インスリン融合ポリペプチド
本発明は、インスリン融合ポリペプチドおよびダイマー；当該ポリペプチドをコードする核酸分子、並びに前記ポリペプチド／ダイマーを使用する治療方法に関する。インスリン活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む核酸分子であって、前記ポリペプチドが直接または間接的にインスリンレセプターポリペプチドに連結されたインスリンまたはそのレセプター結合部位を含む核酸分子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インスリン融合ポリペプチドおよびダイマー；当該ポリペプチドをコードする核酸分子、並びに前記ポリペプチド／ダイマーを使用する治療方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質間の相互作用は機能にとって重要であり、エネルギー代謝、細胞分化および細胞増殖の制御といった細胞における生物学的効果をもたらす。レセプターと相互作用して生化学反応をもたらすタンパク質はアゴニストとして知られ、生化学反応を抑制または妨げるものはアンタゴニストとして知られている。タンパク質の特異的結合によるレセプターの活性化は、とりわけ細胞周期に特異的な遺伝子の発現をもたらす細胞内シグナル伝達カスケードの活性化および静止細胞の増殖活性化を介して細胞増殖を促進する。
【０００３】
インスリンはレセプターを介した生化学反応の活性化を媒介するタンパク質の一つである。インスリンはグルコースのホメオスタシスを制御するように働く。高血糖状態（異常に高濃度の血中グルコース）では、ランゲルハンス島の膵臓β細胞がプロインスリンを合成し、プロインスリンはそのアミノ及びカルボキシ末端で酵素切断されて５１アミノ酸ポリペプチドであるインスリンを生成する。インスリンが分泌されると、インスリンレセプターを発現するターゲット細胞（例えば肝臓、筋肉、脂肪組織）に作用する。インスリンレセプターの活性化は、過剰のグルコースレセプターを取り除き、グルコースを貯蔵用のグリコーゲンへと変換するグルコーストランスポーターの発現をもたらすシグナル伝達カスケードを引き起こす。グルコース濃度が正常に戻ると、インスリンは分解されて、その生物学的効果が取り除かれる。インスリンレセプターはチロシンキナーゼであり、二つのαサブユニットと二つのβサブユニットを含む四量体膜貫通レセプターである。αサブユニットは細胞外にあり、インスリンと結合する。βサブユニットは膜貫通であり、インスリン結合の際に活性化されるチロシンキナーゼドメインとATPを含む。αおよびβサブユニットはジスルフィド結合で互いに連結されている。
【０００４】
高血糖症をもたらす多くの病状が存在しており、その最もよく知られているものは糖尿病である。糖尿病には１型と２型があり得る。１型糖尿病は、膵臓β細胞の破壊をもたらす自己免疫疾患であり、これは患者がインスリンを製造できないことを意味する。２型糖尿病は、より複雑な病状であって、関連する多くの病気に由来し得るが、一般にはインスリンの代謝作用に対する耐性に関与している。例えば、２型糖尿病は、年齢、肥満、インスリン耐性をもたらす殆ど体を動かさない生活に関連している。関連する病状は、患者を２型糖尿病に掛かりやすくさせ得るメタボリックシンドロームと呼ばれる。このシンドロームに関連する症状は、高血圧、脂質異常症、体脂肪沈着の増加および心疾患である。インスリン耐性をもたらすさらなる病状は、成熟卵子を製造できなくなる多嚢胞性卵巣症候群、アンドロゲン過剰および多毛症である。低血糖症（異常に低濃度の血中グルコース）も知られており、典型的にはインスリン過剰投与の結果として引き起こされる。しかしながら、低血糖状態をもたらす過剰インスリン分泌を引き起こす疾患も存在する。例えば、インスリノーマはインスリンの過剰生産をもたらす膵臓β細胞の癌である。
【０００５】
インスリンの投与は、１型および２型糖尿病のような症状を制御する有効な手段である。歴史的に見ると、ヒト以外の起源から抽出されたインスリンが糖尿病の治療に使用されてきた。哺乳動物のインスリンは高度に保存されており、ターゲット細胞に発現されるインスリンレセプターを活性化することができる。組み換えヒトインスリンが製造されており、これらは高血糖の治療に好ましいインスリンである。グルコース代謝を制御するためのインスリンの使用に関連して多くの問題が存在する。これらには、投与形態、投与量およびインスリンのタイプが含まれる。インスリンの多くの形態が当該分野で知られており、インスリン又はインスリン変異体の放出及び活性プロファイルによって互いに区別されている。例えば、即効性（５−１５分）で中程度の放出（３−４時間）形態；遅延性（３０分）で中程度の放出（５−８時間）形態；および遅延性（４−６時間）で持続的放出（２４−２８時間）形態がある。これらは、天然インスリンアミノ酸配列を変更して活性／放出プロファイルを操作したインスリンである。インスリン治療の主な副作用は低血糖症であり、低血糖症のリスクが低い持続的生物活性を与える長時間作用型のインスリンアナログが必要とされている。
【発明の概要】
【０００６】
ここに、変更された薬物動態プロファイルおよび活性を有するインスリン：レセプター融合タンパク質の形態の天然インスリンを開示する。インスリン分子は生物学的に活性であり、ダイマーを形成し、改善された血清安定性を有する。この融合技術は、天然インスリンおよび変性インスリンの両方に適用できることは明らかであろう。この分子の主な利点は、ゼロ次生物学的速度過程（zero order biological kinetics）に傾いた薬物動態プロファイルをもたらし、低血糖症のリスクも低い、部分的に不活性な形態である持続型インスリンを提供することである。
【０００７】
本発明の一態様によれば、インスリンの活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む核酸分子を提供するものであり、ここで前記ポリペプチドは、直接または間接的にインスリンレセプターのインスリン結合ドメインに連結されたインスリンまたはそのレセプター結合部位を含む。
【０００８】
本発明の一態様によれば、直接または間接的にインスリンレセプターポリペプチドに連結されたインスリンポリペプチドまたはその活性レセプター結合部位のアミノ酸配列を含む融合ポリペプチドを提供する。
【０００９】
本発明の好ましい態様では、前記インスリンポリペプチドは天然インスリン；好ましくはヒトインスリンである。
【００１０】
本発明の好ましい態様では、前記インスリンポリペプチドは、図２ａ、２ｂ、２ｃ、２ｄ、２ｅまたは２ｆに示されているアミノ酸配列を含むまたは当該アミノ酸配列からなる。
【００１１】
本発明の別の好ましい態様では、前記インスリンポリペプチドは変性インスリンである。
【００１２】
“変性インスリン(modified insulin)”とは天然インスリンの配列変異体を表す。変性された配列変異体は当該技術分野で知られており、アスパルト（aspart）、リスプロ（lipspro）、レンテ（lente）、ウルトラレンテ（ultralente）、グラルギン（glargine）およびデテミル（determir）のような商業的に入手可能な変異体を含む。
【００１３】
本発明の好ましい態様では、インスリンが、ペプチドリンカー、好ましくは柔軟なペプチドリンカーによってインスリンレセプターの結合ドメインに連結されている。
【００１４】
本発明の好ましい態様では、前記ペプチド連結分子が、ペプチドＧｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒの少なくとも１つのコピーを含む。
【００１５】
本発明の好ましい態様では、前記ペプチド連結分子が、ペプチドＧｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒの２、３、４、５、６、７、８、９または１０コピーを含む。
【００１６】
好ましくは、前記ペプチド連結分子が、ペプチドＧｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒの４コピーからなる。
【００１７】
好ましくは、前記ペプチド連結分子が、ペプチドＧｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒの８コピーからなる。
【００１８】
本発明のさらに別の態様では、前記ポリペプチドがペプチド連結分子を含まず、インスリンとインスリンレセプターのインスリン結合ドメインとの直接融合体である。
【００１９】
インスリンレセプターとその結合ドメインは、本発明の範囲内の多型配列変異体を含む。例えば、図１ｉでは、残基４４８がスレオニン（Ｔ）であり４９２がリシン（Ｋ）であるが、それぞれ、イソロイシン（Ｉ）およびグルタミン（Ｑ）であってもよい。ヒトインスリンレセプターをコードする遺伝子の別の多型は、Ｇ５８→Ｒ；Ｙ１７１→Ｈ；Ｇ８１１→Ｓ；およびＰ８３０→Ｌを含むのアミノ酸の変化をもたらす。
【００２０】
本発明の好ましい態様では、前記インスリンレセプターポリペプチドが、図１ａ、１ｂ、１ｃ、１ｄ、１ｅ、１ｆ、１ｇまたは１ｈからなる群から選択されたアミノ酸配列を含むまたは当該アミノ酸配列からなる。
【００２１】
図１ａ−１ｈに図示したアミノ酸配列は、インスリンレセプターポリペプチドおよびインスリンレセプターポリペプチドのドメインを記載している。ペプチドシグナル配列の存在（配列のアミノ末端に太字で示した）は任意であり、この開示はシグナル配列を含むまたは含まない配列に関する。これは、シグナル配列を含むここに開示された配列に準用する。
【００２２】
本発明の好ましい態様では、前記インスリンレセプターポリペプチドは図１ｇまたは１ｈのアミノ酸配列からなる。
【００２３】
本発明の好ましい態様では、前記融合ポリペプチドは、図３ａに図示されているアミノ酸配列を含むまたは当該アミノ酸配列からなり、ここで前記ポリペプチドはインスリンレセプター調節活性を有する。
【００２４】
本発明の好ましい態様では、前記融合ポリペプチドは、図３ｂに図示されているアミノ酸配列を含むまたは当該アミノ酸配列からなり、ここで前記ポリペプチドはインスリンレセプター調節活性を有する。
【００２５】
本発明の好ましい態様では、前記融合ポリペプチドは、図３ｃに図示されているアミノ酸配列を含むまたは当該アミノ酸配列からなり、ここで前記ポリペプチドはインスリンレセプター調節活性を有する。
【００２６】
本発明の好ましい態様では、前記融合ポリペプチドは、図４ａに図示されているアミノ酸配列を含むまたは当該アミノ酸配列からなり、ここで前記ポリペプチドはインスリンレセプター調節活性を有する。
【００２７】
本発明の好ましい態様では、前記融合ポリペプチドは、図４ｂに図示されているアミノ酸配列を含むまたは当該アミノ酸配列からなり、ここで前記ポリペプチドはインスリンレセプター調節活性を有する。
【００２８】
本発明の好ましい態様では、前記融合ポリペプチドは、図４ｃに図示されているアミノ酸配列を含むまたは当該アミノ酸配列からなり、ここで前記ポリペプチドはインスリンレセプター調節活性を有する。
【００２９】
本発明の好ましい態様では、前記融合ポリペプチドは、図５ａに図示されているアミノ酸配列を含むまたは当該アミノ酸配列からなり、ここで前記ポリペプチドはインスリンレセプター調節活性を有する。
【００３０】
本発明の好ましい態様では、前記融合ポリペプチドは、図５ｂに図示されているアミノ酸配列を含むまたは当該アミノ酸配列からなり、ここで前記ポリペプチドはインスリンレセプター調節活性を有する。
【００３１】
本発明の好ましい態様では、前記融合ポリペプチドは、図５ｃに図示されているアミノ酸配列を含むまたは当該アミノ酸配列からなり、ここで前記ポリペプチドはインスリンレセプター調節活性を有する。
【００３２】
本発明の好ましい態様では、前記融合ポリペプチドは、図６ａに図示されているアミノ酸配列を含むまたは当該アミノ酸配列からなり、ここで前記ポリペプチドはインスリンレセプター調節活性を有する。
【００３３】
本発明の好ましい態様では、前記融合ポリペプチドは、図６ｂに図示されているアミノ酸配列を含むまたは当該アミノ酸配列からなり、ここで前記ポリペプチドはインスリンレセプター調節活性を有する。
【００３４】
本発明の好ましい態様では、前記融合ポリペプチドは、図６ｃに図示されているアミノ酸配列を含むまたは当該アミノ酸配列からなり、ここで前記ポリペプチドはインスリンレセプター調節活性を有する。
【００３５】
本発明の好ましい態様では、前記融合ポリペプチドは、図６ｄに図示されているアミノ酸配列を含むまたは当該アミノ酸配列からなり、ここで前記ポリペプチドはインスリンレセプター調節活性を有する。
【００３６】
本発明の好ましい態様では、前記融合ポリペプチドは、図６ｅに図示されているアミノ酸配列を含むまたは当該アミノ酸配列からなり、ここで前記ポリペプチドはインスリンレセプター調節活性を有する。
【００３７】
本発明の好ましい態様では、前記融合ポリペプチドは、図６ｆに図示されているアミノ酸配列を含むまたは当該アミノ酸配列からなり、ここで前記ポリペプチドはインスリンレセプター調節活性を有する。
【００３８】
本発明の好ましい態様では、前記融合ポリペプチドは、図７ａに図示されているアミノ酸配列を含むまたは当該アミノ酸配列からなり、ここで前記ポリペプチドはインスリンレセプター調節活性を有する。
【００３９】
本発明の好ましい態様では、前記融合ポリペプチドは、図７ｂに図示されているアミノ酸配列を含むまたは当該アミノ酸配列からなり、ここで前記ポリペプチドはインスリンレセプター調節活性を有する。
【００４０】
本発明の好ましい態様では、前記融合ポリペプチドは、図７ｃに図示されているアミノ酸配列を含むまたは当該アミノ酸配列からなり、ここで前記ポリペプチドはインスリンレセプター調節活性を有する。
【００４１】
本発明の好ましい態様では、前記融合ポリペプチドは、図８ａに図示されているアミノ酸配列を含むまたは当該アミノ酸配列からなり、ここで前記ポリペプチドはインスリンレセプター調節活性を有する。
【００４２】
本発明の好ましい態様では、前記融合ポリペプチドは、図８ｂに図示されているアミノ酸配列を含むまたは当該アミノ酸配列からなり、ここで前記ポリペプチドはインスリンレセプター調節活性を有する。
【００４３】
本発明の好ましい態様では、前記融合ポリペプチドは、図８ｃに図示されているアミノ酸配列を含むまたは当該アミノ酸配列からなり、ここで前記ポリペプチドはインスリンレセプター調節活性を有する。
【００４４】
本発明の好ましい態様では、前記融合ポリペプチドは、図９ａに図示されているアミノ酸配列を含むまたは当該アミノ酸配列からなり、ここで前記ポリペプチドはインスリンレセプター調節活性を有する。
【００４５】
本発明の好ましい態様では、前記融合ポリペプチドは、図９ｂに図示されているアミノ酸配列を含むまたは当該アミノ酸配列からなり、ここで前記ポリペプチドはインスリンレセプター調節活性を有する。
【００４６】
本発明の好ましい態様では、前記融合ポリペプチドは、図９ｃに図示されているアミノ酸配列を含むまたは当該アミノ酸配列からなり、ここで前記ポリペプチドはインスリンレセプター調節活性を有する。
【００４７】
本発明の好ましい態様では、前記融合ポリペプチドは、図１０ａに図示されているアミノ酸配列を含むまたは当該アミノ酸配列からなり、ここで前記ポリペプチドはインスリンレセプター調節活性を有する。
【００４８】
本発明の好ましい態様では、前記融合ポリペプチドは、図１０ｂに図示されているアミノ酸配列を含むまたは当該アミノ酸配列からなり、ここで前記ポリペプチドはインスリンレセプター調節活性を有する。
【００４９】
本発明の好ましい態様では、前記融合ポリペプチドは、図１０ｃに図示されているアミノ酸配列を含むまたは当該アミノ酸配列からなり、ここで前記ポリペプチドはインスリンレセプター調節活性を有する。
【００５０】
本発明の好ましい態様では、前記融合ポリペプチドは、図１０ｄに図示されているアミノ酸配列を含むまたは当該アミノ酸配列からなり、ここで前記ポリペプチドはインスリンレセプター調節活性を有する。
【００５１】
本発明の好ましい態様では、前記融合ポリペプチドは、図１０ｅに図示されているアミノ酸配列を含むまたは当該アミノ酸配列からなり、ここで前記ポリペプチドはインスリンレセプター調節活性を有する。
【００５２】
本発明の好ましい態様では、前記融合ポリペプチドは、図１０ｆに図示されているアミノ酸配列を含むまたは当該アミノ酸配列からなり、ここで前記ポリペプチドはインスリンレセプター調節活性を有する。
【００５３】
本発明の好ましい態様では、前記ポリペプチドがアゴニストである。
【００５４】
本発明の別の好ましい態様では、前記ポリペプチドがアンタゴニストである。
【００５５】
本発明のさらなる態様によれば、本発明に係るポリペプチドをコードする核酸分子を提供する。
【００５６】
本発明の態様によれば、本発明に係る二つのポリペプチドからなるホモダイマーを提供する。
【００５７】
本発明のさらなる態様によれば、本発明に係る核酸分子を含むベクターを提供する。
【００５８】
本発明の好ましい態様では、前記ベクターは、本発明に係る核酸分子を発現するのに適合した発現ベクターである。
【００５９】
本発明に係る核酸を含むベクターは、特にそのベクターが安定なトランスフェクションのために組み換え用細胞のゲノムに核酸を導入するために使用される場合には、プロモーターまたは他の制御配列を含む必要はない。好ましくは、ベクター内の核酸は、宿主細胞において、適切なプロモーターまたは転写用の他の調節エレメントに機能的に連結される。ベクターは、多様なホストで機能するバイファンクショナル発現ベクターであってもよい。“プロモーター”は、転写開始部位より上流のヌクレオチド配列を意味し、転写に必要な全ての制御領域を含む。適切なプロモーターは、真核細胞または原核細胞における発現のための構成的、組織特異的、誘導、発生的（developmental）プロモーターなどを含む。“機能的に連結”とは、転写がプロモーターから開始されるのに適切な位置および方向で、同じ核酸分子の一部として組み込まれていることを意味する。プロモーターに機能的に連結したＤＮＡは、プロモーターの“転写開始調節下”にある。
【００６０】
好ましい態様では、プロモーターは、構成的、誘導または調節可能プロモーターである。
【００６１】
本発明のさらなる態様によれば、本発明に係る核酸分子またはベクターでトランスフェクトまたは形質転換された細胞を提供する。
【００６２】
好ましくは、前記細胞は真核細胞である。あるいは、前記細胞は原核細胞である。
【００６３】
本発明の好ましい態様では、前記細胞は、真菌細胞（例えば、ピチア属（Pichia spp）、サッカロミセス属（Saccharomyces spp）、アカパンカビ属（Neurospora spp））；昆虫細胞（例えば、スポドプテラ属）；哺乳動物細胞（例えば、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞）；植物細胞からなる群から選択される。
【００６４】
本発明のさらなる態様によれば、本発明に係るポリペプチドを含み、賦形剤または担体を含む医薬組成物を提供する。
【００６５】
本発明の好ましい態様では、前記医薬組成物はさらなる治療剤と組み合わせられる。
【００６６】
本発明の好ましい態様では、前記さらなる治療剤は変性されたインスリン変異体である。
【００６７】
投与の際に、本発明の医薬組成物は薬学的に許容可能な調製物で投与される。このような調製物は、薬学的に許容できる濃度の塩、緩衝剤、防腐剤、適合する担体、および任意に他の治療剤をごく普通に含んでもよい。
【００６８】
本発明の医薬組成物は、注射を含むあらゆる通常の経路で投与することができる。投与及び適用は、例えば、経口、静脈内、腹腔内、筋肉内、腔内、関節内、皮下、局所（目）、皮膚（例えば、皮膚または粘膜へのクリーム脂溶性挿入物）、経皮または鼻腔内投与とすることができる。
【００６９】
本発明の医薬組成物は有効量で投与される。“有効量”とは、単独で、もしくはさらなる投与または相乗的薬剤と共同で、所望の応答を生じる薬剤／組成物の量である。これは、より好ましくは疾患の進行を永久に停止することを含むが、疾患の進行を一時的に遅延させるだけのものを含んでも良い。これは通常の方法でモニタでき、また、診断方法に従ってモニタすることもできる。
【００７０】
患者に投与される医薬組成物の投与量は、種々のパラメータに従って、特に、使用される投与方式および患者の状態（すなわち年齢および性別）に従って選択することができる。投与の際に、本発明の医薬組成物は薬学的に許容可能な量および薬学的に許容可能な組成物で適用される。薬剤に使用する場合、塩は薬学的に許容可能なものであるが、薬学的に許容できない塩であってもその薬学的に許容可能な塩を調製するために都合よく使用できることから、本発明の範囲から除外されるものではない。このような薬理学的および薬学的に許容可能な塩は、限定されるものではないが、以下の酸：塩酸、硫酸、硝酸、リン酸、マレイン酸、酢酸、サリチル酸、クエン酸、蟻酸、マロン酸、コハク酸等から調製されたものを含む。また、薬学的に許容可能な塩は、ナトリウム、カリウムまたはカルシウム塩のようなアルカリ金属またはアルカリ土類金属塩として調製できる。
【００７１】
医薬組成物は、所望であれば、薬学的に許容可能な担体と組み合わせてもよい。ここで使用する用語“薬学的に許容可能な担体”とは、ヒトへの投与に適した一以上の適合する固体または液体フィラー、希釈剤、封入剤を意味する。用語“担体”とは、天然または合成の有機または無機成分を指し、これと活性成分とを合わせることにより適用が容易となる。医薬組成物の各成分も、所望の薬学的効能を実質的に損なう相互作用が無いような方法で、本発明の分子と互いに混合することができる。
【００７２】
医薬組成物は、塩の状態の酢酸、塩の状態のクエン酸、塩の状態のホウ酸、および塩の状態のリン酸を含む適切な緩衝剤を含んでも良い。
【００７３】
医薬組成物は、任意に、適切な防腐剤、例えば塩化ベンザルコニウム、クロロブタノール、パラベン類、およびチメロサールを含んでもよい。
【００７４】
医薬組成物は、通常は単位投与量形態で提供することができ、薬学分野で周知のいずれかの方法で調製できる。全ての方法が、活性剤を、一以上の補助成分を構成する担体と合わせる工程を含む。一般に、組成物は、活性化合物を均一かつ密接に液状担体、細かく砕いた固形状担体、またはその両方と合わせ、次いで、必要に応じて製品を成形することによって製造される。
【００７５】
非経口投与に適した組成物は、通常は、好ましくは受容者の血液と等張の無菌水性または非水性調製物を含む。この調製物は、適切な分散または湿潤剤および懸濁化剤を用いた公知の方法に従って製造してもよい。無菌の注射用調製物は、例えば１，３−ブタンジオール溶液のような、非毒性の非経口的に許容可能な希釈剤または溶媒における無菌の注射用溶液または懸濁液であってもよい。使用できる許容可能な溶媒は、水、リンガー溶液および生理食塩液である。さらに、無菌の固定油が、溶媒または懸濁媒体として通常用いられる。このために、合成モノ−またはジ−グリセリドを含むあらゆる無菌性の固定油を使用できる。さらに、オレイン酸のような脂肪酸を注射剤の調製に使用してもよい。経口、皮下、静脈内、筋肉内等の投与に適した担体製剤は、Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA.から入手可能である。
【００７６】
本発明のさらなる態様によれば、本発明に係る少なくとも一つのポリペプチドの有効量を投与することを含む、高血糖症を患っているヒト患者を治療する方法を提供する。
【００７７】
本発明のさらなる態様によれば、本発明に係る少なくとも一つのポリペプチドの有効量を投与することを含む、低血糖症を患っているヒト患者を治療する方法を提供する。
【００７８】
本発明の好ましい方法では、前記ポリペプチドは静脈内に投与される。
【００７９】
本発明の別の好ましい方法では、前記ポリペプチドが皮下投与される。
【００８０】
本発明のさらに好ましい方法では、前記ポリペプチドが二日おきに投与され、好ましくは前記ポリペプチドが一週間おき、二週間おき、または一ヶ月おきに投与される。
【００８１】
本発明の好ましい方法では、前記高血糖症状が糖尿病である。
【００８２】
本発明の好ましい方法では、糖尿病が１型である。
【００８３】
本発明の好ましい方法では、糖尿病が２型である。
【００８４】
本発明の好ましい方法では、前記高血糖症がインスリン耐性の結果である。
【００８５】
本発明の好ましい方法では、前記高血糖症がメタボリックシンドロームの結果である。
【００８６】
本発明の態様によれば、糖尿病を治療する医薬を製造するための本発明に係るポリペプチドの使用を提供する。
【００８７】
本発明の好ましい態様では、糖尿病が１型である。
【００８８】
本発明の好ましい態様では、糖尿病が２型である。
【００８９】
本発明の好ましい方法では、前記高血糖症がインスリン耐性の結果である。
【００９０】
本発明の好ましい方法では、前記高血糖症がメタボリックシンドロームの結果である。
【００９１】
本発明のさらに好ましい態様では、前記ポリペプチドが二日おきに投与され、好ましくは前記ポリペプチドが一週間おき、二週間おき、または一ヶ月おきに投与される。
【００９２】
本発明のさらなる態様によれば、本発明に係るポリペプチドまたはダイマーに結合するモノクローナル抗体を提供する。
【００９３】
好ましくは、前記モノクローナル抗体は、ポリペプチドまたはダイマーに結合するが、インスリンまたはインスリンレセプター単独には特異的に結合しない抗体である。
【００９４】
モノクローナル抗体は、本発明のポリペプチドまたは本発明のポリペプチドを含むダイマーのいずれかによって提示される構造的抗原（conformational antigen）に結合する。
【００９５】
本発明のさらなる態様では、以下の工程：
ｉ）少なくとも一つの本発明に係るポリペプチドを含む免疫原で免疫応答性の哺乳動物を免疫化する；
ｉｉ）免疫化した免疫応答性の哺乳動物のリンパ球をミエローマ細胞と融合してハイブリドーマ細胞を形成する；
ｉｉｉ）（ｉ）のポリペプチドに対する結合活性について、工程（ｉｉ）のハイブリドーマ細胞によって製造されたモノクローナル抗体をスクリーニングする、
ｉｖ）ハイブリドーマ細胞を培養して、増殖及び／又は前記モノクローナル抗体を分泌させる、および
ｖ）培養上清からモノクローナル抗体を回収する
を含む、本発明に係るモノクローナル抗体を製造するハイブリドーマ細胞株を調製する方法を提供する。
【００９６】
好ましくは、前記免疫応答性の哺乳動物はマウスである。あるいは、前記免疫応答性の哺乳動物はラットである。
【００９７】
ハイブリドーマ細胞を用いたモノクローナル抗体の製造は、当該分野において周知である。モノクローナル抗体を製造するために使用される方法は、KohlerおよびMilstein, Nature 256, 495-497 (1975)、並びにDonillardおよびHoffman, "Basic Facts about Hybridomas", Compendium of Immunology V.II版. Schwartz, 1981に開示されており、これらを参照として取り込む。
【００９８】
本発明のさらなる態様によれば、本発明に係る方法によって得られたまたは得られるハイブリドーマ細胞株を提供する。
【００９９】
本発明のさらなる態様によれば、以下の工程：
ｉ）試験すべき単離されたサンプルを提供する、
ｉｉ）前記サンプルを本発明に係るポリペプチドに結合するリガンドと接触させる、および
ｉｉｉ）前記サンプルにおける前記リガンドの結合を検出する
を含む、生物学的サンプル中の本発明に係るポリペプチドを検出するための診断試験を提供する。
【０１００】
本発明の好ましい態様では、前記リガンドは抗体であり、好ましくはモノクローナル抗体である。
【０１０１】
本明細書の記載及び特許請求の範囲を通じて、用語“含む(comprise)”および“含む(contain)”およびこれらの用語の変形、例えば“含む(comprising)”および“含む(comprises)”は、“包含するが限定されない(including but not limited to)”ことを意味し、別の部分、添加物、成分、整数または工程を排除することを意図しない（並びに排除しない）。
【０１０２】
本明細書の記載及び特許請求の範囲を通じて、必要がない限り、単数形は複数形を包含する。特に、不定冠詞が使用されるところでは、本明細書は、必要がない限り、単数形も複数形も意図すると解する。
【０１０３】
本発明の特定の態様、実施態様または実施例に関連して記載された特性、整数、特徴、化合物、化学的部分または基は、不適切でなければ、ここに記載された他の態様、実施態様または実施例に適用可能であるものと理解する。
【図面の簡単な説明】
【０１０４】
【図１ｉ】図１ＡはヒトインスリンレセプターアイソフォームＩＲ−Ａを図示する。
【図１ｉｉ】図１ＢはヒトインスリンレセプターアイソフォームＩＲ−Ｂを図示する；図１ＣはヒトインスリンレセプターのＬ１ドメインである；図１Ｄはヒトインスリンレセプターのシステインリッチドメインである；図１ＥはヒトインスリンレセプターのＬ２サブドメインである；図１ＦはヒトインスリンレセプターのＦｎＩＩＩ−１ドメインである。
【図１ｉｉｉ】図１ＧはヒトインスリンレセプターアイソフォームＢの細胞外ドメインである［アミノ酸２８−９５５］；図１ＨはヒトインスリンレセプターアイソフォームＡの細胞外ドメインである［アミノ酸２８−９４３］；図１ｉは多型変異体配列を示すヒトインスリンレセプターである。
【図２】図２Ａはサブドメインに関する概要を含むヒトインスリン前駆体のアミノ酸配列である；図２Ｂはヒトインスリン鎖Ｂのアミノ酸配列である；図２Ｃはヒトインスリン鎖Ａのアミノ酸配列である；図２Ｄはヒトプロインスリンのアミノ酸配列である；図２Ｅはヒトインスリン１のペプチド連結ＢおよびＡ鎖のアミノ酸配列である；図２Ｆはヒトインスリン２のペプチド連結ＡおよびＢ鎖のアミノ酸配列である。
【図３】図３ＡはレセプターＬ１ドメインとプロインスリンからなるキメラ融合タンパク質である；図３ＢはレセプターＬ１ドメインと一本鎖インスリン１からなるキメラ融合タンパク質である；図３ＣはレセプターＬ１ドメインと一本鎖インスリン２からなるキメラ融合タンパク質である。
【図４】図４ＡはレセプターＬ２ドメインとプロインスリンからなるキメラ融合タンパク質である；図４ＢはレセプターＬ２ドメインと一本鎖インスリン１からなるキメラ融合タンパク質である；図４ＣはレセプタードメインＬ２と一本鎖インスリン２からなるキメラ融合タンパク質である。
【図５】図５ＡはレセプターＦｎＩＩＩ−１ドメインとプロインスリンからなるキメラ融合タンパク質である；図５ＢはＦｎＩＩＩ−１ドメインと一本鎖インスリン１を含むキメラ融合タンパク質である；図５ＣはＦｎＩＩＩ−１ドメインＬ２と一本鎖インスリン２を含むキメラ融合タンパク質である。
【図６ｉ】図６ＡはインスリンレセプターアイソフォームＢの細胞外ドメインとプロインスリンからなるキメラ融合タンパク質である；図６ＢはインスリンレセプターアイソフォームＢの細胞外ドメインと一本鎖インスリン１を含むキメラ融合タンパク質である；図６ＣはインスリンレセプターアイソフォームＢの細胞外ドメインと一本鎖インスリン２を含むキメラ融合タンパク質である。
【図６ｉｉ】図６ＤはインスリンレセプターアイソフォームＡの細胞外ドメインとプロインスリンを含むキメラ融合タンパク質である；図６ＥはインスリンレセプターアイソフォームＡの細胞外ドメインと一本鎖インスリン１を含むキメラ融合タンパク質である；図６ＦはインスリンレセプターアイソフォームＡの細胞外ドメインと一本鎖インスリン２を含むキメラ融合タンパク質である。
【図７】図７ＡはプロインスリンとインスリンレセプタードメインＬ１を含むキメラ融合タンパク質である；図７Ｂは一本鎖インスリン１とインスリンレセプタードメインＬ１を含むキメラ融合タンパク質である；図７Ｃは一本鎖インスリン１とインスリンレセプタードメインＬ１を含むキメラ融合タンパク質である。
【図８】図８ＡはプロインスリンとインスリンレセプタードメインＬ２を含むキメラ融合タンパク質である；図８Ｂは一本鎖インスリン１とインスリンレセプタードメインＬ２を含むキメラ融合タンパク質である；図８Ｃは一本鎖インスリン１とインスリンレセプタードメインＬ２を含むキメラ融合タンパク質である。
【図９】図９ＡはプロインスリンとインスリンレセプターＦｎＩＩＩ−１ドメインを含むキメラ融合タンパク質である；図９Ｂは一本鎖インスリン１とインスリンレセプターＦｎＩＩＩ−１ドメインを含むキメラ融合タンパク質である；図９Ｃは一本鎖インスリン２とインスリンレセプターＦｎＩＩＩ−１ドメインを含むキメラ融合タンパク質である。
【図１０ｉ】図１０ＡはプロインスリンとインスリンアイソフォームＢの細胞外ドメインを含むキメラ融合タンパク質である；図１０Ｂは一本鎖インスリン１とインスリンアイソフォームＢの細胞外ドメインを含むキメラ融合タンパク質である；図１０Ｃは一本鎖インスリン２とインスリンアイソフォームＢの細胞外ドメインを含むキメラ融合タンパク質である。
【図１０ｉｉ】図１０ＤはプロインスリンとインスリンアイソフォームＡの細胞外ドメインを含むキメラ融合タンパク質である；図１０Ｅは一本鎖インスリン１とインスリンアイソフォームＡの細胞外ドメインを含むキメラ融合タンパク質である；図１０Ｆは一本鎖インスリン２とインスリンアイソフォームＡの細胞外ドメインを含むキメラ融合タンパク質である。
【図１１】ａ）ＰＣＲを用いて、適切な制限部位（プライマーＲ１−４に含まれる）を隣接させた目的の遺伝子からなるＤＮＡを生成した。ｂ）このＰＣＲ産物を、リンカー領域の各端で適切なベクターに結合させた。ｃ）この構成物を変死して、不要な配列（すなわち、本来のものでない制限酵素認識部位）を含まない的確なリンカーを導入するように変性した。
【図１２】ａ）オリゴヌクレオチドを、特有のオーバーラップを備えた部分的二本鎖領域を形成するように設計し、アニールおよびプロセッシングした際に、リガンド及びレセプターにアニールする隣接領域を備えたリンカーをコードするものとした。ｂ）“メガプライマー”および末端プライマー（Ｒ１およびＲ２）を用いてＰＣＲを行い、ＬＲ-融合遺伝子を製造した。Ｒ１およびＲ２プライマーは、ターゲットベクターへの結合に使用可能な隣接制限酵素認識部位を取り込むように設計した。
【図１３】図１３はインスリン融合タンパク質１２Ｂ１の発現及び免疫ブロットである。
【発明を実施するための形態】
【０１０５】
本発明の実施態様を、実施例を用いて、図面を参照しながら記載する。
【０１０６】
材料と方法
インスリン融合タンパク質活性の試験
ここに記載するインスリン融合タンパク質の生物学的活性の試験方法は、当該分野において周知である。例えば、US2008/057004、US2006/286182、US2005/171008またはUS6200569に記載されている方法およびアッセイを、参照としてここに取り込む。
【０１０７】
免疫学的試験
ポリクローナルおよびモノクローナル抗体に対するインスリンの結合を調べる免疫測定法は、当該分野において知られている。商業的に入手可能なインスリン抗体がサンプル中のインスリンを検出するために利用でき、競争阻害試験における使用にも利用できる。例えば、モノクローナル抗体は、http://www.ab-direct.com/index AbD Serotecで購入することができる。
【０１０８】
融合タンパク質の組み換え生成
融合タンパク質の構成成分を、リガンドまたはレセプターにアニールし、かつ、ターゲットベクターへのクローニングに適した制限酵素認識部位を導入するように設計されたプライマーを用いるＰＣＲによって生成した（図１１ａ）。ＰＣＲのテンプレートはターゲット遺伝子を含んでおり、ＩＭＡＧＥクローン、ｃＤＮＡライブラリーまたはカスタム合成遺伝子から得た。適切な隣接する制限酵素認識部位を有するリガンドおよびレセプター遺伝子を合成したら、これらをターゲットベクターにおいてリンカー領域の両端に結合させた（図１１ｂ）。この構築物を、リンカー領域の両端の二つの特有の制限酵素認識部位間にカスタム合成した長さのＤＮＡを挿入するか、ｓｓＤＮＡ変性技術によってリンカー領域を変異させるか、適切な制限酵素認識部位間にプライマーデュプレックス／マルチプレックス（primer duplex/multiplex）を挿入するか、またはＰＣＲ変性によって、隣接する制限酵素認識部位のない適正なリンカーを含むように変性させた（図１１ｃ）。
【０１０９】
あるいは、最適なリガンド又はレセプタードメインにアニールするように設計された隣接する配列を有するリンカーを、オリゴヌクレオチド二本鎖を生成することによって最初に合成し、これを処理して二本鎖ＤＮＡを生成した（図１２ａ）。次いで“メガプライマー”としてのリンカー配列、この“メガプライマー”がアニールするリガンドおよびレセプターの反対端に対向して設計されたプライマー、およびテンプレートとしてのリガンドおよびレセプターを用いて、ＰＣＲを行った。末端プライマーは、最適な発現ベクターへの結合に適した制限酵素認識部位を用いて設計した。
【０１１０】
融合タンパク質の発現および精製
適切な系（例えば哺乳動物ＣＨＯ細胞、E.coli）で発現を行った。これは、インスリン融合遺伝子が生成されるベクターに依存する。次いで、当該分野で周知のＳＤＳ−ＰＡＧＥ、Ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥ、ウエスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡの一以上を含んでもよい種々の方法を用いて発現を分析した。
【０１１１】
適切なレベルの発現を達成したら、インスリン融合物をより大きいスケールで発現し、精製および次の分析に十分なタンパク質を製造する。
【０１１２】
イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、硫安沈殿法、ゲル濾過、サイズ排除および／またはアフィニティークロマトグラフィー（ニッケル／コバルト樹脂、抗体固定化樹脂および／またはリガンド／レセプター固定化樹脂を使用）のような一以上のクロマトグラフ法の適切な組み合わせを用いて精製を行った。
【０１１３】
精製したタンパク質を、ブラッドフォード分析、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、Ｎａｔｉｖｅ ＰＡＧＥ、ウェスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡを含む種々の方法を用いて分析した。
【０１１４】
インスリン融合物の特性評価
変性ＰＡＧＥ、ｎａｔｉｖｅ ＰＡＧＥゲルおよびウェスタンブロッティングを用いて、融合ポリペプチドを分析し、かつ、インスリン融合物に対して構造的に敏感でない抗体を用いてウェスタンブロッティングを行った。ネイティブの溶液状態分子量情報は、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ Ｇ２００分析カラムおよび分析超遠心を使用したサイズ排除クロマトグラフィーのような技術から得ることができる。
【０１１５】
統計
二つのグループを、分散が正規分布であればスチューデント検定を用いて比較し、正規分布でなければスチューデント−サタースワイト検定（Student-Satterthwaite's test）を用いて比較した。分布はＦ検定でテストした。一元ANOVA(One-way ANOVA)を用いて３以上のグループの平均を比較し、有意水準がｐ＜０．０５であれば、個々の比較をダネット検定を用いて行った。全ての統計的検定が両側５％の有意水準であり、欠測値にデータの補完は行わなかった。
【０１１６】
インスリンＬＲ融合体の発現：ＣＨＯ ＦｌｐIｎ細胞における安定発現からの１２Ｂ１のウェスタンブロッティング
１ｍｌのサンプルを濃縮し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに流した（レーン２）。馴化培地および非馴化培地も濃縮し、ゲルに流した。マーカーは、２５０、１５０、１００、７５、５０、３７、２５、２０および１５ｋＤａである。免疫ブロットをマウス抗インスリン抗体（Abcam.; Cat#: ab9569; 希釈=1:100）および抗マウスＨＲＰ抗体（Abcam.; 希釈=1:2500）を用いて行った。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インスリン融合ポリペプチドおよびダイマー；当該ポリペプチドをコードする核酸分子、並びに前記ポリペプチド／ダイマーを使用する治療方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質間の相互作用は機能にとって重要であり、エネルギー代謝、細胞分化および細胞増殖の制御といった細胞における生物学的効果をもたらす。レセプターと相互作用して生化学反応をもたらすタンパク質はアゴニストとして知られ、生化学反応を抑制または妨げるものはアンタゴニストとして知られている。タンパク質の特異的結合によるレセプターの活性化は、とりわけ細胞周期に特異的な遺伝子の発現をもたらす細胞内シグナル伝達カスケードの活性化および静止細胞の増殖活性化を介して細胞増殖を促進する。
【０００３】
インスリンはレセプターを介した生化学反応の活性化を媒介するタンパク質の一つである。インスリンはグルコースのホメオスタシスを制御するように働く。高血糖状態（異常に高濃度の血中グルコース）では、ランゲルハンス島の膵臓β細胞がプロインスリンを合成し、プロインスリンはそのアミノ及びカルボキシ末端で酵素切断されて５１アミノ酸ポリペプチドであるインスリンを生成する。インスリンが分泌されると、インスリンレセプターを発現するターゲット細胞（例えば肝臓、筋肉、脂肪組織）に作用する。インスリンレセプターの活性化は、過剰のグルコースレセプターを取り除き、グルコースを貯蔵用のグリコーゲンへと変換するグルコーストランスポーターの発現をもたらすシグナル伝達カスケードを引き起こす。グルコース濃度が正常に戻ると、インスリンは分解されて、その生物学的効果が取り除かれる。インスリンレセプターはチロシンキナーゼであり、二つのαサブユニットと二つのβサブユニットを含む四量体膜貫通レセプターである。αサブユニットは細胞外にあり、インスリンと結合する。βサブユニットは膜貫通であり、インスリン結合の際に活性化されるチロシンキナーゼドメインとATPを含む。αおよびβサブユニットはジスルフィド結合で互いに連結されている。
【０００４】
高血糖症をもたらす多くの病状が存在しており、その最もよく知られているものは糖尿病である。糖尿病には１型と２型があり得る。１型糖尿病は、膵臓β細胞の破壊をもたらす自己免疫疾患であり、これは患者がインスリンを製造できないことを意味する。２型糖尿病は、より複雑な病状であって、関連する多くの病気に由来し得るが、一般にはインスリンの代謝作用に対する耐性に関与している。例えば、２型糖尿病は、年齢、肥満、インスリン耐性をもたらす殆ど体を動かさない生活に関連している。関連する病状は、患者を２型糖尿病に掛かりやすくさせ得るメタボリックシンドロームと呼ばれる。このシンドロームに関連する症状は、高血圧、脂質異常症、体脂肪沈着の増加および心疾患である。インスリン耐性をもたらすさらなる病状は、成熟卵子を製造できなくなる多嚢胞性卵巣症候群、アンドロゲン過剰および多毛症である。低血糖症（異常に低濃度の血中グルコース）も知られており、典型的にはインスリン過剰投与の結果として引き起こされる。しかしながら、低血糖状態をもたらす過剰インスリン分泌を引き起こす疾患も存在する。例えば、インスリノーマはインスリンの過剰生産をもたらす膵臓β細胞の癌である。
【０００５】
インスリンの投与は、１型および２型糖尿病のような症状を制御する有効な手段である。歴史的に見ると、ヒト以外の起源から抽出されたインスリンが糖尿病の治療に使用されてきた。哺乳動物のインスリンは高度に保存されており、ターゲット細胞に発現されるインスリンレセプターを活性化することができる。組み換えヒトインスリンが製造されており、これらは高血糖の治療に好ましいインスリンである。グルコース代謝を制御するためのインスリンの使用に関連して多くの問題が存在する。これらには、投与形態、投与量およびインスリンのタイプが含まれる。インスリンの多くの形態が当該分野で知られており、インスリン又はインスリン変異体の放出及び活性プロファイルによって互いに区別されている。例えば、即効性（５−１５分）で中程度の放出（３−４時間）形態；遅延性（３０分）で中程度の放出（５−８時間）形態；および遅延性（４−６時間）で持続的放出（２４−２８時間）形態がある。これらは、天然インスリンアミノ酸配列を変更して活性／放出プロファイルを操作したインスリンである。インスリン治療の主な副作用は低血糖症であり、低血糖症のリスクが低い持続的生物活性を与える長時間作用型のインスリンアナログが必要とされている。
【発明の概要】
【０００６】
ここに、変更された薬物動態プロファイルおよび活性を有するインスリン：レセプター融合タンパク質の形態の天然インスリンを開示する。インスリン分子は生物学的に活性であり、ダイマーを形成し、改善された血清安定性を有する。この融合技術は、天然インスリンおよび変性インスリンの両方に適用できることは明らかであろう。この分子の主な利点は、ゼロ次生物学的速度過程（zero order biological kinetics）に傾いた薬物動態プロファイルをもたらし、低血糖症のリスクも低い、部分的に不活性な形態である持続型インスリンを提供することである。
【０００７】
本発明の一態様によれば、インスリンの活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む核酸分子を提供するものであり、ここで前記ポリペプチドは、直接または間接的にインスリンレセプターのインスリン結合ドメインに連結されたインスリンまたはそのレセプター結合部位を含む。
【０００８】
本発明の一態様によれば、直接または間接的にインスリンレセプターポリペプチドに連結されたインスリンポリペプチドまたはその活性レセプター結合部位のアミノ酸配列を含む融合ポリペプチドを提供する。
【０００９】
本発明の好ましい態様では、前記インスリンポリペプチドは天然インスリン；好ましくはヒトインスリンである。
【００１０】
本発明の好ましい態様では、前記インスリンポリペプチドは、図２ａ、２ｂ、２ｃ、２ｄ、２ｅまたは２ｆに示されているアミノ酸配列を含むまたは当該アミノ酸配列からなる。
【００１１】
本発明の別の好ましい態様では、前記インスリンポリペプチドは変性インスリンである。
【００１２】
“変性インスリン(modified insulin)”とは天然インスリンの配列変異体を表す。変性された配列変異体は当該技術分野で知られており、アスパルト（aspart）、リスプロ（lipspro）、レンテ（lente）、ウルトラレンテ（ultralente）、グラルギン（glargine）およびデテミル（determir）のような商業的に入手可能な変異体を含む。
【００１３】
本発明の好ましい態様では、インスリンが、ペプチドリンカー、好ましくは柔軟なペプチドリンカーによってインスリンレセプターの結合ドメインに連結されている。
【００１４】
本発明の好ましい態様では、前記ペプチド連結分子が、ペプチドＧｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒの少なくとも１つのコピーを含む。
【００１５】
本発明の好ましい態様では、前記ペプチド連結分子が、ペプチドＧｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒの２、３、４、５、６、７、８、９または１０コピーを含む。
【００１６】
好ましくは、前記ペプチド連結分子が、ペプチドＧｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒの４コピーからなる。
【００１７】
好ましくは、前記ペプチド連結分子が、ペプチドＧｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒの８コピーからなる。
【００１８】
本発明のさらに別の態様では、前記ポリペプチドがペプチド連結分子を含まず、インスリンとインスリンレセプターのインスリン結合ドメインとの直接融合体である。
【００１９】
インスリンレセプターとその結合ドメインは、本発明の範囲内の多型配列変異体を含む。例えば、図１ｉでは、残基４４８がスレオニン（Ｔ）であり４９２がリシン（Ｋ）であるが、それぞれ、イソロイシン（Ｉ）およびグルタミン（Ｑ）であってもよい。ヒトインスリンレセプターをコードする遺伝子の別の多型は、Ｇ５８→Ｒ；Ｙ１７１→Ｈ；Ｇ８１１→Ｓ；およびＰ８３０→Ｌを含むのアミノ酸の変化をもたらす。
【００２０】
本発明の好ましい態様では、前記インスリンレセプターポリペプチドが、図１ａ、１ｂ、１ｃ、１ｄ、１ｅ、１ｆ、１ｇまたは１ｈからなる群から選択されたアミノ酸配列を含むまたは当該アミノ酸配列からなる。
【００２１】
図１ａ−１ｈに図示したアミノ酸配列は、インスリンレセプターポリペプチドおよびインスリンレセプターポリペプチドのドメインを記載している。ペプチドシグナル配列の存在（配列のアミノ末端に太字で示した）は任意であり、この開示はシグナル配列を含むまたは含まない配列に関する。これは、シグナル配列を含むここに開示された配列に準用する。
【００２２】
本発明の好ましい態様では、前記インスリンレセプターポリペプチドは図１ｇまたは１ｈのアミノ酸配列からなる。
【００２３】
本発明の好ましい態様では、前記融合ポリペプチドは、図３ａに図示されているアミノ酸配列を含むまたは当該アミノ酸配列からなり、ここで前記ポリペプチドはインスリンレセプター調節活性を有する。
【００２４】
本発明の好ましい態様では、前記融合ポリペプチドは、図３ｂに図示されているアミノ酸配列を含むまたは当該アミノ酸配列からなり、ここで前記ポリペプチドはインスリンレセプター調節活性を有する。
【００２５】
本発明の好ましい態様では、前記融合ポリペプチドは、図３ｃに図示されているアミノ酸配列を含むまたは当該アミノ酸配列からなり、ここで前記ポリペプチドはインスリンレセプター調節活性を有する。
【００２６】
本発明の好ましい態様では、前記融合ポリペプチドは、図４ａに図示されているアミノ酸配列を含むまたは当該アミノ酸配列からなり、ここで前記ポリペプチドはインスリンレセプター調節活性を有する。
【００２７】
本発明の好ましい態様では、前記融合ポリペプチドは、図４ｂに図示されているアミノ酸配列を含むまたは当該アミノ酸配列からなり、ここで前記ポリペプチドはインスリンレセプター調節活性を有する。
【００２８】
本発明の好ましい態様では、前記融合ポリペプチドは、図４ｃに図示されているアミノ酸配列を含むまたは当該アミノ酸配列からなり、ここで前記ポリペプチドはインスリンレセプター調節活性を有する。
【００２９】
本発明の好ましい態様では、前記融合ポリペプチドは、図５ａに図示されているアミノ酸配列を含むまたは当該アミノ酸配列からなり、ここで前記ポリペプチドはインスリンレセプター調節活性を有する。
【００３０】
本発明の好ましい態様では、前記融合ポリペプチドは、図５ｂに図示されているアミノ酸配列を含むまたは当該アミノ酸配列からなり、ここで前記ポリペプチドはインスリンレセプター調節活性を有する。
【００３１】
本発明の好ましい態様では、前記融合ポリペプチドは、図５ｃに図示されているアミノ酸配列を含むまたは当該アミノ酸配列からなり、ここで前記ポリペプチドはインスリンレセプター調節活性を有する。
【００３２】
本発明の好ましい態様では、前記融合ポリペプチドは、図６ａに図示されているアミノ酸配列を含むまたは当該アミノ酸配列からなり、ここで前記ポリペプチドはインスリンレセプター調節活性を有する。
【００３３】
本発明の好ましい態様では、前記融合ポリペプチドは、図６ｂに図示されているアミノ酸配列を含むまたは当該アミノ酸配列からなり、ここで前記ポリペプチドはインスリンレセプター調節活性を有する。
【００３４】
本発明の好ましい態様では、前記融合ポリペプチドは、図６ｃに図示されているアミノ酸配列を含むまたは当該アミノ酸配列からなり、ここで前記ポリペプチドはインスリンレセプター調節活性を有する。
【００３５】
本発明の好ましい態様では、前記融合ポリペプチドは、図６ｄに図示されているアミノ酸配列を含むまたは当該アミノ酸配列からなり、ここで前記ポリペプチドはインスリンレセプター調節活性を有する。
【００３６】
本発明の好ましい態様では、前記融合ポリペプチドは、図６ｅに図示されているアミノ酸配列を含むまたは当該アミノ酸配列からなり、ここで前記ポリペプチドはインスリンレセプター調節活性を有する。
【００３７】
本発明の好ましい態様では、前記融合ポリペプチドは、図６ｆに図示されているアミノ酸配列を含むまたは当該アミノ酸配列からなり、ここで前記ポリペプチドはインスリンレセプター調節活性を有する。
【００３８】
本発明の好ましい態様では、前記融合ポリペプチドは、図７ａに図示されているアミノ酸配列を含むまたは当該アミノ酸配列からなり、ここで前記ポリペプチドはインスリンレセプター調節活性を有する。
【００３９】
本発明の好ましい態様では、前記融合ポリペプチドは、図７ｂに図示されているアミノ酸配列を含むまたは当該アミノ酸配列からなり、ここで前記ポリペプチドはインスリンレセプター調節活性を有する。
【００４０】
本発明の好ましい態様では、前記融合ポリペプチドは、図７ｃに図示されているアミノ酸配列を含むまたは当該アミノ酸配列からなり、ここで前記ポリペプチドはインスリンレセプター調節活性を有する。
【００４１】
本発明の好ましい態様では、前記融合ポリペプチドは、図８ａに図示されているアミノ酸配列を含むまたは当該アミノ酸配列からなり、ここで前記ポリペプチドはインスリンレセプター調節活性を有する。
【００４２】
本発明の好ましい態様では、前記融合ポリペプチドは、図８ｂに図示されているアミノ酸配列を含むまたは当該アミノ酸配列からなり、ここで前記ポリペプチドはインスリンレセプター調節活性を有する。
【００４３】
本発明の好ましい態様では、前記融合ポリペプチドは、図８ｃに図示されているアミノ酸配列を含むまたは当該アミノ酸配列からなり、ここで前記ポリペプチドはインスリンレセプター調節活性を有する。
【００４４】
本発明の好ましい態様では、前記融合ポリペプチドは、図９ａに図示されているアミノ酸配列を含むまたは当該アミノ酸配列からなり、ここで前記ポリペプチドはインスリンレセプター調節活性を有する。
【００４５】
本発明の好ましい態様では、前記融合ポリペプチドは、図９ｂに図示されているアミノ酸配列を含むまたは当該アミノ酸配列からなり、ここで前記ポリペプチドはインスリンレセプター調節活性を有する。
【００４６】
本発明の好ましい態様では、前記融合ポリペプチドは、図９ｃに図示されているアミノ酸配列を含むまたは当該アミノ酸配列からなり、ここで前記ポリペプチドはインスリンレセプター調節活性を有する。
【００４７】
本発明の好ましい態様では、前記融合ポリペプチドは、図１０ａに図示されているアミノ酸配列を含むまたは当該アミノ酸配列からなり、ここで前記ポリペプチドはインスリンレセプター調節活性を有する。
【００４８】
本発明の好ましい態様では、前記融合ポリペプチドは、図１０ｂに図示されているアミノ酸配列を含むまたは当該アミノ酸配列からなり、ここで前記ポリペプチドはインスリンレセプター調節活性を有する。
【００４９】
本発明の好ましい態様では、前記融合ポリペプチドは、図１０ｃに図示されているアミノ酸配列を含むまたは当該アミノ酸配列からなり、ここで前記ポリペプチドはインスリンレセプター調節活性を有する。
【００５０】
本発明の好ましい態様では、前記融合ポリペプチドは、図１０ｄに図示されているアミノ酸配列を含むまたは当該アミノ酸配列からなり、ここで前記ポリペプチドはインスリンレセプター調節活性を有する。
【００５１】
本発明の好ましい態様では、前記融合ポリペプチドは、図１０ｅに図示されているアミノ酸配列を含むまたは当該アミノ酸配列からなり、ここで前記ポリペプチドはインスリンレセプター調節活性を有する。
【００５２】
本発明の好ましい態様では、前記融合ポリペプチドは、図１０ｆに図示されているアミノ酸配列を含むまたは当該アミノ酸配列からなり、ここで前記ポリペプチドはインスリンレセプター調節活性を有する。
【００５３】
本発明の好ましい態様では、前記ポリペプチドがアゴニストである。
【００５４】
本発明の別の好ましい態様では、前記ポリペプチドがアンタゴニストである。
【００５５】
本発明のさらなる態様によれば、本発明に係るポリペプチドをコードする核酸分子を提供する。
【００５６】
本発明の態様によれば、本発明に係る二つのポリペプチドからなるホモダイマーを提供する。
【００５７】
本発明のさらなる態様によれば、本発明に係る核酸分子を含むベクターを提供する。
【００５８】
本発明の好ましい態様では、前記ベクターは、本発明に係る核酸分子を発現するのに適合した発現ベクターである。
【００５９】
本発明に係る核酸を含むベクターは、特にそのベクターが安定なトランスフェクションのために組み換え用細胞のゲノムに核酸を導入するために使用される場合には、プロモーターまたは他の制御配列を含む必要はない。好ましくは、ベクター内の核酸は、宿主細胞において、適切なプロモーターまたは転写用の他の調節エレメントに機能的に連結される。ベクターは、多様なホストで機能するバイファンクショナル発現ベクターであってもよい。“プロモーター”は、転写開始部位より上流のヌクレオチド配列を意味し、転写に必要な全ての制御領域を含む。適切なプロモーターは、真核細胞または原核細胞における発現のための構成的、組織特異的、誘導、発生的（developmental）プロモーターなどを含む。“機能的に連結”とは、転写がプロモーターから開始されるのに適切な位置および方向で、同じ核酸分子の一部として組み込まれていることを意味する。プロモーターに機能的に連結したＤＮＡは、プロモーターの“転写開始調節下”にある。
【００６０】
好ましい態様では、プロモーターは、構成的、誘導または調節可能プロモーターである。
【００６１】
本発明のさらなる態様によれば、本発明に係る核酸分子またはベクターでトランスフェクトまたは形質転換された細胞を提供する。
【００６２】
好ましくは、前記細胞は真核細胞である。あるいは、前記細胞は原核細胞である。
【００６３】
本発明の好ましい態様では、前記細胞は、真菌細胞（例えば、ピチア属（Pichia spp）、サッカロミセス属（Saccharomyces spp）、アカパンカビ属（Neurospora spp））；昆虫細胞（例えば、スポドプテラ属）；哺乳動物細胞（例えば、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞）；植物細胞からなる群から選択される。
【００６４】
本発明のさらなる態様によれば、本発明に係るポリペプチドを含み、賦形剤または担体を含む医薬組成物を提供する。
【００６５】
本発明の好ましい態様では、前記医薬組成物はさらなる治療剤と組み合わせられる。
【００６６】
本発明の好ましい態様では、前記さらなる治療剤は変性されたインスリン変異体である。
【００６７】
投与の際に、本発明の医薬組成物は薬学的に許容可能な調製物で投与される。このような調製物は、薬学的に許容できる濃度の塩、緩衝剤、防腐剤、適合する担体、および任意に他の治療剤をごく普通に含んでもよい。
【００６８】
本発明の医薬組成物は、注射を含むあらゆる通常の経路で投与することができる。投与及び適用は、例えば、経口、静脈内、腹腔内、筋肉内、腔内、関節内、皮下、局所（目）、皮膚（例えば、皮膚または粘膜へのクリーム脂溶性挿入物）、経皮または鼻腔内投与とすることができる。
【００６９】
本発明の医薬組成物は有効量で投与される。“有効量”とは、単独で、もしくはさらなる投与または相乗的薬剤と共同で、所望の応答を生じる薬剤／組成物の量である。これは、より好ましくは疾患の進行を永久に停止することを含むが、疾患の進行を一時的に遅延させるだけのものを含んでも良い。これは通常の方法でモニタでき、また、診断方法に従ってモニタすることもできる。
【００７０】
患者に投与される医薬組成物の投与量は、種々のパラメータに従って、特に、使用される投与方式および患者の状態（すなわち年齢および性別）に従って選択することができる。投与の際に、本発明の医薬組成物は薬学的に許容可能な量および薬学的に許容可能な組成物で適用される。薬剤に使用する場合、塩は薬学的に許容可能なものであるが、薬学的に許容できない塩であってもその薬学的に許容可能な塩を調製するために都合よく使用できることから、本発明の範囲から除外されるものではない。このような薬理学的および薬学的に許容可能な塩は、限定されるものではないが、以下の酸：塩酸、硫酸、硝酸、リン酸、マレイン酸、酢酸、サリチル酸、クエン酸、蟻酸、マロン酸、コハク酸等から調製されたものを含む。また、薬学的に許容可能な塩は、ナトリウム、カリウムまたはカルシウム塩のようなアルカリ金属またはアルカリ土類金属塩として調製できる。
【００７１】
医薬組成物は、所望であれば、薬学的に許容可能な担体と組み合わせてもよい。ここで使用する用語“薬学的に許容可能な担体”とは、ヒトへの投与に適した一以上の適合する固体または液体フィラー、希釈剤、封入剤を意味する。用語“担体”とは、天然または合成の有機または無機成分を指し、これと活性成分とを合わせることにより適用が容易となる。医薬組成物の各成分も、所望の薬学的効能を実質的に損なう相互作用が無いような方法で、本発明の分子と互いに混合することができる。
【００７２】
医薬組成物は、塩の状態の酢酸、塩の状態のクエン酸、塩の状態のホウ酸、および塩の状態のリン酸を含む適切な緩衝剤を含んでも良い。
【００７３】
医薬組成物は、任意に、適切な防腐剤、例えば塩化ベンザルコニウム、クロロブタノール、パラベン類、およびチメロサールを含んでもよい。
【００７４】
医薬組成物は、通常は単位投与量形態で提供することができ、薬学分野で周知のいずれかの方法で調製できる。全ての方法が、活性剤を、一以上の補助成分を構成する担体と合わせる工程を含む。一般に、組成物は、活性化合物を均一かつ密接に液状担体、細かく砕いた固形状担体、またはその両方と合わせ、次いで、必要に応じて製品を成形することによって製造される。
【００７５】
非経口投与に適した組成物は、通常は、好ましくは受容者の血液と等張の無菌水性または非水性調製物を含む。この調製物は、適切な分散または湿潤剤および懸濁化剤を用いた公知の方法に従って製造してもよい。無菌の注射用調製物は、例えば１，３−ブタンジオール溶液のような、非毒性の非経口的に許容可能な希釈剤または溶媒における無菌の注射用溶液または懸濁液であってもよい。使用できる許容可能な溶媒は、水、リンガー溶液および生理食塩液である。さらに、無菌の固定油が、溶媒または懸濁媒体として通常用いられる。このために、合成モノ−またはジ−グリセリドを含むあらゆる無菌性の固定油を使用できる。さらに、オレイン酸のような脂肪酸を注射剤の調製に使用してもよい。経口、皮下、静脈内、筋肉内等の投与に適した担体製剤は、Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA.から入手可能である。
【００７６】
本発明のさらなる態様によれば、本発明に係る少なくとも一つのポリペプチドの有効量を投与することを含む、高血糖症を患っているヒト患者を治療する方法を提供する。
【００７７】
本発明のさらなる態様によれば、本発明に係る少なくとも一つのポリペプチドの有効量を投与することを含む、低血糖症を患っているヒト患者を治療する方法を提供する。
【００７８】
本発明の好ましい方法では、前記ポリペプチドは静脈内に投与される。
【００７９】
本発明の別の好ましい方法では、前記ポリペプチドが皮下投与される。
【００８０】
本発明のさらに好ましい方法では、前記ポリペプチドが二日おきに投与され、好ましくは前記ポリペプチドが一週間おき、二週間おき、または一ヶ月おきに投与される。
【００８１】
本発明の好ましい方法では、前記高血糖症状が糖尿病である。
【００８２】
本発明の好ましい方法では、糖尿病が１型である。
【００８３】
本発明の好ましい方法では、糖尿病が２型である。
【００８４】
本発明の好ましい方法では、前記高血糖症がインスリン耐性の結果である。
【００８５】
本発明の好ましい方法では、前記高血糖症がメタボリックシンドロームの結果である。
【００８６】
本発明の態様によれば、糖尿病を治療する医薬を製造するための本発明に係るポリペプチドの使用を提供する。
【００８７】
本発明の好ましい態様では、糖尿病が１型である。
【００８８】
本発明の好ましい態様では、糖尿病が２型である。
【００８９】
本発明の好ましい方法では、前記高血糖症がインスリン耐性の結果である。
【００９０】
本発明の好ましい方法では、前記高血糖症がメタボリックシンドロームの結果である。
【００９１】
本発明のさらに好ましい態様では、前記ポリペプチドが二日おきに投与され、好ましくは前記ポリペプチドが一週間おき、二週間おき、または一ヶ月おきに投与される。
【００９２】
本発明のさらなる態様によれば、本発明に係るポリペプチドまたはダイマーに結合するモノクローナル抗体を提供する。
【００９３】
好ましくは、前記モノクローナル抗体は、ポリペプチドまたはダイマーに結合するが、インスリンまたはインスリンレセプター単独には特異的に結合しない抗体である。
【００９４】
モノクローナル抗体は、本発明のポリペプチドまたは本発明のポリペプチドを含むダイマーのいずれかによって提示される構造的抗原（conformational antigen）に結合する。
【００９５】
本発明のさらなる態様では、以下の工程：
ｉ）少なくとも一つの本発明に係るポリペプチドを含む免疫原で免疫応答性の哺乳動物を免疫化する；
ｉｉ）免疫化した免疫応答性の哺乳動物のリンパ球をミエローマ細胞と融合してハイブリドーマ細胞を形成する；
ｉｉｉ）（ｉ）のポリペプチドに対する結合活性について、工程（ｉｉ）のハイブリドーマ細胞によって製造されたモノクローナル抗体をスクリーニングする、
ｉｖ）ハイブリドーマ細胞を培養して、増殖及び／又は前記モノクローナル抗体を分泌させる、および
ｖ）培養上清からモノクローナル抗体を回収する
を含む、本発明に係るモノクローナル抗体を製造するハイブリドーマ細胞株を調製する方法を提供する。
【００９６】
好ましくは、前記免疫応答性の哺乳動物はマウスである。あるいは、前記免疫応答性の哺乳動物はラットである。
【００９７】
ハイブリドーマ細胞を用いたモノクローナル抗体の製造は、当該分野において周知である。モノクローナル抗体を製造するために使用される方法は、KohlerおよびMilstein, Nature 256, 495-497 (1975)、並びにDonillardおよびHoffman, "Basic Facts about Hybridomas", Compendium of Immunology V.II版. Schwartz, 1981に開示されており、これらを参照として取り込む。
【００９８】
本発明のさらなる態様によれば、本発明に係る方法によって得られたまたは得られるハイブリドーマ細胞株を提供する。
【００９９】
本発明のさらなる態様によれば、以下の工程：
ｉ）試験すべき単離されたサンプルを提供する、
ｉｉ）前記サンプルを本発明に係るポリペプチドに結合するリガンドと接触させる、および
ｉｉｉ）前記サンプルにおける前記リガンドの結合を検出する
を含む、生物学的サンプル中の本発明に係るポリペプチドを検出するための診断試験を提供する。
【０１００】
本発明の好ましい態様では、前記リガンドは抗体であり、好ましくはモノクローナル抗体である。
【０１０１】
本明細書の記載及び特許請求の範囲を通じて、用語“含む(comprise)”および“含む(contain)”およびこれらの用語の変形、例えば“含む(comprising)”および“含む(comprises)”は、“包含するが限定されない(including but not limited to)”ことを意味し、別の部分、添加物、成分、整数または工程を排除することを意図しない（並びに排除しない）。
【０１０２】
本明細書の記載及び特許請求の範囲を通じて、必要がない限り、単数形は複数形を包含する。特に、不定冠詞が使用されるところでは、本明細書は、必要がない限り、単数形も複数形も意図すると解する。
【０１０３】
本発明の特定の態様、実施態様または実施例に関連して記載された特性、整数、特徴、化合物、化学的部分または基は、不適切でなければ、ここに記載された他の態様、実施態様または実施例に適用可能であるものと理解する。
【図面の簡単な説明】
【０１０４】
【図１ｉ】図１ＡはヒトインスリンレセプターアイソフォームＩＲ−Ａを図示する。
【図１ｉｉ】図１ＢはヒトインスリンレセプターアイソフォームＩＲ−Ｂを図示する；図１ＣはヒトインスリンレセプターのＬ１ドメインである；図１Ｄはヒトインスリンレセプターのシステインリッチドメインである；図１ＥはヒトインスリンレセプターのＬ２サブドメインである；図１ＦはヒトインスリンレセプターのＦｎＩＩＩ−１ドメインである。
【図１ｉｉｉ】図１ＧはヒトインスリンレセプターアイソフォームＢの細胞外ドメインである［アミノ酸２８−９５５］；図１ＨはヒトインスリンレセプターアイソフォームＡの細胞外ドメインである［アミノ酸２８−９４３］；図１ｉは多型変異体配列を示すヒトインスリンレセプターである。
【図２】図２Ａはサブドメインに関する概要を含むヒトインスリン前駆体のアミノ酸配列である；図２Ｂはヒトインスリン鎖Ｂのアミノ酸配列である；図２Ｃはヒトインスリン鎖Ａのアミノ酸配列である；図２Ｄはヒトプロインスリンのアミノ酸配列である；図２Ｅはヒトインスリン１のペプチド連結ＢおよびＡ鎖のアミノ酸配列である；図２Ｆはヒトインスリン２のペプチド連結ＡおよびＢ鎖のアミノ酸配列である。
【図３】図３ＡはレセプターＬ１ドメインとプロインスリンからなるキメラ融合タンパク質である；図３ＢはレセプターＬ１ドメインと一本鎖インスリン１からなるキメラ融合タンパク質である；図３ＣはレセプターＬ１ドメインと一本鎖インスリン２からなるキメラ融合タンパク質である。
【図４】図４ＡはレセプターＬ２ドメインとプロインスリンからなるキメラ融合タンパク質である；図４ＢはレセプターＬ２ドメインと一本鎖インスリン１からなるキメラ融合タンパク質である；図４ＣはレセプタードメインＬ２と一本鎖インスリン２からなるキメラ融合タンパク質である。
【図５】図５ＡはレセプターＦｎＩＩＩ−１ドメインとプロインスリンからなるキメラ融合タンパク質である；図５ＢはＦｎＩＩＩ−１ドメインと一本鎖インスリン１を含むキメラ融合タンパク質である；図５ＣはＦｎＩＩＩ−１ドメインＬ２と一本鎖インスリン２を含むキメラ融合タンパク質である。
【図６ｉ】図６ＡはインスリンレセプターアイソフォームＢの細胞外ドメインとプロインスリンからなるキメラ融合タンパク質である；図６ＢはインスリンレセプターアイソフォームＢの細胞外ドメインと一本鎖インスリン１を含むキメラ融合タンパク質である；図６ＣはインスリンレセプターアイソフォームＢの細胞外ドメインと一本鎖インスリン２を含むキメラ融合タンパク質である。
【図６ｉｉ】図６ＤはインスリンレセプターアイソフォームＡの細胞外ドメインとプロインスリンを含むキメラ融合タンパク質である；図６ＥはインスリンレセプターアイソフォームＡの細胞外ドメインと一本鎖インスリン１を含むキメラ融合タンパク質である；図６ＦはインスリンレセプターアイソフォームＡの細胞外ドメインと一本鎖インスリン２を含むキメラ融合タンパク質である。
【図７】図７ＡはプロインスリンとインスリンレセプタードメインＬ１を含むキメラ融合タンパク質である；図７Ｂは一本鎖インスリン１とインスリンレセプタードメインＬ１を含むキメラ融合タンパク質である；図７Ｃは一本鎖インスリン１とインスリンレセプタードメインＬ１を含むキメラ融合タンパク質である。
【図８】図８ＡはプロインスリンとインスリンレセプタードメインＬ２を含むキメラ融合タンパク質である；図８Ｂは一本鎖インスリン１とインスリンレセプタードメインＬ２を含むキメラ融合タンパク質である；図８Ｃは一本鎖インスリン１とインスリンレセプタードメインＬ２を含むキメラ融合タンパク質である。
【図９】図９ＡはプロインスリンとインスリンレセプターＦｎＩＩＩ−１ドメインを含むキメラ融合タンパク質である；図９Ｂは一本鎖インスリン１とインスリンレセプターＦｎＩＩＩ−１ドメインを含むキメラ融合タンパク質である；図９Ｃは一本鎖インスリン２とインスリンレセプターＦｎＩＩＩ−１ドメインを含むキメラ融合タンパク質である。
【図１０ｉ】図１０ＡはプロインスリンとインスリンアイソフォームＢの細胞外ドメインを含むキメラ融合タンパク質である；図１０Ｂは一本鎖インスリン１とインスリンアイソフォームＢの細胞外ドメインを含むキメラ融合タンパク質である；図１０Ｃは一本鎖インスリン２とインスリンアイソフォームＢの細胞外ドメインを含むキメラ融合タンパク質である。
【図１０ｉｉ】図１０ＤはプロインスリンとインスリンアイソフォームＡの細胞外ドメインを含むキメラ融合タンパク質である；図１０Ｅは一本鎖インスリン１とインスリンアイソフォームＡの細胞外ドメインを含むキメラ融合タンパク質である；図１０Ｆは一本鎖インスリン２とインスリンアイソフォームＡの細胞外ドメインを含むキメラ融合タンパク質である。
【図１１】ａ）ＰＣＲを用いて、適切な制限部位（プライマーＲ１−４に含まれる）を隣接させた目的の遺伝子からなるＤＮＡを生成した。ｂ）このＰＣＲ産物を、リンカー領域の各端で適切なベクターに結合させた。ｃ）この構成物を変死して、不要な配列（すなわち、本来のものでない制限酵素認識部位）を含まない的確なリンカーを導入するように変性した。
【図１２】ａ）オリゴヌクレオチドを、特有のオーバーラップを備えた部分的二本鎖領域を形成するように設計し、アニールおよびプロセッシングした際に、リガンド及びレセプターにアニールする隣接領域を備えたリンカーをコードするものとした。ｂ）“メガプライマー”および末端プライマー（Ｒ１およびＲ２）を用いてＰＣＲを行い、ＬＲ-融合遺伝子を製造した。Ｒ１およびＲ２プライマーは、ターゲットベクターへの結合に使用可能な隣接制限酵素認識部位を取り込むように設計した。
【図１３】図１３はインスリン融合タンパク質１２Ｂ１の発現及び免疫ブロットである。
【発明を実施するための形態】
【０１０５】
本発明の実施態様を、実施例を用いて、図面を参照しながら記載する。
【０１０６】
材料と方法
インスリン融合タンパク質活性の試験
ここに記載するインスリン融合タンパク質の生物学的活性の試験方法は、当該分野において周知である。例えば、US2008/057004、US2006/286182、US2005/171008またはUS6200569に記載されている方法およびアッセイを、参照としてここに取り込む。
【０１０７】
免疫学的試験
ポリクローナルおよびモノクローナル抗体に対するインスリンの結合を調べる免疫測定法は、当該分野において知られている。商業的に入手可能なインスリン抗体がサンプル中のインスリンを検出するために利用でき、競争阻害試験における使用にも利用できる。例えば、モノクローナル抗体は、http://www.ab-direct.com/index AbD Serotecで購入することができる。
【０１０８】
融合タンパク質の組み換え生成
融合タンパク質の構成成分を、リガンドまたはレセプターにアニールし、かつ、ターゲットベクターへのクローニングに適した制限酵素認識部位を導入するように設計されたプライマーを用いるＰＣＲによって生成した（図１１ａ）。ＰＣＲのテンプレートはターゲット遺伝子を含んでおり、ＩＭＡＧＥクローン、ｃＤＮＡライブラリーまたはカスタム合成遺伝子から得た。適切な隣接する制限酵素認識部位を有するリガンドおよびレセプター遺伝子を合成したら、これらをターゲットベクターにおいてリンカー領域の両端に結合させた（図１１ｂ）。この構築物を、リンカー領域の両端の二つの特有の制限酵素認識部位間にカスタム合成した長さのＤＮＡを挿入するか、ｓｓＤＮＡ変性技術によってリンカー領域を変異させるか、適切な制限酵素認識部位間にプライマーデュプレックス／マルチプレックス（primer duplex/multiplex）を挿入するか、またはＰＣＲ変性によって、隣接する制限酵素認識部位のない適正なリンカーを含むように変性させた（図１１ｃ）。
【０１０９】
あるいは、最適なリガンド又はレセプタードメインにアニールするように設計された隣接する配列を有するリンカーを、オリゴヌクレオチド二本鎖を生成することによって最初に合成し、これを処理して二本鎖ＤＮＡを生成した（図１２ａ）。次いで“メガプライマー”としてのリンカー配列、この“メガプライマー”がアニールするリガンドおよびレセプターの反対端に対向して設計されたプライマー、およびテンプレートとしてのリガンドおよびレセプターを用いて、ＰＣＲを行った。末端プライマーは、最適な発現ベクターへの結合に適した制限酵素認識部位を用いて設計した。
【０１１０】
融合タンパク質の発現および精製
適切な系（例えば哺乳動物ＣＨＯ細胞、E.coli）で発現を行った。これは、インスリン融合遺伝子が生成されるベクターに依存する。次いで、当該分野で周知のＳＤＳ−ＰＡＧＥ、Ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥ、ウエスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡの一以上を含んでもよい種々の方法を用いて発現を分析した。
【０１１１】
適切なレベルの発現を達成したら、インスリン融合物をより大きいスケールで発現し、精製および次の分析に十分なタンパク質を製造する。
【０１１２】
イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、硫安沈殿法、ゲル濾過、サイズ排除および／またはアフィニティークロマトグラフィー（ニッケル／コバルト樹脂、抗体固定化樹脂および／またはリガンド／レセプター固定化樹脂を使用）のような一以上のクロマトグラフ法の適切な組み合わせを用いて精製を行った。
【０１１３】
精製したタンパク質を、ブラッドフォード分析、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、Ｎａｔｉｖｅ ＰＡＧＥ、ウェスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡを含む種々の方法を用いて分析した。
【０１１４】
インスリン融合物の特性評価
変性ＰＡＧＥ、ｎａｔｉｖｅ ＰＡＧＥゲルおよびウェスタンブロッティングを用いて、融合ポリペプチドを分析し、かつ、インスリン融合物に対して構造的に敏感でない抗体を用いてウェスタンブロッティングを行った。ネイティブの溶液状態分子量情報は、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ Ｇ２００分析カラムおよび分析超遠心を使用したサイズ排除クロマトグラフィーのような技術から得ることができる。
【０１１５】
統計
二つのグループを、分散が正規分布であればスチューデント検定を用いて比較し、正規分布でなければスチューデント−サタースワイト検定（Student-Satterthwaite's test）を用いて比較した。分布はＦ検定でテストした。一元ANOVA(One-way ANOVA)を用いて３以上のグループの平均を比較し、有意水準がｐ＜０．０５であれば、個々の比較をダネット検定を用いて行った。全ての統計的検定が両側５％の有意水準であり、欠測値にデータの補完は行わなかった。
【０１１６】
インスリンＬＲ融合体の発現：ＣＨＯ ＦｌｐIｎ細胞における安定発現からの１２Ｂ１のウェスタンブロッティング
１ｍｌのサンプルを濃縮し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに流した（レーン２）。馴化培地および非馴化培地も濃縮し、ゲルに流した。マーカーは、２５０、１５０、１００、７５、５０、３７、２５、２０および１５ｋＤａである。免疫ブロットをマウス抗インスリン抗体（Abcam.; Cat#: ab9569; 希釈=1:100）および抗マウスＨＲＰ抗体（Abcam.; 希釈=1:2500）を用いて行った。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
インスリン活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む核酸分子であって、前記ポリペプチドが直接的または間接的にインスリンレセプターポリペプチドに連結されたインスリンまたはそのレセプター結合部位を含む、核酸分子。
【請求項２】
直接的または間接的にインスリンレセプターポリペプチドに連結されたインスリンポリペプチドまたはその活性なレセプター結合部位のアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド。
【請求項３】
前記インスリンポリペプチドが天然インスリンである請求項２記載の融合ポリペプチド。
【請求項４】
前記インスリンポリペプチドがヒトインスリンである請求項２記載の融合ポリペプチド。
【請求項５】
前記インスリンポリペプチドが、図２ａ、２ｂ、２ｃ、２ｄ、２ｅまたは２ｆに示されているアミノ酸配列を含むまたは当該アミノ酸配列からなる、請求項１ないし４のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項６】
前記インスリンポリペプチドが変性インスリンである請求項２記載の融合ポリペプチド。
【請求項７】
インスリンがペプチドリンカーによってインスリンレセプターの結合ドメインに連結されている、請求項１ないし６のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項８】
前記ペプチドリンカーが柔軟なペプチドリンカーである、請求項７記載の融合ポリペプチド。
【請求項９】
前記ペプチド連結分子が、ペプチドＧｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒの少なくとも１つのコピーを含む、請求項８記載の融合ポリペプチド。
【請求項１０】
前記ペプチド連結分子が、ペプチドＧｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒの２、３、４、５、６、７、８、９または１０コピーを含む、請求項９記載の融合ポリペプチド。
【請求項１１】
前記ペプチド連結分子が、ペプチドＧｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒの４コピーからなる、請求項９記載の融合ポリペプチド。
【請求項１２】
前記ペプチド連結分子が、ペプチドＧｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒの８コピーからなる、請求項９記載の融合ポリペプチド。
【請求項１３】
前記ポリペプチドがペプチド連結分子を含まず、インスリンおよびインスリンレセプターポリペプチドの直接融合体である、請求項２記載の融合ポリペプチド。
【請求項１４】
前記インスリンレセプターポリペプチドが、図１ａ、１ｂ、１ｃ、１ｄ、１ｅ、１ｆ、１ｇまたは１ｈからなる群から選択されたアミノ酸配列を含むまたは当該アミノ酸配列からなる、請求項１ないし１３のいずれか一項記載の融合ポリペプチド。
【請求項１５】
前記インスリンレセプターポリペプチドが図１ｇまたは１ｈのアミノ酸配列からなる、請求項１４記載の融合ポリペプチド。
【請求項１６】
前記融合ポリペプチドが、図３ａに図示されているアミノ酸配列を含むまたは当該アミノ酸配列からなり、ここで前記ポリペプチドはインスリンレセプター調節活性を有する、請求項２に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１７】
前記融合ポリペプチドが、図３ｂに図示されているアミノ酸配列を含むまたは当該アミノ酸配列からなり、ここで前記ポリペプチドはインスリンレセプター調節活性を有する、請求項２に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１８】
前記融合ポリペプチドが、図３ｃに図示されているアミノ酸配列を含むまたは当該アミノ酸配列からなり、ここで前記ポリペプチドはインスリンレセプター調節活性を有する、請求項２に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１９】
前記融合ポリペプチドが、図４ａに図示されているアミノ酸配列を含むまたは当該アミノ酸配列からなり、ここで前記ポリペプチドはインスリンレセプター調節活性を有する、請求項２に記載の融合ポリペプチド。
【請求項２０】
前記融合ポリペプチドが、図４ｂに図示されているアミノ酸配列を含むまたは当該アミノ酸配列からなり、ここで前記ポリペプチドはインスリンレセプター調節活性を有する、請求項２に記載の融合ポリペプチド。
【請求項２１】
前記融合ポリペプチドが、図４ｃに図示されているアミノ酸配列を含むまたは当該アミノ酸配列からなり、ここで前記ポリペプチドはインスリンレセプター調節活性を有する、請求項２に記載の融合ポリペプチド。
【請求項２２】
前記融合ポリペプチドが、前記融合ポリペプチドは、図５ａに図示されているアミノ酸配列を含むまたは当該アミノ酸配列からなり、ここで前記ポリペプチドはインスリンレセプター調節活性を有する、請求項２に記載の融合ポリペプチド。
【請求項２３】
前記融合ポリペプチドが、前記融合ポリペプチドは、図５ｂに図示されているアミノ酸配列を含むまたは当該アミノ酸配列からなり、ここで前記ポリペプチドはインスリンレセプター調節活性を有する、請求項２に記載の融合ポリペプチド。
【請求項２４】
前記融合ポリペプチドが、前記融合ポリペプチドは、図５ｃに図示されているアミノ酸配列を含むまたは当該アミノ酸配列からなり、ここで前記ポリペプチドはインスリンレセプター調節活性を有する、請求項２に記載の融合ポリペプチド。
【請求項２５】
前記融合ポリペプチドが、前記融合ポリペプチドは、図６ａに図示されているアミノ酸配列を含むまたは当該アミノ酸配列からなり、ここで前記ポリペプチドはインスリンレセプター調節活性を有する、請求項２に記載の融合ポリペプチド。
【請求項２６】
前記融合ポリペプチドが、前記融合ポリペプチドは、図６ｂに図示されているアミノ酸配列を含むまたは当該アミノ酸配列からなり、ここで前記ポリペプチドはインスリンレセプター調節活性を有する、請求項２に記載の融合ポリペプチド。
【請求項２７】
前記融合ポリペプチドが、前記融合ポリペプチドは、図６ｃに図示されているアミノ酸配列を含むまたは当該アミノ酸配列からなり、ここで前記ポリペプチドはインスリンレセプター調節活性を有する、請求項２に記載の融合ポリペプチド。
【請求項２８】
前記融合ポリペプチドが、前記融合ポリペプチドは、図６ｄに図示されているアミノ酸配列を含むまたは当該アミノ酸配列からなり、ここで前記ポリペプチドはインスリンレセプター調節活性を有する、請求項２に記載の融合ポリペプチド。
【請求項２９】
前記融合ポリペプチドが、前記融合ポリペプチドは、図６ｅに図示されているアミノ酸配列を含むまたは当該アミノ酸配列からなり、ここで前記ポリペプチドはインスリンレセプター調節活性を有する、請求項２に記載の融合ポリペプチド。
【請求項３０】
前記融合ポリペプチドが、前記融合ポリペプチドは、図６ｆに図示されているアミノ酸配列を含むまたは当該アミノ酸配列からなり、ここで前記ポリペプチドはインスリンレセプター調節活性を有する、請求項２に記載の融合ポリペプチド。
【請求項３１】
前記融合ポリペプチドが、前記融合ポリペプチドは、図７ａに図示されているアミノ酸配列を含むまたは当該アミノ酸配列からなり、ここで前記ポリペプチドはインスリンレセプター調節活性を有する、請求項２に記載の融合ポリペプチド。
【請求項３２】
前記融合ポリペプチドが、前記融合ポリペプチドは、図７ｂに図示されているアミノ酸配列を含むまたは当該アミノ酸配列からなり、ここで前記ポリペプチドはインスリンレセプター調節活性を有する、請求項２に記載の融合ポリペプチド。
【請求項３３】
前記融合ポリペプチドが、前記融合ポリペプチドは、図７ｃに図示されているアミノ酸配列を含むまたは当該アミノ酸配列からなり、ここで前記ポリペプチドはインスリンレセプター調節活性を有する、請求項２に記載の融合ポリペプチド。
【請求項３４】
前記融合ポリペプチドが、前記融合ポリペプチドは、図８ａに図示されているアミノ酸配列を含むまたは当該アミノ酸配列からなり、ここで前記ポリペプチドはインスリンレセプター調節活性を有する、請求項２に記載の融合ポリペプチド。
【請求項３５】
前記融合ポリペプチドが、前記融合ポリペプチドは、図８ｂに図示されているアミノ酸配列を含むまたは当該アミノ酸配列からなり、ここで前記ポリペプチドはインスリンレセプター調節活性を有する、請求項２に記載の融合ポリペプチド。
【請求項３６】
前記融合ポリペプチドが、前記融合ポリペプチドは、図８ｃに図示されているアミノ酸配列を含むまたは当該アミノ酸配列からなり、ここで前記ポリペプチドはインスリンレセプター調節活性を有する、請求項２に記載の融合ポリペプチド。
【請求項３７】
前記融合ポリペプチドが、前記融合ポリペプチドは、図９ａに図示されているアミノ酸配列を含むまたは当該アミノ酸配列からなり、ここで前記ポリペプチドはインスリンレセプター調節活性を有する、請求項２に記載の融合ポリペプチド。
【請求項３８】
前記融合ポリペプチドが、前記融合ポリペプチドは、図９ｂに図示されているアミノ酸配列を含むまたは当該アミノ酸配列からなり、ここで前記ポリペプチドはインスリンレセプター調節活性を有する、請求項２に記載の融合ポリペプチド。
【請求項３９】
前記融合ポリペプチドが、前記融合ポリペプチドは、図９ｃに図示されているアミノ酸配列を含むまたは当該アミノ酸配列からなり、ここで前記ポリペプチドはインスリンレセプター調節活性を有する、請求項２に記載の融合ポリペプチド。
【請求項４０】
前記融合ポリペプチドが、前記融合ポリペプチドは、図１０ａに図示されているアミノ酸配列を含むまたは当該アミノ酸配列からなり、ここで前記ポリペプチドはインスリンレセプター調節活性を有する、請求項２に記載の融合ポリペプチド。
【請求項４１】
前記融合ポリペプチドが、前記融合ポリペプチドは、図１０ｂに図示されているアミノ酸配列を含むまたは当該アミノ酸配列からなり、ここで前記ポリペプチドはインスリンレセプター調節活性を有する、請求項２に記載の融合ポリペプチド。
【請求項４２】
前記融合ポリペプチドが、前記融合ポリペプチドは、図１０ｃに図示されているアミノ酸配列を含むまたは当該アミノ酸配列からなり、ここで前記ポリペプチドはインスリンレセプター調節活性を有する、請求項２に記載の融合ポリペプチド。
【請求項４３】
前記融合ポリペプチドが、前記融合ポリペプチドは、図１０ｄに図示されているアミノ酸配列を含むまたは当該アミノ酸配列からなり、ここで前記ポリペプチドはインスリンレセプター調節活性を有する、請求項２に記載の融合ポリペプチド。
【請求項４４】
前記融合ポリペプチドが、前記融合ポリペプチドは、図１０ｅに図示されているアミノ酸配列を含むまたは当該アミノ酸配列からなり、ここで前記ポリペプチドはインスリンレセプター調節活性を有する、請求項２に記載の融合ポリペプチド。
【請求項４５】
前記融合ポリペプチドが、前記融合ポリペプチドは、図１０ｆに図示されているアミノ酸配列を含むまたは当該アミノ酸配列からなり、ここで前記ポリペプチドはインスリンレセプター調節活性を有する、請求項２に記載の融合ポリペプチド。
【請求項４６】
前記ポリペプチドがアゴニストである、請求項２ないし４５のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項４７】
前記ポリペプチドがアンタゴニストである、請求項２ないし４５のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項４８】
請求項２ないし４７のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする核酸分子。
【請求項４９】
請求項４８に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項５０】
請求項４９に記載のベクターまたは核酸分子で形質転換またはトランスフェクトした細胞。
【請求項５１】
請求項２ないし４７のいずれか一項に記載の二つのポリペプチドからなるホモダイマー。
【請求項５２】
賦形剤または担体を含む、請求項２ないし４７のいずれか一項に記載のポリペプチドを含む医薬組成物。
【請求項５３】
前記医薬組成物がさらなる治療剤と組み合わせられている、請求項５２に記載の組成物。
【請求項５４】
請求項２ないし４７のいずれか一項に記載の少なくとも一つのポリペプチドの有効量を投与することを含む高血糖症を患っているヒト患者を治療する方法。
【請求項５５】
請求項２ないし４７のいずれか一項に記載の少なくとも一つのポリペプチドの有効量を投与することを含む低血糖症を患っているヒト患者を治療する方法。
【請求項５６】
前記ポリペプチドが静脈内に投与される、請求項５５記載の方法。
【請求項５７】
前記ポリペプチドが皮下投与される、請求項５５記載の方法。
【請求項５８】
糖尿病が１型である、請求項５５ないし５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
糖尿病が２型である、請求項５５ないし５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
前記高血糖症がインスリン耐性の結果である、請求項５５ないし５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
前記高血糖症がメタボリックシンドロームの結果である、請求項５５ないし５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６２】
糖尿病の治療における請求項２ないし４７のいずれか一項に記載のポリペプチドの使用。
【請求項６３】
糖尿病が１型である、請求項６２に記載の使用。
【請求項６４】
糖尿病が２型である、請求項６２に記載の使用。
【請求項６５】
インスリン耐性の治療における、請求項２ないし４７のいずれか一項に記載のポリペプチドの使用。
【請求項６６】
メタボリックシンドロームの治療における、請求項２ないし４７のいずれか一項に記載のポリペプチドの使用。
【請求項１】
インスリン活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む核酸分子であって、前記ポリペプチドが直接的または間接的にインスリンレセプターポリペプチドに連結されたインスリンまたはそのレセプター結合部位を含む、核酸分子。
【請求項２】
直接的または間接的にインスリンレセプターポリペプチドに連結されたインスリンポリペプチドまたはその活性なレセプター結合部位のアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド。
【請求項３】
前記インスリンポリペプチドが天然インスリンである請求項２記載の融合ポリペプチド。
【請求項４】
前記インスリンポリペプチドがヒトインスリンである請求項２記載の融合ポリペプチド。
【請求項５】
前記インスリンポリペプチドが、図２ａ、２ｂ、２ｃ、２ｄ、２ｅまたは２ｆに示されているアミノ酸配列を含むまたは当該アミノ酸配列からなる、請求項１ないし４のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項６】
前記インスリンポリペプチドが変性インスリンである請求項２記載の融合ポリペプチド。
【請求項７】
インスリンがペプチドリンカーによってインスリンレセプターの結合ドメインに連結されている、請求項１ないし６のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項８】
前記ペプチドリンカーが柔軟なペプチドリンカーである、請求項７記載の融合ポリペプチド。
【請求項９】
前記ペプチド連結分子が、ペプチドＧｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒの少なくとも１つのコピーを含む、請求項８記載の融合ポリペプチド。
【請求項１０】
前記ペプチド連結分子が、ペプチドＧｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒの２、３、４、５、６、７、８、９または１０コピーを含む、請求項９記載の融合ポリペプチド。
【請求項１１】
前記ペプチド連結分子が、ペプチドＧｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒの４コピーからなる、請求項９記載の融合ポリペプチド。
【請求項１２】
前記ペプチド連結分子が、ペプチドＧｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒの８コピーからなる、請求項９記載の融合ポリペプチド。
【請求項１３】
前記ポリペプチドがペプチド連結分子を含まず、インスリンおよびインスリンレセプターポリペプチドの直接融合体である、請求項２記載の融合ポリペプチド。
【請求項１４】
前記インスリンレセプターポリペプチドが、図１ａ、１ｂ、１ｃ、１ｄ、１ｅ、１ｆ、１ｇまたは１ｈからなる群から選択されたアミノ酸配列を含むまたは当該アミノ酸配列からなる、請求項１ないし１３のいずれか一項記載の融合ポリペプチド。
【請求項１５】
前記インスリンレセプターポリペプチドが図１ｇまたは１ｈのアミノ酸配列からなる、請求項１４記載の融合ポリペプチド。
【請求項１６】
前記融合ポリペプチドが、図３ａに図示されているアミノ酸配列を含むまたは当該アミノ酸配列からなり、ここで前記ポリペプチドはインスリンレセプター調節活性を有する、請求項２に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１７】
前記融合ポリペプチドが、図３ｂに図示されているアミノ酸配列を含むまたは当該アミノ酸配列からなり、ここで前記ポリペプチドはインスリンレセプター調節活性を有する、請求項２に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１８】
前記融合ポリペプチドが、図３ｃに図示されているアミノ酸配列を含むまたは当該アミノ酸配列からなり、ここで前記ポリペプチドはインスリンレセプター調節活性を有する、請求項２に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１９】
前記融合ポリペプチドが、図４ａに図示されているアミノ酸配列を含むまたは当該アミノ酸配列からなり、ここで前記ポリペプチドはインスリンレセプター調節活性を有する、請求項２に記載の融合ポリペプチド。
【請求項２０】
前記融合ポリペプチドが、図４ｂに図示されているアミノ酸配列を含むまたは当該アミノ酸配列からなり、ここで前記ポリペプチドはインスリンレセプター調節活性を有する、請求項２に記載の融合ポリペプチド。
【請求項２１】
前記融合ポリペプチドが、図４ｃに図示されているアミノ酸配列を含むまたは当該アミノ酸配列からなり、ここで前記ポリペプチドはインスリンレセプター調節活性を有する、請求項２に記載の融合ポリペプチド。
【請求項２２】
前記融合ポリペプチドが、前記融合ポリペプチドは、図５ａに図示されているアミノ酸配列を含むまたは当該アミノ酸配列からなり、ここで前記ポリペプチドはインスリンレセプター調節活性を有する、請求項２に記載の融合ポリペプチド。
【請求項２３】
前記融合ポリペプチドが、前記融合ポリペプチドは、図５ｂに図示されているアミノ酸配列を含むまたは当該アミノ酸配列からなり、ここで前記ポリペプチドはインスリンレセプター調節活性を有する、請求項２に記載の融合ポリペプチド。
【請求項２４】
前記融合ポリペプチドが、前記融合ポリペプチドは、図５ｃに図示されているアミノ酸配列を含むまたは当該アミノ酸配列からなり、ここで前記ポリペプチドはインスリンレセプター調節活性を有する、請求項２に記載の融合ポリペプチド。
【請求項２５】
前記融合ポリペプチドが、前記融合ポリペプチドは、図６ａに図示されているアミノ酸配列を含むまたは当該アミノ酸配列からなり、ここで前記ポリペプチドはインスリンレセプター調節活性を有する、請求項２に記載の融合ポリペプチド。
【請求項２６】
前記融合ポリペプチドが、前記融合ポリペプチドは、図６ｂに図示されているアミノ酸配列を含むまたは当該アミノ酸配列からなり、ここで前記ポリペプチドはインスリンレセプター調節活性を有する、請求項２に記載の融合ポリペプチド。
【請求項２７】
前記融合ポリペプチドが、前記融合ポリペプチドは、図６ｃに図示されているアミノ酸配列を含むまたは当該アミノ酸配列からなり、ここで前記ポリペプチドはインスリンレセプター調節活性を有する、請求項２に記載の融合ポリペプチド。
【請求項２８】
前記融合ポリペプチドが、前記融合ポリペプチドは、図６ｄに図示されているアミノ酸配列を含むまたは当該アミノ酸配列からなり、ここで前記ポリペプチドはインスリンレセプター調節活性を有する、請求項２に記載の融合ポリペプチド。
【請求項２９】
前記融合ポリペプチドが、前記融合ポリペプチドは、図６ｅに図示されているアミノ酸配列を含むまたは当該アミノ酸配列からなり、ここで前記ポリペプチドはインスリンレセプター調節活性を有する、請求項２に記載の融合ポリペプチド。
【請求項３０】
前記融合ポリペプチドが、前記融合ポリペプチドは、図６ｆに図示されているアミノ酸配列を含むまたは当該アミノ酸配列からなり、ここで前記ポリペプチドはインスリンレセプター調節活性を有する、請求項２に記載の融合ポリペプチド。
【請求項３１】
前記融合ポリペプチドが、前記融合ポリペプチドは、図７ａに図示されているアミノ酸配列を含むまたは当該アミノ酸配列からなり、ここで前記ポリペプチドはインスリンレセプター調節活性を有する、請求項２に記載の融合ポリペプチド。
【請求項３２】
前記融合ポリペプチドが、前記融合ポリペプチドは、図７ｂに図示されているアミノ酸配列を含むまたは当該アミノ酸配列からなり、ここで前記ポリペプチドはインスリンレセプター調節活性を有する、請求項２に記載の融合ポリペプチド。
【請求項３３】
前記融合ポリペプチドが、前記融合ポリペプチドは、図７ｃに図示されているアミノ酸配列を含むまたは当該アミノ酸配列からなり、ここで前記ポリペプチドはインスリンレセプター調節活性を有する、請求項２に記載の融合ポリペプチド。
【請求項３４】
前記融合ポリペプチドが、前記融合ポリペプチドは、図８ａに図示されているアミノ酸配列を含むまたは当該アミノ酸配列からなり、ここで前記ポリペプチドはインスリンレセプター調節活性を有する、請求項２に記載の融合ポリペプチド。
【請求項３５】
前記融合ポリペプチドが、前記融合ポリペプチドは、図８ｂに図示されているアミノ酸配列を含むまたは当該アミノ酸配列からなり、ここで前記ポリペプチドはインスリンレセプター調節活性を有する、請求項２に記載の融合ポリペプチド。
【請求項３６】
前記融合ポリペプチドが、前記融合ポリペプチドは、図８ｃに図示されているアミノ酸配列を含むまたは当該アミノ酸配列からなり、ここで前記ポリペプチドはインスリンレセプター調節活性を有する、請求項２に記載の融合ポリペプチド。
【請求項３７】
前記融合ポリペプチドが、前記融合ポリペプチドは、図９ａに図示されているアミノ酸配列を含むまたは当該アミノ酸配列からなり、ここで前記ポリペプチドはインスリンレセプター調節活性を有する、請求項２に記載の融合ポリペプチド。
【請求項３８】
前記融合ポリペプチドが、前記融合ポリペプチドは、図９ｂに図示されているアミノ酸配列を含むまたは当該アミノ酸配列からなり、ここで前記ポリペプチドはインスリンレセプター調節活性を有する、請求項２に記載の融合ポリペプチド。
【請求項３９】
前記融合ポリペプチドが、前記融合ポリペプチドは、図９ｃに図示されているアミノ酸配列を含むまたは当該アミノ酸配列からなり、ここで前記ポリペプチドはインスリンレセプター調節活性を有する、請求項２に記載の融合ポリペプチド。
【請求項４０】
前記融合ポリペプチドが、前記融合ポリペプチドは、図１０ａに図示されているアミノ酸配列を含むまたは当該アミノ酸配列からなり、ここで前記ポリペプチドはインスリンレセプター調節活性を有する、請求項２に記載の融合ポリペプチド。
【請求項４１】
前記融合ポリペプチドが、前記融合ポリペプチドは、図１０ｂに図示されているアミノ酸配列を含むまたは当該アミノ酸配列からなり、ここで前記ポリペプチドはインスリンレセプター調節活性を有する、請求項２に記載の融合ポリペプチド。
【請求項４２】
前記融合ポリペプチドが、前記融合ポリペプチドは、図１０ｃに図示されているアミノ酸配列を含むまたは当該アミノ酸配列からなり、ここで前記ポリペプチドはインスリンレセプター調節活性を有する、請求項２に記載の融合ポリペプチド。
【請求項４３】
前記融合ポリペプチドが、前記融合ポリペプチドは、図１０ｄに図示されているアミノ酸配列を含むまたは当該アミノ酸配列からなり、ここで前記ポリペプチドはインスリンレセプター調節活性を有する、請求項２に記載の融合ポリペプチド。
【請求項４４】
前記融合ポリペプチドが、前記融合ポリペプチドは、図１０ｅに図示されているアミノ酸配列を含むまたは当該アミノ酸配列からなり、ここで前記ポリペプチドはインスリンレセプター調節活性を有する、請求項２に記載の融合ポリペプチド。
【請求項４５】
前記融合ポリペプチドが、前記融合ポリペプチドは、図１０ｆに図示されているアミノ酸配列を含むまたは当該アミノ酸配列からなり、ここで前記ポリペプチドはインスリンレセプター調節活性を有する、請求項２に記載の融合ポリペプチド。
【請求項４６】
前記ポリペプチドがアゴニストである、請求項２ないし４５のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項４７】
前記ポリペプチドがアンタゴニストである、請求項２ないし４５のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項４８】
請求項２ないし４７のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする核酸分子。
【請求項４９】
請求項４８に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項５０】
請求項４９に記載のベクターまたは核酸分子で形質転換またはトランスフェクトした細胞。
【請求項５１】
請求項２ないし４７のいずれか一項に記載の二つのポリペプチドからなるホモダイマー。
【請求項５２】
賦形剤または担体を含む、請求項２ないし４７のいずれか一項に記載のポリペプチドを含む医薬組成物。
【請求項５３】
前記医薬組成物がさらなる治療剤と組み合わせられている、請求項５２に記載の組成物。
【請求項５４】
請求項２ないし４７のいずれか一項に記載の少なくとも一つのポリペプチドの有効量を投与することを含む高血糖症を患っているヒト患者を治療する方法。
【請求項５５】
請求項２ないし４７のいずれか一項に記載の少なくとも一つのポリペプチドの有効量を投与することを含む低血糖症を患っているヒト患者を治療する方法。
【請求項５６】
前記ポリペプチドが静脈内に投与される、請求項５５記載の方法。
【請求項５７】
前記ポリペプチドが皮下投与される、請求項５５記載の方法。
【請求項５８】
糖尿病が１型である、請求項５５ないし５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
糖尿病が２型である、請求項５５ないし５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
前記高血糖症がインスリン耐性の結果である、請求項５５ないし５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
前記高血糖症がメタボリックシンドロームの結果である、請求項５５ないし５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６２】
糖尿病の治療における請求項２ないし４７のいずれか一項に記載のポリペプチドの使用。
【請求項６３】
糖尿病が１型である、請求項６２に記載の使用。
【請求項６４】
糖尿病が２型である、請求項６２に記載の使用。
【請求項６５】
インスリン耐性の治療における、請求項２ないし４７のいずれか一項に記載のポリペプチドの使用。
【請求項６６】
メタボリックシンドロームの治療における、請求項２ないし４７のいずれか一項に記載のポリペプチドの使用。
【図１ｉ】
【図１ｉｉ】
【図１ｉｉｉ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６ｉ】
【図６ｉｉ】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０ｉ】
【図１０ｉｉ】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１ｉｉ】
【図１ｉｉｉ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６ｉ】
【図６ｉｉ】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０ｉ】
【図１０ｉｉ】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【公表番号】特表２０１１−５２６４９１（Ｐ２０１１−５２６４９１Ａ）
【公表日】平成２３年１０月１３日（２０１１．１０．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５１５６０５（Ｐ２０１１−５１５６０５）
【出願日】平成２１年７月２日（２００９．７．２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００９／００１６６８
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／００１１３４
【国際公開日】平成２２年１月７日（２０１０．１．７）
【出願人】（５０２４５２９７８）アステリオン・リミテッド (13)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年１０月１３日（２０１１．１０．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年７月２日（２００９．７．２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００９／００１６６８
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／００１１３４
【国際公開日】平成２２年１月７日（２０１０．１．７）
【出願人】（５０２４５２９７８）アステリオン・リミテッド (13)
【Ｆターム（参考）】
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