イネ種子リポキシゲナーゼ３変異型遺伝子、並びにリポキシゲナーゼ３が欠失しているイネの選抜方法及び育種方法
【課題】イネ種子中のリポキシゲナーゼ３が欠失しているイネを、当代検定で簡易に選抜することにより、米の劣化が起こりにくく、貯蔵性が向上した米を得ること。
【解決手段】特定な配列の塩基配列からなるイネ種子リポキシゲナーゼ３変異型遺伝子。および、特定な配列の塩基配列からなるイネ種子リポキシゲナーゼ３遺伝子の５’側から第１４９７番目の塩基がアデニンに変異しているイネを、イネ種子のリポキシゲナーゼ３が欠失しているイネであると判定する選抜方法。
【解決手段】特定な配列の塩基配列からなるイネ種子リポキシゲナーゼ３変異型遺伝子。および、特定な配列の塩基配列からなるイネ種子リポキシゲナーゼ３遺伝子の５’側から第１４９７番目の塩基がアデニンに変異しているイネを、イネ種子のリポキシゲナーゼ３が欠失しているイネであると判定する選抜方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、イネ種子リポキシゲナーゼ３変異型遺伝子、並びにリポキシゲナーゼ３が欠失しているイネの選抜方法及び育種方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
イネの種子である米は、他の食品と比べて貯蔵が容易であるが、長期にわたって新鮮な状態を保って貯蔵することは困難であり、貯蔵期間の経過に伴って劣化が生じる。米の劣化は、糊粉層に含まれる脂質の酸化分解が原因とされ、脂質の酸化分解で生じた遊離脂肪酸がデンプンと結合することによって米の物性が低下し、遊離脂肪酸から生じた過酸化脂質が分解することによって古米臭が生じる。
【０００３】
米の劣化を防ぐ方法としては、脂質の酸化を抑えて貯蔵する方法が報告されている。例えば、１）玄米の状態で、１５℃程度の冷温で貯蔵する方法、２）籾の状態で貯蔵する方法、３）米の遊離脂肪酸量を測定し、遊離脂肪酸量が高い場合には精白して貯蔵する方法（特許文献１）、４）玄米を粉砕し、８０〜１６０℃で加熱した後に貯蔵する方法（特許文献２）、５）カプサイシンや二酸化塩素ガスで貯蔵米を殺虫・殺菌処理して米を貯蔵する方法（特許文献３及び４）などが挙げられる。
【０００４】
一方、リポキシゲナーゼは、脂質を過酸化する、ないしは脂質に酸素添加する作用を有する酵素であり、３種類のアイソザイムの存在が知られている。この中でも、リポキシゲナーゼ３は、米の胚芽中で検出されるリポキシゲナーゼ活性の８０〜９０％を占める主要なアイソザイムである。
【０００５】
【特許文献１】特開２０００−４７８４号公報
【特許文献２】特開２００５−３４１４７号公報
【特許文献３】特開平６−３８６７８号公報
【特許文献４】特開平１１−１６８９６９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、従来からの米の貯蔵方法に代えて、上記１）〜５）に記載の方法を実行するには、各方法に適した設備（冷却・保冷施設、籾貯蔵用のスペース等）や処理（遊離脂肪酸の測定、精白処理、加熱処理、殺虫・殺菌処理等）が必要であり、コスト、技術、及び時間の面で問題があった。
【０００７】
また、米の胚芽中で発現し、米の劣化に強く関与するイネ種子リポキシゲナーゼ３遺伝子及びその変異型遺伝子はこれまで同定されておらず、リポキシゲナーゼ３が欠失しているイネを選抜又は育種するには、イネ種子中に含まれるリポキシゲナーゼ３の活性、又はリポキシゲナーゼ３タンパク質の存在を指標に後代検定を行うしか方法がなかった。
【０００８】
そこで本発明は、イネ種子中のリポキシゲナーゼ３が欠失しているイネを、当代検定で簡易に選抜することにより、米の劣化が起こりにくく、貯蔵性が向上した米を得ることを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記目的を達成するため、本発明は、配列表の配列番号１記載の塩基配列からなるイネ種子リポキシゲナーゼ３変異型遺伝子を提供する。
【００１０】
本発明者らは、イネ種子中に存在するリポキシゲナーゼについて鋭意研究を重ねた結果、イネ種子中で特異的に発現し、米の劣化の原因なるイネ種子リポキシゲナーゼ３の遺伝子及びその変異型遺伝子を同定するに至った。これまでも、イネ種子で発現するリポキシゲナーゼ３遺伝子及びその変異型遺伝子を同定する試みはされてきたが、イネのリポキシゲナーゼには、少なくとも３つのアイソザイム（リポキシゲナーゼ１、２、及び３）が存在し、リポキシゲナーゼをコードする遺伝子は、ゲノム上に少なくとも２０種類以上存在することが予測されているため、これらの遺伝子を同定することは非常に困難であった。
【００１１】
上記のイネ種子リポキシゲナーゼ３変異型遺伝子が同定されたことにより、イネ種子における脂質の分解機構の解明がさらに進むと共に、上記のイネ種子リポキシゲナーゼ３変異型遺伝子をホモで保有するイネを育種素材として利用し、イネの種子中で発現する野生型のリポキシゲナーゼ３遺伝子を上記のイネ種子リポキシゲナーゼ３変異型遺伝子に置き換えたイネ系統及び品種を作出すれば、脂質の酸化・分解が抑制され、貯蔵性が向上した米を得ることができる。
【００１２】
本発明は、イネ種子中のリポキシゲナーゼ３が欠失しているイネの選抜方法であって、配列表の配列番号２記載の塩基配列からなるイネ種子リポキシゲナーゼ３遺伝子の５’側から第１４９７番目の塩基がアデニンに変異しているイネを、イネ種子中のリポキシゲナーゼ３が欠失しているイネであると判定する選抜方法を提供する。
【００１３】
上記選抜方法によれば、イネ種子リポキシゲナーゼ３遺伝子の５’側から第１４９７番目の塩基を調べることにより、米の劣化の起こりやすさや米の貯蔵性を判定でき、米の劣化が起こりにくく、貯蔵性に優れたイネの選抜及び育種を当代検定で行うことができる。
【００１４】
上記選抜方法は、被検イネからゲノムＤＮＡを抽出する抽出ステップと、配列表の配列番号３に示される塩基配列の第３１２８番目の塩基より５’側の塩基配列と相同な塩基配列の一部配列からなるプライマーと、配列表の配列番号３に示される塩基配列の第３１２８番目の塩基より３’側の塩基配列と相補的な塩基配列の一部配列からなるプライマーと、からなるプライマーセットで、ゲノムＤＮＡを鋳型にＤＮＡ断片を増幅する増幅ステップと、増幅ステップで増幅されたＤＮＡ断片中に制限酵素ＭｖａＩの認識配列がない場合に、イネ種子中のリポキシゲナーゼ３が欠失しているイネであると判定する判定ステップと、を備えることが好ましい。
【００１５】
上記選抜方法によれば、イネ種子リポキシゲナーゼ３遺伝子の塩基配列を調べることなく、ゲノムＤＮＡを鋳型として増幅されたＤＮＡ断片が制限酵素ＭｖａＩによって切断されるか否かを調べることによって、簡易に米の劣化の起こりやすさや米の貯蔵性を判定できる。
【００１６】
また、上記選抜方法は、被検イネからゲノムＤＮＡを抽出する抽出ステップと、配列表の配列番号３に示される塩基配列の第３１２８番目の塩基より５’側の塩基配列と相同な塩基配列の一部配列からなるプライマーと、配列表の配列番号３に示される塩基配列の第３１２８番目の塩基より３’側の塩基配列と相補的な塩基配列の一部配列からなるプライマーと、からなるプライマーセットで、ゲノムＤＮＡを鋳型にＤＮＡ断片を増幅する増幅ステップと、増幅ステップで増幅されたＤＮＡ断片を膜に固定する固定ステップと、配列表の配列番号３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて第３１２８番目の塩基を含む連続した塩基配列からなる標識オリゴヌクレオチドと、配列表の配列番号４に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて第３１２５番目の塩基を含む連続した塩基配列からなる非標識オリゴヌクレオチドと、を混合した混合プローブを、膜に固定されたＤＮＡ断片にハイブリダイズさせるハイブリダイゼーションステップと、このＤＮＡ断片にハイブリダイズした標識オリゴヌクレオチドからのシグナルを検出する検出ステップと、検出ステップで標識オリゴヌクレオチドからのシグナルが検出されない場合に、イネ種子中のリポキシゲナーゼ３が欠失しているイネであると判定する判定ステップと、を備えることが好ましい。
【００１７】
上記選抜方法によれば、イネ種子リポキシゲナーゼ３遺伝子の塩基配列を調べたり、ゲノムＤＮＡを鋳型として増幅されたＤＮＡ断片を制限酵素で切断したりすることなく、ドットブロッティング法又はサザンブロッティング法等の手段によって、より簡易に米の劣化の起こりやすさや米の貯蔵性を判定できる。
【００１８】
また本発明は、イネ種子中のリポキシゲナーゼ３が欠失しているイネの育種方法であって、イネ種子中のリポキシゲナーゼ３を欠失させたいイネ品種又は系統のイネと、上記のイネ種子リポキシゲナーゼ３変異型遺伝子を保有するイネとを交配して雑種第一代を得る交配ステップと、この雑種第一代に上記イネ品種又は系統のイネを戻し交配して得た後代個体の中から、イネ種子リポキシゲナーゼ３変異型遺伝子をホモで保有する個体を選抜する選抜ステップとを備える育種方法を提供する。
【００１９】
上記育種方法によれば、米の貯蔵性に優れ、かつ、その他の有用形質を保持したイネの新品種及び新系統を作製できる。
【００２０】
また、上記育種方法により選抜されたイネは、その貯蔵において、省エネルギー化及び低コスト化を図ることができ、例えば、脂質酸化や異臭発生が起こりにくい高品質玄米全粒粉の製造や機能性食品等への応用が可能である。
【発明の効果】
【００２１】
本発明によれば、米の劣化の起こりやすさや米の貯蔵性を当代検定で簡易に判定でき、脂質の酸化・分解が抑制され、貯蔵性が向上した米を得ることができる。また本発明によれば、米の劣化が起こりにくく、米の貯蔵性に優れたイネの選抜及び育種を簡易かつ迅速に行うことができ、米の内部で起こっている脂質の分解機構の解明に対しても貢献できる。さらに、本発明の育種方法によって得られた米は、その貯蔵において、省エネルギー化及び低コスト化を図ることができ、米を利用した高付加価値製品の開発に利用できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
以下、本発明の好適な実施形態について説明する。
【００２３】
本発明のイネ種子リポキシゲナーゼ３変異型遺伝子は、配列表の配列番号１記載の塩基配列からなることを特徴としている。
【００２４】
「イネ種子リポキシゲナーゼ３遺伝子」とは、イネの種子で発現するリポキシゲナーゼ３遺伝子のことをいい、「イネ種子リポキシゲナーゼ３変異型遺伝子」とは、イネ種子リポキシゲナーゼ３遺伝子の塩基配列に変異が生じている遺伝子のことをいう。
【００２５】
上記のイネ種子リポキシゲナーゼ３変異型遺伝子（配列番号１）は、イネ種子リポキシゲナーゼ３遺伝子（配列番号２）の５’側から第１４９７番目のグアニンがアデニンに変異しており、この変異がナンセンス変異に該当するために、活性のあるイネ種子リポキシゲナーゼを発現できなくなったものである。
【００２６】
上記のイネ種子リポキシゲナーゼ３変異型遺伝子は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｍａｎｉａｔｉｓら、１９８９年、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス）に記載された方法に従って、配列表の配列番号１に記載の塩基配列情報をもとに合成した標識ｃＤＮＡプローブを用いて、イネｃＤＮＡライブラリー又はゲノムライブラリーからクローニングできる。
【００２７】
また、上記のイネ種子リポキシゲナーゼ３変異型遺伝子は、イネから抽出したトータルＲＮＡ又はポリＡ＋ＲＮＡを鋳型として配列表の配列番号１に記載の塩基配列情報をもとにデザインしたプライマーセットを用いることによって、ＲＴ−ＰＣＲ法で合成でき、さらには、これらの遺伝子の部分配列をＤＮＡ合成機で化学合成し、酵素的手法及びサブクローニングの手法を使ってつなぎ合わせることによっても取得できる。
【００２８】
本発明の選抜方法は、イネ種子中のリポキシゲナーゼ３が欠失しているイネの選抜方法であって、配列表の配列番号２記載の塩基配列からなるイネ種子リポキシゲナーゼ３遺伝子の５’側から第１４９７番目の塩基がアデニンに変異しているイネを、イネ種子中のリポキシゲナーゼ３が欠失しているイネであると判定することを特徴としている。
【００２９】
塩基の変異を利用してイネ種子中のリポキシゲナーゼ３が欠失しているイネを選抜する方法としては、例えば、上記変異部位を含むＤＮＡ断片をＰＣＲ等で増幅し、塩基配列を決定したり、プライマー配列の３’末端又はプライマー配列内部に上記変異部位を含むプライマーを用いて、ゲノムＤＮＡを鋳型にＰＣＲ等でＤＮＡ断片の増幅を行い、増幅の有無や増幅効率の違いを比較したりして、塩基の変異を検出する方法が挙げられる。
【００３０】
上記選抜方法の第一の態様は、被検イネからゲノムＤＮＡを抽出する抽出ステップと、配列表の配列番号３に示される塩基配列の第３１２８番目の塩基より５’側の塩基配列と相同な塩基配列の一部配列からなるプライマーと、配列表の配列番号３に示される塩基配列の第３１２８番目の塩基より３’側の塩基配列と相補的な塩基配列の一部配列からなるプライマーと、からなるプライマーセットで、ゲノムＤＮＡを鋳型にＤＮＡ断片を増幅する増幅ステップと、増幅ステップで増幅されたＤＮＡ断片中に制限酵素ＭｖａＩの認識配列がない場合に、イネ種子中のリポキシゲナーゼ３が欠失しているイネであると判定する判定ステップと、を備えることを特徴としている。
【００３１】
抽出ステップでは、被検イネからゲノムＤＮＡを抽出するが、ゲノムＤＮＡの抽出方法として、例えば、ＣＴＡＢ法（Ｍｕｒｒａｙら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１９８０年、８巻、ｐ．４３２１−４３２５）やＥｔｈｉｄｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ法（ＶａｒａｄａｒａｊａｎとＰｒａｋａｓｈ、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． Ｒｅｐ．、１９９１年、９巻、ｐ．６−１２）によって抽出できる。ここで、ゲノムＤＮＡを抽出する組織はイネ種子のみならず、葉、茎、根等を用いることも可能である。例えば、葉を用いることで、戻し交配世代途中の多数の個体選抜に利用することが可能になる。
【００３２】
増幅ステップでは、例えば、ＰＣＲ法によって行うことができる。ここで、ＰＣＲ法において用いられるプライマーセットは、配列表の配列番号３に示される塩基配列の第３１２８番目の塩基より５’側の塩基配列と相同な塩基配列の一部配列からなるプライマーと、配列表の配列番号３に示される塩基配列の第３１２８番目の塩基より３’側の塩基配列と相補的な塩基配列の一部配列からなるプライマーと、からなるプライマーセットであれば、特定の塩基配列に制限されることはないが、プライマーの長さは、ＰＣＲの条件設定の容易さ及び効率の観点から、それぞれ塩基数が１０〜６０個の連続した塩基であることが好ましく、１５〜３０個の連続した塩基であることがより好ましく、２０個の連続した塩基であることがさらに好ましい。また、各プライマーの塩基配列におけるＧＣ含量は、４０〜６０％であることが好ましく、プライマー内で２次構造を取らないことが好ましい。さらに、プライマーセットの各プライマー間のＴｍ値は、両者に差がないか、あったとしても少ない方が好ましい。
【００３３】
このような条件を満たすプライマーセットとしては、配列表の配列番号５に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（５’‐ｇｃｃａａｇａｇｃａｃｃｇｔｇｔａｃａｃｇ‐３’）と、配列表の配列番号６に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（５’‐ｇｇａａｇａｃｇｇｔｃａｔｃｔｃｇａａｇ‐３’）が挙げられる。なお、各プライマーは、配列表の配列番号３に示される塩基配列を基にして、化学合成できる。
【００３４】
判定ステップでは、増幅ステップで増幅されたＤＮＡ断片中に制限酵素ＭｖａＩの認識配列があるか否かを指標にするため、増幅されたＤＮＡ断片を制限酵素ＭｖａＩで切断し、アガロースゲル電気泳動又はポリアクリルアミドゲル電気泳動でＤＮＡ断片のバンドの数及び長さを調べればよい。増幅されたＤＮＡ断片中に制限酵素ＭｖａＩの認識配列がある場合には、電気泳動で検出されるバンドの数は切断前と比較して１本増えることとなり、バンドの長さについても短くなっていることが容易に確認できるからである。
【００３５】
すなわち、イネ種子リポキシゲナーゼ３遺伝子のゲノムＤＮＡの塩基配列である配列番号３に示される塩基配列の５’側から第３１２８番目の塩基がアデニンに変異していれば、被検イネはイネ種子中のリポキシゲナーゼ３が欠失しているイネであるが、第３１２８番目の塩基は、制限酵素ＭｖａＩの認識配列上にあって、制限酵素ＭｖａＩによって切断されるか否かを決定付ける塩基であるため、イネ種子中のリポキシゲナーゼ３が欠失しているイネの選抜が可能となる。
【００３６】
上記選抜方法の第二の態様は、被検イネからゲノムＤＮＡを抽出する抽出ステップと、配列表の配列番号３に示される塩基配列の第３１２８番目の塩基より５’側の塩基配列と相同な塩基配列の一部配列からなるプライマーと、配列表の配列番号３に示される塩基配列の第３１２８番目の塩基より３’側の塩基配列と相補的な塩基配列の一部配列からなるプライマーと、からなるプライマーセットで、ゲノムＤＮＡを鋳型にＤＮＡ断片を増幅する増幅ステップと、増幅ステップで増幅されたＤＮＡ断片を膜に固定する固定ステップと、配列表の配列番号３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて第３１２８番目の塩基を含む連続した塩基配列からなる標識オリゴヌクレオチドと、配列表の配列番号４に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて第３１２５番目の塩基を含む連続した塩基配列からなる非標識オリゴヌクレオチドと、を混合した混合プローブを、膜に固定されたＤＮＡ断片にハイブリダイズさせるハイブリダイゼーションステップと、このＤＮＡ断片にハイブリダイズした標識オリゴヌクレオチドからのシグナルを検出する検出ステップと、検出ステップで標識オリゴヌクレオチドからのシグナルが検出されない場合に、イネ種子中のリポキシゲナーゼ３が欠失しているイネであると判定する判定ステップと、を備えることを特徴としている。
【００３７】
抽出ステップ及び増幅ステップは、上記選抜方法の第一の態様で示した通りである。
【００３８】
固定ステップでは、増幅ステップで増幅されたＤＮＡ断片を膜に固定するが、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｍａｎｉａｔｉｓら、１９８９年、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス）に記載されたドットブロットハイブリダイゼーション法やサザンブロットハイブリダイゼーション法に従って、ＤＮＡ断片を膜に転写し、ＵＶ光を用いたクロスリンク又は１２０℃で３０分間のベーキングを行うことによってＤＮＡ断片を膜に固定すればよい。ＤＮＡ断片を転写する膜としては、例えば、ニトロセルロース、ナイロン、ＰＶＤＦ、又はそれらの混合物からなる膜を使用できる。
【００３９】
ハイブリダイゼーションステップでは、標識オリゴヌクレオチドと非標識オリゴヌクレオチドとを混合した混合プローブと、膜に固定されたＤＮＡ断片とをハイブリダイズさせるが、ハイブリダイゼーションの手法は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｍａｎｉａｔｉｓら、１９８９年、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス）に記載されたドットブロットハイブリダイゼーション法やサザンブロットハイブリダイゼーション法に従って行えばよい。
【００４０】
混合プローブを構成する標識オリゴヌクレオチドは、配列表の配列番号３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて第３１２８番目の塩基を含む連続した塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをその塩基配列を基に化学合成し、得られたオリゴヌクレオチドを標識すればよい。混合プローブを構成する非標識オリゴヌクレオチドは、配列表の配列番号４に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて第３１２５番目の塩基を含む連続した塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをその塩基配列を基に化学合成すればよい。
【００４１】
混合プローブを構成する標識オリゴヌクレオチド及び非標識オリゴヌクレオチドの長さは、それぞれ塩基数が１０〜３０個の連続した塩基であることが好ましく、１０〜２０個の連続した塩基であることがより好ましく、１７〜２０個の連続した塩基であることがさらに好ましい。また、各オリゴヌクレオチドは、ＧＣ含量が４０〜６０％であることが好ましく、２次構造を取らない配列であることが好ましい。さらに、プローブを構成する各オリゴヌクレオチド間のＴｍ値は、両者に差がないか、あったとしても少ない方が好ましい。
【００４２】
このような条件を満たす標識オリゴヌクレオチドとしては、配列表の配列番号７に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（５’‐ｇａｇｇｃｃｔｇｇｇｔｇｔｇｇｃａ‐３’）を標識したものが挙げられ、非標識オリゴヌクレオチドとしては、配列表の配列番号８に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（５’‐ｇａｇｇｃｃｔｇａｇｔｇｔｇｇｃａ‐３’）が挙げられる。
【００４３】
オリゴヌクレオチドの標識は、化学合成したオリゴヌクレオチドを、例えば、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）、ビオチン、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、ＤＮＰ(ｄｉｎｉｔｒｏｐｈｅｎｏｌ)、及び放射性同位元素のいずれかで標識すればよく、標識部位はオリゴヌクレオチドの５’末端が好ましい。
【００４４】
混合プローブを構成する標識オリゴヌクレオチドと非標識オリゴヌクレオチドの混合割合は、非標識オリゴヌクレオチドを競合プローブとして使用するため、非標識オリゴヌクレオチドの量が、標識オリゴヌクレオチドの量よりも過剰に混合されることが好ましく、その混合割合は、標識オリゴヌクレオチド：非標識オリゴヌクレオチド＝１：２〜１：１０であることが好ましく、標識オリゴヌクレオチド：非標識オリゴヌクレオチド＝１：５であることがより好ましい。
【００４５】
検出ステップでは、膜に固定されたＤＮＡ断片にハイブリダイズした標識オリゴヌクレオチドの標識化合物に起因するシグナルを検出するが、シグナルを検出する手法は、標識に使用した化合物を検出する手法として確立された方法（中山と西方、「バイオイラストレイテド２：遺伝子解析の基礎」、秀潤社、１９９５年；野村と稲澤、「脱アイソトープ実験プロトコール１：ＤＩＧハイブリダイゼーション、秀潤社、１９９４年）に従えばよく、当業者であれば容易にそのシグナルを検出できる。
【００４６】
例えば、ＤＩＧ標識オリゴヌクレオチドをプローブに用いた場合には、以下のようにしてＤＩＧに起因して発生するシグナルを検出できる。
【００４７】
まず、ハイブリダイゼーション後の膜を、緩衝液−１（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．６、１５０ｍＭ ＮａＣl）で十分に洗浄して非特異的に吸着したＤＩＧ標識オリゴヌクレオチドを取り除き、検出時における膜の時のバックグラウンドを低くするために、スキムミルク等のブロッキング試薬を含む上記緩衝液（緩衝液−２）に膜を９０分間浸漬する。
【００４８】
次に、膜を浸漬している緩衝液中に、抗ＤＩＧアルカリフォスファターゼ標識抗体（ロッシュ社）を２μＬ／１０ｍＬの割合で加え、３０分間振盪しながら静置する。その後、膜を取り出し、新しい緩衝液−１に浸漬し、振盪しながら１５分間洗浄する操作を２回繰り返して未反応の抗ＤＩＧアルカリフォスファターゼ標識抗体を取り除き、膜を平衡化緩衝液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ９．５、１００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＭｇＣｌ２）で処理することによって膜上のｐＨをアルカリ側にし、５０〜１００μＬのＣＤＰ−ｓｔａｒ（アルカリフォスファターゼの発光基質；ロッシュ社）を膜上に滴下する。
【００４９】
その後、ＣＤＰ−ｓｔａｒが膜全体にいきわたるようにして暗所で５分間反応させれば、ＤＩＧ標識オリゴヌクレオチドに特異的に結合したアルカリフォスファターゼが発する化学発光シグナルを、化学発光検出解析装置やＸ線フィルム等で検出できる。
【００５０】
判定ステップでは、上記の検出ステップで標識オリゴヌクレオチドからシグナルが検出されるか否かを指標にし、標識オリゴヌクレオチドからのシグナルが検出されない場合に、リポキシゲナーゼ３が欠失しているイネであると判定すればよい。
【００５１】
また、本発明の育種方法は、イネ種子中のリポキシゲナーゼ３が欠失しているイネの育種方法であって、イネ種子中のリポキシゲナーゼ３を欠失させたいイネ品種又は系統のイネと、上記のイネ種子リポキシゲナーゼ３変異型遺伝子を有するイネとを交配して雑種第一代を得る交配ステップと、この雑種第一代に上記イネ品種又は系統のイネを戻し交配して得た後代個体の中から、イネ種子リポキシゲナーゼ３変異型遺伝子をホモで保有する個体を選抜する選抜ステップと、を備えることを特徴としている。
【００５２】
交配ステップでは、イネ種子中のリポキシゲナーゼ３を欠失させたいイネ品種又は系統と、イネ種子リポキシゲナーゼ３変異型遺伝子を有するイネとを、当業者通常行う方法で交配させ、雑種第一代（以下、Ｆ１）を得ればよい。イネ種子リポキシゲナーゼ３変異型遺伝子を有するイネは、上記のイネ種子中のリポキシゲナーゼ３が欠失しているイネの選抜方法で選抜すれば取得できるが、イネ品種Ｄａｗ Ｄａｍがイネ種子リポキシゲナーゼ３変異型遺伝子を有していることが、本願の研究者らによって明らかにされている。イネ品種Ｄａｗ Ｄａｍは、独立行政法人農業生物資源研究所から入手することが可能である。
【００５３】
選抜ステップでは、交配ステップで得たＦ１にイネ品種又は系統を戻し交配して得た後代個体の中から、前記イネ種子リポキシゲナーゼ３変異型遺伝子をホモで保有する個体を選抜するが、この選抜は、上記のイネ種子中のリポキシゲナーゼ３が欠失しているイネの選抜方法を使用すればよい。
【００５４】
また、本発明のイネ種子中のリポキシゲナーゼ３が欠失しているイネは、上記の育種方法により選抜されたことを特徴としており、当業者であれば上記の育種方法に従って育種することが可能である。
【実施例】
【００５５】
本発明を以下の実施例に基づいてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００５６】
１．材料及び方法
１）抗イネ種子リポキシゲナーゼ３抗体を産生するハイブリドーマの作製
（抗原タンパク質の精製）
抗イネ種子リポキシゲナーゼ３抗体を産生するハイブリドーマは、イネ品種日本晴（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ Ｌ． ｃｖ． Ｎｉｐｐｏｎｂａｒｅ）の種子の胚芽から部分精製したイネ種子リポキシゲナーゼ３を抗原タンパク質として用いて作製した。イネ種子リポキシゲナーゼ３の部分精製は、Ｏｈｔａらの方法（Ａｇｒｉｃ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、１９８６年、５０巻、ｐ．３１６５−３１７１）に若干の修正を加え、以下の手順で行った。
【００５７】
具体的には、イネ種子の胚芽（３ｋｇ）を５倍容の抽出用緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．６）中で磨砕し、１時間攪拌した。磨砕液は遠心分離し、その上清に３０％飽和となるように硫安を加えて溶解し、遠心分離後に再び上清に５０％飽和となるように硫安を加えて溶解し、硫安沈殿を行った。その後、沈殿したタンパク質を抽出用緩衝液で溶解し、透析することにより硫安を取り除き、以下の６種類のカラムクロマトグラフィーでイネ種子リポキシゲナーゼ３を部分精製した。
【００５８】
まず、陽イオン交換クロマトグラフィー（カラム：ＱＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ５５０Ｃ；東ソー社）によって、３種のイネ種子リポキシゲナーゼのアイソザイムを分画し、リポキシゲナーゼ活性を指標にイネ種子リポキシゲナーゼ３の画分を回収した。
【００５９】
次に、疎水性クロマトグラフィー（カラム：Ｂｕｔｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ６５０Ｃ；東ソー社）、金属キレートアフィニティークロマトグラフィー（カラム：Ｃｕ２＋−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ；ファルマシア社）、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー（カラム：Ｂｉｏ−Ｇｅｌ ＨＴ；バイオラッド社）、ゲルろ過クロマトグラフィー（カラム：Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−１５０；ファルマシア社）で順次精製し、最後に、再度、陽イオン交換クロマトグラフィー（カラム：ＱＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ５５０Ｃ；東ソー社）で分画することにより、イネ種子リポキシゲナーゼ３を部分精製した。
【００６０】
得られたイネ種子リポキシゲナーゼ３の部分精製物は、−４０℃で凍結保存し、抗イネ種子リポキシゲナーゼ３抗体の抗原タンパク質として使用した。
【００６１】
リポキシゲナーゼ３の活性は、Ａｘｅｌｒｏｄらの方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１９８１年、７１巻、ｐ．４４１−４５１）に従って、リノール酸の過酸化物の生成により生じる吸光度（２３４ｎｍ）の増加を調べることにより求めた。その際、０．３３ｍＭのリノール酸を含む０．２Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）を酵素反応液とし、２５℃、１分間当たり１μｍｏｌのリノール酸を過酸化するリポキシゲナーゼの活性を１ユニット（Ｕｎｉｔ）とした。
【００６２】
また、タンパク質濃度の測定は、Ｂｒａｄｆｏｒｄらの方法（Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１９７６年、７２巻、ｐ．２４８−２５８）に従って、牛血清アルブミンを標準タンパク質として色素結合法により行った。
【００６３】
（抗イネ種子リポキシゲナーゼ３産生ハイブリドーマの作製）
ハイブリドーマの作製は、青木らの方法（「蛋白質・核酸・酵素」、１９８７年、別冊３０、ｐ．１７１−１８５）、岩崎らの方法（「ハイブリドーマとＥＬＩＳＡ」、講談社サイエンティフィック、１９８３年、ｐ．１９６）、及び富山らの方法（「単クローン抗体実験マニュアル」、講談社サイエンティフィック、１９８７年、ｐ．２４６）を参考にして、以下の手順で行った。
【００６４】
まず、イネ種子リポキシゲナーゼ３の部分精製物（６０μｇ）をＰＢＳ（０．１５Ｍ ＮａＣｌを含む１０ｍＭ Ｎａ／Ｋ リン酸緩衝液、ｐＨ７．２）に溶解し、そこにＦｒｅｕｎｄの完全アジュバントを等量加えて乳化させた後、ＢＡＬＢ／ｃマウスに免疫した。初回免疫から４週間後に、イネ種子リポキシゲナーゼ３の部分精製物を不完全アジュバンドと混合して乳化させたものを用いて追加免疫し、追加免疫から３日後に、免疫したＢＡＬＢ／ｃマウスから脾臓細胞（抗体産生細胞）を分離した。その後、脾臓細胞とＰＩＡミエローマ細胞をポリエチレングリコールの存在下で細胞融合させ、９６ウェルプレート上で培養した。
【００６５】
細胞融合から２週間後に、各ウェルから５０μＬの培養上清を採取し、ＥＬＩＳＡ法でイネ種子リポキシゲナーゼ３に対するモノクローナル抗体の産生の有無を試験した。抗イネ種子リポキシゲナーゼ３抗体を産生しているハイブリドーマは、限界希釈法によるクローニングを２回行い、クローンごとに小分けして液体窒素下で凍結保存した。
【００６６】
（抗イネ種子リポキシゲナーゼ３抗体の調製）
抗イネ種子リポキシゲナーゼ３抗体を大量に調製するため、まず、上記の抗イネ種子リポキシゲナーゼ３抗体を産生するハイブリドーマ（３×１０６個）を、予め０．５ｍＬのプリスタンを腹腔内投与しておいたＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内に投与した。
【００６７】
投与２週間後に腹水を集め、５０％飽和となるように硫安を加えて硫安沈殿を行い、沈殿したタンパク質をＰＢＳに溶解し、透析後、抗イネ種子リポキシゲナーゼ３抗体を含む透析画分に等量の平衡緩衝液（１．５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、３．０Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８．９）を加えた。
【００６８】
その後、平衡緩衝液で平衡化したＰｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ カラム（１．５×２．５ｃｍ；ファルマシア社）に平衡緩衝液を加えた透析画分をアプライし、平衡緩衝液で洗浄した後に０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４．０）で抗イネ種子リポキシゲナーゼ３抗体を溶出し、８分の１容の２．５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）を加えて中和した。こうして得られた抗イネ種子リポキシゲナーゼ３抗体は、０．０５％ ＮａＮ３を含むＰＢＳにバッファー交換して４℃で保存した。
【００６９】
２）アフィニティーカラムによるイネ種子リポキシゲナーゼ３の精製
（抗イネ種子リポキシゲナーゼ３抗体アフィニティーカラムの作製）
大量調製した抗イネ種子リポキシゲナーゼ３抗体の約５８ｍｇを、東ソー社のプロトコールに従って、２．３ｇのＴｏｒｅｓｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ６５０（東ソー社）に結合させ、イネ種子リポキシゲナーゼ３の精製用のアフィニティー樹脂を作製した。その後、アフィニティー樹脂は、液体クロマトグラフィー用のカラム（１．５×５．０ｃｍ）に充填し、抗イネ種子リポキシゲナーゼ３抗体アフィニティーカラムとして、イネ種子リポキシゲナーゼ３の精製に使用した。
【００７０】
（イネ種子リポキシゲナーゼ３の精製）
イネ品種日本晴の種子の胚芽（１００ｇ）を５倍容の抽出緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１ｍＭ モノヨード酢酸、ｐＨ８．９）中で磨砕し、１時間攪拌した。磨砕液は遠心分離し、その上清に３０％飽和となるように硫安を加えて溶解し、遠心分離後に再び上清に５０％飽和となるように硫安を加えて溶解し、硫安沈殿を行った。
【００７１】
その後、沈殿したタンパク質をＴＭ緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１ｍＭ ＭＩＡ、ｐＨ７．６）で溶解し、透析することにより硫安を取り除き、ＴＭ緩衝液で平衡化した抗イネ種子リポキシゲナーゼ３抗体アフィニティーカラムにアプライした。その後、ＴＭ緩衝液で抗イネ種子リポキシゲナーゼ３抗体アフィニティーカラムを十分に洗浄し、アフィニティーカラムに保持されたイネ種子リポキシゲナーゼ３を０．１ｍＭのＭＩＡを含む５０％（ｗ／ｖ）エチレングリコールで溶出した。
【００７２】
その結果、リポキシゲナーゼ活性の比活性が４００倍以上高まり、アミノ酸配列の決定が可能な純度のイネ種子リポキシゲナーゼ３が１３７μｇ得られた。
【００７３】
２．実施例
（実施例１）イネ種子リポキシゲナーゼ３タンパク質のアミノ酸配列の決定：
抗イネ種子リポキシゲナーゼ３抗体アフィニティークロマトグラフィーで精製した純度の高いイネ種子リポキシゲナーゼ３タンパク質を、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分画し、ＣＢＢで染色されたバンドを切り出し、Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら（Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１９９２年、２０３巻、ｐ．１７３−１７９）の方法に従ってゲル内消化した。その後、逆相ＨＰＬＣによりペプチドを回収し、イネ種子リポキシゲナーゼ３のアミノ酸配列の部分配列を、アミノ酸シークエンサー（Ｐｒｏｓｉｃｅ ４９４ ＨＴ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ；Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）によって決定した。
【００７４】
その結果、イネ種子リポキシゲナーゼ３タンパク質の３箇所の部分配列を決定でき、そのアミノ酸配列は、ＭＡＤＦＬＧＹＳＩＫ、ＲＦＰＬＱＬＶＫ、及びＤＬＬＰＡＡＧＤＹＩであった。
【００７５】
そこで、この３つのアミノ酸配列を基にＲｉｃｅＢｌａｓｔ（ｈｔｔｐ：／／ｒｉｃｅｂｌａｓｔ．ｄｎａ．ａｆｆｒｃ．ｇｏ．ｊｐ／）でデータベース検索を行い、これらのアミノ酸配列を包含するイネ遺伝子の塩基配列を探索した。その結果、３つの配列のいずれもがイネＯｓ０３ｇ０７００４００（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのアクセッション番号ＮＭ＿００１０５７５２８）のアミノ酸配列に含まれていることが判明した。
【００７６】
図１は、イネＯｓ０３ｇ０７００４００のアミノ酸配列における、ＭＡＤＦＬＧＹＳＩＫ、ＲＦＰＬＱＬＶＫ、及びＤＬＬＰＡＡＧＤＹＩの位置を示したものである。
【００７７】
その結果、イネの種子で発現するイネ種子リポキシゲナーゼ３遺伝子は、イネＯｓ０３ｇ０７００４００の塩基配列と一致することが強く示唆された。
【００７８】
そこで、イネ種子リポキシゲナーゼ遺伝子のゲノムＤＮＡの塩基配列を調べ、イントロンを除いたコーディング領域の塩基配列とイネＯｓ０３ｇ０７００４００の塩基配列とを比較した。
【００７９】
具体的には、イネＯｓ０３ｇ０７００４００の塩基配列を基に、イネ種子リポキシゲナーゼ３遺伝子のゲノムＤＮＡを５つの領域（領域１〜５）に分け、イネ品種日本晴のゲノムＤＮＡを鋳型に用いてＰＣＲを行い、増幅されたＤＮＡ断片をダイレクトシークエンスして、各領域の塩基配列を決定した。
【００８０】
イネ種子リポキシゲナーゼ３遺伝子の領域１の増幅には、ｒｓＬＯＸ３−１−Ｆ：５’−ｔａｔｇｔｃａｃａｔｔｃａｃｃｃａａａａｔｃｃ−３’（配列番号９）とｒｓＬＯＸ３−１−Ｒ：５’−ｃｔｇａｔｇａｇｃｔｇｇｃａｇｇｔｇａｃ−３’（配列番号１０）、領域２の増幅には、ｒｓＬＯＸ３−２−Ｆ：５’−ｇａｇｇｇａｔｃａｔｃｇａｃａｃｃａｔｃ−３’（配列番号１１）とｒｓＬＯＸ３−２−Ｒ：５’−ｇｔｇａａｃｔｇｔｇｇｃａａｃｔａｔｇａｔｇａ−３’（配列番号１２）、領域３の増幅には、ｒｓＬＯＸ３−３−Ｆ：５’−ａａａａｇａａｇｃａｇｃｔｃｔａｃａａｔｇｇａ−３’（配列番号１３）とｒｓＬＯＸ３−３−Ｒ：５’−ｃａｔｇｇｇｇａｇｃｔｔｇａｇｇａｔａｔａｇｔ−３’（配列番号１４）、領域４の増幅には、ｒｓＬＯＸ３−４−Ｆ：５’−ｇａｇｔｔｃｇａｃｔｃｇｔｔｃｃａｇｇａｃ−３’（配列番号１５）とｒｓＬＯＸ３−４−Ｒ：５’−ｇｇａａｇａｃｇｇｔｃａｔｃｔｃｇａａｇ−３’（配列番号１６）、領域５の増幅には、ｒｓＬＯＸ３−５−Ｆ：５’−ｃｔｇｔｇａｔｇｇａｇｃｃｇｔｔｃｇｔ−３’（配列番号１７）とｒｓＬＯＸ３−５−Ｒ：５’−ｇｔａａｔｃｇｔａｇｇｔａｃａｔａｔｔｃａｇ−３’（配列番号１８）を用いて、ＰＣＲを行った。
【００８１】
ＰＣＲ条件は、９４℃で１分間加熱した後に、９８℃で１０秒、６８℃で１分のサイクルを３５サイクル行い、引き続き、７２℃で３分のサイクルを１サイクル行い、その後４℃まで急冷した。
【００８２】
イネ種子リポキシゲナーゼ３遺伝子の領域１〜５に相当する各ＤＮＡ断片は、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（キアゲン社）で精製し、これを鋳型としてダイターミネーター法による反応を行い、ＡＢＩ社のＤＮＡシークエンサーで塩基配列を決定した。
【００８３】
図２は、ダイレクトシークエンスを行ったイネ種子リポキシゲナーゼ３遺伝子のゲノムＤＮＡの５つの領域の位置を示したものである。図３は、イネ種子リポキシゲナーゼ３遺伝子のゲノムＤＮＡの塩基配列を示したものである。下線で示した部分は、エクソンを示している。
【００８４】
その結果、イネ種子リポキシゲナーゼ３遺伝子のゲノムＤＮＡ（配列番号３）は、４４０２塩基からなり、９個のエクソンと、８個のイントロンからなることが明らかとなった。また、イネ種子リポキシゲナーゼ３遺伝子のゲノム配列からイントロンを取り除いたイネ種子リポキシゲナーゼ３遺伝子の塩基配列（配列番号２）は、Ｏｓ０３ｇ０７００４００の塩基配列と完全に一致していることが確認された。
【００８５】
以上の結果より、イネの種子で発現するイネ種子リポキシゲナーゼ３遺伝子の塩基配列は、イネＯｓ０３ｇ０７００４００の塩基配列と一致し、配列表の配列番号２に記載の塩基配列からなる遺伝子は、イネ種子リポキシゲナーゼ遺伝子であることが明らかとなった。
【００８６】
（実施例２）リポキシゲナーゼ３が欠失しているイネ品種Ｄａｗ Ｄａｍが保有するイネ種子リポキシゲナーゼ３遺伝子の検索：
リポキシゲナーゼ３が欠失しているイネ品種Ｄａｗ Ｄａｍのリポキシゲナーゼ３欠失性が、イネ種子リポキシゲナーゼ３遺伝子の変異によるものであるかどうかについて調べた。具体的には、イネ品種Ｄａｗ Ｄａｍのイネ種子リポキシゲナーゼ３遺伝子のゲノムＤＮＡの塩基配列を決定し、イネ種子リポキシゲナーゼ３遺伝子のゲノムＤＮＡの塩基配列（配列番号３）と比較した。
【００８７】
イネ品種Ｄａｗ Ｄａｍが保有するイネ種子リポキシゲナーゼ遺伝子のゲノムＤＮＡの塩基配列は、実施例１と同様に、イネ種子リポキシゲナーゼ３遺伝子のゲノムＤＮＡを５つの領域（領域１〜５）に分け、イネ品種Ｄａｗ ＤａｍのゲノムＤＮＡを鋳型に用いてＰＣＲを行い、増幅されたＤＮＡ断片をダイレクトシークエンスすることによって決定した。プライマーセット及びＰＣＲの条件についても、実施例１と同じである。
【００８８】
図４は、イネ品種Ｄａｗ Ｄａｍのイネ種子リポキシゲナーゼ３遺伝子のゲノムＤＮＡの塩基配列を示したものである。下線で示した部分は、エクソンを示している。また、図５は、イネ品種Ｄａｗ Ｄａｍのイネ種子リポキシゲナーゼ３遺伝子のゲノムＤＮＡで認められた、ナンセンス変異の位置を示したものである。
【００８９】
その結果、イネ品種Ｄａｗ Ｄａｍのイネ種子リポキシゲナーゼ３遺伝子のゲノムＤＮＡの塩基配列（配列番号４）は、第１イントロンにおいて、配列表の配列番号３に示されるイネ種子リポキシゲナーゼ３遺伝子のゲノムＤＮＡの第４２８番目から４３０番目の３塩基（ＡＡＡ）が欠失し、第７エキソンにおいて、配列表の配列番号３に示されるイネ種子リポキシゲナーゼ３遺伝子のゲノムＤＮＡの第３１２８番目の塩基（配列表の配列番号２に記載の塩基配列からなるイネ種子リポキシゲナーゼ３遺伝子の第１４９７番目の塩基）が、アデニンに変異していることが明らかとなった（図４において、変異したアデニン（Ａ）は、太字で示している。）。この変異は、第７エキソンのトリプトファンを指定するコドン（ＴＧＧ）を終止コドン（ＴＧＡ）へと変異させるナンセンス変異であった。
【００９０】
以上の結果より、イネ品種Ｄａｗ Ｄａｍでは、ナンセンス変異により正常なリポキシゲナーゼ３タンパク質が合成されなくなり、これがリポキシゲナーゼ３欠失性を示す原因となっていることが判明した。このため、イネ品種Ｄａｗ Ｄａｍで認められたナンセンス変異を有するイネ種子リポキシゲナーゼ３遺伝子を、イネ種子リポキシゲナーゼ３変異型遺伝子と名付けた。イネ種子リポキシゲナーゼ３変異型遺伝子の塩基配列は、配列表の配列番号１に示した通りである。
【００９１】
（実施例３）ＣＡＰＳ法によるイネ種子リポキシゲナーゼ３が欠失しているイネの選抜方法：
実施例２において、イネ種子リポキシゲナーゼ３変異型遺伝子のゲノムＤＮＡで認められた第３１２８番目の塩基（イネ種子リポキシゲナーゼ３変異型遺伝子で認められた第１４９７番目に相当する塩基）における変異は、制限酵素ＭｖａＩの認識部位（ＣＣＷＧＧ）の４番目の塩基に起きている変異であることが明らかになったため、制限酵素ＭｖａＩを用いたＣＡＰＳ法（ＫｏｎｉｅｃｚｎｙとＡｕｓｕｂｅｌ、１９９３年、Ｐｌａｎｔ Ｊ．、４巻、ｐ．４０３−４１０）によって、上記のナンセンス変異の検出を試みた。
【００９２】
被検イネとして、イネ品種日本晴個体（イネ種子リポキシゲナーゼ３遺伝子をホモで保有）にイネ品種Ｄａｗ Ｄａｍ個体（イネ種子リポキシゲナーゼ３変異型遺伝子をホモで保有）を交配して得たＦ１個体を自殖して得た１５個のＦ２個体（Ｙ−１０３〜１１６及びＹ−１２０）、並びにこれらの交配親であるイネ品種日本晴個体及びＤａｗ Ｄａｍ個体を用いた。
【００９３】
まず、イネ種子リポキシゲナーゼ３変異型遺伝子のゲノムＤＮＡ（配列番号３）の第３１２８番目の塩基より５’側の塩基配列と相同な塩基配列の一部配列からなるプライマーであるｒｓＬＯＸ３−Ｆｒａｇ−Ｆ（５’−ｇｃｃａａｇａｇｃａｃｃｇｔｇｔａｃａｃｇ−３’；配列番号５）と、第３１２８番目の塩基より３’側の塩基配列と相補的な塩基配列の一部配列からなるプライマーであるｒｓＬＯＸ３−Ｆｒａｇ−Ｒ（５’−ｇｇａａｇａｃｇｇｔｃａｔｃｔｃｇａａｇ−３’；配列番号６）と、からなるプライマーセットを合成し、変異が認められた第３１２８番目の塩基を含むＤＮＡ断片を、それぞれ被検イネのゲノムＤＮＡを鋳型にＰＣＲで増幅した。
【００９４】
ＰＣＲは、９４℃で１分間加熱した後に、９４℃で３０秒、６０℃で３０秒、７２℃で３０秒のサイクルを３５サイクル行い、引き続き、７２℃で１分のサイクルを１サイクル行い、その後、４℃まで急冷することにより終了させた。
【００９５】
その際、イネ種子リポキシゲナーゼ３遺伝子とイネ種子リポキシゲナーゼ３変異型遺伝子の双方を保有するヘテロ個体のコントロールとして、イネ品種日本晴とイネ品種Ｄａｗ ＤａｍのゲノムＤＮＡの混合物を鋳型として同様にＰＣＲを行った。
【００９６】
ＰＣＲで増幅されたＤＮＡ断片は、制限酵素ＭｖａＩで切断し、ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、電気泳動後のゲルをエチジウムブロマイドで染色し、ゲルに紫外線を照射することによってＤＮＡバンドとして検出した。
【００９７】
図６は、制限酵素ＭｖａＩを用いたＣＡＰＳ法の手順に従って、被検イネのゲノムを鋳型にＰＣＲを行い、制限酵素ＭｖａＩで切断後に電気泳動して検出されたバンドパターンである。図中の＋は、イネ種子リポキシゲナーゼ３遺伝子をホモで保有している個体（イネ品種日本晴型ホモ個体）、−は、イネ種子リポキシゲナーゼ３変異型遺伝子をホモで保有している個体（イネ品種Ｄａｗ Ｄａｍ型ホモ個体）、±は、イネ種子リポキシゲナーゼ３遺伝子とイネ種子リポキシゲナーゼ３変異型遺伝子とを共に保有している個体（ヘテロ個体）であることを示している。
【００９８】
その結果、イネ種子リポキシゲナーゼ３遺伝子をホモで保有するイネ品種日本晴個体の場合は、得られたＰＣＲ断片が制限酵素ＭｖａＩによって切断され、約２７０ｂｐのバンドのみが検出された。また、イネ種子リポキシゲナーゼ３変異遺伝子をホモで保有し、イネ種子リポキシゲナーゼ３欠失性の表現型を示すイネ品種Ｄａｗ Ｄａｍ個体の場合は、制限酵素ＭｖａＩによって切断されず、約３２０ｂｐのバンドのみが検出された。
【００９９】
また、ヘテロ個体のコントロールの場合は、イネ種子リポキシゲナーゼ３遺伝子とイネ種子リポキシゲナーゼ３変異遺伝子とを共に保有するため、制限酵素ＭｖａＩによって切断された約２７０ｂｐのバンドと、制限酵素ＭｖａＩによって切断されなかった約３２０ｂｐのバンドの双方が検出された。
【０１００】
一方、Ｆ２個体の場合は、イネ品種日本晴個体、イネ品種Ｄａｗ Ｄａｍ個体、又はイネ品種日本晴個体とイネ品種Ｄａｗ Ｄａｍ個体の混合型のバンドパタ−ンのいずれかを示した。
【０１０１】
そこで、１５個のＦ２個体について、抗イネ種子リポキシゲナーゼ３抗体を用いたウェスタンブロッッティングによって、イネ種子中におけるイネ種子リポキシゲナーゼ３の発現の有無を調べた。
【０１０２】
その結果、Ｆ２個体のうち、イネ品種日本晴個体のバンドパターン、又はイネ品種日本晴個体とイネ品種Ｄａｗ Ｄａｍ個体の混合型のバンドパターンを示したＦ２個体では、イネ種子リポキシゲナーゼ３の発現が確認されたものの、イネ品種Ｄａｗ Ｄａｍ型個体のバンドパターンを示したＦ２個体では、イネ種子リポキシゲナーゼ３の発現が確認されなかった。
【０１０３】
よって、イネ品種日本晴個体と同じバンドパターンを示したＦ２個体は、イネ種子リポキシゲナーゼ３遺伝子をホモで保有しているイネ品種日本晴型ホモ個体であり、イネ品種Ｄａｗ Ｄａｍ個体と同じバンドパターンを示したＦ２個体は、イネ種子リポキシゲナーゼ３変異型遺伝子をホモで保有しているイネ品種Ｄａｗ Ｄａｍ型ホモ個体であり、Ｆ１個体と同じバンドパタ−ンを示したＦ２個体は、イネ種子リポキシゲナーゼ３遺伝子とイネ種子リポキシゲナーゼ３変異型遺伝子とを共に保有しているヘテロ個体であることが明らかとなった。
【０１０４】
以上の結果より、配列表の配列番号３に示される塩基配列の第３１２８番目の塩基より５’側の塩基配列と相同な塩基配列の一部配列からなるプライマーと、配列表の配列番号３に示される塩基配列の第３１２８番目の塩基より３’側の塩基配列と相補的な塩基配列の一部配列からなるプライマーと、からなるプライマーセットで、被検イネのゲノムＤＮＡを鋳型にＤＮＡ断片を増幅し、増幅されたＤＮＡ断片中に制限酵素ＭｖａＩの認識配列がなく、制限酵素ＭｖａＩによって切断されない場合に、イネ種子中のリポキシゲナーゼ３が欠失しているイネであると判定することにより、イネ種子リポキシゲナーゼ３変異型遺伝子をホモで保有する個体を選別できることが明らかとなった。すなわち、制限酵素ＭｖａＩを用いたＣＡＰＳ法によって、イネ種子リポキシゲナーゼ３変異型遺伝子をホモで保有する個体を選別できることが明らかとなった。
【０１０５】
（実施例４）ドットブロットＳＮＰ法によるイネ種子リポキシゲナーゼ３欠失イネの選抜方法：
イネ種子リポキシゲナーゼ３変異型遺伝子のゲノムＤＮＡで認められた第３１２８番目の塩基（イネ種子リポキシゲナーゼ３変異型遺伝子で認められた第１４９７番目に相当する塩基）における変異は一塩基置換であったため、一塩基多型を検出に使用されているドットブロットＳＮＰ法（Ｓｈｉｒａｓａｗａら Ｔｈｅｏｒ． Ａｐｐｌ． Ｇｅｎｅｔ．１１３：１４７−１５５）によって、上記のナンセンス変異が検出できるか否かについて試験した。
【０１０６】
被検イネとしては、イネ品種日本晴個体（イネ種子リポキシゲナーゼ３遺伝子をホモで保有）にイネ品種Ｄａｗ Ｄａｍ個体（イネ種子リポキシゲナーゼ３変異型遺伝子をホモで保有）を交配して得たＦ１個体を自殖して得られた１０６個のＦ２個体と、コントロールとして、これらの親株であるイネ品種日本晴個体及びイネ品種Ｄａｗ Ｄａｍ個体を用いた。
【０１０７】
まず、ＣＡＰＳ法で行ったのと同様に、イネ種子リポキシゲナーゼ３遺伝子（配列番号３）の第３１２８番目の塩基より５’側の塩基配列と相同な塩基配列の一部配列からなるプライマーであるｒｓＬＯＸ３−Ｆｒａｇ−Ｆ（５’−ｇｃｃａａｇａｇｃａｃｃｇｔｇｔａｃａｃｇ−３’；配列番号５）と、第３１２８番目の塩基より３’側の塩基配列と相補的な塩基配列の一部配列からなるプライマーであるｒｓＬＯＸ３−Ｆｒａｇ−Ｒ（５’−ｇｇａａｇａｃｇｇｔｃａｔｃｔｃｇａａｇ−３’；配列番号６）とからなるプライマーセットで、変異が認められた第３１２８番目の塩基を含むＤＮＡ断片を、被検イネのゲノムＤＮＡを鋳型にＰＣＲで増幅した。
【０１０８】
ＰＣＲは、９４℃で１分間加熱した後に、９４℃で３０秒、６０℃で３０秒、７２℃で３０秒のサイクルを３５サイクル行い、引き続き、７２℃で１分のサイクルを１サイクル行い、その後、４℃まで急冷することにより終了させた。
【０１０９】
その際、イネ種子リポキシゲナーゼ３遺伝子とイネ種子リポキシゲナーゼ３変異型遺伝子の双方を保有するヘテロ個体のコントロールとして、イネ品種日本晴とイネ品種Ｄａｗ ＤａｍのゲノムＤＮＡの混合物を鋳型として同様にＰＣＲを行った。
【０１１０】
その後、Ｓｈｉｒａｓａｗａら（Ｔｈｅｏｒ． Ａｐｐｌ． Ｇｅｎｅｔ．、２００６年、１１３巻、ｐ．１４７−１５５）の方法に従って、ＰＣＲで増幅された各ＤＮＡ断片をナイロン膜にドットブロットし、検出プローブと競合プローブを混合した混合プローブを用いてハイブリダイゼーションを行った。
【０１１１】
その際、混合プローブは２種類用意し、イネ種子リポキシゲナーゼ３遺伝子を検出するためには、配列表の配列番号３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて第３１２８番目の塩基（グアニン）を含む連続した塩基配列からなるＷＴ−ｒｓＬＯＸ３−ｐｒｏｂｅ（５’−ＧＡＧＧＣＣＴＧＧＧＴＧＴＧＧＣＡ−３’；配列番号７）の５’末端をジゴキシゲニン標識したもの（検出プローブ）と、配列表の配列番号４に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて第３１２５番目の塩基（アデニン）を含む連続した塩基配列からなる非標識のＭｕｔ−ｒｓＬＯＸ３−ｐｒｏｂｅ（５’−ＧＡＧＧＣＣＴＧＡＧＴＧＴＧＧＣＡ−３’；配列番号８）（競合プローブ）とを、１：５の濃度比で混合した混合プローブを用いた。
【０１１２】
一方、イネ種子リポキシゲナーゼ３変異型遺伝子を検出するためには、配列表の配列番号４に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて第３１２５番目の塩基（アデニン）を含む連続した塩基配列からなるＭｕｔ−ｒｓＬＯＸ３−ｐｒｏｂｅ（５’−ＧＡＧＧＣＣＴＧＡＧＴＧＴＧＧＣＡ−３’；配列番号８）の５’末端をジゴキシゲニン標識したもの（検出プローブ）と、配列表の配列番号３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて第３１２８番目の塩基（グアニン）を含む連続した塩基配列からなる非標識のＷＴ−ｒｓＬＯＸ３−ｐｒｏｂｅ（５’−ＧＡＧＧＣＣＴＧＧＧＴＧＴＧＧＣＡ−３’；配列番号７）（競合プローブ）とを、１：５の濃度比で混合した混合プローブを用いた。
【０１１３】
ハイブリダイゼーションは４２℃で行い、非特異的な検出プローブのナイロン膜への吸着は、４２℃の０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳに浸漬し、振盪する操作を数回繰り返すことによって取り除いた。ハイブリダイゼーション後のナイロン膜は、０．５％のブロッキング試薬（ロッシュ社）を含むＤＩＧバッファー１（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．６、１５０ｍＭ ＮａＣl）に９０分間浸漬し、そこに、抗ＤＩＧアルカリフォスファターゼ標識抗体（ロッシュ社）を２μＬ／１０ｍＬの割合で加え、３０分間振盪しながら反応させた。
【０１１４】
その後、ナイロン膜を取り出し、ＤＩＧバッファー１に浸漬し、１５分間振盪する操作を２回繰り返すことにより未反応の抗ＤＩＧアルカリフォスファターゼ標識抗体を取り除き、ＤＩＧバッファー３（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ９．５、１００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＭｇＣｌ２）に５分間浸漬し、約５ｍＬの基質溶液（０．３３ｍｇ／ｍＬ ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）、０．１６ｍｇ／ｍＬ ５−ブロモ-4-クロロ−３−インドリルリン酸（ＢＣＩＰ）、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ９．５、０．１Ｍ Ｎａｃｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２）を膜上に滴下して５分間反応させた。
【０１１５】
その後、ナイロン膜の水分をキムタオルで拭き取り、アルカリフォスファターゼの酵素反応によって得られる発色を検出した。
【０１１６】
図７は、ドットブロットＳＮＰ法による解析結果を示した図である。ナイロン膜は、１４（縦の列：Ａ〜Ｎ）×８（横の行：１〜８）のマスに仕切られ、各マスには、個体ごとのＤＮＡ断片を２スポットずつ、デュプリケートでブロットした。また、Ａ８とＮ３のマスにはイネ品種日本晴個体由来のＤＮＡ断片（イネ品種日本晴型ホモ・コントロール）を、Ａ６とＮ１にはイネ品種Ｄａｗ Ｄａｍ個体由来のＤＮＡ断片（イネ品種Ｄａｗ Ｄａｍ型ホモ・コントロール）を、Ａ７とＮ２のマスにはイネ品種日本晴とイネ品種Ｄａｗ ＤａｍのゲノムＤＮＡの混合物を鋳型にＰＣＲを行って得たＤＮＡ断片（ヘテロ・コントロール）をブロットした。
【０１１７】
図７（Ａ）は、イネ種子リポキシゲナーゼ３遺伝子を検出するために、ＷＴ−ｒｓＬＯＸ３−ｐｒｏｂｅ（５’−ＧＡＧＧＣＣＴＧＧＧＴＧＴＧＧＣＡ−３’；配列番号７）の５’末端をジゴキシゲニン標識したもの（検出プローブ）と、非標識のＭｕｔ−ｒｓＬＯＸ３−ｐｒｏｂｅ（５’−ＧＡＧＧＣＣＴＧＡＧＴＧＴＧＧＣＡ−３’；配列番号８）（競合プローブ）とを、１：５の濃度比で混合した混合プローブを用いて、ドットブロットＳＮＰ法で解析した結果である。
【０１１８】
図７（Ｂ）は、イネ種子リポキシゲナーゼ３変異型遺伝子を検出するために、Ｍｕｔ−ｒｓＬＯＸ３−ｐｒｏｂｅ（５’−ＧＡＧＧＣＣＴＧＡＧＴＧＴＧＧＣＡ−３’；配列番号８）の５’末端をジゴキシゲニン標識したもの（検出プローブ）と、非標識のＷＴ−ｒｓＬＯＸ３−ｐｒｏｂｅ（５’−ＧＡＧＧＣＣＴＧＧＧＴＧＴＧＧＣＡ−３’；配列番号７）（競合プローブ）とを、１：５の濃度比で混合した混合プローブを用いて、ドットブロットＳＮＰ法で解析した結果である。
【０１１９】
その結果、ＷＴ−ｒｓＬＯＸ３−ｐｒｏｂｅの５’末端をジゴキシゲニン標識したものを検出プローブとして用いた場合には、１０６個のＦ２個体のうち７７個体でシグナルが検出され、Ｍｕｔ−ｒｓＬＯＸ３−ｐｒｏｂｅの５’末端をジゴキシゲニン標識したものを検出プローブとして用いた場合には、１０６個のＦ２個体のうち８８個体でシグナルが検出された。
【０１２０】
図７（Ｃ）は、各Ｆ２個体のイネ種子リポキシゲナーゼ３の表現型を示したものである。図中の＋は、イネ種子リポキシゲナーゼ３遺伝子をホモで保有している個体（イネ品種日本晴型ホモ個体）、−は、イネ種子リポキシゲナーゼ３変異型遺伝子をホモで保有している個体（イネ品種Ｄａｗ Ｄａｍ型ホモ個体）、±は、イネ種子リポキシゲナーゼ３遺伝子とイネ種子リポキシゲナーゼ３変異型遺伝子とを共に保有している個体（ヘテロ個体）であることを示している。
【０１２１】
図７（Ａ）でシグナルが検出され、図７（Ｂ）でシグナルが検出されなかたマスの個体はイネ品種日本晴型ホモ個体であり、Ａ８とＮ３にブロットしたイネ品種日本晴個体（イネ品種日本晴型ホモ・コントロール）以外に１８個体認められた。
【０１２２】
図７（Ａ）でシグナルが検出されず、図７（Ｂ）でシグナルが検出されたマスの個体はイネ品種Ｄａｗ Ｄａｍ型ホモ個体であり、Ａ６とＮ１にブロットしたイネ品種Ｄａｗ Ｄａｍ個体（イネ品種Ｄａｗ Ｄａｍ型ホモ・コントロール）以外に２９個体認められた。
【０１２３】
図７（Ａ）と図７（Ｂ）の双方でシグナルが検出されたマスの個体はヘテロであり、Ａ７とＮ２にブロットしたヘテロ・コントロール以外に５９個体認められた。
【０１２４】
そこで、１０６個のＦ２個体について、抗イネ種子リポキシゲナーゼ３抗体を用いたウェスタンブロッッティングによって、イネ種子中におけるイネ種子リポキシゲナーゼ３の発現の有無を調べた。
【０１２５】
その結果、イネ種子リポキシゲナーゼ３は、ドットブロットＳＮＰ法でイネ品種日本晴型ホモ個体及びヘテロ個体であると判定された個体の種子では確認されたが、イネ品種Ｄａｗ Ｄａｍ型ホモ個体であると判定された個体の種子では確認されなかった。
【０１２６】
以上の結果より、配列表の配列番号３に示される塩基配列の第３１２８番目の塩基より５’側の塩基配列と相同な塩基配列の一部配列からなるプライマーと、配列表の配列番号３に示される塩基配列の第３１２８番目の塩基より３’側の塩基配列と相補的な塩基配列の一部配列からなるプライマーと、からなるプライマーセットで、被検イネのゲノムＤＮＡを鋳型にＤＮＡ断片を増幅し、増幅されたＤＮＡ断片をナイロン膜に固定し、配列表の配列番号３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて第３１２８番目の塩基（グアニン）を含む連続した塩基配列からなる標識オリゴヌクレオチドと、配列表の配列番号４に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて第３１２５番目の塩基（アデニン）を含む連続した塩基配列からなる非標識オリゴヌクレオチドと、を混合した混合プローブを、ナイロン膜に固定されたＤＮＡ断片にハイブリダイズさせ、ナイロン膜に固定されたＤＮＡ断片にハイブリダイズした標識オリゴヌクレオチドからのシグナルを検出し、標識オリゴヌクレオチドからのシグナルが検出されない場合に、イネ種子中のリポキシゲナーゼ３が欠失しているイネであると判定することにより、イネ種子リポキシゲナーゼ３変異型遺伝子をホモで保有する個体を選別できることが明らかとなった。すなわち、ドットブロットＳＮＰ法によって、イネ種子リポキシゲナーゼ３変異型遺伝子をホモで保有する個体を選別できることが明らかとなった。
【０１２７】
（実施例５）イネ種子中のリポキシゲナーゼ３が欠失しているイネの育種
イネ種子リポキシゲナーゼ３を欠失していることが明らかとなっている中間母本「北陸ＰＬ２」にイネ品種コシヒカリを、５回反復して戻し交配し、Ｂ４Ｆ２個体を得た。
【０１２８】
２０個のＢ４Ｆ２個体の葉からゲノムＤＮＡを抽出し、実施例３に記載した制限酵素ＭｖａＩを用いたＣＡＰＳ法によって、イネ種子中のリポキシゲナーゼ３が欠失しているイネ個体を選抜した。
【０１２９】
図８は、制限酵素ＭｖａＩを用いたＣＡＰＳ法の手順に従って、各Ｂ４Ｆ２個体のゲノムを鋳型にＰＣＲを行い、制限酵素ＭｖａＩで切断後に電気泳動して検出されたバンドパターンである。図中の＋は、イネ種子リポキシゲナーゼ３遺伝子をホモで保有している個体（イネ品種日本晴型ホモ個体）、−は、イネ種子リポキシゲナーゼ３変異型遺伝子をホモで保有している個体（イネ品種Ｄａｗ Ｄａｍ型ホモ個体）、±は、イネ種子リポキシゲナーゼ３遺伝子とイネ種子リポキシゲナーゼ３変異型遺伝子とを共に保有している個体（ヘテロ個体）であることを示している。
【０１３０】
その結果、９個のＢ４Ｆ２個体（９１４１、９１４３、９１４８〜９１５０、９１５７〜９１６０）は、イネ品種日本晴型ホモ個体、２個のＢ４Ｆ２個体（９１５１、９１４４）は、イネ品種Ｄａｗ Ｄａｍ型ホモ個体、９個のＢ４Ｆ２個体（９１４２、９１４５〜９１４７、９１５２〜９１５６）は、これらのヘテロ個体であると判定された。
【０１３１】
そこで、２０個のＢ４Ｆ２個体を生育させ、そこから種子を採取し、抗イネ種子リポキシゲナーゼ３抗体を用いたウェスタンブロッッティングによって、イネ種子中におけるイネ種子リポキシゲナーゼ３の発現の有無を調べた。
【０１３２】
その結果、イネ種子リポキシゲナーゼ３は、イネ品種日本晴型ホモ個体及びヘテロ個体であると判定された個体の種子では確認されたが、イネ品種Ｄａｗ Ｄａｍ型ホモ個体であると判定された個体の種子では確認されなかった。
【０１３３】
以上の結果より、実施例３に記載した制限酵素ＭｖａＩを用いたＣＡＰＳ法又実施例４に記載したドットブロットＳＮＰ法等によって、配列表の配列番号３に示されるイネ種子リポキシゲナーゼ３遺伝子のゲノムＤＮＡの第３１２８番目の塩基（配列表の配列番号２に記載の塩基配列からなるイネ種子リポキシゲナーゼ３遺伝子の第１４９７番目の塩基）がアデニンに変異しているイネを選抜することにより、イネ種子中のリポキシゲナーゼ３が欠失しているイネを当代検定で選抜でき、育種できることが明らかとなった。
【図面の簡単な説明】
【０１３４】
【図１】イネＯｓ０３ｇ０７００４００のアミノ酸配列における、ＭＡＤＦＬＧＹＳＩＫ、ＲＦＰＬＱＬＶＫ、及びＤＬＬＰＡＡＧＤＹＩの位置を示したものである。
【図２】ダイレクトシークエンスを行ったイネ種子リポキシゲナーゼ３遺伝子のゲノムＤＮＡの５つの領域の位置を示したものである。
【図３】イネ種子リポキシゲナーゼ３遺伝子のゲノムＤＮＡの塩基配列を示したものである。
【図４】イネ品種Ｄａｗ Ｄａｍのイネ種子リポキシゲナーゼ３遺伝子のゲノムＤＮＡの塩基配列を示したものである。
【図５】イネ品種Ｄａｗ Ｄａｍのイネ種子リポキシゲナーゼ３遺伝子のゲノムＤＮＡで認められた、ナンセンス変異の位置を示したものである。
【図６】制限酵素ＭｖａＩを用いたＣＡＰＳ法の手順に従って、被検イネのゲノムを鋳型にＰＣＲを行い、制限酵素ＭｖａＩで切断後に電気泳動して検出されたバンドパターンである。
【図７】ドットブロットＳＮＰ法による解析結果を示した図である。（Ａ）は、イネ種子リポキシゲナーゼ３遺伝子を検出するために、ＷＴ−ｒｓＬＯＸ３−ｐｒｏｂｅの５’末端をジゴキシゲニン標識したものを検出プローブに、非標識のＭｕｔ−ｒｓＬＯＸ３−ｐｒｏｂｅを競合プローブに用いて、ドットブロットＳＮＰ法で解析した結果である。（Ｂ）は、イネ種子リポキシゲナーゼ３変異型遺伝子を検出するために、Ｍｕｔ−ｒｓＬＯＸ３−ｐｒｏｂｅの５’末端をジゴキシゲニン標識したものを検出プローブに、非標識のＷＴ−ｒｓＬＯＸ３−ｐｒｏｂｅを競合プローブに用いて、ドットブロットＳＮＰ法で解析した結果である。（Ｃ）は、各Ｆ２個体のイネ種子リポキシゲナーゼ３の表現型を示したものである。
【図８】制限酵素ＭｖａＩを用いたＣＡＰＳ法の手順に従って、各Ｂ４Ｆ２個体のゲノムを鋳型にＰＣＲを行い、制限酵素ＭｖａＩで切断後に電気泳動して検出されたバンドパターンである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、イネ種子リポキシゲナーゼ３変異型遺伝子、並びにリポキシゲナーゼ３が欠失しているイネの選抜方法及び育種方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
イネの種子である米は、他の食品と比べて貯蔵が容易であるが、長期にわたって新鮮な状態を保って貯蔵することは困難であり、貯蔵期間の経過に伴って劣化が生じる。米の劣化は、糊粉層に含まれる脂質の酸化分解が原因とされ、脂質の酸化分解で生じた遊離脂肪酸がデンプンと結合することによって米の物性が低下し、遊離脂肪酸から生じた過酸化脂質が分解することによって古米臭が生じる。
【０００３】
米の劣化を防ぐ方法としては、脂質の酸化を抑えて貯蔵する方法が報告されている。例えば、１）玄米の状態で、１５℃程度の冷温で貯蔵する方法、２）籾の状態で貯蔵する方法、３）米の遊離脂肪酸量を測定し、遊離脂肪酸量が高い場合には精白して貯蔵する方法（特許文献１）、４）玄米を粉砕し、８０〜１６０℃で加熱した後に貯蔵する方法（特許文献２）、５）カプサイシンや二酸化塩素ガスで貯蔵米を殺虫・殺菌処理して米を貯蔵する方法（特許文献３及び４）などが挙げられる。
【０００４】
一方、リポキシゲナーゼは、脂質を過酸化する、ないしは脂質に酸素添加する作用を有する酵素であり、３種類のアイソザイムの存在が知られている。この中でも、リポキシゲナーゼ３は、米の胚芽中で検出されるリポキシゲナーゼ活性の８０〜９０％を占める主要なアイソザイムである。
【０００５】
【特許文献１】特開２０００−４７８４号公報
【特許文献２】特開２００５−３４１４７号公報
【特許文献３】特開平６−３８６７８号公報
【特許文献４】特開平１１−１６８９６９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、従来からの米の貯蔵方法に代えて、上記１）〜５）に記載の方法を実行するには、各方法に適した設備（冷却・保冷施設、籾貯蔵用のスペース等）や処理（遊離脂肪酸の測定、精白処理、加熱処理、殺虫・殺菌処理等）が必要であり、コスト、技術、及び時間の面で問題があった。
【０００７】
また、米の胚芽中で発現し、米の劣化に強く関与するイネ種子リポキシゲナーゼ３遺伝子及びその変異型遺伝子はこれまで同定されておらず、リポキシゲナーゼ３が欠失しているイネを選抜又は育種するには、イネ種子中に含まれるリポキシゲナーゼ３の活性、又はリポキシゲナーゼ３タンパク質の存在を指標に後代検定を行うしか方法がなかった。
【０００８】
そこで本発明は、イネ種子中のリポキシゲナーゼ３が欠失しているイネを、当代検定で簡易に選抜することにより、米の劣化が起こりにくく、貯蔵性が向上した米を得ることを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記目的を達成するため、本発明は、配列表の配列番号１記載の塩基配列からなるイネ種子リポキシゲナーゼ３変異型遺伝子を提供する。
【００１０】
本発明者らは、イネ種子中に存在するリポキシゲナーゼについて鋭意研究を重ねた結果、イネ種子中で特異的に発現し、米の劣化の原因なるイネ種子リポキシゲナーゼ３の遺伝子及びその変異型遺伝子を同定するに至った。これまでも、イネ種子で発現するリポキシゲナーゼ３遺伝子及びその変異型遺伝子を同定する試みはされてきたが、イネのリポキシゲナーゼには、少なくとも３つのアイソザイム（リポキシゲナーゼ１、２、及び３）が存在し、リポキシゲナーゼをコードする遺伝子は、ゲノム上に少なくとも２０種類以上存在することが予測されているため、これらの遺伝子を同定することは非常に困難であった。
【００１１】
上記のイネ種子リポキシゲナーゼ３変異型遺伝子が同定されたことにより、イネ種子における脂質の分解機構の解明がさらに進むと共に、上記のイネ種子リポキシゲナーゼ３変異型遺伝子をホモで保有するイネを育種素材として利用し、イネの種子中で発現する野生型のリポキシゲナーゼ３遺伝子を上記のイネ種子リポキシゲナーゼ３変異型遺伝子に置き換えたイネ系統及び品種を作出すれば、脂質の酸化・分解が抑制され、貯蔵性が向上した米を得ることができる。
【００１２】
本発明は、イネ種子中のリポキシゲナーゼ３が欠失しているイネの選抜方法であって、配列表の配列番号２記載の塩基配列からなるイネ種子リポキシゲナーゼ３遺伝子の５’側から第１４９７番目の塩基がアデニンに変異しているイネを、イネ種子中のリポキシゲナーゼ３が欠失しているイネであると判定する選抜方法を提供する。
【００１３】
上記選抜方法によれば、イネ種子リポキシゲナーゼ３遺伝子の５’側から第１４９７番目の塩基を調べることにより、米の劣化の起こりやすさや米の貯蔵性を判定でき、米の劣化が起こりにくく、貯蔵性に優れたイネの選抜及び育種を当代検定で行うことができる。
【００１４】
上記選抜方法は、被検イネからゲノムＤＮＡを抽出する抽出ステップと、配列表の配列番号３に示される塩基配列の第３１２８番目の塩基より５’側の塩基配列と相同な塩基配列の一部配列からなるプライマーと、配列表の配列番号３に示される塩基配列の第３１２８番目の塩基より３’側の塩基配列と相補的な塩基配列の一部配列からなるプライマーと、からなるプライマーセットで、ゲノムＤＮＡを鋳型にＤＮＡ断片を増幅する増幅ステップと、増幅ステップで増幅されたＤＮＡ断片中に制限酵素ＭｖａＩの認識配列がない場合に、イネ種子中のリポキシゲナーゼ３が欠失しているイネであると判定する判定ステップと、を備えることが好ましい。
【００１５】
上記選抜方法によれば、イネ種子リポキシゲナーゼ３遺伝子の塩基配列を調べることなく、ゲノムＤＮＡを鋳型として増幅されたＤＮＡ断片が制限酵素ＭｖａＩによって切断されるか否かを調べることによって、簡易に米の劣化の起こりやすさや米の貯蔵性を判定できる。
【００１６】
また、上記選抜方法は、被検イネからゲノムＤＮＡを抽出する抽出ステップと、配列表の配列番号３に示される塩基配列の第３１２８番目の塩基より５’側の塩基配列と相同な塩基配列の一部配列からなるプライマーと、配列表の配列番号３に示される塩基配列の第３１２８番目の塩基より３’側の塩基配列と相補的な塩基配列の一部配列からなるプライマーと、からなるプライマーセットで、ゲノムＤＮＡを鋳型にＤＮＡ断片を増幅する増幅ステップと、増幅ステップで増幅されたＤＮＡ断片を膜に固定する固定ステップと、配列表の配列番号３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて第３１２８番目の塩基を含む連続した塩基配列からなる標識オリゴヌクレオチドと、配列表の配列番号４に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて第３１２５番目の塩基を含む連続した塩基配列からなる非標識オリゴヌクレオチドと、を混合した混合プローブを、膜に固定されたＤＮＡ断片にハイブリダイズさせるハイブリダイゼーションステップと、このＤＮＡ断片にハイブリダイズした標識オリゴヌクレオチドからのシグナルを検出する検出ステップと、検出ステップで標識オリゴヌクレオチドからのシグナルが検出されない場合に、イネ種子中のリポキシゲナーゼ３が欠失しているイネであると判定する判定ステップと、を備えることが好ましい。
【００１７】
上記選抜方法によれば、イネ種子リポキシゲナーゼ３遺伝子の塩基配列を調べたり、ゲノムＤＮＡを鋳型として増幅されたＤＮＡ断片を制限酵素で切断したりすることなく、ドットブロッティング法又はサザンブロッティング法等の手段によって、より簡易に米の劣化の起こりやすさや米の貯蔵性を判定できる。
【００１８】
また本発明は、イネ種子中のリポキシゲナーゼ３が欠失しているイネの育種方法であって、イネ種子中のリポキシゲナーゼ３を欠失させたいイネ品種又は系統のイネと、上記のイネ種子リポキシゲナーゼ３変異型遺伝子を保有するイネとを交配して雑種第一代を得る交配ステップと、この雑種第一代に上記イネ品種又は系統のイネを戻し交配して得た後代個体の中から、イネ種子リポキシゲナーゼ３変異型遺伝子をホモで保有する個体を選抜する選抜ステップとを備える育種方法を提供する。
【００１９】
上記育種方法によれば、米の貯蔵性に優れ、かつ、その他の有用形質を保持したイネの新品種及び新系統を作製できる。
【００２０】
また、上記育種方法により選抜されたイネは、その貯蔵において、省エネルギー化及び低コスト化を図ることができ、例えば、脂質酸化や異臭発生が起こりにくい高品質玄米全粒粉の製造や機能性食品等への応用が可能である。
【発明の効果】
【００２１】
本発明によれば、米の劣化の起こりやすさや米の貯蔵性を当代検定で簡易に判定でき、脂質の酸化・分解が抑制され、貯蔵性が向上した米を得ることができる。また本発明によれば、米の劣化が起こりにくく、米の貯蔵性に優れたイネの選抜及び育種を簡易かつ迅速に行うことができ、米の内部で起こっている脂質の分解機構の解明に対しても貢献できる。さらに、本発明の育種方法によって得られた米は、その貯蔵において、省エネルギー化及び低コスト化を図ることができ、米を利用した高付加価値製品の開発に利用できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
以下、本発明の好適な実施形態について説明する。
【００２３】
本発明のイネ種子リポキシゲナーゼ３変異型遺伝子は、配列表の配列番号１記載の塩基配列からなることを特徴としている。
【００２４】
「イネ種子リポキシゲナーゼ３遺伝子」とは、イネの種子で発現するリポキシゲナーゼ３遺伝子のことをいい、「イネ種子リポキシゲナーゼ３変異型遺伝子」とは、イネ種子リポキシゲナーゼ３遺伝子の塩基配列に変異が生じている遺伝子のことをいう。
【００２５】
上記のイネ種子リポキシゲナーゼ３変異型遺伝子（配列番号１）は、イネ種子リポキシゲナーゼ３遺伝子（配列番号２）の５’側から第１４９７番目のグアニンがアデニンに変異しており、この変異がナンセンス変異に該当するために、活性のあるイネ種子リポキシゲナーゼを発現できなくなったものである。
【００２６】
上記のイネ種子リポキシゲナーゼ３変異型遺伝子は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｍａｎｉａｔｉｓら、１９８９年、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス）に記載された方法に従って、配列表の配列番号１に記載の塩基配列情報をもとに合成した標識ｃＤＮＡプローブを用いて、イネｃＤＮＡライブラリー又はゲノムライブラリーからクローニングできる。
【００２７】
また、上記のイネ種子リポキシゲナーゼ３変異型遺伝子は、イネから抽出したトータルＲＮＡ又はポリＡ＋ＲＮＡを鋳型として配列表の配列番号１に記載の塩基配列情報をもとにデザインしたプライマーセットを用いることによって、ＲＴ−ＰＣＲ法で合成でき、さらには、これらの遺伝子の部分配列をＤＮＡ合成機で化学合成し、酵素的手法及びサブクローニングの手法を使ってつなぎ合わせることによっても取得できる。
【００２８】
本発明の選抜方法は、イネ種子中のリポキシゲナーゼ３が欠失しているイネの選抜方法であって、配列表の配列番号２記載の塩基配列からなるイネ種子リポキシゲナーゼ３遺伝子の５’側から第１４９７番目の塩基がアデニンに変異しているイネを、イネ種子中のリポキシゲナーゼ３が欠失しているイネであると判定することを特徴としている。
【００２９】
塩基の変異を利用してイネ種子中のリポキシゲナーゼ３が欠失しているイネを選抜する方法としては、例えば、上記変異部位を含むＤＮＡ断片をＰＣＲ等で増幅し、塩基配列を決定したり、プライマー配列の３’末端又はプライマー配列内部に上記変異部位を含むプライマーを用いて、ゲノムＤＮＡを鋳型にＰＣＲ等でＤＮＡ断片の増幅を行い、増幅の有無や増幅効率の違いを比較したりして、塩基の変異を検出する方法が挙げられる。
【００３０】
上記選抜方法の第一の態様は、被検イネからゲノムＤＮＡを抽出する抽出ステップと、配列表の配列番号３に示される塩基配列の第３１２８番目の塩基より５’側の塩基配列と相同な塩基配列の一部配列からなるプライマーと、配列表の配列番号３に示される塩基配列の第３１２８番目の塩基より３’側の塩基配列と相補的な塩基配列の一部配列からなるプライマーと、からなるプライマーセットで、ゲノムＤＮＡを鋳型にＤＮＡ断片を増幅する増幅ステップと、増幅ステップで増幅されたＤＮＡ断片中に制限酵素ＭｖａＩの認識配列がない場合に、イネ種子中のリポキシゲナーゼ３が欠失しているイネであると判定する判定ステップと、を備えることを特徴としている。
【００３１】
抽出ステップでは、被検イネからゲノムＤＮＡを抽出するが、ゲノムＤＮＡの抽出方法として、例えば、ＣＴＡＢ法（Ｍｕｒｒａｙら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１９８０年、８巻、ｐ．４３２１−４３２５）やＥｔｈｉｄｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ法（ＶａｒａｄａｒａｊａｎとＰｒａｋａｓｈ、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． Ｒｅｐ．、１９９１年、９巻、ｐ．６−１２）によって抽出できる。ここで、ゲノムＤＮＡを抽出する組織はイネ種子のみならず、葉、茎、根等を用いることも可能である。例えば、葉を用いることで、戻し交配世代途中の多数の個体選抜に利用することが可能になる。
【００３２】
増幅ステップでは、例えば、ＰＣＲ法によって行うことができる。ここで、ＰＣＲ法において用いられるプライマーセットは、配列表の配列番号３に示される塩基配列の第３１２８番目の塩基より５’側の塩基配列と相同な塩基配列の一部配列からなるプライマーと、配列表の配列番号３に示される塩基配列の第３１２８番目の塩基より３’側の塩基配列と相補的な塩基配列の一部配列からなるプライマーと、からなるプライマーセットであれば、特定の塩基配列に制限されることはないが、プライマーの長さは、ＰＣＲの条件設定の容易さ及び効率の観点から、それぞれ塩基数が１０〜６０個の連続した塩基であることが好ましく、１５〜３０個の連続した塩基であることがより好ましく、２０個の連続した塩基であることがさらに好ましい。また、各プライマーの塩基配列におけるＧＣ含量は、４０〜６０％であることが好ましく、プライマー内で２次構造を取らないことが好ましい。さらに、プライマーセットの各プライマー間のＴｍ値は、両者に差がないか、あったとしても少ない方が好ましい。
【００３３】
このような条件を満たすプライマーセットとしては、配列表の配列番号５に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（５’‐ｇｃｃａａｇａｇｃａｃｃｇｔｇｔａｃａｃｇ‐３’）と、配列表の配列番号６に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（５’‐ｇｇａａｇａｃｇｇｔｃａｔｃｔｃｇａａｇ‐３’）が挙げられる。なお、各プライマーは、配列表の配列番号３に示される塩基配列を基にして、化学合成できる。
【００３４】
判定ステップでは、増幅ステップで増幅されたＤＮＡ断片中に制限酵素ＭｖａＩの認識配列があるか否かを指標にするため、増幅されたＤＮＡ断片を制限酵素ＭｖａＩで切断し、アガロースゲル電気泳動又はポリアクリルアミドゲル電気泳動でＤＮＡ断片のバンドの数及び長さを調べればよい。増幅されたＤＮＡ断片中に制限酵素ＭｖａＩの認識配列がある場合には、電気泳動で検出されるバンドの数は切断前と比較して１本増えることとなり、バンドの長さについても短くなっていることが容易に確認できるからである。
【００３５】
すなわち、イネ種子リポキシゲナーゼ３遺伝子のゲノムＤＮＡの塩基配列である配列番号３に示される塩基配列の５’側から第３１２８番目の塩基がアデニンに変異していれば、被検イネはイネ種子中のリポキシゲナーゼ３が欠失しているイネであるが、第３１２８番目の塩基は、制限酵素ＭｖａＩの認識配列上にあって、制限酵素ＭｖａＩによって切断されるか否かを決定付ける塩基であるため、イネ種子中のリポキシゲナーゼ３が欠失しているイネの選抜が可能となる。
【００３６】
上記選抜方法の第二の態様は、被検イネからゲノムＤＮＡを抽出する抽出ステップと、配列表の配列番号３に示される塩基配列の第３１２８番目の塩基より５’側の塩基配列と相同な塩基配列の一部配列からなるプライマーと、配列表の配列番号３に示される塩基配列の第３１２８番目の塩基より３’側の塩基配列と相補的な塩基配列の一部配列からなるプライマーと、からなるプライマーセットで、ゲノムＤＮＡを鋳型にＤＮＡ断片を増幅する増幅ステップと、増幅ステップで増幅されたＤＮＡ断片を膜に固定する固定ステップと、配列表の配列番号３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて第３１２８番目の塩基を含む連続した塩基配列からなる標識オリゴヌクレオチドと、配列表の配列番号４に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて第３１２５番目の塩基を含む連続した塩基配列からなる非標識オリゴヌクレオチドと、を混合した混合プローブを、膜に固定されたＤＮＡ断片にハイブリダイズさせるハイブリダイゼーションステップと、このＤＮＡ断片にハイブリダイズした標識オリゴヌクレオチドからのシグナルを検出する検出ステップと、検出ステップで標識オリゴヌクレオチドからのシグナルが検出されない場合に、イネ種子中のリポキシゲナーゼ３が欠失しているイネであると判定する判定ステップと、を備えることを特徴としている。
【００３７】
抽出ステップ及び増幅ステップは、上記選抜方法の第一の態様で示した通りである。
【００３８】
固定ステップでは、増幅ステップで増幅されたＤＮＡ断片を膜に固定するが、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｍａｎｉａｔｉｓら、１９８９年、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス）に記載されたドットブロットハイブリダイゼーション法やサザンブロットハイブリダイゼーション法に従って、ＤＮＡ断片を膜に転写し、ＵＶ光を用いたクロスリンク又は１２０℃で３０分間のベーキングを行うことによってＤＮＡ断片を膜に固定すればよい。ＤＮＡ断片を転写する膜としては、例えば、ニトロセルロース、ナイロン、ＰＶＤＦ、又はそれらの混合物からなる膜を使用できる。
【００３９】
ハイブリダイゼーションステップでは、標識オリゴヌクレオチドと非標識オリゴヌクレオチドとを混合した混合プローブと、膜に固定されたＤＮＡ断片とをハイブリダイズさせるが、ハイブリダイゼーションの手法は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｍａｎｉａｔｉｓら、１９８９年、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス）に記載されたドットブロットハイブリダイゼーション法やサザンブロットハイブリダイゼーション法に従って行えばよい。
【００４０】
混合プローブを構成する標識オリゴヌクレオチドは、配列表の配列番号３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて第３１２８番目の塩基を含む連続した塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをその塩基配列を基に化学合成し、得られたオリゴヌクレオチドを標識すればよい。混合プローブを構成する非標識オリゴヌクレオチドは、配列表の配列番号４に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて第３１２５番目の塩基を含む連続した塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをその塩基配列を基に化学合成すればよい。
【００４１】
混合プローブを構成する標識オリゴヌクレオチド及び非標識オリゴヌクレオチドの長さは、それぞれ塩基数が１０〜３０個の連続した塩基であることが好ましく、１０〜２０個の連続した塩基であることがより好ましく、１７〜２０個の連続した塩基であることがさらに好ましい。また、各オリゴヌクレオチドは、ＧＣ含量が４０〜６０％であることが好ましく、２次構造を取らない配列であることが好ましい。さらに、プローブを構成する各オリゴヌクレオチド間のＴｍ値は、両者に差がないか、あったとしても少ない方が好ましい。
【００４２】
このような条件を満たす標識オリゴヌクレオチドとしては、配列表の配列番号７に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（５’‐ｇａｇｇｃｃｔｇｇｇｔｇｔｇｇｃａ‐３’）を標識したものが挙げられ、非標識オリゴヌクレオチドとしては、配列表の配列番号８に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（５’‐ｇａｇｇｃｃｔｇａｇｔｇｔｇｇｃａ‐３’）が挙げられる。
【００４３】
オリゴヌクレオチドの標識は、化学合成したオリゴヌクレオチドを、例えば、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）、ビオチン、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、ＤＮＰ(ｄｉｎｉｔｒｏｐｈｅｎｏｌ)、及び放射性同位元素のいずれかで標識すればよく、標識部位はオリゴヌクレオチドの５’末端が好ましい。
【００４４】
混合プローブを構成する標識オリゴヌクレオチドと非標識オリゴヌクレオチドの混合割合は、非標識オリゴヌクレオチドを競合プローブとして使用するため、非標識オリゴヌクレオチドの量が、標識オリゴヌクレオチドの量よりも過剰に混合されることが好ましく、その混合割合は、標識オリゴヌクレオチド：非標識オリゴヌクレオチド＝１：２〜１：１０であることが好ましく、標識オリゴヌクレオチド：非標識オリゴヌクレオチド＝１：５であることがより好ましい。
【００４５】
検出ステップでは、膜に固定されたＤＮＡ断片にハイブリダイズした標識オリゴヌクレオチドの標識化合物に起因するシグナルを検出するが、シグナルを検出する手法は、標識に使用した化合物を検出する手法として確立された方法（中山と西方、「バイオイラストレイテド２：遺伝子解析の基礎」、秀潤社、１９９５年；野村と稲澤、「脱アイソトープ実験プロトコール１：ＤＩＧハイブリダイゼーション、秀潤社、１９９４年）に従えばよく、当業者であれば容易にそのシグナルを検出できる。
【００４６】
例えば、ＤＩＧ標識オリゴヌクレオチドをプローブに用いた場合には、以下のようにしてＤＩＧに起因して発生するシグナルを検出できる。
【００４７】
まず、ハイブリダイゼーション後の膜を、緩衝液−１（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．６、１５０ｍＭ ＮａＣl）で十分に洗浄して非特異的に吸着したＤＩＧ標識オリゴヌクレオチドを取り除き、検出時における膜の時のバックグラウンドを低くするために、スキムミルク等のブロッキング試薬を含む上記緩衝液（緩衝液−２）に膜を９０分間浸漬する。
【００４８】
次に、膜を浸漬している緩衝液中に、抗ＤＩＧアルカリフォスファターゼ標識抗体（ロッシュ社）を２μＬ／１０ｍＬの割合で加え、３０分間振盪しながら静置する。その後、膜を取り出し、新しい緩衝液−１に浸漬し、振盪しながら１５分間洗浄する操作を２回繰り返して未反応の抗ＤＩＧアルカリフォスファターゼ標識抗体を取り除き、膜を平衡化緩衝液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ９．５、１００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＭｇＣｌ２）で処理することによって膜上のｐＨをアルカリ側にし、５０〜１００μＬのＣＤＰ−ｓｔａｒ（アルカリフォスファターゼの発光基質；ロッシュ社）を膜上に滴下する。
【００４９】
その後、ＣＤＰ−ｓｔａｒが膜全体にいきわたるようにして暗所で５分間反応させれば、ＤＩＧ標識オリゴヌクレオチドに特異的に結合したアルカリフォスファターゼが発する化学発光シグナルを、化学発光検出解析装置やＸ線フィルム等で検出できる。
【００５０】
判定ステップでは、上記の検出ステップで標識オリゴヌクレオチドからシグナルが検出されるか否かを指標にし、標識オリゴヌクレオチドからのシグナルが検出されない場合に、リポキシゲナーゼ３が欠失しているイネであると判定すればよい。
【００５１】
また、本発明の育種方法は、イネ種子中のリポキシゲナーゼ３が欠失しているイネの育種方法であって、イネ種子中のリポキシゲナーゼ３を欠失させたいイネ品種又は系統のイネと、上記のイネ種子リポキシゲナーゼ３変異型遺伝子を有するイネとを交配して雑種第一代を得る交配ステップと、この雑種第一代に上記イネ品種又は系統のイネを戻し交配して得た後代個体の中から、イネ種子リポキシゲナーゼ３変異型遺伝子をホモで保有する個体を選抜する選抜ステップと、を備えることを特徴としている。
【００５２】
交配ステップでは、イネ種子中のリポキシゲナーゼ３を欠失させたいイネ品種又は系統と、イネ種子リポキシゲナーゼ３変異型遺伝子を有するイネとを、当業者通常行う方法で交配させ、雑種第一代（以下、Ｆ１）を得ればよい。イネ種子リポキシゲナーゼ３変異型遺伝子を有するイネは、上記のイネ種子中のリポキシゲナーゼ３が欠失しているイネの選抜方法で選抜すれば取得できるが、イネ品種Ｄａｗ Ｄａｍがイネ種子リポキシゲナーゼ３変異型遺伝子を有していることが、本願の研究者らによって明らかにされている。イネ品種Ｄａｗ Ｄａｍは、独立行政法人農業生物資源研究所から入手することが可能である。
【００５３】
選抜ステップでは、交配ステップで得たＦ１にイネ品種又は系統を戻し交配して得た後代個体の中から、前記イネ種子リポキシゲナーゼ３変異型遺伝子をホモで保有する個体を選抜するが、この選抜は、上記のイネ種子中のリポキシゲナーゼ３が欠失しているイネの選抜方法を使用すればよい。
【００５４】
また、本発明のイネ種子中のリポキシゲナーゼ３が欠失しているイネは、上記の育種方法により選抜されたことを特徴としており、当業者であれば上記の育種方法に従って育種することが可能である。
【実施例】
【００５５】
本発明を以下の実施例に基づいてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００５６】
１．材料及び方法
１）抗イネ種子リポキシゲナーゼ３抗体を産生するハイブリドーマの作製
（抗原タンパク質の精製）
抗イネ種子リポキシゲナーゼ３抗体を産生するハイブリドーマは、イネ品種日本晴（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ Ｌ． ｃｖ． Ｎｉｐｐｏｎｂａｒｅ）の種子の胚芽から部分精製したイネ種子リポキシゲナーゼ３を抗原タンパク質として用いて作製した。イネ種子リポキシゲナーゼ３の部分精製は、Ｏｈｔａらの方法（Ａｇｒｉｃ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、１９８６年、５０巻、ｐ．３１６５−３１７１）に若干の修正を加え、以下の手順で行った。
【００５７】
具体的には、イネ種子の胚芽（３ｋｇ）を５倍容の抽出用緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．６）中で磨砕し、１時間攪拌した。磨砕液は遠心分離し、その上清に３０％飽和となるように硫安を加えて溶解し、遠心分離後に再び上清に５０％飽和となるように硫安を加えて溶解し、硫安沈殿を行った。その後、沈殿したタンパク質を抽出用緩衝液で溶解し、透析することにより硫安を取り除き、以下の６種類のカラムクロマトグラフィーでイネ種子リポキシゲナーゼ３を部分精製した。
【００５８】
まず、陽イオン交換クロマトグラフィー（カラム：ＱＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ５５０Ｃ；東ソー社）によって、３種のイネ種子リポキシゲナーゼのアイソザイムを分画し、リポキシゲナーゼ活性を指標にイネ種子リポキシゲナーゼ３の画分を回収した。
【００５９】
次に、疎水性クロマトグラフィー（カラム：Ｂｕｔｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ６５０Ｃ；東ソー社）、金属キレートアフィニティークロマトグラフィー（カラム：Ｃｕ２＋−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ；ファルマシア社）、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー（カラム：Ｂｉｏ−Ｇｅｌ ＨＴ；バイオラッド社）、ゲルろ過クロマトグラフィー（カラム：Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−１５０；ファルマシア社）で順次精製し、最後に、再度、陽イオン交換クロマトグラフィー（カラム：ＱＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ５５０Ｃ；東ソー社）で分画することにより、イネ種子リポキシゲナーゼ３を部分精製した。
【００６０】
得られたイネ種子リポキシゲナーゼ３の部分精製物は、−４０℃で凍結保存し、抗イネ種子リポキシゲナーゼ３抗体の抗原タンパク質として使用した。
【００６１】
リポキシゲナーゼ３の活性は、Ａｘｅｌｒｏｄらの方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１９８１年、７１巻、ｐ．４４１−４５１）に従って、リノール酸の過酸化物の生成により生じる吸光度（２３４ｎｍ）の増加を調べることにより求めた。その際、０．３３ｍＭのリノール酸を含む０．２Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）を酵素反応液とし、２５℃、１分間当たり１μｍｏｌのリノール酸を過酸化するリポキシゲナーゼの活性を１ユニット（Ｕｎｉｔ）とした。
【００６２】
また、タンパク質濃度の測定は、Ｂｒａｄｆｏｒｄらの方法（Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１９７６年、７２巻、ｐ．２４８−２５８）に従って、牛血清アルブミンを標準タンパク質として色素結合法により行った。
【００６３】
（抗イネ種子リポキシゲナーゼ３産生ハイブリドーマの作製）
ハイブリドーマの作製は、青木らの方法（「蛋白質・核酸・酵素」、１９８７年、別冊３０、ｐ．１７１−１８５）、岩崎らの方法（「ハイブリドーマとＥＬＩＳＡ」、講談社サイエンティフィック、１９８３年、ｐ．１９６）、及び富山らの方法（「単クローン抗体実験マニュアル」、講談社サイエンティフィック、１９８７年、ｐ．２４６）を参考にして、以下の手順で行った。
【００６４】
まず、イネ種子リポキシゲナーゼ３の部分精製物（６０μｇ）をＰＢＳ（０．１５Ｍ ＮａＣｌを含む１０ｍＭ Ｎａ／Ｋ リン酸緩衝液、ｐＨ７．２）に溶解し、そこにＦｒｅｕｎｄの完全アジュバントを等量加えて乳化させた後、ＢＡＬＢ／ｃマウスに免疫した。初回免疫から４週間後に、イネ種子リポキシゲナーゼ３の部分精製物を不完全アジュバンドと混合して乳化させたものを用いて追加免疫し、追加免疫から３日後に、免疫したＢＡＬＢ／ｃマウスから脾臓細胞（抗体産生細胞）を分離した。その後、脾臓細胞とＰＩＡミエローマ細胞をポリエチレングリコールの存在下で細胞融合させ、９６ウェルプレート上で培養した。
【００６５】
細胞融合から２週間後に、各ウェルから５０μＬの培養上清を採取し、ＥＬＩＳＡ法でイネ種子リポキシゲナーゼ３に対するモノクローナル抗体の産生の有無を試験した。抗イネ種子リポキシゲナーゼ３抗体を産生しているハイブリドーマは、限界希釈法によるクローニングを２回行い、クローンごとに小分けして液体窒素下で凍結保存した。
【００６６】
（抗イネ種子リポキシゲナーゼ３抗体の調製）
抗イネ種子リポキシゲナーゼ３抗体を大量に調製するため、まず、上記の抗イネ種子リポキシゲナーゼ３抗体を産生するハイブリドーマ（３×１０６個）を、予め０．５ｍＬのプリスタンを腹腔内投与しておいたＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内に投与した。
【００６７】
投与２週間後に腹水を集め、５０％飽和となるように硫安を加えて硫安沈殿を行い、沈殿したタンパク質をＰＢＳに溶解し、透析後、抗イネ種子リポキシゲナーゼ３抗体を含む透析画分に等量の平衡緩衝液（１．５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、３．０Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８．９）を加えた。
【００６８】
その後、平衡緩衝液で平衡化したＰｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ カラム（１．５×２．５ｃｍ；ファルマシア社）に平衡緩衝液を加えた透析画分をアプライし、平衡緩衝液で洗浄した後に０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４．０）で抗イネ種子リポキシゲナーゼ３抗体を溶出し、８分の１容の２．５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）を加えて中和した。こうして得られた抗イネ種子リポキシゲナーゼ３抗体は、０．０５％ ＮａＮ３を含むＰＢＳにバッファー交換して４℃で保存した。
【００６９】
２）アフィニティーカラムによるイネ種子リポキシゲナーゼ３の精製
（抗イネ種子リポキシゲナーゼ３抗体アフィニティーカラムの作製）
大量調製した抗イネ種子リポキシゲナーゼ３抗体の約５８ｍｇを、東ソー社のプロトコールに従って、２．３ｇのＴｏｒｅｓｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ６５０（東ソー社）に結合させ、イネ種子リポキシゲナーゼ３の精製用のアフィニティー樹脂を作製した。その後、アフィニティー樹脂は、液体クロマトグラフィー用のカラム（１．５×５．０ｃｍ）に充填し、抗イネ種子リポキシゲナーゼ３抗体アフィニティーカラムとして、イネ種子リポキシゲナーゼ３の精製に使用した。
【００７０】
（イネ種子リポキシゲナーゼ３の精製）
イネ品種日本晴の種子の胚芽（１００ｇ）を５倍容の抽出緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１ｍＭ モノヨード酢酸、ｐＨ８．９）中で磨砕し、１時間攪拌した。磨砕液は遠心分離し、その上清に３０％飽和となるように硫安を加えて溶解し、遠心分離後に再び上清に５０％飽和となるように硫安を加えて溶解し、硫安沈殿を行った。
【００７１】
その後、沈殿したタンパク質をＴＭ緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１ｍＭ ＭＩＡ、ｐＨ７．６）で溶解し、透析することにより硫安を取り除き、ＴＭ緩衝液で平衡化した抗イネ種子リポキシゲナーゼ３抗体アフィニティーカラムにアプライした。その後、ＴＭ緩衝液で抗イネ種子リポキシゲナーゼ３抗体アフィニティーカラムを十分に洗浄し、アフィニティーカラムに保持されたイネ種子リポキシゲナーゼ３を０．１ｍＭのＭＩＡを含む５０％（ｗ／ｖ）エチレングリコールで溶出した。
【００７２】
その結果、リポキシゲナーゼ活性の比活性が４００倍以上高まり、アミノ酸配列の決定が可能な純度のイネ種子リポキシゲナーゼ３が１３７μｇ得られた。
【００７３】
２．実施例
（実施例１）イネ種子リポキシゲナーゼ３タンパク質のアミノ酸配列の決定：
抗イネ種子リポキシゲナーゼ３抗体アフィニティークロマトグラフィーで精製した純度の高いイネ種子リポキシゲナーゼ３タンパク質を、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分画し、ＣＢＢで染色されたバンドを切り出し、Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら（Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１９９２年、２０３巻、ｐ．１７３−１７９）の方法に従ってゲル内消化した。その後、逆相ＨＰＬＣによりペプチドを回収し、イネ種子リポキシゲナーゼ３のアミノ酸配列の部分配列を、アミノ酸シークエンサー（Ｐｒｏｓｉｃｅ ４９４ ＨＴ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ；Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）によって決定した。
【００７４】
その結果、イネ種子リポキシゲナーゼ３タンパク質の３箇所の部分配列を決定でき、そのアミノ酸配列は、ＭＡＤＦＬＧＹＳＩＫ、ＲＦＰＬＱＬＶＫ、及びＤＬＬＰＡＡＧＤＹＩであった。
【００７５】
そこで、この３つのアミノ酸配列を基にＲｉｃｅＢｌａｓｔ（ｈｔｔｐ：／／ｒｉｃｅｂｌａｓｔ．ｄｎａ．ａｆｆｒｃ．ｇｏ．ｊｐ／）でデータベース検索を行い、これらのアミノ酸配列を包含するイネ遺伝子の塩基配列を探索した。その結果、３つの配列のいずれもがイネＯｓ０３ｇ０７００４００（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのアクセッション番号ＮＭ＿００１０５７５２８）のアミノ酸配列に含まれていることが判明した。
【００７６】
図１は、イネＯｓ０３ｇ０７００４００のアミノ酸配列における、ＭＡＤＦＬＧＹＳＩＫ、ＲＦＰＬＱＬＶＫ、及びＤＬＬＰＡＡＧＤＹＩの位置を示したものである。
【００７７】
その結果、イネの種子で発現するイネ種子リポキシゲナーゼ３遺伝子は、イネＯｓ０３ｇ０７００４００の塩基配列と一致することが強く示唆された。
【００７８】
そこで、イネ種子リポキシゲナーゼ遺伝子のゲノムＤＮＡの塩基配列を調べ、イントロンを除いたコーディング領域の塩基配列とイネＯｓ０３ｇ０７００４００の塩基配列とを比較した。
【００７９】
具体的には、イネＯｓ０３ｇ０７００４００の塩基配列を基に、イネ種子リポキシゲナーゼ３遺伝子のゲノムＤＮＡを５つの領域（領域１〜５）に分け、イネ品種日本晴のゲノムＤＮＡを鋳型に用いてＰＣＲを行い、増幅されたＤＮＡ断片をダイレクトシークエンスして、各領域の塩基配列を決定した。
【００８０】
イネ種子リポキシゲナーゼ３遺伝子の領域１の増幅には、ｒｓＬＯＸ３−１−Ｆ：５’−ｔａｔｇｔｃａｃａｔｔｃａｃｃｃａａａａｔｃｃ−３’（配列番号９）とｒｓＬＯＸ３−１−Ｒ：５’−ｃｔｇａｔｇａｇｃｔｇｇｃａｇｇｔｇａｃ−３’（配列番号１０）、領域２の増幅には、ｒｓＬＯＸ３−２−Ｆ：５’−ｇａｇｇｇａｔｃａｔｃｇａｃａｃｃａｔｃ−３’（配列番号１１）とｒｓＬＯＸ３−２−Ｒ：５’−ｇｔｇａａｃｔｇｔｇｇｃａａｃｔａｔｇａｔｇａ−３’（配列番号１２）、領域３の増幅には、ｒｓＬＯＸ３−３−Ｆ：５’−ａａａａｇａａｇｃａｇｃｔｃｔａｃａａｔｇｇａ−３’（配列番号１３）とｒｓＬＯＸ３−３−Ｒ：５’−ｃａｔｇｇｇｇａｇｃｔｔｇａｇｇａｔａｔａｇｔ−３’（配列番号１４）、領域４の増幅には、ｒｓＬＯＸ３−４−Ｆ：５’−ｇａｇｔｔｃｇａｃｔｃｇｔｔｃｃａｇｇａｃ−３’（配列番号１５）とｒｓＬＯＸ３−４−Ｒ：５’−ｇｇａａｇａｃｇｇｔｃａｔｃｔｃｇａａｇ−３’（配列番号１６）、領域５の増幅には、ｒｓＬＯＸ３−５−Ｆ：５’−ｃｔｇｔｇａｔｇｇａｇｃｃｇｔｔｃｇｔ−３’（配列番号１７）とｒｓＬＯＸ３−５−Ｒ：５’−ｇｔａａｔｃｇｔａｇｇｔａｃａｔａｔｔｃａｇ−３’（配列番号１８）を用いて、ＰＣＲを行った。
【００８１】
ＰＣＲ条件は、９４℃で１分間加熱した後に、９８℃で１０秒、６８℃で１分のサイクルを３５サイクル行い、引き続き、７２℃で３分のサイクルを１サイクル行い、その後４℃まで急冷した。
【００８２】
イネ種子リポキシゲナーゼ３遺伝子の領域１〜５に相当する各ＤＮＡ断片は、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（キアゲン社）で精製し、これを鋳型としてダイターミネーター法による反応を行い、ＡＢＩ社のＤＮＡシークエンサーで塩基配列を決定した。
【００８３】
図２は、ダイレクトシークエンスを行ったイネ種子リポキシゲナーゼ３遺伝子のゲノムＤＮＡの５つの領域の位置を示したものである。図３は、イネ種子リポキシゲナーゼ３遺伝子のゲノムＤＮＡの塩基配列を示したものである。下線で示した部分は、エクソンを示している。
【００８４】
その結果、イネ種子リポキシゲナーゼ３遺伝子のゲノムＤＮＡ（配列番号３）は、４４０２塩基からなり、９個のエクソンと、８個のイントロンからなることが明らかとなった。また、イネ種子リポキシゲナーゼ３遺伝子のゲノム配列からイントロンを取り除いたイネ種子リポキシゲナーゼ３遺伝子の塩基配列（配列番号２）は、Ｏｓ０３ｇ０７００４００の塩基配列と完全に一致していることが確認された。
【００８５】
以上の結果より、イネの種子で発現するイネ種子リポキシゲナーゼ３遺伝子の塩基配列は、イネＯｓ０３ｇ０７００４００の塩基配列と一致し、配列表の配列番号２に記載の塩基配列からなる遺伝子は、イネ種子リポキシゲナーゼ遺伝子であることが明らかとなった。
【００８６】
（実施例２）リポキシゲナーゼ３が欠失しているイネ品種Ｄａｗ Ｄａｍが保有するイネ種子リポキシゲナーゼ３遺伝子の検索：
リポキシゲナーゼ３が欠失しているイネ品種Ｄａｗ Ｄａｍのリポキシゲナーゼ３欠失性が、イネ種子リポキシゲナーゼ３遺伝子の変異によるものであるかどうかについて調べた。具体的には、イネ品種Ｄａｗ Ｄａｍのイネ種子リポキシゲナーゼ３遺伝子のゲノムＤＮＡの塩基配列を決定し、イネ種子リポキシゲナーゼ３遺伝子のゲノムＤＮＡの塩基配列（配列番号３）と比較した。
【００８７】
イネ品種Ｄａｗ Ｄａｍが保有するイネ種子リポキシゲナーゼ遺伝子のゲノムＤＮＡの塩基配列は、実施例１と同様に、イネ種子リポキシゲナーゼ３遺伝子のゲノムＤＮＡを５つの領域（領域１〜５）に分け、イネ品種Ｄａｗ ＤａｍのゲノムＤＮＡを鋳型に用いてＰＣＲを行い、増幅されたＤＮＡ断片をダイレクトシークエンスすることによって決定した。プライマーセット及びＰＣＲの条件についても、実施例１と同じである。
【００８８】
図４は、イネ品種Ｄａｗ Ｄａｍのイネ種子リポキシゲナーゼ３遺伝子のゲノムＤＮＡの塩基配列を示したものである。下線で示した部分は、エクソンを示している。また、図５は、イネ品種Ｄａｗ Ｄａｍのイネ種子リポキシゲナーゼ３遺伝子のゲノムＤＮＡで認められた、ナンセンス変異の位置を示したものである。
【００８９】
その結果、イネ品種Ｄａｗ Ｄａｍのイネ種子リポキシゲナーゼ３遺伝子のゲノムＤＮＡの塩基配列（配列番号４）は、第１イントロンにおいて、配列表の配列番号３に示されるイネ種子リポキシゲナーゼ３遺伝子のゲノムＤＮＡの第４２８番目から４３０番目の３塩基（ＡＡＡ）が欠失し、第７エキソンにおいて、配列表の配列番号３に示されるイネ種子リポキシゲナーゼ３遺伝子のゲノムＤＮＡの第３１２８番目の塩基（配列表の配列番号２に記載の塩基配列からなるイネ種子リポキシゲナーゼ３遺伝子の第１４９７番目の塩基）が、アデニンに変異していることが明らかとなった（図４において、変異したアデニン（Ａ）は、太字で示している。）。この変異は、第７エキソンのトリプトファンを指定するコドン（ＴＧＧ）を終止コドン（ＴＧＡ）へと変異させるナンセンス変異であった。
【００９０】
以上の結果より、イネ品種Ｄａｗ Ｄａｍでは、ナンセンス変異により正常なリポキシゲナーゼ３タンパク質が合成されなくなり、これがリポキシゲナーゼ３欠失性を示す原因となっていることが判明した。このため、イネ品種Ｄａｗ Ｄａｍで認められたナンセンス変異を有するイネ種子リポキシゲナーゼ３遺伝子を、イネ種子リポキシゲナーゼ３変異型遺伝子と名付けた。イネ種子リポキシゲナーゼ３変異型遺伝子の塩基配列は、配列表の配列番号１に示した通りである。
【００９１】
（実施例３）ＣＡＰＳ法によるイネ種子リポキシゲナーゼ３が欠失しているイネの選抜方法：
実施例２において、イネ種子リポキシゲナーゼ３変異型遺伝子のゲノムＤＮＡで認められた第３１２８番目の塩基（イネ種子リポキシゲナーゼ３変異型遺伝子で認められた第１４９７番目に相当する塩基）における変異は、制限酵素ＭｖａＩの認識部位（ＣＣＷＧＧ）の４番目の塩基に起きている変異であることが明らかになったため、制限酵素ＭｖａＩを用いたＣＡＰＳ法（ＫｏｎｉｅｃｚｎｙとＡｕｓｕｂｅｌ、１９９３年、Ｐｌａｎｔ Ｊ．、４巻、ｐ．４０３−４１０）によって、上記のナンセンス変異の検出を試みた。
【００９２】
被検イネとして、イネ品種日本晴個体（イネ種子リポキシゲナーゼ３遺伝子をホモで保有）にイネ品種Ｄａｗ Ｄａｍ個体（イネ種子リポキシゲナーゼ３変異型遺伝子をホモで保有）を交配して得たＦ１個体を自殖して得た１５個のＦ２個体（Ｙ−１０３〜１１６及びＹ−１２０）、並びにこれらの交配親であるイネ品種日本晴個体及びＤａｗ Ｄａｍ個体を用いた。
【００９３】
まず、イネ種子リポキシゲナーゼ３変異型遺伝子のゲノムＤＮＡ（配列番号３）の第３１２８番目の塩基より５’側の塩基配列と相同な塩基配列の一部配列からなるプライマーであるｒｓＬＯＸ３−Ｆｒａｇ−Ｆ（５’−ｇｃｃａａｇａｇｃａｃｃｇｔｇｔａｃａｃｇ−３’；配列番号５）と、第３１２８番目の塩基より３’側の塩基配列と相補的な塩基配列の一部配列からなるプライマーであるｒｓＬＯＸ３−Ｆｒａｇ−Ｒ（５’−ｇｇａａｇａｃｇｇｔｃａｔｃｔｃｇａａｇ−３’；配列番号６）と、からなるプライマーセットを合成し、変異が認められた第３１２８番目の塩基を含むＤＮＡ断片を、それぞれ被検イネのゲノムＤＮＡを鋳型にＰＣＲで増幅した。
【００９４】
ＰＣＲは、９４℃で１分間加熱した後に、９４℃で３０秒、６０℃で３０秒、７２℃で３０秒のサイクルを３５サイクル行い、引き続き、７２℃で１分のサイクルを１サイクル行い、その後、４℃まで急冷することにより終了させた。
【００９５】
その際、イネ種子リポキシゲナーゼ３遺伝子とイネ種子リポキシゲナーゼ３変異型遺伝子の双方を保有するヘテロ個体のコントロールとして、イネ品種日本晴とイネ品種Ｄａｗ ＤａｍのゲノムＤＮＡの混合物を鋳型として同様にＰＣＲを行った。
【００９６】
ＰＣＲで増幅されたＤＮＡ断片は、制限酵素ＭｖａＩで切断し、ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、電気泳動後のゲルをエチジウムブロマイドで染色し、ゲルに紫外線を照射することによってＤＮＡバンドとして検出した。
【００９７】
図６は、制限酵素ＭｖａＩを用いたＣＡＰＳ法の手順に従って、被検イネのゲノムを鋳型にＰＣＲを行い、制限酵素ＭｖａＩで切断後に電気泳動して検出されたバンドパターンである。図中の＋は、イネ種子リポキシゲナーゼ３遺伝子をホモで保有している個体（イネ品種日本晴型ホモ個体）、−は、イネ種子リポキシゲナーゼ３変異型遺伝子をホモで保有している個体（イネ品種Ｄａｗ Ｄａｍ型ホモ個体）、±は、イネ種子リポキシゲナーゼ３遺伝子とイネ種子リポキシゲナーゼ３変異型遺伝子とを共に保有している個体（ヘテロ個体）であることを示している。
【００９８】
その結果、イネ種子リポキシゲナーゼ３遺伝子をホモで保有するイネ品種日本晴個体の場合は、得られたＰＣＲ断片が制限酵素ＭｖａＩによって切断され、約２７０ｂｐのバンドのみが検出された。また、イネ種子リポキシゲナーゼ３変異遺伝子をホモで保有し、イネ種子リポキシゲナーゼ３欠失性の表現型を示すイネ品種Ｄａｗ Ｄａｍ個体の場合は、制限酵素ＭｖａＩによって切断されず、約３２０ｂｐのバンドのみが検出された。
【００９９】
また、ヘテロ個体のコントロールの場合は、イネ種子リポキシゲナーゼ３遺伝子とイネ種子リポキシゲナーゼ３変異遺伝子とを共に保有するため、制限酵素ＭｖａＩによって切断された約２７０ｂｐのバンドと、制限酵素ＭｖａＩによって切断されなかった約３２０ｂｐのバンドの双方が検出された。
【０１００】
一方、Ｆ２個体の場合は、イネ品種日本晴個体、イネ品種Ｄａｗ Ｄａｍ個体、又はイネ品種日本晴個体とイネ品種Ｄａｗ Ｄａｍ個体の混合型のバンドパタ−ンのいずれかを示した。
【０１０１】
そこで、１５個のＦ２個体について、抗イネ種子リポキシゲナーゼ３抗体を用いたウェスタンブロッッティングによって、イネ種子中におけるイネ種子リポキシゲナーゼ３の発現の有無を調べた。
【０１０２】
その結果、Ｆ２個体のうち、イネ品種日本晴個体のバンドパターン、又はイネ品種日本晴個体とイネ品種Ｄａｗ Ｄａｍ個体の混合型のバンドパターンを示したＦ２個体では、イネ種子リポキシゲナーゼ３の発現が確認されたものの、イネ品種Ｄａｗ Ｄａｍ型個体のバンドパターンを示したＦ２個体では、イネ種子リポキシゲナーゼ３の発現が確認されなかった。
【０１０３】
よって、イネ品種日本晴個体と同じバンドパターンを示したＦ２個体は、イネ種子リポキシゲナーゼ３遺伝子をホモで保有しているイネ品種日本晴型ホモ個体であり、イネ品種Ｄａｗ Ｄａｍ個体と同じバンドパターンを示したＦ２個体は、イネ種子リポキシゲナーゼ３変異型遺伝子をホモで保有しているイネ品種Ｄａｗ Ｄａｍ型ホモ個体であり、Ｆ１個体と同じバンドパタ−ンを示したＦ２個体は、イネ種子リポキシゲナーゼ３遺伝子とイネ種子リポキシゲナーゼ３変異型遺伝子とを共に保有しているヘテロ個体であることが明らかとなった。
【０１０４】
以上の結果より、配列表の配列番号３に示される塩基配列の第３１２８番目の塩基より５’側の塩基配列と相同な塩基配列の一部配列からなるプライマーと、配列表の配列番号３に示される塩基配列の第３１２８番目の塩基より３’側の塩基配列と相補的な塩基配列の一部配列からなるプライマーと、からなるプライマーセットで、被検イネのゲノムＤＮＡを鋳型にＤＮＡ断片を増幅し、増幅されたＤＮＡ断片中に制限酵素ＭｖａＩの認識配列がなく、制限酵素ＭｖａＩによって切断されない場合に、イネ種子中のリポキシゲナーゼ３が欠失しているイネであると判定することにより、イネ種子リポキシゲナーゼ３変異型遺伝子をホモで保有する個体を選別できることが明らかとなった。すなわち、制限酵素ＭｖａＩを用いたＣＡＰＳ法によって、イネ種子リポキシゲナーゼ３変異型遺伝子をホモで保有する個体を選別できることが明らかとなった。
【０１０５】
（実施例４）ドットブロットＳＮＰ法によるイネ種子リポキシゲナーゼ３欠失イネの選抜方法：
イネ種子リポキシゲナーゼ３変異型遺伝子のゲノムＤＮＡで認められた第３１２８番目の塩基（イネ種子リポキシゲナーゼ３変異型遺伝子で認められた第１４９７番目に相当する塩基）における変異は一塩基置換であったため、一塩基多型を検出に使用されているドットブロットＳＮＰ法（Ｓｈｉｒａｓａｗａら Ｔｈｅｏｒ． Ａｐｐｌ． Ｇｅｎｅｔ．１１３：１４７−１５５）によって、上記のナンセンス変異が検出できるか否かについて試験した。
【０１０６】
被検イネとしては、イネ品種日本晴個体（イネ種子リポキシゲナーゼ３遺伝子をホモで保有）にイネ品種Ｄａｗ Ｄａｍ個体（イネ種子リポキシゲナーゼ３変異型遺伝子をホモで保有）を交配して得たＦ１個体を自殖して得られた１０６個のＦ２個体と、コントロールとして、これらの親株であるイネ品種日本晴個体及びイネ品種Ｄａｗ Ｄａｍ個体を用いた。
【０１０７】
まず、ＣＡＰＳ法で行ったのと同様に、イネ種子リポキシゲナーゼ３遺伝子（配列番号３）の第３１２８番目の塩基より５’側の塩基配列と相同な塩基配列の一部配列からなるプライマーであるｒｓＬＯＸ３−Ｆｒａｇ−Ｆ（５’−ｇｃｃａａｇａｇｃａｃｃｇｔｇｔａｃａｃｇ−３’；配列番号５）と、第３１２８番目の塩基より３’側の塩基配列と相補的な塩基配列の一部配列からなるプライマーであるｒｓＬＯＸ３−Ｆｒａｇ−Ｒ（５’−ｇｇａａｇａｃｇｇｔｃａｔｃｔｃｇａａｇ−３’；配列番号６）とからなるプライマーセットで、変異が認められた第３１２８番目の塩基を含むＤＮＡ断片を、被検イネのゲノムＤＮＡを鋳型にＰＣＲで増幅した。
【０１０８】
ＰＣＲは、９４℃で１分間加熱した後に、９４℃で３０秒、６０℃で３０秒、７２℃で３０秒のサイクルを３５サイクル行い、引き続き、７２℃で１分のサイクルを１サイクル行い、その後、４℃まで急冷することにより終了させた。
【０１０９】
その際、イネ種子リポキシゲナーゼ３遺伝子とイネ種子リポキシゲナーゼ３変異型遺伝子の双方を保有するヘテロ個体のコントロールとして、イネ品種日本晴とイネ品種Ｄａｗ ＤａｍのゲノムＤＮＡの混合物を鋳型として同様にＰＣＲを行った。
【０１１０】
その後、Ｓｈｉｒａｓａｗａら（Ｔｈｅｏｒ． Ａｐｐｌ． Ｇｅｎｅｔ．、２００６年、１１３巻、ｐ．１４７−１５５）の方法に従って、ＰＣＲで増幅された各ＤＮＡ断片をナイロン膜にドットブロットし、検出プローブと競合プローブを混合した混合プローブを用いてハイブリダイゼーションを行った。
【０１１１】
その際、混合プローブは２種類用意し、イネ種子リポキシゲナーゼ３遺伝子を検出するためには、配列表の配列番号３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて第３１２８番目の塩基（グアニン）を含む連続した塩基配列からなるＷＴ−ｒｓＬＯＸ３−ｐｒｏｂｅ（５’−ＧＡＧＧＣＣＴＧＧＧＴＧＴＧＧＣＡ−３’；配列番号７）の５’末端をジゴキシゲニン標識したもの（検出プローブ）と、配列表の配列番号４に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて第３１２５番目の塩基（アデニン）を含む連続した塩基配列からなる非標識のＭｕｔ−ｒｓＬＯＸ３−ｐｒｏｂｅ（５’−ＧＡＧＧＣＣＴＧＡＧＴＧＴＧＧＣＡ−３’；配列番号８）（競合プローブ）とを、１：５の濃度比で混合した混合プローブを用いた。
【０１１２】
一方、イネ種子リポキシゲナーゼ３変異型遺伝子を検出するためには、配列表の配列番号４に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて第３１２５番目の塩基（アデニン）を含む連続した塩基配列からなるＭｕｔ−ｒｓＬＯＸ３−ｐｒｏｂｅ（５’−ＧＡＧＧＣＣＴＧＡＧＴＧＴＧＧＣＡ−３’；配列番号８）の５’末端をジゴキシゲニン標識したもの（検出プローブ）と、配列表の配列番号３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて第３１２８番目の塩基（グアニン）を含む連続した塩基配列からなる非標識のＷＴ−ｒｓＬＯＸ３−ｐｒｏｂｅ（５’−ＧＡＧＧＣＣＴＧＧＧＴＧＴＧＧＣＡ−３’；配列番号７）（競合プローブ）とを、１：５の濃度比で混合した混合プローブを用いた。
【０１１３】
ハイブリダイゼーションは４２℃で行い、非特異的な検出プローブのナイロン膜への吸着は、４２℃の０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳに浸漬し、振盪する操作を数回繰り返すことによって取り除いた。ハイブリダイゼーション後のナイロン膜は、０．５％のブロッキング試薬（ロッシュ社）を含むＤＩＧバッファー１（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．６、１５０ｍＭ ＮａＣl）に９０分間浸漬し、そこに、抗ＤＩＧアルカリフォスファターゼ標識抗体（ロッシュ社）を２μＬ／１０ｍＬの割合で加え、３０分間振盪しながら反応させた。
【０１１４】
その後、ナイロン膜を取り出し、ＤＩＧバッファー１に浸漬し、１５分間振盪する操作を２回繰り返すことにより未反応の抗ＤＩＧアルカリフォスファターゼ標識抗体を取り除き、ＤＩＧバッファー３（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ９．５、１００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＭｇＣｌ２）に５分間浸漬し、約５ｍＬの基質溶液（０．３３ｍｇ／ｍＬ ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）、０．１６ｍｇ／ｍＬ ５−ブロモ-4-クロロ−３−インドリルリン酸（ＢＣＩＰ）、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ９．５、０．１Ｍ Ｎａｃｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２）を膜上に滴下して５分間反応させた。
【０１１５】
その後、ナイロン膜の水分をキムタオルで拭き取り、アルカリフォスファターゼの酵素反応によって得られる発色を検出した。
【０１１６】
図７は、ドットブロットＳＮＰ法による解析結果を示した図である。ナイロン膜は、１４（縦の列：Ａ〜Ｎ）×８（横の行：１〜８）のマスに仕切られ、各マスには、個体ごとのＤＮＡ断片を２スポットずつ、デュプリケートでブロットした。また、Ａ８とＮ３のマスにはイネ品種日本晴個体由来のＤＮＡ断片（イネ品種日本晴型ホモ・コントロール）を、Ａ６とＮ１にはイネ品種Ｄａｗ Ｄａｍ個体由来のＤＮＡ断片（イネ品種Ｄａｗ Ｄａｍ型ホモ・コントロール）を、Ａ７とＮ２のマスにはイネ品種日本晴とイネ品種Ｄａｗ ＤａｍのゲノムＤＮＡの混合物を鋳型にＰＣＲを行って得たＤＮＡ断片（ヘテロ・コントロール）をブロットした。
【０１１７】
図７（Ａ）は、イネ種子リポキシゲナーゼ３遺伝子を検出するために、ＷＴ−ｒｓＬＯＸ３−ｐｒｏｂｅ（５’−ＧＡＧＧＣＣＴＧＧＧＴＧＴＧＧＣＡ−３’；配列番号７）の５’末端をジゴキシゲニン標識したもの（検出プローブ）と、非標識のＭｕｔ−ｒｓＬＯＸ３−ｐｒｏｂｅ（５’−ＧＡＧＧＣＣＴＧＡＧＴＧＴＧＧＣＡ−３’；配列番号８）（競合プローブ）とを、１：５の濃度比で混合した混合プローブを用いて、ドットブロットＳＮＰ法で解析した結果である。
【０１１８】
図７（Ｂ）は、イネ種子リポキシゲナーゼ３変異型遺伝子を検出するために、Ｍｕｔ−ｒｓＬＯＸ３−ｐｒｏｂｅ（５’−ＧＡＧＧＣＣＴＧＡＧＴＧＴＧＧＣＡ−３’；配列番号８）の５’末端をジゴキシゲニン標識したもの（検出プローブ）と、非標識のＷＴ−ｒｓＬＯＸ３−ｐｒｏｂｅ（５’−ＧＡＧＧＣＣＴＧＧＧＴＧＴＧＧＣＡ−３’；配列番号７）（競合プローブ）とを、１：５の濃度比で混合した混合プローブを用いて、ドットブロットＳＮＰ法で解析した結果である。
【０１１９】
その結果、ＷＴ−ｒｓＬＯＸ３−ｐｒｏｂｅの５’末端をジゴキシゲニン標識したものを検出プローブとして用いた場合には、１０６個のＦ２個体のうち７７個体でシグナルが検出され、Ｍｕｔ−ｒｓＬＯＸ３−ｐｒｏｂｅの５’末端をジゴキシゲニン標識したものを検出プローブとして用いた場合には、１０６個のＦ２個体のうち８８個体でシグナルが検出された。
【０１２０】
図７（Ｃ）は、各Ｆ２個体のイネ種子リポキシゲナーゼ３の表現型を示したものである。図中の＋は、イネ種子リポキシゲナーゼ３遺伝子をホモで保有している個体（イネ品種日本晴型ホモ個体）、−は、イネ種子リポキシゲナーゼ３変異型遺伝子をホモで保有している個体（イネ品種Ｄａｗ Ｄａｍ型ホモ個体）、±は、イネ種子リポキシゲナーゼ３遺伝子とイネ種子リポキシゲナーゼ３変異型遺伝子とを共に保有している個体（ヘテロ個体）であることを示している。
【０１２１】
図７（Ａ）でシグナルが検出され、図７（Ｂ）でシグナルが検出されなかたマスの個体はイネ品種日本晴型ホモ個体であり、Ａ８とＮ３にブロットしたイネ品種日本晴個体（イネ品種日本晴型ホモ・コントロール）以外に１８個体認められた。
【０１２２】
図７（Ａ）でシグナルが検出されず、図７（Ｂ）でシグナルが検出されたマスの個体はイネ品種Ｄａｗ Ｄａｍ型ホモ個体であり、Ａ６とＮ１にブロットしたイネ品種Ｄａｗ Ｄａｍ個体（イネ品種Ｄａｗ Ｄａｍ型ホモ・コントロール）以外に２９個体認められた。
【０１２３】
図７（Ａ）と図７（Ｂ）の双方でシグナルが検出されたマスの個体はヘテロであり、Ａ７とＮ２にブロットしたヘテロ・コントロール以外に５９個体認められた。
【０１２４】
そこで、１０６個のＦ２個体について、抗イネ種子リポキシゲナーゼ３抗体を用いたウェスタンブロッッティングによって、イネ種子中におけるイネ種子リポキシゲナーゼ３の発現の有無を調べた。
【０１２５】
その結果、イネ種子リポキシゲナーゼ３は、ドットブロットＳＮＰ法でイネ品種日本晴型ホモ個体及びヘテロ個体であると判定された個体の種子では確認されたが、イネ品種Ｄａｗ Ｄａｍ型ホモ個体であると判定された個体の種子では確認されなかった。
【０１２６】
以上の結果より、配列表の配列番号３に示される塩基配列の第３１２８番目の塩基より５’側の塩基配列と相同な塩基配列の一部配列からなるプライマーと、配列表の配列番号３に示される塩基配列の第３１２８番目の塩基より３’側の塩基配列と相補的な塩基配列の一部配列からなるプライマーと、からなるプライマーセットで、被検イネのゲノムＤＮＡを鋳型にＤＮＡ断片を増幅し、増幅されたＤＮＡ断片をナイロン膜に固定し、配列表の配列番号３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて第３１２８番目の塩基（グアニン）を含む連続した塩基配列からなる標識オリゴヌクレオチドと、配列表の配列番号４に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて第３１２５番目の塩基（アデニン）を含む連続した塩基配列からなる非標識オリゴヌクレオチドと、を混合した混合プローブを、ナイロン膜に固定されたＤＮＡ断片にハイブリダイズさせ、ナイロン膜に固定されたＤＮＡ断片にハイブリダイズした標識オリゴヌクレオチドからのシグナルを検出し、標識オリゴヌクレオチドからのシグナルが検出されない場合に、イネ種子中のリポキシゲナーゼ３が欠失しているイネであると判定することにより、イネ種子リポキシゲナーゼ３変異型遺伝子をホモで保有する個体を選別できることが明らかとなった。すなわち、ドットブロットＳＮＰ法によって、イネ種子リポキシゲナーゼ３変異型遺伝子をホモで保有する個体を選別できることが明らかとなった。
【０１２７】
（実施例５）イネ種子中のリポキシゲナーゼ３が欠失しているイネの育種
イネ種子リポキシゲナーゼ３を欠失していることが明らかとなっている中間母本「北陸ＰＬ２」にイネ品種コシヒカリを、５回反復して戻し交配し、Ｂ４Ｆ２個体を得た。
【０１２８】
２０個のＢ４Ｆ２個体の葉からゲノムＤＮＡを抽出し、実施例３に記載した制限酵素ＭｖａＩを用いたＣＡＰＳ法によって、イネ種子中のリポキシゲナーゼ３が欠失しているイネ個体を選抜した。
【０１２９】
図８は、制限酵素ＭｖａＩを用いたＣＡＰＳ法の手順に従って、各Ｂ４Ｆ２個体のゲノムを鋳型にＰＣＲを行い、制限酵素ＭｖａＩで切断後に電気泳動して検出されたバンドパターンである。図中の＋は、イネ種子リポキシゲナーゼ３遺伝子をホモで保有している個体（イネ品種日本晴型ホモ個体）、−は、イネ種子リポキシゲナーゼ３変異型遺伝子をホモで保有している個体（イネ品種Ｄａｗ Ｄａｍ型ホモ個体）、±は、イネ種子リポキシゲナーゼ３遺伝子とイネ種子リポキシゲナーゼ３変異型遺伝子とを共に保有している個体（ヘテロ個体）であることを示している。
【０１３０】
その結果、９個のＢ４Ｆ２個体（９１４１、９１４３、９１４８〜９１５０、９１５７〜９１６０）は、イネ品種日本晴型ホモ個体、２個のＢ４Ｆ２個体（９１５１、９１４４）は、イネ品種Ｄａｗ Ｄａｍ型ホモ個体、９個のＢ４Ｆ２個体（９１４２、９１４５〜９１４７、９１５２〜９１５６）は、これらのヘテロ個体であると判定された。
【０１３１】
そこで、２０個のＢ４Ｆ２個体を生育させ、そこから種子を採取し、抗イネ種子リポキシゲナーゼ３抗体を用いたウェスタンブロッッティングによって、イネ種子中におけるイネ種子リポキシゲナーゼ３の発現の有無を調べた。
【０１３２】
その結果、イネ種子リポキシゲナーゼ３は、イネ品種日本晴型ホモ個体及びヘテロ個体であると判定された個体の種子では確認されたが、イネ品種Ｄａｗ Ｄａｍ型ホモ個体であると判定された個体の種子では確認されなかった。
【０１３３】
以上の結果より、実施例３に記載した制限酵素ＭｖａＩを用いたＣＡＰＳ法又実施例４に記載したドットブロットＳＮＰ法等によって、配列表の配列番号３に示されるイネ種子リポキシゲナーゼ３遺伝子のゲノムＤＮＡの第３１２８番目の塩基（配列表の配列番号２に記載の塩基配列からなるイネ種子リポキシゲナーゼ３遺伝子の第１４９７番目の塩基）がアデニンに変異しているイネを選抜することにより、イネ種子中のリポキシゲナーゼ３が欠失しているイネを当代検定で選抜でき、育種できることが明らかとなった。
【図面の簡単な説明】
【０１３４】
【図１】イネＯｓ０３ｇ０７００４００のアミノ酸配列における、ＭＡＤＦＬＧＹＳＩＫ、ＲＦＰＬＱＬＶＫ、及びＤＬＬＰＡＡＧＤＹＩの位置を示したものである。
【図２】ダイレクトシークエンスを行ったイネ種子リポキシゲナーゼ３遺伝子のゲノムＤＮＡの５つの領域の位置を示したものである。
【図３】イネ種子リポキシゲナーゼ３遺伝子のゲノムＤＮＡの塩基配列を示したものである。
【図４】イネ品種Ｄａｗ Ｄａｍのイネ種子リポキシゲナーゼ３遺伝子のゲノムＤＮＡの塩基配列を示したものである。
【図５】イネ品種Ｄａｗ Ｄａｍのイネ種子リポキシゲナーゼ３遺伝子のゲノムＤＮＡで認められた、ナンセンス変異の位置を示したものである。
【図６】制限酵素ＭｖａＩを用いたＣＡＰＳ法の手順に従って、被検イネのゲノムを鋳型にＰＣＲを行い、制限酵素ＭｖａＩで切断後に電気泳動して検出されたバンドパターンである。
【図７】ドットブロットＳＮＰ法による解析結果を示した図である。（Ａ）は、イネ種子リポキシゲナーゼ３遺伝子を検出するために、ＷＴ−ｒｓＬＯＸ３−ｐｒｏｂｅの５’末端をジゴキシゲニン標識したものを検出プローブに、非標識のＭｕｔ−ｒｓＬＯＸ３−ｐｒｏｂｅを競合プローブに用いて、ドットブロットＳＮＰ法で解析した結果である。（Ｂ）は、イネ種子リポキシゲナーゼ３変異型遺伝子を検出するために、Ｍｕｔ−ｒｓＬＯＸ３−ｐｒｏｂｅの５’末端をジゴキシゲニン標識したものを検出プローブに、非標識のＷＴ−ｒｓＬＯＸ３−ｐｒｏｂｅを競合プローブに用いて、ドットブロットＳＮＰ法で解析した結果である。（Ｃ）は、各Ｆ２個体のイネ種子リポキシゲナーゼ３の表現型を示したものである。
【図８】制限酵素ＭｖａＩを用いたＣＡＰＳ法の手順に従って、各Ｂ４Ｆ２個体のゲノムを鋳型にＰＣＲを行い、制限酵素ＭｖａＩで切断後に電気泳動して検出されたバンドパターンである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号１記載の塩基配列からなる、イネ種子リポキシゲナーゼ３変異型遺伝子。
【請求項２】
イネ種子中のリポキシゲナーゼ３が欠失しているイネの選抜方法であって、
配列表の配列番号２記載の塩基配列からなるイネ種子リポキシゲナーゼ３遺伝子の５’側から第１４９７番目の塩基がアデニンに変異しているイネを、イネ種子中のリポキシゲナーゼ３が欠失しているイネであると判定する、選抜方法。
【請求項３】
被検イネからゲノムＤＮＡを抽出する抽出ステップと、
配列表の配列番号３に示される塩基配列の第３１２８番目の塩基より５’側の塩基配列と相同な塩基配列の一部配列からなるプライマーと、配列表の配列番号３に示される塩基配列の第３１２８番目の塩基より３’側の塩基配列と相補的な塩基配列の一部配列からなるプライマーと、からなるプライマーセットで、前記ゲノムＤＮＡを鋳型にＤＮＡ断片を増幅する増幅ステップと、
前記増幅ステップで増幅されたＤＮＡ断片中に制限酵素ＭｖａＩの認識配列がない場合に、イネ種子中のリポキシゲナーゼ３が欠失しているイネであると判定する判定ステップと、
を備える、請求項２記載の選抜方法。
【請求項４】
被検イネからゲノムＤＮＡを抽出する抽出ステップと、
配列表の配列番号３に示される塩基配列の第３１２８番目の塩基より５’側の塩基配列と相同な塩基配列の一部配列からなるプライマーと、配列表の配列番号３に示される塩基配列の第３１２８番目の塩基より３’側の塩基配列と相補的な塩基配列の一部配列からなるプライマーと、からなるプライマーセットで、前記ゲノムＤＮＡを鋳型にＤＮＡ断片を増幅する増幅ステップと、
前記増幅ステップで増幅されたＤＮＡ断片を膜に固定する固定ステップと、
配列表の配列番号３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて第３１２８番目の塩基を含む連続した塩基配列からなる標識オリゴヌクレオチドと、配列表の配列番号４に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて第３１２５番目の塩基を含む連続した塩基配列からなる非標識オリゴヌクレオチドと、を混合した混合プローブを、前記膜に固定された前記ＤＮＡ断片にハイブリダイズさせるハイブリダイゼーションステップと、
前記ＤＮＡ断片にハイブリダイズした前記標識オリゴヌクレオチドからのシグナルを検出する検出ステップと、
前記検出ステップで前記標識オリゴヌクレオチドからのシグナルが検出されない場合に、イネ種子中のリポキシゲナーゼ３が欠失しているイネであると判定する判定ステップと、
を備える、請求項２記載の選抜方法。
【請求項５】
イネ種子中のリポキシゲナーゼ３が欠失しているイネの育種方法であって、
イネ種子中のリポキシゲナーゼ３を欠失させたいイネ品種又は系統のイネ個体と、請求項１記載のイネ種子リポキシゲナーゼ３変異型遺伝子を保有するイネ個体とを交配して雑種第一代を得る交配ステップと、
前記雑種第一代に前記イネ品種又は系統のイネ個体を戻し交配して得た後代個体の中から、前記イネ種子リポキシゲナーゼ３変異型遺伝子をホモで保有する個体を選抜する選抜ステップと、
を備える、育種方法。
【請求項６】
請求項５記載の育種方法により選抜された、イネ種子中のリポキシゲナーゼ３が欠失しているイネ。
【請求項１】
配列表の配列番号１記載の塩基配列からなる、イネ種子リポキシゲナーゼ３変異型遺伝子。
【請求項２】
イネ種子中のリポキシゲナーゼ３が欠失しているイネの選抜方法であって、
配列表の配列番号２記載の塩基配列からなるイネ種子リポキシゲナーゼ３遺伝子の５’側から第１４９７番目の塩基がアデニンに変異しているイネを、イネ種子中のリポキシゲナーゼ３が欠失しているイネであると判定する、選抜方法。
【請求項３】
被検イネからゲノムＤＮＡを抽出する抽出ステップと、
配列表の配列番号３に示される塩基配列の第３１２８番目の塩基より５’側の塩基配列と相同な塩基配列の一部配列からなるプライマーと、配列表の配列番号３に示される塩基配列の第３１２８番目の塩基より３’側の塩基配列と相補的な塩基配列の一部配列からなるプライマーと、からなるプライマーセットで、前記ゲノムＤＮＡを鋳型にＤＮＡ断片を増幅する増幅ステップと、
前記増幅ステップで増幅されたＤＮＡ断片中に制限酵素ＭｖａＩの認識配列がない場合に、イネ種子中のリポキシゲナーゼ３が欠失しているイネであると判定する判定ステップと、
を備える、請求項２記載の選抜方法。
【請求項４】
被検イネからゲノムＤＮＡを抽出する抽出ステップと、
配列表の配列番号３に示される塩基配列の第３１２８番目の塩基より５’側の塩基配列と相同な塩基配列の一部配列からなるプライマーと、配列表の配列番号３に示される塩基配列の第３１２８番目の塩基より３’側の塩基配列と相補的な塩基配列の一部配列からなるプライマーと、からなるプライマーセットで、前記ゲノムＤＮＡを鋳型にＤＮＡ断片を増幅する増幅ステップと、
前記増幅ステップで増幅されたＤＮＡ断片を膜に固定する固定ステップと、
配列表の配列番号３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて第３１２８番目の塩基を含む連続した塩基配列からなる標識オリゴヌクレオチドと、配列表の配列番号４に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて第３１２５番目の塩基を含む連続した塩基配列からなる非標識オリゴヌクレオチドと、を混合した混合プローブを、前記膜に固定された前記ＤＮＡ断片にハイブリダイズさせるハイブリダイゼーションステップと、
前記ＤＮＡ断片にハイブリダイズした前記標識オリゴヌクレオチドからのシグナルを検出する検出ステップと、
前記検出ステップで前記標識オリゴヌクレオチドからのシグナルが検出されない場合に、イネ種子中のリポキシゲナーゼ３が欠失しているイネであると判定する判定ステップと、
を備える、請求項２記載の選抜方法。
【請求項５】
イネ種子中のリポキシゲナーゼ３が欠失しているイネの育種方法であって、
イネ種子中のリポキシゲナーゼ３を欠失させたいイネ品種又は系統のイネ個体と、請求項１記載のイネ種子リポキシゲナーゼ３変異型遺伝子を保有するイネ個体とを交配して雑種第一代を得る交配ステップと、
前記雑種第一代に前記イネ品種又は系統のイネ個体を戻し交配して得た後代個体の中から、前記イネ種子リポキシゲナーゼ３変異型遺伝子をホモで保有する個体を選抜する選抜ステップと、
を備える、育種方法。
【請求項６】
請求項５記載の育種方法により選抜された、イネ種子中のリポキシゲナーゼ３が欠失しているイネ。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公開番号】特開２００９−２７９３８（Ｐ２００９−２７９３８Ａ）
【公開日】平成２１年２月１２日（２００９．２．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−１９２４９９（Ｐ２００７−１９２４９９）
【出願日】平成１９年７月２４日（２００７．７．２４）
【出願人】（５０１２０３３４４）独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構 (827)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年２月１２日（２００９．２．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年７月２４日（２００７．７．２４）
【出願人】（５０１２０３３４４）独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構 (827)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]