イノシン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物及びこれを利用したイノシンの生産方法
イノシン分解経路が遮断され、漏出型のアデニン要求性、及び望ましくは、漏出型のグアニン要求性をさらに有することを特徴とするイノシン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物、及び該微生物を培養する段階を含む、イノシンを生産する方法が開示される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、イノシン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物及び該微生物を培養する段階を含むイノシン生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
イノシンは、うま味調味料として脚光を浴びているイノシン酸（５’−inosinic acid）の化学的合成及び酵素転移反応による合成において、重要な基質である。また、イノシンは、核酸生合成代謝系の中間物質として、動植物の体内で生理的に重要な意味を有するだけではなく、食品及び医薬品などのさまざまな分野で広く利用されている。
【０００３】
イノシンは、従来には主に、バシラス（非特許文献１、特許文献１）、またはコリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Corynebacterium ammoniagenes）（非特許文献２）のような微生物を利用した直接発酵法や、５’−イノシン酸の熱分解法（特許文献２）などを利用して製造した。しかし、熱分解法の場合は、５’−イノシン酸を分解するために、大量の熱消費が要求されて実用性が低く、また直接発酵法の場合は、大腸菌を利用した多様な遺伝子型の菌株が開発されて研究されたが（非特許文献３）、イノシン生産菌株の力価が低く、生産コストが高いという短所がある。また、既存のイノシン研究は、大腸菌とバシラスとに集中していた。
【０００４】
従って、イノシンをさらに高収率で生産して高濃度に蓄積させることができる菌株、及び前記菌株を利用したイノシン生産方法の開発が依然として要求されている。
【０００５】
このために、本発明者らは、微生物を利用した直接発酵法によって、イノシンを高濃度／高収率に生産するために、持続的な研究を行い、その結果、直接発酵法によって、さらに高濃度及び高収率にイノシンを生産する微生物を開発し、本発明を完成した。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】大韓民国登録特許第２７２８０号公報
【特許文献２】特開昭４３−３３２０号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Agric．Biol．Chem．，46，2347(1982)
【非特許文献２】Agric．Biol．Chem．，42，399(1978)
【非特許文献３】Biosci Biotechnol Biochem．2001 Mar；65(3)：570-8
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、イノシン分解経路が遮断され、漏出型のアデニン要求性(a leaky adenine auxotroph)を有し、望ましくは、漏出型のグアニン要求性(a leaky guanine auxotroph)をさらに有することを特徴とする、イノシンを高濃度及び高収率に生産するコリネバクテリウム属微生物を提供することである。
【０００９】
本発明の他の目的は、前記微生物を培養し、高濃度及び高収率にイノシンを生産する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
前記課題を解決するために、本発明は、リボヌクレオシド・ヒドロラーゼ１（ｒｉｈ１）及びリボヌクレオシド・ヒドロラーゼ２（ｒｉｈ２）をコードする遺伝子が不活性化されてイノシン分解が遮断され、漏出型のアデニン要求性であることを特徴とするイノシン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物を提供する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によるコリネバクテリウム・アンモニアゲネスＣＮ０４−００２７（ＫＣＣＭ １０９０５）菌株を利用してイノシンを生産する場合、直接発酵法によってイノシンを、さらに高濃度及び高収率に生産でき、糖消費量の減少によって、生産コストが節減されるという効果がある。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】リボヌクレオシド・ヒドロラーゼ１をコードする遺伝子の構造を破壊するためのｐＤＺｍｒｉｈ１ベクターの製造図を図示する図面である。
【図２】リボヌクレオシド・ヒドロラーゼ２をコードする遺伝子の構造を破壊するためのｐＤＺｍｒｉｈ２ベクターの製造図を図示する図面である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は、イノシン分解経路が遮断され、漏出型のアデニン要求性であることを特徴とするイノシンを、高濃度及び高収率に生産するコリネバクテリウム（Corynebacterium）属微生物を提供する。本発明の微生物は、望ましくは、漏出型のグアニン要求性をさらに有することができる。
【００１４】
本発明の一具体例によれば、イノシンを生産するコリネバクテリウム属微生物は、遺伝子組換えによってイノシン分解経路が遮断され、すなわちそれぞれリボヌクレオシド・ヒドロラーゼ（ribonucleoside hydrolase：ｒｉｈ）１と、リボヌクレオシド・ヒドロラーゼ２とをコードする遺伝子が、塩基の挿入、欠失または置換による配列変異によって不活性化され、同時に人工変異によって選別された漏出型のアデニン要求性及び／または漏出型のグアニン要求性を有することができる。
【００１５】
本発明のコリネバクテリウム属微生物は、コリネバクテリウム・グルタミクム、コリネバクテリウム・エフィシエンス（Corynebacterium efficiens）、コリネバクテリウム・ジフテリア、及びコリネバクテリウム・アンモニアゲネスを含み、望ましくは、コリネバクテリウム・アンモニアゲネスであり、最も望ましくは、コリネバクテリウム・アンモニアゲネスＡＴＣＣ ６８７２から変異したコリネバクテリウム・アンモニアゲネスＣＮ０４−００２７である。親菌株であるコリネバクテリウム・アンモニアゲネスＡＴＣＣ ６８７２は、American Type Culture Collectionで提供するコリネバクテリウム・アンモニアゲネスの野生型菌株であって、イノシンを全く生産しない菌株である。
【００１６】
本発明の一具体例によるコリネバクテリウム・アンモニアゲネスＣＮ０４−００２７（ＫＣＣＭ １０９０５）は、リボヌクレオシド・ヒドロラーゼ１をコードする遺伝子ｒｉｈ１と、リボヌクレオシド・ヒドロラーゼ２をコードする遺伝子ｒｉｈ２との構造を破壊してイノシン分解経路が遮断されると同時に、漏出型のアデニン要求性及び漏出型のグアニン要求性を有し、イノシンをさらに高濃度及び高収率に培養液中に直接蓄積させることができる。
【００１７】
本発明の詳細な説明及び実施例で言及されるように、本発明で、微生物の培養のために使われる栄養培地、最小培地、種培地、及びフラスコ発酵培地の一例は、それぞれ下記の表１に表示された組成からなる培地でありうる。しかし、培地組成は、表１に提示されたものに制限されず、コリネバクテリウム属微生物の培養に適したあらゆる培養培地を使用できる。
【００１８】
（表１）培地組成
【００１９】
本発明の一具体例によれば、本発明の微生物は、イノシン分解を遮断するために、リボヌクレオシド・ヒドロラーゼ１及びリボヌクレオシド・ヒドロラーゼ２をコードするｒｉｈ１及びｒｉｈ２の遺伝子の構造を破壊してその活性を不活性化させ、イノシンが培養液内に蓄積されることを確認した後、人工変異を介して漏出型のアデニン要求性を選別し、さらに漏出型のグアニン要求性であることを選別して完成されたイノシン生産性が向上した変異株でありうる。
【００２０】
本発明の一具体例によれば、本発明の微生物は、コリネバクテリウム・アンモニアゲネスＡＴＣＣ ６８７２で、本発明が属する技術分野の当業者によって既発表のリボヌクレオシド・ヒドロラーゼ１とリボヌクレオシド・ヒドロラーゼ２とをコードする遺伝子（以下、ｒｉｈ１、ｒｉｈ２）に塩基の挿入、欠失または置換によって終止コドンが生成されて配列が変形された遺伝子を運搬する組換えベクターによって形質転換され、これによって蛋白質翻訳が阻害されて前記酵素が不活性化され、イノシン分解経路が遮断された組換え菌株でありうる。
【００２１】
本発明の一具体例によれば、イノシン分解経路が遮断された組換え菌株で配列が変形されて不活性化されたリボヌクレオシド・ヒドロラーゼ１遺伝子及びリボヌクレオシド・ヒドロラーゼ２遺伝子は、それぞれ配列番号９及び配列番号１０で表示される配列を有することができる。
【００２２】
本発明の一具体例によれば、イノシン分解経路が遮断された菌株にさらに漏出型のアデニン要求性形質を付与するために、Ｘ線、紫外線またはＮ−メチル−Ｎ−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニン（Ｎ−methyl−Ｎ−nitro−Ｎ−nitrosoguanine）、硫化ジエチル（diethylsulfide）、エチルアミンなどの化学的変異誘発剤が処理されうる。前記変異誘発剤の処理後、菌株を前記表１の組成を有する最小培地に塗抹後、アデニンが添加されていない培地で成長するが、アデニンが添加された培地で成長がさらに促進される、漏出型のアデニン要求性を示す個別的なコロニー（colonｙ）を収得し、それらをそれぞれ栄養培地で培養し、種培地で２４時間培養した後、発酵培地で５日間ないし６日間培養し、発酵培養液に蓄積されるイノシン生産量が最も優秀な菌株に対してイノシン分解経路が遮断され、漏出型のアデニン要求性を有する菌株として選別されうる。
【００２３】
また、本発明の一具体例によれば、選別された漏出型のアデニン要求性菌株を、前記のような方法で、すなわち、化学的変異誘発剤で処理し、漏出型のグアニン要求性菌株を選別し、栄養培地培養、種培地培養、発酵培地培養を経て、発酵培養液で蓄積されるイノシン生産量が最も優秀な菌株に対してイノシン分解経路が遮断され、漏出型のアデニン要求性及び漏出型のグアニン要求性を有するイノシン生産微生物に選別できる。
【００２４】
本発明はまた、イノシン分解経路が遮断され、漏出型のアデニン要求性及び漏出型のグアニン要求性を有し、イノシンを高収率及び高濃度で生産するコリネバクテリウム属微生物を培養し、前記微生物または培養液中にイノシンを生産する段階、及び前記微生物または培養液からイノシンを回収する段階を含む、イノシンを生産する方法を提供する。
【００２５】
本発明の一具体例によるイノシンを生産する方法で、前記コリネバクテリウム属微生物は、コリネバクテリウム・アンモニアゲネスＣＮ０４−００２７（ＫＣＣＭ １０９０５）でありうる。
【００２６】
本発明によるイノシンを生産する方法は、コリネバクテリウム属微生物を培養し、微生物または培養液中にイノシンを生産する段階を含む。
【００２７】
本発明の一具体例によれば、コリネバクテリウム属微生物を培養する段階は、菌株を適当な炭素源、窒素源、アミノ酸、ビタミンなどを含有した通常の培地内で、好気性条件下で、温度、ｐＨなどを調節しつつ培養する。
【００２８】
このとき、炭素源としては、グルコース、殺菌された前処理糖蜜（すなわち、還元糖に転換された糖蜜）のような炭水化物が使われ、窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウムのような各種無機窒素源、及びペプトン、ＮＺ−アミン、肉類抽出物、酵母抽出物、とうもろこし浸漬液、カゼイン加水分解物、魚類またはその分解生成物、脱脂大豆ケーキまたはその分解生成物などの有機窒素源が使われうる。無機化合物としては、リン酸１カリウム、リン酸２カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸鉄、硫酸マンガン、炭酸カルシウムなどが使われ、それ以外に栄養要求株必要によって、ビタミン及び塩基などが添加されうる。
【００２９】
培養は、好気的条件下、例えば、振盪(shaking)培養または通気撹拌培養によって、望ましくは、２８ないし３６℃の温度で行われる。培地のｐＨは、培養する間、ｐＨ６ないし８の範囲で維持することが望ましい。培養は、５日間ないし６日間行われ、直接発酵によって蓄積されたイノシンは、ＨＰＬＣ(high performance liquid chromatography)を利用して通常の方法で分析されうる。
【００３０】
以下、本発明について、実施例によって具体的に説明する。しかし、本発明の範囲が、いかなる形態でも実施例によって制限されることを意味しない。
【実施例】
【００３１】
実施例１：染色体挿入用ベクター（ｐＤＺ）を利用したリボヌクレオシド・ヒドロラーゼ遺伝子の構造が破壊された菌株の製造
本実施例では、リボヌクレオシド・ヒドロラーゼ１及びリボヌクレオシド・ヒドロラーゼ２をコードする遺伝子で、塩基の挿入、置換または欠失による配列変異を介して前記遺伝子を不活性化させ、イノシン分解経路を遮断させることを目的に、大腸菌クローニング用ベクターｐＡＣＹＣ１７７（New England Biolab、ＧｅｎＢａｎｋ accession＃Ｘ０６４０２）由来のｐＤＺベクターを組換えベクターとして利用した（韓国特許０７−９４４３３）。
【００３２】
図１及び図２は、それぞれリボヌクレオシド・ヒドロラーゼ１（ｒｉｈ１）及びリボヌクレオシド・ヒドロラーゼ２（ｒｉｈ２）をコードする遺伝子の構造を破壊するためのｐＤＺｍｒｉｈ１及びｐＤＺｍｒｉｈ２ベクターの製造図を図示する。
【００３３】
リボヌクレオシド・ヒドロラーゼ１及びリボヌクレオシド・ヒドロラーゼ２をコードする遺伝子を増幅するために、まず、コリネバクテリウム・アンモニアゲネスＡＴＣＣ ６８７２の染色体ＤＮＡをテンプレートとして、それぞれ配列番号１ないし４のプライマー及び配列番号５ないし８のプライマーを利用し、下記と共にＰＣＲ（polymerase chain reaction）を行った。
【００３４】
コリネバクテリウム・アンモニアゲネスＡＴＣＣ ６８７２の染色体ＤＮＡをテンプレートとして、それぞれ配列番号１並びに２、配列番号３並びに４のプライマーを利用したＰＣＲを行い、ｒｉｈ１−Ａ断片及びｒｉｈ１−Ｂの断片を収得した。その後、収得されたｒｉｈ１−Ａ断片及びｒｉｈ１−Ｂ断片をテンプレートとして、配列番号１及び４のプライマーを利用したＰＣＲを行い、変異した配列構造を有する変異遺伝子断片であるｍｒｉｈ１を収得した。また、リボヌクレオシド・ヒドロラーゼ２の配列構造が変形された変異遺伝子断片であるｍｒｉｈ２を収得するために、前記コリネバクテリウム・アンモニアゲネスＡＴＣＣ ６８７２の染色体ＤＮＡをテンプレートとして、それぞれ配列番号５並びに６、配列番号７並びに８のプライマーを利用したＰＣＲを行い、ｒｉｈ２−Ａ及びｒｉｈ２−Ｂ断片を収得し、前記収得されたｒｉｈ２−Ａ及びｒｉｈ２−Ｂをテンプレートとして、配列番号５並びに８のプライマーを利用したＰＣＲを行った。前記で、ｒｉｈ１−Ａ、ｒｉｈ１−Ｂ、ｒｉｈ２−Ａ及びｒｉｈ２−Ｂを収得するために行ったＰＣＲの条件は、９４℃で５分の予備変性、及びそれに続いた９４℃で３０秒、５２℃で３０秒及び７２℃で１分によって構成されたサイクルの２０回反復、及び７２℃で７分の最終伸張であり、各Ａ断片とＢ断片とを統合して変異された遺伝子断片を得るためのＰＣＲ条件は、９４℃で５分の予備変性及びそれに続いた９４℃で３０秒、５０℃で３０秒及び７２℃で１分によって構成されたサイクルの２５回反復、及び７２℃で７分の最終伸張であった。前記増幅されたｍｒｉｈ１及びｍｒｉｈ２とｐＤＺとをそれぞれ制限酵素ＸｂａＩで処理した後、Ｔ４リガーゼによる反応を介して、遺伝子構造破壊用組換えベクターであるｐＤＺｍｒｉｈ１とｐＤＺｍｒｉｈ２とを収得した。
【００３５】
コリネバクテリウムの染色体上のｒｉｈ２遺伝子の配列を、塩基欠失によって変異させるために製作されたｐＤＺｍｒｉｈ２ベクターを、野生型であるコリネバクテリウム・アンモニアゲネスＡＴＣＣ ６８７２に電気穿孔法（electroporation）で形質転換した後（Appl．Microbiol．Biotechnol．(1999)52：541-545による形質転換法利用）、カナマイシン（kanamycin）２５ｍｇ／Ｌを含有した選別培地で、染色体上の同遺伝子との相同性組換えによって、前記ベクターが挿入された菌株を選別した。ベクターの成功裏の染色体挿入は、Ｘ−ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド）を含んだ固体培地で、青色を示すか否かを調べて確認した。一次組換えによって、ベクターが染色体に挿入された菌株を、栄養培地で３０℃で８時間振盪培養した後、それぞれ１０−４から１０−１０まで希釈し、Ｘ−ｇａｌを含んでいる固体培地に塗抹した。ほとんどのコロニーが青色を帯びるに反して、低率で示される白色のコロニーを選別することによって、二次交差（crossover）によって、ベクター配列が染色体から除去された菌株を選別した。これによって、コリネバクテリウム・アンモニアゲネスＡＴＣＣ ６８７２菌株の染色体上のｒｉｈ２遺伝子の２６２番目のＧが欠失された菌株を収得した。その後、ｒｉｈ１遺伝子で塩基置換によって配列を変異させるために、前記で収得されたｒｉｈ２遺伝子の配列に欠失を含む菌株に、ｐＤＺｍｒｉｈ１を形質転換によって導入し、前記ｒｉｈ２遺伝子の変異菌株の選別と同じ方法を行い、ｒｉｈ１遺伝子の１４８番目ＧがＴで置換されてイノシン分解経路が遮断されたコリネバクテリウム・アンモニアゲネスＣＮ０４−００９２を収得した。前記選別された菌株は、最終的に抗生物質カナマイシンに対する感受性の有無、及びＰＣＲを介した遺伝子配列分析を介して確認した。前記菌株の変異したｒｉｈ１及びｒｉｈ２は、それぞれ配列番号９及び１０で表示される配列を有した。
【００３６】
実施例２：漏出型のアデニン要求性変異株ＣＮ０４−００９３の選別
実施例１で収得されたコリネバクテリウム・アンモニアゲネスＣＮ０４−００９２を、リン酸塩緩衝液（ｐＨ７．０）あるいはクエン酸塩緩衝液（ｐＨ５．５）に、１０７ないし１０８細胞／ｍｌで懸濁した後、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニンを、最終濃度が１０ないし５０μｇ／ｍｌになるように添加し、室温あるいは３０ないし３２℃で４０ないし９０分間処理し、突然変異を誘発した。遠心分離後、収得された菌株を三回にわたって０．８５％食塩水で洗浄した後、これを寒天２％が含まれた前記表１に表示された組成を有する最小培地に適切に希釈して塗抹した後、温度３０ないし３４℃で４ないし５日間培養してコロニーを得た。収得されたコロニーを、それぞれアデニンが０ｍｇ／ｌ及び１００ｍｇ／ｌになるように添加された培地に移し、３〜４日の培養後、アデニンが含まれていない培地で成長させるが、１００ｍｇ／ｌが含まれた培地では、成長がさらに促進されるコロニーを選別した。このように選別された菌株を、漏出型のアデニン要求性を有する菌株と確認した後、収得されたそれぞれのコロニーを、前記表１に表示された組成を有する栄養培地で培養し、次に、種培地での２４時間培養及び発酵培地での５日間ないし６日間の培養を介して、イノシン生産量が最も優秀な菌株を選別し、ＣＮ０４−００９３菌株と命名した。
【００３７】
実施例３：漏出型のグアニン要求性変異株ＣＮ０４−００２７（ＫＣＣＭ １０９０５）の選別
実施例２で収得されたコリネバクテリウム・アンモニアゲネスＣＮ０４−００９３をリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．０）あるいはクエン酸塩緩衝液（ｐＨ５．５）に、１０７ないし１０８細胞／ｍｌに懸濁した後、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニンを、最終濃度が１０ないし５０μｇ／ｍｌになるように添加し、室温あるいは３０ないし３２℃で４０ないし９０分間処理し、突然変異を誘発した。遠心分離後、収得された菌株を三回にわたって０．８５％食塩水で洗浄した後、これを寒天２％が含まれた前記表１に表示された組成を有する最小培地に適切に希釈して塗抹した後、温度３０ないし３２℃で４ないし５日間培養し、コロニーを得た。収得されたコロニーを、それぞれグアニンが０ｍｇ／ｌ及び１００ｍｇ／ｌになるように添加された培地に移し、３〜４日の培養後、グアニンが含まれていない培地で成長させるが、１００ｍｇ／ｌが含まれた培地では、成長がさらに促進されるコロニーを選別した。選別されたそれぞれのコロニーを、前記表１に表示された組成を有する栄養培地で培養し、次に、種培地での２４時間培養及び発酵培地での５日間ないし６日間の培養を介して、イノシン生産量が最も優秀な菌株を選別した。前記の通りに選別された、イノシン分解経路が遮断され、漏出型のアデニン要求性及び漏出型のグアニン要求性を有し、イノシンを高収率及び高濃度で生産するコリネバクテリウム・アンモニアゲネスをコリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Corynebacterium ammoniagenes）ＣＮ０４−００２７と命名し、これをブダペスト条約下で、ソウル西大門区弘済１洞所在の韓国微生物保存センター（ＫＣＣＭ：Korean Culture Center of Microorganisms）に、２００７年１２月２０日付で受託番号ＫＣＣＭ １０９０５で寄託した。
【００３８】
実施例４：三角フラスコ発酵力価
前記表１に表示された組成を有する種培地３ｍｌを、直径１８ｍｍの試験管に分注し、１２０℃温度で１０分間加圧殺菌した後、コリネバクテリウム・アンモニアゲネスＡＴＣＣ ６８７２菌株；リボヌクレオシド・ヒドロラーゼ１及び２の遺伝子が破壊された菌株ＣＮ０４−００９２；リボヌクレオシド・ヒドロラーゼ１及び２遺伝子の破壊及び漏出型のアデニン要求性を有する菌株ＣＮ０４−００９３；リボヌクレオシド・ヒドロラーゼ１及び２遺伝子の破壊、漏出型のアデニン要求性及び漏出型のグアニン要求性を有する菌株ＣＮ０４−００２７をそれぞれ接種し、３７℃温度で２４時間振盪培養し、種培養液として使用した。前記表１に表示された組成を有する発酵培地２７ｍｌを、２５０ｍｌ振盪用三角フラスコに分注し、１２０℃温度で１０分間の加圧殺菌後、種培養液３ｍｌを接種した後、５日間ないし６日間振盪培養した。振盪培養器の回転数は、１分当たり２２０回（ｒｐｍ）、温度３２℃、ｐＨ７．２に調節した。培養結果、培地内のイノシン蓄積量は、親菌株であるコリネバクテリウム・アンモニアゲネスＡＴＣＣ ６８７２の場合、０ｇ／Ｌであり、ＣＮ０４−００９２菌株は、約１ｇ／ｌであった。さらに、漏出型のアデニン要求性が付与された変異株であるＣＮ０４−００９３は、ＣＮ０４−００９２よりイノシン蓄積量が約２ｇ／ｌ増加し、さらに漏出型のグアニン要求性が付与された変異株であるＣＮ０４−００２７は、ＣＮ０４−００９３より約２ｇ／ｌが増加された約５ｇ／ｌのイノシンを生産した。各菌株のイノシン生産性は、下記の表２に表示される。
【００３９】
（表２）
【技術分野】
【０００１】
本発明は、イノシン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物及び該微生物を培養する段階を含むイノシン生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
イノシンは、うま味調味料として脚光を浴びているイノシン酸（５’−inosinic acid）の化学的合成及び酵素転移反応による合成において、重要な基質である。また、イノシンは、核酸生合成代謝系の中間物質として、動植物の体内で生理的に重要な意味を有するだけではなく、食品及び医薬品などのさまざまな分野で広く利用されている。
【０００３】
イノシンは、従来には主に、バシラス（非特許文献１、特許文献１）、またはコリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Corynebacterium ammoniagenes）（非特許文献２）のような微生物を利用した直接発酵法や、５’−イノシン酸の熱分解法（特許文献２）などを利用して製造した。しかし、熱分解法の場合は、５’−イノシン酸を分解するために、大量の熱消費が要求されて実用性が低く、また直接発酵法の場合は、大腸菌を利用した多様な遺伝子型の菌株が開発されて研究されたが（非特許文献３）、イノシン生産菌株の力価が低く、生産コストが高いという短所がある。また、既存のイノシン研究は、大腸菌とバシラスとに集中していた。
【０００４】
従って、イノシンをさらに高収率で生産して高濃度に蓄積させることができる菌株、及び前記菌株を利用したイノシン生産方法の開発が依然として要求されている。
【０００５】
このために、本発明者らは、微生物を利用した直接発酵法によって、イノシンを高濃度／高収率に生産するために、持続的な研究を行い、その結果、直接発酵法によって、さらに高濃度及び高収率にイノシンを生産する微生物を開発し、本発明を完成した。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】大韓民国登録特許第２７２８０号公報
【特許文献２】特開昭４３−３３２０号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Agric．Biol．Chem．，46，2347(1982)
【非特許文献２】Agric．Biol．Chem．，42，399(1978)
【非特許文献３】Biosci Biotechnol Biochem．2001 Mar；65(3)：570-8
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、イノシン分解経路が遮断され、漏出型のアデニン要求性(a leaky adenine auxotroph)を有し、望ましくは、漏出型のグアニン要求性(a leaky guanine auxotroph)をさらに有することを特徴とする、イノシンを高濃度及び高収率に生産するコリネバクテリウム属微生物を提供することである。
【０００９】
本発明の他の目的は、前記微生物を培養し、高濃度及び高収率にイノシンを生産する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
前記課題を解決するために、本発明は、リボヌクレオシド・ヒドロラーゼ１（ｒｉｈ１）及びリボヌクレオシド・ヒドロラーゼ２（ｒｉｈ２）をコードする遺伝子が不活性化されてイノシン分解が遮断され、漏出型のアデニン要求性であることを特徴とするイノシン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物を提供する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によるコリネバクテリウム・アンモニアゲネスＣＮ０４−００２７（ＫＣＣＭ １０９０５）菌株を利用してイノシンを生産する場合、直接発酵法によってイノシンを、さらに高濃度及び高収率に生産でき、糖消費量の減少によって、生産コストが節減されるという効果がある。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】リボヌクレオシド・ヒドロラーゼ１をコードする遺伝子の構造を破壊するためのｐＤＺｍｒｉｈ１ベクターの製造図を図示する図面である。
【図２】リボヌクレオシド・ヒドロラーゼ２をコードする遺伝子の構造を破壊するためのｐＤＺｍｒｉｈ２ベクターの製造図を図示する図面である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は、イノシン分解経路が遮断され、漏出型のアデニン要求性であることを特徴とするイノシンを、高濃度及び高収率に生産するコリネバクテリウム（Corynebacterium）属微生物を提供する。本発明の微生物は、望ましくは、漏出型のグアニン要求性をさらに有することができる。
【００１４】
本発明の一具体例によれば、イノシンを生産するコリネバクテリウム属微生物は、遺伝子組換えによってイノシン分解経路が遮断され、すなわちそれぞれリボヌクレオシド・ヒドロラーゼ（ribonucleoside hydrolase：ｒｉｈ）１と、リボヌクレオシド・ヒドロラーゼ２とをコードする遺伝子が、塩基の挿入、欠失または置換による配列変異によって不活性化され、同時に人工変異によって選別された漏出型のアデニン要求性及び／または漏出型のグアニン要求性を有することができる。
【００１５】
本発明のコリネバクテリウム属微生物は、コリネバクテリウム・グルタミクム、コリネバクテリウム・エフィシエンス（Corynebacterium efficiens）、コリネバクテリウム・ジフテリア、及びコリネバクテリウム・アンモニアゲネスを含み、望ましくは、コリネバクテリウム・アンモニアゲネスであり、最も望ましくは、コリネバクテリウム・アンモニアゲネスＡＴＣＣ ６８７２から変異したコリネバクテリウム・アンモニアゲネスＣＮ０４−００２７である。親菌株であるコリネバクテリウム・アンモニアゲネスＡＴＣＣ ６８７２は、American Type Culture Collectionで提供するコリネバクテリウム・アンモニアゲネスの野生型菌株であって、イノシンを全く生産しない菌株である。
【００１６】
本発明の一具体例によるコリネバクテリウム・アンモニアゲネスＣＮ０４−００２７（ＫＣＣＭ １０９０５）は、リボヌクレオシド・ヒドロラーゼ１をコードする遺伝子ｒｉｈ１と、リボヌクレオシド・ヒドロラーゼ２をコードする遺伝子ｒｉｈ２との構造を破壊してイノシン分解経路が遮断されると同時に、漏出型のアデニン要求性及び漏出型のグアニン要求性を有し、イノシンをさらに高濃度及び高収率に培養液中に直接蓄積させることができる。
【００１７】
本発明の詳細な説明及び実施例で言及されるように、本発明で、微生物の培養のために使われる栄養培地、最小培地、種培地、及びフラスコ発酵培地の一例は、それぞれ下記の表１に表示された組成からなる培地でありうる。しかし、培地組成は、表１に提示されたものに制限されず、コリネバクテリウム属微生物の培養に適したあらゆる培養培地を使用できる。
【００１８】
（表１）培地組成
【００１９】
本発明の一具体例によれば、本発明の微生物は、イノシン分解を遮断するために、リボヌクレオシド・ヒドロラーゼ１及びリボヌクレオシド・ヒドロラーゼ２をコードするｒｉｈ１及びｒｉｈ２の遺伝子の構造を破壊してその活性を不活性化させ、イノシンが培養液内に蓄積されることを確認した後、人工変異を介して漏出型のアデニン要求性を選別し、さらに漏出型のグアニン要求性であることを選別して完成されたイノシン生産性が向上した変異株でありうる。
【００２０】
本発明の一具体例によれば、本発明の微生物は、コリネバクテリウム・アンモニアゲネスＡＴＣＣ ６８７２で、本発明が属する技術分野の当業者によって既発表のリボヌクレオシド・ヒドロラーゼ１とリボヌクレオシド・ヒドロラーゼ２とをコードする遺伝子（以下、ｒｉｈ１、ｒｉｈ２）に塩基の挿入、欠失または置換によって終止コドンが生成されて配列が変形された遺伝子を運搬する組換えベクターによって形質転換され、これによって蛋白質翻訳が阻害されて前記酵素が不活性化され、イノシン分解経路が遮断された組換え菌株でありうる。
【００２１】
本発明の一具体例によれば、イノシン分解経路が遮断された組換え菌株で配列が変形されて不活性化されたリボヌクレオシド・ヒドロラーゼ１遺伝子及びリボヌクレオシド・ヒドロラーゼ２遺伝子は、それぞれ配列番号９及び配列番号１０で表示される配列を有することができる。
【００２２】
本発明の一具体例によれば、イノシン分解経路が遮断された菌株にさらに漏出型のアデニン要求性形質を付与するために、Ｘ線、紫外線またはＮ−メチル−Ｎ−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニン（Ｎ−methyl−Ｎ−nitro−Ｎ−nitrosoguanine）、硫化ジエチル（diethylsulfide）、エチルアミンなどの化学的変異誘発剤が処理されうる。前記変異誘発剤の処理後、菌株を前記表１の組成を有する最小培地に塗抹後、アデニンが添加されていない培地で成長するが、アデニンが添加された培地で成長がさらに促進される、漏出型のアデニン要求性を示す個別的なコロニー（colonｙ）を収得し、それらをそれぞれ栄養培地で培養し、種培地で２４時間培養した後、発酵培地で５日間ないし６日間培養し、発酵培養液に蓄積されるイノシン生産量が最も優秀な菌株に対してイノシン分解経路が遮断され、漏出型のアデニン要求性を有する菌株として選別されうる。
【００２３】
また、本発明の一具体例によれば、選別された漏出型のアデニン要求性菌株を、前記のような方法で、すなわち、化学的変異誘発剤で処理し、漏出型のグアニン要求性菌株を選別し、栄養培地培養、種培地培養、発酵培地培養を経て、発酵培養液で蓄積されるイノシン生産量が最も優秀な菌株に対してイノシン分解経路が遮断され、漏出型のアデニン要求性及び漏出型のグアニン要求性を有するイノシン生産微生物に選別できる。
【００２４】
本発明はまた、イノシン分解経路が遮断され、漏出型のアデニン要求性及び漏出型のグアニン要求性を有し、イノシンを高収率及び高濃度で生産するコリネバクテリウム属微生物を培養し、前記微生物または培養液中にイノシンを生産する段階、及び前記微生物または培養液からイノシンを回収する段階を含む、イノシンを生産する方法を提供する。
【００２５】
本発明の一具体例によるイノシンを生産する方法で、前記コリネバクテリウム属微生物は、コリネバクテリウム・アンモニアゲネスＣＮ０４−００２７（ＫＣＣＭ １０９０５）でありうる。
【００２６】
本発明によるイノシンを生産する方法は、コリネバクテリウム属微生物を培養し、微生物または培養液中にイノシンを生産する段階を含む。
【００２７】
本発明の一具体例によれば、コリネバクテリウム属微生物を培養する段階は、菌株を適当な炭素源、窒素源、アミノ酸、ビタミンなどを含有した通常の培地内で、好気性条件下で、温度、ｐＨなどを調節しつつ培養する。
【００２８】
このとき、炭素源としては、グルコース、殺菌された前処理糖蜜（すなわち、還元糖に転換された糖蜜）のような炭水化物が使われ、窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウムのような各種無機窒素源、及びペプトン、ＮＺ−アミン、肉類抽出物、酵母抽出物、とうもろこし浸漬液、カゼイン加水分解物、魚類またはその分解生成物、脱脂大豆ケーキまたはその分解生成物などの有機窒素源が使われうる。無機化合物としては、リン酸１カリウム、リン酸２カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸鉄、硫酸マンガン、炭酸カルシウムなどが使われ、それ以外に栄養要求株必要によって、ビタミン及び塩基などが添加されうる。
【００２９】
培養は、好気的条件下、例えば、振盪(shaking)培養または通気撹拌培養によって、望ましくは、２８ないし３６℃の温度で行われる。培地のｐＨは、培養する間、ｐＨ６ないし８の範囲で維持することが望ましい。培養は、５日間ないし６日間行われ、直接発酵によって蓄積されたイノシンは、ＨＰＬＣ(high performance liquid chromatography)を利用して通常の方法で分析されうる。
【００３０】
以下、本発明について、実施例によって具体的に説明する。しかし、本発明の範囲が、いかなる形態でも実施例によって制限されることを意味しない。
【実施例】
【００３１】
実施例１：染色体挿入用ベクター（ｐＤＺ）を利用したリボヌクレオシド・ヒドロラーゼ遺伝子の構造が破壊された菌株の製造
本実施例では、リボヌクレオシド・ヒドロラーゼ１及びリボヌクレオシド・ヒドロラーゼ２をコードする遺伝子で、塩基の挿入、置換または欠失による配列変異を介して前記遺伝子を不活性化させ、イノシン分解経路を遮断させることを目的に、大腸菌クローニング用ベクターｐＡＣＹＣ１７７（New England Biolab、ＧｅｎＢａｎｋ accession＃Ｘ０６４０２）由来のｐＤＺベクターを組換えベクターとして利用した（韓国特許０７−９４４３３）。
【００３２】
図１及び図２は、それぞれリボヌクレオシド・ヒドロラーゼ１（ｒｉｈ１）及びリボヌクレオシド・ヒドロラーゼ２（ｒｉｈ２）をコードする遺伝子の構造を破壊するためのｐＤＺｍｒｉｈ１及びｐＤＺｍｒｉｈ２ベクターの製造図を図示する。
【００３３】
リボヌクレオシド・ヒドロラーゼ１及びリボヌクレオシド・ヒドロラーゼ２をコードする遺伝子を増幅するために、まず、コリネバクテリウム・アンモニアゲネスＡＴＣＣ ６８７２の染色体ＤＮＡをテンプレートとして、それぞれ配列番号１ないし４のプライマー及び配列番号５ないし８のプライマーを利用し、下記と共にＰＣＲ（polymerase chain reaction）を行った。
【００３４】
コリネバクテリウム・アンモニアゲネスＡＴＣＣ ６８７２の染色体ＤＮＡをテンプレートとして、それぞれ配列番号１並びに２、配列番号３並びに４のプライマーを利用したＰＣＲを行い、ｒｉｈ１−Ａ断片及びｒｉｈ１−Ｂの断片を収得した。その後、収得されたｒｉｈ１−Ａ断片及びｒｉｈ１−Ｂ断片をテンプレートとして、配列番号１及び４のプライマーを利用したＰＣＲを行い、変異した配列構造を有する変異遺伝子断片であるｍｒｉｈ１を収得した。また、リボヌクレオシド・ヒドロラーゼ２の配列構造が変形された変異遺伝子断片であるｍｒｉｈ２を収得するために、前記コリネバクテリウム・アンモニアゲネスＡＴＣＣ ６８７２の染色体ＤＮＡをテンプレートとして、それぞれ配列番号５並びに６、配列番号７並びに８のプライマーを利用したＰＣＲを行い、ｒｉｈ２−Ａ及びｒｉｈ２−Ｂ断片を収得し、前記収得されたｒｉｈ２−Ａ及びｒｉｈ２−Ｂをテンプレートとして、配列番号５並びに８のプライマーを利用したＰＣＲを行った。前記で、ｒｉｈ１−Ａ、ｒｉｈ１−Ｂ、ｒｉｈ２−Ａ及びｒｉｈ２−Ｂを収得するために行ったＰＣＲの条件は、９４℃で５分の予備変性、及びそれに続いた９４℃で３０秒、５２℃で３０秒及び７２℃で１分によって構成されたサイクルの２０回反復、及び７２℃で７分の最終伸張であり、各Ａ断片とＢ断片とを統合して変異された遺伝子断片を得るためのＰＣＲ条件は、９４℃で５分の予備変性及びそれに続いた９４℃で３０秒、５０℃で３０秒及び７２℃で１分によって構成されたサイクルの２５回反復、及び７２℃で７分の最終伸張であった。前記増幅されたｍｒｉｈ１及びｍｒｉｈ２とｐＤＺとをそれぞれ制限酵素ＸｂａＩで処理した後、Ｔ４リガーゼによる反応を介して、遺伝子構造破壊用組換えベクターであるｐＤＺｍｒｉｈ１とｐＤＺｍｒｉｈ２とを収得した。
【００３５】
コリネバクテリウムの染色体上のｒｉｈ２遺伝子の配列を、塩基欠失によって変異させるために製作されたｐＤＺｍｒｉｈ２ベクターを、野生型であるコリネバクテリウム・アンモニアゲネスＡＴＣＣ ６８７２に電気穿孔法（electroporation）で形質転換した後（Appl．Microbiol．Biotechnol．(1999)52：541-545による形質転換法利用）、カナマイシン（kanamycin）２５ｍｇ／Ｌを含有した選別培地で、染色体上の同遺伝子との相同性組換えによって、前記ベクターが挿入された菌株を選別した。ベクターの成功裏の染色体挿入は、Ｘ−ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド）を含んだ固体培地で、青色を示すか否かを調べて確認した。一次組換えによって、ベクターが染色体に挿入された菌株を、栄養培地で３０℃で８時間振盪培養した後、それぞれ１０−４から１０−１０まで希釈し、Ｘ−ｇａｌを含んでいる固体培地に塗抹した。ほとんどのコロニーが青色を帯びるに反して、低率で示される白色のコロニーを選別することによって、二次交差（crossover）によって、ベクター配列が染色体から除去された菌株を選別した。これによって、コリネバクテリウム・アンモニアゲネスＡＴＣＣ ６８７２菌株の染色体上のｒｉｈ２遺伝子の２６２番目のＧが欠失された菌株を収得した。その後、ｒｉｈ１遺伝子で塩基置換によって配列を変異させるために、前記で収得されたｒｉｈ２遺伝子の配列に欠失を含む菌株に、ｐＤＺｍｒｉｈ１を形質転換によって導入し、前記ｒｉｈ２遺伝子の変異菌株の選別と同じ方法を行い、ｒｉｈ１遺伝子の１４８番目ＧがＴで置換されてイノシン分解経路が遮断されたコリネバクテリウム・アンモニアゲネスＣＮ０４−００９２を収得した。前記選別された菌株は、最終的に抗生物質カナマイシンに対する感受性の有無、及びＰＣＲを介した遺伝子配列分析を介して確認した。前記菌株の変異したｒｉｈ１及びｒｉｈ２は、それぞれ配列番号９及び１０で表示される配列を有した。
【００３６】
実施例２：漏出型のアデニン要求性変異株ＣＮ０４−００９３の選別
実施例１で収得されたコリネバクテリウム・アンモニアゲネスＣＮ０４−００９２を、リン酸塩緩衝液（ｐＨ７．０）あるいはクエン酸塩緩衝液（ｐＨ５．５）に、１０７ないし１０８細胞／ｍｌで懸濁した後、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニンを、最終濃度が１０ないし５０μｇ／ｍｌになるように添加し、室温あるいは３０ないし３２℃で４０ないし９０分間処理し、突然変異を誘発した。遠心分離後、収得された菌株を三回にわたって０．８５％食塩水で洗浄した後、これを寒天２％が含まれた前記表１に表示された組成を有する最小培地に適切に希釈して塗抹した後、温度３０ないし３４℃で４ないし５日間培養してコロニーを得た。収得されたコロニーを、それぞれアデニンが０ｍｇ／ｌ及び１００ｍｇ／ｌになるように添加された培地に移し、３〜４日の培養後、アデニンが含まれていない培地で成長させるが、１００ｍｇ／ｌが含まれた培地では、成長がさらに促進されるコロニーを選別した。このように選別された菌株を、漏出型のアデニン要求性を有する菌株と確認した後、収得されたそれぞれのコロニーを、前記表１に表示された組成を有する栄養培地で培養し、次に、種培地での２４時間培養及び発酵培地での５日間ないし６日間の培養を介して、イノシン生産量が最も優秀な菌株を選別し、ＣＮ０４−００９３菌株と命名した。
【００３７】
実施例３：漏出型のグアニン要求性変異株ＣＮ０４−００２７（ＫＣＣＭ １０９０５）の選別
実施例２で収得されたコリネバクテリウム・アンモニアゲネスＣＮ０４−００９３をリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．０）あるいはクエン酸塩緩衝液（ｐＨ５．５）に、１０７ないし１０８細胞／ｍｌに懸濁した後、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニンを、最終濃度が１０ないし５０μｇ／ｍｌになるように添加し、室温あるいは３０ないし３２℃で４０ないし９０分間処理し、突然変異を誘発した。遠心分離後、収得された菌株を三回にわたって０．８５％食塩水で洗浄した後、これを寒天２％が含まれた前記表１に表示された組成を有する最小培地に適切に希釈して塗抹した後、温度３０ないし３２℃で４ないし５日間培養し、コロニーを得た。収得されたコロニーを、それぞれグアニンが０ｍｇ／ｌ及び１００ｍｇ／ｌになるように添加された培地に移し、３〜４日の培養後、グアニンが含まれていない培地で成長させるが、１００ｍｇ／ｌが含まれた培地では、成長がさらに促進されるコロニーを選別した。選別されたそれぞれのコロニーを、前記表１に表示された組成を有する栄養培地で培養し、次に、種培地での２４時間培養及び発酵培地での５日間ないし６日間の培養を介して、イノシン生産量が最も優秀な菌株を選別した。前記の通りに選別された、イノシン分解経路が遮断され、漏出型のアデニン要求性及び漏出型のグアニン要求性を有し、イノシンを高収率及び高濃度で生産するコリネバクテリウム・アンモニアゲネスをコリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Corynebacterium ammoniagenes）ＣＮ０４−００２７と命名し、これをブダペスト条約下で、ソウル西大門区弘済１洞所在の韓国微生物保存センター（ＫＣＣＭ：Korean Culture Center of Microorganisms）に、２００７年１２月２０日付で受託番号ＫＣＣＭ １０９０５で寄託した。
【００３８】
実施例４：三角フラスコ発酵力価
前記表１に表示された組成を有する種培地３ｍｌを、直径１８ｍｍの試験管に分注し、１２０℃温度で１０分間加圧殺菌した後、コリネバクテリウム・アンモニアゲネスＡＴＣＣ ６８７２菌株；リボヌクレオシド・ヒドロラーゼ１及び２の遺伝子が破壊された菌株ＣＮ０４−００９２；リボヌクレオシド・ヒドロラーゼ１及び２遺伝子の破壊及び漏出型のアデニン要求性を有する菌株ＣＮ０４−００９３；リボヌクレオシド・ヒドロラーゼ１及び２遺伝子の破壊、漏出型のアデニン要求性及び漏出型のグアニン要求性を有する菌株ＣＮ０４−００２７をそれぞれ接種し、３７℃温度で２４時間振盪培養し、種培養液として使用した。前記表１に表示された組成を有する発酵培地２７ｍｌを、２５０ｍｌ振盪用三角フラスコに分注し、１２０℃温度で１０分間の加圧殺菌後、種培養液３ｍｌを接種した後、５日間ないし６日間振盪培養した。振盪培養器の回転数は、１分当たり２２０回（ｒｐｍ）、温度３２℃、ｐＨ７．２に調節した。培養結果、培地内のイノシン蓄積量は、親菌株であるコリネバクテリウム・アンモニアゲネスＡＴＣＣ ６８７２の場合、０ｇ／Ｌであり、ＣＮ０４−００９２菌株は、約１ｇ／ｌであった。さらに、漏出型のアデニン要求性が付与された変異株であるＣＮ０４−００９３は、ＣＮ０４−００９２よりイノシン蓄積量が約２ｇ／ｌ増加し、さらに漏出型のグアニン要求性が付与された変異株であるＣＮ０４−００２７は、ＣＮ０４−００９３より約２ｇ／ｌが増加された約５ｇ／ｌのイノシンを生産した。各菌株のイノシン生産性は、下記の表２に表示される。
【００３９】
（表２）
【特許請求の範囲】
【請求項１】
リボヌクレオシド・ヒドロラーゼ１（ｒｉｈ１）及びリボヌクレオシド・ヒドロラーゼ２（ｒｉｈ２）をコードする遺伝子が不活性化されてイノシン分解が遮断され、漏出型のアデニン要求性であることを特徴とするイノシン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物。
【請求項２】
漏出型のグアニン要求性をさらに有することを特徴とする請求項１に記載のコリネバクテリウム属微生物。
【請求項３】
不活性化された、リボヌクレオシド・ヒドロラーゼ１をコードする遺伝子（ｒｉｈ１）及び、不活性化された、リボヌクレオシド・ヒドロラーゼ２をコードする遺伝子（ｒｉｈ２）が、それぞれ配列番号９及び配列番号１０で表示される配列を有することを特徴とする、請求項１または請求項２に記載のコリネバクテリウム属微生物。
【請求項４】
コリネバクテリウム属微生物が、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Corynebacterium ammoniagenes）であることを特徴とする、請求項１または請求項２に記載のコリネバクテリウム属微生物。
【請求項５】
コリネバクテリウム属微生物が、コリネバクテリウム・アンモニアゲネスＣＮ０４−００２７（ＫＣＣＭ １０９０５）であることを特徴とする、請求項４に記載のコリネバクテリウム属微生物。
【請求項６】
請求項１または請求項２に記載の微生物を培養し、前記微生物または培養液中にイノシンを生産する段階と、前記微生物または培養液からイノシンを回収する段階とを含む、イノシンを生産する方法。
【請求項１】
リボヌクレオシド・ヒドロラーゼ１（ｒｉｈ１）及びリボヌクレオシド・ヒドロラーゼ２（ｒｉｈ２）をコードする遺伝子が不活性化されてイノシン分解が遮断され、漏出型のアデニン要求性であることを特徴とするイノシン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物。
【請求項２】
漏出型のグアニン要求性をさらに有することを特徴とする請求項１に記載のコリネバクテリウム属微生物。
【請求項３】
不活性化された、リボヌクレオシド・ヒドロラーゼ１をコードする遺伝子（ｒｉｈ１）及び、不活性化された、リボヌクレオシド・ヒドロラーゼ２をコードする遺伝子（ｒｉｈ２）が、それぞれ配列番号９及び配列番号１０で表示される配列を有することを特徴とする、請求項１または請求項２に記載のコリネバクテリウム属微生物。
【請求項４】
コリネバクテリウム属微生物が、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Corynebacterium ammoniagenes）であることを特徴とする、請求項１または請求項２に記載のコリネバクテリウム属微生物。
【請求項５】
コリネバクテリウム属微生物が、コリネバクテリウム・アンモニアゲネスＣＮ０４−００２７（ＫＣＣＭ １０９０５）であることを特徴とする、請求項４に記載のコリネバクテリウム属微生物。
【請求項６】
請求項１または請求項２に記載の微生物を培養し、前記微生物または培養液中にイノシンを生産する段階と、前記微生物または培養液からイノシンを回収する段階とを含む、イノシンを生産する方法。
【図１】
【図２】
【図２】
【公表番号】特表２０１１−５０８５９９（Ｐ２０１１−５０８５９９Ａ）
【公表日】平成２３年３月１７日（２０１１．３．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５４１４０３（Ｐ２０１０−５４１４０３）
【出願日】平成２１年１月２日（２００９．１．２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００９／００００１７
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０８８１８４
【国際公開日】平成２１年７月１６日（２００９．７．１６）
【出願人】（５０８１３９６６４）シージェイ チェイルジェダン コーポレーション (12)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年３月１７日（２０１１．３．１７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１月２日（２００９．１．２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００９／００００１７
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０８８１８４
【国際公開日】平成２１年７月１６日（２００９．７．１６）
【出願人】（５０８１３９６６４）シージェイ チェイルジェダン コーポレーション (12)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]