イネニコチアナミンシンターゼ遺伝子プロモーター、およびその利用
イネの根から、根で特異的に発現をするニコチアナミンシンターゼ遺伝子の５’上流域を単離し、この上流域のＤＮＡを解析し、鋭意検討を重ねた結果、根特異的に遺伝子の発現を制御するプロモーター機能を有するＤＮＡ配列を特定することに成功した。本発明のプロモーターを用いることにより、外来遺伝子を根特異的に発現させることが可能である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
本願発明は、植物に外来遺伝子を導入して根で特異的に発現させるプロモーターに関する。さらに詳しくは、イネのニコチアナミンシンターゼ１遺伝子（ＮＡＳ１）及びイネのニコチアナミンシンターゼ２遺伝子（ＮＡＳ２）のプロモーター領域、もしくはその一部を用いて根で特異的に外来遺伝子を発現させる方法に関する。
【背景技術】
根は植物を支える役割のほかに、水や養分などの吸収と輸送、植物ホルモンの合成、あるいは養分を蓄積する役割などを担っている。また、根は線虫や病原菌からの被害や、冠水、乾燥、栄養欠乏、栄養過剰などのストレスを受ける部位でもある。
このため植物の根において適切な遺伝子を発現させることで、線虫抵抗性、耐病性、耐冠水、耐乾燥の植物、あるいは特定の栄養素が欠乏した土壌、過剰な土壌などでも生育可能な植物を作出できる可能性がある。また、カドミウムなどの有害物質を効率的に吸収できる植物を作出することで、土壌浄化に利用することも出来る。あるいは、根菜類の栄養改変や、医薬品や生分解性プラスチックなどの原料の生産など、根において外来遺伝子を発現させることによる応用範囲は広く、有用性は高い。
一般に、植物ではその活性が強いことから、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモーターがよく利用されており、実際、除草剤耐性植物やウイルス抵抗性植物の作出に用いられている。
しかしながら、３５Ｓプロモーターは、強力であるが組織特異性がなく、必ずしも最適な形質転換植物の作出に適しているとは限らない。例えば、不必要な部位での発現によって成長異常などをきたしたり、発現強度が高すぎることによってジーンサイレンシング等の好ましくない形質が現れたりすることがある。また、組換え作物の作出に際しては、必要のない形質を持ち込まないことが望まれており、目的遺伝子を必要な組織以外においても発現させてしまうプロモーターでは植物体への適用に際する用途が大きく制限されたものとなる。
このような問題の解決手段として、特定の組織、とりわけ根組織に特異的に目的の遺伝子を制御するプロモーターを用いることが望ましい。植物の主に根で発現するとされている遺伝子はいくつか知られているが（非特許文献１〜１３、２４〜２８参照）、植物の根で特異的に遺伝子発現を制御するプロモーターは従来技術においてはまだ種類が少なく（特許文献１〜３および非特許文献１４〜１６、２９、３０参照）、しかもその特異性は低いのが現状である。
また、ニコチアナミンシンターゼ遺伝子はイネで、ＮＡＳ１，２，３がとられており、他にも、大麦、トマト、シロイヌナズナなどの植物から単離されている（非特許文献１７〜２１参照）。ニコチアナミンシンターゼ遺伝子は、鉄のキレート剤となるムギネ酸の生合成経路で重要な酵素であるニコチアナミンシンターゼをコードしている。
ニコチアナミンシンターゼ遺伝子の発現部位についてはいくつか調べられており、たとえば、オオムギのＮＡＳ１は鉄欠乏にした大麦の根で発現をしており、葉や、鉄欠乏でない植物体の根では発現していないことがノザンハイブリダイゼーションによって解析されている（非特許文献４参照）。また、イネのＮＡＳ１は鉄欠乏にした植物体の根や黄化葉で強く発現しており、鉄欠乏でない植物体の根でも弱く発現していることがノザンハイブリダイゼーションによって確かめられている（非特許文献１８参照）。
ニコチアナミンシンターゼ遺伝子のプロモーター解析については、オオムギのＮＡＳ１プロモーター領域のデリーションシリーズをＧＵＳにつないで、タバコに形質転換した実験が行われている。この場合ＧＵＳは葉では低レベルに恒常的に発現しており、根では鉄欠乏にすると強い発現が見られることがわかった（非特許文献２２参照）。また、シロイヌナズナのＮＡＳ３プロモーター領域のデリーションシリーズをＧＵＳにつないで、タバコの培養細胞に一過的に導入した実験では、エチレン応答性領域の存在が示されている（非特許文献２３参照）。
しかし現在までのところ、イネのニコチアナミンシンターゼ２遺伝子に関しては、その発現パターンやプロモーター解析に関する知見は知られていない。
一般的に、同じ遺伝子ファミリーに属する遺伝子（例えば、ＮＡＳ（ニコチアナミンシンターゼ）遺伝子ファミリーに属するＮＡＳ１とＮＡＳ２とＮＡＳ３など）であっても、それぞれが異なる発現パターンを示すことが多い。また、同じ遺伝子ファミリーに属する、異なる植物種由来の遺伝子同士（例えば、シロイヌナズナのＮＡＳ１とイネのＮＡＳ１とオオムギのＮＡＳ１など）は、それぞれが異なる発現パターンを示すことが多い。つまり当業者であっても、他の植物種のＮＡＳファミリーのプロモーター解析から、イネのＮＡＳ２のプロモーターの性質を推測することは、通常困難と言える。
また、非特許文献１によると、イネのＲＣｃ２遺伝子はノザン解析によって根に特異的発現をすることがわかったが、ＲＣｃ２遺伝子の上流域をプロモーターとして使用した場合は、外来遺伝子を根の分裂域以外、および葉の維管束で発現させることがわかった。この例のように、ノザン解析などで、根特異的発現をする遺伝子を取得しても、外来遺伝子根特異的に発現させるプロモーター部位を取得するのは当業者であっても容易ではない。
【特許文献１】米国特許出願公開第２００１／００１６９５４号明細書
【特許文献２】米国特許第６２７１４３７号明細書
【特許文献３】特開２００２−１４２７６６号公報
【非特許文献１】Ｘｕ，Ｙ．，Ｂｕｃｈｈｏｌｚ，Ｗ．Ｇ．，ＤｅＲｏｓｅ，Ｒ．Ｔ．，およびＨａｌｌ，Ｔ．Ｃ．著、「Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｒｉｃｅ ｇｅｎｅ ｆａｍｉｌｙ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｒｏｏｔ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、Ｖｏｌ．２７、ｐ．２３７−２４８、１９９５年
【非特許文献２】Ｙａｍａｇｕｃｈｉ，Ｉ．Ｊ．，およびＦｕｔｓｕｈａｒａ，Ｙ．著、「Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＧＡＳＲ１，ａ ｒｏｏｔ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＧＡＳＴ１−ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｒｉｃｅ」、Ｒｉｃｅ Ｇｅｎｅｔ．Ｎｅｗｓ１．、Ｖｏｌ．１４、ｐ．１５０−１５２、１９９７年
【非特許文献３】Ｔｓａｙ，Ｙ．Ｆ．，Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ，Ｊ．Ｉ．，Ｆｅｌｄｍａｎｎ，Ｋ．Ａ．，およびＣｒａｗｆｏｒｄ，Ｎ．Ｍ．著、「Ｔｈｅ ｈｅｒｂｉｃｉｄｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｇｅｎｅ ＣＨＬ１ ｏｆ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｅｎｃｏｄｅｓ ａ ｎｉｔｒａｔｅ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｎｉｔｒａｔｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ」、Ｃｅｌｌ、Ｖｏｌ．７２、ｐ．７０５−７１３、１９９３年
【非特許文献４】Ｊｏｈｎ，Ｉ．，Ｈｅｌｄ，Ｂ．Ｍ．，Ｗｕｒｔｅｌｅ，Ｅ．Ｓ．，およびＣｏｌｂｅｒｔ，Ｊ．Ｔ．著、「Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｏｏｔ−ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｃＤＮＡ ｃｌｏｎｅｓ ｆｒｏｍ Ｚｅａ ｍａｙｓ．」、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１５Ａ、ｐ．１３３、１９９１年
【非特許文献５】Ｊｏｈｎ，Ｉ．，Ｗａｎｇ，Ｈ．，Ｈｅｌｄ，Ｂ．Ｍ．，Ｗｕｒｔｅｌｅ，Ｅ．Ｓ．，およびＣｏｌｂｅｒｔ，Ｊ．Ｔ．著、「Ａｎ ｍＲＮＡ ｔｈａｔ ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ ａｃｃｕｍｕｌａｔｅｓ ｉｎ ｍａｉｚｅ ｒｏｏｔｓ ｄｅｌｉｎｅａｔｅｓ ａ ｎｏｖｅｌ ｓｕｂｓｅｔ ｏｆ ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ ｃｏｒｔｉｃａｌ ｃｅｌｌｓ」、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、Ｖｏｌ．２０、ｐ．８２１−８３１、１９９２年
【非特許文献６】Ｈｅｌｄ Ｂ．Ｍ．，Ｗａｎｇ Ｈ．，Ｊｏｈｎ Ｉ．，Ｗｕｒｔｅｌｅ Ｅ．Ｓ．，Ｃｏｌｂｅｒｔ Ｊ．Ｔ．著、「Ａｎ ｍＲＮＡ ｐｕｔａｔｉｖｅｌｙ ｃｏｄｉｎｇ ｆｏｒ ａｎ Ｏ−ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ａｃｃｕｍｕｌａｔｅｓ ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｉｎ ｍａｉｚｅ ｒｏｏｔｓ ａｎｄ ｉｓ ｌｏｃａｔｅｄ ｐｒｅｄｏｍｉｎａｎｔｌｙ ｉｎ ｔｈｅ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｅｎｄｏｄｅｒｍｉｓ．」、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．、Ｖｏｌ．１０２、ｐ．１００１−１００８、１９９３年
【非特許文献７】Ｃｏｎｋｌｉｎｇ，Ｍ．Ａ．，Ｃｈｅｎｇ，Ｃ．Ｌ．，Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｙ．Ｔ．，およびＧｏｏｄｍａｎ，Ｈ．Ｍ．著、「Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｌｙ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｒｏｏｔ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｇｅｎｅｓ ｆｒｏｍ ｔｏｂａｃｃｏ」、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．、Ｖｏｌ．９３、ｐ．１２０３−１２１１、１９９０年
【非特許文献８】Ｌｅｒｎｅｒ，Ｄ．Ｒ．およびＲａｉｋｈｅｌ，Ｎ．Ｖ．著、「Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｏｏｔ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｂａｒｌｅｙ Ｌｅｃｔｉｎ」、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．、Ｖｏｌ．９１、ｐ．１２４−１２９、１９８９年
【非特許文献９】Ｅｖａｎｓ，Ｌ．Ｍ．，Ｓｗｉｎｈｏｅ，Ｒ．，Ｇａｔｅｈｏｕｓｅ，Ｊ．Ａ．，およびＢｏｕｌｔｅｒ，Ｄ．著、「Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ｒｏｏｔ ｍＲＮＡ ｓｐｅｃｉｅｓ ｉｎ ｏｔｈｅｒ ｖｅｇｅｔａｔｉｖｅ ｏｒｇａｎｓ ｏｆ ｐｅａ（Ｐｉｓｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ Ｌ．）」、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．、Ｖｏｌ．２１４、ｐ．１５３−１５７、１９８８年
【非特許文献１０】Ｙａｚａｋｉ，Ｋ．，Ｍａｔｓｕｏｋａ，Ｈ．，Ｓｈｉｎｏｍｕｒａ，Ｋ．，Ｂｅｃｈｔｈｏｌｄ，Ａ．およびＳａｔｏ，Ｆ．著、「Ａ Ｎｏｖｅｌ Ｄａｒｋ−Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ，ＬｅＤＩ−２，ａｎｄ Ｉｔｓ Ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ ｉｎ Ｒｏｏｔ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｉｎ Ｌｉｔｈｏｓｐｅｒｍｕｍ ｅｒｙｔｈｏｒｏｒｈｉｚｏｎ」、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．、Ｖｏｌ．１２５、ｐ．１８３１−１８４１、２００１年
【非特許文献１１】Ｂｅｌｏｕｃｈｉ，Ａ．，Ｃｅｌｌｉｅｒ，Ｍ．，Ｋｗａｎ，Ｔ．，Ｓａｉｎｉ，Ｈ．Ｓ．，Ｌｅｒｏｕｘ，Ｇ．，およびＧｒｏｓ，Ｐ．著、「Ｔｈｅ ｍａｃｒｏｐｈａｒｇｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｎｒａｍｐ ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ ｎａｔｕｒａｌ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ｍｉｃｅ ｈａｓ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｒｏｏｔ ｓｙｓｔｅｍ ｏｆ ｐｌａｎｔ」、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、Ｖｏｌ．２９、ｐ．１１８１−１１９６、１９９５年
【非特許文献１２】Ｌｕｓｃｈｎｉｇ，Ｃ．，Ｇａｘｉｏｌａ，Ｒ．Ａ．，Ｇｒｉｓａｆｉ，Ｐ．，およびＧｅｒａｌｄ，Ｒ．Ｆ．著、「ＥＩＲ１，ａ ｒｏｏｔ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ａｕｘｉｎ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ，ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｇｒａｖｉｔｒｏｐｉｓｍ ｉｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ」、Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖ．、Ｖｏｌ．１２、ｐ．２１７５−２１８７、１９９８年
【非特許文献１３】ｄｅ Ｐａｔｅｒ，Ｂ．Ｓ．およびＳｃｈｉｌｐｅｒｏｏｒｔ，Ｒ．Ａ．著、「Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｒｏｏｔ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｒｉｃｅ ｇｅｎｅ」、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、Ｖｏｌ．１８、ｐ．１６１−１６４、１９９２年
【非特許文献１４】Ｔａｙｌｏｒ，Ｂ．Ｈ．およびＳｃｈｅｕｒｉｎｇ，Ｃ．Ｆ．著、「Ａ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍａｒｋｅｒ ｆｏｒ ｌａｔｅｒａｌ ｒｏｏｔ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ：Ｔｈｅ ＲＳＩ−１ ｇｅｎｅ ｏｆ ｔｏｍａｔｏ（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ Ｍｉｌｌ）ｉｓ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｉｎ ｅａｒｌｙ ｒｏｏｔ ｐｒｉｍｏｒｄｉａｌ」、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．、Ｖｏｌ．２４３、ｐ．１４８−１４７、１９９４年
【非特許文献１５】Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｙ．Ｔ．，Ｔａｙｌｏｒ，Ｃ．Ｇ．，Ａｃｅｄｏ，Ｇ．Ｎ．，Ｃｈｅｎｇ，Ｃ．Ｌ．，およびＣｏｎｋｌｉｎｇ，Ｍ．Ａ．著、「Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｉｓ−ａｃｔｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ ｒｏｏｔ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｔｏｂａｃｃｏ」、Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ、Ｖｏｌ．３、ｐ．３７１−３８２、１９９１年
【非特許文献１６】Ｃｈｏ，Ｈ．−Ｔ．およびＣｏｓｇｒｏｖｅ，Ｄ．Ｊ．著、「Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｏｏｔ Ｈａｉｒ Ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｅｘｐａｎｓｉｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ」、Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ、Ｖｏｌ．１４、ｐ．３２３７−３２５３、２００２年
【非特許文献１７】Ｈｉｇｕｃｈｉ，Ｋ．，Ｓｕｚｕｋｉ Ｋ．，Ｎａｋａｎｉｓｈｉ Ｈ．，Ｙａｍａｇｕｃｈｉ Ｈ．，Ｎｉｓｈｉｚａｗａ，Ｎ．Ｋ．およびＭｏｒｉ，Ｓ．著、「Ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ Ｎｉｃｏｔｉａｎａｍｉｎｅ Ｓｙｎｔｈａｓｅ Ｇｅｎｅｓ，Ｎｏｖｅｌ Ｇｅｎｅｓ Ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｔｈｅ Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｐｈｙｔｏｓｉｄｅｒｏｐｈｏｒｅｓ」、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．、Ｖｏｌ．１１９、ｐ．４７１−４７９、１９９９年
【非特許文献１８】Ｈｉｇｕｃｈｉ，Ｋ．，Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｓ．，Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｍ．，Ｋａｗａｓａｋｉ，Ｓ．，Ｎａｋａｎｉｓｈｉ Ｈ．，Ｎｉｓｈｉｚａｗａ，Ｎ．Ｋ．およびＭｏｒｉ，Ｓ．著、「Ｎｉｃｏｔｉａｎａｍｉｎｅ Ｓｙｎｔｈａｓｅ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｄｉｆｆｅｒｓ ｉｎ Ｂａｒｌｅｙ ａｎｄ Ｒｉｃｅ ｕｎｄｅｒ Ｆｅ−Ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ」、Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ、Ｖｏｌ．２５（２）、ｐ．１５９−１６７、２００１年
【非特許文献１９】Ｈｅｒｂｉｋ Ａ，Ｋｏｃｈ Ｇ，Ｍｏｃｋ ＨＰ，Ｄｕｓｈｋｏｖ Ｄ，Ｃｚｉｈａｌ Ａ，Ｔｈｉｅｌｍａｎｎ Ｊ，Ｓｔｅｐｈａｎ ＵＷ，Ｂａｕｍｌｅｉｎ Ｈ．著、「Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃＤＮＡ ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ｎｉｃｏｔｉａｎａｍｉｎｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｆｒｏｍ ｂａｒｌｅｙ．Ａ ｋｅｙ ｅｎｚｙｍｅ ｆｏｒ ｉｒｏｎ ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ ｉｎ ｐｌａｎｔｓ．」、Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｖｏｌ．２６５、ｐ．２３１−２３９、１９９９年
【非特許文献２０】Ｌｉｎｇ ＨＱ，Ｋｏｃｈ Ｇ，Ｂａｕｍｌｅｉｎ Ｈ，Ｇａｎａｌ ＭＷ．著、「Ｍａｐ−ｂａｓｅｄ ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ｃｈｌｏｒｏｎｅｒｖａ，ａ ｇｅｎｅ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｉｒｏｎ ｕｐｔａｋｅ ｏｆ ｈｉｇｈｅｒ ｐｌａｎｔｓ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｎｉｃｏｔｉａｎａｍｉｎｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ，」、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、Ｖｏｌ．９６、ｐ．７０９８−７１０３、１９９９年
【非特許文献２１】Ｓｕｚｕｋｉ Ｋ．，Ｈｉｇｕｃｈｉ，Ｋ．，Ｎａｋａｎｉｓｈｉ Ｈ．，Ｎｉｓｈｉｚａｗａ，Ｎ．Ｋ．およびＭｏｒｉ，Ｓ．著、「Ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ｎｉｃｏｔｉａｎａｍｉｎｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｇｅｎｅｓ ｆｒｏｍ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ．」、Ｓｏｉｌ Ｓｃｉ．Ｐｌａｎｔ Ｎｕｔｒ．、Ｖｏｌ．４５、ｐ．９９３−１００２、１９９９年
【非特許文献２２】Ｈｉｇｕｃｈｉ，Ｋ．，Ｔａｎｉ，Ｍ．，Ｎａｋａｎｉｓｈｉ Ｈ．，Ｙｏｓｈｉｗａｒａ，Ｔ．，Ｇｏｔｏ，Ｆ．，Ｎｉｓｈｉｚａｗａ，Ｎ．Ｋ．およびＭｏｒｉ，Ｓ．著、「Ｔｈｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａ Ｂａｒｌｅｙ ＨｖＮＡＳ１ Ｎｉｃｏｔｉａｎａｍｉｎｅ Ｓｙｎｔｈａｓｅ Ｇｅｎｅ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ−ｇｕｓ Ｆｕｓｉｏｎ Ｇｅｎｅ ｉｎ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｔｏｂａｃｃｏ ｉｓ Ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｆｅ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｉｎ Ｒｏｏｔｓ．」、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、Ｖｏｌ．６５（７）、ｐ．１６９２−１６９６、２００１年
【非特許文献２３】Ｓｕｚｕｋｉ Ｋ．，Ｎａｋａｎｉｓｈｉ Ｈ．，Ｎｉｓｈｉｚａｗａ，Ｎ．Ｋ．およびＭｏｒｉ，Ｓ．著、「Ａｎａｌｙａｓｉｓ ｏｆ Ｕｐｓｔｒｅａｍ Ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ Ｎｉｃｏｔｉａｎａｍｉｎｅ Ｓｙｎｔｈａｓｅ Ｇｅｎｅ ｆｒｏｍ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ：Ｐｒｅｓｅｎｃｅ ｏｆ Ｐｕｔａｔｉｖｅ ＥＲＥ−ｌｉｋｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ」、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｖｏｌ．６５（１２）、ｐ．２７９４−２７９７、２００１年
【非特許文献２４】Ｃｈｏｉ，Ｄ．Ｗ．，Ｓｏｎｇ，Ｊ．Ｙ．，Ｋｗｏｎ，Ｙ．Ｍ．およびＫｉｍ，Ｓ．Ｇ．著、「Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｃＤＮＡ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ａ ｐｒｏｌｉｎｅ−ｒｉｃｈ １４ｋＤａ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ ｃｏｒｔｉｃａｌ ｃｅｌｌｓ ｏｆ ｔｈｅ ｒｏｏｔｓ ｏｆ ｂｅａｎ（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ）ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ」、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、Ｖｏｌ．３０、Ｎｏ．５、ｐ．９７３−９８２、１９９６年
【非特許文献２５】Ｈｅｌｄ，Ｂ．Ｍ．，Ｊｏｈｎ，Ｉ，Ｗａｎｇ，Ｈ．，Ｍｏｒａｇｏｄａ，Ｌ．，Ｔｉｒｉｍａｎｎｅ，Ｔ．Ｓ．，Ｗｕｒｔｅｌｅ，Ｅ．Ｓ．およびＣｏｌｂｅｒｔ Ｊ．Ｔ．著、「Ｚｒｐ２：ａ ｎｏｖｅｌ ｍａｉｚｅ ｇｅｎｅ ｗｈｏｓｅ ｍＲＮＡ ａｃｃｕｍｕｌａｔｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｒｏｏｔ ｃｏｒｔｅｘ ａｎｄ ｍａｔｕｒｅ ｓｔｅｍｓ．」、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、Ｖｏｌ．３５、Ｎｏ．３、ｐ．３６７−７５、１９９７年
【非特許文献２６】Ｂｏｇｕｓｚ，Ｄ．，Ａｐｐｌｅｂｙ，Ｃ．Ａ．，Ｌａｎｄｓｍａｎｎ，Ｊ．，Ｄｅｎｎｉｓ，Ｅ．Ｓ．，Ｔｒｉｎｉｃｋ，Ｍ．Ｊ．およびＰｅａｃｏｃｋ，Ｗ．Ｊ．著、「Ｆｕｎｃｔｉｏｎｉｎｇ ｈａｅｍｏｇｌｏｂｉｎ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｎｏｎ−ｎｏｄｕｌａｔｉｎｇ ｐｌａｎｔｓ」、Ｎａｔｕｒｅ、Ｖｏｌ．３３１、Ｖｏｌ．６１５２、ｐ．１７８−８０、１９８８年
【非特許文献２７】Ｍｏｎｔｏｌｉｕ，Ｌ．，Ｒｉｇａｕ，Ｊ．およびＰｕｉｇｄｏｍｅｎｅｃｈ，Ｐ．著、「Ａ ｔａｎｄｅｍ ｏｆ ａｌｐｈａ−ｔｕｂｕｌｉｎ ｇｅｎｅｓ ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ｒａｄｉｃｕｌａｒ ｔｉｓｓｕｅｓ ｆｒｏｍ Ｚｅａ ｍａｙｓ」、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、Ｖｏｌ．１４、Ｎｏ．１、ｐ．１−１５、１９８９年
【非特許文献２８】Ｍｏｎｔｏｌｉｕ，Ｌ．，Ｐｕｉｇｄｏｍｅｎｅｃｈ，Ｐ．ａｎｄおよびＲｉｇａｕ，Ｊ．著、「Ｔｈｅ Ｔｕｂ ａｌｐｈａ ３ ｇｅｎｅ ｆｒｏｍ Ｚｅａ ｍａｙｓ：ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｄｉｖｉｄｉｎｇ ｐｌａｎｔ ｔｉｓｓｕｅｓ」、Ｇｅｎｅ、Ｖｏｌ．９４、Ｎｏ．２、ｐ．２０１−２０７、１９９０年
【非特許文献２９】Ｍｉａｏ，Ｇ．Ｈ．，Ｈｉｒｅｌ，Ｂ．，Ｍａｒｓｏｌｉｅｒ，Ｍ．Ｃ．，Ｒｉｄｇｅ，Ｒ．Ｗ．およびＶｅｒｍａ，Ｄ．Ｐ．著、「Ａｍｍｏｎｉａ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａ ｓｏｙｂｅａｎ ｇｅｎｅ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ ｇｌｕｔａｍｉｎｅ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ ｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｌｏｔｕｓ ｃｏｒｎｉｃｕｌａｔｕｓ」、Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ、Ｖｏｌ．３、Ｎｏ．１、ｐ．１１−２２、１９９１年
【非特許文献３０】Ｂｏｇｕｓｚ，Ｄ．，Ｌｌｅｗｅｌｌｙｎ，Ｄ．，Ｃｒａｉｇ，Ｓ．，Ｄｅｎｎｉｓ，Ｅ．Ｓ．，Ａｐｐｌｅｂｙ，Ｃ．Ａ．およびＰｅａｃｏｃｋ，Ｗ．Ｊ．著、「Ｎｏｎｌｅｇｕｍｅ ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ ｇｅｎｅｓ ｒｅｔａｉｎ ｏｒｇ ａｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｐｌａｎｔｓ．」、Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ、Ｖｏｌ．２、ｐ．６３３−６４１、１９９０年
【発明の開示】
本発明の目的は、植物の根で特異的に遺伝子の発現を制御するのに有用なプロモーター、該プロモーターを含有する発現ベクター、該発現ベクターを含む形質転換植物もしくは植物体、およびその作製方法を提供することにある。
本発明者らはイネの根から、根で特異的に発現をするニコチアナミンシンターゼ１（ｎｉｃｏｔｉａｎａｍｉｎｅ ｓｙｎｔａｓｅ １；ＮＡＳ１）遺伝子、及びニコチアナミンシンターゼ２（ｎｉｃｏｔｉａｎａｍｉｎｅ ｓｙｎｔａｓｅ ２；ＮＡＳ２）遺伝子の５’上流域を単離し、この上流域のＤＮＡを解析し、鋭意検討を重ねた結果、ニコチアナミンシンターゼ１遺伝子、及びニコチアナミンシンターゼ２遺伝子のプロモーター機能を有するＤＮＡ配列を特定することに成功し、本発明を完成するに至った。本発明者らによって単離されたプロモーターを利用することによって、実際に外来遺伝子を根特異的に発現させることが可能である。
すなわち、本発明は、以下の〔１〕〜〔１５〕に関する。
〔１〕 下記の（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のＤＮＡを含むプロモーター。
（ａ）配列番号：１または３に記載の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列番号：１または３に記載の塩基配列において１もしくは複数の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなり、かつプロモーター機能を有するＤＮＡ
（ｃ）配列番号：１または３に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下にハイブリダイズし、かつプロモーター機能を有するＤＮＡ
本発明は、より詳しくは、以下に関する。
〔１ｂ〕上記（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のＤＮＡを含む、プロモーターとして使用するためのＤＮＡ、または
〔１ｃ〕上記（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のＤＮＡのプロモーターとしての使用。
〔２〕 〔１〕に記載のプロモーターの下流に、外来遺伝子および植物ターミネーターが機能的に連結した構造を有するＤＮＡ。
〔３〕 〔１〕に記載のプロモーターを含むベクター。
〔４〕 〔１〕に記載のプロモーターの下流に外来遺伝子挿入部位および植物ターミネーターを含む、〔３〕記載のベクター。
〔５〕 〔２〕に記載のＤＮＡを含むベクター。
〔６〕 〔１〕に記載のプロモーター、〔２〕に記載のＤＮＡ、または〔３〕〜〔５〕のいずれかに記載のベクターを含む、形質転換細胞。
〔７〕 微生物である、〔６〕に記載の形質転換細胞。
〔８〕 植物細胞である、〔６〕に記載の形質転換細胞。
〔９〕 〔８〕に記載の細胞を含む、形質転換植物体。
〔１０〕 〔９〕に記載の形質転換植物体の子孫またはクローンである、形質転換植物体。
〔１１〕 〔９〕または〔１０〕に記載の形質転換植物体の繁殖材料。
〔１２〕 〔９〕または〔１０〕に記載の形質転換植物体の作製方法であって、
〔１〕に記載のプロモーター、〔２〕に記載のＤＮＡ、または〔３〕〜〔５〕のいずれかに記載のベクターを植物細胞へ導入し、該植物細胞から植物体を再生させる工程を含む方法。
〔１３〕 植物の根において外来遺伝子を発現させる方法であって、〔２〕に記載のＤＮＡ、または〔４〕もしくは〔５〕に記載のベクターを該植物の細胞へ導入する工程を含む方法。
〔１４〕 被験化合物について、〔１〕に記載のＤＮＡのプロモーター活性を調節するか否かを評価する方法であって、
（ａ）〔１〕に記載のＤＮＡとレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するＤＮＡを含む細胞または細胞抽出液と、被験化合物を接触させる工程、
（ｂ）該レポーター遺伝子の発現レベルを測定する工程、
を含み、被験化合物が該レポーター遺伝子の発現レベルを変化させた場合に、被験化合物が〔１〕に記載のＤＮＡのプロモーター活性を調節すると判定される方法。
〔１５〕 以下の工程（ａ）および（ｂ）を含む、〔１〕に記載のＤＮＡのプロモーター活性を調節する化合物のスクリーニング方法。
（ａ）〔１４〕に記載の評価方法により、被験化合物について、〔１〕に記載のＤＮＡのプロモーター活性を調節するか否かを評価する工程
（ｂ）被験化合物から、該ＤＮＡのプロモーター活性を調節すると評価された化合物を選択する工程
以下、本発明を詳細に説明する。本発明者らは、イネの様々な部位からそれぞれｃＤＮＡライブラリーを作成した。根から作成したｃＤＮＡライブラリーから３３３４個のクローンを単離、根以外の組織から作成したｃＤＮＡライブラリーからは８８７５個のクローンを単離して塩基配列を決定した。
根由来のライブラリーに９回出現し、根以外の組織由来のライブラリーには一度も出現しなかったクローンを選択し、ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬデータベースを元にＢＬＡＳＴプログラムを用いて塩基配列のホモロジー検索を行ったところ、このクローンがニコチアナミンシンターゼ２遺伝子に由来していることが判明した。同様に根由来のライブラリーに２回出現し、根以外の組織由来のライブラリーには一度も出現しなかったクローンはニコチアナミンシンターゼ１遺伝子に由来していることが判明した。ニコチアナミンシンターゼ１遺伝子、及びニコチアナミンシンターゼ２遺伝子の５’上流域を単離し、上流側から段階的に欠損させた断片とＧＦＰ遺伝子を連結させたキメラ遺伝子構築物をイネ、およびシロイヌナズナ植物体に導入することで、ニコチアナミンシンターゼ１遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＢ０４６４０１）及びニコチアナミンシンターゼ２遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＢ０４６４０１）からプロモーター領域を単離することに成功したものである。
本発明はまず、ニコチアナミンシンターゼ１遺伝子プロモーター、及びニコチアナミンシンターゼ２遺伝子プロモーター（ＤＮＡ）を提供する。本発明のプロモーターは、下流の遺伝子を根特異的に発現させることが可能であり、極めて有用である。本発明者らによって単離されたニコチアナミンシンターゼ１遺伝子プロモーターＤＮＡの塩基配列を配列番号：３に、ニコチアナミンシンターゼ２遺伝子プロモーターＤＮＡの塩基配列を配列番号：１に示す。
本発明は、より具体的には、下記の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのＤＮＡを含むプロモーター（プロモーター活性を有するＤＮＡ）を提供する。
（ａ）配列番号：１または３で示される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列番号：１または３で示される塩基配列において１もしくは複数の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなり、かつプロモーター機能（活性）を有するＤＮＡ
（ｃ）配列番号：１または３で示される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下にハイブリダイズし、かつプロモーター機能（活性）を有するＤＮＡ
本発明の「プロモーター」とは、ＤＮＡを鋳型としたｍＲＮＡの合成（転写）の開始に必要な特定塩基配列を含むＤＮＡを意味し、自然界に存在するＤＮＡの他、組換えなどの人工的な改変操作により作成されたＤＮＡを含む。また、本発明のプロモーターは、植物細胞において発現誘導型プロモーターであることが好ましい。
本発明者らは、本発明のプロモーターを得るために、イネのニコチアナミンシンターゼ１遺伝子の上流に存在するゲノム配列から、配列番号：３に示す１１９１ｂｐの配列を含む断片を、イネのニコチアナミンシンターゼ２遺伝子の上流に存在するゲノム配列から、配列番号：２に示す２１２３ｂｐの配列を含む断片をＰＣＲにより取得した。この断片の下流に、植物体において遺伝子発現を容易にモニターすることが可能なレポーター遺伝子として、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子を連結したキメラ遺伝子構築物を作成し、アグロバクテリウムを介してイネ、およびシロイヌナズナの植物体へ導入したところ、ＧＦＰ遺伝子の発現がニコチアナミンシンターゼ１ではイネの根で特異的に観察され、ニコチアナミンシンターゼ２ではイネ、およびシロイヌナズナの根の表皮で主に観察された。
さらに、この断片を上流側から段階的に欠損させ、それぞれの断片とＧＦＰ遺伝子を連結させたキメラ遺伝子構築物をイネ、およびシロイヌナズナ植物体に導入して解析を行ったところ、ニコチアナミンシンターゼ２では根における発現の誘導には少なくとも３１０ｂｐからなる断片（配列表の配列番号：２の１８１４番目から２１２３番目までの配列からなる断片／配列番号：１）で十分機能することを突き止めた。
ニコチアナミンシンターゼ２（Ｎａｓ２）遺伝子プロモーターの塩基配列を配列番号：１に、ニコチアナミンシンターゼ１（Ｎａｓ１）遺伝子プロモーターの塩基配列を配列番号：３に記載する。また、配列番号：４にはニコチアナミンシンターゼ２遺伝子プロモーターのシス領域の配列を示す。
すなわち本発明は、配列番号：１または３に記載の塩基配列からなるＤＮＡ、もしくは該ＤＮＡを含むプロモーター活性を有するＤＮＡを提供する。
本発明のプロモーターは、配列番号：１または３の塩基配列からなるＤＮＡだけでなく、配列番号：１または３の塩基配列において１もしくは複数の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなり、かつ植物プロモーターとして作用する能力を有するＤＮＡ、または、配列番号：１または３の塩基配列において、その３’末端に翻訳効率を上げる塩基配列などを付加したものや、プロモーター活性を失うことなく、その５’末端を欠失したものを含む。
上記ＤＮＡを調製するために、当業者によりよく知られた方法としては、ハイブリダイゼーション技術（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，ＥＭ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ，１９７５，９８，５０３．）やポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術（Ｓａｉｋｉ，ＲＫ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８５，２３０，１３５０．、Ｓａｉｋｉ，ＲＫ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８８，２３９，４８７．）の他に、例えば、該ＤＮＡに対し、ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ法（Ｋｒａｍｅｒ，Ｗ．＆ Ｆｒｉｔｚ，ＨＪ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ，１９８７，１５４，３５０．）により変異を導入する方法が挙げられる。
本発明において欠失、置換等の変異が導入される塩基の数は、変異を導入されたＤＮＡがプロモーター活性を有する限り、特に制限されないが、通常、２０塩基対以内、好ましくは１０塩基対以内、より好ましくは５塩基対以内、最も好ましくは３塩基対以内である。
さらに、本発明の植物プロモーターは、配列番号：１または３の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ植物プロモーターとして作用する能力を有するＤＮＡを含む。ここで、ストリンジェントな条件とは、特に制限されるものではないが、例えば４２℃、２×ＳＳＣ（３００ｍＭ ＮａＣｌ、３０ｍＭクエン酸）、０．１％ＳＤＳの条件であり、好ましくは５０℃、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳの条件であり、さらに好ましくは、６５℃、０．１×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳの条件である。これらの条件において、温度を上げる程に高い相同性を有するＤＮＡが効率的に得られることが期待できる。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度や塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
さらに本発明は、本発明のプロモーターの下流に、外来遺伝子およびターミネーターが機能的に連結した構造を有するＤＮＡを提供する。本発明において外来遺伝子とは、特に制限されず、所望の遺伝子を用いることができる。
また、本発明のターミネーターとは、通常、植物由来ターミネーター（植物ターミネーター）を言い、本発明の植物組識特異的な発現を制御するプロモーター領域に隣接して配置されるＤＮＡ配列であり、例えば、カリフラワーモザイクウイルス由来のターミネーター、あるいはノパリン合成酵素遺伝子由来のターミネーター等を例示することができるが、ターミネーターとしての機能を有するものであれば、これらに特に制限されない。
本発明において「機能的に連結」とは、プロモーターの下流の外来遺伝子がプロモーターからの転写を受けるように該プロモーターと結合している状態、あるいは、ターミネーターによって外来遺伝子の発現が終結するように外来遺伝子がターミネーターと結合した状態を指す。プロモーター、外来遺伝子およびターミネーターを「機能的に連結」させることは、当業者においては一般的な遺伝子工学技術を用いて、簡便に行い得ることである。
また、本発明のプロモーターの一例としては、上記（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載のＤＮＡからなるプロモーター活性を有するＤＮＡを挙げることができる。プロモーター活性は、当業者においては公知の方法（例えば、後述のレポーター遺伝子を用いて該遺伝子の発現を指標に測定する方法）によって適宜、評価することができる。
さらに本発明は、上記本発明のプロモーターを含むベクター、本発明のプロモーターの下流に遺伝子挿入部位およびターミネーターを含むベクター、並びに、本発明の上記ＤＮＡを含むベクターを提供する。
本発明のベクターは、通常、本発明のプロモーターを植物細胞内で複製可能なベクターに挿入したものである。この複製可能なベクターとしては、公知の種々のベクターを用いることができる。例えば、ｐＵＣ誘導体などの大腸菌で増幅可能なベクター、ｐＰＺＰ２Ｈ−ｌａｃなどの大腸菌とアグロバクテリウムの双方で増幅可能なシャトルベクターなどが挙げられる。また、植物ウイルス、例えば、カリフラワーモザイクウイルスを利用することもできる。当業者においては、植物細胞内で複製可能なベクターを、各々の宿主細胞に応じて適宜選択することができる。なお、本発明のプロモーターをベクターに挿入する方法は、通常の遺伝子をベクターに挿入する常法に従う。
また本発明は、本発明のプロモーター、本発明のＤＮＡ、または本発明のベクターを含む形質転換細胞を提供する。
本発明の細胞は、特に制限されるものではないが、好ましくは微生物細胞あるいは植物細胞である。
本発明の形質転換植物細胞は、本発明のＤＮＡもしくはベクターを宿主細胞に導入し、形質転換させた植物細胞である。宿主細胞としては、例えば葉、根、茎、花および種子中の胚盤等の植物細胞、カルス、懸濁培養細胞等が挙げられる。細胞の由来する植物種としては、特に制限されるものではないが、例えば、シロイヌナズナ、タバコ、ペチュニア、コムギ、イネ、トウモロコシ、ダイズ、ナタネ、ダイコン、テンサイ、カボチャ、キュウリ、トマト、ワタなどが挙げられる。尚、本発明における好ましい例として、イネあるいはシロイヌナズナを挙げることができる。
また本発明は、本発明のプロモーター、本発明のＤＮＡまたはベクターを植物細胞へ導入し、該植物細胞から植物体を再生させる工程を含む、形質転換体の作製方法に関する。
本発明のＤＮＡもしくはベクターを宿主植物細胞中に導入するために、さまざまな手法を用いることができる。これらの手法には、形質転換因子としてアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）または、アグロバクテリウム・リゾゲネス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）を用いたＴ−ＤＮＡによる植物細胞の形質転換、プロトプラストへの直接導入（インジェクション法、エレクトロポレーション法など）、パーティクルガン法などや、その他の公知の方法が含まれる。
プロトプラストへの直接導入では、通常、特別に必要とされるベクターはない。例えば、ｐＵＣ誘導体のような単純なプラスミドを用いることができる。目的の遺伝子を植物細胞に導入する方法によっては、他のＤＮＡ配列が必要になることもある。例えばＴｉまたはＲｉプラスミドを植物細胞の形質転換に用いる場合には、ＴｉおよびＲｉプラスミドのＴ−ＤＮＡ領域の少なくとも右端の配列、大抵は両側の端の配列を、導入されるべき遺伝子の隣接領域となるように接続しなければならない。
アグロバクテリウム属菌を形質転換に用いる場合には、導入すべき遺伝子を、特別のプラスミド、すなわち中間ベクターまたはバイナリーベクターの中にクローニングする必要がある。中間ベクターはアグロバクテリウム属菌の中では複製されない。中間ベクターは、ヘルパープラスミドあるいはエレクトロポレーションによってアグロバクテリウム属菌の中に移行される。中間ベクターは、Ｔ−ＤＮＡの配列と相同な領域をもつため、相同的組換えによって、アグロバクテリウム属菌のＴｉまたはＲｉプラスミド中に取り込まれる。宿主として使われるアグロバクテリウム属菌には、ｖｉｒ領域が含まれている必要がある。通常ＴｉまたはＲｉプラスミドにｖｉｒ領域が含まれており、その働きにより、Ｔ−ＤＮＡを植物細胞に移行させることができる。
一方、バイナリーベクターはアグロバクテリウム属菌の中で複製、維持され得るので、ヘルパープラスミドあるいはエレクトロポレーション法あるいは凍結溶解法によってアグロバクテリウム属菌中に取り込まれると、宿主のｖｉｒ領域の働きによって、バイナリーベクター上のＴ−ＤＮＡを植物細胞に移行させることができる。
なお、このようにして得られた中間ベクターまたはバイナリーベクター、およびこれを含む大腸菌やアグロバクテリウム属菌等の微生物も本発明の対象である。
また、本発明のＤＮＡもしくはベクターの導入によって形質転換された植物細胞を効率的に選択するために、上記ベクターは、適当な選抜マーカー遺伝子を含む、もしくは選抜マーカー遺伝子を含むプラスミドベクターとともに植物細胞へ導入することが好ましい。この目的に使用される選抜マーカー遺伝子は、例えば、抗生物質ハイグロマイシン耐性であるハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、カナマイシンまたはゲンタマイシン耐性であるネオマイシンホスホトランスフェラーゼ、および除草剤ホスフィノスリシン耐性であるアセチルトランスフェラーゼ遺伝子等を挙げることができる。
上記ベクターを導入した植物細胞は、導入した選抜マーカーに応じた選抜用薬剤を含む選抜用培地に置床し培養する。これにより、形質転換された植物細胞を得ることができる。
本発明の形質転換植物体とは、本発明の形質転換植物細胞から再生された形質転換植物体である。形質転換された植物細胞から個体を再生する方法は植物細胞の種類により異なるが、例えばイネではＦｕｊｉｍｕｒａら（Ｆｕｊｉｍｕｒａら（１９９５），ＰｌａｎｔＴｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｌｅｔｔ．，ｖｏｌ．２：ｐ７４−）の方法、トウモロコシでは、Ｓｈｉｌｌｉｔｏら（Ｓｈｉｌｌｉｔｏら（１９８９），Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．７：ｐ５８１−）の方法、ジャガイモでは、Ｖｉｓｓｅｒら（Ｖｉｓｓｅｒら（１９８９），Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．，ｖｏｌ．７８：ｐ５８９−）の方法、シロイヌナズナではＡｋａｍａらの方法（Ａｋａｍａら（１９９２），Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．，ｖｏｌ．１２：ｐ７−）が挙げられる。これらの方法により作出された形質転換植物体またはその繁殖材料（例えば種子、果実、塊茎、切穂、塊根、株、カルス、プロトプラストなど）から得た形質転換植物体も本発明の対象である。一旦、染色体内に本発明のプロモーター（ＤＮＡ）が導入された形質転換植物体が得られれば、該植物体から有性生殖または無性生殖により子孫を得ることが可能である。また、該植物体やその子孫あるいはクローンから繁殖材料を得て、それらを基に該植物体を量産することも可能である。
本発明の植物体を作製する方法の好ましい態様においては、本発明のＤＮＡまたはベクターを宿主細胞に導入して形質転換植物細胞を得て、該形質転換植物細胞から形質転換植物体を再生し、得られた形質転換植物体から植物種子を得て、該植物種子から植物体を生産する工程を含む。
形質転換植物体から植物種子を得る工程とは、例えば、形質転換植物体を発根培地から採取し、水を含んだ土を入れたポットに移植し、一定温度下で生育させて、花を形成させ、最終的に種子を形成させる工程をいう。また、種子から植物体を生産する工程とは、例えば、形質転換植物体上で形成された種子が成熟したところで、単離して、水を含んだ土に播種し、一定温度、照度下で生育させることにより、植物体を生産する工程をいう。
本発明の植物プロモーターは、例えば、以下のようにして作製し、利用することができる。なお、実験手法に関しては、特に記載のない限り、「クローニングとシークエンス」（渡辺格監修、杉浦昌弘編集、農村文化社（１９８９年））や、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）」などの実験書に従う。
本発明のＤＮＡには、天然あるいは単離・精製されたゲノムＤＮＡ、および化学合成ＤＮＡが含まれる。ゲノムＤＮＡの調製は、当業者にとって常套手段を利用して行うことが可能である。
本発明のＤＮＡは、目的とする植物、例えば、イネの組織よりゲノムＤＮＡを抽出し精製し、得られたＤＮＡを鋳型としてＰＣＲによって単離することができる。
本発明における、配列番号：１または３に記載の塩基配列からなるＤＮＡ、およびこれとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ根特異的発現を示すプロモーターを単離するためには、例えば、配列番号：１または３に記載の塩基配列からなるＤＮＡ上の配列であって、本発明のプロモーターを増幅するためのプライマー対を用いることができる。このプライマー対を用いて、植物のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、その後、得られた増幅ＤＮＡ断片をプローブとして用いて、同じ植物のゲノムライブラリーをスクリーニングすることができる。そのようなプライマー対の例として、正方向プライマー（ｎａｓ１Ｆ１２ｓ；５’−ＴＧＧＣＣＧｃｇｇｇｔｇａｃａｃｇｇｔｇｔｔａｃｔｃ−３’（配列番号：５））と、逆方向プライマー（ＮＡＳ２Ｒｘ；５’−ｇｇｔｃｔａｇａｃｔｇｔｇａａｇｃｔｔｔｇｔｃｇｃｇｇｔ−３’（配列番号：６））との組合せ、あるいは正方向プライマー（ＮＡＳ２ Ｆｓ；５’−ｔｇｇｃｃｇｃｇｇａｇａｇｃａｇｇａｃａａｃａａｃｔｃ−３’（配列番号：７））と、逆方向プライマー（ＮＡＳ２Ｒｘ；５’−ｇｇｔｃｔａｇａｃｔｇｔｇａａｇｃｔｔｔｇｔｃｇｃｇｇｔ−３’（配列番号：６））との組合せが挙げられる。
ＰＣＲは、市販のキットおよび装置の製造者の指針に基づいて行うか、当業者に周知の手法で行い得る。遺伝子ライブラリーの作製法、および遺伝子のクローニング法なども当業者に周知である。例えば、「クローニングとシークエンス」（渡辺格監修、杉浦昌弘編集、農村文化社（１９８９年））や、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）」などの実験書を参照のこと。得られた遺伝子の塩基配列は、当該分野で公知のヌクレオチド配列解析法または市販されている自動シーケンサーを利用して決定し得る。ＰＣＲ技術やハイブリダイゼーション技術によって単離し得る、配列番号：１または３に記載の塩基配列からなるＤＮＡとハイブリダイズするＤＮＡもまた、本発明のＤＮＡに含まれる。
上記のようなスクリーニングによって単離および同定されたプロモーター（すなわち、配列番号：１または３に示されるプロモーター、およびホモログ）が根特異的遺伝子発現誘導性を示すことは、以下のようにして解析することが可能である。
上記の配列を、例えば、ＧＦＰなどのレポーター遺伝子の上流に連結し、ｐＰＺＰ２Ｈ−ｌａｃなどのベクターに組み込む。レポーター遺伝子としては、ＧＦＰ遺伝子の他にクロラムフェニコール アセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子や、ルシフェラーゼ（ＬＵＣ）遺伝子、ベータ グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子なども利用が可能である。
上記のようにして作成されたキメラ遺伝子構築物は、例えば、アグロバクテリウムを介してシロイヌナズナなどの植物に導入してその機能を解析することが可能である。ｐＰＺＰ２Ｈ−ｌａｃをベクターとして用いた場合は、キメラ遺伝子を含む組換えプラスミドを、例えば、アグロバクテリウム・ツメファシエンスのＥＨＡ１０１株に凍結溶解法を用いて導入し、得られた形質転換菌を、例えば、減圧浸潤法（島本功ら監修、「モデル植物の実験プロトコール」（植物細胞工学別冊、植物細胞工学シリーズ４）秀潤社１９９６年４月発行）によりシロイヌナズナなどの植物体に感染させる。感染処理した植物より得られた種子を、ハイグロマイシンなど用いたベクターに適した薬剤を含む培地に播種し、得られた薬剤耐性個体を用いてＧＦＰ遺伝子の発現について解析する。蛍光顕微鏡で観察することにより、ＧＦＰの蛍光が根で特異的に検出されることが期待される。
本発明のプロモーターまたはそれを含む発現ベクターは、以下のようにして利用することが可能である。本発明のプロモーターの下流に目的の遺伝子、例えば、養分のトランスポーター遺伝子を連結したキメラ遺伝子を、例えば、ｐＰＺＰ２Ｈ−ｌａｃに挿入し発現ベクターを構築する。このベクターをアグロバクテリウムを介してイネなどの植物体に導入する。得られた形質転換植物においては、本発明のプロモーターの働きにより根において養分のトランスポーター遺伝子が特異的に発現し、養分を効率的に取り込むことができるようになることが期待される。この場合、３５Ｓプロモーターのように不要な組織においても発現することがないため、他の好ましくない形質が現れないことが期待される。
本発明のプロモーターで制御可能な遺伝子（外来遺伝子）としては、上記のトランスポーター遺伝子に限定されない。根において特異的に発現させることに意義のあるあらゆる遺伝子に応用が可能である。
また、本発明のプロモーターに他の発現制御配列を連結して本発明のプロモーターの機能を改変することが可能である。このような発現制御配列としては、エンハンサー配列やリプレッサー配列、インスレーター配列などが挙げられる。例えば薬剤に応答して抑制が解除されるリプレッサー配列を本発明のプロモーターと連結したキメラプロモーターを作成し、その下流に目的の遺伝子を連結した構築物を植物に導入すると、得られた形質転換体では、薬剤が存在しない条件下では目的遺伝子の発現が抑制されているが、薬剤を投与することによって抑制が解除され、目的遺伝子が根で発現するようになることが期待される。
なお、本発明における植物細胞の形質転換方法としては、上記のアグロバクテリウムを介した方法の他に、プロトプラストに電気パルス処理してプラスミドを植物細胞へ導入するエレクトロポレーション法や、小細胞、細胞、リソソームなどとプロトプラストとの融合法、マイクロインジェクション法、ポリエチレングリコール法、あるいは、パーティクルガン法などの方法が挙げられる。
また、植物ウイルスをベクターとして利用することによって、目的遺伝子を植物体に導入することができる。利用可能な植物ウイルスとしては、例えば、カリフラワーモザイクウイルスが挙げられる。すなわち、まず、ウイルスゲノムを大腸菌由来のベクターなどに挿入して組換え体を調製した後、ウイルスのゲノム中に、これらの目的遺伝子を挿入する。このようにして修飾されたウイルスゲノムを制限酵素によって該組換え体から切り出し、植物体に接種することによって、これらの目的遺伝子を植物体に導入することができる（Ｈｏｈｎら（１９８２）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｔｕｍｏｒｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）ｐｐ５４９、米国特許第４，４０７，９５６号）。
また本発明は、植物の根において外来遺伝子を発現させる方法を提供する。本方法の好ましい態様においては、本発明のプロモーターの下流に外来遺伝子および植物ターミネーターが機能的に連結した構造を有するＤＮＡを、植物へ導入する工程を含む方法である。本方法においては、該ＤＮＡを、植物細胞へ導入し、該細胞を植物へ再生させることによっても行うことができる。該ＤＮＡの植物もしくは植物細胞への導入は、上述の方法によって実施することができる。
さらに本発明は、被験化合物について、本発明のプロモーター活性を有するＤＮＡ（例えば、配列番号：１または３に記載の塩基配列からなるＤＮＡ）のプロモーター活性を調節するか否かを評価する方法を提供する。この評価方法は、本発明のプロモーターの活性を有するＤＮＡのプロモーター活性を調節する化合物のスクリーニング方法に利用することができる。
本発明の評価方法に用いられる被検化合物としては、特に制限はなく、例えば、天然化合物、有機化合物、無機化合物、タンパク質、ペプチド等の単一化合物、並びに、化合物ライブラリー、遺伝子ライブラリーの発現産物、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物、原核細胞抽出物、真核単細胞抽出物もしくは動物細胞抽出物等を挙げることができる。
この方法においては、まず、本発明のプロモーター活性を有するＤＮＡとレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するＤＮＡを含む細胞または細胞抽出液と、被験化合物を接触させる。
本発明において、「機能的に結合した」とは、本発明のプロモーター活性を有するＤＮＡに転写因子が結合することにより、レポーター遺伝子の発現が誘導されるように、本発明のプロモーター活性を有するＤＮＡとレポーター遺伝子とが結合していることをいう。本方法における「本発明のプロモーター活性を有するＤＮＡとレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するＤＮＡを含む細胞」として、例えば、上記ＤＮＡを含むベクターを導入した細胞を挙げることができる。該ベクターは、当業者に周知の方法により作製することができる。ベクターの細胞への導入は、一般的な方法、例えば、リン酸カルシウム沈殿法、電気パルス穿孔法、リポフェクタミン法、マイクロインジェクション法等によって実施することができる。
また、「本発明のプロモーター活性を有するＤＮＡとレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するＤＮＡを含む細胞」には、染色体に該ＤＮＡが挿入された細胞も含まれる。染色体へのＤＮＡの挿入は、当業者に一般的に用いられる方法、例えば、相同組み換えを利用した遺伝子導入法により行うことができる。
本方法における「本発明のプロモーター活性を有するＤＮＡとレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するＤＮＡを含む細胞抽出液」とは、例えば、市販の試験管内転写翻訳キットに含まれる細胞抽出液に、本発明のプロモーター活性を有するＤＮＡとレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するＤＮＡを添加したものを挙げることができる。
本方法における「接触」は、本発明のプロモーター活性を有するＤＮＡとレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するＤＮＡを含む細胞の培養液に被験化合物を添加する、または該ＤＮＡを含む上記の市販された細胞抽出液に被験化合物を添加することにより行うことができる。被験化合物がタンパク質の場合には、例えば、該タンパク質をコードするＤＮＡを含むベクターを、該細胞へ導入する、または該ベクターを該細胞抽出液に添加することで行うことも可能である。
本方法においては、次いで、該レポーター遺伝子の発現レベルを測定する。レポーター遺伝子の発現レベルは、当業者においては、該レポーター遺伝子の種類を考慮して、測定することができる。
本方法においては、被験化合物の非存在下において測定した場合と比較して、被験化合物がレポーター遺伝子の発現レベルを変化させた場合に、被験化合物が本発明のＤＮＡのプロモーター活性を調節したと判定される。
さらに、本発明においては、上記評価方法を利用して、複数の被験化合物について、本発明のＤＮＡのプロモーター活性を調節するか否かを評価し、プロモーター活性を調節する化合物を選択することにより、効率的にプロモーター活性を調節する化合物をスクリーニングすることができる。該スクリーニング方法によって取得される化合物は、遺伝子の根特異的な発現を制御することが可能であり、非常に有用である。
【図面の簡単な説明】
図１は、配列番号：１または３に示したニコチアナミンシンターゼ遺伝子のプロモーター部分を切り出し、ｐｂｌｕｅ−ｓＧＦＰ（Ｓ６５Ｔ）−ＮＯＳ ＳＫに含まれる緑色蛍光タンパク（ＧＦＰ）遺伝子の上流に連結することによって構築したプラスミドの遺伝子地図と、そのプラスミドからプロモーター：ＧＦＰ：ターミネーターのひとつながりを切り出し、植物用バイナリーベクターであるｐＰＺＰ２Ｈ−ｌａｃのマルチクローニングサイトに挿入することによって構築したプラスミドの遺伝子地図を示した図である。
図２（Ａ）は、本実施例のＤＮＡ断片を上流（５’側）から削ったＤＮＡ断片のシリーズを作製しそれぞれをベクターに連結した図である。図２（Ｂ）は、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターのミニマムプロモーターに本実施例のＤＮＡ断片の一部を連結した図である。
図３は、シロイヌナズナにおける本発明のプロモーターによる遺伝子の発現結果を検証する写真である。（１）ニコチアナミンシンターゼ１遺伝子プロモーター、および（２）ニコチアナミンシンターゼ２遺伝子プロモーターでＧＦＰ遺伝子を発現させた形質転換シロイヌナズナの根を蛍光顕微鏡によって撮影した蛍光像である。ニコチアナミンシンターゼ１遺伝子プロモーターでは特に光っている部位は観察されないが、ニコチアナミンシンターゼ２遺伝子プロモーターでは主に根毛の出る表皮細胞が光っている。
図４は、イネにおける本発明のプロモーターによる遺伝子の発現結果を検証する写真である。（１）ニコチアナミンシンターゼ１遺伝子プロモーター、および（２）ニコチアナミンシンターゼ２遺伝子プロモーターでＧＦＰ遺伝子を発現させた形質転換イネの根を蛍光顕微鏡によって撮影した蛍光像である。（３）ニコチアナミンシンターゼ１遺伝子プロモーターでＧＦＰ遺伝子を発現させた形質転換イネの全体像を左側の写真は通常光下で、右側の写真は青色光下で撮影したものを示す。主に根でのみ蛍光が観察され、葉では蛍光が観察されない。
【発明を実施するための最良の形態】
以下に本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。なお、ゲノムＤＮＡの調製、ｍＲＮＡの調製、ＤＮＡの切断、連結、大腸菌の形質転換、遺伝子の塩基配列決定等一般の遺伝子組換えに必要な方法は、特に記載のない限り、各操作に使用する市販の試薬、機器装置等に添付されている説明書や、実験書（例えば「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）」）に基本的に従った。
〔実施例１〕 根特異的発現をする遺伝子の探索
（ａ）ｃＤＮＡライブラリーの作成
イネの様々な部位からそれぞれｃＤＮＡライブラリーを作成した。ライブラリーの作成は（Ｏｋｕｂｏ ｅｔ ａｌ．Ｌａｒｇｅ ｓｃａｌｅ ｃＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｆｏｒ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ａｎｄ ｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅ ａｓｐｅｃｔｓ ｏｆ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．ｎａｔｕｒｅ ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２：１７３−１７９（１９９２））に基本的に従って行った。根から作成したｃＤＮＡライブラリーから３３３４個のクローンを単離、根以外の組織から作成したｃＤＮＡライブラリーからは８８７５個のクローンを単離して塩基配列を決定した。塩基配列の決定には、ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔ Ｐｒｅ−Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（ＵＳＢ）とＤＹＥｎａｍｉｃ ＥＴ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ ｆｏｒ ＭｅｇａＢＡＣＥ（ａｍａｅｒｓｈａｍ ｐｈａｒｍａｃｉａ ｂｉｏｔｅｃｈ）で反応を行い、ＭｅｇａＢＡＣＥ１０００を用いて行った。
それらのクローンを塩基配列によるクラスタリングにより、グループ分けをし、根由来のライブラリーに９個のクローンが出現し、根以外の組織由来のライブラリーには１個のクローンも含まれていなかったグループと、根由来のライブラリーに２個のクローンが出現し、根以外の組織由来のライブラリーには１個のクローンも含まれていなかったグループとを選択した。
これらのグループの塩基配列をＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬデータベースを元にＢＬＡＳＴプログラムを用いてホモロジー検索を行ったところ、これらのグループがニコチアナミンシンターゼ１遺伝子、およびニコチアナミンシンターゼ２遺伝子に由来していることが判明した。
〔実施例２〕 ニコチアナミンシンターゼ遺伝子のプロモーター領域の単離
公知のイネニコチアナミンシンターゼ遺伝子の配列（アクセッション番号：ＡＢ０４６４０１）に基づいて３種類のプライマー（（ＮＡＳ２Ｒｘ；５’−ｇｇｔｃｔａｇａｃｔｇｔｇａａｇｃｔｔｔｇｔｃｇｃｇｇｔ−３’（配列番号：６）、ＮＡＳ１ Ｆ１２ｓ；５’−ＴＧＧＣＣＧｃｇｇｇｔｇａｃａｃｇｇｔｇｔｔａｃｔｃ−３’（配列番号：５）およびＮＡＳ２ Ｆｓ；５’−ｔｇｇｃｃｇｃｇｇａｇａｇｃａｇｇａｃａａｃａａｃｔｃ−３’（配列番号：７））を合成した。ＮＡＳ１ Ｆ１２ｓとＮＡＳ２ Ｆｓは、正方向プライマーであり、５’末端側に制限酵素ＳａｃＩＩ部位（ｃｃｇｃｇｇ）を有する。ＮＡＳ２Ｒｘは、逆方向プライマーであり、５’末端側に制限酵素ＸｂａＩ部位（ｔｃｔａｇａ）を有する。ＮＡＳ１ Ｆ１２ｓとＮＡＳ２Ｒｘのプライマー対を用いると、ニコチアナミンシンターゼ１遺伝子の翻訳開始点より上流１１９１ｂｐが増幅される。また、ＮＡＳ２ ＦｓとＮＡＳ２Ｒｘのプライマー対を用いると、ニコチアナミンシンターゼ２遺伝子の翻訳開始点より上流２１２４ｂｐが増幅される。
常法に従って、イネ（品種；日本晴）のゲノムＤＮＡを調製した。上記のプライマー対を用い、このＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、増幅ＤＮＡ断片を得た。増幅されたＤＮＡを、制限酵素による切断と、あるいは常法に従って塩基配列決定により目的の部位が増幅されたことを確認した。
〔実施例３〕 ニコチアナミンシンターゼ遺伝子のプロモーター領域活性検定用ベクターの作成
まず、ベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に、植物体内で強い蛍光を発する緑色蛍光タンパク質の変異型ｓＧＦＰ（Ｓ６５Ｔ）（丹羽康夫：植物細胞工学シリーズ４、モデル植物の実験プロトコール、ｐｐ１１７−１２１、秀潤社、１９９６）とＮｏｓターミネーターを組み込んだプラスミドであるｐｂｌｕｅ−ｓＧＦＰ（Ｓ６５Ｔ）−ＮＯＳ ＳＫ（丹羽康夫博士 静岡県立大学大学院より分与）に、ＰＣＲによって得られたＤＮＡ断片を組み込んだプラスミドを作成した（図１）。さらにこのプラスミドをＳａｃＩとＫｐｎＩで切断し、バイナリーベクターであるｐＰＺＰ２Ｈ−ｌａｃ（矢野昌裕博士 農業生物資源研究所より分与）（Ｆｕｓｅ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １８（３）：２１９−２２２）のマルチクローニングサイトにプロモーター領域−ＧＦＰ−Ｎｏｓターミネーターのひとつながりの配列を挿入することで、プロモーター領域の活性を検定するための植物形質転換用バイナリーベクターを完成させた（図１）。
〔実施例４〕 植物への遺伝子導入
作成したベクターは凍結解凍法によりアグロバクテリウム・ツメファシエンス菌ＥＨＡ１０１に導入した。凍結解凍法とは凍結したＥＨＡ１０１のコンピテントセルにプラスミド溶液を加え、３７℃で５分間保温する方法のことをいう。目的のベクターが導入された菌株を用いてシロイヌナズナ（品種：Ｃｏｌｕｍｂｉａ）とイネ（品種：日本晴）に遺伝子を導入した。
シロイヌナズナへの導入は、「減圧浸潤法による形質転換（荒木崇）」（植物細胞工学シリーズ４、モデル植物の実験プロトコール、ｐｐ１０９−１１３、秀潤社、１９９６）に記載の方法に基本的に従って行った。ただし、記載されている減圧の過程は省いて行った。
イネへの導入は、イネのカルス化と植物体の再生に関して、「イネのカルス形成と植物体再生（西村哲、島本功）」（植物細胞工学シリーズ１５、新版モデル植物の実験プロトコール、ｐｐ７８−８１、秀潤社、２００１）を参考に、アグロバクテリウムによる形質転換は、「アグロバクテリウムによる方法（横井修二、鳥山欽哉）」（植物細胞工学シリーズ１５、新版モデル植物の実験プロトコール、ｐｐ７８−８１、秀潤社、２００１）を参考にして行った。
〔実施例５〕 植物体で発現したＧＦＰの観察
ＧＦＰの発現はシャーレにいれた寒天培地上で育てた植物体を、直接蛍光顕微鏡で観察することができる。蛍光顕微鏡はＩＸ−ＦＬＡ（オリンパス）で、Ｕ−ＭＮＩＢＡフィルターを用いて観察を行った。シロイヌナズナにおける蛍光像を図３に、イネにおける蛍光像を図４に示した。
〔実施例６〕 プロモーター領域の絞込み
プロモーターの活性領域を絞り込むために、図２の（Ａ）に示したようにプロモーター領域を上流側から段階的に欠損させたシリーズを作成した。ニコチアナミンシンターゼ１遺伝子のプロモーター領域の場合には、逆方向プライマーは５’末端側に制限酵素ＸｂａＩ部位（ｔｃｔａｇａ）を有するＮＡＳ２Ｒｘを用い、正方向プライマーは５’末端側に制限酵素ＳａｃＩＩ部位（ｃｃｇｃｇｇ）を有するプライマー（ＮＡＳ１ Ｆ０３１ｓ；５’−ＴＧＧＣＣＧｃｇｇｇａｇｔｇａｃｃａｔａｃｇｃｇａｇ−３’（配列番号：８）、ＮＡＳ１ Ｆ０１４ｓ；５’−ＴＧＧＣＣＧＣＧｇｃｔａｔａａｇｔａｔｃｃｃｃｔｔｔａｃａｇ−３’（配列番号：９））をそれぞれ用いて、ニコチアナミンシンターゼ１遺伝子の翻訳開始点より上流３１４、１４３塩基の断片を作成した。
同様にニコチアナミンシンターゼ２遺伝子のプロモーター領域の場合には、逆方向プライマーは５’末端側に制限酵素ＸｂａＩ部位（ｔｃｔａｇａ）を有するＮＡＳ２Ｒｘを用い、正方向プライマーは５’末端側に制限酵素ＳａｃＩＩ部位（ｃｃｇｃｇｇ）を有するプライマー（ＮＡＳ２ Ｆ１５ｓ；５’−ｔｇｇｃｃｇｃｇｇｃｃａｔｃｔｇａｔｃｔａｇｔａｇｃａｇｃ−３’（配列番号：１０）、ＮＡＳ２ Ｆ１０ｓ；５’−ＴＧＧＣＣＧＣｇｇａｇｔｃａｃｔａｃａｔｔａｔｇｇａｇｔａ−３’（配列番号：１１）、ＮＡＳ２ Ｆ０５ｓ；５’−ｔｇｇｃｃｇｃｇｇａｔｃａａａｃｔａｃｔｇｔａａａａｇｇ−３’（配列番号：１２）、ＮＡＳ２ Ｆ０３ｓ；５’−ｔｇｇｃｃｇｃｇｇａａａａｔｇｔｃｇｔｃｃｔｃｔｔｃａａｃ−３’（配列番号：１３）、ＮＡＳ２ Ｆ０２６ｓ；５’−ｔｇｇｃｃｇｃｇｇｃｃｔｃａｔｔｇｇｇｔａｔｇｃａｃｇｃａ−３’（配列番号：１４）、ＮＡＳ２ Ｆ０１６ｓ；５’−ｔｇｇｃｃｇｃｇｇｃａａｔｔｃｔｃｃｔｇｃｔａｔａｔａｔｔｇ−３’（配列番号：１５）、ＮＡＳ２ Ｆ０２１ｓ；５’−ＴＧＧＣＣＧＣＧｇｃａｔａａｔｇｃｇｔｔｃｃａｃａｔｔｃｔｔ−３’（配列番号：１６））をそれぞれ用いて、ニコチアナミンシンターゼ２遺伝子の翻訳開始点より上流１５３０、１０１５、５４９、３１０、２５６、２０７塩基の断片を作成した。
これらのＤＮＡ断片とＧＦＰ遺伝子を連結させたキメラ遺伝子構築物（図２のＡの▲２▼、▲３▼、▲５▼、▲６▼、▲７▼、▲８▼、▲９▼、▲１０▼）をシロイヌナズナの植物体に導入した。
その結果、▲２▼、▲３▼を導入したイネとシロイヌナズナでは光っている部位は観察されなかった。このことから、８７８塩基からなる断片（配列表の配列番号：３の１番目から８７８番目までの配列からなる断片）の一部、または全部がイネの根で特異的な発現をするプロモーターのシス領域として必須であることを突き止めた。また、▲５▼、▲６▼、▲７▼、▲８▼を導入したイネとシロイヌナズナでは▲４▼と同様に主に根の表皮細胞が特異的に光っているのが観察され、▲９▼、▲１０▼を導入したイネとシロイヌナズナでは光っている部位は観察されなかった。このことから、５５塩基からなる断片（配列表の配列番号：２の１８１４番目から１８６８番目までの配列からなる断片）の一部、または全部がイネとシロイヌナズナの根の表皮で発現をするプロモーターのシス領域として必須であることを突き止めた。
〔実施例７〕 根特異的発現の機能獲得実験
単離したプロモーター領域が所与の遺伝子発現制御をもたらすのに十分であることを確かめるために、カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓ最小プロモーターの上流に、配列表の配列番号：２の１８１５番目から１９６４番目までの配列からなる１５０塩基の断片を連結したキメラ遺伝子構築物（図２のＢの▲８▼）を作成した。
キメラ遺伝子構築物の作成方法を以下に記す。公知のＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの配列（アクセッション番号：Ｕ２８４１７）に基づいて一対のプライマー（３５ｓＦｘｓｓ２；５’−ｇｃｔｃｔａｇａｔａｃｇｔａｃｔａｇｔｃｇｃａａｇａｃｃｃｔｔｃｃｔｃｔａｔａｔ−３’（配列番号：１７）および３５ｓＲｂ；５’−ｃｇｇｇａｔｃｃｔｃｔｃｃａａａｔｇａａａｔｇａａｃｔｔｃｃ−３’（配列番号：１８））を合成し、４７塩基の最小プロモーターを単離した。
３５ｓＦｘｓｓ２は、正方向プライマーであり、５’末端側に制限酵素ＸｂａＩ、ＳｎａＢＩ、およびＳｐｅＩ部位を有する。３５ｓＲｂは、逆方向プライマーであり、５’末端側に制限酵素ＢａｍＨＩ部位を有する。ｐｂｌｕｅ−ｓＧＦＰ（Ｓ６５Ｔ）−ＮＯＳ ＳＫに、ＰＣＲによって得られたＤＮＡ断片をＸｂａＩとＢａｍＨＩで切断して組み込みキメラ遺伝子構築物▲１１▼を作成した（図２−Ｂ）。
次に公知のイネニコチアナミンシンターゼ２遺伝子の配列（アクセッション番号：ＡＢ０４６４０１）に基づいて一対のプライマー（ＮＡＳ２Ｆ１５０ｘ；５’−ｔｇｇｔｃｔａｇａａａａｔｇｔｃｇｔｃｃｔｃｔｔｃａａｃ−３’（配列番号：１９）およびＮＡＳ２Ｒ１５０ｓ；５’−ｔｇｇａｃｔａｇｔｃａａａｇａｔｔｇｇｃｔａａａａｇｃｇｔａｇ−３’（配列番号：２０））を合成した。ＮＡＳ２Ｆ１５０ｘは、正方向プライマーであり、５’末端側に制限酵素ＸｂａＩ部位を有する。ＮＡＳ２Ｒ１５０ｓは、逆方向プライマーであり、５’末端側に制限酵素ＳｐｅＩ部位を有する。このプライマー対を用いると、配列表の配列番号：２の１８１５番目から１９６４番目までの配列からなる１５０ｂｐの断片がＰＣＲによって増幅される。
キメラ遺伝子構築物▲１１▼にＰＣＲによって得られたＤＮＡ断片をＸｂａＩとＳｐｅＩで切断して組み込みキメラ遺伝子構築物▲１２▼を作成した（図２−Ｂ）。
実施例３と同様にして、これらのキメラ遺伝子構築物▲１１▼、▲１２▼をｐＰＺＰ２Ｈ−ｌａｃに組みこみ、バイナリーベクターとしてからイネとシロイヌナズナに導入したところ、▲１１▼を導入したイネとシロイヌナズナでは全く光っている部位が見つからなかったのに対し、▲１２▼を導入したイネとシロイヌナズナでは▲４▼、▲５▼、▲６▼、▲７▼、▲８▼の場合と同様に根の表皮細胞が特異的に光っているのが観察されたことから、単離したプロモーターが所与の遺伝子発現制御をもたらすのに機能的に十分であることが裏付けられた。
【産業上の利用の可能性】
本発明により、植物の根で特異的に遺伝子の発現を制御するのに有用なプロモーターとして機能するＤＮＡ、該プロモーターを含む発現ベクター、該発現ベクターを導入した形質転換細胞および形質転換植物体、更には該プロモーターの制御下にある遺伝子の発現量を調節する方法が提供される。
形質転換植物体において、本発明のプロモーターを機能させることにより、根に目的遺伝子を発現させることができる。目的遺伝子としては、あらゆる遺伝子の選択が可能である。
根の表皮は外部の環境と直接接する部位であり、例えば外部より水や養分の吸収をする部位であり、あるいは外部に物質を放出する部位であり、あるいは病原菌や病害虫からの攻撃を受ける部位であることから、作物の改変にあたって重要な役割を果たすと考えられる。
例えば本発明のプロモーターの制御下で養分のトランスポーター遺伝子を発現、あるいは抑制することで、養分吸収を増やす、あるいは減らすことができる可能性がある。また、例えばアレロパシー成分を放出させることで他の植物の成長を抑制したり、あるいは、耐虫性、耐病性遺伝子などを発現することで、線虫抵抗性、耐病性などの性質を得たりすることができる可能性がある。
また、単子葉植物であるイネから単離したプロモーターだが、双子葉植物であるシロイヌナズナでも活性が確認されたことから、幅広い植物種において利用可能である可能性が高い。
更に、該プロモーターの制御下にある目的遺伝子の発現量を調節する方法によって、目的遺伝子の産物であるタンパク質やその働きによって細胞内で生じる物質を効率的に生産させることができ、この生産には、形質転換細胞あるいはその細胞からなる毛状根など組織の培養物、あるいは形質転換植物体の栽培収穫物が利用可能となる。
加えて、本発明のプロモーターに他の発現制御配列、例えば、薬剤に応答して抑制が解除されるリプレッサー配列などを連結することにより、薬剤に応答し、かつ特定の様式で遺伝子発現を誘導するプロモーターの構築が可能になる。
【配列表】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【技術分野】
本願発明は、植物に外来遺伝子を導入して根で特異的に発現させるプロモーターに関する。さらに詳しくは、イネのニコチアナミンシンターゼ１遺伝子（ＮＡＳ１）及びイネのニコチアナミンシンターゼ２遺伝子（ＮＡＳ２）のプロモーター領域、もしくはその一部を用いて根で特異的に外来遺伝子を発現させる方法に関する。
【背景技術】
根は植物を支える役割のほかに、水や養分などの吸収と輸送、植物ホルモンの合成、あるいは養分を蓄積する役割などを担っている。また、根は線虫や病原菌からの被害や、冠水、乾燥、栄養欠乏、栄養過剰などのストレスを受ける部位でもある。
このため植物の根において適切な遺伝子を発現させることで、線虫抵抗性、耐病性、耐冠水、耐乾燥の植物、あるいは特定の栄養素が欠乏した土壌、過剰な土壌などでも生育可能な植物を作出できる可能性がある。また、カドミウムなどの有害物質を効率的に吸収できる植物を作出することで、土壌浄化に利用することも出来る。あるいは、根菜類の栄養改変や、医薬品や生分解性プラスチックなどの原料の生産など、根において外来遺伝子を発現させることによる応用範囲は広く、有用性は高い。
一般に、植物ではその活性が強いことから、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモーターがよく利用されており、実際、除草剤耐性植物やウイルス抵抗性植物の作出に用いられている。
しかしながら、３５Ｓプロモーターは、強力であるが組織特異性がなく、必ずしも最適な形質転換植物の作出に適しているとは限らない。例えば、不必要な部位での発現によって成長異常などをきたしたり、発現強度が高すぎることによってジーンサイレンシング等の好ましくない形質が現れたりすることがある。また、組換え作物の作出に際しては、必要のない形質を持ち込まないことが望まれており、目的遺伝子を必要な組織以外においても発現させてしまうプロモーターでは植物体への適用に際する用途が大きく制限されたものとなる。
このような問題の解決手段として、特定の組織、とりわけ根組織に特異的に目的の遺伝子を制御するプロモーターを用いることが望ましい。植物の主に根で発現するとされている遺伝子はいくつか知られているが（非特許文献１〜１３、２４〜２８参照）、植物の根で特異的に遺伝子発現を制御するプロモーターは従来技術においてはまだ種類が少なく（特許文献１〜３および非特許文献１４〜１６、２９、３０参照）、しかもその特異性は低いのが現状である。
また、ニコチアナミンシンターゼ遺伝子はイネで、ＮＡＳ１，２，３がとられており、他にも、大麦、トマト、シロイヌナズナなどの植物から単離されている（非特許文献１７〜２１参照）。ニコチアナミンシンターゼ遺伝子は、鉄のキレート剤となるムギネ酸の生合成経路で重要な酵素であるニコチアナミンシンターゼをコードしている。
ニコチアナミンシンターゼ遺伝子の発現部位についてはいくつか調べられており、たとえば、オオムギのＮＡＳ１は鉄欠乏にした大麦の根で発現をしており、葉や、鉄欠乏でない植物体の根では発現していないことがノザンハイブリダイゼーションによって解析されている（非特許文献４参照）。また、イネのＮＡＳ１は鉄欠乏にした植物体の根や黄化葉で強く発現しており、鉄欠乏でない植物体の根でも弱く発現していることがノザンハイブリダイゼーションによって確かめられている（非特許文献１８参照）。
ニコチアナミンシンターゼ遺伝子のプロモーター解析については、オオムギのＮＡＳ１プロモーター領域のデリーションシリーズをＧＵＳにつないで、タバコに形質転換した実験が行われている。この場合ＧＵＳは葉では低レベルに恒常的に発現しており、根では鉄欠乏にすると強い発現が見られることがわかった（非特許文献２２参照）。また、シロイヌナズナのＮＡＳ３プロモーター領域のデリーションシリーズをＧＵＳにつないで、タバコの培養細胞に一過的に導入した実験では、エチレン応答性領域の存在が示されている（非特許文献２３参照）。
しかし現在までのところ、イネのニコチアナミンシンターゼ２遺伝子に関しては、その発現パターンやプロモーター解析に関する知見は知られていない。
一般的に、同じ遺伝子ファミリーに属する遺伝子（例えば、ＮＡＳ（ニコチアナミンシンターゼ）遺伝子ファミリーに属するＮＡＳ１とＮＡＳ２とＮＡＳ３など）であっても、それぞれが異なる発現パターンを示すことが多い。また、同じ遺伝子ファミリーに属する、異なる植物種由来の遺伝子同士（例えば、シロイヌナズナのＮＡＳ１とイネのＮＡＳ１とオオムギのＮＡＳ１など）は、それぞれが異なる発現パターンを示すことが多い。つまり当業者であっても、他の植物種のＮＡＳファミリーのプロモーター解析から、イネのＮＡＳ２のプロモーターの性質を推測することは、通常困難と言える。
また、非特許文献１によると、イネのＲＣｃ２遺伝子はノザン解析によって根に特異的発現をすることがわかったが、ＲＣｃ２遺伝子の上流域をプロモーターとして使用した場合は、外来遺伝子を根の分裂域以外、および葉の維管束で発現させることがわかった。この例のように、ノザン解析などで、根特異的発現をする遺伝子を取得しても、外来遺伝子根特異的に発現させるプロモーター部位を取得するのは当業者であっても容易ではない。
【特許文献１】米国特許出願公開第２００１／００１６９５４号明細書
【特許文献２】米国特許第６２７１４３７号明細書
【特許文献３】特開２００２−１４２７６６号公報
【非特許文献１】Ｘｕ，Ｙ．，Ｂｕｃｈｈｏｌｚ，Ｗ．Ｇ．，ＤｅＲｏｓｅ，Ｒ．Ｔ．，およびＨａｌｌ，Ｔ．Ｃ．著、「Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｒｉｃｅ ｇｅｎｅ ｆａｍｉｌｙ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｒｏｏｔ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、Ｖｏｌ．２７、ｐ．２３７−２４８、１９９５年
【非特許文献２】Ｙａｍａｇｕｃｈｉ，Ｉ．Ｊ．，およびＦｕｔｓｕｈａｒａ，Ｙ．著、「Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＧＡＳＲ１，ａ ｒｏｏｔ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＧＡＳＴ１−ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｒｉｃｅ」、Ｒｉｃｅ Ｇｅｎｅｔ．Ｎｅｗｓ１．、Ｖｏｌ．１４、ｐ．１５０−１５２、１９９７年
【非特許文献３】Ｔｓａｙ，Ｙ．Ｆ．，Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ，Ｊ．Ｉ．，Ｆｅｌｄｍａｎｎ，Ｋ．Ａ．，およびＣｒａｗｆｏｒｄ，Ｎ．Ｍ．著、「Ｔｈｅ ｈｅｒｂｉｃｉｄｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｇｅｎｅ ＣＨＬ１ ｏｆ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｅｎｃｏｄｅｓ ａ ｎｉｔｒａｔｅ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｎｉｔｒａｔｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ」、Ｃｅｌｌ、Ｖｏｌ．７２、ｐ．７０５−７１３、１９９３年
【非特許文献４】Ｊｏｈｎ，Ｉ．，Ｈｅｌｄ，Ｂ．Ｍ．，Ｗｕｒｔｅｌｅ，Ｅ．Ｓ．，およびＣｏｌｂｅｒｔ，Ｊ．Ｔ．著、「Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｏｏｔ−ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｃＤＮＡ ｃｌｏｎｅｓ ｆｒｏｍ Ｚｅａ ｍａｙｓ．」、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１５Ａ、ｐ．１３３、１９９１年
【非特許文献５】Ｊｏｈｎ，Ｉ．，Ｗａｎｇ，Ｈ．，Ｈｅｌｄ，Ｂ．Ｍ．，Ｗｕｒｔｅｌｅ，Ｅ．Ｓ．，およびＣｏｌｂｅｒｔ，Ｊ．Ｔ．著、「Ａｎ ｍＲＮＡ ｔｈａｔ ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ ａｃｃｕｍｕｌａｔｅｓ ｉｎ ｍａｉｚｅ ｒｏｏｔｓ ｄｅｌｉｎｅａｔｅｓ ａ ｎｏｖｅｌ ｓｕｂｓｅｔ ｏｆ ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ ｃｏｒｔｉｃａｌ ｃｅｌｌｓ」、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、Ｖｏｌ．２０、ｐ．８２１−８３１、１９９２年
【非特許文献６】Ｈｅｌｄ Ｂ．Ｍ．，Ｗａｎｇ Ｈ．，Ｊｏｈｎ Ｉ．，Ｗｕｒｔｅｌｅ Ｅ．Ｓ．，Ｃｏｌｂｅｒｔ Ｊ．Ｔ．著、「Ａｎ ｍＲＮＡ ｐｕｔａｔｉｖｅｌｙ ｃｏｄｉｎｇ ｆｏｒ ａｎ Ｏ−ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ａｃｃｕｍｕｌａｔｅｓ ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｉｎ ｍａｉｚｅ ｒｏｏｔｓ ａｎｄ ｉｓ ｌｏｃａｔｅｄ ｐｒｅｄｏｍｉｎａｎｔｌｙ ｉｎ ｔｈｅ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｅｎｄｏｄｅｒｍｉｓ．」、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．、Ｖｏｌ．１０２、ｐ．１００１−１００８、１９９３年
【非特許文献７】Ｃｏｎｋｌｉｎｇ，Ｍ．Ａ．，Ｃｈｅｎｇ，Ｃ．Ｌ．，Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｙ．Ｔ．，およびＧｏｏｄｍａｎ，Ｈ．Ｍ．著、「Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｌｙ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｒｏｏｔ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｇｅｎｅｓ ｆｒｏｍ ｔｏｂａｃｃｏ」、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．、Ｖｏｌ．９３、ｐ．１２０３−１２１１、１９９０年
【非特許文献８】Ｌｅｒｎｅｒ，Ｄ．Ｒ．およびＲａｉｋｈｅｌ，Ｎ．Ｖ．著、「Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｏｏｔ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｂａｒｌｅｙ Ｌｅｃｔｉｎ」、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．、Ｖｏｌ．９１、ｐ．１２４−１２９、１９８９年
【非特許文献９】Ｅｖａｎｓ，Ｌ．Ｍ．，Ｓｗｉｎｈｏｅ，Ｒ．，Ｇａｔｅｈｏｕｓｅ，Ｊ．Ａ．，およびＢｏｕｌｔｅｒ，Ｄ．著、「Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ｒｏｏｔ ｍＲＮＡ ｓｐｅｃｉｅｓ ｉｎ ｏｔｈｅｒ ｖｅｇｅｔａｔｉｖｅ ｏｒｇａｎｓ ｏｆ ｐｅａ（Ｐｉｓｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ Ｌ．）」、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．、Ｖｏｌ．２１４、ｐ．１５３−１５７、１９８８年
【非特許文献１０】Ｙａｚａｋｉ，Ｋ．，Ｍａｔｓｕｏｋａ，Ｈ．，Ｓｈｉｎｏｍｕｒａ，Ｋ．，Ｂｅｃｈｔｈｏｌｄ，Ａ．およびＳａｔｏ，Ｆ．著、「Ａ Ｎｏｖｅｌ Ｄａｒｋ−Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ，ＬｅＤＩ−２，ａｎｄ Ｉｔｓ Ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ ｉｎ Ｒｏｏｔ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｉｎ Ｌｉｔｈｏｓｐｅｒｍｕｍ ｅｒｙｔｈｏｒｏｒｈｉｚｏｎ」、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．、Ｖｏｌ．１２５、ｐ．１８３１−１８４１、２００１年
【非特許文献１１】Ｂｅｌｏｕｃｈｉ，Ａ．，Ｃｅｌｌｉｅｒ，Ｍ．，Ｋｗａｎ，Ｔ．，Ｓａｉｎｉ，Ｈ．Ｓ．，Ｌｅｒｏｕｘ，Ｇ．，およびＧｒｏｓ，Ｐ．著、「Ｔｈｅ ｍａｃｒｏｐｈａｒｇｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｎｒａｍｐ ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ ｎａｔｕｒａｌ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ｍｉｃｅ ｈａｓ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｒｏｏｔ ｓｙｓｔｅｍ ｏｆ ｐｌａｎｔ」、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、Ｖｏｌ．２９、ｐ．１１８１−１１９６、１９９５年
【非特許文献１２】Ｌｕｓｃｈｎｉｇ，Ｃ．，Ｇａｘｉｏｌａ，Ｒ．Ａ．，Ｇｒｉｓａｆｉ，Ｐ．，およびＧｅｒａｌｄ，Ｒ．Ｆ．著、「ＥＩＲ１，ａ ｒｏｏｔ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ａｕｘｉｎ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ，ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｇｒａｖｉｔｒｏｐｉｓｍ ｉｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ」、Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖ．、Ｖｏｌ．１２、ｐ．２１７５−２１８７、１９９８年
【非特許文献１３】ｄｅ Ｐａｔｅｒ，Ｂ．Ｓ．およびＳｃｈｉｌｐｅｒｏｏｒｔ，Ｒ．Ａ．著、「Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｒｏｏｔ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｒｉｃｅ ｇｅｎｅ」、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、Ｖｏｌ．１８、ｐ．１６１−１６４、１９９２年
【非特許文献１４】Ｔａｙｌｏｒ，Ｂ．Ｈ．およびＳｃｈｅｕｒｉｎｇ，Ｃ．Ｆ．著、「Ａ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍａｒｋｅｒ ｆｏｒ ｌａｔｅｒａｌ ｒｏｏｔ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ：Ｔｈｅ ＲＳＩ−１ ｇｅｎｅ ｏｆ ｔｏｍａｔｏ（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ Ｍｉｌｌ）ｉｓ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｉｎ ｅａｒｌｙ ｒｏｏｔ ｐｒｉｍｏｒｄｉａｌ」、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．、Ｖｏｌ．２４３、ｐ．１４８−１４７、１９９４年
【非特許文献１５】Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｙ．Ｔ．，Ｔａｙｌｏｒ，Ｃ．Ｇ．，Ａｃｅｄｏ，Ｇ．Ｎ．，Ｃｈｅｎｇ，Ｃ．Ｌ．，およびＣｏｎｋｌｉｎｇ，Ｍ．Ａ．著、「Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｉｓ−ａｃｔｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ ｒｏｏｔ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｔｏｂａｃｃｏ」、Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ、Ｖｏｌ．３、ｐ．３７１−３８２、１９９１年
【非特許文献１６】Ｃｈｏ，Ｈ．−Ｔ．およびＣｏｓｇｒｏｖｅ，Ｄ．Ｊ．著、「Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｏｏｔ Ｈａｉｒ Ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｅｘｐａｎｓｉｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ」、Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ、Ｖｏｌ．１４、ｐ．３２３７−３２５３、２００２年
【非特許文献１７】Ｈｉｇｕｃｈｉ，Ｋ．，Ｓｕｚｕｋｉ Ｋ．，Ｎａｋａｎｉｓｈｉ Ｈ．，Ｙａｍａｇｕｃｈｉ Ｈ．，Ｎｉｓｈｉｚａｗａ，Ｎ．Ｋ．およびＭｏｒｉ，Ｓ．著、「Ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ Ｎｉｃｏｔｉａｎａｍｉｎｅ Ｓｙｎｔｈａｓｅ Ｇｅｎｅｓ，Ｎｏｖｅｌ Ｇｅｎｅｓ Ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｔｈｅ Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｐｈｙｔｏｓｉｄｅｒｏｐｈｏｒｅｓ」、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．、Ｖｏｌ．１１９、ｐ．４７１−４７９、１９９９年
【非特許文献１８】Ｈｉｇｕｃｈｉ，Ｋ．，Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｓ．，Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｍ．，Ｋａｗａｓａｋｉ，Ｓ．，Ｎａｋａｎｉｓｈｉ Ｈ．，Ｎｉｓｈｉｚａｗａ，Ｎ．Ｋ．およびＭｏｒｉ，Ｓ．著、「Ｎｉｃｏｔｉａｎａｍｉｎｅ Ｓｙｎｔｈａｓｅ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｄｉｆｆｅｒｓ ｉｎ Ｂａｒｌｅｙ ａｎｄ Ｒｉｃｅ ｕｎｄｅｒ Ｆｅ−Ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ」、Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ、Ｖｏｌ．２５（２）、ｐ．１５９−１６７、２００１年
【非特許文献１９】Ｈｅｒｂｉｋ Ａ，Ｋｏｃｈ Ｇ，Ｍｏｃｋ ＨＰ，Ｄｕｓｈｋｏｖ Ｄ，Ｃｚｉｈａｌ Ａ，Ｔｈｉｅｌｍａｎｎ Ｊ，Ｓｔｅｐｈａｎ ＵＷ，Ｂａｕｍｌｅｉｎ Ｈ．著、「Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃＤＮＡ ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ｎｉｃｏｔｉａｎａｍｉｎｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｆｒｏｍ ｂａｒｌｅｙ．Ａ ｋｅｙ ｅｎｚｙｍｅ ｆｏｒ ｉｒｏｎ ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ ｉｎ ｐｌａｎｔｓ．」、Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｖｏｌ．２６５、ｐ．２３１−２３９、１９９９年
【非特許文献２０】Ｌｉｎｇ ＨＱ，Ｋｏｃｈ Ｇ，Ｂａｕｍｌｅｉｎ Ｈ，Ｇａｎａｌ ＭＷ．著、「Ｍａｐ−ｂａｓｅｄ ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ｃｈｌｏｒｏｎｅｒｖａ，ａ ｇｅｎｅ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｉｒｏｎ ｕｐｔａｋｅ ｏｆ ｈｉｇｈｅｒ ｐｌａｎｔｓ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｎｉｃｏｔｉａｎａｍｉｎｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ，」、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、Ｖｏｌ．９６、ｐ．７０９８−７１０３、１９９９年
【非特許文献２１】Ｓｕｚｕｋｉ Ｋ．，Ｈｉｇｕｃｈｉ，Ｋ．，Ｎａｋａｎｉｓｈｉ Ｈ．，Ｎｉｓｈｉｚａｗａ，Ｎ．Ｋ．およびＭｏｒｉ，Ｓ．著、「Ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ｎｉｃｏｔｉａｎａｍｉｎｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｇｅｎｅｓ ｆｒｏｍ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ．」、Ｓｏｉｌ Ｓｃｉ．Ｐｌａｎｔ Ｎｕｔｒ．、Ｖｏｌ．４５、ｐ．９９３−１００２、１９９９年
【非特許文献２２】Ｈｉｇｕｃｈｉ，Ｋ．，Ｔａｎｉ，Ｍ．，Ｎａｋａｎｉｓｈｉ Ｈ．，Ｙｏｓｈｉｗａｒａ，Ｔ．，Ｇｏｔｏ，Ｆ．，Ｎｉｓｈｉｚａｗａ，Ｎ．Ｋ．およびＭｏｒｉ，Ｓ．著、「Ｔｈｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａ Ｂａｒｌｅｙ ＨｖＮＡＳ１ Ｎｉｃｏｔｉａｎａｍｉｎｅ Ｓｙｎｔｈａｓｅ Ｇｅｎｅ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ−ｇｕｓ Ｆｕｓｉｏｎ Ｇｅｎｅ ｉｎ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｔｏｂａｃｃｏ ｉｓ Ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｆｅ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｉｎ Ｒｏｏｔｓ．」、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、Ｖｏｌ．６５（７）、ｐ．１６９２−１６９６、２００１年
【非特許文献２３】Ｓｕｚｕｋｉ Ｋ．，Ｎａｋａｎｉｓｈｉ Ｈ．，Ｎｉｓｈｉｚａｗａ，Ｎ．Ｋ．およびＭｏｒｉ，Ｓ．著、「Ａｎａｌｙａｓｉｓ ｏｆ Ｕｐｓｔｒｅａｍ Ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ Ｎｉｃｏｔｉａｎａｍｉｎｅ Ｓｙｎｔｈａｓｅ Ｇｅｎｅ ｆｒｏｍ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ：Ｐｒｅｓｅｎｃｅ ｏｆ Ｐｕｔａｔｉｖｅ ＥＲＥ−ｌｉｋｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ」、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｖｏｌ．６５（１２）、ｐ．２７９４−２７９７、２００１年
【非特許文献２４】Ｃｈｏｉ，Ｄ．Ｗ．，Ｓｏｎｇ，Ｊ．Ｙ．，Ｋｗｏｎ，Ｙ．Ｍ．およびＫｉｍ，Ｓ．Ｇ．著、「Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｃＤＮＡ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ａ ｐｒｏｌｉｎｅ−ｒｉｃｈ １４ｋＤａ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ ｃｏｒｔｉｃａｌ ｃｅｌｌｓ ｏｆ ｔｈｅ ｒｏｏｔｓ ｏｆ ｂｅａｎ（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ）ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ」、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、Ｖｏｌ．３０、Ｎｏ．５、ｐ．９７３−９８２、１９９６年
【非特許文献２５】Ｈｅｌｄ，Ｂ．Ｍ．，Ｊｏｈｎ，Ｉ，Ｗａｎｇ，Ｈ．，Ｍｏｒａｇｏｄａ，Ｌ．，Ｔｉｒｉｍａｎｎｅ，Ｔ．Ｓ．，Ｗｕｒｔｅｌｅ，Ｅ．Ｓ．およびＣｏｌｂｅｒｔ Ｊ．Ｔ．著、「Ｚｒｐ２：ａ ｎｏｖｅｌ ｍａｉｚｅ ｇｅｎｅ ｗｈｏｓｅ ｍＲＮＡ ａｃｃｕｍｕｌａｔｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｒｏｏｔ ｃｏｒｔｅｘ ａｎｄ ｍａｔｕｒｅ ｓｔｅｍｓ．」、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、Ｖｏｌ．３５、Ｎｏ．３、ｐ．３６７−７５、１９９７年
【非特許文献２６】Ｂｏｇｕｓｚ，Ｄ．，Ａｐｐｌｅｂｙ，Ｃ．Ａ．，Ｌａｎｄｓｍａｎｎ，Ｊ．，Ｄｅｎｎｉｓ，Ｅ．Ｓ．，Ｔｒｉｎｉｃｋ，Ｍ．Ｊ．およびＰｅａｃｏｃｋ，Ｗ．Ｊ．著、「Ｆｕｎｃｔｉｏｎｉｎｇ ｈａｅｍｏｇｌｏｂｉｎ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｎｏｎ−ｎｏｄｕｌａｔｉｎｇ ｐｌａｎｔｓ」、Ｎａｔｕｒｅ、Ｖｏｌ．３３１、Ｖｏｌ．６１５２、ｐ．１７８−８０、１９８８年
【非特許文献２７】Ｍｏｎｔｏｌｉｕ，Ｌ．，Ｒｉｇａｕ，Ｊ．およびＰｕｉｇｄｏｍｅｎｅｃｈ，Ｐ．著、「Ａ ｔａｎｄｅｍ ｏｆ ａｌｐｈａ−ｔｕｂｕｌｉｎ ｇｅｎｅｓ ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ｒａｄｉｃｕｌａｒ ｔｉｓｓｕｅｓ ｆｒｏｍ Ｚｅａ ｍａｙｓ」、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、Ｖｏｌ．１４、Ｎｏ．１、ｐ．１−１５、１９８９年
【非特許文献２８】Ｍｏｎｔｏｌｉｕ，Ｌ．，Ｐｕｉｇｄｏｍｅｎｅｃｈ，Ｐ．ａｎｄおよびＲｉｇａｕ，Ｊ．著、「Ｔｈｅ Ｔｕｂ ａｌｐｈａ ３ ｇｅｎｅ ｆｒｏｍ Ｚｅａ ｍａｙｓ：ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｄｉｖｉｄｉｎｇ ｐｌａｎｔ ｔｉｓｓｕｅｓ」、Ｇｅｎｅ、Ｖｏｌ．９４、Ｎｏ．２、ｐ．２０１−２０７、１９９０年
【非特許文献２９】Ｍｉａｏ，Ｇ．Ｈ．，Ｈｉｒｅｌ，Ｂ．，Ｍａｒｓｏｌｉｅｒ，Ｍ．Ｃ．，Ｒｉｄｇｅ，Ｒ．Ｗ．およびＶｅｒｍａ，Ｄ．Ｐ．著、「Ａｍｍｏｎｉａ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａ ｓｏｙｂｅａｎ ｇｅｎｅ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ ｇｌｕｔａｍｉｎｅ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ ｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｌｏｔｕｓ ｃｏｒｎｉｃｕｌａｔｕｓ」、Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ、Ｖｏｌ．３、Ｎｏ．１、ｐ．１１−２２、１９９１年
【非特許文献３０】Ｂｏｇｕｓｚ，Ｄ．，Ｌｌｅｗｅｌｌｙｎ，Ｄ．，Ｃｒａｉｇ，Ｓ．，Ｄｅｎｎｉｓ，Ｅ．Ｓ．，Ａｐｐｌｅｂｙ，Ｃ．Ａ．およびＰｅａｃｏｃｋ，Ｗ．Ｊ．著、「Ｎｏｎｌｅｇｕｍｅ ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ ｇｅｎｅｓ ｒｅｔａｉｎ ｏｒｇ ａｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｐｌａｎｔｓ．」、Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ、Ｖｏｌ．２、ｐ．６３３−６４１、１９９０年
【発明の開示】
本発明の目的は、植物の根で特異的に遺伝子の発現を制御するのに有用なプロモーター、該プロモーターを含有する発現ベクター、該発現ベクターを含む形質転換植物もしくは植物体、およびその作製方法を提供することにある。
本発明者らはイネの根から、根で特異的に発現をするニコチアナミンシンターゼ１（ｎｉｃｏｔｉａｎａｍｉｎｅ ｓｙｎｔａｓｅ １；ＮＡＳ１）遺伝子、及びニコチアナミンシンターゼ２（ｎｉｃｏｔｉａｎａｍｉｎｅ ｓｙｎｔａｓｅ ２；ＮＡＳ２）遺伝子の５’上流域を単離し、この上流域のＤＮＡを解析し、鋭意検討を重ねた結果、ニコチアナミンシンターゼ１遺伝子、及びニコチアナミンシンターゼ２遺伝子のプロモーター機能を有するＤＮＡ配列を特定することに成功し、本発明を完成するに至った。本発明者らによって単離されたプロモーターを利用することによって、実際に外来遺伝子を根特異的に発現させることが可能である。
すなわち、本発明は、以下の〔１〕〜〔１５〕に関する。
〔１〕 下記の（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のＤＮＡを含むプロモーター。
（ａ）配列番号：１または３に記載の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列番号：１または３に記載の塩基配列において１もしくは複数の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなり、かつプロモーター機能を有するＤＮＡ
（ｃ）配列番号：１または３に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下にハイブリダイズし、かつプロモーター機能を有するＤＮＡ
本発明は、より詳しくは、以下に関する。
〔１ｂ〕上記（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のＤＮＡを含む、プロモーターとして使用するためのＤＮＡ、または
〔１ｃ〕上記（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のＤＮＡのプロモーターとしての使用。
〔２〕 〔１〕に記載のプロモーターの下流に、外来遺伝子および植物ターミネーターが機能的に連結した構造を有するＤＮＡ。
〔３〕 〔１〕に記載のプロモーターを含むベクター。
〔４〕 〔１〕に記載のプロモーターの下流に外来遺伝子挿入部位および植物ターミネーターを含む、〔３〕記載のベクター。
〔５〕 〔２〕に記載のＤＮＡを含むベクター。
〔６〕 〔１〕に記載のプロモーター、〔２〕に記載のＤＮＡ、または〔３〕〜〔５〕のいずれかに記載のベクターを含む、形質転換細胞。
〔７〕 微生物である、〔６〕に記載の形質転換細胞。
〔８〕 植物細胞である、〔６〕に記載の形質転換細胞。
〔９〕 〔８〕に記載の細胞を含む、形質転換植物体。
〔１０〕 〔９〕に記載の形質転換植物体の子孫またはクローンである、形質転換植物体。
〔１１〕 〔９〕または〔１０〕に記載の形質転換植物体の繁殖材料。
〔１２〕 〔９〕または〔１０〕に記載の形質転換植物体の作製方法であって、
〔１〕に記載のプロモーター、〔２〕に記載のＤＮＡ、または〔３〕〜〔５〕のいずれかに記載のベクターを植物細胞へ導入し、該植物細胞から植物体を再生させる工程を含む方法。
〔１３〕 植物の根において外来遺伝子を発現させる方法であって、〔２〕に記載のＤＮＡ、または〔４〕もしくは〔５〕に記載のベクターを該植物の細胞へ導入する工程を含む方法。
〔１４〕 被験化合物について、〔１〕に記載のＤＮＡのプロモーター活性を調節するか否かを評価する方法であって、
（ａ）〔１〕に記載のＤＮＡとレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するＤＮＡを含む細胞または細胞抽出液と、被験化合物を接触させる工程、
（ｂ）該レポーター遺伝子の発現レベルを測定する工程、
を含み、被験化合物が該レポーター遺伝子の発現レベルを変化させた場合に、被験化合物が〔１〕に記載のＤＮＡのプロモーター活性を調節すると判定される方法。
〔１５〕 以下の工程（ａ）および（ｂ）を含む、〔１〕に記載のＤＮＡのプロモーター活性を調節する化合物のスクリーニング方法。
（ａ）〔１４〕に記載の評価方法により、被験化合物について、〔１〕に記載のＤＮＡのプロモーター活性を調節するか否かを評価する工程
（ｂ）被験化合物から、該ＤＮＡのプロモーター活性を調節すると評価された化合物を選択する工程
以下、本発明を詳細に説明する。本発明者らは、イネの様々な部位からそれぞれｃＤＮＡライブラリーを作成した。根から作成したｃＤＮＡライブラリーから３３３４個のクローンを単離、根以外の組織から作成したｃＤＮＡライブラリーからは８８７５個のクローンを単離して塩基配列を決定した。
根由来のライブラリーに９回出現し、根以外の組織由来のライブラリーには一度も出現しなかったクローンを選択し、ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬデータベースを元にＢＬＡＳＴプログラムを用いて塩基配列のホモロジー検索を行ったところ、このクローンがニコチアナミンシンターゼ２遺伝子に由来していることが判明した。同様に根由来のライブラリーに２回出現し、根以外の組織由来のライブラリーには一度も出現しなかったクローンはニコチアナミンシンターゼ１遺伝子に由来していることが判明した。ニコチアナミンシンターゼ１遺伝子、及びニコチアナミンシンターゼ２遺伝子の５’上流域を単離し、上流側から段階的に欠損させた断片とＧＦＰ遺伝子を連結させたキメラ遺伝子構築物をイネ、およびシロイヌナズナ植物体に導入することで、ニコチアナミンシンターゼ１遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＢ０４６４０１）及びニコチアナミンシンターゼ２遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＢ０４６４０１）からプロモーター領域を単離することに成功したものである。
本発明はまず、ニコチアナミンシンターゼ１遺伝子プロモーター、及びニコチアナミンシンターゼ２遺伝子プロモーター（ＤＮＡ）を提供する。本発明のプロモーターは、下流の遺伝子を根特異的に発現させることが可能であり、極めて有用である。本発明者らによって単離されたニコチアナミンシンターゼ１遺伝子プロモーターＤＮＡの塩基配列を配列番号：３に、ニコチアナミンシンターゼ２遺伝子プロモーターＤＮＡの塩基配列を配列番号：１に示す。
本発明は、より具体的には、下記の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのＤＮＡを含むプロモーター（プロモーター活性を有するＤＮＡ）を提供する。
（ａ）配列番号：１または３で示される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列番号：１または３で示される塩基配列において１もしくは複数の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなり、かつプロモーター機能（活性）を有するＤＮＡ
（ｃ）配列番号：１または３で示される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下にハイブリダイズし、かつプロモーター機能（活性）を有するＤＮＡ
本発明の「プロモーター」とは、ＤＮＡを鋳型としたｍＲＮＡの合成（転写）の開始に必要な特定塩基配列を含むＤＮＡを意味し、自然界に存在するＤＮＡの他、組換えなどの人工的な改変操作により作成されたＤＮＡを含む。また、本発明のプロモーターは、植物細胞において発現誘導型プロモーターであることが好ましい。
本発明者らは、本発明のプロモーターを得るために、イネのニコチアナミンシンターゼ１遺伝子の上流に存在するゲノム配列から、配列番号：３に示す１１９１ｂｐの配列を含む断片を、イネのニコチアナミンシンターゼ２遺伝子の上流に存在するゲノム配列から、配列番号：２に示す２１２３ｂｐの配列を含む断片をＰＣＲにより取得した。この断片の下流に、植物体において遺伝子発現を容易にモニターすることが可能なレポーター遺伝子として、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子を連結したキメラ遺伝子構築物を作成し、アグロバクテリウムを介してイネ、およびシロイヌナズナの植物体へ導入したところ、ＧＦＰ遺伝子の発現がニコチアナミンシンターゼ１ではイネの根で特異的に観察され、ニコチアナミンシンターゼ２ではイネ、およびシロイヌナズナの根の表皮で主に観察された。
さらに、この断片を上流側から段階的に欠損させ、それぞれの断片とＧＦＰ遺伝子を連結させたキメラ遺伝子構築物をイネ、およびシロイヌナズナ植物体に導入して解析を行ったところ、ニコチアナミンシンターゼ２では根における発現の誘導には少なくとも３１０ｂｐからなる断片（配列表の配列番号：２の１８１４番目から２１２３番目までの配列からなる断片／配列番号：１）で十分機能することを突き止めた。
ニコチアナミンシンターゼ２（Ｎａｓ２）遺伝子プロモーターの塩基配列を配列番号：１に、ニコチアナミンシンターゼ１（Ｎａｓ１）遺伝子プロモーターの塩基配列を配列番号：３に記載する。また、配列番号：４にはニコチアナミンシンターゼ２遺伝子プロモーターのシス領域の配列を示す。
すなわち本発明は、配列番号：１または３に記載の塩基配列からなるＤＮＡ、もしくは該ＤＮＡを含むプロモーター活性を有するＤＮＡを提供する。
本発明のプロモーターは、配列番号：１または３の塩基配列からなるＤＮＡだけでなく、配列番号：１または３の塩基配列において１もしくは複数の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなり、かつ植物プロモーターとして作用する能力を有するＤＮＡ、または、配列番号：１または３の塩基配列において、その３’末端に翻訳効率を上げる塩基配列などを付加したものや、プロモーター活性を失うことなく、その５’末端を欠失したものを含む。
上記ＤＮＡを調製するために、当業者によりよく知られた方法としては、ハイブリダイゼーション技術（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，ＥＭ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ，１９７５，９８，５０３．）やポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術（Ｓａｉｋｉ，ＲＫ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８５，２３０，１３５０．、Ｓａｉｋｉ，ＲＫ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８８，２３９，４８７．）の他に、例えば、該ＤＮＡに対し、ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ法（Ｋｒａｍｅｒ，Ｗ．＆ Ｆｒｉｔｚ，ＨＪ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ，１９８７，１５４，３５０．）により変異を導入する方法が挙げられる。
本発明において欠失、置換等の変異が導入される塩基の数は、変異を導入されたＤＮＡがプロモーター活性を有する限り、特に制限されないが、通常、２０塩基対以内、好ましくは１０塩基対以内、より好ましくは５塩基対以内、最も好ましくは３塩基対以内である。
さらに、本発明の植物プロモーターは、配列番号：１または３の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ植物プロモーターとして作用する能力を有するＤＮＡを含む。ここで、ストリンジェントな条件とは、特に制限されるものではないが、例えば４２℃、２×ＳＳＣ（３００ｍＭ ＮａＣｌ、３０ｍＭクエン酸）、０．１％ＳＤＳの条件であり、好ましくは５０℃、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳの条件であり、さらに好ましくは、６５℃、０．１×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳの条件である。これらの条件において、温度を上げる程に高い相同性を有するＤＮＡが効率的に得られることが期待できる。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度や塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
さらに本発明は、本発明のプロモーターの下流に、外来遺伝子およびターミネーターが機能的に連結した構造を有するＤＮＡを提供する。本発明において外来遺伝子とは、特に制限されず、所望の遺伝子を用いることができる。
また、本発明のターミネーターとは、通常、植物由来ターミネーター（植物ターミネーター）を言い、本発明の植物組識特異的な発現を制御するプロモーター領域に隣接して配置されるＤＮＡ配列であり、例えば、カリフラワーモザイクウイルス由来のターミネーター、あるいはノパリン合成酵素遺伝子由来のターミネーター等を例示することができるが、ターミネーターとしての機能を有するものであれば、これらに特に制限されない。
本発明において「機能的に連結」とは、プロモーターの下流の外来遺伝子がプロモーターからの転写を受けるように該プロモーターと結合している状態、あるいは、ターミネーターによって外来遺伝子の発現が終結するように外来遺伝子がターミネーターと結合した状態を指す。プロモーター、外来遺伝子およびターミネーターを「機能的に連結」させることは、当業者においては一般的な遺伝子工学技術を用いて、簡便に行い得ることである。
また、本発明のプロモーターの一例としては、上記（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載のＤＮＡからなるプロモーター活性を有するＤＮＡを挙げることができる。プロモーター活性は、当業者においては公知の方法（例えば、後述のレポーター遺伝子を用いて該遺伝子の発現を指標に測定する方法）によって適宜、評価することができる。
さらに本発明は、上記本発明のプロモーターを含むベクター、本発明のプロモーターの下流に遺伝子挿入部位およびターミネーターを含むベクター、並びに、本発明の上記ＤＮＡを含むベクターを提供する。
本発明のベクターは、通常、本発明のプロモーターを植物細胞内で複製可能なベクターに挿入したものである。この複製可能なベクターとしては、公知の種々のベクターを用いることができる。例えば、ｐＵＣ誘導体などの大腸菌で増幅可能なベクター、ｐＰＺＰ２Ｈ−ｌａｃなどの大腸菌とアグロバクテリウムの双方で増幅可能なシャトルベクターなどが挙げられる。また、植物ウイルス、例えば、カリフラワーモザイクウイルスを利用することもできる。当業者においては、植物細胞内で複製可能なベクターを、各々の宿主細胞に応じて適宜選択することができる。なお、本発明のプロモーターをベクターに挿入する方法は、通常の遺伝子をベクターに挿入する常法に従う。
また本発明は、本発明のプロモーター、本発明のＤＮＡ、または本発明のベクターを含む形質転換細胞を提供する。
本発明の細胞は、特に制限されるものではないが、好ましくは微生物細胞あるいは植物細胞である。
本発明の形質転換植物細胞は、本発明のＤＮＡもしくはベクターを宿主細胞に導入し、形質転換させた植物細胞である。宿主細胞としては、例えば葉、根、茎、花および種子中の胚盤等の植物細胞、カルス、懸濁培養細胞等が挙げられる。細胞の由来する植物種としては、特に制限されるものではないが、例えば、シロイヌナズナ、タバコ、ペチュニア、コムギ、イネ、トウモロコシ、ダイズ、ナタネ、ダイコン、テンサイ、カボチャ、キュウリ、トマト、ワタなどが挙げられる。尚、本発明における好ましい例として、イネあるいはシロイヌナズナを挙げることができる。
また本発明は、本発明のプロモーター、本発明のＤＮＡまたはベクターを植物細胞へ導入し、該植物細胞から植物体を再生させる工程を含む、形質転換体の作製方法に関する。
本発明のＤＮＡもしくはベクターを宿主植物細胞中に導入するために、さまざまな手法を用いることができる。これらの手法には、形質転換因子としてアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）または、アグロバクテリウム・リゾゲネス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）を用いたＴ−ＤＮＡによる植物細胞の形質転換、プロトプラストへの直接導入（インジェクション法、エレクトロポレーション法など）、パーティクルガン法などや、その他の公知の方法が含まれる。
プロトプラストへの直接導入では、通常、特別に必要とされるベクターはない。例えば、ｐＵＣ誘導体のような単純なプラスミドを用いることができる。目的の遺伝子を植物細胞に導入する方法によっては、他のＤＮＡ配列が必要になることもある。例えばＴｉまたはＲｉプラスミドを植物細胞の形質転換に用いる場合には、ＴｉおよびＲｉプラスミドのＴ−ＤＮＡ領域の少なくとも右端の配列、大抵は両側の端の配列を、導入されるべき遺伝子の隣接領域となるように接続しなければならない。
アグロバクテリウム属菌を形質転換に用いる場合には、導入すべき遺伝子を、特別のプラスミド、すなわち中間ベクターまたはバイナリーベクターの中にクローニングする必要がある。中間ベクターはアグロバクテリウム属菌の中では複製されない。中間ベクターは、ヘルパープラスミドあるいはエレクトロポレーションによってアグロバクテリウム属菌の中に移行される。中間ベクターは、Ｔ−ＤＮＡの配列と相同な領域をもつため、相同的組換えによって、アグロバクテリウム属菌のＴｉまたはＲｉプラスミド中に取り込まれる。宿主として使われるアグロバクテリウム属菌には、ｖｉｒ領域が含まれている必要がある。通常ＴｉまたはＲｉプラスミドにｖｉｒ領域が含まれており、その働きにより、Ｔ−ＤＮＡを植物細胞に移行させることができる。
一方、バイナリーベクターはアグロバクテリウム属菌の中で複製、維持され得るので、ヘルパープラスミドあるいはエレクトロポレーション法あるいは凍結溶解法によってアグロバクテリウム属菌中に取り込まれると、宿主のｖｉｒ領域の働きによって、バイナリーベクター上のＴ−ＤＮＡを植物細胞に移行させることができる。
なお、このようにして得られた中間ベクターまたはバイナリーベクター、およびこれを含む大腸菌やアグロバクテリウム属菌等の微生物も本発明の対象である。
また、本発明のＤＮＡもしくはベクターの導入によって形質転換された植物細胞を効率的に選択するために、上記ベクターは、適当な選抜マーカー遺伝子を含む、もしくは選抜マーカー遺伝子を含むプラスミドベクターとともに植物細胞へ導入することが好ましい。この目的に使用される選抜マーカー遺伝子は、例えば、抗生物質ハイグロマイシン耐性であるハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、カナマイシンまたはゲンタマイシン耐性であるネオマイシンホスホトランスフェラーゼ、および除草剤ホスフィノスリシン耐性であるアセチルトランスフェラーゼ遺伝子等を挙げることができる。
上記ベクターを導入した植物細胞は、導入した選抜マーカーに応じた選抜用薬剤を含む選抜用培地に置床し培養する。これにより、形質転換された植物細胞を得ることができる。
本発明の形質転換植物体とは、本発明の形質転換植物細胞から再生された形質転換植物体である。形質転換された植物細胞から個体を再生する方法は植物細胞の種類により異なるが、例えばイネではＦｕｊｉｍｕｒａら（Ｆｕｊｉｍｕｒａら（１９９５），ＰｌａｎｔＴｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｌｅｔｔ．，ｖｏｌ．２：ｐ７４−）の方法、トウモロコシでは、Ｓｈｉｌｌｉｔｏら（Ｓｈｉｌｌｉｔｏら（１９８９），Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．７：ｐ５８１−）の方法、ジャガイモでは、Ｖｉｓｓｅｒら（Ｖｉｓｓｅｒら（１９８９），Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．，ｖｏｌ．７８：ｐ５８９−）の方法、シロイヌナズナではＡｋａｍａらの方法（Ａｋａｍａら（１９９２），Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．，ｖｏｌ．１２：ｐ７−）が挙げられる。これらの方法により作出された形質転換植物体またはその繁殖材料（例えば種子、果実、塊茎、切穂、塊根、株、カルス、プロトプラストなど）から得た形質転換植物体も本発明の対象である。一旦、染色体内に本発明のプロモーター（ＤＮＡ）が導入された形質転換植物体が得られれば、該植物体から有性生殖または無性生殖により子孫を得ることが可能である。また、該植物体やその子孫あるいはクローンから繁殖材料を得て、それらを基に該植物体を量産することも可能である。
本発明の植物体を作製する方法の好ましい態様においては、本発明のＤＮＡまたはベクターを宿主細胞に導入して形質転換植物細胞を得て、該形質転換植物細胞から形質転換植物体を再生し、得られた形質転換植物体から植物種子を得て、該植物種子から植物体を生産する工程を含む。
形質転換植物体から植物種子を得る工程とは、例えば、形質転換植物体を発根培地から採取し、水を含んだ土を入れたポットに移植し、一定温度下で生育させて、花を形成させ、最終的に種子を形成させる工程をいう。また、種子から植物体を生産する工程とは、例えば、形質転換植物体上で形成された種子が成熟したところで、単離して、水を含んだ土に播種し、一定温度、照度下で生育させることにより、植物体を生産する工程をいう。
本発明の植物プロモーターは、例えば、以下のようにして作製し、利用することができる。なお、実験手法に関しては、特に記載のない限り、「クローニングとシークエンス」（渡辺格監修、杉浦昌弘編集、農村文化社（１９８９年））や、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）」などの実験書に従う。
本発明のＤＮＡには、天然あるいは単離・精製されたゲノムＤＮＡ、および化学合成ＤＮＡが含まれる。ゲノムＤＮＡの調製は、当業者にとって常套手段を利用して行うことが可能である。
本発明のＤＮＡは、目的とする植物、例えば、イネの組織よりゲノムＤＮＡを抽出し精製し、得られたＤＮＡを鋳型としてＰＣＲによって単離することができる。
本発明における、配列番号：１または３に記載の塩基配列からなるＤＮＡ、およびこれとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ根特異的発現を示すプロモーターを単離するためには、例えば、配列番号：１または３に記載の塩基配列からなるＤＮＡ上の配列であって、本発明のプロモーターを増幅するためのプライマー対を用いることができる。このプライマー対を用いて、植物のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、その後、得られた増幅ＤＮＡ断片をプローブとして用いて、同じ植物のゲノムライブラリーをスクリーニングすることができる。そのようなプライマー対の例として、正方向プライマー（ｎａｓ１Ｆ１２ｓ；５’−ＴＧＧＣＣＧｃｇｇｇｔｇａｃａｃｇｇｔｇｔｔａｃｔｃ−３’（配列番号：５））と、逆方向プライマー（ＮＡＳ２Ｒｘ；５’−ｇｇｔｃｔａｇａｃｔｇｔｇａａｇｃｔｔｔｇｔｃｇｃｇｇｔ−３’（配列番号：６））との組合せ、あるいは正方向プライマー（ＮＡＳ２ Ｆｓ；５’−ｔｇｇｃｃｇｃｇｇａｇａｇｃａｇｇａｃａａｃａａｃｔｃ−３’（配列番号：７））と、逆方向プライマー（ＮＡＳ２Ｒｘ；５’−ｇｇｔｃｔａｇａｃｔｇｔｇａａｇｃｔｔｔｇｔｃｇｃｇｇｔ−３’（配列番号：６））との組合せが挙げられる。
ＰＣＲは、市販のキットおよび装置の製造者の指針に基づいて行うか、当業者に周知の手法で行い得る。遺伝子ライブラリーの作製法、および遺伝子のクローニング法なども当業者に周知である。例えば、「クローニングとシークエンス」（渡辺格監修、杉浦昌弘編集、農村文化社（１９８９年））や、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）」などの実験書を参照のこと。得られた遺伝子の塩基配列は、当該分野で公知のヌクレオチド配列解析法または市販されている自動シーケンサーを利用して決定し得る。ＰＣＲ技術やハイブリダイゼーション技術によって単離し得る、配列番号：１または３に記載の塩基配列からなるＤＮＡとハイブリダイズするＤＮＡもまた、本発明のＤＮＡに含まれる。
上記のようなスクリーニングによって単離および同定されたプロモーター（すなわち、配列番号：１または３に示されるプロモーター、およびホモログ）が根特異的遺伝子発現誘導性を示すことは、以下のようにして解析することが可能である。
上記の配列を、例えば、ＧＦＰなどのレポーター遺伝子の上流に連結し、ｐＰＺＰ２Ｈ−ｌａｃなどのベクターに組み込む。レポーター遺伝子としては、ＧＦＰ遺伝子の他にクロラムフェニコール アセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子や、ルシフェラーゼ（ＬＵＣ）遺伝子、ベータ グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子なども利用が可能である。
上記のようにして作成されたキメラ遺伝子構築物は、例えば、アグロバクテリウムを介してシロイヌナズナなどの植物に導入してその機能を解析することが可能である。ｐＰＺＰ２Ｈ−ｌａｃをベクターとして用いた場合は、キメラ遺伝子を含む組換えプラスミドを、例えば、アグロバクテリウム・ツメファシエンスのＥＨＡ１０１株に凍結溶解法を用いて導入し、得られた形質転換菌を、例えば、減圧浸潤法（島本功ら監修、「モデル植物の実験プロトコール」（植物細胞工学別冊、植物細胞工学シリーズ４）秀潤社１９９６年４月発行）によりシロイヌナズナなどの植物体に感染させる。感染処理した植物より得られた種子を、ハイグロマイシンなど用いたベクターに適した薬剤を含む培地に播種し、得られた薬剤耐性個体を用いてＧＦＰ遺伝子の発現について解析する。蛍光顕微鏡で観察することにより、ＧＦＰの蛍光が根で特異的に検出されることが期待される。
本発明のプロモーターまたはそれを含む発現ベクターは、以下のようにして利用することが可能である。本発明のプロモーターの下流に目的の遺伝子、例えば、養分のトランスポーター遺伝子を連結したキメラ遺伝子を、例えば、ｐＰＺＰ２Ｈ−ｌａｃに挿入し発現ベクターを構築する。このベクターをアグロバクテリウムを介してイネなどの植物体に導入する。得られた形質転換植物においては、本発明のプロモーターの働きにより根において養分のトランスポーター遺伝子が特異的に発現し、養分を効率的に取り込むことができるようになることが期待される。この場合、３５Ｓプロモーターのように不要な組織においても発現することがないため、他の好ましくない形質が現れないことが期待される。
本発明のプロモーターで制御可能な遺伝子（外来遺伝子）としては、上記のトランスポーター遺伝子に限定されない。根において特異的に発現させることに意義のあるあらゆる遺伝子に応用が可能である。
また、本発明のプロモーターに他の発現制御配列を連結して本発明のプロモーターの機能を改変することが可能である。このような発現制御配列としては、エンハンサー配列やリプレッサー配列、インスレーター配列などが挙げられる。例えば薬剤に応答して抑制が解除されるリプレッサー配列を本発明のプロモーターと連結したキメラプロモーターを作成し、その下流に目的の遺伝子を連結した構築物を植物に導入すると、得られた形質転換体では、薬剤が存在しない条件下では目的遺伝子の発現が抑制されているが、薬剤を投与することによって抑制が解除され、目的遺伝子が根で発現するようになることが期待される。
なお、本発明における植物細胞の形質転換方法としては、上記のアグロバクテリウムを介した方法の他に、プロトプラストに電気パルス処理してプラスミドを植物細胞へ導入するエレクトロポレーション法や、小細胞、細胞、リソソームなどとプロトプラストとの融合法、マイクロインジェクション法、ポリエチレングリコール法、あるいは、パーティクルガン法などの方法が挙げられる。
また、植物ウイルスをベクターとして利用することによって、目的遺伝子を植物体に導入することができる。利用可能な植物ウイルスとしては、例えば、カリフラワーモザイクウイルスが挙げられる。すなわち、まず、ウイルスゲノムを大腸菌由来のベクターなどに挿入して組換え体を調製した後、ウイルスのゲノム中に、これらの目的遺伝子を挿入する。このようにして修飾されたウイルスゲノムを制限酵素によって該組換え体から切り出し、植物体に接種することによって、これらの目的遺伝子を植物体に導入することができる（Ｈｏｈｎら（１９８２）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｔｕｍｏｒｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）ｐｐ５４９、米国特許第４，４０７，９５６号）。
また本発明は、植物の根において外来遺伝子を発現させる方法を提供する。本方法の好ましい態様においては、本発明のプロモーターの下流に外来遺伝子および植物ターミネーターが機能的に連結した構造を有するＤＮＡを、植物へ導入する工程を含む方法である。本方法においては、該ＤＮＡを、植物細胞へ導入し、該細胞を植物へ再生させることによっても行うことができる。該ＤＮＡの植物もしくは植物細胞への導入は、上述の方法によって実施することができる。
さらに本発明は、被験化合物について、本発明のプロモーター活性を有するＤＮＡ（例えば、配列番号：１または３に記載の塩基配列からなるＤＮＡ）のプロモーター活性を調節するか否かを評価する方法を提供する。この評価方法は、本発明のプロモーターの活性を有するＤＮＡのプロモーター活性を調節する化合物のスクリーニング方法に利用することができる。
本発明の評価方法に用いられる被検化合物としては、特に制限はなく、例えば、天然化合物、有機化合物、無機化合物、タンパク質、ペプチド等の単一化合物、並びに、化合物ライブラリー、遺伝子ライブラリーの発現産物、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物、原核細胞抽出物、真核単細胞抽出物もしくは動物細胞抽出物等を挙げることができる。
この方法においては、まず、本発明のプロモーター活性を有するＤＮＡとレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するＤＮＡを含む細胞または細胞抽出液と、被験化合物を接触させる。
本発明において、「機能的に結合した」とは、本発明のプロモーター活性を有するＤＮＡに転写因子が結合することにより、レポーター遺伝子の発現が誘導されるように、本発明のプロモーター活性を有するＤＮＡとレポーター遺伝子とが結合していることをいう。本方法における「本発明のプロモーター活性を有するＤＮＡとレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するＤＮＡを含む細胞」として、例えば、上記ＤＮＡを含むベクターを導入した細胞を挙げることができる。該ベクターは、当業者に周知の方法により作製することができる。ベクターの細胞への導入は、一般的な方法、例えば、リン酸カルシウム沈殿法、電気パルス穿孔法、リポフェクタミン法、マイクロインジェクション法等によって実施することができる。
また、「本発明のプロモーター活性を有するＤＮＡとレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するＤＮＡを含む細胞」には、染色体に該ＤＮＡが挿入された細胞も含まれる。染色体へのＤＮＡの挿入は、当業者に一般的に用いられる方法、例えば、相同組み換えを利用した遺伝子導入法により行うことができる。
本方法における「本発明のプロモーター活性を有するＤＮＡとレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するＤＮＡを含む細胞抽出液」とは、例えば、市販の試験管内転写翻訳キットに含まれる細胞抽出液に、本発明のプロモーター活性を有するＤＮＡとレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するＤＮＡを添加したものを挙げることができる。
本方法における「接触」は、本発明のプロモーター活性を有するＤＮＡとレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するＤＮＡを含む細胞の培養液に被験化合物を添加する、または該ＤＮＡを含む上記の市販された細胞抽出液に被験化合物を添加することにより行うことができる。被験化合物がタンパク質の場合には、例えば、該タンパク質をコードするＤＮＡを含むベクターを、該細胞へ導入する、または該ベクターを該細胞抽出液に添加することで行うことも可能である。
本方法においては、次いで、該レポーター遺伝子の発現レベルを測定する。レポーター遺伝子の発現レベルは、当業者においては、該レポーター遺伝子の種類を考慮して、測定することができる。
本方法においては、被験化合物の非存在下において測定した場合と比較して、被験化合物がレポーター遺伝子の発現レベルを変化させた場合に、被験化合物が本発明のＤＮＡのプロモーター活性を調節したと判定される。
さらに、本発明においては、上記評価方法を利用して、複数の被験化合物について、本発明のＤＮＡのプロモーター活性を調節するか否かを評価し、プロモーター活性を調節する化合物を選択することにより、効率的にプロモーター活性を調節する化合物をスクリーニングすることができる。該スクリーニング方法によって取得される化合物は、遺伝子の根特異的な発現を制御することが可能であり、非常に有用である。
【図面の簡単な説明】
図１は、配列番号：１または３に示したニコチアナミンシンターゼ遺伝子のプロモーター部分を切り出し、ｐｂｌｕｅ−ｓＧＦＰ（Ｓ６５Ｔ）−ＮＯＳ ＳＫに含まれる緑色蛍光タンパク（ＧＦＰ）遺伝子の上流に連結することによって構築したプラスミドの遺伝子地図と、そのプラスミドからプロモーター：ＧＦＰ：ターミネーターのひとつながりを切り出し、植物用バイナリーベクターであるｐＰＺＰ２Ｈ−ｌａｃのマルチクローニングサイトに挿入することによって構築したプラスミドの遺伝子地図を示した図である。
図２（Ａ）は、本実施例のＤＮＡ断片を上流（５’側）から削ったＤＮＡ断片のシリーズを作製しそれぞれをベクターに連結した図である。図２（Ｂ）は、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターのミニマムプロモーターに本実施例のＤＮＡ断片の一部を連結した図である。
図３は、シロイヌナズナにおける本発明のプロモーターによる遺伝子の発現結果を検証する写真である。（１）ニコチアナミンシンターゼ１遺伝子プロモーター、および（２）ニコチアナミンシンターゼ２遺伝子プロモーターでＧＦＰ遺伝子を発現させた形質転換シロイヌナズナの根を蛍光顕微鏡によって撮影した蛍光像である。ニコチアナミンシンターゼ１遺伝子プロモーターでは特に光っている部位は観察されないが、ニコチアナミンシンターゼ２遺伝子プロモーターでは主に根毛の出る表皮細胞が光っている。
図４は、イネにおける本発明のプロモーターによる遺伝子の発現結果を検証する写真である。（１）ニコチアナミンシンターゼ１遺伝子プロモーター、および（２）ニコチアナミンシンターゼ２遺伝子プロモーターでＧＦＰ遺伝子を発現させた形質転換イネの根を蛍光顕微鏡によって撮影した蛍光像である。（３）ニコチアナミンシンターゼ１遺伝子プロモーターでＧＦＰ遺伝子を発現させた形質転換イネの全体像を左側の写真は通常光下で、右側の写真は青色光下で撮影したものを示す。主に根でのみ蛍光が観察され、葉では蛍光が観察されない。
【発明を実施するための最良の形態】
以下に本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。なお、ゲノムＤＮＡの調製、ｍＲＮＡの調製、ＤＮＡの切断、連結、大腸菌の形質転換、遺伝子の塩基配列決定等一般の遺伝子組換えに必要な方法は、特に記載のない限り、各操作に使用する市販の試薬、機器装置等に添付されている説明書や、実験書（例えば「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）」）に基本的に従った。
〔実施例１〕 根特異的発現をする遺伝子の探索
（ａ）ｃＤＮＡライブラリーの作成
イネの様々な部位からそれぞれｃＤＮＡライブラリーを作成した。ライブラリーの作成は（Ｏｋｕｂｏ ｅｔ ａｌ．Ｌａｒｇｅ ｓｃａｌｅ ｃＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｆｏｒ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ａｎｄ ｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅ ａｓｐｅｃｔｓ ｏｆ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．ｎａｔｕｒｅ ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２：１７３−１７９（１９９２））に基本的に従って行った。根から作成したｃＤＮＡライブラリーから３３３４個のクローンを単離、根以外の組織から作成したｃＤＮＡライブラリーからは８８７５個のクローンを単離して塩基配列を決定した。塩基配列の決定には、ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔ Ｐｒｅ−Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（ＵＳＢ）とＤＹＥｎａｍｉｃ ＥＴ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ ｆｏｒ ＭｅｇａＢＡＣＥ（ａｍａｅｒｓｈａｍ ｐｈａｒｍａｃｉａ ｂｉｏｔｅｃｈ）で反応を行い、ＭｅｇａＢＡＣＥ１０００を用いて行った。
それらのクローンを塩基配列によるクラスタリングにより、グループ分けをし、根由来のライブラリーに９個のクローンが出現し、根以外の組織由来のライブラリーには１個のクローンも含まれていなかったグループと、根由来のライブラリーに２個のクローンが出現し、根以外の組織由来のライブラリーには１個のクローンも含まれていなかったグループとを選択した。
これらのグループの塩基配列をＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬデータベースを元にＢＬＡＳＴプログラムを用いてホモロジー検索を行ったところ、これらのグループがニコチアナミンシンターゼ１遺伝子、およびニコチアナミンシンターゼ２遺伝子に由来していることが判明した。
〔実施例２〕 ニコチアナミンシンターゼ遺伝子のプロモーター領域の単離
公知のイネニコチアナミンシンターゼ遺伝子の配列（アクセッション番号：ＡＢ０４６４０１）に基づいて３種類のプライマー（（ＮＡＳ２Ｒｘ；５’−ｇｇｔｃｔａｇａｃｔｇｔｇａａｇｃｔｔｔｇｔｃｇｃｇｇｔ−３’（配列番号：６）、ＮＡＳ１ Ｆ１２ｓ；５’−ＴＧＧＣＣＧｃｇｇｇｔｇａｃａｃｇｇｔｇｔｔａｃｔｃ−３’（配列番号：５）およびＮＡＳ２ Ｆｓ；５’−ｔｇｇｃｃｇｃｇｇａｇａｇｃａｇｇａｃａａｃａａｃｔｃ−３’（配列番号：７））を合成した。ＮＡＳ１ Ｆ１２ｓとＮＡＳ２ Ｆｓは、正方向プライマーであり、５’末端側に制限酵素ＳａｃＩＩ部位（ｃｃｇｃｇｇ）を有する。ＮＡＳ２Ｒｘは、逆方向プライマーであり、５’末端側に制限酵素ＸｂａＩ部位（ｔｃｔａｇａ）を有する。ＮＡＳ１ Ｆ１２ｓとＮＡＳ２Ｒｘのプライマー対を用いると、ニコチアナミンシンターゼ１遺伝子の翻訳開始点より上流１１９１ｂｐが増幅される。また、ＮＡＳ２ ＦｓとＮＡＳ２Ｒｘのプライマー対を用いると、ニコチアナミンシンターゼ２遺伝子の翻訳開始点より上流２１２４ｂｐが増幅される。
常法に従って、イネ（品種；日本晴）のゲノムＤＮＡを調製した。上記のプライマー対を用い、このＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、増幅ＤＮＡ断片を得た。増幅されたＤＮＡを、制限酵素による切断と、あるいは常法に従って塩基配列決定により目的の部位が増幅されたことを確認した。
〔実施例３〕 ニコチアナミンシンターゼ遺伝子のプロモーター領域活性検定用ベクターの作成
まず、ベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に、植物体内で強い蛍光を発する緑色蛍光タンパク質の変異型ｓＧＦＰ（Ｓ６５Ｔ）（丹羽康夫：植物細胞工学シリーズ４、モデル植物の実験プロトコール、ｐｐ１１７−１２１、秀潤社、１９９６）とＮｏｓターミネーターを組み込んだプラスミドであるｐｂｌｕｅ−ｓＧＦＰ（Ｓ６５Ｔ）−ＮＯＳ ＳＫ（丹羽康夫博士 静岡県立大学大学院より分与）に、ＰＣＲによって得られたＤＮＡ断片を組み込んだプラスミドを作成した（図１）。さらにこのプラスミドをＳａｃＩとＫｐｎＩで切断し、バイナリーベクターであるｐＰＺＰ２Ｈ−ｌａｃ（矢野昌裕博士 農業生物資源研究所より分与）（Ｆｕｓｅ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １８（３）：２１９−２２２）のマルチクローニングサイトにプロモーター領域−ＧＦＰ−Ｎｏｓターミネーターのひとつながりの配列を挿入することで、プロモーター領域の活性を検定するための植物形質転換用バイナリーベクターを完成させた（図１）。
〔実施例４〕 植物への遺伝子導入
作成したベクターは凍結解凍法によりアグロバクテリウム・ツメファシエンス菌ＥＨＡ１０１に導入した。凍結解凍法とは凍結したＥＨＡ１０１のコンピテントセルにプラスミド溶液を加え、３７℃で５分間保温する方法のことをいう。目的のベクターが導入された菌株を用いてシロイヌナズナ（品種：Ｃｏｌｕｍｂｉａ）とイネ（品種：日本晴）に遺伝子を導入した。
シロイヌナズナへの導入は、「減圧浸潤法による形質転換（荒木崇）」（植物細胞工学シリーズ４、モデル植物の実験プロトコール、ｐｐ１０９−１１３、秀潤社、１９９６）に記載の方法に基本的に従って行った。ただし、記載されている減圧の過程は省いて行った。
イネへの導入は、イネのカルス化と植物体の再生に関して、「イネのカルス形成と植物体再生（西村哲、島本功）」（植物細胞工学シリーズ１５、新版モデル植物の実験プロトコール、ｐｐ７８−８１、秀潤社、２００１）を参考に、アグロバクテリウムによる形質転換は、「アグロバクテリウムによる方法（横井修二、鳥山欽哉）」（植物細胞工学シリーズ１５、新版モデル植物の実験プロトコール、ｐｐ７８−８１、秀潤社、２００１）を参考にして行った。
〔実施例５〕 植物体で発現したＧＦＰの観察
ＧＦＰの発現はシャーレにいれた寒天培地上で育てた植物体を、直接蛍光顕微鏡で観察することができる。蛍光顕微鏡はＩＸ−ＦＬＡ（オリンパス）で、Ｕ−ＭＮＩＢＡフィルターを用いて観察を行った。シロイヌナズナにおける蛍光像を図３に、イネにおける蛍光像を図４に示した。
〔実施例６〕 プロモーター領域の絞込み
プロモーターの活性領域を絞り込むために、図２の（Ａ）に示したようにプロモーター領域を上流側から段階的に欠損させたシリーズを作成した。ニコチアナミンシンターゼ１遺伝子のプロモーター領域の場合には、逆方向プライマーは５’末端側に制限酵素ＸｂａＩ部位（ｔｃｔａｇａ）を有するＮＡＳ２Ｒｘを用い、正方向プライマーは５’末端側に制限酵素ＳａｃＩＩ部位（ｃｃｇｃｇｇ）を有するプライマー（ＮＡＳ１ Ｆ０３１ｓ；５’−ＴＧＧＣＣＧｃｇｇｇａｇｔｇａｃｃａｔａｃｇｃｇａｇ−３’（配列番号：８）、ＮＡＳ１ Ｆ０１４ｓ；５’−ＴＧＧＣＣＧＣＧｇｃｔａｔａａｇｔａｔｃｃｃｃｔｔｔａｃａｇ−３’（配列番号：９））をそれぞれ用いて、ニコチアナミンシンターゼ１遺伝子の翻訳開始点より上流３１４、１４３塩基の断片を作成した。
同様にニコチアナミンシンターゼ２遺伝子のプロモーター領域の場合には、逆方向プライマーは５’末端側に制限酵素ＸｂａＩ部位（ｔｃｔａｇａ）を有するＮＡＳ２Ｒｘを用い、正方向プライマーは５’末端側に制限酵素ＳａｃＩＩ部位（ｃｃｇｃｇｇ）を有するプライマー（ＮＡＳ２ Ｆ１５ｓ；５’−ｔｇｇｃｃｇｃｇｇｃｃａｔｃｔｇａｔｃｔａｇｔａｇｃａｇｃ−３’（配列番号：１０）、ＮＡＳ２ Ｆ１０ｓ；５’−ＴＧＧＣＣＧＣｇｇａｇｔｃａｃｔａｃａｔｔａｔｇｇａｇｔａ−３’（配列番号：１１）、ＮＡＳ２ Ｆ０５ｓ；５’−ｔｇｇｃｃｇｃｇｇａｔｃａａａｃｔａｃｔｇｔａａａａｇｇ−３’（配列番号：１２）、ＮＡＳ２ Ｆ０３ｓ；５’−ｔｇｇｃｃｇｃｇｇａａａａｔｇｔｃｇｔｃｃｔｃｔｔｃａａｃ−３’（配列番号：１３）、ＮＡＳ２ Ｆ０２６ｓ；５’−ｔｇｇｃｃｇｃｇｇｃｃｔｃａｔｔｇｇｇｔａｔｇｃａｃｇｃａ−３’（配列番号：１４）、ＮＡＳ２ Ｆ０１６ｓ；５’−ｔｇｇｃｃｇｃｇｇｃａａｔｔｃｔｃｃｔｇｃｔａｔａｔａｔｔｇ−３’（配列番号：１５）、ＮＡＳ２ Ｆ０２１ｓ；５’−ＴＧＧＣＣＧＣＧｇｃａｔａａｔｇｃｇｔｔｃｃａｃａｔｔｃｔｔ−３’（配列番号：１６））をそれぞれ用いて、ニコチアナミンシンターゼ２遺伝子の翻訳開始点より上流１５３０、１０１５、５４９、３１０、２５６、２０７塩基の断片を作成した。
これらのＤＮＡ断片とＧＦＰ遺伝子を連結させたキメラ遺伝子構築物（図２のＡの▲２▼、▲３▼、▲５▼、▲６▼、▲７▼、▲８▼、▲９▼、▲１０▼）をシロイヌナズナの植物体に導入した。
その結果、▲２▼、▲３▼を導入したイネとシロイヌナズナでは光っている部位は観察されなかった。このことから、８７８塩基からなる断片（配列表の配列番号：３の１番目から８７８番目までの配列からなる断片）の一部、または全部がイネの根で特異的な発現をするプロモーターのシス領域として必須であることを突き止めた。また、▲５▼、▲６▼、▲７▼、▲８▼を導入したイネとシロイヌナズナでは▲４▼と同様に主に根の表皮細胞が特異的に光っているのが観察され、▲９▼、▲１０▼を導入したイネとシロイヌナズナでは光っている部位は観察されなかった。このことから、５５塩基からなる断片（配列表の配列番号：２の１８１４番目から１８６８番目までの配列からなる断片）の一部、または全部がイネとシロイヌナズナの根の表皮で発現をするプロモーターのシス領域として必須であることを突き止めた。
〔実施例７〕 根特異的発現の機能獲得実験
単離したプロモーター領域が所与の遺伝子発現制御をもたらすのに十分であることを確かめるために、カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓ最小プロモーターの上流に、配列表の配列番号：２の１８１５番目から１９６４番目までの配列からなる１５０塩基の断片を連結したキメラ遺伝子構築物（図２のＢの▲８▼）を作成した。
キメラ遺伝子構築物の作成方法を以下に記す。公知のＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの配列（アクセッション番号：Ｕ２８４１７）に基づいて一対のプライマー（３５ｓＦｘｓｓ２；５’−ｇｃｔｃｔａｇａｔａｃｇｔａｃｔａｇｔｃｇｃａａｇａｃｃｃｔｔｃｃｔｃｔａｔａｔ−３’（配列番号：１７）および３５ｓＲｂ；５’−ｃｇｇｇａｔｃｃｔｃｔｃｃａａａｔｇａａａｔｇａａｃｔｔｃｃ−３’（配列番号：１８））を合成し、４７塩基の最小プロモーターを単離した。
３５ｓＦｘｓｓ２は、正方向プライマーであり、５’末端側に制限酵素ＸｂａＩ、ＳｎａＢＩ、およびＳｐｅＩ部位を有する。３５ｓＲｂは、逆方向プライマーであり、５’末端側に制限酵素ＢａｍＨＩ部位を有する。ｐｂｌｕｅ−ｓＧＦＰ（Ｓ６５Ｔ）−ＮＯＳ ＳＫに、ＰＣＲによって得られたＤＮＡ断片をＸｂａＩとＢａｍＨＩで切断して組み込みキメラ遺伝子構築物▲１１▼を作成した（図２−Ｂ）。
次に公知のイネニコチアナミンシンターゼ２遺伝子の配列（アクセッション番号：ＡＢ０４６４０１）に基づいて一対のプライマー（ＮＡＳ２Ｆ１５０ｘ；５’−ｔｇｇｔｃｔａｇａａａａｔｇｔｃｇｔｃｃｔｃｔｔｃａａｃ−３’（配列番号：１９）およびＮＡＳ２Ｒ１５０ｓ；５’−ｔｇｇａｃｔａｇｔｃａａａｇａｔｔｇｇｃｔａａａａｇｃｇｔａｇ−３’（配列番号：２０））を合成した。ＮＡＳ２Ｆ１５０ｘは、正方向プライマーであり、５’末端側に制限酵素ＸｂａＩ部位を有する。ＮＡＳ２Ｒ１５０ｓは、逆方向プライマーであり、５’末端側に制限酵素ＳｐｅＩ部位を有する。このプライマー対を用いると、配列表の配列番号：２の１８１５番目から１９６４番目までの配列からなる１５０ｂｐの断片がＰＣＲによって増幅される。
キメラ遺伝子構築物▲１１▼にＰＣＲによって得られたＤＮＡ断片をＸｂａＩとＳｐｅＩで切断して組み込みキメラ遺伝子構築物▲１２▼を作成した（図２−Ｂ）。
実施例３と同様にして、これらのキメラ遺伝子構築物▲１１▼、▲１２▼をｐＰＺＰ２Ｈ−ｌａｃに組みこみ、バイナリーベクターとしてからイネとシロイヌナズナに導入したところ、▲１１▼を導入したイネとシロイヌナズナでは全く光っている部位が見つからなかったのに対し、▲１２▼を導入したイネとシロイヌナズナでは▲４▼、▲５▼、▲６▼、▲７▼、▲８▼の場合と同様に根の表皮細胞が特異的に光っているのが観察されたことから、単離したプロモーターが所与の遺伝子発現制御をもたらすのに機能的に十分であることが裏付けられた。
【産業上の利用の可能性】
本発明により、植物の根で特異的に遺伝子の発現を制御するのに有用なプロモーターとして機能するＤＮＡ、該プロモーターを含む発現ベクター、該発現ベクターを導入した形質転換細胞および形質転換植物体、更には該プロモーターの制御下にある遺伝子の発現量を調節する方法が提供される。
形質転換植物体において、本発明のプロモーターを機能させることにより、根に目的遺伝子を発現させることができる。目的遺伝子としては、あらゆる遺伝子の選択が可能である。
根の表皮は外部の環境と直接接する部位であり、例えば外部より水や養分の吸収をする部位であり、あるいは外部に物質を放出する部位であり、あるいは病原菌や病害虫からの攻撃を受ける部位であることから、作物の改変にあたって重要な役割を果たすと考えられる。
例えば本発明のプロモーターの制御下で養分のトランスポーター遺伝子を発現、あるいは抑制することで、養分吸収を増やす、あるいは減らすことができる可能性がある。また、例えばアレロパシー成分を放出させることで他の植物の成長を抑制したり、あるいは、耐虫性、耐病性遺伝子などを発現することで、線虫抵抗性、耐病性などの性質を得たりすることができる可能性がある。
また、単子葉植物であるイネから単離したプロモーターだが、双子葉植物であるシロイヌナズナでも活性が確認されたことから、幅広い植物種において利用可能である可能性が高い。
更に、該プロモーターの制御下にある目的遺伝子の発現量を調節する方法によって、目的遺伝子の産物であるタンパク質やその働きによって細胞内で生じる物質を効率的に生産させることができ、この生産には、形質転換細胞あるいはその細胞からなる毛状根など組織の培養物、あるいは形質転換植物体の栽培収穫物が利用可能となる。
加えて、本発明のプロモーターに他の発現制御配列、例えば、薬剤に応答して抑制が解除されるリプレッサー配列などを連結することにより、薬剤に応答し、かつ特定の様式で遺伝子発現を誘導するプロモーターの構築が可能になる。
【配列表】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のＤＮＡを含むプロモーター。
（ａ）配列番号：１または３に記載の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列番号：１または３に記載の塩基配列において１もしくは複数の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなり、かつプロモーター機能を有するＤＮＡ
（ｃ）配列番号：１または３に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下にハイブリダイズし、かつプロモーター機能を有するＤＮＡ
【請求項２】
請求項１に記載のプロモーターの下流に、外来遺伝子および植物ターミネーターが機能的に連結した構造を有するＤＮＡ。
【請求項３】
請求項１に記載のプロモーターを含むベクター。
【請求項４】
請求項１に記載のプロモーターの下流に外来遺伝子挿入部位および植物ターミネーターを含む、請求項３記載のベクター。
【請求項５】
請求項２に記載のＤＮＡを含むベクター。
【請求項６】
請求項１に記載のプロモーター、請求項２に記載のＤＮＡ、または請求項３〜５のいずれかに記載のベクターを含む、形質転換細胞。
【請求項７】
微生物である、請求項６に記載の形質転換細胞。
【請求項８】
植物細胞である、請求項６に記載の形質転換細胞。
【請求項９】
請求項８に記載の細胞を含む、形質転換植物体。
【請求項１０】
請求項９に記載の形質転換植物体の子孫またはクローンである、形質転換植物体。
【請求項１１】
請求項９または１０に記載の形質転換植物体の繁殖材料。
【請求項１２】
請求項９または１０に記載の形質転換植物体の作製方法であって、請求項１に記載のプロモーター、請求項２に記載のＤＮＡ、または請求項３〜５のいずれかに記載のベクターを植物細胞へ導入し、該植物細胞から植物体を再生させる工程を含む方法。
【請求項１３】
植物の根において外来遺伝子を発現させる方法であって、請求項２に記載のＤＮＡ、または請求項４もしくは５に記載のベクターを該植物の細胞へ導入する工程を含む方法。
【請求項１４】
被験化合物について、請求項１に記載のＤＮＡのプロモーター活性を調節するか否かを評価する方法であって、
（ａ）請求項１に記載のＤＮＡとレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するＤＮＡを含む細胞または細胞抽出液と、被験化合物を接触させる工程、
（ｂ）該レポーター遺伝子の発現レベルを測定する工程、
を含み、被験化合物が該レポーター遺伝子の発現レベルを変化させた場合に、被験化合物が請求項１に記載のＤＮＡのプロモーター活性を調節すると判定される方法。
【請求項１５】
以下の工程（ａ）および（ｂ）を含む、請求項１に記載のＤＮＡのプロモーター活性を調節する化合物のスクリーニング方法。
（ａ）請求項１４に記載の評価方法により、被験化合物について、請求項１に記載のＤＮＡのプロモーター活性を調節するか否かを評価する工程
（ｂ）被験化合物から、該ＤＮＡのプロモーター活性を調節すると評価された化合物を選択する工程
【請求項１】
下記の（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のＤＮＡを含むプロモーター。
（ａ）配列番号：１または３に記載の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列番号：１または３に記載の塩基配列において１もしくは複数の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなり、かつプロモーター機能を有するＤＮＡ
（ｃ）配列番号：１または３に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下にハイブリダイズし、かつプロモーター機能を有するＤＮＡ
【請求項２】
請求項１に記載のプロモーターの下流に、外来遺伝子および植物ターミネーターが機能的に連結した構造を有するＤＮＡ。
【請求項３】
請求項１に記載のプロモーターを含むベクター。
【請求項４】
請求項１に記載のプロモーターの下流に外来遺伝子挿入部位および植物ターミネーターを含む、請求項３記載のベクター。
【請求項５】
請求項２に記載のＤＮＡを含むベクター。
【請求項６】
請求項１に記載のプロモーター、請求項２に記載のＤＮＡ、または請求項３〜５のいずれかに記載のベクターを含む、形質転換細胞。
【請求項７】
微生物である、請求項６に記載の形質転換細胞。
【請求項８】
植物細胞である、請求項６に記載の形質転換細胞。
【請求項９】
請求項８に記載の細胞を含む、形質転換植物体。
【請求項１０】
請求項９に記載の形質転換植物体の子孫またはクローンである、形質転換植物体。
【請求項１１】
請求項９または１０に記載の形質転換植物体の繁殖材料。
【請求項１２】
請求項９または１０に記載の形質転換植物体の作製方法であって、請求項１に記載のプロモーター、請求項２に記載のＤＮＡ、または請求項３〜５のいずれかに記載のベクターを植物細胞へ導入し、該植物細胞から植物体を再生させる工程を含む方法。
【請求項１３】
植物の根において外来遺伝子を発現させる方法であって、請求項２に記載のＤＮＡ、または請求項４もしくは５に記載のベクターを該植物の細胞へ導入する工程を含む方法。
【請求項１４】
被験化合物について、請求項１に記載のＤＮＡのプロモーター活性を調節するか否かを評価する方法であって、
（ａ）請求項１に記載のＤＮＡとレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するＤＮＡを含む細胞または細胞抽出液と、被験化合物を接触させる工程、
（ｂ）該レポーター遺伝子の発現レベルを測定する工程、
を含み、被験化合物が該レポーター遺伝子の発現レベルを変化させた場合に、被験化合物が請求項１に記載のＤＮＡのプロモーター活性を調節すると判定される方法。
【請求項１５】
以下の工程（ａ）および（ｂ）を含む、請求項１に記載のＤＮＡのプロモーター活性を調節する化合物のスクリーニング方法。
（ａ）請求項１４に記載の評価方法により、被験化合物について、請求項１に記載のＤＮＡのプロモーター活性を調節するか否かを評価する工程
（ｂ）被験化合物から、該ＤＮＡのプロモーター活性を調節すると評価された化合物を選択する工程
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０９２３８０
【国際公開日】平成１６年１０月２８日（２００４．１０．２８）
【発行日】平成１８年７月６日（２００６．７．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５０５３８４（Ｐ２００５−５０５３８４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／００５１６３
【国際出願日】平成１６年４月９日（２００４．４．９）
【出願人】（５０３０４４６１７）株式会社 植物ディー・エヌ・エー機能研究所 (7)
【出願人】（５００３０１３７１）株式会社植物ゲノムセンター (16)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１６年１０月２８日（２００４．１０．２８）
【発行日】平成１８年７月６日（２００６．７．６）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／００５１６３
【国際出願日】平成１６年４月９日（２００４．４．９）
【出願人】（５０３０４４６１７）株式会社 植物ディー・エヌ・エー機能研究所 (7)
【出願人】（５００３０１３７１）株式会社植物ゲノムセンター (16)
【Ｆターム（参考）】
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