アレルギーの治療に用いるための、主要グループ１ダニアレルゲンおよび主要グループ２ダニアレルゲンの低アレルゲン性ハイブリッドタンパク質
本発明は、アレルギー、特にダニによって引き起こされるアレルギーの予防および治療に有用な、D. pteronyssinus に由来する様々なアレルゲンのハイブリッドポリペプチドをコードする組換えＡＤＮ分子に関する。詳しくは、本発明は、アレルゲン Der p 1 および Der p 2 の断片から構成されるハイブリッドタンパク質であって、低減したアレルゲン活性を有し、免疫原性能力を維持し、アレルギーの治療に特に有用であるハイブリッドタンパク質に関する。本発明はまた、異種発現システムを用いてこれらのポリペプチドを生産する方法に関する。本発明はさらに、これらのハイブリッドタンパク質の効率的な精製方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アレルギー、詳しくはチリダニによって引き起こされるアレルギー、さらに詳しくは Dermatophagoides 属のダニによって引き起こされるアレルギー、さらに詳しくはグループ１アレルゲンやグループ２アレルゲンへの感作によって生ずるアレルギーの予防および治療に用いるためのハイブリッドタンパク質の製造の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
アレルギーは、通常は無害である異物（アレルゲン）に反応する能力における特異的遺伝性障害または後天性障害である。アレルギーは、感染した器官（皮膚、結膜、鼻、咽頭、気管支粘膜、消化管）の炎症反応に関連する。この病気の即時の症状の例として、鼻炎、結膜炎、皮膚炎、喘息およびアナフィラキシーショックが挙げられる。この病気の慢性的な症状の例として、喘息やアトピー性皮膚炎の遅発型反応が挙げられる。Ｉ型アレルギーは、先進国における重大な健康問題である。Ｉ型アレルギーは、空気によって運ばれる抗原に対するＩｇＥ抗体の形成によって引き起こされる。これらのＩｇＥ抗体は、マスト細胞および好塩基球と相互作用し、ヒスタミンなどの生物学的メディエーターを放出し、これらが先進国の人口の２５％を超える人々にアレルギー性の鼻炎、結膜炎および気管支喘息を引き起こしている。［Floistrup, H., Swartz, J., Bergstrom, A., Alm, J.S., Scheynius, A., van Hage, M., Waser, M., Braun-Fahrlander, C., Schram-Bijkerk, D., Huber, M., Zutavern, A., von Mutius, E., Ublagger, E., Riedler, J., Michaels, K.B., Pershagen, G., The Parsifal Study Group. (2006). Allergic disease and sensitization in Steiner school children. J Allergy Clin Immunol. 117, 59-66］
【０００３】
現在、アレルギー性疾患の原因に向けられた唯一のアレルギー治療方法は、アレルゲン特異的免疫療法（ＳＩＴ）である。ＳＩＴは、特異的アレルゲンによって引き起こされるアレルギー性疾患の効果的な治療法であって、アレルギーを引き起こすタンパク質（アレルゲン抽出物）を、濃度を高めながら規則的に投与することによって患者の免疫応答を調整することを基本的に含む。様々な研究がこのアレルゲン特異的免疫療法の臨床的効果を実証しているけれども、その免疫学的機構は十分には解明されていない。
【０００４】
今までに知られているのは、注入されたアレルゲンの高濃度の服用が、ナイーブヘルパーＴ細胞（ｎＴH）のＴH１細胞またはＴH０細胞への成長を優先的に促進する抗原提示細胞（たとえば、樹状細胞）によるＩＬ−１２の合成量の増加を誘導する、ということである。これは、ＴH２細胞に関連するアレルギー免疫応答がＩＦＮ−γの高水準の生産を誘導するＴH１／ＴH０応答にスイッチされることを可能にする［Akdis, C.A. and Blaser, K. (2000). Mechanisms of allergen-specific immunotherapy. Allergy 55, 522-530］。この免疫スイッチは、免疫抑制サイトカインであるＩＬ−１０およびＴＧＦ−βを生産する制御性Ｔ細胞（ＴR１）の影響下におけるＴH２メモリー細胞の寛容の誘導（クローナルアネルギーまたはクローン消失）によって強化される［Akdis, C.A., Joss, A., Akdis, M., and Blaser, K. (2001). Mechanism of IL-10 induced cell inactivation in allergic inflammation and normal response to allergens. Int. Arch Allergy Immunol. 124; 180-182］。ＴH２細胞の活性化および増殖の低下は、ＩＬ−４の生産の低下と、Ｂ細胞によるＩｇＥの生産の低下をもたらす。鼻や気管支粘膜におけるＴH２細胞の活性化および浸透の低下は、ＩＬ−５の合成の低下をもたらす。これが、ＭＢＰ（主要塩基性タンパク質）やＥＣＰ（好酸球カチオン性タンパク質）などの炎症性メディエーターの放出の大きな低下につながる、好酸球の浸透の低下を可能にする。支配的な表現型ＴH０のＴ細胞の新しいアレルゲン特異的クローンは、Ｂ細胞による大量のアレルゲン特異的ＩｇＧ抗体の生産を促進する、ＴH１サイトカインおよびＴH２サイトカインの混合物を生産する。さらに、高水準のＩＬ−１０は、アレルゲン特異的ＩｇＧ４抗体の合成量の増加を誘導する。これら２種類の特異的抗体は、マスト細胞に固定されているＩｇＥ−結合受容体の架橋を防止するブロッキング抗体として機能することができ、こうしてヒスタミンの脱顆粒化および放出を阻害する［Moverare, R. (2003). Immunological mechanisms of specific immunotherapy with pollen vaccines: implications for diagnostics and the development of improved vaccination strategies. Expert Rev. Vacc. 2, 85-97; Wachholz, P.A., Soni, N.K., Till, S., and Durham, S.R. (2003). Inhibition of allergen-IgE binding to B cells by IgG antibodies after grass pollen immunotherapy. J. Allergy Clin. Immunol. 112; 915-922］。それらはまた、抗原提示細胞によるＩｇＥ−媒介抗原の捕捉をブロックし、これがアレルゲンとの免疫反応を抑制する。
【０００５】
天然物から単離して得たアレルゲン抽出物は、タンパク質と他の分子との複雑な混合物である。その組成（したがって、そのアレルゲン性も）は、用いる材料に依存する。たとえば、花粉の場合には環境条件に依存し、真菌の場合には成熟期に依存し、また、ダニの場合には成育条件に依存する。さらに、抽出物によっては、主要アレルゲンの濃度が不十分であったり、患者がアレルギーを示さない望ましくない成分に汚染されていたり、それら両方の問題があったりする。今日の免疫療法は完全なアレルゲン抽出物を専ら用いるが、このことが数多くの欠点を招来している。たとえば、次のような欠点がある。
− ワクチンと効果細胞に固定されたＩｇＥ抗体との反応性に起因する重大な逆反応。
− 免疫療法開始後の、ワクチンに存在する他のアレルゲンへの新たな感作の発生。
− いくつかのアレルゲン抽出物における、標準化された生産の困難。
【０００６】
上記の問題のために、免疫療法は、望まれるほど安全で効果的なものとはなっていない。
【０００７】
アレルギーの病原論と特異的免疫療法の機構とのよりよい理解が、上記の問題の解決への接近を可能にした。アレルゲン特異的ＴH２応答におけるＩｇＥ−媒介抗原の提示の影響の理解が、ＩｇＥに結合しないアレルゲンを生産するための努力を増加させた。このようなアレルゲンは、食作用／飲作用に基づく抗原捕捉機構によってＴ細胞に向けられ、ＩｇＥ−架橋とＩｇＥ−依存抗原の提示とは回避されるであろう。これは、Ｔ細胞によるＴH０サイトカインまたはＴH１サイトカインの生産の均衡と、Ｂ細胞によるより低いＩｇＥ生産およびより大きいＩｇＧ生産とを誘導し、これによって、アナフィラキシーの危険なくＴH２型Ｔ細胞の寛容の誘導をもたらすであろう。
【０００８】
アレルゲンとアレルゲン誘導体とを得るための組換え技術の進歩は、アレルギーの治療のための新規なワクチンを開発する能力を大きく高めることを容易にした。当業者が直面する困難は、Ｔ細胞による抗原の認識を維持しながら、抗原のＩｇＥ結合を低減することである。より低いＩｇＥ結合能を有するがＴ細胞との反応性を維持するアレルゲン分子は、より少ない注入回数でより速くて安全な免疫治療を可能にするより大量の服用の形で投与され得るかもしれない。さらに、組換えアレルゲンは微生物的発現システムを用いて発酵タンクにおいて大規模に生産することができ、その精製は天然の同等物の精製より能率的である。
【０００９】
ダニは、節足動物の群に属し、０．３ｍｍより小さいサイズを有する。ダニは、ハウスダストを含め様々な環境において発見され得る。ダニは、１９６０年代後期以降、ハウスダストによるアレルギーの原因であると考えられている。
【００１０】
アレルギー症状を引き起こす主要なダニはコナダニ目に属し、以下のように分類される。
【００１１】
動物界
節足動物門
クモ綱
ダニ亜綱
コナダニ目
【００１２】
・コクダニ科
Glycyphaginae 亜科
Blomia 属
B. freemani
B. kulagini
B. tropicalis
Glycyphagus 属
G. domesticus
Lepidoglyphus 属
L. destructor
Labidophorinae 亜科
Gohieria 属
G. fusca
【００１３】
・チリダニ科
Dermatophagoidinae 亜科
Dermatophagoides 属
D. evansi
D. farinae
D. microceras
D. pteronyssinus
D. siboney
D. neotropicalis
Hirstia 属
H. domicola
Malayoglyphus 属
M. carmelitus
Pyroglyphinae 亜科
Euroglyphus 属
E. maynei
【００１４】
・コナダニ科
Acarus 属
A. siro
Tyrophagus 属
T. longior
T. putrescentiae
【００１５】
・マルニクダニ科
Chortoglyphus 属
C. arcuatus
【００１６】
最もしばしばアレルギーを引き起こす種は、Dermatophagoides 属に属する種である。それらの最適な成育条件は、温度が約２０℃で、相対湿度が７０％超である。湿度が５０〜６０％より低い環境は、ダニの存在を異常な程度に限定する。したがって、ダニは、温暖な沿岸地帯に非常に多く存在し、乾燥した山岳地帯、特に標高が１５００ｍを越える地帯には滅多に存在しない。したがって、ダニの濃度は、雨と温和な温度を有する季節の変わる時期（春と秋）に家屋において上昇し、通常は夏（暑く乾燥した気候）の間と冬（寒く乾燥した気候）の間に減少する。
【００１７】
チリダニ（house dust mite）は、何千種類ものタンパク質や他の巨大分子を生産する複雑な生物である。ダニは最もよく見られるアレルギー源の１つである。アレルギーを患っているＥＵ内の５０００万の人のうち、１５％がダニに感作していると見積もられ、推定約１０００〜１５００万の人が適切な診断を受けていない。他のデータは、喘息の子どもの８０％がダニに感作している可能性があることを示している［de Blay F, et al. Influence of mite exposure on symptoms of mite-sensitive patients with asthma. J Allergy Clin Immunol 1994; 93:136-138］。
【００１８】
現在までに、最もよくあるチリダニである D. pteronyssinus および D. farinae に由来する１４種類のアレルゲンについて、アレルギー患者において非常に異なる程度で存在していることが記載されている。国際免疫学連合（Ｉ．Ｕ．Ｉ．Ｓ．）のアレルゲン命名小委員会（http://www.allergen.org/Allergen.aspx）のアレルゲンの公式リスト（２００７年７月３日）に記載されている D. pteronyssinus のアレルゲンは以下の通りである。
【００１９】
・Der p 1
生化学名： システインプロテアーゼ、２８ｋＤａ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、アレルギー過程においてアジュバント効果を引き起こす可能性のあるタンパク質分解活性を有する。
アレルゲン性： ＲＩＡおよびＲＡＳＴ（ｒ＝０．８２、ｐ＜０．００１、ｎ＝３０）による測定によると、血清において、Der p 1 に対するＩｇＥと D. pteronyssinus の抽出物に対するＩｇＥとの間に正の相関関係がある。検査した１１人の患者のすべてが、Der p 1 への応答において陽性の皮膚試験結果を示した（＜１０-2μｇ／ｍｌ）。４２人のダニアレルギー患者の９２％がＲＡＳＴにおいて rDer p 1 に特異的なＩｇＥを有していた。
【００２０】
・Der p 2
生化学名： ＮＰＣ２ファミリーに属する、１５ｋＤａ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）。
アレルゲン性： １２人のダニアレルギー患者のうち９人（７５％）が Der p 2 への応答において陽性の皮膚試験結果を示した（＜１０-3μｇ／ｍｌ）。６５人のダニアレルギー患者のうち５９人（９０．７％）がＲＡＳＴにおいて Der p 2 に特異的なＩｇＥを有していた。４５人のダニアレルギー患者のうち３２人（７１％）がＲＡＳＴにおいて Der p 2 に特異的なＩｇＥを有していた。３５人のダニアレルギー患者の１００％がＲＡＳＴにおいて Der p 2 に特異的なＩｇＥを有していた。
【００２１】
・Der p 3
生化学名： トリプシン、３１ｋＤａ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）。
アレルゲン性： ５５人のダニアレルギー患者の１００％がＲＡＳＴにおいて Der p 3 に特異的なＩｇＥを有していた。３５人のダニアレルギー患者の９７％がＲＡＳＴにおいて Der p 3 に特異的なＩｇＥを有していた。
【００２２】
・Der p 4
生化学名： α−アミラーゼ、６０ｋＤａ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）。
アレルゲン性： 精製した Der p 4 を用いたイムノブロットを行ったとき、２７人の大人のダニアレルギー患者の４６％が Der p 4 に特異的なＩｇＥを有しており、２０人の子どものダニアレルギー患者の２５％が Der p 4 に特異的なＩｇＥを有していた。検査した１０人のダニアレルギー患者のうち３人がドットブロットにおいて Der p 4 に特異的なＩｇＥを有していた。
【００２３】
・Der p 5
サイズ： １４ｋＤａ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）のタンパク質、記載された他のタンパク質に対して有意の相同性を示さない。
アレルゲン性： １９人のダニアレルギー患者のうち６人（３１％）がＲＩＡにおいて Der p 5 に特異的なＩｇＥを有していた。２０人のダニアレルギー患者のうち７人（３７％）が皮膚プリック試験において Der p 5 に対して１０-4〜１０-2μｇ／ｍｌの範囲の陽性反応性を示した。イムノブロットを行ったとき、ダニアレルギー患者の３８個の血清のうち２１個が Der p 5 を認識した。
【００２４】
・Der p 6
生化学名： ケモトリプシン（chemotrypsin）、２５ｋＤａ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）。
アレルゲン性： ４１％（８８人のうちの３６人）のダニアレルギー患者がＲＡＳＴにおいて Der p 6 に特異的なＩｇＥを有していた。４４％（１８人のうちの８人）のダニアレルギー患者が Der p 6 を用いた皮下内皮膚試験において陽性反応を示した。３５人のダニアレルギー患者の６５％がＲＡＳＴにおいて Der p 6 に対して陽性であった。
・Der p 7
サイズ： ２６ｋＤａ、３０ｋＤａ、３１ｋＤａ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）のタンパク質の群、記載された他のタンパク質に対して有意の相同性を示さない。
アレルゲン性： ５３％（３０人のうちの１６人）のダニアレルギー患者が rDer p 7 を用いた皮下試験において陽性反応を示した(１μｇ／ｍｌ)。３８人の子どものうち１４人（３７％）が rDer p 7 に特異的なＩｇＥを有していた。４１人のダニアレルギー患者のうち１９人（４６％）がＲＩＡにおいて rDer p 7 に特異的なＩｇＥを有していた。
【００２５】
・Der p 8
生化学名： グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、２７ｋＤａ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）。
アレルゲン性： イムノブロットにおいて、ダニアレルギー患者の４０％が rDer p 8 を認識した。
【００２６】
・Der p 9
生化学名： コラーゲン分解性セリンプロテアーゼ、２９ｋＤａ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）。
アレルゲン性： ３５人のダニアレルギー患者の９２％がＲＡＳＴにおいて Der p 9 に特異的なＩｇＥを有していた。
【００２７】
・Der p 10
生化学名： トロポミオシン、３６ｋＤａ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）。
アレルゲン性： ３５人のダニアレルギー患者の５．６％がＲＡＳＴにおいて組換え Der p 10 に特異的なＩｇＥを有していた。
【００２８】
・Der p 11
生化学名： パラミオシン、１０３ｋＤａ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）。
アレルゲン性： イムノドットによって測定した、Der p 11 に特異的ＩｇＥ血清の存在は、患者群に依存して、４１．７％〜６６．７％の範囲で変動した。しかし、非アトピー性の蕁麻疹患者の場合や正常な人の場合では低かった（それぞれ１８．８％、８％）。
【００２９】
・Der p 14
生化学名： アポリポホリン、１７７ｋＤａ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）。
アレルゲン性： Der p 14 は有意のＩｇＥ応答とＴ細胞の刺激を誘導する。
【００３０】
・Der p 20
生化学名： アルギニンキナーゼ、分子量は記載されていない。
【００３１】
・Der p 21
生化学名や分子量は記載されていない。
【００３２】
Der p 1 および Der p 2 は、ダニアレルギー患者の８０〜１００％と反応し［Thomas, W.R., Smith, W-E, Hale, B., Mills, K.L., O’Brien, R.M. (2002). Characterization and immunobiology of house dust mite allergens. Int. Arch. Allergy Immunol. 129; 1-8］、D. pteronyssinus の完全な抽出物に対するＩｇＥの反応性をほぼ完全に阻害することができる［Van der Zee, J.S., van Swieten, P., cansen, H.M., Aalbersen, R.C. (1988). Skin tests and histamine release with P1-depleted D. pteronyssinus body extracts and purified P1. J. Allergy Clin. Immunol. 81; 884-895; Meyer, C.H., Bond, J.F., Chen, M.C., Kasaian, M.T. (1994). Comparison of the levels of the allergens Der p I and Der p II in standardised extract of the house dust mite D. pteronyssinus. Clin. Exp. Allergy 24; 1041-1048］。
【００３３】
グループ１アレルゲン（Der p 1）は、システインプロテアーゼ活性を有するタンパク質であって、パパインやアクチン−システインプロテアーゼと同じファミリーに属する。その成熟タンパク質は、２２２個の残基と８０個のプレタンパク質残基とを有する。それは、ダニの消化器官において生産され、したがって、糞の中に見出され、食物の消化に関係するようである。それは３つのジスルフィド架橋（Ｃ４−Ｃ１１７、Ｃ３１−Ｃ７１およびＣ６４−Ｃ１０３）を有する。その３次元構造は２つの球状ドメインで構成されるものであって、１つはアミノ末端に形成され（２１番〜９０番残基）、もう１つはカルボキシル末端に形成される（１３１番〜２００番残基）。それらは、柔軟なループによって（１０１番〜１３１番の位置において）リンクされており［Meno, K., Thorsted, P.B., Ipsen, H., Kristensen, O., Larsen, J.N., Spangfort, M.D., Gajhede, M., Lund, K. (2005). The crystal structure of recombinant proDer p 1, a major house dust mite proteolytic allergen. J. Immunol. 175, 3835-3845］、そこでは大きなＴ細胞刺激活性が示されている［Kircher, M.F., Haeusler, T., Nickel, R., Lamb, J.R., Renz, H., Beyer, K. (2002). Vb 18.1 and Va 2.3+ T-cell subsets are associated with house dust mite allergy in human subjects. J. Allergy Clin. Immunol. 109, 517-523］。タンパク質である Der p 1 は、中性やアルカリ性のｐＨ条件の下で二量体を形成する傾向がある。Ｂ細胞エピトープは分子全体に亘って分布しており、そのいくつかは立体配座エピトープである［De Halleux, S., Stura, E., VanderElst, L., Carlier, V., Jacquemin, M., Saint-Remy, J.M. (2006). Three-dimensional structure and IgE-binding properties of mature fully active Der p 1, a clinically relevant major allergen. J. Allergy Clin. Immunol. 117, 571-576］。
【００３４】
グループ２アレルゲン（Der p 2）は、３つのジスルフィド架橋（Ｃ８−Ｃ１１９、Ｃ２１−Ｃ２７およびＣ７３−Ｃ７８）を有し、互いに逆平行なβシートで構成されている。タンパク質 Der p 2 のＴ細胞エピトープは、該タンパク質の全体に亘って存在している。しかし、１１１番〜１２９番ペブチドはしばしばＴ細胞によって認識される［O’Brien, R.M., Thomas, W.R., Nicholson, I., Lamb, J.R., Tait, B.D. (1995). An immunogenetic analysis of the T-cell recognition of the major house dust mite allergen Der p 2: identification of high- and low-responder HLA-DQ alleles and localization of T-cell epitopes. Immunology. 86, 176-182］。ＩｇＥ結合は３次構造に大きく依存するので、Ｂ細胞エピトープは立体配座エピトープであるようである。
【００３５】
アレルゲン性ダニ抽出物は、タンパク質と非タンパク質分子との複雑な混合物である。抽出物の各成分に対するＩｇＥの特異性のレベルを見出す技術の使用の増加により、アレルギー患者が通常は数多くの成分に反応することが実証された。単一のアレルゲンにのみ反応するアレルギー患者は少なかった。完全なダニ抽出物を用いた免疫療法研究は、危険な全身的な逆効果が、ダニ抽出物を用いた免疫治療をしている間［Akcakaya, N., Hassanzadeh, A., Camcioglu, Y., Cokugras, H. (2000). Local and systemic reactions during immunotherapy with adsorbed extracts of house dust mite in children Ann. Allergy Asthma Immunol. 85; 317-321］や、貝に対する新たなＩｇＥ反応性の導入の間［van Ree, R., Antonicelli, L., Akkerdaas, J.H., Garritani, M.S., Aalberse, R.C., Bonifazi, F. (1996). Possible induction of food allergy during mite immunotherapy. Allergy 51; 108-113］に、生ずる可能性があることを実証した。こうして、現時点で知られているアレルゲン抽出物はダニアレルギーの最適な治療を達成する上で明らかな欠陥のあることが示された。
【００３６】
発明の特徴
上記の背景に留意しながら、本発明者らは、アレルギーの治療、特にダニによって引き起こされるアレルギーの治療のための新規な有利な方法を研究した。広範な研究の結果、本発明者らは、D. pteronyssinus の２種類のアレルゲン（Der p 1 および Der p 2）の断片を結合させることによって形成される新規なハイブリッドタンパク質に基づくダニアレルギー治療のための新規で効果的な方法、および、それらのタンパク質を得るための各種の方法・手段を発見した。本発明の低アレルゲン性ハイブリッドタンパク質は、個々の天然のアレルゲンやそれらの混合物に比べて有意に低いアレルゲン性を有することができる。たとえば、本発明のハイブリッドタンパク質は、個々の天然のアレルゲン及び／又はそれらの混合物のＩｇＥ結合能の６０％未満の、好ましくは５０％未満の、さらに好ましくは４０％未満、さらに好ましくは２０％未満の、さらに好ましくは１０％未満の、さらに好ましくは２％未満の結合能を有することができる。本発明のハイブリッドタンパク質は、ｉ）D. pteronyssinus に対してアレルギーを示す患者の血清のプールを用いた in vitro ＥＬＩＳＡ、ＥＬＩＳＡ−阻害およびイムノブロッティング試験、ｉｉ）D. pteronyssinus に対してアレルギーを示す患者を対象とする in vivo 皮膚反応性試験、ｉｉｉ）D. pteronyssinus に対してアレルギーを示す患者の血液から単離した好塩基球の ex vivo 活性化試験、およびｉｖ）D. pteronyssinus に対してアレルギーを示す患者の個々の血清を用いた in vitro ＥＡＳＴ試験、に基づいてより低いＩｇＥ結合能を有することが示されるので、「低アレルゲン性」ということができる。さらに、本発明のハイブリッドタンパク質は、ｉ）Ｔ細胞反応性を示す D. pteronyssinus に対してアレルギーを示す２３人の患者から採取した抹消血単核球（ＰＢＭＣ）を用いたリンパ球増殖研究によって実証されているように、免疫原性を維持し、ｉｉ）マウスをハイブリッドタンパク質で免疫化した後の野生タンパク質よりも免疫原性が高く、ｉｉｉ）マウスに「ブロッキング」抗体、即ち Der p 1−特異的ＩｇＧおよび Der p 2−特異的ＩｇＧ（これらは、チリダニアレルギー患者のＩｇＥが天然アレルゲンである Der p 1 および Der p 2 に結合するのを阻害する）を誘導する能力を有する。
【００３７】
したがって、本発明は、アレルゲン Der p 1 およびアレルゲン Der p 2 の断片で構成されるハイブリッドタンパク質（またはキメラ）（以下、ＱＭ１、ＱＭ２と称する）に関する。Der p 2 の２つのβシートのうちの少なくとも１つにおいて。Der p 2 のＣ８とＣ１１９との間のジスルフィド架橋は、図２に示されるように成熟天然タンパク質の８番および１１９番の位置におけるシステイン残基の１つまたは２つが、たとえばセリン残基で置換されることによって、または、追加的アミノ酸配列、たとえば、成熟タンパク質（即ち、図１に示すようなプレ領域を有しないタンパク質）の５番〜２２２番残基からなる断片などの Der p 1 の断片の挿入によって、破壊されている。好ましくは、追加的アミノ酸配列は、図２に示すように、成熟天然タンパク質 Der p 2 の配列の７３番残基と７４番残基との間に挿入される。アレルギー反応性は減ずるが、驚くべきことに、免疫原性には損害を与えない。実際には、ハイブリッドタンパク質は、いくつかの試験において免疫原性の増大を示したのであり、さらに、ＩｇＧ抗体の生産を刺激することができる。
【００３８】
したがって、本発明は、配列番号２または配列番号４の配列に少なくとも７０％の、好ましくは少なくとも８０％の、さらに好ましくは少なくとも９０％の、さらに好ましくは少なくとも９５％の、最も好ましくは１００％の相同性を示すアミノ酸配列を包含する、または該アミノ酸配列からなるペプチド配列を提供する。
【００３９】
該タンパク質は、化学合成法、半化学合成法、発現システム利用法などの標準的なタンパク質合成方法によって製造することができる。したがって、本発明はまた、該キメラタンパク質をコードするＤＮＡを包含する、または該ＤＮＡからなるヌクレオチド配列、発現システム（たとえば、該配列とともに発現および発現制御のための必要な配列を包含する様々なベクター）、ならびに該発現システムによって形質転換した宿主細胞および宿主生物に関する。
【００４０】
したがって、本発明は、配列番号１または配列番号３の配列に少なくとも７０％の、好ましくは少なくとも８０％の、さらに好ましくは少なくとも９０％の、さらに好ましくは少なくとも９５％の、最も好ましくは１００％の相同性を示すヌクレオチド配列を包含する、または該ヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを提供する。
【００４１】
発現ベクターは、本発明のポリヌクレオチドが挿入される宿主細胞に応じて選択することができる。宿主細胞のこのような形質転換は、Sambrook et al［Sambrook, J., Russell, D. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, USA］に教示されている技術などの従来技術を用いて行うことができる。適切なベクターの選択は、当業者の技能の範囲である。適切なベクターの例として、プラスミド、バクテリオファージ、コスミドおよびウイルスが挙げられる。
【００４２】
生産したハイブリッドタンパク質は、任意の適切な方法、たとえば沈降やクロマトグラフ分離（たとえばアフィニティークロマトグラフィー）を用いて、宿主細胞から単離し精製することができる。
【００４３】
本発明はまた、上記のキメラポリペプチドの臨床的利用や、アレルギー、特にチリダニ（D. pteronyssinus）に対するアレルギーの治療のための特異的免疫療法に関する。上記のように、特異的免疫療法は、本発明のハイブリッドタンパク質の１つまたは２つ以上を有効量投与することによってアレルギーを治療また予防する方法である。好ましくは、治療の対象は、哺乳類、特にヒトである。アレルギーは、鼻炎、結膜炎、喘息、蕁麻疹、血管性水腫、湿疹、皮膚炎及び／又はアナフィラキシーショックとしてその症状が現われることがある。したがって、本発明の範囲の治療や予防療法は、これらの症状の１つまたは２つ以上に対する治療を含む。
【００４４】
記載されている方法によって製造されるハイブリッドタンパク質は、アレルギー反応の治療のための薬剤として調製してもよい。本発明はまた、これらのハイブリッドタンパク質を含有する可能な組成物、およびそれらを投与する様々な方法に関する。本発明の１つの具体的な態様は、ワクチン組成物に関するものである。主要な成分は、好ましくはアジュバントとともに投与されるハイブリッドタンパク質である。ヒトに投与するのに適当なアジュバントがいくつかあり、その１つの例は水酸化アルミニウムである。ワクチンの調製は、Vaccine Design (“The subunit and adjuvant approach”), eds. MF Powell & MJ Newman, Plenum Press, New York, 1995 に記載されている。
【００４５】
投与の好ましい形態の例として、ワクチン接種一般のために（特にアレルギー免疫療法のために）記載または示唆されているすべての標準的な投与方法を挙げることができる（経口投与、舌下投与、経皮投与、静脈内投与、鼻腔内投与、粘液内投与など）。
【００４６】
以下、本発明のハイブリッドタンパク質のアレルゲン活性低減特性を説明する。本発明において行われるＥＬＩＳＡ実験およびＥＬＩＳＡ阻害実験を用いた免疫学的試験によれば、キメラＱＭ２は D. pteronyssinus に対してアレルギーを示す患者の血清においてＩｇＥ認識を示さなかった（図９）。両方のアレルゲンタンパク質 Der p 1 および Der p 2 の配列の大部分を含むにもかかわらず、キメラＱＭ１は、図１０に示されるように、両方の天然タンパク質の混合物よりも２５００倍も低いＩｇＥ結合能を有する。ＱＭ１は、両方のタンパク質 Der p 1 および Der p 2 の配列の大部分を含むが、Der p 2 の２つのシステイン（８番残基および１１９番残基）において突然変異を有している。
【００４７】
このような低アレルゲン性を示すデータの信頼性は、皮膚プリック試験を用いた１０７人の患者を対象とする in vivo 実験によって実証された。キメラＱＭ１のアレルゲン性（たとえば腫れのサイズによって示される、ＩｇＥ結合能）は、２つの単離した天然タンパク質 Der p 1 および Der p 2 について得られたもの場合の約１／５０と低かった（図１１）。ＱＭ２のアレルゲン性は実質的に０であった。
【００４８】
キメラＱＭ２の低アレルゲン性は、D. pteronyssinus に対してアレルギーを示す１０７人の患者の血清を用いてＱＭ２の分子の反応性を測定することによって実証された（図１２）。アレルゲン性の低減は、キメラＱＭ１およびキメラＱＭ２の免疫原性能力の維持を伴っており、これは個々の天然タンパク質 Der p 1 および Der p 2 の和について観測されたものより驚くほど高かった（図１３および図１４Ａ）。これらの特性は、これらのキメラを従来技術における完全なアレルゲン抽出物の代替物として、より安全に用いることを可能にする。
【００４９】
株の寄託
本発明の微生物の株は、特許手続上の微生物の寄託の国際承認に関するブダペスト条約に基づき、バレンシア大学の Coleccion Espanola de Cultivos Tipo (CECT) (Universidad de Valencia, Edificio de Investigacion, Campus de Burjasot, 46100 BURJASOT, Valencia) に、下記の参照番号で寄託した。
CECT 7317 Escherichia coli QM1
CECT 7318 Escherichia coli QM2
寄託日は２００７年１０月３日である。
【００５０】
発明の詳細な説明
本発明の低アレルゲン性ハイブリッドタンパク質は、ＱＭ１の場合には、両方のタンパク質（Der p 1 および Der p 2）の融合とジスルフィド架橋（８番〜１１９番残基）の１つの除去によって得られ、ＱＭ２の場合には、Der p 2の７３番残基と７４番残基との間にタンパク質 Der p 1 を挿入することによって得られる。驚くべきことに、これらの変化にもかかわらず、本発明のハイブリッドタンパク質（ＱＭ１およびＱＭ２）は、より高いＴ細胞刺激活性を示し（図１３）、分離された野生の分子よりも強い免疫原性を示した（図１４Ａ）。
【００５１】
本発明のハイブリッドタンパク質を構成するペプチド断片は、それらをコードするヌクレオチド配列から、資格があり訓練された人によって、たとえばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅により、Sambrook et al［Sambrook, J., Russell, D. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, USA］などに記載された当分野において周知の方法を用いることによって合成することができる。該ヌクレオチド配列は、適当な制限酵素によって既に切り離されたものであり、ライゲーションによって発現ベクターに組み入れることができる。ペプチド断片をコードする様々のヌクレオチド配列は、様々の制限酵素によって認識される配列で形成されるリンカーを用いて固定され、したがって、天然のアレルゲンの元の配列には存在しなかったいくつかの残基が最終的なハイブリッドペプチド分子に現われる。これらの新たな残基は、タンパク質への正しい翻訳には干渉しなかったのであり、図６における配列において二重下線でマークされている。
【００５２】
本発明のキメラ（ＱＭ１およびＱＭ２）やそれらから誘導される合成ペプチドの、動物、特にヒトなどの哺乳類の不感作化治療への利用も、本発明の範囲である。不感作化の方法は、非経口（皮下、静脈内または筋肉内）、経口、舌下、経鼻または経直腸による繰り返しの投与を含む。本発明のハイブリッドタンパク質は、現行の法規と利用できる製薬過程に基づき、単独で投与することもできるし、薬理学的に許容される賦形剤、アジュバント及び／又は希釈剤と組み合わせて投与することもできる。
【００５３】
以下、本発明のハイブリッドタンパク質の免疫学的特性を説明する。
【００５４】
本発明のハイブリッドタンパク質であるＱＭ１およびＱＭ２は、図８、９、１０および１２に示されるように、低アレルゲン性である。本発明のハイブリッドタンパク質は、完全な抽出物や、天然タンパク質である Der p 1 と Der p 2 との組み合わせよりも、D. pteronyssinus に対してアレルギーを示す患者の血清との反応性が低い。特に、キメラＱＭ２の場合には、“ex vivo”試験において好塩基球を活性化させる能力がより低い。この低アレルゲン性は、in vivo 皮膚試験においても実証されている（図１１）。
【００５５】
図８は、キメラであるＱＭ１およびＱＭ２が天然タンパク質である Der p 2 の反応性に比べてより低いＩｇＥ結合活性を示すことを実証する試験を示している。アレルゲン性の低減は、D. pteronyssinus に対してアレルギーを示す患者の血清の混合物を用いたＥＬＩＳＡ−阻害試験によって定量的に示された（図１０）。５０％の阻害を達成するのに、２つの天然タンパク質である Der p 1 と Der p 2 との混合物の量の２５００倍の量のＱＭ１が必要であった。したがって、ＱＭ１はこれらの天然タンパク質よりも２５００倍もアレルゲン性が低かったと推論できるのであり、これはＩｇＥ結合能がこれら２つの天然タンパク質の混合物よりも９９％以上低くなっていることを示す。
【００５６】
キメラＱＭ１およびＱＭ２の低アレルゲン性を知るための直接の手段は、D. pteronyssinus に対してアレルギーを示す１０７人の患者の皮膚反応性を直接に測定することによって得られた。図１１のデータは、キメラＱＭ２が著しく皮膚反応性を低下させたことを示している。一方で、キメラＱＭ２は５人の患者に陽性反応を生じさせただけであった。各分布の比較は、キメラＱＭ１が、nDer p 2 について観測されるのより５０倍小さい平均腫れサイズを有し、nDer p 1 について観測されるのより１０倍小さい平均腫れサイズを有することを示す。これは、アレルゲン活性の９０〜９８％の減少を示すであろう。これは、ハイブリッドタンパク質のほうがより大量に投与されたにもかかわらず得られらた結果である。
【００５７】
ハイブリッドタンパク質ＱＭ２の低いＩｇＥ結合活性は、D. pteronyssinus に対してアレルギーを示す他の１０７人の患者の血清を用いたＥＡＳＴ測定によっても実証された（図１２）。すべての患者においてＩｇＥ結合は、ＱＭ２については、天然のタンパク質の混合物であるＤＰＴや、単一のタンパク質（組換え体または天然体）と比較すると、実質的に存在しなかった。
【００５８】
ＩｇＥを結合し逆反応を引き起こす能力のこのような大きな低下は、免疫原性能力の維持を伴った。図１３に示されるように、タンパク質ＱＭ１およびＱＭ２は、２つの純粋なタンパク質 Der p 1 および Der p 2 の混合物（天然体の混合物および組換え体の混合物の両方において）によって誘導されるリンパ球増殖指数と同様のリンパ球増殖指数を示した。これは、変異させたポリペプチド Der p 2（Ｃ８−Ｃ１１９）と Der p 1 との融合によって形成されるハイブリッドタンパク質であるＱＭ１と、Der p 2 の２つの断片および Der p 1 を用いて形成されるハイブリッドタンパク質であるＱＭ２とが、より少ない立体配座ＩｇＥ−結合エピトープを含むけれども防御的免疫応答を誘導するのに十分なＴエピトープを維持したことを実証している。
【００５９】
対応するアレルゲンと比べて低いＩｇＥ結合活性を有することや、Ｔ細胞エピトープを含むこと以外の、ＳＩＴのための候補として用いる場合の低アレルゲン性分子のもう１つの望ましい特徴は、ヒスタミンの脱顆粒化および放出を防止する「ブロッキング」抗体を誘導する能力を有することである。ハイブリッドタンパク質ＱＭ１およびＱＭ２によるマウスの免疫化は、野生のタンパク質の混合物よりも強いＩｇＧ応答を誘導した。これらの Der p 1 特異的ＩｇＧ抗体および Der p 2 特異的ＩｇＧ抗体は、チリダニアレルギー患者のＩｇＥの天然アレルゲン Der p 1 および Der p 2 への結合を阻害し、これによってアレルギー症状の予防を改善する。
【００６０】
本発明は、本発明の物を調製しその質を実証する実験過程に関する下記の実施例によって、よりよく理解されるであろう。これらの実施例は、単に例示のためのものであって、本発明を限定するものではない。
【実施例１】
【００６１】
ダニ由来の天然アレルゲン Der p 1 および Der p 2 の精製
D. pteronyssus（スペイン国、マドリード、Laboratorios Leti 社製）の凍結乾燥体と糞の混合物を出発物質として用い、１ｍｍのＰＭＳＦ（フェニルメチルスルホニルフルオリド）を添加した１０容量（p/v）のＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）において４℃で急速撹拌しながら１５分間抽出した。次に３，８００×ｇで４℃で１５分遠心分離した。抽出上清をＡＰ（Millipore 社製）で濾過し、３６１ｇ／ｌの６０％硫酸アンモニウムを３０分かけてゆっくりと加えた。４℃で１時間撹拌した後、１７，０００×ｇで４℃で１５分遠心分離した。
【００６２】
・天然 Der p 1 の精製
遠心分離後に得られたペレットをｐＨ８．０の２０ｍＭ Ｔｒｉｓの２ｍｌに再懸濁し、０．２２μｍで濾過した。ＰＢＳで平衡させた Superdex S200 16/60カラム（スウェーデン国、ウプサラ、GE-Healthcare 社製）に前工程で得た２ｍｌの再懸濁物を注入して、分子篩クロマトグラフィーを行なった。排除容量から３ｍｌの画分を回収し、非還元条件でＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、２４ｋＤａの画分と合わせた。次に、ｐＨ８．５の２０ｍＭ Ｔｒｉｓで平衡させた HighTrap Q カラム（GE-Healthcare 社製）でアニオン交換クロマトグラフィーを行なった。前工程で得た陽性画分を５リットルの蒸留水で１２０分間透析し、ｐＨ８．５の２０ｍＭ Ｔｒｉｓに加えた。得られたサンプルを１ｍｌ／分で注入し、ｐＨ８．５の２０ｍＭ Ｔｒｉｓ中の２００〜１０００ ｍＭ ＮａＣｌの勾配で溶出させた。
【００６３】
調製物の純度はＳＤＳを用いるポリアクリルアミドゲル中での電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で確認した。基本的には、Laemmli の記載する方法に従い [(19) Laemmli, U.K. (1970). Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 277, 680-685］、電気泳動装置ＭＩＮＩ−ＰＲＯＴＥＡＮ (Bio-Rad 社製）を用いて行なった。サイズが１０×１０ｃｍでポリアクリルアミド濃度１２．５％のゲルを、Ｔｒｉｓ−Ｇｌｙｃｉｎｅ緩衝液中で２００ボルト電流に４５分間かけた。マーカーとしてのタンパク質は、Bio-Rad キットの低分子量用のものを用いた。分子量の計算とゲルの濃度の分析は画像分析計（BioRad 社製、Diversity）を用いて行なった。
【００６４】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥを還元性条件下で行なう天然 Der p 1 の精製の結果、純度が９８％を超え、サイズが２９．０７ｋＤａのタンパク質が得られた（図７）。
【００６５】
・天然 Der p 2 の精製
２３９ｇ／ｌの６０％硫酸アンモニウムを沈殿上清に加えて濃度を９５％とし、４℃で一晩撹拌した。それから、１７，０００×ｇで４℃で１５分遠心分離し、得られたペレットを２５ｍｌの MilliQ 水に再懸濁した。次に、ｐＨ８．０の５０ｍＭ Ｔｒｉｓで平衡させた HighFlow Q 16/20 カラム（GE-Healthcare 社製）でアニオン交換クロマトグラフィーを行なった。得られたサンプルを５リットルの水で一晩透析し、その間に水を３回取り替えた。その後、ｐＨ８．０の２０ｍＭ Ｔｒｉｓに加えた。得られたサンプルを５ｍｌ／分で注入し、非結合画分を回収した。第３精製工程として、ｐＨ５．５の２０ｍＭ ＡｃＮａで平衡させた HighTrap SP カラム（GE-Healthcare 社製）でカチオン交換クロマトグラフィーを行なった。前工程で得た非結合画分を５リットルの水で３時間透析し、ｐＨ５．５の２０ｍＭ ＡｃＮａに加えた。得られたサンプルを１ｍｌ／分で注入し、ｐＨ５．５の２０ｍＭ ＡｃＮａ中の２００〜１０００ ｍＭ ＮａＣｌの勾配で溶出させた。最終精製工程として、ＰＢＳで平衡させた Superdex S75/300カラム（GE-Healthcare 社製）で分子篩クロマトグラフィーを行なった。前工程で得た、２００ ｍＭ ＮａＣｌで溶出した画分を Amicon Ultra 4（Millipore社製）で濃縮し、０．４ｍｌ／分で注入し、０．５ｍｌの画分を回収した。画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。１６ｋＤａのタンパク質を含む画分（Der p 2 に対応する）をプールした。
【００６６】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥを還元性条件下で行なう天然 Der p 2 の精製の結果、純度が９５％を超え、サイズが１６．６３ｋＤａのタンパク質が得られた（図７）。
【実施例２】
【００６７】
アレルゲン Der p 1 および Der p 2 のクローニング
逆転写を行なった後、Dermatophagoides から単離したｍＲＮＡからなるテンプレートと、特定のプライマーとを用いるＰＣＲ増幅を行なうことにより、アレルゲン Der p 1 と Der p 2 の相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）をクローニングした。ｍＲＮＡは、D. pteronyssus（スペイン国、マドリード、Laboratorios Leti社製）の１００ｍｇから Quick Prep MicroRNA Purification キット（GE-Healthcare 社製）を用いて単離した。ｃＤＮＡは、First-Strand cDNA 合成キット（GE-Healthcare 社製）を用いてｍＲＮＡの逆転写を行って得た。
【００６８】
プライマーは、ハイブリダイゼーション ゾーン、異なる制限エンドヌクレアーゼ用の種々の切断部位（以下に下線で示す）、およびアンカー用ヌクレオチドからなる。ＰＣＲ増幅反応は、反応容量５０μｌに以下の成分を含む。ＰＣＲ増幅バッファー×１０、５μｌ；２００μｌのｄＮＴＰ；１００ｐｍの各オリゴヌクレオチドプライマー；２．５ユニットの Taq ポリメラーゼ （Pfx DNA ポリメラーゼ, Invitrogen 社製）;１ｎｇのＤＮＡテンプレート、および５０μｌまでの滅菌蒸留水。増幅反応は、RoboCycler サーモサイクラー（Stratagene 社製）中でケースごとに特定の条件で行なった。反応産物をアガロースゲル（２％）中で電気泳動に付し、Geneclean（Bio101 社製）を製造者の説明書に従って使用して、所望のバンドをゲルから単離した。単離した断片をpGEM vector（Promega 社製）に連結した。連結混合物を用いて、E. coli DH5α（イギリス国、ペーズリーの Invitrogen から入手可能）の適格細胞を形質転換した。得られたコロニーを増殖させてそのプラスミドＤＮＡを単離し、適切な酵素を用いて所望の断片を得た。陽性クローンを配列決定用に選択した。pBluescript に挿入したＤＮＡは、蛍光ジデオキシヌクレオチドを使用するようにしたサンガー法の変法により配列を決定し、PRISM Ready Reaction DyeDeoxy Termination Cycle Sequencing キット（Perkin Elmer 社製）を製造者の説明書に従って使用してサーモサイクラー中で増幅した。
【００６９】
・Der p 1 のｃＤＮＡ
Der p 1 をコードするｃＤＮＡの領域を、公知の配列（GenBank アクセス番号: P08176）に基づいて設計したプライマーを用いるＰＣＲで増幅した。直接プライマー 5’-ACTGACAGGCCTCGTCCATCATCGATCAAAAC-3’（配列番号５）は酵素 StuIの切断配列（下線部）を含み、逆プライマー 5’-CGGAATTCCTAGGTTAGAGAATGACAACATATGG-3’（配列番号６）はエンドヌクレアーゼ EcoRI の切断配列（下線部のうち５’側の６塩基 GAATTC）とエンドヌクレアーゼ AvrII の切断配列（下線部のうち３’側の５塩基 CTAGG）とを含む。増幅条件は以下の通り。９４℃で１分（１サイクル）；９４℃で３０秒、４８℃で１分、７２℃で１分（３５サイクル）；７２℃で１０分（１サイクル）。得られたＰＣＲ産物を単離し、pGEM（Promega 社製）ベクターでクローニングし、配列決定した。
【００７０】
Der p 1のプラスミドＤＮＡは、８０個のアミノ酸からなるプレタンパク質と２２２個のアミノ酸からなる成熟タンパク質を含む３０２個のアミノ酸からなるタンパク質をコードしていた（図１）。この配列は、Der p 1.0105 (P08176) と比較して違い（His152→Asn）があった。このタンパク質の計算分子量は２４．９７ｋＤａであり、等電点は５．４９であった。
【００７１】
・Der p 2のｃＤＮＡ
Der p 2 をコードするｃＤＮＡの領域を、公知の配列（AAF86462）に基づいて設計したプライマーを用いるＰＣＲで増幅した。直接プライマー 5’-CGGGATCCGATCAAGTCGATGTCAAAG-3’（配列番号７）は制限酵素BamHIの切断配列を含み、逆プライマー 5’-CGGAATTCTTAATCGCGGATTTTAGC-3’（配列番号８）は制限酵素 EcoRI の切断配列を含む。増幅条件は以下の通り。９４℃で１分（１サイクル）；９４℃で３０秒、４８℃で１分、７２℃で１分（３５サイクル）；７２℃で１０分（１サイクル）。得られたＰＣＲ産物を単離し、pBluescript II KS ベクター（Stratagene 社製）でクローニングし、配列決定した。Der p 2のｃＤＮＡをコードするプラスミドＤＮＡを、制限酵素 BamHI/EcoRI で消化して単離し、pKN172 ベクターでサブクローンした［(20) Way, M., Pope, B., Gooch, J., Hawkins, M., Weeds, A.G. (1990) Identification of a region in segment 1 of gelsolin critical for actin binding. EMBO J. 9; 4103-4109 and pTrcHis A (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)］。
【００７２】
得られたDer p 2の配列は、１２９個のアミノ酸からなるポリペプチドをコードしていた（図２）。この配列は、Der p 2.0102 (AAF86462) と比較して１個のアミノ酸に違い（Leu127→Ile）があった。しかし、Der p 2 (P49278)と公知の他のアイソフォームもこの位置にイソロイシンを有している。このタンパク質の計算分子量は１４．１０６ｋＤａであり、等電点は７．１０であった。
【実施例３】
【００７３】
組換え Der p 2 の発現と精製
Hanahan法 [(21) Hanahan, D. (1983). Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. J. Mol. Biol. 166, 557-580] を用いて、対応するプラスミドで形質転換した E. coli BL21 (DE3)の細胞を、２００μｇ／ｍｌのアンピシリンを加えたＬＢ培地を含むペトリ皿に広げた。細胞コロニーで５０ｍｌの同培地を予備接種し、３７℃で撹拌（２６０ｒｐｍ）しながら一晩インキュベートした。１リットルの同培地に該予備接種物を接種し、光学密度（６００ｎｍ）を０．２とした。これを３７℃で撹拌しながら、光学密度（６００ｎｍ）が０．６に達するまでインキュベートし（約９０分）、この時点で、イソプロピル−チオ−β−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）を最終濃度０．６ｍＭで用いて誘導を行なった。３時間の誘導の後、細胞を遠心分離で回収した。
【００７４】
細胞を１００００ｒｐｍで１５分間、４℃で遠心分離し、５０ｍｌの溶解バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０; １ｍＭ ＤＴＴ（ジチオトレイトール））に再懸濁した。再懸濁液をリゾチーム（最終濃度０．１ｍｇ／ｍｌ）で、３７℃で３０分間撹拌しながら処理した。次に、アイスバス中で５分間超音波処理し、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を加え、室温で３０分間ゆっくりと撹拌しながらインキュベートした。８０００×ｇで１５分遠心分離し、得られたペレットを２０ｍｌの２Ｍ 尿素と０．２％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００に再懸濁し、室温で３０分間ゆっくりと撹拌しながらインキュベートした。アイスバス中で１分間超音波処理し、８０００×ｇで４℃で１５分遠心分離した。得られたペレットを１０ｍｌの６Ｍ グアニジンクロリドと０．５％ β−メルカプトエタノールに再懸濁した。４℃で１時間磁気撹拌し、ｐＨ８．０の２５ｍＭ Ｔｒｉｓ中の６Ｍ 尿素の２００ｍｌで一晩透析した。サンプルのフォールディングを向上するために、サンプルを６Ｍ 尿素で１〜２ｍｇ／ｍｌに希釈し、以下のもので順次４℃で透析した。４００ｍｌの３Ｍ 尿素 ／ １リットルの１．５Ｍ 尿素 ／ ０．７５Ｍ 尿素 ／ ０．３７Ｍ 尿素 ／ ０．１８Ｍ 尿素（９０分間ごとに変更した）。最後に、５リットルの蒸留水で４℃で一晩透析した。精製工程の最後の操作として、ｐＨ５．５の２５ｍＭ ＡｃＮａで平衡させた HighFlow SP 16/20 カラム（Healthcare 社製）でアニオン交換クロマトグラフィーを行なった。サンプルをｐＨ５．５の２５ｍＭ ＡｃＮａに加えて、３８００×ｇで１０分遠心分離し、ＡＰ（Millipore 社製）と０．４５μｍフィルター（Millipore 社製）で濾過した後、カラムに５ｍｌ／分の速度で流した。溶出はｐＨ５．５の２５ｍＭ ＡｃＮａ中の１０００ｍＭ ＮａＣｌで行なった。
【００７５】
精製の収率は培地１リットル当たり３．８ｍｇであった。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを還元性条件下で行なう組換え Der p 2 の精製の結果、純度が９５％を超え、サイズが１７．０５ｋＤａのタンパク質が得られた（図７）。
【実施例４】
【００７６】
融合体ＱＭ１の構築
Der p 2 のプラスミドＤＮＡを、以下のプライマーを用いるＰＣＲで増幅した。プライマー 5’-CGGGATCCGTCAAAGATAGTGCCAATC-3’ とプライマー 5’-ACGGATCTGCAGGTAGCAATAGCACTGGCCAA-3’ であり、前者は制限酵素 BamHI の切断配列（下線部）を含み、後者は制限酵素 PstI の切断配列（下線部）を含む。増幅条件は以下の通り。９４℃で１分（１サイクル）；９４℃で３０秒、５６℃で３０秒、７２℃で１分（３５サイクル）；７２℃で１０分（１サイクル）。得られた断片を、BamHI/PstI で切断した pBluescript KS ベクター（Stratagene 社製）に連結し、配列決定した。この構築物を酵素 PstI/EcoRI で消化し、Der p 1 の初期配列を酵素 PstI/EcoRI で消化して得られた Der p 1 の成熟タンパク質の部分配列を連結挿入した。得られた融合タンパク質を発現ベクター pKN172 と pTrcHis の BamHI/EcoRI 部位にサブクローンした。
【００７７】
融合タンパク質１は２つの断片を結合して得られた（図３）。第１の断片は、Der p 2の５番〜１２３番アミノ酸からなる配列により形成される断片である。この配列の再増幅のために設計されたオリゴヌクレオチドは、原タンパク質の第８番目と第１１９番目のシステインのセリンによる置換をもたらす塩基置換を含む。第２の断片は、成熟タンパク質 Der p 1の４番〜２２２番アミノ酸からなる配列により形成される断片である。第２の断片を第１の断片に、成熟タンパク質 Der p 1 の３番と５番アミノ酸の間に位置する酵素 PstI のコアで結合した。
【実施例５】
【００７８】
融合体ＱＭ２の構築
以下の３つの断片を結合して融合タンパク質２を構築した。
【００７９】
・断片１： Der p 2 のＮ末端に対応し、酵素 BamHI のコアを含む直接プライマー 5’-CGGGATCCGATCAAGTCGATGTCAAAG-3’と酵素 EcoRI、AvrII と PstI のコアを含む逆プライマー5’- CCGAATTCCCTAGGCTGCAGCCATTTGGATCGAT-3’とで増幅した。増幅条件は以下の通り。９４℃で１分（１サイクル）；９４℃で３０秒、５６℃で３０秒、７２℃で１分（３５サイクル）；７２℃で１０分（１サイクル）。
【００８０】
・断片２（Der p 1の断片）： 以下のオリゴヌクレオチドで増幅した。5’-ACTGACAGGCCTCGTCCATCATCGATCAAAAC-3’ と 5’-CACCTAGGGAGAATGACAACATATGG-3’。直接プライマーは StuI の切断部位を含み、逆プライマーは AvrII の切断部位を含む。増幅条件は以下の通り。９４℃で１分（１サイクル）；９４℃で３０秒、５６℃で３０秒、７２℃で１分（３５サイクル）；７２℃で１０分（１サイクル）。
【００８１】
・断片３： Der p 2 をテンプレートとし、以下のプライマーを用いるＰＣＲで増幅した。プライマー 5’-CACCTAGGCATTACATGAAAAGCCCA-3’ と プライマー 5’-CGGAATTCTTAATCGCGGATTTTAGC-3’。前者は制限酵素 AvrII の認識配列を含み、後者は制限酵素 EcoRI の認識配列を含む。増幅条件は以下の通り。９４℃で１分（１サイクル）；９４℃で３０秒、５２℃で３０秒、７２℃で１分（３５サイクル）；７２℃で１０分（１サイクル）。所望の断片の単離と再増幅の条件は以下の通り。９４℃で１分（１サイクル）；９４℃で３０秒、５６℃で３０秒、７２℃で１分（３５サイクル）；７２℃で１０分（１サイクル）。断片１を、BamHI/EcoRI で切断した pBluescript KS ベクター（Stratagene 社製）にクローニングした。この第１構築物を PstI と AvrII で消化し、これらと同じ酵素であらかじめ消化した断片２を連結挿入した。PstI で消化することにより、この第２の断片には成熟タンパク質 Der p 1 の部分配列のみが導入された。断片１と断片２を含む新たな構築物を、次に AvrII と EcoRI で消化し、断片３に結合した。融合タンパク質をコードするプラスミドＤＮＡを配列決定し、発現ベクター pKN172 と pTrcHis A にサブクローニングした。
【００８２】
Der p 2 の全長タンパク質をコードする配列の７３番アミノ酸残基と７４番アミノ酸残基を決める塩基の間に成熟タンパク質 Der p 1 の５番アミノ酸残基〜最後のアミノ酸残基をコードする配列を挿入して得られる配列から、ＱＭ２融合体のＤＮＡを形成した（図５）。Der p 1 を Der p 2 の第２断片と結合するために、AvrII のコアの６個の塩基（プロリンとアルギニンをコードする）を加えた。断片１と断片３を構築するために設計されたプライマーは、元の配列と比較して若干の違いがあり、それは、Der p 2 の７２番アミノ酸（Ala→Gly）と７８番アミノ酸（Cys→Ser）である（図６）。最終的なタンパク質の３４２番アミノ酸は、Der p 2 の元との配列のアラニンではなく、バリンになっていた。最終的なタンパク質においては、Der p 1 の配列が Der p 2 の７３番アミノ酸の位置に導入された時に、Der p 2 の３次元構造は完全に破壊されていた。最終的なハイブリッドタンパク質は、３４９個のアミノ酸からなり、計算分子量は３８．９２ｋＤａであり、理論的等電点は６．２２であった。
【実施例６】
【００８３】
ハイブリッドタンパク質ＱＭ１およびＱＭ２の発現と精製
対応するプラスミドで形質転換した E. coli BL21 (DE3)の細胞コロニーを２００μｇ／ｍｌのアンピシリンを加えたＬＢ培地から単離し、細胞コロニーで５０ｍｌの同培地を予備接種し、３７℃で撹拌（２６０ｒｐｍ）しながら一晩インキュベートした。１リットルの同培地に該予備接種物を接種し、光学密度（６００ｎｍ）を０．２とした。これを３７℃で撹拌しながら、光学密度（６００ｎｍ）が０．６に達するまでインキュベートし（約９０分）、この時点で、イソプロピル−チオ−β−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）を最終濃度０．６ｍＭで用いて誘導を行なった。３時間の誘導の後、細胞を遠心分離で回収した。
【００８４】
・ＱＭ１の精製
組換えバクテリアの溶解条件と、尿素を除去する段階的透析によるリフォールディングは、rDer p 2 の精製（実施例３）と同様に行なった。最終的に透析による酸化的フォールディングを、ｐＨ８．０の５０ｍＭ Ｔｒｉｓ中の１リットルの５ｍＭ システイン／１ｍＭ シスチンを用いて４℃で一晩行なった。最後に３，８００×ｇで４℃で１０分遠心分離した。得られた上清をＡＰ（Millipore 社製）で濾過し、ｐＨ８．５の２ｍＭ リン酸塩で２時間透析し、１８，０００×ｇで１５分遠心分離して沈殿物を除去した。精製の最終収率は培地１リットル当たり１２０ｍｇであった。
【００８５】
・ＱＭ２の精製
組換えバクテリアの溶解条件は、rDer p 2 の精製（実施例３）と同様に行なった。５０ｍＭ ＤＴＴを、１０ｍｌの６Ｍ グアニジンクロリド中のタンパク質１３５ｍｇに加え、室温で１時間インキュベートした。次に、０．２Ｍ ２−ヨードアセトアミドを加えて、室温で１時間インキュベートした。最後に、０．２Ｍ β−メルカプトエタノールを加えて、室温でさらに１時間インキュベートし、６Ｍ 尿素を加えて５０ｍｌとした。次に、rDer p 2 の精製（実施例３）と同様に、フォールディングを透析により段階的に行って尿素を除去し、３８００×ｇで１５分遠心分離して沈殿物を除去した。次の段階の精製では、ｐＨ１０．０の２０ｍＭ エタノールアミンで平衡させた HighFlow Q 16/20 カラムでアニオン交換クロマトグラフィーを行なった。サンプルを５ｍｌ／分の速度で流し、非結合物質を回収してAmicon Ultra 4（Millipore 社製）で濃縮した。３８００×ｇで１５分遠心分離し、ＡＰと０．４５μｍフィルターで濾過して沈殿物を除去した。最後に、２００ｍＭ ＮＨ4ＨＣＯ3で平衡させた Superdex SX200 16/60カラムにて１ｍｌ／分の速度で分子篩クロマトグラフィーを行なった。タンパク質自体の凝集性により、タンパク質が溶出液中に析出した。純粋調製物を同じバッファー中で凍結乾燥して４℃で保存した。精製の最終収率は培地１リットル当たり４２．４ｍｇであった。
【００８６】
いずれのタンパク質も、封入体としての不溶性画分であり、尿素中で可溶化しないことがわかった。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを還元性条件下で行なうＱＭ１とＱＭ２の精製の結果、純度が９５％を超え、サイズとしては、３４．９１ｋＤａのタンパク質と３９．６７ｋＤａのタンパク質とが得られた（図７）。
【実施例７】
【００８７】
D. pteronyssinusへ のアレルギーをもつ患者から採取した血清の混合物へのハイブリッドタンパク質の低ＩｇＥ結合活性を示す免疫学的試験
【００８８】
Ａ） 免疫検出
キメラＱＭ１とキメラＱＭ２のＩｇＥ結合活性の初期評価を、イムノトランスファー技法を用いて、D. pteronyssinus へのアレルギーをもつ患者から採取した血清の混合物について行なった。タンパク質抽出物と精製タンパク質をポリアクリルアミドゲルに乗せ、Towbin et alの方法によりエレクトロトランスファーを行なった [Towbin, H., Staehelin, I., and Gordon, J. (1979). Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: Procedure and some applications. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 4350-4354]。ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離したタンパク質をＰＶＤＦ（ポリビニリデン ジフルオライド）Hybond-P シート（GE-Healthcare 社製）へ エレクトロトランスファーした。シートを室温で１時間ブロッキングした後、１次抗体と共に４℃で一晩インキュベートし、同じ洗浄バッファーで何回も洗浄し、シートを、ペルオキシダーゼを結合した２次抗体と共に室温で１時間インキュベートした。バンド検出を、ＥＣＬ化学ルミネセンス法（GE-Healthcare 社製）（製造者の表現）を用いて、シートをフィルム（Hyperfilm.ECL、GE-Healthcare 社製）に暴露することにより行った。
【００８９】
免疫検出試験は定量的ではなかったが、２つのキメラの間にＩｇＥ結合活性の違いがあることが示された。こうして、キメラＱＭ１のみがＩｇＥ抗体をわずかに認識し、キメラＱＭ２はＩｇＥ抗体を認識しないことが示された（図８）。
【００９０】
Ｂ） 直接ＥＬＩＳＡ
D. pteronyssinus へのアレルギーをもつ患者から採取した血清を個別に用いて、２つのキメラのＩｇＥ反応性をＥＬＩＳＡ技法で分析した。純粋タンパク質 nDer p 1 と純粋タンパク質 nDer p 2 の等モル混合物をＰＢＳバッファー（１０ｍＭ リン酸塩 ｐＨ７．２; １３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ)に加えて得た試験液を、ポリスチレン製プレート（Greiner 社製）に０．１μｇ／ウェルの量で乗せて、室温で一晩インキュベートした。これらに、１％ ＢＳＡ−０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０を加えたＰＢＳを２００μｌ／ウェルの量で加えてブロックし、３７℃で１時間静置した。次に、D. pteronyssinus へのアレルギーをもつ患者から採取した血清の混合物を１／４に希釈したものを１００μｌ／ウェルの量で加えて、３７℃で９０分間静置した。２００μｌ／ウェルの量のＰＢＳ−Ｔ（ＰＢＳ＋０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０）で３回洗浄した後、ペルオキシダーゼを結合した抗ヒトＩｇＥイムノグロブリン坑血清（Dako 社製）（希釈率１：１０００）を１００μｌ／ウェルの量で加えて、３７℃で９０分間インキュベートした。ＰＢＳ−Ｔでさらに３回洗浄した後、製造者の指示書にしたがい、ｏ−フェニレンジアミン（Sigma 社製、Sigma-Fast Tablet Sets）の溶液を２００μｌ／ウェルの量で加えて、プレートを３０分間暗所に静置した。３Ｍ Ｈ2ＳＯ4を５０μｌ／ウェルの量で加えて反応を停止し、４９２ｎｍでの吸収を ELISA Easy Reader EAR-400 AT プレートリーダー（SLT-Lab Instruments 社製）で測定した。
【００９１】
キメラＱＭ１へのＩｇＥ反応性が一部の患者にだけ見られたが、キメラＱＭ２は患者血清のＩｇＥ抗体には実質的に全く認識されなかった（図９）。
【００９２】
Ｃ） ＥＬＩＳＡ阻害
D. pteronyssinus へのアレルギーをもつ患者から採取した血清の混合物を用いて、２つのキメラへのＩｇＥ反応性をＥＬＩＳＡ阻害技法で分析した。この技法は、D. pteronyssinus へのアレルギーをもつ患者から採取した血清の混合物を１／１０に希釈したものを所定濃度（０．０２５〜２５００ｎｇ／ｍｌ）の阻害性タンパク質と共に４℃で一晩プレインキュベートする以外は、前記の技法と同じである。ＩｇＥに結合した抗体を、直接ＥＬＩＳＡの場合と同様に検出する。
【００９３】
ＥＬＩＳＡ阻害テストにおいて、ＱＭ１は、nDer p 1 - nDer p 2 の等モル混合物よりも低い阻害度を示した。このように、５０％阻害を達成するのに必要な nDer p 1 - nDer p 2 の量は１ｎｇ／ｍｌであり、一方、キメラＱＭ１で同じ効果を達成するためには２５００ｎｇ／ｍｌが必要であった（図１０）。このことは、キメラＱＭ１は患者の特異的ＩｇＥへの結合性が１／２５００に減少しており、したがってそのアレルゲン性は９９．９６％減少していることを示すものであろう。キメラＱＭ２は D. pteronyssinus へのアレルギーをもつ患者の特異的ＩｇＥに対する結合能がなく、したがって、ＥＬＩＳＡ阻害テストにおけるその挙動は、負の対照（ウシ血清アルブミンなど）について得られた挙動と変わらない。
【実施例８】
【００９４】
ハイブリッドタンパク質ＱＭ１およびハイブリッドタンパク質ＱＭ２の皮膚への低い反応性を示すin vivo 実験
【００９５】
キメラＱＭ１とキメラＱＭ２の低アレルゲン性を評価するために、１０７人のダニアレルギー患者に対して皮膚プリックテストを行なった。
【００９６】
皮膚テストは、D. pteronyssinus の抽出物、ダニから単離した nDer p 1 と nDer p 2、E. coli で発現させた rDer p 2、およびキメラＱＭ１とキメラＱＭ２を用いて行なった。全てのサンプルを、０．５％フェノール添加と５０％グリセリン添加の生理食塩水で希釈した。濃度は、非変性タンパク質（nDer p 1、nDer p 2 および rDer p 2）については１μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌであり、キメラについては５μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、５００μｇ／ｍｌであった。負の対照と正の対照として、それぞれＮａＣｌ ０．９％とヒスタミン塩酸塩（１０ｍｇ）を用いた。
【００９７】
実験においては、各アレルゲンの一滴を前腕内側に置き、液滴を通してランセットで前腕内側の皮膚を突いた。各テストは濃度増加と濃度減少の比較のために複数列で繰り返した。１５分後、腫れの周縁部に細字の黒色マーカーペンで線を引いて丸く囲み、低アレルゲン性絆創膏を腫れにそっと押し当てて、インクの跡を絆創膏に転写し、それをさらに腫れ記録シートに転写した。デジタル化ライティングパッド Summasketch とコンピュータ補助デザインプログラム（Autocad v. 11）を用いて、デジタル化記録から腫れの面積を測定した。
【００９８】
反応性測定結果と用いたアレルゲンの濃度には相関が認められた。キメラＱＭ２はわずかな反応性が認められ、具体的には、対象患者１０７人中５人（４．７％）に最高濃度（５００μｇ／ｍｌ）でのみ反応性が認められた。キメラＱＭ１はそれより反応性が高く、８６人（８０．４％）の患者が５００μｇ／ｍｌに対して正の反応を示し、１６人（１６．８％）の患者が５０μｇ／ｍｌに対して正の反応を示したが、野生型タンパク質の反応性よりもはるかに反応性が低かった。得られた実験結果を箱ヒゲ図で示し、また２つの関連する変数のためのウィルコクソン検定を用いることによって示すことにより、比較的に解釈するための統計的研究を行なった（図１０）。これらの図からわかるように、皮膚の反応性（腫れの面積（ｍｍ2）で測定）の値の分布は、ＱＭ１を最高濃度である５００μｇ／ｍｌで用いて得られた値（中央値４０．３３ ｍｍ2、９５％信頼区間：３５．０５〜４７．８８）を、皮膚の反応の誘発性がＱＭ１よりも高い nDer p 1、nDer p 2 および rDer p 2 を１００μｇ／ｍｌの濃度で用いて得た値（中央値はそれぞれ５２．９６ｍｍ2；７８．８６ｍｍ2；および７５．７２ｍｍ2）と比較して、有意に異なっていた（Ｐ＜０．００１）。
【００９９】
しかし、ＱＭ１の反応性は、nDer p 2 を１０μｇ／ｍｌの濃度で用いて得た値（中央値４１．９１ ｍｍ2、９５％信頼区間：２８．２７〜４９．７１）と比較して、有意な違いはなかった（Ｐ＝０．０６７）。また、完全ダニ抽出物の反応性（中央値３９．５５ｍｍ2、９５％信頼区間：３４．１０〜４４．４０）と比較しても、有意な違いはなかった（Ｐ＝０．８７２）。この点で、注目すべきことは、プリック診断に用いたダニ抽出物の調製物は７．９６μｇ／ｍｌの Der p 1 と ２．２２μｇ／ｍｌの Der p 2 とを含んでおり、ＱＭ１のタンパク質量は５００μｇ／ｍｌであったということである。
【０１００】
また、これらの図からは、ＱＭ２の値の分布は、ダニ抽出物（ＤＰＴ）、nDer p 1 および nDer p 2 と比較して有意な違いがあることがわかる（Ｐ＜０．００１）。
【実施例９】
【０１０１】
キメラの比較ＳＰＴ値
【０１０２】
１０ｍｇ／ｍｌのヒスタミンで生じる腫れに類似した腫れを引き起こしたアレルゲン濃度値を比較した。これを、Nordic Guidelines に記載の方法にしたがって行なった［(24) Registration of allergen preparations. Nordic Guidelines (1989). NLN Publication 23, Uppsala, Sweden］。ヒスタミンで生じる腫れに類似した腫れを引き起こしたタンパク質濃度を、各患者について、各タンパク質濃度の異なる濃度で得られた腫れの幾何平均を計算し、得られた値の平均値を対象患者のグループごとに計算した。
【０１０３】
ヒスタミンで生じる腫れに類似した腫れを引き起こしたタンパク質濃度は、nDer p 1 と nDer p 2 については、それぞれ、２０．５μｇ／ｍｌと１７．４μｇ／ｍｌであり、一方、キメラＱＭ１については１８２．４μｇ／ｍｌと大きかった。
【実施例１０】
【０１０４】
ハイブリッドタンパク質ＱＭ１およびハイブリッドタンパク質ＱＭ２のＩｇＥ抗体結合能の低いことを示す実験
【０１０５】
in vivo 試験に加えて、ＥＡＳＴ直接技法を用いて特異的ＩｇＥを定量することによりin vitro 試験を行なった。
【０１０６】
Ceska et alの方法に従って、特異的ＩｇＥを定量した［(25) Ceska, M. and Lundkvist, U. (1972). A new and simple radioimmunoassay method for the determination of IgE. Immunochemistry 9, 1021-1030］。具体的には、天然タンパク質と組換えタンパク質（５０μｇ／ｍｌ）および D. pteronyssinus の抽出物（５００μｇ／ｍｌ）を、シアノゲンブロミドで活性化したディスクにカップリングすることによる方法である。次に、患者の血清５０μｌを加えて、室温で１時間インキュベートした。洗浄後、ディスクを、アルカリフォスファターゼに結合した５０μｌのヒト抗ＩｇＥ抗体と共に３７℃で３０分間インキュベートし、Hytec specific IgE EIA キット（Hycor Biomedical Inc. 社製）の取扱説明書にある製造者の指示にしたがって定量した。
【０１０７】
試験結果は、in vivo 試験の結果を単純に裏付けるものであった。キメラＱＭ２のＩｇＥ抗体への結合能は非常に低く、具体的には、試験した１０７個の血清サンプル中の７個（６．５％）だけが、キメラＱＭ２に結合できるＩｇＥ抗体を有していた。ＱＭ１への特異的ＩｇＥ抗体を有する血清のサンプル数は８８個であった（８２．２％）。ＱＭ１のＩｇＥ抗体結合能（中央値１７．０１Ｕ／ｍｌ、９５％信頼区間：９．９２〜２７．１６）は、全抽出物のＩｇＥ抗体結合能（中央値３９．３５Ｕ／ｍｌ、９５％信頼区間：１８．８０〜５０．９０）と比較して、有意に異なり（Ｐ＜０．００１）、低かった（図１１）。
【実施例１１】
【０１０８】
ハイブリッドタンパク質ＱＭ１およびハイブリッドタンパク質ＱＭ２の好塩基球活性化能を示す実験
【０１０９】
フローサイトメトリーによる好塩基球刺激試験法を用いる実験（フローサイトメトリーによる細胞性アレルゲン刺激試験）をSanz et alの方法により行なった［(26) Sanz, M.L,. Sanchez, G., Gamboa, P., Vila, L., Uasuf, C., Chazot, M. (2001) Allergen-induced basophil activation: CD63 cell expression detected by flow cytometry in patients allergic to D. pteronyssinus and Lolium perenne. Clin. Exp. Allergy 31, 1007-1013］。
【０１１０】
赤血球よりも上の層に位置した血液細胞を遠心分離で回収し、ＩＬ３（２ｎｇ／ｍｌ）と１０μｌのヘパリン（５０００ＵＩ／ｍｌ）を含むＨＥＰＥＳ−Ｃａ2+ バッファー（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１３３ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、７ｍＭ ＣａＣｌ2、３．５ｍＭ ＭｇＣｌ2、１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、ｐＨ７．４）に再懸濁した。アレルゲンの溶液（５０μｌ）と対照物質の溶液（５０μｌ）をＵ字型の底を有するポリスチレンプレート（ドイツ国、フリッケンハウゼン、Greiner Microlon 社製、Greiner-Bio One）のウェルに、２μｇ／ｍｌ〜０．０２ｐｇ／ｍｌの範囲の濃度で加え、患者から採取した細胞の懸濁液５０μｌと混合し、３７℃で４０分間インキュベートした。Ｃａ2+もＭｇ2+も含まず０．２７ｍＭ ＥＤＴＡ（洗浄バッファー）を含むＨＥＰＥＳバッファーの１００μｌを加えて反応を停止し、プレートを遠心分離にかけた。細胞ペレットの好塩基球を、ＰＥ（フィコエリトリン）で標識した抗ＣＤ６３抗体と、ＦＩＴＣ（イソチオシアン酸フルオレセイン）で標識した抗ＩｇＥ抗体とで標識（希釈率１：８０と１：６０、米国、バーリンゲーム、カルタグ）し、４℃で３０分間インキュベートし、その後、赤血球溶解剤を加えた（スペイン国、マドリード、Ortho Diagnostic System 社製）。洗浄バッファーを加えて細胞溶解を停止し、細胞を遠心分離にかけた後、上清を同じバッファーの５００μｌで希釈した。好塩基球の表面マーカーを、４８８ｎｍで１５ｎＷ アルゴンレーザー付きの FACScan フローサイトメトリー装置（米国、サンホセ、Becton Dickinson 社製）を用いるフローサイトメトリーで分析し、データを CellQuest computer package で解析した。各テストにおいて、少なくとも５００個の好塩基球における抗ＩｇＥ抗体と抗ＣＤ６３抗体の標識を研究した。
【０１１１】
抗ＩｇＥモノクロナール抗体であるＬｅ２７（１μｌ／ｍｌ; スイス国、アルシュヴィル、Buhlmann 社製）を正の対照として用い、ＨＥＰＥＳ−Ｃａ2+ バッファーを用いて無刺激の基礎値を評価した。活性化反応は、刺激指数（D. pteronyssinus の抽出物または精製タンパク質で活性化された好塩基球の％ ／ 基礎的条件で活性化された好塩基球の％）が、用いた D. pteronyssinus の抽出物または精製タンパク質のいずれの濃度でも＞２であり、また、アレルゲンによる特異的活性化が＞１０％である場合に、陽性と考えた。
【０１１２】
対照被験者のいずれも、キメラＱＭ１とキメラＱＭ２のいずれについても陽性の結果を示さなかった。D. pteronyssinus へのアレルギーを有する対象患者３３人のうち、ＱＭ１は２８人に陽性反応を引き起こしたが、一方、ＱＭ２は１０人だけに陽性反応を引き起こし、その際の濃度は、ＱＭ１が陽性反応を引き起こした場合よりも常にずっと低いものであった。
【実施例１２】
【０１１３】
ハイブリッドタンパク質ＱＭ１およびＱＭ２の免疫原性能力を実証するための誘導リンパ球増殖実験
低アレルゲン性分子を免疫療法において用いるためには、該分子の抗原性（Ｔエピトープ）が維持されることが絶対に必要である。したがって、ＩｇＥを結合しないことに加えて、ハイブリッドタンパク質が抗原性を保持し続けるかどうかを調べるために、実験で用いた様々なタンパク質によって刺激された抹消血単核球（ＰＢＭＣ）に基づいてリンパ球増殖研究を行った。実験は、フルオレセイン誘導体を精製リンパ球の培養物に導入することによって行った。この誘導体（カルボキシフルオレセインサクシニミジルエステル（ＣＦＳＥ）は、細胞膜を通過することはできたが、細胞エステラーゼによって分解されて、細胞膜を通過できない蛍光性化合物に転換されるまでは蛍光性ではなかった。ＣＦＳＥの導入は、BD FACSCalibur フローサイトメーター（米国、ニュージャージー州、フランクリンレイクス、Becton-Dickinson 社製）を用いたフローサイトメトリーによって分析した。
【０１１４】
D. pteronyssinus に対してアレルギーを示す２３人の患者のＰＢＭＣを、リンパ球分離溶液（Nycomed 社製 Lymphoprep）を用いた密度勾配遠心分離法によって単離した。単離したＰＢＭＣは、培地（Sigma Chemical Co. 社製 RPMI 1640）を用いて１〜２×１０6 viable cells/ml で再懸濁し、その生存率をトリパンブルーのＰＢＳ溶液（トリパンブルーの濃度：０．２５％）（Sigma Chemical Co. 社製）を用いて調べた。９０％を越える生存率を示したＰＢＭＣを、直ちに in vitro 増殖試験に付した。培地 RPMI-1640 において１０×１０6個のＰＢＭＣを、１０分間、３７℃、５％ＣＯ2の加湿雰囲気中で、ＣＦＳＥ（最終濃度：５μＭ）でマークした。マーキングを、５０％のウシ胎児血清を用いて５分間停止し、ＰＢＭＣを、１０％のウシ胎児血清を補充した培地 RPMI-1640 で２回洗い、５％ヒトＡＢ血清を補充した完全培地（RPMI-1640、５０μｇ／ｍｌのゲンタマイシン、２ｍＭのグルタミン）を用いて１〜２×１０6 cells/ml で再懸濁した。ＰＢＭＣを、２４個のウェルを有する平底マイクロプレート（NUNC 社製 Nunclon）に入れて、培地１ｍｌ当たりの最終的な細胞数を１〜２×１０6個とし、抗原（D. pteronyssinus の抽出物および様々な精製タンパク質）を最終濃度が１０μｇ／ｍｌとなるように添加し、７日間、３７℃、５％ＣＯ2の加湿雰囲気でインキュベートした。フローサイトメトリーによる分析を、４色蛍光能を有する BD FACSCalibur フローサイトメーター（Becton-Dickinson 社製）を用いて行った。結果を、Cell Quest ソフトウェアプログラムパッケージ（Becton-Dickinson 社製）を用い、記録された事象の百分率として表した。すべての場合において、刺激されていない３つの培養物を対照として含めた。試験において用いたタンパク質は、２つのハイブリッドタンパク質（ＱＭ１およびＱＭ２）、D. pteronyssinus から得た精製タンパク質 nDer p 1 および nDer p 2 の等モル混合物（天然混合物）、並びに、E. coli から単離した組換えタンパク質 rDer p 1 および rDer p 2 の等モル混合物（組換え混合物）であった。D. pteronyssinus の抽出物も、対照として用いた。
【０１１５】
第１工程において、その後の試験の実施のために、免疫原タンパク質の広範な濃度範囲についての実験を行って最適の濃度を決定した。すべての場合において、最大の増殖（ＩＥ％）を示したタンパク質濃度は１０μｇ／ｍｌであった。
【０１１６】
D. pteronyssinus に対してアレルギーを示す２３人の患者を対象とした増幅試験の結果を、２つの対応するサンプルについて、統計的箱ヒゲ図ダイヤグラム分析とノンパラメトリック検定とによって分析した。統計的分析から、対照として用いた D. pteronyssinus の抽出物（平均：１２％、９５％信頼区間：８〜２０）は、キメラＱＭ１（平均：１５％、９５％信頼区間：１０〜２５）やキメラＱＭ２（平均：１３％、９５％信頼区間：８〜１７）（それぞれ、Ｐ＝０．１２１、Ｐ＝０．３０４）と有意の差のない抗原刺激能力を示した。しかし、ＱＭ１の免疫原性は、天然混合物（平均：９％、９５％信頼区間：５〜１３）（Ｐ＜０．０５）や組換え混合物（平均：９％、９５％信頼区間：５７〜１４．５）（Ｐ＜０．００５）の場合よりも有意に高かった。２つのキメラを互いに比較したところ、ＱＭ１の方が免疫増殖を誘導する能力が有意に高いことが分かった（Ｐ＜０．００５）（図１３）。
【０１１７】
得られた結果から、融合たんぱく質であるＱＭ１およびＱＭ２の両方とも免疫増殖誘導能力を維持し続け、しかもその免疫増殖誘導能力は野生のタンパク質の場合よりも高くさえあることが分かった。
【実施例１３】
【０１１８】
ＱＭ１およびＱＭ２に誘導された抗体による、天然アレルゲンに対する患者ＩｇＥの結合阻害
この目的のために、ハイブリッドタンパク質によってマウスを免疫した。６週齢のメスのＢＡＬＢ／ｃマウス（スペイン国、バルセロナ、Haarlam 社製）に、精製した nDer p 1および nDer p 2 の等モル混合物（nD1D2）、または水酸化アルミニウムに吸着させたＱＭ１若しくはＱＭ２を１０μｇの量で、１５日毎に５回、腹腔内投与することにより、該マウスを免疫した。各タンパク質につき６匹のマウスを使用し、顎下静脈からの出血による最後の追加免疫（boost）の１０日後に血清を得、使用まで−２０℃でプール、保管した。
【０１１９】
最初に、ＥＬＩＳＡ滴定実験により、マウスの nD1D2、ＱＭ１及びＱＭ２による免疫によって得られた抗血清が、nD1D2 に対する反応性を示すか否かを確認した。ＥＬＩＳＡ試験は、実施例７Ｂに記載した手法に従い、以下のようにして行った。２倍に希釈したマウス抗血清をウェルに加え、その後、１／２０００に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ接合マウス抗マウスＩｇＧ抗体（米国、ミズーリ州、セントルイス、Sigma Chemical 社製）と共にウェルをインキュベートした。３回洗浄した後、２００μｌ／ウェルのｏ−フェニレンジアミン溶液（Sigma 社製）を加えてペルオキシダーゼ活性を測定した。３０分後、５０μｌ／ウェルの３Ｍ Ｈ2ＳＯ4を加えて呈色反応を停止し、光学密度を４９２ｎｍにて読み取った。
【０１２０】
精製した nDer p 1 および nDer p 2 の等モル混合物（nD1D2）、ＱＭ１およびＱＭ２でマウスを免疫することにより得た抗血清は、nD1D2 と反応した。これは、両ハイブリッドタンパク質による免疫は、nD1D2 による免疫と比較して、より高度な nD1D2 特異的ＩｇＧ抗体レベルとなることを示すものである（図１４Ａ）。
【０１２１】
ハイブリッド分子に対するマウスＩｇＧが、患者血清ＩｇＥの nD1D2 に対する結合を阻害することが可能かどうかを調べるために、９人のチリダニ（ＨＤＭ）アレルギー患者から採取した血清のそれぞれ、または３０人のＨＤＭアレルギー患者から採取した血清のプール（１／５０に希釈）を用いて競合的ＥＬＩＳＡ分析を行った。ＥＬＩＳＡプレート（Greiner 社製）を、ＰＢＳ中の nD1D2 でコートし（１００ｎｇ／ウェル）、一晩放置し、６匹のマウスの抗 nD1D2、抗ＱＭ１及び抗ＱＭ２血清のプール（それぞれ１／２０に希釈）で予備インキュベートした。免疫前血清プールを、免疫対照として使用した。洗浄後、プレートをそれぞれの血清（１／２０および１／５０に希釈）またはＨＤＭアレルギー患者から採取した血清のプール（１／５０に希釈）と共にインキュベートした。１／２０００に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識抗ヒトＩｇＥ ｍＡｂ（アラバマ州、バーミングハム、Southern 社製）、およびｏ−フェニレンジアミン（Sigma 社製）にて、結合ＩｇＥ抗体を検出した。ブロッキング能は、マウス血清無しの場合に対するウェルのシグナル強度のパーセンテージとして表した。
【０１２２】
ハイブリッドタンパク質によるマウスの免疫化において得られた３種類の特異的マウス抗体間において、９人のダニアレルギー患者のＩｇＥの、nDer p 1 および nDer p 2 の等モル混合物（nD1D2）に対する結合をブロックする能力に相違が見られた。マウス抗 nD1D2 抗体による阻害率は４１〜７２％（平均５６％）であり、マウス抗ＱＭ１および抗ＱＭ２抗体は、ＩｇＥの nD1D2 に対する結合を、それぞれ４３〜８２％（平均６０％）および０〜４５％（平均２０％）阻害した（表１）。マウス抗 nD1D2 抗体による阻害は、マウス抗ＱＭ１抗体の場合より若干低かった（しかし、Ｐ＝０．１３９であり、統計学的な差は認められなかった）。マウス抗ＱＭ２の群の場合に得られた阻害は、抗 nD1D2 の群および抗ＱＭ１の群と比較して、統計学的な差が認められた（Ｐ＜０．０１）。
【０１２３】
【表１】
【０１２４】
更に、マウスのブロッキング抗血清を、３０人のＨＤＭアレルギー患者から採取した血清のプールを用いて評価した（図１４Ｂ）。ＱＭ１およびＱＭ２に対するマウスＩｇＧは、それぞれＩｇＥの nD1D2 に対する結合を７１％および２６％阻害し、これに対して、マウス抗 nD1D2 抗体または免疫前血清による阻害は、それぞれ６５％および１７％であった（図６Ｂ）。ＱＭ２誘導ＩｇＧによるＩｇＥ反応性の部分的阻害は、特異的ＩｇＥの Der p 2 に対する結合阻害能の著しい低さによる。抗ＱＭ２ ＩｇＧ抗体が患者のＩｇＥの Der p 2 に対する結合に干渉する能力は、抗ＱＭ１血清におけるものと比較してずっと低い（それぞれ１３％および８５％）。一方、ＩｇＥの Der p 1 に対する結合の阻害は、いずれのマウス抗血清の場合も同等であった（抗ＱＭ２による阻害：５２％、抗ＱＭ１による阻害：５２％）（図１４Ｂ）。
【０１２５】
ＨＤＭアレルギー患者の血清からのＩｇＥの nD1D2 に対する結合に関しては、ＱＭ１により誘導されたＩｇＧは、ＱＭ２により誘導されたＩｇＧと比較して良好な結合阻害能を示したが、いずれのハイブリッドタンパク質により誘導されたＩｇＧも結合を阻害した。
【０１２６】
ＱＭ２誘導抗血清の場合に見られるようなＩｇＧ反応性の部分的な阻害は、Phl p 2 モザイクタンパク質の場合にも見られる［(30) Mothes-Luksch, N., Stumvoll, S., Linhart, B., Focke, M., Krant, M-T., Hanswirth, A., Valent , P., Verdino, P., Keller, W., Grote, M., Valenta, R. (2008). Disruption of allergenic activity of the major grass pollen allergen Phl p 2 by reassembly as mosaic protein. J Immunol 181, 4864-4873］。上記文献において、著者らは、上記のことがＩｇＥエピトープの破壊によるものであって、元来のＩｇＥエピトープに対するＩｇＧは誘導されない可能性を示唆した。ＱＭ２の場合も、ＩｇＥの Der p 2 への結合に対するＩｇＧブロッキング活性が非常に低く、このハイブリッドのＩｇＥ反応性がほぼ欠失していることから、上記文献に示唆されていることが当てはまるかも知れない。
【０１２７】
マウス抗nD1D2抗体が、それに対するＩｇＥの結合を阻害する能力が低い（６０〜６５％、表１および図１４Ｂ）ことは、Der p 2 特異的ＩｇＥの場合に報告されていることと類似している［Chen, K-W., Fuchs, G., Sonneck, K., Gieras, A., Swoboda, I., Douladiris, N., Linhart, B., Jankovic, M., Pavkov, T., Keller, W., Papadopoulos, N.G., Valent, P., Valenta, R., Vrtala, S. (2008). Reduction of the in vivo allergenicity of Der p 2, the major house-dust mite, by genetic engineering. Mol Immunol. 45, 2486-2498］。このようなネズミＩｇＧとヒトＩｇＥのダニアレルゲンに対する応答特異性の相違は、一部、以前Chapman et al. (1987)により報告されているような免疫化形式の相違に影響されている可能性がある［Chapman, M.D., Heymann, P.W., Platts-Mills, T.A.E. (1987). Epitope mapping of two major inhalant allergens, Der p 1 and Der p 2, from mites of the genus Dermatophagoides. J Immunol. 139, 1479-1484］。アジュバントを含む腹腔内注射によって免疫したマウスにおいて、抗原プロセシングは大々的に進行する。これに対して、アジュバントを伴わない微量のアレルゲンの吸引によって感作されたヒトにおいては、制限されたアレルゲンプロセシングまたは別の抗原プロセシングが発生する。ＱＭ１およびＱＭ２は共に、キメラでない分子の場合と比較して、より高度なＴ細胞刺激能を発揮し、より強い防御抗体反応を誘導した。
【０１２８】
以上のことから、ハイブリッドタンパク質ＱＭ１とＱＭ２は共に、D. pteronyssinus アレルギーの満足な免疫療法の開発に使用可能な低アレルゲン性分子であると結論付けることができる。
【０１２９】
投与方法
本発明は、哺乳類の除感作治療における、上記した低アレルギー誘発性キメラまたは該キメラ由来の合成ペプチドの使用を含む。除感作法は、問題のアレルゲンの非経口（皮下、静脈内または筋肉内）、吸入、経口、舌下、経鼻、または直腸経路に繰り返し投与することを含む。該キメラは、現行の法規と利用できる製薬過程に基づき、単独で投与することも、他の薬理学的に許容される希釈剤または賦形剤と共に投与することもできる。
【図面の簡単な説明】
【０１３０】
【図１】ヌクレオチドの配列と、該ヌクレオチドからコードされる、プレタンパク質 proDer p 1 に対応する、アミノ酸の配列である。プレ領域は枠で囲まれており、ジスルフィド架橋は丸で囲まれたシステイン残基同士を連結する線によって示されている。
【図２】ヌクレオチドの配列と、該ヌクレオチドからコードされる、成熟タンパク質である Der p 2 に対応する、アミノ酸の配列である。ジスルフィド架橋は丸で囲まれたシステイン残基同士を連結する線によって示されている。
【図３】ＱＭ１の構築法を示すためのダイヤグラムである。“＊”は置換された残基の位置を示す。
【図４】ＱＭ１のアミノ酸配列およびそれをコードするヌクレオチド配列である。Der p 2 から導入される残基は、影を付けて示す。Der p 1 から導入される残基は、枠で囲まれている。置換された残基は二重枠で示す。
【図５】ＱＭ２の構築法を示すためのダイヤグラムである。“＊”は置換された残基の位置を示す。
【図６】ＱＭ２のアミノ酸配列およびそれをコードするヌクレオチド配列である。Der p 2 から導入される残基は、影を付けて示す。Der p 1 から導入される残基は、枠で囲まれている。キメラＱＭ２の形成時に置換された残基は二重下線で示す。
【図７】電気泳動後の、クーマシーブルー染色したポリアクリルアミドゲルである。天然アレルゲンおよび組換えアレルゲン（Der p 1 および Der p 2）、ならびに融合タンパク質であるＱＭ１およびＱＭ２が現われている。
【図８】D. pteronyssinus に対してアレルギーを示す患者の血清のプールのＩｇＥ抗体でインキュベートしたイムノブロット。天然アレルゲンおよび組換えアレルゲン（Der p 1 および Der p 2）、ならびに融合タンパク質であるＱＭ１およびＱＭ２が現われている。レーンＭは標準分子量マーカーを示す。
【図９】nDer p 1、nDer p 2、ＱＭ１およびＱＭ２へのＩｇＥ抗体の結合である。D. pteronyssinus に対してアレルギーを示す１９人の患者の血清を用いる（希釈度 ４分の１）。
【図１０】nDer p 1＋Der p 2 の等モル混合物に対する、D. pteronyssinus に対してアレルギーを示す患者の血清のプールの固相におけるＩｇＥ結合活性の、ＥＬＩＳＡ阻害試験の結果である。用いた阻害分子は、nDer p 1＋Der p 2、ＱＭ１およびＱＭ２であった。それぞれの値は、３回の実験の阻害値の平均値（標準偏差は１０％より小さい）を表す。
【図１１】D. pteronyssinus の抽出物（ＤＰＴ）、nDer p 1 および nDer p 2（両方とも、１０μｇ／ｍｌおよび１００μｇ／ｍｌで）、並びにＱＭ１およびＱＭ２（両方とも、５０μｇ／ｍｌおよび５００μｇ／ｍｌで）を用いた、個々の患者（ｎ＝１０７）の皮膚試験の結果である。個々の値（単位はｍｍ2）は両腕について測定した重複腫れ表面積の平均で与えられる。結果は箱ヒゲ図で示す。各箱の端は２５％点および７５％点を示し、箱の中の線は中央値を示す。各箱から上に伸びる棒および下に伸びる棒は、外れ値ではない最大の観測値を示す。中空の円および星は、それぞれの患者群の外れ値および極値を示す。ウィルコクソン順位検定解析の後のＰ値を記載する。
【図１２】個々の患者（ｎ＝１０７）の血清を用いて測定した、D. pteronyssinus の抽出物（ＤＰＴ）、nDer p 1、nDer p 2、nD1D2、ＱＭ１またはＱＭ２に対して重複特異的なＩｇＥの量を箱ヒゲ図で示したものである。箱ヒゲ図において、各箱の端は２５％点および７５％点を示し、箱の中の線は中央値を示す。各箱から上に伸びる棒および下に伸びる棒は、外れ値ではない最大の観測値を示す。中空の円および星は、それぞれの患者群の外れ値および極値を示す。ウィルコクソン順位検定解析の後のＰ値を記載する。
【図１３】D. pteronyssinus の抽出物（ＤＰＴ）（１０μｇ／ｍｌ）、２つのハイブリッドタンパク質、並びに Der p 1 および Der p 2 の天然体の等モル混合物および組換え体の等モル混合物（それぞれＮＡＴ ＭＩＸ、ＲＥＣ ＭＩＸ）について得られたＴリンパ球の増殖を示したものである。記載した値は刺激指数（％）の値である。Ｐ値は差が有意である場合にのみ示す。
【図１４】（Ａ）nD1D2、ＱＭ１およびＱＭ２で免疫したマウスの抗血清滴定である。抗血清の異なる希釈液を、nDer p 1 および nDer p 2（nD1D2）の天然の等モル混合物に対する反応性を調べるために試験した。それぞれの血清希釈液について、固定したＩｇＥ抗体に対応する平均最適密度（ＯＤ）を表示する。（Ｂ）nD1D2特異的、ＱＭ１特異的、ＱＭ２特異的マウスＩｇＧ抗体による予備インキュベーションの後の、ヒトＩｇＥの nD1D2 およびその成分、Der p 1 並びに Der p 2 への結合の阻害。
【配列表フリーテキスト】
【０１３１】
配列番号１： ＱＭ１
配列番号２： タンパク質ＱＭ１
配列番号３： ＱＭ２
配列番号４： タンパク質ＱＭ２
配列番号５： ＰＣＲ
配列番号６： ＰＣＲ
配列番号７： ＰＣＲ
配列番号８： ＰＣＲ
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アレルギー、詳しくはチリダニによって引き起こされるアレルギー、さらに詳しくは Dermatophagoides 属のダニによって引き起こされるアレルギー、さらに詳しくはグループ１アレルゲンやグループ２アレルゲンへの感作によって生ずるアレルギーの予防および治療に用いるためのハイブリッドタンパク質の製造の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
アレルギーは、通常は無害である異物（アレルゲン）に反応する能力における特異的遺伝性障害または後天性障害である。アレルギーは、感染した器官（皮膚、結膜、鼻、咽頭、気管支粘膜、消化管）の炎症反応に関連する。この病気の即時の症状の例として、鼻炎、結膜炎、皮膚炎、喘息およびアナフィラキシーショックが挙げられる。この病気の慢性的な症状の例として、喘息やアトピー性皮膚炎の遅発型反応が挙げられる。Ｉ型アレルギーは、先進国における重大な健康問題である。Ｉ型アレルギーは、空気によって運ばれる抗原に対するＩｇＥ抗体の形成によって引き起こされる。これらのＩｇＥ抗体は、マスト細胞および好塩基球と相互作用し、ヒスタミンなどの生物学的メディエーターを放出し、これらが先進国の人口の２５％を超える人々にアレルギー性の鼻炎、結膜炎および気管支喘息を引き起こしている。［Floistrup, H., Swartz, J., Bergstrom, A., Alm, J.S., Scheynius, A., van Hage, M., Waser, M., Braun-Fahrlander, C., Schram-Bijkerk, D., Huber, M., Zutavern, A., von Mutius, E., Ublagger, E., Riedler, J., Michaels, K.B., Pershagen, G., The Parsifal Study Group. (2006). Allergic disease and sensitization in Steiner school children. J Allergy Clin Immunol. 117, 59-66］
【０００３】
現在、アレルギー性疾患の原因に向けられた唯一のアレルギー治療方法は、アレルゲン特異的免疫療法（ＳＩＴ）である。ＳＩＴは、特異的アレルゲンによって引き起こされるアレルギー性疾患の効果的な治療法であって、アレルギーを引き起こすタンパク質（アレルゲン抽出物）を、濃度を高めながら規則的に投与することによって患者の免疫応答を調整することを基本的に含む。様々な研究がこのアレルゲン特異的免疫療法の臨床的効果を実証しているけれども、その免疫学的機構は十分には解明されていない。
【０００４】
今までに知られているのは、注入されたアレルゲンの高濃度の服用が、ナイーブヘルパーＴ細胞（ｎＴH）のＴH１細胞またはＴH０細胞への成長を優先的に促進する抗原提示細胞（たとえば、樹状細胞）によるＩＬ−１２の合成量の増加を誘導する、ということである。これは、ＴH２細胞に関連するアレルギー免疫応答がＩＦＮ−γの高水準の生産を誘導するＴH１／ＴH０応答にスイッチされることを可能にする［Akdis, C.A. and Blaser, K. (2000). Mechanisms of allergen-specific immunotherapy. Allergy 55, 522-530］。この免疫スイッチは、免疫抑制サイトカインであるＩＬ−１０およびＴＧＦ−βを生産する制御性Ｔ細胞（ＴR１）の影響下におけるＴH２メモリー細胞の寛容の誘導（クローナルアネルギーまたはクローン消失）によって強化される［Akdis, C.A., Joss, A., Akdis, M., and Blaser, K. (2001). Mechanism of IL-10 induced cell inactivation in allergic inflammation and normal response to allergens. Int. Arch Allergy Immunol. 124; 180-182］。ＴH２細胞の活性化および増殖の低下は、ＩＬ−４の生産の低下と、Ｂ細胞によるＩｇＥの生産の低下をもたらす。鼻や気管支粘膜におけるＴH２細胞の活性化および浸透の低下は、ＩＬ−５の合成の低下をもたらす。これが、ＭＢＰ（主要塩基性タンパク質）やＥＣＰ（好酸球カチオン性タンパク質）などの炎症性メディエーターの放出の大きな低下につながる、好酸球の浸透の低下を可能にする。支配的な表現型ＴH０のＴ細胞の新しいアレルゲン特異的クローンは、Ｂ細胞による大量のアレルゲン特異的ＩｇＧ抗体の生産を促進する、ＴH１サイトカインおよびＴH２サイトカインの混合物を生産する。さらに、高水準のＩＬ−１０は、アレルゲン特異的ＩｇＧ４抗体の合成量の増加を誘導する。これら２種類の特異的抗体は、マスト細胞に固定されているＩｇＥ−結合受容体の架橋を防止するブロッキング抗体として機能することができ、こうしてヒスタミンの脱顆粒化および放出を阻害する［Moverare, R. (2003). Immunological mechanisms of specific immunotherapy with pollen vaccines: implications for diagnostics and the development of improved vaccination strategies. Expert Rev. Vacc. 2, 85-97; Wachholz, P.A., Soni, N.K., Till, S., and Durham, S.R. (2003). Inhibition of allergen-IgE binding to B cells by IgG antibodies after grass pollen immunotherapy. J. Allergy Clin. Immunol. 112; 915-922］。それらはまた、抗原提示細胞によるＩｇＥ−媒介抗原の捕捉をブロックし、これがアレルゲンとの免疫反応を抑制する。
【０００５】
天然物から単離して得たアレルゲン抽出物は、タンパク質と他の分子との複雑な混合物である。その組成（したがって、そのアレルゲン性も）は、用いる材料に依存する。たとえば、花粉の場合には環境条件に依存し、真菌の場合には成熟期に依存し、また、ダニの場合には成育条件に依存する。さらに、抽出物によっては、主要アレルゲンの濃度が不十分であったり、患者がアレルギーを示さない望ましくない成分に汚染されていたり、それら両方の問題があったりする。今日の免疫療法は完全なアレルゲン抽出物を専ら用いるが、このことが数多くの欠点を招来している。たとえば、次のような欠点がある。
− ワクチンと効果細胞に固定されたＩｇＥ抗体との反応性に起因する重大な逆反応。
− 免疫療法開始後の、ワクチンに存在する他のアレルゲンへの新たな感作の発生。
− いくつかのアレルゲン抽出物における、標準化された生産の困難。
【０００６】
上記の問題のために、免疫療法は、望まれるほど安全で効果的なものとはなっていない。
【０００７】
アレルギーの病原論と特異的免疫療法の機構とのよりよい理解が、上記の問題の解決への接近を可能にした。アレルゲン特異的ＴH２応答におけるＩｇＥ−媒介抗原の提示の影響の理解が、ＩｇＥに結合しないアレルゲンを生産するための努力を増加させた。このようなアレルゲンは、食作用／飲作用に基づく抗原捕捉機構によってＴ細胞に向けられ、ＩｇＥ−架橋とＩｇＥ−依存抗原の提示とは回避されるであろう。これは、Ｔ細胞によるＴH０サイトカインまたはＴH１サイトカインの生産の均衡と、Ｂ細胞によるより低いＩｇＥ生産およびより大きいＩｇＧ生産とを誘導し、これによって、アナフィラキシーの危険なくＴH２型Ｔ細胞の寛容の誘導をもたらすであろう。
【０００８】
アレルゲンとアレルゲン誘導体とを得るための組換え技術の進歩は、アレルギーの治療のための新規なワクチンを開発する能力を大きく高めることを容易にした。当業者が直面する困難は、Ｔ細胞による抗原の認識を維持しながら、抗原のＩｇＥ結合を低減することである。より低いＩｇＥ結合能を有するがＴ細胞との反応性を維持するアレルゲン分子は、より少ない注入回数でより速くて安全な免疫治療を可能にするより大量の服用の形で投与され得るかもしれない。さらに、組換えアレルゲンは微生物的発現システムを用いて発酵タンクにおいて大規模に生産することができ、その精製は天然の同等物の精製より能率的である。
【０００９】
ダニは、節足動物の群に属し、０．３ｍｍより小さいサイズを有する。ダニは、ハウスダストを含め様々な環境において発見され得る。ダニは、１９６０年代後期以降、ハウスダストによるアレルギーの原因であると考えられている。
【００１０】
アレルギー症状を引き起こす主要なダニはコナダニ目に属し、以下のように分類される。
【００１１】
動物界
節足動物門
クモ綱
ダニ亜綱
コナダニ目
【００１２】
・コクダニ科
Glycyphaginae 亜科
Blomia 属
B. freemani
B. kulagini
B. tropicalis
Glycyphagus 属
G. domesticus
Lepidoglyphus 属
L. destructor
Labidophorinae 亜科
Gohieria 属
G. fusca
【００１３】
・チリダニ科
Dermatophagoidinae 亜科
Dermatophagoides 属
D. evansi
D. farinae
D. microceras
D. pteronyssinus
D. siboney
D. neotropicalis
Hirstia 属
H. domicola
Malayoglyphus 属
M. carmelitus
Pyroglyphinae 亜科
Euroglyphus 属
E. maynei
【００１４】
・コナダニ科
Acarus 属
A. siro
Tyrophagus 属
T. longior
T. putrescentiae
【００１５】
・マルニクダニ科
Chortoglyphus 属
C. arcuatus
【００１６】
最もしばしばアレルギーを引き起こす種は、Dermatophagoides 属に属する種である。それらの最適な成育条件は、温度が約２０℃で、相対湿度が７０％超である。湿度が５０〜６０％より低い環境は、ダニの存在を異常な程度に限定する。したがって、ダニは、温暖な沿岸地帯に非常に多く存在し、乾燥した山岳地帯、特に標高が１５００ｍを越える地帯には滅多に存在しない。したがって、ダニの濃度は、雨と温和な温度を有する季節の変わる時期（春と秋）に家屋において上昇し、通常は夏（暑く乾燥した気候）の間と冬（寒く乾燥した気候）の間に減少する。
【００１７】
チリダニ（house dust mite）は、何千種類ものタンパク質や他の巨大分子を生産する複雑な生物である。ダニは最もよく見られるアレルギー源の１つである。アレルギーを患っているＥＵ内の５０００万の人のうち、１５％がダニに感作していると見積もられ、推定約１０００〜１５００万の人が適切な診断を受けていない。他のデータは、喘息の子どもの８０％がダニに感作している可能性があることを示している［de Blay F, et al. Influence of mite exposure on symptoms of mite-sensitive patients with asthma. J Allergy Clin Immunol 1994; 93:136-138］。
【００１８】
現在までに、最もよくあるチリダニである D. pteronyssinus および D. farinae に由来する１４種類のアレルゲンについて、アレルギー患者において非常に異なる程度で存在していることが記載されている。国際免疫学連合（Ｉ．Ｕ．Ｉ．Ｓ．）のアレルゲン命名小委員会（http://www.allergen.org/Allergen.aspx）のアレルゲンの公式リスト（２００７年７月３日）に記載されている D. pteronyssinus のアレルゲンは以下の通りである。
【００１９】
・Der p 1
生化学名： システインプロテアーゼ、２８ｋＤａ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、アレルギー過程においてアジュバント効果を引き起こす可能性のあるタンパク質分解活性を有する。
アレルゲン性： ＲＩＡおよびＲＡＳＴ（ｒ＝０．８２、ｐ＜０．００１、ｎ＝３０）による測定によると、血清において、Der p 1 に対するＩｇＥと D. pteronyssinus の抽出物に対するＩｇＥとの間に正の相関関係がある。検査した１１人の患者のすべてが、Der p 1 への応答において陽性の皮膚試験結果を示した（＜１０-2μｇ／ｍｌ）。４２人のダニアレルギー患者の９２％がＲＡＳＴにおいて rDer p 1 に特異的なＩｇＥを有していた。
【００２０】
・Der p 2
生化学名： ＮＰＣ２ファミリーに属する、１５ｋＤａ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）。
アレルゲン性： １２人のダニアレルギー患者のうち９人（７５％）が Der p 2 への応答において陽性の皮膚試験結果を示した（＜１０-3μｇ／ｍｌ）。６５人のダニアレルギー患者のうち５９人（９０．７％）がＲＡＳＴにおいて Der p 2 に特異的なＩｇＥを有していた。４５人のダニアレルギー患者のうち３２人（７１％）がＲＡＳＴにおいて Der p 2 に特異的なＩｇＥを有していた。３５人のダニアレルギー患者の１００％がＲＡＳＴにおいて Der p 2 に特異的なＩｇＥを有していた。
【００２１】
・Der p 3
生化学名： トリプシン、３１ｋＤａ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）。
アレルゲン性： ５５人のダニアレルギー患者の１００％がＲＡＳＴにおいて Der p 3 に特異的なＩｇＥを有していた。３５人のダニアレルギー患者の９７％がＲＡＳＴにおいて Der p 3 に特異的なＩｇＥを有していた。
【００２２】
・Der p 4
生化学名： α−アミラーゼ、６０ｋＤａ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）。
アレルゲン性： 精製した Der p 4 を用いたイムノブロットを行ったとき、２７人の大人のダニアレルギー患者の４６％が Der p 4 に特異的なＩｇＥを有しており、２０人の子どものダニアレルギー患者の２５％が Der p 4 に特異的なＩｇＥを有していた。検査した１０人のダニアレルギー患者のうち３人がドットブロットにおいて Der p 4 に特異的なＩｇＥを有していた。
【００２３】
・Der p 5
サイズ： １４ｋＤａ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）のタンパク質、記載された他のタンパク質に対して有意の相同性を示さない。
アレルゲン性： １９人のダニアレルギー患者のうち６人（３１％）がＲＩＡにおいて Der p 5 に特異的なＩｇＥを有していた。２０人のダニアレルギー患者のうち７人（３７％）が皮膚プリック試験において Der p 5 に対して１０-4〜１０-2μｇ／ｍｌの範囲の陽性反応性を示した。イムノブロットを行ったとき、ダニアレルギー患者の３８個の血清のうち２１個が Der p 5 を認識した。
【００２４】
・Der p 6
生化学名： ケモトリプシン（chemotrypsin）、２５ｋＤａ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）。
アレルゲン性： ４１％（８８人のうちの３６人）のダニアレルギー患者がＲＡＳＴにおいて Der p 6 に特異的なＩｇＥを有していた。４４％（１８人のうちの８人）のダニアレルギー患者が Der p 6 を用いた皮下内皮膚試験において陽性反応を示した。３５人のダニアレルギー患者の６５％がＲＡＳＴにおいて Der p 6 に対して陽性であった。
・Der p 7
サイズ： ２６ｋＤａ、３０ｋＤａ、３１ｋＤａ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）のタンパク質の群、記載された他のタンパク質に対して有意の相同性を示さない。
アレルゲン性： ５３％（３０人のうちの１６人）のダニアレルギー患者が rDer p 7 を用いた皮下試験において陽性反応を示した(１μｇ／ｍｌ)。３８人の子どものうち１４人（３７％）が rDer p 7 に特異的なＩｇＥを有していた。４１人のダニアレルギー患者のうち１９人（４６％）がＲＩＡにおいて rDer p 7 に特異的なＩｇＥを有していた。
【００２５】
・Der p 8
生化学名： グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、２７ｋＤａ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）。
アレルゲン性： イムノブロットにおいて、ダニアレルギー患者の４０％が rDer p 8 を認識した。
【００２６】
・Der p 9
生化学名： コラーゲン分解性セリンプロテアーゼ、２９ｋＤａ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）。
アレルゲン性： ３５人のダニアレルギー患者の９２％がＲＡＳＴにおいて Der p 9 に特異的なＩｇＥを有していた。
【００２７】
・Der p 10
生化学名： トロポミオシン、３６ｋＤａ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）。
アレルゲン性： ３５人のダニアレルギー患者の５．６％がＲＡＳＴにおいて組換え Der p 10 に特異的なＩｇＥを有していた。
【００２８】
・Der p 11
生化学名： パラミオシン、１０３ｋＤａ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）。
アレルゲン性： イムノドットによって測定した、Der p 11 に特異的ＩｇＥ血清の存在は、患者群に依存して、４１．７％〜６６．７％の範囲で変動した。しかし、非アトピー性の蕁麻疹患者の場合や正常な人の場合では低かった（それぞれ１８．８％、８％）。
【００２９】
・Der p 14
生化学名： アポリポホリン、１７７ｋＤａ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）。
アレルゲン性： Der p 14 は有意のＩｇＥ応答とＴ細胞の刺激を誘導する。
【００３０】
・Der p 20
生化学名： アルギニンキナーゼ、分子量は記載されていない。
【００３１】
・Der p 21
生化学名や分子量は記載されていない。
【００３２】
Der p 1 および Der p 2 は、ダニアレルギー患者の８０〜１００％と反応し［Thomas, W.R., Smith, W-E, Hale, B., Mills, K.L., O’Brien, R.M. (2002). Characterization and immunobiology of house dust mite allergens. Int. Arch. Allergy Immunol. 129; 1-8］、D. pteronyssinus の完全な抽出物に対するＩｇＥの反応性をほぼ完全に阻害することができる［Van der Zee, J.S., van Swieten, P., cansen, H.M., Aalbersen, R.C. (1988). Skin tests and histamine release with P1-depleted D. pteronyssinus body extracts and purified P1. J. Allergy Clin. Immunol. 81; 884-895; Meyer, C.H., Bond, J.F., Chen, M.C., Kasaian, M.T. (1994). Comparison of the levels of the allergens Der p I and Der p II in standardised extract of the house dust mite D. pteronyssinus. Clin. Exp. Allergy 24; 1041-1048］。
【００３３】
グループ１アレルゲン（Der p 1）は、システインプロテアーゼ活性を有するタンパク質であって、パパインやアクチン−システインプロテアーゼと同じファミリーに属する。その成熟タンパク質は、２２２個の残基と８０個のプレタンパク質残基とを有する。それは、ダニの消化器官において生産され、したがって、糞の中に見出され、食物の消化に関係するようである。それは３つのジスルフィド架橋（Ｃ４−Ｃ１１７、Ｃ３１−Ｃ７１およびＣ６４−Ｃ１０３）を有する。その３次元構造は２つの球状ドメインで構成されるものであって、１つはアミノ末端に形成され（２１番〜９０番残基）、もう１つはカルボキシル末端に形成される（１３１番〜２００番残基）。それらは、柔軟なループによって（１０１番〜１３１番の位置において）リンクされており［Meno, K., Thorsted, P.B., Ipsen, H., Kristensen, O., Larsen, J.N., Spangfort, M.D., Gajhede, M., Lund, K. (2005). The crystal structure of recombinant proDer p 1, a major house dust mite proteolytic allergen. J. Immunol. 175, 3835-3845］、そこでは大きなＴ細胞刺激活性が示されている［Kircher, M.F., Haeusler, T., Nickel, R., Lamb, J.R., Renz, H., Beyer, K. (2002). Vb 18.1 and Va 2.3+ T-cell subsets are associated with house dust mite allergy in human subjects. J. Allergy Clin. Immunol. 109, 517-523］。タンパク質である Der p 1 は、中性やアルカリ性のｐＨ条件の下で二量体を形成する傾向がある。Ｂ細胞エピトープは分子全体に亘って分布しており、そのいくつかは立体配座エピトープである［De Halleux, S., Stura, E., VanderElst, L., Carlier, V., Jacquemin, M., Saint-Remy, J.M. (2006). Three-dimensional structure and IgE-binding properties of mature fully active Der p 1, a clinically relevant major allergen. J. Allergy Clin. Immunol. 117, 571-576］。
【００３４】
グループ２アレルゲン（Der p 2）は、３つのジスルフィド架橋（Ｃ８−Ｃ１１９、Ｃ２１−Ｃ２７およびＣ７３−Ｃ７８）を有し、互いに逆平行なβシートで構成されている。タンパク質 Der p 2 のＴ細胞エピトープは、該タンパク質の全体に亘って存在している。しかし、１１１番〜１２９番ペブチドはしばしばＴ細胞によって認識される［O’Brien, R.M., Thomas, W.R., Nicholson, I., Lamb, J.R., Tait, B.D. (1995). An immunogenetic analysis of the T-cell recognition of the major house dust mite allergen Der p 2: identification of high- and low-responder HLA-DQ alleles and localization of T-cell epitopes. Immunology. 86, 176-182］。ＩｇＥ結合は３次構造に大きく依存するので、Ｂ細胞エピトープは立体配座エピトープであるようである。
【００３５】
アレルゲン性ダニ抽出物は、タンパク質と非タンパク質分子との複雑な混合物である。抽出物の各成分に対するＩｇＥの特異性のレベルを見出す技術の使用の増加により、アレルギー患者が通常は数多くの成分に反応することが実証された。単一のアレルゲンにのみ反応するアレルギー患者は少なかった。完全なダニ抽出物を用いた免疫療法研究は、危険な全身的な逆効果が、ダニ抽出物を用いた免疫治療をしている間［Akcakaya, N., Hassanzadeh, A., Camcioglu, Y., Cokugras, H. (2000). Local and systemic reactions during immunotherapy with adsorbed extracts of house dust mite in children Ann. Allergy Asthma Immunol. 85; 317-321］や、貝に対する新たなＩｇＥ反応性の導入の間［van Ree, R., Antonicelli, L., Akkerdaas, J.H., Garritani, M.S., Aalberse, R.C., Bonifazi, F. (1996). Possible induction of food allergy during mite immunotherapy. Allergy 51; 108-113］に、生ずる可能性があることを実証した。こうして、現時点で知られているアレルゲン抽出物はダニアレルギーの最適な治療を達成する上で明らかな欠陥のあることが示された。
【００３６】
発明の特徴
上記の背景に留意しながら、本発明者らは、アレルギーの治療、特にダニによって引き起こされるアレルギーの治療のための新規な有利な方法を研究した。広範な研究の結果、本発明者らは、D. pteronyssinus の２種類のアレルゲン（Der p 1 および Der p 2）の断片を結合させることによって形成される新規なハイブリッドタンパク質に基づくダニアレルギー治療のための新規で効果的な方法、および、それらのタンパク質を得るための各種の方法・手段を発見した。本発明の低アレルゲン性ハイブリッドタンパク質は、個々の天然のアレルゲンやそれらの混合物に比べて有意に低いアレルゲン性を有することができる。たとえば、本発明のハイブリッドタンパク質は、個々の天然のアレルゲン及び／又はそれらの混合物のＩｇＥ結合能の６０％未満の、好ましくは５０％未満の、さらに好ましくは４０％未満、さらに好ましくは２０％未満の、さらに好ましくは１０％未満の、さらに好ましくは２％未満の結合能を有することができる。本発明のハイブリッドタンパク質は、ｉ）D. pteronyssinus に対してアレルギーを示す患者の血清のプールを用いた in vitro ＥＬＩＳＡ、ＥＬＩＳＡ−阻害およびイムノブロッティング試験、ｉｉ）D. pteronyssinus に対してアレルギーを示す患者を対象とする in vivo 皮膚反応性試験、ｉｉｉ）D. pteronyssinus に対してアレルギーを示す患者の血液から単離した好塩基球の ex vivo 活性化試験、およびｉｖ）D. pteronyssinus に対してアレルギーを示す患者の個々の血清を用いた in vitro ＥＡＳＴ試験、に基づいてより低いＩｇＥ結合能を有することが示されるので、「低アレルゲン性」ということができる。さらに、本発明のハイブリッドタンパク質は、ｉ）Ｔ細胞反応性を示す D. pteronyssinus に対してアレルギーを示す２３人の患者から採取した抹消血単核球（ＰＢＭＣ）を用いたリンパ球増殖研究によって実証されているように、免疫原性を維持し、ｉｉ）マウスをハイブリッドタンパク質で免疫化した後の野生タンパク質よりも免疫原性が高く、ｉｉｉ）マウスに「ブロッキング」抗体、即ち Der p 1−特異的ＩｇＧおよび Der p 2−特異的ＩｇＧ（これらは、チリダニアレルギー患者のＩｇＥが天然アレルゲンである Der p 1 および Der p 2 に結合するのを阻害する）を誘導する能力を有する。
【００３７】
したがって、本発明は、アレルゲン Der p 1 およびアレルゲン Der p 2 の断片で構成されるハイブリッドタンパク質（またはキメラ）（以下、ＱＭ１、ＱＭ２と称する）に関する。Der p 2 の２つのβシートのうちの少なくとも１つにおいて。Der p 2 のＣ８とＣ１１９との間のジスルフィド架橋は、図２に示されるように成熟天然タンパク質の８番および１１９番の位置におけるシステイン残基の１つまたは２つが、たとえばセリン残基で置換されることによって、または、追加的アミノ酸配列、たとえば、成熟タンパク質（即ち、図１に示すようなプレ領域を有しないタンパク質）の５番〜２２２番残基からなる断片などの Der p 1 の断片の挿入によって、破壊されている。好ましくは、追加的アミノ酸配列は、図２に示すように、成熟天然タンパク質 Der p 2 の配列の７３番残基と７４番残基との間に挿入される。アレルギー反応性は減ずるが、驚くべきことに、免疫原性には損害を与えない。実際には、ハイブリッドタンパク質は、いくつかの試験において免疫原性の増大を示したのであり、さらに、ＩｇＧ抗体の生産を刺激することができる。
【００３８】
したがって、本発明は、配列番号２または配列番号４の配列に少なくとも７０％の、好ましくは少なくとも８０％の、さらに好ましくは少なくとも９０％の、さらに好ましくは少なくとも９５％の、最も好ましくは１００％の相同性を示すアミノ酸配列を包含する、または該アミノ酸配列からなるペプチド配列を提供する。
【００３９】
該タンパク質は、化学合成法、半化学合成法、発現システム利用法などの標準的なタンパク質合成方法によって製造することができる。したがって、本発明はまた、該キメラタンパク質をコードするＤＮＡを包含する、または該ＤＮＡからなるヌクレオチド配列、発現システム（たとえば、該配列とともに発現および発現制御のための必要な配列を包含する様々なベクター）、ならびに該発現システムによって形質転換した宿主細胞および宿主生物に関する。
【００４０】
したがって、本発明は、配列番号１または配列番号３の配列に少なくとも７０％の、好ましくは少なくとも８０％の、さらに好ましくは少なくとも９０％の、さらに好ましくは少なくとも９５％の、最も好ましくは１００％の相同性を示すヌクレオチド配列を包含する、または該ヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを提供する。
【００４１】
発現ベクターは、本発明のポリヌクレオチドが挿入される宿主細胞に応じて選択することができる。宿主細胞のこのような形質転換は、Sambrook et al［Sambrook, J., Russell, D. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, USA］に教示されている技術などの従来技術を用いて行うことができる。適切なベクターの選択は、当業者の技能の範囲である。適切なベクターの例として、プラスミド、バクテリオファージ、コスミドおよびウイルスが挙げられる。
【００４２】
生産したハイブリッドタンパク質は、任意の適切な方法、たとえば沈降やクロマトグラフ分離（たとえばアフィニティークロマトグラフィー）を用いて、宿主細胞から単離し精製することができる。
【００４３】
本発明はまた、上記のキメラポリペプチドの臨床的利用や、アレルギー、特にチリダニ（D. pteronyssinus）に対するアレルギーの治療のための特異的免疫療法に関する。上記のように、特異的免疫療法は、本発明のハイブリッドタンパク質の１つまたは２つ以上を有効量投与することによってアレルギーを治療また予防する方法である。好ましくは、治療の対象は、哺乳類、特にヒトである。アレルギーは、鼻炎、結膜炎、喘息、蕁麻疹、血管性水腫、湿疹、皮膚炎及び／又はアナフィラキシーショックとしてその症状が現われることがある。したがって、本発明の範囲の治療や予防療法は、これらの症状の１つまたは２つ以上に対する治療を含む。
【００４４】
記載されている方法によって製造されるハイブリッドタンパク質は、アレルギー反応の治療のための薬剤として調製してもよい。本発明はまた、これらのハイブリッドタンパク質を含有する可能な組成物、およびそれらを投与する様々な方法に関する。本発明の１つの具体的な態様は、ワクチン組成物に関するものである。主要な成分は、好ましくはアジュバントとともに投与されるハイブリッドタンパク質である。ヒトに投与するのに適当なアジュバントがいくつかあり、その１つの例は水酸化アルミニウムである。ワクチンの調製は、Vaccine Design (“The subunit and adjuvant approach”), eds. MF Powell & MJ Newman, Plenum Press, New York, 1995 に記載されている。
【００４５】
投与の好ましい形態の例として、ワクチン接種一般のために（特にアレルギー免疫療法のために）記載または示唆されているすべての標準的な投与方法を挙げることができる（経口投与、舌下投与、経皮投与、静脈内投与、鼻腔内投与、粘液内投与など）。
【００４６】
以下、本発明のハイブリッドタンパク質のアレルゲン活性低減特性を説明する。本発明において行われるＥＬＩＳＡ実験およびＥＬＩＳＡ阻害実験を用いた免疫学的試験によれば、キメラＱＭ２は D. pteronyssinus に対してアレルギーを示す患者の血清においてＩｇＥ認識を示さなかった（図９）。両方のアレルゲンタンパク質 Der p 1 および Der p 2 の配列の大部分を含むにもかかわらず、キメラＱＭ１は、図１０に示されるように、両方の天然タンパク質の混合物よりも２５００倍も低いＩｇＥ結合能を有する。ＱＭ１は、両方のタンパク質 Der p 1 および Der p 2 の配列の大部分を含むが、Der p 2 の２つのシステイン（８番残基および１１９番残基）において突然変異を有している。
【００４７】
このような低アレルゲン性を示すデータの信頼性は、皮膚プリック試験を用いた１０７人の患者を対象とする in vivo 実験によって実証された。キメラＱＭ１のアレルゲン性（たとえば腫れのサイズによって示される、ＩｇＥ結合能）は、２つの単離した天然タンパク質 Der p 1 および Der p 2 について得られたもの場合の約１／５０と低かった（図１１）。ＱＭ２のアレルゲン性は実質的に０であった。
【００４８】
キメラＱＭ２の低アレルゲン性は、D. pteronyssinus に対してアレルギーを示す１０７人の患者の血清を用いてＱＭ２の分子の反応性を測定することによって実証された（図１２）。アレルゲン性の低減は、キメラＱＭ１およびキメラＱＭ２の免疫原性能力の維持を伴っており、これは個々の天然タンパク質 Der p 1 および Der p 2 の和について観測されたものより驚くほど高かった（図１３および図１４Ａ）。これらの特性は、これらのキメラを従来技術における完全なアレルゲン抽出物の代替物として、より安全に用いることを可能にする。
【００４９】
株の寄託
本発明の微生物の株は、特許手続上の微生物の寄託の国際承認に関するブダペスト条約に基づき、バレンシア大学の Coleccion Espanola de Cultivos Tipo (CECT) (Universidad de Valencia, Edificio de Investigacion, Campus de Burjasot, 46100 BURJASOT, Valencia) に、下記の参照番号で寄託した。
CECT 7317 Escherichia coli QM1
CECT 7318 Escherichia coli QM2
寄託日は２００７年１０月３日である。
【００５０】
発明の詳細な説明
本発明の低アレルゲン性ハイブリッドタンパク質は、ＱＭ１の場合には、両方のタンパク質（Der p 1 および Der p 2）の融合とジスルフィド架橋（８番〜１１９番残基）の１つの除去によって得られ、ＱＭ２の場合には、Der p 2の７３番残基と７４番残基との間にタンパク質 Der p 1 を挿入することによって得られる。驚くべきことに、これらの変化にもかかわらず、本発明のハイブリッドタンパク質（ＱＭ１およびＱＭ２）は、より高いＴ細胞刺激活性を示し（図１３）、分離された野生の分子よりも強い免疫原性を示した（図１４Ａ）。
【００５１】
本発明のハイブリッドタンパク質を構成するペプチド断片は、それらをコードするヌクレオチド配列から、資格があり訓練された人によって、たとえばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅により、Sambrook et al［Sambrook, J., Russell, D. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, USA］などに記載された当分野において周知の方法を用いることによって合成することができる。該ヌクレオチド配列は、適当な制限酵素によって既に切り離されたものであり、ライゲーションによって発現ベクターに組み入れることができる。ペプチド断片をコードする様々のヌクレオチド配列は、様々の制限酵素によって認識される配列で形成されるリンカーを用いて固定され、したがって、天然のアレルゲンの元の配列には存在しなかったいくつかの残基が最終的なハイブリッドペプチド分子に現われる。これらの新たな残基は、タンパク質への正しい翻訳には干渉しなかったのであり、図６における配列において二重下線でマークされている。
【００５２】
本発明のキメラ（ＱＭ１およびＱＭ２）やそれらから誘導される合成ペプチドの、動物、特にヒトなどの哺乳類の不感作化治療への利用も、本発明の範囲である。不感作化の方法は、非経口（皮下、静脈内または筋肉内）、経口、舌下、経鼻または経直腸による繰り返しの投与を含む。本発明のハイブリッドタンパク質は、現行の法規と利用できる製薬過程に基づき、単独で投与することもできるし、薬理学的に許容される賦形剤、アジュバント及び／又は希釈剤と組み合わせて投与することもできる。
【００５３】
以下、本発明のハイブリッドタンパク質の免疫学的特性を説明する。
【００５４】
本発明のハイブリッドタンパク質であるＱＭ１およびＱＭ２は、図８、９、１０および１２に示されるように、低アレルゲン性である。本発明のハイブリッドタンパク質は、完全な抽出物や、天然タンパク質である Der p 1 と Der p 2 との組み合わせよりも、D. pteronyssinus に対してアレルギーを示す患者の血清との反応性が低い。特に、キメラＱＭ２の場合には、“ex vivo”試験において好塩基球を活性化させる能力がより低い。この低アレルゲン性は、in vivo 皮膚試験においても実証されている（図１１）。
【００５５】
図８は、キメラであるＱＭ１およびＱＭ２が天然タンパク質である Der p 2 の反応性に比べてより低いＩｇＥ結合活性を示すことを実証する試験を示している。アレルゲン性の低減は、D. pteronyssinus に対してアレルギーを示す患者の血清の混合物を用いたＥＬＩＳＡ−阻害試験によって定量的に示された（図１０）。５０％の阻害を達成するのに、２つの天然タンパク質である Der p 1 と Der p 2 との混合物の量の２５００倍の量のＱＭ１が必要であった。したがって、ＱＭ１はこれらの天然タンパク質よりも２５００倍もアレルゲン性が低かったと推論できるのであり、これはＩｇＥ結合能がこれら２つの天然タンパク質の混合物よりも９９％以上低くなっていることを示す。
【００５６】
キメラＱＭ１およびＱＭ２の低アレルゲン性を知るための直接の手段は、D. pteronyssinus に対してアレルギーを示す１０７人の患者の皮膚反応性を直接に測定することによって得られた。図１１のデータは、キメラＱＭ２が著しく皮膚反応性を低下させたことを示している。一方で、キメラＱＭ２は５人の患者に陽性反応を生じさせただけであった。各分布の比較は、キメラＱＭ１が、nDer p 2 について観測されるのより５０倍小さい平均腫れサイズを有し、nDer p 1 について観測されるのより１０倍小さい平均腫れサイズを有することを示す。これは、アレルゲン活性の９０〜９８％の減少を示すであろう。これは、ハイブリッドタンパク質のほうがより大量に投与されたにもかかわらず得られらた結果である。
【００５７】
ハイブリッドタンパク質ＱＭ２の低いＩｇＥ結合活性は、D. pteronyssinus に対してアレルギーを示す他の１０７人の患者の血清を用いたＥＡＳＴ測定によっても実証された（図１２）。すべての患者においてＩｇＥ結合は、ＱＭ２については、天然のタンパク質の混合物であるＤＰＴや、単一のタンパク質（組換え体または天然体）と比較すると、実質的に存在しなかった。
【００５８】
ＩｇＥを結合し逆反応を引き起こす能力のこのような大きな低下は、免疫原性能力の維持を伴った。図１３に示されるように、タンパク質ＱＭ１およびＱＭ２は、２つの純粋なタンパク質 Der p 1 および Der p 2 の混合物（天然体の混合物および組換え体の混合物の両方において）によって誘導されるリンパ球増殖指数と同様のリンパ球増殖指数を示した。これは、変異させたポリペプチド Der p 2（Ｃ８−Ｃ１１９）と Der p 1 との融合によって形成されるハイブリッドタンパク質であるＱＭ１と、Der p 2 の２つの断片および Der p 1 を用いて形成されるハイブリッドタンパク質であるＱＭ２とが、より少ない立体配座ＩｇＥ−結合エピトープを含むけれども防御的免疫応答を誘導するのに十分なＴエピトープを維持したことを実証している。
【００５９】
対応するアレルゲンと比べて低いＩｇＥ結合活性を有することや、Ｔ細胞エピトープを含むこと以外の、ＳＩＴのための候補として用いる場合の低アレルゲン性分子のもう１つの望ましい特徴は、ヒスタミンの脱顆粒化および放出を防止する「ブロッキング」抗体を誘導する能力を有することである。ハイブリッドタンパク質ＱＭ１およびＱＭ２によるマウスの免疫化は、野生のタンパク質の混合物よりも強いＩｇＧ応答を誘導した。これらの Der p 1 特異的ＩｇＧ抗体および Der p 2 特異的ＩｇＧ抗体は、チリダニアレルギー患者のＩｇＥの天然アレルゲン Der p 1 および Der p 2 への結合を阻害し、これによってアレルギー症状の予防を改善する。
【００６０】
本発明は、本発明の物を調製しその質を実証する実験過程に関する下記の実施例によって、よりよく理解されるであろう。これらの実施例は、単に例示のためのものであって、本発明を限定するものではない。
【実施例１】
【００６１】
ダニ由来の天然アレルゲン Der p 1 および Der p 2 の精製
D. pteronyssus（スペイン国、マドリード、Laboratorios Leti 社製）の凍結乾燥体と糞の混合物を出発物質として用い、１ｍｍのＰＭＳＦ（フェニルメチルスルホニルフルオリド）を添加した１０容量（p/v）のＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）において４℃で急速撹拌しながら１５分間抽出した。次に３，８００×ｇで４℃で１５分遠心分離した。抽出上清をＡＰ（Millipore 社製）で濾過し、３６１ｇ／ｌの６０％硫酸アンモニウムを３０分かけてゆっくりと加えた。４℃で１時間撹拌した後、１７，０００×ｇで４℃で１５分遠心分離した。
【００６２】
・天然 Der p 1 の精製
遠心分離後に得られたペレットをｐＨ８．０の２０ｍＭ Ｔｒｉｓの２ｍｌに再懸濁し、０．２２μｍで濾過した。ＰＢＳで平衡させた Superdex S200 16/60カラム（スウェーデン国、ウプサラ、GE-Healthcare 社製）に前工程で得た２ｍｌの再懸濁物を注入して、分子篩クロマトグラフィーを行なった。排除容量から３ｍｌの画分を回収し、非還元条件でＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、２４ｋＤａの画分と合わせた。次に、ｐＨ８．５の２０ｍＭ Ｔｒｉｓで平衡させた HighTrap Q カラム（GE-Healthcare 社製）でアニオン交換クロマトグラフィーを行なった。前工程で得た陽性画分を５リットルの蒸留水で１２０分間透析し、ｐＨ８．５の２０ｍＭ Ｔｒｉｓに加えた。得られたサンプルを１ｍｌ／分で注入し、ｐＨ８．５の２０ｍＭ Ｔｒｉｓ中の２００〜１０００ ｍＭ ＮａＣｌの勾配で溶出させた。
【００６３】
調製物の純度はＳＤＳを用いるポリアクリルアミドゲル中での電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で確認した。基本的には、Laemmli の記載する方法に従い [(19) Laemmli, U.K. (1970). Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 277, 680-685］、電気泳動装置ＭＩＮＩ−ＰＲＯＴＥＡＮ (Bio-Rad 社製）を用いて行なった。サイズが１０×１０ｃｍでポリアクリルアミド濃度１２．５％のゲルを、Ｔｒｉｓ−Ｇｌｙｃｉｎｅ緩衝液中で２００ボルト電流に４５分間かけた。マーカーとしてのタンパク質は、Bio-Rad キットの低分子量用のものを用いた。分子量の計算とゲルの濃度の分析は画像分析計（BioRad 社製、Diversity）を用いて行なった。
【００６４】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥを還元性条件下で行なう天然 Der p 1 の精製の結果、純度が９８％を超え、サイズが２９．０７ｋＤａのタンパク質が得られた（図７）。
【００６５】
・天然 Der p 2 の精製
２３９ｇ／ｌの６０％硫酸アンモニウムを沈殿上清に加えて濃度を９５％とし、４℃で一晩撹拌した。それから、１７，０００×ｇで４℃で１５分遠心分離し、得られたペレットを２５ｍｌの MilliQ 水に再懸濁した。次に、ｐＨ８．０の５０ｍＭ Ｔｒｉｓで平衡させた HighFlow Q 16/20 カラム（GE-Healthcare 社製）でアニオン交換クロマトグラフィーを行なった。得られたサンプルを５リットルの水で一晩透析し、その間に水を３回取り替えた。その後、ｐＨ８．０の２０ｍＭ Ｔｒｉｓに加えた。得られたサンプルを５ｍｌ／分で注入し、非結合画分を回収した。第３精製工程として、ｐＨ５．５の２０ｍＭ ＡｃＮａで平衡させた HighTrap SP カラム（GE-Healthcare 社製）でカチオン交換クロマトグラフィーを行なった。前工程で得た非結合画分を５リットルの水で３時間透析し、ｐＨ５．５の２０ｍＭ ＡｃＮａに加えた。得られたサンプルを１ｍｌ／分で注入し、ｐＨ５．５の２０ｍＭ ＡｃＮａ中の２００〜１０００ ｍＭ ＮａＣｌの勾配で溶出させた。最終精製工程として、ＰＢＳで平衡させた Superdex S75/300カラム（GE-Healthcare 社製）で分子篩クロマトグラフィーを行なった。前工程で得た、２００ ｍＭ ＮａＣｌで溶出した画分を Amicon Ultra 4（Millipore社製）で濃縮し、０．４ｍｌ／分で注入し、０．５ｍｌの画分を回収した。画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。１６ｋＤａのタンパク質を含む画分（Der p 2 に対応する）をプールした。
【００６６】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥを還元性条件下で行なう天然 Der p 2 の精製の結果、純度が９５％を超え、サイズが１６．６３ｋＤａのタンパク質が得られた（図７）。
【実施例２】
【００６７】
アレルゲン Der p 1 および Der p 2 のクローニング
逆転写を行なった後、Dermatophagoides から単離したｍＲＮＡからなるテンプレートと、特定のプライマーとを用いるＰＣＲ増幅を行なうことにより、アレルゲン Der p 1 と Der p 2 の相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）をクローニングした。ｍＲＮＡは、D. pteronyssus（スペイン国、マドリード、Laboratorios Leti社製）の１００ｍｇから Quick Prep MicroRNA Purification キット（GE-Healthcare 社製）を用いて単離した。ｃＤＮＡは、First-Strand cDNA 合成キット（GE-Healthcare 社製）を用いてｍＲＮＡの逆転写を行って得た。
【００６８】
プライマーは、ハイブリダイゼーション ゾーン、異なる制限エンドヌクレアーゼ用の種々の切断部位（以下に下線で示す）、およびアンカー用ヌクレオチドからなる。ＰＣＲ増幅反応は、反応容量５０μｌに以下の成分を含む。ＰＣＲ増幅バッファー×１０、５μｌ；２００μｌのｄＮＴＰ；１００ｐｍの各オリゴヌクレオチドプライマー；２．５ユニットの Taq ポリメラーゼ （Pfx DNA ポリメラーゼ, Invitrogen 社製）;１ｎｇのＤＮＡテンプレート、および５０μｌまでの滅菌蒸留水。増幅反応は、RoboCycler サーモサイクラー（Stratagene 社製）中でケースごとに特定の条件で行なった。反応産物をアガロースゲル（２％）中で電気泳動に付し、Geneclean（Bio101 社製）を製造者の説明書に従って使用して、所望のバンドをゲルから単離した。単離した断片をpGEM vector（Promega 社製）に連結した。連結混合物を用いて、E. coli DH5α（イギリス国、ペーズリーの Invitrogen から入手可能）の適格細胞を形質転換した。得られたコロニーを増殖させてそのプラスミドＤＮＡを単離し、適切な酵素を用いて所望の断片を得た。陽性クローンを配列決定用に選択した。pBluescript に挿入したＤＮＡは、蛍光ジデオキシヌクレオチドを使用するようにしたサンガー法の変法により配列を決定し、PRISM Ready Reaction DyeDeoxy Termination Cycle Sequencing キット（Perkin Elmer 社製）を製造者の説明書に従って使用してサーモサイクラー中で増幅した。
【００６９】
・Der p 1 のｃＤＮＡ
Der p 1 をコードするｃＤＮＡの領域を、公知の配列（GenBank アクセス番号: P08176）に基づいて設計したプライマーを用いるＰＣＲで増幅した。直接プライマー 5’-ACTGACAGGCCTCGTCCATCATCGATCAAAAC-3’（配列番号５）は酵素 StuIの切断配列（下線部）を含み、逆プライマー 5’-CGGAATTCCTAGGTTAGAGAATGACAACATATGG-3’（配列番号６）はエンドヌクレアーゼ EcoRI の切断配列（下線部のうち５’側の６塩基 GAATTC）とエンドヌクレアーゼ AvrII の切断配列（下線部のうち３’側の５塩基 CTAGG）とを含む。増幅条件は以下の通り。９４℃で１分（１サイクル）；９４℃で３０秒、４８℃で１分、７２℃で１分（３５サイクル）；７２℃で１０分（１サイクル）。得られたＰＣＲ産物を単離し、pGEM（Promega 社製）ベクターでクローニングし、配列決定した。
【００７０】
Der p 1のプラスミドＤＮＡは、８０個のアミノ酸からなるプレタンパク質と２２２個のアミノ酸からなる成熟タンパク質を含む３０２個のアミノ酸からなるタンパク質をコードしていた（図１）。この配列は、Der p 1.0105 (P08176) と比較して違い（His152→Asn）があった。このタンパク質の計算分子量は２４．９７ｋＤａであり、等電点は５．４９であった。
【００７１】
・Der p 2のｃＤＮＡ
Der p 2 をコードするｃＤＮＡの領域を、公知の配列（AAF86462）に基づいて設計したプライマーを用いるＰＣＲで増幅した。直接プライマー 5’-CGGGATCCGATCAAGTCGATGTCAAAG-3’（配列番号７）は制限酵素BamHIの切断配列を含み、逆プライマー 5’-CGGAATTCTTAATCGCGGATTTTAGC-3’（配列番号８）は制限酵素 EcoRI の切断配列を含む。増幅条件は以下の通り。９４℃で１分（１サイクル）；９４℃で３０秒、４８℃で１分、７２℃で１分（３５サイクル）；７２℃で１０分（１サイクル）。得られたＰＣＲ産物を単離し、pBluescript II KS ベクター（Stratagene 社製）でクローニングし、配列決定した。Der p 2のｃＤＮＡをコードするプラスミドＤＮＡを、制限酵素 BamHI/EcoRI で消化して単離し、pKN172 ベクターでサブクローンした［(20) Way, M., Pope, B., Gooch, J., Hawkins, M., Weeds, A.G. (1990) Identification of a region in segment 1 of gelsolin critical for actin binding. EMBO J. 9; 4103-4109 and pTrcHis A (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)］。
【００７２】
得られたDer p 2の配列は、１２９個のアミノ酸からなるポリペプチドをコードしていた（図２）。この配列は、Der p 2.0102 (AAF86462) と比較して１個のアミノ酸に違い（Leu127→Ile）があった。しかし、Der p 2 (P49278)と公知の他のアイソフォームもこの位置にイソロイシンを有している。このタンパク質の計算分子量は１４．１０６ｋＤａであり、等電点は７．１０であった。
【実施例３】
【００７３】
組換え Der p 2 の発現と精製
Hanahan法 [(21) Hanahan, D. (1983). Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. J. Mol. Biol. 166, 557-580] を用いて、対応するプラスミドで形質転換した E. coli BL21 (DE3)の細胞を、２００μｇ／ｍｌのアンピシリンを加えたＬＢ培地を含むペトリ皿に広げた。細胞コロニーで５０ｍｌの同培地を予備接種し、３７℃で撹拌（２６０ｒｐｍ）しながら一晩インキュベートした。１リットルの同培地に該予備接種物を接種し、光学密度（６００ｎｍ）を０．２とした。これを３７℃で撹拌しながら、光学密度（６００ｎｍ）が０．６に達するまでインキュベートし（約９０分）、この時点で、イソプロピル−チオ−β−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）を最終濃度０．６ｍＭで用いて誘導を行なった。３時間の誘導の後、細胞を遠心分離で回収した。
【００７４】
細胞を１００００ｒｐｍで１５分間、４℃で遠心分離し、５０ｍｌの溶解バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０; １ｍＭ ＤＴＴ（ジチオトレイトール））に再懸濁した。再懸濁液をリゾチーム（最終濃度０．１ｍｇ／ｍｌ）で、３７℃で３０分間撹拌しながら処理した。次に、アイスバス中で５分間超音波処理し、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を加え、室温で３０分間ゆっくりと撹拌しながらインキュベートした。８０００×ｇで１５分遠心分離し、得られたペレットを２０ｍｌの２Ｍ 尿素と０．２％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００に再懸濁し、室温で３０分間ゆっくりと撹拌しながらインキュベートした。アイスバス中で１分間超音波処理し、８０００×ｇで４℃で１５分遠心分離した。得られたペレットを１０ｍｌの６Ｍ グアニジンクロリドと０．５％ β−メルカプトエタノールに再懸濁した。４℃で１時間磁気撹拌し、ｐＨ８．０の２５ｍＭ Ｔｒｉｓ中の６Ｍ 尿素の２００ｍｌで一晩透析した。サンプルのフォールディングを向上するために、サンプルを６Ｍ 尿素で１〜２ｍｇ／ｍｌに希釈し、以下のもので順次４℃で透析した。４００ｍｌの３Ｍ 尿素 ／ １リットルの１．５Ｍ 尿素 ／ ０．７５Ｍ 尿素 ／ ０．３７Ｍ 尿素 ／ ０．１８Ｍ 尿素（９０分間ごとに変更した）。最後に、５リットルの蒸留水で４℃で一晩透析した。精製工程の最後の操作として、ｐＨ５．５の２５ｍＭ ＡｃＮａで平衡させた HighFlow SP 16/20 カラム（Healthcare 社製）でアニオン交換クロマトグラフィーを行なった。サンプルをｐＨ５．５の２５ｍＭ ＡｃＮａに加えて、３８００×ｇで１０分遠心分離し、ＡＰ（Millipore 社製）と０．４５μｍフィルター（Millipore 社製）で濾過した後、カラムに５ｍｌ／分の速度で流した。溶出はｐＨ５．５の２５ｍＭ ＡｃＮａ中の１０００ｍＭ ＮａＣｌで行なった。
【００７５】
精製の収率は培地１リットル当たり３．８ｍｇであった。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを還元性条件下で行なう組換え Der p 2 の精製の結果、純度が９５％を超え、サイズが１７．０５ｋＤａのタンパク質が得られた（図７）。
【実施例４】
【００７６】
融合体ＱＭ１の構築
Der p 2 のプラスミドＤＮＡを、以下のプライマーを用いるＰＣＲで増幅した。プライマー 5’-CGGGATCCGTCAAAGATAGTGCCAATC-3’ とプライマー 5’-ACGGATCTGCAGGTAGCAATAGCACTGGCCAA-3’ であり、前者は制限酵素 BamHI の切断配列（下線部）を含み、後者は制限酵素 PstI の切断配列（下線部）を含む。増幅条件は以下の通り。９４℃で１分（１サイクル）；９４℃で３０秒、５６℃で３０秒、７２℃で１分（３５サイクル）；７２℃で１０分（１サイクル）。得られた断片を、BamHI/PstI で切断した pBluescript KS ベクター（Stratagene 社製）に連結し、配列決定した。この構築物を酵素 PstI/EcoRI で消化し、Der p 1 の初期配列を酵素 PstI/EcoRI で消化して得られた Der p 1 の成熟タンパク質の部分配列を連結挿入した。得られた融合タンパク質を発現ベクター pKN172 と pTrcHis の BamHI/EcoRI 部位にサブクローンした。
【００７７】
融合タンパク質１は２つの断片を結合して得られた（図３）。第１の断片は、Der p 2の５番〜１２３番アミノ酸からなる配列により形成される断片である。この配列の再増幅のために設計されたオリゴヌクレオチドは、原タンパク質の第８番目と第１１９番目のシステインのセリンによる置換をもたらす塩基置換を含む。第２の断片は、成熟タンパク質 Der p 1の４番〜２２２番アミノ酸からなる配列により形成される断片である。第２の断片を第１の断片に、成熟タンパク質 Der p 1 の３番と５番アミノ酸の間に位置する酵素 PstI のコアで結合した。
【実施例５】
【００７８】
融合体ＱＭ２の構築
以下の３つの断片を結合して融合タンパク質２を構築した。
【００７９】
・断片１： Der p 2 のＮ末端に対応し、酵素 BamHI のコアを含む直接プライマー 5’-CGGGATCCGATCAAGTCGATGTCAAAG-3’と酵素 EcoRI、AvrII と PstI のコアを含む逆プライマー5’- CCGAATTCCCTAGGCTGCAGCCATTTGGATCGAT-3’とで増幅した。増幅条件は以下の通り。９４℃で１分（１サイクル）；９４℃で３０秒、５６℃で３０秒、７２℃で１分（３５サイクル）；７２℃で１０分（１サイクル）。
【００８０】
・断片２（Der p 1の断片）： 以下のオリゴヌクレオチドで増幅した。5’-ACTGACAGGCCTCGTCCATCATCGATCAAAAC-3’ と 5’-CACCTAGGGAGAATGACAACATATGG-3’。直接プライマーは StuI の切断部位を含み、逆プライマーは AvrII の切断部位を含む。増幅条件は以下の通り。９４℃で１分（１サイクル）；９４℃で３０秒、５６℃で３０秒、７２℃で１分（３５サイクル）；７２℃で１０分（１サイクル）。
【００８１】
・断片３： Der p 2 をテンプレートとし、以下のプライマーを用いるＰＣＲで増幅した。プライマー 5’-CACCTAGGCATTACATGAAAAGCCCA-3’ と プライマー 5’-CGGAATTCTTAATCGCGGATTTTAGC-3’。前者は制限酵素 AvrII の認識配列を含み、後者は制限酵素 EcoRI の認識配列を含む。増幅条件は以下の通り。９４℃で１分（１サイクル）；９４℃で３０秒、５２℃で３０秒、７２℃で１分（３５サイクル）；７２℃で１０分（１サイクル）。所望の断片の単離と再増幅の条件は以下の通り。９４℃で１分（１サイクル）；９４℃で３０秒、５６℃で３０秒、７２℃で１分（３５サイクル）；７２℃で１０分（１サイクル）。断片１を、BamHI/EcoRI で切断した pBluescript KS ベクター（Stratagene 社製）にクローニングした。この第１構築物を PstI と AvrII で消化し、これらと同じ酵素であらかじめ消化した断片２を連結挿入した。PstI で消化することにより、この第２の断片には成熟タンパク質 Der p 1 の部分配列のみが導入された。断片１と断片２を含む新たな構築物を、次に AvrII と EcoRI で消化し、断片３に結合した。融合タンパク質をコードするプラスミドＤＮＡを配列決定し、発現ベクター pKN172 と pTrcHis A にサブクローニングした。
【００８２】
Der p 2 の全長タンパク質をコードする配列の７３番アミノ酸残基と７４番アミノ酸残基を決める塩基の間に成熟タンパク質 Der p 1 の５番アミノ酸残基〜最後のアミノ酸残基をコードする配列を挿入して得られる配列から、ＱＭ２融合体のＤＮＡを形成した（図５）。Der p 1 を Der p 2 の第２断片と結合するために、AvrII のコアの６個の塩基（プロリンとアルギニンをコードする）を加えた。断片１と断片３を構築するために設計されたプライマーは、元の配列と比較して若干の違いがあり、それは、Der p 2 の７２番アミノ酸（Ala→Gly）と７８番アミノ酸（Cys→Ser）である（図６）。最終的なタンパク質の３４２番アミノ酸は、Der p 2 の元との配列のアラニンではなく、バリンになっていた。最終的なタンパク質においては、Der p 1 の配列が Der p 2 の７３番アミノ酸の位置に導入された時に、Der p 2 の３次元構造は完全に破壊されていた。最終的なハイブリッドタンパク質は、３４９個のアミノ酸からなり、計算分子量は３８．９２ｋＤａであり、理論的等電点は６．２２であった。
【実施例６】
【００８３】
ハイブリッドタンパク質ＱＭ１およびＱＭ２の発現と精製
対応するプラスミドで形質転換した E. coli BL21 (DE3)の細胞コロニーを２００μｇ／ｍｌのアンピシリンを加えたＬＢ培地から単離し、細胞コロニーで５０ｍｌの同培地を予備接種し、３７℃で撹拌（２６０ｒｐｍ）しながら一晩インキュベートした。１リットルの同培地に該予備接種物を接種し、光学密度（６００ｎｍ）を０．２とした。これを３７℃で撹拌しながら、光学密度（６００ｎｍ）が０．６に達するまでインキュベートし（約９０分）、この時点で、イソプロピル−チオ−β−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）を最終濃度０．６ｍＭで用いて誘導を行なった。３時間の誘導の後、細胞を遠心分離で回収した。
【００８４】
・ＱＭ１の精製
組換えバクテリアの溶解条件と、尿素を除去する段階的透析によるリフォールディングは、rDer p 2 の精製（実施例３）と同様に行なった。最終的に透析による酸化的フォールディングを、ｐＨ８．０の５０ｍＭ Ｔｒｉｓ中の１リットルの５ｍＭ システイン／１ｍＭ シスチンを用いて４℃で一晩行なった。最後に３，８００×ｇで４℃で１０分遠心分離した。得られた上清をＡＰ（Millipore 社製）で濾過し、ｐＨ８．５の２ｍＭ リン酸塩で２時間透析し、１８，０００×ｇで１５分遠心分離して沈殿物を除去した。精製の最終収率は培地１リットル当たり１２０ｍｇであった。
【００８５】
・ＱＭ２の精製
組換えバクテリアの溶解条件は、rDer p 2 の精製（実施例３）と同様に行なった。５０ｍＭ ＤＴＴを、１０ｍｌの６Ｍ グアニジンクロリド中のタンパク質１３５ｍｇに加え、室温で１時間インキュベートした。次に、０．２Ｍ ２−ヨードアセトアミドを加えて、室温で１時間インキュベートした。最後に、０．２Ｍ β−メルカプトエタノールを加えて、室温でさらに１時間インキュベートし、６Ｍ 尿素を加えて５０ｍｌとした。次に、rDer p 2 の精製（実施例３）と同様に、フォールディングを透析により段階的に行って尿素を除去し、３８００×ｇで１５分遠心分離して沈殿物を除去した。次の段階の精製では、ｐＨ１０．０の２０ｍＭ エタノールアミンで平衡させた HighFlow Q 16/20 カラムでアニオン交換クロマトグラフィーを行なった。サンプルを５ｍｌ／分の速度で流し、非結合物質を回収してAmicon Ultra 4（Millipore 社製）で濃縮した。３８００×ｇで１５分遠心分離し、ＡＰと０．４５μｍフィルターで濾過して沈殿物を除去した。最後に、２００ｍＭ ＮＨ4ＨＣＯ3で平衡させた Superdex SX200 16/60カラムにて１ｍｌ／分の速度で分子篩クロマトグラフィーを行なった。タンパク質自体の凝集性により、タンパク質が溶出液中に析出した。純粋調製物を同じバッファー中で凍結乾燥して４℃で保存した。精製の最終収率は培地１リットル当たり４２．４ｍｇであった。
【００８６】
いずれのタンパク質も、封入体としての不溶性画分であり、尿素中で可溶化しないことがわかった。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを還元性条件下で行なうＱＭ１とＱＭ２の精製の結果、純度が９５％を超え、サイズとしては、３４．９１ｋＤａのタンパク質と３９．６７ｋＤａのタンパク質とが得られた（図７）。
【実施例７】
【００８７】
D. pteronyssinusへ のアレルギーをもつ患者から採取した血清の混合物へのハイブリッドタンパク質の低ＩｇＥ結合活性を示す免疫学的試験
【００８８】
Ａ） 免疫検出
キメラＱＭ１とキメラＱＭ２のＩｇＥ結合活性の初期評価を、イムノトランスファー技法を用いて、D. pteronyssinus へのアレルギーをもつ患者から採取した血清の混合物について行なった。タンパク質抽出物と精製タンパク質をポリアクリルアミドゲルに乗せ、Towbin et alの方法によりエレクトロトランスファーを行なった [Towbin, H., Staehelin, I., and Gordon, J. (1979). Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: Procedure and some applications. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 4350-4354]。ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離したタンパク質をＰＶＤＦ（ポリビニリデン ジフルオライド）Hybond-P シート（GE-Healthcare 社製）へ エレクトロトランスファーした。シートを室温で１時間ブロッキングした後、１次抗体と共に４℃で一晩インキュベートし、同じ洗浄バッファーで何回も洗浄し、シートを、ペルオキシダーゼを結合した２次抗体と共に室温で１時間インキュベートした。バンド検出を、ＥＣＬ化学ルミネセンス法（GE-Healthcare 社製）（製造者の表現）を用いて、シートをフィルム（Hyperfilm.ECL、GE-Healthcare 社製）に暴露することにより行った。
【００８９】
免疫検出試験は定量的ではなかったが、２つのキメラの間にＩｇＥ結合活性の違いがあることが示された。こうして、キメラＱＭ１のみがＩｇＥ抗体をわずかに認識し、キメラＱＭ２はＩｇＥ抗体を認識しないことが示された（図８）。
【００９０】
Ｂ） 直接ＥＬＩＳＡ
D. pteronyssinus へのアレルギーをもつ患者から採取した血清を個別に用いて、２つのキメラのＩｇＥ反応性をＥＬＩＳＡ技法で分析した。純粋タンパク質 nDer p 1 と純粋タンパク質 nDer p 2 の等モル混合物をＰＢＳバッファー（１０ｍＭ リン酸塩 ｐＨ７．２; １３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ)に加えて得た試験液を、ポリスチレン製プレート（Greiner 社製）に０．１μｇ／ウェルの量で乗せて、室温で一晩インキュベートした。これらに、１％ ＢＳＡ−０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０を加えたＰＢＳを２００μｌ／ウェルの量で加えてブロックし、３７℃で１時間静置した。次に、D. pteronyssinus へのアレルギーをもつ患者から採取した血清の混合物を１／４に希釈したものを１００μｌ／ウェルの量で加えて、３７℃で９０分間静置した。２００μｌ／ウェルの量のＰＢＳ−Ｔ（ＰＢＳ＋０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０）で３回洗浄した後、ペルオキシダーゼを結合した抗ヒトＩｇＥイムノグロブリン坑血清（Dako 社製）（希釈率１：１０００）を１００μｌ／ウェルの量で加えて、３７℃で９０分間インキュベートした。ＰＢＳ−Ｔでさらに３回洗浄した後、製造者の指示書にしたがい、ｏ−フェニレンジアミン（Sigma 社製、Sigma-Fast Tablet Sets）の溶液を２００μｌ／ウェルの量で加えて、プレートを３０分間暗所に静置した。３Ｍ Ｈ2ＳＯ4を５０μｌ／ウェルの量で加えて反応を停止し、４９２ｎｍでの吸収を ELISA Easy Reader EAR-400 AT プレートリーダー（SLT-Lab Instruments 社製）で測定した。
【００９１】
キメラＱＭ１へのＩｇＥ反応性が一部の患者にだけ見られたが、キメラＱＭ２は患者血清のＩｇＥ抗体には実質的に全く認識されなかった（図９）。
【００９２】
Ｃ） ＥＬＩＳＡ阻害
D. pteronyssinus へのアレルギーをもつ患者から採取した血清の混合物を用いて、２つのキメラへのＩｇＥ反応性をＥＬＩＳＡ阻害技法で分析した。この技法は、D. pteronyssinus へのアレルギーをもつ患者から採取した血清の混合物を１／１０に希釈したものを所定濃度（０．０２５〜２５００ｎｇ／ｍｌ）の阻害性タンパク質と共に４℃で一晩プレインキュベートする以外は、前記の技法と同じである。ＩｇＥに結合した抗体を、直接ＥＬＩＳＡの場合と同様に検出する。
【００９３】
ＥＬＩＳＡ阻害テストにおいて、ＱＭ１は、nDer p 1 - nDer p 2 の等モル混合物よりも低い阻害度を示した。このように、５０％阻害を達成するのに必要な nDer p 1 - nDer p 2 の量は１ｎｇ／ｍｌであり、一方、キメラＱＭ１で同じ効果を達成するためには２５００ｎｇ／ｍｌが必要であった（図１０）。このことは、キメラＱＭ１は患者の特異的ＩｇＥへの結合性が１／２５００に減少しており、したがってそのアレルゲン性は９９．９６％減少していることを示すものであろう。キメラＱＭ２は D. pteronyssinus へのアレルギーをもつ患者の特異的ＩｇＥに対する結合能がなく、したがって、ＥＬＩＳＡ阻害テストにおけるその挙動は、負の対照（ウシ血清アルブミンなど）について得られた挙動と変わらない。
【実施例８】
【００９４】
ハイブリッドタンパク質ＱＭ１およびハイブリッドタンパク質ＱＭ２の皮膚への低い反応性を示すin vivo 実験
【００９５】
キメラＱＭ１とキメラＱＭ２の低アレルゲン性を評価するために、１０７人のダニアレルギー患者に対して皮膚プリックテストを行なった。
【００９６】
皮膚テストは、D. pteronyssinus の抽出物、ダニから単離した nDer p 1 と nDer p 2、E. coli で発現させた rDer p 2、およびキメラＱＭ１とキメラＱＭ２を用いて行なった。全てのサンプルを、０．５％フェノール添加と５０％グリセリン添加の生理食塩水で希釈した。濃度は、非変性タンパク質（nDer p 1、nDer p 2 および rDer p 2）については１μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌであり、キメラについては５μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、５００μｇ／ｍｌであった。負の対照と正の対照として、それぞれＮａＣｌ ０．９％とヒスタミン塩酸塩（１０ｍｇ）を用いた。
【００９７】
実験においては、各アレルゲンの一滴を前腕内側に置き、液滴を通してランセットで前腕内側の皮膚を突いた。各テストは濃度増加と濃度減少の比較のために複数列で繰り返した。１５分後、腫れの周縁部に細字の黒色マーカーペンで線を引いて丸く囲み、低アレルゲン性絆創膏を腫れにそっと押し当てて、インクの跡を絆創膏に転写し、それをさらに腫れ記録シートに転写した。デジタル化ライティングパッド Summasketch とコンピュータ補助デザインプログラム（Autocad v. 11）を用いて、デジタル化記録から腫れの面積を測定した。
【００９８】
反応性測定結果と用いたアレルゲンの濃度には相関が認められた。キメラＱＭ２はわずかな反応性が認められ、具体的には、対象患者１０７人中５人（４．７％）に最高濃度（５００μｇ／ｍｌ）でのみ反応性が認められた。キメラＱＭ１はそれより反応性が高く、８６人（８０．４％）の患者が５００μｇ／ｍｌに対して正の反応を示し、１６人（１６．８％）の患者が５０μｇ／ｍｌに対して正の反応を示したが、野生型タンパク質の反応性よりもはるかに反応性が低かった。得られた実験結果を箱ヒゲ図で示し、また２つの関連する変数のためのウィルコクソン検定を用いることによって示すことにより、比較的に解釈するための統計的研究を行なった（図１０）。これらの図からわかるように、皮膚の反応性（腫れの面積（ｍｍ2）で測定）の値の分布は、ＱＭ１を最高濃度である５００μｇ／ｍｌで用いて得られた値（中央値４０．３３ ｍｍ2、９５％信頼区間：３５．０５〜４７．８８）を、皮膚の反応の誘発性がＱＭ１よりも高い nDer p 1、nDer p 2 および rDer p 2 を１００μｇ／ｍｌの濃度で用いて得た値（中央値はそれぞれ５２．９６ｍｍ2；７８．８６ｍｍ2；および７５．７２ｍｍ2）と比較して、有意に異なっていた（Ｐ＜０．００１）。
【００９９】
しかし、ＱＭ１の反応性は、nDer p 2 を１０μｇ／ｍｌの濃度で用いて得た値（中央値４１．９１ ｍｍ2、９５％信頼区間：２８．２７〜４９．７１）と比較して、有意な違いはなかった（Ｐ＝０．０６７）。また、完全ダニ抽出物の反応性（中央値３９．５５ｍｍ2、９５％信頼区間：３４．１０〜４４．４０）と比較しても、有意な違いはなかった（Ｐ＝０．８７２）。この点で、注目すべきことは、プリック診断に用いたダニ抽出物の調製物は７．９６μｇ／ｍｌの Der p 1 と ２．２２μｇ／ｍｌの Der p 2 とを含んでおり、ＱＭ１のタンパク質量は５００μｇ／ｍｌであったということである。
【０１００】
また、これらの図からは、ＱＭ２の値の分布は、ダニ抽出物（ＤＰＴ）、nDer p 1 および nDer p 2 と比較して有意な違いがあることがわかる（Ｐ＜０．００１）。
【実施例９】
【０１０１】
キメラの比較ＳＰＴ値
【０１０２】
１０ｍｇ／ｍｌのヒスタミンで生じる腫れに類似した腫れを引き起こしたアレルゲン濃度値を比較した。これを、Nordic Guidelines に記載の方法にしたがって行なった［(24) Registration of allergen preparations. Nordic Guidelines (1989). NLN Publication 23, Uppsala, Sweden］。ヒスタミンで生じる腫れに類似した腫れを引き起こしたタンパク質濃度を、各患者について、各タンパク質濃度の異なる濃度で得られた腫れの幾何平均を計算し、得られた値の平均値を対象患者のグループごとに計算した。
【０１０３】
ヒスタミンで生じる腫れに類似した腫れを引き起こしたタンパク質濃度は、nDer p 1 と nDer p 2 については、それぞれ、２０．５μｇ／ｍｌと１７．４μｇ／ｍｌであり、一方、キメラＱＭ１については１８２．４μｇ／ｍｌと大きかった。
【実施例１０】
【０１０４】
ハイブリッドタンパク質ＱＭ１およびハイブリッドタンパク質ＱＭ２のＩｇＥ抗体結合能の低いことを示す実験
【０１０５】
in vivo 試験に加えて、ＥＡＳＴ直接技法を用いて特異的ＩｇＥを定量することによりin vitro 試験を行なった。
【０１０６】
Ceska et alの方法に従って、特異的ＩｇＥを定量した［(25) Ceska, M. and Lundkvist, U. (1972). A new and simple radioimmunoassay method for the determination of IgE. Immunochemistry 9, 1021-1030］。具体的には、天然タンパク質と組換えタンパク質（５０μｇ／ｍｌ）および D. pteronyssinus の抽出物（５００μｇ／ｍｌ）を、シアノゲンブロミドで活性化したディスクにカップリングすることによる方法である。次に、患者の血清５０μｌを加えて、室温で１時間インキュベートした。洗浄後、ディスクを、アルカリフォスファターゼに結合した５０μｌのヒト抗ＩｇＥ抗体と共に３７℃で３０分間インキュベートし、Hytec specific IgE EIA キット（Hycor Biomedical Inc. 社製）の取扱説明書にある製造者の指示にしたがって定量した。
【０１０７】
試験結果は、in vivo 試験の結果を単純に裏付けるものであった。キメラＱＭ２のＩｇＥ抗体への結合能は非常に低く、具体的には、試験した１０７個の血清サンプル中の７個（６．５％）だけが、キメラＱＭ２に結合できるＩｇＥ抗体を有していた。ＱＭ１への特異的ＩｇＥ抗体を有する血清のサンプル数は８８個であった（８２．２％）。ＱＭ１のＩｇＥ抗体結合能（中央値１７．０１Ｕ／ｍｌ、９５％信頼区間：９．９２〜２７．１６）は、全抽出物のＩｇＥ抗体結合能（中央値３９．３５Ｕ／ｍｌ、９５％信頼区間：１８．８０〜５０．９０）と比較して、有意に異なり（Ｐ＜０．００１）、低かった（図１１）。
【実施例１１】
【０１０８】
ハイブリッドタンパク質ＱＭ１およびハイブリッドタンパク質ＱＭ２の好塩基球活性化能を示す実験
【０１０９】
フローサイトメトリーによる好塩基球刺激試験法を用いる実験（フローサイトメトリーによる細胞性アレルゲン刺激試験）をSanz et alの方法により行なった［(26) Sanz, M.L,. Sanchez, G., Gamboa, P., Vila, L., Uasuf, C., Chazot, M. (2001) Allergen-induced basophil activation: CD63 cell expression detected by flow cytometry in patients allergic to D. pteronyssinus and Lolium perenne. Clin. Exp. Allergy 31, 1007-1013］。
【０１１０】
赤血球よりも上の層に位置した血液細胞を遠心分離で回収し、ＩＬ３（２ｎｇ／ｍｌ）と１０μｌのヘパリン（５０００ＵＩ／ｍｌ）を含むＨＥＰＥＳ−Ｃａ2+ バッファー（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１３３ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、７ｍＭ ＣａＣｌ2、３．５ｍＭ ＭｇＣｌ2、１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、ｐＨ７．４）に再懸濁した。アレルゲンの溶液（５０μｌ）と対照物質の溶液（５０μｌ）をＵ字型の底を有するポリスチレンプレート（ドイツ国、フリッケンハウゼン、Greiner Microlon 社製、Greiner-Bio One）のウェルに、２μｇ／ｍｌ〜０．０２ｐｇ／ｍｌの範囲の濃度で加え、患者から採取した細胞の懸濁液５０μｌと混合し、３７℃で４０分間インキュベートした。Ｃａ2+もＭｇ2+も含まず０．２７ｍＭ ＥＤＴＡ（洗浄バッファー）を含むＨＥＰＥＳバッファーの１００μｌを加えて反応を停止し、プレートを遠心分離にかけた。細胞ペレットの好塩基球を、ＰＥ（フィコエリトリン）で標識した抗ＣＤ６３抗体と、ＦＩＴＣ（イソチオシアン酸フルオレセイン）で標識した抗ＩｇＥ抗体とで標識（希釈率１：８０と１：６０、米国、バーリンゲーム、カルタグ）し、４℃で３０分間インキュベートし、その後、赤血球溶解剤を加えた（スペイン国、マドリード、Ortho Diagnostic System 社製）。洗浄バッファーを加えて細胞溶解を停止し、細胞を遠心分離にかけた後、上清を同じバッファーの５００μｌで希釈した。好塩基球の表面マーカーを、４８８ｎｍで１５ｎＷ アルゴンレーザー付きの FACScan フローサイトメトリー装置（米国、サンホセ、Becton Dickinson 社製）を用いるフローサイトメトリーで分析し、データを CellQuest computer package で解析した。各テストにおいて、少なくとも５００個の好塩基球における抗ＩｇＥ抗体と抗ＣＤ６３抗体の標識を研究した。
【０１１１】
抗ＩｇＥモノクロナール抗体であるＬｅ２７（１μｌ／ｍｌ; スイス国、アルシュヴィル、Buhlmann 社製）を正の対照として用い、ＨＥＰＥＳ−Ｃａ2+ バッファーを用いて無刺激の基礎値を評価した。活性化反応は、刺激指数（D. pteronyssinus の抽出物または精製タンパク質で活性化された好塩基球の％ ／ 基礎的条件で活性化された好塩基球の％）が、用いた D. pteronyssinus の抽出物または精製タンパク質のいずれの濃度でも＞２であり、また、アレルゲンによる特異的活性化が＞１０％である場合に、陽性と考えた。
【０１１２】
対照被験者のいずれも、キメラＱＭ１とキメラＱＭ２のいずれについても陽性の結果を示さなかった。D. pteronyssinus へのアレルギーを有する対象患者３３人のうち、ＱＭ１は２８人に陽性反応を引き起こしたが、一方、ＱＭ２は１０人だけに陽性反応を引き起こし、その際の濃度は、ＱＭ１が陽性反応を引き起こした場合よりも常にずっと低いものであった。
【実施例１２】
【０１１３】
ハイブリッドタンパク質ＱＭ１およびＱＭ２の免疫原性能力を実証するための誘導リンパ球増殖実験
低アレルゲン性分子を免疫療法において用いるためには、該分子の抗原性（Ｔエピトープ）が維持されることが絶対に必要である。したがって、ＩｇＥを結合しないことに加えて、ハイブリッドタンパク質が抗原性を保持し続けるかどうかを調べるために、実験で用いた様々なタンパク質によって刺激された抹消血単核球（ＰＢＭＣ）に基づいてリンパ球増殖研究を行った。実験は、フルオレセイン誘導体を精製リンパ球の培養物に導入することによって行った。この誘導体（カルボキシフルオレセインサクシニミジルエステル（ＣＦＳＥ）は、細胞膜を通過することはできたが、細胞エステラーゼによって分解されて、細胞膜を通過できない蛍光性化合物に転換されるまでは蛍光性ではなかった。ＣＦＳＥの導入は、BD FACSCalibur フローサイトメーター（米国、ニュージャージー州、フランクリンレイクス、Becton-Dickinson 社製）を用いたフローサイトメトリーによって分析した。
【０１１４】
D. pteronyssinus に対してアレルギーを示す２３人の患者のＰＢＭＣを、リンパ球分離溶液（Nycomed 社製 Lymphoprep）を用いた密度勾配遠心分離法によって単離した。単離したＰＢＭＣは、培地（Sigma Chemical Co. 社製 RPMI 1640）を用いて１〜２×１０6 viable cells/ml で再懸濁し、その生存率をトリパンブルーのＰＢＳ溶液（トリパンブルーの濃度：０．２５％）（Sigma Chemical Co. 社製）を用いて調べた。９０％を越える生存率を示したＰＢＭＣを、直ちに in vitro 増殖試験に付した。培地 RPMI-1640 において１０×１０6個のＰＢＭＣを、１０分間、３７℃、５％ＣＯ2の加湿雰囲気中で、ＣＦＳＥ（最終濃度：５μＭ）でマークした。マーキングを、５０％のウシ胎児血清を用いて５分間停止し、ＰＢＭＣを、１０％のウシ胎児血清を補充した培地 RPMI-1640 で２回洗い、５％ヒトＡＢ血清を補充した完全培地（RPMI-1640、５０μｇ／ｍｌのゲンタマイシン、２ｍＭのグルタミン）を用いて１〜２×１０6 cells/ml で再懸濁した。ＰＢＭＣを、２４個のウェルを有する平底マイクロプレート（NUNC 社製 Nunclon）に入れて、培地１ｍｌ当たりの最終的な細胞数を１〜２×１０6個とし、抗原（D. pteronyssinus の抽出物および様々な精製タンパク質）を最終濃度が１０μｇ／ｍｌとなるように添加し、７日間、３７℃、５％ＣＯ2の加湿雰囲気でインキュベートした。フローサイトメトリーによる分析を、４色蛍光能を有する BD FACSCalibur フローサイトメーター（Becton-Dickinson 社製）を用いて行った。結果を、Cell Quest ソフトウェアプログラムパッケージ（Becton-Dickinson 社製）を用い、記録された事象の百分率として表した。すべての場合において、刺激されていない３つの培養物を対照として含めた。試験において用いたタンパク質は、２つのハイブリッドタンパク質（ＱＭ１およびＱＭ２）、D. pteronyssinus から得た精製タンパク質 nDer p 1 および nDer p 2 の等モル混合物（天然混合物）、並びに、E. coli から単離した組換えタンパク質 rDer p 1 および rDer p 2 の等モル混合物（組換え混合物）であった。D. pteronyssinus の抽出物も、対照として用いた。
【０１１５】
第１工程において、その後の試験の実施のために、免疫原タンパク質の広範な濃度範囲についての実験を行って最適の濃度を決定した。すべての場合において、最大の増殖（ＩＥ％）を示したタンパク質濃度は１０μｇ／ｍｌであった。
【０１１６】
D. pteronyssinus に対してアレルギーを示す２３人の患者を対象とした増幅試験の結果を、２つの対応するサンプルについて、統計的箱ヒゲ図ダイヤグラム分析とノンパラメトリック検定とによって分析した。統計的分析から、対照として用いた D. pteronyssinus の抽出物（平均：１２％、９５％信頼区間：８〜２０）は、キメラＱＭ１（平均：１５％、９５％信頼区間：１０〜２５）やキメラＱＭ２（平均：１３％、９５％信頼区間：８〜１７）（それぞれ、Ｐ＝０．１２１、Ｐ＝０．３０４）と有意の差のない抗原刺激能力を示した。しかし、ＱＭ１の免疫原性は、天然混合物（平均：９％、９５％信頼区間：５〜１３）（Ｐ＜０．０５）や組換え混合物（平均：９％、９５％信頼区間：５７〜１４．５）（Ｐ＜０．００５）の場合よりも有意に高かった。２つのキメラを互いに比較したところ、ＱＭ１の方が免疫増殖を誘導する能力が有意に高いことが分かった（Ｐ＜０．００５）（図１３）。
【０１１７】
得られた結果から、融合たんぱく質であるＱＭ１およびＱＭ２の両方とも免疫増殖誘導能力を維持し続け、しかもその免疫増殖誘導能力は野生のタンパク質の場合よりも高くさえあることが分かった。
【実施例１３】
【０１１８】
ＱＭ１およびＱＭ２に誘導された抗体による、天然アレルゲンに対する患者ＩｇＥの結合阻害
この目的のために、ハイブリッドタンパク質によってマウスを免疫した。６週齢のメスのＢＡＬＢ／ｃマウス（スペイン国、バルセロナ、Haarlam 社製）に、精製した nDer p 1および nDer p 2 の等モル混合物（nD1D2）、または水酸化アルミニウムに吸着させたＱＭ１若しくはＱＭ２を１０μｇの量で、１５日毎に５回、腹腔内投与することにより、該マウスを免疫した。各タンパク質につき６匹のマウスを使用し、顎下静脈からの出血による最後の追加免疫（boost）の１０日後に血清を得、使用まで−２０℃でプール、保管した。
【０１１９】
最初に、ＥＬＩＳＡ滴定実験により、マウスの nD1D2、ＱＭ１及びＱＭ２による免疫によって得られた抗血清が、nD1D2 に対する反応性を示すか否かを確認した。ＥＬＩＳＡ試験は、実施例７Ｂに記載した手法に従い、以下のようにして行った。２倍に希釈したマウス抗血清をウェルに加え、その後、１／２０００に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ接合マウス抗マウスＩｇＧ抗体（米国、ミズーリ州、セントルイス、Sigma Chemical 社製）と共にウェルをインキュベートした。３回洗浄した後、２００μｌ／ウェルのｏ−フェニレンジアミン溶液（Sigma 社製）を加えてペルオキシダーゼ活性を測定した。３０分後、５０μｌ／ウェルの３Ｍ Ｈ2ＳＯ4を加えて呈色反応を停止し、光学密度を４９２ｎｍにて読み取った。
【０１２０】
精製した nDer p 1 および nDer p 2 の等モル混合物（nD1D2）、ＱＭ１およびＱＭ２でマウスを免疫することにより得た抗血清は、nD1D2 と反応した。これは、両ハイブリッドタンパク質による免疫は、nD1D2 による免疫と比較して、より高度な nD1D2 特異的ＩｇＧ抗体レベルとなることを示すものである（図１４Ａ）。
【０１２１】
ハイブリッド分子に対するマウスＩｇＧが、患者血清ＩｇＥの nD1D2 に対する結合を阻害することが可能かどうかを調べるために、９人のチリダニ（ＨＤＭ）アレルギー患者から採取した血清のそれぞれ、または３０人のＨＤＭアレルギー患者から採取した血清のプール（１／５０に希釈）を用いて競合的ＥＬＩＳＡ分析を行った。ＥＬＩＳＡプレート（Greiner 社製）を、ＰＢＳ中の nD1D2 でコートし（１００ｎｇ／ウェル）、一晩放置し、６匹のマウスの抗 nD1D2、抗ＱＭ１及び抗ＱＭ２血清のプール（それぞれ１／２０に希釈）で予備インキュベートした。免疫前血清プールを、免疫対照として使用した。洗浄後、プレートをそれぞれの血清（１／２０および１／５０に希釈）またはＨＤＭアレルギー患者から採取した血清のプール（１／５０に希釈）と共にインキュベートした。１／２０００に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識抗ヒトＩｇＥ ｍＡｂ（アラバマ州、バーミングハム、Southern 社製）、およびｏ−フェニレンジアミン（Sigma 社製）にて、結合ＩｇＥ抗体を検出した。ブロッキング能は、マウス血清無しの場合に対するウェルのシグナル強度のパーセンテージとして表した。
【０１２２】
ハイブリッドタンパク質によるマウスの免疫化において得られた３種類の特異的マウス抗体間において、９人のダニアレルギー患者のＩｇＥの、nDer p 1 および nDer p 2 の等モル混合物（nD1D2）に対する結合をブロックする能力に相違が見られた。マウス抗 nD1D2 抗体による阻害率は４１〜７２％（平均５６％）であり、マウス抗ＱＭ１および抗ＱＭ２抗体は、ＩｇＥの nD1D2 に対する結合を、それぞれ４３〜８２％（平均６０％）および０〜４５％（平均２０％）阻害した（表１）。マウス抗 nD1D2 抗体による阻害は、マウス抗ＱＭ１抗体の場合より若干低かった（しかし、Ｐ＝０．１３９であり、統計学的な差は認められなかった）。マウス抗ＱＭ２の群の場合に得られた阻害は、抗 nD1D2 の群および抗ＱＭ１の群と比較して、統計学的な差が認められた（Ｐ＜０．０１）。
【０１２３】
【表１】
【０１２４】
更に、マウスのブロッキング抗血清を、３０人のＨＤＭアレルギー患者から採取した血清のプールを用いて評価した（図１４Ｂ）。ＱＭ１およびＱＭ２に対するマウスＩｇＧは、それぞれＩｇＥの nD1D2 に対する結合を７１％および２６％阻害し、これに対して、マウス抗 nD1D2 抗体または免疫前血清による阻害は、それぞれ６５％および１７％であった（図６Ｂ）。ＱＭ２誘導ＩｇＧによるＩｇＥ反応性の部分的阻害は、特異的ＩｇＥの Der p 2 に対する結合阻害能の著しい低さによる。抗ＱＭ２ ＩｇＧ抗体が患者のＩｇＥの Der p 2 に対する結合に干渉する能力は、抗ＱＭ１血清におけるものと比較してずっと低い（それぞれ１３％および８５％）。一方、ＩｇＥの Der p 1 に対する結合の阻害は、いずれのマウス抗血清の場合も同等であった（抗ＱＭ２による阻害：５２％、抗ＱＭ１による阻害：５２％）（図１４Ｂ）。
【０１２５】
ＨＤＭアレルギー患者の血清からのＩｇＥの nD1D2 に対する結合に関しては、ＱＭ１により誘導されたＩｇＧは、ＱＭ２により誘導されたＩｇＧと比較して良好な結合阻害能を示したが、いずれのハイブリッドタンパク質により誘導されたＩｇＧも結合を阻害した。
【０１２６】
ＱＭ２誘導抗血清の場合に見られるようなＩｇＧ反応性の部分的な阻害は、Phl p 2 モザイクタンパク質の場合にも見られる［(30) Mothes-Luksch, N., Stumvoll, S., Linhart, B., Focke, M., Krant, M-T., Hanswirth, A., Valent , P., Verdino, P., Keller, W., Grote, M., Valenta, R. (2008). Disruption of allergenic activity of the major grass pollen allergen Phl p 2 by reassembly as mosaic protein. J Immunol 181, 4864-4873］。上記文献において、著者らは、上記のことがＩｇＥエピトープの破壊によるものであって、元来のＩｇＥエピトープに対するＩｇＧは誘導されない可能性を示唆した。ＱＭ２の場合も、ＩｇＥの Der p 2 への結合に対するＩｇＧブロッキング活性が非常に低く、このハイブリッドのＩｇＥ反応性がほぼ欠失していることから、上記文献に示唆されていることが当てはまるかも知れない。
【０１２７】
マウス抗nD1D2抗体が、それに対するＩｇＥの結合を阻害する能力が低い（６０〜６５％、表１および図１４Ｂ）ことは、Der p 2 特異的ＩｇＥの場合に報告されていることと類似している［Chen, K-W., Fuchs, G., Sonneck, K., Gieras, A., Swoboda, I., Douladiris, N., Linhart, B., Jankovic, M., Pavkov, T., Keller, W., Papadopoulos, N.G., Valent, P., Valenta, R., Vrtala, S. (2008). Reduction of the in vivo allergenicity of Der p 2, the major house-dust mite, by genetic engineering. Mol Immunol. 45, 2486-2498］。このようなネズミＩｇＧとヒトＩｇＥのダニアレルゲンに対する応答特異性の相違は、一部、以前Chapman et al. (1987)により報告されているような免疫化形式の相違に影響されている可能性がある［Chapman, M.D., Heymann, P.W., Platts-Mills, T.A.E. (1987). Epitope mapping of two major inhalant allergens, Der p 1 and Der p 2, from mites of the genus Dermatophagoides. J Immunol. 139, 1479-1484］。アジュバントを含む腹腔内注射によって免疫したマウスにおいて、抗原プロセシングは大々的に進行する。これに対して、アジュバントを伴わない微量のアレルゲンの吸引によって感作されたヒトにおいては、制限されたアレルゲンプロセシングまたは別の抗原プロセシングが発生する。ＱＭ１およびＱＭ２は共に、キメラでない分子の場合と比較して、より高度なＴ細胞刺激能を発揮し、より強い防御抗体反応を誘導した。
【０１２８】
以上のことから、ハイブリッドタンパク質ＱＭ１とＱＭ２は共に、D. pteronyssinus アレルギーの満足な免疫療法の開発に使用可能な低アレルゲン性分子であると結論付けることができる。
【０１２９】
投与方法
本発明は、哺乳類の除感作治療における、上記した低アレルギー誘発性キメラまたは該キメラ由来の合成ペプチドの使用を含む。除感作法は、問題のアレルゲンの非経口（皮下、静脈内または筋肉内）、吸入、経口、舌下、経鼻、または直腸経路に繰り返し投与することを含む。該キメラは、現行の法規と利用できる製薬過程に基づき、単独で投与することも、他の薬理学的に許容される希釈剤または賦形剤と共に投与することもできる。
【図面の簡単な説明】
【０１３０】
【図１】ヌクレオチドの配列と、該ヌクレオチドからコードされる、プレタンパク質 proDer p 1 に対応する、アミノ酸の配列である。プレ領域は枠で囲まれており、ジスルフィド架橋は丸で囲まれたシステイン残基同士を連結する線によって示されている。
【図２】ヌクレオチドの配列と、該ヌクレオチドからコードされる、成熟タンパク質である Der p 2 に対応する、アミノ酸の配列である。ジスルフィド架橋は丸で囲まれたシステイン残基同士を連結する線によって示されている。
【図３】ＱＭ１の構築法を示すためのダイヤグラムである。“＊”は置換された残基の位置を示す。
【図４】ＱＭ１のアミノ酸配列およびそれをコードするヌクレオチド配列である。Der p 2 から導入される残基は、影を付けて示す。Der p 1 から導入される残基は、枠で囲まれている。置換された残基は二重枠で示す。
【図５】ＱＭ２の構築法を示すためのダイヤグラムである。“＊”は置換された残基の位置を示す。
【図６】ＱＭ２のアミノ酸配列およびそれをコードするヌクレオチド配列である。Der p 2 から導入される残基は、影を付けて示す。Der p 1 から導入される残基は、枠で囲まれている。キメラＱＭ２の形成時に置換された残基は二重下線で示す。
【図７】電気泳動後の、クーマシーブルー染色したポリアクリルアミドゲルである。天然アレルゲンおよび組換えアレルゲン（Der p 1 および Der p 2）、ならびに融合タンパク質であるＱＭ１およびＱＭ２が現われている。
【図８】D. pteronyssinus に対してアレルギーを示す患者の血清のプールのＩｇＥ抗体でインキュベートしたイムノブロット。天然アレルゲンおよび組換えアレルゲン（Der p 1 および Der p 2）、ならびに融合タンパク質であるＱＭ１およびＱＭ２が現われている。レーンＭは標準分子量マーカーを示す。
【図９】nDer p 1、nDer p 2、ＱＭ１およびＱＭ２へのＩｇＥ抗体の結合である。D. pteronyssinus に対してアレルギーを示す１９人の患者の血清を用いる（希釈度 ４分の１）。
【図１０】nDer p 1＋Der p 2 の等モル混合物に対する、D. pteronyssinus に対してアレルギーを示す患者の血清のプールの固相におけるＩｇＥ結合活性の、ＥＬＩＳＡ阻害試験の結果である。用いた阻害分子は、nDer p 1＋Der p 2、ＱＭ１およびＱＭ２であった。それぞれの値は、３回の実験の阻害値の平均値（標準偏差は１０％より小さい）を表す。
【図１１】D. pteronyssinus の抽出物（ＤＰＴ）、nDer p 1 および nDer p 2（両方とも、１０μｇ／ｍｌおよび１００μｇ／ｍｌで）、並びにＱＭ１およびＱＭ２（両方とも、５０μｇ／ｍｌおよび５００μｇ／ｍｌで）を用いた、個々の患者（ｎ＝１０７）の皮膚試験の結果である。個々の値（単位はｍｍ2）は両腕について測定した重複腫れ表面積の平均で与えられる。結果は箱ヒゲ図で示す。各箱の端は２５％点および７５％点を示し、箱の中の線は中央値を示す。各箱から上に伸びる棒および下に伸びる棒は、外れ値ではない最大の観測値を示す。中空の円および星は、それぞれの患者群の外れ値および極値を示す。ウィルコクソン順位検定解析の後のＰ値を記載する。
【図１２】個々の患者（ｎ＝１０７）の血清を用いて測定した、D. pteronyssinus の抽出物（ＤＰＴ）、nDer p 1、nDer p 2、nD1D2、ＱＭ１またはＱＭ２に対して重複特異的なＩｇＥの量を箱ヒゲ図で示したものである。箱ヒゲ図において、各箱の端は２５％点および７５％点を示し、箱の中の線は中央値を示す。各箱から上に伸びる棒および下に伸びる棒は、外れ値ではない最大の観測値を示す。中空の円および星は、それぞれの患者群の外れ値および極値を示す。ウィルコクソン順位検定解析の後のＰ値を記載する。
【図１３】D. pteronyssinus の抽出物（ＤＰＴ）（１０μｇ／ｍｌ）、２つのハイブリッドタンパク質、並びに Der p 1 および Der p 2 の天然体の等モル混合物および組換え体の等モル混合物（それぞれＮＡＴ ＭＩＸ、ＲＥＣ ＭＩＸ）について得られたＴリンパ球の増殖を示したものである。記載した値は刺激指数（％）の値である。Ｐ値は差が有意である場合にのみ示す。
【図１４】（Ａ）nD1D2、ＱＭ１およびＱＭ２で免疫したマウスの抗血清滴定である。抗血清の異なる希釈液を、nDer p 1 および nDer p 2（nD1D2）の天然の等モル混合物に対する反応性を調べるために試験した。それぞれの血清希釈液について、固定したＩｇＥ抗体に対応する平均最適密度（ＯＤ）を表示する。（Ｂ）nD1D2特異的、ＱＭ１特異的、ＱＭ２特異的マウスＩｇＧ抗体による予備インキュベーションの後の、ヒトＩｇＥの nD1D2 およびその成分、Der p 1 並びに Der p 2 への結合の阻害。
【配列表フリーテキスト】
【０１３１】
配列番号１： ＱＭ１
配列番号２： タンパク質ＱＭ１
配列番号３： ＱＭ２
配列番号４： タンパク質ＱＭ２
配列番号５： ＰＣＲ
配列番号６： ＰＣＲ
配列番号７： ＰＣＲ
配列番号８： ＰＣＲ
【特許請求の範囲】
【請求項１】
グループ１ダニアレルゲンのアミノ酸配列の断片およびグループ２ダニアレルゲンのアミノ酸配列の断片を包含する、アレルゲン活性の低減したポリペプチドであって、該配列は１つまたは２つ以上のＩｇＥ抗体結合エピトープを欠失し、該断片は少なくとも５０個の長さのアミノ酸残基を含むことを特徴とするポリペプチド。
【請求項２】
グループ２のアレルゲンの配列のＩｇＥ抗体結合エピトープの少なくとも１つが、少なくとも１つのジスルフィド架橋の除去によって欠失していることを特徴とする、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
少なくとも１つのジスルフィド架橋が、該ジスルフィド架橋を形成するシステイン残基の少なくとも１つが代わりのアミノ酸残基で置換されることによって欠失していることを特徴とする、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
グループ２アレルゲンである全長成熟タンパク質の８番および１１９番の位置におけるシステイン残基の少なくとも１つが置換されていることを特徴とする、請求項３に記載のポリペプチド。
【請求項５】
少なくとも１つのジスルフィド架橋が、追加的アミノ酸配列の挿入によるグループ２アレルゲンの配列の破壊によって欠失していることを特徴とする、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項６】
グループ２アレルゲンのアミノ酸配列が、グループ１アレルゲンのアミノ酸配列の断片の挿入によって破壊されていることを特徴とする、請求項５に記載のポリペプチド。
【請求項７】
グループ１アレルゲンのアミノ酸配列の断片が、成熟したグループ１アレルゲンの５番〜２２２番残基からなる断片であることを特徴とする、請求項６に記載のポリペプチド。
【請求項８】
グループ１ダニアレルゲンが D. pteronyssinus アレルゲン（Der p 1）であり、グループ２ダニアレルゲンが D. pteronyssinus アレルゲン（Der p 2）であることを特徴とする、請求項１〜７のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項９】
配列番号２の配列に少なくとも７０％の相同性を示すアミノ酸配列を含むポリペプチド。
【請求項１０】
配列番号４の配列に少なくとも７０％の相同性を示すアミノ酸配列を含むポリペプチド。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれかに記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項１２】
配列番号１の配列に少なくとも７０％の相同性を示すヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項１３】
配列番号３の配列に少なくとも７０％の相同性を示すヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項１４】
請求項１１〜１３のいずれかに記載のポリヌクレオチドの配列を含む発現ベクター。
【請求項１５】
請求項１４に記載の発現ベクターで形質変換した宿主細胞。
【請求項１６】
真核細胞であることを特徴とする、請求項１５に記載の宿主細胞。
【請求項１７】
原核細胞であることを特徴とする、請求項１５に記載の宿主細胞。
【請求項１８】
E. coli 属に属することを特徴とする、請求項１７に記載の宿主細胞。
【請求項１９】
請求項１５〜１８のいずれかに記載の宿主細胞を培養し、該宿主細胞によって生産されたポリペプチドを単離し精製することを含むことを特徴とする、ポリペプチドを生産するための方法。
【請求項２０】
アレルギーの治療または予防に用いるための、請求項１〜１０のいずれかに記載のポリペプチドまたは請求項１４に記載の発現ベクター。
【請求項２１】
アレルギーの治療または予防に用いる組成物の製造における、請求項１〜１０のいずれかに記載のポリペプチドまたは請求項１４に記載の発現ベクターの使用。
【請求項２２】
請求項１〜１０のいずれかに記載のポリペプチドまたは請求項１４に記載の発現ベクターを含み、場合によってはさらに、薬理学的に許容される賦形剤またはアジュバントを含むことを特徴とする薬剤。
【請求項２３】
請求項２２に記載の薬剤を、それを必要とする個体に投与することを含む、アレルギーを治療または予防するための方法。
【請求項２４】
冷凍乾燥体、積層体、溶液、懸濁液または乳化液の形であることを特徴とする、請求項２０に記載の薬剤。
【請求項２５】
皮下投与、舌下投与、経口投与、経鼻投与、直腸投与、局所投与、吸引投与または非経口投与のための、請求項２０に記載の薬剤。
【請求項２６】
置換されたシステイン残基の少なくとも１つがセリン残基で置換されていることを特徴とする、請求項４に記載のポリペプチド。
【請求項１】
グループ１ダニアレルゲンのアミノ酸配列の断片およびグループ２ダニアレルゲンのアミノ酸配列の断片を包含する、アレルゲン活性の低減したポリペプチドであって、該配列は１つまたは２つ以上のＩｇＥ抗体結合エピトープを欠失し、該断片は少なくとも５０個の長さのアミノ酸残基を含むことを特徴とするポリペプチド。
【請求項２】
グループ２のアレルゲンの配列のＩｇＥ抗体結合エピトープの少なくとも１つが、少なくとも１つのジスルフィド架橋の除去によって欠失していることを特徴とする、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
少なくとも１つのジスルフィド架橋が、該ジスルフィド架橋を形成するシステイン残基の少なくとも１つが代わりのアミノ酸残基で置換されることによって欠失していることを特徴とする、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
グループ２アレルゲンである全長成熟タンパク質の８番および１１９番の位置におけるシステイン残基の少なくとも１つが置換されていることを特徴とする、請求項３に記載のポリペプチド。
【請求項５】
少なくとも１つのジスルフィド架橋が、追加的アミノ酸配列の挿入によるグループ２アレルゲンの配列の破壊によって欠失していることを特徴とする、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項６】
グループ２アレルゲンのアミノ酸配列が、グループ１アレルゲンのアミノ酸配列の断片の挿入によって破壊されていることを特徴とする、請求項５に記載のポリペプチド。
【請求項７】
グループ１アレルゲンのアミノ酸配列の断片が、成熟したグループ１アレルゲンの５番〜２２２番残基からなる断片であることを特徴とする、請求項６に記載のポリペプチド。
【請求項８】
グループ１ダニアレルゲンが D. pteronyssinus アレルゲン（Der p 1）であり、グループ２ダニアレルゲンが D. pteronyssinus アレルゲン（Der p 2）であることを特徴とする、請求項１〜７のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項９】
配列番号２の配列に少なくとも７０％の相同性を示すアミノ酸配列を含むポリペプチド。
【請求項１０】
配列番号４の配列に少なくとも７０％の相同性を示すアミノ酸配列を含むポリペプチド。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれかに記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項１２】
配列番号１の配列に少なくとも７０％の相同性を示すヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項１３】
配列番号３の配列に少なくとも７０％の相同性を示すヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項１４】
請求項１１〜１３のいずれかに記載のポリヌクレオチドの配列を含む発現ベクター。
【請求項１５】
請求項１４に記載の発現ベクターで形質変換した宿主細胞。
【請求項１６】
真核細胞であることを特徴とする、請求項１５に記載の宿主細胞。
【請求項１７】
原核細胞であることを特徴とする、請求項１５に記載の宿主細胞。
【請求項１８】
E. coli 属に属することを特徴とする、請求項１７に記載の宿主細胞。
【請求項１９】
請求項１５〜１８のいずれかに記載の宿主細胞を培養し、該宿主細胞によって生産されたポリペプチドを単離し精製することを含むことを特徴とする、ポリペプチドを生産するための方法。
【請求項２０】
アレルギーの治療または予防に用いるための、請求項１〜１０のいずれかに記載のポリペプチドまたは請求項１４に記載の発現ベクター。
【請求項２１】
アレルギーの治療または予防に用いる組成物の製造における、請求項１〜１０のいずれかに記載のポリペプチドまたは請求項１４に記載の発現ベクターの使用。
【請求項２２】
請求項１〜１０のいずれかに記載のポリペプチドまたは請求項１４に記載の発現ベクターを含み、場合によってはさらに、薬理学的に許容される賦形剤またはアジュバントを含むことを特徴とする薬剤。
【請求項２３】
請求項２２に記載の薬剤を、それを必要とする個体に投与することを含む、アレルギーを治療または予防するための方法。
【請求項２４】
冷凍乾燥体、積層体、溶液、懸濁液または乳化液の形であることを特徴とする、請求項２０に記載の薬剤。
【請求項２５】
皮下投与、舌下投与、経口投与、経鼻投与、直腸投与、局所投与、吸引投与または非経口投与のための、請求項２０に記載の薬剤。
【請求項２６】
置換されたシステイン残基の少なくとも１つがセリン残基で置換されていることを特徴とする、請求項４に記載のポリペプチド。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【公表番号】特表２０１１−５１７４０７（Ｐ２０１１−５１７４０７Ａ）
【公表日】平成２３年６月９日（２０１１．６．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５０１３１８（Ｐ２０１１−５０１３１８）
【出願日】平成２１年３月２４日（２００９．３．２４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００９／００５１１４
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１１８６４２
【国際公開日】平成２１年１０月１日（２００９．１０．１）
【出願人】（５１０２０７３０２）ビアル インドゥストリアル ファルマセウティカ エス．エー． (1)
【氏名又は名称原語表記】ＢＩＡＬ ＩＮＤＵＳＴＲＩＡＬ ＦＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡ Ｓ．Ａ．
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年６月９日（２０１１．６．９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年３月２４日（２００９．３．２４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００９／００５１１４
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１１８６４２
【国際公開日】平成２１年１０月１日（２００９．１０．１）
【出願人】（５１０２０７３０２）ビアル インドゥストリアル ファルマセウティカ エス．エー． (1)
【氏名又は名称原語表記】ＢＩＡＬ ＩＮＤＵＳＴＲＩＡＬ ＦＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡ Ｓ．Ａ．
【Ｆターム（参考）】
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