エイコサノイド代謝を調節する方法
本発明の対象は、エイコサノイド代謝プロセスの調節を必要とする動物の細胞におけるエイコサノイド代謝プロセスを調節する方法であって、エイコサノイドオキシゲナーゼの活性を制御するために有効量の本発明の組成物を上記動物に投与するステップを含む方法に関する。具体的には、本発明の対象は、リポキシゲナーゼ及びシクロオキシゲナーゼを制御するために有効量の本発明の組成物を投与することによるアラキドン酸代謝を調節する方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本出願は、２００５年６月１４日出願の米国仮特許出願第６０／６９０，１６１号、及び２００６年４月１７日出願の米国仮特許出願第６０／７９２，３３０号の利益を主張し、これらの内容は、参照により本明細書中に全体として組み入れられる。
【０００２】
［発明の対象の背景］
（１．発明の対象の分野）
本発明の対象は、エイコサノイド代謝プロセスの調節を必要とする動物の細胞におけるエイコサノイド代謝プロセスを調節する方法に関し、エイコサノイドオキシゲナーゼの活性を制御するために有効量の本発明の組成物を動物に投与するステップを含む。特に、本発明の対象は、リポキシゲナーゼ及びシクロオキシゲナーゼの活性を制御するために有効量の本発明の組成物を投与することによるアラキドン酸代謝を調節する方法に関する。
【０００３】
（２．背景）
前立腺癌などの癌の早期診断及び治療において進歩がなされたが、前立腺癌は、依然として、最も共通した悪性腫瘍であり、米国において死に関連した男性の癌の２番目に多い原因である。この疾患のより関心の高い局面の１つは、潜在的な前立腺癌はアジアと米国の男性の両方で等しい割合で発症するが、臨床的に重大な前立腺癌の発症率はアジアよりも米国の方が非常に高いという事実である。この相違が異なった集団の食事摂取に関連していることを信じるには多数の理由があり、これらの観察が、前立腺癌の進行に影響を与える可能性のある様々な食事の要因の大規模な調査を促進した。高脂肪の食事は、前立腺癌の危険性の上昇と結び付くため、疫学的研究の中には、これは部分的には、典型的な西洋の食事と比べてアジアの食事の脂肪摂取量が低いことに原因があるかもしれないと示唆するものもある。
【０００４】
本出願人らは、本発明の組成物の投与が、骨髄性白血病ＫＢＭ−５細胞におけるＴＮＦ誘導のＮＦ−κＢ活性化を阻害し、肺腺癌Ｈ１２９９細胞におけるタバコの煙の濃縮物によって誘導されるＮＦ−κＢ活性化を阻害することを見出した。本発明の組成物の投与はまた、ＴＮＦ誘導の細胞浸潤及び排除されたＲＡＮＫＬ誘導の破骨細胞形成の抑制をもたらす。更に、本発明の組成物の投与は、ＴＮＦ誘導の種々の抗アポトーシス、増殖及び転移に関わる遺伝子産物の発現を抑制する。
【０００５】
［発明の対象の概要］
本発明の対象は、エイコサノイド代謝プロセスの調節を必要とする動物の細胞におけるエイコサノイド代謝プロセスを調節する方法に関し、この方法は、エイコサノイドオキシゲナーゼの活性を制御するために有効量の本発明の組成物を上記動物に投与するステップを含み、上記組成物は、ローズマリー、ウコン、オレガノ及びジンジャーの治療的に有効量の超臨界抽出物；並びに、ホーリーバジル、ジンジャー、ウコン、コガネバナ（Ｓｃｕｔｅｌｌａｒｉａ ｂａｉｃａｌｅｎｓｉｓ）、ローズマリー、グリーンティー、イタドリ（ｈｕｚｈａｎｇ）、黄蓮（Ｃｈｉｎｅｓｅ ｇｏｌｄｔｈｒｅａｄ）及びメギの治療的に有効量の含水アルコール抽出物を含む。
【０００６】
本発明の対象は、更に、１３−Ｓ−ＨＯＤＥの送達を必要とする動物に１３−Ｓ−ＨＯＤＥを送達する方法に関し、ローズマリー、ウコン、オレガノ及びジンジャーの治療的に有効量の超臨界抽出物；並びに、ホーリーバジル、ジンジャー、ウコン、コガネバナ、ローズマリー、グリーンティー、イタドリ、黄蓮及びメギの治療的に有効量の含水アルコール抽出物を含む組成物を動物に投与するステップを含む。
【０００７】
その上、本発明の対象は、アラキドン酸が媒介した炎症の阻害を必要とする動物におけるアラキドン酸が媒介した炎症を阻害する方法に関し、ローズマリー、ウコン、オレガノ及びジンジャーの治療的に有効量の超臨界抽出物；並びに、ホーリーバジル、ジンジャー、ウコン、コガネバナ、ローズマリー、グリーンティー、イタドリ、黄蓮及びメギの治療的に有効量の含水アルコール抽出物を含む組成物を上記動物に投与するステップを含む。
【０００８】
更に、本発明の対象は、ＮＦ−κＢに制御される遺伝子産物のレベルの調節を必要とする動物の細胞におけるＮＦ−κＢに制御される遺伝子産物のレベルを調節する方法に関し、ローズマリー、ウコン、オレガノ及びジンジャーの治療的に有効量の超臨界抽出物；並びに、ホーリーバジル、ジンジャー、ウコン、コガネバナ、ローズマリー、グリーンティー、イタドリ、黄蓮及びメギの治療的に有効量の含水アルコール抽出物を含む組成物を上記動物に投与するステップを含む。
【０００９】
［発明の対象の詳細な説明］
（定義）
用語「調節すること」は、生物の生物学的活性、機能、健康、又は状態に対する効果を生じさせるプロセスを意味し、このような生物学的活性、機能、健康、又は状態は、生物の一般的な健康及び幸福と調和するように、維持され、増強され、減少され、又は処置される。
【００１０】
生物の生物学的活性、機能、健康、又は状態を「増強すること」という用語は、増大、補強、強化、又は改善のプロセスを意味する。
【００１１】
用語「エイコサノイド」は、アラキドン酸及びリノリニックアシッド（ｌｉｎｏｌｉｎｉｃ ａｃｉｄ）などの多価不飽和脂肪酸から誘導される化合物の分類のいずれかを意味し、細胞活性に関与する。
【００１２】
用語「オキシゲナーゼ」は、酵素の基質への、酸素分子の導入を触媒する、酵素の分類のいずれかを意味する。
【００１３】
用語「超臨界ガス」又は「超臨界流体」は、本明細書中で使用するとき、臨界点温度まで加熱されたガスを意味し、この温度を超えると、ガスは圧力にかかわらずに、ガス状態を維持し、液体に変わらない。ガスの臨界点を超える温度に加熱されたガスは、圧縮により高密になるであろうし、そのためガスの特徴は、流体の特徴に似ているが、液体になるであろう。二酸化炭素は、通常、超臨界流体を必要とする用途において使用されている。超臨界流体の一般的な特性、及び抽出過程での超臨界流体の一般的な使用は、例えば、Ｔａｙｌｏｒ，Ｓｕｐｅｒｃｒｉｔｉｃａｌ Ｆｌｕｉｄ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ，Ｗｉｌｅｙ，１９９６；ＭｃＨｕｇｈ ａｎｄ Ｋｒｕｋｏｎｉｓ，Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｔｉｃａｌ Ｆｌｕｉｄ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，２ｎｄ ｅｄ．，Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ−Ｈｅｉｎｅｍａｎｎ，１９９４；及び、Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｃｌｉｆｆｏｒｄ，Ｓｕｐｅｒｃｒｉｔｉｃａｌ Ｆｌｕｉｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，２０００に記載され、これらの内容は、参照により本明細書中に組み入れられる。
【００１４】
本出願人らは、ハーブ抽出物で構成される混合物を開発し、この混合物は、ＣＯＸ−２阻害活性を有する。本出願人らの組成物は、組成物のいくつかの成分が超臨界ＣＯ２抽出法を経て調製される点で独特である。従来の溶媒系抽出法とは異なって、超臨界ＣＯ２抽出は、化学的な残留物を残すことなくハーブにおける天然産物を調製物中に得ることができる。
【００１５】
用語「超臨界抽出」は、本明細書中で使用するとき、疎水性化合物が超臨界流体を利用する試料から抽出され得る手法を意味する。超臨界流体の溶媒和力は、圧力及び温度が臨界点を上回って上昇するにつれて増加し、疎水性分子の分離のために有効な溶媒を生成する。用語「超臨界抽出物」は、超臨界抽出によって調製された抽出物を意味する。
【００１６】
用語「含水アルコール抽出」は、本明細書中で使用するとき、親水性化合物がアルコール及び水を利用して試料から抽出され、その後、溶液を蒸発させて、溶解した固体からなる抽出物を生成する手法を意味する。用語「含水アルコール抽出物」は、含水アルコール抽出によって調製された抽出物を意味する。
【００１７】
用語「１３−Ｓ−ＨＯＤＥ」は、１３−ヒドロキシオクタデカ−９Ｚ，１１Ｅ−ジエン酸を意味する。
【００１８】
用語「ＮＦ−κＢ」又は「ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ ｋａｐｐａ Ｂ」は、遺伝子発現に関与するマルチサブユニットの転写因子を意味する。活性なＮＦ−κＢは、ＲＥＬファミリー／ｐ６５サブユニット及びｐ５０若しくはｐ５２サブユニットの二量体からなる。ＮＦ−κＢは、ＮＦ−κＢの阻害剤ＩκＢとの相互作用を通じて細胞質に維持されるが、解離によって、細胞核に移動する。
【００１９】
（本発明の組成物）
本発明の組成物は、抗増殖活性、抗炎症活性、抗酸化活性、抗血管形成活性、及びアポトーシス活性を示す構成成分を含むポリハーブ調製剤の類である。本発明の組成物は、ローズマリー、ウコン、オレガノ及びジンジャーの治療的に有効量の超臨界抽出物；並びに、ホーリーバジル、ジンジャー、ウコン、コガネバナ、ローズマリー、グリーンティー、イタドリ、黄蓮及びメギの治療的に有効量の含水アルコール抽出物で構成される。
【００２０】
一態様では、活性な組成物は、下記を含む。
（Ａ）約４．５重量％〜約７．５重量％、より好ましくは約５．５重量％〜約６．５重量％のジンジャーの含水アルコール抽出物；
（Ｂ）約５．５重量％〜約８．５重量％、より好ましくは約６重量％〜約８重量％のジンジャーの超臨界抽出物；
（Ｃ）約１．０重量％〜約１．５重量％、より好ましくは約１．２重量％〜約１．４重量％のウコンの超臨界抽出物；
（Ｄ）約１０．０重量％〜約１６．０重量％、より好ましくは約１１．５重量％〜約１４．５重量％のローズマリーの超臨界抽出物；
（Ｅ）約４．０重量％〜約６．０重量％、より好ましくは約４．５重量％〜約５．５重量％のオレガノの超臨界抽出物；
（Ｆ）約１０．０重量％〜約１６．０重量％、より好ましくは約１１．５重量％〜約１４．５重量％のウコンの含水アルコール抽出物；
（Ｇ）約５．５重量％〜約８．０重量％、より好ましくは約６．０重量％〜約７．０重量％のローズマリーの含水アルコール抽出物；
（Ｈ）約１０．０重量％〜約１６．０重量％、より好ましくは約１１．５重量％〜約１４．５重量％のホーリーバジルの含水アルコール抽出物；
（Ｉ）約１０．０重量％〜約１６．０重量％、より好ましくは約１１．５重量％〜約１４．５重量％のグリーンティーの含水アルコール抽出物；
（Ｊ）約８．０重量％〜約１２．０重量％、より好ましくは約９．０重量％〜約１１．０重量％のイタドリの含水アルコール抽出物；
（Ｋ）約４．０重量％〜約６．０重量％、より好ましくは約４．５重量％〜約５．５重量％の黄蓮の含水アルコール抽出物；
（Ｌ）約４．０重量％〜約６．０重量％、より好ましくは約４．５重量％〜約５．５重量％のメギの含水アルコール抽出物；及び
（Ｍ）約２．０重量％〜約３．０重量％、より好ましくは約２．２５重量％〜約２．７５重量％のコガネバナの含水アルコール抽出物。
【００２１】
場合により、本発明で用いられるジンジャー、ローズマリー、ウコン、又はオレガノの含水アルコール抽出物は、好ましくは、下記の通りに調製される。植物又は植物の一部は、熱に感受性の成分を保存するために、好ましくは低温で粉砕し、好ましくは二酸化炭素を用いて超臨界抽出に共し、本明細書では「超臨界抽出物」と呼ぶオイル抽出物を得る。更なる任意の態様では、オイル不含残留物は、第一段階から単離され、次に、アルコール６０〜８０部と水４０〜２０部で構成される混合物である水／アルコール、好ましくは水／エタノール中で抽出される。次に、アルコール／水の液体を蒸発させて、本明細書中では「含水アルコール抽出物」と呼ぶ粉末化した抽出残留物が残る。
【００２２】
本発明で場合により用いられるジンジャー、ローズマリー、ウコン、及びオレガノの超臨界抽出物は、例えば、本明細書中に参照により組み入れられるＥ．Ｓｔａｈｌ，Ｋ．Ｗ．Ｑｕｉｒｉｎ，Ｄ．Ｇｅｒａｒｄ，Ｄｅｎｓｅ Ｇａｓｅｓ ｆｏｒ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｆｉｎｉｎｇ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ ４ １９８８に開示される既知の超臨界抽出法に従って調製することができる。
【００２３】
好ましい態様では、ジンジャーの超臨界抽出物とジンジャーの含水アルコール抽出物との重量比は、約０．８：１〜約１．４：１である。
【００２４】
本発明で用いられるローズマリー、ウコン、ホーリーバジル、グリーンティー、イタドリ、黄蓮、メギ及びコガネバナの含水アルコール抽出物は、従来の含水アルコール抽出手法に従って調製することができる。例えば、含水アルコール抽出物は、アルコール６０〜８０部と水４０〜２０部で構成される混合物である水／アルコール、好ましくは水／エタノール中で植物部分を抽出し、次に、水／アルコールの液体を蒸発させて、本明細書中では「含水アルコール抽出物」と呼ぶ粉末化した抽出残留物を残すことによって調製することができる。
【００２５】
更に別の態様では、ウコンの含水アルコール抽出物とウコンの超臨界抽出物との重量比は、約８：１〜約１２：１である。
【００２６】
代替の態様では、ローズマリーの超臨界抽出物とローズマリーの含水アルコール抽出物の重量比は、約１．６：１〜約２．４：１である。
【００２７】
なお更なる態様では、ジンジャーの含水アルコール抽出物は、約２．４重量％〜約３．６重量％、より好ましくは約２．７重量％〜約３．３重量％、最も好ましくは約３．０重量％の刺激性化合物を含む。
【００２８】
別の態様では、ジンジャーの超臨界抽出物は、約２４重量％〜約３６重量％、より好ましくは約２７重量％〜約３３重量％、最も好ましくは約３０重量％の刺激性化合物を含み；約６．４重量％〜約９．６重量％、より好ましくは約７．２重量％〜約８．８重量％、最も好ましくは約８重量％のジンギベレンを含む。
【００２９】
更なる態様では、ウコンの超臨界抽出物は、約３６重量％〜約５４重量％、より好ましくは約４０．５重量％〜約４９．５重量％、最も好ましくは約４５重量％のターメロン（ｔｕｒｍｅｒｏｎｅｓ）を含む。
【００３０】
別の態様では、ローズマリーの超臨界抽出物は、約１８．４重量％〜約２７．６重量％、より好ましくは約２０．７重量％〜約２５．３重量％、最も好ましくは約２３重量％の全フェノール系抗酸化物質を含む。
【００３１】
更に別の態様では、オレガノの超臨界抽出物は、約４．０重量％、より好ましくは約４．５重量％〜約５．５重量％、最も好ましくは約５．０重量％の全フェノール系抗酸化物質を含む。
【００３２】
なお更なる態様では、ウコンの含水アルコール抽出物は、約５．６重量％〜約８．４重量％、より好ましくは約６．３重量％〜約７．７重量％、最も好ましくは約７％のクルクミンを含む。
【００３３】
別の態様では、ローズマリーの含水アルコール抽出物は、約１８．４重量％〜約２７．６重量％、より好ましくは約２０．７重量％〜約２５．３重量％、最も好ましくは約２３重量％の全フェノール系抗酸化物質を含む。
【００３４】
更なる態様では、ホーリーバジルの含水アルコール抽出物は、約１．６重量％〜約２．４重量％、より好ましくは約１．８重量％〜約２．２重量％、最も好ましくは約２重量％のウルソル酸を含む。
【００３５】
更なる態様では、グリーンティーの含水アルコール抽出物は、約３６重量％〜約５４重量％、より好ましくは約４０．５重量％〜約４９．５重量％、最も好ましくは４５重量％のポリフェノールを含む。
【００３６】
別の態様では、イタドリの含水アルコール抽出物は、約６．４重量％〜約９．６重量％、より好ましくは約７．２重量％〜約８．８重量％、最も好ましくは約８重量％のレザバトロール（ｒｅｓｅｒｖａｔｒｏｌｓ）を含む。
【００３７】
別の態様では、黄蓮の含水アルコール抽出物は、約４．８重量％〜約７．２重量％、より好ましくは約５．４重量％〜約６．６重量％、最も好ましくは約６重量％のベルベリンを含む。
【００３８】
更なる態様では、メギの含水アルコール抽出物は、約４．８重量％〜約７．２重量％、より好ましくは約５．４重量％〜約６．６重量％、最も好ましくは約６重量％のベルベリンを含む。
【００３９】
代替の態様では、上記組成物は、下記を含む。
（Ａ）約４．５重量％〜約７．５重量％のジンジャーの含水アルコール抽出物、ここで、この抽出物は、約２．４重量％〜約３．６重量％の刺激性化合物を含む；
（Ｂ）約５．５重量％〜約８．５重量％のジンジャーの超臨界抽出物、ここで、この抽出物は、約２４重量％〜約３６重量％の刺激性物質及び約６．４重量％〜約９．６重量％のジンギベレンを含む；
（Ｃ）約１．０重量％〜約１．５重量％のウコンの超臨界抽出物、ここで、この抽出物は、約３６重量％〜約５４重量％のターメロンを含む；
（Ｄ）約１０．０重量％〜約１６．０重量％のローズマリーの超臨界抽出物、ここで、この抽出物は、約１８．４重量％〜約２７．６重量％の全フェノール系抗酸化物質を含む；
（Ｅ）約４．０重量％〜約６．０重量％のオレガノの超臨界抽出物、ここで、この抽出物は、約４．０重量％を超える全フェノール系抗酸化物質を含む；
（Ｆ）約１０．０重量％〜約１６．０重量％のウコンの含水アルコール抽出物、ここで、この抽出物は、約５．６重量％〜約８．４重量％のクルクミンを含む；
（Ｇ）約５．５重量％〜約８．０重量％のローズマリーの含水アルコール抽出物、ここで、この抽出物は、約１８．４重量％〜約２７．６重量％の全フェノール系抗酸化物質を含む；
（Ｈ）約１０．０重量％〜約１６．０重量％のホーリーバジルの含水アルコール抽出物、ここで、この抽出物は、約１．６重量％〜約２．４重量％のウルソル酸を含む；
（Ｉ）約１０．０重量％〜約１６．０重量％のグリーンティーの含水アルコール抽出物、ここで、この抽出物は、約３６重量％〜約５４重量％のポリフェノールを含む；
（Ｊ）約８．０重量％〜約１２．０重量％のイタドリの含水アルコール抽出物、ここで、この抽出物は、約６．４重量％〜約９．６重量％のレザバトロールを含む；
（Ｋ）約４．０重量％〜約６．０重量％の黄蓮の含水アルコール抽出物、ここで、この抽出物は、約４．８重量％〜約７，２重量％のベルベリンを含む；
（Ｌ）約４．０重量％〜約６．０重量％のメギの含水アルコール抽出物、ここで、この抽出物は、約４．８重量％〜約７．２重量％のベルベリンを含む；及び
（Ｍ）約２．０重量％〜約３．０重量％のコガネバナの含水アルコール抽出物を含み、ここで、上記組成物は、更に、下記を含む。
（i）含水アルコール抽出物の１部に対して超臨界抽出物の約０．８〜約１．４部の重量比であるジンジャーの超臨界抽出物及びジンジャーの含水アルコール抽出物；
（ii）超臨界抽出物の１部に対して含水アルコール抽出物の約８〜約１２部の重量比であるウコンの含水アルコール抽出及びウコンの超臨界抽出物；及び
（iii）含水アルコール抽出物の１部に対して超臨界抽出物の約１．６〜約２．４部の重量比であるローズマリーの超臨界抽出物及びローズマリーの含水アルコール抽出物。
【００４０】
代替の態様では、組成物は、抗腫瘍剤、成長阻害剤、及び栄養素からなる群から選択される追加の薬物を含む。
【００４１】
不活性な成分を除いて、本発明の方法で用いられる経口投与される組成物の好ましい実施形態が、表１に記載される。表１に示された量は、列挙された成分の好ましい投薬量を表す。
【００４２】
【表１】
【００４３】
好ましくは、表１に記載される組成物はまた、エクストラバージンオリーブオイル及び蜜ろうを含む。
【００４４】
（本発明の対象の方法）
本発明の対象の組成物は、概して、典型的には東洋の食生活で消費される植物産物（ジンジャー、ローズマリー、ウコンの根、ホーリーバジル、グリーンティー、イタドリ、黄蓮、メギ、オレガノ、及びコガネバナ）からの規準化した超臨界ＣＯ２濃縮抽出物を含む。
【００４５】
本発明の組成物は、ヒトＰＣ３細胞に対する抗増殖作用について調べ、具体的には、この前立腺癌細胞株におけるエイコサノイド代謝における効果について分析した。本発明の組成物は、クローニングされたＣＯＸ−１、ＣＯＸ−２及び５−ＬＯＸ活性の濃度依存的な阻害を生じることが観察され、５−ＨＥＴＥ産生の阻害は、ＰＧＥ２形成の阻害よりも大きかった。
【００４６】
無傷のＰＣ３に適用した場合、本発明の組成物は、１２−ＬＯＸ活性に対して最も強力であることが分かり、続いて５−ＬＯＸ活性、次にＣＯＸ活性に対してであった。驚くべきことに、ＰＣ３細胞における１３−Ｓ−ＨＯＤＥの出現は、本発明の組成物それ自体におけるこのエイコサノイドの存在が原因であり、細胞内の１５−ＬＯＸ活性の刺激ではなかった。ＰＣ３細胞の増殖の濃度依存的な阻害は、細胞周期の選択的なＧ２／Ｍ停止及びアポトーシスの誘導に関連し、アネキシンＶ及びホスファチジルイノシトールを用いたＰＣ３細胞のフローサイトメトリー染色によって証明された。
【００４７】
本発明の組成物はまた、５−ＬＯＸ及び１２−ＬＯＸ発現の濃度依存的なダウンレギュレーション（ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）を生じるが、高濃度では、ＣＯＸ−２発現のアップレギュレーション（ｕｐ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）が示された。いくつかの細胞情報伝達タンパク質のリン酸化状態を測定した。本発明の組成物は、ｐ２１のリン酸化の増加を生じたが、Ｒｂ及びＳＴＡＴ１タンパク質のリン酸化をダウンレギュレートした。ｐＲｂタンパク質の減少は、１２−ＬＯＸの阻害、及び細胞における１２−ＨＥＴＥレベルの減少によることが示された。本発明の組成物で処理した細胞への１２−ＨＥＴＥの添加は、細胞増殖を阻害する本発明の組成物の能力を克服し、これと一致して、１２−ＨＥＴＥは、Ｒｂタンパク質のリン酸化をダウンレギュレートする本発明の組成物の能力を阻害した。
【００４８】
本発明の組成物を用いたヒト前立腺癌細胞の増殖の効果的な制御は、複合機構的であるが、部分的には、１２−ＬＯＸなどの異常な腫瘍細胞のエイコサノイド代謝の制御、１３−（Ｓ）−ＨＯＤＥなどの植物由来のエイコサノイド産物の適用、並びにリン酸化状態の制御を通じたＲｂ腫瘍抑制タンパク質機能の制御に関わると結論付けられる。
【００４９】
更に、他の実験では、組成物はシクロゲナーゼ（クローニングされたＣＯＸ−１及びＣＯＸ−２）の強力な阻害を示したものの、この産物によって引き起こされるヒト前立腺腫瘍細胞成長を低下する能力は、大部分、ＣＯＸ−２に独立した機構によると考えられることが示された。細胞及び組織における複数のエイコサノイドを同時に測定するＬＣ／ＭＳ／ＭＳに基づく方法を用いて、この独自のハーブ組成物によって生じる細胞及び組織におけるエイコサノイド代謝の変化を調べた。
【００５０】
細胞内のＰＧＥ２、１２−ＨＥＴＥ並びに５−ＨＥＴＥのレベルは、組成物に暴露することにより濃度依存的に減少した。対照的に、１５−ＨＥＴＥ及び１３−ＨＯＤＥの細胞レベルは上昇した。１３−ＨＯＤＥの上昇は、劇的ではあったが、上記で検討したように、ハーブ組成物それ自体に存在する１３−ＨＯＤＥの高い含有量に起因するものであり、この重要なエイコサノイドの細胞による生成に依存しなかった。１３−ＨＯＤＥレベルは、腫瘍細胞成長の阻害を説明するには十分に高いと考えられ、これは真の１３−ＨＯＤＥを腫瘍細胞培養物に添加することによって独立に検証された。
【００５１】
ヒト腫瘍細胞（ＰＣ３前立腺癌細胞）の本発明の組成物への曝露はまた、ウェスタンブロット分析によって測定される５−ＬＯＸ発現のダウンレギュレーションをもたらした。アラキドン酸が媒介したマウスの耳炎症を阻害する本発明の能力はまた評価された。本発明の組成物は、ＬＴＢ４合成の有意な阻害を生じ、１５−ＨＥＴＥの産生をアップレギュレートした。
【００５２】
したがって、本発明の対象は、エイコサノイド代謝プロセスの調節を必要とする動物の細胞におけるエイコサノイド代謝プロセスを調節するための方法に関し、この方法は、エイコサノイドオキシゲナーゼの活性を制御するために有効量の組成物を上記動物に投与するステップを含み、当該組成物は、ローズマリー、ウコン、オレガノ及びジンジャーの治療的に有効量の超臨界抽出物；並びに、ホーリーバジル、ジンジャー、ウコン、コガネバナ、ローズマリー、グリーンティー、イタドリ、黄蓮及びメギの治療的に有効量の含水アルコール抽出物を含む。
【００５３】
本発明の対象の一態様では、細胞は癌細胞である。一実施形態では、癌細胞は、前立腺癌細胞、乳癌細胞、肺癌細胞、結腸癌細胞、又はそれらの組合せを含む。
【００５４】
代替の実施形態では、エイコサノイド代謝プロセスは、細胞の癌への形質転換、癌細胞増殖、癌細胞転移、癌細胞浸潤、癌細胞調節の血管形成、癌細胞調節のアポトーシス抑制、又はそれらの組合せに関連した異常代謝である。
【００５５】
エイコサノイド代謝。アラキドン酸及びその前駆体、リノール酸、及びリノリニックアシッド（ｌｉｎｏｌｉｎｉｃ ａｃｉｄ）は、動物脂肪及び様々な植物油に存在し、一般的には、東洋の食生活と比較して、典型的な西洋の食生活により大量に消費されていると考えられる。これらの脂肪酸の摂取の増加は、リポキシゲナーゼ（ＬＯＸ）及びシクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）などのオキシゲナーゼに対する基質利用性を増加させ、これらの酵素は、アラキドン酸などのエイコサノイドのプロスタグランジン、ロイコトレン、リポキシン、１３−Ｓ−ＨＯＤＥ、５−ＨＥＴＥ、及び１２−ＨＥＴＥなどのシグナル分子への変換に関与する。多くの重要な生物学的経路におけるセカンドメッセンジャーとしてのそれらの重要な役割に加えて、エイコサノイド代謝のこれらの産物は、腫瘍発生、進行、増殖、及び転移のあらゆる局面に関わり合っている。
【００５６】
リポキシゲナーゼ及びエイコサノイド代謝。リポキシゲナーゼ酵素（ＬＯＸ）は、細胞における細胞の生存及びアポトーシスの重要な調節因子であることが知られている。リポキシゲナーゼ酵素は、アラキドン酸酸化の部位特異性について分類される脂質過酸化酵素の異種ファミリーを構成する。ＬＯＸは、５−、８−、１２−、及び１５−ＬＯＸアイソフォームとして示され、５（Ｓ）−、８（Ｓ）−、１２（Ｓ）−、及び１５（Ｓ）−ＨＥＴＥとして知られている最終産物を生成する。ＰＣ３細胞におけるＣＯＸ及びＬＯＸ代謝のＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析の応用は、以前に公開された手法を用いて行った。結果は、本発明の組成物が、期待された通りに、クローニングされたＣＯＸ−１及びＣＯＸ−２の酵素活性の阻害剤であることを示した。更に、当該組成物はまた、クローニングされた５−ＬＯＸ活性を阻害し、実際に、ＣＯＸ阻害剤よりは５−ＬＯＸ阻害剤としてより強力であった。培養中のＰＣ３細胞の処理は、本発明の組成物の、ＣＯＸの阻害を通じてＰＧＥ２の形成を阻害する能力が、５−ＬＯＸを阻害する能力より小さく、これは、言い換えると、ヒト前立腺癌の増殖及び転移に重要であることで知られる酵素である１２−ＬＯＸの、本発明を介した阻害よりも小さいことを示した。
【００５７】
１２−ＨＥＴＥ。いくつかの証拠が、現在、癌細胞の発生の調節因子として１２−ＬＯＸを明確に関連付けている。Ｋ．Ｈｏｎｎの研究所は、特に、ヒト前立腺癌における血小板型１２−ＬＯＸ及びその産物である１２（Ｓ）−ＨＥＴＥの役割の理解に大きく貢献してきた。彼らは、例えば、１２−ＬＯＸがいくつかの前立腺癌細胞株において発現すること、バイカレイン又はＢＨＰＰなどの１２−ＬＯＸの阻害剤が前立腺腫瘍の転移を有意に阻害すること、１２−ＬＯＸレベルがヒト前立腺腫瘍の等級及び重症度と相関することを報告した。このグループからの最近の優れた報告では、前立腺細胞成長及び増殖のバイカレイン阻害が１２−ＬＯＸ阻害と特異的に関連し、１２−ＨＥＴＥの減少がリン酸化されたＲｂタンパク質の喪失と相関することも示された。ＲＢのリン酸化の減少は、言い換えると、ＲＢタンパク質がＤＮＡ合成に必要とされる転写因子に結合したままにし、癌細胞増殖の阻害をもたらす。
【００５８】
早期段階の前立腺癌などの癌と関連した炎症に関与する生物活性な脂質が多く存在する。これらは、腫瘍細胞増殖を刺激するＰＧＥ２の十分に立証された能力を含む。これは、典型的には、腫瘍におけるＣＯＸ−２の過剰発現を通じて起こり、ＰＧＤＨ活性の減少のより最近の知見でもあり、この酵素は、ＰＧＥ２の代謝に関与する。５−リポキシゲナーゼからの５−ＨＥＴＥ及び１２−リポキシゲナーゼからの１２−ＨＥＴＥなどのリポキシゲナーゼ産物はまた、前立腺腫瘍細胞増殖を特異的に誘導することが示されている。１２−ＨＥＴＥは、前立腺癌の増殖、転移及び血管形成と関連することが示されているので、１２−ＬＯＸの阻害が前立腺癌の治療における可能性のある治療的アプローチを示すという示唆が最近なされている。１５−ＬＯＸ−１の産物である１３−Ｓ−ＨＯＤＥ、及び１５−ＬＯＸ−２の産物である１５−ＨＥＴＥなどの他のエイコサノイドは、癌、特に、前立腺癌のシグナリングに対して拮抗的な作用をするようであり、実際には、エイコサノイドの作用においては腫瘍タイプ選択的であるかもしれない。
【００５９】
悪性疾患に対する組織炎症の進行における選択された生物活性なエイコサノイドの役割をより良く理解するために、本出願人らは、自らが開発したエレクトロスプレイ・タンデム質量分析アッセイを用いて、前立腺細胞に関連する炎症プロフィールを試験した。この方法は、アラキドン酸又はリノール酸などの外因子基質を添加する必要がなく、一度に最大１０個のシクロオキシゲナーゼ、リポキシゲナーゼ及び／又はチトクロームＰ４５０誘導のエイコサノイドの同時分析を通じて細胞又は組織試料における「ミニ−リピドミクス（ｍｉｎｉ−ｌｉｐｉｄｏｍｉｃｓ）」の測定を可能にする。
【００６０】
ヒトの癌におけるエイコサノイドの役割をより良く理解するために、本出願人らは、ＰＣ３細胞におけるこの新規な組織炎症アッセイを用いて、このヒトの疾患の増殖に重要であると考えられるシクロオキシゲナーゼ及びリポキシゲナーゼ誘導のエイコサノイドに対する本発明の組成物の効果を測定した。本出願人らは、本発明の組成物が、エイコサノイド代謝において、もし、シクロオキシゲナーゼ活性の阻害以外の効果を生じるならば、どのような効果が生じるのかを測定した。本出願人らのデータは、このマルチハーブ産物が、５−ＬＯＸ及び１２−ＬＯＸ活性を阻害することを示唆している。後者の知見は、１２−ＬＯＸ活性の抑制が、腫瘍細胞増殖及びＲｂリン酸化の阻害、したがって、ホルモン抵抗性ＰＣ３前立腺腫瘍細胞に対する腫瘍抑制活性の復帰と特異的に関連していることを見出した点で、特に興味深いものであるかもしれない。
【００６１】
したがって、好ましい態様では、エイコサノイドは、アラキドン酸及びリノリニックアシッド（ｌｉｎｏｌｉｎｉｃ ａｃｉｄ）からなる群から選択される。
【００６２】
より好ましい態様では、エイコサノイドは、アラキドン酸である。
【００６３】
本発明の対象の更なる態様では、エイコサノドオキシゲナーゼは、シクロオキシゲナーゼ−１、シクロオキシゲナーゼ−２、５−リポキシゲナーゼ、１２−リポキシゲナーゼ、又はそれらの組み合わせである。
【００６４】
好ましい態様では、エイコサノイドオキシゲナーゼは、１２−リポキシゲナーゼである。
【００６５】
別の好ましい態様では、エイコサノイドオキシゲナーゼは、５−リポキシゲナーゼである。
【００６６】
シクロオキシゲナーゼ。エイコサノイド代謝を媒介するシクロオキシゲナーゼ酵素は、多くの組織で構成的に発現しているシクロオキシゲナーゼ−１（ＣＯＸ−１）、炎症及び癌などの疾患状態で典型的に誘導されるシクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）の２種類に代表される。多くの分子生物学及び細胞生物学的試験によるデータはまた、ＣＯＸ−２遺伝子は、アポトーシス、増殖、接着、血管形成及び分化を調節する経路に影響する初期の成長応答遺伝子であることを示唆している。
【００６７】
ＣＯＸ及び特にＣＯＸ−２阻害は、何年もの間、抗炎症剤設計の主要な標的であったが、しかしながら、ＣＯＸ−２発現及び癌との間の結びつきは、より最近になって認められたに過ぎない。いくつかの集団ベースの試験による観察は、強力なＣＯＸ阻害活性を有する非ステロイド系抗炎症剤を規則的に摂取する人々において結腸直腸癌の危険性の有意な減少を示している。結腸直腸腫瘍の発症を調査した組織学的試験は、大部分のヒト及び動物の結腸直腸腫瘍が、上昇したＣＯＸ−２レベルを発現し、近接する正常な結腸直腸の上皮細胞が、低度から検出できない程度のＣＯＸ−２レベルであることを示した。これらの観察に類似して、いくつかの研究所はまた、ＣＯＸ−２発現が、正常な上皮細胞と比較して、初期及び進行中の前立腺癌細胞において上昇することを報告しているが、しかしながら、この知見には異論がある。
【００６８】
とは言っても、いくつかの薬理学的なＣＯＸ−２阻害剤は、インビトロにおいて前立腺癌細胞成長を抑制し、アポトーシスを誘導し、免疫欠損マウスモデル又はＴＲＡＭＰマウスなどの前立腺癌のトランスジェニックモデルにおけるヒトの前立腺腫瘍異種移植片の成長を抑制する能力を示したことは明らかである。ＣＯＸ−２が前立腺癌発症又は進行の因子であるかについて異論はあるが、既知のＣＯＸ阻害剤のいくつかは、様々なＣＯＸに依存しない抗癌作用を有すると考えられ、これらの作用は、阻害剤の中で相違しているようである。
【００６９】
これに関して、地域の食生活に目立つ多くの植物は、ＣＯＸ阻害活性を有する物質を含むことは非常に興味深い。これらの植物からの抽出物は、粗製な形態及び単離した成分の両方で、強力な抗炎症活性及び抗癌活性を有することが分かった。サリチル酸は、例えば、ヤナギの木の皮で見つけられた伝統的な炎症阻害剤であり、この薬物の化学的誘導体であるアスピリンは、依然として世界中で最も一般的に用いられるＣＯＸ阻害性物質の１つである。本研究では、本出願人らは、ＣＯＸ−１及びＣＯＸ−２酵素活性に影響を与え、通常用いられるヒト前立腺癌細胞モデルシステムであるＬＮＣａＰ細胞の挙動に影響を及ぼす能力に関して、独特で商業化が可能なハーブ調製物である本発明の組成物の可能性を考察した。上記で詳述した通り、本発明の組成物は、１０個の規準化されたハーブ抽出物（ローズマリー、ウコン、ジンジャー、ホーリーバジル、グリーンティー、イタドリ、黄蓮、メギ、オレガノ及びコガネバナ）を含む。これらのハーブの各々は、ＣＯＸ活性又は発現に影響を及ぼす独特な化学的構成成分を含むことが示され、各々は、抗炎症性活性又は抗癌活性のいずれかについて試験された。この試験は、任意の所定のハーブにおいて見出された優れた化合物に焦点を当てる傾向にあるが、しかしながら、癌などの疾患に対する複数のハーブ／食餌性薬物（ｄｉｅｔａｒｙ ａｇｅｎｔｓ）の組み合わせに付加的な利益があることを信じるには理由がある。本発明の組成物に存在する複数及び化学的に多様な構成成分は、各々、典型的なアジアの食生活に不可欠な成分であるが、任意の単独のハーブ抽出物のみよりは前立腺癌に対して効果的である可能性がある。
【００７０】
したがって、本発明の対象の代替の態様では、エイコサノイドオキシゲナーゼは、シクロオキシゲナーゼ−１、シクロオキシゲナーゼ−２、又はそれらの組み合わせである。
【００７１】
好ましい実施態様では、エイコサノイドオキシゲナーゼは、シクロオキシゲナーゼ−１である。
【００７２】
更に好ましい実施態様では、エイコサノイドオキシゲナーゼは、シクロオキシゲナーゼ−２である。
【００７３】
本発明の対象の一の代替の態様では、エイコサノイドオキシゲナーゼの活性制御は、オキシゲナーゼ阻害である。
【００７４】
本発明の対象の代替の態様では、エイコサノイド代謝プロセスの調節は、動物の細胞におけるＮＦ−κＢ活性を阻害することを含む。
【００７５】
本発明の対象は、更に、１３−Ｓ−ＨＯＤＥの送達を必要とする動物における１３−Ｓ−ＨＯＤＥを送達する方法に関し、この方法は、ローズマリー、ウコン、オレガノ及びジンジャーの治療的に有効量の超臨界抽出物；並びに、ホーリーバジル、ジンジャー、ウコン、コガネバナ、ローズマリー、グリーンティー、イタドリ、黄蓮及びメギの治療的に有効量の含水アルコール抽出物を含む組成物を上記動物に投与するステップを含む。
【００７６】
更に、本発明の対象は、アラキドン酸が媒介する炎症の阻害を必要とする動物におけるアラキドン酸が媒介した炎症を阻害する方法に関し、この方法は、ローズマリー、ウコン、オレガノ及びジンジャーの治療的に有効量の超臨界抽出物；並びに、ホーリーバジル、ジンジャー、ウコン、コガネバナ、ローズマリー、グリーンティー、イタドリ、黄蓮及びメギの治療的に有効量の含水アルコール抽出物を含む組成物を上記動物に投与することを含む。
【００７７】
ＮＦ−κＢ。核因子κＢは、全ての細胞の細胞質に存在するＲｅｌドメインを含むタンパク質のファミリーであり、ＩκＢα、ＩκＢβ、ＩκＢγ、ＩκＢε、ｂｃｌ−３、ｐ１０５及びｐ１００を含むアンカリン（ａｎｃｈｏｒｉｎ）ドメイン含有タンパク質のファミリーによって不活性な状態で維持される。静止条件下で、ＮＦ−κＢは、細胞質中でｐ５０、ｐ６５、及びＩκＢαのヘテロ三量体から成り；活性化され、核に移行された場合のみ、一連のイベントが転写開始へと導く。大部分の発癌物質、炎症性物質、並びにタバコの煙の濃縮物、ホルボールエステル、オカダ酸、Ｈ２Ｏ２、及び腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）を含む腫瘍促進剤は、ＮＦ−κＢ活性化経路を活性化することが示されている。ＮＦ−κＢの活性化は、ＩκＢαのリン酸化、ユビキチン化及び分解並びにｐ６５のリン酸化を含み、続いて、細胞核へのＮＦ−κＢの移行をもたらし、ＤＮＡの特定の応答エレメントに結合する。ＩκＢαのリン酸化は、大部分の薬物によるＮＦ−κＢ活性化に必須であるＩκＢαキナーゼ（ＩＫＫ）によって触媒される。ＮＦ−κＢは、遺伝子産物が腫瘍形成に関与する多数の遺伝子の発現を制御することが示されている。これらは、抗アポトーシス遺伝子（例えば、ｃｉａｐ、ｓｕｖｉｖｉｎ、ｔｒａｆ、ｃｆｌｉｐ、ｂｆｌ−１、ｂｃｌ−２及びｂｃｌ−ｘｌ）、血管形成（ｃｏｘ−２、ｍｍｐ−９、ｖｅｇｆ）、接着分子、ケモカイン、及び炎症性サイトカインをコードする遺伝子；及び細胞周期制御遺伝子（例えば、ｃｙｃｌｉｎ ｄ１、ｃ−ｍｙｃ）を含む。
【００７８】
特定の作用機構に結びつけることなしに、本出願人らは、本発明の組成物が、核因子κＢ（「ＮＦ−κＢ」）の活性化を調節し、言い換えると、腫瘍細胞の増殖、浸潤、及び転移を制御し、フィードバックＮＦ−κＢ活性化を阻害し、ＮＦ−κＢ制御の遺伝子産物の発現を制御すると考えている。特に、出願人は、本発明の組成物がＮＦ−κＢリガンド誘導の破骨細胞形成の受容体活性因子を阻害し、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）誘導の浸潤を抑制し、ＴＮＦ及び化学療法剤によって誘導されるアポトーシスを促進することを見出した。更に、本発明の組成物は、ＴＮＦ及びタバコの煙の濃縮物の両方によって誘導されるＮＦ−κＢ活性化を抑制する。加えて、本発明の組成物は、アポトーシス阻害タンパク質１／２、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｘＬ、ＦＡＤＤ様インターロイキン−１β変換酵素（ＦＬＩＣＥ）／カスパーゼ−８阻害性タンパク質、ＴＮＦ受容体関連因子１、及びサバイビンを含む抗アポトーシスに関与するＮＦ−κＢ制御の遺伝子産物の発現をダウンレギュレートし、更に、血管内皮細胞増殖因子、シクロオキシゲナーゼ−２、細胞間接着分子、及びマトリックスメタロプロテイナーゼを含む血管形成に関与する遺伝子産物の発現をダウンレギュレートする。これらの結果は、ＴＮＦ及び化学療法剤によって誘導されるアポトーシスの促進と相関する。本出願人らの全体的な結果は、本発明の組成物が破骨細胞形成を抑制し、浸潤を阻害し、ＮＦ−κＢ活性化のダウンレギュレーション及びＮＦ−κＢ制御の遺伝子産物のダウンレギュレーションを介してアポトーシスを促進することを示す。
【００７９】
本出願人らは、ＮＦ−κＢ活性化経路に対する本発明の組成物の効果、並びに腫瘍細胞の生存、増殖、浸潤、血管形成及び転移を調節するＮＦ−κＢ制御の遺伝子産物に対する本発明の組成物の効果のいくつかを測定し、本発明の組成物が、ＲＡＮＫＬ誘導の破骨細胞形成及びＴＮＦ誘導の浸潤を阻害し、種々の腫瘍細胞株におけるＴＮＦ及び化学療法剤によって誘導されるアポトーシスを促進することを見出した。ＩＡＰ１、Ｂｆｌ−１／Ａ１、Ｂｃｌ−２、ＴＲＡＦ１、及びｃＦＬＩＰを含む抗アポトーシスに関与する遺伝子産物の発現、ＭＭＰ−９、ＣＯＸ−２、ＩＣＡＭ−１、及びＶＥＧＦを含む転移に関与する遺伝子産物の発現はまた、本発明の組成物によってダウンレギュレートされた。
【００８０】
本出願人らのデータは、本発明の組成物が、ヒト骨髄性白血病ＫＢＭ−５細胞におけるＴＮＦ、肺腺癌Ｈ１２９９細胞におけるタバコの煙の濃縮物、によって活性化されるＮＦ−κＢを抑制することを示す。これは、異なる刺激によって活性化されるＮＦ−κＢにおける本発明の組成物の効果を調べた最初の研究である。これらの結果は、本発明の組成物が、これらの薬物に共通した段階で作用することを示唆している。癌の増殖及び転移に関与しているいくつかの遺伝子は、ＮＦ−κＢによって制御されることが示されている（例えば、Ａｇｇａｒｗａｌ，Ｂ．Ｂ．（２００４）Ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ−ｋａｐｐａ Ｂ：ｔｈｅ ｅｎｅｍｙ ｗｉｔｈｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ，６，２０３−２０８を参照されたい）。本出願人らは、本発明の組成物が、ＮＦ−κＢによって制御されるＣＯＸ−２、ＭＭＰ−９、及びＶＥＧＦの発現を阻害することを示した。
【００８１】
更に、最近の報告では、本発明の組成物はＣＯＸ−１及びＣＯＸ−２の酵素的活性を抑制することを示唆しているが（例えば、Ｂｅｍｉｓ，Ｄ．Ｌ．，Ｃａｐｏｄｉｃｅ，Ｊ．Ｌ．，Ａｎａｓｔａｓｉａｄｉｓ，Ａ．Ｇ．，Ｋａｔｚ，Ａ．Ｅ．ａｎｄ Ｂｕｔｔｙａｎ，Ｒ．（２００５）Ｚｙｆｌａｍｅｎｄ，ａ ｕｎｉｑｕｅ ｈｅｒｂａｌ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｎｏｎｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ＣＯＸ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ａｃｔｉｖｉｔｙ，ｉｎｄｕｃｅｓ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｏｆ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ ｔｈａｔ ｌａｃｋ ＣＯＸ−２ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ． Ｎｕｔｒ．Ｃａｎｃｅｒ．，５２，２０２−２１２を参照されたい）、本出願人らは、本発明の組成物がＣＯＸ−２タンパク質の発現を阻害することを示した。
【００８２】
本出願人らのデータは、本発明の組成物がＮＦ−κＢの直接的な阻害を通じてＮＦ−κＢ制御の経路にその抗癌特性を発揮することを示唆する。ＮＦ−κＢは、ＩＡＰ１、ｘＩＡＰ、Ｂｆｌ−１／Ａ１、ＴＲＡＦ１、Ｂｃｌ−２、ｃＦＬＩＰ、及びサバイビンの発現を制御することで知られ、多数の腫瘍におけるそれらの過剰発現は、生存、化学療法剤耐性、及び放射線耐性と結び付く（例えば、Ｔａｋａｄａ，Ｙ．，Ｓｉｎｇｈ，Ｓ．ａｎｄ Ａｇｇａｒｗａｌ，Ｂ．Ｂ．（２００４）Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｐ６５ ｐｅｐｔｉｄｅ ｔｈａｔ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ＮＦ−ｋａｐｐａ Ｂ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｖａｒｉｏｕｓ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｓｔｉｍｕｌｉ ａｎｄ ｉｔｓ ｒｏｌｅ ｉｎ ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＮＦ−ｋａｐｐａ Ｂ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｕｐ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，２７９，１５０９６−１５１０４を参照されたい）。本出願人らのデータは、本発明の組成物の処理が、これらの遺伝子産物の大部分をダウンレギュレートすることを示す。以前の報告では、本発明の組成物はヒト前立腺癌細胞におけるカスパーゼ媒介の経路を通じてアポトーシスを誘導することが示唆された（例えば、Ｂｅｍｉｓら，（２００５）を参照されたい）。本出願人らの結果はまた、本発明の組成物がＴＮＦ、タキソール、及びドキソルビシンのアポトーシス効果を促進することを示す。これらの効果は、ＮＦ−κＢの特異的な阻害剤を用いて報告された効果と類似する（例えば、Ｔａｋａｄａ，ら（２００４）を参照されたい）。
【００８３】
更に、特定の作用機序に結び付けることなく、本出願人らは、本発明の組成物の投与により観察された抗増殖効果、アポトーシス促進効果、抗浸潤効果、抗破骨細胞形成効果、抗血管形成効果、及び抗転移効果がＮＦ−κＢ制御の遺伝子産物の抑制を介して仲介されると考える。本発明の組成物の製剤化に用いられる各ハーブは、独特の抗炎症性及び抗癌性化合物を含有することで知られているが、本発明の組成物の成分の共通する特性の１つは、ＮＦ−κＢ活性化を抑制する能力であるようである。
【００８４】
本発明の組成物が天然のハーブ供給源から誘導され、健康食品及び栄養補給供給源から容易に入手できるという事実を考慮することによって、癌の処方薬よりも癌を予防し治療するためのより便利で好ましい手段となる。
【００８５】
したがって、本発明の対象はまた、ＮＦ−κＢ制御の遺伝子産物のレベルの調節を必要とする動物の細胞におけるＮＦ−κＢ制御の遺伝子産物のレベルを調節する方法に関し、この方法は、ローズマリー、ウコン、オレガノ及びジンジャーの治療的に有効量の超臨界抽出物；並びに、ホーリーバジル、ジンジャー、ウコン、コガネバナ、ローズマリー、グリーンティー、イタドリ、黄蓮及びメギの治療的に有効量の含水アルコール抽出物を上記動物に投与することを含む。
【００８６】
上記で開示した全ての本発明の方法における動物は、マウス、ラット、ネコ、イヌ、ウマ、ウシ、又は他の家畜、あるいはヒトなどの哺乳動物であってよい。好ましい実施態様では、動物はヒトである。ヒトの疾患、障害、及び状態を治療するための使用に加えて、本発明の方法は、獣医的な用途を有してもよい。
【００８７】
（投与経路）
好ましい実施態様では、経口投与される組成物は、１以上のカプセル、１以上の錠剤、又は１以上の丸薬の形態である。
【００８８】
本発明の組成物は、好ましくは、薬学的に許容される担体を用いて患者に送達される。このような担体は、当該技術分野において周知であり、固体形態又は液体形態のいずれかである。本発明の対象に従って調製されてもよい固体形態の医薬製剤は、粉剤、錠剤、分散顆粒、カプセル、カシェ（ｃａｃｈｅｔ）及び坐薬を含む。一般的に、固体形態製剤は、約５重量％〜約９０重量％の活性剤を含む。
【００８９】
固体担体は、希釈剤、香味剤、可溶化剤、潤滑剤、懸濁剤、結合剤又は錠剤崩壊剤のように作用してもよい１以上の物質であり得る；それはまた、封入剤であり得る。粉剤では、担体は、粘性な活性化合物との混合状態である微細に分割した固体である。錠剤では、活性化合物は、適した比率で必要な結合特性を有する担体と混合され、所望の形状及び大きさに圧縮される。適した固体担体は、炭酸マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、糖、ラクトース、ペクチン、デキストリン、でんぷん、ゼラチン、トラガカント、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、低融点ワックス、ココアバターなどを含む。用語「調製」は、活性成分（他の担体の有無を問わない）が担体によって取り囲まれるカプセル、したがって、担体と関連しているカプセルを提供する担体として封入材を含む活性化合物の調合を含むことが意図される。同様に、カシェが含まれる。錠剤、粉剤、カシェ、及びカプセルは、経口投与に適した固体投薬形態であり得る。利便性又は患者の受け入れの理由で望ましい場合、本発明の対象に従って製造される医薬錠剤は、当該技術分野において周知の技術を用いて、チュアブルな形態で提供されてもよい。
【００９０】
坐薬を製造するためには、脂肪酸グリセリド又はココアバターの混合物のような低融点ワックスがまず融解され、有効成分を撹拌などでその中に均一に分散させる。次に、融解された均一な混合物は、都合の良い大きさの鋳型に注ぎ込まれ、冷却され、凝固される。
【００９１】
液状形態製剤は、溶液、懸濁液、及びエマルジョンを含む。一例として、非経口的注射用に水又は水／プロピレングリコール溶液が挙げられる。液体製剤はまた、水性ポリエチレングリコール溶液中に溶液で調合することができる。経口使用に適した水溶液は、水に有効成分を溶解し、必要に応じて、適した着色剤、フレーバー、安定化材及び増粘剤を添加することによって調合することができる。経口使用に適した水性懸濁液は、粘性の材料、即ち、天然ゴム又は合成ゴム、レジン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、及び他の周知の懸濁剤と共に水中に微細に分割した有効成分を分散することによって調製することができる。液体医薬製剤は１００重量％までの対象の活性剤を含むことができる。
【００９２】
経口又は非経口投与のために液体形態製剤に使用直前に変換されることが意図される固体形態製剤がまた適した担体として意図される。このような液体形態は、溶液、懸濁液、及びエマルジョンを含む。これらの特定の固体製剤は、単位投薬形態で最も好都合に提供され、このような製剤は単一の液体投薬単位を提供するために使用される。あるいは、十分な固体は、液体に変換した後、複数の独立した液体投薬量が、シリンジ、ティースプーン、又は他の計量容器を用いて液体形態製剤の所定の容積を測定することによって得ることができる。複数の液体投薬量がそのように調製される場合、考えられる分解を遅延させるために、低温（即ち、冷却下）で液体投薬量の未使用の部分を維持することが好ましい。液体形態に変換されることが意図される固体形態製剤は、活性材料に加えて、香味剤、着色剤、安定化剤、緩衝剤、人工及び天然の甘味剤、分散剤、増粘剤、可溶化剤等を含んでもよい。有用な液体形態製剤を製造するために利用される液体は、水、等張水、エタノール、グリセリン、プロピレングリコールなど、並びにそれらの混合物であってよい。当然に、利用される液体は、投与経路に関して選ばれる。例えば、大量のエタノールを含む液体製剤は、非経口的使用には適していない。
【００９３】
本発明の医薬製剤は、安息香酸、ソルビン酸、メチルパラベン、プロピルパラベン及びエチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）などの当該技術分野において周知の１以上の保存剤を含んでもよい。保存剤は、一般的には、薬学的組成物の最大約１重量％、好ましくは約０．０５〜約０．５重量％の量で存在する。
【００９４】
本発明の対象の目的のための有用な緩衝液は、薬学的組成物の最大約１重量％、好ましくは約０．０５〜約０．５重量％の量のクエン酸−クエン酸ナトリウム、リン酸−リン酸ナトリウム、及び酢酸−酢酸ナトリウムを含む。有用な懸濁剤又は増粘剤は、薬学的組成物の最大約２０％、好ましくは約１重量％〜約１５％の量でメチルセルロースのようなセルロース誘導体、アルギン酸及びその誘導体のようなカラゲナン、キサンタンガム、ゼラチン、アカシア、及び微結晶性セルロースを含む。
【００９５】
採用することができる甘味剤は、当該技術分野において周知である天然及び人工の甘味剤を含む。キシロース、リボース、グルコース、マンノース、ガラクトース、フルクトース、デキシトロース、スクロース、マルトース、部分加水分解でんぷん又はコーンシロップ固形物などの単糖、二糖及び多糖、及びソルビトール、キシリトール、マンニトール及びそれらの混合物などの糖アルコールなどの甘味剤は、薬学的組成物の約１０重量％〜約６０重量％、好ましくは約２０重量％〜約５０重量％の量で利用されてもよい。サッカリン並びにサッカリンのナトリウム又はカルシウムなどの塩、シクラミン酸塩、アセスルファム−Ｋ、アルパルテーム等、及びそれらの混合物などの水溶性人工甘味剤は、組成物の約０．００１重量％〜約５重量％の量で利用されてもよい。
【００９６】
本発明の対象の薬学的生成物で採用されてもよい香味剤は、天然及び人工のフレーバー、及びペパーミントなどのミント、メントール、バニラ、人工バニラ、チョコレート、人工チョコレート、シナモン、様々なフルーツフレーバーを個別で及び混合して、薬学的組成物の約０．５重量％〜約５重量％の量で含む。
【００９７】
本発明の対象に有用な着色剤は、組成物の最大約６重量％の量で導入されてもよい色素を含む。好ましい色素の二酸化チタンは、最大約１％で導入されてもよい。また、着色剤は、Ｆ．Ｄ．＆Ｃ．染料等として知られる食品、薬物及び化粧品用途に適した他の染料を含んでもよい。このような染料は、一般的に、薬学的製剤の最大約０．２５重量％、好ましくは約０．０５重量％〜約０．２重量％の量で存在する。全てのＦ．Ｄ．＆Ｃ．染料、Ｄ．＆Ｃ．及びそれらの対応する化学構造の全般的な詳細は、Ｋｉｒｋ−Ｏｔｈｍｅｒ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，第５巻，８５７−８８４ページに見出すことができ、したがって、このテキストは、参照により本明細書中に組み入れられる。
【００９８】
有用な可溶化剤は、アルコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等を含み、フレーバーを可溶化するために用いることができる。可溶化剤は、一般的に、薬学的組成物の最大約１０重量％；好ましくは約２重量％〜約５重量％で存在する。
【００９９】
この組成物に所望される場合に用いることができる潤滑剤は、置換及び未置換のポリシロキサンなどのシリコーン油又は流体物、例えば、ジメチコーンとしても知られるジメチルポリシロキサンを含む。他の周知の潤滑剤を採用してもよい。
【０１００】
薬学的組成物はまた、単位投薬形態で調製することができる。このような形態では、製剤は、有効成分の適した量を含む単位投薬量に更に分割される。単位投薬形態は、パッケージされた製剤、製剤の別個の量を含むパッケージ、例えば、バイアル又はアンプル中のパッケージ化した錠剤、カプセル、及び粉剤であり得る。単位投薬形態はまた、カプセル、カシェ、又は錠剤それ自体であり得て、あるいは、パッケージ化した形態の適した数のこれらのいずれかであり得る。
【０１０１】
本発明の対象の化合物は、他の人工又は天然に発生する物質と不都合な相互作用を示すとは考えられない。したがって、本発明の対象の化合物は、例えば、癌を治療するための他の化合物及び組成物を併用して投与されてもよい。特に、本発明の対象の化合物は、本発明の対象の他の化合物、化学療法物質などを併用して投与されてもよい。
【０１０２】
最適な医薬製剤は、投与経路及び所望の投薬量に依存して、当業者によって決定される。例えば、参照により本明細書中に組み入れられる、“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”，第１８版（１９９０，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｃｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ １８０４２），１４３５−１７１２ページを参照されたい。このような製剤は、本発明の対象の治療薬の物理的状態、安定性、インビボでの放出速度、及びインビボでの浄化速度に影響を与えるかもしれない。
【０１０３】
（投薬量）
有効成分化合物又は組成物の約０．００１ｍｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重の次数の投薬レベルは、上記状態の治療に有用であり、好ましいレベルは、２００ｍｇ／日〜１６００ｍｇ／日の範囲である。本発明の対象の化合物及び組成物は、通常、毎日２又は３回の投薬で与えることができる。毎日２回の低投薬量（２００〜３００ｍｇ）から開始して、必要に応じてより高い投薬量に徐々に上げることは好ましいストラテジーである。１回の投薬量形態を生じるように担体材料と組み合わせてもよい有効成分の量は、治療される宿主及び投与の特定の様式に応じて変化する。
【０１０４】
しかしながら、任意の特定の患者の特定の投薬レベルは、採用される特定の化合物の活性；患者の年齢、体重、一般的な健康、性別及び食事；投与時間；排出速度；薬物の組み合わせ；治療される特定の障害の重症度；投与形態を含む様々な因子に依存する。当業者は、このような因子の変動を十分理解するであろうし、単なる日常的な実験を用いて特定の投薬レベルを確立することができる。
【実施例】
【０１０５】
下記の実施例は、本発明の対象の例示であり、それに限定することを意図してはいない。他に指示がなければ、全てのパーセントは、１００重量％の最終組成物に基づいている。
【０１０６】
（一般的材料及び方法）
Ｎｅｗ Ｃｈａｐｔｅｒ Ｉｎｃ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から入手されるＺｙｆｌａｍｅｎｄ（登録商標）は、１０ｍｇ／ｍｌ保存液としてジメチルスルホキシド（「ＤＭＳＯ」）に溶解させ、−２０℃で保存した。５×１０７Ｕ／ｍｇの比活性の均一物になるように精製された、細菌由来のヒト腫瘍壊死因子アルファ（「ＴＮＦ−α」）は、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．（Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）から好意により提供された。ペニシリン、ストレプトマイシン、ＲＰＭＩ１６４０培地、Ｉｓｃｏｖｅ変法ダルベッコ培地（「ＩＭＤＭ」）、Ｄ−ＭＥＭ／Ｆ１２培地、及びウシ胎児血清（「ＦＢＳ」）は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）から入手した。下記のポリクローナル抗体は、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ）から入手した：抗マトリックスメタロプロテイナーゼ９（「ＭＭＰ−９」）；抗細胞接着分子（「ＩＣＡＭ」）；抗アポトーシス阻害タンパク質１／２（「ＩＡＰ１／２」）；抗Ｂｃｌ−２；抗Ｂｆｌ−１／Ａ１；及び抗ＴＮＦ受容体関連因子（「ＴＲＡＦ１」）。抗ＣＯＸ−２及びＸＩＡＰは、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から入手した。タバコの煙の濃縮物（「ＣＳＣ」）は、Ａｎｔｏ，Ｒ．Ｊ．，Ｍｕｋｈｏｐａｄｈｙａｙ，Ａ．，Ｓｈｉｓｈｏｄｉａ，Ｓ．，Ｇａｉｒｏｌａ，Ｃ．Ｇ．ａｎｄ Ａｇｇａｒｗａｌ，Ｂ．Ｂ．（２００２）Ｃｉｇａｒｅｔｔｅ ｓｍｏｋｅ ｃｏｎｄｅｎｓａｔｅ ａｃｔｉｖａｔｅｓ ｎｕｃｌｅａｒ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ−ｋａｐｐａ Ｂ ｔｈｒｏｕｇｈ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ Ｉ ｋａｐｐａ Ｂ（ａｌｐｈａ）：ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ−２．Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ，２３，１５１１−１５１８に記載されるように調製し、Ｄｒ．Ｇ．Ｇａｉｒｏｌａ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｋｅｎｔｕｃｋｙ，Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ，ＫＹ）から好意により供給された。抗血管内皮細胞増殖因子（「ＶＥＧＦ」）は、ＮｅｏＭａｒｋｅｒｓ（Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）から購入した。サバイビン抗体は、Ｒ＆Ｂ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）から入手した。ＦＡＤＤ様インターロイキン−１β−変換酵素（「ＦＬＩＣＥ」）／カスパーゼ−８−阻害性タンパク質（「ｃＦＬＩＰ」）抗体は、Ｉｍｇｅｎｅｘ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から好意により提供された。
【０１０７】
本出願人らの研究で用いられる細胞株は、ヒト非小細胞性肺癌腫（Ｈ１２９９）、ヒト骨髄性白血病（ＫＢＭ−５）、ヒト多発性骨髄腫（Ｕ２６６）、マウスマクロファージ（ＲＡＷ２６４．７）細胞株を含み、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から入手した。Ｈ１２９９及びＵ２６６細胞は、１０％ ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０で培養した。ＫＢＭ−５細胞は、１５％ ＦＢＳを含むＩＭＤＭで培養した。ＲＡＷ２６４．７細胞は、１０％ ＦＢＳを添加したＤ−ＭＥＭ／Ｆ１２培地で培養した。全ての培地には、１００Ｕ／ｍｌペニシリン及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンが添加された。
【０１０８】
（実施例１）
（細胞成長の阻害）
一般的な開始点として、培養中の樹立されたげっ歯類又はヒト細胞株を用いて、細胞成長を阻害する生成物又は薬物の相対的能力を調査する。これの目的は、単に、有効でないか又は毒性である濃度と有意に阻害的又は「効果的」である濃度とを識別することができることである。所定の生成物の作用機構の調査は、幾分ではあるが著しくはない成長阻害及び大量でない細胞死を生じる濃度でなされなければならない。更に、これらの種類の試験は、細胞イベントにおける時間依存的な変化の当初見積もりを提供する。それは、成長阻害又は細胞死の最初の示唆に関連した、薬物媒介のイベントが認められる時である。これは、言い換えると、関与する一連のイベントを示唆するかもしれない。
【０１０９】
取り組んでいる大部分の試験は、ヒト前立腺癌細胞株を用いることを含む。これの理由は、これが対象の細胞株であり、当該細胞株がエイコサノイド代謝に関して本出願人らによって特徴付けられ、本出願人らがＰＩＮの治療／予防に本発明の組成物の進行中の臨床試験に関与するという事実を含む。しかしながら、データが得られるにつれて、前立腺癌それ自体とはほとんど関係がないが、代わりに、一般的な抗炎症活性及びメカニズムを理解するのに有用である他の細胞株及び動物モデルが使用されてもよい。
【０１１０】
図１は、ヒトＡ５４９肺癌及びヒトＰＣ３前立腺癌細胞株の成長に対する本発明の化合物の阻害効果を示す。本発明の組成物の経口製剤が使用された。組成物は、培養中の細胞に添加され、細胞成長の相対的阻害は、薬物への連続曝露の７２時間後に評価した。「ＭＴＴ」法を使用し、未処理の対照細胞群に対する細胞増殖を評価した。肺腺癌細胞より顕著な前立腺ＰＣ３細胞の成長阻害が見られる。
【０１１１】
同様に、図８及び表２は、ヒト乳癌ＭＣＦ７及びＭＤＡ２３１細胞株の成長に対する化合物の阻害効果を示す。ここでも、本発明の組成物の経口製剤が使用された。組成物を培養中の細胞に添加し、細胞成長の相対的阻害は、薬物への連続曝露の７２時間後に評価した。「ＭＴＴ」法を使用して、未処理の対照細胞増殖に対する細胞増殖を評価した。ＭＣＦ７細胞は、ＭＤＡ２３１細胞よりも組成物曝露に感受性であった。
【０１１２】
【表２】
【０１１３】
＊ＩＣ５０は、薬剤への曝露の所定条件（通常は継続期間）下で、（未処理の細胞と比較して）５０％まで細胞の成長阻害を生じる物質の濃度（μｇ／ｍｌ）として定義される。
【０１１４】
試験されるまさに「正常な」ヒト内皮細胞株に対する細胞毒性の相対的欠如は、薬剤の患者の耐性及び投与プロトコールの順守の目的のためには明らかに興味深い。ヒト乳腺ＭＣＦ−７エストロゲン感受性細胞株の組成物への感受性は特に関心があり、この細胞株は、確かにこれまでに試験した最も感受性のある細胞である。本出願人らは、エストロゲン結合をブロックする本発明の組成物を製造するために使用されるいずれの化合物も植物抽出物において認識しておらず、本出願人らは、観察された高い感受性にこの代替の説明は無関係であると考える。
【０１１５】
（実施例２）
（シクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）及びリポキシゲナーゼ（ＬＯＸ）酵素を阻害するための本発明の組成物の能力）
本出願人は、ＣＯＸ−１、ＣＯＸ−２、及び対象となる他のエイコサノイドに対する本発明の組成物の相対的効果を測定した。これらの試験は、組成物が、（クローニングされた酵素として）ＣＯＸ−１及びＣＯＸ−２の両方を阻害することを示し、本出願人が本発明の組成物を構成する種々のハーブ抽出物から得た多様な抗炎症成分に基づいて予期していた通りであった。データはまた、組成物が、同様に５−リポキシゲナーゼ（５−ＬＯＸ）の有用な阻害剤であることを示す。１５−ＬＯＸ−２から誘導されたエイコサノイド産物における選択的な変化は観察されなかった。データはまた、組成物が濃度依存的に１２−リポキシゲナーゼを阻害することを示す。図２及び図３のデータは、組成物がクローニングされたＣＯＸ酵素並びに培養中の細胞の酵素を阻害するという観点で有力であることを示す。ほんの少ないマイクロリットル量の液体中の本発明の組成物は、シクロオキシゲナーゼ酵素の有意な阻害を生じるには十分であった。これは、組成物のこの特定の製剤の６０％が、それ自体はエイコサノイド代謝に影響を与えないオリーブ油であることを思い起こすと、特に強い印象を与える。
【０１１６】
図２は、クローニングされたＣＯＸ−１（ヒツジ）及びＣＯＸ−２（ヒト）酵素を用いたＰＧＥ２の形成における組成物の効果が、５ｍＭ ＥＤＴＡ、２ｍＭフェノール、及び１μＭヘマチンを含有する０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８．０中の酵素（１５ ＩＵ）と共に１０μＭ ＡＡのインキュベーションによって測定されたことを示す。組成物のアリコートは、ＡＡの添加前にチューブに添加した。対照のインキュベーションには、組成物を含めなかった。アスタリスクを付するバーは、「オリーブ油」の対照を表わす。インキュベーションは、３７℃で１５分間行った。１Ｎクエン酸の添加によって反応を停止させた。次に、エイコサノイドは、ヘキサン：酢酸エチル（１：１）溶媒混合物を用いて抽出した；抽出物は、窒素下で乾燥させた。インキュベーション中に形成されたＰＧＥ２は、前述したように抽出され、次に、本出願人らによって公開されたＬＣ／ＭＳ／ＭＳ法（Ｙａｎｇら Ａｎａｌ Ｂｉｃｏｃｈｅｍ．３０８：１６８−１７７，２００２）を用いて分析した。図２に示したデータは、本発明の組成物がＣＯＸ−１及びＣＯＸ−２の両方によってＰＧＥ２の形成を阻害するが、生成物はＣＯＸ−２よりもＣＯＸ−１の阻害において有力であることを示唆する。
【０１１７】
図３は、ＰＣ３細胞におけるＰＧＥ２及び５−ＨＥＴＥの形成における組成物の効果を示す。種々の濃度の組成物は、１５μＭ ＢＳＡを添加した新鮮な無血清培地中での細胞培養物に添加され、３７℃で１０分間インキュベートした。次に、アラキドン酸（１００μＭ）及び補因子を添加した。１０分後、細胞を洗浄し、細胞内に形成したエイコサノイドを測定するために抽出した（図２の説明文を参照されたい）。データは、ＰＣ３細胞におけるＰＧＥ２及び５−ＨＥＴＥの濃度依存的な阻害を示す。データは、平均±ＳＤ（ｎ＝３）として提示される。＊は、対照との比較によるＰ＜０．０５を示す。
【０１１８】
（実施例３）
（５−リポキシゲナーゼの細胞発現に対する本発明の組成物の効果）
抗炎症剤は、多くの異なる機構を通じてその薬学的効果を達成することができる。所定の生成物は、炎症に関連する分子の形成に関与する選択的酵素を阻害することができ、例えばＰＧＥ２の形成を減少させるためにＣＯＸ−２を阻害し、又は５−ＨＥＴＥの形成を阻害させるために５−リポキシゲナーゼを阻害する。組成物はまた、ＮＦ−κＢの活性化のクルクミン媒介の阻害などの炎症関連遺伝子の活性化に直接関与することで知られている転写因子の活性化を阻害する。
【０１１９】
更に、所定の生成物はまた、細胞又は組織中の酵素の実際の合成、したがって発現を直接阻害するというよりは減少させるために作用してもよい。本出願人らが得た初期のデータは、本発明の組成物が、酵素活性の阻害に加えて細胞の５−リポキシゲナーゼの相対的発現の濃度依存的な阻害を提供することを示す。組成物がＣＯＸ−２の相対的な組織発現を阻害しないようであるため、酵素発現の相対的阻害は、一般的な現象ではない。
【０１２０】
（実施例４）
（本発明の組成物における１３−Ｓ−ＨＯＤＥの同定）
図４は、ヒトＡ５４９肺癌細胞におけるエイコサノイド代謝に対する本発明の組成物の濃度依存的な効果を示し、１３−Ｓ−ＨＯＤＥの形成における明らかに濃度依存的な増加を示す。細胞（１×１０６）は、組織培養プレートに一晩接着させ、次に、図に示されるように、異なる濃度の組成物で２４時間処理した。次に、細胞を回収し、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳによるエイコサノイド分析のために抽出した。データは、２μｌ／ｍｌの組成物濃度でＰＧＥ２の小さな阻害（３２％）を示すが、また、１及び２μｌ／ｍｌで１３−Ｓ−ＨＯＤＥの「明らかな」劇的な形成を示す。
【０１２１】
いくつかの細胞株でのアラキドン酸から種々のエイコサノイド生成物への変換における組成物の効果を試験した。上記で示されるデータは、少なくともヒト肺Ａ４５９細胞に関しては、組成物がシクロオキシゲナーゼ又はリポキシゲナーゼ酵素に対する大きな効果を持たないことを示唆する。しかしながら、１５−ＬＯＸ−１酵素の生成物である１３−Ｓ−ＨＯＤＥの濃度依存的な増加は目覚しい。１３−Ｓ−ＨＯＤＥのこのような増加は、酵素それ自体の誘導、又は酵素活性、１３−Ｓ−ＨＯＤＥを優先的に生じるリノール酸などの適した基質の添加、又は別のメカニズムを介して生じるであろう。１５−ＬＯＸ−１の誘導は、実際には、ＮＳＡＩＤが結腸癌細胞に添加される場合に起こり、これは結腸癌の予防薬としてのアスピリンの薬効に対して部分的な説明に役立つ。しかしながら、ウェスタンブロットによって、組成物を用いたインキュベーションの結果として１５−ＬＯＸ−１酵素の有意な誘導は観察されなかった。本発明の組成物はまた、１５−ＬＯＸ−１酵素を介して１３−Ｓ−ＨＯＤＥを生じ得る基質であるリノール酸の相対的含有量を調べた。ＧＣ／ＭＳ／ＭＳ装置を用いることで、最小量のリノール酸だけが見出された。しかしながら、組成物それ自体の試験は、下記の実施例６で検討されるように、大量の１３−Ｓ−ＨＯＤＥの存在を示した。
【０１２２】
図５は、本発明の組成物に１３−Ｓ−ＨＯＤＥの存在を示す質量分析データを示す。図５は、関連した情報の３つのプロットを表わす。最上段のプロットは、重水素化した１３−Ｓ−ＨＯＤＥの総イオンクロマトグラムである（１３−Ｓ−ＨＯＤＥ−ｄ４として示される）。４つの重水素原子は、１３−Ｓ−ＨＯＤＥそれ自体の質量に対してより高分子量（４の追加）を提供する。重水素化した生成物の質量（上段右の電荷比に対する質量によって示される）は「２９９」である。これは、基本的には、この生成物の質量である。２９９＞２８１の表記は、本出願人らが質量２９９に対して装置に選択させ、次に２８１で特徴的な「娘」イオンを生じるようにアルゴン（不活性ガス）を有する分子を衝突させることを意味する。この娘イオンは、定量目的で用いることができる。
【０１２３】
中段のプロットは、Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）から購入した真正の１３−Ｓ−ＨＯＤＥ（２５ｎｇ／ｍｌ）に対するイオントレースを示す。１３−Ｓ−ＨＯＤＥは質量が２９５．３であり、これはプロットに示される。本出願人らは、化合物を特徴付ける２７７．２の娘イオンを見る。即ち、２７７．２の娘イオンを生じるために「分解して」２７７．２の質量を有するいずれか１つの分子の可能性は、対象である実際の分子：１３−Ｓ−ＨＯＤＥを除きほとんどゼロである。
【０１２４】
下段のプロットは、本発明の組成物の抽出物である。質量分析は、質量２９５．３を有する全分子を探すために指示された。次に、本出願人らは、２７７．２で特徴的な娘イオンだけを見るように装置をセットした。装置が、それらを大量に見出したという事実は、１３−Ｓ−ＨＯＤＥが本発明の組成物に存在するということを疑いの余地なく示す。抽出物は、たった５μｌの組成物から得られた。各ピークの２つの数は、ピークの保持時間（例えば、６．６９分）及び相対的なイオン量を表わす。後者は、ピーク内の生成物の「量」に類似している。２５ｎｇ／ｍｌで１３−Ｓ−ＨＯＤＥの真正な標準が８６４，４１２のピーク量を提供し、たった５μｌの組成物が６，３３８，６０６のピーク「量」を生じるという事実は、組成物内における多量のこのエイコサノイドの存在を明らかに示している。肝心なことは、これは、組成物が大量の１３−Ｓ−ＨＯＤＥを含むという「確かな」証明であるということである。
【０１２５】
１３−Ｓ−ＨＯＤＥが処理される物質であることを確かめるために、本発明の組成物中の１３−Ｓ−ＨＯＤＥの存在を、抗体ベースの酵素免疫アッセイキットを用いて評価した。抗体は、１３−Ｓ−ＨＯＤＥを検出するための特異性を提供する。ＥＩＡ分析は、本発明の組成物中に大量の１３−Ｓ−ＨＯＤＥが存在することを確かめた。
【０１２６】
抗炎症剤は、多くの異なったメカニズムを通じて薬学的効果を達成することができる。例えば、所定の生成物は、炎症に関連した分子の形成に関与する選択的酵素を阻害することができる（例えば、ＰＧＥ２の形成を減少させるためにＣＯＸ−２を阻害し、又は５−ＨＥＴＥの形成を阻害させるために５−リポキシゲナーゼを阻害する）。生成物はまた、炎症に関連した遺伝子の活性化に直接関与することで知られる転写因子の活性化を阻害することができる（例えば、ＮＦ−κＢの活性化のクルクミン媒介の阻害）。更に、所定の生成物はまた、酵素を直接的に阻害するというよりはむしろ、細胞又は組織中の酵素の実際の合成、したがって発現を減少させるために作用してもよい。得られた初期のデータは、本発明の組成物が、酵素活性の阻害に加えて、実際に、細胞の５−リポキシゲナーゼの相対的発現の濃度依存的な阻害へと導くことができることを示す。組成物が１２−ＬＯＸの相対的な組織発現を阻害しないようであるため、酵素発現の相対的阻害は、一般的な現象ではない。５−ＬＯＸの発現の消失（ダウンレギュレーション）もまた、細胞への５−ＬＯＸ阻害剤の曝露の一般的な結果ではない。本明細書中にはないが、ＰＣ３細胞が、確立した５−ＬＯＸ阻害剤であるＺｉｌｅｕｔｏｎに曝露された後の、５−ＬＯＸタンパク質含有量（ウェスタンブロット）の相対的効果を調べた。図９に示されるように、Ｚｉｌｅｕｔｏｎは、有力な５−ＬＯＸ阻害剤である（このために喘息の治療に有用である）が、細胞内の相対的な５−ＬＯＸ酵素含量のいかなる変化をも提供しなかった。
【０１２７】
興味深いことの１つは、組成物の細胞への曝露の結果として発生するＣＯＸ−２タンパク質発現における濃度依存的な増加である。一見したところでは、これは、まさに、本出願人らが起こらないことを望んでいたことのようであった。結局、ＣＯＸ−２の阻害は、大きな製薬ビジネスのための基盤である。しかし、Ｃｅｌｅｂｒｅｘ（セレコキシブ）は、ＣＯＸ−２の既知の誘導因子であるという事実はほとんど認識されていない。酵素活性が阻害されるために、炎症が抑制され、自然の力が酵素の合成の増加をさせてそれを克服させようと最善を尽くす。換言すれば、ＣＯＸ−２の阻害剤を受けている人々は、彼らがそれらの摂取を止めるまでまさに良好である。
【０１２８】
（実施例５）
（本発明の組成物の抗炎症作用のインビボでの測定：マウス耳モデル）
非常に単純ではあるが効果的な炎症の動物モデルは、過去数年間用いられてきた。試験マウスの右耳は、推定される抗炎症剤で予め処理され、次に、３０分間放置される。次に、炎症剤（典型的には、アセトン中のアラキドン酸（ＡＡ））が、同じ耳に適用される。ビヒクルが対照として左耳に適用される。ＡＡ適用後の固定時間、マウスを麻酔し、その後、組織の均一なセグメントを得るために、丸い耳のパンチを用いる。マウスの各耳のパンチの組織の重量差を、炎症の相対的な阻害の相対的指数として使用する。計量後、耳パンチ試料は、それに続く、本出願人のＬＣ／ＭＳ／ＭＳ法の使用を通じた、特定のエイコサノイド代謝の分析のために急速に凍結される。
【０１２９】
図６は、マウスの耳浮腫における本発明の組成物の抗炎症作用を示す。組成物（１０μｌ）は、右耳に局所的に投与し、アセトンビヒクルのみを左耳に適用した。ＡＡ処理の１時間後、マウスを麻酔し、均一な組織片を得るために耳を「パンチ」した。次に、右耳の重量が、浮腫を測定するために、左耳の重量から差し引かれる。データは、ＡＡ媒介の耳浮腫を阻害する所定の試験物質の相対的能力を反映している。データは、１０匹の動物からの平均±ＳＤとして提示される。＊Ｐ＜０．００１処理対ＡＡ（浮腫）対照（ＡＡ媒介炎症）。
【０１３０】
図６のデータは、組成物が、アラキドン酸が媒介する炎症の有意な阻害を生じることを示す。
【０１３１】
同様に、図１０は、アラキドン酸が媒介したマウス耳浮腫における本発明の組成物の効果を示す。処理群は、１）オリーブ油対照、２）アセトン対照、３）オリーブ油＋ＡＡ、４）本発明の組成物（１０μｌ）＋ＡＡ、５）本発明の組成物（５μｌ）＋ＡＡ、及び６）本発明の組成物（２．５μｌ）＋ＡＡからなる。データは、平均±ＳＤ（ｎ＝１０匹のマウス／群）として提供される。再度、組成物は、ＡＡによって生じた浮腫を阻害した。図１０に示されるように、浮腫の最大阻害は、３つ全ての組成物の「投薬量」で得られたが、２．５μｌの組成物の使用は、２つのより高い濃度のいずれかよりも僅かに低い効果であるようであった。
【０１３２】
（実施例６）
（本発明の組成物における１３−Ｓ−ＨＯＤＥのハーブ供給源及び相対的重要性）
組成物の液体形態の相対的エイコサノイド含量の分析では、大量の１３−Ｓ−ＨＯＤＥを見ることは驚くべきことであった。これらの分析は、真正の重水素化した標準を、本出願人らが正しいピーク同定を得たことを確かめるために用いたＬＣ／ＭＳ／ＭＳを用いて行った。この観察を二重に確かめるために、液体組成物はまた、１３−Ｓ−ＨＯＤＥの測定のために特に調製した酵素免疫アッセイキットを用いて分析した。ＥＩＡ分析からの結果は、質量分析データを裏付け、表３に示される。
【０１３３】
【表３】
【０１３４】
組成物の経口形態は、６０％オリーブ油（１３−Ｓ−ＨＯＤＥを含有しない）であるという事実は、抽出材料中の１３−Ｓ−ＨＯＤＥの相対的含量が上記で示されるよりもなお高いことを示す。
【０１３５】
図７は、種々の癌細胞株の増殖に対する１３−Ｓ−ＨＯＤＥの効果を示す。上記のデータは、酵素１５−ＬＯＸ−２の産物である１３−Ｓ−ＨＯＤＥが、ヒト腫瘍前立腺（ＰＣ３）及び結腸（ＬＳ１７４）の細胞成長を完全に阻害することができるが、肺腺癌（Ａ５４９）細胞成長は阻害できないことを示す。前立腺癌及び結腸癌細胞株を阻害するための１３−Ｓ−ＨＯＤＥの相対的能力は、ＩＣ５０が３〜４μＭである。これは、本発明の組成物中の１３−Ｓ−ＨＯＤＥの含有量と比較した場合に重要である。換言すれば、上記の表２に示されるように、細胞成長の阻害を説明するのには組成物内に十分な１３−Ｓ−ＨＯＤＥが存在する。組成物内の他の因子もまた、前立腺及び結腸腫瘍細胞成長を阻害する能力に貢献することに疑いはないが、阻害することができる組成物内の１３−Ｓ−ＨＯＤＥの能力は非常に興味深い。
【０１３６】
組成物の液体形態の相対的なエイコサノイド含量を調べ、大量の１３−Ｓ−ＨＯＤＥを見ることは驚くべきことであった。これらの分析は、正しいピーク同定を得たことを裏付けるために真正の重水素化した標準を用いたＬＣ／ＭＳ／ＭＳを用いて行った。この観察を二重に確かめるために、液体組成物はまた、１３−Ｓ−ＨＯＤＥの測定のために特に調製した酵素免疫アッセイキットを用いて分析した。ＥＩＡ分析からの結果は、質量分析データを裏づけた。組成物の経口形態は、６０％オリーブ油（１３−Ｓ−ＨＯＤＥを含有しない）であるという事実は、抽出物中の１３−Ｓ−ＨＯＤＥの相対的含有量が上記で示されるよりもなお高いことを示す。
【０１３７】
組成物を調製するために用いられる異なったハーブ及び植物抽出成分の中で、エイコサノイド生成物の１３−Ｓ−ＨＯＤＥの供給源について調査を行った。アプローチは、抽出物を可溶化させるか又は有機溶媒の混合物に抽出物を共し、その後、脂溶性エイコサノイドを取り出すことである。次に、これらを窒素下で乾燥させ、質量分析装置に適合する固定量の緩衝液中で再構成させる。別のアリコートを、ＧＣ／ＭＳ／ＭＳを用いた相対的なリノール酸含量の分析のために使用した。この背景にある論理的根拠は、１３−Ｓ−ＨＯＤＥそれ自体が抽出物中に存在するか、又は細胞が１５−ＬＯＸ−１を含有し、基質リノール酸を補給した場合の培養中の細胞において酵素反応を通じて誘導され得るということである。
【０１３８】
下記の表４のデータは、リノール酸及び１３−Ｓ−ＨＯＤＥの両方を含む抽出物が存在するが、エイコサノイドそれ自体は、本発明の組成物を調製するために用いられるいくつかのハーブ抽出物の成分であることを納得の行くように示している。１３−Ｓ−ＨＯＤＥがいくつかの抽出物（例えば、グリーンティー）に存在しないという事実はまた興味深く、測定が正しいという事実に信憑性を与える。
【０１３９】
【表４】
【０１４０】
１３−ＨＯＤＥ及びリノール酸の測定を３回行い、同程度の結果であった。１３−Ｓ−ＨＯＤＥは、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳを用いて測定し、リノール酸含量は、ＧＣ／ＭＳ／ＭＳを用いて測定した。組成物の１３−Ｓ−ＨＯＤＥの供給源は、大部分、ジンジャー及びウコンによるものと見られる。この特定のエイコサノイドは、ジンジャーのＰＳＥ及びＳＣＥ抽出物、同様に、より少ない程度でウコンの根に存在することは興味深い。大量の１３−ＨＯＤＥの存在は、必ずしも、１３−Ｓ−ＨＯＤＥを生成する１５−ＬＯＸ−１の基質である大量のリノール酸と関連するとは限らないことは注目に値する。
【０１４１】
（実施例７）
（破骨細胞分化アッセイ）
ＮＦ−κＢリガンド（ＲＡＮＫＬ）誘導の破骨細胞形成の受容体活性化因子に対する本発明の組成物の効果を測定するために、本出願人らは、インビトロでＲＡＮＫＬによって破骨細胞に分化し得るＲＡＷ２６４．７細胞を培養した。ＲＡＷ２６４．７細胞は、１×１０４細胞／ウェルの密度で２４ウェルディッシュ中で培養し、一晩接着させた。次に、培地を交換し、細胞を様々な濃度の本発明の組成物及び５ｎＭ ＲＡＮＫＬを用いて共培養した。５日目に、酸性ホスファターゼキット（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて以前に説明したように酒石酸塩耐性の酸性ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）を染色し、ＴＲＡＰ陽性の多核破骨細胞（＞３個の核）／ウェルをカウントした。
【０１４２】
ＲＡＷ２６４．７細胞（１×１０４細胞／ウェル）を単独で又は５ｎＭ ＲＡＮＫＬ及び０．８ｍｇ／ｍｌの本発明の組成物の存在下で５日間インキュベートし、ＴＲＡＰ発現について染色した。図１１（Ａ）に示されるように、ＴＲＡＰ陽性細胞を撮影した（オリジナル倍率、１００×）。
【０１４３】
ＲＡＷ２６４．７細胞（１×１０４細胞／ウェル）を単独で又は５ｎＭ ＲＡＮＫＬ及び所定濃度の本発明の組成物の存在下で５日間インキュベートし、ＴＲＡＰ発現について染色した。多核（３個の核）破骨細胞をカウントし、結果は、図１１（Ｂ）に図式的に示した。
【０１４４】
本発明の組成物は、ＲＡＮＫＬ誘導の破骨細胞形成を抑制することが示される。ＴＮＦスーパーファミリーのメンバーであるＲＡＮＫＬはＮＦ−κＢの活性化を通じて破骨細胞形成を誘導するため、本出願人らは、本発明の組成物がＲＡＮＫＬ誘導の破骨細胞形成を抑制することができるかどうかを測定した。本出願人らは、図１１（Ａ）に示されるように、ＲＡＮＫＬは、ＴＲＡＰの発現によって示される破骨細胞の分化を誘導し、本発明の組成物が図１１（Ｂ）に示されるように、濃度依存的にこの誘導を抑制することを見出した。
【０１４５】
（実施例８）
（浸潤アッセイ）
細胞外マトリックスを介した浸潤が腫瘍転移における重要な段階であるため、細胞浸潤を評価するために膜浸潤培養システムを用いた。ＢＤ ＢｉｏＣｏａｔ Ｔｕｍｏｒ Ｉｎｖａｓｉｏｎシステムは、８μｍ径の細孔を有する光漏れのないポリエチレンテレフタレート膜を有するチャンバーであり、再構成した基底膜ゲル（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）で被覆されている。Ｈ１２９９全体（２．５×１０４細胞）を無血清培地に懸濁し、上段ウェルに播種した。一晩のインキュベーション後、細胞は、様々な濃度の本発明の組成物及び１ｎＭ ＴＮＦと、１％ ＦＢＳの存在下でさらに２４時間、同時にインキュベートした。マトリゲルを通過して浸潤した細胞（即ち、インキュベーション中に下段のチャンバーに移動した細胞）は、ＰＢＳ中の４μｇ／ｍｌのＣａｌｃｅｉｎ ＡＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を用いて３０分間３７℃で染色し、Ｖｉｃｔｏｒ３マルチプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ ａｎｄ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）を用いて蛍光をスキャンし、蛍光細胞をカウントした。
【０１４６】
Ｈ１２９９細胞（２．５×１０４細胞／ウェル）は、血清なしで、マトリゲル浸潤チャンバーの上段ウェルに一晩播種され、０．３ｍｇ／ｍｌの本発明の組成物及び１ｎＭ ＴＮＦを用いて、１％血清の存在下で同時にインキュベートし、次に、浸潤アッセイに供した。結果は、図１２に示されるように、図式的に示した。本発明の組成物なし及びＴＮＦなしの値を１．０に合わせた。
【０１４７】
本発明の組成物は、ＴＮＦ誘導の腫瘍細胞の浸潤活性を抑制することが示される。ＮＦ−κＢは、腫瘍細胞浸潤を媒介する遺伝子産物（例えば、ＭＭＰ−９、ＣＯＸ−２、及びＶＥＧＦ）の発現を制御することが知られている。本発明の組成物が、ＴＮＦ誘導の腫瘍細胞浸潤活性を調節することができるかどうかをインビトロで調べた。これを測定するために、腫瘍細胞は、本発明の組成物の存在下又は非存在下で、ＴＮＦと共にマトリゲル浸潤チャンバーの上段チャンバーに播種され、次に、浸潤について調べた。図１２に示されるように、ＴＮＦ誘導の腫瘍細胞はほぼ２倍浸潤したが、本発明の組成物は、濃度依存的にこの活性を抑制した。本発明の組成物単独では、浸潤活性に影響がなかった。
【０１４８】
（実施例９）
（生／死（ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ）アッセイ）
アポトーシスを測定するために、本出願人らは、細胞内エステラーゼ活性及び細胞膜の完全性を測定する生／死アッセイ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を用いた。このアッセイは、生細胞内に保持されるポリアニオン性染料であるカルセインを採用し、緑色の蛍光を与える。それはまた、損傷した膜を通過してのみ細胞に入り、核酸に結合することができるエチジウムモノマー染料（赤色蛍光）を採用するが、生細胞の無傷な細胞膜によっては排除される。簡単には、１×１０６細胞は、０．５ｍｇ／ｍｌの本発明の組成物と共に２４時間インキュベートし、次に、１ｎＭ ＴＮＦ又は種々の化学療法剤と１６時間、３７℃で処理した。細胞を生／死試薬（５μＭエチジウムホモ二量体、５μＭカルセイン−ＡＭ）で染色し、次に、３７℃で３０分間インキュベートした。細胞は、蛍光顕微鏡（Ｌａｂｏｐｈｏｔ ２；Ｎｉｋｏｎ、東京、日本）下で解析した。
【０１４９】
ヒト多発性骨髄腫Ｕ２６６細胞（１×１０６細胞／ｍｌ）は２４時間血清を枯渇され、次に、１ｎＭ ＴＮＦ、１ｎＭタキソール及び３００ｎＭドキソルビシン単独で、又は（０．５ｍｇ／ｍｌ）の本発明の組成物と共に、２４時間示されたようにインキュベートした。細胞死は、図１３に示されるように、カルセインＡＭベースの生／死アッセイによって測定した。赤色は、死細胞を強調し、緑色は生細胞を強調する。
【０１５０】
本発明の組成物は、ＴＮＦ及び化学療法剤のアポトーシス作用を促進する。ＮＦ−κＢ活性化は、種々の薬物によって誘導されるアポトーシスを阻害することが示されているので、本発明の組成物がＴＮＦ及び化学療法剤によって誘導されるアポトーシスを調節するかどうかを調べた。ＴＮＦ及び化学療法剤誘導のアポトーシスにおける本発明の組成物の効果は、生／死アッセイによって調べた。生／死アッセイは、細胞内エステラーゼ活性及び細胞膜の完全性を測定するものであり、本発明の組成物は、腫瘍細胞に対するＴＮＦ、タキソール、及びドキソルビシンのアポトーシス作用を増加することを示した。
【０１５１】
（実施例１０）
（ＮＦ−κＢ活性化の電気泳動移動度シフトアッセイ）
ＮＦ−κＢ活性化を測定するために、本出願人らは、基本的には、Ｃｈａｔｕｒｖｅｄｉ，Ｍ．Ｍ．，Ｍｕｋｈｏｐａｄｈｙａｙ，Ａ．ａｎｄ Ａｇｇａｒｗａｌ，Ｂ．Ｂ．（２０００）Ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｒｅｄｏｘ−ｓｅｎｓｔｉｔｉｖｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，３１９，５８５−６０２に以前に記載されるように、電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）を行った。簡単には、核抽出物は（１×１０６細胞／ｍｌ）は、ヒト免疫不全ウイルスの長い末端反復、５’−ＴＴＧＴＴＡＣＡＡ ＧＧＧＡＣＴＴＴＣ ＣＧＣＴＧ ＧＧＧＡＣＴＴＴＣ ＣＡＧＧＧＡＧＧＣＧＴＧＧ−３’（太字はＮＦ−κＢ結合部位を指す）由来の３２Ｐ末端標識した４５ｍｅｒの二本鎖ＮＦ−κＢオリゴヌクレオチド（１６ｆｍｏｌのＤＮＡと１５μｇのタンパク質）と共に、３０分間３７℃でインキュベートし、形成されたＤＮＡ−タンパク質複合体は、６．６％の非変性ポリアクリルアミドゲル上で遊離のオリゴヌクレオチドから分離した。二本鎖変異オリゴヌクレオチド、５’−ＴＴＧＴＴＡＣＡＡ ＣＴＣＡＣＴＴＴＣ ＣＧＣＴＧ ＣＴＣＡＣＴＴＴＣ ＣＡＧＧＧＡＧＧＣＧＴＧＧ−３’は、ＮＦ−κＢのＤＮＡへの結合の特異性を調べるために用いた。乾燥したゲルを視覚化し、放射性バンドは、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔソフトウェアプログラムを有するＳｔｏｒｍ ８２０ ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を用いて定量した。
【０１５２】
ＫＢＭ−５細胞（２×１０６細胞／ｍｌ）は、指定した濃度の本発明の組成物で１時間プレインキュベートし、０．１ｎＭ ＴＮＦで３０分間処理した。核抽出物は、図１４（Ａ）に示されるように、ＥＭＳＡによってＮＦ−κＢ活性化についてアッセイした。
【０１５３】
本発明の組成物は、用量及び時間依存的にＮＦ−κＢ活性化を抑制する。ＮＦ−κＢは、アポトーシス及び細胞浸潤において重要な役割を果たすので、本出願人らは、この転写因子の活性化における本発明の組成物の効果を調べた。本出願人らは、第一に、ヒト骨髄性白血病（ＫＢＭ−５）細胞においてＴＮＦによって誘導されるＮＦ−κＢの活性化に対する本発明の組成物の効果を調べた。ＤＮＡ結合アッセイ（ＥＭＳＡ）の結果は、本発明の組成物単独では、ＮＦ−κＢ活性化に効果がないことを示した。しかしながら、本発明の組成物は、図１４（Ａ）に示されるように、用量依存的にＴＮＦ媒介のＮＦ−κＢ活性化を阻害する。
【０１５４】
ＫＢＭ−５細胞（２×１０６細胞／ｍｌ）は、１ｍｇ／ｍｌの本発明の組成物と共に指定した時間プレインキュベートし、次に、０．１ｎＭ ＴＮＦで３０分間処理した。核抽出物は、図１４（Ｂ）に示されるように、ＥＭＳＡによってＮＦ−κＢ活性化についてアッセイした。本発明の組成物によるＮＦ−κＢ活性化の抑制はまた、時間依存的であることが分かった。
【０１５５】
本発明の組成物は、タバコの煙誘導のＮＦ−κＢ活性化を阻害する。Ｈ１２９９細胞は、本発明の組成物（１ｍｇ／ｍｌ）で１時間プレインキュベートし、次に、タバコの煙（１０μｇ／ｍｌ）で１時間処理した。核抽出物は、図１４（Ｃ）に示されるように、ＥＭＳＡによってＮＦ−κＢ活性化についてアッセイした。
【０１５６】
本発明の組成物は、タバコの煙の濃縮物によって誘導されるＮＦ−κＢ活性化をブロックする。本出願人らは、次に、非小肺腺癌Ｈ１２９９細胞におけるタバコの煙の濃縮物によって誘導されるＮＦ−κＢの活性化における本発明の組成物の効果を調べた。ＤＮＡ結合アッセイ（ＥＭＳＡ）の結果は、図１４（Ｃ）に示されるように、本発明の組成物が、タバコの煙の濃縮物によって誘導されるＮＦ−κＢ活性化を抑制することを示した。これらの結果は、本発明の組成物が、ＴＮＦ及びタバコの煙の濃縮物に共通するＮＦ−κＢ活性化経路の段階で作用したことを示唆する。
【０１５７】
（実施例１１）
（ＴＮＦ誘導の遺伝子発現のウェスタンブロット解析）
ＣＯＸ−２、ＶＥＧＦ、ＩＣＡＭ−１、ＭＭＰ−９、ｃＩＡＰ−１／２、サバイビン、Ｂｆｌ−１／Ａ１、Ｂｃｌ−２、ＢｃｌｘＬ、ｃＦＬＩＰ、ＴＲＡＦ１、及びＸＩＡＰの処理した細胞（２×１０６細胞／ｍｌ）の全細胞抽出物におけるＴＮＦに誘導された発現に対する本発明の組成物の効果を測定するために、３０μｇのタンパク質を、製造業者推薦のプロトコールの通り、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、特異的な抗体を用いたウェスタンブロットによって検出した。ブロットを洗浄し、ＨＲＰ結合の二次抗体に１時間暴露し、最後に、ＥＣＬ試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）によって検出した。
【０１５８】
本発明の組成物は、腫瘍細胞の増殖及び転移に関与するＴＮＦ誘導によるＮＦ−κＢ依存の遺伝子産物を阻害する。本出願人らはまた、本発明の組成物が腫瘍細胞の増殖及び転移に関与するＮＦ−κＢ依存の遺伝子産物を調節することができるかどうかを調べた。ＴＮＦはＣＯＸ−２、ＭＭＰ−９、ＩＣＡＭ−１、及びＶＥＧＦを誘導することが示されており、これら全てはそれらのプロモーター中にＮＦ−κＢ結合部位を有する。図１５（Ａ）に示されるように、ＴＮＦ処理は、ＣＯＸ−２、ＶＥＧＦ、ＩＣＡＭ−１及びＭＭＰ−９遺伝子産物の発現を誘導し、本発明の組成物はその発現を制止した。
【０１５９】
ＫＢＭ−５細胞（２×１０６細胞／ｍｌ）は、１ｍｇ／ｍｌの本発明の組成物で１時間インキュベートし、次に、１ｎＭ ＴＮＦで指定した時間処理した。全細胞抽出物を調製し、図１５（Ｂ）に示されるように、指定した抗体を用いてウェスタンブロット解析に供した。
【０１６０】
本発明の組成物は、ＴＮＦ誘導によるＮＦ−κＢ依存の抗アポトーシス遺伝子産物を阻害する。ＮＦ−κＢは、抗アポトーシスタンパク質であるＩＡＰ１、ＩＡＰ２、サバイビン、Ｂｆｌ−１／Ａ１、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ＸＬ、ｃＦＬＩＰ、ＴＲＡＦ１、及びＸＩＡＰの発現をアップレギュレートする。次に、本出願人らは、本発明の組成物が、これらの遺伝子産物の発現に影響するかどうかを調べた。本出願人らは、本発明の組成物が、図１５（Ｂ）に示されるように、これら全てのタンパク質のＴＮＦ誘導並びに基礎的発現を阻害することを見出した。
【０１６１】
（実施例１２）
（本発明の組成物によって媒介されるＰＣ３細胞のＧ２／Ｍ停止の証拠）
図１６に示されるように、本発明の組成物を用いたＰＣ３細胞の処理は、細胞周期の濃度依存的な阻害を生じる。ハーブ生成物は、０．２８μｌ／ｍｌという低い濃度でさえ明白である細胞の明らかなＧ２／Ｍ蓄積を生じる。より高い濃度では、Ｇ２／Ｍ期は、サブＧ０ピークがアポトーシスを示すので、より明白である。Ｇ２／Ｍにおける細胞数の上昇と一致して、細胞周期のＧ１部分に連続的で濃度依存的な細胞の減少が存在する。対照細胞の１０％だけが、通常、Ｇ２／Ｍ期に存在するが、０．５７μｌ／ｍｌの本発明の組成物を用いた処理によって、４０％を超える細胞がＧ２／Ｍブロックに存在する結果となる。
【０１６２】
図１６Ａに示されるように、上段左のプロットは、ＰＣ３細胞の正常な細胞周期分布を示す。細胞のＧ２／Ｍパーセントは少なく、図の右の小さな（小さな濃い影のピークである。第２のプロット（上段右）では、ＰＣ３細胞は、本発明の組成物０．２８μｌ／ｍｌ組織培養液で処理した。Ｇ２／Ｍピークのサイズが増大する。下段左（本発明の組成物０．５７μｌ／ｍｌ）及び下段右（１．１４μｌ／ｍｌ）のプロットは、本発明の組成物の濃度増加により細胞周期ブロックが増加することを示す。
【０１６３】
図１６Ｂに示されるように、図１６Ａのフローサイトメトリー解析のデータは、図１６Ｂにおいてヒストグラムで再度プロットされる。この図に見られるように、細胞周期のＧ２／Ｍ期での細胞パーセントの明らかな濃度依存的増加があり、一方、これは、細胞周期のＧ１期の細胞における関連した減少である。
【０１６４】
（実施例１３）
（本発明の組成物によって媒介されるアポトーシスのフローサイトメトリー解析）
図１７に示されるように、ほんの低レベルのＧ２／Ｍブロックを生じた本発明の組成物の濃度は、アネキシンＶ及びホスファチジルイノシトール（ＰＩ）による細胞染色によって明らかにされるように、初期のアポトーシスの誘導と関連することが分かった。調べた最低濃度０．２８μｌ／ｍｌでさえ、反転した膜ホスファチジルセリンへのアネキシンＶの結合の明らかな証拠が、本発明の組成物で処理したＰＣ３細胞のフローサイトメトリーによって明らかである。マルチハーブを介したアポトーシス発生の更なる証拠は、細胞膜完全性の破損に続く細胞死の後期段階における核酸に結合したヨウ化プロピジウムの濃度応答にある。
【０１６５】
図１７Ａに示されるように、ＰＣ３細胞は、指定濃度で本発明の組成物を用いて２４時間処理した。次に、細胞をアネキシンＶ及びＰＩ溶液で染色した。フローサイトメトリー分析（ＦＡＣＳ）によってアポトーシスを測定した。０．２８μｌ／ｍｌの低濃度でさえ、初期のアポトーシスの明らかな兆候がある。過剰の１．１μｌ／ｍｌの濃度では、大部分の細胞は死滅し、後期アポトーシス（細胞死）段階であるようである。
【０１６６】
図１７Ｂに示されるように、本発明の組成物で処理したＰＣ３細胞のフローサイトメトリー分析データ（図１７Ａ）は、図１７Ｂのヒストグラムで示される。初期のアポトーシスの特質である細胞膜改変を示すＰＩ染色において明らかな濃度依存的な増加がある。本発明の組成物の最低濃度でさえ、アネキシンＶ染色は、アポトーシスに関連したＤＮＡ染色を示す。アネキシンＶで染色された細胞のパーセントは、細胞死のために本発明の組成物の濃度増加と共に減少する。
【０１６７】
（実施例１４）
（本発明の組成物によって媒介されるエイコサノイド代謝における変化）
図１８Ａ−１８Ｄに示されるように、クローニングされたヒトＣＯＸ−１、ＣＯＸ−２及び５−ＬＯＸ酵素の処理は、それぞれ、エイコサノイド生成物、ＰＧＥ２及び５−ＨＥＴＥの形成の濃度依存的な阻害を生じ、５−ＬＯＸの形成は、ＣＯＸ−１又はＣＯＸ−２のいずれかよりも強力に阻害した（データ示さず）。次に、本発明の組成物とのインキュベーションによるエイコサノイド代謝における細胞内変化を調べた。図１８（Ａ）−（Ｄ）に見られるように、本発明の組成物を用いたＰＣ３細胞の処理は、ＰＧＥ２（図１８Ａ）及び５−ＨＥＴＥ（図１８Ｂ）の形成を減少させた。しかしながら、恐らく１２−ＬＯＸ活性の阻害に起因する１２−ＨＥＴＥレベルの細胞内の減少は、より目覚しかった。０．２５μｌ／ｍｉｎという低い本発明の組成物の濃度は、未処理の対照細胞と比較して、１２−ＨＥＴＥレベルの有意な減少を生じた。調べた最も高い濃度（１μｌ／ｍｌ）の本発明の組成物は、ＰＣ３細胞内で１２−ＨＥＴＥレベルのおよそ８０％の減少をもたらした（図１８Ｃ）。
【０１６８】
本発明の組成物によるＰＣ３細胞の処理はまた、ウェスタンブロット分析によって証明されるように、５−ＬＯＸタンパク質の細胞内含量を明確に減少させた（図１８Ｄ）。１２−ＬＯＸタンパク質含量の減少はまた、０．２５μｌ／ｍｌよりも高い本発明の組成物の濃度で示された。より高レベルの本発明の組成物を用いたＰＣ３細胞のインキュベーションによるＣＯＸ−２タンパク質の増加は、セレコキシブなどの他の抗炎症剤を用いた細胞の処理による、この酵素の上昇を想起させる。
【０１６９】
表５のデータは、本発明の組成物又はスクテラリア（Ｓｃｕｔｅｌｌａｒｉａ）の成分であるバイカレインのいずれかの非毒性な濃度での処理後、ＰＣ３細胞溶解物のリン酸化タンパク質分析から得られた。タンパク質をゲル電気泳動を用いて分離し、次に、ゲルをタンパク質に対するモノクローナル抗体で検出した。抗体は、タンパク質のリン酸化状態の差異を検出することができた。次に、ゲルを、濃度計を用いて定量した。相対的な変化（有意であるが）だけが、上記の表において示されている。細胞周期ブロックに関与するタンパク質（例えば、サイクリンＤ１、サイクリンＤ３及びｐＲＢ）、又はアポトーシスに関連したタンパク質（例えば、サバイビン、Ｂｃｌ−ＸＬ、及びＢｃｌ−２）の類似したアップレギュレーション又はダウンレギュレーションのシグナルを伝えるリン酸化状態の変化において多くの類似性がある。本発明の組成物及びバイカレインはまた、１２−ＬＯＸ活性を阻害する。しかしながら、本発明の組成物又はバイカレインのいずれかでの処理後、これらの重要なタンパク質のリン酸化状態における変化の全部が同一であるわけではなく、本発明の組成物の作用機構が複雑であり、バイカレイン単独の含有量によらないことを示唆している。
【０１７０】
【表５】
【０１７１】
（実施例１５）
（本発明の組成物によって媒介されるＲｂタンパク質のリン酸化の減少）
図１９Ａに示されるように、Ｒｂのリン酸化は濃度依存的に阻害される。０．２５μｌ／ｍｌという低い濃度は、対照と比較してｐＲｂを有意に減少させ、Ｒｂの量は、ｐＲｂが減少するにつれて増加した。本発明の組成物の複数の濃度で起こったＲｂタンパク質のリン酸化の減少はまた、Ｇ２／Ｍ細胞周期ブロック及び初期のアポトーシスに関連した。ウェスタンブロットデータの定量は、図１９Ｂに示される。
【０１７２】
リン酸化されていない（Ｒｂ）及びリン酸化された（ｐＲｂ）などの網膜芽細胞腫のウェスタンブロットが、図１９Ａに示されている。下段のバンド（β−アクチン）は、充填対照としてのみ示される。データは、２４時間、示された濃度の本発明の組成物で処理されたＰＣ３細胞から導かれる。次に、細胞を可溶化し、ゲル上でタンパク質を分離した。Ｒｂ及びｐＲｂタンパク質の存在は、特異的なモノクローナル抗体を用いて測定した。バンド密度の定量を可能にする測光スキャニング装置でゲルをスキャンした後のデータも下段の図に示す。データは、本発明の組成物の０．２５μｌ／ｍｌの濃度でさえ、ｐＲｂ（リン酸化された形態）を明らかに抑制し、Ｒｂ（リン酸化されていない形態）を増加することを示す。
【０１７３】
２μｌ／ｍｌの濃度の本発明の組成物を用いてＰＣ３細胞を２４時間インキュベーションした結果、Ｒｂリン酸化の減少が、Ｔ３５６（対照と比較して５９％減少）、Ｓ８０７（６２％↓）、Ｔ８２１（６２％↓）及びＴ８２６（７９％↓；他はデータを示さない）を含む複数のアミノ酸部位で起った。
【０１７４】
【表６】
【０１７５】
ａ省略形は下記の通りである：ＰＣ３、アンドロゲン非感受性ヒト前立腺癌；Ｒｂ、網膜芽細胞腫タンパク質；ＳＴＡＴ１、シグナル伝達性転写因子１（ｓｉｇｎａｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ ａｎｄ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ １）；Ｆｏｓ、Ｆｏｓ−ｃ ＦＢＪマウス骨肉腫癌タンパク質関連転写因子；ＨｓｐＢ１、熱ショック２７ｋＤａタンパク質；ｐ２１、ｐ２１活性化タンパク質セリンキナーゼ。
【０１７６】
（実施例１６）
（本発明の組成物によるＰＣ３増殖の阻害をブロックする１２−ＨＥＴＥの能力）
図２０Ａ−２０Ｃに示されるように、成長阻害濃度の本発明の組成物で処理したＰＣ３細胞へのＰＧＥ２又は５−ＨＥＴＥの添加は、細胞増殖をブロックしなかった。対照的に、図２０Ａは、本発明の組成物（１μｌ／ｍｌ；アポトーシス及びＧ２／Ｍ停止の強力な誘導を生じる濃度）で処理した細胞へ添加した１２−ＨＥＴＥは、結果として、対照である未処理の細胞レベルまで戻ることはないが、細胞増殖をほぼ２倍にしたことを示す。
【０１７７】
１２−ＨＥＴＥ（１２−Ｈと表す）の添加はまた、結果として、ＰＣ３細胞におけるＲＢタンパク質のリン酸化状態を逆転させる本発明の組成物の能力をブロックした（図２０Ｂ）；ＰＧＥ２及び５−ＨＥＴＥはいずれもｐＲｂ状態を変更する本発明の組成物の能力にいなかる効果もなかった。最後に、ＰＣ３細胞に添加した１２−ＨＥＴＥはまた、Ｇ２／Ｍブロックを媒介した本発明の組成物の部分的な逆転を提供し、本発明の組成物によって媒介されるＰＣ３細胞増殖の阻害におけるこの特別なエイコサノイドの重要性を指摘する。
【０１７８】
したがって、図２０Ａに示されるように、「添加−逆転」実験において、ＰＣ３細胞は、指示した濃度の本発明の組成物で処理され、結果として、細胞増殖は濃度依存的に阻害された（相対的な蛍光は細胞数を示す）。１２−ＨＥＴＥ、すなわち１２−リポキシゲナーゼの添加は、ＰＣ３細胞増殖において中程度の増殖をもたらした。しかしながら、本発明の組成物で処理した細胞への１２−ＨＥＴＥの添加は、本発明の組成物によって媒介された腫瘍細胞増殖阻害を大いにブロックした。
【０１７９】
図２０Ｂに示されるように、本発明の組成物は、ｐＲｂの発現を濃度依存的に減少させた。５−ＨＥＴＥ（５−Ｈ）又はＰＧＥ２のいずれの添加も、この効果をブロックしなかった。しかしながら、１２−ＬＯＸ生成物、１２−ＨＥＴＥの添加は、ｐＲｂ発現の産生を部分的に戻した。総合すれば、これらのデータは、本発明の組成物によって媒介された１２−ＬＯＸの阻害は、１２−ＨＥＴＥが抗増殖活性をブロックし、腫瘍抑制タンパク質Ｒｂの発現を回復させる本発明の組成物の能力をブロックすることができる点で重要であることを示す。
【０１８０】
（参考文献）
下記の参考文献は、関連する技術分野におけるその位置付けに照らして、本発明の対象の理解に有用であると考えられる。本明細書中での引用は、引用されたいずれかの参考文献が本発明の対象の特許性に関連するという主張及び承認として解釈されるべきではない。本出願人らは、情報開示陳述書における特許性に関連する情報を適切に開示している。各参考文献の内容は、本明細書中に全体として組み入れられる。
【０１８１】
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３． Ｐｌｕｍｍｅｒ， Ｓ．Ｍ．， Ｈｏｌｌｏｗａｙ， Ｋ．Ａ．， Ｍａｎｓｏｎ， Ｍ．Ｍ．， Ｍｕｎｋｓ， Ｒ．Ｊ．， Ｋａｐｔｅｉｎ， Ａ．， Ｆａｒｒｏｗ， Ｓ． ａｎｄ Ｈｏｗｅｌｌｓ， Ｌ． （１９９９） Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ ２ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｃｏｌｏｎ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｔｈｅ ｃｈｅｍｏｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅ ａｇｅｎｔ ｃｕｒｃｕｍｉｎ ｉｎｖｏｌｖｅｓ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ＮＦ ｋａｐｐａ Ｂ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｖｉａ ｔｈｅ ＮＩＫ／ＩＫＫ ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ ｃｏｍｐｌｅｘ． Ｏｎｃｏｇｅｎｅ， １８， ６０１３−６０２０．
４． Ｐａｓｃｈｋａ， Ａ．Ｇ．， Ｂｕｔｌｅｒ， Ｒ． ａｎｄ Ｙｏｕｎｇ， Ｃ．Ｙ． （１９９８） Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ｂｙ ｔｈｅ ｇｒｅｅｎ ｔｅａ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ， （−）−ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ−３−ｇａｌｌａｔｅ． Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ， １３０， １−７．
５． Ｋｉｍ， Ｄ．Ｓ．， Ｋｉｍ， Ｈ．Ｒ．， Ｗｏｏ， Ｅ．Ｒ．， Ｈｏｎｇ， Ｓ．Ｔ．， Ｃｈａｅ， Ｈ．Ｊ． ａｎｄ Ｃｈａｅ， Ｓ．Ｗ． （２００５） Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｒｏｓｍａｒｉｎｉｃ ａｃｉｄ ｏｎ ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ Ｈ９ｃ２ ｃａｒｄｉａｃ ｍｕｓｃｌｅ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ ｒｅａｃｔｉｖｅ ｏｘｙｇｅｎ ｓｐｅｃｉｅｓ ａｎｄ ｔｈｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｃ−Ｊｕｎ Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｋｉｎａｓｅ ａｎｄ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｉｇｎａｌ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｋｉｎａｓｅ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．， ７０， １０６６−１０７８．
６． Ｈｕａｎｇ， Ｓ．Ｓ． ａｎｄ Ｚｈｅｎｇ， Ｒ．Ｌ． （２００５） Ｒｏｓｍａｒｉｎｉｃ ａｃｉｄ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ ｉｔｓ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ａｃｔｉｏｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ． Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ．
７． Ｓｈｉｓｈｏｄｉａ， Ｓ．， Ｍａｊｕｍｄａｒ， Ｓ．， Ｂａｎｅｒｊｅｅ， Ｓ． ａｎｄ Ａｇｇａｒｗａｌ， Ｂ．Ｂ． （２００３） Ｕｒｓｏｌｉｃ ａｃｉｄ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ− ｋａｐｐａＢ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｉｃ ａｇｅｎｔｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｉ ｋａｐｐａ Ｂ ａｌｐｈａ ｋｉｎａｓｅ ａｎｄ ｐ６５ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ： ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ ２， ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ９， ａｎｄ ｃｙｃｌｉｎ Ｄｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ６３， ４３７５−４３８３．
８． Ｃｈｏｉ， Ｙ．Ｈ．， Ｂａｅｋ， Ｊ．Ｈ．， Ｙｏｏ， Ｍ．Ａ．， Ｃｈｕｎｇ， Ｈ．Ｙ．， Ｋｉｍ， Ｎ．Ｄ． ａｎｄ Ｋｉｍ， Ｋ．Ｗ． （２０００） Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｂｙ ｕｒｓｏｌｉｃ ａｃｉｄ ｔｈｒｏｕｇｈ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｓｐａｓｅｓ ａｎｄ ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｃ−ＩＡＰｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ． Ｉｎｔ． Ｊ． Ｏｎｃｏｌ．， １７， ５６５−５７１．
９． Ｋｉｍ， Ｓ．Ｏ．， Ｋｕｎｄｕ， Ｊ．Ｋ．， Ｓｈｉｎ， Ｙ．Ｋ．， Ｐａｒｋ， Ｊ．Ｈ．， Ｃｈｏ， Ｍ．Ｈ．， Ｋｉｍ， Ｔ．Ｙ． ａｎｄ Ｓｕｒｈ， Ｙ．Ｊ． （２００５） ［６］−Ｇｉｎｇｅｒｏｌ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ＣＯＸ−２ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｂｙ ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｔｈｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｐ３８ ＭＡＰ ｋｉｎａｓｅ ａｎｄ ＮＦ−ｋａｐｐａＢ ｉｎ ｐｈｏｒｂｏｌ ｅｓｔｅｒ−ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ ｍｏｕｓｅ ｓｋｉｎ． Ｏｎｃｏｇｅｎｅ， ２４， ２５５８−２５６７．
１０． Ａｔｓｕｍｉ， Ｔ．， Ｍｕｒａｋａｍｉ， Ｙ．， Ｓｈｉｂｕｙａ， Ｋ．， Ｔｏｎｏｓａｋｉ， Ｋ． ａｎｄ Ｆｕｊｉｓａｗａ， Ｓ． （２００５） Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ａｎｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ａｎｄ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ−２ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ， ｂｙ ｃｕｒｃｕｍｉｎ ａｎｄ ｉｔｓ ａｎａｌｏｇ， ａｌｐｈａ−ｄｉｉｓｏｅｕｇｅｎｏｌ． Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ２５， ４０２９−４０３６．
１１． Ｔｊｅｎｄｒａｐｕｔｒａ， Ｅ．， Ｔｒａｎ， Ｖ．Ｈ．， Ｌｉｕ−Ｂｒｅｎｎａｎ， Ｄ．， Ｒｏｕｆｏｇａｌｉｓ， Ｂ．Ｄ． ａｎｄ Ｄｕｋｅ， Ｃ．Ｃ． （２００１） Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｇｉｎｇｅｒ ｃｏｎｓｔｉｔｕｅｎｔｓ ａｎｄ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ａｎａｌｏｇｕｅｓ ｏｎ ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ−２ ｅｎｚｙｍｅ ｉｎ ｉｎｔａｃｔ ｃｅｌｌｓ． Ｂｉｏｏｒｇ． Ｃｈｅｍ．， ２９， １５６−１６３．
１２． Ｍａｎｎａ， Ｓ．Ｋ．， Ｍｕｋｈｏｐａｄｈｙａｙ， Ａ． ａｎｄ Ａｇｇａｒｗａｌ， Ｂ．Ｂ． （２０００） Ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ ＴＮＦ−ｉｎｄｕｃｅｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｕｃｌｅａｒ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒｓ ＮＦ−ｋａｐｐａ Ｂ， ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ−１， ａｎｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ： ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｒｏｌｅ ｏｆ ｒｅａｃｔｉｖｅ ｏｘｙｇｅｎ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｓ ａｎｄ ｌｉｐｉｄ ｐｅｒｏｘｉｄａｔｉｏｎ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １６４， ６５０９−６５１９．
１３． Ｆｕｋｕｄａ， Ｋ．， Ｈｉｂｉｙａ， Ｙ．， Ｍｕｔｏｈ， Ｍ．， Ｋｏｓｈｉｊｉ， Ｍ．， Ａｋａｏ， Ｓ． ａｎｄ Ｆｕｊｉｗａｒａ， Ｈ． （１９９９） Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｂｙ ｂｅｒｂｅｒｉｎｅ ｏｆ ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ−２ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃｏｌｏｎ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ． Ｊ． Ｅｔｈｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．， ６６， ２２７−２３３．
１４． ＫｅＩｍ， Ｍ．Ａ．， Ｎａｉｒ， Ｍ．Ｇ．， Ｓｔｒａｓｂｕｒｇ， Ｇ．Ｍ． ａｎｄ ＤｅＷｉｔｔ， Ｄ．Ｌ． （２０００） Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ａｎｄ ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｐｈｅｎｏｌｉｃ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｆｒｏｍ Ｏｃｉｍｕｍ ｓａｎｃｔｕｍ Ｌｉｎｎ． Ｐｈｙｔｏｍｅｄｉｃｉｎｅ， ７， ７−１３．
１５． Ｂｅｍｉｓ， Ｄ．Ｌ．， Ｃａｐｏｄｉｃｅ， Ｊ．Ｌ．， Ａｎａｓｔａｓｉａｄｉｓ， Ａ．Ｇ．， Ｋａｔｚ， Ａ．Ｅ． ａｎｄ Ｂｕｔｔｙａｎ， Ｒ． （２００５） Ｚｙｆｌａｍｅｎｄ， ａ ｕｎｉｑｕｅ ｈｅｒｂａｌ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｎｏｎｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ＣＯＸ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ａｃｔｉｖｉｔｙ， ｉｎｄｕｃｅｓ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｏｆ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ ｔｈａｔ ｌａｃｋ ＣＯＸ−２ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ． Ｎｕｔｒ． Ｃａｎｃｅｒ．， ５２， ２０２−２１２．
１６． Ａｇｇａｒｗａｌ， Ｂ．Ｂ． （２００４） Ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ−ｋａｐｐａＢ： ｔｈｅ ｅｎｅｍｙ ｗｉｔｈｉｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ， ６， ２０３−２０８．
１７． Ａｎｔｏ， Ｒ．Ｊ．， Ｍｕｋｈｏｐａｄｈｙａｙ， Ａ．， Ｓｈｉｓｈｏｄｉａ， Ｓ．， Ｇａｉｒｏｌａ， Ｃ．Ｇ． ａｎｄ Ａｇｇａｒｗａｌ， Ｂ．Ｂ． （２００２） Ｃｉｇａｒｅｔｔｅ ｓｍｏｋｅ ｃｏｎｄｅｎｓａｔｅ ａｃｔｉｖａｔｅｓ ｎｕｃｌｅａｒ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ−ｋａｐｐａＢ ｔｈｒｏｕｇｈ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ ＩｋａｐｐａＢ（ａｌｐｈａ） ： ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ−２． Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ， ２３， １５１１−１５１８．
１８． Ｂｈａｒｔｉ， Ａ．Ｃ， Ｔａｋａｄａ， Ｙ．， Ｓｈｉｓｈｏｄｉａ， Ｓ． ａｎｄ Ａｇｇａｒｗａｌ， Ｂ．Ｂ． （２００４） Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｔｈａｔ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ （ＮＦ）−ｋａｐｐａＢ ｌｉｇａｎｄ ｃａｎ ｓｕｐｐｒｅｓｓ ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｄｕｃｅ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ＮＦ−ｋａｐｐａＢｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｎｄ ＴＲＡＦ６−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７９， ６０６５−６０７６．
１９． Ｔａｋａｄａ， Ｙ．， Ｉｃｈｉｋａｗａ， Ｈ．， Ｂａｄｍａｅｖ， Ｖ． ａｎｄ Ａｇｇａｒｗａｌ， Ｂ．Ｂ． （２００６） Ａｃｅｔｙｌ−１１−ｋｅｔｏｂｅｔａ− ｂｏｓｗｅｌｌｉｃ ａｃｉｄ ｐｏｔｅｎｔｉａｔｅｓ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ， ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｉｎｖａｓｉｏｎ， ａｎｄ ａｂｏｌｉｓｈｅｓ ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔｏｇｅｎｅｓｉｓ ｂｙ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｎｇ ＮＦ−ｋａｐｐａＢ ａｎｄ ＮＦ−ｋａｐｐａＢ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １７６， ３１２７−３１４０．
２０． Ｃｈａｔｕｒｖｅｄｉ， Ｍ．Ｍ．， Ｍｕｋｈｏｐａｄｈｙａｙ， Ａ． ａｎｄ Ａｇｇａｒｗａｌ， Ｂ．Ｂ． （２０００） Ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｒｅｄｏｘ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．， ３１９， ５８５−６０２．
２１． Ａｂｕ−Ａｍｅｒ， Ｙ． ａｎｄ Ｔｏｎｄｒａｖｉ， Ｍ．Ｍ． （１９９７） ＮＦ−ｋａｐｐａＢ ａｎｄ ｂｏｎｅ： ｔｈｅ ｂｒｅａｋｉｎｇ ｐｏｉｎｔ． Ｎａｔ． Ｍｅｄ．， ３， １１８９−１１９０．
２２． Ｌｉｏｔｔａ， Ｌ．Ａ．， Ｔｈｏｒｇｅｉｒｓｓｏｎ， Ｕ．Ｐ． ａｎｄ Ｇａｒｂｉｓａ， Ｓ． （１９８２） Ｒｏｌｅ ｏｆ ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅｓ ｉｎ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌ ｉｎｖａｓｉｏｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ Ｒｅｖ．， １， ２７７−２８８．
２３． Ｖａｎ Ａｎｔｗｅｒｐ， Ｄ．Ｊ．， Ｍａｒｔｉｎ， Ｓ．Ｊ．， Ｋａｆｒｉ， Ｔ．， Ｇｒｅｅｎ， Ｄ．Ｒ． ａｎｄ Ｖｅｒｍａ， Ｉ．Ｍ． （１９９６） Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＴＮＦ−ａｌｐｈａ−ｉｎｄｕｃｅｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｂｙ ＮＦ−ｋａｐｐａＢ． Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２７４， ７８７− ７８９．
２４． Ｗａｎｇ， Ｃ．Ｙ．， Ｍａｙｏ， Ｍ．Ｗ． ａｎｄ Ｂａｌｄｗｉｎ， Ａ．Ｓ．， Ｊｒ． （１９９６） ＴＮＦ− ａｎｄ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙｉｎｄｕｃｅｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ： ｐｏｔｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｂｙ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ＮＦ−ｋａｐｐａＢ． Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２７４， ７８４−７８７．
２５． Ｙａｍａｍｏｔｏ， Ｋ．， Ａｒａｋａｗａ， Ｔ．， Ｕｅｄａ， Ｎ． ａｎｄ Ｙａｍａｍｏｔｏ， Ｓ． （１９９５） Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｒｏｌｅｓ ｏｆ ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ ｋａｐｐａ Ｂ ａｎｄ ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ−ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６ ｉｎ ｔｈｅ ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ ａｌｐｈａ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ−２ ｉｎ ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１ ｃｅｌｌｓ． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７０， ３１３１５−３１３２０．
２６． Ｅｓｔｅｖｅ， Ｐ．Ｏ．， Ｃｈｉｃｏｉｎｅ， Ｅ．， Ｒｏｂｌｅｄｏ， Ｏ．， Ａｏｕｄｊｉｔ， Ｆ．， Ｄｅｓｃｏｔｅａｕｘ， Ａ．， Ｐｏｔｗｏｒｏｗｓｋｉ， Ｅ．Ｆ． ａｎｄ Ｓｔ−Ｐｉｅｒｒｅ， Ｙ． （２００２） Ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ｃ−ｚｅｔａ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−９ ｇｅｎｅ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ＩＬ−１ ａｎｄ ＴＮＦ−ａｌｐｈａ ｉｎ ｇｌｉｏｍａ ｃｅｌｌｓ ｖｉａ ＮＦ−ｋａｐｐａ Ｂ． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７７， ３５１５０−３５１５５．
２７． ｖａｎ ｄｅ Ｓｔｏｌｐｅ， Ａ．， Ｃａｌｄｅｎｈｏｖｅｎ， Ｅ．， Ｓｔａｄｅ， Ｂ．Ｇ．， Ｋｏｅｎｄｅｒｍａｎ， Ｌ．， Ｒａａｉｊｍａｋｅｒｓ， Ｊ．Ａ．， Ｊｏｈｎｓｏｎ， Ｊ．Ｐ． ａｎｄ ｖａｎ ｄｅｒ Ｓａａｇ， Ｐ．Ｔ． （１９９４） １２−Ｏ−ｔｅｔｒａｄｅｃａｎｏｙｌｐｈｏｒｂｏｌ−１３−ａｃｅｔａｔｅ ａｎｄ ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ ａｌｐｈａ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ−１ ｉｓ ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ ｂｙ ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ． Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ−１ ｐｒｏｍｏｔｅｒ． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２６９， ６１８５− ６１９２．
２８． Ｚｈｕ， Ｌ．， Ｆｕｋｕｄａ， Ｓ．， Ｃｏｒｄｉｓ， Ｇ．， Ｄａｓ， Ｄ．Ｋ． ａｎｄ Ｍａｕｌｉｋ， Ｎ． （２００１） Ａｎｔｉ−ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｕｒｖｉｖｉｎ ｐｌａｙｓ ａ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｒｏｌｅ ｉｎ ｔｕｂｕｌａｒ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｃｏｒｏｎａｒｙ ａｒｔｅｒｉｏｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｈｙｐｏｘｉｃ ｐｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ． ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．， ５０８， ３６９−３７４．
２９． Ｃｈｕ， Ｚ．Ｌ．， ＭｃＫｉｎｓｅｙ， Ｔ．Ａ．， Ｌｉｕ， Ｌ．， Ｇｅｎｔｒｙ， Ｊ．Ｊ．， Ｍａｌｉｍ， Ｍ．Ｈ． ａｎｄ Ｂａｌｌａｒｄ， Ｄ．Ｗ． （１９９７） Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ｂｙ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ Ｃ−ＩＡＰ２ ｉｓ ｕｎｄｅｒ ＮＦ−ｋａｐｐａＢ ｃｏｎｔｒｏｌ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ Ｓ Ａ．， ９４， １００５７−１００６２．
３０． Ｙｏｕ， Ｍ．， Ｋｕ， Ｐ．Ｔ．， Ｈｒｄｌｉｃｋｏｖａ， Ｒ． ａｎｄ Ｂｏｓｅ， Ｈ．Ｒ．， Ｊｒ． （１９９７） ｃｈ−ＩＡＰｌ／， ａ ｍｅｍｂｅｒ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−ｏｆ−ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆａｍｉｌｙ， ｉｓ ａ ｍｅｄｉａｔｏｒ ｏｆ ｔｈｅ ａｎｔｉａｐｏｐｔｏｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｖ−Ｒｅｌ ｏｎｃｏｐｒｏｔｅｉｎ． ＭｏＩ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．， １７， ７３２８−７３４１．
３１． Ｃａｔｚ， Ｓ．Ｄ． ａｎｄ Ｊｏｈｎｓｏｎ， Ｊ．Ｌ． （２００１） Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｃｌ−２ ｂｙ ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ ｋａｐｐａ Ｂ ａｎｄ ｉｔｓ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｉｎ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ． Ｏｎｃｏｇｅｎｅ， ２０， ７３４２−７３５１．
３２． Ｓｔｅｈｌｉｋ， Ｃ， ｄｅ Ｍａｒｔｉｎ， Ｒ．， Ｋｕｍａｂａｓｈｉｒｉ， Ｉ．， Ｓｃｈｍｉｄ， Ｊ．Ａ．， Ｂｉｎｄｅｒ， Ｂ．Ｒ． ａｎｄ Ｌｉｐｐ， Ｊ． （１９９８） Ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ （ＮＦ） −ｋａｐｐａＢ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ Ｘ−ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉａｐ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｃｔｓ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ ａｌｐｈａ−ｉｎｄｕｃｅｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ． Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．， １８８， ２１１−２１６．
３３． Ｔａｍａｔａｎｉ， Ｍ．， Ｃｈｅ， Ｙ．Ｈ．， Ｍａｔｓｕｚａｋｉ， Ｈ．， Ｏｇａｗａ， Ｓ．， Ｏｋａｄｏ， Ｈ．， Ｍｉｙａｋｅ， Ｓ．， Ｍｉｚｕｎｏ， Ｔ． ａｎｄ Ｔｏｈｙａｍａ， Ｍ． （１９９９） Ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ ｉｎｄｕｃｅｓ Ｂｃｌ−２ ａｎｄ Ｂｃｌｘ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｔｈｒｏｕｇｈ ＮＦｋａｐｐａＢ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｉｎ ｐｒｉｍａｒｙ ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ ｎｅｕｒｏｎｓ． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７４， ８５３１−８５３８．
３４． Ｓｃｈｗｅｎｚｅｒ， Ｒ．， Ｓｉｅｍｉｅｎｓｋｉ， Ｋ．， Ｌｉｐｔａｙ， Ｓ．， Ｓｃｈｕｂｅｒｔ， Ｇ．， Ｐｅｔｅｒｓ， Ｎ．， Ｓｃｈｅｕｒｉｃｈ， Ｐ．， Ｓｃｈｍｉｄ， Ｒ．Ｍ． ａｎｄ Ｗａｊａｎｔ， Ｈ． （１９９９） Ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ （ＴＮＦ） ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｆａｃｔｏｒ １ ｇｅｎｅ （ＴＲＡＦ１） ｉｓ ｕｐ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｂｙ ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ＴＮＦ ｌｉｇａｎｄ ｆａｍｉｌｙ ａｎｄ ｍｏｄｕｌａｔｅｓ ＴＮＦ−ｉｎｄｕｃｅｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ＮＦ−ｋａｐｐａＢ ａｎｄ ｃ− Ｊｕｎ Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｋｉｎａｓｅ． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７４， １９３６８−１９３７４．
３５． Ｋｒｅｕｚ， Ｓ．， Ｓｉｅｇｍｕｎｄ， Ｄ．， Ｓｃｈｅｕｒｉｃｈ， Ｐ． ａｎｄ Ｗａｊａｎｔ， Ｈ． （２００１） ＮＦ−ｋａｐｐａＢ ｉｎｄｕｃｅｒｓ ｕｐｒｅｇｕｌａｔｅ ｃＦＬＩＰ， ａ ｃｙｃｌｏｈｅｘｉｍｉｄｅ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ｄｅａｔｈ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ． Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．， ２１， ３９６４−３９７３．
３６． Ｓｈｉｓｈｏｄｉａ， Ｓ． ａｎｄ Ａｇｇａｒｗａｌ， Ｂ．Ｂ． （２００４） Ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ−ｋａｐｐａＢ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｍｅｄｉａｔｅｓ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ， ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ， ｉｎｖａｓｉｏｎ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ． Ｃａｎｃｅｒ Ｔｒｅａｔ Ｒｅｓ．， １１９， １３９−１７３．
３７． Ｔａｋａｄａ， Ｙ．， Ｓｉｎｇｈ， Ｓ． ａｎｄ Ａｇｇａｒｗａｌ， Ｂ．Ｂ． （２００４） Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｐ６５ ｐｅｐｔｉｄｅ ｔｈａｔ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ＮＦ−ｋａｐｐａ Ｂ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｖａｒｉｏｕｓ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｓｔｉｍｕｌｉ ａｎｄ ｉｔｓ ｒｏｌｅ ｉｎ ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＮＦ−ｋａｐｐａＢ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｕｐ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ， ２７９， １５０９６−１５１０４．
【０１８２】
本発明の対象はこのように記載され、その対象は、多数の方法で修飾又は変更してもよいことは明らかである。このような修飾及び変更は、本発明の対象の精神及び範囲からの逸脱であると見なされるべきではなく、このような全ての修飾及び変更は、上記の特許請求の範囲内に含まれることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【０１８３】
【図１】図１は、ヒトＡ５４９肺癌細胞株及びヒトＰＣ３前立腺癌細胞株の成長における本発明の対象の組成物の阻害効果を示すグラフである。
【図２】図２は、ＰＧＥ２の形成における本発明の組成物の効果を示すグラフである。
【図３】図３は、ＰＣ３細胞におけるＰＧＥ２及び５−ＨＥＴＥの形成における本発明の組成物の効果を示すグラフである。
【図４】図４は、ヒトＡ５４９肺癌細胞におけるエイコサノイド代謝に対する本発明の組成物の濃度依存的な効果を示すグラフである。
【図５】図５は、本発明の組成物中に１３−Ｓ−ＨＯＤＥが存在することを示す質量分析データを示す。
【図６】図６は、マウスの耳浮腫における本発明の化合物の抗炎症作用を示すグラフである。
【図７】図７は、種々の癌細胞株の増殖における１３−Ｓ−ＨＯＤＥの効果を示すグラフである。
【図８】図８は、ヒト乳癌ＭＣＦ７細胞株及びＭＤＡ２３１細胞株の成長における本発明の化合物の阻害効果を示すグラフである。
【図９】図９は、ヒト腫瘍細胞株（例えば、ＰＣ３）における５−リポキシゲナーゼの存在を濃度依存的にダウンレギュレートする本発明の組成物の能力を示すウェスタンブロットである。
【図１０】図１０は、アラキドン酸（ＡＡ）が媒介したマウスの耳浮腫における本発明の組成物の効果を示すグラフである。
【図１１Ａ】図１１（Ａ）は、単独で、又は０．８ｍｇ／ｍｌの本発明の組成物と共に５ｎＭ ＲＡＮＫＬの存在下で５日間インキュベーション後、ＴＲＡＰ陽性のＲＡＷ ２６４．７細胞を示す一連の写真である。
【図１１Ｂ】図１１（Ｂ）は、単独で、又は０．８ｍｇ／ｍｌの本発明の組成物と共に５ｎＭ ＲＡＮＫＬの存在下で５日間インキュベーション後、ＲＡＷ ２６４．７細胞においてカウントした多核化（３個の核）の破骨細胞の数を示すグラフである。
【図１２】図１２は、１％血清の存在下又は非存在下で０．３ｍｇ／ｍｌの本発明の組成物及び１ｎＭ ＴＮＦで２４時間、一晩の同時インキュベーション後、マトリゲル浸潤チャンバーの浸潤アッセイを示すグラフである。
【図１３】図１３は、１ｎＭ ＴＮＦ、１ｎＭタキソール、及び３００ｎＭドキソルビシンを単独で、又は０．５ｍｇ／ｍｌの本発明の組成物を併用してインキュベートしたヒト多発性骨髄腫Ｕ２６６細胞の細胞死をを示す一連の写真であり、本明細書中に記載されるカルセインＡＭベースの生／死アッセイによって測定した。赤色は死細胞を表し、緑色は生細胞を表している。
【図１４Ａ】図１４（Ａ）は、指定濃度の本発明の組成物と共にプレインキュベートし、０．１ｎＭ ＴＮＦで３０分間処理したＫＢＭ−５細胞のＮＦ−κＢ活性化を示す写真である。
【図１４Ｂ】図１４（Ｂ）は、１ｍｇ／ｍｌの本発明の組成物と共にプレインキュベートし、０．１ｎＭ ＴＮＦで３０分間処理したＫＢＭ−５細胞のＮＦ−κＢ活性化を示す写真である。
【図１４Ｃ】図１４（Ｃ）は、１ｍｇ／ｍｌの本発明の組成物と共にプレインキュベートし、タバコの煙（１０μｇ／ｍｌ）で１時間処理したＫＢＭ−５細胞のＮＦ−κＢ活性化を示す写真である。
【図１５Ａ】図１５（Ａ）は、１ｍｇ／ｍｌの本発明の組成物と共に１時間インキュベートし、１ｎＭ ＴＮＦで指定時間処理したＫＢＭ−５細胞の増殖性及び転移性タンパク質の発現を示す写真である。
【図１５Ｂ】図１５（Ｂ）は、１ｍｇ／ｍｌの本発明の組成物と共に１時間インキュベートし、１ｎＭ ＴＮＦで所定時間処理したＫＢＭ−５細胞の抗アポトーシスタンパク質の発現を示す写真である。
【図１６Ａ】図１６（Ａ）は、細胞周期の分布プロットを示す一連のグラフである。上段左のプロットは、ＰＣ３細胞の正常な細胞周期分布を示す。上段右のプロットでは、Ｇ２／Ｍピークの大きさが増している。下段左及び下段右のプロットは、本発明の組成物の濃度増加によって増している細胞周期のブロックを示す。
【図１６Ｂ】図１６（Ｂ）は、ヒストグラムとして、図１６（Ａ）のフローサイトメトリー分析に基づくデータを示すグラフである。
【図１７Ａ】図１７（Ａ）は、指定濃度の本発明の組成物で処理し、次に、アネキシンＶ及びＰＩ溶液で染色したＰＣ３細胞を示す一連のグラフである。
【図１７Ｂ】図１７（Ｂ）は、指定濃度の本発明の組成物で処理し、次に、アネキシンＶ及びＰＩ溶液で染色したＰＣ３細胞を示す一連のグラフである。
【図１７Ｃ】図１７（Ｃ）は、指定濃度の本発明の組成物で処理し、次に、アネキシンＶ及びＰＩ溶液で染色したＰＣ３細胞を示す一連のグラフである。
【図１７Ｄ】図１７（Ｄ）は、指定濃度の本発明の組成物で処理し、次に、アネキシンＶ及びＰＩ溶液で染色したＰＣ３細胞を示す一連のグラフである。
【図１７Ｅ】図１７（Ｅ）は、ヒストグラムとして、図１７のフローサイトメトリー分析に基づくデータを示すグラフである。
【図１８Ａ】図１８（Ａ）は、示した本発明の組成物の濃度に関するＰＧＥ２の形成を示すグラフである。
【図１８Ｂ】図１８（Ｂ）は、示した本発明の組成物の濃度に関する５−ＨＥＴＥの形成を示すグラフである。
【図１８Ｃ】図１８（Ｃ）は、示した本発明の組成物の濃度に関する１２−ＨＥＴＥの形成を示すグラフである。
【図１８Ｄ】図１８（Ｄ）は、本発明の組成物及び細胞含有量の５−ＬＯＸタンパク質を用いたＰＣ３細胞の処理を示すウェスタンブロットの写真である。
【図１９Ａ】図１９（Ａ）は、リン酸化されていない（Ｒｂ）タンパク質及びリン酸化された（ｐＲｂ）タンパク質として網膜芽腫タンパク質を示すウェスタンブロットの写真である。
【図１９Ｂ】図１９（Ｂ）は、バンド密度の定量を可能にする側光スキャニング装置でゲルをスキャン後の図１９（Ａ）のデータを示すグラフである。
【図２０Ａ】図２０（Ａ）は、指定濃度の本発明の組成物で処理したＰＣ３細胞及び細胞増殖の阻害を示すグラフである。
【図２０Ｂ】図２０（Ｂ）は、本発明の組成物によって引き起こされるｐＲｂの発現の濃度依存的な減少を示すウェスタンブロットの写真である。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本出願は、２００５年６月１４日出願の米国仮特許出願第６０／６９０，１６１号、及び２００６年４月１７日出願の米国仮特許出願第６０／７９２，３３０号の利益を主張し、これらの内容は、参照により本明細書中に全体として組み入れられる。
【０００２】
［発明の対象の背景］
（１．発明の対象の分野）
本発明の対象は、エイコサノイド代謝プロセスの調節を必要とする動物の細胞におけるエイコサノイド代謝プロセスを調節する方法に関し、エイコサノイドオキシゲナーゼの活性を制御するために有効量の本発明の組成物を動物に投与するステップを含む。特に、本発明の対象は、リポキシゲナーゼ及びシクロオキシゲナーゼの活性を制御するために有効量の本発明の組成物を投与することによるアラキドン酸代謝を調節する方法に関する。
【０００３】
（２．背景）
前立腺癌などの癌の早期診断及び治療において進歩がなされたが、前立腺癌は、依然として、最も共通した悪性腫瘍であり、米国において死に関連した男性の癌の２番目に多い原因である。この疾患のより関心の高い局面の１つは、潜在的な前立腺癌はアジアと米国の男性の両方で等しい割合で発症するが、臨床的に重大な前立腺癌の発症率はアジアよりも米国の方が非常に高いという事実である。この相違が異なった集団の食事摂取に関連していることを信じるには多数の理由があり、これらの観察が、前立腺癌の進行に影響を与える可能性のある様々な食事の要因の大規模な調査を促進した。高脂肪の食事は、前立腺癌の危険性の上昇と結び付くため、疫学的研究の中には、これは部分的には、典型的な西洋の食事と比べてアジアの食事の脂肪摂取量が低いことに原因があるかもしれないと示唆するものもある。
【０００４】
本出願人らは、本発明の組成物の投与が、骨髄性白血病ＫＢＭ−５細胞におけるＴＮＦ誘導のＮＦ−κＢ活性化を阻害し、肺腺癌Ｈ１２９９細胞におけるタバコの煙の濃縮物によって誘導されるＮＦ−κＢ活性化を阻害することを見出した。本発明の組成物の投与はまた、ＴＮＦ誘導の細胞浸潤及び排除されたＲＡＮＫＬ誘導の破骨細胞形成の抑制をもたらす。更に、本発明の組成物の投与は、ＴＮＦ誘導の種々の抗アポトーシス、増殖及び転移に関わる遺伝子産物の発現を抑制する。
【０００５】
［発明の対象の概要］
本発明の対象は、エイコサノイド代謝プロセスの調節を必要とする動物の細胞におけるエイコサノイド代謝プロセスを調節する方法に関し、この方法は、エイコサノイドオキシゲナーゼの活性を制御するために有効量の本発明の組成物を上記動物に投与するステップを含み、上記組成物は、ローズマリー、ウコン、オレガノ及びジンジャーの治療的に有効量の超臨界抽出物；並びに、ホーリーバジル、ジンジャー、ウコン、コガネバナ（Ｓｃｕｔｅｌｌａｒｉａ ｂａｉｃａｌｅｎｓｉｓ）、ローズマリー、グリーンティー、イタドリ（ｈｕｚｈａｎｇ）、黄蓮（Ｃｈｉｎｅｓｅ ｇｏｌｄｔｈｒｅａｄ）及びメギの治療的に有効量の含水アルコール抽出物を含む。
【０００６】
本発明の対象は、更に、１３−Ｓ−ＨＯＤＥの送達を必要とする動物に１３−Ｓ−ＨＯＤＥを送達する方法に関し、ローズマリー、ウコン、オレガノ及びジンジャーの治療的に有効量の超臨界抽出物；並びに、ホーリーバジル、ジンジャー、ウコン、コガネバナ、ローズマリー、グリーンティー、イタドリ、黄蓮及びメギの治療的に有効量の含水アルコール抽出物を含む組成物を動物に投与するステップを含む。
【０００７】
その上、本発明の対象は、アラキドン酸が媒介した炎症の阻害を必要とする動物におけるアラキドン酸が媒介した炎症を阻害する方法に関し、ローズマリー、ウコン、オレガノ及びジンジャーの治療的に有効量の超臨界抽出物；並びに、ホーリーバジル、ジンジャー、ウコン、コガネバナ、ローズマリー、グリーンティー、イタドリ、黄蓮及びメギの治療的に有効量の含水アルコール抽出物を含む組成物を上記動物に投与するステップを含む。
【０００８】
更に、本発明の対象は、ＮＦ−κＢに制御される遺伝子産物のレベルの調節を必要とする動物の細胞におけるＮＦ−κＢに制御される遺伝子産物のレベルを調節する方法に関し、ローズマリー、ウコン、オレガノ及びジンジャーの治療的に有効量の超臨界抽出物；並びに、ホーリーバジル、ジンジャー、ウコン、コガネバナ、ローズマリー、グリーンティー、イタドリ、黄蓮及びメギの治療的に有効量の含水アルコール抽出物を含む組成物を上記動物に投与するステップを含む。
【０００９】
［発明の対象の詳細な説明］
（定義）
用語「調節すること」は、生物の生物学的活性、機能、健康、又は状態に対する効果を生じさせるプロセスを意味し、このような生物学的活性、機能、健康、又は状態は、生物の一般的な健康及び幸福と調和するように、維持され、増強され、減少され、又は処置される。
【００１０】
生物の生物学的活性、機能、健康、又は状態を「増強すること」という用語は、増大、補強、強化、又は改善のプロセスを意味する。
【００１１】
用語「エイコサノイド」は、アラキドン酸及びリノリニックアシッド（ｌｉｎｏｌｉｎｉｃ ａｃｉｄ）などの多価不飽和脂肪酸から誘導される化合物の分類のいずれかを意味し、細胞活性に関与する。
【００１２】
用語「オキシゲナーゼ」は、酵素の基質への、酸素分子の導入を触媒する、酵素の分類のいずれかを意味する。
【００１３】
用語「超臨界ガス」又は「超臨界流体」は、本明細書中で使用するとき、臨界点温度まで加熱されたガスを意味し、この温度を超えると、ガスは圧力にかかわらずに、ガス状態を維持し、液体に変わらない。ガスの臨界点を超える温度に加熱されたガスは、圧縮により高密になるであろうし、そのためガスの特徴は、流体の特徴に似ているが、液体になるであろう。二酸化炭素は、通常、超臨界流体を必要とする用途において使用されている。超臨界流体の一般的な特性、及び抽出過程での超臨界流体の一般的な使用は、例えば、Ｔａｙｌｏｒ，Ｓｕｐｅｒｃｒｉｔｉｃａｌ Ｆｌｕｉｄ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ，Ｗｉｌｅｙ，１９９６；ＭｃＨｕｇｈ ａｎｄ Ｋｒｕｋｏｎｉｓ，Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｔｉｃａｌ Ｆｌｕｉｄ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，２ｎｄ ｅｄ．，Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ−Ｈｅｉｎｅｍａｎｎ，１９９４；及び、Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｃｌｉｆｆｏｒｄ，Ｓｕｐｅｒｃｒｉｔｉｃａｌ Ｆｌｕｉｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，２０００に記載され、これらの内容は、参照により本明細書中に組み入れられる。
【００１４】
本出願人らは、ハーブ抽出物で構成される混合物を開発し、この混合物は、ＣＯＸ−２阻害活性を有する。本出願人らの組成物は、組成物のいくつかの成分が超臨界ＣＯ２抽出法を経て調製される点で独特である。従来の溶媒系抽出法とは異なって、超臨界ＣＯ２抽出は、化学的な残留物を残すことなくハーブにおける天然産物を調製物中に得ることができる。
【００１５】
用語「超臨界抽出」は、本明細書中で使用するとき、疎水性化合物が超臨界流体を利用する試料から抽出され得る手法を意味する。超臨界流体の溶媒和力は、圧力及び温度が臨界点を上回って上昇するにつれて増加し、疎水性分子の分離のために有効な溶媒を生成する。用語「超臨界抽出物」は、超臨界抽出によって調製された抽出物を意味する。
【００１６】
用語「含水アルコール抽出」は、本明細書中で使用するとき、親水性化合物がアルコール及び水を利用して試料から抽出され、その後、溶液を蒸発させて、溶解した固体からなる抽出物を生成する手法を意味する。用語「含水アルコール抽出物」は、含水アルコール抽出によって調製された抽出物を意味する。
【００１７】
用語「１３−Ｓ−ＨＯＤＥ」は、１３−ヒドロキシオクタデカ−９Ｚ，１１Ｅ−ジエン酸を意味する。
【００１８】
用語「ＮＦ−κＢ」又は「ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ ｋａｐｐａ Ｂ」は、遺伝子発現に関与するマルチサブユニットの転写因子を意味する。活性なＮＦ−κＢは、ＲＥＬファミリー／ｐ６５サブユニット及びｐ５０若しくはｐ５２サブユニットの二量体からなる。ＮＦ−κＢは、ＮＦ−κＢの阻害剤ＩκＢとの相互作用を通じて細胞質に維持されるが、解離によって、細胞核に移動する。
【００１９】
（本発明の組成物）
本発明の組成物は、抗増殖活性、抗炎症活性、抗酸化活性、抗血管形成活性、及びアポトーシス活性を示す構成成分を含むポリハーブ調製剤の類である。本発明の組成物は、ローズマリー、ウコン、オレガノ及びジンジャーの治療的に有効量の超臨界抽出物；並びに、ホーリーバジル、ジンジャー、ウコン、コガネバナ、ローズマリー、グリーンティー、イタドリ、黄蓮及びメギの治療的に有効量の含水アルコール抽出物で構成される。
【００２０】
一態様では、活性な組成物は、下記を含む。
（Ａ）約４．５重量％〜約７．５重量％、より好ましくは約５．５重量％〜約６．５重量％のジンジャーの含水アルコール抽出物；
（Ｂ）約５．５重量％〜約８．５重量％、より好ましくは約６重量％〜約８重量％のジンジャーの超臨界抽出物；
（Ｃ）約１．０重量％〜約１．５重量％、より好ましくは約１．２重量％〜約１．４重量％のウコンの超臨界抽出物；
（Ｄ）約１０．０重量％〜約１６．０重量％、より好ましくは約１１．５重量％〜約１４．５重量％のローズマリーの超臨界抽出物；
（Ｅ）約４．０重量％〜約６．０重量％、より好ましくは約４．５重量％〜約５．５重量％のオレガノの超臨界抽出物；
（Ｆ）約１０．０重量％〜約１６．０重量％、より好ましくは約１１．５重量％〜約１４．５重量％のウコンの含水アルコール抽出物；
（Ｇ）約５．５重量％〜約８．０重量％、より好ましくは約６．０重量％〜約７．０重量％のローズマリーの含水アルコール抽出物；
（Ｈ）約１０．０重量％〜約１６．０重量％、より好ましくは約１１．５重量％〜約１４．５重量％のホーリーバジルの含水アルコール抽出物；
（Ｉ）約１０．０重量％〜約１６．０重量％、より好ましくは約１１．５重量％〜約１４．５重量％のグリーンティーの含水アルコール抽出物；
（Ｊ）約８．０重量％〜約１２．０重量％、より好ましくは約９．０重量％〜約１１．０重量％のイタドリの含水アルコール抽出物；
（Ｋ）約４．０重量％〜約６．０重量％、より好ましくは約４．５重量％〜約５．５重量％の黄蓮の含水アルコール抽出物；
（Ｌ）約４．０重量％〜約６．０重量％、より好ましくは約４．５重量％〜約５．５重量％のメギの含水アルコール抽出物；及び
（Ｍ）約２．０重量％〜約３．０重量％、より好ましくは約２．２５重量％〜約２．７５重量％のコガネバナの含水アルコール抽出物。
【００２１】
場合により、本発明で用いられるジンジャー、ローズマリー、ウコン、又はオレガノの含水アルコール抽出物は、好ましくは、下記の通りに調製される。植物又は植物の一部は、熱に感受性の成分を保存するために、好ましくは低温で粉砕し、好ましくは二酸化炭素を用いて超臨界抽出に共し、本明細書では「超臨界抽出物」と呼ぶオイル抽出物を得る。更なる任意の態様では、オイル不含残留物は、第一段階から単離され、次に、アルコール６０〜８０部と水４０〜２０部で構成される混合物である水／アルコール、好ましくは水／エタノール中で抽出される。次に、アルコール／水の液体を蒸発させて、本明細書中では「含水アルコール抽出物」と呼ぶ粉末化した抽出残留物が残る。
【００２２】
本発明で場合により用いられるジンジャー、ローズマリー、ウコン、及びオレガノの超臨界抽出物は、例えば、本明細書中に参照により組み入れられるＥ．Ｓｔａｈｌ，Ｋ．Ｗ．Ｑｕｉｒｉｎ，Ｄ．Ｇｅｒａｒｄ，Ｄｅｎｓｅ Ｇａｓｅｓ ｆｏｒ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｆｉｎｉｎｇ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ ４ １９８８に開示される既知の超臨界抽出法に従って調製することができる。
【００２３】
好ましい態様では、ジンジャーの超臨界抽出物とジンジャーの含水アルコール抽出物との重量比は、約０．８：１〜約１．４：１である。
【００２４】
本発明で用いられるローズマリー、ウコン、ホーリーバジル、グリーンティー、イタドリ、黄蓮、メギ及びコガネバナの含水アルコール抽出物は、従来の含水アルコール抽出手法に従って調製することができる。例えば、含水アルコール抽出物は、アルコール６０〜８０部と水４０〜２０部で構成される混合物である水／アルコール、好ましくは水／エタノール中で植物部分を抽出し、次に、水／アルコールの液体を蒸発させて、本明細書中では「含水アルコール抽出物」と呼ぶ粉末化した抽出残留物を残すことによって調製することができる。
【００２５】
更に別の態様では、ウコンの含水アルコール抽出物とウコンの超臨界抽出物との重量比は、約８：１〜約１２：１である。
【００２６】
代替の態様では、ローズマリーの超臨界抽出物とローズマリーの含水アルコール抽出物の重量比は、約１．６：１〜約２．４：１である。
【００２７】
なお更なる態様では、ジンジャーの含水アルコール抽出物は、約２．４重量％〜約３．６重量％、より好ましくは約２．７重量％〜約３．３重量％、最も好ましくは約３．０重量％の刺激性化合物を含む。
【００２８】
別の態様では、ジンジャーの超臨界抽出物は、約２４重量％〜約３６重量％、より好ましくは約２７重量％〜約３３重量％、最も好ましくは約３０重量％の刺激性化合物を含み；約６．４重量％〜約９．６重量％、より好ましくは約７．２重量％〜約８．８重量％、最も好ましくは約８重量％のジンギベレンを含む。
【００２９】
更なる態様では、ウコンの超臨界抽出物は、約３６重量％〜約５４重量％、より好ましくは約４０．５重量％〜約４９．５重量％、最も好ましくは約４５重量％のターメロン（ｔｕｒｍｅｒｏｎｅｓ）を含む。
【００３０】
別の態様では、ローズマリーの超臨界抽出物は、約１８．４重量％〜約２７．６重量％、より好ましくは約２０．７重量％〜約２５．３重量％、最も好ましくは約２３重量％の全フェノール系抗酸化物質を含む。
【００３１】
更に別の態様では、オレガノの超臨界抽出物は、約４．０重量％、より好ましくは約４．５重量％〜約５．５重量％、最も好ましくは約５．０重量％の全フェノール系抗酸化物質を含む。
【００３２】
なお更なる態様では、ウコンの含水アルコール抽出物は、約５．６重量％〜約８．４重量％、より好ましくは約６．３重量％〜約７．７重量％、最も好ましくは約７％のクルクミンを含む。
【００３３】
別の態様では、ローズマリーの含水アルコール抽出物は、約１８．４重量％〜約２７．６重量％、より好ましくは約２０．７重量％〜約２５．３重量％、最も好ましくは約２３重量％の全フェノール系抗酸化物質を含む。
【００３４】
更なる態様では、ホーリーバジルの含水アルコール抽出物は、約１．６重量％〜約２．４重量％、より好ましくは約１．８重量％〜約２．２重量％、最も好ましくは約２重量％のウルソル酸を含む。
【００３５】
更なる態様では、グリーンティーの含水アルコール抽出物は、約３６重量％〜約５４重量％、より好ましくは約４０．５重量％〜約４９．５重量％、最も好ましくは４５重量％のポリフェノールを含む。
【００３６】
別の態様では、イタドリの含水アルコール抽出物は、約６．４重量％〜約９．６重量％、より好ましくは約７．２重量％〜約８．８重量％、最も好ましくは約８重量％のレザバトロール（ｒｅｓｅｒｖａｔｒｏｌｓ）を含む。
【００３７】
別の態様では、黄蓮の含水アルコール抽出物は、約４．８重量％〜約７．２重量％、より好ましくは約５．４重量％〜約６．６重量％、最も好ましくは約６重量％のベルベリンを含む。
【００３８】
更なる態様では、メギの含水アルコール抽出物は、約４．８重量％〜約７．２重量％、より好ましくは約５．４重量％〜約６．６重量％、最も好ましくは約６重量％のベルベリンを含む。
【００３９】
代替の態様では、上記組成物は、下記を含む。
（Ａ）約４．５重量％〜約７．５重量％のジンジャーの含水アルコール抽出物、ここで、この抽出物は、約２．４重量％〜約３．６重量％の刺激性化合物を含む；
（Ｂ）約５．５重量％〜約８．５重量％のジンジャーの超臨界抽出物、ここで、この抽出物は、約２４重量％〜約３６重量％の刺激性物質及び約６．４重量％〜約９．６重量％のジンギベレンを含む；
（Ｃ）約１．０重量％〜約１．５重量％のウコンの超臨界抽出物、ここで、この抽出物は、約３６重量％〜約５４重量％のターメロンを含む；
（Ｄ）約１０．０重量％〜約１６．０重量％のローズマリーの超臨界抽出物、ここで、この抽出物は、約１８．４重量％〜約２７．６重量％の全フェノール系抗酸化物質を含む；
（Ｅ）約４．０重量％〜約６．０重量％のオレガノの超臨界抽出物、ここで、この抽出物は、約４．０重量％を超える全フェノール系抗酸化物質を含む；
（Ｆ）約１０．０重量％〜約１６．０重量％のウコンの含水アルコール抽出物、ここで、この抽出物は、約５．６重量％〜約８．４重量％のクルクミンを含む；
（Ｇ）約５．５重量％〜約８．０重量％のローズマリーの含水アルコール抽出物、ここで、この抽出物は、約１８．４重量％〜約２７．６重量％の全フェノール系抗酸化物質を含む；
（Ｈ）約１０．０重量％〜約１６．０重量％のホーリーバジルの含水アルコール抽出物、ここで、この抽出物は、約１．６重量％〜約２．４重量％のウルソル酸を含む；
（Ｉ）約１０．０重量％〜約１６．０重量％のグリーンティーの含水アルコール抽出物、ここで、この抽出物は、約３６重量％〜約５４重量％のポリフェノールを含む；
（Ｊ）約８．０重量％〜約１２．０重量％のイタドリの含水アルコール抽出物、ここで、この抽出物は、約６．４重量％〜約９．６重量％のレザバトロールを含む；
（Ｋ）約４．０重量％〜約６．０重量％の黄蓮の含水アルコール抽出物、ここで、この抽出物は、約４．８重量％〜約７，２重量％のベルベリンを含む；
（Ｌ）約４．０重量％〜約６．０重量％のメギの含水アルコール抽出物、ここで、この抽出物は、約４．８重量％〜約７．２重量％のベルベリンを含む；及び
（Ｍ）約２．０重量％〜約３．０重量％のコガネバナの含水アルコール抽出物を含み、ここで、上記組成物は、更に、下記を含む。
（i）含水アルコール抽出物の１部に対して超臨界抽出物の約０．８〜約１．４部の重量比であるジンジャーの超臨界抽出物及びジンジャーの含水アルコール抽出物；
（ii）超臨界抽出物の１部に対して含水アルコール抽出物の約８〜約１２部の重量比であるウコンの含水アルコール抽出及びウコンの超臨界抽出物；及び
（iii）含水アルコール抽出物の１部に対して超臨界抽出物の約１．６〜約２．４部の重量比であるローズマリーの超臨界抽出物及びローズマリーの含水アルコール抽出物。
【００４０】
代替の態様では、組成物は、抗腫瘍剤、成長阻害剤、及び栄養素からなる群から選択される追加の薬物を含む。
【００４１】
不活性な成分を除いて、本発明の方法で用いられる経口投与される組成物の好ましい実施形態が、表１に記載される。表１に示された量は、列挙された成分の好ましい投薬量を表す。
【００４２】
【表１】
【００４３】
好ましくは、表１に記載される組成物はまた、エクストラバージンオリーブオイル及び蜜ろうを含む。
【００４４】
（本発明の対象の方法）
本発明の対象の組成物は、概して、典型的には東洋の食生活で消費される植物産物（ジンジャー、ローズマリー、ウコンの根、ホーリーバジル、グリーンティー、イタドリ、黄蓮、メギ、オレガノ、及びコガネバナ）からの規準化した超臨界ＣＯ２濃縮抽出物を含む。
【００４５】
本発明の組成物は、ヒトＰＣ３細胞に対する抗増殖作用について調べ、具体的には、この前立腺癌細胞株におけるエイコサノイド代謝における効果について分析した。本発明の組成物は、クローニングされたＣＯＸ−１、ＣＯＸ−２及び５−ＬＯＸ活性の濃度依存的な阻害を生じることが観察され、５−ＨＥＴＥ産生の阻害は、ＰＧＥ２形成の阻害よりも大きかった。
【００４６】
無傷のＰＣ３に適用した場合、本発明の組成物は、１２−ＬＯＸ活性に対して最も強力であることが分かり、続いて５−ＬＯＸ活性、次にＣＯＸ活性に対してであった。驚くべきことに、ＰＣ３細胞における１３−Ｓ−ＨＯＤＥの出現は、本発明の組成物それ自体におけるこのエイコサノイドの存在が原因であり、細胞内の１５−ＬＯＸ活性の刺激ではなかった。ＰＣ３細胞の増殖の濃度依存的な阻害は、細胞周期の選択的なＧ２／Ｍ停止及びアポトーシスの誘導に関連し、アネキシンＶ及びホスファチジルイノシトールを用いたＰＣ３細胞のフローサイトメトリー染色によって証明された。
【００４７】
本発明の組成物はまた、５−ＬＯＸ及び１２−ＬＯＸ発現の濃度依存的なダウンレギュレーション（ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）を生じるが、高濃度では、ＣＯＸ−２発現のアップレギュレーション（ｕｐ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）が示された。いくつかの細胞情報伝達タンパク質のリン酸化状態を測定した。本発明の組成物は、ｐ２１のリン酸化の増加を生じたが、Ｒｂ及びＳＴＡＴ１タンパク質のリン酸化をダウンレギュレートした。ｐＲｂタンパク質の減少は、１２−ＬＯＸの阻害、及び細胞における１２−ＨＥＴＥレベルの減少によることが示された。本発明の組成物で処理した細胞への１２−ＨＥＴＥの添加は、細胞増殖を阻害する本発明の組成物の能力を克服し、これと一致して、１２−ＨＥＴＥは、Ｒｂタンパク質のリン酸化をダウンレギュレートする本発明の組成物の能力を阻害した。
【００４８】
本発明の組成物を用いたヒト前立腺癌細胞の増殖の効果的な制御は、複合機構的であるが、部分的には、１２−ＬＯＸなどの異常な腫瘍細胞のエイコサノイド代謝の制御、１３−（Ｓ）−ＨＯＤＥなどの植物由来のエイコサノイド産物の適用、並びにリン酸化状態の制御を通じたＲｂ腫瘍抑制タンパク質機能の制御に関わると結論付けられる。
【００４９】
更に、他の実験では、組成物はシクロゲナーゼ（クローニングされたＣＯＸ−１及びＣＯＸ−２）の強力な阻害を示したものの、この産物によって引き起こされるヒト前立腺腫瘍細胞成長を低下する能力は、大部分、ＣＯＸ−２に独立した機構によると考えられることが示された。細胞及び組織における複数のエイコサノイドを同時に測定するＬＣ／ＭＳ／ＭＳに基づく方法を用いて、この独自のハーブ組成物によって生じる細胞及び組織におけるエイコサノイド代謝の変化を調べた。
【００５０】
細胞内のＰＧＥ２、１２−ＨＥＴＥ並びに５−ＨＥＴＥのレベルは、組成物に暴露することにより濃度依存的に減少した。対照的に、１５−ＨＥＴＥ及び１３−ＨＯＤＥの細胞レベルは上昇した。１３−ＨＯＤＥの上昇は、劇的ではあったが、上記で検討したように、ハーブ組成物それ自体に存在する１３−ＨＯＤＥの高い含有量に起因するものであり、この重要なエイコサノイドの細胞による生成に依存しなかった。１３−ＨＯＤＥレベルは、腫瘍細胞成長の阻害を説明するには十分に高いと考えられ、これは真の１３−ＨＯＤＥを腫瘍細胞培養物に添加することによって独立に検証された。
【００５１】
ヒト腫瘍細胞（ＰＣ３前立腺癌細胞）の本発明の組成物への曝露はまた、ウェスタンブロット分析によって測定される５−ＬＯＸ発現のダウンレギュレーションをもたらした。アラキドン酸が媒介したマウスの耳炎症を阻害する本発明の能力はまた評価された。本発明の組成物は、ＬＴＢ４合成の有意な阻害を生じ、１５−ＨＥＴＥの産生をアップレギュレートした。
【００５２】
したがって、本発明の対象は、エイコサノイド代謝プロセスの調節を必要とする動物の細胞におけるエイコサノイド代謝プロセスを調節するための方法に関し、この方法は、エイコサノイドオキシゲナーゼの活性を制御するために有効量の組成物を上記動物に投与するステップを含み、当該組成物は、ローズマリー、ウコン、オレガノ及びジンジャーの治療的に有効量の超臨界抽出物；並びに、ホーリーバジル、ジンジャー、ウコン、コガネバナ、ローズマリー、グリーンティー、イタドリ、黄蓮及びメギの治療的に有効量の含水アルコール抽出物を含む。
【００５３】
本発明の対象の一態様では、細胞は癌細胞である。一実施形態では、癌細胞は、前立腺癌細胞、乳癌細胞、肺癌細胞、結腸癌細胞、又はそれらの組合せを含む。
【００５４】
代替の実施形態では、エイコサノイド代謝プロセスは、細胞の癌への形質転換、癌細胞増殖、癌細胞転移、癌細胞浸潤、癌細胞調節の血管形成、癌細胞調節のアポトーシス抑制、又はそれらの組合せに関連した異常代謝である。
【００５５】
エイコサノイド代謝。アラキドン酸及びその前駆体、リノール酸、及びリノリニックアシッド（ｌｉｎｏｌｉｎｉｃ ａｃｉｄ）は、動物脂肪及び様々な植物油に存在し、一般的には、東洋の食生活と比較して、典型的な西洋の食生活により大量に消費されていると考えられる。これらの脂肪酸の摂取の増加は、リポキシゲナーゼ（ＬＯＸ）及びシクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）などのオキシゲナーゼに対する基質利用性を増加させ、これらの酵素は、アラキドン酸などのエイコサノイドのプロスタグランジン、ロイコトレン、リポキシン、１３−Ｓ−ＨＯＤＥ、５−ＨＥＴＥ、及び１２−ＨＥＴＥなどのシグナル分子への変換に関与する。多くの重要な生物学的経路におけるセカンドメッセンジャーとしてのそれらの重要な役割に加えて、エイコサノイド代謝のこれらの産物は、腫瘍発生、進行、増殖、及び転移のあらゆる局面に関わり合っている。
【００５６】
リポキシゲナーゼ及びエイコサノイド代謝。リポキシゲナーゼ酵素（ＬＯＸ）は、細胞における細胞の生存及びアポトーシスの重要な調節因子であることが知られている。リポキシゲナーゼ酵素は、アラキドン酸酸化の部位特異性について分類される脂質過酸化酵素の異種ファミリーを構成する。ＬＯＸは、５−、８−、１２−、及び１５−ＬＯＸアイソフォームとして示され、５（Ｓ）−、８（Ｓ）−、１２（Ｓ）−、及び１５（Ｓ）−ＨＥＴＥとして知られている最終産物を生成する。ＰＣ３細胞におけるＣＯＸ及びＬＯＸ代謝のＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析の応用は、以前に公開された手法を用いて行った。結果は、本発明の組成物が、期待された通りに、クローニングされたＣＯＸ−１及びＣＯＸ−２の酵素活性の阻害剤であることを示した。更に、当該組成物はまた、クローニングされた５−ＬＯＸ活性を阻害し、実際に、ＣＯＸ阻害剤よりは５−ＬＯＸ阻害剤としてより強力であった。培養中のＰＣ３細胞の処理は、本発明の組成物の、ＣＯＸの阻害を通じてＰＧＥ２の形成を阻害する能力が、５−ＬＯＸを阻害する能力より小さく、これは、言い換えると、ヒト前立腺癌の増殖及び転移に重要であることで知られる酵素である１２−ＬＯＸの、本発明を介した阻害よりも小さいことを示した。
【００５７】
１２−ＨＥＴＥ。いくつかの証拠が、現在、癌細胞の発生の調節因子として１２−ＬＯＸを明確に関連付けている。Ｋ．Ｈｏｎｎの研究所は、特に、ヒト前立腺癌における血小板型１２−ＬＯＸ及びその産物である１２（Ｓ）−ＨＥＴＥの役割の理解に大きく貢献してきた。彼らは、例えば、１２−ＬＯＸがいくつかの前立腺癌細胞株において発現すること、バイカレイン又はＢＨＰＰなどの１２−ＬＯＸの阻害剤が前立腺腫瘍の転移を有意に阻害すること、１２−ＬＯＸレベルがヒト前立腺腫瘍の等級及び重症度と相関することを報告した。このグループからの最近の優れた報告では、前立腺細胞成長及び増殖のバイカレイン阻害が１２−ＬＯＸ阻害と特異的に関連し、１２−ＨＥＴＥの減少がリン酸化されたＲｂタンパク質の喪失と相関することも示された。ＲＢのリン酸化の減少は、言い換えると、ＲＢタンパク質がＤＮＡ合成に必要とされる転写因子に結合したままにし、癌細胞増殖の阻害をもたらす。
【００５８】
早期段階の前立腺癌などの癌と関連した炎症に関与する生物活性な脂質が多く存在する。これらは、腫瘍細胞増殖を刺激するＰＧＥ２の十分に立証された能力を含む。これは、典型的には、腫瘍におけるＣＯＸ−２の過剰発現を通じて起こり、ＰＧＤＨ活性の減少のより最近の知見でもあり、この酵素は、ＰＧＥ２の代謝に関与する。５−リポキシゲナーゼからの５−ＨＥＴＥ及び１２−リポキシゲナーゼからの１２−ＨＥＴＥなどのリポキシゲナーゼ産物はまた、前立腺腫瘍細胞増殖を特異的に誘導することが示されている。１２−ＨＥＴＥは、前立腺癌の増殖、転移及び血管形成と関連することが示されているので、１２−ＬＯＸの阻害が前立腺癌の治療における可能性のある治療的アプローチを示すという示唆が最近なされている。１５−ＬＯＸ−１の産物である１３−Ｓ−ＨＯＤＥ、及び１５−ＬＯＸ−２の産物である１５−ＨＥＴＥなどの他のエイコサノイドは、癌、特に、前立腺癌のシグナリングに対して拮抗的な作用をするようであり、実際には、エイコサノイドの作用においては腫瘍タイプ選択的であるかもしれない。
【００５９】
悪性疾患に対する組織炎症の進行における選択された生物活性なエイコサノイドの役割をより良く理解するために、本出願人らは、自らが開発したエレクトロスプレイ・タンデム質量分析アッセイを用いて、前立腺細胞に関連する炎症プロフィールを試験した。この方法は、アラキドン酸又はリノール酸などの外因子基質を添加する必要がなく、一度に最大１０個のシクロオキシゲナーゼ、リポキシゲナーゼ及び／又はチトクロームＰ４５０誘導のエイコサノイドの同時分析を通じて細胞又は組織試料における「ミニ−リピドミクス（ｍｉｎｉ−ｌｉｐｉｄｏｍｉｃｓ）」の測定を可能にする。
【００６０】
ヒトの癌におけるエイコサノイドの役割をより良く理解するために、本出願人らは、ＰＣ３細胞におけるこの新規な組織炎症アッセイを用いて、このヒトの疾患の増殖に重要であると考えられるシクロオキシゲナーゼ及びリポキシゲナーゼ誘導のエイコサノイドに対する本発明の組成物の効果を測定した。本出願人らは、本発明の組成物が、エイコサノイド代謝において、もし、シクロオキシゲナーゼ活性の阻害以外の効果を生じるならば、どのような効果が生じるのかを測定した。本出願人らのデータは、このマルチハーブ産物が、５−ＬＯＸ及び１２−ＬＯＸ活性を阻害することを示唆している。後者の知見は、１２−ＬＯＸ活性の抑制が、腫瘍細胞増殖及びＲｂリン酸化の阻害、したがって、ホルモン抵抗性ＰＣ３前立腺腫瘍細胞に対する腫瘍抑制活性の復帰と特異的に関連していることを見出した点で、特に興味深いものであるかもしれない。
【００６１】
したがって、好ましい態様では、エイコサノイドは、アラキドン酸及びリノリニックアシッド（ｌｉｎｏｌｉｎｉｃ ａｃｉｄ）からなる群から選択される。
【００６２】
より好ましい態様では、エイコサノイドは、アラキドン酸である。
【００６３】
本発明の対象の更なる態様では、エイコサノドオキシゲナーゼは、シクロオキシゲナーゼ−１、シクロオキシゲナーゼ−２、５−リポキシゲナーゼ、１２−リポキシゲナーゼ、又はそれらの組み合わせである。
【００６４】
好ましい態様では、エイコサノイドオキシゲナーゼは、１２−リポキシゲナーゼである。
【００６５】
別の好ましい態様では、エイコサノイドオキシゲナーゼは、５−リポキシゲナーゼである。
【００６６】
シクロオキシゲナーゼ。エイコサノイド代謝を媒介するシクロオキシゲナーゼ酵素は、多くの組織で構成的に発現しているシクロオキシゲナーゼ−１（ＣＯＸ−１）、炎症及び癌などの疾患状態で典型的に誘導されるシクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）の２種類に代表される。多くの分子生物学及び細胞生物学的試験によるデータはまた、ＣＯＸ−２遺伝子は、アポトーシス、増殖、接着、血管形成及び分化を調節する経路に影響する初期の成長応答遺伝子であることを示唆している。
【００６７】
ＣＯＸ及び特にＣＯＸ−２阻害は、何年もの間、抗炎症剤設計の主要な標的であったが、しかしながら、ＣＯＸ−２発現及び癌との間の結びつきは、より最近になって認められたに過ぎない。いくつかの集団ベースの試験による観察は、強力なＣＯＸ阻害活性を有する非ステロイド系抗炎症剤を規則的に摂取する人々において結腸直腸癌の危険性の有意な減少を示している。結腸直腸腫瘍の発症を調査した組織学的試験は、大部分のヒト及び動物の結腸直腸腫瘍が、上昇したＣＯＸ−２レベルを発現し、近接する正常な結腸直腸の上皮細胞が、低度から検出できない程度のＣＯＸ−２レベルであることを示した。これらの観察に類似して、いくつかの研究所はまた、ＣＯＸ−２発現が、正常な上皮細胞と比較して、初期及び進行中の前立腺癌細胞において上昇することを報告しているが、しかしながら、この知見には異論がある。
【００６８】
とは言っても、いくつかの薬理学的なＣＯＸ−２阻害剤は、インビトロにおいて前立腺癌細胞成長を抑制し、アポトーシスを誘導し、免疫欠損マウスモデル又はＴＲＡＭＰマウスなどの前立腺癌のトランスジェニックモデルにおけるヒトの前立腺腫瘍異種移植片の成長を抑制する能力を示したことは明らかである。ＣＯＸ−２が前立腺癌発症又は進行の因子であるかについて異論はあるが、既知のＣＯＸ阻害剤のいくつかは、様々なＣＯＸに依存しない抗癌作用を有すると考えられ、これらの作用は、阻害剤の中で相違しているようである。
【００６９】
これに関して、地域の食生活に目立つ多くの植物は、ＣＯＸ阻害活性を有する物質を含むことは非常に興味深い。これらの植物からの抽出物は、粗製な形態及び単離した成分の両方で、強力な抗炎症活性及び抗癌活性を有することが分かった。サリチル酸は、例えば、ヤナギの木の皮で見つけられた伝統的な炎症阻害剤であり、この薬物の化学的誘導体であるアスピリンは、依然として世界中で最も一般的に用いられるＣＯＸ阻害性物質の１つである。本研究では、本出願人らは、ＣＯＸ−１及びＣＯＸ−２酵素活性に影響を与え、通常用いられるヒト前立腺癌細胞モデルシステムであるＬＮＣａＰ細胞の挙動に影響を及ぼす能力に関して、独特で商業化が可能なハーブ調製物である本発明の組成物の可能性を考察した。上記で詳述した通り、本発明の組成物は、１０個の規準化されたハーブ抽出物（ローズマリー、ウコン、ジンジャー、ホーリーバジル、グリーンティー、イタドリ、黄蓮、メギ、オレガノ及びコガネバナ）を含む。これらのハーブの各々は、ＣＯＸ活性又は発現に影響を及ぼす独特な化学的構成成分を含むことが示され、各々は、抗炎症性活性又は抗癌活性のいずれかについて試験された。この試験は、任意の所定のハーブにおいて見出された優れた化合物に焦点を当てる傾向にあるが、しかしながら、癌などの疾患に対する複数のハーブ／食餌性薬物（ｄｉｅｔａｒｙ ａｇｅｎｔｓ）の組み合わせに付加的な利益があることを信じるには理由がある。本発明の組成物に存在する複数及び化学的に多様な構成成分は、各々、典型的なアジアの食生活に不可欠な成分であるが、任意の単独のハーブ抽出物のみよりは前立腺癌に対して効果的である可能性がある。
【００７０】
したがって、本発明の対象の代替の態様では、エイコサノイドオキシゲナーゼは、シクロオキシゲナーゼ−１、シクロオキシゲナーゼ−２、又はそれらの組み合わせである。
【００７１】
好ましい実施態様では、エイコサノイドオキシゲナーゼは、シクロオキシゲナーゼ−１である。
【００７２】
更に好ましい実施態様では、エイコサノイドオキシゲナーゼは、シクロオキシゲナーゼ−２である。
【００７３】
本発明の対象の一の代替の態様では、エイコサノイドオキシゲナーゼの活性制御は、オキシゲナーゼ阻害である。
【００７４】
本発明の対象の代替の態様では、エイコサノイド代謝プロセスの調節は、動物の細胞におけるＮＦ−κＢ活性を阻害することを含む。
【００７５】
本発明の対象は、更に、１３−Ｓ−ＨＯＤＥの送達を必要とする動物における１３−Ｓ−ＨＯＤＥを送達する方法に関し、この方法は、ローズマリー、ウコン、オレガノ及びジンジャーの治療的に有効量の超臨界抽出物；並びに、ホーリーバジル、ジンジャー、ウコン、コガネバナ、ローズマリー、グリーンティー、イタドリ、黄蓮及びメギの治療的に有効量の含水アルコール抽出物を含む組成物を上記動物に投与するステップを含む。
【００７６】
更に、本発明の対象は、アラキドン酸が媒介する炎症の阻害を必要とする動物におけるアラキドン酸が媒介した炎症を阻害する方法に関し、この方法は、ローズマリー、ウコン、オレガノ及びジンジャーの治療的に有効量の超臨界抽出物；並びに、ホーリーバジル、ジンジャー、ウコン、コガネバナ、ローズマリー、グリーンティー、イタドリ、黄蓮及びメギの治療的に有効量の含水アルコール抽出物を含む組成物を上記動物に投与することを含む。
【００７７】
ＮＦ−κＢ。核因子κＢは、全ての細胞の細胞質に存在するＲｅｌドメインを含むタンパク質のファミリーであり、ＩκＢα、ＩκＢβ、ＩκＢγ、ＩκＢε、ｂｃｌ−３、ｐ１０５及びｐ１００を含むアンカリン（ａｎｃｈｏｒｉｎ）ドメイン含有タンパク質のファミリーによって不活性な状態で維持される。静止条件下で、ＮＦ−κＢは、細胞質中でｐ５０、ｐ６５、及びＩκＢαのヘテロ三量体から成り；活性化され、核に移行された場合のみ、一連のイベントが転写開始へと導く。大部分の発癌物質、炎症性物質、並びにタバコの煙の濃縮物、ホルボールエステル、オカダ酸、Ｈ２Ｏ２、及び腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）を含む腫瘍促進剤は、ＮＦ−κＢ活性化経路を活性化することが示されている。ＮＦ−κＢの活性化は、ＩκＢαのリン酸化、ユビキチン化及び分解並びにｐ６５のリン酸化を含み、続いて、細胞核へのＮＦ−κＢの移行をもたらし、ＤＮＡの特定の応答エレメントに結合する。ＩκＢαのリン酸化は、大部分の薬物によるＮＦ−κＢ活性化に必須であるＩκＢαキナーゼ（ＩＫＫ）によって触媒される。ＮＦ−κＢは、遺伝子産物が腫瘍形成に関与する多数の遺伝子の発現を制御することが示されている。これらは、抗アポトーシス遺伝子（例えば、ｃｉａｐ、ｓｕｖｉｖｉｎ、ｔｒａｆ、ｃｆｌｉｐ、ｂｆｌ−１、ｂｃｌ−２及びｂｃｌ−ｘｌ）、血管形成（ｃｏｘ−２、ｍｍｐ−９、ｖｅｇｆ）、接着分子、ケモカイン、及び炎症性サイトカインをコードする遺伝子；及び細胞周期制御遺伝子（例えば、ｃｙｃｌｉｎ ｄ１、ｃ−ｍｙｃ）を含む。
【００７８】
特定の作用機構に結びつけることなしに、本出願人らは、本発明の組成物が、核因子κＢ（「ＮＦ−κＢ」）の活性化を調節し、言い換えると、腫瘍細胞の増殖、浸潤、及び転移を制御し、フィードバックＮＦ−κＢ活性化を阻害し、ＮＦ−κＢ制御の遺伝子産物の発現を制御すると考えている。特に、出願人は、本発明の組成物がＮＦ−κＢリガンド誘導の破骨細胞形成の受容体活性因子を阻害し、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）誘導の浸潤を抑制し、ＴＮＦ及び化学療法剤によって誘導されるアポトーシスを促進することを見出した。更に、本発明の組成物は、ＴＮＦ及びタバコの煙の濃縮物の両方によって誘導されるＮＦ−κＢ活性化を抑制する。加えて、本発明の組成物は、アポトーシス阻害タンパク質１／２、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｘＬ、ＦＡＤＤ様インターロイキン−１β変換酵素（ＦＬＩＣＥ）／カスパーゼ−８阻害性タンパク質、ＴＮＦ受容体関連因子１、及びサバイビンを含む抗アポトーシスに関与するＮＦ−κＢ制御の遺伝子産物の発現をダウンレギュレートし、更に、血管内皮細胞増殖因子、シクロオキシゲナーゼ−２、細胞間接着分子、及びマトリックスメタロプロテイナーゼを含む血管形成に関与する遺伝子産物の発現をダウンレギュレートする。これらの結果は、ＴＮＦ及び化学療法剤によって誘導されるアポトーシスの促進と相関する。本出願人らの全体的な結果は、本発明の組成物が破骨細胞形成を抑制し、浸潤を阻害し、ＮＦ−κＢ活性化のダウンレギュレーション及びＮＦ−κＢ制御の遺伝子産物のダウンレギュレーションを介してアポトーシスを促進することを示す。
【００７９】
本出願人らは、ＮＦ−κＢ活性化経路に対する本発明の組成物の効果、並びに腫瘍細胞の生存、増殖、浸潤、血管形成及び転移を調節するＮＦ−κＢ制御の遺伝子産物に対する本発明の組成物の効果のいくつかを測定し、本発明の組成物が、ＲＡＮＫＬ誘導の破骨細胞形成及びＴＮＦ誘導の浸潤を阻害し、種々の腫瘍細胞株におけるＴＮＦ及び化学療法剤によって誘導されるアポトーシスを促進することを見出した。ＩＡＰ１、Ｂｆｌ−１／Ａ１、Ｂｃｌ−２、ＴＲＡＦ１、及びｃＦＬＩＰを含む抗アポトーシスに関与する遺伝子産物の発現、ＭＭＰ−９、ＣＯＸ−２、ＩＣＡＭ−１、及びＶＥＧＦを含む転移に関与する遺伝子産物の発現はまた、本発明の組成物によってダウンレギュレートされた。
【００８０】
本出願人らのデータは、本発明の組成物が、ヒト骨髄性白血病ＫＢＭ−５細胞におけるＴＮＦ、肺腺癌Ｈ１２９９細胞におけるタバコの煙の濃縮物、によって活性化されるＮＦ−κＢを抑制することを示す。これは、異なる刺激によって活性化されるＮＦ−κＢにおける本発明の組成物の効果を調べた最初の研究である。これらの結果は、本発明の組成物が、これらの薬物に共通した段階で作用することを示唆している。癌の増殖及び転移に関与しているいくつかの遺伝子は、ＮＦ−κＢによって制御されることが示されている（例えば、Ａｇｇａｒｗａｌ，Ｂ．Ｂ．（２００４）Ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ−ｋａｐｐａ Ｂ：ｔｈｅ ｅｎｅｍｙ ｗｉｔｈｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ，６，２０３−２０８を参照されたい）。本出願人らは、本発明の組成物が、ＮＦ−κＢによって制御されるＣＯＸ−２、ＭＭＰ−９、及びＶＥＧＦの発現を阻害することを示した。
【００８１】
更に、最近の報告では、本発明の組成物はＣＯＸ−１及びＣＯＸ−２の酵素的活性を抑制することを示唆しているが（例えば、Ｂｅｍｉｓ，Ｄ．Ｌ．，Ｃａｐｏｄｉｃｅ，Ｊ．Ｌ．，Ａｎａｓｔａｓｉａｄｉｓ，Ａ．Ｇ．，Ｋａｔｚ，Ａ．Ｅ．ａｎｄ Ｂｕｔｔｙａｎ，Ｒ．（２００５）Ｚｙｆｌａｍｅｎｄ，ａ ｕｎｉｑｕｅ ｈｅｒｂａｌ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｎｏｎｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ＣＯＸ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ａｃｔｉｖｉｔｙ，ｉｎｄｕｃｅｓ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｏｆ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ ｔｈａｔ ｌａｃｋ ＣＯＸ−２ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ． Ｎｕｔｒ．Ｃａｎｃｅｒ．，５２，２０２−２１２を参照されたい）、本出願人らは、本発明の組成物がＣＯＸ−２タンパク質の発現を阻害することを示した。
【００８２】
本出願人らのデータは、本発明の組成物がＮＦ−κＢの直接的な阻害を通じてＮＦ−κＢ制御の経路にその抗癌特性を発揮することを示唆する。ＮＦ−κＢは、ＩＡＰ１、ｘＩＡＰ、Ｂｆｌ−１／Ａ１、ＴＲＡＦ１、Ｂｃｌ−２、ｃＦＬＩＰ、及びサバイビンの発現を制御することで知られ、多数の腫瘍におけるそれらの過剰発現は、生存、化学療法剤耐性、及び放射線耐性と結び付く（例えば、Ｔａｋａｄａ，Ｙ．，Ｓｉｎｇｈ，Ｓ．ａｎｄ Ａｇｇａｒｗａｌ，Ｂ．Ｂ．（２００４）Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｐ６５ ｐｅｐｔｉｄｅ ｔｈａｔ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ＮＦ−ｋａｐｐａ Ｂ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｖａｒｉｏｕｓ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｓｔｉｍｕｌｉ ａｎｄ ｉｔｓ ｒｏｌｅ ｉｎ ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＮＦ−ｋａｐｐａ Ｂ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｕｐ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，２７９，１５０９６−１５１０４を参照されたい）。本出願人らのデータは、本発明の組成物の処理が、これらの遺伝子産物の大部分をダウンレギュレートすることを示す。以前の報告では、本発明の組成物はヒト前立腺癌細胞におけるカスパーゼ媒介の経路を通じてアポトーシスを誘導することが示唆された（例えば、Ｂｅｍｉｓら，（２００５）を参照されたい）。本出願人らの結果はまた、本発明の組成物がＴＮＦ、タキソール、及びドキソルビシンのアポトーシス効果を促進することを示す。これらの効果は、ＮＦ−κＢの特異的な阻害剤を用いて報告された効果と類似する（例えば、Ｔａｋａｄａ，ら（２００４）を参照されたい）。
【００８３】
更に、特定の作用機序に結び付けることなく、本出願人らは、本発明の組成物の投与により観察された抗増殖効果、アポトーシス促進効果、抗浸潤効果、抗破骨細胞形成効果、抗血管形成効果、及び抗転移効果がＮＦ−κＢ制御の遺伝子産物の抑制を介して仲介されると考える。本発明の組成物の製剤化に用いられる各ハーブは、独特の抗炎症性及び抗癌性化合物を含有することで知られているが、本発明の組成物の成分の共通する特性の１つは、ＮＦ−κＢ活性化を抑制する能力であるようである。
【００８４】
本発明の組成物が天然のハーブ供給源から誘導され、健康食品及び栄養補給供給源から容易に入手できるという事実を考慮することによって、癌の処方薬よりも癌を予防し治療するためのより便利で好ましい手段となる。
【００８５】
したがって、本発明の対象はまた、ＮＦ−κＢ制御の遺伝子産物のレベルの調節を必要とする動物の細胞におけるＮＦ−κＢ制御の遺伝子産物のレベルを調節する方法に関し、この方法は、ローズマリー、ウコン、オレガノ及びジンジャーの治療的に有効量の超臨界抽出物；並びに、ホーリーバジル、ジンジャー、ウコン、コガネバナ、ローズマリー、グリーンティー、イタドリ、黄蓮及びメギの治療的に有効量の含水アルコール抽出物を上記動物に投与することを含む。
【００８６】
上記で開示した全ての本発明の方法における動物は、マウス、ラット、ネコ、イヌ、ウマ、ウシ、又は他の家畜、あるいはヒトなどの哺乳動物であってよい。好ましい実施態様では、動物はヒトである。ヒトの疾患、障害、及び状態を治療するための使用に加えて、本発明の方法は、獣医的な用途を有してもよい。
【００８７】
（投与経路）
好ましい実施態様では、経口投与される組成物は、１以上のカプセル、１以上の錠剤、又は１以上の丸薬の形態である。
【００８８】
本発明の組成物は、好ましくは、薬学的に許容される担体を用いて患者に送達される。このような担体は、当該技術分野において周知であり、固体形態又は液体形態のいずれかである。本発明の対象に従って調製されてもよい固体形態の医薬製剤は、粉剤、錠剤、分散顆粒、カプセル、カシェ（ｃａｃｈｅｔ）及び坐薬を含む。一般的に、固体形態製剤は、約５重量％〜約９０重量％の活性剤を含む。
【００８９】
固体担体は、希釈剤、香味剤、可溶化剤、潤滑剤、懸濁剤、結合剤又は錠剤崩壊剤のように作用してもよい１以上の物質であり得る；それはまた、封入剤であり得る。粉剤では、担体は、粘性な活性化合物との混合状態である微細に分割した固体である。錠剤では、活性化合物は、適した比率で必要な結合特性を有する担体と混合され、所望の形状及び大きさに圧縮される。適した固体担体は、炭酸マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、糖、ラクトース、ペクチン、デキストリン、でんぷん、ゼラチン、トラガカント、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、低融点ワックス、ココアバターなどを含む。用語「調製」は、活性成分（他の担体の有無を問わない）が担体によって取り囲まれるカプセル、したがって、担体と関連しているカプセルを提供する担体として封入材を含む活性化合物の調合を含むことが意図される。同様に、カシェが含まれる。錠剤、粉剤、カシェ、及びカプセルは、経口投与に適した固体投薬形態であり得る。利便性又は患者の受け入れの理由で望ましい場合、本発明の対象に従って製造される医薬錠剤は、当該技術分野において周知の技術を用いて、チュアブルな形態で提供されてもよい。
【００９０】
坐薬を製造するためには、脂肪酸グリセリド又はココアバターの混合物のような低融点ワックスがまず融解され、有効成分を撹拌などでその中に均一に分散させる。次に、融解された均一な混合物は、都合の良い大きさの鋳型に注ぎ込まれ、冷却され、凝固される。
【００９１】
液状形態製剤は、溶液、懸濁液、及びエマルジョンを含む。一例として、非経口的注射用に水又は水／プロピレングリコール溶液が挙げられる。液体製剤はまた、水性ポリエチレングリコール溶液中に溶液で調合することができる。経口使用に適した水溶液は、水に有効成分を溶解し、必要に応じて、適した着色剤、フレーバー、安定化材及び増粘剤を添加することによって調合することができる。経口使用に適した水性懸濁液は、粘性の材料、即ち、天然ゴム又は合成ゴム、レジン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、及び他の周知の懸濁剤と共に水中に微細に分割した有効成分を分散することによって調製することができる。液体医薬製剤は１００重量％までの対象の活性剤を含むことができる。
【００９２】
経口又は非経口投与のために液体形態製剤に使用直前に変換されることが意図される固体形態製剤がまた適した担体として意図される。このような液体形態は、溶液、懸濁液、及びエマルジョンを含む。これらの特定の固体製剤は、単位投薬形態で最も好都合に提供され、このような製剤は単一の液体投薬単位を提供するために使用される。あるいは、十分な固体は、液体に変換した後、複数の独立した液体投薬量が、シリンジ、ティースプーン、又は他の計量容器を用いて液体形態製剤の所定の容積を測定することによって得ることができる。複数の液体投薬量がそのように調製される場合、考えられる分解を遅延させるために、低温（即ち、冷却下）で液体投薬量の未使用の部分を維持することが好ましい。液体形態に変換されることが意図される固体形態製剤は、活性材料に加えて、香味剤、着色剤、安定化剤、緩衝剤、人工及び天然の甘味剤、分散剤、増粘剤、可溶化剤等を含んでもよい。有用な液体形態製剤を製造するために利用される液体は、水、等張水、エタノール、グリセリン、プロピレングリコールなど、並びにそれらの混合物であってよい。当然に、利用される液体は、投与経路に関して選ばれる。例えば、大量のエタノールを含む液体製剤は、非経口的使用には適していない。
【００９３】
本発明の医薬製剤は、安息香酸、ソルビン酸、メチルパラベン、プロピルパラベン及びエチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）などの当該技術分野において周知の１以上の保存剤を含んでもよい。保存剤は、一般的には、薬学的組成物の最大約１重量％、好ましくは約０．０５〜約０．５重量％の量で存在する。
【００９４】
本発明の対象の目的のための有用な緩衝液は、薬学的組成物の最大約１重量％、好ましくは約０．０５〜約０．５重量％の量のクエン酸−クエン酸ナトリウム、リン酸−リン酸ナトリウム、及び酢酸−酢酸ナトリウムを含む。有用な懸濁剤又は増粘剤は、薬学的組成物の最大約２０％、好ましくは約１重量％〜約１５％の量でメチルセルロースのようなセルロース誘導体、アルギン酸及びその誘導体のようなカラゲナン、キサンタンガム、ゼラチン、アカシア、及び微結晶性セルロースを含む。
【００９５】
採用することができる甘味剤は、当該技術分野において周知である天然及び人工の甘味剤を含む。キシロース、リボース、グルコース、マンノース、ガラクトース、フルクトース、デキシトロース、スクロース、マルトース、部分加水分解でんぷん又はコーンシロップ固形物などの単糖、二糖及び多糖、及びソルビトール、キシリトール、マンニトール及びそれらの混合物などの糖アルコールなどの甘味剤は、薬学的組成物の約１０重量％〜約６０重量％、好ましくは約２０重量％〜約５０重量％の量で利用されてもよい。サッカリン並びにサッカリンのナトリウム又はカルシウムなどの塩、シクラミン酸塩、アセスルファム−Ｋ、アルパルテーム等、及びそれらの混合物などの水溶性人工甘味剤は、組成物の約０．００１重量％〜約５重量％の量で利用されてもよい。
【００９６】
本発明の対象の薬学的生成物で採用されてもよい香味剤は、天然及び人工のフレーバー、及びペパーミントなどのミント、メントール、バニラ、人工バニラ、チョコレート、人工チョコレート、シナモン、様々なフルーツフレーバーを個別で及び混合して、薬学的組成物の約０．５重量％〜約５重量％の量で含む。
【００９７】
本発明の対象に有用な着色剤は、組成物の最大約６重量％の量で導入されてもよい色素を含む。好ましい色素の二酸化チタンは、最大約１％で導入されてもよい。また、着色剤は、Ｆ．Ｄ．＆Ｃ．染料等として知られる食品、薬物及び化粧品用途に適した他の染料を含んでもよい。このような染料は、一般的に、薬学的製剤の最大約０．２５重量％、好ましくは約０．０５重量％〜約０．２重量％の量で存在する。全てのＦ．Ｄ．＆Ｃ．染料、Ｄ．＆Ｃ．及びそれらの対応する化学構造の全般的な詳細は、Ｋｉｒｋ−Ｏｔｈｍｅｒ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，第５巻，８５７−８８４ページに見出すことができ、したがって、このテキストは、参照により本明細書中に組み入れられる。
【００９８】
有用な可溶化剤は、アルコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等を含み、フレーバーを可溶化するために用いることができる。可溶化剤は、一般的に、薬学的組成物の最大約１０重量％；好ましくは約２重量％〜約５重量％で存在する。
【００９９】
この組成物に所望される場合に用いることができる潤滑剤は、置換及び未置換のポリシロキサンなどのシリコーン油又は流体物、例えば、ジメチコーンとしても知られるジメチルポリシロキサンを含む。他の周知の潤滑剤を採用してもよい。
【０１００】
薬学的組成物はまた、単位投薬形態で調製することができる。このような形態では、製剤は、有効成分の適した量を含む単位投薬量に更に分割される。単位投薬形態は、パッケージされた製剤、製剤の別個の量を含むパッケージ、例えば、バイアル又はアンプル中のパッケージ化した錠剤、カプセル、及び粉剤であり得る。単位投薬形態はまた、カプセル、カシェ、又は錠剤それ自体であり得て、あるいは、パッケージ化した形態の適した数のこれらのいずれかであり得る。
【０１０１】
本発明の対象の化合物は、他の人工又は天然に発生する物質と不都合な相互作用を示すとは考えられない。したがって、本発明の対象の化合物は、例えば、癌を治療するための他の化合物及び組成物を併用して投与されてもよい。特に、本発明の対象の化合物は、本発明の対象の他の化合物、化学療法物質などを併用して投与されてもよい。
【０１０２】
最適な医薬製剤は、投与経路及び所望の投薬量に依存して、当業者によって決定される。例えば、参照により本明細書中に組み入れられる、“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”，第１８版（１９９０，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｃｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ １８０４２），１４３５−１７１２ページを参照されたい。このような製剤は、本発明の対象の治療薬の物理的状態、安定性、インビボでの放出速度、及びインビボでの浄化速度に影響を与えるかもしれない。
【０１０３】
（投薬量）
有効成分化合物又は組成物の約０．００１ｍｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重の次数の投薬レベルは、上記状態の治療に有用であり、好ましいレベルは、２００ｍｇ／日〜１６００ｍｇ／日の範囲である。本発明の対象の化合物及び組成物は、通常、毎日２又は３回の投薬で与えることができる。毎日２回の低投薬量（２００〜３００ｍｇ）から開始して、必要に応じてより高い投薬量に徐々に上げることは好ましいストラテジーである。１回の投薬量形態を生じるように担体材料と組み合わせてもよい有効成分の量は、治療される宿主及び投与の特定の様式に応じて変化する。
【０１０４】
しかしながら、任意の特定の患者の特定の投薬レベルは、採用される特定の化合物の活性；患者の年齢、体重、一般的な健康、性別及び食事；投与時間；排出速度；薬物の組み合わせ；治療される特定の障害の重症度；投与形態を含む様々な因子に依存する。当業者は、このような因子の変動を十分理解するであろうし、単なる日常的な実験を用いて特定の投薬レベルを確立することができる。
【実施例】
【０１０５】
下記の実施例は、本発明の対象の例示であり、それに限定することを意図してはいない。他に指示がなければ、全てのパーセントは、１００重量％の最終組成物に基づいている。
【０１０６】
（一般的材料及び方法）
Ｎｅｗ Ｃｈａｐｔｅｒ Ｉｎｃ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から入手されるＺｙｆｌａｍｅｎｄ（登録商標）は、１０ｍｇ／ｍｌ保存液としてジメチルスルホキシド（「ＤＭＳＯ」）に溶解させ、−２０℃で保存した。５×１０７Ｕ／ｍｇの比活性の均一物になるように精製された、細菌由来のヒト腫瘍壊死因子アルファ（「ＴＮＦ−α」）は、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．（Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）から好意により提供された。ペニシリン、ストレプトマイシン、ＲＰＭＩ１６４０培地、Ｉｓｃｏｖｅ変法ダルベッコ培地（「ＩＭＤＭ」）、Ｄ−ＭＥＭ／Ｆ１２培地、及びウシ胎児血清（「ＦＢＳ」）は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）から入手した。下記のポリクローナル抗体は、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ）から入手した：抗マトリックスメタロプロテイナーゼ９（「ＭＭＰ−９」）；抗細胞接着分子（「ＩＣＡＭ」）；抗アポトーシス阻害タンパク質１／２（「ＩＡＰ１／２」）；抗Ｂｃｌ−２；抗Ｂｆｌ−１／Ａ１；及び抗ＴＮＦ受容体関連因子（「ＴＲＡＦ１」）。抗ＣＯＸ−２及びＸＩＡＰは、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から入手した。タバコの煙の濃縮物（「ＣＳＣ」）は、Ａｎｔｏ，Ｒ．Ｊ．，Ｍｕｋｈｏｐａｄｈｙａｙ，Ａ．，Ｓｈｉｓｈｏｄｉａ，Ｓ．，Ｇａｉｒｏｌａ，Ｃ．Ｇ．ａｎｄ Ａｇｇａｒｗａｌ，Ｂ．Ｂ．（２００２）Ｃｉｇａｒｅｔｔｅ ｓｍｏｋｅ ｃｏｎｄｅｎｓａｔｅ ａｃｔｉｖａｔｅｓ ｎｕｃｌｅａｒ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ−ｋａｐｐａ Ｂ ｔｈｒｏｕｇｈ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ Ｉ ｋａｐｐａ Ｂ（ａｌｐｈａ）：ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ−２．Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ，２３，１５１１−１５１８に記載されるように調製し、Ｄｒ．Ｇ．Ｇａｉｒｏｌａ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｋｅｎｔｕｃｋｙ，Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ，ＫＹ）から好意により供給された。抗血管内皮細胞増殖因子（「ＶＥＧＦ」）は、ＮｅｏＭａｒｋｅｒｓ（Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）から購入した。サバイビン抗体は、Ｒ＆Ｂ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）から入手した。ＦＡＤＤ様インターロイキン−１β−変換酵素（「ＦＬＩＣＥ」）／カスパーゼ−８−阻害性タンパク質（「ｃＦＬＩＰ」）抗体は、Ｉｍｇｅｎｅｘ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から好意により提供された。
【０１０７】
本出願人らの研究で用いられる細胞株は、ヒト非小細胞性肺癌腫（Ｈ１２９９）、ヒト骨髄性白血病（ＫＢＭ−５）、ヒト多発性骨髄腫（Ｕ２６６）、マウスマクロファージ（ＲＡＷ２６４．７）細胞株を含み、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から入手した。Ｈ１２９９及びＵ２６６細胞は、１０％ ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０で培養した。ＫＢＭ−５細胞は、１５％ ＦＢＳを含むＩＭＤＭで培養した。ＲＡＷ２６４．７細胞は、１０％ ＦＢＳを添加したＤ−ＭＥＭ／Ｆ１２培地で培養した。全ての培地には、１００Ｕ／ｍｌペニシリン及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンが添加された。
【０１０８】
（実施例１）
（細胞成長の阻害）
一般的な開始点として、培養中の樹立されたげっ歯類又はヒト細胞株を用いて、細胞成長を阻害する生成物又は薬物の相対的能力を調査する。これの目的は、単に、有効でないか又は毒性である濃度と有意に阻害的又は「効果的」である濃度とを識別することができることである。所定の生成物の作用機構の調査は、幾分ではあるが著しくはない成長阻害及び大量でない細胞死を生じる濃度でなされなければならない。更に、これらの種類の試験は、細胞イベントにおける時間依存的な変化の当初見積もりを提供する。それは、成長阻害又は細胞死の最初の示唆に関連した、薬物媒介のイベントが認められる時である。これは、言い換えると、関与する一連のイベントを示唆するかもしれない。
【０１０９】
取り組んでいる大部分の試験は、ヒト前立腺癌細胞株を用いることを含む。これの理由は、これが対象の細胞株であり、当該細胞株がエイコサノイド代謝に関して本出願人らによって特徴付けられ、本出願人らがＰＩＮの治療／予防に本発明の組成物の進行中の臨床試験に関与するという事実を含む。しかしながら、データが得られるにつれて、前立腺癌それ自体とはほとんど関係がないが、代わりに、一般的な抗炎症活性及びメカニズムを理解するのに有用である他の細胞株及び動物モデルが使用されてもよい。
【０１１０】
図１は、ヒトＡ５４９肺癌及びヒトＰＣ３前立腺癌細胞株の成長に対する本発明の化合物の阻害効果を示す。本発明の組成物の経口製剤が使用された。組成物は、培養中の細胞に添加され、細胞成長の相対的阻害は、薬物への連続曝露の７２時間後に評価した。「ＭＴＴ」法を使用し、未処理の対照細胞群に対する細胞増殖を評価した。肺腺癌細胞より顕著な前立腺ＰＣ３細胞の成長阻害が見られる。
【０１１１】
同様に、図８及び表２は、ヒト乳癌ＭＣＦ７及びＭＤＡ２３１細胞株の成長に対する化合物の阻害効果を示す。ここでも、本発明の組成物の経口製剤が使用された。組成物を培養中の細胞に添加し、細胞成長の相対的阻害は、薬物への連続曝露の７２時間後に評価した。「ＭＴＴ」法を使用して、未処理の対照細胞増殖に対する細胞増殖を評価した。ＭＣＦ７細胞は、ＭＤＡ２３１細胞よりも組成物曝露に感受性であった。
【０１１２】
【表２】
【０１１３】
＊ＩＣ５０は、薬剤への曝露の所定条件（通常は継続期間）下で、（未処理の細胞と比較して）５０％まで細胞の成長阻害を生じる物質の濃度（μｇ／ｍｌ）として定義される。
【０１１４】
試験されるまさに「正常な」ヒト内皮細胞株に対する細胞毒性の相対的欠如は、薬剤の患者の耐性及び投与プロトコールの順守の目的のためには明らかに興味深い。ヒト乳腺ＭＣＦ−７エストロゲン感受性細胞株の組成物への感受性は特に関心があり、この細胞株は、確かにこれまでに試験した最も感受性のある細胞である。本出願人らは、エストロゲン結合をブロックする本発明の組成物を製造するために使用されるいずれの化合物も植物抽出物において認識しておらず、本出願人らは、観察された高い感受性にこの代替の説明は無関係であると考える。
【０１１５】
（実施例２）
（シクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）及びリポキシゲナーゼ（ＬＯＸ）酵素を阻害するための本発明の組成物の能力）
本出願人は、ＣＯＸ−１、ＣＯＸ−２、及び対象となる他のエイコサノイドに対する本発明の組成物の相対的効果を測定した。これらの試験は、組成物が、（クローニングされた酵素として）ＣＯＸ−１及びＣＯＸ−２の両方を阻害することを示し、本出願人が本発明の組成物を構成する種々のハーブ抽出物から得た多様な抗炎症成分に基づいて予期していた通りであった。データはまた、組成物が、同様に５−リポキシゲナーゼ（５−ＬＯＸ）の有用な阻害剤であることを示す。１５−ＬＯＸ−２から誘導されたエイコサノイド産物における選択的な変化は観察されなかった。データはまた、組成物が濃度依存的に１２−リポキシゲナーゼを阻害することを示す。図２及び図３のデータは、組成物がクローニングされたＣＯＸ酵素並びに培養中の細胞の酵素を阻害するという観点で有力であることを示す。ほんの少ないマイクロリットル量の液体中の本発明の組成物は、シクロオキシゲナーゼ酵素の有意な阻害を生じるには十分であった。これは、組成物のこの特定の製剤の６０％が、それ自体はエイコサノイド代謝に影響を与えないオリーブ油であることを思い起こすと、特に強い印象を与える。
【０１１６】
図２は、クローニングされたＣＯＸ−１（ヒツジ）及びＣＯＸ−２（ヒト）酵素を用いたＰＧＥ２の形成における組成物の効果が、５ｍＭ ＥＤＴＡ、２ｍＭフェノール、及び１μＭヘマチンを含有する０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８．０中の酵素（１５ ＩＵ）と共に１０μＭ ＡＡのインキュベーションによって測定されたことを示す。組成物のアリコートは、ＡＡの添加前にチューブに添加した。対照のインキュベーションには、組成物を含めなかった。アスタリスクを付するバーは、「オリーブ油」の対照を表わす。インキュベーションは、３７℃で１５分間行った。１Ｎクエン酸の添加によって反応を停止させた。次に、エイコサノイドは、ヘキサン：酢酸エチル（１：１）溶媒混合物を用いて抽出した；抽出物は、窒素下で乾燥させた。インキュベーション中に形成されたＰＧＥ２は、前述したように抽出され、次に、本出願人らによって公開されたＬＣ／ＭＳ／ＭＳ法（Ｙａｎｇら Ａｎａｌ Ｂｉｃｏｃｈｅｍ．３０８：１６８−１７７，２００２）を用いて分析した。図２に示したデータは、本発明の組成物がＣＯＸ−１及びＣＯＸ−２の両方によってＰＧＥ２の形成を阻害するが、生成物はＣＯＸ−２よりもＣＯＸ−１の阻害において有力であることを示唆する。
【０１１７】
図３は、ＰＣ３細胞におけるＰＧＥ２及び５−ＨＥＴＥの形成における組成物の効果を示す。種々の濃度の組成物は、１５μＭ ＢＳＡを添加した新鮮な無血清培地中での細胞培養物に添加され、３７℃で１０分間インキュベートした。次に、アラキドン酸（１００μＭ）及び補因子を添加した。１０分後、細胞を洗浄し、細胞内に形成したエイコサノイドを測定するために抽出した（図２の説明文を参照されたい）。データは、ＰＣ３細胞におけるＰＧＥ２及び５−ＨＥＴＥの濃度依存的な阻害を示す。データは、平均±ＳＤ（ｎ＝３）として提示される。＊は、対照との比較によるＰ＜０．０５を示す。
【０１１８】
（実施例３）
（５−リポキシゲナーゼの細胞発現に対する本発明の組成物の効果）
抗炎症剤は、多くの異なる機構を通じてその薬学的効果を達成することができる。所定の生成物は、炎症に関連する分子の形成に関与する選択的酵素を阻害することができ、例えばＰＧＥ２の形成を減少させるためにＣＯＸ−２を阻害し、又は５−ＨＥＴＥの形成を阻害させるために５−リポキシゲナーゼを阻害する。組成物はまた、ＮＦ−κＢの活性化のクルクミン媒介の阻害などの炎症関連遺伝子の活性化に直接関与することで知られている転写因子の活性化を阻害する。
【０１１９】
更に、所定の生成物はまた、細胞又は組織中の酵素の実際の合成、したがって発現を直接阻害するというよりは減少させるために作用してもよい。本出願人らが得た初期のデータは、本発明の組成物が、酵素活性の阻害に加えて細胞の５−リポキシゲナーゼの相対的発現の濃度依存的な阻害を提供することを示す。組成物がＣＯＸ−２の相対的な組織発現を阻害しないようであるため、酵素発現の相対的阻害は、一般的な現象ではない。
【０１２０】
（実施例４）
（本発明の組成物における１３−Ｓ−ＨＯＤＥの同定）
図４は、ヒトＡ５４９肺癌細胞におけるエイコサノイド代謝に対する本発明の組成物の濃度依存的な効果を示し、１３−Ｓ−ＨＯＤＥの形成における明らかに濃度依存的な増加を示す。細胞（１×１０６）は、組織培養プレートに一晩接着させ、次に、図に示されるように、異なる濃度の組成物で２４時間処理した。次に、細胞を回収し、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳによるエイコサノイド分析のために抽出した。データは、２μｌ／ｍｌの組成物濃度でＰＧＥ２の小さな阻害（３２％）を示すが、また、１及び２μｌ／ｍｌで１３−Ｓ−ＨＯＤＥの「明らかな」劇的な形成を示す。
【０１２１】
いくつかの細胞株でのアラキドン酸から種々のエイコサノイド生成物への変換における組成物の効果を試験した。上記で示されるデータは、少なくともヒト肺Ａ４５９細胞に関しては、組成物がシクロオキシゲナーゼ又はリポキシゲナーゼ酵素に対する大きな効果を持たないことを示唆する。しかしながら、１５−ＬＯＸ−１酵素の生成物である１３−Ｓ−ＨＯＤＥの濃度依存的な増加は目覚しい。１３−Ｓ−ＨＯＤＥのこのような増加は、酵素それ自体の誘導、又は酵素活性、１３−Ｓ−ＨＯＤＥを優先的に生じるリノール酸などの適した基質の添加、又は別のメカニズムを介して生じるであろう。１５−ＬＯＸ−１の誘導は、実際には、ＮＳＡＩＤが結腸癌細胞に添加される場合に起こり、これは結腸癌の予防薬としてのアスピリンの薬効に対して部分的な説明に役立つ。しかしながら、ウェスタンブロットによって、組成物を用いたインキュベーションの結果として１５−ＬＯＸ−１酵素の有意な誘導は観察されなかった。本発明の組成物はまた、１５−ＬＯＸ−１酵素を介して１３−Ｓ−ＨＯＤＥを生じ得る基質であるリノール酸の相対的含有量を調べた。ＧＣ／ＭＳ／ＭＳ装置を用いることで、最小量のリノール酸だけが見出された。しかしながら、組成物それ自体の試験は、下記の実施例６で検討されるように、大量の１３−Ｓ−ＨＯＤＥの存在を示した。
【０１２２】
図５は、本発明の組成物に１３−Ｓ−ＨＯＤＥの存在を示す質量分析データを示す。図５は、関連した情報の３つのプロットを表わす。最上段のプロットは、重水素化した１３−Ｓ−ＨＯＤＥの総イオンクロマトグラムである（１３−Ｓ−ＨＯＤＥ−ｄ４として示される）。４つの重水素原子は、１３−Ｓ−ＨＯＤＥそれ自体の質量に対してより高分子量（４の追加）を提供する。重水素化した生成物の質量（上段右の電荷比に対する質量によって示される）は「２９９」である。これは、基本的には、この生成物の質量である。２９９＞２８１の表記は、本出願人らが質量２９９に対して装置に選択させ、次に２８１で特徴的な「娘」イオンを生じるようにアルゴン（不活性ガス）を有する分子を衝突させることを意味する。この娘イオンは、定量目的で用いることができる。
【０１２３】
中段のプロットは、Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）から購入した真正の１３−Ｓ−ＨＯＤＥ（２５ｎｇ／ｍｌ）に対するイオントレースを示す。１３−Ｓ−ＨＯＤＥは質量が２９５．３であり、これはプロットに示される。本出願人らは、化合物を特徴付ける２７７．２の娘イオンを見る。即ち、２７７．２の娘イオンを生じるために「分解して」２７７．２の質量を有するいずれか１つの分子の可能性は、対象である実際の分子：１３−Ｓ−ＨＯＤＥを除きほとんどゼロである。
【０１２４】
下段のプロットは、本発明の組成物の抽出物である。質量分析は、質量２９５．３を有する全分子を探すために指示された。次に、本出願人らは、２７７．２で特徴的な娘イオンだけを見るように装置をセットした。装置が、それらを大量に見出したという事実は、１３−Ｓ−ＨＯＤＥが本発明の組成物に存在するということを疑いの余地なく示す。抽出物は、たった５μｌの組成物から得られた。各ピークの２つの数は、ピークの保持時間（例えば、６．６９分）及び相対的なイオン量を表わす。後者は、ピーク内の生成物の「量」に類似している。２５ｎｇ／ｍｌで１３−Ｓ−ＨＯＤＥの真正な標準が８６４，４１２のピーク量を提供し、たった５μｌの組成物が６，３３８，６０６のピーク「量」を生じるという事実は、組成物内における多量のこのエイコサノイドの存在を明らかに示している。肝心なことは、これは、組成物が大量の１３−Ｓ−ＨＯＤＥを含むという「確かな」証明であるということである。
【０１２５】
１３−Ｓ−ＨＯＤＥが処理される物質であることを確かめるために、本発明の組成物中の１３−Ｓ−ＨＯＤＥの存在を、抗体ベースの酵素免疫アッセイキットを用いて評価した。抗体は、１３−Ｓ−ＨＯＤＥを検出するための特異性を提供する。ＥＩＡ分析は、本発明の組成物中に大量の１３−Ｓ−ＨＯＤＥが存在することを確かめた。
【０１２６】
抗炎症剤は、多くの異なったメカニズムを通じて薬学的効果を達成することができる。例えば、所定の生成物は、炎症に関連した分子の形成に関与する選択的酵素を阻害することができる（例えば、ＰＧＥ２の形成を減少させるためにＣＯＸ−２を阻害し、又は５−ＨＥＴＥの形成を阻害させるために５−リポキシゲナーゼを阻害する）。生成物はまた、炎症に関連した遺伝子の活性化に直接関与することで知られる転写因子の活性化を阻害することができる（例えば、ＮＦ−κＢの活性化のクルクミン媒介の阻害）。更に、所定の生成物はまた、酵素を直接的に阻害するというよりはむしろ、細胞又は組織中の酵素の実際の合成、したがって発現を減少させるために作用してもよい。得られた初期のデータは、本発明の組成物が、酵素活性の阻害に加えて、実際に、細胞の５−リポキシゲナーゼの相対的発現の濃度依存的な阻害へと導くことができることを示す。組成物が１２−ＬＯＸの相対的な組織発現を阻害しないようであるため、酵素発現の相対的阻害は、一般的な現象ではない。５−ＬＯＸの発現の消失（ダウンレギュレーション）もまた、細胞への５−ＬＯＸ阻害剤の曝露の一般的な結果ではない。本明細書中にはないが、ＰＣ３細胞が、確立した５−ＬＯＸ阻害剤であるＺｉｌｅｕｔｏｎに曝露された後の、５−ＬＯＸタンパク質含有量（ウェスタンブロット）の相対的効果を調べた。図９に示されるように、Ｚｉｌｅｕｔｏｎは、有力な５−ＬＯＸ阻害剤である（このために喘息の治療に有用である）が、細胞内の相対的な５−ＬＯＸ酵素含量のいかなる変化をも提供しなかった。
【０１２７】
興味深いことの１つは、組成物の細胞への曝露の結果として発生するＣＯＸ−２タンパク質発現における濃度依存的な増加である。一見したところでは、これは、まさに、本出願人らが起こらないことを望んでいたことのようであった。結局、ＣＯＸ−２の阻害は、大きな製薬ビジネスのための基盤である。しかし、Ｃｅｌｅｂｒｅｘ（セレコキシブ）は、ＣＯＸ−２の既知の誘導因子であるという事実はほとんど認識されていない。酵素活性が阻害されるために、炎症が抑制され、自然の力が酵素の合成の増加をさせてそれを克服させようと最善を尽くす。換言すれば、ＣＯＸ−２の阻害剤を受けている人々は、彼らがそれらの摂取を止めるまでまさに良好である。
【０１２８】
（実施例５）
（本発明の組成物の抗炎症作用のインビボでの測定：マウス耳モデル）
非常に単純ではあるが効果的な炎症の動物モデルは、過去数年間用いられてきた。試験マウスの右耳は、推定される抗炎症剤で予め処理され、次に、３０分間放置される。次に、炎症剤（典型的には、アセトン中のアラキドン酸（ＡＡ））が、同じ耳に適用される。ビヒクルが対照として左耳に適用される。ＡＡ適用後の固定時間、マウスを麻酔し、その後、組織の均一なセグメントを得るために、丸い耳のパンチを用いる。マウスの各耳のパンチの組織の重量差を、炎症の相対的な阻害の相対的指数として使用する。計量後、耳パンチ試料は、それに続く、本出願人のＬＣ／ＭＳ／ＭＳ法の使用を通じた、特定のエイコサノイド代謝の分析のために急速に凍結される。
【０１２９】
図６は、マウスの耳浮腫における本発明の組成物の抗炎症作用を示す。組成物（１０μｌ）は、右耳に局所的に投与し、アセトンビヒクルのみを左耳に適用した。ＡＡ処理の１時間後、マウスを麻酔し、均一な組織片を得るために耳を「パンチ」した。次に、右耳の重量が、浮腫を測定するために、左耳の重量から差し引かれる。データは、ＡＡ媒介の耳浮腫を阻害する所定の試験物質の相対的能力を反映している。データは、１０匹の動物からの平均±ＳＤとして提示される。＊Ｐ＜０．００１処理対ＡＡ（浮腫）対照（ＡＡ媒介炎症）。
【０１３０】
図６のデータは、組成物が、アラキドン酸が媒介する炎症の有意な阻害を生じることを示す。
【０１３１】
同様に、図１０は、アラキドン酸が媒介したマウス耳浮腫における本発明の組成物の効果を示す。処理群は、１）オリーブ油対照、２）アセトン対照、３）オリーブ油＋ＡＡ、４）本発明の組成物（１０μｌ）＋ＡＡ、５）本発明の組成物（５μｌ）＋ＡＡ、及び６）本発明の組成物（２．５μｌ）＋ＡＡからなる。データは、平均±ＳＤ（ｎ＝１０匹のマウス／群）として提供される。再度、組成物は、ＡＡによって生じた浮腫を阻害した。図１０に示されるように、浮腫の最大阻害は、３つ全ての組成物の「投薬量」で得られたが、２．５μｌの組成物の使用は、２つのより高い濃度のいずれかよりも僅かに低い効果であるようであった。
【０１３２】
（実施例６）
（本発明の組成物における１３−Ｓ−ＨＯＤＥのハーブ供給源及び相対的重要性）
組成物の液体形態の相対的エイコサノイド含量の分析では、大量の１３−Ｓ−ＨＯＤＥを見ることは驚くべきことであった。これらの分析は、真正の重水素化した標準を、本出願人らが正しいピーク同定を得たことを確かめるために用いたＬＣ／ＭＳ／ＭＳを用いて行った。この観察を二重に確かめるために、液体組成物はまた、１３−Ｓ−ＨＯＤＥの測定のために特に調製した酵素免疫アッセイキットを用いて分析した。ＥＩＡ分析からの結果は、質量分析データを裏付け、表３に示される。
【０１３３】
【表３】
【０１３４】
組成物の経口形態は、６０％オリーブ油（１３−Ｓ−ＨＯＤＥを含有しない）であるという事実は、抽出材料中の１３−Ｓ−ＨＯＤＥの相対的含量が上記で示されるよりもなお高いことを示す。
【０１３５】
図７は、種々の癌細胞株の増殖に対する１３−Ｓ−ＨＯＤＥの効果を示す。上記のデータは、酵素１５−ＬＯＸ−２の産物である１３−Ｓ−ＨＯＤＥが、ヒト腫瘍前立腺（ＰＣ３）及び結腸（ＬＳ１７４）の細胞成長を完全に阻害することができるが、肺腺癌（Ａ５４９）細胞成長は阻害できないことを示す。前立腺癌及び結腸癌細胞株を阻害するための１３−Ｓ−ＨＯＤＥの相対的能力は、ＩＣ５０が３〜４μＭである。これは、本発明の組成物中の１３−Ｓ−ＨＯＤＥの含有量と比較した場合に重要である。換言すれば、上記の表２に示されるように、細胞成長の阻害を説明するのには組成物内に十分な１３−Ｓ−ＨＯＤＥが存在する。組成物内の他の因子もまた、前立腺及び結腸腫瘍細胞成長を阻害する能力に貢献することに疑いはないが、阻害することができる組成物内の１３−Ｓ−ＨＯＤＥの能力は非常に興味深い。
【０１３６】
組成物の液体形態の相対的なエイコサノイド含量を調べ、大量の１３−Ｓ−ＨＯＤＥを見ることは驚くべきことであった。これらの分析は、正しいピーク同定を得たことを裏付けるために真正の重水素化した標準を用いたＬＣ／ＭＳ／ＭＳを用いて行った。この観察を二重に確かめるために、液体組成物はまた、１３−Ｓ−ＨＯＤＥの測定のために特に調製した酵素免疫アッセイキットを用いて分析した。ＥＩＡ分析からの結果は、質量分析データを裏づけた。組成物の経口形態は、６０％オリーブ油（１３−Ｓ−ＨＯＤＥを含有しない）であるという事実は、抽出物中の１３−Ｓ−ＨＯＤＥの相対的含有量が上記で示されるよりもなお高いことを示す。
【０１３７】
組成物を調製するために用いられる異なったハーブ及び植物抽出成分の中で、エイコサノイド生成物の１３−Ｓ−ＨＯＤＥの供給源について調査を行った。アプローチは、抽出物を可溶化させるか又は有機溶媒の混合物に抽出物を共し、その後、脂溶性エイコサノイドを取り出すことである。次に、これらを窒素下で乾燥させ、質量分析装置に適合する固定量の緩衝液中で再構成させる。別のアリコートを、ＧＣ／ＭＳ／ＭＳを用いた相対的なリノール酸含量の分析のために使用した。この背景にある論理的根拠は、１３−Ｓ−ＨＯＤＥそれ自体が抽出物中に存在するか、又は細胞が１５−ＬＯＸ−１を含有し、基質リノール酸を補給した場合の培養中の細胞において酵素反応を通じて誘導され得るということである。
【０１３８】
下記の表４のデータは、リノール酸及び１３−Ｓ−ＨＯＤＥの両方を含む抽出物が存在するが、エイコサノイドそれ自体は、本発明の組成物を調製するために用いられるいくつかのハーブ抽出物の成分であることを納得の行くように示している。１３−Ｓ−ＨＯＤＥがいくつかの抽出物（例えば、グリーンティー）に存在しないという事実はまた興味深く、測定が正しいという事実に信憑性を与える。
【０１３９】
【表４】
【０１４０】
１３−ＨＯＤＥ及びリノール酸の測定を３回行い、同程度の結果であった。１３−Ｓ−ＨＯＤＥは、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳを用いて測定し、リノール酸含量は、ＧＣ／ＭＳ／ＭＳを用いて測定した。組成物の１３−Ｓ−ＨＯＤＥの供給源は、大部分、ジンジャー及びウコンによるものと見られる。この特定のエイコサノイドは、ジンジャーのＰＳＥ及びＳＣＥ抽出物、同様に、より少ない程度でウコンの根に存在することは興味深い。大量の１３−ＨＯＤＥの存在は、必ずしも、１３−Ｓ−ＨＯＤＥを生成する１５−ＬＯＸ−１の基質である大量のリノール酸と関連するとは限らないことは注目に値する。
【０１４１】
（実施例７）
（破骨細胞分化アッセイ）
ＮＦ−κＢリガンド（ＲＡＮＫＬ）誘導の破骨細胞形成の受容体活性化因子に対する本発明の組成物の効果を測定するために、本出願人らは、インビトロでＲＡＮＫＬによって破骨細胞に分化し得るＲＡＷ２６４．７細胞を培養した。ＲＡＷ２６４．７細胞は、１×１０４細胞／ウェルの密度で２４ウェルディッシュ中で培養し、一晩接着させた。次に、培地を交換し、細胞を様々な濃度の本発明の組成物及び５ｎＭ ＲＡＮＫＬを用いて共培養した。５日目に、酸性ホスファターゼキット（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて以前に説明したように酒石酸塩耐性の酸性ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）を染色し、ＴＲＡＰ陽性の多核破骨細胞（＞３個の核）／ウェルをカウントした。
【０１４２】
ＲＡＷ２６４．７細胞（１×１０４細胞／ウェル）を単独で又は５ｎＭ ＲＡＮＫＬ及び０．８ｍｇ／ｍｌの本発明の組成物の存在下で５日間インキュベートし、ＴＲＡＰ発現について染色した。図１１（Ａ）に示されるように、ＴＲＡＰ陽性細胞を撮影した（オリジナル倍率、１００×）。
【０１４３】
ＲＡＷ２６４．７細胞（１×１０４細胞／ウェル）を単独で又は５ｎＭ ＲＡＮＫＬ及び所定濃度の本発明の組成物の存在下で５日間インキュベートし、ＴＲＡＰ発現について染色した。多核（３個の核）破骨細胞をカウントし、結果は、図１１（Ｂ）に図式的に示した。
【０１４４】
本発明の組成物は、ＲＡＮＫＬ誘導の破骨細胞形成を抑制することが示される。ＴＮＦスーパーファミリーのメンバーであるＲＡＮＫＬはＮＦ−κＢの活性化を通じて破骨細胞形成を誘導するため、本出願人らは、本発明の組成物がＲＡＮＫＬ誘導の破骨細胞形成を抑制することができるかどうかを測定した。本出願人らは、図１１（Ａ）に示されるように、ＲＡＮＫＬは、ＴＲＡＰの発現によって示される破骨細胞の分化を誘導し、本発明の組成物が図１１（Ｂ）に示されるように、濃度依存的にこの誘導を抑制することを見出した。
【０１４５】
（実施例８）
（浸潤アッセイ）
細胞外マトリックスを介した浸潤が腫瘍転移における重要な段階であるため、細胞浸潤を評価するために膜浸潤培養システムを用いた。ＢＤ ＢｉｏＣｏａｔ Ｔｕｍｏｒ Ｉｎｖａｓｉｏｎシステムは、８μｍ径の細孔を有する光漏れのないポリエチレンテレフタレート膜を有するチャンバーであり、再構成した基底膜ゲル（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）で被覆されている。Ｈ１２９９全体（２．５×１０４細胞）を無血清培地に懸濁し、上段ウェルに播種した。一晩のインキュベーション後、細胞は、様々な濃度の本発明の組成物及び１ｎＭ ＴＮＦと、１％ ＦＢＳの存在下でさらに２４時間、同時にインキュベートした。マトリゲルを通過して浸潤した細胞（即ち、インキュベーション中に下段のチャンバーに移動した細胞）は、ＰＢＳ中の４μｇ／ｍｌのＣａｌｃｅｉｎ ＡＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を用いて３０分間３７℃で染色し、Ｖｉｃｔｏｒ３マルチプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ ａｎｄ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）を用いて蛍光をスキャンし、蛍光細胞をカウントした。
【０１４６】
Ｈ１２９９細胞（２．５×１０４細胞／ウェル）は、血清なしで、マトリゲル浸潤チャンバーの上段ウェルに一晩播種され、０．３ｍｇ／ｍｌの本発明の組成物及び１ｎＭ ＴＮＦを用いて、１％血清の存在下で同時にインキュベートし、次に、浸潤アッセイに供した。結果は、図１２に示されるように、図式的に示した。本発明の組成物なし及びＴＮＦなしの値を１．０に合わせた。
【０１４７】
本発明の組成物は、ＴＮＦ誘導の腫瘍細胞の浸潤活性を抑制することが示される。ＮＦ−κＢは、腫瘍細胞浸潤を媒介する遺伝子産物（例えば、ＭＭＰ−９、ＣＯＸ−２、及びＶＥＧＦ）の発現を制御することが知られている。本発明の組成物が、ＴＮＦ誘導の腫瘍細胞浸潤活性を調節することができるかどうかをインビトロで調べた。これを測定するために、腫瘍細胞は、本発明の組成物の存在下又は非存在下で、ＴＮＦと共にマトリゲル浸潤チャンバーの上段チャンバーに播種され、次に、浸潤について調べた。図１２に示されるように、ＴＮＦ誘導の腫瘍細胞はほぼ２倍浸潤したが、本発明の組成物は、濃度依存的にこの活性を抑制した。本発明の組成物単独では、浸潤活性に影響がなかった。
【０１４８】
（実施例９）
（生／死（ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ）アッセイ）
アポトーシスを測定するために、本出願人らは、細胞内エステラーゼ活性及び細胞膜の完全性を測定する生／死アッセイ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を用いた。このアッセイは、生細胞内に保持されるポリアニオン性染料であるカルセインを採用し、緑色の蛍光を与える。それはまた、損傷した膜を通過してのみ細胞に入り、核酸に結合することができるエチジウムモノマー染料（赤色蛍光）を採用するが、生細胞の無傷な細胞膜によっては排除される。簡単には、１×１０６細胞は、０．５ｍｇ／ｍｌの本発明の組成物と共に２４時間インキュベートし、次に、１ｎＭ ＴＮＦ又は種々の化学療法剤と１６時間、３７℃で処理した。細胞を生／死試薬（５μＭエチジウムホモ二量体、５μＭカルセイン−ＡＭ）で染色し、次に、３７℃で３０分間インキュベートした。細胞は、蛍光顕微鏡（Ｌａｂｏｐｈｏｔ ２；Ｎｉｋｏｎ、東京、日本）下で解析した。
【０１４９】
ヒト多発性骨髄腫Ｕ２６６細胞（１×１０６細胞／ｍｌ）は２４時間血清を枯渇され、次に、１ｎＭ ＴＮＦ、１ｎＭタキソール及び３００ｎＭドキソルビシン単独で、又は（０．５ｍｇ／ｍｌ）の本発明の組成物と共に、２４時間示されたようにインキュベートした。細胞死は、図１３に示されるように、カルセインＡＭベースの生／死アッセイによって測定した。赤色は、死細胞を強調し、緑色は生細胞を強調する。
【０１５０】
本発明の組成物は、ＴＮＦ及び化学療法剤のアポトーシス作用を促進する。ＮＦ−κＢ活性化は、種々の薬物によって誘導されるアポトーシスを阻害することが示されているので、本発明の組成物がＴＮＦ及び化学療法剤によって誘導されるアポトーシスを調節するかどうかを調べた。ＴＮＦ及び化学療法剤誘導のアポトーシスにおける本発明の組成物の効果は、生／死アッセイによって調べた。生／死アッセイは、細胞内エステラーゼ活性及び細胞膜の完全性を測定するものであり、本発明の組成物は、腫瘍細胞に対するＴＮＦ、タキソール、及びドキソルビシンのアポトーシス作用を増加することを示した。
【０１５１】
（実施例１０）
（ＮＦ−κＢ活性化の電気泳動移動度シフトアッセイ）
ＮＦ−κＢ活性化を測定するために、本出願人らは、基本的には、Ｃｈａｔｕｒｖｅｄｉ，Ｍ．Ｍ．，Ｍｕｋｈｏｐａｄｈｙａｙ，Ａ．ａｎｄ Ａｇｇａｒｗａｌ，Ｂ．Ｂ．（２０００）Ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｒｅｄｏｘ−ｓｅｎｓｔｉｔｉｖｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，３１９，５８５−６０２に以前に記載されるように、電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）を行った。簡単には、核抽出物は（１×１０６細胞／ｍｌ）は、ヒト免疫不全ウイルスの長い末端反復、５’−ＴＴＧＴＴＡＣＡＡ ＧＧＧＡＣＴＴＴＣ ＣＧＣＴＧ ＧＧＧＡＣＴＴＴＣ ＣＡＧＧＧＡＧＧＣＧＴＧＧ−３’（太字はＮＦ−κＢ結合部位を指す）由来の３２Ｐ末端標識した４５ｍｅｒの二本鎖ＮＦ−κＢオリゴヌクレオチド（１６ｆｍｏｌのＤＮＡと１５μｇのタンパク質）と共に、３０分間３７℃でインキュベートし、形成されたＤＮＡ−タンパク質複合体は、６．６％の非変性ポリアクリルアミドゲル上で遊離のオリゴヌクレオチドから分離した。二本鎖変異オリゴヌクレオチド、５’−ＴＴＧＴＴＡＣＡＡ ＣＴＣＡＣＴＴＴＣ ＣＧＣＴＧ ＣＴＣＡＣＴＴＴＣ ＣＡＧＧＧＡＧＧＣＧＴＧＧ−３’は、ＮＦ−κＢのＤＮＡへの結合の特異性を調べるために用いた。乾燥したゲルを視覚化し、放射性バンドは、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔソフトウェアプログラムを有するＳｔｏｒｍ ８２０ ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を用いて定量した。
【０１５２】
ＫＢＭ−５細胞（２×１０６細胞／ｍｌ）は、指定した濃度の本発明の組成物で１時間プレインキュベートし、０．１ｎＭ ＴＮＦで３０分間処理した。核抽出物は、図１４（Ａ）に示されるように、ＥＭＳＡによってＮＦ−κＢ活性化についてアッセイした。
【０１５３】
本発明の組成物は、用量及び時間依存的にＮＦ−κＢ活性化を抑制する。ＮＦ−κＢは、アポトーシス及び細胞浸潤において重要な役割を果たすので、本出願人らは、この転写因子の活性化における本発明の組成物の効果を調べた。本出願人らは、第一に、ヒト骨髄性白血病（ＫＢＭ−５）細胞においてＴＮＦによって誘導されるＮＦ−κＢの活性化に対する本発明の組成物の効果を調べた。ＤＮＡ結合アッセイ（ＥＭＳＡ）の結果は、本発明の組成物単独では、ＮＦ−κＢ活性化に効果がないことを示した。しかしながら、本発明の組成物は、図１４（Ａ）に示されるように、用量依存的にＴＮＦ媒介のＮＦ−κＢ活性化を阻害する。
【０１５４】
ＫＢＭ−５細胞（２×１０６細胞／ｍｌ）は、１ｍｇ／ｍｌの本発明の組成物と共に指定した時間プレインキュベートし、次に、０．１ｎＭ ＴＮＦで３０分間処理した。核抽出物は、図１４（Ｂ）に示されるように、ＥＭＳＡによってＮＦ−κＢ活性化についてアッセイした。本発明の組成物によるＮＦ−κＢ活性化の抑制はまた、時間依存的であることが分かった。
【０１５５】
本発明の組成物は、タバコの煙誘導のＮＦ−κＢ活性化を阻害する。Ｈ１２９９細胞は、本発明の組成物（１ｍｇ／ｍｌ）で１時間プレインキュベートし、次に、タバコの煙（１０μｇ／ｍｌ）で１時間処理した。核抽出物は、図１４（Ｃ）に示されるように、ＥＭＳＡによってＮＦ−κＢ活性化についてアッセイした。
【０１５６】
本発明の組成物は、タバコの煙の濃縮物によって誘導されるＮＦ−κＢ活性化をブロックする。本出願人らは、次に、非小肺腺癌Ｈ１２９９細胞におけるタバコの煙の濃縮物によって誘導されるＮＦ−κＢの活性化における本発明の組成物の効果を調べた。ＤＮＡ結合アッセイ（ＥＭＳＡ）の結果は、図１４（Ｃ）に示されるように、本発明の組成物が、タバコの煙の濃縮物によって誘導されるＮＦ−κＢ活性化を抑制することを示した。これらの結果は、本発明の組成物が、ＴＮＦ及びタバコの煙の濃縮物に共通するＮＦ−κＢ活性化経路の段階で作用したことを示唆する。
【０１５７】
（実施例１１）
（ＴＮＦ誘導の遺伝子発現のウェスタンブロット解析）
ＣＯＸ−２、ＶＥＧＦ、ＩＣＡＭ−１、ＭＭＰ−９、ｃＩＡＰ−１／２、サバイビン、Ｂｆｌ−１／Ａ１、Ｂｃｌ−２、ＢｃｌｘＬ、ｃＦＬＩＰ、ＴＲＡＦ１、及びＸＩＡＰの処理した細胞（２×１０６細胞／ｍｌ）の全細胞抽出物におけるＴＮＦに誘導された発現に対する本発明の組成物の効果を測定するために、３０μｇのタンパク質を、製造業者推薦のプロトコールの通り、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、特異的な抗体を用いたウェスタンブロットによって検出した。ブロットを洗浄し、ＨＲＰ結合の二次抗体に１時間暴露し、最後に、ＥＣＬ試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）によって検出した。
【０１５８】
本発明の組成物は、腫瘍細胞の増殖及び転移に関与するＴＮＦ誘導によるＮＦ−κＢ依存の遺伝子産物を阻害する。本出願人らはまた、本発明の組成物が腫瘍細胞の増殖及び転移に関与するＮＦ−κＢ依存の遺伝子産物を調節することができるかどうかを調べた。ＴＮＦはＣＯＸ−２、ＭＭＰ−９、ＩＣＡＭ−１、及びＶＥＧＦを誘導することが示されており、これら全てはそれらのプロモーター中にＮＦ−κＢ結合部位を有する。図１５（Ａ）に示されるように、ＴＮＦ処理は、ＣＯＸ−２、ＶＥＧＦ、ＩＣＡＭ−１及びＭＭＰ−９遺伝子産物の発現を誘導し、本発明の組成物はその発現を制止した。
【０１５９】
ＫＢＭ−５細胞（２×１０６細胞／ｍｌ）は、１ｍｇ／ｍｌの本発明の組成物で１時間インキュベートし、次に、１ｎＭ ＴＮＦで指定した時間処理した。全細胞抽出物を調製し、図１５（Ｂ）に示されるように、指定した抗体を用いてウェスタンブロット解析に供した。
【０１６０】
本発明の組成物は、ＴＮＦ誘導によるＮＦ−κＢ依存の抗アポトーシス遺伝子産物を阻害する。ＮＦ−κＢは、抗アポトーシスタンパク質であるＩＡＰ１、ＩＡＰ２、サバイビン、Ｂｆｌ−１／Ａ１、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ＸＬ、ｃＦＬＩＰ、ＴＲＡＦ１、及びＸＩＡＰの発現をアップレギュレートする。次に、本出願人らは、本発明の組成物が、これらの遺伝子産物の発現に影響するかどうかを調べた。本出願人らは、本発明の組成物が、図１５（Ｂ）に示されるように、これら全てのタンパク質のＴＮＦ誘導並びに基礎的発現を阻害することを見出した。
【０１６１】
（実施例１２）
（本発明の組成物によって媒介されるＰＣ３細胞のＧ２／Ｍ停止の証拠）
図１６に示されるように、本発明の組成物を用いたＰＣ３細胞の処理は、細胞周期の濃度依存的な阻害を生じる。ハーブ生成物は、０．２８μｌ／ｍｌという低い濃度でさえ明白である細胞の明らかなＧ２／Ｍ蓄積を生じる。より高い濃度では、Ｇ２／Ｍ期は、サブＧ０ピークがアポトーシスを示すので、より明白である。Ｇ２／Ｍにおける細胞数の上昇と一致して、細胞周期のＧ１部分に連続的で濃度依存的な細胞の減少が存在する。対照細胞の１０％だけが、通常、Ｇ２／Ｍ期に存在するが、０．５７μｌ／ｍｌの本発明の組成物を用いた処理によって、４０％を超える細胞がＧ２／Ｍブロックに存在する結果となる。
【０１６２】
図１６Ａに示されるように、上段左のプロットは、ＰＣ３細胞の正常な細胞周期分布を示す。細胞のＧ２／Ｍパーセントは少なく、図の右の小さな（小さな濃い影のピークである。第２のプロット（上段右）では、ＰＣ３細胞は、本発明の組成物０．２８μｌ／ｍｌ組織培養液で処理した。Ｇ２／Ｍピークのサイズが増大する。下段左（本発明の組成物０．５７μｌ／ｍｌ）及び下段右（１．１４μｌ／ｍｌ）のプロットは、本発明の組成物の濃度増加により細胞周期ブロックが増加することを示す。
【０１６３】
図１６Ｂに示されるように、図１６Ａのフローサイトメトリー解析のデータは、図１６Ｂにおいてヒストグラムで再度プロットされる。この図に見られるように、細胞周期のＧ２／Ｍ期での細胞パーセントの明らかな濃度依存的増加があり、一方、これは、細胞周期のＧ１期の細胞における関連した減少である。
【０１６４】
（実施例１３）
（本発明の組成物によって媒介されるアポトーシスのフローサイトメトリー解析）
図１７に示されるように、ほんの低レベルのＧ２／Ｍブロックを生じた本発明の組成物の濃度は、アネキシンＶ及びホスファチジルイノシトール（ＰＩ）による細胞染色によって明らかにされるように、初期のアポトーシスの誘導と関連することが分かった。調べた最低濃度０．２８μｌ／ｍｌでさえ、反転した膜ホスファチジルセリンへのアネキシンＶの結合の明らかな証拠が、本発明の組成物で処理したＰＣ３細胞のフローサイトメトリーによって明らかである。マルチハーブを介したアポトーシス発生の更なる証拠は、細胞膜完全性の破損に続く細胞死の後期段階における核酸に結合したヨウ化プロピジウムの濃度応答にある。
【０１６５】
図１７Ａに示されるように、ＰＣ３細胞は、指定濃度で本発明の組成物を用いて２４時間処理した。次に、細胞をアネキシンＶ及びＰＩ溶液で染色した。フローサイトメトリー分析（ＦＡＣＳ）によってアポトーシスを測定した。０．２８μｌ／ｍｌの低濃度でさえ、初期のアポトーシスの明らかな兆候がある。過剰の１．１μｌ／ｍｌの濃度では、大部分の細胞は死滅し、後期アポトーシス（細胞死）段階であるようである。
【０１６６】
図１７Ｂに示されるように、本発明の組成物で処理したＰＣ３細胞のフローサイトメトリー分析データ（図１７Ａ）は、図１７Ｂのヒストグラムで示される。初期のアポトーシスの特質である細胞膜改変を示すＰＩ染色において明らかな濃度依存的な増加がある。本発明の組成物の最低濃度でさえ、アネキシンＶ染色は、アポトーシスに関連したＤＮＡ染色を示す。アネキシンＶで染色された細胞のパーセントは、細胞死のために本発明の組成物の濃度増加と共に減少する。
【０１６７】
（実施例１４）
（本発明の組成物によって媒介されるエイコサノイド代謝における変化）
図１８Ａ−１８Ｄに示されるように、クローニングされたヒトＣＯＸ−１、ＣＯＸ−２及び５−ＬＯＸ酵素の処理は、それぞれ、エイコサノイド生成物、ＰＧＥ２及び５−ＨＥＴＥの形成の濃度依存的な阻害を生じ、５−ＬＯＸの形成は、ＣＯＸ−１又はＣＯＸ−２のいずれかよりも強力に阻害した（データ示さず）。次に、本発明の組成物とのインキュベーションによるエイコサノイド代謝における細胞内変化を調べた。図１８（Ａ）−（Ｄ）に見られるように、本発明の組成物を用いたＰＣ３細胞の処理は、ＰＧＥ２（図１８Ａ）及び５−ＨＥＴＥ（図１８Ｂ）の形成を減少させた。しかしながら、恐らく１２−ＬＯＸ活性の阻害に起因する１２−ＨＥＴＥレベルの細胞内の減少は、より目覚しかった。０．２５μｌ／ｍｉｎという低い本発明の組成物の濃度は、未処理の対照細胞と比較して、１２−ＨＥＴＥレベルの有意な減少を生じた。調べた最も高い濃度（１μｌ／ｍｌ）の本発明の組成物は、ＰＣ３細胞内で１２−ＨＥＴＥレベルのおよそ８０％の減少をもたらした（図１８Ｃ）。
【０１６８】
本発明の組成物によるＰＣ３細胞の処理はまた、ウェスタンブロット分析によって証明されるように、５−ＬＯＸタンパク質の細胞内含量を明確に減少させた（図１８Ｄ）。１２−ＬＯＸタンパク質含量の減少はまた、０．２５μｌ／ｍｌよりも高い本発明の組成物の濃度で示された。より高レベルの本発明の組成物を用いたＰＣ３細胞のインキュベーションによるＣＯＸ−２タンパク質の増加は、セレコキシブなどの他の抗炎症剤を用いた細胞の処理による、この酵素の上昇を想起させる。
【０１６９】
表５のデータは、本発明の組成物又はスクテラリア（Ｓｃｕｔｅｌｌａｒｉａ）の成分であるバイカレインのいずれかの非毒性な濃度での処理後、ＰＣ３細胞溶解物のリン酸化タンパク質分析から得られた。タンパク質をゲル電気泳動を用いて分離し、次に、ゲルをタンパク質に対するモノクローナル抗体で検出した。抗体は、タンパク質のリン酸化状態の差異を検出することができた。次に、ゲルを、濃度計を用いて定量した。相対的な変化（有意であるが）だけが、上記の表において示されている。細胞周期ブロックに関与するタンパク質（例えば、サイクリンＤ１、サイクリンＤ３及びｐＲＢ）、又はアポトーシスに関連したタンパク質（例えば、サバイビン、Ｂｃｌ−ＸＬ、及びＢｃｌ−２）の類似したアップレギュレーション又はダウンレギュレーションのシグナルを伝えるリン酸化状態の変化において多くの類似性がある。本発明の組成物及びバイカレインはまた、１２−ＬＯＸ活性を阻害する。しかしながら、本発明の組成物又はバイカレインのいずれかでの処理後、これらの重要なタンパク質のリン酸化状態における変化の全部が同一であるわけではなく、本発明の組成物の作用機構が複雑であり、バイカレイン単独の含有量によらないことを示唆している。
【０１７０】
【表５】
【０１７１】
（実施例１５）
（本発明の組成物によって媒介されるＲｂタンパク質のリン酸化の減少）
図１９Ａに示されるように、Ｒｂのリン酸化は濃度依存的に阻害される。０．２５μｌ／ｍｌという低い濃度は、対照と比較してｐＲｂを有意に減少させ、Ｒｂの量は、ｐＲｂが減少するにつれて増加した。本発明の組成物の複数の濃度で起こったＲｂタンパク質のリン酸化の減少はまた、Ｇ２／Ｍ細胞周期ブロック及び初期のアポトーシスに関連した。ウェスタンブロットデータの定量は、図１９Ｂに示される。
【０１７２】
リン酸化されていない（Ｒｂ）及びリン酸化された（ｐＲｂ）などの網膜芽細胞腫のウェスタンブロットが、図１９Ａに示されている。下段のバンド（β−アクチン）は、充填対照としてのみ示される。データは、２４時間、示された濃度の本発明の組成物で処理されたＰＣ３細胞から導かれる。次に、細胞を可溶化し、ゲル上でタンパク質を分離した。Ｒｂ及びｐＲｂタンパク質の存在は、特異的なモノクローナル抗体を用いて測定した。バンド密度の定量を可能にする測光スキャニング装置でゲルをスキャンした後のデータも下段の図に示す。データは、本発明の組成物の０．２５μｌ／ｍｌの濃度でさえ、ｐＲｂ（リン酸化された形態）を明らかに抑制し、Ｒｂ（リン酸化されていない形態）を増加することを示す。
【０１７３】
２μｌ／ｍｌの濃度の本発明の組成物を用いてＰＣ３細胞を２４時間インキュベーションした結果、Ｒｂリン酸化の減少が、Ｔ３５６（対照と比較して５９％減少）、Ｓ８０７（６２％↓）、Ｔ８２１（６２％↓）及びＴ８２６（７９％↓；他はデータを示さない）を含む複数のアミノ酸部位で起った。
【０１７４】
【表６】
【０１７５】
ａ省略形は下記の通りである：ＰＣ３、アンドロゲン非感受性ヒト前立腺癌；Ｒｂ、網膜芽細胞腫タンパク質；ＳＴＡＴ１、シグナル伝達性転写因子１（ｓｉｇｎａｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ ａｎｄ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ １）；Ｆｏｓ、Ｆｏｓ−ｃ ＦＢＪマウス骨肉腫癌タンパク質関連転写因子；ＨｓｐＢ１、熱ショック２７ｋＤａタンパク質；ｐ２１、ｐ２１活性化タンパク質セリンキナーゼ。
【０１７６】
（実施例１６）
（本発明の組成物によるＰＣ３増殖の阻害をブロックする１２−ＨＥＴＥの能力）
図２０Ａ−２０Ｃに示されるように、成長阻害濃度の本発明の組成物で処理したＰＣ３細胞へのＰＧＥ２又は５−ＨＥＴＥの添加は、細胞増殖をブロックしなかった。対照的に、図２０Ａは、本発明の組成物（１μｌ／ｍｌ；アポトーシス及びＧ２／Ｍ停止の強力な誘導を生じる濃度）で処理した細胞へ添加した１２−ＨＥＴＥは、結果として、対照である未処理の細胞レベルまで戻ることはないが、細胞増殖をほぼ２倍にしたことを示す。
【０１７７】
１２−ＨＥＴＥ（１２−Ｈと表す）の添加はまた、結果として、ＰＣ３細胞におけるＲＢタンパク質のリン酸化状態を逆転させる本発明の組成物の能力をブロックした（図２０Ｂ）；ＰＧＥ２及び５−ＨＥＴＥはいずれもｐＲｂ状態を変更する本発明の組成物の能力にいなかる効果もなかった。最後に、ＰＣ３細胞に添加した１２−ＨＥＴＥはまた、Ｇ２／Ｍブロックを媒介した本発明の組成物の部分的な逆転を提供し、本発明の組成物によって媒介されるＰＣ３細胞増殖の阻害におけるこの特別なエイコサノイドの重要性を指摘する。
【０１７８】
したがって、図２０Ａに示されるように、「添加−逆転」実験において、ＰＣ３細胞は、指示した濃度の本発明の組成物で処理され、結果として、細胞増殖は濃度依存的に阻害された（相対的な蛍光は細胞数を示す）。１２−ＨＥＴＥ、すなわち１２−リポキシゲナーゼの添加は、ＰＣ３細胞増殖において中程度の増殖をもたらした。しかしながら、本発明の組成物で処理した細胞への１２−ＨＥＴＥの添加は、本発明の組成物によって媒介された腫瘍細胞増殖阻害を大いにブロックした。
【０１７９】
図２０Ｂに示されるように、本発明の組成物は、ｐＲｂの発現を濃度依存的に減少させた。５−ＨＥＴＥ（５−Ｈ）又はＰＧＥ２のいずれの添加も、この効果をブロックしなかった。しかしながら、１２−ＬＯＸ生成物、１２−ＨＥＴＥの添加は、ｐＲｂ発現の産生を部分的に戻した。総合すれば、これらのデータは、本発明の組成物によって媒介された１２−ＬＯＸの阻害は、１２−ＨＥＴＥが抗増殖活性をブロックし、腫瘍抑制タンパク質Ｒｂの発現を回復させる本発明の組成物の能力をブロックすることができる点で重要であることを示す。
【０１８０】
（参考文献）
下記の参考文献は、関連する技術分野におけるその位置付けに照らして、本発明の対象の理解に有用であると考えられる。本明細書中での引用は、引用されたいずれかの参考文献が本発明の対象の特許性に関連するという主張及び承認として解釈されるべきではない。本出願人らは、情報開示陳述書における特許性に関連する情報を適切に開示している。各参考文献の内容は、本明細書中に全体として組み入れられる。
【０１８１】
１． Ｓｉｎｇｈ， Ｓ． ａｎｄ Ａｇｇａｒｗａｌ， Ｂ．Ｂ． （１９９５） Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ＮＦ−ｋａｐｐａ Ｂ ｉｓ ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｄ ｂｙ ｃｕｒｃｕｍｉｎ （ｄｉｆｅｒｕｌｏｙｌｍｅｔｈａｎｅ） ［ｃｏｒｒｅｃｔｅｄ］． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７０， ２４９９５− ２５０００．
２． Ａｇｇａｒｗａｌ， Ｓ．， ｌｃｈｉｋａｗａ， Ｈ．， Ｔａｋａｄａ， Ｙ．， Ｓａｎｄｕｒ， Ｓ．Ｋ．， Ｓｈｉｓｈｏｄｉａ， Ｓ． ａｎｄ Ａｇｇａｒｗａｌ， Ｂ．Ｂ． （２００６） Ｃｕｒｃｕｍｉｎ （ｄｉｆｅｒｕｌｏｙｌｍｅｔｈａｎｅ） ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｎｔｉａｐｏｐｔｏｔｉｃ ａｎｄ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｇｅｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｉ ｋａｐｐａ Ｂ ａｌｐｈａ ｋｉｎａｓｅ ａｎｄ Ａｋｔ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ． ＭｏＩ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．， ６９， １９５− ２０６．
３． Ｐｌｕｍｍｅｒ， Ｓ．Ｍ．， Ｈｏｌｌｏｗａｙ， Ｋ．Ａ．， Ｍａｎｓｏｎ， Ｍ．Ｍ．， Ｍｕｎｋｓ， Ｒ．Ｊ．， Ｋａｐｔｅｉｎ， Ａ．， Ｆａｒｒｏｗ， Ｓ． ａｎｄ Ｈｏｗｅｌｌｓ， Ｌ． （１９９９） Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ ２ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｃｏｌｏｎ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｔｈｅ ｃｈｅｍｏｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅ ａｇｅｎｔ ｃｕｒｃｕｍｉｎ ｉｎｖｏｌｖｅｓ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ＮＦ ｋａｐｐａ Ｂ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｖｉａ ｔｈｅ ＮＩＫ／ＩＫＫ ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ ｃｏｍｐｌｅｘ． Ｏｎｃｏｇｅｎｅ， １８， ６０１３−６０２０．
４． Ｐａｓｃｈｋａ， Ａ．Ｇ．， Ｂｕｔｌｅｒ， Ｒ． ａｎｄ Ｙｏｕｎｇ， Ｃ．Ｙ． （１９９８） Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ｂｙ ｔｈｅ ｇｒｅｅｎ ｔｅａ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ， （−）−ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ−３−ｇａｌｌａｔｅ． Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ， １３０， １−７．
５． Ｋｉｍ， Ｄ．Ｓ．， Ｋｉｍ， Ｈ．Ｒ．， Ｗｏｏ， Ｅ．Ｒ．， Ｈｏｎｇ， Ｓ．Ｔ．， Ｃｈａｅ， Ｈ．Ｊ． ａｎｄ Ｃｈａｅ， Ｓ．Ｗ． （２００５） Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｒｏｓｍａｒｉｎｉｃ ａｃｉｄ ｏｎ ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ Ｈ９ｃ２ ｃａｒｄｉａｃ ｍｕｓｃｌｅ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ ｒｅａｃｔｉｖｅ ｏｘｙｇｅｎ ｓｐｅｃｉｅｓ ａｎｄ ｔｈｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｃ−Ｊｕｎ Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｋｉｎａｓｅ ａｎｄ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｉｇｎａｌ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｋｉｎａｓｅ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．， ７０， １０６６−１０７８．
６． Ｈｕａｎｇ， Ｓ．Ｓ． ａｎｄ Ｚｈｅｎｇ， Ｒ．Ｌ． （２００５） Ｒｏｓｍａｒｉｎｉｃ ａｃｉｄ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ ｉｔｓ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ａｃｔｉｏｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ． Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ．
７． Ｓｈｉｓｈｏｄｉａ， Ｓ．， Ｍａｊｕｍｄａｒ， Ｓ．， Ｂａｎｅｒｊｅｅ， Ｓ． ａｎｄ Ａｇｇａｒｗａｌ， Ｂ．Ｂ． （２００３） Ｕｒｓｏｌｉｃ ａｃｉｄ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ− ｋａｐｐａＢ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｉｃ ａｇｅｎｔｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｉ ｋａｐｐａ Ｂ ａｌｐｈａ ｋｉｎａｓｅ ａｎｄ ｐ６５ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ： ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ ２， ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ９， ａｎｄ ｃｙｃｌｉｎ Ｄｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ６３， ４３７５−４３８３．
８． Ｃｈｏｉ， Ｙ．Ｈ．， Ｂａｅｋ， Ｊ．Ｈ．， Ｙｏｏ， Ｍ．Ａ．， Ｃｈｕｎｇ， Ｈ．Ｙ．， Ｋｉｍ， Ｎ．Ｄ． ａｎｄ Ｋｉｍ， Ｋ．Ｗ． （２０００） Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｂｙ ｕｒｓｏｌｉｃ ａｃｉｄ ｔｈｒｏｕｇｈ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｓｐａｓｅｓ ａｎｄ ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｃ−ＩＡＰｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ． Ｉｎｔ． Ｊ． Ｏｎｃｏｌ．， １７， ５６５−５７１．
９． Ｋｉｍ， Ｓ．Ｏ．， Ｋｕｎｄｕ， Ｊ．Ｋ．， Ｓｈｉｎ， Ｙ．Ｋ．， Ｐａｒｋ， Ｊ．Ｈ．， Ｃｈｏ， Ｍ．Ｈ．， Ｋｉｍ， Ｔ．Ｙ． ａｎｄ Ｓｕｒｈ， Ｙ．Ｊ． （２００５） ［６］−Ｇｉｎｇｅｒｏｌ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ＣＯＸ−２ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｂｙ ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｔｈｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｐ３８ ＭＡＰ ｋｉｎａｓｅ ａｎｄ ＮＦ−ｋａｐｐａＢ ｉｎ ｐｈｏｒｂｏｌ ｅｓｔｅｒ−ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ ｍｏｕｓｅ ｓｋｉｎ． Ｏｎｃｏｇｅｎｅ， ２４， ２５５８−２５６７．
１０． Ａｔｓｕｍｉ， Ｔ．， Ｍｕｒａｋａｍｉ， Ｙ．， Ｓｈｉｂｕｙａ， Ｋ．， Ｔｏｎｏｓａｋｉ， Ｋ． ａｎｄ Ｆｕｊｉｓａｗａ， Ｓ． （２００５） Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ａｎｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ａｎｄ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ−２ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ， ｂｙ ｃｕｒｃｕｍｉｎ ａｎｄ ｉｔｓ ａｎａｌｏｇ， ａｌｐｈａ−ｄｉｉｓｏｅｕｇｅｎｏｌ． Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ２５， ４０２９−４０３６．
１１． Ｔｊｅｎｄｒａｐｕｔｒａ， Ｅ．， Ｔｒａｎ， Ｖ．Ｈ．， Ｌｉｕ−Ｂｒｅｎｎａｎ， Ｄ．， Ｒｏｕｆｏｇａｌｉｓ， Ｂ．Ｄ． ａｎｄ Ｄｕｋｅ， Ｃ．Ｃ． （２００１） Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｇｉｎｇｅｒ ｃｏｎｓｔｉｔｕｅｎｔｓ ａｎｄ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ａｎａｌｏｇｕｅｓ ｏｎ ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ−２ ｅｎｚｙｍｅ ｉｎ ｉｎｔａｃｔ ｃｅｌｌｓ． Ｂｉｏｏｒｇ． Ｃｈｅｍ．， ２９， １５６−１６３．
１２． Ｍａｎｎａ， Ｓ．Ｋ．， Ｍｕｋｈｏｐａｄｈｙａｙ， Ａ． ａｎｄ Ａｇｇａｒｗａｌ， Ｂ．Ｂ． （２０００） Ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ ＴＮＦ−ｉｎｄｕｃｅｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｕｃｌｅａｒ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒｓ ＮＦ−ｋａｐｐａ Ｂ， ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ−１， ａｎｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ： ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｒｏｌｅ ｏｆ ｒｅａｃｔｉｖｅ ｏｘｙｇｅｎ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｓ ａｎｄ ｌｉｐｉｄ ｐｅｒｏｘｉｄａｔｉｏｎ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １６４， ６５０９−６５１９．
１３． Ｆｕｋｕｄａ， Ｋ．， Ｈｉｂｉｙａ， Ｙ．， Ｍｕｔｏｈ， Ｍ．， Ｋｏｓｈｉｊｉ， Ｍ．， Ａｋａｏ， Ｓ． ａｎｄ Ｆｕｊｉｗａｒａ， Ｈ． （１９９９） Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｂｙ ｂｅｒｂｅｒｉｎｅ ｏｆ ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ−２ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃｏｌｏｎ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ． Ｊ． Ｅｔｈｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．， ６６， ２２７−２３３．
１４． ＫｅＩｍ， Ｍ．Ａ．， Ｎａｉｒ， Ｍ．Ｇ．， Ｓｔｒａｓｂｕｒｇ， Ｇ．Ｍ． ａｎｄ ＤｅＷｉｔｔ， Ｄ．Ｌ． （２０００） Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ａｎｄ ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｐｈｅｎｏｌｉｃ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｆｒｏｍ Ｏｃｉｍｕｍ ｓａｎｃｔｕｍ Ｌｉｎｎ． Ｐｈｙｔｏｍｅｄｉｃｉｎｅ， ７， ７−１３．
１５． Ｂｅｍｉｓ， Ｄ．Ｌ．， Ｃａｐｏｄｉｃｅ， Ｊ．Ｌ．， Ａｎａｓｔａｓｉａｄｉｓ， Ａ．Ｇ．， Ｋａｔｚ， Ａ．Ｅ． ａｎｄ Ｂｕｔｔｙａｎ， Ｒ． （２００５） Ｚｙｆｌａｍｅｎｄ， ａ ｕｎｉｑｕｅ ｈｅｒｂａｌ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｎｏｎｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ＣＯＸ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ａｃｔｉｖｉｔｙ， ｉｎｄｕｃｅｓ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｏｆ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ ｔｈａｔ ｌａｃｋ ＣＯＸ−２ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ． Ｎｕｔｒ． Ｃａｎｃｅｒ．， ５２， ２０２−２１２．
１６． Ａｇｇａｒｗａｌ， Ｂ．Ｂ． （２００４） Ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ−ｋａｐｐａＢ： ｔｈｅ ｅｎｅｍｙ ｗｉｔｈｉｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ， ６， ２０３−２０８．
１７． Ａｎｔｏ， Ｒ．Ｊ．， Ｍｕｋｈｏｐａｄｈｙａｙ， Ａ．， Ｓｈｉｓｈｏｄｉａ， Ｓ．， Ｇａｉｒｏｌａ， Ｃ．Ｇ． ａｎｄ Ａｇｇａｒｗａｌ， Ｂ．Ｂ． （２００２） Ｃｉｇａｒｅｔｔｅ ｓｍｏｋｅ ｃｏｎｄｅｎｓａｔｅ ａｃｔｉｖａｔｅｓ ｎｕｃｌｅａｒ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ−ｋａｐｐａＢ ｔｈｒｏｕｇｈ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ ＩｋａｐｐａＢ（ａｌｐｈａ） ： ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ−２． Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ， ２３， １５１１−１５１８．
１８． Ｂｈａｒｔｉ， Ａ．Ｃ， Ｔａｋａｄａ， Ｙ．， Ｓｈｉｓｈｏｄｉａ， Ｓ． ａｎｄ Ａｇｇａｒｗａｌ， Ｂ．Ｂ． （２００４） Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｔｈａｔ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ （ＮＦ）−ｋａｐｐａＢ ｌｉｇａｎｄ ｃａｎ ｓｕｐｐｒｅｓｓ ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｄｕｃｅ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ＮＦ−ｋａｐｐａＢｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｎｄ ＴＲＡＦ６−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７９， ６０６５−６０７６．
１９． Ｔａｋａｄａ， Ｙ．， Ｉｃｈｉｋａｗａ， Ｈ．， Ｂａｄｍａｅｖ， Ｖ． ａｎｄ Ａｇｇａｒｗａｌ， Ｂ．Ｂ． （２００６） Ａｃｅｔｙｌ−１１−ｋｅｔｏｂｅｔａ− ｂｏｓｗｅｌｌｉｃ ａｃｉｄ ｐｏｔｅｎｔｉａｔｅｓ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ， ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｉｎｖａｓｉｏｎ， ａｎｄ ａｂｏｌｉｓｈｅｓ ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔｏｇｅｎｅｓｉｓ ｂｙ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｎｇ ＮＦ−ｋａｐｐａＢ ａｎｄ ＮＦ−ｋａｐｐａＢ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １７６， ３１２７−３１４０．
２０． Ｃｈａｔｕｒｖｅｄｉ， Ｍ．Ｍ．， Ｍｕｋｈｏｐａｄｈｙａｙ， Ａ． ａｎｄ Ａｇｇａｒｗａｌ， Ｂ．Ｂ． （２０００） Ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｒｅｄｏｘ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．， ３１９， ５８５−６０２．
２１． Ａｂｕ−Ａｍｅｒ， Ｙ． ａｎｄ Ｔｏｎｄｒａｖｉ， Ｍ．Ｍ． （１９９７） ＮＦ−ｋａｐｐａＢ ａｎｄ ｂｏｎｅ： ｔｈｅ ｂｒｅａｋｉｎｇ ｐｏｉｎｔ． Ｎａｔ． Ｍｅｄ．， ３， １１８９−１１９０．
２２． Ｌｉｏｔｔａ， Ｌ．Ａ．， Ｔｈｏｒｇｅｉｒｓｓｏｎ， Ｕ．Ｐ． ａｎｄ Ｇａｒｂｉｓａ， Ｓ． （１９８２） Ｒｏｌｅ ｏｆ ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅｓ ｉｎ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌ ｉｎｖａｓｉｏｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ Ｒｅｖ．， １， ２７７−２８８．
２３． Ｖａｎ Ａｎｔｗｅｒｐ， Ｄ．Ｊ．， Ｍａｒｔｉｎ， Ｓ．Ｊ．， Ｋａｆｒｉ， Ｔ．， Ｇｒｅｅｎ， Ｄ．Ｒ． ａｎｄ Ｖｅｒｍａ， Ｉ．Ｍ． （１９９６） Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＴＮＦ−ａｌｐｈａ−ｉｎｄｕｃｅｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｂｙ ＮＦ−ｋａｐｐａＢ． Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２７４， ７８７− ７８９．
２４． Ｗａｎｇ， Ｃ．Ｙ．， Ｍａｙｏ， Ｍ．Ｗ． ａｎｄ Ｂａｌｄｗｉｎ， Ａ．Ｓ．， Ｊｒ． （１９９６） ＴＮＦ− ａｎｄ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙｉｎｄｕｃｅｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ： ｐｏｔｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｂｙ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ＮＦ−ｋａｐｐａＢ． Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２７４， ７８４−７８７．
２５． Ｙａｍａｍｏｔｏ， Ｋ．， Ａｒａｋａｗａ， Ｔ．， Ｕｅｄａ， Ｎ． ａｎｄ Ｙａｍａｍｏｔｏ， Ｓ． （１９９５） Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｒｏｌｅｓ ｏｆ ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ ｋａｐｐａ Ｂ ａｎｄ ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ−ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６ ｉｎ ｔｈｅ ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ ａｌｐｈａ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ−２ ｉｎ ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１ ｃｅｌｌｓ． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７０， ３１３１５−３１３２０．
２６． Ｅｓｔｅｖｅ， Ｐ．Ｏ．， Ｃｈｉｃｏｉｎｅ， Ｅ．， Ｒｏｂｌｅｄｏ， Ｏ．， Ａｏｕｄｊｉｔ， Ｆ．， Ｄｅｓｃｏｔｅａｕｘ， Ａ．， Ｐｏｔｗｏｒｏｗｓｋｉ， Ｅ．Ｆ． ａｎｄ Ｓｔ−Ｐｉｅｒｒｅ， Ｙ． （２００２） Ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ｃ−ｚｅｔａ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−９ ｇｅｎｅ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ＩＬ−１ ａｎｄ ＴＮＦ−ａｌｐｈａ ｉｎ ｇｌｉｏｍａ ｃｅｌｌｓ ｖｉａ ＮＦ−ｋａｐｐａ Ｂ． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７７， ３５１５０−３５１５５．
２７． ｖａｎ ｄｅ Ｓｔｏｌｐｅ， Ａ．， Ｃａｌｄｅｎｈｏｖｅｎ， Ｅ．， Ｓｔａｄｅ， Ｂ．Ｇ．， Ｋｏｅｎｄｅｒｍａｎ， Ｌ．， Ｒａａｉｊｍａｋｅｒｓ， Ｊ．Ａ．， Ｊｏｈｎｓｏｎ， Ｊ．Ｐ． ａｎｄ ｖａｎ ｄｅｒ Ｓａａｇ， Ｐ．Ｔ． （１９９４） １２−Ｏ−ｔｅｔｒａｄｅｃａｎｏｙｌｐｈｏｒｂｏｌ−１３−ａｃｅｔａｔｅ ａｎｄ ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ ａｌｐｈａ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ−１ ｉｓ ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ ｂｙ ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ． Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ−１ ｐｒｏｍｏｔｅｒ． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２６９， ６１８５− ６１９２．
２８． Ｚｈｕ， Ｌ．， Ｆｕｋｕｄａ， Ｓ．， Ｃｏｒｄｉｓ， Ｇ．， Ｄａｓ， Ｄ．Ｋ． ａｎｄ Ｍａｕｌｉｋ， Ｎ． （２００１） Ａｎｔｉ−ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｕｒｖｉｖｉｎ ｐｌａｙｓ ａ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｒｏｌｅ ｉｎ ｔｕｂｕｌａｒ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｃｏｒｏｎａｒｙ ａｒｔｅｒｉｏｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｈｙｐｏｘｉｃ ｐｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ． ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．， ５０８， ３６９−３７４．
２９． Ｃｈｕ， Ｚ．Ｌ．， ＭｃＫｉｎｓｅｙ， Ｔ．Ａ．， Ｌｉｕ， Ｌ．， Ｇｅｎｔｒｙ， Ｊ．Ｊ．， Ｍａｌｉｍ， Ｍ．Ｈ． ａｎｄ Ｂａｌｌａｒｄ， Ｄ．Ｗ． （１９９７） Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ｂｙ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ Ｃ−ＩＡＰ２ ｉｓ ｕｎｄｅｒ ＮＦ−ｋａｐｐａＢ ｃｏｎｔｒｏｌ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ Ｓ Ａ．， ９４， １００５７−１００６２．
３０． Ｙｏｕ， Ｍ．， Ｋｕ， Ｐ．Ｔ．， Ｈｒｄｌｉｃｋｏｖａ， Ｒ． ａｎｄ Ｂｏｓｅ， Ｈ．Ｒ．， Ｊｒ． （１９９７） ｃｈ−ＩＡＰｌ／， ａ ｍｅｍｂｅｒ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−ｏｆ−ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆａｍｉｌｙ， ｉｓ ａ ｍｅｄｉａｔｏｒ ｏｆ ｔｈｅ ａｎｔｉａｐｏｐｔｏｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｖ−Ｒｅｌ ｏｎｃｏｐｒｏｔｅｉｎ． ＭｏＩ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．， １７， ７３２８−７３４１．
３１． Ｃａｔｚ， Ｓ．Ｄ． ａｎｄ Ｊｏｈｎｓｏｎ， Ｊ．Ｌ． （２００１） Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｃｌ−２ ｂｙ ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ ｋａｐｐａ Ｂ ａｎｄ ｉｔｓ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｉｎ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ． Ｏｎｃｏｇｅｎｅ， ２０， ７３４２−７３５１．
３２． Ｓｔｅｈｌｉｋ， Ｃ， ｄｅ Ｍａｒｔｉｎ， Ｒ．， Ｋｕｍａｂａｓｈｉｒｉ， Ｉ．， Ｓｃｈｍｉｄ， Ｊ．Ａ．， Ｂｉｎｄｅｒ， Ｂ．Ｒ． ａｎｄ Ｌｉｐｐ， Ｊ． （１９９８） Ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ （ＮＦ） −ｋａｐｐａＢ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ Ｘ−ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉａｐ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｃｔｓ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ ａｌｐｈａ−ｉｎｄｕｃｅｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ． Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．， １８８， ２１１−２１６．
３３． Ｔａｍａｔａｎｉ， Ｍ．， Ｃｈｅ， Ｙ．Ｈ．， Ｍａｔｓｕｚａｋｉ， Ｈ．， Ｏｇａｗａ， Ｓ．， Ｏｋａｄｏ， Ｈ．， Ｍｉｙａｋｅ， Ｓ．， Ｍｉｚｕｎｏ， Ｔ． ａｎｄ Ｔｏｈｙａｍａ， Ｍ． （１９９９） Ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ ｉｎｄｕｃｅｓ Ｂｃｌ−２ ａｎｄ Ｂｃｌｘ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｔｈｒｏｕｇｈ ＮＦｋａｐｐａＢ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｉｎ ｐｒｉｍａｒｙ ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ ｎｅｕｒｏｎｓ． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７４， ８５３１−８５３８．
３４． Ｓｃｈｗｅｎｚｅｒ， Ｒ．， Ｓｉｅｍｉｅｎｓｋｉ， Ｋ．， Ｌｉｐｔａｙ， Ｓ．， Ｓｃｈｕｂｅｒｔ， Ｇ．， Ｐｅｔｅｒｓ， Ｎ．， Ｓｃｈｅｕｒｉｃｈ， Ｐ．， Ｓｃｈｍｉｄ， Ｒ．Ｍ． ａｎｄ Ｗａｊａｎｔ， Ｈ． （１９９９） Ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ （ＴＮＦ） ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｆａｃｔｏｒ １ ｇｅｎｅ （ＴＲＡＦ１） ｉｓ ｕｐ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｂｙ ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ＴＮＦ ｌｉｇａｎｄ ｆａｍｉｌｙ ａｎｄ ｍｏｄｕｌａｔｅｓ ＴＮＦ−ｉｎｄｕｃｅｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ＮＦ−ｋａｐｐａＢ ａｎｄ ｃ− Ｊｕｎ Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｋｉｎａｓｅ． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７４， １９３６８−１９３７４．
３５． Ｋｒｅｕｚ， Ｓ．， Ｓｉｅｇｍｕｎｄ， Ｄ．， Ｓｃｈｅｕｒｉｃｈ， Ｐ． ａｎｄ Ｗａｊａｎｔ， Ｈ． （２００１） ＮＦ−ｋａｐｐａＢ ｉｎｄｕｃｅｒｓ ｕｐｒｅｇｕｌａｔｅ ｃＦＬＩＰ， ａ ｃｙｃｌｏｈｅｘｉｍｉｄｅ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ｄｅａｔｈ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ． Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．， ２１， ３９６４−３９７３．
３６． Ｓｈｉｓｈｏｄｉａ， Ｓ． ａｎｄ Ａｇｇａｒｗａｌ， Ｂ．Ｂ． （２００４） Ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ−ｋａｐｐａＢ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｍｅｄｉａｔｅｓ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ， ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ， ｉｎｖａｓｉｏｎ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ． Ｃａｎｃｅｒ Ｔｒｅａｔ Ｒｅｓ．， １１９， １３９−１７３．
３７． Ｔａｋａｄａ， Ｙ．， Ｓｉｎｇｈ， Ｓ． ａｎｄ Ａｇｇａｒｗａｌ， Ｂ．Ｂ． （２００４） Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｐ６５ ｐｅｐｔｉｄｅ ｔｈａｔ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ＮＦ−ｋａｐｐａ Ｂ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｖａｒｉｏｕｓ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｓｔｉｍｕｌｉ ａｎｄ ｉｔｓ ｒｏｌｅ ｉｎ ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＮＦ−ｋａｐｐａＢ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｕｐ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ， ２７９， １５０９６−１５１０４．
【０１８２】
本発明の対象はこのように記載され、その対象は、多数の方法で修飾又は変更してもよいことは明らかである。このような修飾及び変更は、本発明の対象の精神及び範囲からの逸脱であると見なされるべきではなく、このような全ての修飾及び変更は、上記の特許請求の範囲内に含まれることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【０１８３】
【図１】図１は、ヒトＡ５４９肺癌細胞株及びヒトＰＣ３前立腺癌細胞株の成長における本発明の対象の組成物の阻害効果を示すグラフである。
【図２】図２は、ＰＧＥ２の形成における本発明の組成物の効果を示すグラフである。
【図３】図３は、ＰＣ３細胞におけるＰＧＥ２及び５−ＨＥＴＥの形成における本発明の組成物の効果を示すグラフである。
【図４】図４は、ヒトＡ５４９肺癌細胞におけるエイコサノイド代謝に対する本発明の組成物の濃度依存的な効果を示すグラフである。
【図５】図５は、本発明の組成物中に１３−Ｓ−ＨＯＤＥが存在することを示す質量分析データを示す。
【図６】図６は、マウスの耳浮腫における本発明の化合物の抗炎症作用を示すグラフである。
【図７】図７は、種々の癌細胞株の増殖における１３−Ｓ−ＨＯＤＥの効果を示すグラフである。
【図８】図８は、ヒト乳癌ＭＣＦ７細胞株及びＭＤＡ２３１細胞株の成長における本発明の化合物の阻害効果を示すグラフである。
【図９】図９は、ヒト腫瘍細胞株（例えば、ＰＣ３）における５−リポキシゲナーゼの存在を濃度依存的にダウンレギュレートする本発明の組成物の能力を示すウェスタンブロットである。
【図１０】図１０は、アラキドン酸（ＡＡ）が媒介したマウスの耳浮腫における本発明の組成物の効果を示すグラフである。
【図１１Ａ】図１１（Ａ）は、単独で、又は０．８ｍｇ／ｍｌの本発明の組成物と共に５ｎＭ ＲＡＮＫＬの存在下で５日間インキュベーション後、ＴＲＡＰ陽性のＲＡＷ ２６４．７細胞を示す一連の写真である。
【図１１Ｂ】図１１（Ｂ）は、単独で、又は０．８ｍｇ／ｍｌの本発明の組成物と共に５ｎＭ ＲＡＮＫＬの存在下で５日間インキュベーション後、ＲＡＷ ２６４．７細胞においてカウントした多核化（３個の核）の破骨細胞の数を示すグラフである。
【図１２】図１２は、１％血清の存在下又は非存在下で０．３ｍｇ／ｍｌの本発明の組成物及び１ｎＭ ＴＮＦで２４時間、一晩の同時インキュベーション後、マトリゲル浸潤チャンバーの浸潤アッセイを示すグラフである。
【図１３】図１３は、１ｎＭ ＴＮＦ、１ｎＭタキソール、及び３００ｎＭドキソルビシンを単独で、又は０．５ｍｇ／ｍｌの本発明の組成物を併用してインキュベートしたヒト多発性骨髄腫Ｕ２６６細胞の細胞死をを示す一連の写真であり、本明細書中に記載されるカルセインＡＭベースの生／死アッセイによって測定した。赤色は死細胞を表し、緑色は生細胞を表している。
【図１４Ａ】図１４（Ａ）は、指定濃度の本発明の組成物と共にプレインキュベートし、０．１ｎＭ ＴＮＦで３０分間処理したＫＢＭ−５細胞のＮＦ−κＢ活性化を示す写真である。
【図１４Ｂ】図１４（Ｂ）は、１ｍｇ／ｍｌの本発明の組成物と共にプレインキュベートし、０．１ｎＭ ＴＮＦで３０分間処理したＫＢＭ−５細胞のＮＦ−κＢ活性化を示す写真である。
【図１４Ｃ】図１４（Ｃ）は、１ｍｇ／ｍｌの本発明の組成物と共にプレインキュベートし、タバコの煙（１０μｇ／ｍｌ）で１時間処理したＫＢＭ−５細胞のＮＦ−κＢ活性化を示す写真である。
【図１５Ａ】図１５（Ａ）は、１ｍｇ／ｍｌの本発明の組成物と共に１時間インキュベートし、１ｎＭ ＴＮＦで指定時間処理したＫＢＭ−５細胞の増殖性及び転移性タンパク質の発現を示す写真である。
【図１５Ｂ】図１５（Ｂ）は、１ｍｇ／ｍｌの本発明の組成物と共に１時間インキュベートし、１ｎＭ ＴＮＦで所定時間処理したＫＢＭ−５細胞の抗アポトーシスタンパク質の発現を示す写真である。
【図１６Ａ】図１６（Ａ）は、細胞周期の分布プロットを示す一連のグラフである。上段左のプロットは、ＰＣ３細胞の正常な細胞周期分布を示す。上段右のプロットでは、Ｇ２／Ｍピークの大きさが増している。下段左及び下段右のプロットは、本発明の組成物の濃度増加によって増している細胞周期のブロックを示す。
【図１６Ｂ】図１６（Ｂ）は、ヒストグラムとして、図１６（Ａ）のフローサイトメトリー分析に基づくデータを示すグラフである。
【図１７Ａ】図１７（Ａ）は、指定濃度の本発明の組成物で処理し、次に、アネキシンＶ及びＰＩ溶液で染色したＰＣ３細胞を示す一連のグラフである。
【図１７Ｂ】図１７（Ｂ）は、指定濃度の本発明の組成物で処理し、次に、アネキシンＶ及びＰＩ溶液で染色したＰＣ３細胞を示す一連のグラフである。
【図１７Ｃ】図１７（Ｃ）は、指定濃度の本発明の組成物で処理し、次に、アネキシンＶ及びＰＩ溶液で染色したＰＣ３細胞を示す一連のグラフである。
【図１７Ｄ】図１７（Ｄ）は、指定濃度の本発明の組成物で処理し、次に、アネキシンＶ及びＰＩ溶液で染色したＰＣ３細胞を示す一連のグラフである。
【図１７Ｅ】図１７（Ｅ）は、ヒストグラムとして、図１７のフローサイトメトリー分析に基づくデータを示すグラフである。
【図１８Ａ】図１８（Ａ）は、示した本発明の組成物の濃度に関するＰＧＥ２の形成を示すグラフである。
【図１８Ｂ】図１８（Ｂ）は、示した本発明の組成物の濃度に関する５−ＨＥＴＥの形成を示すグラフである。
【図１８Ｃ】図１８（Ｃ）は、示した本発明の組成物の濃度に関する１２−ＨＥＴＥの形成を示すグラフである。
【図１８Ｄ】図１８（Ｄ）は、本発明の組成物及び細胞含有量の５−ＬＯＸタンパク質を用いたＰＣ３細胞の処理を示すウェスタンブロットの写真である。
【図１９Ａ】図１９（Ａ）は、リン酸化されていない（Ｒｂ）タンパク質及びリン酸化された（ｐＲｂ）タンパク質として網膜芽腫タンパク質を示すウェスタンブロットの写真である。
【図１９Ｂ】図１９（Ｂ）は、バンド密度の定量を可能にする側光スキャニング装置でゲルをスキャン後の図１９（Ａ）のデータを示すグラフである。
【図２０Ａ】図２０（Ａ）は、指定濃度の本発明の組成物で処理したＰＣ３細胞及び細胞増殖の阻害を示すグラフである。
【図２０Ｂ】図２０（Ｂ）は、本発明の組成物によって引き起こされるｐＲｂの発現の濃度依存的な減少を示すウェスタンブロットの写真である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
エイコサノイド代謝プロセスの調節を必要とする動物の細胞におけるエイコサノイド代謝プロセスを調節する方法であって、エイコサノイドオキシゲナーゼの活性を制御するために有効量の組成物を前記動物に投与するステップを含み、
ここで、当該組成物が、ローズマリー、ウコン、オレガノ及びジンジャーの治療的に有効量の超臨界抽出物；並びに、ホーリーバジル、ジンジャー、ウコン、コガネバナ（Ｓｃｕｔｅｌｌａｒｉａ ｂａｉｃａｌｅｎｓｉｓ）、ローズマリー、グリーンティー、イタドリ（ｈｕｚｈａｎｇ）、黄蓮（Ｃｈｉｎｅｓｅ ｇｏｌｄｔｈｒｅａｄ）及びメギの治療的に有効量の含水アルコール抽出物を含む方法。
【請求項２】
前記細胞が癌細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記癌細胞が、前立腺癌細胞、乳癌細胞、肺癌細胞、結腸癌細胞、又はそれらの組合せを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記エイコサノイド代謝プロセスが、細胞の癌への形質転換、癌細胞増殖、癌細胞転移、癌細胞浸潤、癌細胞に調節された血管形成、癌細胞に調節されたアポトーシス抑制、又はそれらの組合せに関連した異常代謝である、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記エイコサノイドが、アラキドン酸及びリノリニックアシッド（ｌｉｎｏｌｉｎｉｃ ａｃｉｄ）からなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記エイコサノイドがアラキドン酸である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記エイコサノイドオキシゲナーゼが、シクロオキシゲナーゼ−１、シクロオキシゲナーゼ−２、５−リポキシゲナーゼ、１２−リポキシゲナーゼ、又はそれらの組合せである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記エイコサノイドオキシゲナーゼが１２−リポキシゲナーゼである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記エイコサノイドオキシゲナーゼが５−リポキシゲナーゼである、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記エイコサノイドオキシゲナーゼが、シクロオキシゲナーゼ−１、シクロオキシゲナーゼ−２、又はそれらの組合せである、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記エイコサノイドオキシゲナーゼがシクロオキシゲナーゼ−１である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記エイコサノイドオキシゲナーゼがシクロオキシゲナーゼ−２である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記エイコサノイドオキシゲナーゼ活性の制御が阻害である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記エイコサノイド代謝プロセスの調節が、動物の細胞におけるＮＦ−κＢ活性を阻害するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記動物がヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
１３−Ｓ−ＨＯＤＥの送達を必要とする動物に１３−Ｓ−ＨＯＤＥを送達する方法であって、ローズマリー、ウコン、オレガノ及びジンジャーの治療的に有効量の超臨界抽出物；並びに、ホーリーバジル、ジンジャー、ウコン、コガネバナ、ローズマリー、グリーンティー、イタドリ、黄蓮及びメギの治療的に有効量の含水アルコール抽出物を含む組成物を前記動物に投与するステップを含む方法。
【請求項１７】
前記動物がヒトである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
アラキドン酸が媒介した炎症の阻害を必要とする動物におけるアラキドン酸が媒介した炎症を阻害する方法であって、ローズマリー、ウコン、オレガノ及びジンジャーの治療的に有効量の超臨界抽出物；並びに、ホーリーバジル、ジンジャー、ウコン、コガネバナ、ローズマリー、グリーンティー、イタドリ、黄蓮及びメギの治療的に有効量の含水アルコール抽出物を含む組成物を当該動物に投与するステップを含む方法。
【請求項１９】
前記動物がヒトである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ＮＦ−κＢ制御の遺伝子産物のレベルの調節を必要とする動物の細胞におけるＮＦ−κＢ制御の遺伝子産物のレベルを調節する方法であって、ローズマリー、ウコン、オレガノ及びジンジャーの治療的に有効量の超臨界抽出物；並びに、ホーリーバジル、ジンジャー、ウコン、コガネバナ、ローズマリー、グリーンティー、イタドリ、黄蓮及びメギの治療的に有効量の含水アルコール抽出物を含む組成物を前記動物に投与するステップを含む方法。
【請求項２１】
前記動物がヒトである、請求項２０に記載の方法。
【請求項１】
エイコサノイド代謝プロセスの調節を必要とする動物の細胞におけるエイコサノイド代謝プロセスを調節する方法であって、エイコサノイドオキシゲナーゼの活性を制御するために有効量の組成物を前記動物に投与するステップを含み、
ここで、当該組成物が、ローズマリー、ウコン、オレガノ及びジンジャーの治療的に有効量の超臨界抽出物；並びに、ホーリーバジル、ジンジャー、ウコン、コガネバナ（Ｓｃｕｔｅｌｌａｒｉａ ｂａｉｃａｌｅｎｓｉｓ）、ローズマリー、グリーンティー、イタドリ（ｈｕｚｈａｎｇ）、黄蓮（Ｃｈｉｎｅｓｅ ｇｏｌｄｔｈｒｅａｄ）及びメギの治療的に有効量の含水アルコール抽出物を含む方法。
【請求項２】
前記細胞が癌細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記癌細胞が、前立腺癌細胞、乳癌細胞、肺癌細胞、結腸癌細胞、又はそれらの組合せを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記エイコサノイド代謝プロセスが、細胞の癌への形質転換、癌細胞増殖、癌細胞転移、癌細胞浸潤、癌細胞に調節された血管形成、癌細胞に調節されたアポトーシス抑制、又はそれらの組合せに関連した異常代謝である、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記エイコサノイドが、アラキドン酸及びリノリニックアシッド（ｌｉｎｏｌｉｎｉｃ ａｃｉｄ）からなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記エイコサノイドがアラキドン酸である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記エイコサノイドオキシゲナーゼが、シクロオキシゲナーゼ−１、シクロオキシゲナーゼ−２、５−リポキシゲナーゼ、１２−リポキシゲナーゼ、又はそれらの組合せである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記エイコサノイドオキシゲナーゼが１２−リポキシゲナーゼである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記エイコサノイドオキシゲナーゼが５−リポキシゲナーゼである、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記エイコサノイドオキシゲナーゼが、シクロオキシゲナーゼ−１、シクロオキシゲナーゼ−２、又はそれらの組合せである、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記エイコサノイドオキシゲナーゼがシクロオキシゲナーゼ−１である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記エイコサノイドオキシゲナーゼがシクロオキシゲナーゼ−２である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記エイコサノイドオキシゲナーゼ活性の制御が阻害である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記エイコサノイド代謝プロセスの調節が、動物の細胞におけるＮＦ−κＢ活性を阻害するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記動物がヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
１３−Ｓ−ＨＯＤＥの送達を必要とする動物に１３−Ｓ−ＨＯＤＥを送達する方法であって、ローズマリー、ウコン、オレガノ及びジンジャーの治療的に有効量の超臨界抽出物；並びに、ホーリーバジル、ジンジャー、ウコン、コガネバナ、ローズマリー、グリーンティー、イタドリ、黄蓮及びメギの治療的に有効量の含水アルコール抽出物を含む組成物を前記動物に投与するステップを含む方法。
【請求項１７】
前記動物がヒトである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
アラキドン酸が媒介した炎症の阻害を必要とする動物におけるアラキドン酸が媒介した炎症を阻害する方法であって、ローズマリー、ウコン、オレガノ及びジンジャーの治療的に有効量の超臨界抽出物；並びに、ホーリーバジル、ジンジャー、ウコン、コガネバナ、ローズマリー、グリーンティー、イタドリ、黄蓮及びメギの治療的に有効量の含水アルコール抽出物を含む組成物を当該動物に投与するステップを含む方法。
【請求項１９】
前記動物がヒトである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ＮＦ−κＢ制御の遺伝子産物のレベルの調節を必要とする動物の細胞におけるＮＦ−κＢ制御の遺伝子産物のレベルを調節する方法であって、ローズマリー、ウコン、オレガノ及びジンジャーの治療的に有効量の超臨界抽出物；並びに、ホーリーバジル、ジンジャー、ウコン、コガネバナ、ローズマリー、グリーンティー、イタドリ、黄蓮及びメギの治療的に有効量の含水アルコール抽出物を含む組成物を前記動物に投与するステップを含む方法。
【請求項２１】
前記動物がヒトである、請求項２０に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１Ａ】
【図１１Ｂ】
【図１２】
【図１３】
【図１４Ａ】
【図１４Ｂ】
【図１４Ｃ】
【図１５Ａ】
【図１５Ｂ】
【図１６Ａ】
【図１６Ｂ】
【図１７Ａ】
【図１７Ｂ】
【図１７Ｃ】
【図１７Ｄ】
【図１７Ｅ】
【図１８Ａ】
【図１８Ｂ】
【図１８Ｃ】
【図１８Ｄ】
【図１９Ａ】
【図１９Ｂ】
【図２０Ａ】
【図２０Ｂ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１Ａ】
【図１１Ｂ】
【図１２】
【図１３】
【図１４Ａ】
【図１４Ｂ】
【図１４Ｃ】
【図１５Ａ】
【図１５Ｂ】
【図１６Ａ】
【図１６Ｂ】
【図１７Ａ】
【図１７Ｂ】
【図１７Ｃ】
【図１７Ｄ】
【図１７Ｅ】
【図１８Ａ】
【図１８Ｂ】
【図１８Ｃ】
【図１８Ｄ】
【図１９Ａ】
【図１９Ｂ】
【図２０Ａ】
【図２０Ｂ】
【公表番号】特表２００８−５４３８５２（Ｐ２００８−５４３８５２Ａ）
【公表日】平成２０年１２月４日（２００８．１２．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５１７０１２（Ｐ２００８−５１７０１２）
【出願日】平成１８年６月１４日（２００６．６．１４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０２２９６７
【国際公開番号】ＷＯ２００６／１３８２９６
【国際公開日】平成１８年１２月２８日（２００６．１２．２８）
【出願人】（５０６３８４２３５）ニュー チャプター，インコーポレイテッド (2)
【出願人】（５０７４１０１１３）ザ ユニヴァーシティー オブ テキサス エム．ディー． アンダーソン キャンサー センター (2)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年１２月４日（２００８．１２．４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年６月１４日（２００６．６．１４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０２２９６７
【国際公開番号】ＷＯ２００６／１３８２９６
【国際公開日】平成１８年１２月２８日（２００６．１２．２８）
【出願人】（５０６３８４２３５）ニュー チャプター，インコーポレイテッド (2)
【出願人】（５０７４１０１１３）ザ ユニヴァーシティー オブ テキサス エム．ディー． アンダーソン キャンサー センター (2)
【Ｆターム（参考）】
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