アルツハイマー病のトランスジェニックモデル及び種々の神経変性疾患の治療におけるその使用
本発明によれば、ＡＰＰにおけるＡｓｐ−＞Ａｌａ（Ｄ６６４Ａ）突然変異（これによりカスパーゼによる切断部位の切断が防止される）などの選択された突然変異によって、たとえこうした突然変異によりアルツハイマー病のトランスジェニックモデルにおいてＡβの産生又はアミロイド斑の形成が妨げられなくても、海馬のシナプス消失及び歯状回萎縮の両方が防止されるということが証明される。この発見によって、ＡＰＰのＡｓｐ６６４番における切断を阻止する作用物質を同定する方法（この方法には作用物質同定の目的に有用なトランスジェニック動物も含まれる）、及び神経変性疾患の治療を目的としたそれら物質の使用方法が開発された。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アルツハイマー病の非ヒトトランスジェニックモデル、及びアルツハイマー病の治療に有用な化合物を同定する方法やその化合物を使用する治療方法等を含めた上記トランスジェニックモデルの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
最も良く知られている痴呆性疾患であるアルツハイマー病（ＡＤ）は、脳における老人斑、神経原線維変化、並びにシナプス及びニューロンの消失をその特徴とする。老人斑の主なタンパク性成分はβアミロイドペプチド（Ａβ）であり、Ａβは、その前駆体であるβアミロイド前駆体タンパク（ＡＰＰ）のタンパク分解性切断によって産生される。アミロイド仮説によれば、ＡβによってＡＤ発症にいたるカスケードが開始される。アミロイド毒性の厳密なメカニズムははっきり分かっていないが、シナプスがＡβ傷害の早期易損性部位であるという証拠はそろっている（例えば、Ｓｅｌｋｏｅ，Ｄ．Ｊ．、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２９８号、７８９〜７９１頁、２００２年を参照）。このような見解と一致して、脳内に高レベルのＡβを有するＡＰＰトランスジェニックマウスの一部には、老人斑の形成に先立ち、シナプスの消失、行動の変化、及びシナプス伝達の低下が見られる（Ｈｓｉａ，Ａ．Ｙ．他、米国ナショナルアカデミーオブサイエンス会報（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ）、９６巻、３２２８〜３２３３頁、１９９９年及びＭｕｃｋｅ他、ジャーナルオブニューロサイエンス（Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．）、２０巻、４０５０〜４０５８頁、２０００年を参照）。最近では、ＡＰＰが、アポトーシスを仲介するシステインプロテアーゼであるカスパーゼによって６６４番のＡｓｐ（ＡＰＰの６９５番）においても切断されることが明らかになっている（Ｇｅｒｖａｉｓ，Ｆ．Ｇ．他、セル（Ｃｅｌｌ）、９７巻、３９５〜４０６頁、１９９９年及びＬｕ，Ｄ．Ｃ．他、ネーチャーメデシン（Ｎａｔ Ｍｅｄ）、６巻、３９７〜４０４頁、２０００年を参照）。このようなプロセッシングによって細胞毒性カルボキシ末端ペプチド、ＡＰＰ−Ｃ３１が遊離される。しかし、カスパーゼによるＡＰＰのプロセッシングがＡＤにおいて果たす役割（仮にあるとすれば）については不明である。カスパーゼによる細胞質内切断に伴って起きる細胞毒性ペプチドの生成は、ＤＣＣ（ｄｅｌｅｔｅｄ ｉｎ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ：大腸癌で発現が欠失している）、ＲＥＴ（ｒｅａｒｒａｎｇｅｄ ｄｕｒｉｎｇ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ：トランスフェクション時に再構成した）及びＵＮＣ５Ｈ１−３（ｕｎｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｄ ｇｅｎｅ ５ ｈｏｍｏｌｏｇｕｅｓ １−３ 非協調的遺伝子５相同体１〜３）などの依存性受容体で起きることが証明されている細胞毒性ペプチドの生成と類似しており、このことは、ＡＡＰが依存性受容体の機能を果たしている可能性を示唆するものである（Ｂｒｅｄｅｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ，印刷中２００４）。
【０００３】
したがって、アルツハイマー病などの神経変性疾患の発生においてカスパーゼなどのタンパク分解酵素が果たしている役割を研究することを可能にするトランスジェニックモデルの開発は、非常に重要であると考えられる。また、このようなトランスジェニックモデルが利用できることになれば、神経変性疾患の新規治療方法の開発が促進されると考えられる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明によれば、ＡＰＰにおけるＡｓｐ−＞Ａｌａ（Ｄ６６４Ａ）突然変異（これによりカスパーゼによる切断部位の切断が防止される）などの選択された突然変異によって、たとえアルツハイマー病のトランスジェニックモデルにおいてＡβの産生又はアミロイド斑の形成が妨げられなくても、海馬のシナプス消失及び歯状回萎縮の両方が防止されるということが証明される。
【０００５】
したがって、この発見によって、ＡＰＰのＡｓｐ６６４番における切断を阻止する作用物質を同定する方法（この方法には作用物質同定の目的に有用なトランスジェニック動物も含まれる）及び神経変性疾患の治療を目的としたそれら作用物質の使用方法が開発された。アルツハイマー病などの神経変性疾患の発生において早期に介入することによって、シナプスの働きの回復が容易になり、神経回路網の消失及び神経変性疾患の進行段階の特徴が低減されることになろう。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明によれば、変異型ヒトβアミロイド前駆体タンパク（ＡＰＰ）又はＡＰＰ類似タンパクをコードするヌクレオチド配列を含む非ヒトトランスジェニック動物であって、前記変異型ヒトＡＰＰ又はＡＰＰ類似タンパクが、前記変異型ヒトＡＰＰ又はＡＰＰ類似タンパクをＡｓｐ６６４番における切断に対して耐性とする突然変異を含み、また、前記変異型ヒトＡＰＰ又はＡＰＰ類似タンパクをコードする前記ヌクレオチド配列が、好適なプロモーターと作動可能に結合している非ヒトトランスジェニック動物が提供される。
【０００７】
本発明の１つの態様においては、Ａｓｐ６６４番における切断はプロテアーゼに誘発される。本発明の現在好ましい態様においては、Ａｓｐ６６４番における切断はカスパーゼに誘発される。
【０００８】
本発明の１つの態様においては、変異型ヒトＡＰＰ又はＡＰＰ類似タンパクは６６４番残基に突然変異を含む。元のＡｓｐ以外の６６４番にあるほとんど任意のアミノ酸残基は、カスパーゼなどのプロテアーゼがＡＰＰ又はＡＰＰ類似タンパクの６６４番を切断する能力を低下させることになることは、当業者には認識されている。６６４番の部位における現在好ましい変異には、元のＡｓｐのＡｌａ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ等への変換が含まれる。
【０００９】
本発明の別の態様においては、変異型ヒトＡＰＰ又はＡＰＰ類似タンパクは、６６４番のアミノ酸残基に隣接する１つ又は２つ以上の変異を含み、それによってカスパーゼなどのプロテアーゼがＡＰＰ又はＡＰＰ類似タンパクの６６４番を切断する能力を低下させる。
【００１０】
当業者ならば容易に理解するように、本発明のトランスジェニック動物の発生において採用されるプロモーターは、構成的に活性なプロモーターであっても誘導的なプロモーターであってもよい。好適なプロモーターは当業者には良く知られているが、Ｔ４、Ｔ３、Ｓｐ６及びＴ７ポリメラーゼを認識することができるプロモーター、バクテリオファージラムダのＰＲ及びＰＬプロモーター、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のｔｒｐ、ｒｅｃＡ、熱ショック及びｌａｃＺプロモーター、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のαアミラーゼ及びσ２８特異的プロモーター、桿菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）のバクテリオファージのプロモーター、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）プロモーター、バクテリオファージラムダのｉｎｔプロモーター、ｐＢＲ３２２のβラクトマーゼ遺伝子のｂｌａプロモーター、並びにクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子のＣＡＴプロモーターなどが含まれる。原核生物プロモーターについては、Ｇｌｉｃｋ（ジャーナルオブインダストリアルマイクロバイオロジー（Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．）、１巻、２７７頁、１９８７年）、Ｗａｔｓｏｎ他（モレキュラーバイオロジーオブザジーン（ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ ＯＦ ＴＨＥ ＧＥＮＥ）、４版、Ｂｅｎｊａｍｉｎ Ｃｕｍｍｉｎｓ編、１９８７年）、Ａｕｓｕｂｅｌ他（同上）、及びＳａｍｂｒｏｏｋ他（同上）によって総説されている。
【００１１】
プロモーター領域はそれぞれ長さ及び配列が異なっており、配列特異的ＤＮＡ結合タンパクのためのＤＮＡ結合部位を１つ若しくは２つ以上、及び／又はエンハンサー若しくはサイレンサーをさらに包含することができる。典型的なプロモーターには、ＣＭＶプロモーター、又は対象とする遺伝子若しくはコード配列を調節するプロモーターとしてのＰ５プロモーターが含まれる。これらプロモーター及びその変異体については、当技術分野では知られており、種々の記載がある（例えば、Ｈｅｎｎｉｇｈａｕｓｅｎ他、ＥＭＢＯジャーナル（ＥＭＢＯ Ｊ．）、５巻、１３６７〜１３７１頁、１９８６年、Ｌｅｈｎｅｒ他、ジャーナルオブクリニカルマイクロビオロジー（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．）、２９巻、２４９４〜２５０２頁、１９９１年、Ｌａｎｇ他、ニュクレイックアシッドリサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．）、２０巻、３２８７〜３２９５頁、１９９２年、Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ他、ジャーナルオブヴァイロロジー（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．）、４５巻、５５５〜５６４頁、１９８３年、Ｇｒｅｅｎ他、ジャーナルオブヴァイロロジー（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．）、３６巻、７９〜９２頁、１９８０年、Ｋｙｏｓｔｉｏ他（同上））。ただし、Ａｄ２又はＡｄ５主要後期プロモーター及び３連リーダー配列、ラウス肉腫ウィルス（ＲＳＶ）末端反復配列、並びに文献に記載されているような他の構成的プロモーターなど、その他のプロモーターも採用できる。例えば、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Ｗａｇｎｅｒ他、ナショナルアカデミーオブサイエンス会報（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ）、７８巻、１４４〜１４５頁、１９８１年）、Ｇａｌ４プロモーターなどの、酵母又は他の真菌類由来のメタロチオニン遺伝子の調節配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒ他、ネーチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、２９６号、３９〜４２頁、１９８２年）プロモーター要素、アルコールデヒドロゲナーゼプロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター、並びにアルカリホスファターゼプロモーター等を採用することができる。同様に、哺乳動物培養細胞のゲノムから又はこのような細胞で増殖したウィルスから単離されるプロモーター（例えば、Ａｄ、ＳＶ４０、ＣＭＶ等）も使用することができる。本発明用としてさらに付け加えられるプロモーターには、アクチンプロモーター、ＰＤＧＦ−βプロモーター、ＰｒＰ（神経特異的）プロモーター、神経特異的エノラーゼプロモーター等が含まれる。
【００１２】
構成的プロモーターを使用する代わりに、適切な信号に反応してプロモーターにアップ及び／又はダウンレギュレーションを起こすことも好ましくできる。例えば、ＩＬ−８プロモーターなどの、ＴＮＦ又は別のサイトカインに反応する誘導的プロモーターを採用することもできる。その他の好適な誘導的プロモーター系の例としては、メタロチオニン誘導性プロモーター系、バクテリアｌａｃ発現系、及びＴ７ポリメラーゼ系が挙げられるが、これに限定されるものではない。さらに、異なる発達段階で選択的に活性化されるプロモーター（例えば、グロビン遺伝子は、胎児と成人では異なって転写される）を採用することもできる。特に、テトラサイクリンなどの外的要因によって調節され得るプロモーター、昆虫由来のホルモンなどの天然のホルモン、エクジソン（若しくはその合成変異体）、又はＲＵ４８６などの合成ホルモンを採用することができる。これらのプロモーター（及び同様にして細胞に付与することができる付随の調節因子）は全て、当技術分野では種々記載されている（例えば、Ｄｅｌｏｒｔ他、ヒュ−マンジーンセラピー（Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ）、７巻、８０９〜８２０頁、１９９６年、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、ＣＬＯＮＴＥＣＨｎｉｑｕｅｓ、「Ｔｅｔ−Ｏｆｆ（商標）とＴｅｔ−Ｏｎ（商標）遺伝子発現系及び細胞系（Ｔｅｔ−Ｏｆｆ．ＴＭ ａｎｄ Ｔｅｔ−Ｏｎ．ＴＭ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅｓ）」、ＸＩ巻、Ｎｏ．３、２〜５頁、１９９６年７月を参照）。
【００１３】
もう１つの選択肢は、アルブミン又はアルファ抗トリプシンの肝細胞特異的プロモーター（Ｆｒａｉｎ他、モレキュラーアンドセルラーバイオロジー（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．）、１０巻、９９１〜９９９頁、１９９０年、Ｃｉｌｉｂｅｒｔｏ他、セル（Ｃｅｌｌ）、４１号、５３１〜５４０頁、１９８５年、Ｐｉｎｋｅｒｔ他、ジーンズアンドデベル（Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ．）、１号、２６８〜２７６頁、１９８７年、Ｋｅｌｓｅｙ他、ジーンズアンドデベル（Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ．）、１号、１６１〜１７１頁、１９８７年）、膵腺房細胞において活性なエラスターゼＩ遺伝子調節領域（例えば、Ｓｗｉｆｔ他、セル（Ｃｅｌｌ）、３８号、６３９〜６４６頁、１９８４年、ＭａｃＤｏｎａｌｄ、ヘパトロジー（Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ）、７号、４２５〜５１５頁、１９８７年）、膵β細胞において活性なインスリン遺伝子調節領域（Ｈａｎａｈａｎ、ネーチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、３１５号、１１５〜１２２頁、１９８５年）、精巣細胞、乳房細胞、リンパ球様細胞及び肥満細胞において活性なマウス乳癌ウィルス調節領域（Ｌｅｄｅｒ他、セル（Ｃｅｌｌ）、４５号、４８５〜４９５頁、１９８６年）、脳内の希突起神経こう細胞において活性なミエリン塩基性タンパク遺伝子調節領域（Ｒｅａｄｈｅａｄ他、セル（Ｃｅｌｌ）、４８号、７０３〜７１２頁、１９８７年）、及び視床下部において活性な性腺刺激放出ホルモン遺伝子調節領域（Ｍａｓｏｎ他、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２３４号、１３７２〜１３７８頁、１９８６年）などの組織特異的プロモーター（すなわち、所定の組織において優先的に活性化され、その活性化された組織において遺伝子産物を発現するプロモーター）を使用することである。同様に、結腸癌の癌胚抗原（Ｓｃｈｒｅｗｅ他、モレキュラーアンドセルラーバイオロジー（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．）、１０巻、２７３８〜２７４８頁、１９９０年）などの腫瘍特異的プロモーターをベクターにおいて使用することもできる。本発明によれば、所望の結合能及びプロモーター強度を有してさえいれば、いずれのプロモーターも突然変異誘発によって変えることができる。
【００１４】
当業者ならば容易に理解できるようが、ゲッ歯動物、ウサギ、ブタ等を含め多様な非ヒト動物を本発明のトランスジェニック動物の作出に使用することができる。現在において好ましい本発明のトランスジェニック動物はゲッ歯動物（例えば、マウス、ラット等）であって、マウスが特に好ましい。
【００１５】
Ｄ６６４Ａ変異（この変異は培養細胞におけるＡβ産生には影響しない（Ｓｏｒｉａｎｏ，Ｓ．、Ｌｕ，Ｄ．Ｃ．、Ｃｈａｎｄｒａ，Ｓ．、Ｐｉｅｔｒｚｉｋ，Ｃ．Ｕ．及びＫｏｏ，Ｅ．Ｈ．、ジャーナルオブバイオロジカルケミストリー（Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ）、２７６号、２９０４５〜２９０５０頁、２００１年参照））を、ＰＤＧＦβ鎖プロモーターの下流にスウェーデン型（Ｋ６７０Ｎ、Ｍ６７１Ｌ）及びインディアナ型（Ｖ７１７Ｆ）家族性ＡＤ変異を担持するヒトＡＰＰ（ｈＡＰＰ）ミニ遺伝子内に導入した。これらの動物を５〜１０世代にわたってＣ５７ＢＬ／６バックグラウンドに交配し、類似の遺伝的バックグラウンドを有するＰＤＡＰＰトタンスジェニックマウス（Ｊ９及びＪ２０系（Ｈｓｉａ他、Ｍｕｃｋｅ、上記文献参照））と比較した。この基礎的な手順を採用して、
【化１】
等を含めた、非常に多くのトランスジェニック系を作出することができる。
【００１６】
作出した最初の６つのトランスジェニック系のうち、１つの系（ＰＤＡＰＰ（Ｄ６６４Ａ）Ｂ２１）は、ＰＤＡＰＰＪ２０系と類似のＡＰＰ発現、Ａβ濃度及び線維状Ａβ斑数を示した（図１Ａ〜１Ｄ参照）。２番のＰＤＡＰＰ（Ｄ６６４Ａ）トランスジェニック系、すなわちＰＤＡＰＰ（Ｄ６６４Ａ）Ｂ１５７は、ＡＰＰの発現レベルがＰＤＡＰＰＪ９系に比べてやや低かった（図１Ａ参照）。これらのトランスジェニック系を、さらなる研究用に選択した。
【００１７】
Ａｓｐ６６４の変異がｉｎ ｖｉｖｏにおいてｈＡＰＰのＣ末端切断を効果的に阻止するかどうかを評価するために、３月齢のＰＤＡＰＰ及びＰＤＡＰＰ（Ｄ６６４Ａ）マウスの脳の切片を、ＡＰＰのＡｓｐ６６４位置での切断後に生成されるＣ末端ネオエピトープ（ＡＰＰＮｅｏ、Ｇａｌｖａｎ，Ｖ．他、ニューロケム（Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ）、８２号、２８３〜２９４頁、２００２年参照）を特異的に認識する抗体で免疫染色した。ＰＤＡＰＰ動物において海馬神経の細胞体及び突起に強いＡＰＰＮｅｏ免疫反応性を検出したが、ＰＤＡＰＰ（Ｄ６６４Ａ）動物の切片の免疫反応性のレベルは、いずれのトランスジェニック系の非トランスジェニック同腹仔に認められる免疫反応性レベルと区別できないものであった（図１Ｅ参照）。
【００１８】
ＡＤ患者の認識能低下の程度は、海馬及び前頭前野皮質のシナプス前小胞タンパク、シナプトフィジン、レベルの変化と強い相関がある（例えば、Ｔｅｒｒｙ，Ｒ．Ｄ．他、アナルズオブニューロロジー（Ａｎｎ Ｎｅｕｒｏｌ）、３０巻、５７２〜５８０頁、１９９１年参照）。シナプトフィジンの低レベル化は、これはシナプスの損傷と関連があると推測されるが、ＡＤの最も初期の段階と関連している（例えば、Ｍａｓｌｉａｈ，Ｅ．他、ニューロロジー（Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ）、５６号、１２７〜１２９頁、２００１年参照）。ＰＤＡＰＰマウスにおいては、斑形成のかなり前に、海馬シナプトフィジン免疫反応性シナプス前膜肥厚の数に減少が見られる（例えば、Ｈｓｉａ，Ａ．Ｙ．他、米国ナショナルアカデミーオブサイエンス会報（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ）、９６巻、３２２８〜３２３３頁、１９９９年参照）。ｈＡＰＰトランスジェニックマウスの海馬におけるシナプス前要素の消失において、Ｄ６６４Ａ変異が何らかの役割を果たしているかどうかを決定するために、８〜１０月齢のＰＤＡＰＰ、ＰＤＡＰＰ（Ｄ６６４Ａ）及び対照のそれぞれのマウスにおいて、海馬シナプス前膜肥厚、シナプス肥厚、及び歯状回の体積を、「立体解剖」法（実施例６及びＨｓｉａ，Ａ．Ｙ．他、米国ナショナルアカデミーオブサイエンス会報（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ）、９６巻、３２２８〜３２３３頁、１９９９年参照）の変法によって測定した。これらのパラメーターはアルツハイマー病における認識能低下と相関があるためである。驚くべきことに、ＰＤＡＰＰマウスでは、その非トランスジェニック同腹仔に比べて海馬シナプス肥厚に顕著な減少が見られたが、Ｂ２１マウスでは見られなかった（図２Ａ及び２Ｂ参照）。２番のＰＤＡＰＰ（Ｄ６６４Ａ）トランスジェニック系であるＢ１５７でも全く同じ結果が得られた。
【００１９】
同様に、最近の文献に記載されているように（Ｒｅｄｗｉｎｅ，Ｊ．Ｍ．、Ｋｏｓｏｆｓｋｙ，Ｂ．、Ｊａｃｏｂｓ，Ｒ．Ｅ．、Ｇａｍｅｓ，Ｄ．、Ｒｅｉｌｌｙ，Ｊ．Ｆ．、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｊ．Ｈ．、Ｙｏｕｎｇ，Ｗ．Ｇ．及びＢｌｏｏｍ，Ｆ．Ｅ．、米国ナショナルアカデミーオブサイエンス会報（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ）、１００巻、１３８１〜１３８６頁、２００３年参照）、ＰＤＡＰＰマウスでは、特に分子層において歯状回の体積減少が見られ、一方Ｂ２１マウスでは著しい消失は認められなかった（図２Ｃ参照）。
【００２０】
皮質の体積の著しい減少は、ＡＤのきわめて重要な神経病理学的特徴の１つである。ＡＤのトランスジェニックマウスが全てこの病気のこの特定の特徴を反復するわけではないが、ＰＤＡＰＰマウスでは比較的若年で（３〜４月齢）、特に分子層において、歯状回の体積減少が見られることが明らかになっている（例えば、Ｄｏｄａｒｔ，Ｊ．Ｃ．他、ニューロバイオロジーオブディスィーズ（Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ Ｄｉｓ）、７号、７１〜８５頁、２０００年及びＲｅｄｗｉｎｅ，Ｊ．Ｍ．他、米国ナショナルアカデミーオブサイエンス会報（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ）、１００巻、１３８１〜１３８６頁、２００３年参照）。それゆえに、ニッスル（Ｎｉｓｓｌ）染色法で染色された切片のデジタル３次元形状復元及び手を使ったカバリエリ解析によって、３月齢のＰＤＡＰＰ、ＰＤＡＰＰ（Ｄ６６４Ａ）及び対照動物における歯状回の体積を測定することは関心を引くものであった。手を使ったカバリエリ解析による測定（図２Ｂ参照）及びデジタル３次元形状復元による測定（図２Ｃ、２Ｄ参照）のいずれの場合にも、ＰＤＡＰＰマウスの脳内には著しい歯状回縮小が見られたが、ＰＤＡＰＰ（Ｄ６６４Ａ）マウスには見られなかった。カバリエリ解析によって得られた体積とデジタル３次元形状復元によって得られた体積との間には高度な相関関係があった（ｒ２＝０．７２、ｐ＜０．００００１、ｎ＝２５）（図５参照）。
【００２１】
ＡＰＰトランスジェニックマウスにおけるシナプス無傷性を考慮した場合、組織学的なシナプス数の定量では脳内に存在する機能的シナプスの数を多く見積もりすぎている恐れがあるため、シナプス伝達の機能的試験が重要である。ＰＤＡＰＰマウスにおけるシナプス前構造体の消失には基礎的シナプス伝達の損傷が伴うことが明らかになっている（Ｈｓｉａ，Ａ．Ｙ．他、米国ナショナルアカデミーオブサイエンス会報（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ）、９６巻、３２２８〜３２３３頁、１９９９年参照）。ＰＤＡＰＰ（Ｄ６６４Ａ）マウスの海馬に認められるシナプス前膜肥厚の回復がシナプス機能の救済と一致しているかどうかを決定するために、３〜７月齢のＰＤＡＰＰ、ＰＤＡＰＰ（Ｄ６６４Ａ）及び対照マウスの脳から取り出した海馬の先鋭切片について電気生理学的記録を実施した。細胞外で記録した興奮性シナプス後電位（ｆＥＰＳＰ）を用いて、海馬ＣＡ３細胞と海馬ＣＡ１細胞間での基礎的なシナプス伝達の強度を評価した。他のトランスジェニックＡＰＰ系に関して類似の報告があるように、ＰＤＡＰＰマウスに関しては、基礎的なシナプス伝達の強度（入力―出力比）に最大４０％の減少が認められ、これによってシナプス伝達に著しい傷害があることが示された。対照的に、ＰＤＡＰＰ（Ｄ６６４Ａ）マウスと非トランスジェニック同腹仔対照マウスとの間では、シナプス伝達に著しい違いは見られなかった（図３Ａ、３Ｂ参照）。観察されたシナプス前膜肥厚数の消失と一致して、ＰＤＡＰＰマウスにおいて明らかであった電気生理学的な障害は、Ｄ６６４Ａ変異を担持している動物には存在しなかった。さらに、伝達物質放出の確率と逆の相関関係を有するペアパルス促進は、全ての試験群の間で変化が認められず（図３Ｃ参照）、ＰＤＡＰＰトランスジェニックマウス同様、ＰＤＡＰＰ（Ｄ６６４Ａ）マウスにはシナプス前機能にさらなる欠陥がないことが示唆された。このように、ＰＤＡＰＰ（Ｄ６６４Ａ）マウスに保持されているシナプス前要素は機能的シナプスである可能性がある。
【００２２】
神経発生は、ＡＤ患者の海馬（Ｊｉｎ，Ｋ．他、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、１０１巻、３４３〜３４７頁、２００４年参照）及びＰＤＡＰＰマウスの脳内で増大する。したがって、損傷誘動性神経発生は、急性及び慢性の神経系疾患に寄与する可能性がある。Ｄ６６４Ａ変異がＰＤＡＰＰ誘導海馬神経発生に及ぼす効果を評価するために、１２月齢の対照、ＰＤＡＰＰ及びＰＤＡＰＰ（Ｄ６６４Ａ）マウスにおいて、ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）を用いて歯状回顆粒下領域（正常成体及びＡＤ誘導神経発生両方の主要部位）の増殖細胞を標識した。ＢｒｄＵ標識細胞（この多くは未成熟神経マーカータンパク、ダブルコルチンを発現した）の数は、ＰＤＡＰＰマウスでは対照マウスのほぼ２培のレベルにまで増大したが、この効果はＤ６６４Ａ変異によって消えた（図４参照）。
【００２３】
要約すると、Ｂ２１マウスはＡβ及びアミロイド沈着物を産生し、この点ではＰＤＡＰＰマウスと区別できなかった。しかし、ＰＤＡＰＰ動物に見られる海馬シナプス肥厚又は歯状回の体積の特徴的な消失は、Ｂ２１マウスには見られなかった。これらの発見は、カスパーゼ（又は恐らくはカスパーゼ以外の１種若しくは複数種のプロテアーゼ）によるＡｓｐ６６４位置におけるｈＡＰＰの切断が、ｈＡＰＰトランスジェニックマウスにおけるシナプスの消失及び歯状回の体積の低減の一因となっていることを示唆している。これらの観察から、このＡＤのマウスモデルの海馬のシナプス消失及び歯状回萎縮が、Ａβ沈着とは無関係に又はＡβ産生の下流で、Ａｓｐ６６４位置におけるＡＰＰ切断によって仲介されている（Ｌｕ他、「アミロイドβタンパク毒性はアミロイドβタンパク前駆体複合体の形成によって仲介される（Ａｍｙｌｏｉｄ β−ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｏｘｉｃｉｔｙ ｉｓ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ａｍｙｌｏｉｄ β−ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ）」、Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ、印刷中）ということがわかる。さらに、これらの結果から、ＡＰＰの細胞質内領域が、これらアルツハイマー表現型の現れに重要な役割を果たしていることがわかる。
【００２４】
また、本明細書に記述の結果から、カスパーゼによる切断部位Ａｓｐ−＞Ａｌａ（Ｄ６６４Ａ）にｉｎ ｖｉｖｏでＡｓｐ６６４位置におけるｈＡＰＰの切断を妨げる変異を担持しているＡＰＰトランスジェニックマウスが、Ａβを産生し続けかつ斑沈着を示し続けることは明白である。しかし、ＰＤＡＰＰマウス（ＰＤＡＰＰマウスはシナプス伝達の激しい減少を示す）の表現形を特徴付ける海馬シナプスの消失又は脳縮小については明らかになっていない。本発明のトランスジェニックマウスを使った研究によって、ＰＤＡＰＰマウスのシナプス伝達障害がＰＤＡＰＰ（Ｄ６６４Ａ）マウスにおいて完全に回復することがわかる。
【００２５】
これらの結果から、ＡＰＰのＣ末端切断がＡＤのマウスモデルに認められるシナプス障害及び体積消失の一因となっていることが明白であり、またこれらの結果はＡＰＰのＣ末端切断がＡＤの病理発生に関与していることと一致する。最も重要なことは、本明細書に記述の結果が、シナプスの消失及び海馬の縮小がＡβの産生及び沈着と無関係であり得ることを示す、遺伝的実験に基づく証拠となっていることである。
【００２６】
ＡＰＰのＣ末端部分の切断は、ＡＰＰが関与している幾つかの異なる細胞機能に影響を及ぼしている可能性がある。本発明のトランスジェニック動物は、シナプス消失に影響を及ぼしかつＡＤなどの神経変性疾患の病理発生の早期段階に潜んでいる初期プロセスを調べるまたとない機会を提供する。ＡＤの早期段階においてシナプス機能を回復することは、病気が進行した遅い段階になって消失した神経回路網を取り替えることに比べれば、はるかに容易な仕事である。ＰＤＡＰＰ（Ｄ６６４Ａ）マウスに関して本明細書に記載した観察結果は、マウスにおけるＡＤ関連の病理学にとって非常に重要でありかつ薬剤発見の新規ターゲットとなる可能性を秘めた、Ａβの産生又は沈着と直接関連のないメカニズムが存在することと一致する。本明細書に示すような、ＡＤの早期段階で作用しているメカニズムを解明し続けることによって、初期ＡＤで起こるシナプスの損傷を遅らせる、ひょっとしたら止めてしまう、或いはそれを逆行させることすらある治療法の開発が促進されることになる。
【００２７】
ヒトの所定の病理学的状態に関与するマーカーを同定することは、遺伝子型、表現型及び生活史などに関係する諸要因のせいで非常にめんどうである。一方、トランスジェニック動物モデルは、これらの変数を制御し得るような適正な実験系を提供する一方で、深刻な潜在的欠点も有している。すなわち、開発時に導入遺伝子が発現する結果、生理学的反応又は補償メカニズムの活性化を生じる可能性がある。したがって、トランスジェニック動物を、その非トランスジェニック同腹仔と比較すれば、導入遺伝子の発現それ自体から生じ、モデル化された疾患の病理発生によっては生じない変化に関する情報を得ることができる。
【００２８】
ＰＤＡＰＰマウスのＡＤに関連する表現形の基本的な特徴は、本発明のトランスジェニック動物においては、ｈＡＰＰ導入遺伝子のＣ末端の切断が妨げられることによって効果的に変えられた。ＰＤＡＰＰマウスとＰＤＡＰＰ（Ｄ６６４Ａ）マウスは多くの遺伝的類似点、すなわち、１）Ａ−＞Ｃのトランスバージョン以外は全く同じベクターから発生し、２）同じ遺伝的バックグランドを共有し、３）ヒトＡＰＰ導入遺伝子を同じようなレベルで発現するという類似点を有しているため、導入遺伝子それ自体の発現によって生じる変化がＰＤＡＰＰ動物とＰＤＡＰＰ（Ｄ６６４Ａ）動物で同じではないかと予想される。したがって、ＰＤＡＰＰマウスにはあるがＰＤＡＰＰ（Ｄ６６４Ａ）マウスにはない変化（マーカー）を非トランスジェニック同腹仔の場合と比較することによって、ＡＤの発現に関与するマーカー及び導入遺伝子の発現それ自体によって生じるマーカーとの相違を、めんどうな遺伝子型、表現型又は環境の変数などの非存在下で明白に同定することが可能になる（動物は十分にコンジェニックであり、制御された環境下で容易に繁殖させることができ飼うことができる）。
【００２９】
ＰＤＡＰＰ系及びＰＤＡＰＰ（Ｄ６６４Ａ）系からの半接合性トランスジェニック動物を作製して実験動物として使うことができる。すなわち、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊバックグランドでコンジェニックな１２匹の２カ月齢半接合性トランスジェニックＰＤＡＰＰ動物及びＰＤＡＰＰ（Ｄ６６４Ａ）動物と、１２匹の非トランスジェニック同腹仔を作製して、プール血清、脳抽出物又は他の関心器官の抽出物を得ることができる。
【００３０】
次いで、上記動物を使い好適な手段によってサンプルを作製し、そのサンプルをプロテオームやゲノムの研究に使うことができる。トランスジェニック及び非トランスジェニック動物から取ったサンプルに存在するタンパク又はｍＲＮＡの同定、また、どのタンパクが上記個体群の１つに独自に存在するか、又は存在しないか、又は多量に増加若しくは減少しているかを決定するためのデータの解析は、例えば質量分析法、ＤＮＡマイクロアレイハイブリダイゼーション等の標準的手法を使って行うことができる。
【００３１】
本発明のさらなる態様によれば、神経変性疾患の治療に有用な化合物を同定する方法が提供され、その方法は、カスパーゼがβアミロイド前駆体タンパク（ＡＰＰ）を切断してカルボキシ末端ペプチドＡＰＰ−Ｃ３１を産生する能力を阻止する化合物を同定することを含んでいる。
【００３２】
当業者ならば容易に理解するであろうが、カスパーゼがβアミロイド前駆体タンパク（ＡＰＰ）を切断してカルボキシ末端ペプチドＡＰＰ−Ｃ３１を産生する能力を阻止する化合物は、種々の方法で同定することができる。例えば、ＡＰＰ又はＡＰＰ類似タンパクをカスパーゼの存在下で試験化合物と接触させ、次いでＡＰＰ−Ｐ３１の形成をモニターするような方法で同定することができ、この方法においては、カスパーゼのＡＰＰ−Ｐ３１産生誘発不履行が、神経変性疾患の治療に有用な化合物であることの目安となる。
【００３３】
或いはまた、カスパーゼがβアミロイド前駆体タンパク（ＡＰＰ）を切断してカルボキシ末端ペプチドＡＰＰ−Ｃ３１を産生する能力を阻止する化合物は、ＡＰＰ又はＡＰＰ類似タンパク（例えば、ＡＰＬＰ１又はＡＰＬＰ２）をカスパーゼの存在下で試験化合物と接触させ、次いで、切断による産物の転位、細胞死の誘発、萎縮の誘発及びシナプス消失の誘発から成る群から選択される切断の証拠をスクリーニングすることによって同定することができる。ＡＰＬＰ１及びＡＰＬＰ２は、ＡＰＰファミリー又はＡＰＰタンパクのメンバーであって、ひとまとめにして「ＡＰＰ類似タンパク」という。ただし、ＡＰＰのγ及びβセクレターゼ切断に必要とされる部位は、ＡＰＬＰ１及びＡＰＬＰ２のいずれにも保存されない。したがって、これらの分子は、βアミロイド類似タンパク産生能を有していない。しかし、ＡＰＰ−Ｃ３１産生を可能にするＣ末端カスパーゼ切断部位は、ＡＰＬＰ１及びＡＰＬＰ２のいずれにも保存される。ＡＰＬＰ１の場合、Ｐ４〜Ｐ１の位置はＶＥＶＤＰと考えられ、ＡＰＬＰ２の場合、Ｐ４〜Ｐ１の位置はＶＥＶＤＰと考えられるが、ＡＰＰではＰ４〜Ｐ１の位置はＶＥＶＤＡである。これらの配列は、ＡＰＰにおける配列と同様、カスパーゼ８及びカスパーゼ９などのイニシエーター／先端カスパーゼに対する前記カスパーゼ切断部位と適合する。予測されるＡＰＬＰ１−Ｃ３１ペプチドは、その５２％がＡＰＰ−Ｃ３１と同等で７７％がＡＰＰ−Ｃ３１と類似する。また、予測されるＡＰＬＰ２−Ｃ３１ペプチドは、その７１％がＡＰＰ−Ｃ３１と同等で８３％がＡＰＰ−Ｃ３１と類似する。
【００３４】
また別の方法として、ＡＰＰ、ＡＰＬＰ１、ＡＰＬＰ２等を発現する細胞を、発作（例えば、Ａβ、虚血、ヒートショック、低酸素、低グルコース、スタウロスポリン等）の存在又は非存在下で検査して、ＡＰＰ−Ｃ３１の産生を阻止する化合物をスクリーニングすることもできる（ＡＰＰ−Ｃ３１は、ＡＰＰのカルボキシ末端切断産物を特異的に検出する抗体を使うか、又はレポーターアッセイ、ＥＬＩＳＡアッセイ等のそれに代わる方法によってアッセイすることができる）。
【００３５】
上記スクリーニング法で同定された化合物は、次いでｉｎ ｖｉｖｏで、例えば、アルツハイマー病の動物モデル（すなわち、Ａｓｐ６６４−＞Ａｌａ変異のない同様のトランスジェニック）においてその効果を試験し、本発明のＡｓｐ６６４−＞Ａｌａ変異型トランスジェニック動物における反応と比較することによって試験することができる。
【００３６】
候補化合物は、合成又は天然化合物のライブラリーを含めた種々のソースから得ることができる。例えば、任意抽出されたオリゴヌクレオチド又はオリゴペプチドの発現を含め、種々の有機化合物及び生体分子を任意に又は規制に従って合成する多数の手段を利用することができる。或いはまた、細菌、真菌、植物及び動物抽出物の形態をした天然化合物のライブラリーを利用することもでき又は容易に作成することもできる。また、天然のライブラリー及び化合物又は合成によって生成されたライブラリー及び化合物は、従来の化学的、物理的及び生化学的手段によって容易に変更され、それらをコンビナトリアルライブラリーの作成に使うこともできる。知られている薬物に、アシル化、エステル化、アミド化等の変更を規制に従って又は任意に加えて、構造的アナログを作成することもできる。候補作用物質は、ペプチド、糖、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、誘導体、構造的アナログ又はそれらの組合せ等の中に見出される。
【００３７】
本発明のさらに別の態様によれば、神経変性疾患の治療法が提供され、その方法は、前記方法によって同定される化合物の有効量を、それを必要としている対象に投与することを含んでいる。
【００３８】
本明細書において「治療する」とは、病気、障害若しくは容態の進行を阻止若しくは停止し、かつ／又は病気、障害若しくは容態の低減、寛解若しくは退行を引き起こすことである。当業者ならば、種々の手順又はアッセイを使って病気、障害若しくは容態を評価することができ、同様に種々の手順又はアッセイを使って病気、障害若しくは容態の低減、寛解若しくは退行を評価することができることを理解するであろう。
【００３９】
基本的には、病因病理学的にアミロイドの形成及び／又は沈着と関連しているいかなる疾病であっても、本発明の治療対象と考えられる。本明細書において「神経変性疾患」とは、アルツハイマー病、老人性全身性アミロイドーシス、ゲルストマンシュトロイスラーシャインカー症候群、ＩＩ型糖尿病、成人発症型糖尿病、インスリノーマ、ＡＡアミロイド症、ＡＬアミロイド症、家族性アミロイド多発神経障害（ポルトガル型、日本型及びスエーデン型）、家族性トランスサイレチンアミロイド症、家族性地中海熱、蕁麻疹及び難聴を伴う家族性アミロイドネフローゼ（マックルウェルズ症候群）、非神経障害性遺伝性全身性アミロイドーシス（家族性アミロイドポリニューロパチーＩＩＩ型）、家族性アミロイドーシスフィンランド型、家族性アミロイド心筋症（デンマーク型）、孤立性心臓アミロイド、孤立性心アミロイドーシス、特発性（原発性）アミロイドーシス、骨髄腫又はマクログロブリン血症に伴うアミロイドーシス、シェーグレン症候群に伴う原発性限局性結節性皮膚アミロイドーシス、反応性（続発性）アミロイドーシス、アイスランド型アミロイドーシスに伴う遺伝性脳出血、長期血液透析に伴うアミロイドーシス、フィブリノーゲン関連遺伝性腎性アミロイドーシス、甲状腺髄様癌に伴うアミロイドーシス、リゾチーム関連遺伝性全身性アミロイドーシス等の疾患を言う。
【００４０】
アミロイド沈着は、大脳皮質、皮質下領域及び海馬の神経細胞萎縮、並びに斑、栄養障害性神経突起及び神経原線維変化の存在を特徴とするアルツハイマー病、神経変性疾患と診断された対象に見られる。アルツハイマー病の場合、栄養異常性の又は異常な神経突起成長、シナプス消失、及び神経原線維のもつれ形成が病気の重篤度と強い相関関係にある。栄養異常性ニューロンは、神経突起の細胞質内に豊富な電気密度の高い積層体を含有し、シナプス接合部が破壊されていることを特徴とする。栄養異常性ニューロンはアミロイド沈着物を囲み、それによって脳神経線維網の至る所及びの血管壁に位置する老人斑を形成する。本発明のアルツハイマー病治療法は、神経細胞の萎縮を低減又は阻止し、老人斑又は神経原線維のもつれの形成を低減又は阻止することができ、それによって病気の進行を遅らせる又は止める。
【００４１】
アミロイド沈着物は、ＩＩ型糖尿病と診断されている患者のランゲルハンス島にも見られる。この沈着物は、正常な動物においてはホルモンの役割を果たしている島アミロイドポリペプチド（ＩＡＰＰ）又はアミリンと呼ばれる大きな前駆体に由来する。ＩＡＰＰは、島のβ細胞によって産生され、肝臓及び横紋筋の細胞によるグルコースの取り込みに大きな影響を及ぼす。ヒトアミリンの導入遺伝子を有し、高脂肪食餌を与えられているトランスジェニックマウスでは、アミリンの過剰産生によって島アミロイド沈着が生じる（Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ、第３版、１９９９年、１２２６頁参照）。ＩＩ型糖尿病に罹患している患者のランゲルハンス島のアミロイド沈着物を治療する本発明の治療法によって、アミロイドタンパクの産生を低減又は予防することができ、アミロイドが沈着してアミロイド沈着物となることを低減又は予防することができる。
【００４２】
アミロイド沈着物が顕著であるまた別の病気として、海綿状脳症の１種であるプリオン病がある。プリオン病は、臨床的には進行性の失調症と痴呆によって特徴付けられ、病理学的には海綿状脳組織の空胞形成によって特徴付けられる神経変性状態である。アミロイド沈着は、クールー病として知られている少なくとも１つプリオン病に由来する。クールー病では、構成的に発現された細胞表面糖タンパクである正常なプリオンタンパクと異なり、プリオンタンパクの約７０％は細胞外に蓄積して斑を形成する（Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ、第３版、上記、１４９２〜１４９６頁参照）。本発明のプリオン病治療法によって、アミロイドタンパクの産生を低減又は予防することができ、アミロイド斑の沈着を低減又は予防することができる。
【００４３】
アミロイド沈着物が顕著であるまた別の病気として、ＡＡアミロイド症がある。ＡＡアミロイド症は、慢性炎症性疾患、腫瘍疾患及び遺伝性疾患などの一見無関係と思われるような疾患に由来するアミロイド症である。アミロイドタンパクの沈着は、このような基礎的疾患の状態に続発する。前駆体分子は、急性期反応タンパクである血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）であり、これは多くの疾患の炎症代用マーカーとして使うことができる。本発明のＡＡアミロイド症治療法によって、アミロイドタンパクの産生を低減又は予防することができ、アミロイドタンパクの前駆体の産生を低減又は予防することができ、活性アミロイドタンパクの産生に必要な幾つかのステップのうち任意の１つを妨げるか又は減らすことができ、またアミロイド斑の沈着を低減又は予防することができる。
【００４４】
アミロイド沈着物が顕著であるまた別の病気として、家族性アミロイドポリニューロパチー（ＦＡＰ）の最も広く現れる型である、家族性トランスサイレチンアミロイド症がある。ヒトアミロイド疾患、すなわち家族性アミロイドポリニューロパチー、家族性アミロイド心筋症及び老人性全身性アミロイドーシスは、抹消神経及び心臓組織に沈着する不溶性トランスサイレチン（ＴＴＲ）原線維によって引き起こされる。トランスサイレチンは、サイロキシン及びレチノールの輸送に関与しているホモテトラマー血漿タンパクである。最も一般的なアミロイド形成ＴＴＲ変異体はＶ３０Ｍ−ＴＴＲであり、一方Ｌ５５Ｐ−ＴＴＲはＦＡＰの最も強力な型に関連する変異体である。トランスサイレチンによって引き起こされるアミロイド症を治療するための本発明の治療法によって、アミロイドタンパクの産生を低減又は予防することができ、アミロイドタンパクの前駆体の産生を低減又は予防することができ、活性アミロイドタンパクの産生に必要な幾つかのステップのうち任意の１つを妨げるか又は減らすことができ、またアミロイド斑の沈着を低減又は予防することができる。
【００４５】
アミロイド沈着物が顕著であるまた別の病気として、ＡＬアミロイド症がある。ＡＬアミロイド症は、原発性アミロイドーシス、形質細胞障害、免疫芽球性リンパ腫、多発性骨髄腫等を含めた、原発性免疫グロブリン産生障害に関係する１群の疾患である。原発性全身性ＡＬ（アミロイド軽鎖）アミロイドーシスは、アミロイド軽鎖タンパクの沈着物が進行性器官不全を起こす形質細胞障害である。原発性アミロイドーシスの予後は一般に不良であり、生存期間中央値は１〜２年である。前駆体タンパクは、限局性ＡＬアミロイドーシス及び全身性ＡＬアミロイドーシスの両者とも、一次構造が同じパターンの分断及び変化を示す免疫グロブリン軽鎖である。ＡＬアミロイドタンパクによって引き起こされるアミロイド症を治療するための本発明の治療法によって、アミロイドタンパクの産生を低減又は予防することができ、アミロイドタンパクの前駆体の産生を低減又は予防することができ、活性アミロイドタンパクの産生に必要な幾つかのステップのうち任意の１つを妨げるか又は減らすことができ、またアミロイド斑の沈着を低減又は予防することができる。
【００４６】
本明細書において「投与する」とは、経口、舌下、静脈内、皮下、経皮、筋肉内、皮内、鞘内、硬膜外、眼球内、頭蓋内、吸入、直腸、膣等の投与を使って、対象に治療上有効量の化合物を付与することを言う。クリーム、ローション、錠剤、カプセル、ペレット、分散性散剤、顆粒剤、坐剤、シロップ剤、エリキシル剤、トローチ剤、注射溶液、滅菌水性又は非水性液剤、懸濁剤、乳剤、パッチ剤等の剤形での投与も考えられる。有効成分は、グルコース、ラクトース、アカシアガム、ゼラチン、マンニトール、デンプンペースト、三ケイ酸マグネシウム、タルク、トウモロコシデンプン、ケラチン、コロイドシリカ、ジャガイモデンプン、尿素、デキストラン等を含む、医薬品として許容し得る無毒性の担体と調合することができる。
【００４７】
好ましい投与経路は、臨床治療上の指示によって異なる。用量の多少の変化は、治療を受けている患者の状態によって必然的に起こると思われるが、いずれにしても、医者が個々の患者にとって適正な用量を決定する。用量当たりの化合物の有効量は、とりわけ、体重、生理学、選択した接種方式によって決まる。化合物の単位用量とは、（担体が使われる場合には）担体の重量を除いた、１投与回当たりに使用される化合物の重量を言う。
【００４８】
ポリマーマトリクス、リポゾーム及びマイクロスフィアなどの標的型薬物送達システムによって、治療薬物を必要とする部位での治療薬物の有効濃度を高めることができ、また治療薬物の望ましくない影響を減らすことができる。治療薬物がより効率的に送達されれば、投与すべき治療薬物の量は少なくてすむため、身体全体の薬物の濃度は低減され、一方、同等又はより良い結果をもたらすことになる。治療薬物の送達効率の向上に適用し得る方法は、一般にどの方法も、攻撃目標とする部分を、治療薬物又は治療薬物を担うことになる担体に結合させている。
【００４９】
タンパク、ペプチド、多糖類、合成ポリマー、コロイド粒子（すなわち、リポゾーム、ベシクル又はミセル）、マイクロエマルジョン、マイクロスフィア及びナノスフィア等の担体を使って、様々な薬物送達システムが設計されている。捕捉された医薬品として有用な薬物を含有するこれらの担体は、細胞特異的又は組織特異的薬物の制御された放出を達成することを意図するものである。
【００５０】
本発明において使用しようとする化合物は、リポゾームの形態で投与することができる。当技術分野で知られているように、一般に、リポゾームはリン脂質又はその他の脂質物質から得られる。リポゾームは、水性媒体中に分散させた水和液晶の１層又は多層によって形成されている。無毒性で、生理学的に許容され、代謝された脂質であって、リポゾームを形成し得るものであれば、いずれの脂質も使うことができる。本明細書に記載の化合物は、リポゾームの形態をしている場合、その化合物以外に安定剤、防腐剤、賦形剤などを含有することができる。好ましい脂質はリン脂質及びホスファチジルコリン（レシチン）であって、天然及び合成のいずれも含まれる。リポゾームを形成する方法は当技術分野では知られている（例えば、Ｐｒｅｓｃｏｔｔ，Ｅｄ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、ＸＩＶ巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．、１９７６年、３３頁、以下参照）。
【００５１】
血液脳関門を迂回して脳に治療薬物を送達するために、幾つかの送達方法を使うことができる。このような方法では、鞘内注射、外科的移植（Ｏｍｍａｙａ、Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ、１巻、１６９〜１７８頁、１９８４年及び米国特許第５，２２２，９８２号）、間質静注（Ｂｏｂｏ他、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、９１巻、２０７６〜２０８０頁、１９９４年参照）等が利用される。これらの戦略によれば、薬物は、脳脊髄液（ＣＳＦ）又は脳実質（ＥＣＦ）に直接投与されることによって、ＣＮＳに送達される。
【００５２】
脳脊髄液を介した中枢神経系への薬物送達は、例えば、発明者の名にちなんで「Ｏｍｍａｙａ ｒｅｓｅｒｖｏｉｒ」と命名された硬膜下移植デバイスを使って達成される。薬物をデバイスに注入し、次いで脳を囲む脳脊髄液内に放出する。薬物は、露出した脳組織の特定の領域に向けて送られ、その特定の領域が薬物を吸着する。この吸着は、薬物が自由に移動できないため限界がある。改良したデバイスでは、レザバーは腹腔に移植されるが、注入された薬物は脊髄から出て脊髄に戻る脳脊髄液によって脳室腔に輸送され、薬物投与に使われる。オメガ３誘導体化によって、部位特異的二分子複合体は、脳組織を介した治療薬物の吸着及び移動の限界を克服することができる。
【００５３】
ＣＮＳへの薬物送達を改善する別の戦略は、血液脳関門を介した薬物の吸収（吸着と輸送）及び細胞による治療薬物の取り込みを高めることによるものである（Ｂｒｏａｄｗｅｌｌ、Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ、７９号１１７〜１２８頁、１９８９、Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ他、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐｅｒｉｍ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、２５５号、８９３〜８９９頁、１９９０年、Ｂａｎｋｓ他、Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、９１号、１３９〜１４８頁、１９９２年、Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ、燃料恒常性と神経系（Ｆｕｅｌ Ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ｎｅｒｖｏｕｓ Ｓｙｓｔｅｍ）、Ｖｒａｎｉｃ他編、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、４３〜５３頁、１９９１年）。血液脳関門を通過して脳にいたる薬物の移動は、薬物それ自体の浸透性を改善するか又は血液脳関門の特性を変えるかのいずれかによって促進することができる。したがって、薬物の移動は、化学的修飾によって薬物脂質の溶解性を高めることにより、かつ／又は薬物をカチオン性担体に結合させることにより、又は血液脳関門を通過して薬剤を輸送することができるペプチドベクターに薬剤を共有結合させることにより促進することができる。輸送ペプチドベクターは、血液脳関門浸透促進化合物（米国特許第５，２６８，１６４号）としても知られている。脳への送達に有用な脂質溶解特性を有する部位特異的巨大分子については、米国特許第６，００５，００４号に記載されている。
【００５４】
その他の例（米国特許第４，７０１，５２１号及び米国特許第４，８４７，２４０号）には、比較的高率で細胞に入り込むカチオン性巨大分子担体に薬物を共有結合させる方法が記載されている。これらの特許は、カチオン性樹脂に共有結合させると、生体分子の細胞内への取り込みが促進されることを教示している。
【００５５】
米国特許第４，０４６，７２２号には、抗癌剤を特定の抗原を担持する細胞に導くことを目的としてカチオン性ポリマーに共有結合させた、抗癌剤が開示されている。このポリマー担体の分子量は約５，０００〜５００，０００である。このようなポリマー担体を採用して、本明細書に記載した化合物を、標的に向けて送達することができる。
【００５６】
さらに酸感受性中間体（スペーサーとしても知られる）分子を介して薬物をカチオン性ポリマーに共有結合させる研究が、米国特許第４，６３１，１９０号及び米国特許第５，１４４，０１１号に記載されている。ｃｉｓ−アコニット酸などの種々のスペーサー分子が、薬剤及びポリマー担体に共有結合する。スペーサー分子は、恐らく細胞のリソソーム内で起こると思われるが、酸性度の穏やかな上昇を受け、巨大分子担体からの薬物の放出を制御する。薬物は、分子接合体から選択的に加水分解されて、未修飾かつ活性な形で細胞内に放出される。分子接合体はリソソームに輸送され、リソソームにおいては、細胞内又は細胞体内の他の区画又は液に比べて酸性のｐＨ下で、リソソーム酵素の作用を受けて代謝される。リソソームのｐＨは約４．８であるとされているが、接合体消化の初期段階においては恐らく３．８と低いと思われる。
【００５７】
本明細書における「治療上有効な量」とは、本発明の実施において使用される化合物に関して使う場合、化合物を投与される者に有益な効果を与えられるだけの高い循環濃度をもたらす、十分な量の化合物用量のことを言う。個々の患者対する治療上有効な具体的用量レベルは、治療対象である疾患、疾患の重篤度、使用する具体的な化合物の活性、具体的な化合物のクリアランス率、治療期間、具体的な化合物と組み合わせて又は偶然同時に使用される薬剤、患者の年齢、体重、性、食餌及び全体的な健康状態、並びに医学的技術分野及び科学分野で良く知られている要因等を含めた種々の要因によって決まる。投与量レベルは、約０．００１から最大１００ｍｇ／ｋｇ／日の範囲であって、約０．０５から１０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲が好ましい。
【００５８】
本明細書において「接触させる」とは、化合物を細胞又は細胞標的に供給することを言う。接触は、固相、液相又は気相で生じ得るが、細胞外及び細胞内で生じる接触も含む。当業者ならば、ｉｎ ｖｉｖｏでの化合物の細胞へ供給が、経口、舌下、静脈内、皮下、経皮、筋肉内、皮内、鞘内、硬膜外、眼球内、頭蓋内、吸入、直腸、膣等を含めた多くの投与形態によってなされることを理解するであろう。
【００５９】
本発明のまた別の態様によれば、神経変性疾患の治療法が提供され、その方法は、βアミロイド前駆体タンパク（ＡＰＰ）及び／又はＡＰＰ類似タンパク（例えば、ＡＰＬＰ１又はＡＰＬＰ２）切断し、カルボキシ末端ペプチド、ＡＰＰ−Ｃ３１、を産生するプロテアーゼの能力を阻止することを含む。
【００６０】
当業者ならば容易に理解するであろうが、プロテアーゼのＡＰＰ及び／又はＡβ切断能は、例えば抗プロテアーゼ抗体、プロテアーゼをコードする配列に基づくアンチセンスヌクレオチド、ペプチド、ペプチドミメティック、リボザイム、干渉ＲＮＡ、プロテアーゼアンタゴニスト、又はプロテアーゼのＡＰＰ及び／又はＡβの細胞内領域切断能を阻止する小分子等によって、様々な方法で阻止することができる。
【００６１】
例えば、本発明の変異型ＡＰＰの発現は、過剰発現も含めて、ポリペプチドをコードするｍＲＮＡに結合しその発現を阻止するアンチセンスヌクレオチドを投与することによって阻止することができる。或いはまた、ｍＲＮＡを切断するリボザイムを使って類似の方法で阻止することもできる。アンチセンス及びリボザイム技術を使って遺伝子の発現を制御する一般的方法、又はこのような方法で外来遺伝子を発現させる遺伝子治療法の一般的方法は、当技術分野では良く知られている。このような方法のいずれも、ベクターなどの、本発明の変異型ＡＰＰのアンチセンス転写又はリボザイム転写をコードする系を利用する。
【００６２】
本明細書において「リボザイム」とは、触媒特性を有する、１つ又は２つ以上のＲＮＡのＲＮＡ建築物を言う。一般に、リボザイムは、エンドヌクレアーゼ、リガーゼ又はポリメラーゼ活性を示す。リボザイムは、ＲＮＡ自己切断反応を仲介するＲＮＡ構造分子である。「ハンマーヘッド」及び「ヘアピン」型を含め、二次構造の異なる種々のトランス作用性リボザイムが同定されている。また種々のリボザイムについて特徴付けがなされている。例えば、米国特許第５，２４６，９２１号、米国特許第５，２２５，３４７号、米国特許第５，２２５，３３７号及び米国特許第５，１４９，７９６号参照。触媒活性を有する、デオキシリボ及びリボオリゴヌクレオチドを含んだ混合リボザイムについても記載されている。Ｐｅｒｒｅａｕｌｔ他、ネーチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、３４４号、５６５〜５６７頁、１９９０年。
【００６３】
本明細書において「アンチセンス」とは、細胞条件下で、本発明の変異型ＡＰＰをコードするゲノムＤＮＡ及び／又は細胞のｍＲＮＡと特異的にハイブリッド形成し、例えば結合し、転写及び／又は翻訳を阻止することによってそのタンパクの発現を阻止するような核酸分子又はその誘導体を言う。結合は、従来の塩基対相補による可能性もあるし、又は、例えばＤＮＡ二重鎖に結合する場合には、二重螺旋の主要な溝における特異的相互作用による可能性もある。
【００６４】
１つの態様において、アンチセンス構造体は、ｅｘ ｖｉｖｏで生成される核酸であって、細胞内に導入されると、ＡＰＰ又はＡＰＰ類似分子のｍＲＮＡ及び／又はゲノム配列とハイブリッド形成すことによって遺伝子発現を阻止することができるような核酸である。
【００６５】
アンチセンス法は、ＡＰＰ又はＡＰＰ類似分子のｍＲＮＡに相補的なオリゴヌクレオチド（ＤＮＡ或いはＲＮＡのいずれか）の設計を伴う。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＡＰＰ又はＡＰＰ類似分子のｍＲＮＡ転写物に結合し、翻訳を妨げると考えられる。
【００６６】
絶対的な相補が好ましいが、必ずしもそうでなくてよい。本明細書で言うＲＮＡタンパクに「相補的」な配列とは、そのＲＮＡとのハイブッリド形成を可能にするに十分な相補性を有し、安定な二重鎖を形成する配列を意味する。二本鎖アンチセンス核酸の場合、二重鎖ＤＮＡの単一のストランドが試験されるか、又は三重鎖形成をアッセイする。ハイブリッド形成能は、相補の程度及びアンチセンス核酸の長さの両方によって決まると考えられる。一般に、ハイブリッド形成する核酸が長ければ長いほど、それに含まれるｍＲＮＡとの塩基のミスマッチが多くなり、安定な二重鎖（又は、あるとすればであるが、三重鎖）が形成される。当業者ならば、標準的な手法を使ってミスマッチの許容される程度を確認し、ハイブリッド形成された複合体の融点を決定することができるであろう。
【００６７】
遺伝子発現を制御するために、アンチセンス、リボザイム技術及びＲＮＡｉ技術を使う一般的な方法、又はこのような方法で外来遺伝子を発現させる遺伝子治療法の一般的方法は、当技術分野では良く知られている。このような方法のいずれも、ベクターなどの、本発明の変異型ＡＰＰのアンチセンス転写又はリボザイム転写をコードする系を利用する。「ＲＮＡｉ」とはＲＮＡの干渉を表す。この用語が、遺伝子の転写をサイレンスすることができるＲＮＡ分子を使う技術を包含することを、当業者ならば理解するであろう。例えば、ＭｃＭａｎｕｓ他、ネーチャーレビュージェネティックス（Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、３号、７３７頁、２００２年を参照のこと。本願においては、「ＲＮＡｉ」は、短干渉ＲＮＡ（ｓＲＮＡｉ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）及び一過性低分子ＲＮＡ（ｓｔＲＮＡ）などの分子を包含する。一般的に、ＲＮＡ干渉は、二本鎖ＲＮＡと遺伝子との相互作用によって生じる。
【００６８】
一般に、メッセージの５’末端に相補的なオリゴヌクレオチド、例えば、ＡＵＧ開始コドンまでの５’非翻訳配列は、翻訳を阻止するうえで最も効率よく作用すべきである。しかし、ｍＲＮＡの３’非翻訳配列に相補的な配列は、ｍＲＮＡの翻訳を阻止する場合にも効果的であることが証明されている。（Ｗａｇｎｅｒ、Ｒ．（１９９４年）Ｎａｔｕｒｅ ３７２：３３３）。ｍＲＮＡ翻訳領域に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、翻訳の阻止剤としてあまり効率がよくないが、本発明により使用することも可能である。ＡＰＰ若しくはＡＰＰ類似ポリペプチドｍＲＮＡの５’、３’、又は翻訳領域にハイブリッド形成するように設計されているかどうかに関係なく、アンチセンス核酸の長さは少なくともヌクレオチド約６個分でなければならず、好ましくは約１００個未満、より好ましくは約５０又は３０個分未満である。典型的には、これらの長さはヌクレオチド１０個分から２５個分までの剥いでなければならない。このような原理は、施術者が適切なオリゴヌクレオチドを選択する際の情報となる。好ましい実施形態では、アンチセンス配列は、ＡＰＰ又はＡＰＰ類似ポリペプチドをコードする核酸配列の約１０〜３０、より好ましくは１５〜２５個の連続オリゴヌクレオチド配列を含むか、又はそれらからなるか、又は本質的にそれらからなるオリゴヌクレオチドから選択される。
【００６９】
このような配列を使用することで、アンチセンスオリゴヌクレオチドを設計することができる。このようなアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＡＰＰ又はＡＰＰ類似ポリペプチドを発現する細胞に投与され、ターゲットＲＮＡ又はタンパク質のレベルと内部対照ＲＮＡ又はタンパク質のレベルとの比較がなされる。アンチセンスオリゴヌクレオチドを使用して得られる結果は、さらに、適当な対照オリゴヌクレオチドを使用して得られる結果とも比較される。好ましい対照オリゴヌクレオチドは、テストオリゴヌクレオチドとほぼ同じ長さを持つオリゴヌクレオチドである。ターゲットＲＮＡ又はタンパク質のレベルの減少を生じさせるこれらのアンチセンスオリゴヌクレオチドが選択される。
【００７０】
オリゴヌクレオチドは、一本鎖又は日本鎖のＤＮＡ又はＲＮＡ又はキメラ混合体又は誘導体又はその修飾が成されたものとすることができる。オリゴヌクレオチドは、例えば、分子、ハイブリダイゼーションなどの安定性を改善するために、塩基部分、糖部分、又はリン酸骨格のところで修飾することができる。オリゴヌクレオチドは、ペプチドなどの他の付加基（例えば、生体内の宿主細胞受容体の場合）、又は細胞膜上の輸送を容易にする作用物質（例えば、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら（１９８９年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃＬ Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：６５５３〜６５５６頁、Ｌｅｍａｉｔｒｅら（１９８７年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃＬ ＵＳＡ ８４：６４８〜６５２頁、１９８８年１２月１５日に公開されたＰＣＴ公開番号ＷＯ８８／０９８１０を参照）、又は血液脳関門（例えば、１９８８年４月２５日に公開されたＰＣＴ公開番号ＷＯ ８９／１０１３４を参照）、ハイブリダイゼーション誘発開裂作用物質（例えば、Ｋｒｏｌら（１９８８年）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：９５８〜９７６頁を参照）、又は挿入剤（例えば、Ｚｏｎ（１９８８年）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．５：５３９〜５４９頁を参照）を含むことができる。この目的のために、オリゴヌクレオチドは、他の分子、例えば、ペプチド、ハイブリダイゼーション誘発架橋剤、輸送剤、ハイブリダイゼーション誘発開裂作用物質などに結合することができる。
【００７１】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、及び５−（カルボキシヒドロキシエチル）ウラシルなどの部分から選択された少なくとも１つの修飾塩基部分を含むことができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、さらに、限定はしないがアラビノース、２−フルオロアラビノース、キシルロース、六炭糖を含む群から選択された少なくとも１つの修飾糖部分を含むことができる。
【００７２】
さらに他の実施形態では、アンチセンスヌクレオチドは、ホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、ホスホロアミドチオアート、ホスホラミデート、ホスホルジアデート、メチルホスホン酸塩、アルキルホスホトリエステル、ホルムアセタール、又はそれらのアナログの群から選択された少なくとも１つの修飾リン酸骨格を含む（米国特許第５，１７６，９９６号、第５，２６４，５６４号、及び第５，２５６，７７５号も参照）。
【００７３】
さらに他の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、α−アノマーオリゴヌクレオチドである。α−アノマーオリゴヌクレオチドは、通常のβユニットとは反対に、鎖が互いに平行に走る相補的ＲＮＡとの特異二本鎖ハイブリッドを形成する（Ｇａｕｔｉｅｒら（１９８７年）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５：６６２５〜６６４１頁）。オリゴヌクレオチドは、２’−０−メチルリボヌクレオチド（Ｉｎｏｕｅら（１９８７年）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５：６１３１〜６１４８頁）、又はキメラＲＮＡ−ＤＮＡアナログ（Ｌｉｏｕｅら（１９８７年）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２１５：３２７〜３３０頁）である。
【００７４】
さらに好適なのは、側鎖位置で核酸と置換されたさまざまなアミノ酸を含有する共重合体を含む、ポリセリン、トレオニンなどのポリペプチドである、ペプチジル核酸である（Ｔ５Ａ５Ｇ５Ｃ５Ｕ）。このような重合体の鎖は、天然ＤＮＡ／ＲＮＡと同じようにして相補的塩基を通じてハイブリッド形成することができる。それとは別に、本発明のアンチセンス建築物は、例えば、細胞内で転写されたときに、本発明のキナーゼポリペプチドをコードする細胞ｍＲＮＡの少なくとも１つの固有の部分に相補的なＲＮＡを生成する発現プラスミド又はベクターとして送達することができる。
【００７５】
ＡＰＰ又はＡＰＰ類似ポリペプチド翻訳領域配列に相補的なアンチセンスヌクレオチドを使用することができるが、転写非翻訳領域に相補的なのが最も好ましい。
【００７６】
本発明のさらに他の態様によれば、海馬シナプス喪失を防ぐための方法が提供され、前記方法は、カスパーゼ又は他のプロテアーゼがβアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）及び／又はＡＰＰ類似タンパク質（例えば、ＡＰＬＰ１又はＡＰＬＰ２）を開裂する能力を阻止することを含む。
【００７７】
上述のように、ＡＰＰ及び／又はＡＰＰ類似タンパク質（例えば、ＡＰＬＰ１又はＡＰＬＰ２）を開裂するプロテアーゼの能力は、さまざまな方法で、例えば、抗タンパク分解酵素抗体、プロテアーゼコード配列に基づくアンチセンスヌクレオチド、ペプチド、ペプチド模倣薬、リボザイム、干渉ＲＮＡ、プロテアーゼ拮抗薬、プロテアーゼがＡＰＰ及び／又はＡＰＰ類似タンパク質（例えば、ＡＰＬＰ１又はＡＰＬＰ２）の細胞質内領域を開裂する能力を阻止する小分子などにより、阻止することができる。
【００７８】
本発明のさらに他の態様によれば、歯状回回転萎縮を防ぐための方法が提供され、前記方法は、カスパーゼ又は他のプロテアーゼがβアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）及び／又はＡＰＰ類似タンパク質（例えば、ＡＰＬＰ１又はＡＰＬＰ２）を開裂する能力を阻止することを含む。
【００７９】
上述のように、ＡＰＰ及び／又はＡＰＰ類似タンパク質（例えば、ＡＰＬＰ１又はＡＰＬＰ２）を開裂するプロテアーゼの能力は、さまざまな方法で、例えば、抗タンパク分解酵素抗体、プロテアーゼコード配列に基づくアンチセンスヌクレオチド、ペプチド、ペプチド模倣薬、リボザイム、干渉ＲＮＡ、プロテアーゼ拮抗薬、プロテアーゼがＡＰＰ及び／又はＡβの細胞質内領域を開裂する能力を阻止する小分子などにより、阻止することができる。
【００８０】
本発明のさらに他の態様によれば、神経変性疾患を治療するための遺伝子療法が提供され、前記方法は突然変異をβアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）に導入し、カスパーゼ媒介開裂を防ぐことを含む。
【００８１】
実際、肯定的な初期結果を実証したヒト遺伝子療法に対する実用的アプローチに進歩があった（Ｍｉｌｌｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ ３５７：４５５〜４６０頁、１９９２年で総説されている）。遺伝子療法の基礎科学については、Ｍｕｌｌｉｇａｎ（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０：９２６〜９３１頁、１９９３年）で説明されている。
【００８２】
したがって、一実施形態では、突然変異ＡＰＰコード配列を含む発現ベクターが、細胞内に挿入され、細胞は、試験管内で増殖され、次いで、多数が患者体内に注入される。
【００８３】
本発明による遺伝子療法は、神経系細胞をターゲットとする突然変異ＡＰＰ ｃＤＮＡを含むアデノウィルスの使用、遺伝子操作を施した細胞の移植による突然変異ＡＰＰの全身性発現、突然変異ＡＰＰコードウィルスによる注入、適切な組織中への裸の突然変異ＡＰＰ ＤＮＡの注入などを伴う場合がある。
【００８４】
このようなレトロウィルス、ワクシニアウィルス、アデノウィルス、アデノ関連ウィルス、ヘルペスウィルス、複数のＲＮＡウィルス、又はウシ乳頭腫ウィルスなどのウィルスに由来する発現ベクターは、本発明によるヌクレオチド配列（例えば、ｃＤＮＡ）コード突然変異ＡＰＰをターゲットの細胞母集団（例えば、神経系細胞）に送達するために使用することができる。当業者によく知られている方法は、コード配列を含む組換えウィルスベクターを較正するために使用できる（Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎ．Ｙ．，１９８９年、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏ−ｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．、１９８９年）。それとは別に、タンパク質配列をコードする組換え核酸分子は、裸のＤＮＡとして、又は再構成系、例えば、リポゾーム又は他の脂質系内で、ターゲット細胞に送達するために使用することができる（例えば、Ｆｅｉｇｎｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３３７：３８７−８、１９８９年）。プラスミドＤＮＡを細胞に直接導入する複数の他の方法が存在し、ヒト遺伝子療法に使用され、これは、プラスミドＤＮＡをタンパク質に錯化することによりＤＮＡのターゲットを細胞上の受容体とすることを伴う（Ｍｉｌｌｅｒ、上記）。
【００８５】
最も単純な形態では、遺伝子導入は、単に、マイクロインジェクション法を使って、微量のＤＮＡを細胞の核に注入することにより実行することができる（Ｃａｐｅｃｃｈｉ，Ｃｅｌｌ ２２：４７９−８８、１９８０年）。組換え遺伝子が細胞内に導入されると、それらは、細胞の転写と翻訳の通常の仕組みにより認識され、遺伝子生成物が発現される。ＤＮＡを多数の細胞に導入する他の方法も試みられた。これらの方法は、ＤＮＡがリン酸カルシウムにより沈殿され、飲作用により細胞内に摂取される、トランスフェクション（Ｃｈｅｎら、ＭｏＩ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．７：２７４５−５２、１９８７年）、細胞が大きな電圧パルスに曝され、膜に孔を開けるエレクトロポレーション（Ｃｈｕら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５：１３１１−２６，１９８７年）、ＤＮＡがターゲット再秒と融合する脂溶性小胞内にパッケージされるリポフェクション／リポゾーム融合（Ｆｅｉｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８４：７４１３−７４１７，１９８７年）、及び小さな発射体に結合されたＤＮＡを使用する粒子衝突（Ｙａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８７：９５６８−９５７２，１９９０年）を含む。ＤＮＡを細胞内に導入する他の方法は、ＤＮＡを化学修飾タンパク質に結合することである。
【００８６】
アデノウィルスがエンドソームを不安定にし、ＤＮＡの細胞内への取り込みを強化することは明らかになっている。ＤＮＡ複合物を含有する溶液にアデノウィルスを混合するか、又はアデノウィルスに共有結合しているポリリシンにタンパク架橋剤を用いてＤＮＡを結合させると、組換え遺伝子の取り込み及び発現が著しく向上する（Ｃｕｒｉｅｌ他、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、６巻、２４７〜２５２頁、１９９２年）。
【００８７】
本明細書において「遺伝子導入」とは、細胞内に外来の核酸分子を導入することを意味する。遺伝子導入は、通例、その遺伝子によってコードされる特定の産物の発現を可能にするために行われる。そのような産物には、タンパク、ポリペプチド、アンチセンスＤＮＡ若しくはＲＮＡ、又は酵素活性を有するＲＮＡを含むことができる。遺伝子導入は、培養細胞中で又は動物に直接投与することによって行う。一般に、遺伝子導入は、非特異的相互作用又はレセプター仲介相互作用による核酸の標的細胞との接触、膜を介した又はエンドサイトーシスによる細胞内への核酸の取り込み、及び細胞形質膜又はエンドソームから細胞質内への核酸の放出というプロセスを含む。発現には、さらに核酸の細胞核への移動及び転写のための適切な核内因子への結合が必要となる。
【００８８】
本明細書において「遺伝子治療」とは、遺伝子導入の１つの形態であって、本明細書において遺伝子導入の定義の中に含まれるものであり、具体的には、ｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞から治療的産物を発現するための遺伝子導入のことを言う。遺伝子導入は、ｅｘ ｖｉｖｏで細胞にて実施し、その後その細胞を患者に移植して行うこともできるし、又は核酸若しくは核酸タンパク者複合体を患者に直接投与して行うこともできる。
【００８９】
別の好ましい実施態様においては、変異型ＡＰＰをコードする核酸配列を有するベクターであって、その核酸配列が特定の組織においてのみ発現されるようなベクターが提供される。組織特異的遺伝子発現を達成する方法については、１９９２年１１月３日に提出され、１９９３年５月１３日に公開された国際公開特許ＷＯ９３／０９２３６に記載されている。
【００９０】
前記した全ベクターにおいて、本発明のさらなる態様によれば、そのベクターに含まれる核酸配列は、その核酸配列の一部又は全てに対する付加、削除又は修正を含むことができる。
【００９１】
本発明を、以下の限定しない実施例に関してさらに詳しく説明する。
【実施例１】
【００９２】
ＰＤＡＰＰ（Ｄ６６４Ａ）変異の発生
ＧからＣへの点変異を、Ａｓｐ６６４（ＡＰＰ６９５番）をＡｌａ（ＰＤＡＰＰ（Ｄ６６４Ａ））に変化させるスェーデン型及びインディアナ型変異を担持しているＰＤＧＦβ鎖プロモーター由来ｈＡＰＰミニ遺伝子（Ｈｓｉａ他、上記文献参照）に導入した。変異は、配列決定と対立遺伝子特異的増幅の両方によって確認した。
【実施例２】
【００９３】
トランスジェニックマウスの作出
ＰＤＡＰＰ（Ｄ６６４Ａ）導入遺伝子のマイクロインジェクション、ＰＣＲによるトランスジェニックファウンダーの同定、及び本研究用ＰＤＡＰＰ（Ｄ６６４）Ｂ２１系の選択を、前に記載されているように実施した（Ｌｉ，Ｙ．、Ｃａｒｌｓｏｎ，Ｅ．、Ｍｕｒａｋａｍｉ，Ｋ．、Ｃｏｐｉｎ，Ｊ．Ｃ．、Ｌｕｃｈｅ，Ｒ．、Ｃｈｅｎ，Ｓ．Ｆ．、Ｅｐｓｔｅｉｎ，Ｃ．Ｊ．及びＣｈａｎ，Ｐ．Ｈ．、ジャーナルオブニューロサイエンスメソッド（Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｍｅｔｈｏｄｓ）、８９号、４９〜５５頁、１９９９年参照）。実質的には以下のように進行した。
【００９４】
ベクター配列を有さない精製した線状ヒトＰＤＡＰＰ（Ｄ６６４Ａ）導入遺伝子ＤＮＡの２ｎｇ／μｌ溶液を、日齢１日のＢ６Ｄ２Ｆ１／Ｊ卵の雄性前核にマイクロインジェクションし、２４時間後に擬妊娠のＣＤ１里親に移した。ｈＡＰＰ導入遺伝子に特異的なプライマー
【化２】
と
及びマウスＰＫＲ遺伝子に特異的なプライマー
【化３】
と
を使用したＰＣＲによって、ファウンダーの同定を行った。
【００９５】
同様の手順で作製されるその他のトタンスジェニック系には、
【化４】
等が含まれる。
【００９６】
トランスジェニック系を、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系統マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）とのヘテロ接合体の交雑種によって維持した。全トランスジェニック動物がその導入遺伝子に関してヘテロ接合であった。非トランスジェニック同腹仔を対照として使用した。免疫沈降反応と、抗ＡＰＰ５Ａ３／Ｇ７モノクローナル抗体を使ったウェスタンブロットとによって、脳ホモジネート中においてヒトＡＰＰ及びマウスＡＰＰを検出した（Ｓｏｒｉａｎｏ他、上記文献参照）。
【実施例３】
【００９７】
可溶性Ａβの検出
免疫沈降反応と、Ａβペプチドのアミノ酸残基１〜１２を認識する２６Ｄ６抗ＡＰＰモノクローナル抗体を使ったウェスタンブロットによって、脳内ＡβレベルをＣＨＡＰＳ可溶性溶解物で評価した。免疫沈降物をｂｉｃｉｎｅ尿素ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上でＡβ４０種とＡβ４２種とに分画した（Ｗｇｇｅｎ他、ネーチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、４１４号、２１２〜２１６頁、２００１年参照）。ＡＰＰのＣ末端を認識するポリクローナル抗体であるＣＴ１５を用いて、ＡＰＰをＣＨＡＰＳ脳溶解物でイムノブロットした。凝集Ａβペプチドの沈降に先立って、全動物の月齢を、３〜４ヶ月の間で同じにした。
【実施例４】
【００９８】
Ａβ沈着物の数量化
ヘテロ接合性ＰＤＡＰＰマウス及びＰＤＡＰＰ（Ｄ６６４Ａ）Ｂ２１マウスの脳の５０ミクロンのビブラトーム切片を、先に記載されている（Ｗｙｓｓ−Ｃｏｒａｙ，Ｔ．、Ｍａｓｌｉａｈ，Ｅ．、Ｍａｌｌｏｒｙ，Ｍ．、ＭｃＣｏｎｌｏｇｕｅ，Ｌ．、Ｊｏｈｎｓｏｎ−Ｗｏｏｄ，Ｋ．、Ｌｉｎ，Ｃ．及びＭｕｃｋｅ，Ｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、３８９号、６０３〜６０６頁、１９９７年参照）ようにして３Ｄ６抗体で染色した。系統及び遺伝子型に関して知らされていない調査員が、全海馬Ａβ斑を同定し、その数を数えた。データを平均＋／−ＳＤで表した。
【実施例５】
【００９９】
ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＡｓｐ６６４位置でのＡＰＰの切断
ＡＡＰのＡｓｐ６６４位置における切断によって発生するネオエピトープに特異的な抗体（Ｇａｌｖａｎ他、Ｊ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ、８２号、２８３〜２９４頁、２００２年参照）を用いて、対照マウス及びＰＤＡＰＰ（Ｄ６６４Ａ）マウス両者に比べてＰＤＡＰＰマウスにおいて切断が増加していることを明らかにした。
【実施例６】
【０１００】
シナプス前膜肥厚の数量化
シナプス前末端の無傷性を測定するために、ヘテロ接合性雌性ＰＤＡＰＰマウス及びＰＤＡＰＰ（Ｄ６６４Ａ）マウスの脳の５０ミクロンのビブラトーム切片を、αシナプトフィジン抗体（１０μｇ／ｍｌ、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）とフルオレセインイソチオシアネート標識ロバ抗マウスＩｇＧ抗体（１：４００、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で順次染色し、次いでプロピジウムアイオダイドで対比染色した後、１００倍の対物レンズと２．７倍のディジタルズームを使ったレーザー走査型共焦点顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ ＰＣＭ−２０００）でイメージングした。ＣＡ１放射状層におけるシナプトフィジン免疫反応性シナプス前末端の３次元数値化した肥厚（ｍｍ３当たりの対象数で表す）を、立体解剖法（Ｈｓａｉ，Ａ．Ｙ．他、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、９６巻、３２２８〜３２３３頁、１９９９年参照）の変法によって測定した。
【０１０１】
各動物につき、６枚の１０２４×１０２４ピクセル（４５μｍ×４５μｍ）モノクロ共焦点画像を、２０７０ＰＭＴゲインで得た。さらに追加して６対の共焦点画像１セットを、Ｘ、Ｙ座標は同じとし、最初の共焦点画像取得の水平面より０．９μｍ下方に水平面をずらして（ｚ＝−０．９０μｍ）２１００ＰＭＴゲインで得、Ｓｉｍｐｌｅ ＰＣＩソフト（Ｃｏｍｐｉｘ，Ｉｎｃ．）を使ってフォトブリーチを補正した。各野の神経プロセスに対応して生じる非染色領域の割合のバラツキがもたらす測定値の変動性を低減するために、各対の画像の最も明るい領域から、プロセスが占める領域を避けて１０μｍ×１０μｍの範囲を２枚取った。異なるｚ座標で取った各対の１０μｍ×１０μｍの範囲の画像を赤と緑で偽着色し、重ね合わせた。得られた画像のボケはＰｈｏｔｏｓｈｏｐを使って修正し、両平面にある免疫標識された対象（黄色）の数を、Ｓｉｍｐｌｅ ＰＣＩを使って数えた。各マウスにつき６つの海馬切片を通過するように無作為に配置された１２のディセクターから得られた免疫標識対象数を、（ディセクター同志が重なるのを回避しながら）対象マウス毎に平均し、続く統計解析に使用した（図２Ｂ及び２Ｃ参照）。
【実施例７】
【０１０２】
体積測定
適切なアトラス（Ｐａｘｉｎｏｓ，Ｇ．、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｋ．Ｂ．Ｊ．、「マウス脳定位座標（Ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｂｒａｉｎ ｉｎ Ｓｔｅｒｅｏｔａｘｉｃ Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｓ）」、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、２００１年、サンディエゴ参照）の助けをかりて、海馬の歯状回（ＤＧ）及び分子層（ＭＬ）の境界を定めた。海馬及びその各野の全体積を、Ｉｍａｒｉｓ３Ｄ（Ｂｉｔｐｌａｎｅ ＡＧ、スイス）を使った３次元形状復元（図２Ｃ参照）によって測定し、カバリエリ（Ｃａｖａｌｉｅｒｉ）解析（図２Ｂ参照）によって確認した。
【０１０３】
Ｉｍａｒｉｓ３Ｄ（Ｂｉｔｐｌａｎｅ）及び手によるカバリエリ（Ｃａｖａｌｉｅｒｉ）解析を使って体積測定するために、適切なアトラス（Ｐａｘｉｎｏｓ，Ｇ．、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｋ．Ｂ．Ｊ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、２００１年、サンディエゴ、カリフォルニア）の助けをかりて、４０μｍのニッスル（Ｎｉｓｓｌ）染色したスナップ凍結マウス（２５匹の１００日齢ヘテロ接合性雄性トランスジェニックマウス又は雄性非トランスジェニック同腹仔に相当）の脳切片の１−ｉｎ−４システマティックランダムシリーズの２Ｘ画像に、各片側海馬、歯状回（ＤＧ）及び分子層（ＭＬ）各野の境界線を、海馬采と脳梁の灰白質／白質境界、分子層と網状分子層の境界、及び多形細胞層と視床の境界で引いた。支脚は除外した。各サンプルにおいて、最後の切片を、連続脳梁線維路を示す切片と定義した。Ｉｍａｒｉｓ３Ｄ体積測定するために、Ａｌｉｇｎアプリケーション（Ｂｉｔｐｌａｎｅ）を使って各切片を一列に並べ、得られた列を必要に応じて手で調節した。続く３Ｄ形状復元及び体積測定には全て３．３μｍ×３．３μｍ×１６０μｍのボクセルサイズを使用した。カバリエリ（Ｃａｖａｌｉｅｒｉ）の原理を使って体積評価するために、サンプルの各切片の１２８０×１０２４ピクセル画像上に２００μｍのグリッドをかぶせ、各各片側海馬、歯状回及び分子層各野内のグリッドの交差点の数を、サンプルの切片毎に数えた。各体積を、先に記載したよう算出した（Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ｌｉｍａ，Ｆ．、Ｂｅｒｎｄｔ，Ｊ．Ｄ．、Ｇａｍｅｓ，Ｄ．及びＲｅｉｍａｎ，Ｅ．Ｍ．、Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ、１２巻、２３７５〜２３７９頁、２００１年参照）。
【０１０４】
カバリエリ（Ｃａｖａｌｉｅｒｉ）解析及びＩｍａｒｉｓ３Ｄ形状復元によって得られた体積の間には、高度な相関関係があった（ｒ２＝０．７２、ｐ＜０．００００１、ｎ＝２５）。各系統間又は遺伝子型間には、総体重又は脳重量の有意な差は見られなかった。全試験について、マウス及び脳組織サンプルは、系統及び遺伝子型に関して知らされていない調査員に対して暗号化されていた。データを平均＋／−ＳＤで表した。有意（ｐ＜０．０５）は、スチューデントの検定（分散が同等であると仮定して）又はピアソンの相関係数検定と、それに続く回帰分析のためのラン検定によって決定した。
【実施例８】
【０１０５】
ｉｎ ｖｉｔｒｏ切片電気生理学
３〜７月齢のＰＤＡＰＰＪ２０、ＰＤＡＰＰ（Ｄ６６４Ａ）Ｂ２１及び非トランスジェニック同腹仔対照マウスから海馬水平断切片（４００μｍ）を作製した（Ｊ２０マウスとＢ２１マウスは似たレベルのＡＰＰ導入遺伝子を発現するため、Ｂ２１マウスと比較するためにＪ２０マウスを選択した）。切片は標準的な方法を使って（例えば、Ｃｏｎｔｒａｃｔｏｒ，Ａ．他、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、２３巻、４２２〜４２９頁、２００３年参照）作製した。要するに、動物にイソフルランで麻酔をかけ、断頭した。脳を摘出し、氷で冷やしたスクローススライス人工脳脊髄液（ＡＣＳＦ）下でスライスした。この人工脳脊髄液（ＡＣＳＦ）
は、８５ｍＭ ＮａＣｌ、２．５ｍＭ ＫＣｌ、１．２５ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、２５ｍＭ ＮａＨＣＯ３、２５ｍＭグルコース、７５ｍＭスクロース、０．５ｍＭ ＣａＣｌ２、及び４ｍＭ ＭｇＣｌ２を含有しかつ９５％Ｏ２及び５％ＣＯ２で平衡状態が保たれていた。また、１０μＭＤ，Ｌ−ＡＰＶ及び１００μＭキヌレナートも含有していた。記録に先立ち、切片を、室温で少なくとも１時間、１２５ｍＭ ＮａＣｌ、２．４ｍＭ ＫＣｌ、１．２ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、２５ｍＭ ＮａＨＣＯ３、２５ｍＭグルコース、１ｍＭ ＣａＣｌ２、及び２ｍＭ ＭｇＣｌ２を含有する標準ＡＣＳＦ中でインキュベートした。記録時は、切片を２ｍＭ ＣａＣｌ２及び１ｍＭ ＭｇＣｌ２を含有するＡＣＳＦで連続して潅流した。
【０１０６】
細胞外場電位（ｆＥＰＳＰ）を、細胞外溶液で満たした記録用ガラスピペット（先端抵抗２〜３Ｍオーム）を使って、海馬ＣＡ１領域の放射状層で記録した。定電流を通す同心双極電極を使い、シャファー側枝／交連経路の刺激に反応して誘発ｆＥＰＳＰを記録した。記録されたｆＥＰＳＰの入力と出力の関係を比較することによって基本的シナプス伝達を測定した（Ｈｓｉａ他）。ここで入力は線維斉射のピーク振幅であり、出力はｆＥＰＳＰの立ち上がり期の傾きである。動物毎に、線維斉射（ＦＶ）振幅及び５〜８００μＡの刺激範囲に反応するｆＥＰＳＰの立ち上がり期の傾きを測定し、両者の値の反応曲線を作成した。次いで、入力と出力の関係を、ｆＥＰＳＰの傾き値をＦＶ振幅値（反応曲線上の直線部分に沿った各点からの）で割り、平均値を取ることによって算出した。刺激間間隔を４０ｍｓとし、ｆＥＰＳＰ（２）のピーク振幅／ｆＥＰＳＰ（１）のピーク振幅として測定した比を用いて、ペアパルス促進を引き出した。１元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）と、次いでＴｕｒｋｅｙ ｐｏｓｔ−ｈｏｃ検定を使って、結果を解析した。
【実施例９】
【０１０７】
神経発生
ＢｒｄＵ（５０ｍｇ／ｋｇ）を食塩水に溶解し、１日２回８時間の間隔をあけて連続３日間腹膜腔内投与し、１週間後にマウスを殺した。脳切片を、マウスモノクローナル抗ＢｒｄＵ（Ｒｏｃｈｅ、２μｇ／ｍｌ）及びビオチニル化したヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｖｅｃｔｏｒ、１：２００）で染色し、染色をジアミノベンジジンとＨ２Ｏ２で可視化した。２００μｍの間隔をあけて配置した、マウス１匹当たり５〜７つの５０μｍ冠状切片において、歯状回のＢｒｄＵ陽性細胞数をやみくもに数えた。細胞数はＭａｇｎｉｆｉｒｅディジタルカメラ付き顕微鏡Ｎｉｋｏｎ Ｅ８００を使い高倍率下で数え、その画像をコンピュータのモニターに表示した。結果は、切片当たりの平均ＢｒｄＵ陽性細胞数で表した。
【０１０８】
本発明をその好ましい実施例に関して詳細に述べたが、特許請求の範囲に記載する本発明の精神及び範囲において変更及び修正ができることは理解されよう。
【図面の簡単な説明】
【０１０９】
【図１】ＰＤＡＰＰ及びＰＤＡＰＰ（Ｄ６６４Ａ）トランスジェニックマウスの特性決定を一括して示す図である。［図１Ａ］ＰＤＡＰＰ及びＰＤＡＰＰ（Ｄ６６４Ａ）トランスジェニックマウスの作出において採用した建築物の誘導を示す図である。［図１Ｂ］種々の実験動物における可溶性Ａβの検出を示す図である。［図１Ｃ］種々の実験動物におけるＡβ斑の数をまとめた図である。［図１Ｄ］月齢１６ヶ月のＰＤＡＰＰ（Ｄ６６４Ａ）マウスから取出した染色脳切片を示す図であって、Ａβ斑が存在することを示す図である。［図１Ｅ］ｉｎ ｖｉｖｏでのＡＰＰのＡｓｐ６６４番における切断を示す図である。ＡＰＰのＡｓｐ６６４番における切断によって生じるネオエピトープに特異的な抗体を用いて、ＰＤＡＰＰでは対照及びＰＤＡＰＰ（Ｄ６６４Ａ）マウスのいずれと比べても切断が増加することを証明したものである。
【図２】Ｄ６６４Ａ変異がシナプス消失及び歯状回萎縮に及ぼす影響をひとまとめにして示す図である。［図２Ａ］種々の実験動物におけるシナプス前膜肥厚を数量化してまとめた図である。［図２Ｂ］Ｉｍａｒｉｓ３Ｄ（Ｂｉｔｐｌａｎｅ ＡＧ、スイス）を使用した３次元形状復元によって測定され（図２Ｃ参照）、カバリエリ（Ｃａｖａｌｉｅｒｉ）解析によって確認される、海馬及びその亜領域の総体積をまとめた図である。［図２Ｃ］典型的なＰＤＡＰＰ（赤）及びＢ２１（黄）トランスジェニックマウスの歯状回分子層の表面を３次元形状に復元した形状の直交、矢状及び冠状面図である。
【図３】Ｄ６６４Ａ変異が基礎的なシナプス伝達に及ぼす影響をひとまとめにして示す図である。［図３Ａ］細胞外記録した幾つかのｆＥＰＳＰ（ｆｉｅｌｄ ＥＰＳＰ）を示す図であり、それらｆＥＰＳＰを用いて、月齢３〜７ヶ月のヘテロ接合Ｔｇ、非ＴｇＰＤＡＰＰＪ２０及びＰＤＡＰＰ（Ｄ６６４Ａ）Ｂ２１マウスの海馬ＣＡ３とＣＡ１細胞間の基礎的なシナプス伝達強度を評価した。刺激強度を増大したときの代表的なｆＥＰＳＰを、先に述べた非トランスジェニック及びトランスジェニックマウスについて示す。ＰＤＡＰＰＪ２０Ｔｇマウスの場合、比較的小さいＥＰＳＰを引き出すために大きい入力（拡大した時間スケールを有する差し込み図を参照。矢印は、活性化された軸策数を測る間接的尺度である線維斉射を表す）が必要であることを注意されたい。［図３Ｂ］先に述べたＴｇ及び非Ｔｇ動物について、立ち上がり期のＥＰＳＰの傾き値を線維斉射の振幅値で割った値を示す図である（非Ｔｇ同腹仔に標準化したデータ）。各データ点は、６〜７匹のマウスから取り出した１７〜２２個の切片から得た平均値を表す。統計解析（ＡＮＯＶＡ）によって有意な群効果（ｐ＜０．０００５）が明らかになった。Ｐｏｓｔ−ｈｏｃ Ｔｕｋｅｙ ｔｅｓｔによって、ＰＤＡＰＰＪ２０マウスが他のどの群よりも基礎的なシナプス伝達が有意に低こと（ｐ＜０．０１）、一方他の群の中では互いに有意な差がないことが確認された。［図３Ｃ］一対の刺激によって引き出されるｆＥＰＳＰの平均振幅値の割合として表される、ペアパルス促進を示す図である。データは、平均値＋／−ＳＥＭとして数字で示してある。
【図４】Ｄ６６４Ａ変異がＰＤＡＰＰに誘発される海馬の神経組織発生の増大に及ぼす影響をひとまとめにして示す図である。［図４Ａ］海馬歯状回の顆粒下領域における増殖細胞のＢｒｄＵ標識を示す図である。月齢１２ヶ月の対照（非Ｔｇ）、ＰＤＡＰＰ及びＰＤＡＰＰ（Ｄ６６４Ａ）マウスの腹腔内にＢｒｄＵを３日間投与し、１週間後に殺した。ＢｒｄＵで標識した細胞（黒い点）を免疫組織化学によって検出した。示した画像は各群につき４〜６匹の代表的例を示すものである。［図４Ｂ］ＢｒｄＵ標識を数量化して示す図である。示したデータは、平均細胞数±ＳＤ（ｎ＝４〜６）であり、スチューデントのｔ検定を用いて差の有意性を評価した。
【図５】カバリエリ解析によって得られた体積と３次元形状復元によって得られた体積との間の相関関係を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アルツハイマー病の非ヒトトランスジェニックモデル、及びアルツハイマー病の治療に有用な化合物を同定する方法やその化合物を使用する治療方法等を含めた上記トランスジェニックモデルの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
最も良く知られている痴呆性疾患であるアルツハイマー病（ＡＤ）は、脳における老人斑、神経原線維変化、並びにシナプス及びニューロンの消失をその特徴とする。老人斑の主なタンパク性成分はβアミロイドペプチド（Ａβ）であり、Ａβは、その前駆体であるβアミロイド前駆体タンパク（ＡＰＰ）のタンパク分解性切断によって産生される。アミロイド仮説によれば、ＡβによってＡＤ発症にいたるカスケードが開始される。アミロイド毒性の厳密なメカニズムははっきり分かっていないが、シナプスがＡβ傷害の早期易損性部位であるという証拠はそろっている（例えば、Ｓｅｌｋｏｅ，Ｄ．Ｊ．、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２９８号、７８９〜７９１頁、２００２年を参照）。このような見解と一致して、脳内に高レベルのＡβを有するＡＰＰトランスジェニックマウスの一部には、老人斑の形成に先立ち、シナプスの消失、行動の変化、及びシナプス伝達の低下が見られる（Ｈｓｉａ，Ａ．Ｙ．他、米国ナショナルアカデミーオブサイエンス会報（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ）、９６巻、３２２８〜３２３３頁、１９９９年及びＭｕｃｋｅ他、ジャーナルオブニューロサイエンス（Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．）、２０巻、４０５０〜４０５８頁、２０００年を参照）。最近では、ＡＰＰが、アポトーシスを仲介するシステインプロテアーゼであるカスパーゼによって６６４番のＡｓｐ（ＡＰＰの６９５番）においても切断されることが明らかになっている（Ｇｅｒｖａｉｓ，Ｆ．Ｇ．他、セル（Ｃｅｌｌ）、９７巻、３９５〜４０６頁、１９９９年及びＬｕ，Ｄ．Ｃ．他、ネーチャーメデシン（Ｎａｔ Ｍｅｄ）、６巻、３９７〜４０４頁、２０００年を参照）。このようなプロセッシングによって細胞毒性カルボキシ末端ペプチド、ＡＰＰ−Ｃ３１が遊離される。しかし、カスパーゼによるＡＰＰのプロセッシングがＡＤにおいて果たす役割（仮にあるとすれば）については不明である。カスパーゼによる細胞質内切断に伴って起きる細胞毒性ペプチドの生成は、ＤＣＣ（ｄｅｌｅｔｅｄ ｉｎ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ：大腸癌で発現が欠失している）、ＲＥＴ（ｒｅａｒｒａｎｇｅｄ ｄｕｒｉｎｇ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ：トランスフェクション時に再構成した）及びＵＮＣ５Ｈ１−３（ｕｎｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｄ ｇｅｎｅ ５ ｈｏｍｏｌｏｇｕｅｓ １−３ 非協調的遺伝子５相同体１〜３）などの依存性受容体で起きることが証明されている細胞毒性ペプチドの生成と類似しており、このことは、ＡＡＰが依存性受容体の機能を果たしている可能性を示唆するものである（Ｂｒｅｄｅｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ，印刷中２００４）。
【０００３】
したがって、アルツハイマー病などの神経変性疾患の発生においてカスパーゼなどのタンパク分解酵素が果たしている役割を研究することを可能にするトランスジェニックモデルの開発は、非常に重要であると考えられる。また、このようなトランスジェニックモデルが利用できることになれば、神経変性疾患の新規治療方法の開発が促進されると考えられる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明によれば、ＡＰＰにおけるＡｓｐ−＞Ａｌａ（Ｄ６６４Ａ）突然変異（これによりカスパーゼによる切断部位の切断が防止される）などの選択された突然変異によって、たとえアルツハイマー病のトランスジェニックモデルにおいてＡβの産生又はアミロイド斑の形成が妨げられなくても、海馬のシナプス消失及び歯状回萎縮の両方が防止されるということが証明される。
【０００５】
したがって、この発見によって、ＡＰＰのＡｓｐ６６４番における切断を阻止する作用物質を同定する方法（この方法には作用物質同定の目的に有用なトランスジェニック動物も含まれる）及び神経変性疾患の治療を目的としたそれら作用物質の使用方法が開発された。アルツハイマー病などの神経変性疾患の発生において早期に介入することによって、シナプスの働きの回復が容易になり、神経回路網の消失及び神経変性疾患の進行段階の特徴が低減されることになろう。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明によれば、変異型ヒトβアミロイド前駆体タンパク（ＡＰＰ）又はＡＰＰ類似タンパクをコードするヌクレオチド配列を含む非ヒトトランスジェニック動物であって、前記変異型ヒトＡＰＰ又はＡＰＰ類似タンパクが、前記変異型ヒトＡＰＰ又はＡＰＰ類似タンパクをＡｓｐ６６４番における切断に対して耐性とする突然変異を含み、また、前記変異型ヒトＡＰＰ又はＡＰＰ類似タンパクをコードする前記ヌクレオチド配列が、好適なプロモーターと作動可能に結合している非ヒトトランスジェニック動物が提供される。
【０００７】
本発明の１つの態様においては、Ａｓｐ６６４番における切断はプロテアーゼに誘発される。本発明の現在好ましい態様においては、Ａｓｐ６６４番における切断はカスパーゼに誘発される。
【０００８】
本発明の１つの態様においては、変異型ヒトＡＰＰ又はＡＰＰ類似タンパクは６６４番残基に突然変異を含む。元のＡｓｐ以外の６６４番にあるほとんど任意のアミノ酸残基は、カスパーゼなどのプロテアーゼがＡＰＰ又はＡＰＰ類似タンパクの６６４番を切断する能力を低下させることになることは、当業者には認識されている。６６４番の部位における現在好ましい変異には、元のＡｓｐのＡｌａ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ等への変換が含まれる。
【０００９】
本発明の別の態様においては、変異型ヒトＡＰＰ又はＡＰＰ類似タンパクは、６６４番のアミノ酸残基に隣接する１つ又は２つ以上の変異を含み、それによってカスパーゼなどのプロテアーゼがＡＰＰ又はＡＰＰ類似タンパクの６６４番を切断する能力を低下させる。
【００１０】
当業者ならば容易に理解するように、本発明のトランスジェニック動物の発生において採用されるプロモーターは、構成的に活性なプロモーターであっても誘導的なプロモーターであってもよい。好適なプロモーターは当業者には良く知られているが、Ｔ４、Ｔ３、Ｓｐ６及びＴ７ポリメラーゼを認識することができるプロモーター、バクテリオファージラムダのＰＲ及びＰＬプロモーター、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のｔｒｐ、ｒｅｃＡ、熱ショック及びｌａｃＺプロモーター、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のαアミラーゼ及びσ２８特異的プロモーター、桿菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）のバクテリオファージのプロモーター、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）プロモーター、バクテリオファージラムダのｉｎｔプロモーター、ｐＢＲ３２２のβラクトマーゼ遺伝子のｂｌａプロモーター、並びにクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子のＣＡＴプロモーターなどが含まれる。原核生物プロモーターについては、Ｇｌｉｃｋ（ジャーナルオブインダストリアルマイクロバイオロジー（Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．）、１巻、２７７頁、１９８７年）、Ｗａｔｓｏｎ他（モレキュラーバイオロジーオブザジーン（ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ ＯＦ ＴＨＥ ＧＥＮＥ）、４版、Ｂｅｎｊａｍｉｎ Ｃｕｍｍｉｎｓ編、１９８７年）、Ａｕｓｕｂｅｌ他（同上）、及びＳａｍｂｒｏｏｋ他（同上）によって総説されている。
【００１１】
プロモーター領域はそれぞれ長さ及び配列が異なっており、配列特異的ＤＮＡ結合タンパクのためのＤＮＡ結合部位を１つ若しくは２つ以上、及び／又はエンハンサー若しくはサイレンサーをさらに包含することができる。典型的なプロモーターには、ＣＭＶプロモーター、又は対象とする遺伝子若しくはコード配列を調節するプロモーターとしてのＰ５プロモーターが含まれる。これらプロモーター及びその変異体については、当技術分野では知られており、種々の記載がある（例えば、Ｈｅｎｎｉｇｈａｕｓｅｎ他、ＥＭＢＯジャーナル（ＥＭＢＯ Ｊ．）、５巻、１３６７〜１３７１頁、１９８６年、Ｌｅｈｎｅｒ他、ジャーナルオブクリニカルマイクロビオロジー（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．）、２９巻、２４９４〜２５０２頁、１９９１年、Ｌａｎｇ他、ニュクレイックアシッドリサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．）、２０巻、３２８７〜３２９５頁、１９９２年、Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ他、ジャーナルオブヴァイロロジー（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．）、４５巻、５５５〜５６４頁、１９８３年、Ｇｒｅｅｎ他、ジャーナルオブヴァイロロジー（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．）、３６巻、７９〜９２頁、１９８０年、Ｋｙｏｓｔｉｏ他（同上））。ただし、Ａｄ２又はＡｄ５主要後期プロモーター及び３連リーダー配列、ラウス肉腫ウィルス（ＲＳＶ）末端反復配列、並びに文献に記載されているような他の構成的プロモーターなど、その他のプロモーターも採用できる。例えば、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Ｗａｇｎｅｒ他、ナショナルアカデミーオブサイエンス会報（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ）、７８巻、１４４〜１４５頁、１９８１年）、Ｇａｌ４プロモーターなどの、酵母又は他の真菌類由来のメタロチオニン遺伝子の調節配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒ他、ネーチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、２９６号、３９〜４２頁、１９８２年）プロモーター要素、アルコールデヒドロゲナーゼプロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター、並びにアルカリホスファターゼプロモーター等を採用することができる。同様に、哺乳動物培養細胞のゲノムから又はこのような細胞で増殖したウィルスから単離されるプロモーター（例えば、Ａｄ、ＳＶ４０、ＣＭＶ等）も使用することができる。本発明用としてさらに付け加えられるプロモーターには、アクチンプロモーター、ＰＤＧＦ−βプロモーター、ＰｒＰ（神経特異的）プロモーター、神経特異的エノラーゼプロモーター等が含まれる。
【００１２】
構成的プロモーターを使用する代わりに、適切な信号に反応してプロモーターにアップ及び／又はダウンレギュレーションを起こすことも好ましくできる。例えば、ＩＬ−８プロモーターなどの、ＴＮＦ又は別のサイトカインに反応する誘導的プロモーターを採用することもできる。その他の好適な誘導的プロモーター系の例としては、メタロチオニン誘導性プロモーター系、バクテリアｌａｃ発現系、及びＴ７ポリメラーゼ系が挙げられるが、これに限定されるものではない。さらに、異なる発達段階で選択的に活性化されるプロモーター（例えば、グロビン遺伝子は、胎児と成人では異なって転写される）を採用することもできる。特に、テトラサイクリンなどの外的要因によって調節され得るプロモーター、昆虫由来のホルモンなどの天然のホルモン、エクジソン（若しくはその合成変異体）、又はＲＵ４８６などの合成ホルモンを採用することができる。これらのプロモーター（及び同様にして細胞に付与することができる付随の調節因子）は全て、当技術分野では種々記載されている（例えば、Ｄｅｌｏｒｔ他、ヒュ−マンジーンセラピー（Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ）、７巻、８０９〜８２０頁、１９９６年、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、ＣＬＯＮＴＥＣＨｎｉｑｕｅｓ、「Ｔｅｔ−Ｏｆｆ（商標）とＴｅｔ−Ｏｎ（商標）遺伝子発現系及び細胞系（Ｔｅｔ−Ｏｆｆ．ＴＭ ａｎｄ Ｔｅｔ−Ｏｎ．ＴＭ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅｓ）」、ＸＩ巻、Ｎｏ．３、２〜５頁、１９９６年７月を参照）。
【００１３】
もう１つの選択肢は、アルブミン又はアルファ抗トリプシンの肝細胞特異的プロモーター（Ｆｒａｉｎ他、モレキュラーアンドセルラーバイオロジー（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．）、１０巻、９９１〜９９９頁、１９９０年、Ｃｉｌｉｂｅｒｔｏ他、セル（Ｃｅｌｌ）、４１号、５３１〜５４０頁、１９８５年、Ｐｉｎｋｅｒｔ他、ジーンズアンドデベル（Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ．）、１号、２６８〜２７６頁、１９８７年、Ｋｅｌｓｅｙ他、ジーンズアンドデベル（Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ．）、１号、１６１〜１７１頁、１９８７年）、膵腺房細胞において活性なエラスターゼＩ遺伝子調節領域（例えば、Ｓｗｉｆｔ他、セル（Ｃｅｌｌ）、３８号、６３９〜６４６頁、１９８４年、ＭａｃＤｏｎａｌｄ、ヘパトロジー（Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ）、７号、４２５〜５１５頁、１９８７年）、膵β細胞において活性なインスリン遺伝子調節領域（Ｈａｎａｈａｎ、ネーチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、３１５号、１１５〜１２２頁、１９８５年）、精巣細胞、乳房細胞、リンパ球様細胞及び肥満細胞において活性なマウス乳癌ウィルス調節領域（Ｌｅｄｅｒ他、セル（Ｃｅｌｌ）、４５号、４８５〜４９５頁、１９８６年）、脳内の希突起神経こう細胞において活性なミエリン塩基性タンパク遺伝子調節領域（Ｒｅａｄｈｅａｄ他、セル（Ｃｅｌｌ）、４８号、７０３〜７１２頁、１９８７年）、及び視床下部において活性な性腺刺激放出ホルモン遺伝子調節領域（Ｍａｓｏｎ他、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２３４号、１３７２〜１３７８頁、１９８６年）などの組織特異的プロモーター（すなわち、所定の組織において優先的に活性化され、その活性化された組織において遺伝子産物を発現するプロモーター）を使用することである。同様に、結腸癌の癌胚抗原（Ｓｃｈｒｅｗｅ他、モレキュラーアンドセルラーバイオロジー（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．）、１０巻、２７３８〜２７４８頁、１９９０年）などの腫瘍特異的プロモーターをベクターにおいて使用することもできる。本発明によれば、所望の結合能及びプロモーター強度を有してさえいれば、いずれのプロモーターも突然変異誘発によって変えることができる。
【００１４】
当業者ならば容易に理解できるようが、ゲッ歯動物、ウサギ、ブタ等を含め多様な非ヒト動物を本発明のトランスジェニック動物の作出に使用することができる。現在において好ましい本発明のトランスジェニック動物はゲッ歯動物（例えば、マウス、ラット等）であって、マウスが特に好ましい。
【００１５】
Ｄ６６４Ａ変異（この変異は培養細胞におけるＡβ産生には影響しない（Ｓｏｒｉａｎｏ，Ｓ．、Ｌｕ，Ｄ．Ｃ．、Ｃｈａｎｄｒａ，Ｓ．、Ｐｉｅｔｒｚｉｋ，Ｃ．Ｕ．及びＫｏｏ，Ｅ．Ｈ．、ジャーナルオブバイオロジカルケミストリー（Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ）、２７６号、２９０４５〜２９０５０頁、２００１年参照））を、ＰＤＧＦβ鎖プロモーターの下流にスウェーデン型（Ｋ６７０Ｎ、Ｍ６７１Ｌ）及びインディアナ型（Ｖ７１７Ｆ）家族性ＡＤ変異を担持するヒトＡＰＰ（ｈＡＰＰ）ミニ遺伝子内に導入した。これらの動物を５〜１０世代にわたってＣ５７ＢＬ／６バックグラウンドに交配し、類似の遺伝的バックグラウンドを有するＰＤＡＰＰトタンスジェニックマウス（Ｊ９及びＪ２０系（Ｈｓｉａ他、Ｍｕｃｋｅ、上記文献参照））と比較した。この基礎的な手順を採用して、
【化１】
等を含めた、非常に多くのトランスジェニック系を作出することができる。
【００１６】
作出した最初の６つのトランスジェニック系のうち、１つの系（ＰＤＡＰＰ（Ｄ６６４Ａ）Ｂ２１）は、ＰＤＡＰＰＪ２０系と類似のＡＰＰ発現、Ａβ濃度及び線維状Ａβ斑数を示した（図１Ａ〜１Ｄ参照）。２番のＰＤＡＰＰ（Ｄ６６４Ａ）トランスジェニック系、すなわちＰＤＡＰＰ（Ｄ６６４Ａ）Ｂ１５７は、ＡＰＰの発現レベルがＰＤＡＰＰＪ９系に比べてやや低かった（図１Ａ参照）。これらのトランスジェニック系を、さらなる研究用に選択した。
【００１７】
Ａｓｐ６６４の変異がｉｎ ｖｉｖｏにおいてｈＡＰＰのＣ末端切断を効果的に阻止するかどうかを評価するために、３月齢のＰＤＡＰＰ及びＰＤＡＰＰ（Ｄ６６４Ａ）マウスの脳の切片を、ＡＰＰのＡｓｐ６６４位置での切断後に生成されるＣ末端ネオエピトープ（ＡＰＰＮｅｏ、Ｇａｌｖａｎ，Ｖ．他、ニューロケム（Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ）、８２号、２８３〜２９４頁、２００２年参照）を特異的に認識する抗体で免疫染色した。ＰＤＡＰＰ動物において海馬神経の細胞体及び突起に強いＡＰＰＮｅｏ免疫反応性を検出したが、ＰＤＡＰＰ（Ｄ６６４Ａ）動物の切片の免疫反応性のレベルは、いずれのトランスジェニック系の非トランスジェニック同腹仔に認められる免疫反応性レベルと区別できないものであった（図１Ｅ参照）。
【００１８】
ＡＤ患者の認識能低下の程度は、海馬及び前頭前野皮質のシナプス前小胞タンパク、シナプトフィジン、レベルの変化と強い相関がある（例えば、Ｔｅｒｒｙ，Ｒ．Ｄ．他、アナルズオブニューロロジー（Ａｎｎ Ｎｅｕｒｏｌ）、３０巻、５７２〜５８０頁、１９９１年参照）。シナプトフィジンの低レベル化は、これはシナプスの損傷と関連があると推測されるが、ＡＤの最も初期の段階と関連している（例えば、Ｍａｓｌｉａｈ，Ｅ．他、ニューロロジー（Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ）、５６号、１２７〜１２９頁、２００１年参照）。ＰＤＡＰＰマウスにおいては、斑形成のかなり前に、海馬シナプトフィジン免疫反応性シナプス前膜肥厚の数に減少が見られる（例えば、Ｈｓｉａ，Ａ．Ｙ．他、米国ナショナルアカデミーオブサイエンス会報（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ）、９６巻、３２２８〜３２３３頁、１９９９年参照）。ｈＡＰＰトランスジェニックマウスの海馬におけるシナプス前要素の消失において、Ｄ６６４Ａ変異が何らかの役割を果たしているかどうかを決定するために、８〜１０月齢のＰＤＡＰＰ、ＰＤＡＰＰ（Ｄ６６４Ａ）及び対照のそれぞれのマウスにおいて、海馬シナプス前膜肥厚、シナプス肥厚、及び歯状回の体積を、「立体解剖」法（実施例６及びＨｓｉａ，Ａ．Ｙ．他、米国ナショナルアカデミーオブサイエンス会報（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ）、９６巻、３２２８〜３２３３頁、１９９９年参照）の変法によって測定した。これらのパラメーターはアルツハイマー病における認識能低下と相関があるためである。驚くべきことに、ＰＤＡＰＰマウスでは、その非トランスジェニック同腹仔に比べて海馬シナプス肥厚に顕著な減少が見られたが、Ｂ２１マウスでは見られなかった（図２Ａ及び２Ｂ参照）。２番のＰＤＡＰＰ（Ｄ６６４Ａ）トランスジェニック系であるＢ１５７でも全く同じ結果が得られた。
【００１９】
同様に、最近の文献に記載されているように（Ｒｅｄｗｉｎｅ，Ｊ．Ｍ．、Ｋｏｓｏｆｓｋｙ，Ｂ．、Ｊａｃｏｂｓ，Ｒ．Ｅ．、Ｇａｍｅｓ，Ｄ．、Ｒｅｉｌｌｙ，Ｊ．Ｆ．、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｊ．Ｈ．、Ｙｏｕｎｇ，Ｗ．Ｇ．及びＢｌｏｏｍ，Ｆ．Ｅ．、米国ナショナルアカデミーオブサイエンス会報（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ）、１００巻、１３８１〜１３８６頁、２００３年参照）、ＰＤＡＰＰマウスでは、特に分子層において歯状回の体積減少が見られ、一方Ｂ２１マウスでは著しい消失は認められなかった（図２Ｃ参照）。
【００２０】
皮質の体積の著しい減少は、ＡＤのきわめて重要な神経病理学的特徴の１つである。ＡＤのトランスジェニックマウスが全てこの病気のこの特定の特徴を反復するわけではないが、ＰＤＡＰＰマウスでは比較的若年で（３〜４月齢）、特に分子層において、歯状回の体積減少が見られることが明らかになっている（例えば、Ｄｏｄａｒｔ，Ｊ．Ｃ．他、ニューロバイオロジーオブディスィーズ（Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ Ｄｉｓ）、７号、７１〜８５頁、２０００年及びＲｅｄｗｉｎｅ，Ｊ．Ｍ．他、米国ナショナルアカデミーオブサイエンス会報（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ）、１００巻、１３８１〜１３８６頁、２００３年参照）。それゆえに、ニッスル（Ｎｉｓｓｌ）染色法で染色された切片のデジタル３次元形状復元及び手を使ったカバリエリ解析によって、３月齢のＰＤＡＰＰ、ＰＤＡＰＰ（Ｄ６６４Ａ）及び対照動物における歯状回の体積を測定することは関心を引くものであった。手を使ったカバリエリ解析による測定（図２Ｂ参照）及びデジタル３次元形状復元による測定（図２Ｃ、２Ｄ参照）のいずれの場合にも、ＰＤＡＰＰマウスの脳内には著しい歯状回縮小が見られたが、ＰＤＡＰＰ（Ｄ６６４Ａ）マウスには見られなかった。カバリエリ解析によって得られた体積とデジタル３次元形状復元によって得られた体積との間には高度な相関関係があった（ｒ２＝０．７２、ｐ＜０．００００１、ｎ＝２５）（図５参照）。
【００２１】
ＡＰＰトランスジェニックマウスにおけるシナプス無傷性を考慮した場合、組織学的なシナプス数の定量では脳内に存在する機能的シナプスの数を多く見積もりすぎている恐れがあるため、シナプス伝達の機能的試験が重要である。ＰＤＡＰＰマウスにおけるシナプス前構造体の消失には基礎的シナプス伝達の損傷が伴うことが明らかになっている（Ｈｓｉａ，Ａ．Ｙ．他、米国ナショナルアカデミーオブサイエンス会報（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ）、９６巻、３２２８〜３２３３頁、１９９９年参照）。ＰＤＡＰＰ（Ｄ６６４Ａ）マウスの海馬に認められるシナプス前膜肥厚の回復がシナプス機能の救済と一致しているかどうかを決定するために、３〜７月齢のＰＤＡＰＰ、ＰＤＡＰＰ（Ｄ６６４Ａ）及び対照マウスの脳から取り出した海馬の先鋭切片について電気生理学的記録を実施した。細胞外で記録した興奮性シナプス後電位（ｆＥＰＳＰ）を用いて、海馬ＣＡ３細胞と海馬ＣＡ１細胞間での基礎的なシナプス伝達の強度を評価した。他のトランスジェニックＡＰＰ系に関して類似の報告があるように、ＰＤＡＰＰマウスに関しては、基礎的なシナプス伝達の強度（入力―出力比）に最大４０％の減少が認められ、これによってシナプス伝達に著しい傷害があることが示された。対照的に、ＰＤＡＰＰ（Ｄ６６４Ａ）マウスと非トランスジェニック同腹仔対照マウスとの間では、シナプス伝達に著しい違いは見られなかった（図３Ａ、３Ｂ参照）。観察されたシナプス前膜肥厚数の消失と一致して、ＰＤＡＰＰマウスにおいて明らかであった電気生理学的な障害は、Ｄ６６４Ａ変異を担持している動物には存在しなかった。さらに、伝達物質放出の確率と逆の相関関係を有するペアパルス促進は、全ての試験群の間で変化が認められず（図３Ｃ参照）、ＰＤＡＰＰトランスジェニックマウス同様、ＰＤＡＰＰ（Ｄ６６４Ａ）マウスにはシナプス前機能にさらなる欠陥がないことが示唆された。このように、ＰＤＡＰＰ（Ｄ６６４Ａ）マウスに保持されているシナプス前要素は機能的シナプスである可能性がある。
【００２２】
神経発生は、ＡＤ患者の海馬（Ｊｉｎ，Ｋ．他、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、１０１巻、３４３〜３４７頁、２００４年参照）及びＰＤＡＰＰマウスの脳内で増大する。したがって、損傷誘動性神経発生は、急性及び慢性の神経系疾患に寄与する可能性がある。Ｄ６６４Ａ変異がＰＤＡＰＰ誘導海馬神経発生に及ぼす効果を評価するために、１２月齢の対照、ＰＤＡＰＰ及びＰＤＡＰＰ（Ｄ６６４Ａ）マウスにおいて、ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）を用いて歯状回顆粒下領域（正常成体及びＡＤ誘導神経発生両方の主要部位）の増殖細胞を標識した。ＢｒｄＵ標識細胞（この多くは未成熟神経マーカータンパク、ダブルコルチンを発現した）の数は、ＰＤＡＰＰマウスでは対照マウスのほぼ２培のレベルにまで増大したが、この効果はＤ６６４Ａ変異によって消えた（図４参照）。
【００２３】
要約すると、Ｂ２１マウスはＡβ及びアミロイド沈着物を産生し、この点ではＰＤＡＰＰマウスと区別できなかった。しかし、ＰＤＡＰＰ動物に見られる海馬シナプス肥厚又は歯状回の体積の特徴的な消失は、Ｂ２１マウスには見られなかった。これらの発見は、カスパーゼ（又は恐らくはカスパーゼ以外の１種若しくは複数種のプロテアーゼ）によるＡｓｐ６６４位置におけるｈＡＰＰの切断が、ｈＡＰＰトランスジェニックマウスにおけるシナプスの消失及び歯状回の体積の低減の一因となっていることを示唆している。これらの観察から、このＡＤのマウスモデルの海馬のシナプス消失及び歯状回萎縮が、Ａβ沈着とは無関係に又はＡβ産生の下流で、Ａｓｐ６６４位置におけるＡＰＰ切断によって仲介されている（Ｌｕ他、「アミロイドβタンパク毒性はアミロイドβタンパク前駆体複合体の形成によって仲介される（Ａｍｙｌｏｉｄ β−ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｏｘｉｃｉｔｙ ｉｓ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ａｍｙｌｏｉｄ β−ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ）」、Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ、印刷中）ということがわかる。さらに、これらの結果から、ＡＰＰの細胞質内領域が、これらアルツハイマー表現型の現れに重要な役割を果たしていることがわかる。
【００２４】
また、本明細書に記述の結果から、カスパーゼによる切断部位Ａｓｐ−＞Ａｌａ（Ｄ６６４Ａ）にｉｎ ｖｉｖｏでＡｓｐ６６４位置におけるｈＡＰＰの切断を妨げる変異を担持しているＡＰＰトランスジェニックマウスが、Ａβを産生し続けかつ斑沈着を示し続けることは明白である。しかし、ＰＤＡＰＰマウス（ＰＤＡＰＰマウスはシナプス伝達の激しい減少を示す）の表現形を特徴付ける海馬シナプスの消失又は脳縮小については明らかになっていない。本発明のトランスジェニックマウスを使った研究によって、ＰＤＡＰＰマウスのシナプス伝達障害がＰＤＡＰＰ（Ｄ６６４Ａ）マウスにおいて完全に回復することがわかる。
【００２５】
これらの結果から、ＡＰＰのＣ末端切断がＡＤのマウスモデルに認められるシナプス障害及び体積消失の一因となっていることが明白であり、またこれらの結果はＡＰＰのＣ末端切断がＡＤの病理発生に関与していることと一致する。最も重要なことは、本明細書に記述の結果が、シナプスの消失及び海馬の縮小がＡβの産生及び沈着と無関係であり得ることを示す、遺伝的実験に基づく証拠となっていることである。
【００２６】
ＡＰＰのＣ末端部分の切断は、ＡＰＰが関与している幾つかの異なる細胞機能に影響を及ぼしている可能性がある。本発明のトランスジェニック動物は、シナプス消失に影響を及ぼしかつＡＤなどの神経変性疾患の病理発生の早期段階に潜んでいる初期プロセスを調べるまたとない機会を提供する。ＡＤの早期段階においてシナプス機能を回復することは、病気が進行した遅い段階になって消失した神経回路網を取り替えることに比べれば、はるかに容易な仕事である。ＰＤＡＰＰ（Ｄ６６４Ａ）マウスに関して本明細書に記載した観察結果は、マウスにおけるＡＤ関連の病理学にとって非常に重要でありかつ薬剤発見の新規ターゲットとなる可能性を秘めた、Ａβの産生又は沈着と直接関連のないメカニズムが存在することと一致する。本明細書に示すような、ＡＤの早期段階で作用しているメカニズムを解明し続けることによって、初期ＡＤで起こるシナプスの損傷を遅らせる、ひょっとしたら止めてしまう、或いはそれを逆行させることすらある治療法の開発が促進されることになる。
【００２７】
ヒトの所定の病理学的状態に関与するマーカーを同定することは、遺伝子型、表現型及び生活史などに関係する諸要因のせいで非常にめんどうである。一方、トランスジェニック動物モデルは、これらの変数を制御し得るような適正な実験系を提供する一方で、深刻な潜在的欠点も有している。すなわち、開発時に導入遺伝子が発現する結果、生理学的反応又は補償メカニズムの活性化を生じる可能性がある。したがって、トランスジェニック動物を、その非トランスジェニック同腹仔と比較すれば、導入遺伝子の発現それ自体から生じ、モデル化された疾患の病理発生によっては生じない変化に関する情報を得ることができる。
【００２８】
ＰＤＡＰＰマウスのＡＤに関連する表現形の基本的な特徴は、本発明のトランスジェニック動物においては、ｈＡＰＰ導入遺伝子のＣ末端の切断が妨げられることによって効果的に変えられた。ＰＤＡＰＰマウスとＰＤＡＰＰ（Ｄ６６４Ａ）マウスは多くの遺伝的類似点、すなわち、１）Ａ−＞Ｃのトランスバージョン以外は全く同じベクターから発生し、２）同じ遺伝的バックグランドを共有し、３）ヒトＡＰＰ導入遺伝子を同じようなレベルで発現するという類似点を有しているため、導入遺伝子それ自体の発現によって生じる変化がＰＤＡＰＰ動物とＰＤＡＰＰ（Ｄ６６４Ａ）動物で同じではないかと予想される。したがって、ＰＤＡＰＰマウスにはあるがＰＤＡＰＰ（Ｄ６６４Ａ）マウスにはない変化（マーカー）を非トランスジェニック同腹仔の場合と比較することによって、ＡＤの発現に関与するマーカー及び導入遺伝子の発現それ自体によって生じるマーカーとの相違を、めんどうな遺伝子型、表現型又は環境の変数などの非存在下で明白に同定することが可能になる（動物は十分にコンジェニックであり、制御された環境下で容易に繁殖させることができ飼うことができる）。
【００２９】
ＰＤＡＰＰ系及びＰＤＡＰＰ（Ｄ６６４Ａ）系からの半接合性トランスジェニック動物を作製して実験動物として使うことができる。すなわち、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊバックグランドでコンジェニックな１２匹の２カ月齢半接合性トランスジェニックＰＤＡＰＰ動物及びＰＤＡＰＰ（Ｄ６６４Ａ）動物と、１２匹の非トランスジェニック同腹仔を作製して、プール血清、脳抽出物又は他の関心器官の抽出物を得ることができる。
【００３０】
次いで、上記動物を使い好適な手段によってサンプルを作製し、そのサンプルをプロテオームやゲノムの研究に使うことができる。トランスジェニック及び非トランスジェニック動物から取ったサンプルに存在するタンパク又はｍＲＮＡの同定、また、どのタンパクが上記個体群の１つに独自に存在するか、又は存在しないか、又は多量に増加若しくは減少しているかを決定するためのデータの解析は、例えば質量分析法、ＤＮＡマイクロアレイハイブリダイゼーション等の標準的手法を使って行うことができる。
【００３１】
本発明のさらなる態様によれば、神経変性疾患の治療に有用な化合物を同定する方法が提供され、その方法は、カスパーゼがβアミロイド前駆体タンパク（ＡＰＰ）を切断してカルボキシ末端ペプチドＡＰＰ−Ｃ３１を産生する能力を阻止する化合物を同定することを含んでいる。
【００３２】
当業者ならば容易に理解するであろうが、カスパーゼがβアミロイド前駆体タンパク（ＡＰＰ）を切断してカルボキシ末端ペプチドＡＰＰ−Ｃ３１を産生する能力を阻止する化合物は、種々の方法で同定することができる。例えば、ＡＰＰ又はＡＰＰ類似タンパクをカスパーゼの存在下で試験化合物と接触させ、次いでＡＰＰ−Ｐ３１の形成をモニターするような方法で同定することができ、この方法においては、カスパーゼのＡＰＰ−Ｐ３１産生誘発不履行が、神経変性疾患の治療に有用な化合物であることの目安となる。
【００３３】
或いはまた、カスパーゼがβアミロイド前駆体タンパク（ＡＰＰ）を切断してカルボキシ末端ペプチドＡＰＰ−Ｃ３１を産生する能力を阻止する化合物は、ＡＰＰ又はＡＰＰ類似タンパク（例えば、ＡＰＬＰ１又はＡＰＬＰ２）をカスパーゼの存在下で試験化合物と接触させ、次いで、切断による産物の転位、細胞死の誘発、萎縮の誘発及びシナプス消失の誘発から成る群から選択される切断の証拠をスクリーニングすることによって同定することができる。ＡＰＬＰ１及びＡＰＬＰ２は、ＡＰＰファミリー又はＡＰＰタンパクのメンバーであって、ひとまとめにして「ＡＰＰ類似タンパク」という。ただし、ＡＰＰのγ及びβセクレターゼ切断に必要とされる部位は、ＡＰＬＰ１及びＡＰＬＰ２のいずれにも保存されない。したがって、これらの分子は、βアミロイド類似タンパク産生能を有していない。しかし、ＡＰＰ−Ｃ３１産生を可能にするＣ末端カスパーゼ切断部位は、ＡＰＬＰ１及びＡＰＬＰ２のいずれにも保存される。ＡＰＬＰ１の場合、Ｐ４〜Ｐ１の位置はＶＥＶＤＰと考えられ、ＡＰＬＰ２の場合、Ｐ４〜Ｐ１の位置はＶＥＶＤＰと考えられるが、ＡＰＰではＰ４〜Ｐ１の位置はＶＥＶＤＡである。これらの配列は、ＡＰＰにおける配列と同様、カスパーゼ８及びカスパーゼ９などのイニシエーター／先端カスパーゼに対する前記カスパーゼ切断部位と適合する。予測されるＡＰＬＰ１−Ｃ３１ペプチドは、その５２％がＡＰＰ−Ｃ３１と同等で７７％がＡＰＰ−Ｃ３１と類似する。また、予測されるＡＰＬＰ２−Ｃ３１ペプチドは、その７１％がＡＰＰ−Ｃ３１と同等で８３％がＡＰＰ−Ｃ３１と類似する。
【００３４】
また別の方法として、ＡＰＰ、ＡＰＬＰ１、ＡＰＬＰ２等を発現する細胞を、発作（例えば、Ａβ、虚血、ヒートショック、低酸素、低グルコース、スタウロスポリン等）の存在又は非存在下で検査して、ＡＰＰ−Ｃ３１の産生を阻止する化合物をスクリーニングすることもできる（ＡＰＰ−Ｃ３１は、ＡＰＰのカルボキシ末端切断産物を特異的に検出する抗体を使うか、又はレポーターアッセイ、ＥＬＩＳＡアッセイ等のそれに代わる方法によってアッセイすることができる）。
【００３５】
上記スクリーニング法で同定された化合物は、次いでｉｎ ｖｉｖｏで、例えば、アルツハイマー病の動物モデル（すなわち、Ａｓｐ６６４−＞Ａｌａ変異のない同様のトランスジェニック）においてその効果を試験し、本発明のＡｓｐ６６４−＞Ａｌａ変異型トランスジェニック動物における反応と比較することによって試験することができる。
【００３６】
候補化合物は、合成又は天然化合物のライブラリーを含めた種々のソースから得ることができる。例えば、任意抽出されたオリゴヌクレオチド又はオリゴペプチドの発現を含め、種々の有機化合物及び生体分子を任意に又は規制に従って合成する多数の手段を利用することができる。或いはまた、細菌、真菌、植物及び動物抽出物の形態をした天然化合物のライブラリーを利用することもでき又は容易に作成することもできる。また、天然のライブラリー及び化合物又は合成によって生成されたライブラリー及び化合物は、従来の化学的、物理的及び生化学的手段によって容易に変更され、それらをコンビナトリアルライブラリーの作成に使うこともできる。知られている薬物に、アシル化、エステル化、アミド化等の変更を規制に従って又は任意に加えて、構造的アナログを作成することもできる。候補作用物質は、ペプチド、糖、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、誘導体、構造的アナログ又はそれらの組合せ等の中に見出される。
【００３７】
本発明のさらに別の態様によれば、神経変性疾患の治療法が提供され、その方法は、前記方法によって同定される化合物の有効量を、それを必要としている対象に投与することを含んでいる。
【００３８】
本明細書において「治療する」とは、病気、障害若しくは容態の進行を阻止若しくは停止し、かつ／又は病気、障害若しくは容態の低減、寛解若しくは退行を引き起こすことである。当業者ならば、種々の手順又はアッセイを使って病気、障害若しくは容態を評価することができ、同様に種々の手順又はアッセイを使って病気、障害若しくは容態の低減、寛解若しくは退行を評価することができることを理解するであろう。
【００３９】
基本的には、病因病理学的にアミロイドの形成及び／又は沈着と関連しているいかなる疾病であっても、本発明の治療対象と考えられる。本明細書において「神経変性疾患」とは、アルツハイマー病、老人性全身性アミロイドーシス、ゲルストマンシュトロイスラーシャインカー症候群、ＩＩ型糖尿病、成人発症型糖尿病、インスリノーマ、ＡＡアミロイド症、ＡＬアミロイド症、家族性アミロイド多発神経障害（ポルトガル型、日本型及びスエーデン型）、家族性トランスサイレチンアミロイド症、家族性地中海熱、蕁麻疹及び難聴を伴う家族性アミロイドネフローゼ（マックルウェルズ症候群）、非神経障害性遺伝性全身性アミロイドーシス（家族性アミロイドポリニューロパチーＩＩＩ型）、家族性アミロイドーシスフィンランド型、家族性アミロイド心筋症（デンマーク型）、孤立性心臓アミロイド、孤立性心アミロイドーシス、特発性（原発性）アミロイドーシス、骨髄腫又はマクログロブリン血症に伴うアミロイドーシス、シェーグレン症候群に伴う原発性限局性結節性皮膚アミロイドーシス、反応性（続発性）アミロイドーシス、アイスランド型アミロイドーシスに伴う遺伝性脳出血、長期血液透析に伴うアミロイドーシス、フィブリノーゲン関連遺伝性腎性アミロイドーシス、甲状腺髄様癌に伴うアミロイドーシス、リゾチーム関連遺伝性全身性アミロイドーシス等の疾患を言う。
【００４０】
アミロイド沈着は、大脳皮質、皮質下領域及び海馬の神経細胞萎縮、並びに斑、栄養障害性神経突起及び神経原線維変化の存在を特徴とするアルツハイマー病、神経変性疾患と診断された対象に見られる。アルツハイマー病の場合、栄養異常性の又は異常な神経突起成長、シナプス消失、及び神経原線維のもつれ形成が病気の重篤度と強い相関関係にある。栄養異常性ニューロンは、神経突起の細胞質内に豊富な電気密度の高い積層体を含有し、シナプス接合部が破壊されていることを特徴とする。栄養異常性ニューロンはアミロイド沈着物を囲み、それによって脳神経線維網の至る所及びの血管壁に位置する老人斑を形成する。本発明のアルツハイマー病治療法は、神経細胞の萎縮を低減又は阻止し、老人斑又は神経原線維のもつれの形成を低減又は阻止することができ、それによって病気の進行を遅らせる又は止める。
【００４１】
アミロイド沈着物は、ＩＩ型糖尿病と診断されている患者のランゲルハンス島にも見られる。この沈着物は、正常な動物においてはホルモンの役割を果たしている島アミロイドポリペプチド（ＩＡＰＰ）又はアミリンと呼ばれる大きな前駆体に由来する。ＩＡＰＰは、島のβ細胞によって産生され、肝臓及び横紋筋の細胞によるグルコースの取り込みに大きな影響を及ぼす。ヒトアミリンの導入遺伝子を有し、高脂肪食餌を与えられているトランスジェニックマウスでは、アミリンの過剰産生によって島アミロイド沈着が生じる（Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ、第３版、１９９９年、１２２６頁参照）。ＩＩ型糖尿病に罹患している患者のランゲルハンス島のアミロイド沈着物を治療する本発明の治療法によって、アミロイドタンパクの産生を低減又は予防することができ、アミロイドが沈着してアミロイド沈着物となることを低減又は予防することができる。
【００４２】
アミロイド沈着物が顕著であるまた別の病気として、海綿状脳症の１種であるプリオン病がある。プリオン病は、臨床的には進行性の失調症と痴呆によって特徴付けられ、病理学的には海綿状脳組織の空胞形成によって特徴付けられる神経変性状態である。アミロイド沈着は、クールー病として知られている少なくとも１つプリオン病に由来する。クールー病では、構成的に発現された細胞表面糖タンパクである正常なプリオンタンパクと異なり、プリオンタンパクの約７０％は細胞外に蓄積して斑を形成する（Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ、第３版、上記、１４９２〜１４９６頁参照）。本発明のプリオン病治療法によって、アミロイドタンパクの産生を低減又は予防することができ、アミロイド斑の沈着を低減又は予防することができる。
【００４３】
アミロイド沈着物が顕著であるまた別の病気として、ＡＡアミロイド症がある。ＡＡアミロイド症は、慢性炎症性疾患、腫瘍疾患及び遺伝性疾患などの一見無関係と思われるような疾患に由来するアミロイド症である。アミロイドタンパクの沈着は、このような基礎的疾患の状態に続発する。前駆体分子は、急性期反応タンパクである血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）であり、これは多くの疾患の炎症代用マーカーとして使うことができる。本発明のＡＡアミロイド症治療法によって、アミロイドタンパクの産生を低減又は予防することができ、アミロイドタンパクの前駆体の産生を低減又は予防することができ、活性アミロイドタンパクの産生に必要な幾つかのステップのうち任意の１つを妨げるか又は減らすことができ、またアミロイド斑の沈着を低減又は予防することができる。
【００４４】
アミロイド沈着物が顕著であるまた別の病気として、家族性アミロイドポリニューロパチー（ＦＡＰ）の最も広く現れる型である、家族性トランスサイレチンアミロイド症がある。ヒトアミロイド疾患、すなわち家族性アミロイドポリニューロパチー、家族性アミロイド心筋症及び老人性全身性アミロイドーシスは、抹消神経及び心臓組織に沈着する不溶性トランスサイレチン（ＴＴＲ）原線維によって引き起こされる。トランスサイレチンは、サイロキシン及びレチノールの輸送に関与しているホモテトラマー血漿タンパクである。最も一般的なアミロイド形成ＴＴＲ変異体はＶ３０Ｍ−ＴＴＲであり、一方Ｌ５５Ｐ−ＴＴＲはＦＡＰの最も強力な型に関連する変異体である。トランスサイレチンによって引き起こされるアミロイド症を治療するための本発明の治療法によって、アミロイドタンパクの産生を低減又は予防することができ、アミロイドタンパクの前駆体の産生を低減又は予防することができ、活性アミロイドタンパクの産生に必要な幾つかのステップのうち任意の１つを妨げるか又は減らすことができ、またアミロイド斑の沈着を低減又は予防することができる。
【００４５】
アミロイド沈着物が顕著であるまた別の病気として、ＡＬアミロイド症がある。ＡＬアミロイド症は、原発性アミロイドーシス、形質細胞障害、免疫芽球性リンパ腫、多発性骨髄腫等を含めた、原発性免疫グロブリン産生障害に関係する１群の疾患である。原発性全身性ＡＬ（アミロイド軽鎖）アミロイドーシスは、アミロイド軽鎖タンパクの沈着物が進行性器官不全を起こす形質細胞障害である。原発性アミロイドーシスの予後は一般に不良であり、生存期間中央値は１〜２年である。前駆体タンパクは、限局性ＡＬアミロイドーシス及び全身性ＡＬアミロイドーシスの両者とも、一次構造が同じパターンの分断及び変化を示す免疫グロブリン軽鎖である。ＡＬアミロイドタンパクによって引き起こされるアミロイド症を治療するための本発明の治療法によって、アミロイドタンパクの産生を低減又は予防することができ、アミロイドタンパクの前駆体の産生を低減又は予防することができ、活性アミロイドタンパクの産生に必要な幾つかのステップのうち任意の１つを妨げるか又は減らすことができ、またアミロイド斑の沈着を低減又は予防することができる。
【００４６】
本明細書において「投与する」とは、経口、舌下、静脈内、皮下、経皮、筋肉内、皮内、鞘内、硬膜外、眼球内、頭蓋内、吸入、直腸、膣等の投与を使って、対象に治療上有効量の化合物を付与することを言う。クリーム、ローション、錠剤、カプセル、ペレット、分散性散剤、顆粒剤、坐剤、シロップ剤、エリキシル剤、トローチ剤、注射溶液、滅菌水性又は非水性液剤、懸濁剤、乳剤、パッチ剤等の剤形での投与も考えられる。有効成分は、グルコース、ラクトース、アカシアガム、ゼラチン、マンニトール、デンプンペースト、三ケイ酸マグネシウム、タルク、トウモロコシデンプン、ケラチン、コロイドシリカ、ジャガイモデンプン、尿素、デキストラン等を含む、医薬品として許容し得る無毒性の担体と調合することができる。
【００４７】
好ましい投与経路は、臨床治療上の指示によって異なる。用量の多少の変化は、治療を受けている患者の状態によって必然的に起こると思われるが、いずれにしても、医者が個々の患者にとって適正な用量を決定する。用量当たりの化合物の有効量は、とりわけ、体重、生理学、選択した接種方式によって決まる。化合物の単位用量とは、（担体が使われる場合には）担体の重量を除いた、１投与回当たりに使用される化合物の重量を言う。
【００４８】
ポリマーマトリクス、リポゾーム及びマイクロスフィアなどの標的型薬物送達システムによって、治療薬物を必要とする部位での治療薬物の有効濃度を高めることができ、また治療薬物の望ましくない影響を減らすことができる。治療薬物がより効率的に送達されれば、投与すべき治療薬物の量は少なくてすむため、身体全体の薬物の濃度は低減され、一方、同等又はより良い結果をもたらすことになる。治療薬物の送達効率の向上に適用し得る方法は、一般にどの方法も、攻撃目標とする部分を、治療薬物又は治療薬物を担うことになる担体に結合させている。
【００４９】
タンパク、ペプチド、多糖類、合成ポリマー、コロイド粒子（すなわち、リポゾーム、ベシクル又はミセル）、マイクロエマルジョン、マイクロスフィア及びナノスフィア等の担体を使って、様々な薬物送達システムが設計されている。捕捉された医薬品として有用な薬物を含有するこれらの担体は、細胞特異的又は組織特異的薬物の制御された放出を達成することを意図するものである。
【００５０】
本発明において使用しようとする化合物は、リポゾームの形態で投与することができる。当技術分野で知られているように、一般に、リポゾームはリン脂質又はその他の脂質物質から得られる。リポゾームは、水性媒体中に分散させた水和液晶の１層又は多層によって形成されている。無毒性で、生理学的に許容され、代謝された脂質であって、リポゾームを形成し得るものであれば、いずれの脂質も使うことができる。本明細書に記載の化合物は、リポゾームの形態をしている場合、その化合物以外に安定剤、防腐剤、賦形剤などを含有することができる。好ましい脂質はリン脂質及びホスファチジルコリン（レシチン）であって、天然及び合成のいずれも含まれる。リポゾームを形成する方法は当技術分野では知られている（例えば、Ｐｒｅｓｃｏｔｔ，Ｅｄ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、ＸＩＶ巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．、１９７６年、３３頁、以下参照）。
【００５１】
血液脳関門を迂回して脳に治療薬物を送達するために、幾つかの送達方法を使うことができる。このような方法では、鞘内注射、外科的移植（Ｏｍｍａｙａ、Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ、１巻、１６９〜１７８頁、１９８４年及び米国特許第５，２２２，９８２号）、間質静注（Ｂｏｂｏ他、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、９１巻、２０７６〜２０８０頁、１９９４年参照）等が利用される。これらの戦略によれば、薬物は、脳脊髄液（ＣＳＦ）又は脳実質（ＥＣＦ）に直接投与されることによって、ＣＮＳに送達される。
【００５２】
脳脊髄液を介した中枢神経系への薬物送達は、例えば、発明者の名にちなんで「Ｏｍｍａｙａ ｒｅｓｅｒｖｏｉｒ」と命名された硬膜下移植デバイスを使って達成される。薬物をデバイスに注入し、次いで脳を囲む脳脊髄液内に放出する。薬物は、露出した脳組織の特定の領域に向けて送られ、その特定の領域が薬物を吸着する。この吸着は、薬物が自由に移動できないため限界がある。改良したデバイスでは、レザバーは腹腔に移植されるが、注入された薬物は脊髄から出て脊髄に戻る脳脊髄液によって脳室腔に輸送され、薬物投与に使われる。オメガ３誘導体化によって、部位特異的二分子複合体は、脳組織を介した治療薬物の吸着及び移動の限界を克服することができる。
【００５３】
ＣＮＳへの薬物送達を改善する別の戦略は、血液脳関門を介した薬物の吸収（吸着と輸送）及び細胞による治療薬物の取り込みを高めることによるものである（Ｂｒｏａｄｗｅｌｌ、Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ、７９号１１７〜１２８頁、１９８９、Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ他、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐｅｒｉｍ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、２５５号、８９３〜８９９頁、１９９０年、Ｂａｎｋｓ他、Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、９１号、１３９〜１４８頁、１９９２年、Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ、燃料恒常性と神経系（Ｆｕｅｌ Ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ｎｅｒｖｏｕｓ Ｓｙｓｔｅｍ）、Ｖｒａｎｉｃ他編、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、４３〜５３頁、１９９１年）。血液脳関門を通過して脳にいたる薬物の移動は、薬物それ自体の浸透性を改善するか又は血液脳関門の特性を変えるかのいずれかによって促進することができる。したがって、薬物の移動は、化学的修飾によって薬物脂質の溶解性を高めることにより、かつ／又は薬物をカチオン性担体に結合させることにより、又は血液脳関門を通過して薬剤を輸送することができるペプチドベクターに薬剤を共有結合させることにより促進することができる。輸送ペプチドベクターは、血液脳関門浸透促進化合物（米国特許第５，２６８，１６４号）としても知られている。脳への送達に有用な脂質溶解特性を有する部位特異的巨大分子については、米国特許第６，００５，００４号に記載されている。
【００５４】
その他の例（米国特許第４，７０１，５２１号及び米国特許第４，８４７，２４０号）には、比較的高率で細胞に入り込むカチオン性巨大分子担体に薬物を共有結合させる方法が記載されている。これらの特許は、カチオン性樹脂に共有結合させると、生体分子の細胞内への取り込みが促進されることを教示している。
【００５５】
米国特許第４，０４６，７２２号には、抗癌剤を特定の抗原を担持する細胞に導くことを目的としてカチオン性ポリマーに共有結合させた、抗癌剤が開示されている。このポリマー担体の分子量は約５，０００〜５００，０００である。このようなポリマー担体を採用して、本明細書に記載した化合物を、標的に向けて送達することができる。
【００５６】
さらに酸感受性中間体（スペーサーとしても知られる）分子を介して薬物をカチオン性ポリマーに共有結合させる研究が、米国特許第４，６３１，１９０号及び米国特許第５，１４４，０１１号に記載されている。ｃｉｓ−アコニット酸などの種々のスペーサー分子が、薬剤及びポリマー担体に共有結合する。スペーサー分子は、恐らく細胞のリソソーム内で起こると思われるが、酸性度の穏やかな上昇を受け、巨大分子担体からの薬物の放出を制御する。薬物は、分子接合体から選択的に加水分解されて、未修飾かつ活性な形で細胞内に放出される。分子接合体はリソソームに輸送され、リソソームにおいては、細胞内又は細胞体内の他の区画又は液に比べて酸性のｐＨ下で、リソソーム酵素の作用を受けて代謝される。リソソームのｐＨは約４．８であるとされているが、接合体消化の初期段階においては恐らく３．８と低いと思われる。
【００５７】
本明細書における「治療上有効な量」とは、本発明の実施において使用される化合物に関して使う場合、化合物を投与される者に有益な効果を与えられるだけの高い循環濃度をもたらす、十分な量の化合物用量のことを言う。個々の患者対する治療上有効な具体的用量レベルは、治療対象である疾患、疾患の重篤度、使用する具体的な化合物の活性、具体的な化合物のクリアランス率、治療期間、具体的な化合物と組み合わせて又は偶然同時に使用される薬剤、患者の年齢、体重、性、食餌及び全体的な健康状態、並びに医学的技術分野及び科学分野で良く知られている要因等を含めた種々の要因によって決まる。投与量レベルは、約０．００１から最大１００ｍｇ／ｋｇ／日の範囲であって、約０．０５から１０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲が好ましい。
【００５８】
本明細書において「接触させる」とは、化合物を細胞又は細胞標的に供給することを言う。接触は、固相、液相又は気相で生じ得るが、細胞外及び細胞内で生じる接触も含む。当業者ならば、ｉｎ ｖｉｖｏでの化合物の細胞へ供給が、経口、舌下、静脈内、皮下、経皮、筋肉内、皮内、鞘内、硬膜外、眼球内、頭蓋内、吸入、直腸、膣等を含めた多くの投与形態によってなされることを理解するであろう。
【００５９】
本発明のまた別の態様によれば、神経変性疾患の治療法が提供され、その方法は、βアミロイド前駆体タンパク（ＡＰＰ）及び／又はＡＰＰ類似タンパク（例えば、ＡＰＬＰ１又はＡＰＬＰ２）切断し、カルボキシ末端ペプチド、ＡＰＰ−Ｃ３１、を産生するプロテアーゼの能力を阻止することを含む。
【００６０】
当業者ならば容易に理解するであろうが、プロテアーゼのＡＰＰ及び／又はＡβ切断能は、例えば抗プロテアーゼ抗体、プロテアーゼをコードする配列に基づくアンチセンスヌクレオチド、ペプチド、ペプチドミメティック、リボザイム、干渉ＲＮＡ、プロテアーゼアンタゴニスト、又はプロテアーゼのＡＰＰ及び／又はＡβの細胞内領域切断能を阻止する小分子等によって、様々な方法で阻止することができる。
【００６１】
例えば、本発明の変異型ＡＰＰの発現は、過剰発現も含めて、ポリペプチドをコードするｍＲＮＡに結合しその発現を阻止するアンチセンスヌクレオチドを投与することによって阻止することができる。或いはまた、ｍＲＮＡを切断するリボザイムを使って類似の方法で阻止することもできる。アンチセンス及びリボザイム技術を使って遺伝子の発現を制御する一般的方法、又はこのような方法で外来遺伝子を発現させる遺伝子治療法の一般的方法は、当技術分野では良く知られている。このような方法のいずれも、ベクターなどの、本発明の変異型ＡＰＰのアンチセンス転写又はリボザイム転写をコードする系を利用する。
【００６２】
本明細書において「リボザイム」とは、触媒特性を有する、１つ又は２つ以上のＲＮＡのＲＮＡ建築物を言う。一般に、リボザイムは、エンドヌクレアーゼ、リガーゼ又はポリメラーゼ活性を示す。リボザイムは、ＲＮＡ自己切断反応を仲介するＲＮＡ構造分子である。「ハンマーヘッド」及び「ヘアピン」型を含め、二次構造の異なる種々のトランス作用性リボザイムが同定されている。また種々のリボザイムについて特徴付けがなされている。例えば、米国特許第５，２４６，９２１号、米国特許第５，２２５，３４７号、米国特許第５，２２５，３３７号及び米国特許第５，１４９，７９６号参照。触媒活性を有する、デオキシリボ及びリボオリゴヌクレオチドを含んだ混合リボザイムについても記載されている。Ｐｅｒｒｅａｕｌｔ他、ネーチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、３４４号、５６５〜５６７頁、１９９０年。
【００６３】
本明細書において「アンチセンス」とは、細胞条件下で、本発明の変異型ＡＰＰをコードするゲノムＤＮＡ及び／又は細胞のｍＲＮＡと特異的にハイブリッド形成し、例えば結合し、転写及び／又は翻訳を阻止することによってそのタンパクの発現を阻止するような核酸分子又はその誘導体を言う。結合は、従来の塩基対相補による可能性もあるし、又は、例えばＤＮＡ二重鎖に結合する場合には、二重螺旋の主要な溝における特異的相互作用による可能性もある。
【００６４】
１つの態様において、アンチセンス構造体は、ｅｘ ｖｉｖｏで生成される核酸であって、細胞内に導入されると、ＡＰＰ又はＡＰＰ類似分子のｍＲＮＡ及び／又はゲノム配列とハイブリッド形成すことによって遺伝子発現を阻止することができるような核酸である。
【００６５】
アンチセンス法は、ＡＰＰ又はＡＰＰ類似分子のｍＲＮＡに相補的なオリゴヌクレオチド（ＤＮＡ或いはＲＮＡのいずれか）の設計を伴う。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＡＰＰ又はＡＰＰ類似分子のｍＲＮＡ転写物に結合し、翻訳を妨げると考えられる。
【００６６】
絶対的な相補が好ましいが、必ずしもそうでなくてよい。本明細書で言うＲＮＡタンパクに「相補的」な配列とは、そのＲＮＡとのハイブッリド形成を可能にするに十分な相補性を有し、安定な二重鎖を形成する配列を意味する。二本鎖アンチセンス核酸の場合、二重鎖ＤＮＡの単一のストランドが試験されるか、又は三重鎖形成をアッセイする。ハイブリッド形成能は、相補の程度及びアンチセンス核酸の長さの両方によって決まると考えられる。一般に、ハイブリッド形成する核酸が長ければ長いほど、それに含まれるｍＲＮＡとの塩基のミスマッチが多くなり、安定な二重鎖（又は、あるとすればであるが、三重鎖）が形成される。当業者ならば、標準的な手法を使ってミスマッチの許容される程度を確認し、ハイブリッド形成された複合体の融点を決定することができるであろう。
【００６７】
遺伝子発現を制御するために、アンチセンス、リボザイム技術及びＲＮＡｉ技術を使う一般的な方法、又はこのような方法で外来遺伝子を発現させる遺伝子治療法の一般的方法は、当技術分野では良く知られている。このような方法のいずれも、ベクターなどの、本発明の変異型ＡＰＰのアンチセンス転写又はリボザイム転写をコードする系を利用する。「ＲＮＡｉ」とはＲＮＡの干渉を表す。この用語が、遺伝子の転写をサイレンスすることができるＲＮＡ分子を使う技術を包含することを、当業者ならば理解するであろう。例えば、ＭｃＭａｎｕｓ他、ネーチャーレビュージェネティックス（Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、３号、７３７頁、２００２年を参照のこと。本願においては、「ＲＮＡｉ」は、短干渉ＲＮＡ（ｓＲＮＡｉ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）及び一過性低分子ＲＮＡ（ｓｔＲＮＡ）などの分子を包含する。一般的に、ＲＮＡ干渉は、二本鎖ＲＮＡと遺伝子との相互作用によって生じる。
【００６８】
一般に、メッセージの５’末端に相補的なオリゴヌクレオチド、例えば、ＡＵＧ開始コドンまでの５’非翻訳配列は、翻訳を阻止するうえで最も効率よく作用すべきである。しかし、ｍＲＮＡの３’非翻訳配列に相補的な配列は、ｍＲＮＡの翻訳を阻止する場合にも効果的であることが証明されている。（Ｗａｇｎｅｒ、Ｒ．（１９９４年）Ｎａｔｕｒｅ ３７２：３３３）。ｍＲＮＡ翻訳領域に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、翻訳の阻止剤としてあまり効率がよくないが、本発明により使用することも可能である。ＡＰＰ若しくはＡＰＰ類似ポリペプチドｍＲＮＡの５’、３’、又は翻訳領域にハイブリッド形成するように設計されているかどうかに関係なく、アンチセンス核酸の長さは少なくともヌクレオチド約６個分でなければならず、好ましくは約１００個未満、より好ましくは約５０又は３０個分未満である。典型的には、これらの長さはヌクレオチド１０個分から２５個分までの剥いでなければならない。このような原理は、施術者が適切なオリゴヌクレオチドを選択する際の情報となる。好ましい実施形態では、アンチセンス配列は、ＡＰＰ又はＡＰＰ類似ポリペプチドをコードする核酸配列の約１０〜３０、より好ましくは１５〜２５個の連続オリゴヌクレオチド配列を含むか、又はそれらからなるか、又は本質的にそれらからなるオリゴヌクレオチドから選択される。
【００６９】
このような配列を使用することで、アンチセンスオリゴヌクレオチドを設計することができる。このようなアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＡＰＰ又はＡＰＰ類似ポリペプチドを発現する細胞に投与され、ターゲットＲＮＡ又はタンパク質のレベルと内部対照ＲＮＡ又はタンパク質のレベルとの比較がなされる。アンチセンスオリゴヌクレオチドを使用して得られる結果は、さらに、適当な対照オリゴヌクレオチドを使用して得られる結果とも比較される。好ましい対照オリゴヌクレオチドは、テストオリゴヌクレオチドとほぼ同じ長さを持つオリゴヌクレオチドである。ターゲットＲＮＡ又はタンパク質のレベルの減少を生じさせるこれらのアンチセンスオリゴヌクレオチドが選択される。
【００７０】
オリゴヌクレオチドは、一本鎖又は日本鎖のＤＮＡ又はＲＮＡ又はキメラ混合体又は誘導体又はその修飾が成されたものとすることができる。オリゴヌクレオチドは、例えば、分子、ハイブリダイゼーションなどの安定性を改善するために、塩基部分、糖部分、又はリン酸骨格のところで修飾することができる。オリゴヌクレオチドは、ペプチドなどの他の付加基（例えば、生体内の宿主細胞受容体の場合）、又は細胞膜上の輸送を容易にする作用物質（例えば、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら（１９８９年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃＬ Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：６５５３〜６５５６頁、Ｌｅｍａｉｔｒｅら（１９８７年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃＬ ＵＳＡ ８４：６４８〜６５２頁、１９８８年１２月１５日に公開されたＰＣＴ公開番号ＷＯ８８／０９８１０を参照）、又は血液脳関門（例えば、１９８８年４月２５日に公開されたＰＣＴ公開番号ＷＯ ８９／１０１３４を参照）、ハイブリダイゼーション誘発開裂作用物質（例えば、Ｋｒｏｌら（１９８８年）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：９５８〜９７６頁を参照）、又は挿入剤（例えば、Ｚｏｎ（１９８８年）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．５：５３９〜５４９頁を参照）を含むことができる。この目的のために、オリゴヌクレオチドは、他の分子、例えば、ペプチド、ハイブリダイゼーション誘発架橋剤、輸送剤、ハイブリダイゼーション誘発開裂作用物質などに結合することができる。
【００７１】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、及び５−（カルボキシヒドロキシエチル）ウラシルなどの部分から選択された少なくとも１つの修飾塩基部分を含むことができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、さらに、限定はしないがアラビノース、２−フルオロアラビノース、キシルロース、六炭糖を含む群から選択された少なくとも１つの修飾糖部分を含むことができる。
【００７２】
さらに他の実施形態では、アンチセンスヌクレオチドは、ホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、ホスホロアミドチオアート、ホスホラミデート、ホスホルジアデート、メチルホスホン酸塩、アルキルホスホトリエステル、ホルムアセタール、又はそれらのアナログの群から選択された少なくとも１つの修飾リン酸骨格を含む（米国特許第５，１７６，９９６号、第５，２６４，５６４号、及び第５，２５６，７７５号も参照）。
【００７３】
さらに他の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、α−アノマーオリゴヌクレオチドである。α−アノマーオリゴヌクレオチドは、通常のβユニットとは反対に、鎖が互いに平行に走る相補的ＲＮＡとの特異二本鎖ハイブリッドを形成する（Ｇａｕｔｉｅｒら（１９８７年）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５：６６２５〜６６４１頁）。オリゴヌクレオチドは、２’−０−メチルリボヌクレオチド（Ｉｎｏｕｅら（１９８７年）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５：６１３１〜６１４８頁）、又はキメラＲＮＡ−ＤＮＡアナログ（Ｌｉｏｕｅら（１９８７年）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２１５：３２７〜３３０頁）である。
【００７４】
さらに好適なのは、側鎖位置で核酸と置換されたさまざまなアミノ酸を含有する共重合体を含む、ポリセリン、トレオニンなどのポリペプチドである、ペプチジル核酸である（Ｔ５Ａ５Ｇ５Ｃ５Ｕ）。このような重合体の鎖は、天然ＤＮＡ／ＲＮＡと同じようにして相補的塩基を通じてハイブリッド形成することができる。それとは別に、本発明のアンチセンス建築物は、例えば、細胞内で転写されたときに、本発明のキナーゼポリペプチドをコードする細胞ｍＲＮＡの少なくとも１つの固有の部分に相補的なＲＮＡを生成する発現プラスミド又はベクターとして送達することができる。
【００７５】
ＡＰＰ又はＡＰＰ類似ポリペプチド翻訳領域配列に相補的なアンチセンスヌクレオチドを使用することができるが、転写非翻訳領域に相補的なのが最も好ましい。
【００７６】
本発明のさらに他の態様によれば、海馬シナプス喪失を防ぐための方法が提供され、前記方法は、カスパーゼ又は他のプロテアーゼがβアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）及び／又はＡＰＰ類似タンパク質（例えば、ＡＰＬＰ１又はＡＰＬＰ２）を開裂する能力を阻止することを含む。
【００７７】
上述のように、ＡＰＰ及び／又はＡＰＰ類似タンパク質（例えば、ＡＰＬＰ１又はＡＰＬＰ２）を開裂するプロテアーゼの能力は、さまざまな方法で、例えば、抗タンパク分解酵素抗体、プロテアーゼコード配列に基づくアンチセンスヌクレオチド、ペプチド、ペプチド模倣薬、リボザイム、干渉ＲＮＡ、プロテアーゼ拮抗薬、プロテアーゼがＡＰＰ及び／又はＡＰＰ類似タンパク質（例えば、ＡＰＬＰ１又はＡＰＬＰ２）の細胞質内領域を開裂する能力を阻止する小分子などにより、阻止することができる。
【００７８】
本発明のさらに他の態様によれば、歯状回回転萎縮を防ぐための方法が提供され、前記方法は、カスパーゼ又は他のプロテアーゼがβアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）及び／又はＡＰＰ類似タンパク質（例えば、ＡＰＬＰ１又はＡＰＬＰ２）を開裂する能力を阻止することを含む。
【００７９】
上述のように、ＡＰＰ及び／又はＡＰＰ類似タンパク質（例えば、ＡＰＬＰ１又はＡＰＬＰ２）を開裂するプロテアーゼの能力は、さまざまな方法で、例えば、抗タンパク分解酵素抗体、プロテアーゼコード配列に基づくアンチセンスヌクレオチド、ペプチド、ペプチド模倣薬、リボザイム、干渉ＲＮＡ、プロテアーゼ拮抗薬、プロテアーゼがＡＰＰ及び／又はＡβの細胞質内領域を開裂する能力を阻止する小分子などにより、阻止することができる。
【００８０】
本発明のさらに他の態様によれば、神経変性疾患を治療するための遺伝子療法が提供され、前記方法は突然変異をβアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）に導入し、カスパーゼ媒介開裂を防ぐことを含む。
【００８１】
実際、肯定的な初期結果を実証したヒト遺伝子療法に対する実用的アプローチに進歩があった（Ｍｉｌｌｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ ３５７：４５５〜４６０頁、１９９２年で総説されている）。遺伝子療法の基礎科学については、Ｍｕｌｌｉｇａｎ（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０：９２６〜９３１頁、１９９３年）で説明されている。
【００８２】
したがって、一実施形態では、突然変異ＡＰＰコード配列を含む発現ベクターが、細胞内に挿入され、細胞は、試験管内で増殖され、次いで、多数が患者体内に注入される。
【００８３】
本発明による遺伝子療法は、神経系細胞をターゲットとする突然変異ＡＰＰ ｃＤＮＡを含むアデノウィルスの使用、遺伝子操作を施した細胞の移植による突然変異ＡＰＰの全身性発現、突然変異ＡＰＰコードウィルスによる注入、適切な組織中への裸の突然変異ＡＰＰ ＤＮＡの注入などを伴う場合がある。
【００８４】
このようなレトロウィルス、ワクシニアウィルス、アデノウィルス、アデノ関連ウィルス、ヘルペスウィルス、複数のＲＮＡウィルス、又はウシ乳頭腫ウィルスなどのウィルスに由来する発現ベクターは、本発明によるヌクレオチド配列（例えば、ｃＤＮＡ）コード突然変異ＡＰＰをターゲットの細胞母集団（例えば、神経系細胞）に送達するために使用することができる。当業者によく知られている方法は、コード配列を含む組換えウィルスベクターを較正するために使用できる（Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎ．Ｙ．，１９８９年、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏ−ｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．、１９８９年）。それとは別に、タンパク質配列をコードする組換え核酸分子は、裸のＤＮＡとして、又は再構成系、例えば、リポゾーム又は他の脂質系内で、ターゲット細胞に送達するために使用することができる（例えば、Ｆｅｉｇｎｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３３７：３８７−８、１９８９年）。プラスミドＤＮＡを細胞に直接導入する複数の他の方法が存在し、ヒト遺伝子療法に使用され、これは、プラスミドＤＮＡをタンパク質に錯化することによりＤＮＡのターゲットを細胞上の受容体とすることを伴う（Ｍｉｌｌｅｒ、上記）。
【００８５】
最も単純な形態では、遺伝子導入は、単に、マイクロインジェクション法を使って、微量のＤＮＡを細胞の核に注入することにより実行することができる（Ｃａｐｅｃｃｈｉ，Ｃｅｌｌ ２２：４７９−８８、１９８０年）。組換え遺伝子が細胞内に導入されると、それらは、細胞の転写と翻訳の通常の仕組みにより認識され、遺伝子生成物が発現される。ＤＮＡを多数の細胞に導入する他の方法も試みられた。これらの方法は、ＤＮＡがリン酸カルシウムにより沈殿され、飲作用により細胞内に摂取される、トランスフェクション（Ｃｈｅｎら、ＭｏＩ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．７：２７４５−５２、１９８７年）、細胞が大きな電圧パルスに曝され、膜に孔を開けるエレクトロポレーション（Ｃｈｕら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５：１３１１−２６，１９８７年）、ＤＮＡがターゲット再秒と融合する脂溶性小胞内にパッケージされるリポフェクション／リポゾーム融合（Ｆｅｉｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８４：７４１３−７４１７，１９８７年）、及び小さな発射体に結合されたＤＮＡを使用する粒子衝突（Ｙａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８７：９５６８−９５７２，１９９０年）を含む。ＤＮＡを細胞内に導入する他の方法は、ＤＮＡを化学修飾タンパク質に結合することである。
【００８６】
アデノウィルスがエンドソームを不安定にし、ＤＮＡの細胞内への取り込みを強化することは明らかになっている。ＤＮＡ複合物を含有する溶液にアデノウィルスを混合するか、又はアデノウィルスに共有結合しているポリリシンにタンパク架橋剤を用いてＤＮＡを結合させると、組換え遺伝子の取り込み及び発現が著しく向上する（Ｃｕｒｉｅｌ他、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、６巻、２４７〜２５２頁、１９９２年）。
【００８７】
本明細書において「遺伝子導入」とは、細胞内に外来の核酸分子を導入することを意味する。遺伝子導入は、通例、その遺伝子によってコードされる特定の産物の発現を可能にするために行われる。そのような産物には、タンパク、ポリペプチド、アンチセンスＤＮＡ若しくはＲＮＡ、又は酵素活性を有するＲＮＡを含むことができる。遺伝子導入は、培養細胞中で又は動物に直接投与することによって行う。一般に、遺伝子導入は、非特異的相互作用又はレセプター仲介相互作用による核酸の標的細胞との接触、膜を介した又はエンドサイトーシスによる細胞内への核酸の取り込み、及び細胞形質膜又はエンドソームから細胞質内への核酸の放出というプロセスを含む。発現には、さらに核酸の細胞核への移動及び転写のための適切な核内因子への結合が必要となる。
【００８８】
本明細書において「遺伝子治療」とは、遺伝子導入の１つの形態であって、本明細書において遺伝子導入の定義の中に含まれるものであり、具体的には、ｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞から治療的産物を発現するための遺伝子導入のことを言う。遺伝子導入は、ｅｘ ｖｉｖｏで細胞にて実施し、その後その細胞を患者に移植して行うこともできるし、又は核酸若しくは核酸タンパク者複合体を患者に直接投与して行うこともできる。
【００８９】
別の好ましい実施態様においては、変異型ＡＰＰをコードする核酸配列を有するベクターであって、その核酸配列が特定の組織においてのみ発現されるようなベクターが提供される。組織特異的遺伝子発現を達成する方法については、１９９２年１１月３日に提出され、１９９３年５月１３日に公開された国際公開特許ＷＯ９３／０９２３６に記載されている。
【００９０】
前記した全ベクターにおいて、本発明のさらなる態様によれば、そのベクターに含まれる核酸配列は、その核酸配列の一部又は全てに対する付加、削除又は修正を含むことができる。
【００９１】
本発明を、以下の限定しない実施例に関してさらに詳しく説明する。
【実施例１】
【００９２】
ＰＤＡＰＰ（Ｄ６６４Ａ）変異の発生
ＧからＣへの点変異を、Ａｓｐ６６４（ＡＰＰ６９５番）をＡｌａ（ＰＤＡＰＰ（Ｄ６６４Ａ））に変化させるスェーデン型及びインディアナ型変異を担持しているＰＤＧＦβ鎖プロモーター由来ｈＡＰＰミニ遺伝子（Ｈｓｉａ他、上記文献参照）に導入した。変異は、配列決定と対立遺伝子特異的増幅の両方によって確認した。
【実施例２】
【００９３】
トランスジェニックマウスの作出
ＰＤＡＰＰ（Ｄ６６４Ａ）導入遺伝子のマイクロインジェクション、ＰＣＲによるトランスジェニックファウンダーの同定、及び本研究用ＰＤＡＰＰ（Ｄ６６４）Ｂ２１系の選択を、前に記載されているように実施した（Ｌｉ，Ｙ．、Ｃａｒｌｓｏｎ，Ｅ．、Ｍｕｒａｋａｍｉ，Ｋ．、Ｃｏｐｉｎ，Ｊ．Ｃ．、Ｌｕｃｈｅ，Ｒ．、Ｃｈｅｎ，Ｓ．Ｆ．、Ｅｐｓｔｅｉｎ，Ｃ．Ｊ．及びＣｈａｎ，Ｐ．Ｈ．、ジャーナルオブニューロサイエンスメソッド（Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｍｅｔｈｏｄｓ）、８９号、４９〜５５頁、１９９９年参照）。実質的には以下のように進行した。
【００９４】
ベクター配列を有さない精製した線状ヒトＰＤＡＰＰ（Ｄ６６４Ａ）導入遺伝子ＤＮＡの２ｎｇ／μｌ溶液を、日齢１日のＢ６Ｄ２Ｆ１／Ｊ卵の雄性前核にマイクロインジェクションし、２４時間後に擬妊娠のＣＤ１里親に移した。ｈＡＰＰ導入遺伝子に特異的なプライマー
【化２】
と
及びマウスＰＫＲ遺伝子に特異的なプライマー
【化３】
と
を使用したＰＣＲによって、ファウンダーの同定を行った。
【００９５】
同様の手順で作製されるその他のトタンスジェニック系には、
【化４】
等が含まれる。
【００９６】
トランスジェニック系を、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系統マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）とのヘテロ接合体の交雑種によって維持した。全トランスジェニック動物がその導入遺伝子に関してヘテロ接合であった。非トランスジェニック同腹仔を対照として使用した。免疫沈降反応と、抗ＡＰＰ５Ａ３／Ｇ７モノクローナル抗体を使ったウェスタンブロットとによって、脳ホモジネート中においてヒトＡＰＰ及びマウスＡＰＰを検出した（Ｓｏｒｉａｎｏ他、上記文献参照）。
【実施例３】
【００９７】
可溶性Ａβの検出
免疫沈降反応と、Ａβペプチドのアミノ酸残基１〜１２を認識する２６Ｄ６抗ＡＰＰモノクローナル抗体を使ったウェスタンブロットによって、脳内ＡβレベルをＣＨＡＰＳ可溶性溶解物で評価した。免疫沈降物をｂｉｃｉｎｅ尿素ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上でＡβ４０種とＡβ４２種とに分画した（Ｗｇｇｅｎ他、ネーチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、４１４号、２１２〜２１６頁、２００１年参照）。ＡＰＰのＣ末端を認識するポリクローナル抗体であるＣＴ１５を用いて、ＡＰＰをＣＨＡＰＳ脳溶解物でイムノブロットした。凝集Ａβペプチドの沈降に先立って、全動物の月齢を、３〜４ヶ月の間で同じにした。
【実施例４】
【００９８】
Ａβ沈着物の数量化
ヘテロ接合性ＰＤＡＰＰマウス及びＰＤＡＰＰ（Ｄ６６４Ａ）Ｂ２１マウスの脳の５０ミクロンのビブラトーム切片を、先に記載されている（Ｗｙｓｓ−Ｃｏｒａｙ，Ｔ．、Ｍａｓｌｉａｈ，Ｅ．、Ｍａｌｌｏｒｙ，Ｍ．、ＭｃＣｏｎｌｏｇｕｅ，Ｌ．、Ｊｏｈｎｓｏｎ−Ｗｏｏｄ，Ｋ．、Ｌｉｎ，Ｃ．及びＭｕｃｋｅ，Ｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、３８９号、６０３〜６０６頁、１９９７年参照）ようにして３Ｄ６抗体で染色した。系統及び遺伝子型に関して知らされていない調査員が、全海馬Ａβ斑を同定し、その数を数えた。データを平均＋／−ＳＤで表した。
【実施例５】
【００９９】
ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＡｓｐ６６４位置でのＡＰＰの切断
ＡＡＰのＡｓｐ６６４位置における切断によって発生するネオエピトープに特異的な抗体（Ｇａｌｖａｎ他、Ｊ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ、８２号、２８３〜２９４頁、２００２年参照）を用いて、対照マウス及びＰＤＡＰＰ（Ｄ６６４Ａ）マウス両者に比べてＰＤＡＰＰマウスにおいて切断が増加していることを明らかにした。
【実施例６】
【０１００】
シナプス前膜肥厚の数量化
シナプス前末端の無傷性を測定するために、ヘテロ接合性雌性ＰＤＡＰＰマウス及びＰＤＡＰＰ（Ｄ６６４Ａ）マウスの脳の５０ミクロンのビブラトーム切片を、αシナプトフィジン抗体（１０μｇ／ｍｌ、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）とフルオレセインイソチオシアネート標識ロバ抗マウスＩｇＧ抗体（１：４００、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で順次染色し、次いでプロピジウムアイオダイドで対比染色した後、１００倍の対物レンズと２．７倍のディジタルズームを使ったレーザー走査型共焦点顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ ＰＣＭ−２０００）でイメージングした。ＣＡ１放射状層におけるシナプトフィジン免疫反応性シナプス前末端の３次元数値化した肥厚（ｍｍ３当たりの対象数で表す）を、立体解剖法（Ｈｓａｉ，Ａ．Ｙ．他、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、９６巻、３２２８〜３２３３頁、１９９９年参照）の変法によって測定した。
【０１０１】
各動物につき、６枚の１０２４×１０２４ピクセル（４５μｍ×４５μｍ）モノクロ共焦点画像を、２０７０ＰＭＴゲインで得た。さらに追加して６対の共焦点画像１セットを、Ｘ、Ｙ座標は同じとし、最初の共焦点画像取得の水平面より０．９μｍ下方に水平面をずらして（ｚ＝−０．９０μｍ）２１００ＰＭＴゲインで得、Ｓｉｍｐｌｅ ＰＣＩソフト（Ｃｏｍｐｉｘ，Ｉｎｃ．）を使ってフォトブリーチを補正した。各野の神経プロセスに対応して生じる非染色領域の割合のバラツキがもたらす測定値の変動性を低減するために、各対の画像の最も明るい領域から、プロセスが占める領域を避けて１０μｍ×１０μｍの範囲を２枚取った。異なるｚ座標で取った各対の１０μｍ×１０μｍの範囲の画像を赤と緑で偽着色し、重ね合わせた。得られた画像のボケはＰｈｏｔｏｓｈｏｐを使って修正し、両平面にある免疫標識された対象（黄色）の数を、Ｓｉｍｐｌｅ ＰＣＩを使って数えた。各マウスにつき６つの海馬切片を通過するように無作為に配置された１２のディセクターから得られた免疫標識対象数を、（ディセクター同志が重なるのを回避しながら）対象マウス毎に平均し、続く統計解析に使用した（図２Ｂ及び２Ｃ参照）。
【実施例７】
【０１０２】
体積測定
適切なアトラス（Ｐａｘｉｎｏｓ，Ｇ．、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｋ．Ｂ．Ｊ．、「マウス脳定位座標（Ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｂｒａｉｎ ｉｎ Ｓｔｅｒｅｏｔａｘｉｃ Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｓ）」、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、２００１年、サンディエゴ参照）の助けをかりて、海馬の歯状回（ＤＧ）及び分子層（ＭＬ）の境界を定めた。海馬及びその各野の全体積を、Ｉｍａｒｉｓ３Ｄ（Ｂｉｔｐｌａｎｅ ＡＧ、スイス）を使った３次元形状復元（図２Ｃ参照）によって測定し、カバリエリ（Ｃａｖａｌｉｅｒｉ）解析（図２Ｂ参照）によって確認した。
【０１０３】
Ｉｍａｒｉｓ３Ｄ（Ｂｉｔｐｌａｎｅ）及び手によるカバリエリ（Ｃａｖａｌｉｅｒｉ）解析を使って体積測定するために、適切なアトラス（Ｐａｘｉｎｏｓ，Ｇ．、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｋ．Ｂ．Ｊ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、２００１年、サンディエゴ、カリフォルニア）の助けをかりて、４０μｍのニッスル（Ｎｉｓｓｌ）染色したスナップ凍結マウス（２５匹の１００日齢ヘテロ接合性雄性トランスジェニックマウス又は雄性非トランスジェニック同腹仔に相当）の脳切片の１−ｉｎ−４システマティックランダムシリーズの２Ｘ画像に、各片側海馬、歯状回（ＤＧ）及び分子層（ＭＬ）各野の境界線を、海馬采と脳梁の灰白質／白質境界、分子層と網状分子層の境界、及び多形細胞層と視床の境界で引いた。支脚は除外した。各サンプルにおいて、最後の切片を、連続脳梁線維路を示す切片と定義した。Ｉｍａｒｉｓ３Ｄ体積測定するために、Ａｌｉｇｎアプリケーション（Ｂｉｔｐｌａｎｅ）を使って各切片を一列に並べ、得られた列を必要に応じて手で調節した。続く３Ｄ形状復元及び体積測定には全て３．３μｍ×３．３μｍ×１６０μｍのボクセルサイズを使用した。カバリエリ（Ｃａｖａｌｉｅｒｉ）の原理を使って体積評価するために、サンプルの各切片の１２８０×１０２４ピクセル画像上に２００μｍのグリッドをかぶせ、各各片側海馬、歯状回及び分子層各野内のグリッドの交差点の数を、サンプルの切片毎に数えた。各体積を、先に記載したよう算出した（Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ｌｉｍａ，Ｆ．、Ｂｅｒｎｄｔ，Ｊ．Ｄ．、Ｇａｍｅｓ，Ｄ．及びＲｅｉｍａｎ，Ｅ．Ｍ．、Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ、１２巻、２３７５〜２３７９頁、２００１年参照）。
【０１０４】
カバリエリ（Ｃａｖａｌｉｅｒｉ）解析及びＩｍａｒｉｓ３Ｄ形状復元によって得られた体積の間には、高度な相関関係があった（ｒ２＝０．７２、ｐ＜０．００００１、ｎ＝２５）。各系統間又は遺伝子型間には、総体重又は脳重量の有意な差は見られなかった。全試験について、マウス及び脳組織サンプルは、系統及び遺伝子型に関して知らされていない調査員に対して暗号化されていた。データを平均＋／−ＳＤで表した。有意（ｐ＜０．０５）は、スチューデントの検定（分散が同等であると仮定して）又はピアソンの相関係数検定と、それに続く回帰分析のためのラン検定によって決定した。
【実施例８】
【０１０５】
ｉｎ ｖｉｔｒｏ切片電気生理学
３〜７月齢のＰＤＡＰＰＪ２０、ＰＤＡＰＰ（Ｄ６６４Ａ）Ｂ２１及び非トランスジェニック同腹仔対照マウスから海馬水平断切片（４００μｍ）を作製した（Ｊ２０マウスとＢ２１マウスは似たレベルのＡＰＰ導入遺伝子を発現するため、Ｂ２１マウスと比較するためにＪ２０マウスを選択した）。切片は標準的な方法を使って（例えば、Ｃｏｎｔｒａｃｔｏｒ，Ａ．他、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、２３巻、４２２〜４２９頁、２００３年参照）作製した。要するに、動物にイソフルランで麻酔をかけ、断頭した。脳を摘出し、氷で冷やしたスクローススライス人工脳脊髄液（ＡＣＳＦ）下でスライスした。この人工脳脊髄液（ＡＣＳＦ）
は、８５ｍＭ ＮａＣｌ、２．５ｍＭ ＫＣｌ、１．２５ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、２５ｍＭ ＮａＨＣＯ３、２５ｍＭグルコース、７５ｍＭスクロース、０．５ｍＭ ＣａＣｌ２、及び４ｍＭ ＭｇＣｌ２を含有しかつ９５％Ｏ２及び５％ＣＯ２で平衡状態が保たれていた。また、１０μＭＤ，Ｌ−ＡＰＶ及び１００μＭキヌレナートも含有していた。記録に先立ち、切片を、室温で少なくとも１時間、１２５ｍＭ ＮａＣｌ、２．４ｍＭ ＫＣｌ、１．２ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、２５ｍＭ ＮａＨＣＯ３、２５ｍＭグルコース、１ｍＭ ＣａＣｌ２、及び２ｍＭ ＭｇＣｌ２を含有する標準ＡＣＳＦ中でインキュベートした。記録時は、切片を２ｍＭ ＣａＣｌ２及び１ｍＭ ＭｇＣｌ２を含有するＡＣＳＦで連続して潅流した。
【０１０６】
細胞外場電位（ｆＥＰＳＰ）を、細胞外溶液で満たした記録用ガラスピペット（先端抵抗２〜３Ｍオーム）を使って、海馬ＣＡ１領域の放射状層で記録した。定電流を通す同心双極電極を使い、シャファー側枝／交連経路の刺激に反応して誘発ｆＥＰＳＰを記録した。記録されたｆＥＰＳＰの入力と出力の関係を比較することによって基本的シナプス伝達を測定した（Ｈｓｉａ他）。ここで入力は線維斉射のピーク振幅であり、出力はｆＥＰＳＰの立ち上がり期の傾きである。動物毎に、線維斉射（ＦＶ）振幅及び５〜８００μＡの刺激範囲に反応するｆＥＰＳＰの立ち上がり期の傾きを測定し、両者の値の反応曲線を作成した。次いで、入力と出力の関係を、ｆＥＰＳＰの傾き値をＦＶ振幅値（反応曲線上の直線部分に沿った各点からの）で割り、平均値を取ることによって算出した。刺激間間隔を４０ｍｓとし、ｆＥＰＳＰ（２）のピーク振幅／ｆＥＰＳＰ（１）のピーク振幅として測定した比を用いて、ペアパルス促進を引き出した。１元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）と、次いでＴｕｒｋｅｙ ｐｏｓｔ−ｈｏｃ検定を使って、結果を解析した。
【実施例９】
【０１０７】
神経発生
ＢｒｄＵ（５０ｍｇ／ｋｇ）を食塩水に溶解し、１日２回８時間の間隔をあけて連続３日間腹膜腔内投与し、１週間後にマウスを殺した。脳切片を、マウスモノクローナル抗ＢｒｄＵ（Ｒｏｃｈｅ、２μｇ／ｍｌ）及びビオチニル化したヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｖｅｃｔｏｒ、１：２００）で染色し、染色をジアミノベンジジンとＨ２Ｏ２で可視化した。２００μｍの間隔をあけて配置した、マウス１匹当たり５〜７つの５０μｍ冠状切片において、歯状回のＢｒｄＵ陽性細胞数をやみくもに数えた。細胞数はＭａｇｎｉｆｉｒｅディジタルカメラ付き顕微鏡Ｎｉｋｏｎ Ｅ８００を使い高倍率下で数え、その画像をコンピュータのモニターに表示した。結果は、切片当たりの平均ＢｒｄＵ陽性細胞数で表した。
【０１０８】
本発明をその好ましい実施例に関して詳細に述べたが、特許請求の範囲に記載する本発明の精神及び範囲において変更及び修正ができることは理解されよう。
【図面の簡単な説明】
【０１０９】
【図１】ＰＤＡＰＰ及びＰＤＡＰＰ（Ｄ６６４Ａ）トランスジェニックマウスの特性決定を一括して示す図である。［図１Ａ］ＰＤＡＰＰ及びＰＤＡＰＰ（Ｄ６６４Ａ）トランスジェニックマウスの作出において採用した建築物の誘導を示す図である。［図１Ｂ］種々の実験動物における可溶性Ａβの検出を示す図である。［図１Ｃ］種々の実験動物におけるＡβ斑の数をまとめた図である。［図１Ｄ］月齢１６ヶ月のＰＤＡＰＰ（Ｄ６６４Ａ）マウスから取出した染色脳切片を示す図であって、Ａβ斑が存在することを示す図である。［図１Ｅ］ｉｎ ｖｉｖｏでのＡＰＰのＡｓｐ６６４番における切断を示す図である。ＡＰＰのＡｓｐ６６４番における切断によって生じるネオエピトープに特異的な抗体を用いて、ＰＤＡＰＰでは対照及びＰＤＡＰＰ（Ｄ６６４Ａ）マウスのいずれと比べても切断が増加することを証明したものである。
【図２】Ｄ６６４Ａ変異がシナプス消失及び歯状回萎縮に及ぼす影響をひとまとめにして示す図である。［図２Ａ］種々の実験動物におけるシナプス前膜肥厚を数量化してまとめた図である。［図２Ｂ］Ｉｍａｒｉｓ３Ｄ（Ｂｉｔｐｌａｎｅ ＡＧ、スイス）を使用した３次元形状復元によって測定され（図２Ｃ参照）、カバリエリ（Ｃａｖａｌｉｅｒｉ）解析によって確認される、海馬及びその亜領域の総体積をまとめた図である。［図２Ｃ］典型的なＰＤＡＰＰ（赤）及びＢ２１（黄）トランスジェニックマウスの歯状回分子層の表面を３次元形状に復元した形状の直交、矢状及び冠状面図である。
【図３】Ｄ６６４Ａ変異が基礎的なシナプス伝達に及ぼす影響をひとまとめにして示す図である。［図３Ａ］細胞外記録した幾つかのｆＥＰＳＰ（ｆｉｅｌｄ ＥＰＳＰ）を示す図であり、それらｆＥＰＳＰを用いて、月齢３〜７ヶ月のヘテロ接合Ｔｇ、非ＴｇＰＤＡＰＰＪ２０及びＰＤＡＰＰ（Ｄ６６４Ａ）Ｂ２１マウスの海馬ＣＡ３とＣＡ１細胞間の基礎的なシナプス伝達強度を評価した。刺激強度を増大したときの代表的なｆＥＰＳＰを、先に述べた非トランスジェニック及びトランスジェニックマウスについて示す。ＰＤＡＰＰＪ２０Ｔｇマウスの場合、比較的小さいＥＰＳＰを引き出すために大きい入力（拡大した時間スケールを有する差し込み図を参照。矢印は、活性化された軸策数を測る間接的尺度である線維斉射を表す）が必要であることを注意されたい。［図３Ｂ］先に述べたＴｇ及び非Ｔｇ動物について、立ち上がり期のＥＰＳＰの傾き値を線維斉射の振幅値で割った値を示す図である（非Ｔｇ同腹仔に標準化したデータ）。各データ点は、６〜７匹のマウスから取り出した１７〜２２個の切片から得た平均値を表す。統計解析（ＡＮＯＶＡ）によって有意な群効果（ｐ＜０．０００５）が明らかになった。Ｐｏｓｔ−ｈｏｃ Ｔｕｋｅｙ ｔｅｓｔによって、ＰＤＡＰＰＪ２０マウスが他のどの群よりも基礎的なシナプス伝達が有意に低こと（ｐ＜０．０１）、一方他の群の中では互いに有意な差がないことが確認された。［図３Ｃ］一対の刺激によって引き出されるｆＥＰＳＰの平均振幅値の割合として表される、ペアパルス促進を示す図である。データは、平均値＋／−ＳＥＭとして数字で示してある。
【図４】Ｄ６６４Ａ変異がＰＤＡＰＰに誘発される海馬の神経組織発生の増大に及ぼす影響をひとまとめにして示す図である。［図４Ａ］海馬歯状回の顆粒下領域における増殖細胞のＢｒｄＵ標識を示す図である。月齢１２ヶ月の対照（非Ｔｇ）、ＰＤＡＰＰ及びＰＤＡＰＰ（Ｄ６６４Ａ）マウスの腹腔内にＢｒｄＵを３日間投与し、１週間後に殺した。ＢｒｄＵで標識した細胞（黒い点）を免疫組織化学によって検出した。示した画像は各群につき４〜６匹の代表的例を示すものである。［図４Ｂ］ＢｒｄＵ標識を数量化して示す図である。示したデータは、平均細胞数±ＳＤ（ｎ＝４〜６）であり、スチューデントのｔ検定を用いて差の有意性を評価した。
【図５】カバリエリ解析によって得られた体積と３次元形状復元によって得られた体積との間の相関関係を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
変異型ヒトβアミロイド前駆体タンパク（ＡＰＰ）又はＡＰＰ類似タンパクをコードするヌクレオチド配列を含む非ヒトトランスジェニック動物であって、前記変異型ヒトＡＰＰ又はＡＰＰ類似タンパクが、前記変異型ヒトＡＰＰ又はＡＰＰ類似タンパクをＡｓｐ６６４番における切断に対して耐性とする突然変異を含み、また、前記変異型ヒトＡＰＰ又はＡＰＰ類似タンパクをコードする前記ヌクレオチド配列が、好適なプロモーターと作動可能に結合している上記非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項２】
Ａｓｐ６６４番における切断がカスパーゼにより誘発される請求項１に記載のトランスジェニック動物。
【請求項３】
前記変異型ヒトＡＰＰ又はＡＰＰ類似タンパクが６６４番残基に突然変異を含む請求項１に記載のトランスジェニック動物。
【請求項４】
６６４番のアミノ酸残基における突然変異によってＡｓｐがＡｌａ、Ｇｌｕ又はＧｌｎに変化している請求項３に記載のトランスジェニック動物。
【請求項５】
前記変異型ヒトＡＰＰ又はＡＰＰ類似タンパクが６６４番のアミノ酸残基に隣接した変異を含む請求項１に記載のトランスジェニック動物。
【請求項６】
前記プロモーターが構成的に活性である請求項１に記載のトランスジェニック動物。
【請求項７】
前記プロモーターが、アクチンプロモーター、ＰＤＧＦ−βプロモーター、ＰｒＰ（神経特異的）プロモーター及び神経特異的エノラーゼプロモーターから成る群から選択される、請求項６に記載のトランスジェニック動物。
【請求項８】
前記プロモーターが誘導的である請求項１に記載のトランスジェニック動物。
【請求項９】
前記プロモーターがＴｅｔ−ｏｎ、Ｔｅｔ−ｏｆｆ、ＲＵ４８６誘導性プロモーター系及びエクジソン誘導性プロモーター系から成る群から選択される、請求項８に記載のトランスジェニック動物。
【請求項１０】
前記動物がゲッ歯類、ウサギ及びブタから成る群から選択される請求項１に記載のトランスジェニック動物。
【請求項１１】
前記動物がゲッ歯類である請求項１に記載のトランスジェニック動物。
【請求項１２】
前記動物がマウスである請求項１に記載のトランスジェニック動物。
【請求項１３】
βアミロイド前駆体タンパク（ＡＰＰ）及び／又はβアミロイドタンパク（Ａβ）を切断し、カルボキシ末端ペプチド、ＡＰＰ−Ｃ３１を産生するプロテアーゼの能力を阻止することを含む、神経変性疾患の治療方法。
【請求項１４】
プロテアーゼのＡＰＰ切断能及び／又はＡβ切断能の阻止が、抗プロテアーゼ抗体、プロテアーゼをコードする配列に基づくアンチセンスヌクレオチド、ペプチド、ペプチドミメティック、リボザイム、干渉ＲＮＡ、プロテアーゼアンタゴニスト、又はプロテアーゼのＡＰＰ及び／又はＡβの細胞質内領域切断能を阻止する小分子によって行われる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
カスパーゼのβアミロイド前駆体タンパク（ＡＰＰ）切断能を阻止することを含む、海馬のシナプス消失を予防する方法。
【請求項１６】
カスパーゼのβアミロイド前駆体タンパク（ＡＰＰ）切断能を阻止することを含む、歯状回萎縮を予防する方法。
【請求項１７】
βアミロイド前駆体タンパク（ＡＰＰ）を切断し、カルボキシ末端ペプチド、ＡＰＰ−Ｃ３１を産生するカスパーゼの能力を阻止する化合物を同定することを含む、神経変性疾患の治療に有用な化合物を同定する方法。
【請求項１８】
βアミロイド前駆体タンパク（ＡＰＰ）を切断し、カルボキシ末端ペプチド、ＡＰＰ−Ｃ３１を産生するカスパーゼの能力を阻止する化合物の同定が、ＡＰＰ又はＡＰＰ類似タンパクをカスパーゼの存在下で試験化合物と接触させ、ＡＰＰ−Ｐ３１の形成をモニターすることによって行われ、また、カスパーゼのＡＰＰ−Ｐ３１産生誘発の不履行が神経変性疾患の治療に有用な化合物であることの目安となる、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
βアミロイド前駆体タンパク（ＡＰＰ）を切断し、カルボキシ末端ペプチド、ＡＰＰ−Ｃ３１を産生するカスパーゼの能力を阻止する化合物の同定が、ＡＰＰ又はＡＰＰ類似タンパクをカスパーゼの存在下で試験化合物と接触させ、切断産物の転位、細胞死の誘発、萎縮の誘発及びシナプス消失の誘発からなる群から選択される切断の証拠を検査することによって行われる、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
請求項１７に記載の方法によって同定された化合物の有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、神経変性疾患の治療法。
【請求項２１】
βアミロイド前駆体タンパク（ＡＰＰ）中に変異を導入することにより、カスパーゼ仲介によるＡＰＰの切断を予防することを含む、神経変性疾患治療のための遺伝子治療法。
【請求項１】
変異型ヒトβアミロイド前駆体タンパク（ＡＰＰ）又はＡＰＰ類似タンパクをコードするヌクレオチド配列を含む非ヒトトランスジェニック動物であって、前記変異型ヒトＡＰＰ又はＡＰＰ類似タンパクが、前記変異型ヒトＡＰＰ又はＡＰＰ類似タンパクをＡｓｐ６６４番における切断に対して耐性とする突然変異を含み、また、前記変異型ヒトＡＰＰ又はＡＰＰ類似タンパクをコードする前記ヌクレオチド配列が、好適なプロモーターと作動可能に結合している上記非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項２】
Ａｓｐ６６４番における切断がカスパーゼにより誘発される請求項１に記載のトランスジェニック動物。
【請求項３】
前記変異型ヒトＡＰＰ又はＡＰＰ類似タンパクが６６４番残基に突然変異を含む請求項１に記載のトランスジェニック動物。
【請求項４】
６６４番のアミノ酸残基における突然変異によってＡｓｐがＡｌａ、Ｇｌｕ又はＧｌｎに変化している請求項３に記載のトランスジェニック動物。
【請求項５】
前記変異型ヒトＡＰＰ又はＡＰＰ類似タンパクが６６４番のアミノ酸残基に隣接した変異を含む請求項１に記載のトランスジェニック動物。
【請求項６】
前記プロモーターが構成的に活性である請求項１に記載のトランスジェニック動物。
【請求項７】
前記プロモーターが、アクチンプロモーター、ＰＤＧＦ−βプロモーター、ＰｒＰ（神経特異的）プロモーター及び神経特異的エノラーゼプロモーターから成る群から選択される、請求項６に記載のトランスジェニック動物。
【請求項８】
前記プロモーターが誘導的である請求項１に記載のトランスジェニック動物。
【請求項９】
前記プロモーターがＴｅｔ−ｏｎ、Ｔｅｔ−ｏｆｆ、ＲＵ４８６誘導性プロモーター系及びエクジソン誘導性プロモーター系から成る群から選択される、請求項８に記載のトランスジェニック動物。
【請求項１０】
前記動物がゲッ歯類、ウサギ及びブタから成る群から選択される請求項１に記載のトランスジェニック動物。
【請求項１１】
前記動物がゲッ歯類である請求項１に記載のトランスジェニック動物。
【請求項１２】
前記動物がマウスである請求項１に記載のトランスジェニック動物。
【請求項１３】
βアミロイド前駆体タンパク（ＡＰＰ）及び／又はβアミロイドタンパク（Ａβ）を切断し、カルボキシ末端ペプチド、ＡＰＰ−Ｃ３１を産生するプロテアーゼの能力を阻止することを含む、神経変性疾患の治療方法。
【請求項１４】
プロテアーゼのＡＰＰ切断能及び／又はＡβ切断能の阻止が、抗プロテアーゼ抗体、プロテアーゼをコードする配列に基づくアンチセンスヌクレオチド、ペプチド、ペプチドミメティック、リボザイム、干渉ＲＮＡ、プロテアーゼアンタゴニスト、又はプロテアーゼのＡＰＰ及び／又はＡβの細胞質内領域切断能を阻止する小分子によって行われる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
カスパーゼのβアミロイド前駆体タンパク（ＡＰＰ）切断能を阻止することを含む、海馬のシナプス消失を予防する方法。
【請求項１６】
カスパーゼのβアミロイド前駆体タンパク（ＡＰＰ）切断能を阻止することを含む、歯状回萎縮を予防する方法。
【請求項１７】
βアミロイド前駆体タンパク（ＡＰＰ）を切断し、カルボキシ末端ペプチド、ＡＰＰ−Ｃ３１を産生するカスパーゼの能力を阻止する化合物を同定することを含む、神経変性疾患の治療に有用な化合物を同定する方法。
【請求項１８】
βアミロイド前駆体タンパク（ＡＰＰ）を切断し、カルボキシ末端ペプチド、ＡＰＰ−Ｃ３１を産生するカスパーゼの能力を阻止する化合物の同定が、ＡＰＰ又はＡＰＰ類似タンパクをカスパーゼの存在下で試験化合物と接触させ、ＡＰＰ−Ｐ３１の形成をモニターすることによって行われ、また、カスパーゼのＡＰＰ−Ｐ３１産生誘発の不履行が神経変性疾患の治療に有用な化合物であることの目安となる、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
βアミロイド前駆体タンパク（ＡＰＰ）を切断し、カルボキシ末端ペプチド、ＡＰＰ−Ｃ３１を産生するカスパーゼの能力を阻止する化合物の同定が、ＡＰＰ又はＡＰＰ類似タンパクをカスパーゼの存在下で試験化合物と接触させ、切断産物の転位、細胞死の誘発、萎縮の誘発及びシナプス消失の誘発からなる群から選択される切断の証拠を検査することによって行われる、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
請求項１７に記載の方法によって同定された化合物の有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、神経変性疾患の治療法。
【請求項２１】
βアミロイド前駆体タンパク（ＡＰＰ）中に変異を導入することにより、カスパーゼ仲介によるＡＰＰの切断を予防することを含む、神経変性疾患治療のための遺伝子治療法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公表番号】特表２００７−５３４３２３（Ｐ２００７−５３４３２３Ａ）
【公表日】平成１９年１１月２９日（２００７．１１．２９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５０９６６５（Ｐ２００７−５０９６６５）
【出願日】平成１７年４月２２日（２００５．４．２２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０１３７６１
【国際公開番号】ＷＯ２００５／１１５１３６
【国際公開日】平成１７年１２月８日（２００５．１２．８）
【出願人】（５０６３５３４０４）バック インスティチュート (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年１１月２９日（２００７．１１．２９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年４月２２日（２００５．４．２２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０１３７６１
【国際公開番号】ＷＯ２００５／１１５１３６
【国際公開日】平成１７年１２月８日（２００５．１２．８）
【出願人】（５０６３５３４０４）バック インスティチュート (1)
【Ｆターム（参考）】
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