ウイルスの抗原性を中和する植物成分
【課題】ウイルスの抗原性を中和する植物成分を明らかにし，イムノグロブリン様の働きを有する植物成分を提供する。
【解決手段】ヒトの食歴のある植物をエタノールで脱脂後、弱アルカリ水で抽出し，その後，該抽出液を遠心濃縮フィルターにかけることで、分子量が１５万から１８万の間の成分を抽出する。ヒトの食歴のある植物の皮は，じゃがいもの皮，米ぬか，小豆の皮，朝鮮人参の絞りかすを用いることができる。飴，チューインガム，トローチなどに含有させることで，粘膜からのウイルス感染を防御することができる。
【解決手段】ヒトの食歴のある植物をエタノールで脱脂後、弱アルカリ水で抽出し，その後，該抽出液を遠心濃縮フィルターにかけることで、分子量が１５万から１８万の間の成分を抽出する。ヒトの食歴のある植物の皮は，じゃがいもの皮，米ぬか，小豆の皮，朝鮮人参の絞りかすを用いることができる。飴，チューインガム，トローチなどに含有させることで，粘膜からのウイルス感染を防御することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウイルスの抗原性を中和し，イムノグロブリン様の働きを有する植物成分に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
動物の免疫細胞が作り出すタンパク質である「イムノグロブリン」は，植物には存在しないというのが定説である。
【特許文献１】特開平１０−６７６６９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本願発明者は，これまでの研究によって，植物が産生する感染防御成分の存在を解明した。本発明が解決しようとする課題は，ウイルスの抗原性を中和する植物成分を明らかにし，イムノグロブリン様の働きを有する植物成分を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
ヒトの食歴のある植物の皮から，分子量１５万から１８万の間であって，水溶性であり，エタノール不溶性の成分を抽出する。ヒトの食歴のある植物の皮は，じゃがいもの皮，米ぬか，小豆の皮，朝鮮人参の絞りかすを用いることができる。
【発明の効果】
【０００５】
粘膜感染を引き起こすロタウイルス，ポリオウイルス，インフルエンザウイルス，Ａ型肝炎ウイルス，Ｂ型肝炎ウイルス，ヘルペスウイルス，ノロウイルス等について抗原性を中和し，ウイルスの感染力を中和する。毒性をもたない範囲の濃度でウイルスを９５パーセント以上抑制する有効濃度を特定できる。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】図１はPhyto-IgAの分子量分布を示すＨＰＣＬチャートである。
【図２】図２はじゃがいもの皮から抽出したPhyto-IgAがインフルエンザウイルスの増殖を抑制する様を示す。イヌ腎臓由来細胞株ＭＤＣＫを宿主細胞として，インフルエンザウイルスＨ１Ｎ１の非感染あるいは感染下で，種々の濃度のPhyto-IgAと混合培養するin vitroモデルを用いた。
【図３】図３は米ぬかから抽出したPhyto-IgAがインフルエンザウイルスの増殖を抑制する様を示す。イヌ腎臓由来細胞株ＭＤＣＫを宿主細胞として，インフルエンザウイルスＨ１Ｎ１の非感染あるいは感染下で，種々の濃度のPhyto-IgAと混合培養するin vitroモデルを用いた。
【図４】図４は小豆皮から抽出したPhyto-IgAがインフルエンザウイルスの増殖を抑制する様を示す。イヌ腎臓由来細胞株ＭＤＣＫを宿主細胞として，インフルエンザウイルスＨ１Ｎ１の非感染あるいは感染下で，種々の濃度のPhyto-IgAと混合培養するin vitroモデルを用いた。
【図５】図５は朝鮮人参滓から抽出したPhyto-IgAがインフルエンザウイルスの増殖を抑制する様を示す。イヌ腎臓由来細胞株ＭＤＣＫを宿主細胞として，インフルエンザウイルスＨ１Ｎ１の非感染あるいは感染下で，種々の濃度のPhyto-IgAと混合培養するin vitroモデルを用いた。
【図６】図６はPhyto-IgAが致死量のインフルエンザウイルスを感染させられたネズミを助命する様を示すグラフである。
【図７】図７はPhyto-IgAがウイルスの抗原性を中和する様を示すグラフである。
【図８】図８はPhyto-IgA Candy の抗ウイルス活性有効時間に関する実験結果を表すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
以下，図面を参照しつつ，本発明の実施形態について説明する。
【０００８】
本発明の植物成分は，後述するように免疫グロブリン様の働きを有すること，そして，粘膜感染を起こすウイルスの感染力を中和する効果をもつことからその機能がIgAに類似する。そこで，本発明の発明者は，本願発明に係る植物成分を植物性イムノグロブリンＡ（Phytoimmunoglobulin A, Phyto-IgA）と名づけた。本願発明者の造語である。なお，IgAの分子量は，約１６万である。
【０００９】
Phyto-IgAを製造するには，ヒトの食歴のある植物をエタノールで脱脂後、弱アルカリ水で抽出し，その後，該抽出液を遠心濃縮フィルターにかけることにより，分子量１５万から１８万の間の成分を得ることによる。ヒトの食歴のある植物は，じゃがいもの皮，米ぬか，小豆の皮，朝鮮人参の絞りかすを用いることができる。ヒトの食歴は，人類が有史以来，食物としたことのあるものをいう。
【実施例１】
【００１０】
〔Phyto-IgAの製造〕Phyto-IgAは、原料となるヒトの食歴のある植物をエタノールで脱脂後、１０倍量の２．５％炭酸水素水（ＮａＨＣＯ３）で９０℃１時間加熱抽出する。該抽出液を０．４５ミクロンのメンブランフィルター（株式会社ミリポア製）でろ過し、株式会社ハイテックの提供するタンパク濃縮・脱塩用遠心ろ過ユニット（ビバスピン4，製品番号VS0443，分画分子量100,000 MWCO）を用いて濃縮分画した。
【００１１】
分画したPhyto-IgAの分子量分布を図１に示す。図より、米ぬか（Ｂ）、小豆皮（Ｃ）、じゃがいも皮（Ｄ）、朝鮮人参滓（Ｅ）から、分子量マーカーとして用いたγイムノグロブリン（Ａ）と同程度の分子量分布を有するPhyto-IgAを分画できたことを見て取ることができる。なお、分子量の測定は、サイズ排除クロマトグラフィ(SEC)カラム（昭和電工製）を用いて、ＨＰＬＣ法（溶媒：水、流速：１ｍｌ／ｍｉｎ，カラム温度：３０℃）で行った。
【実施例２】
【００１２】
次に，Phyto-IgAがインフルエンザウイルスの増殖を抑制することを示す。この試験には，イヌ腎臓由来細胞株ＭＤＣＫを宿主細胞として，インフルエンザウイルス（H1N1）の非感染あるいは感染下で，種々の濃度（0.15〜2.5ｍｇ／ｍｌ）のPhyto-IgAと混合培養するin vitroモデルを用いた。その結果を表１及び図２に示す。ここでは，じゃがいもの皮から抽出したPhyto-IgAを用いた。
【００１３】
【表１】
【００１４】
[試験方法]ＭＤＣＫ細胞を２×１０4/mlに調製し１０％ＦＣＳ添加ＥＭＥＭ培地にて９６穴マイクロカルチャープレートに100μＬづつ播種した。３７℃，５％ＣＯ2条件下で２日間培養した。培養液を除去し，ＰＢＳで洗浄した後，インフルエンザウイルス（Inf/A H1N1)液と試料を含む培地をＭＤＣＫ細胞へ接種し，34.5℃で３日間培養した。培養液を除去後100μＬのＥＭＥＭ培地（ＦＣＳ非添加）を加えた。34.5℃にて２日間培養後上清を除去しＭＴＴ法で測定した（生存細胞をブランクと比較し細胞生存率を算出した）。
【００１５】
表１の結果をグラフに描いたのが図２である。図２の横軸はPyhto-IgAの添加濃度を，縦軸は宿主の生存率を示す。インフルエンザウイルスの非感染（図２の白抜きの縦棒，virus non-infected）下においては，宿主細胞の死滅は全く観察されなかった。このことは，Phyto-IgAは0.15〜2.5ｍｇ／ｍｌの濃度では宿主細胞に毒性がないことを示すものである。
【００１６】
一方，インフルエンザウイルスの感染（図２の黒色の縦棒，virus infected）下においては，Phyto-IgAが無添加では宿主細胞は１００パーセント死滅したことを見て取れる。しかし，Phyto-IgAの添加濃度が高くなるにつれて宿主細胞の生存率が増加した。すなわち，Phyto-IgAが濃度依存的にウイルス感染を抑制したことを示している。
【００１７】
濃度３１３の値と，濃度６２５の値とから，補間法（内挿法）の計算により，ウイルス感染を９５パーセント抑制する有効濃度及び９９．９パーセント抑制する有効濃度を求めることができる。その補間法の計算を表２に示す。
【００１８】
【表２】
【実施例３】
【００１９】
実施例２と同様の実験を米ぬかから抽出したPhyto-IgAについて行ったものを表３及び図３に示す。試験方法は実施例２と同じである。
【００２０】
【表３】
【００２１】
実施例２と同様に，濃度３１３の値と，濃度６２５の値とから，補間法（内挿法）の計算により，ウイルス感染を９０パーセント抑制する有効濃度及び９９．９パーセント抑制する有効濃度を求めることができる。その補間法の計算を表４に示す。
【００２２】
【表４】
【実施例４】
【００２３】
実施例２，３と同様の実験を小豆皮から抽出したPhyto-IgAについて行ったものを表５及び図４に示す。試験方法は実施例２，３と同じである。
【００２４】
【表５】
【００２５】
実施例２，３と同様に，濃度３１３の値と，濃度６２５の値とから，補間法（内挿法）の計算により，ウイルス感染を９０パーセント抑制する有効濃度及び９９．９パーセント抑制する有効濃度を求めることができる。その補間法の計算を表６に示す。
【００２６】
【表６】
【実施例５】
【００２７】
実施例２，３と同様の実験を朝鮮人参滓から抽出したPhyto-IgAについて行ったものを表７及び図５に示す。試験方法は実施例２，３，４と同じである。
【００２８】
【表７】
【００２９】
実施例２，３と同様に，濃度３１３の値と，濃度６２５の値とから，補間法（内挿法）の計算により，ウイルス感染を９０パーセント抑制する有効濃度及び９９．９パーセント抑制する有効濃度を求めることができる。その補間法の計算を表８に示す。
【００３０】
【表８】
【実施例６】
【００３１】
図５は，Phyto-IgAが致死量のインフルエンザウイルスを感染させられたネズミを助命する様を示すグラフである。試験には，ネズミに致死量のインフルエンザウイルス（H1N1）を，Phyto-IgAの非存在あるいは存在下で脳内に感染させ，その後の延命率を日毎に観察するというin vivoモデルを用いた。図５で横軸は感染後の経過日数を，縦軸は宿主動物の生存率を示す。
【００３２】
Phyto-IgAの非存在（白丸）下においては，ウイルス感染６日以降宿主動物は死滅し，最終的に感染から逃れたものは３０パーセントに過ぎなかった。一方，Phyto-IgAの存在（黒丸）下においては，ウイルス感染６日以降死滅する宿主動物は１匹も発生せず，最終的に感染から逃れたものは全例（１００パーセント）であった。これは，Phyto-IgAがウイルス感染を抑制したことを示している。この結果から，Phyto-IgAがインフルエンザウイルス感染から宿主動物を助命することが明らかとなった。これは実施例１から３までの試験管レベルの結果を動物レベルで証明したものといえる。なお，この実験では米ぬかから抽出したPhyto-IgAを用いた。
【実施例７】
【００３３】
近年，H5N1ウイルスにより誘導される過剰免疫反応（サイトカインストーム：cytokine storms）が問題とされ，さらにＳＡＲＳのときにも問題とされたが，本願発明に係るPhyto-IgAがサイトカインストームを回避する手段となりえるか否かを検討した。
【００３４】
試験には，IgA抗体産生細胞としてマウス脾臓細胞を用い，それを種々の濃度のPhyto-IgAと混合培養し，インフルエンザウイルスを感作させた場合と，感作させない場合とで，IgA抗体産生量を比較するというin vitroモデルを用いた。サイトカインストームを回避できるかどうかは，免疫反応の結果として誘導されるIgA抗体産生を抑制するかどうかで評価できる。
【００３５】
ウイルス不活体の調製は，インフルエンザH1N1ウイルスを宿主細胞で増殖後，ウイルス液をホルマリンで不活化することにより行う。脾臓細胞の調整は，ノーマルマウスから脾臓を取り出し（Day 14），脾臓細胞を調整し，５パーセント牛胎児血清（ＦＢＳ）を含むRPMI1640を用い，平底96well plateにて細胞培養を行う。検体はリグニンＰＢＳ溶液（５ｍｇ／ｍｌ）。試験スケジュールは，各リグニンＰＢＳ溶液（濃度：100，200，400μｇ／ｍｌ）及び不活化インフルエンザウイルスを混和し，１時間インキュベーション後，脾臓細胞（１×１０6／well）を添加し，摂氏３７度，５パーセントＣＯ2存在下で培養する（ｎ＝２）。陰性対照として，ウイルスフリー及びリグニンフリーを設定する。IgA測定は，マウスの脾臓細胞培養７日目の培養上清中のインフルエンザウイルス特異的IgAをELISAにて測定する。
【００３６】
図７はPhyto-IgAがウイルスの抗原性を中和することで、サイトカインストームを回避する様を示すグラフである。図中の横軸はPhyto-IgAの添加濃度を，縦軸はIgA抗体産生量を示す。Phyto-IgA無添加（0.0μｇ／ｍｌ）時におけるIgA抗体の産生量は，ウイルス存在（黒丸，Influenza virus +）下で約930ｐｇ／ｍｌ，ウイルス非存在（白丸，Influenza virus -）下で約130ｐｇ／ｍｌで，その間約800ｐｇ／ｍｌの違いが認められた。この産生量の違いは，ウイルス刺激が原因となって生合成された抗体量を指すといえる。この抗体産生には必ずサイトカインが関与し，ウイルス刺激が致死的になると，それを防衛しようとして急激な免疫反応が誘発され，サイトカインの大量放出，すなわちサイトカインストームが発生するものと考えられる。
【００３７】
このような条件で，ウイルス存在（黒丸，Influenza virus +）下で誘導されるIgA抗体の産生量は，Phyto-IgAの添加濃度が高くなるにつれて減少し，200μｇ／ｍｌ（200ppm）以上の濃度ではウイルス非存在のレベルにまで減少させられることが明らかとなった。すなわち，Phyto-IgAがウイルスの抗原性を中和し，ウイルス刺激で誘導されるIgA抗体産生を１００パーセント抑制したことを示している。これは，Phyto-IgA自身がIgA様の働きをすることで，脾臓細胞がIgA抗体を産生する必要がなくなったことを意味している。すなわち，Phyto-IgAによって過剰免疫反応（サイトカインストーム）の発生を回避できることが明らかとなった。Phyto-IgAは，ウイルスと非特異的に吸着し，その働きを失活させるため，ウイルスの種類に関係なく感染防御に奏功することが期待される。
【実施例８】
【００３８】
次に，Phyto-IgAのヘルペスウイルス（ＨＳＶ）に対する感染防御作用を検討した。ＨＳＶ感染によって形成されるプラークを計数するというin vitroモデルを用いた。その結果，Phyto-IgAは，キノコなどの抗腫瘍性多糖では抑制しきれないＨＳＶによるプラーク形成（増殖）を抑制することが明らかとなった（表９）。これは，Phyto-IgAがＨＳＶと結合することで，ウイルスの宿主細胞への吸着／侵入／増殖，すなわち感染を阻害した結果と考えられる。
【００３９】
【表９】
【実施例９】
【００４０】
Phyto-IgAの適応ウイルスとしては，粘膜感染を引き起こすロタウイルス，ポリオウイルス，インフルエンザウイルス，Ａ型肝炎ウイルス，Ｂ型肝炎ウイルス，ヘルペスウイルス，ノロウイルス等が挙げられる。
【実施例１０】
【００４１】
Phyto-IgAの適応剤形としては，口腔内で持続的に唾液に放出できるトローチ，あめ，ガム等が粘膜免疫を活性化する上で好ましい。
【００４２】
【表１０】
【００４３】
表１０は，Phyto-IgA Candyの栄養成分を示す。原材料は，砂糖，水飴，米ぬかから抽出したPhyto-IgA，いちご濃縮果汁，酸味料，香料，紫コーン色素である。この例では，飴１粒中のPhyto-IgAの含有量を０．５パーセントとした。
【００４４】
実験によると，ウイルス感染を９９．９パーセント阻害するのに必要なPhyto-IgAの濃度は５６０ppmである。Phyto-IgA Candy １粒の重量は３．５グラムなので，Phyto-IgAの含有量が０．５パーセントの場合には，１粒の飴に含有されるPhyto-IgAの量は１７，５ｍｇとなる。飴１粒が溶け終わるのに何もせずに（かんだりせずに）保持すれば約３０分であった。唾液は正常であれば１分あたり１ｍｌほど分泌されるので，３０分間で分泌される唾液量は３０ｍｌとなり，Phyto-IgAの唾液中濃度は，０．５８３ｍｇ／ｍｌ（５８３ｐｐｍ）となる。したがって，ウイルス感染を９９．９パーセント以上阻害する持続時間は飴１粒３０分間程度ということになる。
【実施例１１】
【００４５】
適応摂取量は，０．５パーセントから１．５パーセントの添加が好ましい。表１２及び図９は，抗ウイルス活性有効時間についての実験結果を示す。米ぬかから抽出したPhyto-IgAを０．５パーセント含む飴と，１．５パーセント含む飴とについてなめ始めてから１分，５分，１０分，２０分，３０分，４０分，５０分，６０分の唾液を採取して，Phyto-IgAの濃度を調べたものである。
【００４６】
【表１１】
【００４７】
この実験結果から９９.９パーセントウイルス感染を阻害する有効時間を補間法（内挿法）により計算して求めると，表１３に示すように，０．５パーセントの飴の場合は５４分，１．５パーセントの飴の場合は６８分と求まる。
【００４８】
【表１２】
【産業上の利用可能性】
【００４９】
飴，チューインガム，トローチなどに含有させることで，粘膜からのウイルス感染を防御することができる。適応動物としては，ヒト以外に，家畜，養鶏，競走馬，養魚等が挙げられる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウイルスの抗原性を中和し，イムノグロブリン様の働きを有する植物成分に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
動物の免疫細胞が作り出すタンパク質である「イムノグロブリン」は，植物には存在しないというのが定説である。
【特許文献１】特開平１０−６７６６９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本願発明者は，これまでの研究によって，植物が産生する感染防御成分の存在を解明した。本発明が解決しようとする課題は，ウイルスの抗原性を中和する植物成分を明らかにし，イムノグロブリン様の働きを有する植物成分を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
ヒトの食歴のある植物の皮から，分子量１５万から１８万の間であって，水溶性であり，エタノール不溶性の成分を抽出する。ヒトの食歴のある植物の皮は，じゃがいもの皮，米ぬか，小豆の皮，朝鮮人参の絞りかすを用いることができる。
【発明の効果】
【０００５】
粘膜感染を引き起こすロタウイルス，ポリオウイルス，インフルエンザウイルス，Ａ型肝炎ウイルス，Ｂ型肝炎ウイルス，ヘルペスウイルス，ノロウイルス等について抗原性を中和し，ウイルスの感染力を中和する。毒性をもたない範囲の濃度でウイルスを９５パーセント以上抑制する有効濃度を特定できる。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】図１はPhyto-IgAの分子量分布を示すＨＰＣＬチャートである。
【図２】図２はじゃがいもの皮から抽出したPhyto-IgAがインフルエンザウイルスの増殖を抑制する様を示す。イヌ腎臓由来細胞株ＭＤＣＫを宿主細胞として，インフルエンザウイルスＨ１Ｎ１の非感染あるいは感染下で，種々の濃度のPhyto-IgAと混合培養するin vitroモデルを用いた。
【図３】図３は米ぬかから抽出したPhyto-IgAがインフルエンザウイルスの増殖を抑制する様を示す。イヌ腎臓由来細胞株ＭＤＣＫを宿主細胞として，インフルエンザウイルスＨ１Ｎ１の非感染あるいは感染下で，種々の濃度のPhyto-IgAと混合培養するin vitroモデルを用いた。
【図４】図４は小豆皮から抽出したPhyto-IgAがインフルエンザウイルスの増殖を抑制する様を示す。イヌ腎臓由来細胞株ＭＤＣＫを宿主細胞として，インフルエンザウイルスＨ１Ｎ１の非感染あるいは感染下で，種々の濃度のPhyto-IgAと混合培養するin vitroモデルを用いた。
【図５】図５は朝鮮人参滓から抽出したPhyto-IgAがインフルエンザウイルスの増殖を抑制する様を示す。イヌ腎臓由来細胞株ＭＤＣＫを宿主細胞として，インフルエンザウイルスＨ１Ｎ１の非感染あるいは感染下で，種々の濃度のPhyto-IgAと混合培養するin vitroモデルを用いた。
【図６】図６はPhyto-IgAが致死量のインフルエンザウイルスを感染させられたネズミを助命する様を示すグラフである。
【図７】図７はPhyto-IgAがウイルスの抗原性を中和する様を示すグラフである。
【図８】図８はPhyto-IgA Candy の抗ウイルス活性有効時間に関する実験結果を表すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
以下，図面を参照しつつ，本発明の実施形態について説明する。
【０００８】
本発明の植物成分は，後述するように免疫グロブリン様の働きを有すること，そして，粘膜感染を起こすウイルスの感染力を中和する効果をもつことからその機能がIgAに類似する。そこで，本発明の発明者は，本願発明に係る植物成分を植物性イムノグロブリンＡ（Phytoimmunoglobulin A, Phyto-IgA）と名づけた。本願発明者の造語である。なお，IgAの分子量は，約１６万である。
【０００９】
Phyto-IgAを製造するには，ヒトの食歴のある植物をエタノールで脱脂後、弱アルカリ水で抽出し，その後，該抽出液を遠心濃縮フィルターにかけることにより，分子量１５万から１８万の間の成分を得ることによる。ヒトの食歴のある植物は，じゃがいもの皮，米ぬか，小豆の皮，朝鮮人参の絞りかすを用いることができる。ヒトの食歴は，人類が有史以来，食物としたことのあるものをいう。
【実施例１】
【００１０】
〔Phyto-IgAの製造〕Phyto-IgAは、原料となるヒトの食歴のある植物をエタノールで脱脂後、１０倍量の２．５％炭酸水素水（ＮａＨＣＯ３）で９０℃１時間加熱抽出する。該抽出液を０．４５ミクロンのメンブランフィルター（株式会社ミリポア製）でろ過し、株式会社ハイテックの提供するタンパク濃縮・脱塩用遠心ろ過ユニット（ビバスピン4，製品番号VS0443，分画分子量100,000 MWCO）を用いて濃縮分画した。
【００１１】
分画したPhyto-IgAの分子量分布を図１に示す。図より、米ぬか（Ｂ）、小豆皮（Ｃ）、じゃがいも皮（Ｄ）、朝鮮人参滓（Ｅ）から、分子量マーカーとして用いたγイムノグロブリン（Ａ）と同程度の分子量分布を有するPhyto-IgAを分画できたことを見て取ることができる。なお、分子量の測定は、サイズ排除クロマトグラフィ(SEC)カラム（昭和電工製）を用いて、ＨＰＬＣ法（溶媒：水、流速：１ｍｌ／ｍｉｎ，カラム温度：３０℃）で行った。
【実施例２】
【００１２】
次に，Phyto-IgAがインフルエンザウイルスの増殖を抑制することを示す。この試験には，イヌ腎臓由来細胞株ＭＤＣＫを宿主細胞として，インフルエンザウイルス（H1N1）の非感染あるいは感染下で，種々の濃度（0.15〜2.5ｍｇ／ｍｌ）のPhyto-IgAと混合培養するin vitroモデルを用いた。その結果を表１及び図２に示す。ここでは，じゃがいもの皮から抽出したPhyto-IgAを用いた。
【００１３】
【表１】
【００１４】
[試験方法]ＭＤＣＫ細胞を２×１０4/mlに調製し１０％ＦＣＳ添加ＥＭＥＭ培地にて９６穴マイクロカルチャープレートに100μＬづつ播種した。３７℃，５％ＣＯ2条件下で２日間培養した。培養液を除去し，ＰＢＳで洗浄した後，インフルエンザウイルス（Inf/A H1N1)液と試料を含む培地をＭＤＣＫ細胞へ接種し，34.5℃で３日間培養した。培養液を除去後100μＬのＥＭＥＭ培地（ＦＣＳ非添加）を加えた。34.5℃にて２日間培養後上清を除去しＭＴＴ法で測定した（生存細胞をブランクと比較し細胞生存率を算出した）。
【００１５】
表１の結果をグラフに描いたのが図２である。図２の横軸はPyhto-IgAの添加濃度を，縦軸は宿主の生存率を示す。インフルエンザウイルスの非感染（図２の白抜きの縦棒，virus non-infected）下においては，宿主細胞の死滅は全く観察されなかった。このことは，Phyto-IgAは0.15〜2.5ｍｇ／ｍｌの濃度では宿主細胞に毒性がないことを示すものである。
【００１６】
一方，インフルエンザウイルスの感染（図２の黒色の縦棒，virus infected）下においては，Phyto-IgAが無添加では宿主細胞は１００パーセント死滅したことを見て取れる。しかし，Phyto-IgAの添加濃度が高くなるにつれて宿主細胞の生存率が増加した。すなわち，Phyto-IgAが濃度依存的にウイルス感染を抑制したことを示している。
【００１７】
濃度３１３の値と，濃度６２５の値とから，補間法（内挿法）の計算により，ウイルス感染を９５パーセント抑制する有効濃度及び９９．９パーセント抑制する有効濃度を求めることができる。その補間法の計算を表２に示す。
【００１８】
【表２】
【実施例３】
【００１９】
実施例２と同様の実験を米ぬかから抽出したPhyto-IgAについて行ったものを表３及び図３に示す。試験方法は実施例２と同じである。
【００２０】
【表３】
【００２１】
実施例２と同様に，濃度３１３の値と，濃度６２５の値とから，補間法（内挿法）の計算により，ウイルス感染を９０パーセント抑制する有効濃度及び９９．９パーセント抑制する有効濃度を求めることができる。その補間法の計算を表４に示す。
【００２２】
【表４】
【実施例４】
【００２３】
実施例２，３と同様の実験を小豆皮から抽出したPhyto-IgAについて行ったものを表５及び図４に示す。試験方法は実施例２，３と同じである。
【００２４】
【表５】
【００２５】
実施例２，３と同様に，濃度３１３の値と，濃度６２５の値とから，補間法（内挿法）の計算により，ウイルス感染を９０パーセント抑制する有効濃度及び９９．９パーセント抑制する有効濃度を求めることができる。その補間法の計算を表６に示す。
【００２６】
【表６】
【実施例５】
【００２７】
実施例２，３と同様の実験を朝鮮人参滓から抽出したPhyto-IgAについて行ったものを表７及び図５に示す。試験方法は実施例２，３，４と同じである。
【００２８】
【表７】
【００２９】
実施例２，３と同様に，濃度３１３の値と，濃度６２５の値とから，補間法（内挿法）の計算により，ウイルス感染を９０パーセント抑制する有効濃度及び９９．９パーセント抑制する有効濃度を求めることができる。その補間法の計算を表８に示す。
【００３０】
【表８】
【実施例６】
【００３１】
図５は，Phyto-IgAが致死量のインフルエンザウイルスを感染させられたネズミを助命する様を示すグラフである。試験には，ネズミに致死量のインフルエンザウイルス（H1N1）を，Phyto-IgAの非存在あるいは存在下で脳内に感染させ，その後の延命率を日毎に観察するというin vivoモデルを用いた。図５で横軸は感染後の経過日数を，縦軸は宿主動物の生存率を示す。
【００３２】
Phyto-IgAの非存在（白丸）下においては，ウイルス感染６日以降宿主動物は死滅し，最終的に感染から逃れたものは３０パーセントに過ぎなかった。一方，Phyto-IgAの存在（黒丸）下においては，ウイルス感染６日以降死滅する宿主動物は１匹も発生せず，最終的に感染から逃れたものは全例（１００パーセント）であった。これは，Phyto-IgAがウイルス感染を抑制したことを示している。この結果から，Phyto-IgAがインフルエンザウイルス感染から宿主動物を助命することが明らかとなった。これは実施例１から３までの試験管レベルの結果を動物レベルで証明したものといえる。なお，この実験では米ぬかから抽出したPhyto-IgAを用いた。
【実施例７】
【００３３】
近年，H5N1ウイルスにより誘導される過剰免疫反応（サイトカインストーム：cytokine storms）が問題とされ，さらにＳＡＲＳのときにも問題とされたが，本願発明に係るPhyto-IgAがサイトカインストームを回避する手段となりえるか否かを検討した。
【００３４】
試験には，IgA抗体産生細胞としてマウス脾臓細胞を用い，それを種々の濃度のPhyto-IgAと混合培養し，インフルエンザウイルスを感作させた場合と，感作させない場合とで，IgA抗体産生量を比較するというin vitroモデルを用いた。サイトカインストームを回避できるかどうかは，免疫反応の結果として誘導されるIgA抗体産生を抑制するかどうかで評価できる。
【００３５】
ウイルス不活体の調製は，インフルエンザH1N1ウイルスを宿主細胞で増殖後，ウイルス液をホルマリンで不活化することにより行う。脾臓細胞の調整は，ノーマルマウスから脾臓を取り出し（Day 14），脾臓細胞を調整し，５パーセント牛胎児血清（ＦＢＳ）を含むRPMI1640を用い，平底96well plateにて細胞培養を行う。検体はリグニンＰＢＳ溶液（５ｍｇ／ｍｌ）。試験スケジュールは，各リグニンＰＢＳ溶液（濃度：100，200，400μｇ／ｍｌ）及び不活化インフルエンザウイルスを混和し，１時間インキュベーション後，脾臓細胞（１×１０6／well）を添加し，摂氏３７度，５パーセントＣＯ2存在下で培養する（ｎ＝２）。陰性対照として，ウイルスフリー及びリグニンフリーを設定する。IgA測定は，マウスの脾臓細胞培養７日目の培養上清中のインフルエンザウイルス特異的IgAをELISAにて測定する。
【００３６】
図７はPhyto-IgAがウイルスの抗原性を中和することで、サイトカインストームを回避する様を示すグラフである。図中の横軸はPhyto-IgAの添加濃度を，縦軸はIgA抗体産生量を示す。Phyto-IgA無添加（0.0μｇ／ｍｌ）時におけるIgA抗体の産生量は，ウイルス存在（黒丸，Influenza virus +）下で約930ｐｇ／ｍｌ，ウイルス非存在（白丸，Influenza virus -）下で約130ｐｇ／ｍｌで，その間約800ｐｇ／ｍｌの違いが認められた。この産生量の違いは，ウイルス刺激が原因となって生合成された抗体量を指すといえる。この抗体産生には必ずサイトカインが関与し，ウイルス刺激が致死的になると，それを防衛しようとして急激な免疫反応が誘発され，サイトカインの大量放出，すなわちサイトカインストームが発生するものと考えられる。
【００３７】
このような条件で，ウイルス存在（黒丸，Influenza virus +）下で誘導されるIgA抗体の産生量は，Phyto-IgAの添加濃度が高くなるにつれて減少し，200μｇ／ｍｌ（200ppm）以上の濃度ではウイルス非存在のレベルにまで減少させられることが明らかとなった。すなわち，Phyto-IgAがウイルスの抗原性を中和し，ウイルス刺激で誘導されるIgA抗体産生を１００パーセント抑制したことを示している。これは，Phyto-IgA自身がIgA様の働きをすることで，脾臓細胞がIgA抗体を産生する必要がなくなったことを意味している。すなわち，Phyto-IgAによって過剰免疫反応（サイトカインストーム）の発生を回避できることが明らかとなった。Phyto-IgAは，ウイルスと非特異的に吸着し，その働きを失活させるため，ウイルスの種類に関係なく感染防御に奏功することが期待される。
【実施例８】
【００３８】
次に，Phyto-IgAのヘルペスウイルス（ＨＳＶ）に対する感染防御作用を検討した。ＨＳＶ感染によって形成されるプラークを計数するというin vitroモデルを用いた。その結果，Phyto-IgAは，キノコなどの抗腫瘍性多糖では抑制しきれないＨＳＶによるプラーク形成（増殖）を抑制することが明らかとなった（表９）。これは，Phyto-IgAがＨＳＶと結合することで，ウイルスの宿主細胞への吸着／侵入／増殖，すなわち感染を阻害した結果と考えられる。
【００３９】
【表９】
【実施例９】
【００４０】
Phyto-IgAの適応ウイルスとしては，粘膜感染を引き起こすロタウイルス，ポリオウイルス，インフルエンザウイルス，Ａ型肝炎ウイルス，Ｂ型肝炎ウイルス，ヘルペスウイルス，ノロウイルス等が挙げられる。
【実施例１０】
【００４１】
Phyto-IgAの適応剤形としては，口腔内で持続的に唾液に放出できるトローチ，あめ，ガム等が粘膜免疫を活性化する上で好ましい。
【００４２】
【表１０】
【００４３】
表１０は，Phyto-IgA Candyの栄養成分を示す。原材料は，砂糖，水飴，米ぬかから抽出したPhyto-IgA，いちご濃縮果汁，酸味料，香料，紫コーン色素である。この例では，飴１粒中のPhyto-IgAの含有量を０．５パーセントとした。
【００４４】
実験によると，ウイルス感染を９９．９パーセント阻害するのに必要なPhyto-IgAの濃度は５６０ppmである。Phyto-IgA Candy １粒の重量は３．５グラムなので，Phyto-IgAの含有量が０．５パーセントの場合には，１粒の飴に含有されるPhyto-IgAの量は１７，５ｍｇとなる。飴１粒が溶け終わるのに何もせずに（かんだりせずに）保持すれば約３０分であった。唾液は正常であれば１分あたり１ｍｌほど分泌されるので，３０分間で分泌される唾液量は３０ｍｌとなり，Phyto-IgAの唾液中濃度は，０．５８３ｍｇ／ｍｌ（５８３ｐｐｍ）となる。したがって，ウイルス感染を９９．９パーセント以上阻害する持続時間は飴１粒３０分間程度ということになる。
【実施例１１】
【００４５】
適応摂取量は，０．５パーセントから１．５パーセントの添加が好ましい。表１２及び図９は，抗ウイルス活性有効時間についての実験結果を示す。米ぬかから抽出したPhyto-IgAを０．５パーセント含む飴と，１．５パーセント含む飴とについてなめ始めてから１分，５分，１０分，２０分，３０分，４０分，５０分，６０分の唾液を採取して，Phyto-IgAの濃度を調べたものである。
【００４６】
【表１１】
【００４７】
この実験結果から９９.９パーセントウイルス感染を阻害する有効時間を補間法（内挿法）により計算して求めると，表１３に示すように，０．５パーセントの飴の場合は５４分，１．５パーセントの飴の場合は６８分と求まる。
【００４８】
【表１２】
【産業上の利用可能性】
【００４９】
飴，チューインガム，トローチなどに含有させることで，粘膜からのウイルス感染を防御することができる。適応動物としては，ヒト以外に，家畜，養鶏，競走馬，養魚等が挙げられる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトの食歴のある植物から抽出した分子量が１５万から１８万の間の成分であって，ウイルスの抗原性を中和する植物成分。
【請求項２】
ヒトの食歴のある植物から抽出した分子量が１５万から１８万の間の成分であって，ウイルスの感染力を中和する植物成分。
【請求項３】
ヒトの食歴のある植物から抽出した分子量が１５万から１８万の間の成分であって，毒性をもたない範囲の濃度でウイルスを９５パーセント以上抑制する有効濃度を特定できる植物成分。
【請求項４】
請求項１，２又は３のいずれか一に記載した植物成分であって，前記植物が，じゃがいもの皮，米ぬか，小豆の皮，朝鮮人参の絞りかすからなる群のうちのいずれか一であることを特徴とする植物成分。
【請求項５】
請求項１，２又は３のいずれか一に記載した植物成分であって，前記ウイルスが，ロタウイルス，ポリオウイルス，インフルエンザウイルス，Ａ型肝炎ウイルス，Ｂ型肝炎ウイルス，ヘルペスウイルス，ノロウイルスからなる群のうちのいずれか一であることを特徴とする植物成分。
【請求項１】
ヒトの食歴のある植物から抽出した分子量が１５万から１８万の間の成分であって，ウイルスの抗原性を中和する植物成分。
【請求項２】
ヒトの食歴のある植物から抽出した分子量が１５万から１８万の間の成分であって，ウイルスの感染力を中和する植物成分。
【請求項３】
ヒトの食歴のある植物から抽出した分子量が１５万から１８万の間の成分であって，毒性をもたない範囲の濃度でウイルスを９５パーセント以上抑制する有効濃度を特定できる植物成分。
【請求項４】
請求項１，２又は３のいずれか一に記載した植物成分であって，前記植物が，じゃがいもの皮，米ぬか，小豆の皮，朝鮮人参の絞りかすからなる群のうちのいずれか一であることを特徴とする植物成分。
【請求項５】
請求項１，２又は３のいずれか一に記載した植物成分であって，前記ウイルスが，ロタウイルス，ポリオウイルス，インフルエンザウイルス，Ａ型肝炎ウイルス，Ｂ型肝炎ウイルス，ヘルペスウイルス，ノロウイルスからなる群のうちのいずれか一であることを特徴とする植物成分。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公開番号】特開２０１１−１２１９１８（Ｐ２０１１−１２１９１８Ａ）
【公開日】平成２３年６月２３日（２０１１．６．２３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−２８２３２８（Ｐ２００９−２８２３２８）
【出願日】平成２１年１２月１３日（２００９．１２．１３）
【出願人】（３０５０２９６８９）有限会社 生薬発酵研究所 (4)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年６月２３日（２０１１．６．２３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１２月１３日（２００９．１２．１３）
【出願人】（３０５０２９６８９）有限会社 生薬発酵研究所 (4)
【Ｆターム（参考）】
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