イソプレノイドの生産
１つ又はそれ以上の生合成経路によるイソプレノイドの強靭な生産方法を本明細書において提供する。本方法を行うための核酸、酵素、発現ベクター、及び遺伝的に改変された宿主細胞も本明細書において提供する。遺伝的に改変された宿主細胞からのイソプレノイドの高い生産性のための発酵方法も本明細書において提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
先行関連出願
本出願は、２００７年９月２０日出願の米国特許仮出願第６０／９９４，７９０号、及び２００８年４月３０日出願の同第６１／０４９，３５０号の利益を主張するものであり、前記仮出願のすべてはそれら全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
発明の分野
本明細書では、特に、イソプレノイドの強靭な生産（robust production）のための組成物及び方法を提供する。前記方法を行うための核酸、酵素、発現ベクター、及び遺伝子的に改変された宿主細胞も本明細書において提供する。遺伝的に改変された宿主細胞からのイソプレノイドの高い生産性のための発酵方法も本明細書に提供する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
イソプレノイドは、自然界の至る所に存在する。それらは、４０，０００を超える個別産物の多様なファミリーを含み、それらの多くが、生命体にとって必要不可欠である。イソプレノイドは、細胞の流動性、電子輸送、及び他の代謝機能を維持するのに役立つ。数多くの天然及び合成イソプレノイドが、医薬、化粧品、香水、顔料及び着色剤、殺真菌剤、防腐剤、栄養機能食品、及び精製化学薬品中間体として有用である。
【０００４】
不規則なイソプレノイド及びポリテルペンが報告されているが、典型的には、イソプレノイド産物は、五炭素イソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）繰返し単位から構成される。本来、イソプレノイドは、それらの前駆体ＩＰＰとその異性体ジメチルアリルピロリン酸（ＤＭＡＰＰ）の連続的な縮合によって合成される。これらの前駆体については２つの経路が公知である。真核生物は、植物を除いて、一般に、メバロン酸依存性（ＭＥＶ）経路を用いてアセチルコエンザイムＡ（アセチル−ＣｏＡ）をＩＰＰに変換し、その後、それをＤＭＡＰＰに異性体化する。原核生物は、一部を除いて、典型的には、メバロン酸非依存性経路又はデオキシキシルロース−５−リン酸（ＤＸＰ）経路のみを利用してＩＰＰ及びＤＭＡＰＰを生産する。植物は、ＭＥＶ経路とＤＸＰ経路の両方を用いる。Rohmer et al. (1993) Biochem. J. 295: 517-524; Lange et al. (2000) Proc. Natl. Acae. Sci. USA 97 (24): 13172-13177; Rohdich et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA99: 1158-1163 を参照のこと。
【０００５】
従来、イソプレノイドは、天然源、例えば植物、微生物及び動物からの抽出によって製造されてきた。しかし、抽出経由での収率は、多数の重要な制限のため、通常は非常に低い。第一に、大部分のイソプレノイドは、本来、ほんのわずかな量でしか蓄積しない。第二に、供給源生物は、一般に、商業的に採算がとれる量の所望のイソプレノイドを生産するために必要である大規模培養に適用できない。第三に、イソプレノイド抽出のために特定の毒性溶媒を必要とすることは、特別な取り扱い及び廃棄手順を余儀なくさせ、従って、イソプレノイドの商業生産を面倒にする。
【０００６】
ＭＥＶ及びＤＸＰ代謝経路の解明は、イソプレノイドの生合成生産を実現可能にした。例えば、アモルファ−４，１１−ジエンという名のイソプレノイドの生産のためのメバロン酸経路の一部又は全部を過剰発現するように微生物が遺伝子操作された（米国特許第７，１７２，８８６号及び同第７，１９２，７５１号）。他の努力は、グリセルアルデヒド−３−リン酸とピルビン酸のプールのバランスをとることに、又は１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸シンターゼ（ｄｘｓ）及びＩＰＰイソメラーゼ（ｉｄｉ）の発現を増加させることに集中した。Farmer et al. (2001) Biotechnol. Prog. 17:57-61; Kajiwara et al. (1997) Biochem. J. 324:421-426; 及びKim et al. (2001) Biotechnol. Bioeng. 72: 408-415 参照。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許第７，１７２，８８６号
【特許文献２】米国特許第７，１９２，７５１号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Rohmer et al. (1993) Biochem. J. 295: 517-524
【非特許文献２】Lange et al. (2000) Proc. Natl. Acae. Sci. USA 97 (24): 13172-13177
【非特許文献３】Rohdich et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA99: 1158-1163
【非特許文献４】Farmer et al. (2001) Biotechnol. Prog. 17:57-61
【非特許文献５】Kajiwara et al. (1997) Biochem. J. 324:421-426
【非特許文献６】Kim et al. (2001) Biotechnol. Bioeng. 72: 408-415
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
それにもかかわらず、多くの商業用途に必要とされるイソプレノイド産物の非常に多くの量を考え合わせると、現行技術で入手できるものよりさらに多くのイソプレノイドを生産する発現系及び発酵手順が依然として必要とされている。イソプレノイド生産への微生物代謝の最適な再方向づけには、導入される生合成経路を適切に遺伝子操作して、炭素をイソプレノイド生産に効率的に集中させること、及び長期間にわたっての代謝中間体の毒性レベルの蓄積を防止することの、両方が必要である。この必要性に対処する組成物及び方法を本明細書に提供し、関連した利点も提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
発明の要旨
イソプレノイドの強靭な生産のための組成物及び方法を本明細書において提供する。適するイソプレノイドの非限定的な例としては、（１つのイソプレン単位から誘導される）ヘミテルペン、例えばイソプレン；（２つのイソプレン単位から誘導される）モノテルペン、例えばミルセン；（３つのイソプレン単位から誘導される）セスキテルペン、例えばアモルファ−４，１１−ジエン；（４つのイソプレン単位から誘導される）ジテルペン、例えばタキサジエン；（６つのイソプレン単位から誘導される）トリテルペン、例えばスクアレン；（８つのイソプレノイドから誘導される）テトラテルペン、例えばβ−カロチン；及び（８つを超えるイソプレン単位から誘導される）ポリテルペン、例えばポリイソプレンが挙げられる。
【００１１】
１つの態様において、イソプレノイド化合物を生産するための方法を提供し、この方法は、
（ａ）ＭＥＶ又はＤＸＰ経路の酵素をコードする染色体組込み異種核酸配列を含むイソプレノイド化合物を作ることができる複数の宿主細胞を得る工程；
（ｂ）前記宿主細胞が炭素源としてエタノールを用い、イソプレノイド化合物を作る条件下で培地において前記宿主細胞を培養する工程；
（ｃ）前記培地からイソプレノイド化合物を回収する工程
を含む。
【００１２】
一部の実施形態において、前記宿主細胞によって炭素源として消費されるエタノールは、その宿主細胞によって作られる。他の実施形態において、前記宿主細胞によって炭素源として消費されるエタノールは、前記培地に外因的に供給される。
【００１３】
もう１つの態様において、イソプレノイド化合物を作るための方法を提供し、この方法は、
（ａ）イソプレノイド化合物を作ることができる複数の宿主細胞を得る工程；
（ｂ）少なくとも４時間、培地のリットル当たり約１グラムである又はそれより多い量のエタノールを含む培地において、前記宿主細胞を培養する工程；
（ｃ）前記培地からイソプレノイド化合物を回収する工程
を含む。
【００１４】
さらにもう１つの態様において、イソプレノイド化合物を作るための方法を提供し、この方法は、
（ａ）イソプレノイド化合物を作ることができる複数の酵母細胞を得る工程；
（ｂ）炭素源のボーラスを培地に供給することによって、酵母細胞を培養してバイオマスを作る工程；
（ｃ）前記酵母細胞が、少なくとも４時間、１時間につき乾燥細胞重量のグラム当たり約０．０１グラムである又はそれより多いエタノールというエタノール消費速度を有する条件下で細胞を維持する工程；及び
（ｄ）前記培地からイソプレノイド化合物を回収する工程
を含む。
【００１５】
一部の実施形態において、前記宿主細胞は、ＭＥＶ経路を用いてイソプレノイド化合物を作る。他の実施形態において、前記宿主細胞は、ＤＸＰ経路を用いてイソプレノイド化合物を作る。
【００１６】
他の実施形態において、前記宿主細胞は、少なくとも多少の期間、酸素制限条件下で培養又は維持される。さらに他の実施形態において、前記宿主細胞は、少なくとも多少の期間、リン酸塩制限条件（phosphate limited condition）下で培養又は維持される。
【００１７】
参照による援用
本明細書において言及するすべての刊行物及び特許出願は、あたかもそれぞれの個々の刊行物又は特許出願が参照により組み込まれると具体的に及び個々に示されているのと同じ程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】イソペンテニルピロリン酸（「ＩＰＰ」）の生産のためのメバロン酸（「ＭＥＶ」）経路の略図である。
【図２】イソペンテニルピロリン酸（「ＩＰＰ」）及びジメチルアリルピロリン酸（「ＤＭＡＰＰ」）の生産のための１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−二リン酸（「ＤＸＰ」）経路の略図である。Ｄｘｓは、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸シンターゼであり；Ｄｘｒは、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸レダクトイソメラーゼ（ＩｓｐＣとしても公知）であり；ＩｓｐＤは、４−ジホスホシチジル−２Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトールシンターゼであり；ＩｓｐＥは、４−ジホスホシチジル−２Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトールシンターゼであり；ＩｓｐＦは、２Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール２，４−シクロ二リン酸シンターゼであり；ＩｓｐＧは、１−ヒドロキシ−２−メチル−２−（Ｅ）−ブテニル４−二リン酸シンターゼ（ＩｓｐＧ）であり；及びｉｓｐＨは、イソペンテニル／ジメチルアリル二リン酸シンターゼである。
【図３】イソペンテニルピロリン酸（「ＩＰＰ」）及びジメチルアリルピロリン酸（「ＤＭＡＰＰ」）のゲラニルピロリン酸（「ＧＰＰ」）、ファルネシルピロリン酸（「ＦＰＰ」）及びゲラニルゲラニルピロリン酸（「ＧＧＰＰ」）への変換、ならびに様々なイソプレノイドの合成の略図である。
【図４−１】ＤＮＡフラグメントＥＲＧ２０−ＰＧＡＬ−ｔＨＭＧＲ（Ａ）、ＥＲＧ１３−ＰＧＡＬ−ｔＨＭＧＲ（Ｂ）、ＩＤＩ１−ＰＧＡＬ−ｔＨＭＧＲ（Ｃ）、ＥＲＧ１０−ＰＧＡＬ−ＥＲＧ１２（Ｄ）、ＥＲＧ８−ＰＧＡＬ−ＥＲＧ１９（Ｅ）、ＧＡＬ７４から１０２１−ＨＰＨ−ＧＡＬ１１６３７から２５８７（Ｆ）；ＧＬＡ８０−５０から−１−ＮａｔＲ−ＧＡＬ８０１３０９から１３５８（Ｇ）、及びＧＡＬ１１から４８−ＮａｔＲ−ＧＡＬ１１５００から１５５０（Ｈ）のマップを示す。
【図４−２】ＤＮＡフラグメントＥＲＧ２０−ＰＧＡＬ−ｔＨＭＧＲ（Ａ）、ＥＲＧ１３−ＰＧＡＬ−ｔＨＭＧＲ（Ｂ）、ＩＤＩ１−ＰＧＡＬ−ｔＨＭＧＲ（Ｃ）、ＥＲＧ１０−ＰＧＡＬ−ＥＲＧ１２（Ｄ）、ＥＲＧ８−ＰＧＡＬ−ＥＲＧ１９（Ｅ）、ＧＡＬ７４から１０２１−ＨＰＨ−ＧＡＬ１１６３７から２５８７（Ｆ）；ＧＬＡ８０−５０から−１−ＮａｔＲ−ＧＡＬ８０１３０９から１３５８（Ｇ）、及びＧＡＬ１１から４８−ＮａｔＲ−ＧＡＬ１１５００から１５５０（Ｈ）のマップを示す。
【図５】プラスミドｐＡＭ４０４のマップを示す。
【図６】グルコース供給又はグルコース／エタノール混合供給のいずれかを用いる炭素制限下での株Ｙ３３７による細胞増殖及びアモルファ−４，１１−ジエン（ＡＤ）生産を示す。
【図７−１】ＣＯ２制御供給アルゴリズムの流れ図を示す。
【図７−２】エタノールパルス供給を用いる株Ｙ２９３による、二酸化炭素発生率、基質送達、増殖及びアモルファ−４，１１−ジエンの生産の図表を示す。
【図８】初期増殖のために濃縮グルコース供給、その後、生産のためにエタノール供給を用いる炭素制限下での株Ｙ２９３による細胞増殖及びアモルファ−４，１１−ジエン生産を示す。
【図９−１】オレイン酸メチルの存在下又は不在下、エタノールのみの供給での流加、炭素制限発酵での株Ｙ６７７によるエタノール生産／消費、供給速度、増殖、炭素発生率及び酸素利用率ならびにファルネセン生産を示す。
【図９−２】オレイン酸メチルの存在下又は不在下、エタノールのみの供給での流加、炭素制限発酵での株Ｙ６７７によるエタノール生産／消費、供給速度、増殖、炭素発生率及び酸素利用率ならびにファルネセン生産を示す。
【図９−３】オレイン酸メチルの存在下又は不在下、エタノールのみの供給での流加、炭素制限発酵での株Ｙ６７７によるエタノール生産／消費、供給速度、増殖、炭素発生率及び酸素利用率ならびにファルネセン生産を示す。
【図９−４】オレイン酸メチルの存在下又は不在下、エタノールのみの供給での流加、炭素制限発酵での株Ｙ６７７によるエタノール生産／消費、供給速度、増殖、炭素発生率及び酸素利用率ならびにファルネセン生産を示す。
【図９−５】オレイン酸メチルの存在下又は不在下、エタノールのみの供給での流加、炭素制限発酵での株Ｙ６７７によるエタノール生産／消費、供給速度、増殖、炭素発生率及び酸素利用率ならびにファルネセン生産を示す。
【図１０−１】溶存酸素濃度、異なる酸素制限度での株２８３による増殖、エタノール生産／消費及びアモルファ−４，１１−ジエン生産を示す。
【図１０−２】溶存酸素濃度、異なる酸素制限度での株２８３による増殖、エタノール生産／消費及びアモルファ−４，１１−ジエン生産を示す。
【図１０−３】溶存酸素濃度、異なる酸素制限度での株２８３による増殖、エタノール生産／消費及びアモルファ−４，１１−ジエン生産を示す。
【図１０−４】溶存酸素濃度、異なる酸素制限度での株２８３による増殖、エタノール生産／消費及びアモルファ−４，１１−ジエン生産を示す。
【図１０−５】異なる酸素制限度での株Ｙ３５２による増殖、エタノール生産／消費及びファルネセン生産を示す。
【図１０−６】異なる酸素制限度での株Ｙ３５２による増殖、エタノール生産／消費及びファルネセン生産を示す。
【図１０−７】異なる酸素制限度での株Ｙ３５２による増殖、エタノール生産／消費及びファルネセン生産を示す。
【図１１】様々なＫＨ２ＰＯ４濃度での炭素制限下、振盪フラスコ内での株Ｙ３３７による細胞当たりのアモルファ−４，１１−ジエン生産性を示す。
【図１２−１】流加発酵槽供給（Ａ）、ならびにグルコース供給を用いる炭素及びリン酸塩制限下での株Ｙ３３７による細胞増殖（Ｂ）及びアモルファ−４，１１−ジエン生産（Ｃ）を示す。
【図１２−２】流加発酵槽供給（Ａ）、ならびにグルコース供給を用いる炭素及びリン酸塩制限下での株Ｙ３３７による細胞増殖（Ｂ）及びアモルファ−４，１１−ジエン生産（Ｃ）を示す。
【図１２−３】流加発酵槽供給（Ａ）、ならびにグルコース供給を用いる炭素及びリン酸塩制限下での株Ｙ３３７による細胞増殖（Ｂ）及びアモルファ−４，１１−ジエン生産（Ｃ）を示す。
【図１３−１】グルコース／エタノール混合供給を用いる炭素及びリン酸塩制限下での株Ｙ３３７による細胞増殖（Ａ）及びアモルファ−４，１１−ジエン生産（Ｂ）を示す。
【図１３−２】グルコース／エタノール混合供給を用いる炭素及びリン酸塩制限下での株Ｙ３３７による細胞増殖（Ａ）及びアモルファ−４，１１−ジエン生産（Ｂ）を示す。
【図１４】大腸菌（Escherichia coli）のゲノムへの非相同ヌクレオチド配列の組込みに有用なプロモーター−遺伝子−ＦＲＴ−Ｋａｎ−ＦＲＴカセットに隣接する１００ヌクレオチドの長いゲノム座特異的配列の作製を図示する。
【図１５】プラスミドｐＡＭ６１８のマップを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
発明の詳細な説明
定義
別様に定義していない限り、本明細書において用いるすべての技術用語及び科学用語は、当業者によって一般に理解されているのと同じ意味を有する。以下の意味を有すると定義されるものとする多数の用語についてここで触れる：
【００２０】
用語「任意の」又は「必要に応じて」は、後に記載されている特徴又は構造が、存在する場合もあり、しない場合もあること、あるいは後に記載されている事象又は環境が、発生する場合もあり、しない場合もあること、ならびにその記載が、特定の特徴もしくは構造が存在する事例及びその特徴もしくは構造が不在である事例、又はその事象もしくは環境が発生する事例及びその事象もしくは環境が発生しない事例を含むことを意味する。
【００２１】
用語「代謝経路」は、異化経路又は同化経路を指すために本明細書では用いる。同化経路は、より小さな分子からのより大きな分子の構築、エネルギーを必要とするプロセスを伴う。異化経路は、多くの場合エネルギーを放出する、より大きな分子の分解を伴う。
【００２２】
用語「メバロン酸経路(mevalonate pathway)」又は「ＭＥＶ経路」は、アセチル−ＣｏＡをＩＰＰに変換する生合成経路を指すために本明細書では用いる。そのＭＥＶ経路を図１に概略的に図示する。
【００２３】
用語「デオキシキシルロース５−リン酸経路」又は「ＤＸＰ経路」は、グリセルアルデヒド−３−リン酸及びピルビン酸をＩＰＰ及びＤＭＡＰＰに変換させる経路を指すために本明細書では用いる。そのＤＸＰ経路を図２に概略的に図示する。
【００２４】
「ピロリン酸塩（pyrophosphate）」という言葉は、本明細書では「二リン酸塩(diphosphate)」と同義的に用いている。
【００２５】
用語「発現ベクター」又は「ベクター」は、宿主細胞に形質導入し、宿主細胞を形質転換し、又は宿主細胞を感染させ、それによってその細胞にとって生得的であるもの以外の核酸及び／もしくはタンパク質をその細胞に生産させる、又はその細胞にとって自然でない様式で核酸及び／もしくはタンパク質をその細胞に発現させる核酸を指す。
【００２６】
用語「内因性の」は、天然に存在する、例えば非組換え宿主細胞において存在する、物質又はプロセスを指す。
【００２７】
用語「イソペンテニルピロリン酸を作るための酵素的経路」は、メバロン酸経路又はＤＸＰ経路のいずれかを含む（これに限定されない）、イソペンチルピロリン酸を生産することができる任意の経路を指す。
【００２８】
用語「核酸」は、任意の長さの、リボヌクレオチド又はデオキシヌクレオチドのいずれかのヌクレオチドの重合形態を指す。従って、この用語は、１本鎖、２本鎖もしくは多数の鎖のＤＮＡもしくはＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、あるいはプリン及びピリミジン塩基あるいは他の天然の、又は化学的に改変されたもしくは生化学的に改変された非天然のヌクレオチド塩基、又は誘導体化されたヌクレオチド塩基を含むポリマーを含むが、これらに限定されない。
【００２９】
用語「オペロン」は、ＲＮＡ又はタンパク質などの遺伝子産物をそれぞれがコードし、それらの発現が、１つ又はそれ以上の制御要素（例えば、プロモーター）によって調和的に調節される、２つ又はそれ以上の隣接ヌクレオチド配列を指すために使用される。
【００３０】
用語「遺伝子産物」は、ＤＮＡによってコードされるＲＮＡ（もしくはその逆）、又はＲＮＡもしくはＤＮＡによってコードされるタンパク質を指し、この場合、遺伝子は、典型的には、タンパク質をコードする１つ以上のヌクレオチド配列を含むが、遺伝子は、イントロン及び他の非コーディングヌクレオチド配列を含んでいてもよい。
【００３１】
用語「タンパク質」は、コードされた及びコードされていないアミノ酸、化学的もしくは生化学的に改変されたアミノ酸又は誘導体化されたアミノ酸、ならびに改変されたペプチド骨格を有するポリペプチドを含み得る、任意の長さのアミノ酸の重合形態を指す。
【００３２】
用語「異種核酸」は、本明細書において用いる場合、次のうち少なくとも１つにあてはまる核酸を指す：（ａ）その核酸が、所与の宿主細胞にとって異質（「外因性」）である（すなわち、所与の宿主細胞において自然に見つからない）；（ｂ）その核酸が、所与の宿主細胞において自然に見つかる（すなわち、所与の宿主細胞「にとって内因性」である）ヌクレオチド配列を含むが、そのヌクレオチド配列が、その細胞において不自然な（例えば、予想されるものより多い、もしくは自然に見つけられるものより多い）量で生産される；（ｃ）その核酸が、内因性ヌクレオチド配列とは配列の点で異なるヌクレオチド配列を含むが、そのヌクレオチド配列が、（同じもしくは実質的に同じアミノ酸配列を有する）同じタンパク質をコードし、及びその細胞において不自然な（例えば、予想されるものより多い、もしくは自然に見つけられるものより多い）量で生産される；又は（ｄ）その核酸が、本来、互いに同じ関係で見つけられない２つもしくはそれ以上のヌクレオチド配列を含む（例えば、その核酸が組換え体である）。
【００３３】
「トランスジーン」は、宿主細胞に外因的に導入される遺伝子を指す。それは、内因性又は外因性、又は異種の核酸を含む場合がある。
【００３４】
用語「組換え宿主」（「遺伝的に改変された宿主細胞」又は「遺伝的に改変された宿主微生物」とも呼ばれる）は、本明細書に提供する異種核酸を含む宿主細胞を意味する。
【００３５】
用語「外因性核酸」は、宿主細胞に外因的に導入され、従って、本来、所与の細胞において通常はもしくは自然には見つけられない及び／又は所与の細胞によって通常はもしくは自然には生産されない核酸を指す。
【００３６】
用語「調節要素」は、宿主細胞におけるコーディング配列の発現及び／又はコードされたポリペプチドの生産を提供する、及び／又は、これらを調節する、転写及び翻訳の制御配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、ターミネーター、タンパク質分解シグナルなど）を指す。
【００３７】
用語「形質転換」は、新たな核酸の導入による細胞において誘発される永久的又は一過的な遺伝的変化を指す。遺伝的変化（「改変」）は、宿主細胞のゲノムへの新たなＤＮＡの組込み、又はエピソーム要素としての新たなＤＮＡの一過的もしくは安定的維持の、いずれかによって、果たすことができる。真核細胞の場合、永久的な遺伝的変化は、一般に、その細胞のゲノムへのＤＮＡの導入によって達成される。原核細胞の場合、永久的な遺伝的変化を染色体に導入することができ、又は染色体外要素（例えばプラスミド及び発現ベクター）経由で導入することができ、染色体外要素は、組換え宿主細胞におけるそれらの維持を助長するために１つもしくはそれ以上の選択可能マーカーを含有することができる。
【００３８】
用語「作動可能に連結された」は、そのように記載されている成分が、それらが意図された様式で機能することを可能にする関係で存在する並置を指す。例えば、プロモーターがヌクレオチド配列の転写又は発現に影響を及ぼす場合、そのプロモーターは、そのヌクレオチド配列に作動可能に連結されている。
【００３９】
用語「宿主細胞」及び「宿主微生物」は、異種核酸を挿入することができる又は異種核酸が挿入されている任意の古細菌（archae）、細菌又は真核生細胞を指すために、本明細書では同義的に用いている。この用語は、もとの細胞の子孫にも関し、この子孫は、自然、偶発的又は計画的変異のため、形態に関して又はゲノムもしくは全ＤＮＡ補体に関してもとの親と必ずしも完全に同一であるとは限らないことがある。
【００４０】
核酸に関して用いる場合の用語「合成の」は、化学合成されたオリゴヌクレオチド基本構成要素（building block）をアニーリングして遺伝子セグメントを形成し、その後、それらを酵素により組み立てて全遺伝子を構築することを意味する。「化学的手段」を介する核酸の合成とは、ヌクレオチド成分がインビトロで組み立てられることを意味する。
【００４１】
核酸、細胞又は生物に適用される場合の用語「天然の」は、自然界において見つけられる核酸、細胞又は生物を指す。例えば、自然界の供給源から単離することができる非病的（未罹病（un-diseased））生物体内に存在し、研究室において人間により意図的に改変されていないポリペプチド又はポリヌクレオチド配列は、天然である。
【００４２】
核酸、酵素、細胞又は生物に適用される場合の用語「天然に存在する」は、自然界で見つけられる核酸、酵素、細胞又は生物を指す。例えば、自然界の供給源から単離することができる生物体内に存在し、研究室において人間により意図的に改変されていないポリペプチド又はポリヌクレオチド配列は、天然に存在するものである。
【００４３】
タンパク質、ポリペプチド又は酵素に適用される場合の用語「生物活性フラグメント」は、それらのタンパク質又はポリペプチド又は酵素の機能的部分を指す。機能的に等価のものが異なるアミノ酸配列を有することがあり、これは、例えば、核酸配列及びそのようにコードされたタンパク質の中に天然に存在することが公知であるコドン冗長性及び機能的等価性の結果として生じ得る。あるいは、交換されるアミノ酸の特性の考察に基づき、タンパク質構造の変化を操作することができる組換えＤＮＡ技術を適用することによって、機能的に等価のタンパク質又はペプチドを構築することができる。
【００４４】
用語「イソプレノイド」、「イソプレノイド化合物」、「イソプレノイド産物」、「テルペン」、「テルペン化合物」、「テルペノイド」及び「テルペノイド化合物」は、本明細書では同義的に用いている。それらは、ＩＰＰから誘導することができる化合物を指す。
【００４５】
単数形「ａ」、「ａｎｄ」及び「ｔｈｅ」は、その文脈が別様に明確に指示していない限り、複数の指示対象を含む。従って、例えば、「発現ベクター（an expression vector）」への言及は、単数の発現ベクターばかりでなく複数の発現ベクターも含む、及び「宿主細胞（the host cell）」への言及は、１つ又はそれ以上の宿主細胞への言及を含む、等である。本特許請求の範囲が、いずれかの任意の要素を排除するように起草されることがあることにさらに留意しなければならない。従って、この記載は、特許請求の範囲の構成要素の列挙に関しての「単独で」、「ただ・・・のみ」などのような排他的用語の使用、又は「消極的」限定の使用についての先行詞（antecedent basis）としての役割を果たすことが意図される。
【００４６】
別の指示がない限り、本明細書に提供する実施形態は、特定の配列、発現ベクター、酵素、宿主微生物又はプロセスに限定されず、従って、本明細書における教示を考慮して当業者の理解に従って変わることがある。本明細書において用いる専門用語は、特定の実施形態の説明のみを目的とするものであり、限定するためのものではない。
【００４７】
ＩＰＰ経路
本明細書に提供する宿主細胞は、ＩＰＰ及びその異性体、ＤＭＡＰＰを合成するためにＭＥＶ経路、ＤＸＰ経路若しくは両方を含む又は利用する。ＭＥＶ又はＤＸＰ経路の酵素をコードする少なくとも１つの染色体組込み異種核酸配列を含む宿主細胞を本明細書に提供する。他の実施形態において、前記宿主細胞は、ＭＥＶ又はＤＸＰ経路の複数の酵素をコードする少なくとも１つの異種核酸配列を含む。さらに他の実施形態において、前記宿主細胞は、ＭＥＶ経路酵素のすべてをコードする複数の異種核酸配列を含む。さらに他の実施形態において、前記宿主細胞は、ＤＸＰ経路酵素のすべてをコードする複数の異種核酸配列を含む。
【００４８】
一般に、植物以外の真核生物は、排他的にＭＥＶイソプレノイド経路を用いて、アセチル−ＣｏＡをＩＰＰに変換し、その後、それをＤＭＡＰＰへと異性体化する。原核生物は、一部を例外を伴うが、メバロン酸非依存性又はＤＸＰ経路を用いて、分岐点を通ってＩＰＰ及びＤＭＡＰＰを別々に生産する。植物は、ＩＰＰ合成のためにＭＥＶ経路とＤＸＰ経路の両方を用いる。
【００４９】
ＭＥＶ経路
ＭＥＶ経路の略図を図１に記載する。一般に、この経路は、６つの工程を含む。
【００５０】
第一工程では、アセチル−コエンザイムＡの２つの分子を酵素により化合させて、アセトアセチル−ＣｏＡを形成する。この工程を触媒することが公知の酵素は、例えば、アセチル−ＣｏＡチオラーゼ（アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼとしても公知）である。ヌクレオチド配列の説明例としては、以下のＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号及びそれらの配列が由来する生物が挙げられるが、それらに限定されない：（ＮＣ＿０００９１３ ＲＥＧＩＯＮ：２３２４１３１．．２３２５３１５；大腸菌（Escherichia coli））、（Ｄ４９３６２；パラコッカス・デニトリフィカンス（Paracoccus denitrificans））、及び（Ｌ２０４２８；サッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae））。
【００５１】
ＭＥＶ経路の第二工程では、アセトアセチル−ＣｏＡを別のアセチル−ＣｏＡ分子と酵素により縮合させて、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）を形成する。この工程を触媒することが公知の酵素は、例えば、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼである。ヌクレオチド配列の説明例としては、（ＮＣ＿００１１４５．補体１９０６１．．２０５３６；サッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae））、（Ｘ９６６１７；サッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae））、（Ｘ８３８８２；シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana））、（ＡＢ０３７９０７；キタサトスポラ・グリセオラ（Kitasatospora griseola））、（ＢＴ００７３０２；ヒト（Homo sapiens））、及び（ＮＣ＿００２７５８、Ｌｏｃｕｓ ｔａｇ ＳＡＶ２５４６、ＧｅｎｅＩＤ １１２２５７１；黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus））が挙げられるが、それらに限定されない。
【００５２】
第三工程では、ＨＭＧ−ＣｏＡをメバロン酸に酵素により変換する。この工程を触媒することが公知の酵素は、例えば、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼである。ヌクレオチド配列の説明例としては、（ＮＭ＿２０６５４８；キイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster））、（ＮＣ＿００２７５８、Ｌｏｃｕｓ ｔａｇ ＳＡＶ２５４５、ＧｅｎｅＩＤ １１２２５７０；黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus））、（ＮＭ＿２０４４８５；セキショクヤケイ（Gallus gallus））、（ＡＢ０１５６２７；ストレプトマイセス属種（Streptomyces sp.）ＫＯ ３９８８）、（ＡＦ５４２５４３；ニコチアナ・アテヌアタ（Nicotiana attenuata））、（ＡＢ０３７９０７；キタサトスポラ・グリセオラ（Kitasatospora griseola））、（ＡＸ１２８２１３、トランケートされたＨＭＧＲをコードする配列を提供する；サッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae））、及び（ＮＣ＿００１１４５：補体（１１５７３４．．１１８８９８；サッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae））が挙げられるが、それらに限定されない。
【００５３】
第四工程では、メバロン酸を酵素によりリン酸化して、メバロン酸５−リン酸を形成する。この工程を触媒することが公知の酵素は、例えば、メバロン酸キナーゼである。ヌクレオチド配列の説明例としては、（Ｌ７７６８８；シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana））、及び（Ｘ５５８７５；サッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae））が挙げられるが、それらに限定されない。
【００５４】
第五工程では、第二のリン酸基をメバロン酸５−リン酸に酵素により付加させて、メバロン酸５−ピロリン酸を形成する。この工程を触媒することが公知の酵素は、例えば、ホスホメバロン酸キナーゼである。ヌクレオチド配列の説明例としては、（ＡＦ４２９３８５；ヘベア・ブラジリエンシス（Hevea brasiliensis））、（ＮＭ＿００６５５６；ヒト（Homo sapiens））、及び（ＮＣ＿００１１４５．補体７１２３１５．．７１３６７０；サッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae））が挙げられるが、それらに限定されない。
【００５５】
第六工程では、メバロン酸５−ピロリン酸を酵素によりＩＰＰに変換する。この工程を触媒することが公知の酵素は、例えば、メバロン酸ピロリン酸デカルボキシラーゼである。ヌクレオチド配列の説明例としては、（Ｘ９７５５７；サッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae））、（ＡＦ２９００９５；エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）、及び（Ｕ４９２６０；ヒト（Homo sapiens））が挙げられるが、それらに限定されない。
【００５６】
ＩＰＰをＤＭＡＰＰに変換する場合には、第七工程が必要とされる。この工程を触媒することが公知の酵素は、例えば、ＩＰＰイソメラーゼである。ヌクレオチド配列の説明例としては、（ＮＣ＿０００９１３、３０３１０８７．．３０３１６３５；大腸菌（Escherichia coli））、及び（ＡＦ０８２３２６；ヘマトコッカス・プルビアリス（Haematococcus pluvialis））が挙げられるが、それらに限定されない。ＤＭＡＰＰへの変換が必要とされる場合には、ＩＰＰイソメラーゼの発現増加によって、ＩＰＰのＤＭＡＰＰへの変換がその全経路の中での律速段階に相当しないことが保証される。
【００５７】
ＤＸＰ経路
ＤＸＰ経路の略図を図２に記載する。一般に、ＤＸＰ経路は、７つの工程を含む。第一工程において、ピルビン酸をＤ−グリセルアルデヒド３−リン酸と縮合させて、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸を作る。この工程を触媒することが公知の酵素は、例えば、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸シンターゼである。ヌクレオチド配列の説明例としては、（ＡＦ０３５４４０；大腸菌（Escherichia coli））、（ＮＣ＿００２９４７、ｌｏｃｕｓ ｔａｇ ＰＰ０５２７；シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）ＫＴ２４４０）、（ＣＰ００００２６、ｌｏｃｕｓ ｔａｇ ＳＰＡ２３０１；パラチフス菌（Salmonella enterica Paratyphi）、ＡＴＣＣ ９１５０参照）、（ＮＣ＿００７４９３、ｌｏｃｕｓ ｔａｇ ＲＳＰ＿０２５４；ロドバクター・スフェロイデス（Rhodobacter sphaeroides）２．４．１）、（ＮＣ＿００５２９６、ｌｏｃｕｓ ｔａｇ ＲＰＡ０９５２；ロドシュードモナス・パラストリス（Rhodopseudomonas palustris）ＣＧＡ００９）、（ＮＣ＿００４５５６、ｌｏｃｕｓ ｔａｇ ＰＤ １２９３；キシレラ・ファスティディオーサ・テメキュラ１（Xylella fastidiosa Temeculal）、及び（ＮＣ＿００３０７６、ｌｏｃｕｓ ｔａｇ ＡＴ５Ｇ１１３８０；シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana））が挙げられるが、それらに限定されない。
【００５８】
第二工程では、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸を２Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール−４−リン酸に変換する。この工程を触媒することが公知の酵素は、例えば、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸レダクトイソメラーゼである。ヌクレオチド配列の説明例としては、（ＡＢ０１３３００；大腸菌（Escherichia coli））、（ＡＦ１４８８５２；シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana））、（ＮＣ＿００２９４７、ｌｏｃｕｓ ｔａｇ ＰＰ １５９７；シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）ＫＴ２４４０）、（ＡＬ９３９１２４、ｌｏｃｕｓ ｔａｇ ＳＣＯ５６９４；ストレプトマイセス・セリカラー（Streptomyces coelicolor）Ａ３（２））、（ＮＣ＿００７４９３、ｌｏｃｕｓ ｔａｇ ＲＳＰ＿２７０９；ロドバクター・スフェロイデス（Rhodobacter sphaeroides）２．４．１）、及び（ＮＣ＿００７４９２、ｌｏｃｕｓ ｔａｇ Ｐｆｌ＿１１０７；シュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）ＰｆＯ−１）が挙げられるが、それらに限定されない。
【００５９】
第三工程では、２Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール−４−リン酸を４−ジホスホシチジル−２Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトールに変換する。この工程を触媒することが公知の酵素は、例えば、４−ジホスホシチジル−２Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトールシンターゼである。ヌクレオチド配列の説明例としては、（ＡＦ２３０７３６；大腸菌（Escherichia coli））、（ＮＣ＿００７４９３、ｌｏｃｕｓ＿ｔａｇ ＲＳＰ＿２８３５；ロドバクター・スフェロイデス（Rhodobacter sphaeroides）２．４．１）、（ＮＣ＿００３０７１、ｌｏｃｕｓ＿ｔａｇ ＡＴ２Ｇ０２５００；シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana））、及び（ＮＣ＿００２９４７、ｌｏｃｕｓ＿ｔａｇ ＰＰ１６１４；シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）ＫＴ２４４０）が挙げられるが、それらに限定されない。
【００６０】
第四工程では、４−ジホスホシチジル−２Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトールを４−ジホスホシチジル−２Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール−２−リン酸に変換する。この工程を触媒することが公知の酵素は、例えば、４−ジホスホシチジル−２Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトールキナーゼである。ヌクレオチド配列の説明例としては、（ＡＦ２１６３００；大腸菌（Escherichia coli））及び（ＮＣ＿００７４９３、ｌｏｃｕｓ＿ｔａｇ ＲＳＰ＿１７７９；ロドバクター・スフェロイデス（Rhodobacter sphaeroides）２．４．１）が挙げられるが、それらに限定されない。
【００６１】
第五工程では、４−ジホスホシチジル−２Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール−２−リン酸を２Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール２，４−シクロ二リン酸に変換させる。この工程を触媒することが公知の酵素は、例えば、２Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール２，４−シクロ二リン酸シンターゼである。ヌクレオチド配列の説明例としては、（ＡＦ２３０７３８；大腸菌（Escherichia coli））、（ＮＣ＿００７４９３、ｌｏｃｕｓ＿ｔａｇ ＲＳＰ＿６０７１；ロドバクター・スフェロイデス（Rhodobacter sphaeroides）２．４．１）、及び（ＮＣ＿００２９４７、ｌｏｃｕｓ＿ｔａｇ ＰＰ１６１８；シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）ＫＴ２４４０）が挙げられるが、それらに限定されない。
【００６２】
第六工程では、２Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール２，４−シクロ二リン酸を１−ヒドロキシ−２−メチル−２−（Ｅ）−ブテニル−４−二リン酸に変換する。この工程を触媒することが公知の酵素は、例えば、１−ヒドロキシ−２−メチル−２−（Ｅ）−ブテニル−４−二リン酸シンターゼである。ヌクレオチド配列の説明例としては、（ＡＹ０３３５１５；大腸菌（Escherichia coli））、（ＮＣ＿００２９４７、ｌｏｃｕｓ＿ｔａｇ ＰＰ０８５３；シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）ＫＴ２４４０）、及び（ＮＣ＿００７４９３、ｌｏｃｕｓ＿ｔａｇ ＲＳＰ＿２９８２；ロドバクター・スフェロイデス（Rhodobacter sphaeroides）２．４．１）が挙げられるが、それらに限定されない。
【００６３】
第七工程では、１−ヒドロキシ−２−メチル−２−（Ｅ）−ブテニル−４−二リン酸を、ＩＰＰ又はその異性体、ＤＭＡＰＰ、のいずれかに変換する。この工程を触媒することが公知の酵素は、例えば、イソペンチル／ジメチルアリル二リン酸シンターゼである。ヌクレオチド配列の説明例としては、（ＡＹ０６２２１２；大腸菌（Escherichia coli））及び（ＮＣ＿００２９４７、ｌｏｃｕｓ＿ｔａｇ ＰＰ０６０６；シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）ＫＴ２４４０）が挙げられるが、それらに限定されない。
【００６４】
一部の実施形態では、宿主細胞固有の代謝プロセスと本明細書に提供するようなＩＰＰの生産に関与するプロセスとの間の「クロストーク」（又は干渉）を最少化又は完全に排除する。例えば、宿主微生物がＩＰＰの合成に関してＤＸＰ経路に排他的に依存し、及び追加のＩＰＰを提供するためにＭＥＶ経路が導入されるとき、クロストークは最少化又は完全に排除される。そのような宿主生物には、ＭＥＶ経路酵素の発現を変更するための、又はＭＥＶ経路に随伴する中間体をプロセッシングするための装備がなされていないであろう。ＤＸＰ経路に排他的に又は主として依存する生物としては、例えば、大腸菌（Escherichia coli）が挙げられる。
【００６５】
一部の実施形態において、前記宿主細胞は、排他的に又はＤＸＰ経路と併用で、ＭＥＶ経路によってＩＰＰを生産する。他の実施形態では、宿主が排他的に異種導入ＭＥＶ経路によってＩＰＰを生産するように、宿主のＤＸＰ経路を機能不能にする。ＤＸＰ経路は、遺伝子発現を不能にすること又はＤＸＰ経路酵素の１つもしくはそれ以上の機能を不活性化することによって、機能不能にすることができる。
【００６６】
宿主細胞
本明細書に提供する使用に適する宿主細胞の説明例としては、任意の古細菌（archae）、原核又は真核細胞が挙げられる。古細菌細胞の例としては、アエロピュルム属（Aeropyrum）、アルカエグロブス属（Archaeglobus）、ハロバクテリウム属（Halobacterium）、メタノコッカス属（Methanococcus）、メタノバクテリウム属（Methanobacterium）、パイロコッカス属（Pyrococcus）、スルフォロブス属（Sulfolobus）、及びサーモプラスマ属（Thermoplasma）に属するものが挙げられるが、それらに限定されない。古細菌株の説明例としては、アエロピュルム・ペルニクス（Aeropyrum pernix）、アルカエグロブス・フルギダス（Archaeoglobus fulgidus）、メタノコッカス・ヤナシイ（Methanococcus jannaschii）、メタノバクテリウム・サーモオートトロフィカム（Methanobacterium thermoautotrophicum）、パイロコッカス・アビシイ（Pyrococcus abyssi）、パイロコッカス・ホリコシイ（Pyrococcus horikoshii）、サーモプラスマ・アシドフィルム（Thermoplasma acidophilum）、サーモプラスマ・ボルカニウム（Thermoplasma volcanium）が挙げられるが、それらに限定されない。
【００６７】
原核細胞の例としては、アグロバクテリウム属（Agrobacterium）、アリシクロバシラス属（Alicyclobacillus）、アナベナ属（Anabaena）、アナシスティス属（Anacystis）、アルスロバクター属（Arthrobacter）、アゾバクター属（Azobacter）、バシラス属（Bacillus）、ブレビバクテリウム属（Brevibacterium）、クロマチウム属（Chromatium）、クロストリジウム属（Clostridium）、コリネバクテリウム属（Corynebacterium）、エンテロバクター属（Enterobacter）、エルウィニア属（Erwinia）、エシェリキア属（Escherichia）、乳酸杆菌属（Lactobacillus）、ラクトコッカス属（Lactococcus）、メソリゾビウム属（Mesorhizobium）、メチロバクテリウム属（Methylobacterium）、ミクロバクテリウム属（Microbacterium）、フォルミディウム属（Phormidium）、シュードモナス属（Pseudomonas）、ロドバクター属（Rhodobacter）、ロドシュードモナス属（Rhodopseudomonas）、ロドスピリルム属（Rhodospirillum）、ロドコッカス属（Rhodococcus）、サルモネラ属（Salmonella）、セネデスムス属（Scenedesmun）、セラチア属（Serratia）、赤痢菌属（Shigella）、スタフィロコッカス属 （Staphlococcus）、ストレプトマイセス属（Strepromyces）、シネコッカス（Synnecoccus）、及びジモモナス属（Zymomonas）に属するものが挙げられるが、それらに限定されない。
【００６８】
原核細菌株の説明例としては、枯草菌（Bacillus subtilis）、バチルス・アミロリクエファシエンス（Bacillus amyloliquefacines）、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス（Brevibacterium ammoniagenes）、ブレビバクテリウム・インマリオフィルム（Brevibacterium immariophilum）、クロストリジウム・ベエイジェリンキー（Clostridium beigerinckii）、エンテロバクター・サカザキイ（Enterobacter sakazakii）、大腸菌（Escherichia coli）、ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）、メソリゾビウム・ロティ（Mesorhizobium loti）、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）、シュードモナス・メバロニイ（Pseudomonas mevalonii）、シュードモナス・プディカ（Pseudomonas pudica）、ロドバクター・カプスラタス（Rhodobacter capsulatus）、ロドバクター・スファエロイデス（Rhodobacter sphaeroides）、ロドスピリルム・ラブラム（Rhodospirillum rubrum）、サルモネラ・エンテリカ（Salmonella enterica）、チフス菌（Salmonella typhi）、腸チフス菌（Salmonella typhimurium）、志賀赤痢菌（Shigella dysenteriae）、フレクスナー赤痢菌（Shigella flexneri）、ソンネ赤痢菌（Shigella sonnei）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）などが挙げられるが、それらに限定されない。
【００６９】
一般に、細菌宿主細胞を用いる場合、非病原菌株が好ましい。非病原菌株の説明例としては、枯草菌（Bacillus subtilis）、大腸菌（Escherichia coli）、アシドフィルス菌（Lactibacillus acidophilus）、ラクトバチルス・ヘルベティクス（Lactobacillus helveticus）、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）、シュードモナス・メバロニイ（Pseudomonas mevalonii）、シュードモナス・プディタ（Pseudomonas pudita）、ロドバクター・スファエロイデス（Rhodobacter sphaeroides）、ロドバクター・カプスラタス（Rhodobacter capsulatus）、ロドスピリルム・ラブラム（Rhodospirillum rubrum）などが挙げられるが、それらに限定されない。
【００７０】
真核細胞の例としては、真菌細胞が挙げられるが、それらに限定されない。真菌細胞の例としては、コウジカビ属（Aspergillus）、カンジダ属（Candida）、クリソスポリウム属（Chrysosporium）、クリプトコッカス属（Cryotococcus）、フザリウム属（Fusarium）、クリュイベロミセス属（Kluyveromyces）、ネオタイホジウム属（Neotyphodium）、アカパンカビ属（Neurospora）、アオカビ属（Penicillium）、ピキア属（Pichia）、サッカロミセス属（Saccharomyces）、トリコデルマ属（Trichoderma）及びキサントフィロマイセス属（Xanthophyllomyces）（以前はファフィア属（Phaffia））に属するものが挙げられるが、それらに限定されない。
【００７１】
真核菌株の説明例としては、アスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulans）、黒色コウジ菌（Aspergillus niger）、米コウジ菌（Aspergillus oryzae）、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、クリソスポリウム・ラクノウェンス（Chrysosporium lucknowense）、フザリウム・グラミネアラム（Fusarium graminearum）、フザリウム・ベネナツム（Fusarium venenatum）、クリュイベロミセス・ラクティス（Kluyveromyces lactis）、アカパンカビ（Neurospora crassa）、ピキア・アングスタ（Pichia angusta）、ピキア・フィンランディカ（Pichia finlandica）、ピキア・コダメ（Pichia kodamae）、ピキア・メンブラニーファシエンス（Pichia membranaefaciens）、ピキア・メタノリカ（Pichia methanolica）、ピキア・オプンティエ（Pichia opuntiae）、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）、ピキア・ピペリ（Pichia pijperi）、ピキア・クエルキューム（Pichia quercuum）、ピキア・サリクタリア（Pichia salictaria）、ピキア・サーモトレランス（Pichia thermotolerans）、ピキア・トレハロフィラ（Pichia trehalophila）、ピキア・スティピティス（Pichia stipitis）、ストレプトマイセス・アンボファシエンス（Streptomyces ambofaciens）、ストレプトマイセス・オーレオファシエンス（Streptomyces aureofaciens）、ストレプトマイセス・アウレウス（Streptomyces aureus）、サッカロミセス・バヤヌス（Saccaromyces bayanus）、サッカロミセス・ブーラルディ（Saccaromyces boulardi）、サッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）、ストレプトマイセス・フンギシディカス（Streptomyces fungicidicus）、ストレプトマイセス・グリセオクロモジェネス（Streptomyces griseochromogenes）、ストレプトマイセス・グリセウス（Streptomyces griseus）、ストレプトマイセス・リビダンス（Streptomyces lividans）、ストレプトマイセス・オリボグリセウス（Streptomyces olivogriseus）、ストレプトマイセス・ラメウス（Streptomyces rameus）、ストレプトマイセス・タナシエンシス（Streptomyces tanashiensis）、ストレプトマイセス・ビナセウス（Streptomyces vinaceus）、トリコデルマ・リーセイ（Trichoderma reesei）及びキサントフィロマイセス・デンドロラス（Xanthophyllomyces dendrorhous）（以前は、ファフィア・ロドジマ（Phaffia rhodozyma））が挙げられるが、それらに限定されない。
【００７２】
一般に、真核細胞を用いる場合、非病原菌株が好ましい。非病原菌株の説明例としては、フザリウム・グラミネアラム（Fusarium graminearum）、フザリウム・ベネナツム（Fusarium venenatum）、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）、サッカロミセス・ブーラルディ（Saccaromyces boulardi）、及びサッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）が挙げられるが、それらに限定されない。
【００７３】
加えて、一定の菌株は、米国食品医薬品局（the Food and Drug Administration）によってＧＲＡＳすなわち安全性認定食品添加物（Generally Regarded As Safe）として指定されている。これらの菌株としては、枯草菌（Bacillus subtilis）、アシドフィルス菌（Lactibacillus acidophilus）、ラクトバチルス・ヘルベティクス（Lactobacillus helveticus）及びサッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）が挙げられる。
【００７４】
イソプレノイド化合物
本明細書に提供する宿主細胞を用いてイソプレノイドを作る。特定のイソプレノイド化合物は、ＩＰＰ又はＤＭＡＰＰから作られ、及び追加の仕上酵素（finishing enzyme）を必要とすることがある。適するイソプレノイドの非限定的な例としては、（１つのイソプレン単位から誘導される）ヘミテルペン、例えばイソプレン；（２つのイソプレン単位から誘導される）モノテルペン、例えばミルセン；（３つのイソプレン単位から誘導される）セスキテルペン、例えばアモルファ−４，１１−ジエン；（４つのイソプレン単位から誘導される）ジテルペン、例えばタキサジエン；（６つのイソプレン単位から誘導される）トリテルペン、例えばスクアレン；（８つのイソプレノイドから誘導される）テトラテルペン、例えばβ−カロチン；及び（８つを超えるイソプレン単位から誘導される）ポリテルペン、例えばポリイソプレンが挙げられる。一部の実施形態において、前記イソプレノイドは、カロチノイドではない。他の実施形態において、前記イソプレノイドは、Ｃ５−Ｃ２０イソプレノイドである。特定のＣ５−Ｃ２０イソプレノイド化合物及びそれらのそれぞれの仕上酵素の説明例を下でさらに説明する。
【００７５】
Ｃ５化合物
本明細書に提供するＣ５化合物は、一般に、ＩＰＰ又はＤＭＡＰＰから誘導される。これらの化合物は、単一のイソプレン単位（ＩＰＰ又はＤＭＡＰＰ）から誘導されるため、ヘミテルペンとしても公知である。
【００７６】
イソプレン
構造が、
【化１】
であるイソプレンは、多くの植物において見つけることができる。イソプレンは、イソプレンシンターゼによってＩＰＰから作られる。適するヌクレオチド配列の説明例としては、（ＡＢ１９８１９０；ウラジロハコヤナギ（Populus alba）及び（ＡＪ２９４８１９；ウラジロハコヤナギ（Polulus alba）ｘヨーロッパヤマナラシ（Polulus tremula））が挙げられるが、それらに限定されない。
【００７７】
Ｃ１０化合物
本明細書に提供するＣ１０化合物は、一般に、ＩＰＰとＤＭＡＰＰの縮合によって作られるゲラニルピロリン酸（ＧＰＰ）に由来した。この工程を触媒することが公知の酵素は、例えば、ゲラニルピロリン酸シンターゼである。これらのＣ１０化合物は、２つのイソプレン単位から誘導されるため、モノテルペンとしても公知である。
【００７８】
図３は、如何にしてＩＰＰ及びＤＭＡＰＰがＧＰＰを生産でき、それをさらにモノテルペンへとプロセッシングできるかを概略的に示すものである。
【００７９】
ゲラニルピロリン酸シンターゼについてのヌクレオチド配列の説明例としては、（ＡＦ５１３１１１；グランディスモミ（Abies grandis））、（ＡＦ５１３１１２；グランディスモミ（Abies grandis））、（ＡＦ５１３１１３；グランディスモミ（Abies grandis））、（ＡＹ５３４６８６；キンギョソウ（Antirrhinum majus））、（ＡＹ５３４６８７；キンギョソウ（Antirrhinum majus））、（Ｙ１７３７６；シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana））、（ＡＥ０１６８７７、Ｌｏｃｕｓ ＡＰ１１０９２；セレウス菌（Bacillus cereus）；ＡＴＣＣ１４５７９）、（ＡＪ２４３７３９；オレンジ（Citrus sinensis））、（ＡＹ５３４７４５；クラーキア・ブレウェリ（Clarkia breweri））、（ＡＹ９５３５０８；マツキクイムシ（Ips pini））、（ＤＱ２８６９３０；トマト（Lycopersicon esculentum））、（ＡＦ１８２８２８；コショウハッカ（Mentha x piperita））、（ＡＦ１８２８２７；コショウハッカ（Mentha x piperita））、（ＭＰＩ２４９４５３；コショウハッカ（Mentha x piperita））、（ＰＺＥ４３１６９７、Ｌｏｃｕｓ ＣＡＤ２４４２５；パラコッカス・ゼアキサンチニファシエンス（Paracoccus zeaxanthinifaciens））、（ＡＹ８６６４９８；コオウレン（Picrorhiza kurrooa））、（ＡＹ３５１８６２；ブドウ（Vitis vinifera）、及び（ＡＦ２０３８８１、Ｌｏｃｕｓ ＡＡＦ１２８４３；ジモモナス・モビリス（Zymomonas mobilis））が挙げられるが、それらに限定されない。
【００８０】
次いで、その後ＧＰＰを様々なＣ１０化合物に変換する。Ｃ１０化合物の説明例としては、以下のものが挙げられるが、それらに限定されない：
【００８１】
カレン
構造が、
【化２】
であるカレンは、多くの木、特に松の木、の樹脂において見つけられる。カレンは、カレンシンターゼでＧＰＰから作られる。適するヌクレオチド配列の説明例としては、（ＡＦ４６１４６０、ＲＥＧＩＯＮ ４３．．１９２６；オウシュウトウヒ（Picea abies））及び（ＡＦ５２７４１６、ＲＥＧＩＯＮ：７８．．１８７１；サルビア・ステノフィラ（Salvia stenophylla））が挙げられるが、それらに限定されない。
【００８２】
ゲラニオール
構造が
【化３】
であるゲラニオール（ロドノール（rhodnol）としても公知）は、ローズ油(oil-of-rose)及びパルマローザ油の主成分である。それは、ゼラニウム、レモン及びシトロネラソウ中にも存在する。ゲラニオールは、ゲラニオールシンターゼによってＧＰＰから作られる。適するヌクレオチド配列の説明例としては、（ＡＪ４５７０７０；シナモマム・テヌイピラム（Cinnamomum tenuipilum））、（ＡＹ３６２５５３；メボウキ（Ocimum basilicum））、（ＤＱ２３４３００；エゴマ（Perilla frutescens株１８６４））、（ＤＱ２３４２９９；レモンエゴマ（Perilla citriodora）株１８６１）、（ＤＱ２３４２９８；レモンエゴマ（Perilla citriodora）株４９３５）、及び（ＤＱ０８８６６７；レモンエゴマ（Perilla citriodora））が挙げられるが、それらに限定されない。
【００８３】
リナロオール
構造が、
【化４】
であるリナロオールは、多くの花及びスパイス植物（例えば、コリアンダー種子）において見つけられる。リナロオールは、リナロオールシンターゼによってＧＰＰから作られる。適するヌクレオチド配列の説明例としては、（ＡＦ４９７４８５；シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana））、（ＡＣ００２２９４、Ｌｏｃｕｓ ＡＡＢ７１４８２；シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana））、（ＡＹ０５９７５７；シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana））、（ＮＭ＿１０４７９３；シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana））、（ＡＦ１５４１２４；クソニンジン（Artemisia annua））、（ＡＦ０６７６０３；クラーキア・ブレウェリ（Clarkia breweri））、（ＡＦ０６７６０２；クラーキア・コンキンナ（Clarkia concinna））、（ＡＦ０６７６０１；クラーキア・ブレウェリ（Clarkia breweri））、（Ｕ５８３１４；クラーキア・ブレウェリ（Clarkia breweri））、（ＡＹ８４００９１；トマト（Lycopersicon esculentum））、（ＤＱ２６３７４１；イングリッシュラベンダー（Lavandula angustifolia））、（ＡＹ０８３６５３；オレンジミント（Mentha citrate））、（ＡＹ６９３６４７；メボウキ（Ocimum basillucum））、（ＸＭ＿４６３９１８；イネ（Oryza sativa））、（ＡＰ００４０７８、Ｌｏｃｕｓ ＢＡＤ０７６０５；イネ（Oryza sativa））、（ＸＭ＿４６３９１８、Ｌｏｃｕｓ ＸＰ＿４６３９１８；イネ（Oryza sativa））、（ＡＹ９１７１９３；レモンエゴマ（Perilla citriodora））、（ＡＦ２７１２５９；エゴマ（Perilla frutescens））、（ＡＹ４７３６２３；オウシュウトウヒ（Picea abies））、（ＤＱ １９５２７４；シトカトウヒ（Picea sitchensis））、及び（ＡＦ４４４７９８；シソ（Perilla frutescens var. crispa）栽培品種Ｎｏ．７９）が挙げられるが、それらに限定されない。
【００８４】
リモネン
構造が、
【化５】
であるリモネンは、柑橘類の外皮及びハッカにおいて見つけられる。リモネンは、リモネンシンターゼによってＧＰＰから作られる。適するヌクレオチド配列の説明例としては、（＋）−リモネンシンターゼ（ＡＦ５１４２８７、ＲＥＧＩＯＮ：４７．．１８６７；レモン（Citrus limon）及び（ＡＹ０５５２１４、ＲＥＧＩＯＮ：４８．．１８８９；カワミドリ（Agastache rugosa）ならびに（−）−リモネンシンターゼ（ＤＱ１９５２７５、ＲＥＧＩＯＮ：１．．１９０５；シトカトウヒ（Picea sitchensis））、（ＡＦ００６１９３、ＲＥＧＩＯＮ：７３．．１９８６；グランディスモミ（Abies grandis））、及び（ＭＨＣ４ＳＬＳＰ、ＲＥＧＩＯＮ：２９．．１８２８；オランダハッカ（Mentha spicata））が挙げられるが、それらに限定されない。
【００８５】
ミルセン
構造が、
【化６】
であるミルセンは、ゲッケイジュ、バーベナ及びミルキア（myrcia）（その名前は、これから取られている）をはじめとする多くの植物における精油において見つけられる。ミルセンは、ミルセンシンターゼによってＧＰＰから作られる。適するヌクレオチド配列の説明例としては、（Ｕ８７９０８；グランディスモミ（Abies grandis））、（ＡＹ１９５６０９；キンギョソウ（Antirrhinum majus））、（ＡＹ１９５６０８；キンギョソウ（Antirrhinum majus））、（ＮＭ＿１２７９８２；シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）ＴＰＳ１０）、（ＮＭ＿１１３４８５；シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）ＡＴＴＰＳ−ＣＩＮ）、（ＮＭ＿１１３４８３；シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）ＡＴＴＰＳ−ＣＩＮ）、（ＡＦ２７１２５９；エゴマ（Perilla frutescens））、（ＡＹ４７３６２６；オウシュウトウヒ（Picea abies））、（ＡＦ３６９９１９；オウシュウトウヒ（Picea abies））、及び（ＡＪ３０４８３９；セイヨウヒイラギガシ（Quercus ilex））が挙げられるが、それらに限定されない。
【００８６】
オシメン
構造が、それぞれ、
【化７】
である、α−オシメン及びβ−オシメンは、メボウキ（Ocimum basilicum）をはじめとする様々な植物及び果物において見つけられ、オシメンシンターゼによってＧＰＰから作られる。適するヌクレオチド配列の説明例としては、（ＡＹ１９５６０７；キンギョソウ（Antirrhinum majus））、（ＡＹ１９５６０９；キンギョソウ（Antirrhinum majus））、（ＡＹ１９５６０８；キンギョソウ（Antirrhinum majus））、（ＡＫ２２１０２４；シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana））、（ＮＭ＿１１３４８５；シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）ＡＴＴＰＳ−ＣＩＮ）、（ＮＭ＿１１３４８３；シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）ＡＴＴＰＳ−ＣＩＮ）、（ＮＭ＿１１７７７５；シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）ＡＴＴＰＳ０３）、（ＮＭ＿００１０３６５７４；シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）ＡＴＴＰＳ０３）、（ＮＭ＿１２７９８２；シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）ＴＰＳ１０）、（ＡＢ１１０６４２；ウンシュウミカン（Citrus unshiu）ＣｉｔＭＴＳＬ４）、及び（ＡＹ５７５９７０；ミヤコグサ（Lotus corniculatus var. japonicus））が挙げられるが、それらに限定されない。
【００８７】
α−ピネン
構造が、
【化８】
であるα−ピネンは、松の木及びユーカリノキにおいて見つけられる。α−ピネンは、α−ピネンシンターゼによってＧＰＰから作られる。適するヌクレオチド配列の説明例としては、（＋）α−ピネンシンターゼ（ＡＦ５４３５３０、ＲＥＧＩＯＮ：１．．１８８７；タエダマツ（Pinus taeda））、（−）α−ピネンシンターゼ（ＡＦ５４３５２７、ＲＥＧＩＯＮ：３２．．１９２１；タエダマツ（Pinus taeda））、及び（＋）／（−）α−ピネンシンターゼ（ＡＧＵ８７９０９、ＲＥＧＩＯＮ：６１１１８９２；グランディスモミ（Abies grandis））が挙げられるが、それらに限定されない。
【００８８】
β−ピネン
構造が、
【化９】
であるβ−ピネンは、松の木、ローズマリー、パセリ、ディル、バジル、及びバラにおいて見つけられる。β−ピネンは、β−ピネンシンターゼによってＧＰＰから作られる。適するヌクレオチド配列の説明例としては、（−）β−ピネンシンターゼ（ＡＦ２７６０７２、ＲＥＧＩＯＮ：１．．１７４９；クソニンジン（Artemisia annua））及び（ＡＦ５１４２８８、ＲＥＧＩＯＮ：２６．．１８３４；レモン（Citrus limon））が挙げられるが、それらに限定されない。
【００８９】
サビネン
構造が、
【化１０】
であるサビネンは、黒コショウ、キャロットシード、セージ及びティーツリーにおいて見つけられる。サビネンは、サビネンシンターゼによってＧＰＰから作られる。適するヌクレオチド配列の説明例としては、サルビア・オフィシナリス（Salvia officinalis）からのＡＦ０５１９０１、ＲＥＧＩＯＮ：２６．．１７９８が挙げられるが、これに限定されない。
【００９０】
γ−テルピネン
構造が、
【化１１】
であるγ−テルピネンは、柑橘類からの精油の構成成分である。生化学的には、γ−テルピネンは、γ−テルピネンシンターゼによってＧＰＰから作られる。適するヌクレオチド配列の説明例としては、（レモン（Citrus limon）からのＡＦ５１４２８６、ＲＥＧＩＯＮ：３０．．１８３２）及び（ウンシュウミカン（Citrus unshiu）からのＡＢ１１０６４０、ＲＥＧＩＯＮ １．．１８０３）が挙げられる。
【００９１】
テルピノレン
構造が、
【化１２】
であるテルピノレンは、クロフサスグリ、イトスギ、グアバ、レイシ、パパイヤ、松及び茶において見つけられる。テルピノレンは、テルピノレンシンターゼによってＧＰＰから作られる。適するヌクレオチド配列の説明例としては、アメリカトガサワラ（Pseudotsuga menziesii）からのＡＹ９０６８６６、ＲＥＧＩＯＮ：１０．．１８８７が挙げられるが、これに限定されない。
【００９２】
Ｃ１５化合物
本明細書に提供するＣ１５化合物は、一般に、２つのＩＰＰ分子と１つのＤＭＡＰＰ分子の縮合によって作られるファルネシルピロリン酸（ＦＰＰ）に由来する。この工程を触媒することが公知の酵素は、例えば、ファルネシルピロリン酸シンターゼである。これらのＣ１５化合物は、３つのイソプレン単位から誘導されるため、セスキテルペンとしても公知である。
【００９３】
図３は、如何にしてＩＰＰ及びＤＭＡＰＰを化合させてＦＰＰを生産でき、それをさらにセスキテルペンへとプロセッシングできるかを概略的に示すものである。
【００９４】
ファルネシルピロリン酸シンターゼについてのヌクレオチド配列の説明例としては、（ＡＴＵ８０６０５；シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana））、（ＡＴＨＦＰＳ２Ｒ；シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana））、（ＡＡＵ３６３７６；クソニンジン（Artemisia annua））、（ＡＦ４６１０５０；ウシ（Bos taurus））、（Ｄ００６９４；大腸菌（Escherichia coli）Ｋ−１２）、（ＡＥ００９９５１、Ｌｏｃｕｓ ＡＡＬ９５５２３；有核紡錘菌亜種ヌクレアタム（Fusobacterium nucleatum subsp. nucleatum）ＡＴＣＣ２５５８６）、（ＧＦＦＰＰＳＧＥＮ；ジベレラ（Gibberella fujikuroi））、（ＣＰ０００００９、Ｌｏｃｕｓ ＡＡＷ６００３４；グルコノバクター・オキシダンス（Gluconobacter oxydans）６２１Ｈ）、（ＡＦ０１９８９２；ヒマワリ（Helianthus annuus））、（ＨＵＭＦＡＰＳ；ヒト（Homo sapiens））、（ＫＬＰＦＰＳＱＣＲ；クリュイベロミセス・ラクティス（Kluyveromyces lactis）、（ＬＡＵ１５７７７；シロバナハウチマメ（Lupinus albus））、（ＬＡＵ２０７７１；シロバナハウチマメ（Lupinus albus））、（ＡＦ３０９５０８；ハツカネズミ（Mus musculus））、（ＮＣＦＰＰＳＧＥＮ；アカパンカビ（Neurospora crassa））、（ＰＡＦＰＳ１；グアユールゴムノキ（Parthenium argentatum））、（ＰＡＦＰＳ２；グアユールゴムノキ（Parthenium argentatum））、（ＲＡＴＦＡＰＳ；ドブネズミ（Rattus norvegicus））、（ＹＳＣＦＰＰ；サッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae））、（Ｄ８９１０４；分裂酵母（Schizosaccharomyces pombe））、（ＣＰ０００００３、Ｌｏｃｕｓ ＡＡＴ８７３８６；化膿連鎖球菌（Streptococcus pyogenes））、（ＣＰ００００１７、Ｌｏｃｕｓ ＡＡＺ５１８４９；化膿連鎖球菌（Streptococcus pyogenes））、（ＮＣ＿００８０２２、Ｌｏｃｕｓ ＹＰ＿５９８８５６；化膿連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）ＭＧＡＳ１０２７０）、（ＮＣ＿００８０２３、Ｌｏｃｕｓ ＹＰ＿６００８４５；化膿連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）ＭＧＡＳ２０９６）、（ＮＣ＿００８０２４、Ｌｏｃｕｓ ＹＰ＿６０２８３２；化膿連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）ＭＧＡＳ１０７５０）、及び（ＭＺＥＦＰＳ；トウモロコシ（Zea mays））が挙げられるが、それらに限定されない。
【００９５】
あるいは、ＩＰＰをＧＰＰに添加することによってＦＰＰを作ることもできる。この反応が可能な酵素をコードするヌクレオチド配列の説明例としては、（ＡＥ０００６５７、Ｌｏｃｕｓ ＡＡＣ０６９１３；アクイフェックス・エオリカス（Aquifex aeolicus）ＶＦ５）、（ＮＭ＿２０２８３６；シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana））、（Ｄ８４４３２、Ｌｏｃｕｓ ＢＡＡ１２５７５；枯草菌（Bacillus subtilis）、（Ｕ１２６７８、Ｌｏｃｕｓ ＡＡＣ２８８９４；ブラディリゾビウム・ジャポニカム（Bradyrhizobium japonicum）ＵＳＤＡ １１０）、（ＢＡＣＦＤＰＳ；ゲオバシラス・ステアロサーモフィラス（Geobacillus stearothermophilus））、（ＮＣ＿００２９４０、Ｌｏｃｕｓ ＮＰ＿８７３７５４；ヘモフィリス・デュクレイ（Haemophilus ducreyi）３５０００ＨＰ）、（Ｌ４２０２３、Ｌｏｃｕｓ ＡＡＣ２３０８７；インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）Ｒｄ ＫＷ２０）、（Ｊ０５２６２；ヒト（Homo sapiens））、（ＹＰ＿３９５２９４；ラクトバシラス・サケイ亜種サケイ（Lactobacillus sakei subsp. sakei）２３Ｋ）、（ＮＣ＿００５８２３、Ｌｏｃｕｓ ＹＰ＿０００２７３；レプトスピラ・インターロガンス（Leptospira interrogans）血清型（serovar）Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎｉ株Ｆｉｏｃｒｕｚ Ｌ１−１３０）、（ＡＢ００３１８７；ミクロコッカス・ルテウス（Micrococcus luteus）、（ＮＣ＿００２９４６、Ｌｏｃｕｓ ＹＰ＿２０８７６８；淋菌（Neisseria gonorrhoeae）ＦＡ１０９０）、（Ｕ０００９０、Ｌｏｃｕｓ ＡＡＢ９１７５２；リゾビウム属種（Rhizobium sp．）ＮＧＲ２３４）、（Ｊ０５０９１；サッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae））、（ＣＰ００００３１、Ｌｏｃｕｓ ＡＡＶ９３５６８；シリシバクター・ポメロイ（Silicibacter pomeroyi）ＤＳＳ−３）、（ＡＥ００８４８１、Ｌｏｃｕｓ ＡＡＫ９９８９０；肺連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae）Ｒ６）、及び（ＮＣ＿００４５５６、Ｌｏｃｕｓ ＮＰ ７７９７０６；ガハニコナカイガラムシ（Xylella fastidiosa）Ｔｅｍｅｃｕｌａ１）が挙げられるが、それらに限定されない。
【００９６】
次いで、その後ＦＰＰを様々なＣ１５化合物に変換する。Ｃ１５化合物の説明例としては、以下のものが挙げられるが、それらに限定されない：
【００９７】
アモルファジエン
構造が、
【化１３】
であるアモルファジエンは、クソニンジン（Artemisia anna）によって作られるアルテミシニンの前駆体である。アモルファジエンは、アモルファジエンシンターゼによってＦＰＰから作られる。適するヌクレオチド配列の説明例は、米国特許第７，１９２，７５１号の配列番号３７である。
【００９８】
α−ファルネセン
構造が、
【化１４】
であるα−ファルネセンは、アリのデュフール腺ならびにリンゴの皮及び西洋ナシの皮をはじめとする（しかし、これらに限定されない）様々な生物源において見つけられる。α−ファルネセンは、α−ファルネセンシンターゼによってＦＰＰから作られる。適するヌクレオチド配列の説明例としては、セイヨウナシ（Pyrus communis）栽培品種ｄ’Ａｎｊｏｕ（ナシ；遺伝子名ＡＦＳ１）からのＤＱ３０９０３４及び栽培リンゴ（Malus domestica）（リンゴ；遺伝子ＡＦＳ１）からのＡＹ１８２２４１が挙げられるが、それらに限定されない。Pechouus et al, Planta 219 (1): 84-94 (2004)。
【００９９】
β−ファルネセン
構造が、
【化１５】
であるβ−ファルネセンは、アブラムシ及び精油（例えばハッカからのもの）をはじめとする（しかし、これらに限定されない）様々な生物源において見つけられる。野生ジャガイモなどの一部の植物において、β−ファルネセンは、天然の防虫剤として合成される。β−ファルネセンは、β−ファルネセンシンターゼによってＦＰＰから作られる。適するヌクレオチド配列の説明例としては、コショウハッカ（Mentha x piperita）（ハッカ：遺伝子Ｔｓｐａ１１）からのＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ０２４６１５、及びクソニンジン（Artemisia annua）からのＡＹ８３５３９８が挙げられるが、それらに限定されない。Picaud et al., Phytochemistry 66(9): 961-967 (2005)。
【０１００】
ファルネソール
構造が、
【化１６】
であるファルネソールは、昆虫及び精油（例えばシトロネラ（cintronella）、ネロリ、シクラメン、レモングラス、ゲッカコウ及びバラからのもの）をはじめとする様々な生物源において見つけられる。ファルネソールは、ファルネソールシンターゼなどのヒドロキシラーゼによってＦＰＰから作られる。適するヌクレオチド配列の説明例としては、トウモロコシ（Zea mays）からのＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ５２９２６６及びサッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）（遺伝子Ｐｈｏ８）からのＹＤＲ４８１Ｃが挙げられるが、それらに限定されない。Song, L., Applied Biochemistry and Biotechnology 128: 149-158 (2006)。
【０１０１】
ネロリドール
構造が、
【化１７】
であるネロリドールは、ペルビオールとしても公知であり、ならびに例えば精油、例えばネロリ、ショウガ、ジャスミン、ラベンダー、ティーツリー及びレモングラスからのもの、をはじめとする様々な生物源において見つけられる。ネロリドールは、ネロリドールシンターゼなどのヒドロキシラーゼによってＦＰＰから作られる。適するヌクレオチド配列の説明例としては、トウモロコシ（Zea mays）（トウモロコシ；遺伝子ｔｐｓ１）からのＡＦ５２９２６６が挙げられるが、これに限定されない。
【０１０２】
パチョロール
構造が、
【化１８】
であるパチョロール（patchoulol）は、パチョリアルコールとしても公知であり、ポゴステモン・パチョリ（Pogostemon patchouli）の精油の構成成分である。パチョロールは、パチョロールシンターゼによってＦＰＰから作られる。適するヌクレオチド配列の説明例としては、パチョリ（Pogostemon cablin）からのＡＹ５０８７３０ ＲＥＧＩＯＮ：１．．１６５９が挙げられるが、これに限定されない。
【０１０３】
バレンセン
構造が、
【化１９】
であるバレンセンは、オレンジの香り及び風味の主化学成分の１つであり、オレンジの皮において見つけられる。バレンセンは、ヌートカトンシンターゼ（nootkatone synthase）によってＦＰＰから作られる。適するヌクレオチド配列の説明例としては、オレンジ（Citrus sinensis）からのＡＦ４４１１２４ ＲＥＧＩＯＮ：１．．１６４７及びエゴマ（Perilla frutescens）からのＡＹ９１７１９５ ＲＥＧＩＯＮ：１．．１６５３が挙げられるが、それらに限定されない。
【０１０４】
Ｃ２０化合物
本明細書に提供するＣ２０化合物は、一般に、３つのＩＰＰ分子と１つのＤＭＡＰＰ分子の縮合によって作られるゲラニルゲラニオールピロリン酸（ＧＧＰＰ）に由来した。この工程を触媒することが公知の酵素は、例えば、ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼである。これらのＣ２０化合物は、４つのイソプレン単位から誘導されるため、ジテルペンとしても公知である。
【０１０５】
図３は、如何にしてＩＰＰ及びＤＭＡＰＰを併せてＧＧＰＰを生産でき、それをさらにジテルペンへとプロセッシングできるのか、又はそれをさらにプロセシングしてカルチノイドを生産できるのかを概略的に示すものである。
【０１０６】
ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼについてのヌクレオチド配列の説明例としては、（ＡＴＨＧＥＲＰＹＲＳ；シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana））、（ＢＴ００５３２８；シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana））、（ＮＭ＿１１９８４５；シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana））、（ＮＺ＿ＡＡＪＭ０１０００３８０、Ｌｏｃｕｓ ＺＰ＿００７４３０５２；バシラス・スリンジエンシス（Bacillus thuringiensis）血清型（serovar）israelensis、ＡＴＣＣ ３５６４６ ｓｑ１５６３）、（ＣＲＧＧＰＰＳ；ニチニチソウ（Catharanthus roseus）、（ＮＺ＿ＡＡＢＦ０２００００７４、Ｌｏｃｕｓ ＺＰ＿００１４４５０９；有核紡錘菌亜種ビンセンティイ（Fusobacterium nucleatum subsp. vincentii）、ＡＴＣＣ ４９２５６）、（ＧＦＧＧＰＰＳＧＮ；ジベレラ（Gibberella fujikuroi））、（ＡＹ３７１３２１；イチョウ（Ginkgo biloba））、（ＡＢ０５５４９６；ヘベア・ブラジリエンシス（Hevea brasiliensis））、（ＡＢ０１７９７１；ヒト（Homo sapiens））、（ＭＣＩ２７６１２９；ムコール・シルシネロイデス ｆ．ルシタニクス（Mucor circinelloides f. lusitanicus））、（ＡＢ０１６０４４；ハツカネズミ（Mus musculus））、（ＡＡＢＸ０１０００２９８、Ｌｏｃｕｓ ＮＣＵ０１４２７；アカパンカビ（Neurospora crassa））、（ＮＣＵ２０９４０；アカパンカビ（Neurospora crassa））、（ＮＺ＿ＡＡＫＬ０１０００００８、Ｌｏｃｕｓ ＺＰ＿００９４３５６６；ラルストニア・ソラナケアルム（Ralstonia solanacearum）ＵＷ５５１）、（ＡＢ１１８２３８；ドブネズミ（Rattus norvegicus））、（ＳＣＵ３１６３２；サッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae））、（ＡＢ０１６０９５；シネココッカス・エロンゲート（Synechococcus elongates））、（ＳＡＧＧＰＳ；シロガラシ（Sinapis alba））、（ＳＳＯＧＤＳ；スルフォロブス・アシドカルダリウス（Sulfolobus acidocaldarius））、（ＮＣ＿００７７５９、Ｌｏｃｕｓ ＹＰ＿４６１８３２；シントロファス・アシディトロフィクス（Syntrophus aciditrophicus）ＳＢ）、及び（ＮＣ＿００６８４０、Ｌｏｃｕｓ ＹＰ＿２０４０９５；ビブリオ・フィッシェリ（Vibrio fischeri）ＥＳ１１４）が挙げられるが、それらに限定されない。
【０１０７】
あるいは、ＩＰＰをＦＰＰに添加することによってＧＧＰＰを作ることもできる。この反応が可能である酵素をコードするヌクレオチド配列の説明例としては、（ＮＭ＿１１２３１５；シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana））、（ＥＲＷＣＲＴＥ；パントエア・アグロメランス（Pantoea agglomerans）、（Ｄ９００８７、Ｌｏｃｕｓ ＢＡＡ１４１２４；パントエア・アナナティス（Pantoea ananatis））、（Ｘ５２２９１、Ｌｏｃｕｓ ＣＡＡ３６５３８；ロドバクター・カプスラタス（Rhodobacter capsulatus）、（ＡＦ１９５１２２、Ｌｏｃｕｓ ＡＡＦ２４２９４；ロドバクター・スフェロイデス（Rhodobacter sphaeroides））、及び（ＮＣ＿００４３５０、Ｌｏｃｕｓ ＮＰ＿７２１０１５；ミュータンス連鎖球菌（Streptococcus mutans）ＵＡ１５９）が挙げられるが、それらに限定されない。
【０１０８】
次いで、その後、ＧＧＰＰを様々なＣ２０イソプレノイドに変換する。Ｃ２０化合物の説明例としては、以下のものが挙げられるが、それらに限定されない：
【０１０９】
ゲラニルゲラニオール
構造が、
【化２０】
であるゲラニルゲラニオールは、セドレラ・チューナ（Cedrela toona）からのウッドオイルの及び亜麻仁油の構成成分である。ゲラニルゲラニオールは、例えば、ＧＧＰＰシンターゼに関する遺伝子の後に、発現構築物のホスファターゼ遺伝子を付加させることによって、作ることができる。
【０１１０】
アビエタジエン
アビエタジエンは、次の異性体：
【化２１】
を含み、グランディスモミ（Abies grandis）などの木において見つけられる。アビエタジエンは、アビエタジエンシンターゼによって作られる。適するヌクレオチド配列の説明例としては、（Ｕ５０７６８；グランディスモミ（Abies grandis））及び（ＡＹ４７３６２１；オウシュウトウヒ（Picea abies））が挙げられるが、それらに限定されない。
【０１１１】
Ｃ２０＋化合物
Ｃ２０＋化合物も本明細書に提供する範囲内である。そのような化合物の説明例としては、セステルテルペン（５つのイソプレン単位から作られたＣ２５化合物）、トリテルペン（６つのイソプレン単位から作られたＣ３０化合物）、及びテトラテルペン（８つのイソプレン単位から作られたＣ４０化合物）が挙げられる。本明細書に記載する類似の方法の使用、及び適切なシンターゼに関するヌクレオチド配列の置換又は付加によって、これらの化合物を作る。
【０１１２】
イソプレノイド化合物の高い収率
エタノールを炭素源として使用する条件下で宿主細胞を培養又は維持することによる、イソプレノイドの強靭な生産のための組成物及び方法を本明細書に提供する。本明細書に記載する方法を用いると、宿主細胞は、発酵反応混合物のリットル当たり約５グラム（５ｇ／Ｌ）より多くのイソプレノイドを生産する。他の実施形態では、約１０ｇ／Ｌより多く、約１５ｇ／Ｌより多く、約２０ｇ／Ｌより多く、約２５ｇ／Ｌより多くが生産され、又は約３０ｇ／Ｌより多くのイソプレノイドが生産される。
【０１１３】
あるいは、イソプレノイド生産を収率ではなく比生産性によって表現することができる。例えば、本明細書に記載する方法を用いると、宿主細胞は、乾燥宿主細胞のグラム当たり約５０ミリグラムより多くのイソプレノイドを生産する。他の実施形態では、グラム乾燥細胞重量当たり約１００ミリグラムより多く、グラム乾燥細胞重量当たり約１５０ミリグラムより多く、グラム乾燥細胞重量当たり約２００ミリグラムより多く、グラム乾燥細胞重量当たり約２５０ミリグラムより多く、グラム乾燥細胞重量当たり約５００ミリグラムより多く、グラム乾燥細胞重量当たり約７５０ミリグラムより多く、又はグラム乾燥細胞重量当たり約１０００ミリグラムより多くのイソプレノイドが生産される。
【０１１４】
生産レベルを収率によって表現するにせよ、比生産性によって表現するにせよ、約１２０時間未満、約９６時間未満、約７２時間未満、好ましくは約４８時間未満、又はさらに約２４時間未満の間、産生させる。
【０１１５】
本明細書に提供する方法は、バッチ、流加（fed-batch）、又は連続プロセスで行うことができる。バッチプロセスは、概してクローズドプロセスであり、この場合、すべての原料がそのプロセスの開始時に添加される。流加プロセスは、概してクローズドプロセスであり、この場合、炭素源及び／又は他の基質は、そのプロセス全体を通して漸増で添加される。流加プロセスでは、培地及び微生物増殖のより優れた制御が可能になる。連続プロセスは、オープンシステムと見なすことができ、この場合、培地が連続的に添加され、同時に産物が除去される。
【０１１６】
流加プロセスと連続プロセスの間のプロセスを用いることもできる。例えば、１つの実施形態において、プロセスを流加プロセスとして始め、プロセスが継続している間、有機層を培養培地と接触する状態に置く。水溶液におけるより高い有機液への溶解度を概して有するイソプレノイドは、その培地から有機層に抽出される。その培地から産物を除去するため、この方法は、流加プロセスと連続プロセスの両方の特徴を有する。
【０１１７】
有機オーバーレイ（例えば、ドデカン、ミリスチン酸イソプロピル、オレイン酸メチルなど）による産物除去は、多くの場合、イソプレノイド生産の増加をもたらすことができる。産物除去は、生産増加をもたらすことができ、及び特に産物蓄積が経路阻害をもたらす場合、望ましい。一定の実施形態では、前記有機層が、イソプレノイド産物それ自体によって形成されることがある。これは、イソプレノイドが、その飽和点より多く生産され、水性培地から分離できる層を形成する場合に発生する。
【０１１８】
一部の実施形態において、エタノールは、宿主細胞にとって唯一の炭素源である。他の実施形態において、前記炭素源は、エタノール炭素源と非エタノール炭素源の両方を含む。さらに他の実施形態において、前記非エタノール炭素源は、炭水化物である。
【０１１９】
炭水化物の説明例としては、単糖類、二糖類、及びそれらの組み合わせが挙げられる。適する単糖類の一部の非限定的な例としては、グルコース、ガラクトース、マンノース、フルクトース、リボース、及びそれらの組み合わせが挙げられる。適する二糖類の一部の非限定的な例としては、スクロース、ラクトース、マルトース、トレハロース、セロビオース、及びそれらの組み合わせが挙げられる。適する多糖類の一部の非限定的な例としては、デンプン、グリコーゲン、セルロース、キチン、及びそれらの組み合わせが挙げられる。他の炭水化物源としては、キビ汁及び糖蜜が挙げられる。
【０１２０】
一般に、多糖類は、宿主細胞のための炭素源として使われる前に、化学的手段又は酵素法によって先ず単糖類及びオリゴ糖類に変換される。例えば、セルロースを酵素セルラーゼによってグルコースに変換することができる。一定の実施形態において、多糖類の分解後、単糖類及び／又はオリゴ糖類は、発酵の開始時に判定すると、その炭素源の少なくとも約５０重量％を構成する。他の実施形態において、単糖類及び／又はオリゴ糖類は、発酵の開始時に判定すると、その炭素源の少なくとも約８０重量％を又は９０重量％までもを構成するので、その発酵培地はセルロースを本質的には含まない。
【０１２１】
一定の実施形態では、エタノールが炭素源として宿主細胞に外因的に供給される。他の実施形態では、宿主細胞によって炭素源として消費されるエタノールは、それらの宿主細胞によって作られた。言い換えると、非エタノール炭素源（概して炭水化物）が宿主細胞に供給され、それが宿主細胞によってエタノールに変換され、その後、エタノールは宿主細胞によって消費される。
【０１２２】
宿主細胞のエタノール使用は、多数の方法で定量することができる。１つの方法では、エタノール濃度が用いられる。炭素源であることに加えて、培地中のエタノールの存在は、微生物汚染物質を阻止するという有益な効果も有する。
【０１２３】
従って、１つの実施形態において、培地中のエタノール濃度は、少なくとも４時間、培地のリットル当たり少なくとも約１グラムである。前記エタノール濃度は、当該分野において公知のいずれの方法によって決定してもよい。培地をサンプリングすることによって直接測定してもよく、又はオフガスをサンプリングすることによって間接的に測定してもよい。質量分光光度計によるオフガス分析などの間接法を用いる場合、先ず、百万分率でのオフガス測定値と培地中のエタノールの直接測定値との相関関係を確立しなければならない。他の実施形態において、培地中のエタノール濃度は、培地のリットル当たり約１グラムと約５グラムの間、約１グラムと約１０グラムの間、又は約１グラムと約２０グラムの間である。さらに他の実施形態において、培地中のエタノール濃度は、培地のリットル当たり約１０グラムより大きく、又は、培地のリットル当たり約２０グラムより大きい。さらに他の実施形態において、上のエタノール濃度は、少なくとも６時間、８時間、１０時間、１２時間、２４時間、又は４８時間維持される。
【０１２４】
しかし、宿主細胞は、検出できないレベルのエタノール又はゼロに近いエタノール濃度を有するにもかかわらず、エタノールを炭素源として使用し続ける場合がある。例えば、これは、エタノールが供給されるのと同じ速さで宿主細胞がエタノールを消費するときに発生し得る。結果として、宿主細胞のエタノール利用率の代替測度を本明細書において提供する。
【０１２５】
もう１つの実施形態において、宿主細胞は、１時間につき乾燥細胞重量のグラム当たり少なくとも０．０１グラムのエタノールという比エタノール消費速度を有する。他の実施形態において、前記比エタノール消費速度は、１時間につき乾燥細胞重量のグラム当たり約０．０１グラムと約０．２０グラムの間のエタノール、又は約０．０２グラムと約０．１０グラムの間のエタノールである。さらに他の実施形態において、前記比エタノール消費速度は、１時間につき乾燥細胞重量のグラム当たり約０．１０グラムのエタノールより大きい。前記比エタノール消費速度は、少なくとも４時間、６時間、８時間、１０時間、１２時間、２４時間、又は４８時間、維持される。
【０１２６】
あるいは、比エタノール消費速度は、１日につき乾燥細胞重量のグラム当たりのエタノールのグラム数によって表現される。一部の実施形態において、前記宿主細胞は、１日につき乾燥細胞重量のグラム当たり少なくとも０．２グラムのエタノールという比エタノール消費速度を有する。一部の実施形態において、前記比エタノール消費速度は、１日につき乾燥細胞重量のグラム当たり約０．２グラムと約５グラムの間、又は約０．５グラムと約３グラムの間のエタノールである。他の実施形態において、前記比エタノール消費速度は、１日につき乾燥細胞重量のグラム当たり約３グラムのエタノールより大きい。
【０１２７】
一定の実施形態において、前記細胞は、酸素によって制限されない条件下で培養又は維持される。言い換えると、前記細胞は、好気的条件下にある。
【０１２８】
しかし、完全好気的条件の維持は、特に大規模プロセス酸素（large scale processes oxygen）の場合、物質移動の限界及び水溶液への酸素の比較的低い溶解度のため難しい。例えば、タンクへのスパージ(sparge)に空気を用いた場合、水への酸素の溶解度は、２０℃でリットル当たり９ミリグラムである。空気ではなく純粋な酸素を用いた場合には、その溶解度がリットル当たり４３ミリグラムへと増加する。（空気をスパージする又は純粋な酸素をスパージする）いずれの場合も、この酸素量は、酸素が継続的に供給されない限り、活性な密集した微生物集団によって数秒のうちに使い尽くされる。比較では、同じ期間（数秒、例えば、１分未満）の間にそれらの細胞によって使われる他の養分の量は、体積濃度と比較すると無視できる。
【０１２９】
本発明者らは、本明細書に提供する宿主細胞が、多少の期間の酸素制限に耐えることができ、高レベルのイソプレノイド化合物を依然として作ることができることを発見した。この柔軟性が、タンク設計の点での節約、低減される酸素ガス領域、より低い通気エネルギー費用などをもたらすことによって、より経済的なプロセスを可能にする。さらに、一定の状況下では、酸素制限は有益であるようである。理論による拘束を受けないが、酸素制限条件下での細胞増殖は、より多くの炭素をバイオマス又は二酸化炭素による喪失にではなく産物に向かわせるようである。
【０１３０】
結論として、一定の他の実施形態において、宿主細胞は、酸素制限されている条件下で培養又は維持される。この酸素制限期間としては、少なくとも４時間、少なくとも６時間、少なくとも８時間、少なくとも１０時間、少なくとも１２時間、少なくとも２４時間、又は少なくとも４８時間が挙げられる。
【０１３１】
酸素制限は、宿主細胞の比増殖速度が、酸素が制限されない（例えば、過剰に供給される）場合の最大比増殖速度より低いとき、発生する。比増殖速度は、単位時間についてのバイオマスの単位当たりの細胞増殖の速度であり、逆数時間（１／ｔ）の単位を有する。培養培地中の細胞についての最大比増殖速度は、この場合は酸素である、増殖速度に対する基質濃度の影響に関係づけられる。一般に、細胞は、低い基質レベルではゆっくりと増殖し、そして培地中の基質のレベルが増すにつれて、細胞増殖速度も増すこととなる。しかし、細胞増殖の速度は、無期限には上昇し続けず、高い基質レベルでは、基質量の所与の増加が、細胞増殖速度の増加をどんどん小さくさせるであろう。従って、最終的に増殖速度は限界に達し、多くの場合、それが最大比増殖速度と呼ばれる。
【０１３２】
培養における増殖速度間の関係の理論処理は、当業者に周知であり、Ｍｏｎｏｄ式と呼ばれる。例えば、Pirt, Principles of Microbe and Cell Cultivation, Wiley, NY, 1975, pages 4-10を参照のこと。この理論処理において、最大比速度は、無限基質レベルに達するまで決して達することのない漸近的限界である。しかし、実際には、最大比増殖速度は、研究下の条件（例えば、酸素などの基質レベル）が最速の初期増殖速度を支援するときに得られると考えることができる。例えば、流加反応器の場合、増殖に必要なすべての基質（例えば、養分及び酸素）が過剰に供給され、発酵が宿主細胞にとって最適な温度で行われる初期条件が、最大増殖速度のための条件とみなされる。例えば、Lee et al. (1996) Trends Biotechnol. 14: 98-105及びKorz et al. (1995) J Biotechnology 39:59-65を参照のこと。最大比増殖速度は、時として、無限増殖とも呼ばれる。
【０１３３】
１つの方法において、酸素制限は、培地中の酸素濃度によって定量され、溶存酸素濃度（ＤＯＣ）によって表現される。培養培地中のＤＯＣは、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、及び約５％未満であり得る。他の実施形態において、ＤＯＣは、ほぼ０％又は検出レベル未満である。
【０１３４】
しかし、酸素が細胞によって比較的急速に消費されるため、ゼロのＤＯＣは、それらの細胞が嫌気的条件（無酸素）下で培養されていることを意味する場合もあり、又はそれらの細胞が、供給されるのと同じくらい速く酸素を消費していることを意味する場合もある。もう１つの方法では、細胞の酸素使用は、これらの２つの可能性を区別するために酸素摂取率（ＯＵＲ；培地のリットル当たりの細胞の酸素消費の割合）によって表現される。適する酸素摂取率としては、培地のリットル当たり約５０ｍｍｏｌ未満、約４０ｍｍｏｌ未満、約３０ｍｍｏｌ未満、約２０ｍｍｏｌ未満、又は培地のリットル当たり約１０ｍｍｏｌ未満が挙げられる。
【０１３５】
あるいは、細胞密度に関して正規化した値が好ましいときには、比酸素摂取速度（ＳＯＵＲ（細胞密度で割ったＯＵＲである））を用いることができる。発酵のリットル当たりの微生物の量、すなわち微生物の密度は、所与の体積の発酵培地から単離された微生物の重量を測定することによって測定することができる。一般的な測度は、発酵培地のリットル当たりの細胞の乾燥重量である。発酵を、それが進行している間、モニターするために用いることができるもう１つの方法は、その培地の光学密度の測定によるものである。一般的な方法は、ＯＤ６００と呼ばれる、６００ｎｍの波長での光学密度、すなわちＯＤ、を測定することである。このＯＤは、特定の培地中の特定のタイプの生物の密度と相関させることができるが、ＯＤと体積当たりの微生物の量との特異的関係は、一般に、すべてのタイプの培地中のすべてのタイプの生物にわたっては適用できないであろう。ある細胞密度範囲にわたってＯＤ及び乾燥細胞重量を測定することにより、較正曲線を作成することができる。場合によっては、これらの相関関係を、同じ又は類似の培地中の同じ又は類似の微生物の異なる発酵に用いることができることがある。適する比酸素摂取速度としては、１時間につき乾燥細胞重量のグラム当たり約３０ｍｍｏｌ未満、約２５ｍｍｏｌ未満、約２０ｍｍｏｌ未満、約１５ｍｍｏｌ未満、約１０ｍｍｏｌ未満、又は約５ｍｍｏｌ未満が挙げられる。
【０１３６】
本発明者らは、本明細書に提供する宿主細胞が、多少の期間のリン酸塩制限（phasphate limitation）に耐えることができ、高レベルのイソプレノイド化合物を依然として作ることができることを見出した。理論による拘束を受けないが、リン酸塩制限条件下での細胞増殖は、より多くの炭素をバイオマスではなく産物に向かわせるようである。培地中のリン酸塩の適する濃度は、培地のリットル当たり約５グラム未満、約４グラム未満、約３グラム未満、約２グラム未満、又は約１グラム未満である。一定の実施形態において、前記リン酸塩濃度は、ゼロ又は検出レベル未満である。そのようなリン酸塩制限期間としては、少なくとも４時間、少なくとも６時間、少なくとも８時間、少なくとも１０時間、少なくとも１２時間、少なくとも２４時間、又は少なくとも４８時間が挙げられる。
【０１３７】
（酸素制限される、リン酸塩制限される、又は両方）制限条件が課される前に宿主細胞を（最大比増殖に可能にする）非制限条件下で増殖させて、十分なバイオマスを作ることができる。これらの制限条件としては、比増殖が最大比増殖速度の約９０％、８０％、７５％、６０％、５０％、４０％、３０％、２５％、２０％、１０％、５％又は１％未満であるような条件が挙げられる。
【０１３８】
特定の実施形態を本明細書に提供するが、上述の説明は、例証のためのものであり、本実施形態の範囲を限定しない。本実施形態の範囲内の他の態様、利点、及び変形は、当業者には明らかであろう。
【実施例】
【０１３９】
別の指示が無い限り、当該分野の技能の範囲内である生合成産業などの従来の技術を用いて、本明細書に提供する実施形態を実施することができる。そのような技術が本明細書において十分に説明されていない範囲に関しては、科学文献の中でそれらへの豊富な論及を見つけることができる。
【０１４０】
以下の実施例は、用いる数（例えば、量、温度など）に関して正確さを確保するように努力したが、変動及び偏差を含む場合があり、また、万が一、本明細書に報告する数に関する誤記が存在する場合には、当業者は、本明細書中の残りの開示にかんがみて正しい量を導き出すことができる。別の指示が無い限り、温度は、摂氏度で報告し、圧力は、海面での大気圧である又はその付近の気圧である。別の指示が無い限り、すべての試薬は、市場で得た。以下の実施例は、説明目的だけのためのものであり、本明細書に提供する実施形態の範囲を如何なる点においても限定しない。
【０１４１】
実施例１
この実施例は、サッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）の特定の染色体位置への、ＭＥＶ経路の酵素をはじめとする酵素をコードする核酸の、ターゲッティングされた組込みのためのベクターを作る方法を説明するものである。
【０１４２】
サッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）株Ｙ００２及びＹ００３（ＣＥＮ．ＰＫ２バックグラウンドＭＡＴＡ又はＭＡＴα ｕｒａ３−５２ ｔｒｐ１−２８９ ｌｅｕ２−３、１１２ ｈｉｓ３Δ１ ＭＡＬ２−８Ｃ ＳＵＣ２）（van Dijken et al. (2000) Enzyme Microb. Technol. 26:706-714)、Ｙ００７（Ｓ２８８ＣバックグラウンドＭＡＴＡ ｔｒｐ１Δ６３）（ＡＴＣＣ番号２００８７３）、ならびにＥＧ１２３（ＭＡＴＡ ｕｒａ３ ｔｒｐ１ ｌｅｕ２ ｈｉｓ４ ｃａｎ１）（Michaelis & Herskowitz. (1988) Mol. Cell. Biol. 8: 1309-1318）からゲノムＤＮＡを単離した。１％ 酵母エキスと２％ バクト−ペプトンと２％ デキストロースとを含有する液体培地（ＹＰＤ培地）中で一晩、これらの株を増殖させた。３，１００ｒｐｍで遠心分離し、１０ｍＬ 超純水で細胞ペレットを洗浄し、再び遠心分離することによって、１０ｍＬ 液体培養物から細胞を単離した。Ｙ−ＤＥＲ酵母ＤＮＡ抽出キット（イリノイ州、ロックフォードのＰｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を製造業者が提案したプロトコルに従って使用してゲノムＤＮＡを抽出した。抽出したゲノムＤＮＡを１００ｕＬ １０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ８．５に再び懸濁させ、ＮＤ−１０００分光光度計（デラウェア州、ウィルミントンのＮａｎｏＤｒｏｐ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）でＯＤ２６０／２８０測定をして、ゲノムＤＮＡ濃度及び純度を決定した。
【０１４３】
Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅシステム（フィンランド、エスポーのＦｉｎｎｚｙｍｅｓ ＯＹ）を製造業者が提案したプロトコルに従って使用して、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ２７２０ Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ（カリフォルニア州、フォスターシティーのＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．）において、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるＤＮＡ増幅を行った。ＴＯＰＯ ＴＡ ｐＣＲ２．１クローニングベクター（カリフォルニア州、カールズバッドのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に挿入することとなるＤＮＡフラグメントのＰＣＲ増幅が完了したら、１ｕＬのＱｉａｇｅｎ Ｔａｑ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（カリフォルニア州、バレンシアのＱｉａｇｅｎ）をその反応混合物に添加し、さらに１０分間、７２℃ ＰＣＲ伸長工程を行い、その後、４℃に冷却することによって、ヌクレオチドオーバーハングを作った。ＰＣＲ増幅が完了したら、８ｕＬの５０％グリセロール溶液をその反応混合物に添加した。
【０１４４】
０．５ｕｇ／ｍＬ 臭化エチジウムを含有する１％ＴＢＥ（０．８９Ｍ Ｔｒｉｓ、０．８９Ｍ ホウ酸、０．０２Ｍ ＥＤＴＡナトリウム塩）アガロースゲルを使用して、１２０Ｖ、４００ｍＡで３０分間、アガロースゲル電気泳動を行った。紫外線を使用してＤＮＡバンドを可視化した。滅菌した安全かみそりの刃でそのゲルからＤＮＡバンドを切り取り、Ｚｙｍｏｃｌｅａｎ Ｇｅｌ ＤＮＡ Ｒｅｃｏｖｅｒｙ Ｋｉｔ（カリフォルニア州、オレンジのＺｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を製造業者が提案したプロトコルに従って用いて、その切り取ったＤＮＡをゲル精製した。その精製したＤＮＡを１０ｕＬ 超純水に溶出し、ＮＤ−１０００分光光度計でＯＤ２６０／２８０測定をしてＤＮＡ濃度及び純度を決定した。
【０１４５】
１００−５００ｕｇの精製ＰＣＲ産物及びＨｉｇｈ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ Ｔ４ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ（マサチューセッツ州、イプスウィッチのＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を製造業者が提案したプロトコルに従って用いてライゲーションを行った。プラスミド増殖のために、ライゲートした構築物を、大腸菌（Escherichia coli）ＤＨ５α化学的コンピテント細胞（カリフォルニア州、カールズバッドのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に、製造業者が提案したプロトコルに従って形質転換した。１．５％ Ｂａｃｔｏ Ａｇａｒと１％ トリプトンと０．５％ 酵母エキスと１％ ＮａＣｌと適切な抗生物質とを含有する固体培地を用いて、陽性形質転換体を選択した。単離した形質転換体を、１６時間、適切な抗生物質を含有する液体Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔｏｎｉ（ＬＢ）培地中、３７℃で増殖させ、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ（カリフォルニア州、バレンシアのＱｉａｇｅｎ）を製造業者が提案したプロトコルに従って使用してプラスミドを単離して精製した。診断用制限酵素消化を行い、アガロースゲルでＤＮＡフラグメントを分割し、紫外線を使用してそれらのバンドを可視化することによって、構築物を検証した。選択構築物をＤＮＡ塩基配列決定によっても検証し、これは、Ｅｌｉｍ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．（カリフォルニア州、ヘイワード）が行った。
【０１４６】
プラスミドｐＡＭ４８９は、ベクターｐＡＭ４７１のＥＲＧ２０−ＰＧＡＬ−ｔＨＭＧＲインサートをベクターｐＡＭ４６６に挿入することによって生じさせた。ベクターｐＡＭ４７１は、サッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）のＥＲＧ２０遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）（ＥＲＧ２０ヌクレオチド位置１から１２０８；ＡＴＧ開始コドンのＡがヌクレオチド１である）（ＥＲＧ２０）と、サッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）の互いに異なるＧＡＬ１及びＧＡＬ１０プロモーターを含有するゲノム座（ＧＡＬ１ヌクレオチド位置−１から−６６８）（ＰＧＡＬ）と、サッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）のＨＭＧ１遺伝子のトランケートされたＯＲＦ（ＨＭＧ１ヌクレオチド位置１５８６から３３２３）（ｔＨＭＧＲ）とを含むＤＮＡフラグメントＥＲＧ２０−ＰＧＡＬ−ｔＨＭＧＲを、ＴＯＰＯ Ｚｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ ＩＩクローニングベクター（カリフォルニア州、カールズバッドのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に挿入することによって生じさせた。ベクターｐＡＭ４６６は、ヌクレオチド位置−８５６から位置５４８に広がるセグメントであって、塩基−２２６と−２２５の間に非天然内部ＸｍａＩ制限部位を保有するサッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）の野生型ＴＲＰ１遺伝子座のセグメントを含むＤＮＡフラグメントＴＲＰ１−８５６から＋５４８（ＴＲＰ１−８５６〜＋５４８）を、ＴＯＰＯ ＴＡ ｐＣＲ２．１クローニングベクター（カリフォルニア州、カールズバッドのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に挿入することによって生じさせた。ＤＮＡフラグメントＥＲＧ２０−ＰＧＡＬ−ｔＨＭＧＲ及びＴＲＰ１−８５６から＋５４８は、表１において概説するようなＰＣＲ増幅によって生じさせた。ｐＡＭ４８９の構築のために、ＸｍａＩ制限酵素（マサチューセッツ州、イプスウィッチのＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用して４００ｎｇのｐＡＭ４７１及び１００ｎｇのｐＡＭ４６６を最後まで消化し、ＥＲＧ２０−ＰＧＡＬ−ｔＨＭＧＲインサート及び線形化されたｐＡＭ４６６ベクターに対応するＤＮＡフラグメントをゲル精製し、４モル当量のその精製インサートを１モル当量のその精製線形化ベクターとライゲートしてｐＡＭ４８９を得た。図４Ａは、ＥＲＧ２０−ＰＧＡＬ−ｔＨＭＧＲインサートのマップを示し、配列番号：１は、隣接ＴＲＰ１配列を伴うそのインサートのヌクレオチド配列を示す。
【表１】
【０１４７】
プラスミドｐＡＭ４９１は、ベクターｐＡＭ４７２のＥＲＧ１３−ＰＧＡＬ−ｔＨＭＧＲインサートをベクターｐＡＭ４６７に挿入することによって生じさせた。ベクターｐＡＭ４７２は、サッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）のＥＲＧ１３遺伝子のＯＲＦ（ＥＲＧ１３ヌクレオチド位置１から１６２６）（ＥＲＧ１３）と、サッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）の互いに異なるＧＡＬ１及びＧＡＬ１０プロモーターを含有するゲノム座（ＧＡＬ１ヌクレオチド位置−１から−６６８）（ＰＧＡＬ）と、サッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）のＨＭＧ１遺伝子のトランケートされたＯＲＦ（ＨＭＧ１ヌクレオチド位置１５８６から３３２３）（ｔＨＭＧＲ）とを含むＤＮＡフラグメントＥＲＧ１３−ＰＧＡＬ−ｔＨＭＧＲを、ＴＯＰＯ Ｚｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ ＩＩクローニングベクターに挿入することによって生じさせた。ベクターｐＡＭ４６７は、ヌクレオチド位置−７２３から位置−２２４に広がるセグメントであって、塩基−２２４と−２２３の間に非天然内部ＸｍａＩ制限部位を保有するサッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）の野生型ＵＲＡ３遺伝子座のセグメントを含むＤＮＡフラグメントＵＲＡ３−７２３から７０１を、ＴＯＰＯ ＴＡ ｐＣＲ２．１クローニングベクターに挿入することによって生じさせた。ＤＮＡフラグメントＥＲＧ１３−ＰＧＡＬ−ｔＨＭＧＲ及びＵＲＡ３−７２３から７０１は、表２において概説するようなＰＣＲ増幅によって生じさせた。ｐＡＭ４９１の構築のために、ＸｍａＩ制限酵素を使用して４００ｎｇのｐＡＭ４７２及び１００ｎｇのｐＡＭ４６７を最後まで消化し、ＥＲＧ１３−ＰＧＡＬ−ｔＨＭＧＲインサート及び線形化されたｐＡＭ４６７ベクターに対応するＤＮＡフラグメントをゲル精製し、４モル当量のその精製インサートを１モル当量のその精製線形化ベクターとライゲートしてｐＡＭ４９１を得た。図４Ｂは、ＥＲＧ１３−ＰＧＡＬ−ｔＨＭＧＲインサートのマップを示し、配列番号：２は、隣接ＵＲＡ３配列を伴うそのインサートのヌクレオチド配列を示す。
【表２】
【０１４８】
プラスミドｐＡＭ４９３は、ベクターｐＡＭ４７３のＩＤＩ１−ＰＧＡＬ−ｔＨＭＧＲインサートをベクターｐＡＭ４６８に挿入することによって生じさせた。ベクターｐＡＭ４７３は、サッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）のＩＤＩ１遺伝子のＯＲＦ（ＩＤＩ１ヌクレオチド位置１から１０１７）（ＩＤＩ１）と、サッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）の互いに異なるＧＡＬ１及びＧＡＬ１０プロモーターを含有するゲノム座（ＧＡＬ１ヌクレオチド位置−１から−６６８）（ＰＧＡＬ）と、サッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）のＨＭＧ１遺伝子のトランケートされたＯＲＦ（ＨＭＧ１ヌクレオチド位置１５８６から３３２３）（ｔＨＭＧＲ）とを含むＤＮＡフラグメントＩＤＩ１−ＰＧＡＬ−ｔＨＭＧＲを、ＴＯＰＯ Ｚｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ ＩＩクローニングベクターに挿入することによって生じさせた。ベクターｐＡＭ４６８は、ヌクレオチド位置−２２５から位置６５３に広がるセグメントであって、塩基−２２６と−２２５の間に非天然内部ＸｍａＩ制限部位を保有するサッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）の野生型ＡＤＥ１遺伝子座のセグメントを含むＤＮＡフラグメントＡＥＤ１−８２５から６５３を、ＴＯＰＯ ＴＡ ｐＣＲ２．１クローニングベクターに挿入することによって生じさせた。ＤＮＡフラグメントＩＤＩ１−ＰＧＡＬ−ｔＨＭＧＲ及びＡＤＥ１−８２５から６５３は、表３において概説するようなＰＣＲ増幅によって生じさせた。ｐＡＭ４９３の構築のために、ＸｍａＩ制限酵素を使用して４００ｎｇのｐＡＭ４７３及び１００ｎｇのｐＡＭ４６８を最後まで消化し、ＩＤＩ１−ＰＧＡＬ−ｔＨＭＧＲインサート及び線形化されたｐＡＭ４６８ベクターに対応するＤＮＡフラグメントをゲル精製し、４モル当量のその精製インサートを１モル当量のその精製線形化ベクターとライゲートしてベクターｐＡＭ４９３を得た。図４Ｃは、ＩＤＩ１−ＰＧＡＬ−ｔＨＭＧＲインサートのマップを示し、配列番号：３は、隣接ＡＤＥ１配列を伴うそのインサートのヌクレオチド配列を示す。
【表３】
【０１４９】
プラスミドｐＡＭ４９５は、ｐＡＭ４７４のＥＲＧ１０−ＰＧＡＬ−ＥＲＧ１２インサートをベクターｐＡＭ４６９に挿入することによって生じさせた。ベクターｐＡＭ４７４は、サッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）のＥＲＧ１０遺伝子のＯＲＦ（ＥＧＲ１０ヌクレオチド位置１から１３４７）（ＥＲＧ１０）と、サッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）の互いに異なるＧＡＬ１及びＧＡＬ１０プロモーターを含有するゲノム座（ＧＡＬ１ヌクレオチド位置−１から−６６８）（ＰＧＡＬ）と、サッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）のＥＲＧ１２遺伝子のＯＲＦ（ＥＲＧ１２ヌクレオチド位置１から１４８２）（ＥＲＧ１２）とを含むＤＮＡフラグメントＥＲＧ１０−ＰＧＡＬ−ＥＲＧ１２を、ＴＯＰＯ Ｚｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ ＩＩクローニングベクターに挿入することによって生じさせた。ベクターｐＡＭ４６９は、ヌクレオチド位置−３２から位置−１０００及びヌクレオチド位置５０４から位置１１０３に広がるサッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）のＨＩＳ遺伝子座の２つのセグメント、ＨＩＳＭＸマーカー、及びそのＨＩＳ３５０４から−１１０３配列とそのＨＩＳＭＸマーカーの間の非天然ＸｍａＩ制限部位を含む、ＤＮＡフラグメントＨＩＳ３−３２から−１０００−ＨＩＳＭＸ−ＨＩＳ３５０４から−１１０３を、ＴＯＰＯ ＴＡ ｐＣＲ２．１クローニングベクターに挿入することによって生じさせた。ＤＮＡフラグメントＥＲＧ１０−ＰＧＡＬ−ＥＲＧ１２及びＨＩＳ３−３２から−１０００−ＨＩＳＭＸ−ＨＩＳ３５０４から−１１０３は、表４において概説するようなＰＣＲ増幅によって生じさせた。ｐＡＭ４９５の構築のために、ＸｍａＩ制限酵素を使用して４００ｎｇのｐＡＭ４７４及び１００ｎｇのｐＡＭ４６９を最後まで消化し、ＥＲＧ１０−ＰＧＡＬ−ＥＲＧ１２インサート及び線形化されたｐＡＭ４６９ベクターに対応するＤＮＡフラグメントをゲル精製し、４モル当量のその精製インサートを１モル当量のその精製線形化ベクターとライゲートしてベクターｐＡＭ４９５を得た。図４Ｄは、ＥＲＧ１０−ＰＧＡＬ−ＥＲＧ１２インサートのマップを示し、配列番号：４は、隣接ＨＩＳ３配列を伴うそのインサートのヌクレオチド配列を示す。
【表４】
【０１５０】
プラスミドｐＡＭ４９７は、ｐＡＭ４７５のＥＲＧ８−ＰＧＡＬ−ＥＲＧ１９インサートをベクターｐＡＭ４７０に挿入することによって生じさせた。ベクターｐＡＭ４７５は、サッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）のＥＲＧ８遺伝子のＯＲＦ（ＥＲＧ８ヌクレオチド位置１から１５１２）（ＥＲＧ８）と、サッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）の互いに異なるＧＡＬ１及びＧＡＬ１０プロモーターを含有するゲノム座（ＧＡＬ１ヌクレオチド位置−１から−６６８）（ＰＧＡＬ）と、サッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）のＥＲＧ１９遺伝子のＯＲＦ（ＥＲＧ１９ヌクレオチド位置１から１３４１）（ＥＲＧ１９）とを含むＤＮＡフラグメントＥＲＧ８−ＰＧＡＬ−ＥＲＧ１９を、ＴＯＰＯ Ｚｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ ＩＩクローニングベクターに挿入することによって生じさせた。ベクターｐＡＭ４７０は、ヌクレオチド位置−１００から位置４５０及びヌクレオチド位置１０９６から位置１７７０に広がるサッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）のＬＥＵ２遺伝子座の２つのセグメント、ＨＩＳＭＸマーカー、及びそのＬＥＵ２１０９６から１７７０配列とそのＨＩＳＭＸマーカーの間の非天然ＸｍａＩ制限部位を含む、ＤＮＡフラグメントＬＥＵ２−１００から４５０−ＨＩＳＭＸ−ＬＥＵ２１０９６から１７７０を、ＴＯＰＯ ＴＡ ｐＣＲ２．１クローニングベクターに挿入することによって生じさせた。ＤＮＡフラグメントＥＲＧ８−ＰＧＡＬ−ＥＲＧ１９及びＬＥＵ２−１００から４５０−ＨＩＳＭＸ−ＬＥＵ２１０９６から１７７０は、表５において概説するようなＰＣＲ増幅によって生じさせた。ｐＡＭ４９７の構築のために、ＸｍａＩ制限酵素を使用して４００ｎｇのｐＡＭ４７５及び１００ｎｇのｐＡＭ４７０を最後まで消化し、ＥＲＧ８−ＰＧＡＬ−ＥＲＧ１９インサート及び線形化されたｐＡＭ４７０ベクターに対応するＤＮＡフラグメントを精製し、４モル当量のその精製インサートを１モル当量のその精製線形化ベクターとライゲートしてベクターｐＡＭ４９７を得た。図４Ｅは、ＥＲＧ８−ＰＧＡＬ−ＥＲＧ１９インサートのマップを示し、配列番号：５は、隣接ＬＥＵ２配列を伴うそのインサートのヌクレオチド配列を示す。
【表５】
【０１５１】
実施例２
この実施例は、本明細書に提供する実施形態において有用なプラスミド及びＤＮＡフラグメントを作る方法を説明するものである。
【０１５２】
プラスミドｐＡＭ５８４は、ＤＮＡフラグメントＧＡＬ７４から１０２１−ＨＰＨ−ＧＡＬ１１６３７から２５８７をＴＯＰＯ ＺＥＲＯ Ｂｌｕｎｔ ＩＩクローニングベクター（カリフォルニア州、カールズバッドのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に挿入することによって生じさせた。ＤＮＡフラグメントＧＡＬ７４から１０２１−ＨＰＨ−ＧＡＬ１１６３７から２５８７は、サッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）のＧＡＬ７遺伝子のＯＲＦ（ＧＡＬ７ヌクレオチド位置４から１０２１）（ＧＡＬ７４から１０２１）、ヒグロマイシン耐性カセット（ＨＰＨ）、及びサッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）のＧＡＬ１遺伝子の３’非翻訳領域（ＵＴＲ）のセグメント（ＧＡＬ１ヌクレオチド位置１６３７から２５８７）を含む。このＤＮＡフラグメントは、表６において概説するようなＰＣＲ増幅によって生じさせた。図４Ｆは、ＤＮＡフラグメントＧＡＬ７４から１０２１−ＨＰＨ−ＧＡＬ１１６３７から２５８７のマップ及び配列番号：９ヌクレオチド配列を示す。
【表６】
【０１５３】
ＤＮＡフラグメントＧＡＬ８０−５０から−１−ＮａｔＲ−ＧＡＬ８０１３０９から１３５８は、ＰＣＲ増幅によって生じさせた。このＤＮＡフラグメントは、サッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）のＧＡＬ８０遺伝子のコーディング領域の直ぐ上流及び直ぐ下流（それぞれ、ＧＡＬ８０ヌクレオチド位置−５０から−１及び１３０９から１３５８；ＧＡＬ８０−５０から−１及びＧＡＬ８０１３０９から１３５８）にそれぞれ位置する５０ヌクレオチドの２つのセグメントが隣接している、ストレプトマイセス・ナーセイ（Streptomyces noursei）のナーセオトリシン（nourseothricin）耐性選択可能マーカー遺伝子（ＮａｔＲ）を含む。図４Ｇは、ＤＮＡフラグメントＧＡＬ８０−５０から−１−ＮａｔＲ−ＧＡＬ８０１３０９から１３５８のマップ及び配列番号：８ヌクレオチド配列を示す。
【０１５４】
ＤＮＡフラグメントＧＡＬ１１から４８−ＮａｔＲ−ＧＡＬ１１５００から１５５０は、ＰＣＲ増幅によって生じさせた。このＤＮＡフラグメントは、サッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）のＧＡＬ１遺伝子のコーディング領域の５’及び３’末端にそれぞれ位置する４０から５０ヌクレオチドの２つのセグメントが隣接している、ストレプトマイセス・ナーセイ（Streptomyces noursei）のナーセオトリシン耐性選択可能マーカー遺伝子（ＮａｔＲ）を含む（それぞれ、ＧＡＬ１ヌクレオチド位置１から４８及び１５００から１５５０；ＧＡＬ１１から４８及びＧＡＬ１１５００から１５５０）。図４Ｈは、ＤＮＡフラグメントＧＡＬ１１から４８−ＮａｔＲ−ＧＡＬ１１５００から１５５０のマップ及び配列番号：６８ヌクレオチド配列を示す。
【０１５５】
発現プラスミドｐＡＭ３５３は、β−ファルネセンシンターゼをコードするヌクレオチド配列をｐＲＳ４２５−Ｇａｌｌベクター（Mumberg et al. (1994) Nucl. Acids. Res. 22(25):5767-5768）に挿入することによって生じさせた。このヌクレオチド配列インサートは、サッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）における発現のためにコドン最適化されたクソニンジン（Artemisia annua）のβ−ファルネセンシンターゼ遺伝子のコーディング配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ８３５３９８）（配列番号：１０）をテンプレートとして使用して合成により生じさせた。その合成により生じさせたヌクレオチド配列には５’ＢａｍＨＩ及び３’ＸｈｏＩ制限部位が隣接しており、従って、標準ｐＵＣ又はｐＡＣＹＣ由来ベクターなどのクローニングベクターに適合する制限部位にそれをクローニングすることができた。ＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩ制限酵素を使用してＤＮＡ合成構築物を最後まで消化することによって、その合成により生じさせたヌクレオチド配列を単離した。その反応混合物をゲル電気泳動によって分割し、β−ファルネセンシンターゼコーディング配列を含むおよそ１．７ｋｂのＤＮＡフラグメントをゲル抽出し、単離されたＤＮＡフラグメントをｐＲＳ４２５−ＧａｌｌベクターのＢａｍＨＩ ＸｈｏＩ制限部位にライゲートして発現プラスミドｐＡＭ３５３を得た。
【０１５６】
発現プラスミドｐＡＭ４０４は、サッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）における発現のためにコドン最適化された、クソニンジン（Artemisia annua）のβ−ファルネセンシンターゼをコードするヌクレオチド配列を、ベクターｐＡＭ１７８（配列番号：６９）に挿入することによって生じさせた。プライマー５２−８４ ｐＡＭ３２６ ＢａｍＨＩ（配列番号：７１）及び５２−８４ ｐＡＭ３２６ＮｈｅＩ（配列番号：７２）を使用して、β−ファルネセンシンターゼをコードするそのヌクレオチド配列をｐＡＭ３５３からＰＣＲ増幅させた。結果として生じたＰＣＲ産物を、ＢａｍＨＩ及びＮｈｅＩ制限酵素を使用して最後まで消化し、その反応混合物をゲル電気泳動によって分割し、β−ファルネセンシンターゼコーディング配列を含むおよそ１．７ｋｂのＤＮＡフラグメントをゲル抽出し、単離されたＤＮＡフラグメントをベクターｐＡＭ１７８のＢａｍＨＩ ＮｈｅＩ制限部位にライゲートして発現プラスミドｐＡＭ４０４を得た（プラスミドマップについては図５を参照のこと）。
【０１５７】
実施例３
この実施例は、本明細書に提供する実施形態において有用なサッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）株の産生を説明するものである。
【０１５８】
サッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）株：ＣＥＮ．ＰＫ２−１Ｃ Ｙ００２及びＹ００３（ＭＡＴＡ又はＭＡＴアルファ；ｕｒａ３−５２；ｔｒｐ１−２８９；ｌｅｕ２−３、１１２；ｈｉｓ３Δ１；ＭＡＬ２−８Ｃ；ＳＵＣ２）（van Dijken et al. (2000) Enzyme Microb. Technol. 26(9-10):706-714）は、ＥＲＧ９プロモーターをサッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）ＭＥＴ３プロモーターで、及びＡＤＥ１ ＯＲＦをカンジダ・グラブラタ（Candida glabrata）ＬＥＵ２遺伝子（ＣｇＬＥＵ２）で置換することによって、誘発性ＭＥＶ経路遺伝子の導入のために作製した。これは、天然ＥＲＧ９プロモーターに相同の４５の塩基対を含むプライマー５０−５６−ｐｗ１００−Ｇ（配列番号：１０）及び５０−５６−ｐｗ１０１−Ｇ（配列番号：１１）を使用して、クリュイベロミセス・ラクティス（Kluyveromyces lactis）のＴｅｆ１遺伝子のプロモーター及びターミネーターが隣接しているカナマイシン耐性マーカーに続くＰＭＥＴ３プロモーターを含む、ベクターｐＡＭ３２８のＫａｎＭＸ−ＰＭＥＴ３領域（配列番号：６）をＰＣＲ増幅させること、１０ｕｇの結果として生じたＰＣＲ産物を、４０％ ｗ／ｗ ポリエチレングリコール３３５０（ミズーリ州、セントルイスのＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、１００ｍＭ 酢酸リチウム（ミズーリ州、セントルイスのＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）及び１０ｕｇ サケ精子ＤＮＡ（カリフォルニア州、カールズバッドのＩｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．）を使用して、指数増殖しているＹ００２及びＹ００３細胞に形質転換すること、及びそれらの細胞を３０℃で３０分間インキュベートし、その後、それらに４２℃で３０分間熱ショックを与えることによって行った（Schiestl and Gietz (1989) Curr. Genet. 16:399-346）。０．５ｕｇ／ｍＬ ゲネチシンを含有するリッチ培地（カリフォルニア州、カールズバッドのＩｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．）で増殖するそれらの能力によって陽性組換え体を同定し、選択したコロニーを診断ＰＣＲによって確認した。結果として得られたクローンにＹ９３（ＭＡＴ Ａ）及びＹ９４（ＭＡＴ アルファ）という呼称を与えた。その後、ＡＤＥ１ ＯＲＦに隣接する相同性の５０の塩基対を含有するプライマー６１−６７−ＣＰＫ０６６−Ｇ（配列番号：６０）及び６１−６７−ＣＰＫ０６７−Ｇ（配列番号：６１）を使用して、カンジダ・グラブラタ（Candida glabrata）ゲノムＤＮＡ（バージニア州、マナッサスのＡＴＣＣ）から３．５ｋｂ ＣｇＬＥＵ２ゲノム座を増幅し、１０ｕｇの結果として生じたＰＣＲ産物を、指数増殖しているＹ９３及びＹ９４細胞に形質転換させ、ロイシン補足の不在下での増殖について陽性組換え体を選択し、選択したクローンを診断ＰＣＲによって確認した。結果として得られたクローンにＹ１７６（ＭＡＴ Ａ）及びＹ１７７（ＭＡＴ アルファ）という呼称を与えた。
【０１５９】
株Ｙ１８８は、Ｐｍｅｌ制限酵素（マサチューセッツ州、ベヴァリーのＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用してｐＡＭ４９１及びｐＡＭ４９５プラスミドＤＮＡを最後まで消化すること、及び精製されたＤＮＡインサートを指数増殖しているＹ１７６細胞に導入することによって生じさせた。ウラシル及びヒスチジンを欠く培地での増殖によって陽性組換え体を選択し、正しいゲノム座への組込みを診断ＰＣＲによって確認した。
【０１６０】
株Ｙ１８９は、Ｐｍｅｌ制限酵素を使用してｐＡＭ４８９及びｐＡＭ４９７プラスミドＤＮＡを最後まで消化すること、及び精製されたＤＮＡインサートを指数増殖しているＹ１７７細胞に導入することによって生じさせた。トリプトファン及びヒスチジンを欠く培地での増殖によって陽性組換え体を選択し、正しいゲノム座への組込みを診断ＰＣＲによって確認した。
【０１６１】
株Ｙ１８８及びＹ１８９からのおよそ１Ｘ１０７の細胞をＹＰＤ培地プレート上で６時間、室温で混合してマッチングに備えた。ヒスチジン、ウラシル及びトリプトファンを欠く培地にその混合細胞培養物をプレーティングして、二倍体細胞の増殖について選択した。株Ｙ２３８は、ＰｍｅＩ制限酵素を使用して最後まで消化したｐＡＭ４９３プラスミドＤＮＡを使用してその二倍体細胞を形質転換すること、及び精製されたＤＮＡを指数増殖している二倍体細胞に導入することによって生じさせた。アデニンを欠く培地での増殖によって陽性組換え体を選択し、正しいゲノム座への組込みを診断ＰＣＲによって確認した。
【０１６２】
半数体株Ｙ２１１（ＭＡＴ アルファ）は、２％ 酢酸カリウム及び０．０２％ ラフィノース液体培地中で株Ｙ２３８を胞子形成させること、Ｓｉｎｇｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ ＭＳＭ３００シリーズ・マイクロマニピュレーター（英国、サマセットのＳｉｎｇｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ ＬＴＤ）を使用しておよそ２００の遺伝子四分子を単離すること、導入された遺伝物質の適切な補体を含有する独立した遺伝子の分離株を、アデニン、ヒスチジン、ウラシル及びトリプトファンの不在下で増殖するそれらの能力によって同定すること、及び導入されたすべてのＤＮＡの組込みを診断ＰＣＲにより確認することによって生じさせた。
【０１６３】
株Ｙ２２７は、株Ｙ２１１から、その株がＦＰＰをアモルファ−４，１１−ジエンに変換できるようにすることによって生じさせた。この目的のために、指数増殖しているＹ２１１細胞を、サッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）における発現のためにコドン最適化されているアモルファ−４，１１−ジエンシンターゼ遺伝子のコーディング配列に作動可能に連結されたＧＡＬ１プロモーターを含む発現プラスミドｐＡＭ４２６（配列番号：７）で形質転換させた（Merke et al. (2000) Ach. Biochem. Biophys. 381: 173-180）。ロイシンを欠く完全合成培地で宿主細胞形質転換体を選択した。
【０１６４】
株Ｙ２９３は、株Ｙ２２７から、ＧＡＬ８０遺伝子のコーディング配列を欠失させること、及び従ってその株におけるＧＡＬプロモーターを構成的に活性にすることによって生じさせた。この目的のために、指数増殖しているＹ２７７細胞をＤＮＡフラグメントＧＡＬ８０−５０から−１−ＮａｔＲ−ＧＡＬ８０１３０９から１３５８で形質転換させた。１００μｇ／ｍＬ ナーセオトリシンを含有するＹＰＤ寒天で宿主細胞形質転換体を選択し、単コロニーを選び取り、正しいゲノム座への組込みを診断ＰＣＲによって確認した。
【０１６５】
株Ｙ３３７は、株Ｙ２２７から、その株がガラクトースを異化できないようにすることによって生じさせた。この目的のために、ＰｍｅＩ制限酵素を使用してｐＡＭ５８４プラスミドＤＮＡを最後まで消化し、精製されたＤＮＡインサートＧＡＬ７４から１０２１−ＨＰＨ−ＧＡＬ１１６３７から２５８７を、指数増殖しているＹ２２７細胞に導入した。ヒグロマイシンＢを含有するＹＰＤ寒天（ミズーリ州、セントルイスのＳｉｇｍａ）での増殖によって陽性組換え体を選択した。診断ＰＣＲによって、及び炭素源としてガラクトースを使用できないことについてその株を検査することによって、正しいゲノム座への組込みを確認した。
【０１６６】
株Ｙ３５１は、株Ｙ２１１から、その株がガラクトースを異化できないようにすることによって生じさせた。この目的のために、ＰｍｅＩ制限酵素を使用してｐＡＭ５８４プラスミドＤＮＡを最後まで消化し、精製されたＤＮＡインサートＧＡＬ７４から１０２１−ＨＰＨ−ＧＡＬ１１６３７から２５８７を、指数増殖しているＹ２１１に導入した。ヒグロマイシンＢを含有するＹＰＤ寒天で宿主細胞形質転換体を選択した。診断ＰＣＲによって、及び炭素源としてガラクトースを使用できないことについてその株を検査することによって、正しいゲノム座への組込みを確認した。
【０１６７】
株Ｙ３５２は、株Ｙ３５１から、その株がβ−ファルネセンシンターゼを生産できるようにすることによって生じさせた。この目的のために、指数増殖しているＹ３５１細胞を発現プラスミドｐＡＭ４０４で形質転換させた。ロイシンを欠く完全合成培地で宿主細胞形質転換体を選択した。
【０１６８】
株Ｙ２８３は、株Ｙ２２７から、ＧＡＬ１遺伝子のコーディング配列を欠失させること、及び従ってその株がガラクトースを異化できないようにすることによって生じさせた。この目的のために、指数増殖しているＹ２２７細胞を、ＤＮＡフラグメントＧＡＬ１１から４８−ＮａｔＲ−ＧＡＬ１１５００から１５５０で形質転換させた。１００μｇ／ｍＬ ナーセオトリシンを含有するＹＰＤ寒天で宿主細胞形質転換体を選択し、単コロニーを選び取り、診断ＰＣＲによって、ならびにグリセロール及び２−デオキシガラクトースを含有する寒天でその株を増殖させることによって（機能性ＧＡＬ１ｐは、後者を毒素に変換するであろう）、正しいゲノム座への組込みを確認した。
【０１６９】
株Ｙ２２１は、指数増殖しているＹ２１１細胞をベクターｐＡＭ１７８（配列番号：６９）で形質転換することによって、株Ｙ２１１から生じさせた。ロイシンを欠く完全合成培地での増殖によって陽性形質転換体を選択した。
【０１７０】
株Ｙ２９０は、株Ｙ２２１から、ＧＡＬ８０遺伝子のコーディング配列を欠失させること、及び従ってその株におけるＧＡＬプロモーターを構成的に活性にすることによって生じさせた。
【０１７１】
株Ｙ３１８は、コロニーをｐＡＭ１７８ベクターの喪失についてスクリーニングすることによって、株Ｙ２９０から生じさせた。
【０１７２】
株４０９は、株Ｙ３１８から、その株がガラクトースの存在下でβ−ファルンセンシンターゼを生産できるようにすることによって生じさせた。この目的のために、指数増殖しているＹ３１８細胞を発現プラスミドｐＡＭ４０４で形質転換した。ロイシンを欠く完全合成培地で宿主細胞形質転換体を選択した。
【０１７３】
株Ｙ４１９は、株Ｙ４０９から、その株におけるＧＡＬプロモーターを構成的に活性にし、グルコースの存在下でより高いレベルのＧＡＬ４ｐを発現できる（すなわち、グルコースの存在下でガラクトース誘導性プロモーターをより効率的に発現させることができる、ならびにその細胞におけるすべてのガラクトース誘導性プロモーターから発現させるさせるために十分なＧａｌ４ｐ転写因子が確実に存在するようにできる）ようにすることによって生じさせた。この目的のために、その天然プロモーターの「効力のある構成的な」異形（Griggs & Johnston (1991) PNAS 88(19):8597-8601）及びＧＡＬ４ターミネーター（ＰＧａｌ４ＯＣ−ＧＡＬ４−ＴＧＡＬ４）の制御下にあるサッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）のＧＡＬ４遺伝子のＯＲＦと、クリュイベロミセス・ラクティス（Kluyveromyces lactis）のＴｅｆ１遺伝子のプロモーター及びターミネーターが隣接しているストレプトマイセス・ナーセイ（Streptomyces noursei）のナーセオトリシン耐性選択可能マーカー遺伝子（ＮａｔＲ）とを含むＤＮＡフラグメントによって、株Ｙ４０９におけるＥＲＧ９遺伝子座のＫａｎＭＸマーカーを置換した。
【０１７４】
株Ｙ６７７は、ＧＡＬ８０遺伝子座にＰＧＡＬ１の制御下でメバロン酸キナーゼのコーディング領域の別のコピーを導入することによって、株Ｙ４１９から生じさせた。
【０１７５】
株Ｙ２９３、Ｙ２８３、Ｙ３５２及びＹ６７７の細胞バンクは、それらの細胞を、３０℃で、シード培地において、それらが２から５の間のＯＤ６００に達するまで増殖させることによって作製した。ＯＤ６００に達した時点で、フラスコを氷の上に配置した。３部の培養物と２部の氷冷滅菌５０％グリセロールを併せ、この混合物の１ｍＬアリコートをクリオバイアルの中で−８０℃で冷凍した。同じ手順を株Ｙ３３７に用いたが、その株のＯＤ６００は、それを冷凍した時点で１３．６であった。
【０１７６】
実施例４
この実施例は、グルコースのみの供給での流加、炭素制限発酵における宿主細胞によるアモルファ−４，１１−ジエンの生産を説明するものである。
【０１７７】
５０ｍＬ シード培地（表７）が入っている２５０ｍＬ フラスコに１ｍＬ 冷凍バイアルを接種することによってＹ３３７シード培養物を調製した。３０℃で〜２４時間の増殖後、０．５ｍＬのその培養物を、５０ｍＬ シード培地がそれぞれに入っている追加の２５０ｍＬ フラスコに入れて継代培養した。それらのシード培養物を３０℃で一晩、およそ３から１２のＯＤ６００まで増殖させた。フラスコをプールし、それらを使用して、１０％ ｖ／ｖのバッチ培地（表８）が入っているバイオリアクターに接種した。
【表７】
【表８】
【表９】
【０１７８】
発酵のｐＨを自動制御し、１０Ｎ ＮＨ４ＯＨの添加でｐＨ５で維持した。温度を３０℃で維持した。空気流を１ＬＰＭの速度で供給した。攪拌カスケード、続いての酸素富化で、溶存酸素を４０％で維持した。Ｂｉｏｓｐｕｍｅｘ消泡剤２００Ｋで泡を制御した。
【０１７９】
そのバイオリアクター培養物を、バッチ培地中のグルコースが使い尽くされるまで放置して増殖させ、使い尽くされた時点で、下記方程式によって定義される速度でそのバイオリアクターにグルコース供給培地（表１０）をポンピングする指数的グルコース供給を開始した：
【化２２】
【０１８０】
Ｆは、基質質量流量（ｇ／時（ｇ／ｈｒ））であり、Ｖは、所与の時点でのバイオリアクター内の液体体積（Ｌ）であり、ＳＢは、バッチ培地中の基質の濃度（２０ｇ／Ｌ）であり、μｓｅｔは、比供給速度（０．０８７時−１）であり、ｔは、バッチ齢（batch age）（時）であり、ｔ０は、供給を開始したときのバッチ齢（時）であり、Ｖ０は、バイオリアクター内の初期体積であり、及び、Ｖｆｅｅｄは、バイオリアクターに添加された供給物の所与の時点での総体積（Ｌ）である。この指数的供給期は、Ｆ／Ｖの比が事前設定最大供給速度（表１１）に達するまで続いた。この最大値に達した後、Ｆ／Ｖの比を、その残りのプロセスの間、事前設定定常供給速度（表１１）で一定に保った。
【表１０】
【０１８１】
そのバイオリアクター及び供給ボトルへの１０ｇ／Ｌ ガラクトース（２２．２ｍＬの４５０ｇ／Ｌ ガラクトース保存溶液／リットル 培養物体積）の添加での接種の約２４時間後、５０のＯＤ６００でアモルファ−４，１１−ジエンの生産が誘導された。加えて、０．２５ｇ／Ｌ メチオニンをそのバイオリアクターに添加し、１ｇ／Ｌ メチオニンを供給ボトルに添加してＥＲＧ９遺伝子の転写を抑制し（１０ｍＬの２５ｇ／Ｌ メチオニン保存溶液／リットル 培養物体積及び４０ｍＬの２５ｇ／Ｌ メチオニン保存溶液／リットル 供給物体積）、ならびに１０％ ｖ／ｖのオートクレーブ処理済オレイン酸メチルをそのバイオリアクターに添加して、アモルファ−４，１１−ジエンを捕捉した。（４５０ｇ／Ｌ ガラクトース保存溶液は、加熱しながら糖を水に溶解し、その溶液を放置して冷却し、濾過滅菌することによって調製した。２５ｇ／Ｌ メチオニン保存溶液は、メチオニンを水に溶解し、その溶液を濾過滅菌することによって調製した）。
【０１８２】
様々な時点でサンプルを取り、１：２０の比でメタノールで希釈した。それぞれの希釈サンプルを３０分間、ボルテックスにかけ、培養物破壊片を回転沈降させた。内部標準としてのトランス−カリオフィレンでスパイクした９９０から９９５ｕＬ 酢酸エチルが入っている清浄なガラスバイアルに５から１０μＬの上清を移すことによって、アモルファ−４，１１−ジエン力価を判定した。それらの酢酸エチルサンプルを、水素炎イオン化検出器を装備したＡｇｌｉｅｎｔ ７８９０Ｎガスクロマトグラフ（カリフォルニア州、パロアルトのＡｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）で分析した。それぞれのサンプルの１ｕＬアリコート中の化合物を、ＤＢ Ｗａｘカラム（カリフォルニア州、パロアルトのＡｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）、ヘリウムキャリアガス及び次の温度プログラムを用いて分離した：２２０℃を３分間保持し、１００℃／分で２６０℃の温度に温度を上昇させる。このプロトコルを用いると、アモルファ−４，１１−ジエンは、およそ３．４分の保持時間を有する。生じたピーク面積を、トランス−カリオフィレンでスパイクした酢酸エチル中の精製アモルファ−４，１１−ジエンの定量較正曲線と比較することによって、アモルファ−４，１１−ジエン力価を計算した。
【０１８３】
表１１及び図６に示すように、株Ｙ３３７は、グルコースのみを供給するプロセスにおいて発酵の開始後１１４時間の時点で２．４ｇ／Ｌ アモルファ−４，１１−ジエン（ＡＤ）を生産した。
【表１１】
【０１８４】
実施例５
この実施例は、グルコース−エタノール混合供給での流加、炭素制限発酵における宿主細胞によるアモルファ−４，１１−ジエンの生産を説明するものである。
【０１８５】
実施例４において説明したように、Ｙ３３７シード培養物を調製し、バイオリアクターに接種するためにそれらを使用した。下記の変更を伴うが本質的には実施例４において説明したとおり、発酵を行ってサンプルを分析した。
【０１８６】
発酵の初期の間にバッチ培地中の一部のグルコースがエタノールに変換された。バッチ培地中のグルコース及びエタノールが使い尽くされるまでバイオリアクター培養物を放置して増殖させ、使い尽くされた時点で、下記方程式によって定義される速度でそのバイオリアクターに混合供給培地（表１０）をポンピングする指数的供給を開始した：
【化２３】
【０１８７】
Ｆは、基質質量流量（ｇ／時）であり、Ｖは、所与の時点でのバイオリアクター内の液体体積（Ｌ）であり、ＳＢは、バッチ培地中の基質の濃度（２０ｇ／Ｌ）であり、μｓｅｔは、比供給速度（０．０８７時−１）であり、ｔは、バッチ齢（時）であり、ｔ０は、供給を開始したときのバッチ齢（時）であり、Ｖ０は、バイオリアクター内の初期体積であり、及び、Ｖｆｅｅｄは、バイオリアクターに添加された供給物の所与の時点での総体積（Ｌ）である。この指数的供給期は、Ｆ／Ｖの比が、ｇ 基質／時／Ｌ バイオリアクター体積の単位での事前設定最大供給速度（表１１）に達するまで続いた。この最大値に達した後、Ｆ／Ｖの比を、その残りのプロセスの間、事前設定定常供給速度（表１１）で一定に保たった。
【０１８８】
接種の約４０時間後に７７のＯＤ６００でアモルファ−４，１１−ジエンの生産が誘導された。
【０１８９】
表１１及び図６に示すように、株Ｙ３３７は、混合グルコース−エタノール供給発酵では発酵開始後１１８時間の時点で最大１６．５ｇ／Ｌアモルファ−４，１１−ジエンを生産した。
【０１９０】
実施例６
この実施例は、エタノールのみの供給での流加、パルス供給発酵における宿主細胞によるアモルファ−４，１１−ジエンの生産を説明するものである。
【０１９１】
実施例３において説明したように、Ｙ２９３シード培養物を調製し、バイオリアクターに接種するためにそれらを使用した。下記の変更を伴うが本質的には実施例４において説明したとおり、発酵を行ってサンプルを分析した。
【０１９２】
発酵の初期の間にバッチ培地中の一部のグルコースがエタノールに変換された。バッチ培地中のグルコース及びエタノールが使い尽くされるまでバイオリアクター培養物を放置して増殖させ、使い尽くされた時点で、エタノールパルス供給を開始した。供給の速度は、オフガス中のＣＯ２のパーセント（ＣＯ２発生率；ＣＥＲ）によって制御し、オフガス分析器と、オフガス中のＣＯ２パーセントの最大値を追跡する最大ＣＥＲに変数（Ｃｍａｘ）を割り当てるコンピュータアルゴリズムとを用いて、それをモニターした。グルコースを用いて増殖している間にＣＥＲは急展開した（図７Ｂ）。バッチ培地からグルコースが使い尽くされると、ＣＥＲはＣｍａｘの５０％未満に降下し、その降下後、コンピュータアルゴリズムによってＣｍａｘがそのＣＯ２値に再設定された。バッチ培地中の過剰なグルコースから生じたエタノールが使い尽くされると、ＣＥＲは再度降下した。ＣＥＲがその時のＣｍａｘの７５％より下に落ちると、自動的にパルスフィードが誘発された。ポンプがバイオリアクターに５分間、７５％（ｖ／ｖ）エタノールを注入して、培養物におよそ１０ｇ エタノールを送達した。ポンプが切られた時点のオフガス中のＣＯ２パーセント値にＣｍａｘが再設定され、その後、ＣＯ２発生の増加を追跡するように再び指定され、そのＣＥＲが新たに設定されたＣｍａｘの７５％より下に再び落ちるとポンプは再び作動された。この供給アルゴリズムが、発酵の間、繰り返され（図７Ａ）、培地にエタノールが過剰供給されないことを保証した。塩、微量金属、ビタミン、糖又はアミノ酸溶液はいずれもエタノール供給物に可溶性でないため、濃縮供給成分（表１２）を併せ、１日１回、供給成分の前の添加以来、送達されたエタノール体積の量に応じてそのバイオリアクターのヘッドプレート内のセプタムを通して注入した。
【表１２】
【０１９３】
バッチ培地からグルコースが使い尽くされてから１０時間後、０．２５ｇ／Ｌ メチオニンをバイオリアクターにそのヘッドプレートを通して添加し、その容器に１０％ ｖ／ｖのオートクレーブ処理済オレイン酸メチルをポンピングした（株Ｙ２９３は分解ＧＡＬ８０遺伝子を含むので、アモルファ−４，１１−ジエンの生産を誘導するためにガラクトースは必要でなかった）。
【０１９４】
図７Ｂに示すように、株Ｙ２９３は、３６ｇ／Ｌ アモルファ−４，１１−ジエンを生産した。
【０１９５】
実施例７
この実施例は、エタノールのみの供給での流加、炭素制限発酵における宿主細胞によるアモルファ−４，１１−ジエンの生産を説明するものである。
【０１９６】
実施例３において説明したように、Ｙ２９３シード培養物を調製し、バッチ培地（表１３）が入っているバイオリアクターに接種するためにそれらを使用した。
【表１３】
【０１９７】
下記の変更を伴うが本質的には実施例４において説明したとおり、発酵を行ってサンプルを分析した。
【０１９８】
バッチ培地中のグルコースが使い尽くされるまでバイオリアクター培養物を放置して増殖させ、使い尽くされた時点で、下記方程式によって定義される速度でそのバイオリアクターにグルコース供給培地（表１０）をポンピングする指数的供給を開始した：
【化２４】
【０１９９】
Ｆは、基質質量流量（ｇ／時）であり、Ｖは、所与の時点での発酵槽内の液体体積（Ｌ）であり、ＳＢは、バッチ培地中の基質の濃度（２０ｇ／Ｌ）であり、μｓｅｔは、比供給速度（０．０８７時−１）であり、ｔは、バッチ齢（時）であり、ｔ０は、供給を開始したときのバッチ齢（時）であり、Ｖ０は、発酵槽内の初期体積であり、及び、Ｖｆｅｅｄは、発酵槽に添加された供給物の所与の時点での総体積（Ｌ）である。この指数的供給は、７．１ｇ／時／Ｌ最大供給速度（およそ５０のＯＤ６００）に達するまで続いた。達した時点で、その供給をエタノール供給（１９０プルーフ）に切替え、残りの発酵の間、供給速度を２．５ｇ／時／Ｌの一定体積値に設定した。このプログラムされた供給速度を用いて、エタノール消費速度を制御し、それは０．４から１．７５ｇ エタノール／ｇ ＤＣＷ／日にわたった。
【０２００】
図８に示すように、株Ｙ２９３は、発酵開始後１８７時間の時点で３７ｇ／Ｌ アモルファ−４，１１−ジエンを生産した。
【０２０１】
実施例８
この実施例は、エタノールのみの供給での流加、炭素制限発酵における宿主細胞によるファルネセンの生産を説明するものである。
【０２０２】
実施例３において説明したように、Ｙ６７７シード培養物を調製し、６３０ｍＬ バッチ培地（表１４）がそれぞれに入っている２つのバイオリアクターに接種するためにそれらを使用した。２つのバイオリアクターの一方に、産物捕捉のために２００ｍＬ オレイン酸メチルを添加した。下記の変更を伴うが本質的には実施例４において説明したとおり、発酵を行ってサンプルを分析した。
【表１４】
【０２０３】
発酵の初期の間にバッチ培地中の一部のグルコースがエタノールに変換された。バッチ培地中のグルコース及びエタノールが使い尽くされるまでバイオリアクター培養物を放置して増殖させ、使い尽くされた時点で、下記方程式によって定義される速度でそのバイオリアクターに純粋なエタノール（１９０プルーフ）をポンピングする指数的供給を開始した：
【化２５】
【０２０４】
Ｆは、基質質量流量（ｇ／時）であり、Ｖは、所与の時点での発酵槽内の液体体積（Ｌ）であり、ＳＢは、バッチ培地中の基質の濃度（３９．０３ｇ／Ｌ）であり、μｓｅｔは、比供給速度（０．０５８時−１）であり、ｔは、バッチ齢（時）であり、ｔ０は、供給を開始したときのバッチ齢（時）であり、Ｖ０は、発酵槽内の初期体積（０．７Ｌ）であり、及び、Ｖｆｅｅｄは、発酵槽に添加された供給物の所与の時点での総体積（Ｌ）である。この指数的供給期は、Ｆ／Ｖの比が５ｇ 基質／時／Ｌ バイオリアクター体積の最大供給速度に達するまで続いた。この最大値に達した後、Ｆ／Ｖの比を、その残りのプロセスの間、２．５ｇ／時／Ｌの定常供給速度で一定に保たった。しかし、図９Ａに示すように、指数的供給期の最初の比較的遅いエタノール利用速度により、結果としてエタノールの蓄積が生じた。この蓄積により、炭素制限プロセスを維持するために事前設定供給速度（図９Ｂ）の手動調整及び１２時間から１４時間への供給速度倍加時間の増加を余儀なくされた。オレイン酸メチルの存在下で増殖した細胞を迅速に回収し、事前設定最大及び定常供給速度への増殖を再び開始した（図９Ｃ）。対照的に、オレイン酸メチルを含有しない培養物は、蓄積されたエタノールの消費がより遅く、従って、定常供給の第二の一時停止、その後、その定常供給速度の２．５ｇ／時／Ｌから１．２５ｇ／時／Ｌへの減少を必要とした。全般的に言えば、株Ｙ６７７は、オレイン酸メチルの不在下では０から２．１ｇ エタノール／ｇ ＤＣＷ／日の、及びオレイン酸メチルの存在下では０．２７−２．９ｇ エタノール／ｇ ＤＣＷ／日のエタノール消費速度を有した。
【０２０５】
バイオリアクターのオフガスを凝縮器に通して、オフガス質量分析器を使用して酸素摂取率（ＯＵＲ）及びＣＯ２発生（ＣＥＲ）を測定した。図９Ｄは、オレイン酸メチルの存在下での株Ｙ６７７のＣＥＲ及びＯＵＲを示す。
【０２０６】
１日２回のサンプリングによって、細胞密度及びエタノール消費をモニターした。それぞれの時点で、１ｍＬ ブロスサンプルを取り、水で１：１０００希釈し、６００ｎｍ 波長に設定した分光光度計を使用して細胞密度を測定した。
【０２０７】
エタノールのレベルは、ＨＰＬＣによって定量した。それぞれの時点で、１ｍＬ ブロスサンプルを取り、３０ｍＭ 硫酸溶液で２倍希釈した（移動相溶液の濃度に匹敵する１５ｍＭ 硫酸の最終濃度のために４００ｕＬ 上清に対して４００ｕＬ ３０ｍＭ 硫酸）。遠心分離及び濾過によって細胞を除去した後、負荷した。
【０２０８】
生産されたファルネセンのレベルをＧＣ−ＦＩＤによって定量した。それぞれの時点で、１００ｕＬのオレイン酸メチルオーバーレイを取り、０．００１％ トランス−ベータカリオフィレンを含有する酢酸エチルで１：４０希釈した。その混合物を、この方法についての較正曲線の範囲内にあてはまる最終１：４０００希釈のために、もう一度、酢酸エチルで１：１００希釈した。オレイン酸メチルを産物捕捉に用いない場合には、２５ｕＬ 培養ブロスを９７５ｕＬ メタノールと併せ、その混合物を５分間、ボルテックスにかけ、遠心分離し、最後に、０．００１％ トランス−ベータカリオフィレンを含有する酢酸エチルで１：１００希釈した後、分析した。
【０２０９】
図９Ｅに示すように、オレイン酸メチルの存在下では株Ｙ６７７は３０ｇ／Ｌのピークファルネセン力価に達し、オレイン酸メチルの不在下では、４０ｇ／Ｌのピークファルネセン力価に達した。
【０２１０】
実施例９
この実施例は、酸素制限発酵における宿主細胞によるアモルファ−４，１１−ジエン及びファルネセンの生産を説明するものである。
【０２１１】
実施例３において説明したように、Ｙ２８３及びＹ３５２シード培養物を調製し、８００ｍＬ バッチ培地（表１５）及び１００ｍＬ オレイン酸メチルが入っているバイオリアクターに接種するためにそれらを使用した。
【表１５】
【０２１２】
ガス流量比制御装置を伴う２Ｌ Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｂｉｏｓｔａｔ Ｂ ｐｌｕｓ ｔｗｉｎｓにおいて発酵を行った。１５Ｎ ＮＨ４ＯＨ及び５Ｎ Ｈ２ＳＯ４の添加でそのｐＨをｐＨ５．０に自動的に制御した。温度を３０℃で維持し、Ｂｉｏｓｐｕｍｅｘ ２００Ｋ商標消泡剤を使用して泡を制御した。０．６−１の間のＯＤ５００でバイオリアクターに接種し、３０ｇ／Ｌ グルコースで増殖させた。
【０２１３】
そのバイオリアクターのオフガスを凝縮器に通して、オフガス質量分析器を使用して酸素摂取率（ＯＵＲ）及びＣＯ２発生（ＣＥＲ）を測定した。溶存酸素（ＤＯ）濃度は、１０ｐｐｂから飽和までの間の感度を有するＯ２センサープローブ（Ｈａｍｉｌｔｏｎ、ＯＸＹＦＥＲＭ ＦＤＡ ２２５、ネバダ州、リーノーのＨａｍｉｌｔｏｎ Ｃｏｍｐａｎｙ）を使用して測定した。
【０２１４】
発酵の初期の間にバイオリアクター培養物がバッチ培地中のグルコースをバイオマス及びエタノールに変換した。グルコースが消費されると（その培養における酸素の利用率に依存して発酵開始の８〜１４時間後）、ガラクトース輸送及び転写機構のグルコース抑制が緩和され、バッチ培地中のガラクトースによって遺伝子発現オフＧＡＬプロモーターが誘導された。このバッチ培養は、発酵期に生産されたエタノールが使い尽くされるまで増殖し続け、使い尽くされた時点で、ＤＯスパイクが培養期間の終わりを示した。
【０２１５】
好気性プロセスについては、清浄な乾燥した空気を１ＬＰＭの速度で培地にスパージした。攪拌速度を４００ｒｐｍに初期設定し、ＤＯフィードバック制御ループ及び攪拌カスケードプログラムを用いてＤＯ濃度を４０％で維持した（表１６）。
【０２１６】
微好気性プロセスについては、オフガス分析器に到達するガスの希釈を最小にするために、及び質量分析器の感度を増すために、ガス流を０．２５ＬＰＭに減少させた。空気対窒素比が異なるガスフローを用いることにより、酸素送達率を変えた（表１６）。
【０２１７】
厳密な嫌気性プロセスについては、１００％窒素ガスを接種前に０．２５ＬＰＭで水性培地にスパージし、その培養の間、４００ｒｐｍの一定攪拌速度を維持した（表１６）。
【表１６】
【０２１８】
１日２回のサンプリングにより、細胞密度及びエタノール消費をモニターした。それぞれの時点で、１ｍＬ ブロスサンプルを取り、水で１：１００希釈し、６００ｎｍ 波長に設定した分光光度計を使用して細胞密度を測定した。
【０２１９】
オレイン酸メチルサンプルを酢酸エチルで１：４０００希釈ではなく最終１：４００希釈に希釈したことを除き、実施例８において説明したとおり生産されたエタノール及びファルネセンのレベルを定量した。
【０２２０】
図１０Ａは、宿主株Ｙ２８３の様々な発酵におけるＤＯ濃度を示す。図１０Ｂ及び１０Ｃに示すように、株Ｙ２８３において、培養の際の酸素利用率増加は、細胞増殖増加、エタノールへのグルコース変換速度増加、及び培地のエタノールを使い尽くす速度増加につながる。株Ｙ２８３による増殖、産物形成、及びエタノール消費は、十分に空気を供給した培養物（４０％のＤＯ）において最大であったが、それらは２４時間後には安定状態に達した。表１７に示すように、すべての微好気性プロセスについての細胞当たりのエタノール消費速度は、０．４０−０．７２ｇ エタノール／ｇ ＤＣＷ／日の間であった。図１０Ｄに示すように、炭素投入量に対するアモルファ−４，１１−ジエンの最高収率は、８０％空気及び２０％窒素で観察された。
【表１７】
【０２２１】
図１０Ｅ及び１０Ｆに示すように、株Ｙ３５２において、培養の際の酸素利用率増加は、細胞増殖増加、エタノールへのグルコース変換速度増加、及び培地のエタノールを使い尽くす速度増加につながる。表１７に示すように、試験した２つの微好気性プロセスについての細胞当たりのエタノール消費速度は、０．４２−０．８８ｇ エタノール／ｇ ＤＣＷ／日の間であった。図１０Ｇに示すように、炭素投入量に対してファルネセンのわずかに高い収率が１００％空気で観察されたが、微好気性培養でのほうが長い期間にわたって生産が続いた。
【０２２２】
実施例１０
この実施例は、炭素及びリン酸塩制限を伴う振盪フラスコ内培養での宿主細胞によるアモルファ−４，１１−ジエンの生産を説明するものである。
【０２２３】
０．５Ｍ コハク酸緩衝液（ｐＨ５．０）に固体アミログリコシダーゼ（Ｓｉｇｍａ Ａ７４２０−１００ＭＧ）を溶解して１００Ｕ／ｍＬの最終酵素濃度にし、その溶液を濾過滅菌することによって、保存アミログルコシダーゼ（グルコアミラーゼ）酵素溶液を調製した。
【０２２４】
５０ｍＬのリン酸塩制限シード培地（表１８）が入っている２５０ｍＬ バッフル付フラスコに１ｍＬ 冷凍Ｙ３３７細胞を接種することによって、Ｙ３３７シード培養物を調製した。そのシード培養物を一晩、３０℃及び２００ｒｐｍで増殖させた。
【表１８】
【０２２５】
そのＹ３３７シード培養物を用いて、幾つかの２５０ｍＬバッフル付振盪フラスコに０．０５の出発ＯＤ６００まで接種した。生産フラスコには、４０ｍＬのリン酸塩制限生産培地（表１８）が入っていた。ＫＨ２ＰＯ４を、１００ｇ／Ｌ 濾過滅菌保存溶液から０．１ｇ／Ｌ、０．２５ｇ／Ｌ、０．５ｇ／Ｌ、０．８ｇ／Ｌ、２ｇ／Ｌ及び８ｇ／Ｌの最終濃度まで、それぞれのフラスコに添加した。接種前に、８０μＬの新たに解凍した１００Ｕ／ｍＬ アミログリコシダーゼ濾過滅菌保存溶液をそれぞれのフラスコに添加した（０．２Ｕ／ｍＬの最終濃度）。生産フラスコを３０℃及び２００ｒｐｍで最大３日間インキュベートした。この培養期間の間、グルコースが、およそ２０ｍｇ／時の一定速度でグルコアミラーゼによって放出された。
【０２２６】
内部標準としてのベータ−又はトランス−カリオフィレンでスパイクした５００μＬ 酢酸エチルが入っている清浄なガラスバイアルに２から１０μＬのオレイン酸メチルオーバーレイを移し、それらの酢酸エチルサンプルを実施例４において説明したように分析することによって、アモルファ−４，１１−ジエン力価を判定した。
【０２２７】
図１１に示すように、全体としてアモルファ−４，１１−ジエン力価は、最低濃度（０．１／Ｌ）を除き、試験したすべてのリン酸塩濃度で同等であったが、より低いリン酸塩濃度では細胞増殖が制限され、これは、より低いリン酸塩濃度でのアモルファ−４，１１−ジエンの細胞当たりの生産増加と言い換えられる。
【０２２８】
実施例１１
この実施例は、リン酸塩制限及びグルコース供給での流加、炭素制限発酵における宿主細胞によるアモルファ−４，１１−ジエンの生産を説明するものである。
【０２２９】
実施例３において説明したように、Ｙ３３７シード培養物を調製し、リン酸塩制限バッチ培地（表１９）が入っているバイオリアクターに接種するためにそれらを使用した。下記の変更を伴うが本質的には実施例４において説明したとおり、発酵を行ってサンプルを分析した。
【０２３０】
そのバイオリアクター培養物を、バッチ培地中のグルコースが使い尽くされるまで放置して増殖させ、使い尽くされた時点で、下記方程式によって定義される速度でそのバイオリアクターにリン酸塩制限グルコース供給培地（表１９）をポンピングする指数的供給を開始した：
【化２６】
【０２３１】
Ｆは、基質質量流量（ｇ／時）であり、Ｖは、所与の時点でのバイオリアクター内の液体体積（Ｌ）であり、ＳＢは、バッチ培地中の基質の濃度（１９．５ｇ／Ｌ）であり、μｓｅｔは、比供給速度（０．０８７時−１）であり、ｔは、バッチ齢（時）であり、ｔ０は、供給を開始したときのバッチ齢（時）であり、Ｖ０は、バイオリアクター内の初期体積であり、及び、Ｖｆｅｅｄは、バイオリアクターに添加された供給物の所与の時点での総体積（Ｌ）である。この指数的供給は、Ｆ／Ｖの比が事前設定最大供給速度（表２０）に達するまで続いた。この最大供給速度に達した後、Ｆ／Ｖの比を、その残りのプロセスの間、事前設定定常供給速度で一定に保った。しかし、より多くの供給物をバイオリアクターに添加すると体積（Ｖ）は増加し続けるので、基質質量流量（Ｆ）は、その体積がバイオリアクターの最大作業量（初期体積のおよそ３倍）に達するまで増加し続けた。残りのプロセスついては、そのリアクターから継続的に細胞ブロスを除去し、その基質質量流量（Ｆ）を一定に保つことによって、バイオリアクター体積を一定に保った。図１２Ａは、この発酵のグルコース供給速度プロフィールを示す。
【表１９】
【０２３２】
アモルファ−４，１１−ジエンの生産がおよそ５０のＯＤ６００で誘導された。
【０２３３】
表２０及び図１２Ｂに示すように、バッチ培地への８ｇ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４の供給及び供給培地へのリン酸塩の無供給が、５．５２ｇ／Ｌの最高アモルファ−４，１１−ジエン生産を示した。これらの条件下では、バッチ培地中のリン酸塩が４０時間までに消費され、その結果、細胞増殖が制限された（すなわち、炭素はあまりバイオマスに向かわず、より多くの炭素がアモルファ−４，１１−ジエンの生産に向かった）（図１２Ｃ）。
【表２０】
【０２３４】
実施例１２
この実施例は、リン酸塩制限及び混合グルコース／エタノール供給での流加、炭素制限発酵における宿主細胞によるアモルファ−４，１１−ジエンの生産を説明するものである。
【０２３５】
実施例３において説明したように、Ｙ３３７シード培養物を調製し、リン酸塩制限バッチ培地（表１９）が入っているバイオリアクターに接種するためにそれらを使用した。下記の変更を伴うが本質的には実施例４において説明したとおり、発酵を行ってサンプルを分析した。
【０２３６】
発酵の初期の間にバッチ培地中の一部のグルコースがエタノールに変換された。バッチ培地中のグルコース及びエタノールが使い尽くされるまでバイオリアクター培養物を放置して増殖させ、使い尽くされた時点で、下記方程式によって定義される速度でそのバイオリアクターにリン酸塩制限混合供給培地（表１９）をポンピングする指数的供給を開始した：
【化２７】
【０２３７】
Ｆは、基質質量流量（ｇ／時）であり、Ｖは、所与の時点でのバイオリアクター内の液体体積（Ｌ）であり、ＳＢは、バッチ培地中の基質の濃度（２０ｇ／Ｌ）であり、μｓｅｔは、比供給速度（０．０８７時−１）であり、ｔは、バッチ齢（時）であり、ｔ０は、供給を開始したときのバッチ齢（時）であり、Ｖ０は、バイオリアクター内の初期体積であり、及び、Ｖｆｅｅｄは、バイオリアクターに添加された供給物の所与の時点での総体積（Ｌ）である。この指数的供給期は、Ｆ／Ｖの比がｇ 基質／時／Ｌ バイオリアクター体積の単位での事前設定最大供給速度（表２１）に達するまで続いた。この最大値に達した後、Ｆ／Ｖの比を、その残りのプロセスの間、事前設定定常供給速度（表２１）で一定に保たった。
【０２３８】
アモルファ−４，１１−ジエンの生産がおよそ５０のＯＤ６００で誘導された。
【０２３９】
表２１及び図１３Ａに示すように、バッチ培地への８ｇ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４及び供給培地への０から０．５ｇ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４の供給が、２６から２７ｇ／Ｌを超える最高アモルファ−４，１１−ジエン生産を示した。これらの条件下では、バッチ培地中のリン酸塩が４０時間までに消費され、その結果、細胞増殖が制限された（すなわち、炭素はあまりバイオマスに向かわず、より多くの炭素がアモルファ−４，１１−ジエンの生産に向かった）（図１３Ｂ）。供給培地中、０ｇ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４と比較して、供給培地中、０．５ｇ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４は、細胞増殖及びアモルファ−４，１１−ジエン生産をさらに２４時間継続させた。
【表２１】
【０２４０】
実施例１３
この実施例は、ＭＥＶ経路の酵素をはじめとする酵素をコードする非相同ヌクレオチド配列とそれらのゲノムに組み込まれたテルペンシンターゼとを保有する、大腸菌（Escherichia coli）宿主株を生じさせるための方法を説明するものである。
【０２４１】
Ｄａｔｓｅｎｋｏ及びＷａｎｎｅｒによって概説された手順（(2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:6640-6645）の変形を用いてゲノム組込みを行った。この方法は、Ｔ７プロモーター−対象となる遺伝子−ＦＲＴ−Ｋａｎ−ＦＲＴカセットを含むプラスミドを利用する。このカセットの組込みのターゲットとなるゲノム座に隣接する領域に相同であるおよそ１００のヌクレオチドが、このカセットの両側に隣接している。これらの隣接領域は、このカセットの３’又は５’末端のいずれかに相同であるおよそ３０ヌクレオチドの伸長部と、そのゲノム座に隣接する領域に相同であるおよそ５０ヌクレオチドのもう１つの伸長部とを含むプライマーを使用して、このカセットをＰＣＲ増幅することによって作る（図１４）。結果として生じたＰＣＲ産物は、そのカセットのいずれかの末端に対して隣接配列相同性の別の５０のヌクレオチドを付加する第二ＰＣＲ反応において、テンプレートとして使用する（図１４）。その隣接配列を有するカセットを、Ｒｅｄリコンビナーゼタンパク質をコードするプラスミドを保持するエレクトロコンピテント大腸菌（Escherichia coli）細胞にエレクトロポレートする。カナマイシン（「Ｋａｎ」）耐性コロニーをコロニーＰＣＲによってスクリーニングする。陽性組換え体をＰ１−ファージで処理し、Ｐ１−形質導入によって新たな株にその組込みを移す。結果として生じた株を、ＦＬＰリコンビナーゼをコードするプラスミドで形質転換させ、その活性に起因してＫａｎ遺伝子がそのカセットから切り取られ、その結果、ターゲットのゲノム座にＴ７プロモーター−対象となる遺伝子が残る。最終宿主株は、そのＦＬＰリコンビナーゼが回復する。
【０２４２】
説明した方法を適用して、β−ファルネセンシンターゼ（「ＦＳ」）をコードするＤＮＡフラグメントを大腸菌（Escherichia coli）株Ｂ１０２１のＬａｃオペロン（ＭＭ２９４（ＤＥ３）（Ｔ１Ｒ））に組み込むことにより、宿主株Ｂ１０６０を生じさせた。この目的のために、ＤＥ３溶原化キット（ドイツ、ダルムシュタットのＮｏｖａｇｅｎ）を使用して大腸菌（Escherichia coli）株ＭＭ２９４（ＡＴＣＣ３３６２５）をＤＥ３にし、過剰なＴ１ファージの存在下でその株を増殖させることによってＴ１ファージ耐性にし、このようにして株Ｂ１０２１を得た。ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ方法論（Geiser et al. (2001) Biotechniques 31:88-92）の変形を用いて、ＦＲＴ−Ｋａｎ−ＦＲＴカセットを、Ｔ７プロモーターの制御下で、大腸菌（Escherichia coli）における発現のためにコドン最適化された、クソニンジン（Artemisia annua）のβ−ファルネセンシンターゼ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ８３５３９８）をコードする、発現プラスミドｐＡＭ４５４に挿入し、このようにして発現プラスミドｐＡＭ６１７を得た。ｐＡＭ６１７におけるＴ７−ＦＳ−ＦＲＴ−Ｋａｎ−ＦＲＴカセットには、ｍｈｐＲ及びｃｙｎＸ遺伝子座からの配列（配列番号：７０）が既に隣接しているため、Ｌａｃオペロンに隣接するｍｈｐＲ又はｃｙｎＸ配列に相同な１００ヌクレオチド配列を作るために１ラウンドのＰＣＲ増幅しか必要でなかった。（Ｒｅｄリコンビナーゼをコードする）発現プラスミドｐＡＭ８８を保有するＭＭ２９４（ＤＥ３）宿主細胞を、５０ｕｇ／ｍＬ カルベニシリン及び１ｍＭ アラビノースを含有するＬＢ培地中、３０℃で、０．６のＯＤ６００に増殖させた。それらの細胞を回収し、エレクトロコンピテントにし、ＰＣＲ産物で形質転換させた。５０ｕｇ／ｍＬ カナマイシンを含有するＬＢ寒天を用いて３０℃で２日増殖させた後にコロニーを得、コロニーＰＣＲによって正しい組込みを選択した。Ｐ１−形質導入によって宿主株Ｂ１０２１（ＭＭ２９４（ＤＥ３）（Ｔ１Ｒ））にその組込みを移し、結果として生じた株をコンピテントにし、（ＦＬＰリコンビナーゼをコードする）発現プラスミドｐＡＭ８９で形質転換させた。５０ｕｇ／ｍＬ カルベニシリンを含有するＬＢ寒天を用いて３０℃で２日増殖させた後にコロニーを得た。１つのコロニーを単離し、ＬＢ培地中、４２℃で増殖させてプラスミドｐＡＭ８９を喪失し、その結果、株Ｂ１０６０（ＭＭ２９４（ＤＥ３）（Ｔ１Ｒ）ｌａｃ：：Ｔ７−ＦＳ）を得た。
【０２４３】
メバロン酸キナーゼ（「ＭＫ」）をコードするＤＮＡフラグメントを大腸菌（Escherichia coli）株Ｂ１０２１のａｃｋｐｔａオペロンに組み込むことによって、宿主株Ｂ１０６１を生じさせた。この目的のために、大腸菌（Escherichia coli）における発現のためにコドン最適化された、サッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）のメバロン酸キナーゼをコードするＤＮＡフラグメント（配列番号：７１）を、プラスミドｐＡＭ６１８のＮｄｅＩ ＢａｍＨＩ制限部位に挿入した。プラスミドｐＡＭ６１８は、Ｔ７プロモーター、それに続く多数のクローニング部位（ＭＣＳ）そしてＦＲＴ−ＫａｎＲ−ＦＲＴカセットを含む（配列番号：７２、図１５）。結果として生じたＴ７−ＭＫ−ＦＲＴ−Ｋａｎ−ＦＲＴカセットを上で説明したようなＰＣＲ増幅ラウンドに２回付して、ａｃｋ ｐｔａオペロンに相同な１００ヌクレオチド隣接配列を作った。最終ＰＣＲ産物を上で説明したように大腸菌（Escherichia coli）株Ｂ１０２１に導入して、株Ｂ１０６１（ＭＭ２９４（ＤＥ３）（Ｔ１Ｒ）ａｃｋｐｔａ：：Ｔ７−ＭＫ）を得た。この組込を宿主株Ｂ１０６０にも移して、株Ｂ１１２４（ＭＭ２９４（ＤＥ３）（Ｔ１Ｒ）ｌａｃ：：Ｔ７−ＦＳ ａｃｋｐｔａ：：Ｔ７−ＭＫ）を得た。
【０２４４】
ホスホメバロン酸キナーゼ（「ＰＭＫ」）をコードするＤＮＡフラグメントを大腸菌（Escherichia coli）株Ｂ１０２１のｐｏｘＢ遺伝子座に組み込むことによって、宿主株Ｂ１０６２を生じさせた。この目的のために、大腸菌（Escherichia coli）における発現のためにコドン最適化された、サッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）のホスホメバロン酸キナーゼをコードするＤＮＡフラグメント（配列番号：７３）を、プラスミドｐＡＭ６１８のＮｄｅＩ ＢａｍＨＩ制限部位に挿入した。結果として生じたＴ７−ＰＭＫ−ＦＲＴ−Ｋａｎ−ＦＲＴカセットを上で説明したようなＰＣＲ増幅ラウンドに２回付して、ｐｏｘＢ遺伝子座に相同な１００ヌクレオチド隣接配列を作った。最終ＰＣＲ産物を上で説明したように大腸菌（Escherichia coli）株Ｂ１０２１に導入して、株Ｂ１０６２（ＭＭ２９４（ＤＥ３）（Ｔ１Ｒ）ｐｏｘＢ：：Ｔ７−ＰＭＫ）を得た。
【０２４５】
ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ（「ＨＭＧＲ」）をコードするＤＮＡフラグメントを大腸菌（Escherichia coli）株Ｂ１０２１のｌｄｈＡ遺伝子座に組み込むことによって、宿主株Ｂ１２７３を生じさせた。この目的のために、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）のＨＭＧＲをコードするＤＮＡフラグメント（ｍｖａ；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＢＡ００００１７、ＲＥＧＩＯＮ：２６８８９２５．．２６８７６４８）を、プラスミドｐＡＭ６１８のＥｃｏＲＩ ＢａｍＨＩ制限部位に、クレノウ（Klenow）フラグメントでそのＥｃｏＲＩ制限部位を処理した後、挿入した。結果として生じたＴ７−ｍｖａＡ−ＦＲＴ−Ｋａｎ−ＦＲＴカセットを上で説明したＰＣＲ増幅ラウンドに２回付して、ｌｄｈＡ遺伝子座に相同な１００ヌクレオチド隣接配列を作った。最終ＰＣＲ産物を上で説明したように大腸菌（Escherichia coli）株Ｂ１０２１に導入して、株Ｂ１２７３（ＭＭ２９４（ＤＥ３）（Ｔ１Ｒ）ｌｄｈＡ：：Ｔ７−ｍｖａＡ）を得た。
【０２４６】
多くの具体的な実施例を提供したが、上の説明は、本明細書において提供する実施形態を制限するためのものではなく、例証するためのものである。本明細書の再考により当業者にはこれらの実施形態の多くの変形が明らかになるであろう。従って、これらの実施形態の範囲は、上の説明を参照して決定されるべきではなく、添付の特許請求の範囲を等価物の全範囲と共に参照して決定すべきである。
【技術分野】
【０００１】
先行関連出願
本出願は、２００７年９月２０日出願の米国特許仮出願第６０／９９４，７９０号、及び２００８年４月３０日出願の同第６１／０４９，３５０号の利益を主張するものであり、前記仮出願のすべてはそれら全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
発明の分野
本明細書では、特に、イソプレノイドの強靭な生産（robust production）のための組成物及び方法を提供する。前記方法を行うための核酸、酵素、発現ベクター、及び遺伝子的に改変された宿主細胞も本明細書において提供する。遺伝的に改変された宿主細胞からのイソプレノイドの高い生産性のための発酵方法も本明細書に提供する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
イソプレノイドは、自然界の至る所に存在する。それらは、４０，０００を超える個別産物の多様なファミリーを含み、それらの多くが、生命体にとって必要不可欠である。イソプレノイドは、細胞の流動性、電子輸送、及び他の代謝機能を維持するのに役立つ。数多くの天然及び合成イソプレノイドが、医薬、化粧品、香水、顔料及び着色剤、殺真菌剤、防腐剤、栄養機能食品、及び精製化学薬品中間体として有用である。
【０００４】
不規則なイソプレノイド及びポリテルペンが報告されているが、典型的には、イソプレノイド産物は、五炭素イソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）繰返し単位から構成される。本来、イソプレノイドは、それらの前駆体ＩＰＰとその異性体ジメチルアリルピロリン酸（ＤＭＡＰＰ）の連続的な縮合によって合成される。これらの前駆体については２つの経路が公知である。真核生物は、植物を除いて、一般に、メバロン酸依存性（ＭＥＶ）経路を用いてアセチルコエンザイムＡ（アセチル−ＣｏＡ）をＩＰＰに変換し、その後、それをＤＭＡＰＰに異性体化する。原核生物は、一部を除いて、典型的には、メバロン酸非依存性経路又はデオキシキシルロース−５−リン酸（ＤＸＰ）経路のみを利用してＩＰＰ及びＤＭＡＰＰを生産する。植物は、ＭＥＶ経路とＤＸＰ経路の両方を用いる。Rohmer et al. (1993) Biochem. J. 295: 517-524; Lange et al. (2000) Proc. Natl. Acae. Sci. USA 97 (24): 13172-13177; Rohdich et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA99: 1158-1163 を参照のこと。
【０００５】
従来、イソプレノイドは、天然源、例えば植物、微生物及び動物からの抽出によって製造されてきた。しかし、抽出経由での収率は、多数の重要な制限のため、通常は非常に低い。第一に、大部分のイソプレノイドは、本来、ほんのわずかな量でしか蓄積しない。第二に、供給源生物は、一般に、商業的に採算がとれる量の所望のイソプレノイドを生産するために必要である大規模培養に適用できない。第三に、イソプレノイド抽出のために特定の毒性溶媒を必要とすることは、特別な取り扱い及び廃棄手順を余儀なくさせ、従って、イソプレノイドの商業生産を面倒にする。
【０００６】
ＭＥＶ及びＤＸＰ代謝経路の解明は、イソプレノイドの生合成生産を実現可能にした。例えば、アモルファ−４，１１−ジエンという名のイソプレノイドの生産のためのメバロン酸経路の一部又は全部を過剰発現するように微生物が遺伝子操作された（米国特許第７，１７２，８８６号及び同第７，１９２，７５１号）。他の努力は、グリセルアルデヒド−３−リン酸とピルビン酸のプールのバランスをとることに、又は１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸シンターゼ（ｄｘｓ）及びＩＰＰイソメラーゼ（ｉｄｉ）の発現を増加させることに集中した。Farmer et al. (2001) Biotechnol. Prog. 17:57-61; Kajiwara et al. (1997) Biochem. J. 324:421-426; 及びKim et al. (2001) Biotechnol. Bioeng. 72: 408-415 参照。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許第７，１７２，８８６号
【特許文献２】米国特許第７，１９２，７５１号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Rohmer et al. (1993) Biochem. J. 295: 517-524
【非特許文献２】Lange et al. (2000) Proc. Natl. Acae. Sci. USA 97 (24): 13172-13177
【非特許文献３】Rohdich et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA99: 1158-1163
【非特許文献４】Farmer et al. (2001) Biotechnol. Prog. 17:57-61
【非特許文献５】Kajiwara et al. (1997) Biochem. J. 324:421-426
【非特許文献６】Kim et al. (2001) Biotechnol. Bioeng. 72: 408-415
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
それにもかかわらず、多くの商業用途に必要とされるイソプレノイド産物の非常に多くの量を考え合わせると、現行技術で入手できるものよりさらに多くのイソプレノイドを生産する発現系及び発酵手順が依然として必要とされている。イソプレノイド生産への微生物代謝の最適な再方向づけには、導入される生合成経路を適切に遺伝子操作して、炭素をイソプレノイド生産に効率的に集中させること、及び長期間にわたっての代謝中間体の毒性レベルの蓄積を防止することの、両方が必要である。この必要性に対処する組成物及び方法を本明細書に提供し、関連した利点も提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
発明の要旨
イソプレノイドの強靭な生産のための組成物及び方法を本明細書において提供する。適するイソプレノイドの非限定的な例としては、（１つのイソプレン単位から誘導される）ヘミテルペン、例えばイソプレン；（２つのイソプレン単位から誘導される）モノテルペン、例えばミルセン；（３つのイソプレン単位から誘導される）セスキテルペン、例えばアモルファ−４，１１−ジエン；（４つのイソプレン単位から誘導される）ジテルペン、例えばタキサジエン；（６つのイソプレン単位から誘導される）トリテルペン、例えばスクアレン；（８つのイソプレノイドから誘導される）テトラテルペン、例えばβ−カロチン；及び（８つを超えるイソプレン単位から誘導される）ポリテルペン、例えばポリイソプレンが挙げられる。
【００１１】
１つの態様において、イソプレノイド化合物を生産するための方法を提供し、この方法は、
（ａ）ＭＥＶ又はＤＸＰ経路の酵素をコードする染色体組込み異種核酸配列を含むイソプレノイド化合物を作ることができる複数の宿主細胞を得る工程；
（ｂ）前記宿主細胞が炭素源としてエタノールを用い、イソプレノイド化合物を作る条件下で培地において前記宿主細胞を培養する工程；
（ｃ）前記培地からイソプレノイド化合物を回収する工程
を含む。
【００１２】
一部の実施形態において、前記宿主細胞によって炭素源として消費されるエタノールは、その宿主細胞によって作られる。他の実施形態において、前記宿主細胞によって炭素源として消費されるエタノールは、前記培地に外因的に供給される。
【００１３】
もう１つの態様において、イソプレノイド化合物を作るための方法を提供し、この方法は、
（ａ）イソプレノイド化合物を作ることができる複数の宿主細胞を得る工程；
（ｂ）少なくとも４時間、培地のリットル当たり約１グラムである又はそれより多い量のエタノールを含む培地において、前記宿主細胞を培養する工程；
（ｃ）前記培地からイソプレノイド化合物を回収する工程
を含む。
【００１４】
さらにもう１つの態様において、イソプレノイド化合物を作るための方法を提供し、この方法は、
（ａ）イソプレノイド化合物を作ることができる複数の酵母細胞を得る工程；
（ｂ）炭素源のボーラスを培地に供給することによって、酵母細胞を培養してバイオマスを作る工程；
（ｃ）前記酵母細胞が、少なくとも４時間、１時間につき乾燥細胞重量のグラム当たり約０．０１グラムである又はそれより多いエタノールというエタノール消費速度を有する条件下で細胞を維持する工程；及び
（ｄ）前記培地からイソプレノイド化合物を回収する工程
を含む。
【００１５】
一部の実施形態において、前記宿主細胞は、ＭＥＶ経路を用いてイソプレノイド化合物を作る。他の実施形態において、前記宿主細胞は、ＤＸＰ経路を用いてイソプレノイド化合物を作る。
【００１６】
他の実施形態において、前記宿主細胞は、少なくとも多少の期間、酸素制限条件下で培養又は維持される。さらに他の実施形態において、前記宿主細胞は、少なくとも多少の期間、リン酸塩制限条件（phosphate limited condition）下で培養又は維持される。
【００１７】
参照による援用
本明細書において言及するすべての刊行物及び特許出願は、あたかもそれぞれの個々の刊行物又は特許出願が参照により組み込まれると具体的に及び個々に示されているのと同じ程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】イソペンテニルピロリン酸（「ＩＰＰ」）の生産のためのメバロン酸（「ＭＥＶ」）経路の略図である。
【図２】イソペンテニルピロリン酸（「ＩＰＰ」）及びジメチルアリルピロリン酸（「ＤＭＡＰＰ」）の生産のための１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−二リン酸（「ＤＸＰ」）経路の略図である。Ｄｘｓは、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸シンターゼであり；Ｄｘｒは、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸レダクトイソメラーゼ（ＩｓｐＣとしても公知）であり；ＩｓｐＤは、４−ジホスホシチジル−２Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトールシンターゼであり；ＩｓｐＥは、４−ジホスホシチジル−２Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトールシンターゼであり；ＩｓｐＦは、２Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール２，４−シクロ二リン酸シンターゼであり；ＩｓｐＧは、１−ヒドロキシ−２−メチル−２−（Ｅ）−ブテニル４−二リン酸シンターゼ（ＩｓｐＧ）であり；及びｉｓｐＨは、イソペンテニル／ジメチルアリル二リン酸シンターゼである。
【図３】イソペンテニルピロリン酸（「ＩＰＰ」）及びジメチルアリルピロリン酸（「ＤＭＡＰＰ」）のゲラニルピロリン酸（「ＧＰＰ」）、ファルネシルピロリン酸（「ＦＰＰ」）及びゲラニルゲラニルピロリン酸（「ＧＧＰＰ」）への変換、ならびに様々なイソプレノイドの合成の略図である。
【図４−１】ＤＮＡフラグメントＥＲＧ２０−ＰＧＡＬ−ｔＨＭＧＲ（Ａ）、ＥＲＧ１３−ＰＧＡＬ−ｔＨＭＧＲ（Ｂ）、ＩＤＩ１−ＰＧＡＬ−ｔＨＭＧＲ（Ｃ）、ＥＲＧ１０−ＰＧＡＬ−ＥＲＧ１２（Ｄ）、ＥＲＧ８−ＰＧＡＬ−ＥＲＧ１９（Ｅ）、ＧＡＬ７４から１０２１−ＨＰＨ−ＧＡＬ１１６３７から２５８７（Ｆ）；ＧＬＡ８０−５０から−１−ＮａｔＲ−ＧＡＬ８０１３０９から１３５８（Ｇ）、及びＧＡＬ１１から４８−ＮａｔＲ−ＧＡＬ１１５００から１５５０（Ｈ）のマップを示す。
【図４−２】ＤＮＡフラグメントＥＲＧ２０−ＰＧＡＬ−ｔＨＭＧＲ（Ａ）、ＥＲＧ１３−ＰＧＡＬ−ｔＨＭＧＲ（Ｂ）、ＩＤＩ１−ＰＧＡＬ−ｔＨＭＧＲ（Ｃ）、ＥＲＧ１０−ＰＧＡＬ−ＥＲＧ１２（Ｄ）、ＥＲＧ８−ＰＧＡＬ−ＥＲＧ１９（Ｅ）、ＧＡＬ７４から１０２１−ＨＰＨ−ＧＡＬ１１６３７から２５８７（Ｆ）；ＧＬＡ８０−５０から−１−ＮａｔＲ−ＧＡＬ８０１３０９から１３５８（Ｇ）、及びＧＡＬ１１から４８−ＮａｔＲ−ＧＡＬ１１５００から１５５０（Ｈ）のマップを示す。
【図５】プラスミドｐＡＭ４０４のマップを示す。
【図６】グルコース供給又はグルコース／エタノール混合供給のいずれかを用いる炭素制限下での株Ｙ３３７による細胞増殖及びアモルファ−４，１１−ジエン（ＡＤ）生産を示す。
【図７−１】ＣＯ２制御供給アルゴリズムの流れ図を示す。
【図７−２】エタノールパルス供給を用いる株Ｙ２９３による、二酸化炭素発生率、基質送達、増殖及びアモルファ−４，１１−ジエンの生産の図表を示す。
【図８】初期増殖のために濃縮グルコース供給、その後、生産のためにエタノール供給を用いる炭素制限下での株Ｙ２９３による細胞増殖及びアモルファ−４，１１−ジエン生産を示す。
【図９−１】オレイン酸メチルの存在下又は不在下、エタノールのみの供給での流加、炭素制限発酵での株Ｙ６７７によるエタノール生産／消費、供給速度、増殖、炭素発生率及び酸素利用率ならびにファルネセン生産を示す。
【図９−２】オレイン酸メチルの存在下又は不在下、エタノールのみの供給での流加、炭素制限発酵での株Ｙ６７７によるエタノール生産／消費、供給速度、増殖、炭素発生率及び酸素利用率ならびにファルネセン生産を示す。
【図９−３】オレイン酸メチルの存在下又は不在下、エタノールのみの供給での流加、炭素制限発酵での株Ｙ６７７によるエタノール生産／消費、供給速度、増殖、炭素発生率及び酸素利用率ならびにファルネセン生産を示す。
【図９−４】オレイン酸メチルの存在下又は不在下、エタノールのみの供給での流加、炭素制限発酵での株Ｙ６７７によるエタノール生産／消費、供給速度、増殖、炭素発生率及び酸素利用率ならびにファルネセン生産を示す。
【図９−５】オレイン酸メチルの存在下又は不在下、エタノールのみの供給での流加、炭素制限発酵での株Ｙ６７７によるエタノール生産／消費、供給速度、増殖、炭素発生率及び酸素利用率ならびにファルネセン生産を示す。
【図１０−１】溶存酸素濃度、異なる酸素制限度での株２８３による増殖、エタノール生産／消費及びアモルファ−４，１１−ジエン生産を示す。
【図１０−２】溶存酸素濃度、異なる酸素制限度での株２８３による増殖、エタノール生産／消費及びアモルファ−４，１１−ジエン生産を示す。
【図１０−３】溶存酸素濃度、異なる酸素制限度での株２８３による増殖、エタノール生産／消費及びアモルファ−４，１１−ジエン生産を示す。
【図１０−４】溶存酸素濃度、異なる酸素制限度での株２８３による増殖、エタノール生産／消費及びアモルファ−４，１１−ジエン生産を示す。
【図１０−５】異なる酸素制限度での株Ｙ３５２による増殖、エタノール生産／消費及びファルネセン生産を示す。
【図１０−６】異なる酸素制限度での株Ｙ３５２による増殖、エタノール生産／消費及びファルネセン生産を示す。
【図１０−７】異なる酸素制限度での株Ｙ３５２による増殖、エタノール生産／消費及びファルネセン生産を示す。
【図１１】様々なＫＨ２ＰＯ４濃度での炭素制限下、振盪フラスコ内での株Ｙ３３７による細胞当たりのアモルファ−４，１１−ジエン生産性を示す。
【図１２−１】流加発酵槽供給（Ａ）、ならびにグルコース供給を用いる炭素及びリン酸塩制限下での株Ｙ３３７による細胞増殖（Ｂ）及びアモルファ−４，１１−ジエン生産（Ｃ）を示す。
【図１２−２】流加発酵槽供給（Ａ）、ならびにグルコース供給を用いる炭素及びリン酸塩制限下での株Ｙ３３７による細胞増殖（Ｂ）及びアモルファ−４，１１−ジエン生産（Ｃ）を示す。
【図１２−３】流加発酵槽供給（Ａ）、ならびにグルコース供給を用いる炭素及びリン酸塩制限下での株Ｙ３３７による細胞増殖（Ｂ）及びアモルファ−４，１１−ジエン生産（Ｃ）を示す。
【図１３−１】グルコース／エタノール混合供給を用いる炭素及びリン酸塩制限下での株Ｙ３３７による細胞増殖（Ａ）及びアモルファ−４，１１−ジエン生産（Ｂ）を示す。
【図１３−２】グルコース／エタノール混合供給を用いる炭素及びリン酸塩制限下での株Ｙ３３７による細胞増殖（Ａ）及びアモルファ−４，１１−ジエン生産（Ｂ）を示す。
【図１４】大腸菌（Escherichia coli）のゲノムへの非相同ヌクレオチド配列の組込みに有用なプロモーター−遺伝子−ＦＲＴ−Ｋａｎ−ＦＲＴカセットに隣接する１００ヌクレオチドの長いゲノム座特異的配列の作製を図示する。
【図１５】プラスミドｐＡＭ６１８のマップを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
発明の詳細な説明
定義
別様に定義していない限り、本明細書において用いるすべての技術用語及び科学用語は、当業者によって一般に理解されているのと同じ意味を有する。以下の意味を有すると定義されるものとする多数の用語についてここで触れる：
【００２０】
用語「任意の」又は「必要に応じて」は、後に記載されている特徴又は構造が、存在する場合もあり、しない場合もあること、あるいは後に記載されている事象又は環境が、発生する場合もあり、しない場合もあること、ならびにその記載が、特定の特徴もしくは構造が存在する事例及びその特徴もしくは構造が不在である事例、又はその事象もしくは環境が発生する事例及びその事象もしくは環境が発生しない事例を含むことを意味する。
【００２１】
用語「代謝経路」は、異化経路又は同化経路を指すために本明細書では用いる。同化経路は、より小さな分子からのより大きな分子の構築、エネルギーを必要とするプロセスを伴う。異化経路は、多くの場合エネルギーを放出する、より大きな分子の分解を伴う。
【００２２】
用語「メバロン酸経路(mevalonate pathway)」又は「ＭＥＶ経路」は、アセチル−ＣｏＡをＩＰＰに変換する生合成経路を指すために本明細書では用いる。そのＭＥＶ経路を図１に概略的に図示する。
【００２３】
用語「デオキシキシルロース５−リン酸経路」又は「ＤＸＰ経路」は、グリセルアルデヒド−３−リン酸及びピルビン酸をＩＰＰ及びＤＭＡＰＰに変換させる経路を指すために本明細書では用いる。そのＤＸＰ経路を図２に概略的に図示する。
【００２４】
「ピロリン酸塩（pyrophosphate）」という言葉は、本明細書では「二リン酸塩(diphosphate)」と同義的に用いている。
【００２５】
用語「発現ベクター」又は「ベクター」は、宿主細胞に形質導入し、宿主細胞を形質転換し、又は宿主細胞を感染させ、それによってその細胞にとって生得的であるもの以外の核酸及び／もしくはタンパク質をその細胞に生産させる、又はその細胞にとって自然でない様式で核酸及び／もしくはタンパク質をその細胞に発現させる核酸を指す。
【００２６】
用語「内因性の」は、天然に存在する、例えば非組換え宿主細胞において存在する、物質又はプロセスを指す。
【００２７】
用語「イソペンテニルピロリン酸を作るための酵素的経路」は、メバロン酸経路又はＤＸＰ経路のいずれかを含む（これに限定されない）、イソペンチルピロリン酸を生産することができる任意の経路を指す。
【００２８】
用語「核酸」は、任意の長さの、リボヌクレオチド又はデオキシヌクレオチドのいずれかのヌクレオチドの重合形態を指す。従って、この用語は、１本鎖、２本鎖もしくは多数の鎖のＤＮＡもしくはＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、あるいはプリン及びピリミジン塩基あるいは他の天然の、又は化学的に改変されたもしくは生化学的に改変された非天然のヌクレオチド塩基、又は誘導体化されたヌクレオチド塩基を含むポリマーを含むが、これらに限定されない。
【００２９】
用語「オペロン」は、ＲＮＡ又はタンパク質などの遺伝子産物をそれぞれがコードし、それらの発現が、１つ又はそれ以上の制御要素（例えば、プロモーター）によって調和的に調節される、２つ又はそれ以上の隣接ヌクレオチド配列を指すために使用される。
【００３０】
用語「遺伝子産物」は、ＤＮＡによってコードされるＲＮＡ（もしくはその逆）、又はＲＮＡもしくはＤＮＡによってコードされるタンパク質を指し、この場合、遺伝子は、典型的には、タンパク質をコードする１つ以上のヌクレオチド配列を含むが、遺伝子は、イントロン及び他の非コーディングヌクレオチド配列を含んでいてもよい。
【００３１】
用語「タンパク質」は、コードされた及びコードされていないアミノ酸、化学的もしくは生化学的に改変されたアミノ酸又は誘導体化されたアミノ酸、ならびに改変されたペプチド骨格を有するポリペプチドを含み得る、任意の長さのアミノ酸の重合形態を指す。
【００３２】
用語「異種核酸」は、本明細書において用いる場合、次のうち少なくとも１つにあてはまる核酸を指す：（ａ）その核酸が、所与の宿主細胞にとって異質（「外因性」）である（すなわち、所与の宿主細胞において自然に見つからない）；（ｂ）その核酸が、所与の宿主細胞において自然に見つかる（すなわち、所与の宿主細胞「にとって内因性」である）ヌクレオチド配列を含むが、そのヌクレオチド配列が、その細胞において不自然な（例えば、予想されるものより多い、もしくは自然に見つけられるものより多い）量で生産される；（ｃ）その核酸が、内因性ヌクレオチド配列とは配列の点で異なるヌクレオチド配列を含むが、そのヌクレオチド配列が、（同じもしくは実質的に同じアミノ酸配列を有する）同じタンパク質をコードし、及びその細胞において不自然な（例えば、予想されるものより多い、もしくは自然に見つけられるものより多い）量で生産される；又は（ｄ）その核酸が、本来、互いに同じ関係で見つけられない２つもしくはそれ以上のヌクレオチド配列を含む（例えば、その核酸が組換え体である）。
【００３３】
「トランスジーン」は、宿主細胞に外因的に導入される遺伝子を指す。それは、内因性又は外因性、又は異種の核酸を含む場合がある。
【００３４】
用語「組換え宿主」（「遺伝的に改変された宿主細胞」又は「遺伝的に改変された宿主微生物」とも呼ばれる）は、本明細書に提供する異種核酸を含む宿主細胞を意味する。
【００３５】
用語「外因性核酸」は、宿主細胞に外因的に導入され、従って、本来、所与の細胞において通常はもしくは自然には見つけられない及び／又は所与の細胞によって通常はもしくは自然には生産されない核酸を指す。
【００３６】
用語「調節要素」は、宿主細胞におけるコーディング配列の発現及び／又はコードされたポリペプチドの生産を提供する、及び／又は、これらを調節する、転写及び翻訳の制御配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、ターミネーター、タンパク質分解シグナルなど）を指す。
【００３７】
用語「形質転換」は、新たな核酸の導入による細胞において誘発される永久的又は一過的な遺伝的変化を指す。遺伝的変化（「改変」）は、宿主細胞のゲノムへの新たなＤＮＡの組込み、又はエピソーム要素としての新たなＤＮＡの一過的もしくは安定的維持の、いずれかによって、果たすことができる。真核細胞の場合、永久的な遺伝的変化は、一般に、その細胞のゲノムへのＤＮＡの導入によって達成される。原核細胞の場合、永久的な遺伝的変化を染色体に導入することができ、又は染色体外要素（例えばプラスミド及び発現ベクター）経由で導入することができ、染色体外要素は、組換え宿主細胞におけるそれらの維持を助長するために１つもしくはそれ以上の選択可能マーカーを含有することができる。
【００３８】
用語「作動可能に連結された」は、そのように記載されている成分が、それらが意図された様式で機能することを可能にする関係で存在する並置を指す。例えば、プロモーターがヌクレオチド配列の転写又は発現に影響を及ぼす場合、そのプロモーターは、そのヌクレオチド配列に作動可能に連結されている。
【００３９】
用語「宿主細胞」及び「宿主微生物」は、異種核酸を挿入することができる又は異種核酸が挿入されている任意の古細菌（archae）、細菌又は真核生細胞を指すために、本明細書では同義的に用いている。この用語は、もとの細胞の子孫にも関し、この子孫は、自然、偶発的又は計画的変異のため、形態に関して又はゲノムもしくは全ＤＮＡ補体に関してもとの親と必ずしも完全に同一であるとは限らないことがある。
【００４０】
核酸に関して用いる場合の用語「合成の」は、化学合成されたオリゴヌクレオチド基本構成要素（building block）をアニーリングして遺伝子セグメントを形成し、その後、それらを酵素により組み立てて全遺伝子を構築することを意味する。「化学的手段」を介する核酸の合成とは、ヌクレオチド成分がインビトロで組み立てられることを意味する。
【００４１】
核酸、細胞又は生物に適用される場合の用語「天然の」は、自然界において見つけられる核酸、細胞又は生物を指す。例えば、自然界の供給源から単離することができる非病的（未罹病（un-diseased））生物体内に存在し、研究室において人間により意図的に改変されていないポリペプチド又はポリヌクレオチド配列は、天然である。
【００４２】
核酸、酵素、細胞又は生物に適用される場合の用語「天然に存在する」は、自然界で見つけられる核酸、酵素、細胞又は生物を指す。例えば、自然界の供給源から単離することができる生物体内に存在し、研究室において人間により意図的に改変されていないポリペプチド又はポリヌクレオチド配列は、天然に存在するものである。
【００４３】
タンパク質、ポリペプチド又は酵素に適用される場合の用語「生物活性フラグメント」は、それらのタンパク質又はポリペプチド又は酵素の機能的部分を指す。機能的に等価のものが異なるアミノ酸配列を有することがあり、これは、例えば、核酸配列及びそのようにコードされたタンパク質の中に天然に存在することが公知であるコドン冗長性及び機能的等価性の結果として生じ得る。あるいは、交換されるアミノ酸の特性の考察に基づき、タンパク質構造の変化を操作することができる組換えＤＮＡ技術を適用することによって、機能的に等価のタンパク質又はペプチドを構築することができる。
【００４４】
用語「イソプレノイド」、「イソプレノイド化合物」、「イソプレノイド産物」、「テルペン」、「テルペン化合物」、「テルペノイド」及び「テルペノイド化合物」は、本明細書では同義的に用いている。それらは、ＩＰＰから誘導することができる化合物を指す。
【００４５】
単数形「ａ」、「ａｎｄ」及び「ｔｈｅ」は、その文脈が別様に明確に指示していない限り、複数の指示対象を含む。従って、例えば、「発現ベクター（an expression vector）」への言及は、単数の発現ベクターばかりでなく複数の発現ベクターも含む、及び「宿主細胞（the host cell）」への言及は、１つ又はそれ以上の宿主細胞への言及を含む、等である。本特許請求の範囲が、いずれかの任意の要素を排除するように起草されることがあることにさらに留意しなければならない。従って、この記載は、特許請求の範囲の構成要素の列挙に関しての「単独で」、「ただ・・・のみ」などのような排他的用語の使用、又は「消極的」限定の使用についての先行詞（antecedent basis）としての役割を果たすことが意図される。
【００４６】
別の指示がない限り、本明細書に提供する実施形態は、特定の配列、発現ベクター、酵素、宿主微生物又はプロセスに限定されず、従って、本明細書における教示を考慮して当業者の理解に従って変わることがある。本明細書において用いる専門用語は、特定の実施形態の説明のみを目的とするものであり、限定するためのものではない。
【００４７】
ＩＰＰ経路
本明細書に提供する宿主細胞は、ＩＰＰ及びその異性体、ＤＭＡＰＰを合成するためにＭＥＶ経路、ＤＸＰ経路若しくは両方を含む又は利用する。ＭＥＶ又はＤＸＰ経路の酵素をコードする少なくとも１つの染色体組込み異種核酸配列を含む宿主細胞を本明細書に提供する。他の実施形態において、前記宿主細胞は、ＭＥＶ又はＤＸＰ経路の複数の酵素をコードする少なくとも１つの異種核酸配列を含む。さらに他の実施形態において、前記宿主細胞は、ＭＥＶ経路酵素のすべてをコードする複数の異種核酸配列を含む。さらに他の実施形態において、前記宿主細胞は、ＤＸＰ経路酵素のすべてをコードする複数の異種核酸配列を含む。
【００４８】
一般に、植物以外の真核生物は、排他的にＭＥＶイソプレノイド経路を用いて、アセチル−ＣｏＡをＩＰＰに変換し、その後、それをＤＭＡＰＰへと異性体化する。原核生物は、一部を例外を伴うが、メバロン酸非依存性又はＤＸＰ経路を用いて、分岐点を通ってＩＰＰ及びＤＭＡＰＰを別々に生産する。植物は、ＩＰＰ合成のためにＭＥＶ経路とＤＸＰ経路の両方を用いる。
【００４９】
ＭＥＶ経路
ＭＥＶ経路の略図を図１に記載する。一般に、この経路は、６つの工程を含む。
【００５０】
第一工程では、アセチル−コエンザイムＡの２つの分子を酵素により化合させて、アセトアセチル−ＣｏＡを形成する。この工程を触媒することが公知の酵素は、例えば、アセチル−ＣｏＡチオラーゼ（アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼとしても公知）である。ヌクレオチド配列の説明例としては、以下のＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号及びそれらの配列が由来する生物が挙げられるが、それらに限定されない：（ＮＣ＿０００９１３ ＲＥＧＩＯＮ：２３２４１３１．．２３２５３１５；大腸菌（Escherichia coli））、（Ｄ４９３６２；パラコッカス・デニトリフィカンス（Paracoccus denitrificans））、及び（Ｌ２０４２８；サッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae））。
【００５１】
ＭＥＶ経路の第二工程では、アセトアセチル−ＣｏＡを別のアセチル−ＣｏＡ分子と酵素により縮合させて、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）を形成する。この工程を触媒することが公知の酵素は、例えば、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼである。ヌクレオチド配列の説明例としては、（ＮＣ＿００１１４５．補体１９０６１．．２０５３６；サッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae））、（Ｘ９６６１７；サッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae））、（Ｘ８３８８２；シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana））、（ＡＢ０３７９０７；キタサトスポラ・グリセオラ（Kitasatospora griseola））、（ＢＴ００７３０２；ヒト（Homo sapiens））、及び（ＮＣ＿００２７５８、Ｌｏｃｕｓ ｔａｇ ＳＡＶ２５４６、ＧｅｎｅＩＤ １１２２５７１；黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus））が挙げられるが、それらに限定されない。
【００５２】
第三工程では、ＨＭＧ−ＣｏＡをメバロン酸に酵素により変換する。この工程を触媒することが公知の酵素は、例えば、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼである。ヌクレオチド配列の説明例としては、（ＮＭ＿２０６５４８；キイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster））、（ＮＣ＿００２７５８、Ｌｏｃｕｓ ｔａｇ ＳＡＶ２５４５、ＧｅｎｅＩＤ １１２２５７０；黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus））、（ＮＭ＿２０４４８５；セキショクヤケイ（Gallus gallus））、（ＡＢ０１５６２７；ストレプトマイセス属種（Streptomyces sp.）ＫＯ ３９８８）、（ＡＦ５４２５４３；ニコチアナ・アテヌアタ（Nicotiana attenuata））、（ＡＢ０３７９０７；キタサトスポラ・グリセオラ（Kitasatospora griseola））、（ＡＸ１２８２１３、トランケートされたＨＭＧＲをコードする配列を提供する；サッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae））、及び（ＮＣ＿００１１４５：補体（１１５７３４．．１１８８９８；サッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae））が挙げられるが、それらに限定されない。
【００５３】
第四工程では、メバロン酸を酵素によりリン酸化して、メバロン酸５−リン酸を形成する。この工程を触媒することが公知の酵素は、例えば、メバロン酸キナーゼである。ヌクレオチド配列の説明例としては、（Ｌ７７６８８；シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana））、及び（Ｘ５５８７５；サッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae））が挙げられるが、それらに限定されない。
【００５４】
第五工程では、第二のリン酸基をメバロン酸５−リン酸に酵素により付加させて、メバロン酸５−ピロリン酸を形成する。この工程を触媒することが公知の酵素は、例えば、ホスホメバロン酸キナーゼである。ヌクレオチド配列の説明例としては、（ＡＦ４２９３８５；ヘベア・ブラジリエンシス（Hevea brasiliensis））、（ＮＭ＿００６５５６；ヒト（Homo sapiens））、及び（ＮＣ＿００１１４５．補体７１２３１５．．７１３６７０；サッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae））が挙げられるが、それらに限定されない。
【００５５】
第六工程では、メバロン酸５−ピロリン酸を酵素によりＩＰＰに変換する。この工程を触媒することが公知の酵素は、例えば、メバロン酸ピロリン酸デカルボキシラーゼである。ヌクレオチド配列の説明例としては、（Ｘ９７５５７；サッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae））、（ＡＦ２９００９５；エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）、及び（Ｕ４９２６０；ヒト（Homo sapiens））が挙げられるが、それらに限定されない。
【００５６】
ＩＰＰをＤＭＡＰＰに変換する場合には、第七工程が必要とされる。この工程を触媒することが公知の酵素は、例えば、ＩＰＰイソメラーゼである。ヌクレオチド配列の説明例としては、（ＮＣ＿０００９１３、３０３１０８７．．３０３１６３５；大腸菌（Escherichia coli））、及び（ＡＦ０８２３２６；ヘマトコッカス・プルビアリス（Haematococcus pluvialis））が挙げられるが、それらに限定されない。ＤＭＡＰＰへの変換が必要とされる場合には、ＩＰＰイソメラーゼの発現増加によって、ＩＰＰのＤＭＡＰＰへの変換がその全経路の中での律速段階に相当しないことが保証される。
【００５７】
ＤＸＰ経路
ＤＸＰ経路の略図を図２に記載する。一般に、ＤＸＰ経路は、７つの工程を含む。第一工程において、ピルビン酸をＤ−グリセルアルデヒド３−リン酸と縮合させて、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸を作る。この工程を触媒することが公知の酵素は、例えば、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸シンターゼである。ヌクレオチド配列の説明例としては、（ＡＦ０３５４４０；大腸菌（Escherichia coli））、（ＮＣ＿００２９４７、ｌｏｃｕｓ ｔａｇ ＰＰ０５２７；シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）ＫＴ２４４０）、（ＣＰ００００２６、ｌｏｃｕｓ ｔａｇ ＳＰＡ２３０１；パラチフス菌（Salmonella enterica Paratyphi）、ＡＴＣＣ ９１５０参照）、（ＮＣ＿００７４９３、ｌｏｃｕｓ ｔａｇ ＲＳＰ＿０２５４；ロドバクター・スフェロイデス（Rhodobacter sphaeroides）２．４．１）、（ＮＣ＿００５２９６、ｌｏｃｕｓ ｔａｇ ＲＰＡ０９５２；ロドシュードモナス・パラストリス（Rhodopseudomonas palustris）ＣＧＡ００９）、（ＮＣ＿００４５５６、ｌｏｃｕｓ ｔａｇ ＰＤ １２９３；キシレラ・ファスティディオーサ・テメキュラ１（Xylella fastidiosa Temeculal）、及び（ＮＣ＿００３０７６、ｌｏｃｕｓ ｔａｇ ＡＴ５Ｇ１１３８０；シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana））が挙げられるが、それらに限定されない。
【００５８】
第二工程では、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸を２Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール−４−リン酸に変換する。この工程を触媒することが公知の酵素は、例えば、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸レダクトイソメラーゼである。ヌクレオチド配列の説明例としては、（ＡＢ０１３３００；大腸菌（Escherichia coli））、（ＡＦ１４８８５２；シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana））、（ＮＣ＿００２９４７、ｌｏｃｕｓ ｔａｇ ＰＰ １５９７；シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）ＫＴ２４４０）、（ＡＬ９３９１２４、ｌｏｃｕｓ ｔａｇ ＳＣＯ５６９４；ストレプトマイセス・セリカラー（Streptomyces coelicolor）Ａ３（２））、（ＮＣ＿００７４９３、ｌｏｃｕｓ ｔａｇ ＲＳＰ＿２７０９；ロドバクター・スフェロイデス（Rhodobacter sphaeroides）２．４．１）、及び（ＮＣ＿００７４９２、ｌｏｃｕｓ ｔａｇ Ｐｆｌ＿１１０７；シュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）ＰｆＯ−１）が挙げられるが、それらに限定されない。
【００５９】
第三工程では、２Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール−４−リン酸を４−ジホスホシチジル−２Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトールに変換する。この工程を触媒することが公知の酵素は、例えば、４−ジホスホシチジル−２Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトールシンターゼである。ヌクレオチド配列の説明例としては、（ＡＦ２３０７３６；大腸菌（Escherichia coli））、（ＮＣ＿００７４９３、ｌｏｃｕｓ＿ｔａｇ ＲＳＰ＿２８３５；ロドバクター・スフェロイデス（Rhodobacter sphaeroides）２．４．１）、（ＮＣ＿００３０７１、ｌｏｃｕｓ＿ｔａｇ ＡＴ２Ｇ０２５００；シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana））、及び（ＮＣ＿００２９４７、ｌｏｃｕｓ＿ｔａｇ ＰＰ１６１４；シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）ＫＴ２４４０）が挙げられるが、それらに限定されない。
【００６０】
第四工程では、４−ジホスホシチジル−２Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトールを４−ジホスホシチジル−２Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール−２−リン酸に変換する。この工程を触媒することが公知の酵素は、例えば、４−ジホスホシチジル−２Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトールキナーゼである。ヌクレオチド配列の説明例としては、（ＡＦ２１６３００；大腸菌（Escherichia coli））及び（ＮＣ＿００７４９３、ｌｏｃｕｓ＿ｔａｇ ＲＳＰ＿１７７９；ロドバクター・スフェロイデス（Rhodobacter sphaeroides）２．４．１）が挙げられるが、それらに限定されない。
【００６１】
第五工程では、４−ジホスホシチジル−２Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール−２−リン酸を２Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール２，４−シクロ二リン酸に変換させる。この工程を触媒することが公知の酵素は、例えば、２Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール２，４−シクロ二リン酸シンターゼである。ヌクレオチド配列の説明例としては、（ＡＦ２３０７３８；大腸菌（Escherichia coli））、（ＮＣ＿００７４９３、ｌｏｃｕｓ＿ｔａｇ ＲＳＰ＿６０７１；ロドバクター・スフェロイデス（Rhodobacter sphaeroides）２．４．１）、及び（ＮＣ＿００２９４７、ｌｏｃｕｓ＿ｔａｇ ＰＰ１６１８；シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）ＫＴ２４４０）が挙げられるが、それらに限定されない。
【００６２】
第六工程では、２Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール２，４−シクロ二リン酸を１−ヒドロキシ−２−メチル−２−（Ｅ）−ブテニル−４−二リン酸に変換する。この工程を触媒することが公知の酵素は、例えば、１−ヒドロキシ−２−メチル−２−（Ｅ）−ブテニル−４−二リン酸シンターゼである。ヌクレオチド配列の説明例としては、（ＡＹ０３３５１５；大腸菌（Escherichia coli））、（ＮＣ＿００２９４７、ｌｏｃｕｓ＿ｔａｇ ＰＰ０８５３；シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）ＫＴ２４４０）、及び（ＮＣ＿００７４９３、ｌｏｃｕｓ＿ｔａｇ ＲＳＰ＿２９８２；ロドバクター・スフェロイデス（Rhodobacter sphaeroides）２．４．１）が挙げられるが、それらに限定されない。
【００６３】
第七工程では、１−ヒドロキシ−２−メチル−２−（Ｅ）−ブテニル−４−二リン酸を、ＩＰＰ又はその異性体、ＤＭＡＰＰ、のいずれかに変換する。この工程を触媒することが公知の酵素は、例えば、イソペンチル／ジメチルアリル二リン酸シンターゼである。ヌクレオチド配列の説明例としては、（ＡＹ０６２２１２；大腸菌（Escherichia coli））及び（ＮＣ＿００２９４７、ｌｏｃｕｓ＿ｔａｇ ＰＰ０６０６；シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）ＫＴ２４４０）が挙げられるが、それらに限定されない。
【００６４】
一部の実施形態では、宿主細胞固有の代謝プロセスと本明細書に提供するようなＩＰＰの生産に関与するプロセスとの間の「クロストーク」（又は干渉）を最少化又は完全に排除する。例えば、宿主微生物がＩＰＰの合成に関してＤＸＰ経路に排他的に依存し、及び追加のＩＰＰを提供するためにＭＥＶ経路が導入されるとき、クロストークは最少化又は完全に排除される。そのような宿主生物には、ＭＥＶ経路酵素の発現を変更するための、又はＭＥＶ経路に随伴する中間体をプロセッシングするための装備がなされていないであろう。ＤＸＰ経路に排他的に又は主として依存する生物としては、例えば、大腸菌（Escherichia coli）が挙げられる。
【００６５】
一部の実施形態において、前記宿主細胞は、排他的に又はＤＸＰ経路と併用で、ＭＥＶ経路によってＩＰＰを生産する。他の実施形態では、宿主が排他的に異種導入ＭＥＶ経路によってＩＰＰを生産するように、宿主のＤＸＰ経路を機能不能にする。ＤＸＰ経路は、遺伝子発現を不能にすること又はＤＸＰ経路酵素の１つもしくはそれ以上の機能を不活性化することによって、機能不能にすることができる。
【００６６】
宿主細胞
本明細書に提供する使用に適する宿主細胞の説明例としては、任意の古細菌（archae）、原核又は真核細胞が挙げられる。古細菌細胞の例としては、アエロピュルム属（Aeropyrum）、アルカエグロブス属（Archaeglobus）、ハロバクテリウム属（Halobacterium）、メタノコッカス属（Methanococcus）、メタノバクテリウム属（Methanobacterium）、パイロコッカス属（Pyrococcus）、スルフォロブス属（Sulfolobus）、及びサーモプラスマ属（Thermoplasma）に属するものが挙げられるが、それらに限定されない。古細菌株の説明例としては、アエロピュルム・ペルニクス（Aeropyrum pernix）、アルカエグロブス・フルギダス（Archaeoglobus fulgidus）、メタノコッカス・ヤナシイ（Methanococcus jannaschii）、メタノバクテリウム・サーモオートトロフィカム（Methanobacterium thermoautotrophicum）、パイロコッカス・アビシイ（Pyrococcus abyssi）、パイロコッカス・ホリコシイ（Pyrococcus horikoshii）、サーモプラスマ・アシドフィルム（Thermoplasma acidophilum）、サーモプラスマ・ボルカニウム（Thermoplasma volcanium）が挙げられるが、それらに限定されない。
【００６７】
原核細胞の例としては、アグロバクテリウム属（Agrobacterium）、アリシクロバシラス属（Alicyclobacillus）、アナベナ属（Anabaena）、アナシスティス属（Anacystis）、アルスロバクター属（Arthrobacter）、アゾバクター属（Azobacter）、バシラス属（Bacillus）、ブレビバクテリウム属（Brevibacterium）、クロマチウム属（Chromatium）、クロストリジウム属（Clostridium）、コリネバクテリウム属（Corynebacterium）、エンテロバクター属（Enterobacter）、エルウィニア属（Erwinia）、エシェリキア属（Escherichia）、乳酸杆菌属（Lactobacillus）、ラクトコッカス属（Lactococcus）、メソリゾビウム属（Mesorhizobium）、メチロバクテリウム属（Methylobacterium）、ミクロバクテリウム属（Microbacterium）、フォルミディウム属（Phormidium）、シュードモナス属（Pseudomonas）、ロドバクター属（Rhodobacter）、ロドシュードモナス属（Rhodopseudomonas）、ロドスピリルム属（Rhodospirillum）、ロドコッカス属（Rhodococcus）、サルモネラ属（Salmonella）、セネデスムス属（Scenedesmun）、セラチア属（Serratia）、赤痢菌属（Shigella）、スタフィロコッカス属 （Staphlococcus）、ストレプトマイセス属（Strepromyces）、シネコッカス（Synnecoccus）、及びジモモナス属（Zymomonas）に属するものが挙げられるが、それらに限定されない。
【００６８】
原核細菌株の説明例としては、枯草菌（Bacillus subtilis）、バチルス・アミロリクエファシエンス（Bacillus amyloliquefacines）、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス（Brevibacterium ammoniagenes）、ブレビバクテリウム・インマリオフィルム（Brevibacterium immariophilum）、クロストリジウム・ベエイジェリンキー（Clostridium beigerinckii）、エンテロバクター・サカザキイ（Enterobacter sakazakii）、大腸菌（Escherichia coli）、ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）、メソリゾビウム・ロティ（Mesorhizobium loti）、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）、シュードモナス・メバロニイ（Pseudomonas mevalonii）、シュードモナス・プディカ（Pseudomonas pudica）、ロドバクター・カプスラタス（Rhodobacter capsulatus）、ロドバクター・スファエロイデス（Rhodobacter sphaeroides）、ロドスピリルム・ラブラム（Rhodospirillum rubrum）、サルモネラ・エンテリカ（Salmonella enterica）、チフス菌（Salmonella typhi）、腸チフス菌（Salmonella typhimurium）、志賀赤痢菌（Shigella dysenteriae）、フレクスナー赤痢菌（Shigella flexneri）、ソンネ赤痢菌（Shigella sonnei）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）などが挙げられるが、それらに限定されない。
【００６９】
一般に、細菌宿主細胞を用いる場合、非病原菌株が好ましい。非病原菌株の説明例としては、枯草菌（Bacillus subtilis）、大腸菌（Escherichia coli）、アシドフィルス菌（Lactibacillus acidophilus）、ラクトバチルス・ヘルベティクス（Lactobacillus helveticus）、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）、シュードモナス・メバロニイ（Pseudomonas mevalonii）、シュードモナス・プディタ（Pseudomonas pudita）、ロドバクター・スファエロイデス（Rhodobacter sphaeroides）、ロドバクター・カプスラタス（Rhodobacter capsulatus）、ロドスピリルム・ラブラム（Rhodospirillum rubrum）などが挙げられるが、それらに限定されない。
【００７０】
真核細胞の例としては、真菌細胞が挙げられるが、それらに限定されない。真菌細胞の例としては、コウジカビ属（Aspergillus）、カンジダ属（Candida）、クリソスポリウム属（Chrysosporium）、クリプトコッカス属（Cryotococcus）、フザリウム属（Fusarium）、クリュイベロミセス属（Kluyveromyces）、ネオタイホジウム属（Neotyphodium）、アカパンカビ属（Neurospora）、アオカビ属（Penicillium）、ピキア属（Pichia）、サッカロミセス属（Saccharomyces）、トリコデルマ属（Trichoderma）及びキサントフィロマイセス属（Xanthophyllomyces）（以前はファフィア属（Phaffia））に属するものが挙げられるが、それらに限定されない。
【００７１】
真核菌株の説明例としては、アスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulans）、黒色コウジ菌（Aspergillus niger）、米コウジ菌（Aspergillus oryzae）、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、クリソスポリウム・ラクノウェンス（Chrysosporium lucknowense）、フザリウム・グラミネアラム（Fusarium graminearum）、フザリウム・ベネナツム（Fusarium venenatum）、クリュイベロミセス・ラクティス（Kluyveromyces lactis）、アカパンカビ（Neurospora crassa）、ピキア・アングスタ（Pichia angusta）、ピキア・フィンランディカ（Pichia finlandica）、ピキア・コダメ（Pichia kodamae）、ピキア・メンブラニーファシエンス（Pichia membranaefaciens）、ピキア・メタノリカ（Pichia methanolica）、ピキア・オプンティエ（Pichia opuntiae）、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）、ピキア・ピペリ（Pichia pijperi）、ピキア・クエルキューム（Pichia quercuum）、ピキア・サリクタリア（Pichia salictaria）、ピキア・サーモトレランス（Pichia thermotolerans）、ピキア・トレハロフィラ（Pichia trehalophila）、ピキア・スティピティス（Pichia stipitis）、ストレプトマイセス・アンボファシエンス（Streptomyces ambofaciens）、ストレプトマイセス・オーレオファシエンス（Streptomyces aureofaciens）、ストレプトマイセス・アウレウス（Streptomyces aureus）、サッカロミセス・バヤヌス（Saccaromyces bayanus）、サッカロミセス・ブーラルディ（Saccaromyces boulardi）、サッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）、ストレプトマイセス・フンギシディカス（Streptomyces fungicidicus）、ストレプトマイセス・グリセオクロモジェネス（Streptomyces griseochromogenes）、ストレプトマイセス・グリセウス（Streptomyces griseus）、ストレプトマイセス・リビダンス（Streptomyces lividans）、ストレプトマイセス・オリボグリセウス（Streptomyces olivogriseus）、ストレプトマイセス・ラメウス（Streptomyces rameus）、ストレプトマイセス・タナシエンシス（Streptomyces tanashiensis）、ストレプトマイセス・ビナセウス（Streptomyces vinaceus）、トリコデルマ・リーセイ（Trichoderma reesei）及びキサントフィロマイセス・デンドロラス（Xanthophyllomyces dendrorhous）（以前は、ファフィア・ロドジマ（Phaffia rhodozyma））が挙げられるが、それらに限定されない。
【００７２】
一般に、真核細胞を用いる場合、非病原菌株が好ましい。非病原菌株の説明例としては、フザリウム・グラミネアラム（Fusarium graminearum）、フザリウム・ベネナツム（Fusarium venenatum）、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）、サッカロミセス・ブーラルディ（Saccaromyces boulardi）、及びサッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）が挙げられるが、それらに限定されない。
【００７３】
加えて、一定の菌株は、米国食品医薬品局（the Food and Drug Administration）によってＧＲＡＳすなわち安全性認定食品添加物（Generally Regarded As Safe）として指定されている。これらの菌株としては、枯草菌（Bacillus subtilis）、アシドフィルス菌（Lactibacillus acidophilus）、ラクトバチルス・ヘルベティクス（Lactobacillus helveticus）及びサッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）が挙げられる。
【００７４】
イソプレノイド化合物
本明細書に提供する宿主細胞を用いてイソプレノイドを作る。特定のイソプレノイド化合物は、ＩＰＰ又はＤＭＡＰＰから作られ、及び追加の仕上酵素（finishing enzyme）を必要とすることがある。適するイソプレノイドの非限定的な例としては、（１つのイソプレン単位から誘導される）ヘミテルペン、例えばイソプレン；（２つのイソプレン単位から誘導される）モノテルペン、例えばミルセン；（３つのイソプレン単位から誘導される）セスキテルペン、例えばアモルファ−４，１１−ジエン；（４つのイソプレン単位から誘導される）ジテルペン、例えばタキサジエン；（６つのイソプレン単位から誘導される）トリテルペン、例えばスクアレン；（８つのイソプレノイドから誘導される）テトラテルペン、例えばβ−カロチン；及び（８つを超えるイソプレン単位から誘導される）ポリテルペン、例えばポリイソプレンが挙げられる。一部の実施形態において、前記イソプレノイドは、カロチノイドではない。他の実施形態において、前記イソプレノイドは、Ｃ５−Ｃ２０イソプレノイドである。特定のＣ５−Ｃ２０イソプレノイド化合物及びそれらのそれぞれの仕上酵素の説明例を下でさらに説明する。
【００７５】
Ｃ５化合物
本明細書に提供するＣ５化合物は、一般に、ＩＰＰ又はＤＭＡＰＰから誘導される。これらの化合物は、単一のイソプレン単位（ＩＰＰ又はＤＭＡＰＰ）から誘導されるため、ヘミテルペンとしても公知である。
【００７６】
イソプレン
構造が、
【化１】
であるイソプレンは、多くの植物において見つけることができる。イソプレンは、イソプレンシンターゼによってＩＰＰから作られる。適するヌクレオチド配列の説明例としては、（ＡＢ１９８１９０；ウラジロハコヤナギ（Populus alba）及び（ＡＪ２９４８１９；ウラジロハコヤナギ（Polulus alba）ｘヨーロッパヤマナラシ（Polulus tremula））が挙げられるが、それらに限定されない。
【００７７】
Ｃ１０化合物
本明細書に提供するＣ１０化合物は、一般に、ＩＰＰとＤＭＡＰＰの縮合によって作られるゲラニルピロリン酸（ＧＰＰ）に由来した。この工程を触媒することが公知の酵素は、例えば、ゲラニルピロリン酸シンターゼである。これらのＣ１０化合物は、２つのイソプレン単位から誘導されるため、モノテルペンとしても公知である。
【００７８】
図３は、如何にしてＩＰＰ及びＤＭＡＰＰがＧＰＰを生産でき、それをさらにモノテルペンへとプロセッシングできるかを概略的に示すものである。
【００７９】
ゲラニルピロリン酸シンターゼについてのヌクレオチド配列の説明例としては、（ＡＦ５１３１１１；グランディスモミ（Abies grandis））、（ＡＦ５１３１１２；グランディスモミ（Abies grandis））、（ＡＦ５１３１１３；グランディスモミ（Abies grandis））、（ＡＹ５３４６８６；キンギョソウ（Antirrhinum majus））、（ＡＹ５３４６８７；キンギョソウ（Antirrhinum majus））、（Ｙ１７３７６；シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana））、（ＡＥ０１６８７７、Ｌｏｃｕｓ ＡＰ１１０９２；セレウス菌（Bacillus cereus）；ＡＴＣＣ１４５７９）、（ＡＪ２４３７３９；オレンジ（Citrus sinensis））、（ＡＹ５３４７４５；クラーキア・ブレウェリ（Clarkia breweri））、（ＡＹ９５３５０８；マツキクイムシ（Ips pini））、（ＤＱ２８６９３０；トマト（Lycopersicon esculentum））、（ＡＦ１８２８２８；コショウハッカ（Mentha x piperita））、（ＡＦ１８２８２７；コショウハッカ（Mentha x piperita））、（ＭＰＩ２４９４５３；コショウハッカ（Mentha x piperita））、（ＰＺＥ４３１６９７、Ｌｏｃｕｓ ＣＡＤ２４４２５；パラコッカス・ゼアキサンチニファシエンス（Paracoccus zeaxanthinifaciens））、（ＡＹ８６６４９８；コオウレン（Picrorhiza kurrooa））、（ＡＹ３５１８６２；ブドウ（Vitis vinifera）、及び（ＡＦ２０３８８１、Ｌｏｃｕｓ ＡＡＦ１２８４３；ジモモナス・モビリス（Zymomonas mobilis））が挙げられるが、それらに限定されない。
【００８０】
次いで、その後ＧＰＰを様々なＣ１０化合物に変換する。Ｃ１０化合物の説明例としては、以下のものが挙げられるが、それらに限定されない：
【００８１】
カレン
構造が、
【化２】
であるカレンは、多くの木、特に松の木、の樹脂において見つけられる。カレンは、カレンシンターゼでＧＰＰから作られる。適するヌクレオチド配列の説明例としては、（ＡＦ４６１４６０、ＲＥＧＩＯＮ ４３．．１９２６；オウシュウトウヒ（Picea abies））及び（ＡＦ５２７４１６、ＲＥＧＩＯＮ：７８．．１８７１；サルビア・ステノフィラ（Salvia stenophylla））が挙げられるが、それらに限定されない。
【００８２】
ゲラニオール
構造が
【化３】
であるゲラニオール（ロドノール（rhodnol）としても公知）は、ローズ油(oil-of-rose)及びパルマローザ油の主成分である。それは、ゼラニウム、レモン及びシトロネラソウ中にも存在する。ゲラニオールは、ゲラニオールシンターゼによってＧＰＰから作られる。適するヌクレオチド配列の説明例としては、（ＡＪ４５７０７０；シナモマム・テヌイピラム（Cinnamomum tenuipilum））、（ＡＹ３６２５５３；メボウキ（Ocimum basilicum））、（ＤＱ２３４３００；エゴマ（Perilla frutescens株１８６４））、（ＤＱ２３４２９９；レモンエゴマ（Perilla citriodora）株１８６１）、（ＤＱ２３４２９８；レモンエゴマ（Perilla citriodora）株４９３５）、及び（ＤＱ０８８６６７；レモンエゴマ（Perilla citriodora））が挙げられるが、それらに限定されない。
【００８３】
リナロオール
構造が、
【化４】
であるリナロオールは、多くの花及びスパイス植物（例えば、コリアンダー種子）において見つけられる。リナロオールは、リナロオールシンターゼによってＧＰＰから作られる。適するヌクレオチド配列の説明例としては、（ＡＦ４９７４８５；シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana））、（ＡＣ００２２９４、Ｌｏｃｕｓ ＡＡＢ７１４８２；シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana））、（ＡＹ０５９７５７；シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana））、（ＮＭ＿１０４７９３；シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana））、（ＡＦ１５４１２４；クソニンジン（Artemisia annua））、（ＡＦ０６７６０３；クラーキア・ブレウェリ（Clarkia breweri））、（ＡＦ０６７６０２；クラーキア・コンキンナ（Clarkia concinna））、（ＡＦ０６７６０１；クラーキア・ブレウェリ（Clarkia breweri））、（Ｕ５８３１４；クラーキア・ブレウェリ（Clarkia breweri））、（ＡＹ８４００９１；トマト（Lycopersicon esculentum））、（ＤＱ２６３７４１；イングリッシュラベンダー（Lavandula angustifolia））、（ＡＹ０８３６５３；オレンジミント（Mentha citrate））、（ＡＹ６９３６４７；メボウキ（Ocimum basillucum））、（ＸＭ＿４６３９１８；イネ（Oryza sativa））、（ＡＰ００４０７８、Ｌｏｃｕｓ ＢＡＤ０７６０５；イネ（Oryza sativa））、（ＸＭ＿４６３９１８、Ｌｏｃｕｓ ＸＰ＿４６３９１８；イネ（Oryza sativa））、（ＡＹ９１７１９３；レモンエゴマ（Perilla citriodora））、（ＡＦ２７１２５９；エゴマ（Perilla frutescens））、（ＡＹ４７３６２３；オウシュウトウヒ（Picea abies））、（ＤＱ １９５２７４；シトカトウヒ（Picea sitchensis））、及び（ＡＦ４４４７９８；シソ（Perilla frutescens var. crispa）栽培品種Ｎｏ．７９）が挙げられるが、それらに限定されない。
【００８４】
リモネン
構造が、
【化５】
であるリモネンは、柑橘類の外皮及びハッカにおいて見つけられる。リモネンは、リモネンシンターゼによってＧＰＰから作られる。適するヌクレオチド配列の説明例としては、（＋）−リモネンシンターゼ（ＡＦ５１４２８７、ＲＥＧＩＯＮ：４７．．１８６７；レモン（Citrus limon）及び（ＡＹ０５５２１４、ＲＥＧＩＯＮ：４８．．１８８９；カワミドリ（Agastache rugosa）ならびに（−）−リモネンシンターゼ（ＤＱ１９５２７５、ＲＥＧＩＯＮ：１．．１９０５；シトカトウヒ（Picea sitchensis））、（ＡＦ００６１９３、ＲＥＧＩＯＮ：７３．．１９８６；グランディスモミ（Abies grandis））、及び（ＭＨＣ４ＳＬＳＰ、ＲＥＧＩＯＮ：２９．．１８２８；オランダハッカ（Mentha spicata））が挙げられるが、それらに限定されない。
【００８５】
ミルセン
構造が、
【化６】
であるミルセンは、ゲッケイジュ、バーベナ及びミルキア（myrcia）（その名前は、これから取られている）をはじめとする多くの植物における精油において見つけられる。ミルセンは、ミルセンシンターゼによってＧＰＰから作られる。適するヌクレオチド配列の説明例としては、（Ｕ８７９０８；グランディスモミ（Abies grandis））、（ＡＹ１９５６０９；キンギョソウ（Antirrhinum majus））、（ＡＹ１９５６０８；キンギョソウ（Antirrhinum majus））、（ＮＭ＿１２７９８２；シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）ＴＰＳ１０）、（ＮＭ＿１１３４８５；シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）ＡＴＴＰＳ−ＣＩＮ）、（ＮＭ＿１１３４８３；シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）ＡＴＴＰＳ−ＣＩＮ）、（ＡＦ２７１２５９；エゴマ（Perilla frutescens））、（ＡＹ４７３６２６；オウシュウトウヒ（Picea abies））、（ＡＦ３６９９１９；オウシュウトウヒ（Picea abies））、及び（ＡＪ３０４８３９；セイヨウヒイラギガシ（Quercus ilex））が挙げられるが、それらに限定されない。
【００８６】
オシメン
構造が、それぞれ、
【化７】
である、α−オシメン及びβ−オシメンは、メボウキ（Ocimum basilicum）をはじめとする様々な植物及び果物において見つけられ、オシメンシンターゼによってＧＰＰから作られる。適するヌクレオチド配列の説明例としては、（ＡＹ１９５６０７；キンギョソウ（Antirrhinum majus））、（ＡＹ１９５６０９；キンギョソウ（Antirrhinum majus））、（ＡＹ１９５６０８；キンギョソウ（Antirrhinum majus））、（ＡＫ２２１０２４；シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana））、（ＮＭ＿１１３４８５；シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）ＡＴＴＰＳ−ＣＩＮ）、（ＮＭ＿１１３４８３；シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）ＡＴＴＰＳ−ＣＩＮ）、（ＮＭ＿１１７７７５；シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）ＡＴＴＰＳ０３）、（ＮＭ＿００１０３６５７４；シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）ＡＴＴＰＳ０３）、（ＮＭ＿１２７９８２；シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）ＴＰＳ１０）、（ＡＢ１１０６４２；ウンシュウミカン（Citrus unshiu）ＣｉｔＭＴＳＬ４）、及び（ＡＹ５７５９７０；ミヤコグサ（Lotus corniculatus var. japonicus））が挙げられるが、それらに限定されない。
【００８７】
α−ピネン
構造が、
【化８】
であるα−ピネンは、松の木及びユーカリノキにおいて見つけられる。α−ピネンは、α−ピネンシンターゼによってＧＰＰから作られる。適するヌクレオチド配列の説明例としては、（＋）α−ピネンシンターゼ（ＡＦ５４３５３０、ＲＥＧＩＯＮ：１．．１８８７；タエダマツ（Pinus taeda））、（−）α−ピネンシンターゼ（ＡＦ５４３５２７、ＲＥＧＩＯＮ：３２．．１９２１；タエダマツ（Pinus taeda））、及び（＋）／（−）α−ピネンシンターゼ（ＡＧＵ８７９０９、ＲＥＧＩＯＮ：６１１１８９２；グランディスモミ（Abies grandis））が挙げられるが、それらに限定されない。
【００８８】
β−ピネン
構造が、
【化９】
であるβ−ピネンは、松の木、ローズマリー、パセリ、ディル、バジル、及びバラにおいて見つけられる。β−ピネンは、β−ピネンシンターゼによってＧＰＰから作られる。適するヌクレオチド配列の説明例としては、（−）β−ピネンシンターゼ（ＡＦ２７６０７２、ＲＥＧＩＯＮ：１．．１７４９；クソニンジン（Artemisia annua））及び（ＡＦ５１４２８８、ＲＥＧＩＯＮ：２６．．１８３４；レモン（Citrus limon））が挙げられるが、それらに限定されない。
【００８９】
サビネン
構造が、
【化１０】
であるサビネンは、黒コショウ、キャロットシード、セージ及びティーツリーにおいて見つけられる。サビネンは、サビネンシンターゼによってＧＰＰから作られる。適するヌクレオチド配列の説明例としては、サルビア・オフィシナリス（Salvia officinalis）からのＡＦ０５１９０１、ＲＥＧＩＯＮ：２６．．１７９８が挙げられるが、これに限定されない。
【００９０】
γ−テルピネン
構造が、
【化１１】
であるγ−テルピネンは、柑橘類からの精油の構成成分である。生化学的には、γ−テルピネンは、γ−テルピネンシンターゼによってＧＰＰから作られる。適するヌクレオチド配列の説明例としては、（レモン（Citrus limon）からのＡＦ５１４２８６、ＲＥＧＩＯＮ：３０．．１８３２）及び（ウンシュウミカン（Citrus unshiu）からのＡＢ１１０６４０、ＲＥＧＩＯＮ １．．１８０３）が挙げられる。
【００９１】
テルピノレン
構造が、
【化１２】
であるテルピノレンは、クロフサスグリ、イトスギ、グアバ、レイシ、パパイヤ、松及び茶において見つけられる。テルピノレンは、テルピノレンシンターゼによってＧＰＰから作られる。適するヌクレオチド配列の説明例としては、アメリカトガサワラ（Pseudotsuga menziesii）からのＡＹ９０６８６６、ＲＥＧＩＯＮ：１０．．１８８７が挙げられるが、これに限定されない。
【００９２】
Ｃ１５化合物
本明細書に提供するＣ１５化合物は、一般に、２つのＩＰＰ分子と１つのＤＭＡＰＰ分子の縮合によって作られるファルネシルピロリン酸（ＦＰＰ）に由来する。この工程を触媒することが公知の酵素は、例えば、ファルネシルピロリン酸シンターゼである。これらのＣ１５化合物は、３つのイソプレン単位から誘導されるため、セスキテルペンとしても公知である。
【００９３】
図３は、如何にしてＩＰＰ及びＤＭＡＰＰを化合させてＦＰＰを生産でき、それをさらにセスキテルペンへとプロセッシングできるかを概略的に示すものである。
【００９４】
ファルネシルピロリン酸シンターゼについてのヌクレオチド配列の説明例としては、（ＡＴＵ８０６０５；シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana））、（ＡＴＨＦＰＳ２Ｒ；シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana））、（ＡＡＵ３６３７６；クソニンジン（Artemisia annua））、（ＡＦ４６１０５０；ウシ（Bos taurus））、（Ｄ００６９４；大腸菌（Escherichia coli）Ｋ−１２）、（ＡＥ００９９５１、Ｌｏｃｕｓ ＡＡＬ９５５２３；有核紡錘菌亜種ヌクレアタム（Fusobacterium nucleatum subsp. nucleatum）ＡＴＣＣ２５５８６）、（ＧＦＦＰＰＳＧＥＮ；ジベレラ（Gibberella fujikuroi））、（ＣＰ０００００９、Ｌｏｃｕｓ ＡＡＷ６００３４；グルコノバクター・オキシダンス（Gluconobacter oxydans）６２１Ｈ）、（ＡＦ０１９８９２；ヒマワリ（Helianthus annuus））、（ＨＵＭＦＡＰＳ；ヒト（Homo sapiens））、（ＫＬＰＦＰＳＱＣＲ；クリュイベロミセス・ラクティス（Kluyveromyces lactis）、（ＬＡＵ１５７７７；シロバナハウチマメ（Lupinus albus））、（ＬＡＵ２０７７１；シロバナハウチマメ（Lupinus albus））、（ＡＦ３０９５０８；ハツカネズミ（Mus musculus））、（ＮＣＦＰＰＳＧＥＮ；アカパンカビ（Neurospora crassa））、（ＰＡＦＰＳ１；グアユールゴムノキ（Parthenium argentatum））、（ＰＡＦＰＳ２；グアユールゴムノキ（Parthenium argentatum））、（ＲＡＴＦＡＰＳ；ドブネズミ（Rattus norvegicus））、（ＹＳＣＦＰＰ；サッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae））、（Ｄ８９１０４；分裂酵母（Schizosaccharomyces pombe））、（ＣＰ０００００３、Ｌｏｃｕｓ ＡＡＴ８７３８６；化膿連鎖球菌（Streptococcus pyogenes））、（ＣＰ００００１７、Ｌｏｃｕｓ ＡＡＺ５１８４９；化膿連鎖球菌（Streptococcus pyogenes））、（ＮＣ＿００８０２２、Ｌｏｃｕｓ ＹＰ＿５９８８５６；化膿連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）ＭＧＡＳ１０２７０）、（ＮＣ＿００８０２３、Ｌｏｃｕｓ ＹＰ＿６００８４５；化膿連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）ＭＧＡＳ２０９６）、（ＮＣ＿００８０２４、Ｌｏｃｕｓ ＹＰ＿６０２８３２；化膿連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）ＭＧＡＳ１０７５０）、及び（ＭＺＥＦＰＳ；トウモロコシ（Zea mays））が挙げられるが、それらに限定されない。
【００９５】
あるいは、ＩＰＰをＧＰＰに添加することによってＦＰＰを作ることもできる。この反応が可能な酵素をコードするヌクレオチド配列の説明例としては、（ＡＥ０００６５７、Ｌｏｃｕｓ ＡＡＣ０６９１３；アクイフェックス・エオリカス（Aquifex aeolicus）ＶＦ５）、（ＮＭ＿２０２８３６；シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana））、（Ｄ８４４３２、Ｌｏｃｕｓ ＢＡＡ１２５７５；枯草菌（Bacillus subtilis）、（Ｕ１２６７８、Ｌｏｃｕｓ ＡＡＣ２８８９４；ブラディリゾビウム・ジャポニカム（Bradyrhizobium japonicum）ＵＳＤＡ １１０）、（ＢＡＣＦＤＰＳ；ゲオバシラス・ステアロサーモフィラス（Geobacillus stearothermophilus））、（ＮＣ＿００２９４０、Ｌｏｃｕｓ ＮＰ＿８７３７５４；ヘモフィリス・デュクレイ（Haemophilus ducreyi）３５０００ＨＰ）、（Ｌ４２０２３、Ｌｏｃｕｓ ＡＡＣ２３０８７；インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）Ｒｄ ＫＷ２０）、（Ｊ０５２６２；ヒト（Homo sapiens））、（ＹＰ＿３９５２９４；ラクトバシラス・サケイ亜種サケイ（Lactobacillus sakei subsp. sakei）２３Ｋ）、（ＮＣ＿００５８２３、Ｌｏｃｕｓ ＹＰ＿０００２７３；レプトスピラ・インターロガンス（Leptospira interrogans）血清型（serovar）Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎｉ株Ｆｉｏｃｒｕｚ Ｌ１−１３０）、（ＡＢ００３１８７；ミクロコッカス・ルテウス（Micrococcus luteus）、（ＮＣ＿００２９４６、Ｌｏｃｕｓ ＹＰ＿２０８７６８；淋菌（Neisseria gonorrhoeae）ＦＡ１０９０）、（Ｕ０００９０、Ｌｏｃｕｓ ＡＡＢ９１７５２；リゾビウム属種（Rhizobium sp．）ＮＧＲ２３４）、（Ｊ０５０９１；サッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae））、（ＣＰ００００３１、Ｌｏｃｕｓ ＡＡＶ９３５６８；シリシバクター・ポメロイ（Silicibacter pomeroyi）ＤＳＳ−３）、（ＡＥ００８４８１、Ｌｏｃｕｓ ＡＡＫ９９８９０；肺連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae）Ｒ６）、及び（ＮＣ＿００４５５６、Ｌｏｃｕｓ ＮＰ ７７９７０６；ガハニコナカイガラムシ（Xylella fastidiosa）Ｔｅｍｅｃｕｌａ１）が挙げられるが、それらに限定されない。
【００９６】
次いで、その後ＦＰＰを様々なＣ１５化合物に変換する。Ｃ１５化合物の説明例としては、以下のものが挙げられるが、それらに限定されない：
【００９７】
アモルファジエン
構造が、
【化１３】
であるアモルファジエンは、クソニンジン（Artemisia anna）によって作られるアルテミシニンの前駆体である。アモルファジエンは、アモルファジエンシンターゼによってＦＰＰから作られる。適するヌクレオチド配列の説明例は、米国特許第７，１９２，７５１号の配列番号３７である。
【００９８】
α−ファルネセン
構造が、
【化１４】
であるα−ファルネセンは、アリのデュフール腺ならびにリンゴの皮及び西洋ナシの皮をはじめとする（しかし、これらに限定されない）様々な生物源において見つけられる。α−ファルネセンは、α−ファルネセンシンターゼによってＦＰＰから作られる。適するヌクレオチド配列の説明例としては、セイヨウナシ（Pyrus communis）栽培品種ｄ’Ａｎｊｏｕ（ナシ；遺伝子名ＡＦＳ１）からのＤＱ３０９０３４及び栽培リンゴ（Malus domestica）（リンゴ；遺伝子ＡＦＳ１）からのＡＹ１８２２４１が挙げられるが、それらに限定されない。Pechouus et al, Planta 219 (1): 84-94 (2004)。
【００９９】
β−ファルネセン
構造が、
【化１５】
であるβ−ファルネセンは、アブラムシ及び精油（例えばハッカからのもの）をはじめとする（しかし、これらに限定されない）様々な生物源において見つけられる。野生ジャガイモなどの一部の植物において、β−ファルネセンは、天然の防虫剤として合成される。β−ファルネセンは、β−ファルネセンシンターゼによってＦＰＰから作られる。適するヌクレオチド配列の説明例としては、コショウハッカ（Mentha x piperita）（ハッカ：遺伝子Ｔｓｐａ１１）からのＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ０２４６１５、及びクソニンジン（Artemisia annua）からのＡＹ８３５３９８が挙げられるが、それらに限定されない。Picaud et al., Phytochemistry 66(9): 961-967 (2005)。
【０１００】
ファルネソール
構造が、
【化１６】
であるファルネソールは、昆虫及び精油（例えばシトロネラ（cintronella）、ネロリ、シクラメン、レモングラス、ゲッカコウ及びバラからのもの）をはじめとする様々な生物源において見つけられる。ファルネソールは、ファルネソールシンターゼなどのヒドロキシラーゼによってＦＰＰから作られる。適するヌクレオチド配列の説明例としては、トウモロコシ（Zea mays）からのＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ５２９２６６及びサッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）（遺伝子Ｐｈｏ８）からのＹＤＲ４８１Ｃが挙げられるが、それらに限定されない。Song, L., Applied Biochemistry and Biotechnology 128: 149-158 (2006)。
【０１０１】
ネロリドール
構造が、
【化１７】
であるネロリドールは、ペルビオールとしても公知であり、ならびに例えば精油、例えばネロリ、ショウガ、ジャスミン、ラベンダー、ティーツリー及びレモングラスからのもの、をはじめとする様々な生物源において見つけられる。ネロリドールは、ネロリドールシンターゼなどのヒドロキシラーゼによってＦＰＰから作られる。適するヌクレオチド配列の説明例としては、トウモロコシ（Zea mays）（トウモロコシ；遺伝子ｔｐｓ１）からのＡＦ５２９２６６が挙げられるが、これに限定されない。
【０１０２】
パチョロール
構造が、
【化１８】
であるパチョロール（patchoulol）は、パチョリアルコールとしても公知であり、ポゴステモン・パチョリ（Pogostemon patchouli）の精油の構成成分である。パチョロールは、パチョロールシンターゼによってＦＰＰから作られる。適するヌクレオチド配列の説明例としては、パチョリ（Pogostemon cablin）からのＡＹ５０８７３０ ＲＥＧＩＯＮ：１．．１６５９が挙げられるが、これに限定されない。
【０１０３】
バレンセン
構造が、
【化１９】
であるバレンセンは、オレンジの香り及び風味の主化学成分の１つであり、オレンジの皮において見つけられる。バレンセンは、ヌートカトンシンターゼ（nootkatone synthase）によってＦＰＰから作られる。適するヌクレオチド配列の説明例としては、オレンジ（Citrus sinensis）からのＡＦ４４１１２４ ＲＥＧＩＯＮ：１．．１６４７及びエゴマ（Perilla frutescens）からのＡＹ９１７１９５ ＲＥＧＩＯＮ：１．．１６５３が挙げられるが、それらに限定されない。
【０１０４】
Ｃ２０化合物
本明細書に提供するＣ２０化合物は、一般に、３つのＩＰＰ分子と１つのＤＭＡＰＰ分子の縮合によって作られるゲラニルゲラニオールピロリン酸（ＧＧＰＰ）に由来した。この工程を触媒することが公知の酵素は、例えば、ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼである。これらのＣ２０化合物は、４つのイソプレン単位から誘導されるため、ジテルペンとしても公知である。
【０１０５】
図３は、如何にしてＩＰＰ及びＤＭＡＰＰを併せてＧＧＰＰを生産でき、それをさらにジテルペンへとプロセッシングできるのか、又はそれをさらにプロセシングしてカルチノイドを生産できるのかを概略的に示すものである。
【０１０６】
ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼについてのヌクレオチド配列の説明例としては、（ＡＴＨＧＥＲＰＹＲＳ；シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana））、（ＢＴ００５３２８；シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana））、（ＮＭ＿１１９８４５；シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana））、（ＮＺ＿ＡＡＪＭ０１０００３８０、Ｌｏｃｕｓ ＺＰ＿００７４３０５２；バシラス・スリンジエンシス（Bacillus thuringiensis）血清型（serovar）israelensis、ＡＴＣＣ ３５６４６ ｓｑ１５６３）、（ＣＲＧＧＰＰＳ；ニチニチソウ（Catharanthus roseus）、（ＮＺ＿ＡＡＢＦ０２００００７４、Ｌｏｃｕｓ ＺＰ＿００１４４５０９；有核紡錘菌亜種ビンセンティイ（Fusobacterium nucleatum subsp. vincentii）、ＡＴＣＣ ４９２５６）、（ＧＦＧＧＰＰＳＧＮ；ジベレラ（Gibberella fujikuroi））、（ＡＹ３７１３２１；イチョウ（Ginkgo biloba））、（ＡＢ０５５４９６；ヘベア・ブラジリエンシス（Hevea brasiliensis））、（ＡＢ０１７９７１；ヒト（Homo sapiens））、（ＭＣＩ２７６１２９；ムコール・シルシネロイデス ｆ．ルシタニクス（Mucor circinelloides f. lusitanicus））、（ＡＢ０１６０４４；ハツカネズミ（Mus musculus））、（ＡＡＢＸ０１０００２９８、Ｌｏｃｕｓ ＮＣＵ０１４２７；アカパンカビ（Neurospora crassa））、（ＮＣＵ２０９４０；アカパンカビ（Neurospora crassa））、（ＮＺ＿ＡＡＫＬ０１０００００８、Ｌｏｃｕｓ ＺＰ＿００９４３５６６；ラルストニア・ソラナケアルム（Ralstonia solanacearum）ＵＷ５５１）、（ＡＢ１１８２３８；ドブネズミ（Rattus norvegicus））、（ＳＣＵ３１６３２；サッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae））、（ＡＢ０１６０９５；シネココッカス・エロンゲート（Synechococcus elongates））、（ＳＡＧＧＰＳ；シロガラシ（Sinapis alba））、（ＳＳＯＧＤＳ；スルフォロブス・アシドカルダリウス（Sulfolobus acidocaldarius））、（ＮＣ＿００７７５９、Ｌｏｃｕｓ ＹＰ＿４６１８３２；シントロファス・アシディトロフィクス（Syntrophus aciditrophicus）ＳＢ）、及び（ＮＣ＿００６８４０、Ｌｏｃｕｓ ＹＰ＿２０４０９５；ビブリオ・フィッシェリ（Vibrio fischeri）ＥＳ１１４）が挙げられるが、それらに限定されない。
【０１０７】
あるいは、ＩＰＰをＦＰＰに添加することによってＧＧＰＰを作ることもできる。この反応が可能である酵素をコードするヌクレオチド配列の説明例としては、（ＮＭ＿１１２３１５；シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana））、（ＥＲＷＣＲＴＥ；パントエア・アグロメランス（Pantoea agglomerans）、（Ｄ９００８７、Ｌｏｃｕｓ ＢＡＡ１４１２４；パントエア・アナナティス（Pantoea ananatis））、（Ｘ５２２９１、Ｌｏｃｕｓ ＣＡＡ３６５３８；ロドバクター・カプスラタス（Rhodobacter capsulatus）、（ＡＦ１９５１２２、Ｌｏｃｕｓ ＡＡＦ２４２９４；ロドバクター・スフェロイデス（Rhodobacter sphaeroides））、及び（ＮＣ＿００４３５０、Ｌｏｃｕｓ ＮＰ＿７２１０１５；ミュータンス連鎖球菌（Streptococcus mutans）ＵＡ１５９）が挙げられるが、それらに限定されない。
【０１０８】
次いで、その後、ＧＧＰＰを様々なＣ２０イソプレノイドに変換する。Ｃ２０化合物の説明例としては、以下のものが挙げられるが、それらに限定されない：
【０１０９】
ゲラニルゲラニオール
構造が、
【化２０】
であるゲラニルゲラニオールは、セドレラ・チューナ（Cedrela toona）からのウッドオイルの及び亜麻仁油の構成成分である。ゲラニルゲラニオールは、例えば、ＧＧＰＰシンターゼに関する遺伝子の後に、発現構築物のホスファターゼ遺伝子を付加させることによって、作ることができる。
【０１１０】
アビエタジエン
アビエタジエンは、次の異性体：
【化２１】
を含み、グランディスモミ（Abies grandis）などの木において見つけられる。アビエタジエンは、アビエタジエンシンターゼによって作られる。適するヌクレオチド配列の説明例としては、（Ｕ５０７６８；グランディスモミ（Abies grandis））及び（ＡＹ４７３６２１；オウシュウトウヒ（Picea abies））が挙げられるが、それらに限定されない。
【０１１１】
Ｃ２０＋化合物
Ｃ２０＋化合物も本明細書に提供する範囲内である。そのような化合物の説明例としては、セステルテルペン（５つのイソプレン単位から作られたＣ２５化合物）、トリテルペン（６つのイソプレン単位から作られたＣ３０化合物）、及びテトラテルペン（８つのイソプレン単位から作られたＣ４０化合物）が挙げられる。本明細書に記載する類似の方法の使用、及び適切なシンターゼに関するヌクレオチド配列の置換又は付加によって、これらの化合物を作る。
【０１１２】
イソプレノイド化合物の高い収率
エタノールを炭素源として使用する条件下で宿主細胞を培養又は維持することによる、イソプレノイドの強靭な生産のための組成物及び方法を本明細書に提供する。本明細書に記載する方法を用いると、宿主細胞は、発酵反応混合物のリットル当たり約５グラム（５ｇ／Ｌ）より多くのイソプレノイドを生産する。他の実施形態では、約１０ｇ／Ｌより多く、約１５ｇ／Ｌより多く、約２０ｇ／Ｌより多く、約２５ｇ／Ｌより多くが生産され、又は約３０ｇ／Ｌより多くのイソプレノイドが生産される。
【０１１３】
あるいは、イソプレノイド生産を収率ではなく比生産性によって表現することができる。例えば、本明細書に記載する方法を用いると、宿主細胞は、乾燥宿主細胞のグラム当たり約５０ミリグラムより多くのイソプレノイドを生産する。他の実施形態では、グラム乾燥細胞重量当たり約１００ミリグラムより多く、グラム乾燥細胞重量当たり約１５０ミリグラムより多く、グラム乾燥細胞重量当たり約２００ミリグラムより多く、グラム乾燥細胞重量当たり約２５０ミリグラムより多く、グラム乾燥細胞重量当たり約５００ミリグラムより多く、グラム乾燥細胞重量当たり約７５０ミリグラムより多く、又はグラム乾燥細胞重量当たり約１０００ミリグラムより多くのイソプレノイドが生産される。
【０１１４】
生産レベルを収率によって表現するにせよ、比生産性によって表現するにせよ、約１２０時間未満、約９６時間未満、約７２時間未満、好ましくは約４８時間未満、又はさらに約２４時間未満の間、産生させる。
【０１１５】
本明細書に提供する方法は、バッチ、流加（fed-batch）、又は連続プロセスで行うことができる。バッチプロセスは、概してクローズドプロセスであり、この場合、すべての原料がそのプロセスの開始時に添加される。流加プロセスは、概してクローズドプロセスであり、この場合、炭素源及び／又は他の基質は、そのプロセス全体を通して漸増で添加される。流加プロセスでは、培地及び微生物増殖のより優れた制御が可能になる。連続プロセスは、オープンシステムと見なすことができ、この場合、培地が連続的に添加され、同時に産物が除去される。
【０１１６】
流加プロセスと連続プロセスの間のプロセスを用いることもできる。例えば、１つの実施形態において、プロセスを流加プロセスとして始め、プロセスが継続している間、有機層を培養培地と接触する状態に置く。水溶液におけるより高い有機液への溶解度を概して有するイソプレノイドは、その培地から有機層に抽出される。その培地から産物を除去するため、この方法は、流加プロセスと連続プロセスの両方の特徴を有する。
【０１１７】
有機オーバーレイ（例えば、ドデカン、ミリスチン酸イソプロピル、オレイン酸メチルなど）による産物除去は、多くの場合、イソプレノイド生産の増加をもたらすことができる。産物除去は、生産増加をもたらすことができ、及び特に産物蓄積が経路阻害をもたらす場合、望ましい。一定の実施形態では、前記有機層が、イソプレノイド産物それ自体によって形成されることがある。これは、イソプレノイドが、その飽和点より多く生産され、水性培地から分離できる層を形成する場合に発生する。
【０１１８】
一部の実施形態において、エタノールは、宿主細胞にとって唯一の炭素源である。他の実施形態において、前記炭素源は、エタノール炭素源と非エタノール炭素源の両方を含む。さらに他の実施形態において、前記非エタノール炭素源は、炭水化物である。
【０１１９】
炭水化物の説明例としては、単糖類、二糖類、及びそれらの組み合わせが挙げられる。適する単糖類の一部の非限定的な例としては、グルコース、ガラクトース、マンノース、フルクトース、リボース、及びそれらの組み合わせが挙げられる。適する二糖類の一部の非限定的な例としては、スクロース、ラクトース、マルトース、トレハロース、セロビオース、及びそれらの組み合わせが挙げられる。適する多糖類の一部の非限定的な例としては、デンプン、グリコーゲン、セルロース、キチン、及びそれらの組み合わせが挙げられる。他の炭水化物源としては、キビ汁及び糖蜜が挙げられる。
【０１２０】
一般に、多糖類は、宿主細胞のための炭素源として使われる前に、化学的手段又は酵素法によって先ず単糖類及びオリゴ糖類に変換される。例えば、セルロースを酵素セルラーゼによってグルコースに変換することができる。一定の実施形態において、多糖類の分解後、単糖類及び／又はオリゴ糖類は、発酵の開始時に判定すると、その炭素源の少なくとも約５０重量％を構成する。他の実施形態において、単糖類及び／又はオリゴ糖類は、発酵の開始時に判定すると、その炭素源の少なくとも約８０重量％を又は９０重量％までもを構成するので、その発酵培地はセルロースを本質的には含まない。
【０１２１】
一定の実施形態では、エタノールが炭素源として宿主細胞に外因的に供給される。他の実施形態では、宿主細胞によって炭素源として消費されるエタノールは、それらの宿主細胞によって作られた。言い換えると、非エタノール炭素源（概して炭水化物）が宿主細胞に供給され、それが宿主細胞によってエタノールに変換され、その後、エタノールは宿主細胞によって消費される。
【０１２２】
宿主細胞のエタノール使用は、多数の方法で定量することができる。１つの方法では、エタノール濃度が用いられる。炭素源であることに加えて、培地中のエタノールの存在は、微生物汚染物質を阻止するという有益な効果も有する。
【０１２３】
従って、１つの実施形態において、培地中のエタノール濃度は、少なくとも４時間、培地のリットル当たり少なくとも約１グラムである。前記エタノール濃度は、当該分野において公知のいずれの方法によって決定してもよい。培地をサンプリングすることによって直接測定してもよく、又はオフガスをサンプリングすることによって間接的に測定してもよい。質量分光光度計によるオフガス分析などの間接法を用いる場合、先ず、百万分率でのオフガス測定値と培地中のエタノールの直接測定値との相関関係を確立しなければならない。他の実施形態において、培地中のエタノール濃度は、培地のリットル当たり約１グラムと約５グラムの間、約１グラムと約１０グラムの間、又は約１グラムと約２０グラムの間である。さらに他の実施形態において、培地中のエタノール濃度は、培地のリットル当たり約１０グラムより大きく、又は、培地のリットル当たり約２０グラムより大きい。さらに他の実施形態において、上のエタノール濃度は、少なくとも６時間、８時間、１０時間、１２時間、２４時間、又は４８時間維持される。
【０１２４】
しかし、宿主細胞は、検出できないレベルのエタノール又はゼロに近いエタノール濃度を有するにもかかわらず、エタノールを炭素源として使用し続ける場合がある。例えば、これは、エタノールが供給されるのと同じ速さで宿主細胞がエタノールを消費するときに発生し得る。結果として、宿主細胞のエタノール利用率の代替測度を本明細書において提供する。
【０１２５】
もう１つの実施形態において、宿主細胞は、１時間につき乾燥細胞重量のグラム当たり少なくとも０．０１グラムのエタノールという比エタノール消費速度を有する。他の実施形態において、前記比エタノール消費速度は、１時間につき乾燥細胞重量のグラム当たり約０．０１グラムと約０．２０グラムの間のエタノール、又は約０．０２グラムと約０．１０グラムの間のエタノールである。さらに他の実施形態において、前記比エタノール消費速度は、１時間につき乾燥細胞重量のグラム当たり約０．１０グラムのエタノールより大きい。前記比エタノール消費速度は、少なくとも４時間、６時間、８時間、１０時間、１２時間、２４時間、又は４８時間、維持される。
【０１２６】
あるいは、比エタノール消費速度は、１日につき乾燥細胞重量のグラム当たりのエタノールのグラム数によって表現される。一部の実施形態において、前記宿主細胞は、１日につき乾燥細胞重量のグラム当たり少なくとも０．２グラムのエタノールという比エタノール消費速度を有する。一部の実施形態において、前記比エタノール消費速度は、１日につき乾燥細胞重量のグラム当たり約０．２グラムと約５グラムの間、又は約０．５グラムと約３グラムの間のエタノールである。他の実施形態において、前記比エタノール消費速度は、１日につき乾燥細胞重量のグラム当たり約３グラムのエタノールより大きい。
【０１２７】
一定の実施形態において、前記細胞は、酸素によって制限されない条件下で培養又は維持される。言い換えると、前記細胞は、好気的条件下にある。
【０１２８】
しかし、完全好気的条件の維持は、特に大規模プロセス酸素（large scale processes oxygen）の場合、物質移動の限界及び水溶液への酸素の比較的低い溶解度のため難しい。例えば、タンクへのスパージ(sparge)に空気を用いた場合、水への酸素の溶解度は、２０℃でリットル当たり９ミリグラムである。空気ではなく純粋な酸素を用いた場合には、その溶解度がリットル当たり４３ミリグラムへと増加する。（空気をスパージする又は純粋な酸素をスパージする）いずれの場合も、この酸素量は、酸素が継続的に供給されない限り、活性な密集した微生物集団によって数秒のうちに使い尽くされる。比較では、同じ期間（数秒、例えば、１分未満）の間にそれらの細胞によって使われる他の養分の量は、体積濃度と比較すると無視できる。
【０１２９】
本発明者らは、本明細書に提供する宿主細胞が、多少の期間の酸素制限に耐えることができ、高レベルのイソプレノイド化合物を依然として作ることができることを発見した。この柔軟性が、タンク設計の点での節約、低減される酸素ガス領域、より低い通気エネルギー費用などをもたらすことによって、より経済的なプロセスを可能にする。さらに、一定の状況下では、酸素制限は有益であるようである。理論による拘束を受けないが、酸素制限条件下での細胞増殖は、より多くの炭素をバイオマス又は二酸化炭素による喪失にではなく産物に向かわせるようである。
【０１３０】
結論として、一定の他の実施形態において、宿主細胞は、酸素制限されている条件下で培養又は維持される。この酸素制限期間としては、少なくとも４時間、少なくとも６時間、少なくとも８時間、少なくとも１０時間、少なくとも１２時間、少なくとも２４時間、又は少なくとも４８時間が挙げられる。
【０１３１】
酸素制限は、宿主細胞の比増殖速度が、酸素が制限されない（例えば、過剰に供給される）場合の最大比増殖速度より低いとき、発生する。比増殖速度は、単位時間についてのバイオマスの単位当たりの細胞増殖の速度であり、逆数時間（１／ｔ）の単位を有する。培養培地中の細胞についての最大比増殖速度は、この場合は酸素である、増殖速度に対する基質濃度の影響に関係づけられる。一般に、細胞は、低い基質レベルではゆっくりと増殖し、そして培地中の基質のレベルが増すにつれて、細胞増殖速度も増すこととなる。しかし、細胞増殖の速度は、無期限には上昇し続けず、高い基質レベルでは、基質量の所与の増加が、細胞増殖速度の増加をどんどん小さくさせるであろう。従って、最終的に増殖速度は限界に達し、多くの場合、それが最大比増殖速度と呼ばれる。
【０１３２】
培養における増殖速度間の関係の理論処理は、当業者に周知であり、Ｍｏｎｏｄ式と呼ばれる。例えば、Pirt, Principles of Microbe and Cell Cultivation, Wiley, NY, 1975, pages 4-10を参照のこと。この理論処理において、最大比速度は、無限基質レベルに達するまで決して達することのない漸近的限界である。しかし、実際には、最大比増殖速度は、研究下の条件（例えば、酸素などの基質レベル）が最速の初期増殖速度を支援するときに得られると考えることができる。例えば、流加反応器の場合、増殖に必要なすべての基質（例えば、養分及び酸素）が過剰に供給され、発酵が宿主細胞にとって最適な温度で行われる初期条件が、最大増殖速度のための条件とみなされる。例えば、Lee et al. (1996) Trends Biotechnol. 14: 98-105及びKorz et al. (1995) J Biotechnology 39:59-65を参照のこと。最大比増殖速度は、時として、無限増殖とも呼ばれる。
【０１３３】
１つの方法において、酸素制限は、培地中の酸素濃度によって定量され、溶存酸素濃度（ＤＯＣ）によって表現される。培養培地中のＤＯＣは、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、及び約５％未満であり得る。他の実施形態において、ＤＯＣは、ほぼ０％又は検出レベル未満である。
【０１３４】
しかし、酸素が細胞によって比較的急速に消費されるため、ゼロのＤＯＣは、それらの細胞が嫌気的条件（無酸素）下で培養されていることを意味する場合もあり、又はそれらの細胞が、供給されるのと同じくらい速く酸素を消費していることを意味する場合もある。もう１つの方法では、細胞の酸素使用は、これらの２つの可能性を区別するために酸素摂取率（ＯＵＲ；培地のリットル当たりの細胞の酸素消費の割合）によって表現される。適する酸素摂取率としては、培地のリットル当たり約５０ｍｍｏｌ未満、約４０ｍｍｏｌ未満、約３０ｍｍｏｌ未満、約２０ｍｍｏｌ未満、又は培地のリットル当たり約１０ｍｍｏｌ未満が挙げられる。
【０１３５】
あるいは、細胞密度に関して正規化した値が好ましいときには、比酸素摂取速度（ＳＯＵＲ（細胞密度で割ったＯＵＲである））を用いることができる。発酵のリットル当たりの微生物の量、すなわち微生物の密度は、所与の体積の発酵培地から単離された微生物の重量を測定することによって測定することができる。一般的な測度は、発酵培地のリットル当たりの細胞の乾燥重量である。発酵を、それが進行している間、モニターするために用いることができるもう１つの方法は、その培地の光学密度の測定によるものである。一般的な方法は、ＯＤ６００と呼ばれる、６００ｎｍの波長での光学密度、すなわちＯＤ、を測定することである。このＯＤは、特定の培地中の特定のタイプの生物の密度と相関させることができるが、ＯＤと体積当たりの微生物の量との特異的関係は、一般に、すべてのタイプの培地中のすべてのタイプの生物にわたっては適用できないであろう。ある細胞密度範囲にわたってＯＤ及び乾燥細胞重量を測定することにより、較正曲線を作成することができる。場合によっては、これらの相関関係を、同じ又は類似の培地中の同じ又は類似の微生物の異なる発酵に用いることができることがある。適する比酸素摂取速度としては、１時間につき乾燥細胞重量のグラム当たり約３０ｍｍｏｌ未満、約２５ｍｍｏｌ未満、約２０ｍｍｏｌ未満、約１５ｍｍｏｌ未満、約１０ｍｍｏｌ未満、又は約５ｍｍｏｌ未満が挙げられる。
【０１３６】
本発明者らは、本明細書に提供する宿主細胞が、多少の期間のリン酸塩制限（phasphate limitation）に耐えることができ、高レベルのイソプレノイド化合物を依然として作ることができることを見出した。理論による拘束を受けないが、リン酸塩制限条件下での細胞増殖は、より多くの炭素をバイオマスではなく産物に向かわせるようである。培地中のリン酸塩の適する濃度は、培地のリットル当たり約５グラム未満、約４グラム未満、約３グラム未満、約２グラム未満、又は約１グラム未満である。一定の実施形態において、前記リン酸塩濃度は、ゼロ又は検出レベル未満である。そのようなリン酸塩制限期間としては、少なくとも４時間、少なくとも６時間、少なくとも８時間、少なくとも１０時間、少なくとも１２時間、少なくとも２４時間、又は少なくとも４８時間が挙げられる。
【０１３７】
（酸素制限される、リン酸塩制限される、又は両方）制限条件が課される前に宿主細胞を（最大比増殖に可能にする）非制限条件下で増殖させて、十分なバイオマスを作ることができる。これらの制限条件としては、比増殖が最大比増殖速度の約９０％、８０％、７５％、６０％、５０％、４０％、３０％、２５％、２０％、１０％、５％又は１％未満であるような条件が挙げられる。
【０１３８】
特定の実施形態を本明細書に提供するが、上述の説明は、例証のためのものであり、本実施形態の範囲を限定しない。本実施形態の範囲内の他の態様、利点、及び変形は、当業者には明らかであろう。
【実施例】
【０１３９】
別の指示が無い限り、当該分野の技能の範囲内である生合成産業などの従来の技術を用いて、本明細書に提供する実施形態を実施することができる。そのような技術が本明細書において十分に説明されていない範囲に関しては、科学文献の中でそれらへの豊富な論及を見つけることができる。
【０１４０】
以下の実施例は、用いる数（例えば、量、温度など）に関して正確さを確保するように努力したが、変動及び偏差を含む場合があり、また、万が一、本明細書に報告する数に関する誤記が存在する場合には、当業者は、本明細書中の残りの開示にかんがみて正しい量を導き出すことができる。別の指示が無い限り、温度は、摂氏度で報告し、圧力は、海面での大気圧である又はその付近の気圧である。別の指示が無い限り、すべての試薬は、市場で得た。以下の実施例は、説明目的だけのためのものであり、本明細書に提供する実施形態の範囲を如何なる点においても限定しない。
【０１４１】
実施例１
この実施例は、サッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）の特定の染色体位置への、ＭＥＶ経路の酵素をはじめとする酵素をコードする核酸の、ターゲッティングされた組込みのためのベクターを作る方法を説明するものである。
【０１４２】
サッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）株Ｙ００２及びＹ００３（ＣＥＮ．ＰＫ２バックグラウンドＭＡＴＡ又はＭＡＴα ｕｒａ３−５２ ｔｒｐ１−２８９ ｌｅｕ２−３、１１２ ｈｉｓ３Δ１ ＭＡＬ２−８Ｃ ＳＵＣ２）（van Dijken et al. (2000) Enzyme Microb. Technol. 26:706-714)、Ｙ００７（Ｓ２８８ＣバックグラウンドＭＡＴＡ ｔｒｐ１Δ６３）（ＡＴＣＣ番号２００８７３）、ならびにＥＧ１２３（ＭＡＴＡ ｕｒａ３ ｔｒｐ１ ｌｅｕ２ ｈｉｓ４ ｃａｎ１）（Michaelis & Herskowitz. (1988) Mol. Cell. Biol. 8: 1309-1318）からゲノムＤＮＡを単離した。１％ 酵母エキスと２％ バクト−ペプトンと２％ デキストロースとを含有する液体培地（ＹＰＤ培地）中で一晩、これらの株を増殖させた。３，１００ｒｐｍで遠心分離し、１０ｍＬ 超純水で細胞ペレットを洗浄し、再び遠心分離することによって、１０ｍＬ 液体培養物から細胞を単離した。Ｙ−ＤＥＲ酵母ＤＮＡ抽出キット（イリノイ州、ロックフォードのＰｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を製造業者が提案したプロトコルに従って使用してゲノムＤＮＡを抽出した。抽出したゲノムＤＮＡを１００ｕＬ １０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ８．５に再び懸濁させ、ＮＤ−１０００分光光度計（デラウェア州、ウィルミントンのＮａｎｏＤｒｏｐ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）でＯＤ２６０／２８０測定をして、ゲノムＤＮＡ濃度及び純度を決定した。
【０１４３】
Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅシステム（フィンランド、エスポーのＦｉｎｎｚｙｍｅｓ ＯＹ）を製造業者が提案したプロトコルに従って使用して、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ２７２０ Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ（カリフォルニア州、フォスターシティーのＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．）において、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるＤＮＡ増幅を行った。ＴＯＰＯ ＴＡ ｐＣＲ２．１クローニングベクター（カリフォルニア州、カールズバッドのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に挿入することとなるＤＮＡフラグメントのＰＣＲ増幅が完了したら、１ｕＬのＱｉａｇｅｎ Ｔａｑ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（カリフォルニア州、バレンシアのＱｉａｇｅｎ）をその反応混合物に添加し、さらに１０分間、７２℃ ＰＣＲ伸長工程を行い、その後、４℃に冷却することによって、ヌクレオチドオーバーハングを作った。ＰＣＲ増幅が完了したら、８ｕＬの５０％グリセロール溶液をその反応混合物に添加した。
【０１４４】
０．５ｕｇ／ｍＬ 臭化エチジウムを含有する１％ＴＢＥ（０．８９Ｍ Ｔｒｉｓ、０．８９Ｍ ホウ酸、０．０２Ｍ ＥＤＴＡナトリウム塩）アガロースゲルを使用して、１２０Ｖ、４００ｍＡで３０分間、アガロースゲル電気泳動を行った。紫外線を使用してＤＮＡバンドを可視化した。滅菌した安全かみそりの刃でそのゲルからＤＮＡバンドを切り取り、Ｚｙｍｏｃｌｅａｎ Ｇｅｌ ＤＮＡ Ｒｅｃｏｖｅｒｙ Ｋｉｔ（カリフォルニア州、オレンジのＺｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を製造業者が提案したプロトコルに従って用いて、その切り取ったＤＮＡをゲル精製した。その精製したＤＮＡを１０ｕＬ 超純水に溶出し、ＮＤ−１０００分光光度計でＯＤ２６０／２８０測定をしてＤＮＡ濃度及び純度を決定した。
【０１４５】
１００−５００ｕｇの精製ＰＣＲ産物及びＨｉｇｈ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ Ｔ４ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ（マサチューセッツ州、イプスウィッチのＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を製造業者が提案したプロトコルに従って用いてライゲーションを行った。プラスミド増殖のために、ライゲートした構築物を、大腸菌（Escherichia coli）ＤＨ５α化学的コンピテント細胞（カリフォルニア州、カールズバッドのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に、製造業者が提案したプロトコルに従って形質転換した。１．５％ Ｂａｃｔｏ Ａｇａｒと１％ トリプトンと０．５％ 酵母エキスと１％ ＮａＣｌと適切な抗生物質とを含有する固体培地を用いて、陽性形質転換体を選択した。単離した形質転換体を、１６時間、適切な抗生物質を含有する液体Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔｏｎｉ（ＬＢ）培地中、３７℃で増殖させ、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ（カリフォルニア州、バレンシアのＱｉａｇｅｎ）を製造業者が提案したプロトコルに従って使用してプラスミドを単離して精製した。診断用制限酵素消化を行い、アガロースゲルでＤＮＡフラグメントを分割し、紫外線を使用してそれらのバンドを可視化することによって、構築物を検証した。選択構築物をＤＮＡ塩基配列決定によっても検証し、これは、Ｅｌｉｍ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．（カリフォルニア州、ヘイワード）が行った。
【０１４６】
プラスミドｐＡＭ４８９は、ベクターｐＡＭ４７１のＥＲＧ２０−ＰＧＡＬ−ｔＨＭＧＲインサートをベクターｐＡＭ４６６に挿入することによって生じさせた。ベクターｐＡＭ４７１は、サッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）のＥＲＧ２０遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）（ＥＲＧ２０ヌクレオチド位置１から１２０８；ＡＴＧ開始コドンのＡがヌクレオチド１である）（ＥＲＧ２０）と、サッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）の互いに異なるＧＡＬ１及びＧＡＬ１０プロモーターを含有するゲノム座（ＧＡＬ１ヌクレオチド位置−１から−６６８）（ＰＧＡＬ）と、サッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）のＨＭＧ１遺伝子のトランケートされたＯＲＦ（ＨＭＧ１ヌクレオチド位置１５８６から３３２３）（ｔＨＭＧＲ）とを含むＤＮＡフラグメントＥＲＧ２０−ＰＧＡＬ−ｔＨＭＧＲを、ＴＯＰＯ Ｚｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ ＩＩクローニングベクター（カリフォルニア州、カールズバッドのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に挿入することによって生じさせた。ベクターｐＡＭ４６６は、ヌクレオチド位置−８５６から位置５４８に広がるセグメントであって、塩基−２２６と−２２５の間に非天然内部ＸｍａＩ制限部位を保有するサッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）の野生型ＴＲＰ１遺伝子座のセグメントを含むＤＮＡフラグメントＴＲＰ１−８５６から＋５４８（ＴＲＰ１−８５６〜＋５４８）を、ＴＯＰＯ ＴＡ ｐＣＲ２．１クローニングベクター（カリフォルニア州、カールズバッドのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に挿入することによって生じさせた。ＤＮＡフラグメントＥＲＧ２０−ＰＧＡＬ−ｔＨＭＧＲ及びＴＲＰ１−８５６から＋５４８は、表１において概説するようなＰＣＲ増幅によって生じさせた。ｐＡＭ４８９の構築のために、ＸｍａＩ制限酵素（マサチューセッツ州、イプスウィッチのＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用して４００ｎｇのｐＡＭ４７１及び１００ｎｇのｐＡＭ４６６を最後まで消化し、ＥＲＧ２０−ＰＧＡＬ−ｔＨＭＧＲインサート及び線形化されたｐＡＭ４６６ベクターに対応するＤＮＡフラグメントをゲル精製し、４モル当量のその精製インサートを１モル当量のその精製線形化ベクターとライゲートしてｐＡＭ４８９を得た。図４Ａは、ＥＲＧ２０−ＰＧＡＬ−ｔＨＭＧＲインサートのマップを示し、配列番号：１は、隣接ＴＲＰ１配列を伴うそのインサートのヌクレオチド配列を示す。
【表１】
【０１４７】
プラスミドｐＡＭ４９１は、ベクターｐＡＭ４７２のＥＲＧ１３−ＰＧＡＬ−ｔＨＭＧＲインサートをベクターｐＡＭ４６７に挿入することによって生じさせた。ベクターｐＡＭ４７２は、サッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）のＥＲＧ１３遺伝子のＯＲＦ（ＥＲＧ１３ヌクレオチド位置１から１６２６）（ＥＲＧ１３）と、サッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）の互いに異なるＧＡＬ１及びＧＡＬ１０プロモーターを含有するゲノム座（ＧＡＬ１ヌクレオチド位置−１から−６６８）（ＰＧＡＬ）と、サッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）のＨＭＧ１遺伝子のトランケートされたＯＲＦ（ＨＭＧ１ヌクレオチド位置１５８６から３３２３）（ｔＨＭＧＲ）とを含むＤＮＡフラグメントＥＲＧ１３−ＰＧＡＬ−ｔＨＭＧＲを、ＴＯＰＯ Ｚｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ ＩＩクローニングベクターに挿入することによって生じさせた。ベクターｐＡＭ４６７は、ヌクレオチド位置−７２３から位置−２２４に広がるセグメントであって、塩基−２２４と−２２３の間に非天然内部ＸｍａＩ制限部位を保有するサッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）の野生型ＵＲＡ３遺伝子座のセグメントを含むＤＮＡフラグメントＵＲＡ３−７２３から７０１を、ＴＯＰＯ ＴＡ ｐＣＲ２．１クローニングベクターに挿入することによって生じさせた。ＤＮＡフラグメントＥＲＧ１３−ＰＧＡＬ−ｔＨＭＧＲ及びＵＲＡ３−７２３から７０１は、表２において概説するようなＰＣＲ増幅によって生じさせた。ｐＡＭ４９１の構築のために、ＸｍａＩ制限酵素を使用して４００ｎｇのｐＡＭ４７２及び１００ｎｇのｐＡＭ４６７を最後まで消化し、ＥＲＧ１３−ＰＧＡＬ−ｔＨＭＧＲインサート及び線形化されたｐＡＭ４６７ベクターに対応するＤＮＡフラグメントをゲル精製し、４モル当量のその精製インサートを１モル当量のその精製線形化ベクターとライゲートしてｐＡＭ４９１を得た。図４Ｂは、ＥＲＧ１３−ＰＧＡＬ−ｔＨＭＧＲインサートのマップを示し、配列番号：２は、隣接ＵＲＡ３配列を伴うそのインサートのヌクレオチド配列を示す。
【表２】
【０１４８】
プラスミドｐＡＭ４９３は、ベクターｐＡＭ４７３のＩＤＩ１−ＰＧＡＬ−ｔＨＭＧＲインサートをベクターｐＡＭ４６８に挿入することによって生じさせた。ベクターｐＡＭ４７３は、サッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）のＩＤＩ１遺伝子のＯＲＦ（ＩＤＩ１ヌクレオチド位置１から１０１７）（ＩＤＩ１）と、サッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）の互いに異なるＧＡＬ１及びＧＡＬ１０プロモーターを含有するゲノム座（ＧＡＬ１ヌクレオチド位置−１から−６６８）（ＰＧＡＬ）と、サッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）のＨＭＧ１遺伝子のトランケートされたＯＲＦ（ＨＭＧ１ヌクレオチド位置１５８６から３３２３）（ｔＨＭＧＲ）とを含むＤＮＡフラグメントＩＤＩ１−ＰＧＡＬ−ｔＨＭＧＲを、ＴＯＰＯ Ｚｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ ＩＩクローニングベクターに挿入することによって生じさせた。ベクターｐＡＭ４６８は、ヌクレオチド位置−２２５から位置６５３に広がるセグメントであって、塩基−２２６と−２２５の間に非天然内部ＸｍａＩ制限部位を保有するサッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）の野生型ＡＤＥ１遺伝子座のセグメントを含むＤＮＡフラグメントＡＥＤ１−８２５から６５３を、ＴＯＰＯ ＴＡ ｐＣＲ２．１クローニングベクターに挿入することによって生じさせた。ＤＮＡフラグメントＩＤＩ１−ＰＧＡＬ−ｔＨＭＧＲ及びＡＤＥ１−８２５から６５３は、表３において概説するようなＰＣＲ増幅によって生じさせた。ｐＡＭ４９３の構築のために、ＸｍａＩ制限酵素を使用して４００ｎｇのｐＡＭ４７３及び１００ｎｇのｐＡＭ４６８を最後まで消化し、ＩＤＩ１−ＰＧＡＬ−ｔＨＭＧＲインサート及び線形化されたｐＡＭ４６８ベクターに対応するＤＮＡフラグメントをゲル精製し、４モル当量のその精製インサートを１モル当量のその精製線形化ベクターとライゲートしてベクターｐＡＭ４９３を得た。図４Ｃは、ＩＤＩ１−ＰＧＡＬ−ｔＨＭＧＲインサートのマップを示し、配列番号：３は、隣接ＡＤＥ１配列を伴うそのインサートのヌクレオチド配列を示す。
【表３】
【０１４９】
プラスミドｐＡＭ４９５は、ｐＡＭ４７４のＥＲＧ１０−ＰＧＡＬ−ＥＲＧ１２インサートをベクターｐＡＭ４６９に挿入することによって生じさせた。ベクターｐＡＭ４７４は、サッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）のＥＲＧ１０遺伝子のＯＲＦ（ＥＧＲ１０ヌクレオチド位置１から１３４７）（ＥＲＧ１０）と、サッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）の互いに異なるＧＡＬ１及びＧＡＬ１０プロモーターを含有するゲノム座（ＧＡＬ１ヌクレオチド位置−１から−６６８）（ＰＧＡＬ）と、サッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）のＥＲＧ１２遺伝子のＯＲＦ（ＥＲＧ１２ヌクレオチド位置１から１４８２）（ＥＲＧ１２）とを含むＤＮＡフラグメントＥＲＧ１０−ＰＧＡＬ−ＥＲＧ１２を、ＴＯＰＯ Ｚｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ ＩＩクローニングベクターに挿入することによって生じさせた。ベクターｐＡＭ４６９は、ヌクレオチド位置−３２から位置−１０００及びヌクレオチド位置５０４から位置１１０３に広がるサッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）のＨＩＳ遺伝子座の２つのセグメント、ＨＩＳＭＸマーカー、及びそのＨＩＳ３５０４から−１１０３配列とそのＨＩＳＭＸマーカーの間の非天然ＸｍａＩ制限部位を含む、ＤＮＡフラグメントＨＩＳ３−３２から−１０００−ＨＩＳＭＸ−ＨＩＳ３５０４から−１１０３を、ＴＯＰＯ ＴＡ ｐＣＲ２．１クローニングベクターに挿入することによって生じさせた。ＤＮＡフラグメントＥＲＧ１０−ＰＧＡＬ−ＥＲＧ１２及びＨＩＳ３−３２から−１０００−ＨＩＳＭＸ−ＨＩＳ３５０４から−１１０３は、表４において概説するようなＰＣＲ増幅によって生じさせた。ｐＡＭ４９５の構築のために、ＸｍａＩ制限酵素を使用して４００ｎｇのｐＡＭ４７４及び１００ｎｇのｐＡＭ４６９を最後まで消化し、ＥＲＧ１０−ＰＧＡＬ−ＥＲＧ１２インサート及び線形化されたｐＡＭ４６９ベクターに対応するＤＮＡフラグメントをゲル精製し、４モル当量のその精製インサートを１モル当量のその精製線形化ベクターとライゲートしてベクターｐＡＭ４９５を得た。図４Ｄは、ＥＲＧ１０−ＰＧＡＬ−ＥＲＧ１２インサートのマップを示し、配列番号：４は、隣接ＨＩＳ３配列を伴うそのインサートのヌクレオチド配列を示す。
【表４】
【０１５０】
プラスミドｐＡＭ４９７は、ｐＡＭ４７５のＥＲＧ８−ＰＧＡＬ−ＥＲＧ１９インサートをベクターｐＡＭ４７０に挿入することによって生じさせた。ベクターｐＡＭ４７５は、サッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）のＥＲＧ８遺伝子のＯＲＦ（ＥＲＧ８ヌクレオチド位置１から１５１２）（ＥＲＧ８）と、サッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）の互いに異なるＧＡＬ１及びＧＡＬ１０プロモーターを含有するゲノム座（ＧＡＬ１ヌクレオチド位置−１から−６６８）（ＰＧＡＬ）と、サッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）のＥＲＧ１９遺伝子のＯＲＦ（ＥＲＧ１９ヌクレオチド位置１から１３４１）（ＥＲＧ１９）とを含むＤＮＡフラグメントＥＲＧ８−ＰＧＡＬ−ＥＲＧ１９を、ＴＯＰＯ Ｚｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ ＩＩクローニングベクターに挿入することによって生じさせた。ベクターｐＡＭ４７０は、ヌクレオチド位置−１００から位置４５０及びヌクレオチド位置１０９６から位置１７７０に広がるサッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）のＬＥＵ２遺伝子座の２つのセグメント、ＨＩＳＭＸマーカー、及びそのＬＥＵ２１０９６から１７７０配列とそのＨＩＳＭＸマーカーの間の非天然ＸｍａＩ制限部位を含む、ＤＮＡフラグメントＬＥＵ２−１００から４５０−ＨＩＳＭＸ−ＬＥＵ２１０９６から１７７０を、ＴＯＰＯ ＴＡ ｐＣＲ２．１クローニングベクターに挿入することによって生じさせた。ＤＮＡフラグメントＥＲＧ８−ＰＧＡＬ−ＥＲＧ１９及びＬＥＵ２−１００から４５０−ＨＩＳＭＸ−ＬＥＵ２１０９６から１７７０は、表５において概説するようなＰＣＲ増幅によって生じさせた。ｐＡＭ４９７の構築のために、ＸｍａＩ制限酵素を使用して４００ｎｇのｐＡＭ４７５及び１００ｎｇのｐＡＭ４７０を最後まで消化し、ＥＲＧ８−ＰＧＡＬ−ＥＲＧ１９インサート及び線形化されたｐＡＭ４７０ベクターに対応するＤＮＡフラグメントを精製し、４モル当量のその精製インサートを１モル当量のその精製線形化ベクターとライゲートしてベクターｐＡＭ４９７を得た。図４Ｅは、ＥＲＧ８−ＰＧＡＬ−ＥＲＧ１９インサートのマップを示し、配列番号：５は、隣接ＬＥＵ２配列を伴うそのインサートのヌクレオチド配列を示す。
【表５】
【０１５１】
実施例２
この実施例は、本明細書に提供する実施形態において有用なプラスミド及びＤＮＡフラグメントを作る方法を説明するものである。
【０１５２】
プラスミドｐＡＭ５８４は、ＤＮＡフラグメントＧＡＬ７４から１０２１−ＨＰＨ−ＧＡＬ１１６３７から２５８７をＴＯＰＯ ＺＥＲＯ Ｂｌｕｎｔ ＩＩクローニングベクター（カリフォルニア州、カールズバッドのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に挿入することによって生じさせた。ＤＮＡフラグメントＧＡＬ７４から１０２１−ＨＰＨ−ＧＡＬ１１６３７から２５８７は、サッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）のＧＡＬ７遺伝子のＯＲＦ（ＧＡＬ７ヌクレオチド位置４から１０２１）（ＧＡＬ７４から１０２１）、ヒグロマイシン耐性カセット（ＨＰＨ）、及びサッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）のＧＡＬ１遺伝子の３’非翻訳領域（ＵＴＲ）のセグメント（ＧＡＬ１ヌクレオチド位置１６３７から２５８７）を含む。このＤＮＡフラグメントは、表６において概説するようなＰＣＲ増幅によって生じさせた。図４Ｆは、ＤＮＡフラグメントＧＡＬ７４から１０２１−ＨＰＨ−ＧＡＬ１１６３７から２５８７のマップ及び配列番号：９ヌクレオチド配列を示す。
【表６】
【０１５３】
ＤＮＡフラグメントＧＡＬ８０−５０から−１−ＮａｔＲ−ＧＡＬ８０１３０９から１３５８は、ＰＣＲ増幅によって生じさせた。このＤＮＡフラグメントは、サッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）のＧＡＬ８０遺伝子のコーディング領域の直ぐ上流及び直ぐ下流（それぞれ、ＧＡＬ８０ヌクレオチド位置−５０から−１及び１３０９から１３５８；ＧＡＬ８０−５０から−１及びＧＡＬ８０１３０９から１３５８）にそれぞれ位置する５０ヌクレオチドの２つのセグメントが隣接している、ストレプトマイセス・ナーセイ（Streptomyces noursei）のナーセオトリシン（nourseothricin）耐性選択可能マーカー遺伝子（ＮａｔＲ）を含む。図４Ｇは、ＤＮＡフラグメントＧＡＬ８０−５０から−１−ＮａｔＲ−ＧＡＬ８０１３０９から１３５８のマップ及び配列番号：８ヌクレオチド配列を示す。
【０１５４】
ＤＮＡフラグメントＧＡＬ１１から４８−ＮａｔＲ−ＧＡＬ１１５００から１５５０は、ＰＣＲ増幅によって生じさせた。このＤＮＡフラグメントは、サッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）のＧＡＬ１遺伝子のコーディング領域の５’及び３’末端にそれぞれ位置する４０から５０ヌクレオチドの２つのセグメントが隣接している、ストレプトマイセス・ナーセイ（Streptomyces noursei）のナーセオトリシン耐性選択可能マーカー遺伝子（ＮａｔＲ）を含む（それぞれ、ＧＡＬ１ヌクレオチド位置１から４８及び１５００から１５５０；ＧＡＬ１１から４８及びＧＡＬ１１５００から１５５０）。図４Ｈは、ＤＮＡフラグメントＧＡＬ１１から４８−ＮａｔＲ−ＧＡＬ１１５００から１５５０のマップ及び配列番号：６８ヌクレオチド配列を示す。
【０１５５】
発現プラスミドｐＡＭ３５３は、β−ファルネセンシンターゼをコードするヌクレオチド配列をｐＲＳ４２５−Ｇａｌｌベクター（Mumberg et al. (1994) Nucl. Acids. Res. 22(25):5767-5768）に挿入することによって生じさせた。このヌクレオチド配列インサートは、サッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）における発現のためにコドン最適化されたクソニンジン（Artemisia annua）のβ−ファルネセンシンターゼ遺伝子のコーディング配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ８３５３９８）（配列番号：１０）をテンプレートとして使用して合成により生じさせた。その合成により生じさせたヌクレオチド配列には５’ＢａｍＨＩ及び３’ＸｈｏＩ制限部位が隣接しており、従って、標準ｐＵＣ又はｐＡＣＹＣ由来ベクターなどのクローニングベクターに適合する制限部位にそれをクローニングすることができた。ＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩ制限酵素を使用してＤＮＡ合成構築物を最後まで消化することによって、その合成により生じさせたヌクレオチド配列を単離した。その反応混合物をゲル電気泳動によって分割し、β−ファルネセンシンターゼコーディング配列を含むおよそ１．７ｋｂのＤＮＡフラグメントをゲル抽出し、単離されたＤＮＡフラグメントをｐＲＳ４２５−ＧａｌｌベクターのＢａｍＨＩ ＸｈｏＩ制限部位にライゲートして発現プラスミドｐＡＭ３５３を得た。
【０１５６】
発現プラスミドｐＡＭ４０４は、サッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）における発現のためにコドン最適化された、クソニンジン（Artemisia annua）のβ−ファルネセンシンターゼをコードするヌクレオチド配列を、ベクターｐＡＭ１７８（配列番号：６９）に挿入することによって生じさせた。プライマー５２−８４ ｐＡＭ３２６ ＢａｍＨＩ（配列番号：７１）及び５２−８４ ｐＡＭ３２６ＮｈｅＩ（配列番号：７２）を使用して、β−ファルネセンシンターゼをコードするそのヌクレオチド配列をｐＡＭ３５３からＰＣＲ増幅させた。結果として生じたＰＣＲ産物を、ＢａｍＨＩ及びＮｈｅＩ制限酵素を使用して最後まで消化し、その反応混合物をゲル電気泳動によって分割し、β−ファルネセンシンターゼコーディング配列を含むおよそ１．７ｋｂのＤＮＡフラグメントをゲル抽出し、単離されたＤＮＡフラグメントをベクターｐＡＭ１７８のＢａｍＨＩ ＮｈｅＩ制限部位にライゲートして発現プラスミドｐＡＭ４０４を得た（プラスミドマップについては図５を参照のこと）。
【０１５７】
実施例３
この実施例は、本明細書に提供する実施形態において有用なサッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）株の産生を説明するものである。
【０１５８】
サッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）株：ＣＥＮ．ＰＫ２−１Ｃ Ｙ００２及びＹ００３（ＭＡＴＡ又はＭＡＴアルファ；ｕｒａ３−５２；ｔｒｐ１−２８９；ｌｅｕ２−３、１１２；ｈｉｓ３Δ１；ＭＡＬ２−８Ｃ；ＳＵＣ２）（van Dijken et al. (2000) Enzyme Microb. Technol. 26(9-10):706-714）は、ＥＲＧ９プロモーターをサッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）ＭＥＴ３プロモーターで、及びＡＤＥ１ ＯＲＦをカンジダ・グラブラタ（Candida glabrata）ＬＥＵ２遺伝子（ＣｇＬＥＵ２）で置換することによって、誘発性ＭＥＶ経路遺伝子の導入のために作製した。これは、天然ＥＲＧ９プロモーターに相同の４５の塩基対を含むプライマー５０−５６−ｐｗ１００−Ｇ（配列番号：１０）及び５０−５６−ｐｗ１０１−Ｇ（配列番号：１１）を使用して、クリュイベロミセス・ラクティス（Kluyveromyces lactis）のＴｅｆ１遺伝子のプロモーター及びターミネーターが隣接しているカナマイシン耐性マーカーに続くＰＭＥＴ３プロモーターを含む、ベクターｐＡＭ３２８のＫａｎＭＸ−ＰＭＥＴ３領域（配列番号：６）をＰＣＲ増幅させること、１０ｕｇの結果として生じたＰＣＲ産物を、４０％ ｗ／ｗ ポリエチレングリコール３３５０（ミズーリ州、セントルイスのＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、１００ｍＭ 酢酸リチウム（ミズーリ州、セントルイスのＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）及び１０ｕｇ サケ精子ＤＮＡ（カリフォルニア州、カールズバッドのＩｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．）を使用して、指数増殖しているＹ００２及びＹ００３細胞に形質転換すること、及びそれらの細胞を３０℃で３０分間インキュベートし、その後、それらに４２℃で３０分間熱ショックを与えることによって行った（Schiestl and Gietz (1989) Curr. Genet. 16:399-346）。０．５ｕｇ／ｍＬ ゲネチシンを含有するリッチ培地（カリフォルニア州、カールズバッドのＩｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．）で増殖するそれらの能力によって陽性組換え体を同定し、選択したコロニーを診断ＰＣＲによって確認した。結果として得られたクローンにＹ９３（ＭＡＴ Ａ）及びＹ９４（ＭＡＴ アルファ）という呼称を与えた。その後、ＡＤＥ１ ＯＲＦに隣接する相同性の５０の塩基対を含有するプライマー６１−６７−ＣＰＫ０６６−Ｇ（配列番号：６０）及び６１−６７−ＣＰＫ０６７−Ｇ（配列番号：６１）を使用して、カンジダ・グラブラタ（Candida glabrata）ゲノムＤＮＡ（バージニア州、マナッサスのＡＴＣＣ）から３．５ｋｂ ＣｇＬＥＵ２ゲノム座を増幅し、１０ｕｇの結果として生じたＰＣＲ産物を、指数増殖しているＹ９３及びＹ９４細胞に形質転換させ、ロイシン補足の不在下での増殖について陽性組換え体を選択し、選択したクローンを診断ＰＣＲによって確認した。結果として得られたクローンにＹ１７６（ＭＡＴ Ａ）及びＹ１７７（ＭＡＴ アルファ）という呼称を与えた。
【０１５９】
株Ｙ１８８は、Ｐｍｅｌ制限酵素（マサチューセッツ州、ベヴァリーのＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用してｐＡＭ４９１及びｐＡＭ４９５プラスミドＤＮＡを最後まで消化すること、及び精製されたＤＮＡインサートを指数増殖しているＹ１７６細胞に導入することによって生じさせた。ウラシル及びヒスチジンを欠く培地での増殖によって陽性組換え体を選択し、正しいゲノム座への組込みを診断ＰＣＲによって確認した。
【０１６０】
株Ｙ１８９は、Ｐｍｅｌ制限酵素を使用してｐＡＭ４８９及びｐＡＭ４９７プラスミドＤＮＡを最後まで消化すること、及び精製されたＤＮＡインサートを指数増殖しているＹ１７７細胞に導入することによって生じさせた。トリプトファン及びヒスチジンを欠く培地での増殖によって陽性組換え体を選択し、正しいゲノム座への組込みを診断ＰＣＲによって確認した。
【０１６１】
株Ｙ１８８及びＹ１８９からのおよそ１Ｘ１０７の細胞をＹＰＤ培地プレート上で６時間、室温で混合してマッチングに備えた。ヒスチジン、ウラシル及びトリプトファンを欠く培地にその混合細胞培養物をプレーティングして、二倍体細胞の増殖について選択した。株Ｙ２３８は、ＰｍｅＩ制限酵素を使用して最後まで消化したｐＡＭ４９３プラスミドＤＮＡを使用してその二倍体細胞を形質転換すること、及び精製されたＤＮＡを指数増殖している二倍体細胞に導入することによって生じさせた。アデニンを欠く培地での増殖によって陽性組換え体を選択し、正しいゲノム座への組込みを診断ＰＣＲによって確認した。
【０１６２】
半数体株Ｙ２１１（ＭＡＴ アルファ）は、２％ 酢酸カリウム及び０．０２％ ラフィノース液体培地中で株Ｙ２３８を胞子形成させること、Ｓｉｎｇｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ ＭＳＭ３００シリーズ・マイクロマニピュレーター（英国、サマセットのＳｉｎｇｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ ＬＴＤ）を使用しておよそ２００の遺伝子四分子を単離すること、導入された遺伝物質の適切な補体を含有する独立した遺伝子の分離株を、アデニン、ヒスチジン、ウラシル及びトリプトファンの不在下で増殖するそれらの能力によって同定すること、及び導入されたすべてのＤＮＡの組込みを診断ＰＣＲにより確認することによって生じさせた。
【０１６３】
株Ｙ２２７は、株Ｙ２１１から、その株がＦＰＰをアモルファ−４，１１−ジエンに変換できるようにすることによって生じさせた。この目的のために、指数増殖しているＹ２１１細胞を、サッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）における発現のためにコドン最適化されているアモルファ−４，１１−ジエンシンターゼ遺伝子のコーディング配列に作動可能に連結されたＧＡＬ１プロモーターを含む発現プラスミドｐＡＭ４２６（配列番号：７）で形質転換させた（Merke et al. (2000) Ach. Biochem. Biophys. 381: 173-180）。ロイシンを欠く完全合成培地で宿主細胞形質転換体を選択した。
【０１６４】
株Ｙ２９３は、株Ｙ２２７から、ＧＡＬ８０遺伝子のコーディング配列を欠失させること、及び従ってその株におけるＧＡＬプロモーターを構成的に活性にすることによって生じさせた。この目的のために、指数増殖しているＹ２７７細胞をＤＮＡフラグメントＧＡＬ８０−５０から−１−ＮａｔＲ−ＧＡＬ８０１３０９から１３５８で形質転換させた。１００μｇ／ｍＬ ナーセオトリシンを含有するＹＰＤ寒天で宿主細胞形質転換体を選択し、単コロニーを選び取り、正しいゲノム座への組込みを診断ＰＣＲによって確認した。
【０１６５】
株Ｙ３３７は、株Ｙ２２７から、その株がガラクトースを異化できないようにすることによって生じさせた。この目的のために、ＰｍｅＩ制限酵素を使用してｐＡＭ５８４プラスミドＤＮＡを最後まで消化し、精製されたＤＮＡインサートＧＡＬ７４から１０２１−ＨＰＨ−ＧＡＬ１１６３７から２５８７を、指数増殖しているＹ２２７細胞に導入した。ヒグロマイシンＢを含有するＹＰＤ寒天（ミズーリ州、セントルイスのＳｉｇｍａ）での増殖によって陽性組換え体を選択した。診断ＰＣＲによって、及び炭素源としてガラクトースを使用できないことについてその株を検査することによって、正しいゲノム座への組込みを確認した。
【０１６６】
株Ｙ３５１は、株Ｙ２１１から、その株がガラクトースを異化できないようにすることによって生じさせた。この目的のために、ＰｍｅＩ制限酵素を使用してｐＡＭ５８４プラスミドＤＮＡを最後まで消化し、精製されたＤＮＡインサートＧＡＬ７４から１０２１−ＨＰＨ−ＧＡＬ１１６３７から２５８７を、指数増殖しているＹ２１１に導入した。ヒグロマイシンＢを含有するＹＰＤ寒天で宿主細胞形質転換体を選択した。診断ＰＣＲによって、及び炭素源としてガラクトースを使用できないことについてその株を検査することによって、正しいゲノム座への組込みを確認した。
【０１６７】
株Ｙ３５２は、株Ｙ３５１から、その株がβ−ファルネセンシンターゼを生産できるようにすることによって生じさせた。この目的のために、指数増殖しているＹ３５１細胞を発現プラスミドｐＡＭ４０４で形質転換させた。ロイシンを欠く完全合成培地で宿主細胞形質転換体を選択した。
【０１６８】
株Ｙ２８３は、株Ｙ２２７から、ＧＡＬ１遺伝子のコーディング配列を欠失させること、及び従ってその株がガラクトースを異化できないようにすることによって生じさせた。この目的のために、指数増殖しているＹ２２７細胞を、ＤＮＡフラグメントＧＡＬ１１から４８−ＮａｔＲ−ＧＡＬ１１５００から１５５０で形質転換させた。１００μｇ／ｍＬ ナーセオトリシンを含有するＹＰＤ寒天で宿主細胞形質転換体を選択し、単コロニーを選び取り、診断ＰＣＲによって、ならびにグリセロール及び２−デオキシガラクトースを含有する寒天でその株を増殖させることによって（機能性ＧＡＬ１ｐは、後者を毒素に変換するであろう）、正しいゲノム座への組込みを確認した。
【０１６９】
株Ｙ２２１は、指数増殖しているＹ２１１細胞をベクターｐＡＭ１７８（配列番号：６９）で形質転換することによって、株Ｙ２１１から生じさせた。ロイシンを欠く完全合成培地での増殖によって陽性形質転換体を選択した。
【０１７０】
株Ｙ２９０は、株Ｙ２２１から、ＧＡＬ８０遺伝子のコーディング配列を欠失させること、及び従ってその株におけるＧＡＬプロモーターを構成的に活性にすることによって生じさせた。
【０１７１】
株Ｙ３１８は、コロニーをｐＡＭ１７８ベクターの喪失についてスクリーニングすることによって、株Ｙ２９０から生じさせた。
【０１７２】
株４０９は、株Ｙ３１８から、その株がガラクトースの存在下でβ−ファルンセンシンターゼを生産できるようにすることによって生じさせた。この目的のために、指数増殖しているＹ３１８細胞を発現プラスミドｐＡＭ４０４で形質転換した。ロイシンを欠く完全合成培地で宿主細胞形質転換体を選択した。
【０１７３】
株Ｙ４１９は、株Ｙ４０９から、その株におけるＧＡＬプロモーターを構成的に活性にし、グルコースの存在下でより高いレベルのＧＡＬ４ｐを発現できる（すなわち、グルコースの存在下でガラクトース誘導性プロモーターをより効率的に発現させることができる、ならびにその細胞におけるすべてのガラクトース誘導性プロモーターから発現させるさせるために十分なＧａｌ４ｐ転写因子が確実に存在するようにできる）ようにすることによって生じさせた。この目的のために、その天然プロモーターの「効力のある構成的な」異形（Griggs & Johnston (1991) PNAS 88(19):8597-8601）及びＧＡＬ４ターミネーター（ＰＧａｌ４ＯＣ−ＧＡＬ４−ＴＧＡＬ４）の制御下にあるサッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）のＧＡＬ４遺伝子のＯＲＦと、クリュイベロミセス・ラクティス（Kluyveromyces lactis）のＴｅｆ１遺伝子のプロモーター及びターミネーターが隣接しているストレプトマイセス・ナーセイ（Streptomyces noursei）のナーセオトリシン耐性選択可能マーカー遺伝子（ＮａｔＲ）とを含むＤＮＡフラグメントによって、株Ｙ４０９におけるＥＲＧ９遺伝子座のＫａｎＭＸマーカーを置換した。
【０１７４】
株Ｙ６７７は、ＧＡＬ８０遺伝子座にＰＧＡＬ１の制御下でメバロン酸キナーゼのコーディング領域の別のコピーを導入することによって、株Ｙ４１９から生じさせた。
【０１７５】
株Ｙ２９３、Ｙ２８３、Ｙ３５２及びＹ６７７の細胞バンクは、それらの細胞を、３０℃で、シード培地において、それらが２から５の間のＯＤ６００に達するまで増殖させることによって作製した。ＯＤ６００に達した時点で、フラスコを氷の上に配置した。３部の培養物と２部の氷冷滅菌５０％グリセロールを併せ、この混合物の１ｍＬアリコートをクリオバイアルの中で−８０℃で冷凍した。同じ手順を株Ｙ３３７に用いたが、その株のＯＤ６００は、それを冷凍した時点で１３．６であった。
【０１７６】
実施例４
この実施例は、グルコースのみの供給での流加、炭素制限発酵における宿主細胞によるアモルファ−４，１１−ジエンの生産を説明するものである。
【０１７７】
５０ｍＬ シード培地（表７）が入っている２５０ｍＬ フラスコに１ｍＬ 冷凍バイアルを接種することによってＹ３３７シード培養物を調製した。３０℃で〜２４時間の増殖後、０．５ｍＬのその培養物を、５０ｍＬ シード培地がそれぞれに入っている追加の２５０ｍＬ フラスコに入れて継代培養した。それらのシード培養物を３０℃で一晩、およそ３から１２のＯＤ６００まで増殖させた。フラスコをプールし、それらを使用して、１０％ ｖ／ｖのバッチ培地（表８）が入っているバイオリアクターに接種した。
【表７】
【表８】
【表９】
【０１７８】
発酵のｐＨを自動制御し、１０Ｎ ＮＨ４ＯＨの添加でｐＨ５で維持した。温度を３０℃で維持した。空気流を１ＬＰＭの速度で供給した。攪拌カスケード、続いての酸素富化で、溶存酸素を４０％で維持した。Ｂｉｏｓｐｕｍｅｘ消泡剤２００Ｋで泡を制御した。
【０１７９】
そのバイオリアクター培養物を、バッチ培地中のグルコースが使い尽くされるまで放置して増殖させ、使い尽くされた時点で、下記方程式によって定義される速度でそのバイオリアクターにグルコース供給培地（表１０）をポンピングする指数的グルコース供給を開始した：
【化２２】
【０１８０】
Ｆは、基質質量流量（ｇ／時（ｇ／ｈｒ））であり、Ｖは、所与の時点でのバイオリアクター内の液体体積（Ｌ）であり、ＳＢは、バッチ培地中の基質の濃度（２０ｇ／Ｌ）であり、μｓｅｔは、比供給速度（０．０８７時−１）であり、ｔは、バッチ齢（batch age）（時）であり、ｔ０は、供給を開始したときのバッチ齢（時）であり、Ｖ０は、バイオリアクター内の初期体積であり、及び、Ｖｆｅｅｄは、バイオリアクターに添加された供給物の所与の時点での総体積（Ｌ）である。この指数的供給期は、Ｆ／Ｖの比が事前設定最大供給速度（表１１）に達するまで続いた。この最大値に達した後、Ｆ／Ｖの比を、その残りのプロセスの間、事前設定定常供給速度（表１１）で一定に保った。
【表１０】
【０１８１】
そのバイオリアクター及び供給ボトルへの１０ｇ／Ｌ ガラクトース（２２．２ｍＬの４５０ｇ／Ｌ ガラクトース保存溶液／リットル 培養物体積）の添加での接種の約２４時間後、５０のＯＤ６００でアモルファ−４，１１−ジエンの生産が誘導された。加えて、０．２５ｇ／Ｌ メチオニンをそのバイオリアクターに添加し、１ｇ／Ｌ メチオニンを供給ボトルに添加してＥＲＧ９遺伝子の転写を抑制し（１０ｍＬの２５ｇ／Ｌ メチオニン保存溶液／リットル 培養物体積及び４０ｍＬの２５ｇ／Ｌ メチオニン保存溶液／リットル 供給物体積）、ならびに１０％ ｖ／ｖのオートクレーブ処理済オレイン酸メチルをそのバイオリアクターに添加して、アモルファ−４，１１−ジエンを捕捉した。（４５０ｇ／Ｌ ガラクトース保存溶液は、加熱しながら糖を水に溶解し、その溶液を放置して冷却し、濾過滅菌することによって調製した。２５ｇ／Ｌ メチオニン保存溶液は、メチオニンを水に溶解し、その溶液を濾過滅菌することによって調製した）。
【０１８２】
様々な時点でサンプルを取り、１：２０の比でメタノールで希釈した。それぞれの希釈サンプルを３０分間、ボルテックスにかけ、培養物破壊片を回転沈降させた。内部標準としてのトランス−カリオフィレンでスパイクした９９０から９９５ｕＬ 酢酸エチルが入っている清浄なガラスバイアルに５から１０μＬの上清を移すことによって、アモルファ−４，１１−ジエン力価を判定した。それらの酢酸エチルサンプルを、水素炎イオン化検出器を装備したＡｇｌｉｅｎｔ ７８９０Ｎガスクロマトグラフ（カリフォルニア州、パロアルトのＡｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）で分析した。それぞれのサンプルの１ｕＬアリコート中の化合物を、ＤＢ Ｗａｘカラム（カリフォルニア州、パロアルトのＡｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）、ヘリウムキャリアガス及び次の温度プログラムを用いて分離した：２２０℃を３分間保持し、１００℃／分で２６０℃の温度に温度を上昇させる。このプロトコルを用いると、アモルファ−４，１１−ジエンは、およそ３．４分の保持時間を有する。生じたピーク面積を、トランス−カリオフィレンでスパイクした酢酸エチル中の精製アモルファ−４，１１−ジエンの定量較正曲線と比較することによって、アモルファ−４，１１−ジエン力価を計算した。
【０１８３】
表１１及び図６に示すように、株Ｙ３３７は、グルコースのみを供給するプロセスにおいて発酵の開始後１１４時間の時点で２．４ｇ／Ｌ アモルファ−４，１１−ジエン（ＡＤ）を生産した。
【表１１】
【０１８４】
実施例５
この実施例は、グルコース−エタノール混合供給での流加、炭素制限発酵における宿主細胞によるアモルファ−４，１１−ジエンの生産を説明するものである。
【０１８５】
実施例４において説明したように、Ｙ３３７シード培養物を調製し、バイオリアクターに接種するためにそれらを使用した。下記の変更を伴うが本質的には実施例４において説明したとおり、発酵を行ってサンプルを分析した。
【０１８６】
発酵の初期の間にバッチ培地中の一部のグルコースがエタノールに変換された。バッチ培地中のグルコース及びエタノールが使い尽くされるまでバイオリアクター培養物を放置して増殖させ、使い尽くされた時点で、下記方程式によって定義される速度でそのバイオリアクターに混合供給培地（表１０）をポンピングする指数的供給を開始した：
【化２３】
【０１８７】
Ｆは、基質質量流量（ｇ／時）であり、Ｖは、所与の時点でのバイオリアクター内の液体体積（Ｌ）であり、ＳＢは、バッチ培地中の基質の濃度（２０ｇ／Ｌ）であり、μｓｅｔは、比供給速度（０．０８７時−１）であり、ｔは、バッチ齢（時）であり、ｔ０は、供給を開始したときのバッチ齢（時）であり、Ｖ０は、バイオリアクター内の初期体積であり、及び、Ｖｆｅｅｄは、バイオリアクターに添加された供給物の所与の時点での総体積（Ｌ）である。この指数的供給期は、Ｆ／Ｖの比が、ｇ 基質／時／Ｌ バイオリアクター体積の単位での事前設定最大供給速度（表１１）に達するまで続いた。この最大値に達した後、Ｆ／Ｖの比を、その残りのプロセスの間、事前設定定常供給速度（表１１）で一定に保たった。
【０１８８】
接種の約４０時間後に７７のＯＤ６００でアモルファ−４，１１−ジエンの生産が誘導された。
【０１８９】
表１１及び図６に示すように、株Ｙ３３７は、混合グルコース−エタノール供給発酵では発酵開始後１１８時間の時点で最大１６．５ｇ／Ｌアモルファ−４，１１−ジエンを生産した。
【０１９０】
実施例６
この実施例は、エタノールのみの供給での流加、パルス供給発酵における宿主細胞によるアモルファ−４，１１−ジエンの生産を説明するものである。
【０１９１】
実施例３において説明したように、Ｙ２９３シード培養物を調製し、バイオリアクターに接種するためにそれらを使用した。下記の変更を伴うが本質的には実施例４において説明したとおり、発酵を行ってサンプルを分析した。
【０１９２】
発酵の初期の間にバッチ培地中の一部のグルコースがエタノールに変換された。バッチ培地中のグルコース及びエタノールが使い尽くされるまでバイオリアクター培養物を放置して増殖させ、使い尽くされた時点で、エタノールパルス供給を開始した。供給の速度は、オフガス中のＣＯ２のパーセント（ＣＯ２発生率；ＣＥＲ）によって制御し、オフガス分析器と、オフガス中のＣＯ２パーセントの最大値を追跡する最大ＣＥＲに変数（Ｃｍａｘ）を割り当てるコンピュータアルゴリズムとを用いて、それをモニターした。グルコースを用いて増殖している間にＣＥＲは急展開した（図７Ｂ）。バッチ培地からグルコースが使い尽くされると、ＣＥＲはＣｍａｘの５０％未満に降下し、その降下後、コンピュータアルゴリズムによってＣｍａｘがそのＣＯ２値に再設定された。バッチ培地中の過剰なグルコースから生じたエタノールが使い尽くされると、ＣＥＲは再度降下した。ＣＥＲがその時のＣｍａｘの７５％より下に落ちると、自動的にパルスフィードが誘発された。ポンプがバイオリアクターに５分間、７５％（ｖ／ｖ）エタノールを注入して、培養物におよそ１０ｇ エタノールを送達した。ポンプが切られた時点のオフガス中のＣＯ２パーセント値にＣｍａｘが再設定され、その後、ＣＯ２発生の増加を追跡するように再び指定され、そのＣＥＲが新たに設定されたＣｍａｘの７５％より下に再び落ちるとポンプは再び作動された。この供給アルゴリズムが、発酵の間、繰り返され（図７Ａ）、培地にエタノールが過剰供給されないことを保証した。塩、微量金属、ビタミン、糖又はアミノ酸溶液はいずれもエタノール供給物に可溶性でないため、濃縮供給成分（表１２）を併せ、１日１回、供給成分の前の添加以来、送達されたエタノール体積の量に応じてそのバイオリアクターのヘッドプレート内のセプタムを通して注入した。
【表１２】
【０１９３】
バッチ培地からグルコースが使い尽くされてから１０時間後、０．２５ｇ／Ｌ メチオニンをバイオリアクターにそのヘッドプレートを通して添加し、その容器に１０％ ｖ／ｖのオートクレーブ処理済オレイン酸メチルをポンピングした（株Ｙ２９３は分解ＧＡＬ８０遺伝子を含むので、アモルファ−４，１１−ジエンの生産を誘導するためにガラクトースは必要でなかった）。
【０１９４】
図７Ｂに示すように、株Ｙ２９３は、３６ｇ／Ｌ アモルファ−４，１１−ジエンを生産した。
【０１９５】
実施例７
この実施例は、エタノールのみの供給での流加、炭素制限発酵における宿主細胞によるアモルファ−４，１１−ジエンの生産を説明するものである。
【０１９６】
実施例３において説明したように、Ｙ２９３シード培養物を調製し、バッチ培地（表１３）が入っているバイオリアクターに接種するためにそれらを使用した。
【表１３】
【０１９７】
下記の変更を伴うが本質的には実施例４において説明したとおり、発酵を行ってサンプルを分析した。
【０１９８】
バッチ培地中のグルコースが使い尽くされるまでバイオリアクター培養物を放置して増殖させ、使い尽くされた時点で、下記方程式によって定義される速度でそのバイオリアクターにグルコース供給培地（表１０）をポンピングする指数的供給を開始した：
【化２４】
【０１９９】
Ｆは、基質質量流量（ｇ／時）であり、Ｖは、所与の時点での発酵槽内の液体体積（Ｌ）であり、ＳＢは、バッチ培地中の基質の濃度（２０ｇ／Ｌ）であり、μｓｅｔは、比供給速度（０．０８７時−１）であり、ｔは、バッチ齢（時）であり、ｔ０は、供給を開始したときのバッチ齢（時）であり、Ｖ０は、発酵槽内の初期体積であり、及び、Ｖｆｅｅｄは、発酵槽に添加された供給物の所与の時点での総体積（Ｌ）である。この指数的供給は、７．１ｇ／時／Ｌ最大供給速度（およそ５０のＯＤ６００）に達するまで続いた。達した時点で、その供給をエタノール供給（１９０プルーフ）に切替え、残りの発酵の間、供給速度を２．５ｇ／時／Ｌの一定体積値に設定した。このプログラムされた供給速度を用いて、エタノール消費速度を制御し、それは０．４から１．７５ｇ エタノール／ｇ ＤＣＷ／日にわたった。
【０２００】
図８に示すように、株Ｙ２９３は、発酵開始後１８７時間の時点で３７ｇ／Ｌ アモルファ−４，１１−ジエンを生産した。
【０２０１】
実施例８
この実施例は、エタノールのみの供給での流加、炭素制限発酵における宿主細胞によるファルネセンの生産を説明するものである。
【０２０２】
実施例３において説明したように、Ｙ６７７シード培養物を調製し、６３０ｍＬ バッチ培地（表１４）がそれぞれに入っている２つのバイオリアクターに接種するためにそれらを使用した。２つのバイオリアクターの一方に、産物捕捉のために２００ｍＬ オレイン酸メチルを添加した。下記の変更を伴うが本質的には実施例４において説明したとおり、発酵を行ってサンプルを分析した。
【表１４】
【０２０３】
発酵の初期の間にバッチ培地中の一部のグルコースがエタノールに変換された。バッチ培地中のグルコース及びエタノールが使い尽くされるまでバイオリアクター培養物を放置して増殖させ、使い尽くされた時点で、下記方程式によって定義される速度でそのバイオリアクターに純粋なエタノール（１９０プルーフ）をポンピングする指数的供給を開始した：
【化２５】
【０２０４】
Ｆは、基質質量流量（ｇ／時）であり、Ｖは、所与の時点での発酵槽内の液体体積（Ｌ）であり、ＳＢは、バッチ培地中の基質の濃度（３９．０３ｇ／Ｌ）であり、μｓｅｔは、比供給速度（０．０５８時−１）であり、ｔは、バッチ齢（時）であり、ｔ０は、供給を開始したときのバッチ齢（時）であり、Ｖ０は、発酵槽内の初期体積（０．７Ｌ）であり、及び、Ｖｆｅｅｄは、発酵槽に添加された供給物の所与の時点での総体積（Ｌ）である。この指数的供給期は、Ｆ／Ｖの比が５ｇ 基質／時／Ｌ バイオリアクター体積の最大供給速度に達するまで続いた。この最大値に達した後、Ｆ／Ｖの比を、その残りのプロセスの間、２．５ｇ／時／Ｌの定常供給速度で一定に保たった。しかし、図９Ａに示すように、指数的供給期の最初の比較的遅いエタノール利用速度により、結果としてエタノールの蓄積が生じた。この蓄積により、炭素制限プロセスを維持するために事前設定供給速度（図９Ｂ）の手動調整及び１２時間から１４時間への供給速度倍加時間の増加を余儀なくされた。オレイン酸メチルの存在下で増殖した細胞を迅速に回収し、事前設定最大及び定常供給速度への増殖を再び開始した（図９Ｃ）。対照的に、オレイン酸メチルを含有しない培養物は、蓄積されたエタノールの消費がより遅く、従って、定常供給の第二の一時停止、その後、その定常供給速度の２．５ｇ／時／Ｌから１．２５ｇ／時／Ｌへの減少を必要とした。全般的に言えば、株Ｙ６７７は、オレイン酸メチルの不在下では０から２．１ｇ エタノール／ｇ ＤＣＷ／日の、及びオレイン酸メチルの存在下では０．２７−２．９ｇ エタノール／ｇ ＤＣＷ／日のエタノール消費速度を有した。
【０２０５】
バイオリアクターのオフガスを凝縮器に通して、オフガス質量分析器を使用して酸素摂取率（ＯＵＲ）及びＣＯ２発生（ＣＥＲ）を測定した。図９Ｄは、オレイン酸メチルの存在下での株Ｙ６７７のＣＥＲ及びＯＵＲを示す。
【０２０６】
１日２回のサンプリングによって、細胞密度及びエタノール消費をモニターした。それぞれの時点で、１ｍＬ ブロスサンプルを取り、水で１：１０００希釈し、６００ｎｍ 波長に設定した分光光度計を使用して細胞密度を測定した。
【０２０７】
エタノールのレベルは、ＨＰＬＣによって定量した。それぞれの時点で、１ｍＬ ブロスサンプルを取り、３０ｍＭ 硫酸溶液で２倍希釈した（移動相溶液の濃度に匹敵する１５ｍＭ 硫酸の最終濃度のために４００ｕＬ 上清に対して４００ｕＬ ３０ｍＭ 硫酸）。遠心分離及び濾過によって細胞を除去した後、負荷した。
【０２０８】
生産されたファルネセンのレベルをＧＣ−ＦＩＤによって定量した。それぞれの時点で、１００ｕＬのオレイン酸メチルオーバーレイを取り、０．００１％ トランス−ベータカリオフィレンを含有する酢酸エチルで１：４０希釈した。その混合物を、この方法についての較正曲線の範囲内にあてはまる最終１：４０００希釈のために、もう一度、酢酸エチルで１：１００希釈した。オレイン酸メチルを産物捕捉に用いない場合には、２５ｕＬ 培養ブロスを９７５ｕＬ メタノールと併せ、その混合物を５分間、ボルテックスにかけ、遠心分離し、最後に、０．００１％ トランス−ベータカリオフィレンを含有する酢酸エチルで１：１００希釈した後、分析した。
【０２０９】
図９Ｅに示すように、オレイン酸メチルの存在下では株Ｙ６７７は３０ｇ／Ｌのピークファルネセン力価に達し、オレイン酸メチルの不在下では、４０ｇ／Ｌのピークファルネセン力価に達した。
【０２１０】
実施例９
この実施例は、酸素制限発酵における宿主細胞によるアモルファ−４，１１−ジエン及びファルネセンの生産を説明するものである。
【０２１１】
実施例３において説明したように、Ｙ２８３及びＹ３５２シード培養物を調製し、８００ｍＬ バッチ培地（表１５）及び１００ｍＬ オレイン酸メチルが入っているバイオリアクターに接種するためにそれらを使用した。
【表１５】
【０２１２】
ガス流量比制御装置を伴う２Ｌ Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｂｉｏｓｔａｔ Ｂ ｐｌｕｓ ｔｗｉｎｓにおいて発酵を行った。１５Ｎ ＮＨ４ＯＨ及び５Ｎ Ｈ２ＳＯ４の添加でそのｐＨをｐＨ５．０に自動的に制御した。温度を３０℃で維持し、Ｂｉｏｓｐｕｍｅｘ ２００Ｋ商標消泡剤を使用して泡を制御した。０．６−１の間のＯＤ５００でバイオリアクターに接種し、３０ｇ／Ｌ グルコースで増殖させた。
【０２１３】
そのバイオリアクターのオフガスを凝縮器に通して、オフガス質量分析器を使用して酸素摂取率（ＯＵＲ）及びＣＯ２発生（ＣＥＲ）を測定した。溶存酸素（ＤＯ）濃度は、１０ｐｐｂから飽和までの間の感度を有するＯ２センサープローブ（Ｈａｍｉｌｔｏｎ、ＯＸＹＦＥＲＭ ＦＤＡ ２２５、ネバダ州、リーノーのＨａｍｉｌｔｏｎ Ｃｏｍｐａｎｙ）を使用して測定した。
【０２１４】
発酵の初期の間にバイオリアクター培養物がバッチ培地中のグルコースをバイオマス及びエタノールに変換した。グルコースが消費されると（その培養における酸素の利用率に依存して発酵開始の８〜１４時間後）、ガラクトース輸送及び転写機構のグルコース抑制が緩和され、バッチ培地中のガラクトースによって遺伝子発現オフＧＡＬプロモーターが誘導された。このバッチ培養は、発酵期に生産されたエタノールが使い尽くされるまで増殖し続け、使い尽くされた時点で、ＤＯスパイクが培養期間の終わりを示した。
【０２１５】
好気性プロセスについては、清浄な乾燥した空気を１ＬＰＭの速度で培地にスパージした。攪拌速度を４００ｒｐｍに初期設定し、ＤＯフィードバック制御ループ及び攪拌カスケードプログラムを用いてＤＯ濃度を４０％で維持した（表１６）。
【０２１６】
微好気性プロセスについては、オフガス分析器に到達するガスの希釈を最小にするために、及び質量分析器の感度を増すために、ガス流を０．２５ＬＰＭに減少させた。空気対窒素比が異なるガスフローを用いることにより、酸素送達率を変えた（表１６）。
【０２１７】
厳密な嫌気性プロセスについては、１００％窒素ガスを接種前に０．２５ＬＰＭで水性培地にスパージし、その培養の間、４００ｒｐｍの一定攪拌速度を維持した（表１６）。
【表１６】
【０２１８】
１日２回のサンプリングにより、細胞密度及びエタノール消費をモニターした。それぞれの時点で、１ｍＬ ブロスサンプルを取り、水で１：１００希釈し、６００ｎｍ 波長に設定した分光光度計を使用して細胞密度を測定した。
【０２１９】
オレイン酸メチルサンプルを酢酸エチルで１：４０００希釈ではなく最終１：４００希釈に希釈したことを除き、実施例８において説明したとおり生産されたエタノール及びファルネセンのレベルを定量した。
【０２２０】
図１０Ａは、宿主株Ｙ２８３の様々な発酵におけるＤＯ濃度を示す。図１０Ｂ及び１０Ｃに示すように、株Ｙ２８３において、培養の際の酸素利用率増加は、細胞増殖増加、エタノールへのグルコース変換速度増加、及び培地のエタノールを使い尽くす速度増加につながる。株Ｙ２８３による増殖、産物形成、及びエタノール消費は、十分に空気を供給した培養物（４０％のＤＯ）において最大であったが、それらは２４時間後には安定状態に達した。表１７に示すように、すべての微好気性プロセスについての細胞当たりのエタノール消費速度は、０．４０−０．７２ｇ エタノール／ｇ ＤＣＷ／日の間であった。図１０Ｄに示すように、炭素投入量に対するアモルファ−４，１１−ジエンの最高収率は、８０％空気及び２０％窒素で観察された。
【表１７】
【０２２１】
図１０Ｅ及び１０Ｆに示すように、株Ｙ３５２において、培養の際の酸素利用率増加は、細胞増殖増加、エタノールへのグルコース変換速度増加、及び培地のエタノールを使い尽くす速度増加につながる。表１７に示すように、試験した２つの微好気性プロセスについての細胞当たりのエタノール消費速度は、０．４２−０．８８ｇ エタノール／ｇ ＤＣＷ／日の間であった。図１０Ｇに示すように、炭素投入量に対してファルネセンのわずかに高い収率が１００％空気で観察されたが、微好気性培養でのほうが長い期間にわたって生産が続いた。
【０２２２】
実施例１０
この実施例は、炭素及びリン酸塩制限を伴う振盪フラスコ内培養での宿主細胞によるアモルファ−４，１１−ジエンの生産を説明するものである。
【０２２３】
０．５Ｍ コハク酸緩衝液（ｐＨ５．０）に固体アミログリコシダーゼ（Ｓｉｇｍａ Ａ７４２０−１００ＭＧ）を溶解して１００Ｕ／ｍＬの最終酵素濃度にし、その溶液を濾過滅菌することによって、保存アミログルコシダーゼ（グルコアミラーゼ）酵素溶液を調製した。
【０２２４】
５０ｍＬのリン酸塩制限シード培地（表１８）が入っている２５０ｍＬ バッフル付フラスコに１ｍＬ 冷凍Ｙ３３７細胞を接種することによって、Ｙ３３７シード培養物を調製した。そのシード培養物を一晩、３０℃及び２００ｒｐｍで増殖させた。
【表１８】
【０２２５】
そのＹ３３７シード培養物を用いて、幾つかの２５０ｍＬバッフル付振盪フラスコに０．０５の出発ＯＤ６００まで接種した。生産フラスコには、４０ｍＬのリン酸塩制限生産培地（表１８）が入っていた。ＫＨ２ＰＯ４を、１００ｇ／Ｌ 濾過滅菌保存溶液から０．１ｇ／Ｌ、０．２５ｇ／Ｌ、０．５ｇ／Ｌ、０．８ｇ／Ｌ、２ｇ／Ｌ及び８ｇ／Ｌの最終濃度まで、それぞれのフラスコに添加した。接種前に、８０μＬの新たに解凍した１００Ｕ／ｍＬ アミログリコシダーゼ濾過滅菌保存溶液をそれぞれのフラスコに添加した（０．２Ｕ／ｍＬの最終濃度）。生産フラスコを３０℃及び２００ｒｐｍで最大３日間インキュベートした。この培養期間の間、グルコースが、およそ２０ｍｇ／時の一定速度でグルコアミラーゼによって放出された。
【０２２６】
内部標準としてのベータ−又はトランス−カリオフィレンでスパイクした５００μＬ 酢酸エチルが入っている清浄なガラスバイアルに２から１０μＬのオレイン酸メチルオーバーレイを移し、それらの酢酸エチルサンプルを実施例４において説明したように分析することによって、アモルファ−４，１１−ジエン力価を判定した。
【０２２７】
図１１に示すように、全体としてアモルファ−４，１１−ジエン力価は、最低濃度（０．１／Ｌ）を除き、試験したすべてのリン酸塩濃度で同等であったが、より低いリン酸塩濃度では細胞増殖が制限され、これは、より低いリン酸塩濃度でのアモルファ−４，１１−ジエンの細胞当たりの生産増加と言い換えられる。
【０２２８】
実施例１１
この実施例は、リン酸塩制限及びグルコース供給での流加、炭素制限発酵における宿主細胞によるアモルファ−４，１１−ジエンの生産を説明するものである。
【０２２９】
実施例３において説明したように、Ｙ３３７シード培養物を調製し、リン酸塩制限バッチ培地（表１９）が入っているバイオリアクターに接種するためにそれらを使用した。下記の変更を伴うが本質的には実施例４において説明したとおり、発酵を行ってサンプルを分析した。
【０２３０】
そのバイオリアクター培養物を、バッチ培地中のグルコースが使い尽くされるまで放置して増殖させ、使い尽くされた時点で、下記方程式によって定義される速度でそのバイオリアクターにリン酸塩制限グルコース供給培地（表１９）をポンピングする指数的供給を開始した：
【化２６】
【０２３１】
Ｆは、基質質量流量（ｇ／時）であり、Ｖは、所与の時点でのバイオリアクター内の液体体積（Ｌ）であり、ＳＢは、バッチ培地中の基質の濃度（１９．５ｇ／Ｌ）であり、μｓｅｔは、比供給速度（０．０８７時−１）であり、ｔは、バッチ齢（時）であり、ｔ０は、供給を開始したときのバッチ齢（時）であり、Ｖ０は、バイオリアクター内の初期体積であり、及び、Ｖｆｅｅｄは、バイオリアクターに添加された供給物の所与の時点での総体積（Ｌ）である。この指数的供給は、Ｆ／Ｖの比が事前設定最大供給速度（表２０）に達するまで続いた。この最大供給速度に達した後、Ｆ／Ｖの比を、その残りのプロセスの間、事前設定定常供給速度で一定に保った。しかし、より多くの供給物をバイオリアクターに添加すると体積（Ｖ）は増加し続けるので、基質質量流量（Ｆ）は、その体積がバイオリアクターの最大作業量（初期体積のおよそ３倍）に達するまで増加し続けた。残りのプロセスついては、そのリアクターから継続的に細胞ブロスを除去し、その基質質量流量（Ｆ）を一定に保つことによって、バイオリアクター体積を一定に保った。図１２Ａは、この発酵のグルコース供給速度プロフィールを示す。
【表１９】
【０２３２】
アモルファ−４，１１−ジエンの生産がおよそ５０のＯＤ６００で誘導された。
【０２３３】
表２０及び図１２Ｂに示すように、バッチ培地への８ｇ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４の供給及び供給培地へのリン酸塩の無供給が、５．５２ｇ／Ｌの最高アモルファ−４，１１−ジエン生産を示した。これらの条件下では、バッチ培地中のリン酸塩が４０時間までに消費され、その結果、細胞増殖が制限された（すなわち、炭素はあまりバイオマスに向かわず、より多くの炭素がアモルファ−４，１１−ジエンの生産に向かった）（図１２Ｃ）。
【表２０】
【０２３４】
実施例１２
この実施例は、リン酸塩制限及び混合グルコース／エタノール供給での流加、炭素制限発酵における宿主細胞によるアモルファ−４，１１−ジエンの生産を説明するものである。
【０２３５】
実施例３において説明したように、Ｙ３３７シード培養物を調製し、リン酸塩制限バッチ培地（表１９）が入っているバイオリアクターに接種するためにそれらを使用した。下記の変更を伴うが本質的には実施例４において説明したとおり、発酵を行ってサンプルを分析した。
【０２３６】
発酵の初期の間にバッチ培地中の一部のグルコースがエタノールに変換された。バッチ培地中のグルコース及びエタノールが使い尽くされるまでバイオリアクター培養物を放置して増殖させ、使い尽くされた時点で、下記方程式によって定義される速度でそのバイオリアクターにリン酸塩制限混合供給培地（表１９）をポンピングする指数的供給を開始した：
【化２７】
【０２３７】
Ｆは、基質質量流量（ｇ／時）であり、Ｖは、所与の時点でのバイオリアクター内の液体体積（Ｌ）であり、ＳＢは、バッチ培地中の基質の濃度（２０ｇ／Ｌ）であり、μｓｅｔは、比供給速度（０．０８７時−１）であり、ｔは、バッチ齢（時）であり、ｔ０は、供給を開始したときのバッチ齢（時）であり、Ｖ０は、バイオリアクター内の初期体積であり、及び、Ｖｆｅｅｄは、バイオリアクターに添加された供給物の所与の時点での総体積（Ｌ）である。この指数的供給期は、Ｆ／Ｖの比がｇ 基質／時／Ｌ バイオリアクター体積の単位での事前設定最大供給速度（表２１）に達するまで続いた。この最大値に達した後、Ｆ／Ｖの比を、その残りのプロセスの間、事前設定定常供給速度（表２１）で一定に保たった。
【０２３８】
アモルファ−４，１１−ジエンの生産がおよそ５０のＯＤ６００で誘導された。
【０２３９】
表２１及び図１３Ａに示すように、バッチ培地への８ｇ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４及び供給培地への０から０．５ｇ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４の供給が、２６から２７ｇ／Ｌを超える最高アモルファ−４，１１−ジエン生産を示した。これらの条件下では、バッチ培地中のリン酸塩が４０時間までに消費され、その結果、細胞増殖が制限された（すなわち、炭素はあまりバイオマスに向かわず、より多くの炭素がアモルファ−４，１１−ジエンの生産に向かった）（図１３Ｂ）。供給培地中、０ｇ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４と比較して、供給培地中、０．５ｇ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４は、細胞増殖及びアモルファ−４，１１−ジエン生産をさらに２４時間継続させた。
【表２１】
【０２４０】
実施例１３
この実施例は、ＭＥＶ経路の酵素をはじめとする酵素をコードする非相同ヌクレオチド配列とそれらのゲノムに組み込まれたテルペンシンターゼとを保有する、大腸菌（Escherichia coli）宿主株を生じさせるための方法を説明するものである。
【０２４１】
Ｄａｔｓｅｎｋｏ及びＷａｎｎｅｒによって概説された手順（(2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:6640-6645）の変形を用いてゲノム組込みを行った。この方法は、Ｔ７プロモーター−対象となる遺伝子−ＦＲＴ−Ｋａｎ−ＦＲＴカセットを含むプラスミドを利用する。このカセットの組込みのターゲットとなるゲノム座に隣接する領域に相同であるおよそ１００のヌクレオチドが、このカセットの両側に隣接している。これらの隣接領域は、このカセットの３’又は５’末端のいずれかに相同であるおよそ３０ヌクレオチドの伸長部と、そのゲノム座に隣接する領域に相同であるおよそ５０ヌクレオチドのもう１つの伸長部とを含むプライマーを使用して、このカセットをＰＣＲ増幅することによって作る（図１４）。結果として生じたＰＣＲ産物は、そのカセットのいずれかの末端に対して隣接配列相同性の別の５０のヌクレオチドを付加する第二ＰＣＲ反応において、テンプレートとして使用する（図１４）。その隣接配列を有するカセットを、Ｒｅｄリコンビナーゼタンパク質をコードするプラスミドを保持するエレクトロコンピテント大腸菌（Escherichia coli）細胞にエレクトロポレートする。カナマイシン（「Ｋａｎ」）耐性コロニーをコロニーＰＣＲによってスクリーニングする。陽性組換え体をＰ１−ファージで処理し、Ｐ１−形質導入によって新たな株にその組込みを移す。結果として生じた株を、ＦＬＰリコンビナーゼをコードするプラスミドで形質転換させ、その活性に起因してＫａｎ遺伝子がそのカセットから切り取られ、その結果、ターゲットのゲノム座にＴ７プロモーター−対象となる遺伝子が残る。最終宿主株は、そのＦＬＰリコンビナーゼが回復する。
【０２４２】
説明した方法を適用して、β−ファルネセンシンターゼ（「ＦＳ」）をコードするＤＮＡフラグメントを大腸菌（Escherichia coli）株Ｂ１０２１のＬａｃオペロン（ＭＭ２９４（ＤＥ３）（Ｔ１Ｒ））に組み込むことにより、宿主株Ｂ１０６０を生じさせた。この目的のために、ＤＥ３溶原化キット（ドイツ、ダルムシュタットのＮｏｖａｇｅｎ）を使用して大腸菌（Escherichia coli）株ＭＭ２９４（ＡＴＣＣ３３６２５）をＤＥ３にし、過剰なＴ１ファージの存在下でその株を増殖させることによってＴ１ファージ耐性にし、このようにして株Ｂ１０２１を得た。ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ方法論（Geiser et al. (2001) Biotechniques 31:88-92）の変形を用いて、ＦＲＴ−Ｋａｎ−ＦＲＴカセットを、Ｔ７プロモーターの制御下で、大腸菌（Escherichia coli）における発現のためにコドン最適化された、クソニンジン（Artemisia annua）のβ−ファルネセンシンターゼ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ８３５３９８）をコードする、発現プラスミドｐＡＭ４５４に挿入し、このようにして発現プラスミドｐＡＭ６１７を得た。ｐＡＭ６１７におけるＴ７−ＦＳ−ＦＲＴ−Ｋａｎ−ＦＲＴカセットには、ｍｈｐＲ及びｃｙｎＸ遺伝子座からの配列（配列番号：７０）が既に隣接しているため、Ｌａｃオペロンに隣接するｍｈｐＲ又はｃｙｎＸ配列に相同な１００ヌクレオチド配列を作るために１ラウンドのＰＣＲ増幅しか必要でなかった。（Ｒｅｄリコンビナーゼをコードする）発現プラスミドｐＡＭ８８を保有するＭＭ２９４（ＤＥ３）宿主細胞を、５０ｕｇ／ｍＬ カルベニシリン及び１ｍＭ アラビノースを含有するＬＢ培地中、３０℃で、０．６のＯＤ６００に増殖させた。それらの細胞を回収し、エレクトロコンピテントにし、ＰＣＲ産物で形質転換させた。５０ｕｇ／ｍＬ カナマイシンを含有するＬＢ寒天を用いて３０℃で２日増殖させた後にコロニーを得、コロニーＰＣＲによって正しい組込みを選択した。Ｐ１−形質導入によって宿主株Ｂ１０２１（ＭＭ２９４（ＤＥ３）（Ｔ１Ｒ））にその組込みを移し、結果として生じた株をコンピテントにし、（ＦＬＰリコンビナーゼをコードする）発現プラスミドｐＡＭ８９で形質転換させた。５０ｕｇ／ｍＬ カルベニシリンを含有するＬＢ寒天を用いて３０℃で２日増殖させた後にコロニーを得た。１つのコロニーを単離し、ＬＢ培地中、４２℃で増殖させてプラスミドｐＡＭ８９を喪失し、その結果、株Ｂ１０６０（ＭＭ２９４（ＤＥ３）（Ｔ１Ｒ）ｌａｃ：：Ｔ７−ＦＳ）を得た。
【０２４３】
メバロン酸キナーゼ（「ＭＫ」）をコードするＤＮＡフラグメントを大腸菌（Escherichia coli）株Ｂ１０２１のａｃｋｐｔａオペロンに組み込むことによって、宿主株Ｂ１０６１を生じさせた。この目的のために、大腸菌（Escherichia coli）における発現のためにコドン最適化された、サッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）のメバロン酸キナーゼをコードするＤＮＡフラグメント（配列番号：７１）を、プラスミドｐＡＭ６１８のＮｄｅＩ ＢａｍＨＩ制限部位に挿入した。プラスミドｐＡＭ６１８は、Ｔ７プロモーター、それに続く多数のクローニング部位（ＭＣＳ）そしてＦＲＴ−ＫａｎＲ−ＦＲＴカセットを含む（配列番号：７２、図１５）。結果として生じたＴ７−ＭＫ−ＦＲＴ−Ｋａｎ−ＦＲＴカセットを上で説明したようなＰＣＲ増幅ラウンドに２回付して、ａｃｋ ｐｔａオペロンに相同な１００ヌクレオチド隣接配列を作った。最終ＰＣＲ産物を上で説明したように大腸菌（Escherichia coli）株Ｂ１０２１に導入して、株Ｂ１０６１（ＭＭ２９４（ＤＥ３）（Ｔ１Ｒ）ａｃｋｐｔａ：：Ｔ７−ＭＫ）を得た。この組込を宿主株Ｂ１０６０にも移して、株Ｂ１１２４（ＭＭ２９４（ＤＥ３）（Ｔ１Ｒ）ｌａｃ：：Ｔ７−ＦＳ ａｃｋｐｔａ：：Ｔ７−ＭＫ）を得た。
【０２４４】
ホスホメバロン酸キナーゼ（「ＰＭＫ」）をコードするＤＮＡフラグメントを大腸菌（Escherichia coli）株Ｂ１０２１のｐｏｘＢ遺伝子座に組み込むことによって、宿主株Ｂ１０６２を生じさせた。この目的のために、大腸菌（Escherichia coli）における発現のためにコドン最適化された、サッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）のホスホメバロン酸キナーゼをコードするＤＮＡフラグメント（配列番号：７３）を、プラスミドｐＡＭ６１８のＮｄｅＩ ＢａｍＨＩ制限部位に挿入した。結果として生じたＴ７−ＰＭＫ−ＦＲＴ−Ｋａｎ−ＦＲＴカセットを上で説明したようなＰＣＲ増幅ラウンドに２回付して、ｐｏｘＢ遺伝子座に相同な１００ヌクレオチド隣接配列を作った。最終ＰＣＲ産物を上で説明したように大腸菌（Escherichia coli）株Ｂ１０２１に導入して、株Ｂ１０６２（ＭＭ２９４（ＤＥ３）（Ｔ１Ｒ）ｐｏｘＢ：：Ｔ７−ＰＭＫ）を得た。
【０２４５】
ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ（「ＨＭＧＲ」）をコードするＤＮＡフラグメントを大腸菌（Escherichia coli）株Ｂ１０２１のｌｄｈＡ遺伝子座に組み込むことによって、宿主株Ｂ１２７３を生じさせた。この目的のために、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）のＨＭＧＲをコードするＤＮＡフラグメント（ｍｖａ；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＢＡ００００１７、ＲＥＧＩＯＮ：２６８８９２５．．２６８７６４８）を、プラスミドｐＡＭ６１８のＥｃｏＲＩ ＢａｍＨＩ制限部位に、クレノウ（Klenow）フラグメントでそのＥｃｏＲＩ制限部位を処理した後、挿入した。結果として生じたＴ７−ｍｖａＡ−ＦＲＴ−Ｋａｎ−ＦＲＴカセットを上で説明したＰＣＲ増幅ラウンドに２回付して、ｌｄｈＡ遺伝子座に相同な１００ヌクレオチド隣接配列を作った。最終ＰＣＲ産物を上で説明したように大腸菌（Escherichia coli）株Ｂ１０２１に導入して、株Ｂ１２７３（ＭＭ２９４（ＤＥ３）（Ｔ１Ｒ）ｌｄｈＡ：：Ｔ７−ｍｖａＡ）を得た。
【０２４６】
多くの具体的な実施例を提供したが、上の説明は、本明細書において提供する実施形態を制限するためのものではなく、例証するためのものである。本明細書の再考により当業者にはこれらの実施形態の多くの変形が明らかになるであろう。従って、これらの実施形態の範囲は、上の説明を参照して決定されるべきではなく、添付の特許請求の範囲を等価物の全範囲と共に参照して決定すべきである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
イソプレノイド化合物を生産するための方法であって、
（ａ）ＭＥＶ又はＤＸＰ経路の酵素をコードする染色体組込み異種核酸配列を含むイソプレノイド化合物を作ることができる複数の宿主細胞を得る工程；
（ｂ）前記宿主細胞が炭素源としてエタノールを用いてイソプレノイド化合物を作る条件下で培地において前記宿主細胞を培養する工程；及び
（ｃ）前記培地からイソプレノイド化合物を回収すること
を含む、前記方法。
【請求項２】
前記宿主細胞によって炭素源として消費されるエタノールが、その宿主細胞によって作られたものである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記宿主細胞によって炭素源として消費されるエタノールが、前記培地に外因的に供給される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記培地が、少なくとも４時間、リットル当たり約１グラムである又はそれより多いエタノールの濃度でエタノールを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記宿主細胞が、１日につき乾燥細胞重量のグラム当たり約０．２グラムと約５グラムの間である又はそれより多いエタノール消費速度を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記宿主細胞が、イソプレノイド化合物を作っている間、酸素制限されない、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記培養条件が、１時間につき乾燥細胞重量のグラム当たり１０ｍｍｏｌ未満の酸素という比酸素摂取速度の期間を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記培養条件が、前記宿主細胞がリン酸塩制限される期間を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記宿主細胞が、原核細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記宿主細胞が、大腸菌（E.coli）である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記宿主細胞が、真核細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記宿主細胞が、真菌である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記宿主細胞が、Ｓ．セレビジエ（S. cerevisiae）である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記イソプレノイド化合物が、培地のリットル当たり約１０グラムより多い量で生産される、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記イソプレノイド化合物が、乾燥細胞重量のグラム当たり約５０ミリグラムより多い量で生産される、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記イソプレノイド化合物の量が、約７２時間未満の間に生産される、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記イソプレノイド化合物の量が、約４８時間未満の間に生産される、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記イソプレノイド化合物の量が、約２４時間未満の間に生産される、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記イソプレノイドが、ヘミテルペン、モノテルペン、ジテルペン、トリテルペン、テトラテルペン及びポリテルペンから成る群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記イソプレノイドが、Ｃ５−Ｃ２０イソプレノイドである、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記イソプレノイドが、アビエタジエン、アモルファジエン、カレン、α−ファルネセン、β−ファルネセン、ファルネソール、ゲラニオール、ゲラニルゲラニオール、イソプレン、リナロオール、リモネン、ミルセン、ネロリドール、オシメン、パチュロール、β−ピネン、サビネン、γ−テルピネン、テルピノレン及びバレンセンから成る群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
Ｃ５−Ｃ２０イソプレノイド化合物を作るための方法であって、
（ａ）イソプレノイド化合物を作ることができる複数の宿主細胞を得る工程；
（ｂ）少なくとも４時間、培地のリットル当たり約１グラムである又はそれより多い量でエタノールを含む培地において、前記宿主細胞を培養する工程；
（ｃ）培地のリットル当たり少なくとも５グラムのイソプレノイド化合物を回収する工程
を含む、前記方法。
【請求項２３】
前記培地が、培地のリットル当たり約１グラムと約５グラムの間のエタノールを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
前記培地が、培地のリットル当たり約１グラムと約２０グラムの間のエタノールを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
前記培地が、培地のリットル当たり約２０グラムより多い量のエタノールを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２６】
前記宿主細胞が、酵母細胞である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
前記培地中のエタノールの少なくとも一部分が、前記宿主細胞によって作られたものである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２８】
Ｃ５−Ｃ２０イソプレノイド化合物を作るための方法であって、
（ａ）イソプレノイド化合物を作ることができる複数の宿主細胞を得る工程；
（ｂ）炭素源のボーラスを培地に供給することによって、酵母細胞を培養してバイオマスを作る工程；
（ｃ）前記酵母細胞が、１時間につき乾燥細胞重量のグラム当たり約０．０１グラムである又はそれより多いエタノール消費速度を有する条件下で細胞を維持する工程；及び
（ｄ）培地のリットル当たり少なくとも５グラムのイソプレノイド化合物を回収する工程
を含む、前記方法。
【請求項２９】
消費されるエタノールの少なくとも一部分が、前記宿主細胞によって作られたものである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記エタノール消費速度が、１時間につき乾燥細胞重量のグラム当たり約０．０１グラムと約０．２０グラムの間のエタノールである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記エタノール消費速度が、１時間につき乾燥細胞重量のグラム当たり約０．１グラムより多いエタノールである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
前記炭素源が、炭水化物である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３３】
前記炭素源が、炭水化物とエタノールの混合物である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３４】
前記炭素源が、エタノールである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３５】
前記細胞が維持される条件が、少なくとも４時間、酸素制限を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３６】
前記細胞が維持される条件が、少なくとも４時間、リン酸塩制限を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３７】
前記宿主細胞が、酵母細胞である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３８】
前記宿主細胞が、Ｓ．セレビジエ（S.cerevisiae）である、請求項２８に記載の方法。
【請求項１】
イソプレノイド化合物を生産するための方法であって、
（ａ）ＭＥＶ又はＤＸＰ経路の酵素をコードする染色体組込み異種核酸配列を含むイソプレノイド化合物を作ることができる複数の宿主細胞を得る工程；
（ｂ）前記宿主細胞が炭素源としてエタノールを用いてイソプレノイド化合物を作る条件下で培地において前記宿主細胞を培養する工程；及び
（ｃ）前記培地からイソプレノイド化合物を回収すること
を含む、前記方法。
【請求項２】
前記宿主細胞によって炭素源として消費されるエタノールが、その宿主細胞によって作られたものである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記宿主細胞によって炭素源として消費されるエタノールが、前記培地に外因的に供給される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記培地が、少なくとも４時間、リットル当たり約１グラムである又はそれより多いエタノールの濃度でエタノールを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記宿主細胞が、１日につき乾燥細胞重量のグラム当たり約０．２グラムと約５グラムの間である又はそれより多いエタノール消費速度を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記宿主細胞が、イソプレノイド化合物を作っている間、酸素制限されない、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記培養条件が、１時間につき乾燥細胞重量のグラム当たり１０ｍｍｏｌ未満の酸素という比酸素摂取速度の期間を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記培養条件が、前記宿主細胞がリン酸塩制限される期間を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記宿主細胞が、原核細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記宿主細胞が、大腸菌（E.coli）である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記宿主細胞が、真核細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記宿主細胞が、真菌である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記宿主細胞が、Ｓ．セレビジエ（S. cerevisiae）である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記イソプレノイド化合物が、培地のリットル当たり約１０グラムより多い量で生産される、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記イソプレノイド化合物が、乾燥細胞重量のグラム当たり約５０ミリグラムより多い量で生産される、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記イソプレノイド化合物の量が、約７２時間未満の間に生産される、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記イソプレノイド化合物の量が、約４８時間未満の間に生産される、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記イソプレノイド化合物の量が、約２４時間未満の間に生産される、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記イソプレノイドが、ヘミテルペン、モノテルペン、ジテルペン、トリテルペン、テトラテルペン及びポリテルペンから成る群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記イソプレノイドが、Ｃ５−Ｃ２０イソプレノイドである、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記イソプレノイドが、アビエタジエン、アモルファジエン、カレン、α−ファルネセン、β−ファルネセン、ファルネソール、ゲラニオール、ゲラニルゲラニオール、イソプレン、リナロオール、リモネン、ミルセン、ネロリドール、オシメン、パチュロール、β−ピネン、サビネン、γ−テルピネン、テルピノレン及びバレンセンから成る群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
Ｃ５−Ｃ２０イソプレノイド化合物を作るための方法であって、
（ａ）イソプレノイド化合物を作ることができる複数の宿主細胞を得る工程；
（ｂ）少なくとも４時間、培地のリットル当たり約１グラムである又はそれより多い量でエタノールを含む培地において、前記宿主細胞を培養する工程；
（ｃ）培地のリットル当たり少なくとも５グラムのイソプレノイド化合物を回収する工程
を含む、前記方法。
【請求項２３】
前記培地が、培地のリットル当たり約１グラムと約５グラムの間のエタノールを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
前記培地が、培地のリットル当たり約１グラムと約２０グラムの間のエタノールを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
前記培地が、培地のリットル当たり約２０グラムより多い量のエタノールを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２６】
前記宿主細胞が、酵母細胞である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
前記培地中のエタノールの少なくとも一部分が、前記宿主細胞によって作られたものである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２８】
Ｃ５−Ｃ２０イソプレノイド化合物を作るための方法であって、
（ａ）イソプレノイド化合物を作ることができる複数の宿主細胞を得る工程；
（ｂ）炭素源のボーラスを培地に供給することによって、酵母細胞を培養してバイオマスを作る工程；
（ｃ）前記酵母細胞が、１時間につき乾燥細胞重量のグラム当たり約０．０１グラムである又はそれより多いエタノール消費速度を有する条件下で細胞を維持する工程；及び
（ｄ）培地のリットル当たり少なくとも５グラムのイソプレノイド化合物を回収する工程
を含む、前記方法。
【請求項２９】
消費されるエタノールの少なくとも一部分が、前記宿主細胞によって作られたものである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記エタノール消費速度が、１時間につき乾燥細胞重量のグラム当たり約０．０１グラムと約０．２０グラムの間のエタノールである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記エタノール消費速度が、１時間につき乾燥細胞重量のグラム当たり約０．１グラムより多いエタノールである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
前記炭素源が、炭水化物である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３３】
前記炭素源が、炭水化物とエタノールの混合物である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３４】
前記炭素源が、エタノールである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３５】
前記細胞が維持される条件が、少なくとも４時間、酸素制限を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３６】
前記細胞が維持される条件が、少なくとも４時間、リン酸塩制限を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３７】
前記宿主細胞が、酵母細胞である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３８】
前記宿主細胞が、Ｓ．セレビジエ（S.cerevisiae）である、請求項２８に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４−１】
【図４−２】
【図５】
【図６】
【図７−１】
【図７−２】
【図８】
【図９−１】
【図９−２】
【図９−３】
【図９−４】
【図９−５】
【図１０−１】
【図１０−２】
【図１０−３】
【図１０−４】
【図１０−５】
【図１０−６】
【図１０−７】
【図１１】
【図１２−１】
【図１２−２】
【図１２−３】
【図１３−１】
【図１３−２】
【図１４】
【図１５】
【図２】
【図３】
【図４−１】
【図４−２】
【図５】
【図６】
【図７−１】
【図７−２】
【図８】
【図９−１】
【図９−２】
【図９−３】
【図９−４】
【図９−５】
【図１０−１】
【図１０−２】
【図１０−３】
【図１０−４】
【図１０−５】
【図１０−６】
【図１０−７】
【図１１】
【図１２−１】
【図１２−２】
【図１２−３】
【図１３−１】
【図１３−２】
【図１４】
【図１５】
【公表番号】特表２０１０−５３９９０２（Ｐ２０１０−５３９９０２Ａ）
【公表日】平成２２年１２月２４日（２０１０．１２．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５２５８３３（Ｐ２０１０−５２５８３３）
【出願日】平成２０年９月１９日（２００８．９．１９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０１０８８６
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０４２０７０
【国際公開日】平成２１年４月２日（２００９．４．２）
【出願人】（５１００７９００８）アミリス バイオテクノロジーズ，インコーポレイティド (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年１２月２４日（２０１０．１２．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年９月１９日（２００８．９．１９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０１０８８６
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０４２０７０
【国際公開日】平成２１年４月２日（２００９．４．２）
【出願人】（５１００７９００８）アミリス バイオテクノロジーズ，インコーポレイティド (1)
【Ｆターム（参考）】
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