イムノアッセイに有用なインジナビル誘導体
本発明は、生物学的サンプル中のインジナビルの検出に使用する目的での抗体および標識コンジュゲートの生成のための、インジナビルの誘導体ならびにコンジュゲートに関する。該誘導体は、インジナビルのインダン環ヒドロキシル基またはピリジン環窒素から合成される。パラジウム触媒と水素ガスとを用いたインジナビルからの単一ステップでのインジナビル主要代謝物（Ｍ６）の合成も開示される。インジナビルＭ６は、好適な官能基を有するインジナビルの種々のアナログを合成するためにも利用されてきている。これらの誘導体は、インジナビルイムノアッセイの開発におけるインジナビル免疫原、抗体、および標識コンジュゲートの開発で有用である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、イムノアッセイに有用なプロテアーゼ阻害剤誘導体に関する。より詳細には、本発明は、免疫原を生成するために有用な活性化インジナビルハプテン、ならびに、インジナビルに対する抗体を生成するための免疫原として、また、生物学的サンプル中のインジナビルの検出のためのイムノアッセイにおいて有用な、コンジュゲート化した誘導体に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＨＩＶプロテアーゼ阻害剤は、その最初の薬物であるサキナビルが１９９５年に市場に導入されて以来、ＡＩＤＳ患者の保健医療に重大な影響を与えている重要な新しい種類の薬物である。他のプロテアーゼ阻害剤の例としては、アンプレナビル、ネルフィナビル、ロピナビル、リトナビル、インジナビル、およびアタザナビルが挙げられる。それらは逆転写酵素阻害剤などの他の抗ＨＩＶ薬または他のＨＩＶプロテアーゼ阻害剤との併用で特に有効である。これらの新しい治療法による著しい成功にもかかわらず、プロテアーゼ阻害剤の濃度を測定するための治療薬試験方法が利用可能であれば、結果は非常に改善される可能性が高い。すべての患者がプロテアーゼ阻害剤併用療法に最適に反応するとは限らない。反応する患者でも、よく知られているＨＩＶウイルスの高い突然変異率のために、その後薬物耐性を発現し得る。しかし、血漿中のプロテアーゼ阻害剤濃度と、ウイルス量の減少およびＣＤ４細胞数の増加に基づく治療効果との間には明らかな相関関係があることが示されている。１つの問題は、薬物が著しく代謝され、複雑な薬物・薬物相互作用を受けるという点にある。結果は極めて複雑な薬物動態として現れ、特定の時での特定の患者についての投与量と結果として得られる薬物濃度との間の予測不可能な強い要素である。治療薬のモニタリングによって、薬物投与量は患者に対して個別化することができ、ウイルスを抑える可能性はずっと高くなるであろう。しかし、プロテアーゼ阻害剤の日常的な治療薬モニタリングは、ハイスループット臨床分析機器に適応できる簡単な自動化試験の可用性を必要とする。現在のところ、プロテアーゼ阻害剤の治療薬モニタリングにおけるほとんどの報告は、時間がかかり、労働力を要し、高価なＨＰＬＣ法を用いている。最近、サキナビルに対するラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）法の報告があった（Wiltshireら、Analytical Biochemistry 281, 105-114, 2000）。しかし、このような方法はハイスループットの治療薬モニタリングに適応できず、すべてのＲＩＡ法と同様に、アッセイに使用される放射性同位体標識に関する規制問題、安全性の問題および廃棄物問題を有するという欠点を伴う。治療薬モニタリングの最も望ましいアッセイ形式は非同位体イムノアッセイであり、このような方法はＨＩＶプロテアーゼ阻害剤の測定については今まで知られていない。
【０００３】
インジナビル（CRIXIVAN, Merck & Co., Inc.）はヒト免疫不全ウイルスプロテアーゼの強力かつ特異的な阻害剤の１つである。インジナビルは、低濃度の第４級ピリジンＮ−グルクロニド（Ｍ１）、２’，３’−トランス−ジヒドロキシインダニルピリジン−Ｎ−オキシド（Ｍ２）、２’，３’−トランス−ジヒドロキシインダン（Ｍ３）、およびピリジン−Ｎ−オキシド（Ｍ４ａ）アナログ、ならびにＭ３（Ｍ５）およびインジナビル（Ｍ６）のデスピリジルメチルアナログに代謝される。Ｍ６は尿中ならびに血漿中の主要代謝物の１つである（Drug Metabolism and Disposition 24, 1389-94, 1996）。
【０００４】
前述のように、ＨＰＬＣはＨＩＶプロテアーゼ阻害剤の測定のために一般に好まれる方法であった。最近の２つの文献での報告は、ヒト血漿中のいくつかのプロテアーゼ阻害剤の同時測定のためのＨＰＬＣアッセイを記載する（Poirierら、Therapeutic Drug Monitoring 22, 465-473, 2000およびRemmelら、Clinical Chemistry 46, 73-81, 2000）。
【０００５】
化学的および生物学的アッセイは通常、目的のアナライトを事前に測定された量の１つ以上のアッセイ試薬と接触させること、その結果生じた生成物（検出生成物）の１つ以上の特性を測定すること、ならびに、一般的には試験されるサンプルについて予測される範囲で既知量の目的のアナライトを含有する標準サンプルまたは較正サンプルから決定される関係を用いて測定値を元のサンプル中に存在するアナライトの量と相関させることを含む。一般的に、検出生成物は１つ以上のアッセイ試薬によってもたらされる１つ以上の検出可能な標識を取り込む。一般的に使用される標識の例は、官能化微粒子、１２５Ｉおよび３２Ｐなどの放射性同位体標識、ペルオキシダーゼおよびβ−ガラクトシダーゼなどの酵素ならびに酵素基質標識、フルオレセインおよびローダミンなどの蛍光標識、ニトロキシドフリーラジカルなどの電子スピン共鳴標識、抗体および抗原などの免疫反応性標識、ビオチン−アビジンおよびビオチン−ストレプトアビジンなどの結合ペアの一方の構成成分である標識、ならびにルテニウムビピリジル部分を含有するものなどの電気化学発光標識を含む。サンドイッチアッセイは通常、目的のアナライトが、例えば抗体、抗原、または結合ペアの一方の構成成分のような最終的に分離のために使用される１つのアッセイ試薬と、検出可能な標識を提供する第二のアッセイ試薬との間に挟まれた複合体の形成を含む。競合アッセイは通常、目的のアナライトとアナライトのアナログとの両方が別の試薬（例えば抗体）の結合部位について競合するシステムを含み、アナライト、アナログまたは結合試薬の１つは検出可能な標識を有する。
【０００６】
本出願と同一の承継人に係る、２００２年５月２２日にＥＰ １ ２０７ ３９４として公開された、２０００年１１月１４日に出願された同時係属の米国特許出願第０９／７１２，５２５号は、阻害剤を含有するサンプルを阻害剤または該阻害剤の代謝物に特異的な受容体とともに、さらにまた阻害剤のアナログと非同位体シグナル発生部分とを含むコンジュゲートとともにインキュベーションすることを含む、ＨＩＶプロテアーゼ阻害剤のための非同位体イムノアッセイを記載する。受容体による阻害剤の結合の結果として発生するシグナルが測定され、元のサンプル中のプロテアーゼ阻害剤の存在または量と関連付けられる。本発明のプロテアーゼ阻害剤コンジュゲートはこのようなアッセイにおいて特に有用である。
【０００７】
本出願と同一の承継人に係る、２００３年１月２３日にＷＯ ０３／００６５０６として公開された、２００２年７月１０日に出願された同時係属の米国特許出願第１０／１９２，０５２号は、ＨＩＶプロテアーゼ阻害剤に対する免疫原を生成するために有用な活性化ハプテンを記載する。具体的に開示されるのは、インジナビル分子の中央のヒドロキシル基から合成されるインジナビル誘導体および免疫原である。
【特許文献１】ＥＰ １ ２０７ ３９４
【特許文献２】米国特許出願第０９／７１２，５２５号
【特許文献３】ＷＯ ０３／００６５０６
【特許文献４】米国特許出願第１０／１９２，０５２号
【非特許文献１】Wiltshireら、Analytical Biochemistry 281, 105-114, 2000
【非特許文献２】Drug Metabolism and Disposition 24, 1389-94, 1996
【非特許文献３】Poirierら、Therapeutic Drug Monitoring 22, 465-473, 2000
【非特許文献４】Remmelら、Clinical Chemistry 46, 73-81, 2000
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
他の問題の中でも、ＨＩＶプロテアーゼ阻害剤インジナビルの改良された活性化ハプテン、誘導体およびコンジュゲートの必要性、ならびに自動化されたハイスループットの薬物モニタリングに適した方法である、生物学的サンプル中のインジナビルの測定のためのイムノアッセイ法の必要性が残っている。本発明はこれらおよび他の問題を解決する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
発明の概要
上述の背景において、本発明は先行技術を越えるある種の自明でない利点および進歩をもたらす。特に、本発明者らはイムノアッセイに有用なインジナビル誘導体およびコンジュゲートの改良の必要性を認識している。
【００１０】
本発明は、ＨＩＶプロテアーゼ阻害剤インジナビルに対する免疫原の生成に有用な活性化ハプテン、インジナビルに対する抗体の作製に有用な免疫原、および生物学的サンプル中のインジナビルの測定のためのイムノアッセイに有用な標識化コンジュゲートに関する。これらの化合物はインジナビルのピリジン環窒素のインダン環ヒドロキシル基から、およびインジナビルのピリジン窒素から合成される。本発明はまた、水素ガスおよびパラジウム触媒の存在下でインジナビルから単一ステップでインジナビル代謝物Ｍ６を合成する方法、ならびにインジナビルＭ６代謝物に由来する活性化ハプテンおよびコンジュゲートに関する。
【００１１】
本発明の１つの実施形態では、活性化ハプテンは以下の構造を持って提供され、
【化１】
式中、ＹはＯまたはＳであり、ｍは０または１であり、ＸはＣＨ２またはＮＨであり、Ｌは飽和もしくは不飽和の直鎖または分岐鎖として配列する０〜４０個の炭素原子を含み、最大２個の環状構造と０〜２０個のヘテロ原子を含有する連結基であるが、３個以上のヘテロ原子が連続して結合していてはならず、かつＡは、活性エステル、イソシアネート、イソチオシアネート、チオール、イミドエステル、無水物、マレイミド、チオラクトン、ジアゾニウム基およびアルデヒドからなる群より選択される活性型官能基である。
【００１２】
本発明の別の実施形態では、コンジュゲートされた誘導体は以下の構造を持って提供され、
【化２】
式中、ＹはＯまたはＳであり、ｍは０または１であり、ＸはＣＨ２またはＮＨであり、Ｌは飽和もしくは不飽和の直鎖または分岐鎖として配列する０〜４０個の炭素原子を含み、さらに最大２個の環状構造と０〜２０個のヘテロ原子を含有する連結基であるが、３個以上のヘテロ原子が連続して結合していてはならず、Ｚは、−ＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯ−、−ＮＨＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＳＮＨ−、−ＯＣＯＮＨ−、−ＮＨＯＣＯ−、−Ｓ−、−ＮＨ（Ｃ＝ＮＨ）−、−Ｎ＝Ｎ−、−ＮＨ−および
【化３】
からなる群より選択される部分であり、Ｑは、ポリペプチド、多糖、合成ポリマー、および非同位体標識からなる群より選択され、かつｎはＱの分子量５０キロダルトンあたり１〜５０の数である。
【００１３】
本発明の別の実施形態では、活性化ハプテンは以下の構造を持って提供され、
【化４】
式中、Ｌは飽和もしくは不飽和の直鎖または分岐鎖として配列する０〜４０個の炭素原子を含み、最大２個の環状構造と０〜２０個のヘテロ原子を含有する連結基であるが、３個以上のヘテロ原子が連続して結合していてはならず、かつＡは、活性エステル、イソシアネート、イソチオシアネート、チオール、イミドエステル、無水物、マレイミド、チオラクトン、ジアゾニウム基およびアルデヒドからなる群より選択される活性型官能基である。
【００１４】
本発明の別の実施形態では、コンジュゲート化された誘導体は以下の構造を持って提供され、
【化５】
式中、Ｌは飽和もしくは不飽和の直鎖または分岐鎖として配列する０〜４０個の炭素原子を含み、さらに最大２個の環状構造と０〜２０個のヘテロ原子を含有する連結基であるが、３個以上のヘテロ原子が連続して結合していてはならず、Ｚは、−ＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯ−、−ＮＨＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＳＮＨ−、−ＯＣＯＮＨ−、−ＮＨＯＣＯ−、−Ｓ−、−ＮＨ（Ｃ＝ＮＨ）−、−Ｎ＝Ｎ−、−ＮＨ−および
【化６】
からなる群より選択される部分であり、Ｑは、ポリペプチド、多糖、合成ポリマー、および非同位体標識からなる群より選択され、かつｎはＱの分子量５０キロダルトンあたり１〜５０の数である。
【００１５】
本発明のさらに別の実施形態では、活性化ハプテンは以下の構造を持って提供され、
【化７】
式中、ＸはＮまたはＣであり、Ｌは飽和もしくは不飽和の直鎖または分岐鎖として配列する０〜４０個の炭素原子を含み、最大２個の環状構造と０〜２０個のヘテロ原子を含有する連結基であるが、３個以上のヘテロ原子が連続して結合していてはならず、かつＡは、活性エステル、イソシアネート、イソチオシアネート、チオール、イミドエステル、無水物、マレイミド、チオラクトン、ジアゾニウム基およびアルデヒドからなる群より選択される活性型官能基である。
【００１６】
本発明のさらに別の実施形態では、コンジュゲート化された誘導体は以下の構造を持って提供され、
【化８】
式中、ＸはＮまたはＣであり、Ｌは飽和もしくは不飽和の直鎖または分岐鎖として配列する０〜４０個の炭素原子を含み、さらに最大２個の環状構造と０〜２０個のヘテロ原子を含有する連結基であるが、３個以上のヘテロ原子が連続して結合していてはならず、Ｚは、−ＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯ−、−ＮＨＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＳＮＨ−、−ＯＣＯＮＨ−、−ＮＨＯＣＯ−、−Ｓ−、−ＮＨ（Ｃ＝ＮＨ）−、−Ｎ＝Ｎ−、−ＮＨ−および
【化９】
からなる群より選択される部分であり、Ｑは、ポリペプチド、多糖、合成ポリマー、および非同位体標識からなる群より選択され、かつｎはＱの分子量５０キロダルトンあたり１〜５０の数である。
【００１７】
本発明の更なる実施形態では、活性化ハプテンは以下の構造を持って提供され、
【化１０】
式中、Ｌは飽和もしくは不飽和の直鎖または分岐鎖として配列する０〜４０個の炭素原子と、０〜２０個のヘテロ原子とを含む脂肪族連結基であるが、３個以上のヘテロ原子が連続して結合していてはならず、かつＡは、活性エステル、イソシアネート、イソチオシアネート、チオール、イミドエステル、無水物、マレイミド、チオラクトン、ジアゾニウム基およびアルデヒドからなる群より選択される活性型官能基である。
【００１８】
本発明の更なる実施形態では、コンジュゲート化された誘導体は以下の構造を持って提供され、
【化１１】
式中、Ｌは飽和もしくは不飽和の直鎖または分岐鎖として配列する０〜４０個の炭素原子と、さらに０〜２０個のヘテロ原子とを含む脂肪族連結基であるが、３個以上のヘテロ原子が連続して結合していてはならず、Ｚは、−ＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯ−、−ＮＨＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＳＮＨ−、−ＯＣＯＮＨ−、−ＮＨＯＣＯ−、−Ｓ−、−ＮＨ（Ｃ＝ＮＨ）−、−Ｎ＝Ｎ−、−ＮＨ−および
【化１２】
からなる群より選択される部分であり、Ｑは、ポリペプチド、多糖、合成ポリマー、および非同位体標識からなる群より選択され、かつｎはＱの分子量５０キロダルトンあたり１〜５０の数である。
【００１９】
本発明の別の実施形態では、水素ガスおよびパラジウム触媒の存在下でインジナビルから単一ステップでインジナビル代謝物Ｍ６を合成する方法が提供される。合成Ｍ６は、Ｍ６のピペラジン窒素からの連結基を有するインジナビル誘導体の合成に有用である。これらの連結基は、脂肪族基、置換芳香族基、およびピリジル基を含む。
【００２０】
本発明のこれらその他の特徴および利点は、添付の特許請求の範囲と併せて下記の発明の詳細な説明からより完全に理解されるであろう。特許請求の範囲はその中の詳述によって定義され、本説明に記載される特徴および利点の特定の議論によって規定されないことに注意する。
【００２１】
図面の簡単な説明
本発明の実施形態の詳細な説明は、下記の図面と併読して最も良く理解することができる。
図１は、実施例２９に記載されたように高値セット血清較正物を用い、コンジュゲート６Ｃを用いて作成した較正曲線である。
図２は、実施例２９に記載されたように低値セット血清較正物を用い、コンジュゲート６Ｃを用いて作成した較正曲線である。
図３は、実施例２９に記載されたように高値セット血清較正物を用い、コンジュゲート１３Ｃを用いて作成した較正曲線である。
図４は、実施例２９に記載されたように低値セット血清較正物を用い、コンジュゲート１３Ｃを用いて作成した較正曲線である。
図５は、実施例１〜６に記載されたようにインジナビルのインダン環ヒドロキシル基から活性化インジナビルハプテン１２を合成する手順を図解する。
図６は、それぞれ実施例７、８、および２６に記載されたように活性化ハプテン１２のＢＳＡ、ＫＬＨ、およびアミノデキストラン誘導体を合成する手順を図解する。
図７は、実施例９〜１１に記載されたようにインジナビルのピリジン環窒素から活性化インジナビルハプテン５を合成する手順、ならびに、それぞれ実施例１２、１３、および２７に記載されたようにＫＬＨ、ＢＳＡ、およびアミノデキストラン誘導体を合成する手順を図解する。
図８は、実施例１４に記載されたように水素ガスおよびパラジウム触媒の存在下でインジナビルから単一ステップでインジナビル代謝物Ｍ６（２）を合成する手順を図解する。
図９は、実施例１５および１６に記載されたようにＭ６のピペラジン窒素から置換芳香族連結基を有するインジナビル誘導体を合成する手順を図解する。
図１０は、実施例１７および１８に記載されたようにＭ６のピペラジン窒素から脂肪族連結基を有するインジナビル誘導体を合成する手順を図解する。
図１１は、実施例１９〜２１に記載されたようにＭ６のピペラジン窒素からピリジル連結基を有するインジナビル誘導体を合成する手順を図解する。
図１２は、実施例２２〜２４に記載されたようにＭ６のピペラジン窒素からピリジル連結基を有するインジナビル誘導体を合成する手順を図解する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
発明の詳細な説明
本発明がより容易に理解されるために、下記の例には参考文献が与えられ、それは本発明を説明することを目的とするが、その範囲を限定するものではない。
【００２３】
「好ましくは」、「通常」、および「一般的に」のような用語は、本明細書において、特許を受けようとする発明の範囲を限定するために、あるいは、特定の特徴が特許を受けようとする発明の構造もしくは機能にとって重大、必須、またはさらに重要であるとを示すために使用されないことに注意する。むしろ、これらの用語は単に、本発明の特定の実施形態において使用されてもされなくてもよい代替的または付加的な特徴を強調することを目的とする。
【００２４】
本発明の記載および定義のために、「実質的に」という用語は、本明細書において、任意の量的比較、値、測定または他の表現に起因しうる内在的な不確実性の程度を表すために使用されることに注意する。「実質的に」という用語はまた、本明細書において、問題となっている対象の基本的な機能に結果として変化がなく、記載された参照とは定量的表現が異なる場合のその程度を表すために使用される。
【００２５】
詳細においておよびその特定の実施形態への参照によって本発明を記載したように、添付の特許請求の範囲において定義される本発明の範囲から逸脱することなく、改良および変形形態が可能であることは明白である。より具体的には、本発明のいくつかの態様は本明細書において好ましいかまたは特に有利であるとされるが、本発明は必ずしもこれらの本発明の好ましい態様に限定されないと考えられる。
【００２６】
本明細書を通して、下線付きの数字は図面で説明される化学構造を指すために使用される。
【００２７】
本明細書において用いられる場合、アナライトとは、その存在もしくは量を測定するべき物質または物質群を指す。
【００２８】
抗体はアナライトの特異的な結合パートナーを意味し、他の関係のない物質の本質的な排除のためにアナライトに対して特異的な結合親和性を有する任意の物質または物質群である。その用語は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体および抗体フラグメントを含む。
【００２９】
ハプテンは部分抗原または不完全抗原である。それらはタンパク質を含まない物質、多くは低分子量物質であり、それは抗体産生を活性化できないが、抗体に反応する。抗体は、ハプテンを高分子量の担体にカップリングさせ、このカップリング生成物をヒトまたは動物に注射することによって作製される。ハプテンの例としては、ジゴキシンおよびテオフィリンなどの治療薬、サキナビルおよびインジナビルなどのプロテアーゼ阻害剤、モルヒネおよびＬＳＤなどの乱用性薬物、ゲンタマイシンおよびバンコマイシンなどの抗生物質、エストロゲンおよびプロゲステロンなどのホルモン、ビタミンＢ１２および葉酸などのビタミン、チロキシン、ヒスタミン、セロトニン、アドレナリンなどが挙げられる。
【００３０】
活性化ハプテンとは、誘導体コンジュゲートの合成のために、活性基の付加または供与などによって反応のために利用可能な部位が与えられたハプテン誘導体を指す。
【００３１】
リンカーという用語は、ハプテンを担体、免疫原、標識、トレーサーまたは別のリンカーに連結する化学的部分を指す。リンカーは、直鎖または分岐鎖の、飽和または不飽和の炭素鎖でありうる。それらはまた、その鎖の中、または鎖の末端に１つ以上のヘテロ原子を含みうる。ヘテロ原子とは、酸素、窒素および硫黄からなる群より選択される炭素以外の原子を意味する。リンカーの使用は、特定のハプテンと担体のペアに応じて、有利または必要であるかもしれず、そうでないかもしれない。
【００３２】
担体は、その用語が本明細書において用いられる場合、ハプテンと結合でき、それによってハプテンが免疫反応を活性化できるようにする免疫原性物質であり、通常はタンパク質である。担体物質は、異物として認識され、それによって宿主から免疫反応を誘導するタンパク質、糖タンパク質、複合多糖および核酸を含む。
【００３３】
本明細書において用いられる場合、免疫原および免疫原性という用語は、生物に免疫反応を引き起こすかまたは生じさせることができる物質を指す。
【００３４】
コンジュゲートおよび誘導体という用語は、もととなる化合物または分子から１以上の化学反応によって生成される化合物または分子を指す。
【００３５】
本明細書において用いられる場合、検出分子、標識またはトレーサーは、担体物質または分子に結合された際、アナライトを検出するために使用され得る識別タグである。標識はその担体物質に直接、または連結部分もしくは架橋部分によって間接的に結合されうる。標識の例としては、β−ガラクトシダーゼおよびペルオキシダーゼなどの酵素、ローダミンおよびフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）などの蛍光化合物、ジオキセタンおよびルシフェリンなどの発光化合物、ならびに１２５Ｉなどの放射性同位体を含む。
【００３６】
活性エステルという用語は、本発明の意味では、求核試薬を含む物質の他の反応基との妨害副反応が有効に起こり得ない条件下において、限定はされないが、ペプチド、ポリアミノ酸、多糖または標識の遊離アミノ基のような求核試薬と反応し得る活性化エステル基を含む。
【００３７】
下記の構造は、本明細書において言及される誘導体化のための様々な位置を図解し、
【化１３】
式中、ＸはＣＨ２またはＮである。
【００３８】
インジナビル分子の中央のヒドロキシル基から合成されるインジナビル誘導体およびコンジュゲートは、ＷＯ ０３／００６５０６に記載されている。
【００３９】
本発明の１つの実施形態は、インジナビルのピリジン窒素で連結されているインジナビルハプテン構造に関する。
【００４０】
反応条件の調節は、別の部位からの１つの反応部位の選択を可能にする。このアプローチの例は、第３級アミン、好ましくはトリエチルアミンの存在下での硫酸インジナビルのアルキル化反応を含む。このようなアルキル化反応は、図７に示されるようなインジナビルピリジン窒素を選択的に官能化し、
【化１４】
式中、Ｌは飽和もしくは不飽和の直鎖または分岐鎖として配列する０〜４０個の炭素原子を含み、最大２個の環状構造と０〜２０個のヘテロ原子を含有する連結基であるが、３個以上のヘテロ原子が連続して結合していてはならない。Ａは、活性エステル、イソシアネート、イソチオシアネート、チオール、イミドエステル、無水物、マレイミド、およびチオラクトンからなる群より選択される活性型官能基である。
【００４１】
アルキル化試薬は好ましくは、保護されたカルボン酸またはフタルイミド基として保護されたアミノ基のような適切に保護された官能基を有するハロアルキル化剤である。保護されたカルボキシル基は好ましくは、インジナビルに結合した後、例えば、図７の化合物４のように酸性または塩基性条件下で除去されるエステルである。遊離カルボン酸基は活性化され、その後のポリペプチド、多糖、および標識基へのコンジュゲート化のために活性エステルを生じる。遊離アミノ基はまた、脱保護後、活性カルボン酸基を有する二官能性リンカーを用いて伸長されるか、またはそれは尿素結合もしくは同様の基を用いてポリペプチドとカップリングされる場合がある。
【００４２】
リンカー伸長はまた、マレイミドアルカン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルのようなヘテロ二官能性試薬を用いて達成することができ、その後のポリペプチドおよび標識のチオール基へのコンジュゲーションのために末端マレイミド基を生じる。
【００４３】
別法として、アミノ末端リンカーは、一方の末端にアミド結合を形成し、他方の末端に遊離であるかまたは保護されたチオールを形成するように反応するヘテロ二官能性チオール化剤によって伸長され得る。当技術分野においてよく知られているこの種のチオール化試薬のいくつかの例は、２−イミノチオラン（２−ＩＴ）、スクシンイミジルアセチルチオプロピオネート（ＳＡＴＰ）およびスクシンイミド２−ピリジルジチオプロピオネート（ＳＰＤＰ）である。脱保護後、初めの（incipient）チオール基は次に、マレイミドまたはブロモアセチル化修飾された免疫原もしくは標識とチオールエーテルを形成するために使用可能である。
【００４４】
本発明の活性エステルは、比較的低い温度で様々な水性および非水性溶媒混合物中において、求核試薬、特に第１級アミンに反応性である。活性エステルが第１級または第２級アミンとカップリングしてアミドを生じるための典型的な条件は、室温で添加される水の存在下もしくは非存在下での、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）またはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）などの双極性非プロトン性溶媒中での反応である。
【００４５】
バッファーまたは第３級アミンは、第１級アミン反応剤を脱プロトン化状態に保つために必要な塩基性のｐＨを維持するために、しばしば添加される。一般的な活性エステルは、ｐ−ニトロフェニルエステル、Ｎ−ヒドロキシスルホコハク酸イミド（hydroxysulfosuccimidyl）エステル、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド（hydroxysuccimidyl）エステル、１−ヒドロキシベンゾトリアゾリルエステルおよびペンタフルオロフェニルエステルである。好ましい活性エステルは、それらの安定性、反応性および副産物Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドの除去の容易さのバランスから、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルである。他の活性エステルは当業者によく知られており、同様に使用されうる。
【００４６】
あるいは、活性基としてエステル；またはイミニウム基を有するリンカーによるインジナビル誘導体は、例えば、適切な前駆体基、例えば末端ニトリル基を有するリンカーを用いることによって得ることができる。例としては、末端ニトリル基を有するインジナビル誘導体を上述のものと同様の方法で合成し、続いてニトリルのイミダート部分（当技術分野において既知の方法による、例えばアルコール中での塩化水素処理によるイミドイミダート基）への変換を行う。Hermanson、上掲；およびJerry March, Advanced Organic Chemistry,第三版、John Wiley & Sons, 1985も参照されたい。イミドエステルを得る他の方法は当業者に提案されるであろう。
【００４７】
本発明の別の実施形態は、インダンヒドロキシル基で連結されているインジナビル誘導体に関する。これらの活性化ハプテンは以下の構造を有し、
【化１５】
式中、ＹはＯ、ＳまたはＮＨであり、ｍは０または１であり、Ｌは飽和もしくは不飽和の直鎖または分岐鎖として配列する０〜４０個の炭素原子を含み、最大２個の環状構造と０〜２０個のヘテロ原子を含有する連結基であるが、３個以上のヘテロ原子が連続して結合していてはならない。Ａは、活性エステル、イソシアネート、イソチオシアネート、チオール、イミドエステル、無水物、マレイミド、チオラクトン、およびアルデヒドからなる群より選択される活性型官能基である。
【００４８】
インジナビルは２つの第２級ヒドロキシル基、インダンヒドロキシル基および中央のヒドロキシル基を含み、初めにインダン環のヒドロキシル基を保護することが必要である場合がある。選択的修飾は、イソプロピリジン（isopropylidine）環系を用いたインジナビルの隣接したアミド窒素に結合しているインダン環のヒドロキシル基の保護、それに続くインジナビルの中央のヒドロキシル基の保護を必要とする。多くの適切な保護基が当技術分野においてよく知られている。例えば、Protective Groups in Organic Synthesis,第２版、T. GreeneおよびP. Wuts, Wiley-Interscience, 1991を参照されたい。
【００４９】
中央のヒドロキシル基は、シリル保護基、例えば、ＴＢＤＭＳ（ｔ−ブチルジメチルシリル）基またはＴＢＤＰＳ（ｔ−ブチルジフェニルシリル）基として保護することができる。また、イソプロピリジン保護されたインジナビルの中央のヒドロキシ官能基を保護するために、エステル基、好ましくは、塩基、特にトリエチルアミンの存在下でのベンゾエート基も使用することができる。実施例２および図５の化合物８を参照されたい。アシル化反応による中央のヒドロキシル基の保護は、ＤＭＦなどの適切な溶媒、好ましくはＴＨＦ中において、一般的には０．５時間〜７日間行われる。イソプロピリジン基の脱保護後、インダンヒドロキシル基は修飾され、連結部位にウレタン結合を生じ得る。インダンヒドロキシルはまた、修飾されて連結部位にエーテル結合を生じ得るが、一方、インジナビルの中央のヒドロキシル基はシリル基として保護される。例えば、中央のヒドロキシル部位を保護するＴＢＤＭＳを有するインジナビル誘導体のイソプロピリジン基は、酸性条件下で脱保護することができ、遊離したインダンヒドロキシル基は、保護されたカルボン酸、またはフタルイミドとして保護されたアミノ基などの適切に保護された官能基を有するハロアルキル化剤を用いたアルキル化条件に置かれて、エーテル結合を形成しうる。カルボキシル基に保護基を持つかまたは持たないカルボキシアルキルイソシアネートは、インジナビルの標的ヒドロキシル基と直接反応し、保護されたカルボキシルウレタンまたはカルボキシアリールウレタンを生じうる。保護されたカルボキシル基は、好ましくは、塩基性または酸性条件下で除去されるエステルである。カルボキシル基はその後のコンジュゲート化のために活性エステルに変換されてもよく、またはポリペプチド、多糖、および標識に直接コンジュゲートされてもよい。あるいは、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルイソシアネートベンゾエートのような、事前に活性化されたカルボキシアルキルイソシアネートまたはカルボキシアリールイソシアネートはインジナビルヒドロキシル基と直接反応しうる。
【００５０】
別のカルボン酸活性化は無水物形成によるものである。一般的に、カルボン酸は、ＤＭＦもしくはＴＨＦなどの溶媒中、トリエチルアミンまたはＮ−メチルモルホリンなどの第３級アミンの存在下で、通常−３０℃〜＋３０℃、多くの場合は−２０℃〜０℃の温度で、クロロギ酸イソブチルのようなクロロギ酸アルキルと反応する。混合無水物はその後、標識、タンパク質またはペプチドのアミノ基と反応して、安定なアミドコンジュゲートを生じる。
【００５１】
カルボン酸と結合されたプロテアーゼ阻害剤の別の活性化方法は、カルボン酸基とホモシステインチオラクトンのような物質とのカップリングによる、チオラクトンのようなマスクされたチオール基への変換である（米国特許第５，３０２，７１５号）。その結果生じるリンカー−チオラクトンはその後、弱塩基によってマスクを外されて末端チオールを生じ、それはその後、マレイミド修飾もしくはハロアセチル修飾されたペプチド、多糖、ポリアミノ酸、および標識などのマレイミド基またはブロモアセチル基またはヨードアセチル基のような部分に反応性であり、チオ−マレイミドもしくはチオール−アセチル付加物を生じる。
【００５２】
本発明の別の実施形態は、インジナビルＭ６を生成する方法に関する。この単一ステップの還元は、水素化条件下で、例えば、１０％ Ｐｄ−Ｃ、５％ Ｐｄ−Ｃ、ギ酸アンモニウム／Ｐｄ−Ｃ、および２０％のＣ担持水酸化パラジウムなどの触媒を用いて、メタノール、エタノール、酢酸、またはＴＨＦなどの溶媒中、特にメタノール中、室温で１ａｔｍ〜６０ｐｓｉの圧力下で行うことができる。
【化１６】
【００５３】
その結果生じるインジナビルＭ６は、下記のような新しいインジナビルハプテン誘導体を調製するために使用することができる。
【００５４】
本発明の別の実施形態では、インジナビル誘導体は、下記の化学式によって表されるようにピリジン環またはベンゼン環で連結されており、
【化１７】
式中、ＹはＯ、ＳまたはＮＨであり、ｍは０または１であり、Ｌは飽和もしくは不飽和の直鎖または分岐鎖として配列する０〜４０個の炭素原子を含み、最大２個の環状構造と０〜２０個のヘテロ原子を含有する連結基であるが、３個以上のヘテロ原子が連続して結合していてはならない。Ａは、活性エステル、イソシアネート、イソチオシアネート、チオール、イミドエステル、無水物、およびマレイミドからなる群より選択される活性型官能基である。
【００５５】
適切に官能化され保護されたアルキルハロピリジン誘導体は、塩基性条件下でインジナビルＭ６とカップリングすることができる。インジナビルＭ６のピペラジン部分の環状第２級アミン基と適切に官能化され保護されたホルミルピペリジン誘導体とのカップリング反応はまた、還元的アミノ化条件下でも実施することができ、同一の生成物を生じる。
【００５６】
適切に保護されたアルキルハロベンゼン誘導体および芳香族アルデヒド誘導体もまた、同様にインジナビルＭ６とのカップリングに使用することができる（実施例２１および図１２を参照のこと）。脂肪族リンカーもまた、適切に官能化された脂肪族ハロアルキルリンカーを用いた塩基性条件下で、または適切に官能化された脂肪族アルデヒドもしくは市販のコハク酸を用いた還元的アミノ化条件下で、上記と同様の化学反応を用いてインジナビルＭ６のピペラジン部分に結合することができる。例えば、化合物１６（図１０）は、シアノホウ化水素ナトリウムの存在下でコハク酸セミアルデヒドを用いて調製することができる。
【００５７】
これらの活性化ハプテンは以下の構造を有し、
【化１８】
式中、ＹはＯ、ＳまたはＮＨであり、ｍは０または１であり、Ｌは飽和もしくは不飽和の直鎖または分岐鎖として配列する０〜４０個の炭素原子と、０〜２０個のヘテロ原子とを含む脂肪族連結基であるが、３個以上のヘテロ原子が連続して結合していてはならない。Ａは、活性エステル、イソシアネート、イソチオシアネート、チオール、イミドエステル、無水物、およびマレイミドからなる群より選択される活性型官能基である。
【００５８】
本発明の別の実施形態は、以下から選択される構造を有する免疫原に関連し、
【化１９】
【化２０】
【化２１】
【化２２】
式中、ＸはＮまたはＣであり、Ｌは飽和もしくは不飽和の直鎖または分岐鎖として配列する０〜４０個の炭素原子を含み、さらに最大２個の環状構造と０〜２０個のヘテロ原子を含有する連結基であるが、３個以上のヘテロ原子が連続して結合していてはならず、Ｚは、−ＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯ−、−ＮＨＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＳＮＨ−、−ＯＣＯＮＨ−、−ＮＨＯＣＯ−、−Ｓ−、−ＮＨ（Ｃ＝ＮＨ）−、−Ｎ＝Ｎ−、−ＮＨ−および
【化２３】
からなる群より選択される部分であり、Ｑは、ポリペプチド、多糖、合成ポリマー、および非同位体標識からなる群より選択され、かつｎはＱの分子量５０キロダルトンあたり１〜５０の数であるが、さらに構造ＶＩＩＩでは、Ｌは飽和もしくは不飽和の直鎖または分岐鎖として配列する０〜４０個の炭素原子を含み、さらに０〜２０個のヘテロ原子を含有する脂肪族連結基でなければならない。
【００５９】
免疫原性担体は一般的に、１０ｋＤより大きい分子量を有するポリペプチドまたは多糖である。好ましい担体物質の例としては、キーホールリンペット・ヘモシアニン（ＫＬＨ）、リムルスポリヘムス・ヘモシアニン（ＬＰＨ）、およびウシサイログロブリン（ＢＴＧ）が挙げられる。前述のような活性化ハプテン誘導体と担体上のアミノ基との間の反応は、通常、水およびＤＭＳＯなどの水混和性有機溶媒の緩衝混合物中、室温で０．５〜５日間行われる。バッファーのｐＨは通常、活性エステル、イソシアネート、およびイソチオシアネートに対しては６〜８、またはイミダートに対しては７〜１０であり、担体アミノ基および活性型官能基の既知の反応性に従って調整される。末端基Ａがマレイミドである場合、担体の反応基はチオールである。これらのチオール基は担体にもともと存在するか、または、２−ＩＴもしくはＳＡＴＰなどのチオール化試薬を用いて導入される。チオエーテルを生じるためのマレイミドのチオール基へのコンジュゲーションに最適なｐＨは、通常５〜７である。反応後、非コンジュゲート化ハプテンおよび有機溶媒を除去するために、免疫原は透析またはサイズ排除クロマトグラフィーにかけられる。
【００６０】
免疫原を得る別の方法は、活性基がアルデヒドである活性化ハプテンと担体タンパク質またはポリペプチドのアミノ基とのシッフ塩基を形成する反応と、それに続くシアノホウ化水素などの弱い還元剤を用いて安定なアミン結合を形成する還元による。この最後のアプローチにおける変形形態もまた、本発明が属する技術分野の当業者に提案されるであろう。
【００６１】
抗体を作製するために、免疫原は、凍結乾燥された免疫原を再水和して免疫原の溶液または懸濁液を調製することによって、宿主動物への注射のために調製することができる。あるいは、免疫原は事前に調製された溶液またはバッファー中の懸濁液として使用してもよい。免疫原溶液はその後、フロイントアジュバントなどのアジュバントと混合され、免疫原混合物を形成する。免疫原は様々な部位に、数回の投与で、１回以上、数週間にわたって投与する場合がある。
【００６２】
本発明の免疫原を用いたポリクローナル抗体の調製は、当業者にとって既知の任意の従来技術に従って行うことができる。通常、ウサギ、ヤギ、マウス、モルモット、またはウマなどの宿主動物に免疫原混合物を注射する。抗体力価について血清を評価しながら、最適な力価に達したことが決定されるまで、更なる注射を行う。その後、宿主動物から採血し、適切な量の特異抗血清を得る。必要であれば、抗血清がアッセイを行う上での使用に適しているか検討する前に、非特異的抗体のような不要物を除去するために精製ステップを行う。
【００６３】
モノクローナル抗体は、上述のように免疫されたマウス由来のマウスリンパ球と骨髄腫細胞とを、Methods in Enzymology 73 (Part B), pp. 3-46, 1981に記載される方法のようなポリエチレングリコール法を用いて融合させることによって得ることができる。
【００６４】
ＥＬＩＳＡアッセイの場合、マイクロタイタープレートのコーティングのためにはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）にカップリングされたインジナビル誘導体が好ましい。
【００６５】
インジナビルと非同位体標識とのコンジュゲートの合成のためには、免疫原の調製と同様の方法が用いられる。
【００６６】
あるいは、活性化ハプテンは、ＥＬＩＳＡ用の標識を調製するために酵素のアミノ基またはチオール基にコンジュゲートすることができる。コンジュゲートが当技術分野においてよく知られているＥＬＩＳＡのために有用な酵素のいくつかの例は、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼおよびβ−ガラクトシダーゼである。酵素をはじめとするタンパク質のコンジュゲートは、通常、水および水混和性有機溶媒の緩衝混合物中で調製され、続いて免疫原の調製のための条件と同様に透析される。ラテックス凝集アッセイの場合、１０ｋＤ〜３００ｋＤの分子量、好ましくは４０ｋＤの分子量を有するアミノ化デキストラン担体とのコンジュゲートが特に有用である。これらのコンジュゲートは上記のような緩衝溶媒混合物中で、または反応を促進するためにトリエチルアミンのような第３級アミンを含有するＤＭＳＯなどの無水有機溶媒中で調製される。低分子量、すなわち１ｋＤより小さい標識の場合、反応条件は標識の性質に従って調整される。特に好ましい１つの標識は、標識化されたアビジンまたはストレプトアビジンと併用するビオチンである。非同位体検出のための（ストレプト）アビジン／ビオチンシステムの汎用性は、バイオコンジュゲート化学の技術分野においてよく知られている（Hermanson、上掲参照）。高親和性相互作用でビオチン標識物質を検出する、様々なアビジンおよびストレプトアビジンの酵素標識および蛍光団標識コンジュゲートが市販されている。さらに、活性型官能基Ａと反応する、様々なビオチン化剤が市販されている。例えば、ビオチン−アミン誘導体は、Ａが活性エステル、イソシアネートまたはイソチオシアネートである本発明の活性化ハプテンと反応して、それぞれ、ビオチンアミド、尿素およびチオ尿素コンジュゲートを生じうる。これらのカップリング反応は一般的に、トリエチルアミンのような有機塩基を含有するＤＭＦまたはＤＭＳＯなどの双極性非プロトン性溶媒中で、室温で０．５〜５日間行われる。ビオチンコンジュゲートは、逆相ＨＰＬＣなどのクロマトグラフ法によって選択的に単離される。
【００６７】
他の好ましい標識は、フルオレセイン、ローダミン、テキサスレッド、ダンシル、およびシアニン色素、例えばＣｙ−５などの蛍光団であり、その多くの活性化誘導体が市販されている。通常、これらのコンジュゲートは、ビオチンコンジュゲートと同様に第３級アミンを含有する双極性非プロトン性溶媒中で調製され、その後クロマトグラフ単離される。
【００６８】
検出系に間接的にカップリングされる標識としてリポーター基を使用することも可能である。１つの例は、上述のようなビオチンである。別の例は、２００１年１月４日に公開されたＰＣＴ公開ＷＯ２００１０１１３５に記載されるようなイノシン一リン酸デヒドロゲナーゼの阻害のためのミコフェノール酸誘導体である。
【００６９】
ＨＩＶプロテアーゼ阻害剤活性化ハプテン上の活性基Ａとの反応のために、標識上に適切な求核基、例えばアミンまたはチオールを適切に導入した後、本発明に使用することができる、ルテニウムビピリジル誘導体のような電気化学発光標識、アクリジニウムエステルのような化学発光標識、電気化学メディエーター、ならびに様々な微粒子およびナノ粒子を含む他の非同位体標識の可能性があることは、当業者にとって明白であろう。
【００７０】
以下の実施例において、下線付きの数字は図面に示された対応する構造を指す。これらの実施例は説明のためにのみ提示され、本発明の限定を意図するものではない。
【実施例】
【００７１】
すべての溶媒は、特に指定のない限りJ.T. Bakerから入手した。分析用逆相ＲＰ−ＨＰＬＣ解析は、ダイオードアレイ検出器およびクォータナリポンプを組み込んだAgilent HP1100 ＬＣ／ＭＳシステムで行った。ＬＣ／ＭＳ解析は、AJO-4287 (C-180DS) カートリッジとともにPhenomenex KJO-4282ガードキットを装備したVydac 218TP54カラム（300A, 5μ; C18, ４．６ｍｍ×２５０ｍｍ）によって行った。クロマトグラフの流れはカラム後にＭＳ検出器に誘導した。使用したＭＳＤはエレクトロスプレーポジティブモード「ＥＳ（＋）モード」で作動させた。
【００７２】
ＨＰＬＣ画分の凍結乾燥には、特に指定のない限り、減圧下でのアセトニトリルの蒸発、それに続く、例えばドライアイス／アセトン浴を用いた水性残留物の凍結、それに続く、凍結乾燥機を用いた凍結乾燥を含めた。
【００７３】
調製用ＨＰＬＣには下記のVarian DYNAMAX（Rainin）半径方向圧縮カラムの１つを用いた。ＨＰＬＣ作業は、０．１％トリフルオロ酢酸を含有する水−アセトニトリルの勾配系を用いて行った。
Varian DYNAMAX（Rainin）ガードモジュールR00083221G（C-18, 8μ）を伴うR00083221C (Microsorb 60-8, C-18; ２５０ｍｍ×２１．４ｍｍ)。
Varian DYNAMAX（Rainin）ガードモジュールR00083241G（C-18, 8μ）を伴うR00083241C (Microsorb 60-8, C-18; ２５０ｍｍ×４１．４ｍｍ)。
【００７４】
実施例１
Ｎ−（１（Ｓ），２（Ｒ）−２，２−ジメチルインダニルオキサゾール）−２（Ｒ）−（フェニルメチル）−４（Ｓ）−ヒドロキシ−５−［１−［４−（３−ピリジルメチル）−２（Ｓ）−（Ｎ−ｔ−ブチルカルバモイル）ピペラジニル］］ペンタンアミド（７）
フラスコにマグネチックスターラーバー、還流冷却器およびアルゴンガス吸気口を取り付けた隔壁を装着させた。反応フラスコに１ｇ（１．４ｍｍｏｌ）の硫酸インジナビル（１）、３３ｍＬ（２８．７ｍｍｏｌ）の酢酸イソプロピル、１０ｍＬの無水ＤＭＦ、２．０ｍＬ（５２．５ｍｍｏｌ）の２−メトキシプロペンを入れ、続いて１．８ｇｍ（１５．５ｍｍｏｌ）のピリジニウムｐ−トルエンスルホン酸を室温ですべて一度に加えた。その後、反応物を撹拌し、４０℃で１．５時間加熱した。反応進行をＬＣ／ＭＳによってモニタリングし、それは反応の完了を示唆した。その後、反応混合物を室温に冷却し、１．０ｇｍ水酸化リチウム一水和物を加え、反応混合物を約５分間撹拌しておいた。溶媒を減圧下でロータリーエバポレーターで除去した。その結果生じた物質をその後、水に再溶解し、酢酸エチルで抽出した。有機相を集めて無水ＭｇＳＯ４で乾燥させてろ過し、溶媒をロータリーエバポレーターで除去した。その後、粗製油をシリカゲルカラムで精製し、２０：１ ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨで溶出した。生成物を含有するＲｆ ０．４３の画分を回収し、溶媒をロータリーエバポレーターで除去し、真空下で乾燥させて、８６％（０．７２ｇｍ）の収量、MS (m/z) 654.4 (M+H)のオフホワイトの粉末として生成物を得た。図５を参照されたい。
【００７５】
実施例２
Ｎ−（１（Ｓ），２（Ｒ）−２，２−ジメチルインダニルオキサゾール）−２（Ｒ）−（フェニルメチル）−４（Ｓ）−ベンゾイル−５−［１−［４−（３−ピリジルメチル）−２（Ｓ）−（Ｎ−ｔ−ブチルカルバモイル）ピペラジニル］］ペンタンアミド（８）
フラスコにマグネチックスターラーバーおよびアルゴンガス吸気口を取り付けた隔壁を装着させた。フラスコに０．６７ｇ（０．４４ｍｍｏｌ）の７、１０ｍＬの無水ＤＭＦ、７３８μＬ（５．３ｍｍｏｌ）のＥｔ３Ｎを入れた。混合物を６５℃まで加熱し、その温度で５ｍＬの無水ＤＭＦに溶解した１．０ｇｍ（４．４ｍｍｏｌ）の安息香酸無水物を滴下した。その後、反応混合物を８０℃で３日間加熱し、反応進行をＬＣ／ＭＳによってモニタリングした。反応混合物を室温に冷却し、溶媒を減圧下で除去した。その後粗製油を、０．１％トリフルオロ酢酸を含有するアセトニトリル−水の溶媒系を用いて行われる勾配を用いた調製用ＨＰＬＣによって精製した。生成物を含有する画分を回収し凍結乾燥して、８９％の収量、MS (EI): 758.4 (M+H)の０．３０ｇｍの目的とする生成物を得た。図５を参照されたい。
【００７６】
実施例３
Ｎ−（２Ｒ−ヒドロキシ−１（Ｓ）−インダニル）−２Ｒ−（フェニルメチル）−４（Ｓ）−ベンゾイル−５−［１−［４−（３−ピリジルメチル）−２（Ｓ）−（Ｎ−ｔ−ブチルカルバモイル）ピペラジニル］］ペンタンアミド（９）
フラスコにマグネチックスターラーバーおよびアルゴンガス吸気口を取り付けた隔壁を装着させた。フラスコに保護されたインジナビル誘導体８を入れ、続いて１０ｍＬのトリフルオロ酢酸：ジクロロメタンの１：１混合物を加えた。反応物を室温で２時間撹拌した。粗製物のＬＣ／ＭＳは反応が完了したことを示した。その後、溶媒を高真空ロータリーエバポレーターで除去し、粗製物を０．１％トリフルオロ酢酸を含有するアセトニトリル−水の溶媒系を用いて行われる勾配を用いた調製用ＨＰＬＣで精製した。生成物を含有する画分を回収し凍結乾燥して、７７％（０．２２ｇｍ）の目的とする生成物９を得た。MS (EI): 741.3 [(M+H)+Na], 718.3 (M+H), 586.3, 359.7, 298.7, 133.1, HRMS: C43H51N5O5の算出値: 718.3963; 検出値: 718.3967, [α]20D = -28.42°(C = 1.034, CH2Cl2)。図５を参照されたい。
【００７７】
実施例４
Ｎ−（２（Ｒ）−（４−ホルミルアミノ酪酸エチルエステル）−１（Ｓ）−インダニル）−２（Ｒ）−（フェニルメチル）−４（Ｓ）−ベンゾイル−５−［１−［４−（３−ピリジルメチル）−２（Ｓ）−（Ｎ−ｔ−ブチルカルバモイル）ピペラジニル］］ペンタンアミド（１０）
フラスコにマグネチックスターラーバーおよびアルゴンガス吸気口を取り付けた隔壁を装着させた。フラスコに２２０ｍｇ（０．３ｍｍｏｌ）のインジナビル誘導体９および無水ＴＨＦ中の１．２ｍＬ（９．２ｍｍｏｌ）のＥｔ３Ｎを入れた。反応混合物に０．９０ｍＬ（１１．５ｍｍｏｌ）のエチル−４−イソシアネートブチレートを加え、反応物をその後８０℃で２日間加熱した。ＬＣ／ＭＳは生成物形成を示した。反応物を室温に冷却し、溶媒をロータリーエバポレーターで除去し、残留物を０．１％トリフルオロ酢酸を含有するアセトニトリル−水の溶媒系を用いて行われる勾配を用いることによって調製用ＨＰＬＣで精製した。生成物を含有する画分を集めて凍結乾燥し、８７％（２３５ｍｇ）の生成物を得た。MS (EI): 875.4 (M+H), 438.3, 359.7, 158.1。図５を参照されたい。
【００７８】
実施例５
Ｎ−（２（Ｒ）−（４−ホルミルアミノ酪酸）−１（Ｓ）−インダニル）−２（Ｒ）−（フェニルメチル）−４（Ｓ）−ヒドロキシ−５−［１−［４−（３−ピリジルメチル）−２（Ｓ）−（Ｎ−ｔ−ブチルカルバモイル）ピペラジニル］］ペンタンアミド（１１）
２３５ｍｇ（０．２６８ｍｍｏｌ）の１０を入れたフラスコに１０ｍＬのメタノールおよび１０ｍＬの１Ｎ ＮａＯＨ水溶液を加えた。反応物を室温で１日間撹拌した。反応進行をＬＣ／ＭＳによってモニタリングし、それは生成物形成の完了を示唆した。反応物を減圧下で濃縮し、残留物を０．１％トリフルオロ酢酸を含有するアセトニトリル−水の溶媒系を用いて行われる勾配を用いることによって調製用ＨＰＬＣで精製した。生成物を含有する画分を集めて凍結乾燥し、９６％（１９０ｍｇ）の生成物１１を得た。MS (EI): 766.3 (M+Na), 743.3 (M+H), 372.1, 307.7, 60.1。図５を参照されたい。
【００７９】
実施例６
Ｎ−（２（Ｒ）−［（４−ホルミルアミノ酪酸−Ｎ−スクシンイミジルエステル）］−１（Ｓ）−インダニル）−２（Ｒ）−（フェニルメチル）−４（Ｓ）−ヒドロキシ−５−［１−［４−（３−ピリジルメチル）−２（Ｓ）−（Ｎ−ｔ−ブチルカルバモイル）ピペラジニル］］ペンタンアミド（１２）
５０ｍＬの丸底フラスコにマグネチックスターラーバーおよびアルゴンガス吸気口を備えた隔壁を装着させた。フラスコに１９０ｍｇ（０．２５ｍｍｏｌ）の１１、５ｍＬの無水ＴＨＦ、０．１３３ｍＬ（０．７４ｍｍｏｌ）の無水ジイソプロピルエチルアミンおよび２０７ｍｇ（０．６９ｍｍｏｌ）の［Ｏ−（Ｎ−スクシンイミジル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウム］テトラフルオロボレートを０℃で加えた。反応混合物を室温まで温めておき、その温度で２４時間撹拌し、減圧下で濃縮した。残留物を０．１％トリフルオロ酢酸を含有する水−アセトニトリルの勾配系を用いることによって調製用ＨＰＬＣで精製した。含有している画分を集めて凍結乾燥し、白色の固体として５７ｍｇ（２７％）の生成物１２を得た。MS (m/z): 840.4 (M+H), 725.4, 482.3, 420.7, 298.7, 130.2。図５を参照されたい。
【００８０】
実施例７
インダン環からのインジナビル−ＢＳＡコンジュゲート（１３Ａ）
５．８ｍＬの５０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．５）中０．３４ｇのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）溶液を氷浴で冷却した。溶液に８．５ｍＬのＤＭＳＯを滴下し、反応混合物を室温未満に維持した。タンパク質溶液に、１．５ｍＬの無水ＤＭＦ中１５ｍｇ（０．０１７ｍｍｏｌ）のインジナビル誘導体（１２）溶液を滴下した。反応混合物を室温で２４時間撹拌しておいた。その結果生じたコンジュゲートを透析チューブ（１０，０００ＭＷカットオフ）に入れ、室温で１Ｌの７０％ＤＭＳＯ、５０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．５、３回、少なくとも各３時間）、１Ｌの５０％ＤＭＳＯ、５０ｍＭリン酸カリウム（少なくとも３時間）、１Ｌの３０％ＤＭＳＯ、５０ｍＭリン酸カリウム（少なくとも３時間）、１Ｌの１０％ＤＭＳＯ、５０ｍＭリン酸カリウム（少なくとも３時間）で透析し、続いて、４℃で５０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．５）を用いて６回（各１Ｌ、少なくとも各６時間）の透析を行った。Ｂｉｏｒａｄクマシーブルータンパク質アッセイ（Bradford, M., Anal. Biochem. 72, 248, 1976）を用い、タンパク質濃度は１４ｍｇ／ｍＬであると測定された。合計２１．５ｍＬのコンジュゲートが得られた。図６を参照されたい。
【００８１】
実施例８
インダン環からのインジナビル−ＫＬＨコンジュゲート（１３Ｂ）
２ｍＬの５０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．５）中７２ｍｇのキーホールリンペット・ヘモシアニン（ＫＬＨ）溶液を氷浴で冷却した。反応混合物の溶液に４．７ｍＬのＤＭＳＯを滴下し、反応温度を室温以下に維持した。その後、６７０μＬのＤＭＦ中１６．７ｍｇ（０．０１８ｍｍｏｌ）の５の溶液をタンパク質溶液に滴下した。その混合物を室温で１８時間撹拌しておいた。その結果生じたコンジュゲートを透析チューブ（１０，０００ＭＷカットオフ）に入れ、室温で１Ｌの７０％ＤＭＳＯ、５０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．５、３回、少なくとも各３時間）、１Ｌの５０％ＤＭＳＯ、５０ｍＭリン酸カリウム（少なくとも３時間）、１Ｌの３０％ＤＭＳＯ、５０ｍＭリン酸カリウム（少なくとも３時間）、１Ｌの１０％ＤＭＳＯ、５０ｍＭリン酸カリウム（少なくとも３時間）で透析した。Ｂｉｏｒａｄクマシーブルータンパク質アッセイを用い、タンパク質濃度は１１ｍｇ／ｍＬであると測定された。ＴＮＢＳ法（Habeeb AFSA, Anal. Biochem. 14, 328-34, 1988）によって、利用可能なリジン修飾の程度は４６％であると測定された。図６を参照されたい。
【００８２】
実施例９
Ｎ−（２（Ｒ）−ヒドロキシ−１（Ｓ）−インダニル）−２（Ｒ）−（フェニルメチル）−４（Ｓ）−ヒドロキシ−５−［１−［４−（３−｛１−（３−ｔ−ブトキシカルボニル−プロピル）｝ピリジルメチル）−２（Ｓ）−（Ｎ−ｔ−ブチルカルバモイル）ピペラジニル］］ペンタンアミドトリフルオロ酢酸塩（３）
マグネチックスターラーバー、アルゴンガス吸気口を取り付けた隔壁を備えたフラスコに、０．２ｇｍ（０．２８ｍｍｏｌ）の硫酸インジナビル、５ｍＬの無水ＤＭＦを加え、続いて７２μＬ（０．５６ｍｍｏｌ）のＥｔ３Ｎを加えた。この撹拌溶液に、シリンジによって０．４３ｇｍ（１．９６ｍｍｏｌ）のｔ−ブチル−４−ブロモブチレートを加えた。その後、フラスコの内容物を８０℃で１６時間加熱した。粗製物のＬＣ／ＭＳは生成物形成を示し、反応混合物を室温に冷却して溶媒をロータリーエバポレーターで除去した。その後、残留物を０．１％トリフルオロ酢酸を含有する水−アセトニトリルの勾配系を用いることによって調製用ＨＰＬＣで精製した。生成物を含有する画分を集めて凍結乾燥し、７１％（０．１７４ｇｍ）のモノアルキル化生成物を得た。この時点では、アルキル化が起こりうる多数の部位が存在するため、生成物の構造は不明であった。
【００８３】
幸運な偶然にも、その求電子試薬のアルキル化はピリジン環の窒素で起こり、対応するピリジニウムカチオンを生じた。その構造は１Ｈ ＮＭＲおよびＮＯＥ実験を用いて解明された。ピリジニウム窒素に隣接したメチレンプロトンは、４．７０ｐｐｍで三重項として示される。これらのメチレンプロトン（４．７０ｐｐｍ）は、放射線照射された場合、ピリジル窒素原子に隣接した２つのＨαメチンプロトンにおいて、アルキル化されたピリジン環の特徴的な指標となる８．９ｐｐｍおよび９．０２ｐｐｍでのＮＯＥ効果を示し、従って、生成物３の構造が確認された。MS (EI): 756.4 (M+H), 378.7, 330.2, 133.1, HRMS: C44H62N5O6の算出値: 756.4695, 検出値: 756.4693。図７を参照されたい。
【００８４】
実施例１０
Ｎ−（２（Ｒ）−ヒドロキシ−１（Ｓ）−インダニル）−２（Ｒ）−（フェニルメチル）−４（Ｓ）−ヒドロキシ−５−［１−［４−（３−｛１−（３−酪酸）｝ピリジルメチル）−２（Ｓ）−（Ｎ−ｔ−三ブチルカルバモイル）ピペラジニル］］ペンタンアミドトリフルオロアセテート（４）
０．１６５ｇｍ（０．１９ｍｍｏｌ）の３に１０ｍＬの１：１トリフルオロ酢酸：ジクロロメタンを加えた。反応物を室温で３０分間撹拌した。粗反応混合物のＬＣ／ＭＳは生成物のピークのみを示した。反応混合物をロータリーエバポレーターで濃縮した。その後、残留物を０．１％トリフルオロ酢酸を含有する水−アセトニトリルの勾配系を用いることによって調製用ＨＰＬＣで精製した。生成物を含有する画分を集めて凍結乾燥し、３８％（０．０５９ｇｍ）の生成物４を得た。MS (EI): 700.3 (M+H), 568.3, 551.3, 350.8, 341.7, 133.1., HRMS: C40H54N5O6の算出値: 700.4069, 検出値: 700.4075, [α]20D＝＋30.5°(C＝1.0, CH2Cl2)。図７を参照されたい。
【００８５】
実施例１１
Ｎ−（２（Ｒ）−ヒドロキシ−１（Ｓ）−インダニル）−２（Ｒ）−（フェニルメチル）−４（Ｓ）−ヒドロキシ−５−［１−［４−（３−｛１−（４−Ｎ−スクシンイミジルブチラート）｝ピリジルメチル）−２（Ｓ）−（Ｎ−ｔ−ブチルカルバモイル）ピペラジニル］］ペンタンアミドトリフルオロアセテート（５）
５０ｍＬの丸底フラスコ（事前に真空下でヒートガン乾燥した）に、マグネチックスターラーバー、アルゴンガス吸気口を取り付けた隔壁を装着させた。フラスコに、２０ｍｇ（０．０２４ｍｍｏｌ）の４、５ｍＬの無水ＴＨＦ、１２μＬのＥｔ３Ｎを入れ、続いて、１９．９ｍｇ（０．０６６ｍｍｏｌ）の［Ｏ−（Ｎ−スクシンイミジル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウム］テトラフルオロボレートをすべて一度に加えた。反応物を０℃で撹拌し、６時間かけて室温まで温めた。粗反応混合物のＬＣ／ＭＳは生成物形成を示し、反応混合物をロータリーエバポレーターで濃縮した。残留物を０．１％トリフルオロ酢酸を含有する水−アセトニトリルの勾配系を用いて調製用ＨＰＬＣで精製した。生成物を含有する画分を集めて凍結乾燥し、９４．１４％（２１．０ｍｇ）の生成物を得た。MS (EI): 797.3 (M+H), 648.3, 399.2, 324.7, HRMS: C44H57N6O8の算出値: 797.4233, 検出値: 797.4237., [α]D20＝＋44.06°(C＝1.0, CH2Cl2)。図７を参照されたい。
【００８６】
実施例１２
ピリジル環からのインジナビル−ＢＳＡコンジュゲート（６Ａ）
２．４ｍＬの５０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．５）中０．２３ｇのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）溶液を氷浴で冷却した。溶液に４．２５ｍＬのＤＭＳＯを滴下し、反応混合物を室温未満に維持した。タンパク質溶液に、１．５ｍＬの無水ＤＭＦ中１５ｍｇ（０．０１６ｍｍｏｌ）のインジナビル誘導体（５）溶液を滴下した。反応混合物を室温で２４時間撹拌しておいた。その結果生じたコンジュゲートを透析チューブ（１０，０００ＭＷカットオフ）に入れ、室温で１Ｌの７０％ＤＭＳＯ、５０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．５、３回、少なくとも各３時間）、１Ｌの５０％ＤＭＳＯ、５０ｍＭリン酸カリウム（少なくとも３時間）、１Ｌの３０％ＤＭＳＯ、５０ｍＭリン酸カリウム（少なくとも３時間）、１Ｌの１０％ＤＭＳＯ、５０ｍＭリン酸カリウム（少なくとも３時間）で透析し、続いて、４℃で５０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．５）を用いて６回（各１Ｌ、少なくとも各６時間）の透析を行った。Ｂｉｏｒａｄクマシーブルータンパク質アッセイを用い、タンパク質濃度は１２ｍｇ／ｍＬであると測定された。合計１８ｍＬのコンジュゲートが得られた。図７を参照されたい。
【００８７】
実施例１３
ピリジル環からのインジナビル−ＫＬＨコンジュゲート（６Ｂ）
１．５ｍＬの５０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．５）中５４ｍｇのキーホールリンペット・ヘモシアニン（ＫＬＨ）溶液を氷浴で冷却した。反応混合物に４．７ｍＬのＤＭＳＯを滴下し、反応温度を室温未満に維持した。その後、６７０μＬのＤＭＦ中１６．７ｍｇ（０．０１８ｍｍｏｌ）の５の溶液をタンパク質溶液に滴下した。その混合物を室温で１８時間撹拌しておいた。その結果生じたコンジュゲートを透析チューブ（１０，０００ＭＷカットオフ）に入れ、室温で１Ｌの７０％ＤＭＳＯ、５０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．５、３回、少なくとも各３時間）、１Ｌの５０％ＤＭＳＯ、５０ｍＭリン酸カリウム（少なくとも３時間）、１Ｌの３０％ＤＭＳＯ、５０ｍＭリン酸カリウム（少なくとも３時間）、１Ｌの１０％ＤＭＳＯ、５０ｍＭリン酸カリウム（少なくとも３時間）で透析した。Ｂｉｏｒａｄクマシーブルータンパク質アッセイを用い、タンパク質濃度は１１ｍｇ／ｍＬであると測定された。ＴＮＢＳ法によって、利用可能なリジン修飾の程度は４６％であると測定された。図７を参照されたい。
【００８８】
実施例１４
Ｍ６−インジナビル代謝物（２）
マグネチックスターラーバーを装着したフラスコに、０．３０ｇｍ（０．４２１４ｍｍｏｌ）の硫酸インジナビル（１）、３０ｍＬのメタノールを入れ、続いて、４０ｍｇの２０ｗｔ％Ｐｄ（ＯＨ）２／Ｃ触媒を加えた。反応容器中の空気を真空下で除去し、水素ガスを導入して１ａｔｍにした。その後、反応物を室温で１６時間撹拌した。その時、粗製物のＬＣ／ＭＳは反応の完了を示した。その後、それをＣＥＬＩＴＥのパッドでろ過し、溶媒をロータリーエバポレーターで除去し、真空下で乾燥させて９９％（０．２１８７ｇｍ）の生成物を得た。ＭＰ＝１４７℃、ＴＣＬ（シリカゲル）Ｒｆ＝０．３５（ＭｅＯＨ）、MS (EI): 523.3 (M+H), HRMS: C30H42N4O4の算出値: 523.3279, 検出値: 523.3282, [α]D20＝＋13.32°(C＝1.036, CH2Cl2)。図８を参照されたい。
【００８９】
実施例１５
Ｎ−（２（Ｒ）−ヒドロキシ−１（Ｓ）−インダニル）−２（Ｒ）−（フェニルメチル）−４（Ｓ）−ヒドロキシ−５−［１−［４−（４−安息香酸メチル）−２（Ｓ）−（Ｎ−ｔ−ブチルカルバモイル）ピペラジニル］］ペンタンアミド（１４）
マグネチックスターラーバーを装着した丸底フラスコに、無水ＣＨ２Ｃｌ２中７０ｍｇ（０．１３４６ｍｍｏｌ）のインジナビルＭ６（２）を入れ、続いて、２４ｍｇ（０．１６ｍｍｏｌ）の４−カルボキシベンズアルデヒドおよび１６．８ｍｇ（０．２６ｍｍｏｌ）のシアノホウ化水素ナトリウムを加えた。反応混合物を室温で１日間撹拌した。その後それを水によって停止させ、３×２０ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２で抽出した。有機相を集め、無水ＭｇＳＯ４で脱水してろ過し、溶媒をロータリーエバポレーターで除去した。その後、粗製混合物を１：１ヘキサン：酢酸エチルで溶出するシリカゲルカラムで精製し、８０％（７１ｍｇ）を得た。MS (m/z) = 657.3 (M+H)。図９を参照されたい。
【００９０】
実施例１６
４−｛３−ｔ−ブチルカルバモイル−４−［２−ヒドロキシ−４−（２−ヒドロキシ−インダン−１−イルカルバモイル）−５−フェニル−ペンチル］−ピペラジン−１−イルメチル｝−安息香酸２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イルエステル（１５）
５０ｍＬの丸底フラスコ（事前に真空下でヒートガン乾燥した）に、マグネチックスターラーバー、アルゴンガス吸気口を取り付けた隔壁を装着させる。フラスコに、２０ｍｇ（０．０３ｍｍｏｌ）の１４、５ｍＬの無水ＴＨＦ、１２μＬのＥｔ３Ｎを入れ、続いて、１９．９ｍｇ（０．０６ｍｍｏｌ）の［Ｏ−（Ｎ−スクシンイミジル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウム］テトラフルオロボレートをすべて一度に加える。反応物を０℃で撹拌し、室温まで温め、その温度で６時間撹拌しておく。反応混合物をロータリーエバポレーターで濃縮し、調製用ＨＰＬＣで精製して目的とする生成物を得る。図９を参照されたい。
【００９１】
実施例１７
Ｎ−（２（Ｒ）−ヒドロキシ−１（Ｓ）−インダニル）−２（Ｒ）−（フェニルメチル）−４（Ｓ）−ヒドロキシ−５−［１−［４−酪酸］］）−２（Ｓ）−（Ｎ−ｔ−ブチルカルバモイル）ピペラジニル］］ペンタンアミド（１６）
マグネチックスターラーバーと隔壁を装着したフラスコに、０．１ｇ（０．１９ｍｍｏｌ）のインジナビルＭ６（２）、１０ｍＬの無水ＣＨ２Ｃｌ２を入れ、続いて、０．０１２ｇ（０．１９ｍｍｏｌ）のシアノホウ化水素ナトリウムおよび０．０２５ｇ（０．２３ｍｍｏｌ）のコハク酸セミアルデヒド（水中で１５重量％）を加えた。反応物を室温で一晩撹拌した。その後、２０ｍＬの脱イオン水によって反応を停止させ、３Ｎ ＨＣｌによって酸性化し、３×２０ｍＬのジエチルエーテルで抽出した。有機相を集めて無水ＭｇＳＯ４で脱水し、ろ過して溶媒をロータリーエバポレーターで除去した。その後それを、０．１％トリフルオロ酢酸を含有する水−アセトニトリルの勾配系を用いて、調製用ＨＰＬＣで精製した。生成物を含有する画分を集めて凍結乾燥し、６８ｍｇ（４２％）の収量を得た。MS (m/z) = 609.3 (M+H), 477.3, 133.1。図１０を参照されたい。
【００９２】
実施例１８
４−｛３−ｔ−ブチルカルバモイル−４−［２−ヒドロキシ−４−（２−ヒドロキシ−インダン−１−イルカルバモイル）−５−フェニル−ペンチル］−ピペラジン−１−イル｝−酪酸２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イルエステル（１７）
５０ｍＬの乾燥させた丸底フラスコに、マグネチックスターラーバー、アルゴンガス吸気口を取り付けた隔壁を装着させる。フラスコに、０．０３２ｍｍｏｌ（２０ｍｇ）の１６、５ｍＬの無水ＴＨＦ、１２μＬのＥｔ３Ｎを入れ、続いて、０．０６ｍｍｏｌ（１９．９ｍｇ）の［Ｏ−（Ｎ−スクシンイミジル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウム］テトラフルオロボレートをすべて一度に加える。反応物を０℃で撹拌し、６時間かけて徐々に室温まで温める。反応混合物をロータリーエバポレーターで濃縮し、調製用ＨＰＬＣで精製して目的とする活性エステル１７を得る。図１０を参照されたい。
【００９３】
実施例１９
Ｎ−（２（Ｒ）−ヒドロキシ−１（Ｓ）−インダニル）−２（Ｒ）−（フェニルメチル）−４（Ｓ）−ヒドロキシ−５−［１−［４（２−メチルピコレートメチル）］］−２（Ｓ）−（Ｎ−ｔ−ブチルカルバモイル）ピペラジニル］］ペンタンアミド（１８）
マグネチックスターラーバーと隔壁を装着したフラスコに、５０ｍｇ（０．０９５ｍｍｏｌ）のインジナビルＭ６（２）、４ｍＬの無水ＤＭＦ、１５μＬの無水Ｅｔ３Ｎを入れ、続いて、０．０２４ｇ（０．１０ｍｍｏｌ）の２−ブロモメチルピリジン−６−カルボン酸メチルエステルを加えた。反応物を室温で３時間撹拌し、反応進行をＬＣ／ＭＳによってモニタリングした。その後、溶媒を高真空で除去し、物質を調製用ＨＰＬＣで精製した。生成物を含有する画分を集めて凍結乾燥し、２４．７ｍｇ（３８％）の生成物を得た。MS (m/z) = 694.3 (M+Na), 672.3 (M+H), 540.3, 336.7, 133.1。図１１を参照されたい。
【００９４】
実施例２０
６−｛３−ｔ−ブチルカルバモイル−４−［２−ヒドロキシ−４−（２−ヒドロキシ−インダン−１−イルカルバモイル）−５−フェニル−ペンチル］−ピペラジン−１−イルメチル｝−ピリジン−２−カルボン酸（１９）
２５ｍｇ（０．０３７ｍｍｏｌ）の１８を含むフラスコに、３ｍＬのメタノールおよび３ｍＬの１Ｎ ＮａＯＨ水溶液を加える。反応物を室温で１日間撹拌する。ＬＣ−ＭＳは生成物形成の完了を示す。反応混合物を減圧下で濃縮し、残留物を０．１％トリフルオロ酢酸を含有するアセトニトリル−水の溶媒系を用いて行われる勾配を用いた調製用ＨＰＬＣによって精製する。生成物を含有する画分を集めて凍結乾燥し、目的とする生成物１９を得る。図１１を参照されたい。
【００９５】
実施例２１
６−｛３−ｔ−ブチルカルバモイル−４−［２−ヒドロキシ−４−（２−ヒドロキシ−インダン−１−イルカルバモイル）−５−フェニル−ペンチル］−ピペラジン−１−イルメチル｝−ピリジン−２−カルボン酸２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イルエステル（２０）
乾燥させた５０ｍＬの丸底フラスコに、マグネチックスターラーバー、アルゴンガス吸気口を取り付けた隔壁を装着させる。フラスコに、２０ｍｇ（０．０３０ｍｍｏｌ）のインジナビル酸１９、５ｍＬの無水ＴＨＦ、１２μＬのＥｔ３Ｎを入れ、続いて、１９．９ｍｇ（０．０６ｍｍｏｌ）の［Ｏ−（Ｎ−スクシンイミジル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウム］テトラフルオロボレートをすべて一度に加える。反応物を０℃で撹拌し、徐々に室温まで温める。反応混合物を室温で６時間撹拌し、ロータリーエバポレーターで濃縮する。残留物を０．１％トリフルオロ酢酸を含有するアセトニトリル−水の溶媒系を用いて行われる勾配を用いた調製用ＨＰＬＣで精製する。生成物を含有する画分を集めて凍結乾燥し、目的とする生成物２０を得る。図１１を参照されたい。
【００９６】
実施例２２
５−｛３−ｔ−ブチルカルバモイル−４−［２−ヒドロキシ−４−（２−ヒドロキシ−インダン−１−イルカルバモイル）−５−フェニル−ペンチル］−ピペラジン−１−メチル｝−ピリジン−２−カルボン酸エチルエステル（２１）
マグネチックスターラーバーと隔壁を装着した丸底フラスコに、無水ＣＨ２Ｃｌ２中７０ｍｇ（０．１３ｍｍｏｌ）のインジナビルＭ６（２）を入れ、続いて、０．１６ｍｍｏｌ（２６ｍｇ）の５−ホルミル−２−ピリジンカルボン酸エチルエステル（ＵＳ ４，５２６，７８７号）および１６．８ｍｇ（０．２６ｍｍｏｌ）のシアノホウ化水素ナトリウムを加える。反応混合物を室温で１日間撹拌する。反応混合物を水によって停止させ、３×２０ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２で抽出する。有機相を集め、無水ＭｇＳＯ４で脱水してろ過し、溶媒をロータリーエバポレーターで除去する。その後、粗製混合物をシリカゲルカラムで精製し、目的とする生成物を得る。図１２を参照されたい。
【００９７】
実施例２３
５−｛３−ｔ−ブチルカルバモイル−４−［２−ヒドロキシ−４−（２−ヒドロキシ−インダン−１−イルカルバモイル）−５−フェニル−ペンチル］−ピペラジン−１−イルメチル｝−ピリジン−２−カルボン酸（２２）
２５ｍｇ（０．０３７ｍｍｏｌ）の２１を含むフラスコに、３ｍＬのメタノールおよび３ｍＬの１Ｎ ＮａＯＨ水溶液を加える。反応物を室温で１日間撹拌する。ＬＣ−ＭＳは生成物形成の完了を示す。反応物を減圧下で濃縮し、残留物を０．１％トリフルオロ酢酸を含有するアセトニトリル−水の溶媒系を用いて行われる勾配を用いた調製用ＨＰＬＣによって精製する。生成物を含有する画分を回収し、溶媒をロータリーエバポレーターで除去し、凍結乾燥して目的とする生成物を得る。図１２を参照されたい。
【００９８】
実施例２４
５−｛３−ｔ−ブチルカルバモイル−４−［２−ヒドロキシ−４−（２−ヒドロキシ−インダン−１−イルカルバモイル）−５−フェニル−ペンチル］−ピペラジン−１−イルメチル｝−ピリジン−２−カルボン酸２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イル（２３）
５ｍＬの無水ＴＨＦ中２０ｍｇ（０．０３０ｍｍｏｌ）の２２の溶液に、１２μＬのＥｔ３Ｎを加え、続いて、１９．９ｍｇ（０．０６ｍｍｏｌ）の［Ｏ−（Ｎ−スクシンイミジル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウム］テトラフルオロボレートを加える。反応物を０℃で撹拌し、室温まで温める。反応混合物を室温で６時間撹拌し、ロータリーエバポレーターで濃縮する。残留物を０．１％トリフルオロ酢酸を含有するアセトニトリル−水の溶媒系を用いて行われる勾配を用いた調製用ＨＰＬＣで精製する。生成物を含有する画分を集めて凍結乾燥し、目的とする生成物を得る。図１２を参照されたい。
【００９９】
実施例２５
イムノアッセイ形式の原理
本明細書に記載されるインジナビルのためのアッセイ形式は、均一系微粒子イムノアッセイである。それは、血清中のインジナビルの検出のための２試薬システムである。溶液中の微粒子の動力学的相互作用（ＫＩＭＳ）は、Roche Diagnostics/Hitachiファミリーの自動分析装置を用いて測定した。この技術では、インジナビル抗体は微粒子上に共有結合され、薬物誘導体は高分子（アミノデキストラン）に結合される。微粒子上の限られた量の特異的インジナビル抗体との結合について、薬物コンジュゲートと血清サンプル中のインジナビル（存在すれば）との間での競合反応が起こる。溶液中の微粒子の動力学的相互作用は、微粒子上での薬物コンジュゲートと抗体との結合によって引き起こされ、サンプル中のインジナビルの存在によって阻害される。
【０１００】
インジナビル抗体は、ＵＳ ２００４／４０１２７６８９に記載されるインジナビル免疫原から作製した。
【０１０１】
実施例２６
インダン環からのインジナビル−アミノデキストランコンジュゲート（１３Ｃ）
アミノデキストラン（ＭＷ４０，０００）は、ＵＳ６，６５３，４５６号に記載される方法に従って調製した。ＴＮＢＳアッセイによって、生成物は１モルのアミノデキストランあたり５．７アミノ基を有することが分かった。
【０１０２】
このアミノデキストランは、（インダン環からの）インジナビル−アミノデキストランコンジュゲートを調製するために使用された。２０ｍｇのアミノデキストランに室温で１ｍＬのＤＭＳＯを加えた。混合物を室温ですべてのアミノデキストランが溶液になるまで撹拌しておいた。反応混合物に１３μＬ（０．０９２ｍｍｏｌ）のトリエチルアミンを加えた。インジナビル誘導体１２、８．８７ｍｇ（０．０１０ｍｍｏｌ）を０．４４ｍＬの無水ＤＭＳＯに溶解し、撹拌されるアミノデキストラン溶液に滴下した。混合物を室温で４８時間撹拌しておき、SPECTRA/POR透析チューブ（ＭＷカットオフ３５００）に移し、以下のように（１Ｌ容量、少なくとも各８時間で）室温で透析した（各透析は１Ｌ容量を用いた）。すなわち、脱イオン水中８０％ＤＭＳＯ、６０％ＤＭＳＯ、４０％ＤＭＳＯ、および２０％ＤＭＳＯで透析し、続いて脱イオン水で透析を行った。
【０１０３】
溶液を透析チューブから回収して凍結乾燥し、白色の粉末として１５ｍｇのインジナビル−デキストランコンジュゲートを得た。図６を参照されたい。
【０１０４】
実施例２７
ピリジン環からのインジナビル−アミノデキストランコンジュゲート（６Ｃ）
このアミノデキストランは、（ピリジン環からの）インジナビル−アミノデキストランコンジュゲートを調製するために使用した。２０ｍｇのアミノデキストランに室温で１ｍＬのＤＭＳＯを加えた。混合物を室温ですべてのアミノデキストランが溶液になるまで撹拌しておいた。反応混合物に１３μＬ（０．０９２ｍｍｏｌ）のトリエチルアミンを加えた。インジナビル誘導体５、９．８６ｍｇ（０．０１１ｍｍｏｌ）を０．４４ｍＬの無水ＤＭＳＯに溶解し、撹拌中のアミノデキストラン溶液に滴下した。混合物を室温で４８時間撹拌しておき、SPECTRA/POR透析チューブ（ＭＷカットオフ３５００）に移し、以下のように（１Ｌ容量、少なくとも各８時間で）室温で透析した（各透析は１Ｌ容量を用いた）。すなわち、脱イオン水中８０％ＤＭＳＯ、６０％ＤＭＳＯ、４０％ＤＭＳＯ、および２０％ＤＭＳＯで透析し、続いて脱イオン水で透析を行った。溶液を透析チューブから回収して凍結乾燥し、白色の粉末として１５ｍｇのインジナビル−デキストランコンジュゲートを得た。図７を参照されたい。
【０１０５】
実施例２８
インジナビルラテックス試薬の調製
固形分１０％（ｗ／ｖ）のカルボン酸修飾ラテックス微粒子（Seradyn）を脱イオン水で固形分１％（ｗ／ｖ）に希釈した。懸濁液を３２，６００×ｇで１時間４℃で遠心分離した。ペレットを残し、超音波処理によって再懸濁した。１％ラテックス懸濁液を上述のような遠心分離によって５倍当量の脱イオン水で洗浄し、続いて、５倍等量の洗浄バッファー（５０ｍＭ ２−（Ｎ−モルホリノ）−エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、ｐＨ５．５）で洗浄した。ラテックス微粒子を４℃で保存した。ラテックス濃度をRoche Cobas Miraで測定し、５０ｍＭ ＭＥＳバッファー、ｐＨ５．５で１％（ｗ／ｖ）に調整した。
【０１０６】
洗浄された１％（ｗ／ｖ）ラテックスを、１０等量のＮ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）ならびに１０等量の５０ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ５．５中のスルホＮＨＳおよび脱イオン水中５０ｍｇ／ｍＬのＥＤＣ溶液によって活性化した。反応混合物を室温で２時間撹拌した。
【０１０７】
反応混合物を３２００×ｇで１時間４℃で遠心分離し、ラテックスペレットを５０ｍＭ ＭＯＰＳ、ｐＨ６．４に再懸濁した。ラテックス濃度をRoche Cobas Miraで測定し、ラテックス懸濁液を１％（ｗ／ｖ）に調整した。
【０１０８】
所望の量のインジナビルモノクローナル抗体（各抗体付加において、Ｍ２．３５．２およびＭ１．１５８．８それぞれについて１％（ｗ／ｖ）ラテックスあたり０．２ｍｇのＭａｂ（ＵＳ ２００４４０１２７６８９参照））を１％（ｗ／ｖ）ラテックスに加え、ラテックス混合物を室温で２時間撹拌した。
【０１０９】
ラテックス混合物に、５０ｍＭ ＭＯＰＳ、ｐＨ６．４中５０ｍｇ／ｍＬのＢＳＡを加え、室温で一晩撹拌することによって後ブロッキングした。
【０１１０】
ラテックス混合物を３２，６００×ｇで１時間４℃で遠心分離し、ラテックスペレットをラテックス保存バッファー（５０ｍＭ ＭＯＰＳ、０．１％ ＢＳＡ、０．０９％ ＮａＮ３、ｐＨ７．２）に再懸濁した。これが試薬Ｒ２である。
【０１１１】
ラテックスを上述のような遠心分離によってラテックス保存バッファーで３回洗浄した。ラテックス懸濁液の単分散をRoche Cobas Miraで測定した。ラテックス懸濁液濃度を１．５％に調整し、４℃で保存した。
【０１１２】
実施例２９
インジナビル較正曲線
硫酸インジナビルを５０％エタノールに溶解し、１ｍｇ／ｍＬ原液を調製した。２組の血清較正物および対照を調製した。低値セット血清較正物は、インジナビル原液からRoche TDM血清中０．２５、０．３２５、０．７５、１．５および３μｇ／ｍＬのインジナビル濃度で調製された。高値セット血清較正物には、０、０．７５、１．５、３、および１２μｇ／ｍＬの濃度でインジナビルが添加した。
【０１１３】
ｐＨ７．２で０．１％ポリアクリル酸および０．１％ＴＷＥＥＮ ２０を含有する１８０ｍＭ ＰＩＰＥＳバッファー中に０．２ｍｇ／ｍＬのインジナビルアミノデキストランコンジュゲート（１３Ｃまたは６Ｃ）を調製することによって、コンジュゲート試薬を調製した（試薬Ｒ１）。ラテックス試薬Ｒ２の調製は上述した。
【０１１４】
Hitachi 917自動分析装置（Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis）を用い、１２０μＬの第一調製済み試薬（Ｒ１）および１６０μＬの第二調製済み試薬（Ｒ２）および１５μＬのサンプル量を用いて、６００ｎｍの波長での吸収変化を測定して、アッセイを行った。
【図面の簡単な説明】
【０１１５】
【図１】実施例２９に記載されたように高値セット血清較正物を用い、コンジュゲート６Ｃを用いて作成した較正曲線である。
【図２】実施例２９に記載されたように低値セット血清較正物を用い、コンジュゲート６Ｃを用いて作成した較正曲線である。
【図３】実施例２９に記載されたように高値セット血清較正物を用い、コンジュゲート１３Ｃを用いて作成した較正曲線である。
【図４】実施例２９に記載されたように低値セット血清較正物を用い、コンジュゲート１３Ｃを用いて作成した較正曲線である。
【図５】実施例１〜６に記載されたようにインジナビルのインダン環ヒドロキシル基から活性化インジナビルハプテン１２を合成する手順を図解する。
【図６】それぞれ実施例７、８、および２６に記載されたように活性化ハプテン１２のＢＳＡ、ＫＬＨ、およびアミノデキストラン誘導体を合成する手順を図解する。
【図７】実施例９〜１１に記載されたようにインジナビルのピリジン環窒素から活性化インジナビルハプテン５を合成する手順、ならびに、それぞれ実施例１２、１３、および２７に記載されたようにＫＬＨ、ＢＳＡ、およびアミノデキストラン誘導体を合成する手順を図解する。
【図８】実施例１４に記載されたように水素ガスおよびパラジウム触媒の存在下でインジナビルから単一ステップでインジナビル代謝物Ｍ６（２）を合成する手順を図解する。
【図９】実施例１５および１６に記載されたようにＭ６のピペラジン窒素から置換芳香族連結基を有するインジナビル誘導体を合成する手順を図解する。
【図１０】実施例１７および１８に記載されたようにＭ６のピペラジン窒素から脂肪族連結基を有するインジナビル誘導体を合成する手順を図解する。
【図１１】実施例１９〜２１に記載されたようにＭ６のピペラジン窒素からピリジル連結基を有するインジナビル誘導体を合成する手順を図解する。
【図１２】実施例２２〜２４に記載されたようにＭ６のピペラジン窒素からピリジル連結基を有するインジナビル誘導体を合成する手順を図解する。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、イムノアッセイに有用なプロテアーゼ阻害剤誘導体に関する。より詳細には、本発明は、免疫原を生成するために有用な活性化インジナビルハプテン、ならびに、インジナビルに対する抗体を生成するための免疫原として、また、生物学的サンプル中のインジナビルの検出のためのイムノアッセイにおいて有用な、コンジュゲート化した誘導体に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＨＩＶプロテアーゼ阻害剤は、その最初の薬物であるサキナビルが１９９５年に市場に導入されて以来、ＡＩＤＳ患者の保健医療に重大な影響を与えている重要な新しい種類の薬物である。他のプロテアーゼ阻害剤の例としては、アンプレナビル、ネルフィナビル、ロピナビル、リトナビル、インジナビル、およびアタザナビルが挙げられる。それらは逆転写酵素阻害剤などの他の抗ＨＩＶ薬または他のＨＩＶプロテアーゼ阻害剤との併用で特に有効である。これらの新しい治療法による著しい成功にもかかわらず、プロテアーゼ阻害剤の濃度を測定するための治療薬試験方法が利用可能であれば、結果は非常に改善される可能性が高い。すべての患者がプロテアーゼ阻害剤併用療法に最適に反応するとは限らない。反応する患者でも、よく知られているＨＩＶウイルスの高い突然変異率のために、その後薬物耐性を発現し得る。しかし、血漿中のプロテアーゼ阻害剤濃度と、ウイルス量の減少およびＣＤ４細胞数の増加に基づく治療効果との間には明らかな相関関係があることが示されている。１つの問題は、薬物が著しく代謝され、複雑な薬物・薬物相互作用を受けるという点にある。結果は極めて複雑な薬物動態として現れ、特定の時での特定の患者についての投与量と結果として得られる薬物濃度との間の予測不可能な強い要素である。治療薬のモニタリングによって、薬物投与量は患者に対して個別化することができ、ウイルスを抑える可能性はずっと高くなるであろう。しかし、プロテアーゼ阻害剤の日常的な治療薬モニタリングは、ハイスループット臨床分析機器に適応できる簡単な自動化試験の可用性を必要とする。現在のところ、プロテアーゼ阻害剤の治療薬モニタリングにおけるほとんどの報告は、時間がかかり、労働力を要し、高価なＨＰＬＣ法を用いている。最近、サキナビルに対するラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）法の報告があった（Wiltshireら、Analytical Biochemistry 281, 105-114, 2000）。しかし、このような方法はハイスループットの治療薬モニタリングに適応できず、すべてのＲＩＡ法と同様に、アッセイに使用される放射性同位体標識に関する規制問題、安全性の問題および廃棄物問題を有するという欠点を伴う。治療薬モニタリングの最も望ましいアッセイ形式は非同位体イムノアッセイであり、このような方法はＨＩＶプロテアーゼ阻害剤の測定については今まで知られていない。
【０００３】
インジナビル（CRIXIVAN, Merck & Co., Inc.）はヒト免疫不全ウイルスプロテアーゼの強力かつ特異的な阻害剤の１つである。インジナビルは、低濃度の第４級ピリジンＮ−グルクロニド（Ｍ１）、２’，３’−トランス−ジヒドロキシインダニルピリジン−Ｎ−オキシド（Ｍ２）、２’，３’−トランス−ジヒドロキシインダン（Ｍ３）、およびピリジン−Ｎ−オキシド（Ｍ４ａ）アナログ、ならびにＭ３（Ｍ５）およびインジナビル（Ｍ６）のデスピリジルメチルアナログに代謝される。Ｍ６は尿中ならびに血漿中の主要代謝物の１つである（Drug Metabolism and Disposition 24, 1389-94, 1996）。
【０００４】
前述のように、ＨＰＬＣはＨＩＶプロテアーゼ阻害剤の測定のために一般に好まれる方法であった。最近の２つの文献での報告は、ヒト血漿中のいくつかのプロテアーゼ阻害剤の同時測定のためのＨＰＬＣアッセイを記載する（Poirierら、Therapeutic Drug Monitoring 22, 465-473, 2000およびRemmelら、Clinical Chemistry 46, 73-81, 2000）。
【０００５】
化学的および生物学的アッセイは通常、目的のアナライトを事前に測定された量の１つ以上のアッセイ試薬と接触させること、その結果生じた生成物（検出生成物）の１つ以上の特性を測定すること、ならびに、一般的には試験されるサンプルについて予測される範囲で既知量の目的のアナライトを含有する標準サンプルまたは較正サンプルから決定される関係を用いて測定値を元のサンプル中に存在するアナライトの量と相関させることを含む。一般的に、検出生成物は１つ以上のアッセイ試薬によってもたらされる１つ以上の検出可能な標識を取り込む。一般的に使用される標識の例は、官能化微粒子、１２５Ｉおよび３２Ｐなどの放射性同位体標識、ペルオキシダーゼおよびβ−ガラクトシダーゼなどの酵素ならびに酵素基質標識、フルオレセインおよびローダミンなどの蛍光標識、ニトロキシドフリーラジカルなどの電子スピン共鳴標識、抗体および抗原などの免疫反応性標識、ビオチン−アビジンおよびビオチン−ストレプトアビジンなどの結合ペアの一方の構成成分である標識、ならびにルテニウムビピリジル部分を含有するものなどの電気化学発光標識を含む。サンドイッチアッセイは通常、目的のアナライトが、例えば抗体、抗原、または結合ペアの一方の構成成分のような最終的に分離のために使用される１つのアッセイ試薬と、検出可能な標識を提供する第二のアッセイ試薬との間に挟まれた複合体の形成を含む。競合アッセイは通常、目的のアナライトとアナライトのアナログとの両方が別の試薬（例えば抗体）の結合部位について競合するシステムを含み、アナライト、アナログまたは結合試薬の１つは検出可能な標識を有する。
【０００６】
本出願と同一の承継人に係る、２００２年５月２２日にＥＰ １ ２０７ ３９４として公開された、２０００年１１月１４日に出願された同時係属の米国特許出願第０９／７１２，５２５号は、阻害剤を含有するサンプルを阻害剤または該阻害剤の代謝物に特異的な受容体とともに、さらにまた阻害剤のアナログと非同位体シグナル発生部分とを含むコンジュゲートとともにインキュベーションすることを含む、ＨＩＶプロテアーゼ阻害剤のための非同位体イムノアッセイを記載する。受容体による阻害剤の結合の結果として発生するシグナルが測定され、元のサンプル中のプロテアーゼ阻害剤の存在または量と関連付けられる。本発明のプロテアーゼ阻害剤コンジュゲートはこのようなアッセイにおいて特に有用である。
【０００７】
本出願と同一の承継人に係る、２００３年１月２３日にＷＯ ０３／００６５０６として公開された、２００２年７月１０日に出願された同時係属の米国特許出願第１０／１９２，０５２号は、ＨＩＶプロテアーゼ阻害剤に対する免疫原を生成するために有用な活性化ハプテンを記載する。具体的に開示されるのは、インジナビル分子の中央のヒドロキシル基から合成されるインジナビル誘導体および免疫原である。
【特許文献１】ＥＰ １ ２０７ ３９４
【特許文献２】米国特許出願第０９／７１２，５２５号
【特許文献３】ＷＯ ０３／００６５０６
【特許文献４】米国特許出願第１０／１９２，０５２号
【非特許文献１】Wiltshireら、Analytical Biochemistry 281, 105-114, 2000
【非特許文献２】Drug Metabolism and Disposition 24, 1389-94, 1996
【非特許文献３】Poirierら、Therapeutic Drug Monitoring 22, 465-473, 2000
【非特許文献４】Remmelら、Clinical Chemistry 46, 73-81, 2000
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
他の問題の中でも、ＨＩＶプロテアーゼ阻害剤インジナビルの改良された活性化ハプテン、誘導体およびコンジュゲートの必要性、ならびに自動化されたハイスループットの薬物モニタリングに適した方法である、生物学的サンプル中のインジナビルの測定のためのイムノアッセイ法の必要性が残っている。本発明はこれらおよび他の問題を解決する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
発明の概要
上述の背景において、本発明は先行技術を越えるある種の自明でない利点および進歩をもたらす。特に、本発明者らはイムノアッセイに有用なインジナビル誘導体およびコンジュゲートの改良の必要性を認識している。
【００１０】
本発明は、ＨＩＶプロテアーゼ阻害剤インジナビルに対する免疫原の生成に有用な活性化ハプテン、インジナビルに対する抗体の作製に有用な免疫原、および生物学的サンプル中のインジナビルの測定のためのイムノアッセイに有用な標識化コンジュゲートに関する。これらの化合物はインジナビルのピリジン環窒素のインダン環ヒドロキシル基から、およびインジナビルのピリジン窒素から合成される。本発明はまた、水素ガスおよびパラジウム触媒の存在下でインジナビルから単一ステップでインジナビル代謝物Ｍ６を合成する方法、ならびにインジナビルＭ６代謝物に由来する活性化ハプテンおよびコンジュゲートに関する。
【００１１】
本発明の１つの実施形態では、活性化ハプテンは以下の構造を持って提供され、
【化１】
式中、ＹはＯまたはＳであり、ｍは０または１であり、ＸはＣＨ２またはＮＨであり、Ｌは飽和もしくは不飽和の直鎖または分岐鎖として配列する０〜４０個の炭素原子を含み、最大２個の環状構造と０〜２０個のヘテロ原子を含有する連結基であるが、３個以上のヘテロ原子が連続して結合していてはならず、かつＡは、活性エステル、イソシアネート、イソチオシアネート、チオール、イミドエステル、無水物、マレイミド、チオラクトン、ジアゾニウム基およびアルデヒドからなる群より選択される活性型官能基である。
【００１２】
本発明の別の実施形態では、コンジュゲートされた誘導体は以下の構造を持って提供され、
【化２】
式中、ＹはＯまたはＳであり、ｍは０または１であり、ＸはＣＨ２またはＮＨであり、Ｌは飽和もしくは不飽和の直鎖または分岐鎖として配列する０〜４０個の炭素原子を含み、さらに最大２個の環状構造と０〜２０個のヘテロ原子を含有する連結基であるが、３個以上のヘテロ原子が連続して結合していてはならず、Ｚは、−ＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯ−、−ＮＨＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＳＮＨ−、−ＯＣＯＮＨ−、−ＮＨＯＣＯ−、−Ｓ−、−ＮＨ（Ｃ＝ＮＨ）−、−Ｎ＝Ｎ−、−ＮＨ−および
【化３】
からなる群より選択される部分であり、Ｑは、ポリペプチド、多糖、合成ポリマー、および非同位体標識からなる群より選択され、かつｎはＱの分子量５０キロダルトンあたり１〜５０の数である。
【００１３】
本発明の別の実施形態では、活性化ハプテンは以下の構造を持って提供され、
【化４】
式中、Ｌは飽和もしくは不飽和の直鎖または分岐鎖として配列する０〜４０個の炭素原子を含み、最大２個の環状構造と０〜２０個のヘテロ原子を含有する連結基であるが、３個以上のヘテロ原子が連続して結合していてはならず、かつＡは、活性エステル、イソシアネート、イソチオシアネート、チオール、イミドエステル、無水物、マレイミド、チオラクトン、ジアゾニウム基およびアルデヒドからなる群より選択される活性型官能基である。
【００１４】
本発明の別の実施形態では、コンジュゲート化された誘導体は以下の構造を持って提供され、
【化５】
式中、Ｌは飽和もしくは不飽和の直鎖または分岐鎖として配列する０〜４０個の炭素原子を含み、さらに最大２個の環状構造と０〜２０個のヘテロ原子を含有する連結基であるが、３個以上のヘテロ原子が連続して結合していてはならず、Ｚは、−ＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯ−、−ＮＨＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＳＮＨ−、−ＯＣＯＮＨ−、−ＮＨＯＣＯ−、−Ｓ−、−ＮＨ（Ｃ＝ＮＨ）−、−Ｎ＝Ｎ−、−ＮＨ−および
【化６】
からなる群より選択される部分であり、Ｑは、ポリペプチド、多糖、合成ポリマー、および非同位体標識からなる群より選択され、かつｎはＱの分子量５０キロダルトンあたり１〜５０の数である。
【００１５】
本発明のさらに別の実施形態では、活性化ハプテンは以下の構造を持って提供され、
【化７】
式中、ＸはＮまたはＣであり、Ｌは飽和もしくは不飽和の直鎖または分岐鎖として配列する０〜４０個の炭素原子を含み、最大２個の環状構造と０〜２０個のヘテロ原子を含有する連結基であるが、３個以上のヘテロ原子が連続して結合していてはならず、かつＡは、活性エステル、イソシアネート、イソチオシアネート、チオール、イミドエステル、無水物、マレイミド、チオラクトン、ジアゾニウム基およびアルデヒドからなる群より選択される活性型官能基である。
【００１６】
本発明のさらに別の実施形態では、コンジュゲート化された誘導体は以下の構造を持って提供され、
【化８】
式中、ＸはＮまたはＣであり、Ｌは飽和もしくは不飽和の直鎖または分岐鎖として配列する０〜４０個の炭素原子を含み、さらに最大２個の環状構造と０〜２０個のヘテロ原子を含有する連結基であるが、３個以上のヘテロ原子が連続して結合していてはならず、Ｚは、−ＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯ−、−ＮＨＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＳＮＨ−、−ＯＣＯＮＨ−、−ＮＨＯＣＯ−、−Ｓ−、−ＮＨ（Ｃ＝ＮＨ）−、−Ｎ＝Ｎ−、−ＮＨ−および
【化９】
からなる群より選択される部分であり、Ｑは、ポリペプチド、多糖、合成ポリマー、および非同位体標識からなる群より選択され、かつｎはＱの分子量５０キロダルトンあたり１〜５０の数である。
【００１７】
本発明の更なる実施形態では、活性化ハプテンは以下の構造を持って提供され、
【化１０】
式中、Ｌは飽和もしくは不飽和の直鎖または分岐鎖として配列する０〜４０個の炭素原子と、０〜２０個のヘテロ原子とを含む脂肪族連結基であるが、３個以上のヘテロ原子が連続して結合していてはならず、かつＡは、活性エステル、イソシアネート、イソチオシアネート、チオール、イミドエステル、無水物、マレイミド、チオラクトン、ジアゾニウム基およびアルデヒドからなる群より選択される活性型官能基である。
【００１８】
本発明の更なる実施形態では、コンジュゲート化された誘導体は以下の構造を持って提供され、
【化１１】
式中、Ｌは飽和もしくは不飽和の直鎖または分岐鎖として配列する０〜４０個の炭素原子と、さらに０〜２０個のヘテロ原子とを含む脂肪族連結基であるが、３個以上のヘテロ原子が連続して結合していてはならず、Ｚは、−ＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯ−、−ＮＨＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＳＮＨ−、−ＯＣＯＮＨ−、−ＮＨＯＣＯ−、−Ｓ−、−ＮＨ（Ｃ＝ＮＨ）−、−Ｎ＝Ｎ−、−ＮＨ−および
【化１２】
からなる群より選択される部分であり、Ｑは、ポリペプチド、多糖、合成ポリマー、および非同位体標識からなる群より選択され、かつｎはＱの分子量５０キロダルトンあたり１〜５０の数である。
【００１９】
本発明の別の実施形態では、水素ガスおよびパラジウム触媒の存在下でインジナビルから単一ステップでインジナビル代謝物Ｍ６を合成する方法が提供される。合成Ｍ６は、Ｍ６のピペラジン窒素からの連結基を有するインジナビル誘導体の合成に有用である。これらの連結基は、脂肪族基、置換芳香族基、およびピリジル基を含む。
【００２０】
本発明のこれらその他の特徴および利点は、添付の特許請求の範囲と併せて下記の発明の詳細な説明からより完全に理解されるであろう。特許請求の範囲はその中の詳述によって定義され、本説明に記載される特徴および利点の特定の議論によって規定されないことに注意する。
【００２１】
図面の簡単な説明
本発明の実施形態の詳細な説明は、下記の図面と併読して最も良く理解することができる。
図１は、実施例２９に記載されたように高値セット血清較正物を用い、コンジュゲート６Ｃを用いて作成した較正曲線である。
図２は、実施例２９に記載されたように低値セット血清較正物を用い、コンジュゲート６Ｃを用いて作成した較正曲線である。
図３は、実施例２９に記載されたように高値セット血清較正物を用い、コンジュゲート１３Ｃを用いて作成した較正曲線である。
図４は、実施例２９に記載されたように低値セット血清較正物を用い、コンジュゲート１３Ｃを用いて作成した較正曲線である。
図５は、実施例１〜６に記載されたようにインジナビルのインダン環ヒドロキシル基から活性化インジナビルハプテン１２を合成する手順を図解する。
図６は、それぞれ実施例７、８、および２６に記載されたように活性化ハプテン１２のＢＳＡ、ＫＬＨ、およびアミノデキストラン誘導体を合成する手順を図解する。
図７は、実施例９〜１１に記載されたようにインジナビルのピリジン環窒素から活性化インジナビルハプテン５を合成する手順、ならびに、それぞれ実施例１２、１３、および２７に記載されたようにＫＬＨ、ＢＳＡ、およびアミノデキストラン誘導体を合成する手順を図解する。
図８は、実施例１４に記載されたように水素ガスおよびパラジウム触媒の存在下でインジナビルから単一ステップでインジナビル代謝物Ｍ６（２）を合成する手順を図解する。
図９は、実施例１５および１６に記載されたようにＭ６のピペラジン窒素から置換芳香族連結基を有するインジナビル誘導体を合成する手順を図解する。
図１０は、実施例１７および１８に記載されたようにＭ６のピペラジン窒素から脂肪族連結基を有するインジナビル誘導体を合成する手順を図解する。
図１１は、実施例１９〜２１に記載されたようにＭ６のピペラジン窒素からピリジル連結基を有するインジナビル誘導体を合成する手順を図解する。
図１２は、実施例２２〜２４に記載されたようにＭ６のピペラジン窒素からピリジル連結基を有するインジナビル誘導体を合成する手順を図解する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
発明の詳細な説明
本発明がより容易に理解されるために、下記の例には参考文献が与えられ、それは本発明を説明することを目的とするが、その範囲を限定するものではない。
【００２３】
「好ましくは」、「通常」、および「一般的に」のような用語は、本明細書において、特許を受けようとする発明の範囲を限定するために、あるいは、特定の特徴が特許を受けようとする発明の構造もしくは機能にとって重大、必須、またはさらに重要であるとを示すために使用されないことに注意する。むしろ、これらの用語は単に、本発明の特定の実施形態において使用されてもされなくてもよい代替的または付加的な特徴を強調することを目的とする。
【００２４】
本発明の記載および定義のために、「実質的に」という用語は、本明細書において、任意の量的比較、値、測定または他の表現に起因しうる内在的な不確実性の程度を表すために使用されることに注意する。「実質的に」という用語はまた、本明細書において、問題となっている対象の基本的な機能に結果として変化がなく、記載された参照とは定量的表現が異なる場合のその程度を表すために使用される。
【００２５】
詳細においておよびその特定の実施形態への参照によって本発明を記載したように、添付の特許請求の範囲において定義される本発明の範囲から逸脱することなく、改良および変形形態が可能であることは明白である。より具体的には、本発明のいくつかの態様は本明細書において好ましいかまたは特に有利であるとされるが、本発明は必ずしもこれらの本発明の好ましい態様に限定されないと考えられる。
【００２６】
本明細書を通して、下線付きの数字は図面で説明される化学構造を指すために使用される。
【００２７】
本明細書において用いられる場合、アナライトとは、その存在もしくは量を測定するべき物質または物質群を指す。
【００２８】
抗体はアナライトの特異的な結合パートナーを意味し、他の関係のない物質の本質的な排除のためにアナライトに対して特異的な結合親和性を有する任意の物質または物質群である。その用語は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体および抗体フラグメントを含む。
【００２９】
ハプテンは部分抗原または不完全抗原である。それらはタンパク質を含まない物質、多くは低分子量物質であり、それは抗体産生を活性化できないが、抗体に反応する。抗体は、ハプテンを高分子量の担体にカップリングさせ、このカップリング生成物をヒトまたは動物に注射することによって作製される。ハプテンの例としては、ジゴキシンおよびテオフィリンなどの治療薬、サキナビルおよびインジナビルなどのプロテアーゼ阻害剤、モルヒネおよびＬＳＤなどの乱用性薬物、ゲンタマイシンおよびバンコマイシンなどの抗生物質、エストロゲンおよびプロゲステロンなどのホルモン、ビタミンＢ１２および葉酸などのビタミン、チロキシン、ヒスタミン、セロトニン、アドレナリンなどが挙げられる。
【００３０】
活性化ハプテンとは、誘導体コンジュゲートの合成のために、活性基の付加または供与などによって反応のために利用可能な部位が与えられたハプテン誘導体を指す。
【００３１】
リンカーという用語は、ハプテンを担体、免疫原、標識、トレーサーまたは別のリンカーに連結する化学的部分を指す。リンカーは、直鎖または分岐鎖の、飽和または不飽和の炭素鎖でありうる。それらはまた、その鎖の中、または鎖の末端に１つ以上のヘテロ原子を含みうる。ヘテロ原子とは、酸素、窒素および硫黄からなる群より選択される炭素以外の原子を意味する。リンカーの使用は、特定のハプテンと担体のペアに応じて、有利または必要であるかもしれず、そうでないかもしれない。
【００３２】
担体は、その用語が本明細書において用いられる場合、ハプテンと結合でき、それによってハプテンが免疫反応を活性化できるようにする免疫原性物質であり、通常はタンパク質である。担体物質は、異物として認識され、それによって宿主から免疫反応を誘導するタンパク質、糖タンパク質、複合多糖および核酸を含む。
【００３３】
本明細書において用いられる場合、免疫原および免疫原性という用語は、生物に免疫反応を引き起こすかまたは生じさせることができる物質を指す。
【００３４】
コンジュゲートおよび誘導体という用語は、もととなる化合物または分子から１以上の化学反応によって生成される化合物または分子を指す。
【００３５】
本明細書において用いられる場合、検出分子、標識またはトレーサーは、担体物質または分子に結合された際、アナライトを検出するために使用され得る識別タグである。標識はその担体物質に直接、または連結部分もしくは架橋部分によって間接的に結合されうる。標識の例としては、β−ガラクトシダーゼおよびペルオキシダーゼなどの酵素、ローダミンおよびフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）などの蛍光化合物、ジオキセタンおよびルシフェリンなどの発光化合物、ならびに１２５Ｉなどの放射性同位体を含む。
【００３６】
活性エステルという用語は、本発明の意味では、求核試薬を含む物質の他の反応基との妨害副反応が有効に起こり得ない条件下において、限定はされないが、ペプチド、ポリアミノ酸、多糖または標識の遊離アミノ基のような求核試薬と反応し得る活性化エステル基を含む。
【００３７】
下記の構造は、本明細書において言及される誘導体化のための様々な位置を図解し、
【化１３】
式中、ＸはＣＨ２またはＮである。
【００３８】
インジナビル分子の中央のヒドロキシル基から合成されるインジナビル誘導体およびコンジュゲートは、ＷＯ ０３／００６５０６に記載されている。
【００３９】
本発明の１つの実施形態は、インジナビルのピリジン窒素で連結されているインジナビルハプテン構造に関する。
【００４０】
反応条件の調節は、別の部位からの１つの反応部位の選択を可能にする。このアプローチの例は、第３級アミン、好ましくはトリエチルアミンの存在下での硫酸インジナビルのアルキル化反応を含む。このようなアルキル化反応は、図７に示されるようなインジナビルピリジン窒素を選択的に官能化し、
【化１４】
式中、Ｌは飽和もしくは不飽和の直鎖または分岐鎖として配列する０〜４０個の炭素原子を含み、最大２個の環状構造と０〜２０個のヘテロ原子を含有する連結基であるが、３個以上のヘテロ原子が連続して結合していてはならない。Ａは、活性エステル、イソシアネート、イソチオシアネート、チオール、イミドエステル、無水物、マレイミド、およびチオラクトンからなる群より選択される活性型官能基である。
【００４１】
アルキル化試薬は好ましくは、保護されたカルボン酸またはフタルイミド基として保護されたアミノ基のような適切に保護された官能基を有するハロアルキル化剤である。保護されたカルボキシル基は好ましくは、インジナビルに結合した後、例えば、図７の化合物４のように酸性または塩基性条件下で除去されるエステルである。遊離カルボン酸基は活性化され、その後のポリペプチド、多糖、および標識基へのコンジュゲート化のために活性エステルを生じる。遊離アミノ基はまた、脱保護後、活性カルボン酸基を有する二官能性リンカーを用いて伸長されるか、またはそれは尿素結合もしくは同様の基を用いてポリペプチドとカップリングされる場合がある。
【００４２】
リンカー伸長はまた、マレイミドアルカン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルのようなヘテロ二官能性試薬を用いて達成することができ、その後のポリペプチドおよび標識のチオール基へのコンジュゲーションのために末端マレイミド基を生じる。
【００４３】
別法として、アミノ末端リンカーは、一方の末端にアミド結合を形成し、他方の末端に遊離であるかまたは保護されたチオールを形成するように反応するヘテロ二官能性チオール化剤によって伸長され得る。当技術分野においてよく知られているこの種のチオール化試薬のいくつかの例は、２−イミノチオラン（２−ＩＴ）、スクシンイミジルアセチルチオプロピオネート（ＳＡＴＰ）およびスクシンイミド２−ピリジルジチオプロピオネート（ＳＰＤＰ）である。脱保護後、初めの（incipient）チオール基は次に、マレイミドまたはブロモアセチル化修飾された免疫原もしくは標識とチオールエーテルを形成するために使用可能である。
【００４４】
本発明の活性エステルは、比較的低い温度で様々な水性および非水性溶媒混合物中において、求核試薬、特に第１級アミンに反応性である。活性エステルが第１級または第２級アミンとカップリングしてアミドを生じるための典型的な条件は、室温で添加される水の存在下もしくは非存在下での、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）またはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）などの双極性非プロトン性溶媒中での反応である。
【００４５】
バッファーまたは第３級アミンは、第１級アミン反応剤を脱プロトン化状態に保つために必要な塩基性のｐＨを維持するために、しばしば添加される。一般的な活性エステルは、ｐ−ニトロフェニルエステル、Ｎ−ヒドロキシスルホコハク酸イミド（hydroxysulfosuccimidyl）エステル、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド（hydroxysuccimidyl）エステル、１−ヒドロキシベンゾトリアゾリルエステルおよびペンタフルオロフェニルエステルである。好ましい活性エステルは、それらの安定性、反応性および副産物Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドの除去の容易さのバランスから、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルである。他の活性エステルは当業者によく知られており、同様に使用されうる。
【００４６】
あるいは、活性基としてエステル；またはイミニウム基を有するリンカーによるインジナビル誘導体は、例えば、適切な前駆体基、例えば末端ニトリル基を有するリンカーを用いることによって得ることができる。例としては、末端ニトリル基を有するインジナビル誘導体を上述のものと同様の方法で合成し、続いてニトリルのイミダート部分（当技術分野において既知の方法による、例えばアルコール中での塩化水素処理によるイミドイミダート基）への変換を行う。Hermanson、上掲；およびJerry March, Advanced Organic Chemistry,第三版、John Wiley & Sons, 1985も参照されたい。イミドエステルを得る他の方法は当業者に提案されるであろう。
【００４７】
本発明の別の実施形態は、インダンヒドロキシル基で連結されているインジナビル誘導体に関する。これらの活性化ハプテンは以下の構造を有し、
【化１５】
式中、ＹはＯ、ＳまたはＮＨであり、ｍは０または１であり、Ｌは飽和もしくは不飽和の直鎖または分岐鎖として配列する０〜４０個の炭素原子を含み、最大２個の環状構造と０〜２０個のヘテロ原子を含有する連結基であるが、３個以上のヘテロ原子が連続して結合していてはならない。Ａは、活性エステル、イソシアネート、イソチオシアネート、チオール、イミドエステル、無水物、マレイミド、チオラクトン、およびアルデヒドからなる群より選択される活性型官能基である。
【００４８】
インジナビルは２つの第２級ヒドロキシル基、インダンヒドロキシル基および中央のヒドロキシル基を含み、初めにインダン環のヒドロキシル基を保護することが必要である場合がある。選択的修飾は、イソプロピリジン（isopropylidine）環系を用いたインジナビルの隣接したアミド窒素に結合しているインダン環のヒドロキシル基の保護、それに続くインジナビルの中央のヒドロキシル基の保護を必要とする。多くの適切な保護基が当技術分野においてよく知られている。例えば、Protective Groups in Organic Synthesis,第２版、T. GreeneおよびP. Wuts, Wiley-Interscience, 1991を参照されたい。
【００４９】
中央のヒドロキシル基は、シリル保護基、例えば、ＴＢＤＭＳ（ｔ−ブチルジメチルシリル）基またはＴＢＤＰＳ（ｔ−ブチルジフェニルシリル）基として保護することができる。また、イソプロピリジン保護されたインジナビルの中央のヒドロキシ官能基を保護するために、エステル基、好ましくは、塩基、特にトリエチルアミンの存在下でのベンゾエート基も使用することができる。実施例２および図５の化合物８を参照されたい。アシル化反応による中央のヒドロキシル基の保護は、ＤＭＦなどの適切な溶媒、好ましくはＴＨＦ中において、一般的には０．５時間〜７日間行われる。イソプロピリジン基の脱保護後、インダンヒドロキシル基は修飾され、連結部位にウレタン結合を生じ得る。インダンヒドロキシルはまた、修飾されて連結部位にエーテル結合を生じ得るが、一方、インジナビルの中央のヒドロキシル基はシリル基として保護される。例えば、中央のヒドロキシル部位を保護するＴＢＤＭＳを有するインジナビル誘導体のイソプロピリジン基は、酸性条件下で脱保護することができ、遊離したインダンヒドロキシル基は、保護されたカルボン酸、またはフタルイミドとして保護されたアミノ基などの適切に保護された官能基を有するハロアルキル化剤を用いたアルキル化条件に置かれて、エーテル結合を形成しうる。カルボキシル基に保護基を持つかまたは持たないカルボキシアルキルイソシアネートは、インジナビルの標的ヒドロキシル基と直接反応し、保護されたカルボキシルウレタンまたはカルボキシアリールウレタンを生じうる。保護されたカルボキシル基は、好ましくは、塩基性または酸性条件下で除去されるエステルである。カルボキシル基はその後のコンジュゲート化のために活性エステルに変換されてもよく、またはポリペプチド、多糖、および標識に直接コンジュゲートされてもよい。あるいは、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルイソシアネートベンゾエートのような、事前に活性化されたカルボキシアルキルイソシアネートまたはカルボキシアリールイソシアネートはインジナビルヒドロキシル基と直接反応しうる。
【００５０】
別のカルボン酸活性化は無水物形成によるものである。一般的に、カルボン酸は、ＤＭＦもしくはＴＨＦなどの溶媒中、トリエチルアミンまたはＮ−メチルモルホリンなどの第３級アミンの存在下で、通常−３０℃〜＋３０℃、多くの場合は−２０℃〜０℃の温度で、クロロギ酸イソブチルのようなクロロギ酸アルキルと反応する。混合無水物はその後、標識、タンパク質またはペプチドのアミノ基と反応して、安定なアミドコンジュゲートを生じる。
【００５１】
カルボン酸と結合されたプロテアーゼ阻害剤の別の活性化方法は、カルボン酸基とホモシステインチオラクトンのような物質とのカップリングによる、チオラクトンのようなマスクされたチオール基への変換である（米国特許第５，３０２，７１５号）。その結果生じるリンカー−チオラクトンはその後、弱塩基によってマスクを外されて末端チオールを生じ、それはその後、マレイミド修飾もしくはハロアセチル修飾されたペプチド、多糖、ポリアミノ酸、および標識などのマレイミド基またはブロモアセチル基またはヨードアセチル基のような部分に反応性であり、チオ−マレイミドもしくはチオール−アセチル付加物を生じる。
【００５２】
本発明の別の実施形態は、インジナビルＭ６を生成する方法に関する。この単一ステップの還元は、水素化条件下で、例えば、１０％ Ｐｄ−Ｃ、５％ Ｐｄ−Ｃ、ギ酸アンモニウム／Ｐｄ−Ｃ、および２０％のＣ担持水酸化パラジウムなどの触媒を用いて、メタノール、エタノール、酢酸、またはＴＨＦなどの溶媒中、特にメタノール中、室温で１ａｔｍ〜６０ｐｓｉの圧力下で行うことができる。
【化１６】
【００５３】
その結果生じるインジナビルＭ６は、下記のような新しいインジナビルハプテン誘導体を調製するために使用することができる。
【００５４】
本発明の別の実施形態では、インジナビル誘導体は、下記の化学式によって表されるようにピリジン環またはベンゼン環で連結されており、
【化１７】
式中、ＹはＯ、ＳまたはＮＨであり、ｍは０または１であり、Ｌは飽和もしくは不飽和の直鎖または分岐鎖として配列する０〜４０個の炭素原子を含み、最大２個の環状構造と０〜２０個のヘテロ原子を含有する連結基であるが、３個以上のヘテロ原子が連続して結合していてはならない。Ａは、活性エステル、イソシアネート、イソチオシアネート、チオール、イミドエステル、無水物、およびマレイミドからなる群より選択される活性型官能基である。
【００５５】
適切に官能化され保護されたアルキルハロピリジン誘導体は、塩基性条件下でインジナビルＭ６とカップリングすることができる。インジナビルＭ６のピペラジン部分の環状第２級アミン基と適切に官能化され保護されたホルミルピペリジン誘導体とのカップリング反応はまた、還元的アミノ化条件下でも実施することができ、同一の生成物を生じる。
【００５６】
適切に保護されたアルキルハロベンゼン誘導体および芳香族アルデヒド誘導体もまた、同様にインジナビルＭ６とのカップリングに使用することができる（実施例２１および図１２を参照のこと）。脂肪族リンカーもまた、適切に官能化された脂肪族ハロアルキルリンカーを用いた塩基性条件下で、または適切に官能化された脂肪族アルデヒドもしくは市販のコハク酸を用いた還元的アミノ化条件下で、上記と同様の化学反応を用いてインジナビルＭ６のピペラジン部分に結合することができる。例えば、化合物１６（図１０）は、シアノホウ化水素ナトリウムの存在下でコハク酸セミアルデヒドを用いて調製することができる。
【００５７】
これらの活性化ハプテンは以下の構造を有し、
【化１８】
式中、ＹはＯ、ＳまたはＮＨであり、ｍは０または１であり、Ｌは飽和もしくは不飽和の直鎖または分岐鎖として配列する０〜４０個の炭素原子と、０〜２０個のヘテロ原子とを含む脂肪族連結基であるが、３個以上のヘテロ原子が連続して結合していてはならない。Ａは、活性エステル、イソシアネート、イソチオシアネート、チオール、イミドエステル、無水物、およびマレイミドからなる群より選択される活性型官能基である。
【００５８】
本発明の別の実施形態は、以下から選択される構造を有する免疫原に関連し、
【化１９】
【化２０】
【化２１】
【化２２】
式中、ＸはＮまたはＣであり、Ｌは飽和もしくは不飽和の直鎖または分岐鎖として配列する０〜４０個の炭素原子を含み、さらに最大２個の環状構造と０〜２０個のヘテロ原子を含有する連結基であるが、３個以上のヘテロ原子が連続して結合していてはならず、Ｚは、−ＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯ−、−ＮＨＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＳＮＨ−、−ＯＣＯＮＨ−、−ＮＨＯＣＯ−、−Ｓ−、−ＮＨ（Ｃ＝ＮＨ）−、−Ｎ＝Ｎ−、−ＮＨ−および
【化２３】
からなる群より選択される部分であり、Ｑは、ポリペプチド、多糖、合成ポリマー、および非同位体標識からなる群より選択され、かつｎはＱの分子量５０キロダルトンあたり１〜５０の数であるが、さらに構造ＶＩＩＩでは、Ｌは飽和もしくは不飽和の直鎖または分岐鎖として配列する０〜４０個の炭素原子を含み、さらに０〜２０個のヘテロ原子を含有する脂肪族連結基でなければならない。
【００５９】
免疫原性担体は一般的に、１０ｋＤより大きい分子量を有するポリペプチドまたは多糖である。好ましい担体物質の例としては、キーホールリンペット・ヘモシアニン（ＫＬＨ）、リムルスポリヘムス・ヘモシアニン（ＬＰＨ）、およびウシサイログロブリン（ＢＴＧ）が挙げられる。前述のような活性化ハプテン誘導体と担体上のアミノ基との間の反応は、通常、水およびＤＭＳＯなどの水混和性有機溶媒の緩衝混合物中、室温で０．５〜５日間行われる。バッファーのｐＨは通常、活性エステル、イソシアネート、およびイソチオシアネートに対しては６〜８、またはイミダートに対しては７〜１０であり、担体アミノ基および活性型官能基の既知の反応性に従って調整される。末端基Ａがマレイミドである場合、担体の反応基はチオールである。これらのチオール基は担体にもともと存在するか、または、２−ＩＴもしくはＳＡＴＰなどのチオール化試薬を用いて導入される。チオエーテルを生じるためのマレイミドのチオール基へのコンジュゲーションに最適なｐＨは、通常５〜７である。反応後、非コンジュゲート化ハプテンおよび有機溶媒を除去するために、免疫原は透析またはサイズ排除クロマトグラフィーにかけられる。
【００６０】
免疫原を得る別の方法は、活性基がアルデヒドである活性化ハプテンと担体タンパク質またはポリペプチドのアミノ基とのシッフ塩基を形成する反応と、それに続くシアノホウ化水素などの弱い還元剤を用いて安定なアミン結合を形成する還元による。この最後のアプローチにおける変形形態もまた、本発明が属する技術分野の当業者に提案されるであろう。
【００６１】
抗体を作製するために、免疫原は、凍結乾燥された免疫原を再水和して免疫原の溶液または懸濁液を調製することによって、宿主動物への注射のために調製することができる。あるいは、免疫原は事前に調製された溶液またはバッファー中の懸濁液として使用してもよい。免疫原溶液はその後、フロイントアジュバントなどのアジュバントと混合され、免疫原混合物を形成する。免疫原は様々な部位に、数回の投与で、１回以上、数週間にわたって投与する場合がある。
【００６２】
本発明の免疫原を用いたポリクローナル抗体の調製は、当業者にとって既知の任意の従来技術に従って行うことができる。通常、ウサギ、ヤギ、マウス、モルモット、またはウマなどの宿主動物に免疫原混合物を注射する。抗体力価について血清を評価しながら、最適な力価に達したことが決定されるまで、更なる注射を行う。その後、宿主動物から採血し、適切な量の特異抗血清を得る。必要であれば、抗血清がアッセイを行う上での使用に適しているか検討する前に、非特異的抗体のような不要物を除去するために精製ステップを行う。
【００６３】
モノクローナル抗体は、上述のように免疫されたマウス由来のマウスリンパ球と骨髄腫細胞とを、Methods in Enzymology 73 (Part B), pp. 3-46, 1981に記載される方法のようなポリエチレングリコール法を用いて融合させることによって得ることができる。
【００６４】
ＥＬＩＳＡアッセイの場合、マイクロタイタープレートのコーティングのためにはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）にカップリングされたインジナビル誘導体が好ましい。
【００６５】
インジナビルと非同位体標識とのコンジュゲートの合成のためには、免疫原の調製と同様の方法が用いられる。
【００６６】
あるいは、活性化ハプテンは、ＥＬＩＳＡ用の標識を調製するために酵素のアミノ基またはチオール基にコンジュゲートすることができる。コンジュゲートが当技術分野においてよく知られているＥＬＩＳＡのために有用な酵素のいくつかの例は、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼおよびβ−ガラクトシダーゼである。酵素をはじめとするタンパク質のコンジュゲートは、通常、水および水混和性有機溶媒の緩衝混合物中で調製され、続いて免疫原の調製のための条件と同様に透析される。ラテックス凝集アッセイの場合、１０ｋＤ〜３００ｋＤの分子量、好ましくは４０ｋＤの分子量を有するアミノ化デキストラン担体とのコンジュゲートが特に有用である。これらのコンジュゲートは上記のような緩衝溶媒混合物中で、または反応を促進するためにトリエチルアミンのような第３級アミンを含有するＤＭＳＯなどの無水有機溶媒中で調製される。低分子量、すなわち１ｋＤより小さい標識の場合、反応条件は標識の性質に従って調整される。特に好ましい１つの標識は、標識化されたアビジンまたはストレプトアビジンと併用するビオチンである。非同位体検出のための（ストレプト）アビジン／ビオチンシステムの汎用性は、バイオコンジュゲート化学の技術分野においてよく知られている（Hermanson、上掲参照）。高親和性相互作用でビオチン標識物質を検出する、様々なアビジンおよびストレプトアビジンの酵素標識および蛍光団標識コンジュゲートが市販されている。さらに、活性型官能基Ａと反応する、様々なビオチン化剤が市販されている。例えば、ビオチン−アミン誘導体は、Ａが活性エステル、イソシアネートまたはイソチオシアネートである本発明の活性化ハプテンと反応して、それぞれ、ビオチンアミド、尿素およびチオ尿素コンジュゲートを生じうる。これらのカップリング反応は一般的に、トリエチルアミンのような有機塩基を含有するＤＭＦまたはＤＭＳＯなどの双極性非プロトン性溶媒中で、室温で０．５〜５日間行われる。ビオチンコンジュゲートは、逆相ＨＰＬＣなどのクロマトグラフ法によって選択的に単離される。
【００６７】
他の好ましい標識は、フルオレセイン、ローダミン、テキサスレッド、ダンシル、およびシアニン色素、例えばＣｙ−５などの蛍光団であり、その多くの活性化誘導体が市販されている。通常、これらのコンジュゲートは、ビオチンコンジュゲートと同様に第３級アミンを含有する双極性非プロトン性溶媒中で調製され、その後クロマトグラフ単離される。
【００６８】
検出系に間接的にカップリングされる標識としてリポーター基を使用することも可能である。１つの例は、上述のようなビオチンである。別の例は、２００１年１月４日に公開されたＰＣＴ公開ＷＯ２００１０１１３５に記載されるようなイノシン一リン酸デヒドロゲナーゼの阻害のためのミコフェノール酸誘導体である。
【００６９】
ＨＩＶプロテアーゼ阻害剤活性化ハプテン上の活性基Ａとの反応のために、標識上に適切な求核基、例えばアミンまたはチオールを適切に導入した後、本発明に使用することができる、ルテニウムビピリジル誘導体のような電気化学発光標識、アクリジニウムエステルのような化学発光標識、電気化学メディエーター、ならびに様々な微粒子およびナノ粒子を含む他の非同位体標識の可能性があることは、当業者にとって明白であろう。
【００７０】
以下の実施例において、下線付きの数字は図面に示された対応する構造を指す。これらの実施例は説明のためにのみ提示され、本発明の限定を意図するものではない。
【実施例】
【００７１】
すべての溶媒は、特に指定のない限りJ.T. Bakerから入手した。分析用逆相ＲＰ−ＨＰＬＣ解析は、ダイオードアレイ検出器およびクォータナリポンプを組み込んだAgilent HP1100 ＬＣ／ＭＳシステムで行った。ＬＣ／ＭＳ解析は、AJO-4287 (C-180DS) カートリッジとともにPhenomenex KJO-4282ガードキットを装備したVydac 218TP54カラム（300A, 5μ; C18, ４．６ｍｍ×２５０ｍｍ）によって行った。クロマトグラフの流れはカラム後にＭＳ検出器に誘導した。使用したＭＳＤはエレクトロスプレーポジティブモード「ＥＳ（＋）モード」で作動させた。
【００７２】
ＨＰＬＣ画分の凍結乾燥には、特に指定のない限り、減圧下でのアセトニトリルの蒸発、それに続く、例えばドライアイス／アセトン浴を用いた水性残留物の凍結、それに続く、凍結乾燥機を用いた凍結乾燥を含めた。
【００７３】
調製用ＨＰＬＣには下記のVarian DYNAMAX（Rainin）半径方向圧縮カラムの１つを用いた。ＨＰＬＣ作業は、０．１％トリフルオロ酢酸を含有する水−アセトニトリルの勾配系を用いて行った。
Varian DYNAMAX（Rainin）ガードモジュールR00083221G（C-18, 8μ）を伴うR00083221C (Microsorb 60-8, C-18; ２５０ｍｍ×２１．４ｍｍ)。
Varian DYNAMAX（Rainin）ガードモジュールR00083241G（C-18, 8μ）を伴うR00083241C (Microsorb 60-8, C-18; ２５０ｍｍ×４１．４ｍｍ)。
【００７４】
実施例１
Ｎ−（１（Ｓ），２（Ｒ）−２，２−ジメチルインダニルオキサゾール）−２（Ｒ）−（フェニルメチル）−４（Ｓ）−ヒドロキシ−５−［１−［４−（３−ピリジルメチル）−２（Ｓ）−（Ｎ−ｔ−ブチルカルバモイル）ピペラジニル］］ペンタンアミド（７）
フラスコにマグネチックスターラーバー、還流冷却器およびアルゴンガス吸気口を取り付けた隔壁を装着させた。反応フラスコに１ｇ（１．４ｍｍｏｌ）の硫酸インジナビル（１）、３３ｍＬ（２８．７ｍｍｏｌ）の酢酸イソプロピル、１０ｍＬの無水ＤＭＦ、２．０ｍＬ（５２．５ｍｍｏｌ）の２−メトキシプロペンを入れ、続いて１．８ｇｍ（１５．５ｍｍｏｌ）のピリジニウムｐ−トルエンスルホン酸を室温ですべて一度に加えた。その後、反応物を撹拌し、４０℃で１．５時間加熱した。反応進行をＬＣ／ＭＳによってモニタリングし、それは反応の完了を示唆した。その後、反応混合物を室温に冷却し、１．０ｇｍ水酸化リチウム一水和物を加え、反応混合物を約５分間撹拌しておいた。溶媒を減圧下でロータリーエバポレーターで除去した。その結果生じた物質をその後、水に再溶解し、酢酸エチルで抽出した。有機相を集めて無水ＭｇＳＯ４で乾燥させてろ過し、溶媒をロータリーエバポレーターで除去した。その後、粗製油をシリカゲルカラムで精製し、２０：１ ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨで溶出した。生成物を含有するＲｆ ０．４３の画分を回収し、溶媒をロータリーエバポレーターで除去し、真空下で乾燥させて、８６％（０．７２ｇｍ）の収量、MS (m/z) 654.4 (M+H)のオフホワイトの粉末として生成物を得た。図５を参照されたい。
【００７５】
実施例２
Ｎ−（１（Ｓ），２（Ｒ）−２，２−ジメチルインダニルオキサゾール）−２（Ｒ）−（フェニルメチル）−４（Ｓ）−ベンゾイル−５−［１−［４−（３−ピリジルメチル）−２（Ｓ）−（Ｎ−ｔ−ブチルカルバモイル）ピペラジニル］］ペンタンアミド（８）
フラスコにマグネチックスターラーバーおよびアルゴンガス吸気口を取り付けた隔壁を装着させた。フラスコに０．６７ｇ（０．４４ｍｍｏｌ）の７、１０ｍＬの無水ＤＭＦ、７３８μＬ（５．３ｍｍｏｌ）のＥｔ３Ｎを入れた。混合物を６５℃まで加熱し、その温度で５ｍＬの無水ＤＭＦに溶解した１．０ｇｍ（４．４ｍｍｏｌ）の安息香酸無水物を滴下した。その後、反応混合物を８０℃で３日間加熱し、反応進行をＬＣ／ＭＳによってモニタリングした。反応混合物を室温に冷却し、溶媒を減圧下で除去した。その後粗製油を、０．１％トリフルオロ酢酸を含有するアセトニトリル−水の溶媒系を用いて行われる勾配を用いた調製用ＨＰＬＣによって精製した。生成物を含有する画分を回収し凍結乾燥して、８９％の収量、MS (EI): 758.4 (M+H)の０．３０ｇｍの目的とする生成物を得た。図５を参照されたい。
【００７６】
実施例３
Ｎ−（２Ｒ−ヒドロキシ−１（Ｓ）−インダニル）−２Ｒ−（フェニルメチル）−４（Ｓ）−ベンゾイル−５−［１−［４−（３−ピリジルメチル）−２（Ｓ）−（Ｎ−ｔ−ブチルカルバモイル）ピペラジニル］］ペンタンアミド（９）
フラスコにマグネチックスターラーバーおよびアルゴンガス吸気口を取り付けた隔壁を装着させた。フラスコに保護されたインジナビル誘導体８を入れ、続いて１０ｍＬのトリフルオロ酢酸：ジクロロメタンの１：１混合物を加えた。反応物を室温で２時間撹拌した。粗製物のＬＣ／ＭＳは反応が完了したことを示した。その後、溶媒を高真空ロータリーエバポレーターで除去し、粗製物を０．１％トリフルオロ酢酸を含有するアセトニトリル−水の溶媒系を用いて行われる勾配を用いた調製用ＨＰＬＣで精製した。生成物を含有する画分を回収し凍結乾燥して、７７％（０．２２ｇｍ）の目的とする生成物９を得た。MS (EI): 741.3 [(M+H)+Na], 718.3 (M+H), 586.3, 359.7, 298.7, 133.1, HRMS: C43H51N5O5の算出値: 718.3963; 検出値: 718.3967, [α]20D = -28.42°(C = 1.034, CH2Cl2)。図５を参照されたい。
【００７７】
実施例４
Ｎ−（２（Ｒ）−（４−ホルミルアミノ酪酸エチルエステル）−１（Ｓ）−インダニル）−２（Ｒ）−（フェニルメチル）−４（Ｓ）−ベンゾイル−５−［１−［４−（３−ピリジルメチル）−２（Ｓ）−（Ｎ−ｔ−ブチルカルバモイル）ピペラジニル］］ペンタンアミド（１０）
フラスコにマグネチックスターラーバーおよびアルゴンガス吸気口を取り付けた隔壁を装着させた。フラスコに２２０ｍｇ（０．３ｍｍｏｌ）のインジナビル誘導体９および無水ＴＨＦ中の１．２ｍＬ（９．２ｍｍｏｌ）のＥｔ３Ｎを入れた。反応混合物に０．９０ｍＬ（１１．５ｍｍｏｌ）のエチル−４−イソシアネートブチレートを加え、反応物をその後８０℃で２日間加熱した。ＬＣ／ＭＳは生成物形成を示した。反応物を室温に冷却し、溶媒をロータリーエバポレーターで除去し、残留物を０．１％トリフルオロ酢酸を含有するアセトニトリル−水の溶媒系を用いて行われる勾配を用いることによって調製用ＨＰＬＣで精製した。生成物を含有する画分を集めて凍結乾燥し、８７％（２３５ｍｇ）の生成物を得た。MS (EI): 875.4 (M+H), 438.3, 359.7, 158.1。図５を参照されたい。
【００７８】
実施例５
Ｎ−（２（Ｒ）−（４−ホルミルアミノ酪酸）−１（Ｓ）−インダニル）−２（Ｒ）−（フェニルメチル）−４（Ｓ）−ヒドロキシ−５−［１−［４−（３−ピリジルメチル）−２（Ｓ）−（Ｎ−ｔ−ブチルカルバモイル）ピペラジニル］］ペンタンアミド（１１）
２３５ｍｇ（０．２６８ｍｍｏｌ）の１０を入れたフラスコに１０ｍＬのメタノールおよび１０ｍＬの１Ｎ ＮａＯＨ水溶液を加えた。反応物を室温で１日間撹拌した。反応進行をＬＣ／ＭＳによってモニタリングし、それは生成物形成の完了を示唆した。反応物を減圧下で濃縮し、残留物を０．１％トリフルオロ酢酸を含有するアセトニトリル−水の溶媒系を用いて行われる勾配を用いることによって調製用ＨＰＬＣで精製した。生成物を含有する画分を集めて凍結乾燥し、９６％（１９０ｍｇ）の生成物１１を得た。MS (EI): 766.3 (M+Na), 743.3 (M+H), 372.1, 307.7, 60.1。図５を参照されたい。
【００７９】
実施例６
Ｎ−（２（Ｒ）−［（４−ホルミルアミノ酪酸−Ｎ−スクシンイミジルエステル）］−１（Ｓ）−インダニル）−２（Ｒ）−（フェニルメチル）−４（Ｓ）−ヒドロキシ−５−［１−［４−（３−ピリジルメチル）−２（Ｓ）−（Ｎ−ｔ−ブチルカルバモイル）ピペラジニル］］ペンタンアミド（１２）
５０ｍＬの丸底フラスコにマグネチックスターラーバーおよびアルゴンガス吸気口を備えた隔壁を装着させた。フラスコに１９０ｍｇ（０．２５ｍｍｏｌ）の１１、５ｍＬの無水ＴＨＦ、０．１３３ｍＬ（０．７４ｍｍｏｌ）の無水ジイソプロピルエチルアミンおよび２０７ｍｇ（０．６９ｍｍｏｌ）の［Ｏ−（Ｎ−スクシンイミジル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウム］テトラフルオロボレートを０℃で加えた。反応混合物を室温まで温めておき、その温度で２４時間撹拌し、減圧下で濃縮した。残留物を０．１％トリフルオロ酢酸を含有する水−アセトニトリルの勾配系を用いることによって調製用ＨＰＬＣで精製した。含有している画分を集めて凍結乾燥し、白色の固体として５７ｍｇ（２７％）の生成物１２を得た。MS (m/z): 840.4 (M+H), 725.4, 482.3, 420.7, 298.7, 130.2。図５を参照されたい。
【００８０】
実施例７
インダン環からのインジナビル−ＢＳＡコンジュゲート（１３Ａ）
５．８ｍＬの５０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．５）中０．３４ｇのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）溶液を氷浴で冷却した。溶液に８．５ｍＬのＤＭＳＯを滴下し、反応混合物を室温未満に維持した。タンパク質溶液に、１．５ｍＬの無水ＤＭＦ中１５ｍｇ（０．０１７ｍｍｏｌ）のインジナビル誘導体（１２）溶液を滴下した。反応混合物を室温で２４時間撹拌しておいた。その結果生じたコンジュゲートを透析チューブ（１０，０００ＭＷカットオフ）に入れ、室温で１Ｌの７０％ＤＭＳＯ、５０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．５、３回、少なくとも各３時間）、１Ｌの５０％ＤＭＳＯ、５０ｍＭリン酸カリウム（少なくとも３時間）、１Ｌの３０％ＤＭＳＯ、５０ｍＭリン酸カリウム（少なくとも３時間）、１Ｌの１０％ＤＭＳＯ、５０ｍＭリン酸カリウム（少なくとも３時間）で透析し、続いて、４℃で５０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．５）を用いて６回（各１Ｌ、少なくとも各６時間）の透析を行った。Ｂｉｏｒａｄクマシーブルータンパク質アッセイ（Bradford, M., Anal. Biochem. 72, 248, 1976）を用い、タンパク質濃度は１４ｍｇ／ｍＬであると測定された。合計２１．５ｍＬのコンジュゲートが得られた。図６を参照されたい。
【００８１】
実施例８
インダン環からのインジナビル−ＫＬＨコンジュゲート（１３Ｂ）
２ｍＬの５０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．５）中７２ｍｇのキーホールリンペット・ヘモシアニン（ＫＬＨ）溶液を氷浴で冷却した。反応混合物の溶液に４．７ｍＬのＤＭＳＯを滴下し、反応温度を室温以下に維持した。その後、６７０μＬのＤＭＦ中１６．７ｍｇ（０．０１８ｍｍｏｌ）の５の溶液をタンパク質溶液に滴下した。その混合物を室温で１８時間撹拌しておいた。その結果生じたコンジュゲートを透析チューブ（１０，０００ＭＷカットオフ）に入れ、室温で１Ｌの７０％ＤＭＳＯ、５０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．５、３回、少なくとも各３時間）、１Ｌの５０％ＤＭＳＯ、５０ｍＭリン酸カリウム（少なくとも３時間）、１Ｌの３０％ＤＭＳＯ、５０ｍＭリン酸カリウム（少なくとも３時間）、１Ｌの１０％ＤＭＳＯ、５０ｍＭリン酸カリウム（少なくとも３時間）で透析した。Ｂｉｏｒａｄクマシーブルータンパク質アッセイを用い、タンパク質濃度は１１ｍｇ／ｍＬであると測定された。ＴＮＢＳ法（Habeeb AFSA, Anal. Biochem. 14, 328-34, 1988）によって、利用可能なリジン修飾の程度は４６％であると測定された。図６を参照されたい。
【００８２】
実施例９
Ｎ−（２（Ｒ）−ヒドロキシ−１（Ｓ）−インダニル）−２（Ｒ）−（フェニルメチル）−４（Ｓ）−ヒドロキシ−５−［１−［４−（３−｛１−（３−ｔ−ブトキシカルボニル−プロピル）｝ピリジルメチル）−２（Ｓ）−（Ｎ−ｔ−ブチルカルバモイル）ピペラジニル］］ペンタンアミドトリフルオロ酢酸塩（３）
マグネチックスターラーバー、アルゴンガス吸気口を取り付けた隔壁を備えたフラスコに、０．２ｇｍ（０．２８ｍｍｏｌ）の硫酸インジナビル、５ｍＬの無水ＤＭＦを加え、続いて７２μＬ（０．５６ｍｍｏｌ）のＥｔ３Ｎを加えた。この撹拌溶液に、シリンジによって０．４３ｇｍ（１．９６ｍｍｏｌ）のｔ−ブチル−４−ブロモブチレートを加えた。その後、フラスコの内容物を８０℃で１６時間加熱した。粗製物のＬＣ／ＭＳは生成物形成を示し、反応混合物を室温に冷却して溶媒をロータリーエバポレーターで除去した。その後、残留物を０．１％トリフルオロ酢酸を含有する水−アセトニトリルの勾配系を用いることによって調製用ＨＰＬＣで精製した。生成物を含有する画分を集めて凍結乾燥し、７１％（０．１７４ｇｍ）のモノアルキル化生成物を得た。この時点では、アルキル化が起こりうる多数の部位が存在するため、生成物の構造は不明であった。
【００８３】
幸運な偶然にも、その求電子試薬のアルキル化はピリジン環の窒素で起こり、対応するピリジニウムカチオンを生じた。その構造は１Ｈ ＮＭＲおよびＮＯＥ実験を用いて解明された。ピリジニウム窒素に隣接したメチレンプロトンは、４．７０ｐｐｍで三重項として示される。これらのメチレンプロトン（４．７０ｐｐｍ）は、放射線照射された場合、ピリジル窒素原子に隣接した２つのＨαメチンプロトンにおいて、アルキル化されたピリジン環の特徴的な指標となる８．９ｐｐｍおよび９．０２ｐｐｍでのＮＯＥ効果を示し、従って、生成物３の構造が確認された。MS (EI): 756.4 (M+H), 378.7, 330.2, 133.1, HRMS: C44H62N5O6の算出値: 756.4695, 検出値: 756.4693。図７を参照されたい。
【００８４】
実施例１０
Ｎ−（２（Ｒ）−ヒドロキシ−１（Ｓ）−インダニル）−２（Ｒ）−（フェニルメチル）−４（Ｓ）−ヒドロキシ−５−［１−［４−（３−｛１−（３−酪酸）｝ピリジルメチル）−２（Ｓ）−（Ｎ−ｔ−三ブチルカルバモイル）ピペラジニル］］ペンタンアミドトリフルオロアセテート（４）
０．１６５ｇｍ（０．１９ｍｍｏｌ）の３に１０ｍＬの１：１トリフルオロ酢酸：ジクロロメタンを加えた。反応物を室温で３０分間撹拌した。粗反応混合物のＬＣ／ＭＳは生成物のピークのみを示した。反応混合物をロータリーエバポレーターで濃縮した。その後、残留物を０．１％トリフルオロ酢酸を含有する水−アセトニトリルの勾配系を用いることによって調製用ＨＰＬＣで精製した。生成物を含有する画分を集めて凍結乾燥し、３８％（０．０５９ｇｍ）の生成物４を得た。MS (EI): 700.3 (M+H), 568.3, 551.3, 350.8, 341.7, 133.1., HRMS: C40H54N5O6の算出値: 700.4069, 検出値: 700.4075, [α]20D＝＋30.5°(C＝1.0, CH2Cl2)。図７を参照されたい。
【００８５】
実施例１１
Ｎ−（２（Ｒ）−ヒドロキシ−１（Ｓ）−インダニル）−２（Ｒ）−（フェニルメチル）−４（Ｓ）−ヒドロキシ−５−［１−［４−（３−｛１−（４−Ｎ−スクシンイミジルブチラート）｝ピリジルメチル）−２（Ｓ）−（Ｎ−ｔ−ブチルカルバモイル）ピペラジニル］］ペンタンアミドトリフルオロアセテート（５）
５０ｍＬの丸底フラスコ（事前に真空下でヒートガン乾燥した）に、マグネチックスターラーバー、アルゴンガス吸気口を取り付けた隔壁を装着させた。フラスコに、２０ｍｇ（０．０２４ｍｍｏｌ）の４、５ｍＬの無水ＴＨＦ、１２μＬのＥｔ３Ｎを入れ、続いて、１９．９ｍｇ（０．０６６ｍｍｏｌ）の［Ｏ−（Ｎ−スクシンイミジル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウム］テトラフルオロボレートをすべて一度に加えた。反応物を０℃で撹拌し、６時間かけて室温まで温めた。粗反応混合物のＬＣ／ＭＳは生成物形成を示し、反応混合物をロータリーエバポレーターで濃縮した。残留物を０．１％トリフルオロ酢酸を含有する水−アセトニトリルの勾配系を用いて調製用ＨＰＬＣで精製した。生成物を含有する画分を集めて凍結乾燥し、９４．１４％（２１．０ｍｇ）の生成物を得た。MS (EI): 797.3 (M+H), 648.3, 399.2, 324.7, HRMS: C44H57N6O8の算出値: 797.4233, 検出値: 797.4237., [α]D20＝＋44.06°(C＝1.0, CH2Cl2)。図７を参照されたい。
【００８６】
実施例１２
ピリジル環からのインジナビル−ＢＳＡコンジュゲート（６Ａ）
２．４ｍＬの５０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．５）中０．２３ｇのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）溶液を氷浴で冷却した。溶液に４．２５ｍＬのＤＭＳＯを滴下し、反応混合物を室温未満に維持した。タンパク質溶液に、１．５ｍＬの無水ＤＭＦ中１５ｍｇ（０．０１６ｍｍｏｌ）のインジナビル誘導体（５）溶液を滴下した。反応混合物を室温で２４時間撹拌しておいた。その結果生じたコンジュゲートを透析チューブ（１０，０００ＭＷカットオフ）に入れ、室温で１Ｌの７０％ＤＭＳＯ、５０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．５、３回、少なくとも各３時間）、１Ｌの５０％ＤＭＳＯ、５０ｍＭリン酸カリウム（少なくとも３時間）、１Ｌの３０％ＤＭＳＯ、５０ｍＭリン酸カリウム（少なくとも３時間）、１Ｌの１０％ＤＭＳＯ、５０ｍＭリン酸カリウム（少なくとも３時間）で透析し、続いて、４℃で５０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．５）を用いて６回（各１Ｌ、少なくとも各６時間）の透析を行った。Ｂｉｏｒａｄクマシーブルータンパク質アッセイを用い、タンパク質濃度は１２ｍｇ／ｍＬであると測定された。合計１８ｍＬのコンジュゲートが得られた。図７を参照されたい。
【００８７】
実施例１３
ピリジル環からのインジナビル−ＫＬＨコンジュゲート（６Ｂ）
１．５ｍＬの５０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．５）中５４ｍｇのキーホールリンペット・ヘモシアニン（ＫＬＨ）溶液を氷浴で冷却した。反応混合物に４．７ｍＬのＤＭＳＯを滴下し、反応温度を室温未満に維持した。その後、６７０μＬのＤＭＦ中１６．７ｍｇ（０．０１８ｍｍｏｌ）の５の溶液をタンパク質溶液に滴下した。その混合物を室温で１８時間撹拌しておいた。その結果生じたコンジュゲートを透析チューブ（１０，０００ＭＷカットオフ）に入れ、室温で１Ｌの７０％ＤＭＳＯ、５０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．５、３回、少なくとも各３時間）、１Ｌの５０％ＤＭＳＯ、５０ｍＭリン酸カリウム（少なくとも３時間）、１Ｌの３０％ＤＭＳＯ、５０ｍＭリン酸カリウム（少なくとも３時間）、１Ｌの１０％ＤＭＳＯ、５０ｍＭリン酸カリウム（少なくとも３時間）で透析した。Ｂｉｏｒａｄクマシーブルータンパク質アッセイを用い、タンパク質濃度は１１ｍｇ／ｍＬであると測定された。ＴＮＢＳ法によって、利用可能なリジン修飾の程度は４６％であると測定された。図７を参照されたい。
【００８８】
実施例１４
Ｍ６−インジナビル代謝物（２）
マグネチックスターラーバーを装着したフラスコに、０．３０ｇｍ（０．４２１４ｍｍｏｌ）の硫酸インジナビル（１）、３０ｍＬのメタノールを入れ、続いて、４０ｍｇの２０ｗｔ％Ｐｄ（ＯＨ）２／Ｃ触媒を加えた。反応容器中の空気を真空下で除去し、水素ガスを導入して１ａｔｍにした。その後、反応物を室温で１６時間撹拌した。その時、粗製物のＬＣ／ＭＳは反応の完了を示した。その後、それをＣＥＬＩＴＥのパッドでろ過し、溶媒をロータリーエバポレーターで除去し、真空下で乾燥させて９９％（０．２１８７ｇｍ）の生成物を得た。ＭＰ＝１４７℃、ＴＣＬ（シリカゲル）Ｒｆ＝０．３５（ＭｅＯＨ）、MS (EI): 523.3 (M+H), HRMS: C30H42N4O4の算出値: 523.3279, 検出値: 523.3282, [α]D20＝＋13.32°(C＝1.036, CH2Cl2)。図８を参照されたい。
【００８９】
実施例１５
Ｎ−（２（Ｒ）−ヒドロキシ−１（Ｓ）−インダニル）−２（Ｒ）−（フェニルメチル）−４（Ｓ）−ヒドロキシ−５−［１−［４−（４−安息香酸メチル）−２（Ｓ）−（Ｎ−ｔ−ブチルカルバモイル）ピペラジニル］］ペンタンアミド（１４）
マグネチックスターラーバーを装着した丸底フラスコに、無水ＣＨ２Ｃｌ２中７０ｍｇ（０．１３４６ｍｍｏｌ）のインジナビルＭ６（２）を入れ、続いて、２４ｍｇ（０．１６ｍｍｏｌ）の４−カルボキシベンズアルデヒドおよび１６．８ｍｇ（０．２６ｍｍｏｌ）のシアノホウ化水素ナトリウムを加えた。反応混合物を室温で１日間撹拌した。その後それを水によって停止させ、３×２０ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２で抽出した。有機相を集め、無水ＭｇＳＯ４で脱水してろ過し、溶媒をロータリーエバポレーターで除去した。その後、粗製混合物を１：１ヘキサン：酢酸エチルで溶出するシリカゲルカラムで精製し、８０％（７１ｍｇ）を得た。MS (m/z) = 657.3 (M+H)。図９を参照されたい。
【００９０】
実施例１６
４−｛３−ｔ−ブチルカルバモイル−４−［２−ヒドロキシ−４−（２−ヒドロキシ−インダン−１−イルカルバモイル）−５−フェニル−ペンチル］−ピペラジン−１−イルメチル｝−安息香酸２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イルエステル（１５）
５０ｍＬの丸底フラスコ（事前に真空下でヒートガン乾燥した）に、マグネチックスターラーバー、アルゴンガス吸気口を取り付けた隔壁を装着させる。フラスコに、２０ｍｇ（０．０３ｍｍｏｌ）の１４、５ｍＬの無水ＴＨＦ、１２μＬのＥｔ３Ｎを入れ、続いて、１９．９ｍｇ（０．０６ｍｍｏｌ）の［Ｏ−（Ｎ−スクシンイミジル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウム］テトラフルオロボレートをすべて一度に加える。反応物を０℃で撹拌し、室温まで温め、その温度で６時間撹拌しておく。反応混合物をロータリーエバポレーターで濃縮し、調製用ＨＰＬＣで精製して目的とする生成物を得る。図９を参照されたい。
【００９１】
実施例１７
Ｎ−（２（Ｒ）−ヒドロキシ−１（Ｓ）−インダニル）−２（Ｒ）−（フェニルメチル）−４（Ｓ）−ヒドロキシ−５−［１−［４−酪酸］］）−２（Ｓ）−（Ｎ−ｔ−ブチルカルバモイル）ピペラジニル］］ペンタンアミド（１６）
マグネチックスターラーバーと隔壁を装着したフラスコに、０．１ｇ（０．１９ｍｍｏｌ）のインジナビルＭ６（２）、１０ｍＬの無水ＣＨ２Ｃｌ２を入れ、続いて、０．０１２ｇ（０．１９ｍｍｏｌ）のシアノホウ化水素ナトリウムおよび０．０２５ｇ（０．２３ｍｍｏｌ）のコハク酸セミアルデヒド（水中で１５重量％）を加えた。反応物を室温で一晩撹拌した。その後、２０ｍＬの脱イオン水によって反応を停止させ、３Ｎ ＨＣｌによって酸性化し、３×２０ｍＬのジエチルエーテルで抽出した。有機相を集めて無水ＭｇＳＯ４で脱水し、ろ過して溶媒をロータリーエバポレーターで除去した。その後それを、０．１％トリフルオロ酢酸を含有する水−アセトニトリルの勾配系を用いて、調製用ＨＰＬＣで精製した。生成物を含有する画分を集めて凍結乾燥し、６８ｍｇ（４２％）の収量を得た。MS (m/z) = 609.3 (M+H), 477.3, 133.1。図１０を参照されたい。
【００９２】
実施例１８
４−｛３−ｔ−ブチルカルバモイル−４−［２−ヒドロキシ−４−（２−ヒドロキシ−インダン−１−イルカルバモイル）−５−フェニル−ペンチル］−ピペラジン−１−イル｝−酪酸２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イルエステル（１７）
５０ｍＬの乾燥させた丸底フラスコに、マグネチックスターラーバー、アルゴンガス吸気口を取り付けた隔壁を装着させる。フラスコに、０．０３２ｍｍｏｌ（２０ｍｇ）の１６、５ｍＬの無水ＴＨＦ、１２μＬのＥｔ３Ｎを入れ、続いて、０．０６ｍｍｏｌ（１９．９ｍｇ）の［Ｏ−（Ｎ−スクシンイミジル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウム］テトラフルオロボレートをすべて一度に加える。反応物を０℃で撹拌し、６時間かけて徐々に室温まで温める。反応混合物をロータリーエバポレーターで濃縮し、調製用ＨＰＬＣで精製して目的とする活性エステル１７を得る。図１０を参照されたい。
【００９３】
実施例１９
Ｎ−（２（Ｒ）−ヒドロキシ−１（Ｓ）−インダニル）−２（Ｒ）−（フェニルメチル）−４（Ｓ）−ヒドロキシ−５−［１−［４（２−メチルピコレートメチル）］］−２（Ｓ）−（Ｎ−ｔ−ブチルカルバモイル）ピペラジニル］］ペンタンアミド（１８）
マグネチックスターラーバーと隔壁を装着したフラスコに、５０ｍｇ（０．０９５ｍｍｏｌ）のインジナビルＭ６（２）、４ｍＬの無水ＤＭＦ、１５μＬの無水Ｅｔ３Ｎを入れ、続いて、０．０２４ｇ（０．１０ｍｍｏｌ）の２−ブロモメチルピリジン−６−カルボン酸メチルエステルを加えた。反応物を室温で３時間撹拌し、反応進行をＬＣ／ＭＳによってモニタリングした。その後、溶媒を高真空で除去し、物質を調製用ＨＰＬＣで精製した。生成物を含有する画分を集めて凍結乾燥し、２４．７ｍｇ（３８％）の生成物を得た。MS (m/z) = 694.3 (M+Na), 672.3 (M+H), 540.3, 336.7, 133.1。図１１を参照されたい。
【００９４】
実施例２０
６−｛３−ｔ−ブチルカルバモイル−４−［２−ヒドロキシ−４−（２−ヒドロキシ−インダン−１−イルカルバモイル）−５−フェニル−ペンチル］−ピペラジン−１−イルメチル｝−ピリジン−２−カルボン酸（１９）
２５ｍｇ（０．０３７ｍｍｏｌ）の１８を含むフラスコに、３ｍＬのメタノールおよび３ｍＬの１Ｎ ＮａＯＨ水溶液を加える。反応物を室温で１日間撹拌する。ＬＣ−ＭＳは生成物形成の完了を示す。反応混合物を減圧下で濃縮し、残留物を０．１％トリフルオロ酢酸を含有するアセトニトリル−水の溶媒系を用いて行われる勾配を用いた調製用ＨＰＬＣによって精製する。生成物を含有する画分を集めて凍結乾燥し、目的とする生成物１９を得る。図１１を参照されたい。
【００９５】
実施例２１
６−｛３−ｔ−ブチルカルバモイル−４−［２−ヒドロキシ−４−（２−ヒドロキシ−インダン−１−イルカルバモイル）−５−フェニル−ペンチル］−ピペラジン−１−イルメチル｝−ピリジン−２−カルボン酸２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イルエステル（２０）
乾燥させた５０ｍＬの丸底フラスコに、マグネチックスターラーバー、アルゴンガス吸気口を取り付けた隔壁を装着させる。フラスコに、２０ｍｇ（０．０３０ｍｍｏｌ）のインジナビル酸１９、５ｍＬの無水ＴＨＦ、１２μＬのＥｔ３Ｎを入れ、続いて、１９．９ｍｇ（０．０６ｍｍｏｌ）の［Ｏ−（Ｎ−スクシンイミジル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウム］テトラフルオロボレートをすべて一度に加える。反応物を０℃で撹拌し、徐々に室温まで温める。反応混合物を室温で６時間撹拌し、ロータリーエバポレーターで濃縮する。残留物を０．１％トリフルオロ酢酸を含有するアセトニトリル−水の溶媒系を用いて行われる勾配を用いた調製用ＨＰＬＣで精製する。生成物を含有する画分を集めて凍結乾燥し、目的とする生成物２０を得る。図１１を参照されたい。
【００９６】
実施例２２
５−｛３−ｔ−ブチルカルバモイル−４−［２−ヒドロキシ−４−（２−ヒドロキシ−インダン−１−イルカルバモイル）−５−フェニル−ペンチル］−ピペラジン−１−メチル｝−ピリジン−２−カルボン酸エチルエステル（２１）
マグネチックスターラーバーと隔壁を装着した丸底フラスコに、無水ＣＨ２Ｃｌ２中７０ｍｇ（０．１３ｍｍｏｌ）のインジナビルＭ６（２）を入れ、続いて、０．１６ｍｍｏｌ（２６ｍｇ）の５−ホルミル−２−ピリジンカルボン酸エチルエステル（ＵＳ ４，５２６，７８７号）および１６．８ｍｇ（０．２６ｍｍｏｌ）のシアノホウ化水素ナトリウムを加える。反応混合物を室温で１日間撹拌する。反応混合物を水によって停止させ、３×２０ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２で抽出する。有機相を集め、無水ＭｇＳＯ４で脱水してろ過し、溶媒をロータリーエバポレーターで除去する。その後、粗製混合物をシリカゲルカラムで精製し、目的とする生成物を得る。図１２を参照されたい。
【００９７】
実施例２３
５−｛３−ｔ−ブチルカルバモイル−４−［２−ヒドロキシ−４−（２−ヒドロキシ−インダン−１−イルカルバモイル）−５−フェニル−ペンチル］−ピペラジン−１−イルメチル｝−ピリジン−２−カルボン酸（２２）
２５ｍｇ（０．０３７ｍｍｏｌ）の２１を含むフラスコに、３ｍＬのメタノールおよび３ｍＬの１Ｎ ＮａＯＨ水溶液を加える。反応物を室温で１日間撹拌する。ＬＣ−ＭＳは生成物形成の完了を示す。反応物を減圧下で濃縮し、残留物を０．１％トリフルオロ酢酸を含有するアセトニトリル−水の溶媒系を用いて行われる勾配を用いた調製用ＨＰＬＣによって精製する。生成物を含有する画分を回収し、溶媒をロータリーエバポレーターで除去し、凍結乾燥して目的とする生成物を得る。図１２を参照されたい。
【００９８】
実施例２４
５−｛３−ｔ−ブチルカルバモイル−４−［２−ヒドロキシ−４−（２−ヒドロキシ−インダン−１−イルカルバモイル）−５−フェニル−ペンチル］−ピペラジン−１−イルメチル｝−ピリジン−２−カルボン酸２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イル（２３）
５ｍＬの無水ＴＨＦ中２０ｍｇ（０．０３０ｍｍｏｌ）の２２の溶液に、１２μＬのＥｔ３Ｎを加え、続いて、１９．９ｍｇ（０．０６ｍｍｏｌ）の［Ｏ−（Ｎ−スクシンイミジル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウム］テトラフルオロボレートを加える。反応物を０℃で撹拌し、室温まで温める。反応混合物を室温で６時間撹拌し、ロータリーエバポレーターで濃縮する。残留物を０．１％トリフルオロ酢酸を含有するアセトニトリル−水の溶媒系を用いて行われる勾配を用いた調製用ＨＰＬＣで精製する。生成物を含有する画分を集めて凍結乾燥し、目的とする生成物を得る。図１２を参照されたい。
【００９９】
実施例２５
イムノアッセイ形式の原理
本明細書に記載されるインジナビルのためのアッセイ形式は、均一系微粒子イムノアッセイである。それは、血清中のインジナビルの検出のための２試薬システムである。溶液中の微粒子の動力学的相互作用（ＫＩＭＳ）は、Roche Diagnostics/Hitachiファミリーの自動分析装置を用いて測定した。この技術では、インジナビル抗体は微粒子上に共有結合され、薬物誘導体は高分子（アミノデキストラン）に結合される。微粒子上の限られた量の特異的インジナビル抗体との結合について、薬物コンジュゲートと血清サンプル中のインジナビル（存在すれば）との間での競合反応が起こる。溶液中の微粒子の動力学的相互作用は、微粒子上での薬物コンジュゲートと抗体との結合によって引き起こされ、サンプル中のインジナビルの存在によって阻害される。
【０１００】
インジナビル抗体は、ＵＳ ２００４／４０１２７６８９に記載されるインジナビル免疫原から作製した。
【０１０１】
実施例２６
インダン環からのインジナビル−アミノデキストランコンジュゲート（１３Ｃ）
アミノデキストラン（ＭＷ４０，０００）は、ＵＳ６，６５３，４５６号に記載される方法に従って調製した。ＴＮＢＳアッセイによって、生成物は１モルのアミノデキストランあたり５．７アミノ基を有することが分かった。
【０１０２】
このアミノデキストランは、（インダン環からの）インジナビル−アミノデキストランコンジュゲートを調製するために使用された。２０ｍｇのアミノデキストランに室温で１ｍＬのＤＭＳＯを加えた。混合物を室温ですべてのアミノデキストランが溶液になるまで撹拌しておいた。反応混合物に１３μＬ（０．０９２ｍｍｏｌ）のトリエチルアミンを加えた。インジナビル誘導体１２、８．８７ｍｇ（０．０１０ｍｍｏｌ）を０．４４ｍＬの無水ＤＭＳＯに溶解し、撹拌されるアミノデキストラン溶液に滴下した。混合物を室温で４８時間撹拌しておき、SPECTRA/POR透析チューブ（ＭＷカットオフ３５００）に移し、以下のように（１Ｌ容量、少なくとも各８時間で）室温で透析した（各透析は１Ｌ容量を用いた）。すなわち、脱イオン水中８０％ＤＭＳＯ、６０％ＤＭＳＯ、４０％ＤＭＳＯ、および２０％ＤＭＳＯで透析し、続いて脱イオン水で透析を行った。
【０１０３】
溶液を透析チューブから回収して凍結乾燥し、白色の粉末として１５ｍｇのインジナビル−デキストランコンジュゲートを得た。図６を参照されたい。
【０１０４】
実施例２７
ピリジン環からのインジナビル−アミノデキストランコンジュゲート（６Ｃ）
このアミノデキストランは、（ピリジン環からの）インジナビル−アミノデキストランコンジュゲートを調製するために使用した。２０ｍｇのアミノデキストランに室温で１ｍＬのＤＭＳＯを加えた。混合物を室温ですべてのアミノデキストランが溶液になるまで撹拌しておいた。反応混合物に１３μＬ（０．０９２ｍｍｏｌ）のトリエチルアミンを加えた。インジナビル誘導体５、９．８６ｍｇ（０．０１１ｍｍｏｌ）を０．４４ｍＬの無水ＤＭＳＯに溶解し、撹拌中のアミノデキストラン溶液に滴下した。混合物を室温で４８時間撹拌しておき、SPECTRA/POR透析チューブ（ＭＷカットオフ３５００）に移し、以下のように（１Ｌ容量、少なくとも各８時間で）室温で透析した（各透析は１Ｌ容量を用いた）。すなわち、脱イオン水中８０％ＤＭＳＯ、６０％ＤＭＳＯ、４０％ＤＭＳＯ、および２０％ＤＭＳＯで透析し、続いて脱イオン水で透析を行った。溶液を透析チューブから回収して凍結乾燥し、白色の粉末として１５ｍｇのインジナビル−デキストランコンジュゲートを得た。図７を参照されたい。
【０１０５】
実施例２８
インジナビルラテックス試薬の調製
固形分１０％（ｗ／ｖ）のカルボン酸修飾ラテックス微粒子（Seradyn）を脱イオン水で固形分１％（ｗ／ｖ）に希釈した。懸濁液を３２，６００×ｇで１時間４℃で遠心分離した。ペレットを残し、超音波処理によって再懸濁した。１％ラテックス懸濁液を上述のような遠心分離によって５倍当量の脱イオン水で洗浄し、続いて、５倍等量の洗浄バッファー（５０ｍＭ ２−（Ｎ−モルホリノ）−エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、ｐＨ５．５）で洗浄した。ラテックス微粒子を４℃で保存した。ラテックス濃度をRoche Cobas Miraで測定し、５０ｍＭ ＭＥＳバッファー、ｐＨ５．５で１％（ｗ／ｖ）に調整した。
【０１０６】
洗浄された１％（ｗ／ｖ）ラテックスを、１０等量のＮ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）ならびに１０等量の５０ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ５．５中のスルホＮＨＳおよび脱イオン水中５０ｍｇ／ｍＬのＥＤＣ溶液によって活性化した。反応混合物を室温で２時間撹拌した。
【０１０７】
反応混合物を３２００×ｇで１時間４℃で遠心分離し、ラテックスペレットを５０ｍＭ ＭＯＰＳ、ｐＨ６．４に再懸濁した。ラテックス濃度をRoche Cobas Miraで測定し、ラテックス懸濁液を１％（ｗ／ｖ）に調整した。
【０１０８】
所望の量のインジナビルモノクローナル抗体（各抗体付加において、Ｍ２．３５．２およびＭ１．１５８．８それぞれについて１％（ｗ／ｖ）ラテックスあたり０．２ｍｇのＭａｂ（ＵＳ ２００４４０１２７６８９参照））を１％（ｗ／ｖ）ラテックスに加え、ラテックス混合物を室温で２時間撹拌した。
【０１０９】
ラテックス混合物に、５０ｍＭ ＭＯＰＳ、ｐＨ６．４中５０ｍｇ／ｍＬのＢＳＡを加え、室温で一晩撹拌することによって後ブロッキングした。
【０１１０】
ラテックス混合物を３２，６００×ｇで１時間４℃で遠心分離し、ラテックスペレットをラテックス保存バッファー（５０ｍＭ ＭＯＰＳ、０．１％ ＢＳＡ、０．０９％ ＮａＮ３、ｐＨ７．２）に再懸濁した。これが試薬Ｒ２である。
【０１１１】
ラテックスを上述のような遠心分離によってラテックス保存バッファーで３回洗浄した。ラテックス懸濁液の単分散をRoche Cobas Miraで測定した。ラテックス懸濁液濃度を１．５％に調整し、４℃で保存した。
【０１１２】
実施例２９
インジナビル較正曲線
硫酸インジナビルを５０％エタノールに溶解し、１ｍｇ／ｍＬ原液を調製した。２組の血清較正物および対照を調製した。低値セット血清較正物は、インジナビル原液からRoche TDM血清中０．２５、０．３２５、０．７５、１．５および３μｇ／ｍＬのインジナビル濃度で調製された。高値セット血清較正物には、０、０．７５、１．５、３、および１２μｇ／ｍＬの濃度でインジナビルが添加した。
【０１１３】
ｐＨ７．２で０．１％ポリアクリル酸および０．１％ＴＷＥＥＮ ２０を含有する１８０ｍＭ ＰＩＰＥＳバッファー中に０．２ｍｇ／ｍＬのインジナビルアミノデキストランコンジュゲート（１３Ｃまたは６Ｃ）を調製することによって、コンジュゲート試薬を調製した（試薬Ｒ１）。ラテックス試薬Ｒ２の調製は上述した。
【０１１４】
Hitachi 917自動分析装置（Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis）を用い、１２０μＬの第一調製済み試薬（Ｒ１）および１６０μＬの第二調製済み試薬（Ｒ２）および１５μＬのサンプル量を用いて、６００ｎｍの波長での吸収変化を測定して、アッセイを行った。
【図面の簡単な説明】
【０１１５】
【図１】実施例２９に記載されたように高値セット血清較正物を用い、コンジュゲート６Ｃを用いて作成した較正曲線である。
【図２】実施例２９に記載されたように低値セット血清較正物を用い、コンジュゲート６Ｃを用いて作成した較正曲線である。
【図３】実施例２９に記載されたように高値セット血清較正物を用い、コンジュゲート１３Ｃを用いて作成した較正曲線である。
【図４】実施例２９に記載されたように低値セット血清較正物を用い、コンジュゲート１３Ｃを用いて作成した較正曲線である。
【図５】実施例１〜６に記載されたようにインジナビルのインダン環ヒドロキシル基から活性化インジナビルハプテン１２を合成する手順を図解する。
【図６】それぞれ実施例７、８、および２６に記載されたように活性化ハプテン１２のＢＳＡ、ＫＬＨ、およびアミノデキストラン誘導体を合成する手順を図解する。
【図７】実施例９〜１１に記載されたようにインジナビルのピリジン環窒素から活性化インジナビルハプテン５を合成する手順、ならびに、それぞれ実施例１２、１３、および２７に記載されたようにＫＬＨ、ＢＳＡ、およびアミノデキストラン誘導体を合成する手順を図解する。
【図８】実施例１４に記載されたように水素ガスおよびパラジウム触媒の存在下でインジナビルから単一ステップでインジナビル代謝物Ｍ６（２）を合成する手順を図解する。
【図９】実施例１５および１６に記載されたようにＭ６のピペラジン窒素から置換芳香族連結基を有するインジナビル誘導体を合成する手順を図解する。
【図１０】実施例１７および１８に記載されたようにＭ６のピペラジン窒素から脂肪族連結基を有するインジナビル誘導体を合成する手順を図解する。
【図１１】実施例１９〜２１に記載されたようにＭ６のピペラジン窒素からピリジル連結基を有するインジナビル誘導体を合成する手順を図解する。
【図１２】実施例２２〜２４に記載されたようにＭ６のピペラジン窒素からピリジル連結基を有するインジナビル誘導体を合成する手順を図解する。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式：
【化１】
［式中、ＹはＯまたはＳであり、ｍは０または１であり、ＸはＣＨ２またはＮＨであり、Ｌは飽和もしくは不飽和の直鎖または分岐鎖として配列する０〜４０個の炭素原子を含み、最大２個の環状構造と０〜２０個のヘテロ原子を含有する連結基であるが、３個以上のヘテロ原子が連続して結合していてはならず、かつＡは、活性エステル、イソシアネート、イソチオシアネート、チオール、イミドエステル、無水物、マレイミド、チオラクトン、ジアゾニウム基、およびアルデヒドからなる群より選択される活性型官能基である］
により示される化合物。
【請求項２】
Ａが活性エステルである、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
ＹがＯであり、ｍが１であり、Ｌが３個の炭素原子を含んでなり、ＸがＮＨであり、かつＡが活性エステルである、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
以下の式：
【化２】
により示される化合物。
【請求項５】
以下の式：
【化３】
［式中、ＹはＯまたはＳであり、ｍは０または１であり、ＸはＣＨ２またはＮＨであり、Ｌは飽和もしくは不飽和の直鎖または分岐鎖として配列する０〜４０個の炭素原子を含み、最大２個の環状構造と０〜２０個のヘテロ原子をさらに含有する連結基であるが、３個以上のヘテロ原子が連続して結合していてはならず、Ｚは、−ＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯ−、−ＮＨＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＳＮＨ−、−ＯＣＯＮＨ−、−ＮＨＯＣＯ−、−Ｓ−、−ＮＨ（Ｃ＝ＮＨ）−、−Ｎ＝Ｎ−、−ＮＨ−、および
【化４】
からなる群より選択される部分であり、Ｑは、ポリペプチド、多糖、合成ポリマー、および非同位体標識からなる群より選択され、かつｎはＱの分子量５０キロダルトンあたり１〜５０の数である］
により示される化合物。
【請求項６】
Ｑが、ウシ血清アルブミン、キーホールリンペット・ヘモシアニン（keyhole limpet hemocyanin）、リムルスポリヘムス・ヘモシアニン（limulus polyphemus hemocyanin）、ウシサイロブロブリン、およびアミノデキストランからなる群より選択されるポリペプチドまたは多糖である、請求項５に記載の化合物。
【請求項７】
ＹがＯであり、ｍが１であり、ＸがＮＨであり、Ｌが４個の炭素原子を含んでなり、かつＱが、ウシ血清アルブミン、キーホールリンペット・ヘモシアニン（keyhole limpet hemocyanin）、およびアミノデキストランからなる群より選択される、請求項５に記載の化合物。
【請求項８】
以下の式：
【化５】
［式中、Ｑは、ウシ血清アルブミン、キーホルリンペット・ヘモシアニン（keyhole limpet hemocyanin）、およびアミノデキストランからなる群より選択される］
により示される化合物。
【請求項９】
以下の式：
【化６】
［式中、Ｌは飽和もしくは不飽和の直鎖または分岐鎖として配列する０〜４０個の炭素原子を含み、最大２個の環状構造と０〜２０個のヘテロ原子を含有する連結基であるが、３個以上のヘテロ原子が連続して結合していてはならず、かつＡは、活性エステル、イソシアネート、イソチオシアネート、チオール、イミドエステル、無水物、マレイミド、チオラクトン、ジアゾニウム基、およびアルデヒドからなる群より選択される活性型官能基である］
により示される化合物。
【請求項１０】
Ａが活性エステルである、請求項９に記載の化合物。
【請求項１１】
Ｌが３個の炭素原子を含んでなる、請求項１０に記載の化合物。
【請求項１２】
以下の式：
【化７】
により示される化合物。
【請求項１３】
以下の式：
【化８】
［式中、Ｌは飽和もしくは不飽和の直鎖または分岐鎖として配列する０〜４０個の炭素原子を含み、最大２個の環状構造と０〜２０個のヘテロ原子をさらに含む連結基であるが、３個以上のヘテロ原子が連続して結合していてはならず、Ｚは、−ＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯ−、−ＮＨＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＳＮＨ−、−ＯＣＯＮＨ−、−ＮＨＯＣＯ−、−Ｓ−、−ＮＨ（Ｃ＝ＮＨ）−、−Ｎ＝Ｎ−、−ＮＨ−、および
【化９】
からなる群より選択される部分であり、Ｑは、ポリペプチド、多糖、合成ポリマー、および非同位体標識からなる群より選択され、かつｎはＱの分子量５０キロダルトンあたり１〜５０の数である］
により示される化合物。
【請求項１４】
Ｑが、ウシ血清アルブミン、キーホールリンペット・ヘモシアニン（keyhole limpet hemocyanin）、リムルスポリヘムス・ヘモシアニン（limulus polyphemus hemocyanin）、ウシサイロブロブリン、およびアミノデキストランからなる群より選択されるポリペプチドまたは多糖である、請求項１３に記載の化合物。
【請求項１５】
Ｌが４個の炭素原子を含んでなる、請求項１３に記載の化合物。
【請求項１６】
以下の式：
【化１０】
［式中、Ｑは、ウシ血清アルブミン、キーホルリンペット・ヘモシアニン（keyhole limpet hemocyanin）、およびアミノデキストランからなる群より選択される］
により示される化合物。
【請求項１７】
以下の式：
【化１１】
［式中、ＸはＮまたはＣであり、Ｌは飽和もしくは不飽和の直鎖または分岐鎖として配列する０〜４０個の炭素原子を含み、最大２個の環状構造と０〜２０個のヘテロ原子を含有する連結基であるが、３個以上のヘテロ原子が連続して結合していてはならず、かつＡは、活性エステル、イソシアネート、イソチオシアネート、チオール、イミドエステル、無水物、マレイミド、チオラクトン、ジアゾニウム基、およびアルデヒドからなる群より選択される活性型官能基である］
により示される化合物。
【請求項１８】
以下の式：
【化１２】
により示される化合物。
【請求項１９】
以下の式：
【化１３】
により示される化合物。
【請求項２０】
以下の式：
【化１４】
により示される化合物。
【請求項２１】
以下の式：
【化１５】
［式中、ＸはＮまたはＣであり、Ｌは飽和もしくは不飽和の直鎖または分岐鎖として配列する０〜４０個の炭素原子を含み、最大２個の環状構造と０〜２０個のヘテロ原子をさらに含む連結基であるが、３個以上のヘテロ原子が連続して結合していてはならず、Ｚは、−ＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯ−、−ＮＨＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＳＮＨ−、−ＯＣＯＮＨ−、−ＮＨＯＣＯ−、−Ｓ−、−ＮＨ（Ｃ＝ＮＨ）−、−Ｎ＝Ｎ−、−ＮＨ−、および
【化１６】
からなる群より選択される部分であり、Ｑは、ポリペプチド、多糖、合成ポリマー、および非同位体標識からなる群より選択され、かつｎはＱの分子量５０キロダルトンあたり１〜５０の数である］
により示される化合物。
【請求項２２】
以下の式：
【化１７】
［式中、Ｌは飽和もしくは不飽和の直鎖または分岐鎖として配列する０〜４０個の炭素原子と、０〜２０個のヘテロ原子とを含む脂肪族連結基であるが、３個以上のヘテロ原子が連続して結合していてはならず、かつＡは、活性エステル、イソシアネート、イソチオシアネート、チオール、イミドエステル、無水物、マレイミド、チオラクトン、ジアゾニウム基、およびアルデヒドからなる群より選択される活性型官能基である］
により示される化合物。
【請求項２３】
以下の式：
【化１８】
により示される化合物。
【請求項２４】
以下の式：
【化１９】
［式中、Ｌは飽和もしくは不飽和の直鎖または分岐鎖として配列する０〜４０個の炭素原子を含み、０〜２０個のヘテロ原子をさらに含む脂肪族連結基であるが、３個以上のヘテロ原子が連続して結合していてはならず、Ｚは、−ＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯ−、−ＮＨＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＳＮＨ−、−ＯＣＯＮＨ−、−ＮＨＯＣＯ−、−Ｓ−、−ＮＨ（Ｃ＝ＮＨ）−、−Ｎ＝Ｎ−、−ＮＨ−、および
【化２０】
からなる群より選択される部分であり、Ｑは、ポリペプチド、多糖、合成ポリマー、および非同位体標識からなる群より選択され、かつｎはＱの分子量５０キロダルトンあたり１〜５０の数である］
により示される化合物。
【請求項２５】
硫酸インジナビルを水素ガスとパラジウム触媒の存在下で反応させ、それによりインジナビルＭ６を形成させるステップを含む、インジナビルＭ６の合成方法。
【請求項２６】
サンプル中のインジナビルを測定するためのアッセイ方法であって、以下のステップ：
インジナビルを含有することが疑われるサンプルを、インジナビルに特異的な抗体と、インジナビルのアナログおよび非同位体シグナル生成部分を含んでなるコンジュゲートと混合するステップであって、抗体が該サンプル中のインジナビルと結合したときにシグナルが生成され、該コンジュゲートは以下の式：
【化２１】
［式中、ＹはＯまたはＳであり、ｍは０または１であり、ＸはＣＨ２またはＮＨであり、Ｌは飽和もしくは不飽和の直鎖または分岐鎖として０〜２０個の炭素原子を含み、最大２個の環状構造と０〜２０個のヘテロ原子を含有する連結基であり、かつＺはｘｘ、ｘｘ、およびｘｘからなる群より選択される部分である］
により示される上記ステップ、
生成されたシグナルの量を測定するステップ、および
測定されたシグナルと該サンプル中のインジナビルの存在または量とを関連付けるステップ
を含む、上記方法。
【請求項２７】
サンプル中のインジナビルを測定するためのアッセイ方法であって、以下のステップ：
インジナビルを含有することが疑われるサンプルを、インジナビルに特異的な抗体と、インジナビルのアナログおよび非同位体シグナル生成部分を含んでなるコンジュゲートと混合するステップであって、抗体が該サンプル中のインジナビルと結合したときにシグナルが生成され、該コンジュゲートは以下の式：
【化２２】
［式中、Ｌは飽和もしくは不飽和の直鎖または分岐鎖として０〜２０個の炭素原子を含み、最大２個の環状構造と０〜２０個のヘテロ原子を含有する連結基であり、Ｚは、−ＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯ−、−ＮＨＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＳＮＨ−、−ＯＣＯＮＨ−、−ＮＨＯＣＯ−、−Ｓ−、−ＮＨ（Ｃ＝ＮＨ）−、−Ｎ＝Ｎ−、−ＮＨ−、および
【化２３】
からなる群より選択される部分であり、Ｑは、ポリペプチド、多糖、および合成ポリマーからなる群より選択され、かつｎはＱの分子量５０キロダルトンあたり１〜５０の数である］
により示される上記ステップ、
生成されたシグナルの量を測定するステップ、および
測定されたシグナルと該サンプル中のインジナビルの存在または量とを関連付けるステップ
を含む、上記方法。
【請求項２８】
サンプル中のインジナビルを測定するためのアッセイ方法であって、以下のステップ：
インジナビルを含有することが疑われるサンプルを、インジナビルに特異的な抗体と、インジナビルのアナログおよび非同位体シグナル生成部分を含んでなるコンジュゲートと混合するステップであって、抗体が該サンプル中のインジナビルと結合したときにシグナルが生成され、該コンジュゲートは以下の式：
【化２４】
［式中、Ｌは飽和もしくは不飽和の直鎖または分岐鎖として０〜２０個の炭素原子を含み、最大２個の環状構造と０〜２０個のヘテロ原子を含有する連結基であり、Ｚは、−ＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯ−、−ＮＨＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＳＮＨ−、−ＯＣＯＮＨ−、−ＮＨＯＣＯ−、−Ｓ−、−ＮＨ（Ｃ＝ＮＨ）−、−Ｎ＝Ｎ−、−ＮＨ−、および
【化２５】
からなる群より選択される部分であり、Ｑは、ポリペプチド、多糖、および合成ポリマーからなる群より選択され、かつｎはＱの分子量５０キロダルトンあたり１〜５０の数である］
により示される上記ステップ、
生成されたシグナルの量を測定するステップ、および
測定されたシグナルと該サンプル中のインジナビルの存在または量とを関連付けるステップ
を含む、上記方法。
【請求項２９】
請求項５、１３、２１および２４のいずれか１項に記載の式により示される化合物に応答して生成された抗体。
【請求項３０】
請求項２９に記載のインジナビルに対する抗体を生成するための免疫原の使用。
【請求項３１】
生物学的サンプル中のインジナビルの測定のための、請求項２９に記載の抗体を生成する方法。
【請求項１】
以下の式：
【化１】
［式中、ＹはＯまたはＳであり、ｍは０または１であり、ＸはＣＨ２またはＮＨであり、Ｌは飽和もしくは不飽和の直鎖または分岐鎖として配列する０〜４０個の炭素原子を含み、最大２個の環状構造と０〜２０個のヘテロ原子を含有する連結基であるが、３個以上のヘテロ原子が連続して結合していてはならず、かつＡは、活性エステル、イソシアネート、イソチオシアネート、チオール、イミドエステル、無水物、マレイミド、チオラクトン、ジアゾニウム基、およびアルデヒドからなる群より選択される活性型官能基である］
により示される化合物。
【請求項２】
Ａが活性エステルである、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
ＹがＯであり、ｍが１であり、Ｌが３個の炭素原子を含んでなり、ＸがＮＨであり、かつＡが活性エステルである、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
以下の式：
【化２】
により示される化合物。
【請求項５】
以下の式：
【化３】
［式中、ＹはＯまたはＳであり、ｍは０または１であり、ＸはＣＨ２またはＮＨであり、Ｌは飽和もしくは不飽和の直鎖または分岐鎖として配列する０〜４０個の炭素原子を含み、最大２個の環状構造と０〜２０個のヘテロ原子をさらに含有する連結基であるが、３個以上のヘテロ原子が連続して結合していてはならず、Ｚは、−ＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯ−、−ＮＨＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＳＮＨ−、−ＯＣＯＮＨ−、−ＮＨＯＣＯ−、−Ｓ−、−ＮＨ（Ｃ＝ＮＨ）−、−Ｎ＝Ｎ−、−ＮＨ−、および
【化４】
からなる群より選択される部分であり、Ｑは、ポリペプチド、多糖、合成ポリマー、および非同位体標識からなる群より選択され、かつｎはＱの分子量５０キロダルトンあたり１〜５０の数である］
により示される化合物。
【請求項６】
Ｑが、ウシ血清アルブミン、キーホールリンペット・ヘモシアニン（keyhole limpet hemocyanin）、リムルスポリヘムス・ヘモシアニン（limulus polyphemus hemocyanin）、ウシサイロブロブリン、およびアミノデキストランからなる群より選択されるポリペプチドまたは多糖である、請求項５に記載の化合物。
【請求項７】
ＹがＯであり、ｍが１であり、ＸがＮＨであり、Ｌが４個の炭素原子を含んでなり、かつＱが、ウシ血清アルブミン、キーホールリンペット・ヘモシアニン（keyhole limpet hemocyanin）、およびアミノデキストランからなる群より選択される、請求項５に記載の化合物。
【請求項８】
以下の式：
【化５】
［式中、Ｑは、ウシ血清アルブミン、キーホルリンペット・ヘモシアニン（keyhole limpet hemocyanin）、およびアミノデキストランからなる群より選択される］
により示される化合物。
【請求項９】
以下の式：
【化６】
［式中、Ｌは飽和もしくは不飽和の直鎖または分岐鎖として配列する０〜４０個の炭素原子を含み、最大２個の環状構造と０〜２０個のヘテロ原子を含有する連結基であるが、３個以上のヘテロ原子が連続して結合していてはならず、かつＡは、活性エステル、イソシアネート、イソチオシアネート、チオール、イミドエステル、無水物、マレイミド、チオラクトン、ジアゾニウム基、およびアルデヒドからなる群より選択される活性型官能基である］
により示される化合物。
【請求項１０】
Ａが活性エステルである、請求項９に記載の化合物。
【請求項１１】
Ｌが３個の炭素原子を含んでなる、請求項１０に記載の化合物。
【請求項１２】
以下の式：
【化７】
により示される化合物。
【請求項１３】
以下の式：
【化８】
［式中、Ｌは飽和もしくは不飽和の直鎖または分岐鎖として配列する０〜４０個の炭素原子を含み、最大２個の環状構造と０〜２０個のヘテロ原子をさらに含む連結基であるが、３個以上のヘテロ原子が連続して結合していてはならず、Ｚは、−ＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯ−、−ＮＨＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＳＮＨ−、−ＯＣＯＮＨ−、−ＮＨＯＣＯ−、−Ｓ−、−ＮＨ（Ｃ＝ＮＨ）−、−Ｎ＝Ｎ−、−ＮＨ−、および
【化９】
からなる群より選択される部分であり、Ｑは、ポリペプチド、多糖、合成ポリマー、および非同位体標識からなる群より選択され、かつｎはＱの分子量５０キロダルトンあたり１〜５０の数である］
により示される化合物。
【請求項１４】
Ｑが、ウシ血清アルブミン、キーホールリンペット・ヘモシアニン（keyhole limpet hemocyanin）、リムルスポリヘムス・ヘモシアニン（limulus polyphemus hemocyanin）、ウシサイロブロブリン、およびアミノデキストランからなる群より選択されるポリペプチドまたは多糖である、請求項１３に記載の化合物。
【請求項１５】
Ｌが４個の炭素原子を含んでなる、請求項１３に記載の化合物。
【請求項１６】
以下の式：
【化１０】
［式中、Ｑは、ウシ血清アルブミン、キーホルリンペット・ヘモシアニン（keyhole limpet hemocyanin）、およびアミノデキストランからなる群より選択される］
により示される化合物。
【請求項１７】
以下の式：
【化１１】
［式中、ＸはＮまたはＣであり、Ｌは飽和もしくは不飽和の直鎖または分岐鎖として配列する０〜４０個の炭素原子を含み、最大２個の環状構造と０〜２０個のヘテロ原子を含有する連結基であるが、３個以上のヘテロ原子が連続して結合していてはならず、かつＡは、活性エステル、イソシアネート、イソチオシアネート、チオール、イミドエステル、無水物、マレイミド、チオラクトン、ジアゾニウム基、およびアルデヒドからなる群より選択される活性型官能基である］
により示される化合物。
【請求項１８】
以下の式：
【化１２】
により示される化合物。
【請求項１９】
以下の式：
【化１３】
により示される化合物。
【請求項２０】
以下の式：
【化１４】
により示される化合物。
【請求項２１】
以下の式：
【化１５】
［式中、ＸはＮまたはＣであり、Ｌは飽和もしくは不飽和の直鎖または分岐鎖として配列する０〜４０個の炭素原子を含み、最大２個の環状構造と０〜２０個のヘテロ原子をさらに含む連結基であるが、３個以上のヘテロ原子が連続して結合していてはならず、Ｚは、−ＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯ−、−ＮＨＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＳＮＨ−、−ＯＣＯＮＨ−、−ＮＨＯＣＯ−、−Ｓ−、−ＮＨ（Ｃ＝ＮＨ）−、−Ｎ＝Ｎ−、−ＮＨ−、および
【化１６】
からなる群より選択される部分であり、Ｑは、ポリペプチド、多糖、合成ポリマー、および非同位体標識からなる群より選択され、かつｎはＱの分子量５０キロダルトンあたり１〜５０の数である］
により示される化合物。
【請求項２２】
以下の式：
【化１７】
［式中、Ｌは飽和もしくは不飽和の直鎖または分岐鎖として配列する０〜４０個の炭素原子と、０〜２０個のヘテロ原子とを含む脂肪族連結基であるが、３個以上のヘテロ原子が連続して結合していてはならず、かつＡは、活性エステル、イソシアネート、イソチオシアネート、チオール、イミドエステル、無水物、マレイミド、チオラクトン、ジアゾニウム基、およびアルデヒドからなる群より選択される活性型官能基である］
により示される化合物。
【請求項２３】
以下の式：
【化１８】
により示される化合物。
【請求項２４】
以下の式：
【化１９】
［式中、Ｌは飽和もしくは不飽和の直鎖または分岐鎖として配列する０〜４０個の炭素原子を含み、０〜２０個のヘテロ原子をさらに含む脂肪族連結基であるが、３個以上のヘテロ原子が連続して結合していてはならず、Ｚは、−ＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯ−、−ＮＨＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＳＮＨ−、−ＯＣＯＮＨ−、−ＮＨＯＣＯ−、−Ｓ−、−ＮＨ（Ｃ＝ＮＨ）−、−Ｎ＝Ｎ−、−ＮＨ−、および
【化２０】
からなる群より選択される部分であり、Ｑは、ポリペプチド、多糖、合成ポリマー、および非同位体標識からなる群より選択され、かつｎはＱの分子量５０キロダルトンあたり１〜５０の数である］
により示される化合物。
【請求項２５】
硫酸インジナビルを水素ガスとパラジウム触媒の存在下で反応させ、それによりインジナビルＭ６を形成させるステップを含む、インジナビルＭ６の合成方法。
【請求項２６】
サンプル中のインジナビルを測定するためのアッセイ方法であって、以下のステップ：
インジナビルを含有することが疑われるサンプルを、インジナビルに特異的な抗体と、インジナビルのアナログおよび非同位体シグナル生成部分を含んでなるコンジュゲートと混合するステップであって、抗体が該サンプル中のインジナビルと結合したときにシグナルが生成され、該コンジュゲートは以下の式：
【化２１】
［式中、ＹはＯまたはＳであり、ｍは０または１であり、ＸはＣＨ２またはＮＨであり、Ｌは飽和もしくは不飽和の直鎖または分岐鎖として０〜２０個の炭素原子を含み、最大２個の環状構造と０〜２０個のヘテロ原子を含有する連結基であり、かつＺはｘｘ、ｘｘ、およびｘｘからなる群より選択される部分である］
により示される上記ステップ、
生成されたシグナルの量を測定するステップ、および
測定されたシグナルと該サンプル中のインジナビルの存在または量とを関連付けるステップ
を含む、上記方法。
【請求項２７】
サンプル中のインジナビルを測定するためのアッセイ方法であって、以下のステップ：
インジナビルを含有することが疑われるサンプルを、インジナビルに特異的な抗体と、インジナビルのアナログおよび非同位体シグナル生成部分を含んでなるコンジュゲートと混合するステップであって、抗体が該サンプル中のインジナビルと結合したときにシグナルが生成され、該コンジュゲートは以下の式：
【化２２】
［式中、Ｌは飽和もしくは不飽和の直鎖または分岐鎖として０〜２０個の炭素原子を含み、最大２個の環状構造と０〜２０個のヘテロ原子を含有する連結基であり、Ｚは、−ＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯ−、−ＮＨＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＳＮＨ−、−ＯＣＯＮＨ−、−ＮＨＯＣＯ−、−Ｓ−、−ＮＨ（Ｃ＝ＮＨ）−、−Ｎ＝Ｎ−、−ＮＨ−、および
【化２３】
からなる群より選択される部分であり、Ｑは、ポリペプチド、多糖、および合成ポリマーからなる群より選択され、かつｎはＱの分子量５０キロダルトンあたり１〜５０の数である］
により示される上記ステップ、
生成されたシグナルの量を測定するステップ、および
測定されたシグナルと該サンプル中のインジナビルの存在または量とを関連付けるステップ
を含む、上記方法。
【請求項２８】
サンプル中のインジナビルを測定するためのアッセイ方法であって、以下のステップ：
インジナビルを含有することが疑われるサンプルを、インジナビルに特異的な抗体と、インジナビルのアナログおよび非同位体シグナル生成部分を含んでなるコンジュゲートと混合するステップであって、抗体が該サンプル中のインジナビルと結合したときにシグナルが生成され、該コンジュゲートは以下の式：
【化２４】
［式中、Ｌは飽和もしくは不飽和の直鎖または分岐鎖として０〜２０個の炭素原子を含み、最大２個の環状構造と０〜２０個のヘテロ原子を含有する連結基であり、Ｚは、−ＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯ−、−ＮＨＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＳＮＨ−、−ＯＣＯＮＨ−、−ＮＨＯＣＯ−、−Ｓ−、−ＮＨ（Ｃ＝ＮＨ）−、−Ｎ＝Ｎ−、−ＮＨ−、および
【化２５】
からなる群より選択される部分であり、Ｑは、ポリペプチド、多糖、および合成ポリマーからなる群より選択され、かつｎはＱの分子量５０キロダルトンあたり１〜５０の数である］
により示される上記ステップ、
生成されたシグナルの量を測定するステップ、および
測定されたシグナルと該サンプル中のインジナビルの存在または量とを関連付けるステップ
を含む、上記方法。
【請求項２９】
請求項５、１３、２１および２４のいずれか１項に記載の式により示される化合物に応答して生成された抗体。
【請求項３０】
請求項２９に記載のインジナビルに対する抗体を生成するための免疫原の使用。
【請求項３１】
生物学的サンプル中のインジナビルの測定のための、請求項２９に記載の抗体を生成する方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【公表番号】特表２００８−５１９７９３（Ｐ２００８−５１９７９３Ａ）
【公表日】平成２０年６月１２日（２００８．６．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５４０５８７（Ｐ２００７−５４０５８７）
【出願日】平成１７年１１月１１日（２００５．１１．１１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００５／０１２０８５
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０５０９６４
【国際公開日】平成１８年５月１８日（２００６．５．１８）
【出願人】（５９１００３０１３）エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー (1,754)
【氏名又は名称原語表記】Ｆ． ＨＯＦＦＭＡＮＮ−ＬＡ ＲＯＣＨＥ ＡＫＴＩＥＮＧＥＳＥＬＬＳＣＨＡＦＴ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年６月１２日（２００８．６．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１１月１１日（２００５．１１．１１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００５／０１２０８５
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０５０９６４
【国際公開日】平成１８年５月１８日（２００６．５．１８）
【出願人】（５９１００３０１３）エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー (1,754)
【氏名又は名称原語表記】Ｆ． ＨＯＦＦＭＡＮＮ−ＬＡ ＲＯＣＨＥ ＡＫＴＩＥＮＧＥＳＥＬＬＳＣＨＡＦＴ
【Ｆターム（参考）】
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