エポラクタエン誘導体及び血管新生促進組成物
【課題】 血管新生促進効果を効果的に発揮しうる化合物及び血管新生促進組成物を提供する。
【解決手段】 下記一般式（Ｉ）で表されるエポラクタエン誘導体及びこれを含む血管新生促進組成物。
【化１】
（式中、Ｒ1は、炭素数１〜５のアルキル基を表し、Ｒ2は置換又は未置換の飽和又は不飽和の炭素数１〜２０の炭化水素基を表す。）
【解決手段】 下記一般式（Ｉ）で表されるエポラクタエン誘導体及びこれを含む血管新生促進組成物。
【化１】
（式中、Ｒ1は、炭素数１〜５のアルキル基を表し、Ｒ2は置換又は未置換の飽和又は不飽和の炭素数１〜２０の炭化水素基を表す。）
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エポラクタエン誘導体及び血管新生促進組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
血管新生は、生体内において既存の血管から新しい血管が形成される現象であり、多くの病理的状態に関与している。このため、血管新生制御物質の種々の疾患治療への応用が模索されている。例えば、血管新生抑制物質であれば、癌、糖尿病性網膜症、慢性関節リウマチに対する有効な治療薬となる可能性があり、一方、血管新生促進物質であれば、虚血性疾患に対する有効な治療薬となる可能性がある。また血管は周囲の組織へ栄養素を供給する役割を果たすことから、移植片の生着に対する効果も期待できる。
この血管新生制御物質のうち、血管新生促進物質は、血管新生抑制物質ほど多くないものの、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、インターロイキン８（ＩＬ−８）等の増殖因子やサイトカインが知られている（例えば、非特許文献１）。
【０００３】
一方、天然型エポラクタンは、ペニシリウム属の１６８９−Ｐの培養上清から単離された脂質性化合物であり、細胞分化誘導作用、特に、神経細胞に対して優れた分化誘導作用を有する物質として見出され、抗腫瘍剤及び神経分化誘導剤として有用であることが知られている（特許文献１）。また、その後の研究によって、このエポラクタエンが、アポトーシス誘導能、神経突起伸長促進能、ＤＮＡポリメラーゼ及びＤＮＡトポイソメラーゼ活性阻害効果を有することがわかってきた（例えば、非特許文献２〜５）。
【特許文献１】特開平８−２６９０６１号公報
【非特許文献１】北徹他編、「血管研究の最前線２０００年」、実験医学増刊、2000, Vol.18(5), 羊土社
【非特許文献２】J Antibiot (Tokyo). 1995 Jul; Vol.48(7): pp.733-5.
【非特許文献３】J Med Chem. 1997 Feb 14; Vol.40(4): pp.391-4
【非特許文献４】Biochim Biophys Acta. 2002 Mar 15; Vol.1581(1-2): pp.1-10.
【非特許文献５】Biochem Biophys Res Commun. 2000 Jul 5; Vol.273(2): pp.784-8.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、血管新生促進作用が確認されているＶＥＧＦ等の増殖因子やＩＬ−８等のサイトカインはいずれも高分子のタンパク質であり、医薬として実用面から考えると効果的にその作用を発揮することが難しい場合がある。一方、非タンパク質として既知の血管新生促進物質には、トイコトリエンＣ４やプロスタグランジン等もあるが、いずれも生理活性物質であり、化合物としての安定性や溶解性の面で医薬としての利用において制御しにくい面がある。
従って、本発明の目的は、血管新生促進効果を効果的に発揮しうる新規化合物及び血管新生促進組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明のエポラクタエン誘導体は、下記一般式（Ｉ）で表される化合物である。
【０００６】
【化１】
【０００７】
（式中、Ｒ1は、炭素数１〜５のアルキル基を表し、Ｒ2は置換又は未置換の飽和又は不飽和の炭素数１〜２０の炭化水素基を表す。）
また本発明の血管新生促進組成物は、ペルオキシレドキシン活性化因子を含むものである。ここで、ペルオキシレドキシン活性化因子としては、上記一般式（Ｉ）で表されるエポラクタエン誘導体及びエポラクタエンであることが好ましい。
【０００８】
天然型エポラクタエンにはアポトーシス誘導作用があることは知られていた（Biochim Biophys Acta. 2002 Mar 15; Vol.1581(1-2): pp.1-10）が、この天然型エポラクタエン及びエポラクタエン誘導体に血管新生促進作用があることは本発明において見出された事項である。天然型エポラクタエン及びエポラクタエン誘導体は分子量も大きくなく、生体へ効果的に投与することができ、その生理活性効果を発揮することができる。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、血管新生促進効果を効果的に発揮しうる新規化合物及び血管新生促進組成物を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明のエポラクタエン誘導体は、下記一般式（Ｉ）で表されるものである。
【００１１】
【化２】
【００１２】
上記式中Ｒ1は、炭素数１〜５のアルキル基を表し、好ましくは炭素数１〜２であり、メチル基が最も好ましい。
式中Ｒ2は、置換又は未置換の飽和又は不飽和の炭素数１〜２０の炭化水素基を表す。またＲ2は、血管新生促進作用の観点から、好ましくは、式中Ｒ2が炭素数５〜２０の炭化水素基を有するものである。
また置換基を有する場合には、置換基は、炭素数１〜５のアルキル基、アシル基等を挙げることができ、メチル、エチル、アセトキシ等を挙げることができる。
このような化合物としては、下記の化合物を挙げることができる。
【００１３】
【化３】
【００１４】
一般式（Ｉ）で表されるエポラクタエン誘導体としては、下記式１ｂで表される化合物が特に好ましい。このエポラクタエン誘導体１ｂは、下記に示される天然型のエポラクタエンとは、ピロリジン環の３位に結合している置換基において相違している。
【００１５】
【化４】
【００１６】
【化５】
【００１７】
ここで本発明のエポラクタエン誘導体は、下記の合成ルートに従って、合成することができる。
【００１８】
【化６】
【００１９】
本発明に係る式（Ｉ）の化合物は、文献記載の方法（S. Kobayashi et al. Tetrahedron Letters, 40巻, 7367-7370 (1999), Tetrahedron Letters, 40巻, 7371-7374 (1999), Tetrahedron Symposia in Print, 59巻, 9743-9758 (2003). ）に準じて合成することができる。すなわち、上記に示すように、エポキシシリルラクトン１にフッ化テトラブチルアンモニウムの存在下、アルデヒド２と反応させて付加体３とする。アルコールを酸化して４とした後、アンモニアを作用させヒドロキシアミド体５とする。さらに、水酸基を酸化することにより、エポキシラクタム６を製造することができる。
【００２０】
上記一般式（Ｉ）のエポラクタエン誘導体及び天然型エポラクタエンは、ペルオキシレドキシンに結合し、ペルオキシレドキシンを活性化することができる。この結果、本発明の一般式（Ｉ）で表される化合物による血管新生促進作用が発揮される。
【００２１】
本発明の血管新生促進組成物は、ペルオキシレドキシン活性化因子を含むものである。ペルオキシレドキシン活性化因子により、細胞内過酸化水素量を上昇させることができ、これにより、血管新生を促進することができる。本発明は、特定のペルオキシレドキシン活性化因子が、細胞内２２ｋＤａ分子であるペルオキシレドキシン１に結合して活性化することによる細胞内過酸化水素量と密接に関連していることを見出したものである。
【００２２】
このようなペルオキシレドキシン活性化因子としては、上記一般式（Ｉ）で表されるエポラクタエン誘導体及び天然型エポラクタエンを好ましく挙げることができる。
上記ペルオキシレドキシン活性化因子としてのエポラクタエン及びエポラクタエン誘導体は、塩として投与してもよい。用いられる塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩等を挙げることができる。
【００２３】
血管新生促進組成物中のペルオキシレドキシン活性化因子の量は、剤型によって異なるが、組成物の総重量に対して、０．０００１重量％から１００重量％とすることができ、好ましくは０．０００１重量％から１０重量％、更に好ましくは０．００１から約０．１重量％とすることができる。また細胞に対して用いる場合には、細胞の状態によって異なるが、一般に、１０6個の細胞に対して、１μＭから５０μＭで用いることが好ましい。
【００２４】
血管新生促進組成物には、上記ペルオキシレドキシン活性化因子を有効成分とする以外に、薬理学的に許容可能な担体及び／又は添加剤を含むことができる。
このような薬理学的に許容可能な担体としては、この用途に一般に使用される各種有機あるいは無機担体物質が挙げられ、例えば固形製剤における賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤；液状製剤における溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤、無痛化剤等が挙げられる。また、必要に応じて、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤、吸着剤、湿潤剤等の添加物を用いることもできる。
【００２５】
このような添加剤としては、各剤形において一般に使用されているものをそのまま適用することができる。これらの具体的な成分は当業者であれば周知であり、当業者であれば、本組成物では特別な制限はないので周知の成分から適宜選択可能である。またこれらの他の成分の投与量も、当業者であれば適宜選択可能である。
【００２６】
例えば、本発明の血管新生促進組成物を経口投与する場合には、通常その組成物中に含有される結合剤、包含剤、賦形剤、崩壊剤等を含んだ錠剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、カプセル剤等、または内用水剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤等の何れの状態であってもよい。また、非経口投与の場合には、安定化剤、緩衝剤、保存剤、等張化剤等を含有し、通常単位投与量アンプル若しくは多投与量容器またはチューブの状態で投与用に提供される。
【００２７】
本発明の血管新生促進組成物を投与する方法としては、直接目的とする臓器、組織に投与する方法の他、経口または非経口で投与する方法も用いられる。経口投与には舌下投与も含まれる。非経口投与には注射、例えば、皮下、筋肉、静脈、動脈注射、点滴、坐剤、塗布剤、貼付剤、更にはエレクトロポレーション、イオントフォレシスなどが含まれる。
【００２８】
血管新生促進組成物の投与量は、患者の年齢、投与経路、投与回数により異なり、適宜変えることができる。この場合、有効量のペルオキシレドキシン活性化因子と、適切な希釈剤または薬理学的に使用し得る担体との組成物として投与されるが、ヒトを含む哺乳動物に投与する場合には、投与対象の種類、性別、体重、症状、年齢、投与経路及び投与形態によって異なるが、有効成分の量として、一般に体重ｋｇあたり１μｇ〜１０００ｍｇ、好ましくは１０μｇ〜１００ｍｇの範囲にすることができる。この投与量は、一日一回で投与してもよく、数回にわたって投与してもよい。
このとき、ペルオキシレドキシン活性化因子の濃度は、１μＭ以下、好ましくは０．０１μＭ〜１μＭとなるように調整することが好ましい。１μＭを超えると、有効成分としての投与量に対する効果が見込めなくなり、０．０１μＭ未満では血管新生促進作用が充分でない場合がある。
【００２９】
本発明のペルオキシレドキシン活性化因子により血管新生を促進させるには、血管内皮細胞に本発明の血管新生促進組成物を作用させればよい。
【００３０】
本発明の血管新生促進組成物は、血管新生促進作用を有するので、組織への栄養素の供給や、細胞の生着・増殖、組織又は臓器の移植、虚血生疾患の治療、壊死した細胞や組織並びにケガをした組織を対象とした回復促進、更には神経細胞・肝細胞・心房細胞等の維持が要求される用途に好ましく用いることができる。また、細胞・生体組織への生着・増殖のみならず、血管新生抑制物質のスクリーニングや、血管新生制御メカニズムの解析等の用途にも用いることができる。
【実施例】
【００３１】
以下に本発明の実施例について説明するが、これに限定されるものではない。また実施例中の％は、特に断らない限り、重量（質量）基準である。
【００３２】
［実施例１］
＜エポラクタエン誘導体の合成＞
本発明のエポラクタエン誘導体は、以下のようにして合成した（前述の合成経路を参照のこと）。
トラップ混合液（THF:hexane:ether=3:1:1, 23 ml）中のジイソプロピルアミン溶液（0.37 ml, 2.62 mmol) にｎ−ＢｕＬｉ（1.7 ml of a 1.53 M solution in hexane, 2.60 mmol) を０℃で２０分添加した。その後、トリメチルシリルクロリド（1.2 ml, 9.48 mmol)、β−アンジェリカラクトンエポキシド（β-angelica lactone epoxide ）（100.8 mg, 0.883 mmol) を添加して、−１１０℃で１０分間撹拌した。混合物を蒸留水でクエンチさせて酢酸エチルで抽出した。濃縮後、クロマトグラフ（４：１ hexane/EtOAc）で精製し、無色のエポキシシリルラクトン１（116.9 mg, 70%）を得た。
【００３３】
THF（5 ml）中、エポキシシリルラクトン１(55.1 mg, 0.296 mmol)、プロピオンアルデヒド（40 μl, 0.554 mmol）及びＭＳ４Ａ (0.21 g）の溶液をＴＢＡＦ（30 μl of
a 1M solution in THF, 30 μmol）に０℃で添加して、６時間撹拌後、Celiteを通して
精製し、酢酸エチルで洗浄した。有機相を回収して濃縮し、CH3CN (2 ml) に溶解させ、室温で３０分、CH3CN (1 ml)中の５％ＨＦ液に添加した。混合物を蒸留水でクエンチさせて、酢酸エチルで抽出した。抽出物をクロマトグラフ（4:1 hexane/EtOAc）にかけて無色の付加体３を得た（31.2 mg, 61%）。
【００３４】
CH2Cl2 （2 ml）中の付加体３の溶液（36.0 mg, 0.168 mmol）を Dess-Martin ペリオジナン（143 mg, 0.336 mmol）に室温で添加して、１時間撹拌した。次いで、混合物を酢酸エチルで希釈し、飽和Na2S2O3 で洗浄した。有機相を濃縮して、クロマトグラフ（4:1 hexane/EtOAc）で精製し、無色の化合物４を得た。
メタノール中で化合物４（15.7 mg, 0.074 mmol）の溶液とＮＨ3を３時間混合し、次いで溶媒を除去した後、クロマトグラフ（1:1 hexane/EtOAc）で精製して、白色固体のヒドロキシアミド体５を得た（14.6 mg, 86%）。CH2Cl2 (5 ml) 中のヒドロキシアミド体５（31.1 mg, 0.136 mmol) をDess-Martin ペリオジナン（115 mg, 0.272 mmol）に室温で添加して、１時間撹拌した。得られた混合物を酢酸エチルで希釈し、飽和Na2S2O3 、飽和NaHCO3及びH2O で洗浄した。有機相を濃縮し、クロマトグラフ（4:1 hexane/EtOAc）にかけて、およそ１．７：１の互換体混合物としてエポラクタエン誘導体を得た（27.1 mg, 88%）。
【００３５】
エポラクタエン誘導体１ｂ（(1R,5R)-1-Dodecanoyl-4-hydroxy-4-methyl-6-oxa-3-azabicyclo-[3.1.0]hexan-2-one ）は、およそ３．７：１の互換体混合物として調製され、収率８８％の無色のフォームであった。
[α]D22=−75.9 (c 0.12, MeOH); IR (CHCl3) 3455, 3020, 2927, 2856, 1743, 16
93, 1408, 1215, 1161, 1117, 1086, 949, 758, 667 cm-1; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 0.88 (3H, d, J=6.6 Hz, H-12'), 0.88* (3H, t, J=6.6 Hz, H-12'), 1.25-1.50 (18
H, m, H-3'- H-11'), 1.25-1.50* (6H, m, H-3'- H-11'), 1.58 (3H, s, 4-Me), 1.62* (3H, s, 4-Me), 2.19-2.30 (1H, m, H-2'), 2.19-2.30* (1H, m, H-2'), 2.42-2.61 (1H, m, H-2'), 2.42-2.61* (1H, m, H-2'), 3.18* (1H, brs, OH), 3.96* (1H, d, J=1.8 Hz, H-5), 4.24 (1H, d, J=1.8 Hz, H-5), 5.25 (1H, brs, OH), 6.79 (1H, brs, NH), 8.13 (1H, brs, NH); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ: 14.1, 21.3, 22.5, 22.6, 22.7, 24.1
, 29.0, 29.3, 29.3, 29.4, 29.4, 29.4, 29.6, 29.6, 29.6, 31.9, 38.1, 39.9, 61.2, 62.8, 63.9, 65.9, 82.8, 83.7, 166.8, 169.4, 199.7, 202.3 (diastereomeric mixture); HRMS, calcd for C17H29NO4 (M+) 311.2096, found 311.2108.
【００３６】
［実施例２］
＜漿尿膜報による血管新生促進作用＞
実施例１で得られたエポラクタエン誘導体１ｂの血管新生促進作用について、鶏胚漿尿膜法を用いて確認した。
鶏卵を３７℃でインキュベートし、培養４日目に卵白を除去して鶏卵上部に窓を開け、胚と卵殻膜を分離して仮気室を作成し、再び３７℃にてインキュベートした。培養１０日目に各濃度の１ｂを含んだメチルセルロースディスク又はＰＢＳを漿尿膜上に移植した。さらに３日間培養した後にディスク付近の血管網を実体顕微鏡により観察した。ディスクに向かって放射状に伸びる血管が観察されたものを陽性と判定した。結果を図１並びに図２Ａ及びＢに示す。
なお、図１において、横軸は１ｂの濃度、縦軸は、コントロールで確認された血管の合計の長さを１００としたときの割合をそれぞれ示し、グラフ内の数字は、アッセイまで生存した検体数を示す。
【００３７】
図１及び図２Ａに示されるように、１ｂを含んだディスクを移植した漿尿膜では、コントロールと比較して血管網が放射状にのびて、血管の長さが長くなっていることが確認された。このような血管の伸長は、用量依存的に増加しており、特に５０nmolの１ｂを用いたものでは１００％増となって、ほぼ２倍の長さになっていた。従って、１ｂには血管新生を促進することが明らかとなった。
【００３８】
［実施例３］
＜血管内皮細胞に対する増殖能＞
実施例１で得られたエポラクタエン誘導体１ｂの血管内皮細胞に対する増殖能を調べた。
正常ウシ大動脈血管内皮細胞は、ヒューマンサイエンス研究資源バンクより入手した。試験培地は１％ＦＢＳ（Sigma Aldrich社製）を含有するＭＥＭ培地とした。
細胞を９６ウェルプレートに１％ＰＢＳ中１．０×１０4個／ｍｌの濃度で播種し、細胞接着後に１ｂ含有試験培地に交換し、３７℃、５％ＣＯ2下で７日間培養した。培養後、培地を除去して０．１％グルタルアルデヒドで細胞を固定し、０．０２％クリスタルバイオレット溶液で染色、ＰＢＳ（−）で洗浄し、細胞を２％ＳＤＳで可溶化したのち、生存細胞数の指標としてマイクロプレートリーダーでＯＤ５７０の値を測定した。結果を図３に示す。
図３に示されるように、１ｂ含有試験培地による培養によって、血管内皮細胞の増殖が認められ、特に、０．１μＭで最も良好な増殖促進が認められた。
【００３９】
［実施例４］
＜血管内皮細胞の管腔形成能＞
次いで、実施例３で用いられた正常ウシ大動脈血管内皮細胞を用いて、エポラクタエン誘導体１ｂの管腔形成能について調べた。
４８ウェルプレートにマトリゲル溶液（マトリゲル（BD Bioscience-Discovery Labware社製）とＲＰＭＩ １６４０を１：１で混合したもの）１００μｌ／ｗｅｌｌになるように添加し、３７℃、５％ＣＯ2下で２時間インキュベートしてマトリゲルコートプレートを作製した。このプレートに、１％ＰＢＳ中１．０×１０4個の細胞／１００μＬ／ウェルを、１ｂ含有試験培地とともに播種した。３７℃、５％ＣＯ2下で培養８時間後、管腔網を顕微鏡観察して１ウェルあたり９視野を撮影し、管腔の長さを測定した。結果を図４に示す。
【００４０】
図４に示されるように、血管内皮細胞は、１ｂ及びコントロールの双方において管腔形成が認められたが、１ｂと共に培養した方が、１ｂの用量に依存して管腔形成現象の強い促進が認められた。特に、０．１μＭまで用量に依存して管腔が形成されており、０．１μＭ以下の範囲において特に良好な管腔形成能が確認できた。
【００４１】
［実施例５］
＜１ｂの細胞内標的分子の同定＞
エポラクタエン誘導体１ｂによる血管新生促進の作用機序を確認するために、ヒトＢ細胞白血病細胞株ＢＡＬＬ−１を用いて、１ｂの細胞内標的分子の同定を行った。
ヒトＢ細胞白血病細胞株ＢＡＬＬ−１は、理研細胞バンクより購入した。ＢＡＬＬ−１細胞は、カナマイシン硫酸塩（６５ｍｇ／Ｌ）、炭酸水素ナトリウム（２ｇ／Ｌ）、２−メルカプトエタノール（３．５μＬ／Ｌ）及び非動化１０％ＦＢＳ（ＷＡＫＯ社製）を含むＲＢＭＩ １６４０（ニッスイ社製）にて、３７℃５％ＣＯ2下で培養したものを使用した。
【００４２】
細胞を回収してＰＢＳ（−）で洗浄し、溶解バッファー液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０％グリセロール、１％トライトンＸ−１００、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＥＧＴＡ、１％プロテアーゼインヒビターカクテル）を用いて、常法により細胞溶解液を得た。この細胞溶解液にビオチン化１ｂを添加して一晩４℃でインキュベートし、溶解バッファー液で洗浄した後に、ストレプトアビジンアガロース（Amersham Biosciences社製）と共に２時間４℃でインキュベートした。
インキュベート後に、ローディングバッファー液（１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）０．７８ｍｌ、２０％ＳＤＳ ２．５ｍＬ、グリセロール１．４７ｍＬ、飽和ブロモフェノールブルー溶液上清０．７５ｍＬ、１０％２−メルカプトエタノール）を用いて常法により、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる解析を行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、４％濃縮ゲル、１２％分離ゲル、１００Ｖ１００分で実施した。結果を図５に示す。なお、図５中、レーン１は細胞溶解液＋ビオチン、レーン２は細胞溶解液＋ビオチン化１ｂ、レーン３は細胞溶解液＋溶媒（ＤＭＳＯ）のみ、レーン４はＢＡＬＬ−１細胞溶解液を示す。
【００４３】
図５に示されるように、ビオチン化１ｂと結合して共沈させたタンパク質として、細胞内分子３０ｋＤ及び２２ｋＤａのタンパク質分子が１ｂと結合することがわかった。
ビオチン化１ｂを用いて作成した泳動用サンプルから対応するバンドを切り出し、常法により、３０ｋＤａ及び２２ｋＤａのタンパク質分子を結晶化して、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供した。ペプチドマスフィンガープリンティング分析を行って、ペプチド断片の分子量を測定し、得られたペプチド断片の質量を用いて、Ｍａｓｃｏｔ（http://www.matrixscience.bom/dgi/serach＿form.pl?FORMVER=2&SEARCH=PMF）にてデータベース検索を行い、分子の同定を行った。
その結果、２２ｋＤａ分子はペルオキシレドキシン１（Peroxiredoxin1）、３０ｋＤａ分子はアデニンヌクレオチドトランスロケーター２として同定された。Peroxiredoxin 1はサイトソルに局在して細胞内Ｈ2Ｏ2を還元消去する抗酸化酵素であり、一方、adenine nucleotide translocator 2は、ミトコンドリアのpermeability transition（ＰＴ）poreを構成するタンパクの一種である。
また、前記と同様にしてゲルから２２ｋＤａ分子を切り出して、常法により、抗ヒトペルオキシレドキシン１抗体を用いてウェスタンブロットを行ったところ、２２ｋＤａ分子がペルオキシレドキシン１であることが確認できた（図６）。
【００４４】
［実施例６］
＜細胞内Ｈ2Ｏ2量に対する効果＞
ＢＡＬＬ−１細胞を２４ウェルプレートに２×１０5個／ｍＬで播種し、細胞内Ｈ2Ｏ2検出用蛍光プローブ（ＤＣＦＨ−ＤＡ）を１０μＭになるように添加して、３７℃１０分反応させた後、１ｂを各濃度となるように添加して３７℃で３０分反応させた。細胞を回収してＰＢＳ（−）で洗浄した後、ＦＡＣＳに供して細胞内Ｈ2Ｏ2量を測定した。
結果を図７に示す。
図７に示されるように、１ｂの添加により細胞内Ｈ2Ｏ2の量が上昇し、このような細胞内Ｈ2Ｏ2濃度の上昇は１ｂの濃度に依存しており、従って、１ｂにより細胞内過酸化水素が上昇することが明らかであった。
【００４５】
これらのことから、エポラクタエン誘導体１ｂには、顕著な血管新生促進作用が認められることが明らかとなった。このエポラクタエン誘導体がペルオキシレドキシンと結合することは明らかであり、ペルオキシレドキシンが活性化することで血管新生が促進された。またこのエポラクタエン誘導体１ｂは、他の生理活性物質と比較して低分子量であるため、医薬組成物として投与した場合には効果的にその作用を発揮できる。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】本発明の実施例にかかるエポラクタエン誘導体１ｂの鶏漿尿膜に対する血管新生促進作用を説明するグラフである。
【図２Ａ】本発明の実施例にかかるエポラクタエン誘導体１ｂによって血管新生が促進された漿尿膜の光学写真像である（２０倍）。
【図２Ｂ】比較例としての、鶏漿尿膜に対するＰＢＳの影響を示す漿尿膜の光学写真像である（２０倍）。
【図３】本発明の実施例にかかるエポラクタエン誘導体１ｂの正常ウシ大動脈血管内皮細胞に対する増殖能を示すグラフである。
【図４】本発明の実施例にかかるエポラクタエン誘導体１ｂの管腔形成能を説明するグラフである。
【図５】実施例にかかるビオチン化エポラクタエン誘導体１ｂを用いたヒトＢ細胞白血病細胞株ＢＡＬＬ−１の細胞溶解液のＳＤＳ−ＰＡＧＥ像である。
【図６】実施例にかかるビオチン化エポラクタエン誘導体１ｂを用いたヒトＢ細胞白血病細胞株ＢＡＬＬ−１の細胞溶解液のＳＤＳ−ＰＡＧＥ像（上）と、これに対応した抗ヒトペルオキシレドキシン抗体によるイムノブロット像（下）である。
【図７】実施例にかかるヒトＢ細胞白血病細胞株ＢＡＬＬ−１におけるエポラクタエン誘導体１ｂによる細胞内Ｈ2Ｏ2の量の変化を示すグラフ（Ａ）及びチャート（Ｂ）である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エポラクタエン誘導体及び血管新生促進組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
血管新生は、生体内において既存の血管から新しい血管が形成される現象であり、多くの病理的状態に関与している。このため、血管新生制御物質の種々の疾患治療への応用が模索されている。例えば、血管新生抑制物質であれば、癌、糖尿病性網膜症、慢性関節リウマチに対する有効な治療薬となる可能性があり、一方、血管新生促進物質であれば、虚血性疾患に対する有効な治療薬となる可能性がある。また血管は周囲の組織へ栄養素を供給する役割を果たすことから、移植片の生着に対する効果も期待できる。
この血管新生制御物質のうち、血管新生促進物質は、血管新生抑制物質ほど多くないものの、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、インターロイキン８（ＩＬ−８）等の増殖因子やサイトカインが知られている（例えば、非特許文献１）。
【０００３】
一方、天然型エポラクタンは、ペニシリウム属の１６８９−Ｐの培養上清から単離された脂質性化合物であり、細胞分化誘導作用、特に、神経細胞に対して優れた分化誘導作用を有する物質として見出され、抗腫瘍剤及び神経分化誘導剤として有用であることが知られている（特許文献１）。また、その後の研究によって、このエポラクタエンが、アポトーシス誘導能、神経突起伸長促進能、ＤＮＡポリメラーゼ及びＤＮＡトポイソメラーゼ活性阻害効果を有することがわかってきた（例えば、非特許文献２〜５）。
【特許文献１】特開平８−２６９０６１号公報
【非特許文献１】北徹他編、「血管研究の最前線２０００年」、実験医学増刊、2000, Vol.18(5), 羊土社
【非特許文献２】J Antibiot (Tokyo). 1995 Jul; Vol.48(7): pp.733-5.
【非特許文献３】J Med Chem. 1997 Feb 14; Vol.40(4): pp.391-4
【非特許文献４】Biochim Biophys Acta. 2002 Mar 15; Vol.1581(1-2): pp.1-10.
【非特許文献５】Biochem Biophys Res Commun. 2000 Jul 5; Vol.273(2): pp.784-8.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、血管新生促進作用が確認されているＶＥＧＦ等の増殖因子やＩＬ−８等のサイトカインはいずれも高分子のタンパク質であり、医薬として実用面から考えると効果的にその作用を発揮することが難しい場合がある。一方、非タンパク質として既知の血管新生促進物質には、トイコトリエンＣ４やプロスタグランジン等もあるが、いずれも生理活性物質であり、化合物としての安定性や溶解性の面で医薬としての利用において制御しにくい面がある。
従って、本発明の目的は、血管新生促進効果を効果的に発揮しうる新規化合物及び血管新生促進組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明のエポラクタエン誘導体は、下記一般式（Ｉ）で表される化合物である。
【０００６】
【化１】
【０００７】
（式中、Ｒ1は、炭素数１〜５のアルキル基を表し、Ｒ2は置換又は未置換の飽和又は不飽和の炭素数１〜２０の炭化水素基を表す。）
また本発明の血管新生促進組成物は、ペルオキシレドキシン活性化因子を含むものである。ここで、ペルオキシレドキシン活性化因子としては、上記一般式（Ｉ）で表されるエポラクタエン誘導体及びエポラクタエンであることが好ましい。
【０００８】
天然型エポラクタエンにはアポトーシス誘導作用があることは知られていた（Biochim Biophys Acta. 2002 Mar 15; Vol.1581(1-2): pp.1-10）が、この天然型エポラクタエン及びエポラクタエン誘導体に血管新生促進作用があることは本発明において見出された事項である。天然型エポラクタエン及びエポラクタエン誘導体は分子量も大きくなく、生体へ効果的に投与することができ、その生理活性効果を発揮することができる。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、血管新生促進効果を効果的に発揮しうる新規化合物及び血管新生促進組成物を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明のエポラクタエン誘導体は、下記一般式（Ｉ）で表されるものである。
【００１１】
【化２】
【００１２】
上記式中Ｒ1は、炭素数１〜５のアルキル基を表し、好ましくは炭素数１〜２であり、メチル基が最も好ましい。
式中Ｒ2は、置換又は未置換の飽和又は不飽和の炭素数１〜２０の炭化水素基を表す。またＲ2は、血管新生促進作用の観点から、好ましくは、式中Ｒ2が炭素数５〜２０の炭化水素基を有するものである。
また置換基を有する場合には、置換基は、炭素数１〜５のアルキル基、アシル基等を挙げることができ、メチル、エチル、アセトキシ等を挙げることができる。
このような化合物としては、下記の化合物を挙げることができる。
【００１３】
【化３】
【００１４】
一般式（Ｉ）で表されるエポラクタエン誘導体としては、下記式１ｂで表される化合物が特に好ましい。このエポラクタエン誘導体１ｂは、下記に示される天然型のエポラクタエンとは、ピロリジン環の３位に結合している置換基において相違している。
【００１５】
【化４】
【００１６】
【化５】
【００１７】
ここで本発明のエポラクタエン誘導体は、下記の合成ルートに従って、合成することができる。
【００１８】
【化６】
【００１９】
本発明に係る式（Ｉ）の化合物は、文献記載の方法（S. Kobayashi et al. Tetrahedron Letters, 40巻, 7367-7370 (1999), Tetrahedron Letters, 40巻, 7371-7374 (1999), Tetrahedron Symposia in Print, 59巻, 9743-9758 (2003). ）に準じて合成することができる。すなわち、上記に示すように、エポキシシリルラクトン１にフッ化テトラブチルアンモニウムの存在下、アルデヒド２と反応させて付加体３とする。アルコールを酸化して４とした後、アンモニアを作用させヒドロキシアミド体５とする。さらに、水酸基を酸化することにより、エポキシラクタム６を製造することができる。
【００２０】
上記一般式（Ｉ）のエポラクタエン誘導体及び天然型エポラクタエンは、ペルオキシレドキシンに結合し、ペルオキシレドキシンを活性化することができる。この結果、本発明の一般式（Ｉ）で表される化合物による血管新生促進作用が発揮される。
【００２１】
本発明の血管新生促進組成物は、ペルオキシレドキシン活性化因子を含むものである。ペルオキシレドキシン活性化因子により、細胞内過酸化水素量を上昇させることができ、これにより、血管新生を促進することができる。本発明は、特定のペルオキシレドキシン活性化因子が、細胞内２２ｋＤａ分子であるペルオキシレドキシン１に結合して活性化することによる細胞内過酸化水素量と密接に関連していることを見出したものである。
【００２２】
このようなペルオキシレドキシン活性化因子としては、上記一般式（Ｉ）で表されるエポラクタエン誘導体及び天然型エポラクタエンを好ましく挙げることができる。
上記ペルオキシレドキシン活性化因子としてのエポラクタエン及びエポラクタエン誘導体は、塩として投与してもよい。用いられる塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩等を挙げることができる。
【００２３】
血管新生促進組成物中のペルオキシレドキシン活性化因子の量は、剤型によって異なるが、組成物の総重量に対して、０．０００１重量％から１００重量％とすることができ、好ましくは０．０００１重量％から１０重量％、更に好ましくは０．００１から約０．１重量％とすることができる。また細胞に対して用いる場合には、細胞の状態によって異なるが、一般に、１０6個の細胞に対して、１μＭから５０μＭで用いることが好ましい。
【００２４】
血管新生促進組成物には、上記ペルオキシレドキシン活性化因子を有効成分とする以外に、薬理学的に許容可能な担体及び／又は添加剤を含むことができる。
このような薬理学的に許容可能な担体としては、この用途に一般に使用される各種有機あるいは無機担体物質が挙げられ、例えば固形製剤における賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤；液状製剤における溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤、無痛化剤等が挙げられる。また、必要に応じて、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤、吸着剤、湿潤剤等の添加物を用いることもできる。
【００２５】
このような添加剤としては、各剤形において一般に使用されているものをそのまま適用することができる。これらの具体的な成分は当業者であれば周知であり、当業者であれば、本組成物では特別な制限はないので周知の成分から適宜選択可能である。またこれらの他の成分の投与量も、当業者であれば適宜選択可能である。
【００２６】
例えば、本発明の血管新生促進組成物を経口投与する場合には、通常その組成物中に含有される結合剤、包含剤、賦形剤、崩壊剤等を含んだ錠剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、カプセル剤等、または内用水剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤等の何れの状態であってもよい。また、非経口投与の場合には、安定化剤、緩衝剤、保存剤、等張化剤等を含有し、通常単位投与量アンプル若しくは多投与量容器またはチューブの状態で投与用に提供される。
【００２７】
本発明の血管新生促進組成物を投与する方法としては、直接目的とする臓器、組織に投与する方法の他、経口または非経口で投与する方法も用いられる。経口投与には舌下投与も含まれる。非経口投与には注射、例えば、皮下、筋肉、静脈、動脈注射、点滴、坐剤、塗布剤、貼付剤、更にはエレクトロポレーション、イオントフォレシスなどが含まれる。
【００２８】
血管新生促進組成物の投与量は、患者の年齢、投与経路、投与回数により異なり、適宜変えることができる。この場合、有効量のペルオキシレドキシン活性化因子と、適切な希釈剤または薬理学的に使用し得る担体との組成物として投与されるが、ヒトを含む哺乳動物に投与する場合には、投与対象の種類、性別、体重、症状、年齢、投与経路及び投与形態によって異なるが、有効成分の量として、一般に体重ｋｇあたり１μｇ〜１０００ｍｇ、好ましくは１０μｇ〜１００ｍｇの範囲にすることができる。この投与量は、一日一回で投与してもよく、数回にわたって投与してもよい。
このとき、ペルオキシレドキシン活性化因子の濃度は、１μＭ以下、好ましくは０．０１μＭ〜１μＭとなるように調整することが好ましい。１μＭを超えると、有効成分としての投与量に対する効果が見込めなくなり、０．０１μＭ未満では血管新生促進作用が充分でない場合がある。
【００２９】
本発明のペルオキシレドキシン活性化因子により血管新生を促進させるには、血管内皮細胞に本発明の血管新生促進組成物を作用させればよい。
【００３０】
本発明の血管新生促進組成物は、血管新生促進作用を有するので、組織への栄養素の供給や、細胞の生着・増殖、組織又は臓器の移植、虚血生疾患の治療、壊死した細胞や組織並びにケガをした組織を対象とした回復促進、更には神経細胞・肝細胞・心房細胞等の維持が要求される用途に好ましく用いることができる。また、細胞・生体組織への生着・増殖のみならず、血管新生抑制物質のスクリーニングや、血管新生制御メカニズムの解析等の用途にも用いることができる。
【実施例】
【００３１】
以下に本発明の実施例について説明するが、これに限定されるものではない。また実施例中の％は、特に断らない限り、重量（質量）基準である。
【００３２】
［実施例１］
＜エポラクタエン誘導体の合成＞
本発明のエポラクタエン誘導体は、以下のようにして合成した（前述の合成経路を参照のこと）。
トラップ混合液（THF:hexane:ether=3:1:1, 23 ml）中のジイソプロピルアミン溶液（0.37 ml, 2.62 mmol) にｎ−ＢｕＬｉ（1.7 ml of a 1.53 M solution in hexane, 2.60 mmol) を０℃で２０分添加した。その後、トリメチルシリルクロリド（1.2 ml, 9.48 mmol)、β−アンジェリカラクトンエポキシド（β-angelica lactone epoxide ）（100.8 mg, 0.883 mmol) を添加して、−１１０℃で１０分間撹拌した。混合物を蒸留水でクエンチさせて酢酸エチルで抽出した。濃縮後、クロマトグラフ（４：１ hexane/EtOAc）で精製し、無色のエポキシシリルラクトン１（116.9 mg, 70%）を得た。
【００３３】
THF（5 ml）中、エポキシシリルラクトン１(55.1 mg, 0.296 mmol)、プロピオンアルデヒド（40 μl, 0.554 mmol）及びＭＳ４Ａ (0.21 g）の溶液をＴＢＡＦ（30 μl of
a 1M solution in THF, 30 μmol）に０℃で添加して、６時間撹拌後、Celiteを通して
精製し、酢酸エチルで洗浄した。有機相を回収して濃縮し、CH3CN (2 ml) に溶解させ、室温で３０分、CH3CN (1 ml)中の５％ＨＦ液に添加した。混合物を蒸留水でクエンチさせて、酢酸エチルで抽出した。抽出物をクロマトグラフ（4:1 hexane/EtOAc）にかけて無色の付加体３を得た（31.2 mg, 61%）。
【００３４】
CH2Cl2 （2 ml）中の付加体３の溶液（36.0 mg, 0.168 mmol）を Dess-Martin ペリオジナン（143 mg, 0.336 mmol）に室温で添加して、１時間撹拌した。次いで、混合物を酢酸エチルで希釈し、飽和Na2S2O3 で洗浄した。有機相を濃縮して、クロマトグラフ（4:1 hexane/EtOAc）で精製し、無色の化合物４を得た。
メタノール中で化合物４（15.7 mg, 0.074 mmol）の溶液とＮＨ3を３時間混合し、次いで溶媒を除去した後、クロマトグラフ（1:1 hexane/EtOAc）で精製して、白色固体のヒドロキシアミド体５を得た（14.6 mg, 86%）。CH2Cl2 (5 ml) 中のヒドロキシアミド体５（31.1 mg, 0.136 mmol) をDess-Martin ペリオジナン（115 mg, 0.272 mmol）に室温で添加して、１時間撹拌した。得られた混合物を酢酸エチルで希釈し、飽和Na2S2O3 、飽和NaHCO3及びH2O で洗浄した。有機相を濃縮し、クロマトグラフ（4:1 hexane/EtOAc）にかけて、およそ１．７：１の互換体混合物としてエポラクタエン誘導体を得た（27.1 mg, 88%）。
【００３５】
エポラクタエン誘導体１ｂ（(1R,5R)-1-Dodecanoyl-4-hydroxy-4-methyl-6-oxa-3-azabicyclo-[3.1.0]hexan-2-one ）は、およそ３．７：１の互換体混合物として調製され、収率８８％の無色のフォームであった。
[α]D22=−75.9 (c 0.12, MeOH); IR (CHCl3) 3455, 3020, 2927, 2856, 1743, 16
93, 1408, 1215, 1161, 1117, 1086, 949, 758, 667 cm-1; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 0.88 (3H, d, J=6.6 Hz, H-12'), 0.88* (3H, t, J=6.6 Hz, H-12'), 1.25-1.50 (18
H, m, H-3'- H-11'), 1.25-1.50* (6H, m, H-3'- H-11'), 1.58 (3H, s, 4-Me), 1.62* (3H, s, 4-Me), 2.19-2.30 (1H, m, H-2'), 2.19-2.30* (1H, m, H-2'), 2.42-2.61 (1H, m, H-2'), 2.42-2.61* (1H, m, H-2'), 3.18* (1H, brs, OH), 3.96* (1H, d, J=1.8 Hz, H-5), 4.24 (1H, d, J=1.8 Hz, H-5), 5.25 (1H, brs, OH), 6.79 (1H, brs, NH), 8.13 (1H, brs, NH); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ: 14.1, 21.3, 22.5, 22.6, 22.7, 24.1
, 29.0, 29.3, 29.3, 29.4, 29.4, 29.4, 29.6, 29.6, 29.6, 31.9, 38.1, 39.9, 61.2, 62.8, 63.9, 65.9, 82.8, 83.7, 166.8, 169.4, 199.7, 202.3 (diastereomeric mixture); HRMS, calcd for C17H29NO4 (M+) 311.2096, found 311.2108.
【００３６】
［実施例２］
＜漿尿膜報による血管新生促進作用＞
実施例１で得られたエポラクタエン誘導体１ｂの血管新生促進作用について、鶏胚漿尿膜法を用いて確認した。
鶏卵を３７℃でインキュベートし、培養４日目に卵白を除去して鶏卵上部に窓を開け、胚と卵殻膜を分離して仮気室を作成し、再び３７℃にてインキュベートした。培養１０日目に各濃度の１ｂを含んだメチルセルロースディスク又はＰＢＳを漿尿膜上に移植した。さらに３日間培養した後にディスク付近の血管網を実体顕微鏡により観察した。ディスクに向かって放射状に伸びる血管が観察されたものを陽性と判定した。結果を図１並びに図２Ａ及びＢに示す。
なお、図１において、横軸は１ｂの濃度、縦軸は、コントロールで確認された血管の合計の長さを１００としたときの割合をそれぞれ示し、グラフ内の数字は、アッセイまで生存した検体数を示す。
【００３７】
図１及び図２Ａに示されるように、１ｂを含んだディスクを移植した漿尿膜では、コントロールと比較して血管網が放射状にのびて、血管の長さが長くなっていることが確認された。このような血管の伸長は、用量依存的に増加しており、特に５０nmolの１ｂを用いたものでは１００％増となって、ほぼ２倍の長さになっていた。従って、１ｂには血管新生を促進することが明らかとなった。
【００３８】
［実施例３］
＜血管内皮細胞に対する増殖能＞
実施例１で得られたエポラクタエン誘導体１ｂの血管内皮細胞に対する増殖能を調べた。
正常ウシ大動脈血管内皮細胞は、ヒューマンサイエンス研究資源バンクより入手した。試験培地は１％ＦＢＳ（Sigma Aldrich社製）を含有するＭＥＭ培地とした。
細胞を９６ウェルプレートに１％ＰＢＳ中１．０×１０4個／ｍｌの濃度で播種し、細胞接着後に１ｂ含有試験培地に交換し、３７℃、５％ＣＯ2下で７日間培養した。培養後、培地を除去して０．１％グルタルアルデヒドで細胞を固定し、０．０２％クリスタルバイオレット溶液で染色、ＰＢＳ（−）で洗浄し、細胞を２％ＳＤＳで可溶化したのち、生存細胞数の指標としてマイクロプレートリーダーでＯＤ５７０の値を測定した。結果を図３に示す。
図３に示されるように、１ｂ含有試験培地による培養によって、血管内皮細胞の増殖が認められ、特に、０．１μＭで最も良好な増殖促進が認められた。
【００３９】
［実施例４］
＜血管内皮細胞の管腔形成能＞
次いで、実施例３で用いられた正常ウシ大動脈血管内皮細胞を用いて、エポラクタエン誘導体１ｂの管腔形成能について調べた。
４８ウェルプレートにマトリゲル溶液（マトリゲル（BD Bioscience-Discovery Labware社製）とＲＰＭＩ １６４０を１：１で混合したもの）１００μｌ／ｗｅｌｌになるように添加し、３７℃、５％ＣＯ2下で２時間インキュベートしてマトリゲルコートプレートを作製した。このプレートに、１％ＰＢＳ中１．０×１０4個の細胞／１００μＬ／ウェルを、１ｂ含有試験培地とともに播種した。３７℃、５％ＣＯ2下で培養８時間後、管腔網を顕微鏡観察して１ウェルあたり９視野を撮影し、管腔の長さを測定した。結果を図４に示す。
【００４０】
図４に示されるように、血管内皮細胞は、１ｂ及びコントロールの双方において管腔形成が認められたが、１ｂと共に培養した方が、１ｂの用量に依存して管腔形成現象の強い促進が認められた。特に、０．１μＭまで用量に依存して管腔が形成されており、０．１μＭ以下の範囲において特に良好な管腔形成能が確認できた。
【００４１】
［実施例５］
＜１ｂの細胞内標的分子の同定＞
エポラクタエン誘導体１ｂによる血管新生促進の作用機序を確認するために、ヒトＢ細胞白血病細胞株ＢＡＬＬ−１を用いて、１ｂの細胞内標的分子の同定を行った。
ヒトＢ細胞白血病細胞株ＢＡＬＬ−１は、理研細胞バンクより購入した。ＢＡＬＬ−１細胞は、カナマイシン硫酸塩（６５ｍｇ／Ｌ）、炭酸水素ナトリウム（２ｇ／Ｌ）、２−メルカプトエタノール（３．５μＬ／Ｌ）及び非動化１０％ＦＢＳ（ＷＡＫＯ社製）を含むＲＢＭＩ １６４０（ニッスイ社製）にて、３７℃５％ＣＯ2下で培養したものを使用した。
【００４２】
細胞を回収してＰＢＳ（−）で洗浄し、溶解バッファー液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０％グリセロール、１％トライトンＸ−１００、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＥＧＴＡ、１％プロテアーゼインヒビターカクテル）を用いて、常法により細胞溶解液を得た。この細胞溶解液にビオチン化１ｂを添加して一晩４℃でインキュベートし、溶解バッファー液で洗浄した後に、ストレプトアビジンアガロース（Amersham Biosciences社製）と共に２時間４℃でインキュベートした。
インキュベート後に、ローディングバッファー液（１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）０．７８ｍｌ、２０％ＳＤＳ ２．５ｍＬ、グリセロール１．４７ｍＬ、飽和ブロモフェノールブルー溶液上清０．７５ｍＬ、１０％２−メルカプトエタノール）を用いて常法により、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる解析を行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、４％濃縮ゲル、１２％分離ゲル、１００Ｖ１００分で実施した。結果を図５に示す。なお、図５中、レーン１は細胞溶解液＋ビオチン、レーン２は細胞溶解液＋ビオチン化１ｂ、レーン３は細胞溶解液＋溶媒（ＤＭＳＯ）のみ、レーン４はＢＡＬＬ−１細胞溶解液を示す。
【００４３】
図５に示されるように、ビオチン化１ｂと結合して共沈させたタンパク質として、細胞内分子３０ｋＤ及び２２ｋＤａのタンパク質分子が１ｂと結合することがわかった。
ビオチン化１ｂを用いて作成した泳動用サンプルから対応するバンドを切り出し、常法により、３０ｋＤａ及び２２ｋＤａのタンパク質分子を結晶化して、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供した。ペプチドマスフィンガープリンティング分析を行って、ペプチド断片の分子量を測定し、得られたペプチド断片の質量を用いて、Ｍａｓｃｏｔ（http://www.matrixscience.bom/dgi/serach＿form.pl?FORMVER=2&SEARCH=PMF）にてデータベース検索を行い、分子の同定を行った。
その結果、２２ｋＤａ分子はペルオキシレドキシン１（Peroxiredoxin1）、３０ｋＤａ分子はアデニンヌクレオチドトランスロケーター２として同定された。Peroxiredoxin 1はサイトソルに局在して細胞内Ｈ2Ｏ2を還元消去する抗酸化酵素であり、一方、adenine nucleotide translocator 2は、ミトコンドリアのpermeability transition（ＰＴ）poreを構成するタンパクの一種である。
また、前記と同様にしてゲルから２２ｋＤａ分子を切り出して、常法により、抗ヒトペルオキシレドキシン１抗体を用いてウェスタンブロットを行ったところ、２２ｋＤａ分子がペルオキシレドキシン１であることが確認できた（図６）。
【００４４】
［実施例６］
＜細胞内Ｈ2Ｏ2量に対する効果＞
ＢＡＬＬ−１細胞を２４ウェルプレートに２×１０5個／ｍＬで播種し、細胞内Ｈ2Ｏ2検出用蛍光プローブ（ＤＣＦＨ−ＤＡ）を１０μＭになるように添加して、３７℃１０分反応させた後、１ｂを各濃度となるように添加して３７℃で３０分反応させた。細胞を回収してＰＢＳ（−）で洗浄した後、ＦＡＣＳに供して細胞内Ｈ2Ｏ2量を測定した。
結果を図７に示す。
図７に示されるように、１ｂの添加により細胞内Ｈ2Ｏ2の量が上昇し、このような細胞内Ｈ2Ｏ2濃度の上昇は１ｂの濃度に依存しており、従って、１ｂにより細胞内過酸化水素が上昇することが明らかであった。
【００４５】
これらのことから、エポラクタエン誘導体１ｂには、顕著な血管新生促進作用が認められることが明らかとなった。このエポラクタエン誘導体がペルオキシレドキシンと結合することは明らかであり、ペルオキシレドキシンが活性化することで血管新生が促進された。またこのエポラクタエン誘導体１ｂは、他の生理活性物質と比較して低分子量であるため、医薬組成物として投与した場合には効果的にその作用を発揮できる。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】本発明の実施例にかかるエポラクタエン誘導体１ｂの鶏漿尿膜に対する血管新生促進作用を説明するグラフである。
【図２Ａ】本発明の実施例にかかるエポラクタエン誘導体１ｂによって血管新生が促進された漿尿膜の光学写真像である（２０倍）。
【図２Ｂ】比較例としての、鶏漿尿膜に対するＰＢＳの影響を示す漿尿膜の光学写真像である（２０倍）。
【図３】本発明の実施例にかかるエポラクタエン誘導体１ｂの正常ウシ大動脈血管内皮細胞に対する増殖能を示すグラフである。
【図４】本発明の実施例にかかるエポラクタエン誘導体１ｂの管腔形成能を説明するグラフである。
【図５】実施例にかかるビオチン化エポラクタエン誘導体１ｂを用いたヒトＢ細胞白血病細胞株ＢＡＬＬ−１の細胞溶解液のＳＤＳ−ＰＡＧＥ像である。
【図６】実施例にかかるビオチン化エポラクタエン誘導体１ｂを用いたヒトＢ細胞白血病細胞株ＢＡＬＬ−１の細胞溶解液のＳＤＳ−ＰＡＧＥ像（上）と、これに対応した抗ヒトペルオキシレドキシン抗体によるイムノブロット像（下）である。
【図７】実施例にかかるヒトＢ細胞白血病細胞株ＢＡＬＬ−１におけるエポラクタエン誘導体１ｂによる細胞内Ｈ2Ｏ2の量の変化を示すグラフ（Ａ）及びチャート（Ｂ）である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（Ｉ）で表されるエポラクタエン誘導体。
【化１】
（式中、Ｒ1は、炭素数１〜５のアルキル基を表し、Ｒ2は置換又は未置換の飽和又は不飽和の炭素数１〜２０の炭化水素基を表す。）
【請求項２】
前記一般式（Ｉ）中、Ｒ2は未置換の炭素数５〜２０の飽和炭化水素基を表すことを特徴とする請求項１記載のエポラクタエン誘導体。
【請求項３】
下記式１ｂで表されるエポラクタエン誘導体。
【化２】
【請求項４】
ペルオキシレドキシン活性化因子を含む血管新生促進組成物。
【請求項５】
前記ペルオキシレドキシン活性因子が、下記一般式（Ｉ）で表されるエポラクタエン誘導体及び天然型エポラクタエンであることを特徴とする請求項４記載の血管新生促進組成物。
【化３】
（式中、Ｒ1は、炭素数１〜５のアルキル基を表し、Ｒ2は置換又は未置換の飽和又は不飽和の炭素数１〜２０の炭化水素基を表す。）
【請求項６】
前記一般式（Ｉ）中、Ｒ2は未置換の炭素数５〜２０の飽和炭化水素基を表すことを特徴とする請求項４記載の血管新生促進組成物。
【請求項７】
前記ペルオキシレドキシン活性化因子が、前記式（Ｉ）中Ｒ1がメチル基を表し、Ｒ2は未置換の炭素数５〜２０のアルキル基を表す化合物であることを特徴とする請求項５記載の血管新生促進組成物。
【請求項８】
前記ペルオキシレドキシン活性化因子が、下記式１ｂで表されるエポラクタエン誘導体であることを特徴とする請求項４記載の血管新生促進組成物。
【化４】
【請求項１】
下記一般式（Ｉ）で表されるエポラクタエン誘導体。
【化１】
（式中、Ｒ1は、炭素数１〜５のアルキル基を表し、Ｒ2は置換又は未置換の飽和又は不飽和の炭素数１〜２０の炭化水素基を表す。）
【請求項２】
前記一般式（Ｉ）中、Ｒ2は未置換の炭素数５〜２０の飽和炭化水素基を表すことを特徴とする請求項１記載のエポラクタエン誘導体。
【請求項３】
下記式１ｂで表されるエポラクタエン誘導体。
【化２】
【請求項４】
ペルオキシレドキシン活性化因子を含む血管新生促進組成物。
【請求項５】
前記ペルオキシレドキシン活性因子が、下記一般式（Ｉ）で表されるエポラクタエン誘導体及び天然型エポラクタエンであることを特徴とする請求項４記載の血管新生促進組成物。
【化３】
（式中、Ｒ1は、炭素数１〜５のアルキル基を表し、Ｒ2は置換又は未置換の飽和又は不飽和の炭素数１〜２０の炭化水素基を表す。）
【請求項６】
前記一般式（Ｉ）中、Ｒ2は未置換の炭素数５〜２０の飽和炭化水素基を表すことを特徴とする請求項４記載の血管新生促進組成物。
【請求項７】
前記ペルオキシレドキシン活性化因子が、前記式（Ｉ）中Ｒ1がメチル基を表し、Ｒ2は未置換の炭素数５〜２０のアルキル基を表す化合物であることを特徴とする請求項５記載の血管新生促進組成物。
【請求項８】
前記ペルオキシレドキシン活性化因子が、下記式１ｂで表されるエポラクタエン誘導体であることを特徴とする請求項４記載の血管新生促進組成物。
【化４】
【図１】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公開番号】特開２００６−２２５２８５（Ｐ２００６−２２５２８５Ａ）
【公開日】平成１８年８月３１日（２００６．８．３１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−３８４９７（Ｐ２００５−３８４９７）
【出願日】平成１７年２月１５日（２００５．２．１５）
【出願人】（８０３０００１１５）学校法人東京理科大学 (545)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年８月３１日（２００６．８．３１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年２月１５日（２００５．２．１５）
【出願人】（８０３０００１１５）学校法人東京理科大学 (545)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]