アルツハイマー病治療用ワクチン
本発明は、アルツハイマー病のより重篤な形態を有している患者を治療するための方法を提供する。ＡＤの重篤な形態はアミロイドベータペプチド（Ａβ）の病原性沈着物を特徴とする。方法は、Ａβの病原性沈着物、特にＡβのＮ末端欠失形態を含む神経毒性Ａβ形態に特異的な抗体の形態で免疫応答を誘発できる免疫原性Ａβフラグメントを投与する段階を含む。本発明はさらに、ＡＤのより重篤な形態を治療するために適切な免疫原性Ａβフラグメントの選択方法を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はアミロイド原性疾患、特にアルツハイマー病を予防および治療するための組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病（ＡＤ）は、進行性の記憶障害および認識減退を特徴とする。その特徴的病変は、脳の特定領域に見られるアミロイド沈着物（老人斑）、神経原線維のもつれおよびニューロン消失である。アミロイド沈着物は４０から４３個のアミノ酸残基のアミロイドベータペプチド（Ａβ）から構成されており、これらはアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）のタンパク質分解産物である。神経原線維のもつれは高リン酸化タウタンパク質の細胞内線維状凝集塊である（Ｓｅｌｋｏｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７５：６３０−６３１，１９９７）。
【０００３】
ＡＤの発生病理は完全には解明されていないが、多要因イベントであると予測されている。脳組織内にＡβが蓄積および凝集することが疾患の進行に重要な役割を果たすと考えられており、これはアミロイドカスケード仮説としても知られている（Ｇｏｌｄｅ，Ｂｒａｉｎ Ｐａｔｈｏｌ．，１５：８４−８７ １９９５）。この仮説によれば、Ａβ、特にＡβ４２は、小さいオリゴマーから大きく細長い原線維構造までの範囲の様々な形態の凝集塊を形成する傾向がある。これらの凝集塊は神経毒性であり、疾患の初期段階の記憶消失および認識減退に関連したシナプス病理の一因であると考えられている（Ｋｌｅｉｎら，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ａｇｉｎｇ，２５ ５６９−５８０，２００４）。最近の刊行物は、トリプルトランスジェニックマウスにおいてＡβの減少が細胞内タウ沈着も防止することを示唆している（Ｏｄｄｏら，Ｐｒｏｃ．Ｎｅｕｒｏｎ，４３：３２１−３３２，２００４）。この知見は、細胞内アミロイド沈着がその後の神経原線維もつれ形成の原因であり得ること、そこからさらにニューロン消失に至り得ることを示唆している。
【０００４】
ＡＰＰトランスジェニックマウスをＡβ抗原によって免疫感作すると脳のＡβ沈着物を減少させ疾患の進行を緩和することができる。このことはＳｈｅｎｋら，Ｎａｔｕｒｅ，４００：１７３−１７７，１９９９によって最初に報告されたものであり、いまや、様々なトランスジェニック動物モデル、様々な能動ワクチン、ならびに、Ａβ特異的モノクローナル抗体による受動免疫感作を含む多くの研究によって確証されている（Ｂａｒｄら，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ，６：９１６−９１９，２０００；Ｊａｎｕｓら，Ｎａｔｕｒｅ，４０８：９７９−９８２，２０００；Ｍｏｒｇａｎら，Ｎａｔｕｒｅ，４０８：９８２−９８５，２０００；ＤｅＭａｔｔｏｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ，Ｓｃｉ．，９８：８８５０−８８５５，２００１；Ｂａｃｓｋａｉら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，２２：７８７３−７８７８，２００２；Ｗｉｌｃｏｃｋら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，２３：３７４５−３７５１，２００３）。プレ凝集Ａβ１−４２ペプチド（ＡＮ１７９２，Ｂｅｔａｂｌｏｃ）を免疫原とした能動免疫感作を予め受けていた患者から得られた死後のヒト脳組織について発表された３つの評価は、動物データに符合して、老人斑の局所的クリアランスを示した（Ｎｉｃｏｌｌら，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．，９：４４８−４５２，２００３；Ｆｅｒｒｅｒら，Ｂｒａｉｎ Ｐａｔｈｏｌ．，１４：１１−２０，２００４；Ｍａｓｌｉａｈら，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，６４：１２９−１３１，２００５）。これらのデータは総合的に、Ａβ抗原に対する抗体応答を効果的に誘発するワクチンはＡＤに見出される病的老人斑に対して有効であることを示唆する。しかしながら、ワクチンまたは抗体の有効性のメカニズムはいまだ解明されていない。
【０００５】
ＡＤの治療に能動免疫感作法を使用するための最も進んだ研究は、アジュバント，ＱＳ−２１ＴＭ（Ａｎｔｉｇｅｎｉｃｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ）と共に投与されたＡＮ１７９２（Ｂｅｔａｂｌｏｃ）を使用するフェーズＩＩ治験であった。２００２年１月に４人の患者が脳脊髄膜脳炎に符合する症状を示したときにこの研究は停止された（Ｓｅｎｉｏｒ，Ｌａｎｃｅｔ Ｎｅｕｒｏｌ．，１：３，２００２）。最終的に、治療した２９８名の患者のうちの１８名が脳脊髄膜脳炎の徴候を発生した（Ｏｒｇｏｇｏｚｏら，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，６１：４６−５４，２００３）。脳炎と抗体価との間に相関関係は存在せず、このような結末の原因と考えられるメカニズムは自己免疫原、特にＡβ４２の中央部分およびカルボキシ末端部分に対するＴ細胞の活性化であるらしいと報告された（Ｍｏｎｓｏｎｅｇｏら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１１２：４１５−４２２，２００３）。この結論の傍証として、脳炎を発生した２名のワクチンレシピエントから得られた脳組織の死後検査において、一方の患者でＣＤ４＋ Ｔ細胞（Ｎｉｃｏｌｌら，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．，９：４４８−４５２，２００３）および他方の患者でＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ３＋、ＣＤ５＋、ＣＤ７＋ Ｔ細胞（Ｆｅｒｒｅｒら，Ｂｒａｉｎ Ｐａｔｈｏｌ．，１４：１１−２０，２００４）の実質的な髄膜浸潤が明らかになった。これらの知見に部分的に立脚し、ＡβのＮ末端たとえばＡβ１−７およびＡβ１−６を標的とすればＴ細胞介在副作用イベントのない有効性が与えられるであろうという考え方に基づいて能動抗Ａβワクチンによるいくつかの臨床治験が開始された。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｓｅｌｋｏｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７５：６３０−６３１，１９９７
【非特許文献２】Ｇｏｌｄｅ，Ｂｒａｉｎ Ｐａｔｈｏｌ．，１５：８４−８７ １９９５
【非特許文献３】Ｋｌｅｉｎら，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ａｇｉｎｇ，２５ ５６９−５８０，２００４
【非特許文献４】Ｏｄｄｏら，Ｐｒｏｃ．Ｎｅｕｒｏｎ，４３：３２１−３３２，２００４
【非特許文献５】Ｓｈｅｎｋら，Ｎａｔｕｒｅ，４００：１７３−１７７，１９９９
【非特許文献６】Ｂａｒｄら，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ，６：９１６−９１９，２０００
【非特許文献７】Ｊａｎｕｓら，Ｎａｔｕｒｅ，４０８：９７９−９８２，２０００
【非特許文献８】Ｍｏｒｇａｎら，Ｎａｔｕｒｅ，４０８：９８２−９８５，２０００
【非特許文献９】ＤｅＭａｔｔｏｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ，Ｓｃｉ．，９８：８８５０−８８５５，２００１
【非特許文献１０】Ｂａｃｓｋａｉら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，２２：７８７３−７８７８，２００２
【非特許文献１１】Ｗｉｌｃｏｃｋら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，２３：３７４５−３７５１，２００３
【非特許文献１２】Ｎｉｃｏｌｌら，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．，９：４４８−４５２，２００３
【非特許文献１３】Ｆｅｒｒｅｒら，Ｂｒａｉｎ Ｐａｔｈｏｌ．，１４：１１−２０，２００４
【非特許文献１４】Ｍａｓｌｉａｈら，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，６４：１２９−１３１，２００５
【非特許文献１５】Ｓｅｎｉｏｒ，Ｌａｎｃｅｔ Ｎｅｕｒｏｌ．，１：３，２００２
【非特許文献１６】Ｏｒｇｏｇｏｚｏら，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，６１：４６−５４，２００３
【非特許文献１７】Ｍｏｎｓｏｎｅｇｏら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１１２：４１５−４２２，２００３
【発明の概要】
【０００７】
１つの実施態様において、本発明は、（ｉ）患者がアルツハイマー病（ＡＤ）のより重篤な形態を有していることを判定する段階と、（ｉｉ）免疫応答を誘発するために有効な量で、免疫原性Ａβフラグメントを投与する段階とを含む、ＡＤのより重篤な形態を有している患者の治療方法である。ＡＤのより重篤な形態を有している患者は、Ｍｉｎｉ−Ｍｅｎｔａｌ Ｓｔａｔｅ Ｅｘａｍ（ＭＭＳＥ）スコア２０以下の個人、Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ Ｓｃａｌｅ−Ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ（ＡＤＡＳ−Ｃｏｇ）スコア３５以上の個人、Ｇｌｏｂａｌ Ｄｅｔｅｒｉｏｒａｔｉｏｎ Ｓｃａｌｅ（ＧＤＳ）スコアがステージ５以上の個人、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｅｍｅｎｔｉａ Ｒａｔｉｎｇ−Ｓｕｍ ｏｆ Ｂｏｘｅｓ（ＣＤＲ−ＳＢ）スコア２以上の個人、６０歳から６４歳以下の年齢でＡＤの症状を有している個人、または、遺伝子スクリーニング後に早発型アルツハイマー病（ＥＯＡＤ）もしくは家族性ＡＤ形態を有していると診断された個人から成る群から選択される。免疫原性Ａβフラグメントは、それぞれが少なくとも１つの抗原決定基を有しており、かつＴ細胞エピトープが欠損している多様な不連続、および不一致の免疫原性Ａβフラグメントを含んでいる多価ワクチンを包含する。別の実施態様において多価ワクチンは、リシンスカフォールドによって連結されたＡβ３−１０およびＡβ２１−２８を含む。多価ワクチンはさらに、Ａβペプチドフラグメントにコンジュゲートされた担体を含み、また、場合によってはアジュバントと共に投与され得る。
【０００８】
別の実施態様において本発明は、アルツハイマー病（ＡＤ）のより重篤な形態を有している患者の治療に適切なワクチン構築物として使用するための免疫原性Ａβフラグメントの選択方法であり、該方法は、（ｉ）免疫応答を誘発するために有効な量で被験免疫原性Ａβフラグメントを動物に投与する段階と、（ｉｉ）免疫感作動物から得られた抗血清をＡβのＮ末端欠失形態に対する交差反応性について評価する段階とを含む。該方法において、Ａβの１つ以上のＮ末端欠失形態に特異的な抗体の形態で免疫応答を誘発できる構築物が適切なワクチン構築物として選択される。ＡβのＮ末端欠失形態は、Ａβｘ−４２、ｐＧｌｕ−Ａβ３−４０、ｐＧｌｕ−Ａβ３−４２、ｐＧｌｕ−Ａβ１１−４０およびｐＧｌｕ−Ａβ１１−４２から成る群から選択され、ここにｘは、天然に存在するＡβの残基２から１７に対応する。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】担体としてＫＬＨにコンジュゲートされＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（Ｒ）と共に投与されたＡβ１−８（ＭｏＶＣ１−８）のペプチドコンジュゲートで免疫感作した動物から得られた抗血清の系列希釈物から検出された抗体を表す。
【図２】担体としてＯＭＰＣにコンジュゲートされＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（Ｒ）と共に投与された多価ワクチン（Ａβ３−１０／Ａβ２１−２８）（ＭＶＣ）で免疫感作した動物から得られた抗血清の系列希釈物から検出された抗体を表す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
「８−ｍｅｒ」という用語は、Ａβのフラグメント、天然Ａβペプチドの類似体またはペプチド模擬体に対応する８アミノ酸のペプチドを意味する。多価直鎖状ペプチドを形成するためまたは多価分枝状ＭＡＰを形成するために１つ以上の８−ｍｅｒが少なくとも１つのスペースに組合せられるであろう。
【００１１】
「Ａβコンジュゲート」という用語は、キーホールリンペットヘモシアニンまたはＮｅｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの外膜タンパク質複合体（ＯＭＰＣ）のような担体に化学的または生物学的に連結されているＡβの８−ｍｅｒまたは免疫原性Ａβフラグメントを意味する。
【００１２】
「Ａβペプチド」という用語は、ここでワクチン構築物中に使用された合成Ａβペプチドのいずれかを（天然に存在するアミロイドベータペプチド（Ａβ）に比較して）意味しており、非限定的に、直鎖状８−ｍｅｒ、少なくとも１つのスペーサーをもつ多価直鎖状ペプチドおよび多価分枝状多抗原性ペプチド（ＭＡＰ）を含む。
【００１３】
「エピトープ」という用語は、Ｂおよび／またはＴ細胞応答の対象となる抗原上の部位を表す。Ｂ細胞エピトープは連続アミノ酸からまたはタンパク質の三次折畳みによって並置された不連続アミノ酸から形成できる。連続アミノ酸から形成されたエピトープは典型的には変性溶媒に接触したときに保存されているが、三次折畳みによって形成されたエピトープは典型的には変性溶媒で処理したときに消失する。Ｔ細胞エピトープは宿主ＭＨＣ分子と共に複合体を形成できるペプチドから成る。ヒトＭＨＣクラスＩ分子に対するＴ細胞エピトープはＣＤ８＋ Ｔ細胞応答の誘発を担当しており、一般に９から１１個のアミノ酸残基を含んでいる。他方、ヒトＭＨＣクラスＩＩに対するエピトープはＣＤ４＋ Ｔ細胞応答を担当し、典型的には１２以上のアミノ酸残基を含んでいる（Ｂｊｏｒｋｍａｎら，Ｎａｔｕｒｅ ３２９：５０６−５１２，１９８７；Ｍａｄｄｅｎら，Ｃｅｌｌ ７５：６９３−７０８；Ｂａｔａｌｉａ ａｎｄ Ｃｏｌｌｉｎｓ；Ｅｎｇｅｌｈａｒｄ Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２：１８１−２０７−６２２．１９９５；Ｍａｄｄｅｎ，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３：５８７−６２２．１９９５）。Ｔ細胞と違ってＢ細胞は長さ４アミノ酸という小さいペプチドを認識できる。Ｔ細胞活性化に導くＴ細胞受容体によって認識されるのはＴ細胞エピトープ／ＭＨＣ複合体である。
【００１４】
「多価ペプチド」という用語は、２つ以上の抗原決定基を有しているペプチドを表す。
【００１５】
「多価ワクチン」または「ＭＶＣ」という用語は、それぞれが１つの抗原決定基を有しておりかつＴ細胞エピトープが欠損している多様なＡβペプチドから成るワクチン構築物を意味する。１つの実施態様において多価ワクチンは、それぞれのＴ細胞エピトープが欠損している不連続で不一致な２つの免疫原性Ａβフラグメント、たとえば、Ａβ３−１０およびＡβ２１−２８を含む。
【００１６】
「免疫原性Ａβフラグメント」または「Ｔ細胞エピトープが欠損している免疫原性Ａβフラグメント」という用語は、Ａβに対する抗体の形態で免疫応答を誘発できるがその応答が自己抗原Ａβに対するＴ細胞応答を含まない８−ｍｅｒまたはＡβフラグメントを意味する。
【００１７】
「免疫学的」または「免疫性」または「免疫原性」応答という用語は、脊椎動物体内の抗原に対する体液性（抗体に媒介された）および／または細胞性（抗原特異的Ｔ細胞またはそれらの分泌産物によって媒介された）応答の発生を表す。このような応答は、免疫原の投与によって誘発された能動応答または抗体の投与によって誘発された受動応答であり得る。
【００１８】
「ＡＤのより重篤な形態」という用語は、同年齢の対照非ＡＤ患者に比較してより進行したニューロン変性またはより進行した臨床病理に関連したＡＤの何らかの形態を有している患者を表す。このような患者は非限定的に、Ｍｉｎｉ−Ｍｅｎｔａｌ Ｓｔａｔｅ Ｅｘａｍ（ＭＭＳＥ）スコア２０以下の個人、Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ Ｓｃａｌｅ−Ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ（ＡＤＡＳ−Ｃｏｇ）スコア３５以上の個人、Ｇｌｏｂａｌ Ｄｅｔｅｒｉｏｒａｔｉｏｎ Ｓｃａｌｅ（ＧＤＳ）スコアがステージ５以上の個人、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｅｍｅｎｔｉａ Ｒａｔｉｎｇ−Ｓｕｍ ｏｆ Ｂｏｘｅｓ（ＣＤＲ−ＳＢ）スコア２以上の個人、６０歳から６４歳以下の年齢でＡＤ症状を有している個人、または、遺伝子スクリーニング後に早発型アルツハイマー病（ＥＯＡＤ）もしくは家族性ＡＤ形態特にＰＳ−１突然変異に関連した形態を有すると診断された個人、または、Ａβの病原性沈着物を特徴とするＡＤの形態を有している患者を含む。
【００１９】
「アミロイドベータペプチド（Ａβ）の病原性沈着物」または「Ａβの病原性沈着物」という用語は、Ａβの神経毒性形態たとえばＡβ４２、または、より多くのニューロン変性もしくはより重篤な臨床表現型に関連することが判っているＡβのＮ末端もしくはＣ末端欠失形態を含むプラーク沈着物を意味する。Ａβのこのような形態は非限定的に、Ａβ４０、Ａβ４２、ＡβのＮ末端欠失形態たとえばＡβｘ−４２［ここにｘは天然に存在するＡβの残基２−１７に対応する］、および、末端アミノ酸の環化たとえばＮ末端グルタメートの環化によって修飾されたＡβの欠失形態ｐＧｌｕＡβ３−４２またはｐＧｌｕＡβ１１−４２を含む。
【００２０】
「Ａβの病原性沈着物に特異的な抗体」という用語は、全長Ａβ４０もしくはＡβ４２、ＡβのＮ末端欠失形態、または、ｐＧｌｕＡβ３−４２もしくはｐＧｌｕＡβ１１−４２のような末端アミノ酸に修飾を有しているＡβのＮ末端もしくはＣ末端欠失形態を含むＡβの神経毒性形態に交差反応性である抗体を表す。
【００２１】
「医薬組成物」という用語は、哺乳類個体に投与するための適切な化学的または生物学的組成物を意味する。ここに使用したこの用語は、場合によりアジュバントと共にまたはアジュバントなしで投与されるここに記載の８−ｍｅｒ、免疫原性ＡβフラグメントおよびＡβコンジュゲートを含む組成物を表す。
【００２２】
アミロイドベータペプチド（Ａβ）の病原性沈着物
ＡＤ患者の脳内に沈着したＡβが構造的に均質でないことはますます多くの証拠によって示唆されている（Ｓａｉｄｏら，Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｅｔｔｅｒｓ，２１５：１７３−１７６，１９９６）。Ａβ４０およびＡβ４２のような全長アミロイドベータペプチド（Ａβ）の多様な形態に加えて、ペプチドのＮ末端およびＣ末端に修飾を有しているＡβの多様な欠失形態が検出された（Ｒｕｓｓｏら，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ，４０９：４１１−４１６，１９９７；Ｓａｉｄｏ １９９６）。これらの欠失Ａβ形態がＡＤの発生に極めて重要であるという考えがますます有力になっている（Ｐｉｃｃｉｎｉら，Ｊ，Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，，２８０（４０）：３４１８６−３４１９２，２００５）。これらの欠失Ａβ形態のうちでも、残基Ｇｌｕ３またはＧｌｕ１１のピログルタミルから開始するＮ末端欠失ペプチドが優勢に存在する（Ｒｕｓｓｏ，１９９７）。ｐＧｌｕ３形態（Ａβ３（ｐＥ）−４２）が特に顕著であり、Ａβ全体の約５０％を構成する（Ｙｏｕｓｓｅｆら，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ａｇｉｎｇ，２９：１３１９−１３３３，２００８）。
【００２３】
これらのＮ末端欠失形態は、孤発性ＡＤであると診断された患者の脳、早発型家族性ＡＤ（ＥＯＡＤ）の患者、極めて特定的にはプレセニリン−１（ＰＳ−１）突然変異を有する患者、および、ダウン症候群（ＤＳ）である患者において早期に蓄積することが知見された（Ｒｕｓｓｏら，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，４０９：４１１−４１６，１９９７；Ｓａｉｄｏら，Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．，２１５：１７３−１７６，１９９６；Ｔｅｋｉｒｉａｎら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．Ｅｘ．Ｎｅｕｒｏｌ．，５７：７６−９４，１９９８）。孤発性遅発型ＡＤ（ＬＯＡＤ）の患者が突然変異を有していないことに比較して、ＰＳ−１突然変異によって推進されたＥＯＡＤをもつ個人では典型的には６０歳から６４歳以前に疾患症状が発生する。さらに、ダウン症候群である患者も染色体２１の過剰コピー（ｅｘｔｒａ ｃｏｐｙ）に起因するＥＯＡＤを発生する。ＡＤ何らかの遺伝性形態に関連した遺伝子が同じ染色体２１に局在しており、ＡＰＰの３０％増およびＡβ産生の増加に導くからである。家族性デンマーク認知症は早発型認知症の別の形態であり、ｐｙｒｏＧｌｕでＮ末端修飾されたＡβが多くの割合で存在すること、ほぼ全部を占めていることを特徴とする（Ｔｏｍｉｄｏｋｏｒｏら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８０（４４）：３６８８３−３６８９４，２００５）。ＰＳ−１突然変異またはＤＳに起因するＥＯＡＤを有している個人はＬＯＡＤに比較して有意に多いｐＧｌｕＡβ３−４２を脳内に含んでいる（Ｒｕｓｓｏ，１９９７；Ｒｕｓｓｏら，Ｎａｔｕｒｅ，４０５：５３１−５３２，２０００；Ｒｕｓｓｏら，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ｄｉｓ．，８：１７３−１８０，２００１；Ｈｏｓｏｄａら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．，５７：１０８９−１０９５，１９９８）。より重要なことは、死後組織分析から判断して、大きい割合のＮ末端欠失形態、特に優勢なｐＧｌｕＡβ３−４２形態を有している患者は、ニューロン変性の程度および臨床病理の重篤度の双方の観点で疾患がより重篤であると考えられることである（Ｒｕｓｓｏ，１９９７；Ｒｕｓｓｏ ２０００）。
【００２４】
ＡＤまたは認知症の個人の評価は一般に、いくつかの形態の精神的または認識的評価を含み、これらはＡｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ Ｓｃａｌｅ−Ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ（ＡＤＡＳ−Ｃｏｇ）、Ｇｌｏｂａｌ Ｄｅｔｅｒｉｏｒａｔｉｏｎ Ｓｃａｌｅ（ＧＤＳ）、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｅｍｅｎｔｉａ Ｒａｔｉｎｇ−ｓｕｍｍａｒｙ ｏｆ ｂｏｘｅｓ（ＣＤＲ−ＳＢ）、またはより典型的にＭｉｎｉ−Ｍｅｎｔａｌ Ｓｔａｔｅ Ｅｘａｍ（ＭＭＳＥ）を含む様々な方法によって行うことができる。ＭＭＳＥスコアは最大値３０を有しており、スコア全体は、軽度（２１−２６）、中等度（１５−２０）および重度（１４以下）に分類される。ＡＤＡＳ−Ｃｏｇスコアは、０（考えられる最良）から７０（考えられる最悪）までの範囲であり、ほぼ２３というスコアが軽度の障害の限界点であり、約３５以上のスコアが中等度以上の障害に相関している。ＣＤＲのスコアは最大値４であり、スコアは、正常（０）、軽度（０．５−１）、中等度（２）および重度（３−４）として分類される。同様に、ＧＤＳのスコアは、ステージ１（最良）からステージ７（最悪）の範囲であり、グレード４がＡＤＡＳ−Ｃｏｇスコアの約２２．５の軽度の障害と同等であり、ステージ５がＡＤＡＳ−Ｃｏｇスコアの約３５の中等度の障害と同等である。ＡＤおよび認知症に関係付けたＭＭＳＥの概要については、Ｆｏｌｓｔｅｉｎら，Ｊ．Ｐｓｙｃｈｉａｔ．Ｒｅｓ．，１２：１８９−１９８，１９７５を参照するとよい。ＡＤＡＳ−Ｃｏｇ、ＭＭＳＥおよびＧＤＳのスコア結果および妥当性の比較については、Ｄｏｒａｉｓｗａｍｙら，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，４８（６）：１５１１−１５１７，１９９７を参照するとよい。臨床治験における有効性の評価に使用するためにＡＤＡＳ−ＣｏｇおよびＭＭＳＥが一般的に採択されている。考察すべき別の要因は、個人の家族履歴、すなわち、別の一人の（または複数の）極めて近縁の家族構成員が重篤であると考えられるＡＤ形態を有していたかということである。ＦＡＤ突然変異に起因するＥＯＡＤの存在を確認するために患者の白血球から得られたゲノムＤＮＡの配列解析を行うことが可能であった（Ｆｉｎｃｋｈら，Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．，６６：１１０−１１７，２０００）。したがって、ＥＯＡＤまたはＦＡＤのようなＡＤまたは認知症の若年性侵襲的形態を有している個人、特に年齢６０歳から６４歳以下の個人またはＭＭＳＥスコア結果が２０以下の個人はＡＤのより重篤な形態を有していると考えられ、Ｎ末端欠失形態を含む病原性アミロイド沈着物を特徴とするプラークを有していると予測され、本発明の多価ワクチンの候補者であろう。
【００２５】
出願人らはここに、多様な免疫原性Ａβフラグメントを含むワクチン構築物がＡβのＮ末端欠失形態に関連したＡＤのより重篤な形態を有しているＡＤ患者を治療するためのより効果的な手段を提供することを知見した。多価ワクチンは、ＡＤに関連したＡβの全長形態だけでなくＡβのＮ末端欠失形態も含むプラークをもつＡＤの形態を有している患者を治療できる広域スペクトルワクチンである。本発明の多価ワクチンは、神経毒性Ａβの多様な多数の形態、特にＮ末端欠失形態と交差反応できる。出願人はここに、Ｔ細胞エピトープの欠損した多様な不連続、不一致の免疫原性Ａβフラグメントを含む多価ワクチンがＡＤ、特にニューロン変性および臨床病理の観点からより重篤な疾患形態に相関することが判っているＡβ種を有しているＡＤ患者を治療するためにより効果的に使用できることを初めて証明した。
【００２６】
ＡＤのより重篤な形態を治療するためのワクチン構築物
出願人はここに、ここで多価ワクチンと呼ぶＴ細胞エピトープの欠損した多免疫原性Ａβフラグメントを含むワクチン構築物がＡＤのより重篤な形態を有している患者、具体的にはＡβのＮ末端欠失形態を含む病原性Ａβ沈着物を有している患者を治療するための広域スペクトルワクチンを提供できることを知見した。文献に報告された他の抗Ａβワクチン構築物は単一の免疫原性Ａβフラグメントを対象とすると考えられるので、本発明はＡβのＮ末端欠失形態の存在に相関することが判っているＡＤの形態を標的とする利点およびより効果的なワクチンを提供する。
【００２７】
関連の同時係属出願において出願人らは、ＡＤを治療するために、免疫原性Ａβフラグメントを含みＴ細胞エピトープが欠損しておりＡβに対する抗体の形態で有益な免疫応答を誘発できるペプチドコンジュゲートを使用する組成物および方法を記載した（ＰＣＴ／ＵＳ ２００６／０１６４８１，ＷＯ ２００６／１２１６５６；ＵＳＳＮ １１／９１９，８９７，ＵＳ ２００９−００９８１５５、それらの教示は詳細に説明された通りにここに組込まれるものとする）。それらの出願におけるワクチン組成物は、８アミノ酸（８−ｍｅｒ）の大きさに限定された免疫原性Ａβフラグメントから成り、潜在し得るＣ末端Ｔ細胞エピトープアンカー残基を完全に除去するように設計された。免疫原性Ａβフラグメントは８−ｍｅｒの直鎖状ペプチド、少なくとも１つのＰＥＧスペーサーを有している多価直鎖状Ａβコンジュゲート、または、多価分枝状多抗原性ペプチド（ＭＡＰ）であり得る。好ましい実施態様においてワクチン構築物は、リシンスカフォールドに連結されたＡβ３−１０およびＡβ２１−２８を含む分枝状ＭＡＰである。
【００２８】
それらの出願においてＡＤを治療するための能動免疫感作法に使用されるワクチン構築物は医薬組成物の形態で投与でき、該組成物中の免疫原性ＭＡＰフラグメントは、血清アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、免疫グロブリン分子、オバルブミン、破傷風トキソイドタンパク質、または、ジフテリア、Ｅ．ｃｏｌｉ、コレラもしくはＨ．ｐｙｌｏｒｉなどの他の病原性細菌のトキソイド、または、弱毒した毒素誘導体のような担体に化学的または生物学的に連結できる。好ましい実施態様において、担体はＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの外膜タンパク質複合体（ＯＭＰＣ）である。
【００２９】
それらの出願においてＡＤを治療するための能動免疫感作法に使用されるワクチン構築物は、アルミニウム塩（明礬）、脂質たとえば３−デ−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡ（３Ｄ−ＭＰＬ）またはサポニン基剤のアジュバントのようなアジュバントと共に投与され得る。好ましい実施態様において、アジュバントはサポニン基剤のアジュバントＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（Ｒ）（ＣＳＬ Ｌｔｄ，Ｐａｒｋｖｉｌｌｅ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）である。
【００３０】
出願人らはここに、それらの出願におけるペプチドコンジュゲートの１つの好ましい実施態様、すなわち、リシンスカフォールドで連結されたＡβ３−１０およびＡβ２１−２８を含みＯＭＰＣにコンジュゲートされた分枝状ＭＡＰを含む多価ワクチンがいまやＡＤ治療用の広域スペクトル能動ワクチンを提供することを意外にも知見した。この多価ワクチン（ＭＶＣ）の構造を以下に示す：
【００３１】
【化１】
式中の「Ａｈａ」は６−アミノヘキサン酸を表し、「ＢｒＡｃ」はブロモアセチルを表す。
【００３２】
出願人らはここに、この広域スペクトルＭＶＣが現在臨床評価を行っている他の能動ワクチン法に比べて利点を与えることを示した。この多価ワクチンは、多様なＡβの形態、特にＡＤのより重篤な形態に関連したＮ末端欠失Ａβ形態と特異的に交差反応する抗体の形態で免疫応答を与えることを示しただけでなく、Ａβ１−８ワクチンがＡβｘ−４２に対してｘ≧３のときにいかなる免疫応答も産生しなかったことに比較してより強力な免疫応答を提供する。したがって、本発明の多価ワクチンは、ＡβのＮ末端欠失形態に対して臨床考察下の他の能動ワクチンよりも良好な免疫原性、すなわちより広域な応答スペクトルを提供できる。
【００３３】
ＡＤのより重篤な形態を治療するための治療薬
出願人らは、多価ワクチン構築物、すなわち、リシンスカフォールドを介して連結されたＡβ３−１０およびＡβ２１−２８を含む分枝状ＭＡＰ（この文中では多価ワクチン構築物−ＭＶＣとして表す）を担体（ＯＭＰＣ）にコンジュゲートしサポニン基剤のアジュバントＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（Ｒ）と共に投与してモルモットを免疫感作した。免疫感作動物はポリクローナル抗体の形態の免疫応答を産生した。動物から血清を採取し、抗血清を系列希釈し、全長Ａβ４０およびＡβ４２、表１に示したＡβのＮ末端欠失形態を含むＡβの多様な形態に対する交差反応性を試験した。
【００３４】
同様にして出願人らは、天然に存在するＡβのアミノ酸残基１−８に対応する合成一価Ａβペプチド（この文中では一価ワクチン構築物−ＭｏＶＣ１−８として表す）を担体（ＫＬＨ）にコンジュゲートしサポニン基剤のアジュバントＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（Ｒ）と共に投与してモルモットを免疫感作した。情報を信用するならば、現在臨床評価を行っている他の能動ワクチンはＣＲＭ１９７またはＶＬＰにそれぞれコンジュゲートされたＡβ１−７およびＡβ１−６に対応する同様の一価ワクチン構築物を使用していると考えられる。Ａβ１−７／ＣＲＭ１９７ワクチン構築物はサポニン基剤のアジュバントＱＳ−２１と共に投与すべきであると考えられているが、Ａβ１−６／ＶＬＰ構築物はアジユバントと共に投与されない。
【００３５】
現在臨床治験中のＡＤに対する能動ワクチンは、Ａβ配列のＮ末端残基１を含み、６から７アミノ酸の長さである。これに対照的に、出願人が利用したＭＶＣは、Ａβ残基３に対応しており残基１０で終結する１つの免疫原性Ａβフラグメントと残基２１に対応しており残基２８で終結する第二の免疫原性Ａβフラグメントとを含む。ここに証明したように、このＭＶＣは、Ａβ残基１で開始するペプチドを使用する他の能動ワクチン法に比較してより多様なＮ末端欠失Ａβ形態を認識する。何らかの理論に束縛されることは望んでいないが、ＷＯ ２００６／１２１６５６に記載された他の多価ワクチン構築物は同様の特異性で作用すると考えられる。多価８−ｍｅｒ抗原を使用するとき、ここに記載のようなワクチン構築物に組込むことができるいずれかのフラグメント長が抗原特異的Ｔ細胞応答を刺激することなく所望のポリクローナル応答を産生するならば、該フラグメント長に相当する応答が産生されるであろうことを、当業者は認識および理解するであろう。したがって、ここに記載の発明は代替実施態様において７−ｍｅｒ、６−ｍｅｒ、５−ｍｅｒおよび４−ｍｅｒを非限定的に含むＡβフラグメントを含むことができよう。
【００３６】
ここに記載の実験に着手する前に出願人らはワクチン構築物の組成に基づいて、全長形態またはＮ末端欠失形態のいずれのＡβ形態がワクチン接種した動物から得られた抗血清と交差反応するかについて予測を試みた。これらの予測を、多価ワクチン構築物（Ａβ３−１０／Ａβ２１−２８）（ＭＶＣ）および一価ワクチン構築物（Ａβ１−８（ＭｏＶＣ１−８）から得られた抗血清と交差反応した実際の種に比較して表１に示す。また、Ａβの各形態の交差反応性の程度を図１および図２に示す。図１および図２から明らかなように、ここに記載のＭＶＣは、ＭｏＶＣ１−８構築物に比較してより多い種類のＮ末端修飾Ａβペプチドを認識しただけでなく、疾患の最も重篤な形態に最も関連した形態、具体的にはｐＧｌｕ３Ａβ３−４２に対してより高度な交差反応性を有していた。極めて簡潔ではあるがこのデータは、多価ワクチンが８アミノ酸以下のペプチドから成るワクチンに比較して、遊離Ｎ末端で開始する欠失形態（Ａβ１−ｘ）に結合できる抗体を誘発する見込みが高いことを証明する。
【００３７】
【表１】
【００３８】
いくつかのＮ末端欠失Ａβペプチドは残基１で開始するペプチドに比較してより高度に毒性であるかまたは同等に毒性であるが、特に１つのペプチド、すなわち、残基３で開始しグルタミニルシクラーゼによって修飾されたｐｙｒｏｇｌｕ３Ａβ（ｐＧｌｕ３Ａβ３−４２）と命名されたＡβは数桁も高い毒性を示す。この欠失Ａβ形態の優勢な存在がニューロン変性の強度および臨床表現型の重篤度に正比例することが判明した（Ｙｏｕｓｓｅｆら，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ａｇｉｎｇ，２９：１３１９−１３３３，２００８）。出願人らは、一価ワクチン（ＭｏＶＣ１−８）による免疫感作後に生成された哺乳動物の血清が毒性種ｐＧｌｕ３Ａβ３−４２と交差反応しないことを証明した。臨床治験で現在使用されているもっと短いペプチド免疫原（Ａβ１−７およびＡβ１−６）もまたｐＧｌｕ３Ａβ３−４２形態を認識できないであろうことも、当業者は理解および認識するであろう。Ａβ３−８およびＡβ２１−２８を含むワクチンのような他の多価ワクチンによる免疫感作がＡβのＮ末端欠失形態および最も普通に見られるＣ末端欠失形態である−３８、−４０および−４２を含む様々なカルボキシ末端で終結する形態を認識することも予測されるであろう。
【００３９】
この交差反応性によって証明されたように、特許請求した発明は、アルツハイマー病脳のプラーク中に存在する多様なＮ末端欠失Ａβ形態の存在に起因するＡＤのより重篤な形態という臨床上の問題に取組んだものである。何らかの理論に束縛されることは望んでいないが、現在臨床評価が行われているようなＮ末端残基１を含み６または７アミノ酸の長さに限定されたペプチドを使用しているＡＤワクチンに対して考えられる１つの限界は、恐らくはこれらのワクチンがインビボのこれらの限られたＡβ形態に対してのみ、具体的にはＮ末端残基を含んでいたＡβ形態に対してのみ免疫応答を産生していたことである。好ましい形態においては、ＡＤワクチンが残基１を含む形態に加えてすべてのＮ末端欠失Ａβ形態に特異的に交差反応する抗体の形態で免疫応答を誘発することが望ましいであろう。ＡβのＮ末端欠失形態はＡＤのより重篤な形態に相関しているので、このようなより広域の認識はもっと広い臨床集団に使用できると期待される。したがって、ここに特許請求した発明、すなわち、すべてのＮ末端欠失Ａβ形態を認識するＡβ３−１０およびＡβ２１−２８に対応する免疫原性Ａβフラグメントから成るワクチンを代表例とする多価ワクチンの使用が、ＡＤのより重篤な形態を有しているＡＤ患者に対して、Ｎ末端残基１を含むＡβ形態を認識するだけの一価ワクチンから与えられるよりも有効な治療効果を与えるであろうことを、当業者は理解および認識するであろう。この理論的根拠によって、Ａβ１−６またはＡβ１−７によって免疫感作された患者はＭＶＣでワクチン接種された患者と同じ程度には保護されないであろう。特にＡβのＮ末端欠失形態の毒性作用を防御できないであろう。
【００４０】
治療方式
ＡＤのより重篤な形態および他のアミロイド疾患を治療的に処置するためのここに記載の多価ワクチンの有効用量は、投与手段、標的部位、患者の生理的状態、投与される他の医薬、処置が治療的すなわち疾患症状の発生後であるかまたは予防的すなわち疾患症状の発生防止のためであるか、を非限定的に含む多くの要因に従って様々に変更されるであろう。好ましい実施態様においては患者がヒトであり、治療薬は注入によって投与されることになる。
【００４１】
免疫原または治療薬の使用すべき量はまた、アジュバントが同時にまたは順次に投与されるか否かにも左右され、アジュバントが使用されないときにはより高い用量で使用される。
【００４２】
免疫原または治療薬の使用すべき量は変わるが、ヒトに使用する場合には一回の注入あたり０．５から５０μｇのペプチド（Ａβペプチド含量を基準とする）という範囲の量が考えられる。ここに記載のタイプの抗原を含む組成物をどのように配合するかは当業者に周知であろう。
【００４３】
投与方式は、一次免疫感作とその後に設定間隔毎に行うブースター注射とから成る。一次免疫感作とブースター免疫感作との間の間隔、複数のブースター注射間の間隔、ブースター免疫感作の回数は、ワクチンによって誘発された抗体価および持続期間に従属するであろう。また、抗体応答の機能的有効性、すなわち、ＡＤ発生を予防するためまたはＡＤ患者の治療効果を発揮するために必要な抗体価のレベルにも左右されるであろう。典型的な方式は、１、２および６カ月目に行う初回注入セットから成る。別の方式は１および２カ月目に行う初回注入から成る。いずれの方式の場合にも、抗体価および持続期間次第でブースター注射が６ヶ月毎または１年毎に行われるであろう。投与方式はまた、患者の免疫応答のモニタリングによって判断された必要性に基づく。
【００４４】
ＡＤのより重篤な形態の治療に使用するための免疫原性Ａβフラグメントの選択
本発明がまた、ＡβのＮ末端またはＣ末端欠失形態に広域にかつ特異的に交差反応する抗体の形態の免疫応答を産生できる新規なワクチンを同定する方法を提供することを、当業者は理解するであろう。１つの実施態様においては、モルモットまたは他の齧歯類のような動物を免疫感作するために被験免疫原性Ａβフラグメント、すなわち、被験ワクチン構築物が使用されるであろう。ワクチン構築物はさらに、ペプチド構築物がタンパク質担体にコンジュゲートされたコンジュゲートを含むであろう。ワクチン構築物はまた、免疫応答の性質および／または大きさを修飾するために場合によってはアジュバントと共に投与されるであろう。免疫感作動物から得られた抗血清をＥＬＩＳＡまたは他のフォーマットで試験し、ｐＧｌｕＡβ３−４２、ｐＧｌｕＡβ１１−４２、ｐＧｌｕＡβ３−４０またはｐＧｌｕＡβ１１−４０を非限定的に含む１つ以上の欠失Ａβ形態と特異的に交差反応する構築物でワクチン接種することによって産生されたポリクローナル抗体の存在を評価した。ＡＤのより重篤な形態またはＡβの欠失形態を特徴とする関連疾患をもつ患者の治療に使用するために、広域的および特異的交差反応性を産生するワクチン構築物が選択されるであろう。該疾患においては重篤度がＡβのＮ末端欠失種の存在に正比例しており、認識スコア、遺伝子スクリーニングまたは臨床観察に基づいて同定されたＡＤのより重篤な形態を示す患者が特に治療に応答性であることを、当業者は認識および理解するであろう。
【実施例１】
【００４５】
Ａ．ペプチドおよび免疫原の調製
ここに使用したペプチドはＡβ４２を除いてＡｎａｓｐｅｃ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡから購入した。これらのペプチドの一覧を表２に示す。Ａβ４２は実施例１．Ｂ．に示したように調製した。
【００４６】
【表２】
【００４７】
Ｂ．Ａβ１−４２および他のＡβペプチドの調製
Ｒｉｎｋ Ａｍｉｄｅ ＭＢＨＡ樹脂を出発材料とし、全自動ペプチドシンセサイザーで、Ｆｍｏｃ化学プロトコルを製造業者（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）によって供与された通りに使用する固相合成によってＡβ１−４２ペプチドを調製した。組立後に、９４．５％のトリフルオロ酢酸、２．５％の１，２−エタンジチオール、１％のトリイソプロピルシランおよび２．５％のＨ２Ｏのカクテルを使用して樹脂結合ペプチドを脱保護し、樹脂から開裂した。２時間の処理後に反応物を濾過し、濃縮し、得られた油をエチルエーテルと混練した。固体生成物を濾過し、５０％酢酸／Ｈ２Ｏに溶解し、凍結乾燥した。半精製生成物の精製はＣ−１８サポート上で０．１％のＴＦＡ／Ｈ２Ｏ／アセトニトリル勾配を使用するＲＰＨＰＬＣによって完了した。画分を分析用ＨＰＬＣによって評価した。純粋な画分（＞９８％）をプールして凍結乾燥した。アミノ酸解析および質量分析によって一致を確認した。
【００４８】
すべての他のペプチドは、Ａｎａｓｐｅｃ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ ＣＡにおいて同様のＦｍｏｃ化学を使用して合成された。
【００４９】
Ｃ．Ａβ１−８−ＫＬＨコンジュゲ―トの調製
２ｍｇのＡβペプチド（８−ｍｅｒｓ）を１ｍｌの市販マレイミドコンジュゲーションバッファ（８３ｍＭのリン酸ナトリウム、０．１ＭのＥＤＴＡ、０．９ＭのＮａＣｌ、０．０２％のナトリウムアジド，ｐＨ７．２（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）に懸濁させた。市販のマレイミド活性化ＫＬＨ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）の２ｍｇのサンプルをペプチドに添加し、２５℃で４時間反応させた。１００，０００Ｄａの透析チュービングを使用しＰＢＳバッファに対して徹底的な透析を行うことによって未反応ペプチドおよび試薬からコンジュゲートを分離した。コンジュゲートに取り込まれたペプチドの量は７０時間の酸加水分解後のアミノ酸解析によって推定した。ペプチド濃度は０．２４ｍｇ／ｍｌから０．０３ｍｇ／ｍｌまでの範囲であると判定された。
【００５０】
Ｄ．ブロモアセチル化Ａβ（３−１０）（２１−２８）の合成
Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓのモデル４３０Ａの全自動シンセサイザーで、アミノ酸導入用ダブルカップリングプロトコルを使用する標準ｔ−Ｂｏｃ固相合成によってブロモアセチル化ペプチドを調製した。カルボキシ末端Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（ｉｖＤｄｅ）−ＯＨ［ｉｖＤｄｅ＝１，（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソ−シクロヘキシリデン）−３−メチル−ブチル］がＭＢＨＡ樹脂にカップリングした後に、ピペリジンを使用してα−アミノＦｍｏｃ保護基を除去し、ｔ−Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨを導入して合成を継続した。ｔ−Ｂｏｃ基の脱保護後、ＡＢＩシンセサイザーで以下のｔ−Ｂｏｃ保護アミノ酸：Ａｈａ，Ｙ，Ｇ，Ｓ，Ｄ，Ｈ，Ｒ，Ｆ，Ｅによって配列を伸長し、酢酸カップリングによってアミノ末端をキャップした。側鎖リシンＦｍｏｃ保護基をピペリジンで除去し、ＡＢＩシンセサイザーで以下の保護アミノ酸：Ａｈａ，Ｋ，Ｎ，Ｓ，Ｇ，Ｖ，Ｄ，Ｅ，Ａを導入してリシンのＮεアームを伸長し、酢酸カップリングによってアミノ末端をキャップした。ジメチルホルムアミド中の５％ヒドラジンで５分間処理することによってｉｖＤｄｅ保護基を除去すると、カルボキシ末端リシンに非ブロックのＮεアミノ基が与えられた。溶媒としてメチレンクロリド中でＮεアミノ基を無水ブロモ酢酸と３０分間反応させた。樹脂支持体からのペプチドの除去は液体フッ化水素酸およびスカベンジャーとして１０％アニソールで処理することによって行った。逆相Ｃ−１８シリカカラムで０．１％ＴＦＡ／アセトニトリル勾配を使用する分取ＨＰＬＣによってペプチドを精製した。ペプチドの一致および均質性は分析用ＨＰＬＣおよび質量分析によって確認した。
【実施例２】
【００５１】
モルモット抗Ａβペプチド血清の生成
６から１０週齢の雌のモルモットはＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｒａｌｅｉｇｈ，Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａから入手し、Ｍｅｒｃｋ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓの動物施設に収容施設の指針に従って維持した。すべての動物実験はＭｅｒｃｋ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）によって承認された。Ａβペプチドコンジュゲート、Ａβ１−８（ＭｏＶＣＡβ１−８）−ＫＬＨおよびＡβ（３−１０）（２１−２８）（ＭＶＣ）−ＯＭＰＣをそれぞれ、１００μｇ／ｍｌのＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（Ｒ）（ＣＳＬ，Ｌｔｄ．，Ｐａｒｋｖｉｌｌｅ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）および１００μｇ／ｍｌのＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（Ｒ）に４５０μｇ／ｍｌのＭｅｒｃｋアルミニウム明礬を加えたものに配合した。ペプチド含量に基づいた最終抗原濃度はＡβ１−８−ＫＬＨおよびＡβ（３−１０）（２１−２８）−ＯＭＰＣのそれぞれで８μｇ／ｍｌおよび４μｇ／ｍｌであった。２匹のモルモットに４００μｇの各コンジュゲートを４週間隔で２回筋肉内投与することによって免疫感作し、二回目の免疫感作の３週後から４週後までの間に血液サンプルを採取した。各群から採取した血清サンプルをプールし、使用するまで４℃で保存した。
【実施例３】
【００５２】
Ａβペプチドの様々な形態に対するモルモット抗血清の結合
全長ＡβペプチドおよびＮ末端欠失Ａβペプチドに対するモルモット抗血清の結合活性はエンザイムリンクトイムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって測定した。９６ウェルプレート（Ｉｍｍｕｎｏ ９６ Ｍｉｃｒｏ ＷｅｌｌＴＭ Ｐｌａｔｅ，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）に、ＰＢＳ中で４μｇ／ｍｌの濃度にした表２に示す様々なＡβペプチドをウェルあたり５０μｌの量でコートし４℃で一夜維持した。０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０（ＰＢＳＴ）を含有するＰＢＳでプレートを６回洗浄し、ＰＢＳＴ中の３％スキムミルク（ｍｉｌｋ−ＰＢＳＴ）でブロックした。モルモット抗血清はｍｉｌｋ−ＰＢＳＴ中で４倍系列希釈によって調製した。１００μｌの希釈抗血清を各ウェルに加え、プレートを室温で２時間インキュベートし、次いでＰＥＳＴで３回洗浄した。ｍｉｌｋ−ＰＢＳＴで１：５０００に希釈したＨＲＰ−コンジュゲートヤギ抗モルモット二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）をウェルあたり５０μｌの量で添加し室温で１時間インキュベートした。プレートを６回洗浄し、次いで３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）（Ｖｉｒｏｌａｂｓ，Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ，ＶＡ）をウェルあたり１００μｌの量で加えた。室温で３から５分間のインキュベーション後、ウェルあたり１００μｌの停止溶液（Ｖｉｒｏｌａｂｓ，Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ，ＶＡ）を加えて反応停止させた。プレートをＶｅｒｓａＭａｘＴＭマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）に入れ、４５０ｎｍで読取りを行った。
【００５３】
このアッセイの結果を、ＭｏＶＣ１−８およびＭＶＣに対するモルモット抗血清に対して様々なＡβペプチドを評価する図１および２のグラフに示す。グラフは各ペプチドに対して三重複で行った各被験サンプルから得られた平均吸光度を使用している。
【技術分野】
【０００１】
本発明はアミロイド原性疾患、特にアルツハイマー病を予防および治療するための組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病（ＡＤ）は、進行性の記憶障害および認識減退を特徴とする。その特徴的病変は、脳の特定領域に見られるアミロイド沈着物（老人斑）、神経原線維のもつれおよびニューロン消失である。アミロイド沈着物は４０から４３個のアミノ酸残基のアミロイドベータペプチド（Ａβ）から構成されており、これらはアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）のタンパク質分解産物である。神経原線維のもつれは高リン酸化タウタンパク質の細胞内線維状凝集塊である（Ｓｅｌｋｏｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７５：６３０−６３１，１９９７）。
【０００３】
ＡＤの発生病理は完全には解明されていないが、多要因イベントであると予測されている。脳組織内にＡβが蓄積および凝集することが疾患の進行に重要な役割を果たすと考えられており、これはアミロイドカスケード仮説としても知られている（Ｇｏｌｄｅ，Ｂｒａｉｎ Ｐａｔｈｏｌ．，１５：８４−８７ １９９５）。この仮説によれば、Ａβ、特にＡβ４２は、小さいオリゴマーから大きく細長い原線維構造までの範囲の様々な形態の凝集塊を形成する傾向がある。これらの凝集塊は神経毒性であり、疾患の初期段階の記憶消失および認識減退に関連したシナプス病理の一因であると考えられている（Ｋｌｅｉｎら，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ａｇｉｎｇ，２５ ５６９−５８０，２００４）。最近の刊行物は、トリプルトランスジェニックマウスにおいてＡβの減少が細胞内タウ沈着も防止することを示唆している（Ｏｄｄｏら，Ｐｒｏｃ．Ｎｅｕｒｏｎ，４３：３２１−３３２，２００４）。この知見は、細胞内アミロイド沈着がその後の神経原線維もつれ形成の原因であり得ること、そこからさらにニューロン消失に至り得ることを示唆している。
【０００４】
ＡＰＰトランスジェニックマウスをＡβ抗原によって免疫感作すると脳のＡβ沈着物を減少させ疾患の進行を緩和することができる。このことはＳｈｅｎｋら，Ｎａｔｕｒｅ，４００：１７３−１７７，１９９９によって最初に報告されたものであり、いまや、様々なトランスジェニック動物モデル、様々な能動ワクチン、ならびに、Ａβ特異的モノクローナル抗体による受動免疫感作を含む多くの研究によって確証されている（Ｂａｒｄら，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ，６：９１６−９１９，２０００；Ｊａｎｕｓら，Ｎａｔｕｒｅ，４０８：９７９−９８２，２０００；Ｍｏｒｇａｎら，Ｎａｔｕｒｅ，４０８：９８２−９８５，２０００；ＤｅＭａｔｔｏｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ，Ｓｃｉ．，９８：８８５０−８８５５，２００１；Ｂａｃｓｋａｉら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，２２：７８７３−７８７８，２００２；Ｗｉｌｃｏｃｋら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，２３：３７４５−３７５１，２００３）。プレ凝集Ａβ１−４２ペプチド（ＡＮ１７９２，Ｂｅｔａｂｌｏｃ）を免疫原とした能動免疫感作を予め受けていた患者から得られた死後のヒト脳組織について発表された３つの評価は、動物データに符合して、老人斑の局所的クリアランスを示した（Ｎｉｃｏｌｌら，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．，９：４４８−４５２，２００３；Ｆｅｒｒｅｒら，Ｂｒａｉｎ Ｐａｔｈｏｌ．，１４：１１−２０，２００４；Ｍａｓｌｉａｈら，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，６４：１２９−１３１，２００５）。これらのデータは総合的に、Ａβ抗原に対する抗体応答を効果的に誘発するワクチンはＡＤに見出される病的老人斑に対して有効であることを示唆する。しかしながら、ワクチンまたは抗体の有効性のメカニズムはいまだ解明されていない。
【０００５】
ＡＤの治療に能動免疫感作法を使用するための最も進んだ研究は、アジュバント，ＱＳ−２１ＴＭ（Ａｎｔｉｇｅｎｉｃｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ）と共に投与されたＡＮ１７９２（Ｂｅｔａｂｌｏｃ）を使用するフェーズＩＩ治験であった。２００２年１月に４人の患者が脳脊髄膜脳炎に符合する症状を示したときにこの研究は停止された（Ｓｅｎｉｏｒ，Ｌａｎｃｅｔ Ｎｅｕｒｏｌ．，１：３，２００２）。最終的に、治療した２９８名の患者のうちの１８名が脳脊髄膜脳炎の徴候を発生した（Ｏｒｇｏｇｏｚｏら，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，６１：４６−５４，２００３）。脳炎と抗体価との間に相関関係は存在せず、このような結末の原因と考えられるメカニズムは自己免疫原、特にＡβ４２の中央部分およびカルボキシ末端部分に対するＴ細胞の活性化であるらしいと報告された（Ｍｏｎｓｏｎｅｇｏら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１１２：４１５−４２２，２００３）。この結論の傍証として、脳炎を発生した２名のワクチンレシピエントから得られた脳組織の死後検査において、一方の患者でＣＤ４＋ Ｔ細胞（Ｎｉｃｏｌｌら，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．，９：４４８−４５２，２００３）および他方の患者でＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ３＋、ＣＤ５＋、ＣＤ７＋ Ｔ細胞（Ｆｅｒｒｅｒら，Ｂｒａｉｎ Ｐａｔｈｏｌ．，１４：１１−２０，２００４）の実質的な髄膜浸潤が明らかになった。これらの知見に部分的に立脚し、ＡβのＮ末端たとえばＡβ１−７およびＡβ１−６を標的とすればＴ細胞介在副作用イベントのない有効性が与えられるであろうという考え方に基づいて能動抗Ａβワクチンによるいくつかの臨床治験が開始された。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｓｅｌｋｏｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７５：６３０−６３１，１９９７
【非特許文献２】Ｇｏｌｄｅ，Ｂｒａｉｎ Ｐａｔｈｏｌ．，１５：８４−８７ １９９５
【非特許文献３】Ｋｌｅｉｎら，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ａｇｉｎｇ，２５ ５６９−５８０，２００４
【非特許文献４】Ｏｄｄｏら，Ｐｒｏｃ．Ｎｅｕｒｏｎ，４３：３２１−３３２，２００４
【非特許文献５】Ｓｈｅｎｋら，Ｎａｔｕｒｅ，４００：１７３−１７７，１９９９
【非特許文献６】Ｂａｒｄら，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ，６：９１６−９１９，２０００
【非特許文献７】Ｊａｎｕｓら，Ｎａｔｕｒｅ，４０８：９７９−９８２，２０００
【非特許文献８】Ｍｏｒｇａｎら，Ｎａｔｕｒｅ，４０８：９８２−９８５，２０００
【非特許文献９】ＤｅＭａｔｔｏｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ，Ｓｃｉ．，９８：８８５０−８８５５，２００１
【非特許文献１０】Ｂａｃｓｋａｉら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，２２：７８７３−７８７８，２００２
【非特許文献１１】Ｗｉｌｃｏｃｋら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，２３：３７４５−３７５１，２００３
【非特許文献１２】Ｎｉｃｏｌｌら，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．，９：４４８−４５２，２００３
【非特許文献１３】Ｆｅｒｒｅｒら，Ｂｒａｉｎ Ｐａｔｈｏｌ．，１４：１１−２０，２００４
【非特許文献１４】Ｍａｓｌｉａｈら，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，６４：１２９−１３１，２００５
【非特許文献１５】Ｓｅｎｉｏｒ，Ｌａｎｃｅｔ Ｎｅｕｒｏｌ．，１：３，２００２
【非特許文献１６】Ｏｒｇｏｇｏｚｏら，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，６１：４６−５４，２００３
【非特許文献１７】Ｍｏｎｓｏｎｅｇｏら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１１２：４１５−４２２，２００３
【発明の概要】
【０００７】
１つの実施態様において、本発明は、（ｉ）患者がアルツハイマー病（ＡＤ）のより重篤な形態を有していることを判定する段階と、（ｉｉ）免疫応答を誘発するために有効な量で、免疫原性Ａβフラグメントを投与する段階とを含む、ＡＤのより重篤な形態を有している患者の治療方法である。ＡＤのより重篤な形態を有している患者は、Ｍｉｎｉ−Ｍｅｎｔａｌ Ｓｔａｔｅ Ｅｘａｍ（ＭＭＳＥ）スコア２０以下の個人、Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ Ｓｃａｌｅ−Ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ（ＡＤＡＳ−Ｃｏｇ）スコア３５以上の個人、Ｇｌｏｂａｌ Ｄｅｔｅｒｉｏｒａｔｉｏｎ Ｓｃａｌｅ（ＧＤＳ）スコアがステージ５以上の個人、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｅｍｅｎｔｉａ Ｒａｔｉｎｇ−Ｓｕｍ ｏｆ Ｂｏｘｅｓ（ＣＤＲ−ＳＢ）スコア２以上の個人、６０歳から６４歳以下の年齢でＡＤの症状を有している個人、または、遺伝子スクリーニング後に早発型アルツハイマー病（ＥＯＡＤ）もしくは家族性ＡＤ形態を有していると診断された個人から成る群から選択される。免疫原性Ａβフラグメントは、それぞれが少なくとも１つの抗原決定基を有しており、かつＴ細胞エピトープが欠損している多様な不連続、および不一致の免疫原性Ａβフラグメントを含んでいる多価ワクチンを包含する。別の実施態様において多価ワクチンは、リシンスカフォールドによって連結されたＡβ３−１０およびＡβ２１−２８を含む。多価ワクチンはさらに、Ａβペプチドフラグメントにコンジュゲートされた担体を含み、また、場合によってはアジュバントと共に投与され得る。
【０００８】
別の実施態様において本発明は、アルツハイマー病（ＡＤ）のより重篤な形態を有している患者の治療に適切なワクチン構築物として使用するための免疫原性Ａβフラグメントの選択方法であり、該方法は、（ｉ）免疫応答を誘発するために有効な量で被験免疫原性Ａβフラグメントを動物に投与する段階と、（ｉｉ）免疫感作動物から得られた抗血清をＡβのＮ末端欠失形態に対する交差反応性について評価する段階とを含む。該方法において、Ａβの１つ以上のＮ末端欠失形態に特異的な抗体の形態で免疫応答を誘発できる構築物が適切なワクチン構築物として選択される。ＡβのＮ末端欠失形態は、Ａβｘ−４２、ｐＧｌｕ−Ａβ３−４０、ｐＧｌｕ−Ａβ３−４２、ｐＧｌｕ−Ａβ１１−４０およびｐＧｌｕ−Ａβ１１−４２から成る群から選択され、ここにｘは、天然に存在するＡβの残基２から１７に対応する。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】担体としてＫＬＨにコンジュゲートされＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（Ｒ）と共に投与されたＡβ１−８（ＭｏＶＣ１−８）のペプチドコンジュゲートで免疫感作した動物から得られた抗血清の系列希釈物から検出された抗体を表す。
【図２】担体としてＯＭＰＣにコンジュゲートされＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（Ｒ）と共に投与された多価ワクチン（Ａβ３−１０／Ａβ２１−２８）（ＭＶＣ）で免疫感作した動物から得られた抗血清の系列希釈物から検出された抗体を表す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
「８−ｍｅｒ」という用語は、Ａβのフラグメント、天然Ａβペプチドの類似体またはペプチド模擬体に対応する８アミノ酸のペプチドを意味する。多価直鎖状ペプチドを形成するためまたは多価分枝状ＭＡＰを形成するために１つ以上の８−ｍｅｒが少なくとも１つのスペースに組合せられるであろう。
【００１１】
「Ａβコンジュゲート」という用語は、キーホールリンペットヘモシアニンまたはＮｅｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの外膜タンパク質複合体（ＯＭＰＣ）のような担体に化学的または生物学的に連結されているＡβの８−ｍｅｒまたは免疫原性Ａβフラグメントを意味する。
【００１２】
「Ａβペプチド」という用語は、ここでワクチン構築物中に使用された合成Ａβペプチドのいずれかを（天然に存在するアミロイドベータペプチド（Ａβ）に比較して）意味しており、非限定的に、直鎖状８−ｍｅｒ、少なくとも１つのスペーサーをもつ多価直鎖状ペプチドおよび多価分枝状多抗原性ペプチド（ＭＡＰ）を含む。
【００１３】
「エピトープ」という用語は、Ｂおよび／またはＴ細胞応答の対象となる抗原上の部位を表す。Ｂ細胞エピトープは連続アミノ酸からまたはタンパク質の三次折畳みによって並置された不連続アミノ酸から形成できる。連続アミノ酸から形成されたエピトープは典型的には変性溶媒に接触したときに保存されているが、三次折畳みによって形成されたエピトープは典型的には変性溶媒で処理したときに消失する。Ｔ細胞エピトープは宿主ＭＨＣ分子と共に複合体を形成できるペプチドから成る。ヒトＭＨＣクラスＩ分子に対するＴ細胞エピトープはＣＤ８＋ Ｔ細胞応答の誘発を担当しており、一般に９から１１個のアミノ酸残基を含んでいる。他方、ヒトＭＨＣクラスＩＩに対するエピトープはＣＤ４＋ Ｔ細胞応答を担当し、典型的には１２以上のアミノ酸残基を含んでいる（Ｂｊｏｒｋｍａｎら，Ｎａｔｕｒｅ ３２９：５０６−５１２，１９８７；Ｍａｄｄｅｎら，Ｃｅｌｌ ７５：６９３−７０８；Ｂａｔａｌｉａ ａｎｄ Ｃｏｌｌｉｎｓ；Ｅｎｇｅｌｈａｒｄ Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２：１８１−２０７−６２２．１９９５；Ｍａｄｄｅｎ，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３：５８７−６２２．１９９５）。Ｔ細胞と違ってＢ細胞は長さ４アミノ酸という小さいペプチドを認識できる。Ｔ細胞活性化に導くＴ細胞受容体によって認識されるのはＴ細胞エピトープ／ＭＨＣ複合体である。
【００１４】
「多価ペプチド」という用語は、２つ以上の抗原決定基を有しているペプチドを表す。
【００１５】
「多価ワクチン」または「ＭＶＣ」という用語は、それぞれが１つの抗原決定基を有しておりかつＴ細胞エピトープが欠損している多様なＡβペプチドから成るワクチン構築物を意味する。１つの実施態様において多価ワクチンは、それぞれのＴ細胞エピトープが欠損している不連続で不一致な２つの免疫原性Ａβフラグメント、たとえば、Ａβ３−１０およびＡβ２１−２８を含む。
【００１６】
「免疫原性Ａβフラグメント」または「Ｔ細胞エピトープが欠損している免疫原性Ａβフラグメント」という用語は、Ａβに対する抗体の形態で免疫応答を誘発できるがその応答が自己抗原Ａβに対するＴ細胞応答を含まない８−ｍｅｒまたはＡβフラグメントを意味する。
【００１７】
「免疫学的」または「免疫性」または「免疫原性」応答という用語は、脊椎動物体内の抗原に対する体液性（抗体に媒介された）および／または細胞性（抗原特異的Ｔ細胞またはそれらの分泌産物によって媒介された）応答の発生を表す。このような応答は、免疫原の投与によって誘発された能動応答または抗体の投与によって誘発された受動応答であり得る。
【００１８】
「ＡＤのより重篤な形態」という用語は、同年齢の対照非ＡＤ患者に比較してより進行したニューロン変性またはより進行した臨床病理に関連したＡＤの何らかの形態を有している患者を表す。このような患者は非限定的に、Ｍｉｎｉ−Ｍｅｎｔａｌ Ｓｔａｔｅ Ｅｘａｍ（ＭＭＳＥ）スコア２０以下の個人、Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ Ｓｃａｌｅ−Ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ（ＡＤＡＳ−Ｃｏｇ）スコア３５以上の個人、Ｇｌｏｂａｌ Ｄｅｔｅｒｉｏｒａｔｉｏｎ Ｓｃａｌｅ（ＧＤＳ）スコアがステージ５以上の個人、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｅｍｅｎｔｉａ Ｒａｔｉｎｇ−Ｓｕｍ ｏｆ Ｂｏｘｅｓ（ＣＤＲ−ＳＢ）スコア２以上の個人、６０歳から６４歳以下の年齢でＡＤ症状を有している個人、または、遺伝子スクリーニング後に早発型アルツハイマー病（ＥＯＡＤ）もしくは家族性ＡＤ形態特にＰＳ−１突然変異に関連した形態を有すると診断された個人、または、Ａβの病原性沈着物を特徴とするＡＤの形態を有している患者を含む。
【００１９】
「アミロイドベータペプチド（Ａβ）の病原性沈着物」または「Ａβの病原性沈着物」という用語は、Ａβの神経毒性形態たとえばＡβ４２、または、より多くのニューロン変性もしくはより重篤な臨床表現型に関連することが判っているＡβのＮ末端もしくはＣ末端欠失形態を含むプラーク沈着物を意味する。Ａβのこのような形態は非限定的に、Ａβ４０、Ａβ４２、ＡβのＮ末端欠失形態たとえばＡβｘ−４２［ここにｘは天然に存在するＡβの残基２−１７に対応する］、および、末端アミノ酸の環化たとえばＮ末端グルタメートの環化によって修飾されたＡβの欠失形態ｐＧｌｕＡβ３−４２またはｐＧｌｕＡβ１１−４２を含む。
【００２０】
「Ａβの病原性沈着物に特異的な抗体」という用語は、全長Ａβ４０もしくはＡβ４２、ＡβのＮ末端欠失形態、または、ｐＧｌｕＡβ３−４２もしくはｐＧｌｕＡβ１１−４２のような末端アミノ酸に修飾を有しているＡβのＮ末端もしくはＣ末端欠失形態を含むＡβの神経毒性形態に交差反応性である抗体を表す。
【００２１】
「医薬組成物」という用語は、哺乳類個体に投与するための適切な化学的または生物学的組成物を意味する。ここに使用したこの用語は、場合によりアジュバントと共にまたはアジュバントなしで投与されるここに記載の８−ｍｅｒ、免疫原性ＡβフラグメントおよびＡβコンジュゲートを含む組成物を表す。
【００２２】
アミロイドベータペプチド（Ａβ）の病原性沈着物
ＡＤ患者の脳内に沈着したＡβが構造的に均質でないことはますます多くの証拠によって示唆されている（Ｓａｉｄｏら，Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｅｔｔｅｒｓ，２１５：１７３−１７６，１９９６）。Ａβ４０およびＡβ４２のような全長アミロイドベータペプチド（Ａβ）の多様な形態に加えて、ペプチドのＮ末端およびＣ末端に修飾を有しているＡβの多様な欠失形態が検出された（Ｒｕｓｓｏら，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ，４０９：４１１−４１６，１９９７；Ｓａｉｄｏ １９９６）。これらの欠失Ａβ形態がＡＤの発生に極めて重要であるという考えがますます有力になっている（Ｐｉｃｃｉｎｉら，Ｊ，Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，，２８０（４０）：３４１８６−３４１９２，２００５）。これらの欠失Ａβ形態のうちでも、残基Ｇｌｕ３またはＧｌｕ１１のピログルタミルから開始するＮ末端欠失ペプチドが優勢に存在する（Ｒｕｓｓｏ，１９９７）。ｐＧｌｕ３形態（Ａβ３（ｐＥ）−４２）が特に顕著であり、Ａβ全体の約５０％を構成する（Ｙｏｕｓｓｅｆら，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ａｇｉｎｇ，２９：１３１９−１３３３，２００８）。
【００２３】
これらのＮ末端欠失形態は、孤発性ＡＤであると診断された患者の脳、早発型家族性ＡＤ（ＥＯＡＤ）の患者、極めて特定的にはプレセニリン−１（ＰＳ−１）突然変異を有する患者、および、ダウン症候群（ＤＳ）である患者において早期に蓄積することが知見された（Ｒｕｓｓｏら，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，４０９：４１１−４１６，１９９７；Ｓａｉｄｏら，Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．，２１５：１７３−１７６，１９９６；Ｔｅｋｉｒｉａｎら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．Ｅｘ．Ｎｅｕｒｏｌ．，５７：７６−９４，１９９８）。孤発性遅発型ＡＤ（ＬＯＡＤ）の患者が突然変異を有していないことに比較して、ＰＳ−１突然変異によって推進されたＥＯＡＤをもつ個人では典型的には６０歳から６４歳以前に疾患症状が発生する。さらに、ダウン症候群である患者も染色体２１の過剰コピー（ｅｘｔｒａ ｃｏｐｙ）に起因するＥＯＡＤを発生する。ＡＤ何らかの遺伝性形態に関連した遺伝子が同じ染色体２１に局在しており、ＡＰＰの３０％増およびＡβ産生の増加に導くからである。家族性デンマーク認知症は早発型認知症の別の形態であり、ｐｙｒｏＧｌｕでＮ末端修飾されたＡβが多くの割合で存在すること、ほぼ全部を占めていることを特徴とする（Ｔｏｍｉｄｏｋｏｒｏら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８０（４４）：３６８８３−３６８９４，２００５）。ＰＳ−１突然変異またはＤＳに起因するＥＯＡＤを有している個人はＬＯＡＤに比較して有意に多いｐＧｌｕＡβ３−４２を脳内に含んでいる（Ｒｕｓｓｏ，１９９７；Ｒｕｓｓｏら，Ｎａｔｕｒｅ，４０５：５３１−５３２，２０００；Ｒｕｓｓｏら，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ｄｉｓ．，８：１７３−１８０，２００１；Ｈｏｓｏｄａら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．，５７：１０８９−１０９５，１９９８）。より重要なことは、死後組織分析から判断して、大きい割合のＮ末端欠失形態、特に優勢なｐＧｌｕＡβ３−４２形態を有している患者は、ニューロン変性の程度および臨床病理の重篤度の双方の観点で疾患がより重篤であると考えられることである（Ｒｕｓｓｏ，１９９７；Ｒｕｓｓｏ ２０００）。
【００２４】
ＡＤまたは認知症の個人の評価は一般に、いくつかの形態の精神的または認識的評価を含み、これらはＡｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ Ｓｃａｌｅ−Ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ（ＡＤＡＳ−Ｃｏｇ）、Ｇｌｏｂａｌ Ｄｅｔｅｒｉｏｒａｔｉｏｎ Ｓｃａｌｅ（ＧＤＳ）、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｅｍｅｎｔｉａ Ｒａｔｉｎｇ−ｓｕｍｍａｒｙ ｏｆ ｂｏｘｅｓ（ＣＤＲ−ＳＢ）、またはより典型的にＭｉｎｉ−Ｍｅｎｔａｌ Ｓｔａｔｅ Ｅｘａｍ（ＭＭＳＥ）を含む様々な方法によって行うことができる。ＭＭＳＥスコアは最大値３０を有しており、スコア全体は、軽度（２１−２６）、中等度（１５−２０）および重度（１４以下）に分類される。ＡＤＡＳ−Ｃｏｇスコアは、０（考えられる最良）から７０（考えられる最悪）までの範囲であり、ほぼ２３というスコアが軽度の障害の限界点であり、約３５以上のスコアが中等度以上の障害に相関している。ＣＤＲのスコアは最大値４であり、スコアは、正常（０）、軽度（０．５−１）、中等度（２）および重度（３−４）として分類される。同様に、ＧＤＳのスコアは、ステージ１（最良）からステージ７（最悪）の範囲であり、グレード４がＡＤＡＳ−Ｃｏｇスコアの約２２．５の軽度の障害と同等であり、ステージ５がＡＤＡＳ−Ｃｏｇスコアの約３５の中等度の障害と同等である。ＡＤおよび認知症に関係付けたＭＭＳＥの概要については、Ｆｏｌｓｔｅｉｎら，Ｊ．Ｐｓｙｃｈｉａｔ．Ｒｅｓ．，１２：１８９−１９８，１９７５を参照するとよい。ＡＤＡＳ−Ｃｏｇ、ＭＭＳＥおよびＧＤＳのスコア結果および妥当性の比較については、Ｄｏｒａｉｓｗａｍｙら，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，４８（６）：１５１１−１５１７，１９９７を参照するとよい。臨床治験における有効性の評価に使用するためにＡＤＡＳ−ＣｏｇおよびＭＭＳＥが一般的に採択されている。考察すべき別の要因は、個人の家族履歴、すなわち、別の一人の（または複数の）極めて近縁の家族構成員が重篤であると考えられるＡＤ形態を有していたかということである。ＦＡＤ突然変異に起因するＥＯＡＤの存在を確認するために患者の白血球から得られたゲノムＤＮＡの配列解析を行うことが可能であった（Ｆｉｎｃｋｈら，Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．，６６：１１０−１１７，２０００）。したがって、ＥＯＡＤまたはＦＡＤのようなＡＤまたは認知症の若年性侵襲的形態を有している個人、特に年齢６０歳から６４歳以下の個人またはＭＭＳＥスコア結果が２０以下の個人はＡＤのより重篤な形態を有していると考えられ、Ｎ末端欠失形態を含む病原性アミロイド沈着物を特徴とするプラークを有していると予測され、本発明の多価ワクチンの候補者であろう。
【００２５】
出願人らはここに、多様な免疫原性Ａβフラグメントを含むワクチン構築物がＡβのＮ末端欠失形態に関連したＡＤのより重篤な形態を有しているＡＤ患者を治療するためのより効果的な手段を提供することを知見した。多価ワクチンは、ＡＤに関連したＡβの全長形態だけでなくＡβのＮ末端欠失形態も含むプラークをもつＡＤの形態を有している患者を治療できる広域スペクトルワクチンである。本発明の多価ワクチンは、神経毒性Ａβの多様な多数の形態、特にＮ末端欠失形態と交差反応できる。出願人はここに、Ｔ細胞エピトープの欠損した多様な不連続、不一致の免疫原性Ａβフラグメントを含む多価ワクチンがＡＤ、特にニューロン変性および臨床病理の観点からより重篤な疾患形態に相関することが判っているＡβ種を有しているＡＤ患者を治療するためにより効果的に使用できることを初めて証明した。
【００２６】
ＡＤのより重篤な形態を治療するためのワクチン構築物
出願人はここに、ここで多価ワクチンと呼ぶＴ細胞エピトープの欠損した多免疫原性Ａβフラグメントを含むワクチン構築物がＡＤのより重篤な形態を有している患者、具体的にはＡβのＮ末端欠失形態を含む病原性Ａβ沈着物を有している患者を治療するための広域スペクトルワクチンを提供できることを知見した。文献に報告された他の抗Ａβワクチン構築物は単一の免疫原性Ａβフラグメントを対象とすると考えられるので、本発明はＡβのＮ末端欠失形態の存在に相関することが判っているＡＤの形態を標的とする利点およびより効果的なワクチンを提供する。
【００２７】
関連の同時係属出願において出願人らは、ＡＤを治療するために、免疫原性Ａβフラグメントを含みＴ細胞エピトープが欠損しておりＡβに対する抗体の形態で有益な免疫応答を誘発できるペプチドコンジュゲートを使用する組成物および方法を記載した（ＰＣＴ／ＵＳ ２００６／０１６４８１，ＷＯ ２００６／１２１６５６；ＵＳＳＮ １１／９１９，８９７，ＵＳ ２００９−００９８１５５、それらの教示は詳細に説明された通りにここに組込まれるものとする）。それらの出願におけるワクチン組成物は、８アミノ酸（８−ｍｅｒ）の大きさに限定された免疫原性Ａβフラグメントから成り、潜在し得るＣ末端Ｔ細胞エピトープアンカー残基を完全に除去するように設計された。免疫原性Ａβフラグメントは８−ｍｅｒの直鎖状ペプチド、少なくとも１つのＰＥＧスペーサーを有している多価直鎖状Ａβコンジュゲート、または、多価分枝状多抗原性ペプチド（ＭＡＰ）であり得る。好ましい実施態様においてワクチン構築物は、リシンスカフォールドに連結されたＡβ３−１０およびＡβ２１−２８を含む分枝状ＭＡＰである。
【００２８】
それらの出願においてＡＤを治療するための能動免疫感作法に使用されるワクチン構築物は医薬組成物の形態で投与でき、該組成物中の免疫原性ＭＡＰフラグメントは、血清アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、免疫グロブリン分子、オバルブミン、破傷風トキソイドタンパク質、または、ジフテリア、Ｅ．ｃｏｌｉ、コレラもしくはＨ．ｐｙｌｏｒｉなどの他の病原性細菌のトキソイド、または、弱毒した毒素誘導体のような担体に化学的または生物学的に連結できる。好ましい実施態様において、担体はＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの外膜タンパク質複合体（ＯＭＰＣ）である。
【００２９】
それらの出願においてＡＤを治療するための能動免疫感作法に使用されるワクチン構築物は、アルミニウム塩（明礬）、脂質たとえば３−デ−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡ（３Ｄ−ＭＰＬ）またはサポニン基剤のアジュバントのようなアジュバントと共に投与され得る。好ましい実施態様において、アジュバントはサポニン基剤のアジュバントＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（Ｒ）（ＣＳＬ Ｌｔｄ，Ｐａｒｋｖｉｌｌｅ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）である。
【００３０】
出願人らはここに、それらの出願におけるペプチドコンジュゲートの１つの好ましい実施態様、すなわち、リシンスカフォールドで連結されたＡβ３−１０およびＡβ２１−２８を含みＯＭＰＣにコンジュゲートされた分枝状ＭＡＰを含む多価ワクチンがいまやＡＤ治療用の広域スペクトル能動ワクチンを提供することを意外にも知見した。この多価ワクチン（ＭＶＣ）の構造を以下に示す：
【００３１】
【化１】
式中の「Ａｈａ」は６−アミノヘキサン酸を表し、「ＢｒＡｃ」はブロモアセチルを表す。
【００３２】
出願人らはここに、この広域スペクトルＭＶＣが現在臨床評価を行っている他の能動ワクチン法に比べて利点を与えることを示した。この多価ワクチンは、多様なＡβの形態、特にＡＤのより重篤な形態に関連したＮ末端欠失Ａβ形態と特異的に交差反応する抗体の形態で免疫応答を与えることを示しただけでなく、Ａβ１−８ワクチンがＡβｘ−４２に対してｘ≧３のときにいかなる免疫応答も産生しなかったことに比較してより強力な免疫応答を提供する。したがって、本発明の多価ワクチンは、ＡβのＮ末端欠失形態に対して臨床考察下の他の能動ワクチンよりも良好な免疫原性、すなわちより広域な応答スペクトルを提供できる。
【００３３】
ＡＤのより重篤な形態を治療するための治療薬
出願人らは、多価ワクチン構築物、すなわち、リシンスカフォールドを介して連結されたＡβ３−１０およびＡβ２１−２８を含む分枝状ＭＡＰ（この文中では多価ワクチン構築物−ＭＶＣとして表す）を担体（ＯＭＰＣ）にコンジュゲートしサポニン基剤のアジュバントＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（Ｒ）と共に投与してモルモットを免疫感作した。免疫感作動物はポリクローナル抗体の形態の免疫応答を産生した。動物から血清を採取し、抗血清を系列希釈し、全長Ａβ４０およびＡβ４２、表１に示したＡβのＮ末端欠失形態を含むＡβの多様な形態に対する交差反応性を試験した。
【００３４】
同様にして出願人らは、天然に存在するＡβのアミノ酸残基１−８に対応する合成一価Ａβペプチド（この文中では一価ワクチン構築物−ＭｏＶＣ１−８として表す）を担体（ＫＬＨ）にコンジュゲートしサポニン基剤のアジュバントＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（Ｒ）と共に投与してモルモットを免疫感作した。情報を信用するならば、現在臨床評価を行っている他の能動ワクチンはＣＲＭ１９７またはＶＬＰにそれぞれコンジュゲートされたＡβ１−７およびＡβ１−６に対応する同様の一価ワクチン構築物を使用していると考えられる。Ａβ１−７／ＣＲＭ１９７ワクチン構築物はサポニン基剤のアジュバントＱＳ−２１と共に投与すべきであると考えられているが、Ａβ１−６／ＶＬＰ構築物はアジユバントと共に投与されない。
【００３５】
現在臨床治験中のＡＤに対する能動ワクチンは、Ａβ配列のＮ末端残基１を含み、６から７アミノ酸の長さである。これに対照的に、出願人が利用したＭＶＣは、Ａβ残基３に対応しており残基１０で終結する１つの免疫原性Ａβフラグメントと残基２１に対応しており残基２８で終結する第二の免疫原性Ａβフラグメントとを含む。ここに証明したように、このＭＶＣは、Ａβ残基１で開始するペプチドを使用する他の能動ワクチン法に比較してより多様なＮ末端欠失Ａβ形態を認識する。何らかの理論に束縛されることは望んでいないが、ＷＯ ２００６／１２１６５６に記載された他の多価ワクチン構築物は同様の特異性で作用すると考えられる。多価８−ｍｅｒ抗原を使用するとき、ここに記載のようなワクチン構築物に組込むことができるいずれかのフラグメント長が抗原特異的Ｔ細胞応答を刺激することなく所望のポリクローナル応答を産生するならば、該フラグメント長に相当する応答が産生されるであろうことを、当業者は認識および理解するであろう。したがって、ここに記載の発明は代替実施態様において７−ｍｅｒ、６−ｍｅｒ、５−ｍｅｒおよび４−ｍｅｒを非限定的に含むＡβフラグメントを含むことができよう。
【００３６】
ここに記載の実験に着手する前に出願人らはワクチン構築物の組成に基づいて、全長形態またはＮ末端欠失形態のいずれのＡβ形態がワクチン接種した動物から得られた抗血清と交差反応するかについて予測を試みた。これらの予測を、多価ワクチン構築物（Ａβ３−１０／Ａβ２１−２８）（ＭＶＣ）および一価ワクチン構築物（Ａβ１−８（ＭｏＶＣ１−８）から得られた抗血清と交差反応した実際の種に比較して表１に示す。また、Ａβの各形態の交差反応性の程度を図１および図２に示す。図１および図２から明らかなように、ここに記載のＭＶＣは、ＭｏＶＣ１−８構築物に比較してより多い種類のＮ末端修飾Ａβペプチドを認識しただけでなく、疾患の最も重篤な形態に最も関連した形態、具体的にはｐＧｌｕ３Ａβ３−４２に対してより高度な交差反応性を有していた。極めて簡潔ではあるがこのデータは、多価ワクチンが８アミノ酸以下のペプチドから成るワクチンに比較して、遊離Ｎ末端で開始する欠失形態（Ａβ１−ｘ）に結合できる抗体を誘発する見込みが高いことを証明する。
【００３７】
【表１】
【００３８】
いくつかのＮ末端欠失Ａβペプチドは残基１で開始するペプチドに比較してより高度に毒性であるかまたは同等に毒性であるが、特に１つのペプチド、すなわち、残基３で開始しグルタミニルシクラーゼによって修飾されたｐｙｒｏｇｌｕ３Ａβ（ｐＧｌｕ３Ａβ３−４２）と命名されたＡβは数桁も高い毒性を示す。この欠失Ａβ形態の優勢な存在がニューロン変性の強度および臨床表現型の重篤度に正比例することが判明した（Ｙｏｕｓｓｅｆら，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ａｇｉｎｇ，２９：１３１９−１３３３，２００８）。出願人らは、一価ワクチン（ＭｏＶＣ１−８）による免疫感作後に生成された哺乳動物の血清が毒性種ｐＧｌｕ３Ａβ３−４２と交差反応しないことを証明した。臨床治験で現在使用されているもっと短いペプチド免疫原（Ａβ１−７およびＡβ１−６）もまたｐＧｌｕ３Ａβ３−４２形態を認識できないであろうことも、当業者は理解および認識するであろう。Ａβ３−８およびＡβ２１−２８を含むワクチンのような他の多価ワクチンによる免疫感作がＡβのＮ末端欠失形態および最も普通に見られるＣ末端欠失形態である−３８、−４０および−４２を含む様々なカルボキシ末端で終結する形態を認識することも予測されるであろう。
【００３９】
この交差反応性によって証明されたように、特許請求した発明は、アルツハイマー病脳のプラーク中に存在する多様なＮ末端欠失Ａβ形態の存在に起因するＡＤのより重篤な形態という臨床上の問題に取組んだものである。何らかの理論に束縛されることは望んでいないが、現在臨床評価が行われているようなＮ末端残基１を含み６または７アミノ酸の長さに限定されたペプチドを使用しているＡＤワクチンに対して考えられる１つの限界は、恐らくはこれらのワクチンがインビボのこれらの限られたＡβ形態に対してのみ、具体的にはＮ末端残基を含んでいたＡβ形態に対してのみ免疫応答を産生していたことである。好ましい形態においては、ＡＤワクチンが残基１を含む形態に加えてすべてのＮ末端欠失Ａβ形態に特異的に交差反応する抗体の形態で免疫応答を誘発することが望ましいであろう。ＡβのＮ末端欠失形態はＡＤのより重篤な形態に相関しているので、このようなより広域の認識はもっと広い臨床集団に使用できると期待される。したがって、ここに特許請求した発明、すなわち、すべてのＮ末端欠失Ａβ形態を認識するＡβ３−１０およびＡβ２１−２８に対応する免疫原性Ａβフラグメントから成るワクチンを代表例とする多価ワクチンの使用が、ＡＤのより重篤な形態を有しているＡＤ患者に対して、Ｎ末端残基１を含むＡβ形態を認識するだけの一価ワクチンから与えられるよりも有効な治療効果を与えるであろうことを、当業者は理解および認識するであろう。この理論的根拠によって、Ａβ１−６またはＡβ１−７によって免疫感作された患者はＭＶＣでワクチン接種された患者と同じ程度には保護されないであろう。特にＡβのＮ末端欠失形態の毒性作用を防御できないであろう。
【００４０】
治療方式
ＡＤのより重篤な形態および他のアミロイド疾患を治療的に処置するためのここに記載の多価ワクチンの有効用量は、投与手段、標的部位、患者の生理的状態、投与される他の医薬、処置が治療的すなわち疾患症状の発生後であるかまたは予防的すなわち疾患症状の発生防止のためであるか、を非限定的に含む多くの要因に従って様々に変更されるであろう。好ましい実施態様においては患者がヒトであり、治療薬は注入によって投与されることになる。
【００４１】
免疫原または治療薬の使用すべき量はまた、アジュバントが同時にまたは順次に投与されるか否かにも左右され、アジュバントが使用されないときにはより高い用量で使用される。
【００４２】
免疫原または治療薬の使用すべき量は変わるが、ヒトに使用する場合には一回の注入あたり０．５から５０μｇのペプチド（Ａβペプチド含量を基準とする）という範囲の量が考えられる。ここに記載のタイプの抗原を含む組成物をどのように配合するかは当業者に周知であろう。
【００４３】
投与方式は、一次免疫感作とその後に設定間隔毎に行うブースター注射とから成る。一次免疫感作とブースター免疫感作との間の間隔、複数のブースター注射間の間隔、ブースター免疫感作の回数は、ワクチンによって誘発された抗体価および持続期間に従属するであろう。また、抗体応答の機能的有効性、すなわち、ＡＤ発生を予防するためまたはＡＤ患者の治療効果を発揮するために必要な抗体価のレベルにも左右されるであろう。典型的な方式は、１、２および６カ月目に行う初回注入セットから成る。別の方式は１および２カ月目に行う初回注入から成る。いずれの方式の場合にも、抗体価および持続期間次第でブースター注射が６ヶ月毎または１年毎に行われるであろう。投与方式はまた、患者の免疫応答のモニタリングによって判断された必要性に基づく。
【００４４】
ＡＤのより重篤な形態の治療に使用するための免疫原性Ａβフラグメントの選択
本発明がまた、ＡβのＮ末端またはＣ末端欠失形態に広域にかつ特異的に交差反応する抗体の形態の免疫応答を産生できる新規なワクチンを同定する方法を提供することを、当業者は理解するであろう。１つの実施態様においては、モルモットまたは他の齧歯類のような動物を免疫感作するために被験免疫原性Ａβフラグメント、すなわち、被験ワクチン構築物が使用されるであろう。ワクチン構築物はさらに、ペプチド構築物がタンパク質担体にコンジュゲートされたコンジュゲートを含むであろう。ワクチン構築物はまた、免疫応答の性質および／または大きさを修飾するために場合によってはアジュバントと共に投与されるであろう。免疫感作動物から得られた抗血清をＥＬＩＳＡまたは他のフォーマットで試験し、ｐＧｌｕＡβ３−４２、ｐＧｌｕＡβ１１−４２、ｐＧｌｕＡβ３−４０またはｐＧｌｕＡβ１１−４０を非限定的に含む１つ以上の欠失Ａβ形態と特異的に交差反応する構築物でワクチン接種することによって産生されたポリクローナル抗体の存在を評価した。ＡＤのより重篤な形態またはＡβの欠失形態を特徴とする関連疾患をもつ患者の治療に使用するために、広域的および特異的交差反応性を産生するワクチン構築物が選択されるであろう。該疾患においては重篤度がＡβのＮ末端欠失種の存在に正比例しており、認識スコア、遺伝子スクリーニングまたは臨床観察に基づいて同定されたＡＤのより重篤な形態を示す患者が特に治療に応答性であることを、当業者は認識および理解するであろう。
【実施例１】
【００４５】
Ａ．ペプチドおよび免疫原の調製
ここに使用したペプチドはＡβ４２を除いてＡｎａｓｐｅｃ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡから購入した。これらのペプチドの一覧を表２に示す。Ａβ４２は実施例１．Ｂ．に示したように調製した。
【００４６】
【表２】
【００４７】
Ｂ．Ａβ１−４２および他のＡβペプチドの調製
Ｒｉｎｋ Ａｍｉｄｅ ＭＢＨＡ樹脂を出発材料とし、全自動ペプチドシンセサイザーで、Ｆｍｏｃ化学プロトコルを製造業者（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）によって供与された通りに使用する固相合成によってＡβ１−４２ペプチドを調製した。組立後に、９４．５％のトリフルオロ酢酸、２．５％の１，２−エタンジチオール、１％のトリイソプロピルシランおよび２．５％のＨ２Ｏのカクテルを使用して樹脂結合ペプチドを脱保護し、樹脂から開裂した。２時間の処理後に反応物を濾過し、濃縮し、得られた油をエチルエーテルと混練した。固体生成物を濾過し、５０％酢酸／Ｈ２Ｏに溶解し、凍結乾燥した。半精製生成物の精製はＣ−１８サポート上で０．１％のＴＦＡ／Ｈ２Ｏ／アセトニトリル勾配を使用するＲＰＨＰＬＣによって完了した。画分を分析用ＨＰＬＣによって評価した。純粋な画分（＞９８％）をプールして凍結乾燥した。アミノ酸解析および質量分析によって一致を確認した。
【００４８】
すべての他のペプチドは、Ａｎａｓｐｅｃ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ ＣＡにおいて同様のＦｍｏｃ化学を使用して合成された。
【００４９】
Ｃ．Ａβ１−８−ＫＬＨコンジュゲ―トの調製
２ｍｇのＡβペプチド（８−ｍｅｒｓ）を１ｍｌの市販マレイミドコンジュゲーションバッファ（８３ｍＭのリン酸ナトリウム、０．１ＭのＥＤＴＡ、０．９ＭのＮａＣｌ、０．０２％のナトリウムアジド，ｐＨ７．２（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）に懸濁させた。市販のマレイミド活性化ＫＬＨ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）の２ｍｇのサンプルをペプチドに添加し、２５℃で４時間反応させた。１００，０００Ｄａの透析チュービングを使用しＰＢＳバッファに対して徹底的な透析を行うことによって未反応ペプチドおよび試薬からコンジュゲートを分離した。コンジュゲートに取り込まれたペプチドの量は７０時間の酸加水分解後のアミノ酸解析によって推定した。ペプチド濃度は０．２４ｍｇ／ｍｌから０．０３ｍｇ／ｍｌまでの範囲であると判定された。
【００５０】
Ｄ．ブロモアセチル化Ａβ（３−１０）（２１−２８）の合成
Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓのモデル４３０Ａの全自動シンセサイザーで、アミノ酸導入用ダブルカップリングプロトコルを使用する標準ｔ−Ｂｏｃ固相合成によってブロモアセチル化ペプチドを調製した。カルボキシ末端Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（ｉｖＤｄｅ）−ＯＨ［ｉｖＤｄｅ＝１，（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソ−シクロヘキシリデン）−３−メチル−ブチル］がＭＢＨＡ樹脂にカップリングした後に、ピペリジンを使用してα−アミノＦｍｏｃ保護基を除去し、ｔ−Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨを導入して合成を継続した。ｔ−Ｂｏｃ基の脱保護後、ＡＢＩシンセサイザーで以下のｔ−Ｂｏｃ保護アミノ酸：Ａｈａ，Ｙ，Ｇ，Ｓ，Ｄ，Ｈ，Ｒ，Ｆ，Ｅによって配列を伸長し、酢酸カップリングによってアミノ末端をキャップした。側鎖リシンＦｍｏｃ保護基をピペリジンで除去し、ＡＢＩシンセサイザーで以下の保護アミノ酸：Ａｈａ，Ｋ，Ｎ，Ｓ，Ｇ，Ｖ，Ｄ，Ｅ，Ａを導入してリシンのＮεアームを伸長し、酢酸カップリングによってアミノ末端をキャップした。ジメチルホルムアミド中の５％ヒドラジンで５分間処理することによってｉｖＤｄｅ保護基を除去すると、カルボキシ末端リシンに非ブロックのＮεアミノ基が与えられた。溶媒としてメチレンクロリド中でＮεアミノ基を無水ブロモ酢酸と３０分間反応させた。樹脂支持体からのペプチドの除去は液体フッ化水素酸およびスカベンジャーとして１０％アニソールで処理することによって行った。逆相Ｃ−１８シリカカラムで０．１％ＴＦＡ／アセトニトリル勾配を使用する分取ＨＰＬＣによってペプチドを精製した。ペプチドの一致および均質性は分析用ＨＰＬＣおよび質量分析によって確認した。
【実施例２】
【００５１】
モルモット抗Ａβペプチド血清の生成
６から１０週齢の雌のモルモットはＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｒａｌｅｉｇｈ，Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａから入手し、Ｍｅｒｃｋ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓの動物施設に収容施設の指針に従って維持した。すべての動物実験はＭｅｒｃｋ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）によって承認された。Ａβペプチドコンジュゲート、Ａβ１−８（ＭｏＶＣＡβ１−８）−ＫＬＨおよびＡβ（３−１０）（２１−２８）（ＭＶＣ）−ＯＭＰＣをそれぞれ、１００μｇ／ｍｌのＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（Ｒ）（ＣＳＬ，Ｌｔｄ．，Ｐａｒｋｖｉｌｌｅ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）および１００μｇ／ｍｌのＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（Ｒ）に４５０μｇ／ｍｌのＭｅｒｃｋアルミニウム明礬を加えたものに配合した。ペプチド含量に基づいた最終抗原濃度はＡβ１−８−ＫＬＨおよびＡβ（３−１０）（２１−２８）−ＯＭＰＣのそれぞれで８μｇ／ｍｌおよび４μｇ／ｍｌであった。２匹のモルモットに４００μｇの各コンジュゲートを４週間隔で２回筋肉内投与することによって免疫感作し、二回目の免疫感作の３週後から４週後までの間に血液サンプルを採取した。各群から採取した血清サンプルをプールし、使用するまで４℃で保存した。
【実施例３】
【００５２】
Ａβペプチドの様々な形態に対するモルモット抗血清の結合
全長ＡβペプチドおよびＮ末端欠失Ａβペプチドに対するモルモット抗血清の結合活性はエンザイムリンクトイムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって測定した。９６ウェルプレート（Ｉｍｍｕｎｏ ９６ Ｍｉｃｒｏ ＷｅｌｌＴＭ Ｐｌａｔｅ，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）に、ＰＢＳ中で４μｇ／ｍｌの濃度にした表２に示す様々なＡβペプチドをウェルあたり５０μｌの量でコートし４℃で一夜維持した。０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０（ＰＢＳＴ）を含有するＰＢＳでプレートを６回洗浄し、ＰＢＳＴ中の３％スキムミルク（ｍｉｌｋ−ＰＢＳＴ）でブロックした。モルモット抗血清はｍｉｌｋ−ＰＢＳＴ中で４倍系列希釈によって調製した。１００μｌの希釈抗血清を各ウェルに加え、プレートを室温で２時間インキュベートし、次いでＰＥＳＴで３回洗浄した。ｍｉｌｋ−ＰＢＳＴで１：５０００に希釈したＨＲＰ−コンジュゲートヤギ抗モルモット二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）をウェルあたり５０μｌの量で添加し室温で１時間インキュベートした。プレートを６回洗浄し、次いで３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）（Ｖｉｒｏｌａｂｓ，Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ，ＶＡ）をウェルあたり１００μｌの量で加えた。室温で３から５分間のインキュベーション後、ウェルあたり１００μｌの停止溶液（Ｖｉｒｏｌａｂｓ，Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ，ＶＡ）を加えて反応停止させた。プレートをＶｅｒｓａＭａｘＴＭマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）に入れ、４５０ｎｍで読取りを行った。
【００５３】
このアッセイの結果を、ＭｏＶＣ１−８およびＭＶＣに対するモルモット抗血清に対して様々なＡβペプチドを評価する図１および２のグラフに示す。グラフは各ペプチドに対して三重複で行った各被験サンプルから得られた平均吸光度を使用している。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）患者がアルツハイマー病（ＡＤ）のより重篤な形態を有していることを判定する段階と、（ｉｉ）免疫応答を誘発するために有効な量で、免疫原性Ａβフラグメントを投与する段階とを含む、ＡＤのより重篤な形態を有している患者の治療方法。
【請求項２】
ＡＤのより重篤な形態を有している患者が、Ｍｉｎｉ−Ｍｅｎｔａｌ Ｓｔａｔｅ Ｅｘａｍ（ＭＭＳＥ）スコア２０以下の個人、Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ Ｓｃａｌｅ−Ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ（ＡＤＡＳ−Ｃｏｇ）スコア３５以上の個人、Ｇｌｏｂａｌ Ｄｅｔｅｒｉｏｒａｔｉｏｎ Ｓｃａｌｅ（ＧＤＳ）スコアがステージ５以上の個人、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｅｍｅｎｔｉａ Ｒａｔｉｎｇ−Ｓｕｍ ｏｆ Ｂｏｘｅｓ（ＣＤＲ−ＳＢ）スコア２以上の個人、６０歳から６４歳以下の年齢でＡＤ症状を有している個人、または、遺伝子スクリーニング後に早発型アルツハイマー病（ＥＯＡＤ）もしくは家族性ＡＤ形態を有していると診断された個人から成る群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項３】
免疫原性Ａβフラグメントが、それぞれがＴ細胞エピトープの欠損した多様な不連続の免疫原性Ａβフラグメントを含む多価ワクチンを包含する請求項２に記載の方法。
【請求項４】
多価ワクチンが、リシンスカフォールドを介して連結されたＡβ３−１０とＡβ２１−２８とを含む請求項３に記載の方法。
【請求項５】
多価ワクチンがさらに、免疫原性Ａβフラグメントにコンジュゲートされた担体を含む請求項４に記載の方法。
【請求項６】
多価ワクチンがアジュバントと共に投与される請求項５に記載の方法。
【請求項７】
（ｉ）免疫応答を誘発するために有効な量で被験免疫原性Ａβフラグメントを動物に投与する段階と、
（ｉｉ）免疫感作動物から得られた抗血清をＡβのＮ末端欠失形態に対する交差反応性について評価する段階と、
を含み、Ａβの１つ以上のＮ末端欠失形態に特異的な抗体の形態で免疫応答を誘発できる構築物を適切なワクチン構築物として選択することを特徴とする、アルツハイマー病（ＡＤ）のより重篤な形態を有している患者の治療に適切なワクチン構築物として使用するための免疫原性Ａβフラグメントの選択方法。
【請求項８】
ＡβのＮ末端欠失形態が、Ａβｘ−４２、ｐＧｌｕ−Ａβ３−４０、ｐＧｌｕ−Ａβ３−４２、ｐＧｌｕ−Ａβ１１−４０およびｐＧｌｕ−Ａβ１１−４２から成る群から選択され、ここにｘは天然に存在するＡβの残基２から１７に対応する請求項７に記載の方法。
【請求項１】
（ｉ）患者がアルツハイマー病（ＡＤ）のより重篤な形態を有していることを判定する段階と、（ｉｉ）免疫応答を誘発するために有効な量で、免疫原性Ａβフラグメントを投与する段階とを含む、ＡＤのより重篤な形態を有している患者の治療方法。
【請求項２】
ＡＤのより重篤な形態を有している患者が、Ｍｉｎｉ−Ｍｅｎｔａｌ Ｓｔａｔｅ Ｅｘａｍ（ＭＭＳＥ）スコア２０以下の個人、Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ Ｓｃａｌｅ−Ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ（ＡＤＡＳ−Ｃｏｇ）スコア３５以上の個人、Ｇｌｏｂａｌ Ｄｅｔｅｒｉｏｒａｔｉｏｎ Ｓｃａｌｅ（ＧＤＳ）スコアがステージ５以上の個人、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｅｍｅｎｔｉａ Ｒａｔｉｎｇ−Ｓｕｍ ｏｆ Ｂｏｘｅｓ（ＣＤＲ−ＳＢ）スコア２以上の個人、６０歳から６４歳以下の年齢でＡＤ症状を有している個人、または、遺伝子スクリーニング後に早発型アルツハイマー病（ＥＯＡＤ）もしくは家族性ＡＤ形態を有していると診断された個人から成る群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項３】
免疫原性Ａβフラグメントが、それぞれがＴ細胞エピトープの欠損した多様な不連続の免疫原性Ａβフラグメントを含む多価ワクチンを包含する請求項２に記載の方法。
【請求項４】
多価ワクチンが、リシンスカフォールドを介して連結されたＡβ３−１０とＡβ２１−２８とを含む請求項３に記載の方法。
【請求項５】
多価ワクチンがさらに、免疫原性Ａβフラグメントにコンジュゲートされた担体を含む請求項４に記載の方法。
【請求項６】
多価ワクチンがアジュバントと共に投与される請求項５に記載の方法。
【請求項７】
（ｉ）免疫応答を誘発するために有効な量で被験免疫原性Ａβフラグメントを動物に投与する段階と、
（ｉｉ）免疫感作動物から得られた抗血清をＡβのＮ末端欠失形態に対する交差反応性について評価する段階と、
を含み、Ａβの１つ以上のＮ末端欠失形態に特異的な抗体の形態で免疫応答を誘発できる構築物を適切なワクチン構築物として選択することを特徴とする、アルツハイマー病（ＡＤ）のより重篤な形態を有している患者の治療に適切なワクチン構築物として使用するための免疫原性Ａβフラグメントの選択方法。
【請求項８】
ＡβのＮ末端欠失形態が、Ａβｘ−４２、ｐＧｌｕ−Ａβ３−４０、ｐＧｌｕ−Ａβ３−４２、ｐＧｌｕ−Ａβ１１−４０およびｐＧｌｕ−Ａβ１１−４２から成る群から選択され、ここにｘは天然に存在するＡβの残基２から１７に対応する請求項７に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図２】
【公表番号】特表２０１１−５２７６８１（Ｐ２０１１−５２７６８１Ａ）
【公表日】平成２３年１１月４日（２０１１．１１．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５１７４８６（Ｐ２０１１−５１７４８６）
【出願日】平成２１年７月２日（２００９．７．２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０４９４７５
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／００５８５８
【国際公開日】平成２２年１月１４日（２０１０．１．１４）
【出願人】（３９００２３５２６）メルク・シャープ・エンド・ドーム・コーポレイション (924)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年１１月４日（２０１１．１１．４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年７月２日（２００９．７．２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０４９４７５
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／００５８５８
【国際公開日】平成２２年１月１４日（２０１０．１．１４）
【出願人】（３９００２３５２６）メルク・シャープ・エンド・ドーム・コーポレイション (924)
【Ｆターム（参考）】
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