ウシ胎盤から免疫調節ポリペプチドを分離し精製するための方法
【課題】本発明の目的は、ウシ胎盤から免疫調節ポリペプチドを抽出するための方法を提供することである。本発明の別の目的は、ウシ胎盤から抽出された免疫調節ポリペプチドを提供することである。
【解決手段】本発明は、ウシ胎盤から免疫調節ポリペプチドを分離し精製するための方法であって、陰イオン交換クロマトグラフィー、ゲル排除クロマトグラフィー、および逆相高速液体クロマトグラフィーのステップを使用して、ウシ胎盤から免疫調節ポリペプチドを分離し精製し、ＭＴＴ法によってｉｎ ｖｉｔｒｏでのリンパ球増殖を刺激する活性を同定し、次いでＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによって分子量を測定し、ＣＩＥＦによって等電点を測定し、タンパク質配列決定のための分析器によってアミノ酸配列を決定することを特徴とする方法を提供する。本発明による方法によって得られた免疫調節ポリペプチドは、９０％超の純度を有するので、その生物学的利用能は、医薬品の基準に達することができる。
【解決手段】本発明は、ウシ胎盤から免疫調節ポリペプチドを分離し精製するための方法であって、陰イオン交換クロマトグラフィー、ゲル排除クロマトグラフィー、および逆相高速液体クロマトグラフィーのステップを使用して、ウシ胎盤から免疫調節ポリペプチドを分離し精製し、ＭＴＴ法によってｉｎ ｖｉｔｒｏでのリンパ球増殖を刺激する活性を同定し、次いでＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによって分子量を測定し、ＣＩＥＦによって等電点を測定し、タンパク質配列決定のための分析器によってアミノ酸配列を決定することを特徴とする方法を提供する。本発明による方法によって得られた免疫調節ポリペプチドは、９０％超の純度を有するので、その生物学的利用能は、医薬品の基準に達することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物学および薬剤抽出の分野に関する。より詳細には、本発明は、ウシ胎盤から免疫調節ポリペプチドを分離し精製するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
より多くの人々が、自身の生活を現代的な生活スタイルに変えるにつれて、免疫の低下により疾患が生ずる可能性が出て来る。免疫を高めることは、疲労に耐え、作業効率を改善し、疾患を予防するのに欠くことのできない手法の１つである。
【０００３】
胎盤の免疫調節因子の研究は、中国から始まった。その活性成分は、健康な産褥胎盤から抽出された。１９８５年、ＬＩＵ Ｙｕｅｘｉｎは、均質化−透析によって初めて、健康な産褥胎盤から小分子活性物質を抽出することを開示し、この活性物質を胎盤因子と名付けた（非特許文献１参照）。１９９４年、ＨＵＡＮＧ Ｃｈｕｈｕａ他（非特許文献２参照）は、下記のステップ、すなわち新鮮な胎盤を洗浄し切断するステップ、ホモジネートを２倍の生理食塩水で調製するステップ、遠心分離を行うステップ、分子量カットオフが１００００の限外濾過膜によって上澄みを限外濾過するステップ、および濾液を滅菌し分散させるステップとによって、胎盤注射液を得た。１９９６年、ＺＨＡＮＧ Ｘｕｅｒｏｎｇ他（非特許文献３参照）は、胎盤の筋膜を切り取り、無菌水で洗浄し、切断し計量し、１：１の生理食塩水を用いて高速組織ホモジナイザにより均質化物を調製し、次いでこの均質化物を冷蔵庫内で４８時間超−２０℃で凍結し、２５℃の水浴中で解凍し、水晶体破砕法を１５分間施し、複数回の凍結−解凍処理を行い、低温で遠心分離し、上澄みを透析し、膜で濾過することによって、胎盤注射液を得た。２００１年、ＸＵ Ｄａｉｄｉ他（非特許文献４参照）は、ＬＩＵ Ｙｕｅｘｉｎを参照しながら胎盤免疫調節因子を調製した。
【０００４】
これらの研究は、ヒト胎盤免疫調節因子の主成分が、小分子ポリペプチドであることを示している。大量の動物実験および臨床適用例は、胎盤免疫調節因子が安全で、無毒性であり、抗原性がなく、長期使用により抗体が誘導されて活性が低下することがなく、胎盤免疫調節因子は、安全で効果が高い免疫調節剤および免疫賦活剤であることを示している。しかし、胎盤免疫調節因子に関する現在の研究は、ほとんどがその機能および適用例に焦点を当てており、その主要な活性成分をどのように分離し精製するかについての報告は、ほとんど見られない。
【０００５】
新しい種類の胎盤供給源として、ウシ胎盤は、本来の構造および成分がヒトに類似しているが、これらの間に相違点は確かに存在する。したがって、理論上および技術上の両方において、ヒト胎盤免疫調節因子に関する研究を参照しつつも、異なる技術を用いて、ウシ胎盤から免疫調節因子を分離し精製することが重要である。
【非特許文献１】ＬＩＵ Ｙｕｅｘｉｎ，Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｓｔｕｄｙ ｏｎ Ｐｌａｃｅｎｔａ Ｆａｃｔｏｒ−−Ａ Ｎｅｗ Ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒ，Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９８５，１（５）
【非特許文献２】ＨＵＡＮＧ Ｃｈｕｈｕａ他，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｔｕｄｙ ｏｆ Ｐｌａｃｅｎｔａ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ ｏｎ Ｐｈｙｓｉｃａｌ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ａｎｄ Ｂｉｏａｃｔｉｖｉｔｙ，ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ，１９９５，２（２）
【非特許文献３】ＺＨＡＮＧ Ｘｕｅｒｏｎｇ他，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｓｔｕｄｙ ｏｎ Ｐｌａｃｅｎｔａ Ｉｍｍｕｎｏ−ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒ，ＧＵＡＮＧＸＩ ＳＣＩＥＮＣＥＳ，１９９６，３
【非特許文献４】ＸＵ Ｄａｉｄｉ他，Ｐｒｅｐａｒｉｎｇ Ｐｌａｃｅｎｔａ Ｉｍｍｕｎｏ−ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒ，Ｇｕａｎｇｘｉ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ，２００１，８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、ウシ胎盤から免疫調節ポリペプチドを抽出するための方法を提供することである。
【０００７】
本発明の別の目的は、ウシ胎盤から抽出された免疫調節ポリペプチドを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
イオン交換クロマトグラフィーは、固定相としてイオン交換剤を用い、移動相として液体を用いるシステムにおいて実施されることが知られている。イオン交換剤は、母材、イオン基、および対イオンを含む。イオン交換剤と、液体中のイオンまたはイオン化合物との反応は、主にイオン交換に基づいており、またはイオン交換剤のイオン基と溶液中のイオンまたはイオン化合物との吸着に基づいている。イオン交換クロマトグラフィーは、電荷状態（または極性）の相違に基づいて実施される。適切なイオン交換剤は、対象の解離性または電荷状態によって選択されるべきである。吸着および溶出の条件は制御されるべきであり、その主な条件は、イオン強度と溶出剤のｐＨ値である。次いで混合物中の成分を、親和性に応じて順次、クロマトグラフィー・カラムから溶出する。
【０００９】
ゲル排除クロマトグラフィーは、分子が低流速でクロマトグラフィー・カラム内を通過する間の、分子の垂直下向きの移動と無方向性拡散とによって実施される。巨大分子は、その直径が大きく、ゲル粒子の小さい孔の中ではなく粒子間の空間内に拡がり、溶出中により速く垂直方向に移動する。しかし小さい分子は、ゲル粒子間の空間内に拡散するだけではなく、ゲル粒子の内部にも進入する。垂直移動中、小分子は、粒子内部から粒子間の空間へと拡散し、次いでその他の粒子内部に進入する。拡散および進入の運動は、連続的なものである。したがって、小分子の垂直移動の速度は、巨大分子の場合よりも遅い。その結果、巨大分子、中型分子、小分子は、順に、かつ首尾よく分離してカラムの外に出て行く。ゲル排除クロマトグラフィーの明らかな利点は、使用される担体が不活性であり、電荷を持たず、吸着性が弱く、操作環境が穏やかであり、操作温度範囲が広く、有機溶媒を必要とせず、化合物の物理的および化学的性質を維持するのに特別な利点があることである。
【００１０】
逆相クロマトグラフィーは、分離に広く使用される。このシステムでは、溶質が、主に疎水的相互作用によって保持される。疎水的相互作用とは、無極性溶質が水溶液中にある場合、溶質分子間、または溶質分子と水分子との間の相互作用が、水分子間よりもずっと少ないことを意味する。したがって、溶質分子を容易に溶液から除去することができる。種々の化合物は、種々の疎水特性に応じて異なる保持時間を有し、その結果、これらの化合物が分離される。
【００１１】
本発明者は、多くの研究を行っており、これら３つの方法、すなわち陰イオン交換クロマトグラフィー、ゲル排除クロマトグラフィー、および逆相高速液体クロマトグラフィーを一緒に創造的に組み合わせて、免疫調節ポリペプチドをウシ胎盤から抽出し、分子量および等電点と、分離され精製された免疫調節ポリペプチドの配列を決定した。
【００１２】
本発明は、ウシ胎盤から分離された免疫調節ポリペプチドに関する。免疫調節ポリペプチドの特徴は、下記の通りである：ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間質量分析）によって決定された分子量が２１３３．５２Ｄａであり、ＣＩＥＦ（キャピラリー等電点電気泳動）によって決定された等電点が３．８２であり、４９１−タンパク質配列決定器（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，米国）によって決定されたＴｙｒ−Ｘ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｘ−Ｔｈｒ配列であって、Ｘはアミノ酸である。
【００１３】
また本発明は、ウシ胎盤から分離された免疫調節ポリペプチドを調製するための方法にも関する。前記方法は、当業者に知られる下記のステップ、すなわち新鮮なウシ胎盤を洗浄し切断するステップと、胎盤の２倍（ｗ／ｖｏｌ．）のｐＨ６．８〜７．５のリン酸緩衝液を添加するステップと、ホモジネートを調製するステップと、１２０００ｒ／ｍで遠心分離するステップと、沈殿させるステップと、分子量カットオフが１００００の限外濾過膜によって上澄みを限外濾過するステップと、芳香族ポリアミド・ナノ濾過膜で脱塩するステップと、凍結乾燥するステップとを含み、したがって、免疫調節ポリペプチドを含有する凍結乾燥された粉末サンプルが得られる。この方法は、前記凍結乾燥された粉末をリン酸緩衝液中で溶解するステップと、陰イオン交換クロマトグラフィー、ゲル排除クロマトグラフィー、および逆相高速液体クロマトグラフィーを使用して、溶液を分離するステップと、ＲＰ−ＨＰＬＣおよびキャピラリー電気泳動（この結果は、両者とも、シングル・ピークであった。）によって逆相高速液体クロマトグラフィーから収集された活性物質を決定するステップと、次いでＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳにより分子量を、ＣＩＥＦにより等電点を、およびタンパク質配列決定機によりペプチド配列を、決定するステップも含む。
【００１４】
本発明の実施形態によれば、前記陰イオン交換クロマトグラフィーは、溶液サンプルとして１０〜３０ｍｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ６．８〜７．５）のリン酸緩衝液中に前記凍結乾燥粉末を４〜１０：１（ｗ：ｖｏｌ）で溶解し、この溶液サンプルを、０．５〜１．５ｍＬ／分の流速で陰イオン交換カラムに投入し、０．５〜１．５ｍＬ／分の流速で勾配溶出する。前記勾配溶出は、溶出溶液Ａが、リン酸緩衝液１０〜３０ｍｏｌ／Ｌであり、溶出溶液Ｂが、溶液Ａに０．５〜１．５ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌを添加することによって調製された溶液であり、０〜６００分では溶液Ａで溶出し、６００〜１０００分では０〜１００％の溶液Ｂで溶出する。ｉｎ ｖｉｔｒｏでのリンパ球増殖の刺激を介したＭＴＴ法による決定が行われ、スクリーニングが行われ、そして、陰イオン交換クロマトグラフィーによって分離した後に、免疫調節ポリペプチドを含有する成分が収集される。
【００１５】
前記凍結乾燥粉末と、この粉末を溶解するのに使用される緩衝液との比が、４〜８：１（ｗ：ｖｏｌ．）であることが好ましく、前記比が５〜８：１であることがより好ましい。
【００１６】
また、本発明による凍結乾燥粉末を溶解するのに用いられる緩衝液は、Ｎａ２ＨＰＯ４−ＮａＨ２ＰＯ４、Ｋ２ＨＰＯ４−ＫＨ２ＰＯ４、Ｋ２ＨＰＯ４−ＮａＨ２ＰＯ４、および／またはＮａ２ＨＰＯ４−ＫＨ２ＰＯ４溶液から選択された、１種または複数の溶液である。
【００１７】
本発明の別の実施形態によれば、前記凍結乾燥粉末溶液サンプルは、１０〜３０ｍｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ６．８〜７．５）のＮａ２ＨＰＯ４−ＮａＨ２ＰＯ４緩衝液である。
【００１８】
また、陰イオン交換クロマトグラフィーによって用いられる溶出溶液Ａは、Ｎａ２ＨＰＯ４−ＮａＨ２ＰＯ４、Ｋ２ＨＰＯ４−ＫＨ２ＰＯ４、Ｋ２ＨＰＯ４−ＮａＨ２ＰＯ４、およびＮａ２ＨＰＯ４−ＫＨ２ＰＯ４溶出溶液から選択された、１種または複数の溶液である。
【００１９】
本発明の別の実施形態によれば、前記ゲル排除クロマトグラフィーは、以下の条件で行われる。即ち、陰イオン交換クロマトグラフィーから収集された免疫調節ポリペプチド成分を、８〜１２ｍＬ／時の流速で、１０〜３０ｍｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ６．８〜７．５）のリン酸緩衝液である移動相で、ゲル排除カラム上に直接投入し、８〜１２ｍＬ／時の流速で、同じ勾配溶出により溶出し、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのリンパ球増殖の刺激を介したＭＴＴ法による決定が行われ、スクリーニングが行われ、そして、陰イオン交換クロマトグラフィーによって分離した後に、免疫調節ポリペプチドを含有する成分が収集される。
【００２０】
前記ゲル排除カラムは、その長さ／直径の比が６０〜９０であり、サンプルの体積は、カラム床の１〜１０％に達する。
【００２１】
ゲル排除カラムで使用される前記移動相は、Ｎａ２ＨＰＯ４−ＮａＨ２ＰＯ４、Ｋ２ＨＰＯ４−ＫＨ２ＰＯ４、Ｋ２ＨＰＯ４−ＮａＨ２ＰＯ４、およびＮａ２ＨＰＯ４−ＫＨ２ＰＯ４溶液から選択された、１種または複数の溶液であることが好ましい。
【００２２】
本発明の別の実施形態によれば、前記逆相高速液体クロマトグラフィーは、以下の条件で行われる。即ち、ゲル排除クロマトグラフィーから収集された免疫調節ポリペプチド成分を、逆相高速液体クロマトグラフィー・カラムに、０．８〜１．２ｍＬ／分の流速で、直接投入し、移動相Ａは、０．０１〜０．１％のトリフルオロ酢酸を含む５〜１０％のアセトニトリルであり、移動相Ｂは、０．０１〜０．１％のトリフルオロ酢酸を含む４０〜６０％のアセトニトリルであり、０〜８分は溶液Ａで、８〜１２分は溶液Ｂ（０〜１００％）で、１２〜１６分は溶液Ｂで、流速０．８〜１．２ｍＬ／時で勾配溶出するように行われる。
【００２３】
前記逆相高速液体クロマトグラフィー・カラムは、その長さ／直径の比が２５〜５０であり、サンプルの体積は、カラム床の場合の１〜１０％に達する。
【００２４】
本発明で使用される前記移動相Ａは、０．０２〜０．０８％のトリフルオロ酢酸を含む５〜８％のアセトニトリルであり、移動相Ｂは、０．０２〜０．０８％のトリフルオロ酢酸を含む４０〜６０％のアセトニトリルであることが好ましい。
【００２５】
本発明の別の実施形態によれば、前記陰イオン交換カラムは、ジエチルアミノエチルで官能化された、アガロースＤＥＡＥセファロースＣＬ−６Ｂ、ＤＥＡＥ−セファロースＦＦ、あるいはグルカンＤＥＡＥ−セファデックスＡ−２５またはＤＥＡＥ−セファデックスＡ−５０から選択された陰イオン交換媒体を備えている。
【００２６】
前記陰イオン交換カラムは、ＤＥＡＥセファロースＣＬ−６Ｂ、ＤＥＡＥ−セファロースＦＦ、またはＤＥＡＥ−セファデックスＡ−２５を備えていることが好ましい。
【００２７】
本発明の別の実施形態によれば、前記ゲル排除クロマトグラフィー・カラムは、不活性多孔質網状構造を有するグルカン セファデックスＧ−２５、セファデックスＧ−５０、あるいはポリアクリルアミン・ゲル バイオ−ゲル−Ｐ−４、バイオ−ゲル−Ｐ−６、またはバイオ−ゲル−Ｐ−１０であり、タンパク質混合物中の物質を、分子のサイズに基づいて分離する。
【００２８】
前記ゲル排除クロマトグラフィー・カラムは、セファデックスＧ−２５、セファデックスＧ−５０、バイオ−ゲル−Ｐ−４、およびバイオ−ゲル−Ｐ−６から選択された媒体を有するカラムであることが好ましい。
【００２９】
本発明の別の実施形態によれば、前記逆相高速液体クロマトグラフィー・カラムは、ＯＤＳ（オクタデシルシリル−シリカ）が充填されたＳｅｐｈａｓｉｌペプチドＣ１８またはポリマーＣ１８である。
【発明の効果】
【００３０】
本発明から得られた免疫調節ポリペプチドの純度は、９０％よりも高く、その生物学的利用能は、薬剤調製の基準を満たしている。
【００３１】
本発明から得られた免疫調節ポリペプチドは、免疫調節活性を有する健康食品を調製するための、十分な材料を提供する。
【００３２】
本発明から得られた免疫調節ポリペプチドの工業的収量は、１％であり、１００ｇのウシ胎盤から１ｇの免疫調節ポリペプチドが得られる（乾燥ベースに基づく）。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３３】
本発明をより明瞭に理解するために、これより以降、本発明の好ましい実施形態について、添付図面を参照しながら詳細に記述する。
（実験方法の詳細な記述）
（１）ｉｎ ｖｉｔｒｏでのリンパ球増殖の刺激
−細胞の培養−
１．脾臓リンパ球懸濁液の調製
滅菌条件下でマウスの脾臓を取り出し、リンパ球分離媒体によってリンパ球を分離し、細胞濃度を完全１６４０培養溶液で１×１０６／ｍｌに調節する。
【００３４】
２．実験構成
対照群および実験群を別々に設定して、全ての成分による脾臓リンパ球増殖の刺激の活性を確認する。
【００３５】
３．実験方法
１００μＬのマウス脾臓リンパ球懸濁液（１×１０６／ｍＬ）を、９６ウェル培養皿に添加する。１００μＬの生理食塩水／サンプルを、対照群および実験群に別々に添加する。均質になるまで穏かに混合し、インキュベータ内で、５％ＣＯ２中３７℃で６８時間培養する。２０μｌのＭＴＴを、滅菌条件下で全てのウェルに添加し、均質になるまで穏かに混合し、培養を４時間続け、１００μｌのジメチルスルホキシドを全てのウェルに添加し、室温に１０分間保ち、次いでＥＬＩＳＡにより５７０ｎｍで、全てのウェルのＯＤを測定する。
【００３６】
４．データ処理
実験群の脾臓リンパ球増殖率を、下式によって計算する。
Ｐの値を、分散分析によって計算し、有意差をＴ検定によって計算する。
【００３７】
（２）ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによる、免疫調節ポリペプチドの分子量の測定。
【００３８】
（３）ＣＩＥＦによる、免疫調節ポリペプチドの等電点の測定。
【００３９】
（４）タンパク質配列決定器による、免疫調節ポリペプチドの配列の決定。
【００４０】
（５）ＲＰ−ＨＰＬＣおよびキャピラリー電気泳動による測定。
前述の方法（２）〜（５）は、当業者に知られている通常の方法である。
【実施例】
【００４１】
（実施例１）
Ａ．胎盤の調製
新鮮なウシ胎盤を、洗浄し切断し、胎盤の２倍（ｗ／ｖ）のリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を添加し、ホモジネートを調製し、１２０００ｒ／ｍで３分間遠心分離し、沈殿させ、上澄みを、分子量カットオフが１００００の限外濾過膜によって限外濾過し、芳香族ポリアミド・ナノ濾過膜で脱塩し、凍結乾燥し、このようにして、免疫調節ポリペプチドを含有する凍結乾燥粉末サンプルを得た。
【００４２】
Ｂ．陰イオン交換クロマトグラフィー
３０ｍｇの凍結乾燥粉末を、濃度が２０ｍｍｏｌ／ＬのＮａ２ＨＰＯ４−ＮａＨ２ＰＯ４を含む５ｍｌのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解し、この溶液サンプルを、流速１ｍｌ／分で２．６×３５ｃｍのＤＥＡＥセファロースＣＬ−６Ｂ陰イオン交換カラムに投入し、次いで勾配溶出した。前記勾配溶出は、溶出溶液Ａが、２０ｍｍｏｌ／ＬのＮａ２ＨＰＯ４−ＮａＨ２ＰＯ４リン酸緩衝液であり、溶出溶液Ｂが、１ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ溶液が添加された２０ｍｍｏｌ／ＬのＮａ２ＨＰＯ４−ＮａＨ２ＰＯ４リン酸緩衝液であり、０〜６００分では溶液Ａで溶出し、６００〜１０００分では０〜１００％の溶液Ｂで溶出した（０〜１００％とは、溶液Ａ１００％および溶液Ｂ０％から、溶液Ａ０％および溶液Ｂ１００％までを意味する）。
【００４３】
陰イオン交換クロマトグラムを図１に示した。ｉｎ ｖｉｔｒｏでのリンパ球増殖を刺激することによって決定された活性は、図２に示した。活性決定の結果は、陰イオン交換クロマトグラフィーから得られた組成物が、免疫調節ポリペプチドを含有することを示していた（矢印が示すピーク）。
【００４４】
Ｃ．ゲル排除クロマトグラフィー
陰イオン交換クロマトグラフィーから収集された、前述の免疫調節ポリペプチド成分１ａを、流速８ｍＬ／時で、１．０×７５ｃｍのセファデックスＧ−２５ゲル排除カラムに投入した。移動相は、２０ｍｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ７．４）のＮａ２ＨＰＯ４−ＮａＨ２ＰＯ４リン酸緩衝液であった。同じ勾配で溶出した。
【００４５】
ゲル排除クロマトグラムを、図３に示した。ｉｎ ｖｉｔｒｏでのリンパ球増殖を刺激することによって決定された活性は、図４に示した。活性決定の結果は、ゲル排除クロマトグラフィーから得られた組成物が、免疫調節ポリペプチドを含有することを示していた（矢印が示すピーク）。
【００４６】
Ｄ．逆相高速液体クロマトグラフィー
ゲル排除クロマトグラフィーから収集された前述の免疫調節ポリペプチド成分１ｂを、流速１ｍＬ／分で、ＳｅｐｈａｓｉｌペプチドＣ１８逆相高速液体クロマトグラフィー・カラムに投入した。移動相Ａは、０．０５％のトリフルオロ酢酸を含む１０％アセトニトリルであり、移動相Ｂは、０．０５％のトリフルオロ酢酸を含む６０％アセトニトリルであり、０〜８分は溶液Ａで、８〜１２分は溶液Ｂで（０〜１００％）、次いで１２〜１６分は溶液Ｂで勾配溶出した。
【００４７】
逆相高速液体クロマトグラムを、図５に示した。ｉｎ ｖｉｔｒｏでリンパ球増殖を刺激することによって決定された活性は、図６に示した。活性決定の結果は、成分４が、高純度の免疫調節ポリペプチドであることを示した。
【００４８】
Ｅ．同定および分析
成分４をナノ濾過膜で脱塩し、凍結乾燥して、免疫調節ポリペプチド生成物を得た。ＳｅｐｈａｓｉｌペプチドＣ１８ＲＰ−ＨＰＬＣおよびキャピラリー電気泳動によって、生成物の純度を同定した。この結果を図７および図８にそれぞれに示したが、どちらもシングル・ピークであった。
【００４９】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによって測定された免疫調節ポリペプチドの分子量は、２１３３．５２Ｄａであった。
【００５０】
ＣＩＥＦによって測定された免疫調節ポリペプチドの等電点は、３．８２であった。
【００５１】
４９１−タンパク質配列決定機によって決定された免疫調節ポリペプチドのペプチド配列は、Ｔｙｒ−Ｘ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｘ−Ｔｈｒ（Ｘ、アミノ酸）であった。
【００５２】
（実施例２）
Ａ．胎盤の調製
新鮮なウシ胎盤を、洗浄し切断し、胎盤の２倍（ｗ／ｖ）のリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を添加し、ホモジネートを調製し、１２０００ｒ／ｍで遠心分離し、沈殿させ、上澄みを、分子量カットオフが１００００の限外濾過膜によって限外濾過し、芳香族ポリアミド・ナノ濾過膜で脱塩し、凍結乾燥し、このようにして、免疫調節ポリペプチドを含有する凍結乾燥粉末サンプルを得た。
【００５３】
Ｂ．陰イオン交換クロマトグラフィー
３０ｍｇの凍結乾燥粉末を、濃度が２０ｍｍｏｌ／ＬのＮａ２ＨＰＯ４−ＮａＨ２ＰＯ４を含む５ｍｌのｐＨ６．８リン酸緩衝液に溶解し、この溶液サンプルを、流速１ｍｌ／分で２．６×３５ｃｍのＤＥＡＥセファロースＣＬ−６Ｂ陰イオン交換カラムに投入し、次いで勾配溶出した。前記勾配溶出は、溶出溶液Ａが、２０ｍｍｏｌ／ＬのＮａ２ＨＰＯ４−ＮａＨ２ＰＯ４リン酸緩衝液であり、溶出溶液Ｂが、１ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ溶液が添加された２０ｍｍｏｌ／ＬのＮａ２ＨＰＯ４−ＮａＨ２ＰＯ４リン酸緩衝液であり、０〜６００分は溶液Ａで溶出し、６００〜１０００分は０〜１００％の溶液Ｂで溶出した。
【００５４】
陰イオン交換クロマトグラム、およびｉｎ ｖｉｔｒｏでのリンパ球増殖を刺激することによって決定された活性は、それぞれ図１および図２と類似していた。活性決定の結果は、陰イオン交換クロマトグラフィーから得られた組成物が、免疫調節ポリペプチド１を含有することを示していた（矢印が示すピーク）。
【００５５】
Ｃ．ゲル排除クロマトグラフィー
陰イオン交換クロマトグラフィーから収集された、前述の免疫調節ポリペプチド成分１ａを、流速１０ｍＬ／時で、１．０×７５ｃｍのセファデックスＧ−２５ゲル排除カラムに投入した。移動相は、２０ｍｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ６．８）のＮａ２ＨＰＯ４−ＮａＨ２ＰＯ４リン酸緩衝液であった。同じ勾配で溶出した。
【００５６】
ゲル排除クロマトグラム、およびｉｎ ｖｉｔｒｏでのリンパ球増殖を刺激することによって決定された活性は、それぞれ図３および図４と類似していた。活性決定の結果は、ゲル排除クロマトグラフィーから得られた組成物が、免疫調節ポリペプチドを含有することを示していた（矢印が示すピーク）。
【００５７】
Ｄ．逆相高速液体クロマトグラフィー
ゲル排除クロマトグラフィーから収集された前述の免疫調節ポリペプチド成分１ｂを、流速１ｍＬ／分で、ＳｅｐｈａｓｉｌペプチドＣ１８逆相高速液体クロマトグラフィー・カラムに投入した。移動相Ａは、０．０５％のトリフルオロ酢酸を含む８％アセトニトリルであり、移動相Ｂは、０．０５％のトリフルオロ酢酸を含む５５％アセトニトリルであり、０〜８分は溶液Ａで、８〜１２分は溶液Ｂで（０〜１００％）、次いで１２〜１６分は溶液Ｂで勾配溶出した。
【００５８】
逆相高速液体クロマトグラム、およびｉｎ ｖｉｔｒｏでリンパ球増殖を刺激することによって決定された活性は、それぞれ図５および図６と類似していた。活性決定の結果は、成分４が、高純度の免疫調節ポリペプチドであることを示した。
【００５９】
Ｅ．同定および分析
成分４をナノ濾過膜で脱塩し、凍結乾燥して、免疫調節ポリペプチド生成物を得た。ＳｅｐｈａｓｉｌペプチドＣ１８ＲＰ−ＨＰＬＣおよびキャピラリー電気泳動によって、生成物の純度を同定した。これらの結果は、それぞれ図７および図８と類似しており、どちらもシングル・ピークであった。
【００６０】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによって測定された免疫調節ポリペプチドの分子量は、２１３３．５２Ｄａであった。
【００６１】
ＣＩＥＦによって測定された免疫調節ポリペプチドの等電点は、３．８２であった。
【００６２】
４９１−タンパク質配列決定器によって決定された免疫調節ポリペプチドのペプチド配列は、Ｔｙｒ−Ｘ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｘ−Ｔｈｒ（Ｘ、アミノ酸）であった。
【００６３】
（実施例３）
Ａ．胎盤の調製
新鮮なウシ胎盤を、洗浄し切断し、胎盤の２倍（ｗ／ｖ）のリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を添加し、ホモジネートを調製し、１２０００ｒ／ｍで遠心分離し、沈殿させ、上澄みを、分子量カットオフが１００００の限外濾過膜によって限外濾過し、芳香族ポリアミド・ナノ濾過膜で脱塩し、凍結乾燥し、このようにして、免疫調節ポリペプチドを含有する凍結乾燥粉末サンプルを得た。
【００６４】
Ｂ．陰イオン交換クロマトグラフィー
３０ｍｇの凍結乾燥粉末を、濃度が２０ｍｍｏｌ／ＬのＮａ２ＨＰＯ４−ＮａＨ２ＰＯ４を含む５ｍｌのｐＨ７．２リン酸緩衝液に溶解し、この溶液サンプルを、流速１ｍｌ／分で２．６×３５ｃｍのＤＥＡＥセファロースＣＬ−６Ｂ陰イオン交換カラムに投入し、次いで勾配溶出した。前記勾配溶出は、溶出溶液Ａが、２０ｍｍｏｌ／ＬのＮａ２ＨＰＯ４−ＮａＨ２ＰＯ４リン酸緩衝液であり、溶出溶液Ｂが、１ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ溶液が添加された２０ｍｍｏｌ／ＬのＮａ２ＨＰＯ４−ＮａＨ２ＰＯ４リン酸緩衝液であり、０〜６００分は溶液Ａで溶出し、６００〜１０００分は０〜１００％の溶液Ｂで溶出した。
【００６５】
陰イオン交換クロマトグラム、およびｉｎ ｖｉｔｒｏでのリンパ球増殖を刺激することによって決定された活性は、それぞれ図１および図２と類似していた。活性決定の結果は、陰イオン交換クロマトグラフィーから得られた組成物が、免疫調節ポリペプチド１を含有することを示していた（矢印が示すピーク）。
【００６６】
Ｃ．ゲル排除クロマトグラフィー
陰イオン交換クロマトグラフィーから収集された、前述の免疫調節ポリペプチド成分１ａを、流速１２ｍＬ／時で、１．０×７５ｃｍのセファデックスＧ−２５ゲル排除カラムに投入した。移動相は、２０ｍｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ７．２）のＮａ２ＨＰＯ４−ＮａＨ２ＰＯ４リン酸緩衝液であった。同じ勾配で溶出した。
【００６７】
ゲル排除クロマトグラム、およびｉｎ ｖｉｔｒｏでのリンパ球増殖を刺激することによって決定された活性は、それぞれ図３および図４と類似していた。活性決定の結果は、ゲル排除クロマトグラフィーから得られた組成物が、免疫調節ポリペプチドを含有することを示していた（矢印が示すピーク）。
【００６８】
Ｄ．逆相高速液体クロマトグラフィー
ゲル排除クロマトグラフィーから収集された前述の免疫調節ポリペプチド成分１ｂを、流速１ｍＬ／分で、ＳｅｐｈａｓｉｌペプチドＣ１８逆相高速液体クロマトグラフィー・カラムに投入した。移動相Ａは、０．０５％のトリフルオロ酢酸を含む５％アセトニトリルであり、移動相Ｂは、０．０５％のトリフルオロ酢酸を含む４５％アセトニトリルであり、０〜８分は溶液Ａで、８〜１２分は溶液Ｂで（０〜１００％）、次いで１２〜１６分は溶液Ｂで勾配溶出した。
【００６９】
逆相高速液体クロマトグラム、およびｉｎ ｖｉｔｒｏでリンパ球増殖を刺激することによって決定された活性は、それぞれ図５および図６と類似していた。活性決定の結果は、成分４が、高純度の免疫調節ポリペプチドであることを示した。
【００７０】
Ｅ．同定および分析
成分４をナノ濾過膜で脱塩し、凍結乾燥して、免疫調節ポリペプチド生成物を得た。ＳｅｐｈａｓｉｌペプチドＣ１８ＲＰ−ＨＰＬＣおよびキャピラリー電気泳動によって、生成物の純度を同定した。これらの結果は、それぞれ図７および図８と類似しており、どちらもシングル・ピークであった。
【００７１】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによって測定された免疫調節ポリペプチドの分子量は、２１３３．５２Ｄａであった。
【００７２】
ＣＩＥＦによって測定された免疫調節ポリペプチドの等電点は、３．８２であった。
【００７３】
４９１−タンパク質配列決定器によって決定された免疫調節ポリペプチドのペプチド配列は、Ｔｙｒ−Ｘ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｘ−Ｔｈｒ（Ｘ、アミノ酸）であった。
【００７４】
（実施例４）
Ａ．胎盤の調製
新鮮なウシ胎盤を、洗浄し切断し、胎盤の２倍（ｗ／ｖ）のリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を添加し、ホモジネートを調製し、１２０００ｒ／ｍで遠心分離し、沈殿させ、上澄みを、分子量カットオフが１００００の限外濾過膜によって限外濾過し、芳香族ポリアミド・ナノ濾過膜で脱塩し、凍結乾燥し、このようにして、免疫調節ポリペプチドを含有する凍結乾燥粉末サンプルを得た。
【００７５】
Ｂ．陰イオン交換クロマトグラフィー
３０ｍｇの凍結乾燥粉末を、濃度が２０ｍｍｏｌ／ＬのＮａ２ＨＰＯ４−ＮａＨ２ＰＯ４を含む５ｍｌのｐＨ７．２リン酸緩衝液に溶解し、この溶液サンプルを、流速１ｍｌ／分で２．６×３５ｃｍのＤＥＡＥセファロースＣＬ−６Ｂ陰イオン交換カラムに投入し、次いで勾配溶出した。前記勾配溶出は、溶出溶液Ａが、２０ｍｍｏｌ／ＬのＮａ２ＨＰＯ４−ＮａＨ２ＰＯ４リン酸緩衝液であり、溶出溶液Ｂが、１ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ溶液が添加された２０ｍｍｏｌ／ＬのＮａ２ＨＰＯ４−ＮａＨ２ＰＯ４リン酸緩衝液であり、０〜６００分は溶液Ａで溶出し、６００〜１０００分は０〜１００％の溶液Ｂで溶出した。
【００７６】
陰イオン交換クロマトグラム、およびｉｎ ｖｉｔｒｏでのリンパ球増殖を刺激することによって決定された活性は、それぞれ図１および図２と類似していた。活性決定の結果は、陰イオン交換クロマトグラフィーから得られた組成物が、免疫調節ポリペプチド１を含有することを示していた（矢印が示すピーク）。
【００７７】
Ｃ．ゲル排除クロマトグラフィー
陰イオン交換クロマトグラフィーから収集された、前述の免疫調節ポリペプチド成分１ａを、流速１２ｍＬ／時で、１．０×７５ｃｍのセファデックスＧ−２５ゲル排除カラムに投入した。移動相は、２０ｍｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ７．２）のＮａ２ＨＰＯ４−ＮａＨ２ＰＯ４リン酸緩衝液であった。同じ勾配で溶出した。
【００７８】
ゲル排除クロマトグラム、およびｉｎ ｖｉｔｒｏでのリンパ球増殖を刺激することによって決定された活性は、それぞれ図３および図４と類似していた。活性決定の結果は、ゲル排除クロマトグラフィーから得られた組成物が、免疫調節ポリペプチドを含有することを示していた（矢印が示すピーク）。
【００７９】
Ｄ．逆相高速液体クロマトグラフィー
ゲル排除クロマトグラフィーから収集された前述の免疫調節ポリペプチド成分１ｂを、流速１ｍＬ／分で、ＳｅｐｈａｓｉｌペプチドＣ１８逆相高速液体クロマトグラフィー・カラムに投入した。移動相Ａは、０．０５％のトリフルオロ酢酸を含む５％アセトニトリルであり、移動相Ｂは、０．０５％のトリフルオロ酢酸を含む６０％アセトニトリルであり、０〜８分は溶液Ａで、８〜１２分は溶液Ｂで（０〜１００％）、次いで１２〜１６分は溶液Ｂで勾配溶出した。
【００８０】
逆相高速液体クロマトグラム、およびｉｎ ｖｉｔｒｏでリンパ球増殖を刺激することによって決定された活性は、それぞれ図５および図６と類似していた。活性決定の結果は、成分４が、高純度の免疫調節ポリペプチドであることを示した。
【００８１】
Ｅ．同定および分析
成分４をナノ濾過膜で脱塩し、凍結乾燥して、免疫調節ポリペプチド生成物を得た。ＳｅｐｈａｓｉｌペプチドＣ１８ＲＰ−ＨＰＬＣおよびキャピラリー電気泳動によって、生成物の純度を同定した。これらの結果は、それぞれ図７および図８と類似しており、どちらもシングル・ピークであった。
【００８２】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによって測定された免疫調節ポリペプチドの分子量は、２１３３．５２Ｄａであった。
【００８３】
ＣＩＥＦによって測定された免疫調節ポリペプチドの等電点は、３．８２であった。
【００８４】
４９１−タンパク質配列決定器によって決定された免疫調節ポリペプチドのペプチド配列は、Ｔｙｒ−Ｘ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｘ−Ｔｈｒ（Ｘ、アミノ酸）であった。
【００８５】
（実施例５）
Ａ．胎盤の調製
新鮮なウシ胎盤を、洗浄し切断し、胎盤の２倍（ｗ／ｖ）のリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を添加し、ホモジネートを調製し、１２０００ｒ／ｍで遠心分離し、沈殿させ、上澄みを、分子量カットオフが１００００の限外濾過膜によって限外濾過し、芳香族ポリアミド・ナノ濾過膜で脱塩し、凍結乾燥し、このようにして、免疫調節ポリペプチドを含有する凍結乾燥粉末サンプルを得た。
【００８６】
Ｂ．陰イオン交換クロマトグラフィー
３０ｍｇの凍結乾燥粉末を、濃度が２０ｍｍｏｌ／ＬのＮａ２ＨＰＯ４−ＮａＨ２ＰＯ４を含む５ｍｌのｐＨ７．４リン酸緩衝液に溶解し、この溶液サンプルを、流速１ｍｌ／分で２．６×３５ｃｍのＤＥＡＥセファロースＣＬ−６Ｂ陰イオン交換カラムに投入し、次いで勾配溶出した。前記勾配溶出は、溶出溶液Ａが、２０ｍｍｏｌ／ＬのＮａ２ＨＰＯ４−ＮａＨ２ＰＯ４リン酸緩衝液であり、溶出溶液Ｂが、１ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ溶液が添加された２０ｍｍｏｌ／ＬのＮａ２ＨＰＯ４−ＮａＨ２ＰＯ４リン酸緩衝液であり、０〜６００分は溶液Ａで溶出し、６００〜１０００分は０〜１００％の溶液Ｂで溶出した（０〜１００％とは、１００％の溶液Ａおよび０％の溶液Ｂから、０％の溶液Ａおよび１００％の溶液Ｂまでを意味する）。
【００８７】
陰イオン交換クロマトグラム、およびｉｎ ｖｉｔｒｏでのリンパ球増殖を刺激することによって決定された活性は、それぞれ図１および図２と類似していた。活性決定の結果は、陰イオン交換クロマトグラフィーから得られた組成物が、免疫調節ポリペプチド１を含有することを示していた（矢印が示すピーク）。
【００８８】
Ｃ．ゲル排除クロマトグラフィー
陰イオン交換クロマトグラフィーから収集された、前述の免疫調節ポリペプチド成分１ａを、流速１０ｍＬ／時で、１．０×７５ｃｍのセファデックスＧ−２５ゲル排除カラムに投入した。移動相は、２０ｍｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ７．４）のＮａ２ＨＰＯ４−ＮａＨ２ＰＯ４リン酸緩衝液であった。同じ勾配で溶出した。
【００８９】
ゲル排除クロマトグラム、およびｉｎ ｖｉｔｒｏでのリンパ球増殖を刺激することによって決定された活性は、それぞれ図３および図４と類似していた。活性決定の結果は、ゲル排除クロマトグラフィーから得られた組成物が、免疫調節ポリペプチドを含有することを示していた（矢印が示すピーク）。
【００９０】
Ｄ．逆相高速液体クロマトグラフィー
ゲル排除クロマトグラフィーから収集された前述の免疫調節ポリペプチド成分１ｂを、流速１ｍＬ／分で、ＳｅｐｈａｓｉｌペプチドＣ１８逆相高速液体クロマトグラフィー・カラムに投入した。移動相Ａは、０．０５％のトリフルオロ酢酸を含む１０％アセトニトリルであり、移動相Ｂは、０．０５％のトリフルオロ酢酸を含む４０％アセトニトリルであり、０〜８分は溶液Ａで、８〜１２分は溶液Ｂで（０〜１００％）、次いで１２〜１６分は溶液Ｂで勾配溶出した。
【００９１】
逆相高速液体クロマトグラムは、図５と類似しており、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのリンパ球増殖を刺激することによって決定された活性は、図６と類似していた。活性決定の結果は、成分４が、高純度の免疫調節ポリペプチドであることを示した。
【００９２】
Ｅ．同定および分析
成分４をナノ濾過膜で脱塩し、凍結乾燥して、免疫調節ポリペプチド生成物を得た。ＳｅｐｈａｓｉｌペプチドＣ１８ＲＰ−ＨＰＬＣおよびキャピラリー電気泳動によって、生成物の純度を同定した。これらの結果は、それぞれ図７および図８と類似しており、どちらもシングル・ピークであった。
【００９３】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによって測定された免疫調節ポリペプチドの分子量は、２１３３．５２Ｄａであった。
【００９４】
ＣＩＥＦによって測定された免疫調節ポリペプチドの等電点は、３．８２であった。
【００９５】
４９１−タンパク質配列決定器によって決定された免疫調節ポリペプチドのペプチド配列は、Ｔｙｒ−Ｘ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｘ−Ｔｈｒ（Ｘ、アミノ酸）であった。
【００９６】
逆相高速液体クロマトグラフィーによって使用された溶液Ｂは、０．０５％のトリフルオロ酢酸を含む４０％アセトニトリルであり、その他の操作条件は、実施例１と同じであった。
【００９７】
前述の実施形態は、ウシ胎盤から免疫調節ポリペプチドを分離するための方法を説明するのに使用され、本発明の範囲を限定するものではない。しかし、本発明の同じ目的を達成するために、本発明の技術的思想および範囲を逸脱することなく様々な修正および変更を行うことができることは、当業者にしてみれば明らかなことである。
【図面の簡単な説明】
【００９８】
【図１】ＤＥＡＥセファロースＣＬ−６Ｂ陰イオン交換カラム上での、本発明の一実施形態で免疫調節ポリペプチドの分離から得られたクロマトグラムである。図１のピーク１ａは、免疫調節ポリペプチドを含有する成分である。
【図２】ＤＥＡＥセファロースＣＬ−６Ｂ陰イオン交換カラム上での、本発明の一実施形態で免疫調節ポリペプチドから分離された、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのリンパ球増殖を刺激するための４成分の棒グラフである。図２の成分１ａは、免疫調節ポリペプチドを含有する成分である。
【図３】セファデックスＧ−２５ゲル排除クロマトグラフィー・カラム上での、本発明の一実施形態で免疫調節ポリペプチドの分離から得られたクロマトグラムである。図３のピーク１ｂは、免疫調節ポリペプチドを含有する成分である。
【図４】セファデックスＧ−２５ゲル排除クロマトグラフィー・カラム上での、本発明の一実施形態で免疫調節ポリペプチドから分離された、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのリンパ球増殖を刺激するための２成分の棒グラフである。図４の成分１ｂは、免疫調節ポリペプチドを含有する成分である。
【図５】ＳｅｐｈａｓｉｌペプチドＣ１８逆相高速液体クロマトグラフィー・カラム上での、本発明の一実施形態で免疫調節ポリペプチドの分離から得られたクロマトグラムである。図５のピーク４は、免疫調節ポリペプチドを含有する成分である。
【図６】ＳｅｐｈａｓｉｌペプチドＣ１８逆相高速液体クロマトグラフィー・カラム上での、本発明の一実施形態で免疫調節ポリペプチドの分離から得られた、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのリンパ球増殖を刺激するための７成分の棒グラフである。図６の成分４は、免疫調節ポリペプチドを含有する成分である。
【図７】ＳｅｐｈａｓｉｌペプチドＣ１８逆相高速液体クロマトグラフィーによって測定された、本発明の一実施形態における免疫調節ポリペプチドの純度を示す図である。純度は、９０％よりも高い。
【図８】キャピラリー電気泳動によって測定された、本発明の一実施形態における免疫調節ポリペプチドの純度を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物学および薬剤抽出の分野に関する。より詳細には、本発明は、ウシ胎盤から免疫調節ポリペプチドを分離し精製するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
より多くの人々が、自身の生活を現代的な生活スタイルに変えるにつれて、免疫の低下により疾患が生ずる可能性が出て来る。免疫を高めることは、疲労に耐え、作業効率を改善し、疾患を予防するのに欠くことのできない手法の１つである。
【０００３】
胎盤の免疫調節因子の研究は、中国から始まった。その活性成分は、健康な産褥胎盤から抽出された。１９８５年、ＬＩＵ Ｙｕｅｘｉｎは、均質化−透析によって初めて、健康な産褥胎盤から小分子活性物質を抽出することを開示し、この活性物質を胎盤因子と名付けた（非特許文献１参照）。１９９４年、ＨＵＡＮＧ Ｃｈｕｈｕａ他（非特許文献２参照）は、下記のステップ、すなわち新鮮な胎盤を洗浄し切断するステップ、ホモジネートを２倍の生理食塩水で調製するステップ、遠心分離を行うステップ、分子量カットオフが１００００の限外濾過膜によって上澄みを限外濾過するステップ、および濾液を滅菌し分散させるステップとによって、胎盤注射液を得た。１９９６年、ＺＨＡＮＧ Ｘｕｅｒｏｎｇ他（非特許文献３参照）は、胎盤の筋膜を切り取り、無菌水で洗浄し、切断し計量し、１：１の生理食塩水を用いて高速組織ホモジナイザにより均質化物を調製し、次いでこの均質化物を冷蔵庫内で４８時間超−２０℃で凍結し、２５℃の水浴中で解凍し、水晶体破砕法を１５分間施し、複数回の凍結−解凍処理を行い、低温で遠心分離し、上澄みを透析し、膜で濾過することによって、胎盤注射液を得た。２００１年、ＸＵ Ｄａｉｄｉ他（非特許文献４参照）は、ＬＩＵ Ｙｕｅｘｉｎを参照しながら胎盤免疫調節因子を調製した。
【０００４】
これらの研究は、ヒト胎盤免疫調節因子の主成分が、小分子ポリペプチドであることを示している。大量の動物実験および臨床適用例は、胎盤免疫調節因子が安全で、無毒性であり、抗原性がなく、長期使用により抗体が誘導されて活性が低下することがなく、胎盤免疫調節因子は、安全で効果が高い免疫調節剤および免疫賦活剤であることを示している。しかし、胎盤免疫調節因子に関する現在の研究は、ほとんどがその機能および適用例に焦点を当てており、その主要な活性成分をどのように分離し精製するかについての報告は、ほとんど見られない。
【０００５】
新しい種類の胎盤供給源として、ウシ胎盤は、本来の構造および成分がヒトに類似しているが、これらの間に相違点は確かに存在する。したがって、理論上および技術上の両方において、ヒト胎盤免疫調節因子に関する研究を参照しつつも、異なる技術を用いて、ウシ胎盤から免疫調節因子を分離し精製することが重要である。
【非特許文献１】ＬＩＵ Ｙｕｅｘｉｎ，Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｓｔｕｄｙ ｏｎ Ｐｌａｃｅｎｔａ Ｆａｃｔｏｒ−−Ａ Ｎｅｗ Ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒ，Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９８５，１（５）
【非特許文献２】ＨＵＡＮＧ Ｃｈｕｈｕａ他，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｔｕｄｙ ｏｆ Ｐｌａｃｅｎｔａ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ ｏｎ Ｐｈｙｓｉｃａｌ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ａｎｄ Ｂｉｏａｃｔｉｖｉｔｙ，ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ，１９９５，２（２）
【非特許文献３】ＺＨＡＮＧ Ｘｕｅｒｏｎｇ他，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｓｔｕｄｙ ｏｎ Ｐｌａｃｅｎｔａ Ｉｍｍｕｎｏ−ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒ，ＧＵＡＮＧＸＩ ＳＣＩＥＮＣＥＳ，１９９６，３
【非特許文献４】ＸＵ Ｄａｉｄｉ他，Ｐｒｅｐａｒｉｎｇ Ｐｌａｃｅｎｔａ Ｉｍｍｕｎｏ−ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒ，Ｇｕａｎｇｘｉ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ，２００１，８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、ウシ胎盤から免疫調節ポリペプチドを抽出するための方法を提供することである。
【０００７】
本発明の別の目的は、ウシ胎盤から抽出された免疫調節ポリペプチドを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
イオン交換クロマトグラフィーは、固定相としてイオン交換剤を用い、移動相として液体を用いるシステムにおいて実施されることが知られている。イオン交換剤は、母材、イオン基、および対イオンを含む。イオン交換剤と、液体中のイオンまたはイオン化合物との反応は、主にイオン交換に基づいており、またはイオン交換剤のイオン基と溶液中のイオンまたはイオン化合物との吸着に基づいている。イオン交換クロマトグラフィーは、電荷状態（または極性）の相違に基づいて実施される。適切なイオン交換剤は、対象の解離性または電荷状態によって選択されるべきである。吸着および溶出の条件は制御されるべきであり、その主な条件は、イオン強度と溶出剤のｐＨ値である。次いで混合物中の成分を、親和性に応じて順次、クロマトグラフィー・カラムから溶出する。
【０００９】
ゲル排除クロマトグラフィーは、分子が低流速でクロマトグラフィー・カラム内を通過する間の、分子の垂直下向きの移動と無方向性拡散とによって実施される。巨大分子は、その直径が大きく、ゲル粒子の小さい孔の中ではなく粒子間の空間内に拡がり、溶出中により速く垂直方向に移動する。しかし小さい分子は、ゲル粒子間の空間内に拡散するだけではなく、ゲル粒子の内部にも進入する。垂直移動中、小分子は、粒子内部から粒子間の空間へと拡散し、次いでその他の粒子内部に進入する。拡散および進入の運動は、連続的なものである。したがって、小分子の垂直移動の速度は、巨大分子の場合よりも遅い。その結果、巨大分子、中型分子、小分子は、順に、かつ首尾よく分離してカラムの外に出て行く。ゲル排除クロマトグラフィーの明らかな利点は、使用される担体が不活性であり、電荷を持たず、吸着性が弱く、操作環境が穏やかであり、操作温度範囲が広く、有機溶媒を必要とせず、化合物の物理的および化学的性質を維持するのに特別な利点があることである。
【００１０】
逆相クロマトグラフィーは、分離に広く使用される。このシステムでは、溶質が、主に疎水的相互作用によって保持される。疎水的相互作用とは、無極性溶質が水溶液中にある場合、溶質分子間、または溶質分子と水分子との間の相互作用が、水分子間よりもずっと少ないことを意味する。したがって、溶質分子を容易に溶液から除去することができる。種々の化合物は、種々の疎水特性に応じて異なる保持時間を有し、その結果、これらの化合物が分離される。
【００１１】
本発明者は、多くの研究を行っており、これら３つの方法、すなわち陰イオン交換クロマトグラフィー、ゲル排除クロマトグラフィー、および逆相高速液体クロマトグラフィーを一緒に創造的に組み合わせて、免疫調節ポリペプチドをウシ胎盤から抽出し、分子量および等電点と、分離され精製された免疫調節ポリペプチドの配列を決定した。
【００１２】
本発明は、ウシ胎盤から分離された免疫調節ポリペプチドに関する。免疫調節ポリペプチドの特徴は、下記の通りである：ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間質量分析）によって決定された分子量が２１３３．５２Ｄａであり、ＣＩＥＦ（キャピラリー等電点電気泳動）によって決定された等電点が３．８２であり、４９１−タンパク質配列決定器（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，米国）によって決定されたＴｙｒ−Ｘ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｘ−Ｔｈｒ配列であって、Ｘはアミノ酸である。
【００１３】
また本発明は、ウシ胎盤から分離された免疫調節ポリペプチドを調製するための方法にも関する。前記方法は、当業者に知られる下記のステップ、すなわち新鮮なウシ胎盤を洗浄し切断するステップと、胎盤の２倍（ｗ／ｖｏｌ．）のｐＨ６．８〜７．５のリン酸緩衝液を添加するステップと、ホモジネートを調製するステップと、１２０００ｒ／ｍで遠心分離するステップと、沈殿させるステップと、分子量カットオフが１００００の限外濾過膜によって上澄みを限外濾過するステップと、芳香族ポリアミド・ナノ濾過膜で脱塩するステップと、凍結乾燥するステップとを含み、したがって、免疫調節ポリペプチドを含有する凍結乾燥された粉末サンプルが得られる。この方法は、前記凍結乾燥された粉末をリン酸緩衝液中で溶解するステップと、陰イオン交換クロマトグラフィー、ゲル排除クロマトグラフィー、および逆相高速液体クロマトグラフィーを使用して、溶液を分離するステップと、ＲＰ−ＨＰＬＣおよびキャピラリー電気泳動（この結果は、両者とも、シングル・ピークであった。）によって逆相高速液体クロマトグラフィーから収集された活性物質を決定するステップと、次いでＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳにより分子量を、ＣＩＥＦにより等電点を、およびタンパク質配列決定機によりペプチド配列を、決定するステップも含む。
【００１４】
本発明の実施形態によれば、前記陰イオン交換クロマトグラフィーは、溶液サンプルとして１０〜３０ｍｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ６．８〜７．５）のリン酸緩衝液中に前記凍結乾燥粉末を４〜１０：１（ｗ：ｖｏｌ）で溶解し、この溶液サンプルを、０．５〜１．５ｍＬ／分の流速で陰イオン交換カラムに投入し、０．５〜１．５ｍＬ／分の流速で勾配溶出する。前記勾配溶出は、溶出溶液Ａが、リン酸緩衝液１０〜３０ｍｏｌ／Ｌであり、溶出溶液Ｂが、溶液Ａに０．５〜１．５ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌを添加することによって調製された溶液であり、０〜６００分では溶液Ａで溶出し、６００〜１０００分では０〜１００％の溶液Ｂで溶出する。ｉｎ ｖｉｔｒｏでのリンパ球増殖の刺激を介したＭＴＴ法による決定が行われ、スクリーニングが行われ、そして、陰イオン交換クロマトグラフィーによって分離した後に、免疫調節ポリペプチドを含有する成分が収集される。
【００１５】
前記凍結乾燥粉末と、この粉末を溶解するのに使用される緩衝液との比が、４〜８：１（ｗ：ｖｏｌ．）であることが好ましく、前記比が５〜８：１であることがより好ましい。
【００１６】
また、本発明による凍結乾燥粉末を溶解するのに用いられる緩衝液は、Ｎａ２ＨＰＯ４−ＮａＨ２ＰＯ４、Ｋ２ＨＰＯ４−ＫＨ２ＰＯ４、Ｋ２ＨＰＯ４−ＮａＨ２ＰＯ４、および／またはＮａ２ＨＰＯ４−ＫＨ２ＰＯ４溶液から選択された、１種または複数の溶液である。
【００１７】
本発明の別の実施形態によれば、前記凍結乾燥粉末溶液サンプルは、１０〜３０ｍｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ６．８〜７．５）のＮａ２ＨＰＯ４−ＮａＨ２ＰＯ４緩衝液である。
【００１８】
また、陰イオン交換クロマトグラフィーによって用いられる溶出溶液Ａは、Ｎａ２ＨＰＯ４−ＮａＨ２ＰＯ４、Ｋ２ＨＰＯ４−ＫＨ２ＰＯ４、Ｋ２ＨＰＯ４−ＮａＨ２ＰＯ４、およびＮａ２ＨＰＯ４−ＫＨ２ＰＯ４溶出溶液から選択された、１種または複数の溶液である。
【００１９】
本発明の別の実施形態によれば、前記ゲル排除クロマトグラフィーは、以下の条件で行われる。即ち、陰イオン交換クロマトグラフィーから収集された免疫調節ポリペプチド成分を、８〜１２ｍＬ／時の流速で、１０〜３０ｍｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ６．８〜７．５）のリン酸緩衝液である移動相で、ゲル排除カラム上に直接投入し、８〜１２ｍＬ／時の流速で、同じ勾配溶出により溶出し、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのリンパ球増殖の刺激を介したＭＴＴ法による決定が行われ、スクリーニングが行われ、そして、陰イオン交換クロマトグラフィーによって分離した後に、免疫調節ポリペプチドを含有する成分が収集される。
【００２０】
前記ゲル排除カラムは、その長さ／直径の比が６０〜９０であり、サンプルの体積は、カラム床の１〜１０％に達する。
【００２１】
ゲル排除カラムで使用される前記移動相は、Ｎａ２ＨＰＯ４−ＮａＨ２ＰＯ４、Ｋ２ＨＰＯ４−ＫＨ２ＰＯ４、Ｋ２ＨＰＯ４−ＮａＨ２ＰＯ４、およびＮａ２ＨＰＯ４−ＫＨ２ＰＯ４溶液から選択された、１種または複数の溶液であることが好ましい。
【００２２】
本発明の別の実施形態によれば、前記逆相高速液体クロマトグラフィーは、以下の条件で行われる。即ち、ゲル排除クロマトグラフィーから収集された免疫調節ポリペプチド成分を、逆相高速液体クロマトグラフィー・カラムに、０．８〜１．２ｍＬ／分の流速で、直接投入し、移動相Ａは、０．０１〜０．１％のトリフルオロ酢酸を含む５〜１０％のアセトニトリルであり、移動相Ｂは、０．０１〜０．１％のトリフルオロ酢酸を含む４０〜６０％のアセトニトリルであり、０〜８分は溶液Ａで、８〜１２分は溶液Ｂ（０〜１００％）で、１２〜１６分は溶液Ｂで、流速０．８〜１．２ｍＬ／時で勾配溶出するように行われる。
【００２３】
前記逆相高速液体クロマトグラフィー・カラムは、その長さ／直径の比が２５〜５０であり、サンプルの体積は、カラム床の場合の１〜１０％に達する。
【００２４】
本発明で使用される前記移動相Ａは、０．０２〜０．０８％のトリフルオロ酢酸を含む５〜８％のアセトニトリルであり、移動相Ｂは、０．０２〜０．０８％のトリフルオロ酢酸を含む４０〜６０％のアセトニトリルであることが好ましい。
【００２５】
本発明の別の実施形態によれば、前記陰イオン交換カラムは、ジエチルアミノエチルで官能化された、アガロースＤＥＡＥセファロースＣＬ−６Ｂ、ＤＥＡＥ−セファロースＦＦ、あるいはグルカンＤＥＡＥ−セファデックスＡ−２５またはＤＥＡＥ−セファデックスＡ−５０から選択された陰イオン交換媒体を備えている。
【００２６】
前記陰イオン交換カラムは、ＤＥＡＥセファロースＣＬ−６Ｂ、ＤＥＡＥ−セファロースＦＦ、またはＤＥＡＥ−セファデックスＡ−２５を備えていることが好ましい。
【００２７】
本発明の別の実施形態によれば、前記ゲル排除クロマトグラフィー・カラムは、不活性多孔質網状構造を有するグルカン セファデックスＧ−２５、セファデックスＧ−５０、あるいはポリアクリルアミン・ゲル バイオ−ゲル−Ｐ−４、バイオ−ゲル−Ｐ−６、またはバイオ−ゲル−Ｐ−１０であり、タンパク質混合物中の物質を、分子のサイズに基づいて分離する。
【００２８】
前記ゲル排除クロマトグラフィー・カラムは、セファデックスＧ−２５、セファデックスＧ−５０、バイオ−ゲル−Ｐ−４、およびバイオ−ゲル−Ｐ−６から選択された媒体を有するカラムであることが好ましい。
【００２９】
本発明の別の実施形態によれば、前記逆相高速液体クロマトグラフィー・カラムは、ＯＤＳ（オクタデシルシリル−シリカ）が充填されたＳｅｐｈａｓｉｌペプチドＣ１８またはポリマーＣ１８である。
【発明の効果】
【００３０】
本発明から得られた免疫調節ポリペプチドの純度は、９０％よりも高く、その生物学的利用能は、薬剤調製の基準を満たしている。
【００３１】
本発明から得られた免疫調節ポリペプチドは、免疫調節活性を有する健康食品を調製するための、十分な材料を提供する。
【００３２】
本発明から得られた免疫調節ポリペプチドの工業的収量は、１％であり、１００ｇのウシ胎盤から１ｇの免疫調節ポリペプチドが得られる（乾燥ベースに基づく）。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３３】
本発明をより明瞭に理解するために、これより以降、本発明の好ましい実施形態について、添付図面を参照しながら詳細に記述する。
（実験方法の詳細な記述）
（１）ｉｎ ｖｉｔｒｏでのリンパ球増殖の刺激
−細胞の培養−
１．脾臓リンパ球懸濁液の調製
滅菌条件下でマウスの脾臓を取り出し、リンパ球分離媒体によってリンパ球を分離し、細胞濃度を完全１６４０培養溶液で１×１０６／ｍｌに調節する。
【００３４】
２．実験構成
対照群および実験群を別々に設定して、全ての成分による脾臓リンパ球増殖の刺激の活性を確認する。
【００３５】
３．実験方法
１００μＬのマウス脾臓リンパ球懸濁液（１×１０６／ｍＬ）を、９６ウェル培養皿に添加する。１００μＬの生理食塩水／サンプルを、対照群および実験群に別々に添加する。均質になるまで穏かに混合し、インキュベータ内で、５％ＣＯ２中３７℃で６８時間培養する。２０μｌのＭＴＴを、滅菌条件下で全てのウェルに添加し、均質になるまで穏かに混合し、培養を４時間続け、１００μｌのジメチルスルホキシドを全てのウェルに添加し、室温に１０分間保ち、次いでＥＬＩＳＡにより５７０ｎｍで、全てのウェルのＯＤを測定する。
【００３６】
４．データ処理
実験群の脾臓リンパ球増殖率を、下式によって計算する。
Ｐの値を、分散分析によって計算し、有意差をＴ検定によって計算する。
【００３７】
（２）ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによる、免疫調節ポリペプチドの分子量の測定。
【００３８】
（３）ＣＩＥＦによる、免疫調節ポリペプチドの等電点の測定。
【００３９】
（４）タンパク質配列決定器による、免疫調節ポリペプチドの配列の決定。
【００４０】
（５）ＲＰ−ＨＰＬＣおよびキャピラリー電気泳動による測定。
前述の方法（２）〜（５）は、当業者に知られている通常の方法である。
【実施例】
【００４１】
（実施例１）
Ａ．胎盤の調製
新鮮なウシ胎盤を、洗浄し切断し、胎盤の２倍（ｗ／ｖ）のリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を添加し、ホモジネートを調製し、１２０００ｒ／ｍで３分間遠心分離し、沈殿させ、上澄みを、分子量カットオフが１００００の限外濾過膜によって限外濾過し、芳香族ポリアミド・ナノ濾過膜で脱塩し、凍結乾燥し、このようにして、免疫調節ポリペプチドを含有する凍結乾燥粉末サンプルを得た。
【００４２】
Ｂ．陰イオン交換クロマトグラフィー
３０ｍｇの凍結乾燥粉末を、濃度が２０ｍｍｏｌ／ＬのＮａ２ＨＰＯ４−ＮａＨ２ＰＯ４を含む５ｍｌのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解し、この溶液サンプルを、流速１ｍｌ／分で２．６×３５ｃｍのＤＥＡＥセファロースＣＬ−６Ｂ陰イオン交換カラムに投入し、次いで勾配溶出した。前記勾配溶出は、溶出溶液Ａが、２０ｍｍｏｌ／ＬのＮａ２ＨＰＯ４−ＮａＨ２ＰＯ４リン酸緩衝液であり、溶出溶液Ｂが、１ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ溶液が添加された２０ｍｍｏｌ／ＬのＮａ２ＨＰＯ４−ＮａＨ２ＰＯ４リン酸緩衝液であり、０〜６００分では溶液Ａで溶出し、６００〜１０００分では０〜１００％の溶液Ｂで溶出した（０〜１００％とは、溶液Ａ１００％および溶液Ｂ０％から、溶液Ａ０％および溶液Ｂ１００％までを意味する）。
【００４３】
陰イオン交換クロマトグラムを図１に示した。ｉｎ ｖｉｔｒｏでのリンパ球増殖を刺激することによって決定された活性は、図２に示した。活性決定の結果は、陰イオン交換クロマトグラフィーから得られた組成物が、免疫調節ポリペプチドを含有することを示していた（矢印が示すピーク）。
【００４４】
Ｃ．ゲル排除クロマトグラフィー
陰イオン交換クロマトグラフィーから収集された、前述の免疫調節ポリペプチド成分１ａを、流速８ｍＬ／時で、１．０×７５ｃｍのセファデックスＧ−２５ゲル排除カラムに投入した。移動相は、２０ｍｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ７．４）のＮａ２ＨＰＯ４−ＮａＨ２ＰＯ４リン酸緩衝液であった。同じ勾配で溶出した。
【００４５】
ゲル排除クロマトグラムを、図３に示した。ｉｎ ｖｉｔｒｏでのリンパ球増殖を刺激することによって決定された活性は、図４に示した。活性決定の結果は、ゲル排除クロマトグラフィーから得られた組成物が、免疫調節ポリペプチドを含有することを示していた（矢印が示すピーク）。
【００４６】
Ｄ．逆相高速液体クロマトグラフィー
ゲル排除クロマトグラフィーから収集された前述の免疫調節ポリペプチド成分１ｂを、流速１ｍＬ／分で、ＳｅｐｈａｓｉｌペプチドＣ１８逆相高速液体クロマトグラフィー・カラムに投入した。移動相Ａは、０．０５％のトリフルオロ酢酸を含む１０％アセトニトリルであり、移動相Ｂは、０．０５％のトリフルオロ酢酸を含む６０％アセトニトリルであり、０〜８分は溶液Ａで、８〜１２分は溶液Ｂで（０〜１００％）、次いで１２〜１６分は溶液Ｂで勾配溶出した。
【００４７】
逆相高速液体クロマトグラムを、図５に示した。ｉｎ ｖｉｔｒｏでリンパ球増殖を刺激することによって決定された活性は、図６に示した。活性決定の結果は、成分４が、高純度の免疫調節ポリペプチドであることを示した。
【００４８】
Ｅ．同定および分析
成分４をナノ濾過膜で脱塩し、凍結乾燥して、免疫調節ポリペプチド生成物を得た。ＳｅｐｈａｓｉｌペプチドＣ１８ＲＰ−ＨＰＬＣおよびキャピラリー電気泳動によって、生成物の純度を同定した。この結果を図７および図８にそれぞれに示したが、どちらもシングル・ピークであった。
【００４９】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによって測定された免疫調節ポリペプチドの分子量は、２１３３．５２Ｄａであった。
【００５０】
ＣＩＥＦによって測定された免疫調節ポリペプチドの等電点は、３．８２であった。
【００５１】
４９１−タンパク質配列決定機によって決定された免疫調節ポリペプチドのペプチド配列は、Ｔｙｒ−Ｘ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｘ−Ｔｈｒ（Ｘ、アミノ酸）であった。
【００５２】
（実施例２）
Ａ．胎盤の調製
新鮮なウシ胎盤を、洗浄し切断し、胎盤の２倍（ｗ／ｖ）のリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を添加し、ホモジネートを調製し、１２０００ｒ／ｍで遠心分離し、沈殿させ、上澄みを、分子量カットオフが１００００の限外濾過膜によって限外濾過し、芳香族ポリアミド・ナノ濾過膜で脱塩し、凍結乾燥し、このようにして、免疫調節ポリペプチドを含有する凍結乾燥粉末サンプルを得た。
【００５３】
Ｂ．陰イオン交換クロマトグラフィー
３０ｍｇの凍結乾燥粉末を、濃度が２０ｍｍｏｌ／ＬのＮａ２ＨＰＯ４−ＮａＨ２ＰＯ４を含む５ｍｌのｐＨ６．８リン酸緩衝液に溶解し、この溶液サンプルを、流速１ｍｌ／分で２．６×３５ｃｍのＤＥＡＥセファロースＣＬ−６Ｂ陰イオン交換カラムに投入し、次いで勾配溶出した。前記勾配溶出は、溶出溶液Ａが、２０ｍｍｏｌ／ＬのＮａ２ＨＰＯ４−ＮａＨ２ＰＯ４リン酸緩衝液であり、溶出溶液Ｂが、１ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ溶液が添加された２０ｍｍｏｌ／ＬのＮａ２ＨＰＯ４−ＮａＨ２ＰＯ４リン酸緩衝液であり、０〜６００分は溶液Ａで溶出し、６００〜１０００分は０〜１００％の溶液Ｂで溶出した。
【００５４】
陰イオン交換クロマトグラム、およびｉｎ ｖｉｔｒｏでのリンパ球増殖を刺激することによって決定された活性は、それぞれ図１および図２と類似していた。活性決定の結果は、陰イオン交換クロマトグラフィーから得られた組成物が、免疫調節ポリペプチド１を含有することを示していた（矢印が示すピーク）。
【００５５】
Ｃ．ゲル排除クロマトグラフィー
陰イオン交換クロマトグラフィーから収集された、前述の免疫調節ポリペプチド成分１ａを、流速１０ｍＬ／時で、１．０×７５ｃｍのセファデックスＧ−２５ゲル排除カラムに投入した。移動相は、２０ｍｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ６．８）のＮａ２ＨＰＯ４−ＮａＨ２ＰＯ４リン酸緩衝液であった。同じ勾配で溶出した。
【００５６】
ゲル排除クロマトグラム、およびｉｎ ｖｉｔｒｏでのリンパ球増殖を刺激することによって決定された活性は、それぞれ図３および図４と類似していた。活性決定の結果は、ゲル排除クロマトグラフィーから得られた組成物が、免疫調節ポリペプチドを含有することを示していた（矢印が示すピーク）。
【００５７】
Ｄ．逆相高速液体クロマトグラフィー
ゲル排除クロマトグラフィーから収集された前述の免疫調節ポリペプチド成分１ｂを、流速１ｍＬ／分で、ＳｅｐｈａｓｉｌペプチドＣ１８逆相高速液体クロマトグラフィー・カラムに投入した。移動相Ａは、０．０５％のトリフルオロ酢酸を含む８％アセトニトリルであり、移動相Ｂは、０．０５％のトリフルオロ酢酸を含む５５％アセトニトリルであり、０〜８分は溶液Ａで、８〜１２分は溶液Ｂで（０〜１００％）、次いで１２〜１６分は溶液Ｂで勾配溶出した。
【００５８】
逆相高速液体クロマトグラム、およびｉｎ ｖｉｔｒｏでリンパ球増殖を刺激することによって決定された活性は、それぞれ図５および図６と類似していた。活性決定の結果は、成分４が、高純度の免疫調節ポリペプチドであることを示した。
【００５９】
Ｅ．同定および分析
成分４をナノ濾過膜で脱塩し、凍結乾燥して、免疫調節ポリペプチド生成物を得た。ＳｅｐｈａｓｉｌペプチドＣ１８ＲＰ−ＨＰＬＣおよびキャピラリー電気泳動によって、生成物の純度を同定した。これらの結果は、それぞれ図７および図８と類似しており、どちらもシングル・ピークであった。
【００６０】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによって測定された免疫調節ポリペプチドの分子量は、２１３３．５２Ｄａであった。
【００６１】
ＣＩＥＦによって測定された免疫調節ポリペプチドの等電点は、３．８２であった。
【００６２】
４９１−タンパク質配列決定器によって決定された免疫調節ポリペプチドのペプチド配列は、Ｔｙｒ−Ｘ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｘ−Ｔｈｒ（Ｘ、アミノ酸）であった。
【００６３】
（実施例３）
Ａ．胎盤の調製
新鮮なウシ胎盤を、洗浄し切断し、胎盤の２倍（ｗ／ｖ）のリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を添加し、ホモジネートを調製し、１２０００ｒ／ｍで遠心分離し、沈殿させ、上澄みを、分子量カットオフが１００００の限外濾過膜によって限外濾過し、芳香族ポリアミド・ナノ濾過膜で脱塩し、凍結乾燥し、このようにして、免疫調節ポリペプチドを含有する凍結乾燥粉末サンプルを得た。
【００６４】
Ｂ．陰イオン交換クロマトグラフィー
３０ｍｇの凍結乾燥粉末を、濃度が２０ｍｍｏｌ／ＬのＮａ２ＨＰＯ４−ＮａＨ２ＰＯ４を含む５ｍｌのｐＨ７．２リン酸緩衝液に溶解し、この溶液サンプルを、流速１ｍｌ／分で２．６×３５ｃｍのＤＥＡＥセファロースＣＬ−６Ｂ陰イオン交換カラムに投入し、次いで勾配溶出した。前記勾配溶出は、溶出溶液Ａが、２０ｍｍｏｌ／ＬのＮａ２ＨＰＯ４−ＮａＨ２ＰＯ４リン酸緩衝液であり、溶出溶液Ｂが、１ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ溶液が添加された２０ｍｍｏｌ／ＬのＮａ２ＨＰＯ４−ＮａＨ２ＰＯ４リン酸緩衝液であり、０〜６００分は溶液Ａで溶出し、６００〜１０００分は０〜１００％の溶液Ｂで溶出した。
【００６５】
陰イオン交換クロマトグラム、およびｉｎ ｖｉｔｒｏでのリンパ球増殖を刺激することによって決定された活性は、それぞれ図１および図２と類似していた。活性決定の結果は、陰イオン交換クロマトグラフィーから得られた組成物が、免疫調節ポリペプチド１を含有することを示していた（矢印が示すピーク）。
【００６６】
Ｃ．ゲル排除クロマトグラフィー
陰イオン交換クロマトグラフィーから収集された、前述の免疫調節ポリペプチド成分１ａを、流速１２ｍＬ／時で、１．０×７５ｃｍのセファデックスＧ−２５ゲル排除カラムに投入した。移動相は、２０ｍｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ７．２）のＮａ２ＨＰＯ４−ＮａＨ２ＰＯ４リン酸緩衝液であった。同じ勾配で溶出した。
【００６７】
ゲル排除クロマトグラム、およびｉｎ ｖｉｔｒｏでのリンパ球増殖を刺激することによって決定された活性は、それぞれ図３および図４と類似していた。活性決定の結果は、ゲル排除クロマトグラフィーから得られた組成物が、免疫調節ポリペプチドを含有することを示していた（矢印が示すピーク）。
【００６８】
Ｄ．逆相高速液体クロマトグラフィー
ゲル排除クロマトグラフィーから収集された前述の免疫調節ポリペプチド成分１ｂを、流速１ｍＬ／分で、ＳｅｐｈａｓｉｌペプチドＣ１８逆相高速液体クロマトグラフィー・カラムに投入した。移動相Ａは、０．０５％のトリフルオロ酢酸を含む５％アセトニトリルであり、移動相Ｂは、０．０５％のトリフルオロ酢酸を含む４５％アセトニトリルであり、０〜８分は溶液Ａで、８〜１２分は溶液Ｂで（０〜１００％）、次いで１２〜１６分は溶液Ｂで勾配溶出した。
【００６９】
逆相高速液体クロマトグラム、およびｉｎ ｖｉｔｒｏでリンパ球増殖を刺激することによって決定された活性は、それぞれ図５および図６と類似していた。活性決定の結果は、成分４が、高純度の免疫調節ポリペプチドであることを示した。
【００７０】
Ｅ．同定および分析
成分４をナノ濾過膜で脱塩し、凍結乾燥して、免疫調節ポリペプチド生成物を得た。ＳｅｐｈａｓｉｌペプチドＣ１８ＲＰ−ＨＰＬＣおよびキャピラリー電気泳動によって、生成物の純度を同定した。これらの結果は、それぞれ図７および図８と類似しており、どちらもシングル・ピークであった。
【００７１】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによって測定された免疫調節ポリペプチドの分子量は、２１３３．５２Ｄａであった。
【００７２】
ＣＩＥＦによって測定された免疫調節ポリペプチドの等電点は、３．８２であった。
【００７３】
４９１−タンパク質配列決定器によって決定された免疫調節ポリペプチドのペプチド配列は、Ｔｙｒ−Ｘ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｘ−Ｔｈｒ（Ｘ、アミノ酸）であった。
【００７４】
（実施例４）
Ａ．胎盤の調製
新鮮なウシ胎盤を、洗浄し切断し、胎盤の２倍（ｗ／ｖ）のリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を添加し、ホモジネートを調製し、１２０００ｒ／ｍで遠心分離し、沈殿させ、上澄みを、分子量カットオフが１００００の限外濾過膜によって限外濾過し、芳香族ポリアミド・ナノ濾過膜で脱塩し、凍結乾燥し、このようにして、免疫調節ポリペプチドを含有する凍結乾燥粉末サンプルを得た。
【００７５】
Ｂ．陰イオン交換クロマトグラフィー
３０ｍｇの凍結乾燥粉末を、濃度が２０ｍｍｏｌ／ＬのＮａ２ＨＰＯ４−ＮａＨ２ＰＯ４を含む５ｍｌのｐＨ７．２リン酸緩衝液に溶解し、この溶液サンプルを、流速１ｍｌ／分で２．６×３５ｃｍのＤＥＡＥセファロースＣＬ−６Ｂ陰イオン交換カラムに投入し、次いで勾配溶出した。前記勾配溶出は、溶出溶液Ａが、２０ｍｍｏｌ／ＬのＮａ２ＨＰＯ４−ＮａＨ２ＰＯ４リン酸緩衝液であり、溶出溶液Ｂが、１ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ溶液が添加された２０ｍｍｏｌ／ＬのＮａ２ＨＰＯ４−ＮａＨ２ＰＯ４リン酸緩衝液であり、０〜６００分は溶液Ａで溶出し、６００〜１０００分は０〜１００％の溶液Ｂで溶出した。
【００７６】
陰イオン交換クロマトグラム、およびｉｎ ｖｉｔｒｏでのリンパ球増殖を刺激することによって決定された活性は、それぞれ図１および図２と類似していた。活性決定の結果は、陰イオン交換クロマトグラフィーから得られた組成物が、免疫調節ポリペプチド１を含有することを示していた（矢印が示すピーク）。
【００７７】
Ｃ．ゲル排除クロマトグラフィー
陰イオン交換クロマトグラフィーから収集された、前述の免疫調節ポリペプチド成分１ａを、流速１２ｍＬ／時で、１．０×７５ｃｍのセファデックスＧ−２５ゲル排除カラムに投入した。移動相は、２０ｍｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ７．２）のＮａ２ＨＰＯ４−ＮａＨ２ＰＯ４リン酸緩衝液であった。同じ勾配で溶出した。
【００７８】
ゲル排除クロマトグラム、およびｉｎ ｖｉｔｒｏでのリンパ球増殖を刺激することによって決定された活性は、それぞれ図３および図４と類似していた。活性決定の結果は、ゲル排除クロマトグラフィーから得られた組成物が、免疫調節ポリペプチドを含有することを示していた（矢印が示すピーク）。
【００７９】
Ｄ．逆相高速液体クロマトグラフィー
ゲル排除クロマトグラフィーから収集された前述の免疫調節ポリペプチド成分１ｂを、流速１ｍＬ／分で、ＳｅｐｈａｓｉｌペプチドＣ１８逆相高速液体クロマトグラフィー・カラムに投入した。移動相Ａは、０．０５％のトリフルオロ酢酸を含む５％アセトニトリルであり、移動相Ｂは、０．０５％のトリフルオロ酢酸を含む６０％アセトニトリルであり、０〜８分は溶液Ａで、８〜１２分は溶液Ｂで（０〜１００％）、次いで１２〜１６分は溶液Ｂで勾配溶出した。
【００８０】
逆相高速液体クロマトグラム、およびｉｎ ｖｉｔｒｏでリンパ球増殖を刺激することによって決定された活性は、それぞれ図５および図６と類似していた。活性決定の結果は、成分４が、高純度の免疫調節ポリペプチドであることを示した。
【００８１】
Ｅ．同定および分析
成分４をナノ濾過膜で脱塩し、凍結乾燥して、免疫調節ポリペプチド生成物を得た。ＳｅｐｈａｓｉｌペプチドＣ１８ＲＰ−ＨＰＬＣおよびキャピラリー電気泳動によって、生成物の純度を同定した。これらの結果は、それぞれ図７および図８と類似しており、どちらもシングル・ピークであった。
【００８２】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによって測定された免疫調節ポリペプチドの分子量は、２１３３．５２Ｄａであった。
【００８３】
ＣＩＥＦによって測定された免疫調節ポリペプチドの等電点は、３．８２であった。
【００８４】
４９１−タンパク質配列決定器によって決定された免疫調節ポリペプチドのペプチド配列は、Ｔｙｒ−Ｘ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｘ−Ｔｈｒ（Ｘ、アミノ酸）であった。
【００８５】
（実施例５）
Ａ．胎盤の調製
新鮮なウシ胎盤を、洗浄し切断し、胎盤の２倍（ｗ／ｖ）のリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を添加し、ホモジネートを調製し、１２０００ｒ／ｍで遠心分離し、沈殿させ、上澄みを、分子量カットオフが１００００の限外濾過膜によって限外濾過し、芳香族ポリアミド・ナノ濾過膜で脱塩し、凍結乾燥し、このようにして、免疫調節ポリペプチドを含有する凍結乾燥粉末サンプルを得た。
【００８６】
Ｂ．陰イオン交換クロマトグラフィー
３０ｍｇの凍結乾燥粉末を、濃度が２０ｍｍｏｌ／ＬのＮａ２ＨＰＯ４−ＮａＨ２ＰＯ４を含む５ｍｌのｐＨ７．４リン酸緩衝液に溶解し、この溶液サンプルを、流速１ｍｌ／分で２．６×３５ｃｍのＤＥＡＥセファロースＣＬ−６Ｂ陰イオン交換カラムに投入し、次いで勾配溶出した。前記勾配溶出は、溶出溶液Ａが、２０ｍｍｏｌ／ＬのＮａ２ＨＰＯ４−ＮａＨ２ＰＯ４リン酸緩衝液であり、溶出溶液Ｂが、１ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ溶液が添加された２０ｍｍｏｌ／ＬのＮａ２ＨＰＯ４−ＮａＨ２ＰＯ４リン酸緩衝液であり、０〜６００分は溶液Ａで溶出し、６００〜１０００分は０〜１００％の溶液Ｂで溶出した（０〜１００％とは、１００％の溶液Ａおよび０％の溶液Ｂから、０％の溶液Ａおよび１００％の溶液Ｂまでを意味する）。
【００８７】
陰イオン交換クロマトグラム、およびｉｎ ｖｉｔｒｏでのリンパ球増殖を刺激することによって決定された活性は、それぞれ図１および図２と類似していた。活性決定の結果は、陰イオン交換クロマトグラフィーから得られた組成物が、免疫調節ポリペプチド１を含有することを示していた（矢印が示すピーク）。
【００８８】
Ｃ．ゲル排除クロマトグラフィー
陰イオン交換クロマトグラフィーから収集された、前述の免疫調節ポリペプチド成分１ａを、流速１０ｍＬ／時で、１．０×７５ｃｍのセファデックスＧ−２５ゲル排除カラムに投入した。移動相は、２０ｍｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ７．４）のＮａ２ＨＰＯ４−ＮａＨ２ＰＯ４リン酸緩衝液であった。同じ勾配で溶出した。
【００８９】
ゲル排除クロマトグラム、およびｉｎ ｖｉｔｒｏでのリンパ球増殖を刺激することによって決定された活性は、それぞれ図３および図４と類似していた。活性決定の結果は、ゲル排除クロマトグラフィーから得られた組成物が、免疫調節ポリペプチドを含有することを示していた（矢印が示すピーク）。
【００９０】
Ｄ．逆相高速液体クロマトグラフィー
ゲル排除クロマトグラフィーから収集された前述の免疫調節ポリペプチド成分１ｂを、流速１ｍＬ／分で、ＳｅｐｈａｓｉｌペプチドＣ１８逆相高速液体クロマトグラフィー・カラムに投入した。移動相Ａは、０．０５％のトリフルオロ酢酸を含む１０％アセトニトリルであり、移動相Ｂは、０．０５％のトリフルオロ酢酸を含む４０％アセトニトリルであり、０〜８分は溶液Ａで、８〜１２分は溶液Ｂで（０〜１００％）、次いで１２〜１６分は溶液Ｂで勾配溶出した。
【００９１】
逆相高速液体クロマトグラムは、図５と類似しており、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのリンパ球増殖を刺激することによって決定された活性は、図６と類似していた。活性決定の結果は、成分４が、高純度の免疫調節ポリペプチドであることを示した。
【００９２】
Ｅ．同定および分析
成分４をナノ濾過膜で脱塩し、凍結乾燥して、免疫調節ポリペプチド生成物を得た。ＳｅｐｈａｓｉｌペプチドＣ１８ＲＰ−ＨＰＬＣおよびキャピラリー電気泳動によって、生成物の純度を同定した。これらの結果は、それぞれ図７および図８と類似しており、どちらもシングル・ピークであった。
【００９３】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによって測定された免疫調節ポリペプチドの分子量は、２１３３．５２Ｄａであった。
【００９４】
ＣＩＥＦによって測定された免疫調節ポリペプチドの等電点は、３．８２であった。
【００９５】
４９１−タンパク質配列決定器によって決定された免疫調節ポリペプチドのペプチド配列は、Ｔｙｒ−Ｘ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｘ−Ｔｈｒ（Ｘ、アミノ酸）であった。
【００９６】
逆相高速液体クロマトグラフィーによって使用された溶液Ｂは、０．０５％のトリフルオロ酢酸を含む４０％アセトニトリルであり、その他の操作条件は、実施例１と同じであった。
【００９７】
前述の実施形態は、ウシ胎盤から免疫調節ポリペプチドを分離するための方法を説明するのに使用され、本発明の範囲を限定するものではない。しかし、本発明の同じ目的を達成するために、本発明の技術的思想および範囲を逸脱することなく様々な修正および変更を行うことができることは、当業者にしてみれば明らかなことである。
【図面の簡単な説明】
【００９８】
【図１】ＤＥＡＥセファロースＣＬ−６Ｂ陰イオン交換カラム上での、本発明の一実施形態で免疫調節ポリペプチドの分離から得られたクロマトグラムである。図１のピーク１ａは、免疫調節ポリペプチドを含有する成分である。
【図２】ＤＥＡＥセファロースＣＬ−６Ｂ陰イオン交換カラム上での、本発明の一実施形態で免疫調節ポリペプチドから分離された、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのリンパ球増殖を刺激するための４成分の棒グラフである。図２の成分１ａは、免疫調節ポリペプチドを含有する成分である。
【図３】セファデックスＧ−２５ゲル排除クロマトグラフィー・カラム上での、本発明の一実施形態で免疫調節ポリペプチドの分離から得られたクロマトグラムである。図３のピーク１ｂは、免疫調節ポリペプチドを含有する成分である。
【図４】セファデックスＧ−２５ゲル排除クロマトグラフィー・カラム上での、本発明の一実施形態で免疫調節ポリペプチドから分離された、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのリンパ球増殖を刺激するための２成分の棒グラフである。図４の成分１ｂは、免疫調節ポリペプチドを含有する成分である。
【図５】ＳｅｐｈａｓｉｌペプチドＣ１８逆相高速液体クロマトグラフィー・カラム上での、本発明の一実施形態で免疫調節ポリペプチドの分離から得られたクロマトグラムである。図５のピーク４は、免疫調節ポリペプチドを含有する成分である。
【図６】ＳｅｐｈａｓｉｌペプチドＣ１８逆相高速液体クロマトグラフィー・カラム上での、本発明の一実施形態で免疫調節ポリペプチドの分離から得られた、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのリンパ球増殖を刺激するための７成分の棒グラフである。図６の成分４は、免疫調節ポリペプチドを含有する成分である。
【図７】ＳｅｐｈａｓｉｌペプチドＣ１８逆相高速液体クロマトグラフィーによって測定された、本発明の一実施形態における免疫調節ポリペプチドの純度を示す図である。純度は、９０％よりも高い。
【図８】キャピラリー電気泳動によって測定された、本発明の一実施形態における免疫調節ポリペプチドの純度を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫調節ポリペプチドの分子量が２１３３．５２Ｄａであり、等電点が３．８２であり、ペプチド配列がＴｙｒ−Ｘ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｘ−ＴｈｒであってＸがアミノ酸であることを特徴とする、ウシ胎盤から分離された免疫調節ポリペプチド。
【請求項２】
新鮮なウシ胎盤を取り出し、水を加え、切断し、均質化し、遠心分離し、限外濾過し、ナノ濾過膜で脱塩し、凍結乾燥することを含む、ウシ胎盤から分離された免疫調節ポリペプチドを調製するための方法であって、前記凍結乾燥するステップによって得られた凍結乾燥粉末をリン酸緩衝液に溶解し、陰イオン交換クロマトグラフィー、ゲル排除クロマトグラフィー、および逆相高速液体クロマトグラフィーを使用して溶液を分離し、逆相高速液体クロマトグラフィーから収集された成分をナノ濾過膜で脱塩し、凍結乾燥し、ＲＰ−ＨＰＬＣおよびキャピラリー電気泳動によって免疫調節ポリペプチド生成物を測定し、どちらの結果もシングル・ピークであり、次いでＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによって分子量を測定し、ＣＩＥＦによって等電点を測定し、タンパク質配列決定機によってペプチド配列を決定することを含むことを特徴とする方法。
【請求項３】
前記陰イオン交換クロマトグラフィーが、溶液サンプルとして１０〜３０ｍｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ６．８〜７．５）のリン酸緩衝液中に前記凍結乾燥粉末を４〜１０：１（ｗ：ｖｏｌ）で溶解し、前記溶液サンプルを、０．５〜１．５ｍＬ／分の流速で陰イオン交換カラムに投入し、０．５〜１．５ｍＬ／分の流速で勾配溶出し、ｉｎ ｖｉｔｒｏでリンパ球増殖の刺激を介したＭＴＴ法による決定が行われ、スクリーニングが行われ、免疫調節ポリペプチドを含有する成分を、陰イオン交換クロマトグラフィーによって分離した後に収集されるように行われ、
前記勾配溶出において、溶出溶液Ａは、リン酸緩衝液１０〜３０ｍｏｌ／Ｌであり、溶出溶液Ｂは、溶液Ａに０．５〜１．５ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ溶液を添加することによって調製された溶液であり、０〜６００分では溶液Ａで、６００〜１０００分では０〜１００％の溶液Ｂで溶出することを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ゲル排除クロマトグラフィーが、陰イオン交換クロマトグラフィーから収集された免疫調節ポリペプチド成分を、８〜１２ｍＬ／時の流速で、１０〜３０ｍｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ６．８〜７．５）のリン酸緩衝液である移動相で、ゲル排除カラム上に直接投入し、８〜１２ｍＬ／時の流速で、同じ勾配溶出により溶出し、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのリンパ球増殖の刺激を介したＭＴＴ法による決定が行われ、スクリーニングが行われ、そして、陰イオン交換クロマトグラフィーによって分離した後に、免疫調節ポリペプチドを含有する成分が収集されるように行われることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記逆相高速液体クロマトグラフィーは、ゲル排除クロマトグラフィーから収集された免疫調節ポリペプチド成分を、逆相高速液体クロマトグラフィー・カラムに、０．８〜１．２ｍＬ／分の流速で、直接投入し、移動相Ａは、０．０１〜０．１％のトリフルオロ酢酸を含む５〜１０％のアセトニトリルであり、移動相Ｂは、０．０１〜０．１％のトリフルオロ酢酸を含む４０〜６０％のアセトニトリルであり、０〜８分は溶液Ａで、８〜１２分は溶液Ｂ（０〜１００％）で、１２〜１６分は溶液Ｂで、流速０．８〜１．２ｍＬ／時で勾配溶出するように行われることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記陰イオン交換カラムが、ジエチルアミノエチルで官能化された、アガロースＤＥＡＥセファロースＣＬ−６ＢまたはＤＥＡＥセファロースＦＦ、あるいはグルカンＤＥＡＥ−セファデックスＡ−２５またはＤＥＡＥ−セファデックスＡ−５０から選択された陰イオン交換媒体を備えることを特徴とする、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記ゲル排除クロマトグラフィー・カラムが、不活性多孔質網状構造を有する、グルカン セファデックスＧ−２５、セファデックスＧ−５０、またはポリアクリルアミン・ゲル バイオ−ゲル−Ｐ−４、バイオ−ゲル−Ｐ−６、またはバイオ−ゲル−Ｐ−１０であり、タンパク質混合物中の物質を、分子のサイズに基づいて分離することを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
前記逆相高速液体クロマトグラフィー・カラムが、ＯＤＳ逆相充填材が充填されたＳｅｐｈａｓｉｌペプチドＣ１８またはポリマーＣ１８であることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記溶液サンプルが、１０〜３０ｍｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ６．８〜７．５）のＮａ２ＨＰＯ４−ＮａＨ２ＰＯ４緩衝液であることを特徴とする、請求項３に記載の方法。
【請求項１】
免疫調節ポリペプチドの分子量が２１３３．５２Ｄａであり、等電点が３．８２であり、ペプチド配列がＴｙｒ−Ｘ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｘ−ＴｈｒであってＸがアミノ酸であることを特徴とする、ウシ胎盤から分離された免疫調節ポリペプチド。
【請求項２】
新鮮なウシ胎盤を取り出し、水を加え、切断し、均質化し、遠心分離し、限外濾過し、ナノ濾過膜で脱塩し、凍結乾燥することを含む、ウシ胎盤から分離された免疫調節ポリペプチドを調製するための方法であって、前記凍結乾燥するステップによって得られた凍結乾燥粉末をリン酸緩衝液に溶解し、陰イオン交換クロマトグラフィー、ゲル排除クロマトグラフィー、および逆相高速液体クロマトグラフィーを使用して溶液を分離し、逆相高速液体クロマトグラフィーから収集された成分をナノ濾過膜で脱塩し、凍結乾燥し、ＲＰ−ＨＰＬＣおよびキャピラリー電気泳動によって免疫調節ポリペプチド生成物を測定し、どちらの結果もシングル・ピークであり、次いでＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによって分子量を測定し、ＣＩＥＦによって等電点を測定し、タンパク質配列決定機によってペプチド配列を決定することを含むことを特徴とする方法。
【請求項３】
前記陰イオン交換クロマトグラフィーが、溶液サンプルとして１０〜３０ｍｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ６．８〜７．５）のリン酸緩衝液中に前記凍結乾燥粉末を４〜１０：１（ｗ：ｖｏｌ）で溶解し、前記溶液サンプルを、０．５〜１．５ｍＬ／分の流速で陰イオン交換カラムに投入し、０．５〜１．５ｍＬ／分の流速で勾配溶出し、ｉｎ ｖｉｔｒｏでリンパ球増殖の刺激を介したＭＴＴ法による決定が行われ、スクリーニングが行われ、免疫調節ポリペプチドを含有する成分を、陰イオン交換クロマトグラフィーによって分離した後に収集されるように行われ、
前記勾配溶出において、溶出溶液Ａは、リン酸緩衝液１０〜３０ｍｏｌ／Ｌであり、溶出溶液Ｂは、溶液Ａに０．５〜１．５ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ溶液を添加することによって調製された溶液であり、０〜６００分では溶液Ａで、６００〜１０００分では０〜１００％の溶液Ｂで溶出することを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ゲル排除クロマトグラフィーが、陰イオン交換クロマトグラフィーから収集された免疫調節ポリペプチド成分を、８〜１２ｍＬ／時の流速で、１０〜３０ｍｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ６．８〜７．５）のリン酸緩衝液である移動相で、ゲル排除カラム上に直接投入し、８〜１２ｍＬ／時の流速で、同じ勾配溶出により溶出し、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのリンパ球増殖の刺激を介したＭＴＴ法による決定が行われ、スクリーニングが行われ、そして、陰イオン交換クロマトグラフィーによって分離した後に、免疫調節ポリペプチドを含有する成分が収集されるように行われることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記逆相高速液体クロマトグラフィーは、ゲル排除クロマトグラフィーから収集された免疫調節ポリペプチド成分を、逆相高速液体クロマトグラフィー・カラムに、０．８〜１．２ｍＬ／分の流速で、直接投入し、移動相Ａは、０．０１〜０．１％のトリフルオロ酢酸を含む５〜１０％のアセトニトリルであり、移動相Ｂは、０．０１〜０．１％のトリフルオロ酢酸を含む４０〜６０％のアセトニトリルであり、０〜８分は溶液Ａで、８〜１２分は溶液Ｂ（０〜１００％）で、１２〜１６分は溶液Ｂで、流速０．８〜１．２ｍＬ／時で勾配溶出するように行われることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記陰イオン交換カラムが、ジエチルアミノエチルで官能化された、アガロースＤＥＡＥセファロースＣＬ−６ＢまたはＤＥＡＥセファロースＦＦ、あるいはグルカンＤＥＡＥ−セファデックスＡ−２５またはＤＥＡＥ−セファデックスＡ−５０から選択された陰イオン交換媒体を備えることを特徴とする、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記ゲル排除クロマトグラフィー・カラムが、不活性多孔質網状構造を有する、グルカン セファデックスＧ−２５、セファデックスＧ−５０、またはポリアクリルアミン・ゲル バイオ−ゲル−Ｐ−４、バイオ−ゲル−Ｐ−６、またはバイオ−ゲル−Ｐ−１０であり、タンパク質混合物中の物質を、分子のサイズに基づいて分離することを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
前記逆相高速液体クロマトグラフィー・カラムが、ＯＤＳ逆相充填材が充填されたＳｅｐｈａｓｉｌペプチドＣ１８またはポリマーＣ１８であることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記溶液サンプルが、１０〜３０ｍｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ６．８〜７．５）のＮａ２ＨＰＯ４−ＮａＨ２ＰＯ４緩衝液であることを特徴とする、請求項３に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公表番号】特表２００８−５３６８７８（Ｐ２００８−５３６８７８Ａ）
【公表日】平成２０年９月１１日（２００８．９．１１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５０６９０３（Ｐ２００８−５０６９０３）
【出願日】平成１８年２月１４日（２００６．２．１４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＮ２００６／０００２１９
【国際公開番号】ＷＯ２００６／１１１０６０
【国際公開日】平成１８年１０月２６日（２００６．１０．２６）
【出願人】（５０７３４８１５９）石家庄三鹿集▲団▼股▲フェン▼有限公司 (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年９月１１日（２００８．９．１１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年２月１４日（２００６．２．１４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＮ２００６／０００２１９
【国際公開番号】ＷＯ２００６／１１１０６０
【国際公開日】平成１８年１０月２６日（２００６．１０．２６）
【出願人】（５０７３４８１５９）石家庄三鹿集▲団▼股▲フェン▼有限公司 (1)
【Ｆターム（参考）】
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