イソフラボノイドの生産方法
【課題】イソフラボノイドの生産方法の提供。
【解決手段】マメ科以外の植物の２−ヒドロキシイソフラバノン合成酵素（以下ＩＦＳ）を単離し、ＩＦＳをコードする遺伝子を同定する。該ＩＦＳやＩＦＳをコードする遺伝子を用い、アヤメ科植物のＩＦＳを単離し、このＩＦＳをコードする遺伝子を同定する。酵母やシロイヌナズナを用いてＩＦＳを発現させ、イソフラボノイドを生産する。
【解決手段】マメ科以外の植物の２−ヒドロキシイソフラバノン合成酵素（以下ＩＦＳ）を単離し、ＩＦＳをコードする遺伝子を同定する。該ＩＦＳやＩＦＳをコードする遺伝子を用い、アヤメ科植物のＩＦＳを単離し、このＩＦＳをコードする遺伝子を同定する。酵母やシロイヌナズナを用いてＩＦＳを発現させ、イソフラボノイドを生産する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マメ科以外の植物の２−ヒドロキシイソフラバノン合成酵素（イソフラボン骨格合成酵素、以下、ＩＦＳと示す）に関する。さらに詳しくは、ジャーマンアイリス（Ｉｒｉｓ ｇｅｒｍａｎｉｃａ、以下Ｉｇと示す）、キショウブ（Ｉｒｉｓ ｐｓｅｕｄａｃｏｒｕｓ、以下Ｉｐと示す）またはイチハツ（Ｉｒｉｓ ｔｅｃｔｏｒｕｍ、以下Ｉｔと示す）等のアヤメ科植物から単離したＩＦＳに関する。
【背景技術】
【０００２】
２−ヒドロキシイソフラバノン（２−Ｈｙｄｒｏｘｙｉｓｏｆｌａｖａｎｏｎｅ）、イソフラボン（ゲニステイン（Ｇｅｎｉｓｔｅｉｎ））等のイソフラボノイドは、マメ科、アヤメ科等の植物に含まれ、近年、健康補助食品として注目されている。そこで、マメ科のダイズやカンゾウのＩＦＳをコードする遺伝子をシロイヌナズナやタバコ等に導入して、これらのイソフラボノイドを生産することが試みられたが、生産量１ｇあたり、数ｎｍｏｌのイソフラボンが蓄積されただけであった。さらに、ＩＦＳと基質を競合する酵素について、その遺伝子をノックアウトしたシロイヌナズナを用い、イソフラボノイドの生産を向上する試みがなされたが、生産量１ｇあたり、最大でも２００ｎｍｏｌに及ばないイソフラボンが蓄積されただけであり、高濃度のイソフラボノイドを得ることはできなかった（例えば、非特許文献１，２参照）。
【０００３】
イソフラボノイドは、植物体内において、（２Ｓ）−フラバノン（ナリンゲニン（Ｎａｒｉｎｇｅｎｉｎ））にＩＦＳが作用することで２−ヒドロキシイソフラバノンとして合成され、さらに、この２−ヒドロキシイソフラバノンに２−ヒドロキシイソフラバノン脱水酵素（以下、ＨＩＤとする）が作用することでイソフラボンとして合成されることが知られている。
本発明者らは、イソフラボンの合成に働くＨＩＤに着目し、ダイズおよびカンゾウのＨＩＤをコードするポリヌクレオチドを特定し、これらを宿主細胞内で発現させることや、植物細胞に導入することでイソフラボン類の生産量が変化した植物を得ることを開示している（例えば、特許文献１、２参照）。また、上記のように、ダイズやカンゾウのＩＦＳのみでは、イソフラボノイドを効率的に生産できないことから、ＩＦＳとＨＩＤとを組み合わせ、高濃度のイソフラボノイドを生産することも検討している。
【０００４】
イソフラボノイドは、ダイズやカンゾウ等のマメ科の植物に含まれることが特に注目されているが、蘚苔類のハリガネゴケ科、裸子植物のヒノキ科、マキ科、単子葉植物のアヤメ科の植物にも含まれており、イソフラボノイドの生産方法のひとつとして、アヤメ根茎の乾燥粉末をアルコールで抽出する方法（例えば、特許文献３参照）等も開示されている。
しかし、マメ科以外の植物について、ＩＦＳやＨＩＤを単離することや、ＩＦＳやＨＩＤをコードする遺伝子を同定し、これらによってイソフラボノイドの生産を行うことは検討されていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特許第４４７４５１８号
【特許文献２】国際公開第００／４６３５６号パンフレット
【特許文献３】特開２００４−６７５９０号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｙｕ，Ｏ．，Ｊｕｎｇ，Ｗ．，Ｓｈｉ，Ｊ．，Ｃｒｏｅｓ，Ｒ．Ａ．，Ｆａｄｅｒ，Ｇ．Ｍ．，ＭｃＧｏｎｉｇｌｅ，Ｂ．ａｎｄ Ｏｄｅｌｌ，Ｊ．Ｔ．（２０００） "Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｉｓｏｆｌａｖｏｎｅｓ ｇｅｎｉｓｔｅｉｎ ａｎｄ ｄａｉｄｚｅｉｎ ｉｎ ｎｏｎ−ｌｅｇｕｍｅ ｄｉｃｏｔ ａｎｄ ｍｏｎｏｃｏｔ ｔｉｓｓｕｅｓ." Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１２４：７８１−７９３．
【非特許文献２】Ｌｉｕ，Ｃ．Ｊ．，Ｂｌｏｕｎｔ，Ｊ．Ｗ．，Ｓｔｅｅｌｅ，Ｃ．Ｌ．ａｎｄ Ｄｉｘｏｎ，Ｒ．Ａ．（２００２） "Ｂｏｔｔｌｅｎｅｃｋｓ ｆｏｒ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ｉｓｏｆｌａｖｏｎｅ ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｉｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ．" Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９９：１４５７８−１４５８３．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、マメ科以外の植物のＩＦＳを単離し、ＩＦＳをコードする遺伝子を同定することを課題とする。さらに、該ＩＦＳやＩＦＳをコードする遺伝子を用い、イソフラボノイドを生産することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討を行ったところ、Ｉｇ、ＩｐまたはＩｔ等の複数のアヤメ科植物からＩＦＳを単離し、これらのＩＦＳをコードする遺伝子を同定することで、本発明を完成するに至った。本発明で同定された遺伝子は、マメ科のダイズやカンゾウ由来のＩＦＳをコードする遺伝子と３０％程度の同一性しか示さない、新規の特徴を有するものであった。
アヤメ科植物の中でも、Ｉｇ由来のＩＦＳ（以下、ＩｇＩＦＳと示す）は、酵母やシロイヌナズナを用いてその遺伝子を発現させたところ、マメ科植物由来のＩＦＳを用いた場合と比較してイソフラボノイドの生産量が約１００倍であることが確認された。このように、本発明において単離されたＩＦＳは、高い酵素活性を有するものであり、イソフラボノイドの生産に有用なものであった。
【０００９】
すなわち、本発明は、次の（１）〜（２２）で示されるＩＦＳ、該ＩＦＳやＩＦＳをコードする遺伝子を用いるイソフラボノイドを生産させる方法等に関する。
（１）配列表配列番号１１で示されるアミノ酸配列に、７８．５％以上の同一性を示すアヤメ科植物のＩＦＳ。
（２）配列表配列番号１、９または１２のいずれかで示されるアミノ酸配列を実質的に有する上記（１）に記載のＩＦＳ。
（３）上記（１）または（２）に記載のＩＦＳをコードするヌクレオチド配列または該ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を実質的に有するポリヌクレオチド。
（４）配列表配列番号２、１０または１３のいずれかで示されるヌクレオチド配列からなる上記（３）に記載のポリヌクレオチド。
（５）配列表配列番号２、１０または１３のいずれかで示されるヌクレオチド配列に対して８０％以上の同一性を有し、且つＩＦＳをコードするポリヌクレオチド。
（６）アヤメ科植物からクローニングされた上記（４）または（５）に記載のポリヌクレオチド。
（７）アヤメ科植物がＩｇ、ＩｐまたはＩｔである上記（６）に記載のポリヌクレオチド。
（８）上記（３）〜（７）のいずれかに記載されたポリヌクレオチドが挿入されたベクター。
（９）宿主細胞中で、上記（３）〜（７）のいずれかに記載されたポリヌクレオチドを発現しうる発現系を含む組換え体ＤＮＡまたはＲＮＡ。
（１０）上記（８）に記載のベクターにより形質転換された宿主細胞。
（１１）宿主細胞が酵母である上記（１０）に記載の形質転換された宿主細胞。
（１２）上記（３）〜（７）のいずれかに記載されたポリヌクレオチドが挿入されたトランスジェニック植物。
（１３）植物がシロイヌナズナである上記（１２）に記載のトランスジェニック植物。
（１４）アヤメ科植物由来のＩＦＳをコードする遺伝子を導入した形質転換体またはトランスジェニック植物にイソフラボノイドを生産させる方法。
（１５）さらに、ＨＩＤをコードする遺伝子を組み合わせて導入した形質転換体またはトランスジェニック植物にイソフラボノイドを生産させる上記（１４）に記載の方法。
（１６）形質転換体が酵母を宿主細胞とする形質転換体であり、トランスジェニック植物がシロイヌナズナを宿主植物とするトランスジェニック植物である上記（１４）または（１５）に記載の方法。
（１７）アヤメ科植物がＩｇ、ＩｐまたはＩｔである上記（１４）〜（１６）のいずれかに記載の方法。
（１８）アヤメ科植物由来のＩＦＳが配列表配列番号１１で示されるアミノ酸配列に、７８．５％以上の同一性を示すＩＦＳである上記（１４）〜（１７）のいずれかに記載の方法。
（１９）アヤメ科植物由来のＩＦＳが配列表配列番号１、９または１２のいずれかで示されるアミノ酸配列を実質的に有するＩＦＳである上記（１４）〜（１８）のいずれかに記載の方法。
（２０）アヤメ科植物由来のＩＦＳをコードする遺伝子が、配列表配列番号１、９または１２のいずれかで示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列または該ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を実質的に有するポリヌクレオチドである上記（１４）〜（１９）のいずれかに記載の方法。
（２１）アヤメ科植物由来のＩＦＳをコードする遺伝子が、配列表配列番号２、１０または１３のいずれかで示されるヌクレオチド配列または該ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を実質的に有するポリヌクレオチドである上記（１４）〜（１８）のいずれかに記載の方法。
（２２）上記（１４）〜（２１）のいずれかに記載の方法により生産されたイソフラボノイド。
【発明の効果】
【００１０】
本発明のアヤメ科植物由来のＩＦＳおよびＩＦＳをコードする遺伝子を使用することにより、酵母、植物細胞や植物体等を用いてイソフラボノイドを高濃度に生産する技術の確立が可能となる。イソフラボノイドのうち、イソフラボンは特に女性ホルモンであるエストロゲン様の作用を有する。従って、本発明によって、高濃度に生産されたイソフラボノイドは、健康食品や化粧品等、様々な用途に利用され得る。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】Ｉｇ抽出液のイソフラボノイド合成活性を示した図である（実施例１）。
【図２】形質転換体のスクリーニング方法の概要等を示した図である（実施例１）。
【図３】ＩｇＩＦＳによる生成物を示した図である（実施例１）。
【図４】ＩｇＩＦＳを発現している形質転換体（酵母ミクロソーム）の生成物を確認した図である（実施例１）。
【図５】ＩｇＩＦＳを発現している形質転換体（酵母ミクロソーム）におけるイソフラボノイドの生産量を示した図である（実施例１）。
【図６】ＩｇＩＦＳとＰ４５０のアミノ酸配列のアライメントを示した図である（実施例１）。
【図７】ＩｇＩＦＳを含む系統樹を示した図である（実施例１）。
【図８】培養細胞でのイソフラボノイド合成酵素活性（ＩＦＳ活性）の経時変化とＲＴ−ＰＣＲを示した図である（実施例１）。
【図９】ＩｇＩＦＳとＩｐ由来のＩＦＳ（以下、ＩｐＩＦＳと示す）のアライメントを示した図である（実施例２）。
【図１０】アヤメ科植物とマメ科植物のＩＦＳの系統樹を示した図である（実施例２）。
【図１１】ＩｇＩＦＳとＩｔ由来のＩＦＳ（以下、ＩｔＩＦＳと示す）のアライメントを示した図である（実施例３）。
【図１２】各発現ベクターを示した図である（実施例４）。
【図１３】ＩｇＩＦＳを発現しているトランスジェニック植物（シロイヌナズナ）の生成物を確認した図である（実施例４）。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の「ＩＦＳ」には、配列表配列番号１１で示されるアミノ酸配列に、７８．５％、より好ましくは８０％、さらに好ましくは８５％以上の同一性を示すアヤメ科植物のＩＦＳであればいずれのＩＦＳも含まれる。由来となるアヤメ科植物としては、アヤメ科の植物であればいずれであっても良く、例えば、Ｉｇ、ＩｐまたはＩｔ等が挙げられる。
このような本発明の「ＩＦＳ」として、例えば配列表配列番号１で示されるアミノ酸配列を実質的に有するＩｇＩＦＳ、配列表配列番号９で示されるアミノ酸配列を実質的に有するＩｐＩＦＳ、または配列表配列番号１２で示されるアミノ酸配列を実質的に有するＩｔＩＦＳ等が挙げられる。ここで、「アミノ酸配列を実質的に有する」とは、ＩＦＳ活性を有する限り、当該アミノ酸配列に欠失、置換、付加、挿入等の変異があるものも含むことを意味する。欠失、置換、付加、挿入されるアミノ酸の数は、例えば、１〜１００個、好ましくは１〜５０個、より好ましくは１〜１０個、特に１〜５個であり得る。特に、アミノ酸残基を同様の特性のアミノ酸残基で置換したものであり、典型的なかかる置換は、Ａｌａ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅ間、ＳｅｒおよびＴｈｒ間、ＡｓｐおよびＧｌｕ間、ＡｓｎおよびＧｌｎ間、ＬｙｓおよびＡｒｇ間、ＰｈｅおよびＴｙｒ間の置換である。
【００１３】
また、これらのＩＦＳをコードするポリヌクレオチドとして、例えば、配列表配列番号１１で示されるアミノ酸配列に７８．５％、より好ましくは８０％、さらに好ましくは８５％以上の同一性を示すアヤメ科植物のＩＦＳをコードするヌクレオチド配列または該ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を実質的に有するポリヌクレオチド等が挙げられる。
ここで、「ヌクレオチド配列を実質的に有する」とは、ＩＦＳをコードする配列からなるポリヌクレオチドのほか、該配列と縮重による配列の相違、５'末端あるいは３'末端又はその両末端に適当な配列が付加されたポリヌクレオチド等も含む意味である。
このような「ポリヌクレオチド」として、例えば、配列表配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列または該ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を実質的に有するポリヌクレオチド、配列表配列番号９で示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列または該ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を実質的に有するポリヌクレオチド、または配列表配列番号１２で示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列または該ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を実質的に有するポリヌクレオチド等が挙げられる。また、配列表配列番号１、９または１３のいずれかで示されるヌクレオチド配列に対して８０％、より好ましくは８５％、さらに好ましくは９０％以上の同一性を有し、且つＩＦＳをコードするポリヌクレオチド等が挙げられる。
【００１４】
本発明の「ベクター」とは、大腸菌、酵母等の宿主細胞や、植物に導入することで、発現させたい遺伝子を発現させるためのものを指す。本発明において発現させたい遺伝子としては、上記の配列表配列番号１１で示されるアミノ酸配列に７８．５％、より好ましくは８０％、さらに好ましくは８５％以上の同一性を示すアヤメ科植物のＩＦＳをコードするヌクレオチド配列または該ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を実質的に有するポリヌクレオチド等が挙げられる。本発明においてこれらの遺伝子を発現させるベクターとして、従来知られているいずれのベクターも用いることができるが、例えば、酵母発現ベクターであるｐＹＥＳ−ＤＥＳＴ５２（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）やｐＥＳＣ−Ｌｅｕ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）等を用いることができる。
【００１５】
このような発現させたい遺伝子を組み込んだベクターは、酵母や大腸菌等を宿主として導入することができる。これらの宿主は該ベクターによって形質転換できるものであれば何を宿主としても良く、例えば、酵母や大腸菌等を宿主とすることができる。トランスジェニック植物も同様であり、宿主とする植物として例えば、シロイヌナズナ等を挙げることができる。
【００１６】
本発明の「イソフラボノイドを生産させる方法」は、イソフラボノイドの生産にあたり、アヤメ科植物由来のＩＦＳをコードする遺伝子を導入した形質転換体やトランスジェニック植物を用い、これらにイソフラボノイドを生産させる方法であれば良い。さらに、アヤメ科植物由来のＩＦＳをコードする遺伝子の導入に合わせ、ＨＩＤをコードする遺伝子を組み合わせて導入した形質転換体またはトランスジェニック植物を用いて、これらにイソフラボノイドを生産させる方法であっても良い。本発明における「組換え体ＤＮＡまたはＲＮＡ」とは、これらの形質転換体やトランスジェニック植物におけるＤＮＡまたはＲＮＡのことを指す。これらの「組換え体ＤＮＡまたはＲＮＡ」は、酵母や植物において、ＩＦＳやＨＩＤ等の遺伝子を発現させインビトロでフラバノン（基質）をイソフラボノイドへ変換したり、インビボでイソフラボノイドを生産したりするのに用いることができる。
ここで生産される「イソフラボノイド」としては、２−ヒドロキシイソフラバノン、イソフラボン等が挙げられる。
【００１７】
本発明において導入する遺伝子は、「アヤメ科植物由来のＩＦＳ」をコードする遺伝子であれば上記のような遺伝子を導入することができ、組み合わせて導入する「２−ヒドロキシイソフラバノン脱水酵素をコードする遺伝子」のＨＩＤの由来は特に問わない。例えばマメ科のダイズやカンゾウ由来であっても良く、アヤメ科のＩｇ、ＩｐまたはＩｔ由来であっても良い。
【００１８】
以下に、実施例によって本発明を詳細に説明するが、本発明はそれに限定されるものではない。
【実施例１】
【００１９】
試料
１）植物材料
スクロース（３０ｇ／ｌ），プロリン（２５０ｍｇ／ｌ），トリプトンペプトン（２００ｍｇ／ｌ），α−ナフタレン酢酸（１ｍｇ／ｌ），ベンジルアデニン（０．５ｍｇ／ｌ）を含むＭＳ培地で暗所，２５℃で培養したＩｇの不定根カルチャーを用いた（参考文献１）。寒天（９ｇ／ｌ）を含む上記培地で３週間不定根を培養後、寒天を含まない液体培地に不定根を移した。通常のアッセイでは、液体培地で培養後５日目の細胞を回収して，酵素アッセイに用いた。また液体培地に植え次ぎ後経時的（１日，３日，５日，１０日，２０日，３０日）に不定根を回収し−８０℃で保存し、イソフラボノイド合成酵素活性（ＩＦＳ活性）の経時変化の解析とＲＴ−ＰＣＲに用いた。
１０％スクロースと１４ｍＭ ２−メルカプトエタノールを含む１００ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．５）中で不定根を破砕し，ガーゼで濾過した。濾過されたホモジネートを遠心分離（１０，０００ｇ，１０分間）した後、超遠心分離（１６０，０００ｇ，９０分間）でミクロソームを得た。最終的な沈殿物を上記バッファーで懸濁し、Ｉｇ抽出液とした（１．０ｍｇ／ｍｌミクロソームタンパク質）。
このＩｇ抽出液（１ｍｌ）を１ｍＭ ＮＡＤＰＨ存在下でナリンゲニン（１０μｇ）と３０℃で６０分インキュベートしてイソフラボノイド合成活性（ＩＦＳ活性）を調べ、結果を図１に示した。また超遠心分離後の上清に２−ヒドロキシイソフラバノン（１０μｇ）を加え、３０℃で６０分インキュベートしてイソフラボン合成活性（ＨＩＤ活性）を調べ、結果を図１に示した。
参考文献１：Ａｋａｓｈｉ，Ｔ．，Ｍ．Ｉｓｈｉｚａｋｉ，ｅｔ ａｌ．（２００５）．"Ｉｓｏｆｌａｖｏｎｏｉｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ ａｄｖｅｎｔｉｔｉｏｕｓ−ｒｏｏｔ ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｏｆ Ｉｒｉｓ ｇｅｒｍａｎｉｃａ（Ｉｒｉｄａｃｅａｅ）．" Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２２：２０７−２１５．
【００２０】
２）ｃＤＮＡライブラリーおよびスクリーニング
上記と同様に液体培地で４日間培養したＩｇの不定根カルチャーから、Ｓｔａｒａｉｇｔ Ａ'ｓ ｍＲＮＡ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）を使用してｍＲＮＡを単離した。このｍＲＮＡからＣｌｏｎｅＭｉｎｅｒ（登録商標）ｃＤＮＡ Ｌｉｂｌａｒｙ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）によりｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ（ｐＤＯＮＲ２２２）を用いてｃＤＮＡライブラリー（４×１０7ｐｒｉｍａｒｙ ｃｌｏｎｅｓ）を構築した。その後、Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅｒ'ｓ ｐｒｏｔｏｃｏｌ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に従い、ｃＤＮＡを酵母発現ベクター（ｐＹＥＳ−ＤＥＳＴ５２、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）のＧＡＬ１プロモーターの下にｃＤＮＡを組み換えた。
Ｐ４５０はシトクロムＰ４５０還元酵素（ＣＰＲ）と電子伝達系を構成し，Ｐ４５０が活性を示すためにはＣＰＲが必要となることから、マメ科植物ミヤコグサ（Ｌｏｔｕｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）から得たＣＰＲ ｃＤＮＡ（ＬｊＣＰＲ、配列表配列番号３）を酵母発現ベクター（ｐＥＳＣ−Ｌｅｕ，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）に組み込み，ｐＥＳＣ−ＬｊＣＰＲベクターを作成した。これを酵母ＢＪ２１６８株（ニッポンジーン社，Ｎｉｐｐｏｎ Ｇｅｎｅ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）に導入した後、この酵母にさらにｐＹＥＳ−ＤＥＳＴ５２に組み込んだＩｇのｃＤＮＡライブラリーを導入し、形質転換体を作製した。この形質転換体は、ロイシンとウラシルを含まないｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｃｏｍｐｌｅｔｅ（ＳＣ）培地（Ｙｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｂａｓｅ ｗ／ｏ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ（６．７ｇ／ｌ、Ｄｉｆｃｏ社），グルコース（２０ｇ／ｌ）、ＣＳＭ Ｄｒｏｐ−ｏｕｔ −Ｌｅｕ−Ｕｒａ （６７０ｍｇ／ｌ，Ｆｏｒｍｅｄｉｕｍ社））、寒天プレート上で培養した。
約５００の形質転換体を寒天プレートから取り出し、組換えタンパク質を発現させるために、１ｍＭのσ−ａｍｉｎｏｌｅｖｕｌｉｎｉｃ ａｃｉｄｓ（Ｓｉｇｍａ社）を加えた１０ｍｌのＹＰＧ培地（ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ（１０ｇ／ｌ），ｐｅｐｔｏｎｅ（２０ｇ／ｌ）、ｇａｌａｃｔｏｓｅ（２０ｇ／ｌ））が入ったコニカルチューブ（５０ｍｌ）内に接種した。その一部を１つのプールとして、合計１０個の独立したプールを得た。
スクリーニングの第二段階のために、それぞれのプールから取り出した少量のカルチャーを上記と同様の寒天プレートの上においた。ナリンゲニン（０．５ｍｇ）を残ったプールにいれ、形質転換体を３０℃で２４時間培養した。
カルチャーを酢酸エチルで抽出し溶媒を溜去した。抽出物をエタノールに溶解し、ＨＰＬＣによって解析した後、スクリーニングの次の段階のために１０プールのうちポジティブなプールを小分けした（約５０ｃｌｏｎｅｓ／ｐｏｏｌ）。
ポジティブなプールのアッセイを繰り返し、イソフラボノイドを生産するクローンを単離した。イソフラボノイド（２−ヒドロキシイソフラバノン及びイソフラボン）の生産は次の条件でＨＰＬＣを行い確認した。
最終的に、イソフラボノイドを生産する単一酵母コロニーをＩｇＩＦＳ／ＬｊＣＰＲを発現している形質転換体として同定した。この形質転換体からプラスミドを抽出して，ＩｇＩＦＳのアミノ酸配列（配列表配列番号１）を特定するとともに、ＩｇＩＦＳをコードする遺伝子（ｃＤＮＡ）（配列表配列番号２）を同定した。
このスクリーニング方法の概要およびＩｇＩＦＳ／ＬｊＣＰＲを発現している形質転換体におけるイソフラボノイドの生産を図２に示した。
ＨＰＬＣ条件：
ＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ Ｃ１８ ＭＧ ｃｏｌｕｍｎ（４．６ｘ１５０ｍｍ；Ｓｈｉｓｅｉｄｏ社）、４０℃、流量：０．８ｍｌ／ｍｉｎ、３０％〜８０％（ｖ／ｖ）のメタノール溶媒使用、２５分間直線濃度勾配（ｌｉｎｅａｒ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｅｌｕｔｉｏｎ）
【００２１】
３）酵素活性の測定（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）
上記によって得られた本発明の形質転換体と、コントロールとして、ｐＥＳＣ−Ｌｅｕ（ストラタジーン社）およびｐＹＥＳ２（インビトロゲン社）を酵母ＢＪ２１６８株に導入して得た形質転換体を用いた。また、比較として、マメ科カンゾウのＩＦＳ（ＣＹＰ９３Ｃ２、配列表配列番号４）を組み込んだ発現ベクター（ｐＹＥＳ−ＣＹＰ９３Ｃ２）を上記と同様に作成し（参考文献２）、ＣＹＰ９３Ｃ２／ＬｊＣＰＲを発現している形質転換体を得て、これを比較として用いた。
参考文献２：Ａｋａｓｈｉ，Ｔ．，Ｔ．Ａｏｋｉ，ｅｔ ａｌ．（１９９９）． "Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａ ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｐ４５０ ｃＤＮＡ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ２−ｈｙｄｒｏｘｙｉｓｏｆｌａｖａｎｏｎｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｉｓｏｆｌａｖｏｎｏｉｄ ｓｋｅｌｅｔｏｎ ｉｎ ｌｉｃｏｒｉｃｅ．" Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ １２１（３）：８２１−８２８．
【００２２】
ＩｇＩＦＳまたはマメ科カンゾウのＩＦＳ（ＣＹＰ９３Ｃ２）の発現は、参考文献３に従って行った。
即ち、酵母を１０％スクロースと１４ｍＭ ２−メルカプトエタノールを含む１００ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．５）に懸濁し，ガラスビーズを用いて細胞を破砕した．酵母ホモジネートを遠心分離（１０，０００ｇ，１０分間）した後、超遠心分離（１６０，０００ｇ，９０分間）でミクロソームを得た。最終的な沈殿物を上記バッファーで懸濁した（１．０ｍｇ／ｍｌミクロソームタンパク質）。
上記形質転換体のミクロソーム（０．３ｍｇミクロソームタンパク質）を０．１ｍＭ（ＲＳ）−ナリンゲニン（Ｓｉｇｍａ社）と１ｍＭ ＮＡＤＰＨ（和光純薬工業）とともに（全容量１ｍｌ）、３０℃で１５分間インキュベートした。反応ミクスチャーのエタノール抽出物を上記と同じ条件でＨＰＬＣを行い解析した。ＨＰＬＣによる溶出物（ｅｌｕｔｅ）は、ｍｕｌｔｉｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ ｄｅｔｅｃｔｏｒ（ＭＤ−２０１０，ＪＡＳＣＯ社）によってモニターした。
その結果、図３，図４Ａ．に示すようにＩｇＩＦＳを発現している形質転換体（酵母ミクロソーム）ではナリンゲニンからイソフラボノイド（２−ヒドロキシイソフラバノン（図３、４Ａ．：２ＨＩ）とイソフラボン（図３、４Ａ．：Ｇｅｎｉｓｔｅｉｎ））と共に少量の３−ヒドロキシナリンゲニン（３−ＯＨ Ｎａｒｉｎｇｅｎｉｎ、図３、４Ａ．：３ＨＦ）とフラボン（アピゲニン（図３，４Ａ．：Ａｐｉｇｅｎｉｎ））を生成することが示された。従って，このタンパク質がイソフラボノイドの生成に関わっていることが確認された。
また、比較として用いたマメ科カンゾウのＩＦＳ（ＣＹＰ９３Ｃ２）を発現している形質転換体（酵母ミクロソーム）では図３に示したように、２−ヒドロキシイソフラバノン（図３：２ＨＩ）を８８％、イソフラボン（図３：Ｇｅｎｉｓｔｅｉｎ））を５％、と共に少量の３−ヒドロキシナリンゲニン（図３：３ＨＦ）を７％生成することが示された。
【００２３】
反応の立体選択性（ｓｔｅｒｅｏｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ）を決定するために、３０℃で６０分間インキュベートし、残った基質を、ＴＬＣ（Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ Ｆ２５４，Ｍｅｒｃｋ， Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ；ｃｈｒｏｌｏｆｏｒｍ：ｍｅｔｈａｎｏｌ［９８：２，ｖ／ｖ］）から回収し、ｃｈｉｒａｌ ｃｏｌｕｍｎ（参考文献４、Ｃｈｉｒａｌｃｅｌ ＯＤ−ＲＨ ｃｏｌｕｍｎ（４．６ｘ１５０ｍｍ；Ｄａｉｃｅｌ社）、４０℃、流量：０．４ｍｌ／ｍｉｎ、３０％アセトニトリル溶媒使用）において、上記と同じ条件でＨＰＬＣを行い解析した。
その結果、図４Ｂ．に示すように，Ｓ−ナリンゲニンのみ減少し，この酵素はＳ−体のみを基質にすることが確認された．
【００２４】
また、上記の反応ミクスチャーに（ＲＳ）−ｎａｒｉｎｇｅｎｉｎの代わりに表１に示した基質（０．１ｍＭ）をそれぞれ加え、基質特異性を調べた。その結果、表１に示すようにＩｇＩＦＳは、カンゾウＩＦＳ（ＣＹＰ９３Ｃ２）と比べてナリンゲニン対する活性が最も高く，リクイリチゲニンに対する活性は低かった。
【００２５】
さらに、様々な濃度の（Ｓ）−ｎａｒｉｎｇｅｎｉｎ（０．２，０，５，１．０，１．５，５．０，１０，２０および５０μＭ）とＮＡＤＰＨ（（５００μＭ）を組換え酵母ミクロソームとともに全量４ｍｌ、３０℃で１５分間インキュベートし、Ｋｍ値およびＶmax値をＬｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋ ｐｌｏｔにより調べ、結果を表２に示した。参考（比較）として、Ｆ３Ｈ（ｎａｒｉｎｇｅｎｉｎ），ＩＦＳ（ｌｉｃｏｒｉｃｅ）（ｌｉｑｕｉｒｉｔｉｇｅｎｉｎ）またはＩＦＳ（ｓｏｙｂｅａｎ）（ｎａｒｉｎｇｅｎｉｎ）のＫｍ，Ｋｃａｔ値を参考文献５〜７より引用して示した。
参考文献３：Ａｙａｂｅ，Ｓ．，Ｔ．Ａｋａｓｈｉ，ｅｔ ａｌ．（２００２）． "Ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ｃＤＮＡｓ ｅｎｃｏｄｉｎｇ Ｐ４５０ｓ ｉｎ ｔｈｅ ｆｌａｖｏｎｏｉｄ／ｉｓｏｆｌａｖｏｎｏｉｄ ｐａｔｈｗａｙ ｆｒｏｍ ｅｌｉｃｉｔｅｄ ｌｅｇｕｍｉｎｏｕｓ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅｓ．" Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ３５７： ３６０−３６９．
参考文献４：Ｓｈｉｍａｄａ，Ｎ．，Ｔ．Ａｏｋｉ，ｅｔ ａｌ．（２００３）． "Ａ ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ ｇｅｎｅｓ ｅｎｃｏｄｅｓ ｔｈｅ ｔｗｏ ｔｙｐｅｓ ｏｆ ｃｈａｌｃｏｎｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｇｅｎｅｒａｌ ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ ａｎｄ ｌｅｇｕｍｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ５−ｄｅｏｘｙ（ｉｓｏ）ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ ｉｎ Ｌｏｔｕｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ．" Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． １３１： ９４１−９５１
参考文献５：Ｈａｌｂｗｉｒｔｈ，Ｈ．，Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｔ．Ｃ．，Ｓｃｈｌａｎｇｅｎ，Ｋ．，Ｒａｄｅｍａｃｈｅｒ，Ｗ．，Ｓｃｈｌｅｉｆｅｒ，Ｋ−Ｊ．Ｆｏｒｋｍａｎｎ，Ｇ． ａｎｄ Ｓｔｉｃｈ，Ｋ（２００６） "Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｆｏｒ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ ２−ｏｘｏｇｌｕｔａｒａｔｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅｓ： Ｆｌａｖａｎｏｎｅ ３β−ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ ａｎｄ ｆｌａｖｏｎｏｌ ｓｙｎｔｈａｓｅ" Ｐｌａｎｔ ｓｃｉｅｎｃｅ １７１： １９４−２０５．
参考文献６：Ａｋａｓｈｉ，Ｔ．，Ａｏｋｉ，Ｔ． ａｎｄ Ａｙａｂｅ，Ｓ．（１９９９）． "Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａ ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｐ４５０ ｃＤＮＡ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ２−ｈｙｄｒｏｘｙｉｓｏｆｌａｖａｎｏｎｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｉｓｏｆｌａｖｏｎｏｉｄ ｓｋｅｌｅｔｏｎ ｉｎ ｌｉｃｏｒｉｃｅ．" Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ １２１：８２１−８２８．
参考文献７：Ｋｏｃｈｓ， Ｇ． ａｎｄ Ｈ． Ｇｒｉｓｅｂａｃｈ （１９８６）． "Ｅｎｚｙｍｉｃ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｉｓｏｆｌａｖｏｎｅｓ．" Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １５５： ３１１−３１８．
【００２６】
【表１】
【００２７】
【表２】
【００２８】
４）生体内変換（ｉｎ ｖｉｖｏ）
ｉｎ ｖｉｖｏで，ＩｇＩＦＳとマメ科カンゾウのＩＦＳ（ＣＹＰ９３Ｃ２）のイソフラボノイド生産能を比較した。
即ち、上記で作成したＩｇＩＦＳ／ＬｊＣＰＲまたはＣＹＰ９３Ｃ２／ＬｊＣＰＲを発現している形質転換体をそれぞれ用い、寒天を含まないＳＣ培地（５ｍｌ）に接種し、２８℃で２４時間おいた。その後、細胞を遠心分離（３，０００ｘｇ，５ｍｉｎ）によって分離し、この細胞を１ｍＭ−ａｍｉｎｏｌｅｖｕｌｉｎｉｃ ａｃｉｄ、４ｍｇ（ＲＳ）−ｎａｒｉｎｇｅｎｉｎ（ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ ｏｆ ０．７５ｍＭ（Ｓ）−ｎａｒｉｎｇｅｎｉｎ）および０．５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ８０が添加された１０ｍｌ ＹＰＧ培地（ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ（１０ｇ／ｌ），ｐｅｐｔｏｎｅ（２０ｇ／ｌ）、ｇａｌａｃｔｏｓｅ（２０ｇ／ｌ））（ＯＤ600＝０．５）で２４時間、４８時間または７２時間培養した。
培地の一部（１ｍｌ）を採取し、酢酸エチルで抽出したものを、上記と同じ条件でＨＰＬＣを行い解析した。この結果を図５および表３に示した。
図５および表３に示したように、７２時間培養した場合に、ＩｇＩＦＳをコードする遺伝子を導入した組換え酵母細胞では、イソフラボノイド（２ＨＩ＋ｇｅｎｉｓｔｅｉｎ）の生産量が５５０μｍｏｌ／ｌであったのに対し、ＣＹＰ９３Ｃ２／ＬｊＣＰＲを発現している組換え酵母細胞ではわずかに５．５μｍｏｌ／ｌであった。従って、この結果より、従来のマメ科由来のＩＦＳを用いた場合と比較して、本発明のＩｇＩＦＳを用いた場合では、イソフラボノイドの生産量が約１００倍に向上することが示された。
【００２９】
【表３】
【００３０】
５）系統解析（Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ）
ＭＥＧＡ４ ｓｏｆｔｗａｒｅ（ ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｅｇａｓｏｆｔｗａｒｅ．ｎｅｔ／よりダウンロード）を用いて系統解析を行った。
ＩｇＩＦＳを含む植物Ｐ４５０のアミノ酸配列をＣｌａｓｔａｌＷ（ ｈｔｔｐ：／／ｃｌｕｓｔａｌｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／ｔｏｐ−ｊ．ｈｔｍｌ）を用いて整列することでアライメントを調べ（図６）、ｎｅｉｇｈｂｏｒ−ｊｏｉｎｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ（近隣結合法）（参考文献８）を用いて系統樹を構築した。
アライメントを調べることにより、ＩｇＩＦＳはＣＹＰ９３ファミリーとは３０％程度の同一性を有し、ＣＹＰ７５Ｂ（Ｆ３'Ｈ）と最も同一性が高い（約４０％）ことが示された。また、ＩｇＩＦＳにおけるＩ−ｈｅｌｉｘ中央の保存された残基はＴｈｒであり、ＣＹＰ９３Ｃ２のＬ３７１とＫ３７５に相当するアミノ酸残基はそれぞれ，Ｌｅｕ，Ｉｌｅであることが示された。
Ｐ４５０の世代の分岐（Ａｇｅ ｏｆ ｄｉｖｅｒｇｅｎｃｅ）はＭＥＧＡ４ ｓｏｆｔｗａｒｅのｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅ'ｓ ｐｒｏｔｏｃｏｌに従って，Ｐ４５０の核酸配列を用いて算出した。構築した系統樹を図７に示した。
参考文献８：Ｓａｉｔｏｕ，Ｎ． ａｎｄ Ｍ．Ｎｅｉ（１９８７）． "Ｔｈｅ ｎｅｉｇｈｂｏｒ−ｊｏｉｎｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ： ａ ｎｅｗ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇ ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒｅｅｓ．" Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｅｖｏｌ ４（４）：４０６−２５．
【００３１】
６）ＲＴ−ＰＣＲ解析
上記のＩｇ由来の不定根カルチャーからｍＲＮＡを抽出し，ｃＤＮＡを合成した。ＥｘＴａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ社）、ＩｇＩＦＳ特異的プライマー（ＩｇＩＦＳ１−Ｆ（配列表配列番号５）、ＩｇＩＦＳ１−Ｒ（配列表配列番号６）（Ｓｉｇｍａ社で受託合成）を用いてＲＴ−ＰＣＲを行った。
ＲＴ−ＰＣＲは、９４°Ｃ １分で変性させた後、９４°Ｃ，１分；５５°Ｃ，１分；７２°Ｃ，１分の３ステップを３０サイクル行った。１．２％（ｗ／ｖ）のアガロースゲルで電気泳動した後、増幅物をエチジウムブロマイドで染色した。ＰＣＲのための鋳型の濃度はアクチンｃＤＮＡと同様に増幅されるよう調整して用いた。
その結果、ジャーマンアイリスでのイソフラボノイド生合成酵素の活性の変化（図８、上図）とＩｇＩＦＳ遺伝子の発現が対応していることが示され（図８、下図）、ＩｇＩＦＳが植物でイソフラボノイドの生産に関わっている事が強く示唆された．
【実施例２】
【００３２】
キショウブ（Ｉｒｉｓ ｐｓｅｕｄａｃｏｒｕｓ）からＩｐＩＦＳを取得した。
即ち、スクロース（３０ｇ／ｌ），プロリン（２５０ｍｇ／ｌ），トリプトンペプトン（２００ｍｇ／ｌ），α−ナフタレン酢酸（１ｍｇ／ｌ），ベンジルアデニン（０．５ｍｇ／ｌ）を含むＭＳ培地でキショウブ（Ｉｒｉｓ ｐｓｅｕｄａｃｏｒｕｓ）のカルスを培養した。
キショウブカルスからＳｔａｒａｉｇｔ Ａ'ｓ ｍＲＮＡ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）を使用してｍＲＮＡを抽出し，ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いてｃＤＮＡを合成した。このｃＤＮＡを鋳型として、ＥｘＴａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ社）、プライマー（ＩＦＳ−Ｆ（配列表配列番号７）、ＩＦＳ−Ｒ（配列表配列番号８）ともにＳｉｇｍａ社で受託合成）を用いてＲＴ−ＰＣＲを行った。
ＲＴ−ＰＣＲは、９４°Ｃ １分で変性させた後、９４°Ｃ，１分；５５°Ｃ，１分；７２°Ｃ，１分の３ステップを３０サイクル行った。１．２％（ｗ／ｖ）のアガロースゲルで電気泳動した後、増幅物をエチジウムブロマイドで染色した。この増幅産物をアガロースゲルから切り出し、ｐＴ７Ｂｌｕｅ Ｔ−ｖｅｃｔｏｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）に導入後、ＤＮＡシーケンサー（ＡＢＩ３１００，アプライドバイオシステム社）で解析した。得られた配列は、配列解析ソフトウェア（Ｇｅｎｅｔｙｘ−Ｍａｃ Ｖｅｒ１５，ゼネティックス社）で解析し、ＩｐＩＦＳのアミノ酸配列を配列表配列番号９に、ＩｐＩＦＳをコードする塩基配列を配列表配列番号１０にそれぞれ示した。
【００３３】
ＩｐＩＦＳのアミノ酸配列のうち、ＩｇＩＦＳの一部（配列表配列番号１１：配列表配列番号１の２４１番目から４４２番目のアミノ酸配列）に対するアライメントを調べ、図９に示した。ＩｐＩＦＳとＩｇＩＦＳとの同一性（アミノ酸配列）は７８．５％であった。
また、実施例１、５）系統解析（Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ）の記載に従い、ＭＥＧＡ４ ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて系統解析を行った。アヤメ科植物のＩＦＳとマメ科植物のＩＦＳのアミノ酸配列を、ＣｌａｓｔａｌＷを用いて整列することでアライメントを調べ、ｎｅｉｇｈｂｏｒ−ｊｏｉｎｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ（近隣結合法）を用いて系統樹を構築した。その結果、図１０に示すようにアヤメ科植物のＩＦＳとマメ科植物のＩＦＳは別のクレードに属し、ＩｇＩＦＳとＩｐＩＦＳは近縁であることが確認された。
【実施例３】
【００３４】
イチハツ（Ｉｒｉｓ ｔｅｃｔｏｒｕｍ）からＩｔＩＦＳを取得した。
イチハツの根からＳｔａｒａｉｇｔ Ａ’ｓ ｍＲＮＡ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）を使用してｍＲＮＡを抽出し，ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いてｃＤＮＡを合成した。このｃＤＮＡを鋳型として、ＥｘＴａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ社）、プライマー（ＩＦＳ−Ｆ（配列表配列番号７）、ＩＦＳ−Ｒ（配列表配列番号８）ともにＳｉｇｍａ社で受託合成）を用いてＲＴ−ＰＣＲを行った。
ＲＴ−ＰＣＲは、９４°Ｃ １分で変性させた後、９４°Ｃ，１分；５５°Ｃ，１分；７２°Ｃ，１分の３ステップを３５サイクル行った。１．０％（ｗ／ｖ）のアガロースゲルで電気泳動した後、増幅物をエチジウムブロマイドで染色した。この増幅産物をアガロースゲルから切り出し、ｐＴ７Ｂｌｕｅ Ｔ−ｖｅｃｔｏｒ （Ｎｏｖａｇｅｎ社）に導入後、ＤＮＡシーケンサー（ＡＢＩ３１００，アプライドバイオシステム社）で解析した。得られた配列は、配列解析ソフトウェア（Ｇｅｎｅｔｙｘ−Ｍａｃ Ｖｅｒ１５， ゼネティックス社）で解析した。ＩｔＩＦＳのアミノ酸配列を配列表配列番号１２に、ＩｔＩＦＳをコードする塩基配列を配列表配列番号１３にそれぞれ示した。
【００３５】
ＩｇＩＦＳ、ＩｐＩＦＳ、ＩｔＩＦＳの全アミノ酸配列のアライメントを配列解析ソフトウェア（Ｇｅｎｅｔｙｘ−Ｍａｃ Ｖｅｒ１５）を用いて調べ、図１１に示した。ＩｔＩＦＳとＩｇＩＦＳとのアミノ酸配列の同一性は９１％であり、ＩｔＩＦＳとＩｐＩＦＳとのアミノ酸配列の同一性は８２％であった。ＩｇＩＦＳ、ＩｐＩＦＳ、ＩｔＩＦＳは互いに高い相同性を示し、アヤメ属では類似タンパク質がイソフラボン生合成に関わっていることが示唆された。
【実施例４】
【００３６】
モデル植物シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）でのイソフラボノイド生産
植物形質転換用ベクターはｐＲＩ９０９（タカラバイオ社）を用いた。ｐＲＩ９０９のカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモータ（ＣＡＭＶ３５Ｓ）の下流にジャーマンアイリスのＩｇＩＦＳ ｃＤＮＡを組み込んだ発現ベクター（ｐＲＩ９０９-ＩｇＩＦＳ）を作成した（図１２）。
また、マメ科ＩＦＳと生産量を比較するためにｐＲＩ９０９のＣＡＭＶ３５Ｓの下流にマメ科カンゾウＣＹＰ９３Ｃ２ ｃＤＮＡを組み込んだ発現ベクター（ｐＲＩ９０９-ＣＹＰ９３Ｃ２）も作成した。ｐＲＩ９０９-ＩｇＩＦＳ、ｐＲＩ９０９-ＣＹＰ９３Ｃ２およびコントロールとしてｐＲＩ９０９をＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ（ＬＢＡ４４０４、タカラバイオ社）にエレクトロポレーション法で導入した。
形質転換株はカナマイシン（５０ｍｇ/Ｌ）を含むＬＢ寒天培地で２８℃２日間培養した。生じたコロニーを、カナマイシン（５０ｍｇ/Ｌ）を含むＬＢ液体培地で、２８℃で一晩前培養をした後、２８℃で一晩本培養を行った。シロイヌナズナの形質転換は花序浸し法によって行った。得られたＴ０種子を表面殺菌し、カナマイシン（５０ｍｇ/Ｌ）、カルベニシリン（５０ｍｇ/Ｌ）を含むＭＳ培地に播種し選抜した。発芽した組換え個体を培養土に移し、Ｔ１種子を回収してホモ個体を選抜した。
得られたホモ個体（ＩｇＩＦＳ導入株（１個体），ＣＹＰ９３Ｃ２導入株（２個体）、ｐＲＩ９０９導入株（１個体））を恒温・恒湿室（コイトトロン，１８〜２５℃，明期１４時間）で栽培した。
【００３７】
栽培によって２０ｃｍ以上に成長した各個体の茎頂から５ｃｍを採取し、重量を計測し、サンプルとした。各サンプルを液体窒素で凍結粉砕し、１０ｍＬの特級メタノールを加え、１晩静置した。濾過した抽出液を濃縮し、特級エタノール、純水に溶解させてガラスバイアル（マルエム社）に移した。移したサンプルを吹き付け濃縮（ＡＩＲ ＰＵＭＰ ＳＰＰ−６ＧＡ、高槻電気工業株式会社）し、１Ｎ塩酸メタノールで９０℃、１時間酸処理して配糖体の酸加水分解を行った。酸処理したサンプルを再度吹き付け濃縮し、ＩｇＩＦＳ導入株とｐＲＩ９０９導入株はサンプルの生重量１ｇにつき２ｍＬ、ＣＹＰ９３Ｃ２導入株は３倍の濃度になるように７５％メタノールで溶解させ、エキクロディスク（Ｍｉｌｌｅｘ（登録商標）−ＬＨ、ミリポア社）でろ過した。これらをＨＰＬＣ（ＴＳＫ−ｇｅｌ ＯＤＳ−Ｔｍ（東ソー社）；流速、１ｍＬ／ｍｉｎ；カラム温度、４０℃；２０分でメタノール濃度４０％から８０％のグラジエント分析）で分析した。
【００３８】
何も導入していないシロイヌナズナ（コントロール株）はフラボノ-ルのｋａｅｍｐｆｅｒｏｌとｑｕｅｒｃｅｔｉｎを含むが、ＩｇＩＦＳ導入株では両物質はほとんど検出されず、ｇｅｎｉｓｔｅｉｎのみが検出された（図１３）。ＣＹＰ９３Ｃ２導入株ではフラボノール量はコントロール株とほとんど変わらなかったが、少量のｇｅｎｉｓｔｅｉｎが新たに検出された。ＩｇＩＦＳ導入株とＣＹＰ９３Ｃ２導入株でのｇｅｎｉｓｔｅｉｎ生産量はそれぞれ３８．２μｇ／ｇ（Ｆ．Ｗ．），２．１μｇ／ｇ（Ｆ．Ｗ．）であり、ＩｇＩＦＳ導入株の方がＣＹＰ９３Ｃ２導入株よりｇｅｎｉｓｔｅｉｎ生産量は約１８倍高かった。従ってこの結果より、アイリスのＩＦＳ遺伝子を用いた組換え植物でのイソフラボノイド生産が有効であることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００３９】
本発明のアヤメ科植物のＩＦＳおよびアヤメ科植物のＩＦＳをコードする遺伝子を使用することにより、酵母、植物細胞や植物体等を用いてイソフラボノイドを高濃度に生産することができる。本発明によって、高濃度に生産されたイソフラボノイドは、健康食品や化粧品等、様々な用途に利用され得る。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マメ科以外の植物の２−ヒドロキシイソフラバノン合成酵素（イソフラボン骨格合成酵素、以下、ＩＦＳと示す）に関する。さらに詳しくは、ジャーマンアイリス（Ｉｒｉｓ ｇｅｒｍａｎｉｃａ、以下Ｉｇと示す）、キショウブ（Ｉｒｉｓ ｐｓｅｕｄａｃｏｒｕｓ、以下Ｉｐと示す）またはイチハツ（Ｉｒｉｓ ｔｅｃｔｏｒｕｍ、以下Ｉｔと示す）等のアヤメ科植物から単離したＩＦＳに関する。
【背景技術】
【０００２】
２−ヒドロキシイソフラバノン（２−Ｈｙｄｒｏｘｙｉｓｏｆｌａｖａｎｏｎｅ）、イソフラボン（ゲニステイン（Ｇｅｎｉｓｔｅｉｎ））等のイソフラボノイドは、マメ科、アヤメ科等の植物に含まれ、近年、健康補助食品として注目されている。そこで、マメ科のダイズやカンゾウのＩＦＳをコードする遺伝子をシロイヌナズナやタバコ等に導入して、これらのイソフラボノイドを生産することが試みられたが、生産量１ｇあたり、数ｎｍｏｌのイソフラボンが蓄積されただけであった。さらに、ＩＦＳと基質を競合する酵素について、その遺伝子をノックアウトしたシロイヌナズナを用い、イソフラボノイドの生産を向上する試みがなされたが、生産量１ｇあたり、最大でも２００ｎｍｏｌに及ばないイソフラボンが蓄積されただけであり、高濃度のイソフラボノイドを得ることはできなかった（例えば、非特許文献１，２参照）。
【０００３】
イソフラボノイドは、植物体内において、（２Ｓ）−フラバノン（ナリンゲニン（Ｎａｒｉｎｇｅｎｉｎ））にＩＦＳが作用することで２−ヒドロキシイソフラバノンとして合成され、さらに、この２−ヒドロキシイソフラバノンに２−ヒドロキシイソフラバノン脱水酵素（以下、ＨＩＤとする）が作用することでイソフラボンとして合成されることが知られている。
本発明者らは、イソフラボンの合成に働くＨＩＤに着目し、ダイズおよびカンゾウのＨＩＤをコードするポリヌクレオチドを特定し、これらを宿主細胞内で発現させることや、植物細胞に導入することでイソフラボン類の生産量が変化した植物を得ることを開示している（例えば、特許文献１、２参照）。また、上記のように、ダイズやカンゾウのＩＦＳのみでは、イソフラボノイドを効率的に生産できないことから、ＩＦＳとＨＩＤとを組み合わせ、高濃度のイソフラボノイドを生産することも検討している。
【０００４】
イソフラボノイドは、ダイズやカンゾウ等のマメ科の植物に含まれることが特に注目されているが、蘚苔類のハリガネゴケ科、裸子植物のヒノキ科、マキ科、単子葉植物のアヤメ科の植物にも含まれており、イソフラボノイドの生産方法のひとつとして、アヤメ根茎の乾燥粉末をアルコールで抽出する方法（例えば、特許文献３参照）等も開示されている。
しかし、マメ科以外の植物について、ＩＦＳやＨＩＤを単離することや、ＩＦＳやＨＩＤをコードする遺伝子を同定し、これらによってイソフラボノイドの生産を行うことは検討されていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特許第４４７４５１８号
【特許文献２】国際公開第００／４６３５６号パンフレット
【特許文献３】特開２００４−６７５９０号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｙｕ，Ｏ．，Ｊｕｎｇ，Ｗ．，Ｓｈｉ，Ｊ．，Ｃｒｏｅｓ，Ｒ．Ａ．，Ｆａｄｅｒ，Ｇ．Ｍ．，ＭｃＧｏｎｉｇｌｅ，Ｂ．ａｎｄ Ｏｄｅｌｌ，Ｊ．Ｔ．（２０００） "Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｉｓｏｆｌａｖｏｎｅｓ ｇｅｎｉｓｔｅｉｎ ａｎｄ ｄａｉｄｚｅｉｎ ｉｎ ｎｏｎ−ｌｅｇｕｍｅ ｄｉｃｏｔ ａｎｄ ｍｏｎｏｃｏｔ ｔｉｓｓｕｅｓ." Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１２４：７８１−７９３．
【非特許文献２】Ｌｉｕ，Ｃ．Ｊ．，Ｂｌｏｕｎｔ，Ｊ．Ｗ．，Ｓｔｅｅｌｅ，Ｃ．Ｌ．ａｎｄ Ｄｉｘｏｎ，Ｒ．Ａ．（２００２） "Ｂｏｔｔｌｅｎｅｃｋｓ ｆｏｒ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ｉｓｏｆｌａｖｏｎｅ ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｉｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ．" Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９９：１４５７８−１４５８３．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、マメ科以外の植物のＩＦＳを単離し、ＩＦＳをコードする遺伝子を同定することを課題とする。さらに、該ＩＦＳやＩＦＳをコードする遺伝子を用い、イソフラボノイドを生産することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討を行ったところ、Ｉｇ、ＩｐまたはＩｔ等の複数のアヤメ科植物からＩＦＳを単離し、これらのＩＦＳをコードする遺伝子を同定することで、本発明を完成するに至った。本発明で同定された遺伝子は、マメ科のダイズやカンゾウ由来のＩＦＳをコードする遺伝子と３０％程度の同一性しか示さない、新規の特徴を有するものであった。
アヤメ科植物の中でも、Ｉｇ由来のＩＦＳ（以下、ＩｇＩＦＳと示す）は、酵母やシロイヌナズナを用いてその遺伝子を発現させたところ、マメ科植物由来のＩＦＳを用いた場合と比較してイソフラボノイドの生産量が約１００倍であることが確認された。このように、本発明において単離されたＩＦＳは、高い酵素活性を有するものであり、イソフラボノイドの生産に有用なものであった。
【０００９】
すなわち、本発明は、次の（１）〜（２２）で示されるＩＦＳ、該ＩＦＳやＩＦＳをコードする遺伝子を用いるイソフラボノイドを生産させる方法等に関する。
（１）配列表配列番号１１で示されるアミノ酸配列に、７８．５％以上の同一性を示すアヤメ科植物のＩＦＳ。
（２）配列表配列番号１、９または１２のいずれかで示されるアミノ酸配列を実質的に有する上記（１）に記載のＩＦＳ。
（３）上記（１）または（２）に記載のＩＦＳをコードするヌクレオチド配列または該ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を実質的に有するポリヌクレオチド。
（４）配列表配列番号２、１０または１３のいずれかで示されるヌクレオチド配列からなる上記（３）に記載のポリヌクレオチド。
（５）配列表配列番号２、１０または１３のいずれかで示されるヌクレオチド配列に対して８０％以上の同一性を有し、且つＩＦＳをコードするポリヌクレオチド。
（６）アヤメ科植物からクローニングされた上記（４）または（５）に記載のポリヌクレオチド。
（７）アヤメ科植物がＩｇ、ＩｐまたはＩｔである上記（６）に記載のポリヌクレオチド。
（８）上記（３）〜（７）のいずれかに記載されたポリヌクレオチドが挿入されたベクター。
（９）宿主細胞中で、上記（３）〜（７）のいずれかに記載されたポリヌクレオチドを発現しうる発現系を含む組換え体ＤＮＡまたはＲＮＡ。
（１０）上記（８）に記載のベクターにより形質転換された宿主細胞。
（１１）宿主細胞が酵母である上記（１０）に記載の形質転換された宿主細胞。
（１２）上記（３）〜（７）のいずれかに記載されたポリヌクレオチドが挿入されたトランスジェニック植物。
（１３）植物がシロイヌナズナである上記（１２）に記載のトランスジェニック植物。
（１４）アヤメ科植物由来のＩＦＳをコードする遺伝子を導入した形質転換体またはトランスジェニック植物にイソフラボノイドを生産させる方法。
（１５）さらに、ＨＩＤをコードする遺伝子を組み合わせて導入した形質転換体またはトランスジェニック植物にイソフラボノイドを生産させる上記（１４）に記載の方法。
（１６）形質転換体が酵母を宿主細胞とする形質転換体であり、トランスジェニック植物がシロイヌナズナを宿主植物とするトランスジェニック植物である上記（１４）または（１５）に記載の方法。
（１７）アヤメ科植物がＩｇ、ＩｐまたはＩｔである上記（１４）〜（１６）のいずれかに記載の方法。
（１８）アヤメ科植物由来のＩＦＳが配列表配列番号１１で示されるアミノ酸配列に、７８．５％以上の同一性を示すＩＦＳである上記（１４）〜（１７）のいずれかに記載の方法。
（１９）アヤメ科植物由来のＩＦＳが配列表配列番号１、９または１２のいずれかで示されるアミノ酸配列を実質的に有するＩＦＳである上記（１４）〜（１８）のいずれかに記載の方法。
（２０）アヤメ科植物由来のＩＦＳをコードする遺伝子が、配列表配列番号１、９または１２のいずれかで示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列または該ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を実質的に有するポリヌクレオチドである上記（１４）〜（１９）のいずれかに記載の方法。
（２１）アヤメ科植物由来のＩＦＳをコードする遺伝子が、配列表配列番号２、１０または１３のいずれかで示されるヌクレオチド配列または該ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を実質的に有するポリヌクレオチドである上記（１４）〜（１８）のいずれかに記載の方法。
（２２）上記（１４）〜（２１）のいずれかに記載の方法により生産されたイソフラボノイド。
【発明の効果】
【００１０】
本発明のアヤメ科植物由来のＩＦＳおよびＩＦＳをコードする遺伝子を使用することにより、酵母、植物細胞や植物体等を用いてイソフラボノイドを高濃度に生産する技術の確立が可能となる。イソフラボノイドのうち、イソフラボンは特に女性ホルモンであるエストロゲン様の作用を有する。従って、本発明によって、高濃度に生産されたイソフラボノイドは、健康食品や化粧品等、様々な用途に利用され得る。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】Ｉｇ抽出液のイソフラボノイド合成活性を示した図である（実施例１）。
【図２】形質転換体のスクリーニング方法の概要等を示した図である（実施例１）。
【図３】ＩｇＩＦＳによる生成物を示した図である（実施例１）。
【図４】ＩｇＩＦＳを発現している形質転換体（酵母ミクロソーム）の生成物を確認した図である（実施例１）。
【図５】ＩｇＩＦＳを発現している形質転換体（酵母ミクロソーム）におけるイソフラボノイドの生産量を示した図である（実施例１）。
【図６】ＩｇＩＦＳとＰ４５０のアミノ酸配列のアライメントを示した図である（実施例１）。
【図７】ＩｇＩＦＳを含む系統樹を示した図である（実施例１）。
【図８】培養細胞でのイソフラボノイド合成酵素活性（ＩＦＳ活性）の経時変化とＲＴ−ＰＣＲを示した図である（実施例１）。
【図９】ＩｇＩＦＳとＩｐ由来のＩＦＳ（以下、ＩｐＩＦＳと示す）のアライメントを示した図である（実施例２）。
【図１０】アヤメ科植物とマメ科植物のＩＦＳの系統樹を示した図である（実施例２）。
【図１１】ＩｇＩＦＳとＩｔ由来のＩＦＳ（以下、ＩｔＩＦＳと示す）のアライメントを示した図である（実施例３）。
【図１２】各発現ベクターを示した図である（実施例４）。
【図１３】ＩｇＩＦＳを発現しているトランスジェニック植物（シロイヌナズナ）の生成物を確認した図である（実施例４）。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の「ＩＦＳ」には、配列表配列番号１１で示されるアミノ酸配列に、７８．５％、より好ましくは８０％、さらに好ましくは８５％以上の同一性を示すアヤメ科植物のＩＦＳであればいずれのＩＦＳも含まれる。由来となるアヤメ科植物としては、アヤメ科の植物であればいずれであっても良く、例えば、Ｉｇ、ＩｐまたはＩｔ等が挙げられる。
このような本発明の「ＩＦＳ」として、例えば配列表配列番号１で示されるアミノ酸配列を実質的に有するＩｇＩＦＳ、配列表配列番号９で示されるアミノ酸配列を実質的に有するＩｐＩＦＳ、または配列表配列番号１２で示されるアミノ酸配列を実質的に有するＩｔＩＦＳ等が挙げられる。ここで、「アミノ酸配列を実質的に有する」とは、ＩＦＳ活性を有する限り、当該アミノ酸配列に欠失、置換、付加、挿入等の変異があるものも含むことを意味する。欠失、置換、付加、挿入されるアミノ酸の数は、例えば、１〜１００個、好ましくは１〜５０個、より好ましくは１〜１０個、特に１〜５個であり得る。特に、アミノ酸残基を同様の特性のアミノ酸残基で置換したものであり、典型的なかかる置換は、Ａｌａ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅ間、ＳｅｒおよびＴｈｒ間、ＡｓｐおよびＧｌｕ間、ＡｓｎおよびＧｌｎ間、ＬｙｓおよびＡｒｇ間、ＰｈｅおよびＴｙｒ間の置換である。
【００１３】
また、これらのＩＦＳをコードするポリヌクレオチドとして、例えば、配列表配列番号１１で示されるアミノ酸配列に７８．５％、より好ましくは８０％、さらに好ましくは８５％以上の同一性を示すアヤメ科植物のＩＦＳをコードするヌクレオチド配列または該ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を実質的に有するポリヌクレオチド等が挙げられる。
ここで、「ヌクレオチド配列を実質的に有する」とは、ＩＦＳをコードする配列からなるポリヌクレオチドのほか、該配列と縮重による配列の相違、５'末端あるいは３'末端又はその両末端に適当な配列が付加されたポリヌクレオチド等も含む意味である。
このような「ポリヌクレオチド」として、例えば、配列表配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列または該ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を実質的に有するポリヌクレオチド、配列表配列番号９で示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列または該ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を実質的に有するポリヌクレオチド、または配列表配列番号１２で示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列または該ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を実質的に有するポリヌクレオチド等が挙げられる。また、配列表配列番号１、９または１３のいずれかで示されるヌクレオチド配列に対して８０％、より好ましくは８５％、さらに好ましくは９０％以上の同一性を有し、且つＩＦＳをコードするポリヌクレオチド等が挙げられる。
【００１４】
本発明の「ベクター」とは、大腸菌、酵母等の宿主細胞や、植物に導入することで、発現させたい遺伝子を発現させるためのものを指す。本発明において発現させたい遺伝子としては、上記の配列表配列番号１１で示されるアミノ酸配列に７８．５％、より好ましくは８０％、さらに好ましくは８５％以上の同一性を示すアヤメ科植物のＩＦＳをコードするヌクレオチド配列または該ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を実質的に有するポリヌクレオチド等が挙げられる。本発明においてこれらの遺伝子を発現させるベクターとして、従来知られているいずれのベクターも用いることができるが、例えば、酵母発現ベクターであるｐＹＥＳ−ＤＥＳＴ５２（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）やｐＥＳＣ−Ｌｅｕ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）等を用いることができる。
【００１５】
このような発現させたい遺伝子を組み込んだベクターは、酵母や大腸菌等を宿主として導入することができる。これらの宿主は該ベクターによって形質転換できるものであれば何を宿主としても良く、例えば、酵母や大腸菌等を宿主とすることができる。トランスジェニック植物も同様であり、宿主とする植物として例えば、シロイヌナズナ等を挙げることができる。
【００１６】
本発明の「イソフラボノイドを生産させる方法」は、イソフラボノイドの生産にあたり、アヤメ科植物由来のＩＦＳをコードする遺伝子を導入した形質転換体やトランスジェニック植物を用い、これらにイソフラボノイドを生産させる方法であれば良い。さらに、アヤメ科植物由来のＩＦＳをコードする遺伝子の導入に合わせ、ＨＩＤをコードする遺伝子を組み合わせて導入した形質転換体またはトランスジェニック植物を用いて、これらにイソフラボノイドを生産させる方法であっても良い。本発明における「組換え体ＤＮＡまたはＲＮＡ」とは、これらの形質転換体やトランスジェニック植物におけるＤＮＡまたはＲＮＡのことを指す。これらの「組換え体ＤＮＡまたはＲＮＡ」は、酵母や植物において、ＩＦＳやＨＩＤ等の遺伝子を発現させインビトロでフラバノン（基質）をイソフラボノイドへ変換したり、インビボでイソフラボノイドを生産したりするのに用いることができる。
ここで生産される「イソフラボノイド」としては、２−ヒドロキシイソフラバノン、イソフラボン等が挙げられる。
【００１７】
本発明において導入する遺伝子は、「アヤメ科植物由来のＩＦＳ」をコードする遺伝子であれば上記のような遺伝子を導入することができ、組み合わせて導入する「２−ヒドロキシイソフラバノン脱水酵素をコードする遺伝子」のＨＩＤの由来は特に問わない。例えばマメ科のダイズやカンゾウ由来であっても良く、アヤメ科のＩｇ、ＩｐまたはＩｔ由来であっても良い。
【００１８】
以下に、実施例によって本発明を詳細に説明するが、本発明はそれに限定されるものではない。
【実施例１】
【００１９】
試料
１）植物材料
スクロース（３０ｇ／ｌ），プロリン（２５０ｍｇ／ｌ），トリプトンペプトン（２００ｍｇ／ｌ），α−ナフタレン酢酸（１ｍｇ／ｌ），ベンジルアデニン（０．５ｍｇ／ｌ）を含むＭＳ培地で暗所，２５℃で培養したＩｇの不定根カルチャーを用いた（参考文献１）。寒天（９ｇ／ｌ）を含む上記培地で３週間不定根を培養後、寒天を含まない液体培地に不定根を移した。通常のアッセイでは、液体培地で培養後５日目の細胞を回収して，酵素アッセイに用いた。また液体培地に植え次ぎ後経時的（１日，３日，５日，１０日，２０日，３０日）に不定根を回収し−８０℃で保存し、イソフラボノイド合成酵素活性（ＩＦＳ活性）の経時変化の解析とＲＴ−ＰＣＲに用いた。
１０％スクロースと１４ｍＭ ２−メルカプトエタノールを含む１００ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．５）中で不定根を破砕し，ガーゼで濾過した。濾過されたホモジネートを遠心分離（１０，０００ｇ，１０分間）した後、超遠心分離（１６０，０００ｇ，９０分間）でミクロソームを得た。最終的な沈殿物を上記バッファーで懸濁し、Ｉｇ抽出液とした（１．０ｍｇ／ｍｌミクロソームタンパク質）。
このＩｇ抽出液（１ｍｌ）を１ｍＭ ＮＡＤＰＨ存在下でナリンゲニン（１０μｇ）と３０℃で６０分インキュベートしてイソフラボノイド合成活性（ＩＦＳ活性）を調べ、結果を図１に示した。また超遠心分離後の上清に２−ヒドロキシイソフラバノン（１０μｇ）を加え、３０℃で６０分インキュベートしてイソフラボン合成活性（ＨＩＤ活性）を調べ、結果を図１に示した。
参考文献１：Ａｋａｓｈｉ，Ｔ．，Ｍ．Ｉｓｈｉｚａｋｉ，ｅｔ ａｌ．（２００５）．"Ｉｓｏｆｌａｖｏｎｏｉｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ ａｄｖｅｎｔｉｔｉｏｕｓ−ｒｏｏｔ ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｏｆ Ｉｒｉｓ ｇｅｒｍａｎｉｃａ（Ｉｒｉｄａｃｅａｅ）．" Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２２：２０７−２１５．
【００２０】
２）ｃＤＮＡライブラリーおよびスクリーニング
上記と同様に液体培地で４日間培養したＩｇの不定根カルチャーから、Ｓｔａｒａｉｇｔ Ａ'ｓ ｍＲＮＡ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）を使用してｍＲＮＡを単離した。このｍＲＮＡからＣｌｏｎｅＭｉｎｅｒ（登録商標）ｃＤＮＡ Ｌｉｂｌａｒｙ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）によりｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ（ｐＤＯＮＲ２２２）を用いてｃＤＮＡライブラリー（４×１０7ｐｒｉｍａｒｙ ｃｌｏｎｅｓ）を構築した。その後、Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅｒ'ｓ ｐｒｏｔｏｃｏｌ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に従い、ｃＤＮＡを酵母発現ベクター（ｐＹＥＳ−ＤＥＳＴ５２、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）のＧＡＬ１プロモーターの下にｃＤＮＡを組み換えた。
Ｐ４５０はシトクロムＰ４５０還元酵素（ＣＰＲ）と電子伝達系を構成し，Ｐ４５０が活性を示すためにはＣＰＲが必要となることから、マメ科植物ミヤコグサ（Ｌｏｔｕｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）から得たＣＰＲ ｃＤＮＡ（ＬｊＣＰＲ、配列表配列番号３）を酵母発現ベクター（ｐＥＳＣ−Ｌｅｕ，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）に組み込み，ｐＥＳＣ−ＬｊＣＰＲベクターを作成した。これを酵母ＢＪ２１６８株（ニッポンジーン社，Ｎｉｐｐｏｎ Ｇｅｎｅ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）に導入した後、この酵母にさらにｐＹＥＳ−ＤＥＳＴ５２に組み込んだＩｇのｃＤＮＡライブラリーを導入し、形質転換体を作製した。この形質転換体は、ロイシンとウラシルを含まないｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｃｏｍｐｌｅｔｅ（ＳＣ）培地（Ｙｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｂａｓｅ ｗ／ｏ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ（６．７ｇ／ｌ、Ｄｉｆｃｏ社），グルコース（２０ｇ／ｌ）、ＣＳＭ Ｄｒｏｐ−ｏｕｔ −Ｌｅｕ−Ｕｒａ （６７０ｍｇ／ｌ，Ｆｏｒｍｅｄｉｕｍ社））、寒天プレート上で培養した。
約５００の形質転換体を寒天プレートから取り出し、組換えタンパク質を発現させるために、１ｍＭのσ−ａｍｉｎｏｌｅｖｕｌｉｎｉｃ ａｃｉｄｓ（Ｓｉｇｍａ社）を加えた１０ｍｌのＹＰＧ培地（ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ（１０ｇ／ｌ），ｐｅｐｔｏｎｅ（２０ｇ／ｌ）、ｇａｌａｃｔｏｓｅ（２０ｇ／ｌ））が入ったコニカルチューブ（５０ｍｌ）内に接種した。その一部を１つのプールとして、合計１０個の独立したプールを得た。
スクリーニングの第二段階のために、それぞれのプールから取り出した少量のカルチャーを上記と同様の寒天プレートの上においた。ナリンゲニン（０．５ｍｇ）を残ったプールにいれ、形質転換体を３０℃で２４時間培養した。
カルチャーを酢酸エチルで抽出し溶媒を溜去した。抽出物をエタノールに溶解し、ＨＰＬＣによって解析した後、スクリーニングの次の段階のために１０プールのうちポジティブなプールを小分けした（約５０ｃｌｏｎｅｓ／ｐｏｏｌ）。
ポジティブなプールのアッセイを繰り返し、イソフラボノイドを生産するクローンを単離した。イソフラボノイド（２−ヒドロキシイソフラバノン及びイソフラボン）の生産は次の条件でＨＰＬＣを行い確認した。
最終的に、イソフラボノイドを生産する単一酵母コロニーをＩｇＩＦＳ／ＬｊＣＰＲを発現している形質転換体として同定した。この形質転換体からプラスミドを抽出して，ＩｇＩＦＳのアミノ酸配列（配列表配列番号１）を特定するとともに、ＩｇＩＦＳをコードする遺伝子（ｃＤＮＡ）（配列表配列番号２）を同定した。
このスクリーニング方法の概要およびＩｇＩＦＳ／ＬｊＣＰＲを発現している形質転換体におけるイソフラボノイドの生産を図２に示した。
ＨＰＬＣ条件：
ＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ Ｃ１８ ＭＧ ｃｏｌｕｍｎ（４．６ｘ１５０ｍｍ；Ｓｈｉｓｅｉｄｏ社）、４０℃、流量：０．８ｍｌ／ｍｉｎ、３０％〜８０％（ｖ／ｖ）のメタノール溶媒使用、２５分間直線濃度勾配（ｌｉｎｅａｒ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｅｌｕｔｉｏｎ）
【００２１】
３）酵素活性の測定（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）
上記によって得られた本発明の形質転換体と、コントロールとして、ｐＥＳＣ−Ｌｅｕ（ストラタジーン社）およびｐＹＥＳ２（インビトロゲン社）を酵母ＢＪ２１６８株に導入して得た形質転換体を用いた。また、比較として、マメ科カンゾウのＩＦＳ（ＣＹＰ９３Ｃ２、配列表配列番号４）を組み込んだ発現ベクター（ｐＹＥＳ−ＣＹＰ９３Ｃ２）を上記と同様に作成し（参考文献２）、ＣＹＰ９３Ｃ２／ＬｊＣＰＲを発現している形質転換体を得て、これを比較として用いた。
参考文献２：Ａｋａｓｈｉ，Ｔ．，Ｔ．Ａｏｋｉ，ｅｔ ａｌ．（１９９９）． "Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａ ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｐ４５０ ｃＤＮＡ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ２−ｈｙｄｒｏｘｙｉｓｏｆｌａｖａｎｏｎｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｉｓｏｆｌａｖｏｎｏｉｄ ｓｋｅｌｅｔｏｎ ｉｎ ｌｉｃｏｒｉｃｅ．" Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ １２１（３）：８２１−８２８．
【００２２】
ＩｇＩＦＳまたはマメ科カンゾウのＩＦＳ（ＣＹＰ９３Ｃ２）の発現は、参考文献３に従って行った。
即ち、酵母を１０％スクロースと１４ｍＭ ２−メルカプトエタノールを含む１００ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．５）に懸濁し，ガラスビーズを用いて細胞を破砕した．酵母ホモジネートを遠心分離（１０，０００ｇ，１０分間）した後、超遠心分離（１６０，０００ｇ，９０分間）でミクロソームを得た。最終的な沈殿物を上記バッファーで懸濁した（１．０ｍｇ／ｍｌミクロソームタンパク質）。
上記形質転換体のミクロソーム（０．３ｍｇミクロソームタンパク質）を０．１ｍＭ（ＲＳ）−ナリンゲニン（Ｓｉｇｍａ社）と１ｍＭ ＮＡＤＰＨ（和光純薬工業）とともに（全容量１ｍｌ）、３０℃で１５分間インキュベートした。反応ミクスチャーのエタノール抽出物を上記と同じ条件でＨＰＬＣを行い解析した。ＨＰＬＣによる溶出物（ｅｌｕｔｅ）は、ｍｕｌｔｉｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ ｄｅｔｅｃｔｏｒ（ＭＤ−２０１０，ＪＡＳＣＯ社）によってモニターした。
その結果、図３，図４Ａ．に示すようにＩｇＩＦＳを発現している形質転換体（酵母ミクロソーム）ではナリンゲニンからイソフラボノイド（２−ヒドロキシイソフラバノン（図３、４Ａ．：２ＨＩ）とイソフラボン（図３、４Ａ．：Ｇｅｎｉｓｔｅｉｎ））と共に少量の３−ヒドロキシナリンゲニン（３−ＯＨ Ｎａｒｉｎｇｅｎｉｎ、図３、４Ａ．：３ＨＦ）とフラボン（アピゲニン（図３，４Ａ．：Ａｐｉｇｅｎｉｎ））を生成することが示された。従って，このタンパク質がイソフラボノイドの生成に関わっていることが確認された。
また、比較として用いたマメ科カンゾウのＩＦＳ（ＣＹＰ９３Ｃ２）を発現している形質転換体（酵母ミクロソーム）では図３に示したように、２−ヒドロキシイソフラバノン（図３：２ＨＩ）を８８％、イソフラボン（図３：Ｇｅｎｉｓｔｅｉｎ））を５％、と共に少量の３−ヒドロキシナリンゲニン（図３：３ＨＦ）を７％生成することが示された。
【００２３】
反応の立体選択性（ｓｔｅｒｅｏｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ）を決定するために、３０℃で６０分間インキュベートし、残った基質を、ＴＬＣ（Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ Ｆ２５４，Ｍｅｒｃｋ， Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ；ｃｈｒｏｌｏｆｏｒｍ：ｍｅｔｈａｎｏｌ［９８：２，ｖ／ｖ］）から回収し、ｃｈｉｒａｌ ｃｏｌｕｍｎ（参考文献４、Ｃｈｉｒａｌｃｅｌ ＯＤ−ＲＨ ｃｏｌｕｍｎ（４．６ｘ１５０ｍｍ；Ｄａｉｃｅｌ社）、４０℃、流量：０．４ｍｌ／ｍｉｎ、３０％アセトニトリル溶媒使用）において、上記と同じ条件でＨＰＬＣを行い解析した。
その結果、図４Ｂ．に示すように，Ｓ−ナリンゲニンのみ減少し，この酵素はＳ−体のみを基質にすることが確認された．
【００２４】
また、上記の反応ミクスチャーに（ＲＳ）−ｎａｒｉｎｇｅｎｉｎの代わりに表１に示した基質（０．１ｍＭ）をそれぞれ加え、基質特異性を調べた。その結果、表１に示すようにＩｇＩＦＳは、カンゾウＩＦＳ（ＣＹＰ９３Ｃ２）と比べてナリンゲニン対する活性が最も高く，リクイリチゲニンに対する活性は低かった。
【００２５】
さらに、様々な濃度の（Ｓ）−ｎａｒｉｎｇｅｎｉｎ（０．２，０，５，１．０，１．５，５．０，１０，２０および５０μＭ）とＮＡＤＰＨ（（５００μＭ）を組換え酵母ミクロソームとともに全量４ｍｌ、３０℃で１５分間インキュベートし、Ｋｍ値およびＶmax値をＬｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋ ｐｌｏｔにより調べ、結果を表２に示した。参考（比較）として、Ｆ３Ｈ（ｎａｒｉｎｇｅｎｉｎ），ＩＦＳ（ｌｉｃｏｒｉｃｅ）（ｌｉｑｕｉｒｉｔｉｇｅｎｉｎ）またはＩＦＳ（ｓｏｙｂｅａｎ）（ｎａｒｉｎｇｅｎｉｎ）のＫｍ，Ｋｃａｔ値を参考文献５〜７より引用して示した。
参考文献３：Ａｙａｂｅ，Ｓ．，Ｔ．Ａｋａｓｈｉ，ｅｔ ａｌ．（２００２）． "Ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ｃＤＮＡｓ ｅｎｃｏｄｉｎｇ Ｐ４５０ｓ ｉｎ ｔｈｅ ｆｌａｖｏｎｏｉｄ／ｉｓｏｆｌａｖｏｎｏｉｄ ｐａｔｈｗａｙ ｆｒｏｍ ｅｌｉｃｉｔｅｄ ｌｅｇｕｍｉｎｏｕｓ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅｓ．" Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ３５７： ３６０−３６９．
参考文献４：Ｓｈｉｍａｄａ，Ｎ．，Ｔ．Ａｏｋｉ，ｅｔ ａｌ．（２００３）． "Ａ ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ ｇｅｎｅｓ ｅｎｃｏｄｅｓ ｔｈｅ ｔｗｏ ｔｙｐｅｓ ｏｆ ｃｈａｌｃｏｎｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｇｅｎｅｒａｌ ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ ａｎｄ ｌｅｇｕｍｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ５−ｄｅｏｘｙ（ｉｓｏ）ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ ｉｎ Ｌｏｔｕｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ．" Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． １３１： ９４１−９５１
参考文献５：Ｈａｌｂｗｉｒｔｈ，Ｈ．，Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｔ．Ｃ．，Ｓｃｈｌａｎｇｅｎ，Ｋ．，Ｒａｄｅｍａｃｈｅｒ，Ｗ．，Ｓｃｈｌｅｉｆｅｒ，Ｋ−Ｊ．Ｆｏｒｋｍａｎｎ，Ｇ． ａｎｄ Ｓｔｉｃｈ，Ｋ（２００６） "Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｆｏｒ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ ２−ｏｘｏｇｌｕｔａｒａｔｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅｓ： Ｆｌａｖａｎｏｎｅ ３β−ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ ａｎｄ ｆｌａｖｏｎｏｌ ｓｙｎｔｈａｓｅ" Ｐｌａｎｔ ｓｃｉｅｎｃｅ １７１： １９４−２０５．
参考文献６：Ａｋａｓｈｉ，Ｔ．，Ａｏｋｉ，Ｔ． ａｎｄ Ａｙａｂｅ，Ｓ．（１９９９）． "Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａ ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｐ４５０ ｃＤＮＡ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ２−ｈｙｄｒｏｘｙｉｓｏｆｌａｖａｎｏｎｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｉｓｏｆｌａｖｏｎｏｉｄ ｓｋｅｌｅｔｏｎ ｉｎ ｌｉｃｏｒｉｃｅ．" Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ １２１：８２１−８２８．
参考文献７：Ｋｏｃｈｓ， Ｇ． ａｎｄ Ｈ． Ｇｒｉｓｅｂａｃｈ （１９８６）． "Ｅｎｚｙｍｉｃ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｉｓｏｆｌａｖｏｎｅｓ．" Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １５５： ３１１−３１８．
【００２６】
【表１】
【００２７】
【表２】
【００２８】
４）生体内変換（ｉｎ ｖｉｖｏ）
ｉｎ ｖｉｖｏで，ＩｇＩＦＳとマメ科カンゾウのＩＦＳ（ＣＹＰ９３Ｃ２）のイソフラボノイド生産能を比較した。
即ち、上記で作成したＩｇＩＦＳ／ＬｊＣＰＲまたはＣＹＰ９３Ｃ２／ＬｊＣＰＲを発現している形質転換体をそれぞれ用い、寒天を含まないＳＣ培地（５ｍｌ）に接種し、２８℃で２４時間おいた。その後、細胞を遠心分離（３，０００ｘｇ，５ｍｉｎ）によって分離し、この細胞を１ｍＭ−ａｍｉｎｏｌｅｖｕｌｉｎｉｃ ａｃｉｄ、４ｍｇ（ＲＳ）−ｎａｒｉｎｇｅｎｉｎ（ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ ｏｆ ０．７５ｍＭ（Ｓ）−ｎａｒｉｎｇｅｎｉｎ）および０．５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ８０が添加された１０ｍｌ ＹＰＧ培地（ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ（１０ｇ／ｌ），ｐｅｐｔｏｎｅ（２０ｇ／ｌ）、ｇａｌａｃｔｏｓｅ（２０ｇ／ｌ））（ＯＤ600＝０．５）で２４時間、４８時間または７２時間培養した。
培地の一部（１ｍｌ）を採取し、酢酸エチルで抽出したものを、上記と同じ条件でＨＰＬＣを行い解析した。この結果を図５および表３に示した。
図５および表３に示したように、７２時間培養した場合に、ＩｇＩＦＳをコードする遺伝子を導入した組換え酵母細胞では、イソフラボノイド（２ＨＩ＋ｇｅｎｉｓｔｅｉｎ）の生産量が５５０μｍｏｌ／ｌであったのに対し、ＣＹＰ９３Ｃ２／ＬｊＣＰＲを発現している組換え酵母細胞ではわずかに５．５μｍｏｌ／ｌであった。従って、この結果より、従来のマメ科由来のＩＦＳを用いた場合と比較して、本発明のＩｇＩＦＳを用いた場合では、イソフラボノイドの生産量が約１００倍に向上することが示された。
【００２９】
【表３】
【００３０】
５）系統解析（Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ）
ＭＥＧＡ４ ｓｏｆｔｗａｒｅ（ ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｅｇａｓｏｆｔｗａｒｅ．ｎｅｔ／よりダウンロード）を用いて系統解析を行った。
ＩｇＩＦＳを含む植物Ｐ４５０のアミノ酸配列をＣｌａｓｔａｌＷ（ ｈｔｔｐ：／／ｃｌｕｓｔａｌｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／ｔｏｐ−ｊ．ｈｔｍｌ）を用いて整列することでアライメントを調べ（図６）、ｎｅｉｇｈｂｏｒ−ｊｏｉｎｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ（近隣結合法）（参考文献８）を用いて系統樹を構築した。
アライメントを調べることにより、ＩｇＩＦＳはＣＹＰ９３ファミリーとは３０％程度の同一性を有し、ＣＹＰ７５Ｂ（Ｆ３'Ｈ）と最も同一性が高い（約４０％）ことが示された。また、ＩｇＩＦＳにおけるＩ−ｈｅｌｉｘ中央の保存された残基はＴｈｒであり、ＣＹＰ９３Ｃ２のＬ３７１とＫ３７５に相当するアミノ酸残基はそれぞれ，Ｌｅｕ，Ｉｌｅであることが示された。
Ｐ４５０の世代の分岐（Ａｇｅ ｏｆ ｄｉｖｅｒｇｅｎｃｅ）はＭＥＧＡ４ ｓｏｆｔｗａｒｅのｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅ'ｓ ｐｒｏｔｏｃｏｌに従って，Ｐ４５０の核酸配列を用いて算出した。構築した系統樹を図７に示した。
参考文献８：Ｓａｉｔｏｕ，Ｎ． ａｎｄ Ｍ．Ｎｅｉ（１９８７）． "Ｔｈｅ ｎｅｉｇｈｂｏｒ−ｊｏｉｎｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ： ａ ｎｅｗ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇ ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒｅｅｓ．" Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｅｖｏｌ ４（４）：４０６−２５．
【００３１】
６）ＲＴ−ＰＣＲ解析
上記のＩｇ由来の不定根カルチャーからｍＲＮＡを抽出し，ｃＤＮＡを合成した。ＥｘＴａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ社）、ＩｇＩＦＳ特異的プライマー（ＩｇＩＦＳ１−Ｆ（配列表配列番号５）、ＩｇＩＦＳ１−Ｒ（配列表配列番号６）（Ｓｉｇｍａ社で受託合成）を用いてＲＴ−ＰＣＲを行った。
ＲＴ−ＰＣＲは、９４°Ｃ １分で変性させた後、９４°Ｃ，１分；５５°Ｃ，１分；７２°Ｃ，１分の３ステップを３０サイクル行った。１．２％（ｗ／ｖ）のアガロースゲルで電気泳動した後、増幅物をエチジウムブロマイドで染色した。ＰＣＲのための鋳型の濃度はアクチンｃＤＮＡと同様に増幅されるよう調整して用いた。
その結果、ジャーマンアイリスでのイソフラボノイド生合成酵素の活性の変化（図８、上図）とＩｇＩＦＳ遺伝子の発現が対応していることが示され（図８、下図）、ＩｇＩＦＳが植物でイソフラボノイドの生産に関わっている事が強く示唆された．
【実施例２】
【００３２】
キショウブ（Ｉｒｉｓ ｐｓｅｕｄａｃｏｒｕｓ）からＩｐＩＦＳを取得した。
即ち、スクロース（３０ｇ／ｌ），プロリン（２５０ｍｇ／ｌ），トリプトンペプトン（２００ｍｇ／ｌ），α−ナフタレン酢酸（１ｍｇ／ｌ），ベンジルアデニン（０．５ｍｇ／ｌ）を含むＭＳ培地でキショウブ（Ｉｒｉｓ ｐｓｅｕｄａｃｏｒｕｓ）のカルスを培養した。
キショウブカルスからＳｔａｒａｉｇｔ Ａ'ｓ ｍＲＮＡ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）を使用してｍＲＮＡを抽出し，ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いてｃＤＮＡを合成した。このｃＤＮＡを鋳型として、ＥｘＴａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ社）、プライマー（ＩＦＳ−Ｆ（配列表配列番号７）、ＩＦＳ−Ｒ（配列表配列番号８）ともにＳｉｇｍａ社で受託合成）を用いてＲＴ−ＰＣＲを行った。
ＲＴ−ＰＣＲは、９４°Ｃ １分で変性させた後、９４°Ｃ，１分；５５°Ｃ，１分；７２°Ｃ，１分の３ステップを３０サイクル行った。１．２％（ｗ／ｖ）のアガロースゲルで電気泳動した後、増幅物をエチジウムブロマイドで染色した。この増幅産物をアガロースゲルから切り出し、ｐＴ７Ｂｌｕｅ Ｔ−ｖｅｃｔｏｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）に導入後、ＤＮＡシーケンサー（ＡＢＩ３１００，アプライドバイオシステム社）で解析した。得られた配列は、配列解析ソフトウェア（Ｇｅｎｅｔｙｘ−Ｍａｃ Ｖｅｒ１５，ゼネティックス社）で解析し、ＩｐＩＦＳのアミノ酸配列を配列表配列番号９に、ＩｐＩＦＳをコードする塩基配列を配列表配列番号１０にそれぞれ示した。
【００３３】
ＩｐＩＦＳのアミノ酸配列のうち、ＩｇＩＦＳの一部（配列表配列番号１１：配列表配列番号１の２４１番目から４４２番目のアミノ酸配列）に対するアライメントを調べ、図９に示した。ＩｐＩＦＳとＩｇＩＦＳとの同一性（アミノ酸配列）は７８．５％であった。
また、実施例１、５）系統解析（Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ）の記載に従い、ＭＥＧＡ４ ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて系統解析を行った。アヤメ科植物のＩＦＳとマメ科植物のＩＦＳのアミノ酸配列を、ＣｌａｓｔａｌＷを用いて整列することでアライメントを調べ、ｎｅｉｇｈｂｏｒ−ｊｏｉｎｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ（近隣結合法）を用いて系統樹を構築した。その結果、図１０に示すようにアヤメ科植物のＩＦＳとマメ科植物のＩＦＳは別のクレードに属し、ＩｇＩＦＳとＩｐＩＦＳは近縁であることが確認された。
【実施例３】
【００３４】
イチハツ（Ｉｒｉｓ ｔｅｃｔｏｒｕｍ）からＩｔＩＦＳを取得した。
イチハツの根からＳｔａｒａｉｇｔ Ａ’ｓ ｍＲＮＡ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）を使用してｍＲＮＡを抽出し，ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いてｃＤＮＡを合成した。このｃＤＮＡを鋳型として、ＥｘＴａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ社）、プライマー（ＩＦＳ−Ｆ（配列表配列番号７）、ＩＦＳ−Ｒ（配列表配列番号８）ともにＳｉｇｍａ社で受託合成）を用いてＲＴ−ＰＣＲを行った。
ＲＴ−ＰＣＲは、９４°Ｃ １分で変性させた後、９４°Ｃ，１分；５５°Ｃ，１分；７２°Ｃ，１分の３ステップを３５サイクル行った。１．０％（ｗ／ｖ）のアガロースゲルで電気泳動した後、増幅物をエチジウムブロマイドで染色した。この増幅産物をアガロースゲルから切り出し、ｐＴ７Ｂｌｕｅ Ｔ−ｖｅｃｔｏｒ （Ｎｏｖａｇｅｎ社）に導入後、ＤＮＡシーケンサー（ＡＢＩ３１００，アプライドバイオシステム社）で解析した。得られた配列は、配列解析ソフトウェア（Ｇｅｎｅｔｙｘ−Ｍａｃ Ｖｅｒ１５， ゼネティックス社）で解析した。ＩｔＩＦＳのアミノ酸配列を配列表配列番号１２に、ＩｔＩＦＳをコードする塩基配列を配列表配列番号１３にそれぞれ示した。
【００３５】
ＩｇＩＦＳ、ＩｐＩＦＳ、ＩｔＩＦＳの全アミノ酸配列のアライメントを配列解析ソフトウェア（Ｇｅｎｅｔｙｘ−Ｍａｃ Ｖｅｒ１５）を用いて調べ、図１１に示した。ＩｔＩＦＳとＩｇＩＦＳとのアミノ酸配列の同一性は９１％であり、ＩｔＩＦＳとＩｐＩＦＳとのアミノ酸配列の同一性は８２％であった。ＩｇＩＦＳ、ＩｐＩＦＳ、ＩｔＩＦＳは互いに高い相同性を示し、アヤメ属では類似タンパク質がイソフラボン生合成に関わっていることが示唆された。
【実施例４】
【００３６】
モデル植物シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）でのイソフラボノイド生産
植物形質転換用ベクターはｐＲＩ９０９（タカラバイオ社）を用いた。ｐＲＩ９０９のカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモータ（ＣＡＭＶ３５Ｓ）の下流にジャーマンアイリスのＩｇＩＦＳ ｃＤＮＡを組み込んだ発現ベクター（ｐＲＩ９０９-ＩｇＩＦＳ）を作成した（図１２）。
また、マメ科ＩＦＳと生産量を比較するためにｐＲＩ９０９のＣＡＭＶ３５Ｓの下流にマメ科カンゾウＣＹＰ９３Ｃ２ ｃＤＮＡを組み込んだ発現ベクター（ｐＲＩ９０９-ＣＹＰ９３Ｃ２）も作成した。ｐＲＩ９０９-ＩｇＩＦＳ、ｐＲＩ９０９-ＣＹＰ９３Ｃ２およびコントロールとしてｐＲＩ９０９をＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ（ＬＢＡ４４０４、タカラバイオ社）にエレクトロポレーション法で導入した。
形質転換株はカナマイシン（５０ｍｇ/Ｌ）を含むＬＢ寒天培地で２８℃２日間培養した。生じたコロニーを、カナマイシン（５０ｍｇ/Ｌ）を含むＬＢ液体培地で、２８℃で一晩前培養をした後、２８℃で一晩本培養を行った。シロイヌナズナの形質転換は花序浸し法によって行った。得られたＴ０種子を表面殺菌し、カナマイシン（５０ｍｇ/Ｌ）、カルベニシリン（５０ｍｇ/Ｌ）を含むＭＳ培地に播種し選抜した。発芽した組換え個体を培養土に移し、Ｔ１種子を回収してホモ個体を選抜した。
得られたホモ個体（ＩｇＩＦＳ導入株（１個体），ＣＹＰ９３Ｃ２導入株（２個体）、ｐＲＩ９０９導入株（１個体））を恒温・恒湿室（コイトトロン，１８〜２５℃，明期１４時間）で栽培した。
【００３７】
栽培によって２０ｃｍ以上に成長した各個体の茎頂から５ｃｍを採取し、重量を計測し、サンプルとした。各サンプルを液体窒素で凍結粉砕し、１０ｍＬの特級メタノールを加え、１晩静置した。濾過した抽出液を濃縮し、特級エタノール、純水に溶解させてガラスバイアル（マルエム社）に移した。移したサンプルを吹き付け濃縮（ＡＩＲ ＰＵＭＰ ＳＰＰ−６ＧＡ、高槻電気工業株式会社）し、１Ｎ塩酸メタノールで９０℃、１時間酸処理して配糖体の酸加水分解を行った。酸処理したサンプルを再度吹き付け濃縮し、ＩｇＩＦＳ導入株とｐＲＩ９０９導入株はサンプルの生重量１ｇにつき２ｍＬ、ＣＹＰ９３Ｃ２導入株は３倍の濃度になるように７５％メタノールで溶解させ、エキクロディスク（Ｍｉｌｌｅｘ（登録商標）−ＬＨ、ミリポア社）でろ過した。これらをＨＰＬＣ（ＴＳＫ−ｇｅｌ ＯＤＳ−Ｔｍ（東ソー社）；流速、１ｍＬ／ｍｉｎ；カラム温度、４０℃；２０分でメタノール濃度４０％から８０％のグラジエント分析）で分析した。
【００３８】
何も導入していないシロイヌナズナ（コントロール株）はフラボノ-ルのｋａｅｍｐｆｅｒｏｌとｑｕｅｒｃｅｔｉｎを含むが、ＩｇＩＦＳ導入株では両物質はほとんど検出されず、ｇｅｎｉｓｔｅｉｎのみが検出された（図１３）。ＣＹＰ９３Ｃ２導入株ではフラボノール量はコントロール株とほとんど変わらなかったが、少量のｇｅｎｉｓｔｅｉｎが新たに検出された。ＩｇＩＦＳ導入株とＣＹＰ９３Ｃ２導入株でのｇｅｎｉｓｔｅｉｎ生産量はそれぞれ３８．２μｇ／ｇ（Ｆ．Ｗ．），２．１μｇ／ｇ（Ｆ．Ｗ．）であり、ＩｇＩＦＳ導入株の方がＣＹＰ９３Ｃ２導入株よりｇｅｎｉｓｔｅｉｎ生産量は約１８倍高かった。従ってこの結果より、アイリスのＩＦＳ遺伝子を用いた組換え植物でのイソフラボノイド生産が有効であることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００３９】
本発明のアヤメ科植物のＩＦＳおよびアヤメ科植物のＩＦＳをコードする遺伝子を使用することにより、酵母、植物細胞や植物体等を用いてイソフラボノイドを高濃度に生産することができる。本発明によって、高濃度に生産されたイソフラボノイドは、健康食品や化粧品等、様々な用途に利用され得る。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表配列番号１１で示されるアミノ酸配列に、７８．５％以上の同一性を示すアヤメ科植物の２−ヒドロキシイソフラバノン合成酵素。
【請求項２】
配列表配列番号１、９または１２のいずれかで示されるアミノ酸配列を実質的に有する請求項１に記載の２−ヒドロキシイソフラバノン合成酵素。
【請求項３】
請求項１または２に記載の２−ヒドロキシイソフラバノン合成酵素をコードするヌクレオチド配列または該ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を実質的に有するポリヌクレオチド。
【請求項４】
配列表配列番号２、１０または１３のいずれかで示されるヌクレオチド配列からなる請求項３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
配列表配列番号２、１０または１３のいずれかで示されるヌクレオチド配列に対して８０％以上の同一性を有し、且つ２−ヒドロキシイソフラバノン合成酵素をコードするポリヌクレオチド。
【請求項６】
アヤメ科植物からクローニングされた請求項４または５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７】
アヤメ科植物がジャーマンアイリス、キショウブまたはイチハツである請求項６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８】
請求項３〜７のいずれかに記載されたポリヌクレオチドが挿入されたベクター。
【請求項９】
宿主細胞中で、請求項３〜７のいずれかに記載されたポリヌクレオチドを発現しうる発現系を含む組換え体ＤＮＡまたはＲＮＡ。
【請求項１０】
請求項８に記載のベクターにより形質転換された宿主細胞。
【請求項１１】
宿主細胞が酵母である請求項１０に記載の形質転換された宿主細胞。
【請求項１２】
請求項３〜７のいずれかに記載されたポリヌクレオチドが挿入されたトランスジェニック植物。
【請求項１３】
植物がシロイヌナズナである請求項１２に記載のトランスジェニック植物。
【請求項１４】
アヤメ科植物由来の２−ヒドロキシイソフラバノン合成酵素をコードする遺伝子を導入した形質転換体またはトランスジェニック植物にイソフラボノイドを生産させる方法。
【請求項１５】
さらに、２−ヒドロキシイソフラバノン脱水酵素をコードする遺伝子を組み合わせて導入した形質転換体またはトランスジェニック植物にイソフラボノイドを生産させる請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
形質転換体が酵母を宿主細胞とする形質転換体であり、トランスジェニック植物がシロイヌナズナを宿主植物とするトランスジェニック植物である請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１７】
アヤメ科植物がジャーマンアイリス、キショウブまたはイチハツである請求項１４〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
アヤメ科植物由来の２−ヒドロキシイソフラバノン合成酵素が配列表配列番号１１で示されるアミノ酸配列に、７８．５％以上の同一性を示す２−ヒドロキシイソフラバノン合成酵素である請求項１４〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
アヤメ科植物由来の２−ヒドロキシイソフラバノン合成酵素が配列表配列番号１、９または１２のいずれかで示されるアミノ酸配列を実質的に有する２−ヒドロキシイソフラバノン合成酵素である請求項１４〜１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
アヤメ科植物由来の２−ヒドロキシイソフラバノン合成酵素をコードする遺伝子が、配列表配列番号１、９または１２のいずれかで示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列または該ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を実質的に有するポリヌクレオチドである請求項１４〜１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
アヤメ科植物由来の２−ヒドロキシイソフラバノン合成酵素をコードする遺伝子が、配列表配列番号２、１０または１３のいずれかで示されるヌクレオチド配列または該ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を実質的に有するポリヌクレオチドである請求項１４〜１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
請求項１４〜２１のいずれかに記載の方法により生産されたイソフラボノイド。
【請求項１】
配列表配列番号１１で示されるアミノ酸配列に、７８．５％以上の同一性を示すアヤメ科植物の２−ヒドロキシイソフラバノン合成酵素。
【請求項２】
配列表配列番号１、９または１２のいずれかで示されるアミノ酸配列を実質的に有する請求項１に記載の２−ヒドロキシイソフラバノン合成酵素。
【請求項３】
請求項１または２に記載の２−ヒドロキシイソフラバノン合成酵素をコードするヌクレオチド配列または該ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を実質的に有するポリヌクレオチド。
【請求項４】
配列表配列番号２、１０または１３のいずれかで示されるヌクレオチド配列からなる請求項３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
配列表配列番号２、１０または１３のいずれかで示されるヌクレオチド配列に対して８０％以上の同一性を有し、且つ２−ヒドロキシイソフラバノン合成酵素をコードするポリヌクレオチド。
【請求項６】
アヤメ科植物からクローニングされた請求項４または５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７】
アヤメ科植物がジャーマンアイリス、キショウブまたはイチハツである請求項６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８】
請求項３〜７のいずれかに記載されたポリヌクレオチドが挿入されたベクター。
【請求項９】
宿主細胞中で、請求項３〜７のいずれかに記載されたポリヌクレオチドを発現しうる発現系を含む組換え体ＤＮＡまたはＲＮＡ。
【請求項１０】
請求項８に記載のベクターにより形質転換された宿主細胞。
【請求項１１】
宿主細胞が酵母である請求項１０に記載の形質転換された宿主細胞。
【請求項１２】
請求項３〜７のいずれかに記載されたポリヌクレオチドが挿入されたトランスジェニック植物。
【請求項１３】
植物がシロイヌナズナである請求項１２に記載のトランスジェニック植物。
【請求項１４】
アヤメ科植物由来の２−ヒドロキシイソフラバノン合成酵素をコードする遺伝子を導入した形質転換体またはトランスジェニック植物にイソフラボノイドを生産させる方法。
【請求項１５】
さらに、２−ヒドロキシイソフラバノン脱水酵素をコードする遺伝子を組み合わせて導入した形質転換体またはトランスジェニック植物にイソフラボノイドを生産させる請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
形質転換体が酵母を宿主細胞とする形質転換体であり、トランスジェニック植物がシロイヌナズナを宿主植物とするトランスジェニック植物である請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１７】
アヤメ科植物がジャーマンアイリス、キショウブまたはイチハツである請求項１４〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
アヤメ科植物由来の２−ヒドロキシイソフラバノン合成酵素が配列表配列番号１１で示されるアミノ酸配列に、７８．５％以上の同一性を示す２−ヒドロキシイソフラバノン合成酵素である請求項１４〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
アヤメ科植物由来の２−ヒドロキシイソフラバノン合成酵素が配列表配列番号１、９または１２のいずれかで示されるアミノ酸配列を実質的に有する２−ヒドロキシイソフラバノン合成酵素である請求項１４〜１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
アヤメ科植物由来の２−ヒドロキシイソフラバノン合成酵素をコードする遺伝子が、配列表配列番号１、９または１２のいずれかで示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列または該ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を実質的に有するポリヌクレオチドである請求項１４〜１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
アヤメ科植物由来の２−ヒドロキシイソフラバノン合成酵素をコードする遺伝子が、配列表配列番号２、１０または１３のいずれかで示されるヌクレオチド配列または該ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を実質的に有するポリヌクレオチドである請求項１４〜１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
請求項１４〜２１のいずれかに記載の方法により生産されたイソフラボノイド。
【図１】
【図３】
【図４】
【図７】
【図９】
【図１０】
【図１３】
【図２】
【図５】
【図６】
【図８】
【図１１】
【図１２】
【図３】
【図４】
【図７】
【図９】
【図１０】
【図１３】
【図２】
【図５】
【図６】
【図８】
【図１１】
【図１２】
【公開番号】特開２０１２−９５６４４（Ｐ２０１２−９５６４４Ａ）
【公開日】平成２４年５月２４日（２０１２．５．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−２１２０２０（Ｐ２０１１−２１２０２０）
【出願日】平成２３年９月２８日（２０１１．９．２８）
【出願人】（８９９００００５７）学校法人日本大学 (650)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年５月２４日（２０１２．５．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年９月２８日（２０１１．９．２８）
【出願人】（８９９００００５７）学校法人日本大学 (650)
【Ｆターム（参考）】
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