アンチセンス製剤
室温安定及び最小凝集液体製剤は、配列番号１を含む：又は３個以下の不連続な塩基が配列番号１と異なる変異体オリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドと、単糖類及び二糖類並びに／又は糖アルコールから成る群から選択される凝集防止化合物を含む水性担体を含む。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、室温貯蔵安定なオリゴヌクレオチド液体製剤に関する。より特別には、本発明は、凝集体形成も最小化する、Ｈｓｐ２７ ｍＲＮＡに結合するように設計されたホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの安定な製剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｈｓｐ−２７アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）は、Ｈｓｐ２７ ｍＲＮＡに結合してヒトＨｓｐ２７タンパク質の産生を阻害するように設計される。米国特許第７，１０１，９９１号は、種々のＨｓｐ２７ ＡＳＯを記載する。
【０００３】
標的ｐＨ７．４の等張液において、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で調製されたＯＧＸ−４２７、すなわちＨｓｐ２７ ＡＳＯ配列番号１の初期の動物試験用量は、良好な生物学的効果を示した。しかし、より高濃度のＡＳＯでは、ＯＧＸ−４２７製剤は、周囲及び冷蔵の両方の条件下で数日後に非共有凝集体を形成し、結果として臨床使用には望ましくなかった。ＰＢＳ製剤溶液は、類似のアンチセンス産物（クラスタリンＡＳＯに関する米国特許第６，９００，１８７号を参照のこと）については十分に機能し、類似の製剤溶液がＨＳＰ２７ ＡＳＯに使用され得ると期待されていた。しかし、上記に説明及び以下に示されるように、ＨＳＰ２７ ＡＳＯのＰＢＳ溶液は、臨床製剤として実用的ではなかった。
【０００４】
ＡＳＯ製剤の注射可能な投与のための液体製剤は、適切な長期安定性を確保するため習慣的に冷蔵されている。オリゴヌクレオチド製剤の、使用直前の再構成による粉末（フリーズドライ）への凍結乾燥は、製剤送達系に適切な安定性プロフィールを提供するのに利用することができる。しかし、オリゴヌクレオチドの液体製剤、特に周囲（室温）条件下で安定なままであるものには著しい商業利益がある。米国特許公開第２００３／０１１９７６８号は、ｃ−ｍｙｃ ｍＲＮＡを標的にする１５ｍｅｒアンチセンス配列、すなわちＡＡＣＧＴＴＧＡＧＧＧＧＣＡＴ（配列番号２）に関する知見を公開する。４個の連続するＧ残基を含むこの配列は、毒性が増加した、形成された多量体にまで凝集することが観察された。したがって該公開は、使用前の多量体の破壊を開示した。開示された１つのアプローチは、凍結乾燥前にマンニトール、スクロース、グルコース、トリアロース（ｔｒｉａｌｏｓｅ）又はラクトースなどの単糖類の抗凍結剤を添加することである。これは、水により再構成させた際の多量体形成を減少させることが見出された。しかし、長期の溶液安定性及び凝集回避については情報が提供されなかった。
【０００５】
凝集しやすいＡＳＯは、その生物学的有効性を問わず企業の薬剤パイプラインにとって好ましくない臨床候補であり、さらに開発されることはないであろう。しかし、インビボでのＨｓｐ２７ ＡＳＯの生物学的特性はきわめて好ましいため、長期間、液体製剤で貯蔵された場合の凝集及び安定性の問題を克服する努力が行われた。
【０００６】
さらに、ＡＳＯ治療剤は依然として製造するのに費用がかかること、及びそれらの廃棄物又は貯蔵コストのいかなる低減も付加利益となり、商業化可能な薬剤と商業化可能でない薬剤との間の差をもたらす可能性があることも留意されるべきである。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
許容可能な溶液安定性を提供し、配列番号１を有するＡＳＯの非共有凝集を減少させるであろう製剤を見出すためのテストでは、マンニトール（５％）が、２４週間にわたって、−２０℃から６０℃の範囲の温度できわめて低い凝集レベルを維持できることが見出された。類似の結果は、マンニトールの代わりにデキストロースが使用された場合に観察された。全体的な安定性は、この期間、４０℃まで良好であった。故に、本発明は、配列番号１を含む：又は３個以下の不連続な塩基が配列番号１と異なる変異体オリゴヌクレオチドを含むＡＳＯ、並びにデキストロース及びラクトースなどの単糖類及び二糖類、並びにマンニトール及びソルビトールなどの糖アルコールから選択される凝集防止化合物を含む水性担体を含む室温安定最小凝集体製剤の液体製剤を提供する。特定の実施形態では、ＡＳＯは、配列番号１又は３個以下の不連続な塩基が配列番号１と異なる変異体から成る。担体は、リン酸バッファー又はトリスバッファーを含むこともできる。
【０００８】
本発明の他の態様及び特徴は、添付図と併せて本発明の特定の実施形態の以下の記載を再検討すると当業者には明白になるであろう。本発明の実施形態を図示する図は、以下の通りである。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】経時的な凝集体の増加を図示する、４０℃における貯蔵０、３及び５日目のリン酸緩衝生理食塩水（約７０〜７５ｍｇ／ｍＬ）中のＯＧＸ−４２７に関する２つのピーク（左のピークはＯＧＸ−４２７オリゴヌクレオチド単量体であり、右のピークは凝集体である）を示す拡大ＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図２】ＯＧＸ−４２７オリゴヌクレオチド及びこの凝集体（右のピーク）を示すＨＰＬＣクロマトグラムである。高度に凝集された試料（＞５０％）が、ＰＢＳ中、２００ｍｇ／ｍＬ ＯＧＸ−４２７を含有するように調製され、分析前に４日間、周囲条件で経時させた溶液から生成された。
【図３】バッファーなしの５％デキストロース水性製剤中、０、３及び５日目、４０℃、２５ｍｇ／ｍＬでのＯＧＸ−４２７の拡大ＨＰＬＣクロマトグラムを示す図である（バッファーなしの５％マンニトール製剤は事実上同一の結果をもたらした、表１を参照のこと）。
【図４】凝集体形成の増加を示す、０、３及び５日目における、４０℃のカプチソル（Ｃａｐｔｉｓｏｌ）（商標）製剤中２５ｍｇ／ｍＬのＯＧＸ−４２７の拡大ＨＰＬＣクロマトグラムの図である。
【図５】５つの製剤、すなわち：５％マンニトール（Ｖ１）、１０ｍＭトリスバッファー（ｐＨ７．４）中５％マンニトール（Ｖ２）、１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．４）中５％マンニトール（Ｖ３）、５％デキストロース（Ｖ４）、及び１０ｍＭトリスバッファー（ｐＨ７．４）中５％デキストロース（Ｖ５）に関する、貯蔵温度６０℃、４週間にわたるＯＧＸ−４２７の主なピーク面積％純度（約２５ｍｇ／ｍＬ）のプロット表示である。
【図６】温度−２０、２〜８、２５、４０及び６０℃、２４週間にわたる、５％マンニトール及び１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．４）製剤（Ｖ３）の安定性（ＯＧＸ−４２７濃度により示された）のグラフプロット表示である。
【図７】温度−２０℃、２〜８℃、２５℃、４０℃及び６０℃、２４週間にわたる、５％マンニトール及び１０ｍＭトリスバッファー（ｐＨ７．４）製剤（Ｖ２）の安定性のグラフ表示である。
【図８】ガラスバイアル中の、１２週時点での対応する安定性試料（Ｖ１〜Ｖ５）の写真である。約２５ｍｇ／ｍＬの濃度でのＯＧＸ−４２７の全般的分解の影響は、溶液の黒ずみとして容易に見ることができる。バイアル１９＝１０ｍＭリン酸バッファー中５％マンニトールすなわちＶ３；バイアル１８＝１０ｍＭトリスバッファー中５％マンニトールすなわちＶ２、バイアル１７＝５％マンニトールすなわちＶ１；バイアル１６＝１０ｍＭトリスバッファー中５％デキストロースすなわちＶ５；及びバイアル１５＝５％デキストロースすなわちＶ４。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
典型的なオリゴヌクレオチド化合物では、リン酸基は、隣接するヌクレオシドを互いに共有結合させて線状高分子化合物を形成する。オリゴヌクレオチド構造内では、リン酸基は、オリゴヌクレオチドのインターヌクレオシド骨格を形成すると言われる。ＲＮＡ及びＤＮＡの正常な結合又は骨格は、３’から５’のホスホジエステル結合である。ＯＧＸ−４２７は、熱ショックタンパク質２７（Ｈｓｐ２７）の発現を阻害する標的ＡＳＯ治療剤である。ＯＧＸ−４２７の原薬又は活性医薬成分（ＡＰＩ）は、４−１２−４ ＭＯＥギャップマーオリゴヌクレオチドとして一般に分類されるホスホロチオール化（ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｔｈｉｏｌａｔｅｄ）インターヌクレオチド結合を有する合成オリゴヌクレオチドである（ギャップマーの考察については、参照により本明細書に組み込まれているＩｓｉｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社特許ＥＰ ０６１８９２５、及びＯＧＸ−４２７に関する具体的な情報については米国特許第７，１０１，９９１号を参照のこと）。
【００１１】
ＯＧＸ−４２７（Ｈｓｐ２７ ＡＳＯ配列番号１）は、
【化１】
（式中、下線を付したヌクレオシド
【化２】
は、グアノシン、アデノシン、５−メチルシチジン及び５−メチルウリジンリボヌクレオシドの２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−ＭＯＥ）修飾を示し；Ｇ、ＭｅＣ、及びＴは、２’−デオキシグアノシン、２’−デオキシ−５−メチルシチジン、及び２’−デオキシチミジンデオキシリボヌクレオシドを表し；インターヌクレオチド結合は、ホスホロチオエートジエステル（ナトリウム塩）である）
として表すことができる。
【００１２】
ＯＧＸ−４２７のＣＡＳ登録番号（ＣＡＳ＃）は９１５４４３−０９−３であり、ＣＡＳ索引名は「ＤＮＡ，ｄ（Ｐ−チオ）（［２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）］ｒＧ−［２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）］ｒＧ（−｛２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）］ｒＧ−［２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）］ｒＡ−ｍ５ｒＣ−Ｇ−ｍ５ｒＣ−Ｇ−Ｇ−ｍ５ｒＣ−Ｇ−ｍ５ｒＣ−Ｔ−ｍ５ｒＣ−Ｇ−Ｇ−２’−Ｏ−（２−メトキシエチル））ｍ５ｒＵ−｛２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）］ｍ５ｒＣ−［２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）］ｒＡ−［２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）］ｍ５ｒＵ）、ノナデカナトリウム（ｎｏｎａｄｅｃａｓｏｄｉｕｍ）塩である。
【００１３】
本発明は、ＯＧＸ−４２７製剤及びＯＧＸ−４２７と実質的に同じであるアンチセンス治療剤製剤に適用する。故に、これらは配列番号１から成る、すなわち本発明の製剤におけるＡＳＯは、Ｈｓｐ２７発現を阻害する能力を保持する、配列番号１と比べて、３個以下の不連続な塩基が変化されたこの配列のオリゴヌクレオチド変異体から成る。ＡＳＯはまた、依然としてオリゴヌクレオチド（１００塩基長未満）であり、かつＨｓｐ２７発現の阻害能力を保持しつつ、末端塩基の付加により配列番号１すなわち上述の変異体より長くもなり得る。このようなより長いオリゴヌクレオチドは、配列番号１と比べて３個以下の不連続な塩基が変化されたこの配列のオリゴヌクレオチド変異体を含むと言われる。
【００１４】
ＯＧＸ−４２７の特定の配列は、わずか２０のオリゴヌクレオチド配列中のグアノシンリボヌクレオシド（Ｇ）の数により凝集の可能性が影響されるであろうことを示唆した。ＯＧＸ−４２７には、配列のほぼ５０％を含む数である９個のグアノシン残基がある。凝集は、強力なワトソン−クリックの相補的塩基相互作用又は高次構造の形成が原因であり得るが、任意の特定の凝集メカニズムに縛られることは出願人の意図ではない。
【００１５】
前述の通り、ＯＧＸ−４２７用製剤の第一選択は、ＰＢＳ溶液、ｐＨ７．４であった。より高濃度では、ＨＰＬＣクロマトグラムにおける別のピークが該溶液中で観察された。このピークは、非共有凝集体であることが後に判定された。
【００１６】
逸話的歴史的情報は、凝集問題の可能性を有するアンチセンス化合物は基本的に開発されておらず、凝集及び乏しい安定性の問題をいかに解決することができるかについて当技術分野に何の教示も残していないことを示唆している。
【００１７】
したがって、出願人は、幾つかの実験ニーズ、すなわちＯＧＸ−４２７の必要とされる可溶性及び安定性並びに静脈内（ＩＶ）投与とのＯＧＸ−４２７産物の適合性を達成するために可能性のある賦形剤を選択した。
【００１８】
ＰＢＳ中ＯＧＸ−４２７、及びＯＧＸ−４２７の凝集に影響する可能性があると仮定された条件及びさまざまなタイプの賦形剤をモニタリングする対照の役割を果たした。塩化ナトリウム又は他の塩の存在下で形成された非共有凝集体の破壊は、製剤設計を可能にすることに役立ち得る。同様に、シクロデキストリンは、ＯＧＸ−４２７凝集体の形成を防止し得る薬剤をカプセル化することができる。有機共溶媒の導入は、さもなければ凝集を可能にする水素結合現象を破壊することができる。このカテゴリー内で、ＤＭＳＯは、凝集体形成の逆転に役立つことがＯｎｃｏＧｅｎｅｘ社により具体的に知られていた。単糖を含有する製剤もまた、凝集を阻害するように水素結合相互作用を変えることができる。異なるタイプの賦形剤をスクリーニングすると、表１に示されたようなＨｓｐ２７ ＡＳＯ配列番号１の凝集を防止する能力の点で、これらの製剤の間に著しいバリエーションが観察された。
【００１９】
一般に糖／糖アルコールは有望とみられたが、実験努力は、賦形剤のこれらのクラスの代表となりそうな限られた選択を中心とした。さらなる開発は、マンニトール及びデキストロースを含有するものを含む幾つかのプロトタイプ製剤をもたらし、これらは、凝集体形成及び全般的安定性について２４週間まで定期的に調製及び試験された。これらの試験からの結果は、数週間４０℃まででの貯蔵においても、選択製剤に関する安定性の著しいエビデンスを達成した。結果は、ＯＧＸ−４２７のための可能性のある長期室温貯蔵液体製剤を示している。
【００２０】
一般的なアンチセンスオリゴヌクレオチドへのこの知見の外挿結果をもとに、関連化合物（「ホスホルチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｔｈｉｏａｔｅ）オリゴヌクレオチド」）、特に高ＧＣ含量を有する、例えば５０％を超える、より具体的には６５％を超えるものは、マンニトール、デキストロース若しくは他の糖又は糖アルコール、及び場合により本発明におけるようなリン酸バッファーなどの適切なバッファーを使用して液体製剤において室温で安定にすることができる。
【００２１】
このような組成物は、好ましくは、アンチセンスが糖又は糖アルコールを有する液体製剤において調製され、及び６時間を超える、場合により１２時間又は１８時間を超える期間、液体状態で維持され、この期間の後、液体製剤は治療組成物として使用される方法で利用される。
【００２２】
材料及び方法
機器
ＨＰＬＣシステムは、ＵＶ検出及びオートサンプラーを備えたＳｈｉｍａｄｚｕ ＬＣ−１０、並びにＤｅｌｔａ Ｐａｋ（商標）ＨＰＬＣカラム（Ｃ１８ ５μｍ ３００Å ２．１×１５０ｍｍ）であった。
【００２３】
薬品
Ｄ−マンニトール、デキストロース、トリスヒドロキシメチルアミノメタン（トリス）、リン酸、リン酸二水素ナトリウム、第二リン酸ナトリウム、テトラブチルアンモニウム硫酸水素塩、アセトニトリル、ソルビトール、ラクトース、スクロース、酒石酸、ポリソルベート８０ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエート、リン酸バッファー、ＰＥＧ−３００、ＰＥＧ−４００及びジメチル−アセトアミドなどの標準バッファー、糖及び溶媒は、Ｓｉｇｍａ社（セントルイス、ＭＯ）、Ａｌｄｒｉｃｈ社（セントルイス、ＭＯ）、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社（ガーディナ、カリフォルニア）、ＶＷＲ社（ウェストチェスター、ＰＡ、又はＪＴ Ｂａｋｅｒ社（フィリップスバーグ、ＮＪ）から得られた。
【００２４】
ＯＧＸ−４２７は、契約メーカーにより本出願人のために製造された。
【００２５】
Ｃｒｅｍｐｈｏｒ（商標）ＥＬポリエトキシル化ヒマシ油、Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ（商標）４０７アルファ−ヒドロ−オメガ−ヒドロキシポリ（オキシエチレン）、ａポリ（オキシプロピレン）ｂポリ（オキシエチレン）ａブロックコポリマー、ポリエチレン−ポリプロピレングリコール、及びプロピレングリコールなどのポリマーは、ＢＡＳＦ社（フローシャムパーク（Ｆｌｏｒｓｈａｍ Ｐａｒｋ）、ＮＪ）から得られた。
【００２６】
シクロデキストリンであるカプチソル（商標）は、ＣｙＤｅｘ社（レネクサ、ＫＳ）の製品である。
【００２７】
方法
Ｈｓｐ２７ ＡＳＯ配列番号１は、２５ｍＬ容量フラスコにおいて２５０μｇ／ｍＬ Ｈｓｐ２７ ＡＳＯ配列番号１の蒸留水中濃度で、分析ごとに基準として調製された。これは、５段階の線形曲線を確立するための、２５〜２５０μｇ／ｍＬからの希釈の開始溶液の役割を果たした。各較正点はＨＰＬＣに１回挿入された。
【００２８】
ＲＰ−ＨＰＬＣ方法
試験で生成された試料は、５０℃のカラム温度で、並びに２０ｍＭ テトラブチルアンモニウム硫酸水素塩及び２０ｍＭ トリス塩基の移動相「Ａ」、ｐＨ７．８；アセトニトリルの移動相「Ｂ」；及び水の移動相「Ｃ」を用いて、逆相（ＲＰ）−ＨＰＬＣ方法により分析された。流速は０．３５ｍＬ／分であった。試料は適切な濃度まで水で希釈され、ＨＰＬＣバイアルに移され、注入前に冷却されたオートサンプラーで保持された。注入容量は１０μＬであり、検出は２６０ｎｍでのＵＶ吸収によった。
【００２９】
Ｈｓｐ２７ ＡＳＯ安定性及び凝集体形成は、上記のようなＨＰＬＣ方法を用いて評価され、正常及び凝集ピークでの化合物のパーセンテージとして計算又は濃度ｍｇ／ｍＬとして記録された。
【実施例】
【００３０】
（例１）
賦形剤スクリーニング試験
提唱する賦形剤（ｐｒｏｐｏｎｅｎｔ ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ）は、静脈内（ＩＶ）投与のための液体及び／又は凍結乾燥製剤の可能性を提供するように選択した。ＯＧＸ−４２７のオリジナルＰＢＳ製剤は、対照（約７５ｍｇ／ｍＬ）の役割を果たした。
【００３１】
周囲温度及びより高濃度よりも、４０℃でより速く凝集する以前の知見に基づき「加速条件」をシミュレートするため、製剤を４０℃、７５ｍｇ／ｍＬの濃度で経時させた。
【００３２】
１５０ｍｇ／ｍＬ貯蔵溶液を調製した後、試験用の標的濃度の２倍に調製したビヒクルによりアリコートを１：１に希釈した。最終溶液は、標的濃度の約７５ｍｇ／ｍＬ ＯＧＸ−４２７及び賦形剤を含有した。各試料を１．５ｍＬ管で調製し、次いで管を塞ぎ、簡単にボルテックスして試料を混合した。調製後、試験のため試料を４０℃チャンバーに移した。全ビヒクル（共溶媒ベースのビヒクルを除く）は、ＯＧＸ−４２７溶液の調製で使用する前に濾過した。全試験試料は、貯蔵溶液が完成する約６０分以内に調製した。
【００３３】
ＨＰＬＣ試料調製
ＯＧＸ−４２７溶液を水中で１０００倍に希釈して、ＨＰＬＣに注入するための７５０μｇ／ｍＬ試料を得た。調製時（Ｔ＝０）及び４０℃の貯蔵５（Ｔ＝５）日における試料について記録された情報が、表１に示されている。３日すなわちＴ＝３についての結果は示されていないが、Ｔ＝５データと同じ傾向をたどった。図３、４ａ及び４ｂは、デキストロース、ＰＢＳ、及び１０％カプチソル（商標）製剤についての結果を反映している。
【表１】
【００３４】
５日の期間内に及び加速テスト条件下で観察された幾つかの賦形剤の成績には明白な差があった。ＯＧＸ−４２７凝集量の減少又は防止、すなわち単量体としてのＯＧＸ−４２７の維持において、オリジナルＰＢＳ製剤よりも著しく良好であったものには、５％デキストロース及び５％マンニトール並びにスクロース、ラクトース及びソルビトールなどの関連賦形剤が含まれた。
【００３５】
有機共溶媒は、水素結合及びこれに続く凝集体形成を妨げることが期待されていた可能性はあるものの、有機共溶媒の全体的挙動が凝集体形成の防止に役立たなかったことから、最初のスクリーニング後、有機共溶媒についてのさらなるテストは行われなかった。
【００３６】
（例２）
液体プロトタイプ製剤
デキストロース又はマンニトールに焦点をあてたさらなる実験は、リン酸ナトリウム若しくはトリスバッファーのいずれかと併用して、又は緩衝せずに行った。
【００３７】
ＯＧＸ−４２７が２５ｍｇ／ｍＬに調製された５つの液体プロトタイプ製剤を、温度及び時点を通じて試験した：５％マンニトール（Ｖ１）、５％マンニトール及び１０ｍＭトリスバッファー（ｐＨ７．４）（Ｖ２）、５％マンニトール及び１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．４）（Ｖ３）、５％デキストロース（Ｖ４）、並びに５％デキストロース及び１０ｍＭトリスバッファー（ｐＨ７．４）（Ｖ５）。
【００３８】
これらのプロトタイプ溶液は全て、４週間までの−２０℃、５℃、２５℃、及びさらに４０℃での純度結果に対して比較的安定なままであった。同様に、溶液のｐＨ及びオスモル濃度は安定なままであった。全ての製剤は、６０℃で著しく分解することを証明した（図８に示されているように）。しかし、プロトタイプＶ１、Ｖ４及びＶ５は、２週時点までに、６０℃で貯蔵した製剤において変色及び微粒子を裸眼により観察し得たことから、Ｖ２及びＶ３ほど十分に機能しなかった（図５）。データは、これらの３つの製剤がより厳しい条件では一次分解を示すことを示唆した。故に、（緩衝又は非緩衝）デキストロースは５日目の凝集テストでは多少の見込みを示したが、きわめて高温度（６０℃）で貯蔵した場合、緩衝マンニトールに劣っていた。２４週時点までの条件では、これらの緩衝マンニトールプロトタイプ製剤Ｖ２及びＶ３は、透明、無色、及び全ての貯蔵条件からの可視粒子がないように見えた。多少の変動性がＶ２（表２）及びＶ３（表３）の％凝集体成績において観察されたが、観察された凝集量は低レベルで維持された（及び特定条件下での可逆性によるケースでより低くなり得る）。
【表２】
【表３】
【００３９】
加速経時条件下（４０℃まで）でさえ、マンニトール−リン酸緩衝溶液は、冷蔵を必要とするオリゴヌクレオチドの典型的な液体製剤と比べて良好な安定性を提供した。別の興味深い知見は、トリスバッファーがリン酸ナトリウムバッファーほど機能しないことであった（各製剤に関する２４週間のさまざまな温度条件を示す図６及び７、並びにより短い期間（４週）での５つの全プロトタイプを示す図５を参照のこと）。
【００４０】
図６に示されているように、Ｖ３製剤（５％マンニトール及び１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．４）中の２５ｍｇ／ｍＬ ＯＧＸ−４２７）の純度は、４０℃まで及び４０℃を含む貯蔵に関する試験経過を通じて十分に保存され、製剤が純粋オリゴヌクレオチドのようにＯＧＸ−４２７を維持していることを示唆した。ＯＧＸ−４２７濃度の喪失は、２週時点までに６０℃で貯蔵された製剤で観察された。しかし、この温度でさえ、分析は、６０℃での純度の喪失が凝集体形成よりむしろ単量体の分解を反映するものであることを示した。
【００４１】
故に、本発明の製剤の幾つかの実施形態では、ＡＳＯはマンニトールを含む水性担体において調製される。マンニトール量は、所望の貯蔵期間に安定性を提供するのに十分な量（例えば１から１０重量％）であるべきである。好ましい製剤では担体は、生体適合ｐＨ、例えば７．１から７．５の間で緩衝される。具体的な適切なバッファーには、リン酸バッファー（ｐＨ７．４）又はトリスバッファー（ｐＨ７．４）が含まれる。これらの製剤は、冷蔵条件下及び室温においても長期貯蔵期間安定である。他の実施形態では、本発明の製剤では、ＡＳＯはデキストロースを含む水性担体において調製される。デキストロース量は、所望の貯蔵期間に安定性を提供するのに十分な量（例えば１から１０重量％）であるべきである。好ましい製剤では担体は、生体適合ｐＨ、例えば７．１から７．５の間で緩衝される。具体的な適切なバッファーには、リン酸バッファー（ｐＨ７．４）又はトリスバッファー（ｐＨ７．４）が含まれる。これらの製剤は、冷蔵条件下及び室温においても液体溶液として長期貯蔵期間安定である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、室温貯蔵安定なオリゴヌクレオチド液体製剤に関する。より特別には、本発明は、凝集体形成も最小化する、Ｈｓｐ２７ ｍＲＮＡに結合するように設計されたホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの安定な製剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｈｓｐ−２７アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）は、Ｈｓｐ２７ ｍＲＮＡに結合してヒトＨｓｐ２７タンパク質の産生を阻害するように設計される。米国特許第７，１０１，９９１号は、種々のＨｓｐ２７ ＡＳＯを記載する。
【０００３】
標的ｐＨ７．４の等張液において、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で調製されたＯＧＸ−４２７、すなわちＨｓｐ２７ ＡＳＯ配列番号１の初期の動物試験用量は、良好な生物学的効果を示した。しかし、より高濃度のＡＳＯでは、ＯＧＸ−４２７製剤は、周囲及び冷蔵の両方の条件下で数日後に非共有凝集体を形成し、結果として臨床使用には望ましくなかった。ＰＢＳ製剤溶液は、類似のアンチセンス産物（クラスタリンＡＳＯに関する米国特許第６，９００，１８７号を参照のこと）については十分に機能し、類似の製剤溶液がＨＳＰ２７ ＡＳＯに使用され得ると期待されていた。しかし、上記に説明及び以下に示されるように、ＨＳＰ２７ ＡＳＯのＰＢＳ溶液は、臨床製剤として実用的ではなかった。
【０００４】
ＡＳＯ製剤の注射可能な投与のための液体製剤は、適切な長期安定性を確保するため習慣的に冷蔵されている。オリゴヌクレオチド製剤の、使用直前の再構成による粉末（フリーズドライ）への凍結乾燥は、製剤送達系に適切な安定性プロフィールを提供するのに利用することができる。しかし、オリゴヌクレオチドの液体製剤、特に周囲（室温）条件下で安定なままであるものには著しい商業利益がある。米国特許公開第２００３／０１１９７６８号は、ｃ−ｍｙｃ ｍＲＮＡを標的にする１５ｍｅｒアンチセンス配列、すなわちＡＡＣＧＴＴＧＡＧＧＧＧＣＡＴ（配列番号２）に関する知見を公開する。４個の連続するＧ残基を含むこの配列は、毒性が増加した、形成された多量体にまで凝集することが観察された。したがって該公開は、使用前の多量体の破壊を開示した。開示された１つのアプローチは、凍結乾燥前にマンニトール、スクロース、グルコース、トリアロース（ｔｒｉａｌｏｓｅ）又はラクトースなどの単糖類の抗凍結剤を添加することである。これは、水により再構成させた際の多量体形成を減少させることが見出された。しかし、長期の溶液安定性及び凝集回避については情報が提供されなかった。
【０００５】
凝集しやすいＡＳＯは、その生物学的有効性を問わず企業の薬剤パイプラインにとって好ましくない臨床候補であり、さらに開発されることはないであろう。しかし、インビボでのＨｓｐ２７ ＡＳＯの生物学的特性はきわめて好ましいため、長期間、液体製剤で貯蔵された場合の凝集及び安定性の問題を克服する努力が行われた。
【０００６】
さらに、ＡＳＯ治療剤は依然として製造するのに費用がかかること、及びそれらの廃棄物又は貯蔵コストのいかなる低減も付加利益となり、商業化可能な薬剤と商業化可能でない薬剤との間の差をもたらす可能性があることも留意されるべきである。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
許容可能な溶液安定性を提供し、配列番号１を有するＡＳＯの非共有凝集を減少させるであろう製剤を見出すためのテストでは、マンニトール（５％）が、２４週間にわたって、−２０℃から６０℃の範囲の温度できわめて低い凝集レベルを維持できることが見出された。類似の結果は、マンニトールの代わりにデキストロースが使用された場合に観察された。全体的な安定性は、この期間、４０℃まで良好であった。故に、本発明は、配列番号１を含む：又は３個以下の不連続な塩基が配列番号１と異なる変異体オリゴヌクレオチドを含むＡＳＯ、並びにデキストロース及びラクトースなどの単糖類及び二糖類、並びにマンニトール及びソルビトールなどの糖アルコールから選択される凝集防止化合物を含む水性担体を含む室温安定最小凝集体製剤の液体製剤を提供する。特定の実施形態では、ＡＳＯは、配列番号１又は３個以下の不連続な塩基が配列番号１と異なる変異体から成る。担体は、リン酸バッファー又はトリスバッファーを含むこともできる。
【０００８】
本発明の他の態様及び特徴は、添付図と併せて本発明の特定の実施形態の以下の記載を再検討すると当業者には明白になるであろう。本発明の実施形態を図示する図は、以下の通りである。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】経時的な凝集体の増加を図示する、４０℃における貯蔵０、３及び５日目のリン酸緩衝生理食塩水（約７０〜７５ｍｇ／ｍＬ）中のＯＧＸ−４２７に関する２つのピーク（左のピークはＯＧＸ−４２７オリゴヌクレオチド単量体であり、右のピークは凝集体である）を示す拡大ＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図２】ＯＧＸ−４２７オリゴヌクレオチド及びこの凝集体（右のピーク）を示すＨＰＬＣクロマトグラムである。高度に凝集された試料（＞５０％）が、ＰＢＳ中、２００ｍｇ／ｍＬ ＯＧＸ−４２７を含有するように調製され、分析前に４日間、周囲条件で経時させた溶液から生成された。
【図３】バッファーなしの５％デキストロース水性製剤中、０、３及び５日目、４０℃、２５ｍｇ／ｍＬでのＯＧＸ−４２７の拡大ＨＰＬＣクロマトグラムを示す図である（バッファーなしの５％マンニトール製剤は事実上同一の結果をもたらした、表１を参照のこと）。
【図４】凝集体形成の増加を示す、０、３及び５日目における、４０℃のカプチソル（Ｃａｐｔｉｓｏｌ）（商標）製剤中２５ｍｇ／ｍＬのＯＧＸ−４２７の拡大ＨＰＬＣクロマトグラムの図である。
【図５】５つの製剤、すなわち：５％マンニトール（Ｖ１）、１０ｍＭトリスバッファー（ｐＨ７．４）中５％マンニトール（Ｖ２）、１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．４）中５％マンニトール（Ｖ３）、５％デキストロース（Ｖ４）、及び１０ｍＭトリスバッファー（ｐＨ７．４）中５％デキストロース（Ｖ５）に関する、貯蔵温度６０℃、４週間にわたるＯＧＸ−４２７の主なピーク面積％純度（約２５ｍｇ／ｍＬ）のプロット表示である。
【図６】温度−２０、２〜８、２５、４０及び６０℃、２４週間にわたる、５％マンニトール及び１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．４）製剤（Ｖ３）の安定性（ＯＧＸ−４２７濃度により示された）のグラフプロット表示である。
【図７】温度−２０℃、２〜８℃、２５℃、４０℃及び６０℃、２４週間にわたる、５％マンニトール及び１０ｍＭトリスバッファー（ｐＨ７．４）製剤（Ｖ２）の安定性のグラフ表示である。
【図８】ガラスバイアル中の、１２週時点での対応する安定性試料（Ｖ１〜Ｖ５）の写真である。約２５ｍｇ／ｍＬの濃度でのＯＧＸ−４２７の全般的分解の影響は、溶液の黒ずみとして容易に見ることができる。バイアル１９＝１０ｍＭリン酸バッファー中５％マンニトールすなわちＶ３；バイアル１８＝１０ｍＭトリスバッファー中５％マンニトールすなわちＶ２、バイアル１７＝５％マンニトールすなわちＶ１；バイアル１６＝１０ｍＭトリスバッファー中５％デキストロースすなわちＶ５；及びバイアル１５＝５％デキストロースすなわちＶ４。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
典型的なオリゴヌクレオチド化合物では、リン酸基は、隣接するヌクレオシドを互いに共有結合させて線状高分子化合物を形成する。オリゴヌクレオチド構造内では、リン酸基は、オリゴヌクレオチドのインターヌクレオシド骨格を形成すると言われる。ＲＮＡ及びＤＮＡの正常な結合又は骨格は、３’から５’のホスホジエステル結合である。ＯＧＸ−４２７は、熱ショックタンパク質２７（Ｈｓｐ２７）の発現を阻害する標的ＡＳＯ治療剤である。ＯＧＸ−４２７の原薬又は活性医薬成分（ＡＰＩ）は、４−１２−４ ＭＯＥギャップマーオリゴヌクレオチドとして一般に分類されるホスホロチオール化（ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｔｈｉｏｌａｔｅｄ）インターヌクレオチド結合を有する合成オリゴヌクレオチドである（ギャップマーの考察については、参照により本明細書に組み込まれているＩｓｉｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社特許ＥＰ ０６１８９２５、及びＯＧＸ−４２７に関する具体的な情報については米国特許第７，１０１，９９１号を参照のこと）。
【００１１】
ＯＧＸ−４２７（Ｈｓｐ２７ ＡＳＯ配列番号１）は、
【化１】
（式中、下線を付したヌクレオシド
【化２】
は、グアノシン、アデノシン、５−メチルシチジン及び５−メチルウリジンリボヌクレオシドの２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−ＭＯＥ）修飾を示し；Ｇ、ＭｅＣ、及びＴは、２’−デオキシグアノシン、２’−デオキシ−５−メチルシチジン、及び２’−デオキシチミジンデオキシリボヌクレオシドを表し；インターヌクレオチド結合は、ホスホロチオエートジエステル（ナトリウム塩）である）
として表すことができる。
【００１２】
ＯＧＸ−４２７のＣＡＳ登録番号（ＣＡＳ＃）は９１５４４３−０９−３であり、ＣＡＳ索引名は「ＤＮＡ，ｄ（Ｐ−チオ）（［２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）］ｒＧ−［２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）］ｒＧ（−｛２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）］ｒＧ−［２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）］ｒＡ−ｍ５ｒＣ−Ｇ−ｍ５ｒＣ−Ｇ−Ｇ−ｍ５ｒＣ−Ｇ−ｍ５ｒＣ−Ｔ−ｍ５ｒＣ−Ｇ−Ｇ−２’−Ｏ−（２−メトキシエチル））ｍ５ｒＵ−｛２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）］ｍ５ｒＣ−［２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）］ｒＡ−［２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）］ｍ５ｒＵ）、ノナデカナトリウム（ｎｏｎａｄｅｃａｓｏｄｉｕｍ）塩である。
【００１３】
本発明は、ＯＧＸ−４２７製剤及びＯＧＸ−４２７と実質的に同じであるアンチセンス治療剤製剤に適用する。故に、これらは配列番号１から成る、すなわち本発明の製剤におけるＡＳＯは、Ｈｓｐ２７発現を阻害する能力を保持する、配列番号１と比べて、３個以下の不連続な塩基が変化されたこの配列のオリゴヌクレオチド変異体から成る。ＡＳＯはまた、依然としてオリゴヌクレオチド（１００塩基長未満）であり、かつＨｓｐ２７発現の阻害能力を保持しつつ、末端塩基の付加により配列番号１すなわち上述の変異体より長くもなり得る。このようなより長いオリゴヌクレオチドは、配列番号１と比べて３個以下の不連続な塩基が変化されたこの配列のオリゴヌクレオチド変異体を含むと言われる。
【００１４】
ＯＧＸ−４２７の特定の配列は、わずか２０のオリゴヌクレオチド配列中のグアノシンリボヌクレオシド（Ｇ）の数により凝集の可能性が影響されるであろうことを示唆した。ＯＧＸ−４２７には、配列のほぼ５０％を含む数である９個のグアノシン残基がある。凝集は、強力なワトソン−クリックの相補的塩基相互作用又は高次構造の形成が原因であり得るが、任意の特定の凝集メカニズムに縛られることは出願人の意図ではない。
【００１５】
前述の通り、ＯＧＸ−４２７用製剤の第一選択は、ＰＢＳ溶液、ｐＨ７．４であった。より高濃度では、ＨＰＬＣクロマトグラムにおける別のピークが該溶液中で観察された。このピークは、非共有凝集体であることが後に判定された。
【００１６】
逸話的歴史的情報は、凝集問題の可能性を有するアンチセンス化合物は基本的に開発されておらず、凝集及び乏しい安定性の問題をいかに解決することができるかについて当技術分野に何の教示も残していないことを示唆している。
【００１７】
したがって、出願人は、幾つかの実験ニーズ、すなわちＯＧＸ−４２７の必要とされる可溶性及び安定性並びに静脈内（ＩＶ）投与とのＯＧＸ−４２７産物の適合性を達成するために可能性のある賦形剤を選択した。
【００１８】
ＰＢＳ中ＯＧＸ−４２７、及びＯＧＸ−４２７の凝集に影響する可能性があると仮定された条件及びさまざまなタイプの賦形剤をモニタリングする対照の役割を果たした。塩化ナトリウム又は他の塩の存在下で形成された非共有凝集体の破壊は、製剤設計を可能にすることに役立ち得る。同様に、シクロデキストリンは、ＯＧＸ−４２７凝集体の形成を防止し得る薬剤をカプセル化することができる。有機共溶媒の導入は、さもなければ凝集を可能にする水素結合現象を破壊することができる。このカテゴリー内で、ＤＭＳＯは、凝集体形成の逆転に役立つことがＯｎｃｏＧｅｎｅｘ社により具体的に知られていた。単糖を含有する製剤もまた、凝集を阻害するように水素結合相互作用を変えることができる。異なるタイプの賦形剤をスクリーニングすると、表１に示されたようなＨｓｐ２７ ＡＳＯ配列番号１の凝集を防止する能力の点で、これらの製剤の間に著しいバリエーションが観察された。
【００１９】
一般に糖／糖アルコールは有望とみられたが、実験努力は、賦形剤のこれらのクラスの代表となりそうな限られた選択を中心とした。さらなる開発は、マンニトール及びデキストロースを含有するものを含む幾つかのプロトタイプ製剤をもたらし、これらは、凝集体形成及び全般的安定性について２４週間まで定期的に調製及び試験された。これらの試験からの結果は、数週間４０℃まででの貯蔵においても、選択製剤に関する安定性の著しいエビデンスを達成した。結果は、ＯＧＸ−４２７のための可能性のある長期室温貯蔵液体製剤を示している。
【００２０】
一般的なアンチセンスオリゴヌクレオチドへのこの知見の外挿結果をもとに、関連化合物（「ホスホルチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｔｈｉｏａｔｅ）オリゴヌクレオチド」）、特に高ＧＣ含量を有する、例えば５０％を超える、より具体的には６５％を超えるものは、マンニトール、デキストロース若しくは他の糖又は糖アルコール、及び場合により本発明におけるようなリン酸バッファーなどの適切なバッファーを使用して液体製剤において室温で安定にすることができる。
【００２１】
このような組成物は、好ましくは、アンチセンスが糖又は糖アルコールを有する液体製剤において調製され、及び６時間を超える、場合により１２時間又は１８時間を超える期間、液体状態で維持され、この期間の後、液体製剤は治療組成物として使用される方法で利用される。
【００２２】
材料及び方法
機器
ＨＰＬＣシステムは、ＵＶ検出及びオートサンプラーを備えたＳｈｉｍａｄｚｕ ＬＣ−１０、並びにＤｅｌｔａ Ｐａｋ（商標）ＨＰＬＣカラム（Ｃ１８ ５μｍ ３００Å ２．１×１５０ｍｍ）であった。
【００２３】
薬品
Ｄ−マンニトール、デキストロース、トリスヒドロキシメチルアミノメタン（トリス）、リン酸、リン酸二水素ナトリウム、第二リン酸ナトリウム、テトラブチルアンモニウム硫酸水素塩、アセトニトリル、ソルビトール、ラクトース、スクロース、酒石酸、ポリソルベート８０ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエート、リン酸バッファー、ＰＥＧ−３００、ＰＥＧ−４００及びジメチル−アセトアミドなどの標準バッファー、糖及び溶媒は、Ｓｉｇｍａ社（セントルイス、ＭＯ）、Ａｌｄｒｉｃｈ社（セントルイス、ＭＯ）、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社（ガーディナ、カリフォルニア）、ＶＷＲ社（ウェストチェスター、ＰＡ、又はＪＴ Ｂａｋｅｒ社（フィリップスバーグ、ＮＪ）から得られた。
【００２４】
ＯＧＸ−４２７は、契約メーカーにより本出願人のために製造された。
【００２５】
Ｃｒｅｍｐｈｏｒ（商標）ＥＬポリエトキシル化ヒマシ油、Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ（商標）４０７アルファ−ヒドロ−オメガ−ヒドロキシポリ（オキシエチレン）、ａポリ（オキシプロピレン）ｂポリ（オキシエチレン）ａブロックコポリマー、ポリエチレン−ポリプロピレングリコール、及びプロピレングリコールなどのポリマーは、ＢＡＳＦ社（フローシャムパーク（Ｆｌｏｒｓｈａｍ Ｐａｒｋ）、ＮＪ）から得られた。
【００２６】
シクロデキストリンであるカプチソル（商標）は、ＣｙＤｅｘ社（レネクサ、ＫＳ）の製品である。
【００２７】
方法
Ｈｓｐ２７ ＡＳＯ配列番号１は、２５ｍＬ容量フラスコにおいて２５０μｇ／ｍＬ Ｈｓｐ２７ ＡＳＯ配列番号１の蒸留水中濃度で、分析ごとに基準として調製された。これは、５段階の線形曲線を確立するための、２５〜２５０μｇ／ｍＬからの希釈の開始溶液の役割を果たした。各較正点はＨＰＬＣに１回挿入された。
【００２８】
ＲＰ−ＨＰＬＣ方法
試験で生成された試料は、５０℃のカラム温度で、並びに２０ｍＭ テトラブチルアンモニウム硫酸水素塩及び２０ｍＭ トリス塩基の移動相「Ａ」、ｐＨ７．８；アセトニトリルの移動相「Ｂ」；及び水の移動相「Ｃ」を用いて、逆相（ＲＰ）−ＨＰＬＣ方法により分析された。流速は０．３５ｍＬ／分であった。試料は適切な濃度まで水で希釈され、ＨＰＬＣバイアルに移され、注入前に冷却されたオートサンプラーで保持された。注入容量は１０μＬであり、検出は２６０ｎｍでのＵＶ吸収によった。
【００２９】
Ｈｓｐ２７ ＡＳＯ安定性及び凝集体形成は、上記のようなＨＰＬＣ方法を用いて評価され、正常及び凝集ピークでの化合物のパーセンテージとして計算又は濃度ｍｇ／ｍＬとして記録された。
【実施例】
【００３０】
（例１）
賦形剤スクリーニング試験
提唱する賦形剤（ｐｒｏｐｏｎｅｎｔ ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ）は、静脈内（ＩＶ）投与のための液体及び／又は凍結乾燥製剤の可能性を提供するように選択した。ＯＧＸ−４２７のオリジナルＰＢＳ製剤は、対照（約７５ｍｇ／ｍＬ）の役割を果たした。
【００３１】
周囲温度及びより高濃度よりも、４０℃でより速く凝集する以前の知見に基づき「加速条件」をシミュレートするため、製剤を４０℃、７５ｍｇ／ｍＬの濃度で経時させた。
【００３２】
１５０ｍｇ／ｍＬ貯蔵溶液を調製した後、試験用の標的濃度の２倍に調製したビヒクルによりアリコートを１：１に希釈した。最終溶液は、標的濃度の約７５ｍｇ／ｍＬ ＯＧＸ−４２７及び賦形剤を含有した。各試料を１．５ｍＬ管で調製し、次いで管を塞ぎ、簡単にボルテックスして試料を混合した。調製後、試験のため試料を４０℃チャンバーに移した。全ビヒクル（共溶媒ベースのビヒクルを除く）は、ＯＧＸ−４２７溶液の調製で使用する前に濾過した。全試験試料は、貯蔵溶液が完成する約６０分以内に調製した。
【００３３】
ＨＰＬＣ試料調製
ＯＧＸ−４２７溶液を水中で１０００倍に希釈して、ＨＰＬＣに注入するための７５０μｇ／ｍＬ試料を得た。調製時（Ｔ＝０）及び４０℃の貯蔵５（Ｔ＝５）日における試料について記録された情報が、表１に示されている。３日すなわちＴ＝３についての結果は示されていないが、Ｔ＝５データと同じ傾向をたどった。図３、４ａ及び４ｂは、デキストロース、ＰＢＳ、及び１０％カプチソル（商標）製剤についての結果を反映している。
【表１】
【００３４】
５日の期間内に及び加速テスト条件下で観察された幾つかの賦形剤の成績には明白な差があった。ＯＧＸ−４２７凝集量の減少又は防止、すなわち単量体としてのＯＧＸ−４２７の維持において、オリジナルＰＢＳ製剤よりも著しく良好であったものには、５％デキストロース及び５％マンニトール並びにスクロース、ラクトース及びソルビトールなどの関連賦形剤が含まれた。
【００３５】
有機共溶媒は、水素結合及びこれに続く凝集体形成を妨げることが期待されていた可能性はあるものの、有機共溶媒の全体的挙動が凝集体形成の防止に役立たなかったことから、最初のスクリーニング後、有機共溶媒についてのさらなるテストは行われなかった。
【００３６】
（例２）
液体プロトタイプ製剤
デキストロース又はマンニトールに焦点をあてたさらなる実験は、リン酸ナトリウム若しくはトリスバッファーのいずれかと併用して、又は緩衝せずに行った。
【００３７】
ＯＧＸ−４２７が２５ｍｇ／ｍＬに調製された５つの液体プロトタイプ製剤を、温度及び時点を通じて試験した：５％マンニトール（Ｖ１）、５％マンニトール及び１０ｍＭトリスバッファー（ｐＨ７．４）（Ｖ２）、５％マンニトール及び１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．４）（Ｖ３）、５％デキストロース（Ｖ４）、並びに５％デキストロース及び１０ｍＭトリスバッファー（ｐＨ７．４）（Ｖ５）。
【００３８】
これらのプロトタイプ溶液は全て、４週間までの−２０℃、５℃、２５℃、及びさらに４０℃での純度結果に対して比較的安定なままであった。同様に、溶液のｐＨ及びオスモル濃度は安定なままであった。全ての製剤は、６０℃で著しく分解することを証明した（図８に示されているように）。しかし、プロトタイプＶ１、Ｖ４及びＶ５は、２週時点までに、６０℃で貯蔵した製剤において変色及び微粒子を裸眼により観察し得たことから、Ｖ２及びＶ３ほど十分に機能しなかった（図５）。データは、これらの３つの製剤がより厳しい条件では一次分解を示すことを示唆した。故に、（緩衝又は非緩衝）デキストロースは５日目の凝集テストでは多少の見込みを示したが、きわめて高温度（６０℃）で貯蔵した場合、緩衝マンニトールに劣っていた。２４週時点までの条件では、これらの緩衝マンニトールプロトタイプ製剤Ｖ２及びＶ３は、透明、無色、及び全ての貯蔵条件からの可視粒子がないように見えた。多少の変動性がＶ２（表２）及びＶ３（表３）の％凝集体成績において観察されたが、観察された凝集量は低レベルで維持された（及び特定条件下での可逆性によるケースでより低くなり得る）。
【表２】
【表３】
【００３９】
加速経時条件下（４０℃まで）でさえ、マンニトール−リン酸緩衝溶液は、冷蔵を必要とするオリゴヌクレオチドの典型的な液体製剤と比べて良好な安定性を提供した。別の興味深い知見は、トリスバッファーがリン酸ナトリウムバッファーほど機能しないことであった（各製剤に関する２４週間のさまざまな温度条件を示す図６及び７、並びにより短い期間（４週）での５つの全プロトタイプを示す図５を参照のこと）。
【００４０】
図６に示されているように、Ｖ３製剤（５％マンニトール及び１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．４）中の２５ｍｇ／ｍＬ ＯＧＸ−４２７）の純度は、４０℃まで及び４０℃を含む貯蔵に関する試験経過を通じて十分に保存され、製剤が純粋オリゴヌクレオチドのようにＯＧＸ−４２７を維持していることを示唆した。ＯＧＸ−４２７濃度の喪失は、２週時点までに６０℃で貯蔵された製剤で観察された。しかし、この温度でさえ、分析は、６０℃での純度の喪失が凝集体形成よりむしろ単量体の分解を反映するものであることを示した。
【００４１】
故に、本発明の製剤の幾つかの実施形態では、ＡＳＯはマンニトールを含む水性担体において調製される。マンニトール量は、所望の貯蔵期間に安定性を提供するのに十分な量（例えば１から１０重量％）であるべきである。好ましい製剤では担体は、生体適合ｐＨ、例えば７．１から７．５の間で緩衝される。具体的な適切なバッファーには、リン酸バッファー（ｐＨ７．４）又はトリスバッファー（ｐＨ７．４）が含まれる。これらの製剤は、冷蔵条件下及び室温においても長期貯蔵期間安定である。他の実施形態では、本発明の製剤では、ＡＳＯはデキストロースを含む水性担体において調製される。デキストロース量は、所望の貯蔵期間に安定性を提供するのに十分な量（例えば１から１０重量％）であるべきである。好ましい製剤では担体は、生体適合ｐＨ、例えば７．１から７．５の間で緩衝される。具体的な適切なバッファーには、リン酸バッファー（ｐＨ７．４）又はトリスバッファー（ｐＨ７．４）が含まれる。これらの製剤は、冷蔵条件下及び室温においても液体溶液として長期貯蔵期間安定である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号１を含む：又は３個以下の不連続な塩基が配列番号１と異なる変異体オリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドと、
（ｂ）単糖類及び二糖類並びに／又は糖アルコールから成る群から選択される凝集防止化合物を含む水性担体と
を含む、室温安定及び最小凝集液体製剤。
【請求項２】
担体がさらにリン酸バッファーを含む、請求項１に記載の製剤。
【請求項３】
担体がさらにトリスバッファーを含む、請求項１に記載の製剤。
【請求項４】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号１、又は３個以下の不連続な塩基が配列番号１と異なる変異体オリゴヌクレオチドから成る、請求項１、２又は３のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項５】
オリゴヌクレオチドが、次のような修飾：
【化１】
（式中、下線を付したヌクレオシド
【化２】
は、グアノシン、アデノシン、５−メチルシチジン及び５−メチルウリジンリボヌクレオシドの２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−ＭＯＥ）修飾を示し；Ｇ、ＭｅＣ、及びＴは、２’−デオキシグアノシン、２’−デオキシ−５−メチルシチジン、及び２’−デオキシチミジンデオキシリボヌクレオシドを表し；インターヌクレオチド結合は、ホスホロチオエートジエステル（ナトリウム塩）である）
を有するＡ配列番号１から成る、請求項４に記載の製剤。
【請求項６】
凝集防止化合物がマンニトールである、請求項１から５までのいずれか一項に記載の製剤。
【請求項７】
マンニトールが５重量％の量で水性担体中に存在する、請求項６に記載の製剤。
【請求項８】
凝集防止化合物がデキストロースである、請求項１から５までのいずれか一項に記載の製剤。
【請求項９】
デキストロースが５重量％の量で水性担体中に存在する、請求項６に記載の製剤。
【請求項１０】
液体製剤中のアンチセンスを糖又は糖アルコールと併せるステップと、６時間を超える、場合により１２時間又は１８時間を超える期間、液体状態で製剤を維持するステップであって、前記期間の後、液体製剤がインビボ注射のための治療組成物として使用される上記ステップとを含む、インビボ注射のためのアンチセンスオリゴヌクレオチドの調製方法。
【請求項１１】
アンチセンスが請求項１から９までのいずれか一項により調製される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
アンチセンスが６５％以上、例えば７５％以上のＧＣ含量を有する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１】
（ａ）配列番号１を含む：又は３個以下の不連続な塩基が配列番号１と異なる変異体オリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドと、
（ｂ）単糖類及び二糖類並びに／又は糖アルコールから成る群から選択される凝集防止化合物を含む水性担体と
を含む、室温安定及び最小凝集液体製剤。
【請求項２】
担体がさらにリン酸バッファーを含む、請求項１に記載の製剤。
【請求項３】
担体がさらにトリスバッファーを含む、請求項１に記載の製剤。
【請求項４】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号１、又は３個以下の不連続な塩基が配列番号１と異なる変異体オリゴヌクレオチドから成る、請求項１、２又は３のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項５】
オリゴヌクレオチドが、次のような修飾：
【化１】
（式中、下線を付したヌクレオシド
【化２】
は、グアノシン、アデノシン、５−メチルシチジン及び５−メチルウリジンリボヌクレオシドの２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−ＭＯＥ）修飾を示し；Ｇ、ＭｅＣ、及びＴは、２’−デオキシグアノシン、２’−デオキシ−５−メチルシチジン、及び２’−デオキシチミジンデオキシリボヌクレオシドを表し；インターヌクレオチド結合は、ホスホロチオエートジエステル（ナトリウム塩）である）
を有するＡ配列番号１から成る、請求項４に記載の製剤。
【請求項６】
凝集防止化合物がマンニトールである、請求項１から５までのいずれか一項に記載の製剤。
【請求項７】
マンニトールが５重量％の量で水性担体中に存在する、請求項６に記載の製剤。
【請求項８】
凝集防止化合物がデキストロースである、請求項１から５までのいずれか一項に記載の製剤。
【請求項９】
デキストロースが５重量％の量で水性担体中に存在する、請求項６に記載の製剤。
【請求項１０】
液体製剤中のアンチセンスを糖又は糖アルコールと併せるステップと、６時間を超える、場合により１２時間又は１８時間を超える期間、液体状態で製剤を維持するステップであって、前記期間の後、液体製剤がインビボ注射のための治療組成物として使用される上記ステップとを含む、インビボ注射のためのアンチセンスオリゴヌクレオチドの調製方法。
【請求項１１】
アンチセンスが請求項１から９までのいずれか一項により調製される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
アンチセンスが６５％以上、例えば７５％以上のＧＣ含量を有する、請求項１０に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公表番号】特表２０１１−５２８６５７（Ｐ２０１１−５２８６５７Ａ）
【公表日】平成２３年１１月２４日（２０１１．１１．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５１８８１７（Ｐ２０１１−５１８８１７）
【出願日】平成２１年７月１３日（２００９．７．１３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０５０３８２
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／００９０３８
【国際公開日】平成２２年１月２１日（２０１０．１．２１）
【出願人】（５１００３３７０１）オンコジェネックス・テクノロジーズ・インコーポレーテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年１１月２４日（２０１１．１１．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年７月１３日（２００９．７．１３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０５０３８２
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／００９０３８
【国際公開日】平成２２年１月２１日（２０１０．１．２１）
【出願人】（５１００３３７０１）オンコジェネックス・テクノロジーズ・インコーポレーテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
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