アミノカリックスアレーン誘導体とイミンカリックスアレーン誘導体の単分子層に変性されたガラス繊維およびその製造方法と、変性されたガラス繊維にオリゴＤＮＡを固定化したガラス繊維およびその製造方法、ならびにオリゴＤＮＡを固定化したガラス繊維を利用した遺伝子型分析用ストリップ製造方法｛ＭＯＤＩＦＩＥＤＧＬＡＳＳＦＩＢＥＲＳＷＩＴＨＭＯＮＯＬＡＹＥＲＳＯＦＡＭＩＮＯＣＡＬＩＸＡＲＥＮＥＤＥＲＩＶＡＴＩＶＥＳＡＮＤＩＭＩＮＥＣＡＬＩＸＡＲＥＮＥＤＥＲＩＶＡＴＩＶＥＳ、ＡＮＤＯＬＩＧＯ−ＤＮＡＭＯＤＩＦＩＥＤＧＬＡＳＳＦＩＢＥＲＳＢＹＦＩＸＩＮＧＯＬＩＧＯ−ＤＮＡ’ＳＴＯＴＨＥＭＯＮＯＬＡＹＥＲＳ、ＡＮＤＴＨＥＰＲＥＰＡＲＡＴＩＯＮＭＥＴＨＯＤＯＦＧＥＮＯＴＹＰＩＮＧＳＴＲＩＰＳＵＳＩＮＧＴＨＥＯＬＩＧＯ−ＤＮＡＭＯＤＩＦＩＥＤＧＬＡＳＳＦＩＢＥＲＳ｝
本発明は化学式１のアミノカリックスアレーン誘導体または化学式２のイミンカリックスアレーン誘導体をガラス繊維の表面に結合させて単分子層を形成することで表面変性されたガラス繊維を製造する方法、上記方法で製造されたガラス繊維に連続したグアニン塩基を有するオリゴＤＮＡを固定化することでオリゴＤＮＡが固定化したガラス繊維を製造する方法、およびこのような方法により製造された多様なオリゴＤＮＡが固定化したガラス繊維を用いる、多様な遺伝子の遺伝型分析を可能とする遺伝型分析簡易キットを製造する方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アミノカリックスアレーン誘導体またはイミンカリックスアレーン誘導体をガラス繊維表面に結合させて単分子層を形成することで表面−変性されたガラス繊維の製造方法、上記方法により製造されたガラス繊維に連続したグアニン塩基を有するオリゴＤＮＡを固定化することでオリゴＤＮＡが固定化したガラス繊維の製造方法、および上記方法により製造された多様なオリゴ遺伝子が固定化したガラス繊維を用いて多様な遺伝型分析を可能とする速成遺伝型分析キットの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトゲノム研究チームとセレラ・ジェノミクス（Ｃｅｌｅｒａ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）社により競争的に進行されていたヒトゲノムプロジェクト（Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔ）で２０００年にその遺伝子情報地図が完成されながら、遺伝子の機能および変異遺伝子検索に関する研究が全世界的に進行しており、この情報を利用して製造された、多様な遺伝型分析が可能な、オリゴマーＤＮＡが結合されて固定化したオリゴＤＮＡチップの開発が全世界的に進行している。
【０００３】
特に、オリゴＤＮＡチップはウイルス遺伝型分析（ｇｅｎｏｔｙｐｅ）が可能であるため、正確なウイルス感染経路分析、ウイルスの有/無害の把握、および癌誘発ウイルス群の遺伝型分析による癌発病可能性予測用ＤＮＡチップのような、多数のオリゴＤＮＡをオリゴＤＮＡチップ基板に固定化することで製造されたオリゴＤＮＡチップに関して研究が世界的に進行されている。
最近開発されて注目を浴びている、ＨＰＶウイルス遺伝型分析用ＤＮＡチップは、数十種のヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ；ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｏｍａ ｖｉｒｕｓ）の遺伝型分析が可能なＤＮＡチップに開発された。特定遺伝型のウイルスが存在すれば、未来に子宮頸部癌が殆ど９０％以上の確率で発病すると知られている。従って、このようなチップは発病可能性を予測することのできる予防医学的バイオチップとして重要性が認められ、その結果、世界で初めて韓国食品医薬品安全庁（Ｋｏｒｅａ Ｆｏｏｄ Ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）から正式許可が与えられた。
【０００４】
しかし、多様な物理・化学的方法により多種のＤＮＡを固定化し変性したガラススライドから製造されたＤＮＡチップは、人の手によってローディング（ｌｏａｄｉｎｇ）、ハイブリダイゼーション（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）、洗浄等のような過程を経ることになる。人の手を用いて多数のサンプルを処理する上で、至急解決が必要な、下記の問題点が存在する。
１）人の手は均一に作動しない。これに関し、洗浄過程で洗浄時間または水溶液分注速度における微細な差異等が相当な誤差を引き起こしうる。従って、ＤＮＡチップを扱う人の水準によって実験結果が不規則的に示されることがある。
２）５０℃程度の高温で３０分−２時間程度の長期間にかけて進行されるハイブリダイゼーションにおいて、溶媒が蒸発することによって、溶液上に存在する結合、例えばハイブリダイゼーションに関与しうるＤＮＡの濃度が急激に増加する。このような場合、結果として示される信号の差異が数倍に達することがあり、陽性/陰性判定を難しくする。
３）特に、蛍光が検出されてはならない位置に蛍光信号が示されて、該当ＤＮＡが存在するという誤った情報を与える場合がある；即ち、非特異的ＤＮＡ発現が起こり正確な遺伝型分析を難しくしている。
【０００５】
４）ＤＮＡチップにおいて、４乃至８個のサンプルに対する実験を一つの遺伝子チップで進行するようになり、よって、多数の塗布した溶液が互いに混ざる現象が現われる場合が相当数あって、陰性判定されなければならないサンプルが陽性を示すという深刻な問題がある。従って、個々のサンプルを個別にローディング（ｌｏａｄｉｎｇ)して分析することができるようにする新規な遺伝型分析用技術開発が必要となった。
５）特に、ガラススライドに基づいたＤＮＡチップは、使用が簡便な形態への加工が難しい。従って、加工性に優れた材質から使用が簡便な形態に製造され、ＤＮＡチップの性能をそのまま具備する製品を製造することができる技術開発が必要となった。
６）また、ＤＮＡチップの普及を妨げる大きな要因のうちの一つは、チップの最終分析結果を確認するために高価なスキャナーを用いなければならないという点である。現在のスキャナーは大部分が数万ドルに達し、多様なウイルスの遺伝型分析を可能とするＤＮＡチップの開発と使用が制限されている。この問題を解決するために、数百から数千ドル程度の低価の分析機を用いての遺伝型分析を可能とする遺伝型分析用ストリップ、およびこのようなストリップの製造に必須なガラス繊維、即ち、ＤＮＡ固定化が可能で加工性に優れたガラス繊維の変性技術、および変性されたガラス繊維に多様なＤＮＡを固定化して多種遺伝子分析、即ち各種遺伝子の遺伝型分析を可能とする技術の確保が必須である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明においては、ガラススライド上にオリゴＤＮＡを固定化して製造された通常のＤＮＡチップで現われる問題点を、次のような方法で解決するものである。本研究チームは、７−１５個の連続したグアニン塩基を有するオリゴＤＮＡが自然に固定化するガラススライド製造技術を確立している。化学式１のアミノカリックスアレーン誘導体と化学式２のイミンカリックスアレーン誘導体をアミン変性されたガラススライドに適用して、それぞれアミノカリックスアレーン単分子層とイミンカリックスアレーン単分子層を形成することで、このようなガラススライドを製造することができる。このようなガラススライドにオリゴＤＮＡを溶液形態で塗布する場合、多種のオリゴＤＮＡが自然に固定化する。従って、ガラススライドはＤＮＡチップを容易かつ再現性良く製造するのに用いられている。
ガラス繊維に多様なＤＮＡを固定化するために、本発明はガラス繊維の表面がガラススライドの表面と特性が同一であるという性質を用いる。本発明は、公知の方法（Ｌａｎｇｍｕｉｒ、１９９６年、Ｖｏｌ １２、ｐｐ５３３８−５３４２）によってガラス繊維表面をアミンで変性する。次に、本発明は化学式１のアミノカリックスアレーン誘導体と化学式２のイミンカリックスアレーン誘導体をアミンで変性されたガラス繊維に適用してそれぞれアミノカリックスアレーン単分子層とイミンカリックスアレーン単分子層を形成する。次に、ガラススライドの場合と同じ方法でＤＮＡを含む溶液をガラス繊維の表面に塗布してＤＮＡが固定化されたガラス繊維を製造することができる。即ち、本発明は多数のＤＮＡが固定化したガラス繊維製造技術、およびこのようなガラス繊維を用いた遺伝型分析用ストリップ製造方法を提供する。特に、本発明は溶液中の一つまたは一つ以上の遺伝子または溶液においてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を経た結果物をガラス繊維に結合されたプローブＤＮＡとハイブリダイゼーションにより結合させることで遺伝型を確認することができる、遺伝型分析ストリップ製造技術を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、下記化学式１のアミノカリックスアレーン誘導体と下記化学式２のイミンカリックスアレーン誘導体を図１および２の方法によりアミン−変性されたガラス繊維表面に結合させて単分子層を形成することで製造される、表面−変性されたガラス繊維の製造方法を提供する：
【０００８】
【化１】
式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ'１、Ｒ'２、Ｒ'３、Ｒ'４、Ｒ'５、Ｒ'６、Ｒ'７、Ｒ'８は互いに独立して−Ｈ、−ＣＨ３、−Ｃ２Ｈ５、−Ｃ３Ｈ７、−ＯＣＨ３、−Ｃｌ、−Ｃ６Ｈ５、−ＯＨ、−ＯＣＨ２ＣＨ３、−Ｂｒ、−ＣＦ３、−ＯＣＨ２Ｃ６Ｈ５、−ＯＣ６Ｈ５、−ＯＣ６Ｈ４ＣＨ３、−ＯＣ６Ｈ４Ｃ（ＣＨ３）３、−ＯＣ６Ｈ４ＣＦ３、−ＯＣ６Ｈ４Ｃｌ、−ＯＣＯＣＨ３、−ＮＨＣＯＣＨ３、−ＣＯＮＨＣＨ３、−ＣＮ、ＣＯＯＨおよび−ＣＯＯＲからなる群より選ばれ、ここで、Ｒは−ＣＨ３または−Ｃ２Ｈ５を示し；
Ｙ１、Ｙ２、Ｙ３およびＹ４は互いに独立して−Ｈ、−（ＣＨ２）ｎ−ＣＨ＝Ｏ、−（ＣＨ２）ｎ−ＳＨ、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ−ＣＨ２ＣＨ２−ＣＨ＝Ｏ、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ−ＣＨ２ＣＨ２−ＳＨ、−（ＣＨ２）ｍ−Ｃ６Ｈ４−（ＣＨ２）Ｃ−Ｚおよび−ＣＯ−（ＣＨ２）ｍ−１−Ｃ６Ｈ４−（ＣＨ２）Ｃ−Ｚからなる群より選ばれ、ここで、ｎ＝２〜１５、ｍ＝１〜１０、ｃ＝０〜１０、Ｚは−ＳＨ、−ＣＨＯ、−ＣＯＯＨおよび−ＮＨ２からなる群より選ばれる基、そして−Ｃ６Ｈ４−と−Ｃ６Ｈ５はフェニル基として定義される。
【０００９】
【化２】
式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は互いに独立して−Ｈ、−ＣＨ３、−Ｃ２Ｈ５、−Ｃ３Ｈ７、−ＯＣＨ３、−Ｃｌ、−Ｃ６Ｈ５、−ＯＨ、−ＯＣＨ２ＣＨ３、−Ｂｒ、−ＣＦ３、−ＯＣＨ２Ｃ６Ｈ５、−ＯＣ６Ｈ５、−ＯＣ６Ｈ４ＣＨ３、−ＯＣ６Ｈ４Ｃ（ＣＨ３）３、−ＯＣ６Ｈ４ＣＦ３、−ＯＣ６Ｈ４Ｃｌ、−ＯＣＯＣＨ３、−ＮＨＣＯＣＨ３、−ＣＯＮＨＣＨ３、−ＣＮ、ＣＯＯＨおよび−ＣＯＯＲからなる群より選ばれ、ここで、Ｒは−ＣＨ３または−Ｃ２Ｈ５を示し；
Ｙ１、Ｙ２、Ｙ３およびＹ４は互いに独立して−Ｈ、−（ＣＨ２）ｎ−ＣＨ＝Ｏ、−（ＣＨ２）ｎ−ＳＨ、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ−ＣＨ２ＣＨ２−ＣＨ＝Ｏ、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ−ＣＨ２ＣＨ２−ＳＨ、−（ＣＨ２）ｍ−Ｃ６Ｈ４−（ＣＨ２）Ｃ−Ｚ、および−ＣＯ−（ＣＨ２）ｍ−１−Ｃ６Ｈ４−（ＣＨ２）ｃ−Ｚからなる群より選ばれ、ここで、ｎ＝２〜１５、ｍ＝１〜１０、ｃ＝０〜１０、Ｚは−ＳＨ、−ＣＨＯ、−ＣＯＯＨおよび−ＮＨ２からなる群より選ばれる基、そして−Ｃ６Ｈ４−と−Ｃ６Ｈ５はフェニル基として定義される。
化学式１のアミノカリックスアレーン誘導体および化学式２のイミンカリックスアレーン誘導体は、本願に参照として導入される韓国特許出願１０−２００５−００９６３２２号、１０−２００５−０１０３８５７号、１０−２００５−０１０５３４０号および１０−２００５−０１１０８２４号に記載の方法により製造することができる。
【００１０】
ガラス繊維に単分子層を形成する方法において、図３の説明において記載されたように、ガラス繊維は約１０ｎｍから数百μｍの厚さを有し、シラノール（−ＳｉＯＨ）作用基が表面に豊富なガラス繊維を化学反応を通じてアミン末端基を有するガラス繊維に変性する［Ｌａｎｇｍｕｉｒ、１９９７年、Ｖｏｌ １３、ｐｐ４３０５−４３０８；Ｌａｎｇｍｕｉｒ、１９９６年、Ｖｏｌ １２、ｐｐ５３３８−５３４２］。次に、アミン末端基を有するガラス繊維を、ＣＨＣｌ３のような有機溶媒に化学式１または２の化合物を０.１〜５.０ｍＭの濃度で溶かした溶液に約１乃至約２４時間程度浸漬（ｉｍｍｅｒｓｅ）させることができる。次に、ガラス繊維を同一溶媒で洗浄し乾燥してアミノカリックスアレーンまたはイミンカリックスアレーンの単分子層が形成された表面−変性されたガラス繊維を得ることができる。
【００１１】
このような方法により、本発明は化学式１のアミノカリックスアレーン誘導体または化学式２のイミンカリックスアレーン誘導体がイミン結合、これを還元したアミン結合、チオール結合、エステル結合、エーテル結合またはアミド結合等のような化学結合によってガラス繊維の表面に付着された、自己組織化単分子層を有するガラス繊維を提供する。
図４と図５において例示された変性ガラス繊維にＤＮＡを固定化する方法において、６０−６００ｍＭのイオンが存在する固定化溶液において、連続したグアニン塩基を有するオリゴＤＮＡが自然に固定化してＤＮＡが固定化したガラス繊維を製造する。本発明によるＤＮＡの固定化方法は、連続したグアニン塩基、例えば９個の連続したグアニン塩基を有するオリゴＤＮＡをＢＭＴ分注溶液（６００ｍＭアンモニウムイオン溶液）に溶解させて固定化溶液を製造する工程；上記固定化溶液を上記アミノカリックスアレーンまたはイミンカリックスアレーンの単分子層に変性されたガラス繊維に分注する工程；およびオリゴＤＮＡを固定化する工程を含む。上記方法は任意に、上記ガラス繊維を洗浄する工程およびオリゴＤＮＡが固定化したところを以外の位置をブロッキング（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）する工程を含むことができる。上記方法において、固定化工程は常温で約１乃至４時間の間実施することができる。ブロッキング工程は洗浄されたガラス繊維をブロッキング溶液（１ｘ〜４ｘＳＳＣ、０.１−５.０％カゼイン）に入れて１０−３０分間処理する工程を含むことができる。
【００１２】
図９の方法により比較すると、このように製造されたガラス繊維上に固定化されたＤＮＡの濃度は理論的最大値の固定化量の約１/２〜１/３倍であることが観察され、本発明が殆ど理論的最大値に近い量でＤＮＡ固定化が可能なガラス繊維製造技術を達成したということを示す。図５および６は塩基一致度による各種遺伝子のハイブリダイゼーション結果を示す。１.４ｃｍ程度の狭い空間で、ＤＮＡを８本の線状に固定した後、各線に蛍光標識された遺伝子を塗布してハイブリダイゼーションを行う。本発明はハイブリダイゼーションにより固定化された位置で個々の蛍光を特定できる量のＤＮＡが堅固に固定化され、溶液が展開される間にも離隔された状態と固定化された位置を維持するガラス繊維を提供することができ、図５はこのような実験結果を示したものである。実施例３はＤＮＡ固定化方法を示したものであり、実施例４は蛍光標識された遺伝子の塗布方法を示したものである。
また、本発明は下記工程を含む、特定塩基配列を有する遺伝子の存在有無を確認することができる遺伝型分析方法を提供する：
増幅核酸を有し蛍光標識された遺伝子を含む溶液を本願によるガラス繊維上で展開する工程；および
特定塩基配列、例えば特定ウイルス遺伝型を有する遺伝子を、ハイブリダイゼーションにより、ガラス繊維表面に固定化され上記遺伝子に相補的なプローブオリゴＤＮＡと結合する工程。
【００１３】
図６は遺伝型分析結果、即ち遺伝子一致度によるハイブリダイゼーション結果を示す。ハイブリダイゼーション結果を得るために、実施例５の方法によって、遺伝型が一致しない多種の遺伝子を固定化し、一つの遺伝型を有する蛍光標識された遺伝子を塗布した。実際の実験結果および結果分析は図６に提示されている。この結果によると、遺伝型が一致しない部分には蛍光がほとんど発現しないが、一致する位置には約１０倍乃至４０倍程度高い蛍光強度が示される。
【００１４】
本発明による遺伝型分析方法は、約４℃乃至約２０℃の低温、約２０℃乃至約３０℃の常温および約３０℃乃至約６０℃の高温で行うことができる。一方、１９７１年にポリメラーゼ連鎖反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）（Ｋ．ＫｌｅｐｐｅとＧ、Ｋｈｏｒａｎａ発表、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、ｖｏｌ．５６、ｐｐ３４１−３６１）が発表されて以後、一般的に核酸増幅された遺伝子のハイブリダイゼーションは選択性を高めるために約４０℃乃至約６０℃程度の高温で進行されてきた。しかし、本願におけるように常温で進行される反応結果は発表されたことがない。一般的に実験室内の温度は約２２℃乃至約２５℃程度に維持され、ハイブリダイゼーションはこのような温度を含む常温で行うことができる。ハイブリダイゼーションが高温（約３０℃乃至約６０℃）で行われる場合、ハイブリダイゼーションはオーブン等を用いて温度を上げてこそ行うことができる。ハイブリダイゼーションが低温（約４℃乃至約２０℃）で行われる場合、ハイブリダイゼーションは冷却機のような、温度を低める装置を用いて行われる。ハイブリダイゼーションは反応温度および温度を維持する装置によって分類することができる。
【００１５】
本発明において、連続したグアニン塩基を有するプローブＤＮＡ（ｐｒｏｂｅ ＤＮＡｓ）がガラス繊維に固定化されるようにガラス繊維を超分子に変性した。また、本発明において、連続したグアニン塩基によりプローブオリゴＤＮＡ間に適切な間隔を維持することができ、常温または低温でもハイブリダイゼーションを進行することが可能である。一般的な認識とは異なり、変性ガラス繊維に固定化したプローブＤＮＡは常温または低温でハイブリダイズされ、高温におけるハイブリダイゼーションと同等であるか、またはそれ以上のハイブリダイゼーション結果を例示する蛍光強度を得た。図６および図９は多様な蛍光データ中、使用が容易な常温におけるハイブリダイゼーションで進行された蛍光データを示す。
また、既存のガラススライドに基づいたＤＮＡチップから得た結果と比べて、本発明は画期的に選択性に優れ、非特異性が減少された変性ガラス繊維、およびこれを用いた速成型分析（ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ）用ストリップ（例えば、ウイルスの遺伝型分析用ストリップ）の製造および使用技術を提供する。上記遺伝型分析用ストリップは連続したグアニン塩基を有するオリゴＤＮＡを一種類以上含むガラス繊維を含むことができ、オリゴＤＮＡが固定化されていないガラス繊維部分にサンプル注入口を形成することができる。遺伝型分析用ストリップはラピッドストリップ、またはこれを含む遺伝型分析用キットの形態に製造することができる。
【００１６】
また、本発明は下記工程を含む特定塩基配列を有する遺伝子の存在有無を確認することができる遺伝型分析方法を提供する：
本願による遺伝型分析用ストリップのサンプル注入口を通じて、増幅核酸を含み蛍光標識された遺伝子を含む溶液を注入する工程；
上記溶液をガラス繊維上で展開する工程；および
特定塩基配列を有する遺伝子を、ハイブリダイゼーションにより、ガラス繊維の表面に固定化され上記遺伝子に相補的なプローブオリゴＤＮＡに結合する工程。
また、本発明は、本願によるガラス繊維の表面に特定塩基配列を有する遺伝子（ＲＮＡ、ＤＮＡ等）が含まれた溶液を塗布する工程；特定塩基配列を有する遺伝子を、ハイブリダイゼーションにより、ガラス繊維の表面に固定化され連続したグアニン塩基を有し上記遺伝子に相補的なオリゴＤＮＡと結合する工程；蛍光、可視光線等を用いる多様な光学的分析法で結合された遺伝子の総量を測定する工程を含む、遺伝型分析方法を提供する。
【発明の効果】
【００１７】
このような結果を総合すると、本発明は超分子に変性されたガラス繊維にオリゴＤＮＡを固定化したガラス繊維、その製造方法、およびオリゴＤＮＡを固定化したガラス繊維を用いた遺伝型分析ストリップの製造方法等を提供する。また、本発明はオリゴＤＮＡを固定化した表面変性されたガラス繊維を製造および用いる技術を確保した。本発明は、高価なスキャナーを用いるため通常のＤＮＡチップが普及せず、チップのユーザーによって試験結果が変わり、チップの使用が複雑であるという点を解決することができる。また、本発明は使用が容易であり、操作を殆ど必要としない遺伝型分析用ストリップ製造等の技術を確保し、従って既存のガラススライドに基づいたＤＮＡチップに見られ、多くのユーザーにより指摘された問題点を画期的に改善することができる。また、ラピッドキットに用いられるＮＣメンブレインと同様に、ガラス繊維には溶液が特定速度で一定に展開する特性が有る。従って、ガラス繊維の表面にオリゴＤＮＡが固定化されている場合、特定の速度で展開される溶液に含まれる遺伝子は均等に固定化されたＤＮＡの間に一定の速度で展開しながらハイブリダイズされる。従って、本発明は溶液状態のサンプル注入以外にはユーザーによる操作過程を必要としない、ストリップ形態の製品製造が可能である。これにより、本発明はユーザーによる操作を完全に排除して用いることができるチップを提供することができ、試験結果の再現性を画期的に高め、利便性を向上することができる。上記の効果を達成するために、本発明者はオリゴＤＮＡを固定化することでガラス繊維の表面を変性する技術を開発した。
【００１８】
従って、本発明は既存のガラススライド変性技術を改善して、オリゴＤＮＡが高密度で固定化され、ユーザーの操作を完全に排除して用いることができる遺伝型分析用ストリップの製作を可能とするガラス繊維の製造技術を世界で初めて提供する。また、本発明はオリゴＤＮＡが固定化されたガラス繊維を用いる遺伝型分析ストリップの製造技術を確立した。この技術により製造されたストリップは、既存のオリゴＤＮＡチップの製造および使用時に見られた試験結果の再現性の不十分さ、ユーザーによる試験結果変化のような問題点を解決できるのみならず、低価格の分析機で遺伝型分析が可能な（即ち、数万ドルの高価な分析機を用いない）ガラス繊維製のストリップ形態のＤＮＡチップの製造技術を提供することができる。本発明は既存のガラススライドに基づいたＤＮＡチップの製造および使用において発生していた問題点の大部分を解決することができる。このように製造されるストリップにおける試験結果は、線形モーターを装備した数百乃至数千ドル程度の低価のスキャナーを用いて得ることができる。図５は低価スキャナーで得られた実際の実験結果のグラフを示す。本発明は既存のＤＮＡチップを用いる場合に発生する問題点を解決して、遺伝型分析を用いた多様な診断を可能とするという点で重要であると言える。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
以下、下記実施例を参照して本発明を更に具体的に説明する。しかし、本発明がこのような特定実施例に限定されるものではないという点を理解しなければならない。
【実施例１】
【００２０】
５，１１，１７，２３−テトラジベンジルアミノカリックス[４]アレーン−１，３−ヘキサンアルデヒド（ＴＤＢＡＣＡＨＡ）が溶解されている溶液を適用してアミン変性されたガラス繊維に単分子層を形成する方法
ＣＨＣｌ３のような有機溶媒に化学式１の誘導体中で５，１１，１７，２３−テトラジベンジルアミノカリックス[４]アレーン−１，３−ヘキサンアルデヒド（ＴＤＢＡＣＡＨＡ）を０.１〜５.０ｍＭ濃度で溶かした溶液を製造した。図１および図２に示されたところのように、アミン作用基が付着されたガラス繊維（アミンガラス繊維基質）を製造された溶液に１−２４時間の間浸けた後、ガラス繊維をクロロホルム、アセトンおよび水でそれぞれ洗浄し乾燥してアミノカリックスアレーン単分子層を形成した。同一の方法により他のアミノカリックスアレーン誘導体単分子層を製造した。
【実施例２】
【００２１】
５，１１，１７，２３−テトラベンジルイミンアルコキシカリックス[４]アレーン（ＴＢＩＣＯＣＡ）が溶解されている溶液を適用してアミン変性されたガラス繊維を変性する方法（既に知られている方法に従う）
ＣＨＣｌ３のような有機溶媒に化学式２の誘導体中で５，１１，１７，２３−テトラベンジルイミンアルコキシカリックス[４]アレーン（ＴＢＩＣＯＣＡ）を０.１〜５.０ｍＭ濃度で溶かした溶液を製造した。図３に示したところのように、アミン作用基が付着されたガラス繊維（アミンガラス繊維基質）を製造された溶液に１−２４時間の間浸けた後、これをクロロホルム、アセトンおよび水でそれぞれ洗浄し乾燥してイミンカリックスアレーン単分子層を形成した。同一の方法により他のイミンカリックスアレーン誘導体単分子層を製造した。
【実施例３】
【００２２】
変性されたガラス繊維を用いた多種遺伝子の遺伝型分析のためのオリゴＤＮＡ固定化方法
図５に示したオリゴＤＮＡ固定化のためにバイオドット（Ｂｉｏｄｏｔ）分注機装置（モデル名ＸＹＺ ３０５０、アメリカ）を用いた。多種の遺伝子の遺伝型分析のために表１に明記されたように完全に相補的な塩基配列を有するプローブＤＮＡを図５のように固定化した。即ち、連続した９個のグアニン塩基を有するオリゴＤＮＡ３−３０ｐｍｏｌ/μｌをＢＭＴ分注溶液（６００ｍＭアンモニウムイオン溶液）に溶かして、固定化溶液（６００ｍＭアンモニウムイオン溶液；製品名ＢＭＴ ｓｐｏｔｔｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎ−９Ｇ、（株）バイオマトリックステクノロジー社製、韓国）を８セット製造した。上記固定化溶液を分注ノズルを用いて５−５０ｍｍ/ｓｅｃの速度で分注した。実施例１および実施例２の方法により、変性されたガラス基質（ガラス繊維）上に、図４に示されたところのようにアミノカリックスアレーン誘導体単分子層またはイミンカリックスアレーン誘導体単分子層を形成した。次に、オリゴＤＮＡを製造されたガラス基質上に幅０.５−５ｍｍの線状に固定化した。常温で１−４時間の間固定化した後、ガラス繊維を洗浄し、オリゴＤＮＡが固定化していない位置をブロッキング（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）するために、洗浄されたガラス繊維を２５０ｍｌのＢＭＴブロッキング溶液（１ｘ〜４ｘＳＳＣ、０.１−５.０％カゼイン（ｃａｓｅｉｎｅ）；製品名ＢＭＴ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎ−９Ｇ、（株）バイオマトリックステクノロジー社製、韓国）に１０−３０分間浸漬させた（ｉｍｍｅｒｓｅ）。
【００２３】
【表１】
【実施例４】
【００２４】
蛍光標識された標的ＤＮＡとのハイブリダイゼーションを用いる遺伝子検出方法
蛍光標識された標的ＤＮＡとのハイブリダイゼーションのために、１.５ｍｌチューブに表１に明記された蛍光標識した標的ＤＮＡ５μｌとＢＭＴ ｈｙｂ−ｍｉｘＡ（６ｘＳＳＣ、２０％ｆｏｒｍａｍｉｄｅ、０.０５％ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、製品名ＢＭＴ Ｈｙｂ−ｓｏｌｕｔｉｏｎ−９Ｇ、（株）バイオマトリックステクノロジー社製、韓国）７５μｌを入れて８０μｌの混合溶液を製造した。次に、製造された混合溶液を組立てられたストリップのサンプル注入口に注入した。次に、室温（２０±５℃）で５−５０分間ハイブリダイゼーションを進行させた。ハイブリダイゼーションが完了した後、ストリップに０.１ｘ〜４ｘＳＳＣ溶液１００〜３００μｌを注入し、ストリップを分離した。次に、ガラス繊維をスライドに付着してマイクロアレイヤースキャナー（ＧＳＩ Ｌｕｍｏｎｉｃｓ、アメリカ）または線形（ｌｉｎｅａｒ）スキャナーを用いて蛍光強度を定量的に分析した。図５は線形スキャナーを用いて得られた実際の結果を例示する。上記結果はオリゴＤＮＡが固定化されたガラス繊維が製造され、多種の遺伝子を表面変性されたガラス繊維上に適用して蛍光標識された標的ＤＮＡを含む溶液をガラス繊維を上に流し、溶液中の遺伝子と多種の固定化されたオリゴＤＮＡがハイブリダイズされ、これにより上記ガラス繊維を用いて特定遺伝型が溶液に含まれているか否かを特定できるということを示す。
【実施例５】
【００２５】
表面変性されたガラス繊維を用いた特定遺伝型検出試験
図６に示されたオリゴＤＮＡ固定化でバイオドット（Ｂｉｏｄｏｔ）分注機装置（モデル名ＸＹＺ ３０５０、アメリカ）を用いた。非特異的蛍光発現を同時に確認するために表２に示したような完全に相補的な塩基配列を有するプローブオリゴＤＮＡと非相補的なプローブオリゴＤＮＡを図４の方法により図６の形態に固定化した。実施例３と同じ組成の固定化溶液と分注方法を用いてＤＮＡが固定化されたガラス繊維を製造した。
【００２６】
【表２】
蛍光標識されたプライマーあるいはＰＣＲ産物を塗布し、ガラス繊維に固定化されたＤＮＡとハイブリダイズされたか否かを確認するために、上記で製造したガラス繊維基質を図１０に示したようなストリップに組立てた。ハイブリダイゼーションのために、１.５ｍｌチューブに蛍光標識された標的ＤＮＡ５μｌとＢＭＴ ｈｙｂ−ｍｉｘＡ７５μｌを入れて８０μｌの混合溶液を製造した。次に、製造された溶液を組立てられたストリップのサンプル注入口に注入した。次に、常温（２０±５℃）で５−５０分間ハイブリダイゼーションを進行させた。ハイブリダイゼーションが完了した後、ストリップに０.１ｘ〜４ｘＳＳＣ溶液１００〜３００μｌを注入してストリップを分離した。次に、ガラス繊維をスライドに付着してマイクロアレイヤースキャナー（ＧＳＩ Ｌｕｍｏｎｉｃｓ、アメリカ）を用いて蛍光強度を定量的に分析した。図６は実際の実験結果を示す。上記結果は所望の塩基配列を有する線でのみ蛍光が発現することとなり、毛細管現像（ｃａｐｉｌｌａｒｙ ａｃｔｉｏｎ）、微細流体力学的流れ（ｍｉｃｒｏｆｌｕｄｉｃｓ）、側方流動流れ（ｌａｔｅｒａｌ ｆｌｏｗ）等を利用して遺伝子がガラス繊維上を流れると、相補的な塩基配列を有する標的ＤＮＡが特異的に検出されることを示す。
【実施例６】
【００２７】
ガラス繊維の表面に固定化できる遺伝子の理論的な最大量との比較実験
ガラス繊維の表面に固定化できるＤＮＡの理論的な最大量との比較実験のために、実施例３のような方法で相補的な塩基配列を有する連続したグアニン塩基を有するプローブＤＮＡを製造して５本の線の形態で変性されたガラス繊維上に適用した。蛍光標識されたプライマーあるいはＰＣＲ産物を塗布しガラス繊維に固定化したＤＮＡとハイブリダイズされたか否かを確認するために、上記で製造されたガラス繊維基質を図７の模式図や図１０の写真と同様の形態のストリップに組立てた。ハイブリダイゼーションを実施例４と同じ方法で進行した。次に、ハイブリダイゼーションが完了した後、ガラス繊維をストリップから取り外した。次に、マイクロアレイヤースキャナー（ＧＳＩ Ｌｕｍｏｎｉｃｓ、アメリカ）を用いて蛍光強度を定量的に分析して実験データを得た。また、この実験データと表面に固定化できる遺伝子の理論的な最大量とを比較するために、蛍光標識された遺伝子を表面に固定化できる理論的な最大量である１ｘの濃度で含む溶液を製造した。次に、上記溶液を１/３ずつ希釈して１/３、１/９、１/２７、１/８１倍に希釈された溶液を製造した。次に、それぞれの溶液を分注機を用いてガラス繊維上に線形に適用し、ガラス繊維を乾燥させた。蛍光検出器を用いて結果を読取った。図９は実際の結果を示す。
【実施例７】
【００２８】
上記変性ガラス繊維のメンブレイン上でプローブＤＮＡと核酸増幅遺伝子がハイブリダイズされて表れた線を蛍光で検出する方法
イ）標準物質を用いてＰＣＲによる結果物を用いる遺伝型確認実験
本実施例において用いられた標準物質はＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から購入し、次のとおりである：
Ｐｒｏｂｅ−１（ＡＴＣＣ ４５１５０）
Ｐｒｏｂｅ−２（ＡＴＣＣ ４５１５１）
Ｐｒｏｂｅ−３（ＡＴＣＣ ４５１５２）
Ｐｒｏｂｅ−４（ＡＴＣＣ ４５１１３）
上記の中で鋳型としてプラスミド（ｐｌａｓｍｉｄ）ＤＮＡ、および表３のプライマーを用いて、次のようにＰＣＲを行った。ＰＣＲに用いられたプライマーは注文によって（株）バイオニア（Ｂｉｏｎｅｅｒ Ｃｏ．Ｌｔｄ．；韓国）社で合成された。ＰＣＲ実験は（株）バイオニア社から購入したＰＣＲバッファー（ｂｕｆｆｅｒ）１０μｌ、ＭｇＣｌ２ １.５ｍＭ、ｄＮＴＰ ２５０ｕＭ、ＫＣｌ ３０ｍＭ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９.０）１０ｍＭ、Ｔａｑ重合酵素（１ｕｎｉｔ）とプライマー１μｌ（１０ｐｍｏｌ/μｌ）、蒸溜水７μｌ、鋳型ＤＮＡ１μｌを含む反応液を９４℃で５分間１回、９４℃で１分−４５℃で４５秒−７２℃で１分を３５回繰り返し、７２℃で５分間１回の条件で進行した。次に、最終反応液５μｌをＤＮＡスタンダードマーカー（ｓｉｚｅ ｓｔａｎｄａｒｄ ｍａｋｅｒ）と共に２％アガロースゲル（ａｇａｒｏｓｅ ｇｅｌ）に加えて電気泳動した。この際に、電気泳動ゲルを０.００００５％エチジウムブロマイド（ｅｔｈｉｄｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ）溶液で染色した。ゲルの各経路上で出現したバンドの有効如何は ＵＶ を用いて確認した。
【００２９】
【表３】
ロ）蛍光標識されたＰＣＲ結果物を適用してガラス繊維に固定化したプローブＤＮＡとハイブリダイズさせてから、蛍光を用いて分析する方法
図４に示されたプローブＤＮＡ固定化にはバイオドット（Ｂｉｏｄｏｔ）分注機装置（モデル名ＸＹＺ ３０５０、アメリカ）を用いた。表４に明記されているｐｒｏｂｅ１、ｐｒｏｂｅ２、ｐｒｏｂｅ３、ｐｒｏｂｅ４、ＨＣ（Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｃｏｎｔｒｏｌ）を含み連続した９個のグアニン塩基を有するプローブオリゴＤＮＡを７−３０ｐｍｏｌ/μｌでＢＭＴ分注溶液（１００ｍＭアンモニウムイオン溶液）に溶かして固定化溶液を製造した。上記固定化溶液を分注ノズルを用いて２０ｍｍ/ｓｅｃ（０.７ｕｌ/Ｃｍ）の速度で分注し、（株）バイオマトリックステクノロジー社で製造した変性されたガラス繊維に適用した。プローブオリゴＤＮＡを厚さ０.２−３.０ｍｍの線形バンドに塗布して自然に固定化させた。常温で１−２４時間の間固定化を行った。次に、オリゴＤＮＡが固定化していない位置をブロッキング（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）するために、ガラス繊維洗浄後、２５０ｍｌのＢＭＴブロッキング溶液（４ｘＳＳＣ、１％ カゼイン、０.５％ ポリエチレングリコール含む）に入れて１０−３０分間処理して４０−５０℃培養器（ｉｎｃｕｂａｔｏｒ）で３０分−４時間乾燥させ図１０に示したストリップを製造した。
【００３０】
【表４】
ハ）蛍光標識されたＰＣＲ結果物を適用してガラス繊維に固定化したＤＮＡとハイブリダイズした後蛍光を用いて物質分析する方法
蛍光標識されたプライマーまたはＰＣＲ産物をガラス繊維に固定化されＤＮＡとハイブリダイズさせた後、特定遺伝子の結合有無を確認するために、実施例２で製造したガラス繊維基質を実施例７−ロ）のような方法でプローブオリゴＤＮＡが固定化したガラス繊維あるいはストリップを図１０のような形態のケースに組立てた。次に、ＰＣＲ産物をガラス繊維に展開させて特定遺伝子の存在有無を確認した。展開溶液の製造のために１.５ｍｌチューブに実施例７−イ）で製造されたＰＣＲ結果物５μｌとＢＭＴ ｈｙｂ−ｍｉｘ Ａ ７５μｌを入れて混合溶液８０μｌを製造した。次に、上記のように製造された溶液を１００℃の水で３分間加熱し、氷の上に３分間放置して冷却した。次に、混合溶液８０μｌを組立てられたストリップのサンプル注入口に注入した。次に、ストリップを常温（２０〜３０℃）で３−１２０分間放置して、溶液が展開されてハイブリダイゼーションが進行されるようにした。次に、ＢＭＴ Ｗａ−Ｂ−２（４ｘＳＳＣ）溶液を１００μｌ注入して５分後、ストリップを分離した。次に、ガラス繊維（ストリップ）をスライドに取り付けた後、マイクロアレイヤースキャナー（ＧＳＩ Ｌｕｍｏｎｉｃｓ、アメリカ）を用いて蛍光強度を定量的に分析した。分析した結果は図１１乃至図１６の上側部分にストリップ形態で示されている。図１１乃至図１６の中間部分のグラフはＢＭＴでストリップ分析用として用いられるＢＭＴ ＨＰＶ ｓｔｒｉｐ ｒｅａｄｅｒ ｔｙｐｅ−１を用いて分析した結果である。図面において明らかに分かるように、プローブＤＮＡ遺伝子に相補的な増幅した遺伝子を含んでいるサンプルの場合には、相補的なプローブオリゴＤＮＡが固定化されたバンド（線）で特異的なハイブリダイゼーションが起こり、同時にＨＣ領域でもハイブリダイゼーションが進行されてサンプルの分注有無を確認することができる。一方、他の型のプローブＤＮＡの位置ではハイブリダイゼーションが全く生じなかった。即ち、図面は高い選択性と低い非特異的ハイブリダイゼーションの割合を有する、ＰＣＲによって増幅された遺伝子の遺伝型分析を可能とするストリップ型遺伝子チップが開発されて機能する結果を示す。
【００３１】
本発明は化学式１のアミノカリックスアレーン誘導体と化学式２のイミンカリックスアレーン誘導体を用いて単分子層に変性されたガラス繊維およびガラス繊維製造方法、ＤＮＡを固定化した変性ガラス繊維およびその製造方法、そしてＤＮＡが固定化されたガラス繊維を用いた遺伝型分析用ストリップ製造方法を含む、ＤＮＡが固定化されたガラス繊維表面変性技術を世界で初めて開示する。本発明は従来の高価なスキャナーを用いることで発生する費用問題を解決し、使用上の複雑さを解消することにより簡便性を提供し、溶液を均等に展開させる結果、再現性を確保する等、既存技術を画期的に改善した。
【００３２】
ガラス繊維はラピッドキットに用いられるＮＣメンブレインのように、溶液が特定速度で一定に展開される特性を有する。従って、ガラス繊維の表面にオリゴＤＮＡが固定化していれば、特定の速度で展開される溶液に含まれた遺伝子が均等に固定化されたＤＮＡ間を一定の速度で通過すると同時にハイブリダイゼーションが進行され、サンプルのローディング（ｌｏａｄｉｎｇ）以外にはユーザーによる操作を必要としないストリップ形態の製品製造が可能となる。本発明は試験結果の再現性を画期的に高め、利便性を向上させることができる。このような効果を達成するために、本発明者はガラス繊維表面にＤＮＡが固定化するようにガラス繊維の表面を変性する技術を開発した。従って、本発明は従来のガラススライド変性技術を改善して、オリゴＤＮＡが高密度で固定化するガラス繊維製造技術を世界で初めて確立した。また、本発明はオリゴＤＮＡが固定化したガラス繊維を用いる遺伝型分析ストリップの製造技術を確保した。この技術によって製造されたストリップは、既存のオリゴＤＮＡチップの製造および使用の際に現われていた試験結果の再現性の不十分さ、ユーザーによる試験結果の変化のような問題点を解決できるだけでなく、数万ドルの高価な分析機を用いずに低価格の分析機のみで遺伝型分析が可能なガラス繊維に基づいたストリップ形態のＤＮＡチップの製造技術を提供することができる。本発明は、既存のガラススライドに基づいた遺伝子チップの製造および使用上において現われていた全ての問題点を大部分解決することができる。即ち、本発明は既存のＤＮＡチップの使用上の問題点を解決し、多様な形態の遺伝型分析を用いた診断を可能とすることができるという点で重要である。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
図１および図２は、論文（Ｌａｎｇｍｕｉｒ、１９９６年、Ｖｏｌ １２、ｐｐ５３３８−５３４２）に発表された方法により表面をアミンで変性させたガラス繊維の模式図、および化学式１または２の誘導体とアミン−変性されたガラス繊維を結合して超分子単分子層の製造方法を示す模式図である。
図３は、実際の製造に用いられたガラス繊維（フュージョン５、イギリスのＷｈａｔｍａｎ社）写真、拡大写真および模式図である。本発明において用いられるガラス繊維（イギリスのＷｈａｔｍａｎ社、アメリカのＷａｔｅｒ社およびＭｉｌｌｉｐｏｒｅ社の製品等を含む）は、ガラス材質を１０ｎｍから数百μｍに達する直径を有する細いガラス繊維に紡いだ後、メンブレイン形態に製織して得ることができる。従って、上記繊維は繊維の一端に適用された溶媒が重力、毛細管現像、微細流体力学的流れ（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）の力またはこれらの２つ以上の組合せにより展開される特性を有している。本特許は、ガラス繊維の上記のような特性を利用するものである。
【００３４】
図４は、分注機等を用いて連続したグアニン塩基を有するオリゴＤＮＡが溶けている溶液を超分子単分子層に変性されたガラス繊維上に特定の幅を有する線形に分注することにより、オリゴＤＮＡが固定化されたガラス繊維の製造過程を示す模式図である。
図５は、実際の実験結果を示す。本実験において、連続したグアニン塩基を有するオリゴＤＮＡが線形に塗布され多数のオリゴＤＮＡが多重線の形態に固定化されたガラス繊維に、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって得られ蛍光標識された増幅遺伝子を含む溶液を適用する場合、溶液は自然に展開し、固定化したプローブオリゴＤＮＡと相補的な遺伝型を有する遺伝子がハイブリダイゼーションによって結合される。本実験においては蛍光標識された遺伝子を用いて蛍光強度を測定することで結合された遺伝子を確認した。
図６は、多数のオリゴＤＮＡが線状に塗布され固定化されたガラス繊維に蛍光標識された遺伝子を含む溶液を流した後、蛍光スキャナーを用いて分析することで得られた実際の実験結果である。検出しようとする塩基配列と一致するところにおいては蛍光が強く発現し、そうでないところには蛍光発現が全く示されない。従って、本実験においては塩基配列が一致するところでのみ蛍光標識された遺伝子が検出されることが示された。
【００３５】
図７は、多数のオリゴＤＮＡが固定化されているガラス繊維をストリップ内に位置させた後に蓋をして製造されたストリップの模式図である。このストリップのサンプル注入口にＰＣＲによって得られた増幅遺伝子を含む溶液を注入し、図５および図６に示すような遺伝子ハイブリダイゼーション結果を得た。結果は主に分光分析により分析した。
図８は、溶液が展開される図７の過程の後、分光分析で結果を分析する方法を示す模式図である。図８は図７と同様に多種のオリゴＤＮＡが線状に固定化されたガラス繊維をストリップ内部に位置させ、サンプル注入口を通じて多様な遺伝子を含む溶液を注入し、一定時間を経た後、目視または光学機器を用いて各線状に付着した遺伝子の量を観察し、これを信号の大きさで表す過程を示す。このような信号の大きさの差異を用いて溶液中に存在する遺伝子の遺伝型を判別することができる。蛍光を検出することで得られる実際の実験結果は図６に示されている。図６から、遺伝型が一致する場合にのみ相当な水準の蛍光が検出されることを確認することができる。
【００３６】
図９はハイブリダイゼーションすることのできる蛍光標識された遺伝子が理論上の最大量で塗布され乾燥される場合に得られる蛍光強度と、実際に固定化したＤＮＡのハイブリダイゼーションで得られた蛍光強度とを比較する実際の実験結果を示す。ここで、ハイブリダイズできる蛍光標識された遺伝子の理論的な最大量は、線状にＤＮＡを固定化する場合には、連続したグアニン塩基を有しガラス繊維の表面に固定化できるオリゴＤＮＡの最大量を計算し、次にそれらとハイブリダイズできる蛍光標識された遺伝子の最大量を計算することにより得ることができる。ここでは、蛍光標識された遺伝子が固定化されたオリゴＤＮＡと１：１の割合でハイブリダイゼーションをすると仮定して計算した（理論的最大値、即ちｘ１から蛍光強度の減少を確認するために、ｘ１/３、ｘ１/９等のように減少された遺伝子濃度を用いて蛍光強度を測定することができる）。一方、蛍光標識された遺伝子と実際に固定化したＤＮＡとのハイブリダイゼーション実験結果は５本の線で繰り返し確認された。実験により得た蛍光強度は理論的な最大蛍光強度の１/３の水準であり、本発明が極めて優れた遺伝子固定化およびハイブリダイゼーション結果を達成したという点を示す。
【００３７】
図１０は図７と図８において用いられたものと同様のサンプル注入口を有する組立てられたストリップの形態を示す写真である。
図１１乃至図１６は、実施例７と同様に、互いに異なる遺伝型のプローブオリゴＤＮＡが固定化されている変性ガラス繊維を図１０に示したようなストリップに組立て、蛍光標識された増幅遺伝子をストリップ上で展開した後、結果を蛍光スキャナーで読取った結果である。図１１乃至図１４は、一つのプローブ遺伝型に相補的な核酸増幅遺伝子を塗布する場合に得られる結果を示し、図１５および図１６は２つ以上のプローブ遺伝型に相補的な核酸増幅遺伝子を塗布して同一の方法で得られた実際の結果を示す。全ての結果は、変性ガラス繊維を用いる遺伝型分析において、遺伝子が選択的にハイブリダイゼーションされ、非特異的な結合は発生しないということを示す。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アミノカリックスアレーン誘導体またはイミンカリックスアレーン誘導体をガラス繊維表面に結合させて単分子層を形成することで表面−変性されたガラス繊維の製造方法、上記方法により製造されたガラス繊維に連続したグアニン塩基を有するオリゴＤＮＡを固定化することでオリゴＤＮＡが固定化したガラス繊維の製造方法、および上記方法により製造された多様なオリゴ遺伝子が固定化したガラス繊維を用いて多様な遺伝型分析を可能とする速成遺伝型分析キットの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトゲノム研究チームとセレラ・ジェノミクス（Ｃｅｌｅｒａ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）社により競争的に進行されていたヒトゲノムプロジェクト（Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔ）で２０００年にその遺伝子情報地図が完成されながら、遺伝子の機能および変異遺伝子検索に関する研究が全世界的に進行しており、この情報を利用して製造された、多様な遺伝型分析が可能な、オリゴマーＤＮＡが結合されて固定化したオリゴＤＮＡチップの開発が全世界的に進行している。
【０００３】
特に、オリゴＤＮＡチップはウイルス遺伝型分析（ｇｅｎｏｔｙｐｅ）が可能であるため、正確なウイルス感染経路分析、ウイルスの有/無害の把握、および癌誘発ウイルス群の遺伝型分析による癌発病可能性予測用ＤＮＡチップのような、多数のオリゴＤＮＡをオリゴＤＮＡチップ基板に固定化することで製造されたオリゴＤＮＡチップに関して研究が世界的に進行されている。
最近開発されて注目を浴びている、ＨＰＶウイルス遺伝型分析用ＤＮＡチップは、数十種のヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ；ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｏｍａ ｖｉｒｕｓ）の遺伝型分析が可能なＤＮＡチップに開発された。特定遺伝型のウイルスが存在すれば、未来に子宮頸部癌が殆ど９０％以上の確率で発病すると知られている。従って、このようなチップは発病可能性を予測することのできる予防医学的バイオチップとして重要性が認められ、その結果、世界で初めて韓国食品医薬品安全庁（Ｋｏｒｅａ Ｆｏｏｄ Ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）から正式許可が与えられた。
【０００４】
しかし、多様な物理・化学的方法により多種のＤＮＡを固定化し変性したガラススライドから製造されたＤＮＡチップは、人の手によってローディング（ｌｏａｄｉｎｇ）、ハイブリダイゼーション（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）、洗浄等のような過程を経ることになる。人の手を用いて多数のサンプルを処理する上で、至急解決が必要な、下記の問題点が存在する。
１）人の手は均一に作動しない。これに関し、洗浄過程で洗浄時間または水溶液分注速度における微細な差異等が相当な誤差を引き起こしうる。従って、ＤＮＡチップを扱う人の水準によって実験結果が不規則的に示されることがある。
２）５０℃程度の高温で３０分−２時間程度の長期間にかけて進行されるハイブリダイゼーションにおいて、溶媒が蒸発することによって、溶液上に存在する結合、例えばハイブリダイゼーションに関与しうるＤＮＡの濃度が急激に増加する。このような場合、結果として示される信号の差異が数倍に達することがあり、陽性/陰性判定を難しくする。
３）特に、蛍光が検出されてはならない位置に蛍光信号が示されて、該当ＤＮＡが存在するという誤った情報を与える場合がある；即ち、非特異的ＤＮＡ発現が起こり正確な遺伝型分析を難しくしている。
【０００５】
４）ＤＮＡチップにおいて、４乃至８個のサンプルに対する実験を一つの遺伝子チップで進行するようになり、よって、多数の塗布した溶液が互いに混ざる現象が現われる場合が相当数あって、陰性判定されなければならないサンプルが陽性を示すという深刻な問題がある。従って、個々のサンプルを個別にローディング（ｌｏａｄｉｎｇ)して分析することができるようにする新規な遺伝型分析用技術開発が必要となった。
５）特に、ガラススライドに基づいたＤＮＡチップは、使用が簡便な形態への加工が難しい。従って、加工性に優れた材質から使用が簡便な形態に製造され、ＤＮＡチップの性能をそのまま具備する製品を製造することができる技術開発が必要となった。
６）また、ＤＮＡチップの普及を妨げる大きな要因のうちの一つは、チップの最終分析結果を確認するために高価なスキャナーを用いなければならないという点である。現在のスキャナーは大部分が数万ドルに達し、多様なウイルスの遺伝型分析を可能とするＤＮＡチップの開発と使用が制限されている。この問題を解決するために、数百から数千ドル程度の低価の分析機を用いての遺伝型分析を可能とする遺伝型分析用ストリップ、およびこのようなストリップの製造に必須なガラス繊維、即ち、ＤＮＡ固定化が可能で加工性に優れたガラス繊維の変性技術、および変性されたガラス繊維に多様なＤＮＡを固定化して多種遺伝子分析、即ち各種遺伝子の遺伝型分析を可能とする技術の確保が必須である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明においては、ガラススライド上にオリゴＤＮＡを固定化して製造された通常のＤＮＡチップで現われる問題点を、次のような方法で解決するものである。本研究チームは、７−１５個の連続したグアニン塩基を有するオリゴＤＮＡが自然に固定化するガラススライド製造技術を確立している。化学式１のアミノカリックスアレーン誘導体と化学式２のイミンカリックスアレーン誘導体をアミン変性されたガラススライドに適用して、それぞれアミノカリックスアレーン単分子層とイミンカリックスアレーン単分子層を形成することで、このようなガラススライドを製造することができる。このようなガラススライドにオリゴＤＮＡを溶液形態で塗布する場合、多種のオリゴＤＮＡが自然に固定化する。従って、ガラススライドはＤＮＡチップを容易かつ再現性良く製造するのに用いられている。
ガラス繊維に多様なＤＮＡを固定化するために、本発明はガラス繊維の表面がガラススライドの表面と特性が同一であるという性質を用いる。本発明は、公知の方法（Ｌａｎｇｍｕｉｒ、１９９６年、Ｖｏｌ １２、ｐｐ５３３８−５３４２）によってガラス繊維表面をアミンで変性する。次に、本発明は化学式１のアミノカリックスアレーン誘導体と化学式２のイミンカリックスアレーン誘導体をアミンで変性されたガラス繊維に適用してそれぞれアミノカリックスアレーン単分子層とイミンカリックスアレーン単分子層を形成する。次に、ガラススライドの場合と同じ方法でＤＮＡを含む溶液をガラス繊維の表面に塗布してＤＮＡが固定化されたガラス繊維を製造することができる。即ち、本発明は多数のＤＮＡが固定化したガラス繊維製造技術、およびこのようなガラス繊維を用いた遺伝型分析用ストリップ製造方法を提供する。特に、本発明は溶液中の一つまたは一つ以上の遺伝子または溶液においてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を経た結果物をガラス繊維に結合されたプローブＤＮＡとハイブリダイゼーションにより結合させることで遺伝型を確認することができる、遺伝型分析ストリップ製造技術を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、下記化学式１のアミノカリックスアレーン誘導体と下記化学式２のイミンカリックスアレーン誘導体を図１および２の方法によりアミン−変性されたガラス繊維表面に結合させて単分子層を形成することで製造される、表面−変性されたガラス繊維の製造方法を提供する：
【０００８】
【化１】
式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ'１、Ｒ'２、Ｒ'３、Ｒ'４、Ｒ'５、Ｒ'６、Ｒ'７、Ｒ'８は互いに独立して−Ｈ、−ＣＨ３、−Ｃ２Ｈ５、−Ｃ３Ｈ７、−ＯＣＨ３、−Ｃｌ、−Ｃ６Ｈ５、−ＯＨ、−ＯＣＨ２ＣＨ３、−Ｂｒ、−ＣＦ３、−ＯＣＨ２Ｃ６Ｈ５、−ＯＣ６Ｈ５、−ＯＣ６Ｈ４ＣＨ３、−ＯＣ６Ｈ４Ｃ（ＣＨ３）３、−ＯＣ６Ｈ４ＣＦ３、−ＯＣ６Ｈ４Ｃｌ、−ＯＣＯＣＨ３、−ＮＨＣＯＣＨ３、−ＣＯＮＨＣＨ３、−ＣＮ、ＣＯＯＨおよび−ＣＯＯＲからなる群より選ばれ、ここで、Ｒは−ＣＨ３または−Ｃ２Ｈ５を示し；
Ｙ１、Ｙ２、Ｙ３およびＹ４は互いに独立して−Ｈ、−（ＣＨ２）ｎ−ＣＨ＝Ｏ、−（ＣＨ２）ｎ−ＳＨ、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ−ＣＨ２ＣＨ２−ＣＨ＝Ｏ、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ−ＣＨ２ＣＨ２−ＳＨ、−（ＣＨ２）ｍ−Ｃ６Ｈ４−（ＣＨ２）Ｃ−Ｚおよび−ＣＯ−（ＣＨ２）ｍ−１−Ｃ６Ｈ４−（ＣＨ２）Ｃ−Ｚからなる群より選ばれ、ここで、ｎ＝２〜１５、ｍ＝１〜１０、ｃ＝０〜１０、Ｚは−ＳＨ、−ＣＨＯ、−ＣＯＯＨおよび−ＮＨ２からなる群より選ばれる基、そして−Ｃ６Ｈ４−と−Ｃ６Ｈ５はフェニル基として定義される。
【０００９】
【化２】
式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は互いに独立して−Ｈ、−ＣＨ３、−Ｃ２Ｈ５、−Ｃ３Ｈ７、−ＯＣＨ３、−Ｃｌ、−Ｃ６Ｈ５、−ＯＨ、−ＯＣＨ２ＣＨ３、−Ｂｒ、−ＣＦ３、−ＯＣＨ２Ｃ６Ｈ５、−ＯＣ６Ｈ５、−ＯＣ６Ｈ４ＣＨ３、−ＯＣ６Ｈ４Ｃ（ＣＨ３）３、−ＯＣ６Ｈ４ＣＦ３、−ＯＣ６Ｈ４Ｃｌ、−ＯＣＯＣＨ３、−ＮＨＣＯＣＨ３、−ＣＯＮＨＣＨ３、−ＣＮ、ＣＯＯＨおよび−ＣＯＯＲからなる群より選ばれ、ここで、Ｒは−ＣＨ３または−Ｃ２Ｈ５を示し；
Ｙ１、Ｙ２、Ｙ３およびＹ４は互いに独立して−Ｈ、−（ＣＨ２）ｎ−ＣＨ＝Ｏ、−（ＣＨ２）ｎ−ＳＨ、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ−ＣＨ２ＣＨ２−ＣＨ＝Ｏ、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ−ＣＨ２ＣＨ２−ＳＨ、−（ＣＨ２）ｍ−Ｃ６Ｈ４−（ＣＨ２）Ｃ−Ｚ、および−ＣＯ−（ＣＨ２）ｍ−１−Ｃ６Ｈ４−（ＣＨ２）ｃ−Ｚからなる群より選ばれ、ここで、ｎ＝２〜１５、ｍ＝１〜１０、ｃ＝０〜１０、Ｚは−ＳＨ、−ＣＨＯ、−ＣＯＯＨおよび−ＮＨ２からなる群より選ばれる基、そして−Ｃ６Ｈ４−と−Ｃ６Ｈ５はフェニル基として定義される。
化学式１のアミノカリックスアレーン誘導体および化学式２のイミンカリックスアレーン誘導体は、本願に参照として導入される韓国特許出願１０−２００５−００９６３２２号、１０−２００５−０１０３８５７号、１０−２００５−０１０５３４０号および１０−２００５−０１１０８２４号に記載の方法により製造することができる。
【００１０】
ガラス繊維に単分子層を形成する方法において、図３の説明において記載されたように、ガラス繊維は約１０ｎｍから数百μｍの厚さを有し、シラノール（−ＳｉＯＨ）作用基が表面に豊富なガラス繊維を化学反応を通じてアミン末端基を有するガラス繊維に変性する［Ｌａｎｇｍｕｉｒ、１９９７年、Ｖｏｌ １３、ｐｐ４３０５−４３０８；Ｌａｎｇｍｕｉｒ、１９９６年、Ｖｏｌ １２、ｐｐ５３３８−５３４２］。次に、アミン末端基を有するガラス繊維を、ＣＨＣｌ３のような有機溶媒に化学式１または２の化合物を０.１〜５.０ｍＭの濃度で溶かした溶液に約１乃至約２４時間程度浸漬（ｉｍｍｅｒｓｅ）させることができる。次に、ガラス繊維を同一溶媒で洗浄し乾燥してアミノカリックスアレーンまたはイミンカリックスアレーンの単分子層が形成された表面−変性されたガラス繊維を得ることができる。
【００１１】
このような方法により、本発明は化学式１のアミノカリックスアレーン誘導体または化学式２のイミンカリックスアレーン誘導体がイミン結合、これを還元したアミン結合、チオール結合、エステル結合、エーテル結合またはアミド結合等のような化学結合によってガラス繊維の表面に付着された、自己組織化単分子層を有するガラス繊維を提供する。
図４と図５において例示された変性ガラス繊維にＤＮＡを固定化する方法において、６０−６００ｍＭのイオンが存在する固定化溶液において、連続したグアニン塩基を有するオリゴＤＮＡが自然に固定化してＤＮＡが固定化したガラス繊維を製造する。本発明によるＤＮＡの固定化方法は、連続したグアニン塩基、例えば９個の連続したグアニン塩基を有するオリゴＤＮＡをＢＭＴ分注溶液（６００ｍＭアンモニウムイオン溶液）に溶解させて固定化溶液を製造する工程；上記固定化溶液を上記アミノカリックスアレーンまたはイミンカリックスアレーンの単分子層に変性されたガラス繊維に分注する工程；およびオリゴＤＮＡを固定化する工程を含む。上記方法は任意に、上記ガラス繊維を洗浄する工程およびオリゴＤＮＡが固定化したところを以外の位置をブロッキング（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）する工程を含むことができる。上記方法において、固定化工程は常温で約１乃至４時間の間実施することができる。ブロッキング工程は洗浄されたガラス繊維をブロッキング溶液（１ｘ〜４ｘＳＳＣ、０.１−５.０％カゼイン）に入れて１０−３０分間処理する工程を含むことができる。
【００１２】
図９の方法により比較すると、このように製造されたガラス繊維上に固定化されたＤＮＡの濃度は理論的最大値の固定化量の約１/２〜１/３倍であることが観察され、本発明が殆ど理論的最大値に近い量でＤＮＡ固定化が可能なガラス繊維製造技術を達成したということを示す。図５および６は塩基一致度による各種遺伝子のハイブリダイゼーション結果を示す。１.４ｃｍ程度の狭い空間で、ＤＮＡを８本の線状に固定した後、各線に蛍光標識された遺伝子を塗布してハイブリダイゼーションを行う。本発明はハイブリダイゼーションにより固定化された位置で個々の蛍光を特定できる量のＤＮＡが堅固に固定化され、溶液が展開される間にも離隔された状態と固定化された位置を維持するガラス繊維を提供することができ、図５はこのような実験結果を示したものである。実施例３はＤＮＡ固定化方法を示したものであり、実施例４は蛍光標識された遺伝子の塗布方法を示したものである。
また、本発明は下記工程を含む、特定塩基配列を有する遺伝子の存在有無を確認することができる遺伝型分析方法を提供する：
増幅核酸を有し蛍光標識された遺伝子を含む溶液を本願によるガラス繊維上で展開する工程；および
特定塩基配列、例えば特定ウイルス遺伝型を有する遺伝子を、ハイブリダイゼーションにより、ガラス繊維表面に固定化され上記遺伝子に相補的なプローブオリゴＤＮＡと結合する工程。
【００１３】
図６は遺伝型分析結果、即ち遺伝子一致度によるハイブリダイゼーション結果を示す。ハイブリダイゼーション結果を得るために、実施例５の方法によって、遺伝型が一致しない多種の遺伝子を固定化し、一つの遺伝型を有する蛍光標識された遺伝子を塗布した。実際の実験結果および結果分析は図６に提示されている。この結果によると、遺伝型が一致しない部分には蛍光がほとんど発現しないが、一致する位置には約１０倍乃至４０倍程度高い蛍光強度が示される。
【００１４】
本発明による遺伝型分析方法は、約４℃乃至約２０℃の低温、約２０℃乃至約３０℃の常温および約３０℃乃至約６０℃の高温で行うことができる。一方、１９７１年にポリメラーゼ連鎖反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）（Ｋ．ＫｌｅｐｐｅとＧ、Ｋｈｏｒａｎａ発表、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、ｖｏｌ．５６、ｐｐ３４１−３６１）が発表されて以後、一般的に核酸増幅された遺伝子のハイブリダイゼーションは選択性を高めるために約４０℃乃至約６０℃程度の高温で進行されてきた。しかし、本願におけるように常温で進行される反応結果は発表されたことがない。一般的に実験室内の温度は約２２℃乃至約２５℃程度に維持され、ハイブリダイゼーションはこのような温度を含む常温で行うことができる。ハイブリダイゼーションが高温（約３０℃乃至約６０℃）で行われる場合、ハイブリダイゼーションはオーブン等を用いて温度を上げてこそ行うことができる。ハイブリダイゼーションが低温（約４℃乃至約２０℃）で行われる場合、ハイブリダイゼーションは冷却機のような、温度を低める装置を用いて行われる。ハイブリダイゼーションは反応温度および温度を維持する装置によって分類することができる。
【００１５】
本発明において、連続したグアニン塩基を有するプローブＤＮＡ（ｐｒｏｂｅ ＤＮＡｓ）がガラス繊維に固定化されるようにガラス繊維を超分子に変性した。また、本発明において、連続したグアニン塩基によりプローブオリゴＤＮＡ間に適切な間隔を維持することができ、常温または低温でもハイブリダイゼーションを進行することが可能である。一般的な認識とは異なり、変性ガラス繊維に固定化したプローブＤＮＡは常温または低温でハイブリダイズされ、高温におけるハイブリダイゼーションと同等であるか、またはそれ以上のハイブリダイゼーション結果を例示する蛍光強度を得た。図６および図９は多様な蛍光データ中、使用が容易な常温におけるハイブリダイゼーションで進行された蛍光データを示す。
また、既存のガラススライドに基づいたＤＮＡチップから得た結果と比べて、本発明は画期的に選択性に優れ、非特異性が減少された変性ガラス繊維、およびこれを用いた速成型分析（ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ）用ストリップ（例えば、ウイルスの遺伝型分析用ストリップ）の製造および使用技術を提供する。上記遺伝型分析用ストリップは連続したグアニン塩基を有するオリゴＤＮＡを一種類以上含むガラス繊維を含むことができ、オリゴＤＮＡが固定化されていないガラス繊維部分にサンプル注入口を形成することができる。遺伝型分析用ストリップはラピッドストリップ、またはこれを含む遺伝型分析用キットの形態に製造することができる。
【００１６】
また、本発明は下記工程を含む特定塩基配列を有する遺伝子の存在有無を確認することができる遺伝型分析方法を提供する：
本願による遺伝型分析用ストリップのサンプル注入口を通じて、増幅核酸を含み蛍光標識された遺伝子を含む溶液を注入する工程；
上記溶液をガラス繊維上で展開する工程；および
特定塩基配列を有する遺伝子を、ハイブリダイゼーションにより、ガラス繊維の表面に固定化され上記遺伝子に相補的なプローブオリゴＤＮＡに結合する工程。
また、本発明は、本願によるガラス繊維の表面に特定塩基配列を有する遺伝子（ＲＮＡ、ＤＮＡ等）が含まれた溶液を塗布する工程；特定塩基配列を有する遺伝子を、ハイブリダイゼーションにより、ガラス繊維の表面に固定化され連続したグアニン塩基を有し上記遺伝子に相補的なオリゴＤＮＡと結合する工程；蛍光、可視光線等を用いる多様な光学的分析法で結合された遺伝子の総量を測定する工程を含む、遺伝型分析方法を提供する。
【発明の効果】
【００１７】
このような結果を総合すると、本発明は超分子に変性されたガラス繊維にオリゴＤＮＡを固定化したガラス繊維、その製造方法、およびオリゴＤＮＡを固定化したガラス繊維を用いた遺伝型分析ストリップの製造方法等を提供する。また、本発明はオリゴＤＮＡを固定化した表面変性されたガラス繊維を製造および用いる技術を確保した。本発明は、高価なスキャナーを用いるため通常のＤＮＡチップが普及せず、チップのユーザーによって試験結果が変わり、チップの使用が複雑であるという点を解決することができる。また、本発明は使用が容易であり、操作を殆ど必要としない遺伝型分析用ストリップ製造等の技術を確保し、従って既存のガラススライドに基づいたＤＮＡチップに見られ、多くのユーザーにより指摘された問題点を画期的に改善することができる。また、ラピッドキットに用いられるＮＣメンブレインと同様に、ガラス繊維には溶液が特定速度で一定に展開する特性が有る。従って、ガラス繊維の表面にオリゴＤＮＡが固定化されている場合、特定の速度で展開される溶液に含まれる遺伝子は均等に固定化されたＤＮＡの間に一定の速度で展開しながらハイブリダイズされる。従って、本発明は溶液状態のサンプル注入以外にはユーザーによる操作過程を必要としない、ストリップ形態の製品製造が可能である。これにより、本発明はユーザーによる操作を完全に排除して用いることができるチップを提供することができ、試験結果の再現性を画期的に高め、利便性を向上することができる。上記の効果を達成するために、本発明者はオリゴＤＮＡを固定化することでガラス繊維の表面を変性する技術を開発した。
【００１８】
従って、本発明は既存のガラススライド変性技術を改善して、オリゴＤＮＡが高密度で固定化され、ユーザーの操作を完全に排除して用いることができる遺伝型分析用ストリップの製作を可能とするガラス繊維の製造技術を世界で初めて提供する。また、本発明はオリゴＤＮＡが固定化されたガラス繊維を用いる遺伝型分析ストリップの製造技術を確立した。この技術により製造されたストリップは、既存のオリゴＤＮＡチップの製造および使用時に見られた試験結果の再現性の不十分さ、ユーザーによる試験結果変化のような問題点を解決できるのみならず、低価格の分析機で遺伝型分析が可能な（即ち、数万ドルの高価な分析機を用いない）ガラス繊維製のストリップ形態のＤＮＡチップの製造技術を提供することができる。本発明は既存のガラススライドに基づいたＤＮＡチップの製造および使用において発生していた問題点の大部分を解決することができる。このように製造されるストリップにおける試験結果は、線形モーターを装備した数百乃至数千ドル程度の低価のスキャナーを用いて得ることができる。図５は低価スキャナーで得られた実際の実験結果のグラフを示す。本発明は既存のＤＮＡチップを用いる場合に発生する問題点を解決して、遺伝型分析を用いた多様な診断を可能とするという点で重要であると言える。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
以下、下記実施例を参照して本発明を更に具体的に説明する。しかし、本発明がこのような特定実施例に限定されるものではないという点を理解しなければならない。
【実施例１】
【００２０】
５，１１，１７，２３−テトラジベンジルアミノカリックス[４]アレーン−１，３−ヘキサンアルデヒド（ＴＤＢＡＣＡＨＡ）が溶解されている溶液を適用してアミン変性されたガラス繊維に単分子層を形成する方法
ＣＨＣｌ３のような有機溶媒に化学式１の誘導体中で５，１１，１７，２３−テトラジベンジルアミノカリックス[４]アレーン−１，３−ヘキサンアルデヒド（ＴＤＢＡＣＡＨＡ）を０.１〜５.０ｍＭ濃度で溶かした溶液を製造した。図１および図２に示されたところのように、アミン作用基が付着されたガラス繊維（アミンガラス繊維基質）を製造された溶液に１−２４時間の間浸けた後、ガラス繊維をクロロホルム、アセトンおよび水でそれぞれ洗浄し乾燥してアミノカリックスアレーン単分子層を形成した。同一の方法により他のアミノカリックスアレーン誘導体単分子層を製造した。
【実施例２】
【００２１】
５，１１，１７，２３−テトラベンジルイミンアルコキシカリックス[４]アレーン（ＴＢＩＣＯＣＡ）が溶解されている溶液を適用してアミン変性されたガラス繊維を変性する方法（既に知られている方法に従う）
ＣＨＣｌ３のような有機溶媒に化学式２の誘導体中で５，１１，１７，２３−テトラベンジルイミンアルコキシカリックス[４]アレーン（ＴＢＩＣＯＣＡ）を０.１〜５.０ｍＭ濃度で溶かした溶液を製造した。図３に示したところのように、アミン作用基が付着されたガラス繊維（アミンガラス繊維基質）を製造された溶液に１−２４時間の間浸けた後、これをクロロホルム、アセトンおよび水でそれぞれ洗浄し乾燥してイミンカリックスアレーン単分子層を形成した。同一の方法により他のイミンカリックスアレーン誘導体単分子層を製造した。
【実施例３】
【００２２】
変性されたガラス繊維を用いた多種遺伝子の遺伝型分析のためのオリゴＤＮＡ固定化方法
図５に示したオリゴＤＮＡ固定化のためにバイオドット（Ｂｉｏｄｏｔ）分注機装置（モデル名ＸＹＺ ３０５０、アメリカ）を用いた。多種の遺伝子の遺伝型分析のために表１に明記されたように完全に相補的な塩基配列を有するプローブＤＮＡを図５のように固定化した。即ち、連続した９個のグアニン塩基を有するオリゴＤＮＡ３−３０ｐｍｏｌ/μｌをＢＭＴ分注溶液（６００ｍＭアンモニウムイオン溶液）に溶かして、固定化溶液（６００ｍＭアンモニウムイオン溶液；製品名ＢＭＴ ｓｐｏｔｔｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎ−９Ｇ、（株）バイオマトリックステクノロジー社製、韓国）を８セット製造した。上記固定化溶液を分注ノズルを用いて５−５０ｍｍ/ｓｅｃの速度で分注した。実施例１および実施例２の方法により、変性されたガラス基質（ガラス繊維）上に、図４に示されたところのようにアミノカリックスアレーン誘導体単分子層またはイミンカリックスアレーン誘導体単分子層を形成した。次に、オリゴＤＮＡを製造されたガラス基質上に幅０.５−５ｍｍの線状に固定化した。常温で１−４時間の間固定化した後、ガラス繊維を洗浄し、オリゴＤＮＡが固定化していない位置をブロッキング（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）するために、洗浄されたガラス繊維を２５０ｍｌのＢＭＴブロッキング溶液（１ｘ〜４ｘＳＳＣ、０.１−５.０％カゼイン（ｃａｓｅｉｎｅ）；製品名ＢＭＴ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎ−９Ｇ、（株）バイオマトリックステクノロジー社製、韓国）に１０−３０分間浸漬させた（ｉｍｍｅｒｓｅ）。
【００２３】
【表１】
【実施例４】
【００２４】
蛍光標識された標的ＤＮＡとのハイブリダイゼーションを用いる遺伝子検出方法
蛍光標識された標的ＤＮＡとのハイブリダイゼーションのために、１.５ｍｌチューブに表１に明記された蛍光標識した標的ＤＮＡ５μｌとＢＭＴ ｈｙｂ−ｍｉｘＡ（６ｘＳＳＣ、２０％ｆｏｒｍａｍｉｄｅ、０.０５％ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、製品名ＢＭＴ Ｈｙｂ−ｓｏｌｕｔｉｏｎ−９Ｇ、（株）バイオマトリックステクノロジー社製、韓国）７５μｌを入れて８０μｌの混合溶液を製造した。次に、製造された混合溶液を組立てられたストリップのサンプル注入口に注入した。次に、室温（２０±５℃）で５−５０分間ハイブリダイゼーションを進行させた。ハイブリダイゼーションが完了した後、ストリップに０.１ｘ〜４ｘＳＳＣ溶液１００〜３００μｌを注入し、ストリップを分離した。次に、ガラス繊維をスライドに付着してマイクロアレイヤースキャナー（ＧＳＩ Ｌｕｍｏｎｉｃｓ、アメリカ）または線形（ｌｉｎｅａｒ）スキャナーを用いて蛍光強度を定量的に分析した。図５は線形スキャナーを用いて得られた実際の結果を例示する。上記結果はオリゴＤＮＡが固定化されたガラス繊維が製造され、多種の遺伝子を表面変性されたガラス繊維上に適用して蛍光標識された標的ＤＮＡを含む溶液をガラス繊維を上に流し、溶液中の遺伝子と多種の固定化されたオリゴＤＮＡがハイブリダイズされ、これにより上記ガラス繊維を用いて特定遺伝型が溶液に含まれているか否かを特定できるということを示す。
【実施例５】
【００２５】
表面変性されたガラス繊維を用いた特定遺伝型検出試験
図６に示されたオリゴＤＮＡ固定化でバイオドット（Ｂｉｏｄｏｔ）分注機装置（モデル名ＸＹＺ ３０５０、アメリカ）を用いた。非特異的蛍光発現を同時に確認するために表２に示したような完全に相補的な塩基配列を有するプローブオリゴＤＮＡと非相補的なプローブオリゴＤＮＡを図４の方法により図６の形態に固定化した。実施例３と同じ組成の固定化溶液と分注方法を用いてＤＮＡが固定化されたガラス繊維を製造した。
【００２６】
【表２】
蛍光標識されたプライマーあるいはＰＣＲ産物を塗布し、ガラス繊維に固定化されたＤＮＡとハイブリダイズされたか否かを確認するために、上記で製造したガラス繊維基質を図１０に示したようなストリップに組立てた。ハイブリダイゼーションのために、１.５ｍｌチューブに蛍光標識された標的ＤＮＡ５μｌとＢＭＴ ｈｙｂ−ｍｉｘＡ７５μｌを入れて８０μｌの混合溶液を製造した。次に、製造された溶液を組立てられたストリップのサンプル注入口に注入した。次に、常温（２０±５℃）で５−５０分間ハイブリダイゼーションを進行させた。ハイブリダイゼーションが完了した後、ストリップに０.１ｘ〜４ｘＳＳＣ溶液１００〜３００μｌを注入してストリップを分離した。次に、ガラス繊維をスライドに付着してマイクロアレイヤースキャナー（ＧＳＩ Ｌｕｍｏｎｉｃｓ、アメリカ）を用いて蛍光強度を定量的に分析した。図６は実際の実験結果を示す。上記結果は所望の塩基配列を有する線でのみ蛍光が発現することとなり、毛細管現像（ｃａｐｉｌｌａｒｙ ａｃｔｉｏｎ）、微細流体力学的流れ（ｍｉｃｒｏｆｌｕｄｉｃｓ）、側方流動流れ（ｌａｔｅｒａｌ ｆｌｏｗ）等を利用して遺伝子がガラス繊維上を流れると、相補的な塩基配列を有する標的ＤＮＡが特異的に検出されることを示す。
【実施例６】
【００２７】
ガラス繊維の表面に固定化できる遺伝子の理論的な最大量との比較実験
ガラス繊維の表面に固定化できるＤＮＡの理論的な最大量との比較実験のために、実施例３のような方法で相補的な塩基配列を有する連続したグアニン塩基を有するプローブＤＮＡを製造して５本の線の形態で変性されたガラス繊維上に適用した。蛍光標識されたプライマーあるいはＰＣＲ産物を塗布しガラス繊維に固定化したＤＮＡとハイブリダイズされたか否かを確認するために、上記で製造されたガラス繊維基質を図７の模式図や図１０の写真と同様の形態のストリップに組立てた。ハイブリダイゼーションを実施例４と同じ方法で進行した。次に、ハイブリダイゼーションが完了した後、ガラス繊維をストリップから取り外した。次に、マイクロアレイヤースキャナー（ＧＳＩ Ｌｕｍｏｎｉｃｓ、アメリカ）を用いて蛍光強度を定量的に分析して実験データを得た。また、この実験データと表面に固定化できる遺伝子の理論的な最大量とを比較するために、蛍光標識された遺伝子を表面に固定化できる理論的な最大量である１ｘの濃度で含む溶液を製造した。次に、上記溶液を１/３ずつ希釈して１/３、１/９、１/２７、１/８１倍に希釈された溶液を製造した。次に、それぞれの溶液を分注機を用いてガラス繊維上に線形に適用し、ガラス繊維を乾燥させた。蛍光検出器を用いて結果を読取った。図９は実際の結果を示す。
【実施例７】
【００２８】
上記変性ガラス繊維のメンブレイン上でプローブＤＮＡと核酸増幅遺伝子がハイブリダイズされて表れた線を蛍光で検出する方法
イ）標準物質を用いてＰＣＲによる結果物を用いる遺伝型確認実験
本実施例において用いられた標準物質はＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から購入し、次のとおりである：
Ｐｒｏｂｅ−１（ＡＴＣＣ ４５１５０）
Ｐｒｏｂｅ−２（ＡＴＣＣ ４５１５１）
Ｐｒｏｂｅ−３（ＡＴＣＣ ４５１５２）
Ｐｒｏｂｅ−４（ＡＴＣＣ ４５１１３）
上記の中で鋳型としてプラスミド（ｐｌａｓｍｉｄ）ＤＮＡ、および表３のプライマーを用いて、次のようにＰＣＲを行った。ＰＣＲに用いられたプライマーは注文によって（株）バイオニア（Ｂｉｏｎｅｅｒ Ｃｏ．Ｌｔｄ．；韓国）社で合成された。ＰＣＲ実験は（株）バイオニア社から購入したＰＣＲバッファー（ｂｕｆｆｅｒ）１０μｌ、ＭｇＣｌ２ １.５ｍＭ、ｄＮＴＰ ２５０ｕＭ、ＫＣｌ ３０ｍＭ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９.０）１０ｍＭ、Ｔａｑ重合酵素（１ｕｎｉｔ）とプライマー１μｌ（１０ｐｍｏｌ/μｌ）、蒸溜水７μｌ、鋳型ＤＮＡ１μｌを含む反応液を９４℃で５分間１回、９４℃で１分−４５℃で４５秒−７２℃で１分を３５回繰り返し、７２℃で５分間１回の条件で進行した。次に、最終反応液５μｌをＤＮＡスタンダードマーカー（ｓｉｚｅ ｓｔａｎｄａｒｄ ｍａｋｅｒ）と共に２％アガロースゲル（ａｇａｒｏｓｅ ｇｅｌ）に加えて電気泳動した。この際に、電気泳動ゲルを０.００００５％エチジウムブロマイド（ｅｔｈｉｄｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ）溶液で染色した。ゲルの各経路上で出現したバンドの有効如何は ＵＶ を用いて確認した。
【００２９】
【表３】
ロ）蛍光標識されたＰＣＲ結果物を適用してガラス繊維に固定化したプローブＤＮＡとハイブリダイズさせてから、蛍光を用いて分析する方法
図４に示されたプローブＤＮＡ固定化にはバイオドット（Ｂｉｏｄｏｔ）分注機装置（モデル名ＸＹＺ ３０５０、アメリカ）を用いた。表４に明記されているｐｒｏｂｅ１、ｐｒｏｂｅ２、ｐｒｏｂｅ３、ｐｒｏｂｅ４、ＨＣ（Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｃｏｎｔｒｏｌ）を含み連続した９個のグアニン塩基を有するプローブオリゴＤＮＡを７−３０ｐｍｏｌ/μｌでＢＭＴ分注溶液（１００ｍＭアンモニウムイオン溶液）に溶かして固定化溶液を製造した。上記固定化溶液を分注ノズルを用いて２０ｍｍ/ｓｅｃ（０.７ｕｌ/Ｃｍ）の速度で分注し、（株）バイオマトリックステクノロジー社で製造した変性されたガラス繊維に適用した。プローブオリゴＤＮＡを厚さ０.２−３.０ｍｍの線形バンドに塗布して自然に固定化させた。常温で１−２４時間の間固定化を行った。次に、オリゴＤＮＡが固定化していない位置をブロッキング（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）するために、ガラス繊維洗浄後、２５０ｍｌのＢＭＴブロッキング溶液（４ｘＳＳＣ、１％ カゼイン、０.５％ ポリエチレングリコール含む）に入れて１０−３０分間処理して４０−５０℃培養器（ｉｎｃｕｂａｔｏｒ）で３０分−４時間乾燥させ図１０に示したストリップを製造した。
【００３０】
【表４】
ハ）蛍光標識されたＰＣＲ結果物を適用してガラス繊維に固定化したＤＮＡとハイブリダイズした後蛍光を用いて物質分析する方法
蛍光標識されたプライマーまたはＰＣＲ産物をガラス繊維に固定化されＤＮＡとハイブリダイズさせた後、特定遺伝子の結合有無を確認するために、実施例２で製造したガラス繊維基質を実施例７−ロ）のような方法でプローブオリゴＤＮＡが固定化したガラス繊維あるいはストリップを図１０のような形態のケースに組立てた。次に、ＰＣＲ産物をガラス繊維に展開させて特定遺伝子の存在有無を確認した。展開溶液の製造のために１.５ｍｌチューブに実施例７−イ）で製造されたＰＣＲ結果物５μｌとＢＭＴ ｈｙｂ−ｍｉｘ Ａ ７５μｌを入れて混合溶液８０μｌを製造した。次に、上記のように製造された溶液を１００℃の水で３分間加熱し、氷の上に３分間放置して冷却した。次に、混合溶液８０μｌを組立てられたストリップのサンプル注入口に注入した。次に、ストリップを常温（２０〜３０℃）で３−１２０分間放置して、溶液が展開されてハイブリダイゼーションが進行されるようにした。次に、ＢＭＴ Ｗａ−Ｂ−２（４ｘＳＳＣ）溶液を１００μｌ注入して５分後、ストリップを分離した。次に、ガラス繊維（ストリップ）をスライドに取り付けた後、マイクロアレイヤースキャナー（ＧＳＩ Ｌｕｍｏｎｉｃｓ、アメリカ）を用いて蛍光強度を定量的に分析した。分析した結果は図１１乃至図１６の上側部分にストリップ形態で示されている。図１１乃至図１６の中間部分のグラフはＢＭＴでストリップ分析用として用いられるＢＭＴ ＨＰＶ ｓｔｒｉｐ ｒｅａｄｅｒ ｔｙｐｅ−１を用いて分析した結果である。図面において明らかに分かるように、プローブＤＮＡ遺伝子に相補的な増幅した遺伝子を含んでいるサンプルの場合には、相補的なプローブオリゴＤＮＡが固定化されたバンド（線）で特異的なハイブリダイゼーションが起こり、同時にＨＣ領域でもハイブリダイゼーションが進行されてサンプルの分注有無を確認することができる。一方、他の型のプローブＤＮＡの位置ではハイブリダイゼーションが全く生じなかった。即ち、図面は高い選択性と低い非特異的ハイブリダイゼーションの割合を有する、ＰＣＲによって増幅された遺伝子の遺伝型分析を可能とするストリップ型遺伝子チップが開発されて機能する結果を示す。
【００３１】
本発明は化学式１のアミノカリックスアレーン誘導体と化学式２のイミンカリックスアレーン誘導体を用いて単分子層に変性されたガラス繊維およびガラス繊維製造方法、ＤＮＡを固定化した変性ガラス繊維およびその製造方法、そしてＤＮＡが固定化されたガラス繊維を用いた遺伝型分析用ストリップ製造方法を含む、ＤＮＡが固定化されたガラス繊維表面変性技術を世界で初めて開示する。本発明は従来の高価なスキャナーを用いることで発生する費用問題を解決し、使用上の複雑さを解消することにより簡便性を提供し、溶液を均等に展開させる結果、再現性を確保する等、既存技術を画期的に改善した。
【００３２】
ガラス繊維はラピッドキットに用いられるＮＣメンブレインのように、溶液が特定速度で一定に展開される特性を有する。従って、ガラス繊維の表面にオリゴＤＮＡが固定化していれば、特定の速度で展開される溶液に含まれた遺伝子が均等に固定化されたＤＮＡ間を一定の速度で通過すると同時にハイブリダイゼーションが進行され、サンプルのローディング（ｌｏａｄｉｎｇ）以外にはユーザーによる操作を必要としないストリップ形態の製品製造が可能となる。本発明は試験結果の再現性を画期的に高め、利便性を向上させることができる。このような効果を達成するために、本発明者はガラス繊維表面にＤＮＡが固定化するようにガラス繊維の表面を変性する技術を開発した。従って、本発明は従来のガラススライド変性技術を改善して、オリゴＤＮＡが高密度で固定化するガラス繊維製造技術を世界で初めて確立した。また、本発明はオリゴＤＮＡが固定化したガラス繊維を用いる遺伝型分析ストリップの製造技術を確保した。この技術によって製造されたストリップは、既存のオリゴＤＮＡチップの製造および使用の際に現われていた試験結果の再現性の不十分さ、ユーザーによる試験結果の変化のような問題点を解決できるだけでなく、数万ドルの高価な分析機を用いずに低価格の分析機のみで遺伝型分析が可能なガラス繊維に基づいたストリップ形態のＤＮＡチップの製造技術を提供することができる。本発明は、既存のガラススライドに基づいた遺伝子チップの製造および使用上において現われていた全ての問題点を大部分解決することができる。即ち、本発明は既存のＤＮＡチップの使用上の問題点を解決し、多様な形態の遺伝型分析を用いた診断を可能とすることができるという点で重要である。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
図１および図２は、論文（Ｌａｎｇｍｕｉｒ、１９９６年、Ｖｏｌ １２、ｐｐ５３３８−５３４２）に発表された方法により表面をアミンで変性させたガラス繊維の模式図、および化学式１または２の誘導体とアミン−変性されたガラス繊維を結合して超分子単分子層の製造方法を示す模式図である。
図３は、実際の製造に用いられたガラス繊維（フュージョン５、イギリスのＷｈａｔｍａｎ社）写真、拡大写真および模式図である。本発明において用いられるガラス繊維（イギリスのＷｈａｔｍａｎ社、アメリカのＷａｔｅｒ社およびＭｉｌｌｉｐｏｒｅ社の製品等を含む）は、ガラス材質を１０ｎｍから数百μｍに達する直径を有する細いガラス繊維に紡いだ後、メンブレイン形態に製織して得ることができる。従って、上記繊維は繊維の一端に適用された溶媒が重力、毛細管現像、微細流体力学的流れ（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）の力またはこれらの２つ以上の組合せにより展開される特性を有している。本特許は、ガラス繊維の上記のような特性を利用するものである。
【００３４】
図４は、分注機等を用いて連続したグアニン塩基を有するオリゴＤＮＡが溶けている溶液を超分子単分子層に変性されたガラス繊維上に特定の幅を有する線形に分注することにより、オリゴＤＮＡが固定化されたガラス繊維の製造過程を示す模式図である。
図５は、実際の実験結果を示す。本実験において、連続したグアニン塩基を有するオリゴＤＮＡが線形に塗布され多数のオリゴＤＮＡが多重線の形態に固定化されたガラス繊維に、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって得られ蛍光標識された増幅遺伝子を含む溶液を適用する場合、溶液は自然に展開し、固定化したプローブオリゴＤＮＡと相補的な遺伝型を有する遺伝子がハイブリダイゼーションによって結合される。本実験においては蛍光標識された遺伝子を用いて蛍光強度を測定することで結合された遺伝子を確認した。
図６は、多数のオリゴＤＮＡが線状に塗布され固定化されたガラス繊維に蛍光標識された遺伝子を含む溶液を流した後、蛍光スキャナーを用いて分析することで得られた実際の実験結果である。検出しようとする塩基配列と一致するところにおいては蛍光が強く発現し、そうでないところには蛍光発現が全く示されない。従って、本実験においては塩基配列が一致するところでのみ蛍光標識された遺伝子が検出されることが示された。
【００３５】
図７は、多数のオリゴＤＮＡが固定化されているガラス繊維をストリップ内に位置させた後に蓋をして製造されたストリップの模式図である。このストリップのサンプル注入口にＰＣＲによって得られた増幅遺伝子を含む溶液を注入し、図５および図６に示すような遺伝子ハイブリダイゼーション結果を得た。結果は主に分光分析により分析した。
図８は、溶液が展開される図７の過程の後、分光分析で結果を分析する方法を示す模式図である。図８は図７と同様に多種のオリゴＤＮＡが線状に固定化されたガラス繊維をストリップ内部に位置させ、サンプル注入口を通じて多様な遺伝子を含む溶液を注入し、一定時間を経た後、目視または光学機器を用いて各線状に付着した遺伝子の量を観察し、これを信号の大きさで表す過程を示す。このような信号の大きさの差異を用いて溶液中に存在する遺伝子の遺伝型を判別することができる。蛍光を検出することで得られる実際の実験結果は図６に示されている。図６から、遺伝型が一致する場合にのみ相当な水準の蛍光が検出されることを確認することができる。
【００３６】
図９はハイブリダイゼーションすることのできる蛍光標識された遺伝子が理論上の最大量で塗布され乾燥される場合に得られる蛍光強度と、実際に固定化したＤＮＡのハイブリダイゼーションで得られた蛍光強度とを比較する実際の実験結果を示す。ここで、ハイブリダイズできる蛍光標識された遺伝子の理論的な最大量は、線状にＤＮＡを固定化する場合には、連続したグアニン塩基を有しガラス繊維の表面に固定化できるオリゴＤＮＡの最大量を計算し、次にそれらとハイブリダイズできる蛍光標識された遺伝子の最大量を計算することにより得ることができる。ここでは、蛍光標識された遺伝子が固定化されたオリゴＤＮＡと１：１の割合でハイブリダイゼーションをすると仮定して計算した（理論的最大値、即ちｘ１から蛍光強度の減少を確認するために、ｘ１/３、ｘ１/９等のように減少された遺伝子濃度を用いて蛍光強度を測定することができる）。一方、蛍光標識された遺伝子と実際に固定化したＤＮＡとのハイブリダイゼーション実験結果は５本の線で繰り返し確認された。実験により得た蛍光強度は理論的な最大蛍光強度の１/３の水準であり、本発明が極めて優れた遺伝子固定化およびハイブリダイゼーション結果を達成したという点を示す。
【００３７】
図１０は図７と図８において用いられたものと同様のサンプル注入口を有する組立てられたストリップの形態を示す写真である。
図１１乃至図１６は、実施例７と同様に、互いに異なる遺伝型のプローブオリゴＤＮＡが固定化されている変性ガラス繊維を図１０に示したようなストリップに組立て、蛍光標識された増幅遺伝子をストリップ上で展開した後、結果を蛍光スキャナーで読取った結果である。図１１乃至図１４は、一つのプローブ遺伝型に相補的な核酸増幅遺伝子を塗布する場合に得られる結果を示し、図１５および図１６は２つ以上のプローブ遺伝型に相補的な核酸増幅遺伝子を塗布して同一の方法で得られた実際の結果を示す。全ての結果は、変性ガラス繊維を用いる遺伝型分析において、遺伝子が選択的にハイブリダイゼーションされ、非特異的な結合は発生しないということを示す。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記化学式１のアミノカリックスアレーン誘導体をアミン変性されたガラス繊維表面に結合させて単分子層を形成することで表面−変性されたガラス繊維：
【化１】
式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ'１、Ｒ'２、Ｒ'３、Ｒ'４、Ｒ'５、Ｒ'６、Ｒ'７、Ｒ'８は互いに独立して−Ｈ、−ＣＨ３、−Ｃ２Ｈ５、−Ｃ３Ｈ７、−ＯＣＨ３、−Ｃｌ、−Ｃ６Ｈ５、−ＯＨ、−ＯＣＨ２ＣＨ３、−Ｂｒ、−ＣＦ３、−ＯＣＨ２Ｃ６Ｈ５、−ＯＣ６Ｈ５、−ＯＣ６Ｈ４ＣＨ３、−ＯＣ６Ｈ４Ｃ（ＣＨ３）３、−ＯＣ６Ｈ４ＣＦ３、−ＯＣ６Ｈ４Ｃｌ、−ＯＣＯＣＨ３、−ＮＨＣＯＣＨ３、−ＣＯＮＨＣＨ３、−ＣＮ、ＣＯＯＨおよび−ＣＯＯＲからなる群より選ばれ、ここで、Ｒは−ＣＨ３または−Ｃ２Ｈ５を示し；
Ｙ１、Ｙ２、Ｙ３およびＹ４は互いに独立して−Ｈ、−（ＣＨ２）ｎ−ＣＨ＝Ｏ、−（ＣＨ２）ｎ−ＳＨ、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ−ＣＨ２ＣＨ２−ＣＨ＝Ｏ、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ−ＣＨ２ＣＨ２−ＳＨ、−（ＣＨ２）ｍ−Ｃ６Ｈ４−（ＣＨ２）Ｃ−Ｚおよび−ＣＯ−（ＣＨ２）ｍ−１−Ｃ６Ｈ４−（ＣＨ２）Ｃ−Ｚからなる群より選ばれ、ここで、ｎ＝２〜１５、ｍ＝１〜１０、ｃ＝０〜１０、Ｚは−ＳＨ、−ＣＨＯ、−ＣＯＯＨおよび−ＮＨ２からなる群より選ばれる基、そして−Ｃ６Ｈ４−と−Ｃ６Ｈ５はフェニル基として定義される。
【請求項２】
下記化学式２のイミンカリックスアレーン誘導体をアミン変性されたガラス繊維表面に結合させて単分子層を形成することで表面−変性されたガラス繊維：
【化２】
式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は互いに独立して−Ｈ、−ＣＨ３、−Ｃ２Ｈ５、−Ｃ３Ｈ７、−ＯＣＨ３、−Ｃｌ、−Ｃ６Ｈ５、−ＯＨ、−ＯＣＨ２ＣＨ３、−Ｂｒ、−ＣＦ３、−ＯＣＨ２Ｃ６Ｈ５、−ＯＣ６Ｈ５、−ＯＣ６Ｈ４ＣＨ３、−ＯＣ６Ｈ４Ｃ（ＣＨ３）３、−ＯＣ６Ｈ４ＣＦ３、−ＯＣ６Ｈ４Ｃｌ、−ＯＣＯＣＨ３、−ＮＨＣＯＣＨ３、−ＣＯＮＨＣＨ３、−ＣＮ、ＣＯＯＨおよび−ＣＯＯＲからなる群より選ばれ、ここで、Ｒは−ＣＨ３または−Ｃ２Ｈ５を示し；
Ｙ１、Ｙ２、Ｙ３およびＹ４は互いに独立して−Ｈ、−（ＣＨ２）ｎ−ＣＨ＝Ｏ、−（ＣＨ２）ｎ−ＳＨ、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ−ＣＨ２ＣＨ２−ＣＨ＝Ｏ、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ−ＣＨ２ＣＨ２−ＳＨ、−（ＣＨ２）ｍ−Ｃ６Ｈ４−（ＣＨ２）Ｃ−Ｚ、および−ＣＯ−（ＣＨ２）ｍ−１−Ｃ６Ｈ４−（ＣＨ２）ｃ−Ｚからなる群より選ばれ、ここで、ｎ＝２〜１５、ｍ＝１〜１０、ｃ＝０〜１０、Ｚは−ＳＨ、−ＣＨＯ、−ＣＯＯＨおよび−ＮＨ２からなる群より選ばれる基、そして−Ｃ６Ｈ４−と−Ｃ６Ｈ５はフェニル基として定義される。
【請求項３】
下記工程を含む、ガラス繊維の表面変性方法：
−アミン作用基が付着したガラス繊維を、請求項１に記載の化学式１の化合物を有機溶媒に溶かした溶液に浸漬させる工程；
−ガラス繊維を上記溶媒で洗浄する工程；および
−ガラス繊維を乾燥させてアミノカリックスアレーン誘導体の単分子層を形成する工程。
【請求項４】
下記工程を含む、ガラス繊維の表面変性方法：
−アミン作用基が付着したガラス繊維を、請求項２に記載の化学式２の化合物を有機溶媒に溶かした溶液に浸漬させる工程；
−ガラス繊維を上記溶媒で洗浄する工程；および
−ガラス繊維を乾燥させてイミンカリックスアレーン誘導体の単分子層を形成する工程。
【請求項５】
連続したグアニン塩基を有するオリゴＤＮＡがアミノカリックスアレーン誘導体の単分子層に固定化された、請求項１に記載のガラス繊維。
【請求項６】
連続したグアニン塩基を有するオリゴＤＮＡがイミンカリックスアレーン誘導体の単分子層に固定化された、請求項２に記載のガラス繊維。
【請求項７】
下記工程を含む、ガラス繊維の製造方法：
−連続したグアニン塩基を有するオリゴＤＮＡを分注溶液に溶解させて固定化溶液を製造する工程；
−前記固定化溶液を分注して請求項１に記載のアミノカリックスアレーン単分子層により表面変性されたガラス繊維上に塗布する工程；および
−オリゴＤＮＡを前記ガラス繊維の表面上に固定化する工程。
【請求項８】
下記工程を含む、ガラス繊維の製造方法：
−連続したグアニン塩基を有するオリゴＤＮＡを分注溶液に溶解させて固定化溶液を製造する工程；
−前記固定化溶液を分注して請求項２に記載のイミンカリックスアレーン単分子層により表面変性されたガラス繊維上に塗布する工程；および
−オリゴＤＮＡを前記ガラス繊維の表面上に固定化する工程。
【請求項９】
前記オリゴＤＮＡが、増幅核酸を有し蛍光標識された遺伝子を含む溶液を展開させることにより、特定塩基配列を有する遺伝子の存在を特定可能なオリゴＤＮＡである、請求項５に記載のガラス繊維。
【請求項１０】
前記オリゴＤＮＡが、増幅核酸を有し蛍光標識された遺伝子を含む溶液を展開させることにより、特定塩基配列を有する遺伝子の存在を特定可能なオリゴＤＮＡである、請求項６に記載のガラス繊維。
【請求項１１】
前記特定塩基配列がウイルスの遺伝型である、請求項９に記載のガラス繊維。
【請求項１２】
前記特定塩基配列がウイルスの遺伝型である、請求項１０に記載のガラス繊維。
【請求項１３】
下記工程を含む、特定塩基配列を有する遺伝子の存在有無を確認することができる遺伝型分析方法：
−請求項５に記載のガラス繊維上に、増幅核酸を含み蛍光標識された遺伝子を含有する溶液を展開する工程；および
−特定塩基配列をもつ遺伝子を、ハイブリダイゼーションによって、ガラス繊維の表面に固定化され前記遺伝子と相補的なプローブオリゴＤＮＡと結合する工程。
【請求項１４】
下記工程を含む、特定塩基配列を有する遺伝子の存在有無を確認することができる遺伝型分析方法：
−請求項６に記載のガラス繊維上に、増幅核酸を含み蛍光標識された遺伝子を含有する溶液を展開する工程；および
−特定塩基配列をもつ遺伝子を、ハイブリダイゼーションによって、ガラス繊維の表面に固定化され前記遺伝子と相補的なプローブオリゴＤＮＡと結合する工程。
【請求項１５】
前記特定塩基配列がウイルスの遺伝型である、請求項１３に記載の遺伝型分析方法。
【請求項１６】
前記特定塩基配列がウイルスの遺伝型である、請求項１４に記載の遺伝型分析方法。
【請求項１７】
特定塩基配列を有する遺伝子が４℃乃至６０℃の温度でハイブリダイゼーションによって結合される、請求項１３に記載の遺伝型分析方法。
【請求項１８】
特定塩基配列を有する遺伝子が４℃乃至６０℃の温度でハイブリダイゼーションによって結合される、請求項１４に記載の遺伝型分析方法。
【請求項１９】
連続したグアニン塩基を有するオリゴＤＮＡを一種類以上含む請求項５に記載のガラス繊維を含み、オリゴＤＮＡが固定化していないガラス繊維部分にサンプル注入口が形成された、遺伝型分析用ストリップ。
【請求項２０】
連続したグアニン塩基を有するオリゴＤＮＡを一種類以上含む請求項６に記載のガラス繊維を含み、オリゴＤＮＡが固定化していないガラス繊維部分にサンプル注入口が形成された、遺伝型分析用ストリップ。
【請求項２１】
請求項１９に記載の遺伝型分析用ストリップをラピッドストリップ形態で含む、遺伝型分析用キット。
【請求項２２】
請求項２０に記載の遺伝型分析用ストリップをラピッドストリップ形態で含む、遺伝型分析用キット。
【請求項２３】
下記工程を含む、特定塩基配列を有する遺伝子の存在有無を確認することができる遺伝型分析方法：
−請求項１９に記載の遺伝型分析用ストリップのサンプル注入口から、増幅核酸を含み蛍光標識された遺伝子を含む溶液を注入する工程；
−前記溶液をガラス繊維上に展開する工程；および
−特定塩基配列を有する遺伝子を、ハイブリダイゼーションにより、ガラス繊維の表面に固定化され前記遺伝子と相補的なプローブオリゴＤＮＡと結合する工程。
【請求項２４】
下記工程を含む、特定塩基配列を有する遺伝子の存在有無を確認することができる遺伝型分析方法：
−請求項２０に記載の遺伝型分析用ストリップのサンプル注入口から、増幅核酸を含み蛍光標識された遺伝子を含む溶液を注入する工程；
−前記溶液をガラス繊維上に展開する工程；および
−特定塩基配列を有する遺伝子を、ハイブリダイゼーションにより、ガラス繊維の表面に固定化され前記遺伝子と相補的なプローブオリゴＤＮＡと結合する工程。
【請求項２５】
特定塩基配列を有する遺伝子が４℃乃至６０℃の温度でハイブリダイゼーションによって結合される、請求項２３に記載の遺伝型分析方法。
【請求項２６】
特定塩基配列を有する遺伝子が４℃乃至６０℃の温度でハイブリダイゼーションによって結合される、請求項２４に記載の遺伝型分析方法。
【請求項２７】
前記方法が光学的分析法を用いて、結合された特定塩基配列を有する遺伝子の総量を測定する工程を更に含む、請求項１３に記載の遺伝型分析方法。
【請求項１】
下記化学式１のアミノカリックスアレーン誘導体をアミン変性されたガラス繊維表面に結合させて単分子層を形成することで表面−変性されたガラス繊維：
【化１】
式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ'１、Ｒ'２、Ｒ'３、Ｒ'４、Ｒ'５、Ｒ'６、Ｒ'７、Ｒ'８は互いに独立して−Ｈ、−ＣＨ３、−Ｃ２Ｈ５、−Ｃ３Ｈ７、−ＯＣＨ３、−Ｃｌ、−Ｃ６Ｈ５、−ＯＨ、−ＯＣＨ２ＣＨ３、−Ｂｒ、−ＣＦ３、−ＯＣＨ２Ｃ６Ｈ５、−ＯＣ６Ｈ５、−ＯＣ６Ｈ４ＣＨ３、−ＯＣ６Ｈ４Ｃ（ＣＨ３）３、−ＯＣ６Ｈ４ＣＦ３、−ＯＣ６Ｈ４Ｃｌ、−ＯＣＯＣＨ３、−ＮＨＣＯＣＨ３、−ＣＯＮＨＣＨ３、−ＣＮ、ＣＯＯＨおよび−ＣＯＯＲからなる群より選ばれ、ここで、Ｒは−ＣＨ３または−Ｃ２Ｈ５を示し；
Ｙ１、Ｙ２、Ｙ３およびＹ４は互いに独立して−Ｈ、−（ＣＨ２）ｎ−ＣＨ＝Ｏ、−（ＣＨ２）ｎ−ＳＨ、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ−ＣＨ２ＣＨ２−ＣＨ＝Ｏ、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ−ＣＨ２ＣＨ２−ＳＨ、−（ＣＨ２）ｍ−Ｃ６Ｈ４−（ＣＨ２）Ｃ−Ｚおよび−ＣＯ−（ＣＨ２）ｍ−１−Ｃ６Ｈ４−（ＣＨ２）Ｃ−Ｚからなる群より選ばれ、ここで、ｎ＝２〜１５、ｍ＝１〜１０、ｃ＝０〜１０、Ｚは−ＳＨ、−ＣＨＯ、−ＣＯＯＨおよび−ＮＨ２からなる群より選ばれる基、そして−Ｃ６Ｈ４−と−Ｃ６Ｈ５はフェニル基として定義される。
【請求項２】
下記化学式２のイミンカリックスアレーン誘導体をアミン変性されたガラス繊維表面に結合させて単分子層を形成することで表面−変性されたガラス繊維：
【化２】
式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は互いに独立して−Ｈ、−ＣＨ３、−Ｃ２Ｈ５、−Ｃ３Ｈ７、−ＯＣＨ３、−Ｃｌ、−Ｃ６Ｈ５、−ＯＨ、−ＯＣＨ２ＣＨ３、−Ｂｒ、−ＣＦ３、−ＯＣＨ２Ｃ６Ｈ５、−ＯＣ６Ｈ５、−ＯＣ６Ｈ４ＣＨ３、−ＯＣ６Ｈ４Ｃ（ＣＨ３）３、−ＯＣ６Ｈ４ＣＦ３、−ＯＣ６Ｈ４Ｃｌ、−ＯＣＯＣＨ３、−ＮＨＣＯＣＨ３、−ＣＯＮＨＣＨ３、−ＣＮ、ＣＯＯＨおよび−ＣＯＯＲからなる群より選ばれ、ここで、Ｒは−ＣＨ３または−Ｃ２Ｈ５を示し；
Ｙ１、Ｙ２、Ｙ３およびＹ４は互いに独立して−Ｈ、−（ＣＨ２）ｎ−ＣＨ＝Ｏ、−（ＣＨ２）ｎ−ＳＨ、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ−ＣＨ２ＣＨ２−ＣＨ＝Ｏ、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ−ＣＨ２ＣＨ２−ＳＨ、−（ＣＨ２）ｍ−Ｃ６Ｈ４−（ＣＨ２）Ｃ−Ｚ、および−ＣＯ−（ＣＨ２）ｍ−１−Ｃ６Ｈ４−（ＣＨ２）ｃ−Ｚからなる群より選ばれ、ここで、ｎ＝２〜１５、ｍ＝１〜１０、ｃ＝０〜１０、Ｚは−ＳＨ、−ＣＨＯ、−ＣＯＯＨおよび−ＮＨ２からなる群より選ばれる基、そして−Ｃ６Ｈ４−と−Ｃ６Ｈ５はフェニル基として定義される。
【請求項３】
下記工程を含む、ガラス繊維の表面変性方法：
−アミン作用基が付着したガラス繊維を、請求項１に記載の化学式１の化合物を有機溶媒に溶かした溶液に浸漬させる工程；
−ガラス繊維を上記溶媒で洗浄する工程；および
−ガラス繊維を乾燥させてアミノカリックスアレーン誘導体の単分子層を形成する工程。
【請求項４】
下記工程を含む、ガラス繊維の表面変性方法：
−アミン作用基が付着したガラス繊維を、請求項２に記載の化学式２の化合物を有機溶媒に溶かした溶液に浸漬させる工程；
−ガラス繊維を上記溶媒で洗浄する工程；および
−ガラス繊維を乾燥させてイミンカリックスアレーン誘導体の単分子層を形成する工程。
【請求項５】
連続したグアニン塩基を有するオリゴＤＮＡがアミノカリックスアレーン誘導体の単分子層に固定化された、請求項１に記載のガラス繊維。
【請求項６】
連続したグアニン塩基を有するオリゴＤＮＡがイミンカリックスアレーン誘導体の単分子層に固定化された、請求項２に記載のガラス繊維。
【請求項７】
下記工程を含む、ガラス繊維の製造方法：
−連続したグアニン塩基を有するオリゴＤＮＡを分注溶液に溶解させて固定化溶液を製造する工程；
−前記固定化溶液を分注して請求項１に記載のアミノカリックスアレーン単分子層により表面変性されたガラス繊維上に塗布する工程；および
−オリゴＤＮＡを前記ガラス繊維の表面上に固定化する工程。
【請求項８】
下記工程を含む、ガラス繊維の製造方法：
−連続したグアニン塩基を有するオリゴＤＮＡを分注溶液に溶解させて固定化溶液を製造する工程；
−前記固定化溶液を分注して請求項２に記載のイミンカリックスアレーン単分子層により表面変性されたガラス繊維上に塗布する工程；および
−オリゴＤＮＡを前記ガラス繊維の表面上に固定化する工程。
【請求項９】
前記オリゴＤＮＡが、増幅核酸を有し蛍光標識された遺伝子を含む溶液を展開させることにより、特定塩基配列を有する遺伝子の存在を特定可能なオリゴＤＮＡである、請求項５に記載のガラス繊維。
【請求項１０】
前記オリゴＤＮＡが、増幅核酸を有し蛍光標識された遺伝子を含む溶液を展開させることにより、特定塩基配列を有する遺伝子の存在を特定可能なオリゴＤＮＡである、請求項６に記載のガラス繊維。
【請求項１１】
前記特定塩基配列がウイルスの遺伝型である、請求項９に記載のガラス繊維。
【請求項１２】
前記特定塩基配列がウイルスの遺伝型である、請求項１０に記載のガラス繊維。
【請求項１３】
下記工程を含む、特定塩基配列を有する遺伝子の存在有無を確認することができる遺伝型分析方法：
−請求項５に記載のガラス繊維上に、増幅核酸を含み蛍光標識された遺伝子を含有する溶液を展開する工程；および
−特定塩基配列をもつ遺伝子を、ハイブリダイゼーションによって、ガラス繊維の表面に固定化され前記遺伝子と相補的なプローブオリゴＤＮＡと結合する工程。
【請求項１４】
下記工程を含む、特定塩基配列を有する遺伝子の存在有無を確認することができる遺伝型分析方法：
−請求項６に記載のガラス繊維上に、増幅核酸を含み蛍光標識された遺伝子を含有する溶液を展開する工程；および
−特定塩基配列をもつ遺伝子を、ハイブリダイゼーションによって、ガラス繊維の表面に固定化され前記遺伝子と相補的なプローブオリゴＤＮＡと結合する工程。
【請求項１５】
前記特定塩基配列がウイルスの遺伝型である、請求項１３に記載の遺伝型分析方法。
【請求項１６】
前記特定塩基配列がウイルスの遺伝型である、請求項１４に記載の遺伝型分析方法。
【請求項１７】
特定塩基配列を有する遺伝子が４℃乃至６０℃の温度でハイブリダイゼーションによって結合される、請求項１３に記載の遺伝型分析方法。
【請求項１８】
特定塩基配列を有する遺伝子が４℃乃至６０℃の温度でハイブリダイゼーションによって結合される、請求項１４に記載の遺伝型分析方法。
【請求項１９】
連続したグアニン塩基を有するオリゴＤＮＡを一種類以上含む請求項５に記載のガラス繊維を含み、オリゴＤＮＡが固定化していないガラス繊維部分にサンプル注入口が形成された、遺伝型分析用ストリップ。
【請求項２０】
連続したグアニン塩基を有するオリゴＤＮＡを一種類以上含む請求項６に記載のガラス繊維を含み、オリゴＤＮＡが固定化していないガラス繊維部分にサンプル注入口が形成された、遺伝型分析用ストリップ。
【請求項２１】
請求項１９に記載の遺伝型分析用ストリップをラピッドストリップ形態で含む、遺伝型分析用キット。
【請求項２２】
請求項２０に記載の遺伝型分析用ストリップをラピッドストリップ形態で含む、遺伝型分析用キット。
【請求項２３】
下記工程を含む、特定塩基配列を有する遺伝子の存在有無を確認することができる遺伝型分析方法：
−請求項１９に記載の遺伝型分析用ストリップのサンプル注入口から、増幅核酸を含み蛍光標識された遺伝子を含む溶液を注入する工程；
−前記溶液をガラス繊維上に展開する工程；および
−特定塩基配列を有する遺伝子を、ハイブリダイゼーションにより、ガラス繊維の表面に固定化され前記遺伝子と相補的なプローブオリゴＤＮＡと結合する工程。
【請求項２４】
下記工程を含む、特定塩基配列を有する遺伝子の存在有無を確認することができる遺伝型分析方法：
−請求項２０に記載の遺伝型分析用ストリップのサンプル注入口から、増幅核酸を含み蛍光標識された遺伝子を含む溶液を注入する工程；
−前記溶液をガラス繊維上に展開する工程；および
−特定塩基配列を有する遺伝子を、ハイブリダイゼーションにより、ガラス繊維の表面に固定化され前記遺伝子と相補的なプローブオリゴＤＮＡと結合する工程。
【請求項２５】
特定塩基配列を有する遺伝子が４℃乃至６０℃の温度でハイブリダイゼーションによって結合される、請求項２３に記載の遺伝型分析方法。
【請求項２６】
特定塩基配列を有する遺伝子が４℃乃至６０℃の温度でハイブリダイゼーションによって結合される、請求項２４に記載の遺伝型分析方法。
【請求項２７】
前記方法が光学的分析法を用いて、結合された特定塩基配列を有する遺伝子の総量を測定する工程を更に含む、請求項１３に記載の遺伝型分析方法。
【公表番号】特表２０１１−５０２５３１（Ｐ２０１１−５０２５３１Ａ）
【公表日】平成２３年１月２７日（２０１１．１．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５３３９５１（Ｐ２０１０−５３３９５１）
【出願日】平成２０年３月１２日（２００８．３．１２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００８／００１３８１
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０６４０４１
【国際公開日】平成２１年５月２２日（２００９．５．２２）
【出願人】（５０８１１２６１２）バイオメトリックス テクノロジー インコーポレイテッド (2)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年１月２７日（２０１１．１．２７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年３月１２日（２００８．３．１２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００８／００１３８１
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０６４０４１
【国際公開日】平成２１年５月２２日（２００９．５．２２）
【出願人】（５０８１１２６１２）バイオメトリックス テクノロジー インコーポレイテッド (2)
【Ｆターム（参考）】
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