インビトロ及びインビボでＶＥＧＦＲ１発現を低減するための治療用ｓｉＲＮＡ分子
ＲＮＡｉ誘導分子をインビボで送達する方法を改良することは極めて重要である。ＲＮＡｉを誘導する核酸分子を組織を標的として送達することが極めて重要であることも明らかである。ＶＥＧＦ経路遺伝子に選択的なＲＮＡｉを誘導する核酸分子を送達する方法がＮＶ疾患の処置に非常に有益であることも明らかである。本発明の組成物及び方法はこうしたニーズに応えるものである。本発明は、ＲＮＡ干渉によってＶＥＧＦ経路遺伝子の発現及び活性を調節し、腫瘍の血管形成を初めとする望ましくない新生血管形成を減少させるのに用いるための核酸分子組成物、並びにこうした核酸分子を含む方法及び組成物に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願への相互参照）
本願は、米国特許法第１１９条（ｅ）項の下、２００７年１０月１２日に出願された米国仮特許出願第６０／９９６，８３１号からの優先権を主張し、この米国仮特許出願第６０／９９６，８３１号の内容は、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
発明の分野
本発明は、分子生物学及び医学の分野に属し、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ：ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）誘導組成物及びこれを用いてＶＥＧＦＲ１などのＶＥＧＦ経路遺伝子の発現をインビトロ及びインビボで調節することにより望ましくない新生血管形成を有する症状及び疾患を処置する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
本発明は、血管の異常又は過剰な増殖及び成長を示すことが多い望ましくない新生血管形成（ＮＶ：ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）を有する疾患の処置のための組成物及び方法を提供する。ＮＶの進行自体、多くの場合、有害な結果をもたらし、又はこれが疾患の初期の病理学的段階となり得る。血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ：Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ）経路のアンタゴニストを初めとする血管形成の新しい治療用アンタゴニストが導入されたにもかかわらず、ＮＶを制御するための処置法の選択肢は不十分であり、疾患の進行を阻止するか、望ましくない血管形成を抑えるためのＮＶの有効な処置法に対する未だ満たされていない臨床的要望は依然として多く、かつ高まっている。
【０００４】
ＶＥＧＦ経路は、血管新生因子ＶＥＧＦ及びそのチロシンキナーゼ受容体ＶＥＧＦＲ１（Ｆｌｔ−１）及びＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ）を含む。可溶性ＶＥＧＦＲ１（ｓＶＥＧＦＲ１；ｓＦｌｔ−１）は、膜貫通及び細胞質ドメインを欠く膜結合型完全長ＶＥＧＦＲ１のスプライス変異体である。ｓＶＥＧＦＲ１は、ＶＥＧＦを隔離して完全長ＶＥＧＦＲ２と不活性なヘテロ二量体を形成することにより抗血管新生効果を生じる（非特許文献１、これの全体が本明細書に参考として援用されている）。外因性に発現させたｓＶＥＧＦＲ１蛋白質は、細胞系及び腫瘍異種移植モデルにおいて抗血管新生効果を示すことが分かっており（非特許文献２及び非特許文献３）、これらの全体が本明細書に参考として援用されている。
【０００５】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、二本鎖ＲＮＡが配列特異的に遺伝子発現を阻害する転写後過程である。このＲＮＡｉ過程は少なくとも２段階で起こる。即ち、１段階では、長いｄｓＲＮＡが、内因性リボヌクレアーゼにより、酵素ダイサーの使用によって生じるリボヌクレアーゼＩＩＩ様活性による場合より短い２１又は２３ヌクレオチド長ｄｓＲＮＡに切断される。第２の段階では、このより小さなｄｓＲＮＡが、多タンパク質ＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ：ＲＮＡ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｃｏｍｐｌｅｘ）中で対応する配列を有するｍＲＮＡ分子の分解を媒介し、その結果、その遺伝子の発現を選択的に下方制御する。このＲＮＡｉ効果は、より長い二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ：ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ ＲＮＡ）又はより短い低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ：ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）を細胞内標的配列へ誘導することにより達成することができる。また、ＲＮＡｉは、標的遺伝子に対して相補性のｄｓＲＮＡを生じるプラスミドを導入することによっても達成することができる。
【０００６】
ＲＮＡｉ誘導分子をインビボで送達する方法を改良することは極めて重要である。ＲＮＡｉを誘導する核酸分子を組織を標的として送達することが極めて重要であることも明らかである。ＶＥＧＦ経路遺伝子に選択的なＲＮＡｉを誘導する核酸分子を送達する方法がＮＶ疾患の処置に非常に有益であることも明らかである。本発明の組成物及び方法はこうしたニーズに応えるものである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｋｅｎｄａｌｌほか、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９９６年；２２６：ｐ．３２４−３２８
【非特許文献２】Ｍａｈｅｎｄｒａほか、Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２００５年；１２：ｐ．２６−３４
【非特許文献３】Ｋｏｍｍａｒｅｄｄｙほか、Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２００７年；１４：ｐ．４８８−４９８
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
ＶＥＧＦ媒介血管形成及びＮＶは、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ１及び／又はＶＥＧＦＲ２を標的とするアンタゴニストによって低下させることができる。ＶＥＧＦＲ１は完全長「膜結合」型のスプライス変異体として分泌「可溶」型で産生される。可溶性ＶＥＧＦＲ１は、ＶＥＧＦを隔離してこれがもはや完全長ＶＥＧＦＲ１に自由に結合できないようにし、完全長ＶＥＧＦＲ２と不活性なヘテロ二量体を形成することによってＶＥＧＦ経路のアンタゴニストとして作用する（Ｋｅｎｄａｌｌほか、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９９６年；２２６：ｐ．３２４−３２８、この全体が本明細書に参考として援用されている）。
【０００９】
従って、本発明の目的は、ＶＥＧＦＲ１のＲＮＡｉを誘導して血管形成過程を調節し、及び／又はＮＶ発症に関与する遺伝子発現を下方制御することでこの疾患過程を抑制するのに用いるための核酸分子を提供することにある。本発明者らは、意外なことに、完全長のＶＥＧＦＲ１の発現を標的としてこれを低下させ、また、驚くべきことに可溶性ＶＥＧＦＲ１の発現を増加させもするＲＮＡｉ誘導核酸分子を見出した。従って、こうした核酸分子は完全長ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦ及びＶＥＧＦＲ２の血管新生促進活性を同時に低下させる好都合な性質を示す。
【００１０】
本発明の一実施態様では、こうした核酸分子は、完全長ＶＥＧＦＲ１のｍＲＮＡ又は蛋白質レベルの発現を低下させながら、可溶性ＶＥＧＦＲ１のｍＲＮＡ又は蛋白質レベルの発現には影響を与えない。本発明の別の実施態様では、こうした核酸分子は、全ＶＥＧＦＲ１のｍＲＮＡ又は蛋白質レベルの発現を増加させると同時に、可溶性ＶＥＧＦＲ１のｍＲＮＡ又は蛋白質レベルの発現を増加させる。本発明の別の実施態様では、こうした核酸分子は、全ＶＥＧＦＲ１のｍＲＮＡ又は蛋白質レベルの発現を低下させながら、可溶性ＶＥＧＦＲ１のｍＲＮＡ又は蛋白質レベルの発現は増加させる。好ましい実施態様では、こうした核酸分子は、完全長膜結合型ＶＥＧＦＲ１のｍＲＮＡ又は蛋白質レベルの発現を低下させながら、可溶性ＶＥＧＦＲ１のｍＲＮＡ又は蛋白質レベルの発現は増加させる。
【００１１】
本発明の一態様では、哺乳動物においてＶＥＧＦＲ１を１種以上の他のＶＥＧＦ経路遺伝子と組み合わせてこれらの発現を阻害するための組成物及び方法を提供する。本発明の別の態様では、ＶＥＧＦＲ１の発現阻害を単独で、又は１種以上の他のＶＥＧＦ経路遺伝子の発現阻害と組み合わせて、又はＶＥＧＦ経路のアンタゴニストを含む他の薬剤と組み合わせて行うことによってＮＶ疾患を処置するための組成物及び方法を提供する。
【００１２】
本発明は、ＶＥＧＦＲ１遺伝子の発現を下方制御するための組成物及び方法であって、核酸分子を含む組成物を哺乳動物の組織に投与することを含み、この核酸分子はＶＥＧＦＲ１の発現を特異的に低下又は阻害する、組成物及び方法を提供する。この内因性遺伝子の下方制御は、ＶＥＧＦ経路の活性に起因するか、これによって悪化する疾患を処置するのに利用することができる。この疾患はヒトにおいて起こり得る。
【００１３】
また、ＶＥＧＦ経路遺伝子の望ましくない発現を伴う哺乳動物の疾患を処置するための方法であって、製剤に用いられる、有効医薬成分（ＡＰＩ：ａｃｔｉｖｅ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ）としてｄｓＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む核酸組成物を投与することを含み、この製剤はポリマーから構成することができるものとし、核酸組成物はＶＥＧＦ経路遺伝子の発現を低下させ、この疾患におけるＮＶを阻止することができるものとする方法も提供する。この疾患は、癌又は腫瘍であり得、組織は、例えば、腎組織、乳房組織、結腸組織、前立腺組織、肺組織又は卵巣組織であり得る。本発明の一態様では、癌又は腫瘍もしくは前癌状態の処置のための組成物及び方法を提供する。本発明の別の態様では、ＲＮＡｉを誘導する核酸剤を他の治療剤（例えば、低分子及びモノクロナール抗体（ｍＡｂ）が挙げられるが、これらに限定されるものではない）と共に、同じ治療方式で用いる。
【００１４】
ＶＥＧＦＲ１又は１種以上のＶＥＧＦ経路遺伝子と組み合わせたＶＥＧＦＲ１の発現をこの発現を阻害、低下又は増加させることで調節するために本発明のＡＰＩのいずれか又は本明細書に示した組成物のいずれかを用いて本発明の方法のいずれかを実施することができる。一実施態様において、１種以上のＶＥＧＦ経路遺伝子の発現を阻害又は低下させるためのＡＰＩ又は組成物は、ＶＥＧＦの発現を阻害又は低下させる少なくとも１種のｓｉＲＮＡを含む。別の実施態様では、１種以上のＶＥＧＦ経路遺伝子の発現を阻害又は低下させるためのＡＰＩ又は組成物は、ＶＥＧＦＲ１の発現を阻害又は低下させる少なくとも１種のｓｉＲＮＡを含む。さらに別の実施態様では、１種以上のＶＥＧＦ経路遺伝子の発現を阻害又は低下させるためのＡＰＩ又は組成物は、ＶＥＧＦＲ２の発現を阻害又は低下させる少なくとも１種のｓｉＲＮＡを含む。別の実施態様では、１種以上のＶＥＧＦ経路遺伝子の発現を阻害又は低下させるためのＡＰＩ又は組成物は、ＶＥＧＦの発現を阻害又は低下させる少なくとも１種のｓｉＲＮＡ及びＶＥＧＦＲ１の発現を阻害又は低下させる少なくとも１種のｓｉＲＮＡを含む。別の実施態様では、１種以上のＶＥＧＦ経路遺伝子の発現を阻害又は低下させるためのＡＰＩ又は組成物は、ＶＥＧＦの発現を阻害又は低下させる少なくとも１種のｓｉＲＮＡ及びＶＥＧＦＲ１の発現を阻害又は低下させる少なくとも１種のｓｉＲＮＡ及びＶＥＧＦＲ２の発現を阻害する少なくとも１種のｓｉＲＮＡを含む。別の実施態様では、１種以上のＶＥＧＦ経路遺伝子の発現を阻害又は低下させるためのＡＰＩ又は組成物は、ＶＥＧＦＲ１の発現を阻害又は低下させる少なくとも１種のｓｉＲＮＡ及びＶＥＧＦＲ２の発現を阻害する少なくとも１種のｓｉＲＮＡを含む。一実施態様では、１種以上のＶＥＧＦ経路遺伝子の発現を阻害又は低下させるためのＡＰＩ又は組成物は、１種以上のＶＥＧＦ経路遺伝子の発現を阻害又は低下させるためのＡＰＩ又は組成物は、ＶＥＧＦの発現を阻害又は低下させる少なくとも１種のｓｉＲＮＡ及びＶＥＧＦＲ１の発現を阻害又は低下させる少なくとも１種のｓｉＲＮＡ及びＶＥＧＦＲ２の発現を阻害又は低下させる少なくとも１種のｓｉＲＮＡを含む。１種以上のＶＥＧＦ経路遺伝子の発現を阻害又は低下させるための上記ＡＰＩ又は組成物のすべてにおいて、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ１又はＶＥＧＦＲ２の発現を阻害又は低下させるｓｉＲＮＡは本明細書に列挙したｓｉＲＮＡのいずれかとすることができる。
【００１５】
一実施態様において、１種以上のＶＥＧＦ経路遺伝子の発現を阻害又は低下させるためのＡＰＩ又は組成物は、本明細書に列挙したｓｉＲＮＡのいずれかから選ばれる少なくとも１種のｓｉＲＮＡを含む。別の実施態様では、１種以上のＶＥＧＦ経路遺伝子の発現を阻害又は低下させるためのＡＰＩ又は組成物は、本明細書に列挙したｓｉＲＮＡのいずれかから選ばれる少なくとも２種のｓｉＲＮＡを含む。さらに別の実施態様では、１種以上のＶＥＧＦ経路遺伝子の発現を阻害又は低下させるためのＡＰＩ又は組成物は、本明細書に列挙したｓｉＲＮＡのいずれかから選ばれる少なくとも３種のｓｉＲＮＡを含む。
【００１６】
上記組成物は、ポリマー担体をさらに含むことができる。このポリマー担体は、上記ＲＮＡ分子に結合してナノ粒子を形成するカチオン性ポリマーを含むことができる。このカチオン性ポリマーは、例えば、ヒスチジン及びリジン残基を含むアミノ酸コポリマーとすることができる。このポリマーは、分岐ポリマーを含むことができる。上記組成物は、標的合成ベクターを含むことができる。この合成ベクターは、核酸担体としてカチオン性ポリマー、立体保護材として親水性ポリマー及び標的細胞選択的薬剤として標的化リガンドを含むことができる。このカチオン性ポリマーは、ポリエチレンイミン又はポリヒスチジン−リジンコポリマー又は化学的に修飾したポリリジン、又は核酸担体モジュールとして用いることができる他の効果的なポリカチオン性担体を含むことができる。上記親水性ポリマーは、ポリエチレングリコール、ポリアセタール又はポリオキサゾリンを含むことができ、上記標的化リガンドは、ＲＧＤ配列を含むペプチド又は糖もしくは糖アナログ又はｍＡｂもしくはｍＡｂの断片又はその他の効果的な標的化部分を含むことができる。
【００１７】
本発明の組成物及び方法は、ＶＥＧＦＲ１遺伝子の一部と同一、実質的に同一、相同又は実質的に相同である配列を有する、ｄｓＲＮＡオリゴヌクレオチドを初めとするＲＮＡｉ誘導核酸分子を含む。この遺伝子は、野生型遺伝子又は突然変異遺伝子とすることができる。突然変異遺伝子の場合、この突然変異遺伝子の少なくとも１カ所の突然変異はこの遺伝子のコーディング又は調節領域に存在させることができる。こうした方法の全てにおいて、ＶＥＧＦＲ１を標的とするＲＮＡｉ誘導核酸分子は、成長因子遺伝子、蛋白質セリン／スレオニンキナーゼ遺伝子、蛋白質チロシンキナーゼ遺伝子、蛋白質セリン／スレオニンホスファターゼ遺伝子、蛋白質チロシンホスファターゼ遺伝子、受容体遺伝子及び転写因子遺伝子からなる群から選ばれる遺伝子を標的とするＲＮＡｉ誘導核酸分子（類）と組み合わせて用いることができる。こうした追加的な遺伝子としては、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＲ３、ＶＥＧＦ１２１、ＶＥＧＦ１６５、ＶＥＧＦ１８９、ＶＥＧＦ２０６、ＲＡＦ−ａ、ＲＡＦ−ｃ、ＡＫＴ、Ｒａｓ及びＮＦＫｂからなる群から選ばれる１種以上を挙げることができる。また、こうした追加的遺伝子として、ＨＩＦ、ＥＧＦ、ＥＧＦＲ、ｂＦＧＦ、ｂＦＧＦＲ、ＰＤＧＦ及びＰＤＧＦＲを含む、ＮＶ関連の他の生化学的経路由来の１種以上の遺伝子を挙げることができる。また、こうした追加的遺伝子として、Ｈｅｒ−２、ｃ−Ｍｅｔ、ｃ−Ｍｙｃ及びＨＧＦを含む、ＮＶに呼応して機能する他の生化学的経路由来の１種以上の遺伝子を挙げることができる。
【００１８】
また、本発明は、ｓｉＲＮＡのカクテル（ｓｉＲＮＡ−ＯＣ）を含む、複数の遺伝子を阻害するためのＲＮＡｉを誘導する核酸剤を含む組成物及び方法をも提供する。本発明の組成物及び方法は、複数の遺伝子を実質的に同時に阻害することができ、又はこれらは複数の遺伝子を順次に阻害することができる。好ましい実施態様では、こうしたｓｉＲＮＡ−ＯＣ剤は３種のＶＥＧＦ経路遺伝子：ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ１及びＶＥＧＦＲ２を阻害する。別の好ましい実施態様では、こうしたｓｉＲＮＡ−ＯＣは実質的に同時に投与される。
【００１９】
本発明は、ＶＥＧＦＲ１ｍＲＮＡ内の配列に対する実質的な相補性に由来する遺伝子阻害選択性を有する核酸分子を提供する。また、本発明は、複数の内因性遺伝子の阻害剤で処置することができる、ヒト疾患、特にＮＶ関連疾患の処置方法をも提供する。また、本発明は、ある場合には実質的に同時に、別の場合には順次に投与する複数の治療剤の組合せによってヒト疾患を処置する方法をも提供する。
【００２０】
本発明の他の目的、特徴及び効果については次の詳細な説明から明白になろう。しかしながら、本発明の精神及び範囲内で様々な変更や修正を加えることができることはこの詳細な説明から当業者に明瞭に理解されるであろうから、こうした詳細な説明及び具体例は、本発明の好ましい実施態様を示すものではあるが、もっぱら例証として示されるものであることは理解されよう。
【００２１】
本願の全体を通じて、種々の特許、刊行物及び文献について触れている。こうした特許、刊行物及び文献については、あたかも個別に触れられているかのようにして、それらの全体が本明細書に参考として援用されている。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１Ａは、可溶性及び完全長ｈＶＥＧＦＲ１の両者をコードしているｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡを形質移入したＨＵＶＥＣ細胞における可溶性ｈＶＥＧＦＲ１蛋白質のノックダウンを示す棒グラフである。ＨＵＶＥＣ細胞では、可溶性及び完全長膜結合型ｈＶＥＧＦＲ１をコードしているｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡ（表４の１乃至１９、ｈＶＥＧＦＲ１−２５−１乃至ｈＶＥＧＦＲ１−２５−１９ｓｉＲＮＡに対応）は、細胞培養上清中の可溶性ｈＶＥＧＦＲ１蛋白質のレベルを著しく低下させた。ＨＵＶＥＣ細胞には、２０ｎＭのｓｉＲＮＡを形質移入し、移入後４８時間に、市販のｈＶＥＧＦＲ１ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ社）を用いて培地中のｈＶＥＧＦＲ１蛋白質の濃度をアッセイした。１乃至１９：表４のｈＶＥＧＦＲ１−２５−１乃至ｈＶＥＧＦＲ１−２５−１９ｓｉＲＮＡ、Ｍｏｃｋ：擬似的形質移入、Ｃｔｒｏｌ：陰性対照ｓｉＲＮＡ。データは平均値±標準偏差として示した。
【００２３】
図１Ｂは、可溶性及び完全長ｈＶＥＧＦＲ１の両者をコードしているｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡを形質移入したＨＵＶＥＣ細胞における全ｈＶＥＧＦＲ１蛋白質のノックダウンを示す棒グラフである。
ＨＵＶＥＣ細胞では、可溶性及び完全長膜結合型ｈＶＥＧＦＲ１をコードしているｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡ（表４の１乃至１９、ｈＶＥＧＦＲ１−２５−１乃至ｈＶＥＧＦＲ１−２５−１９ｓｉＲＮＡに対応）は、ＨＵＶＥＣ細胞溶解物中の全ｈＶＥＧＦＲ１蛋白質の濃度を著しく低下させた。ＨＵＶＥＣ細胞には、２０ｎＭのｓｉＲＮＡを形質移入し、移入後４８時間に、市販のｈＶＥＧＦＲ１ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ社）を用いて細胞溶解物中のｈＶＥＧＦＲ１蛋白質の濃度をアッセイした。１乃至１９：表４のｈＶＥＧＦＲ１−２５−１乃至ｈＶＥＧＦＲ１−２５−１９ｓｉＲＮＡ、Ｍｏｃｋ：擬似的形質移入、Ｃｔｒｌ：陰性対照ｓｉＲＮＡ。データは平均値±標準偏差として示した。
【図２】図２Ａは、完全長ｈＶＥＧＦＲ１ｍＲＮＡに特異的なｓｉＲＮＡでＨＵＶＥＣ細胞を処置することでは可溶性ｈＶＥＧＦＲ１蛋白質濃度に対して抑制効果が見られないことを示す棒グラフである。ＨＵＶＥＣ細胞では、完全長膜結合型ｈＶＥＧＦＲ１特異的ｓｉＲＮＡ（表５の２０乃至４８、ｈＶＥＧＦＲ１−２５−２０乃至ｈＶＥＧＦＲ１−２５−４８ｓｉＲＮＡに対応）は、細胞培養上清中の可溶性ｈＶＥＧＦＲ１の濃度に対して抑制効果を示さない。ＨＵＶＥＣ細胞には、２０ｎＭのｓｉＲＮＡを形質移入し、移入後４８時間に、市販のｈＶＥＧＦＲ１ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ社）を用いて培地中のｈＶＥＧＦＲ１蛋白質の濃度をアッセイした。２０乃至４８：表５のｈＶＥＧＦＲ１−２５−２０乃至ｈＶＥＧＦＲ１−２５−４８ｓｉＲＮＡ、Ｍｏｃｋ：擬似的形質移入、Ｃｔｒｌ：陰性対照ｓｉＲＮＡ。データは平均値±標準偏差として示した。図２Ｂは、完全長ｈＶＥＧＦＲ１ｍＲＮＡに特異的なｓｉＲＮＡでＨＵＶＥＣ細胞を処置することでは全ｈＶＥＧＦＲ１蛋白質濃度に対して抑制効果が見られないことを示す棒グラフである。ＨＵＶＥＣ細胞では、完全長膜結合型ｈＶＥＧＦＲ１特異的ｓｉＲＮＡ（表５の２０乃至４８、ｈＶＥＧＦＲ１−２５−２０乃至ｈＶＥＧＦＲ１−２５−４８ｓｉＲＮＡに対応）は、細胞溶解物中の全ｈＶＥＧＦＲの濃度に対して抑制効果を示さない。完全長膜結合型ｈＶＥＧＦＲ１特異的ｓｉＲＮＡは、完全長ｈＶＥＧＦＲ１をコードしているｍＲＮＡをノックダウンする（図６参照）ので、細胞溶解物中に存在する可溶性ｈＶＥＧＦＲ１の産生を刺激すると考えられる。ＨＵＶＥＣ細胞には、２０ｎＭのｓｉＲＮＡを形質移入し、移入後４８時間に、市販のｈＶＥＧＦＲ１ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ社）を用いて細胞溶解物中のｈＶＥＧＦＲ１蛋白質の濃度をアッセイした。２０乃至４８：表５のｈＶＥＧＦＲ１−２５−２０乃至ｈＶＥＧＦＲ１−２５−４８ｓｉＲＮＡ、Ｍｏｃｋ：擬似的形質移入、Ｃｔｒｌ：陰性対照ｓｉＲＮＡ。データは平均値±標準偏差として示した。
【図３】形質移入後４８時間のＨＵＶＥＣ細胞上清における可溶性ｈＶＥＧＦＲ１分泌に対する可溶性及び完全長膜結合型のｈＶＥＧＦＲ１の両者（表４の１乃至１９、ｈＶＥＧＦＲ１−２５−１乃至ｈＶＥＧＦＲ１−２５−１９ｓｉＲＮＡに対応）を標的とするｓｉＲＮＡの効果を膜型のｈＶＥＧＦＲ１（表５の２０乃至４８、ｈＶＥＧＦＲ１−２５−２０乃至ｈＶＥＧＦＲ１−２５−４８ｓｉＲＮＡに対応）のみを標的とするｓｉＲＮＡの効果と比較した棒グラフである。効果は、（擬似的形質移入と比較した）可溶性ｈＶＥＧＦＲ１の％ノックダウンによって表した。
【図４】形質移入後４８時間のＨＵＶＥＣ細胞溶解物において測定したｈＶＥＧＦＲ１発現に対する可溶性及び完全長膜結合型のｈＶＥＧＦＲ１の両者（表４の１乃至１９、ｈＶＥＧＦＲ１−２５−１乃至ｈＶＥＧＦＲ１−２５−１９ｓｉＲＮＡに対応）を標的とするｓｉＲＮＡの効果を膜型のｈＶＥＧＦＲ１（表５の２０乃至４８、ｈＶＥＧＦＲ１−２５−２０乃至ｈＶＥＧＦＲ１−２５−４８ｓｉＲＮＡに対応）のみを標的とするｓｉＲＮＡの効果と比較した棒グラフである。効果は、（擬似的形質移入と比較した）全ｈＶＥＧＦＲ１の％ノックダウンによって表した。
【図５】可溶性及び完全長膜結合型ｈＶＥＧＦＲ１の両者をコードしているｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡを形質移入したＨＵＶＥＣ細胞におけるｈＶＥＧＦＲ１ｍＲＮＡのノックダウンを示す棒グラフである。ＨＵＶＥＣ細胞では、可溶性及び完全長膜結合型ｈＶＥＧＦＲ１をコードしているｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡ（表４の１乃至１９、ｈＶＥＧＦＲ１−２５−１乃至ｈＶＥＧＦＲ１−２５−１９ｓｉＲＮＡに対応）は、完全長ｈＶＥＧＦＲ１ｍＲＮＡ（黒色棒）及び全ｈＶＥＧＦＲ１ｍＲＮＡ（灰色棒）のレベルを著しく低下させた。ＨＵＶＥＣ細胞には、１０ｎＭのｓｉＲＮＡを形質移入し、移入後４８時間に、完全長ｈＶＥＧＦＲ１ｍＲＮＡ（黒色棒）に特異的なプライマーセット又は可溶性及び完全長ｈＶＥＧＦＲ１ｍＲＮＡの両者（灰色棒）に特異的なプライマーセットを使用する定量的ＲＴ−ＰＣＲアッセイ法を用いてｈＶＥＧＦＲ１ｍＲＮＡのレベルをアッセイした。１乃至１９：表４のｈＶＥＧＦＲ１−２５−１乃至ｈＶＥＧＦＲ１−２５−１９ｓｉＲＮＡ、Ｍｏｃｋ：擬似的形質移入、Ｃｔｒｌ：陰性対照ｓｉＲＮＡ。データは平均値±標準偏差として示した。
【図６】完全長特異的ｈＶＥＧＦＲ１ｓｉＲＮＡを形質移入したＨＵＶＥＣ細胞におけるｈＶＥＧＦＲ１ｍＲＮＡのノックダウンを示す棒グラフである。ＨＵＶＥＣ細胞では、完全長膜結合型ｈＶＥＧＦＲ１特異的ｓｉＲＮＡ（表５の２０乃至４８、ｈＶＥＧＦＲ１−２５−２０乃至ｈＶＥＧＦＲ１−２５−４８ｓｉＲＮＡに対応）は、完全長ｈＶＥＧＦＲ１ｍＲＮＡ（黒色棒）のみを著しく低下させ、全ｈＶＥＧＦＲ１ｍＲＮＡ（灰色棒）のレベルに対しては抑制効果を示さなかった。従って、完全長膜結合型ｈＶＥＧＦＲ１特異的ｓｉＲＮＡ（表５の２０乃至４８、ｈＶＥＧＦＲ１−２５−２０乃至ｈＶＥＧＦＲ１−２５−４８ｓｉＲＮＡに対応）は、可溶性ｈＶＥＧＦＲ１ｍＲＮＡの発現を刺激すると考えられる。ＨＵＶＥＣ細胞には、１０ｎＭのｓｉＲＮＡを形質移入し、移入後４８時間に、完全長ｈＶＥＧＦＲ１ｍＲＮＡ（黒色棒）に特異的なプライマーセット又は可溶性及び完全長ｈＶＥＧＦＲ１ｍＲＮＡの両者（灰色棒）に特異的なプライマーセットを使用する定量的ＲＴ−ＰＣＲアッセイ法を用いてｈＶＥＧＦＲ１ｍＲＮＡのレベルをアッセイした。２０乃至４８：表５のｈＶＥＧＦＲ１−２５−２０乃至ｈＶＥＧＦＲ１−２５−４８ｓｉＲＮＡ、Ｍｏｃｋ：擬似的形質移入、Ｃｔｒｌ：陰性対照ｓｉＲＮＡ。データは平均値±標準偏差として示した。
【図７Ａ】ヒトＶＥＧＦＲ１ｍＲＮＡのヌクレオチド配列（ＧｅｎＢａｎｋアセッション番号ＡＦ０６３６５７；配列番号１９７）を示す図である。
【図７Ｂ】ヒトＶＥＧＦＲ１ｍＲＮＡのヌクレオチド配列（ＧｅｎＢａｎｋアセッション番号ＡＦ０６３６５７；配列番号１９７）を示す図である。
【図８】ヒト可溶性ＶＥＧＦＲ１ｍＲＮＡのヌクレオチド配列（ＧｅｎＢａｎｋアセッション番号Ｕ０ｌ１３４；配列番号１９８）を示す図である。
【図９Ａ】マウスＶＥＧＦＲ１ｍＲＮＡのヌクレオチド配列（ＧｅｎＢａｎｋアセッション番号ＮＭ＿０１０２２８．２；配列番号１９９）を示す図である。
【図９Ｂ】マウスＶＥＧＦＲ１ｍＲＮＡのヌクレオチド配列（ＧｅｎＢａｎｋアセッション番号ＮＭ＿０１０２２８．２；配列番号１９９）を示す図である。
【図１０】ＰｏｌｙＴｒａｎ（商標）の構造及び組成を示す概略図である。ＰｏｌｙＴｒａｎ（商標）は、合成生分解性カチオン性分岐ポリペプチドである。この陽性荷電ＰｏｌｙＴｒａｎ（商標）ポリペプチドは、陰性荷電ｓｉＲＮＡの担体及びコンデンサとしての機能を果たす。「Ｒ」は配列番号２０５として開示されている。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明は、血管の異常又は過剰な増殖及び成長を示すことが多い望ましくない新生血管形成（ＮＶ）又は血管形成を有する疾患の処置のための組成物及び方法を提供する。ＮＶは正常な生物学的過程でもあるので、望ましくないＮＶの阻害は病的組織に対して選択的に遂行されることが好ましいが、このことは、好ましくは標的化ナノ粒子を用いて治療用分子をその病的組織に選択的に送達することを必要とする。本発明は、ＶＥＧＦ経路遺伝子の発現阻害を初めとするＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を誘導する核酸分子によるＶＥＧＦ生化学経路の選択的阻害及び病的血管形成組織に限定された阻害によって血管形成を制御する組成物及び方法を提供する。一実施態様において、本発明は、ＶＥＧＦＲ１遺伝子発現を阻害する核酸分子を提供する。また、本発明は、ポリマー結合体を含み、さらにＲＮＡｉを誘導する核酸分子を含む合成核酸送達媒体を用いる組成物及び方法をも提供する。
【００２５】
本発明についてここに詳細に説明するが、当業者であれば本発明を最大限理解されよう。
【００２６】
定義
本明細書に用いている「オリゴヌクレオチド」及びこれに基づいた同様な用語は、天然ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド及び非天然の合成又は修飾ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドのことを指す。オリゴヌクレオチドの長さは、１０ヌクレオチド長以上、又は１５もしくは１６もしくは１７もしくは１８もしくは１９もしくは２０ヌクレオチド長以上、又は２１もしくは２２もしくは２３もしくは２４ヌクレオチド長以上、又は２５もしくは２６もしくは２７もしくは２８もしくは２９もしくは３０ヌクレオチド長以上、３５以上、４０以上、４５以上、最大約５０ヌクレオチド長とすることができる。
【００２７】
ｓｉＲＮＡであるオリゴヌクレオチドは、１５乃至３０ヌクレオチドの間の任意のヌクレオチド数を有することができる。多くの実施態様では、ｓｉＲＮＡは１９乃至２７ヌクレオチドの間の任意のヌクレオチド数を有することができる。
【００２８】
「アンチセンス鎖」という用語は、発現低下の標的とする遺伝子のｍＲＮＡ配列の約１０乃至５０個のヌクレオチド（例えば、約１５乃至３０、１６乃至２５、１７乃至２４、１８乃至２３又は１９乃至２２個のヌクレオチド）の区域と実質的に相補性である核酸鎖のことを指す。アンチセンス鎖（又は第１の鎖）は、標的とするｍＲＮＡ配列と十分な相補性を有することによりＲＮＡｉプロセスによって標的ｍＲＮＡの破壊を誘導する。「センス鎖」又は「第２の鎖」とは、「アンチセンス鎖」又は「第１の鎖」と実質的に相補性である核酸鎖のことを指す。
【００２９】
「ＶＥＧＦ」という用語は、特に明記した場合又は文脈から明らかである場合を除き、全ＶＥＧＦのことを指す。
【００３０】
ＶＥＧＦＲ１遺伝子の調節のための核酸分子
本発明は、ＲＮＡｉによりＶＥＧＦＲ１遺伝子の発現を標的として調節するための核酸分子を提供する。このＶＥＧＦＲ１遺伝子を標的とする本発明の例示的なｓｉＲＮＡ配列を表１乃至５に示した。（表１乃至５に列挙した全ての配列について、「開始」位置は、ＡＴＧコドンの「Ａ」が位置１であるとみなされるように表記されている。）
一実施態様において、本発明は、全又は完全長（「膜結合型」とも称する）ＶＥＧＦＲ１ｍＲＮＡ又は蛋白質レベルの低下（「ノックダウン」とも称する）をもたらす核酸分子であって、その低下がこの核酸分子の非存在下の発現レベルに対して少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％，８５％、９０％，９５、９６、９７、９８、９９又は１００％である核酸分子を提供する。別の実施態様では、本発明の核酸分子は可溶性ＶＥＧＦＲ１ｍＲＮＡ又は蛋白質の発現レベルを増加させることができる。可溶性ＶＥＧＦＲ１ｍＲＮＡ又は蛋白質の発現レベルの増加は、この核酸分子の非存在下の発現レベルに対して、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍とすることができる。本発明の核酸分子は、ＶＥＧＦＲ１蛋白質の発現を約５０ｐｇ／μｇ、約４０ｐｇ／μｇ、約３０ｐｇ／μｇ、約２０ｐｇ／μｇ、約１５ｐｇ／μｇ、約１０ｐｇ／μｇ、約７．５ｐｇ／μｇ、約５ｐｇ／μｇ、約２．５ｐｇ／μｇ、約１ｐｇ／μｇ又は約０．５ｐｇ／μｇに低下させることができる。
【００３１】
本発明の一実施態様では、この核酸分子は、完全長ＶＥＧＦＲ１ｍＲＮＡ又は蛋白質の発現レベルを低下させながら、可溶性ＶＥＧＦＲ１ｍＲＮＡ又は蛋白質の発現レベルには影響を与えない。本発明の別の実施態様では、この核酸分子は、全ＶＥＧＦＲ１ｍＲＮＡ又は蛋白質の発現レベルを増加させると同時に、可溶性ＶＥＧＦＲ１ｍＲＮＡ又は蛋白質の発現レベルを増加させる。本発明の別の実施態様では、この核酸分子は、全ＶＥＧＦＲ１ｍＲＮＡ又は蛋白質の発現レベルを低下させながら、可溶性ＶＥＧＦＲ１ｍＲＮＡ又は蛋白質の発現レベルを増加させる。好ましい実施態様では、この核酸分子は、完全長ＶＥＧＦＲ１ｍＲＮＡ又は蛋白質の発現レベルを低下させながら、可溶性ＶＥＧＦＲ１ｍＲＮＡ又は蛋白質の発現レベルを増加させる。
【００３２】
全、完全長及び／又は可溶性ＶＥＧＦＲ１の調節は、この核酸分子の投与の最大２４時間後、最大３６時間後、最大４８時間後、最大６０時間後、最大７２時間後、最大９６時間後又はそれより後に生じさせることができる。特定の実施態様では、この遺伝子発現の調節をもたらす核酸分子は、３０ｎＭ、２５ｎＭ、２０ｎＭ、１５ｎＭ、１２ｎＭ、１０ｎＭ、７．５ｎＭ、５ｎＭ、２ｎＭ、１ｎＭ、０．７５ｎＭ、０．５ｎＭ又は０．２ｎＭの量を投与することができる。
【００３３】
本発明の核酸分子はｄｓＲＮＡであってもｓｓＲＮＡであってもよい。本発明の好ましい実施態様では、この核酸分子はｓｉＲＮＡである。この核酸分子は、１５乃至５０、１５乃至３０、１９乃至２７、１９、２０、２１、２２、２３、２４又は２５個のヌクレオチドを含むことができる。この核酸分子は、１０個以上のヌクレオチド、又は１５もしくは１６もしくは１７もしくは１８もしくは１９もしくは２０個以上のヌクレオチド、又は２１もしくは２２もしくは２３もしくは２４個以上のヌクレオチド、又は２５もしくは２６もしくは２７もしくは２８もしくは２９もしくは３０以上のヌクレオチド、３５個以上、４０個以上、４５個以上又は５０個以上のヌクレオチドを含むことができる。
【００３４】
この核酸分子は、５’−又は３’−一本鎖オーバーハングを含むことができる。この核酸分子は、２つの平滑末端又は２つの粘着末端又は１つの平滑末端と１つの粘着末端を有することができる。粘着末端の一本鎖オーバーハングヌクレオチドは１個乃至４個以上の範囲とすることができる。特定の実施態様では、この核酸分子は平滑末端を有する。好ましい実施態様では、この核酸分子は、平滑末端を有するヌクレオチド２５個の二本鎖ｓｉＲＮＡである。
【００３５】
一部の実施態様では、本発明の核酸分子は、ヒトｍＲＮＡと、これと相同又は類似の、霊長類、マウス、ラットなどの他の非ヒト哺乳動物種のｍＲＮＡとのいずれをも標的とする。
【００３６】
一実施態様において、本発明は、ＶＥＧＦＲ１を標的にするためのアンチセンス核酸分子であって、このアンチセンス核酸が配列番号１２９乃至１９６からなる群から選ばれるセンス鎖に対して相補性である配列を含むアンチセンス核酸分子を提供する。別の実施態様では、本発明は、ＶＥＧＦＲ１を標的にするためのアンチセンス核酸分子であって、このアンチセンス核酸が配列番号２４、４９、５０、５１、８４、８５、８６、８８、８９、１００、１０４、１０５、１８４、１８６、１８８、１９２、１９３、１９４及び１９６からなる群から選ばれるヌクレオチド配列を含むＶＥＧＦＲ１ｍＲＮＡ内のヌクレオチド配列を標的にするアンチセンス核酸分子を提供する。
【００３７】
【表１−１】
【００３８】
【表１−２】
【００３９】
【表１−３】
【００４０】
【表２−１】
【００４１】
【表２−２】
【００４２】
【表２−３】
【００４３】
【表３】
本発明のＲＮＡｉ誘導核酸分子、特にｓｉＲＮＡなどの二本鎖核酸分子の有効性は、米国特許出願公開第２００５／０１８６５８６号、同第２００５／０１８１３８２号、同第２００５／００３７９８８号及び同第２００６／０１３４７８７号（これらの全体が本明細書に参考として援用されている）に開示されている方法によって改善することができる。「ガイド鎖」とは、ＲＩＳＣに入り、標的ｍＲＮＡの分解を誘導するＲＮＡｉ物質の鎖である。ガイド鎖としての機能を果たす際のこのｓｉＲＮＡ分子の有効性は、この分子の非対称性を強めることによって向上させることができる。つまり、ＲＮＡｉにおいてガイド鎖としての機能を果たすｓｉＲＮＡ分子の能力は、二重鎖の第１鎖の５’末端と第２鎖の３’末端との間の塩基対強度を第１鎖の３’末端と第２鎖の５’末端との間の塩基対強度に比し低下させることにより強めることができる。本発明の一実施態様において、ＲＮＡｉにおいてガイド鎖としての機能を果たすｓｉＲＮＡ分子の能力は、アンチセンス鎖の５’末端とセンス鎖の３’末端との間の塩基対強度をアンチセンス鎖の３’末端とセンス鎖の５’末端との間の塩基対強度に比し低下させることにより強めることができる。
【００４４】
塩基対強度は、Ｇ：Ｃ塩基対の数を減らすか、ミスマッチ塩基対を１つ以上挿入することによって低下させることができる。ミスマッチ塩基対の例としては、Ｇ：Ａ、Ｃ：Ａ、Ｃ：Ｕ、Ｇ：Ｇ、Ａ：Ａ、Ｃ：Ｃ、Ｕ：Ｕ、Ｃ：Ｔ及びＵ：Ｔが挙げられる。第１又はアンチセンス鎖の５’末端と第２又はセンス鎖の３’末端との間にＧ：Ｕ又はＧ：Ｔなどのゆらぎ塩基対を挿入しても塩基対強度は低下する。本発明の一実施態様では、これらの方法の１つ以上を組み合わせて塩基対強度を低下させ、本発明のｓｉＲＮＡ分子の有効性を増大させる。
【００４５】
特定の実施態様では、イノシン、１−メチルイノシン、プソイドウリジン、５，６−ジヒドロウリジン、リボチミジン、２Ｎ−メチルグアノシン、２，２Ｎ，Ｎ−ジメチルグアノシンなどの希有ヌクレオチド又は２−アミノ−Ｇ、２−アミノ−Ａ、２，６−ジアミノ−Ｇ、２，６−ジアミノ−Ａなどの修飾ヌクレオチドを含む少なくとも１つの塩基対の組込みによって塩基対強度を低下させる。
【００４６】
化学修飾
化学修飾は、核酸分子の安定性を増大させ、又はサイトカインの産生を低下させるのに、本発明の一部の実施態様において有用となる場合がある。ＲＮＡ、ＤＮＡ、ＬＮＡ及びＲＮＡキメラオリゴヌクレオチドの２’−Ｏ−メチルリボース類似体及び他の核酸オリゴヌクレオチドの化学的類似体などの非天然の化学的類似体の組込みは、考えられる化学修飾の１つのタイプである。また、考えられる修飾としては、５’及び／又は３’末端におけるフランキング配列の付加；バックボーンにおけるホスホジエステル結合ではなくホスホロチオエート、メチルホスホネート、スルホン、サルフェート、ケチル、ホスホロジチオエート、ホスホラミデート、リン酸エステルもしくは２’Ｏ−メチル結合の使用；及び／又は特殊な塩基並びにアデニン、シチジン、グアニン、チミン及びウリジンのアセチル、メチル、チオその他を含む修飾体の採用も挙げられる。核酸中に導入することができる特殊な核酸塩基としては、例えば、イノシン、プリン、ピリジン−４−オン、ピリジン−２−オン、フェニル、シュードウラシル、２，４，６−トリメトキシベンゼン、３−メチルウラシル、ジヒドロウリジン、ナフチル、アミノフェニル、５−アルキルシチジン類（例えば、５−メチルシチジン）、５−アルキルウリジン類（例えば、リボチミジン）、５−ハロウリジン類（例えば、５−ブロモウリジン）もしくは６−アザピリミジン類もしくは６−アルキルピリミジン類（例えば、６−メチルウリジン）、プロピン、ケソシン、２−チオウリジン、４−チオウリジン、ワイブトシン、ワイブトキソシン、４−アセチルチジン（４−ａｃｅｔｙｌｔｉｄｉｎｅ）、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジン、５’−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウリジン、ベータ−Ｄ−ガラクトシルキュエオシン、１−メチルアデノシン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアノシン、３−メチルシチジン、２−メチルアデノシン、２−メチルグアノシン、Ｎ６−メチルアデノシン、７−メチルグアノシン、５−メトキシアミノメチル−２−チオウリジン、５−メチルアミノメチルウリジン、５−メチルカルボニフネチルウリジン、５−メチルオキシウリジン、５−メチル−２−チオウリジン、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンタニルアデノシン、ベータ−Ｄ−マンノシルキュエオシン、ウリジン−５−オキシ酢酸、２−チオシチジン、スレオニン誘導体などが挙げられる（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ、２００７年；１５：ｐ．１６６３−１６６９参照、これの全体が本明細書に参考として援用されている）。これらのポリヌクレオチド変異体は、その核酸分子の活性が実質的には低下しないように修飾することができる。
【００４７】
特定の実施態様では、本発明のオリゴヌクレオチドは、米国特許第５，６２３，０６５号、同第５，８５６，４５５号、同第５，９５５，５８９号、同第６，１４６，８２９号及び同第６，３２６，１９９号（これらの全体が本明細書に参考として援用されている）に開示されているような２’−Ｏ−置換オリゴヌクレオチド類とすることができ、これらのオリゴヌクレオチド類では、相補性標的鎖へのこのオリゴヌクレオチドの結合を、この標的鎖を破壊するＲＮａｓｅＨ活性の発現を可能にしながら、強化するために、オリゴヌクレオチド内に２’置換ヌクレオチドが導入されている。Ｓｐｒｏａｔ、Ｂ．Ｓ．ほか、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９９０年；１８：ｐ．４１（これの全体が本明細書に参考として援用されている）をも参照されたい。２’−Ｏ−メチル及びエチルヌクレオチドを含む核酸分子類も本発明に包含される。
【００４８】
いくつかのグループが他の２’−Ｏ−アルキルグアノシン類の作製について教示している。Ｇｌａｄｋａｙａほか、Ｋｈｉｍ．Ｐｒｉｒ．Ｓｏｅｄｉｎ．、１９８９年；４：ｐ．５６８（これの全体が本明細書に参考として援用されている）にはＮ１−メチル−２’−Ｏ−（テトラヒドロピラン−２−イル）及び２’−Ｏ−メチルグアノシンが開示されており、Ｈａｎｓｓｋｅほか、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、１９８４年；４０：ｐ．１２５（これの全体が本明細書に参考として援用されている）には２’−Ｏメチルチオメチルグアノシンが開示されている。２，６−ジアミノプリンリボシドの２’−Ｏ−メチルチオメチル誘導体も報告されている。Ｓｐｒｏａｔ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９９１年；１９：ｐ．７３３（これの全体が本明細書に参考として援用されている）では２’−Ｏ−アリル−グアノシンの作製について教示されている。Ｉｒｉｂａｒｒｅｎほか、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、１９９０年；８７：ｐ．７７４７（これの全体が本明細書に参考として援用されている）では２’−Ｏ−アリルオリゴヌクレオチドも検討された。特定の実施態様では、本発明の核酸分子類は２’−Ｏ−メチル、−２’−Ｏ−アリル−及び２’−Ｏ−ジメチルアリル−置換ヌクレオチドを含む。
【００４９】
特定の実施態様では、オリゴヌクレオチドのヌクレオチドのうちの少なくとも１つの２’−デオキシリボフラノシル部分の少なくとも１つを修飾する。ハロ、アルコキシ、アミノアルコキシ、アルキル、アジド又はアミノ基を付加することができる。例えば、Ｆ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＯＣＮ、Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、ＳＭｅ、ＳＯ２Ｍｅ、ＯＮＯ２、ＮＯ２、ＮＨ３、ＮＨ２、ＮＨ−アルキル、ＯＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２（アリルオキシ）、ＯＣＨ３＝ＣＨ２、ＯＣＣＨ（但し、アルキルは炭素鎖内に不飽和を有するＣ１乃至Ｃ２０の直鎖又は分岐鎖である）。国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９１／００２４３号、米国特許出願第４６３，３５８号及び米国特許出願第５６６，９７７号には、例えば、オリゴヌクレオチドのヌクレオチド上の２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−エチル、２’−Ｏ−プロピル、２’−Ｏ−アリル、２’−Ｏ−アミノアルキル又は２’−デオキシ−２’−フルオロ基がオリゴヌクレオチドのハイブリッド形成性を向上させることが開示されている。本発明の核酸分子は、ホスホロチオエートバックボーン又は２’−Ｏ-−Ｃ１Ｃ２０−アルキル（例えば、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−エチル、２’−Ｏ−プロピル）、２’−Ｏ-−Ｃ２Ｃ２０−アルケニル（例えば、２’−Ｏ−アリル）、２’−Ｏ-−Ｃ２Ｃ２０−アルキニル、２’−Ｓ-−Ｃ１Ｃ２０−アルキル、２’−Ｓ-−Ｃ２Ｃ２０−アルケニル、２’−Ｓ-−Ｃ２Ｃ２０−アルキニル、２−’ＮＨ−−Ｃ１Ｃ２０−アルキル（２’−Ｏ−アミノアルキル）、２’−ＮＨ-−Ｃ２Ｃ２０−アルケニル、２’−ＮＨ-−Ｃ２Ｃ２０−アルキニルもしくは２’−デオキシ−２’−フルオロ基又はこれらの両方をさらに含むように拡大して安定性を増大させることができる。例えば、米国特許第５，５０６，３５１号（これの全体が本明細書に参考として援用されている）を参照されたい。
【００５０】
例示的な修飾ヌクレオチドは、米国特許第７，１０１，９９３号、同第７，０５６，８９６号、同第６，９１１，５４０号、同第７，０１５，３１５号、同第５，８７２，２３２及び号、同第５，５８７，４６９号（これらの全体が本明細書に参考として援用されている）に見出すことができる。
【００５１】
ＶＥＧＦ経路遺伝子の複合調節
本発明の一態様では、ＶＥＧＦＲ１及び複数の他のＶＥＧＦ経路遺伝子の特異的及び選択的阻害を達成し、その結果、ＮＶ疾患を阻止してより良好な臨床的有益性が得られるように、ｓｉＲＮＡ類などのアンチセンス核酸分子類を併用する。本発明は、ＶＥＧＦＲ１とＶＥＧＦ又はＶＥＧＦＲ２との組合せを初めとするｓｉＲＮＡ標的類の複数の組合せを提供する。ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ１及びＶＥＧＦＲ２のｍＲＮＡを標的にする例示的なｓｉＲＮＡ配列類を表１乃至５及び表７乃至１１に記載した。一実施態様では、本発明は、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ１及びＶＥＧＦＲ２を標的にするｓｉＲＮＡ類の併用を提供する。また、本発明は、ＶＥＧＦ経路中の同じ遺伝子内の１種以上の配列を標的にするｓｉＲＮＡ類の併用も提供する。
【００５２】
本発明の別の実施態様は、ＶＥＧＦＲ１、並びにＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ２、ＰＤＧＦとその受容体、ＥＧＦとその受容体、ＲＡＦとＡＫＴを含む下流シグナル伝達因子及びＮＦκＢを含む転写因子からなる群から選ばれる１種以上の遺伝子を標的にするｓｉＲＮＡの併用である。ＰＤＧＦＲ及びＥＧＦＲを標的にする例示的なｓｉＲＮＡ配列は、米国特許出願公開第２００８／０２２００２７号及び同第２００８／０１５３７７１号並びに国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００８／００７６７２号（これらの全体が本明細書に参考として援用されている）に見出すことができる。本発明のさらに別の実施態様は、ＶＥＧＦとその受容体群及びこれらの下流遺伝子を阻害するｓｉＲＮＡの併用である。
【００５３】
本発明の核酸分子類は、ＮＶ関連疾患の処置のための治療剤として併用することができる。本発明の一実施態様では、これらをカクテルとして混合することができ、別の実施態様では、これらを同じ経路で、又は異なる経路及び製剤で順次投与することができ、さらに別の実施態様では、一部をカクテルとして投与し、一部を順次的に投与することができる。一実施態様では、複数のｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチド類をナノ粒子製剤などの単一製剤として製剤化することができる。ＮＶ関連疾患の処置を達成するための核酸分子類の他の併用及びこうした併用の方法については、当業者には理解されよう。
【００５４】
治療的使用方法
また、本発明は、対象における血管形成又はＮＶ関連疾患の処置方法をも提供する。一部の実施態様において、本発明は、ＶＥＧＦＲ１を標的にすることにより全ＶＥＧＦＲ１の発現を減少させるｓｉＲＮＡ分子を対象に投与することを含む、望ましくない血管形成を伴う疾患又は症状に罹患している対象の処置方法を提供する。別の実施態様では、本発明は、ＶＥＧＦＲ１を標的にすることにより完全長ＶＥＧＦＲ１の発現を減少させるが、可溶性ＶＥＧＦＲ１の発現に対しては影響しないか、増加させないｓｉＲＮＡ分子を対象に投与することを含む、望ましくない血管形成を伴う疾患又は症状に罹患している対象の処置方法を提供する。本発明の一態様において、このようなｓｉＲＮＡ分子は、配列番号２４、２５、４３、４９、５０、５１、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、１００、１０４、１０５、１７３、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８６、１８７、１８８、１９２、１９３、１９４及び１９６からなる群から選ばれるセンス鎖に対して補性であるヌクレオチド配列を含む。好ましい実施態様では、本発明は、ＶＥＧＦＲ１を標的にすることにより完全長ＶＥＧＦＲ１の発現を減少させるが、可溶性ＶＥＧＦＲ１の発現を増加させるｓｉＲＮＡ分子を対象に投与することを含む、望ましくない血管形成を伴う疾患又は症状に罹患している対象の処置方法を提供する。この実施態様では、このようなｓｉＲＮＡ分子は、配列番号２４、４９、５０、５１、８４、８５、８６、８８、８９、１００、１０４、１０５、１８４、１８６、１８８、１９２、１９３、１９４及び１９６からなる群から選ばれるセンス鎖に対して相補性であるヌクレオチド配列を含む。
【００５５】
一部の実施態様において、本発明は、ＶＥＧＦＲ１及びＶＥＧＦの発現が減少するようにＶＥＧＦＲ１を標的にするｓｉＲＮＡ分子及びＶＥＧＦを標的にするｓｉＲＮＡ分子を対象に投与することを含む、望ましくない血管形成を伴う疾患又は症状に罹患している対象の処置方法を提供する。一部の実施態様では、本発明は、ＶＥＧＦＲ１及びＶＥＧＦＲ２の発現が減少するようにＶＥＧＦＲ１を標的にするｓｉＲＮＡ分子及びＶＥＧＦＲ２を標的にするｓｉＲＮＡ分子を対象に投与することを含む、望ましくない血管形成を伴う疾患又は症状に罹患している対象の処置方法を提供する。別の実施態様では、本発明は、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦ及びＶＥＧＦＲ２の発現が減少するようにＶＥＧＦＲ１を標的にするｓｉＲＮＡ分子、ＶＥＧＦを標的にするｓｉＲＮＡ分子及びＶＥＧＦＲ２を標的にするｓｉＲＮＡ分子を対象に投与することを含む、望ましくない血管形成を伴う疾患又は症状に罹患している対象の処置方法を提供する。
【００５６】
また、本発明は、対象における癌、眼疾患、関節炎及び炎症性疾患を含む血管形成又はＮＶ関連疾患の処置方法をも提供する。こうした血管形成関連疾患としては、乳癌、卵巣癌、胃癌、子宮内膜癌、唾液腺癌、肺癌、腎癌、結腸癌、結腸直腸癌、食道癌、甲状腺癌、膵癌、前立腺癌、膀胱癌などの癌及び黒色腫、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、神経膠腫、肝細胞（肝臓）癌、肉腫、頭頸部癌、中皮腫、胆道癌（胆管癌）、小腸腺癌、小児悪性腫瘍、膠芽細胞腫などの他の腫瘍性疾患が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００５７】
こうした分子に拮抗させることが、病態生理学的過程を抑制し、それによって種々の血管形成依存性疾患の有効な治療法となる。固形腫瘍及びその転移の他に、白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫などの血液悪性腫瘍も血管形成依存性である。過剰な血管増殖は多数の非腫瘍性疾患の一因となっている。こうした非腫瘍性血管形成依存性疾患としては、アテローム性動脈硬化、血管腫、血管内皮腫、血管線維腫、血管奇形（例えば、遺伝性出血性毛細血管拡張（ＨＨＴ：Ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ Ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ Ｔｅｌｅａｎｇｉｅｃｔａｓｉａ）もしくはＯｓｌｅｒ−Ｗｅｂｅｒ症候群）、疣贅、化膿性肉芽腫、多毛症、カポジ肉腫、瘢痕ケロイド、アレルギー性浮腫、乾癬、不正子宮出血、濾胞性嚢胞、卵巣過刺激、子宮内膜症、呼吸窮迫症、腹水症、透析患者の腹膜硬化症、腹部手術後の癒着形成、肥満症、関節リウマチ、滑膜炎、骨髄炎、パンヌス増殖、骨棘、血友病性関節、炎症性及び感染性過程（例えば、肝炎、肺炎、糸球体腎炎）、喘息、鼻ポリープ、肝再生、肺高血圧症、未熟児網膜症、糖尿病性網膜症、加齢性黄斑変性、白質軟化症、血管新生緑内障、角膜移植片血管新生、トラコーマ、甲状腺炎、甲状腺腫脹及びリンパ増殖症候群が挙げられる。
【００５８】
本発明の一実施態様において、処置される対象はヒトである。
【００５９】
組成物及び投与方法
別の態様において、本発明は、本発明の、ｓｉＲＮＡを初めとする核酸分子を含む組成物を提供する。この組成物のｓｉＲＮＡは、ＶＥＧＦ経路、特にＶＥＧＦＲ１遺伝子からのｍＲＮＡを標的にすることができる。こうした組成物は、この核酸分子及び医薬用として許容可能な担体、例えば、生理食塩水もしくは緩衝生理食塩水を含むことができる。
【００６０】
特定の実施態様において、本発明は、「剥き出しの」核酸分子又は核酸送達用媒体に含ませた核酸分子を提供する。核酸送達用媒体を含む実施態様では、この媒体はウイルスベクターなどの天然のベクター又はリポソーム、ポリリジンもしくはカチオン性ポリマーのような合成ベクターとすることができる。一実施態様において、組成物は本発明のｓｉＲＮＡ及びカチオン性ポリマーなどの複合体形成剤を含むことができる。また、この組成物は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの親水性ポリマーを含むこともできる。カチオン性ポリマーは、ヒスチジン−リジン（ＨＫ）コポリマー又はポリエチレンイミンとすることができる。
【００６１】
特定の実施態様において、カチオン性ポリマーはＨＫコポリマーである。特定の実施態様において、このＨＫコポリマーは、ポリヒスチジン、ポリリジン、ヒスチジン及び／又はリジンの任意の適切な組合せから合成する。特定の実施態様において、ＨＫコポリマーは線状である。特定の実施態様において、ＨＫコポリマーは分岐状である。
【００６２】
特定の好ましい実施態様において、この分岐状ＨＫコポリマーはポリペプチドバックボーンを含む。このポリペプチドバックボーンは１乃至１０個のアミノ酸残基、好ましくは２乃至５個のアミノ酸残基を含むことができる。
【００６３】
特定の実施態様において、このポリペプチドバックボーンはリジンアミノ酸残基からなる。
【００６４】
特定の実施態様において、分岐状ＨＫコポリマーの分岐の数はバックボーンアミノ酸残基の数プラス１である。特定の実施態様において、この分岐状ＨＫコポリマーは１乃至１１個の分岐を含む。特定の好ましい実施態様では、この分岐状ＨＫコポリマーは２乃至５個の分岐を含む。特定のより好ましい実施態様では、この分岐状ＨＫコポリマーは４個の分岐を含む。
【００６５】
一部の実施態様では、この分岐状ＨＫコポリマーの分岐は１０乃至１００個のアミノ酸残基を含む。特定の好ましい実施態様では、この分岐は１０乃至５０個のアミノ酸残基を含む。特定のより好ましい実施態様では、この分岐は１５乃至２５個のアミノ酸残基を含む。特定の実施態様では、この分岐状ＨＫコポリマーの分岐は、５個のアミノ酸残基のサブセグメント毎に少なくとも３個のヒスチジンアミノ酸残基を含む。特定の他の実施態様において、この分岐は４個のアミノ酸残基のサブセグメント毎に少なくとも３個のヒスチジンアミノ酸残基を含む。特定の他の実施態様において、この分岐は３個のアミノ酸残基のサブセグメント毎に少なくとも２個のヒスチジンアミノ酸残基を含む。特定の他の実施態様では、この分岐は２個のアミノ酸残基のサブセグメント毎に少なくとも１個のヒスチジンアミノ酸残基を含む。
【００６６】
特定の実施態様において、このＨＫコポリマーの分岐の少なくとも５０％は、配列ＫＨＨＨ（配列番号２００）の単位を含む。特定の好ましい実施態様では、この分岐の少なくとも７５％は、配列ＫＨＨＨ（配列番号２００）の単位を含む。
【００６７】
特定の実施態様において、このＨＫコポリマーの分岐は、ヒスチジン又はリジン以外のアミノ酸を含む。特定の好ましい実施態様では、この分岐は、システインアミノ酸残基を含み、この場合、このシステインはＮ末端アミノ酸残基である。
【００６８】
特定の実施態様において、上記ＨＫコポリマーは構造（ＫＨＨＨＫＨＨＨＫＨＨＨＨＫＨＨＨＫ）４−ＫＫＫ（配列番号２０１）を有する。特定の他の実施態様では、このＨＫコポリマーは構造（ＣＫＨＨＨＫＨＨＨＫＨＨＨＨＫＨＨＨＫ）４−ＫＫＫ（配列番号２０２）を有する。
【００６９】
好ましい実施態様では、このＨＫコポリマーはＰｏｌｙＴｒａｎ（商標）であり、図１０に示した構造を有する。
【００７０】
ＨＫコポリマーのいくつかの適切な例は、例えば、米国特許第６，６９２，９１１号、同第７，０７０，８０７号及び同第７，１６３，６９５号（これらの全体が本明細書に参考として援用されている）に見出すことができる。
【００７１】
一実施態様において、本発明の組成物は本発明のｓｉＲＮＡ及びナノ粒子を作製するのに用いる複合体形成剤を含むことができる。このナノ粒子は、任意選択的に立体ポリマー及び／又は標的化部分を含むことができる。この標的化部分はペプチド、抗体又は抗原結合部分とすることができる。この標的化部分は、配列Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）を含むペプチドなどの、血管内皮細胞を標的にする手段としての機能を果たすことができる。このようなペプチドは環状又は線状とすることができる。一実施態様において、このペプチドはＲＧＤＦＫ（配列番号２０３）である。特定の実施態様では、このペプチドは、シクロ（ＲＧＤ−Ｄ−ＦＫ（配列番号２０４））である。別の実施態様では、このペプチドはＡＣＲＧＤＭＦＧＣＡ（配列番号１２）である。
【００７２】
本発明の核酸分子、組成物及び治療法は、単独で用いることができ、或いは他の治療剤及び標的治療法を含む治療法、並びにモノクロナール抗体、低分子阻害剤などのＶＥＧＦ経路アンタゴニスト及びＥＧＦとその受容体、ＰＤＧＦとその受容体又はＭＥＫもしくはＢｃｒ−Ａｂｌを阻害する標的治療法及びＥＧＦＲ阻害剤ＶＥＣＴＩＢＩＸ（登録商標）（パニツムマブ）及びＴＡＲＣＥＶＡ（登録商標）（エルロチニブ）、Ｈｅｒ−２−標的療法剤ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）（トラスツズマブ）もしくはＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）（ベバシズマブ）、ＳＵＴＥＮＴ（登録商標）（リンゴ酸スニチニブ）などの抗血管形成薬などの他の免疫療法及び化学療法剤を含む他の治療剤及び治療法と併用することができる。また、上記核酸分子、組成物及び方法は、放射線、レーザー療法、手術などを含む他の処置法と治療的に併用することができる。
【００７３】
本発明の核酸及び組成物の投与方法は当業者に周知である。投与は、静脈内、腹腔内、筋肉内、腔内、皮下、皮膚又は経皮投与とすることができる。一実施態様では、投与は全身性投与とすることができる。別の実施態様では、投与は局所投与とすることができる。例えば、本発明の核酸分子は、腫瘍組織中に直接注射により、また血管形成組織もしくは望ましくない新脈管構造を有する組織中もしくは近傍に直接、送達することができる。特定の用途では、こうした核酸分子及び組成物は電界を加えることにより投与することができる。特定の実施態様では、本発明は「剥き出しの」ｓｉＲＮＡの投与を提供する。
【００７４】
全身性投与を含む、本発明の核酸、核酸送達媒体及び組成物の投与を試験するための例示的な動物モデルについては国際公開第０８／４５５７６号並びに米国特許出願公開第２００８／０２２００２７号及び同第２００８／０１５３７７１号（これらの全体が本明細書に参考として援用されている）に見出すことができる。
【００７５】
ＶＥＧＦ経路遺伝子の発現を調節する核酸分子を含むナノ粒子の調製
本発明の一実施態様では、ｓｉＲＮＡを含む抗ＶＥＧＦ経路核酸分子のナノ粒子調製のための組成物及び方法を提供する。こうしたナノ粒子はヒスチジン−リジンコポリマー、ポリエチレングリコール又はポリエチレンイミンのうちの１種以上を含むことができる。本発明の一実施態様では、ＲＧＤ媒介リガンド誘導性ナノ粒子を調製することができる。ｓｉＲＮＡを含むＲＧＤ媒介組織標的化ナノ粒子の１つの製造方法では、標的化リガンドＲＧＤ含有ペプチドをポリエチレングリコール又は類似の性質を有する他のポリマーなどの立体ポリマーに結合させる。このリガンド−立体ポリマー結合体を、ポリエチレンイミンなどのポリカチオン又はヒスチジン−リジンコポリマーなどの他の有効な材料にさらに結合させる。この結合は共有結合によるものでも非共有結合によるものでもよく、共有結合の場合は、この結合は切断可能でない場合があり、又は加水分解もしくは還元剤などで切断可能な場合がある。このポリマー結合体を含む溶液、或いはポリマー結合体とリガンド又は立体ポリマーもしくはフソゲン（ｆｕｓｏｇｅｎ）を含む材料などの他のポリマー、液体もしくはミセルとの混合物を含む溶液を上記核酸、一実施態様では対象とする特定のｍＲＮＡを標的にするｓｉＲＮＡ、を含む溶液と所望の比率で混合することによってｓｉＲＮＡを含むナノ粒子を得る。そのような比率により所望の大きさ、安定性又は他の特性のナノ粒子をもたらすことができる。
【００７６】
一実施態様において、ナノ粒子は、上記ポリマー結合体を過剰のポリカチオン及び上記核酸と混合することを含むナノ粒子自己アセンブリによって形成させる。負に荷電した核酸とポリマー結合体の正に荷電した部分との間の非共有結合性静電相互作用によって、ナノ粒子の形成をもたらす自己アセンブリ過程が促進される。この過程は、上記２つの溶液を単純に混合するものであり、この場合、核酸を含む一方の溶液をポリマー結合体及び過剰のポリカチオンを含む別の溶液に添加し、その後に撹拌するか同時に撹拌する。一実施態様では、正荷電の成分と負荷電の成分との比率は、各溶液の濃度を適切に調整することで、又は添加する溶液の容量を調整することで決定する。別の実施態様では、これら２つの溶液は、静的ミキサーなどの混合装置を用いて連続流条件下で混合する。この実施態様では、２つ以上の溶液をこれらの溶液の比率を生じる速度及び圧で静的ミキサーに導入し、これらの溶液流をこの静的ミキサー内で混合する。複数のミキサーが並列又は直列に配置されるような配置は可能である。
【００７７】
一実施態様において、本発明は、３つの性質を有する組織標的化可能な送達を含むｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドの処方を提供する。これらの性質は、細胞質にｓｉＲＮＡを放出することができるコアへの核酸結合、非特異的相互作用からの保護、及び細胞取り込みをもたらす組織標的化である。本発明は、必要な複数の性質を組み合わせてアセンブルするための３種の材料のモジュラー結合体（ｍｏｄｕｌａｒ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）を用いる組成物および方法を提供する。種々の性質が組み込まれるようにこれらを設計、合成し、ｓｉＲＮＡペイロードと混合してナノ粒子を形成することができる。一実施態様は、これらの細胞に特異的なペプチドリガンドを保護ポリマーの一方の末端にカップリングし、他方の末端に核酸のためのカチオン性担体をカップリングすることによって新脈管構造を標的にするモジュラーポリマー結合体を含む。このポリマー結合体は、三官能性ポリマー（ＴＦＰ：ｔｒｉ−ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｐｏｌｙｍｅｒ）と称することもある３つの機能ドメインを有する。この結合体のモジュラー設計により各成分の置換及び最適化が別々に可能となる。別のアプローチは、予め形成したナノ粒子上に表面被膜を付けるものであった。ポリマー上への立体ポリマー被膜の吸着は自己限定的であり、一旦立体層が形成され始めると、ポリマーのさらなる付加が妨げられることになる。本発明の組成物および方法を用いると、上記３つの機能のそれぞれを、概してその他の２つの機能と無関係に、最適化するのに有効な方法が可能となる。
【００７８】
核酸ナノ粒子の保護的立体被覆
細胞外膜に類似した外部脂質二重層を有する均一なリポソームは迅速に認識され、血液から除去される。ナノテクノロジーは広範囲の合成ポリマー化学をもたらす。ＰＥＧ、ポリアセタール、およびポリオキサゾリンなどの親水性ポリマーは、コロイド状薬物の送達系（リポソーム、ポリマー、または静電ナノ粒子を問わない）の表面に「立体」保護層を形成して血液からの免疫クリアランスを減少させるのに有効であることが分かっている。この立体ＰＥＧ層の使用は、立体的に安定化されたリポソームに関して最初に開発され、最も広範に研究された。本発明は、立体ポリマー被膜の他に、表面電荷を化学的に低下させるなどの別のアプローチを提供する。
【００７９】
立体障害と生物学的結果は、化学的性質ではなく物理的性質に由来すると考えられる。いくつかの他の親水性ポリマーがＰＥＧの代替物として報告されている。立体的に安定化したリポソームに関する物理的研究により、ポリマー層の物理的挙動の強い機械的基盤が示されており、これを利用して他のタイブの粒子において同様な被覆を達成することができる。しかしながら、物理的研究によって核酸とのポリマー複合体の表面における同様のポリマー層の形成および類似の生物学的性質の達成が示された一方で、我々は血液からの免疫クリアランスからの保護を正確に予測するために物理的性質を使用するための十分な情報を欠いている。リポソーム研究から、生物活性に対して最も大きな影響を及ぼす物理的性質を２種のポリマーの大きさ及びグラフト密度を変化させて結合体のマトリックスを合成することによって得ることができることが分かる。表面立体層の機能が物理的性質に起因する一方で、最適な結合の化学的性質は依然として立体ポリマー及びこれにカップリングさせる担体の特定の化学的性質によって決まることに留意されたい。
【００８０】
表面立体ポリマー層を有するナノ粒子の形成方法も重要な要素である。一実施態様、立体ポリマーを担体ポリマーにカップリングすることにより核酸と共に自己アセンブルする結合体を得て立体ポリマー表面層を有するナノ粒子を形成する。別の実施態様では、予め形成したナノ粒子上に表面被膜を付ける。自己アセンブリでは、表面立体層の形成は、担体ポリマーとペイロードとの相互作用に依存し、粒子表面と反応させるための形成されている立体層からの浸透には依存しない。この場合、担体ポリマーの核酸ペイロードとの結合能に及ぼす立体ポリマーの影響は粒子形成、従って表面立体層に悪影響を及ぼすことがある。このことが起こる場合、担体上の立体ポリマーのグラフト密度がその最大値を超えてしまっていることになり、又は構造のグラフティング特性が十分ではない。
【００８１】
特定の組織を標的にする表面露出リガンド及び部分
ナノ粒子が選択的に標的細胞の内部に到達する能力は、特定の受容体媒介取り込みを誘導する能力にある。この能力は、本発明では、結合特異性を有する露出リガンド又は標的化部分によって得られる。標的化コロイド送達系のためのリガンドが多種存在する。そのような方法の１つは、リポソーム表面に抗体をカップリングさせるものであり、通常、そのようなリポソームは免疫リポソームと呼ばれる。明らかになっている１つの重要な要素はリガンド密度の影響である。抗体は、リガンドとして使用するための多くの要件（良好な結合選択性、ほぼ任意の受容体に対する調製法がほぼ定型化していること、及びナノ粒子の種類とは無関係に蛋白質カップリング方法が広く適用できることを含む）を満たす傾向がある。モノクロナール抗体は血液脳関門を通過することができる兆候さえ示す。トランスフェリン又はトランスフェリン受容体などの、標的化ナノ粒子用に天然リガンド及び受容体である他の蛋白質も検討されてきた。本発明の一実施態様では、標的化リガンド又は部分は糖又は糖アナログとすることができる。
【００８２】
好ましい種類のリガンドは、内在化受容体に対して強い選択的結合親和性を有する低分子量化合物である。研究では、葉酸、チアミンなどのビタミン、小麦胚凝集素、ｅ−セクレチンに対するシアリルルイスｘなどのポリサッカリド、及びインテグリンに対するＲＧＤなどのペプチド結合ドメインを含む天然の代謝産物が評価されている。ペプチドは用途の広いクラスのリガンドをもたらす。何故なら、インビボパニング法を使用した場合でさえ、ファージディスプレイライブラリーを用いて天然または非天然の配列をスクリーニングすることができるからである。このようなファージディスプレイ法では、配列と無関係に容易にカップリングさせるために１つの末端に非対Ｃｙｓ残基を保持させることが可能となる。新脈管構造へのナノ粒子の送達を標的化するためにＲＧＤペプチドを使用することは、有効なリガンドの主な要件を満たすのに極めて効果的なことがある。即ち、リガンド結合を妨害しないし、免疫クリアランスも誘導しない特定の化学的性質によって、なお一層、標的細胞での受容体媒介性の選択的取り込みが可能となる。
【００８３】
本発明の組成物および方法は、ポリマー、ポリマー結合体、脂質、ミセル、自己アセンブリコロイド、ナノ粒子、立体的に安定化されたナノ粒子、又はリガンド誘導性ナノ粒子を含む核酸送達媒体を用いたｓｉＲＮＡの投与を提供する。国際公開第０１／４９３２４号及び米国特許出願公開第２００３／０１６６６０１号（これらの全体が本明細書に参考として援用されている）に記載のタイプの標的化合成ベクターは、本発明のＲＮＡｉ誘導核酸分子の全身性送達に用いることができる。一実施態様では、ＰＥＩ−ＰＥＧ−ＲＧＤ（ポリエチレンイミン−ポリエチレングリコール−アルギン−グリシン−アスパラギン酸）合成ベクターを調整して、例えば、国際公開第０１／４９３２４号及び米国特許出願公開第２００３／０１６６６０１号の実施例５３及び５６と同様にして用いることができる。このベクターは静脈内注射によって全身性にＲＮＡｉを送達するのに用いられた。当該分野で周知の他の標的化合成ベクター分子を用いることもできる。例えば、このベクターは、ＲＮＡｉおよび少なくとも１つの複合体形成試薬を含むコア複合体で構成されている内殻を有することができる。また、このベクターは、融合誘導部分を含むことができる。この部分は、コア複合体に固定されている殻を含むことができ、又はコア複合体に直接組み込むことができる。ベクターは、さらに、このベクターを安定化し、蛋白質および細胞への非特異的結合を減少させる外殻（ｏｕｔｅｒ ｓｈｅｌｌ）部分を有することができる。この外殻部分は親水性ポリマーを含むことができ、及び／又は融合誘導部分に固定することができる。外殻部分をコア複合体に固定してもよい。このベクターは、標的組織および細胞集団へのベクターの結合を増強する標的化部分を含むことができる。適切な標的化部分は当該分野で周知であり、国際公開第０１／４９３２４号及び米国特許出願公開第２００３／０１６６６０１号に詳細に開示されている。
【００８４】
本発明の一実施態様では、抗ＶＥＧＦ経路ｓｉＲＮＡ短鎖二本鎖ＲＮＡ分子のＲＧＤ媒介リガンド誘導性ナノ粒子調製のための組成物及び方法を提供する。ｓｉＲＮＡを含むＲＧＤ媒介組織標的化ナノ粒子の一製造方法では、標的化リガンドであるＲＧＤ含有ペプチド（ＡＣＲＧＤＭＦＧＣＡ（配列番号１２））をポリエチレングリコールもしくは同様の性質を有する他のポリマーなどの立体ポリマーに結合させる（国際公開第０６／１１０８１３号参照；これの全体が本明細書に参考として援用されている）。このリガンド−立体ポリマー結合体を、ポリエチレンイミンなどのポリカチオン又はヒスチジン−リジンコポリマーなどの他の有効な材料にさらに結合する。この結合は、共有結合でも非共有結合でもよく、共有結合の場合は、この結合は切断可能でない場合があり、又は加水分解もしくは還元剤などで切断可能な場合がある。上記ポリマー結合体を含む溶液、或いはポリマー結合体とリガンド又は立体ポリマーもしくはフソゲンを含む材料などの他のポリマー、液体もしくはミセルとの混合物を含む溶液を上記核酸、一実施態様では対象とする特定の遺伝子を標的にするｓｉＲＮＡ、を含む溶液と所望の比率で混合することによってｓｉＲＮＡを含むナノ粒子を得る。
【００８５】
製剤と電場の併用
特定の用途では、ｓｉＲＮＡを電場をかけて、又はかけないで投与することができる。例えば、これは、本発明のｓｉＲＮＡ分子を、例えば腫瘍組織内に直接注入することにより、また、血管形成組織又は望ましくない新脈管構造を有する組織内又はその近傍に直接送達するのに利用することができる。ｓｉＲＮＡは、例えば、生理食塩水、緩衝生理食塩水などの適切な医薬用担体に含ませることができる。
【００８６】
以上のように一般的に説明してきた本発明は、次の実施例にて一層容易に理解されるであろうが、これらの例は例証として示されるものであり、本発明を限定するものではない。
【実施例】
【００８７】
（実施例１）
ヒトＶＥＧＦＲ１発現を低下させるための候補ｓｉＲＮＡ分子
検証されたアルゴリズムを用い、公表されているヒトＶＥＧＦＲ１ｍＲＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋアセッション番号ＡＦ０６３６５７；図７Ａ及び図７Ｂ；配列番号１９７）、ヒト可溶性ＶＥＧＦＲ１ｍＲＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋアセッション番号Ｕ０ｌ１３４；図８；配列番号１９８）及びマウスＶＥＧＦＲ１ｍＲＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋアセッション番号ＮＭ＿０１０２２８．２；図９Ａ及び図９Ｂ；配列番号１９９）の配列を利用してヒトＶＥＧＦＲ１ｓｉＲＮＡ分子を設計した。
【００８８】
可溶性及び膜結合型ｈＶＥＧＦＲ１の両者を標的にする例示的なｓｉＲＮＡを上記の表１に示した。膜結合型ｈＶＥＧＦＲ１を標的にするが、可溶性ｈＶＥＧＦＲ１は標的にしない例示的なｓｉＲＮＡを上記の表２に示した。ヒト及びマウスＶＥＧＦＲ１の両者を標的にする例示的なｓｉＲＮＡを上記の表３に示した。
【００８９】
（実施例２）
ｓｉＲＮＡ分子は可溶性ヒトＶＥＧＦＲ１蛋白質発現に影響を与えないで完全長ヒトＶＥＧＦＲ１蛋白質発現を阻害する
ヒトＶＥＧＦＲ１を標的にする計４８種の平滑末端２５−マーｓｉＲＮＡについて、ＨＵＶＥＣ細胞を用い、これらを形質移入した細胞でのヒトＶＥＧＦＲ１（「ｈＶＥＧＦＲ１」）発現のノックダウンにおけるこれらの効力を試験した。これらの４８種のｈＶＥＧＦＲ１−ｓｉＲＮＡは、Ｑｉａｇｅｎ社（Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）により合成された表１乃至３及び７乃至１１のｈＶＥＧＦＲ１−ｓｉＲＮＡのリストから選び、ＨＵＶＥＣ細胞における効力スクリーニングにかけた。これらの４８種のｓｉＲＮＡの中で、ｈＶＥＧＦＲ１−ｓｉＲＮＡ＃１乃至１９（表４）は、可溶性（切断型）ｈＶＥＧＦＲ１及び完全長膜結合型ｈＶＥＧＦＲ１をコードしている両ｍＲＮＡを標的にする。これに対して、ｈＶＥＧＦＲ１−ｓｉＲＮＡ＃２０乃至４８（表５）は、完全長ｈＶＥＧＦＲ１ｍＲＮＡのみを標的にする。
【００９０】
【表４−１】
【００９１】
【表４−２】
【００９２】
【表５−１】
【００９３】
【表５−２】
【００９４】
【表５−３】
ＨＵＶＥＣ細胞（Ｃａｍｂｒｅｘ社、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ、ＵＳＡ）は、５％ＣＯ２を含むインキュベーターを用いて３７℃の２％ＦＢＳ含有ＥＧＭ−２培地（Ｃａｍｂｒｅｘ社）中で培養した。３乃至５継代目のＨＵＶＥＣ細胞をｓｉＲＮＡ形質移入に用いた。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭａｘ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用い、メーカーのプロトコルに従ってｓｉＲＮＡ濃度を１０乃至２０ｎＭとしてＨＵＶＥＣ細胞で逆（ｒｅｖｅｒｓｅ）又は前（ｆｏｒｗａｒｄ）ｓｉＲＮＡ形質移入法を実施した。ｓｉＲＮＡ形質移入は、ＥＬＩＳＡアッセイの場合、４８穴プレートで（各ｓｉＲＮＡ配列につき２回）、リアルタイムＰＣＲアッセイの場合、９６穴プレートで実施した。ｈＶＥＧＦＲ１ｓｉＲＮＡ効力スクリーニングの陰性対照としてＱｉａｇｅｎ社製ＡｌｌＳｔａｒｓ Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｉＲＮＡ又はＬｕｃ−ｓｉＲＮＡを使用した（表１２）。
【００９５】
ｈＶＥＧＦＲ１のｓｉＲＮＡ媒介ノックダウンを蛋白質レベルで検出するために、形質移入したＨＵＶＥＣ細胞の細胞培養上清及び細胞溶解物を形質移入後４８時間に収集し、ｈＶＥＧＦＲ１ＥＬＩＳＡアッセイ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ社）を用いて、細胞培養上清に存在する可溶性ｈＶＥＧＦＲ１及び細胞溶解物に存在する全ｈＶＥＧＦＲ１を測定した。可溶性及び膜結合型完全長ｈＶＥＧＦＲ１をコードしている両ｍＲＮＡを標的にするｓｉＲＮＡ＃１乃至１９をＨＵＶＥＣ細胞に形質移入した場合にはこの形質移入ＨＵＶＥＣ細胞の培養上清で可溶性ｈＶＥＧＦＲ１蛋白質の著しいノックダウンが認められた（図１Ａ）が、膜結合型ｈＶＥＧＦＲ１をコードしている完全長ｈＶＥＧＦＲ１ｍＲＮＡのみを標的にするｓｉＲＮＡ＃２０乃至４８を形質移入した細胞では認められなかった（図２Ａ）。ｓｉＲＮＡ＃１乃至１９を形質移入したＨＵＶＥＣ細胞では（可溶性ｈＶＥＧＦＲ１及び膜結合型ｈＶＥＧＦＲ１を含む）全ｈＶＥＧＦＲ１蛋白質の著しいノックダウンが認められた（図１Ｂ）のとは対照的に、ｓｉＲＮＡ＃２０乃至４８の形質移入では全ｈＶＥＧＦＲ１蛋白質のある程度の増大が認められた（図２Ｂ）。
【００９６】
上記４８種の試験ｓｉＲＮＡによる上清及び細胞溶解物の両方におけるｈＶＥＧＦＲ１蛋白質発現の阻害については表６にまとめた。表６のデータは図３及び４にグラフ化されている。
【００９７】
【表６−１】
【００９８】
【表６−２】
全ｈＶＥＧＦＲ１蛋白質レベルを細胞溶解物において測定する場合、ＥＬＩＳＡアッセイでは可溶性ｈＶＥＧＦＲ１と完全長膜結合型ｈＶＥＧＦＲ１を区別することができないので、定量的リアルタイム−ＰＣＲ（「ＱＲＴ−ＰＣＲ：ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＲｅａｌＴｉｍｅ−ＰＣＲ」）を用いて完全長ｈＶＥＧＦＲ１のノックダウンを特異的に測定した。
【００９９】
ｈＶＥＧＦＲ１のｓｉＲＮＡ媒介ノックダウンをｍＲＮＡレベルで検出するために、ＨＵＶＥＣ細胞に１０ｎＭｓｉＲＮＡを形質移入し、形質移入後４８時間に細胞を収集して、完全長ｈＶＥＧＦＲ１ｍＲＮＡ特異的遺伝子発現アッセイ（Ｈｓ＿０１７６５７３＿ｍｌ、ＡＢＩ）又は可溶性及び膜結合型ｈＶＥＧＦＲ１をコードしている両ｍＲＮＡの遺伝子発現アッセイ（Ｈｓ＿０１０５２９３６＿ｍｌ、ＡＢＩ）と共にＱＲＴ−ＰＣＲアッセイを用いて各ｈＶＥＧＦＲ１ｍＲＮＡの相対レベルを測定した。細胞は、ＱＲＴ−ＰＣＲアッセイのために「Ｃｅｌｌ ｔｏ Ｓｉｇｎａｌ Ｋｉｔ」を用いて溶解させた。試料は−８０℃で貯蔵した。全ｈＶＥＧＦＲ１ｍＲＮＡの著しいノックダウンは、ｈＶＥＧＦＲ１−ｓｉＲＮＡ＃１乃至１９を形質移入したＨＵＶＥＣ細胞でのみ認められた（図５、灰色棒）が、ｈＶＥＧＦＲ１−ｓｉＲＮＡ＃２０乃至４８を形質移入したＨＵＶＥＣ細胞では認められず（図６、灰色棒）、このことは蛋白質ノックダウンデータ（図１Ａ、１Ｂ、２Ａ、２Ｂ、３及び４）と一致していた。しかしながら、全てのｈＶＥＧＦＲ１−ｓｉＲＮＡを形質移入したＨＵＶＥＣ細胞において完全長膜結合型ｈＶＥＧＦＲ１をコードしているｍＲＮＡの著しいノックダウンが認められた（図５及び６、黒色棒）。これは、ｈＶＥＧＦＲ１−ｓｉＲＮＡ＃２０乃至４８が完全長ｈＶＥＧＦＲ１ｍＲＮＡのみをノックダウンし、可溶性ｈＶＥＧＦＲ１ｍＲＮＡをノックダウンしないことを明示したものである。
【０１００】
結論として、本発明者らは、ＨＵＶＥＣ細胞においてインビトロでのｓｉＲＮＡのスクリーニングを行うことによって、ここに示したｓｉＲＮＡ候補のうちのいくつかがｈＶＥＧＦＲ１遺伝子発現を蛋白質及びｍＲＮＡレベルで阻害するのに極めて有効であることを明らかにした。さらに、本発明者らは、これらのｓｉＲＮＡが可溶性ｈＶＥＧＦＲ１に影響を与えずに膜結合型完全長ｈＶＥＧＦＲ１のみを減少させることも明らかにした。本発明者らは、意外にも、いく種かの完全長ｈＶＥＧＦＲ１特異的ｓｉＲＮＡが可溶性ｈＶＥＧＦＲ１のレベルを増大させたことを発見した（例えば、ｈＶＥＧＦＲ１−ｓｉＲＮＡ＃２１乃至２５、２７乃至２９、３１、３８、３９及び４１乃至４８については図２Ａ及び６参照）。
【０１０１】
【表７−１】
【０１０２】
【表７−２】
【０１０３】
【表８】
【０１０４】
【表９】
【０１０５】
【表１０−１】
【０１０６】
【表１０−２】
【０１０７】
【表１０−３】
【０１０８】
【表１０−４】
【０１０９】
【表１０−５】
【０１１０】
【表１１】
【０１１１】
【表１２】
参考文献
【０１１２】
【数１】
【０１１３】
【数２】
【０１１４】
【数３】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願への相互参照）
本願は、米国特許法第１１９条（ｅ）項の下、２００７年１０月１２日に出願された米国仮特許出願第６０／９９６，８３１号からの優先権を主張し、この米国仮特許出願第６０／９９６，８３１号の内容は、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
発明の分野
本発明は、分子生物学及び医学の分野に属し、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ：ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）誘導組成物及びこれを用いてＶＥＧＦＲ１などのＶＥＧＦ経路遺伝子の発現をインビトロ及びインビボで調節することにより望ましくない新生血管形成を有する症状及び疾患を処置する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
本発明は、血管の異常又は過剰な増殖及び成長を示すことが多い望ましくない新生血管形成（ＮＶ：ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）を有する疾患の処置のための組成物及び方法を提供する。ＮＶの進行自体、多くの場合、有害な結果をもたらし、又はこれが疾患の初期の病理学的段階となり得る。血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ：Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ）経路のアンタゴニストを初めとする血管形成の新しい治療用アンタゴニストが導入されたにもかかわらず、ＮＶを制御するための処置法の選択肢は不十分であり、疾患の進行を阻止するか、望ましくない血管形成を抑えるためのＮＶの有効な処置法に対する未だ満たされていない臨床的要望は依然として多く、かつ高まっている。
【０００４】
ＶＥＧＦ経路は、血管新生因子ＶＥＧＦ及びそのチロシンキナーゼ受容体ＶＥＧＦＲ１（Ｆｌｔ−１）及びＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ）を含む。可溶性ＶＥＧＦＲ１（ｓＶＥＧＦＲ１；ｓＦｌｔ−１）は、膜貫通及び細胞質ドメインを欠く膜結合型完全長ＶＥＧＦＲ１のスプライス変異体である。ｓＶＥＧＦＲ１は、ＶＥＧＦを隔離して完全長ＶＥＧＦＲ２と不活性なヘテロ二量体を形成することにより抗血管新生効果を生じる（非特許文献１、これの全体が本明細書に参考として援用されている）。外因性に発現させたｓＶＥＧＦＲ１蛋白質は、細胞系及び腫瘍異種移植モデルにおいて抗血管新生効果を示すことが分かっており（非特許文献２及び非特許文献３）、これらの全体が本明細書に参考として援用されている。
【０００５】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、二本鎖ＲＮＡが配列特異的に遺伝子発現を阻害する転写後過程である。このＲＮＡｉ過程は少なくとも２段階で起こる。即ち、１段階では、長いｄｓＲＮＡが、内因性リボヌクレアーゼにより、酵素ダイサーの使用によって生じるリボヌクレアーゼＩＩＩ様活性による場合より短い２１又は２３ヌクレオチド長ｄｓＲＮＡに切断される。第２の段階では、このより小さなｄｓＲＮＡが、多タンパク質ＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ：ＲＮＡ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｃｏｍｐｌｅｘ）中で対応する配列を有するｍＲＮＡ分子の分解を媒介し、その結果、その遺伝子の発現を選択的に下方制御する。このＲＮＡｉ効果は、より長い二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ：ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ ＲＮＡ）又はより短い低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ：ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）を細胞内標的配列へ誘導することにより達成することができる。また、ＲＮＡｉは、標的遺伝子に対して相補性のｄｓＲＮＡを生じるプラスミドを導入することによっても達成することができる。
【０００６】
ＲＮＡｉ誘導分子をインビボで送達する方法を改良することは極めて重要である。ＲＮＡｉを誘導する核酸分子を組織を標的として送達することが極めて重要であることも明らかである。ＶＥＧＦ経路遺伝子に選択的なＲＮＡｉを誘導する核酸分子を送達する方法がＮＶ疾患の処置に非常に有益であることも明らかである。本発明の組成物及び方法はこうしたニーズに応えるものである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｋｅｎｄａｌｌほか、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９９６年；２２６：ｐ．３２４−３２８
【非特許文献２】Ｍａｈｅｎｄｒａほか、Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２００５年；１２：ｐ．２６−３４
【非特許文献３】Ｋｏｍｍａｒｅｄｄｙほか、Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２００７年；１４：ｐ．４８８−４９８
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
ＶＥＧＦ媒介血管形成及びＮＶは、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ１及び／又はＶＥＧＦＲ２を標的とするアンタゴニストによって低下させることができる。ＶＥＧＦＲ１は完全長「膜結合」型のスプライス変異体として分泌「可溶」型で産生される。可溶性ＶＥＧＦＲ１は、ＶＥＧＦを隔離してこれがもはや完全長ＶＥＧＦＲ１に自由に結合できないようにし、完全長ＶＥＧＦＲ２と不活性なヘテロ二量体を形成することによってＶＥＧＦ経路のアンタゴニストとして作用する（Ｋｅｎｄａｌｌほか、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９９６年；２２６：ｐ．３２４−３２８、この全体が本明細書に参考として援用されている）。
【０００９】
従って、本発明の目的は、ＶＥＧＦＲ１のＲＮＡｉを誘導して血管形成過程を調節し、及び／又はＮＶ発症に関与する遺伝子発現を下方制御することでこの疾患過程を抑制するのに用いるための核酸分子を提供することにある。本発明者らは、意外なことに、完全長のＶＥＧＦＲ１の発現を標的としてこれを低下させ、また、驚くべきことに可溶性ＶＥＧＦＲ１の発現を増加させもするＲＮＡｉ誘導核酸分子を見出した。従って、こうした核酸分子は完全長ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦ及びＶＥＧＦＲ２の血管新生促進活性を同時に低下させる好都合な性質を示す。
【００１０】
本発明の一実施態様では、こうした核酸分子は、完全長ＶＥＧＦＲ１のｍＲＮＡ又は蛋白質レベルの発現を低下させながら、可溶性ＶＥＧＦＲ１のｍＲＮＡ又は蛋白質レベルの発現には影響を与えない。本発明の別の実施態様では、こうした核酸分子は、全ＶＥＧＦＲ１のｍＲＮＡ又は蛋白質レベルの発現を増加させると同時に、可溶性ＶＥＧＦＲ１のｍＲＮＡ又は蛋白質レベルの発現を増加させる。本発明の別の実施態様では、こうした核酸分子は、全ＶＥＧＦＲ１のｍＲＮＡ又は蛋白質レベルの発現を低下させながら、可溶性ＶＥＧＦＲ１のｍＲＮＡ又は蛋白質レベルの発現は増加させる。好ましい実施態様では、こうした核酸分子は、完全長膜結合型ＶＥＧＦＲ１のｍＲＮＡ又は蛋白質レベルの発現を低下させながら、可溶性ＶＥＧＦＲ１のｍＲＮＡ又は蛋白質レベルの発現は増加させる。
【００１１】
本発明の一態様では、哺乳動物においてＶＥＧＦＲ１を１種以上の他のＶＥＧＦ経路遺伝子と組み合わせてこれらの発現を阻害するための組成物及び方法を提供する。本発明の別の態様では、ＶＥＧＦＲ１の発現阻害を単独で、又は１種以上の他のＶＥＧＦ経路遺伝子の発現阻害と組み合わせて、又はＶＥＧＦ経路のアンタゴニストを含む他の薬剤と組み合わせて行うことによってＮＶ疾患を処置するための組成物及び方法を提供する。
【００１２】
本発明は、ＶＥＧＦＲ１遺伝子の発現を下方制御するための組成物及び方法であって、核酸分子を含む組成物を哺乳動物の組織に投与することを含み、この核酸分子はＶＥＧＦＲ１の発現を特異的に低下又は阻害する、組成物及び方法を提供する。この内因性遺伝子の下方制御は、ＶＥＧＦ経路の活性に起因するか、これによって悪化する疾患を処置するのに利用することができる。この疾患はヒトにおいて起こり得る。
【００１３】
また、ＶＥＧＦ経路遺伝子の望ましくない発現を伴う哺乳動物の疾患を処置するための方法であって、製剤に用いられる、有効医薬成分（ＡＰＩ：ａｃｔｉｖｅ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ）としてｄｓＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む核酸組成物を投与することを含み、この製剤はポリマーから構成することができるものとし、核酸組成物はＶＥＧＦ経路遺伝子の発現を低下させ、この疾患におけるＮＶを阻止することができるものとする方法も提供する。この疾患は、癌又は腫瘍であり得、組織は、例えば、腎組織、乳房組織、結腸組織、前立腺組織、肺組織又は卵巣組織であり得る。本発明の一態様では、癌又は腫瘍もしくは前癌状態の処置のための組成物及び方法を提供する。本発明の別の態様では、ＲＮＡｉを誘導する核酸剤を他の治療剤（例えば、低分子及びモノクロナール抗体（ｍＡｂ）が挙げられるが、これらに限定されるものではない）と共に、同じ治療方式で用いる。
【００１４】
ＶＥＧＦＲ１又は１種以上のＶＥＧＦ経路遺伝子と組み合わせたＶＥＧＦＲ１の発現をこの発現を阻害、低下又は増加させることで調節するために本発明のＡＰＩのいずれか又は本明細書に示した組成物のいずれかを用いて本発明の方法のいずれかを実施することができる。一実施態様において、１種以上のＶＥＧＦ経路遺伝子の発現を阻害又は低下させるためのＡＰＩ又は組成物は、ＶＥＧＦの発現を阻害又は低下させる少なくとも１種のｓｉＲＮＡを含む。別の実施態様では、１種以上のＶＥＧＦ経路遺伝子の発現を阻害又は低下させるためのＡＰＩ又は組成物は、ＶＥＧＦＲ１の発現を阻害又は低下させる少なくとも１種のｓｉＲＮＡを含む。さらに別の実施態様では、１種以上のＶＥＧＦ経路遺伝子の発現を阻害又は低下させるためのＡＰＩ又は組成物は、ＶＥＧＦＲ２の発現を阻害又は低下させる少なくとも１種のｓｉＲＮＡを含む。別の実施態様では、１種以上のＶＥＧＦ経路遺伝子の発現を阻害又は低下させるためのＡＰＩ又は組成物は、ＶＥＧＦの発現を阻害又は低下させる少なくとも１種のｓｉＲＮＡ及びＶＥＧＦＲ１の発現を阻害又は低下させる少なくとも１種のｓｉＲＮＡを含む。別の実施態様では、１種以上のＶＥＧＦ経路遺伝子の発現を阻害又は低下させるためのＡＰＩ又は組成物は、ＶＥＧＦの発現を阻害又は低下させる少なくとも１種のｓｉＲＮＡ及びＶＥＧＦＲ１の発現を阻害又は低下させる少なくとも１種のｓｉＲＮＡ及びＶＥＧＦＲ２の発現を阻害する少なくとも１種のｓｉＲＮＡを含む。別の実施態様では、１種以上のＶＥＧＦ経路遺伝子の発現を阻害又は低下させるためのＡＰＩ又は組成物は、ＶＥＧＦＲ１の発現を阻害又は低下させる少なくとも１種のｓｉＲＮＡ及びＶＥＧＦＲ２の発現を阻害する少なくとも１種のｓｉＲＮＡを含む。一実施態様では、１種以上のＶＥＧＦ経路遺伝子の発現を阻害又は低下させるためのＡＰＩ又は組成物は、１種以上のＶＥＧＦ経路遺伝子の発現を阻害又は低下させるためのＡＰＩ又は組成物は、ＶＥＧＦの発現を阻害又は低下させる少なくとも１種のｓｉＲＮＡ及びＶＥＧＦＲ１の発現を阻害又は低下させる少なくとも１種のｓｉＲＮＡ及びＶＥＧＦＲ２の発現を阻害又は低下させる少なくとも１種のｓｉＲＮＡを含む。１種以上のＶＥＧＦ経路遺伝子の発現を阻害又は低下させるための上記ＡＰＩ又は組成物のすべてにおいて、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ１又はＶＥＧＦＲ２の発現を阻害又は低下させるｓｉＲＮＡは本明細書に列挙したｓｉＲＮＡのいずれかとすることができる。
【００１５】
一実施態様において、１種以上のＶＥＧＦ経路遺伝子の発現を阻害又は低下させるためのＡＰＩ又は組成物は、本明細書に列挙したｓｉＲＮＡのいずれかから選ばれる少なくとも１種のｓｉＲＮＡを含む。別の実施態様では、１種以上のＶＥＧＦ経路遺伝子の発現を阻害又は低下させるためのＡＰＩ又は組成物は、本明細書に列挙したｓｉＲＮＡのいずれかから選ばれる少なくとも２種のｓｉＲＮＡを含む。さらに別の実施態様では、１種以上のＶＥＧＦ経路遺伝子の発現を阻害又は低下させるためのＡＰＩ又は組成物は、本明細書に列挙したｓｉＲＮＡのいずれかから選ばれる少なくとも３種のｓｉＲＮＡを含む。
【００１６】
上記組成物は、ポリマー担体をさらに含むことができる。このポリマー担体は、上記ＲＮＡ分子に結合してナノ粒子を形成するカチオン性ポリマーを含むことができる。このカチオン性ポリマーは、例えば、ヒスチジン及びリジン残基を含むアミノ酸コポリマーとすることができる。このポリマーは、分岐ポリマーを含むことができる。上記組成物は、標的合成ベクターを含むことができる。この合成ベクターは、核酸担体としてカチオン性ポリマー、立体保護材として親水性ポリマー及び標的細胞選択的薬剤として標的化リガンドを含むことができる。このカチオン性ポリマーは、ポリエチレンイミン又はポリヒスチジン−リジンコポリマー又は化学的に修飾したポリリジン、又は核酸担体モジュールとして用いることができる他の効果的なポリカチオン性担体を含むことができる。上記親水性ポリマーは、ポリエチレングリコール、ポリアセタール又はポリオキサゾリンを含むことができ、上記標的化リガンドは、ＲＧＤ配列を含むペプチド又は糖もしくは糖アナログ又はｍＡｂもしくはｍＡｂの断片又はその他の効果的な標的化部分を含むことができる。
【００１７】
本発明の組成物及び方法は、ＶＥＧＦＲ１遺伝子の一部と同一、実質的に同一、相同又は実質的に相同である配列を有する、ｄｓＲＮＡオリゴヌクレオチドを初めとするＲＮＡｉ誘導核酸分子を含む。この遺伝子は、野生型遺伝子又は突然変異遺伝子とすることができる。突然変異遺伝子の場合、この突然変異遺伝子の少なくとも１カ所の突然変異はこの遺伝子のコーディング又は調節領域に存在させることができる。こうした方法の全てにおいて、ＶＥＧＦＲ１を標的とするＲＮＡｉ誘導核酸分子は、成長因子遺伝子、蛋白質セリン／スレオニンキナーゼ遺伝子、蛋白質チロシンキナーゼ遺伝子、蛋白質セリン／スレオニンホスファターゼ遺伝子、蛋白質チロシンホスファターゼ遺伝子、受容体遺伝子及び転写因子遺伝子からなる群から選ばれる遺伝子を標的とするＲＮＡｉ誘導核酸分子（類）と組み合わせて用いることができる。こうした追加的な遺伝子としては、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＲ３、ＶＥＧＦ１２１、ＶＥＧＦ１６５、ＶＥＧＦ１８９、ＶＥＧＦ２０６、ＲＡＦ−ａ、ＲＡＦ−ｃ、ＡＫＴ、Ｒａｓ及びＮＦＫｂからなる群から選ばれる１種以上を挙げることができる。また、こうした追加的遺伝子として、ＨＩＦ、ＥＧＦ、ＥＧＦＲ、ｂＦＧＦ、ｂＦＧＦＲ、ＰＤＧＦ及びＰＤＧＦＲを含む、ＮＶ関連の他の生化学的経路由来の１種以上の遺伝子を挙げることができる。また、こうした追加的遺伝子として、Ｈｅｒ−２、ｃ−Ｍｅｔ、ｃ−Ｍｙｃ及びＨＧＦを含む、ＮＶに呼応して機能する他の生化学的経路由来の１種以上の遺伝子を挙げることができる。
【００１８】
また、本発明は、ｓｉＲＮＡのカクテル（ｓｉＲＮＡ−ＯＣ）を含む、複数の遺伝子を阻害するためのＲＮＡｉを誘導する核酸剤を含む組成物及び方法をも提供する。本発明の組成物及び方法は、複数の遺伝子を実質的に同時に阻害することができ、又はこれらは複数の遺伝子を順次に阻害することができる。好ましい実施態様では、こうしたｓｉＲＮＡ−ＯＣ剤は３種のＶＥＧＦ経路遺伝子：ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ１及びＶＥＧＦＲ２を阻害する。別の好ましい実施態様では、こうしたｓｉＲＮＡ−ＯＣは実質的に同時に投与される。
【００１９】
本発明は、ＶＥＧＦＲ１ｍＲＮＡ内の配列に対する実質的な相補性に由来する遺伝子阻害選択性を有する核酸分子を提供する。また、本発明は、複数の内因性遺伝子の阻害剤で処置することができる、ヒト疾患、特にＮＶ関連疾患の処置方法をも提供する。また、本発明は、ある場合には実質的に同時に、別の場合には順次に投与する複数の治療剤の組合せによってヒト疾患を処置する方法をも提供する。
【００２０】
本発明の他の目的、特徴及び効果については次の詳細な説明から明白になろう。しかしながら、本発明の精神及び範囲内で様々な変更や修正を加えることができることはこの詳細な説明から当業者に明瞭に理解されるであろうから、こうした詳細な説明及び具体例は、本発明の好ましい実施態様を示すものではあるが、もっぱら例証として示されるものであることは理解されよう。
【００２１】
本願の全体を通じて、種々の特許、刊行物及び文献について触れている。こうした特許、刊行物及び文献については、あたかも個別に触れられているかのようにして、それらの全体が本明細書に参考として援用されている。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１Ａは、可溶性及び完全長ｈＶＥＧＦＲ１の両者をコードしているｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡを形質移入したＨＵＶＥＣ細胞における可溶性ｈＶＥＧＦＲ１蛋白質のノックダウンを示す棒グラフである。ＨＵＶＥＣ細胞では、可溶性及び完全長膜結合型ｈＶＥＧＦＲ１をコードしているｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡ（表４の１乃至１９、ｈＶＥＧＦＲ１−２５−１乃至ｈＶＥＧＦＲ１−２５−１９ｓｉＲＮＡに対応）は、細胞培養上清中の可溶性ｈＶＥＧＦＲ１蛋白質のレベルを著しく低下させた。ＨＵＶＥＣ細胞には、２０ｎＭのｓｉＲＮＡを形質移入し、移入後４８時間に、市販のｈＶＥＧＦＲ１ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ社）を用いて培地中のｈＶＥＧＦＲ１蛋白質の濃度をアッセイした。１乃至１９：表４のｈＶＥＧＦＲ１−２５−１乃至ｈＶＥＧＦＲ１−２５−１９ｓｉＲＮＡ、Ｍｏｃｋ：擬似的形質移入、Ｃｔｒｏｌ：陰性対照ｓｉＲＮＡ。データは平均値±標準偏差として示した。
【００２３】
図１Ｂは、可溶性及び完全長ｈＶＥＧＦＲ１の両者をコードしているｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡを形質移入したＨＵＶＥＣ細胞における全ｈＶＥＧＦＲ１蛋白質のノックダウンを示す棒グラフである。
ＨＵＶＥＣ細胞では、可溶性及び完全長膜結合型ｈＶＥＧＦＲ１をコードしているｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡ（表４の１乃至１９、ｈＶＥＧＦＲ１−２５−１乃至ｈＶＥＧＦＲ１−２５−１９ｓｉＲＮＡに対応）は、ＨＵＶＥＣ細胞溶解物中の全ｈＶＥＧＦＲ１蛋白質の濃度を著しく低下させた。ＨＵＶＥＣ細胞には、２０ｎＭのｓｉＲＮＡを形質移入し、移入後４８時間に、市販のｈＶＥＧＦＲ１ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ社）を用いて細胞溶解物中のｈＶＥＧＦＲ１蛋白質の濃度をアッセイした。１乃至１９：表４のｈＶＥＧＦＲ１−２５−１乃至ｈＶＥＧＦＲ１−２５−１９ｓｉＲＮＡ、Ｍｏｃｋ：擬似的形質移入、Ｃｔｒｌ：陰性対照ｓｉＲＮＡ。データは平均値±標準偏差として示した。
【図２】図２Ａは、完全長ｈＶＥＧＦＲ１ｍＲＮＡに特異的なｓｉＲＮＡでＨＵＶＥＣ細胞を処置することでは可溶性ｈＶＥＧＦＲ１蛋白質濃度に対して抑制効果が見られないことを示す棒グラフである。ＨＵＶＥＣ細胞では、完全長膜結合型ｈＶＥＧＦＲ１特異的ｓｉＲＮＡ（表５の２０乃至４８、ｈＶＥＧＦＲ１−２５−２０乃至ｈＶＥＧＦＲ１−２５−４８ｓｉＲＮＡに対応）は、細胞培養上清中の可溶性ｈＶＥＧＦＲ１の濃度に対して抑制効果を示さない。ＨＵＶＥＣ細胞には、２０ｎＭのｓｉＲＮＡを形質移入し、移入後４８時間に、市販のｈＶＥＧＦＲ１ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ社）を用いて培地中のｈＶＥＧＦＲ１蛋白質の濃度をアッセイした。２０乃至４８：表５のｈＶＥＧＦＲ１−２５−２０乃至ｈＶＥＧＦＲ１−２５−４８ｓｉＲＮＡ、Ｍｏｃｋ：擬似的形質移入、Ｃｔｒｌ：陰性対照ｓｉＲＮＡ。データは平均値±標準偏差として示した。図２Ｂは、完全長ｈＶＥＧＦＲ１ｍＲＮＡに特異的なｓｉＲＮＡでＨＵＶＥＣ細胞を処置することでは全ｈＶＥＧＦＲ１蛋白質濃度に対して抑制効果が見られないことを示す棒グラフである。ＨＵＶＥＣ細胞では、完全長膜結合型ｈＶＥＧＦＲ１特異的ｓｉＲＮＡ（表５の２０乃至４８、ｈＶＥＧＦＲ１−２５−２０乃至ｈＶＥＧＦＲ１−２５−４８ｓｉＲＮＡに対応）は、細胞溶解物中の全ｈＶＥＧＦＲの濃度に対して抑制効果を示さない。完全長膜結合型ｈＶＥＧＦＲ１特異的ｓｉＲＮＡは、完全長ｈＶＥＧＦＲ１をコードしているｍＲＮＡをノックダウンする（図６参照）ので、細胞溶解物中に存在する可溶性ｈＶＥＧＦＲ１の産生を刺激すると考えられる。ＨＵＶＥＣ細胞には、２０ｎＭのｓｉＲＮＡを形質移入し、移入後４８時間に、市販のｈＶＥＧＦＲ１ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ社）を用いて細胞溶解物中のｈＶＥＧＦＲ１蛋白質の濃度をアッセイした。２０乃至４８：表５のｈＶＥＧＦＲ１−２５−２０乃至ｈＶＥＧＦＲ１−２５−４８ｓｉＲＮＡ、Ｍｏｃｋ：擬似的形質移入、Ｃｔｒｌ：陰性対照ｓｉＲＮＡ。データは平均値±標準偏差として示した。
【図３】形質移入後４８時間のＨＵＶＥＣ細胞上清における可溶性ｈＶＥＧＦＲ１分泌に対する可溶性及び完全長膜結合型のｈＶＥＧＦＲ１の両者（表４の１乃至１９、ｈＶＥＧＦＲ１−２５−１乃至ｈＶＥＧＦＲ１−２５−１９ｓｉＲＮＡに対応）を標的とするｓｉＲＮＡの効果を膜型のｈＶＥＧＦＲ１（表５の２０乃至４８、ｈＶＥＧＦＲ１−２５−２０乃至ｈＶＥＧＦＲ１−２５−４８ｓｉＲＮＡに対応）のみを標的とするｓｉＲＮＡの効果と比較した棒グラフである。効果は、（擬似的形質移入と比較した）可溶性ｈＶＥＧＦＲ１の％ノックダウンによって表した。
【図４】形質移入後４８時間のＨＵＶＥＣ細胞溶解物において測定したｈＶＥＧＦＲ１発現に対する可溶性及び完全長膜結合型のｈＶＥＧＦＲ１の両者（表４の１乃至１９、ｈＶＥＧＦＲ１−２５−１乃至ｈＶＥＧＦＲ１−２５−１９ｓｉＲＮＡに対応）を標的とするｓｉＲＮＡの効果を膜型のｈＶＥＧＦＲ１（表５の２０乃至４８、ｈＶＥＧＦＲ１−２５−２０乃至ｈＶＥＧＦＲ１−２５−４８ｓｉＲＮＡに対応）のみを標的とするｓｉＲＮＡの効果と比較した棒グラフである。効果は、（擬似的形質移入と比較した）全ｈＶＥＧＦＲ１の％ノックダウンによって表した。
【図５】可溶性及び完全長膜結合型ｈＶＥＧＦＲ１の両者をコードしているｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡを形質移入したＨＵＶＥＣ細胞におけるｈＶＥＧＦＲ１ｍＲＮＡのノックダウンを示す棒グラフである。ＨＵＶＥＣ細胞では、可溶性及び完全長膜結合型ｈＶＥＧＦＲ１をコードしているｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡ（表４の１乃至１９、ｈＶＥＧＦＲ１−２５−１乃至ｈＶＥＧＦＲ１−２５−１９ｓｉＲＮＡに対応）は、完全長ｈＶＥＧＦＲ１ｍＲＮＡ（黒色棒）及び全ｈＶＥＧＦＲ１ｍＲＮＡ（灰色棒）のレベルを著しく低下させた。ＨＵＶＥＣ細胞には、１０ｎＭのｓｉＲＮＡを形質移入し、移入後４８時間に、完全長ｈＶＥＧＦＲ１ｍＲＮＡ（黒色棒）に特異的なプライマーセット又は可溶性及び完全長ｈＶＥＧＦＲ１ｍＲＮＡの両者（灰色棒）に特異的なプライマーセットを使用する定量的ＲＴ−ＰＣＲアッセイ法を用いてｈＶＥＧＦＲ１ｍＲＮＡのレベルをアッセイした。１乃至１９：表４のｈＶＥＧＦＲ１−２５−１乃至ｈＶＥＧＦＲ１−２５−１９ｓｉＲＮＡ、Ｍｏｃｋ：擬似的形質移入、Ｃｔｒｌ：陰性対照ｓｉＲＮＡ。データは平均値±標準偏差として示した。
【図６】完全長特異的ｈＶＥＧＦＲ１ｓｉＲＮＡを形質移入したＨＵＶＥＣ細胞におけるｈＶＥＧＦＲ１ｍＲＮＡのノックダウンを示す棒グラフである。ＨＵＶＥＣ細胞では、完全長膜結合型ｈＶＥＧＦＲ１特異的ｓｉＲＮＡ（表５の２０乃至４８、ｈＶＥＧＦＲ１−２５−２０乃至ｈＶＥＧＦＲ１−２５−４８ｓｉＲＮＡに対応）は、完全長ｈＶＥＧＦＲ１ｍＲＮＡ（黒色棒）のみを著しく低下させ、全ｈＶＥＧＦＲ１ｍＲＮＡ（灰色棒）のレベルに対しては抑制効果を示さなかった。従って、完全長膜結合型ｈＶＥＧＦＲ１特異的ｓｉＲＮＡ（表５の２０乃至４８、ｈＶＥＧＦＲ１−２５−２０乃至ｈＶＥＧＦＲ１−２５−４８ｓｉＲＮＡに対応）は、可溶性ｈＶＥＧＦＲ１ｍＲＮＡの発現を刺激すると考えられる。ＨＵＶＥＣ細胞には、１０ｎＭのｓｉＲＮＡを形質移入し、移入後４８時間に、完全長ｈＶＥＧＦＲ１ｍＲＮＡ（黒色棒）に特異的なプライマーセット又は可溶性及び完全長ｈＶＥＧＦＲ１ｍＲＮＡの両者（灰色棒）に特異的なプライマーセットを使用する定量的ＲＴ−ＰＣＲアッセイ法を用いてｈＶＥＧＦＲ１ｍＲＮＡのレベルをアッセイした。２０乃至４８：表５のｈＶＥＧＦＲ１−２５−２０乃至ｈＶＥＧＦＲ１−２５−４８ｓｉＲＮＡ、Ｍｏｃｋ：擬似的形質移入、Ｃｔｒｌ：陰性対照ｓｉＲＮＡ。データは平均値±標準偏差として示した。
【図７Ａ】ヒトＶＥＧＦＲ１ｍＲＮＡのヌクレオチド配列（ＧｅｎＢａｎｋアセッション番号ＡＦ０６３６５７；配列番号１９７）を示す図である。
【図７Ｂ】ヒトＶＥＧＦＲ１ｍＲＮＡのヌクレオチド配列（ＧｅｎＢａｎｋアセッション番号ＡＦ０６３６５７；配列番号１９７）を示す図である。
【図８】ヒト可溶性ＶＥＧＦＲ１ｍＲＮＡのヌクレオチド配列（ＧｅｎＢａｎｋアセッション番号Ｕ０ｌ１３４；配列番号１９８）を示す図である。
【図９Ａ】マウスＶＥＧＦＲ１ｍＲＮＡのヌクレオチド配列（ＧｅｎＢａｎｋアセッション番号ＮＭ＿０１０２２８．２；配列番号１９９）を示す図である。
【図９Ｂ】マウスＶＥＧＦＲ１ｍＲＮＡのヌクレオチド配列（ＧｅｎＢａｎｋアセッション番号ＮＭ＿０１０２２８．２；配列番号１９９）を示す図である。
【図１０】ＰｏｌｙＴｒａｎ（商標）の構造及び組成を示す概略図である。ＰｏｌｙＴｒａｎ（商標）は、合成生分解性カチオン性分岐ポリペプチドである。この陽性荷電ＰｏｌｙＴｒａｎ（商標）ポリペプチドは、陰性荷電ｓｉＲＮＡの担体及びコンデンサとしての機能を果たす。「Ｒ」は配列番号２０５として開示されている。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明は、血管の異常又は過剰な増殖及び成長を示すことが多い望ましくない新生血管形成（ＮＶ）又は血管形成を有する疾患の処置のための組成物及び方法を提供する。ＮＶは正常な生物学的過程でもあるので、望ましくないＮＶの阻害は病的組織に対して選択的に遂行されることが好ましいが、このことは、好ましくは標的化ナノ粒子を用いて治療用分子をその病的組織に選択的に送達することを必要とする。本発明は、ＶＥＧＦ経路遺伝子の発現阻害を初めとするＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を誘導する核酸分子によるＶＥＧＦ生化学経路の選択的阻害及び病的血管形成組織に限定された阻害によって血管形成を制御する組成物及び方法を提供する。一実施態様において、本発明は、ＶＥＧＦＲ１遺伝子発現を阻害する核酸分子を提供する。また、本発明は、ポリマー結合体を含み、さらにＲＮＡｉを誘導する核酸分子を含む合成核酸送達媒体を用いる組成物及び方法をも提供する。
【００２５】
本発明についてここに詳細に説明するが、当業者であれば本発明を最大限理解されよう。
【００２６】
定義
本明細書に用いている「オリゴヌクレオチド」及びこれに基づいた同様な用語は、天然ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド及び非天然の合成又は修飾ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドのことを指す。オリゴヌクレオチドの長さは、１０ヌクレオチド長以上、又は１５もしくは１６もしくは１７もしくは１８もしくは１９もしくは２０ヌクレオチド長以上、又は２１もしくは２２もしくは２３もしくは２４ヌクレオチド長以上、又は２５もしくは２６もしくは２７もしくは２８もしくは２９もしくは３０ヌクレオチド長以上、３５以上、４０以上、４５以上、最大約５０ヌクレオチド長とすることができる。
【００２７】
ｓｉＲＮＡであるオリゴヌクレオチドは、１５乃至３０ヌクレオチドの間の任意のヌクレオチド数を有することができる。多くの実施態様では、ｓｉＲＮＡは１９乃至２７ヌクレオチドの間の任意のヌクレオチド数を有することができる。
【００２８】
「アンチセンス鎖」という用語は、発現低下の標的とする遺伝子のｍＲＮＡ配列の約１０乃至５０個のヌクレオチド（例えば、約１５乃至３０、１６乃至２５、１７乃至２４、１８乃至２３又は１９乃至２２個のヌクレオチド）の区域と実質的に相補性である核酸鎖のことを指す。アンチセンス鎖（又は第１の鎖）は、標的とするｍＲＮＡ配列と十分な相補性を有することによりＲＮＡｉプロセスによって標的ｍＲＮＡの破壊を誘導する。「センス鎖」又は「第２の鎖」とは、「アンチセンス鎖」又は「第１の鎖」と実質的に相補性である核酸鎖のことを指す。
【００２９】
「ＶＥＧＦ」という用語は、特に明記した場合又は文脈から明らかである場合を除き、全ＶＥＧＦのことを指す。
【００３０】
ＶＥＧＦＲ１遺伝子の調節のための核酸分子
本発明は、ＲＮＡｉによりＶＥＧＦＲ１遺伝子の発現を標的として調節するための核酸分子を提供する。このＶＥＧＦＲ１遺伝子を標的とする本発明の例示的なｓｉＲＮＡ配列を表１乃至５に示した。（表１乃至５に列挙した全ての配列について、「開始」位置は、ＡＴＧコドンの「Ａ」が位置１であるとみなされるように表記されている。）
一実施態様において、本発明は、全又は完全長（「膜結合型」とも称する）ＶＥＧＦＲ１ｍＲＮＡ又は蛋白質レベルの低下（「ノックダウン」とも称する）をもたらす核酸分子であって、その低下がこの核酸分子の非存在下の発現レベルに対して少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％，８５％、９０％，９５、９６、９７、９８、９９又は１００％である核酸分子を提供する。別の実施態様では、本発明の核酸分子は可溶性ＶＥＧＦＲ１ｍＲＮＡ又は蛋白質の発現レベルを増加させることができる。可溶性ＶＥＧＦＲ１ｍＲＮＡ又は蛋白質の発現レベルの増加は、この核酸分子の非存在下の発現レベルに対して、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍とすることができる。本発明の核酸分子は、ＶＥＧＦＲ１蛋白質の発現を約５０ｐｇ／μｇ、約４０ｐｇ／μｇ、約３０ｐｇ／μｇ、約２０ｐｇ／μｇ、約１５ｐｇ／μｇ、約１０ｐｇ／μｇ、約７．５ｐｇ／μｇ、約５ｐｇ／μｇ、約２．５ｐｇ／μｇ、約１ｐｇ／μｇ又は約０．５ｐｇ／μｇに低下させることができる。
【００３１】
本発明の一実施態様では、この核酸分子は、完全長ＶＥＧＦＲ１ｍＲＮＡ又は蛋白質の発現レベルを低下させながら、可溶性ＶＥＧＦＲ１ｍＲＮＡ又は蛋白質の発現レベルには影響を与えない。本発明の別の実施態様では、この核酸分子は、全ＶＥＧＦＲ１ｍＲＮＡ又は蛋白質の発現レベルを増加させると同時に、可溶性ＶＥＧＦＲ１ｍＲＮＡ又は蛋白質の発現レベルを増加させる。本発明の別の実施態様では、この核酸分子は、全ＶＥＧＦＲ１ｍＲＮＡ又は蛋白質の発現レベルを低下させながら、可溶性ＶＥＧＦＲ１ｍＲＮＡ又は蛋白質の発現レベルを増加させる。好ましい実施態様では、この核酸分子は、完全長ＶＥＧＦＲ１ｍＲＮＡ又は蛋白質の発現レベルを低下させながら、可溶性ＶＥＧＦＲ１ｍＲＮＡ又は蛋白質の発現レベルを増加させる。
【００３２】
全、完全長及び／又は可溶性ＶＥＧＦＲ１の調節は、この核酸分子の投与の最大２４時間後、最大３６時間後、最大４８時間後、最大６０時間後、最大７２時間後、最大９６時間後又はそれより後に生じさせることができる。特定の実施態様では、この遺伝子発現の調節をもたらす核酸分子は、３０ｎＭ、２５ｎＭ、２０ｎＭ、１５ｎＭ、１２ｎＭ、１０ｎＭ、７．５ｎＭ、５ｎＭ、２ｎＭ、１ｎＭ、０．７５ｎＭ、０．５ｎＭ又は０．２ｎＭの量を投与することができる。
【００３３】
本発明の核酸分子はｄｓＲＮＡであってもｓｓＲＮＡであってもよい。本発明の好ましい実施態様では、この核酸分子はｓｉＲＮＡである。この核酸分子は、１５乃至５０、１５乃至３０、１９乃至２７、１９、２０、２１、２２、２３、２４又は２５個のヌクレオチドを含むことができる。この核酸分子は、１０個以上のヌクレオチド、又は１５もしくは１６もしくは１７もしくは１８もしくは１９もしくは２０個以上のヌクレオチド、又は２１もしくは２２もしくは２３もしくは２４個以上のヌクレオチド、又は２５もしくは２６もしくは２７もしくは２８もしくは２９もしくは３０以上のヌクレオチド、３５個以上、４０個以上、４５個以上又は５０個以上のヌクレオチドを含むことができる。
【００３４】
この核酸分子は、５’−又は３’−一本鎖オーバーハングを含むことができる。この核酸分子は、２つの平滑末端又は２つの粘着末端又は１つの平滑末端と１つの粘着末端を有することができる。粘着末端の一本鎖オーバーハングヌクレオチドは１個乃至４個以上の範囲とすることができる。特定の実施態様では、この核酸分子は平滑末端を有する。好ましい実施態様では、この核酸分子は、平滑末端を有するヌクレオチド２５個の二本鎖ｓｉＲＮＡである。
【００３５】
一部の実施態様では、本発明の核酸分子は、ヒトｍＲＮＡと、これと相同又は類似の、霊長類、マウス、ラットなどの他の非ヒト哺乳動物種のｍＲＮＡとのいずれをも標的とする。
【００３６】
一実施態様において、本発明は、ＶＥＧＦＲ１を標的にするためのアンチセンス核酸分子であって、このアンチセンス核酸が配列番号１２９乃至１９６からなる群から選ばれるセンス鎖に対して相補性である配列を含むアンチセンス核酸分子を提供する。別の実施態様では、本発明は、ＶＥＧＦＲ１を標的にするためのアンチセンス核酸分子であって、このアンチセンス核酸が配列番号２４、４９、５０、５１、８４、８５、８６、８８、８９、１００、１０４、１０５、１８４、１８６、１８８、１９２、１９３、１９４及び１９６からなる群から選ばれるヌクレオチド配列を含むＶＥＧＦＲ１ｍＲＮＡ内のヌクレオチド配列を標的にするアンチセンス核酸分子を提供する。
【００３７】
【表１−１】
【００３８】
【表１−２】
【００３９】
【表１−３】
【００４０】
【表２−１】
【００４１】
【表２−２】
【００４２】
【表２−３】
【００４３】
【表３】
本発明のＲＮＡｉ誘導核酸分子、特にｓｉＲＮＡなどの二本鎖核酸分子の有効性は、米国特許出願公開第２００５／０１８６５８６号、同第２００５／０１８１３８２号、同第２００５／００３７９８８号及び同第２００６／０１３４７８７号（これらの全体が本明細書に参考として援用されている）に開示されている方法によって改善することができる。「ガイド鎖」とは、ＲＩＳＣに入り、標的ｍＲＮＡの分解を誘導するＲＮＡｉ物質の鎖である。ガイド鎖としての機能を果たす際のこのｓｉＲＮＡ分子の有効性は、この分子の非対称性を強めることによって向上させることができる。つまり、ＲＮＡｉにおいてガイド鎖としての機能を果たすｓｉＲＮＡ分子の能力は、二重鎖の第１鎖の５’末端と第２鎖の３’末端との間の塩基対強度を第１鎖の３’末端と第２鎖の５’末端との間の塩基対強度に比し低下させることにより強めることができる。本発明の一実施態様において、ＲＮＡｉにおいてガイド鎖としての機能を果たすｓｉＲＮＡ分子の能力は、アンチセンス鎖の５’末端とセンス鎖の３’末端との間の塩基対強度をアンチセンス鎖の３’末端とセンス鎖の５’末端との間の塩基対強度に比し低下させることにより強めることができる。
【００４４】
塩基対強度は、Ｇ：Ｃ塩基対の数を減らすか、ミスマッチ塩基対を１つ以上挿入することによって低下させることができる。ミスマッチ塩基対の例としては、Ｇ：Ａ、Ｃ：Ａ、Ｃ：Ｕ、Ｇ：Ｇ、Ａ：Ａ、Ｃ：Ｃ、Ｕ：Ｕ、Ｃ：Ｔ及びＵ：Ｔが挙げられる。第１又はアンチセンス鎖の５’末端と第２又はセンス鎖の３’末端との間にＧ：Ｕ又はＧ：Ｔなどのゆらぎ塩基対を挿入しても塩基対強度は低下する。本発明の一実施態様では、これらの方法の１つ以上を組み合わせて塩基対強度を低下させ、本発明のｓｉＲＮＡ分子の有効性を増大させる。
【００４５】
特定の実施態様では、イノシン、１−メチルイノシン、プソイドウリジン、５，６−ジヒドロウリジン、リボチミジン、２Ｎ−メチルグアノシン、２，２Ｎ，Ｎ−ジメチルグアノシンなどの希有ヌクレオチド又は２−アミノ−Ｇ、２−アミノ−Ａ、２，６−ジアミノ−Ｇ、２，６−ジアミノ−Ａなどの修飾ヌクレオチドを含む少なくとも１つの塩基対の組込みによって塩基対強度を低下させる。
【００４６】
化学修飾
化学修飾は、核酸分子の安定性を増大させ、又はサイトカインの産生を低下させるのに、本発明の一部の実施態様において有用となる場合がある。ＲＮＡ、ＤＮＡ、ＬＮＡ及びＲＮＡキメラオリゴヌクレオチドの２’−Ｏ−メチルリボース類似体及び他の核酸オリゴヌクレオチドの化学的類似体などの非天然の化学的類似体の組込みは、考えられる化学修飾の１つのタイプである。また、考えられる修飾としては、５’及び／又は３’末端におけるフランキング配列の付加；バックボーンにおけるホスホジエステル結合ではなくホスホロチオエート、メチルホスホネート、スルホン、サルフェート、ケチル、ホスホロジチオエート、ホスホラミデート、リン酸エステルもしくは２’Ｏ−メチル結合の使用；及び／又は特殊な塩基並びにアデニン、シチジン、グアニン、チミン及びウリジンのアセチル、メチル、チオその他を含む修飾体の採用も挙げられる。核酸中に導入することができる特殊な核酸塩基としては、例えば、イノシン、プリン、ピリジン−４−オン、ピリジン−２−オン、フェニル、シュードウラシル、２，４，６−トリメトキシベンゼン、３−メチルウラシル、ジヒドロウリジン、ナフチル、アミノフェニル、５−アルキルシチジン類（例えば、５−メチルシチジン）、５−アルキルウリジン類（例えば、リボチミジン）、５−ハロウリジン類（例えば、５−ブロモウリジン）もしくは６−アザピリミジン類もしくは６−アルキルピリミジン類（例えば、６−メチルウリジン）、プロピン、ケソシン、２−チオウリジン、４−チオウリジン、ワイブトシン、ワイブトキソシン、４−アセチルチジン（４−ａｃｅｔｙｌｔｉｄｉｎｅ）、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジン、５’−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウリジン、ベータ−Ｄ−ガラクトシルキュエオシン、１−メチルアデノシン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアノシン、３−メチルシチジン、２−メチルアデノシン、２−メチルグアノシン、Ｎ６−メチルアデノシン、７−メチルグアノシン、５−メトキシアミノメチル−２−チオウリジン、５−メチルアミノメチルウリジン、５−メチルカルボニフネチルウリジン、５−メチルオキシウリジン、５−メチル−２−チオウリジン、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンタニルアデノシン、ベータ−Ｄ−マンノシルキュエオシン、ウリジン−５−オキシ酢酸、２−チオシチジン、スレオニン誘導体などが挙げられる（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ、２００７年；１５：ｐ．１６６３−１６６９参照、これの全体が本明細書に参考として援用されている）。これらのポリヌクレオチド変異体は、その核酸分子の活性が実質的には低下しないように修飾することができる。
【００４７】
特定の実施態様では、本発明のオリゴヌクレオチドは、米国特許第５，６２３，０６５号、同第５，８５６，４５５号、同第５，９５５，５８９号、同第６，１４６，８２９号及び同第６，３２６，１９９号（これらの全体が本明細書に参考として援用されている）に開示されているような２’−Ｏ−置換オリゴヌクレオチド類とすることができ、これらのオリゴヌクレオチド類では、相補性標的鎖へのこのオリゴヌクレオチドの結合を、この標的鎖を破壊するＲＮａｓｅＨ活性の発現を可能にしながら、強化するために、オリゴヌクレオチド内に２’置換ヌクレオチドが導入されている。Ｓｐｒｏａｔ、Ｂ．Ｓ．ほか、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９９０年；１８：ｐ．４１（これの全体が本明細書に参考として援用されている）をも参照されたい。２’−Ｏ−メチル及びエチルヌクレオチドを含む核酸分子類も本発明に包含される。
【００４８】
いくつかのグループが他の２’−Ｏ−アルキルグアノシン類の作製について教示している。Ｇｌａｄｋａｙａほか、Ｋｈｉｍ．Ｐｒｉｒ．Ｓｏｅｄｉｎ．、１９８９年；４：ｐ．５６８（これの全体が本明細書に参考として援用されている）にはＮ１−メチル−２’−Ｏ−（テトラヒドロピラン−２−イル）及び２’−Ｏ−メチルグアノシンが開示されており、Ｈａｎｓｓｋｅほか、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、１９８４年；４０：ｐ．１２５（これの全体が本明細書に参考として援用されている）には２’−Ｏメチルチオメチルグアノシンが開示されている。２，６−ジアミノプリンリボシドの２’−Ｏ−メチルチオメチル誘導体も報告されている。Ｓｐｒｏａｔ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９９１年；１９：ｐ．７３３（これの全体が本明細書に参考として援用されている）では２’−Ｏ−アリル−グアノシンの作製について教示されている。Ｉｒｉｂａｒｒｅｎほか、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、１９９０年；８７：ｐ．７７４７（これの全体が本明細書に参考として援用されている）では２’−Ｏ−アリルオリゴヌクレオチドも検討された。特定の実施態様では、本発明の核酸分子類は２’−Ｏ−メチル、−２’−Ｏ−アリル−及び２’−Ｏ−ジメチルアリル−置換ヌクレオチドを含む。
【００４９】
特定の実施態様では、オリゴヌクレオチドのヌクレオチドのうちの少なくとも１つの２’−デオキシリボフラノシル部分の少なくとも１つを修飾する。ハロ、アルコキシ、アミノアルコキシ、アルキル、アジド又はアミノ基を付加することができる。例えば、Ｆ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＯＣＮ、Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、ＳＭｅ、ＳＯ２Ｍｅ、ＯＮＯ２、ＮＯ２、ＮＨ３、ＮＨ２、ＮＨ−アルキル、ＯＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２（アリルオキシ）、ＯＣＨ３＝ＣＨ２、ＯＣＣＨ（但し、アルキルは炭素鎖内に不飽和を有するＣ１乃至Ｃ２０の直鎖又は分岐鎖である）。国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９１／００２４３号、米国特許出願第４６３，３５８号及び米国特許出願第５６６，９７７号には、例えば、オリゴヌクレオチドのヌクレオチド上の２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−エチル、２’−Ｏ−プロピル、２’−Ｏ−アリル、２’−Ｏ−アミノアルキル又は２’−デオキシ−２’−フルオロ基がオリゴヌクレオチドのハイブリッド形成性を向上させることが開示されている。本発明の核酸分子は、ホスホロチオエートバックボーン又は２’−Ｏ-−Ｃ１Ｃ２０−アルキル（例えば、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−エチル、２’−Ｏ−プロピル）、２’−Ｏ-−Ｃ２Ｃ２０−アルケニル（例えば、２’−Ｏ−アリル）、２’−Ｏ-−Ｃ２Ｃ２０−アルキニル、２’−Ｓ-−Ｃ１Ｃ２０−アルキル、２’−Ｓ-−Ｃ２Ｃ２０−アルケニル、２’−Ｓ-−Ｃ２Ｃ２０−アルキニル、２−’ＮＨ−−Ｃ１Ｃ２０−アルキル（２’−Ｏ−アミノアルキル）、２’−ＮＨ-−Ｃ２Ｃ２０−アルケニル、２’−ＮＨ-−Ｃ２Ｃ２０−アルキニルもしくは２’−デオキシ−２’−フルオロ基又はこれらの両方をさらに含むように拡大して安定性を増大させることができる。例えば、米国特許第５，５０６，３５１号（これの全体が本明細書に参考として援用されている）を参照されたい。
【００５０】
例示的な修飾ヌクレオチドは、米国特許第７，１０１，９９３号、同第７，０５６，８９６号、同第６，９１１，５４０号、同第７，０１５，３１５号、同第５，８７２，２３２及び号、同第５，５８７，４６９号（これらの全体が本明細書に参考として援用されている）に見出すことができる。
【００５１】
ＶＥＧＦ経路遺伝子の複合調節
本発明の一態様では、ＶＥＧＦＲ１及び複数の他のＶＥＧＦ経路遺伝子の特異的及び選択的阻害を達成し、その結果、ＮＶ疾患を阻止してより良好な臨床的有益性が得られるように、ｓｉＲＮＡ類などのアンチセンス核酸分子類を併用する。本発明は、ＶＥＧＦＲ１とＶＥＧＦ又はＶＥＧＦＲ２との組合せを初めとするｓｉＲＮＡ標的類の複数の組合せを提供する。ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ１及びＶＥＧＦＲ２のｍＲＮＡを標的にする例示的なｓｉＲＮＡ配列類を表１乃至５及び表７乃至１１に記載した。一実施態様では、本発明は、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ１及びＶＥＧＦＲ２を標的にするｓｉＲＮＡ類の併用を提供する。また、本発明は、ＶＥＧＦ経路中の同じ遺伝子内の１種以上の配列を標的にするｓｉＲＮＡ類の併用も提供する。
【００５２】
本発明の別の実施態様は、ＶＥＧＦＲ１、並びにＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ２、ＰＤＧＦとその受容体、ＥＧＦとその受容体、ＲＡＦとＡＫＴを含む下流シグナル伝達因子及びＮＦκＢを含む転写因子からなる群から選ばれる１種以上の遺伝子を標的にするｓｉＲＮＡの併用である。ＰＤＧＦＲ及びＥＧＦＲを標的にする例示的なｓｉＲＮＡ配列は、米国特許出願公開第２００８／０２２００２７号及び同第２００８／０１５３７７１号並びに国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００８／００７６７２号（これらの全体が本明細書に参考として援用されている）に見出すことができる。本発明のさらに別の実施態様は、ＶＥＧＦとその受容体群及びこれらの下流遺伝子を阻害するｓｉＲＮＡの併用である。
【００５３】
本発明の核酸分子類は、ＮＶ関連疾患の処置のための治療剤として併用することができる。本発明の一実施態様では、これらをカクテルとして混合することができ、別の実施態様では、これらを同じ経路で、又は異なる経路及び製剤で順次投与することができ、さらに別の実施態様では、一部をカクテルとして投与し、一部を順次的に投与することができる。一実施態様では、複数のｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチド類をナノ粒子製剤などの単一製剤として製剤化することができる。ＮＶ関連疾患の処置を達成するための核酸分子類の他の併用及びこうした併用の方法については、当業者には理解されよう。
【００５４】
治療的使用方法
また、本発明は、対象における血管形成又はＮＶ関連疾患の処置方法をも提供する。一部の実施態様において、本発明は、ＶＥＧＦＲ１を標的にすることにより全ＶＥＧＦＲ１の発現を減少させるｓｉＲＮＡ分子を対象に投与することを含む、望ましくない血管形成を伴う疾患又は症状に罹患している対象の処置方法を提供する。別の実施態様では、本発明は、ＶＥＧＦＲ１を標的にすることにより完全長ＶＥＧＦＲ１の発現を減少させるが、可溶性ＶＥＧＦＲ１の発現に対しては影響しないか、増加させないｓｉＲＮＡ分子を対象に投与することを含む、望ましくない血管形成を伴う疾患又は症状に罹患している対象の処置方法を提供する。本発明の一態様において、このようなｓｉＲＮＡ分子は、配列番号２４、２５、４３、４９、５０、５１、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、１００、１０４、１０５、１７３、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８６、１８７、１８８、１９２、１９３、１９４及び１９６からなる群から選ばれるセンス鎖に対して補性であるヌクレオチド配列を含む。好ましい実施態様では、本発明は、ＶＥＧＦＲ１を標的にすることにより完全長ＶＥＧＦＲ１の発現を減少させるが、可溶性ＶＥＧＦＲ１の発現を増加させるｓｉＲＮＡ分子を対象に投与することを含む、望ましくない血管形成を伴う疾患又は症状に罹患している対象の処置方法を提供する。この実施態様では、このようなｓｉＲＮＡ分子は、配列番号２４、４９、５０、５１、８４、８５、８６、８８、８９、１００、１０４、１０５、１８４、１８６、１８８、１９２、１９３、１９４及び１９６からなる群から選ばれるセンス鎖に対して相補性であるヌクレオチド配列を含む。
【００５５】
一部の実施態様において、本発明は、ＶＥＧＦＲ１及びＶＥＧＦの発現が減少するようにＶＥＧＦＲ１を標的にするｓｉＲＮＡ分子及びＶＥＧＦを標的にするｓｉＲＮＡ分子を対象に投与することを含む、望ましくない血管形成を伴う疾患又は症状に罹患している対象の処置方法を提供する。一部の実施態様では、本発明は、ＶＥＧＦＲ１及びＶＥＧＦＲ２の発現が減少するようにＶＥＧＦＲ１を標的にするｓｉＲＮＡ分子及びＶＥＧＦＲ２を標的にするｓｉＲＮＡ分子を対象に投与することを含む、望ましくない血管形成を伴う疾患又は症状に罹患している対象の処置方法を提供する。別の実施態様では、本発明は、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦ及びＶＥＧＦＲ２の発現が減少するようにＶＥＧＦＲ１を標的にするｓｉＲＮＡ分子、ＶＥＧＦを標的にするｓｉＲＮＡ分子及びＶＥＧＦＲ２を標的にするｓｉＲＮＡ分子を対象に投与することを含む、望ましくない血管形成を伴う疾患又は症状に罹患している対象の処置方法を提供する。
【００５６】
また、本発明は、対象における癌、眼疾患、関節炎及び炎症性疾患を含む血管形成又はＮＶ関連疾患の処置方法をも提供する。こうした血管形成関連疾患としては、乳癌、卵巣癌、胃癌、子宮内膜癌、唾液腺癌、肺癌、腎癌、結腸癌、結腸直腸癌、食道癌、甲状腺癌、膵癌、前立腺癌、膀胱癌などの癌及び黒色腫、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、神経膠腫、肝細胞（肝臓）癌、肉腫、頭頸部癌、中皮腫、胆道癌（胆管癌）、小腸腺癌、小児悪性腫瘍、膠芽細胞腫などの他の腫瘍性疾患が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００５７】
こうした分子に拮抗させることが、病態生理学的過程を抑制し、それによって種々の血管形成依存性疾患の有効な治療法となる。固形腫瘍及びその転移の他に、白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫などの血液悪性腫瘍も血管形成依存性である。過剰な血管増殖は多数の非腫瘍性疾患の一因となっている。こうした非腫瘍性血管形成依存性疾患としては、アテローム性動脈硬化、血管腫、血管内皮腫、血管線維腫、血管奇形（例えば、遺伝性出血性毛細血管拡張（ＨＨＴ：Ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ Ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ Ｔｅｌｅａｎｇｉｅｃｔａｓｉａ）もしくはＯｓｌｅｒ−Ｗｅｂｅｒ症候群）、疣贅、化膿性肉芽腫、多毛症、カポジ肉腫、瘢痕ケロイド、アレルギー性浮腫、乾癬、不正子宮出血、濾胞性嚢胞、卵巣過刺激、子宮内膜症、呼吸窮迫症、腹水症、透析患者の腹膜硬化症、腹部手術後の癒着形成、肥満症、関節リウマチ、滑膜炎、骨髄炎、パンヌス増殖、骨棘、血友病性関節、炎症性及び感染性過程（例えば、肝炎、肺炎、糸球体腎炎）、喘息、鼻ポリープ、肝再生、肺高血圧症、未熟児網膜症、糖尿病性網膜症、加齢性黄斑変性、白質軟化症、血管新生緑内障、角膜移植片血管新生、トラコーマ、甲状腺炎、甲状腺腫脹及びリンパ増殖症候群が挙げられる。
【００５８】
本発明の一実施態様において、処置される対象はヒトである。
【００５９】
組成物及び投与方法
別の態様において、本発明は、本発明の、ｓｉＲＮＡを初めとする核酸分子を含む組成物を提供する。この組成物のｓｉＲＮＡは、ＶＥＧＦ経路、特にＶＥＧＦＲ１遺伝子からのｍＲＮＡを標的にすることができる。こうした組成物は、この核酸分子及び医薬用として許容可能な担体、例えば、生理食塩水もしくは緩衝生理食塩水を含むことができる。
【００６０】
特定の実施態様において、本発明は、「剥き出しの」核酸分子又は核酸送達用媒体に含ませた核酸分子を提供する。核酸送達用媒体を含む実施態様では、この媒体はウイルスベクターなどの天然のベクター又はリポソーム、ポリリジンもしくはカチオン性ポリマーのような合成ベクターとすることができる。一実施態様において、組成物は本発明のｓｉＲＮＡ及びカチオン性ポリマーなどの複合体形成剤を含むことができる。また、この組成物は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの親水性ポリマーを含むこともできる。カチオン性ポリマーは、ヒスチジン−リジン（ＨＫ）コポリマー又はポリエチレンイミンとすることができる。
【００６１】
特定の実施態様において、カチオン性ポリマーはＨＫコポリマーである。特定の実施態様において、このＨＫコポリマーは、ポリヒスチジン、ポリリジン、ヒスチジン及び／又はリジンの任意の適切な組合せから合成する。特定の実施態様において、ＨＫコポリマーは線状である。特定の実施態様において、ＨＫコポリマーは分岐状である。
【００６２】
特定の好ましい実施態様において、この分岐状ＨＫコポリマーはポリペプチドバックボーンを含む。このポリペプチドバックボーンは１乃至１０個のアミノ酸残基、好ましくは２乃至５個のアミノ酸残基を含むことができる。
【００６３】
特定の実施態様において、このポリペプチドバックボーンはリジンアミノ酸残基からなる。
【００６４】
特定の実施態様において、分岐状ＨＫコポリマーの分岐の数はバックボーンアミノ酸残基の数プラス１である。特定の実施態様において、この分岐状ＨＫコポリマーは１乃至１１個の分岐を含む。特定の好ましい実施態様では、この分岐状ＨＫコポリマーは２乃至５個の分岐を含む。特定のより好ましい実施態様では、この分岐状ＨＫコポリマーは４個の分岐を含む。
【００６５】
一部の実施態様では、この分岐状ＨＫコポリマーの分岐は１０乃至１００個のアミノ酸残基を含む。特定の好ましい実施態様では、この分岐は１０乃至５０個のアミノ酸残基を含む。特定のより好ましい実施態様では、この分岐は１５乃至２５個のアミノ酸残基を含む。特定の実施態様では、この分岐状ＨＫコポリマーの分岐は、５個のアミノ酸残基のサブセグメント毎に少なくとも３個のヒスチジンアミノ酸残基を含む。特定の他の実施態様において、この分岐は４個のアミノ酸残基のサブセグメント毎に少なくとも３個のヒスチジンアミノ酸残基を含む。特定の他の実施態様において、この分岐は３個のアミノ酸残基のサブセグメント毎に少なくとも２個のヒスチジンアミノ酸残基を含む。特定の他の実施態様では、この分岐は２個のアミノ酸残基のサブセグメント毎に少なくとも１個のヒスチジンアミノ酸残基を含む。
【００６６】
特定の実施態様において、このＨＫコポリマーの分岐の少なくとも５０％は、配列ＫＨＨＨ（配列番号２００）の単位を含む。特定の好ましい実施態様では、この分岐の少なくとも７５％は、配列ＫＨＨＨ（配列番号２００）の単位を含む。
【００６７】
特定の実施態様において、このＨＫコポリマーの分岐は、ヒスチジン又はリジン以外のアミノ酸を含む。特定の好ましい実施態様では、この分岐は、システインアミノ酸残基を含み、この場合、このシステインはＮ末端アミノ酸残基である。
【００６８】
特定の実施態様において、上記ＨＫコポリマーは構造（ＫＨＨＨＫＨＨＨＫＨＨＨＨＫＨＨＨＫ）４−ＫＫＫ（配列番号２０１）を有する。特定の他の実施態様では、このＨＫコポリマーは構造（ＣＫＨＨＨＫＨＨＨＫＨＨＨＨＫＨＨＨＫ）４−ＫＫＫ（配列番号２０２）を有する。
【００６９】
好ましい実施態様では、このＨＫコポリマーはＰｏｌｙＴｒａｎ（商標）であり、図１０に示した構造を有する。
【００７０】
ＨＫコポリマーのいくつかの適切な例は、例えば、米国特許第６，６９２，９１１号、同第７，０７０，８０７号及び同第７，１６３，６９５号（これらの全体が本明細書に参考として援用されている）に見出すことができる。
【００７１】
一実施態様において、本発明の組成物は本発明のｓｉＲＮＡ及びナノ粒子を作製するのに用いる複合体形成剤を含むことができる。このナノ粒子は、任意選択的に立体ポリマー及び／又は標的化部分を含むことができる。この標的化部分はペプチド、抗体又は抗原結合部分とすることができる。この標的化部分は、配列Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）を含むペプチドなどの、血管内皮細胞を標的にする手段としての機能を果たすことができる。このようなペプチドは環状又は線状とすることができる。一実施態様において、このペプチドはＲＧＤＦＫ（配列番号２０３）である。特定の実施態様では、このペプチドは、シクロ（ＲＧＤ−Ｄ−ＦＫ（配列番号２０４））である。別の実施態様では、このペプチドはＡＣＲＧＤＭＦＧＣＡ（配列番号１２）である。
【００７２】
本発明の核酸分子、組成物及び治療法は、単独で用いることができ、或いは他の治療剤及び標的治療法を含む治療法、並びにモノクロナール抗体、低分子阻害剤などのＶＥＧＦ経路アンタゴニスト及びＥＧＦとその受容体、ＰＤＧＦとその受容体又はＭＥＫもしくはＢｃｒ−Ａｂｌを阻害する標的治療法及びＥＧＦＲ阻害剤ＶＥＣＴＩＢＩＸ（登録商標）（パニツムマブ）及びＴＡＲＣＥＶＡ（登録商標）（エルロチニブ）、Ｈｅｒ−２−標的療法剤ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）（トラスツズマブ）もしくはＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）（ベバシズマブ）、ＳＵＴＥＮＴ（登録商標）（リンゴ酸スニチニブ）などの抗血管形成薬などの他の免疫療法及び化学療法剤を含む他の治療剤及び治療法と併用することができる。また、上記核酸分子、組成物及び方法は、放射線、レーザー療法、手術などを含む他の処置法と治療的に併用することができる。
【００７３】
本発明の核酸及び組成物の投与方法は当業者に周知である。投与は、静脈内、腹腔内、筋肉内、腔内、皮下、皮膚又は経皮投与とすることができる。一実施態様では、投与は全身性投与とすることができる。別の実施態様では、投与は局所投与とすることができる。例えば、本発明の核酸分子は、腫瘍組織中に直接注射により、また血管形成組織もしくは望ましくない新脈管構造を有する組織中もしくは近傍に直接、送達することができる。特定の用途では、こうした核酸分子及び組成物は電界を加えることにより投与することができる。特定の実施態様では、本発明は「剥き出しの」ｓｉＲＮＡの投与を提供する。
【００７４】
全身性投与を含む、本発明の核酸、核酸送達媒体及び組成物の投与を試験するための例示的な動物モデルについては国際公開第０８／４５５７６号並びに米国特許出願公開第２００８／０２２００２７号及び同第２００８／０１５３７７１号（これらの全体が本明細書に参考として援用されている）に見出すことができる。
【００７５】
ＶＥＧＦ経路遺伝子の発現を調節する核酸分子を含むナノ粒子の調製
本発明の一実施態様では、ｓｉＲＮＡを含む抗ＶＥＧＦ経路核酸分子のナノ粒子調製のための組成物及び方法を提供する。こうしたナノ粒子はヒスチジン−リジンコポリマー、ポリエチレングリコール又はポリエチレンイミンのうちの１種以上を含むことができる。本発明の一実施態様では、ＲＧＤ媒介リガンド誘導性ナノ粒子を調製することができる。ｓｉＲＮＡを含むＲＧＤ媒介組織標的化ナノ粒子の１つの製造方法では、標的化リガンドＲＧＤ含有ペプチドをポリエチレングリコール又は類似の性質を有する他のポリマーなどの立体ポリマーに結合させる。このリガンド−立体ポリマー結合体を、ポリエチレンイミンなどのポリカチオン又はヒスチジン−リジンコポリマーなどの他の有効な材料にさらに結合させる。この結合は共有結合によるものでも非共有結合によるものでもよく、共有結合の場合は、この結合は切断可能でない場合があり、又は加水分解もしくは還元剤などで切断可能な場合がある。このポリマー結合体を含む溶液、或いはポリマー結合体とリガンド又は立体ポリマーもしくはフソゲン（ｆｕｓｏｇｅｎ）を含む材料などの他のポリマー、液体もしくはミセルとの混合物を含む溶液を上記核酸、一実施態様では対象とする特定のｍＲＮＡを標的にするｓｉＲＮＡ、を含む溶液と所望の比率で混合することによってｓｉＲＮＡを含むナノ粒子を得る。そのような比率により所望の大きさ、安定性又は他の特性のナノ粒子をもたらすことができる。
【００７６】
一実施態様において、ナノ粒子は、上記ポリマー結合体を過剰のポリカチオン及び上記核酸と混合することを含むナノ粒子自己アセンブリによって形成させる。負に荷電した核酸とポリマー結合体の正に荷電した部分との間の非共有結合性静電相互作用によって、ナノ粒子の形成をもたらす自己アセンブリ過程が促進される。この過程は、上記２つの溶液を単純に混合するものであり、この場合、核酸を含む一方の溶液をポリマー結合体及び過剰のポリカチオンを含む別の溶液に添加し、その後に撹拌するか同時に撹拌する。一実施態様では、正荷電の成分と負荷電の成分との比率は、各溶液の濃度を適切に調整することで、又は添加する溶液の容量を調整することで決定する。別の実施態様では、これら２つの溶液は、静的ミキサーなどの混合装置を用いて連続流条件下で混合する。この実施態様では、２つ以上の溶液をこれらの溶液の比率を生じる速度及び圧で静的ミキサーに導入し、これらの溶液流をこの静的ミキサー内で混合する。複数のミキサーが並列又は直列に配置されるような配置は可能である。
【００７７】
一実施態様において、本発明は、３つの性質を有する組織標的化可能な送達を含むｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドの処方を提供する。これらの性質は、細胞質にｓｉＲＮＡを放出することができるコアへの核酸結合、非特異的相互作用からの保護、及び細胞取り込みをもたらす組織標的化である。本発明は、必要な複数の性質を組み合わせてアセンブルするための３種の材料のモジュラー結合体（ｍｏｄｕｌａｒ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）を用いる組成物および方法を提供する。種々の性質が組み込まれるようにこれらを設計、合成し、ｓｉＲＮＡペイロードと混合してナノ粒子を形成することができる。一実施態様は、これらの細胞に特異的なペプチドリガンドを保護ポリマーの一方の末端にカップリングし、他方の末端に核酸のためのカチオン性担体をカップリングすることによって新脈管構造を標的にするモジュラーポリマー結合体を含む。このポリマー結合体は、三官能性ポリマー（ＴＦＰ：ｔｒｉ−ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｐｏｌｙｍｅｒ）と称することもある３つの機能ドメインを有する。この結合体のモジュラー設計により各成分の置換及び最適化が別々に可能となる。別のアプローチは、予め形成したナノ粒子上に表面被膜を付けるものであった。ポリマー上への立体ポリマー被膜の吸着は自己限定的であり、一旦立体層が形成され始めると、ポリマーのさらなる付加が妨げられることになる。本発明の組成物および方法を用いると、上記３つの機能のそれぞれを、概してその他の２つの機能と無関係に、最適化するのに有効な方法が可能となる。
【００７８】
核酸ナノ粒子の保護的立体被覆
細胞外膜に類似した外部脂質二重層を有する均一なリポソームは迅速に認識され、血液から除去される。ナノテクノロジーは広範囲の合成ポリマー化学をもたらす。ＰＥＧ、ポリアセタール、およびポリオキサゾリンなどの親水性ポリマーは、コロイド状薬物の送達系（リポソーム、ポリマー、または静電ナノ粒子を問わない）の表面に「立体」保護層を形成して血液からの免疫クリアランスを減少させるのに有効であることが分かっている。この立体ＰＥＧ層の使用は、立体的に安定化されたリポソームに関して最初に開発され、最も広範に研究された。本発明は、立体ポリマー被膜の他に、表面電荷を化学的に低下させるなどの別のアプローチを提供する。
【００７９】
立体障害と生物学的結果は、化学的性質ではなく物理的性質に由来すると考えられる。いくつかの他の親水性ポリマーがＰＥＧの代替物として報告されている。立体的に安定化したリポソームに関する物理的研究により、ポリマー層の物理的挙動の強い機械的基盤が示されており、これを利用して他のタイブの粒子において同様な被覆を達成することができる。しかしながら、物理的研究によって核酸とのポリマー複合体の表面における同様のポリマー層の形成および類似の生物学的性質の達成が示された一方で、我々は血液からの免疫クリアランスからの保護を正確に予測するために物理的性質を使用するための十分な情報を欠いている。リポソーム研究から、生物活性に対して最も大きな影響を及ぼす物理的性質を２種のポリマーの大きさ及びグラフト密度を変化させて結合体のマトリックスを合成することによって得ることができることが分かる。表面立体層の機能が物理的性質に起因する一方で、最適な結合の化学的性質は依然として立体ポリマー及びこれにカップリングさせる担体の特定の化学的性質によって決まることに留意されたい。
【００８０】
表面立体ポリマー層を有するナノ粒子の形成方法も重要な要素である。一実施態様、立体ポリマーを担体ポリマーにカップリングすることにより核酸と共に自己アセンブルする結合体を得て立体ポリマー表面層を有するナノ粒子を形成する。別の実施態様では、予め形成したナノ粒子上に表面被膜を付ける。自己アセンブリでは、表面立体層の形成は、担体ポリマーとペイロードとの相互作用に依存し、粒子表面と反応させるための形成されている立体層からの浸透には依存しない。この場合、担体ポリマーの核酸ペイロードとの結合能に及ぼす立体ポリマーの影響は粒子形成、従って表面立体層に悪影響を及ぼすことがある。このことが起こる場合、担体上の立体ポリマーのグラフト密度がその最大値を超えてしまっていることになり、又は構造のグラフティング特性が十分ではない。
【００８１】
特定の組織を標的にする表面露出リガンド及び部分
ナノ粒子が選択的に標的細胞の内部に到達する能力は、特定の受容体媒介取り込みを誘導する能力にある。この能力は、本発明では、結合特異性を有する露出リガンド又は標的化部分によって得られる。標的化コロイド送達系のためのリガンドが多種存在する。そのような方法の１つは、リポソーム表面に抗体をカップリングさせるものであり、通常、そのようなリポソームは免疫リポソームと呼ばれる。明らかになっている１つの重要な要素はリガンド密度の影響である。抗体は、リガンドとして使用するための多くの要件（良好な結合選択性、ほぼ任意の受容体に対する調製法がほぼ定型化していること、及びナノ粒子の種類とは無関係に蛋白質カップリング方法が広く適用できることを含む）を満たす傾向がある。モノクロナール抗体は血液脳関門を通過することができる兆候さえ示す。トランスフェリン又はトランスフェリン受容体などの、標的化ナノ粒子用に天然リガンド及び受容体である他の蛋白質も検討されてきた。本発明の一実施態様では、標的化リガンド又は部分は糖又は糖アナログとすることができる。
【００８２】
好ましい種類のリガンドは、内在化受容体に対して強い選択的結合親和性を有する低分子量化合物である。研究では、葉酸、チアミンなどのビタミン、小麦胚凝集素、ｅ−セクレチンに対するシアリルルイスｘなどのポリサッカリド、及びインテグリンに対するＲＧＤなどのペプチド結合ドメインを含む天然の代謝産物が評価されている。ペプチドは用途の広いクラスのリガンドをもたらす。何故なら、インビボパニング法を使用した場合でさえ、ファージディスプレイライブラリーを用いて天然または非天然の配列をスクリーニングすることができるからである。このようなファージディスプレイ法では、配列と無関係に容易にカップリングさせるために１つの末端に非対Ｃｙｓ残基を保持させることが可能となる。新脈管構造へのナノ粒子の送達を標的化するためにＲＧＤペプチドを使用することは、有効なリガンドの主な要件を満たすのに極めて効果的なことがある。即ち、リガンド結合を妨害しないし、免疫クリアランスも誘導しない特定の化学的性質によって、なお一層、標的細胞での受容体媒介性の選択的取り込みが可能となる。
【００８３】
本発明の組成物および方法は、ポリマー、ポリマー結合体、脂質、ミセル、自己アセンブリコロイド、ナノ粒子、立体的に安定化されたナノ粒子、又はリガンド誘導性ナノ粒子を含む核酸送達媒体を用いたｓｉＲＮＡの投与を提供する。国際公開第０１／４９３２４号及び米国特許出願公開第２００３／０１６６６０１号（これらの全体が本明細書に参考として援用されている）に記載のタイプの標的化合成ベクターは、本発明のＲＮＡｉ誘導核酸分子の全身性送達に用いることができる。一実施態様では、ＰＥＩ−ＰＥＧ−ＲＧＤ（ポリエチレンイミン−ポリエチレングリコール−アルギン−グリシン−アスパラギン酸）合成ベクターを調整して、例えば、国際公開第０１／４９３２４号及び米国特許出願公開第２００３／０１６６６０１号の実施例５３及び５６と同様にして用いることができる。このベクターは静脈内注射によって全身性にＲＮＡｉを送達するのに用いられた。当該分野で周知の他の標的化合成ベクター分子を用いることもできる。例えば、このベクターは、ＲＮＡｉおよび少なくとも１つの複合体形成試薬を含むコア複合体で構成されている内殻を有することができる。また、このベクターは、融合誘導部分を含むことができる。この部分は、コア複合体に固定されている殻を含むことができ、又はコア複合体に直接組み込むことができる。ベクターは、さらに、このベクターを安定化し、蛋白質および細胞への非特異的結合を減少させる外殻（ｏｕｔｅｒ ｓｈｅｌｌ）部分を有することができる。この外殻部分は親水性ポリマーを含むことができ、及び／又は融合誘導部分に固定することができる。外殻部分をコア複合体に固定してもよい。このベクターは、標的組織および細胞集団へのベクターの結合を増強する標的化部分を含むことができる。適切な標的化部分は当該分野で周知であり、国際公開第０１／４９３２４号及び米国特許出願公開第２００３／０１６６６０１号に詳細に開示されている。
【００８４】
本発明の一実施態様では、抗ＶＥＧＦ経路ｓｉＲＮＡ短鎖二本鎖ＲＮＡ分子のＲＧＤ媒介リガンド誘導性ナノ粒子調製のための組成物及び方法を提供する。ｓｉＲＮＡを含むＲＧＤ媒介組織標的化ナノ粒子の一製造方法では、標的化リガンドであるＲＧＤ含有ペプチド（ＡＣＲＧＤＭＦＧＣＡ（配列番号１２））をポリエチレングリコールもしくは同様の性質を有する他のポリマーなどの立体ポリマーに結合させる（国際公開第０６／１１０８１３号参照；これの全体が本明細書に参考として援用されている）。このリガンド−立体ポリマー結合体を、ポリエチレンイミンなどのポリカチオン又はヒスチジン−リジンコポリマーなどの他の有効な材料にさらに結合する。この結合は、共有結合でも非共有結合でもよく、共有結合の場合は、この結合は切断可能でない場合があり、又は加水分解もしくは還元剤などで切断可能な場合がある。上記ポリマー結合体を含む溶液、或いはポリマー結合体とリガンド又は立体ポリマーもしくはフソゲンを含む材料などの他のポリマー、液体もしくはミセルとの混合物を含む溶液を上記核酸、一実施態様では対象とする特定の遺伝子を標的にするｓｉＲＮＡ、を含む溶液と所望の比率で混合することによってｓｉＲＮＡを含むナノ粒子を得る。
【００８５】
製剤と電場の併用
特定の用途では、ｓｉＲＮＡを電場をかけて、又はかけないで投与することができる。例えば、これは、本発明のｓｉＲＮＡ分子を、例えば腫瘍組織内に直接注入することにより、また、血管形成組織又は望ましくない新脈管構造を有する組織内又はその近傍に直接送達するのに利用することができる。ｓｉＲＮＡは、例えば、生理食塩水、緩衝生理食塩水などの適切な医薬用担体に含ませることができる。
【００８６】
以上のように一般的に説明してきた本発明は、次の実施例にて一層容易に理解されるであろうが、これらの例は例証として示されるものであり、本発明を限定するものではない。
【実施例】
【００８７】
（実施例１）
ヒトＶＥＧＦＲ１発現を低下させるための候補ｓｉＲＮＡ分子
検証されたアルゴリズムを用い、公表されているヒトＶＥＧＦＲ１ｍＲＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋアセッション番号ＡＦ０６３６５７；図７Ａ及び図７Ｂ；配列番号１９７）、ヒト可溶性ＶＥＧＦＲ１ｍＲＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋアセッション番号Ｕ０ｌ１３４；図８；配列番号１９８）及びマウスＶＥＧＦＲ１ｍＲＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋアセッション番号ＮＭ＿０１０２２８．２；図９Ａ及び図９Ｂ；配列番号１９９）の配列を利用してヒトＶＥＧＦＲ１ｓｉＲＮＡ分子を設計した。
【００８８】
可溶性及び膜結合型ｈＶＥＧＦＲ１の両者を標的にする例示的なｓｉＲＮＡを上記の表１に示した。膜結合型ｈＶＥＧＦＲ１を標的にするが、可溶性ｈＶＥＧＦＲ１は標的にしない例示的なｓｉＲＮＡを上記の表２に示した。ヒト及びマウスＶＥＧＦＲ１の両者を標的にする例示的なｓｉＲＮＡを上記の表３に示した。
【００８９】
（実施例２）
ｓｉＲＮＡ分子は可溶性ヒトＶＥＧＦＲ１蛋白質発現に影響を与えないで完全長ヒトＶＥＧＦＲ１蛋白質発現を阻害する
ヒトＶＥＧＦＲ１を標的にする計４８種の平滑末端２５−マーｓｉＲＮＡについて、ＨＵＶＥＣ細胞を用い、これらを形質移入した細胞でのヒトＶＥＧＦＲ１（「ｈＶＥＧＦＲ１」）発現のノックダウンにおけるこれらの効力を試験した。これらの４８種のｈＶＥＧＦＲ１−ｓｉＲＮＡは、Ｑｉａｇｅｎ社（Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）により合成された表１乃至３及び７乃至１１のｈＶＥＧＦＲ１−ｓｉＲＮＡのリストから選び、ＨＵＶＥＣ細胞における効力スクリーニングにかけた。これらの４８種のｓｉＲＮＡの中で、ｈＶＥＧＦＲ１−ｓｉＲＮＡ＃１乃至１９（表４）は、可溶性（切断型）ｈＶＥＧＦＲ１及び完全長膜結合型ｈＶＥＧＦＲ１をコードしている両ｍＲＮＡを標的にする。これに対して、ｈＶＥＧＦＲ１−ｓｉＲＮＡ＃２０乃至４８（表５）は、完全長ｈＶＥＧＦＲ１ｍＲＮＡのみを標的にする。
【００９０】
【表４−１】
【００９１】
【表４−２】
【００９２】
【表５−１】
【００９３】
【表５−２】
【００９４】
【表５−３】
ＨＵＶＥＣ細胞（Ｃａｍｂｒｅｘ社、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ、ＵＳＡ）は、５％ＣＯ２を含むインキュベーターを用いて３７℃の２％ＦＢＳ含有ＥＧＭ−２培地（Ｃａｍｂｒｅｘ社）中で培養した。３乃至５継代目のＨＵＶＥＣ細胞をｓｉＲＮＡ形質移入に用いた。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭａｘ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用い、メーカーのプロトコルに従ってｓｉＲＮＡ濃度を１０乃至２０ｎＭとしてＨＵＶＥＣ細胞で逆（ｒｅｖｅｒｓｅ）又は前（ｆｏｒｗａｒｄ）ｓｉＲＮＡ形質移入法を実施した。ｓｉＲＮＡ形質移入は、ＥＬＩＳＡアッセイの場合、４８穴プレートで（各ｓｉＲＮＡ配列につき２回）、リアルタイムＰＣＲアッセイの場合、９６穴プレートで実施した。ｈＶＥＧＦＲ１ｓｉＲＮＡ効力スクリーニングの陰性対照としてＱｉａｇｅｎ社製ＡｌｌＳｔａｒｓ Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｉＲＮＡ又はＬｕｃ−ｓｉＲＮＡを使用した（表１２）。
【００９５】
ｈＶＥＧＦＲ１のｓｉＲＮＡ媒介ノックダウンを蛋白質レベルで検出するために、形質移入したＨＵＶＥＣ細胞の細胞培養上清及び細胞溶解物を形質移入後４８時間に収集し、ｈＶＥＧＦＲ１ＥＬＩＳＡアッセイ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ社）を用いて、細胞培養上清に存在する可溶性ｈＶＥＧＦＲ１及び細胞溶解物に存在する全ｈＶＥＧＦＲ１を測定した。可溶性及び膜結合型完全長ｈＶＥＧＦＲ１をコードしている両ｍＲＮＡを標的にするｓｉＲＮＡ＃１乃至１９をＨＵＶＥＣ細胞に形質移入した場合にはこの形質移入ＨＵＶＥＣ細胞の培養上清で可溶性ｈＶＥＧＦＲ１蛋白質の著しいノックダウンが認められた（図１Ａ）が、膜結合型ｈＶＥＧＦＲ１をコードしている完全長ｈＶＥＧＦＲ１ｍＲＮＡのみを標的にするｓｉＲＮＡ＃２０乃至４８を形質移入した細胞では認められなかった（図２Ａ）。ｓｉＲＮＡ＃１乃至１９を形質移入したＨＵＶＥＣ細胞では（可溶性ｈＶＥＧＦＲ１及び膜結合型ｈＶＥＧＦＲ１を含む）全ｈＶＥＧＦＲ１蛋白質の著しいノックダウンが認められた（図１Ｂ）のとは対照的に、ｓｉＲＮＡ＃２０乃至４８の形質移入では全ｈＶＥＧＦＲ１蛋白質のある程度の増大が認められた（図２Ｂ）。
【００９６】
上記４８種の試験ｓｉＲＮＡによる上清及び細胞溶解物の両方におけるｈＶＥＧＦＲ１蛋白質発現の阻害については表６にまとめた。表６のデータは図３及び４にグラフ化されている。
【００９７】
【表６−１】
【００９８】
【表６−２】
全ｈＶＥＧＦＲ１蛋白質レベルを細胞溶解物において測定する場合、ＥＬＩＳＡアッセイでは可溶性ｈＶＥＧＦＲ１と完全長膜結合型ｈＶＥＧＦＲ１を区別することができないので、定量的リアルタイム−ＰＣＲ（「ＱＲＴ−ＰＣＲ：ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＲｅａｌＴｉｍｅ−ＰＣＲ」）を用いて完全長ｈＶＥＧＦＲ１のノックダウンを特異的に測定した。
【００９９】
ｈＶＥＧＦＲ１のｓｉＲＮＡ媒介ノックダウンをｍＲＮＡレベルで検出するために、ＨＵＶＥＣ細胞に１０ｎＭｓｉＲＮＡを形質移入し、形質移入後４８時間に細胞を収集して、完全長ｈＶＥＧＦＲ１ｍＲＮＡ特異的遺伝子発現アッセイ（Ｈｓ＿０１７６５７３＿ｍｌ、ＡＢＩ）又は可溶性及び膜結合型ｈＶＥＧＦＲ１をコードしている両ｍＲＮＡの遺伝子発現アッセイ（Ｈｓ＿０１０５２９３６＿ｍｌ、ＡＢＩ）と共にＱＲＴ−ＰＣＲアッセイを用いて各ｈＶＥＧＦＲ１ｍＲＮＡの相対レベルを測定した。細胞は、ＱＲＴ−ＰＣＲアッセイのために「Ｃｅｌｌ ｔｏ Ｓｉｇｎａｌ Ｋｉｔ」を用いて溶解させた。試料は−８０℃で貯蔵した。全ｈＶＥＧＦＲ１ｍＲＮＡの著しいノックダウンは、ｈＶＥＧＦＲ１−ｓｉＲＮＡ＃１乃至１９を形質移入したＨＵＶＥＣ細胞でのみ認められた（図５、灰色棒）が、ｈＶＥＧＦＲ１−ｓｉＲＮＡ＃２０乃至４８を形質移入したＨＵＶＥＣ細胞では認められず（図６、灰色棒）、このことは蛋白質ノックダウンデータ（図１Ａ、１Ｂ、２Ａ、２Ｂ、３及び４）と一致していた。しかしながら、全てのｈＶＥＧＦＲ１−ｓｉＲＮＡを形質移入したＨＵＶＥＣ細胞において完全長膜結合型ｈＶＥＧＦＲ１をコードしているｍＲＮＡの著しいノックダウンが認められた（図５及び６、黒色棒）。これは、ｈＶＥＧＦＲ１−ｓｉＲＮＡ＃２０乃至４８が完全長ｈＶＥＧＦＲ１ｍＲＮＡのみをノックダウンし、可溶性ｈＶＥＧＦＲ１ｍＲＮＡをノックダウンしないことを明示したものである。
【０１００】
結論として、本発明者らは、ＨＵＶＥＣ細胞においてインビトロでのｓｉＲＮＡのスクリーニングを行うことによって、ここに示したｓｉＲＮＡ候補のうちのいくつかがｈＶＥＧＦＲ１遺伝子発現を蛋白質及びｍＲＮＡレベルで阻害するのに極めて有効であることを明らかにした。さらに、本発明者らは、これらのｓｉＲＮＡが可溶性ｈＶＥＧＦＲ１に影響を与えずに膜結合型完全長ｈＶＥＧＦＲ１のみを減少させることも明らかにした。本発明者らは、意外にも、いく種かの完全長ｈＶＥＧＦＲ１特異的ｓｉＲＮＡが可溶性ｈＶＥＧＦＲ１のレベルを増大させたことを発見した（例えば、ｈＶＥＧＦＲ１−ｓｉＲＮＡ＃２１乃至２５、２７乃至２９、３１、３８、３９及び４１乃至４８については図２Ａ及び６参照）。
【０１０１】
【表７−１】
【０１０２】
【表７−２】
【０１０３】
【表８】
【０１０４】
【表９】
【０１０５】
【表１０−１】
【０１０６】
【表１０−２】
【０１０７】
【表１０−３】
【０１０８】
【表１０−４】
【０１０９】
【表１０−５】
【０１１０】
【表１１】
【０１１１】
【表１２】
参考文献
【０１１２】
【数１】
【０１１３】
【数２】
【０１１４】
【数３】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＶＥＧＦＲ１を標的にするアンチセンス核酸分子であって、該アンチセンス核酸は配列番号１２９乃至１９６からなる群から選ばれるセンス鎖に対して相補性であるヌクレオチド配列を含む、アンチセンス核酸分子。
【請求項２】
請求項１に記載のアンチセンス核酸分子及びその対応するセンス鎖を含む、二本鎖核酸分子。
【請求項３】
ＶＥＧＦＲ１を標的にするアンチセンス核酸分子であって、該アンチセンス核酸はＶＥＧＦＲ１ ｍＲＮＡに対して相補性である配列を含み、該核酸分子は細胞内で可溶性ＶＥＧＦＲ１の発現を増加させる、アンチセンス核酸分子。
【請求項４】
請求項３に記載のアンチセンス核酸分子及びその対応するセンス鎖を含む、二本鎖核酸分子。
【請求項５】
ＶＥＧＦＲ１を標的にするアンチセンス核酸分子であって、該アンチセンス核酸はＶＥＧＦＲ１ ｍＲＮＡに対して相補性である配列を含み、該核酸分子は細胞内で可溶性ＶＥＧＦＲ１の発現を増加させ、完全長ＶＥＧＦＲ１の発現を減少させる、アンチセンス核酸分子。
【請求項６】
請求項５に記載のアンチセンス核酸分子及びその対応するセンス鎖を含む、二本鎖核酸分子。
【請求項７】
請求項１乃至６のいずれか１項に記載の核酸分子及び医薬用として許容可能な担体を含む組成物。
【請求項８】
請求項１乃至６のいずれか１項に記載の核酸分子を含む、合成核酸送達媒体。
【請求項９】
前記核酸と複合体を形成したカチオン性ポリマーを含む、請求項８に記載の合成核酸送達媒体。
【請求項１０】
前記カチオン性ポリマーがＰＥＩ又はヒスチジン−リジンコポリマーである、請求項９に記載の合成核酸送達媒体。
【請求項１１】
細胞内における全ＶＥＧＲ１発現を低下させる方法であって、該細胞を請求項１又は請求項２に記載の核酸分子と接触させる工程を含む方法。
【請求項１２】
細胞内における全ＶＥＧＲ１及び完全長ＶＥＧＦＲ１の発現を低下させる方法であって、該細胞を請求項１又は請求項２に記載の核酸分子と接触させる工程を含む方法。
【請求項１３】
細胞内における可溶性ＶＥＧＦＲ１発現を増加させる方法であって、該細胞を、前記完全長ＶＥＧＦＲ１ ｍＲＮＡ内の配列を標的にするが、前記可溶性ＶＥＧＦＲ１ ｍＲＮＡ内の配列を標的にしないアンチセンス核酸分子と接触させる工程を含む方法。
【請求項１４】
前記アンチセンス核酸分子がｓｉＲＮＡである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記アンチセンス核酸分子が配列番号２４、４９、５０、５１、８４、８５、８６、８８、８９、１００、１０４、１０５、１８４、１８６、１８８、１９２、１９３、１９４及び１９６からなる群から選ばれるセンス鎖に対して相補性である配列を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記アンチセンス核酸分子が配列番号２４、４９、５０、５１、８４、８５、８６、８８、８９、１００、１０４、１０５、１８４、１８６、１８８、１９２、１９３、１９４及び１９６からなる群から選ばれるセンス鎖に対して相補性である配列を有するアンチセンス鎖を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記アンチセンス核酸分子が配列番号２４、４９、５０、５１、８４、８５、８６、８８、８９、１００、１０４、１０５、１８４、１８６、１８８、１９２、１９３、１９４及び１９６からなる群から選ばれるセンス鎖の配列を含むＶＥＧＦＲ１内の配列を標的にする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
細胞内における完全長ＶＥＧＦＲ１の発現を低下させる方法であって、該細胞をＶＥＧＦＲ１を標的にするためのアンチセンス核酸分子と接触させる工程を含み、該アンチセンス核酸は配列番号２４、２５、４３、４９、５０、５１、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、１００、１０４、１０５及び１２９乃至１９６からなる群から選ばれるセンス鎖に対して相補性である配列を含む、方法。
【請求項１９】
細胞内における可溶性ＶＥＧＦＲ１の発現を低下させることなく細胞内における完全長ＶＥＧＲ１の発現を低下させる方法であって、該細胞をＶＥＧＦＲ１を標的にするためのアンチセンス核酸分子と接触させる工程を含み、該アンチセンス核酸は配列番号２４、２５、４３、４９、５０、５１、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、１００、１０４、１０５、１７３、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８６、１８７、１８８、１９２、１９３、１９４及び１９６からなる群から選ばれるセンス鎖に対して相補性である配列を含む、方法。
【請求項２０】
細胞内において完全長ＶＥＧＲ１の発現を低下させ、可溶性ＶＥＧＦＲ１の発現を増加させる方法であって、該細胞をＶＥＧＦＲ１を標的にするためのアンチセンス核酸分子と接触させる工程を含み、該アンチセンス核酸は配列番号２４、４９、５０、５１、８４、８５、８６、８８、８９、１００、１０４、１０５、１８４、１８６、１８８、１９２、１９３、１９４及び１９６からなる群から選ばれるセンス鎖に対して相補性である配列を含む、方法。
【請求項２１】
新生血管形成の低減を必要とする対象において、新生血管形成を低減させる方法であって、ＶＥＧＦＲ１を標的にするためのアンチセンス核酸分子を該対象に投与する工程を含み、該アンチセンス核酸は配列番号２４、２５、４３、４９、５０、５１、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、１００、１０４、１０５及び１２９乃至１９６からなる群から選ばれるセンス鎖に対して相補性である配列を含む、方法。
【請求項２２】
前記新生血管形成が腫瘍におけるものである、請求項２１に記載の方法。
【請求項１】
ＶＥＧＦＲ１を標的にするアンチセンス核酸分子であって、該アンチセンス核酸は配列番号１２９乃至１９６からなる群から選ばれるセンス鎖に対して相補性であるヌクレオチド配列を含む、アンチセンス核酸分子。
【請求項２】
請求項１に記載のアンチセンス核酸分子及びその対応するセンス鎖を含む、二本鎖核酸分子。
【請求項３】
ＶＥＧＦＲ１を標的にするアンチセンス核酸分子であって、該アンチセンス核酸はＶＥＧＦＲ１ ｍＲＮＡに対して相補性である配列を含み、該核酸分子は細胞内で可溶性ＶＥＧＦＲ１の発現を増加させる、アンチセンス核酸分子。
【請求項４】
請求項３に記載のアンチセンス核酸分子及びその対応するセンス鎖を含む、二本鎖核酸分子。
【請求項５】
ＶＥＧＦＲ１を標的にするアンチセンス核酸分子であって、該アンチセンス核酸はＶＥＧＦＲ１ ｍＲＮＡに対して相補性である配列を含み、該核酸分子は細胞内で可溶性ＶＥＧＦＲ１の発現を増加させ、完全長ＶＥＧＦＲ１の発現を減少させる、アンチセンス核酸分子。
【請求項６】
請求項５に記載のアンチセンス核酸分子及びその対応するセンス鎖を含む、二本鎖核酸分子。
【請求項７】
請求項１乃至６のいずれか１項に記載の核酸分子及び医薬用として許容可能な担体を含む組成物。
【請求項８】
請求項１乃至６のいずれか１項に記載の核酸分子を含む、合成核酸送達媒体。
【請求項９】
前記核酸と複合体を形成したカチオン性ポリマーを含む、請求項８に記載の合成核酸送達媒体。
【請求項１０】
前記カチオン性ポリマーがＰＥＩ又はヒスチジン−リジンコポリマーである、請求項９に記載の合成核酸送達媒体。
【請求項１１】
細胞内における全ＶＥＧＲ１発現を低下させる方法であって、該細胞を請求項１又は請求項２に記載の核酸分子と接触させる工程を含む方法。
【請求項１２】
細胞内における全ＶＥＧＲ１及び完全長ＶＥＧＦＲ１の発現を低下させる方法であって、該細胞を請求項１又は請求項２に記載の核酸分子と接触させる工程を含む方法。
【請求項１３】
細胞内における可溶性ＶＥＧＦＲ１発現を増加させる方法であって、該細胞を、前記完全長ＶＥＧＦＲ１ ｍＲＮＡ内の配列を標的にするが、前記可溶性ＶＥＧＦＲ１ ｍＲＮＡ内の配列を標的にしないアンチセンス核酸分子と接触させる工程を含む方法。
【請求項１４】
前記アンチセンス核酸分子がｓｉＲＮＡである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記アンチセンス核酸分子が配列番号２４、４９、５０、５１、８４、８５、８６、８８、８９、１００、１０４、１０５、１８４、１８６、１８８、１９２、１９３、１９４及び１９６からなる群から選ばれるセンス鎖に対して相補性である配列を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記アンチセンス核酸分子が配列番号２４、４９、５０、５１、８４、８５、８６、８８、８９、１００、１０４、１０５、１８４、１８６、１８８、１９２、１９３、１９４及び１９６からなる群から選ばれるセンス鎖に対して相補性である配列を有するアンチセンス鎖を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記アンチセンス核酸分子が配列番号２４、４９、５０、５１、８４、８５、８６、８８、８９、１００、１０４、１０５、１８４、１８６、１８８、１９２、１９３、１９４及び１９６からなる群から選ばれるセンス鎖の配列を含むＶＥＧＦＲ１内の配列を標的にする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
細胞内における完全長ＶＥＧＦＲ１の発現を低下させる方法であって、該細胞をＶＥＧＦＲ１を標的にするためのアンチセンス核酸分子と接触させる工程を含み、該アンチセンス核酸は配列番号２４、２５、４３、４９、５０、５１、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、１００、１０４、１０５及び１２９乃至１９６からなる群から選ばれるセンス鎖に対して相補性である配列を含む、方法。
【請求項１９】
細胞内における可溶性ＶＥＧＦＲ１の発現を低下させることなく細胞内における完全長ＶＥＧＲ１の発現を低下させる方法であって、該細胞をＶＥＧＦＲ１を標的にするためのアンチセンス核酸分子と接触させる工程を含み、該アンチセンス核酸は配列番号２４、２５、４３、４９、５０、５１、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、１００、１０４、１０５、１７３、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８６、１８７、１８８、１９２、１９３、１９４及び１９６からなる群から選ばれるセンス鎖に対して相補性である配列を含む、方法。
【請求項２０】
細胞内において完全長ＶＥＧＲ１の発現を低下させ、可溶性ＶＥＧＦＲ１の発現を増加させる方法であって、該細胞をＶＥＧＦＲ１を標的にするためのアンチセンス核酸分子と接触させる工程を含み、該アンチセンス核酸は配列番号２４、４９、５０、５１、８４、８５、８６、８８、８９、１００、１０４、１０５、１８４、１８６、１８８、１９２、１９３、１９４及び１９６からなる群から選ばれるセンス鎖に対して相補性である配列を含む、方法。
【請求項２１】
新生血管形成の低減を必要とする対象において、新生血管形成を低減させる方法であって、ＶＥＧＦＲ１を標的にするためのアンチセンス核酸分子を該対象に投与する工程を含み、該アンチセンス核酸は配列番号２４、２５、４３、４９、５０、５１、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、１００、１０４、１０５及び１２９乃至１９６からなる群から選ばれるセンス鎖に対して相補性である配列を含む、方法。
【請求項２２】
前記新生血管形成が腫瘍におけるものである、請求項２１に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図８】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図１０】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図８】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図１０】
【公表番号】特表２０１１−５０００２３（Ｐ２０１１−５０００２３Ａ）
【公表日】平成２３年１月６日（２０１１．１．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５２８８９３（Ｐ２０１０−５２８８９３）
【出願日】平成２０年１０月１０日（２００８．１０．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０１１６４５
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０５１６５９
【国際公開日】平成２１年４月２３日（２００９．４．２３）
【出願人】（５０９１７３９９３）イントラダイム コーポレイション (5)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年１月６日（２０１１．１．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１０月１０日（２００８．１０．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０１１６４５
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０５１６５９
【国際公開日】平成２１年４月２３日（２００９．４．２３）
【出願人】（５０９１７３９９３）イントラダイム コーポレイション (5)
【Ｆターム（参考）】
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