモジナイザー処理、圧力式細胞破砕処理などにより行うことができる。
具体的な酢酸菌体の破砕方法としては、原料として用いる酢酸菌体の乾燥質量に対して、１〜１００質量倍、好ましくは２０質量倍程度（例えば、乾燥菌体１ｋｇに対して水２０Ｌ程度）の水で懸濁し、フレンチプレス圧力式細胞破砕機を用いて、５００〜５０，０００ｐｓｉ、好ましくは１０，０００〜２０，０００ｐｓｉ程度の破砕圧力で、１〜３回破砕する方法が挙げられ、これによって、次工程の脂溶性有機溶剤抽出に用いることのできる、酢酸菌体破砕物を得ることができる。
【００２４】
なお、上記工程は、酢酸菌体を破砕しない方法で行ってもよい。
例えば、上記の固液分離した酢酸菌体を凍結乾燥し、この凍結乾燥菌体に対して、エタノールを加え、ソックスレー抽出器を用いて加熱還流し、凍結乾燥機，減圧乾燥機，エバポレーターなど、好ましくはエバポレーターを用いて濃縮乾固させることによって、次工程の脂溶性有機溶剤抽出に用いることのできる酢酸菌体エタノール抽出濃縮乾固物を得ることができる。
【００２５】
本発明で使用される脂溶性有機溶剤としては、具体的には、アセトン，酢酸エチル，プロパノール，イソプルパノール，ブタノールなどのアルコール類、酢酸メチル，酢酸エチルなどの脂肪族カルボン酸エステル、その他アセトンなどの有機溶剤又はそれらを組み合わせた溶剤、或いはそれらを含有する水溶液と定義される。
【００２６】
本発明では、上記脂溶性有機溶剤のうちの１種を単独で、もしくは２種以上を混合して用いることができ、常法に従って抽出することで、目的とするアポトーシス誘導能を有する組成物を得ることができる。好ましくは、アセトンを単独、より好ましくは、アセトンで抽出した後、酢酸エチルを用い、以下に記載の方法で抽出を行うことが望ましい。
【００２７】
上記工程で得られた酢酸菌体破砕物が、細胞破砕処理などによって、水又は溶液に懸濁されたものである場合、脂溶性有機溶剤の添加量は、酢酸菌体破砕物を含む溶液量の１質量倍以上、好ましくは４〜９０質量倍程度であることが望ましい。
なお、この場合の脂溶性有機溶剤の添加量が、１倍量より少ない場合、夾雑物により分離ができなかったり、抽出効率が低下するため好ましくない。
【００２８】
一方、上記工程で得られた酢酸菌体の破砕物が乾固物の場合、もしくは酢酸菌体エタノール粗抽出濃縮乾固物である場合、脂溶性有機溶剤の添加量は、原料として用いた酢酸菌体の乾燥質量に対して、１質量倍以上、好ましくは３〜３２質量倍（例えば、アセトンを用いる場合、乾燥菌体１ｋｇに対して、アセトン（比重０．７９）３．８〜４１Ｌ）であることが望ましい。
なお、この場合の脂溶性有機溶剤の添加量が、１質量倍より少ない場合、夾雑物により分離ができなかったり、抽出効率が低下するため好ましくない。
【００２９】
本工程の脂溶性有機溶剤による抽出は、前記酢酸菌体の破砕物もしくは酢酸菌体エタノール粗抽出濃縮乾固物と脂溶性有機溶剤とをよく混合し、０．１〜１０時間の攪拌、振盪又は静置することによって、行うことができる。なお、好ましくは、前記酢酸菌体の破砕物もしくは酢酸菌体エタノール粗抽出濃縮乾固物と脂溶性有機溶剤とをよく混合し、１時間程度の攪拌をすることによって行うことが望ましい。
振盪や攪拌などの操作は、ローテーター、シェーカー、ボルテックスなどで行ってもよい。
【００３０】
得られた脂溶性有機溶剤抽出液は、ろ紙、布、ガーゼなどでろ過することで残渣を分離し、ろ液を抽出液として回収してもよいし、遠心分離により、上清を抽出液として回収してもよい。
脂溶性有機溶剤層と水層とを分離する場合は、分液漏斗などによって分液し、脂溶性有機溶剤層を回収してもよいし、或いは遠心分離により、脂溶性有機溶剤層を回収してもよい。
【００３１】
また、前記ろ過により分離した残渣、又は前記遠心分離により分離した沈殿に対して、アセトンの再抽出を行なうこともできる。残渣又は沈殿に対する脂溶性有機溶剤の再抽出は、原料として用いた酢酸菌体の乾燥質量に対して、１質量倍以上、好ましくは３〜３２質量倍の脂溶性有機溶剤（例えば、アセトンを用いる場合、乾燥菌体１ｋｇに対して、アセトン（比重０．７９）３．８〜４１Ｌ）を用いて行うことができる。
なお、残渣又は沈殿に対する脂溶性有機溶剤の再抽出は、回収率の向上の観点から、１〜１０回、好ましくは２回、繰り返して行うことが望ましい。
このようにして得られた脂溶性有機溶剤の再抽出液は、上記１回目の脂溶性有機溶剤抽出液と混合し、次の濃縮工程に用いることができる。
【００３２】
本発明において、「濃縮する」とは、有機溶剤抽出液を行った後に、該抽出液に含まれる有機溶剤を完全に気化させる工程を意味しており、酢酸菌体の破砕物の懸濁液に含まれた水分が残存する状態も含有する。
即ち、本発明における「濃縮物」とは、有機溶剤及び水分が完全に気化した「濃縮乾固物」と「有機溶剤は気化したが水分は残存した濃縮液」を含むものであるが、好ましくは、「濃縮乾固物」になるまで有機溶剤及び水分を気化したものであることが望ましい。なお、濃縮乾固物は、通常、油脂状、粉末状であるが、砕粒状の形態のものも含まれる。
【００３３】
従って、上記工程で得られた脂溶性有機溶剤抽出液に含まれる脂溶性有機溶剤を気化し、濃縮するには、該抽出液に含まれる脂溶性有機溶剤が完全に気化するまで行えばよいが、好ましくは、乾固するまで脂溶性有機溶剤及び水分を気化させた「濃縮乾固物」にすることが望ましい。
本発明における脂溶性有機溶剤抽出液の濃縮は、減圧乾燥機、エバポレーター、凍結乾燥機、恒温機などを用いることで行うことができるが、具体的には、遠心エバポレーター（型式ＣＶＥ２００Ｄ（ＥＹＥLＡ社製））を用いて、減圧濃縮を行うことができる。
また、脂溶性有機溶剤抽出物の濃縮の後、得られた濃縮物に１〜１０質量倍のエタノールを添加し、再度濃縮することで、脂溶性有機溶剤及び水分の気化をより完全に行うことで、濃縮乾固物を得ることができる。
【００３４】
上記工程を経ることにより、本発明の酢酸菌体の酢酸菌体の脂溶性有機溶剤抽出物を得ることができる。
なお、本発明において、脂溶性有機溶剤による抽出は、例えばアセトンを用いて１回目の抽出を行い濃縮乾固した後、前記したアセトン以外の脂溶性有機溶剤を用いて、２回目の抽出を行ってもよい。特に酢酸エチルが好適に使用される。
なお、２回目の脂溶性有機溶剤抽出として、酢酸エチルを用いて抽出を行う場合、添加する酢酸エチルの容液量に対して、０．５〜１質量倍の水を、同時に加えて抽出操作を行うことがさらに望ましい。抽出操作の後、水層を分液除去することで、水溶性成分を積極的に分離することが可能となり、より純度の高い脂溶性有機溶剤抽出物を得ることができる。
【００３５】
上記工程を経て得られた、本発明の脂溶性有機溶剤抽出物は、そのまま、或いは濃縮してアポトーシス誘導組成物として用いることもできるが、さらに、該抽出物中に含有される、アポトーシス誘導能を有する成分を分離精製し採取し、純度及び活性のより高い、アポトーシス誘導組成物を得ることもできる。
【００３６】
分離精製の方法としては、イオン交換樹脂や疎水性樹脂クロマトグラフィー、膜やゲルろ過による分子量分画など一般的な方法を用いることができるが、シリカゲルを充填したカラムに吸着させた後、脂溶性有機溶媒を用いて通液し、分画する方法により行うことが好ましい。
即ち、本発明において、純度及び活性のより高い、ガン細胞のアポトーシス誘導組成物を分離精製する方法としては、シリカゲルを充填したカラムに吸着させた後、脂溶性有機溶媒を用いて通液し、分画する方法により行うことができる。
具体的には、シリカゲルカラム（Ｗａｋｏｇｅｌ Ｃ−３００、径４ｃｍ×長さ５５ｃｍ）を用いることができるが、カラムの径や長さは任意のものを用いることができる。
【００３７】
シリカゲル充填カラムへの吸着物を溶出させる溶媒としては、クロロホルム、メタノール、酢酸エチル、アセトン、エタノール、ブタノール、１−プロパノール、ジエチルエーテルなど挙げることができるが、これらの中で、好適なものは、クロロホルムとメタノールであり、より好ましくはクロロホルムとメタノールの混合液である。
本発明において、シリカゲル充填カラムに吸着した酢酸菌体の脂溶性有機溶剤抽出物から、アポトーシス誘導能を持つ有効成分の含有画分を分画するためには、クロロホルムとメタノールの容量比が、クロロホルム：メタノール＝９９：１〜８１：１９の混合液、好ましくは、クロロホルム：メタノール＝９５：５〜９０：１０の混合液を通液し、溶出液を回収することによって、当該画分を回収できることができる。
【００３８】
また、シリカゲル充填カラムに吸着した後、前記容量比のクロロホルムとメタノールの混合液を通液する前に、クロロホルム、クロロホルム：メタノール＝１００：１の溶液を順に通液することが、低極性の不純物を除去することができるため、純度を上げる観点から望ましい。
【００３９】
本発明の酢酸菌体の脂溶性有機溶剤抽出物のカラム精製画分は、カラム精製前の酢酸菌体の脂溶性有機溶剤抽出物よりも、純度及び活性のより高い、アポトーシス誘導能を有する組成物として、用いることができる。
【００４０】
なお、酢酸菌体の脂溶性有機溶剤抽出物のカラム精製画分は、クロロホルム及びメタノールが完全に気化するまで濃縮した濃縮物、好ましくは濃縮乾固物として、用いることがさらに望ましい。
カラム精製画分の濃縮は、減圧乾燥機、エバポレーター、凍結乾燥機、恒温機などを用いることで行うことができる。具体的には、ロータリーエバポレーター（型式 ニュー・ロータリー・バキューム・エバポレーター ＮＥ（ＥＹＥＬＡ社製））を用いて、減圧濃縮を行うことができる。
また、カラム精製画分の濃縮の後、もしくは濃縮の途中において、得られた濃縮物にエタノールを添加し、再度濃縮することで、有機溶剤及び水分の気化をより完全にすることができる。
【００４１】
本発明においては、上記の酢酸菌体中から脂溶性有機溶剤を用いて抽出した有効成分を含む抽出物を用いて、アポトーシス誘導能を有する組成物が構成され、該抽出物を有効成分として含有するものであれば、摂取した場合に十分な誘導効果を示し、発熱作用などの副作用がない場合には、菌体や破砕処理した菌体などを含んでいてもよい。
【００４２】
本発明の酢酸菌体脂溶性有機溶剤抽出物が奏する、アポトーシス誘導効果やガン細胞増殖抑制効果については、常法で確認することができ、例えば、アポトーシスの誘導効果については、ガン細胞の培養系において、本発明の酢酸菌体脂溶性有機溶剤抽出物を添加し、アポトーシスに特徴的に見られる核ＤＮＡの断片化を観察すればよい。
また、ガン細胞増殖抑制効果は、ガン細胞の培養系において、本発明の酢酸菌体脂溶性有機溶剤抽出物を添加し、トリパンブルー色素排除能を示す細胞数を血球計算盤を用いて測定することにより全細胞数に対する生細胞数の割合を算出することによって確認できる。
【００４３】
本発明のアポトーシス誘導組成物は、酢酸菌の菌体の脂溶性有機溶剤抽出物を有効成分として含有するが、それ以外の各種原料と混合・均一化した後に、必要に応じて界面活性剤を混合して、安定化を図ることもできる。
これらの界面活性剤としては、ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル及びレシチンなどを用いることができる。
さらに、例えば、ビタミンＥ，コエンザイムＱ１０などの抗酸化物質、海草抽出物、サメなどの魚類、大豆などの植物、牛乳などの乳製品、メシマコブ，アガリクス，ヤマブシタケなどのキノコ類を原料とした破砕物や抽出物を併用して、本発明のアポトーシス誘導組成物とすることもできる。
【００４４】
本発明のアポトーシス誘導組成物の形態としては、粉末状、砕粒状、顆粒状などとすることができ、さらにこのような形態のアポトーシス誘導組成物をそのままカプセルに充填する形態の他、水やエタノールに分散した溶液の形態、又は脂溶性有機溶剤抽出物を賦型剤等と混和して得られる錠剤の形態などとして用いることができる。
【００４５】
さらに、健康補助食品、飲食品、医薬品など、その形態は特に限定されるものではない。飲食品の形態としては、具体的にはトマト，にんじん，セロリ，たまねぎ，紫蘇，キャベツ等を原料とした野菜ジュース、キノコ類を原料としたジュース、リンゴ，ブドウ，パイナップル，グレープフルーツ，レモン，オレンジ，桃等を原料とした果物ジュース、又は野菜ジュースと果物ジュースとの混合品、アルコール飲料、牛乳、ヨーグルト、チーズ等の乳製品及び乳酸菌、スポーツ飲料、コーヒー、紅茶，緑茶，ウーロン茶などの茶製品、又は黒酢、穀物酢、米酢、玄米酢、アルコール酢、リンゴ酢やぶどう酢など果実を原料に含む果実酢、野菜を原料に含む野菜酢などの食酢製品、キャンデイ，ガム，ゼリー，アイスクリーム，クッキー，チョコレート，スナック等の菓子類、食パン，米飯，麺等の主食品等に混合することが挙げられる。
【００４６】
上記の如き形態でアポトーシス誘導能を有する組成物を添加することで、その他の天然物由来の健康機能成分が含有され、相加或いは相乗効果が期待できる。
即ち、上記の如き形態でアポトーシス誘導能を有する組成物を添加することによって、その他の天然物由来の健康機能成分が含有され、相加或いは相乗効果の期待できる、本発明のアポトーシス誘導能を有する組成物を含有する、錠剤や飲食品を製造することができる。
【００４７】
上記製剤や飲食品の例として、具体的には、本発明のアポトーシス誘導能を有する組成物を含有する錠剤を製造する場合、本発明のアポトーシス誘導能を有する組成物を０．００１〜９５％（ｗ／ｗ）、好ましくは０．７％（ｗ／ｗ）程度含有する形態で製造し、提供することができる。
また、本発明のアポトーシス誘導能を有する組成物を含有する飲料を製造する場合、本発明のアポトーシス誘導能を有する組成物を０．００１〜３０（ｗ／ｖ）％、好ましくは０．０４％（ｗ／ｖ）程度（例えば、５００ｍｌの飲料中に０．２ｇ程度の本発明のガン細胞のアポトーシス誘導能を有する組成物を含む）を含有する形態で製造し、提供することができる。
【００４８】
なお、本発明のアポトーシス誘導能を有する組成物としての酢酸菌体中の脂溶性有機溶剤抽出物の投与量は、成人１日当たり０．００１ｍｇ〜１００ｇ、好ましくは０．１ｍｇ〜１０ｇである。
【００４９】
本発明のアポトーシス誘導能を有する組成物は、ガン細胞増殖抑制作用を有しており、ガンの進行の抑制ないしはガンの発生の予防に有効であることが期待される。対象となるガンとしては、胃、大腸、乳房、肺、咽頭、舌、皮膚、脳、肝臓、すい臓、食道、骨髄、前立腺、子宮、滑膜などが例示されるが、特に大腸ガンに有効であることが期待される。
また、アポトーシスが関与するアルツハイマー病等の神経疾患にも有効であることが期待される。
【実施例】
【００５０】
以下、本発明を実施例等によって詳しく説明するが、本発明の範囲はこれらにより何ら限定されるものである。
【００５１】
製造例１（酢酸菌体脂溶性有機溶剤抽出物の調製）
酢酸菌体の脂溶性有機溶剤抽出物の調製は、以下のようにして行った。
酢酸菌として、グルコンアセトバクター・ザイリナスＮＢＲＣ１５２３７（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｘｙｌｉｎｕｓ ＮＢＲＣ１５２３７）株を用いた。この株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジー本部生物遺伝資源部門（千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に保存されており、譲受可能な酢酸菌である。
【００５２】
酢酸菌の乾燥菌体１．８Ｋｇを水３５Ｌに懸濁し、フレンチプレス圧力式細胞破砕機（Ｎｉｒｏ Ｓｏａｖｉ社製）を用い、１０，０００ｐｓｉの破砕圧力で破砕後、菌体波砕物懸濁溶液の４倍量のアセトンと混合する。その後、混合によってできた夾雑物を除去するため濾過を行い、ろ液を回収した。その後、再度、残渣にアセトン７Ｌを混合して、濾過を行い夾雑物を除去し、ろ液を回収した。この再抽出を合計２回繰り返した。
得られた濾過液をロータリーエバポレーター（型式ＴＮ Ｎ−Ｎ（ＥＹＥＬＡ社製））を用いて減圧濃縮し乾固させ、この濃縮乾固物を酢酸エチル３５Ｌおよび水１７．５Ｌを加えて混合した後、分液を行い、有機層を得た。再度水層に酢酸エチルを加えて、同様に分液し有機層を回収した。
得られた有機層を上記ロータリーエバポレーターを用いて減圧濃縮し乾固させ、エタノールに溶解した後、再度、上記ロータリーエバポレーターを用いて減圧濃縮し乾固させ、酢酸菌体の脂溶性有機溶剤抽出物１０８ｇを得た。これを本発明実施品１とした。
【００５３】
製造例２（酢酸菌体脂溶性有機溶剤抽出物のシリカゲルカラムクロマトグラフィー分画物の調製）
シリカゲルカラム（Ｗａｋｏｇｅｌ Ｃ−３００、径４ｃｍ×長さ５５ｃｍ）に、製造例１で得られた酢酸菌体の脂溶性有機溶剤抽出物（本発明実施品１）２gを負荷した後、クロロホルムを通液し、得られた溶出液の画分を濃縮乾固したものを比較製造品１とした。
次いで、クロロホルムとメタノールの容量比が、クロロホルム：メタノール＝１００：１の溶液を通液し、得られた溶出液の画分を濃縮乾固したものを比較製造品２とした。
次いで、クロロホルムとメタノールの容量比が、クロロホルム：メタノール＝９５：５〜９０：１０の溶液を通液し、得られた溶出液の画分を濃縮乾固したものを「本発明実施品２」とした。ここでクロロホルム：メタノール＝９５：５〜９０：１０の溶液を通液し、得られた溶出液の画分とは、クロロホルム：メタノール＝９５：５の溶液を通液して得られた溶出液の画分と、次にクロロホルム：メタノール＝９０：１０の溶液を通液して得られた溶出液の画分とを合わせたものを指す。
次いで、クロロホルムとメタノールの容量比が、クロロホルム：メタノール＝８０：２０の溶液を通液し、得られた溶出液の画分を濃縮乾固したものを比較製造品３とした。
次いで、クロロホルムとメタノールの容量比が、クロロホルム：メタノール＝７０：３０〜０：１００の溶液を通液し、得られた溶出液の画分を濃縮乾固したものを比較製造品４とした。ここでクロロホルム：メタノール＝７０：３０〜０：１００の溶液を通液し、得られた溶出液の画分とは、クロロホルム：メタノール＝７０：３０の溶液を通液して得られた溶出液の画分と、次にクロロホルム：メタノール＝０：１００の溶液を通液して得られた溶出液の画分とを合わせたものを指す。
【００５４】
製造例３（酢酸菌体脂溶性有機溶剤抽出物（アセトン抽出物）の調製）
酢酸発酵液１０キロリッターを、高速遠心機器を用いて、回転数８０００ｒｐｍで２０分間、遠心分離を行って集菌し、湿菌体１０Ｋｇを得た。得られた湿菌体１０Ｋｇを等量の蒸留水に分散させた。この酢酸菌分散液２０ｋｇを高圧ホモジナイザー（処理条件２００００ｐｓｉ）に３回通過させて、細胞破壊処理を施した後に、大型凍結乾燥機で凍結減圧乾固し、乾燥菌体粉末１．５Ｋｇを得た。
得られた乾燥菌体粉末５ｇを、アセトン２００ｍｌに懸濁し、１時間攪拌した後、懸濁液を３５００ｒｐｍで１０分間遠心し、上清を回収した。
回収した上清を減圧乾固した後、エタノール１００ｍｌに溶解し、再度蒸発乾固を行い、酢酸菌体の脂溶性有機溶剤抽出物（アセトン抽出物）０．２４ｇを得た。これを本発明実施品３とした。
【００５５】
実施例１（酢酸菌体脂溶性有機溶剤抽出物のガン細胞のアポトーシス誘導能）
ヒト結腸ガン細胞ＨＴ−２９細胞を直径６ｃｍのディッシュ（コーニング社製）を用いて、３７℃、５％二酸化炭素に設定したインキュベーター中で培養した。培地は、ＤＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社製、Ｌ-グルタミン４ｍＭ、グルコース２５ｍＭ含有）１Ｌ中に、ペニシリンＧカリウム（明治製菓）１００,０００Ｕ、ストレプトマイシン硫酸塩（和光純薬工業）１００ｍｇ、ゲンタマイシン硫酸塩（和光純薬工業）５０ｍｇを加えた後、８％炭酸水素ナトリウムでｐＨ７．０に調整し、これに細胞培養用ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を１０％となるように混合したものを用いた。
培地交換は、細胞の状態に応じて２日に１回行った。
培養して、６０〜７０％コンフルエントになった状態で、製造例１で得た酢酸菌体の脂溶性有機溶剤抽出物（本発明実施品１）を１００μｇ／ｍｌの濃度となるようにジメチルスルホキサイド（ＤＭＳＯ）に溶解し、溶解した液を添加し、添加３日後にリン酸緩衝整生理食塩水１０ｍｌにトリプシン０．０２５ｇを溶解して調製したトリプシン溶液を数滴加えて、３７℃で数分間インキュベートし、細胞をディッシュから遊離させたのち、血清入り培地を加えて、トリプシンの反応を止めた。次に、遠心して培地を取り除いて細胞を回収した。
【００５６】
なお、酢酸菌の脂溶性有機溶剤抽出物の代わりに、該抽出物と等量のＤＭＳＯを前記培地に添加し、ＨＴ−２９を培養したものをネガティブコントロール（陰性対照）とした。
また、前記培地の代わりに、２００ｍＭ 酪酸ナトリウム溶液２００μＬを４０ｍｌの５％ＦＣＳを溶解したＤＭＥＭ培地に添加した培地を用いて、ＨＴ−２９を培養したものをポジティブコントロール（陽性対照）とした。
【００５７】
次いで、回収した細胞をリン酸緩衝整生理食塩水によって洗浄後、１００μＬのｃｅｌｌ ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ７．５、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）を添加後、４℃で１０分間静置後、１５，０００ｒｐｍで２０分遠心し、上清を０．５ｍｌチューブに移して、４μlのＲＮＡａｓｅ(１０ｍｇ／ｍＬ、Ｗａｋｏ製)を加えた。３７℃で１時間置いた後、２μlのプロテナーゼＫ(２０ｍｇ／ｍｌをｃｅｌｌ ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒに溶解)を加え、さらに１時間静置した。２０μＬの５Ｍ ＮａＣｌと１２０μＬのイソプロパノールを加え、一晩フリーザーに置いた。
その後、１５０００ｒｐｍで３０分遠心し上清を取り除きＴＥバッファーを１０μＬ加えて、ピペッティング後、２μＬのローディングバッファー（ブロムフェノールブルー（ＢＰＢ）を含む）を加えて、２％のアガロースゲル電気泳動に供した。ＢＰＢが５ｍｍ移動するまでの間、電気泳動にかけ、Ｔｒｉｓ―酢酸―ＥＤＴＡ溶液（ＴＡＥバッファー）を加え、ＢＰＢがゲルの端に到達したところで電気泳動を止め、ＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社製、５０μＬ／５０ｍＬ）で４０分間染色して、ゲルの写真撮影を行った。結果を図１に示す。
【００５８】
図１が示すように、酢酸菌の脂溶性有機溶剤抽出物（本発明実施品１）を添加した場合、ヒト結腸ガン細胞ＨＴ−２９細胞のゲノムＤＮＡに、アポトーシスに特徴的なＤＮＡ断片化が起こっていることが検出された。
なお、ネガティブコントロール（陰性対照）では、ＤＮＡの断片化が見られないのに対し、ポジティブコントロール（陽性対照）ではアポトーシスに伴っておこるＤＮＡの断片化を示す特徴的なＤＮＡのラダーが検出された。
この結果から、酢酸菌の脂溶性有機溶剤抽出物（本発明実施品１）には、ヒト結腸ガン細胞ＨＴ−２９のアポトーシスを誘導する作用があることが明らかになった。
【００５９】
実施例２（酢酸菌体脂溶性有機溶剤抽出物のガン細胞増殖抑制効果）
実施例１と同様に、ヒト結腸ガン細胞ＨＴ−２９を培養し、６０〜７０％コンフルエントになった状態で、製造例１で得た酢酸菌体の脂溶性有機溶剤抽出物（本発明実施品１）を１００μｇ／ｍｌの濃度となるように溶解して添加し、培養１日後、２日後、３日後にＰＢＳ１０ｍｌにトリプシン０．０２５ｇを溶解したトリプシン溶液を数滴加えて、３７℃で数分間インキュベートし、細胞をディッシュから遊離させ、血清入り培地を加え、トリプシンの反応を止めた。
遠心して培地を取り除いてから、一定量のＰＢＳに懸濁させた状態でトリパンブルーを用いて、細胞を染色し細胞数を観測し、細胞生存率を調べた。細胞数の観測は血球計算板を用いて行った。なお、酢酸菌の脂溶性有機溶剤抽出物の代わりに、抽出物と等量のＤＭＳＯを添加したものをネガティブコントロール（陰性対照）として用いた。結果を図２に示す。
【００６０】
図２が示すように、酢酸菌体の脂溶性有機溶剤抽出物（本発明実施品１）を添加した場合、添加しない場合（陰性対照）に比べ、ヒト結腸ガン細胞ＨＴ−２９の生存率が顕著に低くなることが明らかになった。
この結果から、酢酸菌体の脂溶性有機溶剤抽出物（本発明実施品１）には、ガン細胞増殖抑制作用があることが確認された。
【００６１】
実施例３（酢酸菌体脂溶性有機溶剤抽出物のシリカゲルカラムクロマトグラフィー分画物のガン細胞増殖抑制効果）
製造例２で得られた各溶出液画分（本発明実施品２及び比較製造品１〜４）について、ヒト結腸ガン細胞ＨＴ−２９の増殖に対する影響を調べた。
実施例１と同様に、ヒト結腸ガン細胞ＨＴ−２９を培養し、６０〜７０％コンフルエントになった状態で、製造例２で得た酢酸菌体の脂溶性有機溶剤抽出物の各溶出液画分（本発明実施品２及び比較製造品１〜４）を、１００μｇ／ｍｌの濃度となるように各々溶解して添加し、培養３日後にＰＢＳ１０ｍｌにトリプシン０．０２５ｇを溶解したトリプシン溶液を数滴加えて、３７℃で数分間インキュベートし、細胞をディッシュから遊離させ、血清入り培地を加え、トリプシンの反応を止めた。
遠心して培地を取り除いてから、一定量のＰＢＳに懸濁させた状態でトリパンブルーを用いて、細胞を染色し細胞数を観測し、細胞生存率を調べた。細胞数の観測は血球計算板を用いて行った。なお、酢酸菌の脂溶性有機溶剤抽出物の代わりに、抽出物と等量のＤＭＳＯを添加したものをネガティブコントロール（陰性対照）として用いた。結果を図３に示す。
【００６２】
図３の結果から、酢酸菌体の脂溶性有機溶剤抽出物をシリカゲルカラムに負荷し、クロロホルム：メタノール＝９５：５〜９０：１０の溶液を通液し得られた抽出物（本発明実施品２）を添加した場合、クロロホルム、クロロホルム：メタノール＝１００：１、クロロホルム：メタノール＝８０：２０、クロロホルム：メタノール＝７０：３０〜０：１００の溶液を通液し得られた抽出物（比較製造品１〜４）やＤＭＳＯのみを添加した場合（陰性対照）と比べ、ヒト結腸ガン細胞ＨＴ−２９の生存率が顕著に低くなることが明らかになった。
この結果から、酢酸菌の脂溶性有機溶剤抽出物をシリカゲルカラムに負荷し、クロロホルム：メタノール＝９５：５〜９０：１０の溶液を通液し得られた画分（本発明実施品２）には、ガン細胞増殖抑制作用があることが分かった。
【００６３】
実施例４（錠剤の調製）
酢酸発酵液１０キロリッターを高速遠心機器（８０００ｒｐｍ、２０分）で集菌し、湿菌体１０Ｋｇを得た。得られた湿菌体１０Ｋｇを蒸留水にて洗浄後に大型凍結乾燥機で凍結減圧乾固し、乾燥菌体１．８Ｋｇを得た。
得られた乾燥菌体１Ｋｇをエタノール１０リッターと共にソックスレー抽出器に仕込み、２０時間加熱還流した。得られた抽出液を減圧乾固し、５リットルのアセトンに溶解した。沈殿物をろ過で除去し、ろ液をロータリーエバポレーターで蒸発乾固した後、５Ｌの酢酸エチルと５Ｌの蒸留水を添加し、分液して有機層をロータリーエバポレーターで蒸発乾固した後、淡黄褐色の酢酸菌体の脂溶性有機溶剤抽出物、約２００ｇを得た。
得られた酢酸菌体の脂溶性有機溶剤抽出物１ｇ（０．７重量％）、結晶セルロース３５ｇ（２６．９重量％）、乾燥コーンスターチ６７ｇ（５１．５重量％）、乳糖２２ｇ（１６．９重量％）、ステアリン酸カルシウム２ｇ（１．５重量％）、及び結合剤としてポリビニルピロリドン３ｇ（２．３重量％）を加え、混合粉末化した後に、ゼラチン硬カプセルに充填した。調製された錠剤は、アポトーシス誘導組成物として、有効であることが期待できる。
【００６４】
実施例５（食酢飲料の製造）
製造例３で得られた酢酸菌体の脂溶性有機溶剤抽出物（本発明実施品３）０．２ｇを、りんご酢７５ｍｌ、りんご果汁１００ｍｌ、はちみつ２２．５ｇ、果糖４１．６ｇ、グラニュー糖１０．４ｇ、レモン果汁５ｍからなる溶液に加え、水を加えて全容量を５００ｍｌとした。
この溶液を超音波ホモジナイザー（ＢＲＡＮＳＯＮ社製、型式４５０）にて超音波処理し、該抽出物を十分に分散させた。
その後、全量５００ｍｌを５００ｍｌ容の瓶に分注し、７５℃まで加熱して殺菌し、酢酸菌体の脂溶性有機溶剤抽出物を含有する食酢飲料を得た。調製された食酢は、アポトーシス誘導組成物を有する食品として有効であることが期待できる。
【産業上の利用可能性】
【００６５】
本発明は、食品製造に古来より使用されており、安全性が高いことが認知されている酢酸菌の菌体から、安全性が高く、且つ、ガン細胞増殖抑制効果の強い、アポトーシス誘導組成物を提供することを可能にする。
さらに、本発明は、前記のアポトーシス誘導組成物を、摂取のしやすい飲食品に含有させて、提供することを可能にする。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】実施例１における、酢酸菌体の脂溶性有機溶剤抽出物のガン細胞のアポトーシス誘導能を示す電気泳動図である。１００ｂｐラダーは、分子量マーカーを示す。
【図２】実施例２における、酢酸菌体の脂溶性有機溶剤抽出物のガン細胞生存率への影響を示す図である。横軸は、脂溶性有機溶剤抽出物で処理した後の経過日数（日目）を示し、縦軸はガン細胞の生存率（％）を示す。
【図３】実施例３における、酢酸菌体の脂溶性有機溶剤抽出物を分画した各画分のガン細胞生存率を示す図である。縦軸はガン細胞の生存率（％）を示す
【特許請求の範囲】
【請求項１】
酢酸菌体の脂溶性有機溶剤抽出物を有効成分として含有する、アポトーシス誘導能を有する組成物。
【請求項２】
脂溶性有機溶剤抽出物が、酢酸菌体のアセトン抽出物である、請求項１に記載のアポトーシス誘導能を有する組成物。
【請求項３】
脂溶性有機溶剤抽出物が、前記酢酸菌体のアセトン抽出物を、さらに酢酸エチルで抽出した抽出物である、請求項２に記載のアポトーシス誘導能を有する組成物。
【請求項４】
脂溶性有機溶剤抽出物が、前記アセトン抽出物又は前記酢酸エチル抽出物を、さらにシリカゲルに吸着し、クロロホルム及びメタノールの容量比が、クロロホルム：メタノール＝９９：１〜８１：１９である溶液を用いて溶出させて得られる画分である、請求項２又は３に記載のアポトーシス誘導能を有する組成物。
【請求項５】
脂溶性有機溶剤抽出物が、クロロホルム及びメタノールの容量比が、クロロホルム：メタノール＝９５：５〜９０：１０である溶液を用いて溶出させて得られる画分である、請求項４に記載のアポトーシス誘導能を有する組成物。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載のアポトーシス誘導能を有する組成物を含有する、アポトーシス誘導能を有する飲食品。
【請求項７】
飲食品が食酢である、請求項６に記載のアポトーシス誘導能を有する飲食品。
【請求項８】
請求項１〜５のいずれかに記載のアポトーシス誘導組成物を添加することを特徴とする、アポトーシス誘導能を有する飲食品の製造方法。
【請求項９】
ガンの進行の抑制能及び／又はガンの発生の予防能を有する、請求項１〜５のいずれかに記載のガン細胞のアポトーシス誘導能を有する組成物。
【請求項１】
酢酸菌体の脂溶性有機溶剤抽出物を有効成分として含有する、アポトーシス誘導能を有する組成物。
【請求項２】
脂溶性有機溶剤抽出物が、酢酸菌体のアセトン抽出物である、請求項１に記載のアポトーシス誘導能を有する組成物。
【請求項３】
脂溶性有機溶剤抽出物が、前記酢酸菌体のアセトン抽出物を、さらに酢酸エチルで抽出した抽出物である、請求項２に記載のアポトーシス誘導能を有する組成物。
【請求項４】
脂溶性有機溶剤抽出物が、前記アセトン抽出物又は前記酢酸エチル抽出物を、さらにシリカゲルに吸着し、クロロホルム及びメタノールの容量比が、クロロホルム：メタノール＝９９：１〜８１：１９である溶液を用いて溶出させて得られる画分である、請求項２又は３に記載のアポトーシス誘導能を有する組成物。
【請求項５】
脂溶性有機溶剤抽出物が、クロロホルム及びメタノールの容量比が、クロロホルム：メタノール＝９５：５〜９０：１０である溶液を用いて溶出させて得られる画分である、請求項４に記載のアポトーシス誘導能を有する組成物。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載のアポトーシス誘導能を有する組成物を含有する、アポトーシス誘導能を有する飲食品。
【請求項７】
飲食品が食酢である、請求項６に記載のアポトーシス誘導能を有する飲食品。
【請求項８】
請求項１〜５のいずれかに記載のアポトーシス誘導組成物を添加することを特徴とする、アポトーシス誘導能を有する飲食品の製造方法。
【請求項９】
ガンの進行の抑制能及び／又はガンの発生の予防能を有する、請求項１〜５のいずれかに記載のガン細胞のアポトーシス誘導能を有する組成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２００８−２１４２１５（Ｐ２００８−２１４２１５Ａ）
【公開日】平成２０年９月１８日（２００８．９．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５１１６６（Ｐ２００７−５１１６６）
【出願日】平成１９年３月１日（２００７．３．１）
【出願人】（３９８０６５５３１）株式会社ミツカングループ本社 (157)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年９月１８日（２００８．９．１８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年３月１日（２００７．３．１）
【出願人】（３９８０６５５３１）株式会社ミツカングループ本社 (157)
【Ｆターム（参考）】
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