アルツハイマー病の診断スクリーニング
【課題】アルツハイマー病の病変の初期に起こる細胞変化の存在についてのスクリーニングに基づく、アルツハイマー病の診断スクリーニング方法を提供する。
【解決手段】ヒト被験体ゲノムの細胞周期調節遺伝子中の少なくとも１つの突然変異または対立遺伝子変異体の存在に関してスクリーニングすることを含む方法からなる。細胞周期調節遺伝子中の突然変異または対立遺伝子変異体の存在がアルツハイマー病のしるしであると解釈される方法である。
【解決手段】ヒト被験体ゲノムの細胞周期調節遺伝子中の少なくとも１つの突然変異または対立遺伝子変異体の存在に関してスクリーニングすることを含む方法からなる。細胞周期調節遺伝子中の突然変異または対立遺伝子変異体の存在がアルツハイマー病のしるしであると解釈される方法である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はアルツハイマー病の診断スクリーニングに関し、特にアルツハイマー病の病変の初期に起こる細胞変化の存在についてのスクリーニングに基づく診断試験に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
平均寿命が増すにつれて、西欧社会ではアルツハイマー病（ＡＤ）が大きな健康問題になりつつある。この疾患の信頼できる治療法または予防策を見いだすために集中的な研究が行われてきたが、現在までのところ成功には至っていない。
【０００３】
治療薬の設計および試験における最大の課題の一つは、意味のある介入が可能なほど早期にＡＤ罹患者を同定することが可能な信頼できる臨床診断基準がないことである。現在利用できる臨床診断手段では、重度の痴呆をきたした患者でなければ、アルツハイマー病の正確で信頼できる診断を行うことができない。さらにまた、現在利用できる臨床診断手段では、予防的介入によって利益を受けうる症状発現前のアルツハイマー病を持つ被験者を同定することはできない。
【０００４】
もっともよく使用されている臨床診断基準は、元々は研究目的で設計されたＮＩＮＣＤＳ／ＡＤＲＤＡ基準（ＭｃＫｈａｎｎ， Ｇ．ら（１９８４）Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ３４：９３９−９４４）である。これらの基準は感度が高いものの特異性は低い。これは、アルツハイマー病の「可能性大」（"ｐｒｏｂａｂｌｅ" Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ'ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）または「可能性あり」（"ｐｏｓｓｉｂｌｅ" Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ'ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）という診断の陽性適中率は極めて高いが、陰性適中率は極めて低いという事実によっている（１３）。言い換えると、ある患者がアルツハイマー病に関するＮＩＮＣＤＳ／ＡＤＲＤＡ基準の要件を満たす場合、その患者が実際にアルツハイマー病にかかっている可能性は高い。しかし、これらの基準を満たさない患者（例えば対照とみなされる患者）の一部は、剖検時にアルツハイマー病であることが判明する（１３）。
【０００５】
特異性が低いため、ＮＩＮＣＤＳ／ＡＤＲＤＡ基準は臨床診断目的には理想的でない。さらに、ＮＩＮＣＤＳ／ＡＤＲＤＡ基準は、有意な痴呆を発症する前に使用すれば有効である可能性が最も高いだろう予防的または治療的療法を調べる臨床試験の診断基準としても適切ではない。したがって、アルツハイマー病に関する信頼できる診断試験、特に、予防的介入によって利益を受けうる症状発現前のアルツハイマー病を持つ被験者の早期検出に利用することができる試験は、現在も必要とされている。
【０００６】
アルツハイマー病の病理学的根拠がさまざまな神経細胞様集団の細胞分裂周期への異常な再進入であることは、近年ますます広く受け入れられつつある（１４）。健康な高齢者では、この細胞周期再進入に続いて、迅速な細胞周期停止と再分化が起こりうる。これに対して、アルツハイマー病を持つ患者では調節機構が機能しないらしく、神経細胞が細胞周期の後期に進行して、ＡＤ関連病変の蓄積および／または神経細胞死をもたらす（１４）。
【０００７】
本発明者らの研究および他のグループによる研究によって、アルツハイマー病における細胞周期調節不全はＧ１／Ｓ移行チェックポイントで起こることが示されている（３）。アルツハイマー病患者から採取された線維芽細胞およびリンパ球に関する先の研究により、この状態では、神経細胞以外の細胞でも、細胞分裂周期の調節が乱されている可能性が示されている（８，９，１７）。アルツハイマー病患者が、いくつかの形態の癌にかかりやすいこと（４）、および成人期初期にＡＤを発症するダウン症候群患者が一般集団よりも白血病にかかりやすいこと（７，１０）も知られている。したがって、神経細胞における細胞周期調節不全は、ＡＤの初期（症状発現前）段階でさえ、リンパ球における同様の細胞周期調節機能不全に反映されているという仮説は、妥当であると思われる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ａｒａｇａ Ｓ， Ｋａｇｉｍｏｔｏ Ｈ， Ｆｕｎａｍｏｔｏ ＫおよびＴａｋａｈａｓｈｉ Ｋ（１９９０）Ｊｐｎ Ｊ Ｍｅｄ ２９：５７２−５
【非特許文献２】Ａｒｅｎｄｔ Ｔ， Ｈｏｌｚｅｒ ＭおよびＧａｒｔｎｅｒ Ｕ（１９９８）Ｊ Ｎｅｕｒａｌ Ｔｒａｎｓｍ １０５：９４９−６０
【非特許文献３】Ａｒｅｎｄｔ Ｔ， Ｒｏｄｅｌ Ｌ， Ｇａｒｔｎｅｒ ＵおよびＨｏｌｚｅｒ Ｍ（１９９６）Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ ７：３０４７−９
【非特許文献４】Ｂｕｒｋｅ ＷＪ， ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ ＪＲ， Ｃｈｕｎｇ ＨＤ， Ｇｉｌｌｅｓｐｉｅ ＫＮ， Ｇｒｏｓｓｂｅｒｇ ＧＴ， Ｌｕｑｕｅ ＦＡおよびＺｉｍｍｅｒｍａｎ Ｊ（１９９４）Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ Ｄｉｓ Ａｓｓｏｃ Ｄｉｓｏｒｄ ８：２２−８
【非特許文献５】Ｄａｒｚｙｎｋｉｅｗｉｃｚ Ｚ（１９９３）Ｆａｎｔｅｓ ＰおよびＢｒｏｏｋｓ Ｒ編「Ｔｈｅ ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ」（オックスフォード大学印刷局， オックスフォード）の４３〜６８頁
【非特許文献６】Ｄａｖｉｅｓ ＫＪ（１９９９）ＩＵＢＭＢ Ｌｉｆｅ ４８：４１−７
【非特許文献７】Ｄｒａｂｋｉｎ ＨＡおよびＥｒｉｃｋｓｏｎ Ｐ（１９９５）Ｐｒｏｇ Ｃｌｉｎ Ｂｉｏｌ Ｒｅｓ ３９３：１６９−７６
【非特許文献８】Ｅｃｋｅｒｔ Ａ， Ｈａｒｔｍａｎｎ Ｈ， Ｆｏｒｓｔｌ ＨおよびＭｕｌｌｅｒ ＷＥ（１９９４）Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ ５５：２０１９−２９
【非特許文献９】Ｆｉｓｃｈｍａｎ ＨＫ， Ｒｅｉｓｂｅｒｇ Ｂ， Ａｌｂｕ Ｐ， Ｆｅｒｒｉｓ ＳＨおよびＲａｉｎｅｒ ＪＤ（１９８４）Ｂｉｏｌ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ １９：３１９−２７
【非特許文献１０】Ｆｏｎｇ ＣＴおよびＢｒｏｄｅｕｒ ＧＭ（１９８７）Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅｔ Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ ２８：５５−７６
【非特許文献１１】Ｍｅｃｏｃｃｉ Ｐ， Ｐｏｌｉｄｏｒｉ ＭＣ， Ｉｎｇｅｇｎｉ Ｔ， Ｃｈｅｒｕｂｉｎｉ Ａ， Ｃｈｉｏｎｎｅ Ｆ， Ｃｅｃｃｈｅｔｔｉ ＲおよびＳｅｎｉｎ Ｕ（１９９８）Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ５１：１０１４−１０１７
【非特許文献１２】Ｍｅｌａｒａｇｎｏ ＭＩ， Ｓｍｉｔｈ ＭｄＡ， Ｋｏｒｍａｎｎ Ｂｏｒｔｏｌｏｔｔｏ ＭＨおよびＴｏｎｉｏｌｏ Ｎｅｔｏ ＪＴ（１９９１）Ｇｅｒｏｎｔｏｌｏｇｙ ３７：２９３−８
【非特許文献１３】Ｎａｇｙ Ｚ， Ｅｓｉｒｉ ＭＭ， Ｈｉｎｄｌｅｙ ＮＪ， Ｊｏａｃｈｉｍ Ｃ， Ｍｏｒｒｉｓ ＪＨ， Ｋｉｎｇ ＥＭ−Ｆ， ＭｃＤｏｎａｌｄ Ｂ， Ｌｉｔｃｈｆｉｅｌｄ Ｓ， Ｂａｒｎｅｔｓｏｎ Ｌ， Ｊｏｂｓｔ ＫＡおよびＳｍｉｔｈ ＡＤ（１９９８）Ｄｅｍｅｎｔｉａ ９：２１９−２２６
【非特許文献１４】Ｎａｇｙ Ｚ， Ｅｓｉｒｉ ＭＭおよびＳｍｉｔｈ ＡＤ（１９９８）Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ８４：７３１−７３９
【非特許文献１５】Ｐａｙａｏ ＳＬ， Ｓｍｉｔｈ ＭＤおよびＢｅｒｔｏｌｕｃｃｉ ＰＨ（１９９８）Ｇｅｒｏｎｔｏｌｏｇｙ ４４：２６７−７１
【非特許文献１６】Ｓｈｅｒｒ ＣＪ（１９９４）Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ １２：４７−５５；ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ ５５−７
【非特許文献１７】Ｔａｔｅｂａｙａｓｈｉ Ｙ， Ｔａｋｅｄａ Ｍ， Ｋａｓｈｉｗａｇｉ Ｙ， Ｏｋｏｃｈｉ Ｍ， Ｋｕｒｕｍａｄａｎｉ Ｔ， Ｓｅｋｉｙａｍａ Ａ， Ｋａｎａｙａｍａ Ｇ， Ｈａｒｉｇｕｃｈｉ ＳおよびＮｉｓｈｉｍｕｒａ Ｔ（１９９５）Ｄｅｍｅｎｔｉａ ６：９−１６
【非特許文献１８】Ｔｒｉｅｂ Ｋ， Ｒａｎｓｍａｙｒ Ｇ， Ｓｇｏｎｃ Ｒ， Ｌａｓｓｍａｎｎ ＨおよびＧｒｕｂｅｃｋ Ｌｏｅｂｅｎｓｔｅｉｎ Ｂ（１９９６）Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ Ａｇｉｎｇ １７：５４１−７
【非特許文献１９】Ｗａｇｎｅｒ ＥＦ， Ｈｌｅｂ Ｍ， Ｈａｎｎａ ＮおよびＳｈａｒｍａ Ｓ（１９９８）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６１：１１２３−３１
【発明の概要】
【０００９】
ここに本発明者らは、Ｇ１阻害剤処理に対するリンパ球のインビトロ応答性が、アルツハイマー病患者では対照被験者よりも、有意に有効性が低いことを明らかにした。さらに、初期アルツハイマー病の臨床徴候を示す被験者では、リンパ球応答が、アルツハイマー病患者に見られるものと似ている。これらの発見は、Ｇ１／Ｓ移行制御の不全がアルツハイマー病患者における神経細胞に限定されず、リンパ球などの末梢細胞でも起こるという仮説を裏付ける直接的な証拠になる。
【００１０】
Ｇ１／Ｓ移行での調節欠損が末梢細胞でも起こるという知見は、アルツハイマー病の診断に役立つ新しい診断試験であって、リンパ球培養物などの非神経細胞におけるＧ１／Ｓ移行チェックポイントの活性化を惹起することに依拠する診断試験の根拠となる。神経細胞における細胞周期調節不全は、アルツハイマー病の発病における極めて初期の事象であると思われるので、このような試験は、痴呆に関するＮＩＮＣＤＳ／ＡＤＲＤＡ基準の要件は満たさないがアルツハイマー病の予防策による早期介入によって利益を受けるであろうアルツハイマー病の症状発現前の段階にある被験者の同定に役立つだろうと予想される。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】対照被験者、ｐｒｅＡＤ被験者およびＡＤ患者由来の培養リンパ球に関してフローサイトメーターに表示された測定結果を表す図。ラパマイシン処理細胞と対照無処理細胞との両方について結果を示す。Ｇ１は、細胞が細胞周期のＧ１期にあることを示す。
【図２】ｐｒｅＡＤ、ＡＤ、ＡＤＭ、ｐｏｓｓＡＤ、ＤＮＯＳおよび対照被験者由来の培養リンパ球においてラパマイシンの影響下で起こる細胞周期のＧ１期の相対的延長（左図）および年齢補正した相対的延長（右図）を表す図。
【図３】ｐｒｅＡＤ、ＡＤ、ｐｏｓｓＡＤＭ、ＤＮＯＳおよび対照被験者由来の培養リンパ球において２４時間のラパマイシン処理が細胞の生存に及ぼす効果を表す図。左図には絶対値を示し、右図には年齢補正値を示す。
【図４】ｐｒｅＡＤ、ＡＤ、ｐｏｓｓＡＤＭ、ＤＮＯＳよび対照被験者由来の培養リンパ球においてドキソルビシン処理が細胞の生存に及ぼす効果を表す図。左図には絶対値を示し、右図には年齢補正値を示す。
【図５】ｐｒｅＡＤ、ＡＤ、ｐｏｓｓＡＤＭ、ＤＮＯＳよび対照被験者由来の培養リンパ球においてＨ２Ｏ２処理が細胞の生存に及ぼす効果を表す図。左図には絶対値を示し、右図には年齢補正値を示す。
【図６】ｐ２１のエクソン２およびｐ５７のエクソン２における多型に関するＰＣＲ−ＳＳＣＰスクリーニングの結果を表す図。
【図７】ｐ２１変異体ＡおよびＢと脳におけるサイクリンＢ発現との関係を表す図。白い棒は神経細胞内でサイクリンＢが発現しなかった患者のパーセンテージを示す。黒い棒はサイクリンＢが神経細胞の核で発現した患者のパーセンテージを示す。
【図８】正常なｐ２１（変異体Ｂ）を持つ患者におけるｐ５７エクソン２Ａ変異体ＡおよびＢと脳でのサイクリン発現との関係を表す図。白い棒は神経細胞内でサイクリンＢが発現しなかった患者のパーセンテージを示す。黒い棒はサイクリンＢが神経細胞の核で発現した患者のパーセンテージを示す。
【図９】脳における体細胞突然変異の頻度とＡＤ進行および細胞周期タンパク質との関係を表す図。ｘ軸：ＡＤ重症度のＢｒａａｋ病期。ｙ軸：脳と比較して、血液から異なるＲＡＰＤパターンを生成したプライマーのパーセンテージ。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
（発明の説明）
本発明の第１の態様によれば、ヒト被験体におけるアルツハイマー病の診断方法であって、そのヒト被験体の非神経細胞におけるＧ１／Ｓ期移行での細胞周期調節欠損の存在に関するスクリーニングを含む方法が提供される。
【００１３】
本発明の方法は、最も好ましくは、試験対象であるヒト被験体から単離された非神経細胞に対してインビトロで行われる。非神経細胞は、アルツハイマー病で神経細胞に存在するものと同じＧ１／Ｓ期移行での細胞周期調節欠損を示す非神経細胞タイプであれば、どれでもよい。最も好ましい実施形態として、本方法は、被験者から単離されインビトロで培養されたリンパ球に対して行われる。非神経細胞タイプで細胞周期調節欠損の存在に関する試験を行いうることには、明白な実用上の利点がある。リンパ球は血液試料から容易に単離され、インビトロで培養することができるので、リンパ球の使用は特に便利である。もう一つの好ましい選択肢は、線維芽細胞の使用、特に皮膚生検材料から便利に入手しうる皮膚線維芽細胞の使用である。
【００１４】
本発明の方法を診断的に使用する場合は、非神経細胞タイプにおけるＧ１／Ｓ期移行での細胞周期調節の欠損の存在を、その被験者がアルツハイマー病を持つことのしるしであると解釈する。典型的には、Ｇ１／Ｓ移行でのチェックポイント制御の有効性の低下を、その被験者がアルツハイマー病を持つことのしるしであると解釈する。
【００１５】
アルツハイマー病の病理の根底にある欠損に関して信頼できる試験を利用できるようになれば、この状態を診断する能力が著しく改善され、特に早期診断が可能になるだろう。アルツハイマー病に関して現在利用できる操作的診断基準では、痴呆が既に存在する極めて後期になってからしか、ＡＤの可能性ありまたは可能性大という診断を下すことができない。アルツハイマー病の確定診断は剖検後にしか下すことができない。十分に発達した痴呆の徴候が現れるかなり前に、細胞周期制御の欠損を、リンパ球などの末梢（非神経細胞様）細胞に検出できることは、本発明者らの研究から明らかである。したがって、本発明の方法は、アルツハイマー病の早期診断、特にアルツハイマー病の症状発現前の段階にある個体の検出を行う手段、およびアルツハイマー病そのものはまだ発症していないが、細胞周期調節欠損が存在するのでアルツハイマー病を発症する「恐れ」がある個体の同定を行う手段になる。これにより、例えば生活様式の変更ならびにビタミン養生法および閉経後婦人のＨＲＴなどを含む予防策による早期介入の可能性がもたらされる。
【００１６】
アルツハイマー病そのものはまだ発症していない個体における初期変化を検出することが可能な診断手段を利用できるようになれば、重大な脳病変が発症する前の時点でこの疾患の進行を停止させるための治療法の開発および試験も容易になるだろう。これらの診断試験は初期アルツハイマー病の動物モデルの開発、例えばアルツハイマー病に存在する欠損と類似する欠損を細胞周期調節に示すマウスモデルの同定などにも応用することができる。
【００１７】
Ｇ１／Ｓ移行に細胞周期調節欠損を持つ個体を同定する能力は、臨床試験に含める個体の選択に応用することができる。試験に含める個体を、試験対象である処置によって利益を受ける可能性が最も高い個体となるように選択すれば、臨床試験は意味のある結果をもたらす可能性が増す。
【００１８】
初期（ｉｎｃｉｐｉｅｎｔ）または末期（ｆｕｌｌ−ｂｌｏｗｎ）アルツハイマー病を患っている患者から採取したリンパ球におけるＧ１／Ｓ調節欠損の同定は、その患者における免疫問題の存在、または疾患が進行するにつれてその患者が免疫問題を持つようになる可能性を示しうる。そのような情報を利用できることは、臨床家が、アルツハイマー病に合併する免疫問題を軽減／予防するために治療的介入を行うかどうかを決定する際の助けになる。
【００１９】
本発明の方法は散発性アルツハイマー病の診断には特に好ましい。しかし、等価な細胞周期調節欠損を示す形態の家族性アルツハイマー病の診断にも役立つだろう。一般的に、これには、プレセニリン１またはプレセニリン２突然変異に関係する家族性アルツハイマー病は含まれないだろう。
【００２０】
本発明に従って非神経細胞におけるＧ１／Ｓ期移行での細胞周期調節欠損の存在に関してスクリーニングする方法はいくつかある。一実施形態として、細胞周期調節欠損の存在に関するスクリーニングは、まず細胞の分裂を誘導し、次に細胞分裂阻害物質の添加によって細胞周期停止を惹起し、細胞分裂阻害物質の添加に対する細胞のＧ１／Ｓ細胞周期調節機構の応答性を試験することによって達成することができる。
【００２１】
最も好ましくは、細胞分裂阻害物質は、特異的Ｇ１阻害剤、例えばラパマイシンなどであるだろう。細胞分裂は、細胞分裂促進性刺激の添加、例えば１つまたは複数の成長因子の添加によって誘導することができる。リンパ球を使って試験を行う場合は、フィトヘマグルチニンを使って細胞分裂を誘導することができる。
【００２２】
関連する別の実施形態として、細胞分裂阻害物質による処理を、Ｇ１での細胞周期停止を惹起する刺激、例えば環境刺激による処理で置き換えてもよい。したがって、Ｇ１／Ｓ調節欠損の存在に関するスクリーニングは、細胞の分裂を誘導すること、Ｇ１での細胞周期停止を誘導する刺激に細胞をばく露すること、および細胞周期停止を惹起する刺激の添加に対する細胞のＧ１／Ｓ細胞周期調節機構の応答性を試験することによって達成される。
【００２３】
好適な細胞周期停止の刺激には、例えば電離放射線、低酸素、ＵＶ線などがある。好ましい一実施形態として、細胞をＨ２Ｏ２で処理して酸化ストレスを生じさせることによって、細胞周期停止を誘導することができる。上述のように、細胞分裂は細胞分裂促進性刺激の添加、例えば１つまたは複数の成長因子の添加によって誘導することができる。培養リンパ球ではフィトヘマグルチニンを使って細胞分裂を誘導することができる。
【００２４】
これらの両方法を支えている原理は、まず細胞を刺激して分裂させ、次に、細胞分裂阻害剤または細胞周期停止を惹起する他の刺激を使って細胞周期をＧ１段階で停止させようと試み、次に、細胞周期調節系に対するそのような処理の効果を評価することである。細胞周期調節に対する効果は、後述するように多種多様な手段によって評価することができる。細胞分裂阻害剤または細胞周期停止を誘導する他の刺激による処理を、ここでは、「細胞周期阻害処理」または「阻害処理」と呼ぶ場合がある。もしＧ１／Ｓ移行に細胞周期調節欠損が存在すれば、それは、細胞周期停止の試みに対する細胞の応答性に影響を及ぼすだろう。一般に、Ｇ１／Ｓに細胞周期調節欠損が存在すると、細胞分裂阻害剤またはＧ１での細胞周期停止を誘導する他の刺激による処理に対する応答性が低下する。すなわち、阻害処理は、そのような欠損を持つ細胞では、Ｇ１／Ｓチェックポイントで細胞周期を停止させる効果が低い。
【００２５】
細胞周期阻害処理に対する細胞の応答性を試験するために、細胞分裂促進性刺激の添加前および添加後ならびに細胞周期を停止させる試みの前および後に、さまざまなアプローチを実行することができる。本発明に従って使用することができる好ましいアプローチの非網羅的リストを以下に記載する。他の好適なアプローチは当業者にはわかるだろう。
【００２６】
（１）阻害処理の結果として細胞周期停止が起こったかどうか、そしてどの程度に起こったかを評価するために行われる増殖アッセイ。増殖アッセイは、当技術分野で知られるどの標準的プロトコールに従って行ってもよい。特に好適な一例はＭＴＴ生存率アッセイである（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｔｄから市販されている、Ｍｏｓｍａｎｎ， Ｔ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ， １９８３， ｖｏｌ：６５， ５５−６３を参照されたい）。
【００２７】
典型的なスクリーンでは、細胞分裂阻害剤または細胞周期停止を誘導する他の刺激で処理した細胞と、同じ被験者から採取した無処理の対照細胞との両方に対して、増殖アッセイを行う。阻害処理は無傷のＧ１／Ｓ調節系が存在する場合にのみ有効になるので、処理細胞と無処理細胞の間の増殖の程度の相違は、アルツハイマー病患者の方が年齢対応対照個体より有意に小さい。一般に、阻害処理の存在下で、被験者から得た細胞の増殖活性にほとんど変化がないか全く変化がなければ、それは、Ｇ１期における細胞周期阻害に対する応答性の低下を示し、したがってＧ１／Ｓ移行での調節欠損の存在を示す。結果として、そのような調節欠損の存在は、その被験者がアルツハイマー病を持つことのしるしであると解釈される。
【００２８】
（２）細胞分裂阻害剤または細胞周期停止を誘導する刺激へのばく露の結果として被験者から得た細胞で起こる細胞周期のＧ１期の相対的延長を算出すること。細胞分裂阻害剤または細胞周期停止を誘導する刺激へのばく露の結果として起こるＧ１期の相対的延長は、式：ＲＬ＝１００ｆ−１００を使って算出される（百分率として表される）。「ｆ」は、細胞分裂阻害剤または細胞周期停止を誘導する刺激による阻害処理にさらした細胞（試験対象である被験者から得た非神経細胞）がＧ１にある時間（ＴＧ１ｔｒ）と、阻害処理にばく露していない無処理対照細胞（すなわち、やはり試験対象である被験者から得た非神経細胞）がＧ１にある時間（ＴＧ１ｃ）との比である。ｆは次の関係式に従って算出することができる：
ｆ＝ＴＧ１ｔｒ／ＴＧ１ｃ＝［ｌｎ２−ｌｎ（２−Ｇ１ｔｒ）］［ｌｎ（２−Ｇ１ｃ）］／［ｌｎ（２−Ｇ１ｔｒ）］［ｌｎ２−ｌｎ（２−Ｇ１ｃ）］ （５）。
【００２９】
ＴＧ１ｔｒおよびＴＧ１ｃの値を得るには、さまざまな技術を使用することができる。好ましい一実施形態として、処理細胞（細胞分裂阻害物質または細胞周期停止を誘導する刺激で処理した、試験被験者由来の非神経細胞）と無処理対照細胞（細胞分裂阻害物質または細胞周期停止を誘導する刺激にばく露していない、同じ被験者に由来する非神経細胞）の両方について、細胞周期のさまざまな時期にある細胞の割合を決定することによって、ＴＧ１ｔｒおよびＴＧ１ｃを得ることができる。細胞周期のさまざまな時期にある細胞の割合は、下記の実施例で説明するように、標識ヌクレオチド類似体、好ましくはブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）の取り込みと、それに続く蛍光標示式細胞分別法（ＦＡＣＳ解析）または相当する方法によって、容易に決定することができる。
【００３０】
Ｇ１／Ｓ期移行での細胞周期調節欠損の存在は、試験被験者から得た細胞において、細胞分裂阻害物質または刺激の存在下で起こるＧ１期の相対的延長が、Ｇ１／Ｓ期移行に細胞周期調節欠損を持たない対照細胞（適切な対照細胞のさらなる定義については（１）の説明を参照されたい）と比較して減少することによって示される。Ｇ１／Ｓ期移行に細胞周期調節欠損を持たない対照細胞を、ＲＬの算出に用いる「無処理対照」細胞（これは、阻害処理にばく露されていない、試験被験者由来の細胞である）と混同してはならない。
【００３１】
（３）細胞周期調節タンパク質またはｍＲＮＡ発現の評価。細胞周期調節タンパク質の発現は、例えば免疫ブロット法、ウェスタンブロット法、ＥＬＩＳＡまたはその関連方法などの当技術分野で周知の標準的技術を使って評価することができる。細胞周期調節タンパク質をコードする対応するｍＲＮＡの発現の評価も、例えばハイブリダイゼーション技術、「ＤＮＡチップ」解析もしくはその関連方法、またはＲＴ−ＰＣＲもしくはＮＡＳＢＡ（ｎｕｃｅｌｉｃ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）などの増幅に基づく技術などといった、標準的方法を使って達成することができる。本発明に従って使用することができる好適なｍＲＮＡの検出／定量法は、当業者にはよく知られているだろう。これらの方法の一部、例えばＲＴ−ＰＣＲは、関連ｍＲＮＡのｃＤＮＡコピーの検出／定量に依拠する。
【００３２】
アルツハイマー病に存在する細胞周期調節欠損は、細胞周期調節タンパク質およびそれらに対応するｍＲＮＡの発現パターンの変化をもたらしうる。したがって、特定の細胞周期調節タンパク質および／または対応するｍＲＮＡの発現の変化に関するスクリーニングは、Ｇ１／Ｓでの細胞周期調節欠損の存在を確認するために、診断的に使用することができる。また、細胞周期調節タンパク質の発現は、細胞周期に沿った進行のマーカーとして使用することもできる。したがって、試験被験者から得た細胞において阻害処理がどの程度に細胞周期停止を引き起こすかを決定するために、１つまたは複数の細胞周期調節タンパク質の発現を調べることによって、阻害処理に対する細胞の応答性を評価することができる。好適な細胞周期調節タンパク質には、ＣＤＫＮ３、ｐ１５ｉｎｋ４Ｂ、ｐ１６ｉｎｋ４Ａ、ｐ１９ｉｎｋ４Ｄ、ｐ２７ｋｉｐ１、ｐ２１ｃｉｐ１、ｐ５７ｋｉｐ２およびＴＰ５３などがある。これらのタンパク質およびそれらをコードする遺伝子の配列は公開されている。これらのタンパク質に関するＯＭＩＭアクセッション番号のリストを下記の実施例に記載する。これら各タンパク質の検出に役立つ抗体は市販されている。
【００３３】
（４）当技術分野で知られる任意の方法による細胞生存性および細胞死の評価。増殖細胞をＧ１／Ｓ移行中に停止させると、考え得る２つの「下流」現象の一方、すなわち分化またはプログラム細胞死が起こりうる。これらの下流現象は、Ｇ１／Ｓ移行での調節欠損が細胞集団中に存在することのしるしとして使用することができる。なぜなら、Ｇ１／Ｓ移行の調節に欠損があれば、Ｇ１／Ｓでの細胞周期停止の下流効果も異常になるからである。対照細胞と比較して、試験被験者から得た細胞で阻害処理に応答して起こる細胞死の程度の低下または細胞生存性の程度の上昇は、その被験者がアルツハイマー病を持つことのしるしであると解釈される。
【００３４】
（５）標準的技術による細胞死関連（誘導もしくは防止）タンパク質またはｍＲＮＡ発現の評価。この実施形態では、細胞死関連タンパク質またはそれに対応するｍＲＮＡの発現を、細胞分裂阻害剤またはＧ１／Ｓ移行での細胞周期停止を誘導する他の刺激による処理の下流効果の間接的評価として使用する。好適な細胞死関連タンパク質として、当技術分野で数多く知られているｂｃｌ−２タンパク質ファミリーの構成要素が挙げられる。
【００３５】
（６）標準的技術によるＤＮＡ損傷応答要素タンパク質またはそれに対応するｍＲＮＡの発現の評価。このアプローチは、Ｇ１／Ｓでの細胞周期停止を誘導するために使用する刺激がＤＮＡ損傷である場合、例えばＤＮＡ損傷を引き起こす化学物質による処理またはＵＶ線へのばく露などである場合に、使用することができる。正常な環境では、ＤＮＡ損傷
の存在は細胞をＧ１／Ｓ期移行で停止させ、損傷したＤＮＡをＤＮＡ損傷応答経路の活性化によって修復しようとする。したがって、損傷したＤＮＡの存在に応答して起こるＤＮＡ損傷に対する正常な応答に関与するタンパク質またはそれに対応するｍＲＮＡの発現パターンの変化は、Ｇ１／Ｓ期移行に細胞周期調節欠損が存在するしるしとして使用することができる。好適なＤＮＡ損傷応答要素には、例えばＴＰ５３、Ｇａｄｄ３４、Ｇａｄｄ４５Ａ（１２６３３５）、Ｇａｄｄ４５Ｂ（６０４９４８）、Ｇａｄｄ４５Ｇ（６０４９４９）、Ｇａｄｄ１５３（１２６３３７）およびＰＣＮＡ（１７６７４０）などがある。これらＤＮＡ損傷応答要素に関するＯＭＩＭアクセッション番号のリストは下に記載する。
【００３６】
（７）細胞周期解析を伴う、または細胞周期解析を伴わない、非神経細胞のＤＮＡ含量の評価。この実施形態では、細胞分裂阻害剤または細胞周期停止を誘導する他の刺激で処理した試験被験者由来の細胞のＤＮＡ含量の測定が、そのような細胞におけるＧ１／Ｓ移行での調節欠損の存在の間接的なしるしになる。この方法を支える原理は、Ｇ１期にある細胞と、細胞周期のＤＮＡ複製段階を通過し終えたＧ２期にある細胞との間のＤＮＡ含量の相違である。正常細胞（すなわちＧ１／Ｓに調節欠損を持たない細胞）の集団を処理してＧ１またはＧ１／Ｓでの細胞周期停止を誘導すると、細胞の大半はＧ１期にとどまるだろう。しかし、細胞がＧ１／Ｓに調節欠損を持つ場合は、細胞の一部がＧ１／Ｓチェックポイントを通過して、ＤＮＡ複製を起こすだろう。したがって、Ｇ１での細胞周期停止を誘導するための処理後に、Ｇ１／Ｓに調節欠損を持たない対照細胞と比較して、試験被験者から得た細胞中のＤＮＡ含量が増加すれば、それは、Ｇ１／Ｓに調節欠損が存在するしるしであると解釈される。結果として、そのような調節欠損の存在は、その被験者がアルツハイマー病を持つことのしるしであると解釈される。
【００３７】
細胞分裂阻害剤または細胞周期停止を誘導する刺激による阻害処理に対する非神経細胞（特に培養リンパ球）の応答性を試験するのに適した技術の上記リストは、本発明の例示を意図するものであって、本発明を限定するものではない。
【００３８】
第２の態様として、本発明は、ヒト被験体におけるアルツハイマー病の診断に使用される方法であって、前記被験者のゲノムにおける、細胞周期調節遺伝子中の少なくとも１つの突然変異または対立遺伝子変異体の存在に関するスクリーニングを含み、細胞周期調節遺伝子中の突然変異または対立遺伝子変異体の存在をアルツハイマー病のしるしであると解釈する方法を提供する。
【００３９】
最も好ましくは、本発明の方法では、ＣＤＫＮ３、ｐ１５ｉｎｋ４Ｂ、ｐ１６ｉｎｋ４Ａ、ｐ１９ｉｎｋ４Ｄ、ｐ２７ｋｉｐ１、ｐ２１ｃｉｐ１、ｐ５７ｋｉｐ２およびＴＰ５３からなる群より選択される細胞周期調節遺伝子中の少なくとも１つの突然変異または対立遺伝子変異体の存在に関するスクリーニングが行われるだろう。
【００４０】
アルツハイマー病に関係することが示されている特定の突然変異／変異体の存在に関するスクリーニングも考えられるが、本発明の方法は、特定の突然変異または遺伝的変異体の存在に関するスクリーニングには限定されない。本発明は、細胞周期調節遺伝子またはその小領域を、今までに知られていない突然変異／変異体を含む突然変異または遺伝的変異体の存在に関してスキャンすることを包含する。疑念が生じないように述べると、「遺伝子」という用語は、調節領域、特にプロモーター領域を包含する。細胞周期調節遺伝子における１つまたは複数の突然変異または遺伝的変異体、特にその遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列の変化をもたらす突然変異／変異体、またはコードされているタンパク質の機能を変化させる突然変異／変異体、またはそのタンパク質の発現レベルを変化させる突然変異／変異体の存在は、そのような突然変異または変異体の存在が細胞周期調節欠損のしるしであることに基づいて、その個体がアルツハイマー病を持つことのしるしであると解釈される。
【００４１】
与えられたヒト被験体の細胞周期調節遺伝子を突然変異／対立遺伝子変異体の存在に関してスキャンするために、本発明に従って使用することができる、遺伝的変異を検出するための技術は、当技術分野では数多く知られている。好適な技術には、例えば一本鎖高次構造多型解析（ＳＳＣＰ）、ＰＣＲ−ＳＳＣＰヘテロ二本鎖解析（ＨＡ）、変性勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）、ＤＮＡ配列決定、ＲＮアーゼ切断、ミスマッチの化学的切断（ＣＣＭ）などがある（ＳｃｈａｆｅｒおよびＨａｗｋｉｎｓによる総説Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ：１６， ｐ．３３−３９， １９９８を参照されたい）。
【００４２】
下記実施例２では、ＰＣＲ−ＳＳＣＰを使ったｐ２１ｃｉｐおよびｐ５７遺伝子における多型変異体に関するスクリーニングと、それによるｐ２１ｃｉｐ遺伝子のエクソン２における１つの多型変異体およびｐ５７遺伝子のエクソン２における２つの多型変異体の同定について説明する。他の遺伝子における多型変異体に関するスクリーニングには、適当な変更を加えて、すなわち目的とする遺伝子に特異的なＰＣＲプライマーを選択して、同じ技術的アプローチを使用することができる。
【００４３】
突然変異／対立遺伝子変異体の存在に関するスクリーニングは、ヒト被験体から単離したゲノムＤＮＡの試料に対して行われる。ゲノムＤＮＡは、当技術分野で周知の標準的技術を使って、全血試料から便利に単離することができる。突然変異／対立遺伝子変異体の存在に関してスキャンする工程は、被験者に由来する培養リンパ球から調製したゲノムＤＮＡに対して、有利に行うことができる。同じリンパ球培養物を、Ｇ１／Ｓ期移行での細胞周期調節欠損の存在に関して、例えば本発明の第１に態様による方法を使って阻害処理に対する応答性を試験することなどにより、「機能的に」試験することもできる。
【００４４】
与えられた多型変異体とアルツハイマー病への罹患性との関連は、遺伝的関連研究、例えば家族関連研究または患者対照関連研究などを行うことによって確認することができる。特定の多型変異体の疾患関連性は、遺伝子型と、脳における細胞周期進行のマーカーの発現との関係を評価することによって決定することもできる。下記の実施例では、遺伝子型と、神経細胞の核におけるサイクリンＢ（細胞周期のＧ２段階への進行のマーカー）の発現との関係を評価した。細胞周期進行の他のマーカーを使っても、同じ効果が得られた。
【００４５】
具体的一実施形態として、本方法は、下記実施例に記載するｐ２１およびｐ５７遺伝子中の多型変異体の一つに関する遺伝子タイピングを含みうる。ｐ２１Ｅ２対立遺伝子ＡおよびＢ、ｐ５７Ｅ２Ａ対立遺伝子ＡおよびＢ、ならびにＰ５７Ｅ２Ｂ対立遺伝子ＡおよびＢと表記されるこれらの変異体は、下記実施例に詳述する条件で以下のプライマーセットを使用することにより、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ解析に基づいて遺伝子タイピングすることができる。
ｐ２１Ｅ２ Ａ／Ｂ：５'−ＣＧＧＧＡＴＣＣＧＧＣＧＣＣＡＴＧＴＣＡＧＡＡＣＣＧＧＣ−３'（配列番号１）および５'−ＣＣＡＧＡＣＡＧＧＴＣＡＧＣＣＣＴＴＧＧ−３'（配列番号２）
Ｐ５７Ｅ２Ａ Ａ／Ｂ：５'−ＧＧＣ ＣＡＴ ＧＴＣ ＣＧＡ ＣＧＣ ＧＴＣ−３'（配列番号３）および５'−ＡＧＧ ＣＧＧ ＣＡＧ ＣＧＣ ＣＣＣ ＡＣＣ ＴＧ−３'（配列番号４）
ｐ５７Ｅ２Ｂ Ａ／Ｂ：５'−ＡＴＴ ＡＣＧ ＡＣＴ ＴＣＣ ＡＧＣ ＡＧＧ ＡＣＡ ＴＧ−３'（配列番号５）および５'−ＣＴＧ ＧＡＧ ＣＣＡ ＧＧＡ ＣＣＧ ＧＧＡ ＣＴＧ−３'（配列番号６）。
【００４６】
いずれの場合も、ＡおよびＢ対立遺伝子は、実施例２に定義する条件下で、結果として得られるＰＣＲ産物の示差的な電気泳動移動度に基づいて、図６を参照して同定することができる。ただし、本発明をＰＣＲ−ＳＳＣＰの使用に限定するつもりはなく、他の方法を使って同じ変異体を遺伝子タイピングしてもよい。
【００４７】
ｐ２１Ｅ２ Ａ対立遺伝子およびｐ５７Ｅ２Ａ Ａ対立遺伝子は、どちらも、Ｇ１／Ｓチェックポイント越しの進行の増加と関連しており、したがってアルツハイマー病への罹患性と関連している。
【００４８】
細胞周期調節遺伝子をコードする遺伝子における突然変異または対立遺伝子変異体の存在の検出に基づくスクリーンは、２つ以上の多型変異体に関する遺伝子タイピング、または遺伝的変異の存在に関する１つまたは複数の細胞周期調節遺伝子のスキャニングを含みうる。細胞周期調節遺伝子の機能に対して有害な効果を持つ遺伝的変異はいずれも、Ｇ１／Ｓ移行チェックポイントのバイパスと、その結果として起こるＡＤ病変とをもたらす可能性がある。一つの調節遺伝子内での、または複数の遺伝子にわたる、遺伝的変異の蓄積は、相加的効果を持ちうる。
【００４９】
細胞周期調節遺伝子をコードする遺伝子における突然変異または対立遺伝子変異体の存在の検出に基づくスクリーンは、場合により細胞周期調節欠損の存在に関するスクリーニングなどの他の診断試験と組み合わせて、アルツハイマー病の診断に使用することができる。また、これらのスクリーンは、細胞周期調節遺伝子中に突然変異または対立遺伝子変異体が存在するがゆえにアルツハイマー病の素因を持つ個体を同定するためにも使用することができる。
【００５０】
細胞周期調節遺伝子中の突然変異または対立遺伝子変異体に関してスクリーニングするアプローチは、先にアルツハイマー病の診断を下されている患者におけるアルツハイマー病の遺伝的根拠を決定するためにも使用することができる。
【００５１】
第３の態様として、本発明は、ヒト被験体におけるアルツハイマー病の診断に使用される方法であって、前記被験者のゲノムにおける、ＤＮＡ修復酵素をコードする遺伝子中の少なくとも１つの突然変異または対立遺伝子変異体の存在に関するスクリーニングを含み、そのような遺伝子中の突然変異または対立遺伝子変異体の存在をアルツハイマー病のしるしであると解釈する方法を提供する。
【００５２】
好適な遺伝子としては、ＤＮＡ修復酵素Ｋｕ７０、Ｋｕ８０、Ｋｕ８６、ＮＤＨＩＩ、ＢＬＭ、ＲＥＣＱＬ、ＲＥＣＱＬ４およびＲＥＣＱＬ５をコードする遺伝子が挙げられる。「遺伝子」という用語は調節領域、特にプロモーター領域を包含する。
【００５３】
この場合も、アルツハイマー病に関係する特定の突然変異体／変異体の存在に関するスクリーニングは考えられるが、本発明の方法は、特定の突然変異または遺伝的変異体の存在に関するスクリーニングを必要とはしない。本方法は、ＤＮＡ修復酵素をコードする遺伝子またはそのような遺伝子の小領域を、今までに知られていない突然変異／変異体を含む突然変異または遺伝的変異体の存在に関してスキャンすることを含みうる。
【００５４】
ＤＮＡ修復酵素をコードする遺伝子における１つまたは複数の突然変異または遺伝的変異体の存在は、アルツハイマー病のしるしであると解釈される。なぜなら、ＤＮＡ修復酵素は細胞周期調節に関係する経路に作用するからである。したがって、ＤＮＡ修復酵素をコードする遺伝子における突然変異または対立遺伝子変異体の存在は、細胞周期調節欠損の間接的なしるしである。
【００５５】
ＡＤ患者の脳における体細胞突然変異の量は、細胞周期調節解除およびＡＤ型病変の重症度に有意に関連することが観察される（下記実施例参照）。したがって、ＤＮＡ修復不全はＧ１／Ｓ移行点の調節解除につながり、最終的にはアルツハイマー病の発症につながりうることが示唆される。
【００５６】
ＤＮＡ修復酵素をコードする遺伝子における突然変異または対立遺伝子変異体の存在の検出に基づくスクリーンは診断的に使用すること、特に症状発現前のアルツハイマー病を持つ個体の同定に使用することができる。同様のスクリーンは、ＤＮＡ修復酵素をコードする１つまたは複数の遺伝子に突然変異／変異体が存在するがゆえにアルツハイマー病を発症する素因がある個体を同定するために使用すること、および先にアルツハイマー病の診断を下されている患者におけるアルツハイマー病の遺伝的根拠を決定するために使用することもできる。
【００５７】
突然変異／対立遺伝子変異体の存在に関してスクリーニングする実際の工程は、上述したように、当技術分野で知られる技術のどれを使って行ってもよい。
【００５８】
さらにもう一つの態様として、本発明は、アルツハイマーの処置において薬理活性を持つ可能性がある化合物を同定する方法であって、
Ｇ１／Ｓ期移行に細胞周期調節欠損を示す非神経細胞におけるＧ１／Ｓ移行の調節を、試験化合物の存在下および不在下で解析する工程
を含み、Ｇ１／Ｓ移行での調節欠損の矯正をもたらす試験化合物を、アルツハイマー病の処置において薬理活性を持つ可能性があると同定する方法を提供する。
【００５９】
本発明の方法は、アルツハイマー病で神経細胞に観察されるものと類似するＧ１／Ｓ期移行での細胞周期調節欠損を示す非神経細胞であれば本質的にどの細胞を使って行ってもよい。好適な細胞としては、例えばアルツハイマー病を持つ一個体またはいくつかの個体に由来する培養リンパ球を挙げることができる。
【００６０】
Ｇ１／Ｓ移行の調節の「解析」は、本発明の第１の態様に関連してＧ１／Ｓでの細胞周期調節欠損の存在に関するスクリーニングに適していると説明したどの方法を使って行ってもよい。Ｇ１／Ｓ期移行の調節の解析に使用する方法は、化合物スクリーンを中〜高スループット形式で行うことができるようにマルチウェルマイクロタイタープレートで行うことが可能な方法であると有利だろう。中〜高スループット形式での使用に適した最も好ましい方法は細胞増殖アッセイである。
【００６１】
Ｇ１／Ｓ移行に調節欠損を示す細胞を試験化合物にばく露し、Ｇ１／Ｓ移行の調節に対する試験化合物の効果を、適切な対照（例えばどの試験化合物にもばく露していない細胞）を基準として評価する。典型的なスクリーンでは、試験化合物は、ある範囲のさまざまな濃度で試験されるだろう。
【００６２】
本発明のスクリーニング方法で試験される候補化合物のタイプに制限はない。試験化合物としては、例えば薬理活性または生化学的活性がわかっている化合物、そのような活性は確認されていない化合物、および全く新しい化合物、またはコンビナトリアル化学によって作製されうるような分子ライブラリーなどを挙げることができる。ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ポリペプチドまたはタンパク質である化合物も除外されない。
【００６３】
基本的な化合物スクリーニング方法を、アルツハイマー病の処置の一形態が持つ効力の評価に使用できるように、例えば細胞周期調節に対する特定薬剤の効果を試験するために、適合させてもよい。
【００６４】
有用な変形として、本発明の方法は、特に、ある薬剤がある特定ヒト個体におけるアルツハイマー病の処置に役立つ見込みがあるかどうかを決定するために使用することができる。この場合、アッセイは、Ｇ１／Ｓ期移行に細胞周期調節欠損を示すその個体由来の細胞を使って、最も好ましくは培養リンパ球を使って行われる。それらの細胞を、薬剤の存在下および不在下で、Ｇ１／Ｓ期移行での調節欠損の存在について調べる。Ｇ１／Ｓ移行での調節欠損の「矯正」をもたらす薬剤を、その個体におけるアルツハイマー病の処置に役立つ見込みがあると同定する。「矯正」とは、正常な細胞周期調節への有意な程度の回復を意味する。これは、対照細胞、例えばアルツハイマー病も、Ｇ１／Ｓ移行での調節欠損を示す証拠も、アルツハイマー病の素因を与えると予想しうる遺伝的欠陥／対立遺伝子変異も持たない年齢対応対照個体から採取した同じタイプの細胞を参照することによって評価することができる。
【実施例】
【００６５】
以下の実験例を添付の図面と併せて参照すれば、本発明の理解が深まるだろう。
【００６６】
実施例１−アルツハイマー病患者のリンパ球における細胞周期調節欠損の存在を示す証拠材料および方法
この研究には、オックスフォード記憶および老化研究プロジェクト（Ｏｘｆｏｒｄ Ｐｒｏｊｅｃｔ ｔｏ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ Ｍｅｍｏｒｙ ａｎｄ Ａｇｅｉｎｇ（ＯＰＴＩＭＡ））の正規参加者（ｆｕｌｌ ｐａｒｔｉｃｉｐａｎｔ）である１０２人の被験者が参加した。年１回の定例ＯＰＴＩＭＡ検査には、身体検査、認知および神経心理学試験が含まれる。医薬品の摂取および併発感染症をすべて記録する。血液をヘパリンリチウムまたはＥＤＴＡバキュテイナ中に収集した。Ｆｉｃａｌｌ（Ｓｉｇｍａ）を使用し、標準的プロトコールに従って、リンパ球を単離した。すべての患者について培養方法を標準化するために、分離したリンパ球を凍結し、さらなる解析のために保存しておいた。
【００６７】
培養のためにリンパ球が必要になったら、それらを３７℃の水浴で融解し、ＲＰＭＩで２回洗浄した（細胞の洗浄にはリンパ球の生存を支持するどの培地または緩衝液を使っても等価な効果が得られる）。細胞生存率（トリパンブルー排除法）は典型的には約８０〜９０％だった。
【００６８】
一組目の実験は４９人の被験者に対して行い（表１ａ）、二組目の実験は５５人の被験者に対して行った（表１ｂ）。一組目の実験（４９被験者）では、１０％ＦＣＳを補ったＲＰＭＩ培地に、培養培地１ｍｌあたり１×１０６細胞の濃度で、各個体からそれぞれ２つの並行リンパ球培養物を調製した。リンパ球を活性化するために、フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）を２２μｇ／ｍｌの最終濃度で培養物に添加した。培養物を５％ＣＯ２を含む湿潤雰囲気下に３７℃で４８時間培養した。４８時間の培養後に、一方の培養物を１００ｎｇ／ｍｌのラパマイシンで処理し、他方の無処理培養物は対照としてそのままにしておいた。さらに２３時間の培養後に、ＢｒｄＵを１０μｇ／ｍｌの濃度ですべての培養物に添加した。さらに１時間の後、培養物を「収集」し、７０％氷冷エタノールで固定した。ＢｒｄＵの取り込みを免疫組織化学を使って評価した後、ＦＡＣＳ解析を行った。細胞周期のさまざまな時期にある細胞の割合を決定し、データ変換を行ってＧ１期の相対的延長を求めた（図１）。
【００６９】
算出（対照培養物と比較した処理培養物における細胞周期のＧ１期の相対的延長）は、細胞が指数増殖期にあり、培養物中の増殖率（分裂細胞と休止細胞との比）は１．０であるという仮定に基づいて行った（５）。また、ラパマイシンはＧ１期の長さだけを変化させると仮定した（１９）。これらの仮定に基づき、式：ＲＬ＝１００ｆ−１００（パーセントで表示する）を使って、Ｇ１期の相対的延長を算出した。処理培養物と対照対象物とのＧ１時間の比：ｆ＝ＴＧ１ｔｒ／ＴＧ１ｃ＝［ｌｎ２−ｌｎ（２−Ｇ１ｔｒ）］［ｌｎ（２−Ｇ１ｃ）］／［ｌｎ（２−Ｇ１ｔｒ）］［ｌｎ２−ｌｎ（２−Ｇ１ｃ）］ （５）。
【００７０】
二組目の実験（５３被験者）では、最初の４８時間の培養（同上）後に、４つの独立した培養物を調製した。対照培養物は何も処理を施さずに放置し、一組の培養物は１００ｎｇ／ｍｌのラパマイシンで処理し、三組目は１μＭのドキソルビシンで処理し、四組目は１２０μＭのＨ２Ｏ２で処理した。ドキソルビシンはＧ１／ＳではなくＧ２／Ｍでの停止につながるＤＮＡ損傷を引き起こす。Ｈ２Ｏ２処理はＧ１／Ｓでの可逆的かつ一時的な細胞周期停止につながる酸化ストレスをもたらす。
【００７１】
２０時間のインキュベーション後に、４時間のＭＴＴ生存率アッセイ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｔｄ）を設定した。結果はマイクロプレートリーダー（５７０フィルター６３０参照フィルター）を使って読み取った。処理培養物と対照との細胞数の比をパーセントとして表した。
【００７２】
すべての実験は患者の臨床診断結果に関して盲検的に行った。
【００７３】
ＯＰＴＩＭＡプロジェクトに参加した臨床家が下した臨床診断結果との関連で結果を解析した。
【００７４】
統計的解析はＳｔａｔｇｒａｐｈｉｃｓソフトウェアパッケージを使って行った。ＡＮＯＶＡ検定を行って、細胞培養パラメーターに対する臨床診断結果の影響を調べた。結果に対する年齢の影響を調節するためにもう一組の解析も行った。年齢補正により、試験対象である特定パラメーターにおける年齢関連の変動を考慮に入れることができる。与えられたパラメーターに対する年齢の影響は、健康な被験者での当該パラメーターに対する年齢の影響を調べることによって決定される。
【００７５】
結果
二組の実験に含めた患者の臨床診断結果を表１ａおよび１ｂに要約する。特異的Ｇ１阻害剤ラパマイシンの影響下で起こるＧ１期の相対的延長は、我々の患者の臨床診断結果に有意に依存した（Ａｎｏｖａ ｐ＝０．０４、Ｋｒｕｓｋａｌｌ−Ｗａｌｌｉｓ検定 ｐ＝０．０１７）（図２）。ラパマイシンによるＧ１阻害がより有効であることを示す最も高い値は、対照、ＡＤ以外の痴呆症候群、およびアルツハイマー病の可能性ありの患者と診断された被験者に見いだされた。ＡＤに罹患している（ＮＩＮＣＤＳでＡＤの可能性大）と診断された患者、およびＡＤと他の病変とが共存している患者（ＡＤＭ）は、対照被験者およびＮＩＮＣＤＳ基準による診断でＤＮＯＳまたはｐｏｓｓＡＤに罹患している患者よりも、Ｇ１遮断の有効性が有意に低いことがわかった（図２）。臨床診断分類間の相違は、相対的Ｇ１遅延を年齢に関して補正した場合でも同様である（図２）。
【００７６】
二組目の実験では、ラパマイシン処理後の細胞数が、対照培養物と比較してＡＤ培養物およびｐｏｓｓＡＤ培養物の方が細胞数が多いという予想どおりのパターンを示した（図３）。しかしＭＴＴアッセイ系の感度は比較的低い。ドキソルビシン処理は患者群間に有意な相違をもたらさなかった（図３）。ドキソルビシン処理とは対照的に、Ｈ２Ｏ２処理による細胞数の減少は臨床診断結果に依存した。ＡＤ、ｐｒｅＡＤおよびｐｏｓｓＡＤに罹患している患者は、Ｈ２Ｏ２処理の結果として、対照被験者よりも細胞数が有意に高くなった。ＤＮＯＳ患者は広い変動を示し、他の患者群のいずれとも差がなかった（図４）。
【００７７】
【表１】
【００７８】
略語一覧
対照：認知および神経心理学試験の結果が正常である健康な個体。
ＰｒｅＡＤ：神経心理学試験の結果から初期ＡＤが示唆される健康な個体。
ＰｏｓｓＡＤ：ＮＩＮＣＤＳ基準による診断でアルツハイマー病の可能性あり（ｐｏｓｓｉｂｌｅ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ'ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）
ＡＤ：ＮＩＮＣＤＳ基準による診断でアルツハイマー病の可能性大（ｐｒｏｂａｂｌｅ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ'ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）
ＡＤＭ：アルツハイマー病の可能性あり（ＮＩＮＣＤＳ）および他のタイプの痴呆を示す証拠。
ＤＮＯＳ：アルツハイマー病の可能性大に関するＮＩＮＣＤＳ基準の要件を満たさない痴呆を持つ患者。
【００７９】
考察
この研究では、リンパ球におけるＧ１期の長さに対する特異的Ｇ１阻害剤（ラパマイシン）（１６，１９）の効果を、ＢｒｄＵ取り込みアッセイおよびＦＡＣＳ解析法を使って解析した。ラパマイシン処理後の培養物中の細胞数の減少も評価した。もう一つのアプローチとして、Ｇ１阻害を酸化ストレスによって惹起し、培養系中の細胞数の減少を測定した。
【００８０】
一組目の実験の結果は、細胞周期のＧ１期の延長によって示されるＧ１阻害剤誘導性細胞周期停止の有効性が、アルツハイマー病に罹患している患者では、対照個体よりも、有意に低いことを示している。これらの変化が早期に、患者が臨床的にはまだ痴呆を来していないが痴呆の最初の明瞭な徴候であることがわかっている特異的で迅速な記憶喪失の徴候を示す段階で現れることも明らかである。
【００８１】
ラパマイシンが誘導するＧ１遮断は、サイクリンＥ／ｃｄｋ２複合体の活性を阻害するｐ２７ｋｉｐ１ ＣＤＫＩの発現および活性に依存する（１６，１９）。したがって、ラパマイシンの影響下で起こるＧ１期の相対的延長は、このＣＤＫＩの発現／活性に依存するだろう（１９）。Ｇ１のこの相対的延長がアルツハイマー病患者では高齢の健常な個体よりも有意に低いという事実は、これらの患者では神経細胞におけるＧ１／Ｓチェックポイント不全に付随して他の細胞タイプでも同様の細胞周期制御損傷が生じているという我々の仮説を裏付けるものだろう。また、十分に発達した痴呆の徴候が現れるかなり前に、細胞周期制御の不全を末梢細胞中で検出できることも明白である。これにより、末梢リンパ球の細胞分裂促進性刺激に続いてＧ１／Ｓ移行遮断を試みることに基づくアッセイを使って、ＡＤ型の脳病変を後に発症する恐れがありうる患者を早期に検出することが可能になる。
【００８２】
Ｈ２Ｏ２によって誘導される細胞数の相違は、我々の患者群では有意に異なり、対照被験者由来のリンパ球が、酸化ストレスに対して、より顕著に応答することを示した。１２０ｍＭのＨ２Ｏ２による処理はＧ１／Ｓ移行点における可逆的かつ一時的な細胞周期停止を誘導して（６）、ＤＮＡ損傷−修復の時間を与えることが示されている。我々の結果は、この機構がアルツハイマー病患者では十分に有効ではないことを示している。酸化ストレスに対するこの不十分な応答は、症状発現前のＡＤに罹患している被験者にも存在する。酸化ストレスに対する応答の変化は、ＡＤ患者の方が既存のＤＮＡ損傷が多量であることを反映しているのかもしれない（１１）。しかしこの可能性は、Ｇ１停止ではなくＧ２／Ｍ停止を誘導するドキソルビシン誘導性ＤＮＡ損傷が、我々の患者群では相違しないという事実によって排除される。したがってこの研究の結果は、Ｇ１／Ｓ移行点の調節における特異的不全を示していると解釈される。
【００８３】
要約すると、この研究の結果は、Ｇ１阻害に対する活性化リンパ球の応答が、アルツハイマー病罹患者では有意に変化していることを示している。その上、これらの変化は十分に発達した痴呆症候群の発症前に早期に現れて、後にアルツハイマー病を発症しそうな被験者の同定に役立つ。これらの結果は、Ｇ１／Ｓ移行チェックポイントの完全性の検出に依拠する診断試験によって、後にＡＤを発症する恐れのある被験者を同定しうることを示している。この診断法の利点は、この被験者群をこの診断法によって同定することができ、それらの人々に予防的介入を行う可能性が開かれることにあるだろう。
【００８４】
リンパ球の分離および培養、細胞分裂の誘導、細胞分裂阻害剤またはＨ２Ｏ２誘導性低酸素による細胞周期停止の誘導、ＢｒｄＵ取り込み／ＦＡＣＳ解析、およびＭＴＴ生存率アッセイに関して実施例１で説明したプロトコール、またはその軽微な改造はすべて、Ｇ１／Ｓ移行での調節欠損の存在について試験するために、診断的に使用することができる。
【００８５】
実施例２−ｐ２１ｃｉｐおよびｐ５７における一塩基多型の同定方法
５'−ＣＧＧＧＡＴＣＣＧＧＣＧＣＣＡＴＧＴＣＡＧＡＡＣＣＧＧＣ−３'（配列番号１）および５'−ＣＣＡＧＡＣＡＧＧＴＣＡＧＣＣＣＴＴＧＧ−３'（配列番号２）プライマーを使って、ゲノムＤＮＡ（脳または血液から抽出したもの）から、ｐ２１ｃｉｐのエクソン２を増幅した。ＰＣＲ増幅は、ＰＣＲ緩衝液（７５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．８、２０ｍＭ （ＮＨ４）２ＳＯ４および０．０１％Ｔｗｅｅｎ）中、１．２５単位のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、５％ゼラチン、２００μＭの各ｄＮＴＰを使って、５０μｌの最終液量で行った。ホットスタート（９５℃で５分）の後、９５℃で１分、６５℃で１分、７２℃で１分を３０サイクルした。
【００８６】
５'−ＧＧＣ ＣＡＴ ＧＴＣ ＣＧＡ ＣＧＣ ＧＴＣ−３'（配列番号３）および５'−ＡＧＧ ＣＧＧ ＣＡＧ ＣＧＣ ＣＣＣ ＡＣＣ ＴＧ−３'（配列番号４）プライマーを使って、ゲノムＤＮＡ（脳または血液から抽出したもの）から、ｐ５７のエクソン２の第１セグメント（エクソン２Ａｐ５７）を増幅した。ＰＣＲ増幅は、ＰＣＲ緩衝液（７５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．８、２０ｍＭ （ＮＨ４）２ＳＯ４および０．０１％Ｔｗｅｅｎ）中、１．２５単位のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０％ＤＭＳＯ、２００μＭの各ｄＮＴＰを使って、５０μｌの最終液量で行った。ホットスタート（９５℃で５分）の後、９５℃で３０秒、５２℃で３０秒、７２℃で３０秒を３０サイクルした。
【００８７】
５'−ＡＴＴ ＡＣＧ ＡＣＴ ＴＣＣ ＡＧＣ ＡＧＧ ＡＣＡ ＴＧ−３'（配列番号５）および５'−ＣＴＧ ＧＡＧ ＣＣＡ ＧＧＡ ＣＣＧ ＧＧＡ ＣＴＧ−３'（配列番号６）プライマーを使って、ゲノムＤＮＡ（脳または血液から抽出したもの）から、ｐ５７のエクソン２の第２セグメント（エクソン２Ｂｐ５７）を増幅した。ＰＣＲ増幅は、ＰＣＲ緩衝液（７５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．８、２０ｍＭ （ＮＨ４）２ＳＯ４および０．０１％Ｔｗｅｅｎ）中、１．２５単位のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、２００μＭの各ｄＮＴＰを使って、５０μｌの最終液量で行った。ホットスタート（９５℃で５分）の後、９５℃で３０秒、５３℃で３０秒、７２℃で３０秒を３０サイクルした。
【００８８】
一次スクリーニングのために、ゲル添加量２０μｌに対応する１６μｌの変性溶液（９５％脱イオンホルムアミド、１０ｍＭ ＮａＯＨ、０．０１％ブロモフェノールブルー、および０．０１％キシレンシアノールＦＦ）に４μｌのＰＣＲ産物を加えた。その混合物を９５℃で５分間インキュベートし、１：１００００のＧｅｌＳｔａｒを含むＭｅｔａＰｈｏｒアガロースゲル（ｐ２１エクソン２の場合は２％、エクソン２Ａ ｐ５７およびエクソン２Ｂ ｐ５７の場合は３％）にのせた。電気泳動装置を普通の冷蔵庫で４℃の一定温度に維持した。電気泳動は１×ＴＢＥ（４５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ホウ酸／１ｍＭ ＥＤＴＡ）を使って５Ｖ／ｃｍで２時間行った。ゲルに現れるＳＳＣＰパターンをＵＶ光で検出した。
【００８９】
結果
ｐ２１ｃｉｐ遺伝子のエクソン２およびｐ５７ｋｉｐ２遺伝子のエクソン２に多型が見つかった（図６）。ｐ２１ｃｉｐのエクソン２に検出された多型（変異体Ａ）は、神経細胞における細胞周期調節解除（すなわちサイクリンＢ陽性によって示されるＧ１／Ｓ移行を経たＧ２期への細胞周期の進行）と有意に関連した（図７）。正常なｐ２１ｃｉｐ（変異体Ｂ）を持つ患者では、ｐ５７エクソン２Ａ上の多型が、Ｇ１／Ｓ移行を経たＧ２期への細胞周期の進行を示すサイクリンＢ陽性と関連する（図８）。
【００９０】
実施例３−体細胞突然変異に関するＲＡＰＤスクリーニング方法
遺伝子フィンガープリント法を使って神経細胞における体細胞突然変異をスクリーニングした。すべての患者の脳および血液からＤＮＡを得た。各患者から採取した両方の試料でＰＣＲ増幅を行った。１０本の短いプライマーを使って、多型ＤＮＡ配列をランダムに増幅した（プライマーを表２に列挙する）。ＰＣＲ増幅は、ＰＣＲ緩衝液（７５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．８、２０ｍＭ （ＮＨ４）２ＳＯ４および０．０１％Ｔｗｅｅｎ）中、１．２５単位のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、２００μＭの各ｄＮＴＰを使って、５０μｌの最終液量で行った。ホットスタート（９５℃で５分）の後、９４℃で３０秒、ＡｎＴで１分、７２℃で２分を４０サイクルした。アニーリング温度（ＡｎＴ）はプライマーに応じて３３℃〜３９℃の間で変えた。ＰＣＲ産物を１：１００００のＧｅｌＳｔａｒを含む２％アガロースゲルにのせた。電気泳動は１×ＴＢＥ（４５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ホウ酸／１ｍＭ ＥＤＴＡ）を使って６．５Ｖ／ｃｍで２時間行った。ＲＡＰＤ配列パターンをＵＶ光で検出した。血液ＤＮＡと脳ＤＮＡから得られるＲＡＰＤ配列の相違を患者ごとに比較し、異なるＲＡＰＤプロファイルをもたらすプライマーのパーセンテージとして表した（ＲＡＰＤプロファイルは図示していない）。
【００９１】
結果
ＡＤ患者の脳における体細胞突然変異の量は、細胞周期調節解除およびＡＤ型病変の重症度と有意に関連することが観察された（図９）。したがって、ＤＮＡ修復不全は、Ｇ１／Ｓ移行点の調節解除につながり、最終的にはアルツハイマー病の発症につながりうることが示唆される。
【００９２】
遺伝子タイピングによる知見は、ＣＤＫＩ誘導阻害剤または酸化的ＤＮＡ損傷によって惹起されるＧ１／Ｓ調節制御に検出可能な機能不全が存在することを示すＡＤ患者のリンパ球で得られた先の知見と一致している。
【００９３】
【表２】
【００９４】
【表３】
【００９５】
図面の略語一覧：
対照：認知および神経心理学試験の結果が正常である健康な個体。
ＰｒｅＡＤ：神経心理学試験の結果から初期ＡＤが示唆される健康な個体。
ＰｏｓｓＡＤ：ＮＩＮＣＤＳ基準による診断でアルツハイマー病の可能性あり（ｐｏｓｓｉｂｌｅ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ'ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）
ＡＤ：ＮＩＮＣＤＳ基準による診断でアルツハイマー病の可能性大（ｐｒｏｂａｂｌｅ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ'ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）
ＡＤＭ：アルツハイマー病の可能性あり（ＮＩＮＣＤＳ）および他のタイプの痴呆を示す証拠。
ＤＮＯＳ：アルツハイマー病の可能性大に関するＮＩＮＣＤＳ基準の要件を満たさない痴呆を持つ患者。
【技術分野】
【０００１】
本発明はアルツハイマー病の診断スクリーニングに関し、特にアルツハイマー病の病変の初期に起こる細胞変化の存在についてのスクリーニングに基づく診断試験に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
平均寿命が増すにつれて、西欧社会ではアルツハイマー病（ＡＤ）が大きな健康問題になりつつある。この疾患の信頼できる治療法または予防策を見いだすために集中的な研究が行われてきたが、現在までのところ成功には至っていない。
【０００３】
治療薬の設計および試験における最大の課題の一つは、意味のある介入が可能なほど早期にＡＤ罹患者を同定することが可能な信頼できる臨床診断基準がないことである。現在利用できる臨床診断手段では、重度の痴呆をきたした患者でなければ、アルツハイマー病の正確で信頼できる診断を行うことができない。さらにまた、現在利用できる臨床診断手段では、予防的介入によって利益を受けうる症状発現前のアルツハイマー病を持つ被験者を同定することはできない。
【０００４】
もっともよく使用されている臨床診断基準は、元々は研究目的で設計されたＮＩＮＣＤＳ／ＡＤＲＤＡ基準（ＭｃＫｈａｎｎ， Ｇ．ら（１９８４）Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ３４：９３９−９４４）である。これらの基準は感度が高いものの特異性は低い。これは、アルツハイマー病の「可能性大」（"ｐｒｏｂａｂｌｅ" Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ'ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）または「可能性あり」（"ｐｏｓｓｉｂｌｅ" Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ'ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）という診断の陽性適中率は極めて高いが、陰性適中率は極めて低いという事実によっている（１３）。言い換えると、ある患者がアルツハイマー病に関するＮＩＮＣＤＳ／ＡＤＲＤＡ基準の要件を満たす場合、その患者が実際にアルツハイマー病にかかっている可能性は高い。しかし、これらの基準を満たさない患者（例えば対照とみなされる患者）の一部は、剖検時にアルツハイマー病であることが判明する（１３）。
【０００５】
特異性が低いため、ＮＩＮＣＤＳ／ＡＤＲＤＡ基準は臨床診断目的には理想的でない。さらに、ＮＩＮＣＤＳ／ＡＤＲＤＡ基準は、有意な痴呆を発症する前に使用すれば有効である可能性が最も高いだろう予防的または治療的療法を調べる臨床試験の診断基準としても適切ではない。したがって、アルツハイマー病に関する信頼できる診断試験、特に、予防的介入によって利益を受けうる症状発現前のアルツハイマー病を持つ被験者の早期検出に利用することができる試験は、現在も必要とされている。
【０００６】
アルツハイマー病の病理学的根拠がさまざまな神経細胞様集団の細胞分裂周期への異常な再進入であることは、近年ますます広く受け入れられつつある（１４）。健康な高齢者では、この細胞周期再進入に続いて、迅速な細胞周期停止と再分化が起こりうる。これに対して、アルツハイマー病を持つ患者では調節機構が機能しないらしく、神経細胞が細胞周期の後期に進行して、ＡＤ関連病変の蓄積および／または神経細胞死をもたらす（１４）。
【０００７】
本発明者らの研究および他のグループによる研究によって、アルツハイマー病における細胞周期調節不全はＧ１／Ｓ移行チェックポイントで起こることが示されている（３）。アルツハイマー病患者から採取された線維芽細胞およびリンパ球に関する先の研究により、この状態では、神経細胞以外の細胞でも、細胞分裂周期の調節が乱されている可能性が示されている（８，９，１７）。アルツハイマー病患者が、いくつかの形態の癌にかかりやすいこと（４）、および成人期初期にＡＤを発症するダウン症候群患者が一般集団よりも白血病にかかりやすいこと（７，１０）も知られている。したがって、神経細胞における細胞周期調節不全は、ＡＤの初期（症状発現前）段階でさえ、リンパ球における同様の細胞周期調節機能不全に反映されているという仮説は、妥当であると思われる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ａｒａｇａ Ｓ， Ｋａｇｉｍｏｔｏ Ｈ， Ｆｕｎａｍｏｔｏ ＫおよびＴａｋａｈａｓｈｉ Ｋ（１９９０）Ｊｐｎ Ｊ Ｍｅｄ ２９：５７２−５
【非特許文献２】Ａｒｅｎｄｔ Ｔ， Ｈｏｌｚｅｒ ＭおよびＧａｒｔｎｅｒ Ｕ（１９９８）Ｊ Ｎｅｕｒａｌ Ｔｒａｎｓｍ １０５：９４９−６０
【非特許文献３】Ａｒｅｎｄｔ Ｔ， Ｒｏｄｅｌ Ｌ， Ｇａｒｔｎｅｒ ＵおよびＨｏｌｚｅｒ Ｍ（１９９６）Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ ７：３０４７−９
【非特許文献４】Ｂｕｒｋｅ ＷＪ， ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ ＪＲ， Ｃｈｕｎｇ ＨＤ， Ｇｉｌｌｅｓｐｉｅ ＫＮ， Ｇｒｏｓｓｂｅｒｇ ＧＴ， Ｌｕｑｕｅ ＦＡおよびＺｉｍｍｅｒｍａｎ Ｊ（１９９４）Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ Ｄｉｓ Ａｓｓｏｃ Ｄｉｓｏｒｄ ８：２２−８
【非特許文献５】Ｄａｒｚｙｎｋｉｅｗｉｃｚ Ｚ（１９９３）Ｆａｎｔｅｓ ＰおよびＢｒｏｏｋｓ Ｒ編「Ｔｈｅ ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ」（オックスフォード大学印刷局， オックスフォード）の４３〜６８頁
【非特許文献６】Ｄａｖｉｅｓ ＫＪ（１９９９）ＩＵＢＭＢ Ｌｉｆｅ ４８：４１−７
【非特許文献７】Ｄｒａｂｋｉｎ ＨＡおよびＥｒｉｃｋｓｏｎ Ｐ（１９９５）Ｐｒｏｇ Ｃｌｉｎ Ｂｉｏｌ Ｒｅｓ ３９３：１６９−７６
【非特許文献８】Ｅｃｋｅｒｔ Ａ， Ｈａｒｔｍａｎｎ Ｈ， Ｆｏｒｓｔｌ ＨおよびＭｕｌｌｅｒ ＷＥ（１９９４）Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ ５５：２０１９−２９
【非特許文献９】Ｆｉｓｃｈｍａｎ ＨＫ， Ｒｅｉｓｂｅｒｇ Ｂ， Ａｌｂｕ Ｐ， Ｆｅｒｒｉｓ ＳＨおよびＲａｉｎｅｒ ＪＤ（１９８４）Ｂｉｏｌ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ １９：３１９−２７
【非特許文献１０】Ｆｏｎｇ ＣＴおよびＢｒｏｄｅｕｒ ＧＭ（１９８７）Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅｔ Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ ２８：５５−７６
【非特許文献１１】Ｍｅｃｏｃｃｉ Ｐ， Ｐｏｌｉｄｏｒｉ ＭＣ， Ｉｎｇｅｇｎｉ Ｔ， Ｃｈｅｒｕｂｉｎｉ Ａ， Ｃｈｉｏｎｎｅ Ｆ， Ｃｅｃｃｈｅｔｔｉ ＲおよびＳｅｎｉｎ Ｕ（１９９８）Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ５１：１０１４−１０１７
【非特許文献１２】Ｍｅｌａｒａｇｎｏ ＭＩ， Ｓｍｉｔｈ ＭｄＡ， Ｋｏｒｍａｎｎ Ｂｏｒｔｏｌｏｔｔｏ ＭＨおよびＴｏｎｉｏｌｏ Ｎｅｔｏ ＪＴ（１９９１）Ｇｅｒｏｎｔｏｌｏｇｙ ３７：２９３−８
【非特許文献１３】Ｎａｇｙ Ｚ， Ｅｓｉｒｉ ＭＭ， Ｈｉｎｄｌｅｙ ＮＪ， Ｊｏａｃｈｉｍ Ｃ， Ｍｏｒｒｉｓ ＪＨ， Ｋｉｎｇ ＥＭ−Ｆ， ＭｃＤｏｎａｌｄ Ｂ， Ｌｉｔｃｈｆｉｅｌｄ Ｓ， Ｂａｒｎｅｔｓｏｎ Ｌ， Ｊｏｂｓｔ ＫＡおよびＳｍｉｔｈ ＡＤ（１９９８）Ｄｅｍｅｎｔｉａ ９：２１９−２２６
【非特許文献１４】Ｎａｇｙ Ｚ， Ｅｓｉｒｉ ＭＭおよびＳｍｉｔｈ ＡＤ（１９９８）Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ８４：７３１−７３９
【非特許文献１５】Ｐａｙａｏ ＳＬ， Ｓｍｉｔｈ ＭＤおよびＢｅｒｔｏｌｕｃｃｉ ＰＨ（１９９８）Ｇｅｒｏｎｔｏｌｏｇｙ ４４：２６７−７１
【非特許文献１６】Ｓｈｅｒｒ ＣＪ（１９９４）Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ １２：４７−５５；ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ ５５−７
【非特許文献１７】Ｔａｔｅｂａｙａｓｈｉ Ｙ， Ｔａｋｅｄａ Ｍ， Ｋａｓｈｉｗａｇｉ Ｙ， Ｏｋｏｃｈｉ Ｍ， Ｋｕｒｕｍａｄａｎｉ Ｔ， Ｓｅｋｉｙａｍａ Ａ， Ｋａｎａｙａｍａ Ｇ， Ｈａｒｉｇｕｃｈｉ ＳおよびＮｉｓｈｉｍｕｒａ Ｔ（１９９５）Ｄｅｍｅｎｔｉａ ６：９−１６
【非特許文献１８】Ｔｒｉｅｂ Ｋ， Ｒａｎｓｍａｙｒ Ｇ， Ｓｇｏｎｃ Ｒ， Ｌａｓｓｍａｎｎ ＨおよびＧｒｕｂｅｃｋ Ｌｏｅｂｅｎｓｔｅｉｎ Ｂ（１９９６）Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ Ａｇｉｎｇ １７：５４１−７
【非特許文献１９】Ｗａｇｎｅｒ ＥＦ， Ｈｌｅｂ Ｍ， Ｈａｎｎａ ＮおよびＳｈａｒｍａ Ｓ（１９９８）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６１：１１２３−３１
【発明の概要】
【０００９】
ここに本発明者らは、Ｇ１阻害剤処理に対するリンパ球のインビトロ応答性が、アルツハイマー病患者では対照被験者よりも、有意に有効性が低いことを明らかにした。さらに、初期アルツハイマー病の臨床徴候を示す被験者では、リンパ球応答が、アルツハイマー病患者に見られるものと似ている。これらの発見は、Ｇ１／Ｓ移行制御の不全がアルツハイマー病患者における神経細胞に限定されず、リンパ球などの末梢細胞でも起こるという仮説を裏付ける直接的な証拠になる。
【００１０】
Ｇ１／Ｓ移行での調節欠損が末梢細胞でも起こるという知見は、アルツハイマー病の診断に役立つ新しい診断試験であって、リンパ球培養物などの非神経細胞におけるＧ１／Ｓ移行チェックポイントの活性化を惹起することに依拠する診断試験の根拠となる。神経細胞における細胞周期調節不全は、アルツハイマー病の発病における極めて初期の事象であると思われるので、このような試験は、痴呆に関するＮＩＮＣＤＳ／ＡＤＲＤＡ基準の要件は満たさないがアルツハイマー病の予防策による早期介入によって利益を受けるであろうアルツハイマー病の症状発現前の段階にある被験者の同定に役立つだろうと予想される。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】対照被験者、ｐｒｅＡＤ被験者およびＡＤ患者由来の培養リンパ球に関してフローサイトメーターに表示された測定結果を表す図。ラパマイシン処理細胞と対照無処理細胞との両方について結果を示す。Ｇ１は、細胞が細胞周期のＧ１期にあることを示す。
【図２】ｐｒｅＡＤ、ＡＤ、ＡＤＭ、ｐｏｓｓＡＤ、ＤＮＯＳおよび対照被験者由来の培養リンパ球においてラパマイシンの影響下で起こる細胞周期のＧ１期の相対的延長（左図）および年齢補正した相対的延長（右図）を表す図。
【図３】ｐｒｅＡＤ、ＡＤ、ｐｏｓｓＡＤＭ、ＤＮＯＳおよび対照被験者由来の培養リンパ球において２４時間のラパマイシン処理が細胞の生存に及ぼす効果を表す図。左図には絶対値を示し、右図には年齢補正値を示す。
【図４】ｐｒｅＡＤ、ＡＤ、ｐｏｓｓＡＤＭ、ＤＮＯＳよび対照被験者由来の培養リンパ球においてドキソルビシン処理が細胞の生存に及ぼす効果を表す図。左図には絶対値を示し、右図には年齢補正値を示す。
【図５】ｐｒｅＡＤ、ＡＤ、ｐｏｓｓＡＤＭ、ＤＮＯＳよび対照被験者由来の培養リンパ球においてＨ２Ｏ２処理が細胞の生存に及ぼす効果を表す図。左図には絶対値を示し、右図には年齢補正値を示す。
【図６】ｐ２１のエクソン２およびｐ５７のエクソン２における多型に関するＰＣＲ−ＳＳＣＰスクリーニングの結果を表す図。
【図７】ｐ２１変異体ＡおよびＢと脳におけるサイクリンＢ発現との関係を表す図。白い棒は神経細胞内でサイクリンＢが発現しなかった患者のパーセンテージを示す。黒い棒はサイクリンＢが神経細胞の核で発現した患者のパーセンテージを示す。
【図８】正常なｐ２１（変異体Ｂ）を持つ患者におけるｐ５７エクソン２Ａ変異体ＡおよびＢと脳でのサイクリン発現との関係を表す図。白い棒は神経細胞内でサイクリンＢが発現しなかった患者のパーセンテージを示す。黒い棒はサイクリンＢが神経細胞の核で発現した患者のパーセンテージを示す。
【図９】脳における体細胞突然変異の頻度とＡＤ進行および細胞周期タンパク質との関係を表す図。ｘ軸：ＡＤ重症度のＢｒａａｋ病期。ｙ軸：脳と比較して、血液から異なるＲＡＰＤパターンを生成したプライマーのパーセンテージ。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
（発明の説明）
本発明の第１の態様によれば、ヒト被験体におけるアルツハイマー病の診断方法であって、そのヒト被験体の非神経細胞におけるＧ１／Ｓ期移行での細胞周期調節欠損の存在に関するスクリーニングを含む方法が提供される。
【００１３】
本発明の方法は、最も好ましくは、試験対象であるヒト被験体から単離された非神経細胞に対してインビトロで行われる。非神経細胞は、アルツハイマー病で神経細胞に存在するものと同じＧ１／Ｓ期移行での細胞周期調節欠損を示す非神経細胞タイプであれば、どれでもよい。最も好ましい実施形態として、本方法は、被験者から単離されインビトロで培養されたリンパ球に対して行われる。非神経細胞タイプで細胞周期調節欠損の存在に関する試験を行いうることには、明白な実用上の利点がある。リンパ球は血液試料から容易に単離され、インビトロで培養することができるので、リンパ球の使用は特に便利である。もう一つの好ましい選択肢は、線維芽細胞の使用、特に皮膚生検材料から便利に入手しうる皮膚線維芽細胞の使用である。
【００１４】
本発明の方法を診断的に使用する場合は、非神経細胞タイプにおけるＧ１／Ｓ期移行での細胞周期調節の欠損の存在を、その被験者がアルツハイマー病を持つことのしるしであると解釈する。典型的には、Ｇ１／Ｓ移行でのチェックポイント制御の有効性の低下を、その被験者がアルツハイマー病を持つことのしるしであると解釈する。
【００１５】
アルツハイマー病の病理の根底にある欠損に関して信頼できる試験を利用できるようになれば、この状態を診断する能力が著しく改善され、特に早期診断が可能になるだろう。アルツハイマー病に関して現在利用できる操作的診断基準では、痴呆が既に存在する極めて後期になってからしか、ＡＤの可能性ありまたは可能性大という診断を下すことができない。アルツハイマー病の確定診断は剖検後にしか下すことができない。十分に発達した痴呆の徴候が現れるかなり前に、細胞周期制御の欠損を、リンパ球などの末梢（非神経細胞様）細胞に検出できることは、本発明者らの研究から明らかである。したがって、本発明の方法は、アルツハイマー病の早期診断、特にアルツハイマー病の症状発現前の段階にある個体の検出を行う手段、およびアルツハイマー病そのものはまだ発症していないが、細胞周期調節欠損が存在するのでアルツハイマー病を発症する「恐れ」がある個体の同定を行う手段になる。これにより、例えば生活様式の変更ならびにビタミン養生法および閉経後婦人のＨＲＴなどを含む予防策による早期介入の可能性がもたらされる。
【００１６】
アルツハイマー病そのものはまだ発症していない個体における初期変化を検出することが可能な診断手段を利用できるようになれば、重大な脳病変が発症する前の時点でこの疾患の進行を停止させるための治療法の開発および試験も容易になるだろう。これらの診断試験は初期アルツハイマー病の動物モデルの開発、例えばアルツハイマー病に存在する欠損と類似する欠損を細胞周期調節に示すマウスモデルの同定などにも応用することができる。
【００１７】
Ｇ１／Ｓ移行に細胞周期調節欠損を持つ個体を同定する能力は、臨床試験に含める個体の選択に応用することができる。試験に含める個体を、試験対象である処置によって利益を受ける可能性が最も高い個体となるように選択すれば、臨床試験は意味のある結果をもたらす可能性が増す。
【００１８】
初期（ｉｎｃｉｐｉｅｎｔ）または末期（ｆｕｌｌ−ｂｌｏｗｎ）アルツハイマー病を患っている患者から採取したリンパ球におけるＧ１／Ｓ調節欠損の同定は、その患者における免疫問題の存在、または疾患が進行するにつれてその患者が免疫問題を持つようになる可能性を示しうる。そのような情報を利用できることは、臨床家が、アルツハイマー病に合併する免疫問題を軽減／予防するために治療的介入を行うかどうかを決定する際の助けになる。
【００１９】
本発明の方法は散発性アルツハイマー病の診断には特に好ましい。しかし、等価な細胞周期調節欠損を示す形態の家族性アルツハイマー病の診断にも役立つだろう。一般的に、これには、プレセニリン１またはプレセニリン２突然変異に関係する家族性アルツハイマー病は含まれないだろう。
【００２０】
本発明に従って非神経細胞におけるＧ１／Ｓ期移行での細胞周期調節欠損の存在に関してスクリーニングする方法はいくつかある。一実施形態として、細胞周期調節欠損の存在に関するスクリーニングは、まず細胞の分裂を誘導し、次に細胞分裂阻害物質の添加によって細胞周期停止を惹起し、細胞分裂阻害物質の添加に対する細胞のＧ１／Ｓ細胞周期調節機構の応答性を試験することによって達成することができる。
【００２１】
最も好ましくは、細胞分裂阻害物質は、特異的Ｇ１阻害剤、例えばラパマイシンなどであるだろう。細胞分裂は、細胞分裂促進性刺激の添加、例えば１つまたは複数の成長因子の添加によって誘導することができる。リンパ球を使って試験を行う場合は、フィトヘマグルチニンを使って細胞分裂を誘導することができる。
【００２２】
関連する別の実施形態として、細胞分裂阻害物質による処理を、Ｇ１での細胞周期停止を惹起する刺激、例えば環境刺激による処理で置き換えてもよい。したがって、Ｇ１／Ｓ調節欠損の存在に関するスクリーニングは、細胞の分裂を誘導すること、Ｇ１での細胞周期停止を誘導する刺激に細胞をばく露すること、および細胞周期停止を惹起する刺激の添加に対する細胞のＧ１／Ｓ細胞周期調節機構の応答性を試験することによって達成される。
【００２３】
好適な細胞周期停止の刺激には、例えば電離放射線、低酸素、ＵＶ線などがある。好ましい一実施形態として、細胞をＨ２Ｏ２で処理して酸化ストレスを生じさせることによって、細胞周期停止を誘導することができる。上述のように、細胞分裂は細胞分裂促進性刺激の添加、例えば１つまたは複数の成長因子の添加によって誘導することができる。培養リンパ球ではフィトヘマグルチニンを使って細胞分裂を誘導することができる。
【００２４】
これらの両方法を支えている原理は、まず細胞を刺激して分裂させ、次に、細胞分裂阻害剤または細胞周期停止を惹起する他の刺激を使って細胞周期をＧ１段階で停止させようと試み、次に、細胞周期調節系に対するそのような処理の効果を評価することである。細胞周期調節に対する効果は、後述するように多種多様な手段によって評価することができる。細胞分裂阻害剤または細胞周期停止を誘導する他の刺激による処理を、ここでは、「細胞周期阻害処理」または「阻害処理」と呼ぶ場合がある。もしＧ１／Ｓ移行に細胞周期調節欠損が存在すれば、それは、細胞周期停止の試みに対する細胞の応答性に影響を及ぼすだろう。一般に、Ｇ１／Ｓに細胞周期調節欠損が存在すると、細胞分裂阻害剤またはＧ１での細胞周期停止を誘導する他の刺激による処理に対する応答性が低下する。すなわち、阻害処理は、そのような欠損を持つ細胞では、Ｇ１／Ｓチェックポイントで細胞周期を停止させる効果が低い。
【００２５】
細胞周期阻害処理に対する細胞の応答性を試験するために、細胞分裂促進性刺激の添加前および添加後ならびに細胞周期を停止させる試みの前および後に、さまざまなアプローチを実行することができる。本発明に従って使用することができる好ましいアプローチの非網羅的リストを以下に記載する。他の好適なアプローチは当業者にはわかるだろう。
【００２６】
（１）阻害処理の結果として細胞周期停止が起こったかどうか、そしてどの程度に起こったかを評価するために行われる増殖アッセイ。増殖アッセイは、当技術分野で知られるどの標準的プロトコールに従って行ってもよい。特に好適な一例はＭＴＴ生存率アッセイである（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｔｄから市販されている、Ｍｏｓｍａｎｎ， Ｔ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ， １９８３， ｖｏｌ：６５， ５５−６３を参照されたい）。
【００２７】
典型的なスクリーンでは、細胞分裂阻害剤または細胞周期停止を誘導する他の刺激で処理した細胞と、同じ被験者から採取した無処理の対照細胞との両方に対して、増殖アッセイを行う。阻害処理は無傷のＧ１／Ｓ調節系が存在する場合にのみ有効になるので、処理細胞と無処理細胞の間の増殖の程度の相違は、アルツハイマー病患者の方が年齢対応対照個体より有意に小さい。一般に、阻害処理の存在下で、被験者から得た細胞の増殖活性にほとんど変化がないか全く変化がなければ、それは、Ｇ１期における細胞周期阻害に対する応答性の低下を示し、したがってＧ１／Ｓ移行での調節欠損の存在を示す。結果として、そのような調節欠損の存在は、その被験者がアルツハイマー病を持つことのしるしであると解釈される。
【００２８】
（２）細胞分裂阻害剤または細胞周期停止を誘導する刺激へのばく露の結果として被験者から得た細胞で起こる細胞周期のＧ１期の相対的延長を算出すること。細胞分裂阻害剤または細胞周期停止を誘導する刺激へのばく露の結果として起こるＧ１期の相対的延長は、式：ＲＬ＝１００ｆ−１００を使って算出される（百分率として表される）。「ｆ」は、細胞分裂阻害剤または細胞周期停止を誘導する刺激による阻害処理にさらした細胞（試験対象である被験者から得た非神経細胞）がＧ１にある時間（ＴＧ１ｔｒ）と、阻害処理にばく露していない無処理対照細胞（すなわち、やはり試験対象である被験者から得た非神経細胞）がＧ１にある時間（ＴＧ１ｃ）との比である。ｆは次の関係式に従って算出することができる：
ｆ＝ＴＧ１ｔｒ／ＴＧ１ｃ＝［ｌｎ２−ｌｎ（２−Ｇ１ｔｒ）］［ｌｎ（２−Ｇ１ｃ）］／［ｌｎ（２−Ｇ１ｔｒ）］［ｌｎ２−ｌｎ（２−Ｇ１ｃ）］ （５）。
【００２９】
ＴＧ１ｔｒおよびＴＧ１ｃの値を得るには、さまざまな技術を使用することができる。好ましい一実施形態として、処理細胞（細胞分裂阻害物質または細胞周期停止を誘導する刺激で処理した、試験被験者由来の非神経細胞）と無処理対照細胞（細胞分裂阻害物質または細胞周期停止を誘導する刺激にばく露していない、同じ被験者に由来する非神経細胞）の両方について、細胞周期のさまざまな時期にある細胞の割合を決定することによって、ＴＧ１ｔｒおよびＴＧ１ｃを得ることができる。細胞周期のさまざまな時期にある細胞の割合は、下記の実施例で説明するように、標識ヌクレオチド類似体、好ましくはブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）の取り込みと、それに続く蛍光標示式細胞分別法（ＦＡＣＳ解析）または相当する方法によって、容易に決定することができる。
【００３０】
Ｇ１／Ｓ期移行での細胞周期調節欠損の存在は、試験被験者から得た細胞において、細胞分裂阻害物質または刺激の存在下で起こるＧ１期の相対的延長が、Ｇ１／Ｓ期移行に細胞周期調節欠損を持たない対照細胞（適切な対照細胞のさらなる定義については（１）の説明を参照されたい）と比較して減少することによって示される。Ｇ１／Ｓ期移行に細胞周期調節欠損を持たない対照細胞を、ＲＬの算出に用いる「無処理対照」細胞（これは、阻害処理にばく露されていない、試験被験者由来の細胞である）と混同してはならない。
【００３１】
（３）細胞周期調節タンパク質またはｍＲＮＡ発現の評価。細胞周期調節タンパク質の発現は、例えば免疫ブロット法、ウェスタンブロット法、ＥＬＩＳＡまたはその関連方法などの当技術分野で周知の標準的技術を使って評価することができる。細胞周期調節タンパク質をコードする対応するｍＲＮＡの発現の評価も、例えばハイブリダイゼーション技術、「ＤＮＡチップ」解析もしくはその関連方法、またはＲＴ−ＰＣＲもしくはＮＡＳＢＡ（ｎｕｃｅｌｉｃ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）などの増幅に基づく技術などといった、標準的方法を使って達成することができる。本発明に従って使用することができる好適なｍＲＮＡの検出／定量法は、当業者にはよく知られているだろう。これらの方法の一部、例えばＲＴ−ＰＣＲは、関連ｍＲＮＡのｃＤＮＡコピーの検出／定量に依拠する。
【００３２】
アルツハイマー病に存在する細胞周期調節欠損は、細胞周期調節タンパク質およびそれらに対応するｍＲＮＡの発現パターンの変化をもたらしうる。したがって、特定の細胞周期調節タンパク質および／または対応するｍＲＮＡの発現の変化に関するスクリーニングは、Ｇ１／Ｓでの細胞周期調節欠損の存在を確認するために、診断的に使用することができる。また、細胞周期調節タンパク質の発現は、細胞周期に沿った進行のマーカーとして使用することもできる。したがって、試験被験者から得た細胞において阻害処理がどの程度に細胞周期停止を引き起こすかを決定するために、１つまたは複数の細胞周期調節タンパク質の発現を調べることによって、阻害処理に対する細胞の応答性を評価することができる。好適な細胞周期調節タンパク質には、ＣＤＫＮ３、ｐ１５ｉｎｋ４Ｂ、ｐ１６ｉｎｋ４Ａ、ｐ１９ｉｎｋ４Ｄ、ｐ２７ｋｉｐ１、ｐ２１ｃｉｐ１、ｐ５７ｋｉｐ２およびＴＰ５３などがある。これらのタンパク質およびそれらをコードする遺伝子の配列は公開されている。これらのタンパク質に関するＯＭＩＭアクセッション番号のリストを下記の実施例に記載する。これら各タンパク質の検出に役立つ抗体は市販されている。
【００３３】
（４）当技術分野で知られる任意の方法による細胞生存性および細胞死の評価。増殖細胞をＧ１／Ｓ移行中に停止させると、考え得る２つの「下流」現象の一方、すなわち分化またはプログラム細胞死が起こりうる。これらの下流現象は、Ｇ１／Ｓ移行での調節欠損が細胞集団中に存在することのしるしとして使用することができる。なぜなら、Ｇ１／Ｓ移行の調節に欠損があれば、Ｇ１／Ｓでの細胞周期停止の下流効果も異常になるからである。対照細胞と比較して、試験被験者から得た細胞で阻害処理に応答して起こる細胞死の程度の低下または細胞生存性の程度の上昇は、その被験者がアルツハイマー病を持つことのしるしであると解釈される。
【００３４】
（５）標準的技術による細胞死関連（誘導もしくは防止）タンパク質またはｍＲＮＡ発現の評価。この実施形態では、細胞死関連タンパク質またはそれに対応するｍＲＮＡの発現を、細胞分裂阻害剤またはＧ１／Ｓ移行での細胞周期停止を誘導する他の刺激による処理の下流効果の間接的評価として使用する。好適な細胞死関連タンパク質として、当技術分野で数多く知られているｂｃｌ−２タンパク質ファミリーの構成要素が挙げられる。
【００３５】
（６）標準的技術によるＤＮＡ損傷応答要素タンパク質またはそれに対応するｍＲＮＡの発現の評価。このアプローチは、Ｇ１／Ｓでの細胞周期停止を誘導するために使用する刺激がＤＮＡ損傷である場合、例えばＤＮＡ損傷を引き起こす化学物質による処理またはＵＶ線へのばく露などである場合に、使用することができる。正常な環境では、ＤＮＡ損傷
の存在は細胞をＧ１／Ｓ期移行で停止させ、損傷したＤＮＡをＤＮＡ損傷応答経路の活性化によって修復しようとする。したがって、損傷したＤＮＡの存在に応答して起こるＤＮＡ損傷に対する正常な応答に関与するタンパク質またはそれに対応するｍＲＮＡの発現パターンの変化は、Ｇ１／Ｓ期移行に細胞周期調節欠損が存在するしるしとして使用することができる。好適なＤＮＡ損傷応答要素には、例えばＴＰ５３、Ｇａｄｄ３４、Ｇａｄｄ４５Ａ（１２６３３５）、Ｇａｄｄ４５Ｂ（６０４９４８）、Ｇａｄｄ４５Ｇ（６０４９４９）、Ｇａｄｄ１５３（１２６３３７）およびＰＣＮＡ（１７６７４０）などがある。これらＤＮＡ損傷応答要素に関するＯＭＩＭアクセッション番号のリストは下に記載する。
【００３６】
（７）細胞周期解析を伴う、または細胞周期解析を伴わない、非神経細胞のＤＮＡ含量の評価。この実施形態では、細胞分裂阻害剤または細胞周期停止を誘導する他の刺激で処理した試験被験者由来の細胞のＤＮＡ含量の測定が、そのような細胞におけるＧ１／Ｓ移行での調節欠損の存在の間接的なしるしになる。この方法を支える原理は、Ｇ１期にある細胞と、細胞周期のＤＮＡ複製段階を通過し終えたＧ２期にある細胞との間のＤＮＡ含量の相違である。正常細胞（すなわちＧ１／Ｓに調節欠損を持たない細胞）の集団を処理してＧ１またはＧ１／Ｓでの細胞周期停止を誘導すると、細胞の大半はＧ１期にとどまるだろう。しかし、細胞がＧ１／Ｓに調節欠損を持つ場合は、細胞の一部がＧ１／Ｓチェックポイントを通過して、ＤＮＡ複製を起こすだろう。したがって、Ｇ１での細胞周期停止を誘導するための処理後に、Ｇ１／Ｓに調節欠損を持たない対照細胞と比較して、試験被験者から得た細胞中のＤＮＡ含量が増加すれば、それは、Ｇ１／Ｓに調節欠損が存在するしるしであると解釈される。結果として、そのような調節欠損の存在は、その被験者がアルツハイマー病を持つことのしるしであると解釈される。
【００３７】
細胞分裂阻害剤または細胞周期停止を誘導する刺激による阻害処理に対する非神経細胞（特に培養リンパ球）の応答性を試験するのに適した技術の上記リストは、本発明の例示を意図するものであって、本発明を限定するものではない。
【００３８】
第２の態様として、本発明は、ヒト被験体におけるアルツハイマー病の診断に使用される方法であって、前記被験者のゲノムにおける、細胞周期調節遺伝子中の少なくとも１つの突然変異または対立遺伝子変異体の存在に関するスクリーニングを含み、細胞周期調節遺伝子中の突然変異または対立遺伝子変異体の存在をアルツハイマー病のしるしであると解釈する方法を提供する。
【００３９】
最も好ましくは、本発明の方法では、ＣＤＫＮ３、ｐ１５ｉｎｋ４Ｂ、ｐ１６ｉｎｋ４Ａ、ｐ１９ｉｎｋ４Ｄ、ｐ２７ｋｉｐ１、ｐ２１ｃｉｐ１、ｐ５７ｋｉｐ２およびＴＰ５３からなる群より選択される細胞周期調節遺伝子中の少なくとも１つの突然変異または対立遺伝子変異体の存在に関するスクリーニングが行われるだろう。
【００４０】
アルツハイマー病に関係することが示されている特定の突然変異／変異体の存在に関するスクリーニングも考えられるが、本発明の方法は、特定の突然変異または遺伝的変異体の存在に関するスクリーニングには限定されない。本発明は、細胞周期調節遺伝子またはその小領域を、今までに知られていない突然変異／変異体を含む突然変異または遺伝的変異体の存在に関してスキャンすることを包含する。疑念が生じないように述べると、「遺伝子」という用語は、調節領域、特にプロモーター領域を包含する。細胞周期調節遺伝子における１つまたは複数の突然変異または遺伝的変異体、特にその遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列の変化をもたらす突然変異／変異体、またはコードされているタンパク質の機能を変化させる突然変異／変異体、またはそのタンパク質の発現レベルを変化させる突然変異／変異体の存在は、そのような突然変異または変異体の存在が細胞周期調節欠損のしるしであることに基づいて、その個体がアルツハイマー病を持つことのしるしであると解釈される。
【００４１】
与えられたヒト被験体の細胞周期調節遺伝子を突然変異／対立遺伝子変異体の存在に関してスキャンするために、本発明に従って使用することができる、遺伝的変異を検出するための技術は、当技術分野では数多く知られている。好適な技術には、例えば一本鎖高次構造多型解析（ＳＳＣＰ）、ＰＣＲ−ＳＳＣＰヘテロ二本鎖解析（ＨＡ）、変性勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）、ＤＮＡ配列決定、ＲＮアーゼ切断、ミスマッチの化学的切断（ＣＣＭ）などがある（ＳｃｈａｆｅｒおよびＨａｗｋｉｎｓによる総説Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ：１６， ｐ．３３−３９， １９９８を参照されたい）。
【００４２】
下記実施例２では、ＰＣＲ−ＳＳＣＰを使ったｐ２１ｃｉｐおよびｐ５７遺伝子における多型変異体に関するスクリーニングと、それによるｐ２１ｃｉｐ遺伝子のエクソン２における１つの多型変異体およびｐ５７遺伝子のエクソン２における２つの多型変異体の同定について説明する。他の遺伝子における多型変異体に関するスクリーニングには、適当な変更を加えて、すなわち目的とする遺伝子に特異的なＰＣＲプライマーを選択して、同じ技術的アプローチを使用することができる。
【００４３】
突然変異／対立遺伝子変異体の存在に関するスクリーニングは、ヒト被験体から単離したゲノムＤＮＡの試料に対して行われる。ゲノムＤＮＡは、当技術分野で周知の標準的技術を使って、全血試料から便利に単離することができる。突然変異／対立遺伝子変異体の存在に関してスキャンする工程は、被験者に由来する培養リンパ球から調製したゲノムＤＮＡに対して、有利に行うことができる。同じリンパ球培養物を、Ｇ１／Ｓ期移行での細胞周期調節欠損の存在に関して、例えば本発明の第１に態様による方法を使って阻害処理に対する応答性を試験することなどにより、「機能的に」試験することもできる。
【００４４】
与えられた多型変異体とアルツハイマー病への罹患性との関連は、遺伝的関連研究、例えば家族関連研究または患者対照関連研究などを行うことによって確認することができる。特定の多型変異体の疾患関連性は、遺伝子型と、脳における細胞周期進行のマーカーの発現との関係を評価することによって決定することもできる。下記の実施例では、遺伝子型と、神経細胞の核におけるサイクリンＢ（細胞周期のＧ２段階への進行のマーカー）の発現との関係を評価した。細胞周期進行の他のマーカーを使っても、同じ効果が得られた。
【００４５】
具体的一実施形態として、本方法は、下記実施例に記載するｐ２１およびｐ５７遺伝子中の多型変異体の一つに関する遺伝子タイピングを含みうる。ｐ２１Ｅ２対立遺伝子ＡおよびＢ、ｐ５７Ｅ２Ａ対立遺伝子ＡおよびＢ、ならびにＰ５７Ｅ２Ｂ対立遺伝子ＡおよびＢと表記されるこれらの変異体は、下記実施例に詳述する条件で以下のプライマーセットを使用することにより、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ解析に基づいて遺伝子タイピングすることができる。
ｐ２１Ｅ２ Ａ／Ｂ：５'−ＣＧＧＧＡＴＣＣＧＧＣＧＣＣＡＴＧＴＣＡＧＡＡＣＣＧＧＣ−３'（配列番号１）および５'−ＣＣＡＧＡＣＡＧＧＴＣＡＧＣＣＣＴＴＧＧ−３'（配列番号２）
Ｐ５７Ｅ２Ａ Ａ／Ｂ：５'−ＧＧＣ ＣＡＴ ＧＴＣ ＣＧＡ ＣＧＣ ＧＴＣ−３'（配列番号３）および５'−ＡＧＧ ＣＧＧ ＣＡＧ ＣＧＣ ＣＣＣ ＡＣＣ ＴＧ−３'（配列番号４）
ｐ５７Ｅ２Ｂ Ａ／Ｂ：５'−ＡＴＴ ＡＣＧ ＡＣＴ ＴＣＣ ＡＧＣ ＡＧＧ ＡＣＡ ＴＧ−３'（配列番号５）および５'−ＣＴＧ ＧＡＧ ＣＣＡ ＧＧＡ ＣＣＧ ＧＧＡ ＣＴＧ−３'（配列番号６）。
【００４６】
いずれの場合も、ＡおよびＢ対立遺伝子は、実施例２に定義する条件下で、結果として得られるＰＣＲ産物の示差的な電気泳動移動度に基づいて、図６を参照して同定することができる。ただし、本発明をＰＣＲ−ＳＳＣＰの使用に限定するつもりはなく、他の方法を使って同じ変異体を遺伝子タイピングしてもよい。
【００４７】
ｐ２１Ｅ２ Ａ対立遺伝子およびｐ５７Ｅ２Ａ Ａ対立遺伝子は、どちらも、Ｇ１／Ｓチェックポイント越しの進行の増加と関連しており、したがってアルツハイマー病への罹患性と関連している。
【００４８】
細胞周期調節遺伝子をコードする遺伝子における突然変異または対立遺伝子変異体の存在の検出に基づくスクリーンは、２つ以上の多型変異体に関する遺伝子タイピング、または遺伝的変異の存在に関する１つまたは複数の細胞周期調節遺伝子のスキャニングを含みうる。細胞周期調節遺伝子の機能に対して有害な効果を持つ遺伝的変異はいずれも、Ｇ１／Ｓ移行チェックポイントのバイパスと、その結果として起こるＡＤ病変とをもたらす可能性がある。一つの調節遺伝子内での、または複数の遺伝子にわたる、遺伝的変異の蓄積は、相加的効果を持ちうる。
【００４９】
細胞周期調節遺伝子をコードする遺伝子における突然変異または対立遺伝子変異体の存在の検出に基づくスクリーンは、場合により細胞周期調節欠損の存在に関するスクリーニングなどの他の診断試験と組み合わせて、アルツハイマー病の診断に使用することができる。また、これらのスクリーンは、細胞周期調節遺伝子中に突然変異または対立遺伝子変異体が存在するがゆえにアルツハイマー病の素因を持つ個体を同定するためにも使用することができる。
【００５０】
細胞周期調節遺伝子中の突然変異または対立遺伝子変異体に関してスクリーニングするアプローチは、先にアルツハイマー病の診断を下されている患者におけるアルツハイマー病の遺伝的根拠を決定するためにも使用することができる。
【００５１】
第３の態様として、本発明は、ヒト被験体におけるアルツハイマー病の診断に使用される方法であって、前記被験者のゲノムにおける、ＤＮＡ修復酵素をコードする遺伝子中の少なくとも１つの突然変異または対立遺伝子変異体の存在に関するスクリーニングを含み、そのような遺伝子中の突然変異または対立遺伝子変異体の存在をアルツハイマー病のしるしであると解釈する方法を提供する。
【００５２】
好適な遺伝子としては、ＤＮＡ修復酵素Ｋｕ７０、Ｋｕ８０、Ｋｕ８６、ＮＤＨＩＩ、ＢＬＭ、ＲＥＣＱＬ、ＲＥＣＱＬ４およびＲＥＣＱＬ５をコードする遺伝子が挙げられる。「遺伝子」という用語は調節領域、特にプロモーター領域を包含する。
【００５３】
この場合も、アルツハイマー病に関係する特定の突然変異体／変異体の存在に関するスクリーニングは考えられるが、本発明の方法は、特定の突然変異または遺伝的変異体の存在に関するスクリーニングを必要とはしない。本方法は、ＤＮＡ修復酵素をコードする遺伝子またはそのような遺伝子の小領域を、今までに知られていない突然変異／変異体を含む突然変異または遺伝的変異体の存在に関してスキャンすることを含みうる。
【００５４】
ＤＮＡ修復酵素をコードする遺伝子における１つまたは複数の突然変異または遺伝的変異体の存在は、アルツハイマー病のしるしであると解釈される。なぜなら、ＤＮＡ修復酵素は細胞周期調節に関係する経路に作用するからである。したがって、ＤＮＡ修復酵素をコードする遺伝子における突然変異または対立遺伝子変異体の存在は、細胞周期調節欠損の間接的なしるしである。
【００５５】
ＡＤ患者の脳における体細胞突然変異の量は、細胞周期調節解除およびＡＤ型病変の重症度に有意に関連することが観察される（下記実施例参照）。したがって、ＤＮＡ修復不全はＧ１／Ｓ移行点の調節解除につながり、最終的にはアルツハイマー病の発症につながりうることが示唆される。
【００５６】
ＤＮＡ修復酵素をコードする遺伝子における突然変異または対立遺伝子変異体の存在の検出に基づくスクリーンは診断的に使用すること、特に症状発現前のアルツハイマー病を持つ個体の同定に使用することができる。同様のスクリーンは、ＤＮＡ修復酵素をコードする１つまたは複数の遺伝子に突然変異／変異体が存在するがゆえにアルツハイマー病を発症する素因がある個体を同定するために使用すること、および先にアルツハイマー病の診断を下されている患者におけるアルツハイマー病の遺伝的根拠を決定するために使用することもできる。
【００５７】
突然変異／対立遺伝子変異体の存在に関してスクリーニングする実際の工程は、上述したように、当技術分野で知られる技術のどれを使って行ってもよい。
【００５８】
さらにもう一つの態様として、本発明は、アルツハイマーの処置において薬理活性を持つ可能性がある化合物を同定する方法であって、
Ｇ１／Ｓ期移行に細胞周期調節欠損を示す非神経細胞におけるＧ１／Ｓ移行の調節を、試験化合物の存在下および不在下で解析する工程
を含み、Ｇ１／Ｓ移行での調節欠損の矯正をもたらす試験化合物を、アルツハイマー病の処置において薬理活性を持つ可能性があると同定する方法を提供する。
【００５９】
本発明の方法は、アルツハイマー病で神経細胞に観察されるものと類似するＧ１／Ｓ期移行での細胞周期調節欠損を示す非神経細胞であれば本質的にどの細胞を使って行ってもよい。好適な細胞としては、例えばアルツハイマー病を持つ一個体またはいくつかの個体に由来する培養リンパ球を挙げることができる。
【００６０】
Ｇ１／Ｓ移行の調節の「解析」は、本発明の第１の態様に関連してＧ１／Ｓでの細胞周期調節欠損の存在に関するスクリーニングに適していると説明したどの方法を使って行ってもよい。Ｇ１／Ｓ期移行の調節の解析に使用する方法は、化合物スクリーンを中〜高スループット形式で行うことができるようにマルチウェルマイクロタイタープレートで行うことが可能な方法であると有利だろう。中〜高スループット形式での使用に適した最も好ましい方法は細胞増殖アッセイである。
【００６１】
Ｇ１／Ｓ移行に調節欠損を示す細胞を試験化合物にばく露し、Ｇ１／Ｓ移行の調節に対する試験化合物の効果を、適切な対照（例えばどの試験化合物にもばく露していない細胞）を基準として評価する。典型的なスクリーンでは、試験化合物は、ある範囲のさまざまな濃度で試験されるだろう。
【００６２】
本発明のスクリーニング方法で試験される候補化合物のタイプに制限はない。試験化合物としては、例えば薬理活性または生化学的活性がわかっている化合物、そのような活性は確認されていない化合物、および全く新しい化合物、またはコンビナトリアル化学によって作製されうるような分子ライブラリーなどを挙げることができる。ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ポリペプチドまたはタンパク質である化合物も除外されない。
【００６３】
基本的な化合物スクリーニング方法を、アルツハイマー病の処置の一形態が持つ効力の評価に使用できるように、例えば細胞周期調節に対する特定薬剤の効果を試験するために、適合させてもよい。
【００６４】
有用な変形として、本発明の方法は、特に、ある薬剤がある特定ヒト個体におけるアルツハイマー病の処置に役立つ見込みがあるかどうかを決定するために使用することができる。この場合、アッセイは、Ｇ１／Ｓ期移行に細胞周期調節欠損を示すその個体由来の細胞を使って、最も好ましくは培養リンパ球を使って行われる。それらの細胞を、薬剤の存在下および不在下で、Ｇ１／Ｓ期移行での調節欠損の存在について調べる。Ｇ１／Ｓ移行での調節欠損の「矯正」をもたらす薬剤を、その個体におけるアルツハイマー病の処置に役立つ見込みがあると同定する。「矯正」とは、正常な細胞周期調節への有意な程度の回復を意味する。これは、対照細胞、例えばアルツハイマー病も、Ｇ１／Ｓ移行での調節欠損を示す証拠も、アルツハイマー病の素因を与えると予想しうる遺伝的欠陥／対立遺伝子変異も持たない年齢対応対照個体から採取した同じタイプの細胞を参照することによって評価することができる。
【実施例】
【００６５】
以下の実験例を添付の図面と併せて参照すれば、本発明の理解が深まるだろう。
【００６６】
実施例１−アルツハイマー病患者のリンパ球における細胞周期調節欠損の存在を示す証拠材料および方法
この研究には、オックスフォード記憶および老化研究プロジェクト（Ｏｘｆｏｒｄ Ｐｒｏｊｅｃｔ ｔｏ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ Ｍｅｍｏｒｙ ａｎｄ Ａｇｅｉｎｇ（ＯＰＴＩＭＡ））の正規参加者（ｆｕｌｌ ｐａｒｔｉｃｉｐａｎｔ）である１０２人の被験者が参加した。年１回の定例ＯＰＴＩＭＡ検査には、身体検査、認知および神経心理学試験が含まれる。医薬品の摂取および併発感染症をすべて記録する。血液をヘパリンリチウムまたはＥＤＴＡバキュテイナ中に収集した。Ｆｉｃａｌｌ（Ｓｉｇｍａ）を使用し、標準的プロトコールに従って、リンパ球を単離した。すべての患者について培養方法を標準化するために、分離したリンパ球を凍結し、さらなる解析のために保存しておいた。
【００６７】
培養のためにリンパ球が必要になったら、それらを３７℃の水浴で融解し、ＲＰＭＩで２回洗浄した（細胞の洗浄にはリンパ球の生存を支持するどの培地または緩衝液を使っても等価な効果が得られる）。細胞生存率（トリパンブルー排除法）は典型的には約８０〜９０％だった。
【００６８】
一組目の実験は４９人の被験者に対して行い（表１ａ）、二組目の実験は５５人の被験者に対して行った（表１ｂ）。一組目の実験（４９被験者）では、１０％ＦＣＳを補ったＲＰＭＩ培地に、培養培地１ｍｌあたり１×１０６細胞の濃度で、各個体からそれぞれ２つの並行リンパ球培養物を調製した。リンパ球を活性化するために、フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）を２２μｇ／ｍｌの最終濃度で培養物に添加した。培養物を５％ＣＯ２を含む湿潤雰囲気下に３７℃で４８時間培養した。４８時間の培養後に、一方の培養物を１００ｎｇ／ｍｌのラパマイシンで処理し、他方の無処理培養物は対照としてそのままにしておいた。さらに２３時間の培養後に、ＢｒｄＵを１０μｇ／ｍｌの濃度ですべての培養物に添加した。さらに１時間の後、培養物を「収集」し、７０％氷冷エタノールで固定した。ＢｒｄＵの取り込みを免疫組織化学を使って評価した後、ＦＡＣＳ解析を行った。細胞周期のさまざまな時期にある細胞の割合を決定し、データ変換を行ってＧ１期の相対的延長を求めた（図１）。
【００６９】
算出（対照培養物と比較した処理培養物における細胞周期のＧ１期の相対的延長）は、細胞が指数増殖期にあり、培養物中の増殖率（分裂細胞と休止細胞との比）は１．０であるという仮定に基づいて行った（５）。また、ラパマイシンはＧ１期の長さだけを変化させると仮定した（１９）。これらの仮定に基づき、式：ＲＬ＝１００ｆ−１００（パーセントで表示する）を使って、Ｇ１期の相対的延長を算出した。処理培養物と対照対象物とのＧ１時間の比：ｆ＝ＴＧ１ｔｒ／ＴＧ１ｃ＝［ｌｎ２−ｌｎ（２−Ｇ１ｔｒ）］［ｌｎ（２−Ｇ１ｃ）］／［ｌｎ（２−Ｇ１ｔｒ）］［ｌｎ２−ｌｎ（２−Ｇ１ｃ）］ （５）。
【００７０】
二組目の実験（５３被験者）では、最初の４８時間の培養（同上）後に、４つの独立した培養物を調製した。対照培養物は何も処理を施さずに放置し、一組の培養物は１００ｎｇ／ｍｌのラパマイシンで処理し、三組目は１μＭのドキソルビシンで処理し、四組目は１２０μＭのＨ２Ｏ２で処理した。ドキソルビシンはＧ１／ＳではなくＧ２／Ｍでの停止につながるＤＮＡ損傷を引き起こす。Ｈ２Ｏ２処理はＧ１／Ｓでの可逆的かつ一時的な細胞周期停止につながる酸化ストレスをもたらす。
【００７１】
２０時間のインキュベーション後に、４時間のＭＴＴ生存率アッセイ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｔｄ）を設定した。結果はマイクロプレートリーダー（５７０フィルター６３０参照フィルター）を使って読み取った。処理培養物と対照との細胞数の比をパーセントとして表した。
【００７２】
すべての実験は患者の臨床診断結果に関して盲検的に行った。
【００７３】
ＯＰＴＩＭＡプロジェクトに参加した臨床家が下した臨床診断結果との関連で結果を解析した。
【００７４】
統計的解析はＳｔａｔｇｒａｐｈｉｃｓソフトウェアパッケージを使って行った。ＡＮＯＶＡ検定を行って、細胞培養パラメーターに対する臨床診断結果の影響を調べた。結果に対する年齢の影響を調節するためにもう一組の解析も行った。年齢補正により、試験対象である特定パラメーターにおける年齢関連の変動を考慮に入れることができる。与えられたパラメーターに対する年齢の影響は、健康な被験者での当該パラメーターに対する年齢の影響を調べることによって決定される。
【００７５】
結果
二組の実験に含めた患者の臨床診断結果を表１ａおよび１ｂに要約する。特異的Ｇ１阻害剤ラパマイシンの影響下で起こるＧ１期の相対的延長は、我々の患者の臨床診断結果に有意に依存した（Ａｎｏｖａ ｐ＝０．０４、Ｋｒｕｓｋａｌｌ−Ｗａｌｌｉｓ検定 ｐ＝０．０１７）（図２）。ラパマイシンによるＧ１阻害がより有効であることを示す最も高い値は、対照、ＡＤ以外の痴呆症候群、およびアルツハイマー病の可能性ありの患者と診断された被験者に見いだされた。ＡＤに罹患している（ＮＩＮＣＤＳでＡＤの可能性大）と診断された患者、およびＡＤと他の病変とが共存している患者（ＡＤＭ）は、対照被験者およびＮＩＮＣＤＳ基準による診断でＤＮＯＳまたはｐｏｓｓＡＤに罹患している患者よりも、Ｇ１遮断の有効性が有意に低いことがわかった（図２）。臨床診断分類間の相違は、相対的Ｇ１遅延を年齢に関して補正した場合でも同様である（図２）。
【００７６】
二組目の実験では、ラパマイシン処理後の細胞数が、対照培養物と比較してＡＤ培養物およびｐｏｓｓＡＤ培養物の方が細胞数が多いという予想どおりのパターンを示した（図３）。しかしＭＴＴアッセイ系の感度は比較的低い。ドキソルビシン処理は患者群間に有意な相違をもたらさなかった（図３）。ドキソルビシン処理とは対照的に、Ｈ２Ｏ２処理による細胞数の減少は臨床診断結果に依存した。ＡＤ、ｐｒｅＡＤおよびｐｏｓｓＡＤに罹患している患者は、Ｈ２Ｏ２処理の結果として、対照被験者よりも細胞数が有意に高くなった。ＤＮＯＳ患者は広い変動を示し、他の患者群のいずれとも差がなかった（図４）。
【００７７】
【表１】
【００７８】
略語一覧
対照：認知および神経心理学試験の結果が正常である健康な個体。
ＰｒｅＡＤ：神経心理学試験の結果から初期ＡＤが示唆される健康な個体。
ＰｏｓｓＡＤ：ＮＩＮＣＤＳ基準による診断でアルツハイマー病の可能性あり（ｐｏｓｓｉｂｌｅ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ'ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）
ＡＤ：ＮＩＮＣＤＳ基準による診断でアルツハイマー病の可能性大（ｐｒｏｂａｂｌｅ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ'ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）
ＡＤＭ：アルツハイマー病の可能性あり（ＮＩＮＣＤＳ）および他のタイプの痴呆を示す証拠。
ＤＮＯＳ：アルツハイマー病の可能性大に関するＮＩＮＣＤＳ基準の要件を満たさない痴呆を持つ患者。
【００７９】
考察
この研究では、リンパ球におけるＧ１期の長さに対する特異的Ｇ１阻害剤（ラパマイシン）（１６，１９）の効果を、ＢｒｄＵ取り込みアッセイおよびＦＡＣＳ解析法を使って解析した。ラパマイシン処理後の培養物中の細胞数の減少も評価した。もう一つのアプローチとして、Ｇ１阻害を酸化ストレスによって惹起し、培養系中の細胞数の減少を測定した。
【００８０】
一組目の実験の結果は、細胞周期のＧ１期の延長によって示されるＧ１阻害剤誘導性細胞周期停止の有効性が、アルツハイマー病に罹患している患者では、対照個体よりも、有意に低いことを示している。これらの変化が早期に、患者が臨床的にはまだ痴呆を来していないが痴呆の最初の明瞭な徴候であることがわかっている特異的で迅速な記憶喪失の徴候を示す段階で現れることも明らかである。
【００８１】
ラパマイシンが誘導するＧ１遮断は、サイクリンＥ／ｃｄｋ２複合体の活性を阻害するｐ２７ｋｉｐ１ ＣＤＫＩの発現および活性に依存する（１６，１９）。したがって、ラパマイシンの影響下で起こるＧ１期の相対的延長は、このＣＤＫＩの発現／活性に依存するだろう（１９）。Ｇ１のこの相対的延長がアルツハイマー病患者では高齢の健常な個体よりも有意に低いという事実は、これらの患者では神経細胞におけるＧ１／Ｓチェックポイント不全に付随して他の細胞タイプでも同様の細胞周期制御損傷が生じているという我々の仮説を裏付けるものだろう。また、十分に発達した痴呆の徴候が現れるかなり前に、細胞周期制御の不全を末梢細胞中で検出できることも明白である。これにより、末梢リンパ球の細胞分裂促進性刺激に続いてＧ１／Ｓ移行遮断を試みることに基づくアッセイを使って、ＡＤ型の脳病変を後に発症する恐れがありうる患者を早期に検出することが可能になる。
【００８２】
Ｈ２Ｏ２によって誘導される細胞数の相違は、我々の患者群では有意に異なり、対照被験者由来のリンパ球が、酸化ストレスに対して、より顕著に応答することを示した。１２０ｍＭのＨ２Ｏ２による処理はＧ１／Ｓ移行点における可逆的かつ一時的な細胞周期停止を誘導して（６）、ＤＮＡ損傷−修復の時間を与えることが示されている。我々の結果は、この機構がアルツハイマー病患者では十分に有効ではないことを示している。酸化ストレスに対するこの不十分な応答は、症状発現前のＡＤに罹患している被験者にも存在する。酸化ストレスに対する応答の変化は、ＡＤ患者の方が既存のＤＮＡ損傷が多量であることを反映しているのかもしれない（１１）。しかしこの可能性は、Ｇ１停止ではなくＧ２／Ｍ停止を誘導するドキソルビシン誘導性ＤＮＡ損傷が、我々の患者群では相違しないという事実によって排除される。したがってこの研究の結果は、Ｇ１／Ｓ移行点の調節における特異的不全を示していると解釈される。
【００８３】
要約すると、この研究の結果は、Ｇ１阻害に対する活性化リンパ球の応答が、アルツハイマー病罹患者では有意に変化していることを示している。その上、これらの変化は十分に発達した痴呆症候群の発症前に早期に現れて、後にアルツハイマー病を発症しそうな被験者の同定に役立つ。これらの結果は、Ｇ１／Ｓ移行チェックポイントの完全性の検出に依拠する診断試験によって、後にＡＤを発症する恐れのある被験者を同定しうることを示している。この診断法の利点は、この被験者群をこの診断法によって同定することができ、それらの人々に予防的介入を行う可能性が開かれることにあるだろう。
【００８４】
リンパ球の分離および培養、細胞分裂の誘導、細胞分裂阻害剤またはＨ２Ｏ２誘導性低酸素による細胞周期停止の誘導、ＢｒｄＵ取り込み／ＦＡＣＳ解析、およびＭＴＴ生存率アッセイに関して実施例１で説明したプロトコール、またはその軽微な改造はすべて、Ｇ１／Ｓ移行での調節欠損の存在について試験するために、診断的に使用することができる。
【００８５】
実施例２−ｐ２１ｃｉｐおよびｐ５７における一塩基多型の同定方法
５'−ＣＧＧＧＡＴＣＣＧＧＣＧＣＣＡＴＧＴＣＡＧＡＡＣＣＧＧＣ−３'（配列番号１）および５'−ＣＣＡＧＡＣＡＧＧＴＣＡＧＣＣＣＴＴＧＧ−３'（配列番号２）プライマーを使って、ゲノムＤＮＡ（脳または血液から抽出したもの）から、ｐ２１ｃｉｐのエクソン２を増幅した。ＰＣＲ増幅は、ＰＣＲ緩衝液（７５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．８、２０ｍＭ （ＮＨ４）２ＳＯ４および０．０１％Ｔｗｅｅｎ）中、１．２５単位のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、５％ゼラチン、２００μＭの各ｄＮＴＰを使って、５０μｌの最終液量で行った。ホットスタート（９５℃で５分）の後、９５℃で１分、６５℃で１分、７２℃で１分を３０サイクルした。
【００８６】
５'−ＧＧＣ ＣＡＴ ＧＴＣ ＣＧＡ ＣＧＣ ＧＴＣ−３'（配列番号３）および５'−ＡＧＧ ＣＧＧ ＣＡＧ ＣＧＣ ＣＣＣ ＡＣＣ ＴＧ−３'（配列番号４）プライマーを使って、ゲノムＤＮＡ（脳または血液から抽出したもの）から、ｐ５７のエクソン２の第１セグメント（エクソン２Ａｐ５７）を増幅した。ＰＣＲ増幅は、ＰＣＲ緩衝液（７５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．８、２０ｍＭ （ＮＨ４）２ＳＯ４および０．０１％Ｔｗｅｅｎ）中、１．２５単位のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０％ＤＭＳＯ、２００μＭの各ｄＮＴＰを使って、５０μｌの最終液量で行った。ホットスタート（９５℃で５分）の後、９５℃で３０秒、５２℃で３０秒、７２℃で３０秒を３０サイクルした。
【００８７】
５'−ＡＴＴ ＡＣＧ ＡＣＴ ＴＣＣ ＡＧＣ ＡＧＧ ＡＣＡ ＴＧ−３'（配列番号５）および５'−ＣＴＧ ＧＡＧ ＣＣＡ ＧＧＡ ＣＣＧ ＧＧＡ ＣＴＧ−３'（配列番号６）プライマーを使って、ゲノムＤＮＡ（脳または血液から抽出したもの）から、ｐ５７のエクソン２の第２セグメント（エクソン２Ｂｐ５７）を増幅した。ＰＣＲ増幅は、ＰＣＲ緩衝液（７５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．８、２０ｍＭ （ＮＨ４）２ＳＯ４および０．０１％Ｔｗｅｅｎ）中、１．２５単位のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、２００μＭの各ｄＮＴＰを使って、５０μｌの最終液量で行った。ホットスタート（９５℃で５分）の後、９５℃で３０秒、５３℃で３０秒、７２℃で３０秒を３０サイクルした。
【００８８】
一次スクリーニングのために、ゲル添加量２０μｌに対応する１６μｌの変性溶液（９５％脱イオンホルムアミド、１０ｍＭ ＮａＯＨ、０．０１％ブロモフェノールブルー、および０．０１％キシレンシアノールＦＦ）に４μｌのＰＣＲ産物を加えた。その混合物を９５℃で５分間インキュベートし、１：１００００のＧｅｌＳｔａｒを含むＭｅｔａＰｈｏｒアガロースゲル（ｐ２１エクソン２の場合は２％、エクソン２Ａ ｐ５７およびエクソン２Ｂ ｐ５７の場合は３％）にのせた。電気泳動装置を普通の冷蔵庫で４℃の一定温度に維持した。電気泳動は１×ＴＢＥ（４５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ホウ酸／１ｍＭ ＥＤＴＡ）を使って５Ｖ／ｃｍで２時間行った。ゲルに現れるＳＳＣＰパターンをＵＶ光で検出した。
【００８９】
結果
ｐ２１ｃｉｐ遺伝子のエクソン２およびｐ５７ｋｉｐ２遺伝子のエクソン２に多型が見つかった（図６）。ｐ２１ｃｉｐのエクソン２に検出された多型（変異体Ａ）は、神経細胞における細胞周期調節解除（すなわちサイクリンＢ陽性によって示されるＧ１／Ｓ移行を経たＧ２期への細胞周期の進行）と有意に関連した（図７）。正常なｐ２１ｃｉｐ（変異体Ｂ）を持つ患者では、ｐ５７エクソン２Ａ上の多型が、Ｇ１／Ｓ移行を経たＧ２期への細胞周期の進行を示すサイクリンＢ陽性と関連する（図８）。
【００９０】
実施例３−体細胞突然変異に関するＲＡＰＤスクリーニング方法
遺伝子フィンガープリント法を使って神経細胞における体細胞突然変異をスクリーニングした。すべての患者の脳および血液からＤＮＡを得た。各患者から採取した両方の試料でＰＣＲ増幅を行った。１０本の短いプライマーを使って、多型ＤＮＡ配列をランダムに増幅した（プライマーを表２に列挙する）。ＰＣＲ増幅は、ＰＣＲ緩衝液（７５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．８、２０ｍＭ （ＮＨ４）２ＳＯ４および０．０１％Ｔｗｅｅｎ）中、１．２５単位のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、２００μＭの各ｄＮＴＰを使って、５０μｌの最終液量で行った。ホットスタート（９５℃で５分）の後、９４℃で３０秒、ＡｎＴで１分、７２℃で２分を４０サイクルした。アニーリング温度（ＡｎＴ）はプライマーに応じて３３℃〜３９℃の間で変えた。ＰＣＲ産物を１：１００００のＧｅｌＳｔａｒを含む２％アガロースゲルにのせた。電気泳動は１×ＴＢＥ（４５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ホウ酸／１ｍＭ ＥＤＴＡ）を使って６．５Ｖ／ｃｍで２時間行った。ＲＡＰＤ配列パターンをＵＶ光で検出した。血液ＤＮＡと脳ＤＮＡから得られるＲＡＰＤ配列の相違を患者ごとに比較し、異なるＲＡＰＤプロファイルをもたらすプライマーのパーセンテージとして表した（ＲＡＰＤプロファイルは図示していない）。
【００９１】
結果
ＡＤ患者の脳における体細胞突然変異の量は、細胞周期調節解除およびＡＤ型病変の重症度と有意に関連することが観察された（図９）。したがって、ＤＮＡ修復不全は、Ｇ１／Ｓ移行点の調節解除につながり、最終的にはアルツハイマー病の発症につながりうることが示唆される。
【００９２】
遺伝子タイピングによる知見は、ＣＤＫＩ誘導阻害剤または酸化的ＤＮＡ損傷によって惹起されるＧ１／Ｓ調節制御に検出可能な機能不全が存在することを示すＡＤ患者のリンパ球で得られた先の知見と一致している。
【００９３】
【表２】
【００９４】
【表３】
【００９５】
図面の略語一覧：
対照：認知および神経心理学試験の結果が正常である健康な個体。
ＰｒｅＡＤ：神経心理学試験の結果から初期ＡＤが示唆される健康な個体。
ＰｏｓｓＡＤ：ＮＩＮＣＤＳ基準による診断でアルツハイマー病の可能性あり（ｐｏｓｓｉｂｌｅ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ'ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）
ＡＤ：ＮＩＮＣＤＳ基準による診断でアルツハイマー病の可能性大（ｐｒｏｂａｂｌｅ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ'ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）
ＡＤＭ：アルツハイマー病の可能性あり（ＮＩＮＣＤＳ）および他のタイプの痴呆を示す証拠。
ＤＮＯＳ：アルツハイマー病の可能性大に関するＮＩＮＣＤＳ基準の要件を満たさない痴呆を持つ患者。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト被験体ゲノムの細胞周期調節遺伝子中の少なくとも１つの突然変異または対立遺伝子変異体の存在に関してスクリーニングすることを含む、前記被験体におけるアルツハイマー病の診断に使用する方法であって、細胞周期調節遺伝子中の突然変異または対立遺伝子変異体の存在がアルツハイマー病のしるしであると解釈される方法。
【請求項２】
ヒト被験体におけるアルツハイマー病の遺伝的根拠を決定する方法であって、細胞周期調節遺伝子中の突然変異または対立遺伝子変異体の存在に関して、前記被験体ゲノムをスクリーニングすることを含む方法。
【請求項３】
アルツハイマー病の素因に関してヒト被験体をスクリーニングする方法であって、前記被験体ゲノムの細胞周期調節遺伝子中の少なくとも１つの突然変異または対立遺伝子変異体の存在に関してスクリーニングすることを含む方法。
【請求項４】
ＣＤＫＮ３、ｐ１５ｉｎｋ４Ｂ、ｐ１６ｉｎｋ４Ａ、ｐ１９ｉｎｋ４Ｄ、ｐ２７ｋｉｐ１、ｐ２１ｃｉｐ１、ｐ５７ｋｉｐ２およびＴＰ５３から選択される少なくとも１つの遺伝子中の突然変異または対立遺伝子変異体の存在に関してスクリーニングすることを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
ｐ２１Ｅ２ Ａ／Ｂ多型、ｐ５７Ｅ２Ａ Ａ／Ｂ多型、またはｐ５７Ｅ２Ｂ Ａ／Ｂ多型の１つまたは複数に関して遺伝子タイピングすること含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ヒト被験体ゲノムのＤＮＡ修復酵素をコードする遺伝子中の少なくとも１つの突然変異または対立遺伝子変異体の存在に関してスクリーニングすることを含む、前記被験体におけるアルツハイマー病の診断に使用する方法であって、前記遺伝子中の突然変異または対立遺伝子変異体の存在がアルツハイマー病のしるしであると解釈される方法。
【請求項７】
ヒト被験体におけるアルツハイマー病の遺伝的根拠を決定する方法であって、ＤＮＡ修復酵素をコードする遺伝子中の突然変異または対立遺伝子変異体の存在に関して、前記被験体のゲノムをスクリーニングすることを含む方法。
【請求項８】
アルツハイマー病の素因に関してヒト被験体をスクリーニングする方法であって、前記被験体ゲノムのＤＮＡ修復酵素をコードする遺伝子中の少なくとも１つの突然変異または対立遺伝子変異体の存在に関してスクリーニングすることを含む方法。
【請求項９】
Ｋｕ７０、Ｋｕ８０、Ｋｕ８６、ＮＤＨＩＩ、ＢＬＭ、ＲＥＣＱＬ、ＲＥＣＱＬ４およびＲＥＣＱＬ５から選択される少なくとも１つの遺伝子中の突然変異または対立遺伝子変異体の存在に関してスクリーニングすることを含む、請求項６〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１】
ヒト被験体ゲノムの細胞周期調節遺伝子中の少なくとも１つの突然変異または対立遺伝子変異体の存在に関してスクリーニングすることを含む、前記被験体におけるアルツハイマー病の診断に使用する方法であって、細胞周期調節遺伝子中の突然変異または対立遺伝子変異体の存在がアルツハイマー病のしるしであると解釈される方法。
【請求項２】
ヒト被験体におけるアルツハイマー病の遺伝的根拠を決定する方法であって、細胞周期調節遺伝子中の突然変異または対立遺伝子変異体の存在に関して、前記被験体ゲノムをスクリーニングすることを含む方法。
【請求項３】
アルツハイマー病の素因に関してヒト被験体をスクリーニングする方法であって、前記被験体ゲノムの細胞周期調節遺伝子中の少なくとも１つの突然変異または対立遺伝子変異体の存在に関してスクリーニングすることを含む方法。
【請求項４】
ＣＤＫＮ３、ｐ１５ｉｎｋ４Ｂ、ｐ１６ｉｎｋ４Ａ、ｐ１９ｉｎｋ４Ｄ、ｐ２７ｋｉｐ１、ｐ２１ｃｉｐ１、ｐ５７ｋｉｐ２およびＴＰ５３から選択される少なくとも１つの遺伝子中の突然変異または対立遺伝子変異体の存在に関してスクリーニングすることを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
ｐ２１Ｅ２ Ａ／Ｂ多型、ｐ５７Ｅ２Ａ Ａ／Ｂ多型、またはｐ５７Ｅ２Ｂ Ａ／Ｂ多型の１つまたは複数に関して遺伝子タイピングすること含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ヒト被験体ゲノムのＤＮＡ修復酵素をコードする遺伝子中の少なくとも１つの突然変異または対立遺伝子変異体の存在に関してスクリーニングすることを含む、前記被験体におけるアルツハイマー病の診断に使用する方法であって、前記遺伝子中の突然変異または対立遺伝子変異体の存在がアルツハイマー病のしるしであると解釈される方法。
【請求項７】
ヒト被験体におけるアルツハイマー病の遺伝的根拠を決定する方法であって、ＤＮＡ修復酵素をコードする遺伝子中の突然変異または対立遺伝子変異体の存在に関して、前記被験体のゲノムをスクリーニングすることを含む方法。
【請求項８】
アルツハイマー病の素因に関してヒト被験体をスクリーニングする方法であって、前記被験体ゲノムのＤＮＡ修復酵素をコードする遺伝子中の少なくとも１つの突然変異または対立遺伝子変異体の存在に関してスクリーニングすることを含む方法。
【請求項９】
Ｋｕ７０、Ｋｕ８０、Ｋｕ８６、ＮＤＨＩＩ、ＢＬＭ、ＲＥＣＱＬ、ＲＥＣＱＬ４およびＲＥＣＱＬ５から選択される少なくとも１つの遺伝子中の突然変異または対立遺伝子変異体の存在に関してスクリーニングすることを含む、請求項６〜８のいずれか一項に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公開番号】特開２０１０−１６６９２２（Ｐ２０１０−１６６９２２Ａ）
【公開日】平成２２年８月５日（２０１０．８．５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−４７８６１（Ｐ２０１０−４７８６１）
【出願日】平成２２年３月４日（２０１０．３．４）
【分割の表示】特願２００８−１４１２２６（Ｐ２００８−１４１２２６）の分割
【原出願日】平成１４年３月１２日（２００２．３．１２）
【出願人】（５９９０９３７２０）アイシス・イノヴェイション・リミテッド (7)
【氏名又は名称原語表記】Ｉｓｉｓ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ Ｌｉｍｉｔｅｄ
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年８月５日（２０１０．８．５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年３月４日（２０１０．３．４）
【分割の表示】特願２００８−１４１２２６（Ｐ２００８−１４１２２６）の分割
【原出願日】平成１４年３月１２日（２００２．３．１２）
【出願人】（５９９０９３７２０）アイシス・イノヴェイション・リミテッド (7)
【氏名又は名称原語表記】Ｉｓｉｓ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ Ｌｉｍｉｔｅｄ
【Ｆターム（参考）】
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